TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 488 - THÁNG 3 - SỐ 2 - 2020
211
V. KẾT LUẬN
Tuổi khởi phát bệnh trung bình 4,76 ± 2,53
tuổi, nhiều nhất là từ 1 đến 3 tuổi. Nam mắc bệnh
nhiều hơn nữ. Co giật do sốt là yếu tố tiền sử
bệnh gặp nhiều nhất. Cơn co giật chủ yếu diễn ra
dưới 5 phút với các triệu chứng tím tái, trợn mắt,
co giật, mất ý thức. Sau cơn, phần lớn bệnh nhân
bình thường. Đa số bệnh nhân có điện não đồ bất
thường. Chỉ có tỉ lệ nhỏ bệnh nhân có tổn thương
trên phim cộng hưởng từ sọ não.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Beghi E (2020). The Epidemiology of Epilepsy.
Neuroepidemiology 2020; 54: 185–191
2. Cross HJ (2015). Epilepsy (generalised seizures).
BMJ Clin Evid. 2015; 2015: 1201.
3. Mikati MA(2017). Seizure in childhood, Nelson
21th edition, Part XXVII, Chapter 568: 2013- 2015.
4. Lompo DL, Diallo O, Dao BA, et al. (2018).
Etiologies of non-genetic epilepsies of child and
adolescent, newly diagnosed in Ouagadougou,
Burkina Faso, The Pan African Medical Journal,
31:175.
5. Scott RC, Gadian DG, King MD, et al (2002).
Magnetic resonance imaging findings within 5 days
of status epilepticus in childhood. Brain.
2002;125:1951–9
6. Scott CR (2002). What are the effects of
prolonged seizures in the brain? Epileptic Disord.
2014 Oct; 16(Spec No 1): S6–11.
7. Scheffer IE, Berkovic S, Capovilla G, et al.
(2017). ILAE classification of the epilepsies:
Position paper of the ILAE Commission for
Classification and Terminology, Epilepsia, 58(4):
512-521.
NGHIÊN CỨU SỰ SAO CHÉP HUMAN MAMMAGLOBIN mRNA VÀ
SURVIVIN mRNA TỪ CÁC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ
Nguyễn Minh Hiền*
TÓM TẮT55
Phát hiện các gen đặc hiệu từ tế bào ung thư lưu
hành trong máu (CTCs) có thể hữu ích trong chẩn
đoán, sàng lọc, tiên lượng, theo dõi sau điều trị. Mục
tiêu của nghiên cứu này là: 1.Xây dựng và hoàn chỉnh
kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện, xác định mức độ
sao chép Human Mammaglobin (hMAM) mRNA và
Survivin mRNA từ tế bào ung thư vú (UTV) 2. Ứng
dụng kỹ thuật phát hiện gen đặc hiệu hMAM và
Survivin từ các tế bào UTV trong chẩn đoán bệnh
UTV. Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu trên
43 bệnh nhân được chẩn đoán xác định bằng mô
bệnh học là ung thư vú, 25 bệnh nhân được chẩn
đoán xác định là u xơ vú (UXV), các bệnh nhân tự
nguyện tham gia vào nhóm nghiên cứu. Sử dụng kỹ
thuật RT-PCR, Real time RT-PCR, giải trình tự gen, để
phát hiện hMAM mRNA và survivin mRNA từ dòng tế
bào ung thư vú, mô ung thư vú và các tế bào ung thư
vú trong máu. Kết quả: Đã xây dựng được quy trình
xác định sự sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA
từ các tế bào UTV: Ngưỡng phát hiện được tế bào
UTV trong máu: 200 tế bào/5ml máu, 1tế bào UTV/
104 bạch cầu; Gen hMAM và survivin nhân bản được
từ tế bào UTV trong máu trùng hợp 100% với gen
survivin và hMAM công bố ở ngân hàng gen. Bước đầu
ứng dụng kỹ thuật phát hiện gen hMAM và survivin
trong phát hiện tế bào UTV trong máu. Tỷ lệ phát hiện
sự sao chép hMAM mRNA trong mô UTV:36/43
(83,7%), trong máu 23/43(53,5%), trong mô UXV
2/25 (8.0%), tỷ lệ phát hiện sự sao chép survivin
