Khoá luận: Nghiên cứu quy trình trích ly hoạt chất sinh học Phlorotannin từ rong mơ cho chế biến thực phẩm

§¹I HäC TH¸I NGUY£N

TR¦êNG §¹I HäC N¤NG L¢M ------------------------

trÇn thiªn kh¸

T

Tên đề tài:

Nghiªn cøu quy tr×nh trÝch ly ho¹t chÊt sinh häc

Phlorotannin tõ rong m¬ cho chÕ biÕn th−c phÈm

khãa luËn TèT NGHIÖP ®¹i häc

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Thực phẩm

Khoa : CNSH - CNTP

Khoá học : 2010 - 2014

Thái Nguyên, 2014

§¹I HäC TH¸I NGUY£N

TR¦êNG §¹I HäC N¤NG L¢M ------------------------

trÇn thiªn kh¸

T

Tên đề tài:

Nghiªn cøu quy tr×nh trÝch ly ho¹t chÊt sinh häc

Phlorotannin tõ rong m¬ cho chÕ biÕn th−c phÈm

khãa luËn TèT NGHIÖP ®¹i häc

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Thực phẩm

Khoa : CNSH - CNTP

Lớp : 42 - CNTP

Khoá học : 2010 - 2014

Giảng viên hướng dẫn : 1. ThS. Nguyễn Đức Tiến

2.ThS. Trần Thị Lý

Thái Nguyên, 2014

LỜI CẢM ƠN

Để có được kết quả nghiên cứu này, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Đức Tiến - Trưởng Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và Môi trường nông nghiệp thuộc Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, người đã trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ tận tình và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình thôi thực hiện luận văn.

ThS.Trần Thị Lý – cô giáo trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – trường Ðại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ, hỗ trợ về phương diện nghiên cứu, kiến thức và có những góp ý sâu sắc trong thời gian tôi thực hiện ðề tài.

Tôi xin gửi lời yêu thương chân thành đến bố mẹ, anh chị đã luôn ở bên

động viên trong suốt thời gian học tập.

Cuối cùng, Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè đã động viên, giúp đỡ, chia sẻ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng nãm 2014.

Sinh viên Trần Thiên Khá

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Diện tích rong mơ theo vùng biển các tỉnh. ..................................... 4 Bảng4.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly phlorotannin .................................................................................................... 31 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin ....... 32 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin ............ 34 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin ......... 36 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly phlorotannin ........ 38 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin ............. 39 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến hàm lượng phlorotannin ....... 40 Bảng 4.8. Kết quả đánh giá cảm quan dịch trích ly ........................................ 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

[tetrafucol A (i) và phlorotannin

Trang Hình 2.1. Phloroglucinol (ii), fucodiphloroethol B (iii), fucodiphlorethol A (iv), tetrafuhalol A (v), tetraisofuhalol (vi), phlorofucofuroeckol (vii)] và hoạt tính của chúng ............ 12 Hình 4.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly phlorotannin ............................................................................................ 31 Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin ......................................................................................................... 32 Hình 4.3. Đồ thì biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin ......................................................................................................... 34 Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin ......................................................................................................... 36 Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly phlorotannin ......................................................................................................... 38 Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin ......................................................................................................... 39 Hình 4.7. Sơ đồ quy trình trích ly phlorotannin từ rong Sargassum polycystom .............................................................................................................................. 44

MỤC LỤC

Trang

PHẦN 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài .................................................................. 2 1.2.1. Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................... 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 2.1. Giới thiệu chung về rong mơ ..................................................................... 3 2.1.1. Đặc điểm ................................................................................................. 3 2.1.2. Phân bố .................................................................................................... 4 2.1.3. Thành phần hóa học có trong rong mơ ................................................... 4 2.1.4. Vai trò của rong mơ đối với con người ................................................... 9 2.2. Giới thiệu về các hợp chất chống oxy hóa hiện nay ................................ 10 2.3. Giới thiệu về hợp chất Phlorotannin ........................................................ 12 2.3.1. Đặc điểm ............................................................................................... 12 2.3.2. Cơ chế oxi hóa của phlorotannin .......................................................... 13 2.3.3. Hoạt tính sinh học của phlorotannin ..................................................... 14 2.3.4. Tình hình nghiên cứu phlorotannin trên thế giới .................................. 15 2.3.5. Tình hình nghiên cứu phlorotannin ở Việt Nam ................................... 17 2.4. Giới thiệu về quá trình trích ly ................................................................. 18 2.4.1. Cơ sở của quá trình trích ly ................................................................... 18 2.4.2. Phạm vi sử dụng của quá trình .............................................................. 19 2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly ......................................... 19 2.5. Giới thiệu về phương pháp thu nhận ........................................................ 21 2.5.1. Phương pháp cô đặc .............................................................................. 21 2.5.2. Phương pháp sấy ................................................................................... 21 PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 23 3.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................ 23 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 23

3.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................... 23 3.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 23 3.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 23 3.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 24 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiêm .............................................................. 24 3.3.2. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý .................................................. 28 3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 30

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 31 4.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly phlorotannin ........................................................................................ 31 4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin .................................................................................................... 32 4.3. Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly Phlorotannin .................................................................................................... 34 4.4. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin .................................................................................................... 36 4.6. Kết quả xác định ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin .................................................................................................... 39 4.7. Kết quả xác định thông số thích hợp của quá trình cô đặc ...................... 40 4.8. Kết quả xác định thông số thông số thích hợp của quá trình ly tâm ........ 42 4.9. Đề xuất quy trình trích ly phlorotannin từ rong Sargassum Polycystom. .... 44

PHẦN 5 ........................................................................................................... 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 47 5.1. Kết luận .................................................................................................... 47 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 48

1

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Xã hội ngày càng phát triển, đời sống con người ngày càng được nâng cao. Con người không chỉ quan tâm đến những vấn đề ăn, mặc, ở đơn giản như trước đây mà còn có những yêu cầu cao hơn. Khi đời sống được nâng cao, con người ngày càng quan tâm hơn đến sức khỏe của mình. Do đó, những thực phẩm, vật dụng có thể gây hại cho sức khỏe dần bị loại bỏ và được thay thế bằng các sản phẩm được sản xuất từ các thành phần chiết xuất từ thiên nhiên. Nhu cầu của con người là một trong những yếu tố quan trọng thúc đẩy xã hội phát triển và cũng là động lực thúc đẩy các nhà khoa học, nhà sản xuất tìm tòi, sáng tạo ra nhiều sản phẩm mới.

Với sự phát triển của khoa học, con người đã biết cách chiết xuất ra nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên có lợi cho sức khỏe con người. Trong đó, việc ứng dụng các thành tựu khoa học vào ngành công nghiệp thực phẩm đóng vai trò quan trọng vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Hiện nay, có rất nhiều hợp chất được chiết xuất từ thiên nhiên đã được ứng dụng rộng rãi vào đời sống. Trong số đó không thể không nói đến hợp chất phlorotannin (polyphenol). Thành phần này được sử dụng trong thực phẩm như một loại thực phẩm chức năng nhằm mục đích phòng ngừa bệnh do có tính chất kháng oxi hóa mạnh.

Việt Nam có hệ động vật, thực vật vô cùng phong phú đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Điều kiện tạo nên sự phong phú và giàu có, ấy chính là vùng biển nhiệt đới rộng với bờ dài hơn 3200km bao bọc hết phía đông và nam đất nước. Một trong những nguồn tài nguyên phong phú và có giá trị mà vùng biển ban tặng cho chúng ta là rong biển. Rong biển là loại thực vật biển quý giá được dùng làm nguyên liệu chế biến thành các sản phẩm có giá trị trong công nghiệp và thực phẩm. Từ lâu, rong biển đã được coi là đối tượng nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới. Ở nước ta trữ lượng rong biển rất lớn, là nguồn tài nguyên biển vô cùng phong phú, rong biển chiếm vị trí quan trọng trong lĩnh vực kinh tế biển Việt Nam. Hệ rong biển có nhiều

2

loài, một trong những loài có nhiều tính năng ưu việt được nhiều nhà nghiên cứu ở nước ta quan tâm tới là loài rong mơ. Người ta đã phát hiện ra nhiều thành phần quý có trong rong mơ như: Iod, Alginate, Fuccoidin, hợp chất chống oxi hóa (phlorotannin), các axit béo... Rất có giá trị trong y học, thực phẩm, dược phẩm… Xuất phát từ nhu cầu của xã hội hiện đại, đồng thời tận dụng được nguồn nguyên liệu dồi dào, cần có những tìm hiểu, nghiên cứu, tách chiết ra các hoạt tính sinh học đặc biệt là phlorotannin để gia tăng giá trị rong mơ Việt Nam.

Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu quy trình

trích ly hoạt chất sinh học Phlorotannin từ rong mơ cho chế biến thực phẩm”. 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích

Nghiên cứu quy trình trích ly hoạt chất sinh học Phlorotannin từ rong

mơ cho chế biến thực phẩm.

1.2.2. Yêu cầu

Ảnh hưởng của các điều kiện xử lý nguyên liệu đến khả năng trích ly

Phlorotannin từ rong mơ.

Xác định các thông số của quá trình trích ly Phlorotannin từ rong mơ. Lọc, cô dịch trích ly và thu nhận chế phẩm Phlorotannin trích ly. Đưa ra quy trình sản xuất chế phẩm Phlorotannin.

3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về rong mơ 2.1.1. Đặc điểm

Theo hệ thống phân loại của Agardh, J.G. (1889), họ rong mơ Sargassaceae gồm 3chi: Chi Hormophysa Kuetzing 1843 (rong khế), chi Turbinarina Lamouroux 1828 (rong cùi bắp) và chi Sargassum C.AG. 1821 (rong mơ). Chi Sargassum C.AG. 1821 (rong mơ) gồm có 5 phân chi: Phyllottricha J.Ag, Schizophycus J.Ag, Bactrophycus J.Ag, Arthrophycus J.Ag, SargassumJ.Ag. Sargassum C.Ag (rong mơ) là tảo lớn thuộc họ rong mơ Sargassaceae của ngành rong nâu, rong có kích thước lớn, dài đến 4m hay có khi trên 6 – 8m, rong dài hay ngắn tùy loài và tùy điều kiện môi trường. Chúng bám vào vật bám nhờ đĩa bám hay hệ thống rễ bò phân nhánh. Đĩa bám thường chắc hơn rễ và sóng biển thường đánh đứt rong hơn là nhổ được đĩa bám. Thân rong gồm một trục chính rất ngắn, đa số thường dài trên dưới 1cm, hình trụ, sần sùi. Đỉnh của trục chính sẽ phân ra từ 2 cho đến 4 – 5 nhánh chính. Hai bên nhánh chính mọc ra nhiều nhánh bên. Các nhánh chính và nhánh bên sẽ tạo ra chiều dài của rong. Chiều dài này khác nhau tùy các chi, loài và trong cùng một loài kích thước này cũng thay đổi tùy điều kiện sống, tùy nơi phân bố. Trên các nhánh có các cơ quan dinh dưỡng gần giống như lá và các túi chứa đầy không khí gọi là phao. Khi rong trưởng thành, trên các nhánh bên sẽ mọc ra các nhánh thụ, ngắn (thường từ tháng 3 đến tháng 6), có mang nhiều cơ quan sinh sản đực và cái gọi là đế. Nhờ có hệ thống phao luôn giữ vị trí thẳng đứng trong môi trường biển. Nếu nước cạn và rong khá dài thì phần trên của rong nằm trên mặt nước [5].

Sinh sản hữu tính là cách sinh sản chủ yếu của tất cả các loài rong mơ để tạo thành các bãi rong. Đa số các loài có đế đực và cái trên hai cây khác nhau (cây khác gốc), một số khác có đế đực và cái cùng cây (cùng gốc). Khi rong đạt kích thước và chiều dài tối đa chúng sẽ mọc ra các nhánh ngắn gọi là nhánh thụ, trên đó chủ yếu mọc ra các cơ quan sinh sản. Giao tử đực còn gọi là tinh trùng sẽ được phóng thích khỏi giao tử phòng đực, bơi lội được. Giao

4

tử cái gọi là trứng hay noãn cầu sẽ được phóng thích khỏi giao tử phòng cái. Sự thụ tinh chỉ xảy ra với các giao tử đã được phóng thích. Noãn cầu sau khi thoát ra thường có một lớp nhầy dính chung quanh đế cái. Quan sát các noãn cầu này dưới kính hiển vi chúng ta thấy hầu hết chúng đã thụ tinh và bắt đầu phân cắt [5].

2.1.2. Phân bố

Rong mơ phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Philippin, Úc,… Ở Việt Nam loại thực vật này phân bố rộng, kéo dài từ vùng biển Quảng Ninh đến Kiên Giang và các hải đảo, tập trung nhiều nhất ở vùng bờ biển của thành phố Đà Nẵng và các tỉnh Quảng Nam, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Quảng Ninh. Năng suất ở các vùng tập trung đó có khi lên đến 7kg/m2 mặt nước, bình quân trên dưới 5,5kg/m2, tạo nên nguồn nguyên liệu bền vững cho việc khai thác chế biến và cũng điểm chỉ những môi trường nuôi trồng thuận lợi [20].

Rong mơ là loài chiếm ưu thế nhất ở các khu vực với trữ lượng chiếm 98% tổng trữ lượng của các bãi rong, mật độ cây trung bình 43,8 ± 20,2cây/m2 và sinh lượng trung bình đạt 456 ± 64,2g khô/m2 [7].

Bảng 2.1. Diện tích rong mơ theo vùng biển các tỉnh.

Các địa danh Diện tích (m2) Mùa vụ (tháng)

Quảng Nam – Đà Nẵng 190.000 Năng suất sản lượng (kg/m2) 2 – 7 3 – 4 – 5

Bình Định 42.750 2,5 3 – 4 – 5

Khánh Hòa 2.000.000 5,5 3 – 4 – 5

Ninh Thuận 1.500.000 7 3 – 4 – 5

2.1.3. Thành phần hóa học có trong rong mơ

Màu nâu của rong mơ là kết quả của sắc tố hoàng thể tố fucoxanthin, thành phần chính của rong mơ là các polysaccharide (cellulose, alginate, laminaran, fucoidan…), ngoài ra còn có mannitol, gibberellin, cytokinin… và nhiều loại vitamin. Hàm lượng alginic acid trung bình từ 20 – 30% trọng lượng khô. Một loại đường khác có giá trị trong rong mơ là mannitol với hàm lượng

5

từ 7 – 10% trọng lượng khô. Hàm lượng protein có từ 5 – 15%. Tổng lượng khoáng có từ 20 – 40% trong đó có đầy đủ các nguyên tố khoáng cần thiết cho cơ thể sinh vật, đặc biệt là iod với hàm lượng từ 0,08 – 0,34% là nguồn dược liệu để chữa bệnh bướu cổ. Ngoài ra rong mơ còn chứa các phospho lipid dùng trong y dược và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác [5].

