Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu mô bệnh học, siêu cấu trúc gan, tính đa hình gen CYP2C19 và MDR1 ở bệnh nhân viêm gan mạn tính nhiễm chất da cam/dioxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

PHẠM QUANG PHÚ

NGHIÊN CỨU MÔ BỆNH HỌC, SIÊU CẤU TRÚC

GAN, TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ MDR1

Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN MẠN TÍNH NHIỄM

CHẤT DA CAM/DIOXIN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

PHẠM QUANG PHÚ

NGHIÊN CỨU MÔ BỆNH HỌC, SIÊU CẤU TRÚC

GAN, TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ MDR1

Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN MẠN TÍNH NHIỄM

CHẤT DA CAM/DIOXIN

Chuyên ngành: Nội khoa

Mã số: 972 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Hƣớng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. Nguyễn Bá Vƣợng

2. PGS.TS. Trần Việt Tú

HÀ NỘI - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung

thực. Số liệu trong luận văn nằm trong số liệu đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên

cứu tình trạng một số gen liên quan chuyển hóa, sự thay đổi cấu trúc mô

gan ở ngƣời phơi nhiễm chất da cam/Dioxin”, mã số KHCN- 33.13/11-15,

mà tôi là thành viên chính tham gia thực hiện đề tài. Các thành viên tham gia

thực hiện chính đồng ý cho phép sử dụng số liệu của đề tài cấp nhà nƣớc nói

trên vào mục đích nghiên cứu, viết và báo cáo luận án tiến sỹ của tôi ở các cấp.

Hà Nội, ngày tháng 01 năm 2021

Tác giả luận án Phạm Quang Phú

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này tôi xin trân thành cảm ơn:

- Đảng ủy - Ban giám đốc Học viện Quân y, Đảng ủy – Ban giám đốc

Bệnh viện Quân y 103, đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong

suốt quá trình học tập.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn

PGS.TS Nguyễn Bá Vƣợng và PGS.TS Trần Việt Tú, với tƣ cách ngƣời

thầy hƣớng dẫn đã có những chỉ bảo, góp ý sâu sắc trong quá trình hoàn

thành luận án.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- Các Giáo sƣ, Phó giáo sƣ, Tiến sỹ trong chuyên nghành Nội tiêu hóa và

các chuyên ngành liên quan - những ngƣời thầy đáng kính đã tận tình chỉ bảo,

đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.

- Tập thể cán bộ nhân viên Phòng đào tạo Sau đại học, Bộ môn khoa Nội

Tiêu hóa, Bộ môn Khoa Giải phẫu bệnh – Học viện Quân Y; Khoa sinh học

phân tử - Bệnh viện Trung ƣơng Quân đội 108; Khoa Hình Thái – Viện 69;

Phân viện Hóa – Môi trƣờng, Trung tâm nhiệt đới Việt Nga; Bệnh viện Quân

y 17 đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các bệnh nhân và gia đình bệnh nhân đã nhiệt

tình hợp tác để tôi hoàn thành luận án này.

Tôi xin tỏ lòng biết ơn bố mẹ, vợ con, anh chị và những ngƣời thân trong

gia đình đã hết lòng vì tôi trên con đƣờng học tập để có thành quả ngày hôm

nay. Xin chân thành cảm ơn các bạn bè đồng nghiệp đã động viên giúp đỡ và

chia sẻ khó khăn trong quá trình học tập.

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục biểu đồ

Danh mục hình

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

1.1. VIÊM GAN MẠN TÍNH ....................................................................... 3

1.1.1. Định nghĩa ........................................................................................ 3

1.1.2. Nguyên nhân ...................................................................................... 3

1.1.3. Chẩn đoán .......................................................................................... 4

1.1.4. Xơ hóa gan ........................................................................................ 6

1.1.5. Tổn thƣơng mô bệnh học viêm gan mạn tính ................................... 8

1.1.6. Hình thái siêu cấu trúc gan .............................................................. 11

1.2. CHẤT ĐỘC DA CAM/DIOXIN VÀ TỔN THƢƠNG GAN DO

DIOXIN .................................................................................................................... 15

1.2.1. Chất độc da cam/dioxin ................................................................... 15

1.2.2. Độc động học của dioxin ................................................................. 17

1.2.3. Đánh giá hàm lƣợng dioxin trong máu ........................................... 20

1.2.4. Cơ chế tác động thông qua thụ thể AHR ........................................ 20

1.2.5. Danh mục bệnh liên quan theo Quyết định số 09/QĐ-BYT của

Bộ Y tế Việt Nam ........................................................................... 22

1.2.6 Tổn thƣơng gan do dioxin ............................................................... 24

1.3. TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ MDR1 ....................................... 25

1.3.1. Gen CYP2C19 ................................................................................. 26

1.3.2 Gen MDR-1 .................................................................................... 32

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 41

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU............................................................... 41

2.1.1. Chọn đối tƣợng viêm gan mạn tính nhiễm chất độc da

cam/dioxin ...................................................................................... 41

2.1.2. Chọn các nhóm so sánh ................................................................... 41

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 43

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: ........................................................................ 43

2.2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ................................................................... 44

2.2.3 Các biến số nghiên cứu .................................................................... 47

2.2.4. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu ....................................................... 51

2.2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................... 67

2.2.5 Đạo đức trong nghiên cứu ............................................................... 68

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 69

3.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU ........... 69

3.1.1. Tuổi và giới ..................................................................................... 69

3.1.2. Đặc điểm lâm sàng .......................................................................... 70

3.1.3. Một số xét nghiệm cận lâm sàng .................................................... 71

3.1.4. Thời gian sống tại vùng ô nhiễm dioxin. ........................................ 72

3.2. NỒNG ĐỘ DIOXIN TRONG MÁU. ................................................... 73

3.3. KẾT QUẢ MÔ BỆNH HỌC VÀ SIÊU CẤU TRÚC ........................... 74

3.3.1. Sinh thiết gan ................................................................................... 74

3.3.2. Kết quả mô bệnh học gan ............................................................... 75

3.3.3.Hình ảnh siêu cấu trúc gan ............................................................... 80

3.4. TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ MDR1. ...................................... 86

3.4.1 Tính đa hình gen Cyp2C19 ............................................................... 86

3.4.2. Tính đa hình gen MDR1 .................................................................. 87

3.5. MỐI LIÊN QUAN GIỮA TỔN THƢƠNG MÔ BỆNH HỌC, TÍNH

ĐA HÌNH GEN MDR1, CYP2C19, MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG

VÀ NỒNG ĐỘ DIOXIN. ............................................................................. 89

3.5.1 Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa với một số đặc điểm lâm sàng,

nồng độ dioxin và tính đa hình gen Cyp2C19, MDR1. ................... 89

3.5.2 Mối liên quan giữa tính đa hình gen Cyp2C19, MDR1 và nồng độ

dioxin. ............................................................................................. 94

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN .............................................................................. 96

4.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG. .................... 96

4.1.1 Tuổi và giới ...................................................................................... 96

4.1.2 Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng ..................................... 98

4.1.3. Một số xét nghiệm sinh hóa gan mật .............................................. 99

4.2. NỒNG ĐỘ DIOXIN TRONG MÁU .................................................. 101

4.3. TỔN THƢƠNG MÔ BỆNH HỌC VÀ SIÊU CẤU TRÚC. ............... 106

4.3.1. Sinh thiết gan ................................................................................. 106

4.3.2. Biến chứng trong sinh thiết gan .................................................... 107

4.3.3. Kết quả mô bệnh học ..................................................................... 109

4.3.4. Thay đổi hình ảnh siêu cấu trúc nhu mô gan ................................ 116

4.4. TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ MDR1 ..................................... 124

4.4.1 Tính đa hình gen Cyp2C19 ............................................................. 124

4.4.2 Tính đa hình gen MDR1. ................................................................ 126

4.5. MỐI LIÊN QUAN GIỮA TỔN THƢƠNG MÔ BỆNH HỌC, MỘT

SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19, MDR1

VÀ NỒNG ĐỘ DIOXIN TRÊN NHÓM NGHIÊN CỨU. ........................ 128

4.5.1. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và một số đặc điểm lâm sàng,

tính đa hình gen Cyp2C19, MDR1 và nồng độ dioxin trên nhóm

nghiên cứu..................................................................................... 128

4.5.2. Mối liên quan giữa tính đa hình gen Cyp2C19, MDR1 và nồng

độ dioxin ....................................................................................... 133

KẾT LUẬN ................................................................................................... 136

KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 138

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ............................................................................. 139

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T Aryl hydrocarbon receptor (thụ thể hydrocacbon thơm) AhR Aldehyde dehydronase ALDH Alanin transaminase ALT Agent orange (chất da cam) AO Acid RiboNucleic messager ARNm AHR nuclear translocator (AHR trong nhân) ARNT Aspartat transaminase AST Basic Helix - Loophelix BHL Body mass index (chỉ số trọng lƣợng cơ thể) BMI Bệnh nhân BN Cựu chiến binh CCB Cluster of Differentiation CD Cacbontetraclorua CCl4 CYP1A1 Cytochrome P450A1 protein DNA HBV HCV HIV Ig IOM LD50 MDA ng PCBs PCDD PCDF pg POP Deoxyribonucleic acid Hepatitis B Virus Hepatitis B Virus Human Immuno-deficiency Virus Immunoglobulin (globulin miễn dịch) Institute of Medicine (viện Y khoa) Lethal dose- 50 (liều gây chết 50%) Malondialdehyde Nanogram (1ng/kg = 1pg/g = 1ppt =10-12 gam) Polychlorinated biphenyls Polychlorinated dibenzo-p-dioxin Polychlorinated dibenzofuran Picogram Persistent Organic Pollutants (chất hữu cơ khó phân hủy)

Viết tắt Viết đầy đủ

Single nucleotid polymorphisms (đa hình nucleotid đơn) Parts per trillion Polyvinyl chloride Thời gian bán hủy 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin Toxic Equivalency Factor (hệ số đƣơng lƣợng độc) Toxic Equivalency Quotients (tổng đƣơng lƣợng độc)

SNP ppt PVC T ½ TCDD TEF TEQ US-EPA United States Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ Môi

trƣờng - Hoa Kỳ) World Health Organization (tổ chức Y tế thế giới) WHO

DANH MỤC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

1.1. Phân độ hoạt động viêm gan ................................................................. 10

1.2. Giai đoạn xơ hoá gan theo các thang điểm ........................................... 10

1.3. So sánh tần số allelen của Cyp2C19 của dân tộc Turkman với các quần

thể khác nhau ........................................................................................ 29

1.4. So sánh tỷ lệ kiểu gen Cyp2C19 và chuyển hóa chậm giữa nhóm dân

tộc Turkman và các quần thể khác ....................................................... 30

1.5. Tần số kiểu gen và alen đa hình exon 26 C3435T của MDR1 trên quần

thể các dân tộc khác nhau .................................................................... 37

3.1. Phân bố bệnh nhân theo các nhóm tuổi và giới .................................... 69

3.2. Đặc điểm lâm sàng ............................................................................... 70

3.3. Một số xét nghiệm sinh hóa gan mật .................................................... 71

3.4. Một số đặc điểm trên siêu âm 2D ........................................................ 71

3.5 Thời gian sống tại vùng ô nhiễm dioxin .............................................. 72

3.6. Nồng độ dioxin trong máu .................................................................... 73

3.7. Số khoảng cửa ....................................................................................... 74

3.8. Các biến chứng sinh thiết gan .............................................................. 74

3.9. Tổn thƣơng mô bệnh học trên nhóm nghiên cứu ................................. 75

3.10. Mức độ xơ hóa gan theo Metavir trên nhóm nghiên cứu .................... 76

3.11. Hoại tử kiểu mối gặm và hoại tử kiểu cầu nối trên nhóm 2 ................ 77

3.12. Thoái hóa trong tiểu thùy và hoại tử ổ trên nhóm 2 ............................ 78

3.13. Viêm khoảng cửa trên nhóm 2 ............................................................. 78

3.14. Chỉ số mức độ hoạt tính trên mô học (HAI) trên nhóm 2 .................... 79

3.15. Giai đoạn xơ hóa trên nhóm 2 .............................................................. 79

3.16. Hình ảnh siêu cấu trúc tổ chức gan ....................................................... 80

Bảng Tên bảng Trang

3.17. Xơ hóa tổ chức gan ............................................................................... 81

3.18. Tổn thƣơng siêu cấu trúc tế bào gan ..................................................... 82

3.19. Tổn thƣơng mitochondria ..................................................................... 84

3.20. Phân bố kiểu hình gen Cyp2C19 ........................................................... 86

3.21. Phân bố alleles Cyp2C19 trên nhóm nghiên cứu .................................. 87

3.22. Phân bố alleles MDR1 C3435T ............................................................. 87

3.23. Phân bố kiểu gen MDR1 C3435T ......................................................... 88

3.24. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và tuổi trên nhóm nghiên cứu ..... 89

3.25. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa gan và giới .................................... 89

3.26. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa gan và năm sống tại vùng tồn lƣu

dioxin ..................................................................................................... 90

3.27. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và nồng độ dioxin ......................... 90

3.28. Mối liên quan giữa nồng độ Dioxin và khoảng thời gian sống tại vùng ô

nhiễm ..................................................................................................... 91

3.29. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và kiểu hình gen Cyp2C19 ........... 92

3.30. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và kiểu gen MDR1 C3435T .......... 93

3.31. Mối liên quan kiểu hình Cyp2C19 và nồng độ trung bình dioxin ...... 94

3.32. Mối liên quan giữa kiểu gen MDR1 C3435T và nồng độ dioxin. ......... 95

4.1. Phân bố alleles MDR1 C3435T một số nƣớc trên thế giới ................. 126

4.2. Phân bố alleles MDR1 C3435T một số nƣớc trên thế giới ................. 127

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

3.1. Tỷ lệ nam, nữ ........................................................................................ 70

3.2. Khoảng thời gian sống tại vùng ô nhiễm Dioxin .................................. 72

3.3. Hoạt độ viêm theo Metavir trên nhóm nghiên cứu .............................. 76

DANH MỤC HÌNH

Hình Tên hình Trang

1.1. Các giai đoạn xơ hóa gan theo Metavir ................................................ 11

1.2. Cơ chế tác động của dioxin lên tế bào qua thụ cảm thể AhR ............... 22

2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu...................................................................... 44

2.2. Súng và kim sinh thiết gan Pajunk ........................................................ 45

2.3. Kính hiển vi Olympus BX51 ................................................................ 45

2.4. Hệ thống kính hiển vi điện tử quét ........................................................ 45

2.5. Hệ thống kính hiển vi điện tử truyền qua ............................................. 46

2.6. Máy PCR 9700, Applied Biosystem ..................................................... 46

2.7. Hệ thống Real-time PCR 7500, Applied Biosystem ............................ 47

2.8. Máy giải trình tự tự động CEQ 8800 Sequencer, Beckman Coulter .... 47

2.9. Sinh thiết gan dƣới hƣớng dẫn siêu âm ................................................ 53

2.10. Cơ sở lý thuyết phƣơng pháp ARMS-PCR ........................................... 61

2.11. Cơ sở lý thuyết phƣơng pháp real-time PCR động học đặc hiệu allele 62

2.12. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp PCR đặc hiệu allele tích hợp công

nghệ bắt mồi 2 đoạn (DPO). ................................................................. 62

2.13. Cơ sở lý thuyết phƣơng pháp real time PCR sử dụng kẹp peptide ....... 64

2.14. So sánh tính tƣơng đồng giữa giải trình tự gene trực tiếp và PCR đặc

hiệu allele hiệu hai hƣớng allele có tích hợp công nghệ

Amplification refractory mutation system (ARMS) trong chẩn đoán

kiểu gene Cyp2C19*2 ........................................................................... 66

2.15. So sánh tính tƣơng đồng giữa giải trình tự gene trực tiếp và PCR đặc

hiệu allele hiệu hai hƣớng allele có tích hợp công nghệ

Amplification refractory mutation system (ARMS) trong chẩn đoán

kiểu gene Cyp2C19*3 ........................................................................... 66

3.1. Hình ảnh vi quản mật với các vi nhung mao. TEM, x5000 .................. 80

3.2. Hình ảnh siêu cấu trúc của gan. Xâm nhập của các sợi, bó sợi

Hình Tên hình Trang

collagen vào khoảng gian bào của tế bào nhu mô gan. TEM. x5000 ... 83

3.3. Hình ảnh sợi, bó sợi collagen thâm nhâp vào khoảng gian bào của tế

bào nhu mô gan. SEM, x3500. .............................................................. 83

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở Việt Nam, một lƣợng chất độc da cam/dioxin lớn nhất trên thế giới,

tạp chất lẫn trong các hóa chất diệt cỏ đã đƣợc quân đội Mỹ rải xuống chiến

trƣờng miền Nam trong thời kỳ chiến tranh giai đoạn 1961 - 1972, đã để lại

hậu quả nghiêm trọng đối với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng Việt Nam

trong hơn 50 năm qua [1]. Các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm và

nhiều nghiên cứu trên ngƣời đã công bố trong và ngoài nƣớc cho thấy gan là

một cơ quan chính chịu tác động của chất độc 2,3,7,8- TCDD. Gan là một hệ

thống cơ quan có chức năng chuyển hóa, cố định, bất hoạt và thải trừ các chất

độc nội sinh và ngoại sinh của cơ thể. Chính vì vậy, nó là cơ quan rất dễ tổn

thƣơng trong quá trình nhiễm độc lâu dài các chất độc ngoại sinh, trong đó có

chất da cam/dioxin. Tuy nhiên, mức độ tổn thƣơng gan mạn tính trên mô bệnh

học, siêu cấu trúc và các yếu tố liên quan đến mức độ tổn thƣơng đó còn chƣa

có nhiều công trình nghiên cứu.

Viêm gan mạn tính luôn có diễn tiến liên tục sự phá hủy và hồi phục

nhu mô gan, hậu quả dẫn đến xơ hóa gan và xơ gan, là một trong những

nguyên nhân chính gây tử vong ở nhiều nƣớc trên thế giới. Trƣớc đây, xơ hóa

gan đƣợc cho là một quá trình không thể đảo ngƣợc do các tế bào nhu mô gan

bình thƣờng đƣợc thay thế bởi các tổ chức mô giàu Collagen. Ngày nay, nhờ

những tiến bộ trong hiểu biết về xơ hóa gan mức độ phân tử trong hai thập

niên qua cho phép mở ra hƣớng điều trị kháng xơ hóa, tiến trình xơ hóa gan

có khả năng ngừng hoặc hồi phục nếu đƣợc điều trị thích hợp [2]. Nhƣ vậy,

việc xác định mức độ xơ hóa gan sớm và chính xác đóng vai trò quan trọng

trong chẩn đoán, tiên lƣợng cũng nhƣ chỉ định và đáp ứng điều trị trong quá

trình theo dõi bệnh nhân viêm gan mạn tính. Đánh giá mức độ xơ hóa gan trên

những bệnh nhân bị viêm gan mạn tính phơi nhiễm với chất độc da cam/

dioxin rất có ý nghĩa trong thực tế lâm sàng. Bên cạnh đấy, tìm hiểu đánh giá

tổn thƣơng các bào quan gan ở mức siêu cấu trúc sẽ góp phần hiểu sâu sắc

hơn vào quá trình sinh bệnh học gây tổn thƣơng gan do dioxin.

Dioxin là 1 độc chất khi vào cơ thể sẽ đƣợc chuyển hóa, hấp thu và thải

trừ. Cơ chế tác động dioxin lên tế bào thông qua AhR đã đƣợc nhiều nhà khoa

học nghiên cứu và đƣợc thừa nhận, bên cạnh đấy có vai trò của các gen

chuyển hóa. Trong các gen chuyển hóa có 2 gen Cyp2C19 và MDR1

(Multidrug Resistant Transporter gene 1) có tính đa hình đóng vai trò quan

trọng trong chuyển hóa nhiều thuốc và độc chất [3], [4]. Tính đa hình của gen

Cyp2C19 và MDR1 trên ngƣời phơi nhiễm chất da cam/dioxin có liên quan

đến tình trạng bệnh tật của những đối tƣợng này không? Cho đến nay, ở Việt

Nam cũng nhƣ trên thế giới việc nghiên cứu về hình ảnh mô bệnh học siêu

cấu trúc nhu mô gan, cũng nhƣ sự tính đa hình gen Cyp2C19, MDR1 ở ngƣời

viêm gan mạn tính phơi nhiễm lâu dài chất da cam/dioxin còn rất ít. Vì vậy,

chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mô bệnh học, siêu cấu trúc gan,

tính đa hình gen CYP2C19 và MDR1 ở bệnh nhân viêm gan mạn tính

nhiễm chất da cam/dioxin” với hai mục tiêu:

1: Mô tả tổn thương mô bệnh học, siêu cấu trúc gan, tính đa hình gen

CYP2C19 và MDR1 ở bệnh nhân viêm gan mạn tính nhiễm chất da

cam/Dioxin.

2: Tìm hiểu mối liên quan giữa tổn thương mô bệnh học với nồng độ

chất da cam/Dioxin huyết tương và tính đa hình gen CYP2C19, MDR1 ở bệnh

nhân viêm gan mạn tính nhiễm chất da cam/Dioxin.

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VIÊM GAN MẠN TÍNH

1.1.1. Định nghĩa

Viêm gan mạn tính (Chronic Hepatitis) là tình trạng tổn thƣơng của

gan ở các mức độ, do nhiều nguyên nhân khác nhau, trong đó tình trạng viêm

và hoại tử kéo dài liên tục ít nhất trong 6 tháng [5].

1.1.2. Nguyên nhân

Các nguyên nhân gây viêm gan mạn tính có thể đƣợc phân loại nhƣ

sau [5]:

- Do vi-rút: vi-rút viêm gan B, C, D, Cytomegalo vi-rút, Epstein Barr

vi-rút.

- Do thuốc và độc tố: rƣợu, thuốc nhƣ Nitrofurantoin, Amiodarone,

Methotrexate, Isoniazid, Methyldopa, Phenytoin…

- Bệnh chuyển hóa: bệnh gan nhiễm mỡ không do rƣợu (Non-Alcoholic

Fatty Liver Disease: NAFLD), bệnh ứ sắt di truyền (Hemochromatosis) và ứ

đồng di truyền (bệnh Wilson)

- Tự miễn: viêm gan tự miễn, viêm đƣờng mật xơ hóa nguyên phát, xơ

gan ứ mật nguyên phát

- Nguyên nhân khác: do ký sinh trùng, thiếu Alpha 1 antitrypsin...

Tại Châu Âu, theo Hiệp hội Nghiên cứu Gan mật Châu Âu năm 2013,

những nguyên nhân chính gây viêm gan mạn tính (bao gồm cả xơ gan và ung

thƣ gan) là vi-rút viêm gan B, C, rƣợu [6].

Một nghiên cứu ở Hàn Quốc (2012) khảo sát từ năm 2005 đến 2010

trên 6.307 bệnh nhân có bệnh gan cho thấy viêm gan mạn tính chiếm tỷ lệ cao

nhất là 62,7%. Trong đó, viêm gan mạn tính do HBV, HCV chiếm tỷ lệ

51,2%; NAFLD chiếm 33,3% và rƣợu là 13% [7].

Nguyên nhân chính gây viêm gan mạn tính ở nƣớc ta hiện nay cũng

theo khuynh hƣớng chung của thế giới. Việt Nam là nƣớc thuộc khu vực

Đông Nam Á đƣợc xếp vào vùng dịch tễ lƣu hành cao của HBV và HCV. Có

tới 8,4 triệu ngƣời (10,7%) nhiễm HBV mạn tính ở nƣớc ta, tần suất này thay

đổi tùy theo yếu tố nguy cơ kèm theo, khá cao ở ngƣời tiêm chích ma túy và

ngƣời nhiễm HIV, nhóm dùng ma túy tiêm chích cao hơn (17,4%), nhóm

chạy thận nhân tạo là 14,3%, nhóm nguy cơ thấp là 9,4% [8]. Tỷ lệ nhiễm

HCV có thể lên đến 6,1% liên quan đến tiêm chích ma túy, quan hệ tình dục

và truyền máu…[9].

Chất độc da cam/dioxin không thuộc nhóm nguyên nhân phổ biến gây

viêm gan mạn tính, tuy nhiên rất nhiều công trình đã chứng minh dioxin gây

tổn thƣơng gan trên cả động vật thực nghiệm và trên ngƣời phơi nhiễm [10],

[11], [12], [13].

1.1.3. Chẩn đoán

Về chẩn đoán viêm gan mạn tính chúng ta cần xác định có viêm gan

mạn tính, nguyên nhân gây viêm gan mạn tính và mức độ tổn thƣơng gan

- Chẩn đoán viêm gan mạn tính dựa vào lâm sàng và cận lâm sàng. Để

đánh giá đối với bệnh nhân viêm gan mạn cần thăm khám hỏi bệnh kỹ tiền sử

và khám lâm sàng cẩn thận. Chẩn đoán có thể khó khăn vì khởi phát thƣờng

âm ỉ và nhiều bệnh nhân không có triệu chứng. Các dấu hiệu và triệu chứng

có thể bắt gặp bao gồm mệt mỏi, đau bụng, chán ăn, sụt cân, nƣớc tiểu sẫm

màu và sốt… Một số bệnh nhân có thể nhận đƣợc chẩn đoán sau nhiều lần

thăm khám với các triệu chứng chƣa tìm rõ nguyên nhân nhƣ vàng da tái phát.

Tiền sử tiếp xúc với máu, sử dụng thuốc tiêm tĩnh mạch và nhiễm trùng từ mẹ

là những manh mối quan trọng đối với nguyên nhân do các vi-rút viêm gan.

Biểu hiện bệnh của viêm tuyến giáp, hội chứng Sjogren hoặc viêm đại tràng

vô căn, đặc biệt ở bệnh nhân nữ, làm tăng khả năng chẩn đoán nghĩ tới do căn

nguyên bệnh viêm gan tự miễn. Bên cạnh đó phải tìm tiền sử tiếp xúc với

thuốc và các độc chất [5].

Các bất thƣờng sinh hóa thƣờng không đƣợc chẩn đoán cho một

nguyên nhân cụ thể. Nồng độ aminotransferase huyết thanh thƣờng tăng cao

nhƣng có thể bình thƣờng hoặc tăng thành từng đợt nhƣ trong trƣờng hợp

nhiễm HCV. Mức độ của các Enzym aminotransferase huyết thanh thƣờng

không phản ánh mức độ nghiêm trọng của bệnh, và bệnh nhân có thể tiến

triển thành xơ gan với mức aminotransferase bình thƣờng. Mức độ tổn thƣơng

gan đƣợc xác định qua mô bệnh học từ sinh thiết gan. Có thể tăng Bilirubin

của các enzym huyết thanh khác, chẳng hạn nhƣ phosphatase kiềm và γ

glutamyltranspeptidase [14].

Trái ngƣợc với viêm gan cấp tính, sinh thiết gan làm mô bệnh học là

một công cụ cần thiết trong chẩn đoán và quản lý bệnh nhân viêm gan mạn

tính. Sinh thiết gan cũng đƣợc sử dụng để đánh giá tiên lƣợng bằng cách phân

loại mức độ nghiêm trọng của bệnh và sự tiến triển của nó. Các thuật ngữ

viêm gan hoạt động mãn tính, viêm gan dai dẳng mạn tính và viêm gan tiểu

thùy mạn tính đã đƣợc thay thế bằng thuật ngữ mới hơn để phân loại mức độ

nghiêm trọng của tình trạng viêm và xơ gan từ tối thiểu đến nghiêm trọng [5],

[14]. Những kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh siêu âm, chụp cắt lớp vi tính

(Computed Tomography: CT) hay chụp cộng hƣởng từ (Magnetic resonance

imaging: MRI) gợi ý tình trạng viêm gan mạn tính bằng các dấu hiệu thay đổi

cấu trúc của gan. Biểu hiện mô học của viêm gan mạn tính là sự thâm nhiễm

tế bào viêm đơn nhân mà chủ yếu là tế bào lympho ở khoảng cửa [5], [15].

- Xác định nguyên nhân để điều trị đặc hiệu nhƣ điều trị kháng vi-rút

đối với HBV và HCV; bỏ rƣợu với bệnh gan do rƣợu…nhằm điều trị lành

bệnh hay ngăn chặn tiến triển bệnh.

- Xác định mức độ tổn thƣơng gan bao gồm độ hoạt động viêm và

đặc biệt là giai đoạn xơ hóa gan để chỉ định điều trị, theo dõi điều trị và

tiên lƣợng bệnh.

1.1.4. Xơ hóa gan

Viêm gan mạn tính là một tình trạng bệnh liên quan đến quá trình phá

hủy và thoái hóa không ngừng nhu mô gan dẫn đến xơ hóa gan và cuối cùng

là xơ gan thực sự.

Ở gan bình thƣờng, sự tạo sợi (fibrogenesis) và phân hủy sợi

(fibrolysis) nhu mô gan ở trạng thái cân bằng, xơ hóa chỉ xảy ra khi mô sẹo

tích tụ quá mức và nhanh hơn quá trình bị phân hủy. Sự tạo thành mô sẹo là

đáp ứng bình thƣờng của cơ thể đối với tổn thƣơng, nhƣng trong xơ hóa gan,

quá trình làm lành mô sẹo bị thất bại.

Xơ hóa gan là tình trạng tích tụ chất nền ngoại bào trong gan, là hậu

quả của đáp ứng làm lành tổn thƣơng gan trƣớc những tổn thƣơng lặp đi lặp

lại liên tục khác nhau nhƣ: viêm gan vi-rút, rƣợu, thuốc, tự miễn, bệnh về

đƣờng mật, chuyển hóa và miễn dịch [16].

Hầu hết viêm gan mạn tính đều dẫn đến xơ hóa gan và tiến triển đến xơ

gan. Xơ hóa là hậu quả của tổn thƣơng mạn tính ở gan, biểu hiện bởi sự tích

tụ cơ chất gian bào, trong khi đó những tổn thƣơng gan cấp tính tự giới hạn

không gây xơ hóa, trừ khi tổn thƣơng diễn tiến thành mạn tính.

* Cơ chế bệnh sinh

+ Cấu trúc gan bình thƣờng

Bình thƣờng, các tế bào gan đƣợc bao phủ bởi lớp nội mô có các khe.

Tế bào Kupffer (còn gọi là đại thực bào) nằm trong lòng xoang, sát thành lớp

nội mô. Hoạt hóa tế bào sao có thể làm tích tụ chất nền ngoại bào. Gan bình

thƣờng gồm [17]:

Tế bào gan (thành phần biểu mô), lớp nội mô, tế bào Kupffer.

 Tế bào sao: nằmtrong khoảng Disse. Tế bào này trƣớc đây còn gọi là

tế bào Ito, tế bào mỡ, tế bào quanh xoang hay tế bào chứa mỡ. Loại tế bào này

quan trọng trong việc hình thành xơ hóa gan.

 Khoảng Disse: nằm trong xoang gan, giữa lớp nội mô và lớp tế bào

gan và có chứa ít chất nền tỉ trọng thấp, còn gọi “chất nền giống màng đáy”

* Thay đổi cấu trúc gan khi bị tổn thƣơng

Khi gan bị tổn thƣơng liên tục, chất nền tỉ trọng thấp trở thành mô

“giống sẹo” và chức năng tế bào gan suy giảm. Cấu trúc xoang gan bình

thƣờng với tế bào sao và hệ thống chân phức tạp bao quanh xoang, rất ít chất

nền trong giai đoạn này. Những thay đổi khi tế bào gan bị tổn thƣơng mạn

tính:

+ Thâm nhiễm tế bào lympho viêm vào nhu mô gan. Một số tế bào gan

chết theo chƣơng trình. Tế bào Kupffer đƣợc hoạt hóa. Phóng thích hóa chất

trung gian tạo sợi.

+ Tăng sinh tế bào sao lên nhiều lần và đƣợc bao quanh một lƣợng lớn

chất nền protein ngoại bào. Quá trình này làm mất vi nhung mao tế bào gan

và biến mất các khe giữa các tế bào nội mạc xoang, trƣơng lực co thắt các tế

bào sao gây tăng đề kháng với dòng máu trong xoang gan [18].

Khởi phát xơ hóa gan thƣờng không có triệu chứng và diễn tiến từ từ

thành xơ gan nếu không điều trị. Xơ hóa gan xảy ra do sự mất cân bằng giữa

quá trình sản xuất và thoái hóa cơ chất gian bào. Cơ chất gian bào đƣợc sản

xuất chủ yếu bởi tế bào sao của gan. Tế bào sao nằm trong khoảng Disse, giữa

tế bào gan và tế bào nội mạc xoang gan. Bình thƣờng, tế bào sao ở trạng thái

nghỉ ngơi và là nơi dự trữ chính vitamin A. Khi gan bị tổn thƣơng mạn tính, tế

bào sao đƣợc hoạt hóa để tăng sản xuất và giảm thoái hóa cơ chất gian bào.

Quá trình hoạt hóa tế bào sao gồm 2 giai đoạn [19]:

- Giai đoạn khởi đầu: liên quan đến những thay đổi sớm trong biểu hiện

gen và kiểu hình giúp tế bào phản ứng với các cytokine và những kích thích

khác. Khởi đầu chủ yếu từ sự kích thích của paracrine, là những chất đƣợc tiết

ra từ các tế bào kế cận nhƣ tế bào nội mạc xoang gan, Kupffer, tế bào gan và

tiểu cầu.

- Giai đoạn duy trì: ảnh hƣởng của những kích thích kéo dài nhằm duy

trì kiểu hình đã hoạt hóa. Hậu quả lâu dài này liên quan đến autocrine (chất

đƣợc tiết ra từ tế bào và tác động lên chính thụ thể của tế bào đó) cũng nhƣ

paracrine. Hoạt hóa tế bào sao kéo dài làm thay đổi các đặc tính riêng biệt của

nó nhƣ tăng sinh, hóa ứng động, tạo xơ, co thắt, giảm thoái hóa cơ chất… Hậu

quả của những thay đổi này là nhằm tăng tích tụ cơ chất gian bào.

1.1.5. Tổn thƣơng mô bệnh học viêm gan mạn tính

1.1.5.1. Sinh thiết gan chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Hiện nay, mô bệnh học gan vẫn đóng vai trò quan trọng trong chẩn

đoán nguyên nhân, là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán và đánh giá mức độ

tổn thƣơng gan. Hơn nữa, sinh thiết gan làm mô bệnh học cũng cho phép

đánh giá đáp ứng điều trị và diễn tiến của bệnh gan, đây chính là yếu tố quan

trọng cho quyết định điều trị. Cho đến nay, nhiều phƣơng pháp và kỹ thuật

sinh thiết gan đƣợc công bố, có ba phƣơng pháp sinh thiết gan: sinh thiết gan

qua da, sinh thiết gan qua tĩnh mạch cảnh và sinh thiết gan qua soi ổ bụng.

Trong đấy sinh thiết gan qua da đƣợc thực hiện nhiều nhất trong lâm sàng [20].

* Chỉ định sinh thiết gan

+ Chẩn đoán, đánh giá mức độ và giai đoạn của bệnh gan do rƣợu, bệnh

gan thoái hóa mỡ không do rƣợu và viêm gan tự miễn.

+ Đánh gía mức độ và giai đoạn của viêm gan B và C mạn.

+ Chẩn đoán bệnh gan nhiễm sắt, định lƣợng sắt trong gan.

+ Chẩn đoán bệnh Wilson.

+ Chẩn đoán các bệnh gan ứ mật: Xơ gan ứ mật nguyên phát, xơ hóa

đƣờng mật nguyên phát.

+ Đánh giá các trƣờng hợp có sinh hóa chức năng gan bất thƣờng mà

chƣa rõ nguyên nhân.

+ Đánh giá hiệu quả hoặc tác dụng phụ của thuốc (ví dụ: methotrexate).

+ Chẩn đoán u gan

+ Đánh giá trƣớc và sau gép gan, đánh giá tình trạng gan để ghép [21], [22].

* Chống chỉ định sinh thiết gan cho sinh thiết gan qua da.

+ Chống chỉ định tuyệt đối

- Bệnh nhân không hợp tác.

- Tiền sử chảy máu không rõ nguyên nhân.

- Nguy cơ chảy máu: Thời gian Prothrombin tăng > 3-5 giây so với

chứng. INR > 1,6. Số lƣợng tiểu cầu < 50 G/ l. Thời gian máu chảy > 10 phút.

Dùng kháng viêm không steroid trong vòng 7- 10 ngày trƣớc.

- Không có sẵn máu truyền.

- Nghi ngờ hemangioma hoặc u mạch máu khác.

+ Chống chỉ định tƣơng đối

- Nhiễm trùng khu trú, tràn dịch màng phổi hoặc tràn mủ màng phổi ở

thùy dƣới phổi phải, viêm phúc mạc, viêm mô tế bào tại chỗ sinh thiết.

- Có cổ trƣớng.

- Hemophilia [21], [22].

1.1.5.2. Mô bệnh học viêm gan mạn tính

Mẫu bệnh phẩm có kích thƣớc >1,5 cm, có 6 khoảng cửa, đƣờng kính

1,4 mm đủ tiêu chuẩn đọc mô bệnh học. Bệnh phẩm đƣợc cố định bằng

formol 10%, sau đó đúc paraffin, cắt với lát mỏng 4 µm đem dàn tiêu bản,

nhuộm Hematoxylin – Eosin.

Có nhiều hệ thống điểm mô bệnh học để phân độ giai đoạn xơ hóa gan

nhƣ Knodell IV (kết hợp cả điểm hoại tử, viêm và xơ hóa), Ishak (Knodell cải

tiến), Scheuer, Batts-Ludwing (Scheuer cải tiến), Metavir... (bảng 1.1, bảng

1.2).

Bảng 1.1. Phân độ hoạt động viêm gan

Bậc hoặc điểm số tƣơng đƣơng

Knodell (IV) Ishak-Knodell Metavir

0 Không hoạt động 0 A0

1-4 Hoạt động mức độ rất nhẹ 1-6 A1

5-8 Hoạt động mức độ nhẹ 7-9 A2

9-12 Hoạt động mức độ vừa 10-15 A3

Nguồn:Theo Poynard T. và cộng sự (2000) [23].

13-18 Hoạt động mức độ nặng 16-18 A3

Bảng 1.2. Giai đoạn xơ hoá gan theo các thang điểm

Bậc hoặc điểm số tƣơng đƣơng

Knodell (IV) Ishak-Knodell Metavir

0 Không xơ hóa 0 F0

1 Xơ hóa vài khoảng cửa 1 F1

1 Xơ hóa nhiều khoảng cửa 2 F1

3 Vài cầu nối xơ 3 F2

3 Nhiều cầu nối xơ 4 F3

4 Xơ gan không hoàn toàn 5 F4

Nguồn: Theo Poynard T. và cộng sự (2000) [23].

