intTypePromotion=1
ADSENSE

Nghiên cứu nuôi cấy rễ cây bán tự mốc (Hemigraphis Glaucescens C. B. Clarke) làm nguồn nguyên liệu thu nhận Betuline

Chia sẻ: Trinhthamhodang Trinhthamhodang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

64
lượt xem
1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens), một loài cây có hình thái tương tự như hoàn ngọc đỏ (Pseuderanthemum bacteatum), có dược tính do mang chất betuline và đang được sử dụng như một bài thuốc dân gian khá phổ biến và hữu hiệu trong điều trị cao huyết áp nhưng chưa có công bố khoa học nào về thành phần hóa học cũng như dược tính. Nghiên cứu này đã chứng minh so với hoàn ngọc đỏ, bán tự mốc cũng có hoạt tính kháng oxi hóa và mang cùng dược chất betuline. Nghiên cứu của chúng tôi chủ yếu tập trung sàng lọc và tìm ra nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa từ cây bán tự mốc, từ đó ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu này một cách chủ động. Bằng cách sử dụng phương pháp thử năng lực khử Yen & Duh và phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH, phân đoạn ethanol rễ được xác định có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh nhất trong các phân đoạn cao có độ phân cực khác nhau từ các bộ phân khác nhau của bán tự mốc. Để tạo nguồn rễ in vitro, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tạo rễ bất định bằng auxin và tạo rễ tơ bằng phương pháp chuyển gen tự nhiên nhờ Agrobacterium rhizogenesATCC 15834. Với 2 phương pháp này, rễ cây bán tự mốc có thể được tạo thành một cách chủ động chỉ sau 10 ngày nuôi cấy.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu nuôi cấy rễ cây bán tự mốc (Hemigraphis Glaucescens C. B. Clarke) làm nguồn nguyên liệu thu nhận Betuline

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151<br /> <br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ CÂY BÁN TỰ MỐC (Hemigraphis glaucescens C. B.<br /> Clarke) LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN BETULINE<br /> <br /> Quách Ngô Diễm Phương*, Vũ Thị Bạch Phượng,<br /> Giống Hối Khoánh, Trần Ngọc Trung, Bùi Văn Lệ<br /> Trường Đại học Khoa học tự nhiên, tp. Hồ Chí Minh, *qndphuong@hcmus.edu.vn<br /> <br /> TÓM TẮT: Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens), một loài cây có hình thái tương tự như hoàn ngọc đỏ<br /> (Pseuderanthemum bacteatum), có dược tính do mang chất betuline và đang được sử dụng như một bài<br /> thuốc dân gian khá phổ biến và hữu hiệu trong điều trị cao huyết áp nhưng chưa có công bố khoa học nào<br /> về thành phần hóa học cũng như dược tính. Nghiên cứu này đã chứng minh so với hoàn ngọc đỏ, bán tự<br /> mốc cũng có hoạt tính kháng oxi hóa và mang cùng dược chất betuline. Nghiên cứu của chúng tôi chủ yếu<br /> tập trung sàng lọc và tìm ra nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa từ cây bán tự mốc, từ đó ứng<br /> dụng các kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu này một cách chủ động. Bằng cách<br /> sử dụng phương pháp thử năng lực khử Yen & Duh và phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH, phân đoạn<br /> ethanol rễ được xác định có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh nhất trong các phân đoạn cao có độ phân cực<br /> khác nhau từ các bộ phân khác nhau của bán tự mốc. Để tạo nguồn rễ in vitro, chúng tôi đã sử dụng<br /> phương pháp tạo rễ bất định bằng auxin và tạo rễ tơ bằng phương pháp chuyển gen tự nhiên nhờ<br /> Agrobacterium rhizogenesATCC 15834. Với 2 phương pháp này, rễ cây bán tự mốc có thể được tạo thành<br /> một cách chủ động chỉ sau 10 ngày nuôi cấy.