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng và hóa học của loài Sargassum naozhouense (tính theo trọng lượng khô) thì có hàm lượng protein 11,20%; chất khoáng 35,18%; lipid 1,06%; carbohydrate tổng số 47,73%; tổng carbohydrate tan trong nước 29,74%; polysaccharide tan trong nước 21,01%; và chất xơ tổng số 4,83% [17].

Kotake – Nara và cộng sự nghiên cứu cho thấy rong nâu chi Sargassum và Turbinaria ở vùng nhiệt đới thường có hàm lượng phenol và tannin tương đối thấp hơn nhiều so với ở vùng ôn đới, do đó 2 chi rong nâu ở vùng nhiệt đới thường là thức ăn cho cá, động vật ăn cỏ... (ở vụng nhiệt đới dao động giữa 0 và 1,6% trọng lượng khô, vùng ôn đới dao động từ 3 đến 12% trọng lượng khô) [15].

Rong mơ có khả năng tích lũy hàng loạt các nguyên tố hóa học với hệ số tập trung cao, nồng độ các nguyên tố này trong tro của chúng có thể gấp hàng vạn hay hàng triệu lần so với trong nước biển. Đã tìm thấy khá nhiều nguyên tố hóa học trong rong mơ: Al, Si, Mg, Ca, Sr, Ba, fe, V, Mn, Ti, Co, Ni, Cr, Sn, Ag, Bi, Cu, Pb, Zn, Ga, Be, Na, K… [5]. 2.1.3.1. Sắc tố

Sắc tố trong rong mơ là diệp lục tố (Chlorophyl), diệp hoàng tố (Xantophyl), sắc tố màu nâu (Fucoxanthin), sắc tố đỏ (Caroten). Tùy theo tỷ lệ các loại sắc tố mà rong có màu từ nâu – vàng nâu – nâu đậm – vàng lục. Nhìn chung sắc tố của rong mơ khá bền [8]. 2.1.3.2. Gluxit

* Monosacaride [8] Monosacaride quan trọng trong rong mơ là đường Mannitol được Stenhouds phát hiện ra năm 1884 và được Kylin chứng minh thêm. Mannitol có công thức tổng quát: HOCH2 – (CHOH)4 – CH2OH. Mannitol tan được

6

trong Alcol, dễ tan trong nước có vị ngọt. Hàm lượng từ 14% – 25% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào hoàn cảnh địa lý nơi sinh sống.

Hàm lượng Mannitol biến động theo thời gian sinh trưởng trong năm của rong khá rõ rệt, tăng dần từ tháng 1, tập trung cao vào mùa hè (tháng 4) rồi sau đó giảm đi: Theo Kylin và Vedrinski cho thấy hàm lượng Mannitol đạt 25% về mùa hè rồi bị phân hủy dần trong các tháng mùa đông chỉ còn 4% – 6%. Ở Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học viện Hải Dương học và Đại học Thủy sản, hàm lượng Mannitol cũng theo quy luật này. Hàm lượng Mannitol của các loài rong ở các vùng biển Quảng Nam – Đà Nẵng, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận dao động từ 7% – 15,95% (vào tháng 4 hàng năm). Trong quá trình bảo quản rong khô có hiện tượng xuất hiện các điểm đốm trắng trên thân cây rong, đó là hỗn hợp đường Mannitol theo tỷ lệ : Muối 60% – 80%, mannitol 20% – 40%. Rong bảo quản không tốt, độ ẩm cao làm cho mannitol bị phá hủy. Công dụng của mannitol: Dùng trong y học chữa bệnh cho người già yếu; trong quốc phòng dùng điều chế thuốc nổ theo tỷ lệ hỗn hợp mannitol với hydrogen và nito. Ngoài ra mannitol còn dùng điều chế thuốc sát trùng (mannit với kim loại có tác dụng sát trùng cao). Do có khả năng này mà ngày nay một số tác giả cho thấy có khả năng sản xuất thuốc trừ sâu có bản chất sinh học (bảo vệ thực vật) từ rong biển.

* Polysaccharide - Alginic: Alginic là một polysaccharide tập trung ở giữa vách tế bào, là thành phần chủ yếu tạo thành tầng bên ngoài của màng tế bào rong mơ. Alginic và các muối của nó có nhiều công dụng trong ngành công nghiệp, y học, nông học và thực phẩm. Hàm lượng Alginic trong các loại rong mơ khoảng 2% – 4% so với rong tươi và 13% – 15% so với rong khô. Hàm lượng này phụ thuộc vào loài rong và vị trí địa lý môi trường mà rong sinh sống. Theo các tài liệu tổng kết của Miyake cho thấy hàm lượng Alginic trong các loài rong mơ có ở các vùng biển Liên Xô cũ là 13% – 40%. Theo tài liệu phân tích các chuyên gia Bộ Thủy sản cho thấy hàm lượng Alginic trong các loài rong mơ ở Hải Phòng là 22% – 40%, trong khi đó, rong mơ ở vùng biển Phú Yên – Khánh Hòa có hàm lượng Alginic cao hơn hẳn.

7

- Acid Fucxinic: có tính chất gần giống với acid Alginic. Acid Fucxinic

tác dụng với acid Sunfuric tạo hợp chất có màu phụ thuộc vào nồng độ acid

Sunfuric.

Chẳng hạn:

Acid Fucxinic + H2SO4 0,1%: Cho sản phẩm màu xanh. Acid Fucxinic + H2SO4 10%: Cho sản phẩm màu xanh tím. Acid Fucxinic + H2SO4 25%: Cho sản phẩm màu tím. Acid Fucxinic + H2SO4 25%: Cho sản phẩm màu đỏ. Acid Fucxinic + H2SO4 > 50%: Cho sản phẩm mất màu. Nhờ có tính chất này mà Fucxinic được ứng dụng vào sản xuất tơ sợi

màu, phim ảnh màu. Muối của Fucxinic với kim loại gọi là Fucxin. Fucxinic

tác dụng với Iod cho sản phẩm màu xanh [8].

- Fuccoidin: Là loại muối giữa acid Fuccoidinic với các kim loại hóa trị khác nhau như: Ca, Cu, Zn. Fuccoidin có tính chất gần giống với Alginic, nhưng hàm lượng thấp hơn Alginic.

Fuccoidin hay Fucoidan là một polysaccharide sulfate hóa dị hợp, trong

đó fucose chiếm từ 18,6% – 60% [22]; sulfate chiếm từ 17,7% – 39,2%; ngoài

ra còn có mặt các thành phần đường khác như: galactose, glucose, mannose,

xylose, rhamnose, và acid uronic.

- Laminarin: Laminarin là tinh bột của rong mơ. Laminarin thường ở dạng bột không màu, không mùi và có hai loại: Loại hòa tan và loại không hòa tan trong nước.

Laminarin có hàm lượng từ 10% – 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc

vào loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của rong mơ. Thường thì

vào mùa hè hàm lượng Laminarin giảm vì phải tiêu hao cho quá trình sinh

trưởng và phát triển của cây rong. Công dụng của Laminarin là dùng cho thực

phẩm và chăn nuôi [6].

Laminarin được hình thành từ các gốc D – glucans kết hợp với nhau bằng

các liên kết β – 1,3 và một ít liên kết β – 1,6, gốc đường cuối mạch của một số phân

tử có thể có các gốc manitol (M – series) hoặc vẫn là glucose (G – series) [23].

8

- Cellulose: Là thành phần tạo nên vỏ cây rong. Hàm lượng Cellulose

trong rong Nâu nhiều hơn rong Đỏ. Công dụng: Dùng cho công nghiệp giấy,

trong công nghiệp xây dựng (là phụ gia kết cấu xi măng) [8].

2.1.3.3. Protein

Protein của rong mơ không cao lắm nhưng khá hoàn hảo. Do vậy rong

mơ có thể sử dụng làm thực phẩm. Protein của rong mơ thường ở dạng kết

hợp với Iod tạo Iod hữu cơ như: MonoIodInzodizin, DiIodInzodizin. Iod hữu

cơ rất có giá trị trong y học. Do vậy rong mơ còn được dùng làm thuốc phòng

chống và chữa bệnh bướu cổ (Basedow).

2.1.3.4. Hợp chất chống oxy hóa

Polyphenol trong rong mơ, được phân loại thành các nhóm khác nhau

theo cấu trúc của chúng, bởi sự hiện diện của một số nhóm hydroxyl vòng

thơm, chẳng hạn như các flavonoid, acid phenolic và lignans [25]. Chúng

được tìm thấy rộng rãi trong giới thực vật như các chất chuyển hóa chịu trách

nhiệm về sắc tố, sinh sản, tăng trưởng và có cơ chế bảo vệ chống lại tác nhân

gây bệnh [27]. Polyphenol đã được chứng minh hoạt động chống oxy hóa đa

chức năng, do vòng phenol của nó hoạt động như bẫy điện tử nhặt rác peroxy,

anion và các gốc hydroxyl. Phlorotannins là nhóm duy nhất của tannin của

rong mơ ở biển, chúng gồm polyme phloroglucinols (1,3,5 –

trihydroxybenze), có hàm lượng đạt lên đến 1 – 15% trọng lượng khô của

rong mơ [11]. Màu nâu với màu đen của Phaephyceae là từ phlorotannins và

các sản phẩm quá trình oxy hóa của chúng. Phlorotannins là hợp chất rất ưa

nước [28] và nó cũng được cho là hợp chất có khả năng chống oxy hóa của

rong mơ [9]. Các chất trích ly từ tảo nâu đã cho thấy tác dụng bảo vệ chống

lại tổn thương tế bào hydro peroxide gây ra bằng cách khử gốc tự do [25].

Phlorotannins có tiềm năng ứng dụng trong thành phần của thực phẩm chức

năng [24] đã nghiên cứu các hoạt động chống oxy hóa của phlorotannins phân

lập từ Laminarian ở Nhật Bản, cho thấy hoạt động gấp hai lần hiệu quả chống

oxy hóa như catechin, acid ascorbic và α – tocopherol.

9

2.1.4. Vai trò của rong mơ đối với con người

Nguồn lợi mà rong mơ đem lại cho thế giới rất lớn. Các sản phẩm

truyền thống của nó là mannitol (35000 tấn/năm), alginate (hàng triệu

tấn/năm) [5]. Trong khoảng chục năm gần đây, các nghiên cứu phát hiện rong

mơ có chứa một số thành phần quan trọng, đó chính là fucoxanthin,

phlorotannins, fucoidan,… với những hoạt tính sinh học quý như: Chống ung

thư, giảm mỡ nội tạng, chống cục máu đông, kháng khuẩn, kháng virut (kể cả

virut HIV), chống nghẽn tĩnh mạch... [10].

Rong mơ được sử dụng đầu tiên ở Nhật Bản và Trung Quốc trong vai

trò là nguồn thực phẩm quan trọng. Hàm lượng iod trong rong mơ (0,25 –

0,35% khối lượng khô) cao hơn hàm lượng iod của thực vật ở đất liền vài

trăm lần. Rong mơ được sử dụng như một loại dược thảo chữa bệnh bướu cổ,

nó không chỉ cung cấp iod và các nguyên tố vi lượng cho con người mà còn

cung cấp một số vitamin như A, B, C, D, E, K và hầu hết các acid amin không

thay thế.

Thành phần hóa học có trong vách tế bào của rong mơ có ý nghĩa rất

lớn. Alginic acid là một loại polysaccharide có giá trị sử dụng. Đây là loại

nguyên liệu quan trọng dùng để trích ly keo alginate, dùng trong nhiều ngành

công nghiệp, như: công nghiệp giấy, sơn, cao su, phim ảnh, mỹ phẩm, công

nghiệp thực phẩm, hoặc thay thế carbon metyl cellulose (CMC) làm phụ gia

cho xi măng dùng cho giếng khoan dầu ở biển, có tác dụng làm tăng thời gian

quánh của xi măng, giải quyết sự cố xi măng đông kết sớm gây khó khăn cho

quá trình xây dựng các công trình, có độ bền uốn cao hơn đảm bảo độ bền cho

công trình... Keo alginate còn được ứng dụng sản xuất một số dụng cụ trong

ngành y (băng gạc, chân tay giả,…). Mannitol là một loại polyol, đồng phân

của sorbitol, loại đường rượu này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp

thực phẩm và dược phẩm. Mannitol có tác dụng ngăn ngừa hoặc điều trị nước

trong cơ thể dư thừa. Mannitol là giải pháp hiệu quả làm giảm áp suất trong

mắt, giảm sưng não sau chấn thương đầu, điều trị bệnh giãn mạch vành, trị

ung thư, rất có lợi cho người bị bệnh tiểu đường…

10

2.2. Giới thiệu về các hợp chất chống oxy hóa hiện nay

Polyphenol phân bố rộng rãi ở thực vật, có hoạt tính chống oxy hóa và được nghiên cứu rất nhiều. Polyphenol được chia thành các nhóm chính là: Flavonoids, acid phenolic, tannin, vitamin C, Vitamin E, beta – caroten.

- Flavonoid [32]: Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phong phú và đa dạng vào bậc nhất trong thiên nhiên, có mặt không những chỉ trong những thực vật bậc cao, mà còn trong một số thực vật bậc thấp, thậm chí còn có cả trong các loài tảo. Hơn một nửa rau quả thông thường có chứa flavonoid. Chúng cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu có nguồn gốc thực vật. Đến nay, flavonoid vẫn là lớp chất được các nhà hoá học các hợp chất tự nhiên quan tâm nghiên cứu, có khoảng trên 11.000 hợp chất flavonoid đã được biết về cấu trúc. Flavonoid không những có giá trị về mặt cảm quan mà được khai thác, sử dụng trong nhiều lĩnh vực: Thực phẩm, mỹ phẩm và có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong y dược. Flavonoid có ứng dụng trong y học để điều trị một số bệnh như: Viêm nhiễm, dị ứng, loét dạ dày và hành tá tràng, giúp cơ thể điều hoà các quá trình chuyển hoá, chống lão hoá, làm bền thành mạch máu, và giảm lượng cholesterol trong máu. Các nhà hoá sinh cho rằng flavonoid là một chất chống oxi hoá lý tưởng. Hiện nay nhiều flavonoit được phân lập từ thực vật đã được ứng dụng thành các chế phẩm đặc trị bệnh và sử dụng trong bảo quản thực phẩm, được thế giới công nhận là một trong những lớp chất thiên nhiên có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá và đột biến của các tế bào trong cơ thể.

- Acid phenolic [12]: Được chia thành hai loại là dẫn xuất của acid benzoic, chẳng hạn như acid gallic, và các dẫn xuất của acidcinnamic, acid caffeic và các acid ferulic. Các acid cinnamiac phổ biến hơn. Thực phẩm giàu acid phenolic có lợi cho sức khỏe, chúng có khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa tổn thương tế bào do phản ứng oxy hóa các gốc tự do. Acid phenolic chiếm khoảng một phần ba của hợp chất phenol trong chế độ ăn uống, có thể có mặt ở thực vật trong các hình thức tự do và liên kết với các thành phần khác. Phenol có thể được liên kết với các thành phần thực vật khác nhau thông qua các liên kết este, ether. Các acid hydroxybenzoic gallic, p - hydroxy benzoic, protocatechuic, vanillic syringic acid, phổ biến cấu trúc C6 – C1.

