Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm sàng lọc một số thực vật ở miền Trung có tác dụng hạ đường huyết, từ đó tiến hành nghiên cứu thành phần hoá học của các thực vật này để tìm hiểu về cơ chế hạ đường huyết của các hợp chất có hoạt tính sinh học. Mời các bạn tham khảo nội dung đề tài!
ĐÀ NẴNG - 2021
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. ĐẶNG ĐỨC LONG
2. PGS.TS. THÀNH THỊ THU THỦY
ĐÀ NẴNG - 2021
i
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu
tham khảo đúng quy định.
ii
Để hoàn thành đề tài luận án này tôi xin được gửi lời biết ơn trân trọng nhất tới
TS.Đặng Đức Long và PGS.TS. Thành Thị Thu Thủy, người đã tận tâm hướng dẫn
khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt
thời gian thực hiện luận án.
Tôi cũng xin cảm ơn đến các thầy cô, cán bộ nghiên cứu công tác tại bộ môn
Công nghệ Sinh học, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa đã ủng hộ và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian hoàn thành luận án.
Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu tại Trung tâm Các phương pháp
phổ ứng dụng – Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
hỗ trợ đo phổ NMR, MS và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn
thành bản luận án.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình và bạn bè
đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án.
Xin chân thành cảm ơn!
iii
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ ii
MỤC LỤC .............................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT .............................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... ix
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... XI
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................. 1
2. Mục tiêu của luận án ................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu của luận án ................................................................ 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án................................................... 3
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 5
1.1. Bệnh đái tháo đường ......................................................................................... 5
1.1.1. Bệnh đái tháo đường ............................................................................. 5
1.1.2. Bệnh sinh đái tháo đường type 2.......................................................... 10
1.1.3. Thuốc trong điều trị đái tháo đường ..................................................... 14
1.2. Tổng quan về cây chè dây và lá đắng .............................................................. 17
1.2.1. Cây chè dây (Ampelosis cantoniensis (Hook. et Arn.) Planch) ............ 17
1.2.2. Giới thiệu về cây lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) ........................ 20
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước về thảo dược trong điều trị đái
tháo đường ............................................................................................................ 24
1.3.1. Tình hình nghiên cứu về thảo dược trong điều trị ĐTĐ trên thế giới .... 24
1.3.2. Tình hình nghiên cứu về thảo dược trong điều trị ĐTĐ tại Việt Nam .. 42
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 45
2.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 45
2.1.1. Nguyên liệu thực vật ........................................................................... 45
iv
2.1.2. Nguyên liệu động vật .......................................................................... 47
2.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm ....................................................................... 47
2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 47
2.2.2. Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 48
2.3. Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu ...................................................... 48
2.3.1. Phương pháp chiết xuất ....................................................................... 49
2.3.2. Phương pháp gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 ............................................ 51
2.3.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của 20 mẫu thực vật trên chuột nhắt
ĐTĐ type 2 ........................................................................................................... 55
2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết thực vật lên cấu trúc mô tụy và gan
chuột ĐTĐ type 2 .................................................................................................. 56
2.3.5. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao chiết phân đoạn mẫu lá chè
dây, lá đắng trên chuột nhắt ĐTĐ type 2................................................................ 57
2.3.6. Phương pháp khảo sát khả năng giảm hoạt tính enzyme α-glucosidase và
α-amylase của các hợp chất phân lập ..................................................................... 57
2.3.7. Phương pháp đánh giá hoạt động chống viêm và cải thiện tính kháng insulin
của các hợp chất tinh sạch dựa trên dòng tế bào Raw 264.7 và 3T3-L1...................... 58
2.3.8. Chuẩn bị cao hỗn hợp các thảo dược có khả năng hạ đường huyết....... 61
2.3.9. Xác định độc tính cấp của cao hỗn hợp ................................................ 62
2.3.10. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học .......................... 62
2.3.11. Xử lý số liệu ...................................................................................... 65
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 66
3.1. Kết quả tách chiết mẫu.................................................................................... 66
3.2. Kết quả gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 thực nghiệm............................................ 67
3.2.1. Gây chuột nhắt béo phì ........................................................................ 67
3.2.2. Các chỉ số mỡ máu ở chuột nhắt béo phì ............................................. 68
3.2.3. Gây ĐTĐ type 2 trên chuột béo sau tiêm STZ ..................................... 69
3.2.4. Định lượng insulin trong máu chuột nhắt sau khi tiêm STZ ................. 70
3.2.5. Nghiệm pháp dung nạp glucose ........................................................... 71
v
3.3. Kết quả tác dụng hạ đường huyết của các cao chiết thực vật trên chuột ĐTĐ type
2 ............................................................................................................................ 72
3.3.1. Sàng lọc đợt I ...................................................................................... 72
3.3.2. Sàng lọc đợt II ..................................................................................... 74
3.3.3. Sàng lọc đợt III .................................................................................... 75
3.3.4. Sàng lọc đợt IV ................................................................................... 76
3.4. Kết quả nghiên cứu cao chiết chè dây và lá đắng ............................................ 78
3.4.1. Ảnh hưởng của cao chiết chè dây và lá đắng lên kết quả mô bệnh học của
tụy và gan .............................................................................................................. 79
3.4.2. Nghiên cứu cao chiết phân đoạn lá chè dây ......................................... 81
3.4.3. Nghiên cứu các cao chiết phân đoạn lá đắng ........................................ 91
3.4.4. Khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các hợp chất
phân lập từ chè dây và lá đắng ............................................................................... 98
3.4.5. Hoạt động chống viêm và cải thiện tính kháng insulin của các hợp chất
phân lập từ chè dây và lá đắng ............................................................................. 100
3.4.6. Thảo luận về cơ chế hạ đường huyết của các hợp chất phân lập từ cây chè
dây và lá đắng...................................................................................................... 105
3.5. Kết quả cao hỗn hợp nguồn gốc từ thực vật có khả năng hạ đường huyết ..... 108
3.5.1. Phối hợp các cây thảo dược để tăng hiệu quả trong điều trị ĐTĐ....... 108
3.5.2. Hiệu quả hạ đường huyết của cao hỗn hợp ........................................ 109
3.5.3. Hiệu quả của cao hỗn hợp ở các chỉ số mỡ máu trên chuột ĐTĐ ....... 112
3.5.4. Hiệu quả cao hỗn hợp lên hàm lượng glycogen ở gan chuột ĐTĐ ..... 113
3.5.5. Khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của cao hỗn hợp
............................................................................................................................ 114
3.6. Nghiên cứu độc tính cấp của cao hỗn hợp ..................................................... 114
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 116
CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ ......................................... 120
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 121
PHỤ LỤC .......................................................................................................... PL1
vi
1H-NMR
: 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ
13C-NMR
hạt nhân proton)
: 13C-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng
từ hạt nhân carbon)
Akt : Protein Kinase B
ATP : Adenosine triphosphate
CBuOH : Cao n-buthanol
CC : Cao cồn
CEtOAc : Cao ethylacetate
CHe : Cao n-hexane
COSY : Chemical Shift Correlation Spectroscopy
COX-2 : cyclooxygenase 2
DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
ĐTĐ : Đái tháo đường
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch liên kết
với enzym)
ERK : Extracellular signal-regulated kinase (tín hiệu ngoại bào điều tiết
kinase)
: Free fatty acid (acid béo tự do) FFA
: Gam g
GLP : Glucagon like peptide
GLUT : Glucose transporter (yếu tố vận chuyển glucose)
Grb2 : Growth factorreceptor-bound
: Giờ h
HFD : High fat diet (Chế độ ăn giàu chất béo)
HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Connectivity
HSQC : Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
vii
IC50 : Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ gây ức chế 50%
hoạt tính sinh học hoặc hóa sinh)
IDF : International Diabetes Federation (Liên đoàn Đái tháo đường
Quốc tế)
: Impaired fasting glucose (rối loạn đường huyết lúc đói) IFG
: Impaired glucose tolerance (rối loạn dung nạp glucose) IGT
IKK-beta : IkappaB kinase beta
IL-1β : Interleukin-1 beta,
IL- 6 : Interleukin-6,
IL-8 : Interleukin-8
iNOS : Nitric oxide synthase
IR : Insulin receptor
IRS : Insulin receptor substrate
JNK : C-Jun NH2-terminal kinase
LD50 : Lethal dose, 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm)
LPS : Lipopolysaccharide
m : Khối lượng
MAPK : Mitogen activated protein kinase
μg : Microgram
μl : Microlit
mg : Miligam
ml : Mililit
MS : Mass Spectroscopy (phổ khối lượng)
ND : Normal diet (Ăn chế độ ăn bình thường)
NFκB : Nuclear factor-кB
NMR : Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân)
OD : Optical Density (Mật độ quang)
P-value : Probability value (Trị số p)
viii
PDK1 : Phosphoinositide-Dependent Kinase 1
PDK2 : Phosphoinositide-Dependent Kinase 2
PGE2 : Prostaglandin E2
PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase
PIP2 : phosphatidyl-Inositol-(4,5) biphosphate
PIP3 : Phosphatidylinositol- (3,4,5) -triphosphate
PPAR : Peroxisome proliferator activator receptor
PPARγ : Peroxisome proliferator-activated receptor
PTP1B : Protein tyrosine phosphatase 1B
R : Receptor
R2 : Hệ số tương quan
Rf : Hệ số di chuyển
ROS : Reactive oxygen species (các chuỗi phản ứng oxy hóa)
SGLT1 : Sodium-glucose linked transporter
STZ : Streptozocin
TNF-α : yếu tố hoại tử khối u-alpha
TV : Thực vật
USD : Đô la Mỹ
WHO : World Health Organization - Tổ chức Y tế thế giới
ix
Số hiệu Tên bảng Trang bảng
1.1. Phân loại bệnh ĐTĐ 6
1.2. Tổng quan bệnh ĐTĐ ở Việt Nam 9
1.3. Một số thuốc và nhóm thuốc chống tăng đường huyết 15
1.4. Thảo dược trong điều trị đái tháo đường 25
Các hợp chất có khả năng chống viêm hoặc cải thiện tính 1.5. 30 kháng insulin
Các dịch chiết và hợp chất chiết xuất từ thực vật ức chế 1.6. 36 α-amylase hoặc α-glucosidase
Các loại thực vật (20 loài) được thu nhận tại miền Trung 2.1. 45 Việt Nam
2.2. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 48
Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột 2.3. 51 thí nghiệm
2.4. Bố trí thí nghiệm gây chuột ĐTĐ type 2 53
Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết 2.6. 57 của cao chiết phân đoạn chè dây và lá đắng
3.1. Kết quả tách chiết các mẫu thực vật 66
3.2. Trọng lượng của chuột sau 8 tuần nuôi 67
Sự khác biệt về các chỉ số mỡ máu chuột ở nhóm ND và 3.3. 68 HFD
Phần trăm hàm lượng cao của các cao chiết phân đoạn lá 3.4. 81 chè dây
Nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống 3.5. 82 cao chiết phân đoạn lá chè dây
3.6. Các số liệu phổ của phloretin 87
x
Số hiệu Tên bảng Trang bảng
3.7. Các số liệu phổ của myricitrin (CDE4) 89
Phần trăm hàm lượng cao của các cao chiết phân đoạn lá 3.8. 91 đắng
Nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống 3.9. 92 cao chiết phân đoạn lá đắng
3.10. Các số liệu phổ của vernonioside E 96
3.12.
110
3.13.
110
3.14.
115
Nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống các cao chiết Nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống các cao hỗn hợp Kết quả đánh giá số chuột chết ở các nhóm thử nghiệm sau khi uống cao hỗn hợp
Sự ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các 3.11. 98 hợp chất phân lập từ chè dây và lá đắng
xi
Số hiệu Tên hình Trang hình
1.1. Con đường truyền tin nội bào của insulin 11
1.2. Cơ chế phân tử của tính kháng insulin 13
1.3. Cấu trúc của một số hợp chất phân lập được từ cây chè dây 18
1.4. Cấu trúc của một số hợp chất phân lập được từ cây lá đắng 22
Các loại thực vật (20 loài) được thu nhận tại miền Trung Việt 2.1. 46 Nam
2.2. Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu 49
2.3. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn 50
2.4. Nguyên liệu và thành phẩm thức ăn chuột béo 51
2.5. Tóm tắt quy trình định lượng insulin 54
Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang và nồng độ 2.6. 55 insulin
3.1. Chuột sau 8 tuần nuôi 68
Sự thay đổi nồng độ đường huyết của các lô chuột ở các thời 3.2. 69 điểm khác nhau
3.3. Nồng độ insulin huyết tương của các lô chuột khác nhau 71
3.4. Khả năng dung nạp glucose của các lô chuột 72
Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị bằng 3.5. 73 cao chiết thực vật
Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị bằng 3.6. 74 cao chiết thực vật
Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị bằng 3.7. 75 cao chiết thực vật
Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị bằng 3.8. 77 cao chiết thực vật
xii
Số hiệu Tên hình Trang hình
3.9. Ảnh vi thể tiêu bản đúc cắt tụy của chuột (vật kính 400) 79
3.10. Ảnh vi thể tiêu bản đúc cắt gan của chuột (vật kính 400) 80
3.11. Cấu trúc của myricetin (CDE1) 84
3.12. Cấu trúc của dihydromyricetin (CDE2) 85
3.13. Cấu trúc của phloretin (CDE3) 87
3.14. Cấu trúc của myricitrin (CDE4) 90
3.15. Cấu trúc của quercetin (CDE5) 91
3.16. Cấu trúc của cynaroside (LĐE) 94
Chất tinh sạch LĐB (trái) và sắc kí bản mỏng của vernonioside 3.17. 97 E (LĐB) (phải)
3.18. Cấu trúc của vernonioside E (LĐB) 98
Đánh giá khả năng gây độc của các hợp chất chè dây đối với 3.19. 100 Raw 264.7 (A) và 3T3-L1 (B)
Đánh giá khả năng gây độc của các hợp chất lá đắng đối với 3.20. 100 Raw 264.7 (A) và 3T3-L1 (B)
Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập từ cây chè dây lên quá
3.21. trình sản xuất TNF-α (A), IL-6 (B), IL-8 (C) và IL-10 (D) trong 101
tế bào Raw 264.7 được kích thích bằng LPS
Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập từ cây lá đắng lên quá
3.22. trình sản xuất TNF-α (A), IL-6 (B), IL-8 (C) và IL-10 (D) trong 102
tế bào Raw 264.7 được kích thích bằng LPS
Hoạt động giảm tính kháng insulin của hợp chất phloretin và 3.23. 104 vernonioside E trong tế bào 3T3-L1 được xử lý với TNF-α
Ảnh hưởng của phloretin lên mức độ biểu hiện của hai protein 3.24. 104 IRS1 và pY20
3.25. Phối hợp các cây thảo dược để tăng hiệu quả trong điều trị ĐTĐ 109
xiii
Số hiệu Tên hình Trang hình
Chỉ số triglyceride và cholesterol của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 3.26. 112 ngày uống cao hỗn hợp
Hàm lượng glycogen gan ở chuột bệnh ĐTĐ type 2 sau khi 3.27. 113 uống cao hỗn hợp
Sự ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của cao chiết 114 3.28. hỗn hợp
1
Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh rối loạn chuyển hóa đặc trưng bởi tình trạng
tăng đường huyết mãn tính, do hậu quả của tình trạng giảm tiết insulin hoặc kháng
insulin hoặc kết hợp cả hai. Hậu quả của sự tăng đường huyết là những biến chứng
nghiêm trọng có thể đe dọa đến tính mạng của người bệnh [4]. Trên toàn cầu, tỷ lệ
người mắc bệnh ĐTĐ năm 2016 là 8,5% dân số trưởng thành (422 triệu người) và
con số được dự đoán sẽ tăng lên tới 9,9% vào năm 2045 [142]. Các trường hợp tử
vong liên quan đến bệnh ĐTĐ phổ biến hơn ở các nước có thu nhập thấp và trung
bình, nơi có hơn 80% trường hợp tử vong xảy ra. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cho
rằng bệnh ĐTĐ sẽ là một trong bảy nguyên nhân hàng đầu gây ra tử vong vào năm
2030. Sự gia tăng đột biến về tỷ lệ người mắc bệnh đái tháo đường hiện nay đang là
một gánh nặng cho ngành y tế. Theo công bố của WHO, chi phí trực tiếp mỗi năm
cho bệnh nhân ĐTĐ ước tính khoảng 153-286 tỷ USD, thậm chí còn cao hơn thế, ước
tính đến năm 2025, toàn bộ chi phí cho bệnh nhân ĐTĐ trên thế giới là 213-396 tỷ
USD, chiếm khoảng 7-13% ngân sách chăm sóc sức khoẻ của thế giới [84].
Tại Việt Nam, ĐTĐ cũng không nằm ngoài tình hình chung của thế giới, đang
có xu hướng gia tăng nhanh chóng. Ước tính năm 2006, 2,5% dân số ở độ tuổi trên
20 tại Việt Nam mắc ĐTĐ type 2, dự kiến năm 2025 sẽ tăng lên 3,5% [2]. Theo điều
tra quốc gia năm 2008, tỷ lệ bệnh ĐTĐ ở các đối tượng 30-64 tuổi tại các thành phố
lớn là 7-10% [1]. Theo ước tính năm 2006, Việt Nam phải chi phí cho bệnh ĐTĐ là
606.251 USD, khoản chi này dự kiến sẽ tăng lên 1.114.430 USD vào năm 2025 [2].
Hiện nay, các thuốc điều trị ĐTĐ có nguồn gốc tổng hợp hoá học thường kèm
theo nhiều tác dụng không mong muốn, chi phí điều trị cao và người bệnh có xu
hướng phải tăng liều sau một thời gian dài dùng thuốc [4]. Để đáp ứng được nhu cầu
sử dụng thuốc ngày càng gia tăng và hạn chế được những biến chứng gây ra bởi bệnh
đái tháo đường, việc kế thừa nền y học cổ truyền của dân tộc để từ đó nghiên cứu,
sản xuất ra các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên hiệu quả và an toàn
cao, có khả năng bổ sung và thay thế thuốc điều trị ĐTĐ đang là hướng quan tâm
2
nghiên cứu của các nhà khoa học [151].
Các loài thực vật luôn là nguồn nguyên liệu cây thuốc quý giá, rất nhiều loại
thuốc hiện có sẵn trên thị trường có nguồn gốc trực tiếp hoặc gián tiếp từ chúng. Có
ít nhất 1200 loài thực vật được sử dụng trong y học cổ truyền vì có tác dụng chống
đái tháo đường, tuy nhiên chỉ có khoảng 450 cây đã được nghiên cứu để khám phá
tác dụng của chúng được công bố [129]. Vì vậy, việc tìm kiếm các loại thuốc trị đái
tháo đường mới từ thực vật tự nhiên vẫn luôn hấp dẫn, đặc biệt ở Việt Nam, một nước
có thảm thực vật phong phú, tài nguyên dược liệu vô cùng quý giá.
Cây chè dây (Ampelosis cantoniensis (H. & A.) PL.), họ Nho (Vitaceae) đã được
nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa [146], tuy nhiên
cho đến nay chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu hoạt tính chống ĐTĐ. Bên
cạnh đó, cây lá đắng (Vernonia amygdalina Del.), họ cúc (Asteraceae) đã có công
trình nghiên cứu trên thế giới về khả năng chống ĐTĐ, tuy nhiên các nghiên cứu chưa
nhiều và chưa mang tính toàn diện [35].
Do vậy, để góp phần nghiên cứu tác dụng trị ĐTĐ của một số loài thực vật ở miền
Trung, Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu phân lập và tác dụng điều
trị bệnh đái tháo đường type 2 của các hoạt chất sinh học từ một số loài thực vật thu hái tại miền Trung”. 2. Mục tiêu của luận án
Sàng lọc một số thực vật ở miền Trung có tác dụng hạ đường huyết, từ đó tiến
hành nghiên cứu thành phần hoá học của các thực vật này để tìm hiểu về cơ chế hạ
đường huyết của các hợp chất có hoạt tính sinh học.
- Thu thập một số mẫu thực vật ở miền Trung được tham khảo là có tác dụng
trong điều trị ĐTĐ. Tách chiết các mẫu thực vật bằng cồn 70°, sàng lọc tác dụng hạ
đường huyết của các cao chiết trên mô hình chuột ĐTĐ type 2.
- Chiết phân đoạn lá chè dây và lá đắng bằng các dung môi có độ phân cực khác
nhau và thử nghiệm khả năng hạ đường huyết của các cao phân đoạn đó trên chuột
ĐTĐ type 2.
3
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ các phân đoạn có hoạt
tính hạ đường huyết tốt nhất.
- Nghiên cứu về cơ chế hạ đường huyết của các hợp chất phân lập qua việc đánh
giá hiệu quả ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase cùng với thử nghiệm ảnh
hưởng của chúng đến quá trình sinh các cytokine tiền viêm TNF-α, IL-6 và IL-8 (các
các cytokine tiền viêm là một trong những nguyên nhân chính gây nên tình trạng
kháng insulin), cytokine kháng viêm (IL-10) và tác dụng khôi phục biểu hiện hai
protein pIRS-1 và pY20 của tế bào bào (đây là hai protein rất cần thiết cho con đường
truyền tín hiệu insulin).
- Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao hỗn hợp, tác dụng của cao hỗn
hợp lên nồng độ cholesterol, triglyceride, hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, α-
amylase và hàm lượng glycogen ở chuột ĐTĐ type 2. Xác định độc tính cấp của cao
hỗn hợp.
Nội dung nghiên cứu của luận án có ý nghĩa khoa học và thực tiễn như sau:
- Ý nghĩa khoa học:
+ Kết quả thu được của luận án đã cung cấp thông tin khoa học về khả năng
điều trị bệnh ĐTĐ của một số thực vật miền Trung, đồng thời xác định được cấu trúc
hóa học của các hợp chất phân lập từ các thực vật có hoạt tính hạ đường huyết tốt
nhất. Kết quả này đóng góp vào cơ sở dữ liệu về hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh
học của Việt Nam
+ Kết quả nghiên cứu của luận án đã góp phần làm rõ cơ chế hạ đường huyết
của các hợp chất phân lập qua việc đánh giá hiệu quả ức chế enzyme α-glucosidase
và α-amylase cùng với thử nghiệm ảnh hưởng của chúng đến quá trình sinh các
cytokine tiền viêm TNF-α, IL-6 và IL-8, cytokine kháng viêm (IL-10) và tác dụng
khôi phục biểu hiện hai protein pIRS-1 và pY20 của tế bào.
- Ý nghĩa thực tiễn:
+ Kết quả của luận án là bằng chứng khoa học góp phần đáp ứng việc sử dụng
các sản phẩm có nguồn gốc thực vật trong phòng và điều trị bệnh ĐTĐ type 2, hạn
4
chế được các tác dụng phụ của thuốc có nguồn gốc tổng hợp và những biến chứng
gây ra bởi bệnh đái tháo đường. Kết quả này là cơ sở để phát triển dược phẩm mới từ
những nguồn nguyên liệu sẵn có ở miền Trung.
+ Kết quả của luận án cũng là cơ sở khoa học để khai thác, sử dụng có hiệu quả
cũng như bảo tồn, phát triển bền vững nguồn tài nguyên thực vật chứa các hợp chất
có hoạt tính sinh học.
- Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu của luận án là 20 loại thực vật
sinh trưởng tại miền Trung, trong đó hai đối tượng nghiên cứu chủ yếu là cây chè dây
và lá đắng.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu hoạt tính, ứng dụng và cơ chế hạ đường huyết
của các hợp chất phân lập được từ các loại thực vât nghiên cứu.
5
Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hoá do nhiều nguyên nhân khác
nhau gây nên, đặc trưng của bệnh là tăng đường huyết mạn tính cùng với rối loạn
chuyển hoá lipid, protein ... do thiếu insulin có kèm hoặc không kèm kháng insulin
với các mức độ khác nhau. Các triệu chứng rõ rệt của tăng đường huyết mạn tính là
khát nước, mắt nhìn mờ, tiểu nhiều và giảm cân. Tăng đường huyết mãn tính của
bệnh ĐTĐ có liên quan đến các biến chứng lâu dài bao gồm bệnh võng mạc với khả
năng mất thị lực; suy thận; bệnh thần kinh ngoại biên, các triệu chứng tim mạch và
tăng huyết áp [33].
Bệnh nhân được chẩn đoán xác định là mắc bệnh ĐTĐ khi [33]:
- Hemoglobin (A1c) ≥ 6,5% hoặc nồng độ glucose huyết lúc đói ≥ 7,0 mmol
/l(≥ 126 mg/dl).
- Nồng độ đường huyết ở thời điểm hai giờ sau nghiệm pháp dung nạp glucose
đường uống ≥ 11,1 mmol/l (200 mg/dl) hoặc có các triệu chứng điển hình của tăng
đường huyết và nồng độ đường huyết ở thời điểm bất kỳ ≥ 11,1 mmol/l (200 mg/dl).
Có một số trường hợp nồng độ đường huyết không đáp ứng tiêu chí chẩn đoán
cho bệnh ĐTĐ nhưng lại cao hơn so với nồng độ đường huyết bình thường. Những
trường hợp này được xác định là rối loạn đường huyết lúc đói (impaired fasting
glucose-IFG) hoặc rối loạn dung nạp glucose (impaired glucose tolerance-IGT).
Người bệnh được coi là tiền ĐTĐ (cho thấy nguy cơ tương đối cao cho sự phát triển
của bệnh ĐTĐ trong tương lai khi) khi:
+ Đường huyết lúc đói từ 100 mg/dl (5,6 mmol/l) đến 125 mg/dl (6,9 mmol/l)
(IFG).
+ Đường huyết ở thời điểm hai giờ sau sau khi thực hiện thử nghiệm khả năng
dung nạp glucose, glucose huyết từ 140 mg/dl (7,8 mmol/l) đến 199 mg/dl (11,0
mmol/l) (IGT).
6
Theo báo cáo của Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA), việc phân loại ĐTĐ
được nêu ở bảng 1.1 như sau:
Bảng 1.1. Phân loại bệnh ĐTĐ
Đặc ĐTĐ type 1 ĐTĐ type 2 ĐTĐ thai kỳ điểm
Liên quan đến gen di Liên quan đến gen di truyền, Hormon sản
truyền, hệ thống miễn dịch béo phì, chế độ ăn uống và sinh lúc mang
của chính cơ thể người ít vận động gây nên tình thai, theo gen di
bệnh tấn công và phá hủy trạng kháng insulin. Trong truyền, do chế
một phần của tuyến tụy sản tình trạng kháng insulin, độ ăn uống và
xuất insulin dẫn đến việc gan, cơ và các tế bào mỡ béo phì.
không thể sản xuất insulin. giảm khả năng sử dụng Nguyên Sự thiếu hụt hoàn toàn insulin, tác động này làm nhân insulin làm glucose không cản trở mang glucose vào
thể đi vào tế bào để sinh trong các tế bào của cơ thể,
năng lượng mà tăng cao tụy buộc phải hoạt động
trong máu. nhiều hơn để bù đắp, về lâu
dài khiến tụy bị tổn thương,
giảm cả về số lượng và chất
lượng của insulin.
Do thiếu hụt insulin tuyệt Bệnh diễn biến âm thầm Bệnh thường ít
đối nên các triệu chứng trong nhiều năm, ít triệu triệu chứng. Hay
xuất hiện rầm rộ và đột chứng. Do đó, triệu chứng đói bụng hơn và
ngột, bao gồm: đi tiểu của bệnh chỉ xuất hiện khi khát nước hơn,
Triệu nhiều lần trong ngày, khát bệnh ở giai đoạn bùng phát. thường xuyên đi
chứng nước liên tục, đói và mệt Thường bao gồm một số vệ sinh.
mỏi, sụt cân không rõ triệu chứng như: mệt mỏi
nguyên nhân, mờ mắt, hơi bất thường, tê bì tay chân,
thở có mùi trái cây lên da khô, ngứa, dễ bị nhiễm
men. Do triệu chứng rõ trùng, vết thương chậm
7
ràng nên người bệnh đái lành. Thường được phát
tháo đường type 1 thường hiện muộn hơn, khi người
được phát hiện từ khá sớm. bệnh có kèm theo một số
biến chứng khác.
Diễn ra nhanh, thường cấp Diễn ra chậm hơn, thường Các thai phụ
tính với tình trạng hôn mê xuất hiện âm thầm sau vài mắc ĐTĐ thai
– Biến chứng mãn tính: năm bắt đầu từ khi bị đường kỳ tăng nguy cơ
nhồi máu cơ tim, đột quỵ, huyết cao. tiến triển thành
bệnh võng mạc, suy thận, – Biến chứng mãn tính: ĐTĐ type 2 và
biến chứng thần kinh, loét, Tương tự như người bệnh các biến chứng
nhiễm trùng bàn chân. ĐTĐ type 2. liên quan đặc Biến biệt là biến chứng chứng tim mạch.
Trẻ sinh ra từ
các bà mẹ bị
ĐTĐ thai kỳ có
nguy cơ béo phì,
sớm ĐTĐ type
2.
Được chẩn đoán ở trẻ em khởi phát ở người trưởng Chẩn đoán ở phụ
Tuổi hoặc người trưởng thành thành và người cao tuổi, thể nữ mang thai.
trẻ tuổi, thể trạng gầy. trạng béo (chiếm 85,2%).
Bắt buộc dùng insulin. viên hoặc insulin tùy thuộc Sử dụng thuốc
Điều trị vào thời điểm phát hiện và điều trị bệnh như
triệu chứng. metformin.
Đây là một bệnh nguy Thay đổi lối sống, thường Tăng cường tập
Phòng hiểm, không có cách nào xuyên tập thể dục, thay đổi thể dục và thay
ngừa phòng tránh được. chế độ ăn uống có lợi cho đổi chế độ ăn
sức khỏe. uống.
8
a. Tổng quan bệnh ĐTĐ trên thế giới
Do lão hóa, tốc độ gia tăng dân số, đô thị hóa cùng với lối sống ít vận động và
tỷ lệ béo phì cao, số người mắc bệnh ĐTĐ đang gia tăng trên toàn cầu với tốc độ
nhanh chóng [129]. Ước tính năm 2017 có 451 triệu người có bệnh ĐTĐ trên toàn
thế giới. Những con số này dự kiến sẽ tăng lên 693 triệu vào năm 2045. Ước tính rằng
gần một nửa số người (49,7%) sống chung với bệnh ĐTĐ không được chẩn đoán.
Khoảng 5 triệu ca tử vong trên toàn thế giới được cho là do bệnh ĐTĐ ở độ tuổi 20.
Chi phí chăm sóc sức khỏe toàn cầu cho người mắc bệnh ĐTĐ được ước tính là 850
tỷ USD vào năm 2017 [57].
Ở các nước thu nhập thấp và trung bình, phần lớn những người mắc bệnh
ĐTĐ nằm trong độ tuổi 45-64 [92]. Ngược lại, phần lớn những người mắc bệnh
ĐTĐ ở các nước phát triển đều nhỏ hơn 64 tuổi. Đến năm 2030, ước tính số người
mắc bệnh ĐTĐ nhỏ hơn 64 tuổi sẽ là hơn 82 triệu ở các nước thu nhập thấp đến
trung bình và lớn hơn 48 triệu ở các nước thu nhập cao [157]. Sự gia tăng lớn nhất
trong bệnh nhân ĐTĐ được dự kiến là trong các nhóm tuổi có hiệu quả kinh tế cao
nhất [45].
Mỗi năm trên thế giới có 7 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, chủ yếu là bệnh ĐTĐ
type 2. Tỷ lệ hiện mắc bệnh ở người trưởng thành trong độ tuổi 20-70 dự kiến sẽ
tăng từ 285 triệu người vào năm 2010 lên 438 triệu người vào năm 2030. Người
mắc bệnh ĐTĐ type 2 có nguy cơ mắc bệnh tim mạch cao gấp 2-4 lần và 80%
những người mắc bệnh ĐTĐ sẽ chết vì bệnh này. WHO ước tính rằng có tới 15%
ngân sách y tế hàng năm được chi cho các bệnh liên quan đến bệnh ĐTĐ. Trong
khi ĐTĐ type 2 đặt ra gánh nặng kinh tế lớn cho tất cả các quốc gia, các nước
đang phát triển phải chịu gánh nặng cao nhất vì hơn 80% trường hợp xảy ra ở các
quốc gia này. Xu hướng hiện nay cho thấy hơn 60% dân số mắc bệnh ĐTĐ trên
thế giới sẽ ở các nước Châu Á [127].
b. Tổng quan bệnh ĐTĐ ở Việt Nam
Trong những năm gần đây, bệnh ĐTĐ ở Việt Nam đang có chiều hướng gia
tăng theo thời gian và theo mức độ phát triển kinh tế cũng như đô thị hóa. Tình hình
9
ĐTĐ ở Việt Nam được trình bày ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Tổng quan bệnh ĐTĐ ở Việt Nam
Đặc Tổng quan ĐTĐ ở Việt Nam
điểm
Năm 2008, tỷ lệ ĐTĐ chung là 5,7%, thành phố 6,9%, đồng bằng 6,3%,
ven biển 3,8%, miền núi 4,8%, tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose là 15,4% và
tỷ lệ rối loạn đường huyết lúc đói là 18,2% [5]. Năm 2013, trong kết quả
Tỷ lệ báo cáo của “Dự án phòng chống ĐTĐ Quốc gia” do Bệnh viện Nội tiết
người Trung ương thực hiện trên 11.000 người tuổi 30-69 tại 6 vùng gồm: Miền
mắc núi phía Bắc, Đồng bằng sông Hồng, Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên,
bệnh Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ là 5,7%
ĐTĐ (tỷ lệ mắc cao nhất ở Tây Nam Bộ là 7,2%, thấp nhất là Tây Nguyên 3,8%)
[1]. Năm 2015, Việt Nam có 3,5 triệu người trưởng thành mắc đái tháo
đường, tương đương 6% dân số và dự kiến đến năm 2040 sẽ có 6,1 triệu
người trưởng thành có thể mắc đái tháo đường, tăng 74% [168].
Những người trên 45 tuổi có nguy cơ mắc ĐTĐ type 2 cao gấp 4 lần những
Nhóm người dưới 45 tuổi. Kết quả điều tra do Bộ Y tế thực hiện năm 2015 ở
tuổi nhóm tuổi từ 18-69, cho thấy tỷ lệ ĐTĐ toàn quốc là 4,1%, tiền ĐTĐ là
3,6% [21].
Năm 2006 của Tạ Văn Bình cho thấy rằng 36% đối tượng đã được phát Tình hiện từ trước và 64% mắc bệnh ĐTĐ mà không được phát hiện [3]. Tỷ lệ hình bệnh ĐTĐ chưa được chẩn đoán ở thành phố Hồ Chí Minh, qua điều tra quản dịch tễ năm 2001 xấp xỉ 40% [67]. Gần một nửa số người đang sống với lý bệnh đái tháo đường (độ tuổi 20-79) không được chẩn đoán (46,5%). Đái bệnh tháo đường được quản lý tại cơ sở y tế mới chỉ 28,9% trong khi số chưa ĐTĐ được quản lý theo số liệu thống kê mới nhất năm 2015 là 71,1% [168].
Nhìn chung các nghiên cứu cho thấy bệnh ĐTĐ đang ngày càng tăng nhanh,
không chỉ ở các khu công nghiệp, thành phố mà còn cả miền núi, trung du, tỷ lệ bệnh
nhân ĐTĐ không được chẩn đoán còn cao, tỷ lệ bệnh nhân ĐTĐ ngày càng trẻ hóa
10
cũng như nhận thức chung của cộng đồng về bệnh ĐTĐ còn thấp.
1.1.2.1. Cơ chế tác dụng của insulin
Insulin là một peptide 51 axit amin, được sản xuất và tiết ra bởi các tế bào đảo
tụy. Nó bao gồm hai chuỗi polypeptide, A và B, gồm 21 và 30 axit amin tương ứng,
được nối với nhau bằng cầu nối disulfide. Hoạt động sinh học của insulin bắt đầu khi
nó liên kết với thụ thể. Bản thân thụ thể của insulin (insulin receptor -IR) là gồm 2
tiểu đơn vị α và 2 tiểu đơn vị β. Tiểu đơn vị α có chứa vị trí gắn insulin nằm ở mặt
ngoài của màng plasma. Tiểu đơn vị β xuyên qua màng với miền tyrosine kinase nội
bào được kích hoạt bởi quá trình phosphoryl hóa. Insulin liên kết với tiểu đơn vị α
của thụ thể và kích hoạt hoạt động tyrosine kinase của tiểu đơn vị β dẫn đến quá trình
tự phosphoryl hóa và kích hoạt thụ thể insulin. Kinase này lại hoạt hóa tiếp nhiều
protein kinase khác bằng phản ứng phosphoryl hóa các gốc tyrosine đặc hiệu. Cuối
cùng những enzym này có thể phosphoryl hóa một nhóm các phân tử cơ chất nội bào
điển hình như là thụ thể insulin nền (insulin receptor substrate -IRS). Quá trình
phosphoryl hóa có thể kích hoạt con đường tín hiệu phosphatidylinositol-3-kinase
(PI3K)/AKT, còn được gọi là protein kinase B (PKB), chịu trách nhiệm cho hầu hết
các hoạt động trao đổi chất như thúc đẩy sự chuyển vị của protein vận chuyển glucose,
glycogen, tổng hợp lipid, protein và kiểm soát quá trình tân tạo đường ở gan [156].
Các protein IRS phosphoryl hóa liên kết với các tiểu đơn vị điều tiết
phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K), điều này dẫn đến việc kích hoạt PI3K và PI3K
phosphoryl hóa phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2) thành
phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate (PIP3). PIP3 lại kích hoạt các kinase: PDK-
1 và PDK-2 và cuối cùng là kích hoạt AKT/PKB kinase. Sau đó, AKT xúc tác quá
trình phosphoryl hóa protein cơ chất AS160 kích thích sự dịch chuyển các chất vận
chuyển glucose GLUT-4 từ các túi tế bào chất đến bề mặt màng tế bào và do đó làm
tăng sự vận chuyển glucose phụ thuộc insulin vào tế bào (hình 1.1) [143].
11
Hình 1.1. Con đường truyền tin nội bào của insulin [143]
Insulin được tiết từ các tế bào β trong các đảo tụy chủ yếu được điều hòa bởi sự
xâm nhập glucose thông qua chất vận chuyển của nó. Glucose ngoại bào xâm nhập
vào tế bào thông qua chất vận chuyển GLUT-2, glucose sau đó được chuyển hóa
thông qua quá trình đường phân làm tăng tỷ lệ ATP/ADP, điều này kích hoạt việc
đóng kênh K+ nhạy cảm với ATP trên màng plasma, làm giảm nồng độ K+ dẫn đến
khử cực màng và mở kênh Ca2+ phụ thuộc điện áp. Các ion Ca2+ xâm nhập vào tế
bào dẫn đến tăng mức Ca2+ nội bào và kích thích tăng giải phóng insulin từ tế bào
β [40].
