Ngày nhận bài: 17-12-2024 / Ngày chấp nhận đăng bài: 24-12-2024 / Ngày đăng bài: 28-12-2024
*Tác giả liên hệ: Vũ Thanh Thảo. Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
E-mail: vuthanhthao@ump.edu.vn.
© 2024 Bản quyền thuộc về Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh.
https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn 55
ISSN : 1859-1779
Nghiên cứu Dược học
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học;27(6):55-63
https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07
Nghiên cứu kỹ thuật multiplex RT-QPCR để kiểm tra chỉ
tiêu Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa
trong mỹ phẩm
Trần Quang Ngọc Dũng1, Lê Văn Hoài Trân1, Lê Văn Thanh2, Trịnh Túy An1, Vũ Thanh Thảo1,3,*
1Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh,
Việt Nam
2Bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam
3Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam
Tóm tắt
Đặt vấn đề: Theo hướng dẫn của TCVN 13634:2023, chỉ tiêu Staphylococcus aureus (S. aureus) và Pseudomonas
aeruginosa (P. aeruginosa) là yêu cầu bắt buộc trong kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn của mỹ phẩm. Kỹ thuật mutiplex
RT-qPCR cho phép phát hiện nhanh và đồng thời các vi sinh vật chỉ thị dựa trên các gen đặc hiệu với độ nhạy và chính
xác cao.
Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-qPCR để kiểm tra chỉ tiêu S. aureus và P. aeruginosa trong mỹ phẩm.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Mồi và đoạn dò được đánh giá in vitro để lựa chọn nồng độ thích hợp. Quy trình
định tính các vi khuẩn bằng mutiplex RT-qPCR được thẩm định độ đặc hiệu, tính tuyến tính và độ chính xác theo hướng
dẫn của Broeders. Sau đó, hiệu quả pháp hiện của phương pháp multiplex RT-PCR được so sánh với phương pháp vi
sinh trên 30 mẫu mỹ phẩm giả định.
Kết quả: Kết quả thu được chứng minh rằng phương pháp multiplex RT-qPCR, sử dụng cặp mồi gyrB_F/gyrB_R (400
nM) với đoạn dò gyrB_P-GS (200 nM) đối với S. aureus và cặp mồi pbp-2_F/pbp-2_R (400 nM) với đoạn dò pbp-2 P-
GS (200 nM) đối với P. aeruginosa, đạt được độ đặc hiệu, tính tuyến tính và độ chính xác (RSD< 25%). Phương pháp
multiplex RT-qPCR phát hiện S. aureus và P. aeruginosa cho thấy có hiệu quả phát hiện tương đương với phương pháp
vi sinh theo TCVN 13634:2023 trên mẫu mỹ phẩm giả định.
Kết luận: Kỹ thuật mutiplex RT-qPCR có thể áp dụng để kiểm tra chỉ tiêu S. aureus và P. aeruginosa trong giới hạn nhiễm
vi sinh vật của mỹ phẩm.
Từ khóa: mutiplex RT-qPCR; Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa; giới hạn nhiễm vi sinh vật
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6* 2024
56 | https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07
Abstract
MULTIPLEX RT-QPCR TECHNIQUE FOR TESTING
STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND PSEUDOMONAS AERUGINOSA
IN COSMETICS
Tran Quang Ngoc Dung, Le Van Hoai Tran, Le Van Thanh, Trinh Tuy An, Vu Thanh Thao
Introduction: To ensure cosmetic products meet acceptable microbiological standards, Vietnamese standard
TCVN 13634:2023 mandates testing for microorganisms such as Staphylococcus aureus (S. aureus) and
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Multiplex RT-qPCR offers a rapid and simultaneous detection method for
these indicator microorganisms by targeting specific genes, exhibiting good analytical performance and high specificity.
Objective: This research focused on the application of the multiplex RT-qPCR technique for detecting S. aureus
and P. aeruginosa to assess the microbial quality of cosmetics.
Methods: In this study, primers and probes were evaluated in vitro to determine optimal concentrations. The
identification of indicator bacteria using multiplex RT-qPCR was validated for specificity, accuracy, and precision
following Broeder's guidelines. The detection efficiency of the developed multiplex RT-qPCR method was then
compared with that of the standard microbiological method using 30 simulated cosmetic samples.
