Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định từ cây Đảng Sâm nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

----------

HOÀNG NGỌC HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ

CÂY ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA

(BLUME) HOOK.F.,)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên – 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

----------

HOÀNG NGỌC HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ CÂY

ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA (BLUME)

HOOK.F.,)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Vũ Thị Lan

Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

Thái Nguyên - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự hướng

dẫn của TS.Vũ Thị Lan. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số

liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong

một công trình nào khác.

Thái Nguyên, tháng năm 2017

Tác giả

Hoàng Ngọc Hà

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Thị Lan giảng

viên Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên đã

tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành

luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa ho ̣c - Đại học

Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo, cán bộ

trong Khoa, đặc biệt là sự quan tâm, giúp đỡ của các anh chi ̣ kỹ thuâ ̣t viên phòng thí

nghiệm Khoa Công nghệ sinh học.

Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chi ̣ kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm

nuôi cấy mô tế bào thực vật, Viện nghiên cứu và phát triển Lâm nghiệp, Trường đại

học Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm

luận văn thạc sĩ.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động

viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này.

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận

được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè

Xin trân trọng cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng năm 2017

Tác giả

Hoàng Ngọc Hà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ 3

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. 4

MỤC LỤC ....................................................................................................................... 5

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1

2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................................ 3

1.1. Giới thiệu chung về cây Đảng Sâm .......................................................................... 3

1.1.1. Phân loại khoa học ................................................................................................. 3

1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh thái của cây Đảng Sâm ..................................................... 3

1.1.3. Giá trị dược liệu của cây Đảng Sâm ...................................................................... 5

1.1.4. Thành phần và công dụng của Đảng sâm .............................................................. 5

1.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................... 7

1.2.2. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................................. 8

1.2.3. Môi trường dinh dưỡng ......................................................................................... 8

1.2.4. Sự phát sinh hình thái .......................................................................................... 12

1.3. Tình hình nghiên cứu nhân sinh khối rễ dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô

trên thế giới và Việt Nam. ............................................................................................. 14

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. ..................................................................... 14

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ....................................................................... 15

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 18

2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 18

2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................................. 18

2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .......................................................................... 18

2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................................... 19

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 19

2.3. Chỉ tiêu theo dõi và đánh giá .................................................................................. 21

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................................... 23

3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng phát triển hệ rễ bất định

cây Đảng sâm................................................................................................................. 23

3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô

sẹo và rễ bất định cây Đảng sâm. .................................................................................. 25

3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D lên sự tạo mô sẹo từ lá cây Đảng sâm ............ 25

3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất

định từ mô sẹo cây Đảng sâm ........................................................................................ 28

3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất

định từ mô sẹo cây Đảng sâm ........................................................................................ 29

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên, đường đến sự tăng sinh

khối rễ bất định cây Đảng sâm ...................................................................................... 32

3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm ....................................................................................................................... 32

3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm ....................................................................................................................... 34

3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm ....................................................................................................................... 36

3.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm ........................................................................................................................ 38

3.4. Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định khi nuôi cấy trong môi trường lỏng (bình

bioreactor) ....................................................................................................................... 40

3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân sinh khối rễ

bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục ............................................. 40

3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khối rễ bất

định Đảng sâm trong môi trường lỏng .......................................................................... 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 43

1. Kết luận ...................................................................................................................... 43

2. Kiến nghị ................................................................................................................... 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 44

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

2,4 D : 2,4 – Dichlophenoxy acetic acid

B5 : Gamborg’s

Cs : Cs

CT : Công thức

ĐC : Đối chứng

IBA : Indole butyric acid

MS : Murashige & Skoog (1962)

NAA : - Naphlene axetic acid

TB : Trung bình

KL : Khối lượng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2. Các nguyên tố đa lượng và dạng sử dụng chính ............................................. 9

Bảng 2.1. Danh mục thiết bị sử dụng trong đề tài ......................................................... 18

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng

sâm sau 4 tuần nuôi cấy ................................................................................................. 24

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của 2,4 D đến sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Đảng sâm ......... 26

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến sự hình thành rễ bất định in vitro cây

Đảng sâm sau 40 ngày ................................................................................................... 28

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến sự hình thành rễ bất định in vitro cây

Đảng sâm sau 40 ngày ................................................................................................... 29

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm ....................................................................................................................... 32

Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng tăng

sinh khối rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày ................................ 34

Bảng 3.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả năng sinh trưởng

và phát triển rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày ........................... 36

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm sau 40 ngày ................................................................................................... 39

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân sinh khối rễ bất

định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục ................................................... 40

Bảng 3.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh

khối rễ bất định Đảng sâm trong môi trường lỏng ........................................................ 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) .................................... 4

Hình 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và phát triển

hệ rễ bất định Đảng sâm. ............................................................................................... 24

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến sự hình thành mô sẹo ............................. 27

Hình 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ

mô sẹo cây Đảng sâm .................................................................................................... 29

Hình 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô

sẹo cây Đảng sâm .......................................................................................................... 30

Hình 3.5: Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất

định Đảng sâm trên môi trưởng đặc sau 40 ngày ......................................................... 33

Hình 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng tăng sinh khối rễ bất

định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày .......................................................... 35

Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ peptone đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày .................................................................. 37

Hình 3.8. Ảnh hưởng một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định

cây Đảng sâm .................................................................................................................. 38

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Trong nguồn tài nguyên lâm sản ngoài gỗ phong phú của Việt Nam, cây thuốc

mọc tự nhiên giữ một vị trí quan trọng về số lượng loài, cũng như về giá trị sử dụng và

kinh tế cao. Theo kết quả điều tra nghiên cứu của ngành Y tế, hiện đã biết ở Việt Nam

có tới gần 4000 loài thực vật và Nấm có công dụng làm thuốc. Trong đó có tới hơn

90% là cây mọc tự nhiên và tập trung chủ yếu trong các quần xã rừng [19]. Từ nguồn

cây thuốc mọc tự nhiên, hàng năm đã khai thác được một khối lượng lớn các loại dược

liệu, sử dụng cho nhu cầu làm thuốc trong nước và xuất khẩu [3]. Tuy nhiên, do khai

thác liên tục nhiều năm, cùng với nhiều nguyên nhân tác động khác đã làm cho nguồn

cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam bị giảm sút nghiêm trọng; một số loài thuộc diện

quí hiếm đang lâm vào tình trạng có nguy cơ bị tuyệt chủng cao. Bởi vậy, vấn đề bảo

tồn những cây thuốc bị đe dọa được coi là nhóm đối tượng ưu tiên, trong chiến lược

bảo tồn và phát triển bền vững nguồn tài nguyên lâm sản ngoài sỗ của Việt Nam [9].

Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) là loài cây dược liệu có

giá trị kinh tế cao, là loại thuốc quý có tác dụng bồi bổ sức khỏe, nâng cao thể lực,

tăng khả năng miễn dịch cho cơ thể, có tác dụng ích huyết, sinh tân dịch, chống mệt

mỏi, giảm stress, dùng làm thuốc bổ trong các trường hợp tỳ vị suy yếu, thiếu máu do

mới ốm dậy; chữa đau dạ dày, ho, viêm thận, nước tiểu có albumin...do rễ củ của cây

có chứa nhiều saponins, triterpenes, steroid. Ngoài ra ngọn và lá non làm rau ăn [8].

Ở Việt Nam, Đảng sâm phân bố tương đối rộng rãi ở nhiều tỉnh miền núi,

nhưng do có giá trị sử dụng và kinh tế cao, cây thuốc này đã bị khai thác liên tục nhiều

năm, thậm chí còn được xuất khẩu không chính thức qua biên giới. Hơn nữa, do nạn

phá rừng, mở rộng nương rẫy, đã làm cho Đảng sâm mọc tự nhiên ở tất cả các tỉnh trở

nên hiếm rõ rệt. Đảng sâm đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) và Danh lục Đỏ

cây thuốc Việt Nam (1996, 2001, 2006). Đồng thời cũng có tên trong Nghị định số

32/2006/NĐ 9 CP của Chính phủ (30/3/1006) nhằm tăng cường quản lý và bảo vệ [6].

Việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã làm tăng hệ số nhân

giống của thực vật chỉ trong một thời gian ngắn, đồng thời việc nuôi cấy tế bào, mô và

cơ quan thực vật đã giúp các nhà nghiên cứu thu nhận được sinh khối hay các hợp chất

thứ cấp có giá trị trong y dược với hiệu suất cao khi không thể sản xuất từ tế bào vi

sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hoá học [4].

2

Đối với cây Đảng sâm, hiện nay nguồn cung cấp dược liệu vẫn chủ yếu bằng

thu hái tự nhiên và nuôi trồng truyền thống. Tuy nhiên, việc nuôi trồng lại phụ thuộc

rất nhiều vào các điều kiện sinh thái và trồng trọt. Do cây Đảng sâm có thời gian thu

hoạch phải từ 2-3 năm. Hơn nữa, việc phòng trừ các loại dịch bệnh, tồn dư của thuốc

bảo vệ thực vật cũng là một vấn đề khó khăn [2].

Với các ưu điểm như nâng cao hàm lượng, chủ động quá trình sản xuất, tối ưu

hóa quá trình chiết xuất hợp chất mục tiêu, việc nhân nuôi sinh khối cây dược liệu

bằng phương pháp công nghệ sinh học để thu hợp chất thứ cấp là một biện pháp triển

vọng để khắc phục những hạn chế của phương pháp nuôi trồng truyền thống. Phương

pháp này có thể tạo ra một lượng sinh khối rễ bất định lớn trong thời gian ngắn nhằm

phục vụ nhu cầu dược liệu của con người, rút ngắn thời gian sản xuất, cho hiệu quả

kinh tế vô cùng lớn đồng thời góp phần đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng chế biến sản

phẩm sử dụng trong lĩnh vực y dược [4]. Trên đối tượng cây Đảng sâm, hiện nay các

nghiên cứu chỉ mới tập trung vào đánh giá tác dụng dược lý, phân tích thành phần hóa

học hay nhân giống in vitro [11]. Xuất phát từ thực tiễn này, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định từ cây Đảng Sâm nam (Codonopsis

javanica (Blume) Hook.f.,)”

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được môi trường phù hợp để tạo rễ bất định cây Đảng Sâm in vitro và

nhân sinh khối rễ bất định Đảng Sâm trong bình bioreactor.

2. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định

cây Đảng sâm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo

mô sẹo và rễ bất định.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ tự nhiên, đường đến sự

tăng trưởng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm

- Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định khi nuôi cấy trong môi trường lỏng

(bình bioreactor)

3

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Đảng Sâm

1.1.1. Phân loại khoa học

Đảng sâm có tên khoa học là Codonopsis javanica (Blume) Hook. f. et

Thoms hay còn có tên gọi khác là Sâm leo, Sâm nam, Cây đùi gà, Ngân đằng; Mằn

rày cáy (Tày); Co nhả đòi (Thái); Cang hô (H' Mông). Thường mọc ven rừng,

nương rẫy bỏ hoang lâu ngày ở độ cao 700m trở lên đối với các tỉnh phía Bắc và độ

cao 1300m đối với các tỉnh phía Nam. Là loại cây ưa ẩm, ưa sáng, ưa bóng, mọc

nơi đất tốt, nhiều mùn [6],[8].

Đảng Sâm mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, phân bố chủ

yếu ở các tỉnh Hà Giang (Vị Xuyên, Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ, Yên Minh...).

Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, Mường Khương, Văn Bàn); Lai Châu (Sìn Hồ, Phong

Thổ, Mường Tè, Than Uyên). Yên Bái (Mù Căng Chải, Văn Chấn); Cao Bằng;

Lạng Sơn; Hòa Bình; Sơn La; Nghệ An (Kỳ Sơn); Hải Dương (Chí Linh).., ở các

tỉnh phía nam trở nên hiếm dần, chỉ thấy tập trung xung quanh núi Ngọc Linh

(Quảng Nam, Kon Tum); vùng Đà Lạt và núi LangBiang (Lâm Đồng). Ngoài ra trên

thế giới cây còn xuất hiện ở Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Myanma và Nhật Bản [16].

Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm

sắc thể, cây Đảng Sâm được phân loại như sau: [6],[29].

Tên Việt Nam: Đảng sâm nam

Tên khoa học: Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,

Họ: Hoa chuông (Campanulaceae)

Bộ: Hoa chuông (Campanulales)

Lớp (nhóm): Hai lá mầm (Magnoliopsida)

Ngành: Hạt kín (Magnoliophyta)

Giới: Thực vật (Plantae)

1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh thái của cây Đảng Sâm

Theo Sách đỏ Việt Nam [6] và Từ điển cây thuốc Việt Nam [8] đã chỉ ra đặc điểm

sinh lý, sinh thái của cây Đảng sâm như sau:

4

Dây leo nhỏ, sống nhiều năm, leo bằng thân quấn. Có rễ bất định (củ) hình

trụ, màu ngà vàng, có thể phân nhánh, nạc. Thân leo dài trên 1m, màu xanh hay

phớt tím hồng, có lông nhỏ ở ngọn non sau nhẩn. Lá mọc đối, ít khi mọc so le, có

cuống; phiến lá hình tim, dài 3 - 8cm, rộng 2 - 4cm, gốc lá chia 2 thùy tròn, đầu hơi

nhọn, mép hơi lượn sóng hoặc có răng cưa tù; mặt trên lá xanh, mặt dưới màu hơi

xám bạc; có lông nhỏ lúc non.

Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá, có cuống dài 2 - 3cm; 5 lá đài thuôn hẹp màu xanh

hoặc phớt tía; tràng hình chuông, màu trắng, có các gân màu tía, đầu xẻ thành 5

thùy, họng màu tím đen; 5 nhị, chỉ nhị dẹt, bao phấn đính gốc. Bầu có 5 ô; núm

nhụy ngắn, tồn tại ở quả.

Quả nang, gần hình cầu, đường kính 1 - 1,6cm; vết tràng hoa còn lại thành 5

gờ nông; khi chín màu tím đen. Hạt nhiều, màu vàng nâu. Toàn cây có nhựa mủ

màu trắng. Mùa hoa quả: từ tháng 9 – tháng 12.

Cây ưa ẩm, ưa sáng nhưng có thể hơi chịu bóng; thường mọc lẫn với các cây cỏ

thấp ở ven rừng, đất sau nương rẫy hoặc trong các hốc đá ở rừng núi đá vôi. Độ cao từ

600m (Bắc Sơn - Lạng Sơn) đến 1.600m (Hà Giang, Lào Cai). Đảng sâm sinh trưởng

mạnh trong mùa mưa ẩm. Sau khi quả già, phần trên mặt đất thường tàn lụi và sẽ mọc

lại (từ đầu củ) vào mùa xuân năm sau. Song đối với cây còn nhỏ (chưa ra hoa quả năm

đầu tiên) không có hiện tượng lụi mùa đông. Cây tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt. Do

có củ nằm sâu dưới mặt đất, đảng sâm có thể tồn tại qua đợt cháy rừng hay đốt nương

làm rẫy.