Kháng insulin: là tình trạng các tế bào đích insulin (như tế bào gan, tế bào mỡ, tế
bào cơ) không đáp ứng đúng với kích thích insulin bình thường của người dùng và tình
trạng này có liên quan đến sự gián đoạn của việc truyền tín hiệu insulin. Điều đáng chú
ý là đột biến gen hoặc protein của con đường truyền tin nội bào bị ức chế hiếm khi là
nguyên nhân cho tình trạng kháng insulin và ĐTĐ type 2. Kháng insulin và ĐTĐ type
2 thường liên quan đến béo phì hoặc thừa cân và hiện được hỗ trợ bởi các yếu tố môi
trường như các chất dinh dưỡng (đặc biệt là lipid) và sự thay đổi trong chuyển hóa cơ
chất do không hoạt động thể chất. Các yếu tố đó là nền tảng trung tâm của hiện tượng
viêm mô mãn tính và nhiễm độc lipid dẫn đến việc kích hoạt con đường phản ứng căng
thẳng tế bào, gây ra sự thay đổi trong việc truyền tín hiệu insulin [60].
12
a. Khiếm khuyết phân tử của con đường tín hiệu insulin liên quan đến kháng
insulin [60]:
- Bất hoạt IR thông qua tăng hoạt tính của các enzyme khử phosphoryl của
tyrosin trong con đường truyền tin nội bào của insulin. Một số enzym đã được nghiên
cứu như các protein tyrosin phosphatase (PTP) trong đó chủ yếu là protein tyrosine
phosphatase 1B (PTP-1B). PTP-1B là một enzyme quan trọng khác trong việc suy
giảm tín hiệu insulin vì nó khử phosphoryl của tyrosine trong IR và IRS do đó giảm
tính nhạy cảm của insulin trên tế bào.
- Các enzyme làm giảm tín hiệu PIP3 được biết như là các phosphatase thủy
phân PIP3 thành PIP2. Bên cạnh đó, sự gia tăng phosphoryl hoá các phân tử serin
hoặc threonin không những làm giảm khả năng hoạt hoá PIP3 mà còn làm giảm quá
trình phosphoryl hóa tyrosin của IR, tăng thoái hoá IRS do đó làm giảm tác dụng và
tăng kháng insulin.
- Bất hoạt PIP3 thông qua ức chế tiểu đơn vị điều hoà ngược p85 nằm trên
PI3K: sự thể hiện quá mức dạng hoạt động p100 trên PI3K hoặc kích thích quá mức
Akt đều ức chế p85 làm giảm tác dụng sinh học của insulin.
b. Các nhân tố dẫn đến tình trạng kháng insulin: các yếu tố quan trọng có thể
dẫn đến tình trạng kháng insulin là hàm lượng acid béo tự do vượt mức, stress oxi
hóa, các cytokine gây viêm như interleukin-1 beta (IL-1β), interleukin-6 (IL-6),
interleukin-8 (IL-8) yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-α) [60]:
- Trên thực tế, 85,2% những người mắc bệnh ĐTĐ type 2 bị thừa cân hoặc béo
phì [44]. Ở những bệnh nhân béo phì, các tế bào mỡ gia tăng khối lượng và rối loạn
chức năng gây tích lũy lipid cho các mô khác không phải mô mở (ví dụ: gan, cơ, tim,
tuyến tụy) cũng như gia tăng nồng độ acid béo tự do (FFA). FFA tăng lên cao cạnh
tranh với glucose trong chuyển hóa tại cơ vân, gia tăng FFA gây rối loạn sử dụng
glucose ở ngoại biên [49], làm giảm tổng hợp glycogen ở cơ và tăng glucose tự do,
giảm khả năng vận chuyển glucose (dưới tác dụng của insulin) vào tế bào cơ vân,
kích hoạt protein kinase C (PKC) cùng với dẫn đến sự phosphoryl hóa serine của cả
protein IR và IRS-1 gây ra kháng insulin [126]. Khi mô mỡ gia tăng khối lượng, nó
13
đòi hỏi phải tăng sinh mạch để giảm thiểu tình trạng mạch máu kém lưu thông. Để
đáp ứng với các tín hiệu thiếu oxy, các tế bào kích hoạt các con đường gây căng thẳng
tế bào điều này gây ra viêm ở tế bào và kích hoạt đại thực bào giải phóng các cytokine
và các tín hiệu viêm khác [49], [63].
- Bên cạnh đó, FFA kết hợp với quá tải glucose, dẫn đến tăng hoạt động của các
con đường oxy hóa. Theo thời gian, sự quá tải năng lượng này dẫn đến rối loạn chức
năng ty thể và hậu quả là sự gia tăng các chuỗi phản ứng oxy hóa (ROS). Stress oxy
hóa như vậy có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch bằng cách kích thích yếu tố tiền
viêm và do đó cũng góp phần kháng insulin thông qua cách này [60]. Các cytokine
tiền viêm hoạt hóa kinase serine bao gồm IκB kinase (IKK-β), c-Jun kinase NH2 ở
đầu tận cùng (c-Jun NH2-terminal kinase -JNK). Những kinase này đã được chứng
minh là ức chế hoạt động của insulin bằng cách thúc đẩy sự phosphoryl hóa serine
của con đường truyền tín hiệu insulin, bao gồm protein IR và IRS-1, làm suy yếu tín
hiệu insulin và gây kháng insulin, kích hoạt protein mạng lưới giúp tăng cường phiên
mã các gen cytokine gây viêm [60], [158]. Trái ngược với quá trình phosphoryl
tyrosine của IRS-1 ở trạng thái nhạy cảm với insulin, phosphoryl hóa serine làm suy
yếu tín hiệu insulin bình thường (hình 1.2) [60].
Hình 1.2. Cơ chế phân tử của tính kháng insulin [60]
14
Cả rối loạn chức năng tế bào β và kháng insulin đều dẫn đến tăng đường huyết
kéo dài đặc trưng cho ĐTĐ type 2. Tình trạng kháng insulin làm giảm tác dụng điều
hòa chuyển hóa của insulin ở các mô đích, với biểu hiện rõ ràng nhất là sự tăng đường
huyết. Khi nồng độ đường huyết cao sẽ kích thích tế bào β của đảo tụy tăng tiết
insulin. Tăng sinh tế bào β và tăng insulin máu bù đắp cho việc tăng dần kháng insulin
để duy trì lượng đường ở mức bình thường trong máu, sau một thời gian sẽ dẫn tới
sự suy giảm khối lượng tế bào β. Rối loạn chức năng tế bào β là yếu tố quyết định
quan trọng đối với ĐTĐ type 2 được kết hợp bởi tình trạng kháng insulin.
Sự tương tác giữa rối loạn chức năng tế bào β và kháng insulin vẫn rất phức tạp.
Sự khởi đầu của tăng đường huyết có thể kích hoạt cả rối loạn chức năng tế bào β và
kháng insulin. Rối loạn chức năng tế bào β nghiêm trọng hơn kháng insulin. Với rối
loạn chức năng tế bào β, sự tiết insulin bị suy giảm trong khi với tình trạng kháng
insulin, insulin vẫn có thể được tiết ra nhưng biểu hiện không nhạy cảm với insulin
trong các mô đích. Khi rối loạn chức năng tế bào β và tình trạng kháng insulin trầm
trọng hơn, tăng đường huyết sẽ khuếch đại dẫn đến tiến triển thành bệnh ĐTĐ type
2. Mối quan hệ giữa kháng insulin và rối loạn chức năng tế bào β chủ yếu phụ thuộc
vào trạng thái trao đổi chất được xác định bởi nồng độ đường huyết và insulin. Cả hai
trạng thái bệnh lý ảnh hưởng lẫn nhau và có thể làm trầm trọng thêm bệnh ĐTĐ. Bảo
tồn chức năng tế bào β và tín hiệu insulin trong các tế bào β và tín hiệu insulin trong
các tế bào nhận glucose sẽ duy trì cân bằng nội môi glucose [52].
Đặc trưng cơ bản của bệnh ĐTĐ là tình trạng tăng đường huyết. Do đó mục tiêu
điều trị ĐTĐ là kiểm soát đường huyết, nhằm kéo dài tình trạng ĐTĐ không biến chứng
cấp hoặc phòng ngừa các biến chứng về sau. Nếu một hoặc vài biến chứng đã xảy ra,
việc kiểm soát đường huyết giúp làm ngưng hoặc chậm lại diễn tiến của biến chứng.
Ngày nay, bệnh nhân ĐTĐ, đặc biệt là những người mắc bệnh ĐTĐ type 2, được
khuyên nên thay đổi chế độ ăn uống và chế độ tập luyện thể chất và sau đó tiến triển
dần từ đơn trị liệu, sang kết hợp với nhóm thuốc điều trị ĐTĐ type 2 khác nhau và cuối
cùng là điều trị bằng insulin khi bệnh trở nên nghiêm trọng hơn. Hầu hết các cơ chế
15
hoạt động của các thuốc trong điều trị ĐTĐ có liên quan mật thiết với chuyển hóa
glucose, các hợp chất này bù cho việc mất độ nhạy insulin do không hoạt động hoặc
tiết insulin, cũng như các cơ chế khác gây ra bệnh. Tuy nhiên, các thuốc điều trị ĐTĐ
có một số tác dụng có hại không mong muốn nên việc kiểm soát đường huyết ở bệnh
nhân ĐTĐ đôi khi khá khó khăn. Do đó, điều cấp bách cần phải tìm một loại thuốc
mới, liệu pháp phù hợp nhất trong điều trị bệnh ĐTĐ [106]. Sau đây là một số loại
thuốc uống dùng trong điều trị ĐTĐ được trình bày ở bảng 1.3.
Bảng 1.3. Một số thuốc và nhóm thuốc chống tăng đường huyết
Tên thuốc Nhóm Cơ chế tác dụng Nhược điểm
Gây hạ đường huyết bằng Dễ dẫn đến hạ
cách kích thích giải phóng đường huyết,
insulin từ tế bào β của tuyến tăng cân và tăng
tụy. Chúng liên kết với các insulin máu.
thụ thể sulfonylurea trên
màng sinh chất tế bào β,
Glipizide và gây ra sự đóng cửa của
một số thuốc Sulfonylurea kênh K+ nhạy cảm với ATP
khác [106] dẫn đến khử cực của màng
tế bào. Điều này lần lượt
mở các kênh điện áp, cho
phép dòng ion Ca2+ xâm
nhập vào tế bào kích thích
tăng giải phóng insulin từ tế
bào β.
Exenatide, Kích thích tụy tiết insulin Gây tăng acid dạ Thuốc tương tự liraglutide và thông qua tác động của dày, khó tiêu, peptid-1 giống một số thuốc glucose, cải thiện sự nhạy tiêu chảy, ợ glucagon (GLP- khác [106], cảm của tụy đối với nóng, buồn nôn, 1) [47] glucose, kích thích sự tăng nôn.
16
sinh tế bào β và giảm chết
chương trình tế bào β tụy,
làm chậm với dạ dày và ức
chế sự ngon miệng.
Ức chế quá trình tân tạo Rối loạn tiêu
đường trong cơ thể, nó cũng hóa. Metformin, làm tăng sự hấp thu glucose phenformin Biguanide của cơ xương và làm giảm và buformin sự hấp thu glucose ở niêm [106], [47] mạc ruột, ức chế sản xuất
glucose gan.
Tác động thông qua Gây hiện tượng
receptor PPARγ nằm trong sưng (phù) và
nhân tế bào, làm điều hoà làm tăng cân đột
quá trình biểu hiện gen của ngột suy giảm thị
một số protein quan trọng lực, suy tim.
trong quá trình biệt hoá tế
bào cũng như chuyển hoá Rosiglitazone, glucose và lipid. Đáng chú pioglitazone ý, sự kích thích này thúc và một số Thiazolidinedion đẩy sự biệt hóa của các tế thuốc khác bào mỡ, kích thích các [106], [47] enzyme và protein vận
chuyển của tế bào mỡ như
lipoprotein lipase, yếu tố
vận chuyển acid béo...
trong việc thu nạp acid béo
do đó giúp tăng cường tác
dụng tại chỗ của insulin.
17
Trì hoãn quá trình tiêu hóa Đầy hơi, chướng
carbohydrate thành glucose bụng, táo bón do Acarbose, ở ruột non, từ đó khiến quá trình tiêu miglitol và Thuốc ức chế α- glucose không thể đi vào hóa chậm lại. voglibose glucosidase máu và làm giảm sự gia [106] tăng đường huyết sau bữa
ăn
Chất điều phối chính của Nguy cơ hạ
Insulin [106], quá trình vận chuyển đường huyết, Hormon peptide [47] glucose vào trong tế bào, tăng cân.
bao gồm gan, mỡ và mô cơ.
Chè dây hay còn gọi là Thau rả (theo dân tộc Tày) hay Khau rả (theo dân tộc
Nùng), thuộc chi Ampelosis, họ Nho (Vitaceae). Cây phân bố chủ yếu ở Cao Bằng,
Lào Cai, Lạng Sơn, Hải Phòng, Quảng Ninh, Uông Bí, Bắc Thái, Hà Tây, Ninh Bình,
Đà Nẵng ... [23].
Cây chè dây là cây dây leo, thân hơi cứng, vòi đối diện với lá, chẻ hai. Lá hai
lần kép, mang lá phụ mỏng, dòn, bìa có ít răng thấp, gân phụ 4-5 cặp; lá bẹ tròn, to 4
x 4 mm. Tản phông thưa; nụ tròn; cánh hoa dài 2 mm. Phi quả xoan, to 6 x 5 mm,
đen; hột 3-4. Cây ra hoa tháng 6, có quả tháng 10 [9].
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học
của cây chè dây. Năm 2000, Xu và cộng sự đã nghiên cứu cho thấy rằng trong lá của
chè dây có flavone (4,73 %), protein (9,25 %), rất giàu K, Ca, Fe, Zn và vitamin E, B1,
18
B2 [161]. Năm 2014, Thu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất
từ lá chè dây là dihydromyricetin, myricetin, myricitrin, quercitrin, phloretin, phlorizin,
5,7-dihydroxychromone, 3,5,7–trihydroxychromone, alstilbin, aromadendrin, methyl
gallate, 3,4-dihydro-2-(3′,4′,5′-trihydroxyphenyl)-2Hchromene-4,5,7-triol, arbutin, 2-
(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl-O-β-D-glucopyranoside, gallic acid và 3′,5′,5,7-
tetrahydroxyflavanone [146]. Năm 2019, Nhi và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất
mới ampechromonol A và ampechromonol B từ phân đoạn EtOAc của các bộ phận
trên không của cây chè dây [111].
Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về cây chè dây. Năm 1995,
Phùng Thị Vinh đã phân lập và định lượng 2 flavonoid tinh khiết của lá chè dây bao
gồm: myricetin chiếm 5,32%và dihydromyricetin chiếm 52,83% [23]. Năm 2004,
Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đã xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá chè
dây mọc ở Cao Bằng là 19,56%, hàm lượng tanin là 11,85%, lá chè dây mọc ở Sa Pa
có hàm lượng flavonoid là 20,39% và tanin là 8,02% [13].
Myricetin Phloretin Dihydromyricetin
Ampechromonol B Myricitrin Quercetin
Hình 1.3. Cấu trúc của một số hợp chất phân lập được từ cây chè dây [146]
b. Hoạt tính sinh học
Năm 2004, Tan và cộng sự đã nghiên cứu cảm ứng quá trình apoptosis trong tế
19
bào ung thư bạch cầu cấp tính HL-60 ở người từ dịch chiết thô của cây chè dây, kết
quả cho thấy rằng tùy thuộc vào liều lượng dịch chiết chè dây đã gây độc và cảm ứng
apoptosis ở tế bào ung thư bạch cầu [144]. Các hợp chất phloretin và 5,7,3,5′-
tetrahydroxyflavanone được phân lập từ cây chè dây thể hiện hoạt tính kháng viêm
thông qua thử nghiệm ức chế sản sinh NO trên dòng tế bào đại thực bào chuột RAW-
264.7 với giá trị IC50 là 5,2 và 18,5 μM [146]. Hai hợp chất mới ampechromonol A
và ampechromonol B đã được thử nghiệm về khả năng gây độc tế bào đối với MCF-
7 (dòng tế bào ung thư vú ở người). Ở nồng độ 100 μg/ml, hợp chất ampechromonol
A và ampechromonol B cho thấy độc tính yếu đối với các tế bào MCF-7, với sự ức
chế tăng trưởng lần lượt là 19,7% và 17,4% [111]. Năm 2007, Ha và cộng sự đã tìm
thấy cây chè dây chiết xuất từ MeOH, H2O và hợp chất myricetin phân lập từ chè dây
có tác dụng phòng ngừa đáng kể quá trình oxy hóa LDL gây ra bởi ion kim loại (Cu2+)
hoặc gốc tự do (AAPH). Các chiết xuất từ MeOH, H2O và hợp chất myricetin cho
thấy hoạt động chống oxy hóa cao hơn tocopherol, đặc biệt myricetin có tác dụng
mạnh hơn so với (+) – catechin. Kết quả cho thấy rằng chè dây có thể được sử dụng
như một phương thuốc để ngăn chặn quá trình oxy hóa LDL có liên quan đến tổn
thương xơ vữa động mạch [75].
Ở Việt Nam, hoạt tính sinh học của loài này được các nhà khoa học đánh giá
cao trong điều bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng. Năm 1995, Vũ Nam đã nghiên cứu
chè dây có tác dụng cắt cơn đau do loét hành tá tràng 93,4% cao hơn Alusi 89% và
thời gian cắt cơn đau trung bình của chè dây là 8,9 ngày ngắn hơn Alusi 17,35 ngày,
làm liền sẹo ổ loét hành tá tràng 79,55% cao hơn Alusi 50%, có tác dụng làm sạch
Helicobacter pylori 42,5% cao hơn Alusi 19,35%, có tác dụng làm giảm mức độ hoạt
động của viêm niêm mạc dạ dày 67,45% cao hơn Alusi 36,36%, chè dây cho kết quả
khỏi bệnh hoàn toàn là 43,18% cao hơn Alusi 19,44%, khỏi bệnh ở mức độ liền sẹo
của chè dây 36,36% cũng cao hơn Alusi 30,56%. Năm 2004, Phạm Thanh Kỳ và cộng
sự đã xác định được thuốc Ampelop có hoạt tính ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori
phân lập và nuôi cấy từ các mẫu sinh thiết của bệnh nhân có viêm loét dạ dày tá tràng
đang hoạt động, xác định hàm lượng chất có khả năng ức chế vi khuẩn Helicobacter
20
pylori của chế phẩm Ampelop là 150 µg so với mẫu kháng sinh đối chứng Amoxicilin
30 µg, xây dựng được quy trình sản xuất bột Ampelop từ chè dây và quy trình sản
xuất viên nang Ampelop quy mô phòng thí nghiệm [13].
Năm 2004, Nguyễn Thị Băng Sương và cộng sự đã nghiên cứu polyphenol của
chè dây có tác dụng trên sự hạn chế rối loạn chuyển hoá lipid và xơ vữa động mạch
ở thỏ uống cholesterol, kết quả nghiên cứu đã chứng minh polyphenol chè dây có tác
dụng: giảm triglyceride, cholesterol toàn phần, LDL-C và tăng HDL-C trong huyết
thanh, giảm tổn thương xơ vữa động mạch chủ [17].
Cây lá đắng phân bố chủ yếu ở châu Phi và được được di thực vào Việt Nam,
thường được dân gian quen gọi dưới nhiều tên khác nhau như: khổ diệp thụ, mật gấu
miền Nam hay nam phi diệp.
Thân vừa phải phân nhiều nhánh, thân cành khi non có màu xanh, nhiều lông
bao phủ bên ngoài, khi trưởng thành có màu xám. Lá mọc cách, phiến lá hình trứng
hoặc bầu dục, đầu và gốc lá nhọn, mặt trên màu sẫm, mặt dưới nhạt. Hệ gân lá hình
lông chim, gân chính nổi rõ. Lá có lông mềm, vị đắng. Cuống lá màu xanh, hình trụ,
phía trên hẹp lại, dài khoảng 1-4 cm. Mép lá có khía răng cưa nhỏ.
Cụm hoa hình đầu có nhiều lá bắc nhỏ, màu trắng, có mùi thơm. Tổng bao 25-30
lá bắc, xếp 4-5 hàng, màu xanh hơi nâu ở đỉnh, mặt ngoài có nhiều lông trắng mịn. Hoa
đều, lưỡng tính, mẫu 5. Bộ nhị dài 4,5-5 mm gồm 5 nhị đều, dính nhau ở bao phấn, tạo
thành 1 ống bao quanh vòi nhụy, 5 chỉ nhị rời dạng sợi mảnh, màu trắng. Chỉ nhị dính
với ống tràng hoa. Tràng hoa thu hẹp dần bên dưới. Bao phấn 2 ô, màu trắng, đính đáy.
Hạt phấn hình cầu gai, màu trắng. Bộ nhụy gồm 2 lá noãn dính nhau, tạo thành bầu
dưới 1 ô, mỗi ô chứa 1 noãn, đính noãn gốc. Đầu nhụy dạng sợi dài 2-3 mm. Quả bế,
thuôn dài khoảng 2-3 mm, có chùm lông ở đầu [43], [7].
21
a. Thành phần hóa học
Cây lá đắng được báo cáo chứa lượng đáng kể lipid, protein, chất xơ và các acid
amin thiết yếu. Canxi, sắt, kali, phốt pho, mangan, đồng và coban cũng đã được tìm
thấy trong đáng kể trong lá. Một số thành phần được phân lập trước đây ở lá đắng bao
gồm: sesquiterpene lactones, một số loại sesquiterpene được xác định là vernolide,
vernodalol, vernolepin, vernodalin và hydroxyvernolide, flavonoid như luteolin,
luteolin 7-O-glucoside và luteolin 7-O-glucuronide và saponin nhóm stigmastane như
vernonioside A, A1, A2, A3, A4, B, B2, B3, C, D và edotide cũng được phân lập từ
dịch chiết nước của lá đắng [85]. Gần đây, Owoeye và cộng sự đã phân lập và xác định
cấu trúc của hợp chất cocquiterpene lactone, epivernodalol và elemanolide từ phân
đoạn dichloromethane của lá đắng [118]. Ngoài ra, còn có các hợp chất khác có trong
lá là terpen, coumarin, axit phenolic, lignan, xanthone và anthraquinone [85]. Năm
2011, Eyong và cộng sự đã nghiên cứu cho thấy vỏ thân và rễ dịch chiết ethanol 80%
của lá đắng có sự hiện diện của alkaloid (7,02%), flavonoid (1,02%), saponin
(13,21%,), hydrocyanua (3,04%) và một lượng nhỏ tanin [70].
phân lập được 4 hợp chất bao gồm syringaresinol-O-β-D-glucoside, apigenin 7-O-β-D-
Tiếp tục nghiên cứu loài cây này ở Việt Nam, năm 2017 Tôn Nữ Liên Hương đã
glucoside, luteolin 7-O-β-D-glucoside và trans-phytol. Trong đó, glycoside lignan và
trans phytol là lần đầu tiên được phân lập từ cây lá đắng [12]. Năm 2019, Phạm Việt
Cường đã phân lập được 6 hợp chất. Một hợp chất hoàn toàn mới là
(22R,23S,24R,28S)-3β-glucosyl-28-methoxy-7,8,9,11-tetradehydro-21,24-
dihydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-stigmastane (vernomyosit E). Hai hợp chất lần
đầu tiên phân lập được từ tự nhiên là (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11-
tetradehydro-3β-16α,21,24-trihydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-stigmastane
(vernomyosit C) và (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11-tetradehydro-24,28-
epoxy-5α-stigmastane-21,23 carbolactone (vernomyosit C1). Ba hợp chất đã biết
khác là vernoniacum B, vernonioside B1, vernonioside B2 [6].
22
Vernonioside D
Vernodalol
Vernodalin
Vernolepin
Luteolin
Luteolin 7-O- β-glucoside
Hình 1.4. Cấu trúc của một số hợp chất phân lập được từ cây lá đắng [85]
b. Hoạt tính sinh học cây lá đắng
Dịch chiết lá đắng đã được nghiên cứu khá nhiều về khả năng kháng khuẩn.
Năm 2018, Tsaku và cộng sự đã nghiên cứu cho thấy dịch chiết ethanol, methanol
của lá đắng đều thể hiện khả năng chống lại Pseudomonas aeruginosa, Staphylococus
aureus, Escherichia coli, Streptococcus pneumonia và Klebsiella pneumonia. Trong
đó dịch chiết ethanol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn [147]. Các hợp chất
phân lập từ cây lá đắng như vernolide và isorhamnetin đều thể hiện tác dụng chống vi
khuẩn Gram dương như S. aureus và S. bacillus và vi khuẩn Gram âm như E. coli, K.
pneumonia và Proteus mirabilis [76]. Năm 2016, Omoregie công bố dịch chiết
ethanol của lá đắng có khả năng chống lại Plasmodium berghei là kí sinh trùng gây
bệnh sốt rét ở chuột (với liều 1000 mg/kg ức chế 83%) [117].
Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dịch chiết ethyl acetat của lá đắng có khả năng
chống ung thư vú thông qua ức chế sự tăng sinh trên các tế bào ung thư vú 4T1 [136].
Dịch chiết của choloroform, butanol, ethyl acetat, hexan của lá đắng ức chế sự phát
triển tế bào ung thư vú ở người ngay cả ở nồng độ 0,1 mg/ml [85]. Năm 2017, Johnson
và cộng sự đã chứng minh rằng dịch chiết methanol của lá đắng thể hiện sự ức chế tăng
trưởng đáng kể trên các tế bào ung thư tuyến tiền liệt ở người PC-3 [90]. Hợp chất phân
lập được từ lá đắng là epivernodalol đã thể hiện hoạt tính ức chế dòng tế bào HT-144
23
(u hắc tố da) [118]. Các báo cáo cho rằng coumarin, flavonid, lactone sesquiterpen,
edotide là các chất có khả năng chống ung thư của lá đắng [85].
Năm 2016, Asante và công sự đã chứng minh rằng chiết xuất ethanol của lá
đắng dùng đường uống làm giảm đường huyết ở chuột gây tăng đường huyết do
streptozotocin và thể hiện sự tái tạo các tế bào β của các đảo tụy ở chuột được điều
trị [35]. Sau 28 ngày điều trị với các phân đoạn của lá đắng, nồng độ đường huyết ở
chuột ĐTĐ đã giảm đáng kể: n-hexane (giảm 29,30%), chloroform (giảm 66,70%),
ethyl acetate (giảm 36,20%) và n-butanol (giảm 45,59% ) và dung dịch nước (giảm
39,30%). Khả năng dung nạp glucose được cải thiện đáng kể ở nhóm được điều trị
bằng phân đoạn chloroform so với nhóm điều trị phân đoạn khác và nhóm bệnh ĐTĐ
[115]. Trong nghiên cứu điều trị ĐTĐ ở mô hình in vitro, năm 2018, Alara và cộng
sự đã cho thấy hiệu của dịch chiết lá đắng trong ức chế enzyme α-amylase và α-
glucosidase, ở nồng độ 1,0 mg/ml có khả năng ức chế hai enzyme này cao nhất là
97,28 và 98,08% với IC50 lần lượt là 0,51 và 0,49 mg/ml [30].
Dịch chiết lá đắng cũng cho thấy giảm đáng kể LDL-cholesterol và VLDL-
triglyceride và tăng nồng độ HDL-cholesterol khi so với chuột bệnh ĐTĐ [35]. Các
phân đoạn n-hexane, chloroform, ethyl acetate và n-butanol đã cho thấy tác dụng
giảm đáng kể hàm lượng cholesterol toàn phần, triacylglycerol so với nhóm chuột
ĐTĐ [115]. Dịch chiết ethanol của lá đắng cũng được báo cáo là có khả năng duy trì
mức độ lipid trong giới hạn bình thường khi dùng liều 100-1000 mg/kg thể trọng.
Dịch chiết methanol của lá đắng cho tác dụng hạ lipid ở chuột có chế độ ăn giàu
cholesterol trong 9 tuần nuôi.
Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết lá đắng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa
đáng kể, hoạt tính chống oxy hóa của lá đắng được cho là do có sự hiện diện của các
flavonoid có trong lá [85]. Năm 2008, Erasto và cộng sự đã nghiên cứu khả năng
chống oxy hóa của dịch chiết ethanol của lá đắng và các hợp chất phân lập được
(vernolide và vernodalol) bằng cách đánh giá khả năng loại bỏ gốc tự do 1,1-diphenyl-
2-picryl-hydrazyl (DPPH), kết quả chỉ ra rằng vernolide có khả năng quét gốc tự do
cao hơn vernodalol và dịch chiết ethanol [69].
Dịch chiết ethanol của lá đắng ở liều 50 và 100 mg/kg có thể ngăn ngừa nhiễm
24
độc gan dưới tác dụng của chất INH và rifampicin gây tổn thương gan. Nhóm chuột
được điều trị bằng dịch chiết cho thấy các chỉ số gan (enzyme alanine transferase
(ALT), nồng độ albumin huyết thanh) quay về mức bình thường khi so với thuốc bảo
vệ gan silymarin. Qua kiểm tra mô học, gan chuột được điều trị bằng dịch chiết lá
đắng (100 mg/kg) cho thấy cấu trúc tế bào gan ít bị tổn thương hơn so với nhóm
chứng và tế bào gan gần như tương tự như chuột bình thường [86]. Bên cạnh đó, dịch
chiết lá đắng còn có tác dụng bảo vệ gan chuột sau khi chuột được tiêm alloxan [37].
Các hợp chất nhóm sesquiterpene đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan trong thí nghiệm
gây độc gan chuột bằng tetrachloromethane. Một số nghiên cứu khác chứng minh
rằng chế độ ăn kết hợp với dịch chiết lá đắng có tác dụng chống lại chất gây độc
aflatoxin-B1 gây tổn thương cho gan trên chuột [85].
Các nghiên cứu hoạt tính sinh học của lá đắng ở Việt Nam còn chưa nhiều.
Năm 2019, Phạm Việt Cường đã nghiên cứu cho thấy cao lá đắng có thể hiện hoạt
tính gây độc tế bào ung thư gan người Hep3B (IC50 = 114,82 µg/ml) và tế bào ung
thư vú người MCF-7 (IC50 = 123,03 µg/ml). Cao MeOH có thể hiện hoạt tính
kháng viêm thông qua thử nghiệm ức chế sản sinh NO trên dòng tế bào đại thực
bào chuột RAW264.7, ở nồng độ 100 µg/ml với % ức chế là 61,56 ± 0 ,66% và ức
chế enzyme α-amylase và enzyme α-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là 0,64
và 1,78 mg/ml. Hợp chất vernomyosit E thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-
glucosidase mạnh hơn cả chất chuẩn dương acarbose, đồng thời cũng có hoạt tính
ức chế α-amylase tương đối rõ rệt. Hợp chất vernoniacum B và vernonioside B2
có hoạt động ức chế enzyme α-amylase trung bình với giá trị IC50 được xác định
lần lượt là 83,17 và 87,09 µg/ml [6].
Hiện nay liệu pháp có sẵn cho bệnh ĐTĐ bao gồm insulin và nhiều thuốc hạ
đường huyết đường uống như sulfonylurea, metformin, thuốc ức chế glucosidase,
25
troglitazone …. Tuy nhiên, các báo cáo được cho là có tác dụng phụ nghiêm trọng
như vấn đề về gan, nhiễm acid lactic và tiêu chảy. Các tác dụng phụ của thuốc này
hiện đang ảnh hưởng đến khoảng 143 triệu người và số lượng những người bị ảnh
hưởng đang tăng lên từng ngày, đến năm 2030 nó được dự đoán sẽ đạt 366 triệu dân
trên toàn thế giới. Một số loài thực vật đã được sử dụng để phòng ngừa hoặc quản lý
bệnh ĐTĐ bởi người bản địa Mỹ, Trung Quốc, Nam Mỹ và Châu Á. Hoạt tính sinh
học của thực vật có liên quan đến thành phần hóa học giàu phenolics, alkaloid,
flavonoid, terpenoid, coumarin, và glycosides thường thấy tác dụng tích cực [120]. Mặt
khác, nhiều loại thuốc thông thường để điều trị bệnh ĐTĐ, như metformin là tác nhân
hạ đường huyết có nguồn gốc thực vật. Một số giả thuyết liên quan đến cơ chế tác động
của dịch chiết thực vật lên hoạt động của các tế bào ß tuyến tụy (tổng hợp, giải phóng)
hoặc tăng độ nhạy insulin hoặc hoạt động giống như insulin [120]. Tất cả những hoạt
động này có thể chịu trách nhiệm cho việc giảm hoặc loại bỏ các biến chứng ĐTĐ.
Bảng 1.4. Thảo dược trong điều trị đái tháo đường
Bộ Các dịch Thành phần Mô hình STT Tên Khoa học phận Kết quả chiết hóa học kiểm tra dùng
Pandanus Người ↓Glucose, amaryllifolius(P tình 1 Lá Nước, ethanol - ↑insulin [55] andanacea) -Lá nguyên nếp
Musa balbisiana Hoa Chuột ↓Glucose, 2 (Musaceae)- chuố Ethanol - STZ ↑insulin [46] Chuối hột i
Physalis
angulate Withangulatin- Chuột ↓Glucose 3 Quả Methanol (Solanaceae) A alloxan [123]
-Tầm bóp
4 Carica papaya- Lá Nước Chuột ↓Glucose, -
26
Bộ Các dịch Thành phần Mô hình STT Tên Khoa học phận Kết quả chiết hóa học kiểm tra dùng
(Caricaceae) STZ ↓cholesterol,
Đu đủ ↓triacylglyc-
erol [91]
↓Glucose, ↓ Carica papaya- Chuột ↓cholesterol, 5 (Caricaceae) Lá Nước - alloxan triglyceride, Đu đủ ↑HDL [149]
↓Glucose, Ficus racemosa- Petroleum Chuột ↓cholesterol, 6 (Moraceae ) Lá - ether STZ triglyceride, Sung ↑HDL [162]
↓ Glucose, ↓ Zea mays- Dichlorometh Chuột lipid, ↑HDL, 7 (Poaceae) Lá - ane alloxan ↑insulin Bắp [116]
Artocarpus
altilis- Chuột Bảo vệ đảo 8 Lá Ethanol - (Moraceae) alloxan tụy] [135] Sa kê
Polysaccharide
Gynostemma Lá pentaphyllum Chuột ↓ Glucose 9 và Ethanol (Cucurbitaceae) STZ [154] thân -Giảo cổ lam
-
Gymnema Chuột ↓Glucose, 10 Lá Nước sylvestre STZ ↓cholesterol,
27
Bộ Các dịch Thành phần Mô hình STT Tên Khoa học phận Kết quả chiết hóa học kiểm tra dùng
(Apocynaceae)- ↓triglyceride
Dây thìa canh ↓ALT, AST,
↑HDL,
↑insulin [68]
Nelumbo ↓Glucose, ↓
-
nucifera Chuột lipid, ↓ALT, 11 Hạt Ethanol (Nelumbonaceae) STZ ↓AST,
- Sen ↑insulin [42]
↓Glucose, ↑
-
Ocimum dung nạp Dichlorometh basilicum Thân Chuột glucose, ↑ 12 -ane: metanol (Lamiaceae)- và lá alloxan glycogen, (1: 1) Húng quế ↓cholesterol
[71]
Stevia ↓Glucose,
-
rebaudiana Chuột ↓HbA1c, ↑ 13 Lá Nước STZ glycogen, ↑ (Asteraceae)-Cỏ
ngọt insulin [26]
Toàn Chuột ↓Glucose Retama raetam 14 bộ Nước, ethanol - STZ [120] (Fabaceae) cây
↓Glucose,
Aegeline 2, ↓ HbA1c, Aegle marmelos Lá, Coumarin, Chuột ↑C-peptide, 15 (Rutaceae)- Cây hạt, Ethanol, nước Flavonoid, STZ ↑dung nạp quách quả Alkaloid glucose,
↑glycogen,
28
Bộ Các dịch Thành phần Mô hình STT Tên Khoa học phận Kết quả chiết hóa học kiểm tra dùng
↑insulin
[120]
Diallyl
disulphide
oxide, Ajoene, ↓Glucose, Allyl ↓lipid, propyl Chuột Allium sativum ↑insulin, 16 Rễ disulfide, S- STZ (Alliaceae) -Tỏi ↓stress oxy allyl cysteine, hóa [120] S-allyl
mercaptocystei
ne
Averrhoa
Chuột ↓Glucose, bilimbi - Lá Nước 17 STZ ↓lipid [120] (Oxalidaceae) -
Khế tàu
↓Glucose,
Chuột ↓stress oxy Lycium
STZ, hóa, barbarum 18 Quả Ethanol Polysaccharide thỏ ↑GLUT4, (Solanaceae)-
Alloxan ↑insulin Câu kỷ
[120]
Cinnamomum
Chuột ↓Glucose zeylanicum 19 Lá Ethanol - Alloxan [120] (Lauraceae) -
Quế
Momordica Toàn Methanol, Charantin, Chuột ↓Glucose, 20 charantia bộ nước, Momordicin, SZT ↓HbA1c,
29
Bộ Các dịch Thành phần Mô hình STT Tên Khoa học phận Kết quả chiết hóa học kiểm tra dùng
(Cucurbitaceae) cây chloroform Galactose- ↓stress oxy
- Khổ qua hóa, binding lectin
↑glycogen Non-bitter,
[120] Diosgenin,
Cholesterol,
lanosterol, β-
sitosterol,
Cucurbitacin
glycoside
Mangifera Lá, Chuột Mangiferin, indica thân, STZ, ↓Glucose 21 Nước, ethanol Phenolics, (Anacardiaceae vỏ, chuột [120] Flavonoid ) - Xoài quả Alloxan
Pseudoprototin Aloe vera Chuột ↓ HbA1c osaponin, 22 (Liliaceae ) - Lô Lá Ethanol Db/db [120] Prototinosaponi hội n
↓Glucose, Piper betle Chuột ↓ HbA1c 23 (Piperaceae ) – Lá Nước - STZ [120] Trầu không
Annona Chuột ↓Glucose,
squamosa Lá, STZ, ↓lipid [120] 24 Nước, ethanol - (Annonaceae) - quả thỏ
Na Alloxan
Kháng insulin từ lâu đã được coi là một dấu hiệu chính cho nguyên nhân và
30
bệnh sinh của ĐTĐ type 2. Các mô hình động vật thí nghiệm và nghiên cứu dịch tễ
học ở người cho thấy kháng insulin và viêm được liên kết trực tiếp với nhau trong
quá trình phát triển của ĐTĐ type 2 [49]. Sự gia tăng khối lượng mô mỡ quan sát
thấy trong béo phì có thể dẫn đến sự kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh, do đó,
có thể dẫn đến kháng insulin và ĐTĐ type 2 theo thời gian [167]. Sự phát triển của
kháng insulin chủ yếu liên quan đến các phản ứng viêm đặc hiệu gây ra bởi các chất
trung gian gây viêm hoặc stress oxy hóa khác nhau đáng chú ý là các cytokine tiền
viêm như TNF-α, IL-1β, IL-6 và IL-8 [128]. Tăng tiết cytokine bởi cả tế bào miễn
dịch và tế bào mỡ được quan sát thấy với bệnh béo phì và gây kháng insulin thông
qua nhiều cơ chế bao gồm kích hoạt serine/threonine kinase, giảm biểu hiện IRS-1,
GLUT-4 và PPARγ [128].