Results: The obtained results demonstrated the acceptable specificity, linearity, and accuracy (RSD< 25%) of the
multiplex RT-qPCR method, utilizing the gyrB_F/gyrB_R primer pair (400 nM) with the gyrB_P-GS probe (200 nM)
for S. aureus and the pbp-2_F/pbp-2_R primer pair (400 nM) with the pbp-2 P-GS probe (200 nM) for P. aeruginosa.
The multiplex RT-qPCR method displayed comparable detection efficiency to the standard microbiological method as
specified in TCVN 13634:2023 when tested on the simulated cosmetic samples.
Conclusion: The developed multiplex RT-qPCR technique is a suitable method for testing for S. aureus and P. aeruginosa
as indicators of microbiological quality in cosmetics.
Keywords: multiplex RT-qPCR; Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa; microbiological limits
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng, mỹ phẩm phải
tuân thủ các giới hạn nhiễm vi sinh vật nghiêm ngặt trước
khi được đưa ra thị trường. Điều này giúp ngăn ngừa biến
đổi chất lượng sản phẩm và bảo vệ người dùng khỏi tác hại
tiềm ẩn. Theo quy định của tiêu chuẩn quốc gia TCVN
13634:2023, tương đương với tiêu chuẩn ISO 17516:2014
[1], các vi sinh vật chỉ thị như Escherichia coli (E. coli),
Staphylococcus aureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa
(P. aeruginosa), Candida albicans (C. albicans) không được
phát hiện trong 1 g (ml) với tất cả các loại mỹ phẩm. Phương
pháp tăng sinh và phân lập trên môi trường chọn lọc để giúp
phát hiện sự có mặt của các vi sinh vật chỉ thị trong mẫu,
cũng như phải kết hợp với các phản ứng sinh hóa để xác định
đến loài vi sinh vật. Tuy nhiên, các phương pháp trên cần
thời gian thực hiện kéo dài và phải thực hiện nhiều bước tiến
hành để định danh vi sinh vật nhiễm trong mẫu đến mức độ
loài [2]. Phương pháp qPCR hoặc multiplex qPCR phát hiện
dựa trên gen đặc hiệu cho các chủng vi sinh vật vì vậy giúp
rút ngắn thời gian để phát hiện, mặt khác phương pháp có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao. Đối với multiplex qPCR có thể phát
hiện nhiều chủng vi sinh vật trong cùng một phản ứng vì vậy
giúp giảm chi phí cho việc kiểm nghiệm [3]. Một số nghiên
cứu đã áp dụng kỹ thuật qPCR hoặc multiplex qPCR để xác
định vi sinh vật chỉ thị. Lim và cộng sự (2021) đã nghiên cứu
kỹ thuật multiplex real-time PCR để phát hiện đồng thời
K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. aureus và M. catarrhalis
trong mẫu đờm, phương pháp có giới hạn phát hiện 5.102 bản
sao/phản ứng [4]. Nghiên cứu của Dung và cộng sự (2024)
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6 * 2024
https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07 https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn
|
57
đã sử dụng multiplex real-time PCR để phát hiện đồng thời
tổ hợp 1 (E. coli, S. aurerus và S. pneumoniae) và tổ hợp 2
(A. baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa) trong mẫu
bệnh phẩm đường hô hấp (mẫu hút dịch khí quản), kết quả
cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện là 3,2.103 CFU/ml
với mỗi vi khuẩn [5]. Bên cạnh đó, chỉ tiêu S. aureus và P.
aeruginosa cũng là chỉ tiêu cần kiểm tra đồng thời trong giới
hạn nhiễm khuẩn của các mẫu dược phẩm như thuốc dùng
theo đường niêm mạc, thuốc dùng theo đường âm đạo, thuốc
dán, thuốc hít… Do đó, trong nghiên cứu đặt mục tiêu khảo
sát kỹ thuật multiplex RT-qPCR để kiểm tra đồng thời chỉ
tiêu S. aureus và P. aeruginosa trong mỹ phẩm và cũng
có thể áp dụng cho các mẫu dược phẩm, chỉ tiêu E. coli
và C. albicans sẽ được khảo sát trong nghiên cứu tiếp theo.
