Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC CHỊU NHIỆT SỬ DỤNG TRONG THỨC ĂN CHO CHĂN NUÔI HEO, GÀ QUY MÔ PILOT

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Phạm Huỳnh Ninh

Sinh viên thực hiện

: Trần Lệ Quyên

MSSV: 1311100608 Lớp: 13DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học. Các số liệu, kết quả

nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình

nào. Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực

Sinh viên thực hiện

Trần Lệ Quyên

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp tốt nghiệp ở Phân Viện Chăn Nuôi

Nam Bộ, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã

hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến:

Em xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả

những người thân trong gia đình đã nuôi em khuôn lớn nên người và tận tâm lo lắng,

tạo mọi điều kiện cho em được học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp .

Ngôi trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó suốt bốn

năm qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong

cuộc sống.

Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, các Thầy

Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh

đã trang bị cho em những kiến thức cơ bản, làm nền móng để em thực hiện đề tài và

làm tốt công việc sau này.

TS. Phạm Huỳnh Ninh, Phó bộ môn Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân

Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đề tài tại đây, nhiệt

tình hướng dẫn và hỗ trợ cho em trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Chị Lê Hoàng Bảo Vi, anh Vũ Minh, anh Lê Quang Trí phòng Dinh Dưỡng và

Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy và

giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án

Cô Nguyễn Hoài Hương, phòng vi sinh, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm

– Môi trường, trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em

trong quá trình nhận đề tài

MỤC LỤC

MỤC LỤC ........................................................................................................................ i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................ v

DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................ vii

LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3

1.1 Đại cương về probiotic .............................................................................................................3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic ..................................................................................................3

1.1.2 Định nghĩa probiotic .................................................................................................................4

1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp ..............................................................................................4

1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic ..............................................................7

1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic................................................................................................8

1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi ...............................................................................11

1.1.7 Probiotic từ bào tử ...................................................................................................................12

1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng Probiotic trên thế giới và Việt Nam ....................13

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus ...........................................................................................18

1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus ...........................................................................................18

1.2.2 Bào tử Bacillus .........................................................................................................................22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................... 25

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài……...………...…………………………...... .........25

2.2 Vật liệu ........................................................................................................................25

2.2.1 Chủng vi sinh vật:..................……………………………….……… ......................... ………25

2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ……………………………………….…. ...................... …....25

2.3 Môi trường nghiên cứu……………………………………………… .. …………26

2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)…………........... 30

2.5 Phương pháp nhuộm Gram……………………………………………… ....... …31

2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton......................... ............ ….32

2.7 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc……………… ..... ..…………32

2.7.1 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang………… ................... ..….33

2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng………………………………........... .......................... ...........34

2.7.3 Khảo sát sự tạo thành bào tử…………………………………….... ........................... ..........35

2.8 Khảo sát các đặc điểm probiotic……………………………………… ............ …...…..….35

2.8.1 Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày…………………………………… ........................ …35

2.8.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật…………………………………… ......................... …..36

2.8.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào ….…………………… .......................... …..37

2.8.4 Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường

vuông góc Cross Streak……………………………………………… ....................................... ….40

2.8.5 Khảo sát môi trường tạo bào tử…………………………………… ........................... …….40

2.8.6 Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất……………………....................... ….41

2.8.7 Sản xuất bào tử dạng pilot…………………………………………… ............................ ….42

2.8.8 Phân tích thống kê dữ liệu…………………………………………… ............................ ….44

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………… ................................... ….45

3.1 Khảo sát các đặc điểm probiotic………………………… ............ ………………………..45

3.1.1 Khả năng chịu axit dạ dày…………………………………… ................... ………………..45

3.1.2 Khả năng chịu muối mật………………………………………… ............................ ………46

3.1.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào ( amylase, protease, cellulase)…… ................. .…48

3.1.4 Khả năng đối kháng kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường

vuông góc Cross Streak………………………………………….… .................... ……51

3.2 Đặc tính sinh học và phân loại chủng đã tuyển chọn………………… ....... …………..53

3.2.1 Đặc tính hình thái của chủng Sub và Yoi………………………… ........................ ……..53

3.2.2 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi……… ................... ……..54

3.3 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Sub…………… ......... ……………………….54

3.3.1 Thiết lập đường chuẩn……………………………………………… ............................. …...54

3.3.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng……………………………… .......................... ……….56

3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi…………… ......... ……………………….56

3.4.1 Thiết lập đường chuẩn……………………………………………… ................................. ...56

3.4.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng………………………… .......................... …………….58

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành bào tử của các

chủng Sub và Yoi……………………………………………………………..… ..................... ……58

3.6 Kết quả khảo sát các điều kiện tạo bào tử tốt nhất………………… ....... ……………..59

3.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot……………………………………………… ............. ……...61

3.7.1 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô

pilot………………………….………………………………………..….. ................................. ..……61

3.7.2 Tiến hành tạo bào tử…………...………………………………... .............................. …..…..62

3.8 Tạo chế phẩm……………………………………………………………… .................. ……..64

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ……………………… …………………....65

4.1 Kết luận………………………………………………………..………...…. …….65

4.2 Kiến nghị……………………………………………………………….… ................... ………65

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… ................ …66

PHỤ LỤC…………………………………………………………………….…......... 74

Phụ lục I: Bảng biểu…………………………………………… ………………….….74

Phụ lục II: Hình ảnh……………………………… ................................ ………….….85

iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

KL Khuẩn lạc

MT Môi trường

N Mật độ tế bào

TB Tế bào

TN Thí nghiệm

VK Vi khuẩn

VSV Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị

trường............................................................................................. ........... ....................17

Bảng 1.2. Các đặc điểm khác nhau của tế bào sinh dưỡng và bào tử... ............... .........23

Bảng 3.1. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn vi khuẩn trong môi trường pH

thấp........................................................ .................. ......................................................45

Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường muối mật

2%........................................... ........................ ..............................................................47

Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus.......... ............... ..........49

Bảng 3.4. Hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định ...... ....51

Bảng 3.5. Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi... ................... ...54

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Sub...... ....................................... .......55

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Yoi...... ................................. .............57

Bảng 3.8. Tỷ lệ hình thành bào tử ở các khoảng thời gian khác nhau với quy mô

pilot............................................. ....................................... ...........................................63

Bảng 5.1. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường pH

thấp................ ........................................ ........................................................................74

Bảng 5.2. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường

muối mật 2%................................................ ....................................... ..........................75

Bảng 5.3. Số liệu đường chuẩn của chủng Sub............... ........................................ ......76

Bảng 5.4. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng

Sub................................................................................... ..............................................77

Bảng 5.5. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Sub.......... .................................. .....78

Bảng 5.6. Số liệu đường chuẩn chủng Yoi.............. ..................................... ................79

Bảng 5.7. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng

Yoi.................................... ............................................. ................................................80

Bảng 5.8. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Yoi................. .................... ............81

Bảng 5.9. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào

và bào tử của các chủng Sub......................................... .................................... ............82

Bảng 5.10. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào

và bào tử của các chủng Yoi............................... .............................. ............................82

Bảng 5.11. Tỷ lệ hình thành bào tử qua 7 môi trường của 2 chủng Sub và Yoi. ......... .83

Bảng 5.12. Mật độ bào tử của các phương pháp tạo bào tử tốt ở các khoảng thời gian

khảo sát khác nhau........................ ................................................... .............................83

Bảng 5.13. Tỷ lệ hình thành bào tử theo thời gian của các phương pháp khác nhau

.......................................................................... .............................................................84

Bảng 5.14. Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô

pilot............. .................................................................................................................. 85

Bảng 5.15. Kết quả khảo sát mật độ bào tử theo thời gian với quy mô piot.. ............ ...86

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật…… ..................... …..9

Hình 1.2. Các cấu trúc chính của bào tử B. Subtilis... ........................................ ...........23

Hình 1.3. Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacilllus...... .............. .24

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát............................................................. .....30

Hình 3.1. Vòng phân giải gelatin (protease), tinh bột (amylase), cellulose (cellulase)

của các chủng Bacillus…… .............................. ……………………………........50

Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định của các chủng Bacillu… ............... .52

Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Sub .................... 53

Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Yoi ................... .53

Hình 3.5. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Sub . .......................... 55

Hình 3.6. Đường cong tăng trưởng chủng Sub theo thời gian .................................... ..56

Hình 3.7. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Yoi . .......................... .57

Hình 3.8. Đường cong tăng trưởng chủng Yoi theo thời gian… .................................. 58

Hình 3.9. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng Sub và

Yoi………………… ..................................................................... ……………………59

Hình 3.10. Tỷ lệ hình thành bào tử bằng các phương pháp khác nhau theo thời gian của

chủng Bacillus subtilis ..……………… ...................................................................... .60

Hình 3.11. Mật độ tế bào với quy mô pilot của chủng Bacillus subtilis ..................... ..61

Hình 5.1. Máy ly tâm Avanti JXN Series .................................................................... .87

Hình 5.2. Chế phẩm thử nghiệm bào tử Bacillus subtilis… ......................................... 87

Hình 5.3. Hệ thống lên men 5 L……………… ........................................................... .88

vii

LỜI MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Khí hậu Việt Nam nóng ẩm theo mùa, thời tiết thay đổi thường xuyên, nhiệt độ

không ổn định là môi trường lí tưởng để vi khuẩn gây bệnh bùng phát ở các chuồng trại

chăn nuôi. Ngành chăn nuôi gặp rất nhiều vấn đề về bệnh tật xuất phát từ đường ruột

và hệ tiêu hóa. Theo thống kê hằng năm, tỷ lệ gia súc và gia cầm chết do mắc bệnh

đường ruột lớn nhất so với nguyên nhân gây bênh khác. Không chỉ vậy, trong chăn

nuôi còn tồn tại các vấn đề khác như lạm dụng kháng sinh và chất tăng trọng gây tác

hại đối với người sử dụng, lãng phí thức ăn do vật nuôi không hấp thụ hết thức ăn, dinh

dưỡng. Vì vậy, để giải quyết được những vấn đề trên đồng thời có thể nâng cao năng

suất hiệu quả kinh tế cho bà con nông dân, Probiotic là một giải pháp hiệu quả nhất

hiện nay. Các tác dụng cơ bản của probiotic là tăng cường khả năng miễn dịch, chống

lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng của vi khuẩn

có hại trong hệ tiêu hóa.

Một lượng lớn các sản phẩm probiotic được sản xuất hay nhập khẩu, phân phối

và sử dụng trong chăn nuôi. Các chế phẩm này chủ yếu chứa các vi khuẩn sống thuộc

các giống Bacillus, Lactobacillus, Enteroccocus, nấm men. Số lượng và chủng loại chế

phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam hiện nay rất đa dạng. Tuy

nhiên, không phải chế phẩm nào cũng đạt chuẩn và phù hợp với môi trường, khí hậu,

điều kiện chăn nuôi Việt Nam. Một chế phẩm probiotic đạt hiệu quả ở một quốc gia

nông nghiệp tiên tiến nhưng có thể hoàn toàn không hiệu quả ở một quốc gia nông

nghiệp đang phát triển như Việt Nam. Nguyên nhân lớn nhất xuất phát từ hệ sinh thái

vi sinh từng nơi.

Hiện nay, trong công nghiệp chế biến thức ăn dạng viên thì nguyên liệu thức ăn sẽ được xử lý ở nhiệt độ từ 70 - 80oC, có khi lên đến 90oC nhằm kiểm soát nguy cơ về

nhiễm khuẩn, ví dụ như Salmonella (Jones và cộng sự, 2004; Doyle và cộng sự, 2006)

cũng như để hồ hóa tinh bột. Quá trình xử lý nhiệt làm giảm đáng kể số lượng vi sinh

vật probiotic trong chế phẩm (chứa các tế bào sinh dưỡng). Vì vậy để đảm bảo cung

cấp đủ lượng vi sinh vật probiotic trong thức ăn viên thì cần phải chọn ra một chủng vi

khuẩn có hoạt tính probiotic và có khả năng chịu được nhiệt độ cao. Bào tử vi khuẩn

probiotic thuộc chi Bacillus được xem là một giải pháp thích hợp cho vấn đề sử dụng

trong thức ăn ép viên cho chăn nuôi gia súc và gia cầm. Bào tử Bacillus khá bền nhiệt,

tính kháng axit cao hơn so với tế bào sinh dưỡng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy bào

tử Bacillus nảy mầm và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật nuôi khoảng 70 - 90%. Ở

Việt Nam, hiện có rất ít các nghiên cứu về việc sử dụng bào tử của các chủng Bacillus

bổ sung vào thức ăn cho động vật, hoặc là chưa được quan tâm thực hiện hoặc đã thực

hiện nhưng không công bố, nếu có cũng rất hạn chế về số lượng các nghiên cứu.

Từ hiện trạng nghiên cứu và sản xuất probiotic như trên cho thấy, việc nghiên

cứu sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử Bacillus ở quy mô pilot là một yêu cầu

cấp thiết nhằm tiến tới sản xuất ở quy mô công nghiệp, đáp ứng yêu cầu ngày càng cao

của ngành chăn nuôi an toàn và góp phần hạn chế nhập khẩu, chủ động nguồn sản

phẩm và làm giảm giá thành sản phẩm. Đây là cơ sở cho việc thực hiện khóa luận

“ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho

chăn nuôi heo, gà quy mô pilot”.

Mục đích đề tài

Sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn Bacillus với quy mô pilot

Nhiệm vụ của đề tài

 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có đặc tính probiotic tốt

 Khảo sát điều kiện tạo bào tử trong điều kiện lên men lỏng

 Sản xuất bào tử Bacillus dạng pilot (5 lít )

 Tạo chế phẩm Probiotic

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về probiotic

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic

Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser

(1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc

bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe

mạnh [53].

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng

minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật

đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở

Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên

nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo

cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908) [53].

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang

tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [37].

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn

lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [38]. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu

Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo

bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường

ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung

cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản

xuất ra được [37]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult”

từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái

niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm

lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên

80 [38].

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus

được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm

chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi.

1.1.2 Định nghĩa probiotic

Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic

được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và

những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” [26]. Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic

đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được

đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng

có lợi cho vật chủ.

Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất.

Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của

probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) probiotic là “chất bổ

sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu

hóa theo hướng có lợi cho vật chủ” [26]; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (2001),

probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số

lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”.

1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp

Chế phẩm probiotic là một tập hợp các chủng VSV có ích. Đó là các TB sống

của các chủng VSV, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất sinh học có tác dụng

đến đời sống cây trồng, vật nuôi, cải thiện MT, đồng thời cũng có tác dụng dương tính

đối với sức khỏe con người khi đưa chế phẩm này vào đường ruột [12].

Chế phẩm probiotic thường gồm các nhóm VSV sau:

Các nhóm VSV cơ bản:

 Nhóm VK lactic [17]:

Đây là nhóm VK thân thuộc với con người từ ngàn xưa. Trong tự nhiên, chúng

phân bố rất rộng rãi, thường gặp nhiều trong các sản phẩm muối chua như dưa chua, cà

muối, mắm chua, sữa chua…Ngoài khả năng sinh axit lactic do lên men đồng hình và

dị hình, VK lactic còn có thể sinh hàng loạt chất có hoạt tính kháng sinh được gọi

chung là bacterioxin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin,

brevin,…Các chất này được dùng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi

với vai trò là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phòng và trị các bệnh

đường tiêu hóa cho người và vật nuôi.

Các chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng VK lactic sau: L.

acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes,

Bifidobacterium, Bifidus bacteria, S. faecalis…[24].

Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng 1 chủng VSV như chế phẩm Antibio của

Hàn Quốc (100% là L. acidophilus) hay Biosubtyl của Đà Lạt (100% là bào tử B.

subtilis) hoặc kết hợp nhiều chủng VSV như chế phẩm Emina thuộc Viện Sinh học

Nông nghiệp Hà Nội (ngoài VK lactic còn có VK Bacillus, VK quang dưỡng khử H2S

và nấm men..) [17].