*Bệnh viện Thanh nhàn
Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Minh Hiền
Email: hienshbvtn@gmail.com
Ngày nhận bài: 7.01.2020
Ngày phản biện khoa học: 28.2.2020
Ngày duyệt bài: 10.3.2020
mRNA trong mô UTV: 32/43 (74,4%), trong máu
19/43 (44,2%), trong mô UVLT 3/25 (12.0%); Không
phát hiện được bản sao hMAM mRNA và survivin
mRNA trong máu bệnh nhân UXV. Mức độ sao chép
của hMAM mRNA và survivin mRNA không có sự khác
biệt giữa máu và mô UTV (p>0,05), ở mô ung thư cao
hơn ở mô UVLT (p<0,05). Mức độ sao chép của hMAM
mRNA và survivin mRNA ở mô và máu đều tăng cao
nhất ở giai đoạn 2. Kết luận: Xây dụng được quy
trình phát hiện hMAM mRNA và survivin mRNA từ các
tế bào ung thư vú, ứng dụng phát hiện tế bào UTV
trong máu..
Từ khoá:
Real-time, RT- PCR, hMAM, survivin,
ung thư vú
SUMMARY
RESEARCH THE TRANSCRIPTION HUMAN
MAMMAGLOBIN mRNA AND SURVIVIN
mRNA FROM BREAST CANCER CELLS
The detection sensitive genes from CTCs may
prove useful for screening, prognostication, monitoring
of response to therapy. The goal of this study: 1,
the establishing and complete molecular biology
techniques to detect the level of trancription Human
Mammaglobin (hMAM) mRNA and Survivin mRNA from
breast cancer cells 2 Using the detection hMAM
mRNA and Survivin mRNA from breast turmor cells to
BC diagnosis. Patients and methods: The study of
43 patients diagnosed as breast cancer, 25 patients
who were diagnosed as benign breast tumors, Using
Real-time, RT-PCR, gene sequencing techniques to
discover hMAM gene, Survivin gene in breast cancer
cell lines, cancer tissues and in CTCs. Results: The
procedure was developed to determine the copy
hMAM mRNA and Survivin mRNA from breast cancer
cells: detection threshold breast cance cells is 200
CTCs/5ml peripheral, 1 CTC/104 leukocytes; Survivin
gene and hMAM gene, that is cloning from breast
vietnam medical journal n02 - MARCH - 2020
212
cance cells coincides 100% with Survivin gene and
hMAM gene published in GenBank. Detection rate
hMAM mRNA transcription in breast cancer: in tissue:
36/43 (83,7%), in blood 23/43(53,5%), in benign
breast tumors tissue 2/25 (8%); rate Survivin mRNA
transcription in breast cancer: in tissue: 32/43
(74,4%), in blood: 19/43 (44,2%), in benign breast
tumors tissue: 3/25 (12%). The level of Survivin
mRNA and hMAM mRNA no difference between blood
and breast cancer tissue (p> 0.05). The level of
Survivin mRNA hMAM mRNA are highest in 2 stage.
Conclusion: The findings were hMAM mRNA and
Survivin mRNA from BC cell line, breast cancer cells in
the tissue and the peripheral blood.
Keywords:
Real-time, RT-PCR, hMAM mRNA,
Survivin mRNA, breast cance
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo những lý thuyết về ung thư học trước
đây, sự di căn của các tế bào ung thư chỉ xảy ra
ở giai đoạn muộn. Tuy nhiên, theo công trình
mới nhất của các nhà khoa học Mỹ, các tế bào
ung thư di chuyển (circulating tumor cells -
CTCs) có thể thâm nhập vào máu ngoại vi ngay
từ giai đoạn rất sớm. Sự xuất hiện và di chuyển
của các khối u vào máu ngoại vi bao gồm nhiều
giai đoạn. Ban đầu các tế bào ung thư phát triển
nhanh, cần nhiều oxy nên phát triển xâm lấn.