11

Hydroxycinnamic acid là những hợp chất thơm với một chuỗi bên ba – carbon (C6 – C3), caffeic, ferulic, p – coumaric vàcác acid sinapic là phổ biến nhất.

- Tannin [12]: Nhóm quan trọng thứ ba của phenolics, có thể được chia thành hydrolysable và tannin cô đặc. Nghiên cứu rộng rãi nhất là catechin. Các tannin hydrolysable là các dẫn xuất của acid gallic (3, 4, 5 – trihydroxyl acid benzoic). Acid gallic este hóa polyol lõi, và các nhóm alloyl có thể được tiếp tục este hóa hoặc oxidativelycrosslinked để tạo các tannin hydrolysable phức tạp hơn. Tannin có tác dụng đa dạng trên các hệ thống sinh học vì chúng là chất ion hóa kim loại, tạo kết tủa với protein và chất chống oxy hóa sinh học.

- Vitamin C: Là chất khử trong cơ thể, đóng vai trò rất quan trọng trong

việc ngăn chặn quá trình sản xuất các gốc tự do, bảo vệ acid béo không no của

màng tế bào, đồng thời bảo vệ vitamin E là chất chống oxy hóa chính của

màng tế bào, ngăn không cho gốc này xâm nhập các phân tử cholesterol.

Chúng tăng cường sự bền bỉ của mao mạch, đẩy mạnh mau lành vết thương,

kích thích sản xuất kháng thể, acetylcholine, ngăn chặn tác dụng có hại của

oxygen.

- Vitamin E: Được tìm thấy đầu tiên vào năm 1929 bởi Evans và

Bishop, là loại vitamin tan trong dầu có mặt trong nhiều loại thực phẩm đặc

biệt trong các loại hạt và dầu mỡ. Vitamin E được biết đến là chất chống oxy

hoá mạnh, có thể ngăn cản những tác động có hại của các chất oxy hoá sinh ra

bởi quá trình chuyển hoá trong cơ thể hoặc khi cơ thể bị nhiểm khuẩn. Quá

trình tích luỹ của các chất chuyển hoá này lâu dần sẽ dẫn đến quá trình lão

hoá trong cơ thể hoặc sẽ trở thành yếu tố nguy cơ của các bệnh lý như tim

mạch, ung thư. Vì thế việc bổ sung chất chống oxy hoá ngoại sinh như

vitamin E sẽ góp phần chống lão hoá trong đó có lão hoá da và đẩy lùi nguy

cơ bệnh lý mãn tính.

- Beta – caroten: Được khám phá ra cách đây hơn 150 năm từ lớp màu

cam ở củ cà rốt, beta – caroten hiện giờ là loại chống oxy hóa được tiêu thụ

rất nhiều trên thị trường. Chất này cần cho sự tăng trưởng và cho chức năng

12

của các mô, của xương; tăng cường tính miễn dịch, giảm nguy cơ gây ung

thư, giúp thị lực tốt hơn, nó có thể biến đổi thành vitamin A.

Các chất chống oxy hóa khác gồm có: Selenium, bioflavonoid và ubiquinon cũng được biết đến với khả năng chống lão hóa, nhưng không phổ biến như vitamine C, E và beta – Caroten.

2.3. Giới thiệu về hợp chất Phlorotannin 2.3.1. Đặc điểm

Theo Ragan M. A [23] thì phlorotannin được định nghĩa như sau: Chúng là polyme sinh học được hình thành từ gốc phloroglucinol (1,3,5 – trihydroxybenzen) và các gốc này liên kết với nhau bằng nhiều cách khác nhau. Chính vì vậy mà chúng tạo nên nhiều cấu trúc khác nhau và đôi lúc có trọng lượng phân tử lên đến 650KDA. Cho đến nay, trên thế giới có một số cấu trúc của các hợp chất thuộc nhóm phlorotannin từ rong Mơ đã được xác định và nhiều dịch chiết thô của chúng đã được khảo sát hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, rất ít công trình công bố một cách đầy đủ các cấu trúc của tất cả các dẫn xuất của phloroglucinol trong dịch chiết phlorotannin thô được chiết từ một loài rong cụ thể và hoạt tính của chúng và các công trình này chỉ được công bố trong 10 trở lại đây.

Các nhà khoa học Hàn Quốc cũng đưa ra cấu trúc đầy đủ của các dẫn

xuất của phloroglucinol chiết từ loài rong Ecklonia cava bao gồm:

Hình 2.1. Phloroglucinol (i) và phlorotannin [tetrafucol A (ii), fucodiphloroethol B (iii), fucodiphlorethol A (iv), tetrafuhalol A (v), tetraisofuhalol (vi), phlorofucofuroeckol (vii)] và hoạt tính của chúng

13

2.3.2. Cơ chế oxi hóa của phlorotannin

Trong cơ thể con người thường xuyên diễn ra nhiều hoạt động hoặc xây dựng hoặc phá hủy. Có những chất tưởng như là thực phẩm chính của tế bào nhưng đồng thời cũng làm hại tế bào. Có những phân tử gây ra tổn thương thì cũng có những chất đề kháng lại hoạt động phá phách này. Gốc tự do, oxygen và chất chống oxi hóa là một ví dụ.

Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới hơn 60 bệnh, chúng tấn công lên các phân tử protein, lipid, ADN,… dẫn đến các bệnh nan y như thoái hóa thần kinh, ung thư, tim mạch, tiểu đường, … Vì vậy chế độ ăn nhiều hoa quả và ít cholesterol sẽ làm giảm ung thư, kìm hãm và giảm các gốc tự do. Các chất chống oxi hóa từ trái cây hoặc sản phẩm chiết xuất giúp bảo vệ, ngăn cản quá trình oxi hóa. Để chống lại tác hại lớn do các gốc tự do gây ra, cơ thể con người được trang bị một hệ thống các chất chống oxi hóa. Chất chống oxi hóa là các chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do trực tiếp hoặc gián tiếp. Chất chống oxi hóa có thể phản ứng trực tiếp với gốc tự do hoạt động, tạo ra những gốc mới kém hoạt động hơn, ngăn cản các chuỗi phản ứng dây chuyền do các gốc tự do khơi mào. Chất chống oxi hóa cũng có thể tạo phức gián tiếp với ion kim loại chuyển tiếp ức chế enzyme xúc tác trong phản ứng sinh gốc tự do nhằm ngăn sự hình thành gốc tự do trong cơ thể. Polyphenol được coi là chất chống oxi hóa hữu hiệu nhất hiện nay (hữu hiệu gấp 100 lần vitamin C và gấp 25 lần vitamin E) [6].

Sự oxi hóa của các hợp chất polyphenol có ý nghĩa rất lớn trong sự sinh tổng hợp nhiều chất tự nhiên như lecithin, alkaloid và melanin. Sự tạo thành các hợp chất này có thể giải thích bằng cơ chế gốc tự do, trong đó ở giai đoạn đầu của hợp chất monomerphenol xuất hiện các gốc phenol. Ở giai đoạn sau, xảy ra sự ghép đôi các gốc tự do với sự tạo thành mối liên kết C – C hoặc C – O – C phụ thuộc vào kiểu ghép đôi [6].

Khả năng kháng oxi hóa mạnh của polyphenol được giải thích dựa trên số lượng lớn các nhóm hydroxyl trong công thức chúng, nó cho ghép tiếp nhận electron một cách dễ dàng (polyphenol là chất nhận các gốc tự do), tức là chúng có khả năng dập tắt các quá trình tạo ra gốc tự do.

14

2.3.3. Hoạt tính sinh học của phlorotannin

Hoạt tính sinh học của phlorotannin được công bố nhiều nhất là hoạt tính chống oxi hóa. Hoạt tính này được nghiên cứu thông qua khảo sát khả năng quét các gốc DPPH (2,2 – diphenyl – 1 – picrylhydrasyl), gốc hydroxyl -), khử sắt (III), tạo phức chelat với (OH), các anion như superoxide anion (O2 các ion hóa trị (II) và oxi hóa lipid của chúng.

- và tính khử mạnh [18].

tổng phlorotannin được chiết từ các rong loài

Các nhà khoa học Mexico đã xác định khả năng quét các gốc DPPH, - và hoạt tính khử của hỗn hợp các chất thuộc nhóm phlorotannin anion O2 được chiết từ một số loài rong Nâu sinh trưởng tại vùng biển nhiệt đới tại Mexico. Họ đã thu các phlorotannin bằng chiết lạnh, sử dụng dung môi là dichloromethanol: Methanol (2:1) trong 20 giờ. Kết quả thu được cho thấy tất cả (Lobophora variegate,Padina gymnospora, Dictyota cervicornis và một số loài rong thuộc chi Sargassum, chi Turbinaria) đều có hoạt tính chống oxi hóa với giá trị EC50 của gốc DPPH tương ứng là như sau: Lobophora variegate: 0,32 ± 0,01mg/ml; Padina gymnospora: 3,45mg/ml; chi Sargassum: Từ 6,64 – 7,14mg/ml; chi Turbinaria: 8,85mg/ml và chi Dictyota: 6,42mg/ml. Ngoài ra tổng phlorotannin chiết từ loài Lopophora variegate còn thể hiện khả năng quét gốc anion O2

Hoạt tính kháng vi sinh vật của phlorotannin chiết từ loài rong Ecklonia kurome tại Nhật Bản đã được Koki Nagayama và cộng sự kiểm định [13]. Để thử hoạt tính kháng vi sinh vật của phlorotannin, nhóm tác giả đã sử dụng phương pháp chiết phlorotannin bằng cồn methanol. Hỗn hợp thu được sau khi chiết bằng cồn được chiết lại với ethyl acetate và cuối cùng được tách trên sắc ký bản mỏng. Tất cả các phân đoạn thu được đều thử hoạt tính trên 25 chủng vi sinh vật kiểm định thuộc 02 nhóm Gr(+) và Gr(-). Kết quả là tất cả các phân đoạn đều thể hiện hoạt tính kháng 25 chủng vi sinh vật đem thử.

Trên cơ sở phlorotannin thô chiết từ loài rong Ecklonia cava các nhà khoa học Hàn Quốc đã xác định được nhiều hoạt tính sinh học khác của chúng. Tất cả các dẫn xuất của phloroglucinol phân lập được (tetrafucol A, fucodiphloroethol B, fucodiphlorethol A, tetrafuhalol A, tetraisofuhalol,

15

phlorofucofuroeckol) đều thể hiện hoạt tính ức chế các enzyme matrix metalloproteinase (MMP), Alphaglucosidase, α – amylase và ức chế quá trình giải phóng histamine [26,19, 21]. Kết quả này định hướng cho việc sử dụng chúng để hỗ trợ điều trị các bệnh tiểu đường, thấp khớp, viêm nhiễm kinh niên, chống dị ứng.

2.3.4. Tình hình nghiên cứu phlorotannin trên thế giới

Rong biển là nguồn nguyên liệu quý có khả năng giúp cho cơ thể phòng chống được một số loại bệnh. Do vậy nhiều nước trên thế giới giành khoản ngân sách khá lớn cho việc nghiên cứu ứng dụng sản xuất thực phẩm từ rong biển. Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về phlorotannin do có hoạt tính sinh học cao. Năm 2003, Toshiyuki Shibata, Kohki Nagayama, Ryusuke Tanaka, KunikoYamaguchi và Takashi Nakamura đại học Kyushu Nhật Bản đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của phlorotannin từ loài Laminariaceae bằng cách sử dụng ức chế sự peoxy phospholipid trong hệ thống liposome và xác định các hoạt động khử gốc tự do bằng DPPH. Kết quả: Các oligomers của phloroglucinol là eckol; phlorofucofuroeckol A; dieckol and 8,8-bieckol; phân lập từ tảo Eisenia bicyclis có hoạt tính chống oxy hóa cao và hiệu quả hơn so với ascorbic và α – tocophenol [13].

Năm 2005, Masaaki Nakai, Norihiko Kageyama, Koichi Nakahara và

Wataru Miki đã sàng lọc phlorotannin từ 25 loài rong nâu ở vùng biển Nhật

Bản bằng cách sử dụng ethanol làm dung môi chiết. Kết quả cho thấy loài

Sargassum ringgoldianum cho hoạt tính chống oxy hóa là cao nhất, mạnh gấp

5 hoạt tính của catechin [30].

Năm 2006, Gin Nae Ahn, Kil Nam Kim, Seon Heui Cha, Choon Bok

Song, Jehee Lee, Moon Soo Heo, In Kyu Yeo, Nam Ho Lee, Young Heun Jee

và Jin Soo Kim, đánh giá hoạt động chống oxy hóa của phlorotannin (gồm ba

nhóm phloroglucinol, eckol and diecko) từ loài Ecklonia cava bằng phương

pháp quang phổ ESR và khảo nghiệm hiệu quả ức chế H2O2 thông qua mức độ tổn thương DNA. Kết quả cho thấy hiệu quả ức chế H2O2 rất tốt.

Năm 2007, các tác giả Mayalen Zubia, Daniel Robledo, Yolanda

FreilePelegrin đã chiết xuất phlorotannin và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

16

của 48 loài tảo biển (17 Chlorophyta, 8 Phaeophyta, 23 Rhodophyta) ở bờ

biển Yucantan và Quintana Roo (Mecico). Nhóm tác giả đã sử dụng

dichloromethanol: Methanol (2/1) trong 20 giờ. Hoạt tính chống oxy hóa

được đo bằng DPPH và xác định hàm lượng theo phương pháp Folin –

Ciocalteu. Các kết quả: Tất cả các loài đều biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa,

đặc biệt ba loài (Avrainvillea longicaulis, Chondria baileyana và Lobophora

variegate) biểu hiện tiềm năng chống oxy hóa tuyệt vời với quá trình oxy hóa

rất thấp. Chỉ số EC50 tương ứng 1,44 ± 0,01; 2,84 ± 0,07 và 0,32 ±

0,01mg/ml tương đương với một số chất chống oxy hóa thương mại như α –

tocopherol, ascorbic acid, BHA and BHT [18].

Năm 2008, Riitta Koivikko đã chiết tách hàm lượng phlorotannin từ các loại tảo nâu. Dung môi được sử dụng là nước kết hợp với methanol, ethanol, aceton. Kết quả thu được với tỷ lệ nước và aceton là 3:7 thì thu được hàm lượng phlorotannin cao nhất [29].