<br /> Từ khóa: Hemigraphis glaucescens, Pseuderanthemum bacteatum, chống oxi hóa, rễ bất định, rễ tơ.<br /> <br /> MỞ ĐẦU chống viêm, chống HIV, chống sốt rét cũng như<br /> Theo kinh nghiệm dân gian, phần trên mặt có khả năng gây độc đối với một số dòng tế bào<br /> đất của cây bán tự mốc thường được dùng chữa ung thư [6].<br /> viêm đại tràng cấp và mạn tính, rối loạn tiêu Vì vậy, nghiên cứu này thực hiện nhằm<br /> hóa, đau bụng co thắt, đầy chướng bụng, trĩ nội chứng minh hoạt tính kháng oxi hóa và sự hiện<br /> chảy máu, đại tiện ra máu, chảy máu do chấn diện của betuline trong rễ cây bán tự mốc, đồng<br /> thương; có nơi dùng chữa viêm loét dạ dày, thời nghiên cứu nuôi cấy in vitro rễ nhằm hướng<br /> hoặc chữa bệnh cao huyết áp. Lá cây bán tự đến việc thu nhận nguồn vật liệu sản xuất<br /> mốc có thể dùng tươi, hoặc phơi khô sắc với betuline một cách chủ động trong tương lai.<br /> nước, hoặc dùng đắp vết thương giúp vết<br /> thương mau lành [7]. Tuy nhiên, hiệu quả chữa VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> bệnh của cây này chưa có luận cứ khoa học nào<br /> cụ thể. Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của các bộ<br /> phận khác nhau trong các hệ dung môi khác<br /> Betuline (C30H50O2) là một hợp chất nhau từ cây bán tự mốc<br /> triterpen có nhiều giá trị dược liệu quý, đang<br /> được quan tâm hiện nay: chống viêm, chống Điều chế cao: cây tươi được chia làm ba<br /> virus, chống ung thư [4]. Hiện nay, betuline phần rễ, thân, lá (kg) đem sấy khô ở 50oC đến<br /> được phân lập từ vỏ cây bạch dương, cây hoàn khối lượng không đổi, xay nhuyễn tạo bột (g).<br /> ngọc đỏ và chiếm khoảng 30% trọng lượng khô Lần lượt ngâm dầm bột cây với các loại dung<br /> [2, 3]. Betuline có thể dễ dàng chuyển đổi thành môi có độ phân cực tăng dần: diethy eter,<br /> acid betulinic (nhóm rượu được thay thế bởi chloroform, etanol, nước ở nhiệt độ phòng; lọc<br /> một nhóm acid carboxylic) [1], có hoạt tính sinh sau 48 giờ. Phương pháp cô quay chân không<br /> học hoạt động mạnh hơn so với betuline. Acid được dùng để tạo cao đối với các dung môi<br /> betulinic có khả năng chữa bệnh tương tự như diethyl eter, chloroform và ethanol. Đối với<br /> betuline: có tác dụng chống lại một số khối u ác dung môi nước, cao được tạo bằng phương pháp<br /> tính, một số dạng herpes và thậm chí AIDS [5]; đông khô.<br /> <br /> <br /> 145<br /> Quach Ngo Diem Phương et al.<br /> <br /> Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng (MS), bổ sung đường (30g/l), pH 5,8 dùng nuôi<br /> phương pháp thử năng lực khử Yen & Duh: hút cấy thực vật và môi trường Nutrient Broth (NB)<br /> 1 ml (nồng độ 0,5 mg/ml) chất thử nghiệm; 2,5 dùng tăng sinh vi khuẩn A. rhizogenes ATCC<br /> ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,2M pH 15834.<br /> 6,6; 2,5 ml dung dịch potassium ferricyanide Điều kiện nuôi cấy: chiếu sáng 16 giờ/ngày;<br /> 1%; ổn định ở 20oC sau 20 phút; thêm 2,5 ml với cường độ chiếu sáng 3.000 lux; nhiệt độ<br /> acid tricloroacetic 10%; ly tâm 2.000 vòng/phút phòng nuôi cấy: 22-25oC; ẩm độ trung bình:<br /> trong 10 phút; thu dịch nổi; hút 1ml dịch nổi 70%.