Các tế bào này có mật độ thụ thể trên bề mặt
thấp dẫn tới sự giảm liên kết với nhau và chống
lại quá trình chết theo chương trình. Kết quả là
các tế bào này có khả năng sống sót cao hơn và
dễ dàng xâm nhập vào máu. Sau khi vào máu,
các CTC không còn khả năng biệt hoá và di
chuyển tới các cơ quan khác. Trên mô hình
nghiên cứu ung thư ở động vật, hiện tượng di
căn chỉ xảy ra khi phát hiện 1/10000 tế bào bạch
cầu [1]. Kết quả này chỉ ra ý nghĩa của việc phát
hiện ra các CTC mang những gen chỉ thị đặc
trưng cho khối u trong máu, góp phần xác định
sớm, tiên lượng và theo dõi điều trị ung thư vú.
Trong số các gen được coi là có liên quan đến
bệnh UTV thì hMAM (SCGB2A2 được phát hiện
1998, nằm ở vị trí NST 11q12.2) tác động đến
thay đổi tế bào biểu mô tuyến vú, kích thích tăng
trưởng, tăng tỷ lệ phân bào, nó đặc hiệu cho
ung thư dạng biểu mô. Trong thực tế, sử dụng
kỹ thuật RT-PCR, Watson và Fleming không tìm
thấy có biểu hiện hMAM trong các loại mô lành
tính khác nhau hoặc trong khối u mà chỉ thấy ở
bệnh UTV [2]. Tuy nhiên hạn chế của việc phát
hiện tế bào ung thư ở mô là không đánh giá
được mức độ lan tràn của khối u, những trường
hợp không rõ vị trí khối u nguyên phát hoặc đã
phẫu thuật thì việc xác định tế bào ung thư gặp
nhiều khó khăn. Chính vì vậy xác định tế bào
ung thư đồng thời trong máu và mô ung thư sẽ
mang lại cho các nhà lâm sàng những thông tin
đầy đủ và toàn diện hơn diến biến của bệnh, từ
đó có những phác đồ điều trị phù hợp. Đây là cơ
sở để chúng tôi tiến hành nghiên cứu
"Phát hiện
Human Mammaglobin mRNA và survivin mRNA
từ các tế bào ung thư vú"
với mục tiêu:
1. Xây dựng kỹ thuật sinh học phân tử để
phát hiện và xác định mức độ sao chép hMAM
mRNA và survivin mRNA từ tế bào UTV
2. Ứng dụng kỹ thuật phát hiện gen đặc hiệu
hMAM và survivin từ các tế bào UTV trong chẩn
đoán bệnh UTV.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu:
+ Nhóm 1: 43 Mẫu máu và 43 mẫu mô tương
ứng của bệnh nhân UTV ở giai đoạn I, II, III, IV
đã được chẩn đoán lâm sàng, cận lâm sàng và
mô bệnh học. Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất kỳ một
khối u hay ung thư một cơ quan nào khác ngoài
ung thư vú. Đã được điều trị trước đó
+ Nhóm chứng: Nhóm bệnh nhân mắc bệnh
vú lành tính có 25 người được chẩn đoán là u xơ
tuyến vú.
2. Phương pháp nghiên cứu:
2.1. Quy trình nghiên cứu
- Tách bạch cầu từ 5ml máu toàn phần bằng
cách ly tâm 4000 vòng trong 20 phút
- Tách RNA từ phần tế bào có nhân thu được
và mô UT dựa vào quy trình tách Kit Rneasy Mini
Kit của Quiagen Germany.
- Kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng RNA
tổng số RNA bằng phổ hấp thụ trên máy đo
NanoDrope -1000. Độ tinh sạch phụ thuộc vào tỷ
số OD260nm/OD280nm. Một acid nucleic được gọi là
sạch khi tỷ số này là 1,8 – 2,0. Khi các mẫu
nghiên cứu đảm bảo độ tinh sạch mới tiến hành
các quy trình kỹ thuật tiếp theo.
