Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tác động của all trans retinoic acid lên sự biểu hiện các gen trong con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ dày

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––––

MAI VĂN LINH

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC

ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG

TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ

DẠ DÀY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN – 2019.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––––

MAI VĂN LINH

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC

ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG

TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ

DẠ DÀY

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phú Hùng

THÁI NGUYÊN – 2019.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là

trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả

thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích

dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

Mai Văn Linh

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu tại Khoa Công

nghệ Sinh học – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, em đã

nhận được sự giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức của các thầy cô trong

khoa, các phòng ban trong nhà trường.

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy giáo - TS.

Nguyễn Phú Hùng, Thầy đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em học tập, tiến hành

nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Em xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học và bộ

phận Đào tạo sau đại học - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên

đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và giúp đỡ trong suốt quá trình em học tập tại

trường.

Đề tài luận văn đã nhận được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Bộ, mã số

B2017 - TNA - 48.

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các anh chị

lớp Cao học K11 đã luôn cổ vũ, động viên em hoàn thành tốt quá trình học

tập và nghiên cứu khoa học.

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2019

Tác giả

Mai Văn Linh

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii

MỤC LỤC ........................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v

DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ vi

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3

1.1. Tổng quan về ung thư và ung thư dạ dày ................................................... 3

1.1.1. Khái quát về ung thư và tế bào gốc ung thư ........................................... 3

1.1.2. Tổng quan về ung thư dạ dày .................................................................. 7

1.2. All-trans retinoic acid (ATRA) ................................................................. 13

1.2.1. Retinoids và all-trans retinoic acid (ATRA) ......................................... 13

1.2.2. Thụ thể của ATRA ................................................................................. 16

1.2.3. Retinoids trong điều trị.......................................................................... 17

1.3. Con đường tín hiệu EGF .......................................................................... 19

1.4. Con đường tín hiệu JAK/STAT ............................................................... 22

1.5. Khái quát về apoptosis ............................................................................. 25

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 26

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 26

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 26

2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 27

2.3.1. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D .......................................... 27

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào 3D và xử lí tế bào với ATRA ................. 27

2.3.3. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA ................... 28

2.3.4. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu EGF bằng Realtime PCR ................................................................................ 28

2.3.5. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu JAK/STAT bằng Realtime PCR ..................................................................... 29

2.3.6. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường apoptosis bằng Realtime PCR ......................................................................................... 30

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 31

3.1. Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere ....... 31

3.1.1. Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào trong điều kiện 2D .......................... 31

3.1.2. Nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D và xử lí tumorsphere với ATRA ..... 31

3.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số ............................................................... 33

3.3. Tác động của ATRA lên sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu EGF ................................................................................................................. 34

3.3.1 ATRA ức chế sự biểu hiện các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5 và EGFR ......................................................................................................................... 34

3.3.2. Tác động của ATRA lên sự biểu hiện của các gen CBL, EPS8, BCAR1, NCK2 và SHC1 ............................................................................................... 38

3.4. Ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu JAK/STAT ...................................................................................................... 40

3.4.1. ATRA ức chế biểu hiện của các gen STAT1 và STAT3 ........................ 40

3.4.2. Ảnh hưởng của ATRA đến sự điều hòa biểu hiện của các gen GAB1, GAB2, SRC và PPP2CA ................................................................................. 41

3.5. Ảnh hưởng ATRA lên sự biểu hiện của các gen củ quá trình apoptosis . 43

3.5.1. ATRA tác động lên sự biểu hiện của các gen ức chế apoptosis ........... 44

3.5.2. ATRA ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen thúc đẩy apoptosis.. 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 48

1. Kết luận ....................................................................................................... 48

2. Kiến nghị ..................................................................................................... 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 49

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ viết đầy đủ

AML Acute myeloid leukemia

ATRA All trans retinoic acid

BMDCs Bone marrow derived Dendritic cells

Cancer stem cells CSC

Epidermal growth factor EGF

Epidermal growth factor receptor EGFR

Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog ErbB

GSCs Gastric stem cells

H. pylori Helicobacter pylori

JAK Janus kinases

RA Retinoic acid

RAR Retinoic acid receptor

RXR Retinoid X receptor

STAT

Signal transducer and activator of transcription (proteins)

TNM Tumor – Node - Metastasis

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

29 Bảng 2.1 Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu EGF

29 Bảng 2.2 Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu JAK/STAT

Bảng 2.3 Mã số cặp mồi của các gen trong con đường apoptosis

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang

6 Hình 1.1 Ước tính số ca mắc mới ung thư năm 2018

6 Hình 1.2 Ước tính số lượng tử vong do ung thư năm 2018

Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren 9 Hình 1.3

Cấu tạo một tuyến dạ dày 11 Hình 1.4

12 Hình 1.5 Mô hình nhuộm Lgr5 trong mô ung thư dạ dày

Các thế hệ của retinoids 15 Hình 1.6

Sự chuyển hóa của Vitamin A trong cơ thể 15 Hình 1.7

Quá trình hoạt động của tín hiệu RA 16 Hình 1.8

Con đường tín hiệu của họ thụ thể EGFR 21 Hình 1.9

23 Hình 1.10 Con đường tín hiệu JAK/STAT

24 Hình 1.11 Một con đường JAK/STAT trong ung thư

Hình ảnh nuôi cấy tăng sinh tế bào sau 3 ngày nuôi cấy 31 Hình 3.1

Nuôi cấy tạo tumorsphere và xử lý với ATRA 32 Hình 3.2

Kết quả xác định hàm lượng RNA tổng số 34 Hình 3.3

35 Hình 3.4A Mức độ biểu hiện các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5, EGFR

38 Hình 3.4B Mức độ biểu hiện các gen EPS8, BCAR1, CBL, NCK2, SHC1

40 Hình 3.5A Mức độ biểu hiện các gen STAT3, STAT1

42 Hình 3.5B Mức độ biểu hiện các gen GAB1, SRC, GAB2, PPP2CA

44 Hình 3.6A Mức độ biểu hiện các gen ức chế apoptosis

46 Hình 3.6B Mức độ biểu hiện các gen thúc đẩy apoptosis

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Ung thư dạ dày là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất. Theo ước

tính của Tổ chức Y tế Thế giới (http://gco.iarc.fr/), trong năm 2018 có

1.033.701 bệnh nhân ung thư dạ dày mới (chiếm 5,7%, trong tổng số các ca

ung thư mới), 782.685 ca tử vong do ung thư dạ dày (chiếm 8,2%, trong tổng

số các ca tử vong do ung thư). Ung thư dạ dày được thống kê là dạng ung thư

phổ biến thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong thứ 3 trong nhóm ung thư. Có

769.728 (74,5%) các ca ung thư dạ dày mới được phát hiện ở các nước châu

Á. Tỉ lệ ung thư dạ dày cao nhất được thống kê là Hàn Quốc, Mông Cổ, Nhật

Bản và Trung Quốc. Việt Nam xếp thứ 10 trong thống kê các nước có tỉ lệ

ung thư dạ dày nhiều nhất thế giới với tỉ lệ 15,9 ca mắc ung thư dạ dày trong

100.000 dân số.

Các tế bào gốc ung thư dạ dày là nguyên nhân gây ra các khối u dạ dày.

Các tế bào gốc ung thư dạ dày, còn được gọi là các “tế bào khởi nguồn” của

ung thư dạ dày, có nguồn gốc chủ yếu từ các tế bào gốc dạ dày hoặc các tế

bào gốc định hướng dạ dày [4], [27]. Các tế bào gốc ung thư dạ dày cũng có

thế có nguồn gốc từ các tế bào sinh dưỡng bị biến đổi [6]. Giống với các tế

bào gốc thông thường, các tế bào gốc ung thư dạ dày cũng có chứa các

marker sinh học đặc trưng như CD44, ALDH,… [4]. Đây là những chỉ thị

phân tử quan trọng để xác định tế bào gốc ung thư dạ dày trong nghiên cứu và

điều trị.

All trans retinoic acid (ATRA) là một chất chuyển hóa từ vitamin A, thuộc

nhóm retinoid, có tác dụng điều hoà sự tăng trưởng, biệt hóa và quá trình

apoptosis của tế bào. ATRA được biết đến như một chất có khả năng ức chế

tế bào gốc của nhiều dạng ung thư khác nhau [53]. Hiện nay, ATRA đã được

sử dụng trong điều trị bệnh Lơ-xê-mi cấp dòng tủy (AML), cũng như sử dụng

trong nhiều thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư. Tuy nhiên, ảnh hưởng

của ATRA lên tế bào gốc ung thư ở cấp độ phân tử vẫn chưa được hiểu rõ. Vì

vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: ¨Nghiên cứu tác động của all

trans retinoic acid lên sự biểu hiện các gen trong con đường tín hiệu EGF và

JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ dày¨.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá tác động của ATRA lên sự phiên mã của các gen chính trong

con đường tín hiệu phân tử EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ

dày, cũng như ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các gen apoptosis.

3. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nuôi cấy tế bào trong điều kiện 3D để hình thành nên các

tumorsphere từ các tế bào gốc ung thư dạ dày.

Nội dung 2: Phân tích tác động của ATRA lên sự hình thành và tăng

trưởng của các tumorsphere.

Nội dung 3: Phân tích sự biểu hiện của các gen trong con đường tín

hiệu EGF bằng phương pháp Realtime PCR đối với các tế bào được xử lý

hoặc không xử lý với ATRA.

Nội dung 4: Phân tích ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các

gen của con đường tín hiệu JAK/STAT bằng phương pháp Realtime PCR.

Nội dung 5: Phân tích sự tác động của ATRA lên sự biểu hiện các gen

apoptosis bằng phương pháp Realtime PCR.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về ung thư và ung thư dạ dày

1.1.1. Khái quát về ung thư và tế bào gốc ung thư

1.1.1.1. Lịch sử, khái niệm, phân loại ung thư

Ung thư được miêu tả sớm nhất vào khoảng năm 1.600 TCN (thời Ai

Cập cổ đại) trong các Edwin Smith Papy (một loại giấy cói ghi chép về văn

bản y tế lâu đời nhất). Trong các Edwin Smith Papy có chứa mô tả về ung thư

vú cũng như thủ thuật để loại bỏ các khối u vú. Hippocrates (khoảng năm 460

TCN- khoảng năm 370 TCN) đã mô tả một số loại ung thư, gọi chúng bằng

thuật ngữ karkinos (carcinos) - tiếng Hy Lạp có nghĩa là ¨cua¨ hoặc ¨tôm

càng¨, dựa trên đặc điểm quan sát được của khối u rắn. Celsus (khoảng năm

25 TCN - 50 SCN) đã dịch karkinos thành ¨cancer¨ - ung thư [1].

Hiện nay, khái niệm ung thư (cancer) được sử dụng để chỉ một nhóm

bệnh liên quan đến sự phát triển bất thường của tế bào với khả năng xâm lấn

hoặc lây lan (di căn) sang các bộ phận khác của cơ thể [34].

Các dấu hiệu của ung thư bao gồm: duy trì các tín hiệu tăng sinh, tránh

khỏi sự ức chế sinh trưởng, chống lại quá trình chết của tế bào, nhân lên số

lượng lớn tế bào, tăng cường hình thành mạch máu, xâm lấn và di căn, tái lập

trình trao đổi chất và tránh sự phá hủy của hệ miễn dịch. Những thay đổi từ tế

bào bình thường thành tế bào khối u chủ yếu do sự mất ổn định bộ gen, sự

biểu hiện bất thường về chức năng của các gen ức chế khối u và gen gây ung

thư [34].

Ung thư có thể xuất hiện ở tất cả các bộ phận khác nhau trong cơ thể.

Ung thư được đặt tên theo cơ quan mà chúng bắt đầu và loại tế bào được tạo

ra ngay cả khi chúng lây lan (di căn) sang các bộ phận khác của cơ thể. Hiện

nay đã thống kê được hơn 100 loại ung thư ảnh hưởng đến con người [34].

Ngoài ra ung thư được phân loại theo loại mô, bao gồm:

 Carcinomas: (ung thư biểu mô) là loại ung thư bắt nguồn từ da hoặc các

mô lót hay phủ các cơ quan bên trong.

 Sarcomas: (ung thư mô liên kết) là loại ung thư bắt nguồn từ xương,

sụn, mỡ, cơ, mạch máu hay các mô liên kết khác.

 Lymphomas và leukemias: hai loại ung thư này phát sinh từ các tế bào

tạo máu và có xu hướng phát triển trong các hạch bạch huyết và máu.

 Germ-cell tumor: là loại ung thư bắt nguồn từ các tế bào đa năng,

thường gặp nhất là seminoma (ung thư tinh hoàn) và dysgerminoma (ung

thư buồng trứng).

 Blastoma: là loại ung thư có nguồn gốc từ các tế bào "tiền thân"

(precursor) chưa trưởng thành hoặc phôi. Dạng ung thư này thường gặp ở

trẻ nhỏ.

Carcinomas (ung thư biểu mô) là loại ung thư thường gặp nhất. Ung thư

phổi, ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư dạ dày

là các bệnh ung thư có số lượng bệnh nhân mắc phải và tử vong nhiều nhất

trong nhóm ung thư (WHO, 2018). Carcinomas và arcomas đa phần sẽ tạo

thành các khối tế bào bất thường gọi là khối u (neoplasia), trong khi

leukemias và lymphomas thường không tạo thành các khối u rắn.

1.1.1.2. Tế bào gốc ung thư

Tế bào gốc (Stem cells) là đơn vị phát triển chức năng tái tạo các mô và

cơ quan, đóng vai trò trong cân bằng nội môi và sửa chữa sau khi bị tổn

thương. Các tế bào gốc nằm ở những vị trí đặc biệt bảo vệ chúng khỏi sự hoạt

động quá mức [80]. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các khối u chứa

các tế bào ung thư không đồng nhất về kiểu hình và chức năng [27]. Các khối

u có thể bắt nguồn từ một quần thể nhỏ tế bào gốc ung thư (Cancer stem cell)

có khả năng duy trì sự phát triển lâu dài của khối u, cũng như khả năng tái

phát, kháng apoptosis, di căn, hóa trị và xạ trị [34].

Tế bào gốc ung thư có các đặc điểm tương tự như các tế bào gốc thông

thường bao gồm khả năng tự làm mới không giới hạn, tăng sinh và biệt hóa

thành nhiều dòng. Tế bào gốc ung thư chỉ chiếm một phần nhỏ, tồn tại ở một

vùng trong khối u (CSCs occupy) và thường không hoạt động trong một thời

gian dài. Các tế bào gốc ung thư có khả năng kháng lại các phương pháp điều

trị ung thư thông thường như hóa trị và xạ trị vì chúng có khả năng kích hoạt

các con đường liên quan đến sự phát triển, chống độc tế bào và tăng khả năng

sửa chữa DNA. Hơn nữa, hóa trị và xạ trị còn có thể làm biến đổi các tế bào

trong khối u, biến các tế bào không phải là tế bào gốc ung thư thành các tế

bào gần giống như tế bào gốc ung thư. Các tế bào này có thể vẫn còn tồn tại

sau khi điều trị hóa trị và xạ trị, chúng có thể là nguyên nhân tái phát khối u

[11].