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng: các VK lactic có một vai trò quan trọng

trong quá trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Nhờ khả năng sản sinh ra axit

lactic, axit pyruvic, tổng hợp vitamin nhóm B, sản sinh enzyme…nên có tác dụng ức

chế VSV đường ruột, cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng của vật chủ…

 Nhóm VK Bacillus

Các VK Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử, sống hiếu khí tùy tiện nhưng

trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Chúng phân bố phổ biến trong tự nhiên.

Một số loài của giống này còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người

và động vật. Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ như

protein, tinh bột, cellulose nhờ khả năng sinh enzyme ngoại bào khá mạnh như:

amylase, cellulase, protease [17].

Ngoài các enzyme trên, các VK này còn có khả năng sinh bacterioxin-chất có

hoạt tính kháng sinh có khả năng ức chế một số VSV gây bệnh đường ruột đặc biệt là E.

coli, đồng thời giúp kích thích tiêu hóa và tăng trọng ở vật nuôi.

Trong chế phẩm probiotic, người ta thường sử dụng các chủng thuộc giống

Bacillus sau: B. subtilis, B. mesentericus, B. megathericum, B. licheniformis, B.

clausii,…[8, 17]. Các chủng này rất có ích, không gây bệnh cho người và vật nuôi.

 Nấm men Saccharomyces:

Nhóm này được con người biết đến từ rất lâu và được sử dụng trong nghề làm

bánh mì, nấu rượu, làm bia, ủ rượu vang…Trong thành phần của TB nấm men rất giàu

protein, vitamin nhóm B và khoáng chất nên thường được bổ sung vào chế phẩm

probiotic để làm giàu sinh khối TB [17]. Chúng còn hấp thu và bài thải độc tố ra ngoài,

tham gia chuyển hóa glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt

động và sinh sản [14, 20]. Ngoài ra, TB nấm men có trong chế phẩm còn tạo mùi thơm,

giúp cải thiện mùi cho MT và nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật nuôi.

Để sản xuất probiotic, người ta thường dùng các chủng sau: S. cerevisiae, S.

carlsbergensis, S. vini hoặc S. pombe [13], đặc biệt là S. boulardii. S. boulardii có tác

động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp, ngừa tiêu chảy do kháng sinh

và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori [10].

 Nấm mốc:

Điển hình là Asp. oryzae, Asp. niger. Trong chế phẩm probiotic, chúng có vai

trò sản sinh các enzym amylase, protease, cellulase,…nhằm tăng cường khả năng tiêu

hóa thức ăn của con người và vật nuôi, đồng thời cũng có thể được bổ sung vào chế

phẩm để hỗ trợ quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ do thức ăn thừa hay phân do

vật nuôi bài tiết ra [17].

Ngoài ra, còn một số nhóm VSV khác cũng được bổ sung vào chế phẩm

probiotic giúp cải thiện MT nước nuôi trồng thủy sản, tăng khả năng làm sạch ao hồ,

giảm hoặc mất mùi hôi thối do H2S… như: VK nitrat (Nitrobacter và Nitrosomonas),

VK quang dưỡng khử H2S, VK tía có lưu huỳnh và VK tía không chứa lưu huỳnh

(Rhodobacter sp., Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas

palustris…) [17]

1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật probiotic với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an

toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt

trong đường tiêu hóa vật chủ. Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các

tiêu chuẩn chủ yếu sau:

- Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày:

Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu

hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên,

các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chịu được áp

lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được sử dụng làm

probiotic phải chịu được pH thấp ít nhất 90 phút, tiếp đến chúng phải gắn vào biểu mô

ruột và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với vật chủ. Vì vậy,

đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu, là một trong những tiêu chí quan

trọng khi sàng lọc, tuyển chọn các chủng probiotic [10].

- Khả năng chịu muối mật:

Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi

sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Do vậy, khi thức ăn cùng với VSV probiotic từ dạ

dày chuyển xuống vùng ruột, tại đây, chúng sẽ chịu tác động của muối mật.

Khả năng sống sót của các chủng VSV sau tác dụng của muối mật là một trong

những đặc tính quan trọng của VSV được sử dụng làm probiotic [10, 21, 23]. Thông

thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của động vật dao động 1 – 3 % [50]. Để tồn tại

và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ

muối mật ≥ 2%

- Khả năng sinh enzyme ngoại bào:

Một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh

enzym tiêu hoá như: amylase, cenlulase và protease, lipase và phytase có vai trò làm

tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ

- Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh:

Lựa chọn được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính

quan trọng nhất trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế

vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Salmonella và Staphylococcus aureus. Hoạt tính kháng

khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:

+ Sản sinh ra các chất Bacteriocin.

+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic.

+ Tạo ra H2O2.

+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.

+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.

+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh.

- Khả năng sinh enzyme ngoại bào:

1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic

Đã có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic, song vẫn còn

nhiều ý kiến khác nhau. Sau đây là tóm tắt những kiểu tác động của probiotic được

nhiều nhà khoa học chấp nhận [9, 24, 26].

Cơ chế tác động của probiotic được tóm tắt như sau [9, 27]

Cải thiện sức khỏe và năng suất

Cải thiện sự cân bằng hệ VK dạ dày – ruột Giảm thiểu sự sản sinh nhóm amin độc hại

Tăng độ hữu dụng của chất dinh dưỡng

Cải thiện sự hấp thu

Phân giải các chất dinh dưỡng như protein,…

Cạnh tranh với VK gây bệnh Vi sinh vật có lợi đường ruột Tổng hợp vitamin

Sản xuất axit hữu cơ

Sản xuất kháng sinh

Ức chế sự phát triển của VK gây bệnh Làm giảm pH

Kích thích miễn dịch Trung hòa các độc tố đường ruột

Hình 1.1 Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật

- Probiotic giúp duy trì hệ VSV có lợi trong đường ruột bằng hoạt động đối kháng

với VSV gây bệnh [28].

Đối kháng là hiện tượng một loài VSV bằng cách này hay cách khác ức chế

hoặc tiêu diệt sự ST và phát triển của một loài VSV khác. Một số nhà khoa học cho

rằng, cơ chế tác động đối kháng xảy ra khi nguồn thức ăn cạn kiệt do sự phát triển

nhanh chóng của một vài loại VSV và tạo điều kiện bất lợi cho sự phát triển của VSV

khác

Hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh bao gồm:

 Cạnh tranh về vị trí bám dính trên nhung mao ruột để tranh giành chất

dinh dưỡng và khối lượng các chất được sinh ra. Khi VSV gây bệnh bị cạnh tranh,

thiếu chất dinh dưỡng nên không thể sinh trưởng và phát triển được. Từ đó có thể ức

chế hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột. Phương

pháp sử dụng probiotic để loại trừ các VK có hại bằng quá trình cạnh tranh tốt hơn

nhiều so với phương pháp sử dụng kháng sinh [24]

 Ngoài khả năng gia tăng về số lượng để cạnh tranh vị trí bám với VSV

gây bệnh, VSV probiotic còn có thể tác động nhờ khả năng sản sinh các chất có hoạt

tính kháng khuẩn như: kháng sinh, bacterioxin, axit hữu cơ, H2O2, ethanol,… Những

chất này được sinh ra trong quá trình sống của VSV, có khả năng tiêu diệt có chọn lọc

các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột [17, 20].

- Gia tăng lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa: probiotic kích thích tính

thèm ăn, làm tăng tích lũy mỡ, nitrogen, Ca, P, Cu, Mn, tiết các enzyme tiêu hóa như

amylase, cellulase, lipase, protease…giúp phân giải các chất dinh dưỡng phức tạp

thành chất đơn giản dễ hấp thụ.

- Tổng hợp vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, B12, làm giảm hoạt tính urease

trong ruột non, ngăn chặn tổng hợp những amin độc, giảm nồng độ NH3 trong phân gia

súc, gia cầm, do đó có ảnh hưởng tốt đối với MT [17].

- Kích thích hệ thống miễn dịch: yếu tố được xác định có vai trò kích thích hệ

thống miễn dịch là thành phần của vách TB vi khuẩn (peptidoglycan). Sự phân hủy

peptidoglycan tạo ra chất muramyl peptid có tác dụng kích thích hoạt động của đại

thực bào (Tannock, 1997). Saarela và cộng sự (2000) cho rằng khả năng bám vào niêm

mạc ruột của probiotic tạo nên sự tương tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống

lympho bào đường ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn dịch và

tạo nên sự ổn định của hàng rào bảo vệ ruột [24].

Tóm lại, probiotic được xem là sản phẩm hữu hiệu cho việc phòng ngừa và điều

trị bệnh tiêu chảy ở vật nuôi nhờ cơ chế cạnh tranh và đối kháng với VSV gây bệnh,

sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể

vật chủ… Tuy nhiên, lợi ích của nó chỉ thể hiện rõ khi vật nuôi có sức khỏe kém, stress

hoặc có sự xáo trộn hệ VSV đường ruột [4].

1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi [17]

Probiotic có tác dụng tốt đối với vật nuôi như gia súc, gia cầm, thủy cầm, thủy

sản. Cụ thể như sau:

- Probiotic giúp phát triển hệ VSV đường ruột bình thường, tăng cường khả năng

tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng từ các loại thức ăn. Đối với gia súc dạ cỏ, probiotic còn

giúp hệ VSV dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn.

- Ức chế và có thể tiêu diệt được các VSV có hại. Làm tăng sức đề kháng và khả

năng chống chịu với các điều kiện bất lợi đối với vật nuôi, phòng chống các dịch bệnh

thường gặp, nhất là bệnh phân trắng ở heo con do E. coli.

Nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (2002) về tác dụng kháng khuẩn

của chế phẩm EM1 (do Nhật Bản sản xuất) cho thấy: chế phẩm này có tác dụng ức chế

E. coli, Salmonella, Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Streptococcus,

Clostridium perfringens, Sarcina lutea. Sau khi dùng chế phẩm EM1 trộn với thức ăn cho heo (khoảng 109 cfu /kg thức ăn), kết quả kiểm tra số lượng E. coli trong 1g phân

heo đã giảm 7% ở heo từ 1 - 21 ngày tuổi, giảm 5,3% ở heo từ 22 - 60 ngày tuổi [24].

- Làm cho gia súc, gia cầm cái mắn đẻ hơn, tăng chất lượng thịt và tăng năng suất

chăn nuôi [17].

Lã Văn Kính (1998) đã tổng hợp các công trình nghiên cứu của các tác giả nước

ngoài khi sử dụng các chế phẩm probiotic trên gà đẻ và gà thịt với kết quả như sau: Đối

với gà đẻ, sản lượng trứng tăng 5% ở mức bổ sung 100mg probiotic/kg thức ăn (Mohal

và ctv, 1995). Khi bổ sung hỗn hợp L. acidophilus và L. casei (khoảng 106 cfu /kg

thức ăn) đã cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển hóa thức ăn và chất lượng lòng

trắng (Tortuero và Fernandez, 1995). Đối với gà thịt, tăng trọng cao và tiêu tốn thức ăn

thấp hơn đối chứng. Đặc biệt là hiệu quả sử dụng thức ăn đã cải thiện 2% khi bổ sung hỗn hợp L. acidophilus và S. faecium (2 x 109 cfu /kg thức ăn) cho gà thịt. [9]

- Góp phần cải thiện chất lượng nước, chống ô nhiễm MT nước, tăng cường khả

năng phân hủy các chất hữu cơ, giảm nồng độ N và P, kích thích sinh trưởng của tảo,

giảm nguy cơ mắc bệnh và tăng năng suất tôm, cá,…[3, 27, 28]. Chẳng hạn như sử

dụng chế phẩm chứa B. subtilis, B. licheniformis, B. polymixa, B. circulans, B.

laterosporus đã làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn và thúc đẩy tăng trưởng của ấu

trùng cá tầm Acipenser nudiventris [59].

- Đặc biệt, dùng chế phẩm probiotic hòa vào thức ăn hay nước uống cho vật nuôi

sẽ làm giảm hoặc làm mất mùi hôi thối gây ô nhiễm chuồng trại chăn nuôi. Có thể

dùng dạng dịch pha loãng phun trực tiếp lên cơ thể vật nuôi như chó, lợn…sẽ mất mùi

thối, phun trực tiếp vào bầu vú con cái khi cho con bú sẽ tránh bị nhiễm khuẩn có hại

[17].

Tóm lại, probiotic đã trở thành sản phẩm hữu hiệu, là bạn đồng hành của người

chăn nuôi, giúp người chăn nuôi tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi [1, 8] .

1.1.7 Probiotic từ bào tử

Probiotic từ bào tử đang ngày càng được dùng rộng rãi dưới dạng thực phẩm bổ

sung cho người và động vật dưới dạng các chất thúc đẩy sinh trưởng và cạnh tranh với

vi khuẩn có hại; trong thủy sản để thúc đẩy sự tăng trưởng của tôm, cá; và dùng để

phòng ngừa bệnh tật. Hiện nay không chỉ ở nước ngoài mà ở tại Việt Nam, nhiều sản

phẩm probiotic Bacillus đã được cấp phép làm thực phẩm chức năng. Các loài được

nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus

coagulans và Bacillus licheniformis.[41]

Các ưu điểm của probiotic từ bào tử:

- Sản phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ở điều

kiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống.

- Bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH axit của dịch vị dạ dày

[30,54], trong khi phần lớn các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt [58]. Một

liều lượng nhất định của bào tử có thể được bảo quản vô thời hạn không cần để trong tủ

lạnh và toàn bộ bào tử trong liều dùng đó sẽ được đi vào ruột để phát triển thành vi

khuẩn sống và phát huy tác dụng.

- Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bào tử vi khuẩn,

các loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B. clausii, B. subtilis, B. cereus, B.

licheniformis với nhiều dạng bào chế và số lượng bào tử khác nhau.

1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic từ các chủng Bacilllus trong

chăn nuôi gia súc và gia cầm trên thế giới và Việt Nam

Với đặc điểm sinh lý, sinh hóa ưu việt, Bacillus là một nguồn gen phong phú,

được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp thực

phẩm, trong lĩnh vực CNSH, trong lĩnh vực y học… Đặc biệt là trong chăn nuôi, con

người đã sử dụng Bacillus một cách hiệu quả trong việc tạo ra nhiều chế phẩm

probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh đường tiêu hóa ở gia súc, gia cầm…

1.1.8.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế

giới

Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura

từ B. subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Asp.

Flavus, Asp. Paraciticus. Nghiên cứu này được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ

sản xuất thức ăn chăn nuôi.

Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc dạng lỏng chứa B. subtilis chủng IP

5832, đến năm 1955 có thêm dạng bột và viên nang mềm. Năm 1962, Guy Albot còn

phát hiện B. subtilis có tác dụng tốt trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và

viêm đại tràng mãn tính. Còn khi trộn thêm với VK lactic, B. subtilis chữa chứng loạn

khuẩn rất hiệu quả ở người và vật nuôi.

Tại Nhật Bản, với chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M. (Effective

Microorganisms) trong đó có Bacillus, do GS.TS. TeRuo Higa, Trường Đại học

Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản nghiên cứu năm 1980. Chế phẩm này được sử dụng

nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo vệ môi trường và đã mang lại hiệu quả

khả quan. Cho đến nay, đây là chế phẩm được hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng,

đặc biệt là khu vực Châu Á, Thái bình Dương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc,

Thái Lan và Việt Nam.