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Chủng vi sinh vật
Chủng vi sinh vật gồm có Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae
ATCC 13883, Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans
ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404, chủng vi sinh
vật được mua từ Microbiologics (Hoa Kỳ).
2.2. Phương pháp chiết RNA vi sinh vật
Phương pháp chiết RNA vi sinh vật sử dụng sodium
dodecyl sulfat (SDS) để phá vỡ tế bào và TRIzol để
tinh chế RNA (SDS-TRIzol). Vi khuẩn được tăng sinh
trong Tryptic Soy Broth (TSB) ở 37 ℃ trong 16 giờ.
Mật độ vi khuẩn sau khi tăng sinh được điều chỉnh về
mật độ 108 CFU/ml tương ứng với OD600 khoảng 0,1 bằng
NaCl 0,9%. Ly tâm 1,0 ml dịch vi sinh vật ở 12.000 g trong
1 phút, thu tế bào và chiết tách RNA [6].
2.3. Phản ứng mutiplex RT-qPCR
Phản ứng RT-qPCR được thực hiện bằng bộ kit Luna®
Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (E3006) (New
England BioLabs® Inc). Thành phần của phản ứng bao gồm
Luna reaction mix 2X, Luna enzym mix 20X, mồi xuôi và
mồi ngược và mẫu dò ở nồng độ phù hợp sẽ được khảo sát,
5 µl khuôn mẫu RNA và nước chứa DEPC được bổ sung vừa
đủ thể tích 20 µl. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR
gồm 1 chu kỳ phiên mã ngược ở 55 ℃ trong 600 giây, 1 chu
kỳ biến tính ban đầu ở 95 ℃ trong 60 giây, 40 chu kỳ: biến
tính ở 95 ℃ trong 10 giây và gắn mồi-kéo dài ở 60 ℃ trong
40 giây.
2.4. Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng
multiplex RT-qPCR
Cặp mồi phát hiện S. aureus và P. aeruginosa riêng lẻ
được tham khảo từ nghiên cứu của Alvarez [7] và Savli [8],
đoạn dò được thiết kế bằng công cụ PrimerQuest™ (IDT)
dựa trên trình tự đoạn gen được khuếch đại của mỗi cặp mồi
được lựa chọn, với giá trị Ct chấp nhận của chứng âm là lớn
hơn 33 với P. aeruginosa và lớn hơn 35 với S. aureus. Trong
phản ứng multiplex RT-qPCR, nồng độ mồi được khảo sát
từ 200-400 nM và mẫu dò từ 100-200 nM [9] (Bảng 1).
2.5. Thẩm định phương pháp phát hiện đồng thời
S. aureus và P. aeruginosa bằng kỹ thuật
multiplex RT-qPCR
Độ đặc hiệu của mồi quyết định độ đặc hiệu của
phương pháp, do đó mồi đặc hiệu để phát hiện S. aureus
và P. aeruginosa cần dương tính với RNA của 2 chủng trên
và âm tính với RNA của vi khuẩn khác cũng như vi nấm.
Mẫu vi khuẩn chiết ở OD600 = 0,1 tương ứng với mật độ 108
CFU/ml được pha loãng thành dải nồng độ theo cấp số
10, trải đếm xác định mật độ và chiết RNA để thực hiện
RT-qPCR. Mật độ vi khuẩn khảo sát với S. aureus là 106,
5.105, 105, 5.104, 104, 5.103 tế bào/ml; với P. aeruginosa là
1,6.106, 8.105, 1,6.105, 8.104, 1,6.104, 8.103 tế bào/ml, sau đó
xây dựng đường hồi quy tuyến tính giữa số Ct và log
của số tế bào. Độ chính xác được đánh giá qua hai chỉ
tiêu là độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Để thẩm
định độ lặp lại, mẫu ở các cấp pha loãng được thực hiện
phản ứng RT-qPCR lặp lại 3 lần trong 3 ngày. Độ chính
xác trung gian, mẫu ở các cấp pha loãng được thực hiện
RT-qPCR lặp lại 6 lần trong 2 ngày khác nhau. Số Ct của
các mẫu phải có RSD ≤ 25% [10,11].