Cũng trong năm 2008, Jay Robert Rowen đã nghiên cứu về hợp chất polyphenol chiết xuất từ rong biển Ecklonia cava gọi chung là ECE. Hai hợp chất quan trọng là dieckol và phlorofurofucoeckol (PFF) và được gọi là siêu chất chống oxy hóa. Kết quả cho thấy khả năng bắt gốc tự do mạnh hơn từ 10 đến 100 lần so với các polyphenol từ thực vật trên cạn, vượt xa resveratrol và tannin chè. Ngoài ra ECE có tác dụng giảm đau dây thần kinh, đau khớp ngăn chặn hoặc đảo ngược sự tiến triển của bệnh hen suyễn mãn tính và bệnh phổi, bảo vệ bức xạ, chống ung thư [31].

Năm 2009, Reum Kim, Min Sup, Ji Young Park,Tai Sun Shin, Kyoung Eun Park, Na Young Yoon, Jong Soon Kim, Choi Jae Sue đã xác định được thành phần các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao từ loài Ecklonia solonifera. Các cấu trúc của phlorotannin được xác định trên cơ sở phân tích quang phổ, bao gồm cả NMR và phân tích khối phổ. Kết quả chỉ ra rằng phlorofucofuroeckol A, dieckol và dioxinodehydroeckol cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao. Trong đó phlorofucofuroeckol A có tiềm năng làm thực phẩm chức năng chống oxy hóa và chống viêm [20].

Năm 2010, Hyun Ryul Goo, Jae Sue, Choi Dong Hee Na đại học

Kyungsung, Busan, Hàn Quốc đã định lượng phlorotannin trong tảo Ecklonia

17

stolonifera. Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định

đồng thời ba phlorotannin lớn eckol, dieckol, and phlorofucofuroeckol – A.

Các điều kiện sắc ký tối ưu: Cột – C18 (250 × 4,6mm) bằng cách sử dụng

tách rửa gradient tuyến tính của acetonitrile và nước có chứa axit formic 0,1%

UV 254nm. Phlorotannins tách được xác định bởi phổ sắc ký lỏng khối lượng. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy độ tuyến tính tốt (R2> 0,998), độ chính xác (1,4 – 9,5%), và độ chính xác (93,9 – 108,7%). Các giới

hạn phát hiện dao động 0,06 – 0,30mg/ml và các giới hạn thấp hơn định lượng

dao động 0,2 – 1,0mg/ml. Trong số phlorotannins, dieckol là phong phú nhất

trong cả ethanol và các chất chiết xuất từ acetate ethyl Ecklonia stolonifera

[15].

Năm 2012, Wang T, Jónsdóttir R, Liu H, Gu L, Kristinsson HG,

Raghavan S, Olafsdóttir G đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của

phlorotannin từ loài Fucus vesiculosu bằng DPPH. Sử dụng phương pháp sắc

ký cột hoặc siêu lọc để tinh chế. Kết quả cho thấy hoạt tính của phlorotannin

cao hơn rất nhiều so với acid ascorbic [24].

Hàm lượng phlorotannins tập trung trong rong biển màu nâu có thể

khác nhau giữa các loài, bị ảnh hưởng bởi kích thước, độ tuổi, loại mô, độ

mặn, mùa, mức độ dinh dưỡng, cường độ ăn thực vật, cường độ ánh sáng và

nhiệt độ nước.

2.3.5. Tình hình nghiên cứu phlorotannin ở Việt Nam

Hiện nay việc nghiên cứu tách chiết và ứng dụng phlorotannin vào

trong thực phẩm tại Việt Nam đã và đang được Viện Nghiên Cứu và ứng

dụng Nha Trang tiến hành nghiên cứu:

Năm 2009, Đặng Xuân Cường đã nghiên cứu thành công việc thu nhận

dịch chiết kháng khuẩn chứa polyphenol (phlorotannin) từ rong nâu Dictyota

dichotoma. Tác giả đã xác định các thông số tối ưu để thu nhận phlorotannin

tổng số từ Dictyota dichotoma có hàm lượng tối đa bằng cách sử dụng

phương pháp Folin – Ciocalteu. Đồng thời tử hoạt tính kháng khuẩn trên một

số loại vi khuẩn và đã thu được kết quả cao [1].

18

Năm 2010 đến nay, nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách và sàng lọc các chất phlorotannin có hoạt tính sinh học từ rong Nâu tại vùng biển Nam Trung Bộ đang được thực hiện bởi Trần Thị Thanh Vân và cộng sự [2].

Năm 2010 đến nay, thu nhận phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang – Khánh Hòa và thử nghiệm sử dụng phlorotannin làm thực phẩm chức năng chống oxy hóa đang được thực hiện bởi Đặng Xuân Cường dưới sự hướng dẫn chính của TS. Vũ Ngọc Bội và TS. Trần Thị Thanh Vân [3].

Ngoài ra có một số công bố về chiết tách và nghiên cứu biến động phlorotannin từ rong nâu đã được công bố bởi Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. Sự tích lũy và phân bố phlorotannin chống oxy hóa trong một số loài rong nâu sargassum Khánh Hòa theo thời gian sinh trưởng đã được công bố năm 2011 [2].

Năm 2011, Đặng Xuân Cường, Trần Thị Thanh Vân, Vũ Ngọc Bội đã ứng dụng mô hình đáp ứng bề mặt Box – Behnken trong tối ưu hóa công đọan chiết phlorotannin từ rong nâu (Sargassum aemulumSonder) Khánh Hòa [2]. Tối ưu hóa quá trình chiết phlorotannin từ rong nâu Sargassum baccularia ở Khánh Hòa, Việt Nam bằng phương pháp đáp ứng bề mặt được công bố bởi tài liệu [3, 5] đã công bố các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết polyphenol từ loài rong Sargassum macculurei.

2.4. Giới thiệu về quá trình trích ly 2.4.1. Cơ sở của quá trình trích ly

Phương pháp trích ly là phương pháp thu lấy một hay nhiều chất từ hỗn hợp đã tách biệt, cô lập và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng.

Quá trình trích ly gồm hai giai đoạn như sau: Giai đoạn 1: Dung môi thấm ướt lên bề mặt nguyên liệu, sau đó thấm sâu vào bên trong do quá trình thẩm thấu tạo ra dung dịch chứa các hoạt chất. Sau đó dung môi tiếp tục hòa tan các chất trên bề mặt bằng cách đẩy các bọt khí chiếm đầy trong các khe vách trống của tế bào.

Giai đoạn 2: Giai đoạn tiếp tục hòa tan các hoạt chất trong cácống mao

dẫn của nguyên liệu nhờ vào dung môi đã thấm sâu vào các lớp bên trong…

19

* Phương pháp trích ly Soxhlet:

Soxhlet dựa trên nguyên tắc hóa hơi (dung môi, thường là dung môi phân cực => dễ hóa hơi), theo ống dẫn lên gặp hệ thống làm lạnh rồi ngưng tụ xuống trụ trích ly, hòa tan chất (tan được trong dung môi phân cực) như sắc tố; vitamin nhóm A, D, E, K, Q; lipid; polyphenol ... Sau đó có ống dẫn bên thành trụ chiết hình chữ U ngược hoạt động theo nguyên tắc trên lệch áp suất để về bình cầu khi mức trong trụ vượt mức này. Vậy nên đây chỉ là cách chiết chất thô, chưa được tinh khiết. Hạn chế: tốn thời gian, qua nhiều công đoạn dẫn đến sai số do cân, đo, đong, đếm. Hiện có một số test, phương pháp định lượng nhanh, mức độ chính xác gia tăng.

2.4.2. Phạm vi sử dụng của quá trình

Trong công nghệ thực phẩm nhằm mục đích sau: Khai thác là mục đích chủ yếu. Phổ biến là trích ly các nguyên liệu dạng rắn như: hạt dầu, các nguyên liệu tinh dầu như lá, rễ, cây, hoa hoặc quả; trích ly các loại củ như củ cải đường, trích ly mía. Cũng với mục đích này có thể phối hợp với quá trình khác để nâng cao hiệu suất thu sản phẩm. Ví dụ như phối hợp với quá trình ép trong sản xuất mía đường [4].

Trích ly còn nhằm mục đích chuẩn bị cho các quá trình tiếp theo, ví dụ như ngâm các loại hạt (các loại đậu, ngô, thóc,…) trước khi chế biến; ngâm các loại củ (sắn, khoai,…) làm yếu các liên kết trong vật liệu, đồng thời trích ly một số phân tử vào dung môi ngâm (ví dụ: Hòa tan HCN khi ngâm củ sắn) [4]. Với mục đích thu nhận sản phẩm như tách penicillin từ dung dịch lên men sản xuất nước chấm bằng phương pháp ủ ẩm trích ly, hoặc trích ly trong quá trình sản xuất cà phê hòa tan, trích ly khi ngâm quả, ngâm tẩm các loại thuốc bổ và thuốc chữa bệnh,… [4].

2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly

Thực chất quá trình trích ly là quá trình khuếch tán. Vì vậy sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha (gradient nồng độ) chính là động lực của quá trình. Khi chênh lệch nồng độ lớn, lượng chất trích ly tăng; thời gian trích ly giảm ta thực hiện bằng cách tăng tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu.

20

Quá trình trích ly polyphenol (phlorotannin) hiện nay được thực hiện bằng các loại dung môi. Nguyên tắc của trích ly bằng dung môi dựa trên sự thẩm thấu dung môi vào tế bào, chất cần trích ly hòa tan vào dung môi và khuếch tán ra ngoài tế bào. Quá trình trích ly bằng dung môi có ưu điểm là thiết bị đơn giản, có thể xử lý một lượng lớn nguyên liệu và có thể sử dụng ở quy trình liên tục. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly bằng dung môi: Lựa chọn dung môi trích ly: Dung môi trích ly là dung môi hòa tan được hợp chất cần trích ly. Các polyphenol (phlorotannin) là các hợp chất phân cực nên chủ yếu sử dụng các dung môi phân cực như: Nước, ethanol, acetone, ethyl acetate…

Diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi. Cần tăng diện tích

này để làm tăng hiệu quả của quá trình. Với các nguyên liệu rắn cần tăng diện

tích tiếp xúc giữa chúng và dung môi. Điều này thực hiện bằng cách nghiền

nhỏ, thái nhỏ, băm nhỏ vật liệu. Nó còn làm phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy

quá trình tiếp xúc triệt để giữa dung môi và vật liệu. Tuy nhiên kích thước và

hình dạng của vật liệu khi làm nhỏ cũng có giới hạn vì nếu chúng quá mịn sẽ

bị lắng đọng lên lớp nguyên liệu, làm tắc các ống mao dẫn hoặc bị dòng dung

môi cuốn vào mixen (hỗn hợp) làm cho dung dịch có nhiều cặn gây phức tạp

cho quá trình xử lý tiếp theo [2].

Khuấy trộn: Khuấy trộn giúp tăng cường hiệu quả trích ly, do tăng

cường quá trình truyền khối.

Tính chất của vật liệu cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly. Vật

liệu là hỗn hợp lỏng – lỏng hoặc hỗn hợp rắn – lỏng cộng với một dung môi

hoặc tập hợp một số loại dung môi. Chúng có độ hòa tan khác nhau, nồng độ

các chất khác nhau và có tác dụng tương hỗ, khuếch tán vào nhau. Như khi

trích ly đầu nếu độ ẩm nguyên liệu giảm, tốc độ trích tăng lên, vì độ ẩm tác

dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của

dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán [4].

Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, phần tử

chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phần tử dung môi.

Tuy nhiên nhiệt độ là một yếu tố có giới hạn. Vì khi nhiệt độ quá cao có thể

21

xảy ra các phản ứng khác không cần thiết (làm oxi hóa polyphenol cần trích

ly), gây khó khăn cho quá trình công nghệ [4]. Do đó trong toàn bộ quá trình nhiệt độ không nên vượt quá 700C.

Yếu tố thời gian cũng ảnh hưởng đến quá trình trích ly. Khi thời gian

tăng lên, lượng chất khuếch tán tăng, nhưng thời gian phải có giới hạn. Vì khi

đã đạt được mức độ trích ly cao nhất, nếu kéo dài thời gian sẽ không mang lại

hiệu quả kinh tế.

2.5. Giới thiệu về phương pháp thu nhận

2.5.1. Phương pháp cô đặc

Cô đặc là phương pháp thường dùng để làm tăng nồng độ hàm lượng

các chất có trong dịch trích ly. Tùy theo tính chất của chất cần cô đặc khó bay

hơi (hay không bay hơi trong quá trình đó) ta có thể tách phần dung môi dễ

bay hơi bằng phương pháp nhiệt hay phương pháp làm lạnh kết tinh.

Cô đặc là quá trình làm tăng nồng độ chất rắn hòa tan trong dung dịch

bằng cách tách bớt một phần dung môi qua dạng bay hơi.

Phương pháp nhiệt (đun nóng): Dung môi chuyển từ dạng lỏng sang

trạng thái dạng hơi dưới tác dụng của nhiệt khi áp suất riêng của nó bằng áp

suất tác dụng lên bề mặt thoáng chất lỏng.

Phương pháp lạnh: Khi hạ tháp nhiệt độ đến một mức nào đó thì một

cấu tử sẽ tách ra dạng tinh thể đơn chất tinh khiết, thường là kết tinh dung môi

để tăng nồng độ chất tan. Tùy tính chất của chất tan và áp suất bên ngoài tác

dụng lên mặt thoáng mà quá trình kết tinh đó xảy ra ở nhiệt độ cao hay thấp

và đôi khi phải dùng đến máy lạnh.

2.5.2. Phương pháp sấy

Phương pháp sấy nóng: Trong phương pháp sấy nóng, tác nhân sấy và

vật liệu sấy được đốt nóng. Do tác nhân sấy được đốt nóng nên độ ẩm tương

đối φ giảm dẫn đến phân áp suất hơi nước trong tác nhân sấy giảm. Mặt khác

do nhiệt độ của vật liệu sấy tăng lên nên mật độ hơi trong các mao quản tăng

và phân áp suất hơi nước trên bề mặt vật cũng tăng.

22

Phương pháp sấy lạnh: Khác với phương pháp sấy nóng, để tạo ra sự

chênh lệch áp suất giữa hơi nước của vật liệu sấy với tác nhân sấy, người ta

làm giảm áp suất hơi nước trong tác nhân sấy (bằng cách giảm ẩm trong tác

nhân sấy và độ ẩm tương đối (φ)). Áp suất của môi trường không khí bên

ngoài giảm xuống, độ chênh áp suất của ẩm trong vật sấy vào môi trường

xung quanh tăng lên. Ẩm chuyển dịch từ trong vật ra môi trường. Nhiệt độ

môi trường của sấy lạnh thường thấp (có thể thấp hơn nhiệt độ của môi trường bên ngoài, có khi nhỏ hơn 00C).

Phương pháp sấy thăng hoa: Phương pháp sấy thăng hoa được thực

hiện ở điều kiện nhiệt độ và áp suất thấp. Chế độ làm việc thấp hơn điểm ba thể của nước (t = 0,00980C, p = 4,58mmHg). Quá trình sấy được thực hiện trong một buồng sấy kín.