Năm 1999, Kyriakis và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của probiotic LSP

122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy trên heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí

nghiệm này được tiến hành trên 4 lô: Lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng B. toyoi với liều 106 cfu/kg thức ăn, lô 3 và 4 sử dụng B. licheniformis với liều 106 và 107 cfu/kg

thức ăn. Kết quả cho thấy các lô thí nghiệm (2, 3 và 4) đều có tỷ lệ tiêu chảy và tình

trạng tiêu chảy ít nghiêm trọng hơn so với lô đối chứng. Ngoài ra, sự tăng trọng và tiêu tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với lô đối chứng. Trong đó, lô sử dụng 107 cfu B.

licheniformis/kg thức ăn cho kết quả tốt nhất.

Năm 2001, Lema và cộng sự đã dùng probiotic trộn với thức ăn cho cừu ăn liên tục trong 7 ngày với liều 6 x 106 cfu/kg thức ăn để khảo sát sự bài thải của E.coli

O157:H7. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự bài thải E. coli trong phân thấp hơn so với

đối chứng không sử dụng probiotic trộn với thức ăn.

1.1.8.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt

Nam

Năm 1962, yaourt và canh trùng subtilis được Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hưng

dùng để phòng và trị bệnh phân trắng ở heo con, bước đầu cho kết quả khả quan [5].

Năm 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyễn Văn Hùng đã nghiên cứu sản

xuất chế phẩm B. subtilis dạng viên, nuôi cấy trên MT đậu tương, cua đồng,…hấp thu

bằng tinh bột tan. Chế phẩm này dùng cho heo uống với liều 0,5 - 1g/kg thể trọng. Kết

quả sau khi sử dụng chế phẩm, heo tăng trọng nhanh.

Năm 1979-1984, Phan Thanh Phượng và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất chế

phẩm Biolactyl để phòng và trị bệnh đường ruột ở heo.

Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm Coli-

subtyl (E.coli và B. subtilis) đã làm giảm tỷ lệ tái phát tiêu chảy ở heo so với phương

pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt.

Năm 1996, Lê Thị Tài sử dụng Biseptol và Biosubtyl kết hợp với

Cloramphenicol trong điều trị loạn khuẩn đường ruột ở heo con và chó con. Kết quả

ghi nhận được như sau: trên heo con sau cai sữa, tỷ lệ khỏi bệnh khi dùng Biseptol là

80%, Cloramphenicol là 70%, Biosubtyl là 68%, Biseptol + Biosubtyl là 98% và

Biosubtyl + Cloramphenicol là 95 %; còn trên chó con, sử dụng Biseptol cho tỷ lệ khỏi

bệnh là 80%, Biseptol + Biosubtyl là 95% và Cloramphenicol là 80%.

Năm 1998, Lã Văn Kính đã thử nghiệm probiotic trên gà đẻ cho kết quả sản

lượng tăng 5% so với đối chứng không sử dụng probiotic.

Năm 1999, Lưu Thị Uyên sử dụng chế phẩm EM (Effective Microorganisms)

của Nhật Bản trong phòng ngừa và điều trị hội chứng tiêu chảy ở heo, cho thấy số

lượng E.coli trong 1g phân giảm từ 31,1 đến 80,95 triệu vi khuẩn.

Năm 2001, Lê Thị Phượng ghi nhận hiệu quả phòng ngừa tiêu chảy ở heo con của các chế phẩm sinh học Paciflor (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP*, 109 cfu/g) và Pacicoli (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP*, 109 cfu/g + các kháng sinh:

Colistin 4mg + Lincomycin 3mg). Chế phẩm Paciflor bổ sung trong thức ăn heo nái

mang thai giai đoạn cuối và liên tục 28 ngày sau khi sinh đã làm giảm số lượng E. coli

trong phân heo nái và heo con, giảm tỷ lệ tiêu chảy của heo con theo mẹ; heo con ăn

thức ăn có bổ sung Paciflor hoặc Pacicoli thì số lượng E. coli trong phân giảm, giảm tỷ

lệ tiêu chảy và cải thiện tăng trọng heo.

Cũng trong năm 2001 này, Phan Ngọc Kính sử dụng chế phẩm EM trong chăn

nuôi heo thịt cho thấy chênh lệch tăng trọng so với đối chứng tăng từ 20 - 34%, tỷ lệ

thịt xẻ tăng 1,3%, tỷ lệ nạc tăng 4,5%.

Năm 2002, Nguyễn Thị Minh Chiến bổ sung probiotic cho heo con theo mẹ với

liều 0,8, 1,0 và 1,2 tỷ cfu /kg thức ăn cho kết quả khả quan trong việc làm giảm tỷ lệ

tiêu chảy, tỷ lệ chết và nâng cao tăng trọng heo con lúc cai sữa.

Cũng trong năm 2002 này, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng chế

phẩm VITOM 1.1 và VITOM 3 (do Nga sản xuất, chứa B. subtilis chủng VKPMV-

7092-) để phòng, trị bệnh đường tiêu hóa trên heo và gà. Qua đó nhận thấy khi dùng

VITOM 3 tăng trọng trên heo tăng 6%, tỷ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỷ lệ khỏi

bệnh đạt 100% và không có tái phát, còn khi dùng VITOM 1.1 tăng trọng trên gà tăng

11,8%, tỷ lệ khỏi bệnh đạt 99%.

Năm 2003, Nguyễn Như Pho và Trần Thị Thu Thủy đã nghiên cứu sử dụng

probiotic (Oganic Green) trong việc phòng ngừa tiêu chảy do E. coli trên heo con sau

cai sữa đã cho kết quả làm giảm số lượng E. coli thải qua phân, giảm tỷ lệ tiêu chảy,

cải thiện tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn.

Năm 2009, Trần Quốc Việt và cộng sự thuộc Viện Chăn nuôi Việt Nam đã

nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi. Kết quả đã tìm

ra 2 quy trình sản xuất và 2 chế phẩm probiotic làm tăng sinh trưởng vật nuôi 10%,

tăng hiệu quả sử dụng thức ăn 10%, hạn chế 15% tỷ lệ bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi.

Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường:

Bảng 1.1: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt

trên thị trường

Vi sinh vật sử dụng và mật độ (cfu/g)

Sản phẩm Nước sản xuất Bacillus Nấm men

BioGuard Việt Nam

Vi khuẩn Lactic 107 2 x 107 E.lac Hàn Quốc

BioSix Việt Nam 105 4 x 107 105

Lactacids Việt Nam

107 107 Adepro Việt Nam

Lactizym Việt Nam

Ferment Trung Quốc 6 x 105 109

Lacto-Sacc Mỹ 2,5 x 108 4,6 x 106

Tóm lại, các công trình nghiên cứu được tóm lược ở trên đã sử dụng các chế

phẩm probiotic trên gia súc, gia cầm. Mỗi công trình nghiên cứu về những khía cạnh

khác nhau nhưng điều kết luận là probiotic có ảnh hưởng tốt cho vật nuôi như ức chế

VSV gây bệnh, phòng ngừa và điều trị tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và hệ số tiêu tốn

thức ăn,…

1.1.8.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng probiotic dạng bào tử Bacillus

Hồ Thị Việt Thu (2012) đã nghiên cứu hiệu quả phòng bệnh của bào tử Bacillus

subtilis biểu hiện Interferon alpha gà (B. subtilis - ChIFN), một sản phẩm của bộ môn

Vi sinh Ký sinh – Khoa Dược, Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, trong phòng

bệnh Newcastle cho gà được thực hiện trên gà giống Tam Hoàng 3 tuần tuổi. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả thử nghiệm cho gà uống với liều 0,5 x 1010 bào tử B.

subtilis - ChIFN, sau đó công cường độc virus Newcastle độc lực cao với liều 104

ELD50 cho mỗi gà thí nghiệm, đồng thời so sánh hiệu quả của ChIFN chuẩn với liều

104 IU. Kết quả thí nghiệm cho thấy bào tử B.subtilis - ChIFN có khả năng phòng

bệnh Newcastle với tỷ lệ bảo hộ là 79,17% cao hơn so với tỷ lệ bảo hộ bởi ChIFN

chuẩn (45,83%) và so với lô đối chứng Bacillus subtilis (12,50%).

Phạm Kim Đăng và cộng sự (2016) nghiên cứu đánh giá tác dụng của chế phẩm

probiotics NeoAvi GroMax chứa Bacillus dạng bào tử (trộn thức ăn với tỷ lệ 0,3%) đến

khả năng sản xuất gà thịt, giống Ri Ninh Hoà và gà được bổ sung kháng sinh BMD

(Bacitracin Methylene-Disalicylate) 10% (0,4g/kg thức ăn). Kết quả cho thấy rằng số

lượng vikhuẩn E. coli và Salmonella sp.trong hồi tràng và trong phân giảm xuống; số

lượng Lactobacillus sp. trong hồi tràng tăng lên, đồng thời chiều cao và chiều dày lông

nhung biểu mô tá tràng và không tràng tăng lên. Điều này chứng minh tác dụng của

probiotics dạng bào tử chịu nhiệt đến năng suất gà thịt thông qua tác dụng cải thiện hệ

vi sinh vật đường ruột và sức khỏe biểu mô ruột.

Hầu hết các sản phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus hiện đang bán tại Việt

Nam đều được nhập khẩu từ nước ngoài hay sản xuất tại Việt Nam nhưng nguyên liệu

thô được nhập từ nước ngoài (ví dụ như NeoPig Topgold và PigMax chứa bào tử

Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans và Bacillus indicus với các

nồng độ khác nhau dùng cho heo hay Neoavi Supamax dùng cho gà của Biospring,

Anh Quốc). Một sản phẩm nữa chứa bào tử Bacillus đang được phân phối tại Việt Nam là BioPlus®YC của công ty Evonik, sử dụng cho tất cả các loại vật nuôi.

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus

1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus

- Đặc điểm phân loại: Theo Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology,

Bacillus thuộc: [46]

Giới: Bacteria

Nghành:Firmicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales

Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus, Geobacillus

Vi khuẩn Bacillus được Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là “Virbrio

subtilis”. Năm 1872, Cohn đặt tên lại là B. subtilis (Gordon, 1981). Đó là thành viên

của một chi lớn và đa dạng được Cohn nghiên cứu đầu tiên, là một phần của họ

Bacillaceae. Họ Bacillaceae được chia làm 5 chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus,

Clostridium, Sporosarcina, Desulfortomaculum, đặc trưng của họ này là hình thành nội

bào tử [33, 39]

- Đặc điểm hình thái:

Tế bào hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 - 2,2 x 1,2 -7 µm. Các tế

bào thường xếp thành cặp hay chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông. Là VK Gram dương,

hầu hết có catalase dương tính. Chúng thường di động nhờ roi.

Họ Bacillaceae được Fischer trình bày có hệ thống năm 1895 thì nội bào tử

được dùng trong khóa phân loại vi khuẩn. Đặc điểm của chi Bacillus là tất cả có nội

bào tử, hiếu khí, có thể bắt buộc hay tùy ý, hình que và tạo catalase. Một tế bào chỉ có

thể hình thành duy nhất một nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ. Bào tử

có khả năng chịu nhiệt, axit, sự hình thành nội bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp

xúc không khí. Các loài thuộc chi Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà

vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào tử, trong một số trường hợp chỉ hơi phình to lên

một chút [17]. Tùy theo loài, bào tử có thể nằm giữa, gần cuối, hoặc ở cuối [13, 34].

Tuy nhiên, cũng có một số loài thuộc chi Bacillus không tạo bào tử như B.

thermoamylovorans, B. halodenitrificans [46]

- Đặc điểm phân bố:

Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới

các điều kiện khác nhau. Chúng rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ

nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, không khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa,

lớp mùn...chủ yếu là đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N [28, 33].

- Dinh dưỡng và tăng trưởng:

Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dưỡng, thu năng

lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ như đường, amino axit, axit hữu cơ,... Một

số VK tự dưỡng không bắt buộc (B. schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường

chỉ có CO2. Một số loài Bacillus (B. subtilis) có khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong

khi một số loài khác như B. sphaericus, B. cereus cần các hợp chất hữu cơ (vitamin,

axit amin) cho sự sinh trưởng. Đặc biệt Bacillus gây bệnh cho côn trùng như B.

thuringiensis, B. popllae, B. lentimorbus, B. cereus, B. anthracis (trong đó B. cereus,

B. anthracis gây bệnh trên người) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát

triển được trong môi trường VK thông thường như NA, NB [28, 29, 33].

Phần lớn các loài thuộc chi Bacillus là VK hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 30 – 45oC, một số VK chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu lên tới 65oC, hoặc ưa lạnh (5oC – 25oC). Các loài VK thuộc chi Bacillus sinh trưởng

trong khoảng pH rộng từ 2 – 11. Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện sinh trưởng

tối ưu, Bacillus có thời gian thế hệ là 25 phút. Nhờ có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ và

muối rộng nên Bacillus có thể tồn tại ở điều kiện bất lợi trong thời gian dài [23, 28]

- Một số loài Bacillus phổ biến trong tự nhiên:

B. subtilis có khuẩn lạc khô, không màu hoặc có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn

hay tạo ra các lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch. Khuẩn lạc có mép nhăn bám vào

MT thạch. Trực khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, tế bào đứng riêng rẽ hoặc chuỗi. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 36 - 50oC, tối đa là 60oC. Bào tử chịu được nhiệt độ khá cao,

có hình bầu dục, phân bố lệch tâm. Nhờ khả năng sinh một số enzyme ngoại bào

(amylase, cellulase, protease,…) và sinh tổng hợp được nhiều loại KS như subtilin,

subtilosin A, sublancin,…mà B. subtilis được ứng dụng rất rộng rãi trong chăn nuôi, y

học, thực phẩm,…[17]

B. amyloliquefaciens có hình thái khuẩn lạc và tế bào tương tự B. subtilis.

Nhưng khác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men đường lactose nhanh và

lên men glucose chậm. Chúng phân bố phổ biến trong đất, nước. Do có khả năng sinh

tổng hợp mạnh các enzyme như amylase, protease [73], lipase [48], phytase, xenlulase

và xylanase [36] nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme, công

nghiệp thuộc da [31, 39]. Ngoài ra, B. amyloliquefaciens còn được ứng dụng trong các

lĩnh vực khác như nông nghiệp, y học bởi khả năng sinh các chất chuyển hóa như

vitamin, nucleoside purine (inosine, guanosine) [42, 43], chất kháng khuẩn

(bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trưởng thực vật IAA [39, 42,

43, 56]. Đặc biệt, nhiều nghiên cứu cho thấy các chế phẩm probiotic từ Bacillus

amyloliquefaciens đã góp phần cải thiện chất lượng môi trường nước, tăng cường các

phản ứng miễn dịch, kiểm soát sự phát triển quá mức của VSV gây bệnh cho tôm,

cá,…[46].

B. licheniformis là vi khuẩn hoại sinh, bào tử hình ovan, phát tán chủ yếu trong

đất, kể cả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa mạc. Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng

đục, bề mặt nhăn nheo. Tế bào chuyển động nhờ tiêm mao và loài này kỵ khí không bắt

buộc.

B. pumilus phát tán rộng khắp nơi, thường có mặt trong đất nhiều hơn B. subtilis.

Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ không ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế bào B.

subtilis.

B. megaterium có khuẩn lạc hình tròn đều, không có thùy, không có nếp, mép

tròn hoặc hơi lượn sóng, màu trắng kem, trông giống như giọt bạch lạp (nến trắng),

thường có vòng hoặc các vòng đồng tâm trên mặt. Tế bào dài, đứng riêng rẽ hoặc xếp

thành chuỗi. Bào tử hình elip, nằm lệch tâm. B. megaterium được sử dụng trong sản

xuất penicillin nhờ khả năng tổng hợp penicillin amidase. Bên cạnh đó, chúng còn có

thể sản sinh các enzyme phân hủy sinh học, sản sinh vitamin B12, oxetanocin,

cytochromes P450 và một số axit amin khác

B. polymyxa có khuẩn lạc không màu, phẳng, lồi, trơn, lan dần ra xung quanh,

mép đôi khi có thùy. Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Bào tử hình

bầu dục kéo dài. Loại vi khuẩ này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Ngoài ra,

chúng còn có khả năng cố định đạm. Đây là một vi khuẩn rất phổ biến trong đất.

