Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu thành phần loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN NGUYỄN THÀNH NHƠN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ SONG CHỦ

(DIGENEA) KÝ SINH Ở CÁ CHẼM (LATES CALCARIFER

BLOCH, 1790) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN NGUYỄN THÀNH NHƠN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ SONG CHỦ

(DIGENEA) KÝ SINH Ở CÁ CHẼM (LATES CALCARIFER

BLOCH, 1790) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA

Ngành đào tạo: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 62620301

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS. ĐỖ THỊ HÒA 2. PGS.TS. GLENN ALLAN BRISTOW

KHÁNH HÒA - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài “Nghiên cứu thành phần loài sán lá

song chủ (Digenea) ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại

Khánh Hòa” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố

trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này.

Khánh Hòa, ngày 25 tháng 08 năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của quý phòng

ban trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được hoàn thành đề tài.

Đặc biệt là sự hướng dẫn tận tình của PSG. TS. Đỗ Thị Hòa và PGS.TS. Glenn Allan

Bristow đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến

sự giúp đỡ này.

Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, cùng

các phòng chức năng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận

án.

Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trường Đại học Nha Trang, Khoa Sau Đại học,

Viện Nuôi trồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang đã quan tâm, tạo điều kiện

thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án.

Xin chân thành cảm ơn Dự án NUFU (NUFU Pro 67/2003) đã hỗ trợ kinh phí

cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, tạo điều kiện cho tôi được được tiếp cận

các trang thiết bị hiện đại phục vụ nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp thuộc dự án NUFU, Phòng Sinh học

Thực nghiệm, Phòng Vắc xin và Công nghệ Sinh học Thủy sản, Phòng Khoa học, Hợp

tác quốc tế và Đào tạo - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, Viện Công nghệ

Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ tôi trong quá trình

thu mẫu, phân tích mẫu.

Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè

đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày 25 tháng 08 năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ ii

MỤC LỤC .................................................................................................................... iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................... vii

DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. viii

DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................... x

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .......................................................................................... 4

1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm (Lates calcarifer) ............................... 4

1.2. Tình hình nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) thương phẩm ................................ 6

1.2.1. Nuôi cá chẽm thương phẩm trên thế giới .......................................................... 6

1.2.2. Tình hình nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) thương phẩm ở Việt Nam ............. 9

1.3. Nghiên cứu ký sinh trùng ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi ........................ 10

1.3.1. Thành phần loài ký sinh trùng ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) được phát

hiện và công bố trên thế giới ......................................................................................... 10

1.3.2. Nghiên cứu ký sinh trùng trên cá chẽm (Lates calcarifer) ở Việt Nam ......... 12

1.3.3. Nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở cá biển ........................................... 13

1.4. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phân loại sán lá song chủ ........ 17

1.4.1. Hệ thống học phân tử và hệ thống học truyền thống ...................................... 17

1.4.2. Các chỉ thị phân tử thường sử dụng trong nghiên cứu di truyền .................... 18

1.4.3. Ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại sán lá song chủ .......................... 20

CHƯƠNG II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 29

2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................. 29

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................... 29

2.1.2. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................... 29

2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 29

2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 30

2.2.1. Mẫu cá chẽm thương phẩm ............................................................................. 30

2.3. Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng ..................................................... 33

2.3.1. Phương pháp phát hiện, thu thập, bảo quản, cố định và làm tiêu bản các ký

sinh trùng là sán lá song chủ .......................................................................................... 33

iii

2.3.2. Phân loại sán lá song chủ bằng phương pháp hình thái học ........................... 36

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm di truyền của các loài sán lá song chủ ký

sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) .................................................................................. 37

2.3.4. Khảo sát vòng đời phát triển của 1 loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm .... 43

2.3.5. Xử lý số liệu .................................................................................................... 46

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. ...50

3.1. Tình hình nuôi cá chẽm ở Khánh Hòa...........................................................50

3.1. Thành phần giống loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh ở cá chẽm nuôi tại

Khánh Hòa ............................................................................................................. 501

3.1.1. Thành phần giống loài sán lá song chủ đã tìm thấy ký sinh ở cá chẽm .......... 51

3.1.2. Mô tả hình dạng, cấu tạo của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm. .... 55

3.1.3. Xác định loài Pseudometadena celebesensis là ký sinh trung đặc hữu trên cá

chẽm (Lates calcarifer) ................................................................................................. 66

3.2. Phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài SLSC ký sinh ở

cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bằng kỹ thuật sinh học phân tử .............................. 71

3.2.1 Khuếch đại, giải trình tự ADN của sán lá song chủ trên cá chẽm ................... 71

3.2.2. So sánh sự khác biệt về trình tự gen giữa các loài sán lá song chủ ký sinh trên

cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi ở Khánh Hòa .............................................................. 72

3.2.3. Xây dựng cây phát sinh loài với sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm nuôi ở

Khánh Hòa ..................................................................................................................... 78

3.3. Xác định mức độ nhiễm sán lá song chủ trên chẽm nuôi ở Khánh Hòa ..... 81

3.3.1. Mức độ nhiễm sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi theo năm nghiên cứu ........... 81

3.3.2. Mức độ nhiễm sán lá song chủ (Digenea) ở cá chẽm nuôi trong ao đất và

trong các lồng trên biển ................................................................................................. 84

3.3.3. Mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi thương phẩm ở các kích cỡ

khác nhau của cá ............................................................................................................ 87

3.4. Khảo sát sự phát triển các giai đoạn ấu trùng của loài sán Pseudometadena

celebesensis ký sinh ở cá chẽm ............................................................................... 88

3.4.1. Kiểm tra phát hiện ấu trùng sán lá song chủ ký sinh ở các loài ốc và cá tạp .. 89

3.4.2. Kết quả của thí nghiệm dùng cá đối làm thức ăn cho cá chẽm để nghiên cứu

vòng đời loài sán song chủ Pseudometadena celebesensis ........................................... 94

CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ................................................ 97

4.1. Kết luận ............................................................................................................. 97

4.2. Đề xuất ý kiến ................................................................................................... 98

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .... 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 100

Tài liệu Tiếng Việt ................................................................................................. 100

Tài liệu Tiếng Anh ................................................................................................. 102

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADN : Acid Deoxyribonucleic

CĐCN : Cường độ cảm nhiễm

CĐCNTB : Cường độ cảm nhiễm trung bình

: Ký chủ cuối cùng KCCC

: Ký chủ trung gian KCTG

: Ký sinh trùng KST

ITS1, 2 : Internal Transcribed Spacer 1, 2 (Đoạn chèn giữa 1, 2)

: Polymerase Chain Reaction PCR

: Ribosomal Deoxyribonucleic Acid rRNA

: Sán lá song chủ SLSC

TLCN : Tỷ lệ cảm nhiễm

DANH MỤC CÁ C BẢNG

Bảng 1.1. Sản lượng cá chẽm thế giới giai đoạn 2005 - 2014 ......................................... 6

Bảng 1.2. Thành phần giống loài ký sinh trùng ở cá chẽm (Lates calcarifer) .............. 10

Bảng 2.1. Số lượng và kích cỡ trung bình của mẫu cá chẽm ........................................ 30

Bảng 2.2. Số lượng và kích thước cá chẽm được thu từ các ao nuôi trong thời gian từ

tháng 6/2007 đến tháng 3/ 2009 .................................................................................... 31

Bảng 2.3. Số lượng và kích cỡ trung bình của cá chẽm nuôi ao được thu theo các năm

từ 2010 đến 2013 ........................................................................................................... 31

Bảng 2.4. Số lượng và kích cỡ của các loài cá tạp đã được dùng để kiểm tra ấu trùng

metacercaria của sán lá song chủ ................................................................................... 32

Bảng 2.5. Kích cỡ cá chẽm giống trước khi bố trí thí nghiệm ...................................... 33

Bảng 2.6. Trình tự các đoạn mồi được sử dụng cho phản ứng PCR ............................. 39

Bảng 2.7. Trình tự gen 18S rRNA của các loài sán lá song chủ ký sinh ở một số loài cá

biển ................................................................................................................................ 47

Bảng 2.8. Trình tự gen 28S rRNA của một số loài sán lá song chủ ký sinh ở một số

loài cá biển ..................................................................................................................... 48

Bảng 3.1: Thành phần loài, mức độ nhiễm và vị trí ký sinh của sán lá song chủ ở cá

chẽm ............................................................................................................................... 51

Bảng 3.2. Thành phần loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa ...... 52

Bảng 3.3. So sánh kích thước của loài Erilepturus hamati ký sinh ở cá chẽm nuôi tại

Khánh Hòa với các nghiên cứu khác ............................................................................. 58

Bảng 3.4. So sánh kích thước của loài Transversotrema patialense ký sinh ở cá chẽm

nuôi tại Khánh Hòa với các nghiên cứu khác ................................................................ 60

Bảng 3.5. So sánh kích thước của loài Pseudometadena celebesensis ký sinh ở cá

chẽm nuôi tại Khánh Hòa với các nghiên cứu khác ...................................................... 62

Bảng 3.7. So sánh kích thước của loài Elytrophallus sp. ký sinh ở cá chẽm nuôi tại

Khánh Hòa với nghiên cứu khác ................................................................................... 66

Bảng 3.8. Kết quả Parafit của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm. ................. 69

vii

Bảng 3.9. Sự tương đồng (phía dưới đường bên) và khác biệt (phía trên đường bên) về

trình tự 18S rRNA ......................................................................................................... 74

Bảng 3.10. Sự khác biệt về trình tự vùng ITS1 rRNA của các loài sán lá song chủ ký

sinh ở cá chẽm và trên GenBank ................................................................................... 75

Bảng 3.11. Sự tương đồng (phía dưới đường bên) và khác biệt (phía trên đường bên)

về trình tự 28S rRNA ..................................................................................................... 76

Bảng 3.12. Tỷ lệ nhiễm (%) của các loài sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi tại Khánh

Hòa theo các năm nghiên cứu........................................................................................ 82

Bảng 3.13. Cường độ nhiễm trung bình (trùng/cá) của các loài sán lá song chủ trên cá

chẽm nuôi tại Khánh Hòa theo các năm nghiên cứu ..................................................... 82

Bảng 3.14. Tỷ lệ nhiễm (%) sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi ao và lồng qua từng năm

nghiên cứu ..................................................................................................................... 84

Bảng 3.15. Cường độ cảm nhiễm trung bình (trùng/cá) của SLSC ở cá chẽm nuôi ao và

nuôi lồng tại Khánh Hòa qua từng năm nghiên cứu ...................................................... 85

Bảng 3.16. Mức độ nhiễm sán lá song chủ trên các kích cỡ cá chẽm khác nhau tại

Khánh Hòa ..................................................................................................................... 87

Bảng 3.17. Mức độ nhiễm giai đoạn hậu ấu trùng metacercaria của sán lá song chủ ở

cá đối .............................................................................................................................. 90

Bảng 3.18. Một số chỉ tiêu về hình thái của ấu trùng metacercaria M1 ký sinh ở cá đối

thu tại Khánh Hòa .......................................................................................................... 91

Bảng 3.19. Một số chỉ tiêu hình thái của dạng metacercaria M2 ký sinh trên cá đối thu

tại Khánh Hòa ................................................................................................................ 92

Bảng 3.20. Một số chỉ tiêu hình thái của dạng ấu trùng metacercaria M3 ký sinh trên

cá đối thu tại Khánh Hòa ............................................................................................... 93

Bảng 3.21. Mức độ nhiễm sán lá song chủ loài Pseudometadena celebesensis trong

ruột cá chẽm được nuôi bằng thức ăn là cá đối, sau 30 ngày thí nghiệm ...................... 95

viii

DANH MỤC CÁ C HÌNH

Hình 1.1. Tỷ lệ % tổng sản lượng cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi trong 50 năm của

các nước trong khu vực ................................................................................................... 7

Hình 1.2. Hệ gen ribosome của sinh vật nhân thực ....................................................... 18

Hình 1.3. ADN ti thể sán lá ruột Haplorchis taichui .................................................... 19

Hình 1.4. Cây phát sinh loài của các loài sán song chủ dựa trên gen 18S rRNA ......... 23

Hình 2.1. Địa điểm thu mẫu nghiên cứu ....................................................................... 29

Hình 2.2. Cá chẽm Lates calcarifer Bloch, 1790 .......................................................... 30

Hình 2.3. Ốc đinh Cerithium sp. .................................................................................... 31

Hình 2.4. Các loài cá tạp làm thức ăn cho cá chẽm....................................................... 32

Hình 2.5. Hình dạng và cấu tạo chung của sán lá song chủ trưởng thành .................... 36

Hình 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 18S ........................................... 40

Hình 2.10. Sơ đồ thí nghiệm tìm loài cá là ký chủ trung gian thứ hai của sán lá song

chủ loài Pseudometadena celebesensis ......................................................................... 46

Hình 3.1. Helicometra fasciata Rudolphi, 1819 ........................................................... 55

Hình 3.2. Loài Erilepturus hamati (Yamaguti, 1934) Manter, 1947 ............................ 56

Hình 3.3. Loài Transversotrema patialense Soparkar, 1924 ........................................ 59

Hình 3.4. Loài Pseudometadena celebesensis Yamaguti, 1952 ................................... 61

Hình 3.5. Loài Bucephalus margaritae Ozaki & Ishibashi, 1934 ................................. 63

Hình 3.6. Loài Elytrophallus sp. .................................................................................... 65

Hình 3.7. Cây đồng tiến hóa giữa các loài sán lá song chủ và cá chẽm ........................ 68

Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen 18S rRNA và 28S rRNA của bốn loài sán lá

song chủ ký sinh trên cá chẽm. ........................................................................................ 71

Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS1 rRNA của bốn loài sán lá song chủ ký

sinh trên cá chẽm. ............................................................................................................ 72

Hình 3.10. Cây phát sinh loài dựa trên gen 18S rRNA của các loài SLSC ký sinh trên

cá chẽm. ......................................................................................................................... 78

Hình 3.11 Cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA của các loài SLSC ký sinh trên

cá chẽm. ......................................................................................................................... 80

Hình 3.13. Dạng ấu trùng metacercaria M2 ký sinh trên cá đối thu tại Khánh Hòa ..... 92

Hình 3.14. Dạng ấu trùng metacercaria M3 ký sinh trên cá đối thu tại Khánh Hòa ..... 93

Hình 3.15 Hình ảnh của loài SLSC Pseudometadena celebesensis ký sinh ở ruột của cá

chẽm (Lates calcarifer) sau 30 ngày dùng thức ăn là cá đối (Mugil sp.) ...................... 96

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu thành phần loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh ở

cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi ở Khánh Hòa.

Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản

Mã số: 62620301

Nghiên cứu sinh: Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn

Khóa: 2009

Người hướng dẫn: 1. PGS. TS. Đỗ Thị Hòa

2. PGS. TS. Glenn Allan Bristow

Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang

Nội dung:

1. Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần loài sán lá song chủ ký sinh ở cá

chẽm nuôi bằng sự kết hợp giữa hai phương pháp: hình thái học và kỹ thuật sinh học

phân tử. Kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ thuộc 5 giống, 5 họ ký sinh ở

cá chẽm nuôi thương phẩm tại tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam.

Đặc biệt nghiên cứu này đã xác định được loài sán Pseudometadena celebesensis

là ký sinh trùng đặc hữu trên vật chủ là cá chẽm;

2. Luận án đã đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá song chủ nội ký

sinh trong cơ thể cá chẽm nuôi;

3. Lần đầu tiên tiến hành khảo sát vòng đời phát triển của 1 loài sán lá song chủ

Pseudometadena celebesensis có giai đoạn trưởng thành ký sinh ở ruột của cá chẽm nuôi tại

Khánh Hòa.

Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

PGS. TS. Đỗ Thị Hòa Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn

KEY FINDINGS

Thesis title: The digeneans composition of the cultured seabass (Lates calcarifer

Bloch, 1790) in Khanh Hoa waters.

Major: Aquaculture

Major code: 62620301

PhD Student: Nguyen Nguyen Thanh Nhon

Supervisors: 1. Associate Prof. PhD. Do Thi Hoa

2. Associate Prof. PhD. Glenn Allan Bristow

Institution: Nha Trang University

Key Findings:

1. This is a complete study on the composition of digenean by combining the

morphology and molecular genetic method. The result described six species of

digenean, belongs to 5 genus, 5 families;

Especially, seabass is known as a specific host of one digenean by analysing

coevolution and scientific papers.

2. The results of this thesis assess phylogenetic of digenean in seabass;

3. For the first time a survey was carried out on the development life-cycle of

species Pseudometadena celebesensis that parasitic in intestine of seabass in Khanh

Hoa.

PhD Student

Nguyen Nguyen Thanh Nhon

xii

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam hiện nay, có xu hướng đa dạng hóa các sản phẩm thủy sản trong

khẩu, ngoài các sản phẩm xuất khẩu ổn định nhiều năm nay như cá tra, cá ba sa, tôm

biển, tôm hùm… thì cá biển với giá trị dinh dưỡng và thương mại cao đang là mặt

hàng được ưa chuộng trên thế giới, như cá mú (Epinephelus spp.), cá giò

(Rachycentron canadum), cá chẽm (Lates calcarifer) là những đối tượng nuôi phổ biến

phục vụ xuất khẩu.

Cá chẽm (Lastes calcarifer) là loài rộng muối, có thể nuôi trong môi trường nước

mặn, nước ngọt, nước lợ. So với nhiều loài cá biển khác, cá chẽm dễ nuôi hơn vì

không đòi hỏi môi trường sống khắt khe, có thể nuôi với nhiều mô hình khác nhau,

như việc tận dụng các ao nuôi tôm, ao nuôi cá tra bỏ hoang để nuôi cá chẽm đã mang

lại lợi ích đáng kể về kinh tế và xã hội. Với qui trình sản xuất giống và nuôi thương

phẩm cá chẽm đã hoàn thiện nên việc phát triển nuôi loài cá này theo qui mô công

nghiệp, nhằm cung cấp thực phẩm trong nước và phục vụ xuất khẩu là khả thi, góp

phần nâng cao GDP thủy sản nước ta. Bên cạnh đó, việc thuần hóa cá chẽm để nuôi ở

nước ngọt có thể giúp cải thiện đời sống của người dân ở nhiều vùng địa lý khác nhau.

Với hiệu quả kinh tế, xã hội như đã nêu trên, nuôi cá chẽm hiện nay đã được phát

triển ở nhiều địa phương ở Việt Nam. Tuy nhiên, cũng như nhiều đối tượng thủy sản

khác, khi được nuôi với qui mô công nghiệp thì vấn đề bệnh và tác hại của bệnh trong

quá trình nuôi vẫn là một khó khăn không nhỏ cho người nuôi. Các tác nhân gây bệnh

thông thường như virus, vi khuẩn và ký sinh trùng (KST),…. đã và đang gây những

thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi cá chẽm ở Việt Nam và các nước khác trong khu vực.

Ký sinh trùng gây bệnh ở cá chẽm nuôi có nhiều nhóm khác nhau: động vật đơn

bào-Protozoa, sán lá đơn chủ - Monogenea, giáp xác bậc thấp ký sinh - Crustacae, giun

tròn - Nemathelminthes và sán lá song chủ (SLSC) - Digenea. Các ký sinh trùng là sán

lá song chủ (SLSC) ở giai đoạn trưởng thành chủ yếu sống nội ký sinh ở dạ dày, ruột,

mạch máu, gan, thận…của động vật có xương sống như cá, động vật trên cạn, trong đó

có con người. SLSC là ký sinh trùng có chu kỳ sống phức tạp, trải qua nhiều giai đoạn

ấu trùng, đòi hỏi phải có từ 1 hoặc 2 ký chủ trung gian (KCTG) để hoàn thành vòng

đời. Do vậy, khi SLSC ký sinh gây bệnh ở các loài cá nuôi việc trị bệnh này không

đơn giản, hiệu quả thấp nên cách tốt nhất vẫn là phòng bệnh, ngăn chặn sự xâm nhập

của ấu trùng SLSC vào ao nuôi và vào cơ thể cá (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004).

Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về KST gây bệnh ở cá biển nuôi,

trong đó nghiên cứu trên cá chẽm đã được công bố, như nghiên cứu của Velasquez,

(1975); Leong & Wong (1990); Liang & Leong (1991); Võ Thế Dũng và cộng sự

(2012)... Tuy nhiên, ở các nghiên cứu này việc định danh phân loại đến giống loài của

KST đều dựa vào phương pháp hình thái học nên có thể gây nhầm lẫn giữa các loài

trong cùng 1 giống, hoặc chỉ 1 loài nhưng lại được đặt các tên gọi khác nhau.

Trong thời gian gần đây, ngành sinh học phân tử đã phát triển mạnh và được ứng

dụng vào nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau. Trên thế giới, nhiều nhà khoa học đã

ứng dụng sinh học phân tử để định danh phân loại đến giống loài của nhiều động, thực

vật khác nhau, trong đó có các nhóm sinh vật ký sinh là tác nhân gây bệnh ở động vật

thủy sản, gồm virus, vi khuẩn và KST. Bằng việc kết hợp giữa phương pháp truyền

thống phân loại dựa vào hình thái cấu tạo với kỹ thuật sinh học phân tử có thể đưa lại

một kết quả định danh chính xác đến loài của các tác nhân gây bệnh, ngoài ra có thể

xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài ký sinh trùng với nhau (Blair, 1998;

Anderson, 1999; Olson et al., 2003, 2006).

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài luận án “Nghiên cứu thành phần loài sán lá

song chủ (Digenea) ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại

Khánh Hòa” đã được thực hiện theo Quyết định số 1128/QĐ-ĐHNT của Hiệu trưởng

Trường Đại học Nha Trang ký ngày 23 tháng 09 năm 2009, theo chương trình đào tạo

Tiến sĩ, chuyên ngành Nuôi trồng thủy sản.

Mục tiêu của đề tài luận án:

Xác định được thành phần giống loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh trên cá

chẽm (Lates calcarifer) nuôi, đánh giá mức độ nhiễm và mối quan hệ di truyền của các

KST này ở cá chẽm nuôi, từ đó đánh giá khả năng gây bệnh và đề xuất biện pháp

phòng ngừa các ký sinh trùng này ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa.

Để đạt được mục tiêu trên, luận án đã thực hiện các nội dung sau:

1. Xác định thành phần giống loài sán lá song chủ (SLSC) ký sinh ở cá chẽm

nuôi tại Khánh Hòa.

2. Phân loại và xác định mối quan hệ di truyền của các loài sán lá song chủ ký

sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

3. Xác định mức độ nhiễm (tỷ lệ và cường độ nhiễm) sán lá song chủ ở cá chẽm

nuôi tại Khánh Hòa.

4. Khảo sát sự phát triển các giai đoạn ấu trùng của loài sán Pseudometadena

celebesensis ký sinh ở cá chẽm.

Ý nghĩa của luận án

- Ý nghĩa khoa học: Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần giống loài, mức độ

nhiễm và mối quan hệ di truyền của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm (Lates

calcarifer) nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa và làm cơ sở cho việc phát triển, mở rộng

nghiên cứu trên các loài ký sinh trùng khác.

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài luận án này là cơ sở khoa học

để đề xuất các biện pháp phòng bệnh do sán lá song chủ gây ra ở cá chẽm nuôi.

Điểm mới của luận án:

- Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm

nuôi bằng sự kết hợp giữa hai phương pháp: hình thái học và kỹ thuật sinh học phân

tử. Kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ thuộc 5 giống, 5 họ ký sinh ở cá

chẽm nuôi thương phẩm tại tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam. Đặc biệt nghiên cứu này đã

xác định được loài sán Pseudometadena celebesensis là ký sinh trùng đặc hữu trên vật

chủ là cá chẽm;

- Luận án đã đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá song chủ nội ký

sinh trong cơ thể cá chẽm nuôi;

- Lần đầu tiên tiến hành khảo sát vòng đời phát triển của 1 loài sán lá song chủ

Pseudometadena celebesensis có giai đoạn trưởng thành ký sinh ở ruột của cá chẽm nuôi

tại Khánh Hòa.

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN

1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm (Lates calcarifer) 1.1.1. Hệ thống phân loa ̣i cá chẽm

Ngành Chordata

Ngành phu ̣ Vertebrata

Lớ p Pisces

Lớ p phu ̣ Teleostomi

Bô ̣ Perciformes

Ho ̣ Centropomidae

Giố ng Lates

Loài Lates calcarifer Bloch, 1790

Cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790), tên tiếng Anh là Barramundi hoặc Asian

seabass. Cá chẽm được Bloch mô tả đầu tiên vào năm 1790 và đặt tên Holocentrus

calcarifer. Do cá chẽm có các đặc điểm giống cá vược sông Nile (Lates niloticus

Linnaeus), nên năm 1828, Curvier & Valenciennes đề nghị đặt lại tên giống là Lates

(Grey, 1986). Vì vậy, hiện nay cá chẽm có tên khoa học là Lates calcarifer (Bloch,

1790).

1.1.2. Một số đặc điểm phân bố, sinh thái và dinh dưỡng của cá chẽm

Cá chẽm phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc tây Thái Bình

Dương và Ấn Độ Dương từ Đông Phi đến Papua New Guinea, từ nam Trung Quốc,

Đài Loan đến bắc Úc. Cá chẽm là loài rộng muối, sống được cả vùng nước ngọt, lợ,

mặn và có tập tính di cư xuôi dòng. Cá bố mẹ thành thục tập trung ở vùng cửa sông và

sinh sản. Cá con mới nở theo dòng chảy thủy triều vào sâu trong vùng nước lợ sinh

sống. Khi đủ khả năng ngược dòng, chúng bắt đầu di cư ngược dòng vào sống ở các

dòng sông. Khi phát dục thành thục (ở độ tuổi 3+), chúng di cư xuôi dòng về vùng ven

biển để sinh sản (Grey, 1986; Nguyễn Duy Hoan & Võ Ngọc Thám, 2000). Cá chẽm

là loài chuyển đổi giới tính, lúc nhỏ là cá đực, lớn chuyển sang cái. Trong đàn cá chẽm

cũng tồn tại một số cá thể là cá cái nguyên thủy (Nguyễn Duy Hoan & Võ Ngọc

Thám, 2000).

Cá chẽm có khả năng thích ứng rộng với sự thay đổi độ mặn, cá giai đoạn giống

và trưởng thành sống được ở độ mặn từ 0 – 35‰ và có thể chịu đựng tốt với sự thay

đổi độ mặn đột ngột. Thực tế cho thấy cá giống cỡ 2 – 3 cm có thể thuần hóa từ độ

mặn 30 – 32‰ xuống 5 – 10‰ trong 2 – 3 giờ (Tucker, 2000). Vì vậy, cá chẽm rất

thích hợp cho phát triển nuôi trong các điều kiện môi trường khác nhau, có thể nuôi

trong ao ở cả nước ngọt, lợ cũng như nuôi bằng lồng trên biển. Tuy nhiên khi tiến hành

nuôi ở các môi trường có độ mặn khác nhau, cá giống cần được thuần hóa độ mặn. Cá

chẽm giống hoặc cá trưởng thành có thể thích ứng với nhiệt độ từ 21 – 39oC, thích hợp

nhất là 27 – 30oC. Nhiệt độ thay đổi đột ngột 2 – 3oC có thể gây sốc cho cá giống

(Tucker, 2000).

Cá chẽm là loài cá dữ ăn mồi sống và khi đói chúng có thể ăn thịt đồng loại, đặc

biệt tỷ lệ ăn thịt lẫn nhau cao nhất ở giai đoạn từ 1 – 10 cm, nên nhu cầu protein trong

khẩu phần thức ăn của cá chẽm ở mức cao. Theo Boonyaratpalin và Williams (2002),

nhu cầu protein thô trong thức ăn của cá chẽm giống khoảng 50%, cho cá chẽm giai

đoạn nuôi thịt khoảng 40 – 45%. Hàm lượng một số acid amin thích hợp cho sinh

trưởng của cá chẽm giai đoạn giống là: tryptophan: 0,41% protein; lysine: 4,5%

protein; arginine: 3,8% protein và methionine: 2,24% protein (Boonyaratpalin et al.,

2002; Coloso et al., 2004). Do cá chẽm ăn mồi sống nên trong tự nhiên cũng như trong

nuôi trồng, cá chẽm thường dễ bị nhiễm các loại ký sinh trùng có vòng đời phức tạp

như sán lá song chủ (Digenea), sán dây (Cestoida) hay giun đầu gai (Acanthocephala)

(Đỗ Thị Hòa và và cộng sự, 2004).

Cá chẽm có kích thước lớn, khối lượng tối đa có thể đạt 60 kg. Cá tăng trưởng

chậm ở giai đoạn đầu, khi đạt 20 – 30 g tốc độ tăng trưởng nhanh hơn và chậm lại khi

cá đạt khoảng 4 kg. Cá bột mới nở có chiều dài 1,49 mm, sau 40 ngày nuôi đạt cỡ 17,4

mm, 50 ngày đạt 28,9 mm, 90 ngày đạt 93 mm, khối lượng là 9g. Trong điều kiện

nuôi, cá giống cỡ 2 – 2,5 cm sau từ 6 – 24 tháng nuôi thương phẩm cá đạt cỡ 0,35 – 3

kg (Schipp, 1996).

Những đặc điểm sinh học như phân bố, dinh dưỡng, sinh sản...của cá chẽm đã

được nghiên cứu nhiều. Đây là những điều kiện thuận lợi để nghề nuôi loài cá chẽm

này phát triển nhanh trong những năm qua ở nhiều nước thuộc khu vực Châu Á - Thái

Bình Dương.

1.2. Tình hình nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) thương phẩm

1.2.1. Nuôi cá chẽm thương phẩm trên thế giới

1.2.1.1. Sản lượng và giá trị kinh tế của nghề nuôi cá chẽm trên thế giới

Nghề nuôi trồng thủy sản thế giới tăng trưởng nhanh, từ sản lượng ít hơn 1 triệu

tấn ở đầu những năm 1950, đã đạt đến 59,4 triệu tấn với giá trị 70,3 tỉ USD năm 2004

(FAO, 2004), và đạt 51,7 triệu tấn, 78,8 tỉ USD năm 2006 (FAO, 2008). Riêng nghề

nuôi cá biển năm 2006 đã đóng góp 3% vào tổng sản lượng nuôi thủy sản thế giới, với

8% giá trị (FAO, 2008). Trong thời gian 2002 – 2004, tốc độ tăng trưởng hàng năm

của nghề nuôi cá biển là 9,6% (FAO, 2006).

Cá chẽm (Lates calcarrifer) là đối tượng được nuôi phổ biến ở nhiều nước thuộc

khu vực Châu Á – Thái Bình Dương, đặc biệt ở các nước trong khu vực Đông Nam Á.

Cá chẽm bắt đầu được nghiên cứu sản xuất giống nhân tạo tại Thái Lan năm 1971,

thành công năm 1975. Từ năm 1981, nghề nuôi cá chẽm ở Thái Lan phát triển mạnh,

sau đó mở rộng sang các nước khác trong khu vực như Phillipine, Đài Loan,

Singapore, Malaysia (Copland & Grey, 1987; Boonyaratpalin, 1997). Tại Úc, nghiên

cứu sản xuất giống nhân tạo cá chẽm bắt đầu từ năm 1983 - 1985, năm 1986 đã hình

thành các trại sản xuất giống cá chẽm đầu tiên (Tucker et al., 2002).

Sản lượng cá chẽm nuôi trên thế giới bắt đầu được FAO thống kê từ những năm

đầu thập niên 60. Trong 10 năm (2005 – 2014) tổng sản lượng cá chẽm đánh bắt và

nuôi trồng lần lượt đạt 919.398 tấn và 549.084 tấn, với giá trị trung bình là 3,7

USD/kg. Sản lượng cá chẽm của thế giới tăng liên tục và theo kết quả thống kê của

FAO thì đến năm 2014, sản lượng cá chẽm của thế giới đạt 101.956 tấn đối với đánh

bắt và 71.581 tấn với nuôi trồng.

Bảng 1.1. Sản lượng cá chẽm thế giới giai đoạn 2005 - 2014

Sản lượng đánh bắt (tấn) Sản lượng nuôi (tấn) Năm

2005 72.235 31.388

2006 85.640 32.524

2007 95.269 34.706

2008 81.119 43.372

2009 90.823 48.872

2010 102.827 66.694

2011 94.827 68.557

2012 93.422 77.138

2013 101.280 74.252

2014 101.956 71.581

Tổng 919.398 549.084

(Nguồn: FAO, 2017)

Thái Lan là nước có sản lượng cá chẽm nuôi lớn nhất thế giới. Tổng sản lượng cá

chẽm mà Thái Lan đã sản xuất ra trong 50 năm (từ 1959 -2009) đạt tới 36% tổng sản

lượng của cá chẽm nuôi trên thế giới. Nếu chỉ tính trong 5 năm trở lại đây thì sản

lượng cá chẽm nuôi của Thái Lan chiếm tới 32% tổng sản lượng cá chẽm nuôi trên thế

giới. Đài Loan, Malaysia, Indonesia và Úc lần lượt giữ các vị trí tiếp theo sau Thái

Lan. Tổng sản lượng cá chẽm nuôi do 5 nước này sản xuất ra luôn chiếm trên 95%

1959-2009

tổng sản lượng cá chẽm nuôi trên thế giới (FAO, 2008).

Hình 1.1. Tỷ lệ % tổng sản lượng cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi trong 50 năm của các nước trong khu vực (Nguồn: FishStat plus - FAO)

1.2.1.2. Các hình thức nuôi cá chẽm thương phẩm

Cá chẽm được nuôi với nhiều hình thức khác nhau như, nuôi quảng canh, bán

thâm canh, nuôi đơn, nuôi ghép…Trong thực tế có 2 loại hình nuôi cá chẽm chính là:

nuôi cá trong ao đìa và nuôi cá trong lồng, bè.

* Nuôi cá chẽm trong ao

Có hai dạng nuôi cá chẽm thương phẩm trong ao: nuôi đơn và nuôi ghép. Ao

nuôi cá chẽm thường có hình chữ nhật, diện tích 0,2 – 2 ha, sâu từ 1,2 – 1,5 m. Ở Úc,

hình thức nuôi cá ao được khuyến cáo nên thả nuôi ở mật độ sao cho có thể đạt 10 tấn

cá thu hoạch/ha (với cá thu hoạch đạt 0,5 kg/con, mật độ cá khi thu hoạch: 2 con/m2)

(Schipp, 1996).

Dạng nuôi ghép cá chẽm với cá rô phi, mục đích sử dụng cá rô phi ăn thức ăn

thừa của cá chẽm, nhằm hạn chế ô nhiễm môi trường. Đồng thời, cá rô phi đẻ nhiều, cá

rô phi con sẽ là thức ăn cho cá chẽm, giảm chi phí thức ăn (Trần Vĩ Hích, 2014).

* Nuôi cá chẽm trong lồng

Hình thức nuôi cá biển bằng lồng đã rất phổ biến ở các nước Thái Lan, Hồng

Kông, Malaysia, Singapore và Indonesia. Đây là hình thức nuôi đơn giản và đem lại

lợi nhuận cao hơn so với hình thức nuôi trong ao (Schipp et al., 2007). Lồng nuôi được

cố định dưới đáy biển hoặc thả nổi trên mặt nước. Lồng cố định là một dạng lồng đơn

giản được tạo bởi sự cố định của một lồng lưới vào nền đáy nhờ 4 cọc tre hay cọc gỗ.

Loại lồng này chỉ phù hợp cho việc nuôi cá ở các hồ, vịnh nông và biên độ thủy triều

thấp như hồ Songkhla, Thái Lan.

Hình thức nuôi cá chẽm bằng lồng có một số ưu điểm hơn so với nuôi ao như chi

phí xây dựng cơ bản thấp hơn, mật độ nuôi cá cao hơn mà không cần các thiết bị cung

cấp khí oxy. Việc bắt cá để phân cỡ, phòng trị bệnh hay thu hoạch đều rất dễ dàng.

Khi điều kiện môi trường nuôi bất lợi, việc di chuyển lồng nuôi đến địa điểm mới có

thể thực hiện được hơn so với nuôi cá trong ao đìa. Tuy nhiên, cá nuôi lồng thường lớn

chậm hơn cá nuôi ao vì cá phải mất nhiều năng lượng do bơi liên tục để chống lại sự

đẩy đi của dòng chảy. Những thiệt hại do sự khắc nghiệt của môi trường nuôi như

sóng, bão dễ đem đến những tổn thất lớn (Trần Vĩ Hích, 2014).

Ở nước Úc còn hiện hành hai loại hình nuôi cá chẽm thương phẩm khác là: nuôi

cá chẽm bằng bể trong nhà, phổ biến ở những vùng có khí hậu lạnh, nhiệt độ không

thuận lợi cho nuôi ngoài trời, nguồn nước dùng cho loại hình nuôi cá chẽm trong nhà

chính là nguồn nước nóng tự nhiên (nước ngọt). Năng suất nuôi của loại hình này

thường đạt khoảng 15 kg/m3, đôi khi lên đến 100 kg/m3 (Tucker et al., 2002). Một loại

hình nuôi khác cũng đã được thực hiện ở Úc, đó là nuôi cá bằng lồng đặt trong ao.

Với kiểu nuôi cá bằng lồng đặt trong ao, kích cỡ lồng thường sử dụng là 8 m3 (2x2x2

m), đôi khi cũng gặp kích thước lồng lớn hơn, có thể tích đến 150 m3. Tổng diện tích

lồng nuôi trong ao tại Queensland tăng từ 3.757 m2 năm 1999 lên 16.161 m2 năm

2001. (Lục Minh Diệp, 2010).

1.2.2. Tình hình nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) thương phẩm ở Việt Nam

Cá chẽm là đố i tượng đươ ̣c nuôi quảng canh ở Viê ̣t Nam từ lâu, nguồ n giố ng

đươ ̣c lấy từ tự nhiên hoă ̣c nhâ ̣p từ Thái Lan. Đến năm 1999, khoa Nuôi trồng Thủy

sản, Trường Đại học Nha Trang đã sản xuất giống cá chẽm thành công (Nguyễn Duy

Hoan & Võ Ngọc Thám, 2000), đánh dấu thời kỳ phát triển cho nghề nuôi cá chẽm ở

Việt Nam. Từ cuối năm 2003, cá chẽm đã được sản xuất giống thành công ở quy mô

thương mại và cung cấp giống cho nghề nuôi cá chẽm thương phẩm ở Việt Nam. Hàng

năm, cơ sở nghiên cứu của Trường Đại học Nha Trang sản xuất được 0,8 – 1 triệu cá

chẽm giống cỡ 2 – 3 cm cung cấp cho các tỉnh Bến Tre, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên

Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh và các tỉnh thuộc Nam Trung Bộ. Hiện nay, cơ sở sản

xuất giống này đã chuyển giao công nghệ cho cá đẻ và cung cấp trứng đến các cơ sở

sản xuất giống tư nhân ở các tỉnh như: Khánh Hòa, Ninh Thuận, Phú Yên, Bình Định,

Kiên Giang. Điều này góp phần thúc đẩy nghề nuôi cá chẽm phát triển nhanh chóng

hơn trong những năm qua (Trần Vĩ Hích, 2014).

Cũng giống như mô ̣t số nướ c khác trong khu vực, ở Viê ̣t Nam cá chẽm đươ ̣c nuôi dướ i 2 hình thứ c chính là nuôi ao và nuôi lồ ng bè, trong đó hình thứ c nuôi ao phổ biến hơn. Ở Viê ̣t Nam cũng có mô ̣t số đă ̣c trưng riêng là hầu hết các ao nuôi cá chẽm

là các ao được tận dụng từ ao nuôi tôm bi ̣ bỏ hoang do dịch bê ̣nh, ngoại trừ mô ̣t số

Công ty lớ n như Vĩnh Hoàn - Đồ ng Tháp; Va ̣n Đứ c - Bến Tre; Australis - Khánh

Hò a.... Một vài năm gần đây, cá chẽm đã được đưa vào nuôi lồng trên biển ở các tỉnh

Quảng Ninh, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu…Thức ăn sử dụng nuôi cá chẽm

thương phẩm hiện nay chủ yếu vẫn là cá tạp, do đó dễ gây ô nhiễm môi trường và là

điều kiện để cá chẽm dễ bị nhiễm các loài giun sán có vòng đời phức tạp như sán lá

song chủ (Lục Minh Diệp, 2010).

1.3. Nghiên cứu ký sinh trùng ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi

1.3.1. Thành phần loài ký sinh trùng ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) được phát

hiện và công bố trên thế giới

Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu và công bố về thành phần giống

loài KST ký sinh ở trên và trong cơ thể loài cá chẽm (Lates calcarifer) được nuôi chủ

yếu ở các nước thuộc châu Á (Bảng 1.2).

Bảng 1.2. Thành phần giống loài ký sinh trùng ở cá chẽm (Lates calcarifer)

đã được phát hiện và công bố trên thế giới

Cơ quan TT Tên giống & loài KST Vùng địa lý Tác giả, năm công bố ký sinh

Ngành trùng lông bơi Ciliophora

1 Trichodina japoniaca Mang Ấn Độ Anlan & Robir (2005)

Ruangpan (1982);

2 Trichodina sp. Da, mang Malaysia Leong & Wong (1987);

Leong & Wong (1990)

3 Trichodina spp. Mang Thái Lan Ruangpan (1988)

Thái Lan, Tookwibas (1989);

4 Cryptocaryon sp. Da, mang Malaysia, Ruangpan (1982);

Singapore Leong & Wong (1990)

5 Cryptocaryon irritans Da, mang Thái Lan Ruangpan (1988)

6 Henneguya sp. Mang Thái Lan Ruangpan (1982)

7 Epistylis sp. Da, mang Thái Lan Ruangpan (1982)

8 Zoothamnium sp. Da, mang Thái Lan Ruangpan (1982)

Myxobolus Saugata & Dunga, 9 Da, mang Ấn Độ calcariferum (2003)

Ngành giun dẹp Platyhelminthes

Úc, Leong (1994) 10 Neobenedenia melleni Mang, Da Malaysia Marty et al., (2001)

Malaysia, 11 Diplectanum latesi Mang Ruangpan (1982) Sigapore

12 Diplectanum penanggi Mang Malaysia Leong & Wong (1986);

Liang & Leong (1991)

Pseudohabdosynochus Leong & Wong (1990); 13 Mang Malaysia latesi Liang & Leong (1991)

14 Transversotrema laruei Da Philippine Velasquez (1962)

Velasquez (1962); Lecithochirium 15 Dạ dày Philippine Velasquez (1975); neopacifium Leong & Wong (1987)

Malaysia, Ruangpan (1982) 16 Lecithochirium sp. Dạ dày Singapore Ruangpan (1988)

Velasquez (1962); Philippine, Pseudometadena Ruangpan (1982); 17 Ruột Malaysia, celebesensis Leong & Wong (1987); Sigapore Leong & Wong (1990)

Bucephalus 18 Ruột Philippine Velasquez (1975) polymorphus

19 Bucephalus margaritae Malaysia Leong & Wong (1987) Ruột

20 Allopocotyle serani Malaysia Leong & Wong (1987) Ruột

21 Helicometra nemia Malaysia Leong & Wong (1987) Ruột

Ngành giun tròn Nemathelminthes

22 Rhipidocotyle sp. Ruột Malaysia Leong & Wong (1987)

Malaysia, Ruangpan (1982); 23 Cucullanus sp. Ruột Singapore Ruangpan (1988)

24 Rhaphudascaris sp. Ruột Malaysia Leong & Wong (1987)

Ngành chân khớp Arthropoda

25 Caligus sp. Mang, Da Malaysia Leong & Wong (1986)

Ho & Do (1985);

Malaysia, Leong & Wong (1987); 26 Lernanthropus latis Mang Thái Lan Leong & Wong (1990);

Ho & Kim (2004)

Malaysia, 27 Aega sp. Mang Ruangpan (1988) Singapore

Bảng 1.2 đã thể hiện sự phong phú và đa dạng về thành phần giống loài KST ký

sinh ở cá chẽm nuôi ở các quốc gia khác nhau thuộc Châu Á. Trong đó, có một số

giống loài ký sinh trùng thường ký sinh ở cá chẽm với tỷ lệ và cường độ nhiễm cao và

gây bệnh nguy hiểm cho loài cá này, như loài KST đơn bào Cryptocaryon sp. gây

bệnh đốm trắng, một số giống loài sán lá đơn chủ (Monogenea) như loài Diplectanum

latesi, Pseudohabdosynochus latesi, Neobenedenia melleni ký sinh ở mang và da cá có

thể làm cá chết hàng loạt nếu nhiễm ở mức độ cao, các loài giáp xác như Caligus sp.,

Lernanthropus latis ký sinh ở da và mang cũng có thể làm cá chẽm chết nhiều nếu bị

cảm nhiễm với cường độ cao.

1.3.2. Nghiên cứu ký sinh trùng trên cá chẽm (Lates calcarifer) ở Việt Nam

Khi nghiên cứu về bệnh do KST ký sinh ở cá chẽm nuôi, Đỗ Thị Hòa và cộng sự

(2008) đã công bố về một số bệnh ở cá chẽm nuôi mà tác nhân gây ra là ký sinh trùng

ngoại ký sinh, như bệnh sán lá da do các KST thuộc lớp sán lá đơn chủ - Monogenea

như các loài Neobenedenia melleni, Neobenedenia girellae (Monogenea ký sinh ở da

của cá; Bệnh sán lá mang do KST thuộc các giống loài Pseudorhabdosynochus,

Diplectanum và Haliotrema (Monogenea) ký sinh ở mang cá và bệnh rận cá do một

số giống KST thuộc giáp xác, như Caligus, Lernanthropus (Copepoda) ký sinh. Các

ký sinh trùng này khi cảm nhiễm ở cá chẽm với cường độ và tỷ lệ cảm nhiễm cao đã

gây ra bệnh nguy hiểm cho loài cá nuôi này.

Võ Thế Dũng và cộng sự (2012) đã xuất bản quyển sách “Ký sinh trùng ký sinh ở

cá mú và cá chẽm Việt Nam”. Quyển sách giới thiệu với 59 loài ký sinh trùng thuộc 41

giống, 32 họ, 18 bộ, 9 lớp của 6 ngành, đặc biệt có 3 loài lần đầu được bắt gặp ở khu

vực Đông Nam Á, 5 giống và 19 loài lần đầu được công bố ở Việt Nam. Trong cuốn

sách này đã giới thiệu 14 loài KST tìm thấy ký sinh trên cá chẽm nuôi ở Việt Nam, đó

là các loài Trichodina sp., Ambiphrya sp., Cryptocaryon sp. và Ceratomyxa sp (thuộc

động vật đơn bào - Protozoa), Diplectanum grouperi (thuộc sán lá đơn chủ -

Monogenea ), Bucephalus polymorhus, Lecithochirium neopacifium, Pseudometadena

celebesensis, Transversotrema patialense (thuộc sán lá song chủ - Digenea),

Tylocephalum sp (thuộc sán dây - Cestoidea), Cucullanus sp (thuộc giun tròn -

Nematoda), Zeylanicobdella arugamensis (thuộc lớp đỉa - Hirudinea), Caligus

epidemicus và Lernanthropus latis (thuộc lớp giáp xác - Crustacae).

1.3.3. Nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở cá biển

Sán lá song chủ - Digenea thuộc ngành giun dẹp (Platyhelminthes) có giai đoạn

trưởng thành hoàn toàn sống ký sinh ở trong cơ thể động vật có xương sống, trong đó

có cá, là những KST có vòng đời phức tạp, phát triển qua nhiều giai đoạn ấu trùng và

cần có 1 hoặc 2 ký chủ trung gian trong vòng đời của các loài sán này. Trong nghề

nuôi cá biển thâm canh, sán lá song chủ có thể gây tác động xấu tới sức khỏe của vật

nuôi nếu chúng cảm nhiễm ở các nội quan quan trọng như máu, gan, thận và ruột của

cá với tỷ lệ và cường độ nhiễm cao. Tùy theo từng loài sán lá song chủ khác nhau mà

cá có thể là ký chủ cuối cùng hoặc là ký chủ trung gian thứ hai, với các loài SLSC có

cá lá ký chủ trung gian thì ở giai đoạn trưởng thành chúng sẽ ký sinh ở người và động

vật trên cạn, gây ra các bệnh nguy hiểm như bệnh sán lá gan, sán lá phổi hay sán lá

ruột ở người (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004).

Từ năm 1929, Dogiel (1882-1955) đã phát triển “Phương pháp nghiên cứu ký

sinh trùng đồng bộ ở cá”, công trình này đã mở ra một hướng phát triển mới cho

nghiên cứu các khu hệ KST trên cá và các bệnh do KST gây ra ở cá, trong đó có nhiều

công trình đã nghiên cứu và công bố về thành phần giống loài sán lá song chủ ký sinh

ở cá. Trong thời kỳ này phải kể đến các công trình nghiên cứu về giáp xác - Crustacae

ký sinh (Pillai,1985; Kabata, 1985, 1992); Nghiên cứu về sán dây - Cestoidea ký sinh

(Khalil et al.,1994; Palm, 2004); Về giun tròn - Nemathelminthes (Anderson et

al.,1976); Nghiên cứu về sán lá song chủ - Digenea ký sinh ở cá biển (Möller &

Anders, 1986). Các công trình này đã đề cập đến hình thái cấu tạo, vòng đời và đặc

điểm phân bố của chúng ở cá nước lợ và mặn nên có giá trị tham khảo cao. Gibson &

Bray (1979) đã xuất bản quyển sách về SLSC thuộc bộ phụ Hemiuroidea ký sinh ở cá

biển và cá nước ngọt, đây là công trình có giá trị vì các tác giả đã xây dựng khóa phân

loại, thuật ngữ và chu kỳ phát triển của các loài SLSC ở 14 họ sán thuộc bộ phụ

Hemiuroidea.

Paradiznik et al. (2007) đã nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở một số loài cá

biển sống ở vùng biển bắc Adriatic, Slovenia trong suốt 10 năm, từ 1993 – 2003, công

trình này đã phát hiện và công bố 22 loài sán lá song chủ với tỷ lệ nhiễm là 25,16%,

trong đó có một số loài sán được các tác giả mô tả rất chi tiết như: Hemiurus

appendiculatus, Aphanurus stossichi, Lecithochirium musculus, Lecithaster atherinae,

Derogenes latus, Helicometra fasciata, Monorchis monorchis, Bacciger bacciger,

Metadena depressa, Lepocreadium, Holorchis pycnoporus.

Nước Úc có nguồn cá biển phong phú, nghề nuôi cá biển cũng phát triển mạnh và

lâu đời, nên tại đây cũng có nhiều công trình nghiên cứu về KST, nhiều giống loài sán

lá song chủ ký sinh trên cá biển đã được phát hiện và công bố (Cribb et al., 1992,

2002; Bray et al., 1990, 1991, 1993, 1994). Trong các nghiên cứu này phải kể đến

công trình nghiên cứu của Cribb et al. (2002) đã công bố 147 loài sán lá song chủ,

thuộc 76 giống, 20 họ ký sinh trên 62 loài cá mú thuộc họ Epinephelidae. Khi nghiên

cứu họ sán lá song chủ Transversotrematidae, các nhà khoa học đã đề cập đến 1 giống

mới và 2 loài mới, đồng thời nhất trí rằng các loài có tên khoa học là Transversotrema

koliensis, T. laruei, T. chackai, và T. soparkari đã công bố chỉ là tên đồng nghĩa của

loài Transversotrema patialense (Cribb et al., 1992).

