Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm có giá trị từ quả táo mèo (Docynia indica (Wall.) Decne) ở Việt Nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

LÊ XUÂN DUY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÂY DỰNG QUY

TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT ĐỂ TẠO SẢN PHẨM CÓ GIÁ

TRỊ TỪ QUẢ TÁO MÈO (DOCYNIA INDICA (WALL.) DECNE) Ở

VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Hà Nội - 2020

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

LÊ XUÂN DUY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÂY DỰNG QUY

TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT ĐỂ TẠO SẢN PHẨM CÓ GIÁ

TRỊ TỪ QUẢ TÁO MÈO (DOCYNIA INDICA (WALL.) DECNE) Ở

VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

Mã số chuyên ngành: 9.52.03.01

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng

2. PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của

PGS. TS Vũ Đình Hoàng và PGS. TS Nguyễn Mạnh Cường. Các số liệu và kết

quả thu được trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong

bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Lê Xuân Duy

Ngũ Trường Nhân

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Với sự kính trọng, lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng

biết ơn tới PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường và PGS.TS. Vũ Đình Hoàng là những

người thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian

thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện Hóa học

các hợp chất thiên nhiên, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận án.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và

Phát triển sản phẩm thiên nhiên, Phòng Hóa sinh hữu cơ Viện Hóa học các hợp chất

thiên nhiên đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS. Young Ho Kim, Khoa Dược, Trường

Đại học Chungnam, Hàn Quốc đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt

thời gian thực hiện luận án

Cuối cùng, tôi xin gửi lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến gia đình đã

luôn quan tâm, giúp đỡ, khích lệ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả luận án

Lê Xuân Duy

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ ii

MỤC LỤC .................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ ix

DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... xii DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC .................................................................................... xv

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .......................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về cây táo mèo ....................................................................................... 3 1.1.1. Vài nét về họ Hoa hồng (Rosaceae) .............................................................. 4

1.1.2. Vài nét về chi Táo mèo (Docynia) ................................................................ 4

1.1.3. Phân bố và sản lượng táo mèo ở một số tỉnh trọng điểm nước ta ................... 5

1.2. Thành phần hóa học của táo mèo ......................................................................... 6 1.2.1. Các thành phần hóa học cơ bản. .................................................................... 6

1.2.2. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp được phân lập từ quả táo mèo ................... 7

1.2.3. Hoạt tính sinh học của táo mèo ................................................................... 10

1.3. Tình hình khai thác, chế biến và sử dụng quả táo mèo .................................... 14 1.3.1. Các sản phẩm chế biến truyền thống ........................................................... 14

1.3.2. Các sản phẩm chế biến theo công nghệ hiện đại .......................................... 14

1.4. Định hướng nghiên cứu ........................................................................................ 19 1.5. Vài nét về nhóm hợp chất phenolic ..................................................................... 20 1.5.1. Đặc điểm chung của các hợp chất phenolic ................................................. 20

1.5.2. Phân loại và hoạt tính sinh học các hợp chất phenolic ................................. 21

1.5.3. Chiết xuất phenolic từ thực vật ................................................................... 22

1.6. Giới thiệu về phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) và tối ưu hóa quy trình công nghệ hóa học ........................................................................................................ 27 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 29 2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 29 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 29 2.2.1. Phương pháp định lượng một số thành phần hóa học .................................. 29

2.2.2. Phương pháp xử lý, chiết xuất và phân lập các thành phần hóa học ............ 30 2.2.3. Phương pháp xác định tính chất hóa lý và cấu trúc hóa học ........................ 31

2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học .................................................... 31

2.2.5. Phương pháp chiết vi sóng, chiết siêu âm, chiết hồi lưu và chiết soxhlet ..... 34

2.2.6. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy trình công nghệ .... 35

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM ............................................................................... 37

3.1. Điều chế cao chiết tổng và các cao chiết phân đoạn .......................................... 37 3.1.1. Sơ đồ phân lập các thành phần hóa học từ cao chiết ethyl acetate quả táo

mèo .......................................................................................................... 38

3.1.2. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E2 .............................................. 39 3.1.3. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E3 .............................................. 39

3.1.4. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E5 .............................................. 40

3.1.5. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E6 .............................................. 40

3.1.6. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E7 .............................................. 40 3.1.7. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E8 .............................................. 41

3.2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của cao chiết phân đoạn và thành phần hóa học phân lập được........................................................................................................ 41

3.3. Quy trình chiết xuất phenolic và thiết lập mô hình nghiên cứu....................... 41 3.3.1. Quy trình chiết bằng phương pháp soxhlet .................................................. 42

3.3.2. Quy trình chiết xuất sử dụng vi sóng ........................................................... 42

3.3.3. Quy trình chiết xuất sử dụng siêu âm .......................................................... 43

3.3.4. Quy trình chiết xuất hồi lưu ........................................................................ 44

3.4. Quy trình sấy phun và thiết kế mô hình nghiên cứu ......................................... 45 3.4.1. Tiến hành thí nghiệm .................................................................................. 46

3.4.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm ....................................................... 46

3.5. Sơ đồ định hướng nghiên cứu quy trình công nghệ tạo sản phẩm bột cao

chiết táo mèo quy mô phòng thí nghiệm. ................................................................... 47

CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 48 4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ quả táo mèo ....................... 48 4.1.1. Hợp chất mới TM17, (3S-Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside) ....... 48

4.1.2. Hợp chất TM15 (chrysin) ............................................................................ 54 4.1.3. Hợp chất TM2 (quercetin)........................................................................... 55 4.1.4. Hợp chất TM5 (hyperin) ............................................................................. 57 4.1.5. Hợp chất TM36 (myricitrin)........................................................................ 58 4.1.6. Hợp chất TM16 (naringenin) ...................................................................... 60 4.1.7. Hợp chất TM10 (astilbin) ............................................................................. 61 4.1.8. Hợp chất TM7 (naringenin-7-O- β-D-glucopyranoside) .............................. 63 4.1.9. Hợp chất TM30 (2R/S)-5,7,3’,5’-tetrahydroxy-flavanone 7-O-β-D

glucopyranosie) ........................................................................................ 65

4.1.10. Hợp chất TM33 (Phloretin-2’-O-(β-D-xylopyranosyl-(16)-O-β-D

glucopyranoside)) ..................................................................................... 67

4.1.11. Hợp chất TM8 (phlorizin) ......................................................................... 69

4.1.12. Hợp chất TM37 (2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone) ................... 70 4.1.13. Hợp chất TM24 (ursolic acid) ................................................................... 71

4.1.14. Hợp chất TM23 (23-hydroxy ursolic acid) ................................................ 73

4.1.15. Hợp chất TM20 (pomolic acid) ................................................................. 75 4.1.16. Hợp chất TM22 (euscaphic acid) .............................................................. 76

4.1.17. Hợp chất TM25 (maslinic acid) ................................................................. 78

4.1.18. Hợp chất TM12 (gallic acid ) .................................................................... 80

4.1.19. Hợp chất TM13 (methyl gallate) ............................................................... 81 4.1.20. Hợp chất TM3 (protocatechuic acid) ......................................................... 82

4.1.21. Hợp chất TM9 (3-methoxy, 4-hydroxy-benzoic acid) (vanillic acid) ......... 83

4.1.22. Hợp chất TM6 (4-methyl malate) .............................................................. 84

4.1.23. Hợp chất TM1 (chlorogenic acid methyl ester) ......................................... 85

4.1.24. Hợp chất TM18 (1-O-coumaroyl-β-D-glucopyranose) .............................. 86

4.1.25. Hợp chất TM35 (cis-p-coumaric acid 4-O-β-D-glucopyranoside) ............. 88

4.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết và các hợp chất phân lập được ..... 92 4.2.1. Hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH) của cao chiết phân đoạn và các hợp chất

phân lập được ........................................................................................... 92

4.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được ........................... 94

4.2.3. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư cổ tử cung

(Hela) của các cao chiết phân đoạn ........................................................... 95

4.3. Xây dựng và tối ưu quy trình chiết xuất phenolic từ quả táo mèo quy mô

phòng thí nghiệm ......................................................................................................... 96 4.3.1. Kết quả chiết xuất táo mèo bằng phương pháp chiết soxhlet ....................... 96

4.3.2. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất phenolic sử dụng vi sóng quy

mô phòng thí nghiệm ................................................................................ 97

4.3.3. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất phenolic sử dụng sóng siêu

âm quy mô phòng thí nghiệm ................................................................. 107

4.3.4. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất phenolic bằng phương pháp

chiết hồi lưu quy mô phòng thí nghiệm .................................................. 116 4.3.5. So sánh, đánh giá các phương án công nghệ nghiên cứu. .......................... 123

4.4. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình sấy phun dịch chiết táo mèo quy mô phòng thí nghiệm ....................................................................................................... 125 4.4.1. Ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến hàm mục tiêu của quá trình ................ 125

4.4.2. Thiết lập mô hình và xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm .................. 127

4.4.3. Kiểm tra sự có nghĩa của mô hình ............................................................. 128

4.4.4. Tối ưu hóa quy trình sấy phun .................................................................. 131

4.4.5. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa ................................................................ 132

4.5. Quy trình công nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm bột cao chiết táo mèo quy

BÀI BÁO QUỐC TẾ ....................................................................................... 138

BÀI BÁO TRONG NƯỚC ............................................................................. 138

mô phòng thí nghiệm ................................................................................................. 133 KẾT LUẬN ................................................................................................................ 135 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................... 137 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...... 138   TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 139

PHỤ LỤC ................................................................................................................... 148

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13C

Kí hiệu Diễn giải Tiếng Anh

Carbon -13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

CC Sắc ký cột Column Chromatography

CTPT Công thức phân tử Molecular formula

Distortionless Enhancement DEPT Phổ DEPT by Polarisation Transfer

DMSO Dimethyl Sulfoxide Dimethyl Sulfoxide

Electron Spray Ionzation- ESI-MS Phổ khối lượng phun mù electron Mass Spectroscopy

Ethyl acetate EtOAc CH3COOC2H5

Ethanol EtOH C2H5OH

GAE Acid gallic tương đương Gallic acid equivalent

Liver hepatocellular Hep-G2 Dòng tế bào ung thư ở gan người carcinoma/Human hepatoma

HeLa Ung thư cổ tử cung người Henrietta lacks

HTSH Hoạt tính sinh học Bioactivity

1H-NMR

Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Resonance Spectroscopy

1H-1H- COSY

1H -1H - Correlation Spectroscopy

Phổ tương tác proton

HMBC Phổ tương tác dị nhân qua nhiều liên kết (HMBC) Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC Phổ tương tác dị nhân qua 1 liên kết Heteronuclear Single Quantum Coherence

High Resolution Electron Spray Ionization Mass HR-ESI-MS Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng phun mù điện tử Spectroscopy

viii

IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Nồng độ ức chế 50% Inhibitory concentration 50% IC50

KLPT Khối lượng phân tử Molecular weight

MeOH Methanol CH3OH

ppm Phần triệu Parts per million

Quercetin tương đương Quercetin equivalent QE

Khả năng trung hòa các gốc tự do Scavenging capacity SC

Khả năng bắt gốc tự do 50% Scavening capacity SC50

Tác dụng bảo vệ tim mạch Soluble epoxide hydrolase sEH

Số thứ tự Numerical order STT

TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

TLTK Tài liệu tham khảo Reference

Hàm lượng flavonoid tổng Total flavonoid content TFC

Hàm lượng phenolic tổng Total phenolic content TPC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2.1. Hàm lượng các thành phần hóa học trong quả táo mèo ............................... 7

Bảng 1.2.2.1. Danh sách các hợp chất được phân lập từ loài Docynia indica (Wall.)

Decne ở trong nước ................................................................................... 8

Bảng 1.2.2.2. Danh sách các hợp chất được phân lập từ loài táo mèo

Docynia indica (Wall.) Decne trên thế giới............................................... 9

Bảng 1.4.3. Phân loại các hợp chất phenolic dựa trên bộ khung nguyên tử carbon

trong phân tử ............................................................................................ 21

Bảng 4.1.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM17 và tài liệu tham khảo ................... 53

Bảng 4.1.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM15 và chất tham khảo ........................ 55

Bảng 4.1.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM2 và chất tham khảo .......................... 56

Bảng 4.1.4. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM5 và chất tham khảo .......................... 58

Bảng 4.1.5. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM36 và chất tham khảo ........................ 59

Bảng 4.1.6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM16 và chất tham khảo ........................ 61

Bảng 4.1.7. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM10 và chất tham khảo ........................ 62

Bảng 4.1.8. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM7 và chất tham khảo .......................... 64

Bảng 4.1.9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM30 và chất tham khảo ........................ 66

Bảng 4.1.10. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM33 và chất tham khảo ...................... 68

Bảng 4.1.11. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM8 và chất tham khảo ........................ 69

Bảng 4.1.12. Dữ liệu phổ của hợp chất TM37 và chất tham khảo ................................ 71

Bảng 4.1.13. Dữ liệu phổ của hợp chất TM24 và chất tham khảo ................................ 72

Bảng 4.1.14. Dữ liệu phổ của hợp chất TM23 và chất tham khảo ................................ 74

Bảng 4.1.15. Dữ liệu phổ của hợp chất TM20 và chất tham khảo ................................ 75

Bảng 4.1.16. Dữ liệu phổ của hợp chất TM22 và chất tham khảo ................................ 77

Bảng 4.1.17. Dữ liệu phổ của hợp chất TM25 và chất tham khảo ................................ 79

Bảng 4.1.18. Dữ liệu phổ của chất TM12 và chất tham khảo ....................................... 80

Bảng 4.1.19. Dữ liệu phổ của chất TM13 và chất tham khảo ....................................... 81

Bảng 4.1.20. Dữ liệu phổ của chất TM3 và chất tham khảo ......................................... 82

Bảng 4.1.21. Dữ liệu phổ của chất TM9 và chất tham khảo ......................................... 83

Bảng 4.1.22. Dữ liệu phổ của TM6 và chất tham khảo ................................................. 85

Bảng 4.1.23. Dữ liệu phổ của hợp chất TM1 và chất tham khảo .................................. 86

Bảng 4.1.24. Dữ liệu phổ của hợp chất TM18 với chất tham khảo .............................. 87

Bảng 4.1.25. Dữ liệu phổ của hợp chất TM35 với chất tham khảo .............................. 89

Bảng 4.2.1.1. Đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch của các cao chiết phân đoạn ......... 92

Bảng 4.2.1.2. Đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch của các hợp chất phân lập được .... 93

Bảng 4.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập

được ......................................................................................................... 95

Bảng 4.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế 2 dòng tế bào ung thư gan và ung thư

cổ tử cung ................................................................................................ 96

Bảng 4.3.1. Kết quả chiết xuất táo mèo bằng phương pháp chiết soxhlet .................... 97

Bảng 4.3.2.1.a. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2 ............... 97

Bảng 4.3.2.1.b. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hàm mục tiêu Y1 và

Y2 ............................................................................................................ 98

Bảng 4.3.2.1.c. Ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hàm mục tiêu Y1 và Y2 .......... 99

Bảng 4.3.2.1.d. Ảnh hưởng của độ pH dung môi chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2 ... 99

Bảng 4.3.2.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ .............................. 100

Bảng 4.3.2.2b. Ma trận kế hoạch hóa thực nghiệm của quá trình chiết xuất .............. 100

Bảng 4.3.2.3. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y1, Y2 và Y3 ............... 101

Bảng 4.3.2.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ ................................................. 106

Bảng 4.3.2.5. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại điều kiện tối ưu .......... 107

Bảng 4.3.3.1.a. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu chiết đến hàm mục tiêu

Y1 và Y2 ................................................................................................ 107

Bảng 4.3.3.1.b. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2 ............. 108

Bảng 4.3.3.1.c. Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hàm mục tiêu Y1 và Y2 ....... 109

Bảng 4.3.3.1.d. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2 ............. 109

Bảng 4.3.3.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ .............................. 110

Bảng 4.3.3.2b. Ma trận kế hoạch hóa thực nghiệm của quá trình chiết xuất .............. 110

Bảng 4.3.3.3. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y1 và Y2 ...................... 111

Bảng 4.3.3.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ ................................................. 115

Bảng 4.3.3.5. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại điều kiện tối ưu .......... 116

Bảng 4.3.4.1.a. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2 ............. 116

Bảng 4.3.4.1.b. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu chiết đến hàm mục tiêu

Y1 và Y2 ................................................................................................ 117

Bảng 4.3.4.1.c. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2 .............. 118

Bảng 4.3.4.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ .............................. 118

Bảng 4.3.4.2b. Ma trận kế hoạch hóa thực nghiệm của quá trình chiết xuất .............. 119

Bảng 4.3.4.3. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y1, Y2. ......................... 119

Bảng 4.3.4.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ ................................................. 122

Bảng 4.3.4.5. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại điều kiện tối ưu .......... 123

Bảng 4.3.5a. Hiệu quả chiết xuất của các phương pháp .............................................. 124

Bảng 4.3.5b. Các điều kiện công nghệ tối ưu của 3 phương pháp .............................. 124

Bảng 4.4.1a. Ảnh hưởng của hàm lượng matodextrin đến hàm mục tiêu Y1 và Y2 .. 125

Bảng 4.4.1b. Ảnh hưởng của nhiệt độ khí sấy cấp vào đến hàm mục tiêu Y1 và Y2 . 126

Bảng 4.4.1c. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch đến hàm mục tiêu Y1 và Y2 .............. 127

Bảng 4.4.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ ................................. 127

Bảng 4.4.2b. Ma trận kế hoạch hóa thực nghiệm của quá trình chiết xuất ................. 128

Bảng 4.4.3. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y1, Y2. ............................ 128

Bảng 4.4.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ .................................................... 131

Bảng 4.4.5. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại điều kiện tối ưu ............. 132

xii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Quả và lá loài táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne. ................................... 3

Hình 1.1.3: Diện tích táo mèo tập trung tại một số huyện thuộc ba Tỉnh Yên Bái,

Sơn La và Điện Biên. ................................................................................. 5

Hình 1.3.1. Một số sản phẩm táo mèo truyền thống ..................................................... 14

Hình 1.3.2.1a. Một số loại rượu táo mèo trên thị trường .............................................. 14

Hình 1.3.2.1b: Một số loại sản phẩm khác chế biến từ quả táo mèo trên thị trường .... 15

Hình 1.3.2.2: Một số sản phẩm táo mèo ứng dụng kết quả đề tài nghiên cứu KHCN .. 15

Hình 1.3.2.3a. Sơ đồ quy trình sản xuất rượu táo mèo .................................................. 16

Hình 1.3.2.3b. Sơ đồ quy trình sản xuất nước uống táo mèo ........................................ 17

Hình 1.3.2.3c: Sơ đồ quy trình sản xuất giấm táo mèo ................................................. 18

Hình 2.1.1. Mẫu quả táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne ....................................... 29

Hình 2.2.1. Đồ thị đường chuẩn phenolic (a) và flavonoid (b) ..................................... 30

Hình 3.1. Sơ đồ điều chế cao chiết tổng và các cao chiết phân đoạn quả táo mèo ....... 37

Hình 3.1.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate quả táo mèo.......... 38

Hình 3.5. Sơ đồ định hướng nghiên cứu tạo sản phẩm bột cao chiết táo mèo .............. 47

Hình 4.1.1.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TM17 ..................................................... 48 Hình 4.1.1.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất TM17 ........................................................... 48 Hình 4.1.1.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất TM17 .......................................................... 49

Hình 4.1.1.4. Phổ DEPT của hợp chất TM17 ............................................................... 49

Hình 4.1.1.5. Phổ HMBC của hợp chất TM17 .............................................................. 50

Hình 4.1.1.6. Tương tác trên phổ HMBC của 3S-thunberginol C 6-O-β- D-

glucopyranoside ....................................................................................... 50

Hình 4.1.1.7. Phổ HSQC của hợp chất TM17 ............................................................... 51

Hình 4.1.1.8. Sắc ký đồ HPLC xác định cấu tử đường ................................................. 51

Hình 4.1.1.9. Phổ CD của hợp chất TM17 .................................................................... 52

Hình 4.1.1.10. Hai cấu dạng bền kiểu nửa thuyền của hợp chất TM17 ........................ 53

Hình 4.1.1.11. Cấu trúc hóa học của 3S-thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside ... 53

Hình 4.1.2. Cấu trúc hóa học hợp chất chrysin ............................................................. 55

Hình 4.1.3. Cấu trúc hóa học hợp chất quercetin .......................................................... 56

Hình 4.1.4. Cấu trúc hóa học hợp chất hyperin ............................................................. 57

Hình 4.1.5. Cấu trúc hóa học hợp chất myricitrin ......................................................... 59

Hình 4.1.6. Cấu trúc hóa học hợp chất naringenin ........................................................ 61

xiii

Hình 4.1.7. Cấu trúc hóa học hợp chất astilbin ............................................................. 62

Hình 4.1.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất naringenin-7-O- β-D-glucopyranoside ..... 64

Hình 4.1.9. Cấu trúc hóa học của hỗn hợp chất (2S/R)-5,7,3’,5’-tetrahydroxy-

flavanone 7-O-β-D glucopyranosie) ........................................................ 66

Hình 4.1.10. Cấu trúc hóa học hợp chất phloretin-2’-O-(β-D-xylopyranosyl-(16)-

O-β-D glucopyranoside ........................................................................... 68

Hình 4.1.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất phlorizin .................................................. 69

Hình 4.1.12. Cấu trúc hợp chất 2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone ................ 70

Hình 4.1.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất ursolic acid .............................................. 72

Hình 4.1.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất 23-hydroxyursolic acid ........................... 74

Hình 4.1.15: Cấu trúc hóa học của hợp chất pomolic acid ............................................. 75

Hình 4.1.16. Cấu trúc hóa học hợp cất euscaphic acid .................................................. 77

Hình 4.1.17. Cấu trúc hóa học hợp chất maslinic acid .................................................. 79

Hình 4.1.18. Cấu trúc hóa học hợp chất gallic acid ...................................................... 80

Hình 4.1.19. Cấu trúc hóa học hợp chất methyl gallate ................................................ 81

Hình 4.1.20. Cấu trúc hóa học protocatechuic acid ....................................................... 82

Hình 4.1.21. Cấu trúc hóa học hợp chất 3-methoxy, 4-hydroxy-benzoic acid ............. 83

Hình 4.1.22. Cấu trúc hóa học 4-methyl malate ............................................................ 84

Hình 4.1.23. Cấu trúc hóa học chlorogenic acid methyl ester....................................... 86

Hình 4.1.24. Cấu trúc hóa học hợp chất 1-O-coumaroyl-β-D-glucopyranose .............. 87

Hình 4.1.25. Cấu trúc hóa học hợp chất cis-p-coumaric acid 4-O-β-D-

glucopyranoside ....................................................................................... 88

Hình 4.1.26. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ cặn chiết EtOAc quả táo

mèo Docynia indica (Wall.) Decne. ........................................................ 91

Hình 4.3.2.3a. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1, Y2 và

Y3 .......................................................................................................... 103

Hình 4.3.2.3b. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng phenolic tổng (a), hàm lượng

flavonoid tổng (b) và hàm lượng cao chiết tổng (c). ............................. 105

Hình 4.3.2.4. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất ........................ 106

Hình 4.3.3.3a. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2 112

Hình 4.3.3.3b. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng phenolic tổng (a) và hàm lượng cao

chiết tổng (b) .......................................................................................... 114

Hình 4.3.3.4. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất ........................ 115

Hình 4.3.4.3a. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2 120

xiv

Hình 4.3.4.3b. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng phenolic tổng (a) và hàm lượng cao

chiết tổng (b) .......................................................................................... 121

Hình 4.3.4.4. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất ........................ 123

Hình 4.4.3a. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2 ... 129

Hình 4.4.3b. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng phenolic tổng (a) và độ ẩm (b) của sản

phẩm sau sấy phun ................................................................................. 130

Hình 4.4.4. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình sấy phun ............................ 132

Hình 4.5. Sơ đồ quy trình công nghệ tạo sản phẩm bột cao chiết táo mèo quy mô

phòng thí nghiệm ......................................................................................................... 133

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

PHỤ LỤC .................................................................................................................... 148

PHỤ LỤC A: PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT HÓA HỌC ........................................... 148

PHỤ LỤC 1. PHỔ HỢP CHẤT TM1 ......................................................................... 149

PHỤ LỤC 2. PHỔ HỢP CHẤT TM2 ......................................................................... 150

PHỤ LỤC 3. PHỔ HỢP CHẤT TM3 ......................................................................... 151

PHỤ LỤC 4. PHỔ HỢP CHẤT TM5 ......................................................................... 152

PHỤ LỤC 5. PHỔ HỢP CHẤT TM6 ......................................................................... 153

PHỤ LỤC 6. PHỔ HỢP CHẤT TM7 ......................................................................... 154

PHỤ LỤC 7. PHỔ HỢP CHẤT TM8 ......................................................................... 156

PHỤ LỤC 8. PHỔ HỢP CHẤT TM9 ......................................................................... 157

PHỤ LỤC 9. PHỔ HỢP CHẤT TM10 ....................................................................... 158

PHỤ LỤC 10. PHỔ HỢP CHẤT TM12 ..................................................................... 160

PHỤ LỤC 11. PHỔ HỢP CHẤT TM13 ..................................................................... 161

PHỤ LỤC 12. PHỔ HỢP CHẤT TM15 ..................................................................... 162

PHỤ LỤC 13. PHỔ HỢP CHẤT TM16 ..................................................................... 163

PHỤ LỤC 14. PHỔ HỢP CHẤT TM17 ..................................................................... 164

PHỤ LỤC 15. PHỔ HỢP CHẤT TM18 ..................................................................... 172

PHỤ LỤC 16. PHỔ HỢP CHẤT TM20 ..................................................................... 175

PHỤ LỤC 17. PHỔ HỢP CHẤT TM22 ..................................................................... 176

PHỤ LỤC 18. PHỔ HỢP CHẤT TM23 ..................................................................... 177

PHỤ LỤC 19. PHỔ HỢP CHẤT TM24 ..................................................................... 178

PHỤ LỤC 20. PHỔ HỢP CHẤT TM25 ..................................................................... 179

PHỤ LỤC 21. PHỔ HỢP CHẤT TM30 ..................................................................... 182

PHỤ LỤC 22. PHỔ HỢP CHẤT TM33 ..................................................................... 185

PHỤ LỤC 23. PHỔ HỢP CHẤT TM35 ..................................................................... 189

PHỤ LỤC 24. PHỔ HỢP CHẤT TM36 ..................................................................... 193

PHỤ LỤC 25. PHỔ HỢP CHẤT TM37 ..................................................................... 196

PHỤ LỤC B. TÍNH TOÁN NĂNG LƯỢNG BỀN CÁC CẤU DẠNG CỦA HỢP

CHẤT TM17 ....................................................................................... 200

xvi

PHỤ LỤC C. PHIẾU KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA MẪU

NGHIÊN CỨU .................................................................................. 212

PHỤ LỤC D. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO .......................... 215

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng nguồn thực vật tự nhiên để chăm sóc sức

khỏe, phòng ngừa và điều trị bệnh. Trong những năm trở lại đây, xu hướng sử dụng

các loại thảo dược trong phòng và chữa bệnh ngày một gia tăng. Ngày nay, thảo dược không chỉ được sử dụng ở dạng thô theo y học cổ truyền mà đã được áp dụng những

công nghệ hiện đại trong lĩnh vực hóa học, sinh học kết hợp công nghệ bào chế để tạo

ra các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, tính chất dược lý mạnh.

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa đặc thù nên có nguồn thực

vật phong phú và đa dạng ước tính có trên 13.000 nghìn loài. Theo y học dân tộc, có

hơn 4000 loài được sử dụng làm thuốc hoặc chăm sóc sức khỏe con người. Với định

hướng phát triển các loài cây dược liệu để phục vụ đời sống, hiện nay ở nước ta đã hình thành nhiều khu vực canh tác, trồng cây dược liệu ở quy mô lớn. Đặc biệt, Tại

một số tỉnh Tây Bắc như Yên Bái, Sơn La, Điện Biên những năm gần đây đang phát

triển rất mạnh loài táo mèo để phục vụ nhu cầu của người tiêu dùng.

Táo mèo có tên khoa học là Docynia indica (Wall.) Decne, thuộc họ Hoa hồng

(Rosaceae). Ở nước ta, táo mèo phân bố ở độ cao từ 1000m đến 1500m ở các tỉnh

vùng núi Tây Bắc. Theo Y học cổ truyền, táo mèo có vị chua chát, hơi ngọt, tính ấm,

có tác dụng kiện vị, thuộc nhóm tiêu thực hóa tích, chủ yếu điều trị các chứng rối loạn

tiêu hóa do ăn nhiều thịt, dầu mỡ, ăn không tiêu, giúp ăn ngon miệng. Quả táo mèo khi

sấy khô là một vị thuốc của Đông y giúp tăng bài tiết axit mật và pepsin dịch vị, chống

rối loạn chuyển hóa lipid và giảm mỡ máu… Các nghiên cứu hiện đại gần đây đã cho

thấy dịch chiết quả táo mèo có tác dụng kháng khuẩn, chống rối loạn trao đổi glucid và

lipid; Một số thành phần hóa học phân lập được từ quả táo mèo có tác dụng có tác

dụng kháng viêm và hạ đường huyết.

Việc nghiên cứu, chế biến quả táo mèo tạo sản phẩm chăm sóc sức khỏe, hỗ trợ điều trị một số bệnh lý đang rất được quan tâm. Tuy nhiên cho đến nay, các nghiên

cứu về quả táo mèo cả trong và ngoài nước còn khá khiêm tốn. Do đó, cần các nghiên cứu sâu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của quả táo mèo, đồng thời mở rộng nghiên cứu các công nghệ khai thác, làm giàu các thành phần hóa học có hoạt tính sinh học cao (cụ thể là nhóm hoạt chất phenolic) trong quả táo mèo để đáp ứng yêu cầu về bào chế, tạo các sản phẩm có chất lượng cao.

Từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần

hóa học và xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm có giá trị từ quả táo mèo (Docynia indica (Wall.) Decne) ở Việt Nam”. Nội dung của Luận án

tập trung vào nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và công nghệ chiết

xuất, làm giàu thành phần hóa học có hoạt tính sinh học cao (nhóm hoạt chất phenolic)

để tạo sản phẩm có giá trị từ quả táo mèo.

Nội dung nghiên cứu của luận án gồm

 Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số thành phần hóa học ở phân đoạn cao chiết ethyl acetate của quả táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne):

Điều chế cặn chiết, phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp hóa lý hiện đại.

 Đánh giá hoạt tính sinh học: Tác dụng bảo vệ tim mạch, chống oxy hóa và ức chế một số dòng tế bào ung thư của cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn và một

số hợp chất phân lập được

 Nghiên cứu, tối ưu hóa các quy trình công nghệ chiết xuất, sấy phun để tạo sản

phẩm bột cao chiết táo mèo giàu phenolic quy mô phòng thí nghiệm.

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về cây táo mèo [1,2,3]

Tên khoa học: Docynia indica (Wall.) Decne.

Tên thường gọi: Táo mèo, chi tô di

Phân loại thực vật

Giới : Thực vật (Plantae).

Bộ : Rosales.

Họ : Hoa hồng (Rosaceae).

Phân họ : Maloideae.

Chi : Docynia.

Loài : Táo mèo (Docynia indica (Wall.) Decne.)

Theo hệ thống phân loại thực vật thì táo mèo thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae),

phân họ Maloideae và thuộc chi Docynia.

Đặc điểm hình thái

Hình 1.1. Quả và lá loài táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne.

Cây nhỡ cao 5-6 m, cây non cành có gai. Lá mọc so le, ở cây non xẻ 3-5 thuỳ,

mép có răng cưa không đều. Ở thời kỳ cây trưởng thành lá hình bầu dục dài 6-10cm,

rộng 2-4cm, mép nguyên hoặc hơi khía răng ở gần đầu lá. Hoa họp từ 1-3 hoa ở kẽ

lá, cánh hoa màu trắng, có lông màu trắng bạc. Nhị nhiều. Quả hình cầu thuôn,

đường kính 3-4cm, lúc non có lông, sau nhẵn, khi chín có màu vàng lục, có vị hơi

chua chát [1,3].

Mùa hoa tháng 3-4, mùa quả chín từ tháng 8-10. Cây được gieo trồng bằng hạt,

chồi hoặc chiết cành. Cây ưa sáng, mọc rải rác trong rừng hoặc thành quần thể ven đồi,

ở độ cao 1000-1500m [1,3].

1.1.1. Vài nét về họ Hoa hồng (Rosaceae)

Họ Hoa hồng (danh pháp khoa học: Rosaceae) là một họ lớn trong thực vật, với

khoảng 2.000-4.000 loài trong khoảng 90-120 chi, tùy theo hệ thống phân loại. Hiện

tại hệ thống APG II (hệ thống phân loại sinh học thực vật hiện đại dựa trên việc phân tích phân tử năm 2003) công nhận họ Rosaceae có 2.520 loài thuộc 90 chi [2]

Theo truyền thống họ hoa hồng được chia thành 4 phân họ: Rosoideae,

Spiraeoideae, Maloideae, Amygdaloideae. Các phân họ này được miêu tả đặc trưng

chủ yếu theo cấu trúc của trái cây:

- Phân họ Hoa hồng (Rosoideae): Theo truyền thống bao gồm các chi có quả nhỏ,

là dạng quả bế hay quả hạch nhỏ và thường có phần cùi thịt của quả (ví dụ dâu

tây) hay cuống mang các lá noãn

- Phân họ Thuỷ bia (Spiraeoideae): Theo truyền thống bao gồm các chi với quả

không có cùi thịt bao gồm 5 lá noãn

- Phân họ Táo tây (Maloideae): Theo truyền thống bao gồm các chi (như táo

tây, sơn tra, lê, mộc qua, thanh hương trà v.v), với quả bao gồm 5 lá noãn trong

vỏ quả trong dày cùi thịt, được bao quanh bằng mô cuống chín

- Phân họ Mận (Amygdaloideae) hay (Prunoideae): Theo truyền thống bao gồm

các chi với quả là quả hạch đơn có đường nối, hai gân cạnh đường nối và một

gân đối diện đường nối.

Ở Việt Nam, theo tác giả Phạm Hoàng Hộ (Cây Cỏ Việt Nam) họ hoa hồng hiện

có 172 loài chính thuộc 23 chi [2].

1.1.2. Vài nét về chi Táo mèo (Docynia)

Chi Docynia là một chi thực vật có hoa trong họ Rosaceae. Chi này bao gồm các

loài cây gỗ xanh; nụ hình trứng, nhỏ, với vài vảy phô ra. Các lá đơn, mọc so le, có lá

kèm, có cuống lá, gân lá thứ cấp uốn cong về phía mép lá, mép lá nguyên hay khía

răng cưa, đôi khi phân thùy nhỏ. Hoa có cuống ngắn, mọc thành chùm 2–5, sớm kết

trái hay có các nhị hợp nhất bởi các bao phấn; lá bắc nhỏ, sớm rụng. Đế hoa hình

chuông, có lông măng rậm ở phía xa trục. Lá đài 5, hình mác. Cánh hoa 5, trắng, gốc

có vuốt ngắn. Nhị hoa 30–50, 2 vòng. Bầu nhụy hạ, 5 ngăn, với 3–10 noãn mỗi ngăn;

vòi nhụy 5, hợp sinh tại gốc, có lông tơ. Quả dạng quả táo hình phỏng cầu hay hình

trứng hoặc hình quả lê, đường kính 2–3 cm, với các lá đài bền mọc thẳng hay uốn

cong vào trong. Chúng thụ phấn nhờ côn trùng [2].

Theo Phạm Hoàng Hộ, chi Docynia chỉ có 2 loài là: Docynia indica (Wall.)

Decne, ở Việt Nam còn được gọi là táo mèo và loài Docynia delavayi (Franch.)

C.K.Schneid. Loài Docynia indica (Wall.) Decne Phân bố rộng ở một số quốc gia

như Ấn Độ, Bhutan, Myanma, Nepal, Pakistan, Thái Lan, tây nam Trung Quốc và Việt

Nam. Ở nước ta, loài này tập trung chủ yếu ở các Tỉnh vùng núi Tây Bắc như Sơn La,

Yên Bái, Điện Biên, Lai Châu, Hà Giang…Trong khi đó loài Docynia

delavayi (Franch.) C.K.Schneid. xuất hiện ở tây Quý Châu, tây Tứ Xuyên, đông

bắc Vân Nam của Trung Quốc; Ở Việt Nam theo Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi thì

chưa thấy xuất hiện loài này [2,3].

1.1.3. Phân bố và sản lượng táo mèo ở một số tỉnh trọng điểm nước ta

(nguồn: https://dantocmiennui.vn/son-la-vai-net-tong-quan/131032.html)

Hình 1.1.3. Diện tích táo mèo tập trung tại một số huyện thuộc ba Tỉnh Yên Bái, Sơn La và Điện Biên

Táo mèo (Docynia indica) phân bố ở các tỉnh vùng núi phía Bắc việt Nam như

Sơn La, Yên Bái, Điện Biên, Lai Châu, Hà Giang… Tuy nhiên diện tích trồng và cho

sản lượng táo mèo lớn nhất tập trung chủ yếu tại ba tỉnh là Yên Bái, Sơn La và Điện

Biên. Theo số liệu thống kê năm 2011 của các sở Nông nghiệp phát triển nông thôn

của ba Tỉnh Yên Bái, Sơn La và Điện Biên, tổng diện tích trồng và tự nhiên cây táo

mèo của ba tỉnh này khoảng 3200 hecta với tổng sản lượng hàng năm khoảng 6500

tấn. Ước tính mỗi hecta cho 2 tấn quả trên 1 năm. Trong đó diện tích táo mèo tại Yên

Bái là lớn nhất khoảng 2000 hecta, tiếp đến là Sơn La với diện tích là 1000 hecta, cuối

cùng là Điện Biên với diện tích gần 300 hecta. Sản lượng táo mèo hàng năm của Yên

Bái đạt khoảng 4000 tấn, tại Sơn La đạt 2000 tấn và tại Điện Biên đạt khoảng 500 tấn.

Những năm gần đây, diện tích táo mèo ở các tỉnh nêu trên tiếp tục được mở rộng rất

nhiều cùng với đó là sản lượng táo mèo cũng tăng cao [4].

Cụ thể, Ở tỉnh Yên Bái, việc trồng và phát triển cây táo mèo tập trung chính tạo

2 huyện là Mù Cang Chải và Trạm Tấu. Trong đó, Mù Cang Chải có diện tích trồng

táo mèo là 1490 hectra còn Trạm Tấu có diện tích trồng téo mèo là 440 hecta. Qua số

liệu thống kê có thể thấy, Mù Cang Chải là địa phương cung cấp sản lượng táo mèo

chủ yếu của Yên Bái, chiếm khoảng 75% tổng sản lượng của tỉnh. Cũng theo số liệu

thu thập năm 2018 của sở Nông nghiệp và nông thôn Yên Bái, tỉnh đã trồng mới

thêm được 2.250 hecta nâng tổng diện tích táo mèo của tỉnh lên hơn 4000 hecta [4].

Tại tỉnh Sơn La, táo mèo được trồng và phát triển chủ yếu tập trung tại các huyện

là Bắc Yên, Thuận Châu và Mường La. Tổng diện tích khoảng 1000 hecta và sản

lượng hàng năm đạt gần 2300 tấn/năm (khoảng 2,3 tấn/hecta). Về sản lượng thì Bắc

Yên chiếm lớn nhất, tại Bắc Yên táo mèo cũng được chế biến và tiêu thụ nhiều nhất

trong ba huyện của Sơn La, tiếp đến là Mường La và Thuận Châu. theo số liệu thu

thập mới nhất năm 2018 của sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn Sơn La, diện tích

táo mèo ở tỉnh này đã đạt tới 11000 hecta [4].

Ở Điện Biên, theo số liệu thu thập năm 2011, táo mèo được trồng và phát triển

chủ yếu ở Tuần Giáo, cụ thể ở hai xã là Tỏa Tình và Tênh Phông. So với hai tỉnh Sơn

La và Yên Bái thì Điện Biên có diện tích trồng và phát triển táo mèo là nhỏ nhất.

Tổng diện tích táo mèo tại Điện Biên là 270 hecta, trong đó 150 hecta thuộc xã Tỏa

Tình và 120 hecta thuộc xã Tênh Phông. Tổng sản lượng táo mèo hàng năm của Điện

Biên ước đạt khoảng 500 tấn. Theo số liệu thu thập được từ báo cáo của sở Nông

nghiệp và phát triển nông thôn Điện Biên năm 2018, diện tích trồng táo mèo ở Điện

Biên không tăng lên đáng kể, chủ yếu vẫn chỉ tập trung ở 2 xã Tỏa Tình và Tênh

Phong của Huyện Tuần Giáo [4].

1.2. Thành phần hóa học của táo mèo

1.2.1. Các thành phần hóa học cơ bản. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Hoàng Thị Lụa và cộng sự (2013, 2014),

các thành phần hóa học cơ bản của quả táo mèo ở Việt Nam đã được phân tích, đánh

giá đầy đủ [4,5]. Các mẫu táo mèo khảo sát được thu tại 3 địa phương là Yên Bái, Sơn

La và Điện Biên. Quả táo mèo được xác định gồm nhiều thành phần hóa học như chất

đạm, chất béo, chất khoáng, axit hữu cơ, axit amin và một số vitamin. Các kết quả cụ

thể được thể hiện ở bảng 1.2.1.

Bảng 1.2.1. Hàm lượng các thành phần hóa học trong quả táo mèo

TT Thành phần hóa học Đơn vị tính Hàm lượng

1 Chất đạm g/100 g quả tươi 0.42 - 0.52

2 Chất béo g/100 g quả tươi 0.24 - 0.28

3 Đường tổng g/100 g quả tươi 5.95 - 6.90

4 Phenolic tổng mg GAE/g quả khô 18.87 - 23.60

5 Axit hữu cơ % 2.98 - 3.29

6 Tro toàn phần % 2.28 - 2.34

7 Vitamin C mg/100g quả tươi 19.02 - 22.91

8 Beta-carotene µg/100g quả tươi 25.0 - 36.0

9 Khoáng Ca mg/100g quả tươi 15.70 - 18.88

10 Khoáng Fe mg/100g quả tươi 0.19 - 0.23

11 Khoáng P mg/100g quả tươi 17.60 - 26.40

1.2.2. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp được phân lập từ quả táo mèo

 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam cho đến nay, đã có một số công trình công bố về thành phần hóa học

về quả táo mèo. Công trình của tác giả Đỗ Thị Hà công bố về thành phần hóa học của

phân đoạn n-hexan của chiết xuất quả táo mèo, từ phân đoạn này đã tìm thấy 3 hợp

chất là 1-octacosanol (1), 3-tetracosen (2), β-sitosterol (3) [6]. Công trình của tác giả

Vũ Văn Tuấn đã phân lập được 3 hợp chất là chlorogenic acid (4), quercetin (5) và

quercetin-3-O-β-D galactopyranoside (6) từ cao chiết phân đoạn ethylacetate [7]. Năm 2016, nhóm tác giả Hoàng Việt Dũng và cộng sự đã công bố 13 hợp chất được phân

lập từ dịch chiết quả táo mèo gồm có: Docynicasides A (7), docynicasides B (8), docynicasides C (9), (6S,9R)-vomifoliol 9-O-β-D-xylopyranosyl-(1’’6’)-O-β-D- glucopyranoside (10), hyperin (6), quercitrin (11), quercetin 3-α-L-arabinofuranoside (12), naringenin 7-O-β-D-glucopyranoside (13), phloridzin (14), phloretin 2’-O-β-D- xylopyranosyl-(16)-β-D-glucopyranoside (15), pinosylvin 3-O-β-D-glucopyranoside (16), tormentic acid (17), and chlorogenic acid methyl ester (18) Trong đó 3 hợp chất mới là docynicasides A (7), docynicasides B (8) và docynicasides C (9) [8].

Các nghiên cứu hóa học trong nước về loài Docynia indica (Wall.) Decne được

nghiên cứu sinh tổng kết lại ở bảng 1.2.2.1 theo trình tự thời gian nghiên cứu

Bảng 1.2.2.1. Danh sách các hợp chất được phân lập từ loài Docynia indica (Wall.)

Decne ở trong nước

TLTK [6] [6] [6] [7] [7]

Kí hiệu 1 2 3 4 5 6 Bộ phận Quả Quả Quả Quả Quả Quả [7]

7 8 9 10 [8] [8] [8] [8] Quả Quả Quả Quả

6 11 12 13 14 15 [7,8] [8] [8] [8] [8] [8] Quả Quả Quả Quả Quả Quả

Tên hợp chất 1-octacosanol 3-tetracosen β-sitosterol Chlorogenic acid Quercetin Quercetin-3-O-β-D galactopyranoside (Hyperin) Docynicasides A Docynicasides B Docynicasides C (6S,9R)-vomifoliol 9-O-β-D-xylopyranosyl- (1’’6’)-O-β-D-glucopyranoside Hyperin Quercitrin (Quercetin 3-rhamnoside) Quercetin 3-α-L-arabinofuranoside Naringenin 7-O-β-D-glucopyranoside Phlorizin Phloretin 2’-O-β-D-xylopyranosyl-(16)-β- D-glucopyranoside Pinosylvin 3-O-β-D-glucopyranoside Tormentic acid Chlorogenic acid methyl ester 16 17 18 [8] [8] [8] Quả Quả Quả

Có thể thấy các công trình nghiên cứu trong nước về loài này cũng còn khá

khiêm tốn và chưa đầy đủ. Mới chỉ có 18 hợp chất được phân lập từ quả táo mèo với

chỉ 3 công trình công bố. Các thành phần hóa học đã phân lập được từ loài

Docynia indica (Wall.) Decne chủ yếu chia thành 5 nhóm chính gồm: Các hợp chất

phenolic đơn giản, các flavonoid và glycoside flavonoid, các triterpenoid và các megastigmane.

 Nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, loài táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne được phân bố ở một số quốc gia như Ấn Độ, Bhutan, Myanma, Nepal, Pakistan, Sikkim, Thái Lan, Trung Quốc và Việt Nam. Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học loài này cũng rất khiêm tốn. Một vài năm trở lại đây, táo mèo được một số quốc gia như Ấn Độ, Trung Quốc và Việt Nam quan tâm nghiên cứu bởi những tác dụng sinh học tốt cũng

như hiệu quả kinh tế mà táo mèo mang lại. Tại Trung Quốc và Ấn Độ cũng chỉ có một

vài công trình công bố về thành phần hóa học của loài này

Kết quả nghiên cứu của Shende KM và cộng sự đã xác định trong quả táo mèo

(Docynia indica) thu mẫu tại Ấn độ có chứa 7 hợp chất là catechine (19), caffeic acid

(20), syringic acid (21), ferulic acid (22), gallic acid (23), rutin (24) và quercetin (5) [9].

Nhóm nghiên cứu Trung Quốc Xiaoyu Zhang và cộng sự đã phân lập 2 hợp chất từ quả

táo mèo (Docynia indica) là phlorizin (14) và isoquercetin (25) [10].

Bảng 1.2.2.2. Danh sách các hợp chất được phân lập từ loài táo mèo

Docynia indica (Wall.) Decne trên thế giới

Kí hiệu 19 20 21 22 23 24 5 25 14 Tên hợp chất Catechine Caffeic acid Syringic acid Ferulic acid Gallic acid Rutin Quercetin Isoquercetin Phlorizin Bộ phận Quả Quả Quả Quả Quả Quả Quả Quả Quả TLTK [9] [9] [9] [9] [9] [9] [9] [10] [10]

 Cấu trúc hóa học các thành phần phân lập được từ loài táo mèo

Docynia indica (Wall.) Decne

4 3 5

9 7 8

16 10 13

17 18 19

20 21

R = H (14) R = Xyl (p) (15)

R = Gal (6) R = Rham (11) R = Ara(f) (12) R = Glu (25)

1.2.3. Hoạt tính sinh học của táo mèo

1.2.3.1. Tác dụng theo y học cổ truyền

Theo y học cổ truyền, quả táo mèo có vị chua ngọt, tính hơi ấm, thuộc nhóm thuốc tiêu thực hoá tích, giúp tiêu hoá do tăng bài tiết axit mật và pepsin dịch vị. Từ lâu đời, táo mèo đã được dân gian sử dụng như một vị thuốc quý để chữa các bệnh gan

nhiễm mỡ, huyết áp cao, béo phì, đau đầu mãn tính, mất ngủ…[1,3].

1.2.3.2. Các kết quả đánh giá hoạt tính sinh học hiện đại

 Nghiên cứu trong nước

+ Hoạt tính hạ lipid máu, giảm béo và chống rối loạn trao đổi glucid và lipid [11]

Nhóm nghiên cứu Nguyễn Thị Thanh Loan và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống béo phì, giảm trọng lượng ở các phân đoạn của dịch chiết quả táo mèo trên chuột thử nghiệm. Kết quả cho thấy trọng lượng chuột thử nghiệm giảm lần lượt là: 9,5% ở phân đoạn ethyl acetate; 3,8% ở phân đoạn chloroform và 8,9% ở cao chiết ethanol toàn phần. Chuột béo phì được điều trị với cao chiết phân đoạn ethyl acetate trong 14 ngày, các chỉ số lipid máu đã giảm đáng kể. Cụ thể chỉ số TC (cholesterol tổng) giảm 10,3%, TG (triglyceride) giảm 31,16%, nồng độ glucose trong máu giảm 14,3% so với đối chứng.

Cao chiết quả táo mèo cũng cho thấy khả năng chống rối loạn trao đổi glucid và lipid. Phép thử được tiến hành trên chuột thử nghiệm. Các phân đoạn dịch chiết quả táo mèo được điều trị cho chuột bị béo phì. Kết quả sau 16 ngày điều trị, chỉ số triglyceride của chuột ở các lô đều giảm mạnh, riêng lô đối chứng (lô không điều trị) có hàm lượng triglyceride tăng nhẹ (3,2%). Lô được điều trị bằng cao chiết phân đoạn ethyl acetate có chỉ số triglycerid giảm 31,6%; lô điều trị bằng cao chiết phân đoạn ethanol toàn phần và chloroform có chỉ số triglycerid giảm lần lượt là 29,5% và 30%.

+ Hoạt tính giảm nồng độ glucose trong tế bào [12]

Theo nghiên cứu của Trần Thị Lệ Hằng, cao chiết ethanol 96% toàn phần, cao chiết phân đoạn n-hexan và cao chiết phân đoạn ethyl acetate của quả táo mèo (Docynia indica) ở các nồng độ 100 µg/ml đều có tác dụng giảm đáng kể hàm lượng glucose trong tế bào cơ vân chuột nhắt nguyên phát xuống lần lượt 75,9 ±1,79 %; 74,6 ± 2,44 % và 79,9 ± 2,07 % so với nhóm đối chứng dương sử dụng insulin có tác dụng làm giảm nồng độ này là 77,9 ± 0,68 %. Trong đó hiệu lực tăng dung nạp glucose ở tế bào cơ vân C2C12 của cao ethanol 96% và cao chiết phân đoạn n-hexan mạnh hơn so với đối chứng dương là insulin ở nồng độ thử 100 nM.

+ Hoạt tính kháng vi khuẩn [13]

Công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh Thư cho thấy, dấm táo mèo có hoạt tính kháng vi khuẩn (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm trùng đường hô hấp trên người. Kết quả nghiên cứu chỉ ra dịch lên men quả táo mèo có khả năng kháng vi khuẩn Moraxella catarrhalis kháng kháng sinh. Độ pH và nồng độ các dịch lên men ảnh hưởng đến hoạt tính của vi khuẩn Moraxella catarrhalis. Các phân đoạn có hoạt tính kháng vi khuẩn Moraxella catarrhalis từ dịch lên men chủng TM5.2 và dịch chiết quả Táo Mèo đều có mặt các nhóm hoạt chất như flavonoid, tanin, phenolic, glycoside.