Sự tồn tại của tế bào gốc ung thư lần đầu tiên được Bonnet và Dick [10]

chứng minh có ở bệnh Lơ-xê-mi cấp dòng tủy (AML) bằng cách sử dụng

marker bề mặt tế bào CD34+/CD38-. Trong những năm gần đây, các nghiên

cứu đã cho thấy sự có mặt của tế bào gốc ung thư trong nhiều khối u rắn,

trong đó có ung thư não, ung thư vú, ung thư đầu và cổ, ung thư thận, ung thư

ruột kết, ung thư tuyến tụy, ung thư gan, khối u ác tính, ung thư phổi [11].

Những nghiên cứu in vivo gần đây đã chứng minh các khối u có nguồn gốc từ

tế bào gốc ung thư. Hiện nay, các nghiên cứu đang hướng tới việc xác định

các tế bào gốc ung thư bằng các marker sinh học, thông qua đó sử dụng các

biện pháp điều trị nhắm đích tế bào gốc ung thư [34].

1.1.1.3. Nguyên nhân gây ung thư và tình hình ung thư hiện nay

Phần lớn các bệnh ung thư, khoảng 90% - 95% các trường hợp là do đột

biến gen từ ảnh hưởng của các yếu tố môi trường sống và lối sống, khoảng

5% - 10% còn lại là do yếu tố di truyền. Các yếu tố môi trường phổ biến gây

tử vong do ung thư được thống kê bao gồm: thuốc lá (25%-30%), chế độ ăn

uống (30%-35%), nhiễm trùng (15%- 20%), phóng xạ (10%), stress, ít hoạt

động và ô nhiễm [34].

Theo ước tính của WHO trong năm 2018, có 18.078.957 trường hợp mắc

ung thư, trong đó có 7 loại ung thư phổ biến nhất (chiếm 54%), bao gồm: ung

thư phổi, ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư

dạ dày, ung thư gan và ung thư thực quản (Hình 1.1).

Hình 1.1. Ước tính số ca mắc mới ung thư năm 2018 (Nguồn WHO)

Hình 1.2. Ước tính số lượng tử vong do ung thư năm 2018 (Nguồn WHO)

Ở các nước châu Á, trong năm 2018, ước tính có 8.750.932 trường hợp

mắc mới ung thư và 5.477.064 ca tử vong do ung thư. Hơn 70% số lượng các

các ca tử vong do ung thư tập trung ở các nước đang phát triển (Hình 1.2).

1.1.2. Tổng quan về ung thư dạ dày

1.1.2.1. Dịch tễ học của ung thư dạ dày

Ung thư dạ dày (gastric cancer hay stomach cancer) là loại ung thư phát

triển đầu tiên ở mô dạ dày và di căn sang các bộ phận khác của cơ thể. Tỉ lệ

mắc ung thư dạ dày đang có xu hướng giảm ở cả hai giới trên phạm vi toàn

cầu. Tuy nhiên, do sự già hóa dân số và sự gia tăng dăn số ở các nước đang

phát triển nên số lượng ung thư dạ dày trên thế giới vẫn tiếp tục tăng [3].

Việt Nam có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày (tính trên 100.000 dân số) là 15,9

(đứng thứ 10 trên thế giới) với tỉ lệ mắc theo độ tuổi ở nam là 23,3 (đứng thứ

11 trên thế giới), ở nữ là 10,2 (đứng thứ 14 trên thế giới).

Ung thư dạ dày là kết quả của các tác động phức tạp giữa vật chủ và các

yếu tố môi trường, trong đó đáng chú ý nhất là nhiễm Helicobacter pylori (H.

pylori). WHO xếp H. pylori vào tác nhân gây ung thư nhóm I. Ước tính H.

pylori là nguyên nhân của khoảng 63% các trường hợp ung thư dạ dày không

thuộc tâm vị trên toàn thế giới. Một số yếu tố đáng chú ý khác như chế độ ăn

uống và hút thuốc lá cũng ảnh hưởng tới nguy cơ mắc ung thư dạ dày.

Hoocmon nội tiết tố nữ (estrogen) là một yếu tố làm giảm nguy cơ mắc ung

thư dạ dày ở nữ giới, tỉ lệ mắc mới ung thư dạ dày ở phụ nữ thấp hơn nhiều so

với ở nam giới [3].

1.1.2.2. Phân loại ung thư dạ dày và điều trị

Tùy thuộc vào chỉ tiêu phân loại mà ung thư dạ dày có thể được chia

thành nhiều loại khác nhau. Một số hệ thống phân loại đáng chú ý như hệ

thống phân loại theo vị trí (ung thư tâm vị và ung thư không thuộc tâm vị),

phân loại 4 type của Borrmann [81] và Hiệp hội Ung thư Dạ dày Nhật Bản

[47], phân loại vi thể [56], phân loại theo mô bệnh học của Lauren [56] hay

hệ thông phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày của Tổ chức Y tế Thế giới

[31].

Hiện nay, ung thư dạ dày có xu hướng được chia làm 2 loại là ung thư

tâm vị và ung thư không thuộc tâm vị. Ung thư tâm vị là ung thư trong

khoảng 1cm trên đến 2 cm dưới đường nối thực quản dạ dày. Ung thư dạ dày

không thuộc tâm vị gồm ung thư ở phình vị, thân vị, bờ cong lớn, bờ cong

nhỏ, hang vị và môn vị. Có sự khác nhau rất rõ trong dịch tễ, nguyên nhân

gây bệnh, mô bệnh học, điều trị và tiên lượng giữa ung thư dạ dày tâm vị và

ung thư dạ dày không thuộc tâm vị [61]. Ung thư dạ dày không thuộc tâm vị

thường gặp hơn ở những khu vực có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày cao, ung thư

tâm vị thường gặp ở khu vực có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày thấp. Ung thư tâm vị

đã tăng đáng kể trong vòng 50 năm qua ở các nước phát triển và cả một số

nước điều kiện kinh tế phát triển. Ung thư tâm vị thường là hậu quả của trào

ngược dạ dày thực quản mạn tính, trong khi đó ung thư dạ dày không thuộc

tâm vị có liên quan chặt chẽ tới tình trạng nhiễm H. pylori mãn tính. Tiên

lượng ung thư tâm vị thường xấu hơn ung thư dạ dày không thuộc tâm vị

[61].

Lauren phân loại ung thư dạ dày thành 2 thể mô bệnh học riêng biệt là

thể ruột (intestinal type) và thể lan tỏa (diffuse type) (Hình 1.3) [56]. Thể ruột

gồm những tế bào u kết dính tạo ra cấu trúc ống tuyến tương tự như tuyến

ruột, đi kèm với thâm nhập tế bào viêm lan tỏa. U này thường xuất phát từ

phần xa dạ dày cùng với nhiễm H. pylori, có đặc điểm teo niêm mạc dạ dày

diện rộng, dị sản ruột và thường được đi trước bằng một giai đoạn tiền ung

thư. Thể lan tỏa gồm những mảng tế bào rải rác trong mô đệm, không tạo

tuyến, không có tính kết dính. Ung thư thể lan tỏa có thể gồm các tế bào hình

nhẫn, lan rộng theo lớp dưới niêm mạc, ít thâm nhập tế bào viêm, thường có

mức độ biệt hóa kém. Có xấp xỉ 5-10% các khối u vẫn không thể phân loại

được xếp vào thể “không xác định” hoặc có đặc điểm của cả hai thể ruột và

lan tỏa được xếp vào thể “hỗn hợp” (mixed type). Trong đánh giá bệnh học

lâm sàng, các khối u thể này thường được xem như là thể lan tỏa [56]. Phân

loại mô bệnh học của Lauren khá đơn giản và được sử dụng rộng rãi trên toàn

thế giới. Hai thể mô học này có sự khác nhau rõ rệt về dịch tễ, nguyên nhân

gây bệnh và đặc biệt là tiên lượng. Sự khác nhau về hình thái được cho là do

vai trò của các phân tử kết dính liên bào, các phân tử này được bảo toàn ở thể

ruột và khiếm khuyết ở thể lan tỏa [56].

A. Intestinal type B. Diffuse type C. Mixed type

Hình 1.3. Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren [56]

Để đánh giá giai đoạn của ung thư dạ dày, có hai hệ thống đánh giá được

sử dụng rộng rãi là hệ thống đánh giá của AJCC/UICC [87] và hệ thống đánh

giá của Nhật Bản [47]. Cả hai hệ thống này đều đánh giá giai đoạn của ung

thư dạ dày dựa trên đánh giá mức độ xâm lấn của khối u (Tumor), tình trạng

di căn vùng hạch (Node) và di căn xa (Metastasis) nên còn được gọi là cách

đánh giá giai đoạn TNM (Khối u - Hạch - Di căn). Khối u (Tumor) được đánh

giá dựa vào độ xâm nhập sâu của khối u, giai đoạn hạch bạch huyết (Node)

được đánh giá dựa trên số lượng bạch huyết vùng bị di căn.

Phẫu thuật cắt bỏ là phương pháp điều trị chính và có thể chữa khỏi cho

bệnh nhân bị ung thư dạ dày ở giai đoạn đầu. Tuy nhiên, tỉ lệ sống sót của

bệnh nhân vẫn còn thấp. Phương pháp xạ trị sử dụng trong điều trị ung thư dạ

dày đem lại hiệu quả thấp [56] do tính kháng xạ trị của các tế bào ung thư dạ

dày. Hóa trị liệu là phương pháp điều trị quan trọng nhằm giảm tỉ lệ tái phát

sau phẫu thuật và kéo dài thời gian sống thêm của bệnh nhân. Thời gian sống

thêm của bệnh nhân sử dụng hóa trị có thể kéo dài thêm 9-36 tháng. Độc tính

cao, thời gian đáp ứng ngắn, tỷ lệ đáp ứng thấp là những hạn chế của hóa trị

liệu [70]. Điều trị nhắm đích là phương pháp mới, sử dụng các loại thuốc điều

trị có tác dụng chọn lọc lên tế bào gốc ung thư ở mức độ phân tử mà không

hoặc ít làm ảnh hưởng đến các tế bào bình thường, đang được nghiên cứu và

thử nghiệm trong điều trị ung thư dạ dày [70].

1.1.2.3. Tế bào gốc ung thư dạ dày

Tế bào gốc dạ dày (Gastric stem cells) là các tế bào gốc ở dạ dày, được

tìm thấy ở vùng eo của tuyến dạ dày, gồm nhiều loại tế bào gốc khác nhau

(Hình 1.4). Tế bào gốc dạ dày được bao quanh bởi một lớp myofibroblasts

(SMFs) hoạt động như một hốc chứa và tiết ra các yếu tố tăng trưởng và biệt

hóa khác nhau. Tế bào gốc dạ dày giữ vai trò thiết yếu trong việc tự làm mới

và căn bằng nội môi của tuyến dạ dày; chúng giữ vai trò đặc biệt quan trọng

trong việc sửa chữa biểu mô dạ dày sau chấn thương. Các tế bào gốc tủy

xương (BMDCs) có vai trò quan trọng trong sự tái tạo, phục hồi lại các phần

niêm mạc bị tổn thương do H. pylori. Quá trình tự tái tạo và biệt hóa ở niêm

mạc dạ dày được điều chỉnh bởi một số con đường tín hiệu như Wnt, Notch,

Hedgekey và yếu tố phiên mã liên quan đến Runt 3 (Runx3) [40].

Tế bào gốc ung thư dạ dày được Yang và cộng sự mô tả lần đầu tiền vào

năm 2007 [92]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ung thư dạ dày có thể bắt nguồn

từ tế bào gốc dạ dày bình thường hoặc các tế bào có nguồn gốc từ tủy xương

[6], [40]. McDonand và cộng sự đã đưa ra bằng chứng về quá trình loạn sản ở

các đơn vị dạ dày do sự biến chất đường ruột và nhận thấy rằng chứng loạn

sản đường ruột là vô tính, chứa nhiều tế bào gốc và lây lan qua sự phân hạch

[62]. Tuy nhiên, Barker và cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu truy

tìm nguồn gốc của tế bào gốc gây ra ung thư dạ dày [6]. Trong thí nghiệm,

Barker đã nhận thấy các tế bào gốc môn vị Lgr5+ có khả năng gây khối u khi

bị tác động [6]. Simon và cộng sự tiếp tục kiểm tra mức độ phổ biến, phân bố

và ý nghĩa sinh học khối u của các tế bào Lgr5 trong dạ dày bằng cách nghiên

cứu biểu hiện khác biệt của Lgr5 ở mức độ phiên mã và dịch mã [79]. Nghiên

cứu đã chỉ ra các mô ác tính có sự biểu hiện Lgr5+ cao hơn các mô không ác

tính và có sự di chuyển của các tế bào Lgr5+ ở các giai đoạn khác nhau của

ung thư dạ dày. Nghiên cứu cũng chỉ ra ở trong niêm mạc dạ dày bình thường

các tế bào Lgr5+ nằm chủ yếu ở vùng cổ niêm mạc, trong khi ở ung thư dạ

dày các tế bào Lgr5+ xuất hiện ở vùng eo, trung tâm khối u và mặt trước xâm

lấn (Hình 1.5). Các bệnh nhân dương tính với Lgr5+ cũng có tỉ lệ sống trung

bình ngắn hơn các bệnh nhân âm tính với Lgr5+ [79]. Các tế bào gốc ung thư

dạ dày ngoài nguồn gốc từ tế bào gốc dạ dày [6] còn có thể có nguồn gốc từ

các tế bào gốc tủy xương [85]. Sự viêm nhiễm, tổn thương mãn tính biểu mô

dạ dày do H. pylori dẫn đến mất tế bào gốc dạ dày thường trú và gây ra sự tái

lập tế bào gốc tủy xương trong dạ dày, sau đó là tăng sản, biến chất, loạn sản

và cuối cùng là tăng sản ung thư dạ dày [85].

Hình 1.4. Cấu tạo tuyến dạ dày (Nguồn: Giải phẫu học - Nguyễn Quang Quyền)

Hình 1.5. Mô hình nhuộm Lgr5 trong mô ung thư dạ dày [79]

(A, E) Niêm mạc dạ dày bình thường

(B, F) Mô dạ dày dị sản ruột

(C, G) Ung thư dạ dày trước xâm lấn

Tế bào gốc ung thư dạ dày được xác định chủ yếu nhờ các marker bề mặt

tế bào. Việc sử dụng các marker bề mặt thuận lợi hơn so với sử dụng các yếu

tố nội sinh trong việc xác định tế bào cũng như nhắm đích trong nghiên cứu

điều trị ung thư dạ dày. Hiện nay, các nghiên cứu sử dụng liệu pháp điều trị

nhắm đích tế bào gốc ung thư dạ dày đang được nghiên cứu và phát triển.