B. cereus có khuẩn lạc phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục. Tế bào đứng

riêng rẽ hay xếp thành chuỗi. Bào tử có hình bầu dục, nằm lệch tâm, tế bào chất có

chứa các hạt và không bào nhỏ. Chúng thường phát tán khắp nơi, sinh sôi, nảy nở trên

thực phẩm và có thể sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm.

1.2.2 Bào tử Bacillus

1.2.2.1 Cấu tạo bào tử vi khuẩn Bacillus

Quan sát bào tử khi không nhuộm, thấy có lớp màu đen ở mép rất sáng và chiết

quang, cấu trúc bào tử bao gồm

- Vỏ bào tử (spore coat): bao quanh lớp màng ngoài, gồm những protein di động,

phức tạp, gồm ba lớp khác nhau. Có chức năng bảo vệ lớp peptidoglycan của bào tử

khỏi bị các tác nhân bên ngoài tấn công như enzyme, UV, chất oxy hóa,...

- Cortex: lớp peptidoglycan dày đặc biệt, bao quanh màng trong. Cortex là thành

phần quan trọng giúp bào tử không bị khử nước, do đó tạo sự bền vững và dạng sống

tiềm sinh. Lớp cortex tích điện âm, trong quá trình nảy mầm, lớp này sẽ nhanh chóng

bị thủy giải do enzyme có sẵn trong bào tử

- Lõi tế bào (core): đây là thành phần quan trọng nhất của bào tử, bao gồm đầy đủ

các thành phần gần giống như tế bào sinh dưỡng như protein bào tương, ribosom, thể

nhân chứa DNA. Tuy nhiên, thành phần bào tưởng của bào tử chứa khoảng 30 – 50%

nước, trong khi tế bào sinh dưỡng là 70 – 88% nước.

Hình 1.2 Các cấu trúc chính của bào tử Bacillus [57]

Bảng 1.2 Các đặc điểm khác nhau của tế bào sinh dưỡng và bào tử [2]

Tế bào sinh dưỡng Bào tử Đặc tính

Tế bào Gram dương, điển Vỏ bào tử dày, khó thấm Cấu trúc

hình nước

Thành phần hóa học

Canxi Thấp Cao

Protein Thấp hơn Cao hơn

Hoạt tính enzyme Cao Thấp

Đặc tính chịu nhiệt Yếu Cao

Đặc tính chịu bức xạ Kém Mạnh

Đặc tính chịu các chất hóa Yếu Cao

học và axit

Khả năng bắt màu chất Dễ nhuộm Phải sử dụng phương

nhuộm pháp đặc biệt

1.2.2.2 Quá trình hình thành và nảy mầm của bào tử vi khuẩn Bacillus

Khi gặp điều kiện bất lợi, vi khuẩn Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử.

Quá trình bào tử hóa bắt đầu từ cuối thời kỳ sinh trưởng, khi gặp điều kiện thức ăn cạn

kiệt hoặc có tích lũy sản phẩm trao đổi chất có hại.

Bào tử vi khuẩn Bacillus có khả năng chịu nhiệt, chịu chất độc và enzyme phân

giải. Trong thời kỳ mới bắt đầu hình thành nội bào tử, vi khuẩn Bacillus tiết ra chất

kháng khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn xung quanh.

Ở các loài thuộc chi Bacillus được nghiên cứu, quá trình hình thành bào tử

tương tự nhau. Toàn bộ quá trình diễn ra trong khoảng từ 8 – 10 giờ, bắt đầu bằng việc

phân chia DNA, tách một nhiễm sắc thể bao quanh bởi màng sinh chất tạo thể nguyên

sinh là dạng bào tử sơ khởi, và kết thúc bằng việc hình thành vỏ bào tử, rút hết nước

tạo thành bào tử trưởng thành và phóng thích ra khỏi tế bào mẹ

Sự nảy mầm bào tử là quá trình chuyển bào tử từ trạng thái ngủ sang trạng thái

sinh dưỡng của vi khuẩn. Quá trình này gồm 3 giao đoạn: hoạt hóa, nảy mầm và sinh

trưởng. Có thể hoạt hóa bào tử bằng cách nâng nhiệt độ trong thời gian ngắn, hạ thấp pH, xử lý hóa chất. Ví dụ bào tử B. subtilis có thể được hoạt hóa bằng cách đun 65oC

trong 5 phút.

Hình 1.3 Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacilllus [44]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại phòng công nghệ sinh học, Bộ môn dinh dưỡng và thức ăn

chăn nuôi thuộc Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ

Thời gian thực hiện : 4/2017 – 7/2017

2.2 Vật liệu

2.2.1 Chủng vi sinh vật:

11 chủng Bacillus do phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn dinh dưỡng và thức ăn

chăn nuôi thuộc Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ cung cấp

3 chủng vi sinh vật gây bệnh: Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella

typhimurium (ATCC 14028), Streptococcus aureus (ATCC 65338)

2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

2.2.2.1 Hóa chất

- Peptone, cao nấm men, cao thịt, NaOH, NaCl, glucose, (NH4)2SO4, K2HPO4,

MgSO4.7H2O, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnCl2.4H2O, ZnCl2, CuCl2, CoCl2.6H2O,

Na2MoO4, KCl, Agar…

- Thuốc nhuộm: tím kết tinh, lugol, safranin, lục malachite…

2.2.2.2 Dụng cụ

Que cấy vòng, ống nghiệm, đĩa petri, pipetman 100μl, 1000μl, 5000μl, đầu típ,

becher 100ml, 500ml, erlen 250ml, 1L, đèn cồn, đèn cồn, bật lửa, ống đong, chai nắp

xanh, bông thấm nước, bông không thấm, lame, lamel…

2.2.2.3 Thiết bị

Các loại máy móc: tủ ấm, nồi hấp vô trùng, tủ cấy vô trùng, máy lắc, tủ sấy,

máy đo OD, kính hiển vi quang học, cân phân tích điện tử, tủ lạnh, máy đo pH, tủ giữ

giống, bồn lên men 5l Biostat, máy ly tâm Avanti JXN Series

2.3 Môi trường nghiên cứu

- Môi trường 1: (Môi trường LB) (MT1) (g/l)

Cao nấm men 5g

Peptone 10g

NaCl 10g

Agar 18g

Nước cất 1000ml

- Môi trường 2: ( MT2) (g/l)

Glucose: 10 g

2 g (NH4)2SO4:

13,6 g K2HPO4:

0,2 g MgSO4.7H2O:

Dung dịch muối khoáng :10 ml

Nước cất 1000ml

Dung dịch muối khoáng:

0,42 g CaCl2:

2,29 g FeSO4.7H2O:

0,1 g MnCl2.4H2O:

0,17 g ZnCl2:

0,03 g CuCl2:

0,06 g CoCl2.6H2O:

0,06g Na2MoO4:

Nước cất 1000ml

- Môi trường 3: ( MT3) (g/l)

Peptone 5g/l

Cao thịt 3g/l

KCl 1g/l

0,25g/l MgSO4

Nước cất 1000ml

- Môi trường 4: (MT4) (g/l)

Peptone 10g/l

Cao thịt 6g/l

KCl 2g/l

MgSO4 0,5g/l

Nước cất 1000ml

- Môi trường 5 (MT5) (g/l):

Glucose 2g/l

0,5g/l MgSO4.7H2O

0,5g/l MnCl2.4H2O

6g/l KH2PO4

Cao thịt hoặc cao nấm men 5g/l

Peptone 3g/l

Nước cất 1000ml

- Môi trường 6 (MT6) (g/l):

Glucose 3g

0,6g MgSO4.7H2O

Cao nấm men 10g

6g K2HPO4

Peptone 5g

NaCl 0,01g

1,14ml FeSO4.7H2O 0,1M

0,3ml ZnSO4.7H2O 0,1M

9,9ml CaCl2 0,1M

30ml MnCl2 0,1M

1000ml Nước cất

- Môi trường 7 (MT7) (g/l)

Peptone 10g

Cao thịt 3g

NaCl 3g

B.complex ( vitamin B1) 0,5ml

Nước cất 1000ml

- MT8: ( MT định tính khả năng sinh amylase) (g/l)

Peptone 10g

Cao thịt 3g

NaCl 3g

Tinh bột tan 1%

Agar 18g

Nước cất 1000ml

- MT9( MT định tính khả năng sinh protease) (g/l)

Peptone 10g

Cao thịt 3g

NaCl 3g

Gelatin 1%

Agar 18g

Nước cất 1000ml

- MT10 (MT định tính khả năng sinh cellulase ) (g/l)

Peptone 10g

Cao thịt 3g

NaCl 3g

CMC 1%

Agar 18g

Nước cất 1000ml

Các chất của môi trường nói trên được hòa theo thứ tự vào nước, các thành phần

khoáng được hòa tan với nước cất trước rồi mới cho vào hỗn hợp môi trường theo thứ

tự của công thức môi trường, điều chỉnh pH cho phù hợp với từng môi trường và hấp khử trùng 121oC trong 15 phút

2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)

11 Chủng Bacillus Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày

Khảo sát khả năng chịu muối mật

Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

Sàng lọc chủng Bacillus có đặc tính probiotic tốt

Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định

Dựng đường cong tăng trưởng

Khảo sát các môi trường tạo bào tử

Chủng Bacillus được chọn

Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất

Sản xuất bào tử quy mô pilot

Tạo chế phẩm

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

2.5 Phương pháp nhuộm Gram

Nguyên tắc

- Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với tím kết

tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào

- Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan

làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi

khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc này  Đỏ vàng với

Safranin hay đỏ tía với Fuchsin

- Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại

do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào  màu tím

Cách tiến hành

- Làm tiêu bản:

 Dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi trên lame

 Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn

- Nhuộm tiêu bản:

 Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal Violet trong 30 giây

 Rửa nước

 Nhuộm lugol trong 1 phút

 Rửa nước

 Tẩy cồn 960 trong 20 – 30 giây, để ngiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt

cồn cho đến khi tan hết màu.

 Rửa nước

 Nhuộm bổ sung Fuchsin hoặc Safranin từ 10 – 30 giây

 Rửa nước

 Thấm khô

 Quan sát [16]

2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton

Nguyên tắc

Dựa trên cấu trúc đặc biệt của bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit.

Trước hết xử lí để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit.

- Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và TB bằng thuốc nhuộm có hoạt tính

mạnh.

- Tẩy màu tế bào chất TB đi và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm bổ sung. Nhờ đó tế

bào chất của bào tử và tế bào chất TB bắt màu phân biệt.

Cách tiến hành

- Dùng dây cấy vòng vô trùng lấy sinh khối vi khuẩn cần xác định làm vết bôi

trên lame

- Đặt 1 cốc nước trên bếp từ và đun sôi. Sau đó đặt lên trên miệng cốc một miếng

giấy lọc

- Cho dung dịch Malachite Green 5% vào vết bôi và đặt lame có sinh khối của vi

khuẩn lên miếng giấy lọc trên cốc và để trong thời gian 5 phút

- Sau đó, rửa vết bôi bằng nước trong khoảng thời gian 30 giây

- Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fuchsin trong khoảng 60 – 90 giây

- Rửa lại bằng nước cất rồi thấm khô

- Quan sát dưới kính viển vi

Đọc kết quả

- Bào tử  màu xanh

- Tế bào sinh dưỡng  màu đỏ [11, 16]

2.7 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Nguyên tắc

Đếm số KL mọc trên MT từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi KL

được hình thành từ một TB duy nhất

Cách tiến hành

- Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Dùng pipetman hút 1ml dịch nuôi cấy đưa sang ống nghiệm có 9ml NaCl 0,85%, ta được độ pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng để được các độ pha loãng 10-2,10-3, 10-4, 10-5, 10-6.

- Chuẩn bị MT thạch đĩa: MT1 được vô trùng cẩn thận.

- Cấy và dàn đều dịch pha loãng.

 Dùng pipetman lấy 0,1ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng 10-4, 10-5,

10-6 cho vào mỗi đĩa Petri, mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa.

 Dùng que trang trang mẫu thật đều trên mặt thạch để tách riêng rẽ từng

TB. Ghi vào nắp hộp Petri các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày cấy, chủng cấy mẫu.

- Lật ngược các đĩa Petri vừa cấy, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC.

- Sau 24 giờ, đếm số KL trong mỗi đĩa. Ghi nhận các độ pha loãng có số KL từ

25 đến 250 KL/đĩa [16, 22, 25, 28]

Cách tính kết quả:

Số lượng tế bào VK trong 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức:

𝑁 n1V𝑓1 + … + 𝑛𝑖V𝑓𝑖

X (CFU/ml) =

Trong đó: X: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1ml mẫu

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn (trong khoảng

25 – 250 khuẩn lạc)

n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường

f: độ pha loãng tương ứng

2.7.1 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang

Nguyên tắc:

Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh

sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng. VSV trong MT nuôi cấy có thể hấp thu

hoặc phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Do đó, số lượng ánh

sáng được hấp thu hoặc phân tán có mối tương quan thuận với số lượng VSV trong

dịch nuôi cấy. Độ đục này chính là giá trị OD (Optical Density) đo được ở bước sóng

600nm (OD600nm) trên máy quang phổ (dựa trên sự tương quan tuyến tính giữa OD600nm

và mật độ TB (cfu /ml) [12, 25]

Cách tiến hành

2.7.1.1 Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ TB (đường

chuẩn)

- Pha loãng huyền phù chứa chủng Bacillus cần xác định thành các huyền phù

khác nhau có độ đục đo ở OD600nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Xác

định giá trị thực tế OD600nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế

- Dùng phương pháp đếm KL, xác định mật độ TB (cfu/ml) của các huyền phù

này.

- Tính giá trị log N (cfu /ml) cho mỗi giá trị mật độ tương ứng với mỗi giá trị độ

đục. Vẽ đường chuẩn biểu diễn của log N (cfu/ml) (trục tung) theo OD600nm (trục

hoành). Xác định khoảng tuyến tính giữa log N (cfu /ml) và OD600nm

- Dùng phần mền Microsoft office Excel 2010 để phân tích sự tuyến tính giữa log

N (cfu /ml) - giá trị OD600nm và dựng đường chuẩn bằng công cụ Insert Charts

2.7.1.2 Xác định mật độ TB theo độ đục và OD600nm

- Sau khi nuôi cấy VK trong MT lỏng với các điều kiện phù hợp, lấy dịch sau

nuôi cấy đo OD600nm (dịch nuôi cấy VK cần được pha loãng trước khi đo OD600nm).

- Từ giá trị OD600nm đo được, dựa vào đường chuẩn suy ra số lượng TB (cfu /ml)

của mẫu và nhân với độ pha loãng.

2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng

Chủng vi khuẩn Bacillus thử nghiệm được tăng sinh trong 50ml môi trường LB

ở 37oC, 24 giờ

Cấy 1 lượng dịch vi khuẩn Bacillus thử nghiệm đã huyền phù vào erlen chứa

450ml môi trường LB sao cho OD xấp xỉ khoảng 0,1 - 0,5; đem nuôi cấy lắc 150 vòng/phút ở 37oC

Xác định đường cong tăng trưởng: đo OD dịch nuôi cấy lắc sau mỗi 2 giờ nuôi

cấy, ghi nhận sự phát triển của vi khuẩn

2.7.3 Khảo sát sự tạo thành bào tử

Kiểm tra mật độ bào tử bằng phương pháp xử lý nhiệt ở 80oC trong vòng 15

phút trong bể điều nhiệt. Pha loãng và cấy trang ở các độ pha loãng thích hợp

2.8 Khảo sát các đặc điểm probiotic

2.8.1 Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày

Nguyên tắc:

Dạ dày của gia súc có pH thấp (1 – 3) là nơi có ảnh hưởng mạnh đến khả năng

sống sót của các chủng VSV được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi.