+ Hoạt tính kháng viêm [8]

Nhóm tác giả Hoàng Việt Dũng và cộng sự đã nghiên cứu phân lập được 13 hợp

chất từ quả táo mèo Việt Nam. Nhóm tác giá đã thực hiện thử hoạt tính kháng viêm cho

13 hợp chất đã phân lập được, chất đối chứng dương là L-NMMA có IC50 là 22.1µM và

khả năng bình phục của tế bào sau khi thử nghiệm với 50 µM chất thử là 95.5 ± 4.1 (%).

Kết quả cho thấy có 7 hợp chất thể hiện hoạt tính kháng viêm khá mạnh bao gồm

docynicasides A (7), docynicasides C (9), (6S,9R)-vomifoliol 9-O-β-D-xylopyranosyl-

(1’’6’)-O-β-D-glucopyranoside (10), quercetin 3-α-L arabinofuranoside (12),

naringenin 7-O-β-D-glucopyranoside (13), phlorizin (14) và phloretin 2’-O-β-D-

xylopyranosyl-(16)-β-D-glucopyranoside (15) với giá trị IC50 (µM) và khả năng bình

phục của tế bào sau khi thử nghiệm với 50 µM chất thử (%) lần lượt là: 29.3 ± 3.1 µM,

107.6 ± 2.4 (%); 22.8 ± 1.5 µM, 114.0 ± 4.4 (%); 29.5 ± 2.0 µM, 109.4 ± 3.0 (%); 24.7 ±

1.9 µM, 112.5 ± 3.1 (%); 29.3 ± 1.7 µM, 111.1 ± 4.2 (%); 21.0 ± 2.3 µM, 114.0 ± 4.4

(%) và 26.2 ± 1.8 µM, 102.5 ± 2.6 (%)

 Nghiên cứu trên thế giới

+ Hoạt tính chống oxy hóa [14]

Tác giả Ph. Baleshwor Sharma và cộng sự đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

từ dịch chiết quả táo mèo (Docynia indica) cùng với 4 loại trái cây khác của Ấn Độ

gồm Garcinia pedunculata, Garcinia xanthochymus, Rhus semialata và Averrhoa carambola theo phương pháp DPPH với đối chứng dương là axit gallic (IC50 = 1.04 ± 0.06 µg/ml). Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ

tự lần lượt là: R. semialata > D. indica > G. xanthochymus > A. carambola > G. pedunculata. Giá trị IC50 (µg/ml) có giá trị tương ứng lần lượt là R. semialata (5.31 ± 0.07), D. indica (33.89 ± 0.89), G. xanthochymus (92.08 ± 0.93), A. carambola

(261.30 ± 7.35) và G. pedunculata (493.30 ± 12.06). Kết quả đánh giá hoạt tính chống

oxy hóa theo phương pháp ABTS cho kết quả tương tự như phương pháp DPPH, giá trị IC50 (µg/ml) tương ứng lần lượt là: R. semialata (5.84 ± 0.17), D. indica (49.83 ± 0.24), G. xanthochymus (95.27 ± 0.34), A. carambola (284.70 ± 4.13) và G. pedunculata (535.70 ± 4.04) [15].

+ Hoạt tính kháng khuẩn [9]

Nhóm nghiên cứu của Shende KM và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết quả táo mèo ở các thời kỳ trái cây khác nhau gồm trái cây non (IDIFE) , trái cây trưởng thành tự nhiên (MDIFE) và trái cây được kích lớn sử dụng muối kali

(KDIFE) khi chiết xuất với các dung môi khác nhau gồm methanol 80%, ethanol 80%,

acetone 80% và hỗn hợp methanol, acetone, nước (v/v/v = 1/1/1). Tiến hành thử

nghiệm trên 3 dòng vi khuẩn gram dương là: B. cereus, S. aureus, L. innocua và 3

dòng vi khuẩn gram âm là: E. coli, P. aeruginosa và Y. enteratioitica. Kết quả thử

nghiệm cho thấy dịch chiết methanol của trái cây non (IDIFE) và chiết xuất trái cây trưởng thành (MDIFE) với hỗn hợp dung môi (methanol, aceton, nước) biểu thị khả

năng kháng khuẩn tốt, chúng có giá trị ức chế tối thiểu (MIC) là khá nhỏ đối với cả 6

loại vi khuẩn nghiên cứu.

+ Hoạt tính chống béo phì, hạ đường huyết và cải thiện tình trạng kháng

insulin [15]

Nhóm nghiên cứu của Xiao-yu Zhang và công sự (2018) đã nghiên cứu, đánh

giá tác dụng giảm béo, giảm mỡ máu và khả năng kháng insulin từ một số thành phần

hóa học và dịch chiết quả táo mèo (Docynia indica).

Chuột thử nghiệm được gây béo phì khi cho ăn nhiều chất béo (HDF). Sau đó

tiến hành cho chuột thử nghiệm điều trị với phlozirin (phân lập từ quả táo mèo), dịch

chiết toàn phần từ quả táo mèo (DIDE) và dịch chiết sau khi đã tách phlozirin (NP).

Sau 13 tuần, kết quả nghiên cứu cho thấy chuột bị gây béo phì khi sử dụng 3 phương

thức khác nhau đều đã giảm trọng lượng đáng kể, nồng độ lipid trong máu cũng giảm

xuống, sự tăng sinh của tế bào mỡ và tế bào viêm đều giảm (p < 0,05) so với nhóm đối

chứng. Trong đó, phlozirin cho tác dụng cao nhất đối với việc giảm béo ở chuột thử

nghiệm. Bằng cách so sánh các chỉ số từ nhóm đối chứng và nhóm điều trị cho thấy

DIDE, PHZ và NP đều ức chế chuyển đổi năng lượng thành chất béo. Do đó, DIDE,

PHZ và NP có thể ức chế sự tích tụ lipid và phì đại tế bào mỡ của chuột gây bệnh béo

phì (HFD) mà không ảnh hưởng đến lượng thức ăn.

Nhóm chuột bị gây béo tiếp tục được cho điều trị với DIDE, PHZ và NP. Lần

này nhóm nghiên cứu tiến hành so sánh, đánh giá khả năng giảm đường huyết và tình

trạng kháng insulin của lô chuột được điều trị so với lô chuột không được điều trị. Một

chế độ ăn nhiều chất béo gây ra một hiện tượng hàm lượng đường và insulin tăng

nhanh trong huyết thanh, do đó làm tăng chỉ số HOMA-IR (mức độ kháng insulin) và

giảm chỉ số HOMA-IS (chỉ số nhạy cảm với insulin). Kết quả thử nghiệm cho thấy

những con chuột sau khi điều trị DIDE, PHZ và NP cho thấy sự giảm đáng kể nồng độ

glucose và insulin huyết thanh (giảm chỉ số HOMA-IR và tăng rõ rệt chỉ số HOMA-

IS) so với chuột trong nhóm đối chứng (nhóm không điều trị). Điều này cho thấy rằng

DIDE, PHZ và NP giúp cái thiện đáng kể sự tăng đường huyết và kháng insulin ở

chuột thử nghiệm.

1.3. Tình hình khai thác, chế biến và sử dụng quả táo mèo

1.3.1. Các sản phẩm chế biến truyền thống [16-19]

Các sản phẩm chế biến theo phương pháp truyền thống có thể kể ra như rượu ngâm táo mèo, dấm ngâm táo mèo, mứt táo mèo, ô mai táo mèo, táo mèo sấy khô và một số loại trà nhúng đơn giản (Hình 1.3.1). Các sản phẩm này có thể dễ dàng tìm mua ở bất kỳ cửa hàng nào tại các gian hàng ở các tỉnh Tây Bắc hoặc trên cả nước. Ưu điểm của chúng là giá thành rẻ, dễ dàng sử dụng, đậm nét truyền thống nên dễ dàng tiếp cận khách du lịch. Tuy nhiên các sản phẩm này cũng có những nhược điểm như yếu tố đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm thấp, chất lượng sản phẩm không ổn định, dễ bị ẩm mốc do bảo quản không tốt, thời hạn sử dụng ngắn.

Rượu ngâm táo mèo Giấm táo mèo Mứt táo mèo Táo mèo sấy khô

Hình 1.3.1. Một số sản phẩm táo mèo truyền thống

1.3.2. Các sản phẩm chế biến theo công nghệ hiện đại

1.3.2.1. Sản phẩm táo mèo được phát triển và sản xuất bởi các doanh nghiệp

Trong số các doanh nghiệp chế biến táo mèo đầu tiên phải nhắc tới công ty TNHH Bắc Sơn ở Sơn La. Hàng năm công ty thu mua và chế biến khoảng 1000 tấn táo mèo, tạo ra các sản phẩm rượu táo mèo tiêu biểu như sản phẩm “rượu vang sơn tra” mỗi năm công ty cho ra thị trường từ 50 – 60 nghìn lít. Một số doanh nghiệp khác cũng tạo ra nhiều sản phẩm rượu táo mèo khác nhau như rượu “táo mèo ngũ hành” của công ty TNHH rượu Vân Sơn, rượu “táo mèo Rơm vàng” của công ty Vodka, Rượu “táo mèo vua” của công ty rượu Trúc Bạch (Hình 1.3.2.1a).

Hình 1.3.2.1a. Một số loại rượu táo mèo trên thị trường

Hình 1.3.2.1b. Một số loại sản phẩm khác chế biến từ quả táo mèo trên thị trường

Bên cạnh sản phẩm chủ lực là rượu táo mèo, một số doanh nghiệp đã nghiên cứu chế biến táo mèo thành các sản phẩm thương mại khác như: thực phẩm bảo vệ sức khỏe “Cholessen” của công ty cổ phần Decotra; Sản phầm này có dụng hỗ trợ giảm mỡ máu, chống béo phì; thực phẩm chức năng “Giảm cân AZ” của công ty TNHH Dược phẩm USAPHA. Sản phẩm nước ép táo mèo TURI của công ty TNHH Anh Đào. Sản phẩm giấm táo mèo Lê Gia của công ty TNHH GCAECO (Hình 1.3.2.1b)

1.3.2.2. Sản phẩm táo mèo là kết quả nghiên cứu của đề tài khoa học công nghệ

Kế thừa kết quả nghiên cứu đề tài Khoa học công nghệ “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và phát triển một số sản phẩm đồ uống từ quả táo mèo” thuộc chương trình công nghệ sinh học chế biến của Bộ Công Thương do Viện Công nghiệp thực phẩm chủ trì đã nghiệm thu năm 2016. Công ty cổ phần rượu bia nước giải khát AROMA đã hợp tác với Viện Công nghiệp thực phẩm phát triển và sản xuất ba loại sản phẩm của đề tài là rượu táo mèo, nước giải khát táo mèo và giấm táo mèo. Các sản phẩm đã được thương mại hóa ra thị trường từ đầu năm 2019 [20].

Hình 1.3.2.2. Một số sản phẩm táo mèo ứng dụng kết quả đề tài nghiên cứu KHCN

Đề tài “Nghiên cứu bào chế chế phẩm có tác dụng hạ lipid máu từ ba dược liệu táo mèo, hà thủ ô đỏ, cốt khí củ ở vùng Tây Bắc” năm 2013 – 2018 do Học Viện Quân Y chủ trì đã tạo ra sản phẩm “TABALIX” có tác dụng giảm mỡ máu. Đến nay, sản phẩm này đang được tiếp tục hoàn thiện để đưa ra thị trường phục vụ tiêu dùng [21].

1.3.2.3. Một số quy trình công nghệ chế biến quả táo mèo tạo các loại sản phẩm

 Quy trình sản xuất rượu táo mèo quy mô 2000 lít/mẻ [20]

Táo mèo tươi

Phân loại, rửa sạch, nghiền

Xử lý enzyme Pectinex SPL

Nhiệt độ thường, pH: 4, nồng độ enzyme 0,02 %, thời gian: 60 phút

Xử lý enzyme Pectinex Ultra Clear, tannase

Nhiệt độ: 50-52oC, pH: 4,0, nồng độ enzyme Pectinex Ultra Clear: 0,2 %, enzyme tannase 0,25%, thời gian: 30 phút

Thu hồi dịch quả (cả bã)

Trích ly với rượu

Bã

Tỷ lệ quả và rượu 1:3 (w/v)

Rượu nền 55 độ, đã được xử lý

Thu hồi dịch rượu

Phối chế

Đưa về độ rượu theo yêu cầu

Bổ sung các phụ gia

Lọc trong

(Phương pháp lọc lạnh 8-10oC)

Đóng chai

Phân tích, Kiểm tra

Rượu táo mèo

Hình 1.3.2.3a. Sơ đồ quy trình sản xuất rượu táo mèo

 Quy trình sản xuất nước táo mèo dạng trong quy mô 5000 lít/mẻ [20]

Táo mèo tươi

Lựa chọn

Quả có độ chín đồng đều

Rửa sạch, nghiền xé nhỏ

Sirô đường

Ngâm sirô

2,53 kg đường hòa tan trong 1 lít nước ở 60oC

Tỷ lệ sirô đường: nguyên liệu là 1,25:1, thời gian ngâm 1 tháng

Thu hồi sirô

Sirô có hàm lượng chất khô 57oBx

Bổ sung K2S2O5 200 mg/l

Bã

Pha loãng: về 20oBx

Xử lý enzyme Pectinex Ultra Clear, Tannase Nhiệt độ: 50-52oC, nồng độ enzyme Pectinex Ultra Clear: 0,2 %, enzyme tannase 0,25%, thời gian: 30 phút

Phối chế

15oBx, axit 3g/l

Bổ sung bảo quản Natri Benzoate 0,05%

Lọc trong, đóng chai

Thanh trùng

Giữ 75oC trong 20 phút

Nước táo mèo

Hình 1.3.2.3b. Sơ đồ quy trình sản xuất nước uống táo mèo

 Quy trình công nghệ sản xuất giấm táo mèo quy mô 2000 lít mẻ [20].

Táo mèo tươi

Phân loại

Rửa sạch, nghiền nhỏ

Rửa, ngâm nước muối 5%, 30 phút, nghiền nhỏ 0,5-1cm

Xử lý enzyme pectinase

Pha loãng 1/1,5 (cơ chất/nước) Ultra SPL: nồng độ 0,15%, tại 30oC, 60 phút; Ultra Clear: 0,1 %, 550C, 60 phút

Lọc dịch, pha môi trường lên men

Bã

Tách bã, pha nước tỷ lệ 1:3, bổ sung đường 10%

Lên men rượu

Nhiệt độ 28-320C, thời gian 5-7 ngày

Nấm men giống 10%

Lên men giấm

Vi khuẩn AA 8%

Cồn:6%; acid acetic: 0,5%; đường:2%; cao nấm men: 0,5%, vi khoáng; nhiệt độ: 28-35oC; khuấy 200 vòng/phút; sục khí 300-400 lit/phút

Thanh trùng

900C, 6 phút, hạ nhiệt 12 phút

Lọc thô

Đất trợ lọc Hyflo Supecel Z (0,68kg/cm2)

Tàng trữ

Nhiệt độ 250C-300C trong 6 tháng

Lọc tinh, hoàn thiện đóng chai

Giấm táo mèo

Hình 1.3.2.3c: Sơ đồ quy trình sản xuất giấm táo mèo

Nhận xét:

Các quy trình công nghệ nêu trên đã được nghiên cứu và hoàn thiện ở quy mô

công nghiệp. Quy trình đã áp dụng các kỹ thuật hiện đại như công nghệ enzyme, công

nghệ ủ lên men, trích ly…Sản phẩm tạo ra như rượu táo mèo, giấm táo mèo và nước uống táo mèo có chất lượng ổn đinh.

Các quy trình công nghệ này sử dụng nguồn nguyên liệu là quả táo mèo tươi, sản

xuất theo mô hình bán liên tục, thời gian sản xuất cho mỗi mẻ là tương đối dài (2-3 tháng/mẻ), khối lượng nguyên liệu táo mèo sử dụng đầu vào không quá lớn, do đó

chưa tận dụng hết tiềm năng về sản lượng táo mèo ở nước ta. Bên cạnh đó, các sản

phẩm tạo ra cũng chưa có tính đột phá nên khả năng cạnh tranh trên thị trường khá khó

khăn. Vì vậy, đối với việc nghiên cứu công nghệ chế biến quả táo mèo cần xây dựng những phương án công nghệ mới nhằm tạo ra sản phẩm có tính đột phá như hướng đến

sản phẩm hỗ trợ chăm sóc sức khỏe con người, đồng thời khai thác có hiệu quả tiềm

năng về nguồn nguyên liệu quả táo mèo.

1.4. Định hướng nghiên cứu

Từ những nội dung nêu trên, chúng tôi đã khái quát được tình hình nghiên

cứu, phát triển cũng như khai thác, chế quả táo mèo ở nước ta cũng như trên thế giới.

Từ đó, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu đối tượng quả táo mèo nhằm giải quyết hai

vấn đề lớn dưới đây.

Thứ nhất, táo mèo là loại quả có giá trị dinh dưỡng. Đặc biệt, nó chứa hàm lượng

phenolic khá cao, đây là nhóm hợp chất đã được chứng minh là giàu hoạt tính sinh học.

Vì vậy quả táo có tiềm năng cho việc khai thác và phát triển tạo sản phẩm để phục vụ

cuộc sống. Tuy nhiên cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học các hợp chất

thứ cấp và hoạt tính sinh học về trái cây này có khá khiêm tốn ở cả trong và ngoài nước.

Do đó trong luận án này, chúng tôi định hướng nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cao chiết quả táo mèo, cụ thể là phân đoạn cao chiết

ethyl acetate. Đây là phân đoạn cao chiết thể hiện hoạt tính mạnh nhất theo các công trình đã công bố [8, 11, 12] và cũng là phân đoạn cao chiết tập trung phần lớn các hợp chất phenolic. Kết quả nghiên cứu sẽ đóng góp rất nhiều cho việc nâng cao giá trị quả táo mèo, đồng thời bổ sung cơ sở khoa học cho việc sử dụng táo mèo vào việc hỗ trợ điều trị một số bệnh lý, nâng cao sức khỏe con người.

Thứ hai về vấn đề khai thác và chế biến quá táo mèo. Như đã nêu ở phần trước, sản lượng táo mèo ở nước ta ngày một tăng, trái cây được thu hái theo mùa vụ nên sản lượng là rất lớn trong mùa thu hoạch. Tuy nhiên hiện nay, táo mèo chủ yếu vẫn được

chế biến từ dạng quả tươi như làm mứt, ô mai, ngâm rượu, hay hiện đại hơn là công

nghệ lên men làm nước quả, dấm, làm rượu [16-21]. Những sản phẩm này mới chỉ đáp

ứng một lượng nhỏ sản lượng trái cây tươi mà giá trị mang lại cũng chưa cao do chưa

có tính đột phá. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục đặt vấn đề nghiên cứu các công nghệ hiện

đại trong lĩnh vực chiết xuất nhằm khai thác nhóm hợp chất phenolic giàu hoạt tính trong quả táo mèo một cách hiệu quả từ nguyên liệu táo mèo đã sấy khô. Điều này giải

quyết được vấn đề khó khăn về bảo quản nguyên liệu trong mùa thu hoạch, đồng thời

giúp nâng cao giá trị sản phẩm sau chế biến, hướng tới việc bào chế các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có giá trị cao.

1.5. Vài nét về nhóm hợp chất phenolic

1.5.1. Đặc điểm chung của các hợp chất phenolic [22-24]

Phenol dễ bị oxy hóa thành gốc aryl. Hạt điện tử tự do lúc ấy không còn định vị mật độ spin tập trung cao nhất tại nguyên tử oxy, cũng như tại nguyên tử carbon ở vị

trí para đối với oxy. Các gốc aryl vì thế dễ bị dime hóa qua các liên kết C – C hoặc C –

O mới. Quá trình oxy hóa các liên kết này có thể là nội phân tử hoặc liên phân tử. Nội

phân tử chỉ diễn ra khi khả năng liên kết C – C gặp cản trở vì lý do cấu hình lập thể.

Oxy hóa cầu nối các phenol giữ vai trò rất quan trọng để hình thành các phân tử

lớn như bis-anthraquinon, thậm chí là các phân tử cực lớn như lignin, lignan và tanin.

Điều đó giải thích vì sao khi chúng ta cắt trái cây để lâu ngoài không khí thì phần bề

mặt bị cắt sẽ chuyển thành màu nâu. Trong sinh thể thì xúc tác của quá trình oxy hóa

là các men monophenol monoxygenase như lactase, tyrosinase và các men peoxydase.

Những peroxydase này hầu như loài thực vật nào cũng có, vì thế để chặn trước nguy

cơ bị mất các phenolic phải diệt men.

Một khả năng khác của phenolic là dễ hình thành các liên kết hydro với protein.

Ngay lúc này màng tế bào bị xé rách, các hợp phần phenolic tiếp xúc protein và tạo

phức rất nhanh

Chức năng sinh học của một số phenolic thì đã rõ, ví dụ như lignin là vật liệu

cấu tạo màng tế bào thực vật, các antoxyanin là sắc tố của hoa. Tuy nhiên, còn nhiều điều chưa rõ về chức năng của những nhóm chất phenolic khác, ví dụ như các flavonoid dường như là chất điều hòa sinh trưởng ở cây đậu nhưng lại là sắc tố quang hợp ở cây ra epina.

Phần lớn các phenolic là có màu, đặc biệt là các flavonoid. Song cũng có những nhóm như phenolic đơn giản là các hợp chất không màu. Cách phát hiện thông thường là cho phản ứng với các thuốc thử đặc hiệu như phản ứng với FeCl3 1% hoặc hỗn hợp FeCl3 1% với K3Fe(CN)6 1% trong nước sẽ thấy có màu lục, tía hoặc xanh lam.

Phenolic là các hợp chất thơm nên tất cả chúng đều hấp thụ khá mạnh trong vùng

UV-VIS. Sự có mặt của kiềm còn tạo ra những bước chuyển dịch rõ rệt. Vì vậy, phương

pháp phổ hấp thụ vẫn là phương tiện đầu tay mỗi khi cần nhận dạng và định lượng các

hợp chất phenolic. Việc xác định các hợp chất mới hoặc cấu trúc phức tạp cần thiết phải kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như 1D – NMR, 2D-NMR và MS.

1.5.2. Phân loại và hoạt tính sinh học các hợp chất phenolic [25-27]

Các hợp chất phenolic là các hợp chất có một hay nhiều vòng thơm liên kết trực tiếp với một hoặc nhiều nhóm hydroxyl. Chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực

vật và là các sản phẩm trao đổi chất phong phú của thực vật. Hơn 8000 cấu trúc

phenolic đã được tìm thấy và xác định, từ các phân tử đơn giản như các phenolic acid

đến các polyphenol như tanin, lignan…

Các hợp chất phenolic bao gồm các flavonoid, phenolic acid, coumarin,

xanthon, tanin, lignin, lignan và một số các hợp chất khác. Với cấu trúc có nhiều nhóm

phenol, chúng có khả năng ngăn chặn các chuỗi phản ứng dây chuyền gây ra bởi các

gốc tự do bằng cách phản ứng trực tiếp với các gốc tự do đó tạo thành một gốc tự do

mới bền hơn hoặc chúng cũng có thể tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp vốn là

xúc tác cho quá trình tạo ra các gốc tự do.

Phenolic là nhóm hoạt chất rất phổ biến trong giới thực vật, chúng có tác dụng

sinh học rất phong phú. Các hợp chất phenolic thường có tính chống oxy hóa mạnh

giúp cơ thể chống lại các tổn thương do gốc tự do gây ra một cách hữu hiệu. Nhờ vậy,

chúng có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý liên quan

đến tim mạch như đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch…Bên cạnh đó

các phenolic còn có các hoạt tính như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus và ức

chế tế bào ung thư.

Bảng 1.4.3. Phân loại các hợp chất phenolic dựa trên bộ khung nguyên tử carbon trong phân tử

Khung cơ bản Phân loại

Số nguyên tử carbon

6 Phenolic đơn giản C6

7 Các phenolic acid và các hợp chất cùng họ C6 – C1

8 Acetophenone và phenylacetic acid C6 – C2

9 C6 – C3

Cinamic acid, cinnamyl aldehydes, cinmyl alcohol, coumarin, isocoumarins và chromone

10 Naphthoquinon C6 – C4

13 Xanthonoid C6 -C1-C6

14 Stillbenoid, anthraquinon C6-C2-C6

15 C6-C3-C6

Chalcones, aurone, dihydrochalcone, flavonoid, anthocyanidin, anthocyanin

16 Halogenat algal C6-C4-C6

18 Lignan, neolignan (C6-C3)2

30 Biflavonyl (C6-C3-C6)2

poly

Lignin, catechol, melamin, flavolan, polyphenolic protein, polyphenol (C6-C3)n, (C6)n, (C6-C3-C6)n

1.5.3. Chiết xuất phenolic từ thực vật

Các hợp chất phenolic xuất hiện khá phổ biến trong các loài thực vật. Việc chiết

xuất các hợp chất phenolic đã được nghiên cứu tương đối nhiều. Tuy nhiên với mỗi loại nguyên liệu khác nhau thì cần có những phương pháp và điều kiện chiết xuất phù hợp nhằm đạt được hiệu suất chiết cao nhất. Các kỹ thuật chiết xuất phenolic từ thực

vật được trình bày sau đây.

1.5.3.1. Chiết sử dụng dung môi thông thường (LLE)

Các nhà khoa học đã sử dụng các loại dung môi để nghiên cứu và đánh giá việc

chiết các hợp chất phenolic từ các bộ phận khác nhau của thực vật như lá, quả và hạt.

Dựa trên sự đơn giản và rẻ của phương pháp này, cùng với tính phân cực khác nhau

của dung môi, các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau, họ đã có thể tách chiết các hợp

chất phenolic khác nhau từ thực vật [28].

Thực vật chứa một lượng các hợp chất phenolics rất đa dạng, có cấu trúc đơn

giản và phức tạp. Vì có thể có sự tương tác giữa chúng với các hợp chất khác trong thực

vật như cacbonhydrat và protein, cho nên sẽ khó có thể tìm được một phương pháp thích

hợp để chiết tách tất cả các hợp chất phenolic [29]. Trong phương pháp này, các hợp

chất phenolic khác nhau được chiết tách và sau đó cần tiếp tục tinh chế chúng.

Có 3 cách để chiết các hợp chất phenolic sử dụng phương pháp LLE đó là chiết

soxhlet, ngâm và chưng cất lôi cuốn theo hơi nước. Các thông số ảnh hưởng trong những phương pháp chiết này là loại dung môi, độ phân cực dung môi, tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu, thời gian và nhiệt độ chiết, đặc biệt là thành phần hóa học và đặc tính vật lý của mẫu [30].

Kerouri và cộng sự đã nghiên cứu tổng hàm hượng các hợp chất phenolic, flavonoid và tannin thu được khi sử dụng các loại dung môi khác nhau có độ phân cực khác nhau bằng thiết bị chiết soxhlet và phương pháp ngâm chiết [31]. Các nhóm

hợp chất phenolic khác nhau đã được chiết bằng các loại dung môi có độ phân cực

khác nhau. Ethyl acetate, acetone và ethanol đã được sử dụng như là dung môi tốt

nhất để chiết polyphenol, flavonoid và tannin. Trong một nghiên cứu khác, việc tách

các hợp chất phenolic từ hỗn hợp dầu bằng chất lỏng dicationic ionic đã được tiến hành bởi Wu và cộng sự [32]. Loại chất lỏng này đã cho thấy hiệu suất tách chiết

phenolic tối đa là 96.6% trong vòng 5 phút. Khả năng tái sử dụng chất lỏng

dicationic ionic đã được nghiên cứu và chỉ ra rằng chúng bền sau 4 chu kỳ mà không giảm hiệu quả tách chiết phenolic.

Trong phương pháp chiết này, thường có thể chiết được 1 – 30g các hợp chất

phenolic trong 6 – 24h. Ưu điểm của phương pháp này là quy trình chiết đơn giản và

có thể chiết các hợp chất phenolic khác nhau bằng dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau. Nhưng nhược điểm của quy trình này là tiêu thụ lượng dung môi lớn, thời

gian chiết dài và hiệu suất chiết thấp, nguy cơ phơi nhiễm với hơi dung môi hữu cơ và

sự giảm chất lượng của các hợp chất mục tiêu trong phương pháp chiết [30]. Những

vấn đề trong phương pháp chiết này đã dẫn đến việc tạo ra và phát triển của các kỹ

thuật thay thế mới, hiệu quả hơn trong việc chiết xuất phenolic.

1.5.3.2. Chiết có hỗ trợ siêu âm (UAE)

Sóng siêu âm là sóng có tần số từ 20 kHz đến 10 MHz, có thể truyền qua chất

rắn, lỏng và khí và con người không thể cảm nhận thấy nó. Trong phương pháp chiết

này, các bọt khí được tạo ra có năng lượng cao sẽ phá vỡ cấu trúc thành tế bào của

nguyên liệu, do đó tạo điều kiện giải phóng tốt hơn các vật chất trong tế bào [33].

Sóng siêu âm được ứng dụng và sử dụng ở 2 loại thiết bị là loại đầu dò và bể

siêu âm để chiết các hợp chất phenolic từ thực vật. Bên cạnh các thông thông số vốn

có của thiết bị siêu âm (như biên độ, tần số và bước sóng), công suất và cường độ của

chúng cũng có nhiều ảnh hưởng đến quá trình chiết và các thông số này cần được tối ưu. Thiết kế và hình dạng của bể siêu âm cũng như hình dạng của đầu dò có thể ảnh

hưởng đến quá trình chiết [34].

So sánh với các phương pháp truyền thống, phương pháp chiết hỗ trợ siêu âm (UAE) đã được sử dụng theo các các phương diện đơn giản, dễ sử dụng, chi phi thấp, hiệu quả cao, tiêu thụ dụng môi hữu cơ thấp và giảm thời gian chiết. Nó có thể được sử dụng như một quy trình đơn giản và đáng tin cậy trong phạm vi dung môi hữu cơ rộng cho các hợp chất phenolic khác nhau ở cấp độ quy mô lớn và công nghiệp [35].

Sun và cộng sự đã báo cáo ảnh hưởng của mật độ năng lượng sóng siêu âm (6.8 – 47.4 W/L) và nhiệt độ (20 - 50ºC) đến hiệu suất chiết phenolic tổng bằng cách chiết

siêu âm từ bã nho [36]. Họ sử dụng dung dịch ethanol 50% làm dung môi và cho rằng

tốc độ chiết sẽ tăng lên cùng với sự tăng của mật độ năng lượng siêu âm do hệ số

khuếch tán cao hơn. Hiệu suất chiết các acid phenolic và flavonoid chọn lọc từ thảo

mộc Equisetum arvense L. được thực hiện bởi Oniszczuk và cộng sự [37]. Các phương

pháp chiết khác nhau như chiết soxhlet, chiết hỗ trợ siêu âm (USAE) và chiết dung môi gia tốc (ASE) đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Họ đã chứng minh rằng,

chiết siêu âm ở 60ºC với 3 chu kỳ (30 phút/chu kỳ), dung môi sử dụng methanol 80%

là phương pháp hiệu quả và chính xác hơn các phương pháp khác để tách các acid phenolic và flavonoid chọn lọc từ thảo mộc E.arvense L. Trong một kế hoạch nghiên

cứu khác của Palma và cộng sự, các nhà khoa học đã nghiên cứu các thông số khác

nhau là nhiệt độ, biên độ đầu ra, chu kỳ làm việc, lượng mẫu và thời gian để chiết các

hợp chất phenolic từ quả nho và so sánh các điều kiện tối ưu với các kỹ thuật chiết thông thường [38]. Kết quả cho thấy chiết hỗ trợ siêu âm có thể chiết các hợp chất

phenolic với hiệu suất cao hơn và thời gian chiết ngắn hơn nhiều, chỉ 6 phút thay vì

phải chiết trong 60 phút. Việc chiết hợp chất phenolic từ vỏ nho Syrah cũng đã được

thực hiện bởi Tonon và cộng sự [39]. Họ đã tối ưu công suất chiết, nồng độ acid citric

và tỉ lệ rắn – lỏng cho phương pháp chiết này. Dưới điều kiện tối ưu, 59% hợp chất

phenolic đã định lượng được chiết chỉ trong 3 phút của quá trình, siêu âm đã được coi

là một phương pháp phù hợp dựa trên việc tạo điều kiện dễ dàng giải phóng các hợp

chất phenolic từ gian bào thực vật. Theo con đường tương tự, Zardo và cộng sự đã

báo cáo việc chiết các hợp chất phenolic từ hạt hoa hướng dương [40]. Nhiệt độ và

nồng độ ethanol cho thấy hiệu quả cao nhất trong việc chiết các hợp chất phenolic từ

hạt hướng dương. Các kết quả cho thấy rằng hàm lượng phenolic thu được là khá cao

trong thời gian đầu của quá trình và thời gian dài hơn không ảnh hưởng đến lượng chất

chiết thu được. Cũng trong một kế hoạch nghiên cứu khác của Row và cộng sự đã thực

hiện chiết phenolic từ Laminaria japonica Aresch với 3 loại dung môi là các chất lỏng ionic 1-alkyl-3-methylimidazolium với các loại cations và anions khác nhau [41]. Các

kết quả chỉ ra rằng các đặc tính của cả 2 loại chất lỏng ionic anions và cations có hiệu

quả rõ rệt đến hiệu suất chiết. So sánh các kết quả chiết dưới điều kiện tối ưu sử dụng chất lỏng ionic với dung môi thông thường cho thấy hiệu suất chiết cao hơn trong thời gian chiết ngắn hơn. Sheng và cộng sự đã đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của phenolic chiết từ quả Terminalia chebula Retz. bằng các phương pháp chiết khác nhau là UAE và LLE [42]. Các kết quả chỉ ra rằng hoạt tính chống oxi hóa của hợp chất phenolic chiết bằng UAE trong điều kiện tối ưu thì mạnh hơn phương pháp LLE.

Dựa trên các tài liệu khác nhau về phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm, các hợp chất phenolic có thể được chiết trong 10 – 60 phút và khi so sáng với phương pháp

LLE thì nó dễ xử lý, rẻ tiền, an toàn, tái sản xuất được và có thể sử dụng đồng thời cho

nhiều loại mẫu [43]. Những tính chất này cho thấy chiết có hỗ trợ siêu âm là phương

pháp thay thế có lợi so với phương pháp LLE để chiết các hợp chất phenolic từ các

phần khác nhau của thực vật [44].

1.5.3.3. Chiết có hỗ trợ vi sóng (MAE)

Vi sóng là những bức xạ điện từ với tần số trong khoảng 30 – 300 MHz. Hiệu

ứng nhiệt được sinh ra do sự chuyển động liên tục của các phân tử phân cực trong vật

chất dưới tác động của cảm ứng điện từ, khiến cho thành tế bào bị phá vỡ và giải phóng các hoạt chất trong tế bào ra môi trường.

Các phân tử dung môi lưỡng cực như nước, ethanol có hằng số điện môi cao

hơn các dung môi không phân cực nên có thể hấp thu năng lượng cao, do đó chúng

làm tăng tốc độ và hiệu suất chiết các hợp chất phenolic [45,46].

Cho đến nay, nhiều tài liệu đã báo cáo về việc ứng dụng công nghệ vi sóng để

chiết các hợp chất phenolic từ thực vật. Giảm thời gian và chi phí, hiệu suất cao và tiêu

thụ dung môi hữu cơ ít là những ưu điểm của phương pháp này so với các phương

pháp truyền thống. Ngoài ra, một lợi ích quan trọng khác của quá trình chiết này là

chiết đồng thời một số chất trong thời gian ngắn [30].

Proestos cùng Komaitis và cộng sự đã tiến hành chiết phenolic từ các loại thực

vật thơm với các dung môi khác nhau bằng cách chiết vi sóng [47]. So sánh các kết

quả này với chiết thông thường (chiết hồi lưu) cho thấy chiết vi sóng có thể thực hiện

trong thời gian ngắn hơn, sử dụng ít dung môi và hiệu suất chiết tốt hơn. Ngoài ra,

Memon và cộng sự đã nghiên cứu quá trình chiết, xác định các tính chất chống oxy

hóa của các hợp chất flavonoids trong lá và hoa của loài Cassia angustifolia [48]. Việc

chiết các hợp chất flavonoids được tiến hành bằng 5 phương pháp bao gồm chiết vi

sóng, soxhlet, siêu âm, ngâm chiết và chiết hồi lưu. So sánh hàm lượng flavonoids

tổng thu được tương ứng với các phương pháp chiết khác nhau cho thấy phương pháp chiết vi sóng là lựa chọn tốt nhất và có thể chiết được lần lượt là 28.15 – 26.3 mg/g

flavonoid tổng trong hoa và lá. Ưu điểm của phương pháp này là nó rất dễ, mạnh và quá trình chiết tiến hành trong thời gian ngắn (9 phút), đây là thời gian chiết ngắn nhất khi so sánh với các phương pháp khác. Do đó, phương pháp chiết này đã được chứng minh là hiệu quả hơn một số phương pháp khác trong việc chiết xuất nhiều loại flavonoid hơn.

Guolin và cộng sự đã tiến hành chiết vi sóng pectin từ vỏ chanh sử dụng dung dịch ionic như làm dung môi thay thế [49]. Trong điều kiện tối ưu và khoảng thời gian kéo dài 9,6 phút, hiệu suất chiết pectin là 24,68%, cao hơn nhiều so với hiệu suất chiết

bằng cách chiết hồi lưu trong 2 giờ. Theo kết quả này, các dung dịch ionic có thể được

coi là một dung môi hiệu quả trong chiết vi sóng pectin từ vỏ chanh. Ngoài ra, Liu và

cộng sự đac đánh giá quá trình chiết và xác định taxifolin trong Larix gmelinii bằng

phương pháp chiết vi sóng dựa trên dung dịch ionic [50]. Họ đã nghiên cứu các loại

chất lỏng ionic của 1-alkyl-3-methylimidazolium với các loại cation và anion khác nhau. Theo các kết quả, cả phần anion và cation của dung dịch ionic có thể tác động

đến hiệu suất chiết và dung môi tối ưu để chiết taxifolin là 1-butyl-3-

methylimidazolium bromide. So sánh phương pháp này với các phương pháp truyền thống sử dụng dung môi chiết là nước và có khuấy trộn (WSE), chiết nước hồi lưu

(WRE) và ngâm chiết cho thấy, phương pháp MAE có thể đạt được hiệu suất cao hơn

mà tiêu thụ năng lượng và thời gian ít hơn. Tiếp đó, trong điều kiện chiết tối ưu,

taxifolin ổn định và không xuống cấp trong quá trình chiết.

Hoạt tính chống oxy hóa và tác dụng ức chế của các hợp chất phenolic được

chiết bằng phương pháp vi sóng cao hơn và hiệu quả hơn phương pháp LLE do chiết

vi sóng có thời gian chiết ngắn hơn. Theo thực tế này, Yuan và cộng sự đã báo cáo quá

trình chiết các hợp chất phenolic ở 110ºC trong 15 phút từ 4 loài rong nâu kinh tế sử

dụng MAE. Những hợp chất đã được chiết này có hoạt tính chống oxy hóa và hàm

lượng phenolic tổng trong tất cả các loài rong cao hơn khi so sánh với chất thu được

bằng phương pháp chiết thường ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ [51]. Trong một báo cáo

khác của Alara và cộng sự, các hợp chất phenolic được chiết từ lá Vernoniacinerea

bằng phương pháp vi sóng, chúng có hoạt tính chống oxy hóa và chống tiểu đường cao

hơn khi chiết bằng phương pháp LLE [52].

Nhìn chung, các thông số có hiệu quả của quy trình chiết này là dung môi, áp

suất, nhiệt độ, bản chất của gian bào nguyên liệu và công suất của thiết bị. So sánh

phương pháp chiết vi sóng với phương pháp chiết LLE thì nó dễ sử dụng và cần ít

dung môi hơn [53,54]. Hơn nữa, phương pháp này có thể giảm thời gian và tăng hiệu

suất chiết. Nhược điểm của phương pháp này là dung môi cần phải hấp thụ năng lượng

vi sóng, có nguy cơ gây nổ và khó áp dụng ở quy mô lớn

1.5.3.4. Chiết lỏng siêu tới hạn (SFE)

Trong phương pháp này, dung môi ở nhiệt độ và áp suất trên điểm tới hạn của

nó và và không có sức căng bề mặt trong đó. Do đó, đồng thời nó có các tính chất của

chất lỏng và khí nên có nhiều hiệu quả để chiết các hợp chất phenolic từ thực vật. Độ

nhớt thấp và độ khuếch tán cao của chất lỏng siêu tới hạn cho phép chúng chiết các

hợp chất phenolic khác nhau trong thời gian ngắn mà hiệu suất lại cao.Vì vậy, đây

cũng là một phương pháp thay thế hữu ích cho phương pháp chiết truyền thống [55].

Một tính chất đặc biệt của chiết chất lỏng siêu tới hạn là tỷ trọng của dung dịch siêu tới

hạn có thể dễ dàng thay đổi dựa trên nhiệt độ và áp suất khác nhau. Ngoài ra, ở nhiệt

độ không đổi, tính tan trong chất lỏng siêu tới hạn có liên quan trực tiếp đến tỷ trọng

của nó. Cho nên, bằng cách tăng áp suất thì tính tan của nó cũng có xu hướng tăng. Vì

vậy, những tính chất này có thể được sử dụng để phân tách các hợp chất phenolic với

độ chọn lọc khác nhau [56].

Carbon dioxide được biết đến là là một dung môi chiết có chọn lọc, bền, không độc, an toàn với môi trường và rẻ để chiết chất lỏng siêu tới hạn. Dựa trên những tính

chất nổi bật này, nhiều tài liệu đã công bố rằng carbon dioxide đã được sử dụng làm

dung môi để chiết nhiều hợp chất phenolic khác nhau [57].

Khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phenolic được chiết bằng chất lỏng

siêu tới hạn thì cao hơn nhiều so với phương pháp LLE. Gần đây, Pereira và cộng sự

đã đánh giá hoat tính chống oxy hóa của các hợp chất có hoạt tính sinh học được chiết

từ lá mía và quả mọng bằng phương pháp chiết chất lỏng siêu tới hạn [58]. Họ sử dụng

ba phương pháp khác nhau để nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất

này và các kết quả đã chứng minh rằng các hợp chất phenolic được chiết bằng phương

pháp chất lỏng siêu tới hạn có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn chiết bằng phương

pháp LLE. Ngoài ra, Tan và cộng sự đã báo cáo rằng khả năng chống oxy hóa của dầu

bơ chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn thì cao hơn chiết bằng phương pháp UAE và LLE

[59]. Hơn nữa, dầu bơ chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn có hàm lượng α- và β-

tocopherol gấp 2 đến 4 lần phương pháp LLE và UAE.

Tóm lại, phương pháp chiết chất lỏng siêu tới hạn rất nhanh, không tốn kém để

vận hành và có tính chọn lọc. Cho nên, dù một lượng nhỏ phenolics trong thực vật có

thể chiết bằng phương pháp này. Ngoài ra, phương pháp này yêu cầu ít hoặc không

cần dung môi và các hợp chất không bền với nhiệt sẽ ổn định trong phương pháp chiết

này [60]. Tuy nhiên đây là phương pháp đắt tiền và chỉ phù hợp đối với các nguyên

liệu có giá trị kinh tế cao.

1.6. Giới thiệu về phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) và tối ưu hóa quy trình

công nghệ hóa học [60, 61]

Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response surface methodology) hay còn gọi là quy hoạch thực nghiệm là tổng hợp các kỹ thuật toán học và thống kê để xây dựng mô

hình thực nghiệm. Bằng cách thiết kế một cách cẩn thận, có hệ thống các thí nghiệm,

chúng ta có thể đánh giá kết quả đầu ra (hàm mục tiêu) thông qua ảnh hưởng của các thông số đầu vào (yếu tố công nghệ của quá trình). Mô hình thí nghiệm được đánh giá

thông qua việc phân tích phương sai ANOVA dựa trên các kết quả thực nghiệm thu

được. Cuối cùng, từ dữ liệu được phân tích, chúng ta sẽ tìm được phương trình hồi quy

tổng quát thể hiện mối liên hệ tương quan giữa hàm đầu ra và các biến đầu vào. Tiếp

đó, tiến tới việc tối ưu hóa hàm mục tiêu thông qua công cụ toán học.

Việc áp dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để tối ưu hóa quy trình công

nghệ giúp giảm đáng kể số thí nghiệm cần thiết, hàm lượng thông tin nhiều hơn rõ rệt

nhờ đánh giá được vai trò qua lại giữa các yếu tố công nghệ đầu vào và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu. Chúng ta nhận cũng được mô hình toán học thống kê thực

nghiệm theo các tiêu chuẩn thông kê, đánh giá được sai số của quá trình thực nghiệm

theo các tiêu chuẩn thống kê cho phép xem xét ảnh hưởng của các yếu tố với mức độ

tin cậy cần thiết. Bên cạnh đó, mô hình cho phép xác định được điều kiện tối ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu một cách khá chính xác bằng các công cụ toán học

hiện đại. Một số kế hoạch thực nghiệm được áp dụng cho phương pháp đáp ứng bề

mặt như:

+ Kế hoạch bậc 1 hai mức tối ưu

+ Kế hoạch trực giao bậc 2 của Box-Willson

+ Kế hoạch bậc 2 của Box-Behnken

+ Kế hoạch tâm xoay bậc 2 của Box – Hunter

+ Kế hoạch bậc 2 tối ưu của Kiefe

Tối ưu hóa là quá trình tìm kiếm điều kiện tốt nhất (điều kiện tối ưu) của hàm số

được nghiên cứu, hay nói cách khác chính là bài toán tìm cực trị của hàm mục tiêu với

các biến là các yếu tố công nghệ của quá trình.

Giả sử một hệ thống công nghệ được biểu diễn bằng mô tả toán học dưới dạng:

Y = F(x1,x2,...xk) với x1, x2, xk : thành phần của vectơ thông số đầu vào.

Hàm mục tiêu : I = I (x1,x2,…xk)

Bài toán được biểu diễn:

I opt = opt I (x1 ,x2 ,…xk ) =I (x1 opt,x2 opt,…xk opt )

hoặc I opt = max I ( x1,x2,…xk) : đối với bài toán tìm cực đại

I opt = min I (x1,x2,…xk) : đối với bài toán tìm cực tiểu

opt,x2

opt,…xk opt là nghiệm tối ưu hoặc phương án tối ưu.

Với Iopt: là hiệu quả tối ưu; x1

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phần mềm Design Expert 7.0.0 để xây

dựng mô hình và tối ưu hóa các thông số công nghệ quá trình.

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là quả táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne,

thu hái tại huyện Bắc Yên, tỉnh Sơn La vào tháng 9 năm 2014 và tháng 10 năm 2017. Mẫu nghiên cứu được định danh khoa học bởi TS Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản được lưu tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.

Hình 2.1.1. Mẫu quả táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp định lượng một số thành phần hóa học

2.2.1.1. Phương pháp xác định hàm lượng phenolic tổng

Hàm lượng phenolic tổng được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) [62] bằng cách sử dụng thuốc thử Folin – Ciocalteu và chất chuẩn là acid gallic. Độ hấp thụ quang được đo ở bước sóng 765 nm.

Tiến hành lấy 1mL dịch chiết mẫu, thêm 5 mL thuốc thử Folin – Ciocalteu 10% và lắc đều, sau 3 phút tiếp tục thêm 4 mL dung dịch Na2CO3 7,5%, lắc đều và để yên 1 giờ trong bóng tối. Sau đó tiến hành so màu ở bước sóng 765 nm. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Hàm lượng phenolic tổng số được xác định dựa vào đồ thị đường chuẩn của acid gallic được xây dựng trong khoảng nồng độ 10 ÷ 70 µg/mL (hình 2.2.1a). Các bước xây dựng đường chuẩn được thực hiện tương tự như đối với mẫu phân tích nêu trên.

Công thức tính tổng hàm lượng phenolic tổng

Hàm lượng phenolic tổng =

Trong đó C: Nồng độ phenolic xác định theo đường chuẩn (µg/mL)

V: Thể tích dịch chiết cần phân tích (mL)

m: Khối lượng cao chiết thu được ứng với lượng mẫu đem chiết (g)

2.2.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng

Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo phương pháp của Zhishen và cộng

sự (1999) [63]. Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự tạo phức màu vàng giữa flavonoid với dung dịch AlCl3. Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở bước sóng 415 nm. Quercetin được dùng làm chất chuẩn tham chiếu.

Lấy 1mL dịch chiết thêm vào 4 ml nước cất, sau đó thêm tiếp vào hỗn hợp 0,3 mL dung dịch NaNO2 5%. Sau 5 phút thêm tiếp 0,3 mL dung dịch AlCl3 10% và lắc đều, sau 6 phút tiếp tục thêm vào hỗn hợp 2 mL dung dịch NaOH 1M và định mức đến

thể tích 10 mL bằng nước cất. Độ hấp thụ của dung dịch phản ứng được đo ở bước

sóng 415 nm. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Hàm lượng

flavonoid tổng được xác định dựa vào đồ thị đường chuẩn của quercetin được xây dựng trong khoảng nồng độ 10 ÷ 70 µg/mL (hình 2.2.1b). Các bước xây dựng đường

chuẩn được thực hiện tương tự như đối với mẫu phân tích nêu trên.

Công thức tính tổng hàm lượng flavonoid tổng

Hàm lượng flavonoid tổng =

Trong đó C: Nồng độ flavonoid xác định theo đường chuẩn (µg/mL)

V: Thể tích dịch chiết cần phân tích (mL)

m: Khối lượng cao chiết thu được ứng với lượng mẫu đem chiết (g)

(a) (b)

Hình 2.2.1. Đồ thị đường chuẩn phenolic (a) và flavonoid (b)

2.2.2. Phương pháp xử lý, chiết xuất và phân lập các thành phần hóa học 2.2.2.1. Xử lý nguyên liệu

Nguyên liệu quả tươi sau khi thu mua được phân loại, rửa sạch, sau đó tiến hành thái lát. Mẫu sau đó được sấy diệt men ở 1100C trong 20 phút và được sấy đến khô (hàm ẩm ≤ 10%) ở nhiệt độ 600C. Mẫu táo mèo khô được xay nhỏ tới kích thước 1-2 mm, thu được bột nguyên liệu táo mèo. Bảo quản mẫu trong túi hút chân không.

2.2.2.2. Chiết xuất nguyên liệu để nghiên cứu thành phần hóa học

Bột nguyên liệu táo mèo được tiến hành chiết xuất bằng phương pháp chiết siêu

âm sử dụng dung môi là methanol. Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w = 3/1), 120

phút/lần chiết, ở nhiệt độ phòng, chiết 3-5 lần. Dịch chiết được lọc chân không bằng phễu buchner sau đó cô quay đuổi dung môi để thu cao chiết táo mèo.

2.2.2.3. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715) và RP-18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở 2 bước sóng 254 nm và 365 nm. Sử dụng thuốc thử để hiện màu như dung dịch H2SO4 5% dung dịch vanilin/ H2SO4 (1%), dung dịch Fe3+/ H2SO4 (1%), thymol/ H2SO4 (0,5%).

2.2.2.4. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo.

Silica gel pha thường có cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm (240 – 430 mesh). Silica gel pha đảo

ODS hoặc YMC (30 – 50 µm). Sephadex LH-20 (Merck).

2.2.3. Phương pháp xác định tính chất hóa lý và cấu trúc hóa học

2.2.3.1. Xác định điểm nóng chảy

Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofle Micro – Hotstage của Viện Hóa sinh

biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.3.2. Xác định độ quay cực

Độ quay cực được xác định trên máy JASCO DIP-1000 KUY Polarimeter của

Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3.3. Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS được đo trên máy Agilent 1100 LC-

MSD Trap, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-

Mass, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy: Bruker AM500 FT-NMR của

Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều: HSQC, HMBC, NOESY

2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

+ Đánh giá hoạt tính bảo về tim mạch và chống oxy hóa: thực hiện tại Khoa

Dược, Trường Đại học Chungnam, Hàn Quốc

+ Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào: Thực hiện tại phòng Sinh học thực

nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên

2.2.4.1. Đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH)

Quy trình đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch thông qua cơ chế ức chế enzyme sEH (soluble epoxide hydrolase) được thực hiện tương tự như các nghiên cứu đã được

công bố trước đây [64,65].