Trong nhiều năm qua, các liệu pháp thông thường như hóa trị, xạ trị và miễn

dịch đã được sử dụng trong điều trị ung thư dạ dày. Tuy nhiên, các phương

pháp này chỉ tiêu diệt được các tế bào khối u đã biệt hóa, do đó, sau một thời

gian các khối u lại tái phát do hoạt động của các tế bào gốc ung thư dạ dày. Ở

ung thư dạ dày có các tế bào gốc ung thư dạ dày hoạt động và không hoạt

động, do đó cần có loại thuốc đặc biệt được thiết kế để nhắm đích tế bào gốc

ung thư dạ dày, ức chế sự phân chia của tế bào gốc ung thư dạ dày, thúc đẩy

biệt hóa tế bào gốc ung thư dạ dày và điều hòa môi trường vi mô trong khối u

[34], [91]. Để nhắm mục tiêu các tế bào gốc ung thư dạ dày, một số chiến

lược đã được đề xuất, bao gồm sự kết hợp apoptosis liên quan đến hóa trị liệu,

nhắm đích phân tử và cảm ứng biệt hóa tế bào gốc ung thư dạ dày; gây ra

apoptosis trong khối u; liệu pháp nhắm đích marker bề mặt tế bào gốc ung thư

dạ dày; phát triển kháng thể đơn dòng; nhắm mục tiêu vào môi trường vi môi

tế bào gốc ung thư dạ dày; ức chế các con đường tín hiệu tế bào gốc ung thư

dạ dày [34].

1.2. All-trans retinoic acid (ATRA)

1.2.1. Retinoids và all-trans retinoic acid (ATRA)

Retinoids là những chất có cấu tạo hoặc chức năng tương tự retinol

(Vitamin A). Hiện nay đã có khoảng hơn 4.000 phân tử retinoids tự nhiên và

tổng hợp được công bố. Retinoids là phân tử sinh học thiết yếu cho sự phát

triển của phôi thai và cân bằng nội môi của cơ thể trưởng thành. Động vật hấp

thu retinoids dưới dạng vitamin A, thu được từ 2 nguồn là: vitamin A được

tạo thành từ trước (retinol và retinal ở dạng retinyl ester) và provitamin A

carotenoids (β-carotene, α-carotene, β-cryptoxanthin). Các chất trung gian có

hoạt tính sinh học của vitamin A được xác định là ATRA và 11 – cis retinol.

ATRA là một chất có liên quan đến việc điều chỉnh sự phiên mã của gen,

trong khi đó 11 – cis RA liên quan đến sự cảm nhận màu của thị giác [22].

Retinoids được phân chia thành 3 thế hệ:

 Thế hệ thứ nhất: bao gồm retinol (Vitamin A), tretinoin/retinoic

acid/retin-A (ATRA), isotretinoin (13- cis RA) và alitretinoin (9- cis

RA) (Hình 1.6.A).

 Thế hệ thứ 2: có etretinate, acitretin. (Hình 1.6.B).

 Thế hệ thứ 3: gồm tazarotene, bexarotene, adapalene (Hình 1.6.C).

All-trans retinoic acid (ATRA) hay còn được gọi là Tretinoin, là một một

chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học chính của retinoids. Trong quá trình

phát triển phôi thai sớm, ATRA điều chỉnh sự hình thành lớp mầm, hình

thành trục cơ thể, phát sinh thần kinh, phát sinh tim mạch, cũng như sự phát

triển của tuyến tụy, phổi và mắt. Nó cũng là một yếu tố quan trọng cho chức

năng thị giác [22]. Ở cơ thể trưởng thành, ATRA có liên quan đến sự phát

triển của tế bào, quá trình apoptosis, đáp ứng miễn dịch và sự tăng trưởng

biểu mô [30].

A. Thế hệ thứ nhất của retinoids

B. Thế hệ thứ 2 của retinoids

C. Thế hệ thứ 3 của retinoids

Hình 1.6. Các thế hệ của retinoids [22]

Hình 1.7. Sự chuyển hóa của Vitamin A trong cơ thể [30]

Trong cơ thể, ATRA được tạo thành từ vitamin A. Quá trình biến đổi tạo

thành ATRA từ vitamin A có thể bị đảo ngược bởi một số yếu tố. Enzyme

CYP26 thuộc họ cytochrom P450 hydroxylase là enzyme phân hủy ATRA

(Hình 1.7). Một số enzyme thuộc CYP26 gồm CYP26A1, B1, C1 và D1 đều

có khả năng phân giải ATRA thành retinoids ít hoạt tính sinh học hơn [30].

1.2.2. Thụ thể của ATRA

ATRA được đưa vào nhân bằng CRABP-II và tương tác với các RAR,

bản thân ATRA là một yếu tố phiên mã. RAR và RXR (thụ thể X retinoid)

thuộc họ thụ thể retinoid. RAR có khả năng nhận biết cả ATRA và 9-cis

retinoic acid, trong khi RXR chỉ nhận biết được 9-cis retinoic acid. Thụ thể

RAR gồm 3 thành viên là RARα / β / bind [68]. Khi liên kết với các phối tử,

RAR nhị trùng hợp với RXR tạo thành một heterodimer, sau đó khởi động

quá trình phiên mã bằng cách gắn vào yếu tố phản ứng acid retinoic (RARE)

ở promotor của các gen mục tiêu (Hình 1.8). Sự biểu hiện của các RAR cũng

nằm dưới sự kiểm soát của ATRA. Trong promotor của RARα và β cũng tìm

thấy sự có mặt của RARE [68].

Hình 1.8. Quá trình hoạt động của tín hiệu RA [68]

1.2.3. Retinoids trong điều trị

Retinoids (vitamin A cùng các chất tự nhiên và tổng hợp của vitamin A)

được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh về thị giác và da liễu [22].

Retinoids đã được chứng minh là có thể ức chế sự phát triển của một số dòng

tế bào ung thư [30]. Retinoids có tác dụng ức chế quá trình gây ung thư vì

chúng ức chế sự tăng trưởng, gây ra sự biệt hóa và gây chết tế bào ở nhiều

loại tế bào ung thư khác nhau [30], [69]. Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy

rằng, lượng vitamin A thấp hơn dẫn đến nguy cơ phát triển ung thư cao hơn,

phù hợp với các quan sát về động vật thiếu vitamin A. Thay đổi biểu hiện của

thụ thể RAR cũng liên quan đến sự biến đổi ác tính của các mô động vật hoặc

tế bào nuôi cấy. Hơn nữa, retinoids ức chế quá trình gây ung thư trong các mô

hình động vật ở da, miệng, phổi, vú, bàng quang, buồng trứng và tuyến tiền

liệt [30]. Ở người, retinoids đảo ngược các tổn thương biểu mô ở giai đoạn

tiền ung thư, gây ra sự biệt hóa của các tế bào tủy và ngăn ngừa ung thư phổi,

gan và ung thư vú [30].

ATRA là retinoid tự nhiên đã được nghiên cứu rộng rãi trong nhiều

năm. ATRA hiện đang được thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư hạch,

ung thư bạch cầu, ung thư da, ung thư phổi, ung thư cổ tử cung, ung thư thận,

u nguyên bào thần kinh và u nguyên bào thần kinh đệm [68]. Tuy nhiên, ở

mức độ phân tử, tác động của ATRA lên các tế bào ung thư chưa được hiểu

rõ. Ở một hướng nghiên cứu khác, tác động của ATRA lên sự biểu hiện của

các gen thông qua điều chỉnh các miRNA cũng được chỉ ra [53].

Tác động của ATRA lên ung thư được nghiên cứu trước tiên ở ung thư

bạch cầu (Acute promyelocytic leukemia- APL). Breitman và cộng sự đã

nhận thấy sự biệt hóa của dòng tế bào APL HL-60 khi sử dụng butyrate,

dimethyl sulfoxide và ATRA [12]. Hiện nay, ATRA được sử dụng trong điều

trị APL.

Việc điều trị kết hợp ATRA với các chất ức chế HDAC SL142 hoặc

SL325 có khả năng chống khối u đáng kể và là một phương pháp trị liệu đầy

hứa hẹn để điều trị ung thư phổi ở người. Biểu hiện thúc đẩy apoptosis và

hoạt tính caspase-3 đã tăng lên sau khi điều trị kết hợp. Sự kết hợp của ATRA

và một số các chất chất ức chế HDAC cho thấy tác dụng chống khối u trong u

nguyên bào thần kinh. Liệu pháp kết hợp ATRA với chất ức chế HDAC có

thể cải thiện hiệu quả đồng thời giảm tác dụng phụ [26]. Hơn nữa, ATRA là

chất điều biến mạnh của sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào biểu mô có thể có

tiềm năng để điều trị loạn sản cổ tử cung (CIN) [39].

ATRA đã được chứng minh là có khả năng điều chỉnh sự biểu hiệu của

HbsAg (kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B) và ức chế sự biểu hiện

của topoisomerase II, là một loại enzyme có khả năng thúc đẩy sự phân ly của

nhiễm sắc thế (NST), ở tế bào gan và một số dòng tế bào ung thư gan được

nghiên cứu. Như vậy, ATRA là một chất tiền năng ngăn chặn sự phát triển

của ung thư gan, có thể sử dụng để kết hợp với các chất chống ung thư khác

trong điều trị ung thư gan [41]. Ở ung thư vú, ATRA có khả năng gây ra sự

biệt hóa của các tế bào biểu mô vú biến đổi sớm, qua đó có tác dụng trong

phòng ngừa và làm giảm sự phát triển của ung thư vú [4].

Ở ung thư dạ dày, bằng cách sử dụng các dòng tế bào ung thư dạ dày có

sự biểu hiện RAR khác nhau, Su Liu và cộng sự đã chứng minh được tác

động của ATRA lên tế bào ung thư dạ dày thông qua thụ thể RAR [82]. Trong

nhiều nghiên cứu về ung thư dạ dày đã chỉ ra ATRA cũng có tác dụng ức chế

sự tiến triển của chu kỳ tế bào qua cảm ứng p21WAF1/ CIP1; ức chế sự tăng

sinh tế bào bằng sự ức chế yếu tố phiên mã AP1; ức chế giảm hoạt động của

con đường ERK/MAPK; cảm ứng biểu hiện các dấu hiệu phân biệt tế bào gốc

ung thư dạ dày; ức chế sự tăng sinh tế bào; cảm ứng apoptosis và ức chế tính

chất của tế bào gốc ung thư [23], [69]. Gần đây, tác dụng của ATRA ức chế

sự phát triển của các tế bào gốc ung thư dạ dày có nguồn gốc từ bệnh nhân đã

được ghi nhận. ATRA ức chế sự khởi đầu và tăng trưởng của khối u trong

ống nghiệm, cũng như ức chế sự tiến triển của khối u dạ dày in vivo. Cùng với

đó, việc giảm thiểu các gen CD44, ALDH1, Ki67, PCNA cũng được ghi

nhận. ATRA là một tác nhân mạnh mẽ ức chế hiệu quả sự phát triển của khối

u và quan trọng hơn nữa là nhắm đích tế bào gốc ung thư dạ dày [69].

1.3. Con đường tín hiệu EGF

Sự dẫn truyền thông tin là quá trình tế bào tiếp nhận các tín hiệu thông

tin từ môi trường và truyền đạt lại thông tin thông qua một loạt các phân tử

trong tế bào, tiếp đến là sự đáp ứng lại các tín hiệu đó thông qua các cơ chế

khác nhau. Các con đường tín hiệu tế bào được hoạt hóa bởi nhiều phân tử

khác nhau từ phức hệ tế bào hay từ sự kết nối tế bào- tế bào, chúng tham gia

điều hòa các quá trình của tế bào như sinh tổng hợp protein, sự phát triển và

biệt hóa tế bào, kiểm soát chu trình chết tế bào. Sự rối loạn điều hòa các con

đường tín hiệu làm thay đổi các đặc điểm di truyền hoặc di truyền ngoại sinh

của tế bào đồng thời gây ra những thay đổi ở phức hệ ngoại màng

(extracellular matrix), dẫn tới sự phát triển và lan rộng của khối u [78].

EGFR (epidermal growth factor receptor) thuộc họ thụ thể tyrosine

kinase. EGFR hay còn được biết đến với tên ErbB (Erythroblastic Leukemia

Viral Oncogene Homolog), bao gồm 4 thụ thể: EGFR (ErbB-1/HER1), ErbB-

2 (Neu, HER2), ErbB-3 (HER3) và ErbB-4 (HER4). Ở động vật có vú, có 7

phối tử liên kết và kích hoạt EGFR: EGF, TGF-α, HB-EGF, betacellulin

(BTC), ameraldgulin (ISG), epiregulin (EREG) và epigen (EPGN). Trong đó,

EGF, TGF-α, HB-EGF và BTC là các phối tử có ái lực cao với EGFR; trong

khi ISG, EREG và EPGN là các phối tử có ái lực thấp với EGFR. Các thụ thể

EGFR liên kết thành từng cặp trên màng tế bào (Hình 1.9). Sự kích hoạt các

thụ thể EGFR bằng cách liên kết với các phối tử của chúng tạo ra khởi đầu

của con đường tín hiệu EGF. Đặc biệt, HER2 là thụ thể không có phối tử liên

kết trực tiếp, tuy nhiên ảnh hưởng của HER2 trong ung thư được đặc biệt

quan tâm [54].

Liên kết với phối tử dẫn đến giảm thiểu EGFR và kích hoạt tyrosine

kinase của nó. Phosphoryl hóa tiếp theo của dư lượng tyrosine của EGFR

cung cấp vị trí lắp ghép cho protein với các miền SH2 và PTB, kích hoạt sự

tải nạp tín hiệu thông qua kinase protein được kích hoạt Ras-Raf-

mitogen/kinase 1/2 (MAPK/ERK1/2), phosphoinositide 3-kinase, AKT, Src

họ kinase (SFKs), STATs, phospholipase Cγ1, Rho họ GTPase và các con

đường tín hiệu khác. Thông qua các con đường tín hiệu nội bào được kích

hoạt, tín hiệu EGF có ảnh hưởng đến các quá trình tăng sinh, di động tế bào,

biệt hóa và sống sót của tế bào. Hơn nữa, tín hiệu EGF có thể trực tiếp kiểm

soát chu kì tế bào thông qua sự dịch chuyển thụ thể vào nhân tế bào. Sự tăng

cường hoạt động của tín hiệu EGF cũng đã được chứng minh là có khả năng

bảo vệ tế bào khỏi quá trình apoptosis [44].

Tín hiệu EGF được kích hoạt bất thường hoặc biểu hiệu bất thường

trong nhiều bệnh khác nhau. Vai trò của tín hiệu EGF trong ung thư chưa

được hiểu rõ hoàn toàn, tuy nhiên, sự bất thường của tín hiệu EGF được

nghiên cứu khá kĩ trong quá trình phát triển của ung thư. Ngoài các dạng đột

biến, sự biểu hiện quá mức của tín hiệu EGF cũng thúc đẩy sự tiến triển của

ung thư cũng được nghiên cứu ở các dạng ung thư khác nhau như: ung thư

biểu mô, sarcomas, ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC), ung thư

thần kinh ác tính. Sự biểu hiện quá mức của tín hiệu EGF là một mục tiêu

nghiên cứu chính trong tiên lượng và điều trị ung thư [16]. Ở ung thư dạ dày,

sự biểu hiện quá mức cũng như các đột biến của các gen thuộc con đường tín

hiệu EGF đã được nghiên cứu và sử dụng trong chuẩn đoán. Matuzumab,

panitumumab, trastuzumab và cisplatin là các loại thuốc được sử dụng phổ

biến, mang lại nhiều hiệu quả tích cực trong điều trị nhắm đích con đường tín

hiệu EGF trong ung thư dạ dày [43].

