Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu ứng dụng nano kim loại Ag và Cu trong ức chế nấm Penicillium digitatum và Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên quả cam tại Hàm Yên - Tuyên Quang (Citrus nobilis Lour)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------***------------

Nguyễn Vũ Mai Linh

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NANO KIM LOẠI AG VÀ CU

TRONG ỨC CHẾ NẤM PENICILLIUM DIGITATUM VÀ

COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES GÂY BỆNH TRÊN

QUẢ CAM TẠI HÀM YÊN - TUYÊN QUANG (CITRUS NOBILIS LOUR)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------***------------

Nguyễn Vũ Mai Linh

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NANO KIM LOẠI AG VÀ CU

TRONG ỨC CHẾ NẤM PENICILLIUM DIGITATUM VÀ

COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES GÂY BỆNH TRÊN

QUẢ CAM TẠI HÀM YÊN - TUYÊN QUANG (CITRUS NOBILIS LOUR)

Chuyên ngành: Khoa học Môi trƣờng

Mã số: 8440301.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. Phan Thị Hồng Thảo

PGS. TS. Nguyễn Kiều Băng Tâm

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS. Phan Thị Hồng

Thảo và PGS.TS. Nguyễn Kiều Băng Tâm đã tận tâm hướng dẫn và truyền đạt kiến

thức chuyên môn cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài. Xin cảm ơn nguồn

kinh phí từ dự án Khoa học công nghệ trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam, mã số VAST.TĐ.NANO-NN/15-18, “Nghiên cứu ứng dụng

Công nghệ nano trong nồng nghiệp” do PGS.TS. Nguyễn Hoài Châu làm chủ

nhiệm.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Môi trường, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dành mọi tâm huyết giảng

dạy, trang bị kiến thức cho tôi trong suốt khóa học này.

Tôi cũng xin cảm ơn tập thể nghiên cứu viên Phòng Vi sinh vật đất, Viện

Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn nhiệt

tình cộng tác và giúp đỡ tôi để hoàn thành đề tài này.

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên

động viên, chia sẻ khó khăn giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận

văn này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Học viên cao học

Nguyễn Vũ Mai Linh

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ 3

DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. 4

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... 5

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 7

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ..................................................................................... 9

1.1. Giới thiệu về giá trị của quả cam và vai trò của cây cam Hàm Yên –

Tuyên Quang ............................................................................................................ 9

1.2. Các bệnh phổ biến trên quả cam sau thu hoạch........................................ 11

1.2.1. Bệnh mốc xanh do nấm Penicillium digitatum trên cam ............................ 12

1.2.2. Bệnh thán thư do Colletotrichum gloeosporioides gây ra ........................... 16

1.3. Các phƣơng pháp bảo quản trái cây sau thu hoạch .................................. 20

1.3.1. Phương pháp bảo quản hóa học ................................................................... 20

1.3.2. Phương pháp bảo quản bằng các loại màng ............................................... 22

1.4. Công nghệ nano và tiềm năng ứng dụng của nano ................................... 22

1.4.1. Giới thiệu về công nghệ nano và tình hình nghiên cứu trên thế giới ........ 22

1.4.2. Tiềm năng ứng dụng của nano ..................................................................... 24

1.4.3. Tình hình nghiên cứu nano trong nước ...................................................... 29

2.1. Hóa chất ......................................................................................................... 31

2.2. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 31

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 32

2.3.1. Phân lập nấm từ cam bệnh ............................................................................ 32

2.3.2. Xác định đặc điểm nuôi cấy và phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự

gen ITS ..................................................................................................................... 32

2.3.3. Khảo sát khả năng ức chế của nano kim loại đối với nấm ở giai đoạn bào tử .... ..................................................................................................................... 32

1

2.3.4. Khảo sát khả năng ức chế của nano kim loại đối với nấm ở giai đoạn sinh dưỡng ..................................................................................................................... 33

2.3.5. Xác định tác dụng của nano kim loại ở các nồng độ khác nhau lên nấm gây bệnh trên cam .................................................................................................... 33

2.3.6. Đánh giá chất lượng của quả cam bảo quản sau xử lý nano ở quy mô phòng thí nghiệm ..................................................................................................... 34

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 35

3.1. Phân lập nấm Penicilium và Colletotrichum gây bệnh trên cam Hàm Yên -

Tuyên Quang .......................................................................................................... 35

3.1.1. Phân lập nấm Penicillium ............................................................................ 35

3.1.2. Phân lập nấm Colletotrichum ...................................................................... 36

3.2. Định danh nấm N8 và N11 dựa vào trình tự gen ITS .................................. 38

3.3. Khả năng ức chế của các nano kim loại Ag và Cu đến sự sinh trƣởng của

nấm Penicillium digitatum N11 và Colletotrichum gloeosporioides N8 .............. 40

3.3.1. Giai đoạn bào tử ............................................................................................ 40

3.3.2. Giai đoạn sinh dưỡng.................................................................................... 46

3.4. Nghiên cứu ứng dụng nano trong hạn chế bệnh trên quả cam Hàm Yên -

Tuyên Quang trong lây nhiễm nhân tạo .............................................................. 54

3.5. Đánh giá chất lƣợng của quả cam sau xử lý nano bảo quản ở quy mô nhỏ ..

..................................................................................................................... 58

3.5.1. Ảnh hưởng của sử dụng nano đến tỷ lệ thối hỏng và mốc cuống quả cam58

3.5.2. Ảnh hưởng của sử dụng nano AgH đến chất lượng quả cam trong bảo

quản ..................................................................................................................... 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 66

2

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Adenosine triphosphate ATP

Deoxyribonucleic acid DNA

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

Internal transcribed spacer ITS

Minimum Fungicidal Concentration MFC

Minimum Inhibitory Concentration MIC

PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng khuếch đại gen

rDNA Ribosome Deoxyribonucleic Acid

3

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Một số chất diệt nấm được sử dụng trong bảo quản quả sau thu hoạch --- 20

Bảng 2. Tính chất của các nano Ag và Cu sử dụng trong nghiên cứu --------------- 31

Bảng 3. Mức độ tương đồng của gen mã hóa vùng ITS của chủng nấm N11 với các

chủng trên GenBank ------------------------------------------------------------------------- 39

Bảng 4. Mức độ tương đồng của gen mã hóa vùng ITS của chủng nấm N8 với các

chủng trên GenBank ------------------------------------------------------------------------- 40

Bảng 5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt (MFC) của nano kim loại

Ag và Cu đối với bào tử nấm P. digitatum N11 ----------------------------------------- 41

Bảng 6. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và tiêu diệt (MFC) của các chất nghiên cứu

đối với bào tử nấm C. gloeosporioides N8 ----------------------------------------------- 42

Bảng 7. Ảnh hưởng của nano kim loại đến khả năng phát triển của nấm N11 ----- 47

Bảng 8. Tỷ lệ cam bị bệnh trong điều kiện xâm nhiễm nấm N11 xử lý với nano

AgH sau 5 ngày ------------------------------------------------------------------------------ 56

Bảng 9. Tỷ lệ cam bị bệnh trong điều kiện xâm nhiễm nấm N8 xử lý với nano AgH

sau 5 ngày ------------------------------------------------------------------------------------- 57

Bảng 10. Ảnh hưởng của nano bạc đến tỷ lệ thối hỏng của quả cam ---------------- 59

Bảng 11. Chất lượng quả cam bảo quản với màng EC có bổ sung các nồng độ nano

AgH khác nhau theo ngày ------------------------------------------------------------------ 61

4

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Sản lượng cây có múi Việt Nam từ năm 1990 đến năm 2015 .................... 10

Hình 2. Quả cam bị bệnh mốc xanh, hình thái nấm N11 trên môi trường Hansen,

Czapek và cấu trúc sinh sản và bào tử nấm N11 ...................................................... 36

Hình 3. Cam bị bệnh thán thư .................................................................................. 36

Hình 4. Hình thái khuẩn lạc nấm N8 nuôi cấy trên đĩa môi trường PDA sau 3 ngày

và 2 tuần .................................................................................................................... 37

Hình 5. Khuẩn lạc nấm N8 trên môi trường Czapek; cơ quan sinh bào tử và bào tử

của nấm N8 .............................................................................................................. 37

Hình 6. Điện di kiểm tra DNA tổng số và sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS của

chủng nấm N11 và N8 trên gel agarose 1% .............................................................. 38

Hình 7. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các nano kiểm tra với bào tử nấm

N11với nano Cu , nano AgH, nano Ag và Carbendazim ......................................... 42

Hình 8. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với bào tử nấm N8 với nano Cu, nano Ag,

nano AgH và Carbendazim ....................................................................................... 43

Hình 9. Đánh giá mức độ tác động của nano với nấm N11 ở giai đoạn bào tử với

nano Ag, nano Cu ...................................................................................................... 44

Hình 10. Ảnh hưởng của nano đến khả năng phát triển hình thành khuẩn lạc của

nấm N8 ở giai đoạn bào tử với nano AgH, nano Ag, nano Cu ............................... 45

Hình 11. Hiệu quả ức chế nấm của nano Ag và nano Cu đối với nấm N11 sau 10

ngày ........................................................................................................................... 48

Hình 12. Hiệu quả ức chế nấm của các nano AgH đối với nấm N11 sau 3 ngày và

10 ngày ...................................................................................................................... 48

Hình 13. Hiệu quả ức chế nấm của Carbendazim đối với nấm N11 trong 10 ngày . 49

Hình 14. Hiệu quả ức chế của nano Cu đối với C. gloeosporioides N8 sau 7 ngày 49

Hình 15. Hiệu quả ức chế của nano Ag đối với C. gloeosporioides N8 sau 7 ngày 50

Hình 16. Ảnh hưởng của nano đồng đến sinh trưởng của nấm N8 .......................... 50

Hình 17. Ảnh hưởng của bạc đồng đến sinh trưởng của nấm N8 ............................ 50

Hình 18. Hiệu quả ức chế của AgH đối với C. gloeosporioides N8 sau 7 ngày ...... 51

5

Hình 19. Ảnh hưởng của nano AgH đến sự phát triển của nấm N8......................... 51

Hình 20. Hiệu quả ức chế của Carbendazim với nấm N8 ........................................ 51

Hình 21. Cam Hàm Yên - Tuyên Quang được chuẩn bị cho thí nghiệm ................. 54

Hình 22. Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro đối với nấm N8 ........... 55

Hình 23. Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro đối với nấm N11 ......... 55

Hình 24. Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro xử lý với Anvil đối với

nấm N11 và nấm N8 ................................................................................................. 55

Hình 25. Ảnh hưởng của nano bạc đến tỷ lệ mốc cuống của quả cam .................... 60

Hình 26. Hình ảnh cam bảo quản theo ngày ở quy mô pilot .................................... 64

6

MỞ ĐẦU

Cam là một loại quả rất quan trọng, được Việt Nam định hướng là mặt hàng

thương mại được chú trọng đầu tư đến năm 2030. Sau khi thu hoạch, quả cam

thường được lưu trữ, bảo quản và phân phối. Tuy nhiên, hư hỏng do nấm gây bệnh

thực vật là yếu tố chính hạn chế thời hạn sử dụng của trái cam, gây ra những thất

thoát về cả số lượng và chất lượng của quả. Tăng thời gian bảo quản bằng cách hạn

chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối hỏng trên trái cây có thể giảm tổn thất kinh

tế. Hiện nay, tại Việt Nam, thuốc bảo quản hóa học đang được sử dụng tràn lan và

sự lạm dụng hóa chất đang gây ra những tác động tiêu cực đến môi trường cũng như

sức khỏe con người. Sự kháng thuốc của các vi sinh vật ngày càng gia tăng, thiếu

hụt các biện pháp thay thế thuốc diệt nấm hiệu quả đồng thời những lo ngại về sức

khỏe do đặc tính gây ung thư của hóa chất là thách thức lớn trong lĩnh vực bảo quản

thực phẩm. Thực tế này đặt ra yêu cầu cấp thiết cho sự tìm kiếm cách tiếp cận và

các phương pháp khác an toàn hơn, thân thiện với môi trường để giảm tổn thất sau

thu hoạch.

Trong vài thập kỷ gần gây, vật liệu nano đã nhanh chóng chiếm vị trí quan

trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ do những đặc tính khác biệt của

chúng so với vật liệu khối và khả năng ứng dụng chuyên sâu trong nhiều lĩnh vực

khoa học. Trong những năm đầu tiên, việc áp dụng công nghệ nano trong sản xuất

nông nghiệp chủ yếu được thực hiện qua các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm,

nhưng ngay sau đó nó đã bắt đầu và đang tiếp tục có ảnh hưởng đáng kể trong các

ngành quan trọng. Các vật liệu nano cũng được chú trọng sử dụng trong lĩnh vực

quản lý chất lượng nước và nông sản, đặc biệt là để bảo quản, đóng gói nông sản.

Các ứng dụng trong tương lai hướng tới kéo dài thời hạn sử dụng, cải thiện chất

lượng thực phẩm. Việc áp dụng công nghệ nano vào các ngành nông nghiệp và thực

phẩm được đặt ra lần đầu tiên trong chương trình hành động của Bộ Nông nghiệp

Hoa Kỳ vào tháng 9 năm 2003 và được dự đoán sẽ là công nghệ then chốt tạo ra

thay đổi quan trọng trong các ngành này.

7

Vật liệu chứa nano kim loại kháng khuẩn, kháng nấm dùng trong đóng gói

thực phẩm là một hình thức đầy hứa hẹn của “bao bì thực phẩm hoạt hóa”, đóng

một vai trò quan trọng trong việc kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm và giảm

nguy cơ gây bệnh. Xuất phát từ ý tưởng đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu ứng dụng nano kim loại Ag và Cu trong ức chế nấm Penicillium

digitatum và Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên quả cam tại Hàm Yên

- Tuyên Quang (Citrus nobilis Lour)” nhằm ứng dụng và phát triển công nghệ

nano trong hạn chế nấm bệnh thực vật điển hình trên quả cam, thay thế cho các loại

hóa chất độc hại đang hiện hành, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con

người.

 Mục tiêu của luận văn: Nghiên cứu ứng dụng của chế phẩm nano để ức chế

nấm gây bệnh mốc xanh và bệnh thán thư trên quả cam Hàm Yên- Tuyên

Quang.

 Ý nghĩa khoa học của luận văn:

+ Góp phần nghiên cứu phát triển thêm giải pháp hiệu quả theo hướng thân

thiện với môi trường, thay thế cho biện pháp sử dụng hóa chất trong xử lý

nấm gây thối hỏng quả cam sau thu hoạch

 Nội dung nghiên cứu:

+ Phân lập và định danh được chủng nấm Penicillium sp. gây bệnh mốc xanh

và Colletotrichum sp. bệnh thán thư trên quả cam Hàm Yên- Tuyên Quang.

+ Xác định được nano kim loại thích hợp để ức chế nấm Penicillium sp. và

Colletotrichum sp. trên quả cam.

+ Xác định được nồng độ nano kim loại có khả năng ứng dụng trong bảo quản

quả cam.

+ Đánh giá chất lượng quả cam khi được xử lý với nano sau thời gian bảo

quản.

8

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về giá trị của quả cam và vai trò của cây cam Hàm Yên –

Tuyên Quang

 Giá trị của quả cam

Cam là một loại quả rất quan trọng được con người sử dụng từ thời cổ đại, và

hiện nay được trồng ở trên 100 nước trên thế giới. Quả cam là nguồn cung cấp dồi

dào vitamin C - là hoạt chất có khả năng chống oxy hóa cao [18]. Trong 100 g cam

có chứa hàm lượng dinh dưỡng cao: Calo (47 kcal), Kali (181 mg), Cacbohydrat

(11,75 g), chất xơ (2,4 g), đường (9,35 g), protein (0,94 g ), vitamin A (225 IU ),

vitamin C (53,2 mg), Canxi (40 mg ) [50].

40 - 45% sản lượng cam của thế giới được tiêu thụ trong công nghiệp sản xuất

nước ép. Brazil là nước sản xuất nước cam nhiều nhất thế giới, sau đó là Florida,

Hoa Kỳ. Tinh dầu cam được chế biến bằng cách ép vỏ, nó được dùng làm gia vị

trong thực phẩm và làm hương vị trong nước hoa. Tinh dầu từ quả cam chứa

khoảng 90% D-Limonene, một dung môi có trong nhiều hóa chất dùng trong gia

đình, cùng với dầu chanh dùng để làm chất tẩy dầu mỡ và tẩy rửa nói chung. Chất

tẩy rửa từ tinh chất cam hiệu quả, thân thiện với môi trường, và ít độc hại hơn sản

phẩm cất từ dầu mỏ, đồng thời có mùi dễ chịu hơn [54].