+ 130 µL dung dịch enzym sEH tái tổ hợp (12,15 ng/mL) trong dung dịch đệm BSA (25 mM Bis-Tris-HCl, pH 7,0; 0,1 mg/mL) được hoà tan với 20 µL mẫu thử ở

các nồng độ khác nhau tại nhiệt độ phòng (mẫu nghiên cứu được hòa tan trong

methanol tạo các mẫu thử với các nồng độ khác nhau). Thêm vào hỗn hợp đó

50 µL cơ chất huỳnh quang PHOME (3-Phenyl-cyano(6-methoxy-2 naphthalenyl) methyl ester-2-oxiraneacetic acid) nồng độ 20 µM. Phản ứng này được thực hiện ở 370C trong 1 giờ. Lượng sản phẩm tạo thành từ cơ chất bởi xúc tác của enzyme được xác định bằng phương pháp đo huỳnh quang (bộ lọc kích thích có bước

sóng λ = 330 nm và bộ lọc phát xạ có bước sóng λ = 465 nm). Thiết bị phân tích là

máy Tecan (Mannedorf, Thụy Sĩ).

Khả năng ức chế enzyme sEH được đánh giá qua giá trị phần trăm ức chế (I %):

I (%) = [S40 - S0 / C40 - C0] × 100

Trong đó:

C40 và S40 là giá trị mật độ quang của dung dịch mẫu đối chứng và mẫu thử sau

40 phút.

C0 và S0 là Giá trị mật độ quang của dung dịch mẫu đối chứng và mẫu thử ở 0

phút (thời điểm ban đầu)

+ Chất đối chứng dương sử dụng là 12- (3-adamantan-1-yl-ureido)-dodecanoic

(AUDA). Dựa trên phần trăm ức chế tại các nồng độ khác nhau của mẫu thử (dịch chiết và chất sạch), tiến hành đánh giá khả năng ức chế enzyme sEH của các mẫu thử thông qua giá trị IC50. Giá trị IC50 (Inhibitory concentration) được định nghĩa là nồng độ của mẫu thử mà tại đó nó có thể ức chế được 50% hoạt độ enzyme sEH. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình.

2.2.4.2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa (DPPH)

Xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) [66]. Chất thử được hòa trong dimethyl sulfoxide (DMSO 100%) và DPPH được pha trong ethanol 96%. Sự hấp thụ của DPPH ở bước sóng λ = 515nm được xác định bằng máy đọc khay vi thể Elisa (Biotek – USA, Model ELx 800) sau

khi thêm DPPH vào dung dịch mẫu thử trên phiên vi lượng 96 giếng. Kết quả các thử nghiệm được thể hiện là giá trị trung bình của ít nhất 3 phép thử lặp lại ± độ lệch chuẩn (p ≤ 0,05).

Khả năng trung hòa các gốc tự do (Scavenging capacity, SC%): Giá trị trung

bình của SC (%) ở các nồng độ mẫu được tính toán theo công thức:

SC % = [100 - x 100] ± σ

Độ lệch tiêu chuẩn tính theo công thức sau:

σ =

Hiệu quả bắt gốc tự do tạo ra bởi DPPH của mỗi mẫu được tính dựa trên % trung hòa gốc tự do so với mẫu trắng (Blank) và mẫu đối chứng. Mẫu có biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH được thực hiện các bước tiếp theo để tìm giá trị SC50 (µg/mL). Giá trị SC50 là nồng độ của chất thử mà tại đó trung hòa được 50% các gốc tự do, được xác định bằng phần mềm Table Curve AISN Sofware (Jandel Scientific) qua giá trị SC% và dãy các nồng độ chất thử tương ứng.

2.2.4.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào [67]

MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] được Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI) đánh giá là phương pháp quy chuẩn và hiệu quả cho sàng lọc nhanh các chất có hoạt tính gây độc hoặc ức chế sự tăng sinh tế bào. Nguyên tắc của phương pháp là gián tiếp xác định hoạt tính của chất thử qua khả năng ức chế enzyme oxidoreductase phụ thuộc NAD(P)H của tế bào.

Dòng tế bào: Hep-G2 (tế bào ung thư gan) và HeLa (tế bào ung thư cổ tử cung)

Tế bào được nuôi cấy ở 37oC, CO2 5% trong môi trường phù hợp. Dịch tế bào sau đó được nhỏ lên phiến vi lượng 96 giếng (1.5 x 105 tế bào/giếng), ủ với các mẫu

thử ở dải nồng độ từ 100  6,25 µg/mL đối với mẫu cao chiết hoặc 50  1µg/mL

(µM) đối với chất tinh sạch, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Paclitaxel (Taxol) được dùng làm chất chuẩn dương tính (+). Sản phẩm chuyển hóa dạng tinh thể formazan được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich) và đo mật độ quang ở λ = 570 nm trên thiết bị Infinite F50 (Tecan, Männedorf, Thụy Sỹ).

Khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư ở nồng độ nhất định của chất thử

tính theo % so với đối chứng theo công thức:

Tỷ lệ ức chế tế bào (%) = [1-(OD[mẫu]/OD[đối chứng (-)])] x 100%

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (% ức chế ≥ 50%) được xác định giá trị IC50

(µg/mL hoặc µM) là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế 50% sự sống sót của tế bào,

sử dụng phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel Scientific, San Rafiel, CA).

2.2.5. Phương pháp chiết vi sóng, chiết siêu âm, chiết hồi lưu và chiết soxhlet

2.2.5.1. Phương pháp chiết vi sóng [68]

Vi sóng là sóng cực ngắn hay sóng siêu tần, có tần số từ 0.3 GHz đến 300 GHz,

tương ứng với độ dài sóng trong khoảng 100cm đến 1 cm, thường sử dụng bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz. Trong chiết xuất, khi tác động vi sóng vào môi trường chiết

chứa dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ

dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi.

Hơn nữa, vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật, tạo điều kiện cho chất tan giải phóng vào môi trường dễ dàng, làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng

cũng làm cho dịch chiết lẫn nhiều tạp chất hơn.

Thiết bị sử dụng để chiết vi sóng quy mô phòng thí nghiệm là lò vi sóng thông

thường được kết nối với bộ điều chỉnh điện áp (0 - 250 V) để thay đổi công suất vi

sóng tại các điều kiện nghiên cứu khác nhau.

2.2.5.2. Phương pháp chiết siêu âm [68]

Sóng siêu âm là một dạng sóng điện từ cao tần (lớn hơn 20 KHz). Trong chiết

xuất sóng siêu âm thường đường sử dụng ở tần số từ 20 – 100 KHz. Sóng siêu âm mang năng lượng lớn, khi xuyên qua vật thể chỉ một lượng rất nhỏ của sóng siêu âm bị

vật thể hấp thụ và chuyển thành nhiệt năng; Phần lớn năng lượng của sóng siêu âm

chuyển thành cơ năng. Trong quá trình chiết xuất, sự rung và dao động mạnh kéo dài

tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thẩm thấu dung môi vào vật liệu cũng như khuếch

tán vật chất trong nguyên liệu ra môi trường dung môi.

Thiết bị chiết siêu âm hiện nay có 2 dạng phổ biến là bể siêu âm và thiết bị siêu

âm đầu dò. Tùy từng mục đích nghiên cứu mà lựa chọn loại thiết bị nào cho phù hợp.

2.2.5.3. Phương pháp chiết hồi lưu [69] Chiết xuất hồi lưu là phương pháp sử dụng dung môi để hòa tan các thành phần hóa học trong nguyên liệu dưới sự tác động của nhiệt độ. Dung môi và các chất dễ bay hơi sẽ được hồi lưu lại bình chiết thông qua hệ thống ngưng tụ. Cứ như vậy, sản phẩm thu được sau quá trình chiết xuất là dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết. Chiết hồi lưu được coi là phương pháp chiết đơn

giản và được sử dụng phổ biến để chiết xuất dược liệu. Bên cạnh đó, hiệu suất chiết

xuất bằng phương pháp chiết hồi lưu là cao hơn nhiều so với phương pháp chiết truyền

thống khác như ngâm chiết mà lại tiết kiệm dung môi.

Thiết bị sử dụng chiết hồi lưu khá đơn giản, bao gồm 1 thiết bị gia nhiệt, bình

Chiết soxhlet là phương pháp chiết triệt để nhất. Phương pháp này thường được sử

Đây là cũng phương pháp chiết đơn giản, dễ dàng thực hiện ở quy mô phòng thí

chiết chứa nguyên liệu và dung môi kết nối với hệ thống sinh hàn hồi lưu. 2.2.5.4. Phương pháp chiết soxhlet [69] dụng để phân tích định lượng tổng hàm lượng chất chiết trong vật liệu. Vật liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào ngăn chiết. Dung môi sạch được cho vào bình cầu và đun hồi lưu. Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ bằng sinh hàn và chảy xuống ngăn chiết. Tại đây xảy ra quá trình trích ly rắn/lỏng. Khi dịch chiết đầy đến mức nhất định sẽ chảy qua ống xi phông xuống bình cầu bên dưới, mang theo các chất hòa tan từ vật liệu. Ở bình chưng cất, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi lên tiếp tục được ngưng tụ đi qua lớp dược liệu để hòa tan các chất tan còn lại, sau đó lại chảy xuống bình chưng cất. Cứ như vậy cho đến khi dược liệu được chiết kiệt. nghiệm và có hiệu quả cao. Tuy nhiên, để chiết kiệt thì cần thời gian chiết là khá dài.

2.2.6. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy trình công nghệ

Sau khi lựa chọn được các yếu tố công nghệ chính cần nghiên cứu và khảo sát ảnh hưởng đơn yếu tố của chúng tới quá trình. Tiếp theo sẽ tiến hành thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm theo mô hình kế hoạch trực giao bậc hai của Box-Willson hoặc Box-behnken [60,61]. Tùy vào yêu cầu của từng bài toán cụ thể mà chúng tôi lựa chọn mô hình khảo sát để nghiên cứu và tối ưu hóa quá trình chiết xuất phenolic. Mô hình của Box-behnken đơn giản hơn, các mức thí nghiệm dễ thực hiện hơn tuy nhiên độ chính xác thấp hơn mô hình Box-Willson. Những bài toán khi áp dụng mô hình Box- behnken, điểm tối ưu được xác định nằm ở biên của vùng khảo sát, khi đó để tăng độ chính xác chúng ta cần chuyển sang mô hình của Box-Willson nhằm ở rộng vùng khảo sát để tăng độ chính xác cho kết quả mô hình. Việc lựa chọn mô hình nghiên cứu cho các quy trình chiết xuất sau đây dựa theo những luận giải vừa nêu.

Số thí nghiệm của ma trận kế hoạch được tính theo công thức sau:

+ Đối với mô hình bậc 2 của Box-Willson

N = 2k + 2k + n0 với k < 5; N = 2k-1 + 2k + n0 với k > 5

(N: số thí nghiệm; k: số yếu tố công nghệ; n0: số thí nghiệm tại tâm)

Các mức của kế hoạch thực nghiệm sau khi được mã hóa bao gồm (-α , -1, 0, +1, +α). Trong đó α gọi là cánh tay đòn và được tính theo công thức:

α 4 + 2k α2 – 2k-1(k + 0.5 n0) = 0 với k < 5; α 4 + 2k-1 α2 – 2k-2(k + 0.5 n0) = 0 với k > 5

Sau khi tính toán được giá trị cánh tay đòn α, ta sẽ thiết lập được ma trận kế hoạch

thực nghiệm. Dựa vào đây ta có các thí nghiệm để tính toán giá trị các hàm mục tiêu Y.

+ Đối với mô bình bậc 2 của Box-Behnken

N = 22. + n0

(N: số thí nghiệm; k: số yếu tố công nghệ; n0: số thí nghiệm tại tâm)

Các mức của kế hoạch thực nghiệm sau khi được mã hóa gồm (-1, 0, +1).

Sau khi tiến hành thí nghiệm theo ma trận kế hoạch thực nghiệm. Các bước thực

hiện tiếp theo bao gồm:

 Tìm hệ số của phương trình hồi quy và kiểm định sự có nghĩa của hệ số hồi quy

 Kiểm định sự tương hợp của mô hình đã chọn

 Tối ưu hóa đồng thời nhiều hàm mục tiêu

Phương pháp tối ưu hóa hàm đa mục tiêu (phương pháp hàm nguyện vọng)

- Tối ưu hóa hàm mục tiêu đã chọn bằng phương pháp hàm nguyện vọng

(Harrington 1965), phương pháp này gồm ba bước thực hiện

+ Thiết lập hàm mục tiêu: Yi = fi(X1, X2,..., Xk) có dạng tổng quát

+ + Yk = b0 +

+ Chuyển đổi hàm mục tiêu thành hàm vi phân: di = Ti(Yi)

+ Thiết lập hàm mong đợi: D = g(d1, d2,...,dm)

- Harrington (1965) đã đưa ra phương thức tối ưu hóa đa mục tiêu bằng việc xây dựng hàm nguyện vọng, sau đó Derringer và Suich (1980) đã cải tiến việc tính toán hàm nguyện vọng và được sử dụng trong phần mền Design Expert. Hàm nguyện vọng D được tính như sau:

D =

- Trong trường hợp các hàm mục tiêu (di) có tầm quan trọng hay thứ bậc khác nhau, thì hàm D được tính như sau, có tính đến thứ bậc quan trọng (wi) của các mục tiêu:

D = W =

- Các hàm (di) được tính như sau:

di = exp [- exp (Yi)] Khoảng chấp nhận một phía (phía trái hoặc phải) di = exp (- Yi) Khoảng chấp nhận 2 phía.

Trong luận án này, chúng tôi sử dụng phần mềm Design Expert 7.0.0 để tiến hành xây dựng, đánh giá mô hình và tối ưu hóa các thông số công nghệ của quá trình.

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM

3.1. Điều chế cao chiết tổng và các cao chiết phân đoạn

Quả táo mèo tươi 15 kg được phân loại, rửa sạch và thái lát. Sấy diệt men ở 1100C trong 20 phút và sấy mẫu tới khô ở 600C (hàm ẩm ≤ 10%). Táo mèo khô được

nghiền mịn bằng máy nghiền (đường kính lỗ sàng 2 mm) thu dược 5 kg bột. Bột

nguyên liệu táo mèo 2 kg được chiết siêu âm với methanol ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ

dung môi/nguyên liệu (3/1, v/w). Lọc dịch chiết và cô đặc bằng máy cô quay áp suất

giảm thu được 652 g cặn chiết methanol. Hòa tan cặn methanol với nước cất và chiết

phân bố lần lượt với các dung môi các độ phân cực tăng dần là n-hexan,

dichloromethane và ethyl acetate. Tiến hành lọc và cô đặc các dịch chiết phân bố thu

được các cặn chiết tương ứng là cặn n-hexan (36,2 g); cặn dichloromethane (65 g);

cặn ethyl acetate (258,8 g) và cặn nước (289,4 g).

Bột nguyên liệu táo mèo (2000 g)

1.Chiết siêu âm (MeOH x 5 lần)

2.Cô quay áp suất giảm

Cặn tổng methanol (652 g)

Dịch nước

Hòa tan với 1200 mL nước cất 2. Hoà tan cặn metanol trong MeOH-H2O (1:1)

1.Chiết phân bố với n - hexan

2. Cô quay đuổi dung môi

Dịch nước

1.Chiết phân bố với dichloromethane

2. Cô quay đuổi dung môi

Dịch nước

Cặn n – hexan (36,2 g)

Cặn dichloromethane (65 g)

1.Chiết phân bố với ethyl acetate

2. Cô quay đuổi dung môi

Cô đặc

Cặn nước (289,4 g)

Cặn ethyl acetate (258,8 g) (3 g)

Hình 3.1. Sơ đồ điều chế cao chiết tổng và các cao chiết phân đoạn quả táo mèo

3.1.1. Sơ đồ phân lập các thành phần hóa học từ cao chiết ethyl acetate quả táo mèo

Hình 3.1.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate quả táo mèo 38

Từ kết quả thăm dò hoạt tính sinh học bảo vệ tim mạch (sEH) trên các phân đoạn cao chiết (xem kết quả thử hoạt tính mục 4.2.1.1), chúng tôi thấy rằng phân đoạn cao chiết ethyl acetate thể hiện hoạt tính mạnh nhất; không những thế hoạt tính chống oxy hóa mạnh cũng được thể hiện mạnh nhất ở phân đoạn cao chiết này. Vì vậy, theo định hướng tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học liên quan đến bảo vệ tim mạch và chống oxy hóa, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các thành phần hóa học từ phân đoạn cao chiết ethyl acetate.

Lấy 114 g cặn chiết ethyl acetate (EtOAc), tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải gradient CH2Cl2/MeOH (100:0  0/100) chia thành 8 phân đoạn ký hiệu từ E1 đến E8. Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 5% và hơ nóng bằng máy khò hoặc kiểm tra bằng máy soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm. Gom các phân đoạn giống nhau rồi cô quay đuổi dung môi thu được cao chiết các phân đoạn. Sơ đồ quy trình phân lập được thể hiện ở hình 3.1.1.

3.1.2. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E2

Phân đoạn E2 (12,1 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với dung môi rửa giải là hệ HED (4/1/0,5). Sử dụng sắc ký lớp mỏng để gom các phân đoạn giống nhau sau đó tiến hành cô quay đuổi dung môi ta thu được 4 phân đoạn nhỏ ký hiệu là E2.1 đến E2.4.

+ Phân đoạn E2.1 được tiến hành sắc ký với cột sephadex, sử dụng dung môi

rửa giải là MeOH thu được hợp chất chất TM15 (9,5 mg)

+ Phân đoạn E2.2. được tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa

giải DA (5/1) thu được hợp chất sạch TM13 (6,5 mg)

+ Phân đoạn E2.4 được tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa

giải HE (6/1) thu được hợp chất sạch TM6 (32,0 mg)

Các dữ kiện phổ xem ở bảng 4.1.2 (TM15), bảng 4.1.19 (TM13) và bảng 4.1.22

(TM6).

3.1.3. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E3 Phân đoạn E3 (14,5 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với dung môi rửa giải là hệ DMW (6/1/0,05). Sử dụng sắc ký lớp mỏng để gom các phân đoạn giống nhau sau đó tiến hành cô quay đuổi dung môi ta thu được 5 phân đoạn nhỏ ký hiệu là

E3.1 đến E3.5.

+ Phân đoạn E3.1 được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi

rửa giải MW (5/1) thu được 2 hợp chất sạch là TM20 (8,0 mg) và TM22 (7,6 mg)

+ Phân đoạn E3.3 được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi

rửa giải MW (5/1) thu được 2 hợp chất sạch là TM23 (10,5 mg) và TM25 (11,2 mg)

+ Phân đoạn E3.5 được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi

rửa giải MW (6/1) thu được 1 hợp chất sạch là TM24 (22,0 mg)

Các dữ kiện phổ xem ở bảng 4.1.15 (TM20), bảng 4.1.16 (TM22), bảng 4.1.14

(TM23), bảng 4.1.17 (TM25) và bảng 4.1.13 (TM24).

3.1.4. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E5 Phân đoạn E5 (13,3 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với dung môi rửa

giải là hệ HDE (4/1/0,5). Sử dụng sắc ký lớp mỏng để gom các phân đoạn giống nhau

sau đó tiến hành cô quay đuổi dung môi ta thu được 3 phân đoạn nhỏ ký hiệu là E5.1

đến E5.3.

+ Phân đoạn E5.1 được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi

rửa giải MW (1/1) thu được chất sạch TM2 (21,0 mg) và phân đoạn nhỏ hơn E5.1a.

Sử dụng cột selphadex với hệ dung môi rửa giải MW (5/1) để phân tách phân đoạn

E5.1a thu được 2 hợp chất sạch là TM16 (5,6 mg) và TM37 (4,4 mg)

+ Phân đoạn E5.3 được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi

rửa giải MW (1/1) thu được 2 hợp chất sạch TM18 (12,0 mg) và TM36 (7,2 mg)

Các dữ kiện phổ xem ở bảng 4.1.3 (TM2), bảng 4.1.6 (TM16), bảng 4.1.12

(TM37), bảng 4.1.24 (TM18) và bảng 4.1.5 (TM36).

3.1.5. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E6 Phân đoạn E6 (11,7 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với dung môi rửa

giải là hệ DMW (10/1/0,1). Sử dụng sắc ký lớp mỏng để gom các phân đoạn giống

nhau sau đó tiến hành cô quay đuổi dung môi ta thu được 2 phân đoạn nhỏ ký hiệu là

E6.1 và E6.2.

+ Phân đoạn E6.1 được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi

rửa giải MW (1/1,2) thu được chất sạch TM7 (11,0 mg)

+ Phân đoạn E6.2 được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi

rửa giải MW (1/1,2) thu được 2 chất sạch là TM3 (6,8 mg) và TM12 (19,0 mg).

Các dữ kiện phổ xem ở bảng 4.1.8 (TM7), bảng 4.1.20 (TM3) và bảng 4.1.18

(TM12).

3.1.6. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E7 Phân đoạn E7 (18,9 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với dung môi rửa giải là hệ DMW (9/1/0,1). Sử dụng sắc ký lớp mỏng để gom các phân đoạn giống nhau sau đó tiến hành cô quay đuổi dung môi ta thu được 3 phân đoạn nhỏ ký hiệu là E7.1 đến E7.3. + phân đoạn E7.1 tiếp tục được tiến hành sắc ký cột pha thường với dung môi rửa giải là hệ DM (6/1) thu được 3 phân đoạn nhỏ ký hiệu là E7.1a đến E7.1c. Sử dụng

sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải là MW (1/1,2) để tách phân đoạn E7.1c thu

được 2 hợp chất sạch TM1 (45,5 mg) và TM9 (12,2 mg).

+ phân đoạn E7.3 cũng tiếp tục được tiến hành sắc ký cột pha thường với dung

môi rửa giải là hệ DM (6/1) thu được 3 phân đoạn nhỏ ký hiệu là E7.3a đến E7.3c. Sử dụng sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải là MW (1/1,2) để tách phân đoạn E7.3b

thu được 2 hợp chất sạch TM10 (22,0 mg) và TM17 (6,5 mg).

Các dữ kiện phổ xem ở bảng 4.1.23 (TM1), bảng 4.1.21 (TM9), bảng 4.1.7

(TM10) và bảng 4.1.1. (TM17).

3.1.7. Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn E8 Phân đoạn E8 (29,1 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với dung môi rửa

giải là hệ DMW (8/1/0,1). Sử dụng sắc ký lớp mỏng để gom các phân đoạn giống nhau

sau đó tiến hành cô quay đuổi dung môi ta thu được 2 phân đoạn nhỏ ký hiệu là E8.1

và E8.2.

+ phân đoạn E8.1 tiếp tục được tiến hành sắc ký cột pha thường với dung môi

rửa giải là hệ DM (5/1) thu được 3 phân đoạn nhỏ ký hiệu là E8.1a đến E8.1c. Sử dụng

sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải là MW (1/1,5) để tách phân đoạn E8.1b thu

được 3 hợp chất sạch TM5 (13,5 mg), TM8 (10,8 mg) và TM30 (8,2 mg)

+ phân đoạn E8.2 cũng được tiếp tục được tiến hành sắc ký cột pha thường với

dung môi rửa giải là hệ DM (5/1) thu được 3 phân đoạn nhỏ ký hiệu là E8.2a đến

E8.2c. Sử dụng sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải là MW (1/1,5) để tách phân

đoạn E8.2c thu được 2 hợp chất sạch TM33 (11,3 mg) và TM35 (7,6 mg).

Các dữ kiện phổ xem ở bảng 4.1.4 (TM5), bảng 4.1.11 (TM8), bảng 4.1.9

(TM30), bảng 4.1.10 (TM33) và bảng 4.1.25 (TM35).

3.2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của cao chiết phân đoạn và thành phần hóa

học phân lập được

Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH) và hoạt tính chống oxy hóa được thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Chungnam, Hàn Quốc. Quy trình thí nghiệm được thực hiện theo mô tả phần phương pháp nghiên cứu mục 2.2.4.1 và 2.2.4.2.

Nghiên cứu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào với 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư cổ tử cung (HeLa) được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên – VAST. Quy trình thí nghiệm được thực hiện theo mô tả phần phương pháp nghiên cứu mục 2.2.4.3.

3.3. Quy trình chiết xuất phenolic và thiết lập mô hình nghiên cứu

Từ các kết quả nghiên cứu chiết xuất và phân lập (sơ đồ hình 3.1.1), có thể thấy

các hợp chất phenolic chủ yếu tập trung ở cao chiết phân đoạn ethyl acetate do các

phenolic có độ phân cực tương đồng với độ phân cực của dung môi. Tuy nhiên, ethyl

acetate là dung môi độc hại ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người cũng như môi

trường. Vì vậy, hiện nay để chiết xuất phenolic sử dụng trong công nghiệp thực phẩm

người ta thường sử dụng dung môi khác là ethanol thực phẩm với nồng độ từ 40 – 96% tùy theo loại phenolic mong muốn chiết xuất [70]. Bên cạnh đó, việc điều chỉnh

pH môi trường có tính axit (pH 4-6) giúp các hợp chất phenolic ổn định hơn, ít bị biến

tính giúp nâng cao hiệu quả trích ly [71]. Do đó, trong phần nghiên cứu quy trình công nghệ chiết xuất phenolic từ nguyên liệu quả táo mèo, chúng tôi định hướng nghiên cứu

sử dụng dung môi chiết xuất là ethanol thực phẩm kết hợp điều chỉnh pH dung môi

chiết bằng axit citric. Việc lựa chọn nồng độ ethanol và độ pH dung môi thích hợp cho

quá trình được xác định thông qua các thí nghiệm khảo sát và kết quả tối ưu hóa thông số công nghệ quá trình.

3.3.1. Quy trình chiết bằng phương pháp soxhlet

Chuẩn bị bộ dụng cụ chiết soxhlet. Cân chính xác 10g bột nguyên liệu táo mèo

cho vào túi giấy lọc, buộc kín. Đưa túi lọc chứa nguyên liệu vào ngăn chiết. Nạp 500

mL ethanol thực phẩm 96% vào bình cầu 1000 mL. Tiến hành lắp sinh hàn hồi lưu kết nối thiết bị chiết soxhlet. Bật bếp điện gia nhiệt lên 650C, thời gian chiết là 10 giờ. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được cô quay đuổi dung môi để thu cao chiết tổng. Sau

đó sẽ tiến hành định lượng và phân tích hàm lượng phenolic tổng, flavonoid tổng. Hàm

lượng cao chiết tổng Y (%) được tính theo khối lượng mẫu đem chiết. Trong nghiên

cứu này chúng tôi sử dụng dung môi chiết là ethanol 96%. Kết quả nghiên cứu được

sử dụng làm tiêu chuẩn để so sánh với các phương pháp chiết phenolic dưới đây.

3.3.2. Quy trình chiết xuất sử dụng vi sóng

Qua tham khảo các tài liệu liên quan đến chiết xuất phenolic bằng phương pháp vi sóng, chúng tôi đã xác định 4 yếu tố công nghệ cần nghiên cứu đó là thời gian chiết (phút), nồng độ ethanol chiết xuất (%, v/v), công suất vi sóng (W) và pH của dung môi chiết (độ pH) [47,48]; bên cạnh đó yếu tố công nghệ được cố định từ đầu là tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (5/1, v/w). Hiệu suất chiết của quá trình được xác định thông qua 3 hàm mục tiêu là hàm lượng phenolic tổng Y1 (mg GAE/g cao chiết), hàm lượng flavonoid tổng Y2 (mg QE/g cao chiết) và hàm lượng cao chiết tổng Y3 (%) được tính theo khối lượng mẫu đem chiết.

3.3.2.1. Tiến hành thí nghiệm

100g bột nguyên liệu táo mèo được cho vào bình cầu 1000 mL, thêm 500 mL

dung môi (được pha với nồng độ ethanol và độ pH cần nghiên cứu) vào bình cầu. Đưa bình cầu vào lò vi sóng và tiến hành lắp sinh hàn hồi lưu. Bật sinh hàn, bật lò vi sóng ở

các mức công suất cần nghiên cứu. Thời gian chiết xuất được tính bắt đầu khi bật lò vi

sóng, các khoảng thời gian được cố định theo các mức cần nghiên cứu. Kết thúc quá

trình chiết, dịch chiết được lọc qua phễu lọc buchner và cô đặc sẽ thu được cao chiết

tổng. Tiến hành cân khối lượng để tính hàm lượng cao chiết tổng (%); dựa vào phương trình đường chuẩn phenolic và flavonoid đã xây dựng để phân tích hàm lượng

phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) và flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) trong cao

chiết. Các kết quả phân tích từ các thí nghiệm được sử dụng để làm bài toán quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa các thông số công nghệ của quá trình.

Các thông số công nghệ cần nghiên cứu được thí nghiệm theo các mức trong

ma trận kế hoạch thực nghiệm bảng 4.3.2.2a và 4.3.2.2b.

Dung môi sử dụng là ethanol 96%, điều chỉnh nồng độ cồn bằng nước cất.

Điều chỉnh pH dung môi chiết bằng dung dịch axit citric 0,1M với hệ dung dịch

đệm axit citric/natri citrate

Thiết bị sử dụng: Lò vi sóng Sam sung-Korea, công suất cực đại 800W, điện áp

220V kết nối với bộ điều chỉnh điện áp (điện áp thay đổi từ 0 – 250 V) để thay đổi

công suất vi sóng theo thiết kế thí nghiệm.

3.3.2.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm

Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 4 yếu tố

Z1: Thời gian chiết xuất (phút); Z2: Nồng độ ethanol chiết xuất (%); Z3: Công

suất vi sóng (W) và Z4: Độ pH dung môi chiết

Khảo sát ảnh hưởng của các đơn yếu tố công nghệ đến hàm mục tiêu. Lựa chọn được các mức cơ bản (mức 0) và mức biến thiên (±1). Hàm mục tiêu hướng đến là Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (hàm lượng flavonoid tổng) và Y3 (Hàm lương cao chiết tổng)

Các biến mã hóa của Z1, Z2, Z3 và Z4 lần lượt ký hiệu là A, B, C và D.

Lựa chọn mô hình khảo sát theo Box-Willson với k = 4, lựa chọn cánh tay đòn α = 1.414 và số thí nghiệm tại tâm là 3. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 27 thí nghiệm. Ta có ma trận kế hoạch thực nghiệm cho ở bảng 4.3.2.2b

3.3.3. Quy trình chiết xuất sử dụng siêu âm

Bằng việc tham khảo các tài liệu có liên quan đến chiết xuất phenolic sử dụng phương pháp chiết siêu âm, chúng tôi xác định 4 yếu tố công nghệ cần nghiên cứu đó là tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w), nhiệt độ chiết (0C), công suất siêu âm (W) và thời gian chiết (phút) [37-39]. Bên cạnh đó 1 số yếu tố công nghệ được kế thừa từ các bài toán trước như dung môi chiết sử dụng là ethanol 65% (ethanol 96% pha với nước cất

tỷ lệ 2.1/1 (v/v)), độ pH dung môi chiết là 5.4. Điều chỉnh pH bằng dung dịch axit

citric 0.1M với hệ dung dịch đệm axit citric/natri citrate. Hiệu quả chiết xuất của quá

trình ở bài toán này được xác định thông qua 2 hàm mục tiêu là hàm lượng phenolic

tổng Y1 (mg GAE/g cao chiết), và hàm lượng cao chiết tổng Y2 (%) được tính theo khối lượng mẫu đem chiết.

3.3.3.1. Tiến hành thí nghiệm

100g bột nguyên liệu táo mèo được cho vào bình cầu 1000 mL hoặc 2000 mL loại 3 cổ, dung môi chiết sử dụng ethanol 65%, pH dung môi là 5.4 được thêm vào bình cầu ở các tỷ lệ nghiên cứu (theo bố trí thí nghiệm). Lắp sinh hàn, nhiệt kế và thiết bị siêu âm đầu dò sau đó tiến hành gia nhiệt bằng bếp điện, chiết siêu âm ở các điều kiện nhiệt độ, công suất siêu âm và thời gian cần nghiên cứu. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được lọc qua phễu lọc buchner và cô đặc sẽ thu được cao chiết tổng. Tiến hành cân khối lượng để tính hàm lượng cao chiết tổng (%), phân tích hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) trong cao chiết. Các kết quả phân tích từ các thí nghiệm được sử dụng để làm bài toán quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa các thông số công nghệ của quá trình.

Các thông số công nghệ cần nghiên cứu được thí nghiệm theo các mức trong

ma trận kế hoạch thực nghiệm 4.3.3.2a và 4.3.3.2b.

Thiết bị siêu âm loại đầu dò (UP200Ht, hielscher-Đức), tần số 26 KHz, công

suất siêu âm (0 – 200 W), dung tích siêu âm (100 – 2000 mL).

3.3.3.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm

Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 4 yếu tố

Z1: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w), Z2: Nhiệt độ chiết siêu âm (0C), Z3: Công

suất siêu âm (W) và Z4: Thời gian chiết (phút)

Khảo sát ảnh hưởng của các đơn yếu tố công nghệ đến hàm mục tiêu. Lựa chọn được các mức gốc (mức 0) và mức biến thiên (±1). Hàm mục tiêu hướng đến là Y1

(hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lương cao chiết tổng)

Các biến mã hóa của Z1, Z2, Z3 và Z4 lần lượt ký hiệu là A, B, C và D.

Lựa chọn mô hình khảo sát theo Box-Behnken với k = 4, số thí nghiệm tại tâm là 3. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 27 thí nghiệm. Ta có ma trận kế hoạch thực nghiệm cho ở bảng 4.3.3.2b

3.3.4. Quy trình chiết xuất hồi lưu

Cũng tương tự như các bài toán ở trên. Qua việc tham khảo các tài liệu có liên quan đến chiết xuất phenolic sử dụng phương pháp chiết hồi lưu, chúng tôi đã xác định 3 yếu tố công nghệ cần nghiên cứu đó là thời gian chiết (phút), tỷ lệ dung môi/nguyên

liệu (v/w) và nhiệt độ chiết (0C) [29,30]. Một số yếu tố công nghệ được kế thừa từ các nghiên cứu trước như dung môi chiết sử dụng là ethanol 65%, độ pH dung môi chiết là 5.4. Điều chỉnh pH bằng dung dịch axit citric 0.1M với hệ dung dịch đệm axit citric/natri citrate. Hiệu suất chiết của quá trình được xác định thông qua 2 hàm mục tiêu là hàm lượng phenolic tổng Y1 (mg GAE/g cao chiết) và hàm lượng cao chiết tổng Y2 (%) được tính theo khối lượng mẫu đem chiết.

3.3.4.1. Tiến hành thí nghiệm

100g bột nguyên liệu táo mèo được cho vào bình cầu 2000 mL, dung môi chiết sử dụng ethanol 65%, pH dung môi là 5.4 được thêm vào bình cầu ở các tỷ lệ nghiên cứu. Lắp sinh hàn và tiến hành gia nhiệt bằng bếp điện, chiết hồi lưu ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian cần nghiên cứu. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được lọc qua phễu lọc buchner và cô đặc sẽ thu được cao chiết tổng. Tiến hành cân khối lượng để tính hàm lượng cao chiết tổng (%) và phân tích hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) trong cao chiết. Các kết quả phân tích từ các thí nghiệm được sử dụng để làm bài toán quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa các thông số công nghệ của quá trình.

Các thông số công nghệ cần nghiên cứu được thí nghiệm theo các mức trong

ma trận kế hoạch thực nghiệm 4.3.4.2a và 4.3.4.2b

3.3.4.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm

Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 3 yếu tố

Z1: Thời gian chiết xuất (phút), Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) và Z3:

Nhiệt độ chiết xuất (0C)

Khảo sát ảnh hưởng của các đơn yếu tố công nghệ đến hàm mục tiêu. Lựa chọn được các mức gốc (mức 0) và mức biến thiên (±1). Hàm mục tiêu hướng đến là Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lương cao chiết tổng)

Các biến mã hóa của Z1, Z2 và Z3 lần lượt ký hiệu là A, B, và C.

Với k = 3, lựa chọn cánh tay đòn α = 1.215 và số thí nghiệm tại tâm là 1. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 15 thí nghiệm. Ta có ma trận kế hoạch thực nghiệm cho ở bảng 4.3.4.2b

3.4. Quy trình sấy phun và thiết kế mô hình nghiên cứu

Sấy phun là phương pháp sấy dịch chiết từ dạng lỏng thành dạng bột khô, đây là quá trình quan trọng đối với quy trình sản xuất bột cao chiết bán thành phẩm sau quá trình chiết xuất. Sấy phun có ưu điểm là sản phẩm giữ được chất lượng và các tính

chất đặc thù, phù hợp với các sản phẩm yêu cầu cao về chất lượng.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát và tối ưu hóa quá trình sấy

phun với 3 thông số công nghệ chính là hàm lượng chất trợ sấy maltodextrin (%), nhiệt độ khí sấy đầu vào (0C) và tốc độ bơm dịch (mL/phút). Hai hàm mục tiêu để đánh giá hiệu quả của phương pháp là hàm lượng phenolic tổng của sản phẩm sau sấy phun Y1(mg GAE/g sản phẩm) và độ ẩm của sản phẩm Y2 (%). Độ ẩm được xác định theo

TCVN 10788:2015.

3.4.1. Tiến hành thí nghiệm

Quá trình chiết được thực hiện bằng phương pháp chiết siêu âm (xem mục

4.3.5). 1000g bột nguyên liệu táo mèo được chiết siêu âm với 7.6 lít dung môi ethanol 65%, pH 5.4, thời gian chiết là 70 phút, nhiệt độ 49 ± 20C, công suất siêu âm 140W. Dịch sau chiết được lọc và cô đặc thu được 2.1 lít dịch có hàm lượng chất khô đạt 15- 20%. Bổ sung chất trợ sấy maltodextrin với tỷ lệ nghiên cứu vào dịch chiết cô đặc. Bật

máy khuấy dịch chiết, bật bơm lưu lượng, điều chỉnh lưu lượng dòng cấp ứng với điều

kiện nghiên cứu và tiến hành quá trình sấy phun, tác nhân sấy (khí nóng) được thổi vào

buồng phun dịch. Nhiệt độ tác nhân sấy được thay đổi theo điều kiện nghiên cứu. Thiết

bị sử dụng nghiên cứu là máy sấy phun Buchi B290 mini spray dryer, tốc độ bơm dịch (15-35 mL/phút), nhiệt độ khí nóng đầu vào (120 – 2200C), lưu lượng khí nóng tối đa 35 m3/giờ, công suất bay hơi 1 L H2O/giờ (Viện Công nghệ sinh học – Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà nội). Bột sau sấy phun được phân tích hàm lượng phenolic

tổng và hàm ẩm. kết quả thí nghiệm được sử dụng để xây dựng ma trận kế hoạch thực

nghiệm và tối ưu hóa quy trình.

Các thông số công nghệ cần nghiên cứu được thí nghiệm theo các mức trong

ma trận kế hoạch thực nghiệm bảng 4.4.2a và 4.4.2b.

3.4.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm

Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 3 yếu tố

Z1: Hàm lượng chất trợ sấy maltodextrin (%, w/w), Z2: Nhiệt độ khí nóng đầu

vào (0C) và Z3: Tốc độ phun dịch (mL/phút)

Khảo sát ảnh hưởng của các đơn yếu tố công nghệ đến hàm mục tiêu. Lựa chọn được các mức gốc (mức 0) và mức biến thiên (±1). Hàm mục tiêu hướng đến là Y1 (hàm lượng phenolic tổng của sản phẩm sau sấy phun), Y2 (độ ẩm của sản phẩm sau sấy phun)

Các biến mã hóa của Z1, Z2 và Z3 lần lượt ký hiệu là A, B, và C. Lựa chọn mô hình khảo sát theo Box-Behnken với k = 3, số thí nghiệm tại tâm là 3. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 15. Ta có Ma trận kế hoạch thực nghiệm ở bảng 4.4.2b

3.5. Sơ đồ định hướng nghiên cứu quy trình công nghệ tạo sản phẩm bột cao chiết

táo mèo quy mô phòng thí nghiệm.

Bột nguyên liệu táo mèo được nghiên cứu chiết xuất phenolic bằng 3 phương

pháp khác nhau là chiết vi sóng (chiết có sử dụng vi sóng), chiết siêu âm (chiết có sử dụng siêu âm) và chiết hồi lưu. Kết quả nghiên cứu nhằm mục đích so sánh, đánh giá

hiệu quả cũng như khả năng nâng cấp quy mô của 3 phương pháp. Các yếu tố công

nghệ của cả 3 phương pháp này lần lượt được khảo sát và tối ưu hóa nhằm đưa ra thông số phù hợp nhất cho quá trình chiết xuất phenolic. Sau khi kết thúc quá trình

chiết, dịch chiết được lọc và cô đặc chân không đến nồng độ mong muốn (hàm lượng

chất khô đạt 15-20%). Dịch cao chiết táo mèo sau khi cô đặc tiếp tục được nghiên cứu

công nghệ sấy phun để thu bột cao chiết táo mèo giàu phenolic sử dụng cho các mục đích bào chế khác nhau. Dung môi thu hồi được tái sử dụng cho quá trình chiết xuất

Sơ đồ định hướng nghiên cứu thể hiện ở hình 3.5

Bột nguyên liệu táo mèo

Chiết xuất phenolic

(Nghiên cứu các phương pháp chiết vi sóng, chiết siêu âm, chiết hồi lưu)

Lọc thu dịch chiết

Dung môi

Cô đặc chân không

Sấy phun

Bột cao chiết táo mèo giàu phenolic

Hình 3.5. Sơ đồ định hướng nghiên cứu tạo sản phẩm bột cao chiết táo mèo

CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ quả táo mèo

4.1.1. Hợp chất mới TM17, (3S-Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside)

[M + 35Cl]¯

Hợp chất TM17 thu được ở dạng chất rắn màu trắng. Trên phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của TM17 xuất hiện các píc ion giả phân tử lần lượt là [M - H]¯ tại m/z 433.1119, [M + 35Cl]¯ tại m/z 469.0890 và [M + 37Cl]¯ tại m/z 471.0870. Tính toán lý thuyết cho ion [C21H21O10]¯có m/z 433.1129, ion [C21H22ClO10]¯ có m/z 469.0896 tương ứng với đồng vị 35Cl và 471.0876 tương ứng với đồng vị 37Cl. Từ các dữ kiện trên phổ khối phân giải cao, công thức phân tử của TM17 được xác định là C21H22O10. Độ quay cực của hợp chất TM17 là [α]D = - 690 (c = 0.1, MeOH).

CTPT: C21H22O10

[M + 37Cl]¯

[M - H]¯

Hình 4.1.1.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TM17

Hình 4.1.1.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất TM17

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu của hệ spin AABB [δH 6.80 (d, J= 8.5 Hz, H-3′, 5′); 7.32 (d, J= 8.0 Hz, H-2′, 6′)] cho phép xác định có 1 vòng phenyl bị thế

2 lần trong hợp chất TM17. Bên cạnh đó, vòng thơm của nhân isocoumarin đặc trưng bởi tín hiệu cộng hưởng có độ chuyển dịch hóa học [δH 6.55 (br s, H-5); 6.52 (d, J= 2.0 Hz, H-7, TM17a) và 6.51 (d, J= 2.0 Hz, H-7, TM17b)], trong khi vòng lactone xuất hiện với các tín hiệu cộng hưởng ở δH 5.61 (t, J= 2.5 Hz, H-3eq, TM17a) và 5.59 (t, J= 2.5 Hz, H-3eq, TM17b); 3.11 (t, J = 2.5 Hz, H-4a, TM17a), 3.07 (t, J = 2.5 Hz, H-4a, TM17b), and 3.35 (m, H-4b). 2 tín hiệu proton của nhóm hydroxyl lần lượt là δH 9.598 (4′-OH) và δH 11.094 (8-OH)

Hình 4.1.1.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất TM17

Hình 4.1.1.4. Phổ DEPT của hợp chất TM17

Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy có 19 tín hiệu của nguyên tử carbon bao gồm 2 carbon nhóm methylene (-CH2), 10 carbon nhóm methine (-CH) và 7

carbon bậc 4 không liên kết với hydro. Trong đó có 1 tín hiệu của nhóm ketone liên

kết với nguyên tử oxy (O-C=O) đặc trưng của khung dihydroisocoumarin xuất hiện tại δC 169.25/169.18 ppm, 2 cặp tín hiệu carbon đối xứng của vòng B tại δC (ppm) 128.22/128.20 và 115.18 có độ lớn tích phân gấp đôi các tín hiệu khác, chứng tỏ vòng B bị thế ở 2 vị trí đối xứng nhau trên vòng (C-1’ và C-4’); 2 tín hiệu carbon khác đặc trưng của vòng lactone tại δC (ppm) 80.0 (C-3) và 33.66 (C-4); Bên cạnh đó sự xuất hiện của 6 tín hiệu carbon ở độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 99.77/99.67; 73.06; 76.44; 69.51; 77.11 và 60.52 gợi ý đây là 6 tín hiệu carbon của 1 cấu tử đường.

Các dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất TM17 cho các tín hiệu

đặc trưng của cấu trúc dihydroisocoumarin glycoside [72-74].

Hình 4.1.1.5. Phổ HMBC của hợp chất TM17

Hình 4.1.1.6. Tương tác trên phổ HMBC của 3S-thunberginol C 6-O-β- D-

glucopyranoside

Trên phổ 2 chiều HMBC đã thể hiện sự tương tác của proton anomeric δH (ppm) 4.99 (1H, d, J = 7.5 Hz)/ 4.97 (1H, d, J = 8.0 Hz) với nguyên tử carbon C-6 của phần

aglycon. Hằng số tương tác của proton anomer J= 7.5 – 8.0 Hz cho phép khẳng định

đây là đường dạng beta. Phổ HMBC cũng thể hiện các tương tác giữa H-7 (δH 6.51/6.52) với C-5 (δC 107.37/107.27) và C-9 (δC 102.56/102.54); H-4 (δH 3.08/3.34) với C-5 (δC 107.37/107.27) và C-9 (δC 102.56/102.54); H-5 (δH 6.55) với C-4 (δC 33.66); H-3 (δH 5.61/5.59) với C-10 (δC 142.15), C-6’ (δC 128.22/128.20) và C-2’(δC 128.22/128.20); H-2’(δH 7.32) và H-6’(δH 7.32) với C-4’ (δC 157.76); H3’(δH 6.80) và H-5’(δH 6.80) với C-1’(δC 128.47/128.45). Các tương tác trên cho phép xác định vị trí 2 nhóm thế hydroxyl tại C-8 và C-4’. Bên cạnh đó phổ HSQC cũng chỉ ra các tương

tác của các proton liên kết trực tiếp với nguyên tử carbon trong phân tử.

Hình 4.1.1.7. Phổ HSQC của hợp chất TM17

Từ các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 1D-NMR và 2D-NMR của TM17 kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo có thể khẳng định phần aglycon của TM17 là một dihydroisocoumarin có tên thunberbinol C [72].

Hình 4.1.1.8. Sắc ký đồ HPLC xác định cấu tử đường

Tiến hành thủy phân TM17 và chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao với các đường đối chứng chuẩn đã xác định được cấu tử đường trong phân tử TM17 là đường β-D-glucose (Hình 4.1.1.8).

Trong cấu trúc hóa học của hợp chất TM17, vị trí carbon C-3 là carbon bất đối. Do đó, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất TM17, chúng tôi tiến hành đo phổ lưỡng sắc tròn (phổ CD). Kết quả trên phổ CD cho các hiệu ứng cotton âm xảy ra ở các bước sóng 227 nm (Δε -2.29), 255 nm (Δε -4.85) và 305 nm (Δε -1.21). Trong đó hiệu ứng cotton âm xảy ra mạnh nhất ở bước sóng 255 nm (Δε -4.85) (Hình 4.1.1.9). Tiến hành so sánh phổ CD của hợp chất TM17 với các hợp chất có cấu trúc hóa học và vị trí carbon bất đối tương tự hợp chất TM17 như các hợp chất: 3S- hydrangenol 4’-O-glucoside, 3S-thunberginol I 4’-O-glucoside và 3S-florahydroside. Ở 3 hợp chất vừa nêu, trên phổ CD của chúng đều xảy ra hiệu ứng cotton âm mạnh nhất lần lượt tại 260 nm (Δε -3.76), 255 nm (Δε -8.30) và 255 nm (Δε -0.79) [72-74]. Điều này chỉ ra hợp chất TM17 phù hợp với cấu hình dạng 3S của 3-aryl dihydroisocoumarin. Do đó, hợp chất TM17 được khẳng định là 3S-thunberginol C 6- O-β-D-glucopyranoside. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên.

Δε -4.85

Hình 4.1.1.9. Phổ CD của hợp chất TM17

Tuy nhiên, trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất TM17 xuất hiện các tín hiệu kép theo các cặp tín hiệu rất sát nhau (như trong bảng dữ liệu phổ 4.1.1). Chúng tôi đặt giả thuyết hợp chất TM17 tồn tại đồng thời ở 2 cấu dạng bền khác nhau nên khi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân sẽ xảy ra hiện tượng như trên. Để chứng minh cho giả thuyết này, chúng tôi đã tiến hành tính toán lý thuyết năng lượng bền của các cấu dạng có thể của hợp chất TM17 thông qua việc tính toán enthalpy tương đối (ΔH) của hợp chất này sử dụng phương pháp DFT (density functional theory method) (xem

thêm ở phụ lục B). Kết quả tính toán lý thuyết đã cho thấy hợp chất TM17 có 02 cấu dạng nửa thuyền tồn tại ở trạng thái năng lượng bền với enthalpy tương đối lần lượt là H = 0.0 kcal/mol và H = 0.2 kcal/mol (Hình 4.1.1.10). Điều này đã làm sáng tỏ giả thuyết nêu trên của chúng tôi rằng hợp chất 3S-thunberginol C 6-O-β- D- glucopyranoside tồn tại ở 2 cấu dạng bền khác nhau (a/b).

(a) (b)

Hình 4.1.1.10. Hai cấu dạng bền kiểu nửa thuyền của hợp chất TM17

Hình 4.1.1.11. Cấu trúc hóa học của 3S-thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside

Bảng 4.1.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM17 và tài liệu tham khảo

Thunberginol C (DMSO-d6) [72] TM17 (DMSO-d6)

δH (ppm) 5.54 (1H, t, J= 3.0 Hz) δC (ppm) 169.4 79.7 δC (ppm) 169.25 / 169.18 80.0 Vị trí C 1 3

33.66 33.6 4

δH (ppm) 5.61 (1H, t, J = 2.5 Hz) / 5.59 (1H, t, J = 2.5 Hz) 3.11 (1H, t, J= 2.5 Hz, H-4a)/ 3.07 (1H, t, J= 2.5 Hz, H-4a) 3.03 (1H, dd, J= 3.0; 17.0 Hz, H-4a) 3.24 (1H, dd, J= 12.0; 17.0 Hz, H-4b)

3.35 (overlap, H-4b) 6.55 (1H, br s) 107.37 / 107.27 163.28 6.3 (1H, d, J= 2.0 Hz) 106.8 164.4 5 6

6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz) 100.9 101.76 7

11.1 (-OH) 7.31 (1H, d, J=9.0 Hz) 163.3 100.3 142.2 128.6 128,0 162.99 102.56 / 102.54 142.15 128.47 / 128.45 128.22 / 128.20 8 9 10 1’ 2’

6.8 (1H, d, J=9.0 Hz) 115.1 115.18 3’

9.6 (-OH) 6.8 (1H, d, J=9.0 Hz) 157.6 115.1 157.76 115.18 4’ 5’

7.31 (1H, d, J=9.0 Hz) 128.0 128.22 / 128.20 6’

99.77 / 99.67 1’’

73.06 76.44 69.51 77.11 60.52 2’’ 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ 6.52 (1H, d, J= 2.0 Hz) / 6.51 (1H, d, J = 2.0 Hz) 11.09 (-OH) 7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz) 6.8 (1H, d, J = 8.5 Hz) 9.59 (-OH) 6.8 (1H, d, J = 8.5 Hz) 7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz) 4.99 (1H, d, J = 7.5 Hz) / 4.97 (1H, d, J = 8.0 Hz) 3.24, m 3.37, m 3.18, m 3.2, m 3.46 (1H, m) 3.76 (1H, m)

4.1.2. Hợp chất TM15 (chrysin)

Hợp chất TM15 phân lập được dưới dạng tinh thể màu vàng nhạt, điểm nóng

chảy 280 - 2820C. Phổ UV có các cực đại hấp thụ tại λ max tại 268 và 314 nm.