<br /> qua ống nghiệm khác; thêm 2 ml nước cất và<br /> Khử trùng tạo nguồn mẫu in vitro<br /> 0,5 ml dung dịch FeCl3 1%; lắc đều rồi để yên<br /> sau 5 phút; đo ở bước sóng 700 nm. Quy trình khử trùng chồi bên cây bán tự<br /> mốc gồm rửa xà phòng, lắc với acid benzoid<br /> Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng 0,3% trong 45 phút, rửa lại bằng nước cất.<br /> phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH: bảy Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng, lắc với cồn<br /> loại cao có kết quả tốt nhất từ phương pháp Yen 70% trong 1 phút, rửa bằng nước cất vô trùng;<br /> & Duh được đem xác định giá trị IC50 bằng lắc mẫu trong dung dịch javen: nước (1:2) có bổ<br /> phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH. Pha sung tweens 20 trong 15 phút, rửa lại bằng nước<br /> dung dịch DPPH có nồng độ 0,6 mM trong cất vô trùng. Mẫu được cấy vào môi trường MS<br /> ethanol bằng cách hòa tan 4,728 mg với 20 ml để tạo nguồn nguyên liệu in vitro ban đầu.<br /> dung dịch methanol. Mỗi phân đoạn cao được<br /> pha thành các nồng độ: 500; 250; 125; 62,5; Khảo sát sự tạo rễ bất định do cảm ứng của<br /> 31,25 µg/ml. Thực hiện phản ứng cho các nồng các loại hormon khác nhau<br /> độ đã pha như sau: ethanol (3 ml), dịch thử (0,5 Các mẫu lớp mỏng khác nhau của cây (rễ,<br /> ml), dung dịch DPPH (0,5 ml); lắc hỗn hợp thân, lá) được cấy trên các môi trường có bổ<br /> trong 15 giây; sau đó ủ hỗn hợp trong tối ở nhiệt sung các loại hormone thực vật khác nhau: (1)<br /> độ phòng 30 phút và đo mật độ quang ở bước MS; (2) MS+0,5 mg/l NAA; (3) MS+0,5 mg/l<br /> sóng 516 nm. Hoạt tính kháng oxi hóa (%) được BA; (4) MS+0,5 mg/l Kinetin; (5) MS+0,5 mg/l<br /> tính theo công thức sau: (HTCO%) = 2,4D. Sau 5 tuần nuôi cấy, theo dõi tỷ lệ mẫu tạo<br /> [(ODchứng - ODthử)/ODchứng]. Từ đồ thị biễu rễ (%), và chiều dài rễ (cm) trong từng công<br /> diễn sự tương quan giữa HTCO% và nồng độ thức.<br /> các mẫu, giá trị IC50 sẽ được xác định. Khảo sát sự tạo rễ tơ bằng A. rhizogenes<br /> Chứng minh sự hiện diện của betuline trong ATCC 15834<br /> cây bán tự mốc Chủng A. rhizogenes ATCC 15834 hoạt hóa<br /> Các mẫu cao ethanol của thân, lá, rễ của bán trong 48 giờ trên môi trường NB ở 25-28oC dùng<br /> tự mốc được gửi đi phân tích sự hiện diện và xâm nhiễm lên mô thực vật. Cắt và tạo vết<br /> xác định hàm lượng betuline bằng HPLC-UV thương ở các bộ phận của cây rồi ngâm trong<br /> tại phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, dịch khuẩn 30 phút. Chuyển mẫu vào môi trường<br /> trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học MS, sau 5-7 ngày, khi khuẩn lạc phát triển, rửa<br /> Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. mẫu với kháng sinh cefotaxime 200 mg/l, chuyển<br /> mẫu vào môi trường MS mới. Sau 5 tuần, theo<br /> Nuôi cấy rễ in vitro cây bán tự mốc nhằm thu dõi tỷ lệ tạo rễ (%), chiều dài rễ (cm).