Bray và nhóm nghiên cứu của ông cũng có nhiều công bố về sán lá song chủ ký

sinh ở cá biển phân bố ở nước Úc và ở nhiều vùng biển khác nhau trên thế giới. Ông

đã phát hiện được 29 loài sán lá song chủ ký sinh trên cá biển phân bố ở phía đông

Canada, trong đó có 10 loài mới với khoa học, gồm Plagioporus idoneus,

Helicometra plovmornini, H. insolita, C. nicolli, A. opisthorchis, Neophasis oculatus,

Diphterostomum microacetabulum, Deretrema pycnorganum, Progonus muelleri and

Gonocerca phycidis (Bray et al., 1979). Trên một số loài cá biển ở phía nam Ấn Độ

Dương, các tác giả này đã phát hiện được một số loài sán lá song chủ thuộc 4 họ:

Dinurinae, Elytrophallinae, Glomericirrinae và Plerurinae ký sinh, bao gồm: Dinurus

longisinus, Ectenurus trachuri, Erilepturus tiegsi, Tubulovesicula angusticauda,

Elytrophalloides oatesi, Elytrophalloides humerus, Lecithocladium angustiovum,

Glomericirrus amadai, Plerurus digitatus, Synapto-bothrium sp (Bray et al., 1990).

Những năm tiếp theo, cũng trên các loài cá này tác giả đã mô tả các loài sán lá song

chủ khác nhau thuộc giống Lecithochirium, đó là: L. genypteri, L. magnus, L.

parafusiforme, L. macrorchis, Leithochirium sp., L. kawakawa, Lecithochirium sp., L.

gymnapisti, L. jaffense, Lecithochirium sp. (Bray và cộng sự, 1991). Gần đây, Bray &

Palm đã phát hiện được 3 loài sán lá song chủ thuộc họ Bucephalidae là Rhipidocotyle

danai từ cá thu rắn (Thyrsitoides marleyi), loài R. jayai từ cá sú vàng (Otolithoides

biauritus) và loài Prosorhynchus platycephali từ cá chai (Sunagocia otaitensis) (Bray

& Palm, 2009).

Hollis và Manter (1957) đã phát hiện 13 loài sán lá song chủ đã nhiễm trên cá

biển ở vùng bờ của Thái Bình Dương thuộc Mexico, trong đó có 9 loài và 2 giống mới

được mô tả chi tiết. Arai (1962) cũng nghiên cứu khu hệ sán lá song chủ trên cá biển ở

Mexico và đã phát hiện 23 loài SLSC, trong đó có 3 loài mới, đó là: Metadena

magdalenae, Monorcheides alexanderi và Pleorchis magniporus. Dyer et al. (1986) đã

phát hiện và công bố 252 loài SLSC, thuộc 155 giống và 76 họ ký sinh ở 1019 con cá

biển phân bố ở quần đảo phía Tây và Nam của Puerto Rico từ năm 1972 đến năm

1984. Ngoài ra, các tác giả này còn cho biết, các loài SLSC này đều có mức độ cảm

nhiễm thấp ở cá biển, nhưng có tính đặc hữu ký chủ rất cao.

Trong cuốn sách viết về sán lá song chủ ký sinh trên các loài cá biển phân bố ở

vùng Jamaica, có 148 loài SLSC thuộc 43 họ ký sinh trên 982 mẫu cá thuộc 112 loài

cá biển khác nhau đã được giới thiệu (Nahhas & Carlson, 1994). Bullard & Overstreet

(2006) đã phát hiện và mô tả chi tiết loài sán song chủ Psettarium anthicum sp., thuộc

họ Sanguinicolidae ký sinh ở tim cá bớp Rachycentron canadum. Tương tự như vậy,

có 5 loài SLSC khác là Elytrophalloides oatesi, Parahemiurus merus, Aponurus

laguncula, Ectenurus virgules và Lecithocladium cristatum ký sinh ở loài cá chai

Percophis brasiliensis cũng đã được công bố bởi Braicovich et al. (2009).

Ở Châu Á, Yamaguti là nhà khoa học đã công bố nhiều công trình nghiên cứu về

các loài KST ký sinh trên cá biển. Khi nghiên cứu các loài cá biển của Nhật Bản, tác giả

đã phát hiện 45 loài sán lá song chủ (Yamaguti, 1941). Đến năm 1952, Yamaguti tiếp

tục công bố về 26 loài sán lá song chủ, trong đó có loài Pseudometadena celebesensis

ký sinh ở ruột cá chẽm. Trong một cuốn sách xuất bản năm 1971, Yamaguti đã biên tập

và giới thiệu 1.796 loài sán lá song chủ ký sinh ở động vật có xương sống trong đó có cá

biển (Yamaguti, 1971).

Valasquez (1962) đã phát hiện và mô tả 5 loài sán lá song chủ thuộc họ

Hemiuridae ký sinh trong dạ dày và ruột của một số loài cá ở biển Philippine, trên cá

chẽm tác giả thông báo bắt gặp loài Lecithochirium neopacifium ký sinh ở ruột. Đến

năm 1975, trong cu ốn sách “Sán lá song chủ ký sinh trên cá ở Philippine”.

Valasquez đã mô tả chi tiết 23 loài sán lá song chủ mới, thuộc 15 giống khác nhau

(Valasquez, 1975).

Năm 1982, Madhavi công bố đã phát hiện được 15 loài sán lá song chủ thuộc họ

Didymozoidae ký sinh ở cá biển khu vực vịnh Bengal - Ấn Độ, trong đó có 3 giống và

6 loài mới. Các loài này đã bắt gặp ký sinh ở cá của nhiều nước trên thế giới, kể cả các

nước trong khu vực Đông Nam Á.

Salam et al. (1990) nghiên cứu ở cá mú mỡ (Epinephelus tauvina) thuộc vùng

biển vịnh Ả Rập, lần đầu tiên phát hiện và mô tả loài sán lá song chủ mới

Gonapodasmius epinepheli (Didymozoidae). Tại vùng biển này, Nahhas & Calson

(1994) đã phát hiện và công bố một số loài SLSC ký sinh trên cá biển, trong đó có 2

loài mới với khoa học là Cryptogonimus sphericus và Paracryptogonimus ramadani

(Cryptogonimidae). Nahhas & Sey (2002) đã phát hiện được 8 loài SLSC thuộc họ

Hemiuroidea ký sinh trên cá biển, các loài đã phát hiện là Allostomachicola secundus

(Srivastava, 1937) Yamaguti, 1958, Ectenurus trachuri, Erilepturus hamati

(Yamaguti, 1934), Lecithocladium angustiovum Yamaguti, 1953, Lecithochirium

acutum Chauhan, 1945, Aponurus laguncula Looss, 1907, Lecithaster indicus

Srivastava, 1935, Aphanurus stossichii (Monticelli, 1891) Looss, 1907. Shih et al.

(2004) đã nghiên cứu 37 loài cá biển phân bố ở Đài Loan và thông báo rằng, có 17 loài

cá, chiếm 45,9% số loài cá đã kiểm tra bị nhiễm sán lá song chủ. Các tác giả đã phát

hiện được 16 loài sán lá song chủ thuộc 11 giống và 8 họ, trong đó có tới 7 loài thuộc

họ Hemiuridae.

Một số loài sán lá song chủ có giai đoạn trưởng thành ký sinh và gây bệnh ở

người và động vật trên cạn thường có nguồn gốc từ động vật thủy sản, như loài sán lá

song chủ Heterophyopsis continua đã được các nhà khoa học Hàn Quốc tập trung

nghiên cứu (Chai et al., 1984; Chai & Lee, 2002; Chai et al., 2005).

So với các nước trên thế giới, những nghiên cứu về KST ở Việt Nam, đặc biệt là

sán lá song chủ ký sinh trên cá biển còn hạn chế. Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2004) đã

công bố kết quả nghiên cứu KST ký sinh trên một số loài cá có giá trị kinh tế khai thác

được trên vùng biển Phú Khánh (nay là Khánh Hòa) trong thời gian từ 1978 - 1980, đã

phát hiện được 80 loài KST, trong đó có 29 loài sán lá song chủ. Arthur và Bùi Quang

Tề (2006) công bố 453 loài KST ký sinh ở cá nước ngọt, lợ và mặn, trong đó có 112

loài sán lá song chủ. Những năm gần đây, khi nghề nuôi cá biển đã phát triển ở Việt

Nam đã có một số nghiên cứu của Võ Thế Dũng về SLSC và ấu trùng metacercaria

của sán lá song chủ ký sinh ở cá mú đen - Epinephelus coicoides và cá mú mè -

Epinephelus bleekeri, kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ, 2 loại ấu trùng

metacercaria của SLSC ký sinh ở các loài cá mú thuộc giống Epinephelus spp. và 2

loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm - Lates calcarifer (Võ Thế Dũng và cộng sự,

2010a; 2010b; 2012).

Mặc dù trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về sán lá

song chủ ký sinh trên cá biển, trong đó có cá chẽm, nhưng trong các nghiên này việc

phân loại định danh các giống loài sán chủ yếu dựa theo phương pháp truyền thống,

căn cứ vào hình dạng và cấu tạo của sán để phân loại, với phương pháp này đôi lúc

dẫn đến những sai sót, nhầm lẫn khi phân loại KST, đặc biệt khi nhận biết các loài

khác nhau trong cùng 1 giống hay dẫn đến 1 loài nhưng lại được đặt các tên gọi khác

nhau. Do vậy, gần đây nhiều nhà khoa học đã sử dụng các kỹ thuật về di truyền phân

tử để có thể phân loại KST dựa trên các đặc điểm di truyền (gen).

1.4. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phân loại sán lá song chủ

1.4.1. Hệ thống học phân tử và hệ thống học truyền thống

Hệ thống học truyền thống chủ yếu sử dụng các đặc điểm về hình thái và cấu tạo

để so sánh và định loại. Nhưng các tính trạng hình thái thường biến đổi rất phức tạp

nên đôi khi việc xác định sự giống hay khác nhau của sinh vật gặp nhiều khó khăn.

Việc phân biệt đặc điểm tương đồng với đặc điểm tương tự trong hệ thống học truyền

thống là không dễ dàng, nhất là các bậc phân loại thấp. Vì vậy, hệ thống học truyền

thống phải sự dụng các đặc điểm, các khóa phân loại riêng cho mỗi nhóm sinh vật nhất

định. Hệ thống học phân tử đã sử dụng các đặc điểm của phân tử ADN và protein để

so sánh. Các biến đổi phân tử đơn giản hơn các biến đổi hình thái. Mặt khác các biến

đổi phân tử trong bộ gen của sinh vật ít bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường. Ưu

điểm của phương pháp này là có tính thống nhất cao, sử dụng chung cho cả sinh giới.

Nhược điểm là chưa tiện dụng khi nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế và chưa hình

thành một hệ thống phân loại riêng. Vì vậy, sự kết hợp giữa hệ thống học phân tử và

hệ thống học truyền thống sẽ đem lại kết quả tốt hơn. Phương pháp sinh học phân tử

thường được sử dụng để giải quyết một số vấn đề mà hệ thống học truyền thống còn

gặp khó khăn (Đặng Tất Thế, 2005).

Trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam, bệnh và tác hại của bệnh là nguyên nhân

chính gây tổn thất lớn cho người nuôi, ảnh hưởng đến nền kinh tế của đất nước. Bên

cạnh những bệnh do virus, vi khuẩn và nấm, thì những bệnh do KST ký sinh cũng đã

gây ra những khó khăn không nhỏ cho động vật thủy sản nuôi, ngoài ra những KST

này còn có thể lây truyền ký sinh gây bệnh ở người và động vật trên cạn. Trong những

năm qua đã có nhiều công trình nghiên cứu được công bố về khu hệ ký sinh trùng ký

sinh ở cá nước ngọt, nước lợ và nước mặn ở Việt Nam (Bùi Quang Tề và cộng sự,

1995, 1999; Nguyễn Thị Muội & Đỗ Thị Hòa, 1980, 1986; Đỗ Thị Hòa và cộng sự,

2008; Võ Thế Dũng và cộng sự, 2010a, 2010b và 2012). Tuy nhiên, trong các công

trình nghiên cứu này, việc phân loại ký sinh trùng đều được thực hiện bằng phương

pháp truyền thống, dựa vào hình thái, cấu tạo nên dễ gây nhầm lẫn, nhiều loài KST

cùng giống rất khó phân loại chính xác vì chúng có những đặc điểm phân loại rất

giống nhau. Vì vậy, với tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử, những khó khăn này có

thể dần dần được giải quyết.

1.4.2. Các chỉ thị phân tử thường sử dụng trong nghiên cứu di truyền

Gen ribosome: Các gen khác nhau có thể cung cấp dữ liệu về mối quan hệ phát

sinh loài. Các gen của ADN ribosome mã hóa cấu trúc RNA của ribosome, có xu

hướng xảy ra ở sinh vật nhân thật như là một loạt các đơn vị lặp đi lặp lại, mỗi đơn vị

chứa ba vùng mã hóa (5,8S ~ 150 bp, 18S, ~ 2.000 bp, 28S, ~ 4.500 bp) ngăn cách bởi

các đoạn chèn giữa gen (Hình 1.2). Tốc độ tiến hóa khác nhau giữa các gen và đoạn

chèn đã cung cấp thông tin hữu ích cho các nghiên cứu ở các mức độ khác nhau. Đoạn

chèn giữa gen, nằm giữa gen 18S và gen 28S và ngăn cách bởi tiểu phần 5,8S, là khu

vực ít bảo tồn nhất được sử dụng trong các nghiên cứu, cho đến nay trên giun dẹp.

Hình 1.2. Hệ gen ribosome của sinh vật nhân thực

(Nguồn: htpp://thuviensinhhoc.com)

Chủ yếu là vì lý do lịch sử, gen mã hóa tiểu đơn vị 18S (có trình tự

bảo tồn nhất trong các gen ribosome), đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu mối

quan hệ tiến hóa của ngành giun dẹp. Gen 5,8S của ribosome với số lượng nhỏ trong

hệ gen, nên các nghiên cứu sử dụng gen này cho nghiên cứu phát sinh loài đã được

chứng minh là không phù hợp (Rohde, 1990).

Hệ gen ADN ti thể (mitochondrial DNA - mtDNA) cũng được sử dụng trong

nghiên cứu phát sinh loài. ADN ti thể là một bộ gen độc lập, thường là mạch vòng,

được định vị trong ti thể. Hệ gen ti thể có cấu tạo xoắn kép, trần, mạch vòng, thường

mã hóa 37 gen và thường có chiều dài ít hơn 20.000 bp ở động vật (Avise, 1994), với 2

chức năng chủ yếu: mã hóa nhiều thành phần của ti thể và mã hóa cho một số protein

tham gia vào chuỗi chuyền điện tử (Lee et al., 2013).

Hình 1.3. ADN ti thể sán lá ruột Haplorchis taichui, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 12 vùng mã hóa protein. (Nguồn: Lee et al., 2013)

Gen ti thể thường tích lũy biến dị ở mức cao hơn so với hệ gen của nhân, do đó

dữ liệu từ bộ gen này sẽ hữu ích hơn cho các nghiên cứu về sự phân hóa loài mới.

ADN ti thể được cho là có nguồn gốc tiến hóa (evolutionary origin) khác nhau.

ADN ti thể theo giả thuyết có nguồn gốc từ bộ gen dạng vòng (circular genomes) của

vi khuẩn được tiến hóa bởi các tổ tiên xa xưa của sinh vật nhân thật ngày nay. Một ti

thể chứa khoảng 2 - 10 bản copy của ADN ti thể. Trong tế bào của cơ thể sống, phần

lớn protein hiện diện trong ti thể (số lượng khoảng 1.500 loại khác nhau ở động vật có

vú) được mã hóa bởi ADN nhân (nuclear ADN), nhưng bên cạnh đó, gen của 1 số

trong chúng được chuyển sang nhân ở tế bào nhân thật trong quá trình tiến hóa. Ti thể

di truyền theo dòng mẹ và hệ gen ti thể có số lượng gen ít hơn hệ gen nhân, không có

hiện tượng trao đổi chéo và các thay đổi chủ yếu do đột biến nên dựa vào tốc độ thay

đổi nucleotide có thể xác định thời gian tiến hóa và xác lập đồng hồ phân tử.

Bên cạnh đó việc sử dụng ADN ti thể cũng có một số giới hạn. Đôi khi, trong

những nghiên cứu phân loại, cây phát sinh loài dựa trên gen (gen trees) có thể không

phản ánh đúng hệ thống phân loại của loài (species trees) bởi vì sự phân nhánh của các

lineage có thể trước hoặc sau khi phân chia quần thể, thậm chí loài mới. Hơn nữa, vì

ADN ti thể di truyền theo hệ mẹ nên tính đa dạng có thể lớn và không nhất thiết phản

ánh đúng sự đa dạng tại các vị trí khác của gen ở mức độ loài. Sự khác nhau về giới

tính cũng sẽ ảnh hưởng đến sự đa dạng của ADN ti thể so với ADN bộ gen (Lohse,

2009). Vì vậy, người ta đề nghị nên sử dụng nhiều đoạn gen để có kết quả với độ chính

xác cao (Schander & Wilasen, 2005)

1.4.3. Ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại sán lá song chủ

1.4.3.1. Nghiên cứu phát sinh loài của sán lá song chủ ký sinh trên cá

Ngành Platyhelminthes (giun dẹp) là một trong những ngành lớn, đa dạng và

phân hóa sớm nhất trong giới động vật. Giun dẹp cho thấy sự đa dạng lớn trong giải

phẫu học, môi trường sống, lịch sử vòng đời và kích thước, loài dài nhất là loài sán

dây Diphylhbothrium latunt dài tới 20 m cho đến các loài hầu như không thể nhìn thấy

bằng mắt thường. Chúng cũng thể hiện tính đa dạng di truyền đáng kể trong trình tự

gen 18S rRNA khi so sánh với đơn vị phân loại cao hơn của động vật có xương sống

(Riutort et al., 1993).

Mặc dù có vai trò quan trọng, hệ thống phân loại của ngành giun dẹp và đặc biệt

mối tương quan của các nhóm ký sinh trùng vẫn còn nhiều tranh cãi. Lịch sử tiến hóa

của giun dẹp vẫn còn nhiều bí ẩn vì thông tin rời rạc, đặc điểm hình thái, sinh lý và

chu kỳ sống phức tạp, và bởi vì chúng là động vật thân mềm nên rất ít hóa thạch còn

sót lại. Xây dựng hệ thống phát sinh loài hợp lý cũng sẽ cung cấp những hiểu biết về

nguồn gốc của ký sinh trùng và chia sẻ lịch sử tiến hóa của giun dẹp ký sinh (Blair et

al., 1996).

Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu đã cung cấp những thông tin trong hệ thống phân

loại giun dẹp. Tất cả các nhóm KST giống nhau ở khía cạnh cấu trúc và sự phát triển

của lông mao biểu bì, cơ quan bám, tế bào ngọn lửa và tinh hoàn. Ngoài ra, đơn vị

phân loại các lớp biểu bì của ấu trùng được thay thế ở cá thể trưởng thành bởi một lớp

biểu bì syncitial (Ethes, 1984; 1985; 1986). Các nghiên cứu dựa trên dữ liệu phân tử từ

gen 18S rRNA cũng chứng tỏ một nguồn gốc duy nhất cho các nhóm ký sinh (Rohde

et al., 1993,1994; Baverstock et al., 1991; Blair et al., 1993).

Toàn bộ trình tự gen 18S rRNA (1.970bp) được đánh giá là một nguồn thông tin

hữu ích trong nghiên cứu phát sinh loài của sán lá song chủ bằng cách sử dụng các

trình tự từ 8 loài. Rất ít thông tin phát sinh loài đã được tìm thấy trong khu vực bảo tồn

của gen 18S rRNA (chiếm hơn một nửa chiều dài). Hầu hết các thông tin đến từ các

vùng biến dị và đặc biệt là từ vùng V4 (chiếm khoảng 16%) (Nelles et al., 1984). Dữ

liệu từ vùng gen này hỗ trợ cho việc xác định các nhóm loài sán lá song chủ. Mặc dù

vùng gen V4 có khả năng là vùng gen đích của nhiều nghiên cứu trong tương lai

nhưng bản thân vùng gen này (và có lẽ cả gen 18S) dường như không cung cấp thông

tin về quá trình tiến hóa ban đầu của các loài sán lá song chủ (Brook et al., 1989;

Gibson, 1987; Pearson, 1992; Blair et al., 1996). Một số họ sán đã được đề xuất như

là nhóm gần gũi với sán lá song chủ (Gibson, 1987), tuy nhiên mối quan hệ này vẫn

chưa được giải quyết triệt để (Blair et al., 1996).

Blair et al. (1993) tiến hành nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 8 loài sán lá

song chủ thuộc họ Gyliauchenidae thông qua việc sử dụng đoạn gen 18S RNA bằng

cách đánh giá sự tương đồng và khoảng cách di truyền. Kết quả nghiên cứu này đã

chứng minh rằng một số loài sán thuộc họ Gyliauchenidae có quan hệ gần gũi với các

loài thuộc họ Lepocreadiidae.

Tương tự như vậy, Carranza et al. (1997) đã tiến hành phân tích dựa trên toàn bộ

trình tự gen 18S của 13 loài thuộc lớp giun dẹp có tiêm mao - Tubelarria và so sánh

với các trình tự từ ngân hàng gen (GenBank). Kết quả cho thấy bộ Catenulida tạo

thành một nhánh độc lập và thể hiện như là một nhánh gần gũi với các nhóm còn lại

của Bilateria. Các nhóm còn lại của ngành giun dẹp Platyhelminthes (Rhabditophora),

trong đó bao gồm các KST, tạo thành một nhóm đơn ngành (monophyletic) gần gũi

với Protostomes. Trong ngành Rhabditophora, phân tích cho thấy (1) mối quan hệ chặt

chẽ giữa các bộ Macrostomida và Polycladida, tạo thành một nhóm gần gũi rõ ràng đối

với các họ còn lại, (2) KST thuộc ngành Platyhelminthes xuất hiện sớm trong sự phát

triển của nhóm và tạo thành một nhóm gần gũi với một nhánh mà mối quan hệ tiến hóa

vẫn chưa được giải quyết (Nemertodermatida, Lecithoepitheliata, Prolecithophora,

Proseriata, Tiicladida, và Rhabdocoela, (3) Seriata là nhánh đa ngành (Paraphyletic).

Fernandez et al. (1998a) đã nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa phân tử của 5 loài

sán song chủ thuộc họ Campulidae là: Campula oblonga, Zalophotrema atlanticum,

Hadwenius tursionis, Oschmarinella rochebruni, Orthosplanchnus fraterculus và 1

loài thuộc họ Nasitrematidae: Nasitrema globicephalae dựa trên sự so sánh trình tự

ADN ti thể. Cũng trong năm này, tác giả đã sử dụng gen 18S để nghiên cứu mối quan

hệ di truyền giữa các loài sán lá song chủ thuộc các họ: Campulidae, Fasciolidae và

Acanthocolpidae ký sinh trên cá, trong khi các đặc điểm hình thái của các họ này rất

giống nhau, rất khó phân biệt. Kết quả nghiên cứu cho thấy họ Campulidae rất gần với

họ Acanthocolpidae (Fernandez et al., 1998b).

Littlewood et al. (1999) đã sử dụng toàn bộ trình tự gen 18S rRNA của 82 loài

giun dẹp sống ký sinh và các loài giun dẹp sống tự do thuộc ngành giun dẹp

Platyhelminthes và từ 19 loài động vật không xương sống bậc thấp để phân tích các

mối quan hệ phát sinh loài của ngành Platyhelminthes. Kết quả cho thấy Neodermata

là đơn ngành và các loài thuộc lớp sán lá song chủ (Trematoda), sán lá đơn chủ

(Monogenea) và sán dây (Cestoda) là các nhóm đồng dạng. Nhóm gần gũi của

Neodermata là tất cả các bộ khác như Neoophora Kalyptorhynchia, Typhloplanida,

Dalyclliida và Temiiocephalida.

Litvaitis et al. (1999) đã khảo sát trình tự của vùng gen D3 - D6 của gen 28S

rRNA để xây dựng mối quan hệ tiến hóa trong ngành giun dẹp Platyhelminthes. Mặc

dù, Neodermata xuất hiện như là một nhóm đơn ngành, Monogenea lại thể hiện như

một nhóm đa ngành (p < 0,0001). Xét mối quan hệ khác trong nhóm, Neodermata cho

thấy Trematoda thể hiện là một đơn vị phân loại đơn ngành. Các đơn vị phân loại của

Cestodaria (gồm Amphilinidae và Gyrocotylidae) và Eucestode thể hiện là các nhóm

có quan hệ gần gũi.

Olson et al. (2003) đã sử dụng toàn bộ trình tự của gen 18S RNA ribosome (18S

rRNA), và một phần (vùng gen D1 - D3) của gen 28S ribosome gen (28S rRNA) để

xây dựng cây phát sinh loài của 163 loài sán lá song chủ, đại diện cho 77 họ và có 7

loài thuộc họ Aspidogastridae làm nhóm ngoại. Kết quả cho thấy, sán lá song chủ tạo

thành một nhánh phân đôi gồm bộ Brachylaimoidea, Diplostomoidea và

Schistosomatoidea và phần còn lại của Digenea (Plagiorchiida), trong đó Bivesiculata

và Transversotremata hình thành hai dòng cơ bản nhất.

Choudhury et al. (2007) sử dụng gen 18S rRNA và 28S rRNA để xem xét mối

quan hệ di truyền của 3 loài sán song chủ thuộc họ Allocreadiidae là Crepidostomum

cooperi, Bunodera mediovitellata, và Polylekithum ictaluri với trình tự gen của 79 loài

sán khác từ ngân hàng gen.

Hình1.4 dưới đây là một ví dụ cụ thể về việc kết hợp giữa sử dụng kỹ thuật sinh

học phân tử và hình thái học để xác định chính xác mối quan hệ giống loài của sán lá

song chủ (Blair et al., 1998).

Hình 1.4. Cây phát sinh loài của các loài sán song chủ dựa trên gen 18S rRNA

A là phân loại bằng sinh học phân tử; B là phân loại bằng hình thái học.

(Blair et al., 1998)

Các đoạn chèn giữa các gen có trình tự ít bảo tồn hơn so với các vùng mã hóa, do

đó cung cấp thông tin ở một cấp độ thấp hơn (loài/giống). Đối với các loài sán thuộc

bộ Schistosomes, bao gồm cả sán máu ở con người, trình tự từ những đoạn chèn này

cho thấy mối quan hệ tiến hóa rất rõ ràng và phù hợp với kết luận dựa trên dữ liệu hình

dạng và giải phẫu (Després et al., 1992). Tuy nhiên, Schulenburg et al. (1999) phát

hiện sự tương đồng về trình tự gen tại hơn một nửa của đoạn chèn giữa gen tại đầu 3’.

Sự tương đồng trình tự cho thấy có sự liên quan với sự bảo tồn của cấu trúc bậc 2. Vì

vậy, sự tương đồng có thể do cùng nguồn gốc tổ tiên, không phải là sự tiến hóa cơ hội.

Nhóm tác giả đề xuất nên sử dụng đoạn gen này cho các nghiên cứu mối về quan hệ

tiến hóa ở cấp độ cao hơn.

1.4.3.2. Phân loại sán lá song chủ ký sinh ở cá bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Khi so sánh đoạn chèn ITS2 ở các quần thể và các loài sán lá song chủ thuộc họ

Fasciolidae ký sinh ở cá Nhật Bản, các tác giả thông báo rằng, kết quả giải trình tự

ADN đã xác định được 4 cá thể thuộc loài Fasciola hepatica, 2 cá thể thuộc loài

Fasciola gigantic, 1 cá thể thuộc loài Fasciola magna và 1 cá thể của Fasciola sp..

Trình tự ADN của các loài có sự khác nhau chỉ là 2,8%, giữa 2 loài F. hepatica và F.

gigantic, 13,2% giữa 2 loài F. hepatica và F. magna, trình tự gen của Fasciola sp. ở

Nhật Bản tương tự với loài F. gigantic (Adlard et al., 1993).

Blair et al. (1998) đã nghiên cứu phân loại sán song chủ thuộc bộ Hemiuroidea

bằng phương pháp hình thái học, kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử. Các tác giả đã

xác định rằng, không có sự khác nhau đáng kể giữa phân loại hình thái học và sinh học

phân tử. Kết quả thể hiện bộ Hemiuroidea gồm 2 nhánh: nhánh 1 gồm các họ

Accacoeliidae, Derogenidae, Didymozoidae, Hirudinellidae, Sclerodistomidae,

Syncoeliidae và nhánh 2 gồm hai họ Hemiuridae và Lecithasteridae.

Nghiên cứu sán lá song chủ ký sinh ở 7 loài cá thuộc họ cá hồng Lutjanidae

(Perciformes) ở khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương đã phát hiện 2 loài sán lá song chủ

Siphoderina manilensis (Velasquez, 1961; Miller & Cribb, 2008) và S. marina

(Hafeezullah Siddiqi, 1970) (Miller & Cribb, 2008). Tuy nhiên, khi phân tích dựa trên

đặc điểm hình thái và giải trình tự ADN ribosome, Miller et al. (2010) đã xếp 2 loài

đã nêu trên vào một giống mới Euryakaina: E. manilensis và E. marina. Hai loài trên

rất giống nhau về mặt hình thái, cấu tạo, nhưng dữ liệu trình tự gen và vùng sinh thái

cho thấy chúng là 2 loài cận giống (cryptic species).

Khi khảo sát trình tự gen của 36 cá thể sán lá song chủ mang hình dạng cấu tạo

của loài Transversotrema haasi Witenberg, 1944, ký sinh ở 16 loài cá thuộc họ bàng

chài Labridae, họ cá mó Scaridae, họ cá điêu hồng Haemulidae và họ cá hè

Lethrinidae sống trong các rạn san hô ở đảo Lizard và Heron (phía Tây nước Úc). Kết

quả cho thấy có 4 kiểu gen khác biệt: kiểu gen thứ nhất có liên quan với ba cá thể sán

ký sinh trên cá bàng chài Labridae tại đảo Heron; kiểu thứ hai liên quan với tám cá thể

sán ký sinh ở cá mó Scaridae tại đảo Heron; kiểu thứ ba với hai cá thể ở cá mó

Scaridae từ Ningaloo và kiểu thứ tư với hai cá thể ký sinh trên cá hè Lethrinidae và

một cá thể trên cá điêu hồng Haemulidae từ đảo Lizard. Như vậy, qua khảo sát trình tự

gen thì có tới 3 loài mới thuộc giống Transversotrema đã được phát hiện là T. elegans

ký sinh ở cá bàng chài, loài T. igantica ký sinh ở cá mó và loài T. lacerta ký sinh ở cá

điêu hồng và cá hè được ghi nhận. (Hunter et al., 2010)

1.4.3.3. Nghiên cứu vòng đời sán lá song chủ trên cá

Sán lá song chủ (Digenea) là những KST có chu kỳ phát triển phức tạp, phát triển

qua nhiều giai đoạn ấu trùng: tiêm mao trùng (miracidium), bào trùng (sporocyst),

redia, ấu trùng hình tim (cercaria) và hậu ấu trùng (metacercaria). Trong vòng đời của

sán này đòi hỏi phải có 1 hoặc 2 ký chủ trung gian, ký chủ trung gian thứ nhất thường

là động vật thân mềm như ốc, hoặc động vật 2 mảnh vỏ, ký chủ trung gian thứ hai

thường là cá và ký chủ cuối cùng có thể là các loài cá dữ (cá ăn cá) hay là động vật có

xương sống trên cạn có dùng cá làm thức ăn như người và gia súc gia cầm (Đỗ Thị

Hòa và cộng sự, 2004).

Hình 1.5. Sự phát triển vòng đời của sán lá gan nhỏ

(Nguồn: viendinhduong.vn)

Nghiên cứu vòng đời của sán lá song chủ (Digenea) là một nội dung cần thiết,

nhằm xác định các giai đoạn phát triển ấu trùng của sán lá và các loại ký chủ trung

gian cần phải có để khép kín vòng đời của từng loài sán. Tuy nhiên, tìm hiểu vòng đời

của sán lá song chủ là một công việc không đơn giản, vì các giai đoạn ấu trùng của sán

song chủ thường có kích thước rất nhỏ, hình dạng và cấu tạo các cơ quan chưa hoàn

thiện, do vậy rất khó phát hiện ra nó trong nội tạng KCTG thứ nhất và KCTG thứ hai,

cũng khó định loại đến giống loài bằng phương pháp hình thái học. Vì vậy việc bố trí

cảm nhiễm ấu trùng sán vào cơ thể ký chủ cuối cùng (KCCC), hoặc kết hợp áp dụng

kỹ thuật phân tử có thể giúp các nhà nghiên cứu đạt được những thành công trong

nghiên cứu vòng đời của sán lá song chủ.

Trên thế giới, việc nghiên cứu vòng đời và tìm hiểu về các giai đoạn phát triển

của các loài sán lá song chủ đã được nghiên cứu nhiều năm trước đây với nhiều công

trình đã được công bố. Koei (1977) đã mô tả rất đầy đủ các giai đoạn phát triển ấu

trùng của loài sán Cryptocotyle lingua, trong đó ấu trùng cercaria được tìm thấy trong

loài ốc Littorina littorea và khi cảm nhiễm vào cá sau 8 tuần đã thu được ấu trùng

metacercaria, ấu trùng metacercaria qua 8 tuần phát triển thành sán trưởng thành. Tác

giả này cũng đã mô tả vòng đời phát triển của loài sán Derogenes varicus

(Hemiuridae) và kết luận rằng, ấu trùng cercaria của loài sán này ký sinh trong ốc sên

Natica spp., ký chủ trung gian thứ 2 của loài sán này là loài giáp xác chân chèo

Calanus finmarchicus (copepoda) và ký chủ cuối cùng là cá tuyết Sagitta spp. (Koie,

1986; 1990). Tương tự như vậy, vòng đời của nhiều loài sán khác nhau cũng đã được

tác giả này tìm hiểu và thông báo, như loài sán Mesorchis denticulatus (Koie, 1987),

hai loài sán Lecithaster gibbosus và Brachyphallus crenatus (Koie, 1992a, 1992b).

Matin (1950) đã mô tả vòng đời phát triển của loài sán Parasitictodora hancocki ký

sinh ở loài cá biển Gallus domesticus, sự phát triển ấu trùng của loài sán này, từ giai

đoạn sporocyst đến ấu trùng nang metacercaria được mô tả và đo đạc rất chi tiết.

Ngoài ra, chu kỳ phát triển của bốn loài sán khác là Centrocestus formosanus,

Stellantchasmus falcatus, Haplorchis taichui và H. yokogawai thuộc họ Heterophyidae

ký sinh ở cá biển ở Hawaii cũng đã được tác giả này thông báo.

Một số nhà khoa học khác đã ứng dụng kỹ thuật phân tử để xác định quá trình

phát triển, tiến hóa của các loài sán lá song chủ. Các gen ribosome của hệ gen ti thể,

đặc biệt là các đoạn chèn giữa gen – Internal Transcribed Spacer (ITS), cho phép phân

biệt sự khác biệt giữa các loài sán lá song chủ có mối quan hệ gần gũi và đã được sử

dụng rộng rãi để nghiên cứu các mối quan hệ giữa một số loài giun dẹp ký sinh (Blair

et al., 1996; Bartoli et al., 2000). Việc nghiên cứu các giai đoạn ấu trùng của sán lá

song chủ ký sinh ở KCTG thứ nhất là động vật thân mềm (ốc hay động vật hai mảnh

vỏ) được sử dụng phương pháp mô học và hình thái học (Cheng & Burton, 1965;

Khamdan, 1998; Silva et al., 2002; Laruelle et al., 2002). Đã xuất hiện các dạng bệnh

lý ở KCTG thứ hai (là cá) liên quan đến sự hiện diện của các nang ấu trùng

metacerrcaria của sán lá song chủ ký sinh và phát triển trong các cơ quan nội tạng như:

mang, gan, thận, lách, mắt, tim và cơ của cá với số lượng đáng kể, gây hại các cơ

quan này và ảnh hưởng tới chức năng hoạt động của cơ thể cá (Pina et al., 2009).

Anderson (1999) đã kiểm tra và phát hiện ấu trùng metaceraria của loài sán lá

Indodidymozoon pearsoni ký sinh ở loài cá đục chấm Sillago maculate và cá thờn bơn

Pseudorhambus arsius ở Úc. Các tác giả đã giải trình tự ADN ty thể của các

metacercaria này với đoạn mồi ITS2. Trình tự ADN của metacercaria có chiều dài là

338 bp và trùng khít với trình tự ADN của sán lá song chủ loài Indodidymozoon

pearsoni ở giai đoạn trưởng thành.

Loài ốc Cerastoderma edule được biết là ký chủ của một số KST là động vật đơn

bào hoặc đa bào. Trong số các động vật đa bào ký sinh ở loài ốc này, ấu trùng

sporocyst của sán lá song chủ được tìm thấy nhiều nhất và các nghiên cứu đã chứng

minh rằng, loài ốc C. edule là KCTG thứ nhất của một số loài sán lá song chủ, như ấu

loài sán Labratrema minimus. Ngoài ra, ốc C. edule cũng được biết là KCTG thứ hai

của môt số loài sán lá song chủ, vì các nhà khoa học đã phát hiện được các ấu trùng

metacercaria của các loài sán lá song chủ thuộc họ Echinostomatidae,

Gymnophalllidae và Renicolidae (Lauckner, 1983).

Bartoli et al. (2000) đã nghiên cứu vòng đời của loài sán lá song chủ Monorchis

parvus. Ấu trùng sporocysts của loài sán này được tìm thấy trong tuyến tiêu hóa, tuyến

sinh dục, mang, và chân của ốc Cerastoderma edule sống ngoài khơi Đại Tây Dương.

Trong cơ thể ốc, các ấu trùng sporocysts đã phát triển thành ấu trùng cercaria và

metacercaria. Giai đoạn sán trưởng thành của loài Monorchis parvus đã thu được trong

ruột của cá sau khi tiến hành thí nghiệm cho cá ăn ốc trong điều kiện nhân tạo. Như

vậy loài sán Monorchis parvus chỉ phát triển qua 1 KCTG là loài ốc Cerastoderma

edule.

Cribb et al. (1998) đã thu được ấu trùng sán lá song chủ từ ruột của loài cá bàng

chài Thalassoma lunare (Labridae) có đặc điểm hình thái giống với sán trưởng thành

loài Bivesicula claviformis ký sinh ở ruột cá mú Epinephelus fasciatus (Serranidae).

Kết quả trình tự đoạn gen chèn giữa gen ITS2 rRNA của các ấu trùng sán lá và sán

trưởng thành loài Bivesicula claviformis đã thể hiện sự tương đồng. So sánh với các

loài sán khác thuộc họ Bivesiculidae đã thấy sự khác biệt về trình tự là 12% và 29%.

Kết quả nghiên cứu này đã chứng mình rằng, chu kỳ phát triển của những loài sán

thuộc giống Bivesicula có thể yêu cầu tới 3 ký chủ, trong đó có 2 ký chủ trung gian.

Hơn nữa, với những loài sán lá song chủ có 3 ký chủ trong vòng đời phát triển thì giai

đoạn sán trưởng thành thường tồn tại trong cơ thể những loài cá dữ có kích thước lớn,

hoặc ký sinh ở người và động vật trên cạn.

Để thiết lập vòng đời của loài sán Bucephalus minimus, Pina et al. (2009) đã so

sánh trình tự đoạn chèn ITS1 ở sán trưởng thành thu từ hệ thống tiêu hóa của cá chẽm

châu Âu Dicentrarchus labrax với các nang ấu trùng metacercaria thu từ tim, gan và lá

lách của cá đối Mugil sp. và ấu trùng cercaria thu từ ốc Cerastoderma edule. Kết quả

so sánh cho thấy, các trình tự gen có sự tương đồng đến 100% và kết luận rằng chúng

thuộc cùng 1 loài sán lá song chủ Buccephalus minimus. Ngoài ra, trình tự gen ITS1

của loài sán B. minimus có tỉ lệ tương đồng khá cao, đạt 91% so với loài Buccephalus

polymorphus.

Trong vòng đời của loài sán Macvicaria obovata, giai đoạn trưởng thành ký sinh

ở động vật thân mềm thu từ sông Ebro, phía tây Địa Trung Hải, nhưng các nhà khoa

học đã phát hiện ấu trùng sporocysts của loài sán này nhiễm nặng ở loài ốc Gibbula

adansonii và giai đoạn metacercariae ký sinh ở loài giáp xác chân chèo Cyclope

neritea. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử với đoạn chèn ITS đã xác định được vòng đời

loài sán Macvicaria obovata. (Ana et al., 2012).

CHƯƠNG II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là Sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer)

nuôi ở Khánh Hòa.

2.1.2. Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện luận án từ năm 2009 đến năm 2014. Tuy nhiên, tiến hành thu

mẫu cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa để nghiên cứu thăm dò sán lá song chủ ký sinh được

thực hiện từ năm 2007 đến 2009.

2.1.3. Địa điểm nghiên cứu

- Các mẫu cá chẽm và mẫu ốc được thu tại các ao, lồng bè nuôi thâm canh ở vịnh

Cam Ranh, vịnh Nha Trang thuộc tỉnh Khánh Hòa. Các mẫu cá tạp dùng làm thức ăn

cho cá chẽm được mua từ các đầu nậu thu gom cá tạp bán cho người nuôi thủy sản ở

Cam Ranh.

- Nghiên cứu hình thái cấu tạo của KST và các thí nghiệm sinh học được thực

hiện tại Phòng Sinh học Thực nghiệm - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III.

- Nghiên cứu về đặc điểm di truyền của các sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm

được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Khoa Sinh học – Trường

Đại học Bergen, Nauy.

B A

5Hình 2.1. Địa điểm thu mẫu nghiên cứu. A: Vịnh Nha Trang; B: Vịnh Cam Ranh

2.2. Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Mẫu cá chẽm thương phẩm

Mẫu cá chẽm được thu ngẫu nhiên trong các ao nuôi tại huyện Cam Ranh và

Ninh Hòa hoặc các lồng nuôi cá biển đặt tại Vũng Ngán, thuộc vịnh Nha Trang. Thu

mẫu hàng tháng, mỗi lần thu từ 20 – 30 cá thể. Mẫu cá sau khi thu được giữ trong

thùng xốp chứa nước biển lọc sạch, sục khí, vận chuyển về nhốt giữ trong bể xi măng

1 m3, có sục khí liên tục để đảm bảo các mẫu cá đưa vào nghiên cứu phải còn sống. Có

875 cá chẽm nuôi ao và 205 cá chẽm nuôi lồng được thu để nghiên cứu SLSC và ấu

trùng sán ký sinh trên cá chẽm từ năm 2010 đến 2013. Ngoài ra, trước đó từ 2007 –

2009, 169 mẫu cá chẽm được thu để nghiên cứu thăm dò. Số lượng và kích thước mẫu

cá chẽm đã thu dùng cho nghiên cứu qua các năm được thể hiện ở Bảng 2.1, 2.2 và

2.3.

6Hình 2.2. Cá chẽm Lates calcarifer Bloch, 1790

Bảng 2.1. Số lượng và kích cỡ trung bình của mẫu cá chẽm

thu từ lồng nuôi qua các năm (Số mẫu là 205 con)

Chỉ tiêu Năm 2010 Năm 2011 Năm 2012

Số lượng (con) 89 61 55

171,6 ± 53,6 205,4 ± 52,8 167,8 ± 47,4 Chiều dài (mm) (60 – 285) (100 – 290) (100 – 278)

77,0 ± 66,1 135,7 ± 92,6 71,5 ± 56,2 Khối lượng (g) (3 – 250) (10 – 340) (10 – 250)

(Ghi chú: trong ngoặc là giá trị nhỏ nhất và lớn nhất)

3Bảng 2.2. Số lượng và kích thước cá chẽm được thu từ các ao nuôi trong thời gian từ tháng 6/2007 đến tháng 3/2009 (Số mẫu là 169 con)

Vùng nuôi Số lượng (con)

Cam Ranh 105

Ninh Hòa 64 Chiều dài (mm) 168,2 ± 50,0 (60 – 280) 135,3 ± 47,9 (98 – 290) Khối lượng (g) 75,9 ± 65,9 (3 – 270) 46,7 ± 74,2 (10 – 340)

(Ghi chú: trong ngoặc là giá trị nhỏ nhất và lớn nhất)

4Bảng 2.3. Số lượng và kích cỡ trung bình của cá chẽm nuôi ao được thu theo các

năm từ 2010 đến 2013 (Số mẫu là 875 con)

Chỉ tiêu Năm 2010 Năm 2011 Năm 2012 Năm 2013

Số lượng (con) 173 264 190 248

173,9 ± 70,7 158,7 ± 54,4 165,1 ± 61,2 170,0 ± 67,3 Chiều dài (mm) (60 – 320) (60 – 300) (60 – 300) (60 - 410)

Khối lượng (g) 69,4 ± 74,5 (3 – 340) 77,3 ± 81,2 (3 – 300) 82,0 ± 86,0 (3 – 380)

93,6 ± 100,9 (3 – 450) (Ghi chú: trong ngoặc là giá trị nhỏ nhất và lớn nhất)

2.2.2. Mẫu ốc để khảo sát vòng đời sán lá song chủ

Tổng số 1.255 con ốc đinh thuộc giống Cerithium được thu trực tiếp qua 5 đợt tại

đáy các ao nuôi cá chẽm. Ốc được vận chuyển bằng thùng xốp về cơ sở nghiên cứu để

làm vật liệu tìm kiếm các giai đoạn tiền ấu trùng của SLSC, phục vụ nội dung khảo sát

vòng đời của sán song chủ.

7Hình 2.3. Ốc đinh Cerithium sp.

2.2.3. Mẫu cá tạp dùng làm thức ăn trong nuôi cá chẽm

Qua tìm hiểu ở các cơ sở nuôi cá chẽm thương phẩm, có 5 loài cá tạp gồm cá đối

(Mugil sp. - họ Mugilidae), cá nục (Decapterus spp. - họ Carangidae), cá liệt (một số

giống loài thuộc họ Leiognathidae), cá hố (Trihiurus spp. - họ Trihiuridae) và cá dìa

(Siganus spp. - họ Siganidae) thường được dùng làm thức ăn để nuôi cá chẽm. Do vậy,

cá này được thu mua tại các đầu nậu thu gom cá tạp cung cấp cho các hộ nuôi cá biển

ở khu vực Cam Ranh hoặc thành phố Nha Trang. Số lượng và kích cỡ các loài cá tạp

đã dùng trong nghiên cứu này được thể hiện ở Bảng 2.4.

5Bảng 2.4. Số lượng và kích cỡ của các loài cá tạp đã được dùng để kiểm tra ấu

trùng metacercaria của sán lá song chủ (Số mẫu 70 con)

Số lượng cá

(con)

Chiều dài

131,19±2,97

9,80±6,69

31,20±3,86

130,87±5,21

669,22±36,51

(mm)

(128 – 136)

(87 – 113)

(27 – 37)

(123 – 140)

(630 – 735)

Khối lượng

30,19±1,87

18,20±2,57

128,33±11,35

27,40±2,95

135,56±16,56

(g)

(27 – 33)

(15 – 23)

(116 – 145)

(23 – 32)

(116 – 161)

Chỉ tiêu Cá đối Cá liệt Cá dìa Cá nục Cá hố

(Ghi chú: trong ngoặc là giá trị nhỏ nhất và lớn nhất)

8Hình 2.4. Các loài cá tạp làm thức ăn cho cá chẽm

2.2.4. Mẫu cá chẽm giống (6 - 9 cm) dùng cho các thí nghiệm sinh học

Cá chẽm giống cỡ 6 – 9 cm được mua từ các trại giống ở Nha Trang, vận chuyển

bằng thùng xốp có sục khí về Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III để thực hiện

thí nghiệm. Trước khi bố trí thí nghiệm, 30 cá chẽm giống được giải phẫu để kiểm tra

mức độ cảm nhiễm SLSC, khi 100% cá kiểm tra không bị nhiễm loại KST này thì

những cá giống này được đưa vào bố trí thí nghiệm.

6Bảng 2.5. Kích cỡ cá chẽm giống trước khi bố trí thí nghiệm

Chỉ tiêu Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3

7,78 ± 0,85 7,31 ± 0,59 7,63 ± 0,87 Chiều dài (mm) (6,80 – 9,30) (6,56 – 9,01) (6,60 – 9,10)

7,66 ± 0,86 7,15 ± 0,68 7,49 ± 0,94 Khối lượng (g) (6,56 – 9,00) (6,29 – 8,60) (6,35 – 9,01)

(Các số trong ngoặc là giá trị nhỏ nhất và lớn nhất)

2.2.5. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất cần thiết dùng cho nghiên cứu ký sinh trùng

- Một phòng nghiên cứu ký sinh trùng học, bao gồm các máy móc, dụng cụ và

hóa chất cần thiết phục vụ cho nghiên cứu ký sinh trùng ở cá bằng phương pháp hình

thái học, bao gồm kính hiển vi, kính giải phẫu, bộ tiểu giải phẫu và các dụng cụ, hóa

chất phù hợp với phương pháp nghiên cứu này.

- Một phòng nghiên cứu sinh học phân tử, trong đó có các máy móc và dụng cụ

cần thiết như: máy PCR, máy ly tâm, máy lắc, bộ điện di ngang, cân điện tử, máy soi

gel UV Transilluminator, bộ micropippet, các ống eppendof (loại 1,5 ml và 0,2 ml), kít

tách chiết ADN Quiagen và các hóa chất cần thiết khác: tag polymerase, ADN ladder,

ethium bromide, agarose, dung dịch đệm SB 1X, loading dye 6X...

- Một hệ thống bể nhựa có dung tích 200 lít kèm đường dây sục khí dùng để bố

trí các thí nghiệm sinh học, 1 bể lọc và xử lý chứa nước biển có dung tích 30 m3 để

cung cấp nước biển sạch cho các thí nghiệm

2.3. Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng

2.3.1. Phương pháp phát hiện, thu thập, bảo quản, cố định và làm tiêu bản các ký

sinh trùng là sán lá song chủ

Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng toàn diện ở cá của Dogiel (1929), phương

pháp này sau đó được bổ sung hoàn thiệt bởi Bychowskaija & Paploskaja (1969) và

Hà Ký (1969) được dùng trong nghiên cứu này để phát hiện và xác định thành phần

giống loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm. Các bước tiến hành như sau:

2.3.1.1. Phát hiện, thu thập ký sinh trùng là sán lá song chủ ký sinh trên cá

Các mẫu cá được cân (cân đồng hồ với độ chính xác 1 g) và đo (thước đo với độ

chính xác 1 mm) trước khi đưa vào kiểm tra KST. Nhớt da và mang của cá chẽm được

thu bằng dao giải phẫu, dàn mỏng trên lam và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính

40x – 100x. Ở nhớt da cá chẽm có thể gặp các loài sán song chủ thuộc giống

Transversotrema; kiểm tra nhớt mang có thể phát hiện ấu trùng metacercaria ký sinh.