Trên phồ 1H-NMR xuất hiện hai tín hiệu doublet có δH (ppm) tại 6.26 (1H, d, J=2.0 Hz) và 6.52 (1H, d, J=2.0 Hz) cho thấy vòng A có hai proton ghép cặp meta. Hai

tín hiệu multiplet có δH (ppm) tại 7.09 (3H, m) và 8.01 (2H, m) là của các proton trên vòng B không mang nhóm thế. Một tín hiệu singlet có δH (ppm) tại 6.78 (1H, s) là của H-3.

Trên phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 15 carbon gồm 8 carbon nhóm methine (-CH) có δC (ppm) là 95.2; 100.3; 106.3; 127.4; 130.2 và 132.9. Trong đó có 2 tín hiệu là tín hiệu bội chập đôi tại δC (ppm) 127.4 và 130.2. Bảy tín hiệu của carbon không liên kết với hydro có δC (ppm) 165.6; 183.8; 166.2; 163.2; 159.5; 105.7 và 132.6. Trong đó 1 tín hiệu của nhóm carbonyl là δC

(ppm) 183.8.

Từ kết quả hằng số vật lý, dữ liệu phổ đo được kết hợp với tài liệu tham khảo đã công bố đã xác định chất TM15 chính là chrysin [75]. Chrysin đã được chứng tỏ là chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, hạ huyết áp, chóng dị ứng, chống tan máu và chống oxi hóa tốt [76].

Hình 4.1.2. Cấu trúc hóa học hợp chất chrysin

Bảng 4.1.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM15 và chất tham khảo

Chrysin (DMSO-d6) [75] TM15 (CD3OD+DMSO-d6) Vị trí C δH (ppm) δH (ppm)

2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 6.96 (1H, s) 6.21 (1H, d, J=2.0 Hz) 6.52 (1H, d, J=1.5 Hz) 8.06 (1H, m) 6.78 (1H, s) 6.26 (1H, d, J=2.0 Hz) 6.52 (1H, d, J=2.0 Hz) 8.01 (1H, m) δC (ppm) 165.6 106.3 183.8 163.2 100.3 166.2 95.2 159.5 105.7 132.6 127.4 δC (ppm) 163.1 105.2 181.8 161.4 99.0 164.4 94.1 157.4 104.0 130.7 126.4

7.59 (1H, m) 7.59 (1H, m) 7.59 (1H, m) 8.06 (1H, m) 7.60 (1H, m) 7.60 (1H, m) 7.60 (1H, m) 8.01 (1H, m) 130.2 132.9 130.2 127.4 129.1 132.0 129.1 126.4

3’ 4’ 5’ 6’ 4.1.3. Hợp chất TM2 (quercetin)

Hợp chất TM2 phân lập được ở dạng tinh thể hình kim, màu vàng, điểm nóng

chảy 313 - 3150C. Phổ tử ngoại UV có các cực đại hấp thụ λ max tại 258 và 375 nm.

Trên phổ 1H-NMR chỉ xuất hiện tín hiệu của 5 proton. Các tín hiệu cộng hưởng δH (ppm) ở 6.2 (1H, d, J=2.0 Hz); 6.4 (1H, d, J= 2.5 Hz) thuộc vào hai proton ở vị trí proton H-6 và H-8 ứng với cầu trúc 5,7-dihydroxy của vòng A; Ba tín hiệu cộng hưởng khác ứng với hệ tương tác spin ABX ở δH (ppm) 7.75 (1H, d, J= 2.5 Hz) thuộc

proton H-2’, 6.91 (1H, d, J= 8.5 Hz) và 7.64 (1H, dd, J=8.5; 2.0 Hz) thuộc về 2 proton

H-5’ và H-6’ cho phép vòng B bị thế ở các vị trí 1’, 3’ và 4’.

Trên phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy tín hiệu của 15 carbon trong đó gồm 5 carbon nhóm methine (-CH) có độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 99.2; 94.4; 116.0; 116.2; 121.6; 10 carbon không liên kết với hydro có δC (ppm) 148.0; 137.2; 177.3; 162.5; 165.5; 158.2; 104.5; 124.1; 146.2; 148.7. Hai tín hiệu carbon liên kết trực tiếp với nhóm hydroxyl có δC (ppm) 146.2 và 148.7 tương ứng với vòng B bị thế nhóm hydroxyl ở 2 vị trí octo; 1 tín hiệu cộng hưởng của carbon carbonyl ở δC 177.3 ppm và tín hiệu ở δC 137.2 ppm ứng với C-3 khẳng định có nhóm hydroxyl gắn vào vị

trí C-3 của TM2.

Từ kết quả hằng số vật lý, dữ liệu phổ đo được kết hợp với tài liệu tham khảo đã

công bố, hợp chất TM2 được xác định chính là quercetin [77].

Hình 4.1.3. Cấu trúc hóa học hợp chất quercetin

Bảng 4.1.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM2 và chất tham khảo

Quercetin (DMSO-d6) [77] Chất TM2 (CD3OD-d4) Vị trí C δH (ppm) δH (ppm)

δC (ppm) δC (ppm)

147.2 136.1 176.2 161.1 98.6 6.19 (1H, d, J= 2.1 Hz) 164.3 93.8 6.42 (1H, d, J= 2.1 Hz) 156.6 103.4 122.4 115.4 7.66 (1H, d, J= 2.1 Hz) 145.4 148.1 6.88 (1H, d, J= 8.4 Hz) 116.0 7.53 (1H, dd, J=8.4; 2.1 Hz) 120.5 6.20 (1H, d, J=2.0 Hz) 6.40 (1H, d, J= 2.0 Hz) 7.75 (1H, d, J= 2.5 Hz) 6.90 (1H, d, J= 8.5 Hz) 7.64 (1H, dd, J=8.5; 2.0 Hz) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 148.0 137.2 177.3 162.5 99.2 165.5 94.4 158.2 104.5 124.1 116.0 146.2 148.7 116.2 121.6

4.1.4. Hợp chất TM5 (hyperin)

Hợp chất TM5 phân lập được ở dạng tinh thể màu vàng chanh, có nhiệt độ nóng chảy 225-2260C. Các tín hiệu xuất hiện trên phổ NMR của hợp chất TM5 cho thấy bộ khung của một flavonoid glycoside.

Trên phổ 1H-NMR có sự xuất hiện của hai tín hiệu doublet của 2 proton ghép cặp meta của vòng A tại δH (ppm) 6.21 (1H, d, J=2.2 Hz, H-6) và 6.41 (1H, d, J=2.2 Hz, H-8) và ba tín hiệu doublet khác tại δH (ppm) 7.54 (1H, d, J meta = 2.0 Hz, H-2’), 6.82 (1H, d, Jocto = 8.5 Hz, H-5’) và 7.67 (1H, dd, Jocto và meta = 8.5; 2.0 Hz, H-6’) của vòng B, chứng tỏ vòng B bị thế tại vị trí C-1’, C-3’ và C-4’, dữ liệu phổ 1H-NMR gợi ý phần aglycon của hợp chất TM5 chính là quercetin. Điều này có thể thấy rõ hơn khi trên phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 15 nguyên tử carbon của khung flavonoid bao gồm 5 carbon nhóm methine (-CH) thuộc vùng thơm độ chuyển dịch hóa học δC trong vùng (93.64 đến 122.15 ppm), nhóm carbon carbonyl δC 177.7 ppm và 9 carbon không liên kết với hydro.

Hợp chất TM5 cho thấy có chứa 1 cấu tử đường khi trên phổ 13C-NMR cho tín hiệu của 6 carbon đặc trưng, trong đó 1 tín hiệu carbon anomeric (δC 102.0 ppm) và 5 carbon có độ chuyển dịch hóa học trong khoảng (60.2 đến 75.9 ppm). Trên phổ HMBC cho thấy sự tương tác của carbon C-3 của khung flavonoid (δC 133,6 ppm) với

proton anomeric của cấu tử đường δH 5.38 (1H, d, J=7.68 Hz), điều này cho thấy cấu tử đường gắn vào vị trí C-3 của phần aglycon và cấu tử đường ở đây là dạng beta. Trên phổ 13C-NMR cho 1 tín hiệu tại δC 60.2 ppm nên nhiều khả năng đây là đường galactopyranoside hoặc glucopyranoside có với 1 nhóm -CH2OH. Tiến hành phương án thủy phân và sử dụng sắc ký lớp mỏng so sánh với đối chứng đã xác định được cấu

tử đường là beta –galactopyranoside.

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất TM5 được

xác định là quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside hay còn gọi là hyperin [78].

Hình 4.1.4. Cấu trúc hóa học hợp chất hyperin

Bảng 4.1.4. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM5 và chất tham khảo

TM5 (DMSO-d6)

Vị trí δH (ppm) δH (ppm)

Hyperin (DMSO-d6) [78] δC (ppm) δC (ppm)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 156.9 134.2 178.2 12.63 (1H, br s, -OH) 162.0 6.20 (1H, d, J=2.0 Hz) 99.3 164.5 6.40 (1H, d, J=2.0 Hz) 94.1 156.9 104.3 121.7 7.53 (1H, d, J=2.0 Hz) 115.9 156.5 133.6 177.7 161.4 12.64 (1H, br s, -OH) 98.8 6.21 (1H, d, J=2.2 Hz) 164.4 93.6 6.41 (1H, d, J=2.2 Hz) 156.4 104.0 121.3 7.54 (1H, d, J= 2.0 Hz) 115.3

3’ 4’ 5’ 6’

102.5 71.9 73.9 68.6 76.5 60.8 144.9 148.6 6.82 (1H, d, J= 8.5 Hz) 116.1 122.2 7.67 (1H, dd, J = 8.5; 2.0 Hz) 5.38 (1H, d, J=7.68 Hz) 102.0 3.31 – 3.65 (m) 3.31 – 3.65 (m) 3.31 – 3.65 (m) 3.31 – 3.65 (m) 3.31 – 3.65 (m) 71.2 73.2 67.9 75.9 60.2

145.5 149.2 6.83 (1H, d, J=8.0 Hz) 116.6 122.7 7.67 (1H, dd, J = 8.0; 2.0 Hz) 5.38 (1H, br s) 1’’ 3.30 – 3.67 (m) 2’’ 3.30 – 3.67 (m) 3’’ 3.30 – 3.67 (m) 4’’ 3.30 – 3.67 (m) 5’’ 6’’ 3.30 – 3.67 (m) 4.1.5. Hợp chất TM36 (myricitrin)

Hợp chất TM36 phân lập được ở dạng tinh thể hình kim màu vàng cam, có điểm nóng chảy 196 – 1980C. Các tín hiệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy TM36 có bộ khung của một flavonoid glycoside.

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện 2 tín hiệu cộng hưởng doublet đặc trưng của 2 proton ghép cặp meta với nhau tại δH (ppm) 6.22 (1H, d, J=2.0 Hz), 6.38 (1H, d, J=2.0 Hz), tương ứng với đó là trên phổ HSQC cho thấy 2 tín hiệu tương tác với 2 nguyên tử carbon lần lượt tại δC (ppm) 99.8 và 94.7. Điều này khằng định 2 proton nêu trên là H- 6 và H-8 của vòng A. 2 tín hiệu proton thơm khác trên phổ 1H-NMR xuất hiện tại δH (ppm) 6.97 (2H, s, H-2’, H-6’) có cường độ pic cao gấp đôi so với các tín hiệu methine (-CH) khác tương ứng trên phổ HSQC cho thấy sự tương tác của 2 proton nêu trên với 2 nguyên tử carbon ở vị trí C-2’ và C-6’có độ chuyển dịch tại δC (ppm) 109.6. Điều

này khẳng định vòng B bị thế ở 4 vị trí.

Trên phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy tín hiệu của 21 carbon với 9 nhóm methine (-CH), 1 nhóm methyl (-CH3), và 11 carbon không liên kết với hydro. Trong đó 1 tín hiệu đặc trưng của carbon carbonyl tại độ chuyển dịch δC 179.6 ppm.

Các tín hiệu proton xuất hiện trên phổ 1H-NMR trong vùng δH 3.37 – 4.24 ppm 1 tín hiệu proton anomeric tại δH 5.33 (1H, d, J=1.0 Hz), 1 tín hiệu singlet của nhóm methyl tại δH 0.98 (3H, d, J=6.0 Hz) cùng với các 6 tín hiệu carbon trên phổ 13C-NMR tại δC (ppm ) 103.61; 72.03; 72.14; 73.5; 71.8 và 17.8 (đặc trưng của nhóm –CH3) cho thấy sự có mặt của 1 cấu tử đường α-L-rhamnopyranosyl. Sự tương tác giữa C-3 (δC 136.3 ppm) với proton anomeric (δH 5.33; J=1.5 Hz) trên phổ HMBC chứng tỏ cấu tử

đường được gắn vào khung flavonoid tại vị trí carbon số 3. Sự có mặt của đường α-L-

rhamnopyranosyl được kiểm tra bằng phản ứng thủy phân và sắc ký lớp mỏng.

Qua các dữ liệu vật lý và dữ kiện phổ NMR kết hợp với tài liệu tham khảo đã

công bố, hợp chất TM36 được xác định là myricitrin [79].

Hình 4.1.5. Cấu trúc hóa học hợp chất myricitrin

Bảng 4.1.5. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM36 và chất tham khảo

TM36 (CD3OD) trí δH (ppm) δH (ppm)

Myricitrin [79] (CD3OD) δC (ppm) δC (ppm)

6.22 (1H, d, J = 2.2 Hz) 6.38 (1H, d, J= 2.2 Hz) 6.97 (br s) 159.4 136.3 179.6 163.1 99.8 165.8 94.7 158.5 105.9 122.0 109.6 6.21 (1H, d, J=2.0 Hz) 6.37 (1H, d, J=2.0 Hz) 6.97 (br s) 159.3 136.2 179.6 163.1 99.8 166.0 94.7 158.5 105.7 121.9 109.5 Vị C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’

146.8 146.8 3’

4’ 5’ 6’ 1’’ 2’’ 137.8 146.8 109.5 103.6 71.8 6.97 (br s) 5.33 (1H, d, J= 1.1 Hz) 4.21 (m) 137.9 146.8 109.6 103.6 71.8

3’’ 72.0 72.1

4’’ 5’’ 73.3 72.0 6.97 (br s) 5.33 (1H, d, J = 1.5 Hz) 4.24 (1H, dd, J = 3.5, 1.5 Hz) 3.82 (1H, dd, J = 9.5, 3.5 Hz) 3.37 (1H, m) 3.53 (1H, m) 73.5 72.0

3.81 (1H, dd, J = 9.4, 3.1 Hz) 3.33 (1H, t, J= 9.4 Hz) 3.51 (dd, J = 9.4, 6.1 Hz) 0.96 (3H, d, J=6.1 Hz) 17.6 0.98 (3H, d, J = 6.5 Hz) 17.8

6’’ 4.1.6. Hợp chất TM16 (naringenin)

Hợp chất TM16 phân lập được dưới dạng chất rắn màu vàng nhạt. Điểm nóng chảy của TM16 là 251 – 2520C. Các tín hiệu phổ cộng hường từ hạt nhân cho thấy hợp chất TM16 cũng có bộ khung cơ bản là 1 flavonoid.

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho 2 proton ghép cặp meta của vòng A tại độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 5.90 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6) và 5.91 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8). Các tín hiệu cộng hưởng của

các proton còn lại thuộc về vòng B của khung flavonoid được đặc trưng bởi hệ spin

AABB tại độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 7.33 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2’, H-6’) và 6.83 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3’, H-5’). Điều này cho thấy vòng B bị thế ở vị trí C-1’ và C-

4’. Vòng C xuất hiện tín hiệu cộng hưởng doublet kép của nhóm oxymetin ở độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 5.36 (1H, dd, J=3.0, 13.0 Hz, H-2) và 1 nhóm methylene (-CH2) có độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 2.71 (1H, dd, J=3.0, 17.5 Hz, H-3a) và 3.12 (1H; dd, J=13.0, 17.5 Hz, H-3b).

Trên phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho thấy phân tử hợp chất TM16 có 15 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm carbonyl tại độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) (197.8, C-4), 4 nhóm methine (-CH) thơm đối xứng cho tín hiệu cộng hưởng dạng vạch chập đôi một xuất hiện tại δC (ppm) 131.0 (C-2’, C-6’) và 116.4 (C-3’, C-5’) thuộc vòng B. 2 tín hiệu methine khác thuộc vòng A cho tín hiệu tại độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 97.1 (C-6), 96.2 (C-8). 1 tín hiệu oxymethine của vòng C tại độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 80.5 (C-2). 5 tín hiệu carbon không liên kết với hydro của vòng thơm lần lượt xuất hiện tại δC (ppm) 165.5 (C-5), 168.4 (C-7), 164.9 (C-9), 103.4 (C-10) và 159.0 (C-4’). Cuối cùng là 1 nhóm methylene (-CH2) cho tín hiệu cộng hưởng tại δC (ppm) 44.1 (C-3). Từ các dữ kiện phổ NMR và so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất TM16 được xác định là naringenin [80].

Hình 4.1.6. Cấu trúc hóa học hợp chất naringenin

Bảng 4.1.6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM16 và chất tham khảo

Naringenin [80] (acetone-d6) TM16 (CD3OD) Vị trí C δH (ppm) δH (ppm)

δC (ppm) 80.0 δC (ppm) 80.5 1 2

43.5 44.1 3

197.2 166.8 96.4 167.8 95.9 164.5 103.2 130.7 129.0 5.45 (1H, dd, J=3.0, 12.9 Hz) 2.74 (1H, dd, J=3.0, 17.1 Hz, H-3a) 3.17 (1H, dd, J=12.9, 17.1 Hz, H-3b) 5.95 (1H, d, J=2.1 Hz) 5.96 (1H, d, J=2.1 Hz) 7.39 (1H, d, J=8.5 Hz) 5.36 (1H, dd, J=3.0, 13.0 Hz) 2.71 (1H, dd, J=3.0, 17.5 Hz, H-3a) 3.12 (1H; dd, J=13.0, 17.5 Hz, H-3b) 5.90 (1H, d, J=2.0 Hz) 5.91 (1H, d, J=2.0 Hz) 7.33 (1H, d, J=8.5 Hz ) 197.8 165.5 97.1 168.4 96.2 164.9 103.4 131.8 131.0 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’

116.4 158.7 116.4 129.0 6.90 (1H, d, J=8.5 Hz) 6.90 (1H, d, J=8.5 Hz) 7.39 (1H, d, J=8.5 Hz) 6.83 (1H, d, J=8.5 Hz ) 6.83 (1H, d, J=8.5 Hz ) 7.33 (1H, d, J=8.5 Hz ) 116.4 159.0 116.4 131.0

3’ 4’ 5’ 6’ 4.1.7. Hợp chất TM10 (astilbin)

Hợp chất TM10 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy ở 172 – 1740C. Các dự kiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy hợp chất TM10 có bộ khung của 1 flavonoid glycoside.

Trên phổ 1H-NMR có sự xuất hiện của hai tín hiệu doublet của 2 proton thơm ghép cặp meta của vòng A ở tại δH (ppm) 5.92 (1H, d, J= 2.0 Hz), H-6) và 5.94 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-8) và ba tín hiệu doublet khác tại δH (ppm) 6.84 (1H, d, Jmeta=8.0 Hz, H- 2’), 6.97 (1H, d, Jocto=2.0 Hz, H-5’) và 6.87 (1H, dd, Jmeta và octo=8.0, 2.0 Hz, H-6’) của

vòng B chứng tỏ vòng B bị thế tại vị trí C-1’, C-3’ và C-4’. Ở vùng trường thấp hơn

của vòng C, trên phổ 1H-NMR cũng quan sát thấy 2 tín hiệu cộng hưởng doublet có độ chuyển dịch δH (ppm) 5.09 (1H, d, J= 11,0 Hz) và 4.59 (1H, d, J= 10.5 Hz), kết hợp với phổ HSQC có thể xác định 2 proton vừa nêu lần lượt của C-2 và C-3. Ngoài ra, dữ kiện phổ HMBC còn thể hiện sự tương tác của proton anomeric δH 4.08 (1H, d, J=1.0 Hz, H-1’’) với carbon C-3 (78,6 ppm). Chứng tỏ trong cấu trúc hóa học của TM10 có

chứa 1 cấu tử đường liên kết với phần aglycon tại vị trí C-3.

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho biết trong phân tử TM10 có tổng số 21 carbon. Bao gồm 7 carbon không liên kết với hydro, 12 nhóm methine (-CH) và 1

nhóm methyl (-CH3). Trong đó có 1 tín hiệu của nhóm cacbonyl (C=O) ở C 196.0

ppm, và 5 nhóm methine (-CH) có độ chuyển dịch hóa hoc nằm trong vùng 70.5 –

102.2 ppm càng chứng tỏ đây là các tín hiệu carbon (-CH) của 1 cấu tử đường. Đặc biệt trên phổ 13C-NMR xuất hiện 1 tín hiệu cộng hưởng của nhóm methyl (-CH3) tại độ

chuyển dịch hóa học C 17.8 ppm của cấu tử đường, gợi ý cấu tử đường gắn vào phần

aglycon là đường α-L-rhamnopyranosyl.

Kết hợp phân tích phổ HSQC và HMBC đã xác định các proton gốc đường có

H (ppm) 3.57 (1H, dd, J=3.5, 1.5 Hz, H-2’’), 3.69 (1H, dd, J=9.5, 3.5 Hz, H-3’’), 3.33 (1H, m, H-4’’), 4.27 (1H, m, H-5’’) với C tương ứng 71.8 (C-2’’), 72.2 (C-3’’), 73.8 (C-4’’) và 70.5 (C-5’’).

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã được công bố,

hợp chất TM10 được khẳng định có tên là astilbin [81].

Hình 4.1.7. Cấu trúc hóa học hợp chất astilbin

Bảng 4.1.7. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM10 và chất tham khảo

Astilbin [81] (CD3OD)

H (ppm) C TM10 (CD3OD) H (ppm) C

5.17 (1H, d, J=10.0 Hz) 4.57 (1H, d, J=10.0 Hz) 5.89 (1H, d, J=2.1 Hz) 5.09 (1H, d, J= 11,0 Hz) 4.59 (1H, d, J= 10.5 Hz) 5.92 (1H, d, J= 2.0 Hz) 84.8 79.4 196.7 166.3 98.2 169.7 84.0 78.6 196.0 164.1 97.4 168.6 Vị trí C 2 3 4 5 6 7

5.94 (1H, d, J= 2.0 Hz)

8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1’’ 2’’ 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ 5.91 (1H, d, J=2.1 Hz) 6.8 (1H, d, J=8.2 Hz) 6.95 (1H, d, J=1.8 Hz) 6.84 (1H, dd, J=8.2, 1.8 Hz) 4.04 (brs) 3.53 (brd, J=3.3 Hz) 3.64 (1H, dd, J=9.6, 3.3 Hz) 3.32 (1H, t, J=9.6 Hz) 4.26 (1H, m) 1.18 (3H, d, J=6.2 Hz) 97.2 164.9 103.2 130.0 117.1 6.84 (1H, d, J=8.0 Hz) 147.3 148.1 116.3 6.97 (1H, d, J=2.0 Hz) 121.3 6.87 (1H, dd, J=8.0, 2.0 Hz) 102.9 4.08 (1H, d, J=1.0 Hz) 72.6 72.9 74.6 71.3 18.6 3.57 (1H, dd, J=3.5, 1.5 Hz) 3.69 (1H, dd, J=9.5, 3.5 Hz) 3.33 (1H, m) 4.27 (1H, m) 1.21 (3H, d, J=6.5 Hz) 96.3 165.5 102.5 129.2 115.5 146.6 147.4 116.4 120.5 102.2 71.8 72.2 73.8 70.5 17.8

4.1.8. Hợp chất TM7 (naringenin-7-O- β-D-glucopyranoside)

Hợp chất TM7 phân lập được dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, điểm nóng chảy 223-2250C. Các tín hiệu phổ NMR cho thấy hợp chất TM7 có bộ khung của một flavonoid glycoside.

Phần aglycon của TM7 trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho các tín hiệu cộng hưởng tương tự với hợp chất naringenin. Cụ thể trên phổ 1H-NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho 2 proton ghép cặp meta của vòng A tại độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 6.13 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6) và 6.15 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8). Các tín hiệu cộng hưởng của các proton của vòng B có độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 7.32 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2’, H-6’) và 6.80 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3’, H-5’). Vòng C xuất hiện tín hiệu cộng hưởng doublet của nhóm oxymethine ở độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 5.50 (1H, dd, J=3.0, 12.5 Hz, H-2) và 1 nhóm methylene (- CH2) có độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 2.74 (1H, dd, J=3.0, 17.0 Hz, H-3b) và 3.35 (overlap, H-3b). còn trên phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT cho tín hiệu của 15 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm carbonyl tại độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) (197.2, C- 4), 6 nhóm methine (-CH) thơm thuộc vòng B và A. 1 tín hiệu oxymethine (-OCH)của vòng C tại độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 80.5 (C-2). 5 tín hiệu carbon không liên kết với hydro của vòng thơm và 1 nhóm methylene (-CH2) cho tín hiệu cộng hưởng chuyển dịch về phía trường cao tại δC (ppm) 42.1 (C-3). Dựa vào dữ kiện phổ có thể khẳng định phần aglycon của TM17 là naringenin.

Trên phổ HMBC cho thấy tương tác của proton anomeric có độ chuyển dịch

hóa học δH (ppm) 4.97 (1H, d, J= 7.5 Hz) với nguyên tử carbon C (ppm) 165.3 (C-7) chứng tỏ phần đường gắn vào phần aglycon tại vị trí carbon C-7. Trên phổ 13C-NMR

cho tín hiệu cộng hưởng của 6 proton tại C (ppm) 60.6 (-CH2), 77.1 (-CH), 69.5 (-

CH), 76.3 (-CH), 72.9 (-CH) và 99.6 (-CH) gợi ý đến đường β-D-glucose hoặc β-D-

galactose. Tiến hành thủy phân và sử dụng sắc ký lớp mỏng để so sánh, xác định được cấu tử đường là β-D-glucose.

Dựa trên các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố,

hợp chất TM7 được xác định là naringenin-7-O- β-D-glucopyranoside [82].

Hình 4.1.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất naringenin-7-O- β-D-glucopyranoside

Bảng 4.1.8. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM7 và chất tham khảo

TM7 (DMSO-d6) TT Naringenin-7-O- β-D- glucopyranoside [82] (DMSO-d6)

H (ppm) H (ppm)

Vị trí C 2 C (ppm) 78.6 C (ppm) 78.6

3 42.0 42.1

5.44 (1H, dd, J= 12.5, 3.0 Hz ) 3.35 (overlap, H-3a) 2.74 (1H, dd, J= 17.0, 3.0 Hz, H-3b)

4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1’’ 2’’ 197.2 162.9 96.5 165.3 95.4 162.7 103.2 128.6 128.4 115.2 157.8 115.2 128.4 99.6 72.9 12.04 (-OH) 6.13 (1H, d, J=2.0 Hz) 6.15 (1H, d, J=2.0 Hz) 7.32 (1H, d, J=8.5 Hz) 6.80 (1H, d, J=8.5 Hz) 9.59 (-OH) 6.80 (1H, d, J=8.5 Hz) 7.32 (1H, d, J=8.5Hz) 4.97 (1H, d, J= 7.5 Hz) 3.23 (1H, m) 197.2 162.9 97.5 165.3 95.4 162.7 103.2 128.6 128.4 115.2 157.8 115.2 128.4 99.6 72.9

3’’ 5.51 (1H, dd, J= 12.7, 3.0 Hz ) 3.35 (1H, dd, J= 17.1, 12.7 Hz, H-3a) 2.76 (1H, dd, J= 17.1, 3.0 Hz, H-3b ) 12.06 (-OH) 6.14 (1H, d, J= 2.1 Hz) 6.16 (1H, d, J= 2.1 Hz) 7.33 (1H, d, J=8.5 Hz) 6.81 (1H, d, J=8.5 Hz) 9.61 (-OH) 6.81 (1H, d, J=8.5 Hz) 7.33 (1H, d, J=8.5 Hz) 4.97 (1H, d, J= 7.7 Hz) 3.23 (1H, dd, J=7.7, 9.2 Hz) 3.28 (1H, t, J=9.2 Hz) 76.3 3.27 (1H, t, J=9.2 Hz) 76.3

4’’ 69.5 3.16 (1H, m) 69.5

5’’ 6’’ 77.0 60.5 77.1 60.6

3.39 (1H, m) 3.66 (1H, d, J=11.0, H- 6’’a) 3.46 (1H, m, H-6’’b) 3.16 (1H, dd, J=9.2, 9.1 Hz) 3.39 (1H, m) 3.68 (1H, dd, J=11.8, 3.3 Hz, H-6’’a) 3.46 (1H, dd, J=11.8, 5.8 Hz, H-6’’b)

chất TM30 (2R/S)-5,7,3’,5’-tetrahydroxy-flavanone 7-O-β-D

4.1.9. Hợp glucopyranosie)

Hợp chất TM30 phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng. Phổ UV của hợp chất

TM30 xuất hiện 3 tín hiệu hấp thụ cực đại tại bước sóng lần lượt là 225, 280 và 320

nm, kết hợp cùng với một số tín hiệu đặc trưng trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân gợi ý TM30 là một flavonoid glycoside. Điều này được minh chứng cụ thể trên phổ 1H- NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho 2 proton ghép cặp meta của vòng A tại độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 6.13 (1H, d, J=2.0, H-6) và 6.14 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8). Về phía trường cao hơn thấy xuất hiện 2 tín hiệu cộng hưởng của vòng B lần lượt tại δH (ppm) 6.75 (2H, br s) và 6.88 (1H, br s), điều này chứng tỏ vòng B bị thế ở 3 vị trí. Kết hợp với phổ HMBC và HSQC có thể xác định vòng B bị thế tại 3 vị trí là

C-1’, C3’ và C-5’. Vòng C xuất hiện tín hiệu cộng hưởng doublet của nhóm oxymetin

ở độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 5.44 (1H, dt, J= 12.5, 3.5 Hz, H-2) và 1 nhóm methylene (-CH2) có độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 3.23 (1H, m, H-3a) và 2.73 (1H, dd, J= 17.0, 3.0 Hz, H-3b )

Trên phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy sự xuất hiện của 21 tín hiệu carbon, trong đó có 6 tín hiệu carbon của nhóm methine (-CH) có độ chuyển dịch hóa

học lần lượt tại C (ppm) 99.6; 72.9; 76.3 ; 69.5 ; 77.1 và 60.5 gợi ý trong phân tử

TM30 có 1 cấu tử đường. Trên phổ HMBC xác định được cấu tử đường gắn vào vị trí carbon C-7 của phần aglycon khi xuất hiện sự tương tác của proton anomeri δH (ppm)

4.97 (1H, d, J= 7.5 Hz) tương tác với carbon C (165.3 ppm, C-7). Đường này có cấu

dạng beta khi hằng số tương tác Janome = 7.5 Hz. Tiến hành thủy phân TM30 và sử dụng sắc ký lớp mỏng, cấu tử đường được xác định là đường β-D-glucose.

Trên phổ 13C-NMR, tín hiệu phổ tại nhiều vị trí carbon đều cho thấy sự trùng lặp gần sát nhau của các tín hiệu C-2 (78.70/ 78.66), C-4 (197.14/ 197.11), C-5 (162.89/ 162.86), C-7 (165.25/ 165.16), C-9 (162.71/ 162.66), C-1’’ (129.18/ 129.16). Điều này gợi ý hợp chất TM30 thực chất là 1 cặp đồng phân bất đối quang (R/S) với

carbon bất đối C-2.

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu đã được công bố, hợp chất

TM30 được khẳng định chính là 1 hỗn hợp đồng phân bất đối quang (2R/S)-5,7,3’,5’-

tetrahydroxy-flavanone 7-O-β-D glucopyranosie [83].

Hình 4.1.9. Cấu trúc hóa học của hỗn hợp chất (2S/R)-5,7,3’,5’-tetrahydroxy-

flavanone 7-O-β-D glucopyranosie)

Bảng 4.1.9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM30 và chất tham khảo

TM30 (DMSO-d6)

Vị trí C (2S/R)-5,7,3’,5’-tetrahydroxy- flavanone 7-O-β-D glucopyranosie [83] (DMSO-d6) H (ppm) H (ppm)

C (ppm) 78.7 2

42.1 C (ppm) 78.70/ 78.66 42.13 3

5.44 (1H, dd, J= 12.8, 3.2 Hz ) 3.23 (1H, m, H-3a) 2.72 (1H, dd, J= 17.2, 3.2 Hz, H-3b ) 5.44 (1H, dt, J= 12.5, 3.5 Hz ) 3.23 (1H, m, H-3a) 2.73 (1H, dd, J= 17.0, 3.0 Hz, H-3b ) 197.2 4

12.05 (-OH) 162.9 5

6.13 (1H, d, J= 2.0 Hz) 96.4 165.2 6.13 (1H, d, J= 2.0 Hz) 6 7

6.14 (1H, d, J= 2.0 Hz) 95.4 162.7 6.14 (1H, d, J= 2.0 Hz) 8 9

103.2 129.2 10 1’

6.75 (br s) 118.1 6.75 (br s) 2’

9.09 (-OH) 145.8 9.09 (-OH) 3’

6.88 (br s) 9.03 (-OH) 114.4 145.2 6.88 (br s) 9.03 (-OH) 197.14/ 197.11 162.89/ 162.86 96.39 165.25/ 165.16 95.40 162.71/ 162.66 103.23 129.18/ 129.16 118.04/ 188.05 145.78/ 145.77 114.39 147.17 4’ 5’

6’ 1’’ 6.75 (br s) 4.97 (1H, d, J= 7.6 Hz) 115.3 99.5 6.75 (br s) 4.97 (1H, d, J= 7.5 Hz)

2’’ 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ 73.0 76.3 69.5 77.0 60.6 115.31 99.57/ 99.45 72.98 76.28 69.47 77.05 60.54

3.13-3.25 (m) 3.13-3.25 (m) 3.13-3.25 (m) 3.13-3.25 (m) 3.65 (1H, dd, J=10.4, 5.2 Hz, H-6’’a) 3.40 (1H, m, H-6’’b) 3.12-3.25 (m) 3.12-3.25 (m) 3.12-3.25 (m) 3.12-3.25 (m) 3.66 (1H, d, J=11.5 Hz, H-6’’a) 3.39 (1H, m, H-6’’b)

4.1.10. Hợp chất TM33 (Phloretin-2’-O-(β-D-xylopyranosyl-(16)-O-β-D

glucopyranoside))

Hợp chất TM33 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phân tích dữ kiện phổ một chiều 1H, 13C-NMR và DEPT cho thấy hợp chất TM33 là một chalcone glycoside. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất TM33 xuất hiện tín hiệu của 26

carbon, bao gồm 6 carbon methine thơm (C 94.6-129.1 ppm), 6 carbon methine của

đường (C 69.3-103.8 ppm), 2 carbon methylene bão hòa [C-α (C 44.8), và C-β (C

28.9)], 2 carbon methylene của đường (C 65.6 và 67.9), 9 carbon không liên kết hydro

của vòng thơm (C 105.6-165.3 ppm), và một nhóm carbonyl (C 205.5 ppm). Tương ứng, phổ 1H-NMR của hợp phần chalcone cho thấy tín hiệu proton của một nhóm

phenyl thế hai lần [H (ppm) 6.64 (2H, d, J= 8.5 Hz, H-2, H-6) và 7.02 (2H, d, J= 8.5

Hz, H-3, H-5)], một nhóm phenyl thế bốn lần [H (ppm) 6,19 (1H, d, 2,0 Hz, H-3') và

5,91 (1H, d, 2.0 Hz, H-5')], và cầu nối -CH2-CH2-CO- [H (ppm) 3.35 (overlap, α-

CH2), và 2.78 (β-CH2)]. Trong khi đó, tín hiệu đặc trưng ở H 4.89 (1H, d, J= 7.5 Hz), H 4.18 (1H, d, J= 7.5 Hz), và H 3.00-3.96 ppm trong phổ 1H-NMR cho phép xác định hợp phần đường là β-D-xylopyranosyl-(16)-O-β-D glucopyranoside. Cấu trúc hợp chất TM33 còn được khẳng định bởi dữ kiện phổ hai chiều HSQC và HMBC.

Nhân phenyl thế 1,4 xuất hiện các tương tác HMBC đặc trưng H-2, H-3, H-4, H-5, và

H-6/C-4, nhân phenyl thế 1,2,4,6 cho các tương tác HMBC như H-3'/C-1', C-2', C-4', và C-5', và H-5'/C-1', C-4', và C-6'. Hai nhân phenyl liên kết qua cầu nối (- CH2CH2CO-). Tương tác H-6''/C-1''' trên phổ HMBC còn cho phép xác định tương tác giữa hai đơn vị đường xylopyranosyl và glucopyranosyl theo kiểu liên kết 16. Hợp phần glucopyranosyl liên kết trực tiếp với carbon C-2' được khẳng định bởi tương tác HMBC H-1''/C-2'.

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố [84], hợp chất TM33 được xác định là một chalcone glycoside có tên là phloretin-2’-O-(β-D- xylopyranosyl-(16)-O-β-D glucopyranoside.

Hình 4.1.10. Cấu trúc hóa học hợp chất phloretin-2’-O-(β-D-xylopyranosyl-(16)-O- β-D glucopyranoside

Bảng 4.1.10. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM33 và chất tham khảo

TM33 (DMSO-d6) TT Phloretin-2’-O-(β-D- xylopyranosyl-(16)-O-β-D glucopyranoside [84] (DMSO-d6)

H (ppm) H (ppm) C (ppm)

Vị trí C 1 2 3 4 5 6 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ α β 1’’ 2’’ 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ 131.5 129.1 114.9 155.2 114.9 129.1 105.1 160.7 94.6 165.3 96.9 164.2 204.5 44.8 28.9 100.9 73.1 76.6 69.3 75.9 67.9 C (ppm) 131.6 129.2 115.0 155.3 115.0 129.2 105.3 160.8 94.6 165.3 96.9 164.4 204.7 44.9 28.95 101.1 73.2 76.6 69.4 76.0 68.1

7.03 (1H, d, J= 8.4 Hz) 6.64 (1H, d, J= 8.4 Hz) 6.64 (1H, d, J= 8.4 Hz) 7.03 (1H, d, J= 8.4 Hz) 6.2 (1H, d, J= 1.9 Hz) 5.93 (1H, d, J= 1.9 Hz) 3.35 (2H, m) 2.78 (2H, t, J= 7.2 Hz) 4.89 (1H, d, J= 7.0 Hz) 3.30 (m) 3.30 (m) 3.30 (m) 3.55 (m) 3.6 (1H, m, H-6’’a) 3.96 (1H, d, J= 1.1 Hz, H- 6’’b)

103.8 73.4 76.3 69.5 65.6 103.9 73.4 76.3 69.6 65.6 1’’’ 4.18 (1H, d, J= 7.3 Hz) 2’’’ 3.00 (m) 3’’’ 3.15 (m) 4’’’ 3.28 (m) 5’’’ 3.00 (1H, m, H-5’’’a) 3.7 (1H, m, H-5’’’b) 7.02 (1H, d, J= 8.5 Hz) 6.64 (1H, d, J= 8.5 Hz) 6.64 (1H, d, J= 8.5 Hz) 7.02 (1H, d, J= 8.5 Hz) 6.19 (1H, d, J= 2.0 Hz) 5.91 (1H, d, J= 2.0 Hz) 3.35 (overlap) 2.78 (2H, t, J= 7.0 Hz) 4.89 (1H, d, J= 7.5 Hz) 3.30 (overlap) 3.30 (overlap) 3.30 (overlap) 3.54 (m) 3.61 (1H, m, H-6’’a) 3.96 (1H, d, J= 1.0 Hz, H- 6’’b) 4.18 (1H, d, J= 7.5 Hz) 2.76 - 3.12 (m) 3.14 - 3.16 (m) 3.26 3.28 (overlap) 3.00 (1H, m, H-5’’’a) 3.69 (1H, m, H-5’’’b)

4.1.11. Hợp chất TM8 (phlorizin)

Hợp chất TM8 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 106 – 1080C. Phân tích dữ kiện phổ một chiều 1H, 13C-NMR và DEPT cho thấy hợp chất TM8 là một chalcone glycoside. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất TM8 xuất hiện tín hiệu của 21 carbon bao gồm 6 carbon methine thơm (C 95.4-130.4 ppm), 5 carbon methine của đường (C 71.0-102.0 ppm), 2 carbon methylene bão hòa [C-α (C 46.9), và C-β (C 30.7)], 1 carbon methylene của đường (C 62.4 ppm), 6 carbon bậc không liên kết với hydro của vòng thơm (C 106.8-167.6 ppm), và một nhóm carbonyl (C 206.7 ppm). Các dữ kiện phổ này cho thấy có sự tương đồng với dữ kiện phổ của hợp chất TM33. Tuy nhiên, hợp chất TM8 có số ít hơn 5 nguyên tử carbon so với hợp chất TM33, gợi ý cho ta hợp chất TM8 chỉ có 1 phân tử đường glucose gắn vào khung chalcone. Điều này một lần nữa được khẳng định khi trên phổ HMBC chỉ xuất hiện 1 tín hiệu proton anomeric H ppm 4.94 (overlap) tương tác với nguyên tử carbon C-2’ (C 162.4 ppm). Trên phổ proton 1H-NMR của hợp chất TM8 cũng cho các tín hiệu cộng hưởng tương đương với tín hiệu cộng hưởng của hợp chất TM33. Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo được công bố, hợp chất TM8 được xác định là Phloretin-2’-O-β-D glucopyranoside (phlorizin) [84].

Hình 4.1.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất phlorizin

Bảng 4.1.11. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM8 và chất tham khảo

TM8 (DMSO-d6) H (ppm) H (ppm) C (ppm)

TT Vị trí C 1 2 3 4 5 6 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ Phlorizin [84] (DMSO-d6) C (ppm) 131.5 129.1 114.9 155.2 114.9 129.1 105.1 160.8 94.3 165.3 96.8 164.4 7.03 (1H, d, J= 8.4 Hz) 6.64 (1H, d, J= 8.4 Hz) 6.64 (1H, d, J= 8.4 Hz) 7.03 (1H, d, J= 8.4 Hz) 6.13 (1H, d, J= 2.1 Hz) 5.93 (1H, d, J= 2.1 Hz) 7.01 (1H, d, J= 8.5 Hz) 6.63 (1H, d, J= 8.5 Hz) 6.63 (1H, d, J= 8.5 Hz) 7.01 (1H, d, J= 8.5 Hz) 6.12 (1H, d, J= 2.2 Hz) 5.90 (1H, d, J= 2.2 Hz) 133.9 130.4 116.1 156.4 116.1 130.4 106.8 162.4 95.4 167.6 98.4 165.9

7’ α β 1’’ 2’’ 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ 3.2 – 3.73 (2H, m) 2.79 (2H, t, J= 7.3 Hz) 4.93 (1H, d, J= 7.3 Hz) 4.58 – 5.27 (m) 4.58 – 5.27 (m) 4.58 – 5.27 (m) 4.58 – 5.27 (m) 3.2 – 3.73 (m) 204.7 44.9 28.9 100.8 73.2 76.7 69.4 77.2 60.5 3.2 – 3.8 (2H, m) 2.82 (2H, t, J= 7.5 Hz) 4.94 (overlap) 4.6 – 5.0 (overlap) 4.6 – 5.0 (overlap) 4.7 – 5.0 (overlap) 4.7 – 5.0 (overlap) 3.2 – 3.8 (m) 206.7 46.9 30.7 102.0 74.7 78.4 71.0 78.4 62.4

4.1.12. Hợp chất TM37 (2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone)

Hợp chất TM37 phân lập được ở dạng tinh thể hình kim màu đỏ cam, điểm

nóng chảy ở ở 121-1230C.

Trên phổ 13C-NMR xuất hiện 17 tín hiệu cộng hưởng của 17 nguyên tử carbon. Trong đó có 12 tín hiệu cộng hưởng có độ chuyển dịch hóa học nằm trong vùng thơm (δC 100 – 160 ppm), điều này gợi ý cấu trúc hóa học của hợp chất TM37 có 2 vòng thơm, 2 cặp tín hiệu cộng hưởng tại δC 130.4 và 129.3 ppm, chứng tỏ có 2 cặp nguyên tử carbon tương đương. Trên phổ DEPT cho thấy, có 2 nhóm oxymethyl (-OCH3) tại δC 60.9 và 56.5 ppm, 7 carbon không liên kết với hydro trong đó có 1 nhóm carbonyl tại δC 194.4 ppm, 8 nhóm methine (-CH).

Trên phổ 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 4 proton chia làm 2 cặp tương đương nhau có độ chuyển dịch hóa học tại δH (ppm) 7.64 – 7.66 (2H, m, H- 2,H-6) và 7.41 – 7.45 (2H, m, H-3, H-5). Một tín hiệu singlet tại δH (ppm) 6.01 (1H, s, H-5’) gợi ý vòng A bị thế ở 5 vị trí. Đặc biệt trên phổ 1H-NMR có sự tương tác của 1 cặp proton có độ chuyển dịch hóa học tại δH (ppm) 7.92 (1H, d, J= 16.0 Hz) và 7.73 (1H, d, J= 16.0 Hz) gợi ý cho ta 1 cầu nối 2 vòng thơm có dạng trans vinyl (α, β – keton không no). Kết hợp với phổ HSQC và HMBC có thể xác định vị trí C- α và C- β ứng với độ chuyển dịch hóa học là δH (ppm) 7.92 (1H, d, J= 16.0 Hz, H- α) và 7.73 (1H, d, J= 16.0 Hz, H- β).

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất

TM37 được xác định là 2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone [85].

Hình 4.1.12. Cấu trúc hợp chất 2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone

Bảng 4.1.12. Dữ liệu phổ của hợp chất TM37 và chất tham khảo

TT TM37 (CD3OD-d4)

δH (ppm)

7.35 – 7.65 (1H, m) 7.35 – 7.65 (1H, m) 7.35 – 7.65 (1H, m) 7.35 – 7.65 (1H, m) 7.35 – 7.65 (1H, m)

Vị trí C 1 2 3 4 5 6 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ α 2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone [85] (CDCl3) δC (ppm) 135.6 128.8 128.5 126.9 128.5 128.8 104.4 151.0 128.1 163.1 92.9 158.4 130.2 δC (ppm) 136.8 130.4 129.3 131.2 129.3 130.4 106.9 158.7 130.0 160.5 92.2 160.2 128.8

β 143.3 143.2

7’ MeO-3’ MeO-4’ 6.36 (1H, s) 7.9 (1H, d, J= 16.0 Hz) 7.81 (1H, d, J= 16.0 Hz) 3.93 (3H, s) 3.96 (3H, s) 192.4 61.4 55.9 δH (ppm) - 7.64 – 7.66 (1H, m) 7.41 – 7.45 (1H, m) 7.41 – 7.45 (1H, m) 7.41 – 7.45 (1H, m) 7.64 – 7.66 (1H, m) - - - - 6.09 (1H, s) - 7.92 (1H, d, J= 16.0 Hz) 7.73 (1H, d, J= 16.0 Hz) - 3.92 (3H, s) 3.80 (3H, s) 194.4 60.9 56.5

4.1.13. Hợp chất TM24 (ursolic acid)

Hợp chất TM24 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy ở 279

– 2810C

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 30

nguyên tử carbon đặc trưng của 1 triterpenoid, bao gồm 7 nhóm methyl (-CH3), 9

nhóm methylene (-CH2), 7 nhóm methine (-CH) và 7 carbon không liên kết với hydro.

trong đó có 1 tín hiệu đặc trưng của carbon carboxyl tại độ chuyển dịch hóa học δC

180.04 ppm và 2 carbon olefin tại độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 126.1 và 139.7.

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 1 proton olefine có độ

chuyển dịch hóa học tại δH (ppm) 5.52 (1H, br s), sáu tín hiệu của nhóm methyl lần

lượt 1.27 (3H, s); 1.01 (3H, s); 0.91 (3H, s); 1.03 (3H, s); 1.25 (3H, s); 0.99 (3H, br s)

và 0.91 (3H, br s) cùng với 1 proton của 1 nhóm oxymethine tại δH (ppm) 3.49 (1H,

m). Từ dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR gợi ý hợp chất TM24 là một triterpene acid

có cấu trúc khung ursan.

Trên phổ HMBC, các tương tác giữa H-24 (δH 1.01) với C-3 (δC 78.6), C4 (δC

39.8) và C-5 (δC 56.3) đã chứng minh nhóm hydroxy liên kết với C-3. Các tương tác

giữa H-27 (δH 1.25) với C-8 (δC 40.4), C-13 (δC 139.7), C-14 (δC 43.0) và C-15 (δC

29.2); Giữa H-12 (δH 5.52) với C-9 (δC 48.5), C-14 (δC 43.0) và C-18 (δC 54.0) đã

khẳng định liên kết đôi tại vị trí C-12 và C-13.

Từ những dữ kiện phổ kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo đã công bố, hợp

chất TM24 được xác định chính là ursolic acid [86].

Hình 4.1.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất ursolic acid

Bảng 4.1.13. Dữ liệu phổ của hợp chất TM24 và chất tham khảo

Ursolic acid [86] (pyridin-d5) Vị trí C δH (ppm) δH (ppm)

δC (ppm) 39.8 28.6 78.6 Chất TM24 (pyrindin-d5) δC (ppm) 38.6 28.2 78.6 3.49 (1H, m) 1 2 3

3.48 (1H, dd, J = 9.5, 6.5 Hz) 5.52 (1H, br s) 39.5 56.3 19.2 34.0 40.4 48.2 37.7 24.1 126.1 5.52 (1H, br s) 39.8 56.3 19.2 34.0 40.4 48.5 37.8 23.3 126.1 4 5 6 7 8 9 10 11 12

139.7 43.0 29.1 139.7 43.0 29.2 13 14 15 1.2 (1H, m, H-15a) 2.33 (1H, t, H-15b)

1.23 (1H, m, H-15a) 2.35 (1H, dt, J= 4.3, 11.5 Hz, H-15b) 25.4 25.4 16

2.66 (1H, d, J= 11.0 Hz) 1.27 (3H, s) 1.01 (3H, s) 0.91 (3H, s) 1.03 (3H, s) 1.25 (3H, s) 0.99 (3H, d, J= 7.5 Hz) 0.91 (3H, d, J= 7.5 Hz) 48.5 54.0 39.9 39.8 31.5 37.9 29.3 17.0 16.1 17.9 24.4 180.04 18.0 21.9

17 48.1 18 2.67 (1H, d, J= 11.6 Hz) 54.0 19 39.9 20 39.9 21 31.5 22 37.8 23 29.3 1.28 (3H, s) 24 17.0 1.05 (3H, s) 25 16.1 0.92 (3H, s) 26 17.5 1.08 (3H, s) 27 24.1 1.27 (3H, s) 28 180.0 18.0 29 1.03 (3H, d, J= 7.6 Hz) 21.9 0.98 (3H, d, J= 7.6 Hz) 30 4.1.14. Hợp chất TM23 (23-hydroxy ursolic acid)

Hợp chất TM23 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 280

– 2820C.