- Tạo cDNA (RT-PCR): Sử dụng 4 – 5 µg RNA
tổng số, thêm nước sạch RNase cho vừa đủ 6 µl/
1ống. Thêm 1 µl Reaction mix và 1 µl Random
hexamers để ở nhiệt độ 65oC trong 5 phút. Sau
đó đặt trong đá lạnh 1 phút. Thêm 10 µl buffer
và 2 µl Enzym mix cho đủ 20 µl.Tổng hợp cDNA
với chu trình nhiệt như sau: 25oC/ 10 phút; 50oC/
50 phút; 85oC/ 5 phút. Sau đó sản phẩm cDNA
được bảo quản ở - 20oC cho đến khi sử dụng.
(Invitrogen, USA).
- PCR: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với
cặp mồi GADPH và hMAM tiến hành như sau:
Bước khởi đầu sử dụng nhiệt độ 95oC/ 5 phút;
Tiếp theo thực hiện 30 chu kỳ phản ứng với chu
trình nhiệt: Biến tính 95oC/ 45 giây, bắt cặp
52oC/ 45 giây, kéo dài 72oC/ 45 giây; Bước kéo
dài kết thúc 72oC/ 7 phút để hoàn tất phản ứng.
Sau đó mẫu được bảo quản ở 4oC.
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 488 - THÁNG 3 - SỐ 2 - 2020
213
- Trình tự primer (cặp mồi)
Tên primer
Trình tự
Tm
KT (bp)
GAPDH F
5’-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3’
65.3
307
GAPDH R
5’- AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3’
67
hMAM F
5’- CTC CCA GCA CTG CTA CGC AGG CTC -3’
67,2
202
hMAM R
5’-CAC CTC AAC ATT GCT CAG AGT TTC ATC CG-3’
66,3
SurvivinF
5’-AGA ACT GGC CCT TCT TGG AGG-3’
63,3
170
SurvivinR
5’-CTT TTT ATG TTC CTC TAT GGG GTC-3’
61,8
- Điện di sản phẩm PCR thu được trên
agarose 0,8%.
- Giải trình tự một số mẫu dương tính so
sánh với trình tự hMAM ở ngân hàng gen.
- Real-time- PCR.
Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng real-
time PCR bằng dòng tế bào UTV Phản ứng real-
time PCR với primer hMAM, Survivin xác định số
bản sao các mẫu UTV (quy trình kit real-time
PCR sử dụng SYBR Green trên máy Light Cycler®
của hãng Roche).
*Quy trình được áp dụng cho dòng tế bào
UTV, sau khi xác định được độ nhậy sẽ áp dụng
trong đối tượng nghiên cứu.
-Dòng tế bào: Sử dụng 4 dòng tế bào: MCF-7,
BT474, KPL4, MDA-MB23-1.
2.2/ Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt
ngang. Kết quả thu được được xử lý trên hệ
thống SPSS 16.0 các thuật toán y sinh học
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Phát hiện hMAM mRNA, Survivin
mRNA trong nhóm nghiên cứu:
1.1. Kết quả RT-PCR phát hiện hMAM
mRNA và Survivin mRNA ở dòng tế bào UT
Hình 1: Hình ảnh điện di kết quả sao chép mRNA
hMAM, Survivin, GAPDH ở dòng tế bào UTV
Nhận xét:
Trong số 4 dòng tế bào UTV nghiên
cứu hMAM mRNA được khuyếch đại ở 3 dòng, 1
dòng TB không phát hiện được hMAM mRNA là
MDA-MB 231. Survivin mRNA phát hiện được 3
dòng, 1 dòng không phát hiện được là BT474.
1.2. Ngưỡng phát hiện hMAM mRNA và
Survivin từ tế bào UTV
Sử dụng dòng tế bào UTV: lấy 20000 TBUT
(với hMAM dùng dòng TB BT474, với Survivin
dùng dòng TB MCF7) pha loãng ở các tỷ lệ
1/10/100/1000 tương đương 20000/2000/200/20
tế bào UTV trong 5ml máu chứa 2.000.000 tế bào
bạch cầu. Ở mức pha loãng 100 tương đương 200
tế bào UT thì phát hiện được, mức 20 tế bào
không phát hiện được. Như vậy bằng kỹ thuật
Realtime PCR đã phát hiện được khoảng 200
TBUTV/5ml máu tương đương 40TBUTV/1ml máu
tương đương 1TBUTV/104 bạch cầu.