Nhiều nghiên cứu cho thấy các phương pháp điều trị miễn dịch có thể cải thiện
đường huyết, tình trạng kháng insulin ở bệnh nhân ĐTĐ type 2. Những nghiên cứu
này tạo thành một bằng chứng về khái niệm rằng viêm mãn tính có liên quan đến sinh
lý bệnh của bệnh ĐTĐ type 2 và do đó việc nghiên cứu nhắm vào mục tiêu điều trị
tình trạng viêm có thể cải thiện được kháng insulin ở bệnh ĐTĐ type 2, ngăn chặn sự
tiến triển cũng như biến chứng của bệnh [122]. Trong những năm gần đây, các nhà
nghiên cứu đã chứng minh các đặc tính chống viêm và kháng insulin của nhiều sản
phẩm tự nhiên. Đáng chú ý là các tác nhân trị liệu hiệu quả trong việc kiểm soát nhiều
loại bệnh viêm chủ yếu nhằm vào các đại thực bào và các sản phẩm của chúng. Nhiều
nghiên cứu đã tập trung rộng rãi vào việc chống viêm và hội chứng chuyển hóa. Ví
dụ, ức chế chống TNF-α có thể cải thiện tình trạng kháng insulin ở bệnh nhân viêm
khớp dạng thấp. Thuốc đối kháng thụ thể IL-1β đã được báo cáo là làm tăng độ nhạy
cảm insulin ở bệnh nhân ĐTĐ type 2. Do đó, các nghiên cứu về chống viêm đã trở
thành mục tiêu chính để phòng ngừa và điều trị bệnh béo phì liên quan đến kháng
insulin [122].
Bảng 1.5. Các hợp chất có khả năng chống viêm hoặc cải thiện tính kháng insulin
31
Mô hình kiểm Mẫu nghiên Thành phần hóa học Kết quả STT tra cứu
Chống viêm
(Cà chua)
↓cytokine tiền Gây viêm bằng Solanum viêm (IL-1β, 1 Acid ferulic LPS trong đại lycopersicum TNF-α và NFκB) thực bào [38]
Viêm do LPS gây
Hibiscus ra ở tế bào RAW ↓NO, IL-1β, IL-6
2 tilliaceus Acid Hydroxyanthranilic 264.7 và trong đại và TNF-α, ↑IL-
(Tra làm chiếu) thực bào phúc 10, ↓NFκB [38]
mạc chuột
Viêm gây ra bởi
Terpene và polyphenol
ấm)
LPS trong các tế Nepenthes ↓IL-6, IL-12 và 3 bào đuôi gai có mirabilis ( Nắp TNF-α [38] nguồn gốc từ tủy
xương
Giảm đáng kể
(Hành tây)
khối lượng phù cả Gây viêm khớp Allium cepa ở viêm cấp tính ở chuột bằng và mãn tính, Camellia 4 Quercetin carrageenan tương đương với sinensi (viêm cấp tính tác dụng của (Trà xanh) và mãn tính) phenylbutazone
[38]
Viêm do LPS ↓NO, IL-1β, IL-6 Cymbopogon 5 Luteolin gây ra ở tế bào và TNF-α [38] citratus ( (Sả) RAW 264.7
6 Ampelopsis Phloretin và 5,7,3, 5′- Viêm do LPS ↓NO, ức chế hoạt
32
Mẫu nghiên Mô hình kiểm STT Thành phần hóa học Kết quả cứu tra
cantoniensis tetrahydroxyflavanone gây ra ở tế bào động của iNO
(Chè dây) RAW 264.7 [146]
↓ iNOS và COX- Gây viêm bằng Nardostachys 2, ↓cytokine tiền LPS ở tế bào tế 7 jatamansi Các sesquiterpenoid viêm như IL-1β, bào thần kinh (Cam tùng) IL-12 và TNF-α đệm BV2 [166]
Các mô hình Ức chế phù tai viêm in vitro và Opuntia ficus Các isorhamnetin tương đương với in vivo khác 8 (Xương rồng glycoside các indomethacin, nhau (gây ra bởi Nopal) ↓COX-2, TNF-α LPS và dầu và IL-6 [34] croton)
Isogarcinol;
andrograpanin;
hinokitiol;
tectorigenin; α-iso- ↓IL-1β, IL-6, Mô hình động cubebene; Hợp chất TNF-α, NO, 9 vật (gây viêm schisantherin A; thương mại COX-2 và iNOS bởi LPS) psoralidin; [28]
formosumone A;
isofraxidin; axit
maslinic, mangiferin
10 Momordica Saponin Tế bào ↓COX-2, iNOS,
33
Mẫu nghiên Mô hình kiểm STT Thành phần hóa học Kết quả cứu tra
cymbalaria RAW264.7 NO, và các
(Thuộc chi được kích thích cytokine [134]
mướp đắng) bằng LPS
Mô hình in vivo ↓NO, iNOS, và in vitro TNF-α, IL-6 và (chuột và tế bào Diospyros 11 Myricetin IL-12; ↓COX-2, RAW264.7 gây lotus iNOS và NF-κB viêm bằng LPS) [56]
Cải thiện tính kháng insulin
Cải thiện dung
nạp glucose và
Tế bào cơ xương insulin, tăng Hợp chất 12 Naringenin kháng insulin cường hoạt động thương mại gây bởi TNF- α của GLUT4 và
hấp thu glucose
[97]
Ức chế p38,
Camellia Tế bào HepG2 JNK1/2, iNOS và
13 sinensis (Trà Flavonoid kháng insulin COX-2, tăng
xanh) gây bởi TNF- α cường hấp thu
glucose [72]
Kháng insulin Mô hình nuôi Nelumbinis được cải thiện và chuột béo in 14 Plumula (Tim Alkaloid ↓các cytokine, vivo gây ra gan sen) khôi phục IRS-1 nhiễm mỡ và ngăn chặn sự
34
Mẫu nghiên Mô hình kiểm STT Thành phần hóa học Kết quả cứu tra
biểu hiện của
phosphoryl hóa
JNK [159]
↑phosphoryl hóa
tyrosine và kích
TNF- α được sử hoạt thụ thể
dụng để gây insulin, ↑biểu Hợp chất Acid caffeic và acid 15 kháng insulin ở hiện thụ thể thương mại cinnamic tế bào gan chuột insulin, PI3K,
tổng hợp FL83B
glycogen
và ↑GLUT-2 [80]
↓TNF‑ α, ↑hấp Insulin được sử thu glucose, dụng ở nồng độ ↑biểu hiện của Hợp chất khác nhau để 16 4-Hydroxyisoleucine IRS‑1, ↑GLUT4 thương mại phát triển tế bào và ức chế biểu gan HepG2 hiện của p-IRS-1 kháng insulin (Ser307) [73]
↑Hấp thu glucose Poria cocos Tế bào mỡ 3T3- và phosphoryl 17 Pachymic acid (Phục linh) L1 hóa IRS-1 [82]
TNF- α gây ↑Hấp thu glucose,
kháng insulin ở kích hoạt con Hợp chất 18 Isoorientin tế bào mỡ 3T3- đường dẫn tín thương mại F442A và tế bào hiệu insulin trong
mỡ người tế bào mỡ (IRS-1,
35
Mẫu nghiên Mô hình kiểm STT Thành phần hóa học Kết quả cứu tra
PI3K) [31]
↑Hấp thu glucose, TNF-α gây ức chế biểu hiện Panax ginseng kháng insulin ở 19 Ginsenoside Rb2 của các yếu tố (Nhân sâm) tế bào mỡ 3T3- gây viêm, ↓kháng L1 insulin [61]
Chống lại bệnh Mô hình nuôi béo phì và kháng Hợp chất chuột chế độ ăn 20 Myricetin insulin, ↓nồng độ thương mại nhiều béo in cytokine huyết vivo thanh [58]
Cải thiện độ nhạy Mô hình chuột Mangifera insulin,↑nồng độ 21 Mangiferin với chế độ ăn indica (Xoài) adipokine và giàu chất béo ↓TNF-α [132]
↓Triglyceride,
Coptis ↓cholesterol, Mô hình chuột chinensis ↓kháng insulin, 22 Berberine với chế độ ăn (Hoàng liên ức chế biểu hiện giàu chất béo chân gà) TNF-α, ↑biểu
hiện IRS-1 [99]
↑Nhạy cảm với
Rosmarinus Mô hình chuột insulin, ↑hoạt
23 officinalis Rosmarinic acid với chế độ ăn động của GLUT-
(Hương Thảo) giàu chất béo 4 [131]
24 Hợp chất Naringenin Tế bào cơ L6 ↑Hấp thu glucose,
36
Mô hình kiểm Mẫu nghiên STT Thành phần hóa học Kết quả tra cứu
gây kháng ↑GLUT4 [66] thương mại
insulin bởi
palmitate
↓Cytokine viêm,
↓hoạt động phiên TNF-α gây Hợp chất mã NF-kB, 25 Resveratrol, quercetin kháng insulin ở thương mại ↓phosphoryl hóa tế bào mỡ người JNK, ↓tính kháng
insulin [59]
Hiện nay, bệnh ĐTĐ được kiểm soát bằng nhiều hướng như sử dụng thuốc duy trì
lượng glucose trong máu ổn định như kích thích bài tiết insulin (Sulfonylurea); giảm sự
tân tạo glucose ở gan (Biguanide); chất ức chế tiêu hóa và hấp thu tinh bột (Glucobay);
thuốc cảm ứng độ nhạy của insulin (Thiazolidinediones) [106]. Nhìn chung, các liệu
pháp này có tác dụng nhất định, công dụng chính của các nhóm thuốc này là hạ đường
huyết hoặc cung cấp insulin thay thế tạm thời cho người bệnh ĐTĐ. Trong những thập
kỷ qua, các nhà khoa học trên thế giới rất nỗ lực nghiên cứu để khám phá và phát triển
các hợp chất từ thiên nhiên có khả năng ức chế α-amylase và α-glucosidase nhằm tìm
ra nhưng sản phẩm tiềm năng cho điều trị bệnh điều trị bệnh ĐTĐ. Có rất nhiều hợp
chất tham gia ức chế α-amylase và α-glucosidase được tìm thấy trong thực vật, như các
terpene, alkaloid, flavonoid, glycoside, phenol… [148], [165]. Bảng 1.6 là danh sách
các loại dịch chiết và hợp chất chiết xuất từ thực vật ức chế α-amylase và α-glucosidase
được thể hiện bằng giá trị IC50 (nồng độ gây ức chế tối đa 50% hoạt độ của enzyme).
Bảng 1.6. Các dịch chiết và hợp chất chiết xuất từ thực vật ức chế α-amylase hoặc
37
α-glucosidase
Bộ
STT Thực vật phận Dịch chiết/ Hoạt chất IC50
thu hái
Ức chế enzyme α-amylase
Myricetrin; 4- 1,9; 20; 2,3; 31; hydroxybenzaldehyde; 33 và 8,3 µM 1 Syzygium aqueum Lá europetin-3-O-rhamnoside; [103] phloretin và myrigalone-G;
myrigalone-B
112.8; 420.7; Jaceosidin; pomonic acid; 395.6 µg/ml 2 Wedelia chinensis Lá pomolic acid [145]
Các bộ Luteolin 7-O-glucoside; phận 81,7; 61,5, và 3 Salvia chloroleuca luteolin 7-O-glucuronide và trên 76,3 µM [36] diosmetin 7-O-glucuronide không
(-)-catechin gallato và (-)-
Bergenia ciliata epicatechin gallato 401; 739; 739 và Lá 4 (−)-3-Ogalloylepicatechin 401 μM [41]
và (−)-3- O -galloylcatechin
76,96 mg/ml Carica papaya Hạt Hexane 5 [150] (Đu đủ)
315,89 μg/ml Ficus carica Quả Ethanol 6 [29] (Sung ngọt)
7 Citrus paradise Vỏ Pectin 0,41 mg/ml [29]
Coriandrum
8 sativum Hạt Dịch chiết nước 0,294 mg/ml [29]
(Rau mùi)
38
Bộ
STT Thực vật phận Dịch chiết/ Hoạt chất IC50
thu hái
Olea europia 9 Axit Oleanolic 0,1 mg/ml [29] (Ô liu)
Phyllanthus Axit oleanolic : axit ursolic 10 amarus 2,01 μg/ml [148] (2:1) (Diệp hạ châu)
Nội Gnetum gnemon Gnetin C; gnemonoside C; 203; 840 và 277 11 nhũ (Rau lá bép) và gnemonoside D μg/ml [148]
Citrus medica vỏ 12 n- Hexan 0,62 mg/ml [148] (Thanh yên)
3-O-[β-d-glucopyranosyl-
(1→4)-β-d- Polyscias fruticosa 13 Lá glucuronopyranosyl] 27,1 µg/ml [100] (Đinh lăng) oleanolic acid 28-O-β-d-
glucopyranosyl ester
Dianthus Toàn 14 basuticus Chiết xuất saponin 4,18 mg/ml [108] bộ cây
59,12; 82,29; Rutin; hyperoside; 52,18; 60,48; isoquercitrin; taxifolin; Hợp chất thương 46,81; 62,37; 15 Lá luteolin; quercetin; apigenin; mại 25,14; 50,15; naringenin; kaempferol và 30,48 và 28,46 isorhamnetin µM [98]
Triticum aestivum Axit-Aminobutyric và axit 5,4 và 9,5 mM 16 Chồi (Lúa mì) ferulic [87]
17 Ruta chalepensis Lá Quinoline và Quinazoline 179 và 55,4
39
Bộ
STT Thực vật phận Dịch chiết/ Hoạt chất IC50
thu hái
µg/ml [119]
Camellia sinensis 18 Lá Kaempferol diglycoside 0,09 μM [79] (Chè xanh)
Quả Vaccinium 19 Malvidin-3-O-β-glucoside 0,329 mM [112] chín arctostaphylos
Curcuma longa Curcumin và 6,99 và 1,79 μM Củ 20 (Nghệ) bisdemethoxycurcumin [155]
Ức chế enzyme α-glucosidase [165]
Tribulus (25S) -5α-furastan-3β; Lá 21 33,5 và 37,2 μM longipetalus 22,26-triol và gitogenin
Scrophularia D-Galactopyranosyl
ningpoensis harpagoside; 8-O-feruloyl 2,16; 3,02; 3,09 Rễ 22 (Quảng huyền harpagide; 8-O- (coumaroyl) và 1,54 mM
sâm) harpagide; và ninpogenin
glinoside C; 3-O- (β-D-
xylopyranosyl) - Glinus 127; 1654; 628; Thân spergulagenin A ; 23 oppositifolius (Rau 143, 694 và 1783 và lá spergulacin; spergulin A; đắng đất) μM spergulacin A và spergulin
B
Piper sarmentosum 24 Lá chaplupyrrolidones A và B 7820 và 430 μM (Lá lốt)
bisgerayafoline D; 38,7; 51,3; 29,1; Murraya koenigii bismahanimbinol 25 Quả 46,1; 77,5 và 21,4 (Cà ri Ấn Độ) bispyrayafoline; O-methyl μM mahanine; O-methyl
40
Bộ
STT Thực vật phận Dịch chiết/ Hoạt chất IC50
thu hái
mukonal và mahanine
Commelina Phần Isoquercitrin; swertisin; 0,24; 0,37; 0,42 26 communis trên vitexin và isorhamnetin-3- và 0,51 mM (Rau trai thường) không O-rutinoside
Eucommia
27 ulmoides (Đỗ Lá flavonoid glycoside 0,25 μM
trọng)
quercetin-3,6,7-trimethyl
ether; isovitexin-4′-methyl 14,5; 83,57; Achillea Thân ether; isovitexin; acaetin-6- 28 34,37; và 1,5 fragrantissima và lá C-(6″-acetyl-β-D- mg/ml glucopyranoside)-8-C-α-L-
arabinopyranoside
Phần Brickellia 29 trên Acacetin và quercetin 0,16 và 0,53 mM cavanillesii không
Aquilarisinin; aquilarisin;
hypolaetin 5-O-β-D-
glucuronopyranoside; 273,7; 634,7; aquilarixanthone; 298,9; 678.1; Aquilaria sinensis Mangiferin; iriflophenone 2- 299,7; 366,7; 30 Lá (Bạch mộc hương) O-α-L-rhamnopyranoside; 404,7 và 454,4 iriflophenone 3-C-β-D- μM glucoside và iriflophenone
3,5-C-β-D-
diglucopyranoside
41
Bộ
STT Thực vật phận Dịch chiết/ Hoạt chất IC50
thu hái
trans-Np-
coumaroyltyramine; 1,7-bis Thân Dioscorea opposita (4-hydroxyphenyl) heptan- 0,40; 0,38 và 0,77 31 rễ củ (Khoai mài) 3,5-diol và 6 -hydroxy- mM tươi 2,4,7-trimethoxyphe-nanth-
rene
Stilbene dimmers - Cyperus rotundus Thân 210,5; 168,1 và 32 cassigarol E; scirpusin A và (Củ gấu) rễ 94,3 μM scirpusin B
2,3-Di-O-galloyl-1,5-
anhydro-D-glucitol; 2,4-di-
O-galloyl-1,5-anhydro-D-
glucitol; ginnalin A; 3,6-di- 1745,78;
O-galloyl-1,5-anhydro-D- 1221,84; Acer rubrum 33 glucitol; 2,4,6-tri-O-galloyl- 95,38; 88,42; (Phong đỏ) 1,5-anhydro-D-glucitol; 8,26; 317 và
methyl gallate và 3,4- 6541,11 μM
dihydroxy-5-
methoxybenzoic axit methyl
ester
unicatannin C; hippomanin
A; gemin D; 3,4,6-tri-O- 80,34; 118,19;
Punica granatum galloyl-β-D-glucose; axit 64,19; 56,43; 34 Hoa (Lựu) gallic 3-O-β -D- (6′-O- 737,18; và 79,78
galloyl) -glucopyranoside và μM
phloridzin
42
Bộ
STT Thực vật phận Dịch chiết/ Hoạt chất IC50
thu hái
Phenylpropanoid glycosides
darendoside B; acteoside; và
Scrophularia 2- (3-hydroxy-4-
ningpoensis methoxyphenyl) etyl-O-α-L- 5,51; 1,62 và 36 Rễ (Quảng huyền arabinopyranosyl- (6) -O- 12,01 mM
sâm) [6-deoxy-α-L-
mannopyranosyl- (1 → 3)] -
β-D-Glucopyranoside
36 Fagara tessmannii vỏ axit vanillic 69,4 μM
Nhiều tác giả trên thế giới đã nghiên cứu và phát hiện được tác dụng hạ đường
huyết của một số thực vật. Ở nước ta một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra tác dụng hạ
đường huyết của mướp đắng, dây thìa canh, thổ phục linh. Tuy nhiên trong kho tàng
kinh nghiệm dân gian vẫn còn nhiều cây thuốc có tác dụng hỗ trợ điều trị ĐTĐ chưa
được phát hiện.
Một số sản phẩm được tiêu thụ trên thị trường dưới dạng thực phẩm chức năng
được biết đến như sản phẩm Diabetna chiết xuất từ dây thìa canh, Diabetna được bào
chế từ công thức tối ưu cho cơ địa người Việt Nam dựa trên công trình nghiên cứu
của Trần Văn Ơn cùng các cộng sự, Diabetna không chỉ giúp hạ và ổn định đường
huyết hiệu quả, hạ HbA1c, mà còn giúp người bệnh phòng ngừa các biến chứng ĐTĐ
[169]. Phạm Lan Anh đã thử nghiệm lâm sàng đánh giá khả năng kiểm soát glucose
máu sau ăn và hiệu quả lâu dài trên người khỏe và bệnh nhân ĐTĐ type 2 của sản
phẩm Voscap (chiết xuất từ lá vối, ổi, sen). Kết quả nghiên cứu cho thấy trên bệnh
nhân ĐTĐ type 2, glucose máu sau ăn ngày uống Voscap thấp hơn ngày không uống
tại thời điểm 15 phút: 11,30 mmol/l so với 10,54 mmol/l và 30 phút là 13,58 so với
12,25 mmol/l. Voscap đã có hiệu quả giảm rõ rệt đường máu, HbA1c và chỉ số kháng
43
insulin lâu dài trên bệnh nhân ĐTĐ type 2 sau 12 tuần sử dụng. Tỷ lệ bệnh nhân có
nồng độ glucose máu ≤ 6,7 mmol/l ở nhóm can thiệp tăng có ý nghĩa từ 12,5% lên
53,8%, so với nhóm chứng chỉ tăng từ 8,3% lên 27,8%. Voscap có hiệu quả làm tăng
rõ rệt tỷ lệ bệnh nhân có cholesterol < 5,2 mmol/l sau 12 tuần can thiệp so với tỷ lệ
này ở nhóm chứng. Duy trì ổn định nồng độ creatinin huyết thanh, trong khi ở nhóm
chứng chỉ số này lại tăng [1]. Ngoài ra, tác giả Phùng Thanh Hương nghiên cứu về
thuốc điều trị bệnh đái tháo đường từ thân mướp đắng (Momordica charantia L.), kết
quả cho thấy thân cây mướp đắng có tác dụng điều trị bệnh ĐTĐ tương đương với
quả mướp đắng và với thuốc trị ĐTĐ gliclazide [11]. Nhóm nghiên cứu của Nguyễn
Ngọc Xuân đã bước đầu nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của thổ phục linh
(Smilax glabra Roxb.) trên chuột nhắt. Kết quả cho thấy thổ phục linh có tác dụng hạ
đường huyết mạnh nhất vào giờ thứ 4 sau khi tiêm màng bụng. Tác dụng của thuốc
phụ thuộc vào liều lượng, với liều 100 mg/kg mức hạ glucose tối đa là 38%, với liều
200 mg/kg mức hạ đường huyết tối đa là 56% [25]. Nhóm nghiên cứu của Phùng
Thanh Hương đã xác định được tác dụng hạn chế tăng đường huyết cũng như các chỉ
số mỡ máu (cholesterol, triglyceride) của cao chiết ethanol lá bằng lăng nước trên mô
hình chuột ĐTĐ type 2 [10]. Năm 2012, Đái Thị Xuân Trang và cộng sự nghiên cứu
khả năng hạ đường huyết cao chiết rễ, lá, trái xanh và trái chín của cây nhàu cho thấy
rằng, trong các nhóm chuột điều trị bằng cao chiết cây nhàu với liều lượng 200 mg/kg
× 2 lần/ngày thì nhóm điều trị bằng cao rễ có hiệu quả cao nhất (giảm 58,01%), sau
đó là nhóm điều trị với cao trái chín (giảm 51,62%), cao trái xanh (giảm 41,43%) và
cuối cùng là cao lá (giảm 34,21%). Trong đó nhóm chuột ĐTĐ uống cao chiết rễ có
đường huyết giảm tương đương nhóm chuột ĐTĐ được điều trị với thuốc glucofast
(giảm 67,65%) [20]. Hà Thị Bích Ngọc đã chứng minh cao chiết lá vối, nụ vối, lá chè
đắng, lá tầm gửi trên cây mít, vỏ thân ổi, lá dây thìa canh, thân và lá chó đẻ răng cưa
và cao củ chuối hột có khả năng hạ đường huyết trên chuột ĐTĐ type 2 ở liều 500
mg/kg, sau 20 ngày uống cao chiết đường huyết giảm lần lượt là: 67; 60; 65; 60; 52;
63; 58%. Bên cạnh đó, chế phẩm Thivoda (chiết xuất từ lá vối, nụ vối, lá dây thìa
canh, thân và lá chó đẻ răng cưa và lá chè đắng) có khả năng hạ đường huyết trên
chuột ĐTĐ type 2 một cách ổn định, đường huyết quay về mức 7,5±1,4 mmol/l tương
44
đương mức giảm 71% [14], [19]. Năm 2014, Nguyễn Thanh Tâm và cộng sự đã
nghiên cứu về khả năng hạ đường huyết của một số hợp chất phân lập từ cây dừa cạn
và cho thấy ursolic acid có hiệu quả giảm rõ rệt đường máu trên chuột bị đái tháo
đường bằng alloxan. Kết quả cho thấy: ursolic acid liều 200 và 300 mg/kg/ngày đã
thể hiện tác dụng hạ đường huyết trên chuột gây đái tháo đường bằng alloxan, làm
giảm nồng độ glucose trong huyết thanh 45,75% và 51,31% so với đối chứng ở mức
có ý nghĩa thống kê [18].
45
- Các loại thực vật (20 loài) được thu nhận tại miền Trung Việt Nam (Bảng 2.1
và Hình 2.1). Trong đó các mẫu dây thìa canh, giảo cổ lam, chuối hột và lá sen đã
được nghiên cứu trong nước và trên thế giới [29, 98, 102], một số mẫu khác như lá
đắng, đu đủ, cỏ ngọt và quả sung đã được công bố tác dụng hạ đường huyết trên thế
giới [32, 87, 130, 153]. Một số mẫu thực vật còn lại chúng tôi tham khảo kinh nghiệm
trong dân gian về tác dụng trị ĐTĐ của chúng. Các mẫu thực vật được thu hái hoặc
thu mua vào tháng 7-9, năm 2016-2017. Các mẫu thực vật đã được lưu trữ tại phòng
thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách khoa, Đà Nẵng.
Bảng 2.1. Các loại thực vật (20 loài) được thu nhận tại miền Trung Việt Nam
STT Tên khoa học Mẫu thảo dược
Nơi thu Bộ phận mẫu thu hái Quảng Nam Lá Quảng Trị Lá Lá Huế Quả Quảng Nam
Lá và quả Đà Nẵng
Jasminum subtriplinerve Blume Pandanus amaryllifolius Roxb Musa balbisiana Colla Physalis angulata L. Carica papaya L. Carica papaya L. Ficus racemosa L.
Huế Lá Huế Hạt Quả Huế Quả Đà Nẵng Lá và thân Đà Nẵng
Zea mays L.
1 Cây chè dây Ampelosis cantoniensis (H. & A.) PL. 2 Lá vằng 3 Lá nếp 4 Chuối hột 5 Tầm bóp 6 Đu đủ 7 Đu Đủ 8 Sung 9 Ké đầu ngựa Xanthium strumarium L. 10 Nở ngày đất Gomphrena globosa L. 11 Bắp 12 Cây lá đắng Vernonia amygdalina Delile 13 Sa kê Râu Quảng Nam Quảng Nam Lá Đà Nẵng Lá
14 Lá và thân Quảng Nam Cây giảo cổ lam
15 Dây thìa canh Lá và thân Quảng Trị
Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult Nelumbo nucifera Gaertn Lá Huế
16 Sen 17 Cây lược vàng Callisia fragrans (Lindl.) Woods. 18 Quế Cinnamomum loureirii (Nees) Nees & Lá và thân Quảng Nam Quảng Nam Vỏ
46
STT Tên khoa học Mẫu thảo dược Bộ phận thu hái Nơi thu mẫu
Lá Huế
19 Húng Quế 20 Cỏ ngọt Eberth. Ocimum basilicum L. Stevia rebaudiana (Bert.) Hemsl Lá và thân Quảng Trị
Hình 2.1. Các loại thực vật ( 20 loài) được thu nhận tại miền Trung Việt Nam
A: Chè dây - Ampelosis cantoniensis (H. & A.) PL.; B: Lá vằng - Jasminum
subtriplinerve Blume; C: Lá nếp - Pandanus amaryllifolius Roxb; D: Chuối hột -
Musa balbisiana Colla; E: Tầm bóp - Physalis angulata L.; G: Đu đủ - Carica papaya
L.; H: Hạt Đu đủ - Carica papaya L.; I: Quả cây Sung - Ficus racemosa L.; K: Quả
cây ké đầu ngựa - Xanthium strumarium L.; L: Nở ngày đất - Gomphrena globosa L.;
47
M: Râu bắp - Zea mays L.; N: Lá đắng - Vernonia amygdalina Delile; O: Sa kê -
Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg; P: Giảo cổ lam - Gynostemma pentaphyllum
(Thunb) Makino; Q: Dây thìa canh - Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult ; R:
Sen - Nelumbo nucifera Gaertn; S: Lược vàng - Callisia fragrans (Lindl.) Woods.;
T: Vỏ cây quế - Cinnamomum loureirii (Nees) Nees & Eberth.; U: Húng Quế -
Ocimum basilicum L.; V: Cỏ ngọt - Stevia rebaudiana (Bert.) Hemsl.
- Chuột nhắt trắng đực dòng Swiss, trọng lượng từ 18-22 g, được cung cấp bởi
cơ sở chăn nuôi Suối Dầu - Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Nha Trang.
- Tế bào đại thực bào Raw 264.7 và tế bào mỡ 3T3-L1 được cung cấp bởi phòng
thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzyme, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Sắc ký lớp mỏng phân tích: Sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck
60F254, có độ dày 0,2 mm. Sắc ký cột thường: silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm.
Sắc ký cột pha đảo: RP-18 YMC, Fujisilisa, Chemical Ltd. Sắc ký lọc gel: Sephadex
LH-20 Merck. Dung môi triển khai là một hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng
như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH.
- STZ (streptozotocin) của hãng Sigma
- Kit ELISA định lượng Insulin của hãng Thermo
- Enzyme α-glucosidase (được trích ly từ nấm Saccharomyces cerevisiae) và p-
nitrophenyl-α-D- glucopyranoside (pNPG) của hãng Sigma
- Thuốc Acarbose 100 mg của hãng Bayer
- Enzyme α-amylase và DNSA (3,5-dinitrosalicylic acid) của hãng Sigma
- LPS (lipopolysacharide) của hãng Sigma
- Kit ELISA IL-6, TNF-α, IL-10 của hãng BD.Biociense
- 2-NBDG-glucose của hãng Sigma
- Kháng thể 𝛽-Actin, p-IRS1 và kháng thể pY20 của hãng Santa Cruz
48
Bảng 2.2. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm
STT Thiết bị thí nghiệm Xuất xứ
Máy đo đường huyết One Touch Johnson&JohnsoN (Mỹ) 1
Que thử đường huyết One Touch Trung Quốc 2
Hệ thống phân tích Elisa Thermo Scientific (Mỹ) 3
Máy cô quay chân không Buchi Đức 4
Bình chiết mẫu, bình chiết phân đoạn Trung Quốc, Đức 5
Cột sắc ký các cỡ khác nhau Trung Quốc, Đức 6
Cân phân tích Shimadzu (Nhật) 7
Tủ sấy Sanyo (Nhật) 8
Tủ lạnh âm Sanyo (Nhật) 9
Máy ly tâm Centrifuge (Đức) 10
Máy cắt tiêu bản Thermo Scientific (Mỹ) 11
Máy chuyển bệnh phẩm Thermo Scientific (Mỹ) 12
Máy vùi mô tự động Thermo Scientific (Mỹ) 13
Thiết bị điện di protein Bio-rad Mỹ 14
Tủ ấm CO2 Mỹ 15
Tủ cấy vô trùng Naure Mỹ 16
Máy đo quang phổ UV Labomed (Mỹ) 17
Máy do PH Winlab (Đức) 18
Kính hiển vi Olympus (Nhật) 19
49
Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu
Mẫu (thân; lá; vỏ và quả) thu về được loại bỏ phần héo úa, rửa sạch, phơi trong
bóng râm cho khô, sấy mẫu ở nhiệt độ 60°C cho đến khi mẫu có khối lượng không
đổi, nghiền mẫu thành bột. Bột mẫu được bảo quản trong túi polyetylen, để mẫu nơi
khô ráo.
Mẫu được ngâm trong cồn 70° lần lượt theo các tỷ lệ 1:10 (khối lượng bột
nguyên liệu: thể tích cồn) [105]. Tổng thời gian ngâm chiết là 15 ngày. Tiến hành lọc
50
thu dịch chiết, gộp lại và cô quay chân không thu được cao thô cồn tổng số.
Từ cao thô cồn tổng số tiến hành chiết lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực
tăng dần: n-hexane, ethyl acetate, n-buthanol. Các dịch chiết được cô quay chân không,
thu các cao phân đoạn tương ứng: cao chiết bằng n-hexane (CHe), ethyl acetate
(CEtOAC), n-buthanol (CBuOH). Sơ đồ chiết xuất phân đoạn ở các dung môi khác nhau
được trình bày ở hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn
51
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã áp dụng mô hình gây chuột nhắt ĐTĐ type
2 bằng cách nuôi chuột với chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với tiêm STZ với liều
120 mg/kg của Sawant và cộng sự [137].
Chuột được nuôi ở điều kiện bình thường (12 giờ tối, 12 giờ sáng, nhiệt độ 28-
30°C), trong các lồng riêng để tránh lây nhiễm chéo. Chuột được chia thành 2 nhóm
là nhóm ăn thường (ND - normal diet) được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (6% chất béo)
cung cấp bởi cơ sở chăn nuôi Suối Dầu - Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Nha Trang
và nhóm ăn thức ăn giàu chất béo (35% chất béo) được tính theo bảng thành phần
dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam của Viện Dinh Dưỡng [22] gọi là nhóm nuôi béo
(HFD - high fat diet). Các nhóm chuột được nuôi trong 8 tuần. Tại thời điểm 0 giờ và
8 tuần, tiến hành cân chuột để theo dõi sự tăng trọng của cơ thể.
Bảng 2.3. Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột thí nghiệm
Các thành Lô Carbohydrat Protein Chất béo phần khác
Chuột ăn thường (ND) 60% 20% 6% 14%
Chuột ăn béo (NFD) 34% 20% 35% 11%
A: Nguyên liệu thức ăn chuột béo (1. Bột bắp; 2. Bột cá; 3. Mỡ heo; 4. Thức ăn
tiêu chuẩn); B: Thành phẩm thức ăn của chuột béo
Hình 2.4. Nguyên liệu và thành phẩm thức ăn chuột béo
52
a. Cholesterol
Tiến hành theo phương pháp của Deeg và Zlegenhorn trên máy xét
nghiệm hóa sinh máu bán tự động [65].
- Nguyên tắc:
Cholesterol esterase → Cholesterol + Acid béo (1)
Cholesterol este
Cholesterol oxidase → Cholesten-3-on + H2O2 (2)
Cholesterol + O2
Hydroperoxidase → Quinoneimin + 2H2O (3)
2H2O2 + 4-aminoantipyrine + pHB
Cholesterol ester huyết thanh được thủy phân bởi Cholesterol esterase.
Cholesterol tự do tạo ra sẽ bị oxy hóa bởi cholesterol oxidase để tạo thành cholest-4-
en-3 one và hydrogen peroxidase (H2O2). H2O2 sẽ kết hợp với 4-aminoantipyrin và
phenol với sự hiện diện của peroxidase để tạo thành chất quinoneimin. Cường độ màu
đậm nhạt của quinoneimin có màu đỏ tỷ lệ thuận với nồng độ cholesterol toàn phần
trong mẫu thử và được đo bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 520 nm.
b. Triglyceride
- Nguyên tắc:
Lipase → Glycerol + Acid béo (1)
Triglyceride
Glycerol kinase → Glycerol 1 phosphate + ADP (2)
Glycerol
G 1 P oxidase → Dihydroxyaceton phosphate + H2O2 (3)
Glycerol 1 phosphate + O2
Hydroperoxidase → Quinoneimin + 2H2O (4)
H2O2 + 4-aminoantipyrine + pHBS
Các xét nghiệm hóa sinh được tiến hành tại Trung tâm xét nghiệm Y khoa Phong
Châu, TP. Huế.
Để tạo chuột ĐTĐ type 2, các con chuột bị nhịn đói khoảng 12-14 giờ, sau đó
tiến hành thí nghiệm theo như bố trí trên bảng 2.4.
53
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm gây chuột ĐTĐ type 2
Nhóm chuột Tiêm hóa chất Liều tiêm Kết quả thí nghiệm
STZ (pha trong đệm citrate HFD 120 mg/kg HFD + STZ 0,01M; pH 4,3)
HFD Đệm citrate 0,01M; pH 4,3 10 ml/kg HFD + đệm
STZ (pha trong đệm citrate ND 120 mg/kg ND + STZ 0,01M; pH 4,3)
ND Đệm citrate 0,01M; pH 4,3 10 ml/kg ND + đệm
Sau khi tiến hành tiêm STZ, các con chuột tiếp tục được nuôi bằng chế độ ăn
như ban đầu. Đo nồng độ đường huyết lúc đói tại 0 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 7 ngày, 10
ngày. Sau 10 ngày lấy máu định lượng nồng độ đường huyết và insulin.
Định lượng đường huyết bằng kỹ thuật enzyme, glucose bị oxy hóa nhờ xúc
tác của các enzyme có trên bề mặt của vùng phản ứng giấy thử và đọc kết quả trên
máy.
Nguyên lý: Oxy hóa glucose thành acid gluconic theo phản ứng (1)
𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒 → Acid gluconic + H2O2 (1)
Glucose + H2O + O2
H2O2 tạo thành bị peroxidase phân hủy, giải phóng oxy, oxy hóa o-dianisidin để
tạo thành phức chất có màu vàng nâu theo phản ứng (2).
Peroxidase → Phức hợp vàng nâu + H2O (2)
O-Dianisidin + H2O2
Cường độ màu được xác định bằng phương pháp đo quang tương ứng với lượng
glucose cần định lượng. Máu để định lượng glucose là máu toàn phần lấy từ tĩnh
mạch đuôi chuột sau khi đã bỏ đi giọt máu đầu tiên.
Vào ngày thứ 10 sau khi tiêm STZ, chuột được chia làm 4 nhóm để nghiên cứu
khả năng dung nạp glucose.
Nhóm 1: HFD+STZ
Nhóm 2: HFD+đệm
Nhóm 3: ND+STZ
54
Nhóm 4: ND+đệm
Chuột bị nhịn đói 12 tiếng trước khi thí nghiệm. Cho tất cả các con chuột
uống glucose với liều 5 g/kg cân nặng, pha trong dung dịch nồng độ 20%. Định
lượng đường huyết tại các thời điểm 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ sau khi cho uống dung
dịch glucose [137].
* Nguyên tắc: Insulin trong mẫu thử phản ứng với kháng thể kháng insulin liên
kết với enzym peroxidase và kháng thể kháng insulin cố định trên giếng phản ứng.