Hình 1.1: Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,)

(Nguồn: https://botanyvn.com/cay-dang-sam-nam)

5

1.1.3. Giá trị dược liệu của cây Đảng Sâm

Cây Đảng Sâm có tác dụng và được sử dụng tương tự cây Nhân Sâm trong đời

sống nhân dân Việt Nam và được coi là "nhân sâm của người nghèo" [12]. Thành phần

quan trọng nhất trong cây Đảng Sâm là bộ phận rễ củ của cây. Rễ đảng sâm được thu

hoạch vào năm thứ 3 hay 4 của đời cây và phơi khô trước khi đem bán. Rễ cây Đảng

Sâm có chứa các chất như saponin, đường khử, acid amin, chất béo, terpen, hợp chất

glycosid, vitamin, các nguyên tố khoáng, alkaloid [11]. Hợp chất được ưu tiên quan

tâm nhất trong rễ cây Đảng Sâm là saponin. Nó có nhiều tác dụng to lớn. Đối với các

hệ cơ quan trong cơ thể có tác dụng chống mệt mỏi, tăng cường sự thích nghi của cơ

thể với môi trường ở nhiệt độ cao. Đối với hệ tiêu hóa, có tác dụng tăng cường trương

lực của hối tràng. Đối với tim mạch có tác dụng làm tăng cường độ co bóp của tim,

tăng lượng máu cho não, chân và nội tạng. Đối với máu và hệ thống máu giúp làm

tăng lượng hồng cầu, huyết sắc tố, làm giảm số lượng bạch cầu, làm tăng nhanh máu

đông khô mà không có tác dụng tán huyết. Ngoài ra còn có tác dụng hạ huyết áp, tăng

cường miễn dịch của cơ thể, có tác dụng kháng viêm, giảm ho, kháng khuẩn,…[ 23].

1.1.4. Thành phần và công dụng của Đảng sâm

Thành phần hóa học:

Lá Ðảng sâm non chứa nước 77,5%, protid 4,2%, glucid 13,1%, xơ 3,3%,

caroten 3,6mg%, vitamin C 85,5mg%. Sơ bộ thấy trong rễ cây có đường, chất béo;

không chỉ có saponin là thành phần chính còn có anthraglucosid, iridoid glucoside, các

sterol, các chất vô cơ như K, Na, Mg, Fe, Cu, Zn…, tinh bột, đường, acid hữu cơ, tinh

dầu, vitamin C [11].

Theo Y dược học Trung Hoa [1] và Dược điển Việt Nam [7]. Đảng sâm có rất

nhiều công dụng và có nhiều bài thuốc được áp dụng trong dân gian như sau:

Công dụng dược lý của Đảng sâm:

+ Tác dụng tăng sức: Thực nghiệm cho thấy Đảng sâm có tác dụng chống mỏi

mệt và tăng sự thích nghi của động vật trong môi trường nhiệt độ cao. Thực nghiệm

trên động vật chứng minh rằng Đảng sâm có tác dụng trên cả 2 mặt hưng phấn và ức

chế của vỏ não. Thí nghiệm cho thấy dịch chiết xuất thô của Đảng sâm có tác dụng

làm tăng sự thích nghi của chuột nhắt trong trạng thái thiếu dưỡng khí (do thiếu dưỡng

khí ở tổ chức tế bào, do suy tuần hoàn hoặc do làm tăng sự tiêu hao dưỡng khí…)

thuốc đều có tác dụng với mức độ khác nhau [7].

6

+ Đối với máu và hệ thống tạo máu [7]:

* Nước sắc Đảng sâm có tác dụng làm tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc tố.

Dịch tiêm Đảng sâm tăng nhanh máu đông mà không có tác dụng tán huyết.

* Tiêm mạch máu dung dịch Đảng sâm 20% (4ml/1kg thể trọng) hoặc cho uống

(mỗi ngày 20g) đều thấy hồng cầu tăng lên, bạch cầu giảm xuống.

+ Đối với huyết áp: Tiêm mạch máu dung dịch Đảng sâm 20% (chiết xuất bằng

nước và bằng rượu) cho thỏ và chó đã gây mê đều thấy hạ huyết áp. Tác giả có tiêm

dung dịch 4,8% glucose và đối chứng là dung dịch đảng sâm không chứa glucose thì

không thấy hạ huyết áp, do đó tác giả cho rằng hiện tượng hạ huyết áp không liên quan

đến thành phần đường trong Đảng sâm. Tác giả cho rằng hiện tượng hạ huyết áp là do

gĩan mạch ngoại vi. Đảng sâm còn có tác dụng ức chế hiện tượng cao huyết áp do

Adrenalin gây ra: nếu lượng Adrenalin tiêm thì cao thì hiện tượng ức chế kém, nếu

lượng Adrenalin tiêm thấp thì hiện tượng ức chế càng mạnh [7].

+ Tăng khả năng miễn dịch của cơ thể: dùng chế phẩm Đảng sâm tiêm bụng,

tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch chuột nhắt đều có tác dụng làm tăng số lượng thực bào

rõ rệt, thể tích tế bào tăng giả túc nhiều hơn, khả năng thực bào cüng tăng. Các thành

phần trong tế bào như DNA, RNA, các enzym, acid được tăng lên rõ rệt [7].

+ Kháng viêm, hóa đàm, chỉ khái (giảm ho).

+ Kháng khuẩn: Trên thực nghiệm ‘In Vitro’ thấy Đảng sâm có tác dụng kháng

khuẩn ở mức độ khác nhau đối với các loại vi khuẩn sau: Não mô cầu khuẩn, Trực

khuẩn bạch hầu, Trực khuẩn và Phó trực khuẩn đại tràng, Tụ cầu khuẩn vàng, Trực

khuẩn lao ở người [7].

+ Ngoài ra, Đảng sâm còn có tác dụng làm hưng phấn tử cung cô lập của chuột

cống, phát triển nội mạc tử cung kiểu Progesteron mức độ nhẹ, gây tăng trương lực cổ

tử cung, tiết sữa ở động vật mẹ cho con bú, nâng cao corticosterone trong huyết tương,

nâng cao đường huyết [7].

Một số bài thuốc từ Đảng sâm [1]:

+ Thanh Phế kim, bổ nguyên khí, khai thanh âm, tráng gân cơ: Đảng sâm 640g,

Sa sâm 320g, Quế viên nhục 160g. Nấu thành cao, uống.

+ Trị thần kinh suy nhược: Đảng sâm 12g, Mạch môn 12g, Ngũ vị tử 8g. Sắc uống.

+ Trị trẻ nhỏ miệng bị lở loét: Đảng sâm 40g, Hoàng bá 20g. Tán bột, bôi.

7

+ Trị huyết áp thấp: Đảng sâm 16g, Hoàng tinh 12g, Nhục quế 10g, Cam thảo

6g, Đại táo 10 quả, sắc uống ngày 1 thang. 15 ngày là 1 liệu trình, dùng 1-2 liệu trình.

+ Trị huyết áp cao ở người bị bệnh cơ tim: Đảng sâm 10g, Vỏ con trai (loại cho

ngọc) 16g, Sinh địa 10g, Đương quy 10g, Trắc bá tử (hạt) 16g, Táo 16g, Phục linh

16g, Mộc hương 6g, Hoàng liên 6g. Sắc với 800ml nước, chia làm 3 lần uống liên tục

2 – 2,5 tháng.

+ Trị Phế quản viêm mạn (thể khí hư huyết ứ): Đảng sâm, Ngũ linh chi, Thương

truật, Sinh khương, mỗi thứ 10g, sắc uống. Đã trị 32 trường hợp, mỗi năm uống thuốc

từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau, mỗi lần 20-30ml (những lúc sốt,cảm, không uống),

uống liên tục 1-2 tháng, có kết quả: 93,75%. kết quả tốt 53,13%, không có phản ứng phụ.

+ Trị thần kinh suy nhược: dùng dung dịch tiêm ‘Phức Phương Đảng Sâm’ (mỗi

ml có 1g Đảng sâm, 50mg vitamin B1) tiêm bắp mỗi ngày 1 lần 2ml, liệu trình 15

ngày, có kết quả nhất định.

+ Trị tử cung xuất huyết cơ năng: dùng độc vị Đảng sâm, mỗi ngày 30-60g, sắc,

chia làm 2 lần uống, liên tục 5 ngày trong thời kì kinh nguyệt .

+ Trị hư lao, ho, cơ thể suy nhược: Đảng sâm 16g, Hoài sơn 12g, dĩ nhân 6g,

Cam thảo 2g, Khoản đông hoa 6g, Xa tiền tử 6g. Sắc, chia làm 3 lần uống.

+ Trị Thận suy, hay đau lưng, mỏi gối, đái lắt nhắt, bồi dưỡng cơ thể: Đảng sâm

16g, Cáp giới 6g, Huyết giác 1,2g, Trần bì 0,8g, Tiểu hồi 6g. Ngâm với 1 xị (250ml)

rượu uống trước khi đi ngủ.

+ Trị cơ thể mỏi mệt, ăn không ngon, đại tiện lỏng: sắc 20 – 40g Đảng sâm

uống, hoặc kết hợp các vị thuốc khác như: Bạch truật (sao), Đương quy, Ba kích mỗi

thứ 12g, sắc uống hoặc tán bột viên với mật, ngày uống 12-20g.

+ Trị người già suy yếu lâu ngày, người làm việc nhiều hao sức lao động cüng

như trí óc: Đảng sâm 40g, Ngưu tất, Mạch môn, Đương quy, Long nhãn trí óc, mệt

tim, ê ẩm: Đảng sâm 40g, Ngưu tất, Mạch môn, Đương quy, Long nhãn 8g

+ Trị trung khí suy nhược, vị bất hòa: nấu Đảng sâm với đường cát thành cao

lỏng Đảng sâm, uống

+ Trị khí huyết đều suy: Đảng sâm, Chích hoàng, Bạch truật, Long nhãn,

Đường cát, nấu thành cao uống.

1.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy

trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi

8

trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định [5].

Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở tính toàn năng và sự phân hóa, phản

phân hóa tế bào. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị:

phân hóa tế bào

tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa

phản phân hóa tế bào

1.2.1. Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực

vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay

bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ

lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…) [5],[26].

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên

cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc

lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất

lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy [26].

1.2.2. Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tác với mẫu

cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng.

- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về

ánh sáng và nhiệt độ.

1.2.3. Môi trường dinh dưỡng

Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng và

phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy [10]. Thành phần

và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng tùy thuộc loại mẫu và mục

đích nuôi cấy nhưng đều gồm các thành phần chính sau:

- Nguồn cacbon

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị

dưỡng mặc dù chúng có thể sống bán dị dưỡng trong điều kiện ánh sánh nhân tạo và

lục lạp vẫn có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy

9

nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn cacbon thông dụng nhất hiện nay là

saccharose, ngoài ra có thể sử dụng glucose, maltose [5].

- Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố N, P, K, Mg, Ca, Na, S [5].

Bảng 1.2. Các nguyên tố đa lượng và dạng sử dụng chính

+ , hầu hết các loại thực

Nguyên tố Dạng sử dụng

- hoặc NH4

Thường được sử dụng ở dạng NO3

Nitơ vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hóa và tổng hợp nên các sản

phẩm hữu cơ.

Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng Phospho như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường

Kali Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O

Canxi Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O

-

Magie Sử dụng chủ yếu là MgSO4

Lưu huỳnh Chủ yếu là SO4

Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni… các nguyên tố vi

lượng tuy bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với

quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy [5].

- Vitamin

Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đủ về

lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B [5].

 Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi

cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid.

Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao

đổi chất.

Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp.

Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham

gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hydratcacbon.

- Các chất hữu cơ tự nhiên

10

Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường,

các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin….

Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid.

Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B.

Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh….

- Các thành phần khác

Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm có một số chất hữu cơ

như acid hữu cơ, acid béo; cùng 1 số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn… Ngoài tác

dụng tạo gel cho môi trường agar cũng cung cấp 1 số chất dinh dưỡng cho tế bào, mô

nuôi cấy.

Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế sự

sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng 1 số chất chống oxy hóa khác

như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic.

- pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của

mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng

từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy

sản sinh ra các acid hữu cơ.

- Các chất điều hòa sinh trưởng

Theo Nguyễn Như Khanh trong tài liệu về chất điều hòa sinh trưởng thực vật

đã chỉ ra [20] : các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi

trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật.

Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất

điều hòa sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy.

Dựa vào hoạt tính sinh lý phân chất điều hòa sinh trưởng thành 2 nhóm: Nhóm

chất kích thích sinh trường và nhóm chất ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô, tế bào

thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng [10].

 Nhóm Auxin: Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là

Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch. Sau đó, nhiều nhà

khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này. Auxin trong cơ

thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa. Auxin có

nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể

như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng

11

sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh

sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích

thích sự phân chia của tế bào trụ bì, nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ và biểu bì.

Ngoài ra, auxin còn có tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và

làm chậm sự rụng lá.

Các auxin thường được sử dụng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA

(auxin tự nhiên). Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh

như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân hủy

trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy mô.

NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây

độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus.

 Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu

tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của

hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá

kim. Zeatin có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn. Trong thực vật,

cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc

ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự

phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ,

ngược lại sẽ hình thành chồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu

thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin.

Ngoài ra, cytokinin còn làm chậm sự già hóa.

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì kinetin và BAP được sử dụng phổ biến

vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin với tỷ lệ thích hợp có khả năng kích

thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền với nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng

TDZ, Diphenylurea….

 Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà

khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Gibberellin được tổng hợp trong các

mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Gibberellin có tác dụng chính

trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích

thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin

được sử dụng nhiều nhất.

12

1.2.4. Sự phát sinh hình thái

1.2.4.1. Định nghĩa

Phát sinh hình thái là thuật ngữ được dùng để chỉ những thay đổi của cơ thể

thực vật theo thời gian để hoàn thành chu trình phát triển [20].

Phát sinh hình thái ở thực vật bao gồm các quá trình:

- Phát sinh mô ( Histogenesis )

- Phát sinh cơ quan (Organogenesis)

- Phát sinh phôi ( Embryogenesis )

Phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai quá trình cơ bản: sự điều hòa hướng

kéo dài tế bào và sự kiểm soát vị trí và hướng mặt phẳng phân chia của tế bào. Chính

kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết đinh hình thái của cơ quan và cơ thể

thực vật [20].

1.2.4.2. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sự phát sinh hình thái in vitro dẫn tới nhiều ứng dụng của sinh học

thực vật cho các nghiên cứu về thực vật học, sinh hóa học, vi nhân giống và phát triển

cây trồng chuyển gen ( transgenic crops ) [39],[44].