Hình 2: Real time PCR hMAM cDNA xác
định đường chuẩn và ngưỡng phát hiện
trên dòng tế bào UTV BT474
Hình 3: Real time PCR Survivin cDNA xác
định đường chuẩn và ngưỡng phát hiện
trên dòng tế bào UTV MCF7
*Giải trình tự mẫu dương tính
vietnam medical journal n02 - MARCH - 2020
214
Hình 4: Kết quả giải trình tự bản sao gen
hMAM nhân bản được từ mẫu máu của
bệnh nhân UTV
Hình 5: Kết quả giải trình tự bản sao gen
Survivin nhân bản được từ mẫu máu của
bệnh nhân UTV
Nhận xét:
Tách dòng và giải trình tự một vài
mẫu dương tính với cặp mồi nghiên cứu. Kết quả
giải trình tự bản sao gen hMAM và Survivin thu
được trùng hợp 100% các nucleotid so với trình
tự gen hMAM và Survivin công bố tại GenBank
2. Kết quả phát hiện hMAM mRNA và
Survivin mRNA trong nhóm nghiên cứu.
2.1 Tỷ lệ biểu hiện hMAM mRNA và
Survivin mRNA trong mẫu nghiên cứu
Nhận xét:
Kết quả điện di RT-PCR khuyếch
đại hMAM mRNA và Survivin mRNA ở mô UTV có
tỷ lệ tương đối cao 83,7% và 74.4%. hMAM
mRNA và Survivin mRNA có biểu hiện ở mô UVLT
nhưng tỷ lệ thấp 8% và 12%. Tỷ lệ khuyếch đại
được hMAM mRNA trong máu bệnh nhân UTV là
53,5%, Survivin mRNA là 44,2%. Không phát
hiện được bản sao hMAM và Survivin trong máu
bệnh nhân UVLT.
Hình 6: Tỷ lệ sao chép hMAM mRNA và
Survivin mRNA ở mẫu nghiên cứu
2.2. Kết quả Real- Time PCR đánh giá
mức độ sao chép của hMAm mRNA và
Survivin trong mẫu nghiên cứu
Để xem xét mức độ biểu hiện của các tế bào
UTV chúng tôi tiến hành kỹ thuật Real time PCR
từ các cDNA tạo được sau đó đánh giá số bản
sao đã khuyếch đại được.
Hình 7: Liên quan mức độ sao chép hMAM mRNA
và Survivin mRNA với các giai đoạn bệnh
Nhận xét:
Trong 4 giai đoạn UTV, giai đoạn
2 số bản sao cả hMAM và Survivin đều lớn nhất
sau đó giảm dần ở giai đoạn 3. Bản sao hMAM
tiếp tục giảm ở giai đoạn 4 còn ở gen Survivin số
bản sao tăng lên một chút ở giai đoạn 4.
Bảng 1: Mức độ sao chép của hMAM RNA và Survivin RNA trong máu và trong mô UTV
Số bản sao
Loại mRNA
trong mô UXV
Median (IQR)
hMAM
155,3 (16,6)
p
0,75>0,05
Survivin
1832.3 (2795,4)
p
0,41>0,05
Nhận xét:
Không có sự khác biệt về số
lượng bản sao gen Survivin và hMAM giữa mô
UTV và máu UTV p>0.05. Số bản sao ở mô UVLT
thấp hơn hẳn so với số lượng bản sao mRNA
gen NC trong máu và trong mô UTV.
IV. BÀN LUẬN
Ung thư vú là ung thư có tỷ lệ mắc cao nhất
ở phụ nữ không những ở Việt Nam mà trên toàn
thế giới. UTV mang các đặc điểm của UT nói
chung là các tế bào phát triển vô hạn độ, ngoài
Align.