Sau khi rửa các giếng với dung dịch đệm rửa (PBS - Tween 20) để loại bỏ các kháng
thể không gắn, phát hiện các kháng thể gắn bằng phản ứng với 3,3’,5,5’-
tetramethylbenzidin. Dừng phản ứng bằng dung dịch acid sulfuric 1 N, đo màu ở
bước sóng 450 nm và 550 nm
Hình 2.5. Tóm tắt quy trình định lượng insulin
55
* Cách tiến hành: Tất cả 4 lô chuột được lấy máu đuôi, sau đó cho vào các ống
eppendorf, đem mẫu ly tâm để thu huyết tương làm xét nghiệm định lượng insulin
bằng phản ứng ELISA. Đo mật độ quang của insulin chuẩn ở các nồng độ 300; 150;
75; 37,50; 18,75; 9,38; 4,69 và 0,00 µIU/ml. Từ kết quả đo mật độ quang của insulin
chuẩn tại bước sóng 550 nm, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính để xác định
nồng độ insulin trong huyết tương của chuột thể hiện ở hình 2.6.
y = 0.042x + 0.0024 R² = 0.9942
Hình 2.6. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang và nồng độ insulin
Tiến hành: Với kết quả xây dựng thành công mô hình chuột ĐTĐ type 2, chúng
tôi tiến hành nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của 20 cao chiết các mẫu thực
vật. Những con chuột được xác định là bị ĐTĐ type 2 được phân thành các lô riêng
biệt, mỗi lô gồm 7 con chuột ĐTĐ được cho uống cao chiết với liều 500 mg/kg thể
trọng (cao chiết được hòa trong nước cất) hoặc uống nước cất (10 ml/kg) trong vòng
21 ngày. Thí nghiệm được chia thành 4 đợt cụ thể và được bố trí theo bảng 2.5.
56
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng của hạ đường huyết của 20 mẫu thực vật
Lô Lô Đợt Thí nghiệm trên chuột Đợt Thí nghiệm trên chuột chuột chuột
Đối chứng (10 ml/kg) Đối chứng (10 ml/kg) 1 1
2 Chè dây 2 Lá đu đủ
3 Chuối hột 3 Hạt đu đủ I II 4 Tầm bóp 4 Ké đầu ngựa
5 Lá nếp 5 Nở ngày đất
6 Chè vằng 6 Quả sung
1 1 Đối chứng (10 ml/kg) Đối chứng (10 ml/kg)
2 Dây thìa canh 2 Lá đắng
3 Cỏ ngọt 3 Giảo cổ lam III IV 4 Quế 4 Lược vàng
5 Râu bắp 5 Lá sen
6 Húng quế 6 Lá sa kê
Chuột được uống cao chiết vào buổi sáng hằng ngày và đo nồng độ đường huyết
vào các thời điểm 0 giờ và 21 ngày. Trong 21 ngày thí nghiệm chuột vẫn được cho
ăn chế độ ăn béo như ban đầu.
Bệnh phẩm tươi có bề dày 3 mm bảo quản trong formol sau đó được cố định
bằng dung dịch Bouin, chuyển đúc trong parafin, tiếp tục được cắt thành những tiêu
bản có bề dày 3 µm và nhuộm theo phương pháp hematoxylin-eosin (HE) thường
quy. Nhân tế bào bắt màu xanh đen, bào tương bắt màu hồng. Các tiêu bản được đọc
dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần để đánh giá tổn thương với
phương pháp mù đơn (người đọc không biết ký hiệu của các lô chuột thực nghiệm).
Kỹ thuật vi thể được thực hiện tại bộ môn Mô phôi trường ĐH Y Huế.
57
Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các cao chiết phân đoạn CHe,
CEtOAC, CBuOH các mẫu lá chè dây và lá đắng. Chuột ĐTĐ type 2 được chia thành
7 lô và mỗi lô gồm 7 con chuột. Cho chuột uống cao chiết các phân đoạn với liều 500
mg/kg/ngày. Bố trí thí nghiệm được trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao chiết phân
đoạn chè dây và lá đắng
Lô Cao chiết cho chuột uống Lô Cao chiết cho chuột uống
1 Đối chứng (10 ml/kg.) 5 CHe lá đắng
2 CHe chè dây 6 CEtOAC lá đắng
3 CEtOAC chè dây 7 CBuOH lá đắng
4 CBuOH chè dây
Dựa trên nguyên tắc khả năng ức chế phản ứng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl
α-D-glucopyranosid (p-NPG) của enzym α-glucosidase sinh ra α-D-glucose và p-
nitrophenol (PNP) [133].
Tiến hành: Hỗn hợp phản ứng về khả năng ức chế enzyme α-glucosidase gồm
có: các mẫu thử ( hòa tan trong dung môi DMSO) và acarbose được pha với các nồng
độ khác nhau lần lượt là 5, 10, 25, 50, 100 μM. Hỗn hợp gồm có: 20 μl α-glucosidase
(0,4 U/ml), 110 μl dung dịch đệm phosphate 0,1 M (pH=6,9), 20 μl mẫu thử ở các
nồng độ như trên được ủ trong 15 phút ở 37°C. Cho tiếp 20 μl cơ chất p-NPG sau đó
ủ tiếp 15 phút ở 37°C. Kết thúc phản ứng bằng 80 μl Natri cacbonat 0,2 M. Sau đó
hỗn hợp phản ứng được đo mật độ quang ở bước sóng 405 nm [118]. Hoạt tính ức
chế được tính bằng phần trăm ức chế theo công thức sau:
58
% Ứ𝑐 𝑐ℎế =
(Đối chứng dương − Đối chứng âm) − (𝑀ẫ𝑢 𝑑ươ𝑛𝑔 − 𝑀ẫ𝑢 𝑡𝑟ắ𝑛𝑔) ∗ 100 (Đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔 𝑑ươ𝑛𝑔 − Đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔 â𝑚)
- Đối chứng dương: Đệm + enzyme + cơ chất + kit
- Đối chứng âm: Đệm + đệm + cơ chất + kit
- Mẫu dương: Mẫu + enzyme + cơ chất + kit
- Mẫu trắng: Mẫu + đệm + cơ chất + kit
Mỗi thử nghiệm được thực hiện trong ba lần. Phần trăm ức chế và giá trị IC50
được xác định. Mẫu đối chứng dương được thực hiện bằng thuốc acarbose.
Phản ứng ức chế sự thủy phân tinh bột của enzyme α-amylase bởi các mẫu thử
được thực hiện theo phương pháp của Manaharan [103] có hiệu chỉnh. Enzyme α-
amylase (Sigma Type IV-B) được hòa tan trong nước cất để cho nồng độ 2 U/ml. Các
hợp chất thử nghiệm đã được hòa tan với DMSO (10%) và được hòa tan thêm trong
dung dịch đệm photphat 20 mM ở pH 6,9. Thuốc thử là dung dịch chứa 30 g natri
kali tartrate tetrahydrat trong 100 ml dung dịch NaOH 2 M và 1 g 3,5-dinitrosalicylic
acid (DNSA). Hỗn hợp phản ứng gồm có: 80 μl mẫu thử ở các nồng độ khác nhau,
40 μl α-amylase được thêm vào và ủ trong 10 phút ở 37°C. Sau đó, 40 μl dung dịch
tinh bột (1%) được thêm vào và ủ trong 10 phút. Dừng phản ứng bằng cách thêm
thuốc thử 80 μl DNSA và dung dịch phản ứng được ủ trong bể nước 85-90°C trong
10 phút. Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh và hoạt tính của α-amylase được xác định
bằng cách đo độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 540 nm bằng máy Multiskan Sky.
Tất cả các phép đo đều được thực hiện trong ba lần. Mẫu đối chứng dương được thực
hiện bằng thuốc acarbose.
Tế bào Raw 264.7, 3T3-L1 được lấy từ tủ đông. Sau đó, tế bào được phân chia
từ 5 đến 7 ngày trong môi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) đã
được bổ sung cùng với 10% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 50 U/ml penicinin, 50 μg
streptomycin, và 5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol. 105 tế bào được chia vào đĩa 96 giếng,
59
ủ qua đêm và thay bằng môi trường không có huyết thanh vào sáng hôm sau. Riêng
đối với tế bào 3T3-L1 sau khi được hoạt hóa 2 ngày sẽ được bổ sung
0,5 mmol/l 3-isobutyl-1-metylxanthine (IBMX), 0,5 μg/ml dexamethasone, 5 μg/ml
insulin và 10% huyết thanh trong 3 ngày. Sau đó thay môi trường DMEM bổ sung
10% huyết thanh từ 7–14 ngày.
Ảnh hưởng của các hợp chất tinh sạch tới khả năng sống của tế bào được đánh
giá bằng sử dụng kít đếm tế bào (CellTiter 96 R Aqueous One Solution Cell
Proliferation Assay). RAW 264.7, 3T3-L1 được ủ cùng các hợp chất phân lập từ chè
dây và lá đắng với dải nồng độ nhất định sau 48 giờ. Sau quá trình này, 10 μl của
dung dịch kít được đưa vào các tế bào đã được ủ cùng với các hợp chất này trong 1
giờ. Khả năng hấp thụ của các mẫu này sẽ được đo ở bước sóng 450 nm bằng máy
đọc ELISA.
a. Phương pháp nuôi cấy tế bào và xử lý mẫu
Tế bào đại thực bào RAW 264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM với
thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1,0 mM sodium
pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) và nuôi trong tủ
ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2. Thêm vào các giếng thí nghiệm của đĩa 96 giếng
với lượng tế bào phù hợp (trong 190 μl môi trường) và ủ ở 37°C qua đêm cho tế bào
ổn định. Chất thử (10 µl) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng ở các nồng
độ khác nhau. Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào (190 µl)
và 10 µl DMSO sẽ được sử dụng làm đối chứng âm. Sau 2 giờ thêm LPS với nồng
độ 1 µg/ml vào tất cả các giếng thí nghiệm. Sau 24 giờ, thu dịch nổi nuôi tế bào đã
được thử chất để xác định sự có mặt của IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α có trong môi trường
nuôi cấy.
b. Phương pháp xác định IL- 6, IL-8, IL-10, TNF-α
Được thực hiện dựa trên IL-6, IL-8, IL-10 mouse ELISA Kit và TNF-α mouse
60
ELISA Kit (Promega) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Thêm 100 µl hợp chất
tinh sạch (môi trường nuôi cấy) vào các giếng thí nghiệm và 100 µl dung môi làm
đối chứng âm. Ủ bản ở 37°C trong 90 phút. Loại bỏ dịch nổi và thêm 100 µl kháng
thể IL-6/TNF-α gắn biotin vào các giếng thí nghiệm. Ủ bản ở 37°C trong 60 phút.
Rửa bản 5 lần bằng PBS 0,01 M, thêm 100 µl Avidin-Biotin-Peroxidase Complex
vào các giếng thí nghiệm. Ủ bản ở 37°C trong 30 phút. Rửa bản 5 lần bằng PBS 0,01
M, thêm 90 µl cơ chất TMB vào các giếng thí nghiệm. Ủ bản ở 37°C, tránh ánh sáng
trong 20-25 phút. Dừng phản ứng bằng 100 µl stop solution. Đọc kết quả ở bước sóng
450 nm.
Để hoạt hóa insulin bị bất hoạt, 3T3-L1 được xử lý cùng 50 ng/ml TNF-α trong
24 giờ. Sau đó, các tế bào được rửa bằng đệm (PBS) và đưa các nồng độ khác nhau
của các hợp chất tinh sạch ủ trong 24 giờ. Hỗn hợp phản ứng được rửa bằng PBS và
ủ với DMEM trong 3 h. Sau đó thêm 1 mg/ml bovine serum albumin (BSA) có chứa
100 mmol/l 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl) amino]-2-deoxy-glucose (2-
NBDG-glucose) và 100 nmol/l insulin ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ 37°C. Tiến hành đo
trên thiết bị đọc đĩa huỳnh quang ở bước sóng 485 nm và 535 nm.
Các tế bào 3T3-L1 được nuôi cấy và biệt hóa trong các đĩa 6 giếng. Các tế bào
đã được ủ với TNF-α để gây ra kháng insulin, như được mô tả trước đó, trước khi ủ
với các hợp chất tinh sạch. Tế bào sau đó được ủ với 200 µg/ml các hợp chất tinh
sạch và rosiglitazone trong 24 giờ. Các tế bào được kích thích bằng insulin trong 5
phút trước thu hoạch. Sau đó phá tế bào và phân tích Western blot. Trong phân tích
Western blot: sử dụng đệm ly giải được bổ sung với 1 mM phenylmethylsulfonyl
florua và 1% chất ức chế phosphatase. Protein được phân giải trên gel 8% SDS-
polyacrylamide và thấm qua đêm trên màng immobilon-P polyvinylidene
difluoride. Các protein không đặc hiệu được ngăn chặn bằng 5% BSA trong dung
dịch muối đệm Tris với 0,1% Tween trong 1 giờ và sau đó được ủ qua đêm với
61
kháng thể. Các kháng thể sau được sử dụng để thăm dò: kháng thể p-IRS1 và p-
Y20.
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành kết hợp các thực vật đã nghiên cứu
có hiệu quả trong điều trị ĐTĐ để tạo thành cao hỗn hợp có hiệu quả cao hơn trong
điều trị ĐTĐ. Các mẫu thực vật bao gồm chè dây, lá đắng, cỏ ngọt, chuối hột, lá đu
đủ, hạt đu đủ, dây thìa canh và giảo cổ lam, khi phối hợp các thực vật với nhau, mỗi
sản phẩm cho khuyết một thành phần theo tỷ lệ 1:1:1:1:1:1:1:1 nhằm chọn lọc một
cao hỗn hợp có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất. Thí nghiệm nghiên cứu tác dụng
hạ đường huyết của cao hỗn hợp bằng cách cho chuột nhắt ĐTĐ type 2 uống cao hỗn
hợp với liều 500 và 1000 mg/kg chuột/ngày:
Lô 1 (lô đối chứng, n = 10): Uống nước cất 10 ml/kg.
Lô 2 (lô thử, n = 10): Uống cao hỗn hợp.
Lô 3 (lô chứng dương, n = 10): Uống Pioglite 20 mg/kg
Đường huyết chuột lúc đói được đo tại các thời điểm 0 giờ, 2 ngày, 7 ngày, 14
ngày và 21 ngày.
Hàm lượng glycogen mô gan được xác định bằng phương pháp của Carroll et
al. [50].
Nguyên tắc: glycogen bị kết tủa bởi ethanol và được chiết ra từ dịch chiết mô,
sau đó bị thủy phân thành glucose trong acid sulfuric và thực hiện phản ứng lên màu
với thuốc thử anthrone.
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 1 gam mô gan tươi nghiền đồng nhất với 5ml
acid tricloacetic 7%. Sau đó ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ
tủa protein. Dịch trong thu được cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung acid
tricloacetic cho đủ thể tích, lắc đều. Lấy chính xác 1ml dịch trong vào ống ly tâm và
thêm 5 ml ethanol để kết tủa glycogen. Để kết tủa hoàn toàn glycogen, đặt trong tủ
điều nhiệt 37°C trong thời gian 3 giờ. Sau đó ly tâm trong 15 phút thu tủa glycogen.
62
Hòa tan tủa trong 2ml nước cất, thêm 10 ml thuốc thử anthrone, lắc đều đun sôi cách
thủy 15 phút, thu được dung dịch có màu xanh, tiến hành làm lạnh đến nhiệt độ phòng.
Đo quang ở bước sóng 620 nm.
Xác định liều LD50 theo tài liệu hướng dẫn [8]. Trước khi cho uống thuốc, chuột
bị bỏ đói trong 18 h. Nước cất và thuốc thử được đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng
kim cong đầu tù với lượng thuốc uống hằng định mỗi lần 0,3 ml/10 g cân nặng, uống
3 lần/24 giờ, mỗi lần cách nhau 2 giờ.
Thử nghiệm sơ bộ: Chọn 2 con chuột cho uống liều tối đa có thể cho uống,
quan sát chuột trong 72 giờ. Tìm liều cao nhất chuột không chết và liều thấp nhất
gây chết 100%.
- Trường hợp 1: Nếu không có chuột nào chết, tiếp tục thử nghiệm chính thức.
- Trường hợp 2: Nếu tất cả chuột tử vong thì giảm liều đến khi tìm được liều
làm 1 con sống 1 con chết thì lấy đó làm cơ sở tiếp tục cho các bước thử nghiệm xác
định theo tài liệu hướng dẫn.
Thử nghiệm chính thức:
- Các mức liều thử nghiệm: Chia ngẫu nhiên chuột thành 5 lô, mỗi lô 10 con.
Lô chứng uống nước cất, các lô thử uống thuốc với mức liều 9,6 g, 19,2 g, 28,8 g,
38,4 g thể trọng.
- Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết mỗi lô trong 72 giờ.
Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc. So
sánh với mẫu đối chứng, ghi nhận các biểu hiện lâm sàng và nhận xét kết quả.
a. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng dùng để kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất phân lập được.
Sắc kí lớp mỏng dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung
môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một là một lớp
mỏng các chất hấp phụ là silica gel. Pha động bao gồm thành phần khác nhau của hỗn
63
hợp mẫu cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên
bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các
thành phần trong dung dịch.
Sau khi chạy sắc ký, phát hiện các chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai
bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được
phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ trên bếp điện đến khi hiện màu.
b. Sắc ký cột
Nguyên tắc của sắc ký là dựa vào tính ái lực khác nhau của hỗn hợp nhiều loại
hợp chất đối với pha động và pha tĩnh, để từ đó tách những loại hợp chất đó ra riêng
thành từng loại đơn chất. Trong đó, pha tĩnh được nhồi vào một cột thủy tinh, pha
lỏng là dung môi dùng để chiết cho chảy qua cột. Mẫu được đưa vào một đầu của cột.
Các phần khác nhau của mẫu sẽ đi qua cột với tốc độ khác nhau, các phân tử có kích
thước nhỏ sẽ đi sâu vào mạng lưới của chất nhồi và bị giữ lâu trong cột, còn các phân
tử có kích thước lớn hơn sẽ chỉ thâm nhập ở mức độ nhất định, các phân tử có khối
lượng rất lớn sẽ không di chuyển được vào các mao quản. Kết quả là các phân tử
được giải ly khỏi cột theo thứ tự trọng lượng phân tử giảm dần [15].
a. Phổ khối lượng hay còn gọi là khối phổ (Mass Spectroscopy, MS)
Kỹ thuật phổ khối được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của
các hợp chất hữu cơ, đây là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác
khối lượng phân tử chất đó. Hợp chất cần nghiên cứu đầu tiên được chuyển thành
trạng thái hơi, sau đó được ion hóa bằng các phương pháp thích hợp. Ion phân tử hình
thành bởi phương pháp ion hóa va chạm điện tử (EI-MS) có năng lượng cao và có thể
bị bắn phá thành nhiều mảnh khác nhau. Mỗi một phân tử có cách phân mảnh riêng
và cần đặc biệt quan tâm đến các pic có hàm lượng lớn trong phổ đồ. Các ion tạo
thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích của máy khối phổ. Tùy theo
loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà người ta phân biệt máy khối phổ ion dương
hoặc ion âm.
b. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR- Nuclear Magnetic
64
Resonance)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và phổ biến nhất
hiện nay dùng để cung cấp rất nhiều thông tin về cấu trúc phân tử và từ đó để xác
định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự
cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường
ngoài. Tại vị trí mà một hạt nhân hấp thu năng lượng để có hiện tượng cộng hưởng
được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của
các phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin các hạt nhân từ với nhau (spin
coupling).
- Phổ đồ 1H-NMR: cho biết có bao nhiêu loại proton trong phân tử và cũng cho
biết mỗi loại proton đó có bao nhiêu nguyên tử H. Các loại hạt nhân khác nhau trong
một phân tử có độ dịch chuyển hóa học khác nhau là do mỗi loại hạt nhân được che
chắn khác nhau bởi các đám mây điện tử chung quanh. Dựa vào những đặc trưng của
độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác cặp đôi spin mà có thể xác định được cấu
trúc hóa học của các hợp chất.
- Phổ 13C-NMR: cho thông tin quan trọng về khung sườn cacbon của hợp chất
hữu cơ. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín
hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với
dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0-240 ppm). Khác với phổ proton 1H-
NMR, ở phổ 13C-NMR mỗi cacbon riêng biệt chỉ cho một tín hiệu mũi đơn duy nhất
và không có sự chẻ mũi như trong phổ 1H-NMR.
- Phổ DEPT: để xác định được các loại cacbon có trong phân tử hợp chất hữu
cơ, hiện nay người ta sử dụng kỹ thuật DEPT-NMR. Kỹ thuật DEPT-NMR được thực
hiện đồng thời trong cả hai kênh 1H và kênh 13C một loại những xung phức tạp đã
được chương trình hóa. Hệ quả của xung nầy là các cacbon có gắn một, hai hay ba
nguyên tử hidro sẽ được máy ghi thành những pha khác nhau. Để có được phổ này,
người ta thực hiện ba lần ghi phổ khác nhau, trong đó một lần gọi là DEPT-45, cacbon
nào có mang một hiđro sẽ xuất hiện một mũi trên phổ đồ. Ngay sau đó, một lần ghi
65
phổ thứ nhì gọi là DEP-90, chỉ có những cacbon loại metin >CH- mới xuất hiện trên
phổ đồ. Một lần ghi phổ thứ ba gọi là DEP-135, những cacbon metin >CH- và metyl
–CH3 sẽ xuất hiện trên phổ đồ những mũi dương (hướng lên trên), cacbon metylen –
CH2- sẽ cho mũi hướng về chiều ngược lại với mũi dương, cacbon tứ cấp >C< do không
mang hiđro nên không xuất hiện trong phổ DEPT-NMR.
Đối với các hợp chất hữu cơ có cấu trúc đơn giản, chỉ cần phân tích phổ 1H-
NMR, 13CNMR và DEPT-NMR là hoàn toàn có thể xác định được. Tuy nhiên, đối
với các hợp chất có cấu trúc phức tạp thì nếu chỉ sử dụng phổ 1H-NMR và 13C-NMR
một chiều sẽ rất khó để giải đoán các tín hiệu cộng hưởng và xác định chính xác cấu
trúc hóa học. Khi đó việc sử dụng phổ NMR hai chiều để giải đoán phổ sẽ dễ dàng
hơn. Hiện nay có nhiều loại phổ NMR hai chiều, một số loại được sử dụng phổ biến
là: HMQC, 1H-1H COSY; HMBC.
+ Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): các tương tác trực
tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này.
+ Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu
diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử, cho thông tin về tương quan hai, ba
và đôi khi bốn nối giữa proton và cacbon.
+ Phổ 1H-1H COSY (1H- 1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): phổ này
cho thông tin về các tương tác H-H, chủ yếu của các proton đính với cacbon liền kề
nhau. Nhờ vào phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau [16].
Kết quả được biểu diễn dưới dạng XTB ± SE (XTB: giá trị trung bình của từng
lô, SE: sai số chuẩn). Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS (Version 22) với test thống
kê paired samples T-Test để so sánh sự khác nhau giữa hai nhóm và test thống kê
ANOVA để so sánh sự khác biệt giữa các thời điểm khác nhau trong cùng một nhóm
và giữa các nhóm tại cùng thời điểm. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi p > 0,05.
66
Sau khi tham khảo tài liệu trong và ngoài nước cũng như kinh nghiệm dân gian,
chúng tôi đã quyết định chọn ra các mẫu thực vật được dự đoán là có khả năng hạ
đường huyết để làm đối tượng nghiên cứu. Kết quả tách chiết mẫu thực vật được trình
bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả tách chiết các mẫu thực vật
Khối lượng mẫu Khối lượng cao Phần trăm hàm STT Mẫu thực vật khô (g) (g) lượng cao (%)
1 Chè dây 250 65 26,00
2 Cao vằng 320 73 22,81
3 Lá nếp 400 62 15,50
4 Quả chuối hột 287 58 20,21
5 Tầm bóp 310 56 18,06
6 Lá đu đủ 345 82 23,77
7 Hạt đu đủ 400 37 9,25
8 Quả sung 395 54 13,67
9 Ké đầu ngựa 338 64 18,93
10 Nở ngày đất 365 59 16,16
11 Râu bắp 390 60 15,38
12 Lá đắng 400 48 12,00
13 Lá sa kê 345 52 15,07
14 Giảo cổ lam 367 57 15,53
15 Dây thìa canh 380 93 24,47
16 Lá sen 348 82 23,56
17 Lá lược vàng 400 45 11,25
18 Quế 387 52 13,44
19 Lá húng quế 393 73 18,58
20 Cây cỏ ngọt 355 59 16,62
67
Các mẫu tươi như lá đắng, lá nếp, lá đu đủ, hạt đu đủ, quả sung, râu bắp, lá sa kê,
lá sen, lá lược vàng, lá húng quế, quả chuối hột, tầm bóp chúng tôi thu thập khoảng 2
kg/mẫu, đối với các mẫu khô chúng tôi thu thập khoảng 300 g/mẫu, các mẫu được sấy
ở 60°C và được xay nhỏ và ngâm với cồn 70°. Quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết
được tiến hành trong thiết bị cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60°C.
Qua bảng 3.1 cho thấy các mẫu thực vật khác nhau cho phần trăm hàm lượng
cao khác nhau. Lá chè dây và dây thìa canh cho phần trăm hàm lượng cao khá cao
tương ứng là 26,00% và 24,47%. Lược vàng và hạt đu đủ có phần trăm hàm lượng
cao tương đối thấp lần lượt là và 11,25% và 9,25%.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cồn 70° để tiến hành chiết xuất các
mẫu thực vật là do một số nguyên nhân sau:
- Trong dân gian thường ngâm chiết các thảo dược trong cồn.
- Cồn và nước là môi trường dễ dàng hòa tan các hợp chất sinh hoc.
- Độc tính đối với người sử dụng tương đối thấp.
- Giá cả và nguồn cung cấp hoàn toàn phù hợp.
Sau 8 tuần chuột ở nhóm nuôi béo (HFD) đã thể hiện sự khác biệt rõ rệt về
trọng lượng so với nhóm đối chứng (ND), kết quả được thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Trọng lượng của chuột sau 8 tuần nuôi
Thời gian Tuần 0 Tuần 8 Độ tăng (%) Nhóm
HFĐ 20,69 ± 0,36 60,42 ± 1,03*# 192,03
ND 21,31 ± 0,39 38,95 ± 0,68* 82,78
Ghi chú: *p < 0,01 (p so với thời điểm trước khi ăn béo của cùng nhóm), #p <
0,01 (p so với nhóm ND ở cùng thời điểm khảo sát)
Qua bảng số liệu có thể thấy sự thay đổi trọng lượng cơ thể chuột sau 8 tuần nuôi,
chúng tôi nhận thấy đối với nhóm chuột được nuôi với chế độ ăn giàu chất béo (HFD)
có trọng lượng trung bình là 60,42 g, trọng lượng cơ thể chuột tăng lên gấp 3 lần so
với ban đầu (20,69 g) và tăng gần gấp đôi so với nhóm chuột ăn thức ăn tiêu chuẩn
68
(ND) ở cùng thời điểm (38,95 g). Sự khác biệt là có ý nghĩa thống kê trong cùng
nhóm chuột ở thời điểm khác nhau, giữa nhóm HFD và ND vào thời điểm tuần thứ
8 (p < 0,01). Điều đó cho thấy chế độ dinh dưỡng đã ảnh hưởng rất lớn đến trọng
lượng của chuột và chúng tôi đã bước đầu thành công trong việc gây chuột nhắt béo
phì.
A. Chuột ND; B. Chuột HFD
Hình 3.1. Chuột sau 8 tuần nuôi
Rối loạn lipid máu là một trong những nguyên nhân chính gây nên tình trạng
kháng insulin, tế bào β của đảo tụy tăng tiết insulin, làm suy giảm chức năng của
tuyến tụy gây nên bệnh tiền ĐTĐ và ĐTĐ type 2 [114].
Vào thời điểm tuần thứ 8, chúng tôi chọn ngẫu nhiên ở mỗi nhóm 8 con chuột,
cho nhịn đói 12 giờ, sau đó lấy máu làm xét nghiệm xác định các chỉ số mỡ máu:
cholesterol toàn phần và triglyceride. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Sự khác biệt về các chỉ số mỡ máu chuột ở nhóm ND và HFD
Nhóm chuột ND (mmol/l) HFD (mmol/l) Chỉ số Độ tăng (%) của HFD so với ND
Cholesterol toàn phần 2,11 ± 0,14 4,10 ± 0,05* 94,31
Triglyceride 1,28 ± 0,14 3,33 ± 0,24* 160,16
Ghi chú: * p < 0,01 (p so với nhóm ND ở cùng thời điểm)
Kết quả ghi nhận ở bảng 3.3 cho thấy, các chỉ số mỡ máu của lô chuột HFD tăng
69
cao đáng kể và có ý nghĩa thống kê khi so với lô chuột ND (p < 0,01). Chỉ số cholesterol
toàn phần của nhóm HFD tăng cao (94,31%). Tương tự, chỉ số triglyceride của nhóm
HFD tăng mạnh với mức tăng là 160,16%. Như vậy, có thể kết luận với chế độ ăn giàu
chất béo đã ảnh hưởng lớn đến các chỉ số mỡ máu của nhóm chuột HFD.
Sau 8 tuần, các lô chuột được tiêm STZ liều duy nhất 120 mg/kg thể trọng.
Nồng độ glucose huyết của các lô chuột được đo ở các thời điểm 0 giờ, 48 giờ, 72
giờ, 7 ngày, 10 ngày và kết quả được thể hiện trong hình 3.2 dưới đây.
*#
*#
*
*
ND + Đệm
*
ND + STZ
*
HFD + Đệm
** **
HFD + STZ
Hình 3.2. Sự thay đổi nồng độ đường huyết của các lô chuột ở các thời điểm
khác nhau
Ghi chú: *p < 0,01 (p so với nhóm tiêm đệm ở cùng thời điểm)
#p < 0,01 (p so với nhóm ND + STZ ở cùng thời điểm)
**p < 0,05 (p so với nhóm ND + đệm)
Qua hình 3.2 ta có thể thấy rằng ở tại thời điểm 0 giờ, nồng độ đường huyết của
nhóm chuột HFD + đệm cao hơn so với nhóm chuột ND + đệm, cụ thể là:
6,55 mmol/l và 5,48 mmol/l, sự khác biệt này hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với
p < 0,05. Sau 10 ngày tiêm, ở lô ND + đệm và HFD + đệm không có sự thay đổi đáng
kể về nồng độ đường huyết ở cùng một nhóm qua các thời điểm (p> 0,05). Ở lô ND
+ STZ sau khi tiêm, nồng độ đường huyết tăng và đạt cao nhất ở thời điểm 72 h (13,72
mmol/l), sau đó giảm dần ở ngày thứ 7 và 10, tương ứng là 8,18 và
7,20 mmol/l. Trong khi đó nồng độ đường huyết ở lô HFD + STZ ở các thời điểm
70
tương ứng là rất cao, chuột HFD sau khi tiêm STZ lần lượt là: 18,14; 20,49 và
22,00 mmol/l, sự khác biệt này hoàn toàn có ý nghĩa thống kê khi so sánh với nhóm
chuột ND + STZ ở cùng thời điểm (p < 0,01). Như vậy, nhóm HFD + STZ ở thời
điểm 10 ngày đã có biểu hiện của bệnh ĐTĐ khi so sánh với nhóm chuột không bị
ĐTĐ còn lại (ND + đệm, ND + STZ và HFD + đệm) sự khác biệt này hoàn toàn có ý
nghĩa thống kê (p < 0,01).
Như vậy, chúng tôi đã thành công trong việc gây chuột béo ĐTĐ sau khi tiêm
STZ với liều 120 mg/kg thể trọng (HFD + STZ). Để giải thích cho việc nhóm chuột
ND + STZ sau khi tiêm STZ đã không bị ĐTĐ, chúng tôi cho rằng với liều tiêm 120
mg/kg thể trọng là chưa đủ để gây ĐTĐ cho nhóm chuột ND + STZ vì giống chuột
này có mức độ nhạy cảm với STZ là thấp hơn nhiều so với các giống chuột khác [64].
Trong nghiên cứu này, sau 48 h chuột ND + STZ bị ĐTĐ là do STZ đã làm phá hủy
các tế bào β tuyến tụy, insulin tiết không đủ đáp ứng nhu cầu của cơ thể làm hệ thống
điều hòa đường huyết bị rối loạn, đường huyết tăng cao ở nhóm chuột ND + STZ, tuy
nhiên nhóm chuột ND + STZ sau đó có khả năng tự phục hồi và dần tăng tiết insulin,
hệ thống thăng bằng đường huyết hoạt động có hiệu quả trở lại, mức đường huyết trở
về gần mức bình thường. Trong khi đó, nhóm chuột HFD + STZ với chế độ ăn giàu
chất béo trong thời gian dài là một trong những nguyên nhân chính gây nên tình trạng
kháng insulin, kết hợp với việc tiêm STZ làm cho tế bào β của đảo tụy bị tổn thương
nên đường huyết của nhóm chuột này luôn ở mức cao và duy trì ổn định qua các thời
điểm khác nhau.
* Kết quả định lượng insulin huyết tương
Bên cạnh đo nồng độ đường huyết của chuột nhắt béo phì, để xác định chuột nhắt
béo phì có bị bệnh ĐTĐ type 2 cần phải định lượng insulin trong máu chuột nhắt béo sau
khi tiêm STZ. Nồng độ insulin được xác định thông qua đường chuẩn insulin hình 2.6.
Kết quả nồng độ insulin huyết tương của các lô chuột được trình bày trong hình 3.3.
71
Hình 3.3. Nồng độ insulin huyết tương của các lô chuột khác nhau
Dựa vào hình 3.3. chúng tôi nhận thấy rằng chuột HFD + STZ có nồng độ insulin
ở mức bình thường (18,84 µIU/ml) so với các lô chuột đối chứng ND, ND + STZ và
HFD (21,10; 27,32 và 27,53 µIU/ml ), sự khác biệt hoàn toàn không có ý nghĩa thống
kê với p > 0,05. Như vậy, tuy nhóm chuột HFD + STZ có nồng độ đường huyết cao
(22,00 mmol/l) nhưng nồng độ insulin vẫn duy trì ở mức bình thường, điều này cho
thấy nhóm chuột HFD + STZ có thể là nhóm chuột ĐTĐ type 2. Theo Sawant và
cộng sự các con chuột có nồng độ đường huyết ≥ 300 mg/dl và nồng độ insulin nằm
trong khoảng 12,41 - 49,65 µIU/ml được xem là chuột ĐTĐ type 2 [137]. Nếu xét
theo điều kiện trên, chúng tôi đã gây được 18/20 con chuột ĐTĐ type 2. Tỷ lệ gây
chuột ĐTĐ type 2 là 90%, tương đương với tỷ lệ của tác giả Sawant và cộng sự. Vậy
chúng tôi đã ứng dụng thành công mô hình này.
Nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống có khả năng đánh giá sử dụng
glucose. Nghiệm pháp này được sử dụng để chẩn đoán tiền ĐTĐ và bệnh ĐTĐ.
Chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng dung nạp glucose của các lô chuột vào thời
điểm ngày thứ 10 sau khi tiêm STZ. Kết quả được trình bày ở hình 3.4.
72
Hình 3.4. Khả năng dung nạp glucose của các lô chuột
Ghi chú: * p < 0,05 (p so với thời điểm trước khi uống đường của cùng nhóm)
Tại thời điểm 1 giờ sau khi uống dung dịch đường glucose, đường huyết của
tất cả các nhóm đều tăng, tăng nhiều nhất là nhóm chuột ĐTĐ type 2 (29,24 mmol/l),
sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê khi so với thời điểm 0 h trong cùng một nhóm.
Sau 2 giờ, đường huyết của nhóm chuột ĐTĐ type 2 (HFD + STZ) vẫn duy trì ở mức
cao (28,04 mmol/l) so với thời điểm 0 giờ, và không sự khác biệt so với thời điểm 1
giờ. Trong khi đó đường huyết của các nhóm chuột còn lại gần như đã quay về mức
đường huyết lúc ban đầu (p > 0,05). Như vậy có thể kết luận khả năng dung nạp
glucose của chuột ĐTĐ type 2 là giảm so với 3 lô đối chứng còn lại.
Kết quả thực nghiệm được đánh giá thông qua sự thay đổi nồng độ đường huyết
của chuột ĐTĐ type 2 uống cao chiết mẫu thử với liều 500 mg/kg/ngày so sánh với
lô đối chứng là chuột ĐTĐ type 2 cho uống nước cất, thể hiện ở hình 3.5.
73
Hình 3.5. Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị
bằng cao chiết thực vật
Ghi chú:* p < 0,05; ** p < 0,01 (p so với lô đối chứng cùng thời điểm)
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, cao chiết chè dây và cao chiết quả chuối hột
làm giảm nồng độ đường huyết đáng kể ở thời điểm ngày thứ 21 khi so với nhóm đối
chứng (p ≤ 0,01). Trong đó chuột uống cao chiết mẫu chè dây và quả chuối hột đường
huyết giảm lần lượt là 56,60% và 45,84%. Cụ thể nồng độ đường huyết của nhóm
chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao chiết lá chè dây giảm từ 20,14 xuống còn 8,74
mmol/l và củ chuối hột từ 21,16 xuống còn 11,73 mmol/l. Như vậy, sau khi chuột
ĐTĐ cho uống lá chè dây và quả chuối hột nồng độ đường huyết đã giảm đáng kể
tuy chưa thể về mức bình thường (khoảng 5,5-6 mmo/l).
Trong nhân dân, người ta thường dùng chuối hột chữa được nhiều bệnh như sỏi
thận, hắc lào, sốt cao và dùng để điều trị bệnh ĐTĐ. Nhóm tác giả Đỗ Quốc Việt đã
nghiên cứu sơ bộ tác dụng hạ đường huyết của quả chuối hột trên chuột ĐTĐ, kết
quả cho thấy hoạt chất cyclomusalenon tách chiết bằng cồn với liều tiêm 300 mg/kg
thể hiện hoạt tính hạ đường huyết tới 55% [24]. Trên thế giới, các nghiên cứu trước
đây đã chứng minh hoạt tính chống tăng đường huyết của vỏ các loài chuối hột khác
nhau [110]. Borah và cộng sự đã chứng minh rằng trong khi uống cao chiết bằng
cồn từ hoa và bắp chuối của M. balbisiana (250 mg/kg) trong 2 tuần làm giảm đáng
kể lượng đường trong máu (giảm 56,77 và 51,94%) [46].
74
Không có nghiên cứu nào trước đây ở Việt Nam và trên thế giới chứng minh
về tác dụng của chè dây trong việc điều trị cho bệnh ĐTĐ. Các nghiên cứu trước
đây cho thấy rằng, chè dây là nguồn thực vật giàu flavonoid và nhóm các hợp chất
này được xem là có lợi trong điều trị ĐTĐ [165]. Nghiên cứu của nhóm tác giả
Phạm Thanh Kỳ đã xác định được các hoạt chất: myricetine và dihydromyricetin
cũng như chứng minh tác dụng chống oxy hóa và điều trị viêm loét dạ dày tá tràng
của chè dây [13]. Các nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng chè dây có tác dụng chống
viêm, gây độc tế bào ung thư [146], [144].