4 Xơ gan thực sự 6 F4

Hệ thống điểm Metavir đơn giản và đƣợc sử dụng nhiều nhất. Theo

Metavir, có 5 giai đoạn XHG bao gồm F0: không xơ hóa, F1: xơ hóa khoảng

cửa, F2: xơ hóa khoảng cửa và vài cầu nối, F3: xơ hóa với nhiều cầu nối hay

xơ hóa bắt cầu, F4: xơ gan. Ngoài ra, hệ thống điểm Metavir còn đánh giá độ

hoạt động (grade of activity) bao gồm A0: không hoạt tính viêm hoại tử, A1:

độ hoạt động nhẹ, A2: độ hoạt động trung bình, A3: độ hoạt động nặng. Dựa

vào các giai đoạn, xơ hóa gan đƣợc chia làm 3 mức độ là xơ hóa nhẹ khi F0,

F1; xơ hóa đáng kể (significant fibrosis) khi ≥ F2; xơ hóa nặng (advanced

fibrosis) khi ≥ F3 và xơ gan (F4) [23].

Nguồn: Theo Poynard T. và cs (2000) [23].

Hình 1.1. Các giai đoạn xơ hóa gan theo Metavir

1.1.6. Hình thái siêu cấu trúc gan

Từ những năm cuối của thế kỷ 20, chẩn đoán bệnh lý của gan đƣợc làm

phong phú thêm bởi các phƣơng pháp hóa mô miễn dịch và quan sát siêu cấu

trúc gan dƣới kính hiển vi điện tử. Trong đó, quan sát siêu cấu trúc gan giúp

đánh giá tổn thƣơng các bào quan đã nhanh chóng trở thành một phƣơng pháp

rất quan trọng cho cả quá trình nghiên cứu và chẩn đoán các bệnh lý của gan.

1.1.6.1. Kính hiển vi điện tử

* Kính hiển vi điện tử quét (SEM: scanning electron microscope).

Là một loại kính hiển vi điện tử tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt

mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu [24], [25].

+ Nguyên tắc hoạt động

SEM tạo ra hình ảnh bằng electron thứ cấp phát ra từ bề mặt mẫu do

chum sóng electron ban đầu va đập vào. Trong SEM, chùm electron nhỏ đƣợc

quét ngang qua mẫu đồng thời tín hiệu sinh ra đƣợc thu nhận và hình ảnh sẽ

đƣợc thể hiện lại bằng cách ánh xạ tín hiệu với vị trí của sóng theo từng pixel

(điểm) một. Tín hiệu đƣợc quan sát trên cùng vị trí của mẫu khi chùm

electron đến.

+ Ƣu điểm của kính hiển vi điện tử quét

- Phân tích không cần phá hủy mẫu vật

- Thao tác đơn giản, dễ sử dụng.

- Giá thành thấp hơn kính hiển vi điện tử truyền qua nên đƣợc sử dụng

phổ biến hơn.

- Kỹ thuật chuẩn bị mẫu dễ hơn so với kính hiển vi điện tử truyền qua.

+ Nhƣợc điểm của kính hiển vi điện tử quét

- Hình ảnh thu đƣợc 2D, đòi hỏi ngƣời đọc phải có kinh nghiệm.

* Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM: Transmission electron

microscope).

Kính hiển vi điện tử truyền qua tạo ra ảnh dựa trên kỹ thuật một chùm

electron đƣợc truyền qua một mẫu siêu mỏng, tƣơng tác với các mẫu vật khi

nó đi qua [24], [25].

+ Nguyên lý hoạt động

Hình ảnh đƣợc hình thành bởi sự tƣơng tác của các điện tử truyền qua

mẫu vật. Kết quả hình ảnh đƣợc phóng đại, tập trung vào một thiết bị hình

ảnh ví dụ nhƣ màn huỳnh quang, lớp phim chụp ảnh, hoặc đƣợc phát hiện bởi

một cảm biến trên máy ảnh kỹ thuật số.

TEM có khả năng chụp ảnh tại một vị trí cao hơn đáng kể độ phân giải

hơn kính hiển vi ánh sáng, do bƣớc sóng nhỏ của electron.

- Ƣu điểm của kính hiển vi điện tử truyền qua

. Cung cấp độ phóng đại đạt hơn một triệu lần, hoặc nhiều hơn.

. Cung cấp thông tin về yếu tố và cấu trúc của hợp chất

. Hình ảnh chi tiết, chất lƣợng cao

. Cung cấp thông tin bề mặt, hình dáng và cấu trúc.

- Nhƣợc điểm của kính hiển vi điện tử truyền qua

. Kích thƣớc lớn và đắt tiền, yêu cầu phải đƣợc bảo trì đặc biệt

. Công tác chuẩn bị mẫu, hoạt động và phân tích phức tạp.

. Mẫu dung đƣợc phải là những mẫu mà electron có thể xuyên qua, có

thể chịu đƣợc buồng chân không, đủ nhỏ để vừa buồng chân không.

. Hình ảnh mầu đen và trắng

1.1.6.2. Hình ảnh siêu cấu trúc gan dưới kính hiển vi điện tử .

* Tế bào gan: Tế bào lớn, nhân tròn có đƣờng viền tròn đều, chứa từ 1-

2 hạch nhân, chất nhiễm sắc gần màng nhân, màng nhân riêng biệt.

Hình ảnh tế bào gan tổn thƣơng và chết gồm: Ty thể phù nề, gian bào

co cụm, rách các màng, mất hạch nhân, ty thể tăng tỷ trọng, hoại tử…[25].

* Hình ảnh các bào quan của tế bào gan

+ Ty thể (Mitochondia):

- Hình dạng, kích thƣớc ty thể lớn, đƣờng kính dọc lên tới 10 µm.

- Một số bất thƣờng: Ty thể có trục dọc dài hơn gặp trong trƣờng hợp

bất thƣờng do chuyển hóa. Ty thể có chứa những tinh thể khác nhƣ hình

giống amip đƣợc thấy trong bất thƣờng do chuyển hóa và hội chứng Reye.

Chuyển dạng ung thƣ: ty thể tập trung giống hình ảnh tổ chức ung thƣ.

- Các thành phần khác lòng ty thể, mào ty thể, hạt dự trữ, chất lắng

đọng.

Ty thể co đặc: Khác với bình thƣờng biểu hiện tình trạng xung quanh

bị thay đổi nhƣ mào ty thể giãn, lòng ty thể đục.

Răng lƣợc: Răng lƣợc bị phân hủy là dấu hiệu đánh giá tổn thƣơng có

ý nghĩa nhƣng không đặc hiệu, đôi khi chỉ quan sát thấy mảnh của răng lƣợc

bị cắt đứt tại màng trong (hội chứng Reye). Răng lƣợc hình tròn là dấu hiệu

đặc trƣng của tình trạng ứ mật, đôi khi có thể gặp hình ảnh răng lƣợc bị xoắn

vặn. Hình ảnh thay đổi vị trí, cách sắp xếp còn chƣa đƣợc lý giải nhƣ: xếp

theo hàng dọc, ngang, vuông góc với màng ngoài, bánh xe…

Hình ảnh tự ly giải: không thấy xuất hiện các cơ quan và nhân, do khâu

cố định mẫu kém, nên lấy lại mẫu.

Hạt đặc cơ bản: thƣờng là hạt chứa canxi, hạt lớn có thể có lỗ ở trung

tâm. Vai trò chính xác chƣa rõ, tuy nhiên, khi không có các hạt này thƣờng có

bất thƣờng (độc do thuốc, rối loạn chuyển hóa).

Các thành phần khác: tinh thể, giả tinh thể và cấu trúc sợi, có thể gặp

trong nhân, bào tƣơng và ty lạp thể chỉ ra dạng tổn thƣơng.

Bào quan có hình tròn, elip, góc nhọn, dài, chứa hạt mịn có đƣờng kính

0,25 – 1,34 µm, phân bố ngẫu nhiên, hoặc co cụm ở bào tƣơng, hình dạng

không xác định, đƣợc bao bởi một màng 3 lớp.

Dấu hiệu bệnh lý: Không có peroxisome gặp ở hội chứng não gan, gan

thận. Peroxisome xuất hiện ít gặp bệnh Refsum ở trẻ nhỏ. Peroxisome xuất

hiện nhiều có thể gặp ở hội chứng Reye, bệnh gan do rƣợu, vàng da tắc mật ở

phụ nữ có thai, bệnh nhân dung clofibrate và 6 – mercaptopurine.

* Lysosome (Tiêu thể): Bào quan có nguồn gốc từ bộ máy Golgi, có

vai trò trong quá trình tự tiêu và chết theo chƣơng trình. Một số trƣờng hợp

lysosome chứa chất tiết lộ thành phần quá trình tự tiêu: bệnh dự trữ glycogen

typ2 có phân tử glycogen, phân tử sắt trong bệnh ứ sắt huyết thanh…

* Hình ảnh ứ mật

Ty thể hình tròn, mào đậm đặc, thể chứa mật tập trung xung quanh

xoang mật. Xoang mật giãn, tổn thƣơng vi nhung mao, có thể xuất hiện gai

mật cuộn thành khối tròn. Tắc mật kéo dài có thể xuất hiện màng giả

myelin [25].

1.2. CHẤT ĐỘC DA CAM/DIOXIN VÀ TỔN THƢƠNG GAN DO DIOXIN

1.2.1. Chất độc da cam/dioxin

- Dioxin và các hợp chất tƣơng tự

Dioxin và các hợp chất tƣơng tự (dioxins and related compounds -

DRCs) là một nhóm bao gồm hàng trăm chất hữu cơ độc hại và tồn tại bền

vững trong môi trƣờng (Persistent Organic Pollutants - POP). Thuật ngữ

dioxin hiện nay đƣợc hiểu là gồm 3 nhóm hợp chất , dl-PCBs). Theo định

nghĩa mới nhất của Tổ chức Y tế thế giới (WHO 1997), dioxin gồm 7 đồng

phân của PCDD, 10 đồng phân của PCDF và 12 PCB đồng phẳng (coplanar

PCB) có đặc điểm gây độc tƣơng tự dioxin (dioxin-like PCB) . Các đồng loại

này có thể tác động vào thụ thể hydrocarbon thơm (Aryl hydrocacbon

receptor - AhR), vì vậy chúng có khả năng gây ảnh hƣởng đến sức khỏe con

ngƣời ở mức độ khác nhau tùy theo hệ số độc tƣơng ứng. Các nƣớc phát triển

trƣớc đây chỉ định lƣợng 17 chất đồng loại, gồm 7 đồng phân của PCDD và

10 đồng phân của PCDF, do tỷ lệ tổng đƣơng lƣợng độc các đồng phân của

PCB rất nhỏ. Tuy nhiên, những năm gần đây ngƣời ta thấy sự tham gia ngày

càng nhiều hơn của PCBs trong ô nhiễm dioxin nên đa phần các nƣớc phát

triển đã đƣa cả dl-PCB vào các quy định về ngƣỡng an toàn và yêu cầu định

lƣợng dioxin bao gồm 29 chất đồng loại của tất cả 3 nhóm PCDD, PCDF và

dl-PCB [26],[27].

- Nguồn gốc Dioxin

Dioxin có nguồn gốc rất đa dạng, từ hoạt động của núi lửa, cháy rừng,

trong quá trình sản xuất công nghiệp có liên quan đến chất Clo nhƣ: thuốc trừ

sâu, các chất diệt cỏ, chất phát quang (chủ yếu là 2, 4, 5-T), quá trình sản xuất

và tẩy trắng giấy bằng Clo, sản xuất chất dẻo (PVC), các thiết bị công nghệ cũ

lạc hậu hoặc hết thời hạn sử dụng (động cơ xe, máy các loại), các lò đốt rác,

lò hỏa táng... [28].

Ở miền Nam Việt Nam, nguồn gốc dioxin chủ yếu là từ các chất diệt cỏ

mà quân đội Mỹ sử dụng trong chiến tranh xâm lƣợc Việt Nam. Từ năm 1961

đến năm 1972, quân đội Mỹ đã phun rải gần 80 triệu lít (~ 95 triệu kg) chất

độc hóa học, gồm: chất da cam, chất hồng, chất trắng, chất tím, chất xanh

mạ... Trong các chất diệt cỏ quân đội Mỹ phun rải có khoảng 61% là chất da

cam, các chất khác nhƣ chất hồng, trắng, xanh dƣơng, xanh lá mạ, tím…chỉ

chiếm tỷ lệ rất nhỏ trong tổng lƣợng. Vì vậy, chúng ta thƣờng nghe cụm từ

chất da cam/dioxin do mục đích là chỉ rõ nguồn gốc dioxin chủ yếu từ chất da

cam. Một trong những đặc trƣng quan trọng trong chất diệt cỏ quân đội Mỹ sử

dụng chủ yếu là TCDD, các đồng loại khác chỉ chiếm tỷ lệ rất nhỏ [26].

Tuy nhiên, theo thời gian sự ô nhiễm dioxin tại các khu vực bị phun rải

sẽ giảm dần, hiện nay khu vực chịu ảnh hƣởng nặng nề do chất da cam/dioxin

là các điểm nóng tồn lƣu chất độc da cam/dioxin gồm: khu vực sân bay Biên

Hòa, Đà Nẵng và Phù Cát là những nơi đã đƣợc đo lƣờng ghi nhận tồn dƣ

lƣợng lớn dioxin có nguồn gốc từ chất da cam trong chiến tranh. Theo nghiên

cứu của Nguyễn Hùng Minh và cộng sự (2015), các mẫu đất, trầm tích thu

thập quanh các khu vực ô nhiễm chất da cam/dioxin quanh sân bay Biên Hòa

đều có ô nhiễm nồng độ TEQ cao, cao hơn rất nhiều các khu vực khác trên

thế giới. Đồng thời, các tác giả cũng xác định nồng độ dioxin phát thải từ hoạt

động đốt rác thải công nghiệp, sản xuất thép và sản xuất giấy tại Biên Hòa chỉ

tƣơng đƣơng với nồng độ dioxin trong khí thải của các lò đốt rác và nhà máy

ở miền Bắc và trên thế giới. Nhƣ vậy, nguồn gốc ô nhiễm nặng nề chất độc da

cam/dioxin tại các điểm nóng nêu trên là từ nguồn tổn lƣu chất độc từ chiến

tranh [29].

- Tính chất chung

Ở điều kiện thƣờng, dioxin là chất rắn màu trắng, kết tinh rất mịn, có

nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ sôi cao, nên chúng là các hợp chất rất bền

vững trong môi trƣờng tự nhiên. Dioxin và các hợp chất tƣơng tự đều là các

hợp chất rất bền vững, chúng không phản ứng với các axit mạnh, kiềm mạnh,

chất oxy hóa mạnh khi không có chất xúc tác ngay cả ở nhiệt độ cao. Các

đồng loại độc của dioxin hầu nhƣ không tan trong nƣớc, tan tốt hơn trong các

dung môi hữu cơ nhƣ 1,2-dichlorobenzene, chlorobenzen, chloroform,

benzen... Và đặc biệt tan tốt trong dầu mỡ. Đặc tính ƣa dầu (lipophilic) và kị

nƣớc (hydrophobic) của dioxin liên quan chặt chẽ với độ bền vững của chúng

trong cơ thể sống cũng nhƣ trong tự nhiên [30].

1.2.2. Độc động học của dioxin

* Độc tính

Dioxin là một trong những hợp chất độc nhất mà con ngƣời biết đến.

Trong các đồng loại độc của dioxin, tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) là

chất độc nhất, nó có thể gây ung thƣ cho ngƣời (ung thƣ tổ chức phần mềm,

ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ đƣờng hô hấp nhƣ: ung thƣ phổi, phế quản,

khí quản, thanh quản).Ngoài ra, nó còn là tác nhân gây ra một loạt các bệnh

nguy hiểm khác nhƣ bệnh sạm da, bệnh tiểu đƣờng, bệnh đa u tủy, u lympho

ác tính, bệnh thần kinh ngoại vi… Nguy hiểm hơn, TCDD còn gây thiểu năng

sinh dục cho cả nam và nữ, sinh con quái thai, dị dạng. TCDD đƣợc Tổ chức

Nghiên cứu Ung thƣ Quốc tế (International Agency for Research on Cancer -

IARC) xếp vào nhóm độc loại 1, tức là nhóm gây ung thƣ dẫn đến tử vong đối

với ngƣời.

* Tổng đƣơng lƣợng độc (Toxic Equivalency Quotient-TEQ), Hệ số

đƣơng lƣợng độc (Toxic Equivalency Factor-TEF)

Thƣờng một nguồn ô nhiễm dioxin có thể gồm nhiều chất của

polychlorinated dibenzo-p-dioxin (PCDD), polychlorinated dibenzofuran

(PCDF) và polychlorinated biphenyl (PCB) với tỷ lệ các nồng độ khác nhau.

Vì vậy, để đánh giá mức độ ô nhiễm, phơi nhiễm ngƣời ta phải tính đƣợc

TEQ của tất cả các đồng loại dioxin ở nguồn gây ô nhiễm. TEQ =  (Ci X

TEFi), trong đó Ci là nồng độ độc từng đồng loại dioxin, TEFi là TEF của

đồng loại tƣơng ứng. Giá trị TEF biểu thị mức độ tƣơng đối về độc của dioxin

và các hợp chất tƣơng tự, trong đó chất độc nhất là TCDD đƣợc quy định TEF

bằng 1, những đồng loại khác của dioxin có giá trị theo mức độ độc của nó so

với TCDD.

Giá trị tổng TEQs đƣợc tính toán sẽ phản ánh một cách đầy đủ và toàn

diện mức độ ô nhiễm, là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tác động độc hại do

các đồng loại của dioxin [30].

* Phơi nhiễm dioxin

Sự phơi nhiễm của một ngƣời với một yếu tố nào đó từ bên ngoài cơ

thể là sự xâm nhiễm của yếu tố đó vào trong cơ thể bằng con đƣờng tiếp xúc

trực tiếp, gián tiếp hoặc con đƣờng khác nhƣ: ăn, uống, hít thở, tiêm truyền…

Phơi nhiễm với dioxin là do đối tƣợng tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với các

chất độc hoá học có chứa tạp chất dioxin.

Phơi nhiễm trực tiếp đƣợc hiểu là bị rải trực tiếp chất độc da

cam/dioxin lên môi trƣờng mà đối tƣợng đang đóng quân hoặc sinh sống,

hoặc đang hành quân trên đƣờng hoặc hành quân qua vùng vừa mới bị phun

rải, các chất độc này bám trực tiếp vào da, xâm nhập trực tiếp qua đƣờng hít

thở, cũng có thể tiếp xúc trực tiếp với chất độc còn đọng lại trên lá cây rừng, ở

mặt đất và trong các dòng sông, suối...

Phơi nhiễm gián tiếp đƣợc hiểu là chất da cam/dioxin từ môi trƣờng

xâm nhiễm vào các động vật, thực vật sau đó con ngƣời ăn các loại thực phẩm

này và bị phơi nhiễm với dioxin. Nhƣ vậy, phơi nhiễm gián tiếp với chất da

cam/dioxin trong chiến tranh bao giờ cũng từ một vật trung gian bị phơi

nhiễm trƣớc, sau đó từ vật chủ trung gian này xâm nhiễm vào cơ thể ngƣời

chủ yếu qua đƣờng ăn uống [30].

* Hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ của dioxin

- Hấp thu: cho đến nay sự hiểu biết về quá trình độc học hấp thu của

dioxin vào cơ thể con ngƣời còn có giới hạn. Tuy nhiên số liệu thu đƣợc từ

các nghiên cứu trên động vật và nghiên cứu từ ngƣời bị phơi nhiễm sau các tại

nạn nghề nghiệp, phơi nhiễm của cựu chiến binh Mỹ tham gia chiến tranh ở

miền Nam Việt Nam, các nhà khoa học đã xác định dioxin xâm nhập vào cơ

thể qua 3 đƣờng: đƣờng hô hấp, da niêm mạc và đƣờng tiêu hóa. Phổi có khả

năng hấp thu dioxin trong không khí (dioxin bốc hơi, các hạt bụi dính dioxin);

dioxin có thể đƣợc hấp thu qua da, đặc biệt khi da bị tổn thƣơng, nhƣng sự

hấp thụ qua da diễn ra chậm và mức độ ít hơn rất nhiều so với qua đƣờng hô

hấp và tiêu hoá [30].

- Phân bố: nghiên cứu trên ngƣời và động vật các nhà khoa học đều

nhận thấy rằng mặc dù tìm thấy dioxin trong nhiều tổ chức khác nhau, nhƣng

tập trung chủ yếu là ở mô mỡ và gan, chiếm tới trên 50% tổng lƣợng tồn có

trong cơ thể. Mô mỡ là nơi tích tụ dioxin, ngay cả đối với những ngƣời phơi

nhiễm với nồng độ không cao vẫn có thể có chất này trong cơ thể.

- Chuyển hóa và thải trừ: đến nay vẫn chƣa có nghiên cứu một cách

hoàn chỉnh về chu trình chuyển hoá dioxin trong cơ thể ngƣời. Một số tác giả

cho biết TCDD có sự biến đổi dƣới tác dụng của các enzym chuyển hoá ở pha

I (là quá trình hydroxyl hóa dưới xúc tác của P450), sau đó là các phản ứng

liên hợp dƣới sự xúc tác của các enzym thuộc pha II (quá trình Glucuronic

hóa các sản phẩm hydroxyl hóa, dưới xúc tác của của Uridin Diphtphat

glucuronyl Transferase - UDT). Các phản ứng trên tạo điều kiện để thêm một

số nhóm cực vào phân tử của TCDD, kết quả là xuất hiện 5 dạng chất chuyển

hoá, tuy nhiên cấu trúc của các chất này chƣa thực sự biết rõ. Phần lớn các

nghiên cứu cho rằng các sản phẩm chuyển hoá của TCDD có thể là sự tạo

thành các sản phẩm bị hydroxyl hoá, quá trình chuyển hoá này thực hiện chủ

yếu ở gan, sản phẩm tạo ra ít độc hoặc không độc. Tuy nhiên số lƣợng nghiên

cứu chƣa nhiều, một số kết quả còn mâu thuẫn nên đến nay chỉ có thể nói sự

chuyển hoá của dioxin ở ngƣời và động vật còn chƣa thật rõ ràng, cần tiếp tục

nghiên cứu [30], [31].

- Thải trừ dioxin và các chất chuyển hóa phân cực chủ yếu qua phân.

Sự thải trừ có phụ thuộc liều, ở liều nhiễm thấp khoảng 35% tổng lƣợng

nhiễm tìm thấy trong phân và ở liều nhiễm cao hơn là khoảng 46%. Sự phụ

thuộc liều nhiễm của các chất chuyển hóa trong phân đƣợc cho là do sự tăng

hoạt động của các enzym chuyển hóa khi phơi nhiễm liều cao. Để định lƣợng

sự thải trừ ngƣời ta sử dụng đơn vị thời gian bán hủy (t1/2). Thời gian bán thải

của dioxin dao động phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đối với ngƣời trung bình từ

5,1 - 8,9 năm [7], [31].

1.2.3. Đánh giá hàm lƣợng dioxin trong máu

Hàm lƣợng dioxin trong máu đƣợc xác định bởi định lƣợng 17 đồng

phân của dioxin và furan, thông qua hàm lƣợng của 17 đồng phân PCDD/Fs

từ đó sẽ xác định hàm lƣợng của 17 đồng phân PCDD/Fs từ đó sẽ xác định

hàm lƣợng TEQ trong các mẫu máu. Theo tổ chức y tế thế giới, không có một

mức độ ô nhiễm nào của dioxin trong máu đƣợc coi là an toàn.

Do tại Việt Nam chƣa có một nghiên cứu qui mô nào xác định hàm

lƣợng dioxin nền, và hiện tại chƣa có khuyến cáo hàm lƣợng dioxin nền

chung cho ngƣời dân Việt Nam. Chúng tôi lấy một nghiên cứu rất qui mô với

thời gian theo dõi dài về đánh giá nồng độ dioxin nền trong 10 năm tại Đức ở

nhóm tuổi từ 18-71 tuổi, hàm lƣợng PCDD/Fs trung bình là 9,4 pg/g lipid

[32]. Trong nghiên cứu của chúng tôi đã lấy những mẫu máu có hàm lƣợng

TEQ của PCDD/PCDF > 9,4 pg/g lipid đƣợc coi là có hàm lƣợng dioxin trong

máu cao.

1.2.4. Cơ chế tác động thông qua thụ thể AhR

Cho đến nay, đa số các tác giả đều cho rằng cơ chế tác động của

dioxin đối với cơ thể ngƣời và động vật chủ yếu thông qua thụ thể

hydrocacbon thơm. Tuy nhiên, các chất độc này còn tác động theo một số cơ

chế khác chƣa đƣợc làm rõ [30]. Dioxin di chuyển theo sự tuần hoàn của

máu. Song thời gian trong máu không lâu, vì dioxin là loại hợp chất ái mỡ,

rất ít tan trong nƣớc. Do đƣợc tích lũy chủ yếu trong các mô mỡ, ngƣời càng

béo khả năng tích lũy dioxin càng lớn. Cơ chế tác động thông qua AhR đã

đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu và đƣợc thừa nhận. Khi tiếp xúc với

dioxin, trong tế bào diễn ra sự tăng cƣờng gen mã hóa AhR kèm theo các rối

loạn biểu hiện của hàng loạt gen tham gia vào quá trình điều khiển sự sinh

trƣởng tế bào cũng nhƣ các gen tham gia vào chu trình phân bào [1].

Theo Beischlag và cộng sự (2008) cho rằng, trong bào tƣơng của tế bào

thụ thể AhR tồn tại ở dạng phức hợp với một số phân tử protein bao gồm hai

phân tử protein sốc nhiệt 90 (heat shock protein 90- HSP90), protein kết hợp

X2 (X-associated protein 2: XAP2) (còn đƣợc gọi là protein tƣơng tác với thụ

thể AHR) và phosphoprotein p23 [33].

Bình thƣờng, AhR ở trạng thái không hoạt động. Sau khi phối tử (dioxin) bám

vào thụ thể AhR, phức hợp thụ thể gắn dioxin sẽ thay đổi cấu hình và dịch chuyển

từ bào tƣơng vào nhân tế bào. Tại đây HSP90 đƣợc thay bằng phân tử protein

chuyển dịch vị trí vào nhân - ARNT (Aryl Hydrocarbon receptor Nuclear

Translocator) tạo thành phức hợp AhR-ARNT. Phức hợp này có khả năng bám vào

yếu tố đáp ứng dioxin (Dioxin - Responsive Elementt: DRE) nằm ở vùng promoter

của rất nhiều gen liên quan đến quá trình chuyển hóa thuốc và chất lạ nhƣ các gen

AhRR, CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 và COX-2. Kết quả của quá trình này gây ra

những tác động đến gen đích làm thay đổi biểu hiện của những gen này, từ đó

gây ảnh hƣởng đến quá trình phiên mã, quá trình tổng hợp và chức năng của

các phân tử protein, enzym đích, dẫn đến các tổn thƣơng cho cơ thể nhiễm

độc. Tuy nhiên, do các gen này đƣợc mã hóa khác nhau đối với các cá thể

khác nhau [34]. Vì vậy, tác động của dioxin rất đa dạng và không giống nhau

đối với từng cá thể có cơ địa khác nhau.

Cơ chế tác động của dioxin lên tế bào thông qua thụ cảm thể AhR đƣợc

mô tả trong hình sau:

Hình 1.2. Cơ chế tác động của dioxin lên tế bào qua thụ cảm thể AhR

Ghi chú: AhR: Aryl hydrocarbon receptor; HSP90: Heat shock protein 90; XAP2: X-

associated protein 2; p23: phosphoprotein p23; ARNT: Aryl Hydrocarbon receptor Nuclear

Translocator; XRE: Xenobiotic Responsive Elements: Phần tử đáp ứng với chất ngoại sinh; RNA:

RiboNucleic Acid.

*Nguồn: theo Zhao H. và cộng sự (2019) [34]

Dạng không hoạt động của AhR tồn tại trong tế bào chất là một phức hợp

với protein chaperone, bao gồm HSP90, P23 và XAP2. Phối tử của AhR từ môi

trƣờng, trong đó có dioxin khi xâm nhập vào tế bào cảm thụ, gây cảm ứng sự

thay đổi về hình dạng ở AhR, làm xuất hiện tín hiệu định vị nhân và di chuyển

vào trong nhân tế bào. Trong nhân, AhR liên kết tạo thành một phức chất dị

vòng với ARNT liên kết với mô-đun của phần tử đáp ứng với chất ngoại sinh

XRE (có trình tự 5’-GCGTG-3’). Điều này gây cảm ứng biểu hiện của các gen

mục tiêu nhƣ AhRR, CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 và COX‑ 2 [34].

1.2.5. Danh mục bệnh liên quan theo Quyết định số 09/QĐ-BYT của Bộ Y

tế Việt Nam

Dựa trên các nghiên cứu của Hoa Kỳ có lƣu ý đến các nghiên cứu của

Việt Nam, Bộ Y tế Việt Nam đã ban hành Quyết định số 09/2008/QĐ-BYT

ngày 20/2/2008 về Danh mục bệnh, tật, dị dạng, dị tật có liên quan đến phơi

nhiễm với chất độc hóa học/dioxin [35]. Theo Quyết định này có 17 bệnh/tật

liên quan đến chất độc hóa học/dioxin.

1. Ung thƣ phần mềm (Soft tissue sarcoma)

2. U lympho không Hodgkin (Non - Hodgkin’s lymphoma)

3. U lympho Hodgkin (Hodgkin’s disease)

4. Ung thƣ phế quản - phổi (Lung and Bronchus cancer)

5. Ung thƣ khí quản (Trachea cancer)

6. Ung thƣ thanh quản (Larynx cancer)

7. Ung thƣ tiền liệt tuyến (Prostate cancer)

8. Ung thƣ gan nguyên phát (Primary liver cancer)

9. Bệnh đa u tủy xƣơng ác tính (Kahler’s disease)

10. Bệnh thần kinh ngoại biên cấp tính và bán cấp tính (Acute and

subacute peripheral neuropathy)

11. Tật gai sống chẻ đôi (Spina Bifida)

12. Bệnh trứng cá do clo (Chloracne)

13. Bệnh đái tháo đƣờng type 2 (Type 2 Diabetes)

14. Bệnh Porphyrin xuất hiện chậm (Porphyria cutanea tarda)

15. Các bất thƣờng sinh sản (Unusual births)

16. Các dị dạng, dị tật bẩm sinh (đối với con của ngƣời bị nhiễm chất

độc hóa học/dioxin)

17. Rối loạn tâm thần (Mental disorders).

Danh mục bệnh/tật liên quan phơi nhiễm chất độc hóa học/dioxin là cơ

sở để xác định ngƣời bị phơi nhiễm chất độc hóa học/dioxin có phải là nạn

nhân chất diệt cỏ/dioxin hay không. Tuy nhiên, tính gây bệnh không đặc hiệu

của các chất diệt cỏ/dioxin và sự hiểu biết về khả năng gây bệnh của các loại

hóa chất này còn rất hạn chế.

1.2.6 Tổn thƣơng gan do dioxin

Rất nhiều nghiên cứu trên động vật cho thấy dioxin gây tổn thƣơng

gan. Nghiên cứu độc tính của dioxin trên động vật thực nghiệm chuột cống,

chuột nhắt, chuột lang tình trạng hủy hoại tế bào gan thể hiện rõ khi có tình

trạng enzym ALT, AST tăng cao [10], [11]. Gây độc thực nghiệm trên một số

loài động vật bằng 2.3.7.8- TCDD qua các đƣờng và thời gian phơi nhiễm

khác nhau đều cho thấy tổn thƣơng tại gan là rõ ràng, mặc dù mức độ còn phụ

thuộc vào loài và chủng động vật. Những tổn thƣơng hay gặp nhƣ thoái hóa,

hoại tử tế bào gan, tế bào gan đa nhân, nhân khổng lồ. Một số bất thƣờng khác

nhƣ tăng tình trạng phân bào, xuất hiện nhiều hạt lipit nhỏ trong bào tƣơng

[11], [36].

Nghiên cứu do Mocarrelli P. và cs (1996) tiến hành 6 năm trên những

trẻ em bị nhiễm 2,3,7,8- TCDD trong tai nạn ở Severo. Theo dõi SGOT, GGT

hàng năm từ tháng 06/1977 (1 năm sau tai nạn) đã cho thấy: nhóm trẻ bị nặng

nhất có mức GGT và SGPT tăng nhẹ so với nhóm chứng, các giá trị này trở

về mức bình thƣờng sau 3 năm kể từ lúc phơi nhiễm [37]. Tƣơng tự nhƣ vậy

giá trị sinh hóa bị thay đổi (chủ yếu là tăng transaminase huyết thanh và

GGT) đã đƣợc báo cáo sớm hơn nhiều ở ngƣời cƣ trú trong khu vực của Seveso nhiễm mức 2,3,7,8 TCDD trung bình là 580,4 mg/m2 [38]. Trong

nghiên cứu của Serdar B. và cs cho thấy những ngƣời tham gia trong nhóm

tiếp xúc cao nhất của d1-PCBs và OCPs có mức cao nhất của GGT huyết

thanh [39].

Nghiên cứu của Đỗ Đức Vân (1983) khảo sát “ca bệnh đối chứng” trên

63 ngƣời điều trị tại Bệnh viện Việt Đức, Hà Nội từ tháng 1/1982 đến tháng

9/1982. Kết quả thu đƣợc cho thấy khả năng bị ung thƣ gan tiên phát ở những

ngƣời đƣợc coi là tiếp xúc với chất da cam/dioxin tăng gấp 5 lần so với những ngƣời không tiếp xúc (với khoảng tin cậy 95% là 1,16-23,3 và X2 = 5,25 -

3,81) [40]. Từ kết quả nghiên cứu năm 1983, nhóm nghiên cứu của Đỗ Đức

Vân (1986) tiếp tục nghiên cứu 186 ngƣời. Kết quả thu đƣợc cho thấy khả

năng bị ung thƣ gan nguyên phát ở những ngƣời đƣợc coi là tiếp xúc với chất

da cam/dioxin tăng gấp 4,1 lần so với những ngƣời không tiếp xúc (với khoảng tin cậy 95% là 1,66- 11,54 và X2= 8,90). Khi phân tích thêm các yếu

tố khác nhƣ rƣợu, thuốc lá, sốt rét không có sự liên quan có ý nghĩa thống kê

[12]. Nghiên cứu của Lê Bách Quang và cộng sự trên 47.893 cựu chiến binh

tuổi từ 47 đến 65 cho thấy số bệnh nhân ung thƣ gan trên nhóm có phơi nhiễm

dioxin cao hơn hẳn nhóm không có phơi nhiễm với p<0,01 [13].

Dựa trên nhiều nghiên cứu trong và ngoài nƣớc Bộ Y tế đã đƣa ung

thƣ gan vào danh mục bệnh, tật, dị dạng, dị tật có liên quan đến phơi nhiễm

với chất độc hóa học/dioxin [35]. Để dẫn đến ung thƣ gan trƣớc đấy các đối

tƣợng phơi nhiễm dioxin phải có quá trình tổn thƣơng gan mạn tính, tuy

nhiên nghiên cứu mức độ tổn thƣơng gan trên mô bệnh học ở giai đoạn sớm

chƣa thực sự đƣợc quan tâm có thể do ở giai đoạn sớm các biểu hiện lâm

sàng còn mơ hồ mờ nhạt. Đánh giá đƣợc mức độ tổn thƣơng đặc biệt là mức

độ xơ hóa gan rất có ý nghĩa trong tiên lƣợng, dự phòng và điều trị ở những

đối tƣợng này.

1.3. TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ MDR1

Khái niệm đa hình nucleotid đơn

Theo Viện sức khỏe quốc gia Hoa Kỳ, single nucleotid polymorphisms,

thƣờng đƣợc gọi là SNPs (phát âm là “Snips”), là loại biến đổi di truyền phổ

biến nhất của ngƣời. Mỗi SNP đại diện cho một sự khác biệt chỉ ở một đơn vị

cấu tạo nucletoid, hay nói cách khác, SNP là một vị trí nucleotid trong bộ gen có

sự khác nhau giữa các cá thể.

Tập thể các điểm đa hình trên một gen đƣợc gọi là tính đa hình của gen.

Tuy nhiên không phải tất cả sự biến đổi nucleotid đơn đều là SNP. Một gen đƣợc

coi là đa hình khi tần số xuất hiện allele đột biến trong quần thể bình thƣờng đạt

ít nhất 1%. Với tần suất trung bình mỗi 300 nucleotid xuất hiện 1 SNP, bộ gen

con ngƣời với 3 tỉ nucleotid sẽ có khoảng 10 triệu SNP [41].

Hầu hết các SNPs không có ảnh hƣởng đến sức khỏe hoặc sự phát triển

của cơ thể. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tính đa hình của gen là

một yếu tố quan trọng có thể giúp dự đoán phản ứng của một cá nhân với các

loại thuốc nhất định, sự nhạy cảm với các yếu tố môi trƣờng nhƣ độc tố và nguy

cơ phát triển một bệnh cụ thể.

Một số cách chính mà đa hình di truyền có thể ảnh hƣởng đến sự biểu

hiện của các sản phẩm gen hoặc hoạt động xúc tác của enzym tƣơng ứng có thể

đƣợc tóm tắt nhƣ sau [42]:

- Các biến đổi nucleotide trong vùng mã hóa của gen dẫn đến sự thay thế

acid amin và thay đổi hoạt động của enzyme hoặc liên kết cơ chất.

- Xóa nucleotide vùng mã hóa dẫn đến enzym không hoạt động hoặc thiếu

tổng hợp protein.

- Các đa hình trong khu vực không mã hóa ảnh hƣởng đến các yếu tố

kiểm soát phiên mã liên quan đến biểu hiện và cảm ứng enzym.

- Các biến thể trong tín hiệu polyadenyl hóa của gen ảnh hƣởng đến thời

gian bán hủy phiên mã và do đó ảnh hƣởng đến số lƣợng enzym.

- Khuếch đại gen làm tăng số lƣợng enzym.