Máu từ tim cá được thu bằng xilanh 1 ml. Từng giọt máu được nhỏ lên các lam sạch,

đậy lamel để soi tươi hoặc làm tiêu bản nhuộm để quan sát dưới kính hiển vi hoặc kính

giải phẫu nhằm phát hiện sán lá song chủ ký sinh ở máu cá. Trong máu cá có thể bị nhiễm

SLSC thuộc giống Sanguinicola (họ Sanguinicolidae)

- Vây và xương nắp mang cá chẽm được cắt rời và đặt vào hộp lồng chứa nước

biển, dưới kính hiển vi soi nổi có thể phát hiện KST. Dùng kim giải phẩu tách KST ra,

thu KST bằng pipet và quan sát chúng trực tiếp dưới kính hiển vi.

- Mang cá được cắt rời từng lá cho vào hộp lồng có nước biển và soi tươi Khi

phát hiện KST, cắt các tơ mang có trùng cho vào hộp lồng khác, tách trùng cho lên

lam kính, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100 - 400 lần;

- Nội quan cá được quan sát, ghi nhận các dấu hiệu bất thường và thu thập các KST

kích thước lớn (nếu có). Sau đó, tách túi mật, dùng xilanh hút dịch mật nhỏ lên lam kính,

đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi. Ruột, dạ dày được cho vào các hộp lồng riêng

biệt có chứa nước muối sinh lý, sau đó đem kiểm tra SLSC dưới kính soi nổi. Sau đó, ống

tiêu hóa của các mẫu cá được giải phẫu để thu nhớt dạ dày và ruột, đem kiểm tra dưới

kính hiển vi để phát hiện SLSC có kích thước nhỏ.

- Các mẫu gan, thận, não và cơ của cá được ép mỏng bởi 2 lam kính và quan sát

dưới kính giải phẫu có độ phóng đại thấp.

Khi phát hiện KST là sán lá song chủ ký sinh trong các nội tạng của cá, kim giải

phẫu và ống hút nhỏ được sử dụng để tách từng cá thể của SLSC ra khỏi cơ thể vật

chủ, ngâm và rửa SLSC trong nước muối sinh lý (0,85%). Dưới kính hiển vi, một số

mẫu sán tươi được đưa lên lam kính để quan sát, đo đạc và vẽ lại hình dạng, cấu tạo cơ

thể của sán. Ngoài ra, các thông tin quan sát được ghi chép cụ thể làm cơ sở cho việc

phân loại sán bằng phương pháp hình thái học.

2.3.1.2. Cố định và bảo quản các ký sinh trùng là sán lá song chủ (Digenea)

Những con sán sau khi được rửa sạch trong nước muối sinh lý, được lấy ra và đặt

lên một tấm kính, dùng một lam kính khác ép mỏng cơ thể sán trước khi cố định. Thao

tác ép phải nhẹ nhàng, đảm bảo mẫu sán ép không quá dày sẽ bị tối màu khi nhuộm,

khó quan sát; cũng không quá mỏng sẽ làm vỡ cơ thể sán. Thuốc cố định có thể dùng

là 1 trong 3 loại sau: cồn etylic 70%, dung dịch Bouin (là acid picric hòa tan bão hòa

trong nước cất) hoặc acid acetic đậm đặc. Nhỏ thuốc cố định thấm dần vào cơ thể sán

và duy trì trong thời gian 7 – 10 giờ.

Sau thời gian cố định, sán được lấy ra khỏi 2 tấm kính ép, bảo quản trong cồn 70%

chứa trong một lọ thủy tinh nhỏ có nút đậy. Với những mẫu sán dùng cho phân tích bằng

kỹ thuật sinh học phân tử thì không cần ép mỏng, được cố định và bảo quản trong cồn

etylic 95%.

2.3.1.3. Nhuộm và làm tiêu bản các mẫu sán lá song chủ

- Sau thời gian bảo quản, các mẫu SLSC được làm no nước bằng các thang cồn

có nồng độ nhỏ dần: 70%, 50%, 30%, 10% và 0%. Ở mỗi nồng độ cồn giữ khoảng 15

– 20 phút.

- Sau khi trùng đã no nước, sử dụng dung dịch Carmin hoặc Hematoxylin nhuộm

trong thời gian từ 1 – 3 giờ (tùy theo độ lớn nhỏ của trùng). Theo dõi mẫu nhuộm dưới

kính giải phẫu, khi thấy tầng biểu bì cơ thể sán có màu đỏ, các nội quan bên trong có

màu đỏ đậm, nhạt không giống nhau (nếu nhuộm bằng dung dịch Carmin) hoặc thấy

tầng bì có màu xanh tro, các nội quan bên trong màu xanh tím (khi nhuộm bằng

Hematoxylin) là mẫu sán nhuộm đã đạt yêu cầu. Nếu mẫu sán bắt màu quá đậm cần

phải làm nhạt màu bằng cách nhúng sán trong cồn acid (gồm cồn etylic và acid

chlorhydric, tỷ lệ 1/1). Sau khi mẫu sán bắt màu thuốc nhuộm, cho mẫu vào ngâm và

rửa trong nước vòi chảy nhẹ khoảng 1giờ.

- Tiếp theo là quá trình làm mẫu sán mất nước bằng cách ngâm mẫu sán đã

nhuộm trong cồn etylic có nồng độ tăng dần: 10%, 30%, 50%, 70%, 90% và 100%, sau

đó mẫu được làm trong bằng cách ngâm qua xylen 2 lần (mỗi lần khoảng 15 phút). Ở

những thang cồn cuối 90 – 100% giữ trùng càng lâu càng tốt hoặc thay cồn 2 lần. Sau

cùng, những con sán đã được nhuộm và làm mất nước, được gắp ra bằng panh sạch, đặt

lên lam và gắn tiêu bản bằng keo Bomcanada. Tiêu bản được dán nhãn tên trùng, kí

chủ, cơ quan kí sinh, địa điểm và ngày tháng thu được mẫu.

2.3.2. Phân loại sán lá song chủ bằng phương pháp hình thái học

2.3.2.1. Những các căn cứ chính để phân loại sán lá song chủ trưởng thành

Các tiêu bản SLSC đã được nhuộm hoặc các tiêu bản ép sán tươi được sử dụng

để phân loại sán với các căn cứ như sau: Hình dạng và kích thước cơ thể sán; Số

lượng, hình dạng, kích thước, vị trí của các giác bám và tỷ lệ về kích thước giữa 2 giác

bám miệng và bụng; Hình dạng, kích thước, vị trí của cơ quan sinh dục (gồm buồng

trứng, tinh hoàn, noãn hoàng và các ống dẫn sinh dục) và vị trí lỗ sinh dục; Hệ thống

tiêu hóa: gồm ruột kín hay hở, phân nhánh hay không, ngắn hay dài so với chiều dài

thân, thẳng hay gấp khúc...(Hình 2.5).

9Hình 2.5. Hình dạng và cấu tạo chung của sán lá song chủ trưởng thành (Klaus, 2011)

1. Giác miệng; 2. Hầu; 3. Thực quản; 4. Ruột; 5.

Tuyến noãn hoàng; 6. Giác bụng; 7. Buồng

trứng; 8. Tinh hoàn; 9. Lỗ sinh dục; 10. Tuyến

bài tiết; 11. Lỗ bài tiết; 12. Bao xoắn;

13. Gonotyl; 14. Ống dẫn tinh; 15. Ống Laurer;

16. Tử cung (Nguồn: Klaus, 2011).

2.3.2.2. Những căn cứ chính phân loại ấu trùng metacercaria của sán lá song chủ

Những căn cứ chính dùng cho phân loại ấu trùng metacercaria của SLSC bằng

phương pháp hình thái bao gồm: Vách bào nang của ấu trùng dày hay mỏng; Hình

dạng của ấu trùng khi bị tách ra khỏi bào nang; Vị trí, kích thước và số gai có trên 2

giác bám miệng và bụng; Có điểm mắt hay không; Hình dạng của cơ quan tiêu hóa

chưa hoàn thiện; Hình dạng và vị trí của tuyến sinh dục chưa hoàn thiện (buồng trứng

và tinh sào còn non) và túi bài tiết (Hình 2.6). 36

Hình 2.6. Hình dạng và cấu tạo chung của ấu

trùng metacercaria của SLSC

1. Bào nang; 2. Giác miệng; 3. Gai quanh giác

miệng; 4. Điểm mắt; 5. Hầu; 6. Ruột; 7. Tinh

hoàn; 8. Giác bụng; 9. Túi bài tiết (Nguồn: Võ

Thế Dũng, 2010)

2.3.2.3. Tài liệu dùng cho phân loại sán lá song chủ

- Các tài liệu được dùng để phân loại SLSC trưởng thành ký sinh trên cá biển:

Velasquez (1958, 1961, 1962, 1975); Yamaguti (1941, 1952, 1965, 1971); Võ Thế

Dũng và cộng sự (2012).

- Các tài liệu được dùng để phân loại ấu trùng SLSC: Frandsen và Christensen

(1984); Ginetsinskaya (1988); Murrell et al. (2005).

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm di truyền của các loài sán lá song chủ ký

sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer)

2.3.3.1. Chuẩn bị mẫu

Như đã trình bày ở mục 2.3.1.2., sán lá song chủ sau khi được thu thập, làm

sach trong nước muối sinh lý được cố định và bảo quản trong cồn etylic 95% để dùng

cho phân tích bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Cũng có cách bảo quản mẫu khác dùng

cho phương pháp nghiên cứu này là lưu giữ các mẫu sán này trong tủ đông sâu ở nhiệt

độ -40ºC. Để thực hiện phân tích mẫu sán bằng kỹ thuật sinh học phân tử, từng mẫu

sán được lấy ra khỏi dung dịch bảo quản, cho vào ống eppendorf mới đã được khử

trùng để tiến hành tách chiết ADN.

2.3.3.2. Tách chiết ADN tổng số của sán lá song chủ

- Nguyên tắc: Quá trình tách chiết ADN phải thu được lượng ADN đủ lớn, đủ

tinh sạch, không bị phân hủy, bị gãy bởi tác động cơ học, hoặc bị phân giải bởi một số

enzyme nội bào, ngoại bào và hóa chất (cần tiến hành ở nhiệt độ thấp), không hoặc ít

lẫn tạp protein để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

- Cách tiến hành: ADN của từng cá thể sán trưởng thành hoặc từ 15 – 20 cá thể ấu

trùng metacercariae của cùng 1 loài được tách chiết bằng bộ kit DNeasy® Blood & Tissue

(Qiagen) theo các bước hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

Bước 1: Lấy mẫu sán cho vào trong ống eppendorft 1,5 ml

Bước 2: Thêm 180 µl dung dịch đệm ATL và 20 µl proteinase K, trộn đều

Bước 3: Ủ ở nhiệt độ 56 0C cho đến khi mẫu tan hoàn toàn, trộn đều trong 15 giây

Bước 4: Thêm 200 µl Buffer AL

Bước 5: Thêm 200 µl Ethanol (96 – 100 0C)

Bước 6: Dùng pippet hút toàn bộ dịch chuyển sang ống có cột lọc 2 ml (có sẵn)

Bước 7: Ly tâm tại 8.000 vòng/phút trong 1phút

Bước 8: Loại bỏ dịch và thu cột lọc ở trên

Bước 9: Đặt cột lọc sang ống 2 ml mới (có sẵn)

Bước 10: Thêm 500 µl đệm AW1 (đã bổ sung Ethanol theo hướng dẫn của nhà sản

xuất), ly tâm trong 1 phút tại 8.000 vòng/phút

Bước 11: Loại bỏ dịch và thu cột lọc ở trên

Bước 12: Đặt cột lọc sang ống 2 ml mới (có sẵn)

Bước 13: Thêm 500 µl Buffer AW2 (đã bổ sung Ethanol theo hướng dẫn của nhà

sản xuất), ly tâm 4 phút tại 13.000 vòng/phút

Bước 14: Loại bỏ dịch và chuyển cột lọc ở trên sang ống eppendorft 1,5 ml mới

Bước 15: Thêm 100 µl đệm AE, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 1 phút tại 8.000

vòng/phút thu được 100 µl ADN và bảo quản ở -20 0C.

2.3.3.3. Khuyếch đại ADN đích bằng kỹ thuật PCR

- Nguyên tắc: Kỹ thuật PCR dựa trên các ADN mạch khuôn là 1 trình tự đích

ADN ban đầu, dùng enzyme Taq polymerase xúc tác cho quá trình khuếch đại in vitro

các acid nucleic đặc trưng. PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu

lần các đoạn ADN có chiều dài khoảng từ 200 - 3.000 bp. Đoạn ADN đích được 38

khuếch đại (ADN đích) nhờ sự có mặt của cặp mồi đặc hiệu (oligonucleotide) thường

có chiều dài khoảng 18 - 20 nucleotide.

Đầu tiên là giai đoạn biến tính ở 91 – 97oC, làm biến tính mẫu ADN chuỗi kép

thành các chuỗi đơn; tiếp đến là giai đoạn bắt cặp mồi và sao chép ở nhiệt độ 55 –

65oC, các đoạn mồi oligonucleotide ngắn gắn với các chuỗi ADN đơn; cuối cùng là

giai đoạn kéo dài ở 68 - 73oC, enzyme Taq polymerase xúc tác cho quá trình kéo dài

các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi ADN đích, bắt

nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.

Gradient PCR: Đây là một kỹ thuật phân tử dùng để sao chép DNA, cho phép xác

định nhiệt độ ủ tối ưu, nên chỉ cần sử dụng số lượng các bước ít nhất. Quá trình tối ưu

hóa này có thể đạt được trong một thí nghiệm. Thiết bị là một máy có chức năng

gradient với các nhiệt độ khác nhau và kỹ thuật này được sử dụng trong trường hợp các

band sản phẩm mờ hoặc chưa biết chính xác nhiệt độ ủ thích hợp cho phản ứng PCR.

- Cách tiến hành: Hút 9 µl dung dịch cần tách chiết ADN dùng cho phản ứng

PCR hoặc 5 µl cho gradient PCR để khuếch đại các đoạn gen 18S rRNA, 28S rRNA

và ITS1 rRNA (Internal transcribed spacer 1 – Đoạn chèn giữa gen số 1). Trình tự các

đoạn mồi dùng cho quá trình khuyết đại DNA được trình bày ở bảng 2.6.

Gen

Mồi xuôi

Mồi ngược

Nguồn

A:5‘AMCTGGTTGATC

5’AGGTGAACCTGC

Littlewood et al.

18S

CTGC CAG 3’

AGATGGAC 3’

(1998)

LSU-5:5’TAGGTCGACCCG

1500R:

5’GCTATCCTG

28S

Olson et al. (2003)

CTGAATTTAAGCA 3’

AGGGAAACTTCG 3’

ITSF: 5’GGTAAGTGCAAG

ITSR:

5’GCTGCGCTC

Bartoli et al.

ITS1

TCATAA GC 3’

TTCATCGACA 3’

(2000)

7Bảng 2.6. Trình tự các đoạn mồi được sử dụng cho phản ứng PCR

Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 50 μL gồm: 9 μL khuôn ADN, 5

μL 10X Dream Taq Buffer, 1 μL dNTP (10 mM), 1 μL mỗi mồi (10 µM), 0,25 μL Taq

ADN polymerase (5 Unit/1 µl) và 32,75 ml nước cất cho đủ thể tích.

Phản ứng được tối ưu hóa quá trình bắt cặp mồi với nhiệt độ bắt cặp trong

khoảng 45oC đến 55oC bởi 8 thông số nhiệt độ như sau: 45oC; 45,8oC; 47,1oC; 48,9oC;

51,4oC; 53,3oC; 54,5oC; 55oC.

Trước khi pha hóa chất dùng cho phản ứng PCR, tiến hành bật UV 10 - 20 phút,

các thao tác tiến hành trên đá lạnh. Sau khi pha xong, ly tâm nhẹ các ống eppendort,

cho vào máy PCR chạy với chu trình luân nhiệt sau:

94oC 94oC 30s 3 phút

72oC 1 phút 1X ∞ 24oC 72oC 7 phút 1X 48oC 45s

40X

Hình 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 18S

10Hình 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 18S

rDNA

94 oC 94 oC 3 phút 30s

52 oC 72 oC 1 phút 24 oC 72 oC 7 phút 1X ∞ 1X 45s

30X

Hình 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 28S rDNA

11Hình 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 18S

94 oC 94 oC

72 oC 72 oC 3 phút 30s

1 phút ∞ 1X 7 phút 1X Gradient 55 oC 45 oC 1 phút 24 oC C

30X

Hình 2.9. Chu trình nhiệt của gradient PCR với gen ITS1 rDNA

12Hình 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 18S

2.3.3.4. Điện di sản phẩm PCR

- Nguyên tắc: Khi các phân tử ADN tích điện (-) được đặt trong một điện trường,

chúng sẽ dịch chuyển từ cực (-) sang (+) của điện trường. Trong trường hợp điện di

agarose chúng sẽ di chuyển qua gel aragose được đặt trong dung dịch đệm điện di. Các

phân tử càng nhỏ thì khả năng di chuyển càng nhanh về cực dương của điện trường so

với các phân tử ADN lớn hơn thì sẽ di chuyển chậm hơn. Sản phẩm của phản ứng PCR

được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm Ethidium bromide (EB) (Hồ Huỳnh

Thùy Dương, 2003).

- Cách tiến hành

Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,60 g agarose và 40 ml đệm SB 1X chứa trong bình

tam giác 100 ml. Đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn, để nguội đến

nhiệt độ khoảng 60 – 70oC rồi chuyển qua bình tam giác 100 ml khác, sau đó thêm 2,0

µl Ethidium bromide vào bình, lắc nhẹ tránh tạo bọt để trộn đều Ethidium bromide vào

gel (hóa chất này độc hại cần tuyệt đối cẩn thận khi thao tác). Đổ gel ra khuôn đã lắp

sẵn lược. Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra theo

phương thẳng đứng để tránh rách các giếng.

Chạy điện di: Cho gel vào buồng điện di và thêm đệm SB 1X cho đến khi ngập

bản gel. 4 µl mẫu + 2 µ loading dye 6X được trộn, rồi cho vào các giếng trên bản gel

arogase. Hút 5 µl thang AND của 1 mẫu (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder của

Thermo Scientific) cho vào 1 giếng. Tiến hành chạy điện di với nguồn 90 V, 500 A

trong 20 phút.

Đọc kết quả: Sau khi chạy điện di xong, lấy gel đặt lên bàn UV Transilluminator

và xem các band ADN dưới đèn cực tím.

2.3.3.5. Giải trình tự ADN

Sản phẩm PCR được gửi đi giải trình tự tại Khoa Sinh học – Trường Đại học Bergen

(Nauy), với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như

sau: 96oC trong 20 giây, 50oC trong 20 giây, cuối cùng là 60oC trong 4 phút. Sản phẩm

sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 ADN Analyser (Applied

Biosystems).

2.3.3.6. Xây dựng mối quan hệ phát sinh của các loài sán lá song chủ ký sinh trên cá

chẽm nuôi tại Khánh Hòa

** Xây dựng mối quan hệ phát sinh loài

Trình tự ADN của gen 18S rRNA, 28S rRNA, ITS1 rRNA của các loài sán lá

song chủ ký sinh ở cá chẽm được xử lý và kết nối bằng phần mềm Geneious, sau đó

kiểm chứng bằng chương trình BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/Blast). Các trình tự được

dóng hàng (alignment) bằng phần mềm Bioedit (Hall, 1999), kiểm tra, chỉnh sửa bằng

mắt thường và xác định mức độ tương đồng của các loài. Cây phát sinh loài được xây

dựng dựa trên các trình tự của các loài sán lá song chủ thu được và các trình tự của các

loài sán từ Ngân hàng gen (GenBank) bằng cách sử dụng phần mềm MEGA 6.06

(Kumar et al., 2009), bằng thuật toán Neighbor Joining (NJ) với giá trị bootstrap (độ

tin cậy) (BT) 1000 lần lặp lại. Loài Eudiplozoon nipponicum và loài Dendritobilharzia

pulverulenta lần lượt được sử dụng làm nhóm ngoại cho cây phát sinh loài của gen

18S rRNA và 28S rRNA vì trình tự của loài này thể hiện sự khác biệt cần thiết với các

trình tự trong nghiên cứu hiện tại.

** Khảo sát quá trình đồng tiến hóa (Coevolution)

Để xác định tính đặc hữu của các loài sán lá song chủ ký sinh trên vật chủ là cá

chẽm, ngoài các thông tin có liên quan như mức độ cảm nhiễm (bao gồm tỷ lệ và

cường độ nhiễm) cao ở cá chẽm, các nghiên cứu trong và người nước chỉ gặp loài KST

này ký sinh ở cá chẽm, thì xác định quá trình đồng tiến hóa về gen giữa loài sán lá

song chủ và vật chủ là cá chẽm đã được thực hiện. Mô hình tiến hóa của các loài sán lá

song chủ được kiểm tra bằng Modeltest trong R-studio (Gentleman & Ihaka, 1993)

trước khi xây dựng cây phát sinh loài. Mô hình tối ưu là GTR dựa trên 46 mô hình tiến

hóa với tần suất các base nitơ là A = 0,2095904; C = 0,2200321; G = 0,3187173; T =

0,2516602; Tỷ lệ các vị trí không biến đổi là 0,3753712 và thông số dạng phân bố

gamma là 0,9008871. Các mô hình tiến hóa của các thuật toán được chạy lặp lại 2 lần.

Quá trình đồng tiến hóa (Coevolution) giữa cây phát sinh loài của các loài cá

chẽm với các loài sán lá song chủ được xây dựng dựa trên phần mềm TreeMap 1.0

(Page, 1994) sử dụng ma trận khoảng cách di truyền kết hợp ma trận nhị phân giữa vật

chủ và ký sinh trùng (Fitch & Margoliash, 1967), phần mềm được thiết lập cho giả

thuyết ban đầu (H0) về sự phân bố của các loài ký sinh trùng trên vật chủ. Cây đồng

tiến hóa được xây dựng theo định dạng về chiều dài khoảng cách di truyền trên các

nhánh của cây phát sinh loài (Ronquist, 1998). Quá trình đồng tiến hóa giữa vật chủ và

ký sinh trùng được đánh giá dựa trên phần mềm Parafit (Legendre et al., 2002) với giá

trị ý nghĩa thống kê (0< α ≤ 0.05) sử dụng ma trận Patristic (ma trận thô) trong phần

mềm Patristic 1.0 (Fourment & Gibbs, 2006) và ma trận tọa độ gốc được xây dựng bởi

phần mềm DistPCoA (Legendre & Anderson, 1998). Giá trị P-value của các nhánh

trong cây đồng tiến hóa được phân tích dựa trên 999 hoán vị ngẫu nhiên của phương

pháp phân tích.

2.3.4. Khảo sát vòng đời phát triển của 1 loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm

Trong số 6 loài SLSC đã phát hiện được ký sinh ở loài cá chẽm (Lates calcarifer)

nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa, loài Pseudometadena celebesensis ký sinh ở ruột của

cá chẽm với tỷ lệ và cường độ cảm nhiễm cao (tỷ lệ cảm nhiễm trung bình đạt 49,36% và

cường độ cảm nhiễm trung bình: 23,84 trùng/cá). Do vậy, vòng đời phát triển của loài sán

lá song chủ này đã tiến hành khảo sát.

2.3.4.1. Khảo sát ký chủ trung gian thứ nhất (ốc)

- Phương pháp của Frandsen và Christensen (1984) đã được dùng để kiểm tra ấu

trùng cercaria của SLSC ký sinh trong ốc. Theo phương pháp này, mỗi cá thể ốc hoặc một

nhóm ốc cùng loài được giữ trong cốc chứa nước biển sạch trong 24 giờ và quan sát các

ấu trùng cercaria (ấu trùng có đuôi) tự thoát ra khỏi ốc vào môi trường nước. Thu ấu trùng

này bằng 1 ống hút và bảo quản trong formalin 6% hoặc cồn ethanol 70%. Ấu trùng

cercaria của sán lá đơn chủ được vẽ hình dạng cấu tạo, chụp ảnh và đo kích thước dưới

kính hiển vi có độ phóng đại 40x và 100x. Định loại ấu trùng cercaria theo khóa phân loại

của Ginetsinskaya (1988)

2.3.4.2. Khảo sát ký chủ trung gian thứ hai (các loài cá làm thức ăn cho cá chẽm)

Có 5 loại cá tạp thường được người dân nuôi cá chẽm thương phẩm sử dụng làm

thức ăn cho cá trong những tháng đầu của mỗi chu kỳ nuôi, đó là: cá đối (Mugil sp. - họ

Mugilidae), cá nục (Decapterus sp. - họ Carangidae), cá liệt (một số giống loài thuộc họ

Leiognathidae), cá hố (Trihiurus sp. - họ Trihiuridae) và cá dìa (Siganus sp. - họ

Siganidae). Do vậy, những mẫu cá tạp này được thu tại các đầu nậu chuyên thu gom cá

tạp bán cho người nuôi cá ở Cam Ranh và thành phố Nha Trang để dùng cho việc kiểm

tra, phát hiện ấu trùng metacercaria của sán lá song chủ. Ngoài ra các mẫu cá này còn

được dùng làm thức ăn cho cá chẽm trong 1 thí nghiệm sinh học, nhằm tìm ra ký chủ

trung gian thứ hai của loài SLSC cần nghiên cứu.

a. Phương pháp kiểm tra, phát hiện, thu thập ấu trùng metacercaria của sán lá

song chủ ký sinh ở các loài cá tạp làm thức ăn cho cá chẽm

Phương pháp nghiên cứu và phân loại bằng khóa phân loại ấu trùng được giới thiệu

bởi Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2013) dựa trên các tài liệu phân loại của Pearson

(1964), Yamaguti (1971), Hong et al. (2002), Bùi Quang Tề, (2006, 2007), Sohn (2009)

và Pinto et al. (2012) đã được áp dụng để phát hiện và thu thập ấu trùng metacercaria của

SLSC ở cá. Có 2 cách chính đã được dùng để phát hiện và tách ấu trùng ra khỏi cơ thể ký

chủ trung gian.

** Phương pháp ép mô

Các bộ phận và nội tạng của cá như: mang, cơ, gan, thận, lách được cắt rời đặt vào

các hộp lồng khác nhau có chứa nước muối sinh lý 0,85%. Đồng thời, các mẫu mô nhỏ

của những cơ quan này được ép mỏng giữa 2 lam kính và kiểm tra dưới kính giải phẫu

soi nổi để tìm kiếm ấu trùng metacercaria ký sinh. Nếu phát hiện ấu trùng thì dùng dùi và

ống hút để tách riêng chúng ra.

** Phương pháp tiêu cơ

Mẫu cơ quan nội tạng nào của cá cần kiểm tra được cắt thành từng miếng nhỏ và

được nghiền nát bằng cối sứ hoặc máy xay thịt đã sát trùng để tránh tạp nhiễm. Mẫu

Sau khi nghiền nhỏ được trộn với dung dịch pepsin có pH = 2 (gồm 8 ml HCl + 6 g

pepsin trong 1.000 ml nước cất), đưa hỗn hợp này vào các cốc đốt (pepsin nên ngập

hơn 4/3 mẫu mô) và giữ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 2 – 3 giờ để tiêu

cơ. Khi cơ cá đã tiêu hết, lọc hỗn hợp này qua vợt có mắt lưới lớn để loại bỏ các vật

chất không được phân giải. Sau đó thêm nước muối sinh lý vào mẫu, để hỗn hợp lắng

cặn rồi nhẹ nhàng rót bỏ phần nổi, giữ lấy phần lắng đáy, lặp lại thao tác này vài 3 lần,

sau cùng phần lắng đáy được thu và đưa vào hộp lồng để tìm kiếm ấu trùng sán lá song

chủ dưới kính giải phẫu.

Sử dụng kính giải phẫu hoặc kính hiển vi ở các độ phóng đại 40; 100 và 400 lần

để quan sát hình dạng, cấu tạo và phân loại đến giống, loài ấu trùng metacercaria của

sán lá song chủ bằng phương pháp hình thái học theo các tài liệu đã được giới thiệu

bởi Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2013) dựa trên các tài liệu phân loại của Pearson

(1964), Yamaguti (1971), Hong et al. (2002), Bùi Quang Tề, (2006, 2007), Sohn

(2009) và Pinto et al. (2012). Đếm số lượng ấu trùng đã tìm thấy và xác định tỷ lệ và

cường độ cảm nhiễm của ấu trùng sán theo phương pháp của WHO (1995). Các tiêu

bản ấu trùng metacercaria của SLSC được làm theo phương pháp đã trình bày ở

chương II, mục 2.3.1.3.

b. Bố trí thí nghiệm sinh học để tìm KCTG thứ hai của loài sán nghiên cứu

Cá chẽm giống có kích thước từ 6 – 9 cm được mua từ trại sản xuất giống cá biển

ở thôn Cát Lợi và Trung tâm Nghiên cứu Phát triển nuôi biển Nha Trang. Cá được vận

chuyển bằng thùng xốp có sục khí về Phòng Sinh học Thực nghiệm, thuộc Viện

Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III. Trước khi tiến hành thí nghiệm, 30 con cá/đợt đã

được kiểm tra mức độ nhiễm SLSC, khi 100% số cá kiểm tra không bị nhiễm SLSC ở

ruột, đàn cá này được đưa vào bố trí thí nghiệm.

Các loại thức ăn là các loài cá tạp phổ biến như cá đối, cá liệt, cá hố, cá giò và cá

nục được chuẩn bị làm thức ăn cho cá chẽm ở mỗi nghiệm thức. Cá tạp cũng được

mua từ các đầu nậu cung cấp thức ăn cho người nuôi cá chẽm.

** Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Kay et al. (2009) và có cải tiến

để phù hợp với nghiên cứu này. Cá chẽm giống được bố trí nuôi trong các bể nhựa

dung tích 200l, mật độ thả 50 con/bể. Thí nghiệm có 6 nghiệm thức bao gồm: 1

nghiệm thức đối chứng, ở đó cá được cho ăn thức ăn tổng hợp hiệu INVE và ở mỗi

nghiệm thức còn lại cá nuôi được cho ăn 1 loại cá tạp trong số 5 loại sau: cá đối, cá

liệt, cá hố, cá giò và cá nục, cho cá ăn 1 lần trong ngày vào mỗi buổi sáng. Khẩu phần

ăn của cá ở mỗi nghiệm thức là 10% khối lượng thân. Thí nghiệm tiến hành trong 30

ngày, thực hiện 3 đợt khác nhau. Nước trong các bể thí nghiệm được thay 100% hàng

ngày, kiểm tra thức ăn thừa vào mỗi buổi chiều và theo dõi các yếu tố môi trường như:

nhiệt độ, pH, độ mặn.

Kết thúc thí nghiệm, 100% cá trong các nghiệm thức đều được giải phẫu để kiểm

tra mức độ cảm nhiễm SLSC (bao gồm: tỷ lệ và cường cảm nhiễm). Kết quả kiểm tra

KST ký sinh ở ruột cá sau thí nghiệm đã chứng minh loài cá tạp nào đã đưa ấu trùng

sán lá vào cơ thể cá chẽm, qua đó tìm ra loài cá là KCTG thứ hai của loài sán lá song

chủ cần nghiên cứu. Mô hình thí nghiệm này được trình bày ở hình 2.10.

Cá chẽm giống kích cỡ 6-9 cm, 100% không nhiễm SLSC

NT1

NT2

NT3

NT4

NT5

ĐC

50 cá/bể T.ăn: cá đối

50 cá/bể T.ăn: cá nục

50 cá/bể T. ăn: cá hố

50 cá/bể T.ăn: cá liệt

50 cá/bể T.ăn: cá giò

50 cá/bể T.ăn tổng hợp

- Thí nghiệm có 6 nghiệm thức (NT), lặp lại 3 đợt

- Cá chẽm giống không nhiễm SLSC: 50 con/bể;

mỗi buổi chiều và thay nước 100% hàng ngày

- Theo dõi một số yếu tố môi trường nước bể thí nghiệm: t oC, pH, S‰

- Sau 30 ngày nuôi, kiểm tra mức độ nhiễm loài SLSC cần nghiên cứu (NC)

- Thời gian thí nghiệm: 30 ngày; sục khí liên tục ngày đêm, xi phon đáy vào

Tìm ra loài cá tạp là ký chủ trung gian thứ 2 của loài sán nghiên cứu

13Hình 2.10. Sơ đồ thí nghiệm tìm loài cá là ký chủ trung gian thứ hai của sán lá song chủ loài Pseudometadena celebesensis

2.3.5. Xử lý số liệu

Nhập toàn bộ số liệu thu được vào phần mềm Excell, sau đó tùy thuộc mục đích

sử dụng mà được xử lý trong các phần mềm khác nhau.

2.3.5.1. Xác định mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm, cá tạp và ốc

Mức độ nhiễm SLSC ở các loại ký chủ được thể hiện ở hai chỉ số: tỷ lệ cảm

nhiễm (%) và cường độ cảm nhiễm (con sán/ký chủ).

 Tỷ lệ cảm nhiễm SLSC (%):

Trong đó: A là tỷ lệ cảm nhiễm (%)

N1 là số cá thể vật chủ bị nhiễm SLSC

N là số cá thể vật chủ đưa vào kiểm tra

 Cường độ nhiễm: là số SLSC tìm thấy ở 1 cá thể vật chủ (sán/cá thể vật chủ)

 Cường độ nhiễm trung bình:

Trong đó: P là cường độ nhiễm sán bình quân,

P1 là tổng số SLSC đã tìm thấy của một loài

N1 là số cá thể vật chủ đã kiểm tra thể hiện bị nhiễm SLSC

 So sánh thống kê:

Số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê sử dụng các phần mềm

Microsoft Excel và SPSS version 22.0 for Window. Các giá trị trung bình của TLCN

và CĐCN trong 4 năm (từ 2010 đến 2013), được so sánh theo phương pháp phân tích

phương sai một yếu tố (one-way ANOVA), phép thử Post Hoc theo trắc nghiệm Tukey

với độ tin cậy 95%. Các giá trị trung bình của TLCN và CĐCN trong hai hình thức

nuôi lồng và ao trong 3 năm (từ 2010 đến 2012), được so sánh theo phương pháp phân

tích cặp t-Test với độ tin cậy 95%.

2.3.5.2 Xử lý dữ liệu di truyền

- Phân tích mối quan hệ phát sinh loài

Các trình tự gen 18S rRNA, 28S rRNA và ITS1 rRNA và các trình tự SLSC tương

ứng trên GenBank được xử lý và kết nối bằng phần mềm MEGA 6.06, sau đó kiểm

chứng bằng chương trình BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/Blast). Các trình tự được dóng hàng

bằng phần mềm Bioedit 6.0, sau đó được kiểm tra, chỉnh sửa bằng mắt thường, xác định

mức độ tương đồng và sự khác biệt di truyền của các loài sán. Sự khác biệt di truyền

được tính theo công thức sau:

Số nucleotide khác biệt x 100 Sự khác biệt di truyền (%) =

Tổng số nucleotide dóng hàng

Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6.06 (Kumar et al.,

2008) dựa trên thuật toán Neighbor Joining (NJ) với giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT)

1000 lần độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng. Eudiplozoon nipponicum,

Dendritobilharzia pulverulenta lần lượt được sử dụng làm nhóm ngoại (outgroup) đối

với phân tích dựa trên gen 18S, và 28S rRNA. Các thông tin về loài, vật chủ, khu vực

nghiên cứu, nguồn tham khảo và mã số GenBank được trình bày ở Bảng 2.7 và 2.8.

Bảng 2.7. Trình tự gen 18S rRNA của các loài SLSC ký sinh ở một số loài cá biển

STT

Loài

Họ

Vật chủ

TLTK

Mã số Genbank

Vùng nghiên cứu Việt Nam

NCHT

Cryptogonimidae

USA

Olson et al., 2003 Olson et al., 2003

Việt Nam

NCHT

AY22212 3 AY22212 2

Hemiuridae

Lates calcarifer Micropterus salmoides Sciaenops ocellatus Lates calcarifer Caesio cuning

Cribb et al., 2001

Việt Nam

NCHT

AJ28752 8

Opecoelidae

New Caledonia UK

Bray et al., 2016 Cribb et al., 2001

Việt Nam

NCHT

KU32058 7 AJ28755 8

Transversotrematidae

Lates calcarifer Sargocentron spiniferum Anarhichas lupus Lates calcarifer Caesio cuning

Pseudometadena celebesensis Caecincola parvulus Siphodera vinaledwardsii Erilepturus hamati Lecithochirium caesionis Helicometra fasciata Helicometra boseli Peracreadium idoneum Transversotrema patialense Transversotrema haasi Eudiplozoon nipponicum

Cyprinus carpio

AJ28758 3 AJ28751 0

Cribb et al., 2001 Littlewood and Olson, 2001

9Bảng 2.8. Trình tự gen 28S rRNA của một số loài sán lá song chủ ký sinh ở một số loài cá biển

STT

Loài

TLTK

Vật chủ

Họ

Mã số Genbank

Vùng nghiên cứu

Việt Nam

NCHT

KX186743

Lates calcarifer Pterocaesio marri

Australia

Transversotrematidae

Caesio cuning Australia AY222186

KX186742

KX186736

Australia Australia

Cutmore et al., 2016 Olson et al., 2003 Cutmore et al., 2016 Cutmore et al., 2016

Việt Nam

NCHT

FJ788496

New Caledonia

Cryptogonimidae

USA

AY222230

Transversotrema patialense Transversotrema witenbergi Transversotrema haasi Transversotrema tragorum Transversotrema licinum Pseudometadena celebesensis Adlardia novaecaledoniae Siphodera vinaledwardsii

Bray et al., 2009 Olson et al., 2003

Parupeneus indicus Acanthopagrus australis Lates calcarifer Nemipterus furcosus Sciaenops ocellatus

USA

AY222231

Micropterus salmoides

Caranx crysos

USA

KT273395

Bucephalidae

AY289248

Belarus

Olson et al., 2003 Nolan et al, 2015 Stunzenas et al., 2004

Việt Nam

NCHT

Caecincola parvulus Bucephalus margaritae Bucephalus polymorphus Ertlepturus hamati

AY222201

Plerurus digitatus

Australia

Olson et al., 2003

AY222200

Hemiuridae

Australia

USA

KU527429

USA

KC985235

Olson et al., 2003 Curran, 2016 Calhoun et al., 2013

Việt Nam

NCHT

KU320597

New Caledonia

Opecoelidae

USA

KJ701238

KU320600

AY222209

New Caledonia United Kingdom

USA

KJ701237

Lecithochirium caesionis Lecithochirium floridense Lecithochirium microstomum Helicometra fasciata Helicometra fasciata Helicometra manteri Helicometra boseli Peracreadium idoneum Macvicaria crassigula

Dreissena polymorpha Lates calcarifer Scombermorus commerson Caesio cuning Pterois volitans Trichiurus lepturus Lates calcarifer Epinephelus fasciatus Prionotus alatus Sargocentron spiniferum Anarhichas lupus Calamus bajonado

Opecoelidae

KP056246

Demidospermus mortenthaleri

Brachyplatysto ma juruense

Peru

Bray et al., 2016 Andres et al., 2014 Bray et al., 2016 Olson et al., 2003 Andres et al., 2014 Mendoza- Palmero et al., 2015

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tình hình nuôi cá chẽm ở Khánh Hòa

Theo thông tin thu thập trong quá trình thu mẫu nghiên cứu, nghề nuôi cá chẽm ở

Khánh Hòa chủ yếu là nuôi ao. Người dân cải tạo lại các ao nuôi tôm bị bỏ bỏ hoang

để làm ao nuôi cá chẽm, ao thường có diện tích trung bình 3.000 m2, đáy cát bùn, một

số ao đáy san hô.

Cá chẽm giống cỡ 20 – 30 mm giá 700 – 900 đồng/con được thả nuôi trực tiếp

2 ao, mật độ nuôi 1 – 2 con/m

xuống ao hoặc quây lưới ương khoảng 30 – 45 ngày cá đạt cỡ 60 – 100 mm thì thả ra

, sau thời gian nuôi 6 – 12 tháng cá đạt cỡ 0,8 – 1,2 kg,

năng suất từ 6 – 10 tấn/ha, thậm chí có hộ đạt trên 14 tấn/ha, tỷ lệ sống 58 – 75%, với

giá bán từ 50.000 – 52.000 đồng/kg, trung bình nuôi 1 ha lãi từ 100 – 140 triệu đồng

(Báo Khánh Hòa, 2007). Thức ăn sử dụng nuôi cá chẽm chủ yếu vẫn là cá tạp, do đó

dễ gây ô nhiễm môi trường và dịch bệnh.

Cá chẽm hiện nay là đối tượng được người nuôi quan tâm với thuận lợi như kỹ

thuật nuôi đơn giản, ít tốn nhân công, ít bị ruit ro so với nghề nuôi tôm, đặc biệt đã chủ

động được con giống. Theo số liệu điều tra một số trại sản xuất giống ở Khánh Hòa và

Vũng Tàu năm 2012 sản xuất được 13 triệu con giống các cỡ, nguồn trứng từ nhiều

nguồn khác nhau, từ Trường Đại học Nha Trang, Long Sơn – Vũng Tàu, tự sản xuất.

Kỹ thuật sản xuất giống hầu như các trại đều giống nhau đáp ứng nhu cầu nuôi thương

phẩm trong nước.

Tuy nhiên, nghề nuôi cá chẽm ở Khánh Hòa gặp một số khó khăn như:

- Nghề nuôi cá biển nói chung và cá chẽm nói riêng đã và đang phát triển một

cách tự pháp, công tác quy hoạch chưa đồng bộ nên việc quản lý gặp không ít khó

khăn;

- Hiện nay, thức ăn cho cá chẽm chủ yếu là cá tạp, đây là loại thức ăn có sẵn ở

địa phương, tuy nhiên có người nuôi vẫn gặp khó khăn khi sử dụng nguồn thức ăn này

như lượng cá tạp không ổn định, đặc biệt vào mùa mưa bão, chất lượng thức ăn không

đảm bảo, gây ô nhiễm môi trường và là một trong những nguồn gây bệnh chủ yếu cho

cá chẽm...Do đó, nếu chỉ dựa vào cá tạp làm nguồn thức ăn chính thì khó có thể nâng

cao được quy mô sản xuất và sản lượng cá biển nói chung và cá chẽm nói riêng.

3.2. Thành phần giống loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh ở cá chẽm nuôi tại

Khánh Hòa

3.2.1. Thành phần giống loài sán lá song chủ đã tìm thấy ký sinh ở cá chẽm

Bằng phương pháp hình thái học, đã phát hiện và phân loại được 6 loài SLSC ở

giai đoạn trưởng thành, thuộc 6 giống, 4 họ, 1 bộ thuộc lớp SLSC (Digenea) của ngành

giun dẹp Platyhelminthes. Thành phần giống loài, mức độ nhiễm của SLSC ký sinh ở

cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa được thống kê qua Bảng 3.1 và Bảng 3.2.

10Bảng 3.1. Thành phần loài, mức độ nhiễm và vị trí ký sinh của sán lá song chủ ở cá chẽm (n=1.080)

Loài SLSC Vị trí ký sinh Tỷ lệ nhiễm (%)

Cường độ nhiễm (trùng/cá) 1,88 ± 2,26 Tranversotrema patialense Da dưới vẩy 15,19 (1 – 28)

4,84 ± 5,02 Erilepturus hamati Dạ dày 50,83 (1 – 37)

Pseudometadena 16,57 ± 22,24 Ruột 40,65 celebesensis (1 – 186)

1,33 ± 0,59 Buccephalus margaritae Ruột 3,33 (1 – 3)

Helicometra fasciata* Ruột - -

Elytrophallus sp.* Ruột - -

(Ghi chú: Trong ngoặc là giá trị lớn nhất và nhỏ nhất. Loài * phát hiện 1 con nên

không tính mức độ nhiễm và so sánh).

11Bảng 3.2. Thành phần loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa

Plathelminthes Scheider, 1873 Ngành

Trematoda Rudolphi,1808 Lớp

Plagiorchiida La Rue, 1957 Bộ

Opecoelidae Bucephalidae Hemiuridae Cryptogonimidae Transversotrematidae Họ Ozaki, 1925 Poche, 1907 Luhe, 1901 Ciurea, 1933 Yamaguti, 1954

Helicometra Bucephalus Erilepturus Elytrophallus Pseudometadena Transversotrema Giống Odhner, 1902 Baer, 1826 Woolcock, 1952 Manter, 1940 Yamaguti, 1952 Witengberg, 1944

Helicometra Bucephalus Erilepturus hamati Pseudometadena Transversotrema

fasciata margaritae Ozaki & (Yamaguti, 1934) Elytrophallus sp. celebesensis patialense Loài

Rudolphi, 1819 Ishibashi, 1934 Manter, 1947 Yamaguti, 1952 Soparkar, 1924

Kết quả ở Bảng 3.1 và 3.2 đã thể hiện có sáu loài SLSC được tìm thấy ký sinh

trên cá chẽm, đó là các loài: Transversotrema patialanse; Erilepturus hamati;

Helicometra fasciata; Pseudometadena celebesensis; Buccephalus margaritae và

Elytrophallus sp..

Trong thành phần loài SLSC ký sinh ở cá chẽm tại Khánh Hòa có 3 loài B.

margaritae, P. celebesensis và E. hamati trùng với nghiên cứu của Leong & Wong

(1987, 1990) về SLSC ký sinh trên cá chẽm ở Malaysia. Ruangpan (1982, 1988) cũng

công bố chỉ tìm thấy 2 loài SLSC ở cá chẽm nuôi tại Singapore là Lecithochirium sp.

và P. celebesensis. Trước đó, trên cá chẽm nuôi ở Philippine, Valesquez (1962, 1975)

cũng chỉ tìm thấy 4 loài SLSC là Transversotrema laruei, Pseudometadena

celebesensis, Lecithochirium neopacifium và Bucephalus polymorphus.

Ở cá mú nuôi và tự nhiên tại vùng biển Khánh Hòa, Võ Thế Dũng và cộng sự

(2010) đã tìm thấy 5 loài SLSC, trong đó có 2 loài trùng với kết quả của nghiên cứu

này ở cá chẽm, đó là loài Transversotrema patialense và Helicometra fasciata.

Ngoài ra, kết quả nghiên cứu hoàn toàn không tìm thấy ấu trùng (metacercaria)

của SLSC ký sinh ở cơ, mang hay các nội tạng của cá chẽm, các mẫu SLSC tìm thấy

ký sinh ở cá chẽm đều là giai đoạn trưởng thành. Điều đó chứng minh rằng cá chẽm

nuôi ở Khánh Hòa thường là ký chủ cuối cùng của SLSC. Nhìn chung, số lượng giống

loài SLSC tìm thấy trong luận án này không nhiều và thành phần loài sán tương đối

giống với những nghiên cứu khác trong khu vực về SLSC ký sinh ở loài cá chẽm-

Lates calcarifer.

Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, trong 6 loài SLSC đã tìm thấy ký sinh ở cá

chẽm, có 5 loài SLSC là những ký sinh trùng nội ký sinh, ký sinh ở các cơ quan bên

trong của cá, trong đó 4 loài ký sinh ở thành ruột (Pseudometadena celebesensis,

Bucephalus margaritae, Helicometra fasciata và Elytrophallus sp.), 1 loài ký sinh ở

dạ dày của cá (Erilepturus hamati), chỉ có 1 loài Tranversotrema patialense là KST

ngoại ký sinh, chúng ký sinh ở da, dưới các gốc vảy của cá chẽm. Kết quả này đã

chứng tỏ rằng, đa phần ấu trùng metacercaria của các loài sán này có thể đã xâm nhập

vào cá chẽm qua con đường thức ăn, khi cá tạp là nguồn thức ăn chính được dùng

trong nuôi cá chẽm thương phẩm ở Khánh Hòa. Ngoài ra, như đã biết, các loài cá tạp

này có thể là các ký chủ trung gian thứ 2 của SLSC, chúng thường bị cảm nhiễm giai

đoạn ấu trùng metacercaria của SLSC. Các ấu trùng metacercaria theo nguồn cá tạp

mà xâm nhập vào đường ruột của cá chẽm, tại đó cá tạp được tiêu hóa nhờ các men

tiêu hóa của vật chủ, còn ấu trùng SLSC sẽ bám vào thành ruột hoặc thành dạ dày của

cá rồi phát triển thành trùng trưởng thành và bắt đầu đẻ trứng (Đỗ Thị Hòa và cộng sự,

2004). Do vậy, có thể nghi ngờ cá tạp là nguồn lây nhiễm SLSC cho cá chẽm trong

nuôi thương phẩm

Trong 6 loài SLSC được tìm thấy ký sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa, có 2

loài sán có mức độ cảm nhiễm cao là Erilepturus hamati với tỷ lệ cảm nhiễm và cường

độ cảm nhiễm lần lượt là 50,83% và 4,84 ± 5,02 trùng/cá và loài Pseudometadena

celebesensis cảm nhiễm lần lượt là 40,65% và 16,57 ± 22,24 trùng/cá. Trong đó, loài

P. celebesensis có cường độ nhiễm ở cá chẽm cao nhất, bắt gặp ký sinh nhiều ở ruột cá

chẽm với cường độ dao động từ 1 – 186 con sán/cá. Loài Tranversotrema patialense ký

sinh ở dưới các gốc vẩy cũng có tỷ lệ nhiễm khá cao (15,19%), nhưng cường độ nhiễm

trung bình lại thấp, 1,88 con sán/cá nên tác hại đối với cá không lớn. Các loài sán còn lại

như Bucephalus margaritae có mức độ cảm nhiễm ở cá chẽm rất thấp, chỉ 3,33% với

cường độ nhiễm 1-3 con sán/cá. Đặc biệt, có 2 loài SLSC là Helicometra fasciata và

Elytrophallus sp. chỉ bắt gặp cảm nhiễm ở 1 con cá trong số 1.080 mẫu cá đã được

kiểm tra, nên đã không thể tính được mức độ nhiễm.