Dựa vào khả năng chịu pH thấp (1 - 3) của dạ dày và tồn tại sau thời gian tiêu

hóa ở dạ dày (1 - 3 giờ) làm cơ sở để tuyển chọn các chủng probiotic [15, 23]

Cách tiến hành:

Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong -

MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT1 có pH=2 được điều chỉnh bằng -

HCl 1N. Thí nghiệm lặp lại 3 lần

Chuyển dịch huyền vào ống nghiệm đã chuẩn bị Ủ mẫu ở 37oC. Tại các thời điểm 0, 60, 180 phút tiến hành pha loãng -

mẫu bằng cách cấy trang theo mục 3.4.3

Ủ mẫu sau khi trang ở 37oC, 24 giờ. Đếm số KL mọc trên đĩa và tính tỷ -

lệ sống sót của TB sau các khoảng thời gian khác nhau

Kiểm tra kết quả

- Tính tỷ lệ TB sống sót (%)

× 100 𝑁𝑖 𝑁𝑜

Trong đó: Ni: mật độ TB sau thời điểm i (i là 60 và 180 phút)

No: mật độ TB ở thời điểm 0 phút

- Căn cứ vào tỷ lệ TB sống sót ở pH 2 và thời gian khác nhau để chọn

chủng Bacillus

2.8.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật

Nguyên tắc:

Các chủng VSV probiotic khi qua ruột non sẽ chịu tác động của muối mật trong

đường ruột.

Dựa trên khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác động của muối mật

trong đường ruột làm cơ sở để tuyển chọn các chủng probiotic. [15, 23]

Cách tiến hành:

Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong -

MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT1 có bổ sung 2% muối mật. Thí -

nghiệm lặp lại 3 lần

Chuyển dịch huyền vào ống nghiệm đã chuẩn bị Ủ mẫu ở 37oC. Tại các thời điểm 0, 60, 180 phút tiến hành pha loãng -

mẫu bằng cách cấy trang theo mục 3.4.3

Ủ mẫu sau khi trang ở 37oC, 24 giờ. Đếm số KL mọc trên đĩa và tính tỷ -

lệ sống sót của TB sau các khoảng thời gian khác nhau

Kiểm tra kết quả

- Tính tỷ lệ TB sống sót (%)

× 100 𝑁𝑖 𝑁𝑜

Trong đó: Ni: mật độ TB sau thời điểm i (i là 60 và 180 phút)

No: mật độ TB ở thời điểm 0 phút

- Căn cứ vào tỷ lệ TB sống sót ở muối mất 2% và thời gian khác nhau để

chọn chủng Bacillus

2.8.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

2.8.3.1 Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân

Nguyên tắc:

Xác định chủng Bacillus có khả năng sinh enzyme protease thủy phân

gelatin. Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành

vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của

enzyme [11, 16, 24]

Cách tiến hành:

- Nuôi VK trong MT9 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3,

lắc 150 vòng/phút, 37oC

- Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau

đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại.

- Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% gelatin vào đĩa petri. Chờ môi

trường nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi

trường thạch tạo thành các giếng

- Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37oC.

Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh protease sẽ

tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch.

Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt

tính enzym cao:

- Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo

đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì

khả năng sinh enzym càng nhiều

2.8.3.2 Xác định hoạt tính amylase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [19]

Nguyên tắc:

Xác định chủng Bacillus có khả năng sinh hệ enzyme amylase thủy phân

tinh bột thành glucose. Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân

hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh

hoạt tính của enzyme

Cách tiến hành:

- Nuôi VK trong MT8 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3,

lắc 150 vòng/phút, 37oC

- Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau

đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại.

- Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% tinh bột tan vào đĩa petri. Chờ môi

trường nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi

trường thạch tạo thành các giếng

- Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37oC.

Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh amylase sẽ

tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch

Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt

tính enzym cao:

- Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo

đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì

khả năng sinh enzym càng nhiều

2.8.3.3 Xác định hoạt tính cellulase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [11]

Nguyên tắc:

Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành

vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của

enzyme

Cách tiến hành:

- Nuôi VK trong MT10 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3,

lắc 150 vòng/phút, 37oC

- Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau

đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại.

- Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% CMC vào đĩa petri. Chờ môi trường

nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi trường

thạch tạo thành các giếng

- Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37oC.

Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh cellulase sẽ

tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch

Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt

tính enzym cao:

- Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo

đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì

khả năng sinh enzym càng nhiều

2.8.4 Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp

đường vuông góc Cross Streak

Nguyên tắc:

Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy VK vào MT thạch,

những nơi nào có chất ức chế khuếch tán thì nơi đó VSV kiểm định không sinh trưởng

được và tạo thành đường vô khuẩn

Cách tiến hành

- Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu và các chủng vi sinh vật

gây bệnh được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC.

- Sau 24 giờ tăng sinh các chủng Bacillus nghiên cứu, dùng que cấy vòng

lấy một ít sinh khối và cấy chủng VK dọc theo một đường ngang trên đĩa thạch LA, ủ 37oC

- Sau 24 giờ ủ, tiến hành cấy vi khuẩn gây bệnh đã được tăng sinh trước đó

theo các vạch thẳng góc với vạch vi khuẩn đã mọc. Ủ 37oC, 24 giờ.

- Đo khoảng cách giữa mép của vạch vi khuẩn với chỗ vi sinh vật gây bệnh

bắt đầu sinh trưởng

2.8.5 Khảo sát môi trường tạo bào tử

Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong -

MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC

- Chuẩn bị môi trường tạo bào tử: MT1 đến MT8.

MT1 (môi trường LB) đây là môi trường cơ bản cho tất cả các chủng Bacillus

để sinh trưởng và phát triển tốt. [60]

MT2 được sử dụng để khảo sát tạo mật độ bào tử Bacillus subtilis R14 với mật

độ đạt được 108 cfu/ml. [32]

MT3 cho mật độ tế bào Bacillus subtilis 7,5 × 109 cfu/ml, mật độ bào tử: 3,6 × 109 cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử 48%. Trong khi đó MT4 cho mật độ TB

Bacillus subtilis: 6,2 × 109 cfu/ml, mật độ bào tử: 4,8 × 109 cfu/ml, hiệu suất hình thành

bào tử 77% [51]

MT5 mật độ TB Bacillus subtilis EA-CB0575 đạt được 2,01 × 109 cfu/ml, mật

độ bào tử 1,87 × 109 cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử 93,2% [45]

Chủng Bacillis EA-CB0575 khảo sát trên MT6 cho mật độ bào tử là 1,4 × 109

cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử là 94% [35]

Vitamin cần thiết cho sự hình thành bào tử. Vì vậy MT7 sử dụng môi trường

NA kết hợp với B. complas để tạo môi trường kích thích tạo bào tử [49]

- Sau 24 giờ tăng sinh các chủng Bacillus nghiên cứu được cấy chuyển vào

8 môi trường khác nhau. Ủ 37oC, 150 rpm

- Lấy mẫu kiểm tra: kiểm tra mật độ tế bào sau 24 giờ bằng cách đo OD và

mật độ bào tử sau 72 giờ nuôi cấy

2.8.6 Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất

- Chọn chủng có hoạt tính probiotic tốt nhất khảo sát điều kiện tạo bào tử

tốt nhất

- Các điều kiện khảo sát: cô đặc, nuôi cấy môi trường nghèo dinh dưỡng,

nâng pH, tăng nhiệt độ nuôi cấy

Cách tiến hành

- Chuẩn bị giống: Chủng Bacillus tốt nhất được tăng sinh trong MT1 (không

bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC

- Chuẩn bị môi trường: LB, nước muối sinh lý, môi trường tối ưu tạo bào tử

- Sau 24 giờ tăng sinh cấy chuyển chủng vào bình erlen có chứa 450ml môi

trường LB

- Sau 24 giờ nuôi cấy thì bắt đầu xử lý các điều kiện tạo bào tử nhiều nhất:

 Cô đặc: Bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử

được ly tâm ở 5000 vòng/phút, 5 phút. Sau đó sinh khối ly tâm có chứa một lượng nhỏ

môi trường LB được nuôi cấy lắc ở 150rpm

 Nuôi cấy môi trường nghèo dinh dưỡng: Bình erlen có chứa

450ml môi trường tối ưu tạo bào tử được ly tâm ở 5000 vòng/phút, 5 phút. Sau đó sinh

khối ly tâm được nuôi cấy tiếp trong môi trường nước muối sinh lý, lắc ở 150rpm

 pH: Bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử được

nâng pH = 9, 10, 11 bằng NaOH 10N, lắc ở 150rpm

 Nhiệt độ: Chuyển bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo

bào tử vào điều kiện nuôi cấy là 45oC, lắc ở 150rpm.

- Lấy mẫu kiểm tra mật độ tế bào và mật độ bào tử sau các khoảng thời gian

khác nhau:

Kiểm tra kết quả:

- Hiệu suất hình thành bào tử (%)

× 100 𝑀ậ𝑡 độ 𝑏à𝑜 𝑡ử 𝑔𝑖ờ 𝑖𝑛 𝑀ậ𝑡 độ 𝑡ế 𝑏à𝑜 𝑖𝑜

Trong đó: in: là mật độ bào tử tại các thời điểm khảo sát (cfu/ml)

io: mật độ tế bào nhiều nhất (cfu/ml)

2.8.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot

Từ các kết quả đã khảo sát ở trên đề xuất quy trình lên men trong môi trường

lỏng để thu bào tử của chủng Bacillus với mẻ 3,5 L (trong bồn lên men 5 L thuộc

Biostat, Sartorius, Đức )

2.8.7.1 Khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất

Vì thời gian có hạn nên không thể khảo sát hết các yếu tố cần thiết, nên:

- Thừa kế thông số về tốc độ khuấy, oxy hòa tan (pO2) từ các nghiên cứu

khác (Fabrízio Siquer Boniolo và cộng sự, 2012; Trần Hữu Tâm, 2014; S. M. S.

Monteiro và cộng sự, 2014).

pH: thừa kế thông số về pH như khảo sát ở các thí nghiệm trên -

Xác định thời gian có mật độ tế bào cao nhất: 4 giờ lấy mẫu pha loãng và -

cấy trang trên môi trường LB rắn

2.8.7.2 Tiến hành tạo bào tử

Sau khi có thời gian tối ưu cho mật độ tế bào nhiều nhất, bắt đầu chỉnh -

pH từ pH 7 lên 9 để tạo điều kiện bất lợi giúp cho quá trình hình thành bào tử

Theo nghiên cứu của Fabrízio Siquer Boniolo và cộng sự (2012) thì tiếp -

tục khuấy và sục khí để hình thành bào tử. Mặt khác theo Sarrafzadeh và Navarro

(2006) thấy rằng sự gián đoạn cung cấp oxy ảnh hưởng đến việc hình thành bào tử

2.8.7.3 Sản xuất chế phẩm

Sử dụng kết quả của mục 2.8.7.1 và 2.8.7.2

Cách tiến hành

Chuẩn bị giống: Tăng sinh chủng Bacillus trong bình erlen chứa 350 ml môi

trường LB ở 37oC, 150rpm

Sau 24 giờ tăng sinh, cấy chuyển sang bồn lên men có chứa 3150ml môi trường

tạo bào tử tối ưu.

Thời gian lấy mẫu: 4 giờ lấy mẫu 1 lần. Sau 24 giờ bắt đầu xử lý pH từ -

pH 7 lên pH 9 bằng NaOH và tiếp tục 4 giờ lấy mẫu 1 lần.

Kiểm tra bào tử: xử lý nhiệt ở 80oC, 15 phút bằng bể điều nhiệt. Sau đó -

tiến hành cấy trang và pha loãng ở độ pha loãng phù hợp

Thu bào tử: ly tâm ở 5000 vòng/phút, 10 phút -

Sấy: Bào tử sau ly tâm được trộn với bột mì đã được hấp tiệt trùng ở -

121oC, 15 phút, 1 atm và đem sấy ở nhiệt độ 40oC đến khi khô

- Tạo chế phẩm: sau khi bào tử khô được nghiền mịn, bổ sung các chất

mang và đóng gói.

2.8.8 Phân tích thống kê dữ liệu

Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel, trong bộ

Microsoft Office phiên bản 2010

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát các đặc điểm probiotic

Căn cứ vào các tiêu chuẩn chọn chủng VSV làm probiotic, tiến hành sàng lọc và

tuyển chọn chủng Bacillus đáp ứng yêu cầu tạo chế phẩm probiotic

3.1.1 Khả năng chịu axit dạ dày

Khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác dụng của pH thấp ở dạ dày là

một trong những đặc tính quan trọng của chủng VSV được chọn làm probiotic.

Do vậy, tiến hành khảo sát khả năng chịu pH thấp của chúng ở pH 2 tại các thời

điểm 0, 60, 180 phút (tương ứng với thời gian thức ăn lưu lại tại dạ dày). Đếm số

khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, từ đó tính tỷ lệ tế bào sống sót (%) của các chủng VK

khảo sát với các khoảng thời gian khác nhau (mục 1.4.7.1).

Bảng 3.1 Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường pH thấp

Tỷ lệ tế bào sống sót ở pH 2 qua các Kí hiệu khoảng thời gian (%) STT chủng 0 phút 60 phút 180 phút

1 BI1 158,97 27,32 100

2 BI2 30,35 10,58 100

3 BI3 25,61 12,56 100

4 BI4 16,50 10,43 100

5 MN1 25,83 9,87 100

6 MN2 51,75 11,32 100

100 7 Sub 84,73 43,45

100 8 Yoi 115,80 48,44

9 Liche 0 0 100

10 Natto 0 0 100

11 BA 100 0 0

Số liệu ở bảng trên cho thấy rằng dưới tác động của pH thấp (pH 2), hầu hết các

chủng khảo sát đều có xu hướng giảm tỷ lệ sống sót khi kéo dài thời gian xử lý (0 phút

đến 180 phút). Trong 11 chủng thử nghiệm chỉ có 8 chủng (BI1, BI2, BI3, BI4, MN1,

MN2, Sub, Yoi) có khả năng tồn tại ở điều kiện pH thấp cụ thể như sau:

Sau 60 phút khảo sát thì cả 3 chủng Liche, Natto, BA đều không sống sót được

trong môi trường pH 2 (0%). Trong khi đó sau 180 phút khảo sát của 8 chủng còn lại,

tỷ lệ tế bào sống sót cao nhất thu được từ chủng Yoi (48,4%), kế đến là Sub (43,4%),

BI1, BI3, MN2, BI2, BI4, và thấp nhất là MN1 (9,1%). Trong đó chủng BI1 sau 60

phút có sự phát triển trong môi trường pH 2, điều này cho thấy chủng BI1 thích nghi

tốt trong điều kiện này, tuy nhiên sau 180 phút thì tỷ lệ sống sót của chủng giảm mạnh.

Mặt khác, so sánh với các nghiên cứu của nhóm tác giả Hồ Trung Thông và Hồ

Lê Huỳnh Châu (2009) về khả năng chịu pH thấp của các chủng probiotic: sau 180

phút khảo sát ở pH 2, tỷ lệ TB sống sót của 4 chủng LA5, LA6, LA7 và LA11 lần lượt

là 53,56%, 28,42%, 23,23% và 27,81% [21]. Đồng thời, nghiên cứu của Trần Thị Bích

Quyên (2012) cho thấy tỷ lệ sống sót trong điều kiện pH 2 của 4 chủng Q1, Q16, Q22

và Q29 lần lượt là 42,52%, 42,38%, 45,93% và 38,94% [18]. Từ đây có thể thấy khả

năng chịu pH thấp của 8 chủng là tương đối thấp so với các nghiên cứu đã đề cập ở

trên.