- Các tƣơng tác phức tạp của các gen đa hình và/hoặc các sản phẩm xúc

tác enzym của chúng

1.3.1. Gen CYP2C19

1.3.1.1 CYP2C19 (CYP2C19) và gen CYP2C19

Cytochrome P450 (CYP450) bao gồm các loại hemoprotein khác nhau

và là một trong những siêu họ lớn nhất, linh hoạt nhất về mặt chức năng,

trong đó phân nhóm CYP450 1-3 chịu trách nhiệm chính về sự biến đổi sinh

học của 70-80% tất cả các loại thuốc đƣợc sử dụng trong lâm sàng. Khái niệm

CYP đã trở nên quen thuộc trong y học cá thể hóa, lĩnh vực mà các bác sĩ hiện

nay đã nhận biệt đƣợc tác động quan trọng của CYP là nhóm enzym chính

tham gia vào chuyển hóa thuốc (ở phase I), có tác động giải độc các dƣợc chất

có hại trƣớc khi chúng đƣợc phân phối vào hệ tuần hoàn. Các enzyme

CYP450 đƣợc phân bố rộng rãi tại các mô khác nhau của cơ thể, nhƣng phần

lớn tập trung ở màng lƣới nội bào tƣơng của tế bào gan. Sự biểu hiện của mỗi

CYP bị ảnh hƣởng bởi sự kết hợp của nhiều cơ chế và yếu tố, chủ yếu bao

gồm tính đa hình gen, chuyển hóa xenobiotics, sự điều hòa của cytokine,

hormone, cũng nhƣ trạng thái bệnh lý, giới tính, tuổi tác. Tính đa hình gen

phụ thuộc nhiều vào sắc tộc, đóng một vai trò quan trọng đối với chức năng

của CYPs 2D6, 2C19, 2C9, 2B6, 3A5 và 2A6, và dẫn đến các kiểu hình di

truyền dƣợc lý riêng biệt đƣợc gọi là chất chuyển hóa kém, trung bình, và

mạnh [3].

Gen Cyp2C19 có tên đầy đủ là “Cytochrome P450, gia đình 2, phân họ C,

polypeptide 19” (Cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 19),

nằm trong phân họ CYP2C, chiếm khoảng 20% cytochrom P450 trong gan

ngƣời lớn. Những protein này là monooxygenase xúc tác cho nhiều phản ứng

liên quan đến chuyển hóa thuốc và tổng hợp cholesterol, steroid và các lipid

khác. Protein này khu trú trong màng lƣới nội sinh chất trong bào tƣơng của

tế bào gan và hoạt động trên ít nhất 10% các loại thuốc đang đƣợc sử dụng

trên lâm sàng, đáng chú ý nhất là thuốc điều trị chống kết tập tiểu cầu

clopidogrel (Plavix), thuốc điều trị đau do loét, chẳng hạn nhƣ omeprazole và

một số thuốc quan trọng khác [43].

Các gen CYP2C19 nằm từ cặp base cơ sở 94.762.705 đến cặp base

94.852.913 trên nhiễm sắc thể số 10. Vùng mã hóa gen CYP2C19 đƣợc mã

hóa là NC_000010.11, tƣơng ứng với NM_000769.1. Tính đa hình trong gen

này có liên quan đến khả năng chuyển hóa thuốc, độc chất [44].

1.3.1.2. Tính đa hình của CYP2C19

Theo Tổ chức Biến thể phát sinh Dƣợc phẩm (Pharmacogene Variation

Consortium) sử dụng Cơ sở dữ Danh pháp Allele CYP ngƣời ( Human CYP

Allele Nomenclature Database) và gán nhãn cho các đã hình đã biến có ảnh

hƣởng đến phản ứng thuốc. Một nhãn bao gồm một ký tự dấu hoa thị (*) theo

sau là một số. Gen mã hóa Enzym Cyp2C19 nằm trên nhiễm sắc thể số 10. Biến

thể phổ biến nhất (còn đƣợc gọi là kiểu hoang dã, đƣợc kí hiệu là wt) có nhãn

CYP2C19 * 1 (NM_000769.4) với đầy đủ hoạt tính của enzyme. Có khoảng

20 allele đột biến đã đƣợc ghi nhận cho đến nay đƣợc đánh số từ

Cyp2C19*2 đến Cyp2C19*17 và mới đây là Cyp2C19*26. Các kiểu gen

biến thể của CYP2C19 * 2 (NM_000769.2: c.681G> A; p. Pro227Pro;

rs4244285), CYP2C19 * 3 (NM_000769.2: c.636 G> A; p. Trp212Ter;

rs4986893) và CYP2C19 * 17 (NM_000769.2: c.806 C> T; rs12248560) là

các yếu tố chính do sự khác biệt giữa các cá nhân trong dƣợc động học và

phản ứng với chất nền CYP2C19 [43], [45].

Các đột biến từ Cyp2C19*2 đến Cyp2C19*8 làm mất hoặc làm giảm hoạt

tính của enzyme và đƣợc viết tắt là m (mutation) và đƣợc đánh số thứ tự từ m1

đến m7. Trong đó 2 biến thể quan trọng nhất là Cyp2C19*2 (m1), là 1 đột biến

nằm trên exon 5 và Cyp2C19*3 (m3) nằm trên exon 4. Đây là 2 đột biến có ý

nghĩa lâm sàng lớn và gặp chủ yếu ở ngƣời Châu Á [46]. Cả 2 đột biến này đều

làm ngừng tổng hợp enzyme hoặc tổng hợp ra nhƣng không có hoạt tính dẫn đến

nồng độ thuốc cũng tăng và hiệu quả điều trị của thuốc tăng rõ rệt. Từ rất nhiều

nghiên cứu trên thế giới cho thấy allele đột biến Cyp2C19*2 là thƣờng gặp nhất,

kế đến là allele Cyp2C19*3, còn các allele đột biến khác rất hiếm gặp và không

có ý nghĩa quan trọng, ngoại trừ allele Cyp2C19*17 làm tăng rất mạnh hoạt tính

enzyme, nhƣng allele này chỉ hay gặp ở các nƣớc Châu Âu nhất là dân Bắc Âu,

ít gặp ở ngƣời Châu Á. Đột biến Cyp2C19*17 gặp ở 18% ngƣời Thụy Điển, ở

Trung Quốc khoảng 4%, Nhật Bản là 2%, hiện chƣa thấy có đột biến

Cyp2C19*17 ở ngƣời Việt Nam [47], [48], [49]. Tabari.R.G và cs đã tiến hành

so sánh tần số allele của CYP2C19 và so sánh kiểu gen CYP2C19, tần số chuyển

hóa kém giữa nhóm dân tộc Turkman và các dân tộc khác có kết quả nhƣ sau

(Bảng 1.2 và Bảng 1.3) [47]:

Bảng 1.3. So sánh tần số allelen của Cyp2C19 của dân tộc Turkman với

các quần thể khác nhau

Cyp2C19*1 Cyp2C19*2

23,57 45,5 (<0,001) 27,4(NS) 20,9(NS) 29(NS) 30(NS) 28(NS) 11,4 (0,001) 15 (0,045) 9,1 (0,001) 15,9 (0,047) 13 (0,001) 18,8(NS) 14(NS) 16(NS) 10,9(0.001) 14(NS) 18(NS) 13(NS) 63,3 (0,001) 35,5 (0,015)

56,43 50 61,8 67,5 68 66 66 88 85 90 84 87 81,8 85 84 88,8 85 81 87 22,3 50,1

140 121 217 103 774 127 142 290 200 121 328 153 310 83 239 247 114 251 84 5538 227

Cyp2C19*3 20 4,5(0,005) 10,8(0,013) 11,7(NS) 3(<0,001) 4(<0,001) 6(<0,001) 0,3 (<0,001) 0 (<0,001) 0 (<0,001) 0.2 (<0,001) 0 (<0,001) 0 (<0,001) 0.1 (<0,001) 0 (<0,001) 0.2 (<0,001) 3 (<0,001) 1 (<0,001) 0 (<0,001) 14,4(NS) 14,3(NS)

Dân tộc Cỡ mẫu Tần số allele % (giá trị p so với nhóm dân tộc Turkman)

Iran Turkman Đông Á – Đông Nam Á Trung Quốc Nhật Bản Hàn Quốc Thái Lan Miến Điện Malaysia Châu Âu Nga Croatia Bêlarut Đức Bồ Đào Nha Scandinavia Faroese Thụy Điển Đan Mạch Châu Phi Ai Cập Ethiopians Tansanians Zimbabweans Châu Đại Dƣơng Vanuatu và các đảo Thái Bình Dƣơng khác Thổ dân Úc (NS: No significant differences Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê).

Nguồn: theo Tabari.R.G và cs (2013) [47]

Bảng 1.4. So sánh tỷ lệ kiểu gen Cyp2C19 và chuyển hóa chậm giữa

Dân tộc

Cỡ mẫu

nhóm dân tộc Turkman và các quần thể khác

Tần số kiểu gen% (giá trị p so với nhóm dân tộc Turkman) 1/1 1/2 1/3 2/2 2/3 3/3

Iran Turkman

140

Kiểu gen chuyển hóa chậm (%) 10

42,1

Đông Á- Đông Nam Á Trung Quốc Nhật Bản Hàn Quốc Thái Lan Burnay Malaysians

121 217 103 774 127 142

24 (0,002) 15,2 (NS) 11,7(NS) 9,2(NS) 8,4(NS) 12,7(NS)

37,9 - - - 44,5 44,1 42

- - - 42,6 39,4 40

9,3 - - - 3,7 5,5 6

9,3 - - - 6,7 9,4 6

0 - - - 2.1 1,6 6,3

1,4 - - - 0,4 0 1

Châu Đại Dƣơng Vanuatu và các đảo Thái Bình Dƣơng khác Thổ dân Úc

5,53 227

- -

61(<0,001) 25.6(<0,001)

2(<0,001) 3(<0,001) 1,6(0,005) 4,3(0,017) 1(NS) 0,8(0.001) 5,3(NS) 3,2(0.005) 3,6(NS)

78,7 73 83,5 - - 78,6 75 66 77

290 200 121 328 153 247 114 251 84

0,3 0 0 - - 0,4 1,1 0 0

1,7 3 1,6 - - 0,8 3,3 4 5,3

0 0 0 - - 0 0 0 0

0,3 0 0 - - 0 3 0 0

Châu Âu 19 Nga 24 Croatia 15 Bêlarut - Đức - Bồ Đào Nha Châu Phi 20,2 Ai Cập 19 Ethiopians 30 Tansanians Zimbabweans 19 (NS: No significant differences Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê).

Nguồn: theo Tabari.R.G và cs (2013) [47]

Xét đến kiều hình của enzyme chuyển hóa Cyp2C19, theo Goldstein, đã

phân biệt ra 3 kiểu hình chuyển hóa (phenotype)

- Kiểu hình chuyển hóa nhanh (Extensive Metabolism – EM): là những

ngƣời chứa cả 2 allele gốc (wt/wt). Khi đấy hoạt tính enzyme không bị giảm đi.

-Kiểu hình chuyển hóa trung bình (Intermediate Metabolism – IM) là

những ngƣời chứa 1 allele gốc và 1 allele đột biến (wt/m1 hoặc wt/m2). Khi

đấy hoạt tính enzyme bị giảm đi một phần.

-Kiểu hình chuyển hóa chậm (Poor Metabolism – PM) là những ngƣời

chứa cả 2 allele đột biến (thƣờng là m1/m1, m2/m2, m1/m2). Khi đấy hoạt

tính enzyme giảm đi đáng kể.

Trên nhóm tình nguyện ngƣời Việt Nam kiểu hình enzyme chuyển hóa

chậm theo Yamada. S [49] là 20% khác biệt so với nghiên cứu của Trần Ngọc

Lƣu Phƣơng [50] trên nhóm bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng là chƣa đến

10% có sự khác biệt. Trên ngƣời Việt Nam và dân Châu Á có kiểu hình

enzyme chuyển hóa mạnh khoảng 40% và kiểu hình chuyển hóa trung bình

khoảng 40 – 50% và nhƣ vậy kiểu hình chuyển hóa kém sẽ giao động khoảng

từ 10 -20%. Điều này khác với ngƣời Da trắng khi tỷ lệ kiểu chuyển hóa

mạnh luôn chiếm trên ¾ số trƣờng hợp, còn kiểu hình chuyển hóa kém rất

thấp, thƣờng dƣới 3%. Kiểu hình này sẽ ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển hóa

các chất qua enzyme Cyp2C19 [48], [49].

1.3.1.3 Gen Cyp2C19 liên quan đến chuyển hóa thuốc và tình trạng bệnh lý

Hiểu biết đầy đủ biểu hiện đa hình kiểu gen của các enzyme ở pha I,

pha II của quá trình chuyển hóa giúp tiên lƣợng hoạt động hoạt hóa và chuyển

hóa các chất sinh ung thƣ, tác động gây độc của nó hoặc chất độc ngoại sinh

với cơ thể. Cyp2C19 là một enzyme quan trọng của hệ CYP450, liên quan đến

quá trình chuyển hóa thuốc. Hiện nay, ngƣời ta đã thấy có mối liên quan giữa

sự đa hình của hệ thống CYP450 với hiệu quả chuyển hóa thuốc bao gồm cả

phản ứng phụ, thất bại với liệu pháp điều trị [51].

Các nghiên cứu gần đây cho thấy kiểu hình của gen Cyp2C19 liên quan

đến đáp ứng khi điều trị bằng clopidogrel, nguy cơ xuất hiện biến cố tim

mạch tăng ở những ngƣời có kiểu hình chuyển hóa chậm (PM), mặc dù những

bệnh nhân này sử dụng vừa phải thuốc chống ngƣng tập tiểu cầu [52]. Trên

những bệnh nhân loét dạ dày đƣợc điều trị bằng PPIs, khả năng ức chế nồng

độ acid trên những bệnh nhân có kiểu hình chuyển hóa chậm là mạnh hơn

những bệnh nhân có kiểu hình chuyển hóa nhanh [53]. Bên cạnh đấy, ngƣời ta

còn ghi nhận vai trò của Cyp2C19 trong điều hòa chuyển hóa một số dƣợc

chất chống ung thƣ mà điển hình là tivantinib, dƣợc chất đặc hiệu ức chế C-

Met đích phân tử trong một số thể ung thƣ tạng cứng: theo nghiên cứu do

Yamamoto và cs công bố, tính chất chuyển hóa tivantinib cũng nhƣ tác dụng

phụ do dƣợc chất này gây nên có liên quan chặt chẽ tới kiểu gen Cyp2 C19

của bệnh nhân [54].

Về khía cạnh bệnh học, nghiên cứu gần đây do nhóm tác giả Trung

Quốc công bố cho thấy, kiểu gen chuyển hóa chậm của gen Cyp2C19 có liên

quan đến tần suất mắc mới một số thể ung thƣ nhƣ ung thƣ phổi, dạ dày, ung

thƣ gan trên một số cộng đồng dân cƣ châu Á [55], [56].

Hiện nay, vai trò của Cyp2C19 trong chuyển hóa dioxins và mối liên

quan đến tình trạng bệnh lý, đặc biệt có liên quan với mức độ tổn thƣơng ở

gan chƣa đƣợc đề cập tới, đây là một trong những vấn đề cần làm rõ hơn.

1.3.2 Gen MDR-1 (Multidrug Resistant Transporter gene 1)

Gen đa kháng thuốc MDR – 1 (Multidrug Resistant Transporter gene

1) hay BCDB1 (ATP-bindinh cassette, subfamily B member 1) là gen mã hóa

protein P-glycoprotein, một loại protein màng tế bào. Các nghiên cứu đã

chứng minh P-glycoprotein (P-gp) đóng một vai trò rất quan trọng trong quá

trình hấp thu, phân bố, chuyển hóa, bài tiết và tƣơng tác thuốc-thuốc ở ngƣời

[4]. Nhiều công trình cũng cho thấy, tính đa hình di truyền của MDR1 có liên

quan đến sự thay đổi trong biểu hiện và chức năng P-gp trong các đối tƣợng

sắc tộc khác nhau. Hiện tại, 50 đa hình đơn nucleotide và 3 đa hình chèn / mất

đoạn đã đƣợc tìm thấy trong các gen MDR1. Một số đa hình gen MDR1,

chẳng hạn nhƣ C3435T, đã đƣợc xác định là một yếu tố liên quan với nhiều

bệnh [57].

1.3.2.1. Vai trò, chức năng P-glycoprotein

P-glycogen (P-gp) là sản phẩm protein của gen MDR1 (ABCB-1), còn

đƣợc gọi là protein đa kháng 1 (MDR1) hoặc CD234. Đó là một protein có

trọng lƣợng phân tử 170 Kda, chứa 12 vòng xoắn xuyên màng, đóng vài trò

nhƣ một máy bơm có chức năng vận chuyển các chất vào bên trong hoặc ra

ngoài tế bào, từ đó loại bỏ các chất độc hại ra khỏi tế bào. Ngoài ra, P-gp còn

có vai trò trong chuyển hóa thuốc, thể hiện qua sự hấp thu và thải trừ nhiều

loại thuốc khác nhau [58].

Cùng với gia đình các enzyme của cytochrome P450, biểu hiện đồng

thời của P-gp đƣợc cho là một sự thích nghi tiến hóa quan trọng đối với các

chất độc hại tiềm tàng. P-gp giới hạn sinh khả dụng của thuốc uống bằng cách

bơm vận chuyển chúng ra khỏi tế bào hoặc ngƣợc trở lại vào trong lòng ống

tự nhiên. Các chất nền cho P-gp là các hợp chất có cấu trúc đa dạng hoạt động

nhƣ chất ức chế hoặc chất gây cảm ứng cho các chức năng của P-gp, trong đó

có cả một số loại thuốc. Do đó mức độ biểu hiện và chức năng các sản phẩm

của gen MDR-1 có thể trực tiếp ảnh hƣởng đến hiệu quả điều trị của thuốc đó

[58], [59].

Có nhiểu chất là chất nền của cả P-gp và enzym chuyển hóa thuốc, đặc

biệt là CYP3A4. 2,3 Nhƣ nhiều chất P-glycoprotein cũng là chất nền của

CYP3A4, vì nhiều chất ức chế P-glycoprotein cũng là chất ức chế CYP3A4,

nhiều tƣơng tác thuốc có liên quan đến sự ức chế hoặc cảm ứng của cả hai P-

gp và CYP3A4. Thuốc mà là 'đối tƣợng' của các tƣơng tác nhƣ vậy bao gồm

cyclosporin, tacrolimus và rivaroxaban.

Nhƣ vậy, P-gp là một bơm vận chuyển, có mặt ở nhiều cơ quan và

đóng một vai trò quan trọng trong việc vận chuyển thuốc. Biểu hiện của P-gp

có thể có những ảnh hƣởng quan trọng về sự hấp thu thuốc, phân phối và thải

trừ [60], [61].

1.3.2.2. Tính đa hình của gen MDR1

Gen MDR1 nằm trên nhiễm sắc thể 7q21.1, gồm 28 exon và có thể mã

hóa một protein của 1.280 axit amin [60]. Phân tích đột biến cho thấy tính đa

hình gen MDR1 là rất đa dạng và nó đƣợc sử dụng rộng rãi để nghiên cứu P-

gp giữa mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng. Việc đầu tiên sàng lọc đa

hình đơn nucleotide có hệ thống của gen MDR1 cho thấy 15 SNP exonic và

intronic khác nhau trong dân da trắng khỏe mạnh [61]. Tổng cộng 50 SNP và

3 đa hình chèn / mất đoạn đã đƣợc báo cáo trong các gen MDR1 trong những

năm gần đây [60]. Để xác định đa hình gen MDR1, Hoffmeyer. S và cs sử

dụng kỹ thuật khuếch đại PCR của gen MDR 1 (28 exon và vùng lõi khởi

động) từ DNA của bộ gen có nguồn gốc từ các trình tự đƣợc biết đến từ ngân

hàng gen (vùng khởi động AC002457 ở exon 1-7 và vùng khởi động

AC005068 cho exon 8-28). Kết quả nghiên cứu cho thấy có một ý nghĩa

tƣơng quan của một đa hình trong exon 26 (C3435T) của gen MDR-1 với mức

độ biểu hiện và chức năng của gen MDR-1 thông qua sao mã P-gp. Điều này

chứng tỏ đa hình gen MDR-1 sẽ ảnh hƣởng đến chuyển hóa thuốc ở mô của

nhiều loại thuốc [61].

Theo Hong L.Y. và cs, một số các đa hình của gen MDR1 là 'im lặng',

và không gây ra những thay đổi axit amin (ví dụ nhƣ C1236T, C3396T và

C3435T). Tuy nhiên, một số đƣợc tìm thấy để thay đổi một axit amin (ví dụ:

A61G, G1199A, A2956G, T3421A). Nghiên cứu trên 461 ngƣời Đức da

trắng cho thấy allele và phân phối kiểu gen có thêm hai đột biến hiếm gặp

(G2677A: Ala893Thr; và A3320C: Gln1107Pro) . Đột biến khác đã đƣợc xác

định ở ngƣời châu Á bao gồm 5'-flanking A-41G, C-145G (exon 1a) , cũng

nhƣ ba đột biến (A548G: Asn183Ser; C1474T: Arg492Cys; và T3421A:

Ser1141Thr) ở các dân tộc khác nhau [57]

Hầu hết các MDR1 SNP đã đƣợc xác định, với một số dẫn đến thay đổi

trong biểu hiện và chức năng P-gp. Các đột biến A61G (Asn21Asp) có thể

đóng góp cho một sự thay đổi điện tích gần với N-terminus của P-gp, mà

dƣờng nhƣ chức năng không quan trọng lắm. Hơn nữa, T-129C, một đột biến

không mã hoá nằm trong promoter (exon 1b), đã đƣợc tìm thấy để làm giảm

biểu hiện P-gp. Các axit amin thay đổi Phe103Leu tại T307C (exon 5) nằm

cạnh tên miền transmembrance thứ hai ở phía ngoại bào của P-gp. C1236T

trong exon 12 là một trong những SNPs với các tần số cao nhất. G2677T / A,

một đột biến missense trong exon 21 mà kết quả là sự thay đổi axit amin từ

Ala 893 thành Ser hoặc Thr, cũng đã cho thấy với biểu hiện P-gp thay đổi

[62]. Đa hình khác, G2995A trong exon 24 thay đổi Ala 999 thành Thr trong

miền transmembrance thứ hai gần hơn với miền ATP-binding. Cuối cùng,

MDR1 C3435T là một biến thể có nhiều ý nghĩa, mà không làm thay đổi các

axit amin Ile ở vị trí 1145. Ý nghĩa chức năng tiềm năng của các đa hình có

thể đƣợc suy ra bằng cách định rõ chúng trên các cấu trúc tên miền của P-gp.

Sáu MDR1 cDNA với SNP khác nhau, đó là 2677G / 3435T, 2677A /

3435C, 2677A / 3435T, 2677T / 3435C, 2677T / 3435T và hoang dại 2677G /

3435C, đƣợc thể hiện trong các tế bào LLC-PK1. Hoạt động vận tải

transcellular P-gp và tích tụ trong tế bào đƣợc xác định bằng cách sử dụng

bốn hợp chất có cấu trúc đa dạng: verapamil, digoxin, vinblastine và

cyclosporin A. Các tác giả cho rằng hai đa hình đơn nucleotide MDR1 hay

gặp (G2677T / A, C3435T) không ảnh hƣởng đến hoạt động P-gp mặt các tế

bào LLC-PK1 trong ống nghiệm, và yếu tố di truyền hoặc môi trƣờng khác

nhau có thể kiểm soát các biểu hiện MDR1 và hoạt động của nó trong cơ thể.

Hơn nữa, Sarfaty K. và cs đã tiến hành một nghiên cứu để mô tả hiệu quả

chức năng của năm SNPs mã hóa (Asn21Asp, Phe103Leu, Ser400Asn,

Ala893Ser, Ala999Thr), nhƣng nó cho thấy sự phân bố và chức năng của P-

gp trong các tế bào tƣơng tự nhƣ P-gp hoang dại trong cơ thể con ngƣời [63].

Nhƣ vậy, các cơ chế của những kết quả trái ngƣợc nhau về việc G2677T/A và

đa hình C3435T chức năng còn chƣa xác định rõ.

Kiểu gen MDR1 C3435T

Trong số 50 SNPs của gen MDR1, nhiều nghiên cứu đã và đang chú ý

nhiều hơn vào sự đột biến ở vị trí 3435 trong exon 26 (C3435T), nó là đa

hình đƣợc xác định có thể ảnh hƣởng tới sự biểu hiện P-gp trong các mô của

con ngƣời khác nhau và các chủng tộc khác nhau. Trong nghiên cứu

Hoffmeyer và cộng sự cho thấy dạng allen - T đồng hợp tử (TT) đƣợc kết hợp

với nhau nhiều hơn hai lần, thấp hơn mức độ biểu hiện MDR1 ở ruột so với

dạng đồng hợp tử CC. Ngƣời có kiểu gen TT có sự biểu hiện của P-gp (1,5

lần) thấp hơn so với ngƣời có kiểu gen CC có ý nghĩa đáng kể với (P =

0,0065). Ở nhau thai mức độ biểu hiện trung bình P-gp ở trong thể dị hợp tử

(CT) thấp hơn 2 lần so với dạng đồng hợp tử (TT) [61].

Phân bố kiểu gen MDR1C3435T Sự phân bố sự đa hình của gene C3435T bị ảnh hƣởng đáng kể bởi các

dân tộc khác nhau . Các nghiên cứu quy mô lớn về dự đa hình kiểu của kiểu

gene MDR1C3435T đã đƣợc thực hiện ở các dân tộc khác nhau: Đức, Mỹ

(bao gồm Châu Âu Mỹ và châu Phi của Mỹ), Nhật Bản, Hàn Quốc, New

Zealand, Ngƣời Do Thái cũng nhƣ trong một số quốc gia Châu Phi và Châu

Á. Sự phân tích so sánh kiểu gen MDR1C3435T trong một số các dân tộc

khác nhau đƣợc thể hiện trong bảng 1.6.

Bảng 1.5. Tần số kiểu gen và alen đa hình exon 26 C3435T của MDR1

trên quần thể các dân tộc khác nhau

Tần số Allele Tần số kiểu gen Quần thể nghiên cứu C T C/C C/T T/T

0,56 0,44 0,32 0,48 0,20 Trung Quốc (n = 265)

0,52 0,48 0,27 0,48 0,24 Đức (n = 188)

0,65 0,35 0,42 0,46 0,12 Ashkenazi (n = 100)

0,57 0,43 0,36 0,42 0,22 Pháp (n = 81)

0,48 0,42 0,24 0,48 0,28 Caucasian (UK) (n = 190)

0,52 0,48 0,26 0,52 0,22 Thụy Điển (n = 408)

0,62 0,38 0,42 0,41 0,17 Thổ Nhĩ kì (n = 122)

0,47 0,53 0,21 0,52 0,27 New Zealand (n = 160)

0,83 0,17 0,67 0,34 0,00 Ghana (n = 206)

0,83 0,17 0,70 0,26 0,04 Kenyan (n = 80)

0,73 0,27 0,52 0,43 0,06 Sudanese (n = 51)

0,56 0,41 0,38 0,42 0,20 Philippines (n = 60)

0,55 0,45 0,37 0,38 0,26 Saudi (n = 96)

0,61 0,39 0,35 0,53 0,12 Nhật Bản (n = 114)

0,48 0,52 0,25 0,46 0,28 Malaysia (n = 99)

Nguồn: theo Hong L.Y và cs (2006) [57]

0,38 0,62 0,25 0,46 0,28 Ấn Độ (n = 264)

Nhƣ vậy, tần số của allele C ở các dân số Châu Á / châu Âu (C = 0,38-

0,62), nhƣng thấp hơn nhiều so với châu Phi (C = 0,73-0,83). Phân tích thống

kê cho thấy một sự khác biệt đáng kể trong tần số alen C của các

MDR1C3435T giữa dân số Trung Quốc và Châu Phi (Ghana, Kenya và

Sudan) (p<0,001). Hơn nữa, cũng có một sự khác biệt giữa ngƣời Trung Quốc

và New Zealand. Nghiên cứu cho thấy rằng đột biến alen T là tƣơng đối hiếm

trong quần thể gốc Phi, nhƣng tồn tại cao hơn tần số trong dân số Trung

Quốc. Các kiểu gene TT không phát hiện đƣợc trong số 206 ngƣời Ghana,

nhƣng nó chiếm 20%, 24% và 28% trên các đối tƣợng ở Trung Quốc, Đức,

Anh. Tuy nhiên, tần số của các allele C không khác biệt đáng kể giữa ngƣời

Châu Âu (Đức, Pháp, Ba Lan và Tây Ban Nha) và Châu Á (Philippines, Saudi

Arabia, Malaysia, Ấn Độ và Nhật Bản). Sự khác biệt về tần số đa hình alen

giữa Tây Phi và các quần thể ngƣời Mỹ gốc Phi cũng đã đƣợc tìm thấy.

Những kết quả này gợi ý rằng đánh giá sự đa hình của MDR1C3435T có tầm

quan trọng lớn đối với dƣợc lý của mỗi ngƣời [57].

1.3.2.3. Tính đa hình MDR1, kiểu gen MDR1 C3435T và mối liên quan với

tình trạng bệnh lý

Theo nhƣ mối quan hệ giữa các kiểu gen MDR1C3435T, sự biểu hiện

và chức năng của P-gp, và mối liên quan ở các bệnh trên ngƣời thì có liên

quan với nhau, đó là lý do để đƣa ra giả thuyết rằng kiểu gen phụ thuộc vào

sự biểu hiện P-gp có thể có vai trò cho một bệnh nào đó, mặc dù thực tế là vai

trò sinh lý của P-gp vẫn chƣa đƣợc hiểu đầy đủ. Sự biểu hiện của P-gp trên

đƣờng tiêu hóa thấp có liên quan với sự phát triển của viêm loét đại tràng

(UC). Schwab và đồng nghiệp báo cáo rằng suy giảm chức năng màng chắn ở

các đối tƣợng có kiểu gen 3435TT có thể làm cho kiểu gen này làm cho sự

phát triển của viêm đại tràng sẽ nhạy cảm hơn. Hơn nữa, những dự liệu cho

thấy nguy cơ gia tăng viêm đại tràng gấp hai lần ở bệnh nhân có kiểu gen

MDR1 3435TT, chính vì thế mà nó ủng hộ quan điểm cho rằng sự biểu hiện

biểu hiện P-gp thấp hơn trong kiểu gen này đóng một vai trò trong việc bảo vệ

chống lại vi khuẩn đƣờng tiêu hóa và tạo thành một yếu tố nguy cơ cho sự

phát triển của viêm loét đại tràng [64]. Potocnik và cộng sự cho rằng MDR1 là

một mục tiêu tiềm năng trong liệu pháp điều trị đích cho các bệnh nhân bị

bệnh Crohn và viêm loét đại tràng [65].

Kiểu gen MDR1 có ý nghĩa đối với nguy cơ mắc bệnh và kết quả điều

trị của AIDS, thuốc ức chế protease HIV tất cả hiện đang bán trên thị trƣờng

là chất nền P-gp. Hơn nữa, P-gp cũng đƣợc thể hiện trong các tế bào CD56 +,

CD8 +, CD4 +, CD19 + và nhóm quần thể khác trong PBMC. Hiệu quả điều

trị ARV và nồng độ nội bào của các chất ức chế protease HIV trong các tế

bào CD4 +, là mục tiêu chủ yếu trong điều trị HIV, những ảnh hƣởng này liên

quan đến sự thay đổi sự biểu hiện của P-gp. Thật vậy, trong một số nghiên

cứu ngƣời ta thấy rằng các kiểu gen MDR1 có liên quan đáng kể để đáp ứng

với điều trị ARV. Bằng chứng Fellay và cs cho thấy sau sáu tháng điều trị

ARV, bệnh nhân với các kiểu gen 3435TT đã tăng tế bào CD4 + hơn đáng kể

và xu hƣớng nhiễm virus ít hơn một cách rõ rệt so với những bệnh nhân với

các kiểu gen CT hoặc CC [66].

Các nghiên cứu đa trung tâm trên quân thể dân cƣ Châu Âu (Caucasian)

cho thấy nhóm dân cƣ mang kiểu gene rs1202168_T hoặc rs868755_T alleles

sẽ có nguy cơ bị ung thƣ đại trực tràng cao hơn quần thể bình thƣờng, trong khi

đó thể đa hình tại vị trí rs1045642 (3435C/T) lại giúp làm giảm nguy cơ mắc

bệnh này . Trên công đồng dân cƣ châu Á, ngƣời ta lại thấy kiểu gene ABCB1

rs1045642T làm tăng nguy cơ mắc ung thƣ đại trực tràng [67]. Bằng chứng

mới đây cũng đã gợi ý rằng bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính ở trẻ em có

các biến thể đồng hợp tử T phổ biến hơn [68].

Có nghiên cứu cho thấy kiểu gen MDR1 có ảnh hƣởng đến kết quả điều

trị tiệt trừ H.pylori ở bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng sử dụng phác đồ có

thuốc ức chế bơm proton. Nghiên cứu của Furuta T và cộng sự, nghiên cứu

ảnh hƣởng của đa hình gen MDR1 C3435T về tỷ lệ chữa khỏi Helicobacter

Pylori bằng liệu pháp ba với Lansoprazole, Amoxicilin và Clarithromycin.

Kết quả cho thấy kiểu gen MDR1 cũng nhƣ kiểu gen Cyp2C19 của bệnh nhân

và kiểu gen kháng Clarythromycin của H. Pylori có liên quan đáng kể với

điều trị tiệt trừ H Pylori [69]. Tuy nhiên nghiên cứu của Oh J-H và cộng sự

trên 210 bệnh nhân loét dạ dày tá tràng ngƣời Hàn Quốc với phác đồ 3 thuốc (

Pantoprazole, amoxicillin, clarythromycin) thì có kết quả không có sự khác

biệt đáng kể giữa các kiểu gen của MDR1 [70].

Phụ thuộc nhiều yếu tố, nhƣ chế độ ăn uống, chủng tộc, môi trƣờng và

tình trạng bệnh, có thể ảnh hƣởng biến đổi dƣợc động học của thuốc có chất

nền P-gp và kết quả điều trị của một số bệnh điều trị bằng các loại thuốc này

trong từng cá nhân, tuy nhiên tính đa hình của gen MDR1 là một trong những

yếu tố quyết định chính, đặc biệt là vai trò của kiểu gen MDR1 C3435T. Tuy

nhiên, hiện nay những nghiên cứu về tính đa hình gen MDR1 với tình trạng

bệnh lý, đặc biệt có liên quan với những tổn thƣơng gan trên nhóm bệnh nhân

viêm gan mạn nhiễm dioxin còn rất ít.

CHƢƠNG 2

ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Chọn đối tƣợng viêm gan mạn tính nhiễm chất độc da cam/dioxin

(Nhóm nghiên cứu)

Chúng tôi đã chọn đƣợc 33 đối tƣợng thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn:

*Tiêu chuẩn lựa chọn

Bệnh nhân từ 18 đến 70 tuổi, sống ở vùng “điểm nóng” dioxin (sân bay

Đà Nẵng) trên 5 năm, xét nghiệm máu có nồng độ dioxin cao (TEQ>9,4pg/g

lipid) [32]

Có từng đợt tăng enzyme gan không rõ nguyên nhân liên tục hoặc từng

đợt kéo dài trên 6 tháng (có chỉ định sinh thiết gan). Đƣợc chẩn đoán viêm

gan mạn tính qua mô bệnh học

Chẩn đoán viêm gan mạn qua mô bệnh học: Thâm nhiễm tế bào viêm

mạn tính: bạch cầu đơn nhân với chủ yếu là lympho bào ở khoảng cửa, có thể

có xơ hóa gan trên mô bệnh học [5], [15].

Tình nguyện tham gia nghiên cứu.

*Tiêu chuẩn loại trừ

Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

Viêm gan mạn do các nguyên nhân khác: Do HBV, HCV, do rƣợu, do

thuốc, tự miễn…

Có chống chỉ định sinh thiết gan.

2.1.2. Chọn các nhóm so sánh

Do vấn đề y đức (không có chỉ định sinh thiết gan trên ngƣời không có

bệnh gan mạn tính) nên chúng tôi không thiết kế đƣợc một nhóm chứng để

đối chứng đầy đủ các yếu tố nghiên cứu với nhóm nghiên cứu vì vậy chúng

tôi thiết kế thành 3 nhóm so sánh để so sánh về tính đa hình gen MDR1, gen

Cyp2C19 và hình ảnh tổn thƣơng mô bệnh học, siêu cấu trúc gan với nhóm

nghiên cứu.

2.1.2.1. Nhóm đối tượng nhiễm dioxin (Nhóm 1)

- Chọn 50 đối tƣợng làm xét nghiệm đa hình gen MDR1 và Cyp2C19

theo tiêu chuẩn sau:

- Có thời gian sống ở vùng ô nhiễm dioxin trên 5 năm

- Có nồng độ dioxin trong máu cao (TEQ>9,4pg/g lipid) [32].

- Tiền sử theo dõi sức khỏe và thăm khám lâm sàng hiện tại không phát

hiện các dấu hiệu bệnh lý gan mạn tính, các xét nghiệm enzym gan, siêu âm ổ

bụng, chức năng gan trong giới hạn bình thƣờng.

- Tình nguyên tham gia nghiên cứu.

- Tuổi từ 18 đến 70.

2.1.2.2 Nhóm đối tượng viêm gan B mạn tính (Nhóm 2)

Chọn 33 đối tƣợng viêm gan B mạn tính sống ở khu vực không ô nhiễm

dioxin có chỉ định sinh thiết gan điều trị tại Bệnh viện quân y 103 để tiến

hành làm mô bệnh học và siêu cấu trúc gan.

Chẩn đoán viêm gan vi rút B mạn (Theo Bộ y tế Việt Nam 2014):

- HBsAg (+) ≥ 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti HBc IgG (+)

- AST, ALT tăng từng đợt hoặc liên tục trên 6 tháng.

- Có bằng chứng tổn thƣơng mô bệnh học tiến triển, xơ gan (đƣợc xác

định bằng sinh thiết gan) mà không do căn nguyên khác [71].

Tiêu chuẩn loại trừ nhóm 2

Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.

Viêm gan mạn do các nguyên nhân khác: do HCV, do rƣợu, do thuốc, tự

miễn…

Có chống chỉ định sinh thiết gan.

2.1.2.3 Nhóm người khỏe mạnh (Nhóm 3)

- Chọn 90 ngƣời khỏe mạnh làm xét nghiệm tính đa hình gen MDR1 và

Cyp2C19 theo tiêu chí:

- Qua thăm khám tiền sử và hiện tại không có bệnh lý mạn tính.

- Không sống tại vùng ô nhiễm “điểm nóng” Dioxin.

- Tuổi trên 18.

- Tình nguyện tham gia nghiên cứu.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

- Mô tả cắt ngang.

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2018.

- Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Quân y 17,

Viện 69 – Bộ tƣ lệnh Lăng, Bệnh viện TWQĐ 108, Trung tâm nhiệt đới Việt

Nga.

- Cỡ mẫu: Chúng tôi chọn cỡ mẫu thuận tiện. Dựa vào hồ sơ theo dõi

sức khỏe của hội nạn nhân chất độc da cam tại Đà Nẵng chúng tôi đã chọn đối

tƣợng nghiên cứu lớn nhiều nhất thỏa mãn tiêu chuẩn chọn đối tƣợng nghiên

cứu. Trong thời gian nghiên cứu chúng tôi đã chọn đƣợc 33 đối tƣợng để tiến

hành nghiên cứu.