Các dữ kiện phổ 13C-NMR và 1H-NMR cho thấy có sự tương đồng về cấu trúc

hóa học giữa hợp chất TM23 và TM24 (ursolic acid). Trên phổ 13C-NMR của TM23

cho tín hiệu cộng hưởng của 30 nguyên tử carbon đặc trưng của 1 triterpenoid. Trong

đó có 6 nhóm methyl (-CH3), 9 nhóm methylene (-CH2), 8 nhóm methine (-CH) và 7

carbon không liên kết với hydro trong đó có 1 tín hiệu đặc trưng của carbon carboxyl

tại độ chuyển dịch hóa học δC 180 ppm và 2 carbon olefin tại độ chuyển dịch hóa học

δC (ppm) 126.1 và 139.7.

Trên phổ 1H-NMR cũng xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 1 proton olefin có

độ chuyển dịch hóa học tại δH (ppm) 5.51 (1H, br s), tuy nhiên chỉ có sáu tín hiệu của

nhóm methyl lần lượt 1.07 (3H, s); 0.97 (3H, s); 1.06 (3H, s); 1.16 (3H, s); 0.97 (3H,

br s) và 0.95 (3H, br s) chứng tỏ 1 nhóm methyl đã bị thế bới 1 nhóm thế khác. Trên

phổ 1H-NMR chỉ ra tín hiệu cộng hưởng của 3 proton oxymethine tại δH (ppm) 4.21

13C-NMR gợi ý hợp chất TM23 cũng là một triterpene acid có cấu trúc khung ursan và

(1H, m, H-3), 4.21 (1H, d, H-23a) và 3.74 (1H, d, H-23b). Từ dữ kiện phổ 1H-NMR và

tại vị trí C-23, một proton đã bị thay thế bởi 1 nhóm hydroxyl. Phổ HMBC của TM23

cũng cho thấy các tương tác tương đồng với hợp chất TM24 (ursolic acid)

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất

TM23 được xác định có tên là 23-hydroxy ursolic acid [87].

Hình 4.1.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất 23-hydroxyursolic acid

Bảng 4.1.14. Dữ liệu phổ của hợp chất TM23 và chất tham khảo

Chất TM23 (pyridin-d5) Vị trí C 23-hydroxyursolic acid [87] (DMSO-d6)

δH (ppm) δH (ppm)

1 2 3 δC (ppm) 38.4 27.2 78.0 4.21 (1H, m) δC (ppm) 39.9 28.2 73.9

4 5 6 7 8 9 10 11 12 4.22 (1H, dd, J= 9.6, 6.0 Hz) 5.48 (1H, s) 42.4 48.0 18.1 30.6 39.5 47.5 36.6 23.2 124.5 5.51 (1H, s) 43.4 49.0 19.0 30.6 40.5 48.5 37.6 24.1 126.1

139.7 43.0 28.2 24.4 48.5 53.1 39.9 39.2 37.6 33.7 68.3 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2.33 (1H, t, H-15b) 2.64 (1H, J= 11.5 Hz) 4.21 (1H, d, H-23a) 3.74 (1H, d, H-23b)

24 138.4 42.0 28.2 2.35 (1H, t, H-15b) 24.5 47.5 2.67 (1H, d, J= 11.6 Hz) 53.1 39.0 38.9 37.0 32.8 64.6 4.18 (1H, d, J= 10.4 Hz, H-23a) 3.72 (1H, d, J= 10.4 Hz, H-23b) 1.04 (3H, s) 12.7 1.07 (3H, s) 13.6

0.96 (3H, s) 1.06 (3H, s) 1.17 (3H, s) 0.98 (3H, d, J= 6.4 Hz) 0.92 (3H, d, J= 6.4 Hz) 15.7 17.1 23.4 178.5 17.1 20.9 0.97 (3H, s) 1.06 (3H, s) 1.16 (3H, s) 0.97 (3H, d, J= 6.5 Hz) 0.95 (3H, d, J= 6.5 Hz) 16.6 18.0 24.1 180.0 18.0 21.9

25 26 27 28 29 30 4.1.15. Hợp chất TM20 (pomolic acid)

Hợp chất TM20 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng. Điểm nóng chảy ở 301 -

3030C

Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất TM20 cho các tín hiệu tương đồng với hợp chất TM24 (ursolic acid), chứng tỏ hợp chất này có bộ khung tương tự với cấu

trúc của ursolic acid. Tuy nhiên dữ kiện phổ của hợp chất TM20 cũng có một số điểm khác với hợp chất TM24 cụ thể như trên phổ 13C-NMR xuất hiện thêm tín hiệu của 1 carbon không liên kết với hydro thay thế cho 1 tín hiệu của carbon nhóm methine có độ chuyển dịch hóa học δC 72.7 ppm, chứng tỏ đã có 1 nhóm hydroxyl đã thay thế 1 proton ở vị trí này. Vị trí carbon này chính là C-19, điều này đã được chứng minh bằng phổ 2 chiều HMBC qua các tương tác H-29 (δC 1.28) và C-18 (δC 53.2), C-19 (δC 71.7) và C- 20 (δC 41.4).

Từ các dữ liệu phổ kết hợp với tài liệu tham khảo đã được công bố, hợp chất

TM20 được xác định có tên là pomolic acid [88].

Hình 4.1.15: Cấu trúc hóa học của hợp chất pomolic acid

Bảng 4.1.15. Dữ liệu phổ của hợp chất TM20 và chất tham khảo

Pomolic acid [88] (Pyridine-d5 ) Vị trí C δH (ppm) δH (ppm) Chất TM20 (CD3OD+CDCl3) δC (ppm)

39.3 28.0 78.2 δC (ppm) 39.4 28.1 78.2 1 2 3

3.44 (1H, dd, J= 10.8, 5.5 Hz) 3.40 (1H, dd, J=10.5, 5.0 Hz) 39.4 39.4 4

5 6 7 8 9 10 11 12 5.4 (1H, m) 55.8 18.5 33.4 40.1 47.9 37.5 24.0 128.0 5.34 (1H, m) 55.9 18.9 33.6 40.3 47.8 37.3 24.0 128.5

13 14 15 16 140.0 42.1 29.2 26.4 138.5 42.1 29.3 26.4

3.10 (1H, td, J = 12.6, 4.4 Hz) 3.06 (1H, s) 5.09 (1H, s. –OH) 1.20 (3H, s) 1.01 (3H, s) 0.91 (3H, s) 1.1 (3H, s) 1,72 (3H, s) 1,44 (3H, s) 1,1 (3H, d, J = 6.4 Hz) 48.2 54.5 71.8 42.0 26.6 37.0 28.8 16.4 16.5 17.2 24.8 180.0 27.2 16.5 3.12 (1H, td, J=12.8, 4.4 Hz) 3.02 (1H, s) 5.12 (1H, s, -OH) 1.22 (3H, s) 1.01 (3H, s) 0.9 (3H, s) 1.11 (3H, s) 1.70 (3H, s) 1.42 (3H, s) 1.09 (3H, d, J= 6.5 Hz) 48.4 54.6 72.7 42.4 26.9 37.3 28.8 16.8 16.5 17.4 24.7 180.8 27.1 16.0

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 4.1.16. Hợp chất TM22 (euscaphic acid)

Hợp chất TM22 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy ở

278 – 2800C

Cũng giống như TM20, hợp chất TM22 cũng có các tín hiệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR tương tự như hợp chất TM24 (ursolic acid). Trên phổ 1H-NMR xuất hiện 1 tín hiệu proton olefin tại δH (ppm) 5.12 (1H, br s) và bảy nhóm methyl lần lượt 1.04 (3H, s); 0.69 (3H, s); 0.82 (3H, s); 1.97 (3H, s); 1.45 (3H, s); 1.28 (3H, br s) và 0.98 (3H, br s). Trên phổ 13C-NMR cũng chỉ ra tín hiệu của 30 nguyên tử carbon trong đó có 1 carbon carboxyl δC 179.2 ppm, 2 carbon olefin C-12 và C-13 được xác định qua các tương tác trên phổ 2 chiều HMBC có độ chuyển dịch hóa học lần lượt tại δC (ppm) 126.9 và 138.8. Đây cũng là 1 triterpen acid khung ursan. Tuy nhiên so với hợp chất

TM24, hợp chất TM22 xuất hiện thêm 2 nhóm thế hydroxyl tại các vị trí là C-19 và C- 2. Vị trí nhóm thế hydroxyl tại C-19 được thể hiện trên phổ HMBC qua các tương tác

H-29 (δC 1.28) và C-18 (δC 53.2), C-19 (δC 71.7) và C-20 (δC 41.4). Vị trí nhóm thế

hydroxyl tại C-2 được thể hiện trên phổ HMBC qua các tương tác H-1 (δH 1.28) H-3 (δH 3.75) và C-2 (δC 64.9).

Từ các dữ liệu phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất

TM22 được xác định có tên là euscaphic acid [89].

Hình 4.1.16. Cấu trúc hóa học hợp cất euscaphic acid

Bảng 4.1.16. Dữ liệu phổ của hợp chất TM22 và chất tham khảo

Vị trí C Euscaphic acid (pyridin-d5) [89] δH (ppm) δH (ppm)

δC (ppm) 42.0 66.7 Chất TM22 (CD3OD) δC (ppm) 40.2 64.9 1 2

4,27 (1H, dt, J= 10.0, 3.5 Hz) 3.72 (1H, d, J= 2.5 Hz) 79.6 76.9 3

5.55 (1H, br s) 39.0 48.8 18.8 33.6 40.8 47.8 39.4 24.2 128.6 4.28 (1H, d, J= 9.5 Hz) 3.75 (1H, d, J= 2.5 Hz) 5.52 (1H, br s) 38.6 46.9 16.1 32.7 39.7 46.7 39.1 23.1 126.9 4 5 6 7 8 9 10 11 12

138.9 42.2 29.2 2.33 (m) 138.8 41.1 28.2 13 14 15

26.9 25.1 16

2.29 (1H, ddd, J= 13.5, 13.0, 4.5 Hz) 3.11 (1H, ddd, J = 13.5, 13.0, 4.5 Hz) 3.01 (1H, s) 48.7 54.8 2.97 (1H, dd, J= 13.0, 4.5 Hz) 2.96 (1H, s) 46.7 53.2 17 18

73.3 42.6 26.3 38.7 28.7 16.4 16.4 17.2 24.5 183.8 26.7 16.2 1.04 (3H, s) 0.69 (3H, s) 0.82 (3H, s) 0.97 (3H, s) 1.45 (3H, s) 1.28 (3H, s) 0.98 (3H, s) 71.7 41.4 23.9 36.6 28.1 16.1 16.1 16.5 23.1 179.2 24.2 15.1 1.22 (3H, s) 0.85 (3H, s) 0.94 (3H, s) 1.05 (3H, s) 1.59 (3H, s) 1.38 (3H, s) 1.07 (3H, d, J= 6.0 Hz)

19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 4.1.17. Hợp chất TM25 (maslinic acid)

Hợp chất TM25 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy ở 267 –

2700C.

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện 1 tín hiệu proton olefin tại δH (ppm) 5.46 (1H, br s) và bảy nhóm methyl lần lượt 1.2 (3H, s); 1.1 (3H, s); 0.93 (3H, s); 0.92 (3H, s); 1.17 (3H, s); 0.87 (3H, br s) và 0.99 (3H, br s). Phổ 13C-NMR cùng phổ DEPT chỉ ra tín hiệu của 30 nguyên tử carbon, bao gồm 7 carbon nhóm methyl có độ chuyển dịch lần lượt tại δC (ppm) 28.0 (C-23); 17.3 (C-24); 16.6 (C-25); 17.5 (C-26); 25.2 (C-27); 32.2 (C-29)

và 23.8 (C-30); 10 carbon methylene có độ chuyển dịch lần lượt tại δC (ppm) 48.0 (C-1); 18.2 (C-6); 32.2 (C-7); 23.5 (C-11); 28.8 (C-15); 23.2 (C-16); 46.8 (C-19); 34.7 (C-21); 33.5 (C-22); sáu carbon methine tại δC (ppm) 68.2 (C-2); 82.4 (C-3); 47.1 (C-9); 122.2 (C-12); 144.4 (C-13) và 42.3 (C-18); còn lại là 8 nguyên tử carbon không liên kết với hydro trong có có 1 nguyên tử carbon carboxylic tại δC (ppm) 179,8 (C-28). Hai nguyên tử carbon olefin δC (ppm) 122.2 (C-12); 144.4 (C-13), gợi ý TM25 là 1 triterpen có khung olenane.

Các tương tác HMBC giữa hai nhóm methyl tại H-23 (H 1.2)/H-24 (H 1.1) và

C-3 (δC 82.4); giữa H-3 (H 3.34) và C-2 (C 68.2) xác định vị trí hai nhóm hydroxyl

tại C-2 và C-3. Các tương tác HMBC giữa hai nhóm methyl H-29 (H 0.87)/H-30 (H

0.99) và C-19 (δC 46.8)/C-20 (δC 31.2)/C-21 (δC 34.7) xác định vị trí của hai nhóm methyl này tại C-20. Các tương tác HMBC giữa H-27 (δH 1.17) và C-8 (δC 38.6)/C- 13 (δC 144.4)/C-14 (δC 41.1)/C-15 (δC 28.8) đã chứng minh vị trí của liên kết đôi tại C-12 và C-13.

Từ các dữ kiện phổ kết hợp với tài liệu tham khảo đã được công bố, hợp chất

TM25 được xác định là maslinic acid [90].

Hình 4.1.17. Cấu trúc hóa học hợp chất maslinic acid

Bảng 4.1.17. Dữ liệu phổ của hợp chất TM25 và chất tham khảo

Maslinic acid (CDCl3) [90] Vị trí C δH (ppm) δH (ppm)

1 2 δC (ppm) 47.3 68.0 Chất TM25 (pyridin-d5) δC (ppm) 48.0 68.2

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 4.09 (1H, ddd, J= 11.4, 9.0, 4.4 Hz) 3.39 (1H, d, J= 9.0 Hz) 5.46 (1H, br s) 83.2 39.4 55.4 18.4 32.8 39.3 47.7 38.0 23.5 121.7 4.03 (1H, ddd, J= 11.0, 9.5, 4.0 Hz) 3.34 (1H, d, J=9.5 Hz) 5.46 (1H, br s) 82.4 39.6 55.0 18.2 32.2 38.6 47.1 38.3 23.5 122.2

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 144.4 41.7 27.8 23.3 46.2 2.57 (1H, d, J=11.5 Hz) 41.5 46.0 30.5 33.8 32.7 28.9 1.26 (3H, s) 17.1 1.07 (3H, s) 16.4 0.99 (3H, s) 17.2 0.98 (3H, s) 25.7 1.25 (3H, s) 179.0 2.52 (1H, d, J= 11,5 Hz) 1.2 (3H, s) 1.1 (3H, s) 0.93 (3H, s) 0.92 (3H, s) 1.17 (3H, s) 144.4 41.1 28.8 23.2 45.9 42.3 46.8 31.2 34.7 33.5 28.0 17.3 16.6 17.5 25.2 179.8

32.8 23.3 0.87 (3H, s) 0.99 (3H, s) 32.2 23.8 0.93 (3H, s) 1.01 (3H, s)

29 30 4.1.18. Hợp chất TM12 (gallic acid)

Hợp chất TM12 phân lập được dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng, điểm

nóng chảy 237-2390C.

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện duy nhất 1 tín hiệu singlet của vòng thơm tại độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 7.08 (2H, s), điều này gợi ý hợp chất TM12 có chứa 1 vòng thơm bị thế ở 4 vị trí đối xứng nhau đôi qua 1 trục đối xứng.

Trên phổ 13C-NMR xuất hiện 6 tín hiệu cộng hưởng của 6 nguyên tử thuộc vòng thơm, trong đó gồm 2 nhóm methine (-CH) và 5 carbon không liên kết với hydro.

Trong đó, 1 tín hiệu cộng hưởng của nguyên tử carbon bậc 4 thuộc nhóm carboxyl có độ chuyển dịch hóa học tại δC (ppm) 170.4, (C-7). Tín hiệu cộng hưởng có cường độ pic cao hơn của 2 nhóm methine (-CH) và của 2 cặp carbon không liên kết với hydro đối xứng nhau đôi một có độ chuyển dịch hóa học lần lượt tại δC (ppm) 110.3 (C-2, C- 6) và 146.3 (C-3, C-5). Điều này một lần nữa khẳng định cấu trúc hóa học của hợp

chất TM12 gồm 4 nguyên tử carbon có tính chất đối xứng trục và có 1 nhóm carboxyl

trong phân tử.

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã được công bố,

hợp chất TM12 được xác định có tên là gallic acid [91].

Hình 4.1.18. Cấu trúc hóa học hợp chất gallic acid

Bảng 4.1.18. Dữ liệu phổ của chất TM12 và chất tham khảo

Vị trí C Gallic acid [91] (CD3OD) TM12 (CD3OD)

δH (ppm) δH (ppm)

6.91 (1H) 6.91 (1H) 1 2 3 4 5 6 7 δC (ppm) 121.0 109.0 145.0 138.3 145.0 109.0 168.0 7.08 (1H,s) 7.08 (1H,s) δC (ppm) 122.0 110.3 146.3 139.5 146.3 110.3 170.4

4.1.19. Hợp chất TM13 (methyl gallate)

Hợp chất TM13 phân lập được dưới dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy

ở 201 – 203 0C.

Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy hợp chất TM13 có nhiều tín hiệu tương đồng với hợp chất TM12 cụ thể như trên phổ 1H-NMR đều xuất hiện tín hiệu cộng hưởng tại khoảng δH (ppm) 7.1 (1H, s), trên phổ 13C-NMR xuất hiện tổng cộng 8 tín hiệu nguyên tử carbon trong đó có 1 tín hiệu đặc trưng của nhóm carboxyl δC (ppm) 170.4, (C-7), 4 tín hiệu carbon gồm 2 carbon methine (-CH) và 2 cặp carbon không liên kết với hydro có tính chất đối xứng đôi một có độ chuyển dịch hóa học lần

lượt tại δC (ppm) 110.3 (C-2, C-6) và 144.9 (C-3, C-5).

Ngoài các tín hiệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân tương đồng giữa TM13 và

TM12 nêu trên thì trên phổ NMR của hợp chất TM13 còn có một số tín hiệu khác cụ thể như trên phổ 1H-NMR của TM13 còn xuất hiện 1 tín hiệu singlet có độ chuyển dịch hóa học tại δH (ppm) 3.32 (3H,s), đây có thể là tín hiệu cộng hưởng của 3 proton thuộc nhóm oxymethyl (-OCH3). Ngoài ra trên phổ 13C-NMR của TM13 còn xuất hiện thêm 1 tín hiệu cộng hưởng so với TM12 tại độ chuyển dịch hóa học δC 49.8 ppm, một lần nữa khẳng định đây chính là tín hiệu cộng hưởng của carbon thuộc nhóm -(OCH3)

Từ các dữ kiện phổ kết hợp với so sánh tài liệu đã dược công bố, hợp chất

TM13 được xác định là methyl gallate [92].

Hình 4.1.19. Cấu trúc hóa học hợp chất methyl gallate Bảng 4.1.19. Dữ liệu phổ của chất TM13 và chất tham khảo

Vị trí C Methyl gallate [92] (CD3OD) TM13 (CD3OD)

δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm)

6.91 (1H) 6.91 (1H) 3.4 (3H, s) 121.0 109.0 145.9 138.3 145.9 109.0 168.0 48.5 7.10 (1H,s) 7.08 (1H,s) 3.32 (3H,s) δC (ppm) 121.5 110.3 145.9 139.3 145.9 110.3 170.5 49.8 1 2 3 4 5 6 7 O-CH3

4.1.20. Hợp chất TM3 (protocatechuic acid)

Hợp chất TM3 phân lập được dưới dạng chất rắn màu nâu, điểm nóng chảy ở

220 – 222 0C.

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện 3 tín hiệu singlet của vòng thơm tại độ chuyển dịch hóa học lần lượt là δH (ppm) 7.53 (1H, br s), 7.47 (1H, d, J= 8.0 Hz) và 6.82 (1H, d, J= 8.0 Hz), điều này gợi ý hợp chất TM3 là 1 phenolic đơn giản cấu trúc hóa học có chứa 1

vòng thơm bị thế ở 3 vị trí trên vòng thơm. 3 nhóm methine (-CH) còn lại thì trong đó có 2 carbon ở vị trí octo của nhau (thông qua tương tác 2 proton có hằng số Jocto = 8.0 Hz) và nguyên tử carbon còn lại trí meta và para so với 2 carbon nêu trên.

Trên phổ 13C-NMR xuất hiện 7 tín hiệu cộng hưởng của 7 nguyên tử thuộc vòng thơm gồm 3 nhóm methine (-CH) của vòng thơm có độ chuyển dịch hóa học lần lượt là δC (ppm) 114.5 (C-2), 116.6 (C-5), 122.8 (C-6) và 4 carbon không liên kết với hydro, trrong đó 1 tín hiệu cộng hưởng của nguyên tử carbon không liên kết hydro thuộc nhóm carboxyl có độ chuyển dịch hóa học tại δC (ppm) 175.7, (C-7). Ba tín hiệu cộng hưởng carbon không liên kết hydro còn lại có độ chuyển dịch hóa học lần lượt tại δC (ppm) 122.0 (C-1), 144.4 (C-3) và 149.8 (C-4). Tại 2 vị trí C-3 và C-4 có độ chuyển dịch hóa học di chuyển về phía trường cao hơn chứng tỏ carbon tại 2 vị trí này liên kết

trực tiếp với nguyên tử oxy, gợi ý 2 nhóm thế ở đây là 2 nhóm hydroxyl (-OH).

Từ các dữ kiện phổ kết hợp với so sánh tài liệu đã dược công bố, hợp chất TM3

được xác định là protocatechuic acid [93].

Hình 4.1.20. Cấu trúc hóa học protocatechuic acid

Bảng 4.1.20. Dữ liệu phổ của chất TM3 và chất tham khảo

TM3 (CD3OD + CDCl3)

δH (ppm) δH (ppm)

Vị trí C Protocatechuic acid [93] (CD3OD) δC (ppm) 122.0 114.6 144.9 150.4 116.6 7.49 (1H, d, J=2.0 Hz) 6.8 (1H, d, J= 8.0 Hz) 1 2 3 4 5 δC (ppm) 122.0 114.5 144.4 149.8 116.6 7.53 (1H, br s) 6.82 (1H, d, J= 8.0 Hz)

122.8 6 122.8

169.0 7 7.40 (1H, dd, J= 8.0, 2.0 Hz) 7.47 (1H, d, J= 8.0 Hz) 175.7

4.1.21. Hợp chất TM9 (3-methoxy, 4-hydroxy-benzoic acid) (vanillic acid)

Hợp chất TM9 phân lập được dưới dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy ở

210 – 212 0C.

Dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất TM9 có nhiều tín hiệu tương đồng với hợp chất TM3. Tuy nhiên có một số điểm khác biệt cụ thể như trên phổ 1H- NMR của hợp chất TM9 có sự xuất hiện của 1 tín hiệu singlet tại độ chuyển dịch hóa

học δH (ppm) 3.91 (3H,s), gợi ý có 1 nhóm oxymethyl liên kết với vòng thơm. Trên phổ 13C-NMR, sự có mặt của 1 nhóm oxymethyl đã được khẳng định bởi tín hiệu cộng hưởng có độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 56.4. Nhóm oxymethyl này cũng được chứng minh là liên kết với carbon C-3 của vòng thơm, còn 1 nhóm thế hydroxyl liên kết với carbon C-4 của vòng thơm (độ chuyển dịch hóa học của C-4 của TM9 tương

đồng với TM3).

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất

TM9 được xác định là 3-methoxy, 4-hydroxy-benzoic acid còn gọi là vanillic acid [93].

Hình 4.1.21. Cấu trúc hóa học hợp chất 3-methoxy, 4-hydroxy-benzoic acid

Bảng 4.1.21. Dữ liệu phổ của chất TM9 và chất tham khảo

Vị trí C Vanillic acid [93] (CD3OD) TM9 (CD3OD)

δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm)

1 2 3 4 5 124.1 116.5 151.4 147.5 114.6 δC (ppm) 125.3 115.8 152.7 148.7 113.9

6 122.9 7.58 (1H, m) 6.84 (1H, d, J= 9.0 Hz) 7.56 (1H, m) 123.1

7.58 (1H, d, J=2.0 Hz) 6.82 (1H, d, J= 8.5 Hz) 7.54 (1H, dd, J= 8.5, 2.0 Hz) 3.89 (3H, s) 167.6 55.2 3.91 (3H,s) 170.0 56.4 7 -OCH3

4.1.22. Hợp chất TM6 (4-methyl malate)

Chất rắn TM6 thu được có dạng tinh thể hình kim màu trắng, điểm nóng chảy 128-1300C. phổ khối lượng cũng đã cho thấy các mảnh pic ion giả phân tử m/z lần lượt là 170.8 [M + Na]+; 274.2 [2M + Na – COOH]+; 300.9 [2M + Na – H2O]+ và 314.9 [2M + H2O + H]+. Tính toán được khối lượng phân tử TM6 là M = 148 g/mol

gợi ý công thức phân tử TM6 là C5H8O5

Phổ 1H-NMR của hợp chất TM6 xuất hiện tín hiệu của 6 proton tại δH 2.69

(1H, dd, J=7.5, 16.0 Hz); 2.78 (1H, dd, J= 4.5, 16.0 Hz); 4.5 (1H, dd, J= 4.5, 7.0 Hz)

và 3.76 (3H, s). Trong đó có tín hiệu bội của 3 proton ở δH 3.76 ppm, đây là tín hiệu

proton của nhóm methyl (–CH3) đứng cạnh nguyên tử oxy trong phân tử. Do oxy có

độ âm điện lớn và hút electron nên hiệu ứng che chắn của các pronton ở (-CH3) bị

giảm vì vậy tín hiệu của các proton này bị đẩy về phía trường thấp hơn. Tín hiệu phổ ở

δH 4.5 ppm có dạng doublet doublet là tín hiệu của proton ở vị trí C-2. Proton này bị 2

proton tương đương của C-3 tác động tới. 2 tín hiệu proton tại δH 2.69 và 2.78 đều cho

phổ dạng doublet doublet, 2 proton này có sự tương tác lẫn nhau và bị 1 proton ở vị trí

C-2 tác động tới. Đây chính là 2 proton của nhóm methylene (–CH2) ở vị trí C-3.

Trên phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy sự xuất hiện của 5 carbon lần

lượt xuất hiện ở tần số 39.8; 52.6; 68.6; 173.9; 175.1 ppm. Trong đó 2 tín hiệu xuất

hiện ở 173.9 ppm và 175.1 ppm là 2 carbon không liên kết với hydro của nhóm keton

(-C=O), 3 tín hiệu còn lại gồm 1 nhóm methine (–CH); 1 nhóm methylene (–CH2) và 1

nhóm methyl (–CH3).

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất

TM6 được xác định là 4-methyl malate [94].

Hình 4.1.22. Cấu trúc hóa học 4-methyl malate

Bảng 4.1.22. Dữ liệu phổ của TM6 và chất tham khảo

Chất TM6 (CDCl3)

δC (ppm) 68.6 Vị trí C 1 4-methyl malate [94] (CD3OD) δH (ppm) 4.42 (1H, br) δC (ppm) δH (ppm) 67.1

39.9 2 38.3

2.73 (1H, dd, J= 4.6, 16.3 Hz, H-2a) 2.64 (1H, dd, J= 6.5, 16.3 Hz, H-2b) 4.5 (1H, dd, J= 4.5, 7.0 Hz) 2.78 (1H, dd, J= 4.5, 16.0 Hz, H-2a) 2.69 (1H, dd, J=7.5, 16.0 Hz, H-2b)

173.9 52.6 175.1 3.65 (3H, s) 170.9 52.3 173.5 3.76 (3H, s)

3 4 -CH3 -COOH 4.1.23. Hợp chất TM1 (chlorogenic acid methyl ester)

Hợp chất TM1 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy là 99

– 1010C.

Từ dữ kiện phổ 13C-NMR và 1H-NMR có thể thấy hợp chất TM1 có chứa 1 vòng thơm với tín hiệu của 6 nhóm methine (-CH) có độ chuyển học hóa học trong khoảng δC (ppm) (116.5 – 149.4) và tín hiệu của 3 proton thuộc vòng thơm xuất hiện

tại độ chuyển dịch hóa học lần lượt là H (ppm) 7.01 (s), 6.75 (1H, d, J= 8.1 Hz) và

6.91 (1H, d, J= 8.1 Hz). Điều này gợi ý về việc vòng thơm bị thế bởi 3 vị trí.

Trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu cổng hưởng đặc trưng của 2 proton

olefin tại độ chuyển dịch H (ppm) 6.18 (1H, J= 15.9 Hz) và 6.18 (1H, J= 15.9 Hz) tương ứng với 2 tín hiệu của 2 carbon olefin trên phổ 13C-NMR (147.2, C- α ; 115.1, C- β). Hằng số tương tác J = 15.9 Hz, chứng tỏ hợp chất TM1 có cấu hình dạng trans tại vị trí nối đôi. Phổ 1H-NMR cũng cho tín hiệu cộng hưởng của 3 prton tại vùng

trường thấp tại H ppm 3.69 (3H, m), gợi ý đây là tín hiệu của 1 nhóm oxymethyl (- OCH3) liên kết vời vòng cyclohenxan. Ngoài ra trên phổ 13C-NMR cho tín hiệu cộng

hưởng của 2 nhóm carboxyl (-C=O) lần lượt tại C (ppm) 175.5 và 168.4 cùng với 6

tín hiệu carbon của vòng xyclohexan có độ chuyển dịch hóa học nằm trong vùng C

(ppm) (37.9 – 72.6). Trên phổ HMBC xuất hiện tương tác của proton anomer H (ppm)

5.22 (1H, d, J= 7.5 Hz, H-1’) và C-7 (C 168.4 ppm), chứng tỏ vòng cyclohexan được

gắn với cầu oxy tại vị trí C-1’.

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã được công bố,

hợp chất TM1 được xác định là chlorogenic acid methyl ester [95,96].

Hình 4.1.23. Cấu trúc hóa học chlorogenic acid methyl ester

Bảng 4.1.23. Dữ liệu phổ của hợp chất TM1 và chất tham khảo

TM1 (CD3OD) TT

Vị trí C Chlorogenic acid methyl ester [95,96] (CD3OD) δH (ppm) δH (ppm)

C (ppm)

C (ppm) 127.7 115.2 146.6 149.4 116.5 122.9 1 2 3 4 5 6 7.01 (s) 6.75 (1H, d, J= 8.1 Hz) 6.91 (1H, d, J= 8.1 Hz) 127.7 115.2 146.8 149.7 116.6 123.0

7.08 (1H, d, J= 1.6 Hz) 6.8 (1H, d, J= 8.1 Hz) 6.99 (1H, dd, J= 1.6, 8.1 Hz) 5.2 (1H, d, J= 6.4 Hz) 4.15 (1H, m) 6.10 (1H, J= 16.0 Hz) 6.10 (1H, J= 16.0 Hz) 3.6 (3H, s) 168.3 72.0 73.0 70.7 38.2 76.0 38.2 175.3 147.0 115.2 50.3 168.4 72.1 72.6 70.4 37.9 75.8 37.9 175.5 147.2 115.1 53.0

7 5.22 (1H, d, J= 7.5 Hz) 1’ 4.1 (1H, m) 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 6.18 (1H, J= 15.9 Hz) α 6.18 (1H, J= 15.9 Hz) β 3.69 (3H, m) -OCH3 4.1.24. Hợp chất TM18 (1-O-coumaroyl-β-D-glucopyranose)

Hợp chất TM18 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy ở

211 – 2130C.

Các dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR gợi ý cho thấy hợp chất TM18 là một phenolic glycoside. Phổ 13C-NMR cùng với phổ DEPT cho phép xác định hợp chất này có 15 nguyên tử carbon, trong đó có 6 carbon của 1 vòng thơm có độ chuyển dịch hóa học nằm trong vùng δC (ppm) 115.8 – 160.1 và 6 carbon của 1 phân tử đường có độ chuyển dịch hóa học nằm trong vùng δC (ppm) 63.0 – 94.5, các tín hiệu cộng hưởng

của phân tử đường cho phép ta nghĩ đến 1 đơn vị đường glucose; Bên cạnh đó còn có

1 tín hiệu của nguyên tử carbon carboxyl tại δC 165.3 ppm và 2 carbon olefin có độ

chuyển dịch hóa học tại 145.9 ppm và 113.5 ppm.

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện 2 tín hiệu của 4 proton đối xứng đôi một của vòng

thơm có độ chuyển dịch hóa học lần lượt là H (ppm) 7.57 (1H, d, J= 8.5 Hz, H-2’, H-

6’) và 6.8 (1H, d, J= 8.5 Hz, H-3’, H-5’). Chứng tỏ vòng thơm bị thế tại 2 vị trí là C-1’

và C-4’. Bên cạnh đó, trên phổ này còn xuất hiện 2 tín hiệu proton olefin tương tác với

nhau lần lượt tại H (ppm) 7.65 (1H, d, J= 16.0 Hz, H- α) và 6.38 (1H, d, J= 16.0 Hz,

H- β) ; Độ chuyển dịch hóa học J = 16.0 Hz, chứng tỏ cấu hình hợp chất này ở dạng

trans. Trên phổ HMBC thấy xuất hiện tương tác của proton anomeric H (ppm) 5.45

(1H, d, J= 8.0 Hz) với nguyên tử carbon C (ppm) 165.3 (C-7’). Chứng tỏ phần đường

liên kết với phần aglycon tại vị trí C-7’ và cấu tử đường ở dạng β-D-glucose.

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất

TM18 được xác định có tên là 1-O-coumaroyl-β-D-glucopyranose [97,98].

Hình 4.1.24. Cấu trúc hóa học hợp chất 1-O-coumaroyl-β-D-glucopyranose

Bảng 4.1.24. Dữ liệu phổ của hợp chất TM18 với chất tham khảo

TM18 (DMSO-d6) TT 1-O-coumaroyl-β-D-glucopyranose [97,98] (CD3OD) trí δH (ppm) δH (ppm) C (ppm) C (ppm)

94.5 75.7 94.4 76.4 Vị C 1 2

5.39 (1H, d, J= 8.0 Hz) 3.46 (1H, dd, J= 10.0, 4.0 Hz) 3.76 (1H, m) 3.33 (1H, m) 4.41 (1H, m) 4.72 (1H, m) 7.47 (1H, d, J= 8.5 Hz) 6.79 (1H, d, J= 8.5 Hz) 6.79 (1H, d, J= 8.5 Hz) 7.47 (1H, d, J= 8.5 Hz) 77.5 72.1 70.1 63.0 126.4 130.4 116.0 160.8 116.0 130.4 5.45 (1H, d, J= 8.0 Hz) 3.46 (1H, dd, J= 11.5, 5.5 Hz) 3.65 (1H, d, J= 11.5 Hz) 77.6 72.4 3.45 (1H, m) 69.5 4.55 (1H, s) 62.6 4.98 (1H, s) 124.9 130.4 7.57 (1H, d, J= 8.5 Hz) 115.8 6.8 (1H, d, J= 8.5 Hz) 160.1 115.8 6.8 (1H, d, J= 8.5 Hz) 130.4 7.57 (1H, d, J= 8.5 Hz) 3 4 5 6 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’

7’ α β 168.8 7.65 (1H, d, J= 15.0 Hz) 146.2 6.39 (1H, d, J= 15.0 Hz) 114.1 165.3 7.65 (1H, d, J= 16.0 Hz) 145.9 6.38 (1H, d, J= 16.0 Hz) 113.5

4.1.25. Hợp chất TM35 (cis-p-coumaric acid 4-O-β-D-glucopyranoside)

Hợp chất TM35 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy ở

135 - 1370C.

Tương tự như hợp chất TM18, các dữ kiện phổ cho thấy hợp chất TM35 là một phenolic glycoside. Từ phổ 13C-NMR cùng với phổ DEPT chỉ ra hợp chất TM35 có tất

cả 15 nguyên tử carbon. Trong đó có 6 carbon của vòng thơm độ chuyển dịch hóa học

trong vùng C (ppm) (117.1 – 159.2), 6 carbon của 1 cấu tử đường lần có độ chuyển

dịch hóa học lần lượt là C (ppm) 102.1; 74.9; 78.1; 71.3; 77.9 và 62.5, các tín hiệu

này gợi ý đây là các nguyên tử carbon của 1 cấu tử đường glucose. Bên cạnh đó, trên

phổ còn xuất hiện 1 tín hiệu carbon caboxyl đặc trưng có C (ppm) 173.5 và 2 carbon

olefien có độ chuyển dịch hóa học tương ứng là 137.8 ppm và 122.5 ppm.

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 4 proton của vùng thơm,

trong đó có 2 cặp proton tương đương xuất hiện tại độ chuyển dịch hóa học lần lượt tại

H (ppm) 7.6 (1H, d, J= 8.5 Hz, H-2, H-6) và 7.05 (1H, d, J= 8.5 Hz, H-3, H-5), chứng tỏ vòng thơm bị thế ở 2 vị trí C-1 và C-4. Bên cạnh đó, cũng trên phổ 1H-NMR xuất

hiện tính hiệu cộng hưởng của 2 proton olefin tương tác với nhau có H (ppm) 6.66

(1H, d, J= 12.5 Hz) và 5.92 (1H, d, J= 12.5 Hz), với hằng số tương tác J = 12.5 Hz thì

hợp chất TM35 có cấu hình dạng cis. Các proton của phân tử đường cho các tín hiệu

nằm trong vùng H (ppm) 3.39 – 3.89. Trên phổ HMBC có thấy xuất hiện tương tác

của proton anomeric 4.94 (1H, d, J= 7.5 Hz) với nguyên tử carbon C (ppm) 159.2 (C-

4). Chứng tỏ phần đường liên kết với phần aglycon tại vị trí C-4 và cấu tử đường ở

dạng β-D-glucose.

Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất

TM35 được xác định có tên là cis-p-coumaric acid 4-O-β-D-glucopyranoside [99].

Hình 4.1.25. Cấu trúc hóa học hợp chất cis-p-coumaric acid 4-O-β-D- glucopyranoside

Bảng 4.1.25. Dữ liệu phổ của hợp chất TM35 với chất tham khảo

TM35 (DMSO-d6) TT cis-p-coumaric acid 4-O-β-D- glucopyranoside [99] (CD3OD) trí δH (ppm) δH (ppm) C (ppm) C (ppm)

132.1 132.3 7.42 (1H, d, J= 8.8 Hz) 117.7 6.94 (1H, d, J= 8.8 Hz) 159.1 117.7 6.94 (1H, d, J= 8.8 Hz) 7.42 (1H, d, J= 8.8 Hz) 132.3 6.49 (1H, d, J= 12.7 Hz) 136.7 5.82 (1H, d, J= 12.7 Hz) 124.2 102.3 4.87 (1H, d, J= 7.3 Hz) 75.1 3.18 – 3.81 (m) 78.3 3.18 – 3.81 (m) 71.6 3.18 – 3.81 (m) 78.0 3.18 – 3.81 (m) 62.7 3.18 – 3.81 (m) 131.2 132.1 117.1 159.2 117.1 132.1 137.8 122.5 102.1 74.9 78.1 71.3 77.9 62.5 Vị C 1 2 3 4 5 6 7 8 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’

7.6 (1H, d, J= 8.5 Hz) 7.05 (1H, d, J= 8.5 Hz) 7.05 (1H, d, J= 8.5 Hz) 7.6 (1H, d, J= 8.5 Hz) 6.66 (1H, d, J= 12.5 Hz) 5.92 (1H, d, J= 12.5 Hz) 4.94 (1H, d, J= 7.5 Hz) 3.39 – 3.73 (m) 3.39 – 3.73 (m) 3.39 – 3.73 (m) 3.39 – 3.73 (m) 3.91 (1H, d, J= 12.0 Hz, H-6’a) 3.89 (1H, d, J= 2.0 Hz, H- 6’b) 173.5 174,8

COOH

 Các hợp chất phân lập được từ cặn chiết ethyl acetate quả táo mèo

TM2 (Quercetin) TM3 (Protocatechuic acid) TM1 (Chlorogenic acid methyl ester)

TM6 (4-methyl malate) TM5 (Hyperin) TM7 (Naringenin-7-O- β-D-glucopyranoside)

TM8 (Phlorizin) TM10 (Astilbin)

TM9 (3-methoxy, 4- hydroxy-benzoic acid)

TM15 (Chrysin) TM13 (Methyl gallate) TM12 (Gallic acid )

TM16 (Naringenin) TM18 (1-O-coumaroyl- β-D-glucopyranose)

TM17 (3S- Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside)

TM22 (Euscaphic acid) TM20 (Pomolic acid) TM23 (23-Hydroxy ursolic acid)

TM25 (Maslinic acid) TM24 (Ursolic acid)

TM30 ((2R/S)-5,7,3’,5’- tetrahydroxy-flavanone 7-O-β-D glucopyranosie)

TM33 (Phloretin-2’-O-(β-D-xylopyranosyl-(16)-O-β- D glucopyranoside)) TM35 (cis-p-coumaric acid 4-O-β-D- glucopyranoside)

TM36 (Myricitrin)

TM37 (2’,6’-dihydroxy- 3’,4’- dimethoxychalcone)

Hình 4.1.26. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ cặn chiết EtOAc quả táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne.

Nhận xét:

Từ cặn chiết ethyl acetate quả táo mèo, sử dụng các phương pháp sắc ký nghiên

cứu sinh đã phân lập được 25 hợp chất trong đó bao gồm:

+ 19 hợp chất phenolic (TM1, TM2, TM3, TM5, TM7, TM8, TM9, TM10, TM12, TM13, TM15, TM16, TM17, TM18, TM30, TM33, TM35, TM36, TM37).

Trong đó có 1 hợp chất mới tên là 3S-thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside

(TM17)

+ 5 hợp chất triterpenoid (TM20, TM22, TM23, TM24, TM25)

+ 1 dẫn xuất của axit mạch thẳng: (TM6) Trong 25 hợp chất nêu trên có 17 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài

táo mèo (Docynia indica (Wall.) Decne) là TM3, TM6, TM9, TM13, TM15, TM16,

TM17, TM18, TM20, TM22, TM23, TM24, TM25, TM30, TM35, TM36, TM37.

Có thể thấy trong cặn chiết phân đoạn ethyl actetae quả táo mèo chứa phần lớn

là các hợp chất phenolic. Điều này một lần nữa chứng minh táo mèo là loại trái cây

tiềm năng để khai thác nguồn phenolic giàu hoạt tính sinh học.

4.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết và các hợp chất phân lập được

4.2.1. Hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH) của cao chiết phân đoạn và các hợp chất

phân lập được

Hoạt tính bảo vệ tim mạch thông qua cơ chế ức chế enzyme soluble epoxide

hydrolase (sEH)) được xác định dựa trên việc phân tích huỳnh quang. Epoxide

hydrolase hòa tan (sEH, E.C. 3.3.2.10) là một enzyme thủy phân chuyển đổi axit béo

dạng epoxy thành các dạng diol tương ứng. Các axit epoxyeicosatrienoic (EET) tồn tại

dưới bốn dạng regioisome khác nhau (5,6- EET, 8,9- EET, 11,12- EET và 14,15-EET)

có nguồn gốc từ cytochrom p450 epoxygenase của axit arachidonic. Các EET này có

các hoạt động sinh học bao gồm bảo vệ mạch máu, chống viêm, chống loạn nhịp tim

và chống xơ vữa động mạch 64]. Nghiên cứu gần đây đã xác định vai trò của sEH

trong việc giảm sự tăng huyết áp, chống viêm và chống rối loạn tim mạch [65]. Các

chất ức chế sEH có thể kể đến như trans-4-[4(3-adamantan-1-ylureido)cyclohexyloxy]

axit benzoic (t-AUCB), N- (1-acetylpiperidin-4-yl) N′- (adamant) 1-yl) urê (APAU),

và 12- (3-adamantan-1-yl-ureido)-dodecanoic acid (AUDA) [64].

4.2.1.1. Đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH) của cao chiết phân đoạn

Các cao chiết phân đoạn và cặn nước được tiến hành đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch ở các mức nồng độ khác nhau lần lượt 37,5 µg/mL; 75 µg/mL và 150 µg/mL. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2.1.1.

Bảng 4.2.1.1. Đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch của các cao chiết phân đoạn

TT Phân Đoạn cao chiết Nồng độ thử (µg/mL)

n-hexan

1 2 3 4 Dichloromethane 37.5 75 150 37.5 Phần trăm ức chế I (%) - - 13.9 ± 1.2 28.0 ± 3.4

Ethyl acetate

Cặn nước

Cao tổng methanol

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 75 150 37.5 75 150 37.5 75 150 37.5 75 150 57.9 ± 0.1 83.8 ± 2.7 36.7 ± 2.5 68.7 ± 3.5 92.7 ± 1.2 25.4 ± 1.2 45.9 ± 0.2 68.4 ± 0.1 4.9 ± 0.5 12.8 ± 1.7 21.1 ± 2.2

(-): Không thể hiện hoạt tính

Kết quả bảng 4.2.1.1 cho thấy cao chiết tổng methanol và 3 cao chiết phân đoạn

là dicholoromethane, ethyl acetate và cao nước đều thể hiện hoạt tính còn cao chiết phân đoan n-hexan thì không thể hiện hoạt tính ở nồng độ 37.5 và 75 µg/mL, thể hiện

hoạt tính thấp ở nồng độ 150 µg/mL. Trong 4 phân đoạn thể hiện hoạt tính thì phân

đoạn cao chiết ethyl cetate thể hiện hoạt tính mạnh nhất, tiếp đến lần lượt là cao chiết

dichloromethane, cao nước và cao chiết tổng methanol. Kết quả đánh giá này cho thấy,

cao chiết phân đoạn ethyl acetate có chứa nhiều thành phần hóa học có tác dụng bảo vệ

tim mạch. Điều này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước đó về thành phần hóa học

cao chiết ethyl acetate. Cao chiết ethyl acetate chứa chủ yếu các hợp chất phenolic như

flavonoid, chalcone, coumarin và các triterpenoid. Đây là những nhóm chất cũng đã

được chứng minh có các tác dụng liên quan đến tim mạch. [64, 65, 100, 101].

4.2.1.2. Đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH) của các hợp chất phân lập được

Từ phân đoạn cao chiết ethylacetate của quả táo mèo, đã tiến hành phân lập và

xác định được cấu trúc của 25 hợp chất. Các hợp chất này đã được nghiên cứu, đánh

giá hoạt tính bảo vệ tim mạch ở nồng độ 100 µM. Các hợp chất thể hiện phần trăm ức chế lớn (trên 50%) sẽ tiếp tục được xác định giá trị IC50 (là nồng độ của một mẫu thử

mà tại đó nó có thể ức chế được 50% enzyme sEH). Các thử nghiệm được lặp lại 3 lần, đối chứng dương sử dụng là Auda có IC50 là 16.8 ± 0.5 nM. Kết quả đánh giá hoạt tính được thể hiện ở bảng 4.2.1.2.

Bảng 4.2.1.2. Đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch của các hợp chất phân lập được

TT Kí hiệu IC50 (µM)

Phần trăm ức chế tại nồng độ 100 µM (%) 16.8 ± 0.5 nM

1 2 đối chứng (+) Auda TM1 TM2 73.3 ± 1.1 33.0 ± 2.3 41.9 ± 1.1 NA

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 10.1 ± 0.7 72.8 ± 0.2 9.9 ± 2.2 14.0 ± 0.3 38.3 ± 1.2 >100 79.9 ± 0.4 49.1 ±0.1 42.3 ± 0.5 15.5 ± 1.1 76.8 ± 0.6 43.4 ± 1.8 23.3 ± 1.4 19.6 ± 4.4 45.2 ± 3.2 45.0 ± 0.8 74.0 ± 2.8 46.7 ± 3.0 18.0 ± 1.1 52.7 ± 0.2 - 32.1 ± 0.5 >100 NA 30.5 ± 0.1 NA NA NA 19.3 ± 2.2 22.9 ± 0.2 NA NA NA 24.7 ± 2.5 NA NA NA NA NA 36.1 ± 0.6 NA NA 88.4 ± 0.2 NA NA 10.0 ± 0.6

TM3 TM5 TM6 TM7 TM8 TM9 TM10 TM12 TM13 TM15 TM16 TM17 TM18 TM20 TM22 TM23 TM24 TM25 TM30 TM33 TM35 TM36 TM37 NA: Not available (không đánh giá)

Kết quả ở bảng 4.2.1.2 đã cho thấy trong tổng số 25 hợp chất đem thử hoạt tính

sEH thì có 8 hợp chất thể hiện hoạt tính bao gồm các chất kí hiệu là TM1, TM5,

TM8, TM10, TM16, TM24, TM33 và TM37. Giá trị IC50 (µM) của 8 hợp chất này

nằm trong khoảng từ 10.0 ± 0.6 đến 88.4 ± 0.2. Trong đó, 2 hợp chất TM9 và TM37

thể hiện hoạt tính mạnh nhất khi có các giá trị IC50 lần lượt là 19.3 ± 2.2 và 10.0 ± 0.6

µM. 6 hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính yếu hơn khi giá trị IC50 lần lượt là 22.9 ± 0.2;

24.7 ± 2.5; 30.5 ± 0.1; 36.1 ± 0.6; 41.9 ± 1.1 và 88.4 ± 0.2 µM. Có thể thấy 2 hợp chất

thể hiện hoạt tính mạnh nhất là TM9 (3-methoxy, 4-hydroxy-benzoic acid) và TM37

(2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone) là có tiềm năng cho các nghiên cứu về tim

mạch khi thể hiện hoạt tính mạnh hơn so với các hợp chất khác.

4.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được

Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ quả táo mèo được đánh

giá thông qua khả năng quét gốc tự do DPPH. Các phép thử được thực hiện 3 lần và

lấy trung bình cộng, đối chứng dương sử dụng là acid ascorbic.

Bảng 4.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được

Giá trị SC50 (µg/mL) Ký hiệu Giá trị SC50 (µg/mL) TM17 40.51 ± 0.78 26.40 ± 0.44

Ký hiệu Đối chứng (+) Ascorbic acid TM1 TM2 TM3 TM5 TM6 TM7 TM8 TM9 TM10 TM12 TM13 TM15 TM16 TM18 TM20 TM22 TM23 TM24 TM25 TM20 TM30 TM33 TM35 TM36 TM37 - - - - - - - 41.81 ± 0.45 - - 42.76 ± 2.12 29,12 ± 0.38

35.48 ± 2.02 31.37 ± 0.12 28.18 ± 1.18 29.17 ± 1.67 - 49.34 ± 1.22 - 29.11 ± 0.17 42.32 ± 0.42 18.05 ± 0.69 - 30.12 ± 0,15 33.47 ± 0,51 (-): Không thể hiện hoạt tính đến nồng độ mẫu thử 100 µg/mL

Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được từ quả táo mèo được thể hiện ở bảng 4.2.2. Trong tổng số 25 hợp chất đem thử thì có tới 14 hợp chất thể hiện hoạt tính với giá trị SC50 (µg/mL) nằm trong khoảng (18.05 ±

0.69 đến 49.34 ± 1.22). Đặc biệt trong 14 hợp chất thể hiện hoạt tính có 1 hợp chất thể

hiện hoạt tính mạnh hơn cả đối chứng dương là hợp chất TM12 (gallic acid) có giá trị SC50 là 18.05 (µg/mL). 6 hợp chất khác thể hiện hoạt tính gần tương đương với đối chứng dương bao gồm TM3, TM5, TM9, TM15, TM37 và TM2 có giá trị SC50 (µg/mL) lần lượt là 28.18 ± 1.18; 29.17 ± 1.67; 29.11 ± 0.17; 30.12 ± 0,15; 29,12 ± 0.38

và 31.37 ± 0.12. Các hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính yếu hơn đối chứng dương.