Tóm lại, qua 180 phút khảo sát thì chủng Sub và Yoi có tỷ lệ sống sót cao nhất

(48,4%, 43,4%) tương đồng với khá nhiều tác giả

3.1.2 Khả năng chịu muối mật

Trong hệ tiêu hóa, sau khi trải qua điều kiện khắc nghiệt với pH thấp ở dạ dày,

các VSV probiotic lại phải tiếp xúc với muối mật trong đường ruột. Muối mật được coi

là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV

gây bệnh.

Havenaar và cộng sự (1992) đã chỉ ra rằng, probiotic chỉ phát huy tác dụng có

lợi lên vật chủ khi chúng định cư và tồn tại trong ruột non để từ đó hình thành KL, tăng

khả năng kết dính trong đường ruột. Như vậy, dựa trên khả năng sống sót của các

chủng Bacillus sau tác dụng của muối mật trong đường ruột làm tiêu chí quan trọng để

sàng lọc các chủng VSV probiotic. Ở ruột non, nơi dịch mật toàn phần tiết ra có thể có

nồng độ cao nhất khoảng 2%. Vì vậy tiến hành khảo sát khả năng chịu muối mật của

các chủng Bacillus ở nồng độ muối mật 2% tại các thời điểm 0, 60, 180 phút (tương

ứng với hời gian thức ăn lưu lại tại ruột non của người và động vật (Charteris và cộng

sự, 1998)

Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường muối mật 2%

STT Chủng Tỷ lệ tế bào sống sót ở muối mật 2%

qua các khoảng thời gian (%)

0 phút 60 phút 180 phút

1 BI1 89,12 16,25 100

2 BI2 83,86 39,52 100

3 BI3 33,21 7,56 100

4 BI4 21,25 11,17 100

5 MN1 128,79 45,26 100

6 MN2 19,58 7,20 100

100 7 Sub 269,79 64,44

8 Yoi 169,32 27,74 100

9 Liche 35,52 17,94 100

10 Natto 49,08 20,05 100

11 BA 41,34 31,94 100

Bảng số liệu cho thấy, cả 11 chủng đều có khả năng chịu muối mật 2%. Tuy

nhiên tỷ lệ sống sót giảm dần theo thời gian như sau: Sau 180 phút, tỷ lệ sống sót cao

nhất thu được từ chủng Sub (64,44%), kế đến là MN1 (45,26%), BI2, BA, Yoi, Natto,

Liche, BI1, BI4, BI3, và thấp nhất là MN2 (7,20%).

Mặt khác, so sánh với nghiên cứu của Trần Thị Bích Quyên về khả năng chịu

muối mật của các chủng probiotic thấy được 4 chủng Q1, Q16, Q29, Q22 đều có tỷ lệ

sống sót cao từ 75,51% - 105,85%, trong đó chủng Q22 đạt tỷ lệ sống sót cao nhất

105,85% [18]. Ba chủng còn lại có tỷ lệ sống sót ở thời điểm 4 giờ giảm so với thời

điểm 1 giờ khảo sát

Tóm lại, sau 180 phút khảo sát thì chủng Sub cho tỷ lệ tế bào sống sót tốt nhất

với 64,44%

3.1.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase)

Như chúng ta đã biết, thành phần chủ yếu trong thức ăn chăn nuôi là protein

(bột cá, bột xương, bột đậu nành), xơ thô và tinh bột… Tuy nhiên, sự phân tiết các

enzyme tiêu hóa ở dạ dày và ruột non của động vật còn thấp nên khả năng tiêu hóa

thức ăn còn hạn chế và dễ dẫn đến tiêu chảy. Vì vậy, khả năng sinh các enzyme ngoại

bào (amylase, protease, cellulase) của các chủng probiotic có vai trò hỗ trợ tiêu hóa

thức ăn, chuyển hóa các chất khó tiêu thành chất dễ tiêu, giúp heo con tăng trọng

Vì vậy, 11 chủng Bacillus đang khảo sát được tiến hành xát định khả năng sinh

enzyme ngoại bào theo phương pháp ở mục 1.4.7.3

Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus

STT Kí hiệu Đường kính vòng phân giải, D-d (mm)

chủng Protease Amylase Cellulase

1 BI1 15,00 ± 0,00 14,66 ± 0,47 15,67 ± 0,47

2 BI2 13,33 ± 0,47 14,66 ± 0,47 15,67 ± 0,47

3 BI3 13,00 ± 0,82 13,33 ± 0,47 13,00 ± 0,00

4 BI4 16,67 ± 0,47 13,67 ± 0,47 16,33 ± 0,47

5 MN1 14,33 ± 0,47 11,33 ± 2,36 -

6 MN2 9,33 ± 0,94 - 15,67 ± 1,25

7 Sub 15,67 ± 0,47 8,33 ± 0,94 15,00 ± 0,00

8 Yoi 15,00 ± 0,82 13,00 ± 0,00 14,67 ± 0,47

9 Liche 13,33 ± 0,47 15,00 ± 0,00 18,33 ± 0,94

10 Natto 6,67 ± 0,47 8,33 ± 0,47 -

11 BA 15,67 ± 0,47 14,67 ± 0,47 14,67 ± 0,47

Liche BI4 Sub

Liche – Protease BI4 – Protease Sub – Protease

BA BI1 MN2

BI1 – Amylase MN2 – Amylase BA – Amylase

BI4 BI1 BI2

BI4 – Cellulase BI1 – Cellulase BI2 – Cellulase

Hình 3.1 Vòng phân giải gelatin (protease), tinh bột (amylase), cellulose (cellulase)

của các chủng Bacillus

Kết quả khảo sát phía trên cho thấy rằng hầu hết các chủng Bacillus khảo sát

đều có khả năng sinh cả 3 loại enzyme ngoại bào. Có thể đây là một đặc tính nổi bật

của các loài Bacillus để chúng thích nghi và tồn tại với điều kiện môi trường sống phức

tạp. Trong đó, chủng Liche, BI4, BA và Sub có hoạt tính protease tương đối mạnh (15

– 19 mm) so với các chủng còn lại, chủng MN2, BI1, BI2, BA hoạt tính amylase tương

đối mạnh (14 – 15 mm) so với các chủng còn lại, còn hoạt tính cellulase cũng biểu hiện

tương đối mạnh ở các chủng BI4, BI1, BI2, Sub, Liche (14 – 17 mm)

Tóm lại, hoạt tính protease của chủng Liche là tốt nhất với 18,33 ± 0,94 mm.

Hoạt tính amylase của chủng MN2 là tốt nhất với 15,67 ± 1,25mm. Hoạt tính cellulase

của chủng BI4 là tốt nhất với 16,33 ± 0,47 mm

3.1.4 Khả năng đối kháng kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp

đường vuông góc Cross Streak

Để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, ngoài việc cạnh tranh vị trí bám

dính thì khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh là một đặc tính rất quan trọng của

các chủng VSV được chọn làm probiotic. Các chủng Bacillus được tiến hành khảo sát

khả năng đối kháng với 3 chủng VK kiểm định gồm E. coli, Salmonella typhimurium,

Streptococcus aureus. Tiến hành theo phương pháp 1.4.7.4, thu được kết quả như sau:

Bảng 3.4 Hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định

Khoảng cách đối kháng của các chủng Bacillus

(mm) STT Kí hiệu chủng Salmonella Streptococcus E. coli typhimurium aureus

1 BI1 - - 4

2 BI2 - - 6

3 BI3 - - 3

4 BI4 - - 5

5 MN1 - - 2

6 MN2 - - -

7 Sub - - 4

8 Yoi - - 7

9 Liche - - 5

10 Natto - - 4

11 BA - - 2

BI1 BI2 Sub

BI4 Yoi Liche

Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định của các chủng Bacillus

Kết quả được trình bày ở trên bảng cho thấy, 10/11 chủng có khả năng đối

kháng với vi khuẩn kiểm định Streptococcus aureus, trong đó chủng Yoi, BI2, Liche,

BI4 cho hoạt tính đối kháng tương đối mạnh (7 mm, 6 mm, 5 mm, 5 mm). Tất cả 11

chủng Bacillus khảo sát không có khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định E. coli

và Salmonella typhimurium.

Tóm lại, chủng Yoi cho khả năng đối kháng mạnh với Streptococcus aureus với

khoảng cách đối kháng là 7 mm

Như vậy, qua 4 bước sàng lọc và tuyển chọn các đặc tính probiotic của các

chủng Bacillus trong điều kiện in vitro, nhận thấy được 2 chủng Sub và Yoi có tiểm

năng sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi. Bước kế tiếp, 2 chủng vi khuẩn này sẽ

được khảo sát khả năng tạo sinh khối và sinh bào tử. Từ đó chọn ra chủng vi khuẩn tốt

nhất cho sản xuất probiotic dạng bào tử Bacillus.

3.2 Đặc tính sinh học và phân loại chủng đã tuyển chọn

3.2.1 Đặc tính hình thái của chủng Sub và Yoi

Hình thái khuẩn lạc Hình thái bào tử (x40) Hình thái tế bào (x40)

Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Sub

Hình thái khuẩn lạc Hình thái bào tử (x40) Hình thái tế bào (x40)

Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Yoi

3.2.2 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi

Bảng 3.5 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi

Stt Đặc tính probiotic Sub Yoi

1 Tỷ lệ sống sót ở pH 2 sau 180 phút 43,35% 48,44%

Khả năng chịu muối mật 2% sau 180 2 64,44% 27,74% phút

Vòng phân giải protease (Khả năng phân 3 15,67 ± 0,47 15,00 ± 0,81 giải casein, mm)

Vòng phân giải amylase (Khả năng phân 4 14,67 ± 0,47 13,00 ± 0,00 giải tinh bột, mm)

Vòng phân giải cellulase (Khả năng 5 15,00 ± 0,0 14,67 ± 0,47 phân giải cellulose, mm)

Khoảng cách đối kháng với VK kiểm

6 định Streptococcus aureus (Khả năng 4 7

đối kháng với VK kiểm đinh, mm)

3.3 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Sub

3.3.1 Thiết lập đường chuẩn

Việc thiết lập đường cong tăng trưởng một cách gián tiếp theo giá trị OD bắt

buộc phải thông qua một bước là thiết lập đường chuẩn tương quan giữa OD và mật độ

tế bào. Sau các thao tác pha loãng, đo OD và đếm thì có được các dữ liệu như sau:

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Sub

OD Log N

0,16 7,99

0,215 8,01

0,27 8,07

0,354 8,14

0,4 8,18

0,474 8,24

0,541 N (cfu/ml) 9,70 × 107 1,02 × 108 1,18 × 108 1,38 × 108 1,51 × 108 1,73 × 108 2,10 × 108 8,32

Dựa vào phân tích sự tuyến tính của giá trị OD theo Log N dựa vào công cụ

Data Analysis Regressio, ta có được phương trình hồi quy: y = 0,8792x + 7,8312. Với

giá trị R Square = 0,991 cho thấy 99,1% các trường hợp xảy ra được giải thích bằng

phương trình y = 0,8792x + 7,8312, chỉ có 0,9% trường hợp không thể giải thích với

phương trình này. Mặt khác, giá trị P-value của Intercept và OD đều nhỏ hơn 0,05

chứng tỏ phương trình y = 0,8792x + 7,8312 có ý nghĩa thống kê. Như vậy, phương

trình hồi quy này là phù hợp

Hình 3.5 Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Sub

3.3.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng

Dựa vào biểu đồ cho thấy chủng Sub có pha lag rất nhỏ, chỉ trong 1 giờ đầu

nuôi cấy, sau giờ thứ 1 bắt đầu pha log và kéo dài tới giờ thứ 12, kế tiếp là pha ổn định

kéo dài tới thời điểm 24 giờ.

Hình 3.6 Đường cong tăng trưởng chủng Sub theo thời gian

3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi

3.4.1 Thiết lập đường chuẩn

Việc thiết lập đường cong tăng trưởng một cách gián tiếp theo giá trị OD bắt

buộc phải thông qua một bước là thiết lập đường chuẩn tương quan giữa OD và mật độ

tế bào. Sau các thao tác pha loãng, đo OD và đếm thì có được các dữ liệu như sau:

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Yoi

OD Log N

0.103 7,18

0.151 7,35

0.316 7,69

0.394 7,83

0.527 N (cfu/ml) 1,51 × 107 2,25 × 107 4,90 × 107 6,75 × 107 1,15 × 108 8,18

Phân tích sự tuyến tính của giá trị OD theo Log N dựa vào công cụ Data

Analysis Regressio, ta có được phương trình hồi quy: y = 2,0333x + 7,0164. Với giá trị

R Square = 0,991 cho thấy 99,1% các trường hợp xảy ra được giải thích bằng phương

trình y = 2,0333x + 7,0164, chỉ có 0,9% trường hợp không thể giải thích với phương

trình này. Mặt khác, giá trị P-value của Intercept và OD đều nhỏ hơn 0,05 chứng tỏ

phương trình y = 2,0333x + 7,0164 có ý nghĩa thống kê. Như vậy, phương trình hồi

quy này là phù hợp

Hình 3.7 Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Yoi

3.4.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng

Dựa vào biểu đồ cho thấy chủng Yoi có pha lag rất nhỏ, chỉ trong 2 giờ đầu nuôi

cấy, sau giờ thứ 4 bắt đầu pha log và kéo dài tới giờ thứ 12, kế tiếp là pha ổn định kéo

dài tơi thời điểm 24 giờ.

Hình 3.8 Đường cong tăng trưởng chủng Yoi theo thời gian

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành bào tử của các

chủng Sub và Yoi

Quá trình tạo sinh khối tế bào và bào tử phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện và thành

phần môi trường nuôi cấy. Do đó, việc nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp cho

mục đích này là điều rất cần thiết.

Để khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên khả năng sinh trưởng của chủng nghiên

cứu, chúng tôi nuôi chủng này trên các môi trường khác nhau (MT1 đến MT7 như đã

trình bày trong phần 2.3). Sau 24 giờ nuôi cấy xác định mật độ tế bào (OD600nm và đếm

khuẩn lạc).

Hình 3.9 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng

Sub và Yoi

Qua kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy của cả 2 chủng thì nhận thấy rằng

cùng thời gian khảo sát thì chủng Sub và Yoi hình thành bào tử cao nhất tương ứng ở

môi trường MT6 (79,87%) và MT2 (70,13%).

Do mục đích của nghiên cứu là tạo ra mật độ bào tử nhiều nhất nên quyết định

chọn chủng Sub để nghiên cứu tiếp. Chủng Sub dựa vào tài liệu của Phân Viện Chăn

Nuôi Nam Bộ được xác định là chủng Bacillus Subtilis, do đó sẽ thuận lợi hơn trong

việc khảo sát và nghiên cứu

Theo báo cáo của Trần Quốc Việt và cộng sự (2008), nhóm Bacillus có khả

năng sinh trưởng mạnh ở hầu hết các loại MT, kể cả các MT không đặc trưng cho

chủng. Đó là các đặc tính rất quí của các chủng Bacillus khi chúng thật sự là những VK

hữu ích được sử dụng như nguồn probiotic dùng trong chăn nuôi.

3.6 Kết quả khảo sát các điều kiện tạo bào tử tốt nhất

Bào tử được tạo thành trong điều kiện môi trường thiếu dinh dưỡng, các độc tố do

quá trình trao đổi chất sinh ra quá nhiều, dẫn đến tình trạng không phát triển được. Vì 59

vậy tiến hành khảo sát các điều kiện khác nhau để thúc đẩy quá trình hình thanh bào tử

trong thời gian ngắn như: cô đặc, lên men môi trường nghèo dinh dưỡng, xử lý pH, xử

lý nhiệt độ lên men.