Hình 1.9. Con đường tín hiệu của họ thụ thể EGFR (Nguồn: Thermo Fisher)

1.4. Con đường tín hiệu JAK/STAT

Con đường tín hiệu JAK/STAT (Janus kinases - Signal Transducer and Activator of Transcription proteins) là một cơ chế điều hòa sao chép gen, có ở nấm mốc, giun, ruồi, động vật có xương sống nhưng không có ở nấm và thực vật. Con đường JAK/STAT liên quan đến tăng trưởng tế bào, biệt hóa, apoptosis và các chức năng quan trọng khác của tế bào. Con đường JAK/STAT điều chỉnh sự phát triển phôi và tham gia vào việc kiểm soát các quá trình như duy trì tế bào gốc, tạo máu và phản ứng viêm. Con đường dẫn truyền tín hiệu từ các cytokine, interleukin và các yếu tố tăng trưởng hoạt động thông qua một số họ thụ thể xuyên màng đến JAK sau đó kích hoạt STAT, các STAT liên kết với trình tự khởi đầu và điều chỉnh quá trình phiên mã các gen kiểm soát các quá trình tế bào, bao gồm tăng sinh, biệt hóa và apoptosis (Hình 1.10). Con đường JAK/ STAT cung cấp một cơ chế trực tiếp chuyển đổi tín hiệu ngoại bào thành phản ứng sao chép. Tín hiệu JAK/STAT cũng có liên quan tới hàng loạt các con đường tín hiệu tế bào khác như: EGF, Ras/Raf/MEK/ERK, PI3K/AKT và apoptosis [28].

So với các con đường tín hiệu tế bào khác, con đường tín hiệu JAK/STAT tương đối đơn giản với ít thành phần. Protein JAK và STAT là 2 thành phần cốt lõi của con đường tín hiệu JAK/STAT. Ở động vật có xương sống, có 4 protein JAK là JAK1, JAK2, JAK3 và TYK2; có 7 protein STAT bao gồm: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B và STAT6, chủ yếu đóng vai trò là yếu tố phiên mã. Một loạt các phối tử bao gồm cytokine, hormone và các yếu tố tăng trưởng cùng các thụ thể tương ứng kích thích con đường JAK / STAT. Các protein JAK được kích hoạt khi các phối tử gắn vào các thụ thể của chúng trên bề mặt tế bào. Các phối tử khác nhau kích hoạt các JAK/ STAT khác nhau. Các JAK được kích hoạt sẽ làm thay đổi cấu trúc của các protein STAT giúp cho 2 STAT liên kết với nhau tạo thành một dimer. Các dimer ở tế bào chất di chuyển vào nhân liên kết với DNA của gen đích [28].

Giống với các yếu tố phiên mã khác, STAT có khả năng kết hợp với các đồng kích hoạt (coactivator) như CBP (CREB-binding protein) và p300 (histone acetyltransferase p300) để làm tăng tốc độ phiên mã của gen đích. Các yếu tố đồng kích hoạt này có thể giúp tăng tốc độ phiên mã là nhờ khả năng có thể tạo các điều kiện thuận lợi cho quá trình phiên mã. Con đường tín hiệu JAK/STAT có thể liên kết với các con đường tín hiệu khác như PI3K/AKT/mTOR và MAPK/ERK. Sự điều chỉnh con đường tín hiệu JAK/STAT được thực hiện nhờ ba nhóm protein là các chất ức chế protein của STAT hoạt hóa (PIAS), protein tyrosine phosphatase (PTPs) và ức chế tín hiệu cytokine (SOCS) [28].

Sự rối loạn trong hoạt động của con đường tín hiệu JAK/STAT có thể

dẫn đến nhiều bệnh liên quan đến hệ thống miễn dịch và ung thư. Mức độ

kích hoạt STAT cao có liên quan đến ung thư, đặc biệt kích hoạt STAT3 và

STAT 5 cao gây ra các khối u nguy hiểm hơn. Hoạt động của STAT3 cao quá

mức liên quan đến tái phát khối u sau điều trị ở ung thư da [66]. Hoạt động

quá mức của STAT3 cho phép phiên mã các gen như BCL2, c- Myc có liên

quan đến sự phân chia tế bào (Hình 1.11). Đột biến trong gen JAK2 có thể

dẫn tới leukemia và lymphoma. Cụ thể hơn, các đột biến ở exon 12, 13, 14 và

15 của gen JAK2 là một yếu tố gây nguy cơ phát triển trong leukemia và

lymphoma [48]. Ngoài ra, STAT3 và STAT5 bị đột biến có thể làm tăng tín

hiệu JAK/STAT trong các tế bào NK và T, thúc đẩy tăng sinh tế bào, gây

nguy cơ tiến triển của leukemia [32]. Hơn nữa, sự hoạt động của STAT3 và

STAT5 đã được chứng minh là có khả năng ức chế apoptosis, một dấu hiệu

đặc trưng của ung thư [28]. Các phương pháp điều trị nhắm đích tín hiệu

JAK/STAT với thuốc nhắm mục tiêu phân tử và can thiệp RNA (RNAi) đã

được nghiên cứu rộng rãi. Trong đó, ruxolitinib, tofacitinib và fludarabine là

những thuốc nhắm đích tín hiệu JAK/STAT duy nhất được sử dụng trong các

phòng khám [28].

Hình 1.10. Con đường tín hiệu JAK/STAT (Nguồn Thermo Fisher)

Ở ung thư dạ dày, rối loạn điều hòa con đường tín hiệu JAK/STAT liên

quan mật thiết với protein CagA của vi khuẩn H. pylori [54]. Hơn nữa, nhiễm

H. pylori liên quan đến tăng biểu hiện cytokine, đặc biệt là interleukin-6 (IL

6) và phản ứng viêm mạnh trong ung thư dạ dày [54]. Do đó, có thể thấy việc

kích hoạt con đường tín hiệu IL6-JAK/STAT3 rất quan trọng cho sự phát

triển của ung thư dạ dày. Kích hoạt STAT3 rất quan trọng cho sự khởi đầu và

tiến triển của ung thư dạ dày. Việc kích hoạt STAT3 cũng được xác định xảy

ra mạnh mẽ hơn ở các bệnh nhân ung thư dạ dày nhiễm H. pylori dương tính

CagA [45]. Trong ung thư dạ dày, các thuốc nhắm mục tiêu phân tử con

đường tín hiệu JAK/STAT hiện nay chủ yếu tập trung vào nhắm đích

JAK1/JAK2 và STAT3. Các thuốc ức chế JAK1/JAK2 như: INCB018424,

TG101348, CEP701, AZD1480 đang trong giai đoạn thử nghiệm trên người

đem lại những tín hiệu tích cực trong việc ức chế sự phát triển của khối u và

cảm ứng apoptosis [49]. Thuốc WP-1066 cũng đã được thử nghiệm trên mô

hình ung thư dạ dày là chuột gp757FF và dòng tế bào AGS. Kết quả thử nghiệm

cho thấy sự tăng sinh của các tế bào đã bị chặn, tình trạng viêm giảm và quá

trình apoptosis được tạo ra nhờ cảm ứng ức chế STAT3 [17].

Hình 1.11. Một con đường JAK/STAT trong ung thư [66]

1.5. Khái quát về apoptosis

Apoptosis hay còn gọi là sự chết tế bào được lập trình, là một cơ chế

phức tạp ở mức độ gen để loại bỏ các tế bào bị hư hỏng có trật tự và hiệu

quả như những tế bào sau khi bị tổn thương DNA hay do sai lệch trong quá

trình phát triển. Các thành phần của apoptosis rất phức tạp và có liên quan

đến nhiều con đường tín hiệu tế bào trong đó có con đường tín hiệu EGF và

JAK/STAT. Sự ức chế các con đường tín hiệu liên quan đến sự phát triển

của tế bào làm tế bào dễ dàng đi vào quá trình apoptosis [90]. Quá trình

apoptosis trong một tế bào có thể được kích hoạt thông qua con đường ngoại

sinh - extrinsic apoptotic pathway (phụ thuộc death receptor) hoặc con

đường nội sinh - intrinsic apoptotic pathway (phụ thuộc ty thể). Cả hai con

đường này hội tụ để kích hoạt các apoptotic effector dẫn đến cuối cùng là sự

thay đổi tế bào với các đặc điểm đặc trưng và hình dạng, đặc điểm sinh hóa

của apoptosis [90]. Thông thường, sự cân bằng giữa các chất điều hòa

protein pro-apoptotic và anti apoptotic là một điểm quan trọng để xác định

quá trình apoptosis ở một tế bào. Việc gây ra apoptosis do tổn thương DNA

trong các tổn thương tiền ung thư có thể loại bỏ các tế bào có hại, do đó

ngăn chặn sự phát triển của khối u. Sự ức chế apoptosis có liên quan đến

tăng sinh tế bào không được kiểm soát, sự phát triển và tiến triển của ung

thư và khả năng kháng thuốc trong điều trị. Sự ức chế apoptosis được coi là

một trong những dấu hiệu đặc trưng của bệnh ung thư [34].

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 do phòng Thí nghiệm Inserm

U1053 - Viện Sức khỏe và Nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp tại Bordeaux

cung cấp.

Nhóm đối chứng là các tế bào MKN45 được xử lý bằng DMSO nồng độ

0,01% trong thời gian 48 giờ.

Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trường nuôi cấy

DMEMF12 và RPMI1640 (Invitrogen cung cấp), huyết thanh bò, trypsin,

kháng sinh Penicillin/Streptomycin, DMSO (Sigma cung cấp). Các đĩa nuôi

cấy tế bào, ống pipette và một số dụng cụ nhỏ khác do Thermo Fisher cung

cấp.

All trans retionic acid được cung cấp bởi hãng Sigma Aldrick (Pháp)

với mã sản phẩm 2625.

Các hóa chất sử dụng trong tách chiết RNA và phản ứng Realtime PCR:

RNeasy Mini Kit (Qiagen), Quantitect Reverse Transcriptase (RT) Kit

(Qiagen), TOPreal qPCR 2X PreMix SYBR (Invitrogen).

Các primer dùng trong phân tích mức độ biểu hiện gen do hãng Qiagen

cung cấp.

Các thí nghiệm được triển khai trên các hệ thống trang thiết bị gồm máy

Realtime PCR (Analytic gena), hệ thống nuôi cấy tế bào (Memmert), buồng

thao tác sinh học an toàn sinh học cấp 2 (Thermo Fisher) và các trang thiết bị

phụ trợ khác tại phòng Thí nghiệm Y sinh – Trường Đại học Khoa học.

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Thí nghiệm

Y Sinh – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 05/2018 đến tháng 06/2019.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D

100.000 tế bào ung thư dạ dày dòng MKN45 được nuôi cấy trong hộp

nuôi cấy diện tích 75 cm2, trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640 (Invitrogen)

bổ sung 10% huyết thanh bò và kháng sinh 1% penicilline/streptomycine.

Môi trường nuôi cấy được thay ngày một lần bằng một môi trường nuôi

cấy mới. Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với trypsine 0,05% trong

3 phút. Tế bào được thu lại bằng ly tâm 1.300 rpm trong 5 phút và được cấy

chuyển sang một bình nuôi cấy mới. Tế bào sống, chết được đếm dưới kính

hiển vi đảo ngược, sử dụng trypan blue làm thuốc nhuộm cho tế bào chết.

Hình ảnh tế bào được chụp ảnh bằng kính hiển vi đảo ngược Nikon Eclipse 2.

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào 3D và xử lí tế bào với ATRA

Nuôi cấy các tế bào ung thư dạ dày MKN45 với mật độ 2.000 tế

bào/giếng nuôi cấy có diện tích 3,8 cm2, bề mặt không bám dính để hình

thành nên tumorsphere (khối tế bào ung thư hình cầu). Sử dụng môi trường

DMEMF12/Glutamax có bổ sung 1% ampinicillin/streptomycin, yếu tố tăng

trưởng biểu mô EGF 20 ng/ml, yếu tố tăng trưởng thượng bì FGF 20ng/ml,

0,3% glucose, 5µg/ml insulin ở 370C, 5% CO2. Mỗi 2 ngày của quá trình nuôi

cấy, loại bỏ 1 ml môi trường nuôi cấy cũ, đồng thời bổ sung 1 ml môi trường

nuôi cấy mới.

Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với ATRA ở nồng độ 5µM

(nồng độ ức chế sự tăng sinh tế bào được lựa chọn từ một sàng lọc trong giải

nồng độ từ 0 – 10µM trước khi tiến hành nghiên cứu) trong 48 giờ. Mẫu đối

chứng được xử lý bằng DMSO nồng độ 0,01% trong thời gian tương ứng với

mẫu xử lý ATRA. Thu nhận và phân tách các tumorsphere thành các tế bào

đơn bằng enzyme trypsine nồng độ 0,05% trước khi tách chiết RNA tổng số

(hóa chất được cung cấp bởi Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France).

2.3.3. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA

RNA tổng số của tế bào MKN45 được tách chiết bằng Trizol theo hướng

dẫn của nhà sản xuất (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Tế bào nuôi cấy

trên đĩa 6 giếng được bổ sung 1000µl Trizol, dùng pipette 1ml mix nhiều lần

để tách tế bào ra khỏi bề mặt đĩa. Ủ tế bào ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau

đó ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút ở 40C. Chuyển dịch nổi sang ống

eppendorf mới.

Bổ sung 2ml chloroform, vontex mẫu trong 15 giây và ủ ở nhiệt độ

phòng trong 3 phút. Ly tâm 10.000 rpm trong 15 phút ở 40C. Hút thận trọng

dung dịch pha trên cùng sang một ống eppendoft mới. Bổ sung 500µl

Isopropanol và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm 10.000 rpm

trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và rửa RNA bằng 1ml ethanol 75% bằng cách

ly tâm 7.000 rpm trong 5 phút ở 40C, lặp lại 2 lần. Làm khô RNA trong 5-10

phút và bổ sung 100 µl nước khử ion.

Đo quang phổ tại các bước sóng 260/280nm bằng máy đo quang phổ

NanoDrop. Sử dụng 1µg RNA để tạo cDNA bằng Quantitect Reverse

Transcriptase (RT) kit (do Quiagen, Hilden, Germany cung cấp) theo hướng

dẫn của nhà sản xuất.

2.3.4. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu

EGF bằng Realtime PCR

Phân tích Realtime PCR sử dụng 20ng cDNA cho mỗi phản ứng PCR

với tổng thể tích là 20 µl với chất phát huỳnh quang SYBR Green qPCR do

Invitrogen cung cấp. Danh sách các gen nghiên cứu với mã số cặp mồi tương

ứng do Quiagen cung cấp và được trình bày trong bảng 2.1. Sự thay đổi về

mức độ biểu hiện gen được tính theo phương pháp Delta delta ct (ΔΔCt). Kết

quả được trình bày dưới dạng trung bình của 3 lần lặp lại của thí nghiệm với

độ lệch chuẩn SD, cỡ mẫu cho mỗi lần thí nghiệm n=3.

Dữ liệu được thống kê và phân tích bằng phần mềm SPSS16.0F, sử dụng

kiểm định Mann-Whitney.