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu

- Máy phân tích hóa sinh tự động Hitachi Modular của hãng Roche.

Thuốc thử và dung dịch chuẩn cho hệ thống tự động C.F.A.S của Roche.

- Hệ thống phân tích mẫu bằng sắc ký khí Agilent 7890A – khối phổ

phân giải cao AutoSpec Premier P834.

- Súng bắn kim sinh thiết DeltaCut của hãng Pajunk

Medizintechnologie GmbH- Đức, có thể chỉnh chiều dài lao kim trên súng để

lấy mẫu mô sinh thiết từ 15 -22 mm. Kim sinh thiết kích thƣớc16 Gauge,

chiều dài kim là 16cm.

Hình 2.2. Súng và kim sinh thiết gan Pajunk

- Kính hiển vi Olympus BX51 của hãng Olympus để đọc tiêu bản mô

gan sinh thiết.

Hình 2.3. Kính hiển vi Olympus BX51

- Kính hiển vi điện tử quét (JSM 5410LV – JEOL – Nhật)

Hình 2.4. Hệ thống kính hiển vi điện tử quét

- Kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400, JEOL, Nhật Bản.

Hình 2.5. Hệ thống kính hiển vi điện tử truyền qua

- Hệ thống máy PCR 9700, Applied Biosystem, Real-time PCR 7500:

Applied Biosystem, Máy giải trình tự tự động CEQ 8800 Sequencer,

Beckman Coulter, Mỹ dùng để xét nghiệm tính đa hình gen Cyp2C19, gen

MDR1.

Hình 2.6. Máy PCR 9700, Applied Biosystem

Hình 2.7. Hệ thống Real-time PCR 7500, Applied Biosystem

Hình 2.8. Máy giải trình tự tự động CEQ 8800 Sequencer,

Beckman Coulter

2.2.3. Các biến số nghiên cứu

2.2.3.1. Tuổi và phân nhóm tuổi

Phân nhóm tuổi đƣợc chia thành 3 nhóm: ≤40 tuổi, 40-60 tuổi, và >60

tuổi.

2.2.3.2. Giới

Chia làm 2 nhóm: nam và nữ.

2.2.3.3. Số năm phơi nhiễm dioxin

Đƣợc tính bằng năm là thời gian bắt đầu sống tại vùng ô nhiễm dioxin

đến thời điểm nghiên cứu

2.2.3.4. Triệu chứng cơ năng

Chia thành các nhóm có triệu chứng và không có triệu chứng nhƣ mệt

mỏi chán ăn, giảm khả năng lao động, đau hạ sƣờn phải, rối loạn giấc ngủ,

đầy bụng khó tiêu và nhóm triệu chứng khác.

2.2.3.5. Triệu chứng thực thể

Chia thành các nhóm có triệu chứng và không có triệu chứng nhƣ xuất

huyết tiêu hóa, xuất huyết da niêm, lách to, gan to, sao mạch, bàn tay son,

giãn mạch gò má, xạm da.

2.2.3.6. Xét nghiệm hóa sinh gan mật

AST, ALT tăng khi >40 U/L. GGT tăng khi >60 U/L.

Bilirubin toàn phần tăng khi >17 µmol/l.

2.2.3.7. Định lượng dioxin trong máu

Đơn vị: pg/g lipid.

Khi tổng đƣơng lƣợng độc TEQ>9,4pg/g lipid là có nồng độ dioxin

trong máu cao [32].

2.2.3.8. Mô bệnh học

- Đo độ dài mảnh sinh thiết (Tính theo mm).

- Số khoảng cửa mẫu sinh thiết.

- Tổn thƣơng mô bệnh học

+ Thoái hóa hạt: Có hoặc không.

+Thoái hóa rỗ: Có hoặc không.

+ Thoái hóa mỡ: Có hoặc không.

+ U hạt mỡ: Có hoặc không

+ Lympho bào và bạch cầu đa nhân bao quanh tế bào gan: Có hoặc

không.

+ Thể Mallory: Có hoặc không.

+ Nhiễm sắc tố: Có hoặc không.

+ Mitochondria khổng lồ: Có hoặc không.

+ Biến đổi ƣa toan tế bào gan: Có hoặc không.

+ Nghẽn tĩnh mạch: Có hoặc không.

- Kết quả GPB theo phân loại Metavir:

+ Độ hoạt động: A0 (không), A1 (nhẹ), A2 (trung bình), và A3 (nặng).

+ Giai đoạn xơ hóa: F0, F1, F2, F3 và F4. Mức độ xơ hóa: xơ hóa nhẹ

(F0, F1), xơ hóa có ý nghĩa (F2), xơ hóa nặng (F3), xơ gan (F4).

2.2.3.9. Biến chứng sinh thiết

Các biến chứng nhƣ là đau, xuất huyết trong ổ bụng, nhiễm trùng và

cách xử trí các biến chứng và kết quả.

2.2.3.10. Hình ảnh siêu cấu trúc

- Thâm nhiễm tế bào viêm.

- Khoảng gian bào vi quản mật giãn.

- Xơ hóa tổ chức gan.

- Tổn thƣơng tế bào gan

+ Màng bị tổn thƣơng.

+ Nhân bị tổn thƣơng.

+ Lƣới nội bào hạt dãn rộng.

+ Lƣới nội bào không hạt: Dãn rộng, tạo thể đa màng xoắn.

- Tổn thƣơng mitochondria

+ Vị trí

Phân bố đều.

Tập trung sát màng tế bào.

+ Cấu trúc màng mitochondria

Bình thƣờng (màng kép, rõ nét).

Đứt gãy

+ Mào mitochondria

Cấu trúc bình thƣờng

Thƣa thớt

Không thấy

+ Mật độ bào quan tăng đậm độ điện tử:

1/3 số mitochondria trong tế bào

2/3 số mitochondria trong tế bào

Toàn bộ mitochondria trong tế bào

+ Hạt đậm độ điện tử cao trong bào quan

Có hoặc không

+ Đƣờng tinh thể

Có hoặc không

+ Hình dạng mitochondria

Bình thƣờng

Biến dạng (Hình chùy, có chồi)

+ Kích thƣớc

Đồng đều

Không đồng đều

Khồng lồ

+Mitochondria thể kích

Có hoặc không.

2.2.3.11. Tính đa hình gen MDR1 và Cyp2C19

-Tính đa hình gen MDR1

+ Chúng tôi phân tích kiểu gen MDR1 C3435T thành 3 nhóm: T/T, C/C,

T/C, các allele T, C.

- Tính đa hình gen Cyp2C19

+ Các Alleles: Cyp2C19*1, Cyp2C19*2, Cyp2C19*3.

+ Phân nhóm kiểu hình Cyp2C19 theo mức độ chuyển hóa:

Kiểu hình chuyển hóa nhanh có kiểu gen Cyp2C19*1/*1.

Kiểu hình chuyển hóa trung bình có kiểu gen Cyp2C19 *1/*2, *1/*3.

Kiểu hình chuyển hóa yếu có kiểu gen Cyp2C19 *2/*2, *2/*3, *3/*3.

2.2.4. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu

2.2.4.1. Chuẩn bị bệnh nhân

Các bệnh nhân trong diện nghiên cứu đều đƣợc hỏi kỹ về bệnh sử,

khám lâm sàng và làm các xét nghiệm theo phiếu ghi nhận thông tin bệnh

nhân thỏa mãn các tiêu chuẩn chọn bệnh và tiêu chuẩn loại trừ:

- Tuổi, giới, thời gian sống vùng phơi nhiễm, nhiễm viên gan vi-rút B

và C, nghiện rƣợu, béo phì, tiền sử bệnh lý.

- Đặc điểm lâm sàng: Mệt mỏi, chán ăn sợ mỡ, vàng da, vàng mắt,

lòng bàn tay son, sao mạch, lách to, tuần hoàn bàng hệ…

- Tham số cận lâm sàng: công thức máu, số lƣợng tiểu cầu, đông máu

toàn bộ, Ure, Creatinin máu, đƣờng máu transaminase, Bilirubin TP gamma-

glutamyl transferase, albumin, anti HCV, HBsAg .

Siêu âm bụng 2D thông thƣờng khảo sát cấu trúc nhu mô gan.

Giải thích và bệnh nhân đồng ý ký vào bảng cam kết thực hiện thủ

thuật.

2.2.4.2. Thực hiện các xét nghiệm

- Các loại xét nghiệm:

Tiến hành định lƣợng một số xét nghiệm máu trong nghiên cứu theo

đúng nguyên tắc và kỹ thuật xét nghiệm.

+ AST, ALT, GGT, Bilirubin TP và 1 số xét nghiệm sinh hóa khác

làm cùng thời điểm trong vòng 1 tuần trƣớc sinh thiết, lấy số liệu của ngày

gần nhất với sinh thiết gan và tất cả đƣợc thực hiện ở bệnh viện quân y 103 và

bệnh viện 17 Đà Nẵng

+ INR đƣợc thực hiện trong vòng 72 giờ trƣớc sinh thiết gan.

+ Các xét nghiệm khác nhƣ HBsAg, anti-HCV.

+ Các xét nghiệm cần thiết khác để giúp loại trừ các nguyên nhân

khác gây viêm gan mạn nhƣ Fe, Ferritin, ANA, Ceruloplasmin huyết

thanh…khi cần.

- Nguyên tắc xét nghiệm:

+ Các xét nghiệm hóa sinh

ALT, AST, Bilirubin toàn phần, Bilirubin trực tiếp, và các xét nghiệm

sinh hóa khác trong huyết thanh đƣợc định lƣợng trực tiếp trên máy phân tích

hóa sinh tự động Hitachi Modular của hãng Roche tại khoa Hóa Sinh bệnh

viện quân y 103 và bệnh viện 17 Đà Nẵng. Thuốc thử của Roche. Dung dịch

chuẩn cho hệ thống tự động C.F.A.S của Roche.

2.2.4.3. Xét nghiệm nồng độ Dioxin

Lấy 40 ml máu toàn phần tách lấy huyết thanh bảo quản và vận chuyển

về trung tâm Nhiệt đới Việt Nga tiến hành phân tích.

Phƣơng pháp phân tích: Tiến hành theo phƣơng pháp sắc ký khí phân

giải cao/ khối khổ phân giải cao. Mẫu đƣợc thêm các chất chuẩn nội đánh dấu đồng vị 13C12-PCDD/PCDF, chiết lỏng – lỏng với hỗn hợp hexan – etanol.

Thu lại phần dịch chiết trong n-hexan. Phân đoạn PCDD/PCDF đƣợc tách

trên cột than hoạt tính chuyên dụng. Làm sạch trên “cột đa lớp” chứa

silicagen, silicagen tẩm acid, silicagen tẩm kiềm. PCDD/PCDF đƣợc tách qua cột nhôm oxit, thêm các chất chuẩn đánh dấu đồng vị 13C12-PCDD xác định

hiệu suất thu hồi.

Thiết bị phân tích: Phân tích mẫu bằng sắc ký khí Agilent 7890A –

khối phổ phân giải cao AutoSpec Premier P834.

Nơi phân tích: Phòng phân tích dioxin, Phân viện Hóa – Môi trƣờng,

Trung tâm nhiệt đới Việt Nga. Phòng thí nghiệm đã đƣợc công nhận phù hợp

theo ISO/IEC 17025: 2017, mang số hiệu VILAS 856.

2.2.4.4. Sinh thiết gan và đọc kết quả mô bệnh học

Tất cả các bệnh nhân trong diện nghiên cứu sẽ đƣợc sinh thiết gan qua

da tại phòng siêu âm dƣới hƣớng dẫn của siêu âm 2D. Kết quả mô bệnh học

bởi sự hội chẩn của 2 bác sỹ chuyên ngành: 1 bác sỹ khoa giải phẫu bệnh viện

quân y 103 và 1 bác sỹ khoa Hình thái bệnh viện 69 Bộ tƣ lệnh Lăng –Bộ

quốc phòng.

- Chuẩn bị bệnh nhân trƣớc khi sinh thiết:

+ Giải thích kỹ cho bệnh nhân qui trình thực hiện và nguy cơ tai

biến. Ký giấy cam kết trƣớc khi thực hiện thủ thuật.

+ Cần ngƣng các thuốc chống kết tập tiểu cầu ít nhất 10 ngày, chống

đông máu nhƣ Warfarin ít nhất 5 ngày và có thể dùng lại sau sinh thiết 48-72

giờ, ngƣng Heparin trƣớc 12-24 giờ và có thể dùng lại ngày hôm sau, ngƣng

các kháng viêm không steroid ít nhất 3-5 ngày trƣớc khi sinh thiết.

- Chuẩn bị dụng cụ:

+ Chuẩn bị súng sinh thiết tự động Pajunk của Đức, kích thƣớc kim

là 16 Gauge, chiều dài kim là 16cm, chiều dài lao kim chỉnh trên súng để lấy

mẫu mô sinh thiết là 20 mm (Hình 2.3): vặn lên cò súng, thử súng bằng cách

bấm vào vào nút kích hoạt ở đầu súng. Lên cò súng lại nhƣ lần đầu.

Hình 2.9. Sinh thiết gan dƣới hƣớng dẫn siêu âm

+ Khay vô trùng, bông gòn, gạc, băng keo, cồn iod 0,1%, kềm Kelly, 2

cặp găng vô trùng, 2 cặp găng sạch, 2 ống Lidocain 2% 2ml, 1 lọ có formal

10% ghi thông tin bệnh nhân để đựng bệnh phẩm, hộp thuốc chống sốc.

- Tiến hành sinh thiết gan:

Phƣơng pháp sinh thiết: sinh thiết gan kiểu tru-cut bằng súng sinh thiết

gan Pajunk, mẫu sinh thiết có ít nhất là 6 khoảng cửa hoặc dài tối thiểu là

1,5cm.

+ Bệnh nhân nằm ngửa, tay phải đƣợc đƣa lên đầu để các khoảng gian

sƣờn giãn rộng, đầu quay bên trái.

Gõ xác định diện đục của gan và siêu âm bụng để xác định vị trí sinh

thiết an toàn. Vị trí sinh thiết là khoảng gian sƣờn 7 hoặc 8 đƣờng nách trƣớc

hoặc giữa bên phải để giảm tối đa nguy cơ biến chứng nhƣ đâm vào phổi, túi

mật, thận phải, hoặc đại tràng góc gan. Đánh dấu vị trí chọc sinh thiết bằng

bút viết bic.

+ Mang găng vô trùng. Sát trùng vùng sinh thiết một khoảng rộng

khoảng 30x30cm. Trải khăn lỗ.

+ Tiến hành gây tê tại vị trí chọc: gây tê dƣới da, trong da, tổ chức cơ

đến màng trong gan bằng Lidocain 2% 2ml.

+ Bọc đầu dò siêu âm bằng găng vô trùng, bên trong có gel. Tại vị trí

đánh dấu, chọc kim qua da, mô dƣới da, cơ gian sƣờn dƣới hƣớng dẫn của

siêu âm. Quan sát đầu và hƣớng đi của kim trong quá trình sinh thiết. Khi kim

đã ở vị trí an toàn (tránh mạch máu, đƣờng mật, túi mật), nhấn nút kích hoạt

để thực hiện sinh thiết. Rút kim ra khỏi bệnh nhân, kiểm tra đƣờng đi của kim

qua siêu âm, kiểm tra biến chứng sớm tại chỗ ngay sau sinh thiết nhƣ tụ máu,

chảy máu.

+ Lấy mẫu mô ra khỏi kim một cách cẩn thận, tránh gãy vỡ và cố định

nó vào lọ formol 10% 5ml chuẩn bị sẵn, gửi khoa giải phẫu bệnh.

+ Băng ép cầm máu tại vị trí chọc. Cho bệnh nhân nằm nghiêng phải ít

nhất 2 giờ để tăng hiệu quả băng ép cầm máu vị trí chọc kim.

- Săn sóc và theo dõi sau sinh thiết:

+ Bệnh nhân cần nằm yên nghiêng phải có chèn gối nhỏ lên vùng sinh

thiết trong 2 giờ đầu tiên và hạn chế đi lại tr lại trong 6 giờ đầu.

- Mô bệnh học:

Mẫu mô gan đƣợc ngâm vào lọ chứa dung dịch bảo quảnvà gửi đến

khoa Hình thái Viện 69 Bộ tƣ lệnh Lăng. Kết quả mô bệnh học đƣợc đọc hội

chẩn dƣới kính hiển vi quang học để xác định mức độ xơ hóa, hoại tử theo

thang điểm Metavir bởi 2 bác sĩ chuyên khoa giải phẫu bệnh: khoa Hình thái

bệnh viện 69 và khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện Quân y 103. Quá trình này

độc lập với kết quả khám lâm sàng và cận lâm sàng khác.

Sử dụng kính hiển vi Olympus BX51 của hãng Olympus để đọc tiêu

bản mô gan sinh thiết.

2.2.4.5. Đọc kết quả siêu cấu trúc

Các mảnh sinh thiết nhu mô gan đƣợc cho vào dung dịch bảo quản,

tiến hành chuẩn bị mẫu và đọc siêu cấu trúc trên kính hiển vi điện tử truyền

qua (TEM) và kính hiển vi điện tử quét (SEM).

- Chuẩn bị mẫu đọc kết quả trên kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Các mẫu sau khi sinh thiết đƣợc:

+ Rửa 2 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% hoặc dung dịch đệm cacodylate

(pH 7,3) 2 lần.

+ Cố định bằng dung dịch glutaraldehyte 2% trong đệm cacodylate pH

7,3. 1/10 thể tích mẫu/thể tích dung dịch. Thời gian 2-3 ngày (tùy thuộc kích

thƣớc mẫu).

+ Pha mẫu thành mảnh nhỏ kích thƣớc 1x1x2 mm

+ Rửa bằng đệm cacodylate 2-3 lần trong 1 giờ.

+ Cố định lại bằng dung dịch acid osmic 1% trong đệm cacodylate pH

7,3: 1 giờ

+ Rửa bằng đệm cacodylate pH 7,3: 2-3 lần.

+ Khử nƣớc bằng chuyển lien tục qua các dung dịch cồn 50%, 60%,

70%, 80%, 90%, 100%: 15 phút/dung dịch.

+ Các mảnh mẫu sau khi ngâm trong cồn 100%, đƣợc làm khô bằng

thiết bị làm khô ở điểm tới hạn (critical point drier – EMS850, Mỹ). Cho mẫu

cùng cồn 100% vào buồng mẫu, đậy nắp, hạ nhiệt độ và đƣa CO2 lỏng vào

buồng mẫu. Dùng CO2 lỏng loại cồn ra khỏi mẫu. Tăng áp suất và nhiệt độ

đến điểm tới hạn để CO2 lỏng hóa hơi hoàn toàn, hạ áp suất, nhiệt độ, lấy mẫu

ra khỏi buồng mẫu.

+ Gắn mẫu trên đế bằng băng dính carbon 2 mặt.

+ Mạ phủ bằng vàng trên thiết bị bốc bay kim loại (JFC 1200 – JEOL –

Nhật).

+ Soi, đọc kết quả trên kính hiển vi điện tử quét (JSM 5410LV – JEOL

– Nhật)

- Chuẩn bị mẫu cho kính hiển vi điện tử truyền qua .

Các mẫu sau khi sinh thiết đƣợc

+ Rửa 2 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% hoặc dung dịch đệm cacodylate

(pH 7,3) 2 lần.

+Cố định bằng dung dịch glutaraldehyte 2% trong đệm cacodylate pH

7,3. 1/10 thể tích mẫu/thể tích dung dịch. Thời gian 2-3 ngày (tùy thuộc kích

thƣớc mẫu).

+Pha mẫu thành mảnh nhỏ kích thƣớc 1x1x2 mm

+Rửa bằng đệm cacodylate 2-3 lần trong 1 giờ.

+Cố định lại bằng dung dịch acid osmic 1% trong đệm cacodylate pH

7,3: 1 giờ

+Rửa bằng đệm cacodylate pH 7,3: 2-3 lần.

+Khử nƣớc bằng chuyển lien tục qua các dung dịch cồn 50%, 60%,

70%, 80%, 90%, 100%: 15 phút/dung dịch.

+Sau khi khử nƣớc, mẫu đƣợc chuyển qua dung dịch cồn propylene +

ethylene: 1/1 trong 10 phút, sau đó chuyển qua propylene: 10 phút.

+Tiếp tục chuyển mẫu qua hỗn hợp propylene + epon 812 với tỷ lệ thể

tích: 1/1 trong 15 phút sau đó là hỗn hợp propylene + epon 812: ½ trong 30

phút. Cuối cùng cho mẫu vào epon 812 trong 30 phút.

+ Đúc block bằng khuân. + Lƣu hóa ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.

+Polyme hóa ở nhiệt độ 600C trong 48 giờ

+Sau khi các block đã hóa cứng hoàn toàn, gọt mẫu, cắt bán mỏng,

nhuộm bằng xanh toluidine, định hƣớng vị trí nghiên cứu, gọt mẫu và cắt

bằng máy siêu cắt LBK (Đức) độ dày lát cắt: 50 nm.

+Vớt lát cắt lên lƣới đồng 200 lỗ.

+Nhuộm uranyl acetate 2% trong 5 phút, rửa 2 lần bằng nƣớc cất.

+Nhuộm chì citrate 5% trong 5 phút, rửa 2 lần bằng nƣớc cất.

+Soi, đọc kết quả trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400,

JEOL, Nhật Bản.

2.2.4.6. Xét nghiệm xác định đa hình gen Cyp2C19 và MDR1 C3435T.

- Bƣớc 1: Phƣơng pháp tách chiết, tinh sạch DNA tổng số

+ Tách DNA

200 µl Máu tổng số + 250 µl MCLB1 lắc 1200 vòng/ phút ở nhiệt độ

37oC trong vòng 3 phút

Ủ 950 C trong 5 phút

Trung hòa bằng 250 µl Tris-HCL 1M pH 4.2-4,6

Thêm 400 µl dung dịch phenol, chloroform isoamylalchol 25:24:1 (lắc

đều)

Ly tâm tốc độ tối đa trong 20 phút

Thu dịch nổi

Thêm 0.7 V isopropanol

Ly tâm tốc độ tối đa trong 30 phút

Thu tủa

Thêm 700 µl Cồn 70% rửa 2 lần (ly tâm tốc độ tối đa)

Thêm 200 µl Elution buffer

Đo OD (ng/µl). Đo nồng độ DNA, đánh giá chất lƣợng DNA (thông

qua chỉ số OD 260/OD280).

- Bƣớc 2: Phƣơng pháp đo quang phổ kế xác định nồng độ, độ tinh

sạch DNA.

Xác định hàm lƣợng DNA trong dung dịch phân tích dựa vào mức độ hấp

thụ cực đại ánh sang tia tử ngoại ở bƣớc song 260 nm của các base nitơ trong các

acid nucleic. Giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép

xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa vào mối tƣơng quan.

Phƣơng pháp này có thể xác định đƣợc độ sạch mẫu phân tích dựa trên

tỷ số OD 260/OD280. Mẫu DNA tinh sạch có tỉ số OD 260/OD280 ≈ 1,8. Mẫu

RNA tinh sạch có tỉ số OD 260/OD280 ≈ 2,0. Do đó mẫu DNA/RNA đem phân

tích có giá trị chấp nhận đƣợc trong khoảng từ 1,8-2,0. Nếu mẫu phân tích có

tỉ số OD 260/OD280 < 1,8 thì mẫu phân tích chứa protein hoặc thành phần khác.

Bƣớc 3: Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu và probe phù hợp và tối ƣu

hóa phản ứng PCR cho gen Cyp2C19 và MDR1

Nguyên lý: Dựa vào trình tƣ gen đích chủng hoang dại (Wildtype), chọn

vùng trình tự đặc hiệu của gen đích có chứa vùng đột biến cần phân tích. Sử

dụng phần mềm thiết kế mồi primer-primer chuyên dụng (phần mềm Vector

NTI-11) và kiểm tra trên ngân hàng gene (Genebank)

Cặp mồi đặc hiệu để xác định gen CYP2C19

Chúng tôi xác định các cặp mồi đặc hiệu cho các điểm đa hình đơn

Cyp2C19*2, Cyp2C19*3 bằng 2 bƣớc. Đầu tiên, khuếch đại đoạn gene

Cyp2C19 chứa các điểm đa hình đơn. Trong đó bộ mồi xác định điểm đa hình

rs4986893, (G681A – Cyp2C19*2) gồm 2 primers: cặp mồi (Outer-

CYP2C19*2-F/Outer-2C19*2-R) và bộ mồi xác định điểm đa hình

rs4244285, (G636A – Cyp2C19*3) gồm 2 primers: cặp mồi (Outer-

CYP2C19*3-F/Outer-2C19*3-R). Mục đích là khuếch đại băng nội chuẩn

tƣơng ứng với các kích thƣớc 598bp và 645bp đặc hiệu cho gene Cyp2C19

trong DNA mẫu bệnh phẩm. Sau đó, tiếp tục phân tích từng điểm đa hình đơn

bằng cách nhân lên nhiều lần với cặp mồi đặc hiệu.

Cặp mồi (Outer-CYP2C19*2-F/ARMS-618G-R) và (ARMS-618G-F/

Outer-CYP2C19*2-R) cho phép đánh giá chính xác các biến thể allele G hoặc

A tại vị trí đa hình rs4986893, (G681A – Cyp2C19*2) với kích thƣớc tƣơng

ứng là 214bp hoặc 437bp.

Cặp mồi (Outer-CYP2C19*3-F/ARMS-636A-R) và (ARMS-636G-F/

Outer-CYP2C19*2-R) cho phép phát hiện chính xác các biến thể allele A/G

tại vị trí đa hình rs4244285, (G636A – Cyp2C19*3) với kích thƣớc tƣơng ứng

là 247bp hoặc 442bp.

Cặp mồi đặc hiệu để xác định gen MDR1 C3435T

Thế đa hình đơn MDR1 C3435T, rs1045642 đƣợc phát hiện bằng phản

ứng real time PCR đặc hiệu allele probe với bộ mồi gồm 2 chuỗi

oligonucleotid nhƣ sau:

S-Outer-MDR1-R GCTGAGAACATTGCCTATGGAGAC

Outer-MDR1-F CTTGTATACAGGTAAGGGTGTGATTTGGT

Và các probe sau

Tr- (SNP rs1045642)-C-allele-probe FAM- tttgctgccctcacgatctettectgtg-BHQ

Tr-(SNP rs1045642)-T-allele-probe Joe- tttgetgccctcacaatetcttcctgtg-BHQ

Tr-(SNP rs1045642) A-allele-prob Cy5 -tgggagaatcgtgtgagccetggaggtggaggtt

- BHQ

Cặp mồi này theo lý thuyết sẽ khuếch đại đoạn gen có kích thƣớc 242bp

của gen MDR1, bao phủ khu vực nghi ngờ có các thể đa hình MDR1 SNP

rs1045642 (A/C/T)

Và các probe

Tr-(SNP rs1045642)-C-allele-probe FAM-tttgctgccctcacgatctcttcctgtg-BHQ Tr-(SNP rs1045642)-T-allele-probe Joe-tttgctgccctcacaatctcttcctgtg-BHQ Tr-(SNP rs1045642)-A-alleprobe

Cy5-tgggagaatgtgtgagccctggaggtggaggtt- BHQ

- Bƣớc 4: Phƣơng pháp Amplification refractory mutation system –

ARMS, deoxyinosine primer, dual priming oligonucleotide DPO, peptide

nucleic acid clamp, locked nucleic acid probe– PNA- LNA phát hiện kiểu

gene CYP2C19, MDR1, tại các vị trí đa hình.

Việc tích hợp thêm các giải pháp loại bỏ tín hiệu giả trong thiết kế mồi đặc

hiệu allele làm cho công nghệ PCR hay realtime PCR bất đối xứng trở nên ƣu

việt hơn hẳn phƣơng pháp giải trình tự trực tiếp nhƣ: rút ngắn thời gian tiến hành

xét nghiệm, làm giảm chi phí cho xét nghiệm và nâng cao độ nhạy kỹ thuật. Tuy

nhiên, tính ƣu việt của từng giải pháp cho mỗi vị trí đột biến cụ thể là khác nhau,

vì vậy chúng tôi triển khai đồng thời các công nghệ Amplification refractory

mutation system – ARMS, deoxyinosine primer, dual – priming – oligo DPO,

locked nucleic acid probe, peptide nucleic acid clamp. Nhằm đƣa ra đƣợc giải

pháp tối ƣu cho từng vị trí đa hình gene CYP2C19, MDR1.

- Phƣơng pháp ARMS-PCR

Phƣơng pháp ARMS-PCR hay còn đƣợc gọi là PCR đặc hiệu cho alen,

là một phƣơng pháp rất đơn giản để phát hiện các đột biến đã biết liên quan

đến những thay đổi đơn lẻ hoặc sự mất đoạn nhỏ, dựa trên việc sử dụng các

đoạn mồi PCR cụ thể cho phép khuếch đại đoạn ADN kiểm tra khi có chứa

alen đích trong mẫu. Kỹ thuật ARMS yêu cầu khuếch đại PCR và điện di trên

gel. Trong kỹ thuật ARMS, Phản ứng khuếch đại bao gồm một đoạn mồi

oligonucleotide đặc hiệu cho alen ở đầu 5’ và một đoạn mồi chung ở đầu 3’.

Nếu sự hiện diện của một đột biến đƣợc khuếch đại và đƣợc phát hiện bằng

phƣơng pháp điện di trên gel agarose, điều đó cho thấy trình tự chứa alen đột

biến. Tƣơng tự, nếu kết quả hiển thị không có sự khuếch đại của điểm đột

biến, nó sẽ biểu hiện trình tự DNA bình thƣờng trên điểm cụ thể đó [72].

Hình 2.10. Cơ sở lý thuyết phƣơng pháp ARMS-PCR

- Phƣơng pháp PCR bắt mồi đặc hiệu và PCR bất đối xứng (allele

specific combined asymmetric PCR)

Một bộ mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu là điều kiện bắt buộc quyết định sự

thành công của một phản ứng PCR nói chung, trong đó có PCR đặc hiệu đột

biến. Để thực hiện phản ứng PCR đặc hiệu allele, hoặc phản ứng realtime

PCR đặc hiệu allele, ta tiến hành đồng thời 2 phản ứng real time PCR (có thể

sử dụng Sybr green I để nhận biết sản phẩm PCR) bắt cặp tƣơng ứng với 2

allele tại vị trí nghi ngờ có đột biến. Lúc đó sẽ xảy ra 2 khả năng: i) nếu mẫu

DNA là đồng hợp tử, từ tín hiệu huỳnh quang (trên lý thuyết) chỉ đƣợc ghi

nhận ở duy nhất 1 allele tƣơng ứng. Tuy nhiên trong thực hành sẽ xảy ra hiện

tƣợng bắt cặp lệch (mismatch) của primer, do đó ngay cả khi mẫu DNA là

đồng hợp tử thì tín hiệu huỳnh quang vẫn xuất hiện ở cả 2 allele trong đó tín

hiệu giả sẽ chậm hơn tín hiệu thật khoảng từ 3 đến 15 chu kỳ. Trong trƣờng

hợp mẫu DNA là dị hợp tử, tín hiệu huỳnh quang sẽ có mặt đồng đều ở cả hai

allele, đƣờng cong phổ huỳnh quang của 2 allele sẽ gần trùng khít nhau hoặc

chỉ khác nhau dƣới 1 chu kỳ [73].

Hình 2.11. Cơ sở lý thuyết phƣơng pháp real-time PCR động học đặc

hiệu allele

- Phƣơng pháp bắt mồi hai đoạn (Dual priming oligonucleotide

DPO)

Hình 2.12. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp PCR đặc hiệu allele tích hợp

công nghệ bắt mồi 2 đoạn (DPO).

Mồi DPO chẩn đoán mỗi vị trí đột biến gene CYP2C19, MDR-1 tại

mỗi vị trí đa hình đều đƣợc thiết kế riêng bao gồm 3 đoạn: đoạn nucleotide 5’

bắt cặp bổ sung với khuôn DNA và đƣợc nối với đoạn nucleotide 3’ nhờ một

đoạn deoxyinosine. Số lƣợng các deoxyinosine thay đổi tùy tính chất mỗi

DPO. Đoạn nucleotide 5’ (stabilizer) quyết định giá trị Tm của mồi DPO, còn

đoạn 3’ (determiner) đƣợc thiết kế sao cho đầu tận cùng 3’ bắt cặp chính xác

với nucleotide đột biến vì thế nó quyết định tính đặc hiệu của DPO. Phản ứng

PCR chỉ diễn ra khi cả phần 5’ và 3’ của DPO bắt cặp chính xác với khuôn

mang đột biến. Trong trƣờng hợp chỉ hoặc khu vực 5’ hoặc 3’ bắt cặp với

khuôn DNA, phản ứng PCR sẽ không thể diễn ra. Vị trí đột biến đều có thể

xảy ra 3 đột biến, tuy nhiên tính chất lâm sàng của các thể đột biến này là nhƣ

nhau vì thế không cần thiết phải phân biệt cụ thể từng đột biến đơn lẻ, do vậy

thiết kế phát hiện các thể đột biến trong vị trí xác định có thể đƣợc thực hiện

riêng rẽ hoặc phối hợp với phản ứng Real time PCR đặc hiệu allele tích hợp

công nghệ bắt mồi 2 đoạn (DPO). Để xác định độ nhạy kỹ thuật của thiết kế,

tiến hành pha loãng DNA thể dại với DNA đột biến theo tỉ lệ tạo dựng các

chuỗi pha loãng nồng độ DNA đột biến cuối cùng là 10%, 1%, 0.1% và 0%

của các đột biến đơn lẻ từ đó thực hiện phản ứng Realtime dùng các DPO

đƣợc thiết kế theo.

- Phƣơng pháp real time PCR sử dụng kẹp peptide (peptide nucleic

acid clamp)

Theo phƣơng pháp này kiểu allele tại một vị trí đa hình sẽ đƣợc biết

thông qua tín hiệu từ phản ứng realtime PCR sử dụng taqman probe và và một

kẹp peptide (peptide nucleic acid clamp). Do bản chất bắt cặp mạnh kẹp

peptide khi đƣợc thiết kế bắt cặp vào allele thể chính (major allale) sẽ ức chế

sự nhân lên của amplicon đặc hiệu cho allele này vì thế tín hiệu huỳnh quang

nếu có sẽ đặc hiệu cho allele thể hiếm.

Hình 2.13. Cơ sở lý thuyết phƣơng pháp real time PCR sử dụng kẹp

peptide

- Bƣớc 5: Phƣơng pháp giải trình tự gen (Sequencing):

Kiểm chứng lại kỹ thuật realtime PCR đã phát hiện kiểu gene bằng

phƣơng pháp giải trình tự gen trực tiếp.

Nguyên tắc: Phƣơng pháp giải trình tự gene trực tiếp (Sanger

sequencing) dựa trên nguyên tắc thành phần phản ứng khuếch đại gene có bổ

sung 4 loại ddNTP (dideoxynucleotide triphosphate) bao gồm ddATP,

ddTTP, ddCTP, ddGTP đƣợc đánh dấu bằng 4 chất màu huỳnh quang khác

nhau. Khi các ddNTP liên kết vào phân tử DNA đang đƣợc tổng hợp sẽ làm

ngừng phản ứng do không tạo đƣợc liên kết phosphodieste. Sản phẩm khuếch

đại DNA đƣợc điện di và các tín hiệu huỳnh quang đƣợc máy giải trình tự

hiển thị thành dãy băng màu huỳnh quang tƣơng ứng với trình tự các

nucleotide.

Để so sánh độ nhạy kỹ thuật của phƣơng pháp Real time PCR đặc hiệu

allele có tích hợp công nghệ bắt mồi 2 đoạn (DPO) với phƣơng pháp giải trình

tự gene truyền thống, chúng tôi tiến hành giải trình tự các mẫu DNA có chứa

50%, 20%, 10% và 0% gen đích (CYP2C19, MDR-1) đột biến điểm.

Quy trình: Quá trình giải trình tự gen đƣợc tiến hành trên máy CEQ

8800 sequencer, Beckman Coulter, Mỹ qua 4 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Thực hiện phản ứng PCR sequencing để khuếch đại

DNA đích. Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2 ml với các thành phần theo

qui định.

- Giai đoạn 2: Tinh sạch sản phẩm DNA đã đƣợc khuếch đại từ phản

ứng PCR Cho vào mỗi ống hỗn hợp dung dịch dừng phản ứng (Stop

Solution).

+ Chuyển toàn bộ dung dịch phản ứng PCR giải trình tự vào ống 0.5

mL đã có hỗn hợp Stop Solution và vortex trong vài giây.

Thêm vào mỗi ống 100 μL Ethanol lạnh 95% (đƣợc bảo quản trong tủ lạnh – 20 oC), vortex và ly tâm với tốc độ 14000 rpm trong 15 phút ở 4 oC

thu tủa DNA.

Rửa tủa DNA bằng 200 μL Ethanol lạnh 70% (bảo quản trong tủ lạnh -20 oC) và ly tâm 4 oC với tốc độ 14000 rpm trong 2 phút. Lặp lại bƣớc

này thêm 1 lần.

Làm khô DNA bằng máy quay cô chân không trong vòng 10 phút

Hoà tan tủa DNA vào trong 40 µL SLS

- Giai đoạn 3: Chuẩn bị mẫu để đƣa vào máy giải trình tự

+ Chuyển toàn bộ dung dịch DNA hoà tan trong SLS từ bƣớc tinh sạch

vào giếng tƣơng ứng trên đĩa chạy mẫu.

+ Nhỏ một giọt dầu (mineral oil) lên trên mẫu để tránh bay hơi mẫu

(mineral oil đƣợc cung cấp kèm theo DTCS Quick Start Kit).

- Giai đoạn 4: Xác định trình tự trên máy CEQ 8800 sequencer,

Beckman Coulter, Mỹ.

- Kết quả kiểm chứng

Tính tƣơng đồng giữa PCR đặc hiệu hai hƣớng allele có tích hợp công

nghệ Amplification refractory mutation system (ARMS) và giải trình tự gene

trực tiếp.