Phương pháp sấy phun: Sấy phun được sử dụng để sấy khô các chất cô

của dung dịch canh trường, các chất kháng sinh động vật, các acid amin, các

enzyme, các chất trích ly thu nhận được trên các môi trường dinh dưỡng rắn, các

dung dịch chất lắng thu nhận được khi làm lắng enzyme bằng các dung môi vô

cơ hay bằng các muối trung hoà, cũng như các phần cô chất lỏng canh trường.

Phương pháp sấy chân không: Phương pháp sấy chân không được áp

dụng để sấy các loại vật liệu có chứa nhiều hàm lượng tinh dầu, hương hoa,

dược phẩm, các nông sản thực phẩm có yêu cầu nhiệt độ sấy thấp nhằm giữ

nguyên chất lượng và màu sắc, không gây phá hủy, biến tính các chất.

Nguyên lý cơ bản của phương pháp sấy chân không đó là sự phụ thuộc

vào áp suất điểm sôi của nước. Nếu làm giảm (hạ thấp) áp suất trong một thiết

bị chân không xuống đến áp suất mà ở đấy nước trong vật bắt đầu sôi và bốc

hơi sẽ tạo nên một dòng chênh lệch áp suất đáng kể dọc theo bề mặt vật, làm

hình thành nên một dòng ẩm chuyển động trong vật liệu theo hướng từ trong

ra bề mặt vật.

23

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là trích ly phlorotannin từ loài Sargassum

Polycystum có độ ẩm 16% được thu mua ở Nha Trang – Khánh Hòa

3.1.2. Hóa chất và thiết bị 3.1.2.1. Hóa chất

Các hóa chất: Ethanol, acetone và nước cất (Việt Nam) đều là hóa chất

tinh khiết.

Thuốc thử Folin – Ciocalteu (Đức) gồm: Sodium phosphate và

amonium molybdate (Merck); Na2CO3 10% 3.1.2.2. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Cân kỹ thuật (Cent – 0 – Gram Balance, OHAUS, Mỹ) Cân phân tích (Precisa XT 320M, Thụy Sỹ) Tủ lạnh (Samsung SR – 15NFBA, Nhật Bản) Máy sấy (Grot DZ 47 – 63, Trung Quốc) Thiết bị Soxhlet (TC 15, Trung Quốc) Dụng cụ: Giấy lọc, phễu lọc, cốc đong, bình tam giác các loại, bình định mức, đũa thủy tinh, pipet các loại, nhiệt kế… hiện có tại các phòng thí nghiệm của Viện cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch. 3.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và Môi trường nông nghiệp – Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, 126 phố Trung Kính – Trung Hòa – Cầu Giấy – Hà Nội.

Thời gian: Từ tháng 07/12/ 2013 đến tháng 27/05/2014.

3.2. Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyên liệu đến khả năng

trích ly hoạt chất sinh học phlorotannin từ rong mơ.

Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi, tỷ lệ dung môi đến khả năng

trích ly hoạt chất sinh học phlorotannin từ rong mơ.

24

Nghiên cứu xác định các thông số ảnh hưởng đến khả năng trích ly hoạt

chất sinh học phlorotannin từ rong mơ.

Lọc, cô dịch trích ly và thu được chế phẩm phlorotannin từ rong mơ. Xây dựng quy trình trích ly hoạt chất sinh học phlorotannin từ rong mơ.

3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiêm

Trong quá trình tiến hành thí nghiệm cần chú ý: Rong tránh tiếp xúc với ánh sáng mặt trời do phlorotannin dễ bị phân hủy. Thường xuyên kiểm tra nhiệt độ trong quá trình trích ly. Khi thời gian thí nghiệm kéo dài cần thường xuyên kiểm tra các điều

kiện còn lại để đảm bảo độ chính xác. 3.3.1.1. Thí nghiệm ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly Phlorotannin.

Rong mơ được nghiền nhỏ với các kích thước khác nhau để lựa chọn ra

kích thước tối ưu nhất. Ở đây tôi khảo sát ở các kích thước như sau:

CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3

Kích thước (mm) d ≤ 0,5 0,5 < d ≤ 1 1 < d ≤ 1,5

Rong mơ với các kích thước khác nhau được đem đi trích ly ở cùng

điều kiện. Cố định các điều kiện sau:

Khối lượng mẫu: 10g Dung môi trích ly: Nước cất Tỷ lệ dung môi: 35/1 Thời gian trích ly: 2 giờ Nhiệt độ trích ly: 400C Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc tách bã bằng giấy lọc tinh 1 lần

rồi xác định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định kích thước tối ưu.

Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.

3.3.1.2. Thí nghiệm ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly Phlorotannin Trong thí nghiệm này tôi khảo sát với 3 loại dung môi với nồng độ

dung môi gần như tinh khiết.

25

CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3

Loại dung môi Nước cất Ethanol Aceton

Cố định các điều kiện trích ly sau: Khối lượng mẫu: 10g Kích thước nguyên liệu: Dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.3.2.1 Tỷ lệ dung môi: 35/1 Thời gian trích ly: 2 giờ Nhiệt độ trích ly: 400C Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc tách bã bàng giấy lọc tinh 1 lần

rồi xác định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định dung môi tối ưu.

Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.

3.3.1.3. Thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly Phlorotannin Khi xác định được loại dung môi tôi khảo sát tỷ lệ dung môi để lựa

chọn tỷ lệ tối ưu nhất. Thí nghiệm này tôi khảo sát với các tỷ lệ sau:

CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4

Tỷ lệ DM/NL (ml/g) 30/1 35/1 40/1 45/1

Cố định các điều kiện trích ly sau: Khối lượng mẫu: 10g Kích thước nguyên liệu: Dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.3.2.1 Dung môi: Dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.3.2.2 Thời gian trích ly: 2 giờ Nhiệt độ trích ly: 400C Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc tách bã bằng giấy lọc tinh 1 lần

rồi xác định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định tỷ lệ tối ưu.

Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.

3.3.1.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin Nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả năng hòa tan các chất trong rong nguyên liệu vào môi trường chiết. Khi nhiệt độ tăng các phân tử khuếch tán càng mạnh, độ nhớt giảm, lượng chất tan vào môi trường trích ly càng nhiều. Tuy nhiên nếu nhiệt độ quá cao có thể làm biến tính một số hợp chất có hoạt tính

26

sinh học hoặc làm hao hụt một lượng chất tan dễ bay hơi khác. Nếu nhiệt độ quá thấp, lượng chất tan khuếch tán ra môi trường bị hạn chế. Vì vậy tôi tiến hành thí nghiệm ở các nhiệt độ sau:

CT thí nghiệm Nhiệt độ (0C) CT1 40 CT2 50 CT3 60 CT4 70

Cố định các điều kiện trích ly sau: Khối lượng mẫu: 10g Kích thước nguyên liệu: Dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.3.2.1 Dung môi: Dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.3.2.2 Tỷ lệ dung môi: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.3 Thời gian: 2 giờ Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc bằng giấy lọc tinh 1 lần rồi xác

định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định nhiệt độ trích ly tối ưu.

Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.

3.3.1.5. Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly phlorotannin Thí nghiệm nhằm xác định thời gian trích ly tối ưu để thu được hàm lượng phlorotannin cao nhất. Thời gian trích ly phải hợp lý, nếu kéo dài thời gian trích ly lượng chất hòa tan dung môi đã hết, đồng thời sẽ ảnh hưởng đến thời gian thực hiện và chi phí cho toàn bộ quá trình. Vì vậy tôi tiến hành thí nghiệm ở các thời gian sau:

CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4

3 1 2 4

Thời gian (giờ) Cố định các điều kiện trích ly sau: Khối lượng mẫu: 10g Kích thước nguyên liệu: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.1 Dung môi: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.2 Tỷ lệ dung môi: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.3 Nhiệt độ trích ly: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.4 Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc bằng giấy lọc tinh 1 lần rồi xác

định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định thời gian trích ly tối ưu.

Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.

27

3.3.1.6. Thí nghiệm ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin Tiến hành trích ly mẫu ở điều kiện tối ưu đã khảo sát ở các thì nghiệm trên. Sau khi trích ly 1 lần xong thì tiến hành lấy dịch lọc. Phần bã tiếp tục sử dụng để trích ly lại lần 2, lần 3 tương tự.

CT3 3 CT2 2 CT1 1

CT thí nghiệm Số lần trích ly Cố định các thông số: Khối lượng mẫu: 10g Kích thước nguyên liệu: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.1 Dung môi: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.2 Tỷ lệ dung môi: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.3 Nhiệt độ trích ly: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.4 Thời gian trích ly: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.5 Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc bằng giấy lọc tinh 1 lần rồi xác

định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định số lần trích ly. 3.3.1.7. Thí nghiệm xác định nhiệt độ cô đặc

Quá trình cô đặc là để tách bớt lượng dung môi có trong dịch trích ly tạo điều kiện thuận lợi cho các công đoạn sau. Ta cần xác định nhiệt độ cô đặc thích hợp nhằm hạn chế ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến chất tan cần trích ly. Vì vậy tôi tiến hành thì nghiệm ở các nhiệt độ sau:

CT thí nghiệm Nhiệt độ (0C) CT1 40 CT2 50 CT3 60 CT4 70

Sau khi dịch rong được lọc, ta chia dịch rong thành 4 thể tích bằng nhau rồi tiến hành cô đặc bằng thiết bị cô đặc chân không trong 30 phút. Làm thí nghiệm này khi đã lựa chọn được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết như: Kích thước nguyên liệu, tỷ lệ nguyên liệu, dung môi, nhiệt độ trích ly và thời gian trích ly. Sau đó xác định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định nhiệt độ cô đặc. 3.3.1.8. Thí nghiệm xác định thời gian ly tâm

Quá trình ly tâm là để tách hết cặn (bã rong) còn sót lại trong dịch trích ly trong quá trình cô đặc. Dịch trích ly thu được sẽ trong hơn, sáng màu hơn. Ta cần xác định thời gian ly tâm thích hợp để tách triệt để cặn trong dịch rong, đồng thời tiết kiệm được thời gian và chi phí thực hiện quá trình.

28

Dịch rong sau khi cô đặc tách bớt dung môi được chia thành 5 mẫu và tiến hành ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút tại các mức thời gian 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút.

CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

Thời gian (Phút) 5 10 15 20 25

Sau khi ly tâm kiểm tra độ trong bằng cảm quan và lựa chọn thời gian

ly tâm thích hợp.

3.3.2. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý 3.3.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm

Xác định độ ẩm của chế phẩm sử dụng phương pháp sấy đến khối

lượng không đổi.

Tiến hành: Sấy cốc đến khối lượng không đổi. Cốc được rửa sạch, úp khô, sấy ở nhiệt độ 100 – 1050C trong khoảng 1 giờ, sau đó lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm rồi mang đi cân và sấy tiếp ở nhiệt độ trên, làm nguội trong bình hút ẩm và cân đến khi nào giữa hai lần liên tiếp sai khác khối lượng không quá 5.10-4g là được (sấy đến khối lượng không đổi).

Cân chính xác một lượng rong đã cắt nhỏ (khoảng 10g) vào cốc đã sấy khô đến khối lượng không đổi. Dùng đũa thủy tinh đánh tơi mẫu rồi dàn đều mẫu trên đáy cốc. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở 60 – 800C trong 2 giờ. Sau đó nâng nhiệt độ lên 100 – 1050C, sấy liên tục trong 3 giờ. Chú ý, trong quá trình sấy cứ sau một giờ đảo mẫu một lần. Lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm, sau đó mang cân trên cân phân tích rồi sấy tiếp ở nhiệt độ 100 – 1050C đến khối lượng không đổi như trên.

Tính kết quả: Độ ẩm rong được tính theo công thức:

G1 - G2 X= * 100% G1 - G

Trong đó: X: Độ ẩm (hàm lượng nước) của rong (%). G1: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử trước khi sấy (g).

29

G2: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử sau sấy (g). G: Khối lượng cốc sấy (g).

3.3.2.2. Xác định hàm lượng phlorotannin trong dịch trích ly [13]

Hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết được xác định bằng phương

pháp so màu, dùng thuốc thử Folin – Ciocalteu ở bước sóng 750nm.

Tiến hành: Lấy 1ml dịch trích ly dung môi + 1ml Folin – Ciocalteu

10% + 2ml Na2CO3 10%. Sau đó đặt các ống nghiệm trong bóng tối ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ. Sau khoảng thời gian trên quan sát thấy màu xanh đen xuất hiện và tiến hành so màu bằng máy quang phổ UV – Vis ở bước sóng 750nm, ghi độ hấp thụ và tính toán xác định được hàm lượng phlorotannin có trong mẫu thử.

* Xây dựng đường chuẩn: Cân 1g phlorotannin tinh khiết (chất chuẩn), hòa tan trong bình định mức 1lít bằng nước cất sau khi glucose tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức. Ta có dung dịch chuẩn với nồng độ 1mg/ml (1000ppm).

Từ dung dịch chuẩn ta pha thành dãy chuẩn với các nồng độ: 0,1mg/ml; 0,05mg/ml; 0,02mg/ml; 0,01mg/ml; 0,001mg/ml; tương ứng với các nồng độ 100ppm; 50ppm; 20ppm; 10ppm; 1ppm.

Lấy 5ml mỗi nồng độ chất chuẩn đưa vào các ống nghiệm 1ml. Thêm lần lượt vào tất cả các ống nghiệm chuẩn 1ml Folin – Ciocalteu 10% lắc đều trong 5 phút, rồi bổ sung thêm lần lượt vào các ống nghiệm 2ml Na2CO3 lắc đều và để trong bóng tối khoảng 1 giờ.

Chuyển dãy chuẩn ra các cuvet và đo độ hấp thụ quang học ở bước

sóng là 750nm.

Kết quả xây dựng đường chuẩn: y = 6,4843x + 0,0441 với R2 = 0,9996 (phụ lục 1) * Tính toán xác định hàm lượng phlorotannin trong sinh khối rong mơ. Từ đường chuẩn xác định được nồng độ mẫu phân tích. Hàm lượng phlorotannin được tính theo công thức sau:

x * n * V Hàm lượng phlorotannin (%) = m

30

Trong đó: x: Là số gam xác định từ đường chuẩn n: Là hệ số pha loãng m: Là khối lượng mẫu ban đầu đem phân tích (g) V: Là thể tích dung môi (ml)

3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý các số liệu thực nghiệm theo phương pháp thống kê sử dụng

Iristat 5.0 và MS. Excell

31

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly phlorotannin

Tính chất của nguyên liệu có ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly phlorotannin. Nếu hàm ẩm của nguyên liệu giảm thì tốc độ trích ly tăng lên, vì lượng nước trong nguyên liệu tác dụng với protein và các chất háo nước khác làm ngăn cản sự chuyển dịch của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán. Chúng tôi sử dụng nguyên liệu rong mơ có độ ẩm là 16% để sử dụng cho quá trình trích ly phlorotannin.