DB:ID
Source
Length
Score
Identities
Positives
E()
1
EM_PAT:DM186769
Methods and Materials for Identifying the
Origin of a Carcinoma of Unknown Primary
Origin.
Cross-references and related information in:
• Ontologies
396
1500
100.0
100.0
6.5E-
83
2
EM_PAT:HI416621
Sequence 7 from Patent EP2125034.
Cross-references and related information in:
• Literature
• Ontologies
396
1500
100.0
100.0
6.5E-
83
Sequence 7 from Patent EP2402758.
Cross-references and related information in:
•
6.5E-
•
•
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 488 - THÁNG 3 - SỐ 2 - 2020
215
tầm kiểm soát, kết hợp với sự xâm lấn, di căn.
Đích đến của đề tài này nhằm xây dựng và hoàn
thiện quy trình phát hiện mRNA của hMAM và
Survivin từ tế bào ung thư vú, bước đầu làm
sáng tỏ sự phiên mã bất thường của gen hMAM
và Survivin trong bệnh UTV từ đó trả lời câu hỏi
có thể dùng việc phát hiện gen bất thường để
xác định tế bào ung thư trong máu và mô UT.
Để đánh giá mức độ sao chép của gen hMAM
trong máu ngoại vi ta phải tiến hành tách chiết
được RNA tổng số và tổng hợp cDNA. Trong
nghiên cứu này chúng tôi phải tiến hành tách
chiết RNA tổng số từ mô tươi và từ máu của
bệnh nhân UTV để có đối chứng chặt chẽ. Máu
được lấy trước khi mổ, sau khi lấy máu, cần tiến
hành tách chiết RNA tổng số càng nhanh càng
tốt, thông thường phải tách RNA trong vòng 4
giờ sau khi lấy máu. Mô UTV sau khi lấy được
bảo quản ở - 80oC cho đến khi tiến hành tách
chiết. Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân
hủy bởi các enzyme là các ribonuclease (RNase).
Tách chiết RNA tổng số theo Rneasy Mini Kit của
hãng QIAGEN là phương pháp có hiệu quả, tách
được phân tử RNA có chất lượng cao. Sau khi
tách RNA tổng số thu được 30 µl, độ tinh sạch
của phân tử RNA được xác định bằng các chỉ số
hấp thụ quang phổ, dựa trên tỷ lệ OD260/OD280.
Tỷ lệ OD260/OD280 biểu thị mức độ protein còn
sót lại trong dịch chiết. RNA được coi là tinh sạch
khi giá trị OD260/OD280 từ 1,8 đến 2,0. Tất cả các
mẫu tách RNA của chúng tôi phải đảm bảo sự
tinh sạch mới tiến hành bước kỹ thuật tổng hợp
cDNA tiếp theo. Quá trình tổng hợp cDNA dựa
trên mẫu khuôn là RNA được thực hiện bởi
enzym sao mã ngược thu được 20 µl cDNA. Sau
mỗi lần tổng hợp cDNA, chất lượng sản phẩm
cDNA được kiểm tra bằng phản ứng khuếch đại
gen GAPDH với cặp mồi đặc hiệu. Gen GAPDH
hiện diện ở mọi tế bào của cơ thể và được xem
là gen nội chuẩn và được sử dụng để kiểm tra
chất lượng của DNA hay cDNA. Sau phản ứng
khuếch đại, nếu chất lượng cDNA không tốt, bị
đứt gãy hay tạp nhiễm thì băng điện di trên
agarose sẽ mờ, bờ không đều, xuất hiện các
băng phụ. Sau khi kiểm tra bằng PCR, tiến hành
định lượng số bản sao bằng kỹ thuật Real-Time
PCR với SYBR Green. Để xác định độ nhạy của
kỹ thuật phải tiến hành đếm số lượng tế bào
UTV thu được. Trong nghiên cứu gen hMAM,
chúng tôi chọn dòng tế bào BT47-4. Sau khi trộn
20.000 tế bào BT47-4 pha loãng ở các tỷ lệ
1/10/100/1000 vào 2.000.000 bạch cầu/5ml
máu. Sau khi tiến hành tách RNA, tạo cDNA, tiến
hành ký thuật Real-time PCR với mồi hMAM R/F.