Hình 2.14. So sánh tính tƣơng đồng giữa giải trình tự gene trực tiếp và

PCR đặc hiệu allele hiệu hai hƣớng allele có tích hợp công nghệ

Amplification refractory mutation system (ARMS) trong chẩn đoán kiểu

gene Cyp2C19*2( rs4986893-G681A)

Hình 2.15. So sánh tính tƣơng đồng giữa giải trình tự gene trực tiếp và

PCR đặc hiệu allele hiệu hai hƣớng allele có tích hợp công nghệ

Amplification refractory mutation system (ARMS) trong chẩn đoán kiểu

gene Cyp2C19*3(rs4244285 G636A)

Hình 2.14 và hình 2.15 cho thấy có sự tƣơng đồng tuyệt đối giữa kết

quả chẩn đoán kiểu allele bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu allele kết hợp công

nghệ ARMS do chúng tôi thiết kế với kết quả giải trình tự gen ở cả hai vị trí

đa hình quan trọng của gene Cyp2C19 là Cyp2C19*2(rs4986893-G681A) và

Cyp2C19*3(rs4244285 G636A).

2.2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Các dữ kiện và số liệu thu thập đƣợc kiểm tra và nhập vào máy tính.

- Xử lý số liệu theo chƣơng trình SPSS 22.0 (Statistical Package for

Social Sciences).

- Đánh giá: p ≥ 0,05: Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê; p < 0,05:

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê; p < 0,01: Sự khác biệt rất có ý nghĩa

thống kê; p < 0,001: Sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê rất lớn.

Mô tả biến định lƣợng theo trung bình, độ lệch chuẩn theo phân phối

chuẩn, trung vị, tứ phân vị (25%-75%) cho phân phối không chuẩn.

So sánh hai trị trung bình của hai nhóm độc lập, sử dụng phép kiểm

định Independent- Sample T-Test với phân phối chuẩn và dùng kiểm định phi

tham số Mann Whitney test với phân phối không chuẩn.

So sánh cho trị trung bình của trên 2 nhóm độc lập, sử dụng phƣơng

pháp so sánh phƣơng sai ANOVA với phân phối chuẩn, với phân phối không

chuẩn sử dụng so sánh phi tham số Kruskal Wallis test.

Phân tích biến định tính theo tần số và tỷ lệ phần trăm (%).

Nếu dƣới 20% tần số kỳ vọng lớn hơn 5 thì sử dụng kiểm định Chi bình

phƣơng. Trên 20% kỳ vọng nhỏ hơn 5 thì phải dùng Fisher’s Exact Test.

Phân tích theo các dạng bảng 1 chiều hoặc bảng chéo, kết hợp biểu diến

phân nhóm định tính và chỉ số định lƣợng.

- Khống chế sai số

+ Chọn mẫu ngẫu nhiên, cỡ mẫu đủ lớn để hạn chế sai số ngẫu nhiên.

+ Các định nghĩa, tiêu chuẩn rõ ràng để phân loại đúng tình trạng của

đối tƣợng đƣợc nghiên cứu.

+ Kỹ thuật cân đo chính xác, các dụng cụ, máy móc dùng trong nghiên

cứu đều đã đƣợc chuẩn hóa và có độ chính xác cao. Xét nghiệm đƣợc tiến

hành tại khoa Hóa Sinh, khoa Huyết Học, Bệnh viện Quân y 17 Quân khu 5;

Khoa giải phẫu bệnh Bệnh viện Quân y 103; Khoa sinh học phân tử Bệnh

viện Trung ƣơng Quân đội 108; Phân viện Hóa – Môi trƣờng, Trung tâm

nhiệt đới Việt Nga; Khoa Hình thái Viện 69 Bộ tƣ lệnh Lăng chủ tịch Hồ Chí

Minh, là nơi có đầy đủ các trang thiết bị hiện đại.

+ Thống nhất về cách hỏi, ghi chép, đo các chỉ số nhân trắc.

+ Giám sát chặt chẽ toàn bộ quá trình nghiên cứu.

2.2.5 Đạo đức trong nghiên cứu

Đề tài đƣợc tiến hành sau khi:

Luận án thuộc đề tài nghiên cứu KHCN-33.13 /11-15 đã đƣợc thông

qua Hội đồng đạo đức của Học viện Quân y. Các nội dung nghiên cứu đều

nhằm mục đích chăm sóc sức khỏe thể chất, tinh thần, điều trị giải độc nâng

cao sức khỏe, chất lƣợng sống cho ngƣời phơi nhiễm chất da cam/dioxin cũng

nhƣ thế hệ con cháu họ.

- Chúng tôi chỉ tiến hành nghiên cứu trên bệnh nhân có chỉ định sinh

thiết gan để chẩn đoán, quyết định điều trị và theo dõi diễn biến bệnh.

- Bệnh nhân hoàn toàn không phải chi trả cho toàn bộ xét nghiệm phục

vụ nghiên cứu.

- Đƣợc sự đồng ý của các đối tƣợng nghiên cứu, thông tin đƣợc giữ bí

mật. Các đối tƣợng tham gia nghiên cứu đƣợc giải thích rõ ràng về mục đích

và nội dung triển khai nghiên cứu, chỉ đƣa vào nghiên cứu những đối tƣợng tự

nguyện tham gia suốt quá trình nghiên cứu, nếu từ chối hoặc bỏ cuộc thì loại

khỏi nghiên cứu.

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Trong thời gian nghiên cứu tại Bệnh viện 17 quân khu 5 Đà Nẵng từ

tháng 08 năm 2014 đến tháng 01 năm 2015, chúng tôi thu thập đƣợc 40 bệnh

nhân thỏa mãn tiêu chuẩn chọn bệnh. Tuy nhiên, có 7 bệnh nhân từ chối sinh

thiết gan, do vậy chúng tôi có 33 trƣờng hợp đƣa vào nhóm nghiên cứu.

Thời gian từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2018 chúng tôi thu thập đƣợc

50 bệnh nhân nhiễm dioxin tại Bệnh viện Quân y 103, và 90 trƣờng hợp khỏe

mạnh không sống ở vùng ô nhiễm dioxin làm xét nghiệm tính đa hình gen

Cyp2C19, MDR1. 33 trƣờng hợp có viêm gan mạn tính do HBV tại Bệnh viện

Quân y 103 sinh thiết gan làm mô bệnh học và siêu cấu trúc gan.

3.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU

3.1.1. Tuổi và giới

Bảng 3.1. Phân bố bệnh nhân theo các nhóm tuổi và giới

Giới Nam Nữ Tổng

Nhóm tuổi n (%) n (%) n (%)

≤ 40 tuổi 7 (21,2) 3 (9,1) 10 (30,3)

41-60 tuổi 8 (24,2) 8 (24,2) 16(48,5)

>60 tuổi 3 (9,1) 4 (12,1) 7(21,2)

Tổng 18 (54,5) 15(45,5) 33(100)

46,3 ± 12,1 Trung bình

25 - 19 Lớn nhất – nhỏ nhất

Nhóm tuổi từ 41-60 nhiều nhất chiếm 48,5%, nhóm tuổi nhỏ hơn 40

chiếm tỷ lệ 30,3%. Tuổi trung bình trong nhóm nghiên cứu là 46,3 ± 12,1.

Nhỏ nhất là 25, lớn nhất là 69.

Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ nam, nữ

Nam chiếm tỷ lệ 54,5%, nữ chiếm tỷ lệ 45,5%. Tỷ lệ nam/nữ là 1,2.

3.1.2. Đặc điểm lâm sàng

Bảng 3.2. Đặc điểm lâm sàng (n=33)

Triệu chứng Có Không

n (%) n (%)

Mệt mỏi 27 (81,8) 6 (18,2)

Đau tức nặng hạ sƣờn phải 22 (66,7) 11 (33,3)

Đầy bụng, khó tiêu 16 (48,5) 17 (51,5)

Rối loạn giấc ngủ 28 (84,5) 5 (15,2)

Chán ăn 28 (84,8) 5 (15,2)

Vàng da 1 (3,0) 32 (97,0)

Xuất huyết tiêu hóa 0 (0,0) 33 (100)

Xuất huyết dƣới da, niêm mạc 0 (0,0) 33 (100)

Gan to 0 (0,0) 33 (100)

Lách to 0 (0,0) 33 (100)

Sao mạch, bàn tay son 0 (0,0) 33 (100)

Trên nhóm bệnh nhân nghiên cứu chủ yếu gặp các triệu chứng cơ năng

thƣờng gặp ở bệnh nhân có bệnh gan mạn là mệt mỏi (81,8%), chán ăn

(84,8%). Rối loạn giấc ngủ (84,5%). Đầy bụng, khó tiêu (48,5%), và đau hạ

sƣờn phải (66,7%) có tần suất thấp hơn. Các triệu chứng khám thực thể chỉ có

1 trƣờng hợp (3,0%) có vàng da nhẹ.

3.1.3. Một số xét nghiệm cận lâm sàng

Bảng 3.3. Một số xét nghiệm sinh hóa gan mật (n=33)

Các xét nghiệm Giá trị nhỏ nhất Giá trị lớn nhất Trung bình

AST 34 97 50,5±12,1

ALT 41 72 55±9,3

GGT 40 223 62±31,3

Bilirubin TP 14 28 19,9±3,8

Nồng độ trung bình AST là: 50,5±12,1 U/l, nồng độ ALT trung bình là:

55±9,3 U/l, nồng độ trung bình GGT là 62±31,3 U/l, nồng độ trung bình

Bilirubin là 19,9±3,8 µmol/l.

Bảng 3.4. Một số đặc điểm trên siêu âm 2D (n=33)

Có Không

Đặc điểm siêu âm

n (%) n (%)

29 (87,9) 4 (12,1) Gan bình thƣờng

4 (12,1) 29 (87,9) Nhu mô gan thô

0 (0,0) 33 (100) Bờ gan không đều

0 (0,0) 33 (100) Kích thƣớc gan to

0 (0,0) 33 (100) Lách to

0 (0,0) 33 (100) Dịch ổ bụng

Trên siêu âm 2D trên nhóm nghiên cứu chỉ có thấy 4 trƣờng hợp (12,1%)

có nhu mô gan thô.

3.1.4. Thời gian sống tại vùng ô nhiễm dioxin.

Bảng 3.5. Thời gian sống tại vùng ô nhiễm dioxin (n=33)

Số năm

Thời gian p

Nhóm nghiên cứu (n=33) Nhóm 1 (n=50)

Trung bình (Min-max) 26 ± 10,6 (8-46) 25,5 ± 9,6 (7-45)

>0,05 Trung vị (25%-75%) 28 (17-36) 27 (16-35)

Trên nhóm nghiên cứu thời gian sống tại vùng ô nhiễm dioxin trung

bình 26±10,6 năm, ngƣời có thời gian sống lâu nhất tại vùng ô nhiễm là 46

năm, ngƣời có thời gian ngắn nhất 8 năm. Trung vị (25%-75%) thời gian sống

tại vùng ô nhiễm dioxin là 28 (17-36).

Trên nhóm 1 thời gian sống tại vùng ô nhiễm Dioxin trung bình 25,5 ±

9,6 năm, ngƣời có thời gian sống lâu nhất tại vùng ô nhiễm là 45 năm, ngƣời

có thời gian ngắn nhất 7 năm. Trung vị (25%-75%) thời gian sống tại vùng ô

nhiễm dioxin là 27 (16-35). Sự khác biệt giữa 2 nhóm không có ý nghĩa thống

kê với p>0,05.

Biểu đồ 3.2. Khoảng thời gian sống tại vùng ô nhiễm dioxin

Trên nhóm nghiên cứu số ngƣời có thời gian sống từ 16-30 năm là

nhiều nhất chiếm tỷ lệ 48,5%. Số ngƣời sống tại vùng ô nhiễm dioxin ≤ 15

năm có tỷ lệ 18,2%, số ngƣời sống tại vùng ô nhiễm dioxin > 30 năm là

33,3%.

Trên nhóm so sánh số ngƣời có thời gian sống từ 16-30 năm là nhiều

nhất chiếm tỷ lệ 46%. Số ngƣời sống tại vùng ô nhiễm Dioxin ≤ 15 năm có tỷ

lệ 20%, số ngƣời sống tại vùng ô nhiễm Dioxin > 30 năm là 34 %.

3.2 NỒNG ĐỘ DIOXIN TRONG MÁU.

Bảng 3.6. Nồng độ dioxin trong máu

Giá trị trung Giá trị Giá trị bình Nội dung thấp cao nhất Trung vị nhất (25%-75%)

74,5±135,4 Nhóm

nghiên cứu 11,4 760,5 39.1 (22.4 – Hàm lƣợng PCDD/F 60.3) (n=33) (đƣợc tính ra TEQ 166,9±214,8 pg/g lipid) Nhóm 1 26,0 1050,3 87,1 (52,72- (n=50) 148,1)

Nhóm 50,7 ± 131,9 nghiên cứu 3,3 722 12,1 (5,8-34,3) (n=33) Hàm lƣợng TCDD

(pg/g lipid) 133,4 ± 192,9 Nhóm 1 5,4 858,3 51,9 (33.8- (n=50) 125)

Trên nhóm nghiên cứu ngƣời có nồng độ TCDD trong máu thấp nhất là

3,3 pg/g lipid, ngƣời có nồng độ cao nhất là 722 pg/g lipid, giá trị trung bình

là 50,7 ± 131,9 pg/g lipid. Nồng độ PCDD/F tính ra TEQ ngƣời thấp nhất là

11,4 pg/g lipid, cao nhất là 760,5 pg/g lipid, giá trị trung bình là 74,5±135,4

pg/g lipid.

Trên nhóm 1 ngƣời có nồng độ dioxin trong máu thấp nhất là 5,4 pg/g

lipid, ngƣời có nồng độ cao nhất là 858,3 pg/g lipid, giá trị trung bình là 133,4

± 192,9 pg/g lipid. Nồng độ PCDD/F tính ra TEQ ngƣời thấp nhất là 26 pg/g

lipid, cao nhất là 1050,3 pg/g lipid, giá trị trung bình là 166,9 ± 214,8 pg/g

lipid.

3.3. KẾT QUẢ MÔ BỆNH HỌC VÀ SIÊU CẤU TRÚC

3.3.1. Sinh thiết gan

Bảng 3.7. Số khoảng cửa

n Nhỏ nhất Lớn nhất Giá trị trung bình

Số khoảng cửa 33 6 10 7,4±1,2

Tất cả bệnh nhân trong nghiên cứu đều có số khoảng cửa từ 6 trở lên. Số

khoảng cửa TB: 7,4 ± 1,2, ít nhất: 6, nhiều nhất: 10.

Tất cả 33 bệnh nhân thực hiện sinh thiết gan dƣới hƣớng dẫn của siêu âm

chúng tôi chỉ sinh thiết 1 lần là lấy đƣợc mảnh sinh thiết.

Bảng 3.8. Các biến chứng sinh thiết gan (n=33)

Biến chứng Tỷ lệ (%) n

Đau 25 75,8

Xuất huyết trong ổ bụng 0 0,0

Viêm phúc mạc mật 0 0,0

Tổn thƣơng các cơ quan khác 0 0,0

Tử vong 0 0,0

Đau là biến chứng duy nhất gặp trên nhóm nghiên cứu chiếm tỷ lệ

75,8%.

3.3.2. Kết quả mô bệnh học gan

3.3.2.1. Tổn thương mô bệnh học trên nhóm nghiên cứu

Bảng 3.9. Tổn thƣơng mô bệnh học trên nhóm nghiên cứu (n=33)

Có Không Tổn thƣơng mô bệnh học n (%) n (%)

Thoái hóa hạt 32 (97,0) 1 (3,0)

Thoái hóa rỗ 33 (100) 0 (0,0)

Thoái hóa mỡ 32 (97,0) 1 (3,0)

U hạt mỡ 0 (0,0) 33 (100)

Lympho bào và bạch cầu đa nhân bao quanh 33 (100) 0 (0,0) tế bào gan

Thể Mallory 0 (0,0) 33 (100)

Nhiễm sắc tố 0 (0,0) 33 (100)

Mitochondria khổng lồ 0 (0,0) 33 (100)

Biến đổi ƣa toan tế bào gan 4 (12,1) 29 (87,9)

Nghẽn tĩnh mạch 0 (0,0) 33 (100)

Tổn thƣơng mạn tính gan gặp trên hầu hết các mẫu sinh thiết, bao gồm

thoái hóa tế bào gan: thoái hóa mỡ 32/33 trƣờng hợp (97%), thoái hóa hạt

32/33 trƣờng hợp (97%), thoái hóa rỗ 33/33 trƣờng hợp (100%). Tất cả các

đối tƣợng đều có thâm nhiễm tế bào viêm, có lympho bào và bạch cầu đa

nhân bao quanh tế bào gan. Có 4 trƣờng hợp chiếm tỷ lệ 12,1% có biến đổi ƣa

toan tế bào gan. Các tổn thƣơng mạn tính khác của bệnh gan mạn tính nhƣ thể

Mallory, nhiễm sắc tố, u hạt mỡ, Mitochondria khổng lồ, nghẽn tĩnh mạch

cũng đƣợc đánh giá . Tuy nhiên, các tổn thƣơng đó không bắt gặp trên tất cả

các đối tƣợng nghiên cứu.

Biểu đồ 3.3. Hoạt độ viêm theo Metavir trên nhóm nghiên cứu (n=33)

Hoạt độ viêm theo Metavir chủ yếu ở mức độ A1 với 18/33 trƣờng hợp

chiếm 54,5% và A2 với 12/33 trƣờng hợp chiếm 26,4%.

Bảng 3.10. Mức độ xơ hóa gan theo Metavir trên nhóm nghiên cứu (n=33)

Mức độ xơ hóa gan theo Metavir Số lƣợng Tỷ lệ (%)

F0 9 27,3

F1 14 42,4

F2 10 30,3

F3 0 0,0

F4 0 0,0

33 100 Tổng

Trên nhóm đối tƣợng nghiên cứu tổn thƣơng xơ hóa gan theo hệ thống

điểm Metavir có tỷ lệ lớn nhất là mức độ F1: 14/ 33 trƣờng hợp (42,4%),

nhóm tổn thƣơng xơ hóa gan F0: 9/33 trƣờng hợp (27,3%) và nhóm tổn

thƣơng xơ hóa gan F2 là 10/33 trƣờng (30,3%). Không phát hiện tổn thƣơng

xơ hóa gan mức độ F3 và F4.

3.3.2.2. Tổn thương mô bệnh học trên nhóm 2

Bảng 3.11. Hoại tử kiểu mối gặm và hoại tử kiểu cầu nối trên nhóm 2

(n=33)

Số Tỷ lệ Nội dung lƣợng (%)

Không có 0 0,0

Hoại tử kiểu mối gặm nhẹ 2 6,1

Hoại tử kiểu mối gặm vừa (<50% rìa hầu hết các 8 24,2 khoảng cửa)

Hoại tử kiểu mối gặm nặng (50% rìa hầu hết các 8 24,2 khoảng cửa)

Hoại tử kiểu mối gặm vừa + Hoại tử kiểu cầu nối 5 15,2

Hoại tử kiểu mối gặm nặng + Hoại tử kiểu cầu nối 8 24,2

Hoại tử đa tiểu phân thùy 2 6,1

33 100 Tổng

Trên nhóm 2 đều có tổn thƣơng mô bệnh học hoại tử tế bào gan trong

đấy có 2/33 (6,1%) trƣờng hợp hoại tử kiểu mối gặm nhẹ; 8/33 (24,2%)

trƣờng hợp hoại tử kiểu mối gặm vừa; 8/33 (24,2%) trƣờng hợp hoại tử kiểu

mối gặm vừa + hoại tử kiểu cầu nối; 5/33 (15,2%) trƣờng hợp hoại tử kiểu

mối gặm nặng + hoại tử kiểu cầu nối; 2/15 (6,1) trƣờng hợp hoại tử đa tiểu

thùy.

Bảng 3.12. Thoái hóa trong tiểu thùy và hoại tử ổ trên nhóm 2 (n=33)

Nội dung Số lƣợng Tỷ lệ (%)

Không có 0 0,0

Nhẹ (có các thể ƣa acid, thoái hóa hình cầu và hoại 0 0,0 tử ổ rải rác ở <1/3 các tiểu thùy hoặc các nốt)

Vừa (có các thể ƣa acid, thoái hóa hình cầu và hoại 9 27,3 tử ổ rải rác ở 1/3 -2/3 các tiểu thùy hoặc các nốt

Nặng (có các thể ƣa acid, thoái hóa hình cầu và 24 72,7 hoại tử ổ rải rác ở >2/3 các tiểu thùy hoặc các nốt

33 100 Tổng

Trên nhóm 2 tổn thƣơng mô bệnh học thoái hóa trong tiểu thùy và hoại

tử ổ có 9/33 (27,3%) trƣờng hợp ở mức độ vừa và 24/33 (72,7%) trƣờng hợp

ở mức độ nặng.

Bảng 3.13. Viêm khoảng cửa trên nhóm 2 (n=33)

Viêm khoảng cửa Số lƣợng Tỷ lệ (%)

Không có 0 0,0

Nhẹ (có các tế bào viêm ở <1/3 các khoảng cửa) 0 0,0

Vừa (có các tế bào viêm ở 1/3-2/3 các tiểu thùy và 14 42,4 các nốt)

Nặng (có sự tập trung dầy đặc tế bào viêm ở 2/3 19 57,6 khoảng cửa)

33 100 Tổng

Trên nhóm 2 tổn thƣơng viêm khoảng cửa chủ yếu ở mức độ vừa với 14/33

(42,4%) trƣờng hợp; có 19/33 (57,6%) trƣờng hợp viêm khoảng cửa mức độ nặng.

Bảng 3.14. Chỉ số mức độ hoạt tính trên mô học (HAI) trên nhóm 2

(n=33)

Chỉ số mức độ hoạt tính (HAI) Số lƣợng Tỷ lệ (%)

0 Viêm gan mạn rất nhẹ 0,0

2 Viêm gan mạn nhẹ 6,1

19 Viêm gan mạn vừa 57,6

12 Viêm gan mạn nặng 36,4

33 100 Tổng

Trên nhóm 2 chỉ số mức độ hoạt tính trên mô học (HAI) nhóm viêm

gan mạn nhẹ có 2/33 (6,1%) trƣờng hợp; viêm gan mạn tính vừa có 19/33

(57,6%) trƣờng hợp; viêm gan mạn tính nặng có 12/33 (36,4%) trƣờng hợp.

Bảng 3.15. Giai đoạn xơ hóa trên nhóm 2 (n=33)

Giai đoạn xơ hóa Số lƣợng Tỷ lệ (%)

36,3 12 Không có

33,3 11 Xơ hóa khoảng cửa lan tỏa

Xơ hóa khoảng cửa cầu nối (xơ từ khoảng cửa tới

khoảng cửa hoặc xơ từ khoảng cửa tới trung tâm 5 15,2

tiểu thùy)

15,2 5 Xơ gan rõ

100 33 Tổng

Trên nhóm 2 có 12/33 (36,3%) trƣờng hợp không có xơ hóa gan, 11/33

(33,3%) trƣờng hợp có xơ hóa khoảng cửa lan tỏa, 5/33 (15,2%) trƣờng hợp xơ

hóa khoảng cửa cầu nối, và 5/33 (15,2%) trƣờng hợp xơ gan rõ.

3.3.3.Hình ảnh siêu cấu trúc gan

3.3.3.1. Hình ảnh siêu cấu trúc gan tổ chức gan

Bảng 3.16. Hình ảnh siêu cấu trúc tổ chức gan

Nhóm nghiên cứu (n=33) Nhóm 2 (n=33)

Nội dung Có Không Có Không

n (%) n (%) n (%) n (%)

Thâm nhiễm tế 33 (100) 0 (0,0) 33 (100) 0 (0,0) bào viêm

Khoảng gian bào, 0 (0,0) 33 (100) 0 (0,0) 33 (100) vi quản mật giãn

Trên cả nhóm nghiên cứu và nhóm 2 tất cả các trƣờng hợp đều có thâm

nhiễm tế bào viêm, không phát hiện trƣờng hợp có khoảng gian bào, vi quản

mật bị giãn.

Hình 3.1. Hình ảnh vi quản mật với các vi nhung mao. TEM, x5000

(Bệnh nhân Phạm Ngọc L 32 tuổi – Nhóm nghiên cứu)

Bảng 3. 17. Xơ hóa tổ chức gan

Nhóm nghiên Nhóm 2 cứu Nội dung p Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ

lƣợng (%) lƣợng (%)

Không có xơ hóa gan 2 6,1 1 3,0 0,55*

Xơ hóa quanh xoang (Có hoặc 17 51,5 14 42,4 0,46** không kèm xơ hóa quanh tế bào

Xơ hóa khoảng cửa, rất ít các dải xơ 14 42,4 24,2 0,12* 8

Xơ hóa với nhiều cầu nối hay xơ 0 0,0 4 12,1 0,04* hóa bắc cầu

Xơ gan thực sự 0 0,0 6 18,2 0,01*

33 100 33 100 Tổng

*Fisher test ** Chi-squared test

Về xơ hóa gan trên nhóm nghiên cứu: xơ hóa quanh xoang chiếm tỷ lệ

lớn nhất 51,5% (17/33 trƣờng hợp); xơ hóa khoảng cửa, rất ít các dải xơ có tỷ

lệ 42,4% (14/33 trƣờng hợp); chỉ có 2/33 ( 6,1%) trƣờng hợp là không có xơ

hóa. Không có trƣờng hợp nào xơ hóa với nhiều cầu nối hay xơ gan thực sự.

Trên nhóm 2: Xơ hóa quanh xoang có số lƣợng 42,4%; xơ hóa khoảng

cửa, rất ít các dải xơ có 24,2%; có 3,0%) không có xơ hóa gan; có 12,1% bị

xơ hóa với nhiều cầu nối và 18,2% bị xơ gan thực sự.

Không có sự khác biệt xơ hóa tổ chức gan ở các mức độ không có xơ

hóa gan; xơ hóa quanh xoang và xơ hóa khoảng cửa trên nhóm nghiên cứu và

trên nhóm 2 với p>0,05. Tỷ lệ ớ mức xơ hóa với nhiều cầu nối và xơ gan thật

sự trên nhóm nghiên cứu thấp hơn trên nhóm 2 có ý nghĩa thống kê với p

<0,05.

Bảng 3.18. Tổn thƣơng siêu cấu trúc tế bào gan

Nhóm nghiên cứu (n=33) Nhóm 2 (n=33) Nội dung P* Có Không Có Không

n (%) n (%) n (%) n (%)

Màng tế bào bị tổn thƣơng <0,001 0 (0,0) 33 (100) 18 (54,5) 15 (45,5)

Màng nhân bị tổn thƣơng <0,001 0 (0,0) 33 (100) 21 (63,6) 12 (36,4)

Nhân bị tổn thƣơng <0,001 0 (0,0) 33 (100) 22 (66,7) 11 (33,3)

Lƣới nội bào hạt giãn rộng <0,001 33 (100) 0 (0,0) 0 (0,0) 33 (100)

Giãn rộng >0,05 33 (100) 0 (0,0) 26 (93,3) 7 (6,7)

Lƣới nội bào không hạt <0,001 Tạo thể đa màng xoắn 33 (100) 0 (0,0) 0 (0,0) 33 (100)

*Fisher test

Trên nhóm nghiên cứu tổn thƣơng siêu cấu trúc tế bào gan gặp ở lƣới

nội bào hạt giãn rộng 33/33 trƣờng hợp chiếm 100%, không bắt gặp các tổn

thƣơng ở màng tế bào, màng nhân, và nhân.

Khác với nhóm nghiên cứu tổn thƣơng ở nhóm 2 bắt gặp ở màng tế bào

bị tổn thƣơng 18/33 (54,5%) trƣờng hợp; màng nhân bị tổn thƣơng 21/33

(63,6%) trƣờng hợp; nhân bị tổn thƣơng 22/33 (66,7%) trƣờng hợp; không bắt

gặp hình ảnh lƣới nội bào hạt giãn rộng và lƣới nội bào không hạt tạo thể đa

màng xoắn; có 26/33 (93,3%) trƣờng hợp có hình ảnh lƣới nội bào không hạt

giãn rộng. Sự khác biệt về tổn thƣơng màng tế bào, màng nhân, nhân, lƣới nội

bào hạt giãn rộng và lƣới nội bào không hạt tạo thể đa màng xoắn trên nhóm

nghiên cứu với nhóm so sánh 2 là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

Hình 3.2. Hình ảnh siêu cấu trúc của gan. Xâm nhập của các sợi, bó sợi

collagen vào khoảng gian bào của tế bào nhu mô gan. TEM. x5000

Hình 3.3. Hình ảnh sợi, bó sợi collagen thâm nhâp vào khoảng gian bào

của tế bào nhu mô gan. SEM, x3500.

(Bệnh nhân Võ Văn T 33 tuổi – Nhóm nghiên cứu)

Bảng 3.19. Tổn thƣơng mitochondria

Nội dung P*

Nhóm 2 (N=33) n (%)

Nhóm nghiên cứu (N=33) n (%) 1 (3,0) 33(100)

<0,001* Vị trí mitochondria 32 (97,0) 0 (0,0)

26 (78,8) 28 (84,8) 0,52** Cấu trúc màng mitochondria 7 (21,2) 5 (15,2)

0 (0,0) 33 (100)

<0,001* Phân bố đều Tập trung sát màng tế bào Bình thƣờng (màng kép, rõ nét) Đứt gãy Cấu trúc bình thƣờng Thƣa thớt 33 (100) 0 (0,0) Mào mitochondria

0 (0,0) 0 (0,0)

0 (0,0) 29 (87,9)

1 (3,0) 4 (12,1) <0,001*

Mật độ bào quan tăng đậm độ điện tử

32 (97,0) 0 (0,0)

Không thấy 1/3 số mitochondria trong tế bào 2/3 số mitochondria trong tế bào Toàn bộ mitochondria trong tế bào Có 33 (100) 0 (0,0) <0,001* Không 0 33 (100) Hạt đậm độ điện tử cao trong bào quan

Có 31 (93,9) 0 (0,0) Đƣờng tinh thể <0,001* Không 2 (6,1) 33 100)

0 (0,0) 32 (97,0)

<0,001* Hình dạng mitochondria 33 (100) 1 (3,0)

Bình thƣờng Biến dạng (Hình chùy, có chồi) Đồng đều 0 (0,0) 32 (97,0)

Không đồng đều 33 (100) Kích thƣớc <0,001*

Khổng lồ 0 (0,0)

0,001* Mitochondria thể kính 10 (30,3) 23 (69,7) 1 (3,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 33 (100)

Có Không *Fisher test, **Chi-squared test

Trên nhóm nghiên cứu 100% bệnh nhân đều có ghi nhận sự tổn thƣơng

mitochondria, các tổn thƣơng này tƣơng đối đồng nhất ở các mẫu bao gồm:

Mào mitochondria thƣa thớt, có các hạt đậm độ điện tử cao trong bào quan,

kích thƣớc mitochondria không đồng đều, hình dạng mitochondria biến dạng

gặp ở 33/33 trƣờng hợp (100%); Vị trí mitochondria tập trung sát màng tế bào

32/33 trƣờng hợp (97,0%); Mật độ điện tử tăng đậm độ điện tử toàn bộ

mitochondria trong tế bào 32/33 trƣờng hợp (97,0%); Đƣờng tinh thể có ở

31/33 trƣờng hợp (93,9%); Mitochoindria thể kích có 10/33 trƣờng hợp

(30,3%); Màng mitochondria đứt gãy có 7/33 trƣờng hợp (21,2%).

Trên nhóm 2 tổn thƣơng mitochondria ít gặp có 5/33 (15,2%) trƣờng

hợp có cấu trúc màng mitochondria bị đứt gãy; mật độ bào quan tăng đậm độ

điện tử ở 2/3 số mitochondria trong tế bào có 4/33 (12,1%) trƣờng hợp; kích

thƣớc không đồng đều 1/33 (3%) trƣờng hợp; không bắt gặp mitochondria thể

kích, không có đƣờng tinh thể và hình dạng vị trí mitochondria bình thƣờng.

Sự khác biệt về tổn thƣơng mitochondria trên nhóm nghiên cứu và

nhóm 2 ở vị trí, mào, mật độ bào quan tăng đậm độ điện tử, hạt đậm độ điện

tử cao trong bào quan, đƣờng tinh thể, hình dạng, kích thƣớc và mitochondria

thể kích là có ý nghĩa thống kê với p<0,05.

3.4. TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ MDR1

3.4.1 Tính đa hình gen Cyp2C19

Bảng 3.20. Phân bố kiểu hình gen Cyp2C19

Kiểu hình

Nhóm

Nhóm 1

Nhóm 3

chuyển hóa

nghiên cứu

n (%)

Nhóm nghiên cứu- Nhóm 3 P*

Nhóm nghiên cứu- Nhóm 1 P*

Chuyển hóa

8 (24,2)

24 (48)

39 (43,3)

nhanh

Chuyển hóa

24 (72,7)

24 (48)

46 (51,1)

0,025

0,04

trung bình

Chuyển hóa

1 (3,1)

2 (4,0)

5 (5,6)

>0,05

chậm

*Pearson’s Chi-squared test

Trong nhóm nghiên cứu kiểu hình chuyển hóa vừa chiếm đa số với

24/33 trƣờng hợp chiếm 72,4%, kiểu hình chuyển hóa nhanh có 8/33 trƣờng

hợp chiếm 24,2%, kiểu hình chuyển hóa chậm có 1/33 trƣờng hợp chiếm

3,1%.

Trong nhóm 1 kiểu hình chuyển hóa nhanh có 24/50 trƣờng hợp chiếm

48,0%, kiểu hình chuyển hóa trung bình có 24/50 trƣờng hợp chiếm 48,0%,

kiểu hình chuyển hóa chậm có 2/33 trƣờng hợp chiếm 4,0%.

Trong nhóm 3 kiểu hình chuyển hóa nhanh chiếm 43,3% với 39/90

trƣờng hợp, kiểu hình chuyển hóa trung bình có 46/90 trƣờng hợp chiếm

51,1%, kiểu hình chuyển hóa chậm có 5/90 trƣờng hợp chiếm 5,6%.

Có sự khác biệt về tỷ lệ kiểu hình chuyển hóa trung bình giữa nhóm

nghiên cứu với nhóm 1 và nhóm 3 với p < 0,05.

Bảng 3.21. Phân bố alleles Cyp2C19 trên nhóm nghiên cứu

Nhóm 1 Nhóm 3 Nhóm nghiên cứu Alleles P**

Số lƣợng Số lƣợng Số lƣợng Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%)

Cyp2C19*1 40 60,6 72 72,0 124 68,9

Cyp2C19*2 22 33,3 22 22,0 45 25,0 0,580

Cyp2C19*3 4 6,1 6 6,0 11 6,1

Tổng 66 100 100 100 180 100

** Chi-squared test

Trên nhóm nghiên cứu phân bố alleles Cyp2C19*1 nhiều nhất chiếm tỷ

lệ 60,6%, alleles Cyp2C19*2 có tỷ lệ 33,3%, có một tỷ lệ nhỏ 6,1% là alleles

Cyp2C19*3.

Trên nhóm1 phân bố alleles Cyp2C19*1 nhiều nhất chiếm tỷ lệ 72,0 %,

alleles Cyp2C19*2 có tỷ lệ 22,0 %, có một tỷ lệ nhỏ 6,0 % là alleles

Cyp2C19*3.

Trên nhóm 3 phân bố alleles Cyp2C19*1 nhiều nhất chiếm tỷ lệ 68,9

%, alleles Cyp2C19*2 có tỷ lệ 25,0 %, có một tỷ lệ nhỏ 6,1% là alleles

Cyp2C19*3.

Sự khác biệt giữa các nhóm không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

3.4.2 Tính đa hình gen MDR1

Bảng 3.22. Phân bố alleles MDR1 C3435T

Nhóm nghiên cứu Nhóm 1 Nhóm 3 Allele P** Số lƣợng Tỷ lệ Số lƣợng Tỷ lệ Số lƣợng Tỷ lệ

C 42 63,6 66 66,0 113 62,8 0,864 T 24 36,4 34 34,0 67 37,2

Tổng 66 100 100 100 180 100

** Chi-squared test

Trên nhóm nghiên cứu allele C của gen MDR1 C3435T có 42/66

trƣờng hợp chiếm 63,6%, allele T có 24/66 trƣờng hợp chiếm 36,4%.

Trên nhóm 1 allele C của gen MDR1 C3435T có 66/100 trƣờng hợp

chiếm 66,0%, allele T có 34/100 trƣờng hợp chiếm 34,0%.

Trên nhóm 3 allele C của gen MDR1 C3435T có 113/180 trƣờng hợp

chiếm 62,8%, allele T có 67/180 trƣờng hợp chiếm 37,2%.

Sự khác biệt giữa các nhóm không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

Bảng 3.23. Phân bố kiểu gen MDR1 C3435T

Nhóm nghiên cứu Nhóm 1 Nhóm 3 Kiểu gen P** Số lƣợng Tỷ lệ Số lƣợng Tỷ lệ Số lƣợng Tỷ lệ

T/T 3 9,1 4 8,0 12 13,3

0,862 C/T 18 54,5 26 52,0 43 47,8

C/C 12 36,4 20 40,0 35 38,9

Tổng 33 100 50 100 90 100

** Chi-squared test

Trên nhóm nghiên cứu kiểu gen C/T có tỷ lệ cao nhất với 18/33 trƣờng

hợp chiếm 54,5%, tiếp đến là kiểu gen C/C có 12/33 trƣờng hợp chiếm

36,4%, kiểu gen T/T có tỷ lệ ít nhất chiếm 9,1% với 3/33 trƣờng hợp.

Trên nhóm 1 kiểu gen C/T có tỷ lệ cao nhất với 26/50 trƣờng hợp

chiếm 52,0%, tiếp đến là kiểu gen C/C có 20/50 trƣờng hợp chiếm 36,4%,

kiểu gen T/T có tỷ lệ ít nhất chiếm 8% với 4/50 trƣờng hợp.

Trên nhóm 3 kiểu gen C/T có tỷ lệ cao nhất với 43/90 trƣờng hợp

chiếm 47,8%, tiếp đến là kiểu gen C/C có 35/90 trƣờng hợp chiếm 38,9%,

kiểu gen T/T có tỷ lệ ít nhất chiếm 13,3% với 12/90 trƣờng hợp.

Sự khác biệt giữa các nhóm có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

3.5. MỐI LIÊN QUAN GIỮA TỔN THƢƠNG MÔ BỆNH HỌC, TÍNH

ĐA HÌNH GEN MDR1, CYP2C19, MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG

VÀ NỒNG ĐỘ DIOXIN

3.5.1. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa với một số đặc điểm lâm sàng,

nồng độ dioxin và tính đa hình gen Cyp2C19, MDR1.

3.5.1.1. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và một số đặc điểm lâm sàng.

Bảng 3.24. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và tuổi trên nhóm nghiên cứu

n Giá trị tuổi trung bình (năm) P*

9 47,4±14,1 F0

p>0,05 14 44,1±11,4 F1

10 48,2±11,8 F2

* Kruskal Wallis test.