Hình 3.10 Tỷ lệ hình thành bào tử bằng các phương pháp khác nhau theo thời

gian của chủng Bacillus subtilis

Sau 75 giờ khảo sát các điều kiện tạo bào tử nhiều nhất trong thời gian ngắn

nhất, nhận thấy rằng khi xử lý pH 9 thì sau 29 giờ đã đạt được tỷ lệ hình thành bào tử B.

subtilis là 74,26%, tuy nhiên theo thời gian mật độ bào tử có sự giảm nhẹ. Để đáp ứng

được nhu cầu đối với việc sản xuất bào tử với quy mô pilot, rút ngắn thời gian sản xuất

và mật độ bào tử đạt được nhiều. Vì vậy quyết định chọn xử lý pH 9 để tiếp tục quá

trình lên men bằng bồn lên men 5 lít

3.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot

3.7.1 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô

pilot

- Tốc độ khuấy và oxy hòa tan: Trong 3 giờ đầu, lượng oxy hòa tan (pO2)

được kiểm soát ở 20%, sau đó lượng oxy hòa tan được kiểm soát ở 10% do mật độ tế

bào bắt đầu phát triển mạnh dẫn đến tình trạng lượng oxy hòa tan cần nhiều để đáp ứng

lại nhu cầu tiêu thụ của tế bào. Tuy nhiên do hiện trạng nghiên cứu sử dụng không khí

tự nhiên, không phải khí oxy nguyên chất nên khó nâng lượng oxy hòa tan lên cao.

Lượng khí oxy hòa tan tăng lên được dựa vào hai yếu tố là lượng không khí bơm vào

và tốc độ khuấy. Nếu tốc độ khuấy quá mạnh sẽ làm chết tế bào và tạo lớp bọt phía trên

mặt ngăn cản quá trình trao đổi không khí, nên tốc độ khuấy được kiểm soát dao động

ở 200 – 350 rpm. Lượng khí được bơm vào dao động ở 2000 – 4000 ccm, pO2 dao

động 10 – 20%

- pH bằng 7 được điều chỉnh bằng NaOH 3N và HCl 1N.

- Kiểm tra mật độ: cách 4 giờ lên men lấy mẫu một lần để kiểm tra bằng

cách pha loãng và cấy trang ở độ pha loãng thích hợp

Hình 3.11 Mật độ tế bào với quy mô pilot của chủng Bacillus subtilis

Theo bảng số liệu ở trên cho thấy rằng sau 8 giờ thì mật độ tế bào đạt được nhiều nhất với 8,20 × 108 cfu/ml. Vậy nên, 8 giờ được chọn là thời gian để xử lý pH

tạo điều kiện hình thành bào tử

3.7.2 Tiến hành tạo bào tử

Sau khi có được thời gian hình thành tế bào nhiều nhất, tiến hành lên men tạo bào

tử với bồn lên men.

Từ thí nghiệm mục 3.7.1 thu được kết quả như sau:

- Môi trường tăng sinh: LB

- Môi trường lên men tạo bào tử: MT6

- pO2: dao động trong khoảng 10 – 30%

- Khuấy: 200 – 350 rpm

- Thời gian: 36 giờ

- pH: chỉnh pH 7. Sau 8 giờ lên men pH được chỉnh lên pH 9 bằng NaOH

3N và HCl 1N

- Mật độ cấy giống: 10% - Nhiệt độ: 37oC

- Chất phá bọt: Defoamer XP 747 thuộc công ty Kovin với tỷ lệ 0,5%

- Kiểm tra mật độ tế bào: Sau khi lên men cứ 4 giờ lấy mẫu để kiểm tra.

Sau 8 giờ lên men bắt đầu xử lý pH từ pH 7 lên pH 9 bằng NaOH 3N và HCl 1N để

cân bằng pH trong bồn lên men và cứ 4 giờ lấy mẫu kiểm tra mật độ tế bào và mật độ

bào tử

Bảng 3.8 Tỷ lệ hình thành bào tử ở các khoảng thời gian khác nhau với quy

mô pilot

Thời gian (giờ) Tỷ lệ hình thành bào tử

(%)

0 0

4 0

8 0

12 4,5

24 32,71

28 45,79

32 64,95

36 80,84

Sau khi xử lý pH thì tỷ lệ hình thành bào tử tăng cao theo thời gian. Tuy mật độ

bào tử không cao có thể do tốc độ khuấy và lượng oxy hòa tan ảnh hưởng đến tỷ lệ

hình thành bào tử. Sau khi xử lý pH thì bồn lên men vẫn tiếp tục được bơm không khí

để duy trì lượng oxy hòa tan do lượng oxy hòa tan có ảnh hưởng đến việc hình thành

bào tử. Theo Fabrízio Siqueira Boniola và cộng sự (2012), Sarrafzadeh và Navarro

(2006) đã làm thí nghiệm và thấy được rằng nếu gián đoạn cung cấp oxy hòa tan sau

khi kết thúc giai đoạn tăng trưởng của tế bào thì sẽ ảnh hưởng đến quá trình hình thành

bào tử. Do lượng oxy hòa tan ở giai đoạn ổn định không đủ để cung cấp năng lượng

duy trì sự hình thành bào tử với mật độ tế bào dày đặc. [34, 52]

Tóm lại sau 36 giờ lên men, mật độ bào tử đạt được 80,84% đã đáp ứng được yêu cầu đặt ra là sản xuất sản phẩm với mật độ 108 - 109 cfu/ml có chứa 80% bào tử và

20% tế bào sinh dưỡng.

3.8 Tạo chế phẩm

Sau khi có được mật độ bào tử nhiều nhất, tiến hành ly tâm thu bào tử ở 5000

vòng/phút, 15 phút bằng máy ly tâm. Loại bỏ dịch nổi và thu bào tử, bào tử được trộn với chất mang là bột mì đã được hấp tiệt trùng ở 121oC, 1 atm. Sau đó đem sấy ở 40oC

đến khi khô, nghiền mịn. Sau đó bổ sung các chất mang khác nhau với tỷ lệ thích hợp.

Đóng gói

Chế phẩm probiotic chịu nhiệt:

Thành phần: Bacillus subtilis Mật độ: 8,65 × 107 cfu/ml

Chất mang: bột mì

Đóng gói: bằng túi bạc 1 kg

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

Từ 11 chủng Bacillus thuộc Phân Viện Chăn nuôi Nam Bộ đã chọn ra được

chủng Bacillus subtilis SU có các đặc tính probiotic, có khả năng hình thành bào tử tốt

trên môi trường MT6 với tỷ ệ hình thành bào tử đạt 79,87%

Điều kiện tạo bào tử tốt nhất đối với chủng Bacillus subtilis là xử lý pH bằng 9

sau 29 giờ xử lý (với tỷ lệ hình thành bào tử là 74,26%)

Mật độ tế bào khi sản xuất với quy mô pilot đạt được nhiều nhất sau 8 giờ (8,20

× 108 cfu/ml) và tỷ lệ hình thành bào tử đạt được nhiều nhất sau 36 giờ với 80,84%

Đã sản xuất 35 kg bào tử Bacillus subtilis SU với mật độ 8,65 × 107 cfu/ml với

3,5 lít lên men

4.2 Kiến nghị

- Tối ưu hóa các điều kiện như oxy hòa tan, chất phá bọt, tốc độ khuấy để

nâng cao mật độ tế bào

- Khảo sát tỷ lệ sống sót của bào tử sau khi đóng gói thành sản phẩm

- Khảo sát môi trường lên men tạo bào tử Bacillus subtilis SU sử dụng các

nguồn carbon, nitơ phụ phế phẩm công nghiệp để cải thiện giá thành sản phẩm

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Kiều Hữu Ảnh, 1999. Giáo trình VSV Công nghiệp, NXB Khoa học và kỹ thuật,

tr.100-108.

[2] Tô Minh Châu, 2000. Giáo rình thực tập vi sinh vật học

[3] Phạm Thị Trân Châu, 2007). Công nghệ sinh học (tập 3), NXB Giáo dục

[4] Trần Thị Dân, 2002. Thay đổi sinh lý heo con, Tài liệu giảng dạy, Trường ĐH

Nông lâm Tp. HCM

[5] Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ, 1995. Bệnh đường tiêu hóa ở

lợn, NXB Nông nghiệp, Hà Nội

[6] Phạm Kim Đặng, Nguyên Đình Trình, Nguyễn Hoàng Thịnh và cộng sự, 2016. Ảnh

hưởng của Probiotics Bacillus dạng bào tử chịu nhiệt đến năng suất, vi khuẩn và hình

thái vi thể biểu mô đường ruột gà thịt lông màu. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật chăn nuôi,

số 213

[7] Nguyễn Thị Hoàng Hải, 2009. Nghiên cứu thu nhận enzyme α- amylase từ trực

khuẩn cỏ khô, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM

[8] Hội Nhi khoa Tp. HCM, 2007. Bacillus clausii và vai trò probiotics trong điều trị

tiêu chảy. Báo cáo hội thảo chuyên đề probiotic, tr.1-12

[9] Lã Văn Kính, 1998. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong công nghệ sản xuất

thức ăn gia súc và vai trò của probiotic đối với sức khỏe động vật. Báo cáo khoa học,

Trung tâm Thông tin KH và CN, Sở KHCN và Môi trường Tp. HCM

[10] Trần Thị Ái Liên, 2011. Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của Lactobacillus

acidophilus trong chế phẩm probiotic, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư

phạm Tp. HCM, tr. 7-9, 39-40

[11] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2006. Thí nghiệm vi

sinh vật học (tập 2), NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM

[12] Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương, 2008. Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm,

NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM

[13] Đỗ Thị Thu Nga, 2011. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số

chủng Bacillus, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM, tr. 27-36.

[14] Trần Trường Nhân, 2009. Phân lập VK Bacillus subtilis từ phân heo đối kháng với

E. coli và ứng dụng trong sản xuất probiotic, Luận văn tốt nghiệp ngành Kỹ sư Chăn

nuôi-Thú Y, Trường ĐH Nông lâm Tp. HCM

[15] Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008. Phân lập và sàng lọc một số chủng Bacillus có

hoạt tính probiotic trong nuôi trồng thủy sản, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH

Khoa học tự nhiên Tp. HCM, tr. 8-11, 17-19. 29

[16] Phạm Minh Nhựt, 2015. Giáo trình các phương pháp phân tích vi sinh

[17] Lương Đức Phẩm, 2007. Các chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi

trồng thủy sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 112-152

[18] Trần Thị Bích Quyên, 2012. Nghiên cứu và tuyển chọn một số chủng Bacillus làm

probiotic trong chăn nuôi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM

[19] Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Minh Thái,Nguyễn Thị Linh Giang và cộng sự, 2014.

Nghiên cứu đặc tính probiotic của Bacillus subtilis BS02, Y học thực hành (907) – số

3/2014, trang 20-24

[20] Nguyễn Thị Thu Thảo, 2007. Sản xuất và thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm

probiotic phòng tiêu chảy và trên sự sinh trưởng của heo con sau cai sữa 103 (21 đến

58 ngày tuối), Luận văn tốt nghiệp ngành Bác sĩ Thú y, Trường ĐH Nông lâm Tp.

HCM.

[21] Hồ Trung Thông, Hồ Lê Huỳnh Châu, 2009, Nghiên cứu khả năng sống trong môi

trường đường tiêu hóa của động vật của một số chủng vi sinh vật nhằm từng bước chọn

lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotics, Tạp chí khoa học, 09 (55), Trường Đại học

Nông lâm, Đại học Huế, tr. 82-84

[22] Trần Thanh Thủy, 1999. Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr.

45-56, 97-102,163-171

[23] Văn Thị Thủy, 2011. Phân lập các chủng Bacillus spp. có hoạt tính probiotic từ

ao nuôi cá tra, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp. HCM, tr.

36, 52-54

[24] Trần Thị Thu Thủy, 2003. Khảo sát tác dụng thay thế KS của probiotic trong

phòng ngừa tiêu chảy do E. coli trên heo con, Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp,

Trường ĐH Nông lâm Tp. HCM, tr. 21-24, 28-43

[24] Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009. Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus

phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Trường ĐH Sư

phạm Tp. HCM

[25] Trần Linh Thước, 2013. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm

và mĩ phẩm, NXB Giáo dục Việt Nam

[26] Trần Thị Mỹ Trang, 2006. Nghiên cứu sử dụng VK lactic để sản xuất chế phẩm

probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH

Sư phạm Tp. HCM, tr. 58-60.

[27] Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành, 2009. Công nghệ vi sinh và môi trường, NXB

Giáo dục

[28] Đào Thị Thanh Xuân, 2008. Nghiên cứu sử dụng nhóm VK Bacillus tạo chế phẩm

sinh học xử lí môi trường nước nuôi thủy sản, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH

Tài liệu tiếng anh

Sư phạm Hà Nội, tr. 15-27, 32-35, 47-53

[29] Aronson A. I and Fitz J. 1976. Structure and morphogenesis of the bacterial spore

coat, Bacterial. Rev. 40, pp. 360-402

[30] Barbosa T. M., Serra C. R., La Ragione R. M., Woodward M. J. and Henriques A.

O. (2005). Screening for Bacillus isolated in the broiler gastrointestinal tract, Applied

and Environmental Microbiology, 71, pp. 968 – 978

[31] Baumann P, Clark A. M, Baumann L, Broadwell H. A. 1991. Bacillus sphaericus

as a mosquito pathogen. Properties of the organisms and its toxins. Microbiol, Rev.55,

pp. 425-436

[32] Boniolo FS, Rodrigues RC, Prata AM., et al., 2012. Oxygen supply in Bacillus

thuringiensis fermentations: bringing new insights on their impact on sporulation and

δ-endotoxin production. Appl Microbiol Biotechnol. 94(3), 625-36

[33] Bula J.A, Costilow R, Sapple E.S., 1978. Biology of Bacillus popillae, Adv. Appl,

Microbiol, 23, pp. 1-18

[34] Carvalho A. L. U. D., Oliveira F. H. P. C. D., Mariano R. D. L. R., et al., 2010.

Growth, Sporulation and Production of Bioactive Compounds by Bacillus subtilis R14.

Brazilian archives of biology and technology. 53, 643-652

[35] Escobar, Valeska Villegas, et al. Process for increasing biomass and spores

production of plant growth promoting bacteria of the Bacillus genus. U.S. Patent

Application No. 14/471,345.

[36] Eui-Sun Son and Jong-Il Kim, 2002. Purification and Characterization of

Caseinolytic Extracellular protease from Bacillus amyloliquefaciens S94, The Journal

of Microbiology, 40 (1), pp. 26-32

[37] Fuller. R., 1989. Probiotics in man and animals. J Appl Bacteriol, 66, pp. 65–78

[38] Fuller. R., 1992. History and development of probiotics, In: R. Fuller (Ed.)

Probiotics: The Scientific Basis. pp 1−8. Chapman & Hall, London

[39] Gibson T và Gordon Ruth E., 1975. Bacillus in Bergey`s Manual of Detemenative

Bacteriology, R.E. Buchanan & N.E. Gibbons. Editors, willion & Wilkins, pp576-583

[40] Halimi B., Dortu C., Argwelles A., et al., 2010. Antilisterial Activity on Poultry

Meat of Amylosin, Bacteriocin from Bacillus amyloliquefaciens GA1, Probiotic and

Antimicro. Prot,. DOI10.1007/s. 12602-00-9040-9

[41] Hong H. A., Le Hong Duc, Simon M. C., 2005. The use of bacterial spore formers

as probiotics, FEMS Microbiology Reviews, 29, pp. 813 – 835

[42] Huilin Yang, Yuling liao, Bin Wang, Ying Lin, and Lipan, 2011. Complete

genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens XH7, which exhibits production of

purine nucleosides, Journal of bacteriology, pp. 5393-5594

[43] Idris SE, Iglesias DJ, Talon M, Borriss R, 2007. Tryptophan- dependen

production of Indoles-3-Acetic (IAA) affects level of plant grawth promotion by

Bacillus amyloliquefaciens FZB42, Molecular-Microbe Interactions, 20 ( 6), pp. 619-

626.