Đối với các mẫu thực vật khác, cao chiết quả tầm bóp cho thấy tác dụng hạ
đường huyết so với nhóm đối chứng tuy nhiên chưa cao, chuột sau 21 ngày điều trị
có nồng độ đường huyết còn khá cao (16,49 mmol/l) (p < 0,05). Các mẫu thực vật
còn lại là lá nếp và chè vằng không có tác dụng hạ đường huyết khi so sánh với mẫu
đối chứng (p > 0,05).
Hình 3.6. Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị
bằng cao chiết thực vật
Ghi chú: * p <0,05; ** p < 0,01 (p so với lô đối chứng cùng thời điểm)
Từ hình 3.6 có thể thấy, chuột bị bệnh ĐTĐ type 2 ở lô đối chứng chỉ cho uống
nước cất thì sau 21 ngày nồng độ đường huyết không giảm, thậm chí còn tăng. Trong
số 5 mẫu cao chiết thực vật khác nhau được thử nghiệm khả năng hạ đường huyết chỉ
có mẫu cao lá đu đủ, hạt đu đủ vào cao quả sung thể hiện hoạt tính hạ đường huyết,
75
trong đó cao lá đu đủ và hạt đu đủ thể hiện hoạt tính tốt nhất: chuột uống cao lá đu
đủ đường huyết tại thời điểm ngày thứ 21 giảm 47,62%, chuột uống cao hạt đu đủ
giảm 53,18% so với thời điểm 0 h.
Ở Việt Nam chưa có các nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của lá và hạt đu
đủ (Carica papaya) trên mô hình chuột ĐTĐ thực nghiệm. Trong khi đó, Juárez-Rojop
và cộng sự đã chỉ ra rằng cao chiết nước của đu đủ (0,75 và 1,5 g/100 ml) làm giảm đáng
kể lượng đường trong máu, nó cũng làm giảm nồng độ cholesterol, triacylglycerol, có
thể giúp tái tạo tiểu đảo tuỵ và ngăn chặn sự tích tụ glycogen và chất béo [91].
Đối với cao chiết ké đầu ngựa không có tác dụng hạ đường huyết, thậm chí nồng
độ đường huyết còn cao hơn so với thời điểm ban đầu. Đặc biệt đối với nhóm cho
uống cao chiết nở ngày đất chuột bị chết dần ở thời điểm 8 ngày, do chuột chán ăn và
đi kèm các biến chứng nặng nề khác.
Với 5 mẫu nghiên cứu tiếp theo chúng tôi đã nhận thấy rằng khả năng hạ đường
huyết đáng kể của cao chiết lá dây thìa canh, thân và lá cỏ ngọt (p < 0,01). Chuột
uống dây thìa canh đường huyết giảm 61,08%, chuột uống cỏ ngọt đường huyết giảm
54,93%. Tác dụng hạ đường huyết của hai mẫu thực vật này là khá tốt, chuột sau khi
được điều trị hoàn toàn khỏe mạnh, tăng cân.
Hình 3.7. Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị
bằng cao chiết thực vật
Ghi chú: * p < 0,01 (p so với lô đối chứng ở cùng thời điểm)
Dây thìa canh được đã được nghiên cứu về hoạt tính hạ đường huyết cả trong
76
nước và trên thế giới [19], [32]. Nhóm nghiên cứu Trần Văn Ơn đã sử dụng chuột
bình thường và chuột tăng đường huyết bởi STZ để cho uống dịch chiết thìa canh
trong một thời gian ngắn (tính theo giờ), trong khi đó, chúng tôi đã thử nghiệm trên
chuột nhắt ĐTĐ type 2, trong 21 ngày và thấy rằng cao chiết dây thìa canh có tác
dụng hạ đường huyết ổn định trong thời gian đã nghiên cứu. Ở Việt Nam hiện nay
dây thìa canh được sử dụng như một loại thực phẩm chức năng được sử dụng trong
việc hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ. Hơn nữa, các tác giả trên thế giới đã nghiên cứu tương
đối đầy đủ cả về hoạt tính hạ đường huyết, thành phần hóa học cũng như cơ chế tác
dụng của dây thìa canh như ức chế hấp thu glucose qua thành ruột, giảm đáng kể hàm
lượng cholesterol và triglyceride, kích thích tiết insulin đảo tụy in vitro và in vivo
[32], [68]. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cỏ ngọt ở Việt Nam còn rất hạn
chế, tuy nhiên có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới chứng minh được hoạt tính sinh
học cũng như thành phần hoá học của cỏ ngọt. Shivanna và cộng sự đã chỉ ra rằng cỏ
ngọt có khả năng làm giảm nồng độ đường huyết (66,09%) và glycohemoglobin
(5,32%) đáng kể, trong khi insulin (17,82 μIU/ml) và mức glycogen gan (45,02 mg/g)
được cải thiện đáng kể ở chuột ĐTĐ [140]. Ba steviol glycoside, stevioside,
rebaudioside A và rebaudioside C đã được phân lập và xác định cấu trúc từ cao chiết
lá của cỏ ngọt. Từ đó tìm hiểu về cơ chế hạ đường huyết của chúng, cho thấy steviol
glycoside có đặc tính hoạt động bắt chước insulin và chống oxy hóa, điều này đã
khẳng định vai trò có lợi của chúng trong việc điều trị bệnh ĐTĐ và trong việc duy
trì sức khỏe [81], [124].
Các kết quả trình bày trong hình 3.8 cho thấy khả năng hạ đường huyết của các
5 mẫu thực vật trong đợt sàng lọc cuối cùng.
77
Hình 3.8. Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị
bằng cao chiết thực vật
Ghi chú: * p < 0,01 (p so với lô đối chứng ở cùng thời điểm)
Trong số 5 mẫu cao chiết đem sàng lọc chỉ có mẫu cao chiết giảo cổ lam và lá
đắng cho thấy khả năng hạ đường huyết đáng kể ở chuột ĐTĐ type 2. Chuột sau khi
uống giảo cổ lam đường huyết giảm 58,86% và lá đắng giảm 56,21%. Trong khi đó
chuột uống cao chiết lá sen có tác dụng thay đổi nồng độ đường huyết nhưng không
ổn định, mang tính ngẫu nhiên không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Lược vàng và
lá sa kê không có khả năng hạ đường huyết thậm chí đường huyết còn tăng so với
thời điểm ban đầu.
Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu về khả năng hạ đường huyết của lá đắng trên
mô hình chuột ĐTĐ type 2 được thực hiện lần đầu tiên. Kết quả nghiên cứu của chúng
tôi về hoạt tính hạ đường huyết của cao chiết lá đắng là hoàn toàn phù hợp với các
nghiên cứu trước đó trên của các tác giả trên thế giới [35]. Nhóm tác giả Asante đã
chứng minh rằng cao chiết cồn của lá đắng làm giảm đáng kể nồng độ đường huyết
ở chuột bị ĐTĐ, hơn nữa phân tích mô bệnh học cho thấy cao chiết có hiệu quả cải
thiện của những bệnh lý gây ra bởi STZ trong tuyến tụy và gan. Đáng kể nhất là sự
tái sinh của các tế bào β của các đảo tụy ở chuột ĐTĐ được điều trị [35]. Các nghiên
cứu khác cũng cho rằng coumarin, flavonid, lactones sesquiterpen, edotide là các chất
tạo ra khả năng chống ung thư của lá đắng, cao chiết chloroform của lá đắng có tác
dụng chống ung thư mạnh. Flavonoid được biết đến là chất chống oxy hoá tốt và
78
luteolin (một flavonoid được tìm thấy trong lá đắng) đã được báo cáo là một chất
chống oxy hoá [85].
Một nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng cao chiết ethanol của giảo cổ lam
ức chế hoạt động của protein tyrosine phosphatase 1B (PTP-1B), có thể tăng cường
độ nhạy insulin và do đó cải thiện dung nạp glucose [104]. Ngoài ra, giảo cổ lam đã
cho thấy giảm cả tăng đường huyết và tăng lipid máu ở chuột béo phì Zucker [104].
Các phần phân đoạn saponin thu được từ giảo cổ lam giảm đáng kể nồng độ đường
huyết ở chuột ĐTĐ, phanoside được phân lập từ giảo cổ lam kích thích sự giải phóng
insulin từ các đảo tụy [83]. Ngoài ra cao chiết của giảo cổ lam trong nghiên cứu lâm
sàng gần đây đã được chứng minh như là một một nguồn thảo dược an toàn và hiệu
quả chống lại bệnh ĐTĐ ở những bệnh nhân ĐTĐ type 2 mới được chẩn đoán và có
độ nhạy insulin cao [104]. Bên cạnh đó các gypenoside từ giảo cổ lam cải thiện sự
chuyển hóa lipid và có lợi trong điều trị các khối u [83].
Như vậy, trong quá trình sàng lọc 20 mẫu thực vật chúng tôi nhận thấy rằng có
8 mẫu thực vật cho kết quả hạ đường huyết tốt trên mô hình chuột ĐTĐ type 2:
- Lá chè dây - Quả chuối hột
- Hạt đu đủ - Lá đu đủ
- Lá dây thìa canh - Lá và thân cỏ ngọt
- Giảo cổ lam - Lá đắng
Tuy nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 uống 8 mẫu cao chiết thực vật
này chưa về lại so với mức bình thường, nhưng với mức đường huyết ban đầu của
chuột khá cao (thường trên 16 mmol/l, có trường hợp chuột nhắt ĐTĐ type 2 có nồng
độ đường huyết 31 mmol/l) thì kết quả thu được hoàn toàn hợp lý.
Qua điều tra, mẫu lá chè dây và lá đắng là hai trong số 8 mẫu thực vật có hoạt tính
hạ đường huyết. Qua tham khảo tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nước về hai mẫu thực
vật này là chưa được nghiên cứu ở Việt Nam, riêng đối với chè dây là chưa có bất kì
nghiên cứu nào trên thế giới về hoạt tính hạ đường huyết vì vậy chúng tôi quyết định
chọn chúng cho các nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính chống ĐTĐ:
- Ảnh hưởng của của cao chiết chè dây và lá đắng lên kết quả mô bệnh học của
tụy và gan.
79
- Hiệu quả hạ đường huyết của các cao chiết phân đoạn.
- Phân lập và xác định cấu trúc các hợp tinh sạch từ các cao chiết phân đoạn có
hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất.
- Nghiên cứu hiệu quả ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các hợp
chất tinh sạch.
- Nghiên cứu hiệu quả ảnh hưởng của các hợp chất tinh sạch đến quá trình sinh
các cytokine tiền viêm (TNF-α, IL-6, IL-8), cytokine kháng viêm (IL-10) và tác dụng
khôi phục biểu hiện hai protein pIRS-1 và pY20 của tế bào.
Để kiểm tra ảnh hưởng của cao chiết chè dây đến tình trạng cấu trúc mô tụy của
chuột, chúng tôi tiến hành đánh giá đại thể tiêu bản mô bệnh học của chuột ĐTĐ type
2 ở các lô thí nghiệm sau khi cho uống 500 mg/kg chè dây và lá đắng, kết quả được
trình bày ở hình 3.9.
Hình 3.9. Ảnh vi thể tiêu bản đúc cắt tụy của chuột (vật kính 400)
A. Tụy chuột bình thường; B. Tụy chuột bị ĐTĐ type 2 cho uống nước cất; C.
Tụy của chuột bị ĐTĐ sau khi cho uống cao chiết lá chè dây; D. Tụy của chuột bị
ĐTĐ sau khi uống cao chiết lá đắng.
80
Nhìn vào tiêu bản tụy hình 3.9 có thể thấy, ở chuột bình thường (A), mật độ tiểu
đảo tụy bình thường, hình thái bình thường. Các tế bào tiểu đảo tụy có hình thái và
kích thước bình thường, phân bố đồng đều không thấy dấu hiệu tổn thương. Chuột
ĐTĐ type 2 uống nước cất (B), tụy bị tổn thương, mật độ tiểu đảo tụy giảm, tiểu đảo
tụy biến dạng, thoái hoá và giảm về kích thước. So sánh với chuột ĐTĐ cho uống cao
chiết chè dây và lá đắng, chúng tôi quan sát thấy mật độ và kích thước tiểu đảo tụy
giảm hơn so với bình thường nhưng tiểu đảo tụy có sự phục hồi, không bị biến dạng
teo lại (C, D).
Chúng tôi tiến hành đánh giá đại thể tiêu bản mô bệnh học của gan chuột ĐTĐ
type 2 ở các lô thí nghiệm sau khi cho uống 500 mg/kg cao chiết chè dây và lá đắng,
kết quả được trình bày ở hình 3.10.
Hình 3.10. Ảnh vi thể tiêu bản đúc cắt gan của chuột (vật kính 400)
A. Gan chuột bình thường; B. Gan chuột ĐTĐ type 2 uống nước cất; C. Gan chuột
ĐTĐ type 2 uống cao chiết lá chè dây; D. Gan chuột ĐTĐ type 2 uống cao chiết lá đắng.
81
Tế bào gan chuột bình thường (A) có hình khối đa diện bao bọc bởi màng tế
bào, ở giữa là nhân. Nhân được bao bọc bởi màng nhân, phân biệt rõ với phần tế bào
chất bao quanh nhân. Trong nhân thường có 1-2 hạch nhân to tròn, bắt màu xanh. Tế
bào chất, bắt màu eosin tương đối đều nhau nên toàn bộ các tế bào gan đều có màu
hồng nhạt. Số lượng các tế bào gan có một nhân, chiếm số đông, ít khi gặp các tế bào
gan có hai nhân. Các tế bào gan thuộc mỗi bè Remak xếp sít nhau. Chuột bị bệnh
ĐTĐ type 2 cho uống nước cất (B), các tế bào gan có biểu hiện thoái hóa, tạo thành
các đám hỗn độn với nhiều hình dạng khác nhau, các tế bào biến dạng méo mó rời
rác, một số tế bào có nhân và tế bào chất bắt màu đậm hơn, dây tế bào gan bị biến
dạng trầm trọng. Như vậy, việc tiêm thuốc STZ sau một thời gian đã làm tổn thương
tế bào gan trầm trọng. Chuột bị bệnh ĐTĐ type 2 được điều trị bằng cao chiết chè
dây và lá đắng (C, D), hình dạng và kích thước của tế bào và nhân tế bào không bị
biến dạng, các tế bào gan vẫn thấy nhân nằm ở trung tâm tế bào, nhân tế bào bắt màu
bình thường, dây tế bào gan ít bị biến dạng. Các tế bào gan của chuột ĐTĐ type 2
uống cao chiết ít bị tổn thương hơn so với tế bào gan ở lô chuột ĐTĐ type 2 đối chứng
và khôi phục gần giống với tiêu bản gan chuột bình thường.
Tách chiết các cao chiết phân đoạn của chè dây theo quy trình hình 2.3, chúng
tôi sử dụng 2 kg bột khô lá chè dây, chiết bằng cồn 70° cho đến kiệt trong 2 tuần, thu
được cao cồn (CC), sau đó tách chiết phân đoạn ở các dung môi có độ phân cực khác
nhau thu các cao phân đoạn n-hexan, EtOAc, n-BuOH. Kết quả tách chiết được trình
bày trên bảng 3.4.
Bảng 3.4. Phần trăm hàm lượng cao của các cao chiết phân đoạn lá chè dây
Bột khô CC CHe CEtOAc CBuOH
Khối lượng (g) 2.000 446 37 180 33
Phần trăm hàm lượng cao (%) 8,30 40,36 7,4
82
Trong các phân đoạn chè dây, CEtOAc chiếm tỷ lệ lớn nhất (40,36%), sau
đó là CHe (8,30%) và ít nhất là CBuOH (7,4%). Chuột ĐTĐ type 2 cho uống các
cao chiết phân đoạn chè dây với liều 500 mg/kg ở các thời điểm khác nhau là 0 giờ,
3 ngày, 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày. Kết quả nồng độ đường huyết được thể hiện
trên bảng 3.5.
Bảng 3.5. Nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống cao chiết phân
đoạn lá chè dây
Nồng độ đường huyết (mmol/l)
Lô (n = 10)
Ngày 0 Ngày 3 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21
Đối chứng 22,69 ± 1,18 23,53 ± 0,87 22,74 ± 2,58 24,83 ± 2,79 30,49 ± 0,66
CHe 24,03 ± 1,22 24,80 ± 0,10 22,31 ± 2,61 21,55 ± 2,50 24,90 ± 1,37
CEtOAc 24,65 ± 1,03 22,92 ± 1,00 19,67 ± 1,25** 13,70 ± 0,85**# 9,07 ± 0,48**#
CBuOH 25,18 ± 1,26 23,91 ± 1,05 21,97 ± 1,25* 18,09 ± 0,70** 13,76 ± 0,55** #
Ghi chú: số chuột trong mỗi nghiệm thức 10, *p < 0,05, **p < 0,01 ( p so với
thời điểm trước khi điều trị của cùng nhóm); #p <0,01 (p so với lô chứng bệnh ở cùng
thời điểm khảo sát)
Trước thời điểm 7 ngày, chuột uống CHe, CEtOAc và CBuOH có nồng độ
đường huyết có sự khác biệt nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Từ ngày
thứ 7, CEtOAc thể hiện hoạt tính hạ đường huyết có ý nghĩa thống kê so với thời
điểm trước khi điều trị trong cùng một nhóm và hoạt tính hạ đường huyết là tốt nhất
tại ở ngày thứ 21 (p < 0,01). CBuOH có tác dụng hạ đường huyết bắt đầu ở ngày
thứ 7 khi so với thời điểm trước khi điều trị trong cùng một nhóm (p < 0,05) và cao
nhất vào ngày thứ 21 (p < 0,01). Riêng đối với CHe không có tác dụng hạ đường
huyết, chuột uống cao chiết sau 21 ngày nồng độ đường huyết không hề thay đổi (p
> 0,05).
Có thể thấy CEtOAc chiếm tỷ lệ cao nhất trong quá trình tách chiết đồng thời
83
cũng thể hiện hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất. Sau 21 ngày uống cao chiết, nồng độ
đường huyết trung bình của chuột giảm còn 9,07 mmol/l, tiếp đến là CBuOH (13,76
mmol/l). Như vậy, có thể khẳng định phân đoạn CEtOAc có tác dụng hạ đường huyết
tốt nhất, tiếp theo là phân đoạn CBuOH.
đoạn có hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất để từ đó góp phần chứng minh tác dụng hạ
đường huyết của chè dây. Qua thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được cao CEtOAc
cho thấy hoạt tính hạ đường huyết tốt hơn so với các cao còn lại. Tiến hành phân lập
trên sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thuận và pha đảo sử dụng các hệ dung
môi phù hợp, chúng tôi đã thu được một số hợp chất tinh sạch để tiến hành xác định
cấu trúc.
* Phân lập chất
Phần CEtOAc (40 g) được tiến hành trên sắc ký cột silica gel với các hệ dung
môi rửa giải là CHCl3-acetone-formic (10:3:1→10:5:1) và tách thành 6 phân đoạn,
kí hiệu PĐ1→PĐ6.
Từ phân đoạn 2 (PĐ2) các tinh thể màu vàng sáng xuất hiện. Sau mỗi lần kết
tinh đã thu được hợp chất tinh thể màu vàng sáng. Lọc kết tinh và rửa với cloroform
và acetone thu được hợp chất CDE1 (100 mg).
Phân đoạn 4 (PĐ4) được đưa lên cột silica gel pha đảo (RP-18) sử dụng acetone-
H2O (1:6) làm dung môi rửa giải thu được chất rắn màu trắng. Lọc kết tinh và rửa với
cloroform và ethyl acetate thu được hợp chất CDE2 (170 mg).
Phân đoạn 5 (PĐ5) được đưa lên cột silica gel và tách rửa bằng CHCl3-acetone
(8:1→0:1) để thu được 2 phân đoạn, ký hiệu PĐ5.1→PĐ5.2. Tinh chế tiếp phân đoạn
PĐ5.1 trên cột RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O (2,5:1) đã phân lập được hợp chất
CDE3 (10 mg).
Phân đoạn 6 (PĐ6) được tinh chế trên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải
là MeOH thu được hợp chất CDE4 (6 mg) và chất rắn màu vàng nhạt CDE5 (9 mg).
84
* Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập
a. Myricetin (CDE1)
Hợp chất CDE1 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, công
thức phân tử của hợp chất đã được dự đoán là C15H10O8 dựa trên kết quả phổ ESI-MS đo
ở cả kiểu ion hóa dương [M + H]+ với píc ion phân tử m/z 319 và ion hóa âm [M - H]-
với píc ion phân tử m/z 317. Các phổ NMR của hợp chất CDE1 có dạng điển hình đặc
trưng cho hợp chất flavonoid. Phổ 13C –NMR (phụ lục 1) của hợp chất xuất hiện tín hiệu
của 15 carbon bao gồm một tín hiệu của một nhóm carbonyl có độ dịch chuyển hóa học
ở δC 177,2; bốn tín hiệu của nhóm methine gồm 2 tín hiệu ở δC 99,2; 94,3 và hai tín hiệu
ở δC 108,5 ppm; mười tín hiệu của carbon bậc bốn. Phổ 1H -NMR của hợp chất CDE1
cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của proton vòng thơm tách vạch doublet ở
6,20 (1H; d; J=2,0 Hz) và δH 6,40 (1H; d; J= 2,0Hz) là các tín hiệu ghép cặp meta đặc
δH
trưng tương ứng với H-6 và H-8 của vòng A flavonoid. Ngoài ra còn xuất hiện thêm 2
tín hiệu singlet của proton thơm ở cùng độ dịch chuyển hóa học δH 7,36 (2H; s) được
gán cho hai vị trí H-2’ và H-6’ tương ứng của vòng B. Các số liệu phổ 1H, 13C-NMR của
hợp chất CDE1 (phụ lục 1) tương tự như số liệu phổ NMR của hợp chất myricetin đã
được phân lập từ quả nho đen bởi Dajun và cộng sự [62]. Các dữ liệu phổ 1H và 13C-
NMR cho tất cả các vị trí của proton và carbon của hợp chất (hình 3.13) đã được khẳng
định dựa trên cơ sở các mối tương tác trên phổ HSQC và HMBC. Các mối tương tác
chính trên phổ HMBC của hợp chất đã xác nhận vị trí của tất cả các nhóm hydroxyl ở
các vị trí 5, 7, 3, 3’, 4’, 5’ như hình 3.11. Trên cơ sở các dữ liệu phổ 1D và 2D của NMR
và có so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu [62], cấu trúc của
CDE1 đã được xác định là hợp chất myricetin.
Hình 3.11. Cấu trúc của myricetin (CDE1)
85
b. Dihydromyricetin (CDE2)
Hợp chất CDE2 được phân lập dưới dạng bột màu trắng, công thức phân tử của
hợp chất đã được dự đoán là C15H12O8 dựa trên kết quả phổ ESI-MS với píc ion phân tử [M + Na]+ thu được ở giá trị m/z 343,0; phổ 13C-NMR của hợp chất xuất hiện tín
hiệu của 15 carbon. Phổ UV của hợp chất cho thấy λmax ở 261, 319, và
348 nm gợi mở đây là một flavonoid. Dữ liệu phổ 1H -NMR (phụ lục 2) của hợp chất 5,91 (1H; CDE2 cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu của proton vòng thơm ở δH
d; J=2,5 Hz); δH 5,95 (1H; d; J= 2,0 Hz) và δH 6,59 (2H; s), ngoài ra còn có hai tín
hiệu duplet ở δH 4,52 (1H; d; J= 11,0 Hz) và δH 4,88 (1H; d; J=11,5 Hz) tương ứng
với mỗi một proton trong cấu trúc đề xuất là 3-hydroxyflavanone hoặc 2,
3-dihydroflavonol trong bộ khung cấu trúc của hợp chất. Sự hiện diện của 2,
3- dihydroflavonol được khẳng định thêm bởi các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 13C -NMR (phụ lục 2). Dữ liệu phổ cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của các nhóm oxymethine cộng hưởng ở δC 72,9 và 84,6 ppm. Ngoài ra, dữ liệu phổ 1H-NMR của
hợp chất cũng cho thấy sự hiện diện của hai proton thơm tách vạch doublet ở δH 5,91
(1H; d; J = 2,5 Hz) và 5,95 (1H; d; J = 2,5 Hz), ngoài ra còn thêm tín hiệu của hai
proton thơm singlet khác chập nhau ở độ dịch chuyển là 6,59 ppm tương ứng với bộ
khung pentahydroxyl flavanonol.
Các vị trí của proton và carbon của hợp chất CDE2 đã được xác định dựa trên
cơ sở các tương tác trên phổ HSQC và HMBC và được đưa ra như trên hình 3.12.
Các mối tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất đã xác nhận vị trí của tất cả
năm nhóm hydroxyl ở các vị trí 5, 7, 3, 4’, 5’ như trong hình 3.12. Trên cơ sở các dữ
liệu phổ 1D và 2D của NMR và có so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo
trong tài liệu [54], cấu trúc của CDE2 đã được xác định rõ ràng là dihydromyricetin
(5, 7, 3, 4, 5′-pentahydroxyl flavanonol).
Hình 3.12. Cấu trúc của dihydromyricetin (CDE2)
86
c. Phloretin (CDE3)
Hợp chất CDE3 phân lập được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Công
thức phân tử của hợp chất đã được dự đoán là C15H14O5 dựa trên kết quả phổ ESI-MS
đo ở cả kiểu ion hóa dương [M + H]+ với píc ion phân tử m/z 274,9 và ion hóa âm
sự xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của các proton vòng thơm tách vạch doublet ở δH
[M - H]- với píc ion phân tử m/z 272,8. Phổ 1H-NMR của hợp chất CDE3 cho thấy
6,72 (2H; d; J=8,5 Hz) tương ứng với H-3 và H-5 và δH 7,07 (2H; d; J= 8,5 Hz) tương
ứng với H-2 và H-6. Ngoài ra còn xuất hiện thêm 2 tín hiệu singlet của proton thơm
ở cùng độ dịch chuyển hóa học δH 5,84 (2H; s) được gán cho hai vị trí H-3’ và H-5’
2,88 (2H;
tương ứng bên cạnh đó còn có tín hiệu proton của hai nhóm methylene ở δH
dd, 8,0; 7,5 Hz) và 3,33 (2H; dd, 8,0; 7,5 Hz). Phổ 13C-NMR của hợp chất CDE3 xuất
hiện tín hiệu của 15 carbon bao gồm một tín hiệu của một nhóm carbonyl có độ dịch
chuyển hóa học ở δC 206,4 ppm; sáu tín hiệu của nhóm methine trùng nhau (overlap)
từng cặp ở δC 95,7; 130,3; 116,1 ppm và hai tín hiệu methylene ở δC 31,4; 47,2 ppm;
sáu tín hiệu của carbon bậc bốn. Các số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất CDE3
(bảng 3.6) tương tự như số liệu phổ NMR của hợp chất dihydrochalcone đã được
phân lập năm 2015 bởi Qin và cộng sự [125].
2,88
Các tương tác trên phổ HMBC (phụ lục 3) giữa tín hiệu của proton có δH
3,33 với C-7 (δC
với C-1 (δC 134,0); C-2, C-6 (δC 130,3) và C-9 (δC 206,4) và giữa δH
31,4); C-1 (δC 134,0) và C-9 (δC 206,4) đã khẳng định vị trí của nhóm carbonyl cũng
như vị trí của hai nhóm methylene như trên hình 3.13. Trên cơ sở các dữ liệu phổ 1D
và 2D của NMR và có so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu
[125], cấu trúc của CDE3 đã được xác định rõ ràng là hợp chất phloretin
(dihydrochalcone).
87
Bảng 3.6. Các số liệu phổ của phloretin
*δC
a
a (mult., J = Hz)
Phloretin (dihydrochalcone-CDE3) C δC δH Tương tác HMBC chính
1 132,6 134,0
2 128,9 130,3 7,07 (1H; d; 8,5 Hz) C-4
3 114,7 116,1 6,72 (1H; d; 8,5 Hz) C4
4 155,0 156,4
5 114,7 116,1 6,72 (1H; d; 8,5 Hz) C-4
6 128,9 130,3 7,07 (1H; d; 8,5 Hz) C-4
30,1 31,4 2,88 (2H; dd, 8,0; 7,5 Hz) C-1, C-2, C-6, C-9 7
45,9 47,2 3,33 (2H; dd, 8,0; 7,5 Hz) C-7, C-1, C-9 8
9 205,0 206,4
1’ 103,9 105,3
2’ 164,7 166,1
3’ 94,3 95,7 5,84 (1H, s)
4’ 164,4 165,8
5’ 94,3 95,7 5,84 (1H, s)
6’ 164,7 166,1
Hình 3.13. Cấu trúc của phloretin (CDE3)
d. Myricitrin (CDE4)
Hợp chất CDE4 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, công
thức phân tử của hợp chất đã được dự đoán là C21H20O12 dựa trên kết quả phổ ESI-
88
MS đo ở kiểu ion hóa dương [M + H]+ với píc ion phân tử m/z 464,9 và ion hóa âm
[M - H]- với píc ion phân tử m/z 462,9. Phổ 13C -NMR của hợp chất xuất hiện tín hiệu
của 21 carbon bao gồm một tín hiệu của một nhóm carbonyl có độ dịch chuyển hóa
học ở δC 178,29; bốn tín hiệu của nhóm methine gồm 2 tín hiệu ở
δC 98,43; 93,31 và hai tín hiệu ở δC 108,22 ppm; một nhóm methyl ở δC 16,25 ppm;
1H -NMR của hợp chất CDE4 cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của proton
ba tín hiệu của nhóm methine oxygenate; mười tín hiệu của carbon bậc bốn. Phổ
6,22 (1H; d; J=2,0 Hz) và δH 6,38 (1H; d; J=
vòng thơm tách vạch doublet ở δH
2,0Hz) tương ứng với H-6 và H-8 của vòng A flavonoid. Ngoài ra còn xuất hiện thêm
tín hiệu singlet của proton thơm có giá trị tích phân bằng 2 và có độ dịch chuyển hóa
học ở δH 6,97 (2H; s) được gán cho hai vị trí H-2’ và H-6’ tương ứng của vòng B
trong khung flavonoid. Các số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất CDE4 (bảng 3.7)
tương tự như số liệu phổ NMR của hợp chất CDE1 (myricetin) mà chúng tôi đã phân
lập được, ngoại trừ xuất hiện thêm các tín hiệu của một phân từ đường α-L-
rhamnopyranosyl. Trên phổ 1H-NMR (phụ lục 4) xuất hiện tín hiệu của proton
anomeric của phân tử đường ở δH 5,34 (1H; d; 1,5 Hz; H-1”). Trên phổ HMBC xuất
hiện tương tác giữa H-1” với C-3 (δC 134,93)/C-3” (δC 70,64), và giữa δH 0,99 (3H;
d; 6,0 Hz; H-6”) với C-4” (δC 71,98). Khi so sánh các số liệu phổ của hợp chất CDE4
với dữ liệu phổ trong tài liệu tham khảo, chúng tôi nhận thấy có sự tương đồng rất
cao với số liệu phổ của hợp chất myricitrin, một flavonol glycoside đã được phân lập
từ lá cây Eugenia jambolana (cây trâm mốc) bởi Mahmoud và cộng sự [102]. Các vị
trí của proton và carbon trong cấu trúc của hợp chất CDE4 đã được khẳng định dựa
trên cơ sở các mối tương tác trên phổ HSQC và HMBC và được đưa ra trong bảng
3.7. Các mối tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất đã xác nhận vị trí của tất
cả các nhóm hydroxyl ở các vị trí như trên hình 3.14. Trên cơ sở các dữ liệu phổ 1D
và 2D của NMR và có so sánh với dữ kiện phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu
[102], cấu trúc của CDE4 đã được xác định là hợp chất myricitrin.
89
Bảng 3.7. Các số liệu phổ của myricitrin
Myricitrin (CDE4)
aδC
b
b(mult., J = Hz)
C δC δH Tương tác HMBC
157,47 158,07 2
134,20 134,93 3
177,77 178,29 4
161,30 161,81 5
6 98,60 98,43 6,22 (1H; d; 2,0) C-10, C-8
164,20 164,51 7
8 93,50 93,31 6,38 (1H; d; 2,0) C-10, C-6
156,40 157,14 9
10 104,01 104,50
119,59 120,57 1'
2' 107,88 108,22 6,97 (1H; s) C-2, C-4’, C-6’
145,76 145,47 3'
136,44 136,50 4'
145,76 145,47 5'
6' 107,88 108,22 6,97 (1H; s) C-2, C-2’, C-4’
1'' 101,93 102,23 5,34 (1H; d; 1,5) C-3, C-3”
70,00 70,49 2'' 4,24 (1H; dd; 1,5; 2,0)
70,37 70,64 3'' 3,81 (1H; dd; 3,5; 9,5)
71,26 71,98 4'' 3,6 (1H; m)
70,55 70,76 5'' 3,53 (1H; m)
17,50 16,25 6'' 0,99 (3H; d; 6,0 Hz) C-4”
90
Hình 3.14. Cấu trúc của myricitrin (CDE4)
e. Quercetin (CDE5)
Hợp chất CDE5 được phân lập dưới dạng bột màu vàng nhạt, công thức phân
tử của hợp chất đã được dự đoán là C15H10O7 dựa trên kết quả phổ ESI-MS ở cả hai
kiểu ion hóa dương và ion hóa âm với píc ion phân tử [M + H]+ thu được ở giá trị m/z
302,9 và [M-H]- ở giá trị m/z 300,8. Phổ 13C -NMR của hợp chất CDE5 xuất hiện tín
hiệu của 15 carbon, bao gồm một nhóm carbonyl có độ dịch chuyển hóa học ở δC
99,27; 94,44; 116,03 116, 25 và
177,34; năm nhóm methine ở δC
121,07 ppm, và chín carbon bậc bốn. Dữ liệu phổ MS và 13C-NMR gợi mở rằng đây
là một flavonoid. Phổ 1H –NMR của hợp chất CDE5 cho thấy hai tín hiệu doublet
6,20 (1H; d; J= 2,0 Hz) và
của hai proton ghép cặp meta của proton vòng thơm tại δH
6,41 (1H; d; J= 2,0 Hz) tương ứng với C-6 và C-8 của vòng A. Ngoài ra, còn xuất
hiện các tín hiệu doublet của proton thơm vòng B ở δH 7,75 (1H; d; J= 2,0 Hz); 6,91
(1H; d; J= 8,5 Hz) và δH 7,65 (1H; dd; J= 2,5; 2,5 Hz). Các dữ liệu phổ 1H, 13C -
NMR (phụ lục 5) của hợp chất CDE5 tương tự như dữ liệu phổ NMR của hợp chất
quercetin, một flavonoid đã phân lập được từ loài Azolla microphylla [138]. Các vị
trí của proton và cacbon của CDE5 đã được xác định dựa trên cơ sở các tương tác
trên phổ HSQC và HMBC và được đưa ra như trên hình 3.15. Các mối tương tác
chính trên phổ HMBC (phụ lục 5) của hợp chất đã xác nhận vị trí của tất cả năm nhóm
hydroxyl ở các vị trí 5, 7, 3, 3’, 4’ như trong hình 3.15. Trên cơ sở các dữ liệu phổ
91
1D và 2D của NMR và có so sánh với dữ kiện phổ của hợp chất tham khảo trong tài
liệu [138], cấu trúc của CDE5 đã được khẳng định là quercetin.
Hình 3.15. Cấu trúc của quercetin (CDE5)
Cao cồn lá đắng sau khi tách chiết qua các dung môi phân cực khác nhau, chúng
tôi thu được các cao phân đoạn tương ứng có khối lượng khác nhau được trình bày ở
bảng 3.8.
Bảng 3.8. Phần trăm hàm lượng cao của các cao chiết phân đoạn lá đắng
Bột khô CC CHe CEtOAc CBuOH
Khối lượng (g) 2000 200 100 60 30
Phần trăm hàm lượng cao (%) 50 30 15
CHe lá đắng chiếm tỷ lệ cao nhất (50%), tiếp đến là CEtOA (30%) và CBuOH
(15%). Các cao phân đoạn này sẽ được sử dụng để cho chuột ĐTĐ type 2 uống, từ
đó sàng lọc ra phân đoạn có tác dụng hạ đường huyết tốt. Kết quả nồng độ đường
huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi cho các uống cao chiết phân đoạn lá chè đắng thể
hiện trên bảng 3.9.
92
Bảng 3.9. Nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống cao chiết phân
đoạn lá đắng
Nồng độ đường huyết (mmol/l) Lô
(n = 10) Ngày 0 Ngày 3 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21
Đối 21,03 ± 1,39 22,65 ± 1,40 25,20 ± 1,33 24,54 ± 2,88 26,76 ± 3,06 chứng
CHe 22,05 ± 1,31 22,85 ± 1,31 24,88 ± 1,36 26,72 ± 1,64 26,16 ± 3,02
CEtOAc 21,50 ± 1,49 19,45 ± 1,61 15,85 ± 1,76*# 13,12 ± 1,47**# 9,92 ± 0,76**#
CBuOH 20,06 ± 0,99 18,00 ± 1,18 14,36 ± 1,01**# 11,39 ± 1,02**# 8,94 ± 0,67**#
Ghi chú: số chuột trong mỗi nghiệm thức 10, *p < 0,05, **p < 0,01 (p so với
thời điểm trước khi điều trị của cùng nhóm); #p <0,01 (p so với lô chứng bệnh ở cùng
thời điểm khảo sát)
Từ kết quả thí nghiệm được trình bày ở trên ta có thể thấy, CHe có khối lượng
cao nhất tuy nhiên lại không có tác dụng hạ đường huyết qua các thời điểm khác nhau
(p > 0,05). Trong khi đó cao CEtOAC và CBuOH có tác dụng hạ đường huyết khá rõ
sau 7 ngày chuột được điều trị khi so với nhóm đối chứng cùng thời điểm khảo sát (p
< 0,01). Tác dụng hạ đường huyết của CEtOAC và CBuOH tốt nhất vào ngày 14 và
21 (p < 0,01). Cụ thể chuột cho uống CEtOAC có nồng độ đường huyết giảm đáng
kể từ 21,50 mmol/l về 9,92 mmol/l, tương tự CBuOH từ 20,06 mmol/l về 8,94 mmol/l.
Chúng tôi tiến hành phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phân
đoạn có hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất để từ đó góp phần chứng minh tác dụng hạ
đường huyết của lá đắng. Qua thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được CEtOAC và
CBuOH cho thấy hoạt tính hạ đường huyết tốt. Tiến hành phân lập trên sắc ký cột với
chất hấp phụ là silica gel pha thuận và pha đảo với các hệ dung môi phù hợp và chúng
93
tôi đã thu được một số hợp chất tinh sạch để tiến hành xác định cấu trúc.