Bảng 2.1. Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu EGF

Tên gen Mã số cặp mồi

GAB2 PPH05872A

NUP62 PPH23942A

RPS6KA5 PPH01791A

EPS8 PPH07120A

BCAR1 PPH01530A

CBL PPH00089F

EGFR PPH00138B

NCK2 PPH01626B

SHC1 PPH00229B

2.3.5. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu

JAK/STAT bằng Realtime PCR

Bảng 2.2. Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu JAK/STAT

Tên gen Mã số cặp mồi

GAB1 PPH02307B

SRC PPH00103C

GAB2* PPH05872A

STAT3 PPH00708F

PPP2CA PPH02088C

STAT1 PPH00811C

Thành phần phản ứng Realtime PCR gồm 15µl chứa 20µg cDNA, 3µM

mồi đặc hiệu tương ứng với gen nghiên cứu, sử dụng chất phát quang

SYNBER Green (Invitrogen). Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung

bình của tối thiểu 3 thí nghiệm với độ lệch chuẩn SD. Dữ liệu được thống kê

và phân tích bằng phần mềm SPSS16.0F, sử dụng kiểm định Mann-Whitney.

2.3.6. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường apoptosis

bằng Realtime PCR

Phân tích Realtime PCR sử dụng 20ng cDNA cho mỗi phản ứng PCR

với tổng thể tích là 20 µl với chất phát huỳnh quang SYBR Green qPCR do

Invitrogen cung cấp. Danh sách các gen nghiên cứu với mã số cặp mồi tương

ứng do Quiagen cung cấp và được trình bày trong bảng 2.3. Sự thay đổi về

mức độ biểu hiện gen được tính theo phương pháp Delta delta ct (ΔΔCt). Kết

quả được trình bày dưới dạng trung bình của 3 lần lặp lại của thí nghiệm với

độ lệch chuẩn SD, cỡ mẫu cho mỗi lần thí nghiệm n=3.

Dữ liệu được thống kê và phân tích bằng phần mềm SPSS16.0F, sử dụng

kiểm định Mann-Whitney.

Bảng 2.3. Mã số cặp mồi của các gen trong con đường apoptosis

Mã số cặp mồi Gen

PPH00088B-200 AKT1

Gen ức chế apoptosis NUP62** PPH23942A

BCL2 PPH00079B

MAPK1 PPH00715B

CASP9 PPH00353B

Gen thúc đẩy apoptosis FOXO3 PPH00807A

IL2 PPH00172C

TP53 PPH00213F

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere

3.1.1. Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào trong điều kiện 2D

Nuôi cấy tăng sinh tế bào đóng vai quan trọng cho việc chuẩn bị vật liệu

cho các nghiên cứu tiếp theo. Trong nghiên cứu này, dòng tế bào MKN45 đã

được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS và

kháng sinh. Kết quả nuôi cấy được ghi lại trong hình 3.1.

Hình 3.1. Hình ảnh nuôi cấy tăng sinh tế bào sau 3 ngày nuôi cấy

Thang đo 100 µm

Sau 3 ngày nuôi cấy, các tế bào sinh trưởng tốt trên bề mặt hộp nuôi cấy.

Các tế bào bám dính tốt trên bề mặt. Các tế bào có hình dạng ovan hoặc hình

tròn điển hình. Đây là cơ sở tốt để chúng tôi tiến hành thu nhận tế bào phục

vụ cho nuôi cấy 3D trước khi tiến hành các nghiên cứu ảnh hưởng của ATRA.

3.1.2. Nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D và xử lí tumorsphere với ATRA

Để thử tác động của ATRA lên sự hình thành và phát triển của các

tumorsphere, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D từ các tế

bào nuôi cấy 2D và tiến hành xử lí tumorsphere với ATRA.

Từ các tế bào nuôi cấy 2D, tiến hành thu nhận tế bào bằng phương pháp

xử lí với trypsine và ly tâm, rửa tế bào với PBS 1X. Các tế bào sau đó được

nuôi cấy trên đĩa 24 giếng có bề mặt không bám dính để tạo ra các

tumorsphere. Sau 5 ngày nuôi cấy, các mẫu nuôi cấy được xử lí với ATRA và

DMSO theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.2. Kết quả nuôi cấy tạo

tumorsphere và xử lí với ATRA được thể hiện ở hình 3.2.

A

B

Hình 3.2. Nuôi cấy tạo tumorsphere và xử lí với ATRA Thang đo 100 µm A. Tumorsphere sau 5 ngày nuôi cấy B. Tumorsphere sau 5 ngày nuôi cấy được xử lí ATRA trong 48h

Kết quả nuôi cấy ở hình 3.2A cho thấy, trên bề mặt không bám dính và

môi trường chứa các chất sinh trưởng FGF, EGF, insulin, các tế bào gốc ung

thư đã tạo ra các khối cầu hay còn gọi là tumorsphere. Các tumorsphere lơ

lửng trong môi trường nuôi cấy và có kính thước không đồng nhất. Các

tumorsphere sau 5 ngày nuôi cấy có đường kính từ 100 – 300 µm, chứa

khoảng từ 100 – 200 tế bào đơn. Đây là tiền đề quan trọng để chúng tôi tiến

hành thí nghiệm tiếp theo là xử lí các tumorsphere với ATRA trước khi tiến

hành phân tích ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các gen quan tâm.

Kết quả xử lí các tumorsphere với ATRA trong hình 3.2B cho thấy, sau

48h xử lí các tumorsphere bị giảm về kích thước. Mặt khác, các tumorsphere

đã bị biến đổi về hình dạng và có hiện tượng tan rã thành các tế bào đơn. Điều

này chỉ ra rằng, sự phát triển của các tumorsphere đã bị thay đổi khi xử lí với

ATRA và sự thay đổi này có liên quan đến đặc tính phân chia, tăng sinh và

quá trình chết của tế bào. Như vậy, ATRA đã tác động mạnh lên sự sinh

trưởng, phát triển của các tumorsphere 3D.

3.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số

Để thực hiện mục tiêu trọng tâm của đề tài là đánh giá tác động của

ATRA lên sự biểu hiện của các gen trong con đường tín EGF và con đường

tín hiệu JAK/STAT, RNA tổng số được tách chiết và tinh sạch từ các tế bào

đối chứng (xử lí với DMSO) và tế bào xử lí với ATRA bằng phương pháp

Trizol như đã trình bày ở trên. Kết quả tách chiết được thể hiện ở hình 3.3.

RNA tổng số được tách chiết từ các tế bào ung thư dạ dày thu nhận sau

quá trình nuôi cấy được định lượng bằng máy đo quang phổ NanoDrop ở

bước sóng hấp thụ 260 nm đối với nucleic acid và bước sóng hấp thụ 280 nm

đối với protein.

Kết quả trong hình 3.3 chỉ ra nồng độ RNA thu được dao động từ 168,6

ng/µl đến 188,3 ng/µl và có độ sạch cao với tỉ lệ A260/280 nằm trong khoảng

1,91– 1,98 đáp ứng tốt cho các phản ứng PCR. Các mẫu RNA sau đó được

bảo quản ở -80oC hoặc tiến hành các thí nghiệm đánh giá tác động của ATRA

lên các gen tham gia vào con đường tín hiệu EGF, JAK/STAT hoặc apoptosis

ở tế bào gốc ung thư dạ dày bằng phản ứng RealtimePCR.

Hình 3.3. Kết quả xác định hàm lượng RNA tổng số

Trong đó, các mẫu ARN1 đến ARN4 là các mẫu đối chứng, ARN5 đến

ARN8 là các mẫu xử lí với ATRA 5 µM

3.3. Tác động của ATRA lên sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín

hiệu EGF

3.3.1 ATRA ức chế sự biểu hiện các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5 và

EGFR

Trong nghiên cứu này của chúng tôi, sự tác động của ATRA lên sự biểu

hiện của 9 gen chính trong con đường tín hiệu EGF đã được đánh giá bằng

phương pháp RealtimePCR. Kết quả ở hình 3.4A cho thấy ATRA đã làm

giảm biểu hiểu của các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5 và EGFR. Trong đó,

mức độ suy giảm biểu hiện mạnh nhất là GAB2 và NUP62 với mức suy giảm

biểu hiện mRNA ~50%, sau đó mức độ suy giảm hoạt động gen lần lượt là

RPS6KA5 (MSK1) ~30% và EGFR với mức suy giảm hoạt động ~20%.

Hình 3.4A. Mức độ biểu hiện các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5, EGFR

(so sánh với đối chứng (DC), (n = 3, *p < 0,05)

GAB2 thuộc họ protein GAB, là trung gian cho sự tương tác giữa các thụ

thể tyrosine kinase (RTK) hoặc non-RTK trong đó có thụ thể của con đường

tín hiệu EGF và JAK/STAT. GAB2 có thể điều chỉnh và tích hợp các tín hiệu

phân tử khi chúng đi qua để kiểm soát trạng thái chức năng trong tế [24]. Sự

biểu hiện của GAB2 ở các tế bào ung thư cao hơn nhiều so với các tế bào

bình thường ở cùng một loại mô [55]. Trong nghiên cứu này, từ kết quả xác

định biểu hiện mRNA trong hình 3.4 cho thấy, các tế bào KMN45 xử lí với

ATRA trong 48 giờ có mức độ biểu hiện mRNA gen GAB2 chỉ bằng khoảng

50% so với các tế bào đối chứng. Biểu hiện gen GAB2 giảm mạnh có thể dẫn

đến sự giảm thiểu các tín hiệu tế bào thông qua GAB2. Trong một nghiên cứu

gần đây, Wang và cộng sự đã chỉ ra, ức chế biểu hiện GAB2 bằng các siRNA

ở dòng tế bào ung thư xương MG-63 làm giảm đáng kể sự phát triển và xâm

lấn của tế bào ung thư [86]. Trước đó, Bocanegra và cộng sự cũng nhận thấy

sự ức chế biểu hiện GAB2 làm giảm sự phát triển và sống sót của tế bào ung

thư vú [9]. Ở ung thư dạ dày, sự biểu hiện quá mức của GAB2 trong các tế

bào ung thư đã được nghiên cứu [55], tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào xác

định ảnh hưởng của sự suy giảm biểu hiện GAB2 lên sự phát triển của tế bào

ung thư. Trong nghiên cứu này, cùng với kết quả giảm thiểu biểu hiện của

GAB2 dưới tác động của ATRA, chúng tôi cũng quan sát thấy sự giảm thiểu

sinh trưởng và phát triển của các tế bào gốc ung thư dạ dày KMN45. Như

vậy, sự suy giảm GAB2 gây ức chế sinh trưởng và phát triển của cá tế bào

MKN45.

NUP62 hay p62 là một protein quan trọng của phức hệ lỗ màng nhân

(nuclear pore complexes- NPCs), có khả năng tương tác với các mRNA và

protein vận chuyển qua NPCs [19]. NUP62 có vai trò điều hòa hoạt động của

nhiều con đường truyền tín hiệu nội bào [14], [17]. Trên dòng tế bào ung thư

biểu mô buồng trứng TOV112D, Kinoshita Y và cộng sự nhận thấy, ức chế

biểu hiện NUP62 bằng siRNA dẫn đến sự chậm phát triển của các tế bào ung

thư. Sự ức chế protein NUP62 dẫn đến dừng quá trình phân chia tế bào, tăng

cường khả năng sống sót của tế bào ung thư với hóa trị [50]. Trong một

nghiên cứu khác, Hazawa M và cộng sự đã chỉ ra sự biểu hiện quá mức của

NUP62 ở ung thư biểu mô tế bào vảy (SCC), sự suy giảm của NUP62 ức chế

sự tăng sinh và tăng cường sự biệt hóa các tế bào SCC [37]. Trong nghiên cứu

này, kết quả nghiên cứu chỉ ra biểu hiện mRNA của NUP62 ở tế bào ung thư

dạ dày MKN45 sau khi xử lí với ATRA giảm khoảng 50% mRNA so với các

mẫu không xử lí với ATRA. Như vậy, sự giảm thiểu hoạt động của NUP62 có

thể là một trong những con đường tác động của ATRA với tế bào gốc ung thư

dạ dày MKN45 dẫn đến quá trình điều hòa sinh trưởng tế bào và tăng cường

biệt hóa tế bào gốc.

RPS6KA5 hay MSK1 (mitogen- and stress-activated kinase 1) là protein

hạt nhân được kích hoạt ở hạ lưu của con đường MAPK ERK1/2 và p38, có

vai trò quan trọng trong hạn chế viêm của miễn dịch bẩm sinh [74]. Ở ung thư

vú, MSK1 đáp ứng kích thích từ các hoormon được tiết bởi buồng trứng như

estrogen và progestin, làm tăng cường sự phân chia các tế bào ung thư [72].

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, số lượng mRNA gen MSK1 của

tế bào gốc ung thư dạ dày MKN45 đã giảm khoảng 30% sau khi xử lí với

ATRA trong 48 giờ. Trong một nghiên cứu khác, Reyes D và cộng sự (2014)

nghiên cứu trên dòng tế bào T47D và mô hình chuột đã kết luận, sự suy giảm

MSK1 có tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú phụ thuộc estrogen

(E2) và progesterone [73].

EGFR là thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì EGF, có liên quan đến

các hoạt động tăng sinh, biệt hóa, sống sót và sự di trú của tế bào (cell

migration). Hoạt động quá mức của EGFR được quan sát thấy ở nhiều khối u

rắn khác nhau [44]. Trong nghiên cứu này, kết quả phân tích biểu hiện gen

EGFR cho thấy, dưới tác động của ATRA, biểu hiện gen EGFR giảm. Số

lượng mRNA của gen EGFR trong tế bào KMN45 giảm khoảng 20% so với

các mẫu không xử lí với ATRA. Kết quả nghiên cứu của Zhen Y và cộng sự

(2014) trên các mẫu mô ung thư dạ dày của bệnh nhân cho thấy, biểu hiện của

EGFR cao hơn so với mô bình thường. Sự bất hoạt mRNA gen EGFR của

dòng tế bào ung thư SGC-7901 làm giảm tăng sinh tế bào và xâm lấn; bất

hoạt EGFR cũng gây ra apoptosis và kháng phân bào (cycle arrest) [97].

Trong nghiên cứu này, từ những quan sát hình thái khi xử lí các tế bào với

ATRA, cùng với kết quả phân tích suy giảm hoạt động gen EGFR, chúng tôi

cũng nhận thấy sự tương đồng với nghiên cứu của Zhen khi quan sát thấy sự

suy giảm hoạt động tăng sinh và tăng cường quá trình apoptosis trên dòng tế

bào ung thư MKN45.

3.3.2. Tác động của ATRA lên sự biểu hiện của các gen CBL, EPS8,

BCAR1, NCK2 và SHC1

Từ quan sát kết quả phân tích biểu hiện gen ở mức độ phiên mã trong

hình 3.4B cho thấy, không có sự thay đổi đáng kể nào trong biểu hiện của các

gen CBL, EPS8, BCAR1 và NCK2.

Hình 3.4B. Mức độ biểu hiện các gen EPS8, BCAR1, CBL, NCK2, SHC1

(so sánh với đối chứng (DC), (n = 3, *p < 0,05)

CBL là một gen mã hóa cho protein tế bào chất tham gia vào quá trình

truyền tín hiệu ở hạ lưu của một số thụ thể bao gồm tyrosine kinase, thụ thể

cytokine và thụ thể tế bào T, tế bào B. CBL là các chất vận chuyển tác động

ngược dòng so với các tín hiệu tế bào, là một chất ức chế khối u tiềm năng

[33]. Lai AZ và cộng sự đã nghiên cứu trên các dòng tế bào gốc ung thư dạ

dày và đưa ra kết luận, sự ức chế biểu hiện CBL phụ thuộc hoạt động Met-

kinase có thể thúc đẩy gián tiếp tăng cường hoạt động của tín hiệu EGF [52].

Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi không nhận thấy có sự thay đổi

biểu hiện gen CBL khi so sánh giữa các mẫu xử lí với ATRA và các mẫu đối

chứng.

Gen EPS8 mã hóa cho protein EPS8, là chất nền cho EGFR, hoạt động

như một oncoprotein trong ung thư biểu mô khác nhau, gắn liền với sự phát

triển khối u [20], [38]. Trong một nghiên cứu gần đây, Zhang H và công sự

(2019) đã chỉ ra, sự suy giảm EPS8 làm ức chế khả năng sống sót, xâm lấn và

di căn của u nguyên bào tế bào plasma (multiple myeloma) [95]. Ở ung thư

phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLS), Wen Q và cộng sự cũng chỉ cho ra kết

quả tương tự, ức chế EPS8 thông qua FoxO3a ức chế khả năng di cư và xâm

lấn, dừng chu kỳ tế bào [88]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy

không có sự thay đổi đáng kể trong biểu hiện gen EPS8 do tác động của

ATRA trong tế bào ung thư gốc dạ dày MKN45.

Trong các tế bào, BCAR1 góp phần điều chỉnh một loạt các con đường

tín hiệu tế bào liên quan đến kiểm soát chu kì tế bào, sự vận động và

apoptosis. Nhiều loại tế bào ung thư ở người có sự biểu hiện quá mức BCAR1

[7]. BCAR1 đã được chỉ ra là biểu hiện quá mức ở ung thư dạ dày và gây

phosphorin hóa phân tử p130Cas [21]. Ở ung thư vú, Cabodi S và cộng sự đã

chỉ ra sự ức chế BCAR1 bằng siRNA ở các tế bào dương tính với HER2 làm

giảm sự sự phát triển và xâm lấn của khối u trong điều kiện in vitro và in vivo

[15]. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu này cho thấy, sự biểu hiện của BCAR1

không có sự thay đổi khi xử lí với ATRA ở dòng tế bào MKN45.

NCK2 là một protein bổ trợ, đóng vai trò là một phân tử kết nối các

integrin với các thụ thể tyrosine kinase trong các con đường tín hiệu tế bào.

Sự biểu hiện quá mức NCK2 có thể gián tiếp đóng góp vào quá trình phát

triển ung thư thông qua sự biến đổi tín hiệu điều hòa mạng lưới khung xương

actin của tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho sự di căn [65]. Từ kết quả nghiên

cứu, chúng tôi nhận thấy, ở các tế bào MKN45 được xử lí với ATRA không

thấy có sự thay đổi đáng kể biểu hiện gen NCK2 ở mức độ phiên mã.

SHC1 là một gen mã hóa cho cũng là một proteinbổ trợ, có liên quan tới

việc truyền tín hiệu thông qua nhiều loại thụ thể bề mặt tế bào khác nhau đóng

vai trò quan trọng trong quá trình nguyên phân, gây ung thư và di căn [99].

Thêm vào đó, SHC1 đóng vai trò như một marker sinh học dùng trong tiên

lượng cũng như một đích điều trị đối với các dạng ung thư có đáp ứng với

hormone steroid [2]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi không nhận thấy có sự

thay đổi của số lượng mRNA gen SHC1 sau khi các tế bào gốc ung thư dạ

dày MKN45 được xử lí với ATRA.

Từ các kết quả trên có thể thấy, ATRA có tác động làm suy giảm hoạt

động của con đường tín hiệu EGF thông qua điều hòa giảm sự biểu hiện của

các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5 và EGFR, nhưng không tác động lên các

gen CBL, EPS8, BCAR1, NCK2 và SHC1 không có sự thay đổi biểu hiện gen

khi xử lí tế bào với ATRA.

3.4. Ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín

hiệu JAK/STAT

3.4.1. ATRA ức chế biểu hiện của các gen STAT1 và STAT3

Để nghiên cứu tác động của ATRA lên con đường tín hiệu JAK/STAT,

chúng tôi đi phân tích ảnh hưởng của ATRA lên sự phiên mã của 6 gen chính

trong con đường tín hiệu này bao gồm: GAB1, SRC, GAB2, PPP2CA,

STAT1 và STAT3.

Hình 3.5A. Mức độ biểu hiện các gen STAT3, STAT1 (so sánh với mẫu đối chứng (DC), (n = 3, *p < 0,05)

STAT1 và STAT3 thuộc họ protein STAT, là yếu tố trung tâm quyết

định sự thúc đẩy hay ức chế các tế bào ung thư thông qua các đáp ứng miễn

dịch. Kết quả phân tích biểu hiện mRNA ở hình 3.5A cho thấy, ATRA làm

giảm sự biểu hiện mRNA của STAT1 (15%) và STAT3 (40%).

STAT3 làm tăng cường sự phân chia, sống sót và xâm lấn của các tế bào

thuộc khối u bằng cách ức chế hệ thống miễn dịch chống lại khối u, đồng thời

STAT3 được hoạt hóa liên tục gián tiếp gây ra hiện tượng viêm nhiễm làm

thúc đẩy sự phát triển của khối u [5]. Shu Zhang và cộng sự đã phát hiện thấy

có sự biểu hiện quá mức của STAT3 khi niêm mạc dạ dày đạt đến giai đoạn

khối u [96]. Trong nghiên cứu này, từ kết quả phân tích biểu hiện gen, chúng

tôi đã xác định được ATRA làm giảm biểu hiện của STAT3 ở mức độ phiên

mã, mức độ giảm biểu hiện xác định được khoảng 40% so với đối chứng.

Gen STAT1 mã hóa cho protein STAT1 thuộc họ protein STAT. STAT1

có vai trò chính trong nhiều điều hòa biểu hiện gen ảnh hưởng đến sự sống sót

tế bào, khả năng sống sót hoặc phản ứng của các mần bệnh [28]. STAT1 có

tác động ức chế hoặc kích thích khối u tùy thuộc vào từng loại ung thư [51],

[64], [77]. Kết quả nghiên cứu này cho thấy, ATRA tác động làm giảm hoạt

động của STAT1 ở mức độ phiên mã. Mức độ giảm thiểu số lượng mRNA

được xác định vào khoảng 15% so với đối chứng không xử lí với ATRA. Như

vậy, từ kết quả nghiên cứu có thể xác định, ở các tế bào gốc ung thư dạ dày

MKN45, STAT1 hoạt động như một chất kích thích khối u.

Như vậy, sự suy giảm hoạt động của STAT3 có thể là một trong những

cơ chế quan trọng để ATRA làm giảm sự tăng trưởng của các tế bào ung thư

MKN45 thông qua con đường tín hiệu JAK/STAT. Hơn nữa, sự suy thiểu

hoạt động của STAT3 có thể tác động tích cực đến quá trình viêm do nhiễm

H. pylori.

3.4.2. Ảnh hưởng của ATRA đến sự điều hòa biểu hiện của các gen GAB1,

GAB2, SRC và PPP2CA

Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn phân tích một nhóm các

protein có vai trò quan trọng trong trung gian truyền tải tín hiệu. Kết quả phân

tích ở hình 3.5B cho thấy biểu hiện của các gen GAB1, GAB2 và SRC ở mức

độ phiên mã suy giảm khi chịu tác động của ATRA, trong khi đó, biểu hiện

gen PPP2CA không có sự thay đổi đáng kể so với đối chứng.

GAB1 là một docking protein thuộc họ Gab/DOS tham gia vào quá trình

điều hòa các con đường tín hiệu bằng cách chuyển tiếp hoặc phản hồi tín hiệu

đối với các sự kiện phosphorin hóa cũng như sự tương tác protein– protein.

GAB1 liên quan đến các tín hiệu tăng sinh tế bào, di chuyển và hình thành

biểu mô [89]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy dưới tác động của

ATRA, các tế bào gốc ung thư dạ dày KMN45 có biểu hiện gen GAB1 suy

giảm ở mức độ phiên mã so với các mẫu không xử lí với ATRA. Số lượng

mRNA GAB1 của các tế bào MKN45 xử lí với ATRA đã suy giảm khoảng

30% so với các mẫu không xử lí với ATRA. Như vậy, sự suy giảm biểu hiện

GAB1 sẽ dẫn tới sự thay đổi mức độ dẫn truyền các tín hiệu phát triển của tế

bào.

Hình 3.5B. Mức độ biểu hiện các gen GAB1, SRC, GAB2, PPP2CA

(so sánh với mẫu đối chứng (DC), (n = 3, *p < 0,05)

SRC (sarcoma) là một proto-oncogene điều hòa tăng sinh, biệt hóa, vận

động sống sót và tạo mạch [83]. Hoạt động của SRC tăng lên cùng với sự tiến

triển của nhiều bệnh ung thư và sự kích hoạt SRC được xem như một dấu

hiệu sinh học cho sự phát triển của ung thư [42], [47]. Trong nghiên cứu này,

chúng tôi nhận thấy dưới sự tác động của ATRA, hoạt động của SRC ở mức

độ phiên mã bị ức chế. Cụ thể, số lượng mRNA gen SRC của tế bào gốc ung

thư dạ dày KMN45 xử lí với ATRA chỉ bằng khoảng 50% so với mẫu

KMN45 không xử lí với ATRA. Matsumura T và cộng sự đã nhận thấy có sự

lên kết biểu hiện của SRC và GAB2 trong điều kiện nuôi cấu 3D [60]. Trong

nghiên cứu này, chúng tôi cũng nhận thấy có sự liên kết biểu hiện của SRC và

GAB2, dưới tác động của ATRA, sự biểu hiện gen GAB2 và SRC giảm

khoảng 50% ở mức độ phiên mã.

PP2A là một protein quan trọng trong nhiều chức năng sống của tế bào.

PP2A điều chỉnh các quá trình sinh học khác nhau như chu trình tế bào, sao

chép DNA, sao chép và dịch mã, truyền tín hiệu, tăng sinh tế bào và

apoptosis. PP2A đã được chứng minh là đóng một vai trò trong chuyển đổi tế

bào và ung thư [76]. PPP2CA mã hóa cho tiểu phần của enzyme phosphatase

serine PP2A và được coi là một chất ức chế khối u tiềm năng [46]. Bhardwaj

A và cộng sự nghiên cứu trên mô hình chuột đã chứng minh, phục hồi biểu

hiện của PPP2CA ức chế sự phát triển và di căn của khối u tuyến tiền liệt ở

chuột thí nghiệm [8]. Trong nghiên cứu này dưới tác động của ATRA, chúng

tôi không nhận thấy có sự thay đổi trong biểu hiện gen của PPP2CA ở mức độ

phiên mã.

Từ kết quả nghiên cứu có thể thấy được, ở con đường tín hiệu

JAK/STAT, ATRA có tác động ức chế biểu hiện của các gen STAT1,

STAT3, GAB1, GAB2 và SRC, trong khi đó, biểu hiện gen PPP2CA không

có sự thay đổi khi xử lí với ATRA.

3.5. Ảnh hưởng ATRA lên sự biểu hiện của các gen của quá trình apoptosis

Apoptosis là một cơ chế giúp cho các mô phát triển bình thường, không

phát sinh thành ung thư. Đối với mô ung thư, tế bào có cơ chế kháng lại quá

trình apotosis và giúp cho nó tăng sinh không kiểm soát. Sự tăng sinh không

kiểm soát của các tế bào ung thư cũng liên quan tới sự hoạt động mạnh của

các con đường tín hiệu ung thư trong có có con đường tín hiệu EGF và

JAK/STAT. Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng ức chế của ATRA đối với các

con đường tín hiệu ung thư EGF và JAK/STAT đã được chỉ ra. Từ đó, đưa ra

giả thuyết rằng ATRA ức chế sự biểu hiện của con đường tín hiệu có thể dẫn

tới thúc đẩy apoptosis. Để kiểm tra giả thuyết này, sự biểu hiện của các gen

chủ chốt của apoptosis đã được phân tích.

3.5.1. ATRA tác động lên sự biểu hiện của các gen ức chế apoptosis

Để nghiên cứu tác động của ATRA lên quá trình apoptosis, chúng tôi

tiến hành phân tích biểu hiện của 8 gen thuộc 2 nhóm gen của quá trình

apoptosis gồm: nhóm gen gây ức chế apoptosis: AKT1, NUP62, BCL2,

MAPK1 và nhóm gen thúc đẩy apoptosis: CASP9, FOXO3, IL2, p53.

Kết quả phân tích nhóm gen ức chế apoptosis ở hình 3.6A cho thấy:

ATRA làm giảm rõ rệt biểu hiện mRNA của tất cả các gen ức chế apoptosis

nghiên cứu khi so với mẫu đối chứng.

Hình 3.6A. Mức độ biểu hiện các gen ức chế apoptosis

(so sánh với đối chứng (DC), (n = 3, *p < 0,05)

AKT1 một protein có vai trò quan trọng trong con đường tín hiệu

PI3K/AKT. AKT1 thúc đẩy sự tăng trưởng của tế bào và ức chế apoptosis.

Hơn nữa, hoạt động chức năng của AKT1 chịu ảnh hưởng trực tiếp từ các thụ

thể hạt nhân trong đó có RAR, mặc dù các cơ chế tác động chưa được làm rõ

[59]. Kết quả phân tích biểu hiện gen cho thấy, AKT1 giảm biểu hiện ở mức

độ phiên mã sau khi xử lí các tế bào MKN45 với ATRA. Mức độ biểu hiện

của AKT1 trong các tế bào MKN45 xử lí với ATRA đã suy giảm khoảng 50%

so với đối chứng.

Họ protein BCL2 điều hòa quá trình apoptosis theo con đường nội sinh

phụ thuộc ty thể, được kích hoạt để đáp ứng các tác nhân kích thích gây stress

tế bào như thiếu các yếu tố tăng trưởng, các yếu tố cytokine, hư hỏng DNA do

tia xạ cũng như góp phần gây apoptosis gây ra các yếu tố hoại tử khối u như

Fas, TNF hoặc TRAIL. BCL2 ức chế apoptosis bằng cách can thiệp ức chế

quá trình kích hoạt BAX và BAK (2 protein có chức năng quan trọng trong sự

điều chỉnh màng ty thể gây apoptosis). Các chức năng của BCL2 trong quá

trình apoptosis bị ức chế bởi p53 [36]. Kinoshita Y và cộng sự đã chứng minh

rằng ATRA làm giảm mạnh các marker kháng apoptosis BCL2 [50]. Trong

nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy các tế bào MKN45 có sự suy giảm biểu

hiện của gen BCL2 sau khi xử lí với ATRA.

Mitogen-activated protein kinase1 (MAPK1) thuộc họ MAP kinase.

MAP tham gia vào một loạt các quá trình như tăng sinh, biệt hóa, apoptosis

của tế bào. MAPK1 đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của khối u và

các quá trình tế bào khối u khác nhau, việc bất hoạt MAPK làm tế bào bước

vào quá trình apoptosis [13]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã chỉ ra rằng,

dưới sự tác động của ATRA, các tế bào MKN45 có sự giảm thiểu ở mức độ

biểu hiện của gen MAPK1. Sự giảm thiểu MAPK1 có thể là một trong những

nguyên nhân dẫn đến việc các tế bào MKN45 bước vào quá trình apoptosis

như đã quan sát được.