Tuổi trung bình trên nhóm bệnh nhân có xơ hóa gan F0 là 47,4±14,1

năm, trên nhóm bệnh nhân có xơ hóa gan F1 là 44,1±11,4 năm, trên nhóm

bệnh nhân có xơ hóa gan F2 là 48,2±11,8 năm. Không có sự khác biệt về tuổi

trung bình giữa các nhóm xơ hóa gan.

Bảng 3.25. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa gan và giới

Nam Nữ Chung Mức độ xơ hóa n % n % n %

5 27,78 4 26,67 9 27,27 F0

8 44,44 6 40,0 14 42,43 F1

5 27,78 5 33,33 10 30,3 F2

18 100,0 15 100,0 33 100,0

Tổng P* p> 0,05

* Fisher test

Không có sự khác biệt về phân bố giới giữa các mức độ xơ hóa gan với

p> 0,05.

Bảng 3.26. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa gan và năm sống tại vùng

tồn lƣu dioxin

Mức độ xơ hóa Số lƣợng P* Giá trị trung bình (năm) Trung vị (p25-p75)

F0 9 16,3±7,6 13 (10-21)

F1 14 p<0,05 26,6±14 27,5 (18-34)

F2 10 33,9±7,9 36,5 (28-38)

* Kruskal Wallis test

Thời gian sống trung bình tại vùng tồn lƣu dioxin trên nhóm bệnh nhân

có mức độ xơ hóa gan F0 là 16,3±7,6 năm ít hơn trên nhóm có mức độ xơ hóa

gan F1 là 26,6±14 năm, ít hơn trên nhóm có mức độ xơ hóa gan F2 là

33,9±7,9 năm. Sự khác biệt về thời gian sống trung bình tại vùng tổn lƣu

dioxin trên các nhóm có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05.

3.5.1.2. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và nồng độ dioxin

Bảng 3.27. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và nồng độ dioxin

Mức độ xơ hóa Số lƣợng p*

TEQ trung bình Trung vị (25%-75%) (pg/g lipid)

F0 (1) 9 37,8 ± 26 31,2 (22,4-39,6)

F1 (2) 14 42,7 ± 37,1 32,5 (18,2-59,3) p 1-2 = 0,93 p 3-1= 0,062 p 2-3=0,048

F2 (3) 10 152,6 ± 230 59,55 (41,7-113.6)

* Man-Whiney test

TEQ trung bình trên nhóm bệnh nhân có mức độ xơ hóa gan F0 là 37,8

± 26 pg/g lipid thấp hơn nhóm có mức độ xơ hóa gan F1 là 42,7 ± 37,1 pg/g

lipid thấp hơn nhóm có mức độ xơ hóa gan F2 là 152,6 ± 230 pg/g lipid. Sự

khác biệt giữa nhóm Fo-F1 và F0-F2 không có ý nghĩa thống kê với p>0,05,

sự khác biệt giữa nhóm F1-F2 có ý nghĩa thống kê với p<0,05.

Bảng 3.28. Mối liên quan giữa nồng độ Dioxin và khoảng thời gian sống

tại vùng ô nhiễm

Khoảng thời gian sống tại vùng ô nhiễm n TEQ trung bình Trung vị (25%-75%) (pg/g lipid)

Nhóm nghiên cứu Nhóm 1

≤15 năm

6 26,1 ± 11,5 24,1 (18,2-31,2) 10 58,4 ± 106,6 49,5 (38,1-69,8)

16 – 30 năm

16 82,7 ± 182,4 33,1 (19,6-59,1) 23 168,7 ± 225,9 96,5 (75,6-156,8)

>30 năm

11 89,7 ± 83,4 60,3 (41,7-113,6) 17 172,6 ± 198,6 85,3 (61,7-123,6)

Tổng

33 74,5±135,4 39,1 (22,4-60,3) 50 166,9±214,8 87,1 (52,72-148,1)

P* >0.05 >0.05

* Kruskal Wallis test

Nhóm nghiên cứu nồng độ TEQ trung bình trên nhóm sống tại vùng ô

nhiễm dioxin dƣới 16 năm là 26,1 ± 11,5 pg/g lipid thấp hơn nhóm sống tại

vùng ô nhiễm dioxin từ 16-30 năm là 82,7 ± 182,4 pg/g lipid, thấp hơn nhóm

sống trên 30 năm là 89,7 ± 83,4 pg/g lipid tuy nhiên sự khác biệt giữa các

nhóm không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

Nhóm 1 nồng độ TEQ trung bình trên nhóm sống tại vùng ô nhiễm

dioxin dƣới 16 năm là 58,4 ± 106,6 pg/g lipid thấp hơn nhóm sống tại vùng ô

nhiễm dioxin từ 16-30 năm là 168,7 ± 225,9 pg/g lipid, thấp hơn nhóm sống

trên 30 năm là 166,9 ± 214,8 pg/g lipid tuy nhiên sự khác biệt giữa các nhóm

không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

3.5.1.3 Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và tính đa hình gen Cyp2C19,

MDR1

Bảng 3.29. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và kiểu hình gen Cyp2C19

Kiểu hình

P**

gen Cyp2C19

Tổng n (%)

Chuyển hóa nhanh n (%) Chuyển hóa chậm n (%)

Mức độ xơ hóa

Chuyển hóa trung bình n (%)

7 (29,2) 2 (25,0) 0 (0,0) 9 (27,3)

p>0,05 F1

8 (33,3) 5 (62,5) 1 (100) 14 (42,4)

9 (37,5%) 1 (12,5) 0 (0,0) 10 (30,3)

Tổng

8 (100) 1 (100) 33 (100)

24 (100) **Fisher test

Tỷ lệ mức độ xơ hóa theo Metavir trên 3 nhóm kiểu hình Cyp2C19

không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Tỷ lệ mức độ xơ hóa F2 trên nhóm

kiểu hình chuyển hóa trung bình là 37,5%, nhóm chuyển hóa nhanh là 12,5%.

Tỷ lệ mức độ xơ hóa F1 trên nhóm chuyển hóa trung bình là 33,3%, nhóm

chuyển hóa nhanh là 62,5%, nhóm chuyển hóa chậm có 1/1 trƣờng hợp. Mức

độ xơ hóa F0 trên nhóm chuyển hóa nhanh là 25%, chuyển hóa trung bình là

29,2%.

Bảng 3.30. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và kiểu gen MDR1 C3435T

Kiểu gen MDR1 C3435T

Mức đô xơ hóa P** T/T C/T C/C Tổng

n (%) n (%) n (%) n (%)

4 4 1 F0 (33,3) (22,2) (33,3) 9 (27,3)

8 5 1 F1 (33,3) (44,4) (41,7) 14 (42,4)

6 3 1 p>0,05 F2 (33,3) (33,3) (25,0) 10 (30,3)

3 18 12 Tổng (100) (100) (100) 33 (100)

**Fisher test

Kiểu gen T/T tỷ lệ trên cả 3 nhóm F1, F2, F3 là 33,3%. Với kiểu gen

C/T tỷ lệ mức độ xơ hóa F0, F1, F2 tƣơng ứng là 22,2%, 44,4% và 33,3%.

Kiểu gen C/C tỷ lệ mức độ xơ hóa F0, F1, F2 là 33,3%, 41,7% và 25,0%.

Sự khác biệt giữa các nhóm không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

3.5.2 Mối liên quan giữa tính đa hình gen Cyp2C19, MDR1 và nồng độ

dioxin

Bảng 3.31. Mối liên quan kiểu hình Cyp2C19 và nồng độ trung bình dioxin

TEQ trung bình

Trung vị (25%-75%) (pg/g lipid) Kiểu hình Cyp2C19 Nhóm nghiên cứu Nhóm 1

(n=33) (n=50)

48,3 ± 32,1 151,4 ± 197,6 Chuyển hóa nhanh 49,45 (16,5-69,4) 72,69 (39,25-134,49)

83,7 ± 157,7 181,1 ± 242,1 Chuyển hóa trung bình 34,3 (23,75-56,6) 88.78 (58,53-151,67)

182,0 ± 48,0 Chuyển hóa chậm 72,6 182,03 (148,1-215,98)

74,5 ± 135,4 166,9 ± 214,8 Tổng 39,1 (22,4-60,3) 87,13 (5,73-148,09)

p* p>0,05 p>0,05

* Kruskal Wallis test

Trên nhóm nghiên cứu TEQ trung bình trên nhóm có kiểu hình gen

Cyp2C19 chuyển hóa nhanh là 48,2 ± 32,1 pg/g lipid thấp hơn so với nhóm

chuyển hóa trung bình 83,7 ± 157,7 pg/g lipid. Nhóm chuyển hóa chậm có 1

trƣờng hợp có nồng độ là 72,6 pg/g lipid.

Trên nhóm 1 nồng độ TEQ trung bình trên nhóm có kiểu hình chuyển

hóa nhanh là 151,4 ± 197,6 pg/g lipid, chuyển hóa trung bình là 181,1 ± 242,1

pg/g lipid, chuyển hóa chậm là 166,9 ± 214,8 pg/g lipid

Sự khác biệt về nồng độ trung bình giữa các nhóm là không có ý nghĩa

thống kê với p >0,05.

Bảng 3.32. Mối liên quan giữa kiểu gen MDR1 C3435T và nồng độ dioxin

TEQ trung bình

Trung vị (25%-75%) (pg/g lipid) Kiểu gen Nhóm nghiên cứu Nhóm 1

(n=33) (n=50)

92,7 ± 211,1 124,0 ± 151,3 C/C 28,5 (20,6-47,7) 75,5 (39,6-134,7)

63,4 ± 69,0 216,0 ± 259,2 C/T 45,8 (31,1-63,4) 91,8 (61,6-234,1)

71,3 ± 69,4 61,8 ± 16,7 T/T 41,7 (21,7-150,6) 62,2 (47,8-75,8)

74,8 ± 135,4 166,9±214,8 Tổng 39,1 (22,4-60,3) 87,1 (52,7-148,1)

p* p>0,05 p>0,05

* Kruskal Wallis test

Trên nhóm nghiên cứu kiểu gen C/C có nồng độ trung bình dioxin cao

nhất 92,7 ± 211,1 pg/g lipid, tiếp đến là kiểu gen T/T là 63,4 ± 69 pg/g lipid,

thấp nhất là kiểu gen C/T là 71,3 ± 66,1pg/g lipid.

Trên nhóm 1 kiểu gen C/C có nồng độ trung bình dioxin là 124,0 ±

151,3 pg/g lipid, kiểu gen T/T là 61,8 ± 16,7 pg/g lipid, thấp nhất là kiểu gen

C/T là 216,0 ± 259,2 pg/g lipid.

Sự khác biệt giữa các nhóm là không có ý nghĩa thống kê.

CHƢƠNG 4

BÀN LUẬN

Dioxin gây tổn thƣơng trên nhiều cơ quan, tuy nhiên không có sự tổn

thƣơng giống nhau giữa các cá thể. Gan là một trong những cơ quan chịu sự

tác động của dioxin. Tiến trình phát triển từ xơ hóa gan và cuối cùng dẫn đến

xơ gan là đặc điểm phổ biến ở tất cả bệnh nhân bệnh gan mạn tính. Khi bệnh

nhân ở giai đoạn xơ gan mất bù thƣờng có thời gian sống còn ngắn, nên việc

chẩn đoán sớm xơ hóa gan và xơ gan là vô cùng quan trọng trong quá trình

điều trị và tiên lƣợng bệnh. Bên cạnh đó dioxin gây ra các tác động trên các

cơ quan thông qua thụ thể AhR. Tuy nhiên cơ chế gây tổn thƣơng còn nhiều

vấn đề chƣa sáng tỏ, vì vậy nghiên cứu tổn thƣơng gan dƣới hình ảnh siêu cấu

trúc và vai trò tính đa hình 2 gen Cyp2C19 và MDR1 sẽ góp một phần vào cơ

chế sinh bệnh của dioxin với gan nói riêng và các cơ quan bị tổn thƣơng khác

nói chung.

4.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG.

4.1.1. Tuổi và giới

Dù viêm gan mạn tính do bất cứ nguyên nhân gì, quá trình tích tụ cơ

chất gian bào gây xơ hóa gan rất chậm, ƣớc tính mất khoảng 20-30 năm để

tiến triển đến xơ gan. Viêm gan mạn tính có thể xảy ra ở bất kỳ lứa tuổi nào,

nhƣng thƣờng gặp ở lứa tuổi trung niên. Đa số các nghiên cứu đều cho thấy

viêm gan mạn tính thƣờng xảy ra ở độ tuổi 20-80, với tuổi trung bình trong

khoảng 40-50. Các nghiên cứu cũng cho thấy nguyên nhân gây bệnh lý nhu

mô gan mạn do rƣợu, HBV và HCV - thƣờng bắt đầu ở tuổi trƣởng thành và

gây bệnh lý nhu mô gan mạn tính 10-20 năm sau. Nghiên cứu của chúng tôi

đƣợc tiến hành trên nhóm bệnh nhân nhiễm dioxin có bệnh gan mạn tính về

tuổi có kết quả tuổi trung bình là 46,3 ± 12,1, tuổi nhỏ nhất là 25 lớn nhất là

69 kết quả chúng tôi cũng gần tƣơng tự với các nghiên cứu khác trong nƣớc

[74], [75], [76]và nƣớc ngoài [77], [78], [79].

Về nhóm tuổi số ngƣời trên 60 có tỷ lệ ít nhất chiếm 21,2%. Nhóm tuổi

dƣới 41 có tỷ lệ chiếm 30,3 % đây là những trƣờng hợp sinh sau năm 1975

hoàn toàn không tiếp xúc với dioxin do Mỹ sử dụng trong chiến tranh. Nhóm

tuổi từ 41-60 chiếm tỷ lệ 48,5%. Các nhóm tuổi không có sự chênh lệch

nhiều.

Về đặc điểm giới: Trong nghiên cứu của chúng tôi nam chiếm tỷ lệ

54,5%, nữ chiếm tỷ lệ 45,5%. Tỷ lệ nam/nữ là 1,2. Tuy kết quả của chúng tôi

nam có vẻ nhiều hơn nữ tuy nhiên kết quả của chúng tôi dƣờng nhƣ thấp hơn

với một số các nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nƣớc.Theo nghiên

cứu của Trần Bảo Nghi [75] là 1,49, của Ngô Thị Thanh Quýt và cs [74] là

1,5 , nghiên cứu của Trần Thị Khánh Tƣờng là 1,9 [76]. So với một số

nghiên cứu ngoài nƣớc trong nghiên cứu của Foucher J. và cs, tỉ lệ nam/nữ là

1,32. Trong nghiên cứu của Ziol M. và cs trên 251 bệnh nhân, và tỉ lệ nam/nữ

là 1,62 [80],[81].

Tỷ lệ giới tính tùy thuộc phần lớn vào tỷ lệ các nguyên nhân gây bệnh

gan mạn tính trong nhóm nghiên cứu. HBV, HCV, rƣợu là những nguyên

nhân gây bệnh gan mạn tính hay gặp nhất hiện nay. Đa số bệnh gan mạn tính

do rƣợu là nam giới và các nghiên cứu phân tích tổng hợp về bệnh gan mạn

do HBV [82], HCV [83] đều cho thấy nam giới chiếm tỷ lệ cao hơn nữ giới.

Trên nhóm nghiên cứu của chúng tôi nhóm nhiễm dioxin có bệnh gan mạn

tính cũng giống nhƣ các nguyên nhân khác tỷ lệ nam cao hơn nữ, tuy nhiên tỷ

lệ thấp hơn các nghiên cứu trên. Do vậy có thể thấy các nghiên cứu bệnh gan

mạn tính do nhiều nguyên nhân đều thấy có tỷ lệ nam cao hơn nữ.

Với những nghiên cứu trƣớc kia tại Việt Nam về đối tƣợng phơi nhiễm

dioxin tập trung chủ yếu là những trƣờng hợp là quân nhân, cựu chiến binh là

những ngƣời bị phơi nhiễm trực tiếp do Mỹ rải chất độc trong chiến tranh cho

nên đối tƣợng chủ yếu là nam giới. Những nghiên cứu gần đây thƣờng là

những đối tƣợng phơi nhiễm dioxin do sống ở vùng ô nhiễm tồn lƣu dioxin tỷ

lệ nam/nữ không quá chênh lệch. Nghiên cứu của chúng tôi có tỷ lệ nam/nữ

cũng tƣơng tự những nghiên cứu gần đây về đối tƣợng phơi nhiễm dioxin tại

các điểm nóng tồn lƣu dioxin.

4.1.2. Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng

Hai phần ba trƣờng hợp bệnh gan mạn tính không có triệu chứng rõ

ràng trừ khi diễn tiến đến xơ gan mất bù. Các triệu chứng thƣờng gặp nhất là

mệt mỏi, chán ăn và gan to [84]. Trong nghiên cứu của chúng tôi triệu chứng

mệt mỏi chiếm 81,8%, chán ăn (84,8%) gặp ở phần lớn bệnh nhân. Điều này

cũng phù hợp với lý thuyết vì đây là những triệu chứng xuất hiện đầu tiên.

Đến giai đoạn muộn hơn, các triệu chứng này thƣờng gặp ở 100% bệnh nhân

có bệnh gan mạn tính [84]. Các triệu chứng khác gặp trên nhóm nghiên cứu

rối loạn giấc ngủ (84,5%), đầy bụng, khó tiêu (48,5%), và đau hạ sƣờn phải

(66,7%) có tần suất thấp hơn. Tuy nhiên các triệu chứng trên thƣờng là các

triệu chứng không đặc hiệu có thể gặp ở nhiều bệnh khác, bên cạch đấy mức

độ các triệu chứng trên thƣờng không nặng nề và rõ ràng cho nên nhiều ngƣời

thậm chí các bác sỹ thăm khám cho là không nghiêm trọng. Tuy nhiên nếu

phát hiện và theo dõi các triệu chứng từ sớm sẽ giúp phát hiện bệnh từ đó có

thái độ điều trị và dự phòng thích hợp. Tránh trƣờng hợp bệnh nhân bị bệnh

gan mạn khi đến khám bệnh đã bị xơ gan mất bù hay ung thƣ gan, tình trạng

này là có gặp trong thực tế lâm sàng.

Các triệu chứng cơ năng trên của chúng tôi tƣơng tự nhƣ nghiên cứu

của Trần Bảo Nghi và Trần Thị Khánh Tƣờng, tuy nhiên các triệu chứng thăm

khám thực thể của chúng tôi ít bắt gặp các triệu chứng về bệnh lý gan mật hơn

nghiên cứu trên. Chỉ có 1 trƣờng hợp 3% có vàng da nhẹ. Các triệu chứng

thực thể có thể bị ảnh hƣởng bởi điều kiện thăm khám và đánh giá chủ quan

của bác sĩ. Trong đó, các triệu chứng nhƣ sao mạch, lòng bàn tay son, là

những triệu chứng dễ nhận biết. Các triệu chứng khác nhƣ vàng da, vàng mắt,

tuần hoàn bàng hệ, lúc còn nhẹ và mờ nhạt dễ bị bỏ sót khi điều kiện phòng

thăm khám không đạt chuẩn ánh sáng [75],[76].

Tác giả Trần Bảo Nghi trong nghiên cứu của mình cho thấy xạm da có

đến 68 bệnh nhân (73,9%). Triệu chứng giãn mạch gò má, lòng bàn tay son,

sao mạch. Vàng da, vàng kết mạc mắt có 15 bệnh nhân (16,3%) và xuất huyết

da niêm gặp trong 8 bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 8,7%. Lách to và gan to gặp có 14

và 18 bệnh nhân [75]. Nghiên cứu của Trần Thị Khánh Tƣờng đa số không có

triệu chứng thực thể (92,4%). Chỉ có 9 bệnh nhân (7,6%) có triệu chứng gan

to và hoặc vàng da [76].

Nhƣ vậy chúng ta có thể thấy triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào chọn

nhóm đối tƣợng nghiên cứu. Trong nghiên cứu của chúng tôi, nhóm bệnh

nhân nghiên cứu chỉ có viêm gan mạn (theo kết quả mô bệnh học) không có

bệnh nhân xơ gan bên cạnh đấy cỡ mẫu còn nhỏ cho nên có thể các triệu

chứng lâm sàng của bệnh lý gan mạn tính chƣa xuất hiện đầy đủ. Tuy nhiên,

trong các bài tổng quan và nghiên cứu về các phƣơng pháp chẩn đoán xơ gan

không xâm lấn đều cho rằng nếu chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng thì không

có nhiều ý nghĩa trong chẩn đoán mức độ xơ hóa gan.

4.1.3. Một số xét nghiệm sinh hóa gan mật

Gan là một hệ thống cơ quan có chức năng chuyển hóa, cố định, bất

hoạt và thải trừ các chất độc nội và ngoại sinh của cơ thể. Chính vì vậy, nó là

cơ quan rất dễ tổn thƣơng trong quá trình nhiễm độc lâu dài các chất độc

ngoại sinh, trong đó có dioxin. Nghiên cứu độc tính của dioxin trên động vật

thực nghiệm chuột cống, chuột nhắt, chuột lang có tình trạng hủy hoại tế bào

gan thể hiện rõ khi có tình trạng enzyme ALT, AST tăng cao [36]

Nghiên cứu của Phạm Thế Tài và cs trên 405 ngƣời dân sống xung

quanh hai khu vực ô nhiễm dioxin là sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa cho thấy

nhóm đối tƣợng có tỷ lệ AST và ALT vƣợt ngƣỡng bình thƣờng chiếm tỷ lệ

rất cao cho cả nam và nữ. Tỷ lệ chung cho cả nam và nữ là tăng AST có

100

66,4%, tăng ALT là 38,7%. Có thể trong nghiên cứu của mình các tác giả đã

không loại trừ những ngƣời có sử dụng rƣợu và viêm gan vi-rút. Tuy nhiên, ở

nhóm nữ giới tỷ lệ sử dụng rƣợu và viêm gan vi rút khá thấp, vẫn có 62%

AST tăng vƣợt ngƣỡng và 37,6% ALT tăng vƣợt ngƣỡng [85]. Trong cộng

đồng dân cƣ nói chung vẫn có một tỷ lệ nhất định các men gan ở ngƣỡng bất

thƣờng khi kiểm tra ngẫu nhiên. Tỷ lệ này thấp thƣờng giao động trong

khoảng 0,5-9% tùy thuộc vào từng chỉ số xét nghiệm. Nhƣ vậy, có thể thấy

dioxin gây tổn thƣơng gan dẫn đến tình trạng tăng men gan trên những đối

tƣợng sống tại 2 điểm nóng dioxin nói trên. Tuy nhiên, có thể do những đối

tƣợng trên ở giai đoạn sớm của bệnh gan mạn tính triệu chứng lâm sàng mờ

nhạt, vẫn lao động sinh hoạt bình thƣờng, nên chƣa thực sự để ý đến tình

trạng bệnh tật, chƣa quan tâm đến quá trình theo dõi diễn biến, tiên lƣợng và

điều trị bệnh.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, trên cơ sở theo dõi tình trạng bệnh của

những trƣờng hợp sống tại vùng ô nhiễm dioxin sân bay Đà Nẵng của Hội

nạn nhân chất độc da cam Đà Nẵng, của những nghiên cứu trƣớc chúng tôi

chủ động chọn những đối tƣợng viêm gan mạn tính mà dấu hiệu chủ yếu là

tăng các men gan kéo dài. Đây cũng là lý do chính để bệnh nhân nhập viện,

có chỉ định sinh thiết gan để chẩn đoán xác định và đánh giá mức độ tổn

thƣơng viêm gan mạn tính. Chúng tôi có kết quả xét nghiệm sinh hóa gan mật

nhƣ sau, nồng độ trung bình AST là: 50,5±12,1 U/l, nồng độ ALT trung bình

là: 55±9,3 U/l, nồng độ trung bình GGT là 62±31,3 U/l, nồng độ trung bình

Bilirubin là 19,9±3,8 µmol/l.

Trong phần lớn các nghiên cứu sự thay đổi giá trị AST và ALT là biểu

hiện cận lâm sàng thƣờng gặp sớm trong bệnh lý nhu mô gan mạn tính.

Aminotransferase thƣờng tăng dƣới 10 lần (< 300U/l), tăng cao trong đợt kịch

phát cấp, bilirubin, albumin huyết thanh và INR đa số trong giới hạn bình

thƣờng [29]. Nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả tƣơng tự: GGT, AST và

101

ALT là các xét nghiệm có tỷ lệ bất thƣờng cao, đa số bệnh nhân có bilirubin

TP trong giới hạn bình thƣờng.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi giống nhƣ các kết quả nghiên cứu

khác về bất thƣờng tăng men gan trên nhóm bệnh nhân bệnh gan mạn tính cho

dù do các nguyên nhân khác nhau. Nghiên cứu của Trần Bảo Nghi, AST và

ALT có thay đổi bất thƣờng. AST (72,17 ± 53,96), ALT (55,24 ± 38,52) [75].

Nghiên cứu của Trần Thị Khánh Tƣờng cho kết quả AST (50,15±37,76), ALT

(59,75±40,42), trong nghiên cứu tác giả nhận thấy tất cả bệnh nhân đều có

tình trạng viêm mạn trên mô bệnh học, nhƣng chỉ có 65,6% bệnh nhân có

ALT và hoặc AST tăng, mặc dù đa số bệnh nhân không sử dụng thuốc hạ

enzym gan trƣớc đó [76].

Kết quả nghiên cứu của một số tác giả nƣớc ngoài nhƣ Foucher J và

cs AST (59,5), ALT (79,2) [80], Dominguez E. và cs AST (58 ± 47), ALT

(86 ± 80) [86].

4.2 NỒNG ĐỘ DIOXIN TRONG MÁU

Tại Việt Nam, nguồn gây ô nhiễm dioxin có thể từ các hoạt động công

nghiệp bao gồm: xử lý xác thải, sản xuất xi măng, luyện kim, sản xuất giấy,

nhà máy nhiệt điện, nồi hơi, sản xuất gạch. Tuy nhiên nguồn gây ô nhiễm

nặng là từ chiến tranh Việt Nam do quân đội Mỹ sử dụng. Hiện nay, tại Việt

Nam số liệu điều tra đã xác định đƣợc 3 điểm ô nhiễm nặng dioxin (điểm

nóng) nguồn gốc từ chất diệt cỏ quân đội Mỹ sử dụng trong chiến tranh Việt

Nam gồm sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng, Phù Cát [1].

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 33 đối tƣợng sống tại khu vực ô

nhiễm dioxin sân bay Đà Nẵng có kết quả nồng độ dioxin trong máu nhƣ sau:

Ngƣời có nồng độ TCDD trong máu thấp nhất là 3,3 pg/g lipid, ngƣời có

nồng độ cao nhất là 722 pg/g lipid, giá trị trung bình là 50,7 ± 131,9 pg/g

lipid. Nồng độ PCDD/F tính ra TEQ ngƣời thấp nhất là 11,4 pg/g lipid, cao

nhất là 760,5 pg/g lipid, giá trị trung bình là 74,5±135,4 pg/g lipid.

102

Thời gian sống tại vùng ô nhiễm dioxin trung bình 26±10,6 năm, ngƣời

có thời gian sống lâu nhất tại vùng ô nhiễm là 46 năm, ngƣời có thời gian

ngắn nhất 8 năm. Số ngƣời có thời gian sống từ 16-30 năm là nhiều nhất

chiếm tỷ lệ 48,5%. Có 3 ngƣời sinh ra và lớn lên ở vùng ô nhiễm.

Trên thế giới có nhiều công bố về dioxin trong máu ngƣời. Một nghiên

cứu tại Canada cho thấy nồng độ trung bình của PCDD/Fs và PCB là 11 pg/g

lipit [87]. Nghiên cứu tại Đức cho các đối tƣợng tuổi từ 20-68 cho thấy nồng

độ PCDD/Fs trong máu trung bình là 6,2 pg/g mỡ, nồng độ giới hạn trên của

95% đối tƣợng nghiên cứu là 19,1 pg/g mỡ [88]. Một nghiên cứu tiến hành tại

Napoli, Ý để đánh giá nồng độ dioxin ở những ngƣời không có phơi nhiễm

nghề nghiệp với dioxin và những ngƣời sống ở gần khu vực có nguy cơ phơi

nhiễm dioxin. Kết quả cho thấy, nồng độ TEQ PCDD/Fs trung bình là 7,91

pg/g lipit dao động từ 1,43-17,38 pg/g lipit. Trong đó khu vực thành phố nồng

độ PCDD/Fs là 7,23 pg/g lipit thấp hơn có ý nghĩa so với khu vực nguy cơ

8,81 pg/g lipit [89]. Năm 2012, Consonni D. và cs đã tiến hành tổng hợp 187

nghiên cứu với 29.687 đối tƣợng từ 26 quốc gia trên thế giới thực hiện từ năm

1989 đến 2010 có kết quả nồng độ chung trong quần thể nhƣ sau: Nồng độ

TEQ PCDDs trung bình 9,2 pg/g lipit; TEQ PCDFs trung bình 3,2 pg/g lipit;

nồng độ PCDD/Fs trung bình là 12,4 pg/g lipit [90].

Văn phòng an toàn hóa chất Úc đƣa ra báo cáo vào năm 2015 cho thấy

trung bình nồng độ dioxin (PCDD/Fs và PCBs) ở ngƣời là 10,9 ng WHO-

TEQ/kg lipid, trong đó nam giới là 10,35 ng WHO-TEQ/kg lipid, nữ giới

11,48 ng TEQ/kg lipid [ 91].

Về các nghiên cứu tại Châu Á, nghiên cứu tại 90 vùng thuộc 30 quận

của Nhật Bản cho thấy nồng độ trung bình TEQ của PCDD/Fs là 10 pg/g

lipid, tổng nồng độ TEQ của tất cả các hợp chất dioxin nghiên cứu là 16 pg/g

lipid [92]. Nghiên cứu tại Trung Quốc về đánh giá nồng độ dioxin trong sữa

của các ngƣời mẹ đƣợc sinh ra hoặc chuyển đến Thƣợng Hải với đặc trƣng

103

không phơi nhiễm dioxin hoặc các chất POPs cho thấy trung bình là 5,4 pg/g

lipit dao động từ 0,27-16,8 pg/g lipid. Nồng độ dioxin trong sữa ở ngƣời mẹ ở

vùng thành thị cao hơn vùng nông thôn, phía Đông Trung Quốc cao nhất và

thấp nhất ở Tây Bắc Trung Quốc [93]. Nghiên cứu tại Đài Loan năm 2010

đánh giá nồng độ PCDD/Fs trong máu của những ngƣời sống tại khu vực của

hai nhà máy sản xuất thép, kết quả cho thấy trung bình nồng độ TEQ

PCDD/Fs dao động 3,54-84,7 pg/g lipid, giá trị trung bình là 27,4 pg/g lipid,

những ngƣời phụ nữ có nồng độ PCDD/Fs cao hơn nam giới [94].

Nhƣ vậy, qua các nghiên cứu của các tác giả nƣớc ngoài cho thấy trong

máu ở cộng đồng chung có một lƣợng nhỏ dioxin. Một số nghiên cứu cũng

chỉ ra những đối tƣợng sống ở vùng có ô nhiễm dioxin (chủ yếu từ hoạt động

sản xuất công nghiệp) thì nồng độ dioxin trong máu cao hơn quần thể chung.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy so sánh nồng độ dioxin trong máu

với các tác giả nƣớc ngoài chúng tôi cao hơn rất nhiều. Nồng độ dioxin trong

máu cao hơn so với quần thể chung và cũng cao hơn so với những ngƣời sống

tại khu vực ô nhiễm dioxin từ hoạt động sản xuất công nghiệp.

Tại Việt Nam, có 2 nguồn chính gây ô nhiễm dioxin. Một là, các nguồn

ô nhiễm dioxin trong chiến tranh Việt Nam do quân đội Mỹ sử dụng chất diệt

cỏ có chứa dioxin. Nguồn ô nhiễm này có thể chia thành 2 khu vực, khu vực

bị phun rải nặng, trải rộng từ Quảng Trị đến Cà Mau, nặng nhất là vùng III

chiến thuật (theo phân chia của Mỹ ngụy trong thời gian chiến tranh), nhiều

khu vực đã đƣợc nghiên cứu nhƣ Cam Lộ, Gio Linh tỉnh Quảng Trị, A Lƣới

tỉnh Thừa Thiên- Huế, Sa Thầy tỉnh Kon Tun, Tân Uyên, Phú Giáo tỉnh Bình

Dƣơng…. Qua hơn 40 năm kể từ khi chấm dứt phun rải các CDC (năm 1971),

một phần dioxin trên lớp đất mặt bị phân hủy dƣới tác động của ánh sáng mặt

trời, sinh học, hóa học, một phần trên bề mặt đất bị cuốn theo dòng nƣớc mƣa

lan tỏa đi các nơi và cuối cùng là ra biển. Khu vực thứ hai là các điểm nóng

dioxin là nơi Mỹ dùng để lƣu trữ các chất diệt cỏ, đã có sự rơi rớt, thậm chí sự

104

cố rò rỉ xảy ra. Khu vực này bao gồm sân bay Biên Hòa, sân bay Đà Nẵng và

sân bay Phù Cát, các nghiên cứu cho thấy có sự ô nhiễm nặng nề dioxin tại

các điểm nóng. Chính phủ Việt Nam đã tích cực tiến hành các biện pháp

nghiên cứu đánh giá và khắc phục các điểm nóng về dioxin nói chung. Gần

đây đã hợp tác với chính phủ Mỹ tiến hành các biện pháp xử lý ô nhiễm

dioxin tại các điểm nóng trƣớc tiên là tại sân bay Đà Nẵng [27].

Nguồn gây ô nhiễm dioxin thứ 2 có thể từ các hoạt động công nghiệp

bao gồm: xử lý xác thải, sản xuất xi măng, luyện kim, sản xuất giấy, nhà máy

nhiệt điện, nồi hơi, sản xuất gạch. Gần đây đã có những công trình nghiên cứu

trên những ngƣời có phơi nhiễm dioxin từ nguồn ô nhiễm này [29].

Nghiên cứu của Vũ Tùng Sơn và cs về nồng độ dioxin trong máu từ

năm 2013-2015 trên 66 mẫu máu gộp (mỗi xã chọn tối đa 25 ngƣời/giới, sau

đó mẫu huyết thanh đơn đƣợc gộp theo giới, mỗi xã có 2 mẫu huyết thanh gộp

nam và nữ, có 33 xã nghiên cứu tƣơng ứng với 66 mẫu máu gộp), tiến hành

tại 3 khu vực: khu vực có nguy cơ ô nhiễm dioxin từ chất diệt cỏ trong chiến

tranh Việt Nam (viết tắt KV1) gồm 13 điểm (thuộc 7 tỉnh thành phố cảu miền

Nam từ vỹ tuyến 17 đổ vào. Khu vực có nguy cơ ô nhiễm dioxin từ phát thải

công nghiệp (viết tắt KV2) gồm 9 điểm thuộc 5 tỉnh, trong đó 7 điểm thuộc

miền Bắc và miền Trung, 2 điểm thuộc miền Nam. Khu vực không có nguy

cơ ô nhiễm dioxin từ bất kỳ nguồn phát thải nào (viết tắt là KV0), gồm 11

điểm, miền Bắc 6 điểm, miền Trung và Tây Nguyên 3 điểm, miền Nam 2

điểm. Nghiên cứu cho kết quả theo bảng

Khu vực Số mẫu Hàm lƣợng TEQ (pg/g mỡ) p

Min - max X±SD

KV0 22 3,26-26,96 8,33±5,54 0,32

KV1 26 3,92-15,35 8,69±3,16

KV2 18 3,98-23,71 8,33±5,38

105

Theo nghiên cứu trên thì hàm lƣợng TEQ trung bình ở KV1 cao nhất,

KV0 và KV2 là tƣơng đƣơng nhau và sự khác biệt là không có ý nghĩa thống

kê [95]. Kết quả nghiên cứu về nồng độ dioxin trong máu này nhỏ hơn nghiên

cứu trên 3 miền Bắc, Trung, Nam của Schecter A., Lê Cao Đài và cs năm

1995, cụ thể miền Nam là 31,3 pg/g lipid, miền Trung là 50 pg/g lipid, miền

Bắc 15,3 pg/g lipid [96]. Hai nghiên cứu tiến hành tại hai thời điểm khác

nhau, có thể do theo thời gian những vùng ô nhiễm dioxin sẽ giảm dần dẫn

đến nồng độ dioxin trong máu đƣợc thải trừ dần qua thời gian. Nghiên cứu

trên không tiến hành tại các vùng nóng dioxin, các nghiên cứu tại vùng nóng

đều cho thấy nồng độ dioxin rất cao trong máu cao hơn nhiều so với các

nghiên cứu trên.

Kết quả trên nhóm 1 cho thấy hàm lƣợng trung bình TEQ trong máu là

133,4 ± 192,9 pg/g lipit kết quả là cao hơn so với nhóm nghiên cứu. Theo

chúng tôi có nồng độ cao hơn tại nhóm 1 có thể là do lấy mẫu tại 2 địa điểm

khác nhau. Chúng tôi lấy mẫu nhóm 1 là những ngƣời sống gần sân bay Biên

Hòa Đồng Nai. Trong nhóm 1 chúng tôi đã chọn những ngƣời tiền sử và thăm

khám lâm sàng hiện tại không phát hiện bệnh lý gan mật, tuy nhiên trên nhóm

này có tổn thƣơng những cơ quan khác đƣợc tập trung điều trị tẩy độc tại

Bệnh viện Quân y 103. Điều này một lần nữa cho chúng ta thấy dioxin có thể

gây tổn thƣơng nhiều cơ quan khác nhau.

Nghiên cứu tiến hành năm 2015 trên những ngƣời sống gần hai điểm

nóng sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa cho thấy, hàm lƣợng trung bình TEQ

trong máu tại Đà Nẵng là 54,107 pg/g lipid, sân bay Biên Hòa là 197,9 pg/g

lipid [97]. Kết quả nghiên cứu này tƣơng tự nghiên cứu của chúng tôi về nồng

độ dioxin ở những ngƣời sống ở vùng ô “điểm nóng” ô nhiễm dioxin, và nồng

độ dioxin trong máu những ngƣời tại Biên Hòa cao hơn những ngƣời tại Đà

Nẵng. Nghiên cứu của Hồ Mạnh Dũng và cs năm 2014 tại Phù Cát cho thấy,

hàm lƣợng trung bình TEQ dioxin trong máu là 26 pg/g lipid [98]. Theo

106

nghiên cứu của Văn Phòng 33 và công ty Hatfield năm 2011 tại khu vực quân

sự sân bay Biên Hòa cho thấy nồng độ TEQ của công nhân làm việc tại khu

vực quân sự nằm trong khoảng từ 19,3-2020 pg/g lipid; nồng độ dioxin/furan

trong những ngƣời đánh bắt cá trong khu vực quân sự rất cao từ 1080-2020

pg/g lipid, tất cả các mẫu sữa mẹ đều ghi nhận có chứa dioxin [99].