<br /> nhận nguồn nguyên liệu in vitro chủ động<br /> trong sản xuất betuline Khảo sát điều kiện tăng trưởng của rễ<br /> Dựng đường cong tăng trưởng của rễ và so<br /> Nguồn mẫu: cây bán tự mốc được thu hái tại<br /> sánh hiệu quả của bước nuôi chuyển tiếp sang<br /> quận Tân Phú, tp. Hồ Chí Minh; chủng vi khuẩn<br /> môi trường lỏng trước khi nuôi cấy rễ độc lập:<br /> A. rhizogenes ATCC 15834, được mua từ tổ<br /> 0,5 g rễ cây con in vitro mỗi loại (rễ lỏng, rễ<br /> chức RIKEN-PRC thông qua dự án của Mext,<br /> agar) được nuôi lỏng lắc trong 6 erlen 100 ml<br /> Nhật Bản.<br /> chứa 50 ml môi trường MS trong điều kiện 180<br /> Môi trường sử dụng: Murrashige và Skoog vòng/phút, ở 25-28oC, trọng lượng tươi và trọng<br /> <br /> <br /> 146<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151<br /> <br /> lượng khô của rễ được xác định sau mỗi 6 ngày, phương pháp đông khô có hiệu suất cao nhất.<br /> trong vòng 30 ngày. Riêng đối với phương pháp cô quay chân<br /> Khảo sát thành phần môi trường thích hợp: không, ở bộ phận rễ dung môi ethanol có hiệu<br /> 0,5 g rễ cây con in vitro được nuôi lỏng lắc (100 suất tạo cao tốt nhất, ở bộ phận thân và lá dung<br /> vòng/phút, 25-28oC) trong erlen 100 ml chứa 50 môi chloroform có hiệu suất tạo cao tốt nhất<br /> ml với các môi trường: MS, B5, SH. Sau 3 tuần, (bảng 1).<br /> ghi nhận sự tăng trưởng của rễ qua sự chênh Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương<br /> lệch khối lượng Δ(g). pháp thử năng lực khử theo Yen & Duh<br /> Kết quả định tính khả năng kháng oxi<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> hóa của các loại cao được trình bày trong<br /> Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của các bộ bảng 2.<br /> phận của cây trong các hệ dung môi khác Từ phương pháp của Yen & Duh, chúng<br /> nhau tôi sàng lọc được bảy loại cao có kết quả<br /> Sau khi hút ẩm và sấy khô các loại cao đến kháng oxi hóa tốt nhất, đó là cao R2, R3,<br /> khối lượng không đổi, so sánh với khối lượng R4, T1, T2, T3 và T4, trong đó, cao ethanol<br /> khô ban đầu, thu được kết quả cao nước với rễ (R3) có kết quả tốt nhất.<br /> <br /> Bảng 1. Hiệu suất các loại cao từ các bộ phận rễ, thân, lá<br /> Khối lượng cao (g) Hiệu suất cao (%)<br /> Dung môi Rễ khô Thân khô Lá khô<br /> Rễ Thân Lá<br /> (270g) (500g) (600g)<br /> Diethyl eter 0,7379 2,7832 1,8855 0,2733 0,5566 0,3143<br /> Chloroform 0,9336 3,8900 11,3502 0,3458 0,7780 1,8917<br /> Etanol 2,3377 2,3741 1,6181 0,8658 0,4748 0,2697<br /> Nước 26,9416 55,1300 39,1506 9,9784 11,0260 6,5251<br /> <br /> Bảng 2. Tính khử của các loại cao theo phương pháp Yen & Duh (1993)<br /> Dung dịch đo ABS ± SE<br /> Bộ phận của cây Chứng dương Vit E 1,507±0,07353<br /> Chứng âm ĐC 0,595±0,05231<br /> Cao diethyl eter R1 0,679±0,12929<br /> Cao chloroform R2 0,966±0,14757<br /> Rễ<br /> Cao ethanol R3 1,968±0,22379<br /> Cao nước R4 0,919±0,10303<br /> Cao diethyl eter T1 0,696±0,10930<br /> Cao chloroform T2 0,825±0,15060<br /> Thân<br /> Cao ethanol T3 1,324±0,19654<br /> Cao nước T4 0,823±0,24229<br /> Cao diethyl eter L1 0,642±0,15829<br /> Cao chloroform L2 0,631±0,13949<br /> Lá<br /> Cao ethanol L3 0,673±0,10468<br /> Cao nước L4 0,624±0,04814<br /> <br /> <br /> Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng Gía trị IC50 của bảy loại cao có kết quả tốt<br /> phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH nhất ở phương pháp Yen & Duh được xác định<br /> <br /> <br /> 147<br /> Quach Ngo Diem Phương et al.