Phát sinh hình thái là một trong những vấn đề căn bản và phức tạp nhất của sinh

học. Nhiều nhà sinh học thực vật cho rằng không thể chỉ mô tả hình thái và cấu trúc

thực vật mà cần phải tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố liên quan trong các

biến đổi hình thái và cấu trúc. Do đó, không có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ

nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó. Những kĩ thuật từ nhiều lĩnh

vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều

có thể giúp ta tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái [20].

Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp thường được dùng

nhất là:

- Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển

sau đó.

- Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời

của một cơ thể thực vật.

1.2.4.3. Sự phát sinh rễ

13

Rễ mầm được phát triển từ sinh mô chóp (tiền sinh mô). Sinh mô này có một

hoạt tính đặc biệt có thể riêng cho từng loài thực vật. Về nguồn gốc của rễ có thể có

hai cách giải thích:

- Do ba tế bào nguyên thủy tạo ra: một sẽ tạo ra vùng trục trung tâm, một sẽ tạo

ra vùng vỏ, một sẽ tạo ra vùng chóp. Có thể mỗi vùng có tế bào nguyên thủy riêng.

- Chóp rễ và vỏ tạo thành một nhóm không phân biệt có thể vì tế bào nguyên

thủy chung cho cả ba vùng.

Vì rễ thường khởi đầu từ trong trụ nên rễ thường được cho là có nguồn gốc nội

sinh. Tuy nhiên, ở Cardamine pratensis, các thay đổi xảy ra ở vùng tế bào nằm phía

ngoài vùng trụ. Đây là trường hợp rễ có nguồn gốc ngoại sinh.

Sau khi thoát ra khỏi vỏ hạt và tăng trưởng, rễ sẽ phát triển và tạo rễ nhánh và

rễ phụ. Sự phát triển đó gồm một loại phản ứng phân hóa. Rễ nhánh xuất hiện trên rễ

chính, cơ chế giống rễ bất định. Sự tạo rễ bất định là một bước ngoặc quan trọng sự

nhân giống vô tính những cây gỗ quý, những cây lương thực, thực phẩm.

Rễ bất định là những rễ thông thường ở thực vật có mạch và được tạo ra ở nhiều

vùng trên cơ thể thực vật như đốt, nhánh phụ, lá, thực vật cấp thấp nhưng có mạch;

đơn tử diệp hay song tử diệp nhân giống bằng giò, dây leo hay thủy thực vật hoặc

những thực vật sống bám vào cây chủ. Hiện tượng hình thái giải phẫu thực vật có thể

chung cho hai cơ quan rễ nhánh hoặc rễ bất định [48].

Rễ bất định có thể mọc ra từ mô của thân trong điều kiên môi trường stress hay

bị vết thương cơ học hoặc trong môi trường tái sinh chồi. Có ít nhất hai con đường

hình thành rễ bất định: từ những tế bào có khả năng tạo cơ quan như tế bào tượng tầng

hay từ mô sẹo [54].

Sự hình thành rễ bất định được điều hòa bởi nhiều nhân tố môi trường và các

yếu tố nội sinh [39]. Các tác giả cho rằng sự cân bằng chất hoạt hóa và chất ức chế

phiên mã Auxin Response Factor ( ARF ) điều khiển sự tượng rễ bất định [50]. Auxin

và etilen được xem là hormon kích thích sự hình thành rễ bất định trong khi cytokinin

và gibberelin thì ngược lại [54].

Sự hình thành rễ bất định của cành chiết, cành giâm chia làm ba giai đoạn:

14

+ Giai đoạn đầu là sự tái phân chia của mô phân sinh bên (tầng phát sinh) tức là

một số tế bào xảy ra sự phản phân hóa mạnh ở vùng xuất hiện rễ tạo nên một đám tế

bào lộn xộn đó là mầm mống của rễ [22].

Giai đoạn khử phân hóa tế bào xảy ra như sau: lúc ban đầu không bào còn to,

lạp thể và ti thể phân cắt mạnh, càng lúc càng nhỏ, tế bào trở nên giống như tế bào mô

phân sinh cấp hai; sau đó tế bào chất đậm đặc dần, không bào phân chia, nhân và hạch

nhân to ra. Sau giai đoạn hoạt hóa này, tế bào có đặc tính của tế bào vùng mô phân

sinh cấp một có khả năng sinh cơ quan. Tiếp theo, các tế bào có sự phát triển mạnh

hoạt tính phân chia tế bào để tạo thành khối mô phân sinh nhỏ. Sự phân chia tăng lên

tạo thành mô sẹo hay vùng phát sinh hình thái chứa các tế bào mô phân sinh cấp một [20].

+ Giai đoạn tiếp theo là giai đoạn xuất hiện mầm rễ.

+ Giai đoạn cuối cùng là sự sinh trưởng và kéo dài của rễ, rễ thoát khỏi vỏ ra

ngoài tạo nên rễ bất định [22].

1.3. Tình hình nghiên cứu nhân sinh khối rễ dược liệu bằng phương pháp nuôi

cấy mô trên thế giới và Việt Nam.

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.

Tại Hàn Quốc và một số nước khác, Nhân sâm (Panax ginseng) đã được

nuôi cấy tạo rễ bất định thành công và được ứng dụng sản xuất ở quy mô công

nghiệp [39] [33].

Gao và cs (2006) đã nghiên cứu nuôi cấy rễ bất định trên đối tượng (Panax

notoginseng). Kết quả cho thấy rễ bất định đã được hình thành bằng ba phương

pháp. Trong đó mô sẹo là nguyên liệu tốt cho việc cảm ứng hình thành rễ bất định.

2,4D là hợp chất thích hợp nhất cho cảm ứng hình thành rễ bất định từ mô sẹo.

Việc tăng sinh khối rễ bất định tốt nhất là nuôi cấy trong môi trường lỏng [42].

Lee và cs (2011) đã nghiên cứu ảnh hưởng của auxin, cytokinin và nitơ đến sự

sản xuất rutin từ mô sẹo và rễ bất định của cây Dâu tằm (Morus Alba L.) Mô sẹo và rễ

bất định được hình thành từ ba loài Dâu (Morus). Trong số ba loài dâu thử nghiệm cho

sản xuất rutin, rễ bất định Sugye (M.alba L.) có mức cao nhất (242,2 mg/g mô tươi)

của rutin. Ngoài ra, các lá trưởng thành của loại cây này phát huy cao hơn của rutin so

với các lá non. Thêm auxin như indole-3-acetic acid (IAA), 2,4-dichlorophenoxyacetic

acid (2,4-D) và naphthalene-1-acetic acid (NAA) không chỉ tăng cường sự phát triển

của mô sẹo và rễ bất định, mà còn tăng protein và rutin. Ngược lại, thêm cytokinin như

6-benzyladenine (BA) và kinetin (KIN) mô sẹo chậm phát triển và rễ bất định chậm

15

phát triển [46].

Theo Reis (2011) và Amoo (2013), nhiều nghiên cứu đã cho thấy các chất điều

tiết sinh trưởng, đặc biệt là nhóm auxin có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển rễ bất

định trong điều kiện in vitro. Các loại auxin khác nhau ảnh hưởng khác nhau đến sự

hình thành rễ bất định và chất mục tiêu [38],[47].

Verstraeten và cs (2013) khi nghiên cứu sự tạo rễ bất định ở cây Arabidopsis

thaliana đã bổ sung 5 auxin khác nhau gồm IAA, IBA, -NAA, 2,4 D và picloram vào

môi trường nuôi cấy để cảm ứng tạo rễ bất định từ đoạn thân cây Arabidopsis và nhận

thấy, ở cùng nồng độ, trong khi IAA, IBA, -NAA cảm ứng tạo rễ bất định thì 2,4 D

và picloram hoàn toàn không cảm ứng tạo rễ mà chỉ cảm ứng tạo callus từ mẫu cấy.

Trong đó, - NAA cho hiệu quả cảm ứng tạo rễ bất định cao hơn so với IAA và IBA [51].

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Nguyễn Trung Thành và Paek Kee (2008) đã nghiên cứu ở củ Nhân Sâm Hàn

Quốc và cho kết quả thu được 2,4 D là thích hợp cho sự hình thành và phát triển của

mô sẹo, còn IBA là thích hợp cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định. Số rễ

bất định được hình thành trên môi trường được bổ sung IBA nhiều hơn rất nhiều so với

NAA. Nồng độ đường sucrose ban đầu đã ảnh hưởng đến sự tăng trưởng sinh khối tế

bào và sản phẩm saponin [33].

Trần Thanh Hương và cs (2009) đã nghiên cứu quá trình hình thành rễ bất định

ở chuối bao gồm 4 giai đoạn: tạo tế bào hoạt hóa, hình thành vùng tế bào mô phân

sinh, hình thành sơ khởi rễ và kéo dài rễ. Quá trình này chịu ảnh hưởng phần nào bởi

kiểu gen, bản chất và nồng độ auxin được áp dụng. Ở chuối Cau mẵn, 2,4D 0,1 mg/l

kích thích sự hoạt hóa tế bào rễ tạo mô phân sinh rễ trong khi NAA 0,4 mg/l kích thích

sự tăng trưởng của các tế bào mô phân sinh ñể hình thành rễ thật sự [18].

Nguyễn Thị Liễu và cs (2010) đã nuôi cấy mẫu từ củ sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis) tươi có kích thước 1cm x 1cm x 0,25cm trên môi trường MS có bổ

sung sucrose 50g/l, agar 8g/l, 2,4D 1mg/l đã cho kết quả hình thành mô sẹo và rễ

bất định tốt nhất sau 2 tháng nuôi cấy. Những đoạn cắt dài 1cm của những mẫu rễ

bất định này sau đó được chuyển sang môi trường Gamborg (B5) được bổ sung

sucrose 50g/l, agar 8 g/l, IBA 5mg/l đã cho kết quả hình thành và phát triển rễ bất

định cũng như sự tăng sinh khối rất khả quan [21].

16

Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2013) đã nghiên cứu sự hình thành và tăng trưởng rễ

bất định cây đương quy Nhật Bản. Phiến lá ở ba vị trí khác nhau của chồi in vitro được

nuôi cấy trên môi trường khoáng MS kết hợp với vitamin Morel hay khoáng và

vitamin Gamborg’s B5. Tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt 100% cũng như khối lượng tươi của rễ

(132,7 mg/mẫu) lớn nhất khi phiến lá ở vị trí thứ hai tính từ chồi ngọn được nuôi cấy

trên môi trường Gamborg’s B5. Khi phiến lá được nuôi cấy trên môi trường

Gamborg’s B5 có bổ sung các cytokinin bao gồm BA, Kinetin hoặc TDZ ở các nồng

độ 0,1; 0,5 hay 1 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi của rễ cũng như tỷ

lệ khối lượng tươi rễ/khối lượng tươi mẫu lớn nhất ở nồng độ 0,1 mg/l BA. Trong môi

trường lỏng gồm khoáng MS, vitamin Morel, và bổ sung IBA ở các nồng độ 0,2; 0,5

hay 1 mg/l, rễ bất định của cây Đương quy Nhật Bản in vitro khi được nuôi trên máy

lắc ở tốc độ 100 vòng/phút đã gia tăng sinh khối theo sự gia tăng nồng độ IBA và theo

thời gian nuôi cấy [28].

Trương Thị Quỳnh Như và cs, (2015) đã khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự

hình thành và tăng sinh của rễ bất định dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don).

Kết quả cho thấy sự cảm ứng tạo rễ xảy ra tốt nhất từ vật liệu lá mầm trên môi trường

có IBA 0,7 mg/l hoặc NAA 0,5 mg/l. Nồng độ auxin thích hợp cho sự tăng sinh của rễ

thấp hơn nồng độ auxin sử dụng trong giai đoạn cảm ứng tạo rễ từ mẫu cấy. Môi

trường MS lỏng kết hợp với IBA 0,3 mg/l hoặc NAA 0,1 mg/l thích hợp cho sự tăng

sinh rễ bất định. Các nồng độ cao hơn dẫn đến sự phát triển mạnh và chiếm ưu thế của

mô sẹo. Sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường lỏng, sinh khối thu nhận được xác định

khả năng tích lũy ajmalicine với hàm lượng cao [27].

Nguyễn Trung Hậu và cs (2015) đã nghiên cứu nuôi cấy mô lá Đinh lăng

(Polyscias fruticosa L. Harms) tạo rễ tơ và nhận biết hoạt tính saponin tích lũy. Kết

quả cho thấy môi trường MS có bổ sung NAA 1mg/l thích hợp cho nuôi cấy phát sinh

rễ tơ đạt 0,322 g/cụm. Rễ tơ tăng sinh mạnh trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5

mg/l. Hàm lượng oleanolic acid và saponin tích tụ được xác định bằng HPLC. Kết quả

cho thấy qua nuôi cấy tích tụ trong rễ 40,1 µg/g và saponin 396,2 µg/g [15].

Ninh Thị Thảo và cs (2016) đã tiến hành nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ bất

định cây Ba Kích. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm tạo nguồn rễ bất định cây ba

kích in vitro và bước đầu khảo sát một số yếu tố đến sự tăng trưởng rễ bất định. Đoạn

thân và lá cây ba kích được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA, IAA và IBA

với 5 nồng độ khác nhau (0,1-1,0 mg/l) để cảm ứng tạo rễ bất định. Kết quả cho thấy,

17

-NAA thể hiện hiệu quả tạo rễ bất định từ đoạn thân cây ba kích tốt hơn so với IAA

và IBA. Tỉ lệ đoạn thân tạo rễ đạt cao nhất (100%) trên môi trường bổ sung 0,75 mg/l

-NAA. Khác với vật liệu đoạn thân, mô lá cây ba kích hoàn toàn không cảm ứng tạo

rễ bất định trên môi trường MS + 0,75 mg/l -NAA sau 4 tuần nuôi cấy. Khả năng

tăng trưởng của rễ bất định cây ba kích trên môi trường nền B5 cao hơn so với môi

trường nền MS. Bổ sung -NAA, IAA và IBA vào môi trường nuôi cấy có tác dụng

thúc đẩy sự tăng sinh khối rễ bất định ba kích. Môi trường B5 + 1,0 mg/l -NAA là

thích hợp nhất cho nuôi cấy rễ bất định ba kích, cho khối lượng rễ tươi đạt được cao

nhất (1,264 g) sau 12 tuần nuôi cấy [34].

Đối với cây Đảng sâm hiện nay các nghiên cứu tập trung chủ yếu về nhân giống

in vitro trong phòng thí nghiệm và phân tích thành phần hóa học, tác dụng dược lý của

cây Đảng sâm. Cụ thể:

Tác giả Tống Xuân Hòa (2014) đã nghiên cứu nhân giống Sâm dây bằng kĩ

thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bùi Minh Thắng và cs (2016) đã nhân giống thành

công cây Đảng sâm bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào tại trường Đại học Lâm nghiệp.

Cả 2 tác giả đều nhận định môi trường nền MS là thích hợp cho cây Đảng sâm sinh

trưởng và phát triển đồng thời để phát sinh hình thái chồi sử dụng BA, phát sinh hình

thái rễ sử dụng IBA trong môi trường nuôi cấy [22],[30].