Theo Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2004), sán lá song chủ thường có cấu tạo lưỡng

tính, đẻ trứng, giao phối trên cùng một cơ thể. Vòng đời phát triển của SLSC

(Digenea) khá phức tạp, trải qua nhiều giai đoạn ấu trùng như: ấu trùng miracidium,

sporocys, redia, cercaria và metacercaria, sau đó mới phát triển thành sán trưởng

thành. Trong vòng đời, SLSC đòi hỏi phải trải qua từ 1 hoặc 2 ký chủ trung gian, ký

chủ trung gian thứ nhất thường là ốc hoặc động vật không xương sống khác, ký chủ

trung gian thứ hai thường là cá, động vật thân mềm, giáp xác và ký chủ cuối cùng

thường là động vật có xương sống như cá, lưỡng thê, bò sát, chim, động vật có vú

trong đó có con người. Do đó, SLSC không chỉ gây ảnh hưởng đến các đối tượng nuôi

thủy sản (cá, tôm hay động vật thân mềm), mà còn có thể gây bệnh nguy hiểm cho các

động vật ăn cá, trong đó có con người (Vo The Dung et al., 2008)

3.2.2. Mô tả hình dạng, cấu tạo của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm.

Lớp: Sán lá song chủ (Trematoda Rudolphi, 1808)

Bộ: Strigeidida La Rue, 1924

Họ: Bucephalidae Poche, 1907

Giống: Helicometra Odhner, 1902

0,75mm

3.2.2.1. Loài: Helicometra fasciata Rudolphi, 1819

14Hình 3.1. Helicometra fasciata Rudolphi, 1819 1 - Giác miệng; 2 - Hầu; 3 - Ruột; 4 - Giác bụng; 5 - Trứng; 6 - Buồng trứng; 7 - Tinh hoàn; 8 - Ống dẫn trứng

Vị trí ký sinh ở cá chẽm: Ruột

Mô tả hình thái: Kích thước cơ thể dài 2,61 mm, rộng 1,00 mm. Phía trước cơ thể

có giác hút miệng với đường kính 0,22 mm, tiếp đến là thực quản và ruột, ruột kín chia

làm hai nhánh chạy dọc ra phía sau cơ thể. Có giác hút bụng lớn hơn giác hút miệng

(đường kính 0,4 mm). Trứng có dây dài. Buồng trứng và hai túi tinh phân thùy chạy

dọc cơ thể, buồng trứng nằm trước túi tinh và ở nửa cuối cơ thể. Ở vịnh Begal

Malaysia, Madhavi (1975) tìm thấy loài sán này ký sinh trong ruột cá Scorpaenopsis

sirrhosua và mô tả khá chi tiết về chúng. Aken et al. (2006) đã công bố bắt gặp loài

sán này ký sinh ở nhiều loài cá biển ở Austrealia như Antennarius striatus, Apogon 55

limenus, Microcanthus strigatus, Pseudolabrus guentheri, Pseudorhombus arsius,

Parapercis nebulosa, Centropogon australis, Acanthopagrus australis, Rhabdosargus

sarba ở Úc. Ở Việt Nam, lần đầu tiên Arthur và Bùi Quang Tề (2006) đã tìm thấy loài

Helicometra fasciata trên cá mú Epinephelus merra. Cũng trên cá mú đen

(Epinephelus coioides) và cá mú mè (Epinephelus bleekeri) ở Khánh Hòa, Võ Thế

Dũng và cộng sự cũng đã thông báo bắt gặp loài H. fasciata vào năm 2008, 2010.

Họ: Hemuiridae Loos, 1899

Giống: Erilepturus Woolcock, 1935

3.2.2.2. Loài: Erilepturus hamati (Yamaguti, 1934) Manter, 1947

0,1mm

Tên đồng nghĩa: Ectenurus hamati Yamaguti, 1934

15 Hình 3.2. Loài Erilepturus hamati (Yamaguti, 1934) Manter, 1947 1- Giác miệng; 2- Hầu; 3- Cơ quan giao cấu; 4-Ruột; 5- Giác bụng; 6- Tinh hoàn; 7-Trứng; 8-Buồng trứng; 9-Túi ài tiết

Vị trí ký sinh ở cá chẽm: Dạ dày

Mô tả hình thái: Kích thước cơ thể dài khoảng 1,97 ± 0,43 mm (1,10 – 2,53

mm), chiều ngang nơi rộng nhất 0,66 ± 0,19 mm (0,34 – 1,00 mm). Giác bụng to nằm

giữa cơ thể, giác miệng nhỏ hơn ở phía trước cơ thể. Miệng mở ra trong giác miệng. 56

Tinh hoàn và buồng trứng hình cầu. Ruột kín chia thành hai nhánh chạy dọc đến cuối

cơ thể. Phía sau hai bên giác hút bụng là hai tinh hoàn hình cầu có kích thước gần

bằng nhau. Lỗ sinh dục nằm lệch một bên so với giác miệng. Số lượng trứng rất nhiều,

chiếm khoảng 2/3 xoang cơ thể, trứng không có dây. Túi bài tiết hình phễu lớn có thể

đưa ra ngoài hay kéo vào trong cơ thể và đây là đặc điểm quan trọng để phân loại họ

Hemiuridae. Lỗ bài tiết ở cuối cơ thể.

Loài này đã được phát hiện ký sinh ở nhiều loài cá và phân bố ở nhiều vùng biển

khác nhau. Manter (1947) là người đầu tiên phát hiện loài SLSC này ở cá hồng

Latjanus ehrenbergi và mô tả chúng. Loài này được đặt nhiều tên khác nhau, Bray et

al. (1993) đã thống kê được tới 25 tên khác nhau của loài này. Vì loài sán này có thể

ký sinh ở nhiều vật chủ, phân bố ở nhiều nơi, nên cấu trúc cơ thể khá phức tạp, kích

thước của các chỉ tiêu phân loại đã thay đổi nhiều khi ký sinh trên các loài vật chủ

khác nhau, đã làm cho việc phân loại chúng hết sức khó khăn và có nhiều nhầm lẫn.

Yamaguti (1941) phát hiện loài này ký sinh trong dạ dày cá Sciaena schelegeli và cá

mú Epinephelus septenfasiatus ở Nhật Bản. Velasquez (1975) cũng công bố bắt loài

SLSC này ký sinh trên cá Harengula dispilonotus ở Philippine. Nghiên cứu cấu trúc bề

mặt loài sán này, Abdou (2001) tìm thấy chúng ký sinh ở 2 loài cá Pherapon jabua và

Lethrinus mahsena phân bố ở vùng biển Ai Cập. Tại Việt Nam, Võ Thế Dũng (2010)

đã bắt gặp loài sán này ký sinh ở các loài cá mú thuộc giống Epinephelus spp. nuôi ở

Khánh Hòa. Trong nghiên cứu này, loài sán Erilepturus hamati đã được phát hiện ký

sinh ở dạ dày cá chẽm (Lates calcarifer) với tỷ lệ nhiễm cao, xấp xỉ 50% số cá đưa vào

nghiên cứu (n=1.080).

Khi so sánh các chỉ số về kích thước của loài sán E. hamati ký sinh ở cá chẽm

(Lates calcarifer) nuôi tại Khánh Hòa với các nghiên cứu khác cho thấy, loài sán E.

hamati có kích thước (dài và rộng) lớn hơn khi ký sinh ở cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa

so với khi ký sinh ở cá chẽm nuôi ở Philippine (Velasquez,1975), nhưng lại có kích

thước nhỏ hơn khi chúng ký sinh ở loài cá mú Epinephelus septenfaciatus (Yamaguti,

1941) (Bảng 3.3).

12Bảng 3.3. So sánh kích thước của loài Erilepturus hamati ký sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa với các nghiên cứu khác

Cơ quan Nghiên cứu này Yamaguti (1941) Velasquez (1975)

Ký chủ Lates calcarifer E. septenfaciatus Lates calcarifer

Chiều dài 1.300 – 2.000 2.300 – 3.400 780 - 1240

Chiều rộng 750 – 850 500 - 850 250 – 460

Giác miệng 55 – 180 150-190x160-200 60 – 140 x 79 - 140

Hầu 84-114 x 84-110 30-50 x 41-53

Giác bụng 310 – 400 350 – 450 140-250 x 160-250

Phải: 97 x 51-140 Tinh hoàn 90 – 152 160 - 280 x 180-310 Trái: 64-120 x 44x160

Buồng trứng 140 - 300 110-180 x 200-300

Trứng 18-21 x 11-12 1 – 14 x 7 - 10

Túi bài tiết 76 – 180

(Chú thích: các số đo thể hiện trong bảng có đơn vị tính là µm)

Họ: Transversotrematidae Witernberg, 1944

Giống: Transversotrema Soparkar, 1924

3.2.2.3. Loài: Transversotrema patialense Soparkar, 1924

Tên đồng nghĩa: Transversotrema koliensis Oliver, 1947; Transversotrema

laruei Velasquez, 1958; Transversotrema chackai Mohandas, 1973 và

Transversotrema sopakari Pandey, 1971.

Vị trí ký sinh ở cá: Da dưới vảy

Mô tả hình thái: Cơ thể dẹt lưng bụng, chiều ngang khoảng 702,8 ± 166,5 (480 –

1.000) µm, chiều cao khoảng 469,8 ± 129,4 (310 – 692) µm, ruột tịt gồm 2 nhánh nối

với nhau phía sau, thành ruột gấp lại thành nếp. Giác miệng nhỏ hơn giác bụng, nằm

nửa trên cơ thể. Chiều dài hầu là 69,4 ± 21,2 (30 – 91) µm, chiều ngang hầu 81,3 ±

14,3 (60 – 100) µm. Hai điểm mắt rõ, nằm 2 bên giác miệng. Giác bụng tròn với

đường kính khoảng 131,3 ± 24,2 (100 – 166) µm. Hai tinh hoàn lớn, 1 buồng trứng.

Tinh hoàn hình bầu dục, phân thành 6 – 8 thùy, chiều dài khoảng 144,6 ± 25,0 (115 –

178) µm, chiều ngang khoảng 97,5 ± 12,9 (84,5 – 114,5). Buồng trứng nằm ngay phía

trước tinh hoàn trái, chiều dài của buồng trứng khoảng 84,6 ± 10,9 (76,9 – 92,5) µm.

Lỗ sinh dục nằm ở mép trước cơ thể, phía trước miệng. Ống dẫn tinh và ống dẫn trứng

nằm gần nhau chạy ngang phía sau hầu trước khi đổ vào lỗ sinh dục chung.

0,1mm

16Hình 3.3. Loài Transversotrema patialense Soparkar, 1924 1- Giác miệng; 2- Điểm mắt; 3-Giác bụng; 4- Ruột, 5- Tinh hoàn; 6- Buồng trứng; 7- Lỗ sinh dục

Loài sán song chủ T. patialense thuộc họ Transversotrematidae, ở giai đoạn

trưởng thành ngoại ký sinh ở gốc vảy của nhiều loài cá biển. Các nhà khoa học đã phát

hiện được 9 loài khác nhau thuộc họ này (Cribb et al., 1992). Hiện nay đã có nhiều

công trình nghiên cứu về loài này, như xác định hệ thống phân loại, đặc điểm sinh học,

nghiên cứu vòng đời phát triển... Velasquez (1958, 1975) đã mô tả các giai đoạn phát

triển của loài này khi nghiên cứu SLSC ký sinh ở cá biển của Philippine. Theo Cribb

et al. (1992), loài sán T. patialense ký sinh trên cá phân bố ở châu Phi, Ấn Độ,

SriLanka và nước Úc. Whitfield và Wells (1973) cho rằng trong vòng đời của loài sán

này chỉ đòi hỏi 1 ký chủ trung gian là loài ốc Melanoides tuberculata và ký chủ cuối

cùng là các loài cá biển (Möller, 1774). Mills (1980) thông báo rằng, ở giai đoạn

trưởng thành, loài sán T. patialense đẻ ít trứng, thường < 4 trứng/ ngày, trứng này sẽ

nở thành ấu trùng miracidium sau 13 - 17 ngày ở nhiệt độ 30oC. Từ KCTG là ốc, ấu

trùng hình tim (cercaria) được thải ra môi trường nước và ấu trùng này sau đó bám

vào bề mặt cơ thể cá biển, ký sinh dưới vẩy và phát triển thành sán trưởng thành.

Kích thước của loài sán T. patialense ký sinh trên cá chẽm ở nghiên cứu này lớn

hơn so với các mô tả đã được thông báo của Velasquez (1975) khi phát hiện chúng ký

sinh ở cá chẽm của Philippine, nhưng lại có kích thước tương đương với loài sán này

khi tìm thấy chúng ký sinh ở da của cá mú (Epinephelus spp) trong nghiên cứu của Võ

Thế Dũng và cộng sự (2010) (Bảng 3.4).

13Bảng 3.4. So sánh kích thước của loài Transversotrema patialense ký sinh ở cá

chẽm nuôi tại Khánh Hòa với các nghiên cứu khác

Cơ quan Nghiên cứu này Velasquez (1975), Philippines

Ký chủ Lates calcarifer Lates calcarifer

Võ Thế Dũng (2010), Việt Nam Epinephelus bleekeri, E. coioides 480 – 1000 310 – 692 69,4 – 81,3 100 - 166 472 – 960 305 – 680 30 - 91 x 60 - 100 100 - 160 115-178 x 84,5 -114,5 76,9 – 92,5 1 cái 230 - 550 460 - 900 40 - 50 70 - 90 125 - 150 x 46 - 81 5 – 6 cái

Chiều ngang Chiều cao Hầu Giác bụng Tinh hoàn Buồng trứng Trứng (Chú thích: các số đo thể hiện trong bảng có đơn vị tính là µm)

Họ: Cryptogonimidae Ciurea, 1933

Giống: Pseudometadena Yamaguti, 1952

3.2.2.4. Loài Pseudometadena celebesensis Yamaguti, 1952

Vị trí ký sinh ở cá chẽm: Ruột

Đặc điểm: cơ thể dạng hình oval hoặc hình elip, kích thước cơ thể có chiều

dài đạt từ 1.300 – 2.100 µm và chiều rộng lớn nhất của sán đạt khoảng 580 – 800 µm.

Giác miệng được cấu tạo bằng cơ nằm sát mép thành trước cơ thể, có kích thước đạt

75x103 µm. Hầu của sán khá phát triển nằm ngay dưới giác miệng, có chiều dài 37,5

µm, chiều rộng đạt 70 µm. Có thực quản ngắn, ruột kín có thành mỏng, chia 2 nhánh

kéo dài tới tận cùng cơ thể. Giác bụng được cấu tạo bằng cơ có kích thước đạt 100

x150 µm, nằm ở nửa trên cơ thể, chiếm khoảng 2/6 bề rộng cơ thể. Tinh hoàn là 1

cặp, hình oval, có kích thước xấp xỉ nhau: 60 x120 µm, nằm đối xứng 2 bên ở phía

dưới giác bụng và nằm đè lên 2 nhánh ruột. Buồng trứng nằm giữa cơ thể, giữa 2

nhánh ruột và dưới giác bụng, có kích thước đạt 0,21 x 0,33 µm. Trứng thon dài, phân

bố rất nhiều ở nửa sau cơ thể. Túi bài tiết hình chữ “Y’’.

0,1mm

17Hình 3.4. Loài Pseudometadena celebesensis Yamaguti, 1952 1- Giác miệng; 2- Hầu; 3- Ruột; 4- Giác bụng; - Tinh hoàn; 6- Buồng trứng; 7- Trứng

Khi so sánh các số đo về hình thái của loài sán P. celebesensis tìm thấy ký sinh

trong ruột cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa với các kết quả nghiên cứu khác đã công bố, cho

thấy kích thước cơ thể và các cơ quan bên trong của sán tìm thấy ở Khánh Hòa (Việt

Nam) lớn hơn so với các mô tả của Velasquez (1975) về loài này tìm thấy ở

Philippines, nhưng lại tương đương với những mô tả của Yamaguti (1952) về loài

SLSC tìm thấy ở Indonessia (Bảng 3.5).

14Bảng 3.5. So sánh kích thước của loài Pseudometadena celebesensis ký sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa với các nghiên cứu khác

Yamaguti (1952) Velasquez (1975), Cơ quan Nghiên cứu này Celebes- Indonessia Philippines

Ký chủ Lates calcarifer Lates calcarifer Lates calcarifer

Chiều dài 1.300 – 2.100 700 – 1700 430 – 1170

Giác miệng 75 x 103 60 – 100 x 80 – 135 56 – 115

Trước hầu Ít khi thấy rõ Ít khi thấy rõ 30 – 64

50 -75 x 45 – 80 12 – 23 Hầu 37,5 x 70

100 – 160 60 – 180 x 50 – 120 Giác bụng 100 x 150

Ngắn 70 – 120 Thực quản Ngắn

Tinh hoàn 60 x120 90 – 100 x 130 – 260 20 – 180 x 23 – 120

Buồng trứng 210 x 330 180 – 270 x 240 – 480 23 – 130 x 35 – 120

Trứng 17 x 9 15 – 20 x 9 – 11 15 – 20 x 9 – 11

(Chú thích: các số đo thể hiện trong bảng có đơn vị tính là µm)

Loài SLSC này đã được nhiều tác giả nghiên cứu và công bố, nhưng trong tất cả

các công bố này, loài P. celebesensis đều được tìm thấy ký sinh ở ruột của loài cá

chẽm (Lates calcarifer). Yamaguti đã tìm thấy loài sán P. celebesensis ký sinh trong

ruột của loài cá chẽm nuôi ở vùng biển Celebes-Indonessia (Yamaguti, 1942; 1952).

Các nhà khoa học đã phát hiện loài sán này ký sinh ở ruột của cá chẽm tự nhiên và cá

chẽm nuôi ở Philippines (Velasquez, 1961; 1975), ở cá chẽm nuôi tại Malaysia

(Ruanpan, 1982; Leong & Wong, 1990), ở Singapore (Ruanpan, 1982).

Trong khi đó, cho đến thời điểm này chưa thấy một công bố khoa học nào đã

phát hiện loài sán song chủ P. celebesensis ký sinh ở các loài cá biển khác ngoài cá

chẽm. Ở Việt Nam, đã không tìm thấy loài SLSC P. celebesensis trong thành phần loài

SLSC tìm thấy ký sinh ở các loài cá mú (Epinephelus spp.) nuôi và tự nhiên tại Khánh

Hòa (Vo The Dung et al., 2008; Võ Thế Dũng, 2010), loài này cũng cũng không thấy

trong danh mục thành phần SLSC ký sinh ở các loài cá biển có giá trị kinh tế khai thác

tự nhiên ở Phú Khánh, nay là Khánh Hòa (Nguyễn Thị Muội và Đỗ Thị Hòa, 1980). Do

đó, dựa trên kết quả nghiên cứu và thảo luận trên để đi đến kết luận rằng, loài P.

celebesensis có thể là một loài KST đặc hữu ký sinh trong ruột của cá chẽm - Lates

calcarifer. Nhận định này sẽ được làm rõ hơn ở mục 3.1.3 về Nghiên cứu đồng tiến

hóa của các loài SLSC ký sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa

Họ: Bucephalidae Poche, 1907

Giống: Bucephalus Baer, 1826

3.2.2.5. Loài Bucephalus margaritae Ozaki & Ishibashi, 1934

Tên đồng nghĩa: Buccephalus polymorphus Baer, 1827; B. varicus Manter,

1940; B. polymorphus Caballero, Bravo-Hollis, Grocott, 1953; B. pseudovaricus

Velasques, 1959 (Hình 3.5)

0,1mm

18Hình 3.5. Loài Bucephalus margaritae Ozaki & Ishibashi, 1934 1-Xúc tu; 2-Giác miệng; 3-Giác bụng; 4-Buồng trứng; 5- Trứng; 6- Noãn hoàng; 7-Tinh hoàn; 8-Tử cung 63

Cơ thể sán thon dài, kích thước cơ thể đạt 1.000 x 270µm. Xung quanh lớp vỏ

cutin có gai nhỏ. Giác miệng lớn, có 8 xúc tu nhỏ xung quanh, kích thước đo được là

80 x 75 µm. Miệng nằm phía trước cơ thể, phía trên tinh hoàn trước và đối diện với

buồng trứng, rất khó nhìn thấy. Túi chứa tinh khá lớn nằm giữa cơ thể. Hai tinh hoàn

hình cầu lớn, nằm chéo nhau ở vị trí nửa sau cơ thể sán, tinh hoàn trước nằm chồng lên

cái sau. Buồng trứng tròn, nằm trước tinh hoàn trước, chèn lên ruột. Tử cung có kích

thước lớn, chiếm 2/3 phía sau cơ thể sán. Noãn hoàng dạng hạt lớn, xếp thành 2 dãy

dọc theo nửa trước cơ thể, có khoảng 8 – 9 hạt/bên. Trứng màu vàng, phủ kín xoang

cơ thể.

Các chỉ tiêu về hình thái phân loại của loài B. margaritae trong nghiên cứu này

trùng khớp với một số nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới. Cũng trên cá

chẽm phân bố tự nhiên ở Philippine, Velasquez (1975) đã tìm thấy loài B. varicus ký

sinh ở thành ruột của vật chủ và đã mô tả rất chi tiết về hình thái cấu tạo của loài sán

này. Tại vùng biển Mexico, Arai (1962) công bố bắt gặp loài sán B. varicus ký sinh ở

thành ruột của loài cá biển Centroponus pectinatus. Nahhas và Calson (1994) phát

hiện loài sán B. varicus trong ruột cá Carax latus ở vùng biển Jamaica. Đây là phát

hiện đầu tiên về loài B. margaritae ký sinh ở cá chẽm Lates calcarifer ở Việt Nam

Bảng 3.6. So sánh kích thước của loài Bucephalus margaritae ký sinh ở cá chẽm

nuôi tại Khánh Hòa với nghiên cứu khác

Velasquez (1975) Cơ quan Nghiên cứu này Philippines

Lates calcarifer Caranx sp. Ký chủ

980 – 1000 Chiều dài 1000

240 – 300 Chiều rộng 270

77-81 x 63-90 Giác trước 80 x 75

27 - 23 Hầu -

Noãn hoàng 18 – 20 cái Khoảng 20 cái

Tử cung 2/3 nửa sau cơ thể 2/3 nửa sau cơ thể

Trứng - 18-22,5 x 12,6-13,5

(Chú thích: các số đo thể hiện trong bảng có đơn vị tính là µm)

Khi so sánh các chỉ tiêu hình thái của loài sán Bucephalus margaritae ký sinh ở

cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi tại Khánh Hòa (Việt Nam) với công bố của Velasquez,

1975 cho thấy không có sự khác nhau đáng kể về các chỉ tiêu hình thái (chiều dài,

rộng) với loài sán B. margaritae ký sinh ở loài cá biển Caranx sp. phân bố ở

Philippine (Bảng 3.6).

Họ: Hemuiridae Loos, 1899

Giống: Elytrophallus Manter, 1940

3.2.2.6. Loài: Elytrophallus sp.

Cơ quan kí sinh: Dạ dày

Đặc điểm: Cơ thể trùng thuôn dài. Trùng có kích thước cơ thể lớn, khoảng 1.000

– 3.000 µm. 2 giác bám rất phát triển, giác miệng nhỏ, giác bụng lớn hơn nằm về

phía trước cơ thể gần giác miệng. Ruột chia 2 nhánh chạy dọc đến cuối cơ thể. Tinh

hoàn có 2 cái kích thước gần bằng nhau nằm hơi chéo bên dưới giác bụng. Buồng

0.5mm

trứng nằm gần về phía cuối cơ thể. Túi bài tiết hình phễu lớn nằm cuối cơ thể.

19Hình 3.6. Loài Elytrophallus sp. 1-Giác miệng; 2- Hầu; 3-Ruột; 4-Giác bụng; 5-Tinh hoàn; 6-Buồng trứng; 7-Túi bài tiết

Loài Elytrophallus sp. lần đầu tiên được tìm thấy ký sinh ở cá chẽm nuôi ở Việt

Nam và chỉ tìm thấy 1 con sán nên việc làm tiêu bản và mô tả rất khó khăn. Một số chỉ

tiêu hình thái cơ bản của loài này tương tự như mô tả trong nghiên cứu của Rivera

(1995). Ngoài ra, một loài khác thuộc giống Elytrophallus như E. carettae được Blair

(1984) tìm thấy ký sinh trong dạ dày của rùa (Caretta caretta) ở vùng biển

Queensland, Úc (Bảng 3.7.)

15Bảng 3.7. So sánh kích thước của loài Elytrophallus sp. ký sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa với nghiên cứu khác

Cơ quan

Ký chủ Chiều dài cơ thể Chiều rộng cơ thể Giác miệng Nghiên cứu này Lates calcarifer 1700 380 87

250

Giác bụng 380 - 387 Rivera (1995), Mexico E. labriformis 957 – 2579 (1878) 265 – 567 (414) 70 – 111 (96) 218 - 417 x 236 – 432 (315 x 318)

Tinh hoàn

Buồng trứng Trứng 190 x 270 10x18

Túi bài tiết 230 x 395 158 - 686 x 152 - 413 (437 x 265)

(Chú thích: các số đo thể hiện trong bảng có đơn vị tính là µm)

3.2.3. Xác định loài Pseudometadena celebesensis là ký sinh trung đặc hữu trên cá

chẽm (Lates calcarifer)

Trong tự nhiên, có nhiều loài KST chỉ ký sinh, chỉ sinh trưởng và phát triển tốt ở

một hoặc một số loài vật chủ nhất định, đặc tính đó được gọi là đặc hữu vật chủ. Có

thể bắt gặp các ký sinh trùng đặc hữu ở hầu hết các nhóm ký sinh trùng khác nhau, đặc

biệt là giun sán ký sinh (Võ Thế Dũng, 2010).

Như đã trình bày ở mục 3.2.2., loài Pseudometadena celebesensis đã được phát

hiện ký sinh trong ruột cá chẽm nuôi tại Khánh hòa với mức độ cảm nhiễm cao, tỷ lệ

cảm nhiễm 40,65% và cường độ cảm nhiễm trung bình 16,57 trùng/cá. Ngoài ra cho

đến thời điểm hiện tại, đã có nhiều tác giả thông báo về việc phát hiện được loài sán

này ký sinh trong ruột của cá chẽm châu Á. Rukert et al. (2008) tìm thấy P.

celebesensis ký sinh ở cá chẽm nuôi ở Indonesia, ở cá chẽm nuôi ở biển Celebes -

Indonessia (Yamaguti,1952), ở cá chẽm nuôi ở Malaysia, Singapore và Thái Lan

(Leong và Wong,1982, 1987, 1992), tương tự ở Philippine (Velasquez, 1962;

Ruangpan, 1982; Arthur et al.,1997). Chinabut et al. (1994) nghiên cứu về bệnh trên cá

chẽm và cá mú nuôi ở Thái Lan đã phát hiện được loài sán lá song chủ P. celebesensis

ký sinh ở ruột cá chẽm mà không tìm thấy ở cá mú. Trong các công bố về SLSC ký

sinh ở cá biển Việt Nam đến thời điểm này, chưa thấy công trình nào bắt gặp loài sán

lá P. celebensensis ký sinh ở các loài cá biển khác ngoài cá chẽm. Trong các nghiên

cứu của Vo The Dung et al. (2008), Võ Thế Dũng (2010) đã không tìm thấy loài SLSC

P. celebesensis trong thành phần loài SLSC ký sinh ở các loài cá mú (Epinephelus spp.)

nuôi và tự nhiên ở Khánh Hòa. Tương tự như vậy, loài này cũng cũng vắng mặt trong

danh mục thành phần SLSC ký sinh ở các loài cá biển có giá trị kinh tế khai thác tự

nhiên ở Phú Khánh - nay là Khánh Hòa (Nguyễn Thị Muội và Đỗ Thị Hòa, 1980)

Trong khi đó, đa số các loài sán SLSC khác đã được phát hiện ký sinh ở cá chẽm

nuôi tại Khánh Hòa đều được công bố tìm thấy ký sinh ở các loài cá biển khác trong

nhiều công trình nghiên cứu về KST ký sinh ở cá biển. Các loài Tranversotrema

patialense, Erilepturus hamati và Helicometra fasciata đều đã được thông báo tìm thấy

ký sinh ở cá mú (Epinephelus spp.) nuôi ở Việt Nam (Vo The Dung et al., 2008; Võ

Thế Dũng và cộng sự, 2010). Loài H. fasciata được tìm thấy ký sinh trên nhiều loài cá

biển khác nhau như Antennarius striatus, Apogon limenus, Microcanthus strigatus,

Pseudolabrus guentheri, Pseudorhombus arsius, Parapercis nebulosa, Centropogon

australis, Acanthopagrus australis, Rhabdosargus sarba phân bố ở nước Úc (Aken et

al., 2006). Loài sán lá song chủ T. patialense ký sinh dưới vảy của nhiều loài cá nước

ngọt và cá biển (Velasquez, 1961). Loài sán lá E. hamati được biết ký sinh ở dạ dày

của nhiều loài cá biển khác nhau, như loài cá Sciaena schelegeli và cá mú

Epinephelus septenfasiatus ở Nhật Bản (Yamaguti,1941), ký sinh ở cá Harengula

dispilonotus ở Philippine (Velasquez, 1975), ký sinh ở 2 loài cá Pherapon jabua và

Lethrinus mahsena ở vùng biển Ai Cập (Abdou, 2001). Loài SLSC Bucephalus

margaritae cũng được nhiều tác giả tìm thấy ký sinh ở các loài cá biển khác, như loài

cá Caranx latus (Nahhas và Calson,1994), loài cá Carax sp. ở Philippine,

(Velasquez,1975) và ở loài cá Centropomus pectinatus ở Mexico (Arai, 1962).

Từ kết quả nghiên cứu về thành phần loài SLSC ký sinh ở cá chẽm nuôi tại

Khánh Hòa (Việt Nam), kết hợp với nhiều công trình nghiên cứu khác về KST ở cá

biển tại Việt Nam và các nước trong khu vực châu Á của nhiều tác giả, đã có một nhận

định được đưa ra, đó là loài SLSC Pseudometadena celebesensis có thể là ký sinh

trùng đặc hữu ở cá chẽm (Lates calcarifer).

** Khảo sát đồng tiến hóa của các loài sán lá song chủ và vật chủ là cá chẽm

Để khẳng định về tính đặc hữu của loài SLSC Pseudometadena celebesensis ở

cá chẽm, các kết quả phân tích di truyền bằng kỹ thuật sinh học phân tử đã được dùng

để khảo sát hiện tượng đồng tiến hóa của SLSC và cá chẽm. Cây đồng tiến hóa được

xây dựng dựa trên gen 18S rRNA và 28S rRNA của SLSC thông qua phần mềm

Treemap 1.0, bao gồm 6 loài sán lá song chủ được phát hiện của luận án (NCHT) và 5

loài cá chẽm (dữ liệu từ GenBank). Kết quả được trình bày trong Hình 3.7. và Bảng

3.8

20Hình 3.7. Cây đồng tiến hóa giữa các loài sán lá song chủ và cá chẽm

(Chú thích: Bên trái là các loài cá chẽm, bên phải là các loài sán lá song chủ đã

phát hiện ký sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa. Các đường màu đen là sự xuất hiện

của các loài SLSC ở các loài cá chẽm. Đường màu đỏ là cặp KST và vật chủ đã xảy ra

quá trình đồng tiến hóa.)

16Bảng 3.8. Kết quả Parafit của các loài SLSC ký sinh ở cá chẽm

Vật chủ Ký sinh trùng P-value

Lates calcarifer Transversotrema patialense 0,999

Lates calcarifer Bucephalus margaritae 0,976

Lates calcarifer Pseudometadena celebesensis 0,043*

Lates calcarifer Helicometra fasciata 0,981

Lates calcarifer Ertlepturus hamati 0,998

Lates calcarifer Prosorhynchus pacificus 0,169

0,390 Dicentrarchus labrax Bucephalus margaritae

0,426 Stereolepis gigas Helicometra fasciata

0,341 Lateolabrax japonicus Ertlepturus hamati

0,185 Paralabrax nebulifer Prosorhynchus pacificus

Global test 0,008 (Kiểm tra tổng thể)

(Chú thích: Giá trị P được tính toán sau khi phân tích 999 hoán vị ngẫu nhiên. Giá trị có ý nghĩa khi P ≤ 0,05)

Đây là các dữ liệu đầu tiên ở Việt Nam về quá trình đồng tiến hóa giữa các loài

sán lá song chủ và cá chẽm. Theo Bảng 3.8, giá trị kiểm tra tổng thể (Global test) cho

thấy có mối quan hệ tiến hóa của các loài SLSC với vật chủ là các loài cá chẽm (P =

0,008 < 0,05). Quá trình kiểm tra giá trị P-value được tính toán phù hợp với giả thuyết

(0 < α ≤ 0.05) của từng cá thể SLSC cho thấy các loài có mối quan hệ tiến hóa chung

được hiển thị trong bảng (P ≤ 0.05). Tuy vậy, khi xem xét riêng từng loài SLSC ký

sinh trên các loài cá chẽm cho thấy chỉ có loài Pseudometadena celebesensis đã thể

hiện có tồn tại mối quan hệ đồng tiến hóa với vật chủ của nó là cá chẽm - Lates

calcarifer (với giá trị P = 0,043 < 0,05). Trong khi đó, ở 5 loài SLSC khác cũng đã tìm

thấy ký sinh trên cá chẽm châu Á - Lates calcarifer nuôi ở Khánh Hòa đã không tồn

tại mối quan hệ đồng tiến hóa có ý nghĩa (p>0,05) với vật chủ là cá chẽm. Kết quả

nghiên cứu này đã chứng tỏ rằng, loài SLSC Pseudometadena celebesensis có thể đã

có quá trình ký sinh lâu dài trên cá chẽm (Lates calcarifer).

Đối với ngành giun dẹp, đã có một số báo cáo tương tự khác về quá trình đồng

tiến hóa giữa KST và vật chủ. Desdevises et al. (2002) đã khảo sát quá trình đồng tiến

hóa giữa các loài sán lá đơn chủ - Monogenea thuộc họ Diplectanidae và các loài cá

thuộc họ Sparidae, dựa vào gen 16S rRNA và 18S rRNA. Kết quả cho thấy có 2 trong

số 41 cặp xuất hiện quá trình đồng tiến hóa khi kiểm tra bằng Parafit, giá trị tin cậy cao

với mức ý nghĩa p=0.028. Huyse & Volckaert (2005) cũng ghi nhận một số kết quả

tương tự khi so sánh cây phát sinh loài của các loài sán lá đơn chủ thuộc giống

Gyrodactylus và các loài cá bống thuộc giống Gobius dựa vào trình tự gen 18S rRNA,

ITS rRNA, 12S và 16S mtRNA. Kết quả Parafit cho thấy 1 trong 12 cặp đã xảy ra quá

trình đồng tiến hóa (P <0,05) và giá trị tổng thể phù hợp với giả thuyết ban đầu (P =

0,029 <0,05).

Khi nghiên cứu về KST thuộc sán lá đơn chủ - Monogenea ký sinh ở cá,

Bychowsky (1957) đã công bố về tính đặc hữu vật chủ cao của nhóm KST này. Theo

đó, có tới 74% số loài sán lá đơn chủ (Monogenea) là ký sinh trùng đặc hữu, chỉ ký

sinh trên một loài vật chủ. Rohde (1979) cũng đã thông báo rằng có tới 78% số loài

sán lá đơn chủ ký sinh ở cá biển có tính đặc hữu với một loài vật chủ riêng biệt, 89%

số loài chỉ ký sinh ở một giống cá biển riêng biệt, 96% số loài chỉ ký sinh trên một họ

cá riêng biệt và đến 98% số loài chỉ ký sinh trên một bộ cá riêng biệt. Một số loài có

tính đặc hữu vật chủ cao tới mức có thể coi chúng như là một chỉ thị sinh thái và chỉ

thị địa lý (Lambert, 1995).

Trên thế giới, tính đặc hữu vật chủ của SLSC (Digenea) đã được nghiên cứu từ

lâu và có nhiều công trình đã được công bố. Khi nghiên cứu SLSC ký sinh ở cá ở vùng

biển Florida (Mỹ), Manter (1947) đã phát hiện có đến 105 loài (chiếm 55%) trong số

189 loài sán song chủ được tìm thấy chỉ ký sinh ở một loài vật chủ; 43 loài (chiếm

22,7%) chỉ ký sinh ở 2 loài vật chủ; 14 loài (chiếm 7,4%) ký sinh ở 3 loài vật chủ; 8

loài (chiếm 4,2%) ký sinh ở 5 loài vật chủ và 3 loài (chiếm 1,6%) ký sinh ở 6 loài vật

chủ. Như vậy, sán lá song chủ cũng có xu hướng rõ ràng về tính đặc hữu vật chủ.

Đã có một số công trình công bố về tính đặc hữu của sán dây (Cestoidea) với vật

chủ, như Richard và Gold (1996); Palm và Caira (2008) đã nghiên cứu về tính đặc hữu

vật chủ ở giai đoạn sán trưởng thành và giai đoạn hậu ấu trùng của nhiều loài sán dây

thuộc bộ Trypanorhyncha và cho rằng, tùy thuộc vào giai đoạn hậu ấu trùng mà tính

đặc hữu vật chủ của các loài sán dây có khác nhau.

Ở Việt Nam, Võ Thế Dũng (2010) đã nghiên cứu tính đặc hữu vật chủ của nhiều

loài KST ký sinh ở các loài cá mú thuộc giống Epinephelus spp. tại Khánh Hòa. Trong

đó tác giả cho rằng, cá mú đen (Epinephelus coicoides) có nhiều khả năng là vật chủ

ưa thích của loài sán lá song chủ Gonapodasmius epinepheli.

Như vậy, từ kết quả phân tích đồng tiến hóa và tất cả dữ liệu đã nêu ra và thảo

luận ở trên, có thể kết luận rằng: cá chẽm (Lates calcarrifer) được xem là vật chủ ưa

thích của loài SLSC P. celebensensis và ở giai đoạn trưởng thành loài sán này là ký

sinh trùng đặc hữu của loài cá chẽm châu Á.

3.3. Phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài SLSC ký sinh ở cá

chẽm nuôi ở Khánh Hòa bằng kỹ thuật sinh học phân tử

3.3.1 Khuếch đại, giải trình tự ADN của SLSC ký sinh ở cá chẽm

21Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen 18S rRNA và 28S rRNA của bốn loài

sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm.

(Giếng M: Marker; Giếng 1 – 4: Sản phẩm PCR đoạn gen 28S rRNA của lần lượt loài

T. patialense, E. hamati, P.celebesensis, B. margaritae; Giếng 5-8: là Sản phẩm PCR

đoạn gen 18S rRNA của lần lượt loài T. patialense, E. hamati, P.celebesensis, B.

margaritae; Giếng C: là Mẫu đối chứng âm)

22Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS1 rRNA của bố loài sán lá song

chủ ký sinh trên cá chẽm.

(Giếng M: Marker; Giếng 1 – 4: Sản phẩm PCR vùng ITS1 rRNA từ sán trưởng thành

trên cá chẽm (1: P. celebeniensis, 2: E. hamati, 3: metacercaria 2 và metacercaria 3)

Sử dụng ADN tổng số đã tách chiết làm khuôn, sử dụng các cặp mồi chung và

mồi chuyên biệt cho các gen khác nhau, với chu trình nhiệt của phản ứng PCR như đã

trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu. Sản phẩm PCR thu được là một băng ADN

duy nhất, có kích thước là 1.790 bp với đoạn gen 18S rRNA, 1.200 bp với gen 28S

rRNA và 900 bp với đoạn chèn ITS1 rRNA (Hình 3.8 và Hình 3.9).

3.3.2. So sánh sự khác biệt về trình tự gen giữa các loài sán lá song chủ ký sinh trên

cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi ở Khánh Hòa

Các trình tự gen 18S rRNA của 4 loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm và 7

loài trên GenBank sau khi được kết nối và dóng hàng, sự khác biệt di truyền giữa các

loài sán được thể hiện ở Bảng 3.9.

Giữa 4 loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm, sự khác biệt về di truyền ở gen

18S rRNA nằm trong khoảng <2% đến 14,5%. Sự khác biệt lớn nhất là giữa 2 loài

Helicometra fasciata và Transversotrema patialense và sự khác biệt nhỏ nhất là giữa

Pseudometadena celebesensis và Helicometra fasciata (2%). Hai loài cùng giống

Helicometra fasciata và H. boseli có sự khác biệt trình tự là 2,5%.

Mặt khác, số liệu ở Bảng 3.9 cũng cho thấy có một số loài sán ký sinh ở cá

chẽm nuôi ở Khánh Hòa có sự sai khác rất nhỏ về trình tự gen 18S rRNA so với một

số loài sán có trên GenBank như loài P. celebesensis có sự trùng khớp tới 98,7% (khác

biệt 1,3%) với loài Caecincola parvulus và 97,2% (khác biệt 2,8%) với loài Siphodera

vinaledwardsii; 3 loài này cùng nằm trong họ Cryptogonimidae. Loài Helicometra

fasciata có sự trùng khớp 97,5% (khác biệt 2,5%) với một loài cùng giống đó là loài

H. boseli, thuộc họ Bucephalidae. Loài Erilepturus hamati có sự khác biệt khá lớn với

các loài khác giống nhưng cùng họ Hemiluridae như, tương đồng là 85,5% (khác biệt

14,5%) và với loài Lecithochirium caesionis; 84,4/15,6 với loài Plerurus digitatus. Sự

khác biệt này lớn hơn so với sự khác biệt giữa E. hamati với các loài khác họ như C.

parvulus (97,3%/2,7%), Siphodera vinaledwardsii (95,5%/4,5%). Loài T. patialense

có sự tương đồng với loài cùng giống T. haasi (98,3%). Như vậy, có sự khác biệt nhất

định về trình tự của gen 18S rRNA giữa các loài sán khác giống và giữa các loài trong

cùng 1 giống.

Đối với gen 28S rRNA ở Bảng 3.11, giữa 4 loài sán lá ký sinh ở cá chẽm đã có

sự khác biệt khá lớn, sự khác biệt này nằm trong khoảng 25,6% đến 40,8%, do các

loài này đều nằm trong các họ khác nhau. So sánh với gen 18S rRNA cho thấy, gen

28S rDAN thể hiện sự đa dạng lớn hơn.

Mặt khác, khi so sánh trình tự của gen 28S rRNA của 4 loài sán lá ký sinh ở cá

chẽm với các loài sán khác từ GenBank cho thấy loài Transversotrema patialense có

sự khác biệt với các loài cùng giống dao động từ 4% (T. haasi) -16.6% (T. tragorum).

Riêng loài sán P. celebesensis có sự khác biệt 1,3 %, 2,8 % khi so sánh với loài cùng

họ là Caecincola parvulus và S. vinaledwardsii ở gen 18S, nhưng lại khác nhau tới 9

% và 10,3 % khi phân tích gen 28S rRNA, điều này chứng tỏ đây là 2 loài khác nhau

và nên phân tích cùng lúc nhiều đoạn gen sẽ giúp cho công tác định danh KST chính

xác hơn. Kết quả phân tích gen 18S và 28S rRNA cho thấy dữ liệu di truyền có thể

kiểm chứng lại kết quả định danh KST bằng phương pháp hình thái.

17Bảng 3.9. Sự tương đồng (phía dưới đường bên) và khác biệt (phía trên đường bên) về trình tự 18S rRNA

Trình tự 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1

0.024 0.013 0.114 0.101 0.105 0.027 0.151 0.166 0.112 0.117 1 Caecincola parvulus AY222123 ID

Siphodera vinaledwardsii AY222122 0.976 ID 2 0.028 0.113 0.110 0.116 0.045 0.157 0.169 0.117 0.122

Pseudometadena celebesensis 0.987 0.972 0.117 0.103 0.108 0.020 0.151 0.166 0.114 0.120 ID 3

Peracreadium idoneum AJ287558 0.886 0.887 0.883 ID 4 0.057 0.062 0.120 0.185 0.196 0.148 0.145

0.025 0.108 0.181 0.197 0.146 0.143 0.899 0.890 0.897 0.943 5 Helicometra boseli KU320587 ID

0.895 0.884 0.892 0.938 0.975 0.113 0.176 0.194 0.145 0.143 6 Helicometra fasciata ID

Erilepturus hamati 0.145 0.156 0.116 0.123 ID 7 0.973 0.955 0.980 0.880 0.892 0.887

Lecithochirium caesionis AJ287528 0.849 0.843 0.849 0.815 0.819 0.824 0.855 0.102 0.177 0.175 ID 8

Plerurus digitatus AJ287562 0.834 0.831 0.834 0.804 0.803 0.806 0.844 0.898 0.195 0.194 ID 9

0.888 0.883 0.886 0.852 0.854 0.855 0.884 0.823 0.805 0.017 10 Transversotrema patialense ID

0.883 0.878 0.880 0.855 0.857 0.857 0.877 0.825 0.806 0.983 11 Transversotrema haasi AJ287583 ID

Loài Helicometra fasciata ký sinh ở cá chẽm khác biệt với các loài cùng giống

lần lượt là 4,3% (H. manteri) và 8,8% (H. boseli), với loài cùng giống Bucephalus, lần

lượt là 27,3 và 25,8%. Loài Erilepturus hamati khác biệt với loài cùng họ là

Lecithochirium caesionis là 16,4 %. Sự khác biệt giữa các giống thấp nhất là 16,2%

(giữa Ertlepturus hamati và Lecithochirium spp.), cao nhất là 43,2% (giữa

Lecithochirium và Transversotrema spp.). Tương tự như gen 18S rRNA, tỷ lệ này cho

thấy sự khác biệt trình tự gen của các loài sán dao động giữa các giống, họ và giữa các

loài trong cùng 1 giống (Bảng 3.11)

Khi dùng vùng ITS1 rRNA để so sánh sự khác biệt di truyền của các loài sán

song chủ ký sinh ở cá chẽm, kết quả phân tích thể hiện ở Bảng 3.10

18Bảng 3.10. Sự khác biệt về trình tự vùng ITS1 rRNA của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm và trên GenBank

P. celebesensis H. fasciata

Loài P. celebesensis H. fasciata H. fasciataGB E. hamati 1,000 0,379 0,379 0,379 1,000 1,000 0,342 H. fasciataGB 1,000 0,342 E. hamati 1,000

Kết quả ở Bảng 3.11 đã thể hiện, với gen ITS1 rRNA, sự khác biệt trình tự giữa

các loài sán là rất lớn, dao động từ 62,1% đến 65,8%. Đa số các trình tự gen chỉ có sự

tương đồng ở phần gen 18S rRNA và 28S rRNA, còn lại đoạn gen ITS1 đã thể hiện sự

sai khác, đa dạng rất lớn.

19Bảng 3.11. Sự tương đồng (phía dưới đường bên) và khác biệt (phía trên đường bên) về trình tự 28S rRNA

Trình tự

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

1

0.043 0.089 0.121 0.123 0.272

0.26

0.232 0.253 0.239 0.239 0.354 0.345 0.362

0.36

0.364 0.329 0.357 0.346 0.345 0.348

ID

0.957

0.077

0.11

0.107 0.254 0.246 0.223 0.244 0.233 0.232 0.351 0.347 0.358 0.358 0.359 0.332 0.359 0.346 0.342 0.348

ID

0.911

0.923

0.109 0.107 0.253 0.236

0.22

0.242 0.231 0.233

0.35

0.347 0.353 0.356 0.356 0.321 0.345

0.34

0.335 0.341

ID

0.879

0.89

0.891

0.03

0.252 0.238 0.217 0.234 0.228 0.228 0.352 0.346 0.358 0.354

0.36

0.332 0.349 0.342 0.338 0.342

ID

0.877

0.893 0.893

0.97

0.251 0.232 0.217 0.235 0.228 0.227 0.348 0.344 0.352 0.356 0.354

0.33

0.349 0.341 0.337 0.342

ID

0.728

0.746 0.747 0.748 0.749

0.088 0.255 0.266 0.276 0.264 0.355

0.35

0.359 0.373 0.356 0.339 0.357 0.343

0.34

0.343

ID

0.74

0.754 0.764 0.762 0.768 0.912

0.241 0.245

0.26

0.244 0.354 0.348 0.352 0.361 0.349 0.333 0.358

0.34

0.338 0.341

ID

0.768

0.777

0.78

0.783 0.783 0.745 0.759

0.075

0.09

0.074 0.338 0.336 0.345 0.344 0.349 0.353 0.374 0.363 0.365

0.37

ID

0.747

0.756 0.758 0.766 0.765 0.734 0.755 0.925

0.103 0.074 0.336 0.341

0.35

0.351 0.351 0.361 0.383 0.367 0.369 0.375

ID

0.761

0.767 0.769 0.772 0.772 0.724

0.74

0.91

0.897

0.087 0.346 0.343 0.359 0.356 0.359 0.355

0.37

0.367 0.367 0.368

ID

0.761

0.768 0.767 0.772 0.773 0.736 0.756 0.926 0.926 0.913

0.342 0.343 0.354 0.341 0.353 0.366 0.384

0.37

0.371 0.375

ID

0.646

0.649

0.65

0.648 0.652 0.645 0.646 0.662 0.664 0.654 0.658

0.04

0.128 0.166

0.14

0.408 0.424 0.425 0.431 0.432

ID

0.655

0.653 0.653 0.654 0.656

0.65

0.652 0.664 0.659 0.657 0.657

0.96

0.149

0.16

0.152 0.407 0.421 0.419 0.424 0.424

ID

0.638

0.642 0.647 0.642 0.648 0.641 0.648 0.655

0.65

0.641 0.646 0.872 0.851

0.121 0.032 0.423 0.432 0.425 0.431 0.432

ID

Helicometra fasciata Helicometra manteri KJ701238 Helicometra boseli KU320600 Peracreadium idoneum AY222209 Macvicaria crassigula KJ701237 Bucephalus margaritae KT273395 Bucephalus polymorphus AY289248 Caecincola parvulus AY222231 Siphodera vinaledwardsii AY222230 Pseudometadena celebesensis Adlardia novaecaledoniae FJ788496 Transversotrema patialense Transversotrema haasi AY22218 Transversotrema witenbergi KX186743

0.64

0.642 0.644 0.646 0.644 0.627 0.639 0.656 0.649 0.644 0.659 0.834

0.84

0.879

0.116 0.425 0.435 0.431 0.431 0.432

ID

0.636

0.641 0.644

0.64

0.646 0.644 0.651 0.651 0.649 0.641 0.647

0.86

0.848 0.968 0.884

0.422 0.431 0.433 0.437 0.438

ID

Transversotrema tragorum KX186742 Transversotrema licinum KX186736

0.671

0.668 0.679 0.668

0.67

0.661 0.667 0.647 0.639 0.645 0.634 0.592 0.593 0.577 0.575 0.578

0.13

0.164 0.164 0.173

ID

0.643

0.641 0.655 0.651 0.651 0.643 0.642 0.626 0.617

0.63

0.616 0.576 0.579 0.568 0.565 0.569

0.87

0.202 0.199 0.206

ID

0.654

0.66

0.658 0.659 0.657

0.66

0.637 0.633 0.633

0.63

0.575 0.581 0.575 0.569 0.567 0.836 0.798

0.048 0.058

ID

0.655

0.658 0.665 0.662 0.663

0.66

0.662 0.635 0.631 0.633 0.629 0.569 0.576 0.569 0.569 0.563 0.836 0.801 0.952

0.038

ID

0.652

0.652 0.659 0.658 0.658 0.657 0.659

0.63

0.625 0.632 0.625 0.568 0.576 0.568 0.568 0.562 0.827 0.794 0.942 0.962

ID

Erilepturus hamati Plerurus digitatus AY222201 Lecithochirium caesionis AY222200 Lecithochirium floridense KU527429 Lecithochirium microstomum KC985235

3.3.3. Xây dựng cây phát sinh loài với sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm nuôi ở

Khánh Hòa

3.3.3.1. Cây phát sinh loài dựa theo chuỗi gen 18S rRNA

Sau khi so sánh và dóng hàng trình tự, 935 bp được sử dụng cho việc phân tích

mối quan hệ tiến hóa. Kết quả phân tích đối với dữ liệu trình tự gen 18S rRNA dựa

theo phương pháp Neighbor Joining (NJ) của Felsenstein (1981) được trình bày ở hình

3.10 với giá trị bootstrap (BT) được thể hiện trên các nhánh.