Kích thước của nguyên liệu có ảnh hưởng lớn đến khả năng trích ly phlorotannin, nếu kích thước nguyên liệu mà lớn thì dung môi khó tiếp xúc với nguyên liệu do đó khả năng trích ly thấp. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly phlorotannin được trình bày ở bảng 4.1 Bảng 4.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly phlorotannin

Kích thước (mm) d ≤ 0,5 0,5 < d ≤ 1 1 < d ≤ 1,5 Hàm lượng phlorotannin ( mg/g chất khô ) 9,372a 8,150b 7,077c

(Ghi chú: Trên cùng một cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo tiêu chuẩn LSD)

Hình 4.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly phlorotannin

32

Từ bảng 4.1 chúng tôi nhận thấy, khi nguyên liệu có kích thước d ≤ 0,5mm thì hàm lượng phlorotannin cao nhất đạt 9,372mg/g. Sau đó là hàm lượng phlorotannin ở kích thước 0,5 < d ≤ 1mm là 8,150mg/g. Nguyên liệu có kích thước 1 < d ≤ 1,5mm có hiệu suất thấp nhất là 7,077mg/g. Kết quả xử lý thống kê cho thấy giá trị hàm lượng phlorotannin ở các kích thước khác nhau là khác nhau ở mức ý nghĩa α = 0,05. Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn kích thước d ≤ 0,5mm là phù hợp nhất cho quá trình trích ly phlorotannin và sử dụng kết quả này cho các nghiên cứu sau. 4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin

Tiến hành 3 thí nghiệm, mỗi mẫu lấy 10g nguyên liệu để trích ly phlorotannin bằng cách sử dụng các dung môi khác nhau. Mẫu 1: Nước cất; Mẫu 2: Ethanol; Mẫu 3: Aceton. Sau khi trích ly thu nhận phlorotannin để đánh giá kết quả. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2 và hình 4.2:

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin

Dung môi

Nước cất

Ethanol

Aceton Hàm lượng phlorotannin (mg/g chất khô) 9,376a 8,970b 7,624c

(Ghi chú: Trên cùng một cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo tiêu chuẩn LSD)

Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin

33

Qua kết quả nghiên cứu bảng 4.2 và hình 4.2 thể hiện: Khi trích ly bằng 3 dung môi nói trên thì hàm lượng phlorotannin thu được giảm dần theo thứ tự sau: Nước cất, ethanol, aceton. Điều này cho thấy những dung môi có độ phân cực mạnh hơn thì hàm lượng phlorotannin thu được cao hơn.

Kết quả nghiên cứu hình 4.2 cho thấy: Khi trích ly bằng dung môi nước cất hàm lượng phlorotannin là cao nhất 9,376mg/g nguyên liệu. Trong khi đó hàm lượng phlorotannin thu được thấp nhất khi sử dụng aceton 7,624mg/g nguyên liệu. Ethanol cũng là dung môi trích ly được phlorotannin với hàm lượng khá cao 8,970mg/g nguyên liệu. Có thể giải thích những điều trên như sau:

Độ phân cực của dung môi và hợp chất tự nhiên là rất quan trọng trong trích ly. Dung môi phân cực thì sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực. Theo tài liệu [29] cho thấy các hợp chất phenol thường dễ dàng hòa tan trong các dung môi phân cực bằng hoặc nhỏ hơn so với nước. Phlorotannin là hợp chất có độ phân cực do đó hiệu quả trích ly của dung môi tăng khi độ phân cực tăng.

Phân tử nước được cấu tạo một phân tử oxy và hai phân tử hydro, mà đôi electron trong môi trường liên kết này bị kéo về phía oxy nên phân tử nước có tính phân cực, do đó nước dễ liên kết với các nguyên tử, phân tử và các chất khác. Mặt khác các phân tử nước liên kết với nhau bằng liên kết hydro (liên kết kém bền) nên các phân tử, nguyên tử hoặc các chất khác dễ bẻ gãy liên kết đó để tạo nên chất mới. Vì vậy trong dịch trích ly thu được hàm lượng cao nhất so với các dung môi còn lại.

Khi trích ly bằng ethanol 960, etahnol được sử dụng có độ nhớt cao 1,20cp sẽ làm cản trở dung môi thấm vào nguyên liệu, nhưng do sức căng bề mặt khá nhỏ 22,03dyn/cm và quan trọng hơn là ethanol có tính phân cực khá mạnh nên khả năng hòa tan phlorotannin vẫn dễ dàng. Vì vậy trong dịch trích ly hàm lượng phlorotannin thu được cũng khá cao 8,970mg/g nhưng vẫn thấp hơn dung môi là nước cất 9,376mg/g.

Khi trích ly bằng aceton, aceton được sử dụng có độ nhớt 0,32cp thấp hơn so với ethanol rất nhiều do đó dễ thấm vào nguyên liệu hơn. Nhưng sức căng bề mặt của aceton là 23,7dyn/cm lớn hơn sức căng bề mặt của ethanol nên hàm lượng phlorotannin thu được trong dịch trích ly thấp hơn so với trích

34

ly bằng ethanol. Vì vậy hàm lượng phlorotannin thu được bằng dung môi là aceton là thấp nhất trong 3 loại dung môi khảo sát.

Theo Riitta Koivikko đã chiết tách hàm lượng phlorotannin từ các loại tảo nâu. Dung môi được sử dụng là nước kết hợp với methanol, ethanol, aceton. Kết quả thu được với tỷ lệ nước và acetone là 3:7 thì thu được hàm lượng phlorotannin cao nhất [29]. Nhưng dựa trên giá trị kinh tế và kết quả khảo sát của mình tôi nên tôi lựa chọn dung môi để trích ly cho các thì nghiệm về sau là nước cất.

4.3. Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly Phlorotannin

Sau khi xác định kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5mm, dung môi là nước cất, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến khá năng trích ly phlorotannin từ rong mơ. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 và hình 4.4

Bảng 4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin

Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (ml/g) 30/1 35/1 40/1 45/1 Hàm lượng phlorotannin (mg/g chất khô) 8,554c 9,375b 10,280a 10,276ab

(Ghi chú: Trên cùng một cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo tiêu chuẩn LSD)

Hình 4.3. Đồ thì biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin

35

Qua kết quả nghiên cứu hình 4.3 và bảng 4.3 cho thấy khi tăng thể tích dung môi thì hàm lượng phlorotannin thu được tăng, cao nhất ở tỷ lệ dung môi/nguyên liệu = 40/1 đạt 10,280mg/g nguyên liệu. Khi vượt quá tỷ lệ 40/1 thì hàm lượng phlorotannin không tăng nữa. Ở tỷ lệ 45/1 hàm lượng phlorotannin đạt 10,276mg/g nguyên liệu thấp hơn 0,004mg/g so với khi trích ly ở tỷ lệ 40/1. Có thể giải thích như sau:

Trong quá trình trích ly bằng dung môi thì nhận thấy rằng khi lượng dung môi càng lớn thì hiệu quả trích ly càng tăng do chúng luôn tạo ra được một sự chênh lệch nồng độ cần thiết bên trong và bên ngoài môi trường tức là luôn có động lực cho quá trình.

Khi tỷ lệ tăng, phlorotannin và các chất tan có điều kiện hòa tan tốt vào dung môi bởi lượng dung môi lớn sẽ làm tăng khả năng tiếp xúc, từ đó làm tăng sự chênh lệch áp nồng độ phlorotannin giữa môi trường bên trong và bên ngoài nguyên liệu. Sự chênh lệch này càng lớn thì tốc độ trích ly càng nhanh. Khi chưa đạt cân bằng thì quá trình khuếch tán vẫn tiếp tục diễn ra.

Lúc đầu nồng độ chất phlorotannin và các chất tan có trong nguyên liệu nhiều, sự khuếch tán chúng ra khỏi tế bào cũng nhanh và mạnh. Nhưng dần dần khi lượng dung môi đã ngấm kiệt vào trong các thành phần của nguyên liệu (sự thẩm thấu gần đạt trạng thái bão hòa) và nồng độ chất tan cũng như phlorotannin đã giảm so với ban đầu, thì sự khuếch tán các chất này ra khỏi tế bào nguyên liệu cũng giảm và chậm hơn. Do đó khả năng hòa tan của chúng vào môi trường trích ly sẽ bị giảm và dần ổn định (lúc này chênh lệch nồng độ chất tan trong tế bào nguyên liệu và trong dịch trích ly rất nhỏ).

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu = 30/1 là tỷ lệ thấp nhất và hàm lượng phlorotanin thấp nhất do dung môi thấp chưa đủ tách hết lượng phlorotanin trong nguyên liệu ra ngoài môi trường trích ly hoàn toàn.

Ở tỷ lệ dung môi/nguyên liệu = 35/1 là 9,375mg/g chưa đạt được hàm lượng phlorotannin cao nhất do lượng dung môi chưa đủ để tách hết lượng phlorotannin trong nguyên liệu.

Tại tỷ lệ 40/1 tạo ra sự chênh lệch nồng độ lớn nhất, lượng phlorotannin dịch chuyển qua màng tế bào và thoát ra ngoài môi trường nhiều 10,280mg/g. Vì vậy cho hàm lượng phlorotannin cao nhất.

36

Nhưng khi tỷ lệ 45/1 lại thu được hàm lượng phlorotannin là 10,276mg/g xấp xỉ với hàm lượng thu được với tỷ lệ 40/1, có thể giải thích như sau: Khi tỷ lệ quá cao sẽ dẫn đến sự cân bằng pha, trong dịch trích ly phlorotannin còn có nhiều chất tan khác do đó lượng phlorotannin thu được không tăng.

Do đó tôi chọn tỷ lệ dung môi/nguyên lệu là 40/1 là tỷ lệ thích hợp cho

quá trình trích ly và là thông số cố định cho các thí nghiệm tiếp theo.

4.4. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin

Sau khi xác định được kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5mm, dung môi là nước cất và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu = 40/1 thích hợp, tôi tiến hành ngiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin trong các điều kiện này. Kết quả được thể hiện tại bảng 4.4 và hình 4.4.

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin

Nhiệt độ (0C)

40 50 60 70 Hàm lượng phlorotannin ( mg/g chất khô ) 10,286c 10,868a 9,851b 8,214d

(Ghi chú: Trên cùng một cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo tiêu chuẩn LSD)

Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin

37

Từ kết quả nghiên cứu bảng 4.4 và đồ thị (hình 4.4), ta thấy hàm lượng phorotannin trong dịch trích ly tăng lên khi ta tăng nhiệt độ từ 400C đến 500C từ 10,286mg/g lên 10,868mg/g và bắt đầu giảm xuống khi tăng nhiệt độ từ 500C đến 700C và hàm lượng phlorotannin là 8,214mg/g. Có thể giải thích như sau:

Khi tăng nhiệt độ trích ly sẽ làm giảm độ nhớt của dịch, làm tăng tốc độ

phản ứng giữa các thành phần hóa học [4] trong nguyên liệu với nhau cũng

như các thành phần đó với hỗn hợp dung môi trích ly. Và tăng hiệu quả của

quá trình trích ly. Tuy nhiên nhiệt độ quá cao làm cho hiện tượng chuyển pha

của dung môi diễn ra mãnh liệt đồng thời quá trình oxy hóa phlorotannin tăng

cao nên làm giảm hiệu quả trích ly.

Khi tăng nhiệt độ trích ly làm cho chuyển động nhiệt tăng lên, tốc độ

khếch tán các chất tan cũng như phlorotannin từ bên trong nguyên liệu ra

ngoài môi trường trích ly sẽ tăng, làm tăng sự thẩm thấu giữa dung môi và tế

bào nguyên liệu [4]. Vì vậy hàm lượng phlorotannin trong dịch tăng lên. Tuy

nhiên nhiệt độ là một yếu tố có giới hạn, vì nhiệt độ quá cao làm cho hiện

tượng chuyển pha của dung môi diễn ra mãnh liệt, đồng thời quá trình oxy

hóa phlorotannin tăng cao nên làm giảm hiệu quả trích ly. Ngoài ra, nhiệt độ

có thể xảy ra các phản ứng không mong muốn, làm biến tính hay thay đổi một

số thành phần chất tan cần thiết. Còn nếu nhiệt độ quá thấp thì lại kéo dài thời

gian trích ly ảnh hưởng đến cả quá trình.

Nhìn chung có thể nhìn thấy rõ yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng rất rõ đến quá trình trích ly. Vì vậy tôi chọn nhiệt độ 500C là nhiệt độ trích ly thích hợp cho quá trình trích ly và là thông số cố định cho các thí nghiệm tiếp theo.

4.5. Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích

ly phlorotannin

Kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5mm, dung môi là nước cất, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu = 40/1, nhiệt độ trích ly là 500C, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly trong những điều kiện cố định này.

Kết quả được thể hiện tại bảng 4.5 và hình 4.5.

38

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly phlorotannin

Thời gian (giờ)

1

2

3

4 Hàm lượng phlorotannin (mg/g chất khô) 7,613d 10,868c 10,928b 11,074a

(Ghi chú: Trên cùng một cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo tiêu chuẩn LSD)

Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly phlorotannin

Từ kết quả nghiên cứu, ta thấy được rằng khi thay đổi thời gian từ 1 giờ đến 4 giờ thì hàm lượng phlorotannin tăng dần; từ 1 giờ đến 2 giờ thì hàm lượng phlorotannin tăng nhanh từ 7,613mg/g lên đến 10,868 mg/g nguyên liệu, nhưng từ 2 giờ đến 3 giờ lại tăng chậm 10,928mg/g và 4 giờ là 11.074mg/g. Có thể giải thích điều này như sau:

Khi thời gian kéo dài, giúp dung môi thẩm thấu vào trong từng tế bào nguyên liệu qua các mao quản, tạo điều kiện thuận lợi cho sự khuếch tán chất tan và phlorotannin ra khỏi nguyên liệu vào môi trường trích ly.

Lúc đầu lượng chất tan và phlorotannin có trong nguyên liệu nhiều nên khả năng hòa tan của nó trong môi trường trích ly sẽ lớn. Nhưng lượng phlorotannin trong nguyên liệu chỉ có ở mức độ giới hạn nhất định. Vì vậy hàm lượng phlorotannin chỉ tăng mạnh ở thời gian đầu, đến một thời điểm

39

nào đó khi sự khếch tán các chất tan và phlorotannin xảy ra hạn chế thì hàm lượng phlorotannin sẽ giảm vì khả năng oxy hóa của phlorotannin.

Ta thấy thời gian trích ly dài thì hàm lượng phlorotannin trong dịch tăng, nhưng việc kéo dài thời gian lại bất lợi về mặt năng lượng và ảnh hưởng đến thời gian thực hiện quy trình.

Qua quá trình thực hiện nghiên cứu và kết quả thu được sau quá trình

nghiên cứu nên tôi chọn thời gian trích ly là 2 giờ thích hợp nhất.