Có thể thấy rằng các hợp chất phân lập từ quả táo mèo chủ yếu là các phenolic,

và dẫn xuất của chúng, do đó các hợp chất này thể hiện hoạt tính chống oxy hóa khá

mạnh, điều này là hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu đánh giá trước đây về nhóm

hợp chất này [22,102]. Có thể thấy quả táo mèo có nhiều tiềm năng trong việc khai thác chế biến tạo ra sản phẩm có hoạt tính chống oxy hóa mạnh.

4.2.3. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư cổ tử cung (Hela) của các cao chiết phân đoạn

Các cao chiết được thử hoạt tính ức chế 2 dòng tế bào ung thư gan và ung thư

cổ tử cung bao gồm: cao chiết methanol tổng (MeOH), ethanol tổng (EtOH), cao chiết phân đoạn n-hexan, ethyl acetate (EtOAc), dichloromethane (CH2Cl2) và nước. Nghiên cứu này được thực hiện tại phòng sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất

thiên nhiên, VAST. Các thí nghiệm được thực hiện 3 lần và lấy giá trị trung bình. Chất

đối chứng sử dụng bao gồm DMSO (đối chứng âm) và paclitaxel (đối chứng dương).

Kết quả đánh giá được thể hiện ở bảng 4.2.3

Bảng 4.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế 2 dòng tế bào ung thư gan và ung thư cổ tử cung

TT Kí hiệu Tế bào Hela mẫu Tế bào Hep-G2 IC50 IC50 Nồng độ thử cao nhất

Tỷ lệ ức chế tế bào (%) 0 -

0.1% 5 µg/mL Tỷ lệ ức chế tế bào (%) 0 86.7 ± 2.4 - 0.043 µM 87.12 ± 1.2 0.045 µM

DMSO (-) Paclitaxel (+) MeOH 100 µg/mL 13.0 ± 1.1 41.6 ± 1.2 1

EtOH 100 µg/mL 31.6 ± 0.7 1.2 ± 0.4 2

n-hexan 100 µg/mL 7.8 ± 1.2 50 ± 1.7 3

100 µg/mL 32.8 ± 0.8 62.1 ± 1.1 4 CH2Cl2

EtOAc 100 µg/mL 39.4 ± 1.2 0.8 ± 0.3 5

Nước 100 µg/mL 30.1 ± 0.9 16.6 ± 0.9 6 ≥ 100 µg/mL ≥ 100 µg/mL ≥ 100 µg/mL ≥ 100 µg/mL ≥ 100 µg/mL ≥ 100 µg/mL ≥ 100 µg/mL ≥ 100 µg/mL 99,24 µg/mL 67,2 µg/mL ≥ 100 µg/mL ≥ 100 µg/mL

Kết quả đánh giá ở bảng 4.2.3 cho thấy trong 6 cao chiết phân đoạn được đánh giá thì chỉ có 2 cao chiết phân đoạn n-hexan và dicholoromethane (CH2Cl2) là thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư cổ tử cung (Hela) với giá trị IC50 lần lượt là 99.24 µg/mL và 67.2 µg/mL. Các cao chiết phân đoạn còn lại không thể hiện hoạt tính ức

chế với cả 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư cổ tử cung (Hela) ở nồng

độ mẫu thử đến 100 µg/mL. 2 cao chiết phân đoạn n-hexan và dicholoromethane

(CH2Cl2) là có tiềm năng trong nghiên cứu in vivo đối với dùng tế bào ung thư cổ tử cung Hela.

4.3. Xây dựng và tối ưu quy trình chiết xuất phenolic từ quả táo mèo quy mô phòng thí nghiệm

4.3.1. Kết quả chiết xuất táo mèo bằng phương pháp chiết soxhlet

Sau quá trình chiết soxhlet, dịch chiết táo mèo được cô quay đuổi dung môi chúng tôi thu được cao chiết táo mèo. Từ cao chiết táo mèo, tiếp tục tiến hành phân tích hàm lượng phenolic tổng và flavonoid tổng. Kết quả được cho ở bảng 4.3.1.

Bảng 4.3.1. Kết quả chiết xuất táo mèo bằng phương pháp chiết soxhlet

Tên chỉ tiêu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

Hàm lượng cao chiết tổng (%) 35.9 36.2 36.1 36.07 ± 0.13

Hàm lượng phenolic tổng 28.7 29.1 28.9 28.9 ± 0.12

(mg GAE/ g cao chiết)

Hàm lượng flavonoid tổng 20.1 19.8 20.2 20 ± 0.11

(mg QE/ g cao chiết)

Kết quả bảng 4.3.1. cho thấy, khi chiết táo mèo bằng phương pháp chiết soxhet

cho hiệu suất chiết rất cao do đây là phương pháp chiết kiệt nhất với dung môi sử dụng

là ethanol 96%. Hàm lượng cao chiết tổng thu được trung bình đạt 36.07± 0.13 %.

Hàm lượng phenolic tổng và hàm lượng flavonoid tổng cũng khá cao với giá trị trung

bình lần lượt là 28.9 ± 0.12 (mg GAE/g cao chiết) và 20 ± 0.11 (mg QE/g cao chiết).

4.3.2. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất phenolic sử dụng vi sóng quy mô

phòng thí nghiệm

4.3.2.1. Ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến hàm mục tiêu của quá trình

Bằng một số thí nghiệm khảo sát sơ bộ, chúng tôi lựa chọn điều kiện nghiên

cứu ban đầu là: Thời gian chiết 30 phút, nồng độ ethanol dung môi chiết: 60 (%, v/v),

công suất vi sóng: 400 (W) và độ pH của dung môi là 4.

a. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất chiết

Thời gian chiết được kháo sát ở các mức 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút và 50 phút, 3 thông số công nghệ còn lại được giữ ở mức cơ bản là nồng độ ethanol dung

môi chiết: 60 (%, v/v), công suất vi sóng: 400 (W) và độ pH của dung môi là 4. Kết

quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.3.2.1.a

Bảng 4.3.2.1.a. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

Y2 (mg QE/ g cao chiết) TT

1 2 3 4 5 Thời gian chiết (phút) 10 20 30 40 50 Y1 (mg GAE/g cao chiết) 22.4 27.7 30.9 32.5 32 14.8 17.3 21.8 22.5 22.2

Kết quả cho thấy hàm lượng phenolic tổng và flavonoid tổng tăng nhanh theo thời gian chiết từ 10 phút đến 30 phút. Tiếp tục tăng thời gian chiết lên 40 phút thì hàm lượng phenolic tổng và flavonoid tổng tăng nhẹ, đạt giá trị cực đại lần lượt là (32.5 mg GAE/g) và (22.5 mg QE/g). Khi thời gian chiết tăng lên đến 50 phút, giá trị hàm lượng

của cả 2 hàm Y1, Y2 đều đã giảm xuống còn 32 mg GAE/g và 22.2 mg QE/g. Điều này có thể là giải thích bởi thực tế là khi thời gian chiết vượt quá một giới hạn nhất định, một số phenolic và flavonoid sẽ phân hủy làm giảm hàm lượng của chúng. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Wang et al. (2010) trong nghiên cứu về chiết xuất polyphenol được hỗ trợ bằng lò vi sóng từ lá trà [103]. Từ các kết quả khảo sát, chúng tôi lựa chọn thời gian chiết xuất là 30 phút làm mức cơ bản cho các nghiên cứu tiếp theo để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm.

b. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết ethanol đến hiệu suất chiết

Nồng độ dung môi chiết ethanol được khảo sát ở các mức 30%, 40%, 50%, 60%, 70% và 80%. Các thông số công nghệ khác được giữ cố định là thời gian chiết: 30 phút, công suất vi sóng: 400 (W) và độ pH của dung môi là 4. Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.3.2.1.b

Bảng 4.3.2.1.b. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

TT Nồng độ ethanol (%) Y1 (mg GAE/g cao chiết) Y2 (mg QE/g cao chiết) 1 2 3 4 5 6 12.7 16.8 21.5 22.3 22.5 23.1 19.8 27.4 30.8 32.6 33.5 32.2 30 40 50 60 70 80

Kết quả cho thấy khi nồng độ ethanol tăng từ 30 - 60%, hàm lượng phenolic

tổng và flavonoid tổng tăng nhanh lần lượt từ 19.8 – 32.6 (mg GAE/g) và từ 12.7 –

22.3 (mg QE/g). Tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 70% thì hàm lượng phenolic tổng

và hàm lượng flavonoid tổng tăng nhẹ lên 33.5 (mg GAE/g) và 22.5 (mg QE/g). Ở

nồng độ ethanol 80%, hàm lượng phenolic tổng có xu hướng giảm nhẹ, trong khi

hàm lượng flavonoid tổng lại tăng nhẹ. Kết quả này có thể giải thích là khi nồng độ

ethanol tăng, sự phân cực của dung môi sẽ giảm dần đến mức phù hợp với sự phân

cực của nhóm phenolic và giúp khả năng hòa tan các phenolic dễ dàng hơn. Tuy

nhiên nếu độ phân cực của dung môi giảm thấp quá cũng sẽ làm giảm khả năng chiết

xuất và hòa tan các phenolic này dẫn dến hiệu suất chiết sẽ giảm. Các kết quả nghiên

cứu của Dent et al. (2013) cũng chỉ ra rằng sự thu hồi các hợp chất phenolic phụ

thuộc vào loại dung môi được sử dụng, tính phân cực của nó và độ hòa tan của các

hợp chất phenolic trong dung môi chiết [104]. Dựa vào kết quả khảo sát ở trên, nồng

độ ethanol 60% được lựa chọn làm mức cơ bản cho các thí nghiệm tiếp theo để xây

dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm.

c. Ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hiệu suất chiết

Công suất vi sóng được khảo sát ở các mức 80W, 240W, 400W, 560W và 720W. Các thông số công nghệ khác được giữ cố định là thời gian chiết: 30 phút, nồng độ dung môi ethanol 60% và độ pH của dung môi là 4. Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.3.2.1.c

Bảng 4.3.2.1.c. Ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

TT Công suất vi sóng (W) Y1 (mg GAE/g cao chiết) Y2 (mg QE/g cao chiết) 1 2 3 4 5 12.5 17.1 22.8 23.4 18.2 18.5 26.4 32.8 33.4 30.2 80 240 400 560 720

Kết quả cho thấy khi công suất vi sóng tăng từ 80 - 400 W, hàm lượng phenolic tổng và flavonoid tổng tăng nhanh tương ứng từ 18.5 – 32.8 (mg GAE/g) và 12.5 – 22.8 (mg QE/g). Tiếp tục để tăng công suất vi sóng tới 560 W, hàm lượng phenolic tổng và flavonoid tổng tăng nhẹ lần lượt lên 33.4 (mg GAE/g) và 23.4 (mg QE/g). Khi công suất vi sóng đạt 720W, hàm lượng phenol tổng và flavonoid tổng đều bị giảm đi còn lần lượt là 30.2 (mg GAE/g) và 18.2 (mg QE/g). Điều này có thể giải thích do công suất vi sóng có liên quan trực tiếp đến hiệu ứng nhiệt cho quá trình chiết xuất. Cụ thể, công suất vi sóng cao dẫn đến nhiệt độ cao, làm phân hủy phenolic và flavonoid, kết quả này phù hợp với kết quả được đưa ra bởi Su et al. (2018) [105]. Từ các kết quả thí nghiệm ở trên, công suất vi sóng ở 400 W được chọn là mức cơ bản cho các thí nghiệm tiếp theo để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm.

d. Ảnh hưởng của độ pH dung môi chiết đến hiệu suất chiết

Độ pH dung môi chiết được khảo sát ở các mức 2, 3, 4, 5, 6 và 7. Các thông số công nghệ khác được giữ cố định là thời gian chiết: 30 phút, nồng độ dung môi ethanol 60% và công suất vi sóng là 400W. Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.3.2.1.d

Bảng 4.3.2.1.d. Ảnh hưởng của độ pH dung môi chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

TT Độ pH dung môi chiết Y1 (mg GAE/g cao chiết) Y2 (mg QE/g cao chiết) 1 2 3 4 5 6 16.8 20.1 29.2 30.1 29.8 25.4 9.6 14.2 22.4 23.3 22.1 16.6 2 3 4 5 6 7

Kết quả cho thấy khi pH dung môi tăng từ 2 đến 4, hàm lượng phenol tổng và flavonoid tổng tăng nhanh từ 16.8 – 29.2 (mg GAE/g) và 9.6 – 22.4 (mg QE/g). Khi pH dung môi tăng lên là 5, hàm lượng phenol tổng và flavonoid tổng tăng nhẹ lên 30.1 (mg GAE/g) và 23.3 (mg QE/g). Ở pH là 6, hàm lượng phenol tổng và flavonoid tổng

100

bắt đầu giảm nhẹ. Ở pH dung môi là 7 thì hàm lượng phenolic tổng và flavonoid tổng giảm nhanh xuống còn 25.4 (mg GAE/g) và 16.6 (mg QE/g). Kết quả này cho thấy độ pH của dịch chiết dung môi ảnh hưởng đến sự ổn định của các hợp chất phenolic thực vật, ở pH cao sẽ tạo điều kiện cho các phản ứng xảy ra làm sụt giảm hàm lượng phenolic vì bản thân các phenolic có tính axit. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Friedman et al. (2000) [106]. Dựa trên kết quả thí nghiệm ở trên, pH dung môi là 4 được lựa chọn là mức cơ bản cho các thí nghiệm tiếp theo để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm.

4.3.2.2. Thiết lập mô hình và xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm

Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu Y1 và Y2, lựa chọn mô hình bậc 2 kế hoạch hóa thực nghiệm hỗn hợp trung tâm theo mô tả của Box-Willson. Các mức gốc (hay mức cơ bản), khoảng biến thiên của các yếu tố và hệ số α = 1.414 (với K= 4) được thể hiện ở bảng 4.3.2.2a

Bảng 4.3.2.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ

Tên biến, khoảng biến thiên Mức nghiên cứu

Biến thực

-1 15 40 1 45 80

Biến mã A B C D Khoảng biến thiên (Δ) 15 20 160 2 +α 0 -α 51 30 9 32 88 60 175 240 400 560 625 6.8 4 1.2 2 6 Z1: thời gian chiết (phút) Z2: Nồng độ ethanol (%) Z3: Công suất máy vi sóng (W) Z4: độ pH

Sử dụng phần mềm Design expert 7.0.0 để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 27 thí nghiệm. Các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 (mg GAE/g): Hàm lượng phenolic tổng; Y2 (mg QE/g): Hàm lượng flavonoid tổng và Y3 (%): Hàm lượng cao chiết tổng. Kết quả thí nghiệm được cho ở bảng 4.3.2.2b

Bảng 4.3.2.2b. Ma trận kế hoạch hóa thực nghiệm của quá trình chiết xuất

Biến mã hóa

Y3 (%)

Y1 (mg GAE/g) 19.2 24.9 23.8 25.5 25.4 30.5 26.2 27.4 18.6 27.1 Hàm mục tiêu Y1 (mg QE/g) 14.1 19.4 18.5 20.7 19.5 23.3 18.8 20.2 13.8 20.1 22.3 27.4 27.1 30.9 27.4 31.3 27.8 28.6 22 28.5 STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 B -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 C -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 -1 D -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 +1 +1

101

-1 11 +1 12 -1 13 +1 14 - 1 15 +1 16 -1.414 17 18 +1.414 19 20 21 22 23 24 25 26 27 -1 -1 +1 +1 +1 +1 0 0 0 0 -1.414 +1.414 0 0 0 0 0 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0 0 0 0 0 0 -1.414 +1.414 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24.8 30.5 23.6 33.6 25.5 33.2 22.3 32.4 24.2 27.6 25.6 29.4 25.6 27 28.9 31.1 31.9 18.3 28.3 17.5 24.5 19.1 22.9 17.3 25.1 18.0 20.5 19.8 21.7 19 20.9 20.6 21.4 22.2 26.6 32.4 26.9 31.6 28.8 33.2 25.5 32.6 26.6 28.9 28.2 30.1 27.8 31.3 29 29.8 30.5

+1 +1 -1 -1 +1 +1 0 0 -1.414 +1.414 0 0 0 0 0 0 0 4.3.2.3. Kiểm tra sự có nghĩa của mô hình

Sự có nghĩa của mô hình và các hệ số được tiến hành bằng việc phân tích

phương sai (ANOVA) thể hiện ở bảng 4.3.2.3

Bảng 4.3.2.3. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y1, Y2 và Y3

Y1 (mg GAE/g) Y2 (mg QE/g) Y3 (%) Nguồn

F-value p-value F-value 34.07 < 0.0001* 94.11 < 0.0001* 274.16 23.75 0.0133* 8.41 50.01 < 0.0001* 34.9 8.56 0.0264* 6.4 14.41 0.0213* 7.01 0.7584NS 1.74 0.099 15.65 0.0071* 10.50 50.02 0.0107* 9.11 0.1902NS 6.34 1.93 0.6517NS 0.19 0.21 0.2271NS 0.072 1.62 19.0 0.0142* 8.22 0.2896NS 0.64 1.23 7.28 0.0319* 5.89 p-value < 0.0001* < 0.0001* 0.0004* < 0.0001* 0.0127* 0.0025* 0.2119NS 0.0019* < 0.0001* 0.0270* 0.6681NS 0.7924NS 0.0009* 0.4399NS 0.0194* F-value 21.03 156.67 34.88 34.34 11.40 2.81 5.29 5.87 23.49 3.48 1.25 0.89 11.16 0.57 0.00037 p-value < 0.0001* < 0.0001* < 0.0001* < 0.0001* 0.0055* 0.1192NS 0.0403* 0.0321* 0.0004* 0.0869NS 0.2852NS 0.3647NS 0.0059* 0.4634NS 0.9849NS

Model A B C D AB AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2 R2 Adj- R2 Adeq-Precision 0.9423 0.8750 15.029 0.9755 0.9568 24.479 0.9608 0.9151 18.724

*p < 0.05: Các giá trị có ý nghĩa; NSp > 0.05: các giá trị không có ý nghĩa

102

Kết quả phân tích của mô hình ở bảng 4.3.2.3 cho thấy mô hình này là hoàn

toàn tương hợp với thực nghiệm điều này được chứng minh với các chuẩn F (Fisher)

của mô hình có giá trị với hàm Y1 (14) , Y2 (34.07) và Y3 (21.03). Các mô này có ý

nghĩa thống kê với độ tin cậy cao với các p đều có giá trị nhỏ hơn 0.0001.

Sự phù hợp của mô hình thực nghiệm cũng được kiểm chứng bằng hệ số xác định R2. Giá trị R2 càng gần 1 thì giá trị thực nghiệm càng gần với giá trị dự đoán của mô hình. Theo số liệu phân tích ở bảng 4.3.2.3, hệ số xác định R2 của 3 mô hình Y1, Y2 và Y3 lần lượt có giá trị là 0.9423 (94.23%); 0.9755 (97.55%) và 0.9608 (96.08%), Bên cạnh đó giá trị Adj- R2 của mô hình Y1, Y2 và Y3 lần lượt có giá trị là 0.8750 (87.50%); 0.9568 (95.68%) và 0.9151 (91.51%). Theo Guan and Yao (2008) và Zabeti et al. (2009) thì mô hình có tính tương hợp cao với thực nghiệm khi giá trị R2 và Adj- R2 lớn hơn 0,8 cùng với đó chỉ số Adeq Precision lớn hơn 4 là cần thiết [107,108]. Từ các kết quả thu được ta có thể khẳng định mô hình đã xây dựng là có tính tương hợp

cao với thực nghiệm.

Một cách khác, chúng tôi có thể đánh giá sự tương hợp của mô hình thông qua

các biểu đồ thực nghiệm và dự đoán (predicted and actual value plots) và các biểu đồ

phân bố ngẫu nhiên của các lần thí nghiệm (residuals versus runs models) thể hiện ở

hình 4.3.2.3a. Mô hình có sự tương hợp cao giữa thực nghiệm và lý thuyết khi các

điểm thí nghiệm tập trung theo dạng đường chéo thẳng ở đồ thị thứ nhất và phân bố

của các điểm thí nghiệm là ngẫu nhiên trong phạm vi (-3, 3) ở đồ thị thứ 2.

103

Hình 4.3.2.3a. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1, Y2 và Y3

Sau khi loại bỏ các biến không có ý nghĩa (p> 0.05). Hàm mục tiêu Y1, Y2 và Y3

của mô hình cũng được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:

Y1 = 29.42 + 2.93A + 0.88B + 1.78C + 0.76D – 0.89AB + 1.09AD – 1.02BC –

1.3B2 – 1.1D2 (1)

Y2 = 21.22 + 2.32A + 0.68B + 0.99C + 0.41D – 0.59AB + 0.62AD – 1.11BC +

0.39BD – 0.92B2 – 0.57D2 (2)

Y3 = 29.65 + 2.55A + 1.06B + 1.05C + 0.61D – 0.46AC + 0.49AD – 0.97BC –

0.91B2 (3)

Sự ảnh hưởng của các yếu tố tuyến tính (A, B, C, D) đến giá trị hàm mục tiêu là

lớn nhất, sau đó là ảnh hưởng của các yếu tố chập đôi (AB, AC, AD, BC, BD, CD) và ảnh hưởng ít nhất đến giá trị hàm mục tiêu là các yếu tố bình phương (A2, B2, C2, D2).

+ Từ phương trình hồi quy (1) ta có thể thấy ngay ảnh hưởng của các yếu tố lên

hàm mục tiêu Y1 (phenolic tổng). Ta thấy cả 4 yếu tố A, B, C và D đều ảnh hưởng

tương tác dương (ảnh hưởng đồng biến) với hàm Y1. Trong đó mức độ ảnh hưởng của

4 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần A > C > B > D tương ứng với các hệ số của

chúng trong phương trình hồi quy (1).

+ Tương tự như vậy, phương trình hồi quy (2) cho thấy ngay ảnh hưởng của các

yếu tố lên hàm mục tiêu Y2 (flavonoid tổng). Ta thấy cả 4 yếu tố A, B, C và D đều ảnh hưởng tương tác dương (ảnh hưởng đồng biến) với hàm Y2. Trong đó mức độ ảnh

hưởng của 4 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần A > C > B > D tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình hồi quy (2)

+ Phương trình hồi quy (3) cho thấy ngay ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm mục tiêu Y3 (hàm lượng cao chiết tổng). Ta thấy cả 4 yếu tố A, B, C và D đều ảnh hưởng tương tác dương (ảnh hưởng đồng biến) với hàm Y3. Trong đó mức độ ảnh hưởng của 4 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần A > B > C > D tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình hồi quy (3)

104

Ảnh hưởng của các cặp yếu tố công nghệ thể hiện ở hiệu ứng tương tác đôi đến

các hàm mục tiêu được biểu thị thông qua các bề mặt đáp ứng của hàm lượng phenolic

tổng, flavonoid tổng và hàm lượng cao chiết tổng ở hình 4.3.2.3b.

(a)

(b)

105

(c)

Hình 4.3.2.3b. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng phenolic tổng (a), hàm lượng flavonoid

tổng (b) và hàm lượng cao chiết tổng (c).

Trên các bề mặt đáp ứng, vùng màu đỏ sẫm là vùng tối ưu. Tại đó, các giá trị hàm mục tiêu Y1, Y2 và Y3 nằm trong vùng giá trị lớn nhất. Từ các bề mặt đáp ứng ở hình 4.3.2.3b có thể đưa ra nhận xét như sau:

Với các bề mặt đáp ứng biểu diễn hàm Y1, Y2 và Y3: Ta thấy bề mặt đáp ứng thể hiện hiệu ứng tương tác đôi của 3 cặp yếu tố công nghệ (AB, AC, AD) thể hiện rõ vùng tối ưu, các bề mặt đáp ứng thể hiện hiệu ứng tương tác đôi của các cặp yếu tố công nghệ còn lại (BC, BD, CD) không thể hiện rõ vùng tối ưu. Điều này hoàn phù hợp với mô tả ở phương trình hồi quy (1), (2) và (3) với mức độ ảnh hưởng của 4 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần A > C > B > D (phương trình hồi quy 1, 2) và A > B > C > D (phương trình hồi quy 3). Yếu tố công nghệ A ảnh hưởng mạnh nhất đến giá trị hàm mục tiêu, do đó các tương tác của yếu tố công nghệ A với các yếu tố công nghệ khác như AB, AC, AD sẽ ảnh hưởng đến giá trị hàm mục tiêu mạnh hơn so với sự tương tác của các cặp yếu tố khác như BC, BD, CD lên giá trị hàm mục tiêu.

4.3.2.4. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất

Quá trình chiết xuất nguyên liệu táo mèo cần được tối ưu sao cho cả 3 hàm mục tiêu Y1, Y2 và Y3 đều đạt giá trị lớn nhất. Điều này được giải quyết bằng việc tiến hành giải bài toán tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5). Trong bài toán này, với các mục tiêu đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau:

106

Hàm lượng phenolic tổng Y1 (mức 5), hàm lượng flavonoid tổng Y2 (mức 3)

và hàm lượng cao chiết tổng Y3 (mức 2).

Bảng 4.3.2.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ

Biến mã hóa Biến thực

A B C D

1.34 0.23 0.26 0.7 Thời gian (phút) 50.1 Nồng độ ethanol (%,v/v) 64.6 Công suất vi sóng (W) 441.6 Độ pH dung môi 5.4

Hình 4.3.2.4. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất

Kết quả tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0.0 cho ta 25 giải pháp tương

ứng với 25 bộ số liệu công nghệ khác nhau. Tuy nhiên ta cần lựa chọn giải pháp có bộ

số liệu công nghệ phù hợp với các điều kiện thí nghiệm nhất. Giải pháp tối ưu được lựa chọn như bảng 4.3.2.4. Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.3.2.4, giá

trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 33.64 (mg GAE/g); Y2 = 25.1 (mg

QE/g) và Y3 = 33.33 (%). Mức độ đáp ứng theo hàm nguyện vọng được thể hiện ở

hình 4.3.2.4. Theo đó với giải pháp này thì yêu cầu đối với 4 yếu tố ảnh hưởng đều đạt

100% nguyện vọng, mục tiêu về hàm phenolic tổng, hàm lượng flavonoid tổng và hàm

lượng cao chiết tổng đều đạt 100% nguyện vọng.

4.3.2.5. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa

Thực nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần với bộ thông số công nghệ tại điều kiện tối ưu bao gồm thời gian chiết 50 phút, nồng độ ethanol dung môi 65%, công suất vi sóng 440W và độ pH dung môi là 5.4. Kết quả thí nghiệm được cho ở bảng 4.3.2.5.

Kết quả bảng 4.3.2.5. cho thấy các kết quả thực nghiệm tại điều kiện tối ưu có giá trị gần bằng với các giá trị dự đoán của hàm mục tiêu. Do đó mô hình tính toán tối ưu là tương hợp với thực nghiệm.

107

Bảng 4.3.2.5. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại điều kiện tối ưu

Kết quả Hàm mục tiêu

Độ pH Thực nghiệm Lý thuyết

Thời gian chiết (phút) 50 Thông số công nghệ Công suất vi sóng (W) 440 Nồng độ ethanl (%) 65 5.4 33.57 ± 0.12 33.64

25.01 ± 0.11 25.1

Y1 (mg GAE/g) Y2 (mg QE/g) Y3 (%) 33.44 ± 0.14 33.33

4.3.3. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất phenolic sử dụng sóng siêu âm

quy mô phòng thí nghiệm

4.3.3.1. Ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến hàm mục tiêu của quá trình

Bằng một số thí nghiệm khảo sát sơ bộ, nghiên cứu sinh lựa chọn mức nghiên cứu cơ bản ban đầu là: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 7/1 (v/w), nhiệt độ chiết: 45 (0C), Công suất siêu âm: 140 (W) và thời gian chiết: 60 (phút).

a. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất chiết

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu được khảo sát ở các mức là 3/1, 5/1, 7/1, 9/1 và 11/1 (v/w). các thông số công nghệ khác được giữ cố định ở các mức cơ bản nhiệt độ chiết: 50 (0C), Công suất siêu âm: 150 (W) và thời gian chiết: 60 (phút). Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.3.3.1a

Bảng 4.3.3.1.a. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu chiết đến hàm mục tiêu Y1

và Y2

TT Y2 (%)

1 2 3 4 5 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) 3/1 5/1 7/1 9/1 11/1 10.8 17.1 28.5 29.8 29.9

Y1 (mg GAE/g cao chiết) 15.7 22.8 29.2 29.6 29.3 Kết quả cho thấy khi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu chiết tăng từ 3/1 – 7/1 (v/w) thì hàm lượng phenolic tổng và hàm lượng cao chiết tổng tăng mạnh tương ứng lần lượt từ 15.7 – 29.2 (mg GAE/g) và 10.8 – 28.5 (%). Tiếp tục tăng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu chiết lên 9/1 (v/w) thì cả 2 hàm phenolic tổng và hàm lượng cao chiết tổng chỉ tăng nhẹ lên ở các giá trị là 29.6 (mg GAE/g) và 29.8 (%). Khi tỷ lệ chiết là 11/1 thì giá trị cả 2 hàm Y1 và Y2 gần như không thay đổi. Điều này có thể giải thích là khi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu còn thấp thì khả năng chiết tách khá kém vì dung môi nhanh đạt đến trạng thái gần bão hòa nên cản trở quá trình khuếch tan vật chất từ nguyên liệu

108

ra dung môi. Tuy nhiên tỷ lệ này quá lớn thì gây ra sự dư thừa dung môi vì lượng vật chất trong nguyên liệu chỉ cần 1 lượng dung môi vừa đủ là có thể chiết kiệt. Do đó, để đảm bảo hiệu suất quá trinh chiết cũng như yếu tố về kinh tế, các tỷ lệ dung môi/nguyên liệu được chọn làm mức cơ bản là 7/1 (v/w) cho các thí nghiệm tiếp theo để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm.

b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết

Nhiệt độ chiết được khảo sát ở các mức là 250C, 350C, 450C, 550C và 650C. các thông số công nghệ khác được giữ cố định ở các mức cơ bản tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 7/1 (v/w), Công suất siêu âm: 140 (W) và thời gian chiết: 60 (phút). Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.3.3.1b

Bảng 4.3.3.1.b. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

TT Y2 (%)

1 2 3 4 5 Nhiệt độ chiết (0C) 25 35 45 55 65 Y1 (mg GAE/g cao chiết) 12.9 20.5 29.2 31.3 30.6 11.8 17.1 28.5 29.9 29.6

Kết quả cho thấy khi nhiệt độ chiết tăng từ 25 – 45 (0C) thì hàm lượng phenolic tổng và hàm lượng cao chiết tổng tăng nhanh tương ứng lần lượt là 12.9 – 29.1 (mg GAE/g) và 11.8 – 28.5 (%). Khi nhiệt độ chiết tăng lên 550C thì giá trí hàm lượng phenolic và hàm lượng cao chiết tổng đạt mức cao nhất lần lượt là 31.3 (mg GAE/g) và 29.9 (%), nhiệt độ chiết tiếp tục tăng lên 650C thì cả 2 hàm Y1 và Y2 đều bị sụt giảm. Kết quả thí nghiệm được giải thích là ở nhiệt độ chiết còn thấp, mặc dù có sử

dụng siêu âm nhưng khả năng khuếch tán vật chất từ nguyên liệu ra dung môi còn

kém, khi nhiệt độ tăng lên thì khả năng khuếch tán vật chất được tăng lên bởi nhiệt độ

sinh ra dòng đối lưu trong dung môi. Tuy nhiên khi nhiệt độ tăng cao cộng thêm tác

động của sóng siêu âm có thể lại cản trở ngược lại quá trình khuếch tán do dung môi bị

bay hơi nhanh hơn và tạo thành các bóng khí dưới tác dụng của siêu âm, hàm lượng phenolic cũng có thể sụt giảm bới ở nhiệt độ cao những phenolic nhạy cảm bị biến tính. Từ kết quả khảo sát, nhiệt độ chiết ở mức cơ bản là 450C cho các thí nghiệm tiếp theo để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm.

c. Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hiệu suất chiết

Công suất siêu âm được khảo sát ở các mức 100W, 120W, 140W, 160W và 180W. Các thông số công nghệ còn lại được giữ cố định ở mức tỷ lệ dung môi/nguyên

109

liệu: 7/1 (v/w), nhiệt độ chiết: 45 (0C) và thời gian chiết: 60 (phút). Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.3.3.1c

Bảng 4.3.3.1.c. Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

TT Công suất siêu âm Y2 (%)

1 2 3 4 5 (W) 100 120 140 160 180 Y1 (mg GAE/g cao chiết) 18.5 26.4 32.1 32.6 31.8 13.8 19.1 30.5 31.8 31.5

Kết quả cho thấy khi công suất siêu âm tăng từ 100 – 140 (W) thì hàm lượng

phenolic tổng và hàm lượng cao chiết tổng tăng mạnh tương ứng lần lượt từ 18.5 –

32.1 (mg GAE/g) và 13.8 – 30.5 (%). Tiếp tục tăng công suất siêu âm lên 160 (W) thì

giá trị của 2 hàm Y1 và Y3 vẫn tăng lên nhưng tăng chậm tương ứng là 32.6 (mg GAE/g) và 31.8 (%). Công suất tăng lên 180 (W) thì cả 2 hàm Y1 và Y2 đều giảm nhẹ

xuống còn 31.8 (mg GAE/g) và 31.5 (%). Điều này chứng tỏ công suất vi sóng ảnh

hưởng cả tích cực lẫn tiêu cực đến quá trình chiết xuất. Cơ chế này được giải thích là sóng siêu âm đóng vai trò như tác nhân phá bỏ các lớp màng tế bào của vật liệu chiết

thông qua việc tạo thành các bong bóng khí nhỏ và liên lục bị vỡ tạo ra lực cắt cực lớn,

điều này giúp quá trình khuếch tán vật chất từ vật liệu ra dung môi dễ dàng hơn. Tuy

nhiên khi công suất siêu âm vượt ngưỡng lên mức quá cao thì quá trình trích ly lại bị

cản trở do số bong bóng khí hình thành quá nhiều, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và

dung môi bị giảm đi làm hiệu suất chiết giảm đi. Do đó, cần chọn mức công suất siêu

âm phù hợp cho quá trình này. Từ kết quả khảo sát, công suất siêu âm ở mức cơ bản là

140 (W) cho các thí nghiệm tiếp theo để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm.

d. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất chiết

Thời gian chiết được khảo sát ở các mức 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút và

90 phút. Các thông số công nghệ khác được giữ cố định ở mức tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 7/1 (v/w), nhiệt độ chiết: 45 (0C) và Công suất siêu âm: 140 (W). Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.3.3.1d

Bảng 4.3.3.1.d. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

Thời gian chiết (W) 30 45 60 75 90 Y1 (mg GAE/g cao chiết) 14.5 24.4 32.1 32.9 32.8 Y2 (%) 13.7 19.1 32.5 33.2 33.4 TT 1 2 3 4 5

110

Kết quả cho thấy thời gian là yếu tố công nghệ quan trọng ảnh hưởng tới quá

trình chiết xuất. Khi thời gian chiết thay đổi từ 30 – 60 (phút) thì hàm lượng phenolic

tổng và hàm lượng cao chiết tổng tăng tương ứng từ 14.5 – 32.1 (mg GAE/g) và 13.7 –

32.5 (%).Thời gian tăng lên 75 (phút) thì hàm lượng phenolic tổng và hàm lượng cao chiết tổng có tăng nhẹ lên lần lượt là 32.9 (mg GAE/g) và 32.8 (%). Thời gian chiết

tiếp tục tăng lên 90 (phút) thì giá trị của cả 2 hàm Y1 và Y2 gần như không thay đổi.

Điều này cho thấy, thời gian chiết quá dài không ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết. Từ các kết quả khảo sát, thời gian chiết ở mức mức cơ bản là 60 (phút) cho các thí

nghiệm tiếp theo để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm.

4.3.3.2. Thiết lập mô hình và xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm

Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu Y1 và Y2, nghiên cứu sinh lựa chọn mô hình bậc 2, kế hoạch hóa thực

nghiệm theo mô tả của Box- Behnken. Các mức gốc (0), mức thấp (-1) và mức cao

(+1), của các yếu tố (với k= 4) và khoảng biến thiên được thể hiện ở bảng 4.3.3.2a.

Bảng 4.3.3.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ

Biến thực

Biến mã A Khoảng biến thiên (Δ) 2 Mức nghiên cứu 0 7 -1 5 1 9

Z1: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) Z2: Nhiệt độ chiết (0C) Z3: Công suất siêu âm (W) Z4: Thời gian chiết (phút) B C D 15 40 15 30 100 45 45 140 60 60 180 75

Sử dụng phần mềm Design expert 7.0.0 để xây dựng ma trận kế hoạch thực

nghiệm với 27 thí nghiệm. Các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 (mg GAE/g): Hàm lượng

phenolic tổng và Y2 (%) Hàm lượng cao chiết tổng. Kết quả thí nghiệm được cho ở

bảng 4.3.3.2b

Bảng 4.3.3.2b. Ma trận kế hoạch hóa thực nghiệm của quá trình chiết xuất

TT Hàm mục tiêu

1 2 3 4 5 6 7 8 9 A -1 +1 -1 +1 0 0 0 0 -1 Biến mã hóa C B 0 -1 0 -1 0 +1 0 +1 -1 0 +1 0 -1 0 +1 0 0 0 Y1 (mg GAE/g) 24.49 25.17 28.14 27.84 27.3 21.4 26.9 27.52 26.65 Y2 (%) 21.58 20.86 16.5 25.35 15.49 18.2 28.7 31.5 17.8 D 0 0 0 0 -1 -1 +1 +1 -1

111

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 +1 -1 +1 0 0 0 0 -1 +1 -1 +1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 +1 -1 +1 0 0 0 0 -1 +1 -1 +1 0 0 0 0 0 0 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 0 0 0 0 0 0 0 -1 +1 +1 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 +1 +1 0 0 0 26.54 29.2 29.3 25.9 25.6 19.6 26.1 24.8 28.15 27.73 25.0 26.37 23.23 22.48 29.31 33.58 33.62 33.6 12.7 18.22 34.44 20.44 21.35 27.25 19.08 17.16 21.18 21.65 27.68 19.91 17.84 28.69 32.08 28.19 28.65 28.93

4.3.3.3. Kiểm tra sự có nghĩa của mô hình

Sự có nghĩa của mô hình và các hệ số được tiến hành bằng việc phân tích

phương sai (ANOVA) thể hiện ở bảng 4.3.3.3

Bảng 4.3.3.3. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y1 và Y2

Y1 (mg GAE/g) Y2 (%)

F - value p - value F - value p - value < 0.0001* 26.06 0.0003* 25.11 0.286 NS 1.25 0.0037* 12.95 150.30 < 0.0001* 0.0150* 8.04 0.5627 NS 0.35 < 0.0001* 39.88 0.0197* 7.23 0.1318NS 2.62 0.9792NS 0.0007 < 0.0001* 41.76 0.0027* 14.13 0.0019* 15.78 0.0118* 8.79 < 0.0001* 30.53 0.7328NS 0.12 < 0.0001* 32.74 0.0018* 15.91 0.0005* 21.77 0.5602NS 0.36 0.0029* 13.82 0.9 NS 0.016 0.0013* 17.28 < 0.0001* 37.15 0.0018* 15.89 48.01 < 0.0001* 183.81 < 0.0001* 167.26 < 0.0001* < 0.0001* 87.10

Nguồn Model A B C D AB AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2 R2 Adj-R2 Adeq-Precision 0.9609 0.9153 17.969 0.9727 0.9408 21.939

*p < 0,05: Các giá trị có ý nghĩa; NSp > 0,05: các giá trị không có ý nghĩa

112

Kết quả phân tích của mô hình ở bảng 4.3.3.3 cho thấy mô hình này là hoàn

toàn tương hợp với thực nghiệm điều này được chứng minh với các chuẩn F (Fisher)

của mô hình có giá trị với hàm Y1 (30.53) , Y2 (26.06). Các mô này có ý nghĩa thống

kê với độ tin cậy cao với các hệ số p đều có giá trị (< 0.0001).

tiêu phụ thuộc vào các biến ảnh hưởng là rất lớn, mô hình thiết lập là tương hợp với thực nghiệm.

chúng ta cũng có thể đánh giá sự tương hợp của mô hình thông qua các biểu đồ

thực nghiệm và dự đoán (predicted and actual value plots) và các biểu đồ phân bố

ngẫu nhiên của các lần thí nghiệm (residuals versus runs models) thể hiện ở hình

4.3.3.3a. Mô hình có sự tương quan tốt giữa thực nghiệm và lý thuyết khi các điểm thí

nghiệm tập trung theo dạng đường chéo thẳng ở đồ thị thứ nhất và phân bố của các

điểm thí nghiệm là ngẫu nhiên trong phạm vi (-3, 3) ở đồ thị thứ hai.

Hình 4.3.3.3a. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2

113

Sau khi loại bỏ các biến không có ý nghĩa (p > 0.05) Hàm mục tiêu Y1, Y2 của

mô hình cũng được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:

Y1 = 33.60 + 1.35B – 0.94C + 1.1D – 1.52AC + 1.7BC + 2.49BD + 1.63CD –

2.45 A2 – 4.8B2 – 4.58 C2 – 3.30D2 (1)

Y2 = 28.59 + 2.44A + 1.75C + 5.97D + 2.39AB + 5.33AD – 2.27BC – 4.72A2

– 2.75B2 – 2.9C2 – 2.17D2 (2)

Sự ảnh hưởng của các yếu tố tuyến tính (A, B, C, D) đến giá trị hàm mục tiêu là lớn nhất, sau đó là ảnh hưởng của các yếu tố chập (AB, AC, AD, BC, BD, CD) và ảnh hưởng ít nhất đến giá trị hàm mục tiêu là các yếu tố bình phương (A2, B2, C2, D2).

+ Từ phương trình hồi quy (1) ta có thể thấy ngay ảnh hưởng của các yếu tố lên

hàm mục tiêu Y1 (phenolic tổng). Ta thấy chỉ có 3 yếu tố B, C và D ảnh hưởng chính đến hàm Y1. Yếu tố A thể hiện mức độ ảnh hưởng yếu hơn thông qua các tương tác chập đôi và tương tác bình phương (AC, A2). Trong đó mức độ ảnh hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần B > D > C. Hai yếu tố B và D thì ảnh hưởng đồng

biến (tương tác dương) với Y1 còn yếu tố C ảnh hưởng nghịch biến (tương tác âm) với

Y1 tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình hồi quy (1).

+ Tương tự như vậy, phương trình hồi quy (2) cho thấy ngay ảnh hưởng của các

yếu tố lên hàm mục tiêu Y2 (hàm lượng cao chiết tổng). Ta thấy 3 yếu tố A, C và D

ảnh hưởng chính đến hàm Y2. Yếu tố B thể hiện mức độ ảnh hưởng yếu hơn thông qua các tương tác chập và tương tác bình phương (AB, B2). Trong đó mức độ ảnh hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần D > A > C, cả 3 yếu tố đều ảnh

hưởng đồng biến (tương tác dương) với Y2 tương ứng với các hệ số của chúng trong

phương trình hồi quy (2)

Ảnh hưởng của các cặp yếu tố công nghệ thể hiện ở hiệu ứng tương tác đôi đến

các hàm mục tiêu được biểu thị thông qua các bề mặt đáp ứng của hàm lượng phenolic tổng và hàm lượng cao chiết tổng ở hình 4.3.3.3b.

114

(a)

(b) Hình 4.3.3.3b. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng phenolic tổng (a) và hàm lượng cao

chiết tổng (b)

Trên các bề mặt đáp ứng, vùng màu đỏ sẫm là vùng tối ưu. Tại đó, các giá trị

hàm mục tiêu Y1, Y2 nằm trong vùng giá trị lớn nhất. Từ các bề mặt đáp ứng ở hình

4.3.3.3b có thể đưa ra nhận xét như sau:

+ Với các bề mặt đáp ứng biểu diễn hàm Y1: Bề mặt đáp ứng của 3 cặp yếu tố

thể hiện hiệu ứng tương tác đôi (BD, AB, AD) cho thấy vùng tối ưu lớn hơn bề mặt

đáp ứng của 3 cặp yếu tố thể hiện hiệu ứng tương tác đôi còn lại (AC BC, CD). Điều

này hoàn phù hợp với kết quả thể hiện ở phương trình hồi quy (1) vì yếu tố công nghệ C ảnh hưởng nghịch biến với hàm mục tiêu (mang hệ số âm) do đó các hiệu ứng tương tác đôi của yếu tố công nghệ C với các yếu tố công nghệ khác sẽ làm giảm giá trị hàm mục tiêu dẫn tới vùng tối ưu cũng nhỏ hơn các hiệu ứng tương tác đôi mà cả 2 yếu tố

công nghệ đều ảnh hưởng đồng biến (mang hệ số dương) với hàm mục tiêu.

+ Các bề mặt đáp ứng biểu diễn hàm Y2 cho thấy: Ta thấy chỉ có bề mặt đáp ứng thể hiện hiệu ứng tương tác đôi của 3 cặp yếu tố (AD, BD, CD) là có vùng tối ưu. Các bề mặt đáp ứng thể hiện hiệu ứng tương tác còn lại không cho thấy vùng tối ưu.. Điều này hoàn phù hợp với kết quả thể hiện ở phương trình hồi quy (2) khi mức độ

115

ảnh hưởng của 3 yếu tố công nghệ đến giá trị hàm mục tiêu theo thứ tự giảm dần D > A > C, tất cả các yếu tố công nghệ đều ảnh hưởng đồng biến (mang hệ số dương) đến hàm mục tiêu.

4.3.3.4. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất

Tương tự như bài toán trước đó, quá trình chiết xuất nguyên liệu táo mèo cần được tối ưu sao cho cả 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2 đều đạt giá trị lớn nhất. Điều này được giải quyết bằng việc tiến hành giải bài toán tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5). Trong bài toán này, với các mục tiêu đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau:

+ Hàm lượng phenolic tổng Y1 (mức 5)

+ Hàm lượng cao chiết tổng Y2 (mức 3)

Kết quả tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0.0 cho ta 1 giải pháp tương ứng với 1 bộ số liệu công nghệ. Bộ thông số công nghệ tối ưu được trình bày ở bảng 4.3.3.4. Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.3.3.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 33.26 (mg GAE/g) và Y2 = 32.82 (%). Mức độ đáp ứng theo hàm nguyện vọng được thể hiện ở hình 4.3.3.4. Theo đó với giải pháp này thì yêu cầu đối với 4 yếu tố ảnh hưởng đều đạt 100% nguyện vọng, mục tiêu về hàm phenolic tổng đạt 97.43% nguyện vọng và hàm lượng cao chiết tổng cũng đạt 92.54% nguyện vọng. Nguyện vọng tổng thể đạt 95.57%.

Bảng 4.3.3.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ

Biến mã hóa Biến thực

A B C D

0.29 0.27 0.05 0.61 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) 7.58 Nhiệt độ chiết siêu âm (0C) 49.05 Công suất chiết siêu âm (W) 142 Thời gian chiết (phút) 69.15

Hình 4.3.3.4. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất

116

4.3.3.5. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa

Thực nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần với bộ thông số công nghệ tại điều

kện tối ưu bao gồm Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 7.5 (v/w); Nhiệt độ chiết siêu âm 49(0C); Công suất chiết siêu âm 140 (W) và Thời gian chiết 69 (phút). Kết quả thí nghiệm được cho ở bảng 4.3.3.5.

Bảng 4.3.3.5. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại điều kiện tối ưu

Kết quả Hàm mục tiêu

Thực nghiệm Lý thuyết Nhiệt độ chiết (0C)

Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (v/w) 7.6 Thông số công nghệ Công suất chiết siêu âm (W) 140 49 Thời gian chiết 69 (phút) 70 33.05 ± 0.33 33.26

Y1 (mg GAE/g) Y2 (%) 32.9 ± 0.21 32.82

Kết quả bảng 4.3.3.5. cho thấy các kết quả thực nghiệm tại điều kiện tối ưu có

giá trị gần bằng với các giá trị dự đoán của hàm mục tiêu. Do đó mô hình tính toán tối

ưu là tương hợp với thực nghiệm.

4.3.4. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất phenolic bằng phương pháp chiết

hồi lưu quy mô phòng thí nghiệm

4.3.4.1. Ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến hàm mục tiêu của quá trình

Bằng một số thí nghiệm khảo sát sơ bộ, nghiên cứu sinh lựa chọn mức nghiên

cứu cơ bản ban đầu là: Thời gian chiết: 300 (phút), Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 7/1 (v/w) và nhiệt độ chiết: 55 (0C).

a. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất chiết

Thời gian chiết được kháo sát ở các mức 120 phút, 180 phút, 240 phút, 300 phút và

360 phút, 2 thông số công nghệ còn lại được giữ ở mức cơ bản là tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 7/1 (v/w) và nhiệt độ chiết 55 (0C). Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.3.4.1.a

Bảng 4.3.4.1.a. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

TT Y2 (%)

1 2 3 4 5 Thời gian chiết (phút) 120 180 240 300 360 Y1 (mg GAE/g cao chiết) 13.7 18.8 24.4 28.6 29.1 11.2 18.6 23.7 29.1 29.8

117

Kết quả cho thấy khi thời gian chiết tăng từ 120 - 300 phút, hàm lượng phenol

tổng và hàm lượng cao chiết tổng tăng tuyến tính từ 13.7 – 28.6 (mg GAE / g) và 11.2

– 29.1 (%). Tiếp tục tăng thời gian chiết lên 360 phút, tổng hàm lượng phenol và năng

suất chiết chỉ tăng nhẹ tương ứng lên 29.1 (mg GAE / g) và 29.8 (%). Có thể thấy thời gian chiết là yếu tố công nghệ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết xuất, thời gian tăng

thì hiệu suất chiết cũng tăng lên. Từ các số liệu khảo sát ở trên, để đảm bảo về yếu tố

kinh tế và năng lượng, nghiên cứu sinh đã chọn thời gian trích xuất là 300 phút làm mức cơ bản cho các thí nghiệm tiếp theo để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm.

b. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất chiết

Tỷ lệ chiết được khảo sát ở các mức (v/w) 4/1, 5/1, 6/1, 7/1 và 8/1. 2 thông số công

nghệ còn lại được điều chỉnh ở các mức thời gian chiết 300 (phút) và nhiệt độ chiết là 55 (0C). Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.3.4.1.b

Bảng 4.3.4.1.b. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu chiết đến hàm mục tiêu Y1

và Y2

TT Y2 (%) Y1 (mg GAE/g cao chiết)

1 2 3 4 5 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) 4/1 5/1 6/1 7/1 8/1 12.8 17.5 25.5 29.4 29.9 11.2 16.4 23.8 28.7 29.4

Kết quả cho thấy khi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tăng từ (4/1, v/w) lên (7/1,

v/w), hàm lượng phenol tổng và hàm lượng cao chiết tổng tăng mạnh tương ứng từ

12.8 – 29.4 (mg GAE/g) và từ 11.2 – 28.7 (%). Tiếp tục tăng tỷ lệ dung môi so với vật

liệu lên (8/1, v/w), cả hàm lượng phenol và năng suất đều tăng nhẹ. Kết quả nghiên

cứu là phù hợp bởi vì khi chúng tôi tăng tỷ lệ dung môi/vật liệu, điều này làm cho quá

trình khuếch tán vật chất vào dung môi dễ dàng hơn, giúp tăng hiệu quả chiết. Tuy nhiên, nếu tăng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu lên cao thì năng suất chiết không thay đổi nhiều mà lại hao tốn dung môi. Do đó, để đạt hiệu quả kinh tế, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu liệu (7/1, v / w) được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo để xây dựng ma trận kế

hoạch thực nghiệm.

c. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết

Nhiệt độ chiết xuất được khảo sát ở các mức 350C, 450C, 550C, 650C và 750C. 2 yếu tố công nghệ còn lại được giữ cố định ở các mức lần lượt là thời gian chiết 300 (phút) và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 7/1 (v/w). Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.3.4.1.c

118

Bảng 4.3.4.1.c. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

TT Y2 (%)

1 2 3 4 5 Nhiệt độ chiết (0C) 35 45 55 65 75 Y1 (mg GAE/g cao chiết) 12.9 19.5 28.9 31.3 30.6 10.8 17.1 28.5 29.8 29.9

Kết quả cho thấy, khi nhiệt độ chiết tăng từ 350C - 550C, hàm lượng phenol tổng và hàm lượng cao chiết tổng tăng mạnh tương ứng từ 12.9 – 28.9 (mg GAE/g) và 10.8 – 29.8 (%). Khi nhiệt độ chiết là 650C, cả hàm lượng và tổng sản lượng phenol tăng nhẹ lên 31.3 (mg GAE/g) và 29.8 (%). Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nhiệt độ chiết lên 750C, tổng hàm lượng phenol bắt đầu giảm xuống 30,6 (mg GAE/g) và năng suất không thay đổi. Kết quả này cho thấy nhiệt độ chiết xuất ảnh hưởng đến sự ổn định của các hợp chất phenolic thực vật. Cụ thể, ở nhiệt độ cao, một số hợp chất phenolic

dễ bị oxy hóa và biến đổi vì vậy làm sụt giảm hàm lượng của chúng. Dựa trên các kết quả thí nghiệm nghiên cứu, nhiệt độ chiết là 550C được chọn làm mức cơ bản cho tiến hành các thí nghiệm tiếp theo để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm.