23Hình 3.10. Cây phát sinh loài dựa trên gen 18S rRNA của các loài SLSC ký sinh trên cá chẽm.

(Loài Ediplozoon nipponucun được sử dụng làm nhóm ngoại - outgroup. Loài có kí

hiệu GB được lấy từ GenBank.)

Qua Hình 3.10 cho thấy các loài SLSC ký sinh trên cá chẽm phân thành 1 nhóm

với giá trị BT và giá trị tin cậy tương đối cao (NJ 100%,). Bốn nhóm phụ được phát

hiện bao gồm Nhóm 1 gồm loài P. celebesensis có quan hệ gần gũi với loài

Caecincola parvulus, Siphodera vinaledwardsii (thuộc họ Cryptogonimidae) trên

GenBank và Erilepturus hamati; Nhóm 2 gồm loài Helicometra fasciata từ nghiên

cứu này được sắp xếp cùng nhánh với loài Helicometra boseli và nhóm này có quan

hệ gần gũi với Peracreadium idoneum, 3 loài này đều thuộc họ Opecoelidae; Nhóm 3

gồm loài Lecithirium caecionis thuộc giống Lecithochirium và loài Plerurus digitatus

(thuộc họ Hemiuridae); Nhóm 4 bao gồm 2 loài thuộc giống Transversotrema (họ

Transversotrematidae) là loài Transversotrema patialense và loài Transversotrema

haasii từ GenBank. Kết quả này cũng cho thấy kết quả phân loại dựa trên đặc điểm

hình thái là chính xác, các loài đều được sắp xếp với các loài cùng giống hoặc các

giống cùng một họ. Tuy nhiên, loài Erilepturus hammati thuộc họ Hemiurida (Nhóm

3) lại được xếp với các loài thuộc họ Cryptogonimidae (Nhóm 1).

Bray et al. (2016) đã xây dựng cây phát sinh loài đối với các loài thuộc họ

Opecoelidae dựa vào trình tự gen 18S cho thấy có sự không phù hợp về mặt hình thái và

di truyền, ví dụ liên họ Plariopoginae là không đồng nhất. Nhóm tác giả đã đề xuất liên

họ Heliometinae bao gồm: giống Helicometra, Helicometrina và giống Neohelicometra.

Tác giả cũng chỉ rõ sự phân tách của các nhóm thuộc giống khác nhau và trong đó các

loài thuộc giống Helicometra đều có đặc điểm chung (trứng có lông tơ và đặc điểm của

tử cung) để nằm trên cùng 1 nhánh của cây phát sinh loài.

Blair et al. (1998) nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh loài của các loài SLSC

(Digenea) thuộc trên họ (superfamily) Hemiuroidea dựa vào đặc điểm hình thái và di

truyền, cây phát sinh loài dựa trên gen 18S của các loài SLSC này cho thấy sự ít phù

hợp về đặc điểm hình thái và di truyền (do thiếu các đặc điểm hình thái), các loài khác

giống nằm trên các nhánh khác nhau, loài thuộc giống Erilepturus có quan hệ gần gũi

với các loài thuộc giống Lecithochirium trên cây phát sinh loài. Kết quả của Bray et al.

(1998) đã chứng tỏ sự tương tự với kết quả trong nghiên cứu hiện tại về loài

Lecithochirium caesionis trên GenBank với E. hamati trên cây phát sinh loài.

3.3.3.2. Cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA

Sau khi so sánh và dóng hàng trình tự, 1.325 bp được sử dụng cho việc phân tích

mối quan hệ tiến hóa. Kết quả phân tích đối với dữ liệu trình tự gen 28S rRNA dựa

trên phương pháp Neighbor Joining (NJ) với giá trị Bootstrap (BT) được thể hiện trên

các nhánh (Hình 3.11)

Kết quả ở Hình 3.11 đã thể hiện cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA chia

thành 2 nhánh chính. Nhánh 1 lại được chia thành 4 nhóm phụ. Nhóm 1.1 gồm loài

Helicometra fasciata từ nghiên cứu hiện tại, thể hiện sự tương đồng cao với loài cùng

giống từ GenBank, được sắp xếp cùng với 2 loài thuộc họ Opecoelidae (Peracreadium

idoneum và Macvicaria crassigula). Tiếp đó là nhóm 1.2 với các loài thuộc giống

Bucephalus spp. (Họ Bucephalidae). Nhóm 1.3 là loài P. celebesensis sắp xếp với các

loài cùng họ Cryptogonimidae. Cuối cùng là nhóm 1.4 phân tách khỏi 3 nhóm gồm

các loài thuộc giống Transversotrema. Nhánh 2 bao gồm loài E. hamati nằm cùng

nhánh với loài Plerurus digatatus và nhánh này có quan hệ gần gũi với các loài thuộc

giống Lecithochinium, các loài này đều thuộc họ Hemiuridae.

24Hình 3.11 Cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA của các loài SLSC ký sinh trên cá chẽm.

(Dendritobilharzia pulverulenta được sử dụng làm nhóm ngoại –outgroup; Loài có kí

hiệu GB được lấy từ GenBank).

Dựa vào cây phát sinh loài xây dựng của trên trình tự gen 28S đã thể hiện các loài

có quan hệ gần gũi với nhau và phù hợp về đặc điểm hình thái và di truyền. Các loài

thuộc cùng 1 giống đều nằm trên 1 nhánh chung và có sự sắp xếp hợp lý với các loài

cùng một họ. Đặc biệt, đối với gen 28S rRNA, loài E. hamati được sắp xếp cùng với các

loài cùng họ Hemiuridae, trong khi ở cây phát sinh loài dựa trên gen 18S rRNA, chúng

lại được sắp xếp với các loài thuộc họ Cryptogonimidae.

Các loài thuộc họ Transversotrematidae là nhóm SLSC ký sinh tại các vị trí đặc

biệt trên vật chủ (mang hoặc vảy), nên có cấu trúc cơ thể khác với các loài SLSC khác.

Trên cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA, các loài thuộc giống Transversotrema

có quan hệ gần gũi với nhau và nằm trên cùng một nhánh riêng biệt (Nhóm 1.3). Kết

quả này phù hợp với thông báo của Cribb et al. (2013) khi khảo sát mối quan hệ tiến hóa

của các loài thuộc giống Transversotrema ký sinh ở một số loài cá hồng dựa vào trình tự

gen ITS2. Cutmore et al. (2016) cũng cho thấy mối quan hệ gần gũi của các loài thuộc

giống Transversotrema đối với trình tự gen 28S và ITS2 khi xây dựng cây phát sinh

loài.

Vùng ITS1 rRNA cho thấy sự đa dạng di truyền quá lớn nên không thể sử dụng

để phân tích mối quan hệ phát sinh loài nhưng có thể sử dụng để định danh và phân

biệt các loài cùng giống, đặc biệt là với đoạn mồi được thiết kế rất hữu hiệu để định

danh các loài Erilepturus hamati và Pseudometadema celebesensis.

Các công trình nghiên cứu về khu hệ ký sinh trùng ký sinh ở cá chẽm còn nhiều

hạn chế, đặc biệt các nghiên cứu về di truyền học. Một số loài được phát hiện ký sinh

ở cá chẽm chưa có trình tự trên GenBank để so sánh, như loài Erilepturus hamati, và

Pseudometadema celebesensis. Tuy nhiên, phân tích cây phát sinh loài dựa vào gen

18S rRNA và 28S rRNA đã thể hiện sự gần gũi của các loài SLSC này với các giống

Lecithochirium và Caesincola trên GenBank.

Những phân tích và thảo luận ở trên đã chứng minh rằng cả 2 cây phân loại đều

chứng tỏ, trong nghiên cứu này có sự phù hợp giữa hệ thống phân loại dựa vào phương

pháp hình thái học và di truyền học.

3.4. Xác định mức độ nhiễm sán lá song chủ trên chẽm nuôi ở Khánh Hòa

3.4.1. Mức độ nhiễm sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi theo năm nghiên cứu

Như đã giới thiệu ở chương II, từ năm 2010 đến năm 2013, đã có 1.080 con cá

chẽm được đưa vào kiểm tra để phát hiện thành phần giống loài sán lá song chủ

(Digenea) ký sinh ở cá chẽm. Mức độ nhiễm SLSC qua các năm nghiên cứu được thể

hiện ở các Bảng 3.12, 3.13.

20Bảng 3.12. Tỷ lệ nhiễm (%) của các loài sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa theo các năm nghiên cứu

Loài sán Năm T.patialense H.hamati P.celebesensis B.varicus

2010 (n=262) 12,98 41,60 38,93 2,67

2011 (n=325) 15,08 55,38 32,00 0,92

2012 (n=245) 18,78 57,14 49,39 5,31

2013 (n=248) 14,11 48,98 45,71 5,31

21Bảng 3.13. Cường độ nhiễm trung bình (trùng/cá) của các loài sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa theo các năm nghiên cứu

Loài sán (trùng/cá) Năm T.patialense H.hamati P.celebesensis B.varicus

2010 2.29 ± 4.60 3.89 ± 2.83 18.22 ± 26.66 1.29 ± 0.49

(n=262) (1 – 28) (1 – 15) (1 – 132) (1 – 2)

2011 1.98 ± 1.18 4.96 ± 5.30 23.84 ± 32.37 1.00 ± 0,00

(n=325) (1 – 6) (1 – 32) (1 – 186) (1 – 1)

2012 1.83 ± 0.97 4.56 ± 4.10 12.53 ± 10.79 1.38 ± 0.65

(n=245) (1 – 4) (1 – 26) (1 – 55) (1 – 3)

2013 1.43 ± 0.61 5.75 ± 6.72 12.35 ± 11.07 1.38 ± 0.65

(n=248) (1 – 3) (1 – 37) (1 – 50) (1 – 3)

(Ghi chú: trong ngoặc đơn là giá trị cảm nhiễm nhỏ nhất và lớn nhất)

Qua 4 năm nghiên cứu (từ 2010- 2013), mỗi năm đều bắt gặp cả 4 loài SLSC ký

sinh ở cá chẽm với TLCN % và CĐCN (trùng/cá) khác nhau tùy loài nhưng không có

sự biến động lớn giữa các năm. Trong 4 loài ký sinh trùng này có 3 loài (H. hamati, P.

celebesensis và B. margaritae) luôn là những ký sinh trùng nội ký sinh trong đường

tiêu hóa của cá (dạ dày và ruột), 1 loài (T. patialense) ngoại ký sinh ở dưới các gốc

vẩy của cá. Qua các năm nghiên cứu, tỷ lệ % và cường độ cảm nhiễm của các loài sán

lá song chủ ở cá chẽm biến động không lớn, thể hiện trong Bảng 3.12 và 3.13.

Có 2 loài SLSC luôn bắt gặp cảm nhiễm ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa với

TLCN % cao ở tất cả các năm nghiên cứu, đó là loài H. hamati dao động từ 41,60% -

57,14% và loài P. celebensensis dao động 32,00% - 49,39%. Các loài còn lại có mức

độ nhiễm không cao, như T. patialense có tỷ lệ nhiễm ở cá chẽm qua các năm dao

động từ 12,98 % - 18,78% và loài sán B. margaritae có tỷ lệ nhiễm thấp ở tất cả các

năm, dao động từ 0,92% - 5,31%.

Kết quả ở Bảng 3.13 cũng thể hiện không có biến động lớn về cường độ cảm

nhiễm trung bình của 4 loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm qua các năm nghiên

cứu. Trong đó loài sán P. celebensensis có cường độ nhiễm ở cá chẽm cao nhất, nhiễm

trung bình ở mỗi năm dao động từ 12,35- 23,84 con sán/cá, có những mẫu cá chẽm đã

nhiễm loài sán này tới 132 – 186 con sán/cá. Những loài sán còn lại bao gồm H.

hamati, T. patialense và B. margaritae đều nhiễm ở cá chẽm với cường độ trung bình

thấp qua các năm, lần lượt là 3,89 - 5,75 con sán/cá; 1,43- 2,29 con sán/cá và 1,00 -

1,38 con sán/cá.

Như vậy, kết quả nghiên cứu này chứng tỏ rằng, ngoại trừ loài sán P.

celebensensis đã cảm nhiễm ở ruột cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa với tỷ lệ và cường độ

cảm nhiễm khá cao, có thể gây ra những tác hại nhất định, ảnh hưởng tới sinh trưởng

và chất lượng thịt cá chẽm nuôi, còn các loài sán khác đều cảm nhiễm với cường độ

thấp (1 vài con sán/cá) sẽ ảnh hưởng không đáng kể tới sức khỏe của cá. Tuy vậy, khi

những KST này cảm nhiễm ở da hay ở thành ruột, thành dạ dày có thể gây ra các

thương tổn, phá vỡ rào chắn ngoại biên của cá, tạo điều kiện cho việc xâm nhập của

các loại tác nhân gây bệnh khác như: vi khuẩn, virus hoặc nấm.

Việc không có khác biệt lớn về thành phần loài SLSC và mức độ nhiễm (tỷ lệ

cảm nhiễm (%) và cường độ cảm nhiễm trung bình (trùng/cá)) của các loài SLSC ký

sinh ở cá chẽm qua 4 năm nghiên cứu (từ 2010-2013) được lý giải bằng một thực tế,

trong các năm này kỹ thuật nuôi cá chẽm ở Việt Nam chưa được cải thiện nhiều, thức

ăn tươi như các loài cá tạp (cá đối, cá nục, cá liệt, cá hố…) vẫn là nguồn thức ăn chủ

yếu dùng để nuôi cá chẽm thương phẩm. Do vậy, cơ hội xâm nhập của các ấu trùng

sán (metacercaria) vào cơ thể cá chẽm qua con đường thức ăn là cá tạp vẫn tồn tại qua

các năm nghiên cứu. Những tác động tiêu cực tới môi trường và sức khỏe của cá khi

dùng nguồn cá tạp làm thức ăn để nuôi cá biển thương phẩm đã từng được cảnh báo

bởi nhiều nhà khoa học khác nhau (Hà Ký & Bùi Quang Tề, 2007; Đỗ Thị Hòa và

cộng sự, 2004, 2008; Võ Thế Dũng, 2010; Leong & Wong, 1990, 1991; Ruanpan,

1988 và Valesquez, 1975).

3.4.2. Mức độ nhiễm sán lá song chủ (Digenea) ở cá chẽm nuôi trong ao đất và

trong lồng trên biển

Như đã được trình bày ở chương I, cá chẽm (Lates calcarifer) ở Việt Nam

thường được nuôi thương phẩm bằng 2 hình thức: nuôi lồng trên biển và nuôi trong

các ao đất ven biển. Do vậy, trong 3 năm đầu (từ 2010- 2012), mẫu cá chẽm dùng cho

nghiên cứu này đã được thu từ cả 2 loại hình nuôi trên, trong đó có 205 mẫu cá thu từ

các lồng nuôi và 875 mẫu cá thu từ các ao nuôi. Mức độ nhiễm sán lá song chủ ở 2

nhóm mẫu cá này đã được tổng hợp và thể hiện ở 2 Bảng: 3.14, 3.15.

Năm

H.thức nuôi T. patialense

E. hamati

P. celebesensis B. margaritae

Ao (n=173)

17,92

50,29

46,82

3,47

2010

Lồng (n=89)

2,25

24,72

23,60

1,12

Ao (n=264)

18,56

59,85

37,12

1,14

2011

Lồng (n=61)

0,00

36,07

9,84

0,00

Ao (n=190)

22,63

67,89

58,42

6,32

2012

Lồng (n=58)

6,90

22,41

18,97

1,72

19,70±0,03a1 59,37±0,09b1

47,43±0,17b1

3,63±0,03a1

TLCNTB (%)

(2010-2012)

Lồng

3,03±0,04a2

27,73±0,07b2

17,47±0,07b2

0,93±0,01a1

22Bảng 3.14. Tỷ lệ nhiễm (%) sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi ao và lồng qua từng năm nghiên cứu

(Ghi chú: các số liệu cùng hàng có ký tự mũ khác nhau, các số liệu cùng cột có số mũ

khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê).

Kết quả ở Bảng 3.14 đã thể hiện, cá chẽm nuôi ao ven biển hoặc nuôi lồng trên

biển đều bị nhiễm cả 4 loài sán lá song chủ: T. patialense, E. hamati, P. celebesensis

và B. margaritae, tuy nhiên tỷ lệ nhiễm (%) trung bình của từng loài sán ở cá nuôi ao

và cá nuôi lồng có sự khác nhau và sự khác nhau này được lặp lại ở cả 3 năm nghiên

cứu, trong đó có 3 loài SLSC có tỷ lệ % nhiễm trung bình khác nhau có ý nghĩa thống

kê (p<0,05), chỉ có loài B. margaritae có tỷ lệ nhiễm khác nhau giữa nuôi ao và lồng

nhưng không có ý nghĩa thống kê qua các năm nghiên cứu (p>0,05). Loài sán E.

hamati có tỷ lệ nhiễm (%) ở cá nuôi ao trong các năm 2010, 2011 và 2012 lần lượt là:

50,29%, 59,85% và 67,89%, trong khi đó cá nuôi lồng bị nhiễm loài sán này với tỷ lệ

thấp hơn, lần lượt qua các năm nghiên cứu là: 24,72%, 36,07% và 22,41%. Loài sán T.

patialense ký sinh ở da của cá chẽm có tỷ lệ nhiễm (%) ở cá nuôi ao cao gấp 9 lần cá

nuôi lồng (năm 2010), gấp 3 lần (năm 2012) và hoàn toàn không gặp cảm nhiễm ở cá

nuôi lồng vào năm 2011. Với loài sán P. celebesensis ký sinh ở ruột của cá chẽm cũng

có các kết quả tương tự, tỷ lệ nhiễm (%) của loài sán này ở cá chẽm nuôi trong ao đất

cao xấp xỉ gấp 4 lần (năm 2011) và 3 lần (2012) so với cá nuôi ở lồng trên biển.

Khi so sánh về cường độ nhiễm trung bình (sán/cá) của SLSC ký sinh ở cá chẽm

nuôi trong ao đất và nuôi lồng trên biển cũng có sai khác, cá nuôi ao luôn có cường độ

nhiễm trung bình cao hơn cá nuôi lồng qua các năm nghiên cứu, nhưng sự sai khác này

không có ý nghĩa (p>0,05), hiện tượng này gặp ở hầu hết các loài SLSC tìm thấy ký

sinh ở cá chẽm, trừ loài Erilepturus hamati ký sinh ở dạ dày của cá có cường độ nhiễm

ở cá nuôi ao cao hơn có ý nghĩa (p<0,05) so với cá nuôi lồng (Bảng 3.15)

Năm

H.thức nuôi T. patialense

Ao (n=173)

2,32±4,81 (1 – 28)

1,33±0,52 (1 – 2)

2010

Lồng (n=89)

1,00

Ao (n=264)

1,00

1,98±1,18 (1 – 6)

2011

Lồng (n=61)

0,00

Ao (n=190)

1,42±0,67 (1 – 3)

2012

Lồng (n=58)

1,00

1,84±1,00 (1 – 4) 1,50±0,58 (1 – 2) 2,04±0,24a1

E. hamati 4,26±2,96 (1- 15) 2,41±1,53 (1 – 7) 5,37±5,51 (1 -32) 1,95±1,17 (1 – 4) 4,70±4,22 (1 – 26) 2,69±1,65 (1 – 6) 4,71±0,65a1

P. celebesensis B. margaritae 21,69±28,89 (1 – 132) 4,81±3,64 (1 – 17) 25,06±32,95 (1 – 186) 3,83±3,43 (1 – 10) 12,95±11,11 (1 – 55) 7,73±3,85 (4 – 17) 16,42±7,52b1

1,25±0,22a1

5,46±2,03b1

2,35±0,37a2

0,83±0,76a1

0,67±0,58a1

Lồng

CĐCNTB (trùng/cá) (2010-2012) (Ghi chú: các số liệu cùng hàng có ký tự mũ khác nhau, các số liệu cùng cột có số mũ

23Bảng 3.15. Cường độ cảm nhiễm trung bình (trùng/cá) của SLSC ở cá chẽm nuôi ao và nuôi lồng tại Khánh Hòa qua từng năm nghiên cứu

khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê).

Sự khác nhau về tỷ lệ nhiễm (%) và cường độ nhiễm (trùng/cá) các loài sán lá

song chủ ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi trong ao đất và nuôi ở lồng trên

biển được cho rằng có liên quan tới đặc điểm của 2 hình thức nuôi này. Dù ở cả 2 hình

thức nuôi, cá tạp vẫn là nguồn thức ăn chủ yếu nên nguy cơ nhiễm các loài sán lá song

chủ ở cá nuôi lồng hay nuôi ao là như nhau, nhưng cá nuôi lồng được đặt trên biển

hoặc trên các vịnh, cách đáy biển 2 – 3 m, có dòng chảy dưới 1 m/s, chất lượng nước

trong lồng luôn được thay đổi nhờ dòng chảy này và phân của cá nuôi lồng thải ra có

thể chứa trứng của sán được dòng chảy đưa đi nơi khác xa lồng nuôi, do đó cơ hội để

cho các loài sán này khép kín vòng đời ở ngay vị trí đặt lồng và gia tăng mức độ nhiễm

sán của cá nuôi lồng là không cao. Do vậy, dù đã bị nhiễm đủ các loài sán lá song chủ

tương tự như cá nuôi ao, nhưng tỷ lệ và cường độ nhiễm ở cá nuôi lồng lại thấp hơn.

Trong khi đó, cá nuôi ở ao với chu kỳ kéo dài cả năm, nước trong ao chỉ được

thay khi cần thiết, độ sâu ở các ao này chỉ dao động 1,5 - 2,0 m, ao nuôi thường đặt ở

vùng triều có biên độ dao động thủy triều lớn nên sự tích lũy bùn đáy ao, thức ăn dư

thừa và phân của cá nuôi chứa trứng sán thải ra nằm lại ở đáy ao đã tạo điều kiện để

động vật thân mềm như các loài ốc, động vật 2 vỏ là ký chủ trung gian của các loài sán

lá song chủ phát triển. Ngoài ra, trong ao nuôi cá chẽm còn có các loài cá tạp khác vào

ao theo nguồn nước biển, cùng sinh sống. Do vậy, với những KST có vòng đời phức

tạp và cần qua nhiều vật chủ trung gian như sán lá song chủ (Digenea), môi trường

chưa hẳn đã là yếu tố ảnh hưởng nhiều đến mức độ nhiễm của KST này ở cá, mà yếu

tố quan trọng là sự tồn tại của các vật chủ trung gian (thứ nhất và thứ hai) mang ấu

trùng sán lá trong môi trường sinh sống của cá, tạo cơ hội để các loài sán lá song chủ

gia tăng mức độ nhiễm ở cá chẽm.

Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Võ Thế Dũng (2010) khi nghiên

cứu về ký sinh trùng ký sinh ở cá mú –Epinephelus spp. Theo tác giả này, cá nuôi ao

thường bị nhiễm KST với mức độ nhiễm cao hơn cá nuôi lồng trên biển, do môi

trường ao nuôi thường không được trong sạch như môi trường ngoài biển, mật độ cá

nuôi trong ao cao hơn nuôi cá ở lồng nên khả năng lây lan giữa các cá thể cá trong ao

cao hơn. Bên cạnh đó nhiều ao nuôi cá biển nằm ở vùng triều là nơi có nhiều loại vật

chủ trung gian của giun sán như động vật thân mềm, giáp xác cư trú và cá tạp mà

người dân sử dụng làm thức ăn cũng là một nguồn lây nhiễm.

3.4.3. Mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi thương phẩm ở các kích cỡ

khác nhau của cá

Đã có 1.080 con cá chẽm có kích cỡ khác nhau được đưa vào nghiên cứu SLSC

ký sinh trong 3 năm, từ 2011 đến 2013. Dựa vào khối lượng, các mẫu cá này được chia

thành 4 nhóm khác nhau, số lượng cá và khối lượng của từng nhóm như sau: nhóm 1:

<50g (578 con cá), nhóm 2: 50 – 100g (144 con cá), nhóm 3: >100 – 200g (174 con

cá) và nhóm 4: >200g (142 con cá). Mức độ nhiễm của SLSC ở các nhóm cỡ cá được

thể hiện qua Bảng 3.16.

Số liệu ở Bảng 3.16 đã thể hiện, cả 4 loài SLSC là T. patialense, E. hamati, P.

celebesensis và B. margaritae đều được phát hiện ký sinh ở 4 nhóm cá chẽm có kích

cỡ khác nhau, cá có kích thước từ < 50g đến > 200g đều bị nhiễm các loài sán lá song

chủ này. Tuy nhiên, tỷ lệ cảm cảm nhiễm (%) và cường độ cảm nhiễm (trùng/cá) có

khác nhau tùy từng loài KST và từng nhóm cỡ cá, cụ thể cá có khối lượng càng lớn thì

mức độ nhiễm SLSC càng cao, nhóm cá > 200g có mức độ nhiễm cao nhất và loài P.

celebesensis có tỷ lệ và cường độ cảm nhiễm cao nhất lần lượt là 81,67% và

27,69±25,09 trùng/cá, tiếp theo là loài E. hamati với 78,17% và 8,24±6,53 trùng/cá.

Ngược lại, nhóm cá có khối lượng nhỏ nhất (<50g) bị nhiễm sán lá song chủ với mức

độ nhiễm thấp nhất và loài có mức độ nhiễm thấp nhất là B. margaritae (Tỷ lệ cảm

nhiễm 2,94% và cường độ cảm nhiễm 1,24±0,66 trùng/cá). Như vậy, trong phạm vi

nghiên cứu này, ở cá chẽm có kích cỡ từ < 50g đến > 200g, cá có khối lượng càng lớn

thì bị nhiễm SLSC với mức độ nhiễm càng cao và ngược lại.

24Bảng 3.16. Mức độ nhiễm sán lá song chủ trên các kích cỡ cá chẽm khác nhau tại Khánh Hòa

Cỡ cá (g)

< 50g 50 – 100g >100-200 > 200 Loài sán (n=578) (n=144) (n=174) (n=142)

Tỷ lệ cảm nhiễm (%)

T. patialense 12,80 25,29 18,31 7,64

E. hamati 43,77 63,22 78,17 38,19

P. celebesensis 23,70 63,79 81,69 40,28

B. margaritae 2,94 4,06 4,93 2,78

Cường độ cảm nhiễm (trùng/cá)

T. patialense 1,55±0,95 1,36±0,50 1,77±0,86 3,15±5,20

E. hamati 3,12± 2,87 4,49±2,88 4,95±4,88 8,24±6,53

P. celebesensis 6,75±6,40 18,59±28,23 16,14±23,84 27,69±25,09

B. margaritae 1,24±0,66 1,75±0,50 1,38±0,52 1,92±0,49

Hiện tượng này có thể được lý giải như sau: SLSC ký sinh ở cá chẽm đều ở giai

đoạn sán trưởng thành, đa phần đều ký sinh ở ruột cá, điều này có nghĩa cá chẽm là ký

chủ cuối cùng của các loài sán này và ấu trùng sán xâm nhập vào cá chẽm thông qua

quá trình sử dụng thức ăn của cá chẽm. Mặt khác chúng ta cũng được biết rằng, cá tạp

là nguồn thức ăn chính dùng cho cá chẽm nuôi thương phẩm (ở ao hoặc ở lồng) và cá

tạp cũng có thể là ký chủ trung gian thứ II của các loài SLSC. Do vậy, khi cá càng lớn,

lượng thức ăn dùng càng nhiều hơn thì khả năng tích lũy SLSC thông qua con đường

thức ăn ở những loài cá ăn động vật như cá chẽm sẽ cao hơn. Đó là lý do làm cho cá

chẽm có kích thước lớn hơn đã nhiễm sán lá song chủ với mức độ nhiễm (gồm tỷ lệ

nhiễm % và cường độ nhiễm (trùng/cá)) cao hơn so với cá có kích thước nhỏ.

3.5. Khảo sát sự phát triển các giai đoạn ấu trùng của loài sán Pseudometadena

celebesensis ký sinh ở cá chẽm

Như đã phân tích ở mục 3.1.3 về tính đặc hữu của sán lá song chủ ký sinh ở cá

chẽm, loài sán Pseudometadena celebesensis đã được xem là loài ký sinh đặc hữu trên

cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi ở vùng biển Khánh Hòa, Việt Nam. Ngoài ra, kết quả

ghi trong các mục 3.1.1, 3.2.1 và 3.2.2. cũng đã thể hiện loài sán P. celebesensis luôn

được bắt gặp ký sinh ở ruột cá chẽm với tỷ lệ (%) và cường độ cảm nhiễm (trùng/cá)

cao hơn các loài sán lá song chủ khác, có nguy cơ ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe

của cá chẽm nuôi. Do vậy, khảo sát về sự phát triển các giai đoạn ấu trùng, các ký chủ

trung gian cần có trong vòng đời của loài sán này là cần thiết, làm cơ sở cho các đề

nghị cải tiến kỹ thuật nuôi, nhằm giảm thiểu mức độ nhiễm của loài sán lá song chủ

này ở cá chẽm nuôi.

Theo các tài liệu đã công bố, sán lá song chủ (Digenea) thường phát triển qua

nhiều giai đoạn ấu trùng: ấu trùng có tiêm mao (miracidium), bào ấu (sporocyst và

redia), ấu trùng hình tim (Cercaria) và hậu ấu trùng (metacercaria). Trong chu kỳ phát

triển, sán lá song chủ thường yêu cầu từ 1 hoặc 2 ký chủ trung gian (trong đó đó

KCTG thứ nhất thường là động vật thân mềm và KCTG thứ hai là cá), ký chủ cuối

cùng của SLSC là các động vật có xương sống: cá, động vật trên cạn, trong đó có con

người (Hà Ký và Bùi Quang Tề, 2007; Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004; Williams &

Jones, 1994; Moller & Anders, 1986).

3.5.1. Kiểm tra phát hiện ấu trùng sán lá song chủ ký sinh ở các loài ốc và cá tạp

Để khảo sát các giai đoạn ấu trùng của loài sán lá song chủ Pseudometadena

celebesensis mà giai đoạn trưởng thành ký sinh ở ruột cá chẽm, có 1.255 con ốc thu từ

đáy các ao nuôi cá chẽm và 70 con cá tạp gồm cá đối (Mugil sp.- họ Mugilidae), cá nục

(Decapterus spp. - họ Carangidae), cá liệt (một số giống loài thuộc họ Leiognathidae),

cá hố (Trihiurus sp. - họ Trihiuridae) và cá dìa (Siganus sp. - họ Siganidae) là các loài cá

tạp thường được người nuôi dùng làm thức ăn để nuôi cá chẽm, được đưa vào kiểm

tra. Số lượng, kích cỡ mẫu cá tạp và phương pháp dùng để kiểm tra, phát hiện ấu trùng

sán lá song chủ ở ốc và cá đã được giới thiệu ở chương II của báo cáo này.

3.5.1.1. Phát hiện ấu trùng sporocyst, redia và cercaria của sán lá song chủ trong cơ

thể của ốc thu ở đáy các ao nuôi cá chẽm

Để tìm hiểu các giai đoạn ấu trùng sporocyst, redia và cercaria của loài sán lá

song chủ có giai đoạn trưởng thành ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer), những mẫu

ốc thu ở đáy ao nuôi cá chẽm đã được đưa vào kiểm tra theo phương pháp của

Frandsen và Christensen (1984).

Tuy nhiên, mọi tìm kiếm về các giai đoạn tiền ấu trùng (sporocyst, redia và

cercaria) của sán lá đơn chủ đều không thành công. Trong quá trình kiểm tra, chưa một

lần tìm thấy các giai đoạn tiền ấu trùng của sán lá song chủ cảm nhiễm ở các mẫu ốc

đã đưa về phòng thí nghiệm.

3.5.1.2. Kết quả phát hiện giai đoạn hậu ấu trùng metacercaria ký sinh ở các mẫu

cá tạp đưa vào nghiên cứu.

Bằng phương pháp ép mô và tiêu cơ (Hong et al., 2002; Sohn, 2009 và et al.,

2012), đã phát hiện và thu được ấu trùng metacercaria của sán lá song chủ (Digenea)

ký sinh ở các mẫu cá đối và cá liệt, nhưng không tìm thấy ấu trùng này ở 3 loài cá tạp

còn lại đã đưa vào nghiên cứu, là cá nục, cá giò và cá hố. Khi quan sát dưới kính giải

phẫu và kính hiển vi, các ấu trùng metacercaria ký sinh ở cá đối đều còn sống, ấu trùng

vận động nhẹ nhàng trong các nang sán, còn các ấu trùng tìm thấy ở cá liệt đều đã

chết, có thể do cá liệt sống ở ngoài khơi, ngư dân đánh bắt và bảo quản thời gian lâu

trước khi bán cho các đầu nậu.

Căn cứ vào đặc điểm hình thái cấu tạo, ấu trùng metacercaria của SLSC thu từ cá

đối được chia thành 3 dạng khác nhau và mức độ nhiễm của 3 dạng ấu trùng này ở cá

đối được thể hiện ở Bảng 3.17.

25Bảng 3.17. Mức độ nhiễm giai đoạn hậu ấu trùng metacercaria của sán lá song chủ ở cá đối (n=16)

Loại dạng metacercaria Mức độ cảm Ấu trùng nhiễm Dạng M1 Dạng M2 Dạng M3 metacercaria

Tỷ lệ nhiễm (%) 87,50 62,50 81,25 31,25

Cường độ nhiễm 7,79 ± 4,06 1,90 ± 0,74 6,23 ± 4,15 1,80 ± 0,84 trung bình (3 – 14) (1 – 3) (1 -12) (1 – 3) (metacercaria/cá)

(Chú thích: trong ngoặc là giá trị nhỏ nhất và lớn nhất)

Kết quả ở Bảng 3.17 đã thể hiện rằng, cá đối bị nhiễm ấu trùng metacercaria của

sán lá song chủ với tỷ lệ cảm nhiễm rất cao (87,50%), trong đó dạng metacercaria M2

có TLCN tới 81,25%, dạng M1 là 62,50%, dạng M3 là 31,25%. Hình dạng và cấu tạo

của 3 dạng metacercaria tìm thấy ký sinh ở cá đối thu tại cơ sở đầu nậu bán cá tạp ở

Nha Trang và Cam Ranh được thể hiện ở các Hình 3.12, 3.13 và 3.14. và các Bảng

3.18, 3.19 và 3.20

 Dạng ấu trùng Metacercaria M1 ký sinh ở cá đối

Tỷ lệ nhiễm: 62,50 %

Cường độ nhiễm trung bình: 1,90 metacercaria/cá

Cơ quan ký sinh: Cơ

Đặc điểm hình thái: Ấu trùng nằm trong bào nang hình elip, kích thước 225 ± 5 x

156,5 ± 1,5 μm, thành bào nang là 1 lớp mỏng, sau khi đã phá nang, ấu trùng có dạng

trứng, giác miệng lớn (41 x 53,5 ± 0,5 μm) gấp 2 giác bụng (27,5 ± 0,5 x 32 ± 1), hầu

nhỏ xuất hiện nằm dưới giác miệng, giác bụng nằm ở vị trí lệch sang bên phải của

đường giữa hai nhánh ruột tịt, lỗ sinh dục nằm ở mép phải giác bụng gần túi bài tiết, các

sắc tố màu vàng nâu nằm rải rác xung quanh cơ thể, túi bài tiết hình chữ D lớn ở phía

cuối cơ thể. Ở giai đoạn ấu trùng này, cơ quan sinh dục đực và cái có thể đã xuất hiện

nhưng chưa thành thục, chưa quan sát thấy các sản phẩm sinh dục trong xoang cơ thể

của metacercaria. Dạng metacercaria M1 tìm thấy ở nghiên cứu này đã được mô tả

trong nghiên cứu của Hà Ký và cộng sự (2007); Sohn et al. (2009).

26Bảng 3.18. Một số chỉ tiêu về hình thái của ấu trùng metacercaria M1 ký sinh ở

cá đối thu tại Khánh Hòa

Metacercaria

225 ± 5,0

156,5 ± 1,5

53,5 ± 0,5

27,5 ± 0,5 32 ± 1,0

0,1mm

Giác miệng (μm) Giác bụng (μm) Chiều dài Chiều rộng Loại ấu trùng (μm) (μm) Dài Rộng Dài Rộng

Hình 3.12. Dạng ấu trùng metacercaria M1 ký sinh trên cá đối thu tại

 Khánh Hòa. (1-Giác miệng; 2-Hầu; 3-Giác bụng; 4-Tinh hoàn)

 Dạng ấu trùng metacercaria M2 ký sinh ở cá đối

Tỷ lệ nhiễm: 81,25%

CĐN: 6,25 metacercariae/con cá

Cơ quan ký sinh: Cơ

27Bảng 3.19. Một số chỉ tiêu hình thái của dạng metacercaria M2 ký sinh trên cá

đối thu tại Khánh Hòa

Giác miệng (μm) Giác bụng (μm) Chiều dài Dạng ấu trùng Chiều rộng (μm) (μm) Dài Rộng Dài Rộng

0,1mm

Metacercaria M2 255 187,5 ± 2,5 26 ± 1,0 39 23,5 ± 0,5 32

25Hình 3.13. Dạng ấu trùng metacercaria M2 ký sinh trên cá đối thu tại Khánh Hòa. (1-Giác miệng; 2-Hầu; 3-Giác bụng; 4-Tinh hoàn; 5-Túi bài tiết)

Đặc điểm hình dạng và cấu tạo: Bào nang hình cầu hoặc elip, thành bào nang là

một lớp mỏng và trong suốt, kích thước ấu trùng 255 x 187,5 ± 2,5 μm. Giác bám miệng

có kích thước 26 ± 1,0 x 39 μm nằm phía trước cơ thể, giác bám bụng có kích thước

23,5 ± 0,5 x 32 μm nằm ở giữa cơ thể, dưới đoạn ruột chẻ nhánh. Đã quan sát thấy cơ

quan sinh dục của ấu trùng, có 1 tinh hoàn nhỏ nằm ở bên phải ruột, sắc tố màu vàng

nâu nằm rải rác khắp cơ thể, túi bài tiết hình chữ D phía sau cơ thể. Dạng metacercaria

M2 trong nghiên cứu này có đặc điểm khá giống với một loại ấu trùng metacercaria

được mô tả bởi Hà Ký và cộng sự (2007), Sohn et al. (2009). Các chỉ tiêu hình thái cơ

bản của dạng metacercaria M2 được phát hiện ở cá đối thu tại Nha Trang, Khánh Hòa

được trình bày ở Bảng 3.19 và Hình 3.13.

 Dạng ấu trùng metacercaria M3

Tỷ lệ cảm nhiễm: 31,35 %

Cường độ nhiễm trung bình: 1,81 metacercariae/con cá

Cơ quan ký sinh: Cơ

28Bảng 3.20. Một số chỉ tiêu hình thái của dạng ấu trùng metacercaria M3 ký

sinh trên cá đối thu tại Khánh Hòa

Giác miệng (μm) Giác bụng (μm) Chiều dài Chiều rộng Dạng ấu trùng (μm) (μm) Dài Rộng Dài Rộng

0,1mm

Metacercaria 171,5 ± 3,5 134,5 ± 0,5 35 46,5 ± 0,5 34,5 ± 0,5 44 M3

26Hình 3.14. Dạng ấu trùng metacercaria M3 ký sinh trên cá đối thu tại Khánh Hòa. (1-Giác miệng; 2-Giác bụng; 3-Túi bài tiết)

Đặc điểm hình thái cấu tạo: Bào nang hình elip, có kích thước 171,5 ± 3,5 x 134,5

± 0,5 μm, thành bào nang là 1 lớp mỏng, giác miệng lớn nằm ở phía trước cơ thể ấu

trùng, có kích thước trung bình là 38 x 46,5 ± 0,5 μm, giác bụng có kích thước gần bằng

giác miệng (39,5 ± 0,5 x 48 μm), bào nang nhìn rõ dưới kính hiển vi, có sắc tố màu vàng

nâu nằm rải rác khắp cơ thể, túi bài tiết nhỏ hình chữ D ở phía cuối cơ thể. Dạng ấu

trùng metacercaria M3 ký sinh ở cá đối trong nghiên cứu này có một số chỉ tiêu hình

thái được thể hiện ở Bảng 3.20 và Hình 3.14

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu ấu trùng của sán lá song chủ đã được

quan tâm ở Việt Nam, đặc biệt là ấu trùng của các loài SLSC cảm nhiễm và gây bệnh

ở người và động vật trên cạn có nguồn gốc từ động vật thủy sản. Thông qua dự án “Ký

sinh trùng có nguồn gốc thủy sản – FIBOZOPA”, các nghiên cứu này đã được thực

hiện ở khu vực Hà Nội, Hải Dương, Nam Định (Trần Văn Quyên và cộng sự, 2012); Ở

Thừa Thiên Huế (Trương Thị Hoa và Nguyễn Ngọc Phước, 2009); Ở Khánh Hòa (Vo

The Dung et al., 2008); Ở An Giang (Nguyễn Diễm Thu và cộng sự, 2007)…Từ các 93

nghiên cứu này, nhiều loài cá nước ngọt được ghi nhận là vật chủ trung gian của sán lá

song chủ, ký sinh ở giai đoạn metacercaria như cá tra (Phạm Cử Thiện và cộng sự,

2009, Đinh Thị Thủy, 2010); ở cá mè, cá chép, cá trắm cỏ, cá trôi, cá diếc, cá rô phi,

trong đó cá mè nhiễm metacercaria cao nhất (Trương Thị Hoa và Nguyễn Ngọc

Phước, 2009; Nguyễn Văn Đề và Phạm Văn Khuê, 2009, Trần Văn Quyên và cộng sự,

2012); cá rô đồng (Phạm Cử Thiện và cộng sự, 2007), cá đối và cá mú là những loài cá

phân bố ở nước lợ, mặn cũng được thông báo nhiễm ấu trùng metacercaria của sán lá

song chủ (Vo The Dung et al., 2008).

Cá đối (Mugil sp.) là loài sự phân bố rộng, chúng sống cả nước mặn, nước lợ và

là loài cá ăn mùn bã hữu cơ, động vật nhỏ, nên chúng rất dễ nhiễm sán lá song chủ ở

cả giai đoạn trưởng thành và hậu ấu trùng. Võ Thế Dũng et al. (2008) đã phát hiện ấu

trùng metacercaria của loài sán Pygidiopsis summa và Heterophiopsis continua ký

sinh ở cá đối (Mugil cephalus) với TLCN lần lượt là 17,6 – 75,5% và 2,5 – 32,4%.

Đặng Thúy Bình và cộng sự (2014) nghiên cứu ấu trùng metacercaria ký sinh ở một số

loài cá và công bố đã tìm thấy 137 ấu trùng metacercaria ký sinh ở loài cá đối (Mugil

cephalus). Một số nhà khoa học đã dùng các loài cá được xác định nhiễm hậu ấu trùng

metacercaria làm thức ăn các loài cá dữ khác, qua đó nghiên cứu vòng đời sán lá song

chủ (Velasquez, 1961).

3.5.2. Kết quả của thí nghiệm dùng cá đối làm thức ăn cho cá chẽm để nghiên cứu

vòng đời loài sán song chủ Pseudometadena celebesensis

Cá chẽm giống dùng cho các đợt thí nghiệm có kích cỡ trung bình từ 7,31 - 7,78

mm và từ 7,15 - 7,66 g (Bảng 2.3, chương II) được đưa vềcơ sở thực nghiệm. Đàn cá

này đã được dùng cho thí nghiệm sau khi khẳng định 100% chúng không nhiễm SLSC

(kiểm tra 30 cá thể). Bố trí thí nghiệm đã được mô tả ở chương II với nguồn thức ăn

dùng cho cá trong thời gian thí nghiệm lá các loài cá tạp. Thí nghiệm có 6 nghiệm

thức, cá trong mỗi nghiệm thức được cho ăn 1 trong 6 loại thức ăn sau: cá đối, cá liệt,

cá dìa, cá hố, cá nục và thức ăn tổng hợp hiệu INVE dùng cho cá ở nghiệm thức ĐC.

Thí nghiệm được thực hiện trong 3 đợt: đợt 1 từ ngày 28/3/2014, đợt 2 từ ngày

3/5/2014 và đợt 3 từ ngày 10/6/2014, mỗi đợt thí nghiệm kéo dài 30 ngày. Thí nghiệm

được thực hiện trong điều kiện các yếu tố môi trường đều nằm trong khoảng thích hợp

cho sự phát triển của cá chẽm, cụ thể nhiệt độ là 28,59 ± 0,95oC, độ mặn là 33,0 ±

1,0‰ và pH là 7,8 ± 0,3. Mô hình thí nghiệm đã được trình bày ở Hình 2.7, Chương II.

Sau 30 ngày cho mỗi đợt thí nghiệm, cá chẽm còn lại ở các nghiệm thức được thu và

đưa vào kiểm tra để phát hiện sán lá song chủ ký sinh ở đường tiêu hóa của cá chẽm

(dạ dày và ruột).

Kết quả kiểm tra đã cho thấy, cá nuôi trong các nghiệm thức được cho ăn bằng

các loại cá tạp: cá liệt, cá giò, cá hố, cá nục và cá ở nghiệm thức đối chứng (ăn thức ăn

tổng hợp) đều không tìm thấy sán lá song chủ ký sinh trong đường tiêu hóa của cá

chẽm sau thí nghiệm. Tuy vậy, cá ở nghiệm thức cho ăn bằng cá đối băm nhỏ đã phát

hiện nhiễm sán lá song chủ loài Pseudometadena celebesensis ký sinh ở ruột cá chẽm

với tỷ lệ nhiễm cao ở cả 3 đợt thí nghiệm. Mức độ nhiễm sán P. celebesensis ở cá

chẽm sau thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.21.

29Bảng 3.21. Mức độ nhiễm sán lá song chủ loài P. celebesensis trong ruột cá

chẽm được nuôi bằng thức ăn là cá đối, sau 30 ngày thí nghiệm

Mức độ nhiễm Đợt TN.1 Đợt TN.2 Đợt TN.3

Số cá kiểm tra sau TN (con) 46 45 41

TLCN (%) 71,74 82,22 70,73

CĐCN (trùng/cá) 2,36 ± 1,25 2,32 ± 1,06 2,69 ± 1,14

Số liệu ở Bảng 3.21 đã thể hiện, khi cá chẽm giống được dùng loại thức ăn là cá

đối trong 30 ngày đã bị nhiễm sán lá song chủ ở ruột với mức độ nhiễm cao, tỷ lệ

nhiễm (%) và cường độ nhiễm (trùng/cá) của sán lá song chủ ở ruột cá chẽm thí

nghiệm ở 3 đợt lần lượt là: 71,74% và 3,36 ± 1,25 trùng/cá, 82,22% và 2,32 ± 1,06

trùng/cá và 70,73% và 2,69 ± 1,14 trùng/cá.

Loài sán lá song chủ tìm thấy ký sinh ở ruột của cá chẽm sau khi được dùng thức

ăn là cá đối (Mugil sp.) ở thí nghiệm này có hình dạng và cấu tạo đặc trưng của loài

sán Pseudometadena celebesensis. Bên cạnh những cá thể sán lá song chủ đã trưởng

thành, còn quan sát thấy một số cá thể sán còn ở dạng con non, đã thoát ra khỏi bào

nang của ấu trùng metacercaria nhưng tuyến sinh dục vẫn chưa hoàn toàn thành thục

(Hình 3.15).

27Hình 3.15 Hình ảnh của loài SLSC Pseudometadena celebesensis ký sinh ở ruột của cá chẽm (Lates calcarifer) sau 30 ngày dùng thức ăn là cá đối (Mugil sp.)

Hình A: SLSC được tìm thấy ở ruột cá chẽm sau thí nghiệm, cá thể này đã thoát

ra khỏi bào nang, nhưng còn non. Cơ thể hình elip, giác miệng và giác bụng thấy rõ,

hầu nhỏ dưới giác miệng, ruột lớn chia thành 2 nhánh chạy dọc 2 bên cơ thể. 2 tinh

hoàn nhỏ nằm chèn lên 2 nhánh ruột, chưa xuất hiện buồng trứng, trứng và cơ quan

giao cấu.

Hình B: Cơ thể sán đã xuất hiện sắc tố, hầu thấy rõ hơn, ruột màu đen chia 2

nhánh 2 bên cơ thể, 2 tinh hoàn nhỏ nhưng thấy rõ, đã xuất hiện các nhánh noãn

hoàng nằm phía sau, đã thấy rõ 2 tinh hoàn và buồng trứng, cơ quan giao cấu có màu

vàng nhạt nằm sát phía dưới giác miệng, lỗ bài tiết nằm tận cùng cơ thể.

Hình C: Cá thể sán trưởng thành, cơ quan sinh dục và các nội quan khác trong

cơ thể đã phát triển hoàn chỉnh. Dưới kính hiển vi đã quan sát thấy rõ những đặc điểm

phân loại chính của loài sán Pseudometadena celebesensis. Noãn hoàng đã xuất hiện

sắc tố đen, trứng có màu nâu nhạt phủ khắp cơ thể.

Tóm lại: Các kết quả nghiên cứu và thí nghiệm đã trình bày trong luận án này

đã chứng tỏ rằng, cá chẽm –Lates calcarifer là ký chủ cuối cùng và cá đối (Mugil sp.)

là một trong các ký chủ trung gian thứ hai của loài SLSC Pseudometadena

celebesensis, đây cũng được xem là loài ký sinh trùng đặc hữu ở cá chẽm. Kết quả

nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học và thực tế không nhỏ, là cơ sở để có thể đề xuất

các biện pháp kỹ thuật nhằm giảm thiểu mức độ nhiễm sán lá song chủ (Digenea) ở cá

chẽm nuôi thương phẩm tại Việt Nam.

CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN

4.1. Kết luận

1. Đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh ở loài cá chẽm

(Lates calcarifer) nuôi ở Khánh Hòa, trong đó các loài Helicometra fasciata,

Bucephalus margaritae, Erilepturus hamati, Pseudometadena celebesensis, và

Elytrophallus sp. ký sinh ở đường tiêu hóa (dạ dày và ruột) và loài Transversotrema

patialense ký sinh ở dưới các gốc vảy của cá chẽm.

2. Loài sán lá song chủ Pseudometadena celebesensis được xác định là loài ký sinh

trùng đặc hữu ở vật chủ là cá chẽm-Lates calcarifer. Loài SLSC này thường có tỷ lệ và

cường độ nhiễm cao và có thể gây những tác hại nhất định ở cá chẽm nuôi thương

phẩm.