* Phân lập chất
Phần CEtOAc (40 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel với hệ dung môi rửa
giải bằng hexan-ethyl acetate (9:1→0:1) và tách được 8 phân đoạn. Các phân đoạn 4
đến 6 được nạp lên cột silica gel và sử dụng CHCl3-MeOH (4:1) làm hệ dung môi
rửa giải để thu được kết tinh màu vàng xuất hiện trong các lọ, tiến hành lọc rửa và
kết tinh lại nhiều lần thu được hợp chất LĐE (12 mg).
30 g cao CBuOH được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột với dung môi rửa giải
là CH2Cl2-MeOH (9:1→0:1) thu được 8 phân đoạn. Từ phân đoạn 4 tinh chế tiếp tục
trên cột RP-18 với dung môi rửa giải là acetone-H2O (1:1,5→1,5:1) xuất hiện các kết
tinh màu trắng, tiến lọc kết tinh và thu được hợp LĐB (64 mg).
* Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập
a. Cynaroside (LĐE)
Hợp chất LĐE được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, công
thức phân tử của hợp chất đã được dự đoán là C21H20O11 dựa trên kết quả phổ ESI- MS đo ở kiểu ion hóa dương [M + H]+ với píc ion phân tử m/z 448,9 ion hóa âm [M - H]- với píc ion phân tử m/z 446,9. Phổ 13C, DEPT-NMR (phụ lục 6) của hợp chất
xuất hiện tín hiệu của 21 carbon bao gồm một tín hiệu của một nhóm carbonyl có độ
dịch chuyển hóa học ở δC 181,8 ppm; sáu tín hiệu của nhóm methine ở δC 99,5; 94,7;
103,1; 113,5; 115,9 và 119,1 ppm; một nhóm methylene ở
δC 60,6 ppm; bốn tín hiệu của nhóm oxymethine có độ dịch chuyển trong khoảng từ
69,5 – 77,1 ppm; bảy tín hiệu của carbon bậc bốn. Phổ MS và NMR của hợp chất LĐE có dạng phổ của một hợp chất flavonoid glycoside. Trên phổ 1H -NMR của hợp
chất LĐE xuất hiện hai tín hiệu tách vạch doublet của hai proton ghép cặp meta tại
δH 6,44 (1H; d; J= 2,0 Hz) và δH 6,78 (1H; d; J= 2,0 Hz) tương ứng với tín hiệu của
2 nguyên tử carbon tại δC 99,5 và 94,7 ppm trên phổ HSQC đặc trưng cho sự có mặt
của 2 proton H-6 và H-8 của vòng A flavonoid; một tín hiệu singlet tại δH 6,73 (1H;
s) tương ứng với tín hiệu của nguyên tử carbon tại δC 103,1 trên phổ HSQC đặc trưng
cho sự có mặt của proton H-3 của vòng C. Ngoài ra còn xuất hiện thêm 3 tín hiệu
doublet của proton thơm tại δH 7,41 (1H; d; 2,0 Hz); 6,91 (1H; d; 8,5 Hz) và 7,45
(1H; dd; 2,0; 8,5 Hz) được gán cho ba vị trí H-2’, H-5’ và H-6’ tương ứng của vòng
94
B. Bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của một phân tử
đường: tín hiệu doublet của proton anomeric tại δH 5,08 (1H; d; J= 7,5 Hz) cùng với
các tín hiệu khác của các nhóm oxymethin trong vùng 3,26 – 3,71 ppm. Các số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất LĐE (phụ lục 6) tương tự như số liệu phổ NMR của
hợp chất Luteolin-7-O-β-glucopyranoside (cynaroside) đã được Wang và cộng sự
phân lập từ loài Salvia officinalis [152]. Các tương tác trên phổ HMBC giữa các tín
hiệu của proton anomeric của phân tử đường ở δH 5,08 (1H; d; 7,5 Hz; H-1”) với C-
7 (δC 162,9) và giữa δH 6,78 (1H; d; 2,0 Hz; H-8) với C-1”
(δC 99,9) đã khẳng định vị trí của phân tử đường -O-β-glucopyranoside ở C-7 (trên
hình 3.16). Trên cơ sở các dữ kiện phổ 1D và 2D của NMR của hợp chất LĐE và có
so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu [152], cấu trúc của hợp
chất LĐE đã được xác định là hợp chất cynaroside (hình 3.16).
Hình 3.16. Cấu trúc của cynaroside (LĐE)
b. Vernonioside E (LĐB)
Hợp chất LĐB thu được dưới dạng bột màu trắng và công thức phân tử của nó
được xác định là C35H54O12 dựa trên kết quả phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS với
píc ion phân tử m/z 667,3693. Phổ 1H-NMR của LĐB (bảng 3.10) cho thấy các tín
hiệu sau: hai tín hiệu proton olefinic ở δH 5,36 (1H, br s) và 4,23 (1H, d, J = 7,0 Hz), ba
tín hiệu proton methyl bậc ba ở δH 0,47 (3H, s); 0,82 (3H, s); 1,34 (3H, s) và hai nhóm
proton methyl đính với cacbon bậc 2 ở δH 0,88 (3H, d, J = 6,5 Hz); 0,87 (3H, d, J =
6,5 Hz). Tín hiệu của proton anomeric của phân tử đường ở δH 5,34 (1H; d;
J = 7,5 Hz). Phổ 13C-NMR và DEPT (phụ lục 7) cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của
năm methyl, năm cacbon bậc bốn, hai olefinic, chín nhóm methine-oxigenate, bảy
methine và bảy methylene. Các số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất LĐB tương
tự như dữ liệu phổ của vernonioside B2 [89] ngoại trừ tín hiệu của nhóm methoxyl
95
tại C-28 đã được thay thế bởi nhóm –OH, điều này cho thấy rằng hợp chất LĐB có
thể là một steroid glucoside mới thuộc khung stigmastane. Sự hiện diện của một phân
tử đường β-glucoside tại C-3 của aglycone đã được xác định bằng cách so sánh với
dữ liệu phổ NMR được công bố trong tài liệu [89] và tương tác trên phổ HMBC giữa
các tín hiệu của proton anomeric H-1' (δH 4,23; d, 7,5 Hz) với C-3
(δC 74,8), C-3' (δC 76,8), C-5' (δC 76,7). Các tương quan trên phổ HMBC từ H-18 (δH
0,47) đến C-12 (δC 40,6), C-17 (δC 54,7), C-13 (δC 42,7) và C-14 (δC 48,0); từ H-19
(δH 0,82) đến C-1 (δC 33,7), C-10 (δC 35,5), C-9 (δC 143.3) và C-5 (δC 38,5); đã khẳng
định vị trí hai nhóm methyl ở C-10, C-13. Sự hiện diện của hai tín hiệu carbon ở δC
80,3 (C-24) và 109,1 (C-28) và các tương tác trên phổ HMBC giữa hai tín hiệu
doublet của proton methyl ở δH 0,88 (3H, d, H-26) và 0,87 (3H, d, H-27) đến carbon
ở δC 80,3 (C-24) và δC-25 (C 31,7), từ tín hiệu δH 1,34 (3H, d, H-29) đến δC 109,1 (C-
28) và C-24 ( δC 80,3), chỉ ra rằng có một nhóm methyl và một isopropyl lần lượt ở
vị trí C-24 và C-28 (hình 3.20) ở vòng bên giống như của vernonioside B2. Các tương
tác trên phổ HMBC từ H-7 (δH 5,36) đến C-9
(δC 143,3) và C-14 (δC 48,0); từ H-11 (δH 5,48) đến C-8 (δC 135,3), C-10 (δC 35,5) và
C-13 (δC 42,7) đã chỉ ra rằng hai liên kết đôi ở tại vị trí C-7/C-8 và C-9/C-11. Sự vắng
mặt của tín hiệu methoxyl tại C-28 và độ dịch chuyển hóa học của carbon
C-28 (δC 109,1) về vùng trường cao đã chỉ ra rằng nhóm methoxyl của vernonioside
B2 đã được thay thế bằng -OH (bảng 3.10). Như vậy, cấu trúc phẳng của hợp chất
LĐB đã được xác định, phổ 1H-1H COSY-NMR đã chứng minh rõ ràng mối liên kết
của C-23-C-22-C-20-C-17-C-16-C-15-C- 14 và C-20-C-21. Sự dịch chuyển hóa học
của H-14 (δH 2,40) phần lớn được dịch chuyển từ vernonioside A1, nhưng gần với
vernonioside A2 [89], [88]. Điều này cho thấy nhóm hydroxy tại C-16 có cấu hình α
[93]. Hơn nữa, cấu hình của nhóm 16-hydroxy có được nhờ sự dịch chuyển hóa học
gần của Me-18 (δH 0,47) và H-15 (δH 1,92) so với vernonioside A2 [93], [88]. Mối
tương quan NOESY giữa H- 3 (δH 4,16) và H-5 (δH 1,35), H-5 (δH 1,35) và H-14
(δH 2,40), H-14 (δH 2,40) và H-17 (δH 1,87), Me-18 ( δH 0,47) và Me-19 (δH 0,82), cũng
như Me-18 (δH 0,47) và H-21 (δH 5,36) chỉ ra rằng LĐB chứa các vòng trans của bộ
96
khung chính, H-3, H-5, H -14 và H-17 có cấu hình α, trong khi Me-18, Me-19 và H-21
có cấu hình β. Mối tương quan trên phổ NOESY từ H-23 (δH 4,46) đến H-21 (δH 5,36)
và H-22 (δH 4,63) chỉ ra rằng proton H-22 và H-23 có cấu hình β . Do đó, cấu trúc hợp
chất 1 đã được xác định và đặt tên là vernonioside E (hình 3.18).
Vernonioside E (LĐB)
Bảng 3.10. Các số liệu phổ của vernonioside E
*δC
a (mult., J = Hz)
a
C δH δC
1 35,2 1,17 (1Ha, m), 1,81 (1Hb, m) 33,7
2 29,7 1,44 (1Ha, m), 1,86 (1Hb, m) 29,2
3 77,1 4,16 (br d, 7,0) 74,8
4 34.9 1,22 (1Ha, m), 1,78 (1Hb, m) 34,1
5 38,9 1,35 (1H, m) 38,5
6 29,9 1,79 (1Ha, m), 1,91 (1Hb, m) 29,4
7 121,8 5,36 (1H, br s) 120,5
8 135,7 - 135,3
9 143,7 - 143,3
10 36,0 - 35,5
11 118,6 118,1 5,48 (1H, d, 7,0)
12 41,1 40,6 1,94 (1Ha, m), 2,09 (1Hb, m)
13 43,1 - 42,7
14 48,5 48,0 2,40 (1H, m)
15 34,9 34,1 1,66 (1Ha, m), 1,92 (1Hb, m)
16 76,7 76,3 3,55 (1H, m)
17 54,9 54,7 1,87 (1H, m)
18 14,3 13,9 0,47 (3H, s)
19 19,7 19,2 0,82 (3H, s)
20 47,9 47,2 2,04 (1H, m)
21 98,4 98,0 5,36 (1H, br s)
22 80,2 79,3 4,63 (1H, br d, 6,0)
23 90,2 90,1 4,46 (1H, d, 6,0)
97
Vernonioside E (LĐB)
*δC
a (mult., J = Hz)
a
C δH δC
24 81,3 - 80,3
25 31,7 1,95 (1H, m) 31,7
26 17,5 0,88 (3H, d, 6,5) 16,8
27 18,4 0,87 (3H, d, 6,5) 18,1
28 112,4 109,1 -
29 17,5 23,1 1,34 (3H, s)
1’ 101,4 100,9 4,23 (1H, d, 7,5)
2’ 75,5 2,89 (1H, m) 73,5
3’ 80,2 3,06 (1H, m) 76,8
4’ 72,9 3,02 (1H, m) 70,1
5’ 77,2 3,04 (1H, m) 76,7
6’ 61,6 3,40 (1Ha, m), 3.63 (1Hb, m) 61,1
28-OCH3 48,2
Hình 3.17. Chất tinh sạch LĐB (trái) và
sắc kí bản mỏng của vernonioside E (LĐB) (phải)
98
Hình 3.18. Cấu trúc của vernonioside E (LĐB)
Một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để điều trị bệnh ĐTĐ, đặc biệt là bệnh ĐTĐ type
2 là làm giảm đường huyết sau ăn bằng cách ức chế các enzyme thủy phân
carbohydrate trong đường tiêu hóa, trong đó có enzyme α-amylase và glucosidase có
liên quan đến việc phân hủy chuỗi dài của tinh bột. Các chất ức chế enzyme này làm
chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate, gây giảm hấp thu đường và do đó làm giảm
đường huyết sau ăn [96].
Để tìm hiểu sâu hơn về hoạt tính hạ đường huyết của cao chiết lá chè dây và lá
đắng, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-
glucosidase của các hợp chất đã được tinh sạch để xác định cơ chế hạ đường huyết
của chúng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Sự ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các hợp chất phân
lập từ chè dây và lá đắng
Mẫu α-amylase (IC50 µM) α-glucosidase (IC50 µM)
Acarbose 211,35 4,305 187,41 0,80
Quercetin 136,58 6,77 10,64 1,62
Myricetin 86,31 4,91 9,20 0,04
Myricitrin 9,64 0,68 8,92 3,65
99
_
Phloretin 199,11 7 ,60 18,74 0,07
Dihydromyricetin 374,47 2,69
Cynaroside 83,30 3,28 21,52 2,33
Vernonioside E _ 351,26 6,21
Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy sự ức chế enzyme α-amylase và glucosidase từ 7
hợp chất được phân lập từ cây chè dây và lá đắng, trong đó có 5 hợp chất thể hiện
hoạt tính ức chế 2 enzyme này khá tốt. Khả năng ức chế của các hợp chất với enzyme
α-amylase và α-glucosidase được xác định bằng nồng độ ức chế 50% (IC50). Cả 5 hợp
chất: Myricitrin; quercetin; myricetin; phloretin; cynaroside đều thể hiện hoạt tính ức
chế 2 enzyme này khá mạnh khi so với thuốc Acarbose. Kết quả về giá trị IC50 đối
với enzyme α-amylase cho thấy myricitrin có giá trị IC50 nhỏ nhất (IC50 = 9,64 µM ),
tiếp đến là cynaroside; myricetin; quercetin và phloretin với giá trị IC50 lần lượt là:
83,30; 86,31; 136,58 và 199,11 µM. Tương tự, kết quả về về khả năng ức chế enzyme
α-glucosidase theo thứ tự lần lượt là myricitrin (8.92 µM), myricetin (9.20 µM),
quercetin (10.64 µM ), phloretin (18.74 µM) và cynaroside (21,52 µM). Riêng đối
với dihydromyricetin và vernonioside E thể hiện khả năng ức chế yếu đối với hoạt
động của enzyme α-glucosidase và không có tác dụng ức chế enzyme α-amylase. Một
số chất phân lập được đã có các báo cáo cho thấy khả năng ức chế enzyme α-amylase
và α-glucosidase [103]. Trong đó khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-
glucosidase của myricitrin và cynaroside là phù hợp với các nghiên cứu trước đây
[103], [96].
Đây là một trong những điểm mới mà đề tài luận án đã thực hiện được khi
nghiên cứu về cơ chế hạ đường huyết trên hai đối tượng chè dây và lá đắng. So với
các số liệu IC50 của các hợp chất trong bảng tổng hợp 1.6 và IC50 của acarbose, chúng
tôi nhận thấy IC50 của các chất tinh sạch này là tương đối thấp, điều này khẳng định
hoạt tính ức chế enzym α-amylase và α-glucosidase của các chất tinh sạch là khá
mạnh. Từ các kết quả trình bày trên cho thấy, các hợp chất phân lập từ chè dây và lá
đắng có khả năng điều trị ĐTĐ theo cơ chế ức chế hoạt động của enzyme thủy phân
100
tinh bột là α-amylase và α-glucosidase, góp phần giải thích cho hoạt tính hạ đường
huyết của cao cồn tổng cũng như các cao chiết phân đoạn của chè dây và lá đắng.
3.4.5.1. Kết quả ảnh hưởng của các hợp chất phân lập từ chè dây và lá đắng lên khả
năng sống sót của dòng tế bào Raw 264.7 và 3T3-L1
Kết quả thử hoạt tính gây độc lên dòng tế bào Raw 264.7 và 3T3-L1 của các
hợp chất phân lập được từ chè dây (myricetin; dihydromyricetin; phloretin; myricitrin
và quercetin) và lá đắng (cynaroside và vernonioside E) được trình bày ở hình 3.19
và 3.20. Từ kết quả cho thấy, các hợp chất myricetin; dihydromyricetin; phloretin;
myricitrin; quercetin; cynaroside và vernonioside E không có khả năng gây độc với
tế bào Raw 264.7 và 3T3-L1 ở các nồng độ 5-40 µg/mL.
Hình 3.19. Đánh giá khả năng gây độc của các hợp chất chè dây đối với Raw 264.7
(A) và 3T3-L1 (B)
Hình 3.20. Đánh giá khả năng gây độc của các hợp chất lá đắng đối với Raw 264.7
(A) và 3T3-L1 (B)
101
LPS kích hoạt thụ thể trong các đại thực bào để tạo ra sự biểu hiện của các chất
trung gian gây viêm như các cytokine tiền viêm (IL-1β, IL-6 và TNF-α) và các
cytokine chống viêm (IL-10) [164]. Trong số 7 hợp chất phân lập được từ cây chè
dây và lá đắng hợp chất phloretin (chè dây) và vernonioside E (lá đắng) có khả năng
ức chế hiệu quả đến quá trình sinh các cytokine tiền viêm TNF-α, IL-6, IL-8 so với
các hợp chất myricetin; dihydromyricetin; quercetin; myricitrin và cynaroside. Tất cả
các hợp chất phân lập không ức chế cytokine kháng viêm IL-10, kết quả thí nghiệm
được trình bày ở hình 3.21 và 3.22.
Hình 3.21. Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập từ cây chè dây lên quá trình
sản xuất TNF-α (A), IL-6 (B), IL-8 (C) và IL-10 (D) trong tế bào Raw 264.7
được kích thích bằng LPS
102
Hình 3.22. Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập từ cây lá đắng lên quá trình
sản xuất TNF-α (A), IL-6 (B), IL-8 (C) và IL-10 (D) trong tế bào Raw 264.7
được kích thích bằng LPS
Tế bào đã được ủ với LPS sẽ làm tăng đáng kể hàm lượng cytokine (IL-6,
IL-8, TNF-α và IL-10) khi so với tế bào không được xử lý bởi LPS. Điều trị các tế
bào với nồng độ khác nhau (5-30 µg/mL) của phloretin và vernonioside E làm giảm
đáng kể nồng độ IL-6, IL-8, TNF-α). Mức độ sản sinh TNF-α trong các tế bào sau
khi được điều trị bằng hợp chất phloretin và vernonioside E từ 250,63 và 310,49
pg/ml ở nồng độ 5 μg/ml giảm xuống còn 72,89 và 119,56 pg/ml ở nồng độ 30 μg/ml.
Sau khi điều trị phloretin và vernonioside E, quá trình sinh IL-6 giảm xuống còn
211,53 và 219,86 pg/ml ở nồng độ 30 μg/ml và cũng cho thấy tác dụng ức chế tế bào
sản sinh IL-8 ở nồng độ 30 μg/ml (166,58 và 170,18 pg/ml). Ngược lại, phloretin và
vernonioside E không ức chế cytokine kháng viêm IL-10. Trong khi đó, các hợp chất
myricetin; dihydromyricetin; quercetin; myricitrin và cynaroside cho thấy hiệu quả
ức chế các cytokine yếu và không ức chế cytokine kháng viêm IL-10. Kết quả thực
103
nghiệm cho thấy phloretin và vernonioside E thể hiện rõ khả năng ức chế tế bào miễn
dịch sản sinh TNF-α, IL-6 và IL-8 ở nồng độ 30 µg/ml. Như vậy, có thể khẳng định
phloretin và vernonioside E là hoạt chất chính trong cao chiết cồn 700 của chè dây và
lá đắng gây ức chế các cytokine tiền viêm TNF- α,
IL-6 và IL-8. Tác dụng chống viêm của phloretin đã được nghiên cứu trên thế giới,
với liều 10 μM phloretin ức chế đáng kể nồng độ NO, PGE2, IL-6, TNF-α, iNOS và
COX-2 [53], trong khi đó vernonioside E là lần đầu tiên được báo cáo về hoạt tính
chống viêm. Myricetin; quercetin; dihydromyricetin đã được công bố về hoạt tính
chống viêm với khả năng làm giảm đáng kể nồng độ TNF-α và IL-6 [56], [94], [95].
Tuy nhiên kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự không đồng nhất với các kết
quả nghiên cứu trước đó, vì vậy vai trò thật sự của các hợp chất này đối với ức chế
các cytokine tiền viêm cần được làm rõ hơn trong các nghiên cứu sâu hơn.
Để gây kháng insulin, tế bào sẽ được bất hoạt insulin bởi TNF-α, từ đó để kiểm
tra tác dụng của phloretin đối với độ nhạy insulin trong tế bào 3T3-L1. Quá trình
kháng insulin trong các tế bào mô mỡ đã được chỉ ra có mối liên hệ với đáp ứng viêm,
đặc biệt là với TNF-α đã ngăn chặn biểu hiện của nhiều protein trong tế bào mỡ như
IR, IRS và GLUT4 dẫn tới giảm hấp thu glucose khi kích thích bằng insulin [51],
[107]. Trong số hai hợp chất thử nghiệm phloretin và vernonioside E, chỉ có phloretin
có khả năng giảm tính kháng insulin trong tế bào mô mỡ 3T3-L1 thông qua khả năng
hấp thụ lượng đường và kết quả được trình bày ở hình 3.23. Tế bào mô mỡ kháng
insulin được xử lý bằng phloretin (40 µg/ml) có khả năng hấp thụ lượng đường tăng
(85,22 %) so với khi tế bào bị kháng insulin không được xử lý bằng phloretin (39,45
%). Do đó, phloretin đã cải thiện khả năng hấp thu đường đáng kể trong các tế bào
3T3-L1 kháng insulin. Hợp chất phloretin lần đầu tiên được nghiên cứu về tác dụng
giảm tính kháng insulin ở tế bào 3T3-L1 gây ra bởi TNF-α.
104
Hình 3.23. Hoạt động giảm tính kháng insulin của hợp chất phloretin và
vernonioside E trong tế bào 3T3-L1 được xử lý với TNF-α
Kết quả tác động của phloretin đối với biểu hiện p-IRS1 và Y20 trong con đường
tín hiệu hoạt động insulin được trình bày ở hình 3.24.
Hình 3.24. Ảnh hưởng của phloretin lên mức độ biểu hiện của hai protein IRS1
và pY20
Ghi chú: Các mức độ biểu hiện khác nhau của quá trình phosphoryl hóa thụ
thể p-IRS1 và phosphoryl hóa tyrosin pY20. IR: tế bào bị bất hoạt insulin; RM: nhóm tế bào được ủ với thuốc rosiglitazone; ĐC: nhóm tế bào bình thường; Phloretin: nhóm tế bào được ủ với phloretin. Các thí nghiệm đều lập lại ba lần.
105
Từ kết quả hình 3.23 cho thấy cả hai protein (IRS-1 và Y20) được biểu hiện rõ
ràng (sau khi ủ với phloretin và rosiglitazone-RM) hoặc không biểu hiện (không ủ
với phloretin) ở tế bào kháng insulin (IR), điều này chỉ ra rằng có sự gián đoạn trong
con đường truyền tín hiệu insulin như báo cáo trước đây của Solomon và cộng sự
[141]. Sau khi điều trị bằng phloretin (200 µg/mL) và rosiglitazone (120 𝜇M) đã cho
thấy làm tăng biểu hiện của cả hai protein Y20 và IRS-1 ở các tế bào kháng insulin.
Biểu hiện của Y20 mạnh sau khi ủ với phloretin đã cung cấp cơ sở chứng minh cho
khả năng tiềm tàng của phloretin trong tăng khả năng nhạy cảm của tế bào đối với tín
hiệu insulin. Biểu hiện IRS-1 cũng được quan sát trong các tế bào bình thường và ở
tế bào điều trị bằng phloretin và rosiglitazone. Trong khi đó, không có dải IRS-1 nào
được quan sát thấy trong các tế bào kháng insulin không được điều trị. Các tế bào
được điều trị với rosiglitazone và phloretin đã cho thấy có thể khôi phục các biểu hiện
của IRS-1. Như vậy, phloretin có hiệu quả trong con đường truyền tín hiệu insulin
thông qua phục hồi biểu hiện của hai protein Y20 và IRS-1, điều này sẽ dẫn đến sự
dịch chuyển của GLUT-4 để tăng sự hấp thu glucose vào trong tế bào. Các tác dụng
hạ đường huyết của phloretin thông qua khôi phục biểu hiện hai protein IRS-1 và Y20
của tế bào chưa từng được được báo cáo trước đây.
Phương pháp điều trị ĐTĐ hiện nay tập trung vào việc kiểm soát và giảm nồng
độ đường huyết trong mức bình thường. Cơ chế của cả thuốc hiện đại và thuốc cổ
truyền nhằm giảm nồng độ đường huyết trong máu là: (1) để kích thích tế bào beta
của đảo tụy tiết ra nhiều insulin; (2) ức chế hoạt động của các hormone làm tăng nồng
độ glucose trong máu; (3) tăng độ nhạy của vị trí thụ thể insulin; (4) ức chế quá trình
thủy phân glycogen ở gan; giảm hấp thu carbohydrate ở ruột non thông qua ức chế
enzyme α-glucosidase và α-amylase; (5) tăng cường sử dụng glucose trong mô và cơ
quan; (6) chống quá trình oxy hóa, chống lại sự peroxy hóa các lipid và sửa chữa rối
loạn trao đổi lipid và protein [153]. Các hợp chất chống ĐTĐ, có thể có tác dụng hiệu
quả theo một hay nhiều cơ chế hạ đường huyết kể trên.
106
Điều chỉnh đường huyết sau ăn trở thành một hướng điều trị phổ biến ở bệnh
nhân ĐTĐ type 2. Ức chế α-glucosidase và α-amylase đã được xem là đích mục tiêu
để làm chậm lại quá trình hấp thu đường vào máu từ quá trình phân hủy carbohydrate
của thức ăn, cho phép tuyến tụy có thêm thời gian để tăng tiết insulin để đáp ứng với
sự gia tăng nồng độ đường trong máu. Hiện nay, có ba chất ức chế α-glucosidase và
α-amylase có sẵn được sử dụng làm thuốc trị đái tháo đường: acarbose, miglitol và
voglibose. Tuy nhiên, các thuốc này có một số tác dụng phụ phổ biến nhất là đầy hơi,
tiêu chảy và tăng men gan [106]. Có rất nhiều hoạt chất tham gia ức chế α-glucosidase
và α-amylase được tìm thấy trong thực vật, như các terpene, alkaloid, flavonoid,
glycoside, phenol…được cho là tác dụng phụ ít hơn so với các thuốc hóa dược. Trong
nghiên cứu này, kết quả ức chế chế enzym
α-glucosidase và α-amylase của 7 hợp chất phân lập được từ cây chè dây và lá đắng
cho thấy: Myricitrin; quercetin; myricetin; phloretin và cynaroside đều thể hiện hoạt
tính ức chế 2 enzyme này khá mạnh khi so với thuốc Acarbose, trong khi đó 2 hợp
chất dihydromyricetin và vernonioside E thể hiện khả năng ức chế yếu đối với hoạt
động của enzyme α-glucosidase và không có tác dụng ức chế enzyme α-amylase. Như
đã trình bày ở trên, một số hợp chất phân lập từ chè dây và lá đắng không có tác dụng
tốt trong việc ức chế enzym α-glucosidase và α-amylase, tuy nhiên các hợp chất này
có thể tác dụng tốt theo một cơ chế khác, vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên
cứu các cơ chế hạ đường huyết khác của các hợp chất này để từ đó làm sáng tỏ thêm
về tác dụng hạ đường huyết của cây chè dây và lá đắng.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng viêm mãn tính có liên quan đến sinh lý bệnh
của bệnh ĐTĐ type 2 và do đó việc nghiên cứu nhắm vào mục tiêu điều trị tình trạng
viêm có thể cải thiện được kháng insulin ở bệnh ĐTĐ type 2, ngăn chặn sự tiến triển
cũng như biến chứng của bệnh [122]. Nhiều công trình nghiên cứu cũng đã chứng
minh rằng các chất trung gian gây viêm hoạt hóa kinase serine bao gồm IκB kinase
(IKK-β), c-Jun kinase NH2 ở đầu tận cùng (c-Jun NH2-terminal kinase -JNK), những
kinase này ức chế hoạt động của insulin bằng cách thúc đẩy sự phosphoryl hóa serine
của con đường truyền tín hiệu insulin, bao gồm protein IR và IRS-1 làm suy yếu tín
hiệu insulin và gây kháng insulin [125]. Các hoạt động chống viêm của flavonoid
107
trong mô hình in vitro và in vivo đã được khẳng định ở nhiều công trình nghiên cứu
trên thế giới. Hoạt động chống viêm của flavonoid liên quan đến ức chế tổng hợp và
hoạt động của các chất trung gian gây viêm khác nhau như eicosanoid, cytokine, yếu
tố phiên mã NFκB và protein phản ứng C [139]. Hoạt động chống viêm của các hợp
chất phân lập từ chè dây và lá đắng đã được chúng tôi nghiên cứu, trong đó chỉ có
hợp chất phloretin và vernonioside E có hoạt tính chống viêm thông qua ức chế các
cytokine tiền viêm: IL-6; IL-8 và TNF–α. Hiện nay, các loại thuốc chính được sử
dụng trong điều trị bệnh ĐTĐ như: Sulfonylurea, metformin và thiazolidinedione
cũng cho thấy là thuốc có khả năng chống viêm thông qua làm giảm TNF-α, IL-6,
CRP và các dấu hiệu viêm khác. Trong nghiên cứu lâm sàng, nhiều thuốc chống viêm
không steroid (NSAID) và chất ức chế cyclooxygenase (ibuprofen, naproxen) có thể
cải thiện giải phóng insulin và giảm tình trạng kháng insulin, tăng hấp thụ glucose ở
bệnh nhân ĐTĐ [74]. Từ đó có thể thấy, các chất phloretin và vernonioside E có cơ
chế tế bào tương tự như các thuốc chống ĐTĐ phổ biến hiện nay, do đó chúng có khả
năng trị bệnh ĐTĐ có hiệu quả. Trên thực tế, hợp chất phloretin đã được chứng minh
tác dụng chống bệnh ĐTĐ trên mô hình in vivo [160]. Nghiên cứu của chúng tôi ở
đây đã góp phần làm sáng tỏ một trong những cơ chế điều trị ĐTĐ của phloretin, và
có thể của vernonioside E, là con đường tăng độ nhạy của vị trí thụ thể insulin và cải
thiện tính kháng insulin thông qua giảm nồng độ các cytokine tiền viêm [125].
Như đã đề cập ở trên, tăng tiết cytokine bởi cả tế bào miễn dịch và gây kháng
insulin thông qua nhiều cơ chế bao gồm kích hoạt serine/threonine kinase, giảm biểu
hiện IR, IRS-1, GLUT-4. Vì vậy, để giúp hiểu thêm về cơ chế hạ đường huyết của
các hợp chất này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các hợp
chất này thông qua khả năng làm giảm tính kháng insulin bằng cách tăng cường hấp
thu đường và biểu hiện của hai protein Y20 và p-IRS-1. Trong số các hợp chất thử
nghiệm chỉ có phloretin (chè dây) đã cải thiện khả năng hấp thu đường đáng kể trong
các tế bào 3T3-L1 kháng insulin. Từ đó chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tác động của
phloretin đối với biểu hiện p-IRS1 và Y20 (đây là hai protein rất cần thiết cho con
đường truyền tín hiệu insulin). Từ kết quả thí nghiệm cho thấy, phloretin có hiệu quả
trong con đường truyền tín hiệu insulin thông qua phục hồi biểu hiện của hai protein
108
Y20 và IRS-1, điều này sẽ dẫn đến sự dịch chuyển của GLUT-4 để tăng sự hấp thu
đường vào trong tế bào. Đã có nhiều công trình nghiên cứu công bố tác dụng trị bệnh
ĐTĐ của các dịch chiết cây cỏ ngọt, trà xanh cũng như các hợp chất được phân lập
từ các dịch chiết thực vật như genipin, epigallocatechin gallate, naringenin và
procyanidin thông qua cơ chế làm giảm tính kháng insulin bằng cách tăng cường quá
trình phosphoryl hóa IR, IRS-1 và tăng cường dịch chuyển của GLUT-4 đến màng tế
bào từ đó làm tăng cường quá trình hấp thu glucose vào tế bào [107], [77], [101].
Như vậy, có thể khẳng định rằng các hợp chất phân lập được từ chè dây và lá
đắng có tác dụng trị bệnh ĐTĐ thông qua các cơ chế hạ đường huyết sau: làm chậm
quá trình hấp thu glucose vào máu thông qua ức chế enzyme enzym α-glucosidase và
α-amylase (myricitrin; quercetin; myricetin; phloretin và cynaroside); hoạt động
chống viêm liên quan đến ức chế tổng hợp và hoạt động của các chất trung gian gây
viêm (phloretin và vernonioside E) và đã cải thiện khả năng hấp thu đường đáng kể
của tế bào thông qua tăng cường biểu hiện của hai protein Y20 và IRS-1 (phloretin).
Kết quả về khả năng điều trị ĐTĐ của các hợp chất này góp phần vào việc phát triển
dược phẩm mới từ những nguồn nguyên liệu sẵn có ở miền Trung.
Ngoài sử dụng cây thảo dược đơn lẻ trong điều trị ĐTĐ, nhiều nghiên cứu ở Ấn
độ, Trung quốc, Hàn quốc và một số quốc gia khác đã chứng minh vai trò của sự kết
hợp nhiều loại cây thảo dược dưới dạng công thức (polyherbal formulation), giúp
tăng hiệu quả điều trị bệnh ĐTĐ đáng kể [1]. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, những
thảo dược có nguồn gốc tự nhiên với ưu thế của sự kết hợp nhiều nhóm hoạt chất
khác nhau, đã gây hạ đường huyết, đem lại hiệu quả điều trị tốt hơn kèm với tính an
toàn cao [109].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành kết hợp các thực vật đã nghiên cứu
có hiệu quả trong điều trị ĐTĐ để tạo thành cao hỗn hợp có hiệu quả hơn trong điều
trị ĐTĐ, khi phối hợp các thực vật với nhau, mỗi cao hỗn hợp cho khuyết một thành
109
phần, được phối trộn theo tỷ lệ 1:1:1:1:1:1:1:1 (được trình bày ở phụ lục 8), kết quả
lựa chọn cao hỗn hợp được trình bày ở hình 3.25.
*
*
Hình 3.25. Phối hợp các cây thảo dược để tăng hiệu quả trong điều trị ĐTĐ
Ghi chú: *p <0,05 (p so với nhóm điều trị ở cùng thời điểm khảo sát)
Kết quả ở hình 3.25 cho thấy, cao hỗn hợp khuyết mẫu lá đu đủ (lô 6), hạt đu
đủ (lô 5), quả chuối hột (lô 7) và lá đắng (lô 3) là không làm ảnh hưởng đến hoạt tính
hạ đường huyết trên chuột (p > 0,05), ngược lại sản phẩm khuyết mẫu chè dây (lô 2)
và cỏ ngọt (lô 4) thì hoạt tính hạ đường huyết suy giảm (p < 0,05). Kết quả này một
lần nữa khẳng định vai trò quan trọng của chè dây trong điều trị bệnh ĐTĐ. Mẫu lá
đu đủ, hạt đu đủ và quả chuối hột được loại ra khỏi cao hỗn hợp. Cuối cùng, chúng
tôi đã chọn ra 5 loài thực vật làm thành phần cao hỗn hợp, bao gồm: chè dây, lá đắng,
cỏ ngọt, giảo cổ lam và dây thìa canh.
Do điều kiện thời gian chúng tôi đưa ra tỷ lệ phối trộn của cao hỗn hợp (bao
gồm: chè dây, lá đắng, cỏ ngọt, giảo cổ lam và dây thìa canh) theo tỷ lệ 1:1:1:1:1.
Đây có thể chưa phải là tỷ lệ tối ưu nhất của cao hỗn hợp, nếu có điều kiện chúng tôi
sẽ tiến hành nghiên cứu nhiều tỷ lệ phối trộn khác để thu được cao hỗn hợp có tác
dụng tốt nhất.
110
Khả năng hạ đường huyết của các cao chiết trên mô hình chuột ĐTĐ type 2
được thể hiện trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống các cao chiết
Nồng độ đường huyết (mmol/L) Nhóm (n=5) 0 giờ 21 ngày
Nước cất (đối chứng) 19,68 ± 0,99 23,66 ± 1,20
Cao lá đắng (350 mg/kg) 19,84 ± 1,28 19,08 ± 1,84
Cao chè dây (350 mg/kg) 22,06 ± 2,21 21,18 ± 2,32
Cao cỏ ngọt (350 mg/kg) 20,78 ± 2,44 20,64 ± 2,99
Cao giảo cổ lam (350 mg/kg) 22,26 ± 1,83 21,26 ± 1,80
Cao dây thìa canh (350mg/kg) 21,00 ± 2,25 19,64 ± 1,86
Cao hỗn hợp (350 mg/kg) 20,34 ± 1,40 12,56 ± 1,86*
Ghi chú: số chuột trong mỗi nghiệm thức 5, *p <0,01 (p so với lô chứng bệnh ở
cùng thời điểm khảo sát)
Kết quả trình bày ở bảng 3.12 cho thấy, chuột ĐTĐ uống cao chiết riêng lẻ
của của lá đắng, chè dây, cỏ ngọt, giảo cổ lam và dây thìa canh với liều 350 mg/kg
sau 21 ngày điều trị nồng độ đường huyết có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê
so với nhóm đối chứng ở cùng thời điểm (p > 0,05). Trong khi đó, nồng độ đường
huyết của chuột ĐTĐ sau khi uống cao hỗn hợp cũng ở liều 350 mg/kg giảm đáng kể
(p < 0,05). Sau 21 ngày điều trị cao hỗn hợp đường huyết giảm 38,25 % so với thời
điểm 0 giờ. Như vậy, sự kết hợp các loại thảo dược riêng lẻ với nhau làm giảm đáng
kể nồng độ đường huyết ở chuột bị bệnh ĐTĐ so với nhóm chứng.
Kết quả khảo sát nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 ở các nhóm thử
nghiệm sau khi cho uống cao hỗn hợp được trình bày trong bảng 3.13.