Kết quả thu được cho thấy ngưỡng phát hiện
được tế bào BT47-4 ở mức pha loãng 100 tức là
khoảng 200 tế bào thì phát hiện được. mức phát
hiện này tương đương 200 tế bào UTV/ 2.000.
000 bạch cầu (tương đương 1/104). Cũng theo
quy trình như xác định ngưỡng phát hiện gen
hMAM, ngưỡng phát hiện gen Survivin cũng vào
khoảng 200 tế bào UTV/5ml máu. Như vậy với
quy trình kỹ thuật được tiến hành trong nghiên
cứu thì ngưỡng phát hiện tế bào UTV trong máu
khoảng 200 TB/5ml, khoảng 1TB UT/104 BC. Sau
khi nhân bản PCR chúng tôi tiến hành tách dòng
và giải trình tự một số mẫu dương tính ở dòng
tế bào UTV, mô và máu bệnh nhân UTV. Kết quả
giải trình tự cho thấy trùng hợp 100% với cấu
trúc gen hMAM và Survivin ngân hàng gen đã
công bố. Đây là sự khẳng định đã nhân bản
thành công hMAM mRNA và Survivin mRNA từ
các tế bào UTV. Điều này mở ra triển vọng có
thể ứng dụng phát hiện mRNA của hMAM và
Survivin là một marker mới trong chẩn đoán
UTV. Sau khi xây dựng quy trình chuẩn cho phát
hiện mRNA của hMAM và Survivin ở dòng tế bào
UTV nuôi cấy, chúng tôi áp dụng quy trình này
để xác định tế bào UTV ở nhóm nghiên cứu.
Phát hiện gen UT từ tế bào ung thư ở trong
mô và đặc biệt là ở trong máu bệnh nhân UT đã
góp phần vào chẩn đoán, tiên lượng, theo dõi
điều trị. Phát hiện được tế bào UT trong máu ở
giai đoạn sớm ngoài ý nghĩa tiên lượng khả năng
di căn (giai đoạn Mx) mà còn giúp các nhà lâm
sàng có quyết định điều trị phù hợp, điều trị toàn
thân thay cho điều trị tại chỗ. Nghiên cứu phát
hiện tế bào ung thư đồng thời cả trong mô và
máu của bệnh nhân UT ngoài tính đồng nhất còn
là tính chặt chẽ. Mô UT chính là đối chứng
dương cho mẫu máu UT. Trong nghiên cứu này
với 43 mẫu máu UTV và 43 mẫu mô UTV là đối
chứng dương trực tiếp, 25 mẫu máu và mẫu mô
u xơ tương ứng là đối chứng âm. trước khi
khuyếch đại gen hMAM và Survivin gen GAPDH
được khuyếch đại nhằm chứng tỏ cDNA của các
mẫu tốt, đảm bảo tiêu chuẩn để tiến hành
khuyếch đại hMAM và Survivin. Trong số 43 mẫu
mô UTV nghiên cứu có 36 trường hợp (chiếm tỷ
lệ 83,7%) phát hiện được sự sao chép của hMAM
mRNA, 32 trường hợp (chiếm tỷ lệ 74.4%) phát
hiện được gen Survivin. Kết quả này cũng gần
tương đương với các nghiên cứu trước, tỷ lệ phát
hiện gen đặc hiệu UT trong mô ung thư từ 69%
đến 98% từy theo giai đoạn bệnh. Tỷ lệ biểu
hiện gen UT trên mô cao là phù hợp vì mô chứa
rất nhiều tế bào UT. Nếu kỹ thuật tốt thì việc
phát hiện gen UT từ tế bào UT ở mô UT là điều
kiện lý tưởng cho chẩn đoán bệnh UTV. Việc
phát hiện hMAM và Survivin trên mô UTV là một