Ngoài ra, những nghiên cứu trên Đảng sâm còn chủ yếu về phân tích thành

phần hóa học, tác dụng dược lý.

Năm 2002, Hoàng Minh Chung và cs đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa

học của vị thuốc Đảng sâm Việt Nam [11] và cho thấy:

-Trong rễ Đảng sâm sống và chế biến có đường, saponin, acid amin và chất béo.

- Bằng sắc kí lớp mỏng, bước đầu đã xác định được 5 vết trong saponin của Đảng

sâm sống và chưng 2 giờ thấy hàm lượng saponin trong mẫu chế (1,47%) thấp hơn

trong mẫu sống,

- Rễ Đảng sâm có 17 acid amin tuy hàm lượng không cao nhưng có đầy đủ acid

amin cần thiết cho cơ thể.

Tuy nhiên, theo tìm hiểu của tác giả các nghiên cứu về rễ bất định ở cây Đảng

sâm hiện tại vẫn chưa có một công bố nào hay một công trình nào được đưa ra.

18

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu thực vật

Lá lấy từ chồi in vitro cây Đảng sâm thuộc phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào

thực vật – Viện nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp - Trường Đại học Nông Lâm

Thái Nguyên.

2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

a) Hóa chất

Các thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS gồm khoáng đa

lượng, vi lượng và vitamin (Murashige và Skoog, 1962).

- Chất điều hòa sinh trưởng: 2,4 D, NAA, IBA (Sigma, Đức).

- Hợp chất hữu cơ: Cao nấm men, peptone (Phytech, USA), nước dừa.

- Hóa chất khác: Đường sucrose, agar (Hạ Long, Việt Nam)

b) Thiết bị

Bảng 2.1. Danh mục thiết bị sử dụng trong đề tài

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất Quốc gia

1 Cân phân tích PA 214 Ohaus Mỹ

2 Cân kỹ thuật KB2000-2N Kern Đức

3 Nồi hấp khử trùng HV110 Hirayama Nhật Bản

4 Tủ sấy ED 240 Binder Đức

5 Tủ cấy vô trùng AHC-3D1 Esco Singapore

6 Máy đo pH HI2211 Hanna Italia

7 Lò vi sóng NNCD997SYTE Pansonic Nhật Bản

8 EMC Đức Bộ micro- pipette 1 kênh

9 Việt Nam Bình bioreactor (2l) sục khí liên tục

Ngoài ra còn một số thiết bị khác của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của Viện

nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.

19

2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 9/2016 – 9/2017 tại phòng thí nghiệm

nuôi cấy mô tế bào thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp – Đại học

Nông lâm Thái Nguyên.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm 1: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến

khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm.

- Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 4 công thức, mỗi công

thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 3 mẫu. Trên môi trường lần

lượt: CT1: MS, CT2: ½ MS, CT3: B5, CT4: ½ B5 không bổ sung chất kích thích sinh

trưởng và sử dụng mẫu lá làm vật liệu nghiên cứu.

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ.

Thí nghiệm 2: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến sự

hình thành mô sẹo từ mẫu lá cây Đảng sâm.

Giả sử chọn được môi trường tốt nhất đã được chọn ở thí nghiệm 1 là A. Mẫu lá

từ chồi cây Đảng sâm in vitro được cắt thành những mảnh có kích thước 2 x 4 mm

được tạo vết thương ở hai đầu. Mẫu cấy được đặt trên môi trường A đặc có bổ sung

2,4 D với nồng độ: 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 mg/l để tạo mô sẹo tương ứng với các công

thức từ 1 đến 5.

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công

thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 3 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi: Ngày hình thành mô sẹo, Khối lượng mô sẹo TB, Khối lượng

mô sẹo tăng, hình thái mô sẹo.

Thí nghiệm 3, thí nghiệm 4: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của hàm

lượng IBA, NAA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm.

Khối mô sẹo thu được từ thí nghiệm 2 được cấy chuyển sang môi trường A đặc

có bổ sung NAA, IBA với lần lượt các công thức: CT1: 0 mg/L, CT2: 0,5 mg/L, CT3:

1 mg/L, CT4: 2 mg/L, CT5: 4mg/L.

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công

thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu.

Thời gian theo dõi: 40 ngày

20

Chỉ tiêu theo dõi: Số rễ trung bình/mẫu, hình thái rễ

Thí nghiệm 5: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến

khả năng tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trên môi trường đặc.

Giả sử chọn được môi trường tốt nhất đã được chọn ở thí nghiệm 1 và nội dung 3

là B, kết hợp với các hàm lượng nước dừa khác nhau với các thể thích: CT1: 0 ml/L,

CT2: 50 ml/L, CT3: 100 ml/L, CT4: 150ml/L, CT5: 200 ml/L.

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công

thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ

Thí nghiệm 6: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến

khả năng tăng sinh khối củ cây Đảng sâm trên môi trường đặc.

Giả sử chọn ra được môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 1 và nội dung 2 làm môi

trường nền (B), kết hợp với các hàm lượng cao nấm men khác nhau.

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công

thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu. Trong đó nồng độ cao nấm men thay đổi

lần lượt với CT1: 0 g/L, CT2: 0,5 g/L, CT3: 1 g/L, CT4: 2 g/L

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ.

Thí nghiệm 7: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng pepton đến khả

năng tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trên môi trường đặc.

Giả sử dụng chọn ra được môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 1 và nội dung 2 là B

làm môi trường nền, kết hợp với các hàm lượng peptone (g/L) khác nhau từ 0; 0,5; 1; 2

lần lượt là các công thức từ 1 đến 5.

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công

thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ.

*Từ các thí nghiệm 5, thí nghiệm 6, thí nghiệm 7 tìm được chất hữu cơ ảnh

hưởng đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trên môi trường đặc và

hàm lượng cho kết quả tốt nhất.

Thí nghiệm 8: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến

khả năng tăng rễ bất định cây Đảng sâm.

Giả sử chọn được môi trường tốt nhất ở các nội dung 1,2,3,4 làm môi trường nền

là C, kết hợp với các hàm lượng đường khác nhau.

21

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 6 CT, mỗi CT nhắc

lại 3 lần, mỗi lần 30 mẫu. CT1: 0 g/L, CT2: 10 g/L, CT3: 20 g/L, CT4: 30 g/L, CT5:

40 g/L, CT6: 50 g/L.

- Thời gian theo dõi: 40 ngày.

- Chỉ tiêu đánh giá: chất lượng rễ, khối lượng rễ tăng

Thí nghiệm 9: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thể tích môi trường đến

khả năng nhân nhanh sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trong môi trường lỏng.

Giả sử chọn được môi trường tốt nhất ở tất cả các thí nghiệm trên làm thí nghiệm

9 nhưng trên môi trường lỏng ta không bổ sung agar là E. Thí nghiệm được thực hiện

nuôi lỏng trong bình 5000ml.

Chọn những mẫu sống, không nhiễm để tiến hành thí nghiệm.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 2 CT, mỗi CT nhắc

lại 3 lần, mỗi bình 20 mẫu. Trong đó: CT1: 1000 ml, CT2: 2000 ml.

- Thời gian theo dõi: 40 ngày.

- Chỉ tiêu đánh giá: chất lượng rễ, khối lượng rễ tươi trung bình, khối lượng rễ tăng.

Thí nghiệm 10: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả

năng nhân nhanh sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trong môi trường lỏng.

Giả sử chọn được môi trường tốt nhất ở tất cả các thí nghiệm trên làm thí nghiệm

10 nhưng trên môi trường lỏng ta không bổ sung agar là E. Thí nghiệm được thực hiện

nuôi lỏng trong bình 5000ml.

Chọn những mẫu sống, không nhiễm để tiến hành thí nghiệm.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 2 CT: CT1: 1 ống sục

khí, CT2: 2 ống sục khí, mỗi CT nhắc lại 3 lần, mỗi lần 2 bình, mỗi bình 20 mẫu.

- Thời gian theo dõi: 40 ngày.

- Chỉ tiêu đánh giá: chất lượng rễ, khối lượng rễ tươi trung bình, khối lượng rễ tăng.

2.3. Chỉ tiêu theo dõi và đánh giá

Khối lượng mô sẹo: Tổng khối lượng mô sẹo tạo ra Khối lượng mô sẹo TB (g) = Tổng số lần nhắc lại

Khối lượng mô sẹo tăng = Khối lượng mô sẹo TB – Khối lượng mẫu ban đầu

22

Khối lượng rễ: Tổng khối lượng rễ tươi tạo ra

Khối lượng rễ tươi TB (g) = Tổng số lần nhắc lại

Khối lượng rễ tăng (g) = Khối lượng rễ tươi TB – Khối lượng rễ ban đầu

Chất lượng rễ:

+ Rễ tốt : Rễ khỏe, mập, vàng

+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, vàng

+ Rễ kém: Rễ yếu, nhỏ

- Thu thập và xử lý kết quả bằng phần mềm thống kê toán học Microsoft Excel

2010 và phần mềm IRRISTAT 4.0.

23

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng phát triển hệ rễ bất

định cây Đảng sâm

Môi trường là một trong những yếu tố quan trong nhất quyết định đến sự thành

công cho sinh trưởng và phát triển hệ thực vật. Khi tiến hành nuôi cấy mô tế bào đối

với một số đói tượng nhất định, vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào

để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản,

các công trình đã nghiên cứu về đối tượng đó hoặc cùng họ tương đương xem các tác

tác giả đã sử dụng môi trường loại nào. Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của

tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp qua các thí nghiệm thăm dò.

Trong hằng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây

khác nhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau. Về cơ bản có thể chia ra làm 3 loại:

Môi trường nghèo dinh dưỡng, môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình:

B5 của Gamborg, môi trường giàu dinh dưỡng: Điển hình là môi trường MS

(Murashige-Skoog).

Đảng sâm là một loài cây có một số đặc điểm khá tương đồng với sâm Ngọc

Linh do vậy kế thừa các nghiên cứu về rễ bất định của Sâm Ngọc Linh tiến hành thử

nghiệm trên 2 môi trường giàu dinh dưỡng MS và môi trường có hàm lượng dinh

dưỡng trung bình là B5. Do đó môi trường sử dụng trong thí nghiệm là môi trường MS

và B5, đây cũng là những môi trường được sử dụng phổ biến để nuôi cấy rễ in vitro

nhiều đối tượng khác nhau như cây cà rốt [36], cây Nhân sâm [33], cây Nhàu [17],….

Kết hợp với mẫu sử dụng là lá cây Đảng sâm in vitro.

Kết quả thí nghiệm thể hiện trong bảng 3.1.

Môi trường MS cho Khối lượng rễ tươi TB cao nhất (3,29g), khối lượng rễ tăng

2,71 g cho chất lượng rễ tốt. ½ B5 cho Khối lượng rễ tươi TB thấp nhất (2,14g), khối

lượng rễ tăng 1,4 g chất lượng chồi kém (Hình 3.1). Các môi trường ½ MS (CT2), B5

(CT3) cho tỷ lệ lần lượt là 2,54g; 2,35g.

Từ bảng kết quả trên ta thấy:

Ở chỉ tiêu khối lượng TB rễ tươi giá trị CV = 4,8% và LSD.05 = 0,25 thì công

thức 1 sử dụng môi trường MS cho kết quả cao nhất có sự sai khác có ý nghĩa với các

công thức còn lại ở mức độ tin cậy 95%.

24

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây

Đảng sâm sau 4 tuần nuôi cấy

Các chỉ tiêu đánh giá

Môi trường Số mẫu nuôi cấy Chất lượng rễ Khối lượng rễ tăng (g) Khối lượng TB rễ ban đầu (g)

0,58 Khối lượng rễ tươi TB(g) 3,29 MS 30 Tốt 2,71

0,66 ½ MS 30 Trung bình 1,88 2,54

0,65 B5 30 Trung bình 1,7 2,35

0,74 ½ B5 Kém 1,4 2,14

4,8 30 CV (%) LSD.05

0,25

Rễ tốt: khỏe, mập,vàng; Rễ trung bình: Rễ khỏe, vàng; Rễ kém: yếu, nhỏ.

B A

C D

Hình 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và phát

triển hệ rễ bất định Đảng sâm (sau 30 ngày).

A: CT1 (MS)

B: CT2 (1/2MS)

C:CT3 (B5)

D:CT4 (1/2B5)

25

Kết quả thu được sau khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau là ½ B5, B5,

½ MS, MS được thể hiện như sau: Khối lượng rễ tươi TB tăng dao động từ 2,14 g đến

3,29g, khối lượng rễ tăng sau 4 tuần nuôi cấy từ 1,4 g đến 2,71 g chất lượng rễ cũng

cải thiện từ rễ kém lên tốt (Hình 3.1).

Kết quả thu được có thể giải thích như sau: Hai môi trường này ảnh hưởng trực

tiếp đến sự sinh trưởng ở thực vật, mẫu sạch được đưa vào các môi trường nuôi cấy,

sau đó theo dõi khả năng phát triển hệ rễ trong 4 tuần. Các môi trường thí nghiệm đều

chứa hầu hết các chất dinh dưỡng cần thiết, chủ yếu là các chất khoáng cho sự sinh

trưởng của rễ, tuy nhiên, hàm lượng khoáng trong các môi trường là khác nhau. Đồng

thời, MS là một môi trường giàu dinh dưỡng, có thành phần dinh dưỡng cao, hoạt tính

mạnh cung cấp chất dinh dưỡng cho thực vật, nhờ đó có tác dụng cung cấp chất dinh

dưỡng cho rễ sinh trưởng và phát triển nên khi cho rễ bất định Đảng sâm nuôi trên môi

trường giàu dinh dưỡng MS cho Khối lượng rễ tươi TB cao nhất với 3,29g , khối

lượng rễ tăng 2,71 g chất lượng rễ tốt. Môi trường nghèo dinh dưỡng và bị giảm đi

một nửa (1/2 MS, B5, ½ B5) cho kết quả không tốt mà có xu hướng giảm, điều này có

thể giải thích là đối với đối tượng này môi trường nghèo dinh dưỡng cung cấp ít chất

dinh dưỡng hơn cho thực vật.

Theo Bùi Đình Thạch (2016), trong môi trường MS, rễ tơ cây Bạch hoa xà tăng

trưởng tốt hơn so với trong môi trường SH và B5 [30]. Đồng thời kết quả nghiên cứu

cũng cho thấy phù hợp với kết luận trong nghiên cứu nuôi cấy in vitro rễ bất định cây

Tam thất vũ diệp của Bùi Đình Thạch và cs [40]. Tuy nhiên, theo ghi nhận của Xu và

cs (2009) thì rễ tơ cây Angelica gigas phát triển tốt hơn trong môi trường SH so với

MS và B5 [53]. Theo Ninh Thị Thảo và cs (2015), hàm lượng amonium trong môi

trường MS cao hơn 12 lần so với hàm lượng ammonium trong môi trường B5 đã làm

giảm sự phát triển sinh khỗi rễ tơ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) [35]. Điều

này cho thấy thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của rễ

nhưng còn phụ thuộc vào đặc điểm loài thực vật cá thể.