Bảng 3.13. Nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống các
cao hỗn hợp
111
Nồng độ đường huyết (mmol/l)
Lô (n = 10)
Ngày 0 Ngày 2 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21
21,0 ± 1,47 22,27±1,26 23,70±1,43 24,32±1,07 25,94 ±1,23 Nước cất (Đối chứng)
Pioglite (20 21,49±1,39 17,54±1,06* 13,16±1,50**# 10,67±0,90**# 7,9±0,59**# mg/kg)
21,60±1,44 18,59±1,49 16,18±1,53*# 10,91±1,01**# 7,69±0,60**# Cao hỗn hợp (500 mg/kg)
Cao hỗn hợp
19,73±1,04 19,20±0,97 15,52±1,01*# 11,22±0,78**# 8,12±0,50**# (1000
mg/kg)
Ghi chú: *p < 0,05, **p < 0,01 (p so với thời điểm trước khi điều trị của cùng
nhóm), #p <0,01 (p so với lô chứng bệnh ở cùng thời điểm khảo sát)
Kết quả có thể thấy, ở thời điểm 2 ngày sau khi sử dụng thuốc pioglite đường
huyết của nhóm chuột ĐTĐ giảm (từ 21,49 xuống còn 17,54 mmol/l) có ý nghĩa thống
kê so với thời điểm trước khi điều trị trong cùng nhóm (p < 0,05) và có tác dụng hạ
đường huyết nhanh chóng trong vòng 7 ngày, 14 ngày (13,16 và 10,67 mmol/l). Vào
ngày thứ 21 đường huyết giảm còn 7,90 mmol/l (p < 0,01).
Trong khi đó, chuột ĐTĐ type 2 uống cao hỗn hợp trong vòng 2 ngày nồng độ
đường huyết thấp hơn đối chứng bệnh và thấp hơn trước khi điều trị nhưng không có
ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Từ ngày thứ 7, đường huyết của cả hai nhóm điều trị
bằng cao hỗn hợp ở liều 500 mg/kg và 1000 mg/kg giảm có ý nghĩa thống kê so với
nhóm đối chứng tại cùng thời điểm khảo sát (p < 0,01) và có tác dụng hạ đường huyết
tốt sau 14 và 21 ngày điều trị. Sau 21 ngày điều trị bằng cao hỗn hợp đường huyết
giảm lần lượt là 64,40% và 58,84% so với trước khi điều trị bằng cao hỗn hợp 500
mg/kg và 1000 mg/kg (p < 0,01).
Ngoài ra, kết quả cho thấy đường huyết của hai nhóm sau khi uống cao hỗn hợp
và thuốc pioglite 20 mg/kg không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
(p > 0,05) sau 21 ngày điều trị. Chuột ĐTĐ sau khi điều trị bằng cao hỗn hợp ở liều
112
500 mg/kg và 1000 mg/kg khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Trong bệnh ĐTĐ type 2, các tế bào β tuyến tụy trở nên rối loạn chức năng vì
nồng độ glucose hoặc lipid liên tục ở mức cao, chất trung gian gây viêm giải phóng
từ mô mỡ và lưới nội chất, hoặc stress oxy hóa [113]. Vì vậy, duy trì chức năng của
tế bào β tuyến tụy cũng như các chỉ số mỡ máu ở mức ổn định có thể là một cách tiếp
5
4.37
cận chiến lược để phòng ngừa và điều trị bệnh ĐTĐ.
4
2.93
3
* 2.11
* 1.87
* 1.86
2
* 1.40
* 1.33
* 1.28
1
0
Hình 3.26. Chỉ số triglyceride và cholesterol của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày
uống cao hỗn hợp
Ghi chú: *p<0,01 (p so với nhóm không điều trị)
Từ kết quả trình bày ở hình 3.26 cho thấy các chỉ số mỡ máu của nhóm chuột
ĐTĐ type 2 không điều trị (chỉ uống nước cất) tăng cao đáng kể và có ý nghĩa thống
kê khi so với lô chuột bình thường (p < 0,01). Với nhóm chuột ĐTĐ type 2 không
điều trị nồng độ cholesterol và triglyceride ở mức cao hơn khi so với chuột uống cao
hỗn hợp (p < 0,01). Chuột ĐTĐ type 2 chỉ uống nước cất do ăn thức ăn chứa nhiều
chất béo trong thời gian khá dài nên các chỉ tiêu mỡ máu cholesterol (4,37 mmol/l)
và triglyceride (2,93 mmol/l) đều rất cao. Trong khi đó, chuột được điều trị bằng cao
hỗn hợp nồng độ cholesterol và triglyceride giảm đáng kể so với chuột không được
điều trị lần lượt là 1,87 và 1,4 mmol/l.
Lá đắng và giảo cổ lam đã được nghiên cứu là những thực vật giàu saponin [28],
[78]. Saponin ức chế enzyme acetyl coenzyme và carboxylase, do đó, ức chế tổng
113
hợp acid béo, làm tăng tỷ lệ cholesterol HDL so với cholesterol LDL, và nó có thể có
hiệu quả trong việc giảm các biến chứng tim mạch của bệnh ĐTĐ. Nghiên cứu gần
đây cũng đã chứng minh rằng cao chiết lá đắng và giảo cổ lam có hiệu quả của trong
việc giảm triglyceride, cholesterol ở chuột [115], [104]. Vì vậy cao hỗn hợp cho thấy
có tác dụng giảm các chỉ số lipid máu của chuột ĐTĐ type 2 có thể là do sự kết hợp
của các cao chiết có tác dụng hạ lipid như đã trình bày ở trên.
Glycogen là một dạng dự trữ của glucose do đó việc đánh giá hàm lượng
glycogen là một khâu quan trọng trong quá trình nghiên cứu các cơ chế tác dụng của
thuốc trên chuyển hóa glucide cũng như để chẩn đoán những bệnh liên quan trong có
5
* 4.49
* 4.29
* 4.25
4
có bệnh ĐTĐ đang ngày càng gia tăng.
3
2.42
2
1
0
Hình 3.27. Hàm lượng glycogen gan ở chuột bệnh ĐTĐ type 2 sau khi uống
cao hỗn hợp
Ghi chú: *p<0,01 (p so với nhóm không điều trị)
Tác dụng của cao hỗn hợp và pioglite lên hàm lượng glycogen ở chuột bệnh
ĐTĐ trình bày ở hình 3.27. Kết quả cho thấy chuột ĐTĐ type 2 không điều trị giảm
đáng kể hàm lượng glycogen gan khi so sánh với chuột bình thường (giảm 46,10%),
trong khi chuột uống cao hỗn hợp và pioglite hàm lượng glycogen tăng lên đáng kể
lần lượt là 75,62% và 77,27% so với nhóm chuột không điều trị (p < 0,01) và không
có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với hàm lượng glycogen ở nhóm chuột bình
thường (p > 0,05). Việc ngăn chặn sự suy giảm glycogen trong mô gan có thể là do
114
sự kích thích giải phóng insulin từ các tế bào β của tuyến tụy từ đó kích hoạt hệ thống
tổng hợp glycogen [121].
Hình 3.28. Sự ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của cao chiết hỗn hợp
Tác dụng của cao hỗn hợp ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase được
trình bày ở hình 3.28. Kết quả cho thấy cao hỗn hợp có tác dụng ức chế hoạt động
của cả enzyme α-glucosidase và α-amylase phụ thuộc vào nồng độ cao chiết. Cao hỗn
hợp cho thấy khả năng ức chế 84,69 và 80,99 % hoạt tính của enzyme α-glucosidase
và α-amylase ở nồng độ 200 μg/ml. Từ tương quan tuyến tính giữa nồng độ mẫu thử
và giá trị % ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase (hình 3.27) có được giá trị
IC50 ức chế hai enzyme này của mẫu cao chiết hỗn hợp lần lượt là 40,55 μg/ml và
102,29 μg/ml. Trong khi đó, các cao chiết riêng lẽ đã được nghiên cứu trước đây như
cao chiết dây thìa canh, cỏ ngọt, lá đắng có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase
với IC50 lần lượt là 182,26; 596,77; 490,00 μg/ml và α-amylase là 195,30; 198,40;
510 μg/ml [163], [130], [30]. Như vậy, từ kết quả thí nghiệm này cho thấy cao chiết
hỗn hợp có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase tốt hơn khi so với
cao riêng lẽ được nghiên cứu trước đó.
Thuốc muốn sử dụng phải an toàn và có hiệu lực. Để chứng minh thuốc có an
115
toàn không thì cần phải tiến hành nghiên cứu độc tính [8]. Trong nghiên cứu này, sau
khi cho chuột uống cao hỗn hợp với liều lượng tăng dần, kết quả đánh giá số chuột
chết ở các nhóm thử nghiệm trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả đánh giá số chuột chết ở các nhóm thử nghiệm sau khi uống
cao hỗn hợp
Số Nhóm Liều dùng Thể tích cho Số chuột chuột thí chuột (g/kg) uống chết (con) nghiệm
Nhóm 1 10 Nước cất 0,3 ml x 3 lần 0
Nhóm 2 10 9,6 0,3 ml x 3 lần 0
Nhóm 3 10 19,2 0,3 ml x 3 lần 0
Nhóm 4 10 28,8 0,3 ml x 3 lần 0
Nhóm 5 10 38,4 0,3 ml x 3 lần 0
Tiêu thụ thức ăn và nước uống của chuột: Sau 4 giờ uống mẫu thử, trong các
nhóm 1, 2, 3 và 4 đều ăn uống, bài tiết và hoạt động bình thường riêng đối với nhóm
5 có biểu hiện giảm hoạt động nhẹ. Sau 72 giờ uống mẫu thử chuột ở các nhóm 1, 2,
3, 4 và 5 đã hoạt động và ăn uống bình thường, và tăng trọng lượng cơ thể như nhau
trong thời gian theo dõi.
Quan sát dấu hiệu ngộ độc: Không quan sát thấy có biểu hiện ngộ độc ở các
nhóm chứng 1 và nhóm thử 2, 3, 4, và 5 trong vòng 72 giờ sau uống thuốc và không
có chuột nào chết trong 7 ngày theo dõi tiếp theo. Nhìn chung, với mức liều cao nhất
có thể cho chuột uống là 38,4 g/kg, không có biểu hiện của độc tính cấp của cao hỗn
hợp theo đường uống trên chuột nhắt trắng.
Với dược liệu có liều chết LD50 gấp trên 10 lần điều trị được xem là có khoảng
an toàn điều trị tốt [8], chẳng hạn như trường hợp ở đây là cao hỗn hợp. Không xác
định được liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) vì không tìm được liều gây
chết chuột, cho thấy dịch chiết của cao hỗn hợp có tính an toàn cao trong thử nghiệm đánh giá độc tính cấp trên chuột.
116
Với các kết quả đạt được của luận án chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:
1. Kết quả về sàng lọc thực vật có tác dụng hạ đường huyết:
- Đã xác định được 8/20 mẫu thực vật có tác dụng hạ đường huyết trên mô hình
chuột ĐTĐ type 2 đó là chè dây, quả chuối hột, hạt đu đủ, lá đu đủ, lá dây thìa canh,
lá và thân cỏ ngọt, giảo cổ lam và lá đắng.
- Trong đó, chè dây, hạt đu đủ, lá đu đủ, lá và thân cỏ ngọt và lá đắng là lần đầu
tiên nghiên cứu về hoạt tính hạ đường huyết ở Việt Nam và chè dây là lần đầu tiên
được nghiên cứu về hoạt tính hạ đường huyết trên thế giới.
2. Kết quả nghiên cứu đối với lá chè dây:
- Đã nghiên cứu tác dụng của cao chiết chè dây (500 mg/kg) lên phục hồi tuỵ
và gan chuột ĐTĐ type 2 bị tổn thương.
- Đã xác định được 2 cao chiết phân đoạn CEtOAc, CBuOH có khả năng hạ
đường huyết tốt nhất trên chuột ĐTĐ type 2.
- Đã phân lập và xác định được 5 chất trong phân đoạn CEtOAc là myricetin
(CDE1); dihydromyricetin (CDE2); phloretin (CDE3); myricitrin (CDE4) và
quercetin (CDE5). Trong đó quercetin tuy không phải là chất mới nhưng lần đầu tiên
được phân lập từ chè dây.
- Nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính ức chế enzym α-amylase và α-glucosidase
của của các chất tinh sạch từ cây chè dây. Kết quả về giá trị IC50 đối với enzyme α-
amylase của các hợp chất myricitrin, myricetin, quercetin và phloretin tương ứng là
9,64, 86,31, 136,58 và 199,11 μM. Tương tự, kết quả về về khả năng ức chế enzyme
α-glucosidase theo thứ tự lần lượt là myricitrin (8,92 µM), myricetin (9,20 µM),
quercetin (10,64 µM), phloretin (18,74 µM).
- Các hợp chất myricitrin, myricetin, quercetin, dihydromyricetin và phloretin
không gây độc trên dòng tế bào độc Raw 264.7 và 3T3-L1 ở các nồng độ 5-40 µg/ml.
- Phloretin có khả năng ức chế hiệu quả đến quá trình sinh các cytokine tiền
viêm TNF-α, IL-6, IL-8 và không ức chế cytokine kháng viêm IL-10. Hợp chất
117
phloretin lần đầu tiên được nghiên cứu về tác dụng giảm tính kháng insulin ở tế bào
3T3-L1 gây ra bởi TNF-α và tác dụng khôi phục biểu hiện hai protein pIRS-1 và
pY20 của tế bào.
3. Kết quả nghiên cứu đối với lá đắng:
- Lá đắng ngoài tác dụng hạ đường huyết còn có tác dụng phục hồi tuỵ và gan
chuột ĐTĐ type 2 bị tổn thương.
- Đã xác định được 2 cao chiết phân đoạn có khả năng hạ đường huyết tốt nhất
trên chuột ĐTĐ type 2 là: CEtOAc, CBuOH.
- Đã phân lập và xác định được 1 chất trong phân đoạn CEtOAc của lá đắng là
cynaroside (LĐE). Từ phân đoạn CBuOH đã phân lập và xác định được 1 chất mới là
vernonioside E (LĐB). Chất này lần đầu tiên được phân lập từ lá đắng và cũng là lần đầu tiên
phân lập từ thiên nhiên.
- Hợp chất cynaroside được phân lập từ cây lá đắng có hoạt tính ức chế enzyme
α-amylase và α-glucosidase với IC50 lần lượt là 83,30 và 21,52 µM.
- Các hợp chất cynaroside và vernonioside E không gây độc trên dòng tế bào
độc Raw 264.7 và 3T3-L1 ở các nồng độ 5-40 µg/mL.
- Vernonioside E có khả năng ức chế hiệu quả đến quá trình sinh các cytokine
tiền viêm TNF-α, IL-6, IL-8 và không ức chế cytokine kháng viêm IL-10.
4. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cao hỗn hợp (bao gồm: chè dây, lá đắng, cỏ
ngọt, dây thìa canh và giảo cổ lam) trong điều trị ĐTĐ:
- Cao hỗn hợp không những có hiệu quả tốt trong hạ đường huyết ở chuột ĐTĐ
type 2 (giảm 64,40%) mà còn có tác dụng giảm nồng độ cholesterol và triglycide
cũng như ngăn chặn sự suy giảm glycogen trong mô gan.
- Cao hỗn hợp không có độc tính cấp ở liều 38,4 mg/kg.
Sau khi phân tích tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới thì nhận
thấy các kết quả nghiên cứu của luận án đã có những đóng góp mới cho khoa học và
thực tiễn như sau:
118
- Lần đầu tiên ở Việt Nam hoạt tính hạ đường huyết của 5 loại thực vật: chè dây,
hạt đu đủ, lá đu đủ, cỏ ngọt và lá đắng được nghiên cứu. Lần đầu tiên trên thế giới
chè dây được nghiên cứu về hoạt tính hạ đường huyết.
- Lần đầu tiên phân lập được hợp chất quercetin từ cây chè dây.
- Lần đầu tiên hợp chất phloretin (từ chè dây) được nghiên cứu về tác dụng giảm
tính kháng insulin ở tế bào 3T3-L1 gây ra bởi TNF-α cũng như tác dụng khôi phục
biểu hiện hai protein pIRS-1 và pY20 của tế bào.
- Từ phân đoạn CBuOH của cao chiết lá đắng đã phân lập và xác định được một
chất mới là vernonioside E (LĐB). Chất này lần đầu tiên được phân lập từ lá đắng và
cũng là lần đầu tiên phân lập từ thiên nhiên, nó có khả năng ức chế quá trình sinh
tổng hợp các cytokine tiền viêm TNF-α, IL-6, IL-8 và không ức chế cytokine kháng
viêm IL-10.
- Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chè dây ngoài tác dụng hạ đường huyết còn
có tác dụng phục hồi tuỵ và gan chuột ĐTĐ type 2.
- Đã phát triển được cao hỗn hợp có hiệu quả tốt trong hạ đường huyết ở chuột
ĐTĐ type 2 và có tác dụng giảm nồng độ cholesterol và triglyceride, ngăn chặn sự
suy giảm glycogen trong mô gan cũng như ức chế hoạt động của enzym α-glucosidase
và α-amylase. Đây là điểm mới có giá trị thực tiễn của luận án.
Từ các kết quả nghiên cứu thu được, có thể thấy chè dây, lá đắng và cao hỗn
hợp là một dược liệu có tiềm năng trong điều trị ĐTĐ. Với nguồn nguyên liệu dồi
dào trong nước, để có thể sử dụng chè dây, lá đắng và cao hỗn hợp một cách hiệu quả
trong điều trị ĐTĐ, đề tài xin đưa ra đề xuất:
- Nghiên cứu một số cơ chế có tác dụng gây hạ đường huyết khác của cao hỗn
hợp và các hoạt chất phân lập được.
- Nghiên cứu bào chế cao hỗn hợp, cần khảo sát cao hỗn hợp ở các tỷ lệ khác
nhau từ đó tìm ra được cao hỗn hợp có tỷ lệ tối ưu trong điều trị ĐTĐ, xác định các
chỉ tiêu vi sinh vật, hàm lượng kim loại nặng và hàm lượng các chất độc hại có thể
có trong cao hỗn hợp.
119
- Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của cao hỗn hợp, cũng như các nghiên
cứu thử nghiệm lâm sàng qua các giai đoạn trên các bệnh nhân ĐTĐ type 2 để phát
triển thành thuốc đặc trị.
120
1. Nguyễn Thị Xuân Thu, Đặng Đức Long (2017), “Hiệu quả hạ đường huyết trên
chuột bệnh đái tháo đường type 2 và thành phần hóa học của cao chiết cây chè dây
(Ampelopsis cantoniensis Planch.)” Tạp chí Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, Tập 55, số 4E23, trang: 124-129.
2. Phạm Thị Kim Thảo, Nguyễn Thị Xuân Thu, Đặng Đức Long (2017), “Khảo sát
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây chè dây (Ampelopsis
cantoniensis) ở huyện Đông Giang, tỉnh Quảng Nam, Việt Nam”, Tạp chí Khoa
học và Công nghệ đại học Đà Nẵng, tập 1, số 110, trang: 136-140.
3. Nguyễn Thị Xuân Thu, Đặng Đức Long, Thành Thị Thu Thủy (2019), “Nghiên
cứu tác dụng hạ đường huyết và chống oxy hóa của một số cao chiết thực vật”,
Tạp chí Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tập 41, số 2,
trang: 119-128.
4. Nguyen Thi Xuan Thu, Dang Duc Long, Giang Thi Kim Lien (2019),
“Hypoglycemic effect and acute toxicity of the polyherbal formulation (DANGT)
in streptozocin-induced diabetic type 2 mice”, Journal of Medicinal Materials, vol.
24, issue 5, p: 301-307.
5. Nguyễn Thị Xuân Thu, Đặng Đức Long, Thành Thị Thu Thủy (2019), “Nghiên
cứu sàng lọc một số thực vật có khả năng hạ đường huyết trên mô hình chuột đái
tháo đường thực nghiệm”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam, tập 17, số 3, trang: 1-8.
6. Thi Xuan Thu Nguyen, Duc Long Dang, Van Quang Ngo, Tat Cuong Trinh, Quang
Nam Trinh, Trung Dong Do, Thi Thu Thuy Thanh (2020), “Anti-inflammatory
activity of a new compound from Vernonia amygdalina”, Natural Product
Research, Jul 07:1-5. DOI: 10.1080/14786419.2020.1788556.
7. Nguyen Thi Xuan Thu, Ngo Van Quang, Dang Duc Long, Thanh Thi Thu Thuy
(2020), “Structure and biological activity of five flavonoids from Ampelopsis
cantoniensis”, Vietnam Journal of Science and Technology, 58 (6A), 181-188.
121
[1]. Phạm Thị Lan Anh, Trương Tuyết Mai, Phạm Văn Hoan, Lê Thị Hợp (2013),
“Khả năng kiểm soát đường huyết sau ăn của sản phẩm VOSCAP chiết tách từ lá
vối, lá ổi, lá sen trên người khỏe mạnh”, Tạp chí Y học Thực hành, 3 (864), 129-
131.
[2]. David Beran, Tạ Văn Bình, Hoàng Kim Ước, Lê Quang Toàn (2008), Báo cáo
chương trình đánh giá nhanh tình hình tiếp cận insulin tại Việt Nam, 1-54.
[3]. Tạ Văn Bình (2006), Dịch tễ học bệnh ĐTĐ ở Việt nam các phương pháp điều
trị và biện pháp dự phòng, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
[4]. Tạ Văn Bình (2007), Bệnh đái tháo đường - Tăng glucose máu, NXB Y học, Hà Nội.
[5]. Tạ Văn Bình (2009), Điều tra dịch tễ học bệnh đái tháo đường và hội chứng
chứng chuyển hóa tại một số vùng sinh thái của Việt Nam, Hà Nội: Báo cáo kết
quả đề tài nghiên cứu cấp bộ.
[6]. Phạm Việt Cường(2019), Nghiên cứu phát triển cây dược liệu mới Vernonia
amygdalina Delile (cây lá đắng) tại tỉnh Thừa Thiên Huế và định hướng ứng
dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
[7]. Hồ Thị Dung, Trần Thị Oanh, Nguyễn Thị Minh Thúy, Phạm Thị Hải Yến,
Nguyễn Thu Hằng, Đặng Thị Vân Anh (2018). “Nghiên cứu đặc điểm thực vật
của dược liệu lá đắng thu hái ở Nghệ An”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 12, 30-
34.
[8]. Đỗ Trung Đàm (2014), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, NXB Y
học Hà Nội.
[9]. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, quyển II, Nhà xuất bản trẻ.
[10]. Phùng Thanh Hương, Nguyễn Thị Thu Hiền (2009), “Tác dụng của dịch chiết
lá bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.) trên chuột cống đái tháo
đường type 2”, Tạp chí Dược học, 401(49), 19-22.
[11]. Phùng Thanh Hương, Nguyễn Xuân Thắng Trường (2002), “Tác dụng hạn chế
tăng glucose huyết của thân mướp đắng trên một số mô hình gây tăng glucose
122
huyết thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, 1, 22-25.
[12]. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Thị Bách Hà, Nguyễn Cẩm Tú, Lê Minh Thịnh
(2017), “Lignan and flavononol glycosides of Vernonia amygdalina Del.”, Tạp
chí hóa học, 55 (4E23), 304-307.
[13]. Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (2004), Hoàn thiện công nghệ sản xuất Ampelop
làm thuốc điều trị viêm loét dạ dày - tá tràng, Báo cáo tổng kết dự án sản xuất
thử nghiệm cấp nhà nước.
[14]. Hà Thị Bích Ngọc, Nguyễn Văn Mùi, Trần Thị Kiều Diệp (2011), “Nghiên cứu
độc tính cấp và tác dụng hạ đường huyết của chế phẩm Thivoda trên chuột nhắt
đái tháo đường”, Tạp chí Y học Việt Nam, 384(2), 210-213.
[15]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất
bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
[16]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, NXB
ĐHQG TP. Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh.
[17]. Nguyễn Thị Băng Sương, Nguyễn Thị Hà, Phạm Thiện Ngọc, Phạm Thanh Kỳ
(2004), “Nghiên cứu tác dụng của polyphenol cây chè dây (Ampelopsis
cantoniensis Planch) trên một số chỉ số lipid máu và mô bệnh học của xơ vữa
động mạch ở thỏ uống cholesterol”, Tạp chí Công nghệ Y học, 29 (3), 1-8.
[18]. Nguyễn Thanh Tâm (2014), Nghiên cứu phát hiện các chất có hoạt tính hạ
đường huyết từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus) của Việt Nam, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
[19]. Đỗ Thị Trang, Hà Thị Bích Ngọc, Nguyễn Văn Mùi, Phan Văn Chi (2010),
“Điều tra, nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của một số thực vật Việt Nam
lên mô hình chuột đái tháo đường týp 2”, Tạp chí Y học Việt Nam, 372(2), 100-
103.
[20]. Đái Thị Xuân Trang, Nguyễn Thị Mai Phương, Võ Thị Ngọc Diễm,Quách Tú
Huê (2012), Khảo sát hiệu quả hạ đường huyết và chống oxy hóa của cao chiết
cây nhàu (Morinda citrifolia L.) Ở chuột bệnh tiểu đường, Tạp chí Khoa học,
23, 115-124
123
[21]. Nguyễn Bá Trí, Lê Trí Khải, Đào Duy Khánh, Lê Nam Khánh, Nguyễn Trọng
Hào (2017), “Tỷ lệ hiện mắc bệnh đái tháo đường ở người 45-69 tuổi và một số
yếu tố liên quan tại thị trấn Sa Thầy, huyện Sa Thầy, tỉnh Kon Tum năm 2016”,
Tạp chí Y học dự phòng, 27(28), 146-153.
[22]. Viện Dinh dưỡng (2009) Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam. Bộ
Y Tế.
[23]. Phùng Thị Vinh (1995), Nghiên cứu về thực vật, thành phần hoá học và tác
dụng sinh học của cây chè dây, Luận án Phó tiến sỹ khoa học Y dược, Trường
Đại học Dược Hà Nội.
[24]. Đỗ Quốc Việt, Trần Văn Sung, Nguyễn Thanh Thúy (2006), “Sơ bộ nghiên cứu
tác dụng hạ đường huyết của quả chuối hột (Musa balbisiana) trên chuột thực
nghiệm”, Tạp chí Dược học, (361), 8-11.
[25]. Nguyễn Ngọc Xuân, Đào Văn Phan, Nguyễn Duy Thuần (2000) “Bước đầu
nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của thổ phục linh (Smilax glabra roxb.) trên
chuột nhắt”, Tạp chí Dược học, 4, 12-13.
[26]. Ahmad U., Ahmad R.S. (2018), “Anti diabetic property of aqueous extract of
Stevia rebaudiana Bertoni leaves in Streptozotocin-induced diabetes in albino
rats”, BMC Complement Altern Med., 18(1), 1-11.
[27]. Ai W., Li H., Song N., Li L., Chen H. (2013), “Optimal method to Stimulate
Cytokine Production and Its Use in Immunotoxicity Assessment”, Int. J.
Environ. Res. Public Health, 10, 3834-3842.
[28]. Akpaso M.I., Atangwho I.J., Akpantah A., Fischer V.A., Igiri A.O., Ebong P.E.
(2011), “Effect of Combined Leaf Extracts of Vernonia amygdalina (Bitter
Leaf) and Gongronema latifolium (Utazi) on the Pancreatic β-Cells of
Streptozotocin Induced Diabetic Rats”, Br. J. Med. Med. Res., 1(1), 24-34.
[29]. Alam F., Shafique Z., Amjad S.T., Bin Asad. M.H.H. (2019), “Enzymes
inhibitors from natural sources with antidiabetic activity: A review”, Phytother
Res., 33, 41-54.
124
[30]. Alara O.R., Abdurahman N.H. (2019), “Anti-diabetic activity and mineral
elements evaluation of Vernonia amygdalina leaves obtained from Malaysia”,
J.Res.Pharm. , 23(3), 514-521.
[31]. Alonso-Castro A.J., Zapata-Bustos R., Gómez-Espinoza G., Salazar-Olivo L.A.
(2012), “Isoorientin reverts TNF-α-induced insulin resistance in adipocytes
activating the insulin signaling pathway”, Endocrinology, 153(11), 5222-5230.
[32]. Al-Romaiyan A., Liu B., Asare-Anane H., Maity C.R., Chatterjee S.K., Koley
N., Biswas T., Chatterji A.K., Huang G.C., Amiel S.A., Persaud S.J., Jones P.M.
(2010), “A novel Gymnema sylvestre extract stimulates insulin secretion from
human islets in vivo and in vitro”, Phytother Res., 24(9), 1370-1376.
[33]. American Diabetes Association (2010), “Diagnosis and Classification of
Diabetes Mellitus”, Diabetes Care, 33(1), 62-69.
[34]. Antunes-Ricardo M., Gutiérrez-Uribe J.A., Martínez-Vitela C., Serna-Saldívar
S.O. (2015), “Topical Anti-Inflammatory Effects of Isorhamnetin Glycosides
Isolated from Opuntia ficus-indica”, Biomed Res. Int., 2015.
[35]. Asante D.B., Effah-Yeboah E., Barnes P., Abban H.A., Ameyaw E.O.,
Boampong J.N., Ofori E.G., Dadzie J.B. (2016), “Antidiabetic Effect of Young
and Old Ethanolic Leaf Extracts of Vernonia amygdalina: A Comparative
Study”, J. Diabetes Res., 2016, 1-13.
[36]. Asghari B., Salehi P., Sonboli A., Nejad Ebrahimi S. (2015), “Flavonoids
from Salvia chloroleuca with α-Amylase and α-Glucosidase Inhibitory Effect”,
Iran J Pharm Res., 14(2), 609-615.
[37]. Atangwho I., Ebong P.E., Egbung E., Eteng M.U. (2007), “Effect of Vernonia
amygdalina Del. on liver function in alloxan-induced hyperglycaemic rats”,
Journal of Pharmacy & Bioresources, 4(1), 25-31.
[38]. Azab A., Nassar A., Azab A.N. (2016), “Anti-Inflammatory Activity of Natural
Products”, Molecules, 21(10), 1321.
[39]. Barbour L.A., McCurdy C.E., Hernandez T.L., Kirwan J.P., Catalano P.M.,
Friedman J.E. (2007), “Cellular Mechanisms for Insulin Resistance in Normal
125
Pregnancy and Gestational Diabetes”, Diabetes Care, 30(2), 112-119.
[40]. Bataille D. (2002), “Molecular mechanisms of insulin secretion”, Diabetes
Metab., 28(6), 7-13.
[41]. Bhandari M.R., Jong-Anurakkun N., Hong G., Kawabata J. (2008), “Alpha-
glucosidase and alpha-amylase inhibitory activities of Nepalese medicinal herb
Pakhanbhed (Bergenia ciliata, Haw.)”, Food Chem.,106,247-252.
[42]. Bhardwaj A., Modi K.P. (2017), “Antidiabetic and antihyperlipidaemic activity
of Nelumbo nucifera gaertn ethanol seed extract in streptozotocin induced
diabetic rats”, Int. J. Pharm. Pharm., 9(10), 197-204.
[43]. Bhattachariee B., Lakshminarasimhan P., Bhattacharjee A., Agrawala D.K.,
Pathak M.K. (2013), “Vernonia amygdalina Delile (Asteraceae) – An African
medicinal plant introduced in India”, Zoos' Print J., 28(5), 18-20
[44]. Bhupathiraju S.N., Hu F.B. (2016), “Epidemiology of Obesity and Diabetes and
Their Cardiovascular Complications”, Circ. Res., 118(11), 1723-1735.
[45]. Bjork S., Kapur A., King H., Nair J., Ramachandran A. (2003), “Global policy:
aspects of diabetes in India”, Health Policy, 66(1), 61-72.
[46]. Borah M., Das S. (2017), “Antidiabetic, antihyperlipidemic, and antioxidant
activities of Musa balbisiana Colla. in Type 1 diabetic rats”, Indian J.
Pharmacol. 49(1), 71-76.
[47]. Bösenberg L.H., ChB M.B. (2008), “The mechanism of action of oral
antidiabetic drugs: A review of recent literature”, Metabolism and Diabetes of
South Africa, 13(3), 80-88.
[48]. Budluang P., Pitchakarn P., Ting P., Temviriyanukul P., Wongnoppawich A.,
Imsumran A. (2016). “Anti-inflammatory and anti- insulin resistance activities
of aqueous extract from Anoectochilus burmannicus”, Food Sci. Nutr., 5(3),
486–496.
[49]. Calle M.C., Fernandez M.L. (2012), “Inflammation and type 2 diabetes”,
Diabetes & Metabolism, 38(3), 183-191.
[50]. Caroll N.V., Longley R.W., Roe J.H. (1956), “The determination of glycogen
126
in liver and muscle by use of anthrone reagent”, J. Biol. Chem., 200, 583-93.
[51]. Cawthorn W.P., Sethi J.K. (2008), “TNF-α and adipocyte biology”, FEBS Lett.
582(1), 117-131.
[52]. Cerf M.E. (2013), “Beta Cell Dysfunction and Insulin Resistance”, Front.
Endocrinol (Lausanne), 4, 37.
[53]. Chang W.T., Huang W.C., Liou C.J. (2012), “Evaluation of the anti-
inflammatory effects of phloretin and phlorizin in lipopolysaccharide-
stimulated mouse macrophages”, Food Chem., 134(2), 972-979.
[54]. Chaturvedula V.S.P., Huang R. (2013), “Isolation and NMR Spectral Studies of
Dihydromyricetin”, J. Pharmacogn. Phytochem., 2(4), 113-115.
[55]. Chiabchalard A., Nooron N. (2015), “Antihyperglycemic effects of Pandanus
amaryllifolius Roxb. leaf extract”, Pharmacogn. Mag., 11(41), 117-122.
[56]. Cho B.O., Yin H.H., Park S.H., Byun E.B., Ha H.Y., Jang S.I. (2016), “Anti-
inflammatory activity of myricetin from Diospyros lotus through suppression
of NF-κB and STAT1 activation and Nrf2-mediated HO-1 induction in
lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophages”, Biosci. Biotechnol.
Biochem., 80(8), 1520-1530.
[57]. Cho N.H., Shaw J.E., Karuranga S., Huang Y., da Rocha Fernandes J.D.,
Ohlrogge A.W., Malanda B. (2018), “IDF Diabetes Atlas: Global estimates of
diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045”, Diabetes. Res. Clin.
Pract., 138, 271-281.
[58]. Choi H.N., Kang M.J., Lee S.J., Kim J.I. (2014), “Ameliorative effect of
myricetin on insulin resistance in mice fed a high-fat, high-sucrose diet”, Nutr.
Res. Pract., 8(5), 544-549.
[59]. Chuang C.C., Martinez K., Xie G., Kennedy A., Bumrungpert A., Overman A.,
Jia W., McIntosh M.K. (2010), “Quercetin is equally or more effective than
resveratrol in attenuating tumor necrosis factor-{alpha}-mediated inflammation
and insulin resistance in primary human adipocytes”, Am. J. Clin. Nutr., 92(6),
1511-1521.
127
[60]. Croze M.L. (2013), Study of the insulin-sensitizing effect of myo-inositol in
mouse: Evaluation of the nutritional interest of a myo-inositol supplementation,
PhD. thesis of biochemistry, Doctoral School of Health Science.
[61]. Dai S., Hong Y., Xu J., Lin Y., Si Q., Gu X. (2018), “Ginsenoside Rb2 promotes
glucose metabolism and attenuates fat accumulation via AKT-dependent
mechanisms”, Biomed. Pharmacother., 100, 93-100.
[62]. Dajun H., Dongyu G., Huang Y., Ayupbek A., Yang Y., Aisa H.A., Ito Y.
(2009), “Separation and purification of phenolic acids and myricetin from black
currant by high speed countercurrent chromatography”, J. Liq. Chromatogr.
Relat. Technol., 32(20), 3077-3088.
[63]. De Luca C., Olefsky J.M. (2008), “Inflammation and insulin resistance”, FEBS
Lett., 582(1), 97-105.
[64]. Deeds M.C., Anderson J.M., Armstrong A.S., Gastineau D.A., Hiddinga H.J.,
Jahangir A., Eberhardt N.L., Kudva Y.C. (2011), “Single Dose Streptozotocin
Induced Diabetes: Considerations for Study Design in Islet Transplantation
Models”, Lab. Anim., 45(3), 131-140.
[65]. Deeg R., Zlegenhorn J. (1983), “Kinetic Enzymic Method for Automated
Determination of Total Cholesterol insulin Serum”, Clinical. Chemistry.,
29(10), 1798 – 1802.
[66]. Den Hartogh D.J., Tsiani E. (2019), “Antidiabetic Properties of Naringenin: A
Citrus Fruit Polyphenol”, Biomolecules, 9(3), 99.
[67]. Duc Son L.N., Kusama K., Hung N.T., Loan T.T., Chuyen N.V., Kunii D., Sakai
T., Yamamoto S. (2004), “Prevalence and risk factors for diabetes in Ho Chi
Minh city, Viet Nam”, Diabet. Med., 21(4), 371-376.
[68]. El-Shafey A., El-Ezabi M.M., Seliem M., Ouda H.H.M. (2013), “Effect of
Gymnema sylvestre R. Br. leaves extraction certain physiological parameters of
diabetic rat”, J. King Saud Univ. Sci., 25(2), 135-141.
[69]. Erasto P., Afolayan A.J., Grierson D.S. (2007), “Antioxidant Constituents in
Vernonia amygdalina leaves”, J. Pharm. Biol., 45(3), 195-199.
[70]. Eyong E.U., Agiang M.A., Atangwho I.J., Iwara I.A., Odey M.O., Ebong P.E.
128
(2011), “Phytochemicals and micronutrients composition of root and stem bark
extracts of Vernonia amygdalina Del.”, J. Med. Sci., 2(6), 900-90330.
[71]. Ezeani C., Ezenyi I., Okoye T., Okoli C. (2017), “Ocimum basilicum extract
exhibits antidiabetic effects via inhibition of hepatic glucose mobilization and
carbohydrate metabolizing enzymes”, J. Intercult. Ethnopharmacol., 6(1), 22-
28.
[72]. Fu-Chih Chen, Kuo-Ping Shen, Liang-Yin Ke, Hui-Li Lin, Chia-Chang
Wu, and Shyh-Yu Shaw (2019), “Flavonoids from Camellia sinensis (L.) O.
Kuntze seed ameliorates TNF-α induced insulin resistance in HepG2 cells”,
Saudi Pharm. J., 27(4), 507-516.
[73]. Gao F., Jian L., Zafar M.I., Du W., Cai Q., Shafqat R.A., Lu F. (2015),
“4-Hydroxyisoleucine improves insulin resistance in HepG2 cells by decreasing
TNF-α and regulating the expression of insulin signal transduction proteins”,
Molecular Medicine Reports, 12(5), 6555-6560.
[74]. Gothai S., Ganesan P., Park S., Fakurazi S., Choi D., Arulselvan P. (2016),
“Natural phyto-bioactive compounds for the treatment of type 2 diabetes:
Inflammation as a target”, Nutrients, 8(461), 1-28.
[75]. Ha D.T., Thuong P.T., Thuan N.D. (2007), “Protective action of Ampelopsis
cantoniensis and its major constituent - Myricetin against LDL oxidation”. J.
Chem., 45(6), 768-771.