 Vai trò của cây cam trên thế giới và tại Việt Nam

Cây có múi là cây ăn quả quan trọng nhất trên thế giới, với tổng sản lượng

vượt xa các cây rụng lá như táo, lê, đào và mận. Sản lượng trồng các loại cây có

múi ở thế giới trong niên vụ 2014 - 2015 vào khoảng 130,947 triệu tấn, trong đó

cam giữ vị trí dẫn đầu với 52,39%, thứ hai là quýt 29,25%, 11,83% chanh, và

6,53% bưởi. Tổng số sản lượng các loại trái cây có múi đã tăng lên trong những

thập kỷ qua và đạt mức cao nhất là 131 triệu tấn trong năm 2014 [15]. Cam được

trồng rộng rãi ở những nơi có khí hậu ấm áp, và vị cam có thể biến đổi từ ngọt đến

chua. Khu vực Địa Trung Hải gồm các nước xuất khẩu trái cây tươi lớn nhất. Các

nhà nhập khẩu lớn nhất là Đức, Pháp, Hà Lan và Anh. Hiện nay cam quýt được

trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, giới hạn bởi vĩ độ 40 Bắc, Nam tại hơn

9

137 quốc gia trên 6 lục địa và tạo ra khoảng 105 tỷ $ mỗi năm trên thị trường trái

cây thế giới [19].

Theo số liệu về cây có múi năm 2014 và 2015 của FAO [15], tại Việt Nam,

tổng sản lượng cây có múi năm 1990 đạt 109,2 nghìn tấn đã tăng lên 985,6 nghìn

tấn năm 2015 và 998,7 nghìn tấn năm 2016. Trong đó, sản lượng cam đạt 520 nghìn

tấn năm 2015 và luôn đóng vai trò quan trọng nhất trong sản lượng cây có múi.

Trong quy hoạch phát triển cây nông nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm

2030 của Chính Phủ, cây cam, quýt được định hướng phát triển từ 61,5 nghìn ha

năm 2010 mở rộng đến diện tích 115 nghìn ha và là quả thương mại được chú trọng

đầu tư.

Sản lƣợng cây có múi tại Việt Nam

998,7

1000

900

800

ì

700

) n ấ t n h g N

600

(

500

400

g n ơ ƣ

l

300

n ả S

200

109,2

100

0

Năm 1990

Năm 2015

Hình 1. Sản lượng cây có múi Việt Nam từ năm 1990 đến năm 2015 [15]

Một số giống cam đặc sản ở Việt Nam bao gồm cam Sành Bố Hạ, cam Sành

Hà Giang - Tuyên Quang - Yên Bái, Cam Xã Đoài, Cam Ham-Lin, Cam Sông Con,

Cam Vân Du, Cam Bù Hà Tĩnh, Cam Canh [51].

10

 Cam Sành Hàm Yên-Tuyên Quang

Tuyên Quang có tọa độ 21°46′38″B 105°13′42″Đ, là một tỉnh thuộc vùng

Đông Bắc Việt Nam. Khu vực này có điều kiện tự nhiên - kinh tế xã hội thuận lợi

để sản xuất một số sản phẩm nông nghiệp. Trong đó, cam Sành là giống cây địa

phương đã được người dân ưu tiên khai thác từ lâu đời và đem lại nguồn thu nhập

đáng kể cho người nông dân. Trên địa bàn huyện Hàm Yên, cam Sành được trồng ở

15 xã, thị trấn, trong đó có 9 xã, thị trấn nằm trong vùng được quy hoạch gồm: Yên

Thuận, Yên Phú, Bạch Xa, Minh Khương, Minh Dân, Yên Lâm, Tân Thành, Phù

Lưu và thị trấn Tân Yên. Trong mùa vụ 2015-2016, huyện Hàm Yên có 4037,9 ha

cam Sành, năng suất trung bình trên 13 tấn / ha, sản lượng đạt 31,075 tấn quả; tổng

thu nhập trên 310 tỷ đồng. Đặc biệt, năm 2013 cam Sành Hàm Yên đã được vinh

danh và lọt vào Top 10 loại trái cây nổi tiếng bậc nhất Việt Nam. Xác định đây là

loại cây trồng mũi nhọn trong phát triển kinh tế, huyện Hàm Yên sẽ ưu tiên phát

triển, mở rộng diện tích vùng trồng cam trong những năm tiếp theo và đẩy mạnh

thương hiệu cam Sành Hàm Yên [56].

1.2. Các bệnh phổ biến trên quả cam sau thu hoạch

Trái cây sau thu hái luôn có những biến đổi về vật lý, sinh lý và sinh hóa,

gây ra những thất thoát về cả số lượng và chất lượng của quả. Các biến đổi này xảy

ra có mối liên hệ chặt chẽ với nhau và phụ thuộc nhiều vào yếu tố như giống, điều

kiện chăm sóc, độ chín, vận chuyển, kỹ thuật bảo quản... Trong đó, yếu tố vi sinh

vật gây ra sự tổn thất đáng kể của trái cam sau thu hoạch. Tại Việt Nam, khí hậu nhiệt đới nóng ẩm quanh năm, nhiệt độ trên 20oC đến 35oC (hoặc cao hơn), và độ

ẩm không khí thường xuyên trên 80 ÷ 90% nên rất thích hợp cho vi sinh vật phát

triển. Do đó, trái cây dù ở dạng tươi hay dạng đã chế biến, thường bị các vi sinh vật,

đặc biệt là nấm mốc gây hư hỏng, ảnh hưởng xấu đến chất lượng và giá trị thương

phẩm của trái cây [2].

Hư hỏng sau thu hoạch do nhiễm nấm tiềm ẩn thông qua vết thương gây ra

tổn thất lớn (25 ÷ 50%) và vẫn là một thách thức quan trọng trong sản xuất lương

thực bền vững [39]. Tình trạng tổn thất sau thu hoạch của các loại trái cây có múi

11

nói chung và quả cam nói riêng bắt nguồn từ một trong hai giai đoạn phát triển của

cây. Giai đoạn đầu là khoảng thời gian từ khi ra hoa đến khi quả chín. Giai đoạn thứ

hai kéo dài trong suốt quá trình thu hoạch đến các hoạt động bảo quản. Nhiễm nấm

thường tiềm ẩn trong quả trước khi thu hoạch, ngay tại các vườn trồng, trong quá

trình thu hái và trong quá trình hoàn thiện sản phẩm: tại các nhà buôn, nhà phân

phối, bán lẻ… nhưng tồn tại trong trạng thái nghỉ và hoạt động khi gặp các điều

kiện thích hợp cho sự phát triển.

Trong nhiều năm qua, Viện Bảo vệ thực vật đã điều tra phát hiện trên cây có

múi tại Việt Nam có tới 19 loại bệnh do nấm, 2 loại bệnh do vi rút, 2 loại do bệnh vi

khuẩn. Hiện nay, các vùng trồng cam quýt ở nước ta bị nhiễm các bệnh do nấm

Phytophthora (bệnh chảy gôm), Capnodium citri (bệnh nấm muội đen), vi khuẩn

Xanthomonas (bệnh loét) vv…, nấm Colletotrichum gloeosporioides (bệnh thán

thư), nấm Lasiodiplodia theobromae (bệnh thối cuống), Penicillium digitatum

(bệnh mốc xanh lá), P. intalicum (bệnh mốc xanh da trời)… [52]. Bệnh thán thư và

bệnh mốc xanh là nguyên nhân chính gây thất thoát nặng nề sau thu hoạch cho trái

cam tại Hàm Yên, Tuyên Quang.

1.2.1. Bệnh mốc xanh do nấm Penicillium digitatum trên cam

Trong số các tác nhân gây bệnh từ vết thương, nấm mốc xanh lá

(P.digitatum) và mốc xanh da trời (P. italicum) chính là nguyên nhân gây hư hỏng

quả có múi trên toàn thế giới [31]. Các bào tử trong Penicillium chứa sắc tố màu

xanh lá hoặc xanh da trời, đây là màu sắc đặc trưng của nấm khi phát triển và phát

bệnh trên quả.

Penicillium digitatum, nấm mốc màu xanh lá, được mô tả và phân loại bởi

Saccardo năm 1886. Hiện nay, tên khoa học được chấp nhận là Penicillium

digitatum (Pers: Fr.) Sacc. (MycoBank # 169.502). Theo cơ sở dữ liệu MycoBank,

có ba tên đơn vị phân loại: P. digitatum var. californicum Thom (1930), P.

digitatum var. digitatum, và P. digitatum var. latum S. Abe (1956). Các loài được

xếp vào giới Nấm, ngành Ascomycota (nấm túi hay nấm nang), ngành phụ

12

Pezizomycotina, lớp Eurotiomycetes, lớp phụ Eurotiomycetidae, bộ Eurotiales, họ

Trichocomaceae, và chi Penicillium [28].

Bề mặt khuẩn lạc có màu xanh lá và mặt dưới thường có màu vàng hoặc

xanh. Kết cấu khuẩn lạc có lông tơ, không có giọt tiết. Các loại nấm có khả năng

nảy mầm trong môi trường nhân tạo tại 5°C, không tăng trưởng ở 37°C. Bộ máy

sinh bào tử rất dễ vỡ và có xu hướng phá vỡ thành nhiều tế bào. Bào tử sinh ra từ

sợi nấm khí sinh, bề mặt bào tử đính trơn, có thành bao quanh, hình dạng thay đổi

từ elip đến hình trụ, kích thước không đồng đều, trung bình là 3,5 ÷ 8,0 × 3,0 ÷ 4,0

mm. Nảy mầm bào tử là bước đầu tiên để nấm bệnh xâm nhiễm vào cây chủ [28].

Thiệt hại thực tế do tác động của Penicillium thay đổi phụ thuộc vào khí hậu

và các yếu tố vườn cây ăn quả, giống quả, mức độ chấn thương vật lý quả trong thu

hoạch, hiệu quả của phương pháp xử lý nấm, và môi trường sau thu hoạch [41]. Tại

Tây Ban Nha, nghiên cứu của Tuset (1988) ước tính rằng quả thối hỏng do

Penicillium spp. chiếm 55 ÷ 80% tổng số quả bị hư hỏng sau thu hoạch khi theo dõi

trong suốt mùa vụ thương mại, và chiếm 30 ÷ 55% trong các phòng lưu trữ đóng

gói quả trong nhà. Kiểm tra ở New York, quả có múi ở California và Florida bị

nhiễm nấm mốc màu xanh lá và màu xanh da trời chiếm 30% các lô hàng kiểm tra

[7]. Mốc xanh lá thường gây thiệt hại lớn hơn trong thương mại hóa bởi vì nó chiếm

ưu thế ở nhiệt độ môi trường, nhưng mốc xanh da trời trở nên nghiêm trọng hơn khi

trái cây có múi bảo quản ở nhiệt độ rất lạnh trong thời gian dài vì P. italicum phát

triển nhanh hơn so với P. digitatum dưới 10°C [31]. Nhìn chung, tỷ lệ hư hỏng sau

thu hoạch cao hơn trong trồng trọt tại những vùng có lượng mưa dồi dào, như

Brazil, Florida hay Đông Nam Á. Mầm bệnh do nấm Penicillium spp. có ảnh hưởng

rất lớn đến tất cả các khu vực này vì chúng sinh sản rất nhanh, bào tử của chúng có

mặt khắp nơi trong bầu không khí, trên bề mặt trái cây và dễ dàng được phát tán bởi

dòng không khí. Vì vậy, nguồn gốc nấm bệnh trong vườn cam quýt và khu bảo

quản tồn tại trong suốt mùa vụ, và chính trái cây có thể bị lây nhiễm trong khu

vườn, trong khu bảo quản, đóng gói, phân phối và tiếp thị.

13

 Quá trình nhiễm bệnh của nấm

Bệnh sau thu hoạch được chia thành hai nhóm dựa trên thời gian chiếm ưu

thế nhiễm bệnh: nhiễm bệnh trước thu hoạch gây ra những mầm bệnh tiềm ẩn, và

nhiễm bệnh sau thu hoạch do những mầm bệnh trên vết thương. Nấm mốc

Penicillum gây bệnh theo cách thứ hai.

Penicillium digitatum và P. italicum là nguyên nhân gây bệnh cho trái cây có

múi chỉ thông qua nhiễm trùng vết thương vỏ. Thông thường, những vết thương

được gây ra trong quá trình thu hoạch và xử lý trái cây trong nhà đóng gói hoặc

trong quá trình thương mại hóa, nhưng một nấm bệnh có thể lây nhiễm trước khi

thu hoạch thông qua chấn thương, vết nứt hay vết thương do côn trùng. Trong

trường hợp này, nếu trái cây nhiễm bệnh một thời gian dài trước khi thu hoạch

thường rụng xuống khỏi cây, nhưng trái cây bị nhiễm ít hơn 3 ngày trước khi thu

hoạch không thể phát hiện được và có thể được thu hoạch như quả lành. Bào tử nấm

từ hoa quả thối rữa trên mặt đất trong vườn cây ăn quả, trong bao bì ở các cơ sở lưu

trữ, hoặc ở bất kỳ nơi nào trong quá trình vận chuyển và tiếp thị đang liên tục

chuyển động bằng dòng không khí và có thể dễ dàng lây nhiễm trái cây xung quanh.

Bệnh không phát tác nếu các trái cây có vỏ còn nguyên vẹn vì bào tử tự do nằm trên

bề mặt vỏ không thể nảy mầm. Ngược lại, các bào tử nằm ở vết thương bị vỡ tuyến

dầu của vỏ thường gây ra sự nhiễm bệnh chỉ trong vòng 48 giờ ở 20 ÷ 25°C. Bào tử

của nấm Penicillium spp. nảy mầm bên trong vết thương vỏ và sự phát triển sợi nấm

tiếp theo đòi hỏi nước, chất dinh dưỡng, điều kiện nhiệt độ và pH riêng [28].

Khi nhiễm P. digitatum thường chỉ nhìn thấy bằng mắt thường sau 3 ngày ở

điều kiện nhiệt độ phòng. Một vòng tròn xung quanh các chỗ bị nhiễm trùng (vỏ vết

thương) xuất hiện ướt nước, mềm và mất màu. Nấm sản xuất ra enzyme thủy phân,

chủ yếu là polygalacturonase và cellulase làm mềm các mô vỏ, tạo điều kiện phát

triển bệnh. Khi phát triển, sợi nấm khí sinh màu trắng phát triển tại trung tâm tổn

thương và mở rộng tỏa tròn. Tùy thuộc vào mức độ của nguồn bệnh, bào tử bắt đầu

hình thành sau 3 đến 5 ngày ở nhiệt độ phòng (15 ÷ 28°C), sau 7 đến 8 ngày, khu

vực trung tâm của tổn thương có màu xanh lá được bao quanh bởi một dải rộng dày

14

đặc, trắng của những sợi nấm không hình thành bào tử, giới hạn ngoài là viền vỏ

mục nát [28].

Chủng P. digitatum có thể thay đổi khả năng tấn công, nhưng không có báo

cáo nào về những chủng phân lập bị biến đổi di truyền làm mất khả năng gây độc.

Sự nhiễm bệnh rõ ràng và sự phát triển bệnh phụ thuộc vào số lượng bào tử của các

chủng Penicillium để sự xâm nhiễm thành công qua vết thương ở vỏ. Các mối quan

hệ giữa số lượng bào tử và tỷ lệ nhiễm thực tế là tuyến tính, với điều kiện là các trái

cây nhạy cảm cao (không non) và nhiệt độ thích hợp cho nhiễm trùng (20 ÷ 25°C).

Trong những điều kiện này, 50 và 500 bào tử của P. digitatum được cấy vào vết

thương vỏ cam trên dẫn đến tỷ lệ nhiễm nấm màu xanh lá tương ứng là 10% và 65%. Mật độ cấy 106 bào tử / ml P. digitatum đã được đề nghị là mật độ thí nghiệm

để thu được các các mức độ gây bệnh có thể chấp nhận được sau khi cấy nhân tạo

vào quả có múi để đánh giá khả năng kiểm soát của phương pháp điều trị chống

nấm sau thu hoạch. Nhiều báo cáo cho rằng Penicillium spp. thường kết hợp với

một mầm bệnh quan trọng từ vết thương sau thu hoạch trên cam quýt, ví dụ như

Geotrichum citri-aurantii (Ferraris) E.E. Butler - nguyên nhân gây ra bệnh thối

chua [28].

Mốc xanh lá xuất hiện thường xuyên hơn trên trái cây giữ ở nhiệt độ phòng,

vì nó phát triển nhanh hơn trong những điều kiện này. Các nghiên cứu in vitro khác

nhau cho thấy P. italicum nảy mầm và lớn nhanh hơn so với P. digitatum ở nhiệt độ

thấp và trong điều kiện khô hạn. Các nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm và phát triển

của cả hai loài là 25°C và chúng hoạt động trong khoảng 4 ÷ 30°C. Tuy nhiên,

chúng đều không thể phát triển ở 37°C. Khi cam bảo quản ở nhiệt độ 4°C, triệu

chứng mốc xanh lá có thể nhìn thấy sau 16 ngày. Ngược lại, P. digitatum lớn nhanh

hơn ở nhiệt độ khác nhau trên 10°C. Về ảnh hưởng của pH, kết quả bởi Prusky et al.

(2004) cho rằng P. digitatum và P. italicum tăng cường tính độc của chúng bằng

cách axit hóa môi trường xung quanh vết thương trên vỏ cam quýt [28].

15

 Các yếu tố sau thu hoạch ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm của nấm

Cả P. digitatum và P. italicum là mầm bệnh gây hại trên vết thương sau khi

thu hoạch. Sự xâm nhiễm vào trái non của các loại nấm rất hiếm khi phát triển

thành bệnh do khả năng kháng bệnh tự nhiên của cây chủ được kích hoạt bằng hàng

loạt cơ chế phức tạp.