Từ các kết quả thu được chúng tôi kết luận công thức 1 với môi trường MS cho

kết quả tốt nhất.

3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo

mô sẹo và rễ bất định cây Đảng sâm.

3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D lên sự tạo mô sẹo từ lá cây Đảng sâm

Từ kết quả nghiên cứu thí nghiệm 1 chúng tôi nhận thấy môi trường nền MS là

tốt nhất cho sự hình thành rễ bất định cây Đảng sâm. Chính vì vậy, chúng tôi nghiên

cứu ảnh hưởng của 2,4D lên sự hình thành mô sẹo từ lá cây Đảng sâm trên nền môi

trường MS có bổ sung 2,4 D ở các nồng độ từ 0,0 – 4,0 mg/l.

26

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của 2,4 D đến sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Đảng sâm

Các chỉ tiêu đánh giá

Hình thái mô sẹo

Nồng độ 2,4D (mg/L)

Khối lượng TB mẫu ban đầu (g)

0 0.5 1

Thời gian hình thành mô sẹo (ngày) - 10 10

0,62 0,73 0,69

Khối lượng mô sẹo TB(g) - 2,38 2,54

Khối lượng mô sẹo tăng (g) - 1,65 1,85

2

7

0,55

3,25

2,7

4

7

0,77

2,25

1,48

CV (%) LSD.05

2,8 0,13

- Trắng, xốp Vàng nhạt, xốp Vàng nhạt, xốp Vàng đậm, cứng

(-): Không có sự hình thành mô sẹo

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: Các mẫu cấy trên môi trường có nồng độ 2,4D từ 2,0 – 4,0 mg/l bắt đầu có sự hình thành mô sẹo (callus) sau 7 ngày nuôi cấy. Các mẫu nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2,4D từ 0,5-1,0 mg/l hình thành sẹo sau 10 ngày nuôi cấy, còn các mẫu nuôi cấy trên môi trường không có 2,4D không có sự hình thành sẹo. Điều đó chứng tỏ sự có mặt của 2,4D là cần thiết cho sự hình thành mô sẹo (Hình 3.2). Tuy nhiên sau 40 ngày nuôi cấy ở tất cả các công thức đều không thấy xuất hiện rễ. Như vậy đối Đảng sâm 2,4D không có tác dụng hình thành rễ in vitro mà chỉ cảm ứng tạo mô sẹo.

Các mô sẹo hình thành trên môi trường có bổ sung 2,4D 2mg/l cho khối lượng trung bình mô sẹo tươi cao nhất (3,25g), khối lượng mô sẹo tăng 2,7 g cho chất lượng rễ tốt. CT4 cho khối lượng mô sẹo trung bình thấp nhất (2,25g), khối lượng mô sẹo tăng 1,48 g chất lượng mô sẹo kém.

Các mô sẹo hình thành trên môi trường có bổ sung 2,4D 2 mg/l sinh trưởng mạnh, khối sẹo lớn lên rất nhanh, có màu vàng nhạt, xốp. Trong khi đó, các mẫu nuôi cấy trên môi trường có nồng độ 2,4D 4,0 mg/l thì sự sinh trưởng của khối sẹo càng giảm, sẹo già đi nhanh chóng, các mẫu nuôi cấy chỉ sau 30 ngày nuôi cấy đã chuyển sang màu vàng; các khối sẹo cũng cứng, ít xốp hơn. Các mô sẹo hình thành trên môi trường 2,4D 0,5 -1,0 mg/l tăng kích thước rất chậm.

Như vậy, nồng độ 2,4D không chỉ có tác dụng gây phản biệt hóa các tế bào trong mẫu cấy, tạo khối mô sẹo mà còn có ảnh hưởng rất rõ rệt đến sự sinh trưởng của khối mô sẹo. Điều đó có thể được giải thích là do sự hiện diện của 2,4D trong môi trường làm tăng hàm lượng các DNA, RNA, đặc biệt là mRNA trong mẫu cấy, do đó làm gia tăng quá trình sinh tổng hợp các protein, dẫn đến sự gia tăng sinh khối của mẫu cấy. Nồng độ 2,4D tăng làm tăng quá trình sinh tổng hợp protein. Nhưng khi hàm lượng 2,4D quá cao sẽ làm gia tăng các RNA, và dạng

tích lũy là rRNA [32],[37], do đó mẫu cấy trở nên sinh trưởng chậm hẳn đi, khối mô sẹo trở nên chai cứng và nhanh già.

27

Nồng độ 2,4D trong môi trường nuôi cấy thấp sẽ làm thời gian cảm ứng tạo sẹo kéo dài, khối mô sẹo tăng trưởng chậm. Khi nồng độ 2,4D vượt quá mức 2,0 mg/l giúp rút ngắn thời gian cảm ứng tạo sẹo của mẫu cấy nhưng gây ức chế quá trình sinh trưởng của khối mô sẹo, tạo khối mô sẹo cứng, nhanh già.

Từ bảng kết quả trên ta thấy: Ở chỉ tiêu khối lượng TB mô sẹo tươi giá trị CV = 2,8% và LSD.05 = 0,13 thì công thức 4 sử dụng môi trường MS kết hợp 2,4D ở nồng độ 2,0 mg/l cho kết quả cao nhất có sự sai khác có ý nghĩa với các công thức còn lại ở mức độ tin cậy 95%. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Liễu và cs đã đi tới kết luận trên môi trường MS bổ sung 2,4D 1mg/L đã cho kết quả hình thành mô sẹo sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) cao hơn so với môi trường B5, WPM, SH [21]. Đồng quan điểm với Trần Văn Minh (2013), ở các nghiệm thức có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 2,4D cho thấy không có sự hình thành rễ tơ; 2,4D là một loại auxin có hoạt lực mạnh, kích thích sự phân chia tế bào nhu mô phát sinh mô sẹo hay tế bào tiền phôi và 2,4D chỉ có tác dụng giúp hình thành mô sẹo làm bước khởi đầu cho quá trình hình thành rễ bất định, rễ tơ khi kết hợp với auxin [25].

A B C

D E

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến sự hình thành mô sẹo

A: CT1 (ĐC) B: CT2 (2,4D 0,5 mg/L)

C: CT3 (2,4D 1 mg/L)

D:CT4 (2,4D 2 mg/L)

E:CT5 (2,4D 4 mg/L)

28

3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng cảm ứng tạo rễ

bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng cảm ứng

tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm được trình bày qua bảng 3.3 và hình 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến sự hình thành rễ bất định in vitro

cây Đảng sâm sau 40 ngày

Hàm lượng Tỉ lệ tạo rễ Số rễ TB/ Hình thái rễ CT NAA (mg/l) (%) mẫu

1 0 - - -

2 0,5 100 15,93 Rễ mảnh, trắng, trong

3 1 100 17,59 Rễ mảnh, trắng, trong

4 2 100 20,79 Rễ mảnh, trắng, trong

5 4 100 19,32 Rễ mảnh, trắng, trong

2,6 CV (%)

0,42 LSD.05

Khi giá trị LSD.05 = 0,42 và CV= 2,6% thì công thức 4 có sự sai khác có ý nghĩa

với các công thức khác ở mức độ tin cậy 95% và số rễ khác nhau ở mỗi mẫu là do hàm

lượng NAA khác nhau.

Từ bảng số liệu trên ta thấy công thức 4 với hàm lượng NAA là 2mg/l cho kết

quả cao nhất là 20,79 rễ/ mẫu.

Ở công thức đối chứng không bổ sung NAA không thấy hình rễ bất định,

điều này cho thấy auxin nội sinh có trong mẫu không đủ để cảm ứng cho việc hình

rễ in vitro trên đối tượng này. Khi nồng độ NAA vượt qua ngưỡng tối thích ở CT4

(2mg/l) thì số rễ/mẫu có xu hướng giảm dần, đồng thời ở CT5 (4mg/l) có hiện

tượng mô sẹo hình thành ở gốc rễ và phát triển mạnh. Kết quả này thích hợp với lý

thuyết về sự tác động của auxin lên sự hình thành và phát triển của rễ. Các nhà

nghiên cứu cho rằng nồng độ auxin quá cao có tác động ngăn cản sự phát triển của

rễ [28]. Vậy NAA có hiệu quả kích thích sự hình thành rễ bất định in vitro khá cao

ở Đảng sâm, trên môi trường MS có bổ sung ở nồng độ 2 mg/l.

29

A B

D C

Hình 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm CT2: A (NAA 0,5 mg/L)

CT3: B (NAA 1 mg/L)

CT4: C (NAA 2 mg/L)

CT5: D (NAA 4 mg/L)

3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất

định từ mô sẹo cây Đảng sâm

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng cảm ứng tạo

rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.4.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến sự hình thành rễ bất định in vitro

cây Đảng sâm sau 40 ngày

CT Hình thái rễ Hàm lượng IBA (mg/l) Tỉ lệ tạo rễ (%) Số rễ TB/ mẫu

1 2 0 0,5 - 100 - 21,4 - Rễ mập, vàng nhạt

3 1 100 24,42 Rễ mập, vàng nhạt

4 5 2 4 Rễ mập, vàng đậm Rễ mập, vàng đậm

30,32 27,89 CV (%) LSD.05 100 100 4,8 0,27

(-): Không có sự hình thành rễ

Kết quả bảng 3.4 cho thấy: Khi bổ sung IBA vào môi trường thí nghiệm cũng

cho kết quả tương đương khi bổ sung NAA là 100% số mẫu mô sẹo đều có sự đáp

30

ứng tạo rễ bất định in vitro. Tuy nhiên sau 40 ngày nuôi cấy số lượng rễ hình

thành/mẫu cấy ở các nồng độ bổ sung IBA khác nhau thì khác nhau.

Với CV (%) là 4,8 và LSD là 0,27 kết quả phân tích cho thấy số rễ trung bình

ở các công thức khác nhau có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%, số rễ ở các công thức khác

nhau là do nồng độ IBA khác nhau.

Khi tăng dần nồng độ IBA trong môi trường từ 0,5 - 2 mg/l số rễ trung

bình/mẫu tăng dần, chất lượng rễ nâng cao từ rễ mập, vàng nhạt đến rễ mập, vàng

đậm và đạt cao nhất khi môi trường được bổ sung IBA với hàm lượng 2 mg/l. Tuy

nhiên khi tiếp tục tăng hàm lượng IBA vào môi trường nuôi cấy số rễ trung

bình/mẫu sẽ giảm và cũng có hiện tượng hình thành khối mô sẹo lớn. Đó là do

nồng độ cao của auxin sẽ khiến nó trở thành tác nhân ức chế sự hình thành rễ ở

mẫu cấy.

Vậy IBA có hiệu quả kích thích sự hình thành rễ bất định Đảng sâm in vitro

tốt nhất trong môi trường MS có bổ sung ở nồng độ 2 mg/l.

B A

C D

Hình 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm

CT2: A (IBA 0,5 mg/L)

CT3: B (IBA 1,0 mg/L)

CT4: C (IBA 2,0 mg/L)

CT5: D (IBA 4 mg/L)

31

So sánh giữa các môi trường nuôi cấy có IBA và NAA, chúng tôi nhận thấy

các môi trường có bổ sung NAA đều cho kết quả (số lượng rễ hình thành) kém

hơn so với các môi trường tương ứng có bổ sung IBA ở cùng nồng độ. Đồng thời

chất lượng rễ trong môi trường có bổ sung IBA cũng tốt hơn: Rễ mập, vàng nhạt.

Chứng tỏ IBA là chất kích thích tạo rễ thích hợp hơn cho nuôi cấy tạo rễ bất định

in vitro ở cây Đảng sâm. IBA cũng đã được chứng minh là auxin hiệu quả nhất

cho sự hình thành rễ trên nhiều đối tượng khác (P. ginseng) [51] và cũng phù hợp

với kết quả thí nghiệm mà Nguyễn Thị Liễu và cs tiến hành trên đối tượng Sâm

Ngọc Linh khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và IBA tới việc tạo rễ

bất định cho cây Sâm Ngọc Linh [21]. Trong khảo sát nuôi cấy rễ bất định Panax

ginseng C. A. Meyer, Nguyễn Trung Thành và cs (2008) cho rằng IBA thích hợp cho

sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định, số rễ hình thành trên môi trường bổ sung

IBA cao hơn nhiều so với khi sử dụng NAA [33]. Kim và cs (2003) chứng minh IBA

có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự hình thành rễ bất định sau 7 ngày nuôi cấy rễ bất định

cây Sâm Panax ginseng [46]. San José và cs (2012) cũng đã chứng minh bổ sung IBA

0,1 mg/L vào môi trường nuôi cấy đã làm sự hình thành rễ thứ cấp của cây Alnus

glutinosa gia tăng rõ rệt so với đối chứng trên môi trường không có IBA [49] . Theo

Abdullahil (2010) bổ sung -NAA và IBA vào môi trường nuôi cấy làm gia tăng sinh

khối rễ bất định cây Morinda citrifolia [38]. Theo nghiên cứu của Trương Quỳnh Như

sự tạo rễ bất định dừa cạn xảy ra tốt nhất trên các môi trường ½ MS bổ sung IBA 0,7

mg/L đối với lá mầm và lá của chồi in vitro, hoặc NAA 0,5 mg/L từ lá của chồi in

vitro. Tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo và xu hướng rễ bất định tạo sẹo trong các môi

trường có NAA phổ biến hơn IBA [27]. Đối với nghiên cứu sự hình thành rễ tơ ở cây

Đinh Lăng, tác giả Nguyễn Trung Hậu đã cho kết quả Môi trường MS + NAA 1 mg/l

thích hợp cho nuôi cấy mô lá tạo rễ tơ (0,322 g/cum), sự tăng sinh rễ tơ tốt nhất trên

môi trường MS + NAA 0,5 mg/l là 2,018 g/cụm [15] và phù hợp với kết quả nghiên

cứu trên cây Nhày của tác giả Nguyễn Thị Ngọc Hương [17]. Theo kết quả nghiên cứu

của Verstraeten và cs (2013) trên đối tượng cây Arabidopsis thaliana cho thấy NAA

là phù hợp nhất đối với tạo rễ bất định trên đối tượng cây tác giả đang nghiên cứu [52].

Như vậy, loại và nồng độ auxin có ảnh hưởng lớn đến các hoạt động biến dưỡng của

các dòng/ kiểu tế bào khác nhau [18],[54].