4.3.4.2. Thiết lập mô hình và xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm

Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ đơn biến đến

hàm mục tiêu Y1 và Y2, nghiên cứu sinh lựa chọn mô hình bậc 2, kế hoạch hóa thực

nghiệm hỗn hợp trung tâm theo mô tả của Box-Willson. Các mức gốc (hay mức cơ

bản) của các yếu tố và hệ số α = 1.215 (với K= 3) và khoảng biến thiên được thể hiện

ở bảng 4.3.4.2a

Bảng 4.3.4.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ

Tên biến, khoảng biến thiên Mức nghiên cứu

-1 1

Biến mã A Khoảng biến thiên (Δ) 60 -α +α 0 227 240 300 360 373

B C 2 15 4.57 36.8 5 40 7 55 9 70 9.43 73.2 Biến thực Z1: thời gian chiết (phút) Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w). Z3: Nhiệt độ chiết (0C)

Sử dụng phần mềm Design expert 7.0 để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 15 thí nghiệm. Các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 (mg GAE/g): Hàm lượng phenolic tổng và Y2 (%): Hàm lượng cao chiết tổng. Kết quả thí nghiệm được cho ở

bảng 4.3.4.2b

119

Bảng 4.3.4.2b. Ma trận kế hoạch hóa thực nghiệm của quá trình chiết xuất

Hàm mục tiêu TT Biến mã hóa B Y1 (mg GAE/g) Y2 (%) A C

−1 −1 −1 1 16.18 15.24

+1 −1 +1 −1 +1 −1 +1 −1.215 +1.215 0 0 0 0 0 −1 +1 +1 −1 −1 +1 +1 0 0 −1.215 +1.215 0 0 0 −1 −1 −1 +1 +1 +1 +1 0 0 0 0 −1.215 +1.215 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 17.96 19.11 22.89 17.34 23.47 23.57 33.56 21.42 28.98 22.84 33.57 25.24 31.02 29.78 16.93 18.41 23.86 17.32 26.83 22.80 32.48 20.49 28.51 22.18 33.16 24.85 29.90 30.19

4.3.4.3. Kiểm tra sự có nghĩa của mô hình

Sự có nghĩa của mô hình và các hệ số được tiến hành bằng việc phân tích

phương sai (ANOVA) thể hiện ở bảng 4.3.4.3

Bảng 4.3.4.3. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y1, Y2

Y1 (mg GAE/g) Y2 (%) Nguồn

F-Value p-Value F-Value 0.0010* 0.0010* 0.0004* 0.0014* 0.1874NS 0.0403* 0.0787NS 0.0010* 0.0137* 0.0126* 27.46 47.22 68.66 41.18 2.33 7.57 4.86 46.99 13.86 14.45 21.55 49.55 45.51 36.89 0.81 7.57 0.055 34.33 8.78 10.45 p-Value 0.0018* 0.0009* 0.0011* 0.0017* 0.4107NS 0.0403* 0.8234NS 0.0021* 0.0314* 0.0231*

Model A B C AB AC BC A2 B2 C2 R2 Adj-R2 Adeq-Precision 0.9802 0.9445 15.967 0.9749 0.9296 14.697

*p < 0,05: Các giá trị có ý nghĩa; NSp > 0,05: các giá trị không có ý nghĩa

Kết quả phân tích của mô hình ở bảng 4.3.4.3 cho thấy mô hình này là hoàn toàn tương hợp với thực nghiệm điều này được chứng minh với các chuẩn F (Fisher)

120

của mô hình có giá trị với hàm Y1 (27.46) và Y2 (21.55). Các mô này có ý nghĩa

thống kê với độ tin cậy cao với các giá trị p tương ứng là 0.001 và 0.0018.

và Y2 lần lượt có giá trị là 0.9802 (98.02%) và 0.9749 (97.49%). Bên cạnh đó giá trị Adj-R2 cũng lần lượt là 0.9445 (94.45%); 0.9296 (92.96%) đều lớn hơn 0.8 (80%) và giá trị Adeq-Precision lần lượt là 15.967; 14.697 đều lớn hơn 4. Điều này cho thấy giá

trị của hàm mục tiêu phụ thuộc vào các biến ảnh hưởng là rất lớn, mô hình thiết lập là

tương hợp với thực nghiệm.

chúng ta cũng có thể đánh giá sự hội tụ của mô hình thông qua các biểu đồ thực nghiệm và dự đoán (predicted and actual value plots) và các biểu đồ phân bố ngẫu

nhiên của các lần thí nghiệm (residuals versus runs models) thể hiện ở hình hình

4.3.4.3a. Mô hình có sự tương quan tốt giữa thực nghiệm và lý thuyết khi các điểm thí

nghiệm tập trung theo dạng đường chéo thẳng ở đồ thị thứ nhất và phân bố của các

điểm thí nghiệm là ngẫu nhiên trong phạm vi (-3, 3) ở đồ thị thứ hai.

Hình 4.3.4.3a. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2

Sau khi loại bỏ các biến không có ý nghĩa (p> 0.05). Hàm mục tiêu Y1 và Y2 của

mô hình cũng được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:

Y1 = 31.28 + 2.82A + 3.4B + 2.63C + 1.32AC − 4.45A2 – 2.42B2 – 2.47C2 (1)

121

Y2 = 30.74 + 3.29A + 3.16B + 2.84C + 1.51AC − 4.34A2 – 2.2B2 – 2.4C2 (2)

Sự ảnh hưởng của các yếu tố tuyến tính (A, B, C) đến giá trị hàm mục tiêu là

lớn nhất, sau đó là ảnh hưởng của các yếu tố chập (AB, AC, BC) và ảnh hưởng ít nhất đến giá trị hàm mục tiêu là các yếu tố bình phương (A2, B2, C2).

+ Từ phương trình hồi quy (1) ta có thể thấy ngay ảnh hưởng của các yếu tố lên

hàm mục tiêu Y1 (phenolic tổng). Ta thấy cả 3 yếu tố A, B, C đều ảnh hưởng đồng

biến (tương tác dương) đến hàm Y1. Trong đó mức độ ảnh hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần B > A > C tương ứng với các hệ số của chúng trong phương

trình hồi quy (1).

+ Tương tự như vậy, phương trình hồi quy (2) cho thấy ngay ảnh hưởng của các

yếu tố lên hàm mục tiêu Y2. Cũng giống như ở hàm Y1, cả 3 yếu tố A, B, C đều ảnh hưởng đồng biến (tương tác dương) đến hàm Y2. Trong đó mức độ ảnh hưởng của 3

yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần A > B > C tương ứng với các hệ số của chúng

trong phương trình hồi quy (2)

Ảnh hưởng của các cặp yếu tố công nghệ thể hiện ở hiệu ứng tương tác đôi đến

các hàm mục tiêu được biểu thị thông qua các bề mặt đáp ứng của hàm lượng phenolic

tổng và hàm lượng cao chiết tổng ở hình 4.3.4.3b.

(a)

(b)

Hình 4.3.4.3b. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng phenolic tổng (a) và hàm lượng cao chiết tổng (b)

122

Trên các bề mặt đáp ứng, vùng màu đỏ sẫm là vùng tối ưu. Tại đó, các giá trị

hàm mục tiêu Y1, Y2 nằm trong vùng giá trị lớn nhất. Từ các bề mặt đáp ứng ở hình

4.3.4.3b có thể đưa ra nhận xét như sau:

+ Với các bề mặt đáp ứng biểu diễn hàm Y1: Bề mặt đáp ứng thể hiện hiệu ứng tương tác đôi của 3 cặp yếu tố công nghệ (AB, AC, BC) chỉ ra rằng diện tích vùng tối

ưu của 3 bề mặt đáp ứng này giảm dần theo thứ tương tác của các cặp yếu tố công

nghệ AB > BC > AC. Điều này hoàn phù hợp với kết quả thể hiện ở phương trình hồi quy (1) mức độ ảnh hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần B > A > C.

+ Các bề mặt đáp ứng biểu diễn hàm Y2 tương tự với hàm Y1 cho thấy: Bề mặt

đáp ứng thể hiện hiệu ứng tương tác đôi của 3 cặp yếu tố công nghệ (AB, AC, BC) chỉ

ra rằng diện tích vùng tối ưu của 3 bề mặt đáp ứng này giảm dần theo thứ tương tác của các cặp yếu tố công nghệ AB > AC > BC. Điều này hoàn phù hợp với kết quả thể

hiện ở phương trình hồi quy (2) mức độ ảnh hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự

giảm dần A > B > C.

4.3.4.4. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất

Cũng tương tư như các bài toán trước, quá trình chiết xuất nguyên liệu táo mèo

cần được tối ưu sao cho cả 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2 đều đạt giá trị lớn nhất. Trong

bài toán này, với các mục tiêu đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các

hàm mục tiêu như sau:

+ Hàm lượng phenolic tổng Y1 (mức 4)

+ Hàm lượng cao chiết tổng Y2 (mức 3)

Kết quả tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0.0 cho ta 15 giải pháp tương

ứng với 15 bộ số liệu công nghệ khác nhau. Tuy nhiên ta cần lựa chọn giải pháp có bộ

số liệu công nghệ phù hợp với các điều kiện thí nghiệm nhất. Giải pháp tối ưu được

lựa chọn như bảng 4.3.4.4. Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.3.4.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 33.96 (mg GAE/g) và Y2 = 33.21 (%). Mức độ đáp ứng theo hàm nguyện vọng được thể hiện ở hình 4.3.4.4. Theo đó với giải pháp này thì yêu cầu đối với 3 yếu tố ảnh hưởng đều đạt 100% nguyện vọng, mục tiêu về hàm phenolic tổng và hàm lượng cao chiết tổng đều đạt 100% nguyện vọng.

Bảng 4.3.4.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ

Biến mã hóa B A C Thời gian (phút) Nhiệt độ chiết (0C)

0.17 0.81 0.46 310.2 Biến thực Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) 8.62 61.9

123

Hình 4.3.4.4. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất

4.3.4.5. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa

Thực nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần với bộ thông số công nghệ tại điều

kện tối ưu bao gồm thời gian chiết 310 phút, Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 8.6 (v/w) và nhiệt đọ chiết 620C. Kết quả thí nghiệm được cho ở bảng 4.3.4.5.

Bảng 4.3.4.5. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại điều kiện tối ưu

Thông số công nghệ Kết quả

Thực nghiệm Hàm mục tiêu Lý thuyết Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)

Thời gian chiết (phút) 310 8.6/1 Nhiệt độ chiết (0C) 62 34.1 ± 0.17 33.96

Y1 (mg GAE/g) Y2 (%) 33.3 ± 0.22 33.21

Kết quả bảng 4.3.4.5. cho thấy các kết quả thực nghiệm tại điều kiện tối ưu có

giá trị gần bằng với các giá trị dự đoán của hàm mục tiêu. Do đó mô hình tính toán tối

ưu là phù hợp với thực nghiệm.

4.3.5. So sánh, đánh giá các phương án công nghệ nghiên cứu.

Ba phương pháp chiết xuất phenolic tử quả táo mèo quy mô phòng thí nghiệm

đã được nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình bao gồm chiết vi sóng (chiết có sử dụng vi sóng), chiết siêu âm (chiết có sử dụng sóng siêu âm) và chiết hồi lưu được so sánh với nhau và so sánh với phương pháp chiết soxhlet nhằm đánh giá hiệu suất chiết cũng như khả năng nâng cấp quy mô của quy trình. Hiệu quả quá trình chiết được đánh giá qua hàm lượng cao chiết và hàm lượng phenolic tổng trong cao chiết.

Về hàm lượng cao chiết thì 3 phương pháp chiết xuất phenolic được nghiên cứu cho kết quả gần như tương đương nhau và đều thấp hơn so với phương pháp chiết

soxhlet khoảng 3%. Điều này có thể giải thích rằng quy trình được nghiên cứu áp dụng cho việc chiết xuất phenolic nên những thành phần khác có tính chất phân cực kém

124

(như chất béo, sáp, hợp chất mạch dài) sẽ không bị chiết ra. Trái lại, phương pháp

chiết soxhlet sử dụng dung môi ethanol 96% với thời gian chiết 10 (giờ), nhiệt độ chiết 650C sẽ chiết gần như toàn bộ các hợp chất có trong nguyên liệu nên hàm lượng cao chiết tổng thu được sẽ cao hơn.

Về hàm lượng phenolic tổng thì phương pháp chiết hồi lưu cho hàm lượng

phenolic tổng cao nhất 34.1 ± 0.17 (mg GAE/g) tiếp đến là phương pháp chiết vi sóng

33.5 ± 0.12 (mg GAE/g) và cuối cùng là phương pháp chiết siêu âm 32.8 ± 0.33. Tuy nhiên ở 3 phương pháp vừa nêu thì hàm lượng phenolic tổng trong cao chiết chênh

lệch không đáng kể. Phương pháp chiết soxlet cho hàm lượng phenolic tổng thấp nhất

đạt 28.9 ± 0.12 (mg GAE/g), điều này có thể giải thích vì hàm lượng cao chiết tổng

của phương pháp chiết soxhlet là lớn hơn 3 phương pháp còn lại. Bên cạnh đó, nguyên nhân chính là việc chiết soxhlet sử dụng dung môi ethanol nồng độ 96% (tối ưu là

65%) và không có sự điều chỉnh pH (pH dung môi tối ưu là 5.4) cũng làm một phần

phenolic không được chiết ra dẫn tới hàm lượng phenolic trong cao chiết giảm đi. Hiệu

quả chiết của các phương pháp được thể hiện ở bảng 4.3.5a.

Bảng 4.3.5a. Hiệu quả chiết xuất của các phương pháp

Chiết vi sóng Chiết siêu âm Chiết hồi lưu Chiết soxhlet

33.5 ± 0.12 33.05 ± 0.33 34.1 ± 0.17 28.9 ± 0.12

33.4 ± 0.14 32.9 ± 0.21 33.3 ± 0.22 36.07 ± 0.13 Hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g) Hàm lượng cao chiết tổng (%)

Chúng tôi tiếp tục so sánh sâu hơn về các điều kiện công nghệ tối ưu của 3

phương pháp chiết phenolic. Kết quả so sánh được thể hiện ở bảng 4.3.5b.

Bảng 4.3.5b. Các điều kiện công nghệ tối ưu của 3 phương pháp

Chiết vi sóng 65 Chiết siêu âm 65 Chiết hồi lưu 65

5.4 7.6/1 5.4 8.6/1 5.4 5/1

Nồng độ ethanol của dung môi chiết (%, v/v) pH dung môi chiết Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) Thời gian chiết (phút) Nhiệt độ chiết (0C) Công suất vi sóng (W) Công suất siêu âm (W) 70 49 140 310 62 50 440

Bảng tổng hợp 4.3.5b cho thấy, nhược điểm của phương pháp chiết hồi lưu là

thới gian chiết rất dài 310 phút cao hơn 4.5 và 6.2 lần hai phương pháp chiết siêu âm

và chiết vi sóng, lượng dung môi sử dụng cũng lớn hơn 2 phương pháp còn lại, Do đó

125

phương pháp này là không hữu hiệu cho việc triển khai chiết ở lượng lớn hơn. Đối với

chiết vi sóng thì có ưu điểm là thời gian chiết ngắn nhất, dung môi sử dụng cũng ở tỷ

lệ nhỏ nhất trong 3 phương pháp, tuy nhiên chiết vi sóng chỉ phù hợp với quy mô

phòng thì nghiệm, không phù hợp cho việc triển khai chiết ở quy mô lớn hơn do yêu cầu chế tạo thiết bị cũng như an toàn làm việc sẽ khó có thể đáp ứng. Cuối cùng là

phương pháp chiết siêu âm, các thông số công nghệ đều thể hiện các ưu điểm như thời

gian chiết không quá dài, nhiệt độ chiết khá thấp, tỷ lệ dung môi sử dụng là vừa phải, đặc biệt là công suất siêu âm không quá lớn. Hiện nay, trên thế giởi đã phát triển và sử

dụng các thiết bị siêu âm có công suất lên đến từ 10.000 – 20.000 W. Do đó việc triển

khai chiết siêu âm ở quy mô lớn hơn là hoàn toàn khả thi.

Từ việc so sánh hiệu quả chiết suất và phân tích các yếu tố liên quan đến công nghệ cũng như khả năng triển khai, nâng cấp quy mô công nghệ. Trong 3 phương pháp

nghiên cứu, chúng tôi đánh giá phương pháp chiết siêu âm là phù hợp nhất để triển

khai công nghệ chiết xuất và có nhiều tiềm năng để áp dụng vào thực tế sản xuất.

Trong nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết siêu âm để tiến hành

chiết xuất táo mèo, thu dịch chiết để nghiên cứu quy trình sấy phun.

4.4. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình sấy phun dịch chiết táo mèo quy mô phòng

thí nghiệm

4.4.1. Ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến hàm mục tiêu của quá trình

Bằng một số thí nghiệm khảo sát sơ bộ, nghiên cứu sinh lựa chọn mức nghiên

cứu cơ bản ban đầu là: hàm lượng maltodextrin 9 (%, w/w), nhiệt độ khí sấy đầu vào 140 (0C) và tốc độ bơm dịch 30 (mL/phút). Khi tiến hành khảo sát đơn biến thì 1 biến được thay đổi ở các mức khác nhau và 2 biến còn lại được giữ cố định ở mức phù hợp.

a. Ảnh hưởng của hàm lượng maltodextrin bổ sung đến chất lượng sản phẩm

Hàm lượng maltodextrin bổ sung được khảo sát ở các mức 5%, 7%, 9%, 11% và 13%, 2 thông số công nghệ còn lại được giữ ở mức cơ bản là nhiệt độ khí sấy đầu vào 150 (0C) và tốc độ bơm dịch là 25 (mL/phút). Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.4.1a

Bảng 4.4.1a. Ảnh hưởng của hàm lượng matodextrin đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

TT Y2 (%)

1 2 3 4 5 Hàm lượng maltodextril (%) 5 7 9 11 13 Y1 (mg GAE/g sản phẩm) 16.28 15.51 13.12 10.83 7.54 8.11 7.32 6.91 6.22 5.76

126

Kết quả cho thấy khi hàm lượng maltodextrin tăng từ 5 đến 13 (%, w/w), hàm

lượng phenolic tổng giảm từ 16.28 – 7.54 (mg GAE/g) và độ ẩm cũng giảm từ 8.11 –

5.76 (%). Điều này có thể được giải thích rằng khi nồng độ maltodextrin tăng lên, hàm

lượng chiết xuất táo mèo của sản phẩm thu được sẽ giảm, do đó hàm lượng phenolic tổng (TPC) của sản phẩm cũng sẽ giảm. Bên cạnh đó, khi tăng nồng độ maltodextril,

bột sấy phun sẽ khô hơn và độ ẩm (MC) cũng thấp hơn. Do đó, nồng độ maltodextril

càng cao thì TPC và MC càng thấp. Dựa trên các kết quả thí nghiệm, chúng tôi thấy rằng nồng độ maltodextril trong khoảng 7-11 (%) ảnh hưởng rất lớn đến sự thay đổi

TPC và MC của sản phẩm. Do đó, chúng tôi đã chọn mức thấp, cao và cơ sở cho các

thử nghiệm tiếp theo lần lượt là 7 (%), 11 (%) và 9 (%) để xây dựng ma trận kế hoạch

thực nghiệm. Tại hàm lượng maltodextril là 9 (%), sản phẩm bột sấy phun có tổng hàm lượng phenol là 13.12 (%) và độ ẩm là 6.91 (%).

b. Ảnh hưởng của nhiệt độ khí sấy đầu vào đến chất lượng sản phẩm

Nhiệt độ khí sấy cấp vào được khảo sát ở các mức 1200C, 1300C, 1400C, 1500C, 1600C và 1700C. 2 thông số công nghệ còn lại được giữ ở mức hàm lượng maltodextril là 9 (%) và tốc độ bơm dịch 30 (mL/phút). Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.4.1b

Bảng 4.4.1b. Ảnh hưởng của nhiệt độ khí sấy cấp vào đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

TT Nhiệt độ khí sấy Y2 (%)

1 2 3 4 5 6 vào (0C) 120 130 140 150 160 170 Y1 (mg GAE/g sản phẩm) 15.78 15.12 14.69 13.23 12.56 10.77 7.11 6.78 5.98 5.31 5.1 4.92

Kết quả cho thấy khi nhiệt độ khí sấy vào tăng từ 1200C - 1700C, hàm lượng phenol (TPC) và độ ẩm (MC) tương ứng giảm từ 15.78 – 10.77 (mg GAE/g) và từ 7.11

– 4.92 (%). Những kết quả này là rõ ràng khi nhiệt độ tăng cao có xu hướng làm cho các phenolic nhạy cảm bị phân hủy nên TPC bị sụt giảm. Nhiệt độ khí sấy tăng lên làm

giảm độ ẩm của vật liệu tuy nhiên lại làm giảm TPC. Có thể thấy trong vùng nhiệt độ 1200C và 1600C, 2 hàm Y1 và Y2 có sự biến thiên tương đối lớn. Do đó, để duy trì TPC cao và đảm bảo các tiêu chuẩn về độ ẩm, nhiệt độ không khí vào ở 1400C được chọn làm mức cơ bản, mức thấp và mức cao được lựa chọn là 1200C và 1600C cho các nghiên cứu tiếp theo để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm. Ở nhiệt độ khí sấy đầu vào1400C, tổng hàm lượng phenolic đạt 14.69 (mg GAE/g) và độ ẩm là 5.98 (%).

c. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch đến chất lượng sản phẩm

127

Tốc độ bơm dịch được khảo sát ở các mức 20 (mL/phút), 25 (mL/phút), 30

(mL/phút), 35 (mL/phút), và 40 (mL/phút). 2 thông số công nghệ còn lại được giữ cố định ở các mức hàm lượng maltodextril 9 (%) và nhiệt độ khí sấy đầu vào 140 (0C). Kết quả khảo sát được biểu thị ở bảng 4.4.1c

Bảng 4.4.1c. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch đến hàm mục tiêu Y1 và Y2

TT Tốc độ bơm dịch Y2 (%)

1 2 3 4 5 (mL/phút) 20 25 30 35 40 Y1 (mg GAE/g sản phẩm) 14.89 15.25 15.96 15.34 14.45 5.25 5.34 5.62 611 6.87

Kết quả cho thấy khi tốc độ bơm dịch tăng từ 20 - 30 (mL/phút), hàm lượng

phenolic tổng (TPC) và độ ẩm (MC) tăng tương ứng từ 14.89 – 15.96 (mg GAE/g) và 5.25 – 5.62 (% ). Tiếp tục tăng tốc độ bơm dịch đến 40 (mL/phút) thì hàm lượng

phenol tổng giảm xuống 14.45 (mg GAE / g) còn độ ẩm tiếp tục tăng lên 6.87 (%). Kết

quả này cho thấy tốc độ dòng cấp liệu có thể ảnh hưởng đến việc giữ lại các vật liệu sấy phun. Cụ thể, tốc độ bơm dịch quá cao có thể làm cho sản phẩm chưa được sấy

khô bám vào bề mặt buồng sấy phun, dẫn đến hàm lượng maltodextrin cao hơn trong

sản phẩm sấy khô và từ đó làm giảm TPC. Tốc độ bơm dịch cao cũng làm cho độ ẩm

của sản phẩm tăng lên do xảy ra hiện tượng dính bết. Từ kết quả nghiên cứu, tốc độ

dòng cấp liệu là 30 (mL/phút) được chọn làm mức cơ bản, mức thấp và mức cao lần

lượt được chọn là 25 (mL/phút) và 35 (mL/phút) cho các nghiên cứu tiếp theo để xây

dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm.

4.4.2. Thiết lập mô hình và xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm

Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ đơn biến đến

hàm mục tiêu Y1 và Y2, nghiên cứu sinh lựa chọn mô hình bậc 2, kế hoạch hóa thực

nghiệm theo mô tả của Box- Behnken. Các mức gốc (0), mức thấp (-1) và mức cao

(+1), của các yếu tố (với K= 3) và khoảng biến thiên được thể hiện ở bảng 4.4.2a.

Bảng 4.4.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ

Biến thực

Biến mã A Khoảng biến thiên (Δ) 2 Mức nghiên cứu 0 9 -1 7 1 11

Z1: Hàm lượng Maltodextrin bổ sung (%, w/w) Z2: Nhiệt độ khí sấy vào (0C) Z3: tốc độ bơm dịch (mL/phút) B C 20 5 120 25 140 30 160 35

128

Sử dụng phần mềm Design expert 7.0.0 để xây dựng ma trận kế hoạch thực

nghiệm với 15 thí nghiệm. Các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 (mg GAE/g): Hàm lượng

phenolic tổng của sản phẩm và Y2 (%): Độ ẩm của sản phẩm. Kết quả thí nghiệm

được cho ở bảng 4.4.2b

Bảng 4.4.2b. Ma trận kế hoạch hóa thực nghiệm của quá trình chiết xuất

Hàm mục tiêu TT

Biến mã hóa B -1 -1 +1 +1 0 0 0 0 -1 +1 -1 +1 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Y1 (mg GAE/g) 15.56 12.26 15 9.81 15.37 10.39 14.56 11.03 14.27 12.29 13.72 12.475 13.49 13.52 13.56 Y2 (%) 6.19 7.98 5.23 5.41 6.54 7.35 6.72 7.65 7.25 5.36 7.45 5.69 6.88 6.85 6.82

A C -1 0 +1 0 -1 0 +1 0 -1 -1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 0 -1 0 -1 0 +1 0 +1 0 0 0 0 0 0 4.4.3. Kiểm tra sự có nghĩa của mô hình

Sự có nghĩa của mô hình và các hệ số được tiến hành bằng việc phân tích

phương sai (ANOVA) thể hiện ở bảng 4.4.3

Bảng 4.4.3. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y1, Y2

Y1 (mg GAE/g) Y2 (%) Nguồn

F-Value 1777.03 13313.88 1793.81 13.43 329.12 93.72 49.10 174.32 0.085 146.33 p-Value < 0.0001* < 0.0001* < 0.0001* 0.0145* < 0.0001* < 0.0001* 0.0009* < 0.0001* 0.7820NS < 0.0001* p-Value F-Value < 0.0001* 566.32 < 0.0001* 817.35 3061.31 < 0.0001* 0.0006* 60.58 < 0.0001* 307.85 0.2479NS 1.71 0.2157NS 2.01 0.6927NS 0.18 < 0.0001* 712.86 0.0002* 88.80

Model A B C AB AC BC A2 B2 C2 R2 Adj-R2 Adeq-Precision 0.9997 0.9991 136.61 0.9990 0.9973 72.67

*p < 0,05: Các giá trị có ý nghĩa; NSp > 0,05: các giá trị không có ý nghĩa

129

Kết quả phân tích của mô hình ở bảng 4.4.3 cho thấy mô hình này là hoàn toàn

tương hợp với thực nghiệm điều này được chứng minh với các chuẩn F (Fisher) của

mô hình có giá trị với hàm Y1 (1777.03) và Y2 (566.32). Các mô này có ý nghĩa thống

kê với độ tin cậy cao với các hệ số p đều có giá trị nhỏ hơn 0.0001.

Sự phù hợp của mô hình thực nghiệm cũng được kiểm chứng bằng hệ số xác định R2. Giá trị R2 càng gần 1 thì giá trị thực nghiệm càng gần với giá trị dự đoán của mô hình. Theo số liệu phân tích ở bảng 4.4.3, hệ số xác định của của 2 mô hình Y1 và Y2 lần lượt có giá trị là 0.9997 (99.97%) và 0.9990 (99.90%). Bên cạnh đó giá trị Adj R2 cũng lần lượt là 0.9991 (99.91%); 0.9973 (99.73%) đều lớn hơn 0.8 (80%) và giá trị Adeq-Precision lần lượt là 136.61; 72.67 đều lớn hơn 4. Điều này cho thấy giá trị của

hàm mục tiêu phụ thuộc vào các biến ảnh hưởng là rất lớn, mô hình thiết lập là tương hợp với thực nghiệm.

chúng ta cũng có thể đánh giá sự tương hợp của mô hình thông qua các biểu đồ

thực nghiệm và dự đoán (predicted and actual value plots) và các biểu đồ phân bố

ngẫu nhiên của các lần thí nghiệm (residuals versus runs models) thể hiện ở hình

4.4.3a. Mô hình có sự tương hợp tốt giữa thực nghiệm và lý thuyết khi các điểm thí

nghiệm tập trung theo dạng đường chéo thẳng ở đồ thị thứ nhất và phân bố của các

điểm thí nghiệm là ngẫu nhiên trong phạm vi (-3, 3) ở đồ thị thứ hai.

Hình 4.4.3a. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2

130

Sau khi loại bỏ các biến không có ý nghĩa (p> 0.05). Hàm mục tiêu Y1 và Y2 của

mô hình cũng được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:

Y1 = 13.52 – 2.13A – 0.78B – 0.067C – 0.47AB + 0.36AC + 0.18BC – 0.36A2

– 0.33C2 (1)

Y2 = 6.85 + 0.46A – 0.9B + 0.13C – 0.4AB – 0.64B2 + 0.22 C2 (2)

Sự ảnh hưởng của các yếu tố tuyến tính (A, B, C) đến giá trị hàm mục tiêu là

lớn nhất, sau đó là ảnh hưởng của các yếu tố chập (AB, AC, BC) và ảnh hưởng ít nhất đến giá trị hàm mục tiêu là các yếu tố bình phương (A2, B2, C2).

+ Từ phương trình hồi quy (1) ta có thể thấy cả 3 yếu tố A, B, C đều ảnh hưởng

nghịch biến (tương tác âm) đến hàm Y1. Trong đó mức độ ảnh hưởng của chúng theo

thứ tự giảm dần A > B > C tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình (1).

+ Tương tự như vậy, phương trình hồi quy (2) cho thấy ngay hai yếu tố A, C

ảnh hưởng đồng biến (tương tác dương) đến hàm Y2 còn yếu tố B ảnh hưởng nghịch

biến (tương tác âm) đến hàm Y2. Trong đó mức độ ảnh hưởng của chúng theo thứ tự

giảm dần B > A > C tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình (2).

(a)

(b)

Hình 4.4.3b. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng phenolic tổng (a) và độ ẩm (b) của sản phẩm sau sấy phun

Ảnh hưởng của các cặp yếu tố công nghệ thể hiện ở hiệu ứng tương tác đôi đến các hàm mục tiêu được biểu thị thông qua các bề mặt đáp ứng hàm lượng phenolic

tổng (a) và độ ẩm (b) của sản phẩm sau sấy phun hình 4.4.3b.

131

Trên các bề mặt đáp ứng, vùng màu vàng và đỏ là vùng gồm các giá trị lớn

nhất, còn mục màu xanh lam là vùng gồm các giá trị nhỏ nhất. Từ các bề mặt đáp ứng

ở hình 4.4.3b có thể đưa ra nhận xét như sau:

+ Với các bề mặt đáp ứng biểu diễn hàm Y1: Bề mặt đáp ứng thể hiện hiệu ứng tương tác đôi của 3 cặp yếu tố công nghệ (AB, AC, BC) chỉ ra rằng diện tích vùng

gồm các giá trị lớn nhất của 3 bề mặt đáp ứng này giảm dần theo thứ tương tác của các

cặp yếu tố công nghệ BC > BA > AC. Điều này hoàn phù hợp với kết quả thể hiện ở phương trình hồi quy (1) với mức độ ảnh hưởng nghịch biến đến hàm mục tiêu của 3

yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần A > B > C.

+ Với các bề mặt đáp ứng biểu diễn hàm Y2: Bề mặt đáp ứng thể hiện hiệu ứng

tương tác đôi của 3 cặp yếu tố công nghệ (AB, AC, BC) chỉ ra rằng diện tích vùng gồm các giá trị nhỏ nhất của 3 bề mặt đáp ứng này giảm dần theo thứ tương tác của

các cặp yếu tố công nghệ BC > AB > AC. Điều này hoàn phù hợp với kết quả thể hiện

ở phương trình hồi quy (2) với mức độ ảnh hưởng đồng biến của 2 yếu tố công nghệ

A, C và ảnh hưởng nghịch biến của yếu tố B đến hàm mục tiêu.

4.4.4. Tối ưu hóa quy trình sấy phun

Cũng tương tư như các bài toán trước, quá trình sấy phun dịch chiết táo mèo cần

được tối ưu sao cho hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng phenolic tổng) đạt giá trị lớn nhất và

Y2 (độ ẩm của sản phẩm) đạt giá trị nhỏ nhất. Trong bài toán này, với các mục tiêu đặt

ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu là như nhau:

+ Hàm lượng phenolic tổng của sản phẩm Y1 (mức 3)

+ Độ ẩm của sản phẩm Y2 (mức 3)

Kết quả tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0 cho ta 10 giải pháp tương ứng

với 10 bộ số liệu công nghệ khác nhau. Tuy nhiên ta cần lựa chọn giải pháp có bộ số

liệu công nghệ phù hợp với các điều kiện thí nghiệm nhất, có thể dễ dàng triển khai ở quy mô lớn hơn. Giải pháp tối ưu được lựa chọn như bảng 4.4.4. Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.4.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 15.02 (mg GAE/g) và Y2 = 5.23 (%).

Bảng 4.4.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ

Biến mã hóa Biến thực

A B C

Hàm lượng maltodextrin (%, w/w) Nhiệt độ khí sấy vào (0C) Tốc độ bơm dịch (mL/phút)

-1 1 -0,36 7 160 28.2

132

Hình 4.4.4. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình sấy phun

Mức độ đáp ứng theo hàm nguyện vọng được thể hiện ở hình 4.4.4. Theo đó với

giải pháp này thì yêu cầu đối với 3 yếu tố ảnh hưởng đều đạt 100% nguyện vọng, mục

tiêu về hàm phenolic tổng đạt 90.8% nguyện vọng và độ ẩm sản phẩm đạt 100% nguyện

vọng. Mức nguyện vọng trung bình đạt 95.29%.

4.4.5. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa

Thực nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần với bộ thông số công nghệ tại điều

kện tối ưu bao gồm hàm lượng maltodextrin bổ sung 7 (%, w/w), nhiệt độ khí sấy vào 160 (0C) và tốc độ bơm dịch 28.2 (mL/phút). Kết quả thí nghiệm được cho ở bảng 4.4.5.

Bảng 4.4.5. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại điều kiện tối ưu

Thông số công nghệ Hàm mục tiêu Kết quả

hàm lượng nhiệt độ tốc độ Thực nghiệm Lý

maltodextrin bơm dịch thuyết

(%, w/w) (mL/phút)

7 khí sấy vào (0C) 160 28,2 Y1 (mg GAE/g) 14.98 ± 0.17 15.02

Y2 (%) 5.17 ± 0.12 5.23

Kết quả bảng 4.4.5. cho thấy các kết quả thực nghiệm tại điều kiện tối ưu có giá trị gần bằng với các giá trị dự đoán của hàm mục tiêu. Do đó mô hình tính toán tối ưu là phù hợp với thực nghiệm. Nhận xét: Sản phẩm bột sấy phun táo mèo có hàm lượng phenolic tổng đạt 14.98 (mg GAE/g sản phẩm) thấp hơn 2.2 lần so với hàm lượng phenolic tổng trong cao chiết nguyên chất được chiết bằng phương pháp siêu âm (33.05 mg GAE/g cao chiết). Điều này là phù hợp do sản phẩm bột sấy phun được bổ sung chất mang maltodextril hàm lượng 7% (w/w) so với khối lượng dịch chiết (hàm lượng chất khô là 15%). Bên cạnh

đó, trong quá trình một số phenolic cũng đã bị biến chất dẫn đến sự hao hụt này.

133

4.5. Quy trình công nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm bột cao chiết táo mèo quy

mô phòng thí nghiệm

Bột nguyên liệu táo mèo (1 kg)

Chiết xuất phenolic (chiết siêu âm)

Dung môi ethanol 65%, độ pH 5.4, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 7.6/1 (v/w), nhiệt độ chiết 490C, công suất siêu âm 140W, thời gian chiết 70 phút.

Lọc dịch chiết

Dung môi

Lọc chân không sử dụng phễu buchner

Cô đặc

Nồng độ chất khô đạt 15-20%

Sấy phun

Hàm lượng maltodextrin bổ sung 7% (w/w), Nhiệt độ tác nhân sấy đầu vào 1600C, tốc độ bơm dịch 28.2 (mL/phút)

Bột cao chiết táo mèo giàu phenolic (320 g)

Hình 4.5. Sơ đồ quy trình công nghệ tạo sản phẩm bột cao chiết táo mèo quy mô

phòng thí nghiệm

134

Thuyết minh quy trình

1 kg bột nguyên liệu táo mèo sau khi tiền xử lý (độ ẩm ≤ 12%, độ mịn d ≤ 2 mm)

cho vào bình thủy tinh dung tích 15 lít. Thêm vào bình 7.6 lít ethanol thực phẩm 65%, độ

pH 5.4 (pH dung môi được điều chỉnh bằng dung dịch axit citric 0.1M với hệ đệm axit citric/natri citrate). Khuấy đều 5 phút để dung môi ngấm đều vào nguyên liệu. Đưa bình

chiết vào thiết bị bể siêu âm dung tích 20 lít (model: UCP-20, Jeiotech – Hàn quốc, công

suất siêu âm tối đa 500W). Điều chỉnh công suất siêu âm ở chế độ trung bình (140- 150W), cài đặt nhiệt độ chiết 49 ± 20C. Tiến hành chiết siêu âm trong thời gian 70 phút. Kết thúc quá trình chiết xuất, tiến hành lọc thu dịch chiết bằng phễu buchner thu được 7.2

lít dịch chiết. Sử dụng máy cô cất chân không (model R300, Buchi – Thụy sĩ) cô đặc dịch

chiết đến nồng độ chất khô 15%, lượng dịch chiết thu được là 2.1 lít.

Quá trình sấy phun dịch chiết được thực hiện trên máy sấy phun mini Buchi B290

(Viện Công nghệ sinh học – Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội). Bật máy sấy phun,

điều chỉnh và ổn định nhiệt độ tác nhân sấy đầu vào ở 1600C, đầu ra 900C. Chuẩn bị dịch

sấy phun, bổ sung 7% (w/w) chất mang maltodextrin vào dịch chiết và khuấy đều. Bật bơm

lưu lượng, điều chỉnh tốc độ bơm dịch đạt 28 mL/phút, tiến hành sấy phun. Kết thúc quá

trình sấy phun thu được 320 g bột cao chiết táo mèo giàu phenolic. Sản phẩm bột táo mèo

thu được có độ ẩm 5.2 %, hàm lượng phenolic tổng đạt 14.9 (mg GAE/g bột). Sản phẩm

được đóng túi hút chân không và bảo quản ở nhiệt độ 250C.

135

KẾT LUẬN

Luận án đã thực hiện được những kết quả bao gồm

1. Nghiên cứu thành phần hóa học

Từ phân đoạn cao chiết ethyl acetate của quả táo mèo (Docynia indica (Wall.) Decne) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 25 hợp chất bao gồm: 19 hợp chất phenolic, 5 hợp chất triterpenoid và 1 dẫn xuất của axit hữu cơ mạch thẳng. Trong đó có 1 hợp chất mới có tên là 3S-Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside và

16 hợp chất khác lần đầu phân lập từ quả táo mèo.

2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học - Hoạt tính bảo vệ tim mạch

+ Các cao chiết phân đoạn: Cao chiết ethyl acetate thể hiện hoạt tính mạnh nhất, tiếp đến lần lượt là cao chiết dichloromethane, cao nước và cao chiết methanol.

Cao chiết n-hexan thể hiện hoạt tính thấp ở nồng độ 150 µg/mL.

+ Các hợp chất phân lập được: Có 8 trong số 25 hợp chất thể hiện hoạt tính với giá trị IC50 (µM) nằm trong khoảng từ 10.0 ± 0.6 đến 88.4 ± 0.2. Trong đó 2 hợp chất TM9 và TM37 thể hiện hoạt tính mạnh nhất khi có các giá trị IC50 lần lượt là 19.3 ± 2.2 và 10.0 ± 0.6 µM.

- Hoạt tính chống oxy hóa: Có 14 trong số 25 hợp chất thể hiện hoạt tính với giá trị SC50 (µg/mL) nằm trong khoảng (18.05 ± 0.69 đến 49.34 ± 1.22). Đặc biệt, 2 hợp chất thể hiện hoạt tính bảo vệ tim mạch nhất là TM9 và TM37 cũng thể

hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh tương đương đối chứng dương với giá trị SC50 lần lượt là 29.11 ± 0.17 và 29.12 ± 0.38 (µg/mL).

- Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư cổ tử cung

(Hela)

Trong 6 cao chiết phân đoạn đem thử nghiệm thì có 2 cao chiết phân đoạn n-

hexan và dicholoromethane (CH2Cl2) là thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư cổ tử cung (Hela) với giá trị IC50 lần lượt là 99.24 µg/mL và 67.2 µg/mL. Các cao chiết phân đoạn còn lại không thể hiện hoạt tính đến nồng độ 100 µg/mL.

3. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết xuất phenolic - Đã tiến hành nghiên cứu và tối ưu hóa quá trình chiết xuất phenolic từ quả táo mèo sử dụng 3 phương pháp là chiết vi sóng, chiết siêu âm và chiết hồi lưu. Kết quả quá trình chiết xuất phenolic của 3 phương pháp tại điều kiện tối ưu đã

được đánh giá. hàm lượng phenolic tổng dao động từ 32.05 – 34.1 (mg GAE/g cao chiết) và hàm lượng cao chiết tổng thu được dao động từ 32.9 – 33.4 (%).

136

- Trong 3 phương pháp chiết xuất được nghiên cứu, phương pháp chiết siêu âm được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu nâng cấp quy mô. Các thông số công nghệ

tối ưu của phương pháp chiết siêu âm quy mô phòng thí nghiệm là: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 7.6/1 (v/w), nhiệt độ chiết siêu âm 49 (0C), công suất chiết siêu âm 140 (W), thời gian chiết 70 (phút) với dung môi chiết là ethanol 65% và pH

dung môi là 5.4. Khi đó Hàm lượng phenolic tổng là 33.05 ± 0.33 (mg GAE/g),

và hàm lượng cao chiết tổng là 32.9 ± 0.21 (%).

4. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sấy phun dịch chiết táo mèo

Các thông số công nghệ tối ưu của quy trình sấy phun là: hàm lượng chất mang maltodextrin 7 (%, w/w), nhiệt độ khí sấy vào 160 (0C) và tốc độ bơm dịch 28,2 (mL/phút). Khi đó hàm lượng phenolic tổng và độ ẩm của sản phẩm lần lượt là 14.98 ± 0.17 (mg GAE/g) và 5.17 ± 0.12 (%). Sản phẩm có màu sắc và mùi vị đặc

trưng của táo mèo, dạng bột mịn, không vón cục.

137

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên cứu và phân lập một số thành phần hóa học từ các phân đoạn

cao chiết khác của quả táo mèo như phân đoạn nước, dicholoromethane.

2. Tiếp tục nghiên cứu thăm dò hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

liên quan đến các bệnh tiểu đường, mỡ máu…

3. Tiếp tục nghiên cứu, nâng cấp quy mô và hoàn thiện công nghệ để có thể triển khai

sản xuất ở quy mô lớn

NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Lần đầu tiên áp dụng mô hình khảo sát thành phần hóa học quả táo mèo theo định hướng hoạt tính bảo vệ tim mạch. Từ phân đoạn ethyl acetate có tác dụng bảo vệ tim mạch mạnh nhất đã phân lập được 25 hợp chất trong đó có 1 hợp

chất mới và 16 hợp chất khác lần đầu tiên phân lập từ quả táo mèo.

2. Lần đầu tiến hành nghiên cứu và tối ưu hóa thông số công nghệ quá trình chiết xuất phenolic bằng 3 phương pháp chiết khác nhau là chiết vi sóng, chiết siêu

âm và chiết hồi lưu; Từ đó tiến hành so sánh, đánh giá và lựa chọn được

phương pháp chiết xuất phù hợp nhất.

3. Lần đầu tiến hành nghiên cứu và tối ưu hóa thông số công nghệ quá trình sấy phun dịch chiết táo mèo thu bột cao chiết táo mèo giàu phenolic sử dụng cho

mục đích bào chế tạo sản phẩm chăm sóc sức khỏe.

138

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

 BÀI BÁO QUỐC TẾ

1. Xuan Duy Le, Manh Cuong Nguyen, Dinh Hoang Vu, Minh Quan Pham, Quoc Long Pham, Quang Tung Nguyen, Tuan Anh Nguyen, Van Thinh Pham, Long Giang Bach, Tuong Van Nguyen. “Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Total Phenolic and Total Flavonoid from Fruits of Docynia indica (Wall.) Decne. Using Response Surface Methodology”. Processes 7.8 (2019): 485. (SCI-E, Q2), Doi:10.3390/pr7080485.

2. Le Xuan Duy, Le Ba Vinh, Gao Dan, Vu Dinh Hoang, Tran Quoc Toan, Young Ho Kim, Nguyen Manh Cuong “Soluble epoxide hydrolase inhibitors from Docynia indica (Wall.) Decne.”. Nat. Prod. Res. (2020): 1-6 (SCI-E, Q2), DOI: 10.1080/14786419.2020.1774759.

 BÀI BÁO TRONG NƯỚC

3. Lê Xuân Duy, Trần Quốc Toàn, Lê Tất Thành, Cầm Thị Ính, Đỗ Hữu Nghị, Hà Việt Hải, Vũ Đình Hoàng, Đỗ Thị Nguyệt, Phạm Quốc Long. “Một số kết quả

nghiên cứu về thành phần hóa học quả táo mèo (Docynia indica Wall.) Việt

Nam”. Tạp chí Khoa học công nghệ, tập 53 số 4C (2015) Tr 81-87.

4. Le Xuan Duy, Tran Quoc Toan, Do Huu Nghi, Le Tat Thanh, Vu Dinh Hoang, Young Ho Kim, Nguyen Manh Cuong. “Triterpene acids from Docynia indica

fruits and their cytotoxic activity”. Vietnam J. Technol 56 (2018): 199-204

5. Le Xuan Duy, Nguyen Manh Cuong, Vu Dinh Hoang, Pham Minh Quan, Lai Phuong Phuong Thao, Pham Quoc Long, Tran Quoc Toan. “Process optimization for the extraction of phenolics from the fruits of Vietnam Docynia indica (Wall.) Decne.” Proceeding of international workshop (2019) on trade

and science – technology development in the Mekong delta in the context of

international integration, pp. 506-513 (ISBN:978-604-965-263-9).

139

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc việt nam, NXB Y học, Hà nội, (1997), 1097-1098

1. 2. 3. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, Hà nội, (1999), 768 – 809. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà nội,

(1999), 355 – 356

Lua, H. T., Degrande, A., Catacutan, D., Hoa, N. T., & Cuong, V. K. “Son tra (Docynia indica) value chain and market analysis”. AFLI Technical Report No.

9 (2013).

5. Lua, H. T., Degrande, A., Catacutan, D., Hoa, N. T., & Cuong, V. K. “Study on

nutrient compositions of Son tra fruits (Docynia indica (Wall.)” AFLI Technical Report STAGE-1. (2014).

6. Đỗ Thị Hà, Nguyễn Thị Ngọc Loan, Nguyễn Minh Khởi. “Thành phần hóa học

phân đoạn n-hexan của quả Táo mèo”. Tạp chí dược liệu , tập 18, số 2 (2013):

102-108.

7. Thu, N. T. B., V. V. Tuan, and P. T. Thuong. "Flavonoids and chlorogenic acid

from ethyl acetate fraction of the fruits of Docynia indica." Journal of

Medicinal Materials 20 (2015): 283-285.

8. Dung, H. V., Bach, N. V., Trung, T. N., Nhiem, N. X., Tai, B. H., Kiem, P. V.

"Megastigmane Glycosides from Docynia indica and Their Anti‐inflammatory

Activities." Helvetica Chimica Acta 99.9 (2016): 681-686.

9. Shende, K., Singh, N., & Negi, P. "Phytochemical characterization and

biological activities of Docynia indica (Wall) fruit extracts." J Mol Genet

Med 10.204 (2016): 1747-0862.

10.

Zhang, X., Mei, X., Wang, Z., Wu, J., Liu, G., Hu, H. "Chemical Fingerprint and Quantitative Analysis for the Quality Evaluation of Docynia dcne Leaves

11.

by High-Performance Liquid Chromatography Coupled with Chemometrics Analysis." Journal of chromatographic science 56.7 (2018): 575-581 Loan, N. T. T., Tan, H. T. M., Tam, V. T. H., Luan, C. L "Anti-obesity and body weight reducing effect of Docynia indica (Wall.) Decne fruit extract fractions in experimentally obese mice." VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 27.2 (2011). Trần Thị Lệ Hằng, “Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng dung 12.

nạp glucose trên tế bào cơ vân của quả táo mèo (Docynia indica), Luận văn thạc sĩ Dược học, Học Viện Quân Y, Hà nội. (2013).

140

13. Nguyễn Thị Minh Thư. “Nghiên cứu tác dụng chống lại một số vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở

người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica. Wall.) Đại học Quốc

14. gia Hà Nội, (2012). Sharma, P. B., Handique, P. J., & Devi, H. S. "Antioxidant properties, physico-

chemical characteristics and proximate composition of five wild fruits of

15. Manipur, India." Journal of food science and technology 52.2 (2015): 894-902 Zhang, X. Y., Yi, K., Chen, J., Li, R. P., Xie, J., Jin, Y. "Purified phlorizin from

DocynIa Indica (Wall.) Decne by HSCCC, compared with whole extract,

phlorizin and non-phlorizin fragment ameliorate obesity, insulin resistance, and

improves intestinal barrier function in high-fat-diet-fed mice." Molecules 23.10 (2018): 2701

16. https://dacsansonla.com.vn/xem-san-pham/tao-meo-son-la-471.html. ngày truy

cập 31/3/2020

17. http://vov4.vov.vn/TV/chuyen-muc/dam-da-huong-vi-tao-meo-son-la-c1242-

102473.aspx. Ngày truy cập 31/3/2020.

18. https://vnexpress.net/doi-song/mua-tao-meo-noi-nui-rung-yen-bai-

2307125.html. Ngày truy cập 31/3/2020.