Tuy nhiên, còn có các yếu tố khác bên cạnh những điều kiện nội tại để mầm

bệnh và cây chủ có thể ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm hoặc phát triển bệnh. Các

thông số quan trọng (nhiệt độ, mật độ cấy, vỏ trưởng thành và điều kiện…) có thể

giải thích ảnh hưởng của các hoạt động xử lý trái cây thương mại như làm sạch,

phân loại hoặc lưu trữ kho lạnh.

Thu hoạch: mối quan hệ trực tiếp giữa mức độ của chấn thương vỏ và tỷ lệ

nấm Penicillium đã được chứng minh. Do đó, việc xử lý trái cây khi thu hoạch cần

rất cẩn thận để giảm thiểu việc trầy xước vỏ, tạo thương tổn, vết bầm tím, và chấn

thương cơ học nói chung. Mặt khác, thu hoạch không nên thực hiện sau mưa hoặc

khi nước tự do tồn tại trên bề mặt trái cây. Đây là những điều kiện thuận lợi cho sự

hình thành bào tử mầm bệnh, và sự căng quá mức của vỏ làm cho nó dễ bị tổn

thương cơ học và nhiễm trùng sau đó [28].

1.2.2. Bệnh thán thư do Colletotrichum gloeosporioides gây ra

Tên Colletotrichum gloeosporioides lần đầu tiên được đề xuất ở Penzig

(1882) dưới tên Vermicularia gloeosporioides, loại mẫu được thu thập từ cây có

múi ở Ý. C. gloeosporioides gây bệnh thán thư với nhiều loại cây trên toàn thế giới.

Ảnh hưởng nghiêm trọng của C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc và bệnh thán

thư gây ra cho sản phẩm rau quả hiện là mối đe dọa đối với nông nghiệp toàn cầu.

Trong những khoản thua lỗ khi kinh doanh trái cây tươi và rau quả, hơn 50% gây ra

bởi loài nấm Colletotrichum [6, 29]. Bệnh thán thư dễ bùng phát ở điều kiện ẩm ướt

và ấm [53]. Các triệu chứng không xuất hiện trong suốt mùa vụ là nguyên nhân gây

ra bệnh và dẫn đến thua lỗ đáng kể sau thu hoạch. Các tác nhân gây bệnh thán thư

xâm nhiễm trước thu hoạch trong chùm hoa, trái cây, lá và thân của một loạt các

loại cây ăn quả. Các loại nấm sản xuất các enzym (polygalacturonase và

16

pectatelyase) làm suy giảm thành tế bào thực vật và nguyên nhân thiệt hại kinh tế

đáng kể [34]. Triệu chứng bệnh thán thư có đặc điểm điển hình là vết bệnh dạng

đốm tròn hoặc bất kỳ, có viền xung quanh màu nâu đỏ đến nâu đen. Vết đốm có thể

nứt, lõm sâu trên thân, quả.

Phân loại nấm Colletotrichum lần đầu tiên được nghiên cứu bởi Corda

(1837), lúc đó được gọi là Colletothrichum, sau đó cũng chính tác giả đã đổi lại tên

gọi thành Colletotrichum và được mô tả có 11 loài. Theo ý kiến gần nhất của

Baxter và cộng sự (1985), Colletotrichum được giới thiệu có 21 loài: C. coccodes,

C. dematium, C. gloeosporioides, C. graminicola, C. falcatum và C. capsici… là

những loài thường gây bệnh thán thư (anthracnose). Các loài Colletotrichum gây

bệnh trên cây trồng tại một số vùng ở Việt Nam được xác định là C. acutatum (cao

su); C. gloeosporioides (địa lan); C. acutatum (dâu tây); C. gloeosporioides (cà phê,

cam, xoài); C. capsici (ớt) [1].

Nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 4oC nhưng nhiệt độ thích hợp nhất cho

nấm phát triển là ở nhiệt độ 28 † 30°C và độ ẩm cao. Đặc biệt bào tử nấm thán thư

có sức sống cao, có khả năng chịu đựng khô hạn, dễ dàng phát tán nhờ gió và côn

trùng. Bào tử nảy mầm sau 6 † 12 giờ ở độ ẩm 98 † 100%. Bào tử phân sinh hình

thành nhiều trên lá già trong giai đoạn khô có thể tồn tại vài tuần tới 60 ngày. Nấm

gây bệnh tồn tại chủ yếu ở dạng sợi nấm và bào tử phân sinh trên tàn dư lá, thân

cành, quả và hạt bị nhiễm bệnh. Vì vậy, tàn dư cây bị nhiễm bệnh và hạt giống cũng

là những con đường truyền lan bệnh chủ yếu trong tự nhiên. Sợi nấm già đôi khi

hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là hậu bào tử, nó

có thể ở tận cùng hoặc xen giữa sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài, khi tách ra

chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới [39].

Trên môi trường Hansen, tản nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm.

Ở một số mẫu phân lập sợi nấm kí sinh chỉ hình thành quả thể và quả thể hình thành

trên khuẩn lạc non phổ biến hơn so với khuẩn lạc già.

Phân loại các chủng Colletotrichum chủ yếu dựa vào đặc điểm khuẩn lạc,

hình dạng, kích thước bào tử, lông gai và giác bám. Đĩa cành hình thành trên các bộ

17

phận của cây, có lông cứng dài màu nâu, thuôn về phía đỉnh, hơi phồng nhẹ ở phần

gốc, kích thước khoảng 500 µm, đường kính 4 † 8 µm, có từ 1 ÷ 4 vách ngăn, đôi

khi bào tử cũng được sinh ra từ lông gai. Bào tử phân sinh hình thành trên cành bào

tử ngắn, trong suốt, hình trụ, đầu hơi tù, đỉnh tròn, không có vách ngăn, kích thước

9 ÷ 24 × 3 ÷ 6 µm. Trên môi trường khoai tây PDA, kích thước và hình dạng bào tử

có sự thay đổi so với trên cây kí chủ. Bào tử màu hồng nhạt được hình thành trên

cành bào tử phân sinh đơn độc sinh ra từ sợi nấm trong đĩa cành nhẵn hoặc có lông

gai. Bào tử nảy mầm và hình thành giác bám màu nâu, hình ôvan hoặc hình quả

đấm, kích thước 6 † 20 × 4 † 12 µm. Colletotrichum chỉ sinh sản vô tính bằng bào

tử đính, bào tử đính phát triển trên cuống bào tử trong dạng quả thể là cụm cuống

bào tử. Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi

cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt.

Cuống bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử trong

suốt. Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử,

dài, thuôn nhọn, không phân nhánh và cấu trúc đa bào như tơ cứng. Frost (1964) mô

tả một loài Colletotrichum có hoặc không có lông cứng có thể được kiểm soát bởi

sự thay đổi độ ẩm. Sự hình thành một số lớp của bào tử gây nứt gãy trên bề mặt vật

chủ, gặp điều kiện thuận lợi, mỗi bào tử mọc từ một đến nhiều ống mầm để hình

thành hệ sợi nấm [39].

Nấm Colletotrichum xâm nhập vào cây chủ yếu bằng bào tử. Trước khi xâm

nhập bào tử phải tiếp xúc trực tiếp với kí chủ, gặp điều kiện thuận lợi (nhiệt độ, độ

ẩm) bào tử nấm sẽ nảy mầm thành ống mầm. Đầu ống mầm hình thành một cấu trúc

đặc biệt gọi là giác bám. Trên giác bám hình thành đế xâm nhập đâm xuyên qua bề

mặt kí chủ gồm tầng cutin và vách tế bào. Giác bám tích lũy nhiều cacbohydrate

(chủ yếu là glycerol) tạo áp lực thẩm thấu giúp hút nước từ bên ngoài vào bên trong

giác bám, tạo áp suất trương lớn, cho phép nấm xâm nhập vào bề mặt kí chủ. Ngoài

ra, nấm cũng tiết ra các enzyme nhằm hỗ trợ cho sự xâm nhập như cellulase,

pectinase. Trong nhiều trường hợp, sự xâm nhập chỉ có thể xảy ra nếu giác bám tích

18

lũy sắc tố đen (melanin). Melanin sẽ làm cho vách giác bám vững chắc, không bị vỡ

khi hút nước để tạo áp suất trương lớn [39].

 Phạm vi cây chủ và sự mất mùa

Chu kỳ sống của mầm bệnh này bắt đầu từ sự nảy mầm của bào tử trên bề

mặt thực vật để tạo thành các cấu trúc xâm nhiễm melanin hoá, được gọi là

appressoria, sau đó là sự xâm nhập vào mô chủ. Tại các điểm xâm nhiễm, các sợi

nấm dày được sinh ra từ các tế bào bị nhiễm trùng sơ cấp, giai đoạn này được gọi là

giai đoạn sinh biotrophic. Sau đó, nấm đột ngột chuyển sang giai đoạn hoại tử, được

đặc trưng bởi sự hình thành của các sợi nấm thứ cấp mỏng, có nguồn gốc từ các sợi

nấm sơ cấp. Sợi nấm thứ cấp bắt đầu xâm nhập vào các tế bào gần đó, dẫn đến sự

phát triển của các tổn thương nhìn thấy được ở vị trí nhiễm trùng. Cuối cùng các

bào tử được hình thành trên bề mặt của mô bị nhiễm bệnh và chúng được phát tán

bởi côn trùng, không khí và dòng nước để bắt đầu một chu kỳ lây nhiễm [38].

C. gloeosporioides lây nhiễm cho khoảng 470 loại cây chủ khác nhau, gồm

một số cây trồng quan trọng trước và sau thu hoạch như: bơ, xoài, đậu, hạt điều, cây

sả, cây cam quýt, bông, đậu bò, dưa leo, cà tím, xanh lá, xoài, hành, tiêu, bí , đu đủ,

đậu tương, cà chua, dưa hấu, lúa mì, dưa chuột, ngũ cốc, đậu và rau chân vịt [38].

Gần đây, các chi Colletotrichum được đánh giá là nhóm nấm gây bệnh thực vật

đứng thứ tám trên thế giới, dựa trên đánh giá giá trị khoa học và kinh tế [11].

Trong hai thập kỷ vừa qua thiệt hại đáng kể trong vùng sản xuất cam quýt ở

Bồ Đào Nha liên quan đến bệnh thán thư đã được ghi nhận, nguyên nhân chủ yếu là

do C. gloeosporioides. Trên cây cam quýt, C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc

và C. acutatum J. H. Simmonds là hai loài được báo cáo là các tác nhân phổ biến

gây ra triệu chứng của bệnh thán thư. Gần đây hơn, các nghiên cứu bệnh dịch và

dịch tễ học được thực hiện tại Brazil cho thấy, C. gloeosporioides cũng tham gia

vào quá trình hoại tử trong các cụm hoa của các giống cam ngọt [33]. Sự nhiễm

bệnh đối với quả cà phê ở Việt Nam đã được quan sát và mầm bệnh gây bệnh C.

gloeosporioides được xác định bằng các phương pháp hình thái học và phân tử.

19

Viện Bảo vệ thực vật cho biết bệnh thán thư có mặt trên tất cả các vùng trồng cam

của nước ta.

1.3. Các phƣơng pháp bảo quản trái cây sau thu hoạch

Sự ổn định các chỉ tiêu của nông sản thực phẩm là một vấn đề ưu tiên hàng

đầu của nông dân, thương nhân và người sử dụng. Có rất nhiều hình thức bảo quản

nông sản (lý học, hóa học và sinh học) để duy trì, nâng cao chất lượng của nông sản

sau khi đến tay người tiêu dùng.

1.3.1. Phương pháp bảo quản hóa học

Tùy từng loại đối tượng quả sử dụng các loại hóa chất khác nhau. Thông

thường các hóa chất này có tác dụng diệt vi sinh vật, đặc biệt là nấm trên bề mặt

quả. Theo Nguyễn Mạnh Khải (2007) một số hóa chất diệt nấm thường được sử

dụng để bảo quản quả sau thu hoạch như trên Bảng 1.

Bảng 1. Một số chất diệt nấm được sử dụng trong bảo quản quả sau thu hoạch

Tên hoá chất Đối tƣợng phòng trừ Đối tƣợng nông sản

Benzimidazole, Benomyl, Penicillium, Cam, quýt

thiabendazole, thiophanate, Colletotrichum Chuối, táo, lê, dứa,

methyl, Carbendazim Các nấm khác đào, mận

Hydrocacbon và các dẫn Penicillium xuất: Biphenyl, Methyl Cam, quýt Diplodia chloroform

Vi khuẩn và nấm nhiễm Các chất oxy hoá: Axit Nông sản nói chung, trong nước rửa hypocloric, Iot cam, quýt, nho Vi khuẩn, nấm Nitơ trichlorit Cà chua, cam, quýt Penicillium

Botrytis và các nấm khác Các axit hữu cơ và aldehyt Dâu tây Alternaria, Axit dehydroaxetic, sorbic Vải Cladosporium

Lưu huỳnh (vô cơ): Bột Monilinia Đào

lưu Botrytis Nho

20

huỳnh, Bisulphate, dioxide

sulphur

Thối hỏng trong bảo

quản bởi Clasdosporium Lưu huỳnh HC: Captan, Rau quả các loại: Thối đầu và cuống quả Thiram, Zizam, Thiourea, Dâu tây, Chuối, bởi Alternaria Thioacetamide Cam, quýt Bào tử của Penicillium,

Diplodia

Đối với các loại quả có múi, sử dụng dung dịch Carbendazim 0,1% hoặc

dung dịch Topxin-M 0,1%. Có thể sử dụng một số hóa chất khác như Guazatine:

1000 ppm (0,1%) + Benomyl 500 ppm, hoặc Thiabendazole 1000 ppm [2].

Carbendazim, Benomyl và Thiophanate Methyl là những hợp chất hóa học

thuộc nhóm Benzimidazole. Trên thực vật, trong nước và ngoài môi trường,

Benomyl và Thiophanate Methyl nhanh chóng bị chuyển hóa chủ yếu thành

Carbendazim (Benomyl chuyển hóa sau 2 giờ trong nước, 19 giờ trong đất;

Thiophanate Methyl chuyển hóa sau 2 ngày trong nước và 1 ngày trong đất). Thuộc

nhóm độc IV, LD50 qua miệng > 7.500 mg/kg, LD50 qua da >2.000 mg/kg. Là

thuốc trừ nấm nội hấp, phổ tác dụng rộng, liều lượng sử dụng thông thường từ 0,2 ÷

2,0 kg, lít/ha, thời gian cách ly 7 đến 14 ngày, dư lượng tối đa cho phép trên rau 1,0

÷ 1,5 mg/kg; ngũ cốc, dưa leo 0,5 mg/kg; chuối 0,2 mg/kg; sản phẩm khác 0,1

mg/kg. Tuy nhiên, do những hoạt chất trên có khả năng gây ảnh hưởng xấu đến sức

khỏe con người, vật nuôi, hệ sinh thái, môi trường và có hiệu lực thấp đối với sinh

vật gây hại (điểm a, b - khoản 2 – điều 49 Luật Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật),

ngày 03/01/2017, Bộ Nông nghiệp & PTNT đã ban hành quyết định số 03/QĐ-

BNN-BVTV về việc loại bỏ thuốc BVTV chứa hoạt chất Carbendazim, Benomyl và

Thiophanate Methyl ra khỏi Danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng tại Việt

Nam hiện hành. Theo lộ trình được Bộ Nông nghiệp & PTNT đưa ra, các thuốc

BVTV có chứa hoạt chất Carbendazim, Benomyl và Thiophanate Methyl chỉ được

sản xuất, nhập khẩu tối đa 1 năm; được buôn bán, sử dụng tối đa 2 năm kể từ ngày

21

03/01/2017. Đồng thời ngừng toàn bộ các thủ tục đưa vào Danh mục đối với các hồ

sơ đăng ký thuốc BVTV có chứa 3 loại hoạt chất trên [55].

Hiện nay, kiểm soát nguồn bệnh sau thu hoạch phần lớn vẫn dựa trên các

chất diệt nấm tổng hợp. Tuy nhiên, sự lạm dụng hóa chất có độc tính mạnh đã làm

gia tăng các chủng kháng thuốc cũng như lượng tồn dư sản phẩm hóa học gây ra

nhiều bệnh lý trầm trọng tới sức khỏe con người. Trước thực trạng này, người tiêu

dùng đang yêu cầu thực hiện cắt giảm việc sử dụng thuốc hóa học về cả số lượng và

hàm lượng. Điều này thúc đẩy các nhà khoa học tìm kiếm các chiến lược kiểm soát

thay thế thân thiện và hiệu quả hơn.

1.3.2. Phương pháp bảo quản bằng các loại màng

Thuật ngữ "bao gói kháng khuẩn" hiện được sử dụng rộng rãi và được ngành

công nghiệp thực phẩm quan tâm đặc biệt, bao gồm tất cả các kỹ thuật bao gói được

sử dụng để kiểm soát sinh trưởng của vi sinh vật trong thực phẩm.

Đó là các vật liệu bao gói, các màng bọc, màng ăn được có chứa các chất

kháng khuẩn và các kỹ thuật thay đổi không khí trong gói. Màng có tiềm năng kiểm

soát vận chuyển khối lượng giữa thực phẩm và môi trường và giữa các thành phần

khác nhau của thực phẩm, như vậy sẽ kéo dài thời gian bảo quản và cải thiện chất

lượng cũng như tăng thời gian sử dụng của quả tươi. Người tiêu dùng đòi hỏi sản

phẩm không có chất bảo quản nhưng vẫn giữ được chất lượng cao, vì vậy màng

hoặc kỹ thuật bao gói được đánh giá có hiệu quả hơn, mặc dù áp dụng phức tạp hơn

[2].