32

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên, đường đến sự tăng

sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm

3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất

định Đảng sâm

Nước dừa được sử dụng rộng rãi như một thành phần thúc đẩy tăng trưởng

trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật. Một số thành phần quan trọng có trong

nước dừa là tập hợp của phytohormone; trong đó, quan trọng và hữu ích nhất là

cytokinin và auxin. Theo Ngô Xuân Bình (2010) [5], nước dừa bao gồm nhiều axit

amin, hợp chất đạm, hợp chất vô cơ, các axit hữu cơ, nguồn carbon, vitamin và có khả

năng điều chỉnh sự phát triển như cytokinin và auxin. Khi bổ sung nước dừa vào môi

trường nuôi cấy, hiệu quả kích thích được nhận thấy chỉ xảy ra khi hàm lượng nước

dừa được thêm vào từ 10 – 15 % và hàm lượng 20 % [24].

Do vậy trong thí nghiệm này nước dừa ở các nồng độ khác nhau từ 0 – 200ml/l

được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để nghiên cứu khả năng tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm. Sau 40 ngày nuôi cấy, kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm (sau 40 ngày)

Các chỉ tiêu đánh giá

CT Chất lượng rễ

Khối lượng TB rễ ban đầu (g) 0,94 0,83 0,88 0,91 0,78 1 2 3 4 5

Hàm lượng nước dừa (ml/l) 0 50 100 150 200 CV (%) LSD.05 Khối lượng rễ tươi TB (g) 2,53 4,48 5,34 3,58 2,85 3,3 0,32 Khối lượng rễ tăng (g) 1,59 3,65 4,46 2,67 2,07 Kém Tốt Tốt Trung bình Trung bình

Môi trường có hàm lượng nước dừa 100ml/l cho Khối lượng rễ tươi TB cao

nhất đạt 5,34g so với khối lượng rễ trung bình đưa vào là 0,88g, chất lượng rễ tốt.

Khối lượng rễ tươi trung bình cũng khá cao ở công thức 2 có hàm lượng nước dừa là

50ml/l với 4,48g, rễ vàng, mập. Giảm dần ở các công thức 4, 5 với hàm lượng nước

dừa là 150ml/l; 200ml/l cho khối lượng rễ tươi trung bình là 3,58g; 2,85g, cho chất

lượng rễ trung bình. Kém hiệu quả nhất là công thức đối chứng (CT1) cho khối lượng

rễ tươi trung bình là 2,53g, chất lượng rễ kém.

33

Trong chỉ tiêu khối lượng rễ tươi trung bình với LSD.05 = 0,32 và CV = 3,3% thì

các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%.

Hàm lượng nước dừa từ 0 – 200ml/l sẽ cho tỷ lệ khối lượng rễ tươi TB dao động

từ 2,53g – 5,34g. Công thức 3 tương ứng với hàm lượng nước dừa 100ml/l cho khối

lượng rễ tươi trung bình cao nhất (5,34g) từ 0 – 100ml/l tỷ lệ khối lượng rễ tươi tăng

tỷ lệ thuận với hàm lượng nước dừa. Tới hàm lượng từ 150 – 200ml/l thì tỷ lệ khối

lượng rễ và chất lượng rễ giảm rõ rệt, chất lượng rễ trung bình.

Kết quả thu được có thể được giải thích như sau: Nước dừa là nguồn dinh

dưỡng dồi dào, cung cấp nguồn đạm (từ nhiều loại axit amin, axit hữu cơ) và

cacbohydrat (như glucose, fuctose, sucrose). Khi bổ sung nước dừa vượt qua mức tối

ưu (100 ml/l) có thể đã cung cấp hàm lượng đạm và cacbohydrat cao làm tăng áp suất

thẩm thấu của môi trường, gây ức chế sự phát triển của tế bào rễ Đảng sâm. Từ đó

chọn hàm lượng nước dừa thích hợp để tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm là

100ml/l.

A B C

D E

Hình 3.5: Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất

định Đảng sâm trên môi trưởng đặc sau 40 ngày

A: CT1 (ĐC)

B: CT2 ( Nước dừa 50 ml/L)

C:CT3 ( Nước dừa 100 ml/L)

D:CT4 (Nước dừa 150 ml/L)

E: CT5 ( Nước dừa 200 ml/L)

34

3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả tăng sinh khối rễ bất

định Đảng sâm

Cao nấm men là hỗn hợp dinh dưỡng hữu cơ phức tạp và được sử dụng nhiều

trong nuôi cấy mô có tác dụng để làm tăng sự phát triển chồi, rễ và tăng chất lượng.

Ngoài việc tạo được số lượng rễ nhiều, thì sinh trưởng, phát triển và chất lượng

rễ cũng rất quan trọng. Nó cũng có vai trò quyết định đến việc tăng sinh khối, khối

lượng rễ. Vì vậy qua tiến hành thí nghiệm bổ sung các nồng độ cao nấm men từ 0 –

2g/l vào môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 2. Từ thí nghiệm, chúng tôi đã nghiên cứu

được nồng độ cao nấm men thích hợp nhất được trình bày ở bảng kết quả 3.6, hình 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng

tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày

Các chỉ tiêu đánh giá Khối

Nồng độ Công lượng rễ Khối lượng Khối lượng rễ Chất lượng rễ cao nấm thức ban đầu TB rễ tươi tăng ( g ) men (g/l) (g) (g)

0 1 0,82 4,45 3,63 Trung bình

0,5 2 0,86 4,98 4,12 Trung bình

1 3 0,95 5,54 4,59 Trung bình

1,5 4 0,88 6,06 5,18 Tốt

2 5 0,91 5,73 4,82 Tốt

2,7 CV (%)

0,25 LSD.05

Môi trường có nồng độ cao nấm men 1,5g/l (CT4) cho hiệu quả khối lượng rễ

cao nhất đạt 6,06g, khối lượng rễ tăng 5,18 g, chất lượng chồi tốt. Tỷ lệ cũng khá cao ở

công thức có nồng độ 2g/l (CT5) với 5,73g, khối lượng rễ tăng 4,82 g so với khối

lượng mẫu ban đầu, chất lượng tốt, rễ mập, trắng. Tiếp đó là công thức đối chứng và

các công thức còn lại với nồng độ 0-1g/l cho khối lượng rễ tăng dần từ 4,45g – 5,54g, chất

lượng rễ trung bình.

Trong chỉ tiêu khối lượng rễ tươi trung bình với LSD.05 = 0,25, CV = 2,7% thì

các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%.

35

Căn cứ vào bảng số liệu 3.6, nồng độ cao nấm men từ 0 – 2g/l sẽ cho tỷ lệ khối

lượng rễ dao động từ 4,45g đến 6,06g. Trong đó công thức đối chứng (CT1 0g/l) cho

khối lượng rễ tươi TB là 4,45g, chất lượng rễ TB. Công thức 4 (nồng độ cao nấm men

1,5g/l) cho khối lượng rễ tươi trung bình cao nhất ( 6,06g), khối lượng rễ tăng 5,18 g,

chất lượng rễ tốt. Tăng nồng độ lên 2,0g/l thì khối lượng rễ tươi TB có xu hướng giảm

tuy nhiên chất lượng chỗi vẫn tốt.

A B

C D

E

Hình 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng tăng sinh khối rễ

bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày

CT1: A (ĐC)

CT2: B (Cao nấm men 0,5 g/L)

CT3: C (Cao nấm men 1,0 g/L)

CT4: D (Cao nấm men 1,5 g/L)

CT5: E (Cao nấm men 2,0 g/L)

Kết quả thu được có thể được lý giải như sau: Cao nấm men là nội bào của tế bào

nấm men. Chúng gồm tế bào chất, nhân tế bào và các cơ quan tế bào và thường rất

giàu axit amin, vitamin, cacbonhydrat và muối. Nó sử dụng cacbonhydrate (đường,

mạch nha, cao đường) để tăng sinh khối [31]. Bổ sung cao nấm men vào môi trường

giúp phân chia tế bào, tăng sinh khối rễ. Trong thí nghiệm này khi nồng độ cao nấm

men từ 0 – 1,5g/l cho khối lượng rễ tăng dần và đạt mức cao nhất ở nồng độ 1,5g/l

(6,06g), cho khối lượng rễ tăng 5,18 g. Tuy nhiên, ở nồng độ cao lại ức chế khả năng

36

tăng sinh khối, do đó làm khối lượng rễ tươi TB giảm. Thí nghiệm đã xác định được

nồng độ cao nấm men 1,5g/l là tốt nhất tới khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm.

3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả năng tăng sinh khối rễ bất

định Đảng sâm

Sau khi chọn được công thức tốt nhất ở thí nghiệm 1, 2 và 3, ta tiếp tục tiến hành

thử nghiệm mẫu trên môi trường bổ sung peptone với các nồng độ khác nhau. Thí

nghiệm được theo dõi sau 40 ngày. Kết quả được thể hiện bảng 3.7 và hình 3.7.

Bảng 3.7: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả năng sinh

trưởng và phát triển rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày

Các chỉ tiêu đánh giá

Chất lượng rễ Công thức

Nồng độ peptone (g/l) 0 0,5 1 1,5 2 1 2 3 4 5

Khối lượng TB rễ tươi (g) 5,55 5,98 6,36 6,83 7,12 2,5 0,29 Khối lượng rễ tăng ( g ) 4,77 5,15 5,47 5,92 6,26 Trung bình Trung bình Tốt Tốt Tốt Khối lượng rễ ban đầu (g) 0,78 0,83 0,89 0,91 0,86 CV (%) LSD.05

Công thức đối chứng cho khối lượng rễ tươi TB thấp nhất (5,55g). Tăng dần

nồng độ peptone lên 0,5; 1,0 và 1,5g/l thấy khối lượng rễ tươi trung bình tăng lên lần

lượt là 5,98; 6,36 và 6,83g. Môi trường có peptone 2g/l cho khối lượng rễ tươi cao

nhất đạt 7,12g, chất lượng rễ tốt.

Trong chỉ tiêu khối lượng rễ tươi trung bình với LSD.05 = 0,29, CV = 2,5% thì

các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%.

Khối lượng rễ tươi trung bình tỷ lệ thuận với nồng độ peptone đưa vào môi

trường nuôi cấy. Công thức đối chứng (0g/l) cho kết quả thấp nhất, chất lượng rễ đạt

mức trung bình. Tăng dần nồng độ peptone thì khối lượng và chất lượng tăng lên.

Công thức 5 (peptone 2g/l) đạt khối lượng cao nhất với 7,12g rễ khỏe, mập, vàng.

Công thức 3 và công thức 4 cũng cho khối lượng đáng kể tỷ lệ 6,36g; 6,83g, cho chất

lượng rễ mập, vàng.

Ở chỉ tiêu khối lượng rễ tăng, công thức đối chứng cho kết quả thấp nhât (tăng

4,77g), cho chất lượng rễ TB. Công thức 5 cho khối lượng rễ tăng cao nhất (6,26 g),

cho chất lượng rễ tốt, giảm dần là CT4 với khối lượng rễ tăng là 7,53 g cho chất lượng

37

rễ tốt.

Kết quả trên có thể được giải thích như sau: Peptone còn được gọi là cao thịt,

chính các chất đạm hữu cơ, đường, muối khoáng và các vitamin được thủy phân bằng

protease hoặc acid sau đó cô lại thành bột. Peptone là một enzyme tiêu hóa của

protein động vật.Peptone được sử dụng như nguồn nitơ hữu cơ trong môi trường [31].

Tuy nhiên giá trị dinh dưỡng của peptone phần lớn là phụ thuộc vào hàm lượng axit

amin cung cấp N cần thiết. Ở nồng độ thấp quá thì không cung cấp nguồn dinh dưỡng

cho thực vật, cao quá thì sẽ gây ức chế sự phát triển. Kết quả thí nghiệm đã xác đinh

công thức 5 có hàm lượng peptone 2g/l cho kết quả cao nhất.

Kết quả bảng 3.7 cho thấy, khi bổ sung thêm peptone vào môi trường nuôi cấy

cũng có tác dụng làm gia tăng chỉ số tăng trưởng của rễ Đảng sâm giống như nước dừa

và cao nấm men. Tuy nhiên ở các nồng độ khác nhau cho kết quả tăng sinh khối khác

nhau. Phân tích thống kê thấy có sự sai khác có ý nghĩa giữa các công thức thí nghiệm.

A B C

D E

Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ peptone đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày

CT1: A (ĐC)

CT2: B (Peptone 0,5 g/L)

CT3: C (Peptone 1 g/L)

CT4: D (Peptone 1,5 g/L)

CT5: E (Peptone 2 g/L)

Qua kết quả nghiên cứu ở các thí nghiệm cho thấy: Việc bổ sung thêm các hợp

chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy đều có tác dụng làm tăng sinh khối rễ Đảng sâm.

Tuy nhiên khi sử dụng peptone tỏ ra ưu thế hơn. Ở nồng độ 2 g/L cho khối lượng mẫu

tăng 6,26 g cao hơn khi bổ sung nồng độ tối ưu của cao nấm men và nước dừa. Như

38

vậy peptone với nồng độ 2 g/L là thích hợp cho sự tăng trưởng sinh khối rễ Đảng sâm.

A B

C D

Hình 3.8. Ảnh hưởng một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm

A: ĐC

B: MS + nước dừa 100 ml/L

C: MS + cao nấm men 1,5 g/L

D: MS + peptone 2,0 g/L

3.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng sinh khối rễ bất

định Đảng sâm

Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh dưỡng nuôi

cấy mô thực vật, đường cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của mẫu. Quá trình

quang hợp của mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sự sinh trưởng của chúng. Vì

mẫu được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quang hợp hay thậm chí hoàn

toàn không có quang hợp (nuôi cấy trong bóng tối). Nhiều nghiên cứu đã chứng

minh rằng nồng độ đường ban đầu có thể ảnh hưởng đến các thông số khác nhau

trong quá trình nuôi cấy tế bào thực vật, như tỷ số tăng trưởng, năng suất của sự

trao đổi chất thứ cấp [14]. Trong nuôi cấy tế bào lỏng của Perilla frutescens, nồng

độ đường cao hơn 45 g/L là thích hợp cho sản phẩm anthocyanin [45]. Nguyễn

Trung Thành và cs (2008) cũng đã báo cáo về nồng độ đường ban đầu đã ảnh

hưởng đến sự tăng trưởng sinh khối củ và sản phẩm ginsenoside ở Nhân sâm P.

ginseng [33]. Nồng độ đường cũng ảnh hưởng tới sự hình thành và kích thước củ

39

ly ly in vitro [13], củ khoai tây bi in vitro [14]. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành

nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng sinh khối rễ bất

định Đảng sâm.