<br /> <br /> bằng phương pháp DPPH theo hình 1. phân tích HPLC cho kết quả định lượng như ở<br /> Cao ethanol rễ có hoạt tính kháng oxi hóa hình 2. Kết quả ở bảng 3 cho thấy, rõ ràng các<br /> cao nhất với IC50=75 µg/ml, cao ethanol thân bộ phận của cây bán tự mốc đều có sự hiện diện<br /> (T3) cũng có hoạt tính kháng oxi hóa ở mức cao của betuline, trong đó, mẫu rễ có chứa hàm<br /> với giá trị IC50=97 µg/ml. Tính kháng oxi hóa lượng betuline cao nhất.<br /> theo phương pháp DPPH của bảy loại cao xếp<br /> theo thứ tự giảm dần như sau: R3>T3>R2>R4> Bảng 3. Kết quả định lượng betuline bằng<br /> T4>T2>T1. Như vậy, rễ là bộ phận có hoạt tính phương pháp HPLC-UV<br /> kháng oxi hóa tốt nhất trong cây bán tự mốc và<br /> Tên mẫu Kết quả phân tích (µg/g)<br /> ethanol là dung môi thích hợp để có thể tách<br /> Lá 13,4<br /> chiết các hoạt chất có hoạt tính cao từ rễ.<br /> Thân 7,0<br /> Rễ 59,3<br /> <br /> Nuôi cấy rễ in vitro nhằm thu nhận nguồn<br /> nguyên liệu in vitro chủ động trong sản xuất<br /> betuline<br /> Khảo sát sự tạo rễ bất định do cảm ứng của các<br /> loại hormone khác nhau<br /> Kết quả cảm ứng tạo rễ bằng hormone thực vật<br /> Hình 1. Biểu đồ thể hiện giá trị IC50 (µg/ml) của từ các bộ phận khác nhau (rễ, thân, lá) của cây<br /> bảy phân đoạn cao bán tự mốc in vitro được trình bày trong hình 3<br /> và 4. Trong đó, rễ bất định chỉ được cảm ứng<br /> Chứng minh sự hiện diện của betuline tạo thành trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5<br /> Các mẫu cao ethanol rễ, thân, lá sau khi mg/l.<br /> <br /> A B C D<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Sắc kí đồ của A: betuline 20 ppm; B: mẫu lá; C: mẫu thân; D: mẫu rễ<br /> <br /> Sau 5 tuần nuôi cấy, rễ bất định từ thân và lá<br /> phát triển dài hơn rễ bất định từ rễ, do đó, để tạo<br /> rễ bất định bằng cảm ứng hormone thực vật,<br /> chúng tôi đề xuất bộ phân thích hợp là thân hay<br /> lá, và hormone thích hợp là NAA.<br /> Khảo sát sự tạo rễ tơ bằng A. rhizogenes ATCC<br /> 15834<br /> Sau 10 ngày nuôi cấy, kết quả cho thấy rõ<br /> hiệu quả tác động tạo rễ của A. rhizogenes ATCC<br /> 15834 lên mẫu cắt ngang (lá, thân, rễ) có tạo vết<br /> Hình 3. Đồ thị chiều dài rễ bất định trên môi thương: xuất hiện rễ trên công thức có bổ sung<br /> trường MS+0,5mg/l NAA sau 5 tuần A. rhizogenes, trong khi công thức đối chứng<br /> <br /> 148<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151<br /> <br /> không có (hình 5). Khả năng phát triển của rễ ATCC 15834 sau đó được ghi nhận sau 5 tuần<br /> (chiều dài rễ) được cảm ứng bởi A. rhizogenes tiếp theo được trình bày ở hình 6.<br /> <br /> A B C D E F<br /> <br /> <br /> 1cm 1cm 1cm 1cm 1cm 1cm<br /> <br /> Hình 4. Mẫu sau 10 ngày nuôi cấy: A: MS; B:MS+0,5 mg/l NAA; C: MS+0,5mg/l Kinetin;<br /> D:MS+0,5 mg/l 2,4D; E: MS+0,5 mg/l 2,4D; F: Rễ trên môi trường B (5 tuần)<br /> <br /> A B<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6. Đồ thị thể hiện chiều dài của rễ sau 5<br /> Hình 5. A. Mẫu không nhiễm A. rhizogenes; tuần nuôi cấy từ các bộ phận được nhiễm<br /> B. Mẫu có nhiễm A. Rhizogenes A. rhizogenes<br /> <br /> Để chứng minh sự hiện diện của gen chuyển Vẽ đường cong tăng trưởng của rễ và so<br /> trong