1.4. Công nghệ nano và tiềm năng ứng dụng của nano

1.4.1. Giới thiệu về công nghệ nano và tình hình nghiên cứu trên thế giới

Công nghệ nano là lĩnh vực khoa học mới xuất hiện nhưng đang dần chiếm

lĩnh sự quan tâm về tiềm năng vượt trội trong việc chế tạo ra những vật liệu mới

độc đáo có khả năng ứng dụng chuyên sâu trong nhiều lĩnh vực khoa học như dược

phẩm, hóa học, nông nghiệp, công nghệ sinh học [47].

Công nghệ nano là công nghệ liên quan đến thiết kế, phân tích, chế tạo và

ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng cách điều chỉnh các hình dạng và

22

kích cỡ theo thang đo nano mét (nm, 1 nm = 10-9 m). Ở quy mô nano, vật liệu có

các tính năng đặc biệt mà các vật liệu truyền thống không có do giảm kích thước và

tăng diện tích bề mặt.

Ý tưởng cơ bản về công nghệ nano được đưa ra bởi nhà vật lí người Mỹ

Richard Feynman năm 1959. Thuật ngữ "công nghệ nano" bắt đầu được sử dụng

năm 1974 bởi Norio Taniguchi - một nhà nghiên cứu thuộc Đại học Tokyo, để chỉ

khả năng chế tạo vi cấu trúc [8].

Loại vật liệu này có đặc tính khác biệt, thường vượt trội hơn so với các vật

liệu thông thường ở hai đặc điểm chính: hiệu ứng bề mặt (tỷ lệ bề mặt/khối lượng

rất cao do đó các nguyên tử của hạt nano liên kết với nhau một cách yếu ớt nên

chúng có phản ứng mạnh hơn) và hiệu ứng lượng tử (các điện tử thay đổi vị trí

trong giới hạn bề mặt của hạt nano và không còn phân bố theo mức năng lượng một

cách rõ ràng, do đó chúng dao động tập thể tạo ra hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề

mặt) [35]. Những đặc điểm này ảnh hưởng đến đặc tính hóa lý chung của các vật

liệu nano và tạo ra các đặc tính mới chưa từng có ở các vật liệu khối. Công nghệ

mới này đã hình thành cơ sở cho một lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng liên ngành

rộng lớn được phát triển nhanh trên toàn thế giới trong một vài thập kỷ vừa qua [3].

Việc áp dụng công nghệ nano vào các ngành nông nghiệp và thực phẩm

được đặt ra lần đầu tiên trong chương trình hành động của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ

vào tháng chín năm 2003 [42] và được dự đoán sẽ là công nghệ then chốt tạo ra

thay đổi quan trọng trong các ngành này. Trong những năm đầu tiên, việc áp dụng

công nghệ nano trong sản xuất nông nghiệp chủ yếu được thực hiện qua các nghiên

cứu trong phòng thí nghiệm, nhưng ngay sau đó nó đã bắt đầu và đang tiếp tục có

ảnh hưởng đáng kể trong các lĩnh vực quan trọng như lai tạo các giống cây trồng

mới, phát triển vật liệu chức năng mới và hệ thống phân phối thông minh cho hóa

chất nông nghiệp như thuốc diệt cỏ, phân bón và thuốc trừ sâu, hệ thống thông minh

cho chế biến thực phẩm, bao bì và các lĩnh vực khác như như khắc phục hậu quả

của dư lượng chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu trong thực vật và đất, trong xử lý nước

23

thải, quản lý tài nguyên thiên nhiên và phát hiện sớm các mầm bệnh, các chất gây ô

nhiễm trong cây trồng và thực phẩm …[24].

Do khả năng ứng dụng kỳ diệu và sâu rộng của công nghệ nano mà hiện nay

trên thế giới đang xảy ra một cuộc chạy đua sôi động về việc nghiên cứu và phát

triển ứng dụng công nghệ nano vào đời sống. Công nghệ nano được xem như là

cuộc cách mạng công nghiệp mới không chỉ ở các nước phát triển, mà còn ở cả các

nước đang phát triển. Chính phủ của nhiều quốc gia đã dành một khoản ngân sách

đáng kể để hỗ trợ cho việc nghiên cứu và phát triển ứng dụng công nghệ nano vào

thực tiễn. Không chỉ các trường Đại học, Viện nghiên cứu có các phòng thí nghiệm

với các thiết bị nghiên cứu quy mô mà các tập đoàn sản xuất cũng tiến hành đầu tư

vào nghiên cứu và phát triển công nghệ nano với các phòng thí nghiệm có tổng chi

phí đầu tư không nhỏ. Trong thời kỳ 2005-2006, Hoa Kỳ dẫn đầu với chi phí đầu tư

là 3,7 tỷ USD/năm thông qua Chương trình Sáng kiến Công nghệ nano quốc gia

(NNI). Tiếp theo là Nhật Bản và Liên minh châu Âu với 750 triệu USD và 1,2 tỷ

USD/năm. Mức đầu tư ở các nước đang phát triển tuy thấp hơn, nhưng không làm

giảm bớt dấu ấn của các nước này trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ nano. Ở

Trung Quốc, số lượng các công trình khoa học liên quan đến công nghệ nano đã

tăng từ 7,5% vào năm 1995 lên 18,3% vào năm 2004 và trở thành nước đứng thứ

hai trong việc đầu tư cho vấn đề này. Các nước khác như như Ấn Độ, Hàn Quốc,

Iran và Thái Lan cũng đang bắt kịp bằng cách tập trung vào các ứng dụng cụ thể

cho sự phát triển và nhu cầu của từng nước đất. Hiện nay, Iran có chương trình

trọng điểm ứng dụng công nghệ nano trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm.

1.4.2. Tiềm năng ứng dụng của nano

1.4.2.1. Khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của các hạt nano

Bạc và đồng là những kim loại từ lâu đã được biết đến với sự thể hiện độc

tính mạnh, chống lại một loạt các vi sinh vật như vi khuẩn, virus, tảo và nấm. Tuy

nhiên, không giống với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể

hiện tính độc với con người. Do vậy, từ xa xưa các hợp chất cấu tạo từ bạc, đồng đã

được sử dụng thường xuyên trong y học để điều trị bỏng và nhiễm trùng. Sau khi

24

thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả cao, người ta

không còn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa. Tuy nhiên, từ những

năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh vật ngày càng trở nên kháng thuốc,

người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng

dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano. Những tác dụng

kháng khuẩn này đã được nhiều nhà nghiên cứu ghi nhận. Các tiềm năng kháng

khuẩn của kim loại này cho phép sử dụng chúng trong các sản phẩm liên quan đến

chăm sóc sức khỏe con người. Nghiên cứu cho thấy tác dụng kháng khuẩn mạnh mẽ

của các hạt nano bạc trên cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-), chủ yếu là các chủng

đa kháng thuốc. Nó cũng có thể được sử dụng như một tác nhân kháng nấm, và hoạt

tính này đã được nghiên cứu khá cụ thể. Các hạt nano, bao gồm nano bạc có thể có

nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, que và hình khối [17]. Các hạt nano bạc

trải qua sự tương tác với vi khuẩn phụ thuộc vào hình dạng và trực tiếp ảnh hưởng

đến hiệu quả kháng khuẩn [27].

Trong số các vật liệu kim loại chuyển tiếp, đồng là nguyên liệu quan trọng

nhất. Đặc biệt, hiệu quả ức chế nấm của nano Cu tốt hơn so với các hạt nano kim

loại khác như Al, Fe, Mn, Ni, Zn, và các sản phẩm hạt Cu kích thước lớn hơn. Đặc

biệt, việc sử dụng các loại thuốc tổng quát với một lượng đồng lớn dẫn đến dư

lượng đồng cao trong sản xuất cũng như trong đất và gây ô nhiễm nước. Cu là nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự phát triển của cây trồng, tồn tại ở dạng Cu2+ và Cu+ trong điều kiện sinh lý. Nồng độ cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật là 10-14 đến 10-16 M, thấp hơn nồng độ này sẽ xảy ra thiếu hụt. Tuy nhiên

nồng độ cao hơn so với nồng độ cần thiết lại sẽ ức chế quang hợp của cây trồng. Nó

hoạt động như một thành phần cấu trúc quy định sự tổng hợp protein, tham gia vận

chuyển điện tử quang hợp, hô hấp của ty thể, chuyển hóa thành tế bào, tín hiệu của

hormone, phản ứng oxy hóa, đồng là yếu tố cho nhiều phản ứng enzyme thực hiện

bởi các enzyme như polyphenol oxidase, amino oxidase, plastocyanin, laccase,

superoxide dismutase. Ở cấp độ tế bào, nó đóng một vai trò quan trọng trong sự

phosphoryl oxy hóa, và huy động sắt. Sự thiếu hụt đồng trong thực vật được biểu

25

hiện như uốn cong cuống lá và úa nhẹ cùng với sự đi mất vĩnh viễn sức trương

trong lá non [37]. Tính chất kháng khuẩn của các hạt nano đồng đã được so sánh

với triclosan và cả hai đều có tác dụng kháng khuẩn hiệu quả. Đồng dạng nano ở

nồng độ thấp có khả năng kháng khuẩn rất mạnh. Cơ quan bảo vệ môi trường của

Mỹ đã công nhận nano đồng là chất kháng khuẩn để diệt các vi khuẩn Gram (-) và

Gram (+). Theo Durán [13] và Prabhu [32], giống như các hạt nano bạc, nano Cu

cũng đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc vào kích thước. Vì vậy, để

đạt được các hoạt tính kháng khuẩn tối đa, cần phải phát triển các phương pháp

khác nhau nhằm tổng hợp các hạt nano Cu phân tán với kích thước nhỏ, tỷ lệ diện

tích bề mặt/ thể tích lớn. Kanhed và cộng sự (2014) đã thông báo khả năng của nano

đồng chống lại hàng loạt nấm gây bệnh ở cây trồng như Phoma destructiva,

Curvularia lunata, Alternaria alternata và Fusarium oxysporum [21]. Ouda (2014)

đồng thời phát hiện nano đồng và nano đồng kết hợp với nano bạc có khả năng kìm

hãm và diệt hai loại nấm Uernaria alternata và Botrytis cinere gây bệnh trên nhiều

loại cây trồng khác nhau [26]. Hơn nữa, việc sử dụng nano Cu giúp giảm lượng hóa

chất trong công tác phòng ngừa bệnh nấm Fusarium sp. Đã có báo cáo chỉ ra ở

nồng độ nano Cu 450 ppm đường kính của tản nấm Fusarium sp. hầu như không

tăng và có thể ức chế 93,98% sự phát triển nấm sau 9 ngày ủ [44]. Các nano Cu

cũng cho thấy hoạt tính kháng nấm đầy hứa hẹn đối với nấm gây bệnh thực vật F.

oxysporum, C. lunata, A. alternata, và P. destructiva. Các hoạt động của nano Cu

đã được tìm thấy là tốt hơn so với các loại thuốc diệt nấm Bavistin thương mại

chống lại tất cả 4 loại nấm gây bệnh thực vật. Trong sự kết hợp của nano Cu với

Bavistin, sự ức chế tăng không đáng kể và khi đó, chỉ sử dụng nano Cu đã đem lại

hiệu quả để kiểm soát nấm gây bệnh cây trồng. Như vậy, các nano Cu có thể được

sử dụng như một chất kháng nấm mới trong nông nghiệp để kiểm soát các loại nấm

gây bệnh thực vật cũng như một chất khử trùng mạnh ở gia cầm và chăn nuôi [21].

Hoạt tính kháng khuẩn của các hạt nano có thể liên quan đến một số cơ chế.

Các hạt nano có thể tương tác trực tiếp với các tế bào vi sinh vật, ví dụ: làm gián

đoạn quá trình vận chuyển điện tử qua màng, phá vỡ và thâm nhập vào thành tế bào,

26

hoặc oxy hóa các thành phần tế bào, hoặc sản xuất các sản phẩm thứ cấp (ví dụ: các

các các gốc tự do oxy hóa (ROS) hoặc các ion kim loại nặng hòa tan gây thiệt hại)

[23].

1.4.2.2. Lợi ích khi sử dụng các hạt nano trong kháng nấm, kháng khuẩn

Kích thước của các hạt nano kim loại đảm bảo rằng các hạt nano có diện tích

tiếp xúc lớn đáng kể khi xử lý với nước thải chứa vi khuẩn. Xem xét một tình huống

giả định với các hạt hình cầu có kích thước đồng đều, giảm kích thước hạt từ ~10 μm xuống 10 nm sẽ tăng diện tích bề mặt tiếp xúc lên 109 lần. Với bề mặt tiếp xúc

lớn như vậy được dự kiến sẽ tăng cường mức độ loại bỏ vi khuẩn. Theo Agnihotri

và cộng sự (2014), những hạt nano kích thước 10 nm sẽ tăng tác động kháng khuẩn.

Do kích thước của chúng nhỏ nhất, hạt dễ dàng xâm nhập vào các vi sinh vật, gây ra

hiệu ứng độc tính cao hơn so với những hạt lớn hơn [20]. Khi sử dụng với nồng độ

thấp hơn, các hạt có kích thước nano sẽ đủ khả năng để kiểm soát vi sinh vật. Cách

tiếp cận này có thể có hiệu quả hơn phương pháp điều trị hiện có, đặc biệt là đối với

một số sinh vật ít nhạy cảm với kháng sinh vì khả năng chống lại sự thâm nhập tế

bào [17]. Tuy nhiên, kích thước không phải là mục đích chính khi lựa chọn các hạt

nano có hoạt tính kháng khuẩn, mà đặc tính hóa lý của hạt nano là mối quan tâm lớn

trong việc chế tạo các vật liệu diệt khuẩn [27].

Các hạt nano vô cơ có lợi thế khác biệt hơn hẳn các tác nhân kháng khuẩn

hóa học thông thường. Vấn đề quan trọng nhất gây ra bởi các tác nhân kháng khuẩn

hóa học là kháng đa thuốc. Các sản phẩm liên quan đến nano bạc nhấn mạnh thêm

công bố về sức mạnh của nano bạc như: giết chết khoảng 650 loại vi khuẩn có hại

trong một thời gian ngắn khoảng 30 phút, nhanh hơn so với các dạng khác của bạc

từ 2 ÷ 5 lần. Gần đây, các hạt nano bạc được báo cáo là hợp chất kháng khuẩn mới

mà không phát triển vi khuẩn kháng thuốc. Ion bạc rất dễ phản ứng, dẫn đến ức chế

hô hấp của vi sinh vật và sự trao đổi chất. Hơn nữa, nó đã được đề xuất rằng các ion

bạc xen vào DNA của vi khuẩn khi xâm nhập vào tế bào, ngăn chặn sự sinh sôi của

các tác nhân gây bệnh [20].

27

1.4.2.3. Tiềm năng ứng dụng nano trong lĩnh vực bảo quản

Việc điều chỉnh polyme sử dụng cho các ứng dụng thực phẩm nhằm ngăn

ngừa sự nhiễm vi sinh vật hoặc sự gia tăng hư hỏng thực phẩm do vi sinh vật đang

được chú ý. Một loại hợp chất thu hút sự quan tâm lớn trong lĩnh vực bao bì thực

phẩm là các hạt nano kim loại, chẳng hạn như đồng, kẽm, titan, magiê, vàng và bạc.

Những vật liệu polyme được bổ sung các hạt nano và có thể thay đổi các hạt nano

để làm cho chúng hoạt động hơn do đó tạo ra các vật liệu mới phù hợp có khả năng

ứng dụng trong bảo quản và bao gói, nhằm kéo dài thời hạn sử dụng của các mặt

hàng thực phẩm. Trong số các hạt nano có sẵn, các hạt nano bạc đã thu hút được sự

quan tâm đáng kể do hiệu quả của chúng đối với một loạt các vi sinh vật. Vì lý do

này bạc đã được sử dụng như là một chất phụ gia hoặc lớp phủ trên các polyme

khác nhau để kháng khuẩn. Các ion kim loại như bạc, bạc zeolite, đồng và vàng,

được chấp thuận làm phụ gia trong polyme thực phẩm, đặc biệt là ở Mỹ và Nhật

Bản [12].

Bao bì kháng khuẩn là một hình thức đầy hứa hẹn của vật liệu đóng gói thực

phẩm hoạt hóa ngăn ngừa nhiễm khuẩn trong thực phẩm [12]. Việc kết hợp vật liệu

nano cho bao bì thực phẩm được đẩy mạnh trong thập kỷ vừa qua, có thể được chia

thành hai hình thức chính:

+ Bao bì cải thiện, cho phép vật liệu nano được trộn vào mạng lưới polymer để cải

thiện các đặc tính rào cản khí như polymer hoặc lớp nanocomposites.