Trong thí nghiệm này, đường được bổ sung với nồng độ từ 10-50 g/l. Môi

trường nền nuôi cấy là môi trường khoáng MS. Sau 40 ngày theo dõi, kết quả được

thể hiện trong bảng 3.8.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng sinh khối rễ bất

định Đảng sâm sau 40 ngày

Các chỉ tiêu đánh giá

Hàm lượng đường (g/l) Chất lượng rễ Công thức Khối lượng rễ tăng ( lần )

0 10 20 30 40 50 1 2 3 4 5 6

Khối lượng TB rễ tươi (g) 5,98 6,37 6,84 7,95 7,34 7,02 2,7 0,32 5,13 5,51 6,07 7,13 6,57 6,11 Trung bình Tốt Tốt Tốt Tốt Tốt Khối lượng rễ ban đầu (g) 0,83 0,86 0,77 0,82 0,77 0,91 CV (%) LSD.05

Môi trường không bổ sung đường cho kết quả thấp nhất, chất lượng rễ trung

bình. Tỷ lệ hàm lượng đường tăng từ 10 – 30g/l cho thấy khối lượng rễ tươi tăng dần

lên từ 6,37g – 7,95g, chất lượng rễ tốt. Hàm lượng đường ở CT4 (30g/l) cho kết quả

cao nhất cả về khối lượng và chất lượng là 7,95g,chất lượng rễ khỏe; mập. Hàm lượng

đường tăng từ 40-50g/l cho thấy khối lượng TB rễ tươi có xu hướng giảm.

Khi khối lượng rễ tươi trung bình có giá trị LSD.05 = 0,32, CV = 2,7% thì công

thức 4 có sự sai khác có ý nghĩa với mức tin cậy 95% với các công thức còn lại. Công

thức 5 và 6 tương ứng với hàm lượng đường 40g/l và 50g/l có sự sai khác không có ý

nghĩa. Công thức 2 và 3 có sự sai khác không có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%.

Công thức 1 hàm lượng đường 0g/l cho kết quả thấp nhất.

Từ bảng số liệu trên ta thấy,hàm lượng đường từ 0 – 50g/l cho tỷ lệ khối lượng rễ

tươi dao động từ 5,98 – 7,95g. Hàm lượng đường ở công thức 4 (30g/l) cho khối lượng

rễ cao nhất 7,95g, chất lượng rễ tốt. Công thức đối chứng có kết quả thấp nhất, chất

lượng rễ trung bình. Tỷ lệ hàm lượng đường giữa các công thứ 2; 3 và 5; 6 cho khối

lượng thấp hơn so với công thức 4 nhưng vẫn cho chất lượng rễ tốt.

40

Theo Demet và cs (2010) [ 41] đã báo cáo rằng ở nồng độ đường cao sẽ gây ra sự

hình thành của các cơ quan phụ trong các loài thực vật khác nhau cũng có thể gây ra

sự ức chế đối với thực vật.

Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi kết luận sử dụng môi trường có hàm

lượng đường 30g/l sẽ cho hiệu quả cao nhất cho tăng sinh khối rễ Đảng sâm, dùng

hàm lượng ít hơn ở các thí nghiệm trên cho kết quả thấp hơn. Điều này cũng phù hợp

với kết quả nghiên cứu Nguyễn Thái Hà và cs (2003) trong nghiên cứu ảnh hưởng của

hàm lượng đường đến sự phát sinh củ in vitro của các giống hoa Lilium spp [13].

Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hằng và cs (2015) về ảnh hưởng của điều kiện

ánh sáng và thành phần dinh dưỡng đến sự tạo củ bi Khoai tây trong nuôi cấy in vitro

đã chứng minh hàm lượng đường sử dụng chỉ phù hợp với mỗi loài cây ở một mức độ

nhất định, khi vượt qua ngưỡng cho phép, chất lượng cụ, khối lượng củ sẽ giảm [14].

3.4. Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định khi nuôi cấy trong môi trường lỏng

(bình bioreactor)

3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân sinh khối

rễ bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục

Nuôi cấy sinh khối bằng hệ thống bioreactor sục khí liên tục là quá trình nuôi

cấy mẫu trong dung dịch dinh dưỡng lỏng kết hợp với tăng cường độ thoáng khí. Khi

nuôi cấy trong bình bioreactor mẫu cấy được tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh

dưỡng nên làm cho tốc độ tăng trưởng và phát triển được tăng nhanh. Do đó chúng tôi

đã tiến hành nuôi cấy rễ bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục với

mật độ 20 mẫu tương đương 17,23 g trong thể tích môi trường dinh dưỡng 1,0 lít và

2,0 lít để khảo sát khả năng tăng sinh khối.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân sinh khối rễ

bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục

Thể tích Khối lượng môi Khối lượng Khối lượng Chất lượng CT TB rễ tươi trường ban đầu (g) rễ tăng (g) rễ (g) (lít)

1 1,0 143,8 17,82 125,98 Tốt

2 2,0 115,38 18,61 96,77 Tốt

2,3 CV (%)

LSD.05 0,37

41

Kết quả nhận được cho thấy: Cùng khối lượng đầu vào như nhau khi nuôi với

thể tích dinh dưỡng khác nhau cho kết quả tăng sinh khối là khác nhau. Với trọng

lượng mô tươi cấy ban đầu là 17,82 g mô tăng sinh khối trong bioreactor chứa thể tích

môi trường dinh dưỡng 1,0 lít và 2,0 lít đạt lần lượt 143,8g (tăng 125,98 g) và 115,38 g

(tăng 96,77 g) sau 40 ngày nuôi cấy.

Với LSD.05 = 0.37 và CV = 2,3% cho thấy 2 công thức có sự sai khác có ý nghĩa.

Giải thích điều này là do cùng tốc độ sục khí nhưng trong thể tích nhỏ hơn tốc độ

lưu thông của môi trường lỏng cao hơn, giúp quá trình trao đổi chất của mẫu nuôi cây

diễn ra mạnh, hấp thu dinh dưỡng tốt nên mẫu sinh trưởng nhanh hơn. Như vậy khi nuôi

cấy với mật độ 20 mẫu/ bình bioreactor (2l) thì thể tích dinh dưỡng tối ưu cho sự tăng

trưởng của mẫu nuôi cấy là 1,0 l.

Theo Escalona và cs [42] khi nuôi cấy dứa bằng bình bioreactor đã xác định thể

tích môi trường từ 5,0 đến 50,0 ml/mẫu cấy, hệ số nhân chồi tăng từ 8,3 chồi lên đến

23,9 chồi sau 40 ngày nuôi cấy. Thể tích nhiều hơn tỏ ra không hiệu quả cho nhân

chồi. Giải thích hiện tượng này tác giả cho rằng trong quá trình nuôi cấy, thực vật tiết

ra ngoài môi trường các hợp chất kích thích tạo chồi và với thể tích lớn các hợp chất

này bị pha loãng đi.

3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khối rễ

bất định Đảng sâm trong môi trường lỏng

Bảng 3.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân

sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong môi trường lỏng ( 40 ngày)

CT Khối Khối lượng Khối lượng Chất lượng

lượng ban TB rễ tươi (g) rễ tăng (g) rễ

đầu (g)

1 (1 ống sục khí) 17,23 111,13 93,9 TB

18,61 2 (2 ống sục khí) 143,8 125,19 Tốt

5,3 CV (%)

LSD.05 3,4

Tốc độ sục khí với 2 ống sục cho kết quả cao (tăng 125,19 g), với một ống sục

cho kết quả thấp hơn (tăng 93,9 g).

42

Với giá trị LSD = 3,4; CV = 5,3% cho thấy công thức 2 có sự sai khác có ý nghĩa

với công thức 1 với mức tin cậy 95%.

Kết quả trên có thể được giải thích như sau: tốc độ sục khí ảnh hưởng rất lớn

đến việc tăng sinh khối rễ. Khi tốc độ sục khí nhanh thì quá trình trao đổi chất được

diễn ra liên tục, giúp tế bào thực vật phát triển một cách nhanh chóng.

Trong thí nghiệm này, rễ tăng trưởng còn nhờ vào nguồn carbon hữu cơ có mặt

trong môi trường nuôi cấy, chủ yếu là của đường sucrose. Rễ cây thông qua hô hấp sẽ

tiêu thụ carbon đồng hóa để có năng lượng cần thiết cho sự duy trì và gia tăng sinh

khối, vì vậy tiến trình này cần thiết phải có sự hiện diện của oxy. Theo Yu và cs.

(2000) [55], sự thông khí của hệ thống nuôi cấy là yếu tố quan trọng trong sự hình

thành rễ bất định. Soffer và Burger (1988) [50] cũng đã chứng minh rằng oxy hòa tan

thiết yếu cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định.

Qua đó ta có kết luận rằng với tốc độ sục khí là 2 ống sục cho kết quả cao nhất. Và

kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Quỳnh cùng cs trong

nghiên cứu rễ bất định ở cây Đương quy Nhật Bản [28].

43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Từ kết quả nghiên cứu thí nghiệm trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi đưa ra một

số kết luận như sau:

1) Môi trường thích hợp để cảm ứng tạo rễ bất định cây Đảng Sâm là môi

trường MS.

2) Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo và

rễ bất định: Nồng độ 2,4 D thích hợp cho sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Đảng sâm là 2

mg/L, IBA với nồng độ 2 mg/L là thích hợp cho khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ

mô sẹo cây Đảng sâm.

3) Ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ, đường đến sự tăng sinh khối rễ bất

định cây Đảng sâm: Peptone là tối ưu cho tăng trưởng sinh khối rễ bất định Đảng sâm với

nồng độ 2 g/L, hàm lượng đường 30g/L là thích hợp cho khả năng tăng trưởng sinh

khối rễ bất định Đảng sâm.

4) Ảnh hưởng của tốc độ sục khí và thể tích môi trường đến khả năng nhân

nhanh sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trên môi trường lỏng (bioreactor) với mật

độ 20 mẫu cấy thì thể tích phù hợp cho sự tăng trưởng sinh khối rễ bất định Đảng sâm

là 1 lít, tốc độ sục khí với 2 ống sục là tốc độ sục tối ưu để tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm.

2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy trong bình bioreactor với các thể

tích lớn hơn để thu được sinh khối lớn.

Nghiên cứu phân tích, tách chiết các hoạt chất có trong sinh khối rễ Đảng sâm

nuôi cấy.

44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tiếng Việt

1. Ngô Triệu Anh (2011), Y Dược học Trung Hoa, NXB Y học.

2. Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ hạt kín ở Việt

Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Đông, Đỗ

Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mẫn, Trần

Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1, NXB Khoa học

và kỹ thuật, Hà Nội

4. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ tế bào thực vật trong

cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội.

5. Ngô Xuân Bình (2010), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB khoa học kỹ thuật.

6. Bộ Khoa học và công nghệ, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam (2007), Sách đỏ

Việt Nam, Phần II-Thực vật, NXB. Khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội.

7. Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam (in lần thứ 3), NXB Y học, Hà Nội, tr. 310-311.

8. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội.

9. Chính Phủ (2002), Nghị định số 48/2002/NĐ-CP ngày 22 tháng 4 năm 2002. Quy

định danh mục thực vật, động vật rừng quý hiếm và chế độ quản lý, bảo vệ.

10. Nguyễn Minh Chơn (2004), Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật,

Khoa Nông nghiệp- Đại học Cần Thơ.

11. Hoàng Minh Chung, Phạm Xuân Sinh, Nguyễn Mạnh Tuyển (2002), “ Bước đầu

nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc Đảng Sâm Việt Nam”, Tạp chí dược

liệu, 7(1), tr:36-42

12. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm

Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật.

13. Nguyễn Thái Hà (2003), Nghiên cứu sự phát sinh củ in vitro các giống hoa Lilium

spp, Báo cáo khoa học Hội nghị sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr.

875-879

14. Nguyễn Thị Thu Hằng, Trịnh Thị Lan Anh, Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Trung

Thành (2015), “Ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng và thành phần dinh dưỡng

(đường, benzyl adenine, chlorocholine chloride) đến sự tạo củ bi Khoai tây

(Solanum tuberosum L.) trong nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN:

45

Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 31 (3), tr. 9-15.

15. Nguyễn Trung Hậu, Trần Văn Minh (2015), “Nuôi cấy mô lá Đinh lăng (Polyscias

fruticosa L. Harms) tạo rễ tơ và nhận biết hoạt tính saponin tích lũy”, Tạp chí

Khoa học Đại học An Giang, 7(1), tr. 75-83.

16. Đinh Thị Hoa, Đoàn Thị Thùy Linh (2015),“Đặc điểm phân bố loài Đảng sâm

(Codonopsis javanica (Blume) Hook. F. et Thoms) tại khu bảo tồn thiên nhiên

Copia, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La”- Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái

và tài nguyên sinh vật lần thứ 5

17. Nguyễn Thị Ngọc Hương, Võ Thị Bạch Mai (2009). Tìm hiểu sự phát sinh hình

thái rễ trong nuôi cấy in vitro cây nhàu (Morinda citrifolia L.), Tạp chí phát triển

Khoa học và Công nghệ, 12(17): 100-105

18. Trần Thanh Hương, Bùi Trang Việt, Feng Teng Yung (2009). Vai trò của các chất

điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự hình thành rễ bất định từ các khúc cắt mang

chồi ở một vài giống chuối (Musa sp.), Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ,

12(9): 23-30.

19. Lê Đình Khả, Hà Huy Thịnh, Nguyễn Văn Thảo (2003),Chọn tạo và nhân giống

cho một số loài cây trồng rừng chủ yếu ở Việt Nam, NXB nông nghiệp, Hà Nội.

20. Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình các chất điều hòa

sinh trưởng thực vật, NXB Giáo dục Việt Nam.

21. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011) “Nghiên cứu

khả năng tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro”, Tạp chí khoa học

DHQGHN, Khoa học tự nhiên và công nghệ, 27, tr. 30-36

22. Hà Thị Loan, Dương Hoa X , Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Hoàng Quân, Vũ Thị

Đào, Nathalie Pawlicki-Jullian, Eric Gontier (2014) “Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm

Ngọc Linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gen ROL nhờ vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes”, Tạp chí sinh học, 36(1se): 293-300.

23. Đỗ Tất Lợi (2004), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học

24. Võ Thị Bạch Mai (2004), Sự phát triển chồi và rễ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia

TP HCM.

25. Trần Văn Minh (2013), Công nghệ Sinh học thực vật, Giáo trình dành cho Cao học

và Nghiên cứu sinh, Trường Đại học Nông Lâm TPHCM.

26. Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997), Bảo tồn nguồn gen cây trồng, NXB Nông

46

nghiệp, Hà Nội.

27. Trương Quỳnh Như, Võ Thanh Phúc, Lê Thị Thủy Tiên (2015), “Khảo sát ảnh

hưởng của auxin lên sự hình thành và tăng sinh của rễ bất định dừa cạn

(Catharanthus roseus (L.) G. Don)”, Tạp chí phát triển KH&CN, 18(5), tr 75 – 86.

28. Nguyễn Thị Quỳnh, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Lê Anh Thư (2013) “Nghiên

cứu sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định từ nuôi cấy in vitro của cây Đương

quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa)”, Tạp chí sinh học, tr35(3se):165-173.