[44] J. Errington, 2003. Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis, Nat Rev

Microbiol, 1(2), pp. 117-26

[45] Luisa F. Posada-Uribe, Magally Romero-Tabarez, Valeska Villegas-Escobar,

2015. Effect of medium components and culture conditions in Bacillus subtilis EA-

CB0575 spore production. Bioprocess Biosyst Eng,. 38(10), 1879-88

[46] Niall A. Logan and Paul De Vos, 2009. Bacillus in Bergey’s Manual of Systematic

Bacteriology, Paul De Vos, George M. Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg,

Wolfgang Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-Heinz Schleifer, William B. Whitman, Editor,

Springer: London, pp. 21-128

[47] Nista E. C., Candelli M., Cremonini F., Cazzato I. A. and et al., 2004. Bacillus

clausii therapy to reduce side-effects of anti-Helicobacter pylori treatment: randomized,

double-blind, placebo controlled trial, Alimentary Pharmacology and Therapeutics,

20(10), pp. 1181 – 1188

[48] Priest (F.G), Goodfellow (M.), Shute (LA) and Berkeley (R.C.W), 1987.

Bacillus amyloliquefaciens sp. nov. nom. rev, Int, j. Syst. Bacteriol, 37, pp. 69-71

[49] S. M. S. Monteiro, J. J. Clemente, M. J. T. Carrondo., et al., 2014. Enhanced

Spore Production of Bacillus subtilis Grown in a Chemically Defined Medium.

Advances in Microbiology. 4, 444-454

[50] Sameh. H. M. (2003), “Influence of Different Capsule Materials on the

Physiologycal Properties of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus”,

Dessertation at the University of Bonn. pp. 49-50

[51] Sandra M. Monteiro, João J. Clemente, Adriano O. Henriques., et al., 2005. A

Procedure for High-Yield Spore Production by Bacillus subtilis. Biotechnol . 21, 1026-

1031

[52] Sarrafzadeh MH, Navarro JM, 2006. The effect of oxygen on the sporulation, δ-

endotoxin synthesis and toxicity of Bacillus thuringiensis. World J Microbiol

Biotechnol 22:305–310

[53] Schillinger U., 1996. Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins

for the biological preservation of foods, Trend in food Science and Technology, 64, pp.

158-164

[54] Spinosa M. R., Braccini T., Ricca E., De Felice M., Morelli L., Pozzi G. and

Oggioni M. R., 2000. On the fate of ingested Bacillus spores, Research in

Microbiology, 151, pp. 361 – 368

[55] Spinosa M. R., Wallet F., Courcol J. R. and Oggioni M. R., 2000. The trouble in

tracing opportunistic pathogens: cholangitis due to Bacillus in a French hospital caused

by a train related to an Italian probiotics, Microbial ercology in health and disease, 12,

pp. 99 – 101

[56] Sutyak K, Wrawan. R, Aroutchera A, Chikindas M, 2008. Isolation of the Bacillus

amyloliquefaciens antimicrobial peptide subtilesin from the dairy product-derived

Bacillus amyloliquefaciens, J. Appl. Microbiol, 104, pp. 1067-1074.

[57] T. C. Braman, J. T. Greenamyre, T. R. Corner, H. S. Pankratz and P. Gerhardt,

1982. Bacterial sopre heat resistance correlated with water content, wet density, and

protoplast/sporoplast volume ratio, J Bacteriol, 150(2), pp. 870-7

[58] Tuohy K. M., et al., 2007.Survivability of a probiotic Lactobacillus casei in the

gastrointestinal tract of healthy human volunteers and its impact on the faecal

microflora, J Appl Microbiol, 102, pp. 1026 – 1032

Các trang web

[59] www.premierhort.com

[60] http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/visv13.htm

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC I: BẢNG BIỂU

Bảng 5.1 Số lượng KL và mật độ TB vi khuẩn sống sót trong môi trường pH thấp

Kí

Khuẩn lạc

Mật độ tế

Khuẩn lạc

Mật độ tế

Khuẩn lạc

Mật độ tế

ST

hiệu

lúc 0 phút

bào lúc 0

lúc 60 phút

bào lúc 60

lúc 180 phút

bào lúc

T

chung

phút

180 phút

(cfu/ml)

10-6

10-4

10-5

10-4

10-3

10-5

2,21 × 108

3,52 × 108

6,04 × 107

112

220

1 BI1

100

180

>250

6,05 × 108

1,84 × 108

6,40 × 107

131

2 BI2

120

>250

129

1,13 × 109

2,90 × 108

1,43 × 108

235

3 BI3

241

>250

1,02 × 109

1,68 × 108

1,06 × 108

210

4 BI4

187

>250

130

>250

7,70 × 108

1,98 × 108

7,60 × 107

5 MN1

209

>250

6,80 × 108

3,52 × 108

7,69 × 107

6 MN2

186

>250

2,57 × 108

2,24 × 108

1,11 × 108

235

213

7 Sub

150

283

2,27× 108

2,62 × 108

1,10 × 108

197

207

8 Yoi

198

161

146

1,44 × 108

9 Liche

124

2,91 × 107

10 Natto

148

1,51 × 108

11 BA

135

Bảng 5.2 Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường

muối mật 2%

ST

Kí

Khuẩn lạc

Mật độ tế

Khuẩn lạc

Mật độ tế

Khuẩn lạc

Mật độ tế

T

hiệu

lúc 0 phút

bào lúc 0

lúc 60 phút

bào lúc 60

lúc 180 phút

bào lúc

chung

phút

180 phút

10-5

10-6

10-4

10-5

10-3

10-4

>250

(cfu/ml) 4,75 × 108

(cfu/ml) 4,23 × 108

(cfu/ml) 7,72 × 107

1 BI1

119

>250

115

1,76 × 108

1,48 × 108

6,97 × 107

194

128

2 BI2

125

126

>250

100

8,60 × 108

2,85 × 108

6,50 × 107

3 BI3

>250

6,00 × 108

1,28 × 108

6,70 × 107

4 BI4

>250

162

2,06 × 108

2,65 × 108

9,31 × 107

184

5 MN1

166

112

>250

110

1,19 × 109

2,32 × 108

8,53 × 107

107

6 MN2

>250

127

197

1,19 × 108

3,21 × 108

7,67 × 107

130

7 Sub

132

140

>250

2,50 × 108

4,23 × 108

6,93 × 107

144

8 Yoi

>250

128

110

7,25 × 108

2,58 × 108

1,30 × 108

194

9 Liche >250

>250

211

7,95 × 108

3,90 × 108

>250

1,59 × 108

10 Natto >250

>250

230

>250

1,03 × 109

4,26 × 108

3,29 × 108

>250

11 BA

>250

109

>250

Bảng 5.3 Số liệu đường chuẩn của chủng Sub

Tỷ lệ pha Khuẩn lạc Khuẩn lạc Khuẩn lạc Mật độ tế OD

loãng bào

ở độ pha loãng 10-4 ở độ pha loãng 10-5 ở độ pha loãng 10-6

1:3,5 204 (cfu/ml) 2,10 × 108 0,541 29

200 28

1:4 >250 151 1,73 × 108 0,474 37

>250 160 32

1:5 >250 137 1,51 × 108 0,4

>250 165

1:6 >250 140 1,38 × 108 0,354

>250 135

1:8 >250 122 1,18 × 108 0,27

>250 114

1:11 >250 100 1,02 × 108 0,215

>250 103

1:13 >250 96 9,70 × 107 0,16

>250 98

Bảng 5.4 Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng Sub

0,995667 0,991353

0,989623

0,012448

Regression Statistics Multiple R R Square Adjusted R Square Standard Error Observations 7

ANOVA

F Significance F

Df 1 5 6 Regression Residual Total SS 0,088822 0,000775 0,089596 MS 0,088822 573,2107 2,37E-06 0,000155

Intercept OD Coefficients 7,831245 0,879174 Standard Error 0,013509 0,036721 Lower 95% t Stat P-value 579,6901 2,9E-13 7,796518 23,94182 2,37E-06 0,784779

Bảng 5.5 Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Sub

Giờ Độ pha loãng Log N OD

0 7,119 1 0,327

2 7,974 1 0,162

4 8,202 1 0,422

6 8,468 2 0,382

8 8,650 4 0,247

10 8,704 4 0,308

12 8,819 5 0,327

14 8,820 5 0,33

16 8,806 5 0,314

18 8,815 5 0,324

20 8,803 5 0,21

22 8,776 5 0,28

24 8,773 5 0,276

Bảng 5.6 Số liệu đường chuẩn chủng Yoi

Tỷ lệ pha Khuẩn lạc Khuẩn lạc Khuẩn lạc Mật độ tế OD

loãng bào

ở độ pha loãng 10-4 ở độ pha loãng 10-5 ở độ pha loãng 10-6

1:3 111 (cfu/ml) 1,15 × 108 0,527 6

119 14

1:3,5 65 6,75 × 107 0,394 7

70 10

1:5 >250 50 4,90 × 107 0,316

>250 48

1:11 207 38 2,25 × 107 0,151

209 42

1:18 149 29 1,51 × 107 0,103 20

140 15 2

Bảng 5.7 Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng Yoi

0,995242 0,990506

0,987342

0,040078

Regression Statistics Multiple R R Square Adjusted R Square Standard Error Observations 5

ANOVA

Significance F

F 313,0037 0,000394

Df 1 3 4 Regression Residual Total SS 0,50277 0,004819 0,507589 MS 0,50277 0,001606

Lower 95%

Intercept OD Coefficients 7,016377 2,033253 Standard Error 0,038675 0,114926 t Stat P-value 181,4197 3,69E-07 6,893296 17,69191 0,000394 1,667508

Bảng 5.8 Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Yoi

Giờ Độ pha loãng Log N OD

0 1 7,135 0,55

2 1 7,305 0,142

4 1 7,700 0,336

6 2 8,074 0,372

8 2 8,232 0,45

10 4 8,432 0,4

12 8 8,674 0,371

14 10 8,700 0,334

16 10 8,716 0,344

18 10 8,702 0,337

20 10 8,679 0,326

22 10 8,710 0,341

24 10 8,683 0,328

Bảng 5.9 Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế

bào và bào tử của các chủng Sub

Môi trường Mật độ tế bào Mật độ tế bào lúc Mật độ bào tử lúc

24 giờ (cfu/ml) 72 giờ (cfu/ml) (OD600nm) lúc 24

giờ

MT1 2,009 ± 0,008

MT2 1,843 ± 0,005

MT3 1,823 ± 0,009

MT4 1,976 ± 0,006

MT5 1,558 ± 0,002 1,43 × 109 1,54 × 108 2,68 × 108 7,75 × 108 2,81 × 108 2,03 × 108 2,50 × 107 2,10 × 108 3,20 × 108 1,55 × 108

MT6 1,731 ± 0,008

MT7 1,948 ± 0,005 1,49 × 109 8,70 × 108 1,19 × 109 5,35 × 108

Bảng 5.10 Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành

tế bào và bào tử của các chủng Yoi

Môi trường Mật độ tế bào Mật độ tế bào lúc Mật độ bào tử lúc

24 giờ (cfu/ml) 72 giờ (cfu/ml) (OD600nm) lúc 24

giờ

MT1 2,193 ± 0,017

MT2 1,571 ± 0,073

MT3 2,030 ± 0,002

MT4 2,192 ± 0,008

MT5 2,126 ± 0,001

MT6 1,738 ± 0,019

MT7 2,149 ± 0,020 1,15 × 109 1,54 × 108 9,90 × 108 8,85 × 108 8,15 × 108 2,17 × 109 8,60 × 108 2,98 × 108 1,08 × 108 1,47 × 108 2,44 × 108 2,55 × 108 2,27 × 108 2,07 × 108

Bảng 5.11 Tỷ lệ hình thành bào tử qua 7 môi trường của 2 chủng Sub và Yoi

STT Môi trường Tỷ lệ hình thành bào tử (%)

Yoi Sub

25,91 14,20 1 MT1

70,13 16,23 2 MT2

14,85 78,36 3 MT3

27,57 41,29 4 MT4

31,29 55,16 5 MT5

10,46 6 MT6 79,87

24,07 61,49 7 MT7

Bảng 5.12 Mật độ bào tử của các phương pháp tạo bào tử tốt ở các khoảng thời

gian khảo sát khác nhau

Mật độ bào tử ở các khoảng thời gian khác nhau (cfu/ml)

Tổng TB

ST

Phương

ban đầu

T

pháp

5 giờ

19 giờ

29 giờ

43 giờ

53 giờ

65 giờ

75 giờ

3,75 × 106

5,05 × 106

7,50 × 106

6,80 × 106

6,60 × 106

6,75 × 106

6,80 × 106

(cfu/ml) 1,01 × 107

pH 9

9,00 × 107

7,20 × 106

7,25 × 106

2,52 × 107

5,35 × 107

6,20 × 107

6,05 × 107

6,75 × 107

pH 10

1,15 × 107

6,25 × 106

5,65 × 106

7,15 × 106

9,48 × 106

9,05 × 106

8,55 × 106

9,24 × 106

pH 11

nghèo

6,05 × 107

8,65 × 106

6,25 × 106

5,70 × 106

7,90 × 106

9,30 × 106

7,80 × 106

9,90 × 106

dinh

dưỡng

Cô đặc

1,52 × 108

5,15 × 107

4,85 × 107

6,60 × 107

5,25 × 107

6,95 × 107

8,20 × 107

8,90 × 107

Nhiệt độ

4,05 × 107

1,06 × 107

1,03 × 107

1,08 × 107

1,16 × 107

9,62 × 106

9,05 × 106

Bảng 5.13 Tỷ lệ hình thành bào tử theo thời gian của các phương pháp

khác nhau

STT Phương Tỷ lệ hình thành bào tử theo thời gian của các phương pháp

pháp khác nhau (%)

5 giờ 19 giờ 29 giờ 43 giờ 53 giờ 65 giờ 75 giờ

37,13 50 67,33 65,35 66,83 67,33 1 pH 9 74,26

pH 10 8 8,06 27,99 59,44 68,89 67,22 75 2

pH 11 54,35 49,13 61,17 82,4 78,67 74,35 80,33 3

MT 14,3 10,33 9,42 13,06 15,37 12,89 16,38 4

nghèo

dinh

dưỡng

Cô đặc 33,8 31,83 43,31 34,45 45,61 53,81 58,41 5

Nhiệt 26,17 25,31 26,67 28,57 23,75 22,34 22,35 6

độ

Bảng 5.14 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy

mô pilot

Thời gian Khuẩn lạc ở Khuẩn lạc ở Khuẩn lạc ở Mật độ tế Log N

(giờ) bào (cfu/ml)

độ pha loãng 10-4 độ pha loãng 10-5 độ pha loãng 10-6

0 148 25 1,68 × 106 6,23

167 30

4 177 12 1,72 × 107 7,24

167 13

8 >250 77 8,20 × 108 8,91

>250 87

12 >250 40 4,25 × 108 8,62

>250 45

24 >250 39 3,70 × 108 8,56

>250 35

Bảng 5.15 Kết quả khảo sát mật độ bào tử theo thời gian với quy mô piot

Giờ Khuẩn lạc Khuẩn lạc sau khi xử Mật độ tế Mật độ

bào tử bào

(cfu/ml) 10-4 10-5 10-6 10-4 lý nhiệt 10-5 10-6

0 85 12 (cfu/ml) 8,75 × 106 0

90 19

4 >250 69 6,80 × 107 0

>250 67

8 >250 >250 100 1,07 × 109 0

>250 >250 114

12 >250 53 4,90 × 107

>250 45

24 >250 39 3,50 × 108

>250 31

28 >250 50 4,90 × 108

>250 48

32 >250 63 6,95 × 108

>250 76

36 >250 81 8,65 × 108

>250 92

PHỤ LỤC 2: HÌNH ẢNH

Hình 5.1 Máy ly tâm Avanti JXN Series

Hình 5.2 Chế phẩm thử nghiệm bào tử Bacillus subtilis

Hình 5.3 Hệ thống lên men 5 L