[76]. Habtamu A., Melaku Y. (2018), “Antibacterial and Antioxidant Compounds
from the Flower Extracts of Vernonia amygdalina”, Adv. Pharmacol. Sci., 2018,
1-6.
[77]. Herrera I.C., Martín M.A., Bravo L., Goya L., Ramos S. (2013), “Cocoa
flavonoids improve insulin signalling and modulate glucose production via
AKT and AMPK in HepG2 cells”, Mol. Nutr. Food Res., 00, 1–12.
[78]. Hong M., Cai Z., Song L., Liu Y., Wang Q., Feng X. (2018), “Gynostemma
pentaphyllum attenuates the progression of nonalcoholic fatty liver disease in
mice: a biomedical investigation integrated with in silico assay”, Evid. Based.
129
Complement. Alternat. Med., 2018, 1-13.
[79]. Hua F., Zhou P., Wu H.Y., Chu G.X., Xie Z.W. , Bao G.H. (2018), “Inhibition
of α-glucosidase and α-amylase by flavonoid glycosides from Lu'an GuaPian
tea: molecular docking and interaction mechanism”, Food Funct., 9(8), 4173-
4183.
[80]. Huang D.W., Shen S.C., Wu J.S. (2009), “Effects of caffeic acid and cinnamic
acid on glucose uptake in insulin-resistant mouse hepatocytes”, J. Agric. Food
Chem., 57(17), 7687-7692.
[81]. Huang X.Y., Fu J.F., Di D.L. (2010), “Preparative isolation and purification of
steviol glycosides from Stevia rebaudiana Bertoni using high-speed counter-
current chromatography”, Sep. Purif. Technol., 71(2), 220-224.
[82]. Huang Y.C., Chang W.L., Huang S.F., Lin C.Y., Lin H.C., Chang T.C. (2010),
“Pachymic acid stimulates glucose uptake through enhanced GLUT4
expression and translocation”, Eur. J. Pharmacol., 648, 39-49.
[83]. Huyen V.T.T., Phan D.V., Thang P., Ky P.T., Hoa N.K., Ostenson C.G. (2010),
“Antidiabetic effect of Gynostemma pentaphyllum tea in randomly assigned
type 2 diabetic patients”, Horm. Metab Res. 42(5), 353-357.
[84]. IDF (2010), Diabes Atlas, International diabetes federation, 4.
[85]. Ijeh I.I., Ejike C.E.C.C. (2011), “Current perspectives on the medicinal
potentials of Vernonia amygdalina Del.”, J. Med. Plant Res., 5, 1054-1059.
[86]. Iwo M.I., Sjahlim S.L., Rahmawati S.F. (2017), “Effect of Vernonia amygdalina
Del. leaf ethanolic extract on intoxicated male wistar rats liver”, Sci. Pharm.,
85(2), 1-7.
[87]. Jeong E.Y., Cho K.S., Lee H.S. (2012), “α-Amylase and α-Glucosidase
Inhibitors Isolated from Triticum aestivum L. Sprouts”, J. Korean Soc. Appl.
Biol. Chem., 55, 47-51.
[88]. Jisaka M., Ohigashi H., Takagaki T., Nozakia H., Tadab T., Hirotac M., Iriec
R., Huffman M.A., Nishidad T., Kajie M., Koshimizu K. (1992), “Bitter Steroid
Glucosides, Vernoniosides A1, A2, and A3, and Related B1 from a Possible
Medicinal Plant, Vernonia amygdalina, used by Wild Chimpanzees”,
130
Tetrahedron, (48)4, 625-632.
[89]. Jisaka M., Ohigashi H., Takegawa K., Hirota M., Irie R., Huffman M.A.,
Koshimizu K. (1993), “Steroid glucosides from Vernonia amygdalina,
apossible chimpanzee medicinal plant”, Phytochemistry, 34(2), 409-413.
[90]. Johnson W., Tchounwou P.B., Yedjou C.G. (2017), “Therapeutic Mechanisms
of Vernonia amygdalina Delile in the Treatment of Prostate Cancer”,
Molecules, 22, 1594.
[91]. Juárez-Rojop I.E., Díaz-Zagoya J.C., Ble-Castillo J.L., Miranda-Osorio P.H.,
Castell-Rodríguez A.E., Tovilla-Zárate C.A., Rodríguez-Hernández A.,
Aguilar-Mariscal H., Ramón-Frías T., Bermúdez-Ocaña D.Y. (2012),
“Hypoglycemic effect of Carica papaya leaves in streptozotocin-induced
diabetic rats”, BMC Complement. Altern. Medicine.,12 (1), 1-11.
[92]. King H., Aubert R.E., Herman W.H. (1998), “Global burden of diabetes, 1995-
2025: prevalence, numerical estimates, and projections”, Diabetes. Care.,
21(9), 1414- 1431.
[93]. Kirk D.N., Toms H.C., Douglas C., White K.A., Smith K.E., Latif S., Hubbard
R.W.P. (1990), “A survey of the high-field 1H-NMR spectra of the steroid
hormones, their hydroxylated derivatives, and related compounds”, J. Chem.
Soc. Perkin Trans., 2, 1567-1594.
[94]. Lee H.N., Shin S.A., Choo G.S., Kim H.J., Park Y.S., Kim B.S. (2017), “Anti
inflammatory effect of quercetin and galangin in LPS stimulated RAW264.7
macrophages and DNCB induced atopic dermatitis animal models”, Int. J. Mol.
Med., 888-898.
[95]. Li H., Li Q., Liu Z., Yang K., Chen Z., Cheng Q., Wu L. (2017), “ The Versatile
Effects of Dihydromyricetin in Health”, Evid. Based. Complement. Alternat.
Med., 1-10.
[96]. Li K., Yao F., Xue Q., Fan H., Yang L., Li X., Sun L., Liu Y. (2018), “Inhibitory
effects against α-glucosidase and α-amylase of the flavonoids-rich extract
from Scutellaria baicalensis shoots and interpretation of structure–activity
relationship of its eight flavonoids by a refined assign-score method”, Chem.
131
Cent. J., 12(1), 82.
[97]. Li S., Zhang Y., Sun Y., Zhang G., Bai J., Guo J., Su X., Du H., Cao X., Yang
J., Wang T. (2019), “Naringenin improves insulin sensitivity in gestational
diabetes mellitus mice through AMPK”, Nutr. Diabetes., 9, 28.
[98]. Liao L., Chen J., Liu L., Xiao A. (2018), “Screening and Binding Analysis of
Flavonoids with Alpha-Amylase Inhibitory Activity from Lotus Leaf”, J. Braz.
Chem. Soc., 29(3), 587-593.
[99]. Liu D., Zhang Y., Liu Y., Hou L., Li S., Tian H., Zhao T. (2018), “Berberine
Modulates Gut Microbiota and Reduces Insulin Resistance via the TLR4
Signaling Pathway”, Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes., 126(8), 513-520.
[100]. Luyen N.T., Dang N.H., Binh P.T.X., Hai N.T., Dat N.T. (2018),
“Hypoglycemic property of triterpenoid saponin PFS isolated from Polyscias
fruticosa leaves”, An. Acad. Bras. Cienc., 90(3), 2881-2886.
[101]. Ma C., Nie A., Zhang Z., Zhang Z., Du L., Li X., Ning G. (2013), “Genipin
stimulates glucose transport in C2C12 myotubes via an IRS-1 and calcium-
dependent mechanism”, J. Endocrinol., 216, 353-362.
[102]. Mahmouda I.I., Marzoukb M.S.A., Moharrama F.A., El-Gindia M.R., Hassana
A.M.K., (2001) “Acylated flavonol glycosides from Eugenia jambolana
leaves”, Phytochemistry, 58,1239-1244.
[103]. Manaharan T., Appleton D., Cheng H.M., Palanisamy U.D. (2012),
“Flavonoids isolated from Syzygium aqueum leaf extract as potential
antihyperglycaemic agents”, Food Chem., 132, 1802-1807.
[104]. Megalli S., Davies N.M., Roufogalis B.D. (2006), “Anti-hyperlipidemic and
hypoglycemic effects of Gynostemma pentaphyllum in the Zucker fatty rat”, J.
Pharm. Pharm. Sci., 9(3), 281-291.
[105]. Meireles M.A.A. (2008), “Extracting Bioactive Compounds For Food
Products: Theory and Applications”, CRC Press, NewYork.
[106]. Meneses M.J., Silva B.M., Sousa M., Sá R., Oliveira P.F., Alves M.G. (2015),
“Antidiabetic Drugs: Mechanisms of Action and Potential Outcomes on
Cellular Metabolism”, Curr. Pharm. Des., 21(25), 3606-3620.
132
[107]. Mohd-Radzman N.H., Ismail W.I., Jaapar S.S., Adam Z., Adam A. (2013),
“Stevioside from Stevia rebaudiana Bertoni Increases Insulin Sensitivity in
3T3-L1 Adipocytes”, Evid. Based. Complement. Alternat. Med., 2013(1), 1-8.
[109] [108]. Nafiu M.O., Ashafa A.O.T. (2017), “Antioxidant and inhibitory effects
of saponin extracts from Dianthus basuticus Burtt Davy on key enzymes
implicated in type 2 diabetes In vitro”, Pharmacogn. Mag., 13(52), 576-582.
[110] [109]. Nagja T., Vimal K., Acharya S. (2016), “Anti-Diabetic Activity of a
Polyherbal Formulation in Streptozotocin Induced Type 2 Diabetic Rats”, J.
Nat. Med., 2016, 149-152.
[110]. Navghare V.V., Dhawale S.C. (2017), “In vitro antioxidant, hypoglycemic and
oral glucose tolerance test of banana peels”, Alexandria J. Med., 53(3), 237-
243.
[111]. Nhi Y.T.N., Ngoc S.L.P., Phu H.D., Duc M.N., Huu P.D., Quan L.T. (2019),
“Two new meroterpenoids from the aerial parts of Ampelopsis cantoniensis
(Vitaceae)”, J. Asian Nat. Prod. Res., 1-7.
[112]. Nickavar B., Amin G. (2010), “Bioassay-guided separation of an alpha-
amylase inhibitor anthocyanin from Vaccinium arctostaphylos berries”, Z.
Naturforsch, 65c, 567-570.
[113]. Oh Y.S. (2015), “Plant-Derived Compounds Targeting Pancreatic Beta Cells
for the Treatment of Diabetes”, Evid. Based. Complement. Alternat. Med.,
2015(1), 1-12.
[114]. Oh Y.S., Bae G.D., Baek D.J., Park E.Y., Jun H.S. (2018), “Fatty Acid-Induced
Lipotoxicity in Pancreatic Beta-Cells During Development of Type 2 Diabetes”,
Front. Endocrinol. (Lausanne), 9, 384.
[115]. Okoduwa S.I.R., Umar I.A., James D.B., Inuwa H.M. (2017), “Validation of the
antidiabetic effects of Vernonia amygdalina delile leaf fractions in fortified diet-
fed streptozotocin-treated rat model of type-2 diabetes”, J. Diabetol., 8(3), 74-85.
[116]. Okokon J.E., Nyong M.E. (2018), “Antidiabetic and hypolipidemic activities
of Zea mays husk extract and fractions”, J. Herbs Spices Med. Plants, 24(2),
134-150.
133
[117].Omoregie E.S., Pal A. (2016), “Antiplasmodial, antioxidant and
immunomodulatory activities of ethanol extract of Vernonia amygdalina del.
Leaf in Swiss mice”, Avicenna J. Phytomed., 6(2), 236-247.
[118]. Owoeye O., Yousuf S., Akhtar M.N., Qamar K., Dar A., Farombi E.O.,
Onwuka S.K., Choudhary M.I. (2010), “Another Anticancer Elemanolide
from Vernonia amygdalina Del.”, Int. J. Biol. Chem. Sci., 4 (1), 226-234.
[119]. Park J.H., Lee H.S. (2015), “Inhibitory Effects of Quinoline Isolated from Ruta
chalepensis and Its Structurally Related Derivatives against α-Amylase or α-
Glucosidase”, J. Appl. Biol. Chem., 58(1), 5-8.
[120]. Patel D.K., Prasad S.K., Kumar R., Hemalatha S. (2012), “An overview on
antidiabetic medicinal plants having insulin mimetic property”, Asian Pac. J.
Trop. Biomed., 2(4), 320-330.
[121]. Petchi R.R, Vijaya C., Parasuraman S. (2014), “Antidiabetic Activity of
Polyherbal Formulation in Streptozotocin - Nicotinamide Induced Diabetic
Wistar Rats”, J. Tradit. Complement. Med., 4(2), 108-117.
[122]. Pollack R.M., Donath M,Y, LeRoith D., Leibowitz G. (2016), “Anti-
inflammatory Agents in the Treatment of Diabetes and Its Vascular
Complications”, Diabetes Care, 39(2), 244-252.
[123]. Porika R., Estari M. (2015), “Anti-diabetic activity of compound isolated from
Physalis angulata fruit extracts in alloxan induced diabetic rats”, Am. J. Med.
Sci., 1(1), 40-43.
[124]. Prata C., Zambonin L., Rizzo B., Maraldi T., Angeloni C., Vieceli Dalla Sega
F., Fiorentini D., Hrelia S. (2017), “Glycosides from Stevia rebaudiana
Bertoni Possess Insulin-Mimetic and Antioxidant Activities in Rat Cardiac
Fibroblasts”, Oxid. Med. Cell. Longev., 2017, 3724545.
134
[125]. Qin X., Xing Y.F., Zhou Z., Yao Y. (2015), “Dihydrochalcone Compounds
Isolated from Crabapple Leaves Showed Anticancer Effects on Human Cancer
Cell Lines”, Molecules, 20 (12), 21193-21203.
[126]. Ragheb R., Medhat A.M. (2011), “Mechanisms of Fatty Acid-Induced Insulin
Resistance in Muscle and Liver”, J. Diabetes Metab., 2011, 2(4), 1-5.
[127]. Ramachandran A., Snehalatha C., Shetty A.S., Nanditha A. (2012), “Trends in
prevalence of diabetes in Asian countries”, World J. Diabetes, 3(6), 110-117.
[128]. Rehman K., Akash M.S. (2016), “Mechanisms of inflammatory responses and
development of insulin resistance: how are they interlinked?”, J. Biomed. Sci.,
23, 87.
[129]. Rugerio-Escalona C., Ordaz-Pichardo C., Becerra-Martinez E., Cruz-López
M.D.C., López-Y-López V.E., Mendieta-Moctezuma A., Maldonado-Mendoza
I.E., Jiménez-Montejo F.E. (2018), “Diabetes and Metabolism Disorders
Medicinal Plants: A Glance at the Past and a Look to the Future 2018:
Antihyperglycemic Activity of Hamelia patens Jacq. Extracts”, Evid. Based.
Complement. Alternat. Med., 9.
[130]. Ruiz-Ruiz J.C., Moguel-Ordoñez Y.B., Matus-Basto A.J., Segura-Campos
M.R. (2015), “Antidiabetic and antioxidant activity of Stevia rebaudiana
extracts (Var. Morita) and their incorporation into a potential functional bread”,
J. Food Sci. Technol., 52(12), 7894-7903.
[131]. Runtuwene J., Cheng K., Asakawa A., Amitani H., Amitani M., Morinaga A.,
Takimoto Y., Kairupan B.H.R., Inui A., (2016), “Rosmarinic acid ameliorates
hyperglycemia and insulin sensitivity in diabetic rats, potentially by modulating
the expression of PEPCK and GLUT4”, Drug Des. Devel. Ther., 2016(10),
2193-2202.
[132]. Saleh S., El-Maraghy N., Reda E., Barakat W. (2014), “Modulation of diabetes
and dyslipidemia in diabetic insulin-resistant rats by Mmangiferin: Role of
adiponectin and TNF-α”, An. Acad. Bras. Cienc., 86(4), 1935-1947.
[133]. Salehi P., Asghar B., Esmaeili M.A., Dehghan H., Ghazi I. (2013), “α-
135
Glucosidase and α-amylase inhibitory effect and antioxidant activity of ten plant
extracts traditionally used in Iran for diabetes”, J. Med. Plants Res., 7(6). 257-
266.
[134]. Samaddar S., Koneri R. (2019), “Saponin of Momordica cymbalaria exhibits
anti-inflammatory activity by suppressing the expression of inflammatory
mediators in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophages”,
Pharmacognosy Res., 11(1), 8-13.
[135]. Sari D.R.A.P., Ahmad F.F., Djabir Y.Y., Yulianty R. (2020), “Breadfruit leaves
extract (Artocarpus altilis) effect on pancreatic damage in diabetic type II
animal model induced by alloxan–nicotinamide”, Med. Clin. Pract., 3(S1), 1-4.
[136]. Satria D., Hasibuana P.A.Z., Harahapa U., Sitorusb P. (2021), “The anticancer
activities of Vernonia amygdalina Delile. leaves on 4T1 breastcancer cells
through phosphoinositide 3-kinase (PI3K) pathway”, Heliyon , 6(2020), 1-5.
[137]. Sawant S.P., Dnyanmote A.V., Mitra M.S., Chilakapati J., Warbritton A.,
Latendresse J.R, Mehendale H.M. (2006), “Protective effect of type 2 diabetes
on acetaminophen-induced hepatotoxicity in male swiss webster mice”, J.
Pharmacol. Exp. Ther., 316 (2), 507-519.
[138]. Selvaraj K., Chowdhury R., Bhattacharjee C. (2013), “Isolation and structural
elucidation of flavonoids from aquatic fern Azolla microphylla and evaluation
of free radical scavenging activity”, Int. J. Pharm. Pharm. Sci., 5(3), 743-749.
[139]. Serafini M., Peluso I., Raguzzini A. (2010), “Flavonoids as anti-inflammatory
agents”, Proc. Nutr. Soc., 69(3), 273-278.
[140]. Shivanna N., Naika M., Khanum F., Kaul V.K. (2013), “Antioxidant, anti-
diabetic and renal protective properties of Stevia rebaudiana”, J. Diabetes
Complications, 27(2), 103-113.
[141]. Solomon S.S., Mishra S.K., Palazzolo M.R., Postlethwaite A.E., Seyer J.M.
(1997), “Identification of specific sites in the TNF-α molecule promoting
insulin resistance in H-411E cells” J. Lab. Clin. Med., 130(2), 139-146.
[142]. Sudasinghe H.P., Peiris D.C. (2018), “Hypoglycemic and hypolipidemic
136
activity of aqueous leaf extract of Passiflora suberosa L.”, Peer J., 6, 1-17.
[143]. Świderska E., Strycharz J., Wróblewski A., Szemraj J., Drzewoski J., Śliwińska
A. (2018), Blood Glucose Levels, Chapter: Role of PI3K/AKT Pathway in
Insulin-Mediated Glucose Uptake, IntechOpen, 1-18.
[144]. Tan T.W., Tsai H.Y., Chen Y.F., Chung J.G. (2004), “Induction of apoptosis in
human promyelocytic Leukemia HL-60 cells by Ampelopsis cantoniensis crude
extract”, In Vivo, 8(4), 457-462.
[145]. Thao N.P., Binh P.T., Luyen N.T., Hung T.M., Dang N.H., Dat N.T. (2018),
“α-Amylase and α-glucosidase inhibitory activities of chemical constituents
from Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. leaves”, J. Anal. Methods. Chem.,
2018.
[146]. Thu V.N., Cuong T.D., Hung T.M., Van Luong H., Woo M.H., Choi J.S., Lee
J.H., Kim J.A., Min B.S. (2015), “Anti-inflammatory compounds from
Ampelopsis cantoniensis”, Nat. Prod. Commun., 10(3), 383-385.
[147]. Tsaku A.P., Ibrahim T., Ekeleme I.K., Nkenne I.H., Oti V.B., Abimiku R.H.
(2018), “Phytochemical and antibacterial analysis of aqueous and alcoholic
extracts of Vernonia amygdalina (del.) leaf”, World J. Pharm. Res., 7(7), 9-17.
[148]. Tundis R., Loizzo M.R., Menichini F. (2010), “Natural Products as -amylase
and -glucosidase inhibitors and their hypoglycaemic potential in the treatment
of diabetes: An update”, Mini. Rev. Med. Chem., 10, 315-331.
[149]. Ukpabi C.F., Chukwu M.N., Onyemaechi J.N., Ibe P., Onuh E.F. (2019),
“Antidiabetic and antihyperlipidemic effects of aqueous extract of Carica
papaya leaf on the experimental model against single alloxan toxicity”, World
Sci. Res., 6(1), 14-18.
[150]. Usmana W.A., Agadaa R., Shehua S., Thagariki D. (2020), “In vitro and in vivo
inhibitory effects of Carica papaya seed on α-amylase and α-glucosidase
enzymes”, Heliyon, 6(3), 1-12.
[151]. Verma S., Gupta M., Popli H. and Aggarwal G. (2018), “Diabetes mellitus
treatment using herbal drugs”, Int. J. Phytomedicine, 10(10), 1-10.
137
[152]. Wang M., Li J., Rangarajan M., Shao Y., LaVoie E.J., Huang T.C., Ho C.T.
“Antioxidative phenolic compounds from sage (Salvia officinalis)” (1998), J.
Agric. Food Chem., 46(12), 4869-4873.
[153]. Wang Z., Wang J., Chan P. (2013),“Treating type 2 diabetes mellitus with
traditional Chinese and Indian medicinal herbs”, Evid. Based. Complement.
Alternat. Med., 2013, 1-17.
[154]. Wang Z., Zhao X., Liu X., Lu W., Jia S., Hong T., Li R., Zhang H., Peng L.,
Zhan X. (2019), “Anti-diabetic activity evaluation of a polysaccharide extracted
from Gynostemma pentaphyllum”, Int. J. Biol. Macromol., 126, 209-214.
[155]. Widowati W., Wargasetia T.L., Afifah E., Mozef T. (2018), “Antioxidant and
antidiabetic potential of Curcuma longa and its compounds”, Asian J. Agri. &
Biol., 6(2), 149-161.
[156]. Wilcox G. (2005), “Insulin and insulin resistance”, Clin. Biochem. Rev., 26(2),
19-39.
[157]. Wild S., Roglic G., Green A., Sicree R., King H. (2004), “Global prevalence of
diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030”, Diabetes Care,
27(5), 1047-1053.
[158]. Wu H., Ballantyne C.M. (2020), “Metabolic inflammation and insulin resistance
in obesity”, Circ. Res., 26(11), 1549-1564.
[159]. Xie Y., Zhang Y., Guo Z., Zeng H., Zheng B. (2016), “Effect of alkaloids from
Nelumbinis Plumula against insulin resistance of high-fat diet-induced
nonalcoholic fatty liver disease in mice”, J. Diabetes Res., 2016.
[160]. Xin S., Nan Z., Shengyong Z. (2017), “Phloretin exerts hypoglycemic effect in
streptozotocin-induced diabetic rats and improves insulin resistance in vitro”,
Drug Des. Devel. Ther., 11, 313-324.
[161]. Xu Z., Zhang Y., et al. (2000), “Analysis and evaluation of nutritional
component and flavol of Ampelosis cantoniensis leaf”, Academy of Agricultural
Sciences, 21(12), 113-114.
[162]. Yadav R.K., Keshari A.K, Singh A.K, Saha S. (2015), “Antidiabetic and
138
hypolipidemic effect of Ficus racemosa petroleum ether extract in
streptozotocin induced diabetic albino rats”, Int. J. Pharm. Pharm., 7(4), 283-
287.
[163]. Ya'u M. (2017), “In vitro antioxidant and antidiabetic potential of Gymnema
sylvestre methanol leaf extract”, Eur. Sci. J., 13(36), 218-238.
[164]. Yin S., Liu X., Chen Y., Wu Y., Zheng W., Dong H., Bai Y., Qin Y., Li J.,
Feng S., Zhao P. (2018), “LPS-induced proinflammatory cytokine expression
in human airway epithelial cells and macrophages via NF-κB, STAT3 or AP-1
activation”, Mol. Med. Rep., 17(4), 5484-5491.
[165]. Yin Z., Zhang W., Feng F., Zhang Y., Kang W. (2014), “α-Glucosidase
inhibitors isolated from medicinal plants”, Food Sci. Hum. Wellness, 3(3–4),
pp. 136-174.
[166]. Yoon C.S., Kim D.C., Park J.S., Kim K.W., Kim Y.C., Oh H. (2018), “Isolation
of novel sesquiterpenoids and anti-neuroinflammatory metabolites
from Nardostachys jatamansi”, Molecules, 23(9), 2367.
[167]. Zatterale F., Longo M., Naderi J., Raciti G.A., Desiderio A., Miele C., Beguinot
F. (2019), “Chronic adipose tissue inflammation linking obesity to insulin
resistance and type 2 diabetes”, Front. Physiol.,10, 1607-1626.
Trang web:
[168].https://nhandan.vn/tin-tuc-y-te/70-nguoi-mac-benh-dai-thao-duong-tai-viet-
nam-chua-duoc-chan-doan-304235.
[169].https://suckhoenoitiet.vn/download/Tap%20chi%20Dai%20Thao%20Duong_
sua%20lan%203-1517247563.pdf.
PL1
PHỤ LỤC 1. BỘ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CHẤT CDE1 (MYRICETIN)............... 3
Phụ lục 1.1. Phổ 1H của chất CDE1 (myricetin) ...................................................... 3
Phụ lục 1.2. Phổ 13C của hợp chất CDE1 (myricetin) ............................................. 4
Phụ lục 1.3. Phổ HMBC của hợp chất CDE1 (myricetin) ........................................ 5
Phụ lục 1.4. Phổ HSQC của hợp chất CDE1 (myricetin).......................................... 6
Phụ lục 1.5. Các số liệu phổ của myricetin .............................................................. 7
PHỤ LỤC 2. BỘ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CHẤT CDE2 (DIHYDROMYRICETIN)
................................................................................................................................ 8
Phụ lục 2.1. Phổ 1H của chất CDE2 (dihydromyricetin) .......................................... 8
Phụ lục 2.2. Phổ 13C của chất CDE2 (dihydromyricetin) ........................................ 9
Phụ lục 2.3. Phổ HMBC của chất CDE2 (dihydromyricetin) ................................. 10
Phụ lục 2.4. Phổ HSQC của chất CDE2 (dihydromyricetin) .................................. 11
Phụ lục 2.5. Các số liệu phổ của dihydromyricetin ................................................ 12
PHỤ LỤC 3. BỘ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CHẤT CDE3 (PHLORETIN) ............ 13
Phụ lục 3.1. Phổ 1H của chất CDE3 (phloretin) ..................................................... 13
Phụ lục 3.2. Phổ 13C của chất CDE3 (phloretin) ................................................... 14
Phụ lục 3.3. Phổ HMBC của chất CDE3 (phloretin) .............................................. 15
Phụ lục 3.4. Phổ HSQC của chất CDE3 (phloretin) ............................................... 16
PHỤ LỤC 4. BỘ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CHẤT CDE4 (MYRICITRIN) ........... 17
Phụ lục 4.1. Phổ 1H của chất CDE4 (myricitrin) ................................................... 17
Phụ lục 4.2. Phổ 13C của chất CDE4 (myricitrin) .................................................. 18
Phụ lục 4.3. Phổ HMBC của chất CDE4 (myricitrin) ............................................. 19
Phụ lục 4.4. Phổ HSQC của chất CDE4 (myricitrin) .............................................. 20
PHỤ LỤC 5. BỘ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CHẤT CDE5 (QUERCETIN) ............ 21
Phụ lục 5.1. Phổ 1H của chất CDE5 (quercetin) .................................................... 21
Phụ lục 5.2. Phổ 13C của chất CDE5 (quercetin) ................................................... 22
Phụ lục 5.3. Phổ HMBC của chất CDE5 (quercetin) .............................................. 23
PL2
Phụ lục 5.4. Phổ HSQC của chất CDE5 (quercetin) ............................................... 24
PHỤ LỤC 5.5. CÁC SỐ LIỆU PHỔ CỦA QUERCETIN ................................. 25
PHỤ LỤC 6. BỘ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CHẤT LĐE (CYNAROSIDE) ............ 26
Phụ lục 6.1. Phổ 1H của chất LĐE (cynaroside) .................................................... 26
Phụ lục 6.2. Phổ 13C của chất LĐE (cynaroside)................................................... 27
Phụ lục 6.3. Phổ HMBC của chất LĐE (cynaroside) .............................................. 28
Phụ lục 6.4. Phổ HSQC của chất LĐE (cynaroside) ............................................... 29
Phụ lục 6.5. Phổ COSY của chất LĐE (cynaroside) ............................................... 30
Phụ lục 6.6. Phổ DEPT của chất LĐE (cynaroside) ............................................... 31
BẢNG 6.7. CÁC SỐ LIỆU PHỔ CỦA CYNAROSIDE .................................... 32
PHỤ LỤC 7. BỘ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CHẤT LĐB (VERNONIOSIDE E) .... 33
Phụ lục 7.1. Phổ 1H của chất LĐB (vernonioside E) ............................................. 33
Phụ lục 7.2. Phổ 13C của chất LĐB (vernonioside E) ............................................ 34
Phụ lục 7.3. Phổ HMBC của chất LĐB (vernonioside E) ....................................... 35
Phụ lục 7.4. Phổ HSQC của chất LĐB (vernonioside E) ........................................ 36
Phụ lục 7.5. Phổ COSY của chất LĐB (vernonioside E) ........................................ 37
Phụ lục 7.6. Phổ DEPT của chất LĐB (vernonioside E)......................................... 38
Phụ lục 7.7. Phổ NOESY của chất LĐB (vernonioside E) ..................................... 39
Phụ lục 7.8a. Phổ ESI-MS của chất LĐB (vernonioside E) .................................... 40
Phụ lục 7.8b. Phổ ESI-MS của chất LĐB (vernonioside E) .................................... 41
Phụ lục 7.9. Phổ HR ESI-MS của chất LĐB (vernonioside E) ............................... 42
PHỤ LỤC 8. CHUẨN BỊ CAO HỖN HỢP NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT CÓ
KHẢ NĂNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT .................................................................... 43
PL3
Phụ lục 1.1. Phổ 1H của chất CDE1 (myricetin)
PL4
Phụ lục 1.2. Phổ 13C của hợp chất CDE1 (myricetin)
PL5
Phụ lục 1.3. Phổ HMBC của hợp chất CDE1 (myricetin)
PL6
Phụ lục 1.4. Phổ HSQC của hợp chất CDE1 (myricetin)
PL7
a (mult., J = Hz)
C δH
*δC 146,75 135,88 175,71 160,69 98,20 164,08 93,21 156,07 102,86 120,74 107,11 145,73 135,84 145,73 107,11
2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ Myricetin (CDE1) a δC 148,0 137,3 177,2 162,4 99,2 165,5 94,3 158,2 104,5 123,1 108,5 146,7 136,9 146,7 108,5 6,20 (1H, d, 2,0) 6,40 (1H, d, 2,0) 7,36 (1H, s) 7,36 (1H, s)
Phụ lục 1.5. Các số liệu phổ của myricetin
PL8
Phụ lục 2.1. Phổ 1H của chất CDE2 (dihydromyricetin)
PL9
Phụ lục 2.2. Phổ 13C của chất CDE2 (dihydromyricetin)
PL10
Phụ lục 2.3. Phổ HMBC của chất CDE2 (dihydromyricetin)
PL11
Phụ lục 2.4. Phổ HSQC của chất CDE2 (dihydromyricetin)
PL12
a (mult., J = Hz)
Ampelopsin (dihydromyricetin-CDE2) C δH
4,88 (1H; d; 11,084.6 Hz) 4,52 (1H; d; 11,0 Hz) 5,91 (1H; d; 2,5 Hz) 5,95 (1H; d; 2,5 Hz)
*δC 83,3 71,7 197,7 163,4 95,9 166,8 95,0 162,6 100,5 127,2 106,9 145,7 133,5 145,7 106,9
a δC 84,6 72,9 198,0 163,9 95,9 168,1 96,9 164,8 101,3 128,7 107,9 6,59 (1H; s) 146,3 134,3 146,3 107,9 6,59 (1H; s)
2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ Tương tác HMBC chính C3; C2’; C6’, C1’, C4 C2; C1’ C8; C10; C5; C7 C6; C10; C9; C7 C2; C1’; C4’; C6’ C2; C2’; C4’; C1’
Phụ lục 2.5. Các số liệu phổ của dihydromyricetin
PL13
Phụ lục 3.1. Phổ 1H của chất CDE3 (phloretin)
PL14
Phụ lục 3.2. Phổ 13C của chất CDE3 (phloretin)
PL15
Phụ lục 3.3. Phổ HMBC của chất CDE3 (phloretin)
PL16
Phụ lục 3.4. Phổ HSQC của chất CDE3 (phloretin)
PL17
Phụ lục 4.1. Phổ 1H của chất CDE4 (myricitrin)
PL18
Phụ lục 4.2. Phổ 13C của chất CDE4 (myricitrin)
PL19
Phụ lục 4.3. Phổ HMBC của chất CDE4 (myricitrin)
PL20
Phụ lục 4.4. Phổ HSQC của chất CDE4 (myricitrin)
PL21
Phụ lục 5.1. Phổ 1H của chất CDE5 (quercetin)
PL22
Phụ lục 5.2. Phổ 13C của chất CDE5 (quercetin)
PL23
Phụ lục 5.3. Phổ HMBC của chất CDE5 (quercetin)
PL24
Phụ lục 5.4. Phổ HSQC của chất CDE5 (quercetin)
PL25
*δC
a
a (mult., J = Hz)
Quercetin (CDE5) C δC δH Tương tác HMBC chính
2 148,8 148,05
3 137,3 137,21
4 177,4 177,34
5 162,5 162,48
6 99,3 99,27 6,20 (1H; d; J= 2,0 Hz) C8; C10
7 165,6 165,57
8 94,5 94,44 6,41 (1H; d; J= 2,0 Hz) C6; C10
9 158,3 158,24
10 104,6 104,53
1’ 124,2 124,16
2’ 116,0 116,03 7,75 (1H; d; J= 2,0 Hz) C2; C4’; C6’
3’ 146,3 146,22
4’ 148,1 148,77
5’ 116,3 116,25 6,91 (1H; d; J= 8,5 Hz) C-3’; C-1’
7,65 (1H; dd; J= 2,5; 8,5 6’ 121,7 121,70 C2; C4’ Hz)
PL26
Phụ lục 6.1. Phổ 1H của chất LĐE (cynaroside)
PL27
Phụ lục 6.2. Phổ 13C của chất LĐE (cynaroside)
PL28
Phụ lục 6.3. Phổ HMBC của chất LĐE (cynaroside)
PL29
Phụ lục 6.4. Phổ HSQC của chất LĐE (cynaroside)
PL30
Phụ lục 6.5. Phổ COSY của chất LĐE (cynaroside)
PL31
Phụ lục 6.6. Phổ DEPT của chất LĐE (cynaroside)
PL32
Cynaroside (LĐE) a(mult., J = Hz)
δH 6,73 (1H; s)
6,44 (1H; d; 2,0 Hz) Tương tác HMBC C-10; C-7; C-4 C-8; C-10; C-5
C-1”; C-10
6,78 (1H; d; 2,0 Hz) 7,41 (1H; d; 2,0 Hz)
C-6’; C-4’; C-2 C-3’; C-1’
C-7 C-1”; C-3” C-4”; C-2” C-6”; C-3”
bδC 163,2 103,4 182,2 161,4 99,8 164,8 95,0 157,2 105,6 121,6 113,8 146,0 150,2 116,2 119,4 100,1 73,4 76,7 69,8 77,4 60,9
a δC 164,4 103,1 181,8 161,1 99,5 162,9 94,7 156,9 105,3 121,3 113,5 145,7 149,9 115,9 119,1 99,9 73,1 76,4 69,5 77,1 60,6
C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' C-3”;
6,91 (1H; d; 8,5 Hz) 7,45 (1H; dd; 2,0; 8,5 Hz) C-2’; C-4’; C-2 5,08 (1H; d; 7,5 Hz) 3,26 (1H; m) 3,29 (1H; m) 3,18 (1H; t; 5,0 Hz) 3,43 (1H; dd; 1,5; 5,5 Hz) C-3” 3,46 (1H; d; 3,0 Hz) 3,71 (1H; d; 5,5 Hz)
PL33
Phụ lục 7.1. Phổ 1H của chất LĐB (vernonioside E)
PL34
Phụ lục 7.2. Phổ 13C của chất LĐB (vernonioside E)
PL35
Phụ lục 7.3. Phổ HMBC của chất LĐB (vernonioside E)
PL36
Phụ lục 7.4. Phổ HSQC của chất LĐB (vernonioside E)
PL37
Phụ lục 7.5. Phổ COSY của chất LĐB (vernonioside E)
PL38
Phụ lục 7.6. Phổ DEPT của chất LĐB (vernonioside E)
PL39
Phụ lục 7.7. Phổ NOESY của chất LĐB (vernonioside E)
PL40
Phụ lục 7.8a. Phổ ESI-MS của chất LĐB (vernonioside E)
PL41
Phụ lục 7.8b. Phổ ESI-MS của chất LĐB (vernonioside E)
PL42
Phụ lục 7.9. Phổ HR ESI-MS của chất LĐB (vernonioside E)
PL43
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành kết hợp các thực vật đã nghiên cứu
có hiệu quả trong điều trị ĐTĐ để tạo thành sản phẩm có hiệu quả nhất trong đều trị
ĐTĐ. Các mẫu thực vật bao gồm chè dây (CD), lá đắng (LĐ), cỏ ngọt (CN), chuối
hột (CH), lá đu đủ (LĐĐ), hạt đu đủ (HĐĐ), dây thìa canh (DTC) và giảo cổ lam
(GCL), khi phối hợp các thực vật với nhau, mỗi sản phẩm cho khuyết một thành phần
theo tỷ lệ 1:1:1:1:1:1:1:1. Chuột nhắt ĐTĐ type 2 được chia thành 8 lô, mỗi lô gồm
7 con chuột được uống mỗi sản phẩm khác nhau với liều 500 mg/kg chuột/ngày.
Chuột được bố trí lô thí nghiệm theo bảng 1.
Bảng 1. Bố trí thí nghiệm chọn lọc hỗn hợp
Lô Cao chiết cho chuột uống Lô
ĐC Đối chứng (10 ml/kg.) 4
1 5
2 6
3 7 Cao chiết cho chuột uống DTC + GCL + CH + LĐĐ + HĐĐ + CD + LĐ DTC + GCL+ CH + LĐĐ + CN + CD + LĐ DTC + GCL+ CH + HĐĐ + CN + CD + LĐ DTC + GCL+ LĐĐ + HĐĐ + CN + CD + LĐ
DTC + GCL + CH+ LĐĐ + HĐĐ + CN + LĐ + CD DTC + GCL + CH + LĐĐ + HĐĐ + CN + LĐ DTC + GCL + CH + LĐĐ + HĐĐ + CN + CD
Thí nghiệm được kéo dài trong 21 ngày. Đường huyết chuột được đo lúc đói
tại các thời điểm 0 và 21 ngày. Chọn lọc cao hỗn hợp có hiệu quả hạ đường huyết tốt
trên chuột.