29. Hoàng Thị Sản (2009), Phân loại thực vật, NXB Giáo dục

30. Bùi Đình Thạch (2016). Nghiên cứu tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà (Plumbago

zeylanica L.) và khảo sát khả năng tạo plumbagin trong nuôi cấy in vitro, Luận án

tiến sĩ Viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

31. Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở Công nghệ sinh học-tập 3, Nxb Giáo dục.

32. Nguyễn Đức Thành (2002), Nuôi cấy mô tế bào thực vật- nghiên cứu và ứng

dụng, NXB Nông nghiệp.

33. Nguyễn Trung Thành, Paek Kee (2008), “Nhân nhanh rễ bất định Nhân sâm

Panax ginseng C.A. Meyer và ảnh hưởng của một số nhân tố lý hóa lên sự tăng

trưởng sinh khối và sản phẩm trao đổi chất ginsenosides”, Tạp chí khoa học

DHQGHN, Khoa học tự nhiên và công nghệ 24, tr 318-323.

34. Ninh Thị Thảo , Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thuỳ Linh, Nguyễn Tuấn

Minh, Nguyễn Quỳnh Chi, Trần Thị Anh Đào (2016), “Nghiên cứu cảm ứng và

nuôi cấy rễ bất định cây ba kích (Morinda officinalis How)”, Tạp chí KH Nông

nghiệp Việt Nam 2016, tập 14, số 6: 921-930

35. Ninh Thị Thảo, Lê Tiến Vinh, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị

Phương Thảo (2015), “Nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm (Salvia

miltiorrhiza bunge)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, Vol.13, No. 2: 251-258

36. Lê Thị Thúy, Trịnh Mộng Nhi, Phạm Văn Lộc (2014), “Khảo sát ảnh hưởng của

chất điều hòa tăng trưởng thực vật và môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo rễ cà

rốt trong nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, 5(18): 62-67.

37. Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

47

II. Tiếng Anh

38. Abdullahil, B. (2010), Growth, secondary metabolite production and antioxidant

enzyme response of Morinda citrifolia adventitious root as affected by auxin and

cytokinin, Plant Biotechnology Reports, 4(2): 109-116

39. Amoo, S. O., Aremu, A. O., Staden, J. (2013), Shoot proliferation and rooting

treatments influence secondary metabolite production and antioxidant activity in

tissue culture-derived Aloe arborescens grown ex vitro. Plant Growth Regulators,

70: 115-122

40. Bui Dinh Thach, Le Nguyen Tu Linh, Nguyen Thi Thuy Van, Trinh Thi Ben, Mai

Truong, Nguyen Huu Ho (2014), A study on the formation and development

of Panax bipinnatifidus Seem. adventitious root, Journal of Developmental Biology

and Tissue Engineering 6(1): 1-7 (ISSN: 2141-2251)

41. Demet A., Daradogan T. (2010), “The effect of carbon sources on in vitro

microtuberization of potato (Solanum tuberosum L.)”, Turkish Journal of Field

Crops, 15(1), pp. 7-11.

42. Escalona M., Lorenzo J.C., Gonzales B.L., Daquinta M., Borroto C.G , Gozales

J.I., Desjardine Y. (1999), “Pineapple (Ananas comosus L Merr.)

micropropagation in temporary immersion system”, Plant Cell Rep, 18, pp. 743 –

748.

43. Gao X.F., Xu Z.H., Liu J.J., Ma L.P., Yin L.P., Jia W. (2006), “Adventitious root

induction and in vitro culture of Panax notoginseng”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.,

31(18), pp. 1485-8.

44. Geert-Jan De Klerk, Wim Van Der Krieken, Joke C. De Jong (1999), Review:

The formation of adventitious roots: new concepts, new possibilities, In Vitro Cell.

Dev. Bio Plant, 35, 189-199.

45. J.J. Zhong (1998), Production of ginseng saponin and polysaccharide by cell

cultures of P. ginseng and P. notoginseng. Effects of plant growth regulators, Appl.

Biochem. and Biotechnol., 75:261.

46. Kim, J. S., Hahn, E. J., Yeung, E. C., Paek, K. Y. (2003), Lateral root development

and saponin accumulation as affected by IBA or NAA in adventitious root cultures

of Panax ginseng C. A. Meyer. In Vitro Cellular and Developmental Biology -

Plant, 39(2): 245-249

47. Lee Y., Lee D.E., Lee H.S., Kim S.K, Lee W.S., Kim S.H., M.W. (2011),

48

“Influence of auxins, cytokinins, and nitrogen on production of rutin from callus

and adventitious roots of the white mulberry tree (Morusalba L.)”, Plant cell,

Tissue and Organ Culture (PCTOC), 105(1), pp. 9-19.

48. Reis, R., Borges, A., Chierrito, T., de Souto, E., de Souza, L., Iacomini, M., de

Oliveira, A., Goncalves, R. (2011), Establishment of adventitious root culture of

Stevia rebaudiana Bertoni in a roller bottle system. Plant Cell Tissue Organ

Culture, 106: 329-335

49. San José, M. C., Romero, L., Janeiro, L.V. (2012), Effect of indole-3-butyric acid

on root formation in Alnus glutinosa microcuttings, Silva Fennica, 46(5): 643-654.

50. Soffer H., Burgur D. W., 1988, Effects of dissolved oxygen concentrations in aero

hydroponics on the formation and growth of adventitious roots, J. Am. Soc. Hort.

Sci., 113: 218-221

51. Son S.H., Choi S.M., Hyung S.J., Yun S.R., Choi M.S., Shin E.M., Hong Y.P.

(1999) “Induction and culture of mountain ginseng adventitious roots and AFLP

analysis for indentifying mountain ginseng”, Biotechnology and Bioprocess

Engineering, 4(2), pp. 119-123.

52. Verstraeten I., Beeckman T., Geelen D. (2013), Adventitious root induction in

Arabidopsis thaliana as a model for in vitro root organogenesis, Methods in

Molecular Biology, 959: 159-175.

53. Xu H., Park J. H., Kim Y. K., Park N., Lee S. Y., Park S. U. (2009), Optimization

of growth and pyranocoumarins production in hairy root culture of Angelica gigas

Naka, Journal of Medicinal Plants Research, 3: 978 – 981

54. Yew Lee, Dong-Eun Lee, Hak-Soo Lee, Seong-Ki Kim, Woo Sung Lee, Soo-

Hwan Kim, Myoung-Won Kim (2011), Influence of auxins, cytokinins and nitrogen

on production of rutin from callus and adventitious roots of the white mulberry tree

(Morus alba L.), Plant Cell Tissue Organ Culture, 105, 9-19.

55. Yu T. A., Yeh S. D., Cheng Y. H., Yang

J. S., (2000), Efficient rooting for establishment of papaya plantlets by

micropropagation, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 61(1): 29-35.

PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Bảng 1.1: Môi trường MS Murashige and Skoog’s

Thể tích cần lấy

MS thành cho 1 lít môi Thành phần MS Khối lượng (g/l) phần trường nuôi cấy

(ml)

82,5 NH4NO3 20 I 95 KNO3

37 MgSO4.7H2O

2,23 MnSO4.4H2O 10 II 1,058 ZnSO4.7H2O

0,0025 CuSO4.5H2O

44 CaCl2.2H2O

KI 0,083 10 III

0,0025 CoCl2.6H2O

17 KH2PO4

0,62 10 H3BO4 IV

0,025 Na2MoO4.2H2O

2,784 FeSO4.7H2O 10 V 3,724 Na2EDTA.2H2O

mg/100ml

Nicotinic acid 100 0,5

Glycine 100 2,0 Vitamin Thiamine acid 100 0,1

Pyridocine HCl 100 0,5

30 g Sucrose

6g Agar

5,7-5,8 pH

Bảng 1.2: Môi trường B5

Thể tích cần lấy

B5 thành Khối lượng cho 1 lít môi Thành phần phần (g/l) trường nuôi cấy

(ml)

250 20 KNO3

13,4 (NH4)2SO4 10 15,0 MgSO4.7H2O

15 10 NaH2PO4.H2O

1,0 10 MnSO4.H2O

0,3 H3BO3

0,2 10 ZnSO4.7H2O

KI 0,075

0,025 10 Na2MoO4.2H2O

0,0025 CuSO4.5H2O

0,0025 CoCl2.6H2O

2,785 10 FeSO4.7H2O

3,725 Na2EDTA

15,0 CaCl2.2H2O

Inositol

mg/100ml

Vitamins Nicotinic acid 100 1

Thiamine HCL 100 10

Pyridoxine HCL 100 1

Sucrose

Agar 6g

pH 5,6 - 5,8

PHỤ LỤC 02. XỬ LÝ SỐ LIỆU

Bảng 1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định

cây Đảng sâm

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KL FILE ND1 12/09/** 15: 3 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1

Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm

VARIATE V003 KL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 2.27629 .758764 34.16 0.001 3 2 NL 2 .145167E-01 .725835E-02 0.33 0.736 3 * RESIDUAL 6 .133284 .222139E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 2.42409 .220372 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE ND1 12/09/** 15: 3 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2

Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm

MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS KL 1 KL 1 4 2.53000 2 4 2.60500 3 4 2.60250 SE(N= 4) 0.745217E-01 5%LSD 6DF 0.257782 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE ND1 12/09/** 15: 3 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3

Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NL | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | KL 12 2.5792 0.46944 0.14904 4.8 0.0006 0.7356

Bảng 2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng 2,4D lên sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE MS 12/ 09/** 15:30 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1

Anh huong cua 2,4D lens u hinh thanh mo seo tu mau la Dang sam

VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 3 1.91333 .637778 117.20 0.000 2 * RESIDUAL 8 .435334E-01 .544167E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 1.95687 .177897 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MS 12/ 09/** 15:30 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2

Anh huong cua 2,4D lens u hinh thanh mo seo tu mau la Dang sam

MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS KLRT 1 3 2.38333 2 3 2.55000 3 3 3.25333 4 3 2.25000 SE(N= 3) 0.425898E-01 5%LSD 8DF 0.138881 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MS 12/ 09/** 15:30 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3

Anh huong cua 2,4D lens u hinh thanh mo seo tu mau la Dang sam

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLRT 12 2.6167 0.42178 0.73768E-01 2.8 0.0000

Đảng sâm.

Bảng 3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng cảm

19.32222

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE NAA 12/ 09/** 15:12 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 2 .711621 .355811 7.69 0.023 2 * RESIDUAL 6 .277667 .462778E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 .989288 .123661 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NAA 12/ 09/** 15:12 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS KLRT 1 3 15.93000 2 3 17.59367 3 3 20.79000 4 3 SE(N= 4) 0.124201 5%LSD 6DF 0.429632 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NAA 12/ 09/** 15:12 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLRT 9 8.1489 0.35165 0.21512 2.6 0.0226

ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm.

Bảng 4: Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE IBA 12/ 09/** 5:59 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 4.79583 1.19896 46.60 0.000 2 * RESIDUAL 10 .257267 .257267E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 5.05309 .360935 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IBA 12/ 09/** 5:59 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS KLRT 1 3 00.00000 2 3 21.44000 3 3 24.42222 4 3 30.32830 5 3 27.89000 SE(N= 3) 0.926043E-01 5%LSD 10DF 0.271799 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IBA 12/ 09/** 5:59 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLRT 15 6.3693 0.60078 0.16040 4.8 0.0000

mô sẹo cây Đảng sâm

Bảng 5: Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng sinh khối rễ bất

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE DUONG 12/ 09/** 9:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 5 8.10444 1.62089 48.32 0.000 2 * RESIDUAL 12 .402534 .335445E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 8.50698 .500410 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DUONG 12/ 09/** 9:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS KLRT 1 3 5.98000 2 3 6.37000 3 3 6.36667 4 3 7.95000 5 3 7.34000 6 3 7.02667 SE(N= 3) 0.105743 5%LSD 12DF 0.325829 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE DUONG 12/ 09/** 9:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLRT 18 6.8389 0.70740 0.18315 2.7 0.0000

định cây Đảng sâm.

Bảng 6: Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định cây

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE NUOCDUA 12/ 09/** 17:49 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 16.0424 4.01061 84.89 0.000 2 * RESIDUAL 10 .472468 .472468E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 16.5149 1.17964 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NUOCDUA 12/ 09/** 17:49 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS KLRT 1 3 2.55000 2 3 4.48333 3 3 5.34333 4 3 3.58333 5 3 2.85333 SE(N= 3) 0.125495 5%LSD 10DF 0.325439 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NUOCDUA 12/ 09/** 17:49 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLRT 15 3.7627 1.0861 0.21736 3.3 0.0000

Đảng sâm

Bảng 7: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đén khả năng tăng sinh khối rễ bất

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE NAMMEN1 12/ 09/** 22:31 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 4.87643 1.21911 60.15 0.000 2 * RESIDUAL 10 .202667 .202667E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 5.07909 .362792 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NAMMEN1 12/ 09/** 22:31 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS KLRT 1 3 4.45333 2 3 4.98000 3 3 5.54000 4 3 6.06000 5 3 5.73000 SE(N= 3) 0.821922E-01 5%LSD 10DF 0.258991 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NAMMEN1 12/ 09/** 22:31 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLRT 15 5.3527 0.60232 0.14236 2.7 0.0000

định cây Đảng sâm

Bảng 8: Ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định cây

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE PEPTONE 12/ 09/** 5:59 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 4.79583 1.19896 46.60 0.000 2 * RESIDUAL 10 .257267 .257267E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 5.05309 .360935 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PEPTONE 12/ 09/** 5:59 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS KLRT 1 3 5.55000 2 3 5.98000 3 3 6.36667 4 3 6.83000 5 3 7.12000 SE(N= 3) 0.926043E-01 5%LSD 10DF 0.291799 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PEPTONE 12/ 09/** 5:59 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLRT 15 6.3693 0.60078 0.16040 2.5 0.0000

Đảng sâm

Bảng 9: Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân sinh khối rễ bất

ALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE THETICH 12/ 09/** 16:34 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 2 1.13820 .569100 15.76 0.005 2 * RESIDUAL 6 .216600 .361000E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1.35480 .169350 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THETICH 12/ 09/** 16:34 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS KLRT 1 3 143.82000 2 3 115.38000 SE(N= 2) 0.109697 5%LSD 6DF 0.379458 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THETICH 12/ 09/** 16:34 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 6) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLRT 9 8.3500 0.41152 0.19000 2.3 0.0046

định cây Đảng sâm trong môi trường lỏng

Bảng 10: Ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE SUCKHI2 12/ 09/** 18: 1 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua toc do suc khi VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 1 1304.49 1304.49 5.65 0.076 2 * RESIDUAL 4 923.720 230.930 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 5 2228.21 445.642 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SUCKHI2 12/ 09/** 18: 1 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua toc do suc khi MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS KLRT 1 3 111.130 2 3 143.800 SE(N= 3) 8.77363 5%LSD 4DF 3.43908 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SUCKHI2 12/ 09/** 18: 1 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua toc do suc khi F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 6) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KLRT 6 285.29 21.110 15.196 5.3 0.0760

cây Đảng sâm trong môi trường lỏng