4.6. Kết quả xác định ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin

Sau 3 lần trích ly thì hàm lượng phlorotannin trong nguyên liệu còn lại

không đáng kể, kết quả được thể hiện ở bảng 4.6 và hình 4.6.

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin

Số lần trích ly

1

2

3 Hàm lượng phlorotannin (mg/g) 10,867a 2,784b 0,893c

(Ghi chú: Trên cùng một cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo tiêu chuẩn LSD)

Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin

40

Qua kết quả hình 4.6 cho thấy khi trích ly lần 1 hàm lượng phlorotannin là cao nhất 10,867mg/g nguyên liệu. Trích ly lần thứ 2, thì hàm lượng phlorotannin giảm xuống đáng kể chỉ còn 2,784mg/g nguyên liệu. Tiếp tục trích ly đến lần thứ 3 thì hàm lượng phlorotannin thu được rất ít 0,893mg/g nguyên liệu. Có thể giải thích như sau: Ban đầu nồng độ chất tan trong nguyên liệu lớn nên dịch trích ly thu được nhiều. Hàm lượng phlorotannin trong rong có mức giới hạn nhất định, nên đến một thời điểm nào đó thì sự khuếch tán sẽ cân bằng. Ở những lần trích ly sau, lượng phlorotannin trong rong rất ít. Khi đó sẽ không thu thêm được lượng phlorotannin được nữa, mà còn lẫn nhiều tạp chất khác.

Như vậy lượng phlorotannin thu được qua 3 lần trích ly tăng lên không đáng kể so với trích ly 1 lần. Trong khi dung môi sử dụng nhiều, gây khó khăn cho quá trình cô đặc đồng thời gây lãng phí dung môi, nên không cần thiết trích ly nhiều lần. Vì vậy tôi lựa chọn trích ly 2 lần. 4.7. Kết quả xác định thông số thích hợp của quá trình cô đặc

Vì tôi chọ tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 40/1 nên thể tích dịch trích ly lớn và nồng độ chất trích ly nhỏ. Vì vậy cần thiết phải tăng nồng độ chất chiết bằng phương pháp khác nhau. Trong luận văn này, tôi chọn phương pháp cô đặc chân không với áp suất chân không. Đây là phương pháp sử dụng phổ biến với các chất có hoạt tính sinh học. Để xác định nhiệt độ cô đặc, mỗi một mẫu tôi lấy 500ml dịch trích ly đem cô tại các nhiệt độ 400C, 500C, 600C, 700C tại áp suất thường cho đến khi thể tích dung dịch còn 1/10 thể tích ban đầu (50ml) và đem các mẫu đi phân tích và đánh giá cảm quan. Kết quả thể hiện ở bảng 4.7.

Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến hàm lượng phlorotannin

STT Chất lượng cảm quan Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)

Hàm lượng phlorotannin (mg/g) 10,868a 1 40 50

2 50 40 10,868a

3 60 30 10,321b

4 70 20 9,894c Màu nâu, dạng lỏng có cặn màu trắng Màu nâu, dạng lỏng có cặn màu trắng Màu nâu đen, dạng lỏng có cặn màu trắng Màu nâu đen, dạng lỏng có cặn màu vàng

41

Số liệu bảng 4.7 cho thấy rằng, hàm lượng phorotannin ít thay đổi theo

nhiệt độ cô đặc. Tuy nhiên các chỉ tiêu cảm quan thay đổi đổi rõ rệt từ màu nâu sang nâu đen khi nhiệt độ cô đặc từ 400C đến 700C.

Nguyên nhân là do quá trình cô đặc là quá trình làm bay hơi chất lỏng

khỏi dung dịch trích ly, nhờ sự chênh lệch nhiệt độ và áp suất. Tốc độ chuyển

động nhiệt của các phân tử chất lỏng nằm gần mặt thoáng có một giới hạn

nhất định, ở một thời điểm nào đó các phân tử sẽ thoát ra khỏi bề mặt trở

thành trạng thái tự do (dạng hơi). Không những phân tử ở trên bề mặt thoáng

bay hơi mà chủ yếu là các bọt hơi tạo thành trong chất lỏng. Chúng là những

tâm tạo thành hơi nhờ lực đẩy Acsimet được đẩy lên bề mặt thoáng và chúng

chuyển động liên tục bên trong lớp chất lỏng lên bề mặt thoáng. Điều kiện tạo

thành hơi là áp suất bọt bằng áp suất chất lỏng [4]. Khi đó dung môi sẽ bay

hơi, làm giảm thể tích của dịch trích ly. Từ đó tăng nồng độ dung dịch và màu

của dịch sau khi cô đặc sẽ làm đậm lại.

Trong quá trình cô đặc, nhiệt độ sôi của dịch phụ thuộc vào áp suất hơi

ở trên bề mặt, nồng độ chất khô và tính chất vật lý, hóa học của hỗn hợp. Khi

áp suất hơi trên bề mặt của sản phẩm càng thấp thì nhiệt độ sôi sẽ giảm. Hay

nói cách khác chúng ta điều chỉnh nhiệt độ sôi bằng cách thay đổi độ chân

không [1]. Đồng thời, khi nhiệt độ sôi thấp tính chất của sản phẩm ít bị biến

đổi và màu sắc cũng ít biến đổi. Nhiệt độ sôi thấp còn là giảm tốc độ ăn mòn

của vật liệu lên thiết bị, kéo dài thời gian bền của thiết bị [1].

Khi nhiệt độ tăng lên từ 400C đến 500C hàm lượng phlorotannin và màu sắc của dịch trích ly ít bị thay đổi nhưng khi nâng nhiệt độ đến 600C thì hàm lượng phlorotannin bắt đầu giảm dần và màu sắc cũng chuyển dần sang màu

nâu đen, có thể giải thích như sau: Nhiệt độ cao có thể xảy ra các phản ứng

không mong muốn, làm biến tính hay thay đổi một số thành phần chất tan cần

thiết. Vì vậy hàm lượng phlorotanin cũng sẽ biến tính và mất dần khi nhiệt độ

tăng cao.

Do vậy tôi lựa chọn phương pháp cô chân không để dễ điều chỉnh được

nhiệt độ sôi bằng cách giảm áp suất mà không cần tăng nhiệt độ, hạn chế được

42

quá trình oxy hóa chất tan cũng như ảnh hưởng xấu của nhiệt độ cao đến cô

dịch. Bên cạnh đó, để tiết kiệm thời gian và chi phí năng lượng cho quá trình thực hiện, tôi tiến hành cô dịch trích ly ở nhiệt độ 500C trong khoảng 40 phút. 4.8. Kết quả xác định thông số thích hợp của quá trình ly tâm

Dung dich sau khi cô đặc chứa các muối khoáng và một số tạp chất khác ít tan trong nước tạo dạng cặn màu trắng đục. Vì vậy, tôi tiến hành loại bỏ cặn bằng phương pháp ly tâm. Để xác định thời gian ly tâm thích hợp, tôi tiến hành thí nghiệm như sau: Mỗi một thí nghiệm lấy 300ml đem ly tâm tại các thời gian khác nhau là 5 phút; 10 phút; 15 phút; 20 phút và 25 phút với tốc độ 5000 vòng/phút. Các mẫu đem đi đánh giá cảm quan và kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.8.

Bảng 4.8. Kết quả đánh giá cảm quan dịch trích ly

1 2 3 4 5 Mẫu

5 10 15 20 25

Thời gian (phút)

Màu sắc Màu vàng nâu Màu vàng nâu Màu vàng nâu Màu vàng nâu Màu vàng nâu

Độ trong

Còn cặn lơ lửng trong dịch trích ly Dịch trong, lượng cặn không đổi Dich trong, lượng căn không đổi Còn cặn lơ lửng trong dịch trích ly nhưng đã giảm đáng kể Dịch trong không còn cặn lơ lửng trong dịch trích ly

Từ kết quả nghiên cứu ta thấy trong quá trình ly tâm, lượng tạp chất trong dịch trích ly phụ thuộc vào thời gian ly tâm. Thời gian càng dài, lực ly tâm càng có điều kiện tác động lên toàn bộ các phần tử trong dịch rong, khả năng phân tách các tạp chất cao nên lượng tạp chất tách ra càng nhiều, dịch càng trong và sáng hơn. Nhưng nếu càng kéo dài thời gian ly tâm, sự tác động của lực ly tâm đến các thành phần trong dịch đã đạt đến trạng thái ổn định và lượng tạp chất trong dịch rong lúc này không còn nhiều như lúc đầu nên chúng sẽ thay đổi ít hoặc không thay đổi. Cụ thể như sau:

43

Dịch chiết sau khi ly tâm trong 5 phút vẫn còn nhiều cặn lơ lửng, lượng

tạp chất tách ra ít và màu vẫn kém sáng.

Khi ly tâm trong 10 phút, dịch chiết trong hơn, lượng tạp chất tách ra nhiều hơn nhưng vẫn còn một lượng cặn nhất định lơ lửng trong dịch trích ly. Khi tiến hành ly tâm trong thời gian 15 phút ta thấy dịch trích ly trong, lượng tạp chất đã lắng hết, màu dịch sáng rõ rệt.

Tuy nhiên khi kéo dài thời gian ly tâm trong khoảng 20 − 25 phút quan sát kĩ ta thấy dịch trong và sáng nhưng lượng tạp chất tồn tại trong dịch vẫn không thay đổi.

Do vậy, để dịch trích ly thu được trong hơn và sáng màu hơn, đồng thời tránh lãng phí thời gian và năng lượng ta chọn thời gian thích hợp nhất là 15 phút với tốc độ ly tâm là 5000 vòng/phút để làm thông số cố định cho quá trình ly tâm.

44

4.9. Đề xuất quy trình trích ly phlorotannin từ rong Sargassum Polycystum.

*Sơ đồ quy trình:

Rong mơ ( 1,6 – 1,8%)

Xử lý nguyên liệu (sấy đến độ ẩm 16%, kích thước d ≤ 0,5mm)

Trích ly (tỷ lệ dung môi 40/1, nhiệt độ 500C, thời gian 2 giờ, dung môi nước cất)

Lọc

Bã

Cô đặc chân không (500C, 40 phút)

Ly tâm (15 phút)

Chế phẩm phlorotannin

Hình 4.7. Sơ đồ quy trình trích ly phlorotannin từ rong Sargassum polycystum

45

* Thuyết minh quy trình:

Nguyên liệu:

Lựa chọn rong mơ ít tạp chất, có nguồn gốc và được thu mua đúng cách.

Rong khô cần được bảo quản trong điều kiện thích hợp, tránh hút ẩm,

tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời. Vì khi đó một số thành phần

nhạy cảm của rong với môi trường sẽ bị phân hủy gây hao hụt hoặc làm biến

tính giá trị của chúng. Do đó rong được bảo quản trong bao bì nilon và để

trong bóng tối.

Xử lý nguyên liệu:

Mục đích: Loại bỏ tạp chất dính trên rong mơ. Tiến hành cắt nhỏ

nguyên liệu d ≤ 0,5mm

Trích ly:

Rong đã được cắt nhỏ cho vào các lọ thủy tinh có nắp đậy kín, tránh

hiện tượng dung môi bay hơi trong quá trình ngâm rong. Ta tiến hành trích ly

trong các điều kiện: Dung môi là nước cất; tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 40/1; kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5mm; nhiệt độ trích ly là 500C; thời gian trích ly là 2 giờ.

Thực hiện công đoạn trích ly theo phương pháp ngâm. Khi gia nhiệt

cho quá trình trích ly, sử dụng tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ, đồng thời phải

thường xuyên lắc mẫu trong suốt thời gian trích ly.

Lọc:

Lọc nhằm mục đích loại bỏ các chất không tan, bã ra khỏi hỗn hợp trích

ly và thu hồi dịch trích ly. Tiến hành lọc ở điều kiện phòng và sử dụng giấy

lọc Whatman 01.

Cô đặc: Tiến hành cô đặc ở nhiệt độ 500C trong khoảng thời gian 40 phút thì đạt được nồng độ chất khô hoặc thể tích dịch trích ly như mong muốn. Sau khi cô

đặc hầu như dung môi nước bay hơi hết.

Sử dụng thiết bị cô quay điều chỉnh được nhiệt độ và áp suất một cách

dễ dàng, tạo môi trường chân không và khấy đảo cho quá trình cô đặc. Từ đó

46

hạn chế được ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, nhiệt độ cao đến hàm

lượng và hoạt tính chất ta cần thiết.

Ly tâm:

Một lượng tạp chất còn lại sau quá trình lọc và cô đặc sẽ được tách hết

ra khỏi dịch trích ly như vào lực ly tâm của quá trình ly tâm. Vì thế sau khi ly

tâm, dịch lọc trong hơn và sáng màu hơn.

47

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

Qua thời gian thực hiện đề tài, tôi rút ra một số kết luận như sau: Đã xây dựng được quy trình trích ly phlorotannin từ rong Sargassum

Polycystom của bờ biển Nha Trang – Khánh Hòa.

Phlorotannin tồn tại chủ yếu trong tế bào của cây rong và là thành phần có nhiều giá trị trong y học, thực phẩm, mỹ phẩm,… Nếu quá trình thu hái, bảo quản làm cây rong bị dập nát sẽ rất dễ gây tổn thất một lượng phlorotannin nhất định. Do đó, tôi lựa chọn nguyên liệu có nguồn gốc khô và đươc bảo quản trong túi nilon và để trong bống tối.

Xác định được các thông số kỹ thuật cho quá trình trích ly, đó là: Dung môi nước cất; tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 40/1; kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5mm; nhiệt độ trích ly là 500C; thời gian trích ly là 2 giờ.

Xác định được chế độ cô đặc phù hợp, cô đặc trong điều kiện chân

không với nhiệt độ cô 500C trong khoảng 40 phút.

Xác định được thời gian ly tâm là 15 phút với tốc độ ly tâm là 5000

vòng/phút.

5.2. Kiến nghị

Mặc dù đã cố gắng trong quá trình làm đề tài, song do thời gian và điều kiện nghiên cứu có giới hạn nên đề tài vẫn có giới hạn nên đề tài vẫn còn nhiều hạn chế và thiếu sót. Vì vậy tôi xin đề xuất một số kiến nghị sau:

Cần nghiên cứu thêm phương pháp thu hái và bảo quản rong từ lúc còn

tươi để hạn chế tổn thất các thành phần quý trong rong.

Áp dụng phương pháp nghiên cứu sử dụng trong đề tài đối với những loại rong có điều kiện sống khác nhau. Tìm hiểu những yếu tố ban đầu ảnh hưởng đến hàm lượng phlorotannin trong rong như: Tính chất thủy hóa, thòi gian thu hái, độ tuổi của rong, môi trường sinh sống …

Sử dụng những phương pháp trích ly phlorotannin khác. Nghiên cứu khả năng ứng dụng của hợp chất phlorotannin vào trong

các lĩnh vực: Thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,…

48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu trong nước

1. Đặng Xuân Cường (2009), Nghiên cứu thu nhận dịch chiết có hoạt

tính kháng khuẩn từ rong Nâu Dictyota Dichotoma Việt Nam, Luận văn Thạc

sỹ, Đại học Nha Trang.