3. Không có sự khác biệt rõ ràng về thành phần giống loài SLSC ký sinh ở cá

chẽm nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa qua các năm nghiên cứu (từ năm 2010-2013), ở

2 loại hình nuôi và ở các nhóm kích cỡ cá khác nhau. Tuy nhiên, đã có sự khác biệt có ý

nghĩa về tỷ lệ nhiễm (%) của SLSC giữa các nhóm kích cỡ cá khác nhau, giữa cá nuôi

trong các ao đất và nuôi lồng trên biển. Cá chẽm nuôi trong ao đất ven biển thường bị

nhiễm SLSC với mức độ cao hơn cá nuôi lồng bè và khi cá có khối lượng cơ thể càng

lớn thường bị nhiễm SLSC này ở mức độ cao hơn so với cá nhỏ và ngược lại.

4. Bốn loài sán lá song chủ là Pseudometadena celebesensis, Erilepturus hamati,

Transversotrema patialense và Helicometra fasciata ký sinh trên cá chẽm tại Khánh

Hòa có sự khác biệt về đặc điểm di truyền ở gen 18S rRNA dao động từ <2% đến

14,5%, ở gen 28S rRNA dao động từ 25,6% đến 40,8%, và ở gen ITS rRNA dao động

từ 62,1% đến 65,6%. Cây phát sinh loài được xây dựng dựa theo gen 18S rRNA và 28S

rRNA đã cho thấy 4 loài sán tìm thấy ở cá chẽm được phân thành 1 nhóm chính, trong

đó có 4 nhóm phụ. Loài Helicometra fasciata có sự tương đồng về gen ở mức độ cao

với loài H. fasciata có từ GenBank, hai loài là P. celebesensis và E. hamati chưa có

trình tự DNA trên GenBank để so sánh.

5. Kết quả nghiên cứu và các thí nghiệm sinh học đã xác định được rằng, cá

chẽm - Lates calcarifer là ký chủ cuối cùng và cá đối - Mugil sp. là ký chủ trung gian

thứ hai của loài sán lá song chủ Pseudometadema celebesensis.

4.2. Đề xuất ý kiến

1. Nên kết hợp giữa phương pháp phân loại truyền thống bằng hình thái học với

phương pháp phân loại dựa trên các chỉ thị phân tử để định danh KST ký sinh ở cá.

Mặt khác, để việc định danh được chính xác và đánh giá mối quan hệ phát sinh loài rõ

ràng hơn cần nghiên cứu thêm các vùng gen khác nhau trên gen ti thể và gen nhân.

2. Để giảm thiểu mức độ nhiễm sán lá song chủ (Digenea) ở cá chẽm (Lates

calcarifer) từ nguồn cá tạp làm thức ăn tươi như hiện nay, cần có những nghiên cứu

sản xuất thức ăn công nghiệp phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng của cá chẽm và các loài

cá biển nuôi khác.

3. Cần tiến hành nghiên cứu về sán lá song chủ ở các loài cá tạp khác làm thức ăn

cho nuôi cá chẽm để từ đó xác định ra đường lây nhiễm, làm cơ sở cho nghiên cứu

phòng trị bệnh ở cá chẽm.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Võ Thế Dũng, Võ Thị Dung, Glenn Allan Bristow,

Đỗ Thị Hòa (2010), “Một số ký sinh trùng ở cá chẽm (Lates calcarifer Bloch,

1790) nuôi tại Khánh Hòa”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn,

6/2010, tr. 59-63.

2. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Đỗ Thị Hòa, Glenn Allan Bristow, Phạm Thị Hạnh

(2017), “Thành phần và mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm (Lates

calcarifer) nuôi tại Khánh Hòa”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn,

6/2017, tr. 90-94.

3. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Đỗ Thị Hòa, Đặng Thúy Bình, Phạm Thị Hạnh,

Trương Thị Oanh (2017), “Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của sán lá song

chủ ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa”, Tạp

chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang, 2/2017, tr. 63-70.

Ngoài ra, trong quá trình thực hiện luận án, NCS đã xuất bản 2 bài báo và đồng tác giả

quyển sách về ký sinh trùng trên cá chẽm (Lates calcarifer):

1. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn (2014), “Tình hình nghiên cứu ký sinh trùng trên cá

chẽm (Lates calcarifer) ở Việt Nam và Thế giới”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát

triển Nông thôn, Số 4/2014. Tr. 106-112. ISSN: 1859-4581.

2. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn và Đỗ Thị Hòa (2015), “Thành phần sán lá song chủ

trên cá mú (Epinephelus sp.) và cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi ở Khánh Hòa”,

Báo cáo khoa học toàn văn Hội nghị Ký sinh học toàn quốc lần thứ 42 tại Cửa

Lò – Nghệ An tháng 4/2015, tr. 282-290.

3. Võ Thế Dũng, Glenn Allan Bristow, Nguyễn Hữu Dũng, Võ Thị Dung, Nguyễn Nguyễn

Thành Nhơn (2012), Ký sinh trùng cá chẽm và cá chẽm ở Việt Nam, Nhà Xuất Bản

Nông nghiệp, 180 tr.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Đặng Thúy Bình, Vũ Đặng Hạ Quyên, Lê Thị Thu Hà, Trần Quang Sáng và

Nguyễn Đắc Kiên (2014), “Xác định ấu trùng sán lá song chủ (metacercariae)

ký sinh trên một số loài cá dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền”, Tạp chí

Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2, pp. 15-23.

2. Lục Minh Diệp (2010), Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ nuôi thâm

canh cá chẽm Lates calcarifer (Bloch, 1790) bằng thức ăn công nghiệp. Báo cáo

đề tài cấp bộ, 128 tr.

3. Võ Thế Dũng (2010a), “Ấu trùng metacercariae của sán lá song chủ ký sinh ở cá

mú đen (Epinephelus coioides) và cá mú mè (Epinephelus bleekeri) thu tại

Khánh Hòa”, Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học công nghệ (2004-

2009) Kỷ niệm 25 năm thành lập Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, Nhà

xuất bản Nông Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 675-683.

4. Võ Thế Dũng (2010b). Động vật ký sinh ở cá chẽm thuộc giống Epinephelus,

Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Hải Dương Học, Nha Trang.

5. Võ Thế Dũng, Glenn Allan Bristow, Nguyễn Hữu Dũng, Võ Thị Dung, Nguyễn

Nguyễn Thành Nhơn (2012), Ký sinh trùng cá mú và cá chẽm ở Việt Nam, Nhà Xuất

Bản Nông nghiệp, 180 tr.

6. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, Nhà Xuất bản Giáo dục, Tái

bản lần thứ 3, 304 tr.

7. Nguyễn Văn Đề và Phạm Văn Khuê (2009), Bệnh ký sinh trùng truyền lây giữa

người và động vật, Nhà Xuất bản Giáo dục Việt Nam, tr. 46-52.

8. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004), Bệnh

học Thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh, 357 tr.

9. Đỗ Thị Hòa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị

Nguyệt Huệ (2008), “Các loại bệnh thường gặp trên cá biển nuôi ở Khánh Hòa”,

Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang, tr. 16-24.

100

10. Nguyễn Duy Hoan và Võ Ngọc Thám (2000), Nghiên cứu sản xuất thử giống cá

chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) tại Khánh Hòa. Báo cáo khoa học, 82tr.

11. Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007), Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam, Nhà Xuất

bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

12. Trần Vĩ Hích (2014), Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (Lates

calcarifer) đối với vi khuẩn Streptococcus iniae, Luận án tiến sĩ nông nghiệp,

Trường Đại học Nha Trang.

13. Kungvankij, P., Pudadera B.J., Tiro L.B., Potestas I.O., Tookwinas S., Ruangpan

L. (1994), Sinh học và kỹ thuật nuôi cá chẽm (Lates calcarifer Bloch). Nguyễn

Thanh Phương dịch. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội, 77 tr.

14. Trần Văn Quyên, Nguyễn Văn Thọ, Nguyễn Thị Hoàng Yến, Nguyễn Thị Hồng

Chiên, Nguyễn Văn Phương (2012), “Một số đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan

nhỏ do Clonorchis sinensis”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, Trường Đại học

Nông nghiệp Hà Nội, 10(1), tr. 142 – 147.

15. Bùi Quang Tề (1995), “Sán lá song chủ (Trematoda) ký sinh ở một số loài cá

nước ngọt Đồng Bằng Sông Cửu Long”, Tạp chí Thủy sản, 6, tr. 17-19.

16. Bùi Quang Tề (1999), “Kết quả nghiên cứu ký sinh trùng cá nước ngọt Việt

Nam”, Tạp chí Sinh học, 21(2), tr. 56-68.

17. Đặng Tất Thế (2005), Phân loại Vọoc (Colobinae) ở Việt Nam trên cơ sở tiến

hóa phân tử, Luận án tiến sĩ khoa học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật.

18. Kim Văn Vạn (2009), “Xử lý ấu trùng Metacercaria Centrocestus formosanus

nhiễm ở mang cá chép (Cyprinus carpio) bằng thuốc Praziquantel”, Bản tin Dự

án Ký sinh trùng gây bệnh có nguồn gốc thủy sản Việt Nam, Viện Nghiên cứu

Nuôi trồng Thủy sản I và Khoa Khoa học đời sống (Đại học Copenhagen, Đan

Mạch).

19. Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2013), Sán lá lây truyền qua cá tại Việt Nam,

Nhà Xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 87 tr.

20. Lê Thị Vinh, Dương Trọng Kiểm, Nguyễn Hồng Thu, Phạm Hữu Tâm, Phạm

Hồng Ngọc (2008), “Một vấn đề về môi trường nước ở Thành phố Nha Trang”,

101

Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Quốc gia, Nhà Xuất bản Khoa học Tự

nhiên và công nghệ, Hà Nội, tr. 307-322.

Tài liệu Tiếng Anh

21. Abdou, N.E. (2001), “Surface topography of Erilepturus hamati Manter, 1947

(Digenea, Family: Hemiuridae) by scanning electron microscopy”, Journal of the

Egyptian Society of Parasitology, 31(1), pp. 199-212.

22. Abdul-Salam, J., Sreelatha, B., Farah, M. (1990), “Gonapodasmius epinepheli n.

sp. (Didymozoidae) from the grouper Epinephelus tauvina from the Arabian

Gulf”, Systematic Parasitology, 17(1), pp. 67–74.

23. Adlard, R.D., Barker, S.C., Blair, D., Cribb, T.H. (1993), “Comparison of the

second internal transcribed spacer (ribosomal ADN) from populations and

species of Fasciolidae (Digenea)”. International Journal for Parasitology, 23(3),

pp. 423-425.

24. Aken’Ova, T.O.L., Cribb, T.H. and Rodney, A. Bray, R.A. (2006), “Helicometra

Odhner, 1902 (Digenea: Opecoelidae) in Australian waters: problems of species

identification and a description of H. sprenti n. sp”, Systematic Parasitology, 63,

pp. 17–27.

25. Ana, B.T., Kostadinova, A., Raga, J.A., Holzer, A.S. (2012), “Molecular and

morphological identification of larval opecoelids (Digenea: Opecoelidae)

parasitising prosobranch snails in a Western Mediterranean Lagoon”,

Parasitology International, 61, pp. 450–460.

26. Anderson, G.R. and Cribb, T.H. (1994), “Five new didymozoid trematodes

(Platyhelminthes, Digenea) from Australian platycephalid fishes”, Zoologica

scripta, 23(2), pp. 83-93.

27. Anderson, G.R. and Cribb, T.H. (1995), “New didymozoid trematodes from

Onigocia-stem Platychephalid Fishes”, Parasite, 2, pp. 49-54.

28. Anderson, R.C., Chabaud ,A.G., Willmott, S. (1976), CIH Keys to The Nematode

Parasites of Vertebrates, Commonwealth Agriculture Bureaux, Great Britain.

102

29. Anderson, G.R. (1999), “Identification and maturation of the metacercaria of

Indodidymozoom pearsoni”, Journal of Helminthology, 73, pp. 21-26.

30. Andres, M.J., Ray C.L., Pulis, E.E., Curran, S.S. and Overstreet, R.M. (2014),

“Molecular characterization of two opecoelid trematodes from fishes in the Gulf

of Mexico, with a description of a new species of Helicometra”, Journal Acta

Parasitol, 59(3), pp. 405-412.

31. Anlan, K.M. and Robir, K.B. (2005), First records of Trichodina japoniaca Imai,

Miyazaki et Nomura 1991 and Trichodina mutabilis Kazubski et Migala 1968

(Ciliophora, Trichodinidae) from India fishes, Parasitology Laboratory,

Department of Zoology, University of Kalyani, Kalyani, West Begal, India, pp.

121 – 127.

32. Arai, H.P. (1962), “Trematodos Digeneos De Peces Marinos De Baja California,

Mexico”, Anales del Instituto de Biología (Univ. Méx.). Tomo XXXIII, Nos. 1 y

2. Mexico.

33. Arthur, J.R. and Bui Quang Te (2006), Check list of the parasites of fishes of Viet

Nam, FAO fisheries technical paper, FAO, Rome, Italy, 369/2.

34. Arthur, J.R. and Lumanlan-Mayo, S. (1997), Checklist of the parasites of fishes

of the Philippines, FAO Fish. Tech. Pap, 369, 102 p, FAO, Rome.

35. Avise, J.C. (1994), “Molecular Markers, Natural History and Evolution,

Chapman & Hall”, Journal of Evolutionary Biology, 7(6), pp. 766–767.

36. Bartoli, P., Jousson, O. and Russell-Pinto, F. (2000), “The life cycle of

Monorchis parvus (Digenea: Monorchiidae) demonstrated by developmental and

molecular data”, Journal of Parasitology, 86, pp. 479-489.

37. Baverstock, P.R., Fielke, R., Johnson, A.M., Bray, R.A. and Beveridge, I. (1991),

“Conflicting phylogenetic hypotheses for the parasitic platyhelminths tested by

partial sequencing of 18S ribosomal RNA”, International Journal Parasitology,

21, pp. 329-339.

38. Berland, B. (2005), Whole mount, Occational peclication No. 1, Institue of

Oceanography, Kolej University Sains dan Teknologi Malaysia (Kustem).

103

39. Blair, D. (1984), “Elytrophallus carettae sp. n. (Digenea: Hemiuridae) from the

stomach of Loggerhead Turtles (Caretta caretta (L.)) from Australia”,

Proceedings of the Helminthological Society of Washington, 51(1), pp. 135-139.

40. Blair, D. and Barker, S.C. (1993), “Affinities of the Gyliauchenidae: utility of the

18S rRNA gene for phylogenetic inference in the digenea (Platyhelminthes)”,

International Journal for Parasirology, 23(4), pp. 527-532

41. Blair, D., Bray, R.A., and Barker, S.C. (1998), “Molecules and Morphology in

Phylogenetic Studies of the Hemiuroidea (Digenea: Trematoda:

Platyhelminthes)”, Molecular Phylogenetivà cs and Evolution, 9(1), pp. 15-25.

42. Blair, D., Campos, A., Cummings, M.R. and Laclette, J.R. (1996), “Evolutionary

Biology of Parasitic Platyhelminths: The Role of Molecular Phylogenetivà cs”,

Parasitology Today, 12(2), pp. 66-71.

43. Boonyaratpalin, M. and Williams, K. (2002), Asian seabass, Lates calcarifer, In

Nutrient requirements and feeding of finfish for aquaculture, edited by C. D.

Webster and C. Lim, pp. 40-49, CABI Publishing.

44. Boonyaratpalin, M. (1997), “Nutrient requirements of marine food fish cultures

in Southeast Asia”, Aquaculture, 151, pp. 283-313.

45. Braicovich, P.E., Etchegoin, J.A. and Timi, J.T. (2009), “Digenetic trematodes

of the Brazilian flathead, Percophis brasiliensis Quoy et Gaimard, 1825

(Percophidae, Perciformes), from Argentinean and Uruguayan waters”, Acta

Parasitologica, 54(4), pp. 368-373.

46. Bray, R.A. and Justine, J.L. (2006), “Prosorhynchus maternus sp. n. (Digenea:

Bucephalidae) from the Malabar grouper Epinephelus malabaricus (Perciformes:

Serranidae) off New Caledonia”, Folia Parasitologica, 53, pp. 181–188.

47. Bray, R.A. and Palm, H.W. (2009), “Bucephalids (Digenea: Bucephalidae) from

marine fishes off the south-western coast of Java, Indonesia, including the

description of two new species of Rhipidocotyle and comments on the marine

fish digenean fauna of Indonesia”, Zootaxa, 2223, pp. 1-24.

104

48. Bray, R.A., Cribb, T.H. and Barker, S.C. (1993), “The Hemiuroidea (Digenea) of

pomacentrid fishes (Perciformes) from Heron Island, Queensland”, Australia,

Systematic Parasitology, 24(3), pp. 159-184.

49. Bray, R.A., Cribb, T.H., Barker, S.C. (1993), “Hemuiridae (Digenea) from

marine fishes of the Great Barrier Reef, Queensland, Australia”, Systematic

Parasitology, 25(1), pp. 37-62.

50. Bray, R.A., Cribb, T.H., Barker, S.C. (1994), “Fellodistomidae and

Lepocreadiidae (Platyhelminthes: Digenea) from Chaetodontid fishes

(Perciformes) from Heron Island, Southern Great Barrier Reef, Queensland,

Australia”, Invertebrate Taxonomy, 8, pp. 545 – 581.

51. Bray, R.A., Cribb, T.H., Littlewood, D.T., Waeschenbach, A. (2016), “The

molecular phylogeny of the digenean family Opecoelidae Ozaki, 1925 and the

value of morphological characters, with the erection of a new subfamily”, Folia

Parasitol (Praha), 63, pp. 2-11.

52. Bray, R.A. (1979), “Digenea in marine fishes from the eastern seaboard of

Canada”, Journal of Natural History, 13(4), pp. 399-431.

53. Bray, R.A. (1990), “Hemiuridae (Digenea) from marine fishes of the southern

Indian Ocean: Dinurinae, Elytrophallinae, Glomericirrinae and Plerurinae”,

Systematic Parasitology, 17(3), pp. 183-217.

54. Bray, R.A. (1991), “Hemiuridae (Digenea) from marine fishes of the southern

Indian Ocean: Genus Lecithochirium Lühe, 1901 (Lecithochiriinae)”, Systematic

Parasitology, 18(3), pp. 193-219.

55. Bray, R., Waeschenbach A., Cribb T., Weedall G., Dyal P., Littlewood D. (2009),

“The phylogeny of the Lepocreadioidea (Platyhelminthes, Digenea) inferred

from nuclear and mitochondrial genes: Implications for their systematics and

evolution”, Acta Parasitologica, 54(4), pp. 310–329.

56. Brooks, D.R., Bandoni, S.M., Macdonald, C.A., O'grady, R.T. (1989), “Aspects

of the phylogeny of the Trematoda Rudolphi, 1808. (Platheminthes:

Cercomeria)”, Canadian Journal of Zoology, 67, pp. 2609-2624.

105

57. Bullard, S.A. and Overstreet, R.M. (2006), “Psettarium anthicum sp. n.

(Digenea: Sanguinicolidae) from the heart of cobia Rachycentron canadum

(Rachycentridae) in the northern Gulf of Mexico”, Folia Parasitologica, 53, pp.

117–124.

58. Bychowsky, B.E. (1957), Monogenetic trematodes, their classification and

phylogeny (in Russian). Moscow: Academy of Sciences, USSR. English

translation by Hargis W.J.Jr. and P.C. Outstinoff, Washington DC: American

Institute of Biological Science, 1961.

59. Carranza, S., Baguna, J. and Riutort, M. (1997), “Are the Platheminthes a

Monophyletic Primitive Group? An Assessment Using 18s rRNA Sequences”,

Molecular Biology and Evolution, 14(5), pp. 485-497.

60. Chai, J.Y. and Lee, S.H. (2002), “Food-borne trematode infections in the

Republic of Korea”, Parasitology International, 51(2), pp. 129–154.

61. Chai, J.Y., Murrell, K.D., Lymbery, A.J. (2005), “Fish-borne parasitic zoonoses:

Status and issues”, International Journal for Parasitology, 35(11-12), pp. 1233-

1254.

62. Chai, J.Y., Seo, B.S., Lee, S.H. (1984), “Studies on intestinal trematodes in

Korea XI. Two cases of human infection by Heterophyes heterophyes nocens”,

The Korean Journal of Parasitology, 22(1), pp. 37–42.

63. Chauhan, B.S. (1953), Studies on the trematode fauna of India. In Ed. Director,

Zoological Survey of India, Records of the Indian Museum, The Manager of

publications, Delhli, Vol.51, Part II, pp. 113–393.

64. Cheng, T.C. and Burton, R.W. (1965), “Relationships between Bucephalus sp.

and Crassostrea virginica: histopathology and sites of infection”, Chesapeaks

Science, 6, pp. 3-16.

65. Choudhury, A., Valdez, R.R., Johnson, R.C., Hoffmann, B. and De Leon, G.P.P.

(2007), “The Phylogenetic Position of Allocreadiidae (Trematoda: Digenea)

From Partial Sequences of the 18S and 28S Ribosomal RNA Genes”, The

Journal of Parasitology, 93(1), pp. 192-196.

106

66. Coloso, R.M., Murillo-Gurrea, D.P., Borlongan, I.G. and Catacutan, M.R.

(2004), “Tryptophan requirement of juvenile Asian seabass Lates calcarifer”,

Journal of Applied Ichthyology, 20, pp. 43-47.

67. Copland, J.W and Grey, D.L. (1987), Management of wild and culture

seabass/barramundi (Lates calcarifer). Proceedings of an International Worshop

held at Darwin, NT, Australia, 24-30 September 1986. ACIAR Proceedings

No.20, 210p. Printed by Ruskin Press, Melbourne.

68. Cribb, T.H., Bray, R.A., Barker, S.C. (1992), “A review of the family

Transversotrematidae (Trematoda: Digenea) with the description of a new genus,

Cruziella”, Invertebrate Taxonomy, 6(4), pp. 909-935.

69. Cribb, T.H., Bray, R.A., Littlewood, D.T.J., Pichelin, S. And Herniou, E.A.

(2001), Relationships of the Digenea - evidence from molecules and morphology,

Chapter 16 In: Interrelationships of The Platyhelminthes, pp.186-193.

70. Cribb, T.H., Bray, R.A., Wright, T., Pichelin, S. (2002), “The Trematodes of

groupers (Serranidae: Epinephelinae): Knowledge, nature and evolution”,

Parasitology, Supplement 124, pp. 23-42.

71. Cribb, T.H., Anderson, G.R., Adlard, R.D. and Bray, R.A. (1998), “A DNA-

based demonstration of a three-host life-cycle for the Bivesiculidae

(Platheminthes: Digenea)”. International Journal for Parasitology, 28, pp. 1791-

1795.

72. Cutmore, S.C., Diggles, B.K. and Cribb, T.H. (2016), “Transversotrema

Witenberg, 1944 (Trematoda: Transversotrematidae) from inshore fishes of

Australia: description of a new species and significant range extensions for three

congeners”, Systematic Parasitology, 93, pp. 639-652.

73. Da Silva, P.M., Magalhaes, A.R.M. and Barracco, M.A. (2002), “Effects of

Bucephalus sp. (Trematoda: Bucephalidae) on Perna perna mussels from a

culture station in Ratones Grande Island, Brazil”, Journal of Invertebrate

Pathology, 79, pp. 154–162.

74. Darwin, M., Chai, J. and Sohn, W. (2005), Identification of zoonotic

metacercaria from fish, Fishborne Zoonotic Parasites in Viet Nam 08.

107

75. Desdevises, Y., Sorand, S. and Legendre, P. (2002), “Evolution and determinants

of host specificity in the genus Lamellodiscus (Monogenea)”, Biological Journal

of the Linnean Society,77, pp. 431 – 443.

76. Després, L., Imbert-Estable, D., Combes, C. and Bomhomme, F. (1992),

“Molecular evidence linking hominoid evolution to recent radiation of

schistosomes (Platyhelmines: Trematoda)”, Mol. Phyl. Evol., 1, pp. 295-304.

77. Dinh Thi Thuy, Kania, P., Buchmann, K. (2010), “Infection status of zoonotic

trematode metacercariae in Sutchi catfish (Pangasianodon hypophthalmus) in

Vietnam: Associations with season, management and host age”, Aquaculture,

302(1-2), pp. 19-25.

78. Hoa, D.T. and Ut, P.V. (2007), “Monogenean disease in cultured grouper

(Epinephelus spp.) and snapper (Lutjanus argentimaculatus) in Khanh Hoa

province, Vietnam”, Marine Finfish Aquaculture Network, p. 40-42.

79. Durio, W.O. and Manter, H.W. (1969), “Some Digenetic Trematodes of Marine

Fishes of New Caledonia. III. Acanthocolpidae, Haploporidae, Gyliauchenidae,

and Cryptogonimidae”, The Journal of Parasitology, 55(2), pp. 293 - 300.

80. Dyer, W.G., Williams, Jr.E.H., and Bunkley-Williams, L. (1985), “Digenetic

trematodes of marine fishes of the western and southwestern coasts of Puerto

Rico”, Proceedings of the Helminthological Society of Washington, 52, pp. 85-

94.

81. Edward, J. N. (2000), Fish disease, Diagnosis And Treatment. Iowa State University

Press/ Ames. 367p.

82. Ehlers, U. (1984), “Phylogenetisches System der Platyhehninthes. Verh.

Naturwiss”, Ver. Hamburg, 27, pp. 291-294

83. Ehlers, U. (1985), Das phylogenetische System der Phltyhehninlhes. G, Fischer.

84. Ehlers, U. (1986), “Comments on a phylogenetic system of the Platheminthes”,

Hydrobiologia, 132, pp. 1-12.

85. Eun-Taek, H., Eun-Hee, S., Souvanny, P., Bounthong, S., Jae-Lip, K., Han, J.R.,

Jong-Yil, C. (2008), “Centrocestus formosanus (Digenea: Heterophyidae)

108

encysted in the freshwater fish, Puntius brevis, from Lao PDR”, The Korean

Journal of Parasitology, 46 (1), pp. 49-53.

86. Faliex, E. and Morand, S. (1994), “Population-dynamivà cs of the metacercarial

stage of the Buchepalid Trematode, Labratrema minimus (Stossich, 1887) from

Salses-Leucate Lagoon (France) during the cercarial shedding period”, Journal of

Helminthology, 68, pp. 35–40.

87. Faliex, E. (1991), “Ultrastructural study of the host-parasite interface after infect

of 2 species of teleosts by Labratrema minimus metacercariae (Trematoda,

Bucephalidae)”, Diseases of Aquatic Organisms, 10, pp. 93–101.

88. FAO (2006), The state of world fisheries and aquaculture 2006. FAO Fisheries

Technical Paper.

89. FAO (2008), The state of world fisheries and aquaculture 2008. FAO Fisheries

Technical Paper.

90. FAO (2017). Cultured Aquatic Species Information Programme. Lates calcarifer

91. Fernandez, M., Aznar, F.J., Latorre, A., Raga, J.A. (1998a), “Molecular

phylogeny of the families Campulidae and Nasitrematidae (Trematoda) based on

mtADN sequence comparisons”, International Journal for Parasitology, 28, pp.

767-775.

92. Fernandez, M., Littlewood, D.T.J., Latorre, A., Raga, J.A. and Rollinson, D.

(1998b), “Phylogenetic relationships of the family Campulidae (Trematoda)

based on 18S rRNA sequences”, Parasitology, 117, pp. 383-391.

93. Fitch, W.M. and Margoliash, E. (1967), “Construction of phylogenetic trees”.

Science, 155(3760), pp. 279 – 284.

94. Fourment, M. and Gibbs, M.J. (2006), “PATRISTIC: a program for calculating

patristic distances and graphically comparing the components of genetic change”,

BMC Evolutionary Biology, 6, pp. 1 – 15.

95. Frandsen, F. and Christensen, NO. (1984), “An introductory guide to the

identification of cercariae from African freshwater snails with special reference

109

to cercariae of trematode species of medical and veterinary importance”. Acta

Tropica, 41, pp. 181-202.

97. Gibson, D.I and Bray, R.A. (1979), “The Hemiuroidea: terminology, systematics

96. Gentleman, R. and Ihaka, R. (1993), R Programming, Tutorials Point, 186p.

and evolution”, Zoology series, 36(2), p. 35-146.

98. Gibson, D.I. (1987), “Questions in digenean systemativà cs and evolution”,

Parasitology, 95, pp. 429-460.

99. Ginetsinskaya, T.A. (1988), Trematodes, their Life Cycles, Biology and

Evolution, South Asia Books.

100. Grey, D.L. (1986), An overview of Lates calcarifer in Australia and Asia. In

Manegement of wild and culture seabass/ barramundi (Lates calcarifer), edited

by Coland J.W & Grey D.L., pp. 15-21, Proceeding of an International

workingshop, 24-30 September 1986, Darwin.

101. Hall, T.A. (1999), “BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor

and analysis program for Windows 95/98/NT”, Nucleic Acids Symposium Series,

41, pp. 95-98.

102. Ho, J.S. and Do, T.T. (1985), Copepods of the Family Lernanthropidae parasitic

on Japanese Marine Fishes, with a Phylogenetic Analysis of the Lernanthropid

Genera, pp. 31 – 36. Parasitic copepoda on Fishes and Blue Mussel in Japan.

103. Ho, J.S. and Kim, I.H. (2004), “Lernanthropid copepods (Siphonostomatoida)

parasitic on fishes of the Gulf of Thailand”, Systematic Parasitology, 58(1),

pp.71-21.

104. Holiis, M.B. and Manter, H.W. (1957), “Trematode of Marine Fishes of Mexican

Waters, X. Thirteen Digenea, Including Nine New from the Pacific Coast”,

Proceedings of The Helminthological Society, 2(2), pp. 35 – 48.

105. Hong, K.O., Ching, I.C. and Yuzaburo, O. (2002), “Excystation of Haplorchis

taichui metacercariae could be elicited by change in pH”. Japanese Journal of

Veterinary Research, 50(1), pp. 3-7.

110

106. Hunter, J.A., Ingram, E., Adlard, R.D., Bray, R.A. and Cribb, T.H, (2010), “A

cryptic complex of Transversotrema species (Digenea: Transversotrematidae) on

labroid, haemulid and lethrinid fishes in the Indo–West Pacific Region, including

the description of three new species”, Zootaxa, 2652, pp. 17–32.

107. Huyse, T. and Volckaert, F.A. (2005), “Comparing host and parasite

phylogenies: gyrodactylus flatworms jumping from Goby to Goby”, Systematic

Biology, 54(5), pp. 710 - 718.

108. Jousson, O., Bartoli, P., Zaninetti, L. and Pawlowski, J. (1998), “Use of the ITS

rRNA for elucidation of some life-cycles of Mesometridae (Trematoda,

Digenea)”, International Journal for Parasitology, 28(9), pp. 1403-1411.

109. Kabata, Z. (1985), Parasites and diseases of fish cultured in the tropivà cs.

Taylor & Francis, London and Philadelphia.

110. Kabata, Z. (1992), Copepods parasitic on fishes-Synopses of the British Fauna,

The Bath Press, Avon, Great Britian.

111. Klaus, R. (2011), "Flukes-Trematodes. The biology, morphology and medical

/economic importance of endoparasitic flatworms", Clinical Sciences, pp. 1-10.

112. Kay, H., Murrell, K.D, Hansen, A.K., Madsen, H, Trang, N.T.T., Hung, N.M.

(2009), “Optimization of an experimental model for the recovery of adult

Haplorchis pumilio (Heterophyidae: Digenea)”, Journal of Parasitology, 95(3),

pp. 629-633.

113. Khamdan, S.A.A. (1998), “Occurrence of Bucephalus sp. trematode in the gonad

of the pearl oyster, Pinctada radiata”, Environment International, 24, pp. 117–

120.

114. Koie, M. (1977), “Stereoscan studies of cercariae, metacercariae, and adults of

Cryptocotyle lingua (Creplin 1825) Fischoeder 1903 (Trematoda:

Heterophyidae)”, The Journal of parasitology,63(5), pp. 835-839.

115. Koie, M. (1979), "On the Morphology and Life-History of Derogenes varicus

(Miiller, 1784) Looss, 1901(Trematoda, Hemiuridae)”, Zeitschriit for

Parasitenkunde, 59, pp. 67 -78.

111

116. Koie, M. (1986), “The life-history of Mesorchis denticulatus (Rudolphi, 1802)

Dietz, 1909 (Trematoda, Echinostomatidae)”, Zeitschriit for Parasitenkunde, 72,

pp. 335 - 343.

117. Koie, M. (1987), “Scanning electron microscopy of rediae, cercariae,

metacercariae and adults of Mesorchis denticulatus (Rudolphi, 1802)

(Trematoda, Echinostomatidae)”, Parasitology Research, 73, pp. 50-56.

118. Koie, M. (1989), “On the morphology and life history of Lecithaster gibbosus

(Rudolphi, 1802) Liihe, 1901 (Digenea, Hemiuroidea)”, Parasitology Research,

75, pp. 361- 367.

119. Koie, M. (1990), “The Life Cycle of Pygidiopsis ardeae Køie, 1990 (Digenea,

Heterophyidae)”, The Journal of Parasitology, 76(4), pp. 537-541

120. Koie, M. (1992a), “Scanning electron microscopy of cercariae, metacercariae and

adults of Pygidiopsis ardeae Koie, 1990 (Digenea, Heterophyidae)”.

Parasitology Research, 78, pp. 469 - 474.

121. Koie, M. (1992b), “Life Cycle and Structure of the Fish Digenean Brachyphallus

crenatus (Hemiuridae)”. The Journal of Parasitology, 78(2), pp. 338-343.

122. Lambert, A., Gharbi, S. E. (1995), “Monogenean host specificity as a biological

and taxonomic indicator for fish”, Biological Conservation, 72(2), pp. 227-235.

123. Laruelle, F., Molloy, D. P. and Roitman, V. A. (2002), “Histological analysis of

trematodes in Dreissena polymorpha: Their location, pathogenicity, and

distinguishing morphological characteristivà cs”, Journal of Parasitology, 88, pp.

856–863.

124. Lauckner, G. (1983), Diseases of Mollusca: Bivalvia, In: Kinne O (ed) Diseases

of marine animals, volume II introduction. Bivalvia to Scaphopoda. Biologische

Anstalt Helgoland, Hamburg, pp. 477-961.

125. Lee, D., Choe, S., Park, H., Jeon, H.K., Chai J.Y., Sohn, W.M., Yong, T.S., Min,

D.Y., Rim, H.J., Eom, K.S. (2013), “Complete Mitochondrial Genome of

Haplorchis taichui and Comparative Analysis with Other Trematodes”, Korean

Journal Parasitol, 51(6), pp. 2013.

112

126. Leong, T.S. and Wong, S.Y. (1990a), Parasites of Healthy and Diseased

Juvenile Grouper (Epinephelus malabaricus (Bloch and Schneider)) and Seabass

(Lates calcarifer (Bloch)) in Floating Cages in Penang, Malaysia, School of

Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia, Minden 11800, Penang,

Malaysia.

127. Leong, T.S. and Wong, S.Y. (1990b), Parasites of seabass, Lates calcarifer

(Bloch) cultured in ponds and floating net cages in Thailand, School of

Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia, 11800 USM, Penang, Malaysia.

128. Leong, T.S. and Wong, S.Y. (1986), Parasite Fauna of Seabass, Lates calcarifer

Bloch, from Thailand and from Floating Cage Culture in Penang, Malaysia,

School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia, Penang, Malaysia.

129. Leong, T.S. and Wong, S.Y. (1987), Bacterial Pathogens and Parasites in greasy

grouper, Epinephelus salmoides Maxwell, silver seabass, Lates calcarifer Bloch

and golden snapper, Lutjanus johni Bloch cultured in floating net-cages in

Penang, Perak and Kedah, Peninsular, Malaysia, Final report, School of

Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia, Minden 11800, Penang, Malaysia.

130. Legendre, P. and Anderson, M.J. (1998), “Distance-based redundancy analysis:

testing multi-species responses in multi-factorial ecological experiments”,

Ecological Monographs, 69(1), 1999, pp. 1–24.

131. Legendre, P., Desdevises, Y. and Bazin, E. (2002), “A Statistical Test for Host–

Parasite Coevolution”, Systematic Biology, 51(2), pp. 217–234.

132. Liang, K.S. and Leong, T.S. (1991), A redescription of Pseudohabdosynochus

latesi (Tripathi, 1955) and description of Diplectanum penangi n. sp

(Monogenea: Diplectanidae) from Lates calcarifer cultured in floating cages in

Malaysia and Thailand, School of Biological Sciences, Universiti Sains

Malaysia, 11800 USM, Penang, Malaysia.

133. Littlewood, D.T.J., Rohde, K. and Clough, K.A. (1999), “The interrelationships

of all major groups of Platheminthes: phylogenetic evidence from morphology

and molecules”, Biological Journal of The Linnean Society, 66, pp. 75-114.

113

134. Littlewood, D.T.J. and Olson, D.P. (2001), Small subunit rDNA and the

Platyhelminthes: signal, noise, conflict and compromise, Chapter 25 In:

Interrelationships of the Platyhelminthes, pp. 262-278.

135. Litvaitis, M.K. and Rohde, K. (1999), “A molecular test of Platyhelminth

phylogeny: inferences from partial 28S rRNA sequences”, Invertebrate Biology,

118(1), pp. 42-56.

136. Lohse, K. (2009), “Can mtADN Barcodes Be Used to Delimit Species? A

Response to Pons và cs (2006)”, Systematic Biology, 58(4), pp. 439–442.

137. Madhavi, R., Jhansilakshmibai, K. (1994), “The miracidium of Transversotrema

patialense (Soparkar, 1924)”, Journal of Helminthology, 68(1), pp. 49-51.

138. Madhavi, R. (1974). ”Digenetic trematodes from marine fishes of Waltair coast,

Bay of Bengal. Family Bucephalidae”, Rivision Parassitology, 35(3), pp. 188-

199.

139. Madhavi, R. (1982), “Didymozoid trematodes (including new genera and

species) from marine fishes of the Waltair coast, Bay of Bengal”, Systematic

Parasitology, 4(2), pp. 99-124.

140. Manter, H.W. (1947), “The digenetic trematodes of marine fishes of Tortugas,

Florida”, American Midland Naturalist, 38(2), pp. 257-416.

141. Martin, W.E. (1950), “Parasitictodora hancocki n. gen., n. sp. (Trematoda:

Heterophyidae), with Observations on Its Life Cycle”, The Journal of

Parasitology, 36(4), pp. 360-370.

142. Martin, W.E. (1958), “The Life Histories of Some Hawaiian Heterophyid

Trematodes”, The Journal of Parasitology, 44(3), pp. 305-318.

143. Marty. R.D., Leslie A.C. and Ian D.W. (2001), First published record of the

pathogenic monogenean parasite Neobenedenia melleni (Capsalidae) from

Australia, Department of Microbiology and Parasitology, School of Moleculer and

Microbial Science, The University of Queensland, Brisbane, Queensland 4072,

Australia.

114

144. Miller. T.L, Adlard. R.D, Bray. R.A, Justine. J.L, Cribb. T.H. (2010), “Cryptic

species of Euryakaina n. g. (Digenea: Cryptogonimidae) from sympatric

lutjanids in the Indo-West Pacific”, Systematic Parasitology. 77(3), pp. 185-204.

145. Miller. T.L. and Cribb. T.H. (2005), “A new genus and species of cryptogonimid

from lutjanus spp. (pisces: lutjanidae) on the Great Barrier Reef and New

Caledonia”, Journal of Parasitology, 91(4), pp. 922 – 924.

146. Mills. C.A. (1980), “Age and density-dependent growth within populations of the

ectoparasitic digenean Transversotrema patialense on the fish host”.

International Journal for Parasitology, 10(4), pp. 287-291.

147. Mohandas, A. (1973), “Transversotrema chackai sp. Nov, adult of Cercaria

Chackai, from Fishes (Digenea: Transversotrematidae)”, Hydrobiologia, 43, pp.

148. Möller. H. and Anders. K. (1986), Diseases and Parasites of Marine Fishes,

183 -188.

Verlag Möller, Germany.

149. Murrell. K.D. and Fried. B. (2007), Food-borne Parasitic Zoonoses, World Class

Parasites: Volume 11- Fish and Plant –Borne Parasites. Springer Science, USA.

150. Nadakal. A.M., Mohandas. A., Sunderaraman. V. (1969), “Cercaria chackai sp.

n. (Transversotrematidae) from Kerala, India”, The Journal of Parasitology,

55(6), pp. 1187-1190.

151. Nadler, S.A. (1990). “Molecular approaches to studying helminth population

genetivà cs and phylogeny”, International Journalfor Parasitology, 20, pp. 11-

29.

152. Nahhas. F.M. and Sey. O. (2002), “Digenetic trematodes from marine fishes of

the coast of Kuwait, Arabian Gulf: Superfamily Hemiuroidea”, Acta Zoological

Academiae Sciemtiarum Hungaricae, 48(1), pp. 1-20.

153. Nahhas. F.M., Sey. O., Nakahara. G. (2006), “Digenetic trematodes of marine

fishes of the Arabian gulf of the coast of Kuwait. Family Bucephalidae Poche,

1907 and the description of a new species”, Helminthologia, 43(3), pp. 147-157.

115

154. Nahhas. F.M. and Carlson, K. (1994), Digenetic Trematodes of Marine Fishes of

Jamaica, West Indies, Ecological Survey of Jamaica, Publication No. 2, 68p.

155. Nelles, L., Fang, B.L., Volckaert, G., Vandenberghe, A. and De Wachter, R.

(1984), “Nucleotide sequence of a crustacean 18S ribosomal RNA gene and

secondary structure of eukaryotic small subunit ribosomal RNAs”. Nucleic Acids

Research, 12, pp. 8749–8768.

156. Thu, N.D., Dalsgaard, A., Loan, L.T.T., Murrell, K.D. (2007), “Survey for

zoonotic liver and intestinal trematode metacercariae in cultured and wild fish in

An Giang Province, Vietnam”, The Korean Journal of Parasitology, 45(1), pp.

45–54.

157. Nolan, M.J., Curran, S.S., Miller, T.L., Cutmore, S.C., Cantacessi, C., Cribb,

T.H. (2000), “Dollfustrema durum n. sp. and Heterobucephalopsis perardua n. sp.

(Digenea: Bucephalidae) from the giant moray eel, Gymnothorax javanicus

(Bleeker) (Anguilliformes: Muraenidae), and proposal of the

Heterobucephalopsinae n. subfam”, Journal of Parasitology, 86(2), pp: 283-288.

158. Nolan, M.J., Curran, S.S., Miller, T.L., Cutmore, S.C., Cantacessi, C., Cribb,

T.H. (2015), “Dollfustrema durum n. sp. and Heterobucephalopsis perardua n.

sp. (Digenea: Bucephalidae) from the giant moray eel, Gymnothorax javanicus

(Bleeker) (Anguilliformes: Muraenidae), and proposal of the

Heterobucephalopsinae n. subfam”, Parasitology International Journal, 64(6), pp.

559-570.

159. Olson, P.D., Cribb, T.H., Tkachd, V.V., Bray, R.A., Littlewood, D.T.J. (2003),

“Phylogeny and classification of the Digenea (Platheminthes: Trematoda)”,

International Journal for Parasitology, 33, pp. 733–755.

160. Olson, P.D. and Littlewood, D.T. (2016). “Phylogenetivà cs of the Monogenea-

evidence from a medley of molecules”, Folia Parasitol (Praha), 63. pii:

2016.013. doi: 10.14411/fp.2016.013.

161. Page, D.M.R. (1994), “Parallel phylogenies: Reconstructing the history of host-

parasite assemblages”, Cladistics,10, pp. 155 - 173.

116

162. Palm, H.W. (2004), The Trypanorhyncha Diesing, 1863, Centre for marine and

coastal resources studies, Bogor Agriculture University (IPB), Indonesia and

Institute for Zoomorphology, Cell biology and Parasitology, Heinrich-Hein-

University Düsseldorf, Gemany.

163. Palm, H.W., Caira J. N. (2008), “Host specificity of adult versus larval cestodes

of the elasmobranch tapeworm order Trypanorhyncha”, International Journal for

Parasitology, 33(3-4), pp. 383-388.

164. Paradižnik, V. and Radujković, B. (2007), “Digenea trematodes in fish of the

North Adriatic Sea”, Acta Adriat, 48(2), pp. 115-129.

165. Pearson, J.C. (1964), “A revision of the subfamily Haplorchinae Loss, 1899

(Trematoda: Heterophyinae”, Parasitology, 54, pp. 604-676.

166. Pearson, J.C. (1992), “On the position of the digenean family Heronimidae: an

enquiry into a cladistic classification of the Digenea”, Systematic Parasitology,

21, pp. 81-106.

167. Thien, P.C, Dalsgaard, A., Nhan, T.N., Olsen, A., Murrell, K.D. (2009),

“Prevalence of zoonotic tremetode parasites in fish fry and juveniles in fish of the

Mekong Delta, Vietnam”, Aquaculture, 295, pp. 1-5.

168. Thien, P.C, Dalsgaard A., Olsen A., Murrell K.D. (2007), “Prevalence of

fishborne zoonotic parasites in important cultured fish species in the Mekong

Delta, Vietnam”, Parasitology Research, 101, pp. 1277-1284.

169. Pillai, N.K. (1985), The Fauna of India: Copepod Parasites of Marine Fishes,

Ed. By Director, Zoological Survey of India. Director, Zoological Survey of

India.

170. Pina, S., Barandela, T., Santos, M.J., Russell-Pinto, F., and Rodrigues, P. (2009),

“Identification and Description of Bucephalus minimus (Digenea: Bucephalidae)

Life Cycle in Portugal: Morphological, Histopathological, and Molecular Data”,

Journal of Parasitology, 95(2), pp. 353-359.

171. Pinto, H. and Melo, A. (2012), “(Trematoda : Heterophyidae) in Australoheros

facetus (Pisces: Cichlidae ) in Brazil”, 2961, pp. 334 – 337.

117

172. Richard, E.C. and Gold, R.E. (1996), “Host Specificity of Gregarina

blattarumvon Siebold, 1839 (Apicomplexa: Eugregarinida) among Five Species

of Domiciliary Cockroaches”, Journal of Invertebrate Pathology, 67(3), pp. 219-

223.

173. Riutort, M., Kate, G., Field, K.G., Raff, R. A. and Baguña, J. (1993), “18S rRNA

sequences and phylogeny of Platheminthes”, Biochemical Systemativà cs and

Ecology, 21(1), pp. 71-77

174. Rohde, K., Hefford, C., Ellis, J.T., Baverstock, P.R., Johnson, A.M., Watson,

N.A. and Dittmann, S. (1993), “Contributions to the phylogeny of Platheminthes

based on partial sequencing of 18S ribosomal ADN”, International Journal

Parasitology, 23, pp. 705-724.

175. Rohde, K., Luton, K., Baverstock, P.R. and Johnson, A.M. (1994), “The

phylogenetic relationships of Kronborgia (Platheminthes, Fecampiida) based on

comparison of 188 ribosomal ADN sequences”, International Journal

Parasitology, 24, pp. 657—669.

176. Rohde, K. (1979), “A critical evaluation of intrinsic and extrinsic factors

responsible for niche restriction in parasites”, American Natulist, 114(5), 648-

671.

177. Rohde, K. (1990), “Phylogeny of Platheminthes, with special reference to

parasitic groups”, International Journalfor Parasitology, 20(8), pp. 979-1007.

178. Ronquist, F. (1998), “Phylogenetic approaches in coevolution and

biogeography”, Zoologica Scripta, 26, pp. 313- 322.

179. Ruangpan, L. (1982), Diseases and parasites of seabass Lates calcarifer, In

Report of training course on seabass spawning and larvae rearing, Songkla,

Thailand, 1-20 June 1982. pp. 46 – 52

180. Ruangpan, L. (1988), Diseases of cultured seabass, Lates calcarifer, Report On

The Training Course On Seabass Breeding And Culture.

181. Ruckert, S., Palm, H.W. and Klimpel, S. (2008), “Parasite fauna of seabass

(Lates calcarifer) under mariculture conditions in Lampung Bay, Indonesia”,

Journal of Applied Ichthyology, 24, pp. 321–327

118

182. Saugata, B. and Dunga, P.H. (2003), “Three new species of Myxobolus Butschli,

1882 from different food fishes of West Bengal, India”, Acta Protozool, 42, pp.

245-251.

183. Schander, C. and Willassen, E. (2005), “What can biological barcoding do for

Marine Biology?”, Marine Biology Research, 1, pp. 79-83.

184. Schipp, G., Bosmans, J., Hamphrey, J. (2007), Northern Territory barramundi

farming handbook, Department of Primary Industry, Fisheries and Mines.

Northern Territory Government, 80pp.

185. Schipp, G. (1996), Barranmundi farming in the Northern Terriority, Aquaculture

Branch, Fisheries Division, Department of Primary Industry and Fisheries.

Darwin NT, Australia.

186. Shih, H.H., Liu, W. and Qiu Z.Z. (2004), “Digenean Fauna in Marine Fishes

from Taiwanese Waters with the Description of a New Species, Lecithochirium

tetraorchis sp. Nov”, Zoological Studies, 43(4), pp. 671-676.

187. Snyder, S.D. and Loker, E.S. (2002), “Evolutionary relationships among the

Schistosomatidae (Platyhelminthes: Digenea) and an Asian origin for

Schistosoma. International Journal Parasitology, 32(3), pp. 233-44.

188. Sohn, W. (2009), “Fish-borne zoonotic trematode metacercariae in the Republic

of Korea”, The Korean journal of parasitology, 47, pp. 103–113.

189. Tucker, J.W., Russel, D.J. and Rimmer, M.A. (2002), “Barramundi culture: A

success story for aquaculture in Asia and Australia”, World Aquaculture, 33(4),

pp. 67-72.

190. Tucker, J. W. (2000), Marine fish culture. Kluwer Academic Publishers. Boston/

Dordrecht/ London, 750 pp.

191. Velasquez, C.C. (1958), “Transversotrema laruei, a new trematode of Philippine

fish (Digenea: Transversotrematidae)”, The Journal of Parasitology, 44(4), pp.

449-451.

119

192. Velasquez, C.C. (1959), “Studies on the family Bucephalidae Poch, 1907

(Trematoda) from Philippines food fishes”, The Journal of Parasitology, 45(2),

pp. 135-147.

193. Velasquez, C.C. (1961), “Further Studies on Transversotrema laruei Velasquez

with Observations on the Life Cycle (Digenea: Transversotrematidae)”, The

Journal of Parasitology, 47(1), pp. 65-70.

194. Velasquez, C.C. (1962), “Some Hemiurid Trematods From Philippine Fishes”,

The Journal Of Parasitology, 48(4), pp. 539 – 544.

195. Velasquez, C.C. (1975), “Some parasitic helmints of Philippine fishes”, The

University of the Philippines Research Digest, 5(1), pp. 23-29.

196. Dung, V.T., Bristow, G.A., Dung, N.D., Dung, V.T., Nhon, N.N.T., Trung, T.C.

(2008a), “Parasitic digenean trematodes of cultured grouper in Khanh Hoa

Province, Viet Nam”, Proceeding of the VII workshop on Diseases in Asian

Aquaculture, Taiwan 22-26, July, 2008, (In press).

197. Williams, H. and Jones, A. (1994), “Parasitic worms of fish”, Folia

Parasitologica, 41, pp. 38.

198. World Health Organization (1995). Control of foodborne trematode infections.

WHO Technical Report Series No. 849. WHO, Geneva.