+ "Bao bì hoạt hóa", trong đó hạt nano có đặc tính kháng khuẩn mạnh tương tác

trực tiếp với thực phẩm hoặc môi trường để bảo vệ thức ăn tốt hơn. Nano kim

loại nổi bật đang thu hút sự nghiên cứu về tính chất diệt khuẩn là Cu, Zn, Au, Ti,

và Ag. Nano kim loại có thể được gắn vào các mạng lưới khác nhau như polyme

và chất ổn định (citrate và rượu chuỗi dài) thông qua các phương thức sản xuất

khác nhau như được phủ, hấp phụ hoặc kết hợp trực tiếp trong quá trình tổng

hợp [6]. Các vật liệu có mặt nano bạc kết hợp vào vật liệu đóng gói đã có thể

kiểm soát vi sinh vật tạp nhiễm bằng cách giảm tốc độ tăng trưởng của vi sinh

vật. Vì bạc kháng khuẩn có thể được giải phóng dần khỏi bao bì trong một thời

28

gian dài, hoạt động này cũng có thể được kéo dài sang giai đoạn vận chuyển và

lưu trữ phân phối thực phẩm [12].

Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để kết hợp các hạt nano bạc thành các vật

liệu đóng gói có thể chấp nhận được như giấy lọc, polyethylene mật độ thấp và

polymethyl methacrylate. Ngoài ra, nhiều vật liệu phân hủy sinh học, ví dụ:

polysaccharide (như tinh bột, chitosan, alginate, và konjak glucomannan) đã được

sử dụng để chế tạo hỗn hợp dựa trên màng nano bạc. Ví dụ, zeolit bạc đã được phát

triển như là chất kháng khuẩn phổ biến nhất được kết hợp thành nhựa và được phép

sử dụng trong bảo quản thực phẩm, thanh trùng các sản phẩm. Zeolit có một số

nguyên tử bề mặt được thay thế bằng các nguyên tử bạc được ép thành lớp mỏng (3

÷ 6 mm) trên bề mặt của các polyme bao bì tiếp xúc với thực phẩm, liên tục giải

phóng các ion bạc khi các hạt nano bạc tiếp xúc với dung dịch nước từ thức ăn [45].

Một số bằng chứng đã chứng minh sự an toàn của việc áp dụng các vật liệu

bạc. Có rất ít báo cáo trong các tài liệu về độc tính bạc mặc dù phơi nhiễm lớn với

bạc trong điều trị vết thương bỏng. Tính không độc hại của dung dịch nano bạc đặc

biệt là trong trường hợp các hạt nano nhỏ hơn đã được chứng minh qua xét nghiệm

kích thích da thực hiện trên thỏ. Hendi và cộng sự báo cáo rằng các hạt nano bạc có

thể thúc đẩy chữa lành vết thương và giảm sự xuất hiện vết sẹo theo các mức độ

phụ thuộc vào liều. Hơn nữa, kết quả thí nghiệm cho thấy các hạt nano bạc hoạt

động bằng cách giảm viêm, và không có tác dụng phụ trên chức năng gan và thận

thông qua mô hình thí nghiệm trên chuột [45].

Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu đã khuyến cáo nồng độ giới hạn của

nano Ag giải phóng từ bao bì không được vượt quá 0,05 mg/L trong nước và 0,05

mg/kg trong thực phẩm [6]. Các sản phẩm của nano bạc đã được chứng minh có thể

được sử dụng như một lớp phủ bề màng trên các loại rau dễ hư hỏng để tăng cường

sự kháng khuẩn và tăng thời hạn sử dụng thực phẩm [43].

1.4.3. Tình hình nghiên cứu nano trong nước

Ở nước ta, công nghệ nano đã được triển khai nghiên cứu và ứng dụng từ

hơn 2 thập kỷ trước, tuy nhiên chủ yếu nhằm phục vụ cho các nghiên cứu vật lý và

29

nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano trong một số lĩnh vực như môi trường, y học,

sinh học, điện tử v.v... Đến nay mới chỉ có rất ít công ty cho lưu hành một vài sản

phẩm nano như Nano bạc N200 Pro phòng trị bệnh cho cây trồng của Công ty Cổ

phần Đầu tư và Phát triển Bắc Sơn. Công ty Tratipha cũng đã cung cấp ra thị trường

sản phẩm Nano bạc phục vụ sản xuất nông nghiệp từ tháng 6/2013 với khuyến cáo

sử dụng cho nhiều loại cây trồng khác nhau, dùng để xử lý đất, xử lý cho hoa, cây

cảnh, cây lương thực, cây rau các loại và cây công nghiệp, ngoài ra nano bạc còn

khuyến cáo dùng trong phòng và trị các bệnh hại do vi khuẩn.

30

CHƢƠNG II: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Hóa chất

Glucose, cao thịt (Merk, Đức) Cao nấm men (Merk, Đức) và các hoá chất

thông dụng khác (Trung Quốc).

Môi trường Hansen (g/l): glucose: 50; trypton: 10; KH2PO4: 2,

MgSO4.7H2O: 2; agar: 20; pH 6,0.

Môi trường Czapeck (g/l): NaNO3: 3,5; K2HPO4: 1,5; MgSO4.7H2O: 0,5;

FeSO4: 0,01; Saccharose: 30; agar: 20; pH 6,0.

Môi trường PDA (g/l): nước chiết khoai tây: 200; dextrose: 20; agar: 20; pH

6,0.

Bộ kit tinh sạch phẩm PCR, Invitrogen, Mỹ. Các đoạn mồi khuếch đại gen

ITS1 và ITS4 do Invitrogen (Hồng Kông) cung cấp.

Dung dịch TAE 50X (g/l): Trisbase - 24,2%; glacial axetic axit - 57,1ml;

EDTA 0,5M - 100ml.

2.2. Vật liệu nghiên cứu

Cam bị bệnh được thu thập tại các vườn trồng tại Tuyên Quang. Các triệu

chứng bệnh đã biểu hiện rõ ràng và có thể nhận thấy bằng mắt thường.

Vật liệu nano Ag và Cu nhận từ Viện Công nghệ môi trường, có các đặc

điểm được mô tả trong Bảng 2:

Bảng 2. Tính chất của các nano Ag và Cu sử dụng trong nghiên cứu

Vật liệu Hình dạng Phương pháp chế tạo

Cu Hình cầu Khử CuSO4 với NaBH4

Ag Hình cầu Khử AgNO3 với NaBH4

AgH Hình cầu H2O2 30% + nano Ag với tỷ lệ 1:1

31

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phân lập nấm từ cam bệnh

Chọn ngẫu nhiên 10 quả nhiễm nấm. Các trái cây này được rửa sach bằng

nước, khử trùng bề mặt bằng natri hypochlorite (NaClO) 0,5% trong 2 ÷ 5 phút.

Mẫu vỏ quả được cắt bằng dụng cụ tiệt trùng từ ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh (3 ÷ 5 mm) và đặt trên môi trường phân lập PDA ủ ở 25 ± 1oC trong 5 ngày. Các

dòng nấm phân lập được làm sạch và giữ trên môi trường PDA để nghiên cứu sâu

hơn [48].

2.3.2. Xác định đặc điểm nuôi cấy và phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự

gen ITS

Xác định đặc điểm sinh học của nấm Penicillium [14, 16, 30] và

Colletotrichum [46] thông qua sự phát triển của sợi nấm, hình dạng khuẩn lạc nấm,

đặc điểm cơ quan sinh sản và bào tử phân sinh.

DNA tổng số nấm được tách chiết dựa trên phương pháp tách chiết theo

phương pháp của Sambrook [36]. Vùng gen ITS-rDNA được khuếch đại bằng phản

ứng PCR từ DNA tổng số, sử dụng cặp mồi ITS1 (5‟-TCC GTA GGTGAA CCT

GCG G-3‟) và ITS4 (5‟-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3‟) theo Ni và cộng

sự [25].

2.3.3. Khảo sát khả năng ức chế của nano kim loại đối với nấm ở giai đoạn bào tử

Tính nhạy cảm của nấm ở giai đoạn bào tử đối với nano được xác định theo

MIC (Minimum Inhibitory Concentration) và MFC (Minimum Fungal

Concentration). Trong đó, MIC là nồng độ ức chế tối thiểu, và MFC là nồng độ tối

thiểu diệt nấm. Sử dụng phương pháp pha loãng ½ để thu được các nồng độ nano khảo sát, với mật độ bào tử nấm nghiên cứu là 106 CFU/ml. Sau 72 giờ nuôi lắc ở

25ᵒ C, quan sát sự phát triển của vi sinh vật. Nồng độ nano thấp nhất không phát

hiện bằng mắt thường sự phát triển của nấm được xác định là MIC. Hút 100 μl từ

các thí nghiệm có nồng độ nano ≥ MIC để trang đĩa và ủ ở 25ᵒ C. MFC được định

nghĩa là nồng độ thấp nhất có <3 khuẩn lạc nấm xuất hiện [4].

32

2.3.4. Khảo sát khả năng ức chế của nano kim loại đối với nấm ở giai đoạn sinh

dưỡng

Hoạt động của nano kim loại kháng nấm ở giai đoạn sinh dưỡng được đánh

giá trên đĩa thạch Petri. Môi trường đĩa thạch PDA được bổ sung nano kim loại ở

các nồng độ khác nhau:

nano Cu: 100, 250, 500, 1000, 1500 ppm

nano Ag: 10, 30, 50, 100, 200, 300, 400 ppm

nano AgH: 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 ppm

Các đĩa nấm được nuôi trong 5 ngày ở 25°C được sử dụng làm giống. Các

khoanh thạch nấm giống đường kính 6 mm được đặt vào trung tâm đĩa thạch nano.

Đối chứng (-) không bổ sung nano và đối chứng (+) sử dụng Carbendazim. Ủ đĩa ở

25°C và theo dõi đường kính sinh trưởng của nấm theo thời gian. Hiệu quả ức chế

của nano kim loại với nấm được tính toán theo công thức sau:

Tỷ lệ ức chế (%) = x 100

Trong đó R: đường kính khuẩn lạc nấm trên đĩa đối chứng và r là đường kính

khuẩn lạc nấm trên đĩa thí nghiệm [22].

2.3.5. Xác định tác dụng của nano kim loại ở các nồng độ khác nhau lên nấm

gây bệnh trên cam

Thí nghiệm bố trí gồm 6 công thức với các nồng độ nano kim loại. Mỗi công

thức lặp 3 quả.

Quy trình xâm nhiễm cam: Rửa nước sạch → Khô bề mặt → Tạo vết thương trên bề mặt quả → Nhiễm nấm bệnh với mật độ nghiên cứu 106 bào tử nấm →

Nhúng vào dung dịch nano kim loại → Khô bề mặt → Đóng thùng carton → Lưu trữ ở 25oC.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh theo thời gian.

Số quả bị bệnh

Tỷ lệ bệnh (%) = x 100 Tổng số quả thí nghiệm

33

2.3.6. Đánh giá chất lượng của quả cam bảo quản sau xử lý nano ở quy mô

phòng thí nghiệm

Quy trình xử lí cam: Cắt tỉa cuống → Rửa nước sạch → Khô bề mặt → Bọc

màng có bổ sung nano kim loại → Khô bề mặt → Đóng thùng carton → Bảo quản 10 ÷ 12oC.

Thí nghiệm được thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức được lặp lại 3

lần và trong cùng một thời điểm.

Theo dõi và lấy mẫu phân tích trong thời gian bảo quản 40 ngày, tần suất 10

ngày/lần. Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng gồm: hàm lượng chất khô hòa tan tổng số

TSS (◦Brix), hàm lượng axit chuẩn độ được (%), hàm lượng đường tổng số (%), tỷ

lệ thối hỏng (%), tỷ lệ hao hụt khối lượng (%), tỷ lệ mốc cuống (%), hàm lượng

vitamin C (mg/100g).

34

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập nấm Penicilium và Colletotrichum gây bệnh trên cam Hàm Yên -

Tuyên Quang

3.1.1. Phân lập nấm Penicillium

Trên các mẫu quả cam thu thập tại Tuyên Quang, triệu chứng ban đầu của

nấm mốc xanh là sự xuất hiện của những vết mềm từ 1 ÷ 2 cm và bị mất màu. Vết

bệnh nhanh chóng lan rộng tỏa tròn, có đường kính 3 ÷ 5 cm sau 1 đến 2 ngày. Khi

hệ sợi nấm trên bề mặt quả đạt kích thước 2 ÷ 3 cm, bắt đầu xuất hiện các bào tử

màu xanh. Các ngày tiếp theo, toàn bộ bề mặt trái cây nhanh chóng được bao phủ

bởi các bào tử màu xanh lá (Hình 2a).

Từ mẫu quả bệnh điển hình, đã phân lập và thuần khiết được chủng nấm

N11. Khuẩn lạc nấm N11 phát triển trên môi trường Czapek khá nhanh, đường kính

đạt 4 ÷ 5 cm/ 7 ngày ở nhiệt độ 24 ÷ 26°C. Mặt khuẩn lạc bằng phẳng, dạng nhung,

vùng mép dị thường. Hệ sợi nấm thường mờ, thành mỏng, ráp nhẹ. Mặt trái màu

vàng nhạt đến nâu, không sinh giọt tiết và sắc tố (Hình 2c).

Cơ quan sinh bào tử được sinh ra từ bề mặt hoặc từ hệ sợi khí sinh. Dưới

kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần, quan sát được cuống kích thước

70,0 ÷ 150,0 x 5,0 ÷ 7,0 μm, với thành mỏng và nhẵn, mang các chổi khi phát triển

tốt nhất là ba vòng thể bình, nhưng thường là hai vòng hoặc dị thường. Nhánh 20,0

÷ 30,0 x 5,0 ÷ 6,0 μm, nhẵn; metulae thường có 2 ÷ 3 cái, kích thước 15,0 ÷ 25,0 x

5,0 ÷ 6,0 μm; thể bình trên một vòng thường 3 ÷ 5 cái, hình trụ tròn đầu, kích thước

10,0 ÷ 20,0 x 4,0 ÷ 5,0 μm; bào tử trần hình elip đến trụ tròn, 6,0 ÷ 15,0 x 2,5 ÷ 6,0

μm, nhẵn, tạo thành chuỗi dài đặc trưng cho các đặc điểm của nấm Penicillium

digitatum (Hình 2d).

Dựa trên các triệu chứng, mô tả hình thái học của nấm, chủng N11 được xác

định là P. digitatum.

35

b a

c d

Hình 2. Quả cam bị bệnh mốc xanh (a), hình thái nấm N11 trên môi trường

Hansen (b), Czapek (c) và cấu trúc sinh sản và bào tử nấm N11 (độ phóng đại 400

lần) (d)

3.1.2. Phân lập nấm Colletotrichum

Triệu chứng bệnh thán thư trên cam do nấm Colletotrichum gây ra là những

đốm nhỏ hình tròn, màu vàng nhạt cho đến nâu đậm trên vỏ, vết bệnh hơi lõm vào

phía trong của vỏ. Tại vết bệnh, vỏ bị khô sần sùi, bệnh càng nặng vết bệnh càng

lan rộng (Hình 3). Từ quả cam bệnh đã được làm sạch bề mặt, cắt một phần mô

bệnh đặt trên môi trường PDA để phân lập nấm và thu nhận được chủng N8.

Hình 3. Cam bị bệnh thán thư

36

a b

Hình 4. Hình thái khuẩn lạc nấm N8 nuôi cấy trên đĩa môi trường PDA sau

a) 3 ngày; b) 2 tuần

Thể bình sinh ra từ các mô mềm của đĩa giá, kích thước đến 30 µm dài; bào

tử đơn độc, hình trụ tròn đầu, không ngăn vách, không màu, nhẵn, kích thước 10,0 ÷

21,0 x 4,0 ÷ 5,0 µm (Hình 5 b và 5c). Đối chiếu các kết quả về đặc điểm hình thái,

nhận định sơ bộ chủng N8 thuộc loài Colletotrichum gloeosporioides.

a

b c

Hình 5. Khuẩn lạc nấm N8 trên môi trường Czapek (a); cơ quan sinh bào tử

37

và bào tử của nấm N8 (độ phóng đại 400 lần) (b, c)

Như vậy, từ nguồn mẫu là các quả bệnh thu nhận tại vườn cam Tuyên

Quang, bằng phương pháp phân lập nấm bệnh và xác định sợ bộ bằng hình thái,

bước đầu nhận định hai loài nấm gây bệnh điển hình trên cam Hàm Yên - Tuyên

Quang là Penicillium digitatum N11 và Colletotrichum gloeosporioides N8. Tuy

nhiên để định danh chính xác hai loài nấm này, cần kết hợp với phân tích trình tự

gen vùng ITS.

3.2. Định danh nấm N8 và N11 dựa vào trình tự gen ITS

Để định danh hai chủng nấm đến loài, vùng gen ITS1-5,8S-ITS2 được giải

trình tự và phân tích.

DNA tổng số của hai chủng nấm N8 và N11 được tách chiết thành công theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001) và bảo quản ở 4oC để sử dụng cho

các thí nghiệm tiếp theo (Hình 6a). DNA tổng số được sử dụng làm khuôn cho phản

ứng PCR khuếch đại gen vùng ITS của hai chủng nấm, và sản phẩm PCR thu được

có chất lượng tốt với một băng rõ duy nhất trên gel điện di, có kích thước khoảng

500 bp (Hình 6b).

Hình 6. Điện di kiểm tra DNA tổng số (a) và sản phẩm PCR khuếch đại

vùng ITS của chủng nấm N11 và N8 trên gel agarose 1% (b), trong đó: M là marker

38

và giếng 1 và 2 là sản phẩm PCR của N11 và N8.