gennome của rễ được tạo thành nhờ A. sánh hiệu quả của bước nuôi chuyển tiếp sang<br /> rhizogenes ATCC 15834, phản ứng PCR nhằm môi trường lỏng trước khi nuôi cấy rễ độc lập ở<br /> khuếch đại trình tự gen đặc trưng của A. điều kiện lỏng-lắc (hình 8). Kết quả cho thấy, rễ<br /> rhizogenes ATCC 15834 hiện diện trong tăng trưởng đều đặn và đạt trọng lượng tối đa<br /> gennome của rễ tạo thành đã được tiến hành, kết sau 18 ngày nuôi cấy, sau đó trọng lượng giảm<br /> quả được trình bày trong hình 7. dần vì lúc này rễ bắt đầu tổng hợp và sản sinh<br /> hợp chất thứ cấp, làm nồng độ áp suất thẩm thấu<br /> A trong môi trường tăng cao, cản trở hấp thu chất<br /> 600bp B dinh dưỡng, dẫn đến tăng trưởng giảm.<br /> 400bp<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 7. Sản phẩm PCR<br /> A. cặp mồi rolBF-rolBR; B. cặp mồi rolCF-rolCR;<br /> 1. Thang; 2. Rễ invitro đối chứng;<br /> 3. Rễ invitro chuyển gen.<br /> Hình 8. Đường cong tăng trưởng rễ lỏng<br /> Kết quả PCR cho thấy sự hiện diện của<br /> đoạn gen rolB (422bp) và rolC (625bp) của A.<br /> rhizogenes ATCC 15834 trong genome của rễ<br /> tạo thành. Như vậy, A. rhizogenes ATCC 15834<br /> đã cảm ứng tạo được rễ tơ từ mẫu cây bán tự<br /> mốc.<br /> Khảo sát điều kiện tăng trưởng của nguồn rễ<br /> độc lập Hình 9. Đường cong tăng trưởng rễ agar<br /> <br /> <br /> 149<br /> Quach Ngo Diem Phương et al.<br /> <br /> Kết quả dựng đường cong tăng trưởng rễ Kết quả cho thấy đã thành công việc trong<br /> agar được trình bày ở hình 9. Rễ của cây con nuôi cấy lỏng lắc rễ cây bán tự mốc, trong đó<br /> được nuôi từ môi trường agar (rễ agar), khi bước chuyển sang nuôi lỏng trước nuôi cấy<br /> chuyển qua môi trường lỏng-lắc, do chưa thích lỏng-lắc là phù hợp, điều kiện nuôi này giúp<br /> nghi được nên rễ bị sốc, hóa nâu và chết dần khẳng định hướng thu nhận nguồn rễ có thể<br /> (hình 10). được ứng dụng ở quy mô công nghiệp sau này.<br /> <br /> A B<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 1cm 1cm<br /> <br /> Hình 10. Sự khác biệt giữa rễ lỏng (A) và rễ agar (B) khi nuôi lỏng-lắc sau 1 tuần<br /> <br /> Khảo sát thành phần môi trường thích hợp cấy lỏng trước đó và bằng môi trường SH nhằm<br /> Kết quả tăng trưởng rễ được thể hiện qua sự hướng đến thu nhận sinh khối rễ ở quy mô sản<br /> chênh lệch khối lượng Δ(g) (hình 11). Mỗi loài xuất công nghiệp.<br /> thực vật có sự hấp thu khác nhau về thành phần<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> môi trường. Trong thí nghiệm này, có thể thấy<br /> khi nuôi cấy trên môi trường SH, rễ có sự tăng<br /> 1. Csuk R., Schmuck K., Schäfer R., 2006. A<br /> trưởng cao hơn.<br /> practical synthesis of betulinic acid.<br /> Tetrahedron letters, 47(49): 8769-8770.<br /> 2. Gao Y., Xu H., Lu Z., Xu Z., 2009.<br /> Khối lượng (g)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Quantitative determination of steroids in the<br /> fruiting bodies and submerged-cultured<br /> mycelia of Inonotus obliquus. Se pu=<br /> Chinese Journal of Chromatography/<br /> Zhongguo hua xue hui, 27(6): 745.<br /> Môi trường<br /> 3. Green B., Bentley M. D., Chung B. Y.,<br /> Hình 11. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của các Lynch N. G., Jensen B. L., 2007. Isolation<br /> loại môi trường lên sự tăng trưởng rễ of betulin and rearrangement to allobetulin.