199. Yamaguti, S. (1941), “Studies on The Helminth Fauna in Japan, Part 31:

Trematodes of Fishes”, Japanese Journal of Zoology, 9(1), pp. 35-108.

200. Yamaguti, S. (1952), “Parasitic Worms Mainly from Celebes, Part 1: New

Digenetic Trematodes of Fishes”, Acta Medicinae Okayama, 8(2), pp. 146 – 198.

201. Yamaguti, S. (1965), “New digenetic trematodes from Hawaiian fishes, Part 1”.

Pacific Science, 19(1-4), pp. 458-481.

202. Yamaguti, S. (1971), Synopsis of digenetic trematodes of vertebrates, Vol. 1, 2.

Keigaku Publishing Co., Tokyo, Japan.

120

PHỤ LỤC 1

Oneway: So sánh TLCN (%) của 4 loài trong ao và trong lồng từ 2010-2012

Ghi chú: L1 - Transversotrema patialense; L2 - Erilepturus hamati; L3 - Pseudometadena celebesensis; L4 - Buccephalus margaritae

Descriptives

95% Confidence Interval for Mean

N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum

TLCN_Ao L1 3 .1970 .02536 .01464 .1340 .2600 .18 .23

L2 3 .5937 .08812 .05088 .3748 .8126 .50 .68

L3 3 .4743 .10664 .06157 .2094 .7392 .37 .58

L4 3 .0363 .02603 .01503 -.0283 .1010 .01 .06

Total

TLCN_Long L1 L2 L3 L4 Total 12 3 3 3 3 12 .3253 .0303 .2773 .1747 .0093 .1229 .23808 .03525 .07336 .07027 .00862 .12331 .06873 .02035 .04236 .04057 .00498 .03560 .1741 -.0572 .0951 .0001 -.0121 .0446 .4766 .1179 .4596 .3492 .0308 .2013 .01 .00 .22 .10 .00 .00 .68 .07 .36 .24 .02 .36

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic

df1

df2

Sig.

TLCN_Ao TLCN_Long

1.625 3.214

3 3

8 8

.259 .083

ANOVA

Sum of Squares

df Mean Square

Sig.

TLCN_Ao Between

.583

.194

37.969

.000

Groups

Within Groups

.041

.005

Total

.623

TLCN_Long Between

.144

.048

16.498

.001

Groups Within Groups Total

.023 .167

8 11

.003

Tukey HSD

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons

95% Confidence Interval

(I) CDCN & TLCN

(J) CDCN & TLCN

Dependent Variable

Std. Error

Sig.

Upper Bound

Lower Bound

TLCN_Ao

.05839

.001

-.5837

-.2097

.05839

.006

-.4643

-.0903

.05839

.094

-.0263

.3477

.05839

.001

.2097

.5837

.05839

.249

-.0677

.3063

.05839

.000

.3703

.7443

.05839

.006

.0903

.4643

.05839

.249

-.3063

.0677

.05839

.000

.2510

.6250

.05839

.094

-.3477

.0263

.05839

.000

-.7443

-.3703

TLCN_Long L1

Mean Difference (I- J) -.39667* -.27733* .16067 .39667* .11933 .55733* .27733* -.11933 .43800* -.16067 -.55733* -.43800* -.24700* -.14433*

L3 L2 L3

.05839 .04404 .04404

.000 .002 .045

-.6250 -.3880 -.2854

-.2510 -.1060 -.0033

L4 L1 L3 L4 L1 L2 L4 L1 L2 L3

.02100 .24700* .10267 .26800* .14433* -.10267 .16533* -.02100 -.26800* -.16533*

.04404 .04404 .04404 .04404 .04404 .04404 .04404 .04404 .04404 .04404

.962 .002 .170 .001 .045 .170 .023 .962 .001 .023

-.1200 .1060 -.0384 .1270 .0033 -.2437 .0243 -.1620 -.4090 -.3064

.1620 .3880 .2437 .4090 .2854 .0384 .3064 .1200 -.1270 -.0243

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Tukey HSD

Subset for alpha = 0.05

CDCN & TLCN

.0363 .1970

3 3 3 3

.094

L4 L1 .4743 L3 .5937 L2 Sig. .249 Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

Homogeneous Subsets TLCN_Ao

TLCN_Long

Tukey HSD

Subset for alpha = 0.05

CDC N & TLCN

.0093 .0303

3 3 3 3

.962

.1747 .2773 .170

L4 L1 L3 L2 Sig.

PHỤ LỤC 2

Oneway: So sánh CĐCN (trùng/cá) của 4 loài trong ao và trong lồng từ 2010-2012

Ghi chú: L1 - Transversotrema patialense; L2 - Erilepturus hamati; L3 - Pseudometadena celebesensis; L4 - Buccephalus margaritae

Descriptives

95% Confidence Interval for Mean

Mean

Std. Deviation Std. Error

Lower Bound

Upper Bound

Minimum Maximum

CDCN_Ao

2.0433

.24132

.13932

1.4439

2.6428

1.84

2.31

4.7133

.65010

.37534

3.0984

6.3283

4.07

5.37

3 16.4233

7.52715

4.34580

-2.2752

35.1218

11.26

25.06

1.2500

.22113

.12767

.7007

1.7993

1.00

1.42

Total

6.1075

7.13375

2.05934

1.5749

10.6401

1.00

25.06

CDVCN_Long L1

.8333

.76376

.44096

-1.0640

2.7306

.00

1.50

2.3500

.37363

.21572

1.4218

3.2782

1.95

2.69

5.4567

2.02883

1.17134

.4168

10.4965

3.83

7.73

.6667

.57735

.33333

-.7676

2.1009

.00

1.00

2.22984

.64370

Total

2.3267

.9099

3.7434

.00

7.73

ANOVA

Sum of Squares

df Mean Square

Sig.

CDCN_Ao

Between Groups

445.419

148.473

10.385

.004

Within Groups

114.376

14.297

Total

CDVCN_Long Between Groups

11.432

.003

Within Groups Total

559.794 44.349 10.345 54.694

11 3 8 11

14.783 1.293

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic

df1

df2

Sig.

12.825

.002

4.362

.043

CDCN_Ao CDVCN_Lon g

Tukey HSD

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons

95% Confidence Interval

Std. Error Sig.

Dependent Variable

Mean Difference (I- J)

(I) CDCN & TLCN

(J) CDCN & TLCN

Lower Bound

Upper Bound

CDCN_Ao

.823

-12.5566

7.2166

.007

-24.2666

-4.4934

-2.67000 3.08728 -14.38000* 3.08728 .79333 3.08728

.994

-9.0932

10.6799

.823

-7.2166

12.5566

.022

-21.5966

-1.8234

.687

-6.4232

13.3499

.007

4.4934

24.2666

.022

1.8234

21.5966

.005

5.2868

25.0599

2.67000 3.08728 -11.71000* 3.08728 3.46333 3.08728 14.38000* 3.08728 11.71000* 3.08728 15.17333* 3.08728 -.79333 3.08728

.994

-10.6799

9.0932

.687

-13.3499

6.4232

CDVCN_Long L1

L3 L2 L3 L4 L1 L3

-3.46333 3.08728 -15.17333* 3.08728 .92848 .92848 .92848 .92848 .92848

-1.51667 -4.62333* .16667 1.51667 -3.10667*

.005 .414 .005 .998 .414 .041

-25.0599 -4.4900 -7.5966 -2.8066 -1.4566 -6.0800

-5.2868 1.4566 -1.6500 3.1400 4.4900 -.1334

1.68333 4.62333* 3.10667* 4.79000* -.16667 -1.68333 -4.79000*

.92848 .92848 .92848 .92848 .92848 .92848 .92848

-1.2900 1.6500 .1334 1.8167 -3.1400 -4.6566 -7.7633

4.6566 7.5966 6.0800 7.7633 2.8066 1.2900 -1.8167

L4 L1 L2 L4 L1 L2 L3 *. The mean difference is significant at the 0.05 level.

.334 .005 .041 .004 .998 .334 .004

Homogeneous Subsets

CDCN_Ao

Tukey HSD

Subset for alpha = 0.05

CDCN & TLCN

1 1.2500 2.0433 4.7133

3 3

16.4233

.687

1.000

Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

CDVCN_Long

Tukey HSD

Subset for alpha = 0.05

CDCN & TLCN

.6667 .8333 2.3500

3 3 3 3

.334

5.4567 1.000

L4 L1 L2 L3 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

PHỤ LỤC 3

So sánh TLCN (%) của từng loài sán lá song chủ trong nuôi ao và nuôi lồng

* T-Test: Loài L1 (Transversotrema patialense)

Paired Samples Statistics

Mean

Std. Deviation Std. Error Mean

Pair 1

L1_Ao

.1970

.02536

.01464

L1_Long

.0303

.03525

.02035

Paired Samples Correlations

Correlation

Sig.

L1_Ao & L1_Long

.898

.290

Pair 1

Paired Samples Test

Paired Differences

95% Confidence Interval of the Difference

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

Lower

Upper

Sig. (2-tailed)

.00967

.12507

.20826 17.241

.003

.16667

.01674

Pair 1 L1_Ao - L1_Long * T-Test: Loài L2 (Erilepturus hamati)

Paired Samples Statistics

Mean

Std. Deviation Std. Error Mean

Pair 1

TLCN_AO_L2

.5933

.09018

.05207

TLCN_LONG_L2

.2767

.07371

.04256

Paired Samples Correlations

Correlation

Sig.

Pair 1

-.140

.910

TLCN_AO_L2 & TLCN_LONG_L2

Paired Samples Test

Paired Differences

95% Confidence Interval of the Difference

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

Lower Upper

Sig. (2-tailed)

Pair 1 TLCN_AO_L2 -

.31667

.12423

.07172

.00806

.62527

4.415

.048

TLCN_LONG_L2

* T-Test: Loài L3 (Pseudometadena celebesensis)

Paired Samples Statistics

Mean

Std. Deviation Std. Error Mean

Pair 1

L3_Ao

.4743

.10664

.06157

L3_Long

.1747

.07027

.04057

Paired Samples Correlations

Correlation

Sig.

L3_Ao & L3_Long

.615

.578

Pair 1

Paired Samples Test

Paired Differences

95% Confidence Interval of the Difference

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

Lower

Upper

Sig. (2-tailed)

.29967

.04863

.08423

.09043

.50890 6.162

.025

Pair 1 L3_Ao - L3_Long * T-Test: Loài L4 (Buccephalus margaritae)

Paired Samples Statistics

Mean

Std. Deviation Std. Error Mean

Pair 1

L4_Ao

.0363

.02603

.01503

L4_Long

.0093

.00862

.00498

Paired Samples Correlations

Correlation

Sig.

L4_Ao & L4_Long

.977

.135

Pair 1

Paired Samples Test

Paired Differences

95% Confidence Interval of the Difference

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

Lower

Upper

df Sig. (2-tailed)

.02700

.01769

.01021

-.01695

.07095

2.643

.118

Pair 1 L4_Ao - L4_Long

PHỤ LỤC 4

So sánh CĐCN (trùng/cá) của từng loài sán lá song chủ nuôi ao và nuôi lồng

* T-Test: Loài L1 (Transversotrema patialense)

Paired Samples Statistics

Mean

Std. Deviation Std. Error Mean

Pair 1 CDCN_L1_AO

2.0433

.24132

.13932

CDCN_L1_LONG

.8333

.76376

.44096

Paired Samples Correlations

Correlation

Sig.

-.104

.934

Pair 1 CDCN_L1_AO & CDCN_L1_LONG

Paired Samples Test

Paired Differences

95% Confidence Interval of the Difference

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

Lower

Upper

df Sig. (2-tailed)

Pair 1 CDCN_L1_AO -

1.21000

.82456

.47606

-.83832 3.25832 2.542

.126

CDCN_L1_LONG

* T-Test: Loài L2 (Erilepturus hamati)

Paired Samples Statistics

Mean

Std. Deviation Std. Error Mean

Pair 1 CDCN_L2_AO

4.7133

.65010

.37534

CDCN_L2_LONG

2.3500

.37363

.21572

Paired Samples Correlations

Correlation

Sig.

-.629

.567

Pair 1 CDCN_L2_AO & CDCN_L2_LONG

Paired Samples Test

Paired Differences

95% Confidence Interval of the Difference

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

Lower

Upper

Sig. (2-tailed)

Pair 1 CDCN_L2_AO -

.93168

.53791

.04890 4.67776 4.394

.048

CDCN_L2_LONG

2.3633 3

* T-Test: Loài L3 (Pseudometadena celebesensis)

Paired Samples Statistics

Mean

Std. Deviation Std. Error Mean

Pair 1 CDCN_L3_AO

16.4233

7.52715

4.34580

CDCN_L3_LONG

5.4567

2.02883

1.17134

Paired Samples Correlations

Correlation

Sig.

-.609

.583

Pair 1 CDCN_L3_AO & CDCN_L3_LONG

Paired Samples Test

Paired Differences

95% Confidence Interval of the Difference

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

Lower

Upper

df Sig. (2-tailed)

Pair 1 CDCN_L3_AO -

1.09667E1 8.90956 5.14394

33.09924 2.132

.047

CDCN_L3_LONG

- 11.16590

* T-Test: Loài L4 (Buccephalus margaritae)

Paired Samples Statistics

Mean

Std. Deviation Std. Error Mean

Pair 1 CDCN_L4_AO

1.2500

.22113

.12767

CDCN_L4_LONG

.6667

.57735

.33333

Paired Samples Correlations

Correlation

Sig.

Pair 1 CDCN_L4_AO &

.979

.130

CDCN_L4_LONG

Paired Samples Test

Paired Differences

95% Confidence

Interval of the

Difference

Std.

Std. Error

Mean

Deviation

Mean

Lower

Upper

Sig. (2-tailed)

Pair 1 CDCN_L4_AO -

.58333

.36364

.20995

-.32000 1.48666

2.778

.109

CDCN_L4_LONG

PHỤ LỤC 5

Mức độ nhiễm ấu trùng metacercaria trên cá đối (Mugil sp.)

Khối Chiều Metacercaria

TT Ngày thu lượng dài Dạng 1 Dạng 1 Dạng 1 Tổng (g) (mm)

1 28/03/2014 28 128

2 28/03/2014 28 128 1 8 2 11

3 28/03/2014 29 129 2 12 14

4 28/03/2014 29 130 3 1 4

5 28/03/2014 27 128 3 1 4

6 28/03/2014 30 130 4 3 7

7 03/05/2014 30 131 2 1 3

8 03/05/2014 32 135

9 03/05/2014 31 132 3 2 5

10 03/05/2014 31 133 2 12 14

11 03/05/2014 33 136 2 1 3

12 10/06/2014 33 135 2 9 11

13 10/06/2014 33 136 6 6

14 10/06/2014 30 131 2 3 5

15 10/06/2014 29 128 1 11 12

16 10/06/2014 30 129 1 9 10

Tông số cá nhiễm (con) 10 13 5 14

Tỷ lệ cảm nhiễm (%) 62,50 81,25 31,25 87,50

Tông số metacercaria (con) 19 81 9 109

Cường độ cảm nhiễm TB (meta/cá) 1,90 6,23 1,80 7,79

Độ lệch chuẩn 0,74 4,15 0,84 4,06

Min 1 1 1 3

Max 3 12 3 14

PHỤ LỤC 6

Ngày bắt đầu thí nghiệm: 28/03/2014

Ngày kết thúc thí nghiệm: 29/04/2014

KẾT QUẢ KIỂM TRA CÁ CHẼM GIỐNG CHO ĂN CÁ ĐỐI ĐỢT 1

Loài P.celebesensis

2 2 1 4 2 2 1 3 1 2 3

5 2

1 2

6 3 5 2 2 3 2 2 2

TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

Khối lượng (g) 20 20 20 15 20 20 18 18 15 22 15 22 18 20 10 10 17 16 25 28 25 30 32 23 30 30 28 35 30 20 20 30 20 20 28 28 25 18

Chiều dài (mm) 115 125 125 110 125 117 110 110 110 130 105 120 115 120 105 90 115 110 130 130 125 135 145 125 120 130 130 135 135 125 125 130 125 115 135 125 155 120

2 1 4

1 2

2 3

39 40 41 42 43 44 45 46

20 10 15 15 10 10 15 13

125 110 105 105 95 95 105 100

33 71,74 78 2,36 1,25 1 6

Tổng số cá nhiễm (con) Tỷ lệ cảm nhiễm (%) Tổng số metacercaria (con) Cường độ cảm nhiễm TB (meta/cá) Độ lệch chuẩn Min Max

PHỤ LỤC 7

Ngày bắt đầu thí nghiệm: 03/05/2014

Ngày kết thúc thí nghiệm: 04/06/2014

KẾT QUẢ KIỂM TRA CÁ CHẼM GIỐNG CHO ĂN CÁ ĐỐI ĐỢT 2

TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

Khối lượng (g) 15 20 20 20 20 18 18 15 17 25 20 22 22 18 15 15 17 16 22 25 22 30 30 25 25 22 30 28 20 20 20 32 15 10 15 25 35 20 Chiều dài (mm) 110 120 125 120 118 115 110 110 115 130 115 120 120 120 105 100 105 110 130 130 120 135 140 125 120 130 130 125 115 120 125 130 100 90 110 125 155 120 Loài P.celebesensis 1 2 2 1 4 2 3 2 2 4 1 2 4 2 1 2 3 5 2 3 3 2 4 2 1 2 3 3 3 4

39 40 41 42 43 44 45

22 15 12 12 10 12 20 125 110 105 105 90 95 115

Tổng số cá nhiễm (con) Tỷ lệ cảm nhiễm (%) Tổng số metacercaria (con) Cường độ cảm nhiễm TB (meta/cá) Độ lệch chuẩn Min Max 2 1 2 1 2 1 2 37 82,22 86 2,32 1,06 1 5

PHỤ LỤC 8

Ngày bắt đầu thí nghiệm: 10/06/2014

Ngày kết thúc thí nghiệm: 10/07/2014

KẾT QUẢ KIỂM TRA CÁ CHẼM GIỐNG CHO ĂN CÁ ĐỐI ĐỢT 3

TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

Khối lượng (g) 25 25 30 20 25 20 27 20 15 30 30 25 22 20 25 25 20 20 30 25 18 15 20 25 20 28 25 25 20 22 25 28 20 18 20 20 30 30 Chiều dài (mm) 130 125 140 120 125 120 130 120 115 130 130 125 120 120 130 127 115 115 130 130 120 115 120 125 120 130 130 125 120 120 125 130 120 125 120 115 140 140 Loài P.celebesensis 3 6 2 3 4 2 2 1 3 2 2 5 3 1 2 3 1 3 4 2 2 3 3 2 3 4 2

39 40 41

30 22 17 135 120 110

Tổng số cá nhiễm (con) Tỷ lệ cảm nhiễm (%) Tổng số metacercaria (con) Cường độ cảm nhiễm TB (meta/cá) Độ lệch chuẩn Min Max 2 3 29 70,73 78 2,69 1,14 1 6

PHỤ LỤC 9

Một số hình ảnh thí nghiệm khảo sát vòng đời sán lá song chủ

Hình kiểm tra mẫu ốc trong ao nuôi cá chẽm

Hình cá tạp trước khi thí nghiệm cho cá chẽm giống ăn

Hình thí nghiệm nuôi cá chẽm giống bằng thức ăn cá tạp

Hình ấu trùng metacercaria ký sinh ở cá đối

PHỤ LỤC 10

Bảng 1. Đối chiếu trình tự ADN của gen 18S rRNA từ các mẫu sán lá song chủ ở

P.ce.LT

GGTTTCCCGG GGACTGCCCG CAG-GGCCAA TAATCGCGCC ACCACGGATC

L.ca.GB

GGTTTCCCGG GGACTGCCCG TGG-GGCCAA AAGCGGCAC - GCCACGGATC

C.pa.GB

GGTTTCCCGG GGACTGCCCG CGG-GGCCAA TAATCGCGCC ACCACGGATC

E.ha.LT

GGTTTCCCGG GGACTGCCCG CGG-GGCCAA AAATAGCTC - GCCGCGGATC

T.sp.GR

GGTTTACCGG GGACTGCCCA CGG- GATCA- CAGAAAGACG CACGCGGATC

T.ha.GB

GGTTTTCCGG GGGCTGCCCA CGAAGGTCA- CAGATTGACA CCCGCGGATC

H.bo.GB

GGTTTCCCGG GGGCTGCCCG CGG-GGCCGA TAATGGTACC ACCACGGATC

H.bo.GB

GGTTTCCCGG GGGCTGCCCG CGG-GGCCGA TAATGGTACC ACCACGGATC

E.ni.GB

GGTTTCCCGG AGACTGCCCG TGGGGACAAA CGAATATTAC CCCACGGATC

P.ce.LT

GTCAGTTGGC ATCGTTTATG GTCAGAACTA GGACGGTATC TGATCGTCTT

L.ca.GB

GTCAGTTGGC ATCGTTTATG GTCAGAACTA GGACGGTATC TGATCGTCTT

C.pa.GB

GTCAGTTGGC ATCGTTTATG GTCAGAACTA GGACGGTATC TGATCGTCTT

E.ha.LT

GTCAGTTGGC ATCGTTTATG GTCAGAACTA GGACGGTATC TGATCGTCTT

T.sp.GR.

GTCAGTTGGC ATCGTTTATG GTCAGAACTA GGACGGTATC TGATCGTCTT

T.ha.GB

GTCAGATGGC ATCGTTTATG GTCAGAACTA GGACGGTATC TGATCGTCTT

H.bo.GB

GTCAGTTGGC ATCGTTTATG GTCAGAACTA GGACGGTATC TGATCGTCTT

H.bo.GB

GTCAGTTGGC ATCGTTTATG GTCAGAACTA GGACGGTATC TGATCGTCTT

E.ni.GB

GTCAGTCGGC ATCGTTTATG GTCAGAACTA GGACGGTATC TGATCGTCTT

P.ce.LT

CGAACCTCTG ACTTTCGCTC CAGATCAATG AAAACATCCT TGGCAAATGC

L.ca.GB

CGAACCTCTG ACTTTCGCTC CAGATCAATG AAAACATCCT TGGCAAATGC

C.pa.GB

CGAACCTCTG ACTTTCGCTC CAGATCAATG AAAACATCCT TGGCAAATGC

E.ha.LT

CGAACCTCTG ACTTTCGCTC CAGATCAATG AAAACATCCT TGGCAAATGC

T.sp.GR.

CGAACCTCCG ACTGTCGCTC TTGATCAATG AAAACATCCT TGGCAAATGC

T.ha.GB

CGAACCTCCG ACTGTCGCTC TTGATCAATG AAAACATCCT TGGCAAATGC

H.bo.GB

CGAACCTCTG ACTTTCGCTC CAGATCAATG AAAACATCCT TGGCAAATGC

H.bo.GB

CGAACCTCTG ACTTTCGCTC CAGATCAATG AAAACATCCT TGGCAAATGC

E.ni.GB

CGAACCTCTG ACTTTCGCTC TTTGTCAATG AAAACATTCC TGGCAAATGC

P.ce.LT

TTTCGCT-GT AGTTTGTCTG GCGGCGATCC AAGAATTTCA CCTCTAACAC

L.ca.GB

TTTCGCTTGT AGTTTGTCTG GCGACGATCC ATGAATTTCA CCTCTCACGC

C.pa.GB

TTTCGCT-GT AGTTTGTCTG GCGGCGATCC AAGAATTTCA CCTCTAACAC

E.ha.LT

TTTCGCT-GT AGTTTGTCTG GCGACGATCC AAGAATTTCA CCTCTAACAC

T.sp.GR.

TTTCGCT-TT AGTTTGTCTG GCGATGATCC AAGAATTTCA CCTCTAACAC

T.ha.GB

TTTCGCT-TT AGTTTGTCTG GCGATGATCC AAGAATTTCA CCTCTAACAC

H.bo.GB

TTTCGCT-GT AGTTTGTCTG GCGACGATCC AAGAATTTCA CCTCTAACGC

cá chẽm, cá mú và trên GenBank

H.bo.GB

TTTCGCT-GT AGTTTGTCTG GCGACGATCC AAGAATTTCA CCTCTAACGC

E.ni.GB

TTTCGCT-TC AGGCTGTCTG GTGGCGATCC AAGAATTTCA CCTCTAACAC

P.ce.LT

CGCCATACAA ATGCCCCCGT CTGTCCCTTT TAACCATTAC TTCGGATCCG

L.ca.GB

CGCCATACAA ATGCCCCCGT TTGTCCCTCT TAACCATTAC TTCGGATCCG

C.pa.GB

CGCCATACAA ATGCCCCCGT CTGTCCCTTT TAACCATTAC TTCGGATCCG

E.ha.LT

CGCCATACAA ATGCCCCCGT CTGTCCCTTT TAACCATTAC TTCGGATCCG

T.sp.GR.

CGCCATACAA ATGCCCCCGT CTGTCCCTCT TAACCATTAC TTCGGAACCG

T.ha.GB

CGCCATACAA ATGCCCCCGT CTGTCCCTCT TAACCATTAC TTCGGAACCG

H.bo.GB

CGCCATACAA ATGCCCCCGT CTGTCCCTCT TAACCATTAC TTCGGATCCG

H.bo.GB

CGCCATACAA ATGCCCCCGT CTGTCCCTCT TAACCATTAC TTCGGATCCG

E.ni.GB

CACCATACAA ATGCCCCCGT CTGTCTCTCT TAACCATTAC TTCAGATCCG

P.ce.LT

AAAACCAACA AAATAGAACC GAAGTCCTAT TCCATTATTC CATGCAAGAA

L.ca.GB

AAAACCAACA AAATAGAACC GAAGTCCTAT TTCATTATTC CATGCAAGAC

C.pa.GB

AAAACCAACA AAATAGAACC GAAGTCCTAT TCCATTATTC CATGCAAGAA

E.ha.LT

AAAACCAACA AAATAGAACC GAAGTCCTAT TCCATTATTC CATGCAAGAA

T.sp.GR.

AAAACCAACA AAATAGAACC GAAGTCCTAT TCCATTATTC CATGCACGGA

T.ha.GB

AAAACCAACA AAATAGAACC GAAGTCCTAT TCCATTATTC CATGCACGGA

H.bo.GB

AAAACCAACA AAATAGGACC GAAGTCCTAT TCCATTATTC CATGCAAGAC

H.bo.GB

AAAACCAACA AAATAGGACC GAAGTCCTAT TCCATTATTC CATGCAAGAC

E.ni.GB

AAAACCAACA AAATAGAACT GAAGTCCTAT TCCATTATTC CATGCAAGAC

P.ce.LT

TTTTCAGGCA CGCTGGCCTG CTTTGAGCAC TCAAATTTGT TCAAAGTAAA

L.ca.GB

TTTTCAGGCT CTACGGCCTG CTTTGAGCAC TCAAATTTGT TCAAAGTAAA

C.pa.GB

TTTTCAGGCA CAATGGCCTG CTTTGAGCAC TCAAATTTGT TCAAAGTAAA

E.ha.LT

TTTTCAGGCT CGCTGGCCTG CTTTGAGCAC TCAAATTTGT TCAAAGTAAA

T.sp.GR.

CTTTCAGGCA CTTAGGCCTG CTTTGAGCAC TCAGATTTGT TCAAAGTAAA

T.ha.GB

CTTTCAGGCA CTTAGGCCTG CTTTGAGCAC TCAGATTTGT TCAAAGTAAA

H.bo.GB

TTTTCAGGCA CACGGGCCTG CTTTGAGCAC TCAAATTTGT TCAAAGTAAA

H.bo.GB

TTTTCAGGCA CACGGGCCTG CTTTGAGCAC TCAAATTTGT TCAAAGTAAA

E.ni.GB

TTTTCAGACA CACTGGCCTG CTTTGAGCAC TCAAATTTGT TCAAAGTAAA

P.ce.LT

CGTGCTGTCC GCCCC - CGAC ACCCGGTTAA AGGCACCTGA GAGCATGTCG

L.ca.GB

ATTGCCGCCC GCTAC - AAGC ACACAGCGAA GTGCACCTGA AAGCATGCCA

C.pa.GB

CGTGCTGTCC GCCCC - CGAC ACCCGGTTAA AGGCACCTGA GAGCATGTCG

E.ha.LT

CGTGCTGTCC GCCCC - CGAC ACCCGGTTAA AGGCACCTGA GAGCATGTCG

T.sp.GR.

CTTGCCGTCC GCCTC - CGAC ACCCGTTTAA AGGCACCAGG AGGCATGCCA

T.ha.GB

CTTGCCGTCC GCCTC - CGAC ACCCGTTGAA AGGCACCAGG AGGCGTGCCA

H.bo.GB

CATGCTGTCC GC - CCCCGAC ACCCGTTGAA AGGCATCCGG AAGCATGCCA

H.bo.GB

CATGCTGTCC GC - CCCCGAC ACCCGTTCAA AGGCATCCGA AAGCATGCCA

E.ni.GB

CATGCCGCCC GCACCACGAC ACGCAATCAA GTGGATCGCA GTGCGTACCG

P.ce.LT

ACACGTCAGC AGGACGAACC CACCAAACAC GCCAACACCT GT - - - - - C - A

L.ca.GB

ACCAACCAAG CCTTAAAGGA GAC - CGGCCA GCCA- CACCT GCACTTCCGA

C.pa.GB

ACAGATCAGC AGGACGAACC CACCAAACAT GCCAACACCT GT - - - - - CGA

E.ha.LT

GCACGTCGGA CGGACGACGC CACCAAACAC GCCAACACCT GT - - - - - CGA

T.sp.GR.

ATCAAATGAT AGATA - AATC CACCAAATG - ATCAGCACCT T - - - - - -T - -

T.ha.GB

ACCAACTGAC AGGAA -CGCC TGCCAGATG - ATTAGCACCT GA - - - - - T - -

H.bo.GB

AC - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CGAA - - - - GCCAGCACCT GTG - - - - TGA

H.bo.GB

AC - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CGAA - - - - ATCGGCACCT GTG - - - - TAC

E.ni.GB

GCTGACAGGC AAGATATACT TAACCG-TCA GTCAGCACCT GAAC- -CCAG

P.ce.LT

A - - - - - - ACA GACACAGCAG AAAGGCTGCA CAACCACGG- CACCGACCCG

L.ca.GB

AGAAGACACA GACACGGCAG AAAGGTTACA CGACCAAAG- CACCGGGCCG

C.pa.GB

A - - - - - - ACA GACACAGCAG AAAGGCTGCA CAACCACGG- CACCGACCCG

E.ha.LT

A - - - - - - ACA GACACAGCAG AAAGGTTGCA CAACCACGG- CACCGACCCG

T.sp.GR.

A - - - - - - AAA GACACGGCAG AAAGATCACA CAACCACTA- CACCG--CGC-

T.ha.GB

A - - - - - - ACA GACACGGCAG AAAGACCACA CAACCACTA- CACCG - - TAC

H.bo.GB

A - - - - - - - CA GACACAGCAG AAAGACCGAA CGACCGCAA- CACCGACTCA

H.bo.GB

A - - - - - - - CA GACACAGCAG AAAGACCGAA CGACCGAAA- CACCGACTCA

E.ni.GB

AAGGGCA-CA GACACGGCTG AAAGACTGCA CCACCTACGC AGCATAGTTC

P.ce.LT

- CAAACCCGA - - - - - - - - - - - - C - - - CCAG CAG - AG - - CC AGACCAG-GA

L.ca.GB

- ACAACACCA CGAGC-ACTG AACAC-GGAG TAC - AGAACC CGAAATGCGA

C.pa.GB

- CCAACCCGA - - - - - - - - - - - - T - - - CCAG CAG - AG- - CC AAACCAG-GA

E.ha.LT

- CAAACCCGA - - - - - - - - - - - - C - - - CCAG CAG - AG- - CC AGACCAG-GA

T.sp.GR.

- CTCACTGAC CGC - - - - - - - - - - A - - - CGG AAG – AA - CA GTACGAT-CA

T.ha.GB

- CTATCCGAA CGC - - - - - - - - - - A - - - TGG CAG – AAG -CC GCACGAA-CA

H.bo.GB

- CGAACCCGA - - - - - - - - - - - - - - - CCCGG AGTGAA - - CC AGACCGA-GA

H.bo.GB

- CCAACCCGA - - - - - - - - - - - - - - - TCCGG CGTAAA - - CC AGACCAG-GA

E.ni.GB

GCCGTCTCAA AGG - - - - - - - - - - - - - -AAA CACGAGG - TT TTCCTCC -AA

P.ce.LT

AAGCAAGCAA CGGCATGTAG CCATGCGACC CA - - - - - - - - GATCCAACTA --

L.ca.GB

AGCCAACCA - CGGCGATCAG CCATGAGACC CA - - - - - - - - GATCCAACTA --

C.pa.GB

AAGCAAGCAA CGGCATGTAG CCATGCGACC CA - - - - - - - - GATCCAACTA --

E.ha.LT

AAGCAAGCAA CGGCATGTAG CCATGCGACC CA - - - - - - - - GATCCAACTA --

T.sp.GR.

GATCTGACAC TGGCATGCAG CCATGTGACC CA - - - - - - - - GATCCAACTA --

T.ha.GB

GCTTTGGCAC TGGTAAGTAG CCATGTGACC CA - - - - - - - - GATCCAACTA --

H.bo.GB

ACGCAAGCA- CGGCGCACAG CCATCCGACC CA - - - - - - - - GATCCAACTA --

H.bo.GB

AGTAGAGCA- CGGCGAACAG CCATCCAACC CA - - - - - - - - GATCCAACTA --

E.ni.GB

AGGCAGAC-- - - GTAACCAA CCACGCGGCA CTGCCGTCAA GATCCAACTA

P.ce.LT CGAGCTTTTT AACTGCAACA ACTTTAATAT ACGCTTCTGG AGCTGGAGTT

L.ca.GB

CGAGCTTTTT AACTGCAACA ACTTTAATAT ACGCTTCTGG AGCTGGAGTT

C.pa.GB

CGAGCTTTTT AACTGCAACA ACTTTAATAT ACGCTTCTGG AGCTGGAGTT

E.ha.LT

CGAGCTTTTT AACTGCAACA ACTTTAATAT ACGCTTCTGG AGCTGGAGTT

T.sp.GR.

CGAGCTTTTT AACTGCAACA ACTTTAATAT ACGCTACTGG AGCTGGAGTT

T.ha.GB

CGAGCTTTTT AACTGCAACA ACTTTAATAT ACGCTACTGG AGCTGGAGTT

H.bo.GB

CGAGCTTTTT AACTGCAACA ACTTTAATAT ATGCCACTGG AGCTGGAGTT

H.bo.GB

CGAGCTTTTT AACTGCAACA ACTTTAATAT ATGCCACTGG AGCTGGAGTT

E.ni.GB

CGAGCTTTTT AACTGCAGCA ACTTTAATAT ACGCTATTGG AGCTGGAGTT

P.ce.LT

ACCGCGGCTG CTGGCACCAG ACTTGCCCTC CAGTTGATCC TCGTTAAAGG

L.ca.GB

ACCGCGGCTG CTGGCACCAG ACTTGCCCTC CAGTTGTTCC TCGTTAAAGG

C.pa.GB

ACCGCGGCTG CTGGCACCAG ACTTGCCCTC CAGTTGATCC TCGTTAAAGG

E.ha.LT

ACCGCGGCTG CTGGCACCAG ACTTGCCCTC CAGTTGATCC TCGTTAAAGG

T.sp.GR.

ACCGCGGCTG CTGGCACCAG ACTTGCCCTC CAGTTGTTCC TCGTTAAAGG

T.ha.GB

ACCGCGGCTG CTGGCACCAG ACTTGCCCTC CAGTTGTTCC TCGTTAAAGG

H.bo.GB

ACCGCGGCTG CTGGCACCAG ACTTGCCCTC CAGTTGATCC TCGTTAAAGG

H.bo.GB

ACCGCGGCTG CTGGCACCAG ACTTGCCCTC CAGTTGATCC TCGTTAAAGG

E.ni.GB

ACCGCGGCTG CTGGCACCAG ACTTGCCCTC CAATTGATCC TCGTTAAAGG

P.ce.LT

ATTTAAATTG TACTCATTCG AATTACGGAG CCTCTAATGA GTCCCGTATC

L.ca.GB

ATTTAAATTG TACTCATTCG GATGTCGGAG GCCCTAACGA GTCCCGTCTC

C.pa.GB

ATTTAAATTG TACTCATTCG AATTACGGAG CCTCTAATGA GTCCCGTATC

E.ha.LT

ATTTAAATTG TACTCATTCG AATTACGGAG CCTCTAATGA GTCCCGTATC

T.sp.GR.

ATTTAAAGTG TACTCATTCG AATTACGGAG CCTCAAAAGA GTCCCGTATC

T.ha.GB

ATTTAAAATG TACTCATTCG AATTACGGAG CCTCTAAAGA GTCCCGTATC

H.bo.GB

ATTTGGATTG TACTCATTCG AATTACGGAG CCTCTTTTGA GTCCCGTATC

H.bo.GB

ATTTGAATTG TACTCATTCG AATTACGGAG CCTCTTTTGA GTCCCGTATC

E.ni.GB

CTTTAGACTG TACTCATTCC GATTACGGAT CCTC-AAAGA GCCCCGCATC

P.ce.LT

CGTATTTTTC GTCACTACCT CCCCGTTCCG GGATTGGGTA ATTTGCGCGC

L.ca.GB

CGTATTTTTC GTCACTACCT CCCCGTGCCG GGATTGGGTA ATTTGCGCGC

C.pa.GB

CGTATTTTTC GTCACTACCT CCCCGTTCTG GGATTGGGTA ATTTGCGCGC

E.ha.LT

CGTATTTTTC GTCACTACCT CCCCGTTCCG GGATTGGGTA ATTTGCGCGC

T.sp.GR.

CATATTTTTC GTCACTACCT CCCCGTTCTG GGAATGGGTA AGTTGCGCGC

T.ha.GB

CGTATTTTTC GTCACTACCT CCCCGTTCTG GGAATGGGTA AGTTGCGCGC

H.bo.GB

CGTATTTTTC GTCACTACCT CCCCGTTCTG GGATTGGGTA ATTTGCGCGC

H.bo.GB

CGTATTTTTC GTCACTACCT CCCCGTTCTG GGATTGGGTA ATTTGCGCGC

E.ni.GB

GTTATTTTTC GTCACTACCT CCCCGTGCCG GGAGTGGGTA ATTTGCGCGC

P.ce.LT

CTGCTGCCTT CCTTGGAAGT GGTAGCCGTT TCTCAGGCTC CCTCTCCGGA

L.ca.GB

CTGCTGCCTT CCTTGGATGT GGTAGCCGTT TCTCAGGCTC CCTCTCCGGA

C.pa.GB

CTGCTGCCTT CCTTGGAAGT GGTAGCCGTT TCTCAGGCTC CCTCTCCGGA

E.ha.LT

CTGCTGCCTT CCTTGGAAGT GGTAGCCGTT TCTCAGGCTC CCTCTCCGGA

T.sp.GR.

CTGCTGCCTT CCTTGGATGT GGTAGCCGTT TCTCAGGCTC CCTCTCCGGA

T.ha.GB

CTGCTGCCTT CCTTGGATGT GGTAGCCGTT TCTCAGGCTC CCTCTCCGGA

H.bo.GB

CTGCTGCCTT CCTTGGAAGT GGTAGCCGTC TCTCAGGCTC CCTCTCCGGA

H.bo.GB

CTGCTGCCTT CCTTGGAAGT GGTAGCCGTC TCTCAGGCTC CCTCTCCGGA

E.ni.GB

CTGCTGCCTT CCTTGGATGT GGTAGCCGTT TCTCAGGCTC CCTCTCCGGA

P.ce.LT

ATCGAACCCT GATTCCCCGT TACCCGTTAT CACCATGGTA GGCAGGTCAC

L.ca.GB

ATCGAACCCT GATTCCCCGT TACCCGTTAT TACCATGGTA GGCAGGTCGC

C.pa.GB

ATCGAACCCT GATTCCCCGT TACCCGTTAT CACCATGGTA GGCAGGTCAC

E.ha.LT

ATCGAACCCT GATTCCCCGT TACCCGTTAT CACCATGGTA GGCAGGTCAC

T.sp.GR

ATCGAACCCT GATTCCCCGT TACCCGTTAT CACCATGGTA GGCAGGTCAC

T.ha.GB

ATCGAACCCT GATTCCCCGT TACCCGTTAT CACCATGGTA GGCAGGTCAC

H.bo.GB

ATCGAACCCT GATTCCCCGT TACCCGTTAT CACCGTGGTA GGCAGGTCAC

H.bo.GB

ATCGAACCCT GATTCCCCGT TACCCGTTAT CACCGTGGTA GGCAGGTCAC

E.ni.GB

ATCGAACCCT GATTCCCCGT TACCCGTTAT AACCATGGTA GGCAGGTCAC

P.ce.LT

CTACCATCGA AAATTGATAG GGCAGACATT TGAAAG

L.ca.GB

CTACCATCGA CAATTGATAG GGCAGCCATT CGAAGG

C.pa.GB

CTACCATCGA AAATTGATAG GGCAGACATT TGAAAG

E.ha.LT

CTACCATCGA AAATTGATAG GGCAGACATT TGAAAG

T.sp.GR

CTACCATCGA CAATTGATAG GGCAGACATT TGAAAG

T.ha.GB

CTACCATCGA CAATTGATAG GTCAGACATT TGAAAG

H.bo.GB

CTACCATCGA AAATTGATAA GACAGACATT TGAAAG

H.bo.GB

CTACCATCGA AAATTGATAA GACAGACATT TGAAAG

E.ni.GB

CTACCATCGT AAGTTGATAG GGCAGACACT TGAAAG

Bảng 2. Đối chiếu trình tự ADN của gen 28S rRNA từ các mẫu sán lá song chủ ở

T.pa.LT

AAGAGG-GAA AAGCCCAGCA CCGAAGGTAG TATTCATTTG AGTACCTACC

T.ha.GB

AAGAGG-GAA AAGCCCAGCA CCGAAGGTAG TATTCATTTG AGTACCTACC

T.sp.GR

AAGAGG-GAA TAGCCCAGCA CCGAAGGTAG TATCCGTTTG GGTACCTACC

P.ce.LT

AACAGG-GAA AAGCCCAGCA CCGAAGCCTG TGGTCATTTG GCTACTAGGC

H.fa.LT

AACAGG-GAA AAGCCCAGCA CCGAAGCCTG TGGCCGTTTG GCCACCAGGC

H.fa.GB

AACAGG-GAA AAGCCCAGCA CCGAAGCCTG TGGTCGTTTG GCCACCAGGC

E.ha.LT

AAGAGG-GAA GAGCCCAGCA CCGAAGCCTG TGGTCATTTG ATCATTAGGC

C.pa.GB

AACAGG-GAA AAGCCCAGCA CCGAAGCCTG TGGCCATTTG GTTACTAGGC

L.cf.ca.GB

AAGAGG-GAA GAGCCCAGCA CCGAAGCCTG TGTTCATTTG ATCATTAGGC

L.ca.GB

AAGAGG-GAA GAGCCCAGCA CCGAAGCCTG TGGTCATTTG ATCATTAGGC

P.pa.GR

AACAGG-GAT GAGCCCAGCA CCGAAGCCTG TGGCCGCTTG GTCACTAGGC

P.pa.GB

A -CAGG-GAA GAGCCCAGCA CCGAAGCCTG TGGCCAATTG GTCACTAGGC

cá chẽm, cá mú và trên GenBank

D.pu.GB

AGCGGGTACT CACATCTGAT CCGAGGTCAG GGTAAA - - G CTCACTATGT

T.pa.LT

- - AATGTG- G TGTTAAGGT - CGACTTG - - - - - - -TGTAAG TGTGGCTCCA

T.ha.GB

- - AATGTG- G TGTTAAGGT - CGACTTG - - - - - - -TGTAAG TGTGGCTCCA

T.sp.GR

- - AATGTG- G TGTTTTGGT - CAGCTCTG - - - - - -TATGAG TGCGGCTCCA

P.ce.LT

- - AATGTG- G TGTTTAGGT - CGTTCCT - - - - - - -TGAGAG CGCTGCCTCA

H.fa.LT

- - AATGTG- G TGTTCAGGT - TGTTCCG - - - - - - -CGGATG TACTGCTCCA

H.fa.GB

- - AATGTG- G TGTTCAGGT - TGTTCCG - - - - - - -CGGATG TACTGCTCCA

E.ha.LT

- - AATGTG- G TGTTTAGGTA TGT - TTTG - - - - - -CGAATT TACTGCTCTG

C.pa.GB

- - AATGTG- G TGTTTAGGT- CGTTCCT - - - - - - -TGGGGG CGCTGCCTCA

L.cf.ca.GB

- - AATGTG- G TGTTTAGGTG TAC - TCTG - - - - - -CGATGA CACTGCTCTG

L.ca.GB

- - AATGTG- G TGTTTAGGTG TGC- TTTG - - - - - -CGATGA CTCTGCTCTG

P.pa.GR

- - AATGTG- G TGTTTAGGT- CGTCTCA - - - - - - -CAGTGA TGCCGCTCCA

P.pa.GB

- - AATGTG- G TGTTCAGGT- CATCTCA - - - - - - -CAGTGG TGCTACTCCA

D.pu.GB

GCATTACACA CACTCGG-TT CAAC-CATAG ACTATGCATA GACT - - TCCA

T.pa.LT

TCTCAAGT- C CAGCA-ATGA GTACGGTTTT TTGGACTTG - GC-CCAAAGT

T.ha.GB

TCTCAAGT- C CAGCA-ATGA GTACGGTTTT TTGGACTTG - GC-CCAAAGT

T.sp.GR

TCTCAAGT- C CAGCA-ATGA GTACGGTTTT TTGGACTTG - GC-CCAGAGC

P.ce.LT

CTCCAAGT- C CAGCA-ATGA GTACGGTAAC ATTGACATG - GC-CCAGAGA

H.fa.LT

CCCTAAGT- C CAATA-ATGA GTACGGTGGT ACGGACATG - GC-CCAAGGA

H.fa.GB

CCCTAAGT- C CAATA-ATGA GTACGGTGGT ACGGACATG - GC-CCAAGGA

E.ha.LT

CTCTAAGT- C CAGTT-ATGA AAACGGT- CC CTGGACATT - GC-CCATAGA

C.pa.GB

CTCCAAGT- C CAGCA-ATGA GTACGGTTAT ATTGACTTG - GC-CCAGAGA

L.cf.ca.GB

CTCTAAGT- C CAGTT-ATGA ATACGGT-TC ATGGACGTT - GC-CCATAGA

L.ca.GB

CTCTAAGT- C CAGTT-ATGA ATACGGT-TC ATGGACGTT - GC-CCATAGA

P.pa.GR

CCCTAAGT- C CAACA-TTGA GTGCGGTTGT ATGGACATG - GC-CCAGGGA

P.pa.GB

CCCTAAGT- C CAACA-CTGA GTGCGGTTGT ATGGACATG - GC-CCAGGGA

D.pu.GB

ATCAAGCTGT TGATTTATAT TTATATTTAT GT-AATGTTC ACACGATAGG

T.pa.LT

GGGTGAAAGG CCCGTGGAGG TGGAGATC - - - AGAAATGTC CGCGCTTA - -

T.ha.GB

GGGTGAAAGG CCCGTGGAGG TGGAGATC - - - AGAAATGTC CGCGCTTA - -

T.sp.GR

GGGTGAAAGG CCCGTTGAGG TGGAGATC - - - AGGTATGTC CGCGCTTG - -

P.ce.LT

GGGTGAAAGG CCCGTGGGAG TGAGGTCGC - - AGACATGCC AGTGCTTT - -

H.fa.LT

GGGTGAAAGG CCCGTGGGGG TGGAGATC - - - ATGTTGGCC AGTACATT - -

H.fa.GB

GGGTGAAAGG CCCGTGGGGG TGGAGATC - - - ATGTTGGCC AGTACATT - -

E.ha.LT

GGGTGAAAGG CCCGTATGAG CGGAG - - - - - - AGGTTGGC - AGTCTATT - -

C.pa.GB

GGGTGAAAGG CCCGTGGGGG TGAGGTCGC - - AGAAATGTC AGTGCCTT - -

L.cf.ca.GB

GGGTGAAAGG CCCGTGTGAG CGGAG - - - - - - ACGTTAGC- AGTGTTGT - -

L.ca.GB

GGGTGAAAGG CCCGTATGAG CGGAG - - - - - - ACGTTAGC- AGTGTTGT - -

P.pa.GR

GGGTGAAAGG CCCGTGGGGG TGGAGGC - - - CAGACAGGTT GTGTCACTA

P.pa.GB

GGGTGAAAGG CCCGTGGGGG TGGAGAT - - - CAGATATGTT GGTATCACTA

D.pu.GB

CCATGTA - CT CTCGAGCGTT TTTATATCTT TATATGCGTT TATCATTAAG

T.pa.LT

T - CGAGTTTG ACCATGGAGT CGGGTTGTT - TGTGAATGCA GCCCAAAGTG

T.ha.GB

T - CGAGTTTG ACCATGGAGT CGGGTTGTT - TGTGAATGCA GCCCAAAGTG

T.sp.GR

T - CTTGTTTG ACCATGGAGT CGGGTTGTT - TGTGAATGCA GCCCAAAGTG

P.ce.LT

CCTGGAT-AG ACCTTGGAGT CGGGTTGTT - TGTGAATGCA GCCCAAAGTG

H.fa.LT

CCTGGAG-AG ACCTTGGAGT CGGGTTGTT - TGTGAATGCA GCCCAAAGTG

H.fa.GB

CCTGGAG-AG ACCTTGGAGT CGGGTTGTT - TGTGAATGCA GCCCAAAGTG

E.ha.LT

CCTGAAC-TT ACCTTGGAGT CGGGTTGTT - TGAGAATGCA GCCCAAAGTG

C.pa.GB

CCTGGAT-AG ACCTTGGAGT CGGGTTGTT - TGTGAATGCA GCCCAAAGTG

L.cf.ca.GB

CCTGAGT-GT ACCTTGGAGT CGGGTTGTT - TGAGAATGCA GCCCAAAGTG

L.ca.GB

CCTGAGT-AT ACCTTGGAGT CGGGTTGTT - TGAGAATGCA GCCCAAAGTG

P.pa.GR

TATGAGT-AG ACCTTGGAGT CGGGTTGTT - TGTGAATGCA GCCCAAAGTG

P.pa.GB

TATGAGT-AG ACCTTGGAGT CGGGTTGTT - TGTGAATGCA GCCCAAAGTG

D.pu.GB

CC------AC GA CTCGAGCAC- AACCCACCG - CGTCAACTCA ATCAGAAGTA

T.pa.LT

-GGTGGTAAA CTTCATCCAA GGCTAAATA - - CGTACACGA GTCCGATAGC

T.ha.GB

-GGTGGTAAA CTTCATCCAA GGCTAAATA- -CGTACACGA GTCCGATAGC

T.sp.GR

-GGTGGTAAA CTCCATCCAA GGCTAAATA- -CTTGCACGA GTCCGATAGC

P.ce.LT

-GGTGGTAAA CTCCATCCAA GGCTAAATA- -CTAACACGA GTCCGATAGC

H.fa.LT

-GGTGGTAAA CTCCATCCAA GGCTAAATA- -CTAGCACGA GTCCGATAGC

H.fa.GB

-GGTGGTAAA CTCCATCCAA GGCTAAATA- -CTAGCACGA GTCCGATAGC

E.ha.LT

-GGTGGTAAA CTCCATCCAA GGCTCAATA- -CTGGCACGA GTCCGATAGC

C.pa.GB

-GGTGGTAAA CTCCATCCAA GGCTAAATA- -CTAACACGA GTCCGATAGC

L.cf.ca.GB

-GGTGGTAAA CTCCATCCAA GGCTCAATA- -CTGGCACGA GTCCGATAGC

L.ca.GB

-GGTGGTAAA CTCCATCCAA GGCTCAATA- -CTGGCACGA GTCCGATAGC

P.pa.GR

-GGTGGTAAA CTCCATCCAA GGCTAAATA- -CTGACACGA GTCCGATAGC

P.pa.GB

-GGTGGTAAA CTCCATCCAA GGCTAAATA- -CTGACACGA GTCCGATAGC

D.pu.GB

CTACGCCAGA CTAGG-CTGT GGCCGGACAA ATTAGGACGG AGCCTTTG - -

T.pa.LT

GAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTTTGAA GAGAGAGTAA

T.ha.GB

GAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTTTGAA GAGAGAGTAA

T.sp.GR

GAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTTTGAA GAGAGAGTAA

P.ce.LT

AAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTTTGAA GAGAGAGTAA

H.fa.LT

GAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTCTGAA GAGAGAGTAA

H.fa.GB

GAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTCTGAA GAGAGAGTAA

E.ha.LT

GAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTCTGAA GAGAGAGTAA

C.pa.GB

GAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTTTGAA GAGAGAGTAA

L.cf.ca.GB

GAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTCTGAA GAGAGAGTAA

L.ca.GB

GAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTCTGAA GAGAGAGTAA

P.pa.GR

AAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTTTGAA GAGAGAGTAA

P.pa.GB

AAACAAGTAC C-GTGAGGGA AAGTTGAAAA GTACTTTGAA GAGAGAGTAA

D.pu.GB

-ACCAGCAAC CCGCGTTGAT ATACGGGTAT ATATGCCGGC AGGCACGCGC

T.pa.LT

ACAGTGCGTG AAGCCGCATA GAGGTTAAAC G-GGTAGAGT T-AAGCTGCG

T.ha.GB

ACAGTGCGTG AAGCCGCATA GAGGTTAAAC G-GGTAGAGT T-AAGCTGCG

T.sp.GR

ACAGTGCGTG AAGCCGCATA GAGGTTAAAC G-GGTAGAGT T-AAGCTGCG

P.ce.LT

ACAGTGCGTG AAACCGCTCA GAGG-TAAAC G-GGTGGAGT T-GAACTGTA

H.fa.LT

ACAGTGCGTG AAGCCGCTCA GAGG-TAAAC G-GATGGAGT T-AAACTGTG

H.fa.GB

ACAGTGCGTG AAGCCGCTCA GAGG-TAAAC G-GGTGGAGT T-AAACTGTG

E.ha.LT

ACAGTACGTG AAACCGCGCA AAGG-TAAAC G-GGTAGAGT T-GAACTGCA

C.pa.GB

ACAGTGCGTG AAACCGCTCA GAGG-TAAAC G-GGTGGAGT T-GAACTGTG

L.cf.ca.GB

ACAGTACGTG AAACCGCGCA AAGG-TAAAC G-GGTAGAGT T-GAACTGCA

L.ca.GB

ACAGTACGTG AAACCGCGCA AAGG-TAAAC G-GGTAGAGT T-GAACTGCA

P.pa.GR

ACAGTGCGTG AAACCGTTCA GAGG-TAAAC G-GGTGGAGT T-GAACTGCA

P.pa.GB

ACAGTGCGTG AAACCGTTCA GAGG-TAAAC G-GGTGGAGT T-GAACTGCA

D.pu.GB

CCAATCCACG A- - - - - CTTA AAGT-GCATC GTGATAG- -A TGGAA-AGCC

T.pa.LT

TG - AGTCATG - - GATTCAGC TGG - TGAATT -TGGC-TTGT GCTTG-GACA

T.ha.GB

TG - AGTCATG - - GATTCAGC TGG - TGAATT -TGGC-TTGT GCTTG-GACA

T.sp.GR

TG - GGTCATG - - GATTCAGC TGG - TGAACT -TGAC-TTGT GCTTG-GGCA

P.ce.LT

AT - CTCTGTG - - GATTTAGC TGG - TGAGTA -TGGC-TTGT GCTTG-GACA

H.fa.LT

AG - TTTCGGG - - GGTTCAGC TGG - -TGGCA TTGA--TCGG GCTTG-GTCG

H.fa.GB

AG - TTTCGGG - - GGTTCAGC TGG - -TGGCA TTGA--TCGG GCTTG-GTCG

E.ha.LT

AG - CCTGGAA - - GATTCAGC TGGTTCGGTT

- - GGT-TGGT GGCTG--GCA

C.pa.GB

AT - CTCTGTG - - GATTTAAC TGG -TGAGCA

- TGGT-TTGA GCTTG - GGCA

L.cf.ca.GB

AG - CCTGCAA - - GATTCAGC CGGTTTGGT - - - GGTATGCT CGGTG - - - - -

L.ca.GB

AG - CCTGCAA - - GATTCAGC TGGTTTGGT - - - TGCGAGGT TGGTG - - - - -

P.pa.GR

AGCTCTGAGG

- - - ATTCAGC TGG-TGAGTG T- - GGTTTGA GCTTGG - - - G

P.pa.GB

AACTCTGAGG

- - - ATTCAGC TGG-TGGGTG T- - GGTTTGA GCTTGT - - - G

D.pu.GB

GACCCTCGGA CAGACGTGGC CAC-AGGATA T- - - - CCCGT AGCCGCAATA

T.pa.LT

TA- - -ATGCA ATCATCTG-A GTCTGCTT- A GCTG-CAGGT CCCTCT - - - -

T.ha.GB

TA- - -ATGCA ATCATCTG-A GTCTGCTT- A GCTG-CAGGT CCCTCT - - - -

T.sp.GR

CATT-GTATC GTCTTCTG-A GTCTGCTT- A ACTG-CAGGT TCCAGGATTC

P.ce.LT

AA- -TTGGTT GAGTCCTGGA ATCTGCTT- A GCCG-CGGGT CCTTGCCT - -

H.fa.LT

AG- -TTTGTT GGGCCCTGTG GTCTGCGA- A GTAG-CAGGT CCTCGCC - - -

H.fa.GB

AG- -TTTGTT GGGCCCTGTG GTCTGCGA- A GTAG-CAGGT CCTCGCC - - -

E.ha.LT

TAA- - - - - - - - - - - - - - - AG GTTCGCTT- A ACGG-CGGGT CACTGCTTCC

C.pa.GB

TA- -TTGGTT GTATTCTGGA ATCTGCTT- A GCCG-CAGGT CCTTGCCT - -

L.cf.ca.GB

-G- - - - - - - - - - -- - - - - - - - -TCCGATA- A AAAT-CGGGT CAGTGCTCCT

L.ca.GB

-G- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CCGTGAAG TTAC-CGGGT CAGTGCTCCT