3.5.2. ATRA ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen thúc đẩy apoptosis

Trong nghiên cứu này, 4 gen đã được chứng minh là có chức năng thúc

đẩy quá trình apoptosis được phân tích bao gồm: CASP9, FOX3, IL2 và p53.

Kết quả chỉ ra ở hình 3.6B cho thấy: ATRA làm tăng biểu hiện của tất cả các

gen thúc đẩy apoptosis được chọn để nghiên cứu ở mức độ phiên mã khi so

với mẫu đối chứng.

FOXO3, caspase-9 (được mã hóa bởi gen CASP9) và p53 (hay tp53) là

các protein tham gia hoạt hóa apoptosis thông qua con đường nội sinh (phụ

thuộc ti thể). Caspase-9 (CASP9) được mã hóa bởi gen CASP9, là caspase

khởi tạo quá trình apoptosis nội sinh [63]. Yoo và cộng sự (2007) đã chỉ ra

rằng sự biểu hiện CASP9 thường bị ức chế trong tế bào ung thư dạ dày [93].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy ở các tế bào MKN45, CASP9 tăng

cường biểu hiện ở mức độ phiên mã khi xử lí với ATRA. Hơn nữa, Mueller

và cộng sự trong nghiên cứu trước đó đã kết luận: sự suy giảm hoạt động của

CASP9 làm tăng cường ngưỡng apoptosis gây ra bởi cisplatin [67]. Điều này

gợi ý rằng có thể sử dụng ATRA như một loại thuốc hỗ trợ khi điều trị ung

thư bằng hóa trị.

Hình 3.6B. Mức độ biểu hiện các gen thúc đẩy apoptosis (so sánh với đối chứng (DC), (n = 3, *p < 0,05)

Gen FOXO3 mã hóa cho protein FOXO3, thuộc họ protein Forkhead

box (FOX). Sự kích hoạt FOXO3 dẫn đến apoptosis, ngừng chu kỳ tế bào,

ngược lại, sự bất hoạt FOXO3 tăng cường sự sống tế bào và tăng sinh tế bào

[18]. Sự suy giảm hoạt động của FOXO3 đã được ghi nhận ở nhiều loại tế bào

ung thư khác nhau [25]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định được

hoạt động của FOXO3 đã được tăng cường ở mức độ phiên mã khi các tế bào

gốc ung thư MKN45 được xử lí với ATRA. Ở các tế bào ung thư bạch cầu

(APL), Sakoe Y và cộng sự (2010) cũng nhận thấy kết quả tương tự,

FOXO3A tăng cường biểu hiện khi điều trị bằng ATRA [75]. Nghiên cứu của

Sakoe cũng chỉ ra rằng FOXO3A là một phân tử quan trọng gây ra apoptosis

khi điều trị bằng ATRA ở APL.

Tp53 hay p53 là một protein liên kết DNA làm dừng chu kỳ tế bào do

căng thẳng gen [35], là gen thúc đẩy apoptosis có ý nghĩa quan trọng trong

ung thư. Cơ bản p53 cản trở sự tăng sinh của các tế bào có DNA bị hỏng [71].

50% số bệnh ung thư ở người đã được phát hiện có đột biến gen làm tổn hại

trực tiếp đến chức năng của p53, trong phần lớn các khối u còn lại có một tỷ

lệ lớn các đột biến hoặc thay đổi biểu hiện thay đổi của các gen khác ảnh

hưởng đến chức năng của protein p53 [84]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng

ATRA tăng cường hoạt động của p53 ở các tế bào của ung thư tụy, ung thư

máu và ung thư hắc sắc tố [57], [94], [98]. Trong nghiên cứu này, kết quả

phân tích biểu hiện p53 ở mức độ phiên mã cho thấy, ATRA làm tăng cường

hoạt động của gen p53 ở các tế bào ung thư MKN45.

Interleukin 2 (IL2), là một interleukin, đóng vai trò quan trọng trong tăng

cường sự biểu hiện của các phân tử tiền apoptosis trong tế bào T [58]. Như

vậy, IL2 là một chất thúc đẩy apoptosis tiềm năng. Fan và cộng sự (2017) đã

chỉ ra ATRA làm tăng biểu hiện của IL2 ở các tế bào ung thư phổi [29].

Trong kết quả nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy các tế bào MKN45 được

xử lí với ATRA có sự gia tăng biểu hiện gen IL2, biểu hiện của IL2 tăng gấp

khoảng 3 lần so với các tế bào đối chứng không xử lí với ATRA.

Như vậy, ATRA đã tác động đến quá trình apoptosis ở tế bào gốc ung

thư dạ dày MKN45 thông qua tác động suy giảm biểu hiện các gen ức chế

apoptosis: AKT1, NUP62, BCL2, MAPK1 và tăng cường hoạt động của các

gen thúc đẩy apoptosis: CASP9, FOXO3, IL2, p53.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

1. Đã nuôi cấy thành công các tumorsphere 3D của các tế bào ung thư

MKN45 để phục vụ cho quá trình thử tác động của ATRA.

2. Đã chỉ ra rằng ATRA ức chế sự hình thành và tăng trưởng của các

tumorsphere.

3. ATRA đã làm giảm sự hoạt động của con đường tín hiệu EGF bằng

cách điều hòa giảm sự biểu hiện của các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5 và

EGFR, nhưng không ảnh hưởng lên sự hiện các gen EPS8, BCAR1, CBL,

NCK2 và SHC1 của con đường tín hiệu này ở mức độ phiên mã.

4. ATRA đã điều hòa giảm sự hoạt động của con đường tín hiệu

JAK/STAT, thông qua điều hòa giảm sự biểu hiện của các gen GAB1,

GAB2, SRC, STAT1 và STAT3 ở mức độ phiên mã.

5. Ở con đường apoptosis, ATRA làm giảm sự biểu hiện của các gen ức

chế apoptosis: AKT1, NUP62, BCL2, MAPK1 và tăng cường biểu hiện của

các gen thúc đẩy apoptosis: CASP9, FOX3, IL2, P53 ở mức độ phiên mã.

Kết luận chung: ATRA đã ức chế sự sinh trưởng và phát triển các tế bào

ung thư dạ dày MKN45 thông qua điều hoà làm giảm biểu hiện các gen chủ

chốt của hai con đường tín hiệu EGF, JAK/STAT và thúc đẩy quá trình

apoptosis.

2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các gen

thuộc các con đường tín hiệu EGF, JAK/STAT, apoptosis ở mức độ protein.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Akulapalli S. (2009), History of Cancer, Ancient and Modern

Treatment Methods, doi: 10.4172/1948-5956.100000e2.

2. Alam S.M., Rajendran M., Ouyang S., Veeramani S., Zhang L., Lin

M.F. (2009), “ novel role of Shc adaptor proteins in steroid hormone-

regulated cancers”, Endocr Relat Cancer, 16(1), pp. 1-9.

3. Ali R.Y., Kamran B.L., Peivand B., Maryam R., Zahra K. (2018),

“Risk Factors for Gastric Cancer: A Systematic Review”, Asian Pac J

Cancer Prev, 19(3), pp. 591–603.

4. Arisi M..F, Starker R.A., Addya S., Huang Y., Fernandez S.V. (2014),

“All transretinoic acid (ATRA) induces re-differentiation of early

transformed breast epithelial cells”, Int J Oncol, 44, pp. 1831–42.

5. Avalle L., Camporeale A., Camperi A., Poli V. (2017), “STAT3 in

cancer: A double-edged sword”, Cytokine, 98, pp. 42–50.

6. Barker N., Huch M., Kujala P., van de Wetering M., Snippert H.J., van

Es J.H., et al (2010), “Lgr5+ve stem cells drive self-renewal in the

stomach and build long-lived gastric units in vitro”, Cell Stem Cell, 6,

pp. 25–36.

7. Barrett A., Pellet-Many C., Zachary I.C., Evans I.M., Frankel P. (2013),

"p130Cas: a key signalling node in health and disease", Cell.

Signal, 25(4), pp. 766–77.

8. Bhardwaj A., Singh S., Srivastava S.K., Arora S., Andrews J., Grizzle

W.E., Singh A.P. (2014), “Restoration of PPP2CA expression reverses

epithelial-to-mesenchymal transition and suppresses prostate tumour

growth and metastasis in an orthotopic mouse model”, Br J Cancer,

110(8), pp. 2000-10.

9. Bocanegra M., Bergamaschi A., Kim Y.H. , Miller M.A., Rajput

A.B. , Kao J., Han W., Jeffrey S.S., Huntsman D.G. , Pollack J.R.

(2010), “Focal amplification and oncogene dependency of GAB2 in

breast cancer”, Oncogene, 29(5), pp. 774-9.

10. Bonnet D., Dick J.E. (1997), “Human acute myeloid leukemia is

organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic

cell”, Nat Med, 3, pp. 730–7.

11. Borovski T., De Sousa E., Melo F., Vermeulen L., Medema J.P. (2011),

“Cancer stem cell niche: the place to be”, Cancer Res, 71, pp. 634–9.

12. Breitman T.R., Selonick S.E., Collins S.J. (1980), “Induction of

differentiation of the human promyelocytic leukemia cell line (HL-60)

by retinoic acid”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 2936–40.

13. Bruck N., Vitoux D., Ferry C., Duong V., Bauer A., de Thé H., et al.

(2009), “A coordinated phosphorylation cascade initiated by

p38MAPK/MSK1 directs RARalpha to target promoters”, EMBO J, 28,

pp. 34–47.

14. Bullock T.L., Clarkson W.D., Kent H.M., Stewart M. (1996). "The 1.6

angstroms resolution crystal structure of nuclear transport factor 2

(NTF2)", J. Mol. Biol, 260(3), pp. 422–31.

15. Cabodi S., Tinnirello A., Bisaro B., Tornillo G., del Pilar Camacho-

Leal M., Forni G., Cojoca R., Iezzi M., Amici A., Montani M., Eva A.,

Di Stefano P., Muthuswamy S.K., Tarone G., Turco E., Defilippi P.

(2010), "p130Cas is an essential transducer element in ErbB2

transformation", FASEB J, 24(10), pp. 3796–808.

16. Carlos L.A, Jeffrey A.E (2014), “ERBB receptors: From oncogene

discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics”,

Cancer Cell, 25(3), pp. 282–303.

17. Chen T., Yang K., Yu J., Meng W., Yuan D., Bi F., Liu F., Liu J., Dai

B., Chen X., Wang F., Zeng F., Xu H., Hu J., Mo X. (2012),

“Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and

peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients”, Cell

Res, 22(1), pp. 248-58.

18. Chiacchiera F., Simone C. (2010), “The AMPK-FoxO3A axis as a

target for cancer treatment”, Cell Cycle, 9(6), pp. 1091-6.

19. Chow K.H., Factor R.E., Ullman K.S. (2012), “The nuclear envelope

environment and its cancer connections”, Nat Rev Cancer, 12(3), pp.

196–209.

20. Chu P.Y., Liou J.H., Lin Y.M., Chen C.J., Chen M.K., Lin S.H., Yeh

C.M., Wang H.K., Maa M.C., Leu T.H., Chang N.W., Hsu N.C., Yeh

K.T. (2012), “Expression of EPS8 correlates with poor survival in oral

squamous cell carcinoma”, Asia Pac J Clin Oncol, 8, pp. 77–81.

21. Dai Y., Qi L., Zhang X., Li Y., Chen M., Zu X. (2011), "CrkI and

p130Cas complex regulates the migration and invasion of prostate

cancer cells”, Cell biochem funct, 29 (8), pp. 625-9.

22. D'Ambrosio D.N., Clugston R.D., Blaner W.S. (2011), “Vitamin A

Metabolism: An Update”, Nutrients, 3(1), pp. 63–103.

23. Damien B., Julie G., Caroline G., Christine V. (2018), “Efficiency of

All-Trans Retinoic Acid on Gastric Cancer: A Narrative Literature

Review”, Int J Mol Sci, 19(11), pp. 3388-93.

24. Ding C.B., Yu W.N, Feng J.H, Luo J.M (2015), “Structure and

function of Gab2 and its role in cancer (Review)”, Mol Med Rep, 12(3),

pp. 4007–14.

25. Du W.W., Fang L., Yang W., Wu N., Awan F.M., Yang Z., Yang B.B.

(2017), “Induction of tumor apoptosis through a circular RNA

enhancing Foxo3 activity”, Cell Death Differ, 24(2), pp. 357-370.

26. Edelman M.J., Smith R., Hausner P., Doyle L.A., Kalra K., Kendall J.,

Bedor M., Bisaccia S. (2005), “Phase II trial of the novel retinoid,

bexarotene, and gemcitabine plus carboplatin in advanced non-small-

cell lung cancer”, J Clin Oncol, 23, pp. 5774–8.

27. Egeblad M., Nakasone E.S., Werb Z. (2010), “Tumors as organs:

complex tissues that interface with the entire organism”, Dev Cell,

18(6), pp. 884–901.

28. Emira B., Hamidreza M.A. (2018), “ “Do We Know Jack” About JAK?

A Closer Look at JAK/STAT Signaling Pathway”, Front Oncol, 8, pp.

287-92.

29. Fan X.Y., Wang P.Y., Zhang C., Zhang Y.L., Fu Y., Zhang C., Li

Q.X., Zhou J.N., Shan B.E., He D.W. (2017), “All-trans retinoic acid

enhances cytotoxicity of CIK cells against human lung adenocarcinoma

by upregulating MICA and IL-2 secretion”, Sci Rep, 7(1), pp. 16481-9.

30. Fatemeh A., Azam B., Tahereh N., Sepideh A.B. (2014), “Retinoids

and their biological effects against cancer”, Int Immunopharmacology,

18(1), pp. 43–9.

31. Fenoglio-Preiser C.M., Carneiro F., Correa P., et al. (2000), Tumours of

the Stomach, World Health Organization Classification of Tumours, pp.

37-67.

32. Groner B., von Manstein V. (2017), "Jak Stat signaling and cancer:

Opportunities, benefits and side effects of targeted

inhibition", Molecular and Cellular Endocrinology, 451, pp. 1–14.

33. Han S., Fukazawa T., Yamatsuji T., Matsuoka J., Miyachi H., Maeda

Y., et al. (2010), “Anti-tumor effect in human lung cancer by a

combination treatment of novel histone deacetylase inhibitors: SL142

or SL325 and retinoic acids”, PLoS One, 5(11), pp. 1–11.

34. Hanahan D., Weinberg R.A. (2011), “Hallmarks of cancer: the next

generation”, Cell, 144(5), pp. 646-74.

35. Harris S.L., Levine A.J. (2005), “The p53 pathway: positive and

negative feedback loops”, Oncogene, 24(17), pp. 2899-908.

36. Hata A.N., Engelman J.A. (2015), “The BCL2 Family: Key Mediators

of the Apoptotic Response to Targeted Anticancer Therapeutics”,

Cancer Discov, 5(5), pp. 475-87.

37. Hazawa M., Lin D.C., Kobayashi A., Jiang Y.Y., Xu L., Mohamed

M.S., Hartono N.M, Meguro H.M., Horike S..I, Koeffler H.P., Wong

R.W. (2018), ”ROCK-dependent phosphorylation of NUP62 regulates

p63 nuclear transport and squamous cell carcinoma proliferation”,

EMBO Rep, 19(1), pp. 73-88.