Bảng 3. Mức độ tương đồng của gen mã hóa vùng ITS của chủng nấm N11

với các chủng trên GenBank

Mã số truy cập trên Độ tƣơng đồng Chủng nấm so sánh GenBank (%)

P. digitatum FRR1313 AY373910 99

P. digitatum CBS 112082 KJ834506 99

Penicillium sp. 13 BRO-2013 KF367511 99

P. digitatum NRRL 786 AF033471 99

P. digitatum M2 HQ850929 99

P. digitatum CBS 136.65 AB479307 99

So sánh trình tự gen ITS1-5,8S-ITS2 rDNA (562 bp) của chủng N11 với các

trình tự tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST

trên NCBI cho thấy, trình tự ITS của chủng nấm nghiên cứu có độ tương đồng cao

với các chủng nấm thuộc loài P. digitatum như: P. digitatum FRR1313 (99%); P.

digitatum CBS 112082 99%. Dựa vào các đặc điểm sinh học và phân tích trình tự

gen vùng ITS cho thấy, chủng nấm N11 có độ tương đồng cao và có nhiều đặc điểm

gần gũi với loài Penicillium digitatum nên chủng nấm này được đặt tên là

Penicillium digitatum N11.

Trình tự gen chủng N8 có kích thước là 444 bp được so sánh với các trình tự

trên GenBank cho thấy có độ tương đồng cao (100%) với Colletotrichum

gloeosporioides, như C. gloeosporioides ETHCTR069 (KT282690.1) và C.

gloeosporioides ETHCTR004 (KT282633.1). Dựa vào các đặc điểm sinh học và

phân tích trình tự gen vùng ITS cho thấy, chủng nấm N8 có độ tương đồng cao và

có nhiều đặc điểm gần gũi với loài Colletotrichum gloeosporioides nên chủng nấm

39

này được đặt tên là Colletotrichum gloeosporioides N8.

Bảng 4. Mức độ tương đồng của gen mã hóa vùng ITS của chủng nấm N8

với các chủng trên GenBank

Độ tƣơng Mã số truy cập Chủng nấm so sánh đồng (%) trên GenBank

Colletotrichum gloeosporioides ETHCTR069 100 KT282690.1

Colletotrichum gloeosporioides ETHCTR004 100 KT282633.1

Colletotrichum gloeosporioides T146 99 FJ459931.1

Colletotrichum gloeosporioides A677 99 KX463049.1

Colletotrichum gloeosporioides A720 99 KU529807.1

Hai chủng nấm N11 và N8 được sử dụng làm chủng kiểm định trong các

nghiên cứu tiếp theo.

3.3. Khả năng ức chế của các nano kim loại Ag và Cu đến sự sinh trƣởng của

nấm Penicillium digitatum N11 và Colletotrichum gloeosporioides N8

Để lựa chọn được nano kim loại tiềm năng, có khả năng ứng dụng trong bảo

quản cam, cần đánh giá khả năng kháng nấm của các nano kim loại trong nghiên

cứu với hai chủng nấm phân lập được.

Sự bùng phát của bệnh sau thu hoạch là kết quả của quá trình nhiễm nấm

tiềm ẩn xảy ra trước khi thu hoạch, khi các bào tử nấm xâm nhập vào các vết

thương ở vỏ nhưng tồn tại trong trạng thái nghỉ và hoạt động khi gặp các điều kiện

thích hợp cho sự phát triển. Vì vậy, đánh giá sự ức chế nấm của các nano kim loại

đối với hai giai đoạn phát triển của nấm là bào tử và sinh dưỡng.

3.3.1. Giai đoạn bào tử

Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu được áp dụng nhằm xác định

nồng độ chất kháng nấm nhỏ nhất ức chế được sự phát triển của vi sinh vật, làm cơ

40

sở cho lựa chọn và tính toán liều lượng chất kháng nấm cần sử dụng.

Trong nghiên cứu dưới đây, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng

độ tiêu diệt (MFC) của các nano Ag và nano Cu đến khả năng phát triển của bào tử

nấm P. digitatum N11 và nấm C. gloeosporioides N8 được trình bày ở Bảng 5,

Bảng 6, Hình 7 và 8.

Bảng 5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt (MFC) của nano kim loại

Ag và Cu đối với bào tử nấm P. digitatum N11

Nano kim loại MIC (ppm) MFC (ppm)

Cu 500 1000

Ag 12,5 400

AgH 0,098 0,098

Carbendazim 400 400

Kết quả phân tích cho thấy, nano Cu thể hiện hiệu quả ức chế bào tử nấm P.

digitatum phát triển ở nồng độ 500 ppm và nano Ag ức chế ở nồng độ thấp hơn

(12,5 ppm) và thể hiện nồng độ tiêu diệt ở nồng độ 400 ppm. Sau 3 ngày xử lý với

nano trong ống nghiệm, trang đĩa kiểm tra khả năng hình thành khuẩn lạc trên môi

trường PDA. Kết quả trên Hình 7 cho thấy, khi sử dụng nano Ag và Cu, nấm N11 bị

ức chế và làm mất khả năng nảy mầm bào tử tạo khuẩn lạc ở các nồng độ kiểm tra.

Ở nồng độ Ag là 400 ppm nấm N11 mất hoàn toàn khả năng phát triển từ bào tử thành hệ sợi nấm. Với mật độ bào tử ban đầu 106 CFU/ml, số bào tử phát triển thành

khuẩn lạc chỉ còn dưới 3 khuẩn lạc khi xử lý với nano Cu ở nồng độ 1000 ppm.

Như vậy ở nồng độ này khả năng tiêu diệt bào tử nấm bệnh lên đến trên 99 %. Ở

nồng độ 500, nano Cu tiêu diệt bào tử nấm bệnh từ 30 %. Và nano AgH ức chế

41

mạnh sự phát triển của bào tử nấm mạnh nhất với MIC và MFC đều là 0,098 ppm.

a

c b

e d

Hình 7. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các nano kiểm tra với bào tử nấm

N11(a) với nano Cu (b), nano AgH (c), nano Ag (d) và Carbendazim (e)

Bảng 6. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và tiêu diệt (MFC) của các chất nghiên cứu

đối với bào tử nấm C. gloeosporioides N8

Chất kiểm tra MIC (ppm) MFC (ppm)

2000 Cu 1000

100 Ag 50

0,195 AgH 0,098

42

>400 Carbendazim >400

a

b

c

d e Hình 8. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với bào tử nấm N8 (a) với nano Cu (b),

nano Ag (c), nano AgH (d) và Carbendazim (e)

Đối với nấm N8, kết quả cho thấy các hạt nano ức chế sự hình thành các

khuẩn lạc của nấm ở các nồng độ khác nhau. MIC của nano Cu và Ag tương ứng là

1000 ppm và 50 ppm. Nano Cu ở nồng độ trên 2000 ppm và nano Ag 100 ppm làm

chết hoàn toàn sự phát triển của bào tử nấm bệnh. Với các nồng độ thấp hơn 50 ppm

đối với nano Ag và 1000 ppm của nano Cu gây ức chế trên bào tử nấm đến trên

90% (Hình 10). Riêng nano AgH có sự kết hợp giữa nano Ag và H2O2 trong quá

43

trình sản xuất, cho thấy khả năng ức chế mạnh sự phát triển của bào tử nấm với

MIC và MFC lần lượt là 0,098 và 0,195 ppm, thể hiện hiệu quả kháng nấm N8

mạnh nhất trong các nano nghiên cứu.

a

b

Hình 9. Đánh giá mức độ tác động của nano với nấm N11 ở giai đoạn bào tử với nano Ag (a), nano Cu (b)

a

44

b

c

Hình 10. Ảnh hưởng của nano đến khả năng phát triển hình thành khuẩn lạc của

nấm N8 ở giai đoạn bào tử với nano AgH (a), nano Ag (b), nano Cu (c)

Hiệu quả ức chế nấm của hai nano kim loại Ag và Cu trong thí nghiệm của

này phù hợp với thứ tự công bố của Zhao và Stevens (1998) về hiệu quả ức chế của

các nano với vi sinh vật là Ag > Hg > Cu > Cd > Cr > Pb > Co > Au > Zn > Fe >

Mn > Mo > Sn [49].

Carbendazim là chất diệt nấm được sử dụng trên toàn thế giới như phương

thức điều trị trước và sau thu hoạch để kiểm soát các bệnh nấm trên nhiều loại cây,

trái cây như chuối, xoài, dâu tây, dứa, ngũ cốc, củ cải đường, cây cảnh, thảo dược

và cam. Tại Châu Âu và Mỹ, carbendazim đã bị cấm sử dụng do những tác động

đến sức khỏe con người [40] và ở Việt Nam hiện nay, thuốc hóa học này cũng

không được sử dụng trong diệt nấm trên rau quả. Ở nồng độ 400 ppm, carbendazim

tiêu diệt được bào tử nấm N11, tương đương với nồng độ tiêu diệt của nano Ag,

thấp hơn MFC của nano Cu, và cao hơn MFC của nano AgH gần 40 lần.

Carbendazim nồng độ 400 ppm không ức chế hoàn toàn bào tử nấm N8 phát triển,

cho thấy khả năng kháng nấm thấp khi so sánh với hiệu quả tiêu diệt của nano Ag

nồng độ 100 ppm và nano AgH 0,195 ppm. Điều này chứng tỏ nano kim loại có khả

năng kháng nấm hiệu quả với liều lượng thấp hơn hàng trăm lần so với chất diệt

nấm và có thể sử dụng để thay thế các hóa chất độc hại.

Nano kim loại thể hiện khả năng kháng nấm khác nhau với các loại nấm

khác nhau. Trong nghiên cứu này, với các nano được sản xuất tại Viện Công nghệ

45

môi trường, MFC của nano Cu với nấm N8 cao hơn 2 lần MFC với nấm N11,

chứng tỏ nano Cu diệt nấm N11 hiệu quả hơn nấm N8. Mặt khác, nano Ag có MFC

với nấm N8 bằng ¼ MFC với nấm N11, do đó, N8 nhạy cảm với nano Ag hơn nấm

N11. Nano AgH thể hiện hiệu quả diệt bào tử của cả hai nấm mạnh nhất trong các

nano khảo sát. Đã có nhiều nghiên cứu khác chứng minh nano Ag có khả năng

kháng nấm và trong hầu hết các trường hợp, sự ức chế nấm gây bệnh thực vật được

ghi nhận ở nồng độ 100 ppm, cao gấp 8 lần nồng độ nano Ag ức chế nấm P.

digitatum (12,5 ppm) trong nghiên cứu này. Mahdizadeh và cộng sự đã báo cáo

rằng dung dịch nano Ag nồng độ 35 ppm ức chế được Aspergillus, Penicillium và

Trichoderma. Nguyên nhân của sự khác nhau này có thể do đặc tính của nano sản

xuất và chủng nấm kiểm định. Kanhed và cộng sự (2014) đã nghiên cứu khả năng

ức chế của nano Cu với các nấm gây bệnh ở thực vật như Phoma destructiva,

Curvularia lunata, Alternaria alternata và Fusarium oxysporum nhưng chưa có

nghiên cứu cụ thể nào trên nấm Penicillium sp. [21]. Tuy nhiên, những các báo cáo

về giá trị MFC dao động trong phạm vi rộng.

3.3.2. Giai đoạn sinh dưỡng

3.3.2.1. Giai đoạn sinh dưỡng nấm N11

Để khảo sát khả năng ức chế của nano Ag và Cu với hai nấm bệnh kiểm tra,

tiến hành đánh gía tốc độ phát triển của hệ sợi nấm trên môi trường dinh dưỡng có

bổ sung các nano khảo sát ở các nồng độ khác nhau. Kết quả được chỉ ra trong Bảng

46

7, Hình 11, 12 và 13.

Bảng 7. Ảnh hưởng của nano kim loại đến khả năng phát triển của nấm N11

Hiệu quả ức chế nấm theo thời gian, %

Nồng độ

3 ngày 7 ngày 10 ngày

Ag 10 ppm 17,07 35,80 41,67

Ag 30 ppm 41,46 51,85 55,00

Ag 50 ppm 43,90 45,68 50,00

Ag 200 ppm 48,78 61,73 64,17

Ag 300 ppm 56,10 65,43 65,83

Ag 400 ppm 58,54 71,60 76,67

Cu 100 ppm 24,39 23,46 22,50

Cu 250 ppm 21,95 46,91 57,50

Cu 500 ppm 100 100 100

AgH 5 ppm 100 10,00 0

AgH 10 ppm 100 50,00 79,17

AgH 15 ppm 100 100 100

47

100 100 100 Carbendazim 400 ppm

a

b

Hình 11. Hiệu quả ức chế nấm của nano Ag (a) và nano Cu (b) đối với nấm N11 sau 10 ngày

a

b

48

Hình 12. Hiệu quả ức chế nấm của các nano AgH đối với nấm N11 sau 3 ngày (a) và 10 ngày (b)

Hình 13. Hiệu quả ức chế nấm của Carbendazim đối với nấm N11 trong 10 ngày

Hiệu quả ức chế sự phát triển của nấm tăng dần theo nồng độ các nano sử

dụng. Ở giai đoạn sinh dưỡng, nano Cu ức chế 50% ở nồng độ 250 ppm và tỷ lệ ức

chế 100% được quan sát thấy ở nồng độ 500 ppm, nano Ag ức chế khoảng 50% sự

phát triển của nấm ở nồng độ 30 ppm và tăng dần trên 80% ở nồng độ 400 ppm.

Trong khi đó, nano AgH ức chế hoàn toàn nấm N11 ở nồng độ 15 ppm. Hóa chất

diệt nấm carbendazim trên thị trường cũng ức chế 100% ở nồng độ 400 ppm.

3.3.2.2. Giai đoạn sinh dưỡng nấm N8

Trong tất cả các thí nghiệm với nano Cu, đường kính tăng trưởng của nấm

trên đĩa thí nghiệm có bổ sung nano đều nhỏ hơn so với đĩa đối chứng. Mức ức chế

nano Cu thấp nhất được quan sát ở nồng độ 100 ppm. Mức ức chế cao nhất được

quan sát ở nồng độ 1000 ppm. Sau 7 ngày, sự ức chế tăng trưởng là khoảng 72,78%,

mạnh hơn mười một lần so với mức thấp nhất (6,33%).

Hình 14. Hiệu quả ức chế của nano Cu đối với C. gloeosporioides N8 sau 7 ngày

Hoạt tính kháng nấm cao nhất đã được quan sát trong xử lý với các hạt nano

bạc ở nồng độ 100 ppm. Sau 3 ngày và 7 ngày, tỷ lệ ức chế giảm còn lần lượt là

81,82% và 62,58%. Kết quả thu được tương tự như báo cáo của Lamsal và cộng sự

(2011), ông chỉ ra rằng, các hạt nano bạc có thể kiểm soát chặt chẽ sự tăng trưởng

49

của mầm bệnh Colletotrichum ở nồng độ thấp hơn các ion bạc.

3 ngày

7 ngày

Hình 15. Hiệu quả ức chế của nano Ag đối với C. gloeosporioides N8 sau 7 ngày

)

%

( ế h c c ứ ệ l

ỷ T

100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00

100

250

500

1000

Nồng độ nano Cu (ppm)

3 ngày

7 ngày

Hình 16. Ảnh hưởng của nano đồng đến sinh trưởng của nấm N8

)

%

( ế h c c ứ ệ l

ỷ T

100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00

30

100

50 Nồng độ nano Ag (ppm)

50

Hình 17. Ảnh hưởng của bạc đến sinh trưởng của nấm N8

Tương tự các hạt nano bạc, hạt nano AgH có thể hạn chế sự phát triển của

nấm. Ở nồng độ thấp nhất của AgH (1ppm), hiệu quả ức chế là 62,50% sau khi ủ

trong 3 ngày, và 83,00% sau 7 ngày. Ở nồng độ 3 ppm, nano AgH, sự phát triển của

nấm có thể bị ức chế hoàn toàn và quan sát thấy không có sự tăng trưởng của nấm

trên đĩa sau 10 ngày ủ (Hình 18).

3 ngày

7 ngày

100.00

Hình 18. Hiệu quả ức chế của AgH đối với C. gloeosporioides N8 sau 7 ngày

)

80.00

%

60.00

40.00

( ế h c c ứ ệ l

ỷ T

20.00

0.00

1

2

4

5

3 Nồng độ nano AgH (ppm)

Hình 19. Ảnh hưởng của nano AgH đến sự phát triển của nấm N8

51

Hình 20. Hiệu quả ức chế của Carbendazim với nấm N8

Khả năng ức chế nấm của nano Cu cũng được chứng minh trong nghiên cứu

của Phạm Văn Việt và cộng sự (2016) [44]. Các hạt nano đồng có kích thước 20 ÷

50 ppm, ở nồng độ 380 ppm ức chế 43,00% sự tăng trưởng của sp. so với đĩa đối

chứng sau 3 ngày. Ở nồng độ 450 ppm, hiệu quả ức chế nấm 67,38% sau 3 ngày và

lên tới 93,98% sau 9 ngày, vì sợi nấm hầu như không phát triển ở đĩa thí nghiệm

trong khi phát triển nhanh ở đĩa đối chứng [44]. Như vậy đối với các nấm khác nhau

sự ức chế của nano Cu là khác nhau. Tương tự như vậy, trong thí nghiệm này, sau 7

ngày, nano Cu ở nồng độ 500 ppm chỉ ức chế được 56,96% nấm C. gloeosporioides

N8, nhưng ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm P. digitatum N11, kết quả này

tương đồng với thí nghiệm của chúng tôi.