2. Đặng Xuân Cường, Trần Thị Thanh Vân, Bùi Minh Lý, Vũ Ngọc

Bội(2011), Sự tích lũy và phân bố phlorotannin chống oxy hóa trong một số

loài rong Sargassum Khánh Hòa theo thời gian sinh trưởng. Quyển 4 – sinh

học và nguồn lợi, Hội nghị Khoa học và công nghệ biển toàn quốc lần thứ V,

Tuyển tập báo cáo, nxb. Khoa học tự nhiên và công nghệ.

3. Đặng Xuân Cường, Trần Thị Thanh Vân, Vũ Ngọc Bội (2011), Ứng

dụng mô hình đáp ứng bề mặt Box – Behnken trong tối ưu hóa công đoạn

chiết Phlorotannin từ rong nâu (Sargassum aemulum Sonder) Khánh Hòa, Kỷ

yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc – Khu vực phía Nam lần thứ II –

năm 2011, TP. HCM.

4. Khoa hóa thực phẩm và công nghệ sinh học, Các quá trình công

nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.

5. Ngô Đăng Nghĩa, Luận án tiến sỹ (1999) , Tối ưu hóa quy trình

công nghệ sản xuất alginate natri từ rong mơ Việt Nam và ứng dụng của nó

trong một số lĩnh vực sản xuất.

6. Nguyễn Hải Hà (2004), Nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà

Camellia sinensis (L), Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí

Minh.

7. Phạm Đức Thịnh (2007), Tách chiết và phân tích thành phần các

polysacchrid tan trong nước từ một số loài rong nâu Việt Nam, luận văn thạc

sĩ, Viện Nghiên Cứu và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang, Khánh Hòa.

8. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng

Nghĩa (2004), Chế biến rong biển, NXB Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh.

49

Tài liệu nước ngoài

9. Airanthi, Hosokawa, M., & Miyashita, K. (2011). Comparative Antioxidant Activity of Edible Japanese Brown Seaweeds. Journal of Food Science, 76(1), C104 – C111.

10. B. Tangorone, J.C.Royer, J.P. Nakas (1989), Purification and characterization of an endo – (1,3) – β – D – glucanase from Trichoderma longibrachiatum, Applied and environmental. Microbiology, Vol 55, No 1, pp 177 – 184).

11. Burtin, P. (2003). Nutritonal value of seaweeds. Electronic Journal

Of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 24, 498 – 503.

12. Ioana Ignat, Irina Volf, Valentin I. Popa (2011), A critical review of methods for characterisation of polyphenolic compounds in fruit and vegetables, Food Chemistry, 126, 1821–1835.

13. Franciska S, Steinhoff, Martin Graeve, Krzysztof Bartoszek, KaiBischof,Christian Wiencke (2012), Phlorotannin Production and Lipid Oxidation as a Potential Protective Function Against High Photosynthetically Active and UV Radiation in Gametophytes of Alaria esculenta (Alariales, Phaeophyceae) Photochemistry and Photobiology, 88, 1, 46–57.

14. Koki Nagayama, Yoshitoshi Iwamura, Toshiyuki Shibata, Izumi , Bactericidal activity of the brown algal, Ecklonia kurome, Journal of from

Hirayamal and Takashi Nakamura (2002) phlorotannins Antimicrobial Chemotherapy 50, 889 – 893.

15. Kotake – Nara E, Asai A, Nagao A (2005), Neoxanthin and fucoxanthin Induceapoptosis in PC-3 human prostate cancer cells. Cancer Lett. 2005;220:75 – 84.

16. MariaE. R. Duarte, aMarcA. Cardoso, aMiguelD. Noseda, a, lAlberto S. Cerezo(2001), Structural studieson fucoidans from the brown seaweed Sargassum Stenophyllum, Carbohydrate Research 333, pp 281 – 293. 17. Maria I. Bilan, Alexey A. Grachev, Alexander S. Shashkov, Nikolay E, Nifantiev and Anatolii I. Usov (2006), Structure of a Fucoidan

50

from the brown seaweed Fucus serratus L, Carbohydrate Research 341, pp 238 – 245.

18. Mayalen Zubia, Daniel Robledo, Yolanda Freile – Pelegrin (2007), Antioxidant activities in tropical marine macrroalgae from the Yucatan Peninsula, Mexico, J Appl PHYCOL 19:449 – 458.

in Ecklonia extract cava

19. Moon Moo Kim, Quang Van Ta, Eresha Mendis, Niranjan Rajapakse, Won Kyo Jung, Hee Guk Byun, You Jin Jeon, Se Kwon Kim (2006), Phlorotannins inhibit matrix metalloproteinase activity, LifeSciences79 1436 – 1443.

20. Mülheim an der Ruhr (2009), Isolation, Characterisation,

Modification an Application of Fucoidan from Fucus vesiculosu.

21. Murat Artan, Yong Li, Fatih Karadeniz, Sang Hoo Lee, Moon Moo Kim, Se Kwon Kim (2008), Anti – HIV – 1 activity of phloroglucinol derivative; 6,6’ – bieckol, from Echlonia cava, Bioorganic & Medicinal Chemistry 167921 – 7926.

22. Nelson T.E., Lewis B. A (1974), Separation and characterization of thesoluble and insoluble components of insoluble laminaran // Carbohydr. Res. Vol.33. P. 63 – 74.

23. Rangan M. A. and Glombitza K. W. 1986, Phlorotannin, Brown

Algal polyphenols, Prog. Phycol. Res, 4, 1290241.

24. Shibata T, Ishimaru K, Kawaguchi S, Yoshikawa H, & HamaY (2008), Antioxidant activities of phlorotannins isolated from Japanese Laminariaceae. Journal of Applied Phycology, 20(5), 705 – 711.

25. Tierney, M. S., Croft, A. K., & Hayes, M. (2010). A review of antihypertensive and antioxidant activities in macroalgae. Botanica Marina, 53(5), 387 – 408.

26. Sang Hoon Lee, Li Yong , Fatih Karadeniz, Moon Moo Kim, Se Kwon Kim (2008), α – glucosidaseand α – amylase inhibitory activities of phlorotannin derivatives from Ecklonia cava, Journal of Biotechnology 136S S577 – S588.

51

27. Yuan. (2007). Antioxidants from Edible Seaweeds. In F. Shahidi & C. T.Ho (Eds.), Antioxidant Measurement and Applications (Vol. 956, pp. 268 – 301): American Chemical Society.

28. Yvonne, Y. (2007). Marine Algal Constituents Marine

Nutraceuticals and Functional Foods (pp. 259 – 296): CRC Press.

29. Riitta Koivikko (2008), Brown algal phlorotannins improving and Applying chemical methods, Ph. D. Thesis, University of Turku, Turku, Finland.

30. Masaaki Nakai, Norihiko Kageyama, Koichi Nakahara and WataruMiki (2006), Phlorotannins as Radical Scavengers from the Extract of Sargassum ringgoldianum, Marine biotechnology, 409 – 414.

31. Jay Robert Rowen (2008), Super Antioxidant from the Sea, From

the Townsend Letter.

Tài liệu internet

32. http://www.kilobooks.com/threads/117470 – Các – phương – pháp

– chiết – suất – và tổng – hợp – flavonoid#ixzz1vA2z0xeZ.

52

PHỤ LỤC

Kết quả xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang

vào nồng độ phlorotannin để xác định hàm lượng phlorotannin.

Đồ thị đường chuẩn phlorotannin

53

Một số hình ảnh trong đề tài

Nguyên liệu rau mơ Kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5 mm

Dịch trích ly 600C Dịch trích ly tỷ lệ 35/1

54

Xử lý Irristat

Kích thước nguyên liệu trích ly BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQFILE SL1 1/ 6/14 15: 3 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua kich thuoc den kha nang trich ly phlorotannin VARIATE V002 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ===================================================================== ======== 1 KT$ 2 7.91164 3.95582 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 6 .474180E-02 .790299E-03 -------------------------------------------------------------------- --------- * TOTAL (CORRECTED) 8 7.91638 .989547 -------------------------------------------------------------------- --------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL1 1/ 6/14 15: 3 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua kich thuoc den kha nang trich ly phlorotannin MEANS FOR EFFECT KT$ -------------------------------------------------------------------- ----------- KT$ NOS KQ 0.5 3 9.37200 1 3 8.15000 1.5 3 7.07700 SE(N= 3) 0.162306E-01 5%LSD 6DF 0.561443E-01 -------------------------------------------------------------------- ----------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL1 1/ 6/14 15: 3 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua kich thuoc den kha nang trich ly phlorotannin F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |KT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 9 8.1997 0.99476 0.28112E-01 0.3 0.0000

55

Dung môi trích ly BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE SL2 1/ 6/14 15:41 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua dung moi den kha nang trich ly phlorotannin VARIATE V002 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ===================================================================== ======== 1 DM$ 2 5.04956 2.52478 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 6 .185966E-03 .309943E-04 -------------------------------------------------------------------- --------- * TOTAL (CORRECTED) 8 5.04975 .631218 -------------------------------------------------------------------- --------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL2 1/ 6/14 15:41 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua dung moi den kha nang trich ly phlorotannin MEANS FOR EFFECT DM$ -------------------------------------------------------------------- ----------- DM$ NOS KQ NUOC 3 9.37667 ETHANOL 3 8.97033 ACETON 3 7.62400 SE(N= 3) 0.321425E-02 5%LSD 6DF 0.111186E-01 -------------------------------------------------------------------- ----------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL2 1/ 6/14 15:41 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua dung moi den kha nang trich ly phlorotannin F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |DM$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 9 8.6570 0.79449 0.55672E-02 0.1 0.0000

56

Tỷ lệ dung môi trích ly BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE SL1 4/ 6/14 1:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua ty le dung moi den kha nang trich ly phlorotannin VARIATE V002 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ===================================================================== ======== 1 TLDM$ 3 6.18348 2.06116 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 .200025E-02 .250031E-03 -------------------------------------------------------------------- --------- * TOTAL (CORRECTED) 11 6.18548 .562317 -------------------------------------------------------------------- --------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL1 4/ 6/14 1:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua ty le dung moi den kha nang trich ly phlorotannin MEANS FOR EFFECT TLDM$ -------------------------------------------------------------------- ----------- TLDM$ NOS KQ 30/1 3 8.55467 35/1 3 9.37533 40/1 3 10.2800 45/1 3 10.2763 SE(N= 3) 0.912927E-02 5%LSD 8DF 0.297696E-01 -------------------------------------------------------------------- ----------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL1 4/ 6/14 1:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua ty le dung moi den kha nang trich ly phlorotannin F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |TLDM$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 12 9.6216 0.74988 0.15812E-01 0.2 0.0000

57

Nhiệt độ trích ly BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE SL5 20/ 5/14 23: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua nhiet do den hieu suat trich ly phlorotannin VARIATE V002 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ===================================================================== ======== 1 ND$ 3 11.6285 3.87615 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 .150546E-04 .188182E-05 -------------------------------------------------------------------- --------- * TOTAL (CORRECTED) 11 11.6285 1.05713 -------------------------------------------------------------------- --------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL5 20/ 5/14 23: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua nhiet do den hieu suat trich ly phlorotannin MEANS FOR EFFECT ND$ -------------------------------------------------------------------- ----------- ND$ NOS KQ 40 3 10.2683 50 3 10.8677 60 3 9.85067 70 3 8.21433 SE(N= 3) 0.792007E-03 5%LSD 8DF 0.258265E-02 -------------------------------------------------------------------- ----------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL5 20/ 5/14 23: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua nhiet do den hieu suat trich ly phlorotannin F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |ND$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 12 9.8003 1.0282 0.13718E-02 0.0 0.0000

58

Thời gian trích ly BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE SL2 4/ 6/14 1:52 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua thoi gian trich ly den kha nang trich ly phlorotannin VARIATE V002 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ===================================================================== ======== 1 TG$ 3 25.2257 8.40857 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 .155445E-03 .194306E-04 -------------------------------------------------------------------- --------- * TOTAL (CORRECTED) 11 25.2259 2.29326 -------------------------------------------------------------------- --------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL2 4/ 6/14 1:52 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua thoi gian trich ly den kha nang trich ly phlorotannin MEANS FOR EFFECT TG$ -------------------------------------------------------------------- ----------- TG$ NOS KQ 1 3 7.61300 2 3 10.8683 3 3 10.9283 4 3 11.0740 SE(N= 3) 0.254497E-02 5%LSD 8DF 0.829888E-02 -------------------------------------------------------------------- ----------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL2 4/ 6/14 1:52 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua thoi gian trich ly den kha nang trich ly phlorotannin F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |TG$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 12 10.121 1.5144 0.44080E-02 0.0 0.0000

59

Số lần trích ly BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE DAF 4/ 6/14 2: 8 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua so lan trich ly den khar nang trich ly phlorotannin VARIATE V002 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ===================================================================== ======== 1 SLTL$ 2 168.391 84.1957 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 6 .320757E-04 .534594E-05 -------------------------------------------------------------------- --------- * TOTAL (CORRECTED) 8 168.391 21.0489 -------------------------------------------------------------------- --------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DAF 4/ 6/14 2: 8 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua so lan trich ly den khar nang trich ly phlorotannin MEANS FOR EFFECT SLTL$ -------------------------------------------------------------------- ----------- SLTL$ NOS KQ 1 3 10.8673 2 3 2.78433 3 3 0.893333 SE(N= 3) 0.133491E-02 5%LSD 6DF 0.461766E-02 -------------------------------------------------------------------- ----------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE DAF 4/ 6/14 2: 8 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua so lan trich ly den khar nang trich ly phlorotannin F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |SLTL$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 9 4.8483 4.5879 0.23121E-02 0.0 0.0000

60

Nhiệt độ cô đặc BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE VZDVDVCD 23/ 5/14 8:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua nhiet do co dac VARIATE V002 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ===================================================================== ======== 1 NDCD$ 3 1.70740 .569135 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 .279885E-04 .349856E-05 -------------------------------------------------------------------- --------- * TOTAL (CORRECTED) 11 1.70743 .155221 -------------------------------------------------------------------- --------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE VZDVDVCD 23/ 5/14 8:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua nhiet do co dac MEANS FOR EFFECT NDCD$ -------------------------------------------------------------------- ----------- NDCD$ NOS KQ 40 3 10.86833 50 3 10.86780 60 3 10.3213 70 3 9.89467 SE(N= 3) 0.107990E-02 5%LSD 8DF 0.352145E-02 -------------------------------------------------------------------- ----------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE VZDVDVCD 23/ 5/14 8:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua nhiet do co dac F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NDCD$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 12 10.454 0.39398 0.18704E-02 0.0 0.000