38. He Y.Z., Liang Z., Wu M.R., Wen Q., Deng L., Song C.Y., Wu B.Y.,

Tu S.F., Huang R., Li Y.H. (2015), “Overexpression of EPS8 is

associated with poor prognosis in patients with acute lymphoblastic

leukemia”, Leuk Res, 39, pp. 575-81.

39. Helm C.W., Lorenz D.J., Meyer N.J., Rising W.W., Wulff J.L.R.

(2013), “Retinoids for preventing the progression of cervical intra-

epithelial neoplasia”, Cochrane Database Syst Rev, 6, pp. CD003296.

40. Hoffmann W. (2012), “Stem cells, self-renewal and cancer of the

gastric epithelium”, Curr Med Chem, 19, pp. 5975–83.

41. Hsu S.L., Lin Y.F., Chou C.K. (1993), “Retinoic acid biphasically

regulates the gene expression of hepatitis B virus surface antigen in

human hepatoma Hep3B cell”, J BiolChem, 268, pp. 23093–7.

42. Humar B., Fukuzawa R., Blair V., Dunbier A., More H., Charlton A., et

al. (2007), “Destabilized adhesion in the gastric proliferative zone and

c-Src kinase activation mark the development of early diffuse gastric

cancer”, Cancer Res, 67(6), pp. 2480-9.

43. Ismael R., Kathleen S., Jaime A.E., Helga W., Patricia G., Bruno N.,

Marcelo G., Alejandro H.C., Juan C.R, Carolina B. (2015), “Molecular

classification of gastric cancer: Towards a pathway-driven targeted

therapy”, Oncotarget, 6(28), pp. 24750–79.

44. Itziar P.M., Alexandre G., Umamaheswar D., Simon C.W., Alexander

S. (2017), “EGF receptor signaling, phosphorylation, ubiquitylation and

endocytosis in tumors in vivo”, eLife, 6, pp. e31993.

45. Jackson C.B., et al (2007), “Augmented gp130-mediated cytokine

signalling accompanies human gastric cancer progression”, J

Pathol, 213, pp. 140–51.

46. Janssens V., Goris J., Van Hoof C. (2005), “PP2A: the expected tumor

suppressor”, Curr Opin Gen Dev, 15(1), pp. 34-41.

47. Japanese Gastric Cancer Association (2011), Japanese classification of

gastric carcinoma, 3rd English ed. Gastric Cancer 14, pp. 101-12.

48. Jatiani S.S., Baker, S.J., Silverman L.R. (2010), "JAK/STAT Pathways

in Cytokine Signaling and Myeloproliferative Disorders: Approaches

for Targeted Therapies", Genes & Cancer, 1(10), pp. 979–93.

49. Judd L.M., Menheniott T.R., Ling H., Jackson C.B., Howlett M.,

Kalantzis A., Priebe W., Giraud A.S., “Inhibition of the JAK2/STAT3

pathway reduces gastric cancer growth in vitro and in vivo”, PLoS One,

9(5), pp. e95993.

50. Kinoshita Y., Kalir T., Rahaman J., Dottino P., Kohtz D.S. (2012),

“Alterations in nuclear pore architecture allow cancer cell entry into or

exit from drug-resistant dormancy”, Am. J. Pathol, 180(1), pp. 375-89.

51. Klampfer L. (2008), “The role of signal transducers and activators of

transcription in colon cancer”, Front. Biosci, 13, pp. 2888–99.

52. Lai A.Z., Durrant M., Zuo D., Park M. (2012), “Met Kinase-dependent

Loss of the E3 Ligase Cbl in Gastric Cancer”, J Biol Chem, 287(11),

pp. 8048–59.

53. Lara L., Thaísa C.M., Diego M., Jéssica N.A., Isabela S.L, Camila

X.A., Julieta G., Vivian N.S. (2019), “Modulation of all-trans retinoic

acid-induced MiRNA expression in neoplastic cell lines: a systematic

review”, BMC Cancer, 19, pp. 866-72.

54. Lee I.O., et al (2010), “Helicobacter pylori CagA phosphorylation

status determines the gp130-activated SHP2/ERK and JAK/STAT

signal transduction pathways in gastric epithelial cells”, J Biol Chem,

285, pp. 16042–50.

55. Lee S.H., Jeong E.G., Nam S.W., Lee J.Y., Yoo N.J. (2007), “Increased

expression of Gab2, a scaffolding adaptor of the tyrosine kinase

signalling, in gastric carcinomas”, Pathology, 39(3), pp. 326-9.

56. Leung W.K., Ng E. K. W., Sung J. J. Y. (2009), Tumors of the stomach,

Textbook of Gastroenterologyogy, pp. 10261053.

57. Li J., Orr B., White K., Belogortseva N., Niles R., et al. (2009), “Chmp

1A is a mediator of the antiproliferative effects of all-trans retinoic acid

in human pancreatic cancer cells”, Mol. Cancer, 8, pp. 7-15.

58. Liao W., Lin J.X., Leonard W.J. (2011), “IL-2 Family Cytokines: New

Insights into the Complex Roles of IL-2 as a Broad Regulator of T

helper Cell Differentiation”, Curr Opin Immunol, 23(5), pp. 598-604.

59. Manning B.D., Toker A. (2017), “AKT/PKB Signaling: Navigating the

Network”, Cell, 169(3), pp. 381-405.

60. Matsumura T., Sugimachi K., Takahashi Y., Uchi R., Sawada G., Ueda

M., ... & Kurashige J. (2014), “Clinical significance of GAB2, a

scaffolding/docking protein acting downstream of EGFR in human

colorectal cancer”, Annals of surgical oncology, 2(4), pp.743-9.

61. McColl K.E.L., (2006), “Cancer of the gastric cardia”, Best Practice &

Research Clinical Gastroenterology, 20(4), pp. 687-96.

62. McDonald S.A., Greaves L.C., Gutierrez-Gonzalez L., et al. (2008),

“Mechanisms of field cancerization in the human stomach: the

expansion and spread of mutatedgastric stem cells”, Gastroenterology,

134, pp. 500–10.

63. McIlwain D.R., Berger T., Mak T.W. (2013), “Caspase functions in cell

death and disease”, Cold Spring Harb Perspect Biol, 5(4), pp. a008656.

64. Meissl K., Macho-Maschler S., Müller M., Strobl B. (2017), “The good

and the bad faces of STAT1 in solid tumours”, Cytokine, 89, pp.12–20.

65. Mélissa L.C, Julie D., Salma I., Aude P.C., Peter M.S., Louise L.

(2011), “Nck2 promotes human melanoma cell proliferation, migration

and invasion in vitro and primary melanoma-derived tumor growth in

vivo”, BMC Cancer, 11, pp. 443-50.

66. Messina J.L., Yu H., Riker A.I., Munster P.N., Jove R.L., Daud A.I.

(2008), "Activated Stat-3 in Melanoma", Cancer Control, 15(3), pp.

196–201.

67. Mueller T., Voigt W., Simon H., Fruehauf A., Bulankin A., Grothey

A., Schmoll H.J. (2003), “Failure of activation of caspase-9 induces a

higher threshold for apoptosis and cisplatin resistance in testicular

cancer”, Cancer Res, 63(2), pp. 513-21.

68. Nathan B., Yu-Jui Y.W. (2010), “Retinoid Pathway and Cancer

Therapeutics”, Adv Drug Deliv Rev, 62(13), pp. 1285–98.

69. Nguyen P.H., Giraud J., Staedel C., Chambonnier L., Dubus P.,

Chevret E., ... & Soubeyran I. (2016), “All-trans retinoic acid targets

gastric cancer stem cells and inhibits patient-derived gastric carcinoma

tumor growth”, Oncogene, 35(43), pp. 5619-28.

70. Ohtsu A., (2008), “Chemotherapy for metastatic gastric cancer: past,

present, and future”, Journal of Gastroenterology, 43, pp. 256-64.

71. Powell D.J., Hrstka R., Candeias M., Bourougaa K., Vojtesek

B., Fåhraeus R. (2008), “Stress-dependent changes in the properties

of p53 complexes by the alternative translation product p53/47”, Cell

Cycle, 7(7), pp. 950-9.

72. Pu X., Storr S.J., Ahmad N.S., Rakha S.A., Green A.R., Ellis I.O.,

Martin S.G. (2018), “High nuclear MSK1 is associated with longer

survival in breast cancer patients”, J cancer re clin oncol, 144(3), pp.

509-17.

73. Reyes D., Ballaré C., Castellano G., Soronellas D., Bagó J.R., Blanco

J., Beato M. (2014), “Activation of mitogen- and stress-activated kinase

1 is required for proliferation of breast cancer cells in response to

estrogens or progestins”, Oncogene, 33(12), pp. 1570-80.

74. Reyskens K.M., Arthur J.S. (2016), “Emerging Roles of the Mitogen

and Stress Activated Kinases MSK1 and MSK2”, Front Cell Dev Biol,

4, pp. 56-62.

75. Sakoe Y., Sakoe K., Kirito K., Ozawa K., Komatsu N. (2010),

“FOXO3A as a key molecule for all-trans retinoic acid-induced

granulocytic differentiation and apoptosis in acute promyelocytic

leukemia”, Blood, 115(18), pp. 3787-95.

76. Schonthal A.H. (2001), “Role of serine/threonine protein phosphatase

2A in cancer”, Cancer Lett, 170, pp. 1-13.

77. Schreiber S., Rosenstiel P., Hampe J., Nikolaus S., Groessner B.,

Schottelius A., Kühbacher T., Hämling J., Fölsch U.R., Seegert D.

(2002), “Activation of signal transducer and activator of transcription

(STAT) 1 in human chronic inflammatory bowel disease”, Gut, 51, pp.

379–85.

78. Sever R., & Brugge J.S. (2015), “Signal transduction in cancer”, Cold

Spring Harbor perspectives in medicine, 5(4), pp. a006098.

79. Simon E., Petke D., Boger C., Behrens H.M., Warneke V., Ebert M.,

Röcken C. (2012), “The spatial distribution of LGR5+ cells correlates

with gastric cancer progression”, PLoS One, pp. 7:e35486.

80. Singh S.R. (2012), “Stem cell niche in tissue homeostasis, aging and

cancer”, Curr Med Chem, 19, pp. 5965–74.

81. Stemmermann G.N., Fenoglio-Preiser C.M. (2008), Gastric Cancer:

Pathology, Principles and practice of gastrointestinal oncology, pp.

257-74.

82. Su L., Qiao W., Zheng-Ming C., Wen-Jin S. (2001), “The effect

pathway of retinoic acid through regulation of retinoic acid receptor a

in gastric cancer cells”, World Journal of gastroenterology, 7(5), pp.

662–6.

83. Summy J.M., Gallick G.E. (2006), “Treatment for advanced tumors:

SRC reclaims center stage”, Clin Cancer Res, 12(5), pp. 1398-401.

84. Toledo F., Wahl G.M. (2006), “Regulating the p53 pathway: in vitro

hypotheses, in vivo veritas”, Nat Rev Cancer, 6(12), pp. 909-23.

85. Varon C., Dubus P., Mazurier F., Asencio C., Chambonnier L., et al.

(2012), “Helicobacter pylori infection recruits bone marrow-derived

cells that participate in gastric preneoplasia in mice”, Gastroenterology,

142, pp. 281–91.

86. Wang H., He H., Meng H., Cui Y., Wang W. (2018), “Effects of Grb2-

associated binding protein 2-specific siRNA on the migration and

invasion of MG-63 osteosarcoma cells”, Oncol Lett, 15(1), pp. 926-30.

87. Washington K., (2010), “7th Edition of the AJCC Cancer Staging

Manual: Stomach”, Annals of Surgical Oncology, 17, pp. 3077-9.

88. Wen Q., Jiao X., Kuang F., Hou B., Zhu Y., Guo W., Sun G., Ba Y.,

Yu D., Wang D., Zhang F., Qiao H.C., Wang S., Tang S., Qiao H.

(2019), “FoxO3a inhibiting expression of EPS8 to prevent progression

of NSCLC: A new negative loop of EGFR signaling”, EbioMedicine,

40, pp. 198-209.

89. Wöhrle F.U., Daly R.J., Brummer T. (2009), “Function, regulation and

pathological roles of the Gab/DOS docking proteins”, Cell

Communication and Signaling, 7(1), pp. 22-8.

90. Wong R.S. (2011), “Apoptosis in cancer: from pathogenesis to

treatment”, J Exp Clin Cancer Res, 30(1), pp. 87-92.

91. Yakisich J.S. (2012), “Challenges and limitations of targeting cancer

stem cells and/or the tumour microenvironment”, Drugs Ther Stud,

2(1), pp. e10.

92. Yang Y.C., Wang S.W., Hung H.Y., et al (2007), “ Isolation and

characterization of human gastric cell lines with stem cell phenotypes”,

J Gastroenterol Hepatol, 22, pp. 1460–8.

93. Yoo N.J., Lee S.H., Jeong E.G., Lee SH. (2007), “Expression of

phosphorylated caspase-9 in gastric carcinomas”, APMIS, 115(4), pp.

354-9.

94. Zhang H., Rosdahl I. (2004), “Expression profiles of p53, p21, bax and

bcl-2 proteins in all-trans-retinoic acid treated primary and metastatic

melanoma cells”, Int. J. Oncol., 25, pp. 303-10.

95. Zhang H., Zhou L., Zhou W., Xie X., Wu M., Chen Y., Hu Y., Du J.,

He Y., Li Y. (2019), “EPS8-mediated regulation of multiple myeloma

cell growth and survival”, Am J Cancer Res, 9(8), pp. 1622-34.

96. Zhang S., Huang S., Deng C., Cao Y., Yang J., Chen G., Zhang

B., Duan C., Shi J., Kong B., Friess H., Zhao N., Huang C., Huang

X., Wang L., Zou X. (2017), “Co-ordinated overexpression of SIRT1

and STAT3 is associated with poor survival outcome in gastric cancer

patients”, Oncotarget, 8(12), pp. 18848-60.

97. Zhen Y., Guanghui L., Xiefu Z. (2014), “Knockdown of EGFR inhibits

growth and invasion of gastric cancer cells”, Cancer Gene Ther,

21(11), pp. 491-7.

98. Zheng A., Mantymaa P., Saily M., Savolainen E., Vahakangas K.,

Koistinen P. (2000), “p53 pathway in apoptosis induced by all-trans-

retinoic acid in acute myeloblastic leukaemia cells”, Acta Haematol,

103, pp. 135-42.

99. Zheng Y., Zhang C., David R.C., Mohamed A.S., Nicole S.D., Adrian

P., Lorne T., Stephen A.T., Rod W.H., Karen C., Anna Y.D., Rick

B., James W.D, Gingras A.C, Roger J.D., Tony P. (2013), “Temporal

regulation of EGF signaling networks by the scaffold protein Shc1”,

Nature, 499(7457), pp. 166-71.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tác động của all trans retinoic acid lên sự biểu hiện các gen trong con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ dày

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC

ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG

TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ

DẠ DÀY

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC

ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG

TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ

DẠ DÀY

1. Đặt vấn đề

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

A

B

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tác động của all trans retinoic acid lên sự biểu hiện các gen trong con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ dày

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC

ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG

TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ

DẠ DÀY

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC

ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG

TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ

DẠ DÀY

1. Đặt vấn đề

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

A

B

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok