Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY

DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don )

LU N ÁN TI N S SINH HỌC

Thái Nguyên - 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY

DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don )

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 9 42 01 21

LU N ÁN TI N S SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm

2. GS.TS. Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của

PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm và GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết quả

trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các tạp chí khoa học

công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

Bùi Thị Hà

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu và

PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã chỉ bảo, động viên và tận tình hướng dẫn trong

suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn và các cán bộ, nghiên

cứu viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất

để tôi có thể hoàn thành một số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh học hiện

đại và Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học

Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có nhiều góp ý sâu sắc cho tôi

trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô và

các cán bộ bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái

Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Y Dược, chân thành

cảm ơn các đồng nghiệp Khoa Khoa học cơ bản, Trường Đại học Y Dược – Đại

học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình học tập và công tác.

Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động

viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.

Thái Nguyên, tháng 02 năm 2018

TÁC GIẢ

Bùi Thị Hà

iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan…………………………………………………................. i

Lời cảm ơn………………………………………………………..…....... ii

Mục lục………………………………………………………..………… iii

Danh mục những chữ viết tắt trong luận án…………………………….. vi

Danh mục bảng trong luận án…………………………………………… ix

Danh mục hình trong luận án…………………………………………… xi

MỞ ĐẦU…………………………………………………...…………… 1

1.Đặt vấn đề……………………………………………………………. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………….. 2

3. Nôi dung nghiên cứu………………………………………………..... 2

4. Những đóng góp mới của luận án………………………………...….. 3

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án…………………….. 3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………..... 4

1.1.Alkaloid ………………………………………………..………….. 4

1.1.1. Vai trò của alkaloid thực vật........................................................... 4

1.2. Sinh tổng hợp alkaloid và hoạt động của enzyme DAT ở cây dừa cạn.. 10

1.1.2. Alkaloid ở cây dừa cạn…………………………………………... 6

1.2.1. Quá trình sinh tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn…………...…….. 10

1.2.2. Hoạt động của enzyme DAT và gen DAT................................... 16

1.3. Nghiên cứu cải thiện hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn.................... 18

1.3.1. Nâng cao hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn bằng phương pháp

nuôi cấy mô tế bào thực vật……………………...................................... 18

1.3.2. Nâng cao hàm lượng alkaloid bằng kỹ thuật chuyển gen………. 21

Chƣơng 2. V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 27

2.1. Vật liệu nghiên cứu .………………………………………………. 27

2.1.1. Vật liệu thực vật…………………………………………………. 27

2.1.2. Chủng vi khuẩn và các loại vector………………………………. 27

2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu………………………... 27

2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu…………………………………… 27

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án……………………. 28

2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………….. 29

2.3.1. Các phương pháp sinh học phân tử……………………………… 29

2.3.2. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT 33

2.3.3. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc lá..................... 37

2.3.4. Tái sinh và chuyển gen gus ở cây dừa cạn...................................... 38

2.3.5. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây dừa cạn thông qua

A.tumefaciens............................................................................................. 43

2.3.6. Phương pháp phân tích cây chuyển gen......................................... 45

2.3.7. Phương pháp tính hiệu suất chuyển gen………………………… 49

2.3.8. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu……………………… 49

Chƣơng 3. K T QUẢ VÀ THẢO LU N………………………….... 50

3.1. Đặc điểm của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn.......................... 50

3.1.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen

CrDAT………………………………………………………………………….. 50

3.1.2. So sánh trình tự nucleotite của gen CrDAT............................. 52

3.2. Thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá 56

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT……. 56

3.2.2. Phân tích biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá chuyển gen........ 61

3.2.3. Thảo luận kết quả thiết kế và đánh giá hoạt động của vector

chuyển gen pBI121-CrDAT………………………………………………… 67

3.3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh và xây dựng quy trình chuyển gen ở

cây dừa cạn................................................................................................ 70

3.3.1. Nuôi cấy in vitro cây dừa cạn…………………………………… 70

3.3.2. Xây dựng quy trình chuyển gen thông qua gen gus………………... 76

3.3.3. Kết quả chuyển gen gus vào cây dừa cạn ..................................... 82

3.4. Kết quả chuyển gen CrDAT và tạo cây dừa cạn chuyển gen...................... 87

3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT và tái sinh cây dừa cạn chuyên gen.. 87

3.4.2. Xác định sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong

hệ gen của các cây dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T0................................. 89

3.4.3. Phân tích biểu hiện protein DAT tái tổ hợp ở thế hệ T1................. 92

3.4.4. Thảo luận về kết quả sự tăng cường biểu hiện gen CrDAT ở cây

dừa cạn chuyển gen…………………………………………………… 96

K T LU N VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………... 100

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIỆN QUAN Đ N LU N ÁN…. 101

TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 102

PHỤ LỤC……………………………………………………………... 119

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VI T TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

AS Acetosyringone

A. Tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

A. Rhizogenes Agrobacterium rhizogenes

Benzylaminopurine BAP

Promoter CaMV 35S 35S

base pair Cặp bazơ nitơ bp

cộng sự cs

Cocultivation medium CCM Môi trường đồng nuôi cấy

Deoxyribonucleic acid DNA

Complementary DNA DNA bổ sung cDNA

CTAB Cetyltrimethyl ammonium Bromide

Gen CrDAT CrDAT Cathanthus roseus Deacetyl vindoline 4-O-acetyltransferase

Diethyl pyrocarbonate DEPC

Deoxynucleoside triphosphate dNTP

Escherichia coli E. coli

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

Phản ứng ELISA ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

Germination Medium Môi trường tái sinh GM

β-Glucuronidase gus

Indole Acetic acid IAA

IPTG Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside

vii

Kilo base Kb

Kilo Dalton kDa

Luria Bertami LB

Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn

Murashige và Skoog MS

Tên gọi đặt cho môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy mô thực vật

Messenger ribonucleic acid mRNA

Naphthaleneacetic acid NAA

Neomycyn phosphatranferaseII Gen kháng kanamycine NptII

Optical density Mật độ quang OD

Polymerase chain reaction PCR Phản ứng chuỗi polymerase

Ribonucleic acid RNA

Rooting medium Môi trường tạo rễ RM

rCrDAT Recombinant CrDAT protein Protein DAT tái tổ hợp

Sodium dodecyl sulfate SDS

Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi SIM

Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi SEM

Tris Acetate EDTA TAE

Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase

T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA được chuyển vào thực vật

T0, T1 Các thế hệ cây chuyển gen

T0 Cây chuyển gen tái sinh từ chồi trong ống nghiệm

T1 Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây

viii

TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine

WT Wild type Cây không chuyển gen

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-galacto-pyranoside

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.........................................

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR............................................................

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen CrDAT vào vector tách dòng........

Bảng 2.4. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn...................................

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt DNA bằng BamHI……………………

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI/ NcoI……………….

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII...........................

Bảng 3.1. Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide của gen

CrDAT...............................................................................................................

Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn của protein

DAT ở mẫu dừa cạn TN1, TN2 và protein mang mã số AAC99311 trên Ngân

hàng Gen................................................................................................

Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc

lá...................................................................................................................

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ đoạn

thân mang mắt chồi bên……………………………………………………..

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của sự kết hợp BAP 1,0mg l với IBA đến sự phát sinh

chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên………….

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của BAP đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của

chồi từ nách lá mầm……………………………………………………........

Bảng 3.7. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 0,5mg l và IBA đến sự phát sinh và

sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm……………………………..….............

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của mật độ A. tumefaciens đến tỷ lệ biểu hiện gen gus

tạm thời khi lây nhiễm qua nách lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên........

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ biểu hiện tạm

thời gen gus ...................................................................................................

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ Km đến chọn lọc mẫu chuyển gen.......

Bảng 3.12. Kết quả chuyển gen gus vào dừa cạn...........................................

Bảng 3.13. Kết quả biến nạp cấu trúc CrDAT vào mẫu dừa cạn hoa hồng tím..

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus roseus………………………….. 7

Trang

Hình 1.2. Sơ đồ biểu diễn con đường sinh tổng hợp các terpenoid indole

alkaloid (TIA)……........................................................................................

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của viblastine và vincristine............................ 15

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát…………………………………….... 29

Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrDAT …………….... 34

Hình 2.3.Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây dừa cạn qua nách lá mầm... 43

Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT………... 50

Hình 3.2. Trình tự nucleotide của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn mẫu

TN1, TN2 và trình tự mang mã số AF053307 trên Ngân hàng gen quốc tế..

Hình 3.3. Trình tự amino acid suy diễn của gen CrDAT từ hai mẫu dừa cạn

TN1, TN2 và của protein mang mã số AAC99311 trên Ngân hàng Gen. ....

Hình 3.4. Kết quả cắt vector tách dòng tái tổ hợp pBT-CrDAT với cặp

enzyme giới hạn NcoI và NotI…………………….......................................

Hình 3.5. Kết quả cắt mở vòng vector pRTRA7 3………………………… 58

Hình 3.6. Kết quả tạo vector tái tổ hợp pRTRA7 3-CrDAT………………... 59

Hình 3.7. Kết quả tạo vector chuyển gen pBI121-CrDAT............................. 60

Hình 3.8. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT và kết quả

điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR.........................................................

Hình 3.9. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp, chọn lọc và tái sinh tạo cây thuốc

lá chuyển gen..........................................................................................................

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen

xii

CrDAT trong các cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng…………………..... 64

Hình 3.11. Kết quả phân tích Southern blot các dòng thuốc lá chuyển gen

CrDAT.................................................................................................

Hình 3.12. Kết quả phân tích Western blot các dòng cây thuốc lá chuyển gen

CrDAT.................................................................................................

Hình 3.13. Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt dừa cạn 70

Hình 3.14. Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm… 73

Hình 3.15. Sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên và từ nách

lá mầm dưới ảnh hưởng của sự kết hợp BAP với IBA……..........................

Hình 3.16. Kết quả biểu hiện tạm thời gen gus.............................................. 77

Hình 3.17. Kết quả biểu hiện gen gus ở cây dừa cạn chuyển gen.................. 84

Hình 3.18. Sơ đồ quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi

khuẩn A. tumefaciens.....................................................................................

Hình 3.19. Hình ảnh biến nạp và tái sinh cây dừa cạn chuyển gen............... 88

Hình 3.20. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT từ

các cây dừa cạn chuyển gen...........................................................................

Hình 3.21. Kết quả phân tích Southern blot DNA tổng số các cây dừa cạn

chuyển gen CrDAT với đoạn dò nptII được đánh dấu bằng biotin....................

Hình 3.22. Kết quả phân tích Western blot từ 4 dòng dừa cạn chuyển gen

và cây đối chứng không chuyển gen..............................................................

Hình 3.23. Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp

CrDAT của 4 dòng dừa cạn chuyển gen T1và cây đối chứng không chuyển

gen.......................................................................................................................

xiii

Hình 3.24. Các dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 và cây đối chứng

không chuyển gen..........................................................................................

Hình 3.25. Hàm lượng alkaloid tổng số của 4 dòng dừa cạn chuyển gen ở

thế hệ T1 và cây đối chứng không chuyển gen……………………………..

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Hiện nay, loài người trên thế giới đang phải đối mặt với rất nhiều căn bệnh

nguy hiểm như ung thư, AIDS, tiểu đường, thoái hóa khớp, viêm gan B, C. Ung

thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Theo tổ chức Y tế Thế

giới (WHO) tỉ lệ người mắc ung thư năm 2012 là 14 triệu người, đến năm 2014

đã có hơn 90 triệu người mắc ung thư và hàng năm có hơn 8 triệu người chết vì

ung thư [41]. Bệnh ung thư đang gia tăng ở trẻ em. Tại Mỹ, năm 2016 có hơn 10

nghìn trẻ mắc ung thư từ sơ sinh đến 14 tuổi và có khoảng hơn một nghìn trẻ sẽ

chết vì căn bệnh này [43]. Vì vậy, việc tìm kiếm và phát triển thuốc chữa các

bệnh ung thư là vấn đề cấp bách hiện nay.

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) là một trong những loại

cây dược liệu quý. Cây dừa cạn có khả năng sản xuất các indole alkaloid có

dược tính quan trọng và ứng dụng trong sản xuất các loại thuốc chống ung thư,

đặc biệt là ung thư máu. Ngoài ra, cây dừa cạn còn được chỉ dẫn trong điều trị

bệnh bạch cầu lympho cấp và một số bệnh ung thư khác. Trong dân gian, dừa

cạn được sử dụng trị cao huyết áp, bệnh đái tháo đường, điều hòa kinh nguyệt,

chữa tiêu hóa kém và chữa lị, lợi tiểu khá mạnh, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, tẩy

giun, chữa sốt cao [12].

Trong tất cả các alkaloid thực vật, terpenoid indole alkaloid (TIA) là một

nhóm quan trọng chứa hơn 3000 loại hợp chất có cấu trúc đa dạng và được tìm

thấy ở 8 họ thực vật [119]. Trong đó, các loài cây có nguồn gốc từ họ mã tiền

(Loganiaceae), họ trúc đào (Apocynaceae) và họ cà phê (Rubiaceae) chứa hàm

lượng alkaloid cao [39]. Dừa cạn có chứa 2 loại alkaloid là vinblastine và

vincristine được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh ung thư [105]. Vinblastine và

vincristine là những chất ức chế mạnh sự phân chia tế bào và do vậy ngăn cản sự

tăng số lượng tế bào. Ngoài ra, một số TIA khác như ajmalicine và serpentine

được sử dụng để điều trị rối loạn tuần hoàn [105]. Quá trình chuyển hóa tổng hợp

các TIA ở cây dừa cạn là một quá trình phức tạp, trải qua nhiều phản ứng với sự

tham gia của nhiều enzyme, các chất điều hòa và các chất vận chuyển [118].

Hàm lượng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn tự nhiên rất thấp

[76], vì vậy, định hướng nghiên cứu nhằm tăng hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn

được quan tâm, trong đó xác định việc tăng cường biểu hiện enzyme chìa khóa

tham gia trong quá trình chuyển hóa tổng hợp alkaloid là rất quan trọng.

Deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) là một enzyme chìa khóa trong

chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn. Biểu hiện mạnh gen mã hóa

enzyme DAT sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng

vinblastine và vincristine trong dừa cạn được nâng cao.

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã thực hiện đề tài luận án:

“Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng

hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định đặc điểm và biểu hiện được gen mã hóa C. roseus

deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (CrDAT) phân lập từ cây dừa cạn. Tạo

được cây dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng alkaloid được cải thiện.

3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Nghiên cứu thu thập thông tin về gen CrDAT, thiết kế cặp mồi PCR nhân

bản đoạn gen CrDAT, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự nucleotide của

đoạn gen CrDAT.

3.2. Thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa gen CrDAT và đánh giá hoạt động

của vector chuyển gen trên cây thuốc lá.

3.3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua

Agrobacterium tumafaciens ở cây dừa cạn.

3.4. Nghiên cứu chuyển gen CrDAT vào dừa cạn, phân tích cây chuyển gen và

đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển CrDAT ở cây dừa cạn.

4. Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân

lập, tách dòng phân tử đến thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện gen CrDAT ở

cây thuốc lá và cây dừa cạn, cụ thể là:

1) Đã phân lập được gen CrDAT từ mRNA của cây dừa cạn, gen CrDAT (cDNA)

có kích thước 1320 bp, mã hóa 439 amino acid.

2) Xây dựng được quy trình tái sinh, quy trình chuyển gen thông qua

A.tumefaciens và tạo được 4 dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT ở thế hệ T1 (T1-1;

T1-3; T1-6; T1-7) có hàm lượng alkaloid tổng số tăng từ 3,16 lần đến 15,17 lần

so với đối chứng không chuyển gen.

3) Protein tái tổ hợp rCrDAT được biểu hiện trên cây thuốc lá và trên cây dừa

cạn chuyển gen, kết quả biểu hiện mạnh gen CrDAT được kiểm chứng bằng

Western blot và ELISA.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

Về mặt khoa học

Kết quả nghiên cứu trong luận án góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc

của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn màu hoa hồng tím và màu hoa trắng thu

thập tại Thái Nguyên. Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật tăng cường biểu

hiện gen mã hóa enzyme chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid

nhằm nâng cao hàm lượng alkaloid của cây dừa cạn.

Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học cùng với 2 trình tự gen công

bố trên Ngân hàng gen quốc tế là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên

cứu và giảng dạy sinh học và công nghệ sinh học.

Về mặt thực tiễn

Các trình tự gen CrDAT được phân lập, cấu trúc vector chuyển gen, các

dòng cây chuyển gen góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc sử dụng

kỹ thuật chuyển gen để cải thiện hàm lượng alkaloid trong cây dược liệu nói

chung và cây dừa cạn nói riêng. Kết quả nghiên cứu đã mở ra triển vọng ứng

dụng kỹ thuật biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme vào việc nâng cao hàm lượng

dược chất trong cây dược liệu.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ALKALOID

1.1.1. Vai trò của alkaloid thực vật

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có

phản ứng kiềm, thường gặp ở thực vật và đôi khi có trong động vật, có dược tính

mạnh. Ngoài carbon, hydro và nitơ, alkaloid cũng có thể chứa oxy, lưu huỳnh và

các yếu tố khác như clo, brom, và phospho [118]. Alkaloid được sản xuất bởi một

lượng lớn các sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật. Trong lĩnh

vực y học, alkaloid cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và đặc biệt

bao gồm cả thuốc chống sốt rét (quinine), chữa trị bệnh hen suyễn (ephedrine),

chống ung thư (homoharringtonine), thuốc an thần (galantamine) [54], giãn mạch

(vincamine), chống loạn nhịp (quinidine), giảm đau (morphine), kháng khuẩn

(chelerythrine) [37],[38], chữa bệnh Alzhemimer [86] và thuốc chữa huyết áp

(piperine) [85].

Ranh giới giữa alkaloid và các hợp chất tự nhiên có chứa nitơ khác không

rõ ràng. Các hợp chất như amino acid, protein, nucleic acid, amin và các loại

thuốc kháng sinh thường không được gọi là alkaloid. Các hợp chất tự nhiên có

chứa nitơ ở vị trí exocyclic (mescaline, serotonin, dopamine …) được phân loại

là hợp chất amin, không gọi là alkaloid [84].

Các nghiên cứu về alkaloid bắt đầu vào thế kỷ XIX. Năm 1804 - 1805, ở

Pháp và Đức đã phân lập được morphin và điều chế được dạng muối, đồng thời

chứng minh được morphin là hoạt chất chính của cây thuốc phiện có tác dụng

sinh lý rõ rệt. Năm 1980, từ vỏ cây canhkina (thuộc họ cà phê) người ta đã chiết

và kết tinh được một chất đặt tên là “cinchonino”. Sau đó hai nhà hóa học Pháp

đã xác định cinchonino là hỗn hợp của hai alkaloid là quinin và cinchonin. Năm

1918, người ta đã phát hiện ra alkaloid của họ mã tiền là strycnin và bruxin và

cũng là năm phát hiện cafein trong chè, cà phê, sau đó là nicotin trong thuốc lá,

atropin trong cà độc dược, theobromin trong cacao, codein trong thuốc phiện,

cocain trong lá coca. Giữa năm 1973, người ta đã xác định được 4959 loại

alkaloid khác nhau, trong đó có 3293 chất đã xác định được công thức hóa học.

Hiện nay, số loại alkaloid đã đưa vào ứng dụng trong y học ngày một tăng [74].

So với các thành phần khác của các hợp chất tự nhiên, alkaloid được đặc

trưng bởi sự đa dạng về cấu trúc và không có sự phân loại thống nhất. Phương

pháp phân loại alkaloid đầu tiên trong lịch sử dựa vào nguồn gốc tự nhiên là phổ

biến. Việc phân loại không dựa vào cấu trúc hóa học của alkaloid, cho nên

phương pháp trên được coi là lỗi thời [118]. Các alkaloid thông thường được

phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất

được sử dụng để tạo ra phân tử. Khi còn ít thông tin về quá trình sinh tổng hợp

alkaloid, các loại alkaloid được gộp lại thành nhóm theo tên của các hợp chất đã

biết, hay gọi tên dựa theo nhóm động vật, thực vật mà từ đó người ta chiết xuất ra

các alkaloid. Ví dụ các alkaloid chiết từ cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là

các vinca alkaloid. Khi có thông tin và hiểu biết nhiều hơn về một alkaloid cụ

thể, việc gộp nhóm thường lấy theo tên gọi của amin quan trọng về mặt sinh học

và nổi bật nhất trong quá trình tổng hợp.

Trong giới thực vật bậc cao, người ta đã xác định được một số cây dược

liệu chứa alkaloid như: cây ba chạc, bách bộ, bình vôi, cà độc dược, cà phê,

canhkina, cau, lá ngón, chè, cỏ nhọ nồi, dừa cạn, đại, hoàng liên, hoàng liên gai,

hồ tiêu, khổ sâm, kim tiền thảo, ma hoàng, mộc hoa trắng, mộc hương, ớt, ô đầu

phụ tử, sen, táo nhân, thuốc lá, thuốc phiện, tỏi độc, trinh nữ hoàng cung, vối.

Điểm chung của các loài cây dược liệu này là alkaloid có hàm lượng rất thấp và

khó tách chiết, nhưng lại có giá trị rất lớn đối với y học và ngành dược phẩm

[83]. Trong cơ thể thực vật, alkaloid là những chất chuyển hóa thứ cấp, là sản

phẩm cuối cùng trong quá trình chuyển hóa ở thực vật. Một số các alkaloid thực

vật có vai trò bảo vệ như aporphine của cây tulip, bởi khả năng kháng lại nấm ký

sinh. Một số alkaloid khác có khả năng ngăn ngừa côn trùng và động vật gây hại,

số ít có thể đóng vai trò là các chất điều hòa sự sinh trưởng và quá trình chuyển

hóa của thực vật, tương tự như hormone thực vật [26]. Đối với con người, nhiều

alkaloid thực vật có hoạt tính sinh học mạnh và được sử dụng trong y học. Từ thế

kỷ XIX, nhiều alkaloid được phát hiện để sử dụng làm thuốc và được ứng dụng

trong y học như morphine, quinine… Một số chất quá độc, không dùng trong y

học (Gelsemin trong lá ngón), nhiều chất có thêm tác động nguy hại đến xã hội

(gây nghiện, ma túy, ảo giác) [75]. Ngoài ra, một số alkaloid còn là các chất dự

trữ, có khả năng cung cấp nitơ hoặc các chất khác. Việc nghiên cứu các alkaloid

có giá trị rất lớn góp phần vào việc tạo ra nhiều loại dược phẩm ứng dụng trong

điều trị các bệnh.

1.1.2. Alkaloid ở cây dừa cạn

1.1.2.1. Cây dừa cạn

Theo Đỗ Tất Lợi (1977), cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don.)

hay hải đằng, dương giác, bông dừa, trường xuân hoa là một loài thực vật trong

chi Catharanthus thuộc họ La bố ma (Apocynaceae) [12]. Dừa cạn là cây bản địa

và đặc hữu của Madagascar (Châu Phi). Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại,

phân bố tự nhiên, từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển và

tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế,

Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng ven biển, dừa cạn

mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp,

có khả năng chịu đựng điều kiện khô cằn của vùng cát ven biển. Dừa cạn còn

được trồng để làm cảnh và làm thuốc [21].

Dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại terpenoid indole

alkaloid (TIA) được tách chiết từ ba giống, đó là roseus có cánh hoa màu hồng

tím, albus có cánh hoa màu trắng vàng và ocellatus có cánh hoa màu trắng đỏ.

Trong đó dừa cạn hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao

nhất (Hình 1.1) [79].

Hình 1.1. Hoa của ba giống dừa cạn Catharanthus roseus. A: Catharanthus

roseus var. roseus; B: Catharanthus roseus var. ocellatus; C: Catharanthus

roseus var. albus [79].

Cây dừa cạn là loài cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 - 60 cm, phân

nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Mọc

thành bụi dày. Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, cuống lá hẹp nhọn, dài 4 -

6 cm, rộng 2 - 3 cm, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng, mặt dưới nhạt. Cánh hoa

màu trắng hoặc cánh hoa màu hồng tím, có mùi thơm. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá

gần ngọn. Vòi nhụy dài bằng ống tràng, dạng sợi màu trắng. Đầu nhụy hình trụ,

màu xanh, đỉnh có 2 thùy nhọn, phía dưới có màng mỏng màu vàng. Hai đĩa mật

màu vàng, hình tam giác hẹp nằm xen kẽ 2 lá noãn. Quả gồm 2 đại, dài 2 - 4 cm,

rộng 2 - 3 cm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu

quả hơi tù, trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt

có các hột nổi thành đường chạy dọc. Mùa hoa và quả gần như quanh năm [21].

1.1.2.2. Các loại alkaloid và tác dụng của alkaloid

Trong cây dừa cạn có khoảng 130 loại alkaloid, trong đó vinblastine và

vincristine là hai hợp chất quan trọng nhất [105]. Alkaloid có nhân indol được

tìm thấy trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất trong lá và rễ. Alkaloid

toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37% - 1,15%, thân 0,40%, rễ chính

0,7% - 2,4%, rễ phụ 0,9% - 3,7%, hoa 0,14% - 0,84%, vỏ quả 1,14%, hạt

0,18%. Trong các loại alkaloid đã được chiết từ cây dừa cạn, người ta đặc biệt

chú ý 20 nhóm alkaloid có hoạt tính chống ung thư bao gồm vincristine và

vinblastine [79].

Các alkaloid chủ yếu trong cây dừa cạn là vinblastine, vincristine

tetrahydroalstonine, prinine, vindoline, catharanthine, ajmalicine, vincosid [119].

Từ dừa cạn, người ta còn chiết xuất được pyrocatechic, sắc tố flavonoid và

anthocyanine từ thân và lá dừa cạn hoa hồng tím. Ngoài ra từ lá chiết được acid

ursoloc, từ rễ chiết được choline.

Căn cứ vào cấu tạo hóa học, alkaloid trong cây dừa cạn được chia làm ba

nhóm chính: (1) Nhóm alkaloid nhân indole gồm có các loại như perivine,

peviridine, perosine, catharanthine, cavicine, ajmalicin... (2) Nhóm alkaloid nhân

indoline: vindoline, ajmaline, lochnericine, lochneridine, lochrovine... (3) Nhóm

alkaloid có 2 vòng indole hoặc một vòng indole và một vòng indoline như

leurosine, leubcosidine... và đặc biệt là các alkaloid có tác dụng chữa bệnh ung

thư nhưng có hàm lượng rất thấp như vinblastine (vincaleucoblastine) 0,005–

0,015% trong lá, vincristine (leucocristine) 0,003 – 0,005% trong lá [79].

Tác dụng dược lý của cây dừa cạn

Từ những năm 1950, y học đã phát hiện ra dược tính của dừa cạn. Người

thử nghiệm đầu tiên về tác dụng của cây dừa cạn là bác sĩ Clark Noble ở Canada.

Ông đã phát hiện thấy cây dừa cạn không những có tác dụng hạ đường huyết

trong máu mà còn có hoạt tính trị bệnh ung thư bạch cầu ở người. Dừa cạn đã

được đưa vào bệnh viện thử nghiệm và trở thành cây dược liệu chính thức trong y

khoa hiện đại [74]. Thành phần vincristine có tác dụng với bệnh nhân ung thư

nhưng chúng lại là thành phần gây hại cho thai nhi, ức chế hệ thần kinh.

Kết quả phân tích thành phần alkaloid chiết xuất từ cây dừa cạn cho

thấy, dừa cạn giàu vinblastine, vincristine, tetrahydroalstonine, pirinine,

vindoline, catharanthine, ajmalicine…..Trong đó, vincristine và vinblastine khi

điều chế thành dạng thuốc tiêm sẽ có tác dụng lớn trong ức chế sự phân bào và

sinh trưởng của tế bào, cho nên hạn chế được việc hình thành bạch cầu thừa ở

bệnh nhân ung thư máu [74].

Ở Việt Nam và một số nước châu Phi, châu Mỹ, dừa cạn được trồng làm

cảnh và làm thuốc thông tiểu, điều kinh, trị tăng huyết áp, đái tháo đường, sốt rét,

kiết lị, tiêu hoá kém… Bộ phận dùng làm thuốc là rễ, hoặc lá, hoặc cả cây. Sử

dụng nguyên bụi cây dừa cạn đem phơi khô, chặt nhỏ, sao qua cho thơm trước

khi nấu nước uống. Tùy vào mục đích trị liệu và kinh nghiệm địa phương, có thể

dùng độc vị dừa cạn hoặc phối hợp với những vị thuốc khác [12].

Trong điều trị ung thư, thường sử dụng dạng muối sufat để chế tạo dạng

chế phẩm tiêm truyền tĩnh mạch. Vincristine sulfat được sử dụng khá rộng rãi để

điều trị ung thư máu, đặc biệt là bệnh bạch cầu lympho cấp. Trong khi đó,

vinblastine sulfat lại có tác dụng tốt trong điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn, ung

thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư biểu mô thận, u nguyên bào thần

kinh, ung thư vú, ung thư cổ tử cung,… Một đặc điểm của vinblastine là chưa

phát hiện sự đề kháng chéo với các loại thuốc chống ung thư khác [102].

Bên cạnh việc sử dụng các alkaloid thiên nhiên chiết xuất từ dừa cạn, các

chuyên gia dược học đã nghiên cứu bán tổng hợp một số alkaloid để mở rộng

phạm vi và hiệu quả của điều trị ung thư. Vindesine, navelbine là những sản

phẩm phối hợp những tính năng của cả vinblastine và vincristine có nhiều hứa

hẹn trong lĩnh vực điều trị u thần kinh đệm mãn tính, u hắc sắc tố, u lympho bào,

ung thư biểu mô trực tràng, đại tràng, vú, thực quản [63]. Tương tự các loại thuốc

kháng ung thư khác, các chế phẩm alkaloid của dừa cạn cũng gây một số phản

ứng bất lợi như buồn nôn, nôn, nhức đầu, tiêu chảy, táo bón, tắc ruột, liệt, chán

ăn, viêm miệng, rụng tóc, giảm bạch cầu, viêm thần kinh. Sử dụng liều cao và

kéo dài có thể gây mù, tử vong. Thuốc có thể gây độc cho thai, nên tránh dùng

cho thai phụ và người đang nuôi con bằng sữa mẹ [44].

1.2. SINH TỔNG HỢP ALKALOID VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME DAT

Ở CÂY DỪA CẠN

1.2.1. Quá trình sinh tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn

Trong những năm gần đây, con đường chuyển hóa tổng hợp các alkaloid ở

cây dừa cạn được nghiên cứu khá chi tiết. Ở mức độ phân tử, con đường chuyển

hóa tổng hợp terpenoid indole alkaloid (TIA) ở cây dừa cạn rất phức tạp, chịu sự

chi phối của nhiều nhân tố và với sự tham gia của 30 loại enzyme và trải qua 35

phản ứng trung gian [40], [105]. Quá trình chuyển hóa tổng hợp các TIA trong

cây dừa cạn trải qua 4 con đường, đó là con đường MEP (methyler-ythritol

phosphate), con đường seco-iridoid, con đường shikmate và con đường vindoline

(Hình 1.2).

Trong con đường MEP trải qua 7 phản ứng trung gian với sự tham gia của

6 enzyme và tạo nên sản phẩm cuối cùng là geranyl diphosphate (GPP). GPP là

tiền chất để tạo các monoterpenoid trong đó có secologanin, sau đó được chuyển

vào trong con đường seco - iridoid [32], [47].

Con đường seco - iridoid là con đường quan trọng trong quá trình tổng

hợp các TIA. Chất đầu tiên là geranyl diphosphate từ con đường seco - iridoid

trải qua 9 phản ứng trung gian với sự tham gia của nhiều enzyme, trong đó

enzyme SLS (secologanin synthase) là enzyme xúc tác cho phản ứng cuối cùng

tạo thành sản phẩm là secologanin [30], [67].

Con đường shikimate dẫn đến sự hình thành vòng thơm amino acid

tryptophan, nguồn cung cấp vòng indole duy nhất cho sự chuyển hóa của cây bao

gồm auxin, glucosinolate, phytoalexin, TIAs [24], [55]. Tryptophan được tách

cacboxyl để hình thành tryptamin bởi hoạt động xúc tác của enzyme tryptophan

decarboxylase, enzyme này được mã hóa bởi gen TDC (tryptophan decarboxyl)

[45], [75].

Hình 1.2. Sơ đồ biểu diễn con đường sinh tổng hợp các terpenoid indole alkaloid

(TIA) [52].

: Phản ứng trực tiếp; : Qua nhiều phản ứng; Khung màu cam : Con

đường chuyển hóa; Các khung màu xanh : Sản phẩm chuyển hóa.

Khi biểu hiện mạnh gen TDC với mục đích làm tăng tổng hợp các TIA lại

không thành công vì sự biểu hiện quá mức của gen TDC phụ thuộc nhiều vào sự

có sẵn của tryptophan [114], [115]. Secologanin kết hợp với tryptamine tạo nên

phân tử strictosidine trong không bào và được xúc tác bởi enzyme strictosidine

synthase [29], [48], [96].

Từ strictosidine trải qua nhiều phản ứng trung gian với sự tham gia của

nhiều enzyme tạo nên dehydrosecodine. Từ dehydrosecodine một hướng tạo

thành tabersonine trong con đường vindoline, một hướng tạo thành catharanthine

để kết hợp với vindoline tạo thành Iminium.

Tabersonine chuyển hóa thành vindoline cần có sự tham gia của ánh sáng

và ánh sáng tác động đến các giai đoạn phát triển khác nhau của cây [29], [48],

[94], [114]. Hầu như mọi nghiên cứu đều tập trung vào con đường tổng hợp

vindoline, bởi vì vindoline liên quan trực tiếp đến sự hình thành các alkaloid,

trong đó có vinblastine và vincristine. Tuy nhiên khi quá trình tích lũy

tabersonine ở mức độ cao lại thường không tổng hợp được vindoline [36],[70].

Con đường vindoline được miêu tả khá kỹ, từ tabersonine trải qua 6 phản

ứng trung gian với sự tham gia của 6 loại enzyme để tạo nên deacetylvindoline.

Từ tabersonine chuyển thành 16 - hydroxytabersonine được xúc tác bởi enzyme

tabersonine -16 - hydroxylase (T16H), sau đó được methyl hóa bằng 16-

hydroxytabersonine-16-O-methyl transferase (16OMT) tạo nên 16-

methoxytabersonine [59]. Sau đó trải qua bước oxi hóa để biến đổi từ 16-

methoxy tabersonine thành 16 methoxy -2, 3-dihydrotabersonine bởi enzyme

tabersonine 3-oxygenase (T3O). Các bước tiếp theo liên quan đến một enzyme N

- methyltransferase (NMT) để tạo nên deacetoxy vindoline [61]. Hai phản ứng

cuối cùng được xúc tác bởi hai enzyme là deacetoxy vindoline – 4 - hydroxylase

(D4H) tạo deacetylvindoline và enzyme deacetylvindoline – 4 – O -

acetyltransferase (DAT) tạo nên vindoline.

Vindoline là một tiền chất quan trọng trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp

nên vinblastine và vincristine. Sau đó vindoline kết hợp với catharanthine tạo nên

iminium, từ iminium tạo thành α 3’4’anhydrovinblastine (AVLB) với sự xúc tác

của perosidase 1 (Prx1) để hình thành nên vinblastine và sau đó hình thành nên

vincristine đánh dấu sự hoàn thiện quá trình sinh tổng hợp các TIA hữu ích ở cây

dừa cạn [33], [56].

Prx là loại enzyme thực vật, định vị trong không bào, có khả năng sử dụng

H2O2 để oxy hóa một số hợp chất trung gian trong quá trình chuyển hóa, đặc biệt

[50],[56].

là phenol. Chức năng sinh hoá của Prx trong cây dừa cạn đã được phát hiện từ

nghiên cứu về khả năng oxy hóa các hợp chất phenol khi sử dụng H2O2

Gen mã hoá enzyme Prx đã được phân lập từ hệ gen cây dừa cạn bởi

Kumar và cs (2007) có kích thước 1357 bp, vùng mã hoá gồm 993 nucleotide, từ

nucleotide số 41 đến nucleotide số 1034. Protein Prx có 330 amino acid, trong đó

có 21 amino acid của đoạn peptide tín hiệu. Khối lượng phân tử của Prx ước tính

khoảng 37,43 kDa và có giá trị pI là 8,68. Phân tử mRNA của gen Prx và enzyme

Prx đã được tìm thấy trong lá dừa cạn bằng phương pháp Northern blot và Western

blot [56].

Cả catharanthine và vindoline đều được tổng hợp ở trong thân, rễ và lá

của cây dừa cạn [58]. Khi phân tích alkaloid bằng phương pháp sắc ký cho thấy,

0,16 đến 1,8% và thấp hơn so với ở lá. Điều này cho thấy khả năng tích lũy

hàm lượng vindoline và catharanthine ở rễ và thân của cây rất thấp, khoảng từ

alkaloid ở lá cao hơn các bộ phận khác của cây, đặc biệt cao nhất ở biểu bì lá

cây dừa cạn. Các nghiên cứu trước đây cho rằng, sự tích lũy catharanthine phụ

thuộc vào sự có mặt của các TIA trên bề mặt của lá [85]. Một phần

catharanthine kết hợp với vindoline tạo sản phẩm cuối cùng vinblastine và

vincristine, một phần catharanthine có trên bề mặt lá được hoạt động như lớp

sáp chống lại sự phá hại của côn trùng và nấm mốc. Bằng thực nghiệm các

nghiên cứu đã chỉ ra rằng, phần hòa tan bằng chloroform bề mặt của lá dừa cạn

chứa 100% catharanthine và 3–5% vindoline so với toàn bộ lá. Sự tích lũy và

chiết xuất catharanthine trên bề mặt lá đã cho thấy con đường sinh tổng hợp

catharanthine xảy ra ở biểu bì lá [85].

Roepke và cs (2010) nghiên cứu ảnh hưởng của catharanthine đến loài

nấm Phytopthora nicotianiae cho thấy, catharanthine ức chế sự phát triển của

nấm trong môi trường có nồng độ 10 μg ml. Đây là nồng độ thấp hơn rất nhiều

so với nồng độ trung bình của catharanthine trong lá non và lá già là 14 μg và 23

μg/ml. Các tác dụng chống côn trùng xâm hại của catharanthine được thí nghiệm

bằng cách cho các loài côn trùng như Spodoptera littoralis, Spodoptera eridania,

Helicoverpa armigera, Phaedon cochleariaeand Bombyx mori ăn lá cây dừa cạn.

Kết quả cho thấy, ấu trùng của S. eridania không ăn lá dừa cạn, trong khi hai

loài là Spodoptera và B. mori ăn lá mà không bị chết. Ngược lại, P. cochleariae

không ăn lá trong vòng 5 ngày và bị chết đói. Khi cho ấu trùng B. mori ăn với

chế độ ăn trộn lá dừa cạn với lá dâu tằm đã cho thấy tỷ lệ tử vong giảm khi

nghiền lá thành bột. Mặt khác, khi cho ấu trùng ăn lá dâu tằm trộn với

catharanthine tinh khiết thì chúng đã bị chết và tỷ lệ chết phụ thuộc vào liều

lượng catharanthine [85].

Vinblastine hay còn gọi là vincaleucoblastine là tinh thể hình kim kết tinh

bởi methanol, không tan trong nước và ether dầu hỏa, tan trong alcol, aceton,

ethyl acetat, chloroforme [21]. Vinblastine có khả năng ức chế sự hình thành các

cấu trúc vi ống, được sử dụng trong điều trị các tế bào tiền ung thư, khối u ác

tính, u sùi dạng nấm, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư tinh hoàn và ung thư

nhau thai.

Vincristine hay còn gọi là leurocristine là tinh thể hình phiến, sau khi tiêm

vincristine nhanh chóng phân bố vào các mô trong cơ thể và gắn với các yếu tố

máu đã hình thành, đặc biệt là hồng cầu và tiểu cầu. Vincristine thường được

dùng để điều trị khối u ác tính ở trẻ em ở liều lượng thích hợp. Mặt khác ở cả

người lớn và trẻ em, vincristine là một phần cần thiết trong liệu pháp hóa học để

chữa viêm bạch cầu cấp tính, bệnh lymphoma Hodgkin… Vincristine cũng đóng

vai trò trong liệu pháp điều trị khối u Wilms, u nguyên bào thần kinh, tế bào ung

thư phổi ở người lớn.

Vinblastine và vincristine được tạo thành từ sự ghép nối của catharanthine

(indole) và vindoline (dihydroindole) ở trạng thái tự do trong cây. Vincristine

cũng có cấu trúc tương tự như vinblastine, nhưng trong cấu tạo của vincristine,

trên phân tử nitrogen indole của vindoline là nhóm formyl (CHO), còn ở

vinblastine là nhóm methyl (CH3) [80], [120].

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của vinblastine và vincristine [120]

Nghiên cứu của Amirjani (2013) cho thấy, khi gây hạn nhẹ cho cây dừa

cạn trong môi trường nuôi cấy in vitro đã làm tăng hàm lượng vinblastine và

vincristine. Tuy nhiên, khi cây bị hạn nặng có thể ảnh hưởng đến việc tổng hợp

vinblastine và vincristine [23].

Hiện nay, có thể tạo ra sự biến đổi vinblastine thành vincristine bằng

phương pháp hóa học hay thông qua sự chuyển hóa của vi sinh vật. Vinblastine

và vincristine liên kết đặc hiệu với tubulin là những protein vi ống ở thoi phân

bào và ngăn cản sự kết hợp của những cấu trúc hình ống có ở trong nguyên sinh

chất của nhiều tế bào di động, ngăn cản sự phân chia tế bào từ giai đoạn kỳ giữa

của nguyên phân, do vậy hạn chế sự tăng sinh về số lượng tế bào. Vinblastine có

tác dụng chống ung thư bởi tác động chuyển hoá glutamate và aspartate, còn

vincristine tác dụng chống ung thư do ngăn cản sự tổng hợp mRNA và các

protein. Ở nồng độ cao vinblastine và vincristine có thể diệt được tế bào, còn ở

nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào ở kỳ giữa. Vì thế, chúng được sử dụng

làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [21].

1.2.2. Hoạt động của enzyme DAT và gen DAT

DAT là enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối cùng trong chuỗi

tổng hợp vindoline từ deacetylvindoline ở cây dừa cạn [94], [81]. Trong nghiên

cứu của Benoit và cs (1998), sự hoạt động của enzyme DAT được xác định ở

những cơ quan khác nhau của cây dừa cạn. Enzyme DAT hoạt động cao nhất ở lá

non, giảm xuống 76% ở lá già, ở thân là 5%, hoa khoảng 11% và ở rễ không

đáng kể [25]. Mối quan hệ giữa hoạt động của enzyme và sự tích lũy protein

DAT được xác định bằng kết quả phân tích Western blot [25].

Để chứng minh mức độ hoạt động của enzyme DAT và gen CrDAT tương

quan với sự tích lũy các mRNA người ta đã tách chiết mRNA từ các bộ phận

khác nhau của cây. Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử phân tích mRNA của

gen CrDAT ở các bộ phận khác nhau của cây dừa cạn cho thấy mRNA của gen

CrDAT có kích thước khoảng 1,3 kb xuất hiện nhiều nhất ở lá non, lá trưởng

thành và giảm dần trong thân cây và hoa, nhưng lại không có trong rễ cây [25].

Khảo sát tác động của ánh sáng đến hoạt động của enzyme DAT cho thấy, khi

cây dừa cạn non ở trong tối thì enzyme DAT hoạt động kém, nhưng sau khi điều

chỉnh ánh sáng thì hoạt động của DAT tăng dần theo thời gian. Phân tích Western

blot cho thấy, khi cây ở trong tối protein DAT có trọng lượng phân tử khoảng 50

kDa và khi cây ở ngoài sáng trọng lượng phân tử của DAT tăng lên và đạt

khoảng 52 kDa [25],[97]. Ánh sáng kích thích quá trình phiên mã gen CrDAT và

cùng với các gen mã hóa enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các

alkaloid khác như deacetoxy vindoline 4 - hydroxylase (D4H) và tryptophan

decarboxylase (TDC) [85], [107], [108].

Khi nghiên cứu gen DAT người ta đã xác định được gen DAT có ở 18 loài

thực vật (17-30%), số còn lại chưa biết hết chức năng. Trong đó, 13 gen phân lập

từ loài Arabidopsis thaliana, 19 gen phân lập từ hoa cẩm chướng [22]. Theo St-

Pierre và cs (1998), gen CrDAT phân lập từ DNA genome cây dừa cạn có kích

thước 1320 bp, mã hóa enzyme DAT có 439 amino acid và DAT gồm 9 chuỗi

polypeptid tham gia vào bước cuối cùng trong quá trình sinh tổng hợp vindoline

ở cây dừa cạn [94].

Quá trình phiên mã của gen liên quan đến chức năng của các nhân tố khởi

đầu phiên mã, trong đó có mã mở đầu. Tuy nhiên, sự phiên mã còn phụ thuộc vào

nhiều yếu tố khác như: vùng promoter, vùng mã hóa, các protein là nhân tố phiên

mã ... Các nghiên cứu cũng cho thấy gen CrDAT chỉ được biểu hiện khi có tín

hiệu của ánh sáng hoặc tín hiệu methyl jasmonate [104]. Wang và cs (2010), đã

jasmonate trong vùng khởi động của gen CrDAT. Các phân tích vùng promoter

mô tả trình tự của 3 đoạn TGACG liên quan đến con đường tín hiệu methyl

của gen CrDAT có đoạn motif liên quan đến tín hiệu ánh sáng. Ngoài ra, một số

motif khác có liên quan đến nhân tố vô sinh và hữu sinh, hormon sinh trưởng

như gibberellin và auxin [112]. Gen CrDAT biểu hiện mạnh nhất ở biểu bì lá cây

dừa cạn, nhưng ở cây Arabidopsis thaliana có thêm một số các promoter khác

liên quan tới việc biểu hiện gen CrDAT trong tế bào biểu bì lá [112 ].

1.3. NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN HÀM LƯỢNG ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN

1.3.1. Nâng cao hàm lƣợng alkaloid ở cây dừa cạn bằng phƣơng pháp nuôi

cấy mô tế bào thực vật

Hướng nghiên cứu thu nhận alkaloid từ nuôi cấy tế bào huyền phù và

phương pháp sản xuất catharanthine và ajmalicine trong dịch huyền phù được

nuôi cấy trong bình bioreactor đã được thử nghiệm thành công. Moreno và cs

(1995), đã đánh giá tác động của các chất cảm ứng đến con đường chuyển hóa

tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào huyền phù đối với dừa cạn

[70]. Sử dụng dịch chiết tế bào nấm Phytium aphanidermatum đã tiệt trùng để

nghiên cứu ảnh hưởng của chúng đến quá trình chuyển hóa tổng hợp alkaloid của

tế bào dừa cạn. Kết quả cho thấy, các tế bào nuôi cấy huyền phù đã phản ứng lại

tác động của nấm. Zhao và cs (2001), đã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng nhận

được từ 12 loại nấm và ảnh hưởng của chúng lên việc tăng cường tổng hợp

alkaloid ở tế bào huyền phù cây dừa cạn. Kết quả nghiên cứu cho thấy, chất chiết

từ nấm đã kích thích sự tích lũy các alkaloid, có thể tăng gấp 2 đến 5 lần so với ở

điều kiện nuôi cấy bình thường [117].

Zhao và cs (2001), đã tăng sản phẩm catharanthine trong tế bào nuôi cấy

cây dừa cạn bằng cách kết hợp với chất cảm ứng nuôi trong bình bioreactor. Tác

động tổng hợp lên sự tích lũy alkaloid trong tế bào nuôi cấy đã được phân tích

khi chúng được xử lý bởi sự kết hợp giữa chất cảm ứng của nấm và hóa chất. Sự

kết hợp giữa tetramethyl ammonium bromide và nấm sợi Aspergillum niger đã

cho hiệu suất tổng hợp ajmalicine cao nhất và cải thiện sự tích lũy catharanthine

[117]. Tương tự, sự kết hợp giữa chất cảm ứng malate và sodium alginate cho

hiệu suất tổng hợp catharanthine cao và cũng tạo ra sự tích lũy ajmalicine trong tế

bào nuôi cấy. Các tác giả sau đó đã phát triển quy trình nuôi cấy trong bình

bioreactor nhằm nâng cao hàm lượng catharanthine ở tế bào dừa cạn trong môi

trường nuôi cấy in vitro. Sau 10 ngày nuôi cấy đã thu được catharanthine với

hiệu suất theo thứ tự là 25 mg 1, 32 mg 1 và 22 mg 1 trong bình lắc có dung tích

500 ml, 1000 ml và bình bioreactor dạng sục khí 20 lít.

Nuôi cấy mô sẹo là nguồn sản xuất alkaloid chính. Miura và cs (1987) đã

cô lập vinblastine từ mô sẹo cây dừa cạn hình thành từ những đoạn lá non. Sử

dụng môi trường MS có bổ sung NAA 1.0 mg 1 và kinetin 0.1 mg 1. Các mô sẹo

đã được nuôi cấy trong môi trường tối. Sự hiện diện của vinblastine trong mô

sẹo của những rễ khác nhau đã được xác định bằng phương pháp sắc lý lỏng cao

áp (HPLC) và phép đo phổ khối lượng. Lượng vinblastine (1pg g chất khô), thấp

hơn so với cây mẹ.

Năm 1993, nghiên cứu của Marfori và Alejar về khả năng sản xuất alkaloid

của những mô sẹo có nguồn gốc từ rễ, thân, lá và hoa của hai giống dừa cạn hoa

màu trắng và hoa màu hồng tím. Kết quả đã thu được tám dòng mô sẹo bằng

cách sử dụng môi trường MS bổ sung BAP 3.0 mg/1, 2,4-D 0.5 mg 1 và nước

dừa. Sau khi các mô được hình thành thì được chuyển vào môi trường MS không

có chất điều hòa sinh trưởng và được nuôi trồng trong 1 năm. Hàm lượng

alkaloid cao nhất là trong cây dừa cạn hoa màu hồng tím và trong mô sẹo có

nguồn gốc từ rễ.

Trong nghiên cứu của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng thì mô sẹo xanh

được cảm ứng từ lá cây dừa cạn in vitro được nuôi trong môi trường MS lỏng có

bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau gồm có auxin và

cytokinin. Ở nồng độ NAA: 1,0 mg/l và kenetin 0,5 mg/l thu nhận được sinh

khối và alkaloid toàn phần cao nhất trong khi cũng ở môi trường này nhưng thay

thế NAA bằng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ở cùng nồng độ thu được

sinh khối và alkaloid toàn phần thấp [9].

Theo cách tiếp cận khác, Allen và cs (2002), đã đề xuất hướng nhân giống

in vitro cây dừa cạn bằng cách nuôi cấy mô phân sinh ngọn và chồi nách từ

những cây được trồng trong nhà kính [22]. Các tác giả đã sử dụng môi trường

MS cơ bản có bổ sung BAP và 2,4D ở nồng độ thấp. Những chồi nách nuôi cấy

sẽ hình thành chồi ngọn sau 4 - 5 tuần nuôi cấy. Một phần những cành đã nhân

giống được chuyển vào nuôi cấy tiếp, sau đó chúng được cắt, tạo rễ in vitro trong

môi trường MS được bổ sung với NAA và được trồng, sinh trưởng và phát triển

trong nhà kính với độ ẩm tương đối 100%.

Trong những năm gần đây, một hướng nghiên cứu tăng sinh khối dừa cạn

bằng phương pháp nuôi cấy rễ, chủ yếu là tạo rễ tơ trong ống nghiệm và kết quả

là sinh khối dừa cạn đã tăng lên đáng kể. Sự phát triển của kỹ thuật nhân giống

và phương pháp nuôi cấy rễ tơ in vitro là rất đáng chú ý và có thể trở thành giải

pháp quan trọng để giải quyết việc thu nhận các alkaloid từ cây dừa cạn. Sự tổng

hợp các hợp chất thứ cấp nhiều hơn ở những cây trồng trong tự nhiên, hàm lượng

alkaloid trong rễ tơ có thể tương đương hoặc cao hơn so với hàm lượng ở rễ tự

nhiên. Các alkaloid chiếm ưu thế trong rễ tơ được tìm thấy là ajmalicine,

serpentine, vindoline và catharanthine với hàm lượng cao hơn trong rễ cây dừa

cạn tự nhiên.

Năm 2010, Shihai và cs đã kết hợp các chất kích thích tăng trưởng thực

vật như ethylene (0,1 mM) + chlormequat clorua (0,1 mM), salicylic acid (0,1

mM) + chlormequat clorua (0,1 mM) và salicylic acid (0,1 mM) + ethylene (0,1

mM) + chlormequat clorua (0,1 mM) nhằm tăng hàm lượng vindoline,

catharanthine và vinblastine. Trong đó, nhóm kết hợp salicylic acid (0,1 mM) +

ethylene (0,1mM) + chlormequat clorua (0,01 mM) và salicylic acid (0,1 mM) +

ethylene (0,1mM) + chlormequatclorua (1mM) có ảnh hưởng đến hàm lượng

vindoline và catharanthine nhưng không có tác dụng với vinblastine. Trong số

các phương pháp kết hợp thì kết hợp giữa salicylic acid (0,1 mM) + ethylene (0,1

mM), ethylene (0,1 mM) + chlormequat clorua (0,1 mM) và salicylic acid (0,1

mM) + ethylene (0,1 mM) + chlormequat clorua (0,1 mM) có thể làm tăng đáng kể

hàm lượng vinblastine tương ứng bằng 209 % ở 48 giờ, 246 % ở 48 giờ và 213 %

ở 24 giờ [89]. Như vậy, so với phương pháp sử dụng đơn chất thì phương pháp kết

hợp các chất hóa học đã tích lũy alkaloid có hiệu quả hơn. Kết quả này có thể ứng

dụng vào sản xuất alkaloid ở cây dừa cạn trên quy mô công nghiệp.

Cũng theo hướng này, kết quả nghiên cứu của Zhao và cs (2013) đã làm rõ

ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tổng hợp alkaloid và đề xuất con đường

chuyển hóa các chất trong quá trình tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn [118].

1.3.2. Nâng cao hàm lƣợng alkaloid bằng kỹ thuật chuyển gen

1.3.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở thực vật thông qua

chuyển gen gus nhờ A.tumefaciens

Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu ở nước ta đã quan tâm đến

xây dựng quy trình chuyển gen ở loài cây lương thực, cây thực phẩm và cây lâm

nghiệp thông qua chuyển gen mã hóa β-glucuronidase (gus). β-glucuronidase

được phân lập từ chủng E. coli RA201, là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải

các β-glucuronide kết quả cho sản phẩm có màu xanh lam đặc trưng, dễ nhận

biết. Cơ chất của β-glucuronidase thường dùng trong phản ứng để nhận biết sự

tồn tại của gen gus là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide).

Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của β-glucuronidase sẽ chuyển sang

màu xanh lam. Nhờ đặc tính này mà các nhà khoa học đã thiết kế gen gus vào các

vector chuyển gen để làm chỉ thị nhận biết gen chuyển có mặt ở mô, tế bào thực

vật [51].

Trong 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở

Việt Nam thông qua biểu hiện gen gus đã được quan tâm. Đoàn Thu Thủy và cs

(2008), đã nghiên cứu và đánh giá sự hoạt động của 4 promoter (Rd29A, Gt1,

RCg2 và CaMV35S) nhằm chọn ra một promoter thích hợp cho quá trình chuyển

gen vào cây lúa thông qua sự biểu hiện của gen gus. Tác giả nhận thấy, các

promoter khác nhau không có ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành mô sẹo và

khả năng tái sinh in vitro. Sự biểu hiện tạm thời của gen gus ở phôi non của lúa

sau khi chuyển gen bằng súng bắn gen cũng không phụ thuộc vào promoter được

thiết kế trong vector. Tuy nhiên, gen gus biểu hiện bền vững chỉ quan sát được ở

cây chuyển gen khi sử dụng promoter RCg2 [18]. Trong nghiên cứu chuyển gen

ở cây lúa thông qua A.tumefaciens, Lê Trần Bình (2008) đã rút ra nhận xét về

điều kiện tối ưu cho chuyển gen ở lúa là mật độ vi khuẩn thích hợp là OD = 1,6 -

1,9 và nồng độ AS 200µM, phôi non và mô sẹo 3 tuần tuổi là vật liệu nhận gen,

đồng nuôi cấy với A. tumefaciens trong 3 ngày, chọn lọc bằng carbenicillin 250

mg/l và cefotaxim 100 mg/l [1]. Nghiên cứu cải tiến quy trình chuyển gen ở lúa

của Hoàng Thị Giang và cs (2015), theo hướng thao tác đơn giản, giảm thiểu

khối lượng công việc, nhưng hiệu suất chuyển gen cao. Theo quy trình này, dịch

khuẩn A. tumefaciens có mật độ OD600nm = 0,1 là tối ưu với tần số biểu hiện gen

gus ở mô sẹo cao (81,25%) và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp. Đánh giá sự biểu hiện của

gen gus và phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T1 đã chứng minh sự di truyền ổn

định của gen chuyển sang thế hệ sau [4]. Nghiên cứu chuyển gen gus vào đậu

tương của Đinh Thị Phòng và cs (2007) cho thấy, thời gian nhiễm khuẩn cho hiệu

quả biến nạp gen gus tốt nhất là 2 giờ, biểu hiện qua tỷ lệ mẫu sống sót là 67,5 %,

tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi là 47% và hiệu quả biểu hiện gen gus ở cây tái sinh in vitro

đạt 12,8% [15]. Ngoài cây lúa, nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở một

số cây trồng khác như khoai lang, sắn, cà chua, dưa dấu cũng được quan tâm.

Theo Vũ Thị Lan và cs (2013), vật liệu nhận gen là mảnh cấy từ đỉnh ngọn được

nhiễm với A.tumefaciens CV58 ở nồng độ OD600nm = 0,8, bổ sung AS 150µM

trong 20 - 30 phút, thu được tỉ lệ biểu hiện tạm thời gen gus cao nhất (38%). Mô

sẹo chuyển gen được chọn lọc trên môi trường CP3 bổ sung cefotaxim 500 mg/l,

kanamycine 50 mg/l trong 3 - 4 tuần. Chồi tái sinh từ các mô sẹo sống sót được

chọn lọc tiếp trên môi trường ra rễ MS bổ sung kanamycine 100 mg l. Kết quả

ban đầu về chuyển gen gus vào giống khoai lang KB1 là hầu hết các dòng mô sẹo

sống sót đều biểu hiện hoạt động gen gus (có màu xanh chàm rất đậm) và thu

được 8 21 dòng cây khoai lang chuyển gen gus ra rễ trên môi trường chọn lọc bổ

sung kanamycine 50 mg/l [8]. Một số nghiên cứu khác như chuyển gen gus ở cây

cà chua của Đỗ Xuân Đồng và cs (2007), ở cây dưa hấu của Nguyễn Thị Thanh

Nga và cs (2012), ở cây dầu mè của Võ Thị Thúy Huệ và cs (2011), ở cây thông

nhựa của Vương Đình Tuấn và cs (2012), ở cây xoan ta của Bùi Văn Thắng và cs

(2013). Ngoài ra, nghiên cứu chuyển gen cũng được tiến hành trên cây lan hồ

điệp (Phalaenopsis amabilis) của Trần Lê Lưu Li và cs (2008) với thí nghiệm lây

nhiễm bởi A.tumefaciens CV58 pGV2260 mang vector 35S -GUS-INT chứa gen

uidA và nptII và thu được kết quả biểu hiện gus tối ưu ở nồng độ AS 50μM sau 4

ngày đồng nuôi cấy [3], [6], [11], [14], [17], [20].

1.3.2.2. Thành tựu nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn

Trong những năm gần đây, nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn nhờ vi

khuẩn Agrobacterium rhizogens (A. rhizogens) được nhiều tác giả quan tâm [27],

[46], [49], [77], [99], [100],[ 116]. Nghiên cứu của Mohsen Zargar và cs (2010)

cho thấy, các dòng cây dừa cạn chuyển gen có hàm lượng alkaloid tăng đáng kể

so với các dòng cây không chuyển gen [69].

Các nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ ở cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A.

rhizogens cho thấy kiểu hình của cây chuyển gen thông qua A. rhizogens có sự

biểu hiện khác thường như gióng cây ngắn, lá nhăn và khối lượng rễ nhiều [34],

[65], [80] .

Năm 2010, Wang và cs đã chuyển gen G10H và ORCA3 (một nhân tố của

họ AP2) vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A. rhizogens MSU440. Phân tích

mức độ tích lũy alkaloid cho thấy rằng, tất cả các cây chuyển gen đều tích lũy

catharanthine nhiều hơn 6,5 lần so với các cây không chuyển gen và mức độ tích

lũy cao nhất ở các cây chuyển gen OG12. Sau khi xử lý với ABA, mức độ tích

lũy catharanthine đạt 1,96 mg g khối lượng khô ở cây chuyển gen OG12. Các

mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các TIA

trong các dòng cây chuyển gen và cây không chuyển gen cũng đã được phân tích

[113]. Năm 2012, Mei và cs đã sử dụng A. rhizogens A4 để tạo rễ tơ và cho thấy

nồng độ kanamycine phù hợp cho chuyển gen là 100 mg/l. Gen CrORCA3 được

biểu hiện mạnh bằng phương pháp nhuộm cytohistochemical đã được sử dụng để

chứng minh gen đã được chuyển vào tế bào rễ cây dừa cạn [68].

Gần đây, một vài nghiên cứu chuyển gen thông qua A. tumefaciens đã

được thực hiện ở cây dừa cạn bằng phương pháp biến nạp qua mô sẹo và các vật

liệu nhận gen khác của cây dừa cạn [92], [109]. Tuy nhiên, hệ thống chuyển gen

chưa được chứng minh thông qua các thí nghiệm phân tích Southern blot và sắc

ký lỏng cao áp HPLC. Để giải quyết vấn đề này, nghiên cứu của Wang và cs

(2012) đã phát triển hệ thống tái sinh và chuyển gen thành công vào cây dừa cạn

thông qua A. tumefaciens. Kết quả chuyển gen được chứng minh bằng các phân

tích sinh học phân tử, xác định được sự hoạt động của gen chuyển CrDAT trong

quá trình sinh tổng hợp các TIA và kiểm tra sự tăng tích lũy vindoline ở cây

chuyển gen bằng phân tích sắc ký lỏng HPLC [83].

Chuyển gen qua nuôi cấy dịch huyền phù tế bào được lây nhiễm bởi vi

khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu sâu hơn [30], [65], [106]. Nhưng các

dòng tế bào chuyển gen có sự tổng hợp alkaloid không ổn định và khả năng tích

lũy các TIA giảm dần qua các lần cấy chuyển [114]. Mohsen Zargar và cs (2010),

nghiên cứu chuyển gen vào rễ cây dừa cạn khi sử dụng lá mầm trên môi trường

MS cơ bản có bổ sung BAP và NAA. Sau 10 ngày ra rễ trên môi trường MS cơ

bản, rễ có chiều dài 8-9 cm và hình thái cây dừa cạn chuyển gen không có gì

khác so với cây không chuyển gen [69]. Alkaloid tạo ra được chiết suất và phân

tích bằng sắc ký lỏng (HPLC) đã xác định được hai loại alkaloid quan trọng là

vinblastine và vincristine.

Cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu chuyển gen thông qua

A.tumefaciens ở dừa cạn đã thu được kết quả đáng khích lệ. Verma và Mathur

(2011), đã chuyển gen uidA vào dừa cạn sử dụng vector chuyển gen pBI121 có

chứa gen gus và gen kháng kanamycine nptII. Hiệu quả chuyển gen cao nhất đạt

1,4 chồi mẫu biến nạp khi gây cảm ứng với lá trước 10 ngày. Các tác giả sử dụng

kỹ thuật PCR để chứng minh gen uidA đã được chuyển vào cây dừa cạn [111].

Năm 2012, Wang và cs đã đề xuất quy trình chuyển gen thông qua A.

tumefaciens EHA105 sử dụng gen chỉ thị gus. Trong nghiên cứu này, các tác giả

đã sử dụng vật liệu chuyển gen là lá mầm, nuôi cấy trên môi trường MS có chứa

AS 100 µM, thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút có bổ sung kanamycine [113]. Sau

khi chuyển thành công gen gus vào cây dừa cạn. Tác giả dựa trên quy trình đó và

đã chuyển gen CrDAT vào cây dừa cạn. Đây là báo cáo đầu tiên tính đến thời

điểm công bố chuyển gen qua A. tumefaciens ở cây dừa cạn. Quan trọng hơn,

việc chuyển thành công gen CrDAT vào cây dừa cạn đã khẳng định việc ứng

dụng kĩ thuật chuyển gen ở cây dừa cạn được phát triển hoàn thiện và nâng cao

tích lũy vindoline trong cây chuyển gen [113].

Các nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn hiện nay trên thế giới mới chỉ

công bố thành công ở mức độ nuôi cấy mô trong phòng thí nghiệm. Song các kết

quả nghiên cứu này đã khẳng định tính khả thi của hướng nghiên cứu tạo cây dừa

cạn chuyển gen nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine phục vụ

Ở Việt Nam nhiều tác giả cũng quan tâm nhiều đến giá trị dược học của cây

dừa cạn và đã có một số nghiên cứu tách chiết, xác định hàm lượng và thu nhận

alkaloid từ cây dừa cạn trong nuôi cấy in vitro. Năm 2006, với công trình của Bùi

Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng

thực vật và đường saccarozơ lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn

Catharanthus roseus [9]. Đào Hùng Cường và Lê Xuân Văn (2011) đã tiến hành

điều chế thuốc chữa trị ung thư hiệu quả.

nghiên cứu thành phần hóa học của cây dừa cạn bằng phương pháp tách chiết

alkaloid. Bằng việc sử dụng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ (LC – MS) đã xác

định được 2 alkaloid quan trọng là vinblastine và vincristine từ rễ cây dừa cạn hoa

màu hồng tím [2]. Tuy nhiên, cho đến nay ở nước ta chưa tìm thấy công trình nào

nghiên cứu nâng cao hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn bằng kỹ thuật chuyển gen.

Chƣơng 2. V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. V T LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Vật liệu thực vật

Hạt của giống dừa cạn màu hoa hồng tím (TN1) và màu hoa trắng (TN2)

được cung cấp bởi Trung tâm giống cây trồng tỉnh Thái Nguyên. Hai mẫu giống

dừa cạn TN1 và TN2 được sử dụng trong phân lập gen CrDAT; giống dừa cạn

hoa hồng tím TN1 được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen.

Giống thuốc lá Nicotinana tabacum K326 có nguồn gốc từ Viện kinh tế kỹ

thuật thuốc lá, do Phòng tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.

2.1.2. Chủng vi khuẩn và các loại vector

Các chủng vi khuẩn E. Coli (DH5α), chủng A. tumefaciens CV58 do

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.

Các loại vector tách dòng pBT, vector pCB-gusplus, vector pRTRA7/3,

vector chuyển gen pBI121 (Phụ lục 1) do Phòng Công nghệ ADN ứng dụng,

Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

cung cấp.

2.2. HÓA CHẤT, THI T BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

Hóa chất

Hóa chất tinh khiết sử dụng trong phân tích sinh học phân tử có nguồn gốc

từ các hãng Fermentas, Bio-Neer, Invitrogen, như Trizol Reagents, kít Maxima®

First Strand cDNA Synthesis, kít GenJET PCR Purification, kít Plasmid

Extraction, taq-polymerase, buffer PCR, EDTA, Tris, agarose, enzyme giới hạn

như BamHI, NotI, NcoI, HindIII, T4 ligase, kháng sinh kanamycine để chọn dòng

vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp, rifamycine, cefotaxime, carbenicillin là những

loại kháng sinh có tính kháng khuẩn được sử dụng để chống lại vi khuẩn nhiễm

vào mẫu biến nạp và một số hóa chất khác có nguồn gốc từ các hãng Fermentas,

Invitrogen, Sigma, Amersham và một số hãng khác.

Thang chuẩn 1 kb của hãng Guangzhou Genshun Biotech Ltd. Kháng thể

1 (anti-cmyc từ chuột), kháng thể 2 (anti-mouse-Ig, Horseradish peroxidase)

được đặt tổng hợp từ hãng GE Health UK Limited.

Thiết bị

Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac

300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy

chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy Vortex

(Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ),

máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser,… cùng một số các thiết bị khác phục

vụ cho nghiên cứu.

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án

Các thí nghiệm phân lập gen, chuyển gen được thực hiện tại Phòng công

nghệ gen và Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học,

Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Các thí nghiệm thiết kế vector

chuyển gen, phân tích cây chuyển gen được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng

điểm công nghệ gen, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng và Phòng công nghệ tế

bào thực vật thuộc Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

Luận án được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại&Giáo dục sinh

học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm trong đề tài luận án được tiến hành theo sơ đồ khái quát ở

hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

2.3.1. Các phƣơng pháp sinh học phân tử

2.3.1.1. Nghiên cứu thông tin về gen và thiết kế cặp mồi nhân gen

Dựa trên những thông tin về trình tự gen CrDAT của cây dừa cạn đã công

bố trên Ngân hàng gen quốc tế mang mã số AF053307 [95] cặp mồi đặc hiệu

DAT- NcoI/F DAT - NotI/R đã được thiết kế để khuếch đại đoạn mã hoá enzyme

DAT từ cDNA và dự kiến kích thước đoạn cDNA được nhân bản là 1320 bp. Cặp

mồi XbaI-DAT-F/cmyc-KDEL-SacI-R sử dụng cho PCR để kiểm tra cây chuyển

gen dự kiến có kích thước là 1383 bp (Bảng 2.1).

2.3.1.2. Phân lập gen

Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA

RNA tổng số được tách chiết bằng Trizol Reagent Kit. cDNA được tổng

hợp theo quy trình Maxima® First Strand cDNA Synthesis Kit và được tách chiết

theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Ký hiệu

Trình tự nucleotide (5’-3’)

Sản phẩm dự kiến (bp)

CATGCCATGGATGGAGTCAGGAAAAATATC

DAT-NcoI-F/

1320

DAT-NotI-R

TTGCGGCCGCATTAGAAACAAATTGAAGTA

CGTCTAGAATGGAGTCAGGAAAAATATCGG

XbaI-DAT-F/

1383

cmyc-KDEL-SacI-R

CCGAGCTCCTAGAGTTCGTCTTTGGAACC

Kỹ thuật PCR khuếch đại gen CrDAT

Gen CrDAT được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu.

Thành phần phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.2.

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR

STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)

PCR Master Mix 2X 12,5 1

DAT-NcoI 10pmol/ µl 1,0 2

DAT-NotI 10pmol/ µl 1,0 3

DNA hoặc cDNA khuôn 500ng/ µl 2,0 4

Nước khử ion - 8,5 5

Tổng thể tích 25

Phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt: 94o trong 4 phút, lặp lại 30

chu kỳ, trong mỗi chu kỳ nhiệt độ và thời gian của các giai đoạn là biến tính ở 94oC trong 1 phút, gắn mồi ở 58oC trong 1 phút, tổng hợp ở 72oC trong 1 phút 30 giây); ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 7 phút, bảo quản ở 4oC.

2.3.1.3. Tách dòng gen

Kỹ thuật tách dòng gen được thực hiện theo Sambrook và Russell (2001)

[87], gồm các bước tinh sạch gen, gắn đoạn DNA vào vector tách dòng pBT,

chọn các dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony - PCR, cắt

kiểm tra gen CrDAT trên plasmid tái tổ hợp.

Tinh sạch gen

Gen CrDAT được tinh sạch bằng bộ kít GenJET PCR Purification của

hãng Fermentas theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất.

Gắn đoạn CrDAT vào vector tách dòng pBT

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%; tinh sạch

sản phẩm PCR theo GenJET PCR Purification Kit và gắn vào vector tách dòng pBT để tạo plasmid tái tổ hợp mang gen CrDAT với điều kiện phản ứng 20oC

trong 3 giờ và thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen CrDAT vào vector tách dòng

STT

Thành phần

Nồng độ

Thể tích (µl)

T4 DNA Ligase Buffer

10X

2,0

T4 DNA Ligase

5 u/µl

1,0

CrDAT

100ng/ µl

pBT

100ng/ µl

3,0

Nước khử ion

2,0

Tổng

20

Biến nạp vector tách dòng vào tế bào khả biến E.coli DH5α

Sau khi tạo được vector tách dòng pBT thì biến nạp vào tế bào khả biến E.

coli DH5α bằng sốc nhiệt (42oC trong 1 phút 30 giây).

Sau khi sốc nhiệt bổ sung 200 - 300 µl LB lỏng để nuôi phục hồi ở 37oC,

nuôi lắc 200 rpm trong 2 giờ. Vi khuẩn mang vector tái tổ hợp được cấy chọn lọc

trên môi trường LB đặc bổ sung X-gal 30 mg/l, IPTG 100 µM, kháng sinh carbenicillin 50 mg l. Sau đó nuôi ở 37oC trong 16 giờ (Bảng 2.4).

Bảng 2.4. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Môi trƣờng Thành phần

LB lỏng Bacto pepton 10 g/l +NaCl 10 g/l + Yeast Extract 5 g/l, pH = 7

LB đặc LB lỏng + agar 10 g/l

Chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony - PCR

Chọn lọc những khuẩn lạc màu trắng có khả năng mang plasmid tái tổ hợp

gen CrDAT, hòa vào 5 µl nước khử ion, dùng dung dịch này để làm DNA khuôn

cho phản ứng colony - PCR. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu DAT-NcoI/DAT-NotI.

Thành phần phản ứng colony - PCR và chu kỳ nhiệt được thực hiện như phản

ứng PCR cơ bản đã được mô tả ở phần trên.

Plasmid tái tổ hợp được thu nhận bằng cách tách chiết theo phương pháp

tách dòng phân tử theo Sambrook và Russell (2001) [87].

Cắt kiểm tra gen CrDAT trên plasmid tái tổ hợp

Sử dụng enzyme giới hạn BamHI để xác định sự có mặt của gen CrDAT với thành phần, điều kiện phản ứng 37oC trong 4 giờ và thành phần phản ứng

được trình bày ở bảng 2.5. Sản phẩm được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel

agarose 0,8 %.

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt DNA bằng BamHI

STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)

1 BamHI Buffer 10X 1,0

2 BamHI 5 u/µl 1,0

3 Plasmid 200ng/ µl 5,0

4 Nước khử ion - 3,0

Tổng 10

Trình tự gen CrDAT được xác định trên thiết bị giải trình tự gen tự động

ABI Prism 3130 - Hoa Kỳ. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Tin sinh học, như

Blast trong NCBI, BioEdit và DNAStar.

2.3.2. Phƣơng pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen

CrDAT

Vector chuyển gen mang gen CrDAT được thiết kế theo hai bước cơ bản

(1) Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrDAT; (2) Gắn cấu trúc chứa gen

CrDAT vào vector chuyển gen thực vật pBI121. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen

mang cấu trúc chứa gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn được tóm tắt ở sơ đồ

hình 2.2.

2.3.2.1. Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrDAT

Xử lý vector tái tổ hợp pBT - CrDAT và vector pRTRA 7 3 bằng cặp

enzyme giới hạn NcoI/NotI tạo các đầu dính tương ứng với thành phần và điều

kiện phản ứng trình bày ở bảng 2.6. Dựa vào kích thước phân đoạn DNA, lựa

chọn và tinh sạch các băng điện di theo kít GenJET PCR Purification để thu nhận

các thành phần cần cho thiết kế vector gồm gen đích mang gen CrDAT và vector

trung gian pRTRA 7/3.

Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrDAT

Tiến hành phản ứng ghép nối gen CrDAT với vector pRTRA 7 3 đã mở

vòng sau khi tinh sạch, bổ sung T4 ligase xúc tác cho quá trình gắn nối nhằm tạo

được vector trung gian tái tổ hợp pRTRA 7 3 chứa cấu trúc mang gen chuyển

CrDAT (35S-DAT-cmyc-KDEL). Vector tái tổ hợp pRTRA 7 3 mang gen

chuyển CrDAT (pRTRA 7/3 – CrDAT) được đưa vào tế bào vi khuẩn E.coli

DH5α bằng biến nạp nhờ sốc nhiệt và chọn dòng tái tổ hợp bằng colony - PCR

với cặp mồi đặc hiệu DAT-NcoI/DAT-NotI.

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI/ NcoI

STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)

1 Orange Buffer 10X 2,0

2 NcoI 5 u/µl 2,0

3 NotI 5 u/µl 1,5

4 Plasmid 200ng/ µl 8,0

5 Nước khử ion - 6,5

Tổng 20

2.3.2.2. Gắn cấu trúc mang gen chuyển CrDAT vào vector chuyển gen pBI121

Xử lý vector pRTRA - CrDAT và pBI121 với enzyme giới hạn HindIII với

các thành phần được thể hiện ở bảng 2.7. Dựa vào kích thước các phân đoạn

DNA, lựa chọn và tinh sạch các băng điện di theo kít GenJET PCR Purification

để thu nhận thành phần cần thiết.

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII

STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)

Red Buffer 10X 2,0 1

HindIII 5 u/µl 2,0 2

Plasmid 200ng/ µl 10 3

6,0 Nước khử ion - 4

Tổng 20

Thực hiện phản ứng ghép nối cấu trúc mang gen CrDAT tinh sạch với

vector pBI121 đã mở vòng, bổ sung T4 DNA ligase xúc tác cho quá trình gắn nối

nhằm tạo được vector chuyển gen thực vật pBI121 mang cấu trúc gen CrDAT.

Vector tái tổ hợp pBI121 mang cấu trúc gen CrDAT được nhân dòng trong E.coli

DH5α bằng biến nạp nhờ sốc nhiệt và chọn dòng tái tổ hợp bằng colony - PCR

với cặp mồi đặc hiệu DAT-NcoI/DAT-NotI.

2.3.2.3. iến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens

Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens bằng cách làm mới giống trên môi

trường LB đặc. Nuôi cấy khuẩn lạc trong 2 ml môi trường LB lỏng ở 28oC trong

6 giờ. Lấy 100 l dung dịch vi khuẩn nuôi cấy tiếp ở 28oC qua đêm trong 100 ml

LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc đến khi OD600nm = 1 - 1,5. Làm lạnh

mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5000 vòng phút trong 20 phút để thu cặn tế bào. Rửa

cặn hai lần trong 10 ml HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2 -

ethanesulfonic acid) pH 7,0. Cặn tế bào hoà tan trong 500-700 l 10% glycerol.

Chia 45 l dịch tế bào vào mỗi ống eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và giữ

chủng ở -85oC.

Khi đã có được tế bào khả biến A. tumefaciens, tiến hành biến nạp vector

tái tổ hợp vào tế bào bằng phương pháp xung điện. Tế bào khả biến đặt trong đá

5 phút. Bổ sung 1µl vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và trộn nhẹ. Rửa cuvette

bằng cồn 100o, rửa lại bằng nước khử ion, khử trùng rồi thấm khô. Chuyển tất cả hỗn

hợp dịch A. tumefaciens và vector tái tổ hợp vào cuvette. Xung điện ở 2,5 kv, 25 μF

và điện trở 400 , sau đó đặt ngay vào trong đá, sau 5 phút bổ sung 500 μl LB

lỏng và đảo nhẹ. Chuyển sang ống eppendorft 2 ml, ủ ở 28oC trong 1 giờ trên

máy lắc. Chuyển 300 µl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh kanamycine 50

mg l và rifamycin 50 mg l. Ủ ở 28oC từ 24 - 48 giờ. Giữ chủng trong tủ lạnh và

dùng cho lây nhiễm trong chuyển gen.

2.3.3. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc lá

Phương pháp chuyển cấu trúc chứa gen CrDAT vào cây thuốc lá trong môi

trường tái sinh in vitro (Phụ lục 2-P2.1) được thực hiện theo Topping (1998), qua

các bước cơ bản sau [103].

Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp: Sử dụng cây con của giống thuốc lá K326 đã

phát triển được 2-3 lá thật có thể tiến hành các thí nghiệm cho phục vụ chuyển

gen. Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1cm2 và cảm ứng trên môi

trường tái sinh (MS + sucrose 30 g/l + agar 10 g/l + BAP 1 mg l) trong 48 giờ.

Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: A.tumefaciens mang vector chuyển gen chứa

CrDAT được nuôi chọn lọc trong 15 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng

sinh kanamycine 50 mg l và rifamycine 50 mg l ở 28oC lắc 200 rpm trong 48 giờ.

Lấy 10 ml dịch huyền phù tế bào trên vào 50 ml LB lỏng không kháng sinh để nuôi phục hồi ở 28oC lắc 200 rpm khi OD600nm= 0,8 là thích hợp cho biến nạp. Ly

tâm thu cặn tế bào, hòa tan cặn trong dung dịch ½ MS +AS 50 µl đặt trong nước

đá lạnh.

Biến nạp: Ngâm các mảnh lá đã đặt cảm ứng vào dịch huyền phù vi khuẩn có

OD600nm= 0,8 trong 10 phút, thấm khô và chuyển lên môi trường GM không chứa

kháng sinh để đồng nuôi cấy 2 ngày.

Tái sinh đa chồi: Thực hiện rửa khuẩn ngoại vi bằng cách ngâm các mảnh lá biến

nạp trong ½ MS + cefotaxim 400 mg l, 10 phút, thấm khô và chuyển lên môi

trường GM bổ sung kanamycine 50 mg/l và cefotaxim 400 mg/l.

Chọn lọc và kéo dài chồi: Sau 3 tuần các cụm chồi hình thành được cắt tách nhỏ và

chuyển sang môi trường MS có bổ sung kanamycin 50 mg l và cefotaxim 400 mg l.

Ra rễ: Sau 5 tuần các chồi phát triển cao khoảng 3 cm thì được cắt và chuyển

sang môi trường ra rễ RM có bổ sung kanamycin 50 mg l và cefotaxim 400 mg l.

Ra bầu và nhà lưới: Sau 4 tuần cây con ra rễ và phát triển hoàn chỉnh với 3-4 lá

thật sẵn sàng cho ra bầu trấu : cát (tỷ lệ 1:1). Cây phát triển với 5 lá thật thì

chuyển ra trồng trong nhà lưới.

2.3.4. Tái sinh và chuyển gen gus ở cây dừa cạn

2.3.4.1. Tái sinh cây dừa cạn in vitro

Khử trùng hạt

Hạt dừa cạn hoa màu hồng tím được rửa sạch dưới vòi nước, sau đó để ráo

nước. Hạt được đưa vào trong box cấy để khử trùng, bằng cách lắc trong ethanol

70o khoảng thời gian 1phút. Sau đó, tráng hạt 5 lần bằng nước cất khử trùng. Tiếp

tục lắc hạt trong dung dịch javen 60%, trong thời gian 15 phút. Tiếp theo, rửa

sạch hạt 10 - 15 lần bằng nước cất khử trùng. Sau khi khử trùng, cấy hạt lên môi

trường MS [71] có bổ sung sucrose 30 g/l, agar 10 g l, pH = 5,8. Thí nghiệm lặp

lại 3 lần và tính trung bình của 3 lần gieo hạt.

Sử dụng môi trường nền MS + đường 30 g l + agar 10 g/l + than hoạt

tính 1g/l + nước dừa 100ml l, bổ sung kích thích sinh trưởng BAP với nồng độ

0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg l và kết hợp giữa BAP (nồng độ tối ưu) và

IBA với nồng độ 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg l; 0,8 mg l để phân tích ảnh hưởng

của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi

bên sau 4, 8 tuần nuôi cấy và từ nách lá mầm sau 6, 8 tuần (Phụ lục 2-P 2.2).

Tái sinh đa chồi từ đoạn thân

Sử dụng đoạn thân dừa cạn có kích thước 1,0 - 1,5 cm mang mắt chồi

bên 6 - 8 tuần tuổi nuôi cấy in vitro. Gây tổn thương bằng dao chẻ dọc qua mắt

chồi bên và dùng đầu mũi dao châm vào mắt tạo chồi bên. Sau đó, ngâm trong

dung dịch MS bổ sung BAP 1,0 mg/l, IBA 0,6 mg/l trong 20 phút. Nuôi mô

lên môi trường BAP 1,0 mg/l + IBA 0,6 mg l + MS + đường sucrose 30 g/l +

agar 10 g l + nước dừa 100 ml l và để trong tối 2 ngày, cấy mẫu trên môi

trường tạo chồi tối ưu.

Tái sinh đa chồi từ nách lá mầm

Hạt dừa cạn nảy mầm trong môi trường GM sau 10 ngày tuổi, thu lá mầm.

Dùng dao tách lá mầm 10 ngày tuổi làm hai mảnh, sau đó sử dụng đầu kim nhọn

gây tổn thương vào phần nách lá mầm. Sau đó ngâm mẫu vào dung dịch MS có

bổ sung chất kích thích sinh trưởng.

Sự phát sinh và sinh trưởng của chồi được đánh giá đồng thời các chỉ tiêu

về số chồi mẫu, chiều cao chồi (cm), số lá chồi, chất lượng chồi. Chỉ tiêu chồi tốt

là lá xanh đậm, thân mập, số lượng chồi nhiều. Chồi trung bình là lá xanh nhạt,

thân bình thường, số chồi trung bình. Chồi kém là lá vàng, úa, thân gầy, số lượng

chồi ít. Mỗi công thức thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần đánh giá 30 mẫu. Các số

liệu được xử lí trên máy vi tính bằng chương trình Excel với trị số S [13].

Tái sinh tạo rễ: Những chồi tạo ra có từ 4 - 5 lá, được cấy chuyển sang môi

trường tạo rễ bổ sung chất kích thích sinh trưởng NAA, IBA với nồng độ 0,1

mg/l; 0,2 mg/l; 0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 1,0 mg l vào môi trường MS và ½ MS. Mỗi

công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 chồi, lặp lại 3 lần. Kết quả được

đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: tỷ lệ chồi ra rễ (%),

số rễ chồi, chất lượng rễ (rễ tốt: bề mặt rễ trơn nhẵn, dài; rễ trung bình: bề mặt rễ

trơn nhẵn, màu trắng; rễ kém: bề mặt rễ sùi, rễ xốp, màu trắng).

Ra cây trên giá thể: Chọn cây dừa cạn sau 8 tuần nuôi cấy có bộ rễ dài, khỏe, lá

xanh, đang thời kì sung sức để đưa ra môi trường tự nhiên. Tiêu chuẩn cây con:

kích thước trung bình cây khoảng 5 cm. Rễ dài khoảng 3 - 4 cm. Số lá đạt 8- 10 lá.

Phương pháp ra cây, trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên tiến

hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài bằng cách:

Đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên, không cho ánh sáng

chiếu trực tiếp vào bình nuôi cây. Thời gian này kéo dài khoảng 7 ngày, tăng dần

cường độ chiếu sáng vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thích nghi của

cây. Sau đó, các bình cây được mở nắp, đổ nước vào ngâm 15 phút, lắc nhẹ để

thạch rời ra khỏi rễ, dùng panh gắp nhẹ các cây ra khỏi bình không để dập nát.

Rửa sạch phần thạch và đường bám vào vì chúng thường là môi trường thích hợp

cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công. Sau đó, ngâm cây trong chậu

nước sạch để tránh hiện tượng mất nước rồi đem trồng vào giá thể. Các giá thể sử

dụng trong thí nghiệm bao gồm: đất thịt trung bình, đất thịt pha cát 2:1 và đất hỗn

hợp (đất thịt, đất phù sa, cát).

Chế độ chăm sóc cây con trên các giá thể, trong 2 - 3 ngày đầu tưới nước

sạch bằng cách phun sương 4 lần ngày (giữ độ ẩm giá thể khoảng 75% - 80%).

Sau đó, tưới nước bằng bình phun 2 - 3 lần/ngày. Sau khi cây sống, ra rễ mới, lá

mới có thể đưa ra ngoài nhà lưới.

Các công thức được bố trí với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 60 cây công

thức. Đánh giá kết quả sau khi ra cây 45 ngày. Theo dõi tỷ lệ cây sống, khả năng

sinh trưởng của cây (chiều cao cây, kích thước lá, màu sắc lá..).

2.3.4.2. Xây dựng quy trình chuyển gen thông qua chuyển gen gus

Môi trường tái sinh cây dừa cạn chuyển gen được thể hiện ở phụ lục 2-

P2.3. Sử dụng gen chỉ thị gus để xây dựng quy trình chuyển gen cho cây dừa cạn.

Thông qua chuyển gen gus, mật độ tế bào A. tumefaciens, nồng độ

acetosyringone, thời gian nhiễm khuẩn và nồng độ kanamycine được tối ưu làm

cơ sở cho chuyển gen đích vào cây dừa cạn.

Xác định mật độ tế bào A. tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn

Cấy trải A. tumefaciens cất giữ trong glycerol lên đĩa môi trường LB đặc

có bổ sung kanamycine 50 mg/l và rifamicine 50 mg/l, nuôi ở 28oC trong 48 giờ.

Sau đó, lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung

kháng sinh kanamycine và nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút ở 28oC trong 16 -

18 giờ. Lấy 1 ml dịch vi khuẩn nuôi hoạt hóa trong 10 ml LB lỏng ở tốc độ 220

vòng/phút ở 28oC trong 3 - 4 giờ. Lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy lần 2 ly

tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút, ở 4oC trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan

cặn với môi trường 1/2 MS và pha loãng cho tới mật độ tế bào vi khuẩn OD600nm

là 0,6; 0,8 và 1,0.

Lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên được ngâm trong dịch huyền phù

vi khuẩn có bổ sung AS 100 µM, trong 30 phút sau đó thấm khô, cấy trên môi

trường môi trường đồng nuôi cấy: MS + sucrose 30 g/l + agar 8 g/l + MES 3,9 g/l

+ muối B5 0,3 g/l + AS 100 µM. Nuôi trong tối 3 ngày ở 25oC.

Xác định nồng độ AS phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn

Các bước nghiên cứu được tiến hành giống như ở trên, chỉ khác là dung

dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens được bổ sung để dẫn dụ vi khuẩn với ba

nồng độ AS: 100 M, 150 M và 200 M.

Xác định thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở cây

dừa cạn

Làm các bước tương tự như trên, tuy nhiên lá mầm và đoạn thân được ngâm

trong dịch huyền phù vi khuẩn với thời gian là 10 phút, 20 phút và 30 phút.

Xác định nồng độ kanamycine (Km) thích hợp để chọn lọc chồi chuyển gen

Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Km đến khả năng sinh trưởng, phát

triển của chồi dừa cạn, các đoạn thân mang mắt tạo chồi bên (không chuyển gen)

đã được nuôi trên môi trường có bổ sung các nồng độ Km khác nhau là 0 mg l;

25 mg/l; 50 mg/l; 75 mg/l; 100 mg/l và 150 mg/l. Theo dõi tỷ lệ tạo chồi sau 2

tuần và tỷ lệ sống sót của chồi sau 4 tuần.

Tái sinh cây dừa cạn chuyển gen gus

Sau 4 tuần, chuyển các mẫu tạo chồi lên môi trường: MS + sucrose 30 g/l

+ agar 8 g/l + MES 0,59 g l + muối B5 3 g/l + BAP 0,5 mg l để kéo dài chồi.

Chồi đạt chiều cao 2 - 3cm được chuyển sang môi trường ra rễ (có bổ sung Km)

để tăng hiệu quả chọn lọc cây chuyển gen: MS + sucrose 30 g/l + agar 8 g/l +

BAP 0,5 mg/l + IBA 0,4 mg/l. Ra cây trong bầu và để trong nhà lưới.

Phân tích biểu hiện gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào để kiểm tra sự biểu

hiện bền vững gen gus trong cây dừa cạn chuyển gen theo phương pháp của

Jefferson và cs (1987) [51]. Các mẫu sau khi nhiễm khuẩn, sau 3 ngày nuôi tối

được nhuộm với dung dịch 5-bromo-4- chloro-3-indolyl glucuronide (X-gluc), để

8 - 12 giờ trong tối ở nhiệt độ 37oC. Sau đó rửa bằng cồn 70% ba lần và quan sát

dưới kính hiển vi, những vùng biểu hiện gen gus có màu xanh lam.

2.3.5. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây dừa cạn thông qua

A.tumefaciens

Thí nghiệm chuyển gen CrDAT vào cây dừa cạn được thực hiện theo sơ đồ

thí nghiệm ở hình 2.3.

Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây dừa cạn qua nách lá mầm

Biến nạp cấu trúc mang gen chuyển qua nách lá mầm

Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: Vi khuẩn được nuôi trong 15 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc Km 50 mg/l và rifamycine 50 mg l ở 28oC, 150 rpm,

48 giờ. Lấy 10 ml dịch huyền phù tế bào trên vào 50 ml LB lỏng không kháng sinh để nuôi phục hồi ở 28oC, 150 rpm đến khi OD600nm = 0,8 là đạt số lượng tế bào tối ưu để biến nạp. Ly tâm dịch tế bào ở 4oC, 5000 rpm trong 15 phút. Hòa tan tế bào

lắng tạo huyền phù vi khuẩn vào 40 ml dung dịch môi trường ½ MS để biến nạp.

Nách lá mầm hạt dừa cạn sau khi được tách đôi, gây tổn thương bằng mũi

kim nhọn được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có chứa kháng sinh chọn lọc

Km 50 mg l và rifamycine 50 mg l trong thời gian 30 phút.

Lây nhiễm và đồng nuôi cấy: Nách lá mầm dừa cạn được gây tổn thương bằng mũi

dao nhọn trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 20 phút. Sau thời gian

nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy đặc không bổ sung kháng sinh. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối ở 25oC trong 3 ngày.

Tái sinh cây dừa cạn chuyển gen: Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp

được rửa trong môi trường ½ MS có bổ sung 400 mg/l cefotaxim với thời gian là

10 phút. Thấm khô mẫu bằng giấy thấm khử trùng, cấy mẫu lên môi trường tái

sinh có bổ sung cefotaxim 400 mg/l và Km 50 mg l (lần 1). Khoảng 2 tuần sau,

mẫu được chuyển sang môi trường lần 2 có bổ sung cefotaxim 400 mg/l và Km

75 mg/l.

Kéo dài chồi: Sau 2-3 tuần các cụm chồi sống sót trên môi trường chọn lọc được

chuyển sang môi trường kéo dài chồi có bổ sung cefotaxim 400 mg/l và Km 50

mg/l.

Tạo rễ: Khi các chồi phát triển kéo dài có kích thước khoảng 3-4 cm được

chuyển sang môi trường tạo rễ có bổ sung cefotaxim 400 mg/l và Km 50 mg l để

tạo cây hoàn chỉnh.

Chuyển cây vào nhà lưới: Chọn những cây khỏe mạnh đưa ra bầu trấu hun:cát

(tỷ lệ 1:1). Khi những cây sống sót được đưa ra nhà lưới trồng để theo dõi sự sinh

trưởng của cây.

2.3.6. Phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen

2.3.6.1. Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong

cây chuyển gen

DNA của cây chuyển gen được tách chiết theo phương pháp của Murray

và cs (1980) [72]. Gen chuyển CrDAT trong cây chuyển gen được xác định bằng

phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu DAT-NcoI/DAT-NotI. DNA tổng số và sản

phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% và 1%.

2.3.6.2. Xác định sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT vào hệ gen của cây

chuyển gen

Xác định sự hợp nhất gen chuyển CrDAT vào hệ gen tế bào chủ của cây

thuốc lá và cây dừa cạn chuyển gen bằng Sothern blot được thực hiện theo mô tả

của Southern (1975) [91].

Tổng hợp mẫu dò: Tổng hợp DNA dò có đánh dấu huỳnh quang bằng PCR với

mồi ngẫu nhiên.

Ở cây thuốc lá sử dụng sản phẩm PCR nhân gen CrDAT tinh sạch để làm

khuôn cho phản ứng tổng hợp mẫu dò theo hướng dẫn của bộ Biotin DecaLabel

DNA Labeling Kit. Gen chuyển CrDAT được đánh dấu bằng biotin.

Ở cây dừa cạn chuyển gen tồn tại cả gen nội tại và gen chuyển, cho nên

trong tổng hợp mẫu dò sử dụng gen nptII kháng kháng sinh Km để đánh dấu.

Vector chuyển gen pBI121-CrDAT chứa trình tự kháng kháng sinh Km

(Neomycyn phosphotransferase II - nptII), vì thế tổng hợp mẫu dò từ trình tự gen

nptII kháng Km của vector chuyển gen. Nhân dòng trình tự gen nptII từ plasmid

pBI121-CrDAT mang gen nptII bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu nptII-

F/nptII-R có trình tự nucleotide là:

nptII-F: 5’-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3’

nptII-R: 5’-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3’

Mẫu PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm PCR tinh

sạch được sử dụng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp mẫu dò theo hướng dẫn của

bộ Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit. Gen nptII được đánh dấu bằng biotin.

DNA hệ gen cây chuyển gen được cắt bằng enzyme giới hạn SacI với

thành phần gồm 5 µl enzyme SacI (10 u/µl), 5 µl buffer 10X, DNA 200 ng/μl,

nước khử ion. Phản ứng ở 37oC để qua đêm. Điện di sản phẩm cắt DNA tổng số

trên gel agarose 1%, ở điện thế thấp trong thời gian là 6 giờ. Chuyển sản phẩm

cắt DNA lên màng cellulose (blotting). Sau đó màng lai được rửa với dung dịch

2X SSC và tiến hành lai với mẫu dò.

Màng lai được đưa vào khay nhựa chứa dung dịch tiền lai (6xSSC,

5xDenhardt’s buffer, 0,5% BSA, 50% deion formamide) và ủ trong 4 giờ ở 44oC

trong ống lai. Sau đó bỏ dung dịch tiền lai và chuyển màng sang khay chứa dung

dịch lai (60 µl/cm2), lai qua đêm ở 44°C. Rửa màng lai 2 lần trong dung dịch

SSC 2x + SDS 0,1% trong 10 phút ở nhiệt độ phòng và 2 lần trong dung dịch

SSC 0,1x + SDS 0,1% trong 30 phút ở 60oC. Đổ bỏ dung dịch, dùng giấy lọc làm

khô màng lai.

Hiển thị trên phim X quang và phân tích kết quả: Phức hợp enzyme

Streptavidin-AP có khả năng gắn bám đặc hiệu với gốc biotin trên mẫu dò. Ngoài

ra, enzyme Alkaline phosphatase có khả năng phân hủy BCIP-T (5-bromo-4-

chloro-3-indolyl phosphate, p-toluidine salt) thành hợp chất có màu tím đen. Nhờ

vậy có thể phát hiện mẫu dò gắn với đoạn DNA cần nghiên cứu trên màng lai.

Quy trình này được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit Biotin Chromogenic

Detection Kit (hãng Themosience).

2.3.6.3. Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp CrDAT trong cây

chuyển gen

Các cây chuyển gen dương tính với kết quả lai Southern được sử dụng cho

phân tích sự biểu hiện protein tái tổ hợp CrDAT bằng Western blot. Western blot

thực hiện với các bước cơ bản sau: (1) Tách chiết protein tổng số (nghiền 0,5 g lá

trong nitơ lỏng và hoà tan trong 1ml PBS + Tween 0,05%, ly tâm 13000 rpm, 15

phút); (2) Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide - SDS 10 %; (3)

Chuyển protein trên gel điện di lên màng lai nitrocellulose bằng máy Pierce G2

Fast Blotter (25V, 1,3 mA trong 20 phút); (4) Màng chứa kháng nguyên c-myc

được phủ bằng 5% sữa tách béo pha trong dung dịch PBS + Tween 0,05% trong

16 giờ; (5) Lai kháng thể 1 (ngâm màng trong 15 ml dung dịch PBS 5% sữa tách

béo có chứa kháng thể c-myc với độ pha loãng 700 lần, lắc trong 3 giờ ở nhiệt độ

phòng); (6) Lai kháng thể 2 (ngâm màng trong 15 ml dung dịch PBS + 5% sữa

tách béo có chứa kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (Horse Radish

Peroxidase) trong 2 giờ); (7) Hiện màu trong dung dịch có chứa cơ chất TMB

(3,3’,5,5’-tetramethyl benzidine) và hiển thị kết quả dưới ánh sáng thường [57].

2.3.6.4. Phân tích định lượng protein tái tổ hợp rCrDAT trong cây chuyển gen

bằng ELISA

Định lượng protein tái tổ hợp rCrDAT được tiến hành theo phương pháp

của Sun và cs (2006) [98]. Dịch chiết protein tổng số từ cây thuốc lá và từ cây

dừa cạn chuyển gen được pha loãng đến nồng độ 200 µg ml, lấy 100 µl mẫu tra

vào đĩa microplate, mỗi mẫu lặp lại 3 lần. Lượng protein tái tổ hợp được xác định

sử dụng kháng thể 1 kháng cmyc, kháng thể 2 là kháng thể kháng chuột IgG cộng

hợp HRP và cơ chất màu là dung dịch TMB. Kết quả đo màu ở bước sóng 630

nm cho phép xác định nồng độ protein tái tổ hợp gắn đuôi cmyc. Đối chứng

dương là protein scFv được pha loãng bằng dung dịch đệm. Dãy pha loãng

protein scFv gắn đuôi cmyc được tra vào giếng với lượng 25; 50; 100,0; 200,0;

400,0 ng giếng để gián tiếp dựng đường chuẩn định lượng. Phương trình tuyến

tính Y=0,0019X+0,0562 và hệ số tương quan R=0,9993.

2.3.6.5. Xác định hàm lượng alkaloid tổng số trong cây dừa cạn bằng phương

pháp phân tích khối lượng

Các dòng dừa cạn chuyển gen T1-1; T1-3; T1-6; T1-7 và các cây đối

chứng không chuyển gen (WT) được trồng trong cùng điều kiện tại Vườn thực

nghiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên. Các cây

đối chứng là những cây không chuyển gen in vitro ở thế hệ R1. Tái sinh in vitro

từ lá mầm hạt dừa cạn (thế hệ R0) đem trồng trong môi trường tự nhiên tại vườn,

thu hạt và tiếp tục gieo trồng được các cây ở thế hệ R1. Thí nghiệm trồng cây

chuyển gen và cây đối chứng được thực hiện song song trồng cùng một điều kiện

ánh sáng, độ ẩm, chế độ chăm sóc .... Mẫu lá, thân dừa cạn chuyển gen và cây đối

chứng được thu cùng một thời điểm để phân tích.

Mẫu dừa cạn sấy khô và được nghiền nhỏ thành dạng bột và trộn đồng

nhất, cân khoảng 2-5g mẫu đã đồng nhất cho vào bình nón 100ml, thêm khoảng

50 ml HCl 1%, lắc đều ngâm 2 giờ, ly tâm trong 30 phút. Gạn lấy dịch lọc, cho

vào phễu chiết 500ml. Phần cặn được chiết lặp lại với khoảng 50 ml HCl 1% .

Gộp dịch chiết, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac đậm đặc. Thêm khoảng 50ml

CHCl3, lắc đều trong khoảng 2 phút. Tách lấy lớp dung môi trên, lớp phía dưới

chiết lặp lại với khoảng 30ml CHCl3. Gộp dịch chiết, lọc qua natri sulfat khan

cho vào bình cô quay đã cân khối lượng trước đó, cô cạn bằng máy cất quay. Để

nguội trong bình hút ẩm, rồi cân bình cô quay và tính khối lượng alkaloid thu

được. Phân tích 3 lần song song không được lệch quá 5% so với giá trị trung

bình, nếu không phải thực hiện lại.

Hàm lượng alkaloid tổng (g 100g khối lương khô) = [(A-B) x 100]/S

A: khối lượng bình cô quay khi có mẫu (g)

B: khối lượng bình cô quay trước khi có mẫu (g)

S: khối lượng mẫu thí nghiệm (g khối lượng khô)

2.3.7. Phƣơng pháp tính hiệu suất chuyển gen

Phương pháp tính hiệu suất chuyển gen được tính bằng số dòng cây dương

tính với PCR, hoặc dương tính với Southern blot, hoặc với Western blot trong tổng

số mẫu biến nạp theo công thức sau:

Số cây dương tính

Hiệu suất chuyển gen = X 100%

Tổng số mẫu biến nạp

2.3.8. Các phƣơng pháp phân tích, xử lý số liệu

Các số liệu trong nghiên cứu được xử lý thống kê bằng chương trình Excel

theo Chu Hoàng Mậu (2008), xác định giá trị trung bình, phương sai, độ lệch

chuẩn, sai số trung bình mẫu [13].

Chƣơng 3. K T QUẢ VÀ THẢO LU N

3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN CrDAT PHÂN L P TỪ CÂY DỪA CẠN

3.1.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen CrDAT

3.1.1.1. ết qu khuếch đại và tách d ng cDNA

Dựa trên những thông tin về trình tự gen DAT của cây dừa cạn đã công bố

trên Ngân hàng gen mang mã số AF053307 [95], cặp mồi PCR DAT-NcoI-

F/DATR-NotI-R (có trình tự nucleotide thể hiện ở bảng 2.1) được thiết kế để

nhân bản gen CrDAT từ mRNA, dự kiến kích thước cDNA được khuếch đại là

1320 bp.

RNA tổng số được tách chiết từ lá cây dừa cạn hoa hồng tím (TN1), dừa

cạn hoa trắng (TN2) và cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số bằng phản ứng

phiên mã ngược. Phản ứng PCR khuếch đại cDNA của gen CrDAT với cặp mồi

đã thiết kế DAT-NcoI-F/DAT-NotI-R. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện

di trên gel agarose 1% cùng với thang DNA 1 kb được thể hiện ở hình 3.1.

Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT. A: Sản phẩm

PCR nhân gen CrDAT (cDNA) từ hai mẫu dừa cạn TN1 và TN2. M: thang DNA 1

kb; 1,2: gen CrDAT (cDNA) khuếch đại từ mẫu TN1; 3,4: gen CrDAT (cDNA)

khuếch đại từ mẫu TN2). B: Sản phẩm colony-PCR từ 12 dòng khuẩn lạc. 1-6:

đoạn gen CrDAT (cDNA) khuếch đại từ khuẩn lạc của mẫu TN2; 7-12: đoạn gen

CrDAT (cDNA) khuếch đại từ khuẩn lạc của mẫu TN1.

Kết quả thu được ở hình 3.1A cho thấy, mẫu dừa cạn TN1 và TN2 cho sản

phẩm PCR với một băng DNA với kích thước ước tính khoảng 1,3 kb. Các băng

đều sáng, rõ nét và không có sản phẩm phụ. Kích thước này phù hợp theo tính

toán lý thuyết và tương ứng với kích thước của đoạn mã hoá của gen CrDAT ở

dừa cạn mang mã số AF053307 trên Ngân hàng gen. Tuy nhiên, để khẳng định

chính xác sản phẩm PCR thu được là gen CrDAT của cây dừa cạn chúng tôi đã

tiến hành tách dòng, xác định trình tự nucleotide và so sánh với trình tự gen DAT

của dừa cạn mang mã số AF053307 trên Ngân hàng gen quốc tế.

Sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng

pBT, tạo vector tái tổ hợp pBT-CrDAT và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli

DH5α. Tiến hành chọn dòng các khuẩn lạc màu trắng và chọn ngẫu nhiên 12

dòng khuẩn lạc trắng cho phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu DAT-NcoI-

F/DAT-NotI-R. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR ở hình 3.1B cho

thấy, băng DNA có kích thước khoảng 1,3 kb xuất hiện ở tất cả các làn điện di 7,

8, 9, 10, 11, 12 của các dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen CrDAT từ mẫu TN1; băng

DNA xuất hiện ở các làn điện di số 1, 2, 4, 5 đối với các dòng khuẩn lạc chứa

đoạn gen CrDAT từ mẫu TN2; Kích thước của đoạn DNA tương ứng kích thước

của gen DAT của cây dừa cạn theo tính toán lý thuyết.

Các khuẩn lạc màu trắng dương tính với phản ứng với colony-PCR được

sử dụng tách chiết plasmid và các plasmid tái tổ hợp được đem giải trình tự

nucleotide.

3.1.1.2. Xác định trình tự gen CrDAT

Kết quả giải trình tự nucleotide của đoạn cDNA phân lập từ hai mẫu dừa

cạn TN1 và TN2 đều cho kích thước 1320 bp (Hình 3.2). Phân tích bằng BLAST

trong NCBI cho thấy trình tự nucleotide của đoạn cDNA phân lập từ hai mẫu dừa

cạn TN1 và TN2 là đoạn gen DAT của cây dừa cạn. Trình tự gen CrDAT của hai

mẫu dừa cạn TN1, TN2 thu được so với trình tự gen DAT mang mã số AF053307

trên Ngân hàng gen NCBI cho thấy, đoạn mã hóa của gen CrDAT có độ tương

đồng cao. Gen CrDAT phân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1 và TN2 có độ tương

đồng so với trình tự gen DAT mang mã số AF053307 là 99,5% và 99%. Như vậy

có thể kết luận rằng, gen CrDAT phân lập từ mẫu dừa cạn TN1 và TN2 đã được

tách dòng thành công. Trình tự nucleoitde của gen CrDAT phân lập từ hai mẫu

dừa cạn TN1, TN2 đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen quốc tế với mã số

LN809930 và LN809931.

3.1.2. So sánh trình tự nucleotite của gen CrDAT

Trình tự nucleotide của mẫu dừa cạn TN1 có sự sai khác so với trình tự

mang mã số AF053307 ở 6 vị trí nucleotide (1281, 1282, 1283, 1284, 1286, 1287).

Gen CrDAT của mẫu dừa cạn TN2 có sự sai khác so với trình tự mang mã số

AF053307 ở 7 vị trí nucleotide (482, 493, 500, 503, 505, 519, 566). Trình tự

nucleotide của gen CrDAT ở hai mẫu dừa cạn TN1 và TN2 khác nhau ở 13

nucleotide (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide của

gen CrDAT

Vị trí 482 493 500 503 505 519 566 1281 1282 1283 1284 1286 1287

AF053307 C A C C T G C T G A G A G

TN1 C A C C T G C G A G A G A

TN2 G T T T G T G T G A G A G

Hình 3.2. Trình tự nucleotide của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn mẫu TN1,

TN2 và trình tự mang mã số AF053307 trên Ngân hàng gen quốc tế.

Tiếp tục phân tích, so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự nucleotite

của hai mẫu dừa cạn TN1, TN2 với protein mang mã số AAC99311 trên Ngân

hàng Gen (protein suy diễn từ gen CrDAT mang mã số AF053307), kết quả được

thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3.3. Trình tự amino acid suy diễn của gen CrDAT từ hai mẫu dừa cạn TN1,

TN2 và của protein mang mã số AAC99311 trên Ngân hàng Gen.

Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của protein DAT ở hai mẫu

dừa cạn TN1, TN2 và protein DAT mang mã số AAC99311 trên Ngân hàng Gen

(protein suy diễn từ gen CrDAT mang mã số AF053307) (Hình 3.3) cho thấy

protein DAT gồm 439 amino acid và có độ tương đồng cao. So với protein mang

mã số AAC99311 trên Ngân hàng gen thì trình tự amino acid suy diễn của mẫu

TN1 có độ tương đồng 99,3 %, của mẫu TN2 có độ tương đồng 99,4 %. Trình tự

amino acid suy diễn của hai mẫu TN1 và TN2 tương đồng là 97,7 %. Tuy nhiên,

các trình tự amnio acid của protein DAT cũng có sự khác nhau ở 10 vị trí amino

acid (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn của protein DAT ở

mẫu dừa cạn TN1, TN2 và protein mang mã số AAC99311 trên Ngân hàng Gen.

Vị trí 161 165 167 168 169 173 189 427 428 429

AAC99311 A T A S F W P F E K

T A S F W P L R R A TN1

S V L V C R F E K G TN2

Bảng 3.2 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn của mẫu TN1 khác với

DAT mang mã số AAC99311 ở 3 amino acid (427, 428, 429), còn trình tự amino

acid suy diễn của mẫu TN2 khác với DAT mang mã số AAC99311 ở 7 amino

acid (161, 165, 167, 168, 169, 173, 189).

Deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase là enzyme thành viên của họ

transferase có chức năng xúc tác ở khâu cuối cùng trong sinh tổng hợp vindoline.

Motif HXXXD có thể là một phần trong vị trí hoạt động của enzyme này. Vùng

transferase của DAT có 427 amino acid, từ amino acid thứ 8 đến 434 [95]. Cây

dừa cạn gồm ba giống khác nhau, giống dừa cạn hoa hồng tím, dừa cạn hoa trắng

và dừa cạn hoa trắng đỏ. Marfori và Alejar (1993), đã phân tích sự thay đổi hàm

lượng alkaloid trong mô sẹo có nguồn gốc từ lá, rễ và hoa của mẫu dừa cạn hoa

hồng tím và mẫu hoa trắng đưa ra nhận xét rằng, hàm lượng alkaloid phụ thuộc

vào nguồn gốc mô sẹo từ lá, rễ hay hoa và hàm lượng alkaloid ở mô sẹo có

nguồn gốc từ rễ của mẫu dừa cạn hoa hồng tím cao hơn ở mẫu hoa trắng [66].

Protein DAT của mẫu dừa cạn TN1 và TN2 khác nhau ở 10 amino acid trong

vùng transferase, sự khác nhau này có liên quan gì đến tổng hợp alkaloid và sự

khác nhau về hàm lượng alkaloid giữa mẫu hoa hồng tím và mẫu hoa trắng là vấn

đề cần tiếp tục nghiên cứu để làm sáng tỏ.

3.2. THI T K VECTOR CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN CrDAT TRÊN

CÂY THUỐC LÁ

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT

3.2.1.1. Tạo vector mang cấu trúc chứa gen đích CrDAT

Thu nhận gen CrDAT từ vector tách dòng tái tổ hợp pBT-CrDAT

Gen CrDAT của cây dừa cạn màu hoa hồng tím đã được tách dòng trong

vector pBT (pBT-CrDAT) được cắt bằng cặp enzyme giới hạn là NcoI/ NotI. Kết

quả tạo hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 1,3 kb và 2,7 kb. Trong đó

phân đoạn DNA 1,3 kb chính là gen CrDAT cần thu nhận. Hình 3.4 thể hiện sản

phẩm DNA tinh sạch có kích thước khoảng 1,3 kb tương ứng với kích thước gen

CrDAT sau khi cắt vector pBT tái tổ hợp bởi cặp enzyme giới hạn là NcoI/ NotI .

Đoạn DNA này được dùng để phát triển vector chuyển gen ở các bước tiếp theo.

Tạo vector tái tổ hợp chứa cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL

Vector trung gian pRTRA7 3 được dùng để cung cấp các thành phần cần

thiết cho việc biểu hiện và kiểm tra hoạt động của gen đích CrDAT trong tế bào

thực vật như: CaMV35S là promotor mạnh phân lập từ virus gây khảm súp lơ, có

thể khởi động phiên mã gen chuyển ở tất cả các tế bào và mô trên cơ thể thực vật.

Vector pRTRA 7 3 còn cung cấp trình tự chuỗi peptit kháng nguyên cmyc để có

thể dễ dàng xác định sự có mặt của sản phẩm protein đích khi dùng kháng thể

tương ứng bằng Western blot hoặc ELISA.

Sau khi cắt mở vòng được vector pRTRA7 3 bằng sử dụng cặp enzyme

giới hạn NcoI/NotI thu được hai phân đoạn DNA với kích thước tính toán khoảng

0,9 kb (là đoạn 2SP và antiABA) và 3,3 kb (kích thước của vector pRTRA7 3),

trong đó phân đoạn 3,3 kb chính là của pRTRA7 3 đã mở vòng.

Hình 3.4. Kết quả cắt vector tách dòng tái tổ hợp pBT-CrDAT với cặp enzyme

giới hạn NcoI và NotI. A: Sơ đồ mô tả cắt vector tách dòng tái tổ hợp pBT-

CrDAT tạo gen CrDAT; B: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt pBT-CrDAT;

M: DNA 1 kb; 1: pBT-CrDAT đã cắt; 2: pBT-CrDAT chưa cắt.

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt ở hình 3.5 đúng như tính toán. Phân

đoạn có kích thước 3,3 kb được tinh sạch để thu nhận cấu trúc mở vòng của

pRTRA7/3 (Hình 3.5).

Hình 3.5. Kết quả cắt mở vòng vector pRTRA7 3. A. Sơ đồ cắt vector pRTRA7 3 bằng cặp enzyme NotI/NcoI. B: Kết quả cắt pRTRA7 3; M: DNA 1 kb; 1: pRTRA7 3 chưa cắt; 2: pRTRA7 3 đã cắt) C- Sản phẩm tinh sạch vector pRTRA7/3: M- Thang DNA 1kb; 1- Vector pRTRA7 3 tinh sạch.

Tiến hành phản ứng gắn gen CrDAT vào vector pRTRA7 3 đã mở vòng

nhờ DNA T4 ligase tạo ra cấu trúc tái tổ hợp pRTRA7 3 – CrDAT chứa cấu trúc

35S-CrDAT-cmyc-KDEL (Hình 3.6A). Vector pRTRA7/3 – CrDAT được biến

nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và chọn dòng bằng phản ứng colony – PCR

với cặp mồi đặc hiệu CrDAT-NcoI/CrDAT-NotI. Kết quả điện di kiểm tra cho

thấy, cả 5 dòng khuẩn lạc xuất hiện một băng DNA đặc hiệu khoảng 1,3 kb tương

ứng với kích thước của gen CrDAT (Hình 3.6B). Như vậy cả 6 dòng vi khuẩn

chọn lọc đều mang plasmid tái tổ hợp chứa gen CrDAT. Plasmid tái tổ hợp

pRTRA7/3-DAT được sử dụng để thu nhận cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL

phục vụ thiết kế vector chuyển gen thực vật.

Hình 3.6. Kết quả tạo vector tái tổ hợp pRTRA7 3-CrDAT. A: Sơ đồ tạo vector

pRTRA7/3-CrDAT. B: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm clony-PCR các dòng

khuẩn lạc chứa pRTRA7 3-CrDAT. M: thang DNA 1kb; 1-6: Các dòng khuẩn lạc.

Thu nhận cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL-polyA, cắt mở vòng pBI121 và tạo

vector chuyển gen pBI121-CrDAT

Sau khi tạo được cấu trúc gen CrDAT đầy đủ các thành phần cần thiết cho

biểu hiện và kiểm tra hoạt động của gen trong vector trung gian pRTRA7/3-

CrDAT. Sử dụng enzyme giới hạn HindIII xử lý vector pRTRA7 3-CrDAT để thu

nhận cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL-polyA.

3.2.1.2. Tạo vector chuyển gen và chọn d ng A.tumefaciens tái tổ hợp chứa

vector chuyển gen pBI121-CrDAT

Sử dụng enzyme giới hạn HindIII mở vòng vector chuyển gen pBI121.

Gắn cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL-polyA vào vector chuyển gen pBI121

bằng DNA T4 ligase tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen chuyển

CrDAT (pBI121-CrDAT) (Hình 3.7A). Sản phẩm tái tổ hợp pBI121-CrDAT được

biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Vi khuẩn sau khi biến nạp được nuôi

trên môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc Km (mg/l).

Hình 3.7. Kết quả tạo vector chuyển gen pBI121- CrDAT. A- Sơ đồ tạo cấu trúc

vector chuyển gen pBI121-CrDAT. LB: bờ trái của T-DNA; RB: bờ phải của T-

DNA; nptII: gen kháng Km; 35S: promoter CaMV35S. B- Kết quả điện di kiểm

tra sản phẩm colony-PCR các dòng khuẩn lạc E.coli DH5. M: thang DNA 1 kb;

1-8: kết quả điện di sản phẩm colony-PCR từ 8 dòng khuẩn lạc.

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony - PCR ở hình 3.7B cho thấy 2

dòng khuẩn lạc (làn điện di số 1,5) âm tính, không xuất hiện băng đặc hiệu, có thể

do chứa plasmid pBI121 tự đóng vòng, kháng được Km nhưng không mang cấu

trúc gen CrDAT. Các dòng dương tính với colony - PCR (làn điện di số 2, 3, 4, 6,

7, 8) xuất hiện băng đặc hiệu khoảng 1,3 kb, chứa plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc

gen CrDAT. Những dòng khuẩn lạc dương tính được nuôi trong LB lỏng bổ sung

kháng sinh chọn lọc Km để nhân dòng vector tái tổ hợp.

Chọn dòng A. tumefaciens tái tổ hợp mang vector chuyển gen pBI121-CrDAT

Plasmid tái tổ hợp pBI121-35S-CrDAT-cmyc-KDEL được tách chiết,

kiểm tra và biến nạp vào A. tumefaciens. Cấu trúc vector chuyển gen pBI121 –

CrDAT bao gồm các thành phần chính được thể hiện ở hình 3.8A. Các dòng A.

tumefaciens tái tổ hợp chứa vector chuyển gen pBI121-35S-DAT-cmyc được

kiểm tra bằng colony - PCR và kết quả phân tích ngẫu nhiên 10 dòng khuẩn lạc

thu được 8 dòng dương tính với colony-PCR (Hình 3.8B). Các dòng

A.tumefaciens tái tổ hợp chứa vector chuyển gen pBI121-CrDAT được lưu giữ và

sử dụng cho các thí nghiệm chuyển gen tiếp theo.

Hình 3.8. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT và kết quả điện di

kiểm tra sản phẩm colony-PCR. A: Cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT.

LB: bờ trái của T-DNA; RB: bờ phải của T-DNA; nptII: gen kháng kanamycine;

35S: promoter CaMV35S. B: Kết quả kiểm tra sản phẩm colony-PCR các dòng

A. tumefaciens chứa vector chuyển gen pBI121-CrDAT.

3.2.2. Phân tích biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá chuyển gen

3.2.2.1. iến nạp cấu trúc chứa gen CrDAT và tạo cây thuốc lá chuyển gen

nhờ A.tumefacinens

Các mảnh lá cây thuốc lá giống K326 có kích thước khoảng 1cm2 được

sử dụng làm vật liệu nhận gen. Thí nghiệm chuyển gen CrDAT vào thuốc lá

được trình bày ở hình 3.9.

Hình 3.9. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp, chọn lọc và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen. A: Mảnh lá sau khi rửa khuẩn được cấy trên môi trường chọn lọc; B, C: Tái sinh đa chồi; D: Kéo dài chồi; E: Tạo rễ; G: Ra cây trong bầu ở điều kiện nhà lưới.

Sau khi ngâm mảnh lá trong dung dịch chứa khuẩn A. tumefaciens CV58

tái tổ hợp mang cấu trúc chứa gen CrDAT trong 30 phút, thấm khô mảnh lá và

nuôi tiếp trên môi trường MS. Sau ba ngày đồng nuôi cấy trong tối trên môi

trường MS, rửa khuẩn bằng kháng sinh cefotaxim và được chuyển sang môi

trường MS có bổ sung kháng sinh cefotaxim, Km và BAP 1 mg/l (Hình 3.9A).

Sau 2-3 tuần từ các mảnh lá xuất hiện các chồi nhỏ (Hình 3.9B,C). Các chồi nhỏ

được tách từ các mảnh lá và cấy lên môi trường MS bổ sung kháng sinh (Hình

3.9D), các chồi được cấy chuyển sang môi trường MS để cho ra rễ (Hình 3.9E).

Các cây thuốc lá sau khi ra rễ trên môi trường có kháng sinh chọn lọc được

chuyển trực tiếp ra bầu chứa giá thể ra cây trong nhà lưới (Hình 3.9G). Kết quả

biến nạp gen và tái sinh cây thuốc lá chuyển gen được trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc lá

Đối chứng và thí nghiệm Số cây ra bầu

Tổng số mảnh lá Số cây trồng trong nhà lƣới

Số mảnh lá sống sót sau 4 tuần 0 Số mảnh lá cảm ứng tạo chồi 0 Số cây ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc 0 30 0 0

ĐC0* ĐC1* 30 30 40 25 15 15

Lần 1 82 79 68 55 34 22 Thí Lần 2 90 86 74 61 44 25 nghiệm Lần 3 77 70 63 52 35 18

65 Tổng 249 235 205 186 113

Ghi chú: ĐC0*: các mẫu thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1*: các mẫu thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh.

Bảng 3.3 cho thấy, sau 3 lần biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào các

mảnh thuốc lá. Kết quả có 235 249 mảnh lá sống sót sau 4 tuần, phát sinh 205

chồi và thu được 186 cây con in vitro sống sót trên môi trường MS có bổ sung

kháng sinh. Số cây ra bầu đất là 113 cây và có 65 cây trồng tại nhà lưới có biểu

hiện xanh tốt, mập mạp. Trong khi đó, ở ĐC0* trong 30 mảnh lá không có mẫu

nào sống sót; còn ở ĐC1* thuốc lá không chuyển gen được cấy lên môi trường

tái sinh không bổ sung kháng sinh thu được 30 cây sống, số cây ra bầu đất là 15

cây và đem trồng ở nhà lưới.

3.2.2.2. Phân tích sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong hệ

gen cây thuốc lá

Xác định sự có mặt của gen chuyển CrDAT trong hệ gen cây thuốc lá bằng PCR

Các dòng cây thuốc lá chuyển gen T0 sau khi trồng trong nhà lưới được 4

tuần thì tiến hành thu lá để thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen

chuyển CrDAT. Thu lá của 19 cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 có sự sinh

trưởng và phát triển bình thường (ký hiệu từ T0-1 đến T0-19) đem tách chiết

DNA tổng số và tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu CrDATF-

Xba/CrDATR-Sac. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%

được thể hiện ở hình 3.10.

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen CrDAT trong các cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng. Từ 1 đến 19: các dòng cây thuốc lá chuyển gen; M: thang DNA 1 kb; wt: cây thuốc lá không chuyển gen.

Hình 3.10 cho thấy, trong 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen thì có 12 dòng

cây thuốc lá chuyển gen dương tính với phản ứng PCR là các dòng T0-1, T0-2,

T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15, T0-16, T0-17, T0-19 (các dòng ở

làn điện di số 1, 2, 4, 5, 6, 8, 12, 13, 15, 16, 17, 19); còn 7 dòng T0-3, T07, T0-9,

T0-10, T0-11, T0-14, T0-18 (các dòng ở làn điện di số 3, 7, 9, 10, 11, 14, 18)

không xuất hiện băng DNA. Băng điện di sản phẩm PCR thu được có kích thước

khoảng 1,3 kb phù hợp với kích thước của gen chuyển CrDAT. Như vậy bước

đầu có thể nhận xét rằng, cấu trúc mang gen chuyển CrDAT đã được chuyển vào

cây thuốc lá giống K326 và tạo được các dòng cây thuốc lá chuyển gen T0.

Xác định sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT vào hệ gen cây thuốc lá bằng

Southern blot

Để khẳng định gen chuyển CrDAT đã được hợp nhất vào hệ gen cây thuốc

lá, DNA của 9 cây thuốc lá chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-

12, T0-13, T0-15) cho kết quả PCR dương tính được lựa chọn ngẫu nhiên để sử

dụng phân tích bằng Southern blot. Sử dụng emzyme giới hạn SacI cắt DNA tổng

số của 9 dòng cây thuốc lá chuyển gen và kết quả phân tích Southern blot được

thể hiện ở hình 3.11.

Hình 3.11. Kết quả phân tích Southern blot các dòng thuốc lá chuyển gen

CrDAT. M: Marker 1kbplus, (+) Plasmid pBI121- CrDAT cắt bởi SacI, 1-15: các

cây chuyển gen T0 (1: T0-1 ; 2 : T0-2 ; 4 : T0-4 ; 5 : T0-5 ; 6 : T0-6 ; 8 : T0-8 ;

12 : T0-12 ; 13 : T0-13; 15 : T0-15), WT: cây đối chứng không chuyển gen.

Hình 3.11 cho thấy, tất cả 9 dòng thuốc lá chuyển gen cho kết quả lai

Southern (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15), trong đó

hai dòng T0-5 và T0-15 cho 2 băng DNA (2 bản copy), bảy dòng còn lại đều có

một băng DNA ở các kích thước khác nhau. Bảy dòng thuốc lá chuyển gen (T0-

1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13) cho kết quả lai Southern có một bản

copy được sử dụng phân tích Western blot.

3.2.2.3. Phân tích sự biểu hiện protein CrDAT tái tổ hợp trên cây thuốc lá

chuyển gen

Protein tổng số của 7 dòng thuốc lá chuyển gen T0-1, T0-2, T0-4, T0-6,

T0-8, T0-12, T0-13 xuất hiện 1 băng DNA từ kết quả lai Southern được phân tích

điện di SDS-PAGE và chuyển các phân đoạn protein lên màng nitrocellulose và

thực hiện phản ứng lai Western. Protein CrDAT tái tổ hợp trong mẫu protein

chiết từ các cây thuốc lá chuyển gen được phát hiện nhờ phản ứng hiện màu bằng

cơ chất TMB (3,3′; 5,5′-Tetramethylbenzidine). Kết quả phân tích sự biểu hiện

protein tái tổ hợp CrDAT ở 7 dòng cây thuốc lá chuyển gen T0-1, T0-2, T0-4,

T0-6, T0-8, T0-12, T0-13 có phản ứng dương tính với lai Southern bằng Western

blot được thể hiện ở hình 3.12.

Hình 3.12. Kết quả phân tích Western blot các dòng cây thuốc lá chuyển gen

CrDAT. M: thang protein chuẩn ; (+) đối chứng dương ; T0-1, T0-2, T0-4, T0-6,

T0-8, T0-12, T0-13: các cây chuyển gen; WT: cây đối chứng không chuyển gen.

Hình 3.12 cho thấy, trên màng lai nitrocellulose xuất hiện băng màu ở vị

trí kích thước khoảng 51 kDa ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen T0-1, T0-2,

T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, còn cây thuốc lá không chuyển gen (WT) không

xuất hiện băng protein. Kết quả cho thấy, 7 dòng cây thuốc lá chuyển gen đều có

protein tái tổ hợp mang đuôi c-myc nên xảy ra phản ứng tạo màu của enzyme

trên kháng thể với cơ chất. Làn chạy điện di protein của cây thuốc lá không

chuyển gen do không có protein gắn đuôi c-myc nên không xảy ra phản ứng tạo

màu. Như vậy có thể thấy gen CrDAT đã được biểu hiện và protein tái tổ hợp

CrDAT được tổng hợp ở các dòng cây thuốc lá Nicotinana tabacum K326.

Kết quả phân tích PCR, Southern blot và Western blot các dòng cây thuốc

lá chuyển gen CrDAT ở thế hệ T0 đã chứng minh gen chuyển CrDAT đã hợp

nhất vào hệ gen của cây thuốc lá được chuyển gen và gen chuyển CrDAT hoạt

động phiên mã và dịch mã cho kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp CrDAT.

3.2.3. Thảo luận kết quả thiết kế và đánh giá hoạt động của vector chuyển

gen pBI121-CrDAT

Vector pBI121-CrDAT được thiết kế chứa cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-

KDEL-polyA, gen nptII kháng Km và một số thành phần khác. Tập hợp các

thành phần trong cấu trúc nằm giữa bờ trái (Left Border-LB) và bờ phải (Righ

Border-RB) của vector thiết kế bảo đảm cho gen đích hoạt động và dễ dàng sàng

lọc thể tái tổ hợp được gọi là cấu trúc gen chuyển hoàn chỉnh (cassettle).

Promoter 35S, một promoter mạnh được phân lập từ virus gây bệnh khảm lá súp

lơ (Cauliflower Mosaic Virus - CaMV). CaMV35S là promoter mạnh có thể khởi

động phiên mã cho gen trong tất cả các loại mô bào thực vật ở các giai đoạn sinh

trưởng và phát triển. Trong nghiên cứu này, khi thiết kế vector chuyển gen

pBI121, promoter CaMV35S đã được sử dụng hướng đến việc khởi động phiên

mã của gen chuyển CrDAT nhằm tăng cường sinh tổng hợp vindoline ở cây dừa

cạn. Một số nghiên cứu gần đây về chuyển gen ở thực vật đã sử dụng promoter

CaMV35S trong cấu trúc vector chuyển gen đã thu được kết quả biểu hiện gen

chuyển khả quan thông qua phân tích Western blot và ELISA. Promoter

CaMV35S trong vector chuyển gen pCB301-GmEXP1 đã tăng cường sự biểu

hiện của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá chuyển gen được xác nhận bằng

kết quả phân tích Real-time RT-PCR và Western blot (Lo và cs, 2015). Sự biểu

hiện mạnh của gen mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB2 trong vector pBI121-

GmDREB2 chứa promoter CaMV35S được minh chứng bằng kết quả biểu hiện

protein tái tổ hợp GmDREB2 và tác động tăng cường tổng hợp proline ở cây

chuyển gen trong điều kiện gây hạn nhân tạo (Tan và cs, 2015). Theo hướng tạo

cây chuyển gen kháng virus theo cơ chế RNAi, Lo Thi Mai Thu và cs (2016) đã

sử dụng promoter CaMV35S trong vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi

[pK7GW-CPi (SMV-BYMV)]. Kết quả phân tích các cây thuốc lá chuyển gen

bằng Real-time RT-PCR đã chứng minh sự điều khiển phiên mã của CaMV35S

đối với cấu trúc RNAi. Kế thừa kết quả của các nghiên cứu trước, vector chuyển

gen pBI121-CrDAT chứa promoter CaMV35S được thiết kế trong mục đích biểu

hiện mạnh gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn sẽ được chứng minh trong các thí

nghiệm chuyển gen ở cây thuốc lá và cây dừa cạn.

Cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc chứa đoạn peptide cmyc đã được sử dụng làm

kháng nguyên cho phản ứng Western blot để phát hiện protein tái tổ hợp trong

cây chuyển gen. Một số cặp kháng nguyên đã được thiết kế để sử dụng cho mục

đích chọn cây biến đổi gen, nhưng đuôi cmyc đã được coi là một lựa chọn có

hiệu quả và kinh tế cho nhiều nghiên cứu hiện tại. Trong kết quả nghiên cứu của

chúng tôi, sự biểu hiện protein tái tổ hợp được phát hiện trong cây thuốc lá mô

hình nhờ cấu trúc cmyc trong lai Western blot và hiệu quả sử dụng vector

PBI121-CrDAT đã được thử nghiệm và đánh giá trên cây mô hình là nền tảng cơ

bản cho việc sử dụng vector chuyển gen chứa gen CrDAT để biến nạp vào cây

dừa cạn.

Khi kiểm tra hoạt động của gen CrDAT trên thuốc lá chuyển gen. Kết quả

nghiên cứu của Magnotta và cs (2006,2007), cho thấy hoạt động của CrDAT ở

cây thuốc lá chuyển gen ít hơn 10 lần so với enzyme được tìm thấy trong chiết

xuất lá cây dừa cạn. Một nghiên cứu theo hướng sử dụng promoter DAT để đánh

giá hoạt động của gen CrDAT với việc sử dụng các promotor DAT khác nhau

(pDAT 812, pDAT 2.3, pDAT 2.3/DAT và pCAMBIA1305.1) thông qua lây

nhiễm A. tumefaciens LB4404 vào lá cây thuốc lá để kiểm tra hiệu quả hoạt động

của gen CrDAT làm cơ sở lựa chọn promoter điều khiển gen CrDAT biểu hiện

mạnh, kết quả cho thấy vùng promotor DAT được xác định là có cảm ứng với

ánh sáng. Nhận xét này cũng được chứng minh bằng thực nghiệm rằng sự biểu

hiện gen CrDAT liên quan đến sự cảm ứng ánh sáng của promoter [48], [93],

[94], [107]. Nghiên cứu của Magnotta và cs (2007) đã chứng minh gen CrDAT

được biểu hiện ở hệ thống rễ dưới sự điều khiển của promotor 35S [65]. Nghiên

cứu của chúng tôi, promoter 35S được sử dụng điều khiển hoạt động của gen

CrDAT trên cây thuốc lá K326 cho kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp CrDAT

với kích khước khoảng 51,5 kDa và được kiểm tra bằng Western blot. Từ các kết

quả trên đã cung cấp thông tin rõ ràng về hoạt động của gen CrDAT liên quan

đến các nhân tố phiên mã trans và yếu tố cis của promoter trong vai trò biểu hiện

protein CrDAT ở mô hoặc tế bào cụ thể ở thực vật. Tuy nhiên, yếu tố cis và nhân

tố trans có vai trò cụ thể như thế nào với sự biểu hiện của gen CrDAT trong thực

vật chuyển gen cần tiếp được phân tích làm sáng tỏ.

Cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc đã được chuyển thành công vào mô thuốc lá

N. tabacum K326 nhờ A. tumefaciens, tạo cây thuốc lá chuyển gen. Sự có mặt và

hợp nhất của gen chuyển CrDAT vào hệ gen của cây thuốc lá được chuyển gen

được kiểm tra bằng PCR và Southern blot. Protein tái tổ hợp CrDAT có trọng

lượng phân tử khoảng 51 kDa được biểu hiện ở 7 dòng thuốc lá chuyển gen. Kết

quả biến nạp và đánh giá hoạt động của cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc ở cây thuốc

lá chuyển gen là cơ sở cho việc điều khiển biểu hiện mạnh gen CrDAT trong cây

dừa cạn, tạo dòng dừa cạn chuyển gen có hàm lượng vincristine và vinblastine

được cải thiện.

3.3. NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH

CHUYỂN GEN Ở CÂY DỪA CẠN

3.3.1. Nuôi cấy in vitro cây dừa cạn

Tạo vật liệu sạch

Hạt dừa cạn sau khi được khử trùng bằng cồn 70 % trong 1 phút và dung

dịch javen 60 % trong thời gian từ 5- 20 phút, gieo trên môi trường MS cơ

bản. Kết quả nhận được công thức khử trùng tối ưu nhất tại thời gian 15 phút

với tỷ lệ hạt nảy mầm 94,3 % và tỷ lệ hạt nảy mầm không bị nhiễm đạt 94,0 %

mầm mập và xanh bình thường (Hình 3.13).

Hình 3.13. Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt dừa cạn

nh hưởng của AP và sự kết hợp gi a AP v i I A đến sự phát sinh chồi và

sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự sinh

trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên trên môi trường MS bổ sung

đường 30 g/l, agar 8,5 g l, than hoạt tính 1 g l, nước dừa 100 ml l sau 4, 8

tuần được trình bày ở bảng 3.4. Bảng 3.4 cho thấy, ở nồng độ BAP 1,0 mg l

cho số chồi mẫu, chiều cao của chồi, số lá chồi đều cao nhất và chất lượng

chồi là tốt nhất so với các công thức thí nghiệm khác. Như vậy, môi trường

thích hợp cho sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi là BAP 1,0 mg l +

MS + đường 30 g/l + agar 8,5 g l + than hoạt tính 1 g l + nước dừa 100 ml/l.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ đoạn thân

mang mắt chồi bên

Nồng độ BAP

Số chồi/mẫu

Chiều cao

Số lá/chồi

Chất lƣợng

chồi (cm)

chồi

(mg/l)

Sau 6 tuần

1,21 ± 0,11

1,36 ± 0,15

2,45 ± 0,13

2,33 ± 0,23

1,63 ± 0,13

4,33 ± 0,25

0,5

3,63 ± 0,15

1,76 ± 0,17

4,66 ± 0,15

1,0

2,23 ± 0,23

1,64 ± 0,21

4,22 ± 0,15

1,5

1,76 ± 0,16

1,45 ± 0,16

3,61 ± 0,20

2,0

Sau 8 tuần

1,33 ± 0,13

1,66 ± 0,16

4,45 ± 0,16

2,63 ± 0,22

2,13 ± 0,17

5,56 ± 0,27

0,5

3,83 ± 0,26

2,85 ± 0,16

6,21 ± 0,17

1,0

2,31 ± 0,20

2,01 ± 0,18

5,34 ± 0,13

1,5

1,85 ± 0,13

1,79 ± 0,18

4,12 ± 0,21

2,0

Chú thích: T: chồi tốt; K: chồi kém; TB: chồi trung bình

BAP là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, ảnh hưởng rõ

rệt và đặc trưng đến sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là phân hóa

chồi. IBA là loại auxin tổng hợp nhân tạo, thích hợp trong nuôi cấy mô tế bào

thực vật. Ở giai đoạn tạo chồi, sự kết hợp IBA với nhóm cytokinin sẽ cho số

chồi mẫu đạt kết quả cao, tương tự như sự kết hợp BAP với NAA [10]. Từ kết

quả xác định nồng độ BAP tối ưu là 1,0 mg l, thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng

của sự kết hợp giữa BAP với IBA ở nồng độ 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg l; 0,8

mg l, sau 4, 8 tuần nuôi cấy đã được tiến hành và thu được kết quả ở bảng 3.5.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của sự kết hợp BAP 1,0 mg l với IBA đến sự phát sinh

chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên

Nồng độ IBA

Chất lƣợng

Chiều cao

Số chồi/mẫu

Số lá/chồi

(mg/l)

chồi

chồi (cm)

Sau 6 tuần

3,63 ± 0,15

1,36 ± 0,15

2,45 ± 0,12

0,2

4,81 ± 0,29

1,46 ± 0,13

4,14 ± 0,21

0,4

5,74 ± 0,31

1,47 ± 0,17

4,02 ± 0,16

0,6

7,41 ± 0,26

1,52 ± 0,21

3,73 ± 0,15

0,8

5,42 ± 0,33

1,43 ± 0,16

3,22 ± 0,22

Sau 8 tuần

3,83 ± 0,26

2,85 ± 0,16

6,21 ± 0,21

0,2

5,54 ± 0,36

2,77 ± 0,15

6,32 ± 0,12

0,4

6,48 ± 0,44

2,86 ± 0,08

6, 55 ± 0,14

0,6

10,20 ± 0,36

3,15 ± 0,16

6,78 ± 0,19

0,8

6,12 ± 0,37

2,68 ± 0,71

5,98 ± 0,11

Chú thích: CT: chồi tốt; CK: chồi kém; TB: chồi trung bình

Kết quả bảng 3.5 cho thấy, khi có sự kết hợp BAP và IBA số chồi mẫu đã tăng

so với đối chứng sau 4, 8 tuần. Quan sát thực nghiệm cho thấy chồi non được

phát sinh không chỉ từ mắt chồi bên mà còn được tạo ra từ mô sẹo. Sau 4 tuần

tạo chồi trên môi trường không có than hoạt tính, chuyển khối đa chồi sang

môi trường có than hoạt tính quan sát thấy chồi phát triển tốt. Từ kết quả ở

bảng 3.4 và bảng 3.5 có thể thấy, công thức tối ưu cho sự phát sinh chồi và sự

sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên là môi trường MS +

BAP 1,0 mg/l + IBA 0,6 mg l + đường sucrose 30 g l + agar 8,5 g/l + than

hoạt tính 1 g l (sau khi cấy chuyển cụm chồi) + nước dừa 100 ml/l.

nh hưởng của AP và sự kết hợp gi a AP v i I A đến sự phát sinh chồi và

sự sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự sinh

trưởng của chồi từ nách lá mầm 7 đến 10 ngày tuổi trên môi trường MS bổ

sung đường 30 g/l , agar 8,5 g l, than hoạt tính 1 g l, nước dừa 100 ml l sau 6,

8 tuần được thể hiện ở hình 3.14 và bảng 3.6. Bảng 3.6 cho thấy, sau 6, 8 tuần,

môi trường thích hợp tạo đa chồi từ nách lá mầm dừa cạn là MS + đường

sucrose 30 g/l + agar 8,5 g l + than hoạt tính 1 g l + nước dừa 100 ml l bổ

sung BAP 0,5 mg/l.

Hình 3.14. Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm. A -

sau 1 tuần; B - sau 4 tuần; C - sau 6 tuần; D - sau 8 tuần.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP 0,5 mg l với IBA

đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm ở bảng 3.7

cho thấy, sau 6 và 8 tuần tỷ lệ chồi mẫu đạt cao nhất ở công thức BAP 0,5

mg l và IBA 0,4 mg l. Như vậy, trong phạm vi thí nghiệm môi trường thích

hợp cho sự phát sinh và sự sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm là MS + BAP

0,5 mg/l + IBA 0,4 mg l + đường sucrose 30 g/l + agar 8,5 g l + than hoạt tính

1 g l + nước dừa 100 ml/l.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của BAP đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm Nồng độ

Chiều cao chồi

Số chồi/mẫu

Chất lƣợng

Số lá/chồi

BAP (mg/l)

(cm)

chồi

Sau 6 tuần

1,04 ± 0,15

0,76 ± 0,21

2,03 ± 0,12

0,5

2,66 ± 0,24

1,43 ± 0,17

4,65 ± 0,20

1,0

2,03 ± 0,22

1,21 ± 0,13

4,12 ± 0,18

1,5

1,63 ± 0,19

1,16 ± 0,20

4,06 ± 0,13

2,0

1,15 ± 0,15

0,96 ± 0,23

3,65 ± 0,24

Sau 8 tuần

1,06 ± 0,16

1,15 ± 0,22

3,43 ± 0,13

0,5

3,36 ± 0,21

2,33 ± 0,14

6,15 ± 0,21

1,0

2,53 ± 0,20

1,91 ± 0,15

5,12 ± 0,16

1,5

1,73 ± 0,15

1,74 ± 0,23

4,36 ± 0,14

2,0

1,26 ± 0,17

1,38 ± 0,21

3,65 ± 0,22

Chú thích: T: chồi tốt; K: chồi kém; TB: chồi trung bình

Hình 3.15. Sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên và từ nách lá

mầm dưới ảnh hưởng của sự kết hợp BAP với IBA. A, B: Ảnh hưởng kết hợp của

BAP 1,0 mg/l và IBA 0,6 mg l đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi của

từ đoạn thân mang mắt chồi bên sau 4 tuần và 8 tuần . C, D: Ảnh hưởng kết hợp

của BAP 0,5 mg/l và IBA 0,4 mg l đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ

nách lá mầm sau 6 tuần và 8 tuần.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 0,5 mg l và IBA đến sự phát sinh và sinh

trưởng của chồi từ nách lá mầm

Số lá/chồi

Nồng độ IBA (mg/l)

Số chồi/mẫu

Chất lƣợng chồi

Chiều cao chồi (cm) Sau 6 tuần

2,66 ± 0,24

1,16 ± 0,17

4,65 ± 0,20

0,2

4,55 ± 0,13

0,94 ± 0,15

3,05 ± 0,20

0,4

5,67 ± 0,23

0,96 ± 0,08

3,95 ± 0,20

0,6

2,14 ± 0,22

0,64 ± 0,16

3,65 ± 0,20

Sau 8 tuần

3,38 ± 0,24

2,36 ± 0,17

6,26 + 0,24

0,2

5,25 ± 0,25

2,67 ± 0,15

6,15 + 0,15

0,4

7,87 ± 0,37

3,16 ± 0,08

6,34 + 0,21

0,6

2,38 ± 0,26

1,94 ± 0,16

3,78 + 0,16

Chú thích: T: chồi tốt; K: chồi kém

Như vậy, có thể kết luận rằng khử trùng hạt dừa cạn bằng cồn 70 %

trong 1 phút và dung dịch javen 60 % trong 15 phút cho hiệu quả cao nhất.

Môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 8,5 g/l; BAP 1,0 mg/l và IBA 0,6

mg l; nước dừa 100 ml l; pH = 5,8 thích hợp cho sự phát sinh chồi và sự sinh

trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên. Môi trường MS bổ sung sucrose

30 g/l; agar 8,5 g/l; BAP 0,5 mg/l và IBA 0,4 mg l; nước dừa 100 ml/l; pH =

5,8, thích hợp cho sự phát sinh chồi và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm. Gây

tổn thương bằng cách chẻ dọc hoặc dùng mũi dao châm vào đoạn thân mang

mắt chồi bên đều cho hiệu quả đa chồi cao. Môi trường tối ưu tạo đa chồi là cơ

sở cho những thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn.

3.3.2. Xây dựng quy trình chuyển gen thông qua gen gus

Gen β - glucuronidase (gus) được phân lập từ chủng E.coli RA201. β-

glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide tạo

sản phẩm phân giải có màu xanh lam đặc trưng, dễ nhận biết. Cơ chất của β-

glucuronidase thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen

gus là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-gluc

không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh

lam. Vì thế gen gus được thiết kế trong các vector chuyển gen để làm chỉ thị nhận

biết kết quả biểu hiện gen gus ở mô, tế bào thực vật [51]. Các mẫu biến nạp sau

khi nhiễm khuẩn được nuôi trong tối 3 ngày và nhuộm X-gluc để xác định hiệu

suất chuyển gen gus (Hình 3.16).

Hình 3.16. Kết quả biểu hiện tạm thời gen gus. A: Lá mầm chuyển gen; B: Đoạn thân chuyển gen; C: Lá mầm không chuyển gen; D: Đoạn thân không chuyển gen

Kết quả xác định tối ưu về mật độ A. tumefaciens, nồng độ AS, thời gian

nhiễm khuẩn đến hiệu quả chuyển gen gus và ngưỡng chọn lọc Km ở cây dừa cạn

là cơ sở đề chuyển cấu trúc mang gen đích CrDAT vào dừa cạn.

Xác định mật độ tế bào A. tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn

Hiệu suất chuyển gen thông qua A. tumefaciens không những phụ thuộc

vào các yếu tố liên quan đến thực vật mà còn phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn và

thời gian lây nhiễm. Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của A. tumefaciens ở bốn

mật độ tế bào OD600nm= 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 đến hiệu suất chuyển gen qua nách lá

mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên, kết quả được trình bày ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của mật độ A. tumefaciens đến tỷ lệ biểu hiện gen gus tạm

thời khi lây nhiễm qua nách lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên

Mật độ vi

Số mẫu

Lá mầm

Đoạn thân

khuẩn

lây nhiễm

Số mẫu

Tỷ lệ biểu

Số mẫu biểu

Tỷ lệ biểu hiện

(OD 600nm)

biểu hiện

hiện gen gus

gen gus tạm

gen gus

tạm thời (%)

thời (%)

25,56 ± 2,22

26,67 ± 1,92

0,4

28,89 ± 1,11

26,67 ± 1,92

0,6

47,78 ± 1,11

43,33 ± 1,92

0,8

31,11 ± 1,11

32,22 ± 4,01

1,0

Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, tỷ lệ biểu hiện gen gus tạm thời của các mẫu

chuyển gen sau đồng nuôi cấy của hai loại vật liệu nhận gen là lá mầm và đoạn

thân mang mắt chồi bên phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn sử dụng biến nạp. Ở mỗi

mật độ vi khuẩn, tỷ lệ biểu hiện gen gus của từng loại vật liệu không có sự chênh

lệch nhiều song lá mầm có hiệu suất biến nạp gen cao hơn so với đoạn thân. Ở

mật độ vi khuẩn OD600nm = 0,6 và OD600nm = 1,0 thu được hiệu quả biến nạp gen

thấp, tỷ lệ biểu hiện gen gus tạm thời ở mật độ OD600nm = 1,0 chỉ đạt từ 31,11 %

đến 32,22 %; còn ở mật độ OD600nm = 0,6 tỷ lệ biểu hiện đạt 28,89 % (đối với lá

mầm), thấp nhất là 26,67 % (đoạn thân); còn ở OD600nm = 0,4 đạt 25,56 % đến

26,67 %. Tỷ lệ biểu hiện gen gus tạm thời của cả lá mầm và đoạn thân cao nhất

tại mật độ vi khuẩn OD600nm = 0,8, trong đó vật liệu lá mầm đạt tỷ lệ cao hơn

(47,78 %) so với ở đoạn thân (43,33 %).

Xác định nồng độ acetosyringone phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn

Acetosyringone (AS) là một loại phenol được tiết ra từ thực vật bị tổn

thương, chúng có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhập vào tế bào

thực vật tại nơi tổn thương. Vì vậy, để nâng cao hiệu quả chuyển gen, AS được

bổ sung vào môi trường lây nhiễm ở các các nồng độ là 75 M, 100 M; 150 M

và 200 M đến tỷ lệ biểu hiện gen gus đối với cả hai loại vật liệu nhận gen là lá

mầm và đoạn thân. Kết quả nhuộm tạm thời sau 3 ngày đồng nuôi cấy được trình

bày ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus

Lá mầm Đoạn thân

Vật liệu Nồng chuyển độ AS gen Số mẫu lây nhiễm

(M) Số mẫu biểu hiện gen gus Tỷ lệ biểu hiện gen gus tạm thời (%) Số mẫu biểu hiện gen gus Tỷ lệ biểu hiện gen gus tạm thời (%)

120 65 54,17 ± 0,83 55 45,83±2,20 75

120 89 74,17 ± 2,20 86 71,67± 2,20 100

120 67 55,83 ± 0,83 63 52,50 ± 1,44 150

120 55 45,83 ± 2,20 49 40,83 ± 0,83 200

Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy, bổ sung AS với các nồng độ khác nhau thì

ảnh hưởng khác nhau tới tỷ lệ biểu hiện gen gus. Nhìn chung, tỷ lệ biểu hiện gen

gus tạm thời thu được là khá cao và đồng đều ở cả hai loai vật liệu tiến hành

nghiên cứu, nhưng kết quả biểu hiện của vật liệu lá mầm luôn cao hơn so với

đoạn thân ở cùng một nồng độ AS nghiên cứu. Ở nồng độ 75 µM tỷ lệ biểu hiện

gen gus chỉ đạt 54,17 % (lá mầm) và 45,83 % (đoạn thân). Khi nồng độ AS tăng

lên 100 µM, hiệu suất biến nạp gen đã đạt tỷ lệ cao, lần lượt là 74,17 % và 71,67

%. Khi tăng nồng độ AS lên 200 µM thì hiệu quả biến nạp gen giảm đi gần một

nửa, tỷ lệ biểu hiện gen gus tạm thời ở lá mầm lúc này chỉ đạt 45,83 % còn ở

đoạn thân hiệu suất biến nạp gen là thấp nhất khi chỉ có 40,83 % mẫu biểu hiện

gen gus tạm thời.

Như vậy, trong 4 nồng độ AS nghiên cứu, bổ sung AS với nồng độ 100

µM là thích hợp nhất cho việc tạo cây dừa cạn chuyển gen. Theo một số nghiên

cứu khác cho thấy, nồng độ AS phù hợp là khác nhau trong các quy trình chuyển

gen ở các loài cây khác nhau. Kết quả nghiên cứu của Lê Trần Bình (2008) cho

thấy, nồng độ AS 200 µM là tối ưu cho chuyển gen vào dòng lúa indica [1]. Vũ

Thị Lan (2013), khi nghiên cứu chuyển gen vào khoai lang lại đưa ra nồng độ AS

150 µM là tối ưu [8].

Xác định thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens phù hợp cho cây dừa cạn

Thời gian nhiễm khuẩn là một yếu tố rất quan trọng trong quá trình biến

nạp, phụ thuộc vào loài thực vật và từng loại vật liệu chuyển gen ở mỗi loài. Thời

gian lây nhiễm phải đủ để mẫu thực vật và vi khuẩn tiếp xúc, tạo cơ hội cho vi

khuẩn có cơ hội xâm nhập và chuyển gen. Tuy nhiên, thời gian lây nhiễm quá dài

sẽ ảnh hưởng tới sức sống của mẫu. Do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm

chuyển gen vào lá mầm và đoạn thân trong 3 lần lây nhiễm với bốn khoảng thời

gian nhiễm khuẩn là 10 phút, 20 phút, 30 phút và 40 phút, kết quả được trình bày

ở bảng 3.10. Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy, hiệu quả biến nạp tăng dần theo thời

gian nhiễm khuẩn. Khi nhiễm khuẩn với thời gian 10 phút tỷ lệ biểu hiện tạm

thời gen gus thu được rất thấp, chỉ đạt 27,50 % ở vật liệu lá mầm và 17,5 % ở

đoạn thân. Điều này cho thấy khoảng thời gian 10 phút là chưa đủ cho sự tiếp xúc

và xâm nhập của vi khuẩn vào vật liệu thực vật. Tỷ lệ biểu hiện gen gus ở thời

gian nhiễm khuẩn 20 phút cũng có sự tăng lên so với 10 phút, hiệu quả biến nạp

tăng lên đáng kể là 30,83 % đối với vật liệu lá mầm và 30,00 % đối với đoạn

thân. Ở thời gian nhiễm khuẩn 30 phút đạt tỷ lệ biểu hiện gen gus cao nhất là

42,50 % đối với lá mầm và 41,67 % đối với đoạn thân. Khi tăng thời gian lên 40

phút hiệu quả biểu hiện gen gus giảm, chỉ đạt 26,67 % (lá mầm) và 23,33 %

(đoạn thân).

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ biểu hiện tạm thời

gen gus

Lá mầm Đoạn thân

Thời gian nhiễm khuẩn (phút) Số mẫu lây nhiễm

Số mẫu biểu hiện gen gus Tỷ lệ biểu hiện gen gus tạm thời (%) Số mẫu biểu hiện gen gus Tỷ lệ biểu hiện gen gus tạm thời (%)

120 23 27,50 ± 1,44 21 10 17,50 ± 1,44

120 37 30,83 ± 0,83 36 20 30,00 ± 1,44

120 51 42,50 ± 1,44 50 30 41,67 ± 2,20

120 32 26,67 ± 0,83 28 40 23,33± 0,83

Như vậy, với thời gian nhiễm khuẩn 30 phút, ở cả hai loại vật liệu thí

nghiệm nhận gen có tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus cao nhất, đạt 42,50 % đối

với lá mầm và 41,67 % đối với đoạn thân.

Xác định nồng độ kanamycin m thích hợp để chọn lọc chồi và tái sinh in vitro

cây chuyển gen

Việc chọn lọc và xác định những cá thể mang gen chuyển là khâu rất quan

trọng trong quá trình chuyển gen. Để chọn lọc có hiệu quả, cần xác định được

nồng độ chất chọn lọc phù hợp giúp cho việc loại bỏ phần lớn mẫu biến nạp

không được chuyển gen, đồng thời giữ lại các mẫu chuyển gen. Trong nghiên

cứu này, vector mang gen gus chứa gen chọn lọc nptII kháng kháng sinh Km, do

vậy thí nghiệm xác định ngưỡng nồng độ kháng sinh chọn lọc Km phù hợp cho

chọn lọc cây dừa cạn chuyển gen được bố trí ở 3 thang nồng độ: 25 mg/l, 50

mg/l, 75 mg/l.

Tiến hành chuyển gen gus vào lá mầm và đoạn thân thông qua

A.tumefaciens. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy, mẫu được chuyển lên môi trường tạo

chồi có bổ sung ba nồng độ Km là 25 mg l, 50 mg l và 75 mg l để xác định

ngưỡng chọn lọc kháng sinh thích hợp cho chồi chuyển gen. Tiếp tục theo dõi tỉ

lệ mẫu tạo chồi sau 2 tuần, và tỉ lệ chồi sống sót sau 4 tuần kết quả thu được được

trình bày ở bảng 3.11.

Bảng 3.11. Ản ởng n ng n n u u n gen

Nồng độ Lá mầm Đoạn thân

Km Tỉ lệ tạo chồi Tỉ lệ chồi sống Tỉ lệ tạo chồi Tỉ lệ chồi sống

(mg/l) (%) sót (%) (%) sót (%)

(sau 2 tuần) (sau 4 tuần) (sau 2 tuần) (sau 4 tuần)

60, 00 ± 0,03 54,45 ± 0,05 56,67 ± 0,03 51,11 ± 0,05 25

23,33 ± 0,03 6,67 ± 0,02 21,11 ± 0,03 13,33 ± 0,02 50

7,78 ± 0,03 4,45 ± 0,01 7,78 ± 0,02 2,22 ± 0,01 75

Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy, Km có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tạo

chồi và sự sống sót của chồi chuyển gen. Ở cùng một nồng độ Km lại không

có sự chênh lệch quá lớn giữa hai loại vật liệu nhận gen là lá mầm và đoạn

thân. Tỷ lệ mẫu tạo chồi sau 2 tuần ở nồng độ Km 25 mg l khá cao, lần lượt là

60 % (lá mầm) và 56,67 % (đoạn thân). Tỷ lệ này giảm mạnh khi tăng nồng độ

Km lên 50 mg/l và 75 mg/l khi chỉ có 23,33% và 7,78 % mẫu tạo chồi trong

cùng thời gian nghiên cứu.

Sau 4 tuần, tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trường có bổ sung Km 25 mg l vẫn

khá cao, lần lượt là 54,45 % ở vật liệu lá mầm và 51,11 % ở vật liệu đoạn thân.

Nồng độ kháng sinh Km 25 mg l tỏ ra không thích hợp cho chọn lọc mẫu chuyển

gen, tỉ lệ mẫu sống sót khá lớn đồng nghĩa với hiệu quả chọn lọc chưa cao. Khi

tăng nồng độ kháng sinh Km lên 50 mg l tỉ lệ mẫu sống sót ở vật liệu lá mầm

giảm mạnh xuống chỉ còn 6,7 % trong khi ở vật liệu đoạn thân đạt 13,3 %. Điều

này cho thấy, hiệu quả chọn lọc trên vật liệu lá mầm ở nồng độ Km 50 mg l là

khá tốt. Môi trường bổ sung nồng độ Km 75 mg l gần như ức chế hoàn toàn khả

năng sống sót của chồi, tỉ lệ mẫu sống sót thu được là rất thấp, chỉ đạt lần lượt 2,2

% và 4,5 %. Các lá mầm không cảm ứng tạo chồi, đã bị chết trên môi trường

chọn lọc dần chuyển sang màu vàng nhạt.

Tiến hành lấy ngẫu nhiên lá từ các chồi sống sót ở môi trường có bổ sung

kanamycin 50 mg l và 75 mg l để kiểm tra sự biểu hiện gen gus. Kết quả nhuộm

cho thấy hầu hết lá của các chồi sống sót đều có màu xanh chàm đặc trưng, điều

này chứng tỏ gen gus đã được chuyển vào và nhân lên trong môi trường nuôi cấy.

Các mẫu bị chết có thể do gen kháng Km chưa được chuyển vào hoặc đã được

chuyển vào nhưng không tiếp tục phiên mã nên chúng không thể tái sinh trên môi

trường chọn lọc.

Căn cứ vào kết quả trên, chúng tôi lựa chọn nồng độ Km 50 mg l là

ngưỡng chọn lọc thích hợp cho cây dừa cạn chuyển gen. Theo Brukhin và cs

(2000), ngưỡng nồng độ chất chọn lọc phù hợp là khi loại bỏ được khoảng 90 %

các cây không chuyển gen [28]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với

nhận xét này.

3.3.3. Kết quả chuyển gen gus vào cây dừa cạn

Từ kết quả nghiên cứu tối ưu các điều kiện ảnh hưởng hiệu quả chuyển

gen gus ở cây dừa cạn, tiến hành chuyển cấu trúc mang gen gus bằng phương

pháp lây nhiễm A.tumefaciens qua nách lá mầm của cây dừa cạn. Lá mầm được

ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600nm= 0,8, bổ sung AS 100 M

trong 30 phút. Sau khi đồng nuôi cấy 3 ngày, chuyển mẫu lên môi trường nuôi

cấy để chọn lọc và tái sinh chồi chuyển gen (MS + sucrose 30 g/l + agar 8 g/l +

MES 0,59 g l + muối B5 3 g/l + BAP 0,5 mg/l + cefotaxim 500 mg/l + Km 50

mg/l). Các mẫu tạo chồi được đưa sang môi trường chọn lọc để tránh các mẫu

chết sản sinh ra các chất làm ức chế tái sinh ở các mẫu tạo chồi. Chồi đạt chiều

cao 2 - 3 cm được chuyển sang môi trường ra rễ (MS + sucrose 30 g/l + agar 8 g/l

+ BAP 0,5 mg/l + IBA 0,4 mg/l + Km 50 mg/l). Cây con có chiều cao 8 - 10 cm

và rễ đạt từ 5 - 7 cm được đưa ra bầu đất. Thí nghiệm tiến hành ở 3 lô với tổng số

mẫu biến nạp là 360 mẫu, kết quả được trình bày ở bảng 3.12.

Bảng 3.12. Kết quả chuyển gen gus vào cây dừa cạn

Lô thí nghiệm và đối chứng Số mẫu Số chồi ra rễ

Số mẫu tạo chồi (sau 2 tuần) 30 Số chồi sống sót (sau 4 tuần) 28 Số cây sống sót trong nhà lƣới 18 Hiệu suất chuyển gen gus (%) 0 Đối chứng 30 25

1 90 20 11 6 4

2 120 29 13 8 5 Thí 4,17 nghiệm 3 150 35 10 7 5

Tổng 360 84 34 21 15

Bảng 3.12 cho thấy, kết quả chọn lọc sau 2 tuần thu được 84 mẫu tạo chồi

(đạt 23,3 %), sau 4 tuần số chồi sống sót là 34 mẫu (đạt 9,45 %), trong đó có 21

chồi ra rễ. Khi đưa cây ra môi trường thu được 15 cây sống sót. Lấy ngẫu nhiên

lá và rễ của 15 cây đem nhuộm X-gluc để kiểm tra biểu hiện của gen gus. Tất cả

15 cây này đều cho kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh chàm đặc trưng.

Hình 3.17 thể hiện kết quả kiểm tra biểu hiện gen gus ở lá và rễ cây dừa cạn

chuyển gen.

Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở thực vật thông qua gen gus

đã được xác định là khâu đầu trong nghiên cứu chuyển gen ở một loài thực vật.

Trong nghiên cứu của Lê Trần Bình (2008) về chuyển gen gus vào cây lúa đã đạt

được hiệu suất là 12,5 % [1], chuyển gen gus vào cây xoan ta của Bùi Văn Thắng

(2013) đạt 18,15 % [17], hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương của Nguyễn

Thu Hiền (2014) được xác định là 7,8 % đối với giống đậu tương ĐT12 và 4,3 %

với giống DT84 [5]. Tuy nhiên kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ đạt hiệu suất

chuyển gen gus vào dừa cạn là 4,17 %, nhìn chung thấp hơn so với các nghiên

cứu của các tác giả trên.

Hình 3.17. Kết quả biểu hiện gen gus ở cây dừa cạn chuyển gen. A: Lá cây chuyển gen gus; B: Rễ cây chuyển gen gus; C: Lá cây không chuyển gen; D: Rễ cây không chuyển gen.

Từ các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đã tối ưu được một số yếu tố ảnh

hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào cây dừa cạn bao gồm: (i) Vật liệu chuyển

gen là lá mầm; (ii) Nồng độ vi khuẩn OD600nm= 0,8; (iii) Nồng độ AS là 100 µM;

(iv) Thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút; (v) Nồng độ Km để chọn lọc chồi chuyển

gen là 50 mg l. Quy trình chuyển gen gus vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A.

tumefaciens được tóm tắt ở hình 3.18.

Hình 3.18. Sơ đồ quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A.

tumefaciens

Sử dụng gen chỉ thị gus trong nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở

thực vật đã được nhiều tác giả trong nước cũng như ở nước ngoài quan tâm tiến

hành. Các nghiên cứu chuyển gen ở khoai lang, sắn, cà chua, dưa dấu cũng đã

được xây dựng và tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen. Mật độ

vi khuẩn, nồng độ AS, vật liệu thực vật dùng làm thể nhận gen, thời gian nhiễm

khuẩn và ngưỡng nồng độ chất chọn lọc kháng sinh Km đã được khảo sát. Các

nghiên cứu đều sử dụng kết quả tối ưu hiệu quả chuyển gen gus để ứng dụng

chuyển gen mục tiêu vào cây đích (Đỗ Xuân Đồng và cs, 2007; Nguyễn Thị

Thanh Nga và cs, 2012; Vũ Thị Lan và cs, 2013 ...) [3],[8],[14]. Đối với cây dừa

cạn, nghiên cứu chuyển gen gus của Wang và cs (2012), bằng cách dùng kim

châm để gây tổn thương lên vật liệu nhận gen để gen dễ dàng tiếp nhận vào mô tế

bào [113]. Sử dụng vi khuẩn trung gian có tên là Sonication-assisted (SAAT) để

tăng cường hiệu quả chuyển gen ở các mô thực vật khác nhau [42]. Mật độ khuẩn

đo được OD600 = 0,8 và ngâm trong khuẩn là 30 phút, nồng độ AS là 100 μM/1lít

môi trường. Đến nay sử dụng SAAT đã thành công trong việc chuyển gen ở

nhiều loài như đậu, củ cải, [42],[76]. Vận dụng xây dựng quy trình chuyển gen

đối với cây dừa cạn, nghiên cứu của chúng tôi cũng sử dụng gen chỉ thị gus

chuyển vào dừa cạn qua nách lá mầm. Kết quả nghiên cứu chuyển gen gus vào

cây dừa cạn qua nách lá mầm nhờ A.tumefaciens đã được tối ưu ở nồng độ

A.tumefaciens là OD600nm= 0,8; AS là 100 µM và thời gian nhiễm khuẩn là 30

phút; chọn lọc bằng kháng sinh Km thích hợp ở nồng độ 50 mg/l.

Có nhiều vector chuyển gen vào thực vật được thiết kế có mang gen gus

như pB1121, pCAM301,… nhưng nhược điểm của các vector này là không được

thiết kế đoạn intron ở đầu 5’ trước gen gus. Vì vậy khi nhuộm X-gluc gen gus

biểu hiện trong cả tế bào vi khuẩn và trong cả tế bào thực vật, điều này gây khó

khăn cho việc nhận biết chính xác sự có mặt của gen gus trong mô tế bào thực

vật. Để khắc phục nhược điểm này, vector pPTN289 đã được thiết kế thêm đoạn

intron ở đầu 5’ trước gen gus. Vì thế, khi phân tích gen gus, màu xanh chàm chỉ

biểu hiện trong mô tế bào thực vật mà không biểu hiện trong vi khuẩn khi có mặt

của cơ chất X-gluc [104]. Chính vì vậy khi xây dựng quy trình chuyển gen vào

cây dừa cạn chúng tôi lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58/pGV2260

mang vector chuyển gen pCB-gusplus mang gen gus.

3.4. K T QUẢ CHUYỂN GEN CrDAT VÀ TẠO CÂY DỪA CẠN CHUYỂN GEN

3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT và tái sinh cây dừa cạn chuyển gen

Lá mầm thu từ hạt dừa cạn nảy mầm được sử dụng làm mẫu biến nạp. Cấu

trúc mang gen CrDAT được chuyển vào cây dừa cạn thông qua A.tumefaciens lây

nhiễm qua nách lá mầm. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp, giai đoạn nuôi cấy

và chọn lọc, tái sinh cây và tạo cây dừa cạn chuyển gen được mô tả ở hình 3.19.

Trên hình 3.19, hạt dừa cạn đem khử trùng (Hình 3.19A) cho nảy mầm trong tối

trên môi trường GM (Hình 3.19B), sau đó cắt bỏ rễ mầm, chồi mầm, bỏ vỏ, thu lá

mầm để làm vật liệu nhận gen (Hình 3.19C). Gây tổn thương nách lá mầm và các

mảnh lá mầm tổn thương được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn 30 phút để

lây nhiễm (Hình 3.19D). Các mẫu sau đó được đưa sang môi trường đồng nuôi cấy

3 ngày trong tối (Hình 3.19E). Sau đó mẫu được rửa khuẩn bổ sung kháng sinh

cefotaxime 500 mg l và đặt lên môi trường cảm ứng tạo đa chồi (Hình 3.19F). Khi

các mẫu phát sinh cụm chồi gồm các chồi nhỏ (Hình 3.1G, H). tiến hành cắt bỏ lá

mầm và chuyển sang môi trường chọn lọc kéo dài chồi (Hình 3.19I). Các chồi nhỏ

sống sót kéo dài trên môi trường có kháng sinh chọn lọc Km (Hình 3.16L). Chọn

những chồi có sức sinh trưởng tốt và chuyển sang môi trường ra rễ RM (Hình

3.19K, L) và sau đó đem trồng trên giá thể (Hình 3.19M).

Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen chuyển CrDAT nhờ vi khuẩn

A.tumefaciens qua nách lá mầm được trình bày ở bảng 3.13. Bảng 3.13 cho thấy,

với 390 mẫu biến nạp trong 3 lần biến nạp ở lô thí nghiệm có 233 mẫu tạo chồi,

qua hai lần chọn lọc kháng sinh ở giai đoạn chồi và sinh trưởng của chồi, đã thu

được 164 chồi kéo dài sống sót và sinh trưởng tốt chuyển sang môi trường ra rễ

và có 120 chồi ra rễ. Kết quả chọn được 70 cây in vitro có hình thái thân, lá, rễ

bình thường đem trồng trên giá thể và thu được 19 cây sống sót và sinh trưởng

bình thường ở điều kiện nhà lưới. Như vậy, trong 390 mẫu biến nạp, qua các giai

đoạn tái sinh và sinh trưởng chồi, chọn lọc bằng kháng sinh tạo được 19 cây được

chuyển gen CrDAT trong điều kiện nhà lưới, chiếm 4,87 %.

Hình 3.19. Hình ảnh biến nạp và tái sinh cây dừa cạn chuyển gen. A: Hạt dừa

cạn; B: Hạt nảy mầm trên môi trường MS; C: Lá mầm dừa cạn; D: Nhiễm khuẩn

trong 30 phút; E. Đồng nuôi cấy trong tối; F: Cảm ứng tạo đa chồi; G: Tái sinh đa

chồi sau 2 tuần ; H: Tái sinh đa chồi sau 4 tuần; I: Chọn lọc và kéo dài chồi; K,

L: Ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh; M: Cây trồng trên giá thể.

Các cây dừa cạn chuyển gen ra bầu có lá xanh tốt được đưa trồng ở vườn

thực nghiệm. Kết quả trong 19 cây chuyển gen T0 đem trồng trong môi trường tự

nhiên chỉ có 7 cây sinh trưởng, phát triển bình thường (chiếm tỷ lệ 36,84 %).

Bảng 3.13. Kết quả biến nạp cấu trúc CrDAT vào mẫu dừa cạn hoa hồng tím

Đối chứng và

Tổng số

Số mẫu

Số chồi

Số cây

Số cây sống và

thí nghiệm

mẫu

tạo chồi

kéo dài

ra rễ

ra bầu

tr ng tại v ờn

t ự ng iệ

ĐC0*

ĐC1*

Lần 1

Thí

Lần 2

120

nghiệm

Lần 3

180

Tổng

390

233

164

120

70

19

Ghi chú: *ĐC0: Dừa cạn không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; *ĐC1: Dừa cạn không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh.

3.4.2. Xác định sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong hệ

gen của các cây dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T0

Kết quả kiểm tra các cây dừa cạn được chuyển gen bằng PCR

Sau khi trồng cây dừa cạn chuyển gen ra vườn, thu lá để tách DNA tổng số

và tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu XbaI-DAT-F/cmyc-KDEL-

SacI-R để khuếch đại gen chuyển CrDAT từ hệ gen cây dừa cạn chuyển gen. Gen

nội tại và gen chuyển phân biệt nhau ở trình tự gắn đuôi cmyc và KDEL. Gen nội

tại CrDAT trong cây dừa cạn có có kích thước 1320 bp và gen chuyển có thêm

đuôi cmyc và KDEL nên kích thước là 1383 bp. Trong 19 cây dừa cạn chuyển

gen trồng trong vườn thực nghiệm, chọn 7 cây sinh trưởng, phát triển tốt sử dụng

phân tích xác định sự có mặt của gen chuyển CrDAT bằng phản ứng PCR, kết

quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thể hiện ở hình 3.20.

Hình 3.20. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT từ các cây

dừa cạn chuyển gen. M: thang DNA chuẩn 1 kb; (+) đối chứng dương (+) là

plasmid pBT-CrDAT; (-) Đối chứng âm (-) kết quả PCR nhân gen CrDAT từ cây

dừa cạn không chuyển gen; 1-7 các dòng cây dừa cạn chuyển gen CrDAT.

Trên bản gel điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen CrDAT, các

làn chạy chỉ xuất hiện một băng duy nhất với kích thước hơn 1,3 kb tương ứng

với kích thước của gen CrDAT nội tại và gen chuyển. Gen CrDAT nội tại của cây

dừa cạn có kích thước 1320 bp, không có đuôi cmyc và KDEL; gen chuyển

CrDAT chứa điểm cắt của enzyme giới hạn XbaI và SacI, đuôi cmyc và KDEL có

kích thước là 1383 bp. Điểm phân biệt giữa gen nội tại CrDAT và gen chuyển

CrDAT ở kết quả PCR nhân bản đoạn gen DAT với cặp mồi XbaI-DAT-F/cmyc-

KDEL-SacI-R và PCR chỉ nhân bản được cấu trúc CrDAT-cmyc-KDEL (1383

bp). Như vậy cả 7 dòng dừa cạn mang kiểm tra bằng PCR đều có mặt của gen

chuyển CrDAT và có thể nhận xét rằng, cấu trúc mang gen chuyển CrDAT có khả

năng xâm nhập vào hệ gen của cây dừa cạn được chuyển gen. Tuy nhiên, gen

chuyển có hợp nhất vào hệ gen của tế bào chủ hay không cần tiếp tục kiểm tra

bằng các phương pháp khác.

Kết quả kiểm tra sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT vào hệ gen của cây dừa cạn

bằng Southern blot

Sử dụng Southern blot để kiểm tra kết quả gắn gen chuyển CrDAT vào hệ

gen của cây dừa cạn được chuyển gen. Bảy cây dừa cạn chuyển gen dương tính

với PCR và cây đối chứng không chuyển gen đã được sử dụng để phân tích

Southern blot. DNA tổng số được tách chiết từ lá của các cây dừa cạn chuyển gen

và cây đối chứng không chuyển gen, tinh sạch và xử lý bằng enzyme giới hạn

SacI. Kết quả cắt DNA tổng số của các dòng dừa cạn chuyển gen đã thu được các

đoạn DNA chứa gen nptII có kích thước khác nhau (Hình 3.21).

Hình 3.21. Kết quả phân tích Southern blot DNA tổng số các cây dừa cạn

chuyển gen CrDAT với đoạn dò nptII được đánh dấu bằng biotin. M: thang

DNA chuẩn 1 kb, (+): vector pBI121-CrDAT; 1-7: các dòng dừa cạn chuyển

gen dương tính với PCR (T0-1; T0-2; T0-3; T0-4; T0-5; T0-6; T0-7); (-): cây

dừa cạn không chuyển gen.

Kết quả ở hình 3.21 cho thấy băng DNA xuất hiện ở các dòng chuyển gen

T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-6 và T0-7; dòng dừa cạn chuyển gen T0-5 và cây đối

chứng không chuyển gen không xuất hiện băng DNA. Dòng T0-2 và T0-4 xuất

hiện 2 băng DNA (2 bản copy), các dòng còn lại T0-1, T0-3, T0-6, T0-7 có một

bản copy. Hiệu suất chuyển gen tính đến thời điểm phân tích lai Southern là

1,54% (6 390). Các dòng chuyển gen cho kết quả lai Southern tiếp tục được đánh

giá sự sinh trưởng và phát triển thu hạt phục vụ các thí nghiệm phân tích cây

chuyển gen ở thế hệ gen T1.

Như vậy từ kết quả phân tích PCR và Southern blot bước đầu đã khẳng

định gen chuyển CrDAT đã được biến nạp thành công và hợp nhất vào hệ gen của

cây dừa cạn. Các dòng dừa cạn chuyển gen tiếp tục được theo dõi và phát triển

phục vụ cho những phân tích về khả năng hoạt động và biểu hiện mạnh của gen

chuyển CrDAT.

3.4.3. Phân tích biểu hiện protein DAT tái tổ hợp ở thế hệ T1

Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của 6 cây dừa cạn ở thế hệ T0 (T0-1,

T0-2, T0-3, T0-4, T0-6, T0-7) nhận thấy có 4 cây ra hoa và cho quả (T0-1, T0-3,

T0-6, T0-7), còn 2 cây ra hoa nhưng không cho quả (T0-2, T0-4). Thu quả và hạt

của 4 dòng dừa cạn chuyển gen (T0-1, T0-3, T0-6, T0-7) và đem gieo trồng,

chăm sóc, theo dõi sự sinh trưởng phát triển. Các cây dừa cạn chuyển gen được

gọi là thế hệ T1, ký hiệu là T1-1, T1-3, T1-6, T1-7 được tiến hành phân tích sự

biểu hiện và đánh giá hoạt động của protein CrDAT tái tổ hợp.

Lá của 4 dòng cây dừa cạn chuyển gen T1-1, T1-3, T1-6, T1-7 ở thế hệ T1

được sử dụng để chiết rút protein cho phân tích điện di protein SDS-PAGE trên

gel polyacrylamid và phân tích Western blot. Protein DAT tái tổ hợp có đặc điểm

phân biệt với protein DAT nội tại là có chứa đuôi c-myc ở phía đầu C của chuỗi

polypeptide. Do đó, thực hiện lai Western cho phép phát hiện những protein trên

màng lai nitrocellulose có mang đuôi c-myc khi gắn kháng thể phù hợp để cho

phản ứng màu với cơ chất, kết quả lai Western phân tích biểu hiện protein tái tổ

hợp của 4 cây dừa cạn chuyển gen T1 được thể hiện ở hình 3.22.

Hình 3.22. Kết quả phân tích Western blot từ 4 dòng dừa cạn chuyển gen và cây

đối chứng không chuyển gen. (+): protein đối chứng dương; M: thang protein

chuẩn; T1-1, T1-3, T1-6, T1-7: protein của bốn cây dừa cạn chuyển gen dương

tính với southern blot; (-) protein cây dừa cạn đối chứng không chuyển gen.

Kết quả phân tích Western blot ở hình 3.22 cho thấy, trên màng lai

nitrocellulose xuất hiện một băng màu ở vị trí kích thước khoảng 51 kDa ở cả 4

dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1, tương ứng với kích thước phân tử của

protein CrDAT tái tổ hợp và đã cho kết quả biểu hiện ở cây thuốc lá chuyển gen.

Điều đó chứng tỏ rằng gen chuyển CrDAT ở bốn dòng dừa cạn chuyển gen T1 đã

biểu hiện dịch mã cho protein CrDAT tái tổ hợp. Hiệu suất chuyển gen đến giai

đoạn dịch mã là 1,02 % (4/390).

Như vậy, kết quả phân tích Western blot đã xác định protein tái tổ hợp

CrDAT đã được biểu hiện thành công trên 4 dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ

T1 và chứng minh gen chuyển CrDAT được di truyền qua sinh sản hữu tính từ

thế hệ T0 sang T1 và hoạt động ổn định ở hai thế hệ cây dừa cạn chuyển gen.

Khi phân tích hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT từ 4 dòng dừa cạn

chuyển gen CrDAT ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật ELISA kết quả được thể hiện ở

biểu đồ hình 3.23.

Hình 3.23. Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp

CrDAT của 4 dòng dừa cạn chuyển gen T1 (T1-1, T1-3, T1-6, T1-7 ) và cây đối

chứng không chuyển gen (WT)

Hình 3.23 cho thấy, 4 dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng

protein tái tổ hợp dao động từ 2,87 µg mg đến 5,12 µg mg, dòng dừa cạn chuyển

gen T1-1 có hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT cao nhất (5,12 µg mg) và dòng

T1-3 có hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT thấp nhất (2,87 µg/mg) (Hình

3.24). Hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT được xếp theo thứ tự từ cao đến thấp

là T1-1 > T1-6 > T1-7 > T1-3. Kết quả phân tích hàm lượng protein tái tổ hợp

CrDAT trong các dòng dừa cạn chuyển gen T1 đã chứng minh gen CrDAT trong

các dòng dừa cạn chuyển gen đã được tăng cường biểu hiện làm tăng hàm lượng

protein DAT so với cây đối chứng không chuyển gen.

Kết quả phân tích hàm lƣợng alkaloid tổng số của các dòng dừa cạn chuyển

gen

Bốn dòng cây dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 (T1-1, T1-3, T1-6 ,T1-7) có

sự sinh trưởng, phát triển bình thường, không có sự khác biệt về hình thái giữa

cây chuyển gen và cây không chuyển gen (Hình 3.24).

Hình 3.24. Các dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 và cây đối chứng không

chuyển gen. WT: cây dừa cạn không chuyển gen; T1-1; T1-3; T1-6; T1-7: các

dòng dừa cạn chuyển gen T1.

Tiến hành phân tích hàm lượng alkaloid tổng số của 4 dòng cây dừa cạn

chuyển gen T1-1; T1-3; T1-6; T1-7 và cây đối chứng không chuyển gen (WT)

kết quả thu được được thể hiện ở hình 3.25. Trên hình 3.25 cho thấy, bốn dòng

dừa cạn chuyển gen có hàm lượng alkaloid tổng số dao động từ 0,38 g 100g (khối

lượng khô) đến 1,82g 100g (khối lượng khô), trong đó dòng T1-1 có hàm lượng

alkaloid cao nhất (1,82g 100g), tiếp đến là dòng T1-6 (1,52 g/100g), dòng T1-7

(0,64 g/100g) và thấp nhất là dòng T1-3 có hàm lượng 0,38g 100g. Ở đối chứng,

hàm lượng alkaloid là 0,12g 100g và như vậy, so với đối chứng các dòng dừa cạn

chuyển gen CrDAT có hàm lượng alkaloid tổng số tăng từ 3,16 - 15,17 (lần)

Hình 3.25. Hàm lượng alkaloid tổng số (g/100g khối lượng khô) của 4 dòng dừa

cạn chuyển gen ở thế hệ T1 và cây đối chứng không chuyển gen. WT: dừa cạn

không chuyển gen; T1-1; T1-3; T1-6; T1-7: các dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT

ở thế hệ T1.

3.4.4. Thảo luận về kết quả sự tăng cƣờng biểu hiện gen CrDAT ở cây dừa cạn

chuyển gen

Dừa cạn (Catharanthus roseus) là cây thuốc có giá trị dược học, sản sinh

ra nhiều TIA như vindoline, ajamlicine, serpentine, catharanthine, vinblastine và

vincristine và nhiều hợp chất thứ cấp khác. Một số trong số đó là thành phần

quan trọng của thuốc điều trị ung thư và cao huyết áp [83]. Dừa cạn được sử

dụng trong điều trị lâm sàng các bệnh khác nhau ở người và là cơ sở cho việc

phát triển các loại dược phẩm mới [52], [63]. Vinblastine và vincristine là những

chất chuyển hóa thứ cấp từ cây dừa cạn, có giá trị dược học rất cao được sử dụng

trong điều trị ung thư. Tuy nhiên các hợp chất này được tổng hợp trong cây dừa

cạn rất ít. Để cải thiện việc sản xuất các alkaloids trong cây dừa cạn, nhiều

nghiên cứu đã được thực hiện như tăng sinh khối tế bào, rễ tơ và các nỗ lực để

làm sáng tỏ quá trình tổng hợp monoterpenoid indole alkaloid (MIA) (Qifang Pan

và cs, 2012) [82]. Nisa Nur Iskandar và Iriawati (2016), tiếp cận nghiên cứu cải

thiện hàm lượng vinblastine và vincristine bằng nuôi cấy in vitro dừa cạn trong

môi trường tạo mô sẹo dưới tác động của polyethylene glycol [73], nhưng Wang

Q và cs (2012) cho rằng, để cải thiện việc sản xuất các TIA trong cây dừa cạn,

cần thiết lập một phương pháp chuyển gen hiệu quả [113]. Trên cơ sở tổng kết

các tài liệu về ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong biểu hiện mạnh gen chuyển có

nguồn gốc của chính loài thực vật đó trong mục đích tăng hàm lượng sản phẩm

biểu hiện gen và dẫn đến nâng cao hàm lượng các hợp chất thứ cấp trong thực

vật. Giả thuyết nghiên cứu của chúng tôi đặt ra là biểu hiện mạnh gen mã hóa

enzyme chìa khóa DAT trong chu trình sinh tổng hợp alkaloid của cây dừa cạn

bằng chuyển gen trong kỳ vọng cải thiện hàm lượng của hai loại alkaloid là

vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn. Dừa cạn là cây hai lá mầm và ứng

dụng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật hai lá mầm trong mục đích tăng cường biểu

hiện gen nhằm cải thiện hàm lượng protein là sản phẩm của gen nội tại trong

chính loài cây trồng đó đã được nhiều tác giả quan tâm [7], [16], [19], [101]. Đối

với các loài cây thuộc lớp hai lá mầm, kỹ thuật chuyển gen thông qua

A.tumefaciens được sử dụng có hiệu quả khi lây nhiễm vi khuẩn qua nách lá

mầm [7], [16], [101]. Hạt dừa cạn và kích thước lá mầm rất nhỏ do vậy tạo vật

liệu nhận gen ở dừa cạn khó hơn các loài thực vật có kích hạt lớn như đậu tương,

đậu xanh. Chính vì vậy kỹ thuật gây tổn thương nách lá mầm cần phải có kỹ

thuật khéo léo hơn. Gây tổn thương phần nách lá mầm, ngâm lá mầm trong dịch

khuẩn A. tumefaciens và đồng nuôi cấy. Tái sinh đa chồi và tạo cây dừa cạn

chuyển gen. Kết quả phân tích hiệu suất chuyển gen ở thế hệ T0 dựa trên kết quả

phân tích Southern blot đạt 1,54 %. Ở thế hệ T1, dựa trên kết quả Western blot

hiệu suất chuyển gen đạt 1,02 %. Khi biến nạp vào tế bào chủ, gen chuyển có thể

gắn vào một hay một số vị trí trong hệ gen của cây chủ, nhưng không được di

truyền cho thế hệ sau hoặc bị mất đi cho nên protein tái tổ hợp không được biểu

hiện hoặc hiệu quả biểu hiện thấp, hoặc có thể gen chuyển bị bất hoạt.

Ở cây dừa cạn, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật gen nhằm tăng hàm lượng

alakloid được mô tả sự biểu hiện của bước cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp

vindoline với sự tham gia của gen CrDAT trong nuôi cấy rễ tơ ở dừa cạn. Các

phân tích sinh hóa cho thấy một số dòng rễ tơ biểu hiện hoạt tính của enzyme

DAT cao so với việc nuôi cấy rễ tơ biểu hiện hoạt tính beta-glucuronidase. Phân

tích chất chuyển hóa thứ cấp bằng sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy

các hàm lượng alkaloid thay đổi trong các dòng thể hiện mạnh gen DAT [65].

Jiayi Sun và cs (2016), nghiên cứu tạo dòng rễ tơ chuyển gen mã hóa anthranilate

synthase từ cây Arabidopsis cho thấy tăng quá mức hàm lượng anthranilate

synthase đều dẫn đến tăng hoặc giảm các TIA trong cây dừa cạn [53]. Nghiên

cứu của Qifang Pan và cs (2012), cho thấy sự biểu hiện quá mức ORCA3 tạo ra

sự gia tăng đáng kể sự tích tụ của strictosidine, vindoline, catharanthine và

ajmalicine trong dừa cạn. Tuy nhiên, việc tăng cường tổng hợp MIA bằng sự thay

đổi nhân tố phiên mã ORCA3 và G10H có thể ảnh hưởng đến các quá trình trao

đổi chất khác trong quá trình chuyển hóa ở cây dừa cạn.

Theo hướng này, Wang và cs (2012) [113], khi phân tích bằng sắc ký lỏng

cho thấy các cây dừa cạn chuyển gen DAT với việc sử dụng vector chuyển gen

pCAMBIA2301 nhận thấy, khi gen DAT biểu hiện quá mức thì làm tăng hàm

lượng vindoline từ 1,42 -2,72 μg mg (khối lượng khô) và 1,15 μg/mg trong quá

trình tổng hợp alakaloid ở cây dừa cạn so với cây không chuyển gen. Tuy nhiên,

Wang và cs (2012) mới chỉ sử dụng Real time PCR để phân tích biểu hiện gen

DAT ở mức phiên mã mà chưa phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp DAT ở cây

dừa cạn chuyển gen. Gen chuyển DAT được phiên mã tạo mRNA, tuy nhiên

mRNA có bị phân hủy bởi cơ chế RNA interference hoặc bị ức chế dịch mã hay

không thì Wang và cs (2012) chưa chứng minh được. Nghiên cứu của chúng tôi

đã chứng minh được gen chuyển CrDAT đã được dịch mã tổng hợp protein

CrDAT tái tổ hợp, gen chuyển CrDAT được biểu hiện mạnh hơn những cây đối

chứng không chuyển gen bằng phân tích ELISA. Đây là điểm khác biệt về kết

quả nghiên cứu của chúng tôi so với kết quả của Wang và cs (2012).

DAT là enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối cùng trong quá trình

sinh tổng hợp vindoline ở cây dừa cạn và bằng sự biểu hiện mạnh gen CrDAT

làm tăng hàm lượng protein DAT và dẫn đến hiệu quả hoạt động của enzyme

DAT được tăng cường. Nghiên cứu của chúng tôi chuyển gen CrDAT phân lập từ

cây dừa cạn hoa hồng tím vào chính cây dừa cạn qua nách lá mầm nhờ

A.tumefaciens nhằm tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme chìa khóa DAT.

Kết quả đã thu được bốn dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 (T1-1; T1-3; T1-

6; T1-7 ) có hàm lượng alkaloid tăng từ 3,16 lần đến 15,17 lần so với cây đối

chứng không chuyển gen. Như vậy, kết quả biểu hiện mạnh gen CrDAT trong cây

dừa cạn đã chứng minh rằng, bằng kỹ thuật chuyển gen có thể cải thiện được hàm

lượng alakaloid trong cây dừa cạn.

100

K T LU N VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1.1. Gen CrDAT phân lập từ hai giống dừa cạn TN1 và TN2 đã được tách dòng

phân tử và xác định trình tự nucleotide. Gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320

bp, mã hóa cho 439 amino acid.

1.2. Vector chuyển gen thực vật pBI121-CrDAT được thiết kế và biểu hiện thành

công trên cây thuốc lá, protein tái tổ hợp CrDAT có kích thước khoảng 51 kDa.

1.3. Môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 10 g/l; BAP 1,0 mg/l và IBA

0,6 mg l; nước dừa 100 ml l; pH = 5,8 thích hợp cho sự phát sinh chồi và sự sinh

trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên. Môi trường MS bổ sung sucrose

30 g/l; agar 10 g/l; BAP 0,5 mg/l và IBA 0,4 mg l; nước dừa 100 ml/l; pH =

5,8 thích hợp cho sự phát sinh chồi và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm. Hiệu

quả chuyển gen gus vào cây dừa cạn qua nách lá mầm được tối ưu ở mật độ

A.tumefaciens là OD600nm= 0,8; AS 100 µM và thời gian nhiễm khuẩn 30 phút;

chọn lọc bằng kháng sinh Km thích hợp ở nồng độ 50 mg/l.

1.4. Cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc được chuyển thành công vào cây dừa cạn hoa

hồng tím với hiệu suất chuyển gen là 1,02%. Protein tái tổ hợp CrDAT được biểu

hiện ở 4 dòng dừa cạn chuyển gen T1 có khối lượng phân tử khoảng 51 kDa, hàm

lượng protein tái tổ hợp dao động từ 2,87 µg mg đến 5,12 µg mg. Các dòng dừa

cạn chuyển gen CrDAT ở thế hệ T1 có hàm lượng alkaloid tổng số tăng so với

dừa cạn đối chứng không chuyển gen từ 3,16 - 15,17 (lần).

2. Đề nghị

Tiếp tục phân tích và đánh giá bốn dòng dừa cạn chuyển gen (T1-1, T1-3,

T1-6, T1-7) ở các thế hệ T2, T3,... nhằm chọn được dòng dừa cạn chuyển gen có

hàm lượng alkaloid cao và ổn định.

101

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN Đ N LU N ÁN

Các bài báo

1. Bùi Thị Hà, Hồ Mạnh Tường, Hoàng Phú Hiệp, Lê Văn Sơn, Nguyễn Thị

Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015), “Tách dòng phân tử và thiết kế vector chuyển gen

DAT phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don), TAP CHI

SINH HOC 37(2), tr 236-243.

2. Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015),

“Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồi in vitro ở cây dừa cạn (Catharanthus

roseus (L.).G.Don)”, Tạp chí Khoa học Tự nhiên và công nghệ, Đại học Quốc gia

Hà Nội 31(4S), tr 56-62.

3. Bùi Thị Hà, Đỗ Huy Hoàng, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2016),

“Nghiên cứu quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.

Don)”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 157 (12/1), tr. 89-95.

4. Thi Ha Bui, Ngoc Lan Thi Nguyen, Thi Tam Nguyen, Van Son Le, Hoang

Mau Chu (2018), “Expression analysis of the recombinant Catharanthus roseus

deacetylvindoline 4-O-acetyl transferase in tobacco plants”. Australian Journal of

Crop Science (AJCS) (Scopus) chấp nhận đăng ngày 9-2-2018.

Các trình tự gen đã đăng ký trên Ngân hàng Gen quốc tế

[1]. Bui H.T., Hoang H.P., Nguyen T.T. and Chu M.H (2015), Catharanthus

roseus mRNA for DAT enzyme (DAT gen), isolate TN1 (Pink-purple flower),

GenBank: LN809930.1

[2]. Bui H.T., Hoang H.P., Nguyen T.T. and Chu M.H (2015), Catharanthus

roseus mRNA for DAT enzyme (DAT gen), isolate TN2 (White flower),

GenBank: LN809931.1

102

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam, NXB

Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.

2. Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn (2011), "Nghiên cứu chiết tách alkaloid của

rễ cây dừa cạn hoa hồng tại Bình Định", Tạp chí Khoa học và Công nghệ -

Đại học Đà Nẵng, 43(2), tr. 85 - 92.

3. Đỗ Xuân Đồng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Nghiên cứu quy

trình tái sinh và hệ thống chuyển gen cà chua của Việt Nam”, Tạp chí Công

nghệ Sinh học, 5(2), tr. 217- 223.

4. Hoàng Thị Giang, Mai Đức Chung, Nguyễn Thị Huế, Jeremy Lavarenne,

Mathieu Gonin, Nguyễn Thanh Hải, Đỗ Năng Vịnh, Pascal Gantet (2015),

“Hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống lúa Taichung 65 thông qua vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí khoa học và nông nghiệp Việt

Nam, 13(5), tr. 764 - 773.

5. Nguyễn Thu Hiền (2014), Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt

của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật, Luận

án tiến sĩ Sinh học, Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

6. Võ Thị Thúy Huệ, Mã Yến Thanh (2011), “Thiết lập quy trình tái sinh in

vitro và đánh giá bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha

curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí KHKT Nông

Lâm Nghiệp, số 1, tr. 6 - 10.

7. Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân lập tạo đột biến điểm ở gen P5CS

liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt

Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

103

8. Vũ Thị Lan, Mai Thị Phương Nga, Nguyễn Trung Nam, Phạm Bích Ngọc,

Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2013), “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng

đến hiệu quả chuyển gen gus vào khoai lang thông qua Agrobacterium

tumefaciens”, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc,

NXB Đại học Thái Nguyên, tr. 888 - 892.

9. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng (2006), "Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng

trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa

cạn Catharanthus roseus.", Tạp chí Phát triển KH & CN- ĐHQG TP. HCM,

9(6), tr. 59 - 66.

10. Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo

trình công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội.

11. Trần Lê Lưu Li, Nguyễn Hữu Hoàng, Bùi Lan Anh (2008), “Thử nghiệm

chuyển gen trên lan hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) bằng phương pháp bắn

gen và Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí phát triển KH&CN- ĐH Quốc

gia TP.HCM, 11(10), tr. 109 - 113.

12. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.

13. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong

chọn giống cây trồng, NXB Đại học Thái Nguyên.

14. Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường

Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2012), “Nghiên cứu quy trình chuyển

gen vào cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb)”, Tạp chí Sinh học, 34(3), tr.

389 - 396.

15. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Thu (2007), “Chuyển gen gus vào đỉnh phôi

hạt chín giống đậu tương DT12 thông qua Agrobacteria tumefaciens”, Tạp

chí Công nghệ Sinh học, 5(4), tr. 471- 478.

104

16. Hoàng Thị Thao (2017), Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả

năng kháng mọt, Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học Sư phạm - Đại học

Thái Nguyên.

17. Bùi Văn Thắng, Đỗ Xuân Đồng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013), “Quy

trình chuyển gen vào cây xoan ta (Melia azedazach L.) đạt hiệu suất cao”,

Tạp chí Sinh học, 35(2), tr. 227 - 233.

18. Đoàn Thu Thủy, Trịnh Quốc Cần, N Baiskh, O Normal, SW Datta (2008),

“Kết quả chuyển gen gus vào cây lúa với sự điều khiển của các promoter

khác nhau”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(3), tr. 321- 326

19. Vì Thị Xuân Thủy (2017), Nghiên cứu đặc điểm và biểu hiện gen liên quan

đến tính kháng mọt phân lập từ cây ngô, Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học

Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

20. Vương Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cường, Phan Thị Mỵ Lan (2012), “Nghiên

cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen gus vào phôi trưởng thành 6

gia đình Thông nhựa bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Kết quả

nghiên cứu Khoa học công nghệ lâm nghiệp giai đoạn 2006-2010, NXB

Nông nghiệp, tr. 60 - 66.

21. Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1,

NXB Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội.

Tài liệu Tiếng Anh

22. Allen G. J., Murata Y., Chu S. P., Nafisi M., Schoeder J. I. (2002),

“Hypersensitivity of abscisic acid-induced cytosolic calcium increases in the

Arabidopsis farnesyltransferase mutant era1-2”, Plant Cell, 14(7), pp. 1649 -

1662.

105

23. Amirjani M. R. (2013), “Effects of drought stress on the alkaloid contents

and growth parameters of Catharanthus roseus”, ARPN Journal of

Agricultural and Biological Sciences 8(11), pp. 745 - 750.

24. Arcuri H. A., Zafalon G. F. D., Marucci E. A., Bonalumi C. E., Da Silviera

N. J. F., Machado J. M., De Azevedo W. F., Palma M. S. (2010), “SKPDB:

a structural database of shikimate pathway enzymes”, BMC Bioinformatics,

Jan 7;11:12. doi: 10.1186/1471-2105-11-12.

25. Benoid St-Pierre, Pierre Laflamme, Anne-Marie Alarco and Vincenzo De

Luca (1998), “The terminal O-acetyltransferase involved in vindoline

biosynthesis defines a new class of proteins responsible for coenzyme A-

dependent acyl transfer”, The Plant Journal, 14(6), pp. 703 - 713.

26. Bernays E. A. (1982), The insect on a plant- A closer look in: insect-plant

Relationships, Wageningen, pp. 3 – 17.

27. Brown R. L., Kazan K., McGrath K. C., Maclean D. J., Manners J. M.

(2003), “A role for the GCC-box in jasmonate-mediated activation of the

PDF1.2 gen of Arabidopsis”. Plant Physiology, 132, pp. 1020 – 1032.

28. Brukhin V., Clapham D., Elfstrand M., von Arnold S. (2000), “Basta

tolerance as a selectable and screening marker for transgenic plants of

Norway spruce”, Plant Cell Reports, 19(9), pp. 899 - 903.

29. Campous-Tamayo F., Hernandez-Dominguez E., Vazquez-Flota F. A.

(2008), "Vindoline formation in shoot cultures of Catharanthus roseus is

synchronously activated with morphogensis through the last biosynthetic

step", Annals of Botany, 102(3), pp. 409 - 415

30. Canel C., Lopes-Cardoso M. I., Whitmer S., van der Fits L., Pasquali G., van

der Heijden R., Hoge J. H. C., Verpoorte R. (1998), "Effects of over-

expression of strictosidine synthase and tryptophan decarboxylase on

106

alkaloid production by cell cultures of Catharanthus roseus", Planta, 205

(3), pp. 414 – 419.

31. Collu G., Unver N., Peltenburg-Looman A. M. G., van der Heijden R.,

Verpoorte R., Memelink J. (2001), "Geraniol 10-hydroxylase, a cytochrome

P450 enzyme involved in terpenoid indole alkaloid biosynthesis", FEBS

Letters, 16: 508(2), pp. 215 – 220.

32. Contin A., van der Heijden R., Lefeber A. W. M., Verpoorte R. (1998), "The

iridoid glucoside secologanin is derived from the novel triose

phosphate/pyruvate pathway in a Catharanthus roseus cell culture", FEBS

Letters, 434(3,4), pp. 413 – 416

33. Costa M. M. R., Hilliou F., Duarte P., Pereira L. G., Almeida I., Leech M.,

Memelink J., Barcelo A. R., Sottomayor M. (2008), "Molecular cloning and

characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the

metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus", Plant

Physiology, 146, pp. 403 – 417.

34. Choi P. S., Kim Y. D., Choi K. M., Chung H. J., Choi D. W., Liu J. (2004), "

Plant regenration from hairy-root cultures transformed by infection with

Agrobacterium rhizogenes in Catharanthus roseus", Plant Cell Reports,

22(11), pp. 828 – 831.

35. Dao Xuan Tan, Ho Manh Tuong, Vu Thi Thu Thuy, Le Van Son, and Chu

Hoang Mau (2015), "Cloning and overexpression of GmDREB2 gen from

Vietnamese drought-resistant soybean variety", Brazilian Archives Biology

and Technology, 58 (5), pp. 651 - 657.

36. De Carolis E., Chan F., Balsevich J., De Luca V. (1990), "Isolation and

characterization of a 2-oxoglutarate dependent dioxygenase involved in the

107

second-to-last step in vindoline biosynthesis", Plant Physiology, 94(3), pp.

1323 –1329.

37. De Luca V., Balsevich J., Tyler R. T., Eilert U., Panchuk B. D., Kurz W. G.

W. (1986), "Biosynthesis of indole alkaloids: developmental regulation of

the biosynthetic pathway from tabersonine to vindoline in Catharanthus

roseus", Journal of Plant Physiology, 125(1-2), pp. 147 – 156.

38. De Luca V., Cutler A. J. (1987), "Subcellular localization of enzymes

involved in indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus", Plant

Physiology, 85(4), pp.1099 – 1102.

39. De Waal A., Meijer A. H., Verpoorte R. (1995), "Strictosidine synthase from

Catharanthus roseus: purification and characterization of multiple forms",

Biochemical Journal, 306 (2), pp. 571 – 580.

40. Facchini P. J., De Luca V. (2008), "Opium poppy and Madagascar

periwinkle: model non-model systems to investigate alkaloid biosynthesis in

plants", Plant Journal ,54(4), pp. 763 – 784.

41. Ferlay, I. Soerjomataram, R. Dikshit, S. Eser, C. Mathers, M. Rebelo, D. M.

Parkin, D. Forman, F. Bray (2014), “Globocan, Cancer Incidence and

Mortality Worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN

2012”, International Journal of Cancer, 136(5), doi:10.1002/ijc.29210

PMID:25220842.

42. Finer K. R., Finer J. J., (2000), "Use of Agrobacterium expressing green

fluorescent protein to evaluate colonization of sonication-assisted

Agrobacteriummediated transformation-treated soybean cotyledons", Letters

in Applled Microbiology, 30, pp. 406 – 410.

43. Global Burden of Disease Study 2015 provides GPS for global health 2030

(GBD) Collaborators (630) (2016), "Global, regional, and national

108

incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and

injuries: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study

2015", Lancet, 388 (10053), pp. 1545 – 1602.

44. Gajalakshmi S., Vijayalakshmi S., and Rajeswari V. (2013),

"Pharmacological activities of catharanthus roseus: A perspective review",

Internaltional Joural of Phama Bio Sciences, 4(2), pp. 431 – 439.

45. Goddijin O. J. M., De Kam R. J., Zanetti A., Schilperoort R. A., Hoge J.

H.C. (1992), "Auxin rapidly down-regulates transcription of the tryptophan

decarboxylase gen from Catharanthus roseus", Plant Molecular Biology,

18(6), pp. 1113 – 1120.

46. Guillon S., Gantet P., Trémouillaux-Guiller J., Thiersault M., Rideau M.

(2008), Hairy Roots of Catharanthus roseus: Efficient routes to monomeric

indole alkaloid, Bioactive Molecules and Mdicinal Plants, pp. 285 – 295.

47. Hedhili S., Courdavault V., Giglioli-Guivarc’h N., Gantet P. (2007),

“Regulation of the terpene moiety biosynthesis of Catharanthus roseus

terpene indole alkaloids", Phytochemistry Reviews, 6(2-3), pp. 341 – 351.

48. Hernandez-Dominguez E., Campos-Tamayo F., Vazquez-Flota F. (2004),

"Vindoline synthesis in vitro shoot cultures of Catharanthus roseus",

Biotechnology Letters, 26(8), pp. 671 – 674.

49. Hughes E., Hong S., Gibson S., Shanks J., San K., (2004), "Metabolic

engineering of the indole pathway in Catharanthus roseus hairy roots and

increased accumulation of tryptamine and serpentine", Metabolic

Engineering, 6(4), pp. 268 – 276.

50. Jaggi M., Kumar S., Sinha A. K. (2011), “Overexpression of an apoplastic

peroxidase gen CrPrx in transgenic hairy root lines of Catharanthus

109

roseus”, Applied Microbiology Biotechnology, 90(3), pp. 1005 - 1016,

doi:10.1007/ s00253-011-3131-8.

51. Jefferson R. A., Kavanagh T. A., and Bevan M. W. (1987), “GUS fusion: β-

glucuronidase as a sensitive and versatile gen fusion marker in higher

plants”, The EMBO Journal, 6(13), pp. 3901 - 3907.

52. Jiaqi Liu, Junjun Cai, Rui Wang and Shihai Yang (2017), "Transcriptional

Regulation and Transport of Terpenoid Indole Alkaloid in Catharanthus

roseus: Exploration of New Research Directions", Internaltional Journal of

Molecular Bio Sciences, 18(1), pp.53.

53. Jiayi Sun (2016), “Examining the Transcriptional Response of

Overexpressing Anthranilate Synthase in the Hairy Roots of an Important

Medicinal Plant Catharanthus Roseus by RNA-seq”, BMC plant Biology, 16

(1), pp. 108, doi: 10.1186/s12870-016-0794-4.

54. Kittakoop P., Mahidol C., Ruchirawat S. (2014), "Alkaloids as important

scaffolds in therapeutic drugs for the treatments of cancer, tuberculosis,

and smoking cessation", Current Topics Medicinal Chemistry, 14 (2), pp.

239 - 252.

55. Knaggs A. R. (2001), "The biosynthesis of shikimate metabolites", Natural

Product Reports, 18(3), pp. 334 - 355.

56. Kumar S., Dutta A., Sinha A. K., Sen J. (2007), “Cloning characterization

and localization of a novel basic peroxidase gen from Catharanthus

roseus”, FEBS Journal, 274(5), pp. 1290 – 1303.

57. Laemmli UK (1970), “Cleavage of structural protein during the assembly of

the head of Bacteriophage T4”, Nature, 227, pp. 680 - 685.

110

58. Laflamme P., St Pierre B., De Luca V. (2001), “Molecular and biochemical

analysis of a Madagascar periwinkle root - specific minovincinine – 19 -

hydroxy-O-acetyltransferase. Plant Physiology, 125, pp. 189 – 198.

59. Levac D., Murata J., Kim W. S., De Luca V. (2008), “Application of

carborundum abrasion for investigating leaf epidermis: molecular cloning of

Catharanthus roseus 16-hydroxy-tabersonine-16-Omethyltransferase” Plant

Journal, 53(2), pp. 225 – 236.

60. Liu Z., Park B. J., Kanno A., Kameya T. (2005), “The novel use of a

combination of sonication and vacuum infiltration in Agrobacterium-

mediated transformation of kidney bean (Phaseolus vulgaris L.) with lea

gen”, Molecular Breeding, 16, pp. 189 – 197.

61. Liscombe D. K., Usera A. R., O’Connor S. E. (2010), “Homologue of

tocopherol C methyltransferases catalyzes N methylation in anticancer

alkaloid biosynthesis”, Proceedings of the National Academy of Sciences of

the USA, 107(44), pp.18793 –18798.

62. Lo Thi Mai Thu, Vi Thi Xuan Thuy, Le Hoang Duc, Le Van Son, Chu

Hoang Ha, Chu Hoang Mau (2016), “RNAi-mediated resistance to SMV

and BYMV in transgenic tobacco”, Crop Breeding and Applied

Biotechnology, 6, pp. 213 - 218.

63. Lorena Almagro, Francisco Fernández-Pérez and Maria Angeles Pedreño

(2015), Indole Alkaloids from Catharanthus roseus: Bioproduction and

Their Effect on Human Health, Molecules, 20(2), pp. 2973 - 3000;

doi:10.3390/molecules20022973.

64. Magnotta M, Murata J, Chen J, De Luca V. (2006), Identification of a low

vindoline accumulating cultivar of Catharanthus roseus (L.) G Don. by

alkaloid and enzymatic profiling. Phytochemistry, 67, pp. 1758 – 1764.

111

65. Magnotta M, Murata J, Chen J, De Luca V. (2007), “Expression of

deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase in Catharanthus roseus hairy

2007.04.037.

roots”.Phytochemistry 68(14), pp. 1922- 1931. doi:10.1016/j. phytochem.

66. Marfori E. C., Alejar A. A., (1993), “Alkaloid yield variation in callus

cultures derived from different plant parts of white and rosy-purple

periwinkle Catharanthus roseus (L.) Don”. Philippine Journal of

Biotechnology, 4(1), pp. 1 - 8.

67. Meehan T.D., Coscia C.J. (1973), Hydroxylation of geraniol and nerol by a

monooxygenase from Vinca rosea. Biochemistry Biophys Res Commun 53,

pp. 1043 – 1048.

68. Mei-Liang Zhou, Xue-Mei Zhu, Ji-JongShao, Yan-Min Wu, Yi-Xiong Tang

(2012), An protocol for gentic transformation of catharanthus roseus by

Agrobacterium rhizogenes A4. Appl Biochemistry Biotechnology; 166(7),

pp. 1674 - 1684.

69. Mohsen Zargar, Farah Farahani, Tahereh Nabavi (2010), Hairy roots

production of transgenic Catharanthus roseus L. plants with Agrobacterium

rhizogens under in vitro conditions, Journal of Medicinal Plants Research,

4(21), pp. 2199 - 2200.

70. Moreno PRH, Van der Heijden R, Verpoorte R. (1995), Cell and tissue

cultures of Catharanthus roseus: a literature survey II. Updating from 1988

to 1993. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 42, pp. 1 – 25.

71. Murashige, T and F. Skoog. (1962), “Arevised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco cultures”, Physiology plant: 15, pp. 473 - 479.

72. Murray M. G., Thompson W. F. (1980), “Rapid isolation of high molecular

weight plant DNA”, Nucleic Acids Res., 8(19), pp. 4321- 4325.

112

73. Nisa Nur Iskandar and Iriawati (2016), “Vinblastine and Vincristine

Production on Madagascar Periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

Callus Culture Treated with Polethylene Glycol”, Makara Journal of

Science, 20/1, pp. 7 - 16 doi: 10.7454/mss.v20i1.5656.

74. Noble R. L. (1990), “The discovery of the vinca alkaloids–chemotherapeutic

agents against cancer”. Biochemistry Cell Biology, 68(12), pp. 1344 – 1351.

75. Noé W., Mollenschott C., Berlin J. (1984), “Tryptophan decarboxylase from

Catharanthus roseus cell suspension cultures: purification, molecular and

kinetic data of the homogenous protein”, Plant Molecular Biology 3(5), pp.

281 – 288.

76. Nowacki E. and Wezyk S., (1960), “Preliminary reseach on lupin alkaloid.

Toxicity for Rabbit organism”, Rozniki Nauk Rolinkzych, pp. 75 - 383.

77. O’Keefe B. R., Mahady G. B., Gills J. J., Beecher C. W. W. (1997), “Stable

vindoline production in transformed cell cultures of Catharanthus roseus”,

Journal of Natural Products 60(3), pp. 261 – 264.

78. Park B.J., Liu Z., Kanno A., Kameya T. (2005), “Transformation of radish

(Raphanus sativus L.) via sonication and vacuum infiltration of germinated

seeds with Agrobacterium harboring a group 3 LEA gen from B. napus”,

Plant Cell Reports, 24(8), pp. 494 – 500.

79. Pahwa D. (2008), Catharanthus alkaloids, B. Pharm Punjab University

Chandigarh.

80. Peebles C. A., Sander G. W., Hughes E. H., Peacock R., Shanks J. V., San

K. Y. (2011), “The expression of 1-deoxy-D-xylulose synthase and

geraniol-10-hydroxylase or anthranilate synthase increases terpenoid indole

alkaloid accumulation in Catharanthus roseus hairy roots”, Metabolic

England, 13(2), pp. 234 – 240.

113

81. Power R., Kurz W. G., De Luca V. (1990), “Purification and

characterization of acetylcoenzyme A: deacetylvindoline 4-O-

acetyltransferase from Catharanthus roseus”, Arch Biochemistry

Biophysology, 279(2), pp. 370 - 376.

82. Qifang Pan., Quan Wang., Fang Yuan., Shihai Xing., Jingya Zhao., Young Hae Choi., Robert Verpoorte., Yuesheng Tian., Guofeng Wang and Kexuan

Tang. (2012), “Overexpression of ORCA3 and G10H in Catharanthus

roseus Plants Regulated Alkaloid Biosynthesis and Metabolism Revealed by

NMR-Metabolomics”, BMC Biotechnology, 7(8), pp. 12 - 34. doi:

10.1186/1472-6750.

83. Qiu S., Sun H., Zhang A. H., Xu H. Y., Yan G. L., Han Y., Wang X. J.

(2014), "Natural alkaloids: basic aspects, biological roles, and future

perspectives", Chinese Journal of Natural Medicines, 12 (6), pp. 401 –

406. doi:10.1016/S1875-5364 (14) 60063-7.PMID 24969519.

84. Robert A. Meyers, Encyclopedia of Physical Science and Technology , 3rd

edition. ISBN 978-0-12-227410-7.

85. Roepke J., Salim V., Wu M., Thamm A. M. K., Murata J., Ploss K.,

Boland W., De Luca V. (2010), “Vinca drug components accumulate

exclusively in leaf exudates of Madagascar periwinkle”, Proceedings of

the National Academy of Sciences of the United States of America,

107(34), pp. 15287 – 15292.

86. Russo P., Frustaci A., Del Bufalo A., Fini M., Cesario A. (2013),

“Multitarget drugs of plants origin acting on Alzheimer's disease”, Current

Medicinal Chemistry. 20 (13), pp. 1686 - 1693.

87. Sambrook J., Russell D W., (2001), Molecular Cloning: A Laboratory

Manual. NeW York, Cold Sping Harbor Laboratory Press.

114

88. Santarém ER., Trick HN., Essig JS., Finer JJ. (1998), “Sonication assisted

Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons:

optimization of transient expression”. Plant Cell Reports, 17 (10), pp. 752 – 759.

89. Shihai Xing., Qifang Pan., Yuesheng Tian., Quan Wang., Pin Liu., Jingya

Zhao., Guofeng Wang1., Xiaofen Sun., Kexuan Tang. (2011), “Effect of

plant growth regulator combinations on the biosynthesis of terpenoid indole

alkaloids in Catharanthus roseus”. Journal of Medicinal Plants Research

5(9), pp. 1692 - 1700.

90. Smith B D. (1966), “Effect of plant alkaloid sparteine on the distribution of

the aphid Acythosiphon spartii”, Nature 212, pp. 213 - 214.

doi:10.1038/212213b0.

91. Southern EM. (1975), “Detection of specific sequences among DNA

fragments separated by gel electrophoresis”, Journal of molecular Biology,

98(3), pp. 503 - 517.

92. Srivastava T., Das S., Kumar Sopory S., Srivastava PS. (2009), “A reliable

protocol for transformation of Catharanthus roseus through Agrobacterium

tumefaciens”, Physiology and molecular biology of plants, 15(1), pp. 93 - 98.

93. St-Pierre B., De Luca V. (1995), “A Cytochrome P-450 Monooxygenase

Catalyzes the First Step in the Conversion of Tabersonine to Vindoline in

Catharanthus roseus”. Plant Physiology 109(1), pp. 131 - 139.

94. St-Pierre B., Laflamme P., Alarco AM., De Luca V. (1998), “The terminal

Oacetyltransferase involved in vindoline biosynthesis defines a new class of

proteins responsible for coenzyme A dependent acyl transfer”. Plant

Journal 14(6), pp. 703 – 713

115

95. St-Pierre B., Vazquez-Flota FA., De Luca V. (1999), “Multicellular

compartmentation of Catharanthus roseus alkaloid biosynthesis predicts

intercellular translocation of a pathway intermediate”. Plant Cell 11(5), pp.

887 – 900.

96. Stevens LH., Blom TJM., Verpoorte R. (1993), “Subcellular localization of

tryptophan decarboxylase, strictosidine synthase and strictosidine

glucosidase in suspension cultured cells of Catharanthus roseus and

Tabernaemontana divaricata”. Plant Cell Reports., 12(10), pp. 573 – 576.

97. Shukla AK., Shasany AK., Verma RK., Gupta MM., Mathur AK., Khanuja

SPS. (2010), “Influence of cellular differentiation and licitation on

intermediate and late steps of terpenoid indole alkaloid biosynthesis in

Catharanthus roseus”. Protoplasma 242, pp. 35 – 47.

98. Sun HJ., Cui ML., Ma B., Ezura H. (2006), “Functional expression of the

tastemodifying protein, miraculin, in transgenic lettuce”, FEBS Letters, 580

(2), pp. 620 - 626.

99. Taha HS., Salah EM., Ola IM., El-Hamshary., Nahla S E A., Naglaa., M N.,

El-Bahr M., Medhat M., El-Nasr S. (2008), “In vitro studies on Egyptian

Catharanthus roseus (L.) G. Don: III. Effects of extra tryptophan

decarboxylase and strictosidine synthase gen copies in indole alkaloid

production”, Journal of Cell and Molecular Biology, 2(2), pp. 18 - 23.

100. Tanaka N., Takao M., Matsumoto T. (1994), “Agrobacterium rhizogenses-

mediated transformation and regenration of vinca minor L”. Plant Tissue

Culture Letters, 11(3), pp. 191 - 198.

101. Thanh Son LO., Hoang Duc LE., Vu Thanh Thanh NGUYEN., Hoang Ha

CHU., Van Son LE., Hoang Mau CHU. (2015), “Overexpression of a

soybean expansin gen, GmEXP1, improves drought tolerance in transgenic

tobacco”. Turkish Journal of Botany 39, pp. 988 - 995.

116

102. Toki K., Saito N., Irie Y., Tatsuzawa F., Shigihara A., Honda T. (2008), “7-

O-Methylated anthocyanidin glycosides from Catharanthus roseus”.

Phytochemistry. 69 (5), pp. 1215 – 1219. doi:10.1016/j. phytochem.

2007.11.005.

103. Topping J F., Foster G D., Taylor S C. (1998), “Plant virology protocols,

from virus isolation to transgenic resistance”, Human Press, Totowa, 81, pp.

365 - 480.

104. Vancanneyt G., Schmidt R., Connor-Sanchez AO., Willmitzer L., Sosa MR

(1990), “Contruction of an intron-containing maker gen: Splicing of the

intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in

Agobacterium-mediated plants transformation”. Molecular Gen gent, 220,

pp. 245 - 250.

105. Van der Heijden R., Jabos DJ., Snoeijer W., Hallard D., Verpoorte R.

(2004), “The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology”.

Current medicinal chemistry. 11(5), pp. 607 – 628.

106. Van der Fits L., Memelink J (2000), “ORCA3, a jasmonate - responsive

transcriptional regulator of plant primary and secondary metabolism”.

Science, 289 (5477), pp. 295 - 297.

107. Vázquez - Flota F., Vincenzo De Luca V. (1998), “Jasmonate modulates

development and light regulated alkaloid biosynthesis in Catharanthus

roseus”. Phytochemistry 49(2), pp. 395 – 402.

108. Vázquez - Flota FA., St-Pierre B., De Luca V. (2000), “Light activation of

vindoline biosynthesis does not require cytomorphogensis in Catharanthus

roseus seedlings”. Phytochemistry 55(6), pp. 531 – 536.

109. Vázquez - Flota F., De Luca V., Carrillo - Pech M., Canto - Flick A., de

Lourde M - Ham M. (2002), “Vindoline biosynthesis is transcriptionally

117

blocked in Catharanthus roseus cell suspension cultures”. Molecular

Biotechnology 22(1), pp. 1 - 8.

110. Verma P., Mathur AK (2011a), “Direct shoot bud organogensis and plant

regenration from leaf explants in Catharanthus roseus. Plant Cell”, Tissue

and Organ Culture. 106(3), pp. 401 – 408.

111. Verma P., Mathur AK (2011b), “Agrobacterium tumefaciens - mediated

transgenic plant production via direct shoot bud organogensis from

preplasmolyzed leaf explants of Catharanthus roseus”. Biotechnology

Letters, 33 (5), pp. 1053 - 1060.

112. Wang Q., Yuan F., Pan Q., Li M., Wang G., Zhao J., Tang K. (2010),

“Isolation and functional analysis of the Catharanthus roseus

deacetylvindoline-4-Oacetyltransferase gen promoter”. Plant Cell Reports,

29(2), pp. 185 - 192.

113. Wang Q., Shihai Xing, Qifang Pan., Fang Yuan., Jingya Zhao.,

Yuesheng Tia., Yu Chen., Guofeng Wang., Kexuan Tang. (2012),

“Development of efficient catharanthus roseus regenration and

transformation system using Agrobacterium tumefaciens and hypocotyls as

explants”. BioMed Central Biotechnology, pp. 12 - 34 doi: 10.1186/1472-

6750-12-34.

114. Whitmer S., Canel C., Hallard D., Goncalves C., Verpoorte R. (1998),

“Influence of precursor availability on alkaloid accumulation by transgenic

cell line of Catharanthus roseus”. Plant Physiology, 116(2), pp. 853 – 857.

115. Whitmer S., Canel C., van der Heijden R., Verpoorte R. (2003), “Long - term

instability of alkaloid production by stably transformed cell lines of

Catharanthus roseus”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 74(1), pp. 73 – 80.

118

116. Zárate R., Verpoorte R. (2007), “Strategies for the gentic modification of

the medicinal plant Catharanthus roseus (L.) G. Don” Phytochemistry.

Reviews 6(2-3), pp. 475 - 491.

117. Zhao J., Zhu WH., Hu Q. (2001), “Effects of light and plant growth

regulators on the biosynthesis of vindoline and other indole alkaloids in

Catharanthus roseus callus cultures”. Plant Growth Regulation 33(1),

pp. 43 - 49.

118. Zhao L., Sander GW., Shanks JV. (2013), “Perspectives of the metabolic

engineering of terpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus hairy

roots”. Advances in Biochemical Eng Biotechnology(;134), pp. 23 - 54.

119. Woolley JG (2001), Plant Alkaloids. Encyclopedia of life science. Nature

Publishing Group / www.els.net (11 peges).

Trang web

120. http://www.chm.bris.ac.uk/webprojects2002/jjones/Content/vincristine.htm

119

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng trong nghiên cứu

P1.1. Sơ đồ cấu trúc vector tách dòng pBT

P1.2. Sơ đồ cấu trúc vector pCB-gusplus

120

P1.3. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pRTRA7/3

P1.4. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121

121

Phụ lục 2. Thành phần môi trường sử dụng trong nuôi cấy in vitro và chuyển gen

P2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy in vitro cây thuốc lá

Môi trƣờng

Thành phần

Nảy mầm

MS1(20ml/l) + MS2 (20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) +

(MS)

MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + sucrose (30g/l); pH=5,8