Hạt nano bạc đã chứng minh được hoạt tính kháng lại nấm thông qua nhiều

nghiên cứu khác nhau. Trong nghiên cứu của Woo và cộng sự (2009), đĩa môi

trường Malt Agar bổ sung các nồng độ khác nhau của 3 dạng nano bạc khác nhau

ức chế tăng trưởng sợi nấm Raffaelea sp. và gây ra các vết đốm bất thường trên

phần lớn sợi nấm khí sinh đã được quan sát ở nồng độ cao hơn 10 ppm. Trong

nghiên cứu khác của Park và cộng sự (2006), cho rằng nấm gây bệnh thực vật sau

đây có thể được điều trị và kiểm soát bằng cách sử dụng silica-bạc có kích thước

nano bao gồm: Blumeria spp., Sphaerotheca spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia

spp., Colletotrichum spp., Botrytis spp., Magnaporthe spp. và Pythium spp. Tổn

thương trên bề mặt của sợi nấm cũng được quan sát thấy, là nguyên nhân gây ra sự

giải phóng các tế bào chất bên trong tế bào và làm co rút của sợi nấm. Các ion bạc

và các hạt nano có độc tính thấp và phổ kháng nấm rộng, hoạt động cũng rất hiệu

quả trong việc giảm các bệnh thực vật gây ra bởi bào tử nấm. Cả hai nấm Both

sorokiniana và Magnaporthe grisea gây bệnh rụng lá và sinh sản vô tính bằng bào

tử đã được Jo và các cộng sự nghiên cứu (2009). Hiệu quả kháng nấm của nano bạc

đã được giảm xuống 24 giờ sau khi tiếp xúc. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự tương

tác trực tiếp của nano bạc với bào tử hoặc ống mầm của nấm là điều cần thiết trong

quá trình ức chế sự phát triển của bệnh. Nồng độ khác nhau của các hạt nano bạc

52

cũng được chứng minh có ảnh hưởng đến mức độ ức chế tăng trưởng của

Trichoderma viride và T. harzianum. Kết quả cho thấy tốc độ tăng trưởng của nấm

giảm khi tăng thời gian tiếp xúc và nồng độ sử dụng của các hạt nano bạc. Quan sát

bằng kính hiển vi cho thấy sự nảy mầm bào tử bị ức chế trên các đĩa thạch chứa hạt

nano bạc, trong khi phát triển sợi nấm do nảy mầm bào tử đã được quan sát rõ ràng

trên các đĩa chỉ được xử lý bằng nước. Nảy mầm không xảy ra sau một thời gian dài

ủ bào tử nấm với nano bạc. Các hạt nano bạc có thể trực tiếp gắn và thâm nhập vào

màng tế bào để diệt bào tử, mặc dù sự xâm nhập của các hạt nano bạc vào màng tế

bào vi sinh vật không được hiểu đầy đủ. Một cơ chế giải thích cho hoạt tính kháng

nấm của các hạt nano được đề xuất bởi quá trình nảy mầm và gây bệnh ở một số

loại nấm. Các hạt nano bạc phá vỡ các hệ thống vận chuyển, bao gồm cả sự phát tán

ion, làm rối loạn chức năng và gây ra một số vấn đề trong tế bào nấm như quá trình

chuyển hóa và hô hấp. Nano Ag cũng làm mất khả năng nhân bản DNA, dẫn đến sự

biểu hiện bất hoạt của các protein nằm trên tiểu đơn vị ribosome, cũng như một số

protein và các enzyme khác cần thiết cho sản xuất ATP. Hơn nữa, các ion bạc được

biết là tạo ra các gốc tự do oxy hóa (ROS) có hại cho các tế bào gây tổn thương

protein, lipid và axit nucleic. Hạt nano ức chế mạnh sự sinh trưởng, phát triển của

nấm và gây tổn thương thành tế bào. Các hạt nano bạc cho thấy hoạt tính kháng

nấm đáng kể trong cả hai thí nghiệm trên ống nghiệm đĩa Petri và trong các thí

nghiệm lây nhiễm trên thực vật. Sự lan rộng và hình thành sợi nấm bị ức chế đáng

kể khi có mặt nano bạc [17].

Sử dụng nano Ag và Cu có khả năng ức chế nấm P. digitatum N11 và nấm

C. gloeosporioides N8. Trong khi đó, các hóa chất ở nồng độ cao Benomyl (200

ppm), Thiabendazole (2000 ppm) đều không có khả năng loại bỏ nấm mốc [9].

Carbendazim và Thiabendazole là những chất kháng nấm thường được sử dụng để

kiểm soát nấm bệnh do Penicillium sp. gây ra cho cây có múi [10], nhưng lại có tác

động tiêu cực lâu dài cho con người và môi trường. Như vậy, có thể ứng dụng các

nano này thay thế thuốc bảo vệ thực vật trong hạn chế tác hại của nấm bệnh trong

53

tương lai.

3.4. Nghiên cứu ứng dụng nano trong hạn chế bệnh trên quả cam Hàm Yên -

Tuyên Quang trong lây nhiễm nhân tạo

Để đánh giá tiềm năng ứng dụng nano trong bảo quản cam, tiến hành gây vết

thương và xâm nhiễm nấm N11 và N8 trên quả cam sau đó nhúng nano ở các nồng

độ khác nhau trên quả. Đánh giá khả năng hạn chế bệnh của các thí nghiệm theo

thời gian. Trong thí nghiệm này, sử dụng là sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật trên thị

trường là Anvil có chứa Hexaconazole 50g/L (do bên Viện Bảo vệ thực vật cung

cấp) để làm đối chứng so sánh.

Hình 21. Cam Hàm Yên - Tuyên Quang được chuẩn bị cho thí nghiệm

54

xâm nhiễm nhân tạo

Hình 22. Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro đối với nấm N8

Hình 23. Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro đối với nấm N11

a

b

Hình 24. Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro xử lý với Anvil đối với

55

nấm N11 (a) và nấm N8 (b)

Bảng 8. Tỷ lệ cam bị bệnh trong điều kiện xâm nhiễm nấm N11 xử lý với nano

AgH sau 5 ngày

Thí nghiệm Nồng độ nano sử dụng Tỷ lệ bệnh (%)

AgH 0 ppm 46,64 ĐC

AgH 10 ppm 41,67 CT1

AgH 15 ppm 41,67 CT2

AgH 20 ppm 41,67 CT3

AgH 50 ppm 8,33 CT4

AgH 75 ppm 8,33 CT5

AgH 150 ppm 8,33 CT6

AgH 200 ppm 0 CT7

CT8 Anvil (Hexaconazole 400ppm) 41,67

Các CT1, CT2, CT3 có nồng độ nano AgH ≤ 50 ppm, trong điều kiện xâm

nhiễm nhân tạo không đem lại hiệu quả, mức độ quả bị bệnh giảm không đáng kể so

với đối chứng có bệnh và không xử lý với nano AgH. Tuy nhiên khi so sánh đường

kính vết bệnh trên quả cho thấy, sử dụng nano AgH nấm phát triển chậm hơn trên

quả và đường kính vết bệnh lan chậm hơn. Các CT4, CT5, CT6, CT7 cho hiệu quả

cao, với tỷ lệ bệnh giảm từ 46,64 % ở ĐC xuống còn 8,33% khi sử dụng nồng độ

nano AgH là 50 ppm (dưới 10% quả bị bệnh). Như vậy, nên sử dụng nano AgH ≥

50 ppm sẽ cho hiệu quả trong xử lý nấm bệnh. So sánh với thí nghiệm xử lý bằng

Anvil, với nồng độ khuyến cáo trong thử nghiệm (400ppm), kết quả cho thấy Anvil

56

ức chế kém sự phát triển của nấm, giảm khoảng 5% so với ĐC.

Bảng 9. Tỷ lệ cam bị bệnh trong điều kiện xâm nhiễm nấm N8 xử lý với nano AgH

sau 5 ngày

Thí nghiệm Nồng độ nano sử dụng Tỷ lệ bệnh (%)

AgH 0 ppm ĐC 91,67

AgH 1 ppm CT1 91,67

AgH 3 ppm CT2 91,67

AgH 5 ppm CT3 91,67

AgH 50 ppm CT4 25,00

AgH 75 ppm CT5 8,33

AgH 150 ppm CT6 0

AgH 200 ppm CT7 0

CT8 Anvil (Hexaconazole 400ppm) 83,33

Các công thức sử dụng AgH nồng độ thấp <50 ppm có tỷ lệ bệnh tương

đương ĐC, chứng tỏ không có khả năng diệt nấm bệnh khi xâm nhiễm trên quả.

Tuy vậy, đường kính vết bệnh nhỏ hơn so với đối chứng, chứng tỏ nano AgH ở các

nồng độ này đã ức chế tốc độ phát triển của nấm trên quả. Với nồng độ nano ≥

50ppm, hiệu quả ức chế đã tăng lên đáng kể, tỷ lệ bệnh ở 50 ppm giảm 66,67% so

với ĐC, 100ppm giảm còn 8,33%, và nấm bị ức chế hoàn toàn trong thời gian theo

dõi với nồng độ nano AgH sử dụng là 150 ppm và 200 ppm. Thí nghiệm với thuốc

trừ sâu thương mại Anvil chỉ giảm được 10% bệnh so với ĐC.

Thông qua những kết quả về hiệu quả hạn chế nấm bệnh của nano AgH đối

với hai chủng nấm nghiên cứu, nồng độ AgH > 50 ppm thể hiện được khả năng ức

57

chế các chủng nấm tương đối hiệu quả trong điều kiện xâm nhiễm nhân tạo. Vì vậy,

trong thí nghiệm tiếp theo, tiếp tục nghiên cứu hiệu quả của các nồng độ AgH ≥ 50

ppm trong bảo quản ở quy mô pilot.

3.5. Đánh giá chất lƣợng của quả cam sau xử lý nano bảo quản ở quy mô nhỏ

Mục tiêu của thí nghiệm này nhằm đánh giá ảnh hưởng của việc sử dung

nano bạc đến khả năng hạn chế bệnh trên quả và ảnh hưởng của chúng đến các chỉ

tiêu chất lượng quả trong quá trình bảo quản cam sau thu hoạch.

Nano AgH được phối trộn vào chế phẩm màng phủ EC do Viện Cơ điện

nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch chế tạo. Thành phần chế phẩm phù màng

EC: nước, HPMC, nano chitosan, nano carnauba, nano cellulose, amoniac và chất

chống bọt.

Tiến hành khảo sát với 6 công thức:

ĐC: Không bọc màng,

CT0: Màng bọc + 0 ppm AgH,

CT1: Màng bọc + 50 ppm AgH

CT2: Màng bọc + 75 ppm AgH,

CT3: Màng bọc + 100 ppm AgH,

CT4: Màng bọc + 125 ppm AgH.

3.5.1. Ảnh hưởng của sử dụng nano đến tỷ lệ thối hỏng và mốc cuống quả cam

Cam trong lưu trữ được đánh giá tỷ lệ thối hỏng và mốc cuống nhằm đánh

giá khả năng sử dụng của nano AgH hỗ trợ trong quá trình xử lý bệnh, kết quả được

58

chỉ ra trong các Bảng 10 và Hình 25.

Bảng 10. Ảnh hưởng của nano bạc đến tỷ lệ thối hỏng của quả cam

Công thức 10 ngày 20 ngày 30 ngày 40 ngày

ĐC 0 22,00 d 24,00 d 25,00 d

CT0 4,35 6,00 c 8,00 c 10,00 bc

CT1 0 4,55 bc 5,55 b 8,33 bc

CT2 0 4,55 bc 5,30 b 7,40 b

CT3 0 3,55 b 8,00 c 11,00 c

(Trong cùng một cột, các giá trị có ít nhất một chữ giống nhau thì không khác nhau ở mức ý nghĩa α ≤0,05)

CT4 0 1,00 a 1,00 a 4,35 a

Từ số liệu phân tích và xử lí thông kê, cho thấy, thối hỏng đều có ở tất cả các

công thức, tuy nhiên mức độ thối hỏng là khác nhau. Có thể thấy, tác động tốt của

các công thức phủ màng có bổ sung nano Ag đến tỷ lệ thối hỏng của quả cam. Ở

mẫu ĐC - không phủ màng, thối hỏng xảy ra ở ngay giai đoạn đầu của bảo quản và

tăng lên theo thời gian cùng với đó tỷ lệ thối hỏng là cao nhất khoảng 28% sau 40

ngày bảo quản. Các mẫu CT2, CT4 tỷ lệ thối hỏng diễn ra chậm trong giai đoạn đầu

bảo quản và tăng lên ở giai đoạn sau. Mẫu CT4 tỷ lệ thối hỏng thấp nhất khoảng

7,45%, tiếp theo là mẫu CT2 khoảng 8,26%. Ở mẫu CT0, CT1, CT3 tỷ lệ thối hỏng

59

lần lượt là 13,25%, 11,98%, 12,65%, giữa các mẫu này không có sự khác biệt rõ rệt.

35

30

)

25

%

DC

(

CT0

20

CT1

15

CT2

g n ố u c c ố m ệ l

CT3

ỷ T

10

CT4

5

0 10 ngày

20 ngày

30 ngày

40 ngày

50 ngày

Hình 25. Ảnh hưởng của nano bạc đến tỷ lệ mốc cuống của quả cam

Từ Hình 25 cho thấy, tất cả các mẫu đều xuất hiện mốc cuống, tuy nhiên

giữa các mẫu có sự khác nhau. Sau 40 ngày bảo quản, tỷ lệ mốc cuống ở CT3 và

CT4 là thấp nhất, lần lượt là 21,50% và 22,22%. Mốc cuống ở mẫu ĐC là cao nhất,

khoảng 32% sau 40 ngày. Như vậy sử dụng nano AgH trong xử lý quả cam giúp

hạn chế bệnh trên quả trong quá trình lưu trữ.

3.5.2. Ảnh hưởng của sử dụng nano AgH đến chất lượng quả cam trong

bảo quản

Để đánh giá chất lượng quả cam, sau bảo quản, cam được xử lý và đánh giá

hàm lượng đường, axit, màu sắc sau theo thời gian so với mẫu đối chứng. Kết quả

60

được thể hiện trong Bảng 11.

Bảng 11. Chất lượng quả cam bảo quản với màng EC có bổ sung các nồng độ nano

AgH khác nhau theo ngày

0 ngày 40 ngày

Hàm lƣợng vitamin C

Hàm lƣợng vitamin C

Hàm lƣợng axit hữu cơ

Hàm lƣợng đƣờng tổng số

Hàm lƣợng chất khô hòa tan

Hàm lƣợng axit hữu cơ

Hàm lƣợng đƣờng tổng số

Hàm lƣợng chất khô hòa tan

(mg/100 g)

(%)

(%)

(◦Brix)

(%)

(%)

(◦Brix)

(mg/100g )

29,18 0,71 6,70 8,06 20,14a 0,32a 6,85a 11,25 a ĐC

29,18 0,71 6,70 8,06 24,05c 0,38ab 7,82b 11,56 b CT0

29,18 0,71 6,70 8,06 23,58b 0,3a 7,75c 10,80 c CT1

29,18 0,71 6,70 8,06 25,48d 0,55bc 8,05c 11,00 d CT2

29,18 0,71 6,70 8,06 26,84e 0,61c 7,69c 10,23 e CT3

(Trong cùng một cột, các giá trị có ít nhất một chữ giống nhau thì không khác nhau ở mức ý nghĩa α ≤0,05)

29,18 0,71 6,70 8,06 27,23f 0,56bc 7,52d 9,95 f CT4

Sự biến đổi vitamin C trong bảo quản cam được thể hiện tại Bảng 11. Cụ thể,

hầu hết ở các mẫu vitamin C đều tăng trong những ngày đầu bảo quản sau đó giảm

mạnh sau 20 ngày. Đến cuối đợt bảo quản, sau 40 ngày, ở mẫu ĐC hàm lượng

vitamin C giảm 30% so với ban đầu, mẫu CT3 và CT4 hàm lượng vitamin C giảm ít

nhất so với ban đầu, lần lượt khoảng 8% và 6%.

Axit hữu cơ trong rau quả có dưới dạng tự do, dạng muối, este. Chúng tham

gia vào quá trình oxi hoá khử trong rau quả như glucid và hô hấp. Vì vậy trong quá

trình tồn trữ lâu dài, giá trị cảm quan về mùi vị của một số loại rau quả giảm đi rõ

rệt. Số liệu phân tích cũng cho thấy, hàm lượng axit hữu cơ của quả cam giảm trong

suốt thời gian bảo quản. Sau 40 ngày bảo quản, mẫu ĐC, CT0, CT1 hàm lượng axit

61

hữu cơ giảm nhiều nhất, lần lượt là 54%, 46% và 57% so với hàm lượng axit ban

đầu; mẫu CT2, CT3,CT4 hàm lượng axit hữu cơ giảm ít hơn, lần lượt là 22%, 13%

và 20% so với ban đầu và giữa các mẫu này không có sự khác biệt nhiều. Điều này

cho thấy, mẫu CT2, CT3, CT4 vẫn giữ được hương vị trong quá trình bảo quản.

Trong quá trình bảo quản hàm lượng đường tổng số của quả cam có sự biến

đổi. Trong giai đoạn đầu bảo quản, hàm lượng đường ở mẫu ĐC tăng đáng kể từ

6,70% lên 9,05%, ở các mẫu CT0, CT1, CT2, CT3, CT4 hàm lượng đường tăng nhẹ

so với ban đầu. Ở giai đoạn sau của quá trình bảo quản, mẫu ĐC, CT0, CT1 hàm

lượng đường có xu hướng giảm dần, mẫu CT2, CT3 và CT4 hàm lượng đường vẫn

tăng nhẹ. Có thể giải thích rằng, sau 10 ngày đầu bảo quản mẫu ĐC hàm lượng

đường tăng cao do quả đang bước vào giai đoạn chín, sau đó giảm dần ở cuối kì bảo

quản, khi đó quả xuống cấp kém chất lượng. Riêng các công thức CT2, CT3 và

CT4, hàm lượng đường tăng nhẹ trong quá trình bảo quản, quả vẫn giữ được chất

lượng.

Chất khô hòa tan (TSS) trong rau quả gồm: các loại đường, các axit hữu cơ,

pectin, các chất đạm, các chất chát, chất thơm, một số vitamin, một số enzym, một

số chất khoáng…. Cùng với quá trình chín của quả, hàm lượng chất khô hòa tan

tăng lên, tuy nhiên sẽ giảm đi khi quả mất chất lượng. Từ số liệu phân tích xử lí

thống kê, có thể nhận thấy hàm lượng chất khô hòa tan biến đổi trong quá trình bảo

quản ở các công thức khác nhau. Hầu hết, trong giai đoạn đầu bảo quản, chất khô

hòa tan đều tăng ở tất cả các mẫu. Ở 20 ngày, mẫu ĐC tăng cao nhất là 12,35% và

có sự khác biệt đáng kể đối với các mẫu khác. Tuy nhiên, ở cuối giai đoạn bảo

quản, hàm lượng chất khô hòa tan ở mẫu ĐC, CT0, và CT1 giảm nhẹ; các mẫu CT2,

CT3 và CT4 vẫn có xu hướng tăng. Điều này chứng tỏ, bổ sung nano Ag vào màng

coating có ảnh hưởng đến sự chín của quả trong quá trình bảo quản.

Ở các mẫu thí nghiệm, quả vẫn giữ được màu sắc tốt trong quá trình bảo

62

quản, trong khi ở mẫu đối chứng, quả đã có sự đổi màu rõ rệt sang màu vàng.

Ban đầu

63

20 ngày

30 ngày

40 ngày

Hình 26. Hình ảnh cam bảo quản theo ngày ở quy mô pilot

Như vậy, thông qua các kết quả theo dõi trên quả cam có và không xử lý với

nano AgH cho thấy, sử dụng nano AgH có tác dụng hạn chế thối hỏng trên quả cam,

giảm tỷ lệ mốc cuống. Các nồng độ nano AgH sử dụng đều không làm ảnh hưởng

64

đến chất lượng quả cam. Nồng độ nano AgH sử dụng thích hợp là 75 ÷ 125 ppm.

KẾT LUẬN

- Đã phân lập được nấm N11 gây bệnh mốc xanh và nấm N8 gây bệnh thán

thư trên quả cam Tuyên Quang từ quả cam có các triệu chứng bệnh.

- Dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự gen ITS, đã định danh được chủng

nấm N11 gây bệnh mốc xanh là Penicillium digitatum N11 và chủng nấm

gây bệnh thán thư N8 được định danh là Colletotrichum gloeosporioide

N8.

- Trong phòng thí nghiệm, ở nồng độ 3 ppm, nano AgH có thể ức chế hoàn

toàn sự phát triển của nấm N11. Nano AgH 15 ppm ức chế hoàn toàn sự

phát triển của nấm N8.

- Trong thí nghiệm xâm nhiễm nhân tạo hai nấm gây bệnh trên quả cam,

nồng độ nano AgH ≥ 50 ppm thể hiện khả năng ức chế nấm hiệu quả

(≥75%) và được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

- Thí nghiệm trên quy môi pilot, màng coating bổ sung nano AgH có khả

năng hạn chế nấm trên quả cam, tăng chất lượng bảo quản. Các công thức

coating đều cho chất lượng tốt hơn so với mẫu đối chứng (hàm lượng

đường, hàm lượng vitamin C, đánh giá cảm quan), và tỷ lệ thối hỏng thấp

hơn mẫu đối chứng.

- Đã xác định được nồng độ nano AgH thích hợp sử dụng trong bảo quản

65

cam là 75 ÷ 125 ppm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành (2005), Giáo trình nấm

học, Trường ĐH Cần Thơ, Cần Thơ.

2. Nguyễn Thị Kim Cúc (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế

phẩm sinh học từ thực vật có chứa cacbua terpenic, xeton sesquiterpenic và

turmeron trong bảo quản quả tươi sau thu hoạch, Bộ Khoa học và Công nghệ

Việt Nam, Hà Nội.

Tiếng Anh

3. Aitken, R. J., Chaudhry, M. Q., Boxall, A. B. A., Hull, M. (2006),

“Manufacture and use of nanomaterials: current status in the UK and global

trends”, Occupational Medicine, 56, pp. 300-306.

4. Andrews, J. M. (2001), “Determination of Minimum Inhibitory

Concentrations”, Journal Antimicrob Chemother, 48, pp. 5-16.

5. Awang, Y., Ghani, M.A.A., Sijam, K., Mohamad, R.B. (2011), “Effect of

calcium chloride on anthracnose disease and postharvest quality of red-flesh

dragon fruit Hylocereus polyrhizus”, African Journal of Microbiology

Research, 5, 5250–5259.

6. Carbone, M., Donia, T. D., Sabbatella, G., Antiochia, R. (2016), “Silver

nanoparticles in polymeric matrices for fresh food packaging”, Journal of King

Saud University – Science, 28, pp. 273–279.

7. Ceponis, M. J., Cappellini, R. A., Lightner, G. W. (1986), « Disorders in

citrus shipments to the New York Market, 1972–1984”, Plant Dieases, 70, pp.

1162–1165

8. Chavada, P. J., Chudasama, M. M., Bariya A. R., Gadhvi Y. H., Nalwaya, S.

B., Deokar, S. S. and Sadhu B. B. (2016), “Novel application of

nanotechnology of nanotechnology in dairy and food industry: Nano inside”,

66

International Journal of Agriculture Sciences, 8(54), pp.-2920-2922.

9. Chen, P. S., Peng, Y. H., Chung, W. C., Chung, K. R., Huang, H. C. and

Huang, J. W. (2016), “Inhibition of Penicillium digitatum and citrus green

mold by volatile compounds produced by Enterobacter cloacae”, Journal of

Plant Pathology and Microbiology, 7-339.

10. Cunningham, N. M. and Taverner, P. D. (2007), “Efficacy of integrated

postharvest treatments against mixed innoculations of Penicillium digitatum

and Geotrichum citriaurantii in „leng‟ navel oranges (citrus sinensis)”, New

Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 35(2), 187-192.

11. Dean, R., Van Kan, J. A., Pretorius, Z. A., Hammond-Kosack, K. E., Di Pietro,

A., Spanu, P. D., Rudd, J. J., Dickman, M., Kahmann, R., Ellis, J., Foster, G.

D. (2012), “The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology”,

Molecular Plant Pathology, 13, 414–430

12. Del Nobile, M. A. and Conte, A. (2013), Packaging for Food Preservation,

Springer-Verlag New York.

13. Durán, N., Marcato, P. D., De Conti, R., Alves, O. L., Costa, F. T. M., and

Brocchi, M. (2010), “Potential use of silver nanoparticles on pathogenic

bacteria, their toxicity and possible mechanisms of action,” Journal of the

Brazilian Chemical Society, 21(6), pp. 949–959.

14. El-Gali, Z. I. (2014), “Control of Penicillium digitatum on Orange Fruits with

Calcium Chloride Dipping”, Journal of Microbiology Research and Reviews,

2(6), pp. 54-61.

15. FAO (2017), Citrus fruit fresh and processed statistical bulletin 2016.

16. Frisvad, J. C. and Samson, R. A. (2004), “Polyphasic taxonomy of Penicillium

subgenus Penicillium: A guide to identification of food and air-borne

terverticillate Penicillia and their mycotoxins”, Studies in Mycology, 49, pp. 1-

174.

17. Gavanji, S. (2013), “The effects of silver Nanoparticles on microorganisms: A

67

review”, Applied Science Reports, 1(2): 50-56.

18. Gorinstein, S., Martin-Belloso, O., Park, Y., Haruenkit, R., Lojek, A., Milan,

I., Caspi, A., Libman, I., Trakhtenberg, S. (2001), “Comparison of some

biochemical characteristics of different citrus fruits”, Food Chem, 74(3), pp.

309-315.

19. Ismail, M. and Zhang, J. (2004), “Postharvest citrus diseases and their

control”, Outlook of pest management, 15: 29–35.

20. Jafari, A., Pourakbar, L., Farhadi, K., Mohamadgolizad, L., Goosta, Y. (2015),

“Biological synthesis of silver nanoparticles and evaluation of antibacterial

and antifungal properties of silver and copper nanoparticles”, Turkish Journal

of Biology, 39, pp. 556-56.

21. Kanhed, P., Birla, S., Gaikwad, S., Gade, A., Seabra, A. B., Rubilar, O.,

Duran, N., Rai, M. (2014), “In vitro antifungal efficacy of copper

nanoparticles against selected crop pathogenic fungi”, Materials Letters, 115:

13-17

22. Kim, S. W., Jung, J. H., Lamsal, K., Kim, K. S., Min, J. S, Lee, Y. S. (2012),

“Antifungal Effects of Silver Nanoparticles (AgNPs) against Various Plant

Pathogenic Fungi”, Mycobiology, 40(1), pp. 53–58.

23. Li, Q., Mahendra, S.; Lyon, D. Y.; Brunet, L.; Liga, M. V.; Li, D. & Alvarez,

P. J. J. (2008), Antimicrobial nanomaterials for water disinfection and

microbial control: Potential applications and implications. Watter Research,

42(8), pp. 4591-4602, ISSN 0043-1354.

24. Moraru, C., Panchapakesan, C., Huang, Q. and Takhistov. P. (2003).

“Nanotechnology: A new frontier in food science”, Food Technology , 57, pp.

25-27.

25. Ni, H. F., Yang, H. R, Chen, R. S., Liou, R. F., Hung, T. H. (2012), “New

Botryosphaeriaceae fruit rot of mango in Taiwan: identification and

68

pathogenicity”, Botanical Studies 2012, 53, pp. 467-478.

26. Ouda, S. M. (2014), “Antifungal activity of silver and copper nanoparticles on

two plant pathogens, Alternaria alternata and Botrytis cinerea”, Research

Journal of Microbiology, 9, pp. 34-42.

27. Pal, S., Tak, Y. K. and Song, J. M. (2007), “Does the antibacterial activity of

silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the

Gram-negative bacterium Escherichia coli”, Applied and Environmental

Microbiology, 73(6), pp: 1712-1720.

28. Palou, L., 2014, “Chapter 2: Penicillium digitatum, Penicillium italicum

Green Mold, Blue Mold”, Postharvest Decay, Elsevier , pp. 45-101

29. Paull, R. E., Nishijima, W., Reyes, M., Cavaletto, C. (1997), “Postharvest

handling and losses during marketing of papaya Carica papaya”, Postharvest

Biology and Technology, 11, pp. 165–179.

30. Pitt J. I., (1991), Laboratory guide to common Penicillium species,

Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization, Food

Research laboratory, N.S.W. Australia.

31. Plaza, P., Usall, J., Teixidó, N., Viñas, I. (2003a), “Effect of water activity and

temperature on germination and growth of Penicillium digitatum, P. italicum

and Geotrichum candidum”, Journal of Applied Microbiology, 94, pp. 549–

554.

32. Prabhu, B. M., Ali, S. F., Murdock, R. C., Hussain, S. M., and Srivatsan, M.

(2010), “Copper nanoparticles exert size and concentration dependent toxicity

on somatosensory neurons of rat”, Nanotoxicology, 4(2), pp. 150–160.

33. Ramos, A. P., Talhinhas, P., Sreenivasaprasad, S., Oliveira, H. (2016),

“Characterization of Colletotrichum gloeosporioides, as the main causal agent

of citrus anthracnose, and C. karstii as species preferentially associated with

lemon twig dieback in Portugal”, Phytoparasitica, 44(2), pp. 549–561. DOI

10.1007/s12600-016-0537-y.

34. Rodríguez-López, E. S., González-Prieto, J. M., Mayek-Pérez, N. (2009), “La

69

infección de Colletotrichum gloeosporioides Penz. Penz. and Sacc. en

aguacatero Persea americana Mill.: Aspectos bioquímicos y genéticos”,

Mexico. J Phytopathol, 27, pp. 53–63.

35. Roduner, E. (2006), “Size matters: why nanomaterials are different”,

Chemical Society Review, 35, pp.583-592.

36. Sambrook, J. and Russell D.W. (2001), Molecular cloning. A laboratory

manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.

37. Servin, A., Elmer W., Mukherjee, A., Torre-Roche, R. D., Hamdi, H., White,

J. C., Bindraban, P., Dimkpa, C. (2015), “A review of the use of engineered

nanomaterials to suppress plant disease and enhance crop yield,” Journal of

Nanoparticle Research, 17(2), pp. 1–21.

38. Sharma, M. and Kulshrestha, S. (2015), “Colletotrichum gloeosporioides: An

Anthracnose Causing Pathogen of Fruits and Vegetables”, Biosciences

biotechnology research Asia, 122, pp. 1233-1246.

39. Sibi, G., Apsara, V., Dhananjaya, K., Mallesha, H. and Ravikumar, K. R.

(2012), “Biological control of postharvest fungal pathogens of sweet oranges

by Plumeria latex”, Asian Journal of Plant Science and Research, 2(5), pp.

613-619.

40. Singh, S., Singh, N., Kumar, V., Datta, S., Wani, A. B., Singh, D., Singh, K.,

Singh, T. (2016), “Toxicity, monitoring and biodegradation of the fungicide

carbendazim”, Environmental Chemistry Letters, 14(3).

41. Smilanick, J. L., Brown, G. E., Eckert, J. W. (2006a). “The biology and

control of postharvest diseases”, Fresh Citrus Fruits, second ed. Florida

Science Source, pp. 339–396.

42. Tarafdar, J. C., Sharma, S., Raliya, R. (2013), “Nanotechnology:

Interdisciplinary science of applications”, African Journal of Biotechnology,

12, pp. 219-226.

43. Uthaya Chandirika, J., Tamil Selvi, S., Annadurai, G. (2018), “Synthesis and

70

characterization of silver nanoparticle using Melia azedarach for vegetable

coating and antibacterial activity”, Journal of Innovations in Pharmaceutical

and Biological Sciences, 5(2), pp. 38-42.

44. Viet, P. V., Nguyen, H. T., Cao, M. T., and Hieu, L. V. (2016), “Fusarium

antifungal activities of copper nanoparticles synthesized by a chemical

reduction method”, Journal of Nanomaterials, Volume 2016.

45. Wang, D., An, J., Luo, Q., Li, X., and Yan, L. (2012), “Chapter 2: Synthesis,

Characterization and Application of Silver-Based Antimicrobial

Nanocomposites”, Nano-Antimicrobials Progress and Prospects, Springer-

Verlag Berlin Heidelberg.

46. Weir, B. S., Johnston P. R., Damm U., 2012. The Colletotrichum

gloeosporioides species complex. Stud Mycol., 73(1):115-80.

47. Xia, Z. K., Ma, Q. H., Li, S. Y., Zhang, D. Q., Cong, L., Tian, Y. L., Yang, R.

Y. (2016), “The antifungal effect of silver nanoparticles on Trichosporon

asahii”, Journal of Microbiology, Immunology and Infection, 492, pp. 182-8.

48. Xie, L., Zhang, J. Z., Wan, Y. and Hu, D. W. (2010), “Identification of

Colletotrichum spp. isolated from strawberry in Zhejiang Province and

Shanghai City, China”, Journal of Zhejiang University. Science. B, 11(1), pp.

61–70.

49. Zhao, G. J., Stevens, S. E. (1998), “Multiple parameters for the comprehensive

evaluation of the susceptibility of Escherichia coli to the silver ion”, Bimetals,

11, pp. 27–32.

Trang web

50. https://www.fatsecret.com/caloriesnutrition/usda/oranges?portionid=58609&p

ortionamount=100.000

51. http://www.cuctrongtrot.gov.vn/DetailInfomation.aspx?InfomationID=IN0000

2160

52. http://www.hoabinh.gov.vn/

53. infonet-biovision.com

71

54. https://vi.wikipedia.org/wiki/Cam

55. http://ttbvtv.lamdong.gov.vn/quan-ly-thuoc-bao-ve-thuc-vat/1405-loai-bo-cac-

thuoc-bvtv-co-chua-hoat-chat-carbendazim,-benomyl-va-thiophanate-methyl-

ra-khoi-danh-muc-thuoc-bvtv-duoc-phep-su-dung-tai-viet-nam-tu-ngay-03-01-

2019

56. http://dulichtuyenquang.gov.vn/DetailView/2720/32/26/Dac-san-cam-sanh-

72

Ham-Yen.html

73