<br /> A biomimetic natural product synthesis.<br /> KẾT LUẬN Journal of Chemical Education, 84(12):<br /> Rễ cây bán tự mốc có hoạt tính kháng oxi hóa 1985.<br /> khá mạnh (IC50 = 75 µg/ml), nó cũng chính là 4. Hiroya K., Takahashi T., Miura N.,<br /> nguồn vật liệu mang betuline cao nhất của cây. Naganuma A., Sakamoto T., 2002.<br /> Nguồn rễ cây bán tự mốc bất định có thể thu Synthesis of betulin derivatives and their<br /> được một cách chủ động bằng cách nuôi cấy protective effects against the cytotoxicity of<br /> trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA. Rễ cadmium. Bioorganic & Medicinal<br /> tơ cũng có thể được tạo thành bằng phương Chemistry, 10(10): 3229-3236.<br /> pháp chuyển gen tự nhiên nhờ A. rhizogenes 5. Kim D. S. H. L., Pezzuto J. M., Pisha E.,<br /> ATCC 15834. Nguồn rễ độc lập này hoàn toàn 1998. Synthesis of betulinic acid derivatives<br /> có thể nuôi cấy lỏng lắc với bước chuyển nuôi with activity against human melanoma.<br /> <br /> <br /> 150<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151<br /> <br /> Bioorganic & Medicinal Chemistry letters, sequential requirement for new protein<br /> 8(13): 1707-1712. synthesis, formation of reactive oxygen<br /> 6. Wolfgang W., Grimmel C., Wagenknecht species, and caspase processing. Journal of<br /> B., Dichgans J., Weller M., 1999. Betulinic Pharmacology and Experimental<br /> acid-induced apoptosis in glioma cells: A Therapeutics, 289(3): 1306-1312.<br /> <br /> <br /> A STUDY ON ROOT CULTURES OF Hemigraphis glaucescens C. B. Clarke<br /> FOR BETULINE PRODUCTION<br /> <br /> Quach Ngo Diem Phuong, Vu Thi Bach Phuong,<br /> Giong Hoi Khoanh, Tran Ngoc Trung, Bui Van Le<br /> University of Sicence, Ho Chi Minh City<br /> <br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Up to now, there has not been any scientific publication related to chemistry and pharmaceutical value of<br /> Hemigraphis glaucescens C. B. Clarke. However, they have been used as a popular and effective therapy for<br /> hypertensive patients like Pseuderanthemum bracteatum, which has been posted in many publications to<br /> include medicinal properties of betuline. This research demonstrated that Hemigraphis glaucescens also<br /> contains betuline, the same substance in Pseuderanthemum bracteatum. Besides, it focused on screening and<br /> finding out antioxidant extract fraction of Hermigraphis glaucescens; accordingly, we can apply in vitro<br /> culture technique on getting antioxidant materials actively. In details, by using Ferric cyanine reducing<br /> antioxidant power (Yen and Duh) and free radicals scavenging (DPPH) assay, we elucidated that ethanol<br /> fraction of root Hermigraphis glaucescens was the best. Adventitious roots were formed by using 0.5 mg/l<br /> NAA and hairy roots were also formed by co-culturing with Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 after 10<br /> days.<br /> Keywords: Agrobacterium rhizogenes, Hemigraphis glaucescens, betuline, hairy root culture.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 15-7-2013<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 151<br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2