2.6. So sánh phương pháp multiplex RT-PCR và
phương pháp vi sinh trên mẫu giả định
Ba mươi mẫu mỹ phẩm giả định được chuẩn bị bằng cách
thêm 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa và S. aureus
vào mẫu. Các chủng được kỹ thuật viên (KTV) đầu tiên thêm
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6* 2024
58 | https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07
mẫu mỹ phẩm dạng xịt khoáng ở mật độ khoảng 1-5 tế
bào/ml, KTV thứ hai sẽ hút 1 ml mẫu sau khi chuẩn bị và
tăng sinh trong 9 ml môi trường TSB trong 24 giờ. Sau 24
giờ tăng sinh, tiến hành chiết RNA, kiểm tra bằng phản ứng
multiplex RT-qPCR. Dịch tăng sinh đồng thời được cấy vào
đĩa thạch Manitol Salt Agar (MSA) để phát hiện S. aureus và
Cetrimid Agar để phát hiện P. aeruginosa bằng phương pháp
vi sinh. Danh sách các chủng được thêm vào ở mỗi mẫu sẽ
được ghi lại bởi KTV thứ nhất nhưng không được chia sẻ
cho KTV thứ hai (mù đơn). So sánh chỉ số của 2 phương
pháp bao gồm: độ nhạy (sensitivity), giá trị chẩn đoán dương
tính (positive predictive value, PPV), độ đặc hiệu
(specificity), giá trị chẩn đoán âm tính (negative predictive
value, NPV), độ chính xác [12].
Bảng 1. Danh sách các mồi và đoạn dò sử dụng trong nghiên cứu
Gen đích
Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tham khảo/ thiết kế
pbp-2 pbp-2_F CCGCCACTACCCGCTGAAG Savli [8]
pbp-2_R TGCCGTGCAACTCGCTCTC
pbp-2_P-GS HEX-CGCCCGACGTACCCGACCGA-BHQ1 Thiết kế
gyrB gyrB_F GGTGCTGGGCAAATACAAGT Alvarez [7]
gyrB_R TGGGATACCACGTCCGTTAT
gyrB_P-GS FAM-TGGTGCAAACCTCTCTCTGAAGTCG-BHQ1 Thiết kế
3. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng
multiplex RT-qPCR
Bảng 2. Kết quả khảo sát nồng độ của cặp mồi và đoạn dò phát
hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa
Nồng độ mồi/đoạn
dò (nM)
Ct
S. aureus P. aeruginosa
Chứng
dương
Chứng
âm
Chứng
dương
Chứng
âm
400/200 24,21 - 21,50 37,03
300/150 24,97 - 23,00 38,83
200/100 27,33 - 26,09 36,98
Ghi chú: “-”: âm tính
Cặp mồi và đoạn dò pbp-2_F/ pbp-2_R/ pbp-2_P-GS và
gyrB_F/ gyrB_R/ gyrB_P-GS được khảo sát ở các nồng độ
mồi 400 nM-200 nM và đoạn dò từ 200 nM-100 nM. Khi
giảm nồng độ mồi và mẫu dò thì Ct các mẫu chứng dương ở
nồng độ mồi từ 400-200 nM có tăng dần từ 24,21-27,31 với
S. aureus và 21,50-26,09 với P. aeruginosa. Mẫu chứng âm
ở nồng độ mồi 400-200 nM khi phát hiện P. aeruginosa có
Ct là 36,98-38,83; các mẫu chứng âm khi phát hiện S. aureus
đều không ghi nhận Ct. Vì vậy cặp mồi và đoạn dò pbp-2_F/
pbp-2_R/ pbp-2_P-GS và gyrB_F/ gyrB_R/ gyrB_P-GS,
nồng độ mồi 400 nM và đoạn dò 200 nM được chọn để phát
hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa (Bảng 2).
3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phát hiện
đồng thời Staphylococcus aureus và
Pseudomonas aeruginosa bằng kỹ thuật
multiplex RT-qPCR
3.1.1. Độ đặc hiệu
Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi và đoạn dò
pbp-2_F/ pbp-2_R/ pbp-2_P-GS và gyrB_F/ gyrB_R/
gyrB_P-GS cho Ct các mẫu RNA vi khuẩn K. pneumoniae,
E. coli, B. subtilis và vi nấm như A. niger và C. albicans lần
lượt âm tính với tín hiệu FAM để phát hiện S. aureus, Ct của
các mẫu trên với tín hiệu huỳnh quang là HEX để phát hiện
P. aeruginosa dao động trong khoảng 37 đến 38 tương
đương với mẫu chứng âm. Vậy cặp mồi cặp mồi và đoạn dò
gyrB_F/ gyrB_R/ gyrB_P-GS và pbp-2_F/ pbp-2_R/ pbp-
2_P-GS bắt cặp đặc hiệu với S. aureus và P. aeruginosa,
phương pháp phát hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa
bằng multiplex RT-qPCR đạt độ đặc hiệu (Hình 1).
3.1.2. Tính tuyến tính
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp
phát hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa cho
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6 * 2024
https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07 https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn
|
59
thấy đối với S. aureus các mẫu có RSD dao động từ
0,32-1,12% (< 25%).
Đường hồi quy tuyến tính được xây dựng có phương
trình: y = -3,3529x + 44,334 với r2 = 0,998 (> 0,980). Kết
quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp phát hiện
đồng thời S. aureus và P. aeruginosa đối với
P. aeruginosa cho thấy các mẫu có RSD dao động từ
0,32-0,97% (< 25%). Đường hồi quy tuyến tính được
xây dựng có phương trình: y = -3,2477x + 41,94 với
r2 = 0,996 (> 0,980), trong đó x là log của số tế bào và y
là giá trị Ct. Vậy phương pháp phát hiện đồng thời S.
aureus và P. aeruginosa bằng kỹ thuật RT-qPCR đạt độ
tuyến tính với khoảng xác định từ 5.103-1.106 tế bào.
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1,52.103 tế
bào/ml với S. aureus và 2,42.103 tế bào/ml với
P. aeruginosa (Hình 2).
Hình 1. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang theo số chu kỳ của mẫu khảo sát độ đặc hiệu để phát hiện S. aureus và P. aeruginosa
A. S. aureus, B. P. aeruginosa, 1. Mẫu RNA của S. aureus, 2. Mẫu RNA của P. aeruginosa
Hình 2. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang theo số chu kỳ của mẫu khảo sát độ tuyến tính để phát hiện S. aureus và P. Aeruginosa
A. S. aureus, B. P. aeruginosa, 1-6: các nồng độ khảo sát trên đường tuyến tính, 7: mẫu chứng âm.
3.1.3. Độ chính xác
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp phát hiện
đồng thời S. aureus và P. aeruginosa đối với S. aureus của
các mẫu có RSD dao động từ 0,87-2,13%. Kết quả khảo sát
độ lặp lại của phương pháp phát hiện đồng thời S. aureus và
P. aeruginosa đối với P. aeruginosa của các mẫu có RSD dao
động từ 0,78-1,95% (Bảng 3). Độ chính xác trung gian
với phương pháp phát hiện đồng thời S. aureus và
P. aeruginosa đối với S. aureus của các mẫu có RSD từ
0,57-1,52% (< 25%). Độ chính xác trung gian với
phương pháp phát hiện đồng thời S. aureus và P.
aeruginosa đối với P. aeruginosa của các mẫu có RSD dao
động từ 0,62-1,38% (< 25%) (Bảng 4).
Bảng 3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp phát hiện
đồng thời S. aureus và P. aeruginosa bằng kỹ thuật multiplex
RT-qPCR
S. aureus P. aeruginosa
Tế bào
Ct
ത
ത
ത
SD RSD (%) Tế bào
Ct
ത
ത
ത
SD RSD
(%)
106 24,28
0,31 1,27%
1,6.106
21,63
0,24
1,10%
5.105
25,17
0,42
1,65%
8.105
22,86
0,32 1,41%
105 27,67
0,22
0,79%
1,6.105
25,20
0,23
0,93%
5.104
28,77
0,25 0,87%
8.104
26,23
0,21 0,78%
104 31,03
0,47
1,51%
1,6.104
28,44
0,38
1,35%
5.103
31,88
0,68
2,13%
8.103
29,12
0,57 1,95%