Nhƣ vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi tƣơng tự các nghiên cứu

khác tại các điểm nóng dioxin cho thấy nồng độ trong máu của những trƣờng

hợp sống ở khu vực điểm nóng cao hơn rất nhiều so với quần thể nói chung,

cao hơn những ngƣời sống tại khu vực có nguy cơ ô nhiễm dioxin (khu vực

phun rải dioxin trong chiến tranh và khu vực nguy cơ ô nhiễm dioxin từ sản

xuất công nghiệp). Nhƣ vậy qua các nghiên cứu chúng ta có thể khẳng định ô

nhiễm dioxin tại các điểm nóng vẫn là một vấn đề thời sự cấp bách.

4.3. TỔN THƢƠNG MÔ BỆNH HỌC VÀ SIÊU CẤU TRÚC

4.3.1 Sinh thiết gan

Cho đến nay, sinh thiết gan vẫn là tiêu chuẩn vàng trong đánh giá mức

độ xơ hóa gan. Tuy nhiên sinh thiết gan là phƣơng pháp xâm nhập, có biến

chứng bên cạnh đó mẫu mô gan chỉ đại diện cho 1/50.000-1/65.000 toàn bộ

gan, do đó kỹ thuật sinh thiết phải đạt chất lƣợng cao và cần có những yếu tố

quan trọng nhƣ chọn kim sinh thiết có kích thƣớc đúng, vị trí sinh thiết đƣợc

chọn lựa cẩn thận, chuẩn bị mẫu bệnh phẩm đúng kỹ thuật, phân tích giải

phẫu bệnh chính xác. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng súng sinh thiết

Pajunk của Đức độ dài mảnh sinh thiết đƣợc chỉnh trên máy với mong muốn

độ dài là 20 mm với kim sinh thiết 16 G, có đƣờng kính 1,6mm. Chúng tôi

tiến hành sinh thiết dƣới hƣớng dẫn của siêu âm, vị trí sinh thiết đƣợc chọn

lựa cẩn thận và đƣờng đi của kim đƣợc theo dõi trên siêu âm nên đảm bảo

chất lƣợng mẫu bệnh phẩm và sự an toàn. Mẫu bệnh phẩm đƣợc nhuộm HE

phân tích mô bệnh học đƣợc tiến hành với sự hội chẩn bởi 2 bác sĩ chuyên

ngành giải phẫu bệnh có kinh nghiệm về phân tích mô bệnh học gan.

107

Chất lƣợng mẫu nhu mô gan là một trong các yếu tố quan trọng để cho

kết quả mô bệnh học chính xác. Đánh giá mẫu nhu mô gan đủ tiêu chuẩn

không đồng nhất giữa các nghiên cứu. Một số nghiên cứu tiêu chuẩn chỉ cần

độ dài của mẫu nhu mô gan, một số chỉ cần đạt số khoảng cửa tối thiểu, một

số cần cả 2 tiêu chuẩn kể trên. Ngay cả số khoảng cửa tối thiểu là bao nhiêu,

chiều dài mẫu nhu mô gan bao nhiêu là đạt tiêu chuẩn cũng khác nhau giữa

các nghiên cứu. Một số nghiên cứu đƣa kích thƣớc mẫu mô gan vào tiêu

chuẩn chọn bệnh có hay không có số khoảng cửa tối thiểu nhƣ độ dài ≥ 20mm

[78], ≥ 15 mm [100], hay kết hợp cả 2 tiêu chuẩn nhƣ ≥ 15mm và ≥ 6 khoảng

cửa [101], ≥ 10mm và ≥ 6 khoảng cửa [77]. Một số nghiên cứu chỉ cần tiêu

chuẩn ≥ 6 khoảng cửa [102], [103]. Trong khi đó, một số nghiên cứu trong

nƣớc, tiêu chuẩn chọn bệnh chỉ cần tối thiểu 3 khoảng cửa [74], [104] và một

số nghiên cứu không nêu tiêu chuẩn về mẫu mô sinh thiết [105], [106]. Trong

nghiên cứu của chúng tôi, mẫu mô gan đạt chuẩn khi có ≥ 6 khoảng cửa,

trong trƣờng hợp khó xác định số khoảng cửa (do xơ hóa nặng) mẫu mô gan

phải dài ≥ 15 mm.

Chúng tôi thực hiện sinh thiết 33 trƣờng hợp, Tất cả bệnh nhân trong

nghiên cứu đều có số khoảng cửa từ 6 trở lên. Số khoảng cửa TB: 7,4 ± 1,2, ít

nhất: 6, nhiều nhất: 10. Cả 33 bệnh nhân thực hiện sinh thiết gan dƣới hƣớng

dẫn của siêu âm chúng tôi chỉ sinh thiết 1 lần là lấy đƣợc mảnh sinh thiết.

Nhƣ vậy kết quả sinh thiết gan đạt yêu cầu của chúng tôi đạt tỷ lệ 100%.

Một số tác giả trong nƣớc khi thực hiện sinh thiết gan bằng kỹ thuật hút

để sinh thiết với kim Menghini nhƣ Lê Thị Thanh Quýt đạt tỷ lệ (95,9%)

[74]. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của các tác giả này, mẫu mô không đạt

chuẩn chỉ khi số khoảng cửa <3. Vì vậy, nếu theo tiêu chuẩn của chúng tôi, tỷ

lệ sinh thiết gan thành công của các tác giả kể trên có lẽ sẽ thấp hơn nữa.

Với một số tác trong và ngoài nƣớc cùng với tiêu chuẩn tối thiểu 6

khoảng cửa và với phƣơng pháp sinh thiết gan bằng súng dƣới hƣớng dẫn siêu

âm tỷ lệ thành công cũng rất cao. Trần Thị Khánh Tƣờng có tỷ lệ thành công

108

93,7%, Trần Bảo Nghi Tỷ lệ thành công 95,8 % [75], [76]. Nghiên cứu của

Friedrich-Rust M có 93,4% (57/61) mẫu sinh thiết đạt chuẩn [107].

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có tỷ lệ thành công 100%, bên cạnh

đó không có bệnh nhân nào phải sinh thiết 2 lần. Nghiên cứu của Trần Bảo

Nghi có 7 bệnh nhân phải thực hiện sinh thiết 2 lần [75]. Kết quả chúng tôi

cao hơn các nghiên cứu khác có thể do chúng tôi sinh thiết trên nhóm bệnh

nhân nhỏ hơn so với các tác giả khác.

Số khoảng cửa trung bình trong nghiên cứu của chúng tôi là 7,4. Số

khoảng cửa ít nhất là 6 và số khoảng cửa nhiều nhất là 10, đủ tiêu chuẩn để

phân tích mô bệnh học. Kết quả của chúng tôi gần tƣơng tự nghiên cứu của

Takahashi H. và cs (6,8 khoảng cửa), Trần Thị Khánh Tƣờng (7,11 khoảng

cửa) [76], nhƣng thấp hơn so với nghiên cứu của Crespo G. và cs (9 khoảng

cửa) [101].

4.3.2. Biến chứng trong sinh thiết gan

Sinh thiết gan qua da là thủ thuật xâm lấn với nhiều biến chứng. Những

biến chứng thay đổi từ nhẹ, nhƣ đau và thay đổi huyết áp thoáng qua, cho đến

những biến chứng nặng nhƣ xuất huyết (trong phúc mạc, trong gan, và xuất

huyết màng phổi, dò tạng (túi mật, đại tràng, màng phổi), dò động tĩnh mạch

trong gan. Xuất huyết nặng và viêm phúc mạc mật là những biến chứng nặng

có thể tử vong, tỉ lệ tử vong trong sinh thiết gan khoảng 0,01%-0,1% [108].

Gan rất nhiều mạch máu nhƣng các biến chứng do sinh thiết gan qua

da, kể cả biến chứng chảy máu, thƣờng hiếm gặp, 60% biến chứng thƣờng

xảy ra trong vòng 2 giờ đầu; và 96% trong vòng 24 giờ sau thủ thuật. Chảy

máu thƣờng số lƣợng ít, tự giới hạn tại chỗ chọc kim, có thể kéo dài một vài

phút, số lƣợng 5-10ml máu. Chảy máu số lƣợng nhiều ít gặp hơn có thể gây tử

vong. Vị trí chảy máu thƣờng là vào ổ bụng, bao gan, nhu mô gan, đƣờng

mật. Các yếu tố nguy cơ của chảy máu gồm: cao tuổi, chọc kim sinh thiết

nhiểu hơn 3 lần trong thực hiện thủ thuật, rối loạn đông máu, tổn thƣơng tế

109

bào gan có biểu hiện xơ gan, u mạch máu và khối u có tăng sinh mạch máu

[20].

Đau là biến chứng duy nhất gặp trên nhóm nghiên cứu của chúng tôi

chiếm tỷ lệ 75,8%. Trong nhóm nghiên cứu của chúng tôi sau sinh thiết bệnh

nhân hay bị đau tại chỗ mức độ nhẹ hoặc vừa bệnh nhân thƣờng chịu đƣợc

không phải can thiệp gì, có 3 trƣờng hợp cần dùng thuốc giảm đau đƣờng

uống một lần. Không có những biến chứng khác nhƣ xuất huyết nội ,viêm

phúc mạc....Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tƣơng tự Trần Bảo Nghi

khi sinh thiết gan bằng súng dƣới hƣớng dẫn siêu âm, theo tác giả đau có tỷ lệ

64,1% và chủ yếu là đau nhẹ tự hết, không gặp các biến chứng khác [75].

Nghiên cứu của chúng tôi cỡ mẫu chƣa lớn, tuy nhiên cũng tƣơng đối phù hợp

với các tác giả khác.

Qua các nghiên cứu trên chúng ta có thể thấy, sinh thiết gan kiểu Tru-

cut có ƣu thế hơn sinh thiết kiểu hút với những bệnh nhân có xơ hóa gan và

xơ gan. Nhiều bằng chứng cho thấy rằng sinh thiết gan qua da dƣới hƣớng

dẫn của siêu âm có ƣu thế hơn hẳn sinh thiết mù qua da. Nhiều nghiên cứu đã

cho thấy, sinh thiết gan mù qua da có những nguy cơ cao hơn: biến chứng

nặng, đau sau sinh thiết và sinh thiết thất bại. Vì thế, sinh thiết gan qua da

dƣới hƣớng dẫn của siêu âm đƣợc xem nhƣ là một kỹ thuật quan trọng và

đƣợc sử dụng rộng rãi trong lâm sàng.

4.3.3. Kết quả mô bệnh học

4.3.3.1. Phân loại giai đoạn xơ hóa gan theo Metavir

Nghiên cứu của Đỗ Đức Vân và cs (1983) khảo sát “ca bệnh đối

chứng” trên 63 ngƣời điều trị tại Bệnh viện Việt Đức, Hà Nội từ tháng 1/1982

đến tháng 9/1982. Trong đó 21 ngƣời (6 ngƣời có tiền sử tiếp xúc với chất

độc da cam/dioxin ở miền Nam Việt Nam) đƣợc mổ và chẩn đoán xác định

giải phẫu bệnh lý là Hépatome, 42 ngƣời đối chứng (3 ngƣời có tiền sử tiếp

xúc chất độc da cam/dioxin). Kết quả thu đƣợc cho thấy khả năng bị ung thƣ

110

gan tiên phát ở những ngƣời đƣợc coi là tiếp xúc với chất da cam/dioxin tăng

gấp 5 lần so với những ngƣời không tiếp xúc (với khoảng tin cậy 95% là 1,16- 23,3 và X2 = 5,25 -3,81) [40]. Từ kết quả nghiên cứu năm 1983, nhóm nghiên cứu của Đỗ Đức Vân (1986) tiếp tục nghiên cứu 186 ngƣời, trong đó 62

ngƣời (có 13 tiếp xúc với chất da cam/dioxin) đƣợc chẩn đoán xác định giải

phẫu bệnh là Hépatome, 124 ngƣời (có 7 ngƣời có tiền sử tiếp xúc với chất da

cam/dioxin) đối chứng gồm 98 ngƣời loét hành tá tràng, 12 ngƣời loét bờ

cong nhỏ và 14 ngƣời ung thƣ dạ dày, tất cả 124 ngƣời đối chứng đều đƣợc

mổ làm giải phẫu bệnh lý. Kết quả thu đƣợc cho thấy khả năng bị ung thƣ gan

nguyên phát ở những ngƣời đƣợc coi là tiếp xúc với chất da cam/dioxin tăng

gấp 4,1 lần so với những ngƣời không tiếp xúc (với khoảng tin cậy 95% là 1,66- 11,54 và X2= 8,90). Khi phân tích thêm các yếu tố khác nhƣ rƣợu, thuốc

lá, sốt rét không có sự liên quan có ý nghĩa thống kê [12].

Nghiên cứu của Lê Bách Quang và cs trên 47.893 cựu chiến binh tuổi

từ 47 đến 65 cho thấy số bệnh nhân ung thƣ gan trên nhóm có phơi nhiễm

dioxin là 267/28.817 trƣờng hợp chiếm tỷ lệ 0,93% cao hơn hẳn nhóm không

có phơi nhiễm là 35/19.076 chiếm tỷ lệ 0,18% với p<0,01 [13]. Các nghiên

cứu trên đƣợc tiến hành trên những đối tƣợng là bộ đội, cựu chiến binh là

những ngƣời tiếp xúc trực tiếp với dioxin phun rải do Mỹ thực hiện trong

chiến tranh.

Bộ y tế đã xếp ung thƣ gan nguyên phát vào Danh mục bệnh, tật, dị

dạng, dị tật có liên quan đến phơi nhiễm với chất độc hóa học/dioxin [35].

Nhƣ vậy, chúng ta thấy đối với tổn thƣơng gan mạn tính dioxin có thể gây

những tổn thƣơng gan rất nặng nề, tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi

không có trƣờng hợp nào có tổn thƣơng gan nặng nhƣ vậy. Có thể do nhóm

nghiên cứu của chúng tôi đƣợc tiến hành trên những ngƣời sống tại điểm

nóng ô nhiễm dioxin Đà Nẵng, tuy có thời gian tiếp xúc với dioxin lâu hơn

111

nhƣng với nồng độ ít hơn và giảm dần theo thời gian (do sự phân hủy tự nhiên

của dioxin và quá trình tẩy độc dioxin của chính quyền).

Trên nhóm đối tƣợng nghiên cứu tổn thƣơng xơ hóa gan theo hệ thống

điểm Metavir có tỷ lệ lớn nhất là mức độ F1: 14/ 33 trƣờng hợp (42,4%),

nhóm tổn thƣơng xơ hóa gan F0: 9/33 trƣờng hợp (27,3%) và nhóm tổn

thƣơng xơ hóa gan F2 là 10/33 trƣờng (30,3%). Không phát hiện tổn thƣơng

xơ hóa gan mức độ F3 và F4. Các nghiên cứu của các tác giả trên chủ yếu trên

các cựu chiến binh trong đấy đa phần là bị phơi nhiễm trực tiếp dioxin do Mỹ

phun rải trong chiến tranh và tiến hành cách hiện nay đã khá xa. Các nghiên

cứu gần đây trên các điểm nóng dioxin cũng có phát hiện tổn thƣơng gan trên

nhóm nghiên cứu, tuy nhiên các tác giả không đi sâu đánh giá mức độ tổn

thƣơng trên mô bệnh học nên chúng tôi không có số liệu để so sánh.

Đối với bệnh gan mạn tính do các nguyên nhân khác kết quả mức độ xơ

hóa gan theo Metavir của chúng tôi nhẹ hơn. Không có trƣờng hợp nào F3,

F4, tuy nhiên trong các nghiên cứu khác tỷ lệ F0, F1, F2 của các tác giả cũng

khá cao.

Theo y văn, F0 là không xơ hóa, F1 là xơ hóa nhẹ. Theo các tác giả,

việc phân biệt F0 và F1 không có nhiều ý nghĩa trong tiên lƣợng điều trị vì

vậy có thể gộp kết quả 2 nhóm lại với nhau. Qua một số nghiên cứu, có thể

thấy rằng phân bố tần suất xơ hóa gan theo Metavir phụ thuộc vào cách chọn

đối tƣợng vào nhóm nghiên cứu. Nhìn chung tỷ lệ bệnh nhân xơ hoá giai đoạn

F0,1 chiếm tỷ lệ cao, xơ hóa nặng F3, và xơ gan F4 chiếm tỷ lệ thấp hơn.

Theo nghiên cứu của Trần Bảo Nghi tỷ lệ gộp nhóm F0 và F1 có tỷ lệ

cao nhất 28,26%, nhóm xơ hóa có ý nghĩa F2 là 26,09%, nhóm xơ hóa nặng

F3 có 23,9%, và xơ gan là 21,75% [75]. Trong nghiên cứu của Ngô Thị

Thanh Quýt, số bệnh nhân nhóm F0,1 là 15 (31,91%); Xơ hóa gan mức độ có

ý nghĩa (F2) là 10 ca (21,28%). Xơ hóa nặng F3, 12 ca (25,53%); Và xơ gan

là F4 có 10 ca (21,28%) [74]. Nghiên cứu của Trần Thị Khánh Tƣờng nhóm

xơ hóa F0 là 9/119 chiếm tỷ lệ 7,6%, F1 là 57/119 có tỷ lệ 47,9%, F2 là

112

23/119 chiếm tỷ lệ 19,3%, F3 là 19/119 chiếm tỷ lệ 16%, F4 là 11/119 chiểm

tỷ lệ 9,2% [76].

Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Foucher J và cs

[80], Dominguez G. và cs [86]. Trong nghiên cứu của Foucher J và cs, tần

suất bệnh nhân nhóm F0 và F1 chiếm 31,4% và F3, F4 lần lƣợt là 13,8% và

26,8%.

Việc xác định mức độ xơ hóa gan nhƣ xơ hóa đáng kể hay xơ hóa nặng

rất quan trọng để chỉ định điều trị và tầm soát biến chứng. Hầu hết bệnh nhân

có xơ hóa đáng kể (≥ F2) cần đƣợc chỉ định điều trị ngay, đặc biệt đối với

viêm gan mạn do HBV, HCV để tránh tiến triển đến xơ hóa nặng. Đối với xơ

hóa nặng (≥ F3), bệnh nhân cần theo dõi đặc biệt, bắt đầu tầm soát biến chứng

(ung thƣ gan, xuất huyết tiêu hóa do dãn vỡ tĩnh mạch thực quản…). Hầu hết

các hƣớng dẫn thực hành lâm sàng của các hiệp hội bệnh gan trên thế giới đều

nêu rõ vai trò quan trọng của đánh giá mức độ xơ hóa gan trong điều trị và

theo dõi viêm gan mạn do HBV, HCV và do rƣợu.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 72,7% bệnh nhân có xơ hóa gan

(F1,2). Trong đó mức độ xơ hóa nhẹ chiếm tỷ lệ 42,4%, xơ hóa đáng kể

chiếm 30,3%, không có xơ hóa nặng. Nhƣ vậy những trƣờng hợp xơ hóa đáng

kể cần phải theo dõi và có kế hoạch điều trị. Bên cạnh đấy vấn đề các bệnh

nhân tiếp tục phơi nhiễm với dioxin có thể sẽ làm tình trạng tổn thƣơng gan

xơ hóa tăng lên cũng cần phải đặt ra.

4.3.3.2 Tổn thương mô bệnh học

Tổn thƣơng mạn tính gan gặp trên hầu hết các mẫu sinh thiết, bao gồm

thoái hóa tế bào gan: thoái hóa mỡ 32/33 trƣờng hợp (97%), thoái hóa hạt

32/33 trƣờng hợp (97%), thoái hóa rỗ 33/33 trƣờng hợp (100%). Tất cả các

đối tƣợng đều có thâm nhiễm tế bào viêm, có lympho bào và bạch cầu đa

nhân bao quanh tế bào gan. Các tổn thƣơng trên đều không đặc hiệu và có thể

bắt gặp ở bệnh gan mạn tính do các nguyên nhân khác. Các tổn thƣơng mạn

113

tính khác của bệnh gan mạn tính nhƣ thể Mallory, nhiễm sắc tố, u hạt mỡ,

biến đổi ƣa toan tế bào, Mitochondria khổng lồ, nghẽn tĩnh mạch cũng đƣợc

đánh giá . Tuy nhiên, các tổn thƣơng đó không bắt gặp trên tất cả các đối

tƣợng nghiên cứu. Nhƣ vậy, trên nhóm nghiên cứu chúng tôi đi tìm những tổn

thƣơng mô bệnh học đặc hiệu nhƣng không có. Đối với những đối tƣợng viêm

gan mạn tính do các nguyên nhân khác, tổn thƣơng mô bệnh học có những giá

trị gợi ý đến nguyên nhân.

Đối với bệnh gan do rƣợu tổn thƣơng gan đƣợc chia thành 3 giai đoạn

kế tiếp nhau là gan nhiễm mỡ (steatosis hepatis), viêm gan do rƣợu (alcoholic

steatohepatitis- ASH) và xơ gan do rƣợu (alcoholic cirrhosis), các giai đoạn

này thƣờng chồng chéo lên nhau.

Gan nhiễm mỡ hay thoái hóa mỡ gan, đó là tình trạng lƣợng mỡ tích tụ

trong gan > 5% trọng lƣợng gan hay trên 50% tổng số tế bòa gan bị nhiễm

mỡ. Khoảng 90% số ngƣời nghiện rƣợu có gan nhiễm mỡ, ngừng uống rƣợu

tình trạng nhiễm mỡ sẽ giảm, nếu tiếp tục sẽ tiến triển thành viêm gan, hoặc

xơ gan do rƣợu. Thoái hóa bọt do rƣợu thƣờng gặp ở gan nhiễm mỡ do rƣợu:

tế bào gan phồng lên với các hạt trong bào tƣơng, các hạt này thƣờng phân tán

thành các sợi mảnh. Nhân tế bào nhỏ và bắt mầu đậm (tăng sắc). Bọt hình

thành do giữ nƣớc và mất khả năng tiết protein của các vi ống từ tế bào gan

[109], [110].

Chẩn đoán mô bệnh học viêm gan do rƣợu dựa trên: thâm nhiễm bạch

cầu trung tính, ứ mật, và sự hiện diện của ty thể khổng lồ, thể Mallory. Thể

Mallory thấy ở 76% bệnh nhân bệnh gan do rƣợu, thể Mallory còn có thể tìm

thấy ở viêm gan nhiễm mỡ không do rƣợu tuy nhiên trong bệnh gan do rƣợu

thể Malorry dày hơn và thô hơn. Bạch cầu thâm nhiễm trong bệnh gan do

rƣợu lan rộng hơn. Xơ cứng hoại tử hyaline, trong đó tĩnh mạch trung tâm cơ

bản vị phá hủy trong bệnh gan do rƣợu [110]. Dấu hiệu của viêm gan do rƣợu

là sự hiện diện của quá trình xơ hóa, lúc đầu xuất hiện ở trung tâm tiểu thùy

114

gan xung quanh tĩnh mạch gan và có thể từ đây lan rộng ra khắp toàn bộ gan.

Ngoài ra bệnh gan do rƣợu còn có những tổn thƣơng mô bệnh học khác, có

thể ƣa acid biểu hiện sự chết theo chƣơng trình. Xơ hóa khoảng Disse, số

lƣợng các lỗ và độ xốp của lớp đệm xoang giảm. Các tổn thƣơng ở tĩnh mạch

tiểu thùy và đoạn cuối tĩnh mạch bao gồm viêm tĩnh mạch do xâm nhập

lympho bào. Ứ mật trong vi quản mật là dấu hiệu chỉ xuất hiện ở giai đoạn

mất bù và liên quan đến tiên lƣợng mức độ bệnh. Ty thể phồng to tạo nên các

thể hình cầu trong bào tƣơng, liên quan đến uống rƣợu nặng gần đây và tiến

triển của bệnh, trong bệnh gan do rƣợu ty thể khổng lồ phong phú hơn bệnh

gan không do rƣợu [110].

Xơ gan do rƣợu thƣờng có đặc điểm bao gồm khối lƣợng thùy đuôi lớn

hơn, kích thƣớc nốt tái tạo tế bào gan nhỏ hơn so với xơ hóa gan do vi rút. Sự

hình thành các nốt thƣờng chậm, xơ gan do rƣợu là xơ gan nốt nhỏ. Xơ gan có

thể xuất hiện sau xơ hóa quanh tế bào mà không có hoại tử tế bào và quá trình

viêm [111].

Đối với tổn thƣơng gan do vi rút thang điểm Knodell là hệ thống thang

diểm đƣợc áp dụng rộng rãi. Chúng tôi đã tiến hành đọc tổn thƣơng mô bệnh

học cho nhóm 2 là những trƣờng hợp viêm gan mạn do vi rút viêm gan B có

kết quả: có 2/33 (6,1%) trƣờng hợp hoại tử kiểu mối gặm nhẹ; 8/33 (24,2%)

trƣờng hợp hoại tử kiểu mối gặm vừa; 8/33 (24,2%) trƣờng hợp hoại tử kiểu

mối gặm vừa + hoại tử kiểu cầu nối; 5/33 (15,2%) trƣờng hợp hoại tử kiểu

mối gặm nặng + hoại tử kiểu cầu nối; 2/15 (6,1) trƣờng hợp hoại tử đa tiểu

thùy. Tổn thƣơng thoái hóa trong tiểu thùy và hoại tử ổ có 9/33 (27,3%)

trƣờng hợp ở mức độ vừa và 24/33 (72,7%) trƣờng hợp ở mức độ nặng. Tổn

thƣơng viêm khoảng cửa chủ yếu ở mức độ vừa với 14/33 (42,4%) trƣờng hợp;

có 19/33 (57,6%) trƣờng hợp viêm khoảng cửa mức độ nặng. Về mức độ hoạt

tính trên mô học (Histologycal Activity Index- HAI) nhóm viêm gan mạn nhẹ

115

có 2/33 (6,1%) trƣờng hợp; viêm gan mạn tính vừa có 19/33 (57,6%) trƣờng

hợp; viêm gan mạn tính nặng có 12/33 (36,4%) trƣờng hợp.

Tổn thƣơng gan đƣợc Knodell đánh giá thông qua chỉ số hoạt tính mô

học (HAI). HAI gồm 2 yếu tố. Tổn thƣơng viêm, hoại tử ở khoảng cửa, quanh

khoảng cửa, lan vào trong tiểu thùy, hoại tử tiểu thùy và hoại tử thành ổ, yếu

tố này cho phép đánh giá độ hoạt động và phản ánh mức độ bệnh. Tổn thƣơng

xơ hóa từ các giải xơ mỏng ở khoảng cửa, xơ phát triển, xâm nhập vào trong

tiểu thùy tạo ra các vách ngăn nối các khoảng cửa với nhau, gây xơ hóa, đảo

lộn cấu trúc tiểu thùy gan, cuối cùng là xơ gan [112]. Đối với bệnh nhân viêm

gan vi rút B mạn hoạt động, hoại tử mối gặm là tiêu chuẩn tối thiểu phải có,

khi có hoại tử cầu nối hoặc hoại tử đa tiểu phân thùy là tiên lƣợng nặng, bệnh

có thể tiến triển tới xơ gan, suy gan cấp và tử vong [113].

Nhƣ vậy, chúng ta có thể thấy tổn thƣơng mô bệnh học bên cạnh đánh

giá hoạt động và mức độ bệnh có thể tìm thấy những tổn thƣơng đặc hiệu để

định hƣớng giúp chẩn đoán nguyên nhân. Tuy nhiên trên nghiên cứu của

chúng tôi không tìm thấy những tổn thƣơng, dấu hiệu trên mô bệnh học đặc

hiệu nào, có thể do cỡ mẫu chúng tôi chƣa thực sự lớn.

Về kết quả diễn tiến mức độ hoạt độ viêm theo Metavir, trong nghiên

cứu của chúng tôi, tần suất hoạt độ viêm chủ yếu là A1 là 18/33 bệnh nhân

chiếm 54,5%, A2 là 12/33 bệnh nhân chiếm 36,4%, A0 và A3 có tỷ lệ ít. Kết

quả chúng tôi tƣơng tự của Trần Thị Khánh Tƣờng hoạt độ viêm A1 và A2

đa số, chiếm đến 85,9% [76]. Trong nghiên cứu của Ngô Thị Thanh Quýt và

cs, phần lớn mức độ hoạt độ viêm cũng ở giai đoạn A1 và A2, chiếm gần

95%, giai đoạn A0 và A3 chiếm rất nhỏ, chỉ 2,13% [74].

Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Ziol M và cs, phần

lớn bệnh nhân cũng tập trung ở mức độ hoạt độ viêm A1, và A2. Cụ thể trong

trong nghiên cứu của Ziol M và cs, A1 chiếm đến 66,5% và A2 là 30,3%, còn

A0 và A3 chiếm tần suất không đáng kể [81].

116

Trong phần lớn các nghiên cứu, các tác giả đều ghi nhận rằng giữa mức

độ xơ hóa và mức độ hoạt độ viêm không có sự tƣơng quan nhau.

4.3.4. Thay đổi hình ảnh siêu cấu trúc nhu mô gan

4.3.4.1. Thay đổi hình ảnh siêu cấu trúc một số thành phần cấu tạo gan

Kết quả siêu cấu trúc gan trên nhóm nghiên cứu có: tất cả các trƣờng

hợp đều có thâm nhiễm tế bào viêm, không phát hiện trƣờng hợp có khoảng

gian bào, vi quản mật bị giãn. Về xơ hóa gan: xơ hóa quanh xoang chiếm tỷ lệ

lớn nhất 51,5%, xơ hóa khoảng cửa, rất ít các dải xơ có tỷ lệ 42,4%, chỉ có

2/33 ( 6,1%) trƣờng hợp là không có xơ hóa.

Các kết quả nghiên cứu siêu cấu trúc của 33 mẫu sinh thiết gan từ các

bệnh nhân đƣợc xác nhận phơi nhiễm mạn tính với dioxin cho thấy những tổn

thƣơng đồng nhất nhu mô gan. Các tổn thƣơng cơ bản bao gồm:

Trên bề mặt mẫu sinh thiết nhu mô gan cho thấy các cấu trúc của tiểu

thùy, tĩnh mạch trung tâm, khoảng cửa.

Mặt cắt qua tĩnh mạch trung tâm: là khoảng trống, bên trong đƣợc lót

bởi cấu trúc phẳng của biểu mô nội mạc mạch, bắt gặp hình ảnh nhô cao ở

phần nhân của các tế bào nội mạc. Xung quanh có các tế bào gan xếp sát

nhau, thấy rõ các đƣờng thông của tĩnh mạch nan hoa. Một số vị trí thấy rõ

hình ảnh của các sợi, bó sợi collagen nằm ở khoảng giữa nội mạc và tế bào.

Mặt cắt qua xoang tĩnh mạch nan hoa: Khoảng trống kích thƣớc nhỏ,

bao quanh bởi các tế bào gan. Bên trong thấy rõ bề mặt nhẵn của tế bào nội

mạc, vùng nhân nhô cao hơn, đôi khi bắt gặp tế bào Kupffer nằm trong lòng

mạch với các nhánh bào tƣơng dài, ngắn bám vào bề mặt nội mạc mạch.

Khoảng Disse rõ, một số trƣờng hợp thấy có các sợi collagen.

Mặt cắt qua khoảng cửa: Khoảng cửa có cấu trúc phức tạp, với sự có

mặt của tĩnh mạch cửa, động mạch gan. Ở tất cả các mẫu đều thấy có các sợi,

bó sợi collagen.

Trên kính hiển vi điện tử truyền qua cũng nhƣ kính hiển vi điện tử quét

đều cho thấy các tế bào sợi xuất hiện ở khoảng cửa với các mức độ khác nhau.

117

Hình ảnh tổn thƣơng chủ yếu là sự xuất hiện hay sự xâm nhập của các sợi, bó

sợi collagen vào khoang Disse, khoảng gian bào. Các bệnh nhân có mức độ

tổn thƣơng xơ hóa khác nhau, sự xâm nhập của các tế bào viêm phụ thuộc vào

mức độ viêm gan.

Tất cả các trƣờng hợp, về siêu cấu trúc mô gan cho thấy những thay đổi

bao gồm nhiễm mỡ, xơ hóa khoảng cửa, hoại tử vùng trung tâm. Đôi khi thấy

xơ hóa nhẹ khoảng cửa.

Sự mô tả của Turner và Collins đặt cơ sở trên các kiểm tra độc học của

Silkworth và cs cung cấp số liệu trên các thay đổi của tế bào nhu mô gan lợn

guinea từ bụi Binghamton. Về cơ bản, các phát hiện của họ cho thấy các hậu

quả độc học thƣờng thấy gây ra bởi dioxin hoặc, PCBs trên lợn guinea đƣợc

thấy từ hỗn hợp tro đặc biệt này mặc dù furans và các hóa chất khác có thể

góp phần định lƣợng và định lƣợng đối vói các biến đổi và thay đổi bệnh lý.

Họ lƣu ý sự nở to của các thế bào gan, gan nhiễm mỡ, hoại tử trung tâm, tăng

ống dẫn mật (adenofibrosis), tăng lƣới nội bào không hạt, các mạng màng

đồng tâm (concentric membrane arrays - CMAs), các thay đổi về hình dạng

mitochondria và mào mitochondria, giảm lƣới nội bào hạt và các thể tự thực

bào [114], [115].

Kết quả siêu cấu trúc về một số thành phần cấu tạo nhu mô gan chúng

ta có thể thấy cơ bản giống nhƣ kết quả mô bệnh học. Tất cả 33/33 trƣờng hợp

đều có hiện tƣợng thâm nhiễm tế bào viêm và không có trƣờng hợp nào

khoảng gian bào, vi quản mật bị giãn. Tuy nhiên, trong kết quả siêu cấu trúc

dƣờng nhƣ dƣới độ kính phóng đại lớn hơn chúng ta thấy mức độ xơ hóa gan

nặng nề hơn. Trong mô bệnh học sử dụng thang điểm Metavir để đánh giá

dƣới kính hiển vi thƣờng, chúng tôi đã áp dụng các chỉ tiêu đặc điểm của

thang điểm xơ hóa theo Metavir dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy. Chỉ có

2/31 trƣờng hợp (6,1%) không có xơ hóa tƣơng đƣơng F0 (kết quả mô bệnh

học là 9/33 trƣờng hợp 27,3%). Xơ hóa quanh xoang, có hoặc không có xơ

118

hóa quanh tế bào có 17/33 trƣờng hợp chiếm tỷ lệ lớn nhất 51,5%, tƣơng

đƣơng F1 kết quả mô bệnh học là 14/33 trƣờng hợp chiếm 42,4%. Xơ hóa

khoảng cửa, rất ít các dải xơ có 14/33 trƣờng hợp tỷ lệ 42,4% , tƣơng đƣơng

F2 kết quả mô bệnh học là 10/33 trƣờng hợp tỷ lệ 30,3%. Cả trên hình ảnh mô

bệnh học và siêu cấu trúc đều không phát hiện trƣờng hợp nào mức độ xơ hóa

F3, F4. Nhƣ vậy chúng ta có thể thấy dƣới hình ảnh siêu cấu trúc với độ

phóng đại kính tốt hơn, phát hiện xơ hóa gan và mức độ xơ hóa dƣờng nhƣ

sớm hơn và nặng hơn so với mô bệnh học. Vấn đề này cần tiếp tục nghiên cứu

trên cỡ mẫu lớn hơn và ở nhiều mức độ xơ hóa hơn.

4.3.4.2. Thay đổi hình ảnh siêu cấu trúc tế bào gan

Toàn bộ 33 mẫu sinh thiết đều có ghi nhận có sự tổn thƣơng bào quan và

tế bào gan ở mức siêu cấu trúc. Các tổn thƣơng này tƣơng đối đồng nhất ở các

mẫu. Các tổn thƣơng đồng nhất ở mức siêu cấu trúc đƣợc tìm thấy bao gồm:

Lƣới nội bào hạt dãn rộng, lƣới nội bào không hạt dãn rộng và tạo thể đa màng

xoắn 33/33 trƣờng hợp (100%). Mào mitochondria thƣa thớt, có các hạt đậm độ

điện tử cao trong bào quan, kích thƣớc mitochondria không đồng đều, hình

dạng mitochondria biến dạng gặp ở 33/33 trƣờng hợp (100%); Vị trí

mitochondria tập trung sát màng tế bào 32/33 trƣờng hợp (97%); Mật độ điện

tử tăng đậm độ điện tử toàn bộ mitochondria trong tế bào 32/33 trƣờng hợp

(97%); Đƣờng tinh thể có ở 31/33 trƣờng hợp (93,9%); Mitochoindria thể kích

có 10/33 trƣờng hợp (30,3%); Màng mitochondria đứt gãy có 7/33 trƣờng hợp

(21,2%). Không phát hiện mẫu nào có tổn thƣơng màng tế bào và nhân.

Nhƣ vậy chúng ta có thể thấy các tổn thƣơng siêu cấu trúc của tế bào

gan ở nhóm nghiên cứu tƣơng đối đồng nhất bao gồm:

- Các mitochondria tăng đậm độ điện tử đồng đều, biến dạng, đứt gãy

màng, xuất hiện các mitochondria thể kính, nhiều hình dạng, kích thƣớc khác

nhau (elip, dài, có nhánh, quả tạ…). Bên trong chứa 1-3 hạt hình cầu đậm độ

119

điện tử cao, có các đƣờng tinh thể. Xuất hiện các mitochondria có 1 đến 3

mào nằm dọc theo trục dọc của bào quan

- Lƣới nội bào không hạt dãn rộng tăng số lƣợng,

- Lƣới nội bào hạt bao quanh, đôi khi nằm sát mitochondria dãn nhẹ.

- Xuất hiện các thể đa màng dạng xoắn trong bào tƣơng tế bào nhu mô gan.

Nghiên cứu hình ảnh siêu cấu trúc tổn thƣơng gan trên những ngƣời phơi

nhiễm dioxin trên thế giới chƣa có nhiều, hiện tại chƣa có nghiên cứu nghiên

cứu nào tại Việt Nam tìm hiều về vấn đề này vì vậy chúng tôi không có số

liệu để so sánh. Tuy nhiên có nhiều công trình nghiên cứu trên động vật về

vấn đề này.

Phơi nhiễm mạn tính với dioxin, gây tác động căng thẳng, kéo dài với

sự đáp ứng giải độc của tế bào gan, gây nên những thay đổi về hình thái siêu

cấu trúc của tế bào gan mà đặc biệt đƣợc thừa nhận là các mitochondria.

Nhiều nghiên cứu trƣớc đây sử dụng động vật trong các nghiên cứu cho ăn

thức ăn với các dioxin đã tìm thấy một số những thay đổi đặc tính siêu cấu

trúc của tế bào gan. Các mạng màng đồng tâm, các màng tạo thành khối, tăng

lƣới nội bào không hạt, tăng hoặc giảm lƣới nội bào hạt, và các biến đổi của

mitochondria về hình dạng cũng nhƣ sự sắp xếp của mào mitochondria ở dạng

song song với trục dọc nhiều hơn so với dạng vuông góc đã đƣợc ghi nhận

[114], [115].

Một cấu trúc bất thƣờng của mitochondria đó là các thể kính của

mitochondria (10/33) gặp trên nhóm nghiên cứu. Các mitochondria thể kính là

kết quả của quá trình rối loạn chuyển hóa hoàn toàn trong các mitochondria,

làm mất hoàn toàn chức năng hô hấp tế bào, sinh năng lƣợng của chung.

Guzelian, cũng lƣu ý các tổn thƣơng siêu cấu trúc với một số hình ảnh tƣơng

tự tổn thƣơng của PCB hoặc dioxin trên động vật, đặc biệt đối với

mitochondria, và cấu trúc thể kính của mitochondria cũng nhƣ thay đổi đối

với lƣới nội bào.

120

Bên cạnh đó, chúng tôi còn thấy các mitochonria của các tế bào gan

chứa 1-3 hạt hình cầu có đậm độ điện tử cao. Các thể tăng đậm độ điện tử cao

này không có vị trí cố định trong mitochondria, các vị trí thấy một cách ngẫu

nhiên không có quy luật. Điều này cho thấy sự hình thành chúng hoàn toàn

phụ thuộc vào rối loạn bên trong bào quan. Trên cơ sở các lý thuyết về cơ chế

tác động của dioxin với protein cho phép nghĩ đến sự hình thành của các thể

tăng đậm độ điện tử này là do sự kết dính của các protein chức năng có trong

mitochondria. Sự thay đổi cộng hóa trị của các protein gan bởi phản ứng

chuyển hóa của 2,4-D có thể dẫn tới một số tổn thƣơng nguy hiểm cho gan

khi phơi nhiễm với 2,4-D, và đƣợc thừa nhận bởi các nghiên cứu cơ chế

chuyển hóa thuốc ở gan [116]. Một vài báo cáo chứng minh rằng 2,4-D có thể

tạo cầu nối vững chắc với các protein của gan ở chuột và gà [117]. Li và cộng

sự đã đƣa ra một phản ứng chuyển hóa mới của 2,4-D– 2,4-

dichlorophenoxyacetol-S-acetyl-CoA (2,4-D-CoA). Các phản ứng hóa học

chuyển hóa 2,4-D đƣợc đƣa ra nhƣ cách trung hòa độc tính gan của 2,4-D.

Các tác giả cho rằng 2,4-D-CoA có thể góp phần tạo thành dạng 2,4-D-

protein khép và qua in vivo và vì thế liên quan tới độc tế bào gan [118].

Tƣơng tự nhƣ vậy, 93,9% (31/33) trƣờng hợp thấy có các đƣờng tinh

thể trong mitochondria. Các đƣờng tinh thể đƣợc các tác giả trƣớc đây thừa

nhận khi nghiên cứu tổn thƣơng tế bào gan ngƣời phơi nhiễm mạn tính với

dioxin. Schecter A. và cs nghiên cứu siêu cấu trúc tế bào gan trên 3 bệnh nhân

nhiễm độc khói trong một tai nạn cháy đã cho thấy 2/3 trƣờng hợp các

mitochondria có chứa các đƣờng tinh thể. Mặc dù không đƣa ra giả thuyết về

cơ chế xuất hiện nhƣng tác giả cho rằng sự thay đổi này của mitochondria

mằn trong cơ chế chung về độc hoạc tế bào gan của dioxin. Sự xuất hiện các

đƣờng tinh thể chứng tỏ quá trình gây căng thẳng lâu dài của dioxin và các

sản phẩm chuyển hóa của nó đối với đáp ứng giải độc của tế bào gan.

121

Một nghiên cứu trên bệnh nhân trẻ em có gan nhiễm mỡ không do rƣợu

về hình ảnh siêu cấu trúc đƣợc tiến hành trên các mẫu gan sinh thiết thu đƣợc

từ 10 trẻ em (6 bé trai và 4 bé gái) tuổi từ 2-14 tuổi với bệnh đƣợc chẩn đoán

trƣớc đó về mặt lâm sàng. Phân tích siêu cấu trúc đã cho thấy những bất

thƣờng mitochondria lặp đi lặp lại đặc trƣng trong tế bào gan; chủ yếu là đa

hình ti thể nhƣ megamitochondria, mất croche ty thể, và sự hiện diện của vùi

tinh thể, của mật độ điện tử tăng lên. Các vùi tinh thể đặc biệt rõ ràng trong

megamitochondria (MMC), mà dƣờng nhƣ đƣợc phân phối ngẫu nhiên cả

trong tế bào nhu mô gan và các vùng của thùy gan [119].

Các nghiên cứu đặc điểm siêu cấu trúc tế bào nhu mô gan trên động vật

phơi nhiễm cấp tính với dioxin xác nhận các vòng xoắn đồng tâm dạng màng

của lƣới nội bào đƣợc mô tả trong các nghiên cứu khác không hề thấy trong

các tế bào gan của bất cứ động vật nào phơi nhiễm cấp tính với dioxin trong

khoảng thời gian tiến hành thực nghiệm [117]. Việc vắng dạng vòng màng

xoắn đồng tâm ở các tế bào gan chuột phơi nhiễm cấp tính với dioxin sử dụng

trong nghiên cứu này có thể gợi ý rằng phơi nhiễm mạn tính và sự tích lũy của

dioxin hoặc chuyển hóa của nó trong tế bào gan là nguyên nhân gây ra các

biến đổi về hình thái. Khả năng khác là các dioxin khác hoặc các hợp chất

thơm chlorid hóa (aromatic chlorinated) có tác dụng hình thành các vòng

màng xoắn đƣợc quan sát thấy ở các nghiên cứu trƣớc đây. Các thể đa màng

dạng xoắn đồng tâm đƣợc thấy cả trên TEM và SEM ở tất cả các trƣờng hợp

trong nghiên cứu của chúng tôi. Nhƣ vậy có thể thấy, các rối loạn về chuyển

hóa do phơi nhiễm mạn tính với dioxin tạo ra các biến đổi hình thái của lƣới

nội bào của tế bào nhu mô gan.

Nhƣ vậy, nghiên cứu siêu cấu trúc phát hiện những thay đổi rõ ràng và

ổn định của các bào quan tế bào nhu mô gan. Các thay đổi rõ ràng nhất về

siêu cấu trúc quan sát thấy trên các tế bào gan của của các bệnh nhân phơi

nhiễm mạn tính với dioxin là sự gia tăng nhanh, thay đổi cấu trúc và sự phân

bố không đều của hầu hết hệ thống bào quan của tế bào kết quả cuối cùng là

122

làm mất hoàn toàn tính đồng nhất của tế bào. Các thay đổi tƣơng tự đƣợc

quan sát thấy trong một vài nghiên cứu khác nhằm đánh giá ảnh hƣởng phơi

nhiễm mạn tính với dioxin, các dẫn chất của nó ở các quần thể động vật sống

trong các môi trƣờng bị ô nhiễm .Nhìn chung, phần lớn các phản ứng của gan

đƣợc quan sát thấy có thể đƣợc coi nhƣ những triệu chứng của sự căng thẳng

cao của cơ thể con ngƣời trong phạm vi huy động năng lƣợng dự trữ và tái

cấu trúc lại hình thái nhằm đáp ứng với đòi hỏi của nhu cầu chuyển hóa/giải

độc tăng cao [120], [121], [122], [123].

Những thay đổi của lƣới nội bào hạt (RER), bao gồm sự tăng sinh, đứt

gãy và chƣơng phồng, là phản ứng chung đối với sự căng thẳng chất sinh học

ngoại lai và đƣợc coi có liên quan đến khả năng chuyển dạng sinh học cao của

các tế bào gan [121], [122]. Hiện tƣợng tăng sinh lƣới nội bào không hạt SER,

đƣợc xem nhƣ triệu chứng rõ ràng của sự nhiễm độc và có liên quan tới sự

hiện diện của quá trình khử độc các chất sinh học ngoại lai. Tăng sinh lƣới nội

bào không hạt đƣợc thấy trong các nghiên cứu khác trên gan động vật có phơi

nhiễm với các chất sinh học ngoại lai. Từ nhiều enzym chuyển dạng sinh học

khu trú trên các màng của lƣới nội bào đƣợc cho là có liên quan đến sự khử

độc đối với nhiều chất độc hữu cơ, tăng sinh lƣới nội bào không hạt đƣợc thừa

nhận nhƣ vật chỉ thị mức độ dễ tổn thƣơng khi phơi nhiễm với các chất độc

hữu cơ trên động vật và trên ngƣời [123], [124].

Chúng tôi phân tích kết quả siêu cấu trúc tế bào gan trên nhóm 2 viêm

gan mạn do HBV có cũng có sự tổn thƣơng tƣơng đối đồng nhất và có đặc

điểm khác với nhóm nghiên cứu: màng tế bào bị tổn thƣơng 18/33 (54,5%)

trƣờng hợp; màng nhân bị tổn thƣơng 21/33 (63,6%) trƣờng hợp; nhân bị tổn

thƣơng 22/33 (66,7%) trƣờng hợp; không bắt gặp hình ảnh lƣới nội bào hạt

giãn rộng và lƣới nội bào không hạt tạo thể đa màng xoắn; có 26/33 (93,3%)

trƣờng hợp có hình ảnh lƣới nội bào không hạt giãn rộng. Sự khác biệt về tổn

thƣơng màng tế bào, màng nhân, nhân, lƣới nội bào hạt giãn rộng và lƣới nội

123

bào không hạt tạo thể đa màng xoắn trên nhóm nghiên cứu với nhóm so sánh

2 là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

Tổn thƣơng mitochondria ít gặp có 5/33 (15,2%) trƣờng hợp có cấu

trúc màng mitochondria bị đứt gãy; mật độ bào quan tăng đậm độ điện tử ở

2/3 số mitochondria trong tế bào có 4/33 (12,1%) trƣờng hợp; kích thƣớc

không đồng đều 1/33 (3%) trƣờng hợp; không bắt gặp mitochondria thể kích,

không có đƣờng tinh thể và hình dạng vị trí mitochondria bình thƣờng. Sự

khác biệt về tổn thƣơng mitochondria trên nhóm nghiên cứu và nhóm so sánh

2 ở vị trí, mào, mật độ bào quan tăng đậm độ điện tử, hạt đậm độ điện tử cao

trong bào quan, đƣờng tinh thể, hình dạng, kích thƣớc và mitochondria thể

kích là có ý nghĩa thống kê với p<0,05.

Trên nhóm viêm gan vi-rút B mạn, ở mức siêu cấu trúc tổn thƣơng xảy

ra ở cả mức tế bào và các bào quan. Các tế bào gan tổn thƣơng nặng nhất có

hình ảnh tan rã, thoái hóa lỏng, tổn thƣơng làm bào tƣơng “rỗng”, nhân giảm

đậm độ điện tử, sáng, chất nhân thƣa thớt. Bên cạnh đó, còn thấy các thế bào

bị hoại tử đông, nhân co, màng nhân nhăn, gồ ghề, chất nhân, bào tƣơng tăng

đậm độ điện tử.

Các tổn thƣơng ở mức độ bào quan tập trung ở lƣới nội bào không hạt

và các bào quan có cấu trúc một lớp màng. Chủ yếu là hình ảnh dãn rộng kích

thƣớc và hình dạng không xác định, cấu trúc màng không rõ, trong lòng chứa

các hạt nhỏ định hình, đậm độ điện tử thấp không. Điều này phù hớp với các

tác giả khác khi nghiên cứu trên thực nghiệm cho thấy các virus đƣợc nhân

lên trong tế bào gan nhờ việc tạp thành cấu trúc vỏ tại bộ Golgi, các bể chứa

của bộ Golgi và lƣới nội bào không hạt [125]. Trong khi đó, các tổn thƣơng

của các tế bào gan bị nhiễm dioxin mạn tính tập trung chủ yếu trên các ti thể.

Nhƣ vậy, chúng ta có thể thấy có sự tổn thƣơng rõ ràng và đồng nhất

trên hình ảnh siêu cấu trúc gan của nhóm nghiên cứu. Kết quả tƣơng tự nhƣ

các nghiên cứu về tổn thƣơng gan trên động vật bị nhiễm độc. Bên cạnh đấy

124

tổn thƣơng siêu cấu trúc gan ghi nhận đƣợc trên nhóm nghiên cứu chủ yếu là

tổn thƣơng mitochondria là cơ quan phụ trách cung cấp năng lƣợng hóa học

cho tế bào, khác hẳn tổn thƣơng siêu cấu trúc gan do vi rút viêm gan B trên

nhóm so sánh tổn thƣơng chủ yếu ở màng tế bào, màng nhân và nhân. Điều

này giúp chúng ta khẳng định thêm tổn thƣơng gan do nhiễm độc dioxin trên

nhóm nghiên cứu. Từ kết quả siêu cấu trúc kết hợp những nghiên cứu cơ bản

về sinh lý, sinh lý bệnh, sinh học phân tử... sẽ góp phần làm rõ hơn cơ chế gây

tổn thƣơng gan của dioxin.

4.4 TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ MDR1

4.4.1 Tính đa hình gen Cyp2C19

Phần lớn những gen chuyển hóa ở gan đƣợc xác định là gen đa hình.

Một gen đƣợc coi là đa hình khi tần số allele đột biến trong quần thể bình

thƣờng đạt ít nhất là 1%. Biểu hiện đa hình của từng kiểu gen rất khác nhau

trong từng quần thể và chủng tộc khác nhau. Gen Cyp2C19 có rất nhiều đa

hình đơn (single nucleotide polymorphisms (SNPs)), hơn 20 đa hình đơn đã

đƣợc mô tả trong các khu vực quy định và mã hóa của gen Cyp2C19. Allele

gốc (wild type allele) đƣợc viết tắt là Cyp2C19*1. Các đột biến khác đƣợc sắp

xếp theo thứ tự từ Cyp2C19*2 đến Cyp2C19*3. Trong đó có 2 đột biến có ý

nghĩa lâm sàng lớn và gặp chủ yếu ở ngƣời Châu Á là Cyp2C19*2 và

Cyp2C19*3. Chúng tôi có kết quả tỷ lệ các allele Cyp2C19*1, Cyp2C19*2,

Cyp2C19*3 trên nhóm nghiên cứu lần lƣợt là: 60,6%, 33,3%, và 6,1%.

Sự phân bố tỷ lệ của các allele Cyp2C19 là khác nhau trên thế giới.

Ngƣời Châu Âu, Châu Phi và Châu Mỹ chủ yếu là alleles Cyp2C19*1, tiếp

đến là Cyp2C19*2, còn alleles Cyp2C19*3 gần nhƣ không có. Còn ở Châu Á

trong đó có Việt Nam tỷ lệ Cyp2C19*3 có thấy nhƣng với tỷ lệ ít nhất, tiếp

đến là Cyp2C19*2 và nhiều nhất cũng là Cyp2C19*1 [49], [52], [55]. Kết quả

của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu về tỷ lệ kiểu gen Cyp2C19 trên

ngƣời Việt Nam. Nhƣ nghiên cứu của Veiga M.I và cs trên 72 ngƣời khỏe

125

mạnh Việt Nam có tỷ lệ Cyp2C19*1, Cyp2C19*2 và Cyp2C19*3 tƣơng ứng

là 63,2%, 30,6% và 6,3% [48]. Nghiên cứu của Trần Ngọc Lƣu Phƣơng và cs

trên 251 trƣờng hợp Cyp2C19*1, Cyp2C19*2 và Cyp2C19*3 tƣơng ứng là

65,34%, 28,69% và 5,97% [50].

Tùy theo kiểu gen Cyp2C19 đã phân biệt ra 3 kiểu hình chuyển hóa.

Kiểu hình chuyển hóa nhanh là những ngƣời chứa cả 2 allele gốc wt/wt

(Cyp2C19*1/*1). Kiểu hình chuyển hóa trung bình chứa 1 allele gốc và 1

allele đột biến wt/m1 hoăc wt/m2 (Cyp2C19*1/*2 hoặc Cyp2C19*1/*3). Kiểu

hình chuyển hóa yếu chứa cả 2 allele đột biến m1/m1, m2/m2 hoặc m1/m2

(Cyp2C19*2/*2, Cyp2C19*3/*3, Cyp2C19*2/*3). Trong nhóm nghiên cứu

của chúng tôi, kiểu hình chuyển hóa trung bình chiếm đa số với 24/33 trƣờng

hợp chiếm 72,4%, kiểu hình chuyển hóa nhanh có 8/33 trƣờng hợp chiếm

24,2%, kiểu hình chuyển hóa chậm có 1/33 trƣờng hợp chiếm 3,1%.

Ở Châu Âu đa phần là kiểu hình chuyển hóa nhanh, kiểu hình chuyển

hóa chậm ít thƣờng là 2-5%. Tại Châu Á kiểu hình chuyển hóa chậm có tỷ lệ

cao hơn từ 10-20%, kiểu hình chuyển hóa trung bình thƣờng nhiều nhất dao

động từ 40-50%, kiểu hình chuyển hóa nhanh dao động từ 30-50%. Trên

nghiên cứu của chúng tôi kiểu hình chuyển hóa trung bình chiếm tỷ lệ nhiều

nhất nhƣng cao hơn hẳn các nghiên cứu trên chiếm 72,4% và kiểu chuyển hóa

nhanh có tỷ lệ thấp hơn các nghiên cứu khác đặc biệt so sánh với các nghiên

cứu trên ngƣời Việt Nam. Trong nhóm 1 kiểu hình chuyển hóa nhanh có

24/50 trƣờng hợp chiếm 48,0%, kiểu hình chuyển hóa trung bình có 24/50

trƣờng hợp chiếm 48,0%, kiểu hình chuyển hóa chậm có 2/33 trƣờng hợp

chiếm 4,0%.Trong nhóm khỏe mạnh kiểu hình chuyển hóa nhanh chiếm

43,3% với 39/90 trƣờng hợp, kiểu hình chuyển hóa trung bình có 46/90

trƣờng hợp chiếm 51,1%, kiểu hình chuyển hóa chậm có 5/90 trƣờng hợp

chiếm 5,6%.

Nghiên cứu của Trần Ngọc Lƣu Phƣơng và cs kiểu hình chuyển hóa

trung bình chiếm 49%, kiểu hình chuyển hóa nhanh là 43,43% [50]. Nghiên

126

cứu của Nguyễn Thị Thúy Mậu trên 64 bệnh nhân nhồi máu cơ tim chuyển

hóa nhanh là 26/64 chiếm 40,6%, chuyển hóa trung bình là 31/64 trƣờng hợp

chiếm 48,4% [126]. Nhƣ vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi tƣơng đƣơng

với các nghiên cứu khác trên ngƣời Việt Nam.

4.4.2. Tính đa hình gen MDR1

Kết quả trên nhóm nghiên cứu của chúng tối về phân bố các allele

MDR1 C3435T là allele C có 42/66 trƣờng hợp chiếm 63,6%, allele T có

24/66 trƣờng hợp chiếm 36,4%. Sự phân bố alleles MDR1 C3435T khác nhau

ở từng quốc gia và từng dân tộc khác nhau trên thế giới, các nghiên cứu trên

thế giới đã công bố:

Bảng 4.1. Phân bố alleles MDR1 C3435T một số nƣớc trên thế giới

Quốc gia n Phân bố alleles MDR1 C3435T

T (%) C (%)

72 Việt Nam 40,3 59,7

265 Trung Quốc 44,0 56,0

114 Nhật 38,5 61,5

224 Singapore 47,0 53,0

126 Iran 56,0 44,0

147 Ấn Độ 70,0 30,0

99 Malaysia 52,0 48,0

91 Úc 54,5 45,5

160 New Zealand 52,0 48,0

317 Ecuadoti 48,5 51,5

122 Ba Lan 37,5 62,5

81 Pháp 53,1 46,9

Nguồn: theo Veiga M.I và cs (2009) [48].

408 Tây Ban Nha 48,0 52,0

Qua các nghiên cứu trên chúng ta thấy có sự khác nhau về phân bố giữa

các alleles MDR1 C3435T giữa các quốc gia và các dân tộc. Nói chung, tỷ lệ

127

allele C dao động từ khoảng 30,0 -60,0%, allele T dao động khoảng từ 35,0-

70,0%. Nghiên cứu của chúng tôi thuộc phạm vi dao động đó và tƣơng đƣơng

với nghiên cứu của Veiga M.I. và cstrên ngƣời Việt Nam [48].

Về kết quả kiểu gen MDR1 C3435T là kiểu gen C/T có tỷ lệ cao nhất

với 18/33 trƣờng hợp chiếm 54,5%, tiếp đến là kiểu gen G/G có 12/33 trƣờng

hợp chiếm 36,4%, kiểu gen T/T có tỷ lệ ít nhất chiếm 9,1% với 3/33 trƣờng

hợp. So với một số kết quả nghiên cứu trên thế giới:

Bảng 4.2. Phân bố alleles MDR1 C3435T một số nƣớc trên thế giới

Quốc gia n Phân bố kiểu gen MDR1 C3435T

C/T (%) C/C (%) T/T (%)

Việt Nam 72 55,6 31,9 12,5

Trung Quốc 265 48,0 32,0 20,0

Nhật 114 53,0 35,0 12,0

Singapore 224 50,0 28,0 22,0

Iran 126 57,9 15,1 27,0

Ấn Độ 147 36,0 52,0 12,0

Malaysia 99 46,0 25,0 29,0

Úc 91 47,0 22,0 31,0

New Zealand 160 52,0 21,0 27,0

Ecuadoti 317 53,0 25,0 22,0

Ba Lan 122 41,0 42,0 17,0

Pháp 81 22,2 35,8 42,0

Nguồn: Veiga. M.I và cs (2009) [48]

Tây Ban Nha 408 52,0 26,0 22,0

Qua các kết quả nghiên cứu trên chúng ta thấy có sự khác nhau ở các

quốc gia và dân tộc về kiểu gen MDR1 C3435T. Kiểu gen C/T thƣờng chiếm

tỷ lệ cao nhất dao động từ khoảng 25,0-55,0%, tiếp đến là kiểu gen C/C dao

động khoảng 20,0-35,0%, kiểu gen T/T ít nhất dao động khoảng từ 10,0 -40,0

%. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cơ bản nằm trong khoảng kết quả trên

128

và có kết quả tƣơng đƣơng nghiên cứu của Veiga M.I và cs trên ngƣời Việt

Nam [48].

4.5. MỐI LIÊN QUAN GIỮA TỔN THƢƠNG MÔ BỆNH HỌC, MỘT

SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19, MDR1

VÀ NỒNG ĐỘ DIOXIN TRÊN NHÓM NGHIÊN CỨU

4.5.1. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và một số đặc điểm lâm sàng, tính

đa hình gen Cyp2C19, MDR1 và nồng độ dioxin trên nhóm nghiên cứu

4.5.1.1. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và một số đặc điểm lâm sàng

Theo cơ chế sinh bệnh học đối với một bệnh mạn tính thông thƣờng khi

thời gian mắc càng lâu thì mức độ bệnh càng nặng, bên cạnh đấy một số bệnh

có liên quan đến đặc thù giới. Khi tiến hành tìm hiểu mối liên quan giữa mức

độ xơ hóa với một số đặc điểm lâm sàng trên nhóm nghiên cứu chúng tôi có

kết quả.

Tuổi trung bình trên nhóm bệnh nhân có xơ hóa gan F0 là 47,4±14,1

năm, trên nhóm bệnh nhân có xơ hóa gan F1 là 44,1±11,4 năm, trên nhóm

bệnh nhân có xơ hóa gan F2 là 48,2±11,8 năm. Không có sự khác biệt về tuổi

trung bình giữa các nhóm xơ hóa gan.

Không có sự khác biệt về phân bố giới giữa các mức độ xơ hóa gan với

p> 0,05.

Thời gian sống trung bình tại vùng tồn lƣu dioxin trên nhóm bệnh nhân

có mức độ xơ hóa gan F0 là 16,3±7,6 năm ít hơn trên nhóm có mức độ xơ hóa

gan F1 là 26,6±14 năm, ít hơn trên nhóm có mức độ xơ hóa gan F2 là

33,9±7,9 năm. Sự khác biệt về mức độ xơ hóa với thời gian sống trung bình

tại vùng tồn lƣu dioxin có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05.

Nhƣ vậy trên nhóm nghiên cứu chúng ta thấy không có mối liên quan

giữa tuổi và giới với mức độ xơ hóa. Có sự liên quan có ý nghĩa thống kê với

thời gian sống tại vùng ô nhiễm tồn lƣu dioxin với mức độ xơ hóa, thời gian

sống tại vùng ô nhiễm càng lâu thì mức độ xơ hóa càng nặng. Có nhiều

129

nghiên cứu trên các bệnh lý mạn tính nói chung và bệnh gan mạn tính nói

riêng có kết quả khi tác nhân gây bệnh càng lâu thì mức độ bệnh càng nặng.

Viêm gan mạn tính là một tình trạng bệnh liên quan đến quá trình phá

hủy và thoái hóa không ngừng nhu mô gan dẫn đến xơ hóa gan và xơ gan.

Hầu hết bệnh gan mạn tính đều dẫn đến xơ hóa gan và tiến triển đến xơ gan.

Xơ hóa là hậu quả của tổn thƣơng mạn tính ở gan, biểu hiện bởi sự tích tụ cơ

chất gian bào, trong khi đó những tổn thƣơng gan cấp tính tự giới hạn không

gây xơ hóa, trừ khi tổn thƣơng diễn tiến thành mạn tính. Xơ hóa gan là tình

trạng tích tụ chất nền ngoại bào trong gan, là hậu quả của đáp ứng làm lành

tổn thƣơng gan trƣớc những tổn thƣơng lập đi lập lại liên tục khác nhau nhƣ:

viêm gan vi-rút, tự miễn, thuốc, rƣợu, bệnh về đƣờng mật, chuyển hóa và

miễn dịch [16]. Xơ hóa gan thƣờng khởi phát âm thầm, phần lớn những bệnh

nhân này thƣờng tiến triển đến xơ gan sau một khoảng thời gian dài 15-20

năm. Nhƣ vậy theo y văn chúng ta có thể thấy rõ thời gian tác động kéo dài có

liên quan đến mức độ bệnh.

Theo y văn, uống rƣợu nhiều và kéo dài có thể mắc viêm gan mạn tính,

nguy cơ của bệnh nhân bệnh gan do rƣợu có liên quan đến thời gian uống và

lƣợng rƣợu uống hàng ngày. Nếu một ngƣời nam giới uống trung bình tên 80

g/ngày và nữ uống trên 60 g/ngày, uống liên tục trên 10 năm thì nguy cơ xơ

gan đến 12-15%. Những ngƣời uống quá 230 g alcohol/ngày trong 20 năm có

khoảng 50% nguy cơ phát triển xơ gan. Nghiên cứu của Lê Thị Thu Hiền trên

83 bệnh nhân bệnh gan do rƣợu cho thấy thời gian uống rƣợu càng nhiều mức

độ xơ hóa gan càng nặng có ý nghĩa thống kê [127].

Mặc dù tỷ lệ nghiện rƣợu ở nam giới cao hơn, nhƣng phụ nữ lạm dụng

rƣợu dễ gây tổn thƣơng gan hơn, bệnh tiến triển nhanh và nặng hơn so với

nam giới. Ngƣợc lại tổn thƣơng gan do vi-rút B và vi-rút C ở nữ lại tiến triển

chậm hơn nam giới [84].

130

4.5.1.2 Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và nồng độ dioxin

Bên cạnh, có sự liên quan thời gian tác động của tác nhân gây bệnh với

mức độ bệnh trên các bệnh nhân mạn tính thì cƣờng độ tác động của tác nhân

gây bệnh cũng có mối liên quan. Chúng tôi tiến hành phân tích mối liên quan

giữa nồng độ trung bình dioxin với mức độ xơ hóa có kết quả.

TEQ trung bình trên nhóm bệnh nhân có mức độ xơ hóa gan F0 là 37,8 ±

26 pg/g lipid thấp hơn nhóm có mức độ xơ hóa gan F1 là 42,7 ± 37,1 pg/g

lipid thấp hơn nhóm có mức độ xơ hóa gan F2 là 152,6 ± 230 pg/g lipid . Sự

khác biệt giữa nhóm Fo-F1 và F0-F2 không có ý nghĩa thống kê với p>0,05,

sự khác biệt giữa nhóm F1-F2 có ý nghĩa thống kê với p<0,05.

Chúng tôi không thấy có các nghiên cứu tƣơng tự về mức độ tổn thƣơng

gan với nồng độ dioxin để so sánh. Tuy nhiên, có nhiều công trình nghiên cứu

trên các nhóm bệnh gan mạn tính cho thấy cƣờng độ tác nhân gây bệnh có

liên quan đến mức độ tổn thƣơng gan.

Đối với viêm gan vi rút B mạn tính, mức độ viêm và hoại tử và các biến

chứng có mối liên quan với mức độ sao chép của vi rút và tải lƣợng vi rút

huyết thanh [128]. Báo cáo của Highleymen L. và cs về tải lƣợng vi rút với

mức độ xơ hóa theo thang điểm Metavir thì có mối liên quan giữa tải lƣợng vi

rút với mức độ bệnh A2 và A3, giai đoạn bệnh F2-F4. Tuy nhiên có những

báo cáo cho thấy không có mối liên quan giữa tổn thƣơng mô bệnh học và tải

lƣợng vi rút nhƣ Alam S. và cs (Bangladesh) nghiên cứu mô bệnh học trên

191 bệnh nhân theo thang điểm Knodell và so sánh tổn thƣơng mô học viêm

và hoại tử và tổn thƣơng xơ hóa gan giữa các mức tải lƣợng vi rút khác nhau

cho thấy không có mối liên quan giữa tổn thƣơng viêm, hoại tử và mức độ xơ

hóa với các mức tải lƣợng vi rút [129].

Có sự đồng thuận về sự liên quan giữa số lƣợng rƣợu sử dụng và tiến

triển của bệnh gan do rƣợu. Nguy cơ xơ gan hoặc bệnh gan mạn tính tăng lên

nếu sử dụng 30-50 g alcohol/ngày. Tỷ lệ phát triển xơ gan khi sử dụng > 30g

131

alcohol/ngày là 23,6% và khi so với ngƣời không sử dụng là 13,7%. Nghiên

cứu của Trần Thị Thu Hiền trên 83 bệnh nhân bệnh gan do rƣợu cho thấy

lƣợng rƣợu sử dụng càng nhiều mức độ xơ hóa gan càng nặng có ý nghĩa

thống kê [127].

Nồng độ TEQ trung bình trên nhóm sống tại vùng ô nhiễm dioxin dƣới

16 năm là 26,1 ± 11,5 pg/g lipid thấp hơn nhóm sống tại vùng ô nhiễm dioxin

từ 16-30 năm là 82,7 ± 182,4 pg/g lipid, thấp hơn nhóm sống trên 30 năm là

89,7 ± 83,4 pg/g lipid tuy nhiên sự khác biệt giữa các nhóm không có ý nghĩa

thống kê với p>0,05.

4.5.1.3. Mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và tính đa hình gen Cyp2C19 và

MDR1.

Kết quả trên nhóm nghiên cứu vê mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và

tính đa hình gen Cyp2C19 cho thấy: Tỷ lệ mức độ xơ hóa F2 trên nhóm

chuyển hóa vừa (37,9%) cao hơn so với trên nhóm chuyển hóa mạnh (12,5%).

Tỷ lệ mức độ xơ hóa F1 trên nhóm chuyển hóa vừa (33,3%) thấp hơn so với

nhóm chuyển hóa mạnh (62,5%). Mức độ xơ hóa F0 trên 2 nhóm là tƣơng

đƣơng. Nhóm chuyển hóa chậm chỉ có 1 trƣờng hợp bị mức độ xơ hóa F1. Sự

khác biệt giữa các nhóm không có ý nghĩa thống kê.

Về mối liên quan giữa mức độ xơ hóa và tính đa hình gen MDR1 cho

thấy: Trên 3 kiểu gen tỷ lệ mức độ xơ hóa gần nhƣ tƣơng đƣơng. Với kiểu

gen T/T tỷ lệ trên cả 3 nhóm F1, F2, F3 là 33,3%. Với kiểu gen C/T tỷ lệ mức

độ xơ hóa F0, F1, F2 tƣơng ứng là 22,2%, 44,4% và 33,3%. Kiểu gen C/C tỷ

lệ mức độ xơ hóa F0, F1, F2 là 33,3%, 41,7% và 25%.

Để làm sáng tỏ ở cấp độ gen về mối liên quan phơi nhiễm với dioxin và

PCB và bệnh lý lạc nội mạc tử cung, một nghiên cứu bệnh chứng đã đƣợc

thực hiện tại Nhật Bản. Nghiên cứu tìm hiểu liệu rằng tính đa hình của gen

cytochrome P450 có làm thay đổi mức độ tác động của dioxin và PCB lên

nguy cơ lạc nội mạc tử cung hay không. Nghiên cứu bao gồm 138 phụ nữ

132

hiếm muộn trong độ tuổi 20 đến 45, đƣợc chẩn đoán qua nội soi ổ bụng và

phân thành ba nhóm : đối chứng (không lạc nội mạc tử cung), lạc nội mạc tử

cung giai đoạn sớm (giai đoạn I- II) và lạc nội mạc tử cung giai đoạn tiến triển

(giai đoạn III - IV). Không thấy mối liên quan một cách độc lập giữa dạng đa

hình của gen Cyp1A1 Ile462Val và gen Cyp1B1 Leu432Val (kiểu gen có so

với kiểu gen không có allele phụ) cũng nhƣ nồng độ dioxin và PCB trong

huyết thanh (nồng độ cao so với nồng độ thấp) với nguy cơ lạc nội mạc tử

cung giai đoạn sớm hay giai đoạn tiến triển. Tuy nhiên, kiểu gen với allele

CYP1A1 462Val làm giảm một cách có ý nghĩa thống kê nguy cơ lạc nội mạc

tử cung tiến triển ở nhóm nồng độ TEQ trong huyết thanh cao (OR hiệu chỉnh

= 0,13; khoảng tin cậy 95%: 0,02 - 0,76). Mặc dù không tìm thấy mối liên

quan giữa nồng độ PCB (TEQ) huyết thanh với lạc nội mạc tử cung tiến triển

ở bất kỳ dạng nào của đa hình gen Cyp1B1 Leu432Val, tuy nhiên sự tƣơng tác

có ý nghĩa thống kê (P = 0,05). Dạng đa hình của gen Cyp1A1 và Cyp1B1có

thể thay đổi mối liên quan giữa phơi nhiễm từ môi trƣờng với các hợp chất

Chlo hữu cơ và nguy cơ lạc nội mạc tử cung tiến triển [130].

Wang H và cs có nghiên cứu cho thấy, kiểu gen chuyển hóa kém của gen

Cyp2C19 có liên quan đến tần suất mắc mới một số thể ung thƣ nhƣ ung thƣ

phổi, dạ dày, ung thƣ gan trên một số cộng đồng dân cƣ châu Á [55].

Sự liên quan giữa tính đa hình kiểu gen MDR1 C3435 T với một số tình

trạng bệnh lí đã nhiều công trình nghiên cứu. Schwab và cs báo cáo rằng suy

giảm chức năng màng chắn ở các đối tƣợng có kiểu gen 3435TT có thể làm

cho kiểu gen này làm cho sự phát triển của viêm đại tràng sẽ nhạy cảm hơn.

Hơn nữa, những dự liệu cho thấy nguy cơ gia tăng viêm đại tràng gấp hai lần

ở bệnh nhân có kiểu gen MDR1 3435TT, chính vì thế mà nó ủng hộ quan

điểm cho rằng sự biểu hiện biểu hiện P-gp thấp hơn trong kiểu gen này đóng

một vai trò trong việc bảo vệ chống lại vi khuẩn đƣờng tiêu hóa và tạo thành

một yếu tố nguy cơ cho sự phát triển của viêm loét đại tràng [64]. Potocnik và

133

cs cho rằng MDR1 là một mục tiêu tiềm năng trong liệu pháp điều trị đích cho

các bệnh nhân bị bệnh Crohn và viêm loét đại tràng [65]. Bằng chứng mới

đây cũng đã gợi ý rằng bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính ở trẻ em có các

biến thể đồng hợp tử T phổ biến hơn [68].

Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng đa hình gen MDR1 C3435T có liên

quan đến tốc độ diệt vi khuẩn H. pylori trong điều trị ba thuốc ức chế bơm

proton (PPI). Tuy nhiên, kết luận không nhất quán. Le và cộng sự đã tiến

hành phân tích tổng hợp chỉ ra rằng kiểu gen TT của đa hình MDR1 C3435T

đã làm giảm sự diệt trừ H. pylori ở dân số châu Á và cũng có liên quan đến tỷ

lệ chữa khỏi của H. pylori ở những bệnh nhân sử dụng liệu pháp ba loại dựa

trên lansoprazole và omeprazole. Trong các phân tích đƣợc phân tầng theo

loại bệnh, không thấy sự khác biệt đáng kể ở nhóm loét dạ dày và phân nhóm

bệnh kết hợp. Tuy nhiên, tác giả chỉ ra các nghiên cứu trong tƣơng lai sử dụng

cỡ mẫu lớn hơn là bắt buộc [131].

4.5.2. Mối liên quan giữa tính đa hình gen Cyp2C19, MDR1 và nồng độ

dioxin

Trên nhóm nghiên cứu mối liên quan giữa tính đa hình gen Cyp2C19 và

nồng độ dioxin cho thấy: Nồng độ trung bình dioxin trên nhóm có kiểu hình

gen Cyp2C19 chuyển hóa mạnh là 19,1±21,5 thấp hơn so với nhóm chuyển

hóa vừa 61,1±153,6. Nhóm chuyển hóa chậm có 1 trƣờng hợp có nồng độ

trung bình là 54,5. Sự khác biệt về nồng độ trung bình giữa các nhóm là

không có ý nghĩa thống kê với p >0,05.

Về mối liên quan giữa tính đa hình gen MDR1 và nồng độ dioxin: Kiểu

gen C/C có nồng độ trung bình dioxin cao nhất 174,1 ±204,7, tiếp đến là kiểu

gen T/T là 53,9±70,4, thấp nhất là kiểu gen C/T là 34,6±66,1. Sự khác biệt

giữa các nhóm là không có ý nghĩa thống kê.

Kiểu gene MDR1 có ý nghĩa đối với nguy cơ mắc bệnh và kết quả điều

trị của AIDS, thuốc ức chế protease HIV tất cả hiện đang bán trên thị trƣờng

134