P.pa.GR

TATACTGGTC GGCCGATCAA GTTCGCTT- A ATTG-CGGGT CCCTGTCATT

P.pa.GB

TATACTGGTC GGCCAATCAA GTTCGCTT- A ATTG-CGGGT CCCTGTCATT

D.pu.GB

TGCG - -TTCA AGATGTCGAT GTTCAAAGCA GTATGCAGTT CAC-ATTAAT

T.pa.LT

- - - - - - - - GG GATT-CGCGA GG-CACTTTT -TAAGTGTT - - - - - - - - - - G

T.ha.GB

- - - - - - - - GG GATT-CGCGA GG-CACTTTT -TAAGTGTT - - - - - - - - - - G

T.sp.GR

CT- - - - - - GG GATA-TGCGA CG-CACTTAC -TGGGGGCT - - - - - - - - - - G

P.ce.LT

- TCGGGTAGG GATG-CGTGA TG-CACTCAT -CAGGTGCT - - - - - - - - - - A

H.fa.LT

- - CGGTGGG GATG-CGCGA TA-CACTCGT

-GGAGTGTT - - - - - - - - - - G

H.fa.GB

- -TCGGTGGG GATG-CGCGA TA-CACTCGT -CGAGTGTT - - - - - - - - - - G

E.ha.LT

TGTGGGTGGT GAC- - - GGGT GTGCACTCGA -CAAGTGTAG CCT- - - - - - C

C.pa.GB

-TCGGGTGGG GATT-CGCGA TG-CACTCAC -CAGGTGCT- - - - - - - - - - G

L.cf.ca.GB

TGTGGGTGCT GTC- - - GGAT GTGTACTTAT CATGGTGCAG TCC- - - - - - -

L.ca.GB

TGTGTGTGCT GTC- - - GGAC GTGTGCTTAA CATG-TGCAG TCC- - - - - - -

P.pa.GR

GGCAGG- - - - GAT- - - GCGG GGGCACTTGC -CAAGTGCTG CGC- - - - - - -

P.pa.GB

GGCGGG- - - - GAT- - - GCGA GGGCACTTGT -CAAGTGCTG CGC- - - - - - -

D.pu.GB

TCACACAGTT GGCTGCACTC TT-CATCGAC ACACGAGCCG - -AGTGATCC

T.pa.LT

CGTGCTCAG - TTG - - ACATT ACAG- - - CTA TTTGCCGGTG CACTTCCATG

T.ha.GB

CGTGCTCAG - TTG - - ACATT - - - CTA - - - - TTTGCCGGTG CACTTCCATG

T.sp.GR

CATGCTTAG - TT - - - - GATG AGATGT-CGG TTCGTCGGTG CACTTCTAGG

P.ce.LT

CGCGTTCTG - - - G - - GTATC TCGT- GCTAG CTCGCCAGTG CACTTTCACA

H.fa.LT

CGCGCT- - - G CAG- - GTGTC CCGG-GCCGG GCTGCCAGTG CACTCCCTCG

H.fa.GB

CGCGCT- - - G CAG- - GTGTC CCGG-GCCGG GCTGCCAGTG CACTCCCTCG

E.ha.LT

GCT-TTTGTG TTG- - GTGC - - - - - CCCTGG G- - - CCAGTG CACTTCTTTC

C.pa.GB

CGTGTTCCG - - - G - - ATATT TCGT- GCCAG CTCGCCGGTG CACTTTCGCA

L.cf.ca.GB

GCTGCCTAAG CTC- - AAGCT - - - - GCCTAA - - - - CCAGTG CACTTCTTGT

L.ca.GB

GCTACCTCTC CTT - - - TGTT - - - - GCCTGT - - - - CCAGTG CACTTCTTGT

P.pa.GR

- - - GCTTGAA ATGGTTCACC - - - GGGCCAA TTCACCAGTG CACTTTCTCG

P.pa.GB

- - - GCTTGGA GTGGTTCACC - - - GGGCCAA TTCACCAGTG CACTTTCTTG

D.pu.GB

ACCGCTCAAA GTT- - GTACT CCTA- - - TAA TCCTACACAC CGGTTTCCCA

T.pa.LT

AC - TTCTTGA CC- -ACG- -A TCGGTGTTGT TGGACTG-CT CCTGTTGTC -

T.ha.GB

AC - TTCTTGA CC- -ACG- -A TCGGTGTTGT TGGACTG-CT CCTGTTGTC -

T.sp.GR

GT - TCCTTGA CC- -ACG- -A TCGGTGTCGT TGAATTG-CC CTCGTTGTC -

P.ce.LT

GG - GTGATCA CC- -ACG- -A CCGGCATTGT TG-TCTGGCT GTTGTGGTTA

H.fa.LT

GA - ACGGTCA CC- -ACG- -A CCGGCACTGC TG-TCTGTCT TTTATGGTCA

H.fa.GB

GA - ACGGTCA CC- -ACG- -A CCGGCACTGC TG-TCTGTCT TTTATGGTCA

E.ha.LT

AG - GTCTTCA TC- -ACG- -A CCGGCGCTGC TG-TCTGTCT GCTCTGGCT -

C.pa.GB

GA - GTGTTCA CC- -ACG- -A CCGGCACTGC TG-TCTGGCT GTTGTGGTTA

L.cf.ca.GB

GG - GTCTTCA TC- -ACG- -A CCGGCGCTGC TG-TCAGTCT GCCTTGTCT -

L.ca.GB

GG - GTCTTCA TC- -ACG- -A CCGGCGCTGC TG-CCTGTCT GCCTTGTCT -

P.pa.GR

GA - GTAGTCA CC- -ACG- -A CCGGCGCTGC TG-TTGGTCT GCTGTTGTC -

P.pa.GB

GA - GTAGTCA CC- -ACG- -A CCGGCGTTGC TG-TTGGTCT GCTGTTGTC -

D.pu.GB

GATGTATAGA ACTAAAGGT- TCGAGGCTGC AG-CCTGGGC G - - CAAGTCT

T.pa.LT

- - - AAACTGT - - -GGATGTA GGCCT - CA-A CCTATGTCC- - TCGGTGTGA

T.ha.GB

- - - AAACTGT - - - GGATGTA GGCCT - CA-A CCTATGTCC- - TCGGTGTGA

T.sp.GR

- - - AAACTGT - - - GGATGTA GGCCATCA- - CCTATGTCC- - TCGGTGTGA

P.ce.LT

- - - AA-CCGG C - CTTTCTTT GTCCT - CGTG GCTTTGAATT GTCGGGATGG

H.fa.LT

- - - AA-CCTT T - TGTGCATC GTCCT - CGTG GCTTTGTGCA ATCGGGAAGG

H.fa.GB

- - - AA-CCTT T - CGTGCATC GTCCT - CGTG GCTTTGTGCA ATCGGGAAGG

E.ha.LT

- - -AAACCAG T - GGGGCTCG GGCCT - TGTG TCCTTGTTCT GCTGGGATGG

C.pa.GB

- - - AA-CCGG C - CTTGCTTA GTCCT - CGTG GCTTTGCTTT GTCGGGATGG

L.cf.ca.GB

- - -AAACCAG T - TGAGCTCG GTCCT - TGTG GCCTTGTTTG GCTGGGATGG

L.ca.GB

- - -AAACCAG T - TGGGCTCG GTCCT - TGTG GCCTTTTCTG GCTGGGATGG

P.pa.GR

- - AAACTCGT - - CGGATGGG GTCCT - TGCG GCCTTATTCG GCGGGGATGG

P.pa.GB

- - GAACCCGT - - CGGTTAAG TTCCT - TGTG TTCTTATTCG GTGGGGATGG

D.pu.GB

ACCAGGCCAG CGTACATGCA GTCCAGCACG AAGCCAGGT- GCATGCGAGG

T.pa.LT

TAG - TACCTC CACGAA- - - - - - - TGT- - - - - - - - - - - - - - - - GGGC - -TG

T.ha.GB

TAG - TACCTC CACGAA- - - - - - - TGT- - - - - - - - - - - - - - - - GGGC- - TG

T.sp.GR

CAG-CACCCC TGTGAA- - - - - - - TGC- - - - - - - - - - - - - - - - AGGT- - CG

P.ce.LT

CAGGTAGCTC AATTGCCTTG CT-TGTGGCT TGCTGCGAGT TTTGGCT - CT

H.fa.LT

CAGGTAACTC GTTGGC- TTG CT-TGC- - - - - - - - - - - - - - - - AGGCT - CT

H.fa.GB

CAGGTAACTC GTTGGC- TTG CT-TGC- - - - - - - - - - - - - - - - AGGCT - CT

E.ha.LT

CAGGTAGATT GTTGGC- -TA CTT- GC- - - - - - - - - - - - - - - - TAGCT - TG

C.pa.GB

CAGGTAGCTC GATTGCTCTG GCCTGTAGTT CGCTGCGGGT TTTGACT - CT

L.cf.ca.GB

CAGGTAGCCT GTTGGT- -CA CTTCGG- - - - - - - - - - - - - - - - TGGTC -TT

L.ca.GB

CAGGTAGCCT GTTGGT- -TA CTTCGG- - - - - - - - - - - - - - - - TGGCC- TT

P.pa.GR

CAGGTAGCTC GTTGGC- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - TTGTCCTT

P.pa.GB

CAGGTAGCTC GTTGGC- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - TTGTCCTT

D.pu.GB

CAGCAAACCC GTGAAT- - -G GCAAGCCAAA CCGG- - - - - - - - - ATCGCT

T.pa.LT

C-AGT - - TGT - - - CAGCGG - - -GCAGCA- - - - - - - - - - GT TCG - ATGGAC

T.ha.GB

C-AGT - - TGT - - - CAGCGG - - -GCAGCA- - - - - - - - - - GT TCG - ATGGAC

T.sp.GR

C-AGT - - TGT - - - CAGCGG - - -GAAGTA- - - - - - - - - - AT TCA - GTGGAC

P.ce.LT

CGGG- - - TGT TACTAGCTG - - -ACTGCATC - G-GTGCTGT GCA - ATATGT

H.fa.LT

CGGG- - - TGT - AATAGCTG - - -GCTGTAAT - T-TGGCTGT GCA - GTGTGT

H.fa.GB

CGGG- - - TGT - AATAGCTG - - -GCTGTAAT - T-TGGCTGT GCA - GTGTGT

E.ha.LT

CGAT- - - TGT - AATAGCTA - - -GTCAGAGT - GTGAGCTGT GCA - GTGCGT

C.pa.GB

CGGG- - - TGT TATCAGCTG - - -ACCGCATC - G-GTTCTGT ACG - GTGTGT

L.cf.ca.GB

CGGG- - - TGT - AATAGCCA - - -GACTTGGT - GTGATCTGT ACA - GTGTGT

L.ca.GB

CGGG- - - TGT - AATAGCCA -

- -GACTTGGT - GTGATCTGT GCA - GTGTGT

P.pa.GR

CGAG- - - TGT TATCAGCTT - -GGCATCAGT GGTACTGATG CCA - GTGCGT

P.pa.GB

CGAG- - - TGT TATCAGCT - - - GGCATCAGT GGTATTGTA- - CA - GTGCGT

D.pu.GB

TAAACAGTGT AAAAAGGAGT AAACATTATC AGGGCGAGGC GCACGCATAT

T.pa.LT

CGT- GACGGC GGCC- - - - TA GG- - - - CAT- - - - - GCTTTC A - - TGCTCTC

T.ha.GB

CGT- GACGGC GGCC- - - - TA GG- - - - CAT- - - - - GCTTTC A - - TGCTCTC

T.sp.GR

CGG- GACGGC GGCC- - - -TT GGTTGCCCT- - - - TGC - - - - - - ATGCTCTT

P.ce.LT

CGGAGACGGC GG-CTT - -GT G- - GTACAT- - - - - GCGTGC G - - TACTCGT

H.fa.LT

CGGGGACGGC GG-CTC- - TT G- - GTGTGT- - - - - GCGTGC G - ATGCCTTT

H.fa.GB

CGGGGACGGC GG-CTC- - TT G- - GTGTGT- - - - - GCGTGC G - - TGCCTTT

E.ha.LT

CGGAGATGGC G- -GTT- - AT A- -ATGGGTA - - - - GCGTGA A - - TGCTGGT

C.pa.GB

CGGAGACGGC GG-CTT- -GT G- - GTACAT- - - - - GCGTGC G - - TGCTAGT

L.cf.ca.GB

CGGAGACGGC G- -GTT- -GT A- -ATGGGTG - - - - GCGTGG A - - TGCCGGC

L.ca.GB

CGGAGACGGC G- -GCT- -GT A- -ATGGGTG - - - - GCGTGA A - - TGCTGGC

P.pa.GR

CGGAGACGGC GG-CTT- -GT G- -GTGTTGG CAATGCGTGC A - - TGCTCTG

P.pa.GB

CGGGGACGGC GG-CTT- -GT G--GTGTTGG CA-TGCGTGC A - - TGCTCTG

D.pu.GB

AGCACACAGC CTTCTTCAAA C- - - - - - - - - - - - - - CTTGC ACACAACCAT

T.pa.LT

T- - - GCTAGA CAATAGTG-T GTATG-GCTA TCA-TGTG- - - - CTTGTGTA

T.ha.GB

T- - - GCTAGA CAATAGTG-T GTATG-GCTA TCA-TGTG- - - - CTTGTGTA

T.sp.GR

- - - - - CTAGA TTTTGTTG-G GTATG-GTTA TTTGTGTG- - - - CCTGTGCA

P.ce.LT

TG- -GTT- GG CATGTTCGG- GTTTG-GTTG CTA-TGTTG - - - CTCGTGTG

H.fa.LT

CCTTTCT- GG CGTATCCAT- GTCTG-GTTG CTC-AGTTG - - - CTCACCTG

H.fa.GB

CCT-TCT- GG CGTATCCAT- GTCTG-GTTG CTC-AGTTG - - - CTCACCTG

E.ha.LT

TG- - - - TAGT AGACT-GCAG GT-CG-ACTG CCT-AATTG - - - GT- -TGTT

C.pa.GB

TG- - GTT-GG CGTGTCCGA- GTTTG-GTTG CTT-TGTTG - - - CTTGTATT

L.cf.ca.GB

CT- - - - TGTT TGGTC-TGGA GT-TG-GTTG CCT-TCCTG - - - GT- -TGCC

L.ca.GB

CT- - - - TGCC TGTCC-TTGA GT-TG-GTTG CCT-TCCTG - - - GT- -GGTC

P.pa.GR

CC- - - - TGGC AGCTG-TCGG GTTTG-GTTG TCG-TGTCG - - - CCTGTAAA

P.pa.GB

C- - - - - TGGC AGTAC--CGG GTTTG-GTTG TCG-TGTTG - - - CCTGTAAA

D.pu.GB

AA- - - - - -GG TCG-CGCACT ATCCC-ATCG CTCTTGGCAG ATCTGGCAAC

T.pa.LT

AGCAAGC-CT GA- - - - -TGG CTAC- - - - AT ATTGTTATCT - GGTAGTGT -

T.ha.GB

AGCAAGC-CT GA- - - - -TGG CTAC- - - - AT ATTGTTATCT - GGTAGTGT -

T.sp.GR

AACAGGCCCT G- - - - - - TAA CTAC- - - - AC AATGTTATCT AG-TAGAGT -

P.ce.LT

TACGGGC-CT AG- - - - -TGA CAGCTCGGGT ATGTTCAAAT - GGCAGTT - -

H.fa.LT

-GTGAGC- CA AG- - - - -CGG CGACTGGGAT GCGTTCAGTT - GGTTGTT - -

H.fa.GB

-GTGAGC- CA AG- - - - -CGG CGACTGGGAT GCGTTCAGTT - GGTTGTT - -

E.ha.LT

GG- - CTT- GT GG- - - - - - -- - T-TTTG - - - - -CTGCAGTT - - - - AGTT - -

C.pa.GB

AGCAGGC-CT GG- - - - -TGA TAGCTCGGGT TCGTTCAGCC - GGCAGTT - -

L.cf.ca.GB

TT- - CTC- TT TG- - - - - - - - - - - CTGG - - - - - GCTTGGTT - - - - GGTT - -

L.ca.GB

TT- - CTCATG CG- - - - - - - - - - - CTGGG - - - - TTTTGGTT - - - - AGTT - -

P.pa.GR

AGCAGGC-CT GGTG- -ATAG - - - CCCGATG TTGTTTGGCA -GGCAGTG - -

P.pa.GB

AGCAGGC-CT GGTG- -ATAG - - - CTCGGTG TTGTTTGGTA -GGCAGTG - -

D.pu.GB

AATAGTCACG AGAACACCAT CAGAGC- -AT GTGACAGKCT AGGTA- - - - C

T.pa.LT

- GGTGTGTGA GAAGCCGCT- - CAAATGGGC CAA-AG-T - - CGGTGGTGT -

T.ha.GB

- GGTGTGTGA GAAGCCGCT- - CAAATGGGC CAA-AG-T - - CGGTGGTGT -

T.sp.GR

- ATTGTTTGG GAAACCT-TA TTA- - TGGGC CAA-AG-T - - CAGTGGTGT -

P.ce.LT

- - - - GTGTAC GTAG-TGCT-

- TTCCAGGGC CAACAG-T - - CTGTGGTGTT

H.fa.LT

- - - - GCGTGC GTGA-CACG- GGACTTGGGC CAACAG-T - - CTGTGGTGTT

H.fa.GB

- - - - GCGTGC GTGA-CACG- GGACTTGGGC CAACAG-T - - CTGTGGTGTT

E.ha.LT

- - - - CTTTGC GTT- - - GCT- - TTTAATGGC CGATAG-T - - CTGTGATGTA

C.pa.GB

- - - - GCGTGC GTAG-TGCT-

- TTCCAGGGC CAATAG-T - - CTGTGGTGTT

L.cf.ca.GB

- - - - CTTTGC GTT- - - GCT- - TTTAATGGC CGATAG-T - - CTGTGATGTA

L.ca.GB

- - - - CTTTGC GTT- - - GCT- - TTTAATGGC CGATAG-T - - CTGTGATGTA

P.pa.GR

- - - - GCGTGT GTTA-CACTA TCATGAGGGC CTATAG-T - - CTGTGGTGTA

P.pa.GB

- - - - GCGTGT GTTA-CACT- TTGCAAGGGC CTATAG-T - - CTGTGGTGCA

D.pu.GB

CCCGGTCAAA GTAATATTTA - - - - - TATGC - - AGGGCTGA TTG - ACTA-G

T.pa.LT

GTGG-TAAAC TTTCTACCCG ACCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGTT

T.ha.GB

GTGG-TAAAC TTTCTACCCG ACCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGTT

T.sp.GR

GTGG-TAAAC TTTCTACCCG ACCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGTT

P.ce.LT

GCGG-TAGAC GATCCACCTG ACCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGAG

H.fa.LT

GCGG-TAGAC TATCCATCCG CCCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGAG

H.fa.GB

GCGG-TAGAC TATCCATCCG CCCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGAG

E.ha.LT

GTGG-TATGC TCTCTTCCCG ACCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGTT

C.pa.GB

GCGG-TAGAC TATCCACCTG ACCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGAG

L.cf.ca.GB

GTGG-TATGC TCTCTACCCG ACCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGTT

L.ca.GB

GTGG-TATGC TCTCTTCCCG ACCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGTT

P.pa.GR

GTGG-TAGAC CATCCACCTG ACCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGAT

P.pa.GB

GTGG-TAGAC CATCCACCTG ACCCGTCTTG AAA-CACGGA CCAAGGAGAG

D.pu.GB

GCAGGTGAGA TTTATAGT- - - - - CTCCTTG GCAGCATACG CCGGC- - - - C

T.pa.LT

TAACATGTGC GCGAGTCATT G- - - -GGCAA TACGTAACCT AAAGGCGAAG

T.ha.GB

TAACATGTGC GCGAGTCATT G- - - -GGCAA TACGTAACCT AAAGGCGAAG

T.sp.GR

TAACATGTGC GCGAGTCATT G- - - -GGCCA TCCGTAACCC AAAGGCGAAG

P.ce.LT

TAACATGTGC GCGAGTCATT G- - - -GGTGT AACGAAACCT AAAGGCGCAG

H.fa.LT

TAACATGTGC GCGAGTCATT G- - - -GGCGT CACGAAACCC AAAGGCGCAG

H.fa.GB

TAACATGTGC GCGAGTCATT G- - - -GGCGT CACGAAACCC AAAGGCGCAG

E.ha.LT

TAACATGTGC GCGAGTCATT G- - - -GGTTC TACGAAACCT ACAGGCGCAA

C.pa.GB

TAACATGTGC GCGAGTCAAT G- - - -GGCGT AACGAAACCC AAAGGCGAAG

L.cf.ca.GB

TAACATGTGC GCGAGTCATT G- - - -GGTAT TACGAAACCT ACAGGCGCAA

L.ca.GB

TAACATGTGC GCGAGTCATT G- - - -GGTAT TACGAAACCT ACAGGCGCAA

P.pa.GR

TAACATGTGC GCAAGTCATT G- - - -GGCGT TACGAAACCC AAAGGCGTAG

P.pa.GB

TAACATGTGC GCAAGTCATT G- - - -GGCGA TACGAAACCC AAAGGCGTAG

D.pu.GB

TACCGTCTTC GCCAACCAAC ACCATAGTTT TATCTTTCGG GTTCACAGAT

T.pa.LT

TGAAAGTGAA GGTTTGCATT

-TGCAAGCTG TGGTGAGATC CTGTCGTTTC

T.ha.GB

TGAAAGTGAA GGTTTGCATT

-TGCAAGCTG TGGTGAGATC CTGTCGTTTC

T.sp.GR

TGAAAGTGAA GGTTTGCTTT -GGCAGACTG TGGTGAGATC CTGTCGTCTC

P.ce.LT

TGAAAGTAAA GGTCTGACTT GTTCGGACTG AGGTGAGATC CTGCTGTTTC

H.fa.LT

TGAAAGTAAA GGCTCGGTTC GCCCGAGCTA AGGTGAGATC CTGTCGTTTC

H.fa.GB

TGAAAGTAAA GGCTCGGTTC GCCCGAGCTA AGGTGAGATC CTGTCGTTTC

E.ha.LT

TGAAAGTAAA GGTTTGGCTT GTCCGAACTA AGGTGAGATC CAGTCGTTTC

C.pa.GB

TGAAAGTAAA GGTCTGGCTT GTCCGGACTG AGGTGAGATC CTGTTGTTTC

L.cf.ca.GB

TGAAAGTGAA GGTTCGGCTT GTCTGAACTT AGGTGAGATC CGGGCGTATC

L.ca.GB

TGAAAGTGAA GGTTCGGCTT GTCTGAACTT AGGTGAGATC CGGGCGTATC

P.pa.GR

TGAAAGTAAA GGTTCGGCTT GTCCGGACTG AGGTGAGATC CTGGCGTTTC

P.pa.GB

TGAAAGTAAA TGTTCGGCTT GTCCGGACTG AGGTGAGATC CTGACGTTTC

D.pu.GB

TGATTTTAAA AATGCTGATT GACTAGGC- - AGGTGAGATC - TATAGTCTC

T.pa.LT

C- - - - TGTG - - -TCACCGGG CATTCGA-GC GGCAGGCGCA TCACCGGTCC

T.ha.GB

C- - - - TGTG - - -TCACCGGG CATTCGA-GC GGCAGGCGCA TCACCGGTCC

T.sp.GR

C- - - - TGTG - - -CCACCAAG CATTCGA-AC GGCAGGCGCA TCACCGGTCC

P.ce.LT

TCATGCGCGG TATTACCAAG CA-TCGA-GC AGTAGGCGCA TCACCGGCCC

H.fa.LT

TTACGCGCGG TACTACCAAG CA-TCGA-GC GGCAGGCGCA TCACCGGCCC

H.fa.GB

TTACGCGCGG TACTACCAAG CA-TCGA-GC GGCAGGCGCA TCACCGGCCC

E.ha.LT

T- - - GTGTG - CCTTTCCGGG TGTGCGGTAC GGTTGGCGCA TCACCGGCCC

C.pa.GB

TCACGCGCGG TATTTCCAAG CA-TCGA-GC AGCAGGCGCA TCACCGGCCC

L.cf.ca.GB

T- - - GTGTG - CCTCTCGGGG TATGCGGTGC GTTTGGCGCA TCACCGGCCC

L.ca.GB

T- - - GTGTG - CCTTTCGGGG TGTGCGGTGC GTTCGGCGCA TCACCGGCCC

P.pa.GR

TCACGCATGG TATCGCCAAG CATACGA-GC GTCAGGCGCA TCACCGGCCC

P.pa.GB

TCACGCGTGG TATCACCAAG CATACGA-GC GTCAGGCGCA TCACCGGCCC

D.pu.GB

CTTGGCAGCA TACGGCC- GG CCTACCG- - - TCTTCGCCAA CCAAC- - - AC

T.pa.LT

GTCCAATAAT GT- - - GGTTG ATTT- CAGTG A- TTTTACAT CATT- - - - - G

T.ha.GB

GTCCAATAAT GT- - - GGTTG ATTT- CAGTG A- TTTTACAT CATT- - - - - G

T.sp.GR

GTCCAATAAT GT- - - GGTTG AGAT- CATTG G- TTTCACAT CATT- - - - - G

P.ce.LT

GTCCCATGGT GT- - - GGTGA CTCC- CTTCG GAGGGTTCGT CACC- - - - - G

H.fa.LT

GTCCCATGAC

- - - - - - - - - - GTCGGCAGTG GCTCGTCTAT TGCACAGTCG

H.fa.GB

GTCCCATGAC

- - - - - - - - - - GTCGGCAGTG GCTCGTCTAT TGCACAGTCG

E.ha.LT

GTCCCATGGT GTGGTCATAG CTCC- TTGTG AGATGTGCAT CACC- - - - - G

C.pa.GB

GTCCCATGGT GT- - - GGTGA CTTC- TTTCG AGGGGTTCGT CACC- - - - - G

L.cf.ca.GB

GTCCCATGGT GTGGTCACGG CTCC- TTGTG GGTTGTGCAT CACC- - - - - G

L.ca.GB

GTCCCATGGT GTGGTCACGG CTCC- TTGTG GGCTGTGCGT CACC- - - - - G

P.pa.GR

GTCCCATGGC GTGGTCAC-G CTCT- -TCGG AGTTGTGCAT CGTC- - - - - G

P.pa.GB

GTCCCATGGC GTAGTGTC-A CTCT- -T-GT

AGTGGTGCAT CGTC- - - - - G

D.pu.GB

TTTCAGTGGC AT- - - - - - GA CTTA- - - - - -

- - - - - - GCA - CACC- -ACAA

T.pa.LT

GGGCGGAACA TGAGCGCACA CGTTGAGACC CGAAAGATGG TG-AACTATG

T.ha.GB

GGGCGGAACA TGAGCGCACA CGTTGAGACC CGAAAGATGG TG-AACTATG

T.sp.GR

GGGCGGAACA TGAGCGCACA CGTTGAGACC CGAAAGATGG TG-AACTATG

P.ce.LT

GGGCGGAGCA TGAGCGTACA TGTTGAGACC CGAAAGATGG TG-AACTATG

H.fa.LT

GGGCGGAGCA AGAGCGTACA TGTTGAGACC CGAAAGATGG TG-AACTATG

H.fa.GB

GGGCGGAGCA AGAGCGTACA TGTTGAGACC CGAAAGATGG TG-AACTATG

E.ha.LT

GGGTGGAGCA TGAGCGTACA TGTTGAGACC CGAAAGATGG TG-AACTATG

C.pa.GB

GGGCGGAGCA TGAGCGTACA TGTTGAGACC CGAAAGATGG TG-AACTATG

L.cf.ca.GB

GGGTGGAGCA TGAGCGTACA TGTTGAGACC CGAAAGATGG TG-AACTATG

L.ca.GB

GGGTGGAGCA TGAGCGTACA TGTTGAGACC CGAAAGATGG TC-AACTATG

P.pa.GR

GGGTGGAGCA TGAGCGTACA TGTTGAGACC CGAAAGATGG TG-AACTATG

P.pa.GB

GGGTGGAGCA TGAGCGTACA TGTTGAGACC CGAAAGATGG TG-AACTATG

D.pu.GB

AGGCCGTGTT T- - - CAATTA GGGTCAGATG - TGATTGTCT

TGTAATGATC

T.pa.LT

CTTGCGCAGG TTGAAGCCAG GGGAAA

T.ha.GB

CTTGCGCAGG TTGAAGCCAG GGGAAA

T.sp.GR

CTTGCGCAGG TTGAAGCCAG GGGAAA

P.ce.LT

CTTGCGCAGG TTGAAGCCAG AGGAAA

H.fa.LT

CTTGTGCAGG TTGAAGCCAG AGGAAA

H.fa.GB

CTTGTGCAGG TTGAAGCCAG AGGAAA

E.ha.LT

CTTGTGCAGG TTGAAGCCAG AGGAAA

C.pa.GB

CTTGCGCAGG TTGAAGCCAG AGGAAA

L.cf.ca.GB

CTTGTGCAGG TTGAAGCCAG AGGAAA

L.ca.GB

CTTGTGCAGG TTGAAGCCAG AGGAAA

P.pa.GR

CTTGCAAAGG TTGAAGCCAG AGGAAA

P.pa.GB

CTTGCAAAGG TTGAAGCCAG AGGAAA

D.pu.GB

CTTCCGCAGG TTCA - - CCTA CGGAAA

Bảng 3. Đối chiếu trình tự ADN của vùng ITS1 rRNA từ các mẫu sán lá song chủ

P.ce.LT

GGTTTAGCAA GG - - TCATCG GATTGGGACC ATTGTAGTTG CTC - T- - GCA

H.fa.LT

GGTTTAGCAA GG - - TCATCG GATTGGCGCC ATTATGGTTG CTC - - G - CCA

H.fa.GB

GGTTTAGCAA GG - - TCATCG GATTGGCGCC ATTATGGTTG CTC - - G - CCA

E.ha.LT

GGTTTAGCAA GG - - TCATCG GATTGCTTCA AT--CAGTGG TGT – CA - GCC

D.pu.GB

AAATTAGGAC GAAGCCCTCT GACCAGCCAA CCCGCGTTGA TATACGGGGT

P.ce.LT

GCTCG-ACCG GTTCTGAGAA -GACGACCAA A-CTTGATCA TTTAGAGG-A

H.fa.LT

GCCTG - -TTG GTGCTGAAAA -GACGACCGA G-CTTGATCA TTTAGAGG-A

H.fa.GB

GCCTG - -TTG GTGCTGAAAA -GACGACCGA G-CTTGATCA TTTAGAGG-A

E.ha.LT

ACACG-ATTG ATGGTGAGAA -GACGACCGA A-CTTGATCA TTTAGAGG-A

D.pu.GB

ATATATGCC- - - - GGAAGGC AGTCCCCCCA A- -TCCACGA CTTTAAAG- -

P.ce.LT

TCATTACAGT - - - - - -TACA CCTAAACA - C AC - ACC - - - - - - - GCTCAGT

H.fa.LT

TCATCATACC T- -ATAAAAA GCGAAATATA AA - - - - GCGA AAAACACGGA

trên cá chẽm, cá mú và GenBank

H.fa.GB

TCATCATACC T--ATAAAAA GCGAAATATA AA - - - - GCGA AAAACACGGA

E.ha.LT

TCATTAAAGA ACC- - - - -AA CCTAACTAAA - - - - - CCTTC CTGGTTTGGT

D.pu.GB

- CGTGGCCAC A - - - - - - - - - - - - GGATAT - - - - - - - - CCC GTAGCCCGCA

P.ce.LT

CT - - - - - - - - T - ACTGGG - - CTTCG - - - - - - - - - - TGCGG AT - - - - - ATC

H.fa.LT

CC - - - - - - - - A - AACAAG - - CTATAAAGCT ATGA-AGCTG GGTT - - - - - -

H.fa.GB

CC - - - - - - - - A - AACAAG - - CTATAAAGCT ATGA-AGCTG GGTT - - - - - -

E.ha.LT

AA - - - - - - - - T - ACTTGCCA CTG - - - - - - - - - - - - GACGG CC - - - - - - - -

D.pu.GB

ATATGCGTTC AAGATGT - - - CGATGTTCAA AGCAGTATGC AGTTCACATT

P.ce.LT

GTCA - - - - - T ATGTCCGTGC - - - - - - - - AT TT – T - - GCA - - - - - - - - - - -

H.fa.LT

GACATGCCTG GTTTTGATGT T - - - - - - - AT ATAT - -ACTG ATCTTG - - -G

H.fa.GB

GACATGCCTG GTTTTGATGT T - - - - - - - AT ATA T- -ACTG ATCTTG - - -G

E.ha.LT

GACATACCCC CTTTTGGCAA - - - - - - - GG- AGATAAGG- - - - - - CC - - - -

D.pu.GB

AATTCC - - - - ACACA-GTTG GCTGCACTCT TCATCGACAC - - - - ACGAGC

P.ce.LT

- - - - GCATAG TCT - GCCTAA AGCGG - - AGC GCT - - - - TCA G - - TTCCGTC

H.fa.LT

CTATACCT - G TCGCGCAAGT GACTAAGTAC AGTC - - - - TA T - - ACCCGGA

H.fa.GB

CTATACCT - G TCGCGCAAGT GACTAAGTAC AGTC - - - - TA T- -ACCCGGA

E.ha.LT

- TGTATGCCT TAC - GCTCGA CT - - - - - TTG GCTGAA - - - - TGCGCCTTGC

D.pu.GB

C -GAGTGATC CACCGCTCAA A G - - - - TGGT ACTC - - - - CT ATAGCTTTA -

P.ce.LT

AGCATTTCTG CAG-CAT - AG TCTGCCTAAA - - - - - - - - GC GGA - - - - - - -

H.fa.LT

GGGGTGCCTA CCT-GTC - - A GATGCCGATG G-TTTGCTGC GGCCT- - - - T

H.fa.GB

GGGGTGCCTA CCT-GTC - - A GATGCCGATG G-TTTGCTGC GGCCT- - - - T

E.ha.LT

GTACTGATTG ACG -TATCAA AACGAAGGTG GT- -TCATTT GGTCATCGTA

D.pu.GB

- - - CACACCG GTTTCCC - - A GATGTATAAA AC-- - -CAAA GGTTAAA - - -

P.ce.LT

- - - - - - GCGC CTCA- - - - - - - - GTTCCGTC AG- - - - - CAT TTCTGCAG - -

H.fa.LT

GTGTCGCCAG TCTCACTGGA -GGTGACGGG AGG-TGCTGT CTACATGACA

H.fa.GB

GTGTCGCCAG TCTCACTGGA -GGTGACGGG AGG-TGCTGT CTACATGACA

E.ha.LT

CATTGGTTGA TGTGCAG - - - -TGCCCAGGG GCAT- - -TGG CTGTGGTT - -

D.pu.GB

- - - - - - - - GA CTG - - - - - - - CAACCTGGGC GCA-AGTCTA CCA - - -GGCC

P.ce.LT

- - - - - - - - - C ATAGTCTGCC - - TAA – AG - - - - - - CGGAG - - - - - - - - - - -

H.fa.LT

GTGCTAGG-C TTGAAGAGTG G - TTT - GGAC - - TACGGTCT G-GCCACCGC

H.fa.GB

GTGCTAGG-C TTGAAGAGTG G - TTT - GGAC - - TACGGTCT G-GCCACCGC

E.ha.LT

---------G TTGC ATGCT- - - - - GACAGGCCAT - - - - TGTTGC TATGCAACCC

D.pu.GB

AGCCTACATC CAGTCCAGCA CGAAGCC - -A GGTGCATGCG - - - - GGGCAG

P.ce.LT

C - - GCCTCA - - - - - - - - GTT C- - - CG - TCA GTTGTTCTG- - - - - - - - GTG

H.fa.LT

CCCGCCTTAT TGT - - - TATC CTATTATTAC ATT - - - - - - - G-TTCAAGTG

H.fa.GB

CCCGCCTTAT TGT - - - TATC CTATTATTAC ATT - - - - - - - G-TTCAAGTG

E.ha.LT

G - -ACCGTCG - TCTCGGGTG TG - -TAGTGA GTAGGCCGGT GTCATTACGG

D.pu.GB

CAAACCCGT - - - - - - - - GAA T - - - - GGCAA GCCAAACCG- - - - - - - - GAT

P.ce.LT

G - - CTGTAT - C - - - - TGGCT - - - - TTTGT - - - - - - - - CCG TGCA- - GTCG

H.fa.LT

GTAGTAG - T- CCTCGTGGCT G - - - CCTATC -ATTGCTCGG CATA -TGCAC

H.fa.GB

GTAGTAG - T- CCTCGTGGCT G - - - CCTATC - ATTGCTCGG CATA- TGCAC

E.ha.LT

AAGGGGTGCA C - - - - TAGTT GTTGCACGCT A - - CGCTGCC CA -AGCGCCC

D.pu.GB

CGCTTAAAC - - - - - - - - - - - - - - - AGTGTA A - - - - - - - AA TGGATTAAAC

P.ce.LT

ACT - GTCT-- - - - GACAGGG TGC - - - C - - - TACCTGTG - - - - - GAAAAT-

H.fa.LT

- - - - GCCCTT GTGGCATGCA TACGCGCAGT CGCCTGGC - - - - - GGTGCCT

H.fa.GB

- - - - GCCCTT GTGGCATGCA TACGCGCAGT CGCCTGGC - - - - - GGTGCCT

E.ha.LT

G-ATGCTTCG CG - - GGGGGG TGA - - - - - - - CAGCTAGCCT GCGACCACTC

D.pu.GB

A - TTATCA- - - - GGGCGAGG CGTAT- - - - G CAATTGGC - - - - ACACAG - -

P.ce.LT

- - - - C - - - -T G - - CAGTT- - - - - TGCCTGT TTCT - - TCGG AGACC - - - - -

H.fa.LT

TCCCTGGGTT - - - CGACTGA AAACGGCTTC AGCATTTCGG GCGAAA- - - -

H.fa.GB

TCCCTGGGTT - - - CGACTGA AAACGGCTTC AGCATTTCGG GCGAAA- - - -

E.ha.LT

- - - - - - GACT GCTCG - - - - - - - ACACCCCC TCTA - - ACAT ACG - - - - GCT

D.pu.GB

- - - - CCTTCT T - - CAAA - - - - - - - CCTTGC A - - - - - - CAC AAC - - - CATT

P.ce.LT

- AGTGTACAC AGCGGAT-AC - - - - AGGA - - - - - - - TGTAC TT - - - - - - - -

H.fa.LT

- AGCTCGTGG GGTTGGT-GC TGTATGTACA ACTCTTGTGC CGTGGAT- - -

H.fa.GB

- AGCTCGTGG GGTTGGT-GC TGTATGTACA ACTCTTGTGC CGTGGAT- - -

E.ha.LT

GGGTGTGAAG - GGGTGTTAC - - - GTGCATT G - TTACGTGC TAT - - - - - - -

D.pu.GB

- AGGTCGCGC ACTATCCCAT - - - - CG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CCC

P.ce.LT

- C - CCT - - - C TGTG - GTAGT GCTAGGTT - - - - - - - - TAAA G-AGTG--GG

H.fa.LT

- CACTC - - GG CTCGTGTGTC GATGAAG - A- GCGCAGCCAA C-TGTGGGA-

H.fa.GB

- CACTC - - GG CTCGTGTGTC GATGAAG - A- GCGCAGCCAA C-TGTGGGA-

E.ha.LT

- - GCCGCCAC AACACGCGTA GCCGATCCTC TTACACTAAC CTACTA-- - -

D.pu.GB

TTGGCAT - -A TCTG - GCAAC AATAGT - - - - - - - - - - CACG AGAACA-- - -

P.ce.LT

GTTCTG - - - - GA - -TCAG - A TG - - - - - - - - - - - - - AGCGT GTTTGCT- CA

H.fa.LT

ATTCATGTG- AACTGCATGC TCATTTGAAC ATCG-ACTTC TTGAACG- CA

H.fa.GB

ATTCATGTG- AACTGCATGC TCATTTGAAC ATCG-ACTTC TTGAACG- CA

E.ha.LT

- TGCAA- - -C ACCCTGC - C TGCCTGCCTG C - -CTGCCTG GCTAGCTCTA

D.pu.GB

- -CCAT- - CA GAGCAT - - - G TGACA - - - - - - - - - - GGTTA GGTACC-CCG

P.ce.LT

CCCCACCG -C CCTGT - - - - - - - - - - - - TCA TG - - - - - TTG TTTC – C - - - -

H.fa.LT

AATTGCGG -C CACGGGTTTT CTC - - - - - -G TGGCC- - ACG TCTATCCGAG

H.fa.GB

AATTGCGG -C CACGGGTTTT CTC - - - - - -G TGGCC- - ACG TCTATCCGAG

E.ha.LT

CACTTCTT - C CTTAC - - - - - GCAA - - -GCT C - - - - - - - TG TTCGC - - - - -

D.pu.GB

GTCAAAGTAA TAGGTAT- - - - - - - - - - ATA CAG - - - - - TG CTGATTGACT

P.ce.LT

- - - - - - - - - T AC - - - - CATT - - - - - TTACA C- -TGTTAAA GTG - - - GCTC

H.fa.LT

GGTCGGTT-T ATAAACTATC - - - - ACGACG C- -CCATAAA GTCGTGGCTT

H.fa.GB

GGTCGGTT-T ATAAACTATC - - - - ACGACG C- -CCATAAA GTCGTGGCTT

E.ha.LT

- - - - - - - - - T TTGA -GCGGT ATGCCTAGCA C - - - - - TGAC GCGGGGGGCC

D.pu.GB

AGGCAAGT-T ATAT - - - - - - - - - - - TCACA GTTTCTTT- G GCA - - - GCAT

P.ce.LT

AGG- CTTGCT -TGC - AT - GC T- - TGTGTCA - TTG -CCCGA - - - - - - CAT -

H.fa.LT

GGGTCTTGCC -AGCCGACAT G - - TATTCCT - CCGTCTCGT CACGGAGGTG

H.fa.GB

GGGTCTTGCC -AGCCGACAT G - - TATTCCT - CCGTCTCGT CACGGAGGTG

E.ha.LT

AAT - -TCGCC -CAGCACCTC TCTGCTACGC GCTTACTTGA - - - - - - - ATC

D.pu.GB

AC-GCTAGCC -TGTAGC - - - - - - - - - CCTC ATCAACCAAC A- - - - CCGT -

P.ce.LT

- - - GCAC - - T TGG - -TGCTT G - - - - - - CA - - CTAACCT- - GCATGTG- - C

H.fa.LT

T-CGGATCAA TGGCTTCTCC - - - - - - - - - - - CTAATGTAT CCAGGCG- - C

H.fa.GB

T-CGGATCAA TGGCTTCTCC - - - - - - - - - - - CTAATGTAT CCAGGCG- - C

E.ha.LT

ATTGCAT- -G CGGC -TGACT GTCTAGGCAT TCTGACAAGT GCCTATG- - C

D.pu.GB

- - - - TGT T- T TAATCTTT - - - - - - - - - - - - - CGGGTAA -- ACATGTAAAC

P.ce.LT

AG - - - - TCGC -CTGGCGGTG CCTT - - CCCT GG-GTACGAC TGATAACAC

H.fa.LT

GGTCTGTGGT CCTTCGGGTC CACTT-CGGC GGCGGCGGAG TCGTGGCTT

H.fa.GB

GGTCTGTGGT CCTTCGGGTC CACTT-CGGC GGCGGCGGAG TCGTGGCTT

E.ha.LT

CTTCGACCAA -CATGCATTG CTTT- - CCCA GGCTCTCTGC TCAGGCTAT

D.pu.GB

AT - - - - GTGT GT- - ATAGTG GCATGA-CAT AGCACACCAC GGAGGCCGT