19. http://yenbai.gov.vn/lehoimuonglomcc/noidung/tintuc/Pages/chi-tiet-tin

tuc.aspx?ItemID=44&l=TinHoatDong. Ngày truy cập 31/3/2020.

20. Nguyễn Thị Việt Anh, Hoàn thiện công nghệ sản xuất một số sản phẩm đồ uống từ quả táo mèo, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ thuộc Đề án phát

triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến

năm 2020, Bộ Công Thương, (2018).

21. Nguyễn Văn Bạch, Nghiên cứu bào chế chế phẩm có tác dụng hạ lipid máu từ ba dược liệu táo mèo, hà thủ ô đỏ, cốt khí củ ở vùng Tây Bắc, Báo cáo tổng kết

đề tài chương trình khoa học cấp công nghệ nhà nước giai đoàn 2013 – 2018,

mã sỗ: KHCN – TB.04C/13-18, (2016).

22. Heim, K. E., Tagliaferro, A. R., & Bobilya, D. J. "Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships." The Journal of nutritional biochemistry 13.10 (2002): 572-584.

23. Wink, Michael. “Annual plant reviews, functions and biotechnology of plant

secondary metabolites”. Vol. 39. John Wiley & Sons, (2010).

24. Harborne, Jeffrey B. The flavonoids: advances in research since 1980.

Springer, (2013).

141

25. Vuolo, M. M., Lima, V. S., & Junior, M. R. M. "Phenolic Compounds:

Structure, Classification, and Antioxidant Power." Bioactive compounds.

Woodhead Publishing, (2019): 33-50.

26. Vermerris, W., & Nicholson, R. "Families of phenolic compounds and means

of classification." Phenolic compound biochemistry. Springer, Dordrecht,

(2008): 1-34.

27. Jahromi, S. G. "Extraction Techniques of Phenolic Compounds from Plants."

Plant Physiological Aspects of Phenolic Compounds. IntechOpen, (2019).

28. Jiao, T., Li, C., Zhuang, X., Cao, S., Chen, H. "The new liquid–liquid extraction

method for separation of phenolic compounds from coal tar." Chemical

Engineering Journal 266 (2015): 148-155.

29. Yu, J., Ahmedna, M., & Goktepe, I. "Effects of processing methods and

extraction solvents on concentration and antioxidant activity of peanut skin

phenolics." Food chemistry 90.1-2 (2005): 199-206.

30. Garcia-Salas, P., Morales-Soto, A., Segura-Carretero, A. "Phenolic-compound-

extraction systems for fruit and vegetable samples." Molecules 15.12 (2010):

8813-8826.

31. Cheynier, V. "Phenolic compounds: from plants to foods." Phytochemistry

reviews 11.2-3 (2012): 153-177.

32. Ji, Y., Hou, Y., Ren, S., Yao, C. "Highly efficient separation of phenolic

compounds from oil mixtures by imidazolium-based dicationic ionic liquids via

forming deep eutectic solvents." Energy & Fuels 31.9 (2017): 10274-10282.

33. Altemimi, A., Watson, D. G., Choudhary, R. "Ultrasound assisted extraction of

phenolic compounds from peaches and pumpkins." PloS one 11.2 (2016):

e0148758.

34. Wang, C., Tallian, C., Su, J., Vielnascher, R., Silva. "Ultrasound-assisted

extraction of hemicellulose and phenolic compounds from bamboo bast fiber

powder." PloS one 13.6 (2018).

35. Olmo-García, L., Bajoub, A., Benlamaalam, S. "Establishing the phenolic

composition of Olea europaea L. leaves from cultivars grown in Morocco as a

crucial step towards their subsequent exploitation." Molecules 23.10 (2018): 2524.

36. Tao, Y., Zhang, Z., & Sun, D. W. "Kinetic modeling of ultrasound-assisted

extraction of phenolic compounds from grape marc: influence of acoustic energy

density and temperature." Ultrasonics Sonochemistry 21.4 (2014): 1461-1469.

142

37. Oniszczuk, A., Podgórski, R., Oniszczuk, T. "Extraction methods for the from Equisetum arvense L.

determination of phenolic compounds herb." Industrial Crops and Products 61 (2014): 377-381.

38. Carrera, C., Ruiz-Rodríguez, A., Palma, M. "Ultrasound assisted extraction of phenolic compounds from grapes." Analytica chimica acta 732 (2012): 100-104.

40.

39. Mazza, K. E., Santiago, M. C., do Nascimento, L. S. "Syrah grape skin valorisation using ultrasound‐assisted extraction: Phenolic compounds recovery, antioxidant capacity and phenolic profile." International journal of food science & technology 54.3 (2019): 641-650. Zardo, I., de Espíndola Sobczyk, A., Marczak, L.D.F. "Optimization of ultrasound assisted extraction of phenolic compounds from sunflower seed cake using response surface methodology." Waste and biomass valorization 10.1 (2019): 33-44.

41. Han, D., Zhu, T., & Row, K. H. "Ultrasonic extraction of phenolic compounds liquid as extraction ionic japonica Aresch using

42.

43.

the antioxidant properties of

from Laminaria solvent." Bulletin of the Korean Chemical Society 32.7 (2011): 2212-2216. Sheng, Z., Zhao, J., Muhammad, I. "Optimization of total phenolic content from Terminalia chebula Retz. fruits using response surface methodology and evaluation of their antioxidant activities." PloS one 13.8 (2018). Turrini, F., Boggia, R., Leardi, R. "Optimization of the ultrasonic-assisted extraction of phenolic compounds from Oryza sativa L.‘Violet Nori’and its caryopses and determination of leaves." Molecules 23.4 (2018): 844.

45.

44. Abdelkebir, R., Alcántara, C., Falcó, I., Sánchez, G. "Effect of ultrasound technology combined with binary mixtures of ethanol and water on antibacterial and antiviral activities of Erodium glaucophyllum extracts." Innovative food science & emerging technologies 52 (2019): 189-196. Sookjitsumran, W., Devahastin, S., Mujumdar, A. S. "Comparative evaluation of microwave assisted extraction and preheated solvent extraction of bioactive compounds from a plant material: a case study with cabbages." International Journal of Food Science & Technology 51.11 (2016): 2440-2449.

46. Vlaisavljević, S., Kaurinović, B., Popović, M. "Profile of phenolic compounds in Trifolium pratense L. extracts at different growth stages and their biological activities." International journal of food properties 20.12 (2017): 3090-3101. Proestos, C., & Komaitis, M. "Ultrasonically assisted extraction of phenolic 47.

compounds from aromatic plants: comparison with conventional extraction

technics." Journal of food quality 29.5 (2006): 567-582.

143

48. Laghari, A. Q., Memon, S., Nelofar, A. "Extraction, identification and

antioxidative properties of the flavonoid-rich fractions from leaves and flowers of

Cassia angustifolia." American Journal of Analytical Chemistry 2.08 (2011): 871.

49. Guolin, H., Jeffrey, S., Kai, Z., Xiaolan, H. "Application of ionic liquids in the

microwave-assisted extraction of pectin from lemon peels." Journal of

analytical methods in chemistry 2012 (2012).

50. Liu, Z., Jia, J., Chen, F., Yang, F., Zu, Y. "Development of an ionic liquid-based

microwave-assisted method for the extraction and determination of taxifolin in

different parts of Larix gmelinii." Molecules 19.12 (2014): 19471-19490.

51. Yuan, Y., Zhang, J., Fan, J., Clark, J. "Microwave assisted extraction of

phenolic compounds from four economic brown macroalgae species and

evaluation of their antioxidant activities and inhibitory effects on α-amylase, α-

glucosidase, pancreatic lipase and tyrosinase." Food Research International 113

(2018): 288-297.

52. Alara, O. R., Abdurahman, N. H. "Vernonia cinerea leaves as the source of

phenolic compounds, antioxidants, and anti-diabetic activity using microwave-

assisted extraction technique." Industrial Crops and Products 122 (2018): 533-544.

53. Özbek, H. N., Halahlih, F., Göğüş, F., Yanık, D. K. "Pistachio (Pistacia vera L.)

Hull as a potential source of phenolic compounds: Evaluation of ethanol–water

binary solvent extraction on antioxidant activity and phenolic content of

pistachio hull extracts." Waste and Biomass Valorization (2018): 1-10.

54. Hernández, Y. R., García Serrano, L. A., Maruri, D. T. "Optimization of the microwave-assisted ethanosolv extraction of lignocellulosic compounds from the

bagasse of agave angustifolia haw using the response methodology." Journal of

agricultural and food chemistry 66.13 (2018): 3533-3540.

55. Vatai, T., Škerget, M., & Knez, Ž. "Extraction of phenolic compounds from elder berry and different grape marc varieties using organic solvents and/or supercritical carbon dioxide." Journal of Food Engineering 90.2 (2009): 246-254. 56. Marques, L. L. M., Panizzon, G. P., Aguiar, B. A. A. "Guaraná (Paullinia cupana) seeds: Selective supercritical extraction of phenolic compounds." Food chemistry 212 (2016): 703-711. Pereira, P., Cebola, M. J., Oliveira, M. C. "Supercritical fluid extraction vs 57.

conventional extraction of myrtle leaves and berries: Comparison of antioxidant

activity and identification of bioactive compounds." The journal of supercritical

fluids 113 (2016): 1-9.

144

58. Tan, C. X., Chong, G. H., Hamzah, H. "Characterization of virgin avocado oil

obtained via advanced green techniques." European journal of lipid science and

technology 120.10 (2018): 1800170.

59. Khaw, K. Y., Parat, M. O., Shaw, P. N. "Solvent supercritical fluid technologies to extract bioactive compounds from natural sources: a review." Molecules 22.7

(2017): 1186.

60. Nguyễn Minh Tuyển, Quy hoạch thực nghiệm. Nhà Xuất Bản Khoa học và Kỹ

thuật, (2005).

61. Phạm Hồng Hải, Ngô Kim Chi, Xử lý số liệu và quy hoạch thực nghiệm trong

nghiên cứu Hóa học. Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, (2007).

62.

Singleton, V. L., Orthofer, R., & Lamuela-Raventós, R. M. "[14] Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-

ciocalteu reagent." Methods in enzymology. Vol. 299. Academic press, (1999):

152-178.

63. Zhishen, J., Mengcheng, T., & Jianming, W. "The determination of flavonoid

contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals." Food

chemistry 64.4 (1999): 555-559.

64. Kim, J. H., Cho, I. S., Ryu, J., Lee, J. S. "In vitro and in silico investigation of anthocyanin derivatives as soluble epoxide hydrolase inhibitors." International

journal of biological macromolecules 112 (2018): 961-967.

65. Thao, N. P., Luyen, B. T. T., Lee, J. S. "Inhibition potential of cycloartane-type

glycosides from the roots of Cimicifuga dahurica against soluble epoxide

hydrolase." Journal of natural products 80.6 (2017): 1867-1875.

66. Gorinstein, S., Haruenkit, R., Park, Y. S., Jung, S. T. "Bioactive compounds and antioxidant potential in fresh and dried Jaffa® sweeties, a new kind of citrus fruit." Journal of the Science of Food and Agriculture 84.12 (2004):

1459-1463.

67. Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., & Cloos, J. "Cell sensitivity assays: the MTT

assay." Cancer cell culture. Humana Press, 2011. 237-245.

68. Nguyễn Văn Hân, Kỹ thuật chiết xuất dược liệu. Nhà xuất bản Y học, (2017). 69. Nguyễn Thượng Dong, Nghiên cứu thuốc từ thảo dược. Nhà xuất bản Khoa học

kỹ thuật, (2006).

70. Dent, M., Dragović-Uzelac, V., Penić, M. "The effect of extraction solvents, temperature and time on the composition and mass fraction of polyphenols in Dalmatian wild sage (Salvia officinalis L.) extracts." Food technology and

biotechnology 51.1 (2013): 84-91.

145

71. Friedman, M., & Jürgens, H. S. "Effect of pH on the stability of plant phenolic

compounds." Journal of agricultural and food chemistry 48.6 (2000): 2101-2110.

72. TOSHIKAWA, M., UCHIDA, E., CHATANI, N., KOBAYASHI, H.

"Thunberginols C, D, and E, new antiallergic and antimicrobial dihydroisocoumarins, and thunberginol G 3'-O-glucoside and (-)-hydrangenol

4'-O-glucoside, new dihydroisocoumarin glycosides, from Hydrangeae Dulcis

Folium". Chemical and pharmaceutical bulletin 40.12 (1992): 3352-3354. Shimoda, H., MURAKAMI, 73. Yoshikawa, M., Ueda, T., T.

“Dihydroisocoumarin constituents from the leaves of Hydrangea macrophylla

var. thunbergii (2).: Absolute stereostructures of hydrangenol, thunberginol I,

and phyllodulcin glycosides and isomerization reaction at the 3-positions of phyllodulcin and its glycosides”. Chemical and pharmaceutical bulletin 47.3

(1999): 383-387.

74. Liu, J., Nakamura, S., Zhuang, Y., Yoshikawa, M. "Medicinal Flowers. XXXX.

1) Structures of Dihydroisocoumarin Glycosides and Inhibitory Effects on

Aldose Reducatase from the Flowers of Hydrangea macrophylla var.

thunbergii." Chemical and Pharmaceutical Bulletin 61.6 (2013): 655-661.

75. Liu, H., Mou, Y., Zhao, J., Wang, J. "Flavonoids from Halostachys caspica and

their antimicrobial and antioxidant activities." Molecules 15.11 (2010): 7933-7945.

76. Feizi, S., Jabbari, M., & Farajtabar, A. "A systematic study on solubility and

solvation of bioactive compound chrysin in some water+ cosolvent

mixtures." Journal of Molecular Liquids 220 (2016): 478-483.

77. Zhang, Y., Wang, D., Yang, L., Zhou, D. "Purification and characterization of

flavonoids from the leaves of Zanthoxylum bungeanum and correlation

between their structure and antioxidant activity." PloS one 9.8 (2014). Chang, S. W., Kim, K. H., Lee, I. K. "Phytochemical constituents of Geranium 78.

eriostemon." Nat. Prod. Sci 15.3 (2009): 151-155.

79. Khan, Z. I., Ahmad, K., Safdar, H., Ugulu, I.. "Research Journal of

80.

81.

Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences." (2012). da Silva, L. A. L., Faqueti, L. G. "Phytochemical analysis of Vernonanthura tweedieana and a validated UPLC-PDA method for the quantification of eriodictyol." Revista Brasileira de Farmacognosia 25.4 (2015): 375-381. Jusoh, S., Zakaria, Z., & Din, L. B. "Isolation of astilbin from leaves of Cratoxylum arborescens." Malaysian Journal of Analytical Sciences 17.3 (2013): 430-435.

146

82. Ragab, E. A., Hosny, M., Kadry, H. A. "Flavanone glycosides from Gleditsia

caspia." J Nat Prod 3 (2010): 35-46.

83. Sun, J. M., Yang, J. S., & Zhang, H. "Two new flavanone glycosides of their anti-oxidant activities." Chemical and lanceolarium and

Jasminum pharmaceutical bulletin 55.3 (2007): 474-476.

84. Lu, Y., & Foo, L. Y. "Identification and quantification of major polyphenols in

apple pomace." Food Chemistry 59.2 (1997): 187-194.

85. Kurkina, A. V., Ryazanova, T. K. "Flavonoids from the Aerial Part of Polygonum

hydropiper." Chemistry of natural compounds 49.5 (2013): 830-832.

86. Alves, J. S., de Castro, J. C., Freire, M. O. "Complete assignment of the 1H and 13C NMR spectra of four triterpenes of the ursane, artane, lupane and friedelane groups." Magnetic Resonance in Chemistry 38.3 (2000): 201-206.

87. Hou, W., Li, Y., Zhang, Q., Wei, X., Peng, A. "Triterpene acids isolated from Lagerstroemia speciosa leaves as α‐glucosidase inhibitors." Phytotherapy

Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and

Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives 23.5 (2009): 614-618.

88. Cheng, J. J., Zhang, L. J., Cheng, H. L. "Cytotoxic hexacyclic triterpene acids

from Euscaphis japonica." Journal of natural products 73.10 (2010): 1655-1658. 89. Woo, K. W., Han, J. Y., Choi, S. U. "Triterpenes from Perilla frutescens var. acuta and their cytotoxic activity." Natural Product Sciences 20.2 (2014): 71-75. 90. Kim, D. H., Han, K. M., Chung, I. S. "Triterpenoids from the flower of Campsis grandiflora K. Schum. as human acyl-CoA: cholesterol acyltransferase

inhibitors." Archives of pharmacal research 28.5 (2005): 550-556.

91. Eldahshan, O. A. "Isolation and structure elucidation of phenolic compounds of

carob leaves grown in Egypt." Curr Res J Biol Sci 3.1 (2011): 52-55.

92. Kane, C. J., Menna, J. H., & Yeh, Y. C. "Methyl gallate, methyl-3, 4, 5- trihydroxy-benzoate, is a potent and highly specific inhibitor of herpes simplex

93.

virusin vitro. I. Purification and characterization of methyl gallate fromSapium sebiferum." Bioscience reports 8.1 (1988): 85-94. Chang, S. W., Kim, K. H., Lee, I. K. "Phytochemical constituents of Bistorta manshuriensis." Nat. Prod. Sci 15 (2009): 234-240.

95.

94. Meyhoff, U., Riber, U., & Boas, U. "Convergent synthesis of degradable dendrons based on L-malic acid." New Journal of Chemistry 39.2 (2015): 1161-1171. Deyama, T., IKAWA, T. "The constituents of Eucommia ulmoides Oliv. V. isomers and phenolic Isolation of dihydroxydehydrodiconiferyl alcohol

compounds." Chemical and pharmaceutical bulletin 35.5 (1987): 1785-1789.

147

96. Zhu, X., Dong, X., Wang, Y., Ju, P. "Phenolic compounds from Viburnum

cylindricum." Helvetica Chimica Acta 88.2 (2005): 339-342.

97. Georgopoulou, C., Aligiannis, N Georgopoulou, C., Aligiannis, N., Fokialakis,

N. "Acretoside, a new sucrose ester from Aristolochia cretica." Journal of Asian natural products research 7.6 (2005): 799-803.

98. Jiang, Z. H., Hirose, Y., Iwata, H., Sakamoto, S. "Caffeoyl, coumaroyl, galloyl,

and hexahydroxydiphenoyl glucoses from Balanophora japonica." Chemical and pharmaceutical bulletin 49.7 (2001): 887-892.

99. Foo, L. Y., Lu, Y., Molan, A. L., Woodfield, D. R. "The phenols and

prodelphinidins of white clover flowers." Phytochemistry 54.5 (2000): 539-548. 100. Khanh, P. N., Duc, H. V., Huong, T. T., Son, N. T. "Alkylphloroglucinol derivatives and triterpenoids with soluble epoxide hydrolase inhibitory activity

from Callistemon citrinus." Fitoterapia 109 (2016): 39-44

101. Vinh, L. B., Kim, J. H., Lee, J. S., Nguyet, N. T. M. "Soluble epoxide hydrolase inhibitory activity of phenolic glycosides from Polygala tenuifolia and in silico

approach." Medicinal Chemistry Research 27.3 (2018): 726-734.

102. Aquino, R., Morelli, S., Lauro, M. R. "Phenolic constituents and antioxidant activity of an extract of anthurium v ersicolor leaves." Journal of Natural

Products 64.8 (2001): 1019-1023.

103. Wang, L., Qin, P., & Hu, Y. "Study on the microwave-assisted extraction of polyphenols from tea." Frontiers of Chemical Engineering in China 4.3 (2010):

307-313.

104. Dent, M., Dragović-Uzelac, V., Penić, M. "The effect of extraction solvents, temperature and time on the composition and mass fraction of polyphenols in

Dalmatian wild sage (Salvia officinalis L.) extracts." Food technology and biotechnology 51.1 (2013): 84-91.

105. Su, D., Li, H., & Lu, C. "Microwave Extraction of Polyphenol from

Pomegranate Seed." Asian J. Bot.(Transferred) 1 (2018): 36-46.

106. Friedman, M., & Jürgens, H. S. "Effect of pH on the stability of plant phenolic

compounds." Journal of agricultural and food chemistry 48.6 (2000): 2101-2110.

108.

107. Guan, X., & Yao, H. "Optimization of Viscozyme L-assisted extraction of oat bran protein using response surface methodology." Food chemistry 106.1 (2008): 345-351. Zabeti, M., Daud, W. M. A. W. "Optimization of the activity of CaO/Al2O3 catalyst for biodiesel production using response surface methodology." Applied

Catalysis A: General 366.1 (2009): 154-159.

148

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A: PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT HÓA HỌC

149

PHỤ LỤC 1. PHỔ HỢP CHẤT TM1

1H-NMR-MEOD –TM1

13C-NMR-MEOD

150

PHỤ LỤC 2. PHỔ HỢP CHẤT TM2

151

PHỤ LỤC 3. PHỔ HỢP CHẤT TM3

152

PHỤ LỤC 4. PHỔ HỢP CHẤT TM5

1H-NMR-MEOD

13C-NMR-MEOD

153

PHỤ LỤC 5. PHỔ HỢP CHẤT TM6

154

PHỤ LỤC 6. PHỔ HỢP CHẤT TM7

155

156

PHỤ LỤC 7. PHỔ HỢP CHẤT TM8

1H-NMR-DMSO

13C-NMR-DMSO

157

PHỤ LỤC 8. PHỔ HỢP CHẤT TM9

158

PHỤ LỤC 9. PHỔ HỢP CHẤT TM10

159

160

PHỤ LỤC 10. PHỔ HỢP CHẤT TM12

161

PHỤ LỤC 11. PHỔ HỢP CHẤT TM13

1H-NMR-MEOD

13C-NMR-MEOD

162

PHỤ LỤC 12. PHỔ HỢP CHẤT TM15

163

PHỤ LỤC 13. PHỔ HỢP CHẤT TM16

164

PHỤ LỤC 14. PHỔ HỢP CHẤT TM17

165

166

167

168

169

170

171

172

PHỤ LỤC 15. PHỔ HỢP CHẤT TM18

173

174

175

PHỤ LỤC 16. PHỔ HỢP CHẤT TM20

176

PHỤ LỤC 17. PHỔ HỢP CHẤT TM22

1H-NMR-MEOD

13C-NMR-MEOD

177

PHỤ LỤC 18. PHỔ HỢP CHẤT TM23

1H, 13C-NMR-PYRIDIN

178

PHỤ LỤC 19. PHỔ HỢP CHẤT TM24

1H,13C-NMR-PYRIDIN

179

PHỤ LỤC 20. PHỔ HỢP CHẤT TM25

180

181

182

PHỤ LỤC 21. PHỔ HỢP CHẤT TM30

183

184

185

PHỤ LỤC 22. PHỔ HỢP CHẤT TM33

186

187

188

189

PHỤ LỤC 23. PHỔ HỢP CHẤT TM35

190

191

192

193

PHỤ LỤC 24. PHỔ HỢP CHẤT TM36

194

195

196

PHỤ LỤC 25. PHỔ HỢP CHẤT TM37

197

198

199

200

PHỤ LỤC B

TÍNH TOÁN NĂNG LƯỢNG BỀN CÁC CẤU DẠNG CỦA HỢP CHẤT TM17

Cartesian coordinate and thermochemistry data of the five most stable boat- and chair-like conformers calculated at the M05-2X/6-311++G(d,p) level of theory in vacuo. Relative enthalpy of the conformer compared with the most stable one is also noted.

kcal/mol

201

Boat Conformer 1 0 1 C -4.80872800 0.11321800 -0.58327400 C -4.19895600 -0.81119800 0.47419600 C -2.62909200 0.99270400 0.80799600 C -3.58409700 2.06593300 0.27560900 C -4.96210900 1.48323700 0.03817400 H -5.01711100 -1.13619400 1.11993000 H -4.15857700 0.17998000 -1.46261700 H -2.03499900 1.40725200 1.61964700 H -3.19695200 2.42239800 -0.68116300 H -5.47532300 1.37775700 1.00048100 O -3.28028600 -0.12667300 1.33660200 O -1.78425000 0.63140600 -0.27994000 O -3.61814900 3.11438800 1.22455200 H -4.26811500 3.75555400 0.92465500 O -5.66511000 2.37834300 -0.79974700 H -6.45732000 1.92325000 -1.10201900 O -6.10007600 -0.32691900 -0.96579200 H -5.99722300 -1.20689800 -1.34400400 C -3.53707100 -2.02925300 -0.15291800 H -2.74411800 -1.72099200 -0.83105900 H -3.10840600 -2.66842900 0.61908100 O -4.50986500 -2.72951000 -0.93729200 H -4.90981100 -3.41818100 -0.40505800 C -0.65702000 -0.08886900 -0.02328200 C 0.19682900 -0.25181500 -1.12412300 C -0.35766600 -0.63559600 1.21235500 C 1.37056100 -0.94905000 -0.96675000 H -0.08036200 0.19087300 -2.07041800 C 0.83368800 -1.34887500 1.36640100 H -1.02528600 -0.56922900 2.05628800 C 1.71559200 -1.49584700 0.28067300 C 2.96140500 -2.24543600 0.45649700 C 2.33335800 -1.17928100 -2.09664500 H 2.13370500 -2.15153700 -2.55305100 H 2.22410800 -0.42596200 -2.87405000 C 3.74945400 -1.20486700 -1.54941200 O 3.84274200 -2.25967600 -0.55884100 H 4.44167200 -1.53246800 -2.32198700 O 3.22493100 -2.87433600 1.46306800 C 4.23557300 0.09755300 -0.94333900 C 5.29759000 0.06775000 -0.04175600 C 3.68922900 1.33351500 -1.28311300 C 5.80156300 1.23741400 0.50676900 H 5.72662300 -0.88276800 0.24454400 C 4.18676700 2.50989600 -0.74385700 H 2.85501200 1.39750200 -1.96696300 C 5.24596800 2.46222000 0.15298400 H 6.62373600 1.19627100 1.21099800 H 3.76048700 3.46935000 -0.99913000 O 5.69708200 3.64350500 0.65872700

202

H 6.41126400 3.48186700 1.27810600 O 1.07905500 -1.88013000 2.56590300 H 1.91137000 -2.39270600 2.50076800 - Thermochemistry data - Zero-point correction= 0.425530 (Hartree/Particle) Thermal correction to Energy= 0.452847 Thermal correction to Enthalpy= 0.453791 Thermal correction to Gibbs Free Energy= 0.365566 Sum of electronic and zero-point Energies= -1565.600106 Sum of electronic and thermal Energies= -1565.572789 Sum of electronic and thermal Enthalpies= -1565.571845 Sum of electronic and thermal Free Energies= -1565.660070 Boat Conformer 2 0 1 C -4.83176500 0.11164000 -0.58894700 C -4.21810900 -0.80902600 0.46958200 C -2.65125500 0.99914600 0.79898800 C -3.60738400 2.06795500 0.25933000 C -4.98547300 1.48313400 0.02915000 H -5.03445200 -1.13564800 1.11661500 H -4.18355300 0.17703100 -1.46993800 H -2.06107900 1.41799300 1.61136300 H -3.22246300 2.41607100 -0.70144500 H -5.49563700 1.37993800 0.99330700 O -3.30087600 -0.11989000 1.32986600 O -1.80147300 0.63701500 -0.28475100 O -3.63985000 3.12534300 1.19855600 H -4.29781700 3.75836400 0.89862100 O -5.69204100 2.37511700 -0.80919500 H -6.48439000 1.91812400 -1.10831800 O -6.12316200 -0.33118300 -0.96742600 H -6.02034200 -1.21392800 -1.33931800 C -3.55292600 -2.02573600 -0.15648300 H -2.75797400 -1.71582800 -0.83164700 H -3.12632700 -2.66527100 0.61623900 O -4.52450700 -2.72521200 -0.94338200 H -4.90402000 -3.43436100 -0.42347200 C -0.67311300 -0.07993200 -0.02173800 C 0.18642600 -0.24161300 -1.11789200 C -0.37762700 -0.62394400 1.21605100 C 1.36225800 -0.93512200 -0.95397700 H -0.08774600 0.19821100 -2.06654800 C 0.81415800 -1.33557900 1.37592100 H -1.04925300 -0.55862100 2.05689700 C 1.70200400 -1.48114400 0.29448500 C 2.94498700 -2.23615300 0.47523600 C 2.33045100 -1.15926100 -2.08112600 H 2.12189400 -2.12280600 -2.55158400 H 2.23354700 -0.39313800 -2.84839700 C 3.74523800 -1.20408800 -1.53410500 O 3.82804700 -2.25659800 -0.53669800 H 4.43049000 -1.54822700 -2.30549800 O 3.19861200 -2.86683000 1.48293300 C 4.26217600 0.08946100 -0.93901800

203

C 3.63420400 1.31473600 -1.12329200 C 5.44349700 0.05176600 -0.19347200 C 4.16974700 2.47906900 -0.58370700 H 2.70898400 1.38426400 -1.67705400 C 5.98430300 1.20169100 0.35092000 H 5.93294500 -0.89878300 -0.02790900 C 5.34482100 2.42210000 0.15298800 H 3.66530200 3.42635000 -0.73052500 H 6.89432500 1.17653600 0.93293900 O 5.91551900 3.52627400 0.70891100 H 5.37671800 4.29894500 0.52866700 O 1.05402100 -1.86656300 2.57609400 H 1.88682800 -2.37959600 2.51437300 - Thermochemistry data - Zero-point correction= 0.425623 (Hartree/Particle) Thermal correction to Energy= 0.452856 Thermal correction to Enthalpy= 0.453800 Thermal correction to Gibbs Free Energy= 0.366223 Sum of electronic and zero-point Energies= -1565.599802 Sum of electronic and thermal Energies= -1565.572569 Sum of electronic and thermal Enthalpies= -1565.571625 Sum of electronic and thermal Free Energies= -1565.659202 Boat Conformer C3 0 1 C 3.57465800 0.69185900 -0.60544100 C 2.45805800 1.02583400 0.38464000 C 2.50766900 -1.34840800 0.86947100 C 3.96845100 -1.51324900 0.43997700 C 4.58582700 -0.16477600 0.12526000 H 2.81977000 1.84749700 1.00430100 H 3.18089200 0.14789000 -1.47090500 H 2.29875700 -1.99845000 1.71709000 H 3.98994800 -2.11942200 -0.46755500 H 4.84427100 0.33340200 1.06656900 O 2.19115600 -0.05412500 1.29174900 O 1.72609200 -1.74480000 -0.25455500 O 4.65223900 -2.16424500 1.49461000 H 5.58014600 -2.21378100 1.24986500 O 5.74990500 -0.39679800 -0.64221300 H 6.03284800 0.45381700 -0.99253700 O 4.24581300 1.86563100 -1.02761300 H 3.57821100 2.47170200 -1.37017400 C 1.17723400 1.46691200 -0.30125600 H 0.80879400 0.68618900 -0.97024500 H 0.41555700 1.67750500 0.45056900 O 1.52203500 2.64082300 -1.03934600 H 0.72704200 3.11466700 -1.30263900 C 0.37304000 -1.82013400 -0.14357700 C -0.33671200 -1.43178000 1.00255100 C -0.27869600 -2.28289500 -1.27676800 C -1.71482900 -1.43783200 0.94948700 H 0.17032700 -1.05910400 1.87758100 C -1.66686400 -2.31521700 -1.31312700 H 0.29000500 -2.60169000 -2.13727600

204

C -2.39626300 -1.84740100 -0.20154100 C -3.84352000 -1.66337400 -0.31737300 C -2.57005500 -0.94064000 2.07806800 H -3.03528100 -1.77672100 2.60491100 H -1.97987200 -0.36877700 2.79147400 C -3.66745000 -0.06367100 1.47847600 O -4.45481000 -0.84381000 0.56098700 O -4.51422300 -2.17004300 -1.19370700 H -4.37729800 0.23179400 2.24767900 C -3.08342200 1.17000800 0.81836200 C -2.50199300 2.14073500 1.63025900 C -3.03465800 1.34130600 -0.56182200 C -1.83645400 3.22974900 1.08480200 H -2.55366400 2.04451400 2.70807900 C -2.36592100 2.42095500 -1.12136500 H -3.52145200 0.63626000 -1.21992900 C -1.74535500 3.34700700 -0.29675600 H -1.37055500 3.96517900 1.72932200 H -2.31140800 2.54998900 -2.19320800 O -1.01353300 4.33737000 -0.90326400 H -0.73949800 4.99129700 -0.25569000 O -2.25946800 -2.75846100 -2.42626000 H -3.22564700 -2.73602800 -2.28435200 Zero-point correction= 0.426645 (Hartree/Particle) Thermal correction to Energy= 0.453141 Thermal correction to Enthalpy= 0.454085 Thermal correction to Gibbs Free Energy= 0.370887 Sum of electronic and zero-point Energies= -1565.604731 Sum of electronic and thermal Energies= -1565.578235 Sum of electronic and thermal Enthalpies= -1565.577291 Sum of electronic and thermal Free Energies= -1565.660489 Boat Conformer C4 0 1 C 4.01249600 1.07634300 -0.55081900 C 2.80707300 1.38074600 0.34408300 C 2.83799500 -0.98935700 0.78929700 C 4.32549400 -1.14488600 0.45987300 C 4.96678800 0.21023300 0.24087500 H 3.10012300 2.20710100 0.99556300 H 3.69978800 0.54513500 -1.45608600 H 2.57955200 -1.66623100 1.60062300 H 4.41098100 -1.71627100 -0.46656000 H 5.14415100 0.68101000 1.21437300 O 2.49152600 0.29514300 1.22761000 O 2.12599200 -1.33389500 -0.39100200 O 4.92829200 -1.83842000 1.53569900 H 5.87023800 -1.89370900 1.35368300 O 6.18941100 -0.00034700 -0.43480700 H 6.49689400 0.85760000 -0.74372300 O 4.70563600 2.26307800 -0.89766200 H 4.10530500 2.79785600 -1.42748600 C 1.58746500 1.78952700 -0.46993900 H 1.32136200 1.00872800 -1.17860800 H 0.73232200 1.96898100 0.18379100

205

O 1.91342500 2.94871700 -1.24322800 H 1.80087200 3.72966900 -0.69925700 C 0.77754200 -1.52353700 -0.31466200 C 0.03566900 -1.33209200 0.85851300 C 0.17410400 -1.91990300 -1.49661600 C -1.32772000 -1.54623300 0.81629300 H 0.49969300 -0.98752100 1.76907300 C -1.19830100 -2.13752900 -1.53414200 H 0.76708000 -2.07681700 -2.38506700 C -1.96574900 -1.93263600 -0.36829300 C -3.41588600 -2.13982700 -0.40948000 C -2.19546500 -1.38485000 2.03190800 H -2.34701500 -2.35825600 2.50419800 H -1.72948500 -0.73541700 2.76988300 C -3.55362900 -0.85570400 1.60688000 O -4.13947800 -1.79032600 0.66974700 O -3.99241600 -2.62897300 -1.36010100 H -4.24499200 -0.88184300 2.44650300 C -3.54087100 0.53372900 0.99678700 C -2.58332200 1.48322300 1.33546000 C -4.55112800 0.89948700 0.10432600 C -2.63039800 2.76693000 0.80374600 H -1.78029000 1.24027000 2.01708500 C -4.60405500 2.17219100 -0.43627600 H -5.29990800 0.17163400 -0.17629800 C -3.64174800 3.11177000 -0.08350500 H -1.88032500 3.49770300 1.08243700 H -5.38125400 2.45580200 -1.13131000 O -3.74014300 4.35140500 -0.63893300 H -3.02917200 4.91090500 -0.32148100 O -1.73770200 -2.53686600 -2.68768500 H -2.69040200 -2.69819700 -2.53428400 - Thermochemistry data - Zero-point correction= 0.425863 (Hartree/Particle) Thermal correction to Energy= 0.452929 Thermal correction to Enthalpy= 0.453873 Thermal correction to Gibbs Free Energy= 0.366571 Sum of electronic and zero-point Energies= -1565.598595 Sum of electronic and thermal Energies= -1565.571529 Sum of electronic and thermal Enthalpies= -1565.570585 Sum of electronic and thermal Free Energies= -1565.657887 Boat Conformer C5

0 1 C 3.62233000 0.73118200 -0.53838900 C 2.55305600 1.01818200 0.51533700 C 2.52246100 -1.39192700 0.78365700 C 3.96705000 -1.56725100 0.30512000 C 4.62312600 -0.21829400 0.08401000 H 2.96995700 1.76224900 1.19548100 H 3.18095300 0.27634600 -1.43186200 H 2.30740100 -2.10713300 1.57547300 H 3.94689400 -2.09774400 -0.64861900 H 4.92663500 0.18954900 1.05494700 O 2.26188000 -0.13066700 1.32614900 O 1.70379600 -1.66302900 -0.35161100 O 4.65181100 -2.32415100 1.28588200 H 5.57212500 -2.38183500 1.01562000 O 5.75530400 -0.42238200 -0.73734300 H 6.05770900 0.44550500 -1.02321400 O 4.32271000 1.91295600 -0.88345700 H 3.66739600 2.57616200 -1.13114400 C 1.27062500 1.57183100 -0.07762400 H 0.83987300 0.86594800 -0.79182900 H 0.55246500 1.74555100 0.72317400 O 1.63026700 2.79042300 -0.72932100 H 0.85447100 3.35022200 -0.83848800 C 0.35447700 -1.75249200 -0.20989700 C -0.33024500 -1.40135400 0.96352800 C -0.32139400 -2.18810400 -1.33977700 C -1.70942400 -1.42173500 0.94495300 H 0.19742200 -1.04675100 1.83409500 C -1.70936200 -2.23748200 -1.34127500 H 0.22870300 -2.47837500 -2.22215600 C -2.41567900 -1.81183100 -0.19826000 C -3.86879700 -1.65453200 -0.26856600 C -2.54107600 -0.95301600 2.10367100 H -2.98415700 -1.80156700 2.62952700 H -1.93854400 -0.38754300 2.81138600 C -3.66498800 -0.08380500 1.54267400 O -4.47215700 -0.87620700 0.65284800 O -4.55456700 -2.14945500 -1.14024700 H -4.35266500 0.20732700 2.33341800 C -3.11266400 1.14667200 0.84822500 C -3.23205900 1.35181200 -0.52077500 C -2.38701100 2.07077900 1.60012500 C -2.57324400 2.40715100 -1.14104200 H -3.83076500 0.68568500 -1.12522100 C -1.73900800 3.13653900 0.99686400 H -2.31325000 1.95458000 2.67444500 C -1.80237200 3.27473100 -0.38374300 H -2.64238100 2.53205300 -2.21470800 H -1.16389700 3.84813700 1.57294200 O -1.03800500 4.26526900 -0.95479000 H -1.31157600 4.40783200 -1.86432600 O -2.32511700 -2.65891700 -2.45070300 H -3.28696300 -2.65927100 -2.28109500

206

Zero-point correction= 0.426759 (Hartree/Particle) Thermal correction to Energy= 0.453188 Thermal correction to Enthalpy= 0.454132 Thermal correction to Gibbs Free Energy= 0.370858 Sum of electronic and zero-point Energies= -1565.604399 Sum of electronic and thermal Energies= -1565.577970 Sum of electronic and thermal Enthalpies= -1565.577025 Sum of electronic and thermal Free Energies= -1565.660300

207

Chair Conformer C1 0 1 C 5.00919300 -0.56472100 0.76378700 C 3.66674700 -1.08461000 1.28642300 C 2.93852300 -0.81818500 -0.99994200 C 4.35321100 -0.92982000 -1.57697700 C 5.33885100 -1.32936500 -0.49852300 H 3.87682800 -2.00298100 1.83819600 H 4.95031100 0.50588400 0.53889600 H 2.23587900 -1.28689600 -1.68542700 H 4.64460900 0.05118300 -1.95761000 H 5.23431700 -2.40167000 -0.29874400 O 2.77778300 -1.47073300 0.22794900 O 2.65871300 0.57109500 -0.88178000 O 4.31091000 -1.88184200 -2.62283400 H 5.20866300 -1.99701200 -2.94587700 O 6.63603000 -1.04182000 -0.97886000 H 7.23820200 -1.10402700 -0.23073000 O 6.05022700 -0.81004900 1.69296000 H 5.83620900 -0.31846300 2.49317500 C 2.99590500 -0.08067000 2.21250500 H 2.81835000 0.85667400 1.68962000 H 2.04129600 -0.46960800 2.56805900 O 3.88302400 0.20932300 3.29799900 H 3.69818200 -0.38486300 4.02628800 C 1.37250200 0.96635000 -0.66511400 C 0.31801800 0.07401800 -0.43259400 C 1.17115100 2.33764700 -0.68053600 C -0.95181100 0.58858500 -0.25093700 H 0.48537400 -0.98925800 -0.36286000 C -0.10286300 2.85265200 -0.47802700 H 2.00022500 3.00752600 -0.85228400 C -1.18689300 1.96804700 -0.28707300 C -2.53181400 2.50876900 -0.06620500 C -2.13261900 -0.29811600 0.02706500 H -1.98422500 -1.29235300 -0.39298400 H -2.28149000 -0.40838600 1.10504300 C -3.38390100 0.32321000 -0.57118200 O -3.56538000 1.65245700 -0.03906000 H -3.26052700 0.41812500 -1.65284500 O -2.75244500 3.69041000 0.10877700 C -4.62233700 -0.47173600 -0.26538200 C -5.41104800 -0.19346500 0.84383300 C -4.95512000 -1.55418500 -1.07708700 C -6.51203100 -0.98649900 1.14094700

208

= 2.7 kcal/mol

H -5.17594900 0.65736300 1.46705400 C -6.04790200 -2.35413100 -0.78783200 H -4.35633300 -1.77240000 -1.95341300 C -6.82835700 -2.06779900 0.32705000 H -7.12830200 -0.75800500 2.00218800 H -6.31789100 -3.19186700 -1.41453700 O -7.89655600 -2.87855400 0.56929600 H -8.37267300 -2.56863500 1.34196900 O -0.25136500 4.17924700 -0.48091400 H -1.18299800 4.37754300 -0.25663400 Zero-point correction= 0.425282 (Hartree/Particle) Thermal correction to Energy= 0.452701 Thermal correction to Enthalpy= 0.453645 Thermal correction to Gibbs Free Energy= 0.365567 Sum of electronic and zero-point Energies= -1565.600609 Sum of electronic and thermal Energies= -1565.573191 Sum of electronic and thermal Enthalpies= -1565.572247 Sum of electronic and thermal Free Energies= -1565.660324 Chair Conformer C2 0 1 C -4.78281900 -1.43579200 0.43522200 C -4.29907200 -0.22322200 1.23517700 C -3.62771700 0.63551000 -0.91935600 C -4.64207800 -0.21224200 -1.69369300 C -5.58243200 -0.92102700 -0.74064600 H -5.13140800 0.09068400 1.86823300 H -3.93408700 -2.02529400 0.07128400 H -3.51866800 1.60258200 -1.40562900 H -4.09352800 -0.97068400 -2.25601400 H -6.32613600 -0.20449300 -0.37452300 O -4.00889500 0.90498000 0.39882900 O -2.39404800 -0.07521800 -0.96404000 O -5.34045300 0.65289300 -2.56804200 H -6.01830700 0.13376300 -3.00907100 O -6.21270700 -1.96194800 -1.45918000 H -6.65573500 -2.52472900 -0.81644200 O -5.64404400 -2.25118700 1.21051100 H -5.13138500 -2.56991100 1.96110900 C -3.10046700 -0.56265400 2.10883400 H -2.27541000 -0.91883400 1.49561700 H -2.77146200 0.31783500 2.66112600 O -3.45762200 -1.63441500 2.98888100 H -3.79187600 -1.27098200 3.80989900 C -1.25218700 0.56773300 -0.59422900 C -0.07325300 -0.15750900 -0.81838500 C -1.22804100 1.83508600 -0.03684700 C 1.13564200 0.40052100 -0.47527600 H -0.13943800 -1.13717000 -1.26975500 C 0.00230700 2.40519500 0.29638800 H -2.12350400 2.39784500 0.17239500 C 1.19299700 1.68041500 0.10120800 C 2.47695300 2.28936200 0.45734500 C 2.44378100 -0.29500500 -0.71992100 H 2.31793800 -1.37712500 -0.73167200

209

H 2.85835000 0.00504500 -1.68645100 C 3.43218100 0.08955600 0.36899900 O 3.57983600 1.52496400 0.40561600 H 3.04200300 -0.22332100 1.34072800 O 2.59320200 3.45433200 0.78330800 C 4.79174600 -0.51158900 0.14777100 C 5.78475000 0.16745000 -0.54701000 C 5.04391600 -1.80728100 0.59346000 C 7.00877200 -0.43960500 -0.79709100 H 5.60777200 1.18083000 -0.87785600 C 6.25875900 -2.42406700 0.34548800 H 4.28249900 -2.34197700 1.14886000 C 7.24422900 -1.73572500 -0.35381800 H 7.78174800 0.09916400 -1.33183300 H 6.46603000 -3.42630500 0.69188900 O 8.42543100 -2.37997400 -0.56992700 H 9.03174600 -1.80171100 -1.03659700 O -0.01112400 3.63689200 0.81008000 H 0.91845500 3.92357700 0.92468400 Zero-point correction= 0.425068 (Hartree/Particle) Thermal correction to Energy= 0.452577 Thermal correction to Enthalpy= 0.453521 Thermal correction to Gibbs Free Energy= 0.365064 Sum of electronic and zero-point Energies= -1565.601456 Sum of electronic and thermal Energies= -1565.573948 Sum of electronic and thermal Enthalpies= -1565.573004 Sum of electronic and thermal Free Energies= -1565.661461 Chair Conformer C3 0 1 C 5.01305000 -0.57112800 0.75097800 C 3.67126900 -1.08778800 1.27862000 C 2.93573500 -0.82224400 -1.00547000 C 4.34837200 -0.93601400 -1.58709900 C 5.33668400 -1.33740800 -0.51186900 H 3.88139100 -2.00571900 1.83107000 H 4.95561800 0.49943600 0.52546700 H 2.23046500 -1.29082000 -1.68834200 H 4.64017200 0.04455800 -1.96852100 H 5.23024800 -2.40933400 -0.31106000 O 2.77840500 -1.47391400 0.22339200 O 2.65775000 0.56722700 -0.88727600 O 4.30140800 -1.88783200 -2.63307200 H 5.19822200 -2.00489000 -2.95805200 O 6.63296200 -1.05339400 -0.99679100 H 7.23731600 -1.11565900 -0.25041600 O 6.05678800 -0.81790600 1.67669800 H 5.84608200 -0.32574200 2.47746200 C 3.00553500 -0.08115700 2.20548700 H 2.82688400 0.85538100 1.68154600 H 2.05202400 -0.46815400 2.56598900 O 3.89804300 0.20941100 3.28647900 H 3.71142800 -0.37857100 4.01929600 C 1.37253800 0.96349300 -0.66525400 C 0.31774200 0.07174300 -0.43244600

210

C 1.17261000 2.33500000 -0.67607800 C -0.95110600 0.58728500 -0.24608800 H 0.48383000 -0.99194500 -0.36619700 C -0.10034000 2.85081300 -0.46809800 H 2.00192600 3.00455500 -0.84798400 C -1.18494500 1.96688700 -0.27729700 C -2.52905100 2.50850600 -0.05043500 C -2.13202300 -0.29980100 0.03016900 H -1.98580600 -1.29180800 -0.39580100 H -2.27733600 -0.41628900 1.10805900 C -3.38416700 0.32445600 -0.56227800 O -3.56331300 1.65354600 -0.02161600 H -3.26424400 0.42415800 -1.64352600 O -2.74626000 3.69039000 0.12767100 C -4.62370200 -0.46545500 -0.25654600 C -5.11190500 -1.37603800 -1.18380900 C -5.26269100 -0.34778500 0.97694800 C -6.21347500 -2.17032300 -0.88941800 H -4.63506100 -1.46835100 -2.15188700 C -6.36539500 -1.12767900 1.27875300 H -4.90509300 0.37818200 1.69425700 C -6.83902600 -2.04430000 0.34471300 H -6.58947900 -2.87480100 -1.62129600 H -6.87745700 -1.03829200 2.22607400 O -7.92635500 -2.78745500 0.69320400 H -8.17167500 -3.36773800 -0.02982900 O -0.24754700 4.17745500 -0.46607000 H -1.17874900 4.37524900 -0.23816800 Zero-point correction= 0.425166 (Hartree/Particle) Thermal correction to Energy= 0.452611 Thermal correction to Enthalpy= 0.453555 Thermal correction to Gibbs Free Energy= 0.365432 Sum of electronic and zero-point Energies= -1565.600499 Sum of electronic and thermal Energies= -1565.573053 Sum of electronic and thermal Enthalpies= -1565.572109 Sum of electronic and thermal Free Energies= -1565.660232 Chair Conformer C4 0 1 C -4.78706300 -1.44174000 0.42030200 C -4.30664600 -0.23417400 1.22976800 C -3.62731600 0.63781700 -0.91667500 C -4.63983900 -0.20378900 -1.70006500 C -5.58291500 -0.91961600 -0.75488600 H -5.14155200 0.07548200 1.86161300 H -3.93684900 -2.02845600 0.05539800 H -3.51526800 1.60792300 -1.39619500 H -4.08992500 -0.95804400 -2.26667100 H -6.32826300 -0.20594000 -0.38653200 O -4.01363800 0.89927100 0.40176700 O -2.39452000 -0.07413300 -0.96112000 O -5.33576600 0.66811000 -2.56961300 H -6.01210000 0.15242300 -3.01695400 O -6.21018600 -1.95610100 -1.48247000 H -6.65602700 -2.52273700 -0.84510900

O -5.65052000 -2.26263000 1.18743000 H -5.14011200 -2.58644700 1.93735400 C -3.11134400 -0.57864200 2.10599100 H -2.28458400 -0.93309300 1.49410300 H -2.78329500 0.29919200 2.66310500 O -3.47189800 -1.65391400 2.98038500 H -3.81805800 -1.29317600 3.79771000 C -1.25285100 0.56582400 -0.58461200 C -0.07356200 -0.15682000 -0.81453900 C -1.22963900 1.82785900 -0.01540000 C 1.13493500 0.39878800 -0.46558800 H -0.13891300 -1.13215800 -1.27530600 C 0.00032100 2.39537300 0.32405900 H -2.12553900 2.38831500 0.19814300 C 1.19148200 1.67302100 0.12284600 C 2.47530800 2.27956800 0.48524500 C 2.44312800 -0.29413600 -0.71734600 H 2.31792500 -1.37617900 -0.73743700 H 2.85453200 0.01336600 -1.68297900 C 3.43413300 0.08007700 0.37235000 O 3.57923500 1.51812000 0.42388400 H 3.04944000 -0.24458100 1.34196700 O 2.58844700 3.44109400 0.82469800 C 4.79539200 -0.50918500 0.14044100 C 5.15708900 -1.69122500 0.77213900 C 5.68683200 0.07882000 -0.75594000 C 6.38281300 -2.29170900 0.51080900 H 4.48119600 -2.15263000 1.48161100 C 6.91372200 -0.50511100 -1.01807900 H 5.42326500 1.01295300 -1.23276700 C 7.26048200 -1.69582700 -0.38632500 H 6.65752000 -3.21212800 1.01147000 H 7.61845100 -0.05405900 -1.70183400 O 8.47894100 -2.22888100 -0.68155700 H 8.61579200 -3.03245200 -0.17638600 O -0.01389500 3.62206200 0.84929100 H 0.91599300 3.90741900 0.96716300 Zero-point correction= 0.425079 (Hartree/Particle) Thermal correction to Energy= 0.452564 Thermal correction to Enthalpy= 0.453508 Thermal correction to Gibbs Free Energy= 0.365038 Sum of electronic and zero-point Energies= -1565.601136 Sum of electronic and thermal Energies= -1565.573651 Sum of electronic and thermal Enthalpies= -1565.572707 Sum of electronic and thermal Free Energies= -1565.661177

211

212

PHỤ LỤC C

KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA MẪU NGHIÊN CỨU

213

214

215

PHỤ LỤC D

PHIẾU KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO