Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trong cây Kinh giới (Elsholtzia ciliata) ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

B x

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------------------------------

Trần Phúc Đạt

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KINH GIỚI

Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------------------------------

Trần Phúc Đạt

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KINH GIỚI

Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 60440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. ĐỖ THỊ VIỆT HƯƠNG

Hà Nội – Năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Việt

Hương – giảng viên khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà

Nội, người thầy luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em

thực hiện đề tài này.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô thuộc bộ môn Hóa Dược, Khoa

Hóa học, trường ĐHKHTN, cũng như các thầy cô khoa Hóa học đã luôn hỗ trợ em

trong quá trình tiến hành thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè làm việc tại phòng Hóa Dược, khoa

Hóa học, trường ĐHKHTN, các cô chú, anh chị làm việc tại phòng Hóa sinh ứng

dụng thuộc Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam luôn tạo

điều kiện thuận lợi để em hoàn thành kết quả đề tài này.

Hà Nội, ngày tháng năm

Học viên Trần Phúc Đạt

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU 6

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ 7

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT 8

MỞ ĐẦU 1

Chương 1- TỔNG QUAN 2

1.1. Khái quát về kinh giới 2

1.1.1. Đặc điểm thực vật của cây kinh giới, loài Elscholtzia ciliata, họ

Lamiaceae 2

1.1.2. Vùng phân bố, thu hát và chế biến 6

1.2. Nghiên cứu về dược lý của kinh giới 7

1.2.1. Tác dụng trị liệu theo kinh nghiệm dân gian 7

1.2.2. Những nghiên cứu khoa học 8

1.3. Thành phần hóa học của kinh giới 9

1.3.1. Các hợp chất Flavonoid 10

1.3.2. Terpenoids và steroids 11

1.3.3. Acid béo 14

1.3.4. Một số hợp chất có trong tinh dầu E. ciliata 14

1.4. Hoạt tính sinh học 15

1.4.1. Khả năng chống oxy hóa 15

1.4.2. Hoạt tính ức chế enzym -glucosidase 17

Chương 2 - THỰC NGHIỆM 18

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1. Đối tượng nghiên cứu 18

2.2. Phương pháp nghiên cứu 18

2.3. Thực nghiệm 19

2.3.1. Chiết các lớp chất từ mẫu cây kinh giới 19

2.3.2. Phân tách phần chiết n-hexan (EH) và phần chiết etyl acetat (EE) bằng

phương pháp sắc ký cột (CC) 21

2.3.3. Khảo sát định tính các nhóm phân đoạn trên hệ thống sắc ký khổi phổ

GC/MS 24

2.3.4. Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học 26

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1. Khảo sát định tính các nhóm phân đoạn trên hệ thống GC/MS 28

3.1.1. Cặn chiết n-hexan 28

3.1.2. Cặn chiết etyl acetat 36

3.2. Khảo sát hoạt tính sinh học 43

3.2.1. Hoạt tính chống oxy hóa 43

3.2.2. Hoạt tính ức chế enzym -glucosidase. 45

KẾT LUẬN 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 53

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Thành phần hóa học được nghiên cứu của chi kinh giới .......................... 10

Bảng 1.2. Một số hợp chất được phân lập từ loài E. ciliata...................................... 10

Bảng 2.1. Hiệu suất của các phần chiết từ mẫu cây kinh giới .................................. 20

Bảng 3.1. Kết quả phân tách cặn chiết n-hexan bằng sắc ký cột .............................. 28

Bảng 3.2. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan .......................................... 29

Bảng 3.3. Các tín hiệu phổ của H1............................................................................ 34

Bảng 3.4. Kết quả phân tách cặn chiết etyl acetat bằng sắc ký cột ........................... 37

Bảng 3.5. Thành phần hóa học trong dịch chiết etyl acetat ...................................... 38

Bảng 3.6. Kết quả độ hấp thụ quang ......................................................................... 43

Bảng 3.7. Khả năng ức chế enzym 𝛼-glucosidase của cặn chiết kinh giới ............... 45

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1. Cây, lá và hoa kinh giới .............................................................................. 4

Hình 1.2. Cấu trúc của các flavonoid phân lập được từ loài E. ciliata ..................... 11

Hình 1.3. Cấu trúc của daucosterol ........................................................................... 14

Hình 2.1. Mẫu kinh giới thu mua .............................................................................. 18

Hình 3.1. Sắc ký đồ GC-MS của phân đoạn EH2 cây kinh giới ............................... 29

Hình 3.2. Các acid béo mạch dài trong dịch chiết kinh giới ..................................... 31

Hình 3.3. Tecpenoid trong dịch chiết kinh giới ........................................................ 32

Hình 3.4. Flavonoid trong dịch chiết kinh giới ......................................................... 32

Hình 3.5. Phổ NMR của hợp chất H1 ....................................................................... 33

Hình 3.6. Cấu trúc của H1 ......................................................................................... 33

Hình 3.7. Sắc ký đồ của H2....................................................................................... 35

Hình 3.8. Phổ khối của H2 ........................................................................................ 36

Hình 3.9. Sắc ký đồ GC-MS của phân đoạn EE2 cây kinh giới ............................... 37

Hình 3.10. Cấu trúc của E1 ....................................................................................... 39

Hình 3.11. Sắc ký đồ của hợp chất E1 ...................................................................... 39

Hình 3.12. Phổ khối lượng của E1 so sánh với thư viện MS .................................... 40

Hình 3.13. Cấu trúc của E2 ....................................................................................... 41

Hình 3.14. Sắc ký đồ GC của E2 .............................................................................. 41

Hình 3.15. Phổ khối của E2 so sánh với thư viện MS .............................................. 42

Hình 3.16. Đường chuẩn phenolic ............................................................................ 43

Hình 3.17. Tổng phenolic của các dịch chiết từ kinh giới ........................................ 44

Hình 3.18. Tổng lượng flavonoid trong dịch chiết kinh giới .................................... 45

Hình 3.19. Đồ thị khảo sát khả năng ức chế enzym 𝛼-glucosidase .......................... 46

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết từ mẫu khô ............................................................................ 20

Sơ đồ 2.2. Phân tách các phân đoạn dịch chiết n-hexan ........................................... 22

Sơ đồ 2.3. Phân tách các phân đoạn dịch chiết etyl acetat ........................................ 23

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Ý nghĩa

Abs Độ hấp thụ quang

CC Sắc ký cột thường

EH Cặn chiết n-hexan

EE Cặn chiết etyl acetat

E. Elsholtzia

FC sắc ký cột nhanh

GC-MS Phương pháp phân tích sắc ký khí kết hợp khối phổ

Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử IC50

Liều gây chết 50% đối tượng thử LD50

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

TLC Sắc ký bản mỏng

TT Thứ tự

MỞ ĐẦU

Nước Việt Nam chúng ta nằm trong vùng nhiệt đới cho nên những điều kiện

khí hậu như nhiệt độ, lượng mưa, ánh sáng…và hơn hết điều kiện thổ nhưỡng đặc

trưng thích hợp cho nhiều loài thực vật có giá trị tồn tại và phát triển. Đó là nguồn tài

nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo được. Từ thời xa xưa cho đến

xã hội loài người hiện nay đều khai thác nguồn tài nguyên này để làm thực phẩm,

thuốc chữa bệnh, các vật liệu cũng như nhiên liệu cho cuộc sống thường ngày.

Kinh giới, được biết đến là một loại rau thơm, không chỉ dùng trong bữa ăn

hàng ngày nhờ vị bạc hà đặc trưng, mà còn sử dụng như một loài nước xông chữa

một số bệnh ngoài da ở trẻ em. Kinh giới thuộc chi Elsholtizia, họ Lamaecia rất phổ

biến ở nước ta. Do tính chất sử dụng rộng rãi, nên đã nhiều công trình khoa học nghiên

cứu về thực vật cũng như hóa học, nhằm lựa chọn nâng cao giá trị sử dụng của mỗi

loài. Tuy nhiên sự nghiên cứu các loài kinh giới về thành phần hóa học, công dụng

cũng như số lượng các loài kinh giới còn chưa đầy đủ và không đồng nhất ở một số

tài liệu. Để góp phần vào việc nghiên cứu một cách sâu hơn và rộng hơn các loài

riềng có ở trong nước, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học trong cây Kinh giới (Elsholtzia ciliata) ở Việt Nam” và từ đó đưa ra

hướng khai thác và ứng dụng loài kinh giới này trong đời sống. Vì vậy, nhiệm vụ đặt

ra cho chúng tôi là:

1. Xây dựng một quy trình chiết thích hợp để điều chế các phần chiết từ cây

kinh giới, từ đó định hướng khảo sát thành phần hóa học các hợp chất có trong cây

kinh giới.

2. Nhận dạng một số hợp chất phân lập được từ các phân đoạn chiết của cây

kinh giới.

3. Khảo sát hoạt tính sinh học của các phần chiết cây kinh giới.

Chương 1- TỔNG QUAN

1.1. Khái quát về kinh giới

Chi kinh giới (Elsholtzia Willd) thuộc họ Lamiaceae, có khoảng 40 loài kinh

giới trên thế giới phân bố chủ yếu ở Đông Á, Châu Phi, Bắc Mỹ, và một số quốc gia

Châu Âu [10, 33]. Ở Việt Nam, có 7 loài thuộc chi kinh giới được nghiên cứu và ứng

dụng làm thực phẩm và dược phẩm.

1.1.1. Đặc điểm thực vật của cây kinh giới, loài Elscholtzia ciliata, họ

Lamiaceae

Tên khoa học: Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland, họ Lamiaceae.

Tên thông thường: Kinh giới rìa, Kinh giới trồng [1]

Tên đồng nghĩa: Sideritis ciliata Thunb., Elsholtzia cristata Will., Hyssopus

ocymifolius Lamk., Mentha ovata Cav., Mentha patrini Lepech., Perilla polystachya

D. Don, Elsholtzia pattini (Lepech.) Garcke.

Một số tên khác: Khương giới [3], Giả tô, Nhả nát bom (Thái), Phjăc bom

khao (Tày), Bài hương thảo.

Mô tả thực vật

Kinh giới là cây thảo sống hằng năm có đặc điểm như sau:

Thân thuộc loại cỏ đứng, cao 0,6-0,8 m, toàn cây có lông màu trắng, có mùi

rất thơm [3]. Thân non màu xanh, tiết diện vuông hơi khuyết ở bốn cạnh. Thân già

màu nâu tía có bốn góc lồi tròn dọc thân.

Lá đơn, mọc đối chéo chữ thập. Phiến là màu xanh đậm hơn ở mặt trên, hình

trứng đinh nhọn, gốc hình nêm men một phần dọc theo hai bên cuống lá, kích thước

3-7 x 2,5-5 cm, bìa răng cưa nhọn không đều ở 2/3 phía trên, mặt dưới nhiều chấm

nhỏ (lông tiết). Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, 4-7 cặp gân phụ hơi cong

ở ngọn. Cuống lá hình trụ hơi phẳng ở mặt trên, gốc cuống lồi thành u nhỏ, mặt trên

có lông rậm màu trắng ở giữa, dài 2,5-4cm.

Hoa mọc thành cụm xim co tạo thành gié giả dài 5-12 cm ở ngọn cành, tạt về

một phía dày đặc hoa. Một đến hai xim co ở nách lá bắc, mỗi xim có 3-5 hoa. Lá bắc

màu xanh hay xanh tím nhiều gân nổi, hình thoi rộng mũi nhọn, nhiều lông ở mặt

ngoài, kích thước 3-5 x 6-7 mm. Cuống hoa màu xanh rất ngắn hoặc gần như không

có. Lá đài màu xanh, gần đều, dính nhau thành một ống hình chuông dài khoảng 1,5

mm, trên chia 5 phiến tam giác nhọn khoảng 1 x 0,5 mm, mặt ngoài đầy lông tơ trắng,

nhiều hơn ở rìa. Cánh hoa màu trắng hay tím nhạt đậm dần phía trên, mặt ngoài phủ

đầy lông dài màu trắng và có nhiều điểm tuyến màu vàng, dính nhau ở dưới thành

ống hơi thắt ở gần đáy, dài khoảng 2-3 mm, trên chia môi 2/3: môi trên xẻ cạn làm 2

thùy giống nhau, hình hơi tròn, kích thước nhỏ, khoảng 0,5 x 0,5 mm; môi dưới chia

3 thùy không đều, hai thùy bên giống nhau hình cung to hơn thùy môi trên, thùy giữa

to nhất hơi khum hình gần tròn, rìa hơi lượn, kích thước khoảng 1,5 x 1,5 mm. Nhị

kiểu 2 trội, chỉ nhị dạng sợi mảnh màu trắng hay tím nhạt, nhẵn, đính khoảng giữa

ống tràng xen kẽ với cánh hoa, nhị trước dài khoảng 0,6-0,7 cm, nhị sau dài 0,3-0,4

cm. Bao phần màu đỏ tím, hai buồng xếp thành hình số tám dọc, nút dọc, hướng

trong, đính giữa, chung đới dạng đòn cân ở mặt ngoài. Hạt phấn rời màu trắng sữa,

hình bầu dục có rãnh, mặt ngoài có nhiều vân, kích thước 37,5-45 x 30-32,5 μm. Lá

noãn phần bầy trên hình cầu hai ô, có vách giả chia làm bốn ô rời, mỗi ô một noãn

đính đáy. Một vòi nhụy màu trắng trong mờ, nhẵn, dạng sợi đính ở đáy bầu giữa các

ô, dài 0,7-0,8 cm, tận cùng hai nhánh đầu nhụy màu hơi tím nhật dài khoảng 1 mm

choãi ra hướng trước sau. Đĩa mật ở gốc bầu dạng bồ gờ nạc. Quả bế hình bầu dục có

cạnh, màu nâu, dài khoảng 0,5 mm, rốn hẹp ở đáy, mang trong đài tồn tại khô xác

màu nâu.

Hình 1.1. Cây, lá và hoa kinh giới

Đặc điểm vi mẫu (giải phẫu)

Thân vi phẫu hình vuông lõm ở bốn cạnh. Các mô gồm: Biểu bì một lớp tế bào

hình chữ nhật hay đa giác gần tròn kích thước nhỏ, gần đều, lớp cutin mỏng hơi răng

cưa. Trên biểu bì rải rác có lỗ khí, lông tiết đa bào, lông che chở đa bào. Lông tiết

ngắn với đầu hình tròn hay lõm ở giữa gồm một, hai hoặc bốn tế bào. Lông che chở

đa bào kích thước to, phía trên là một dãy 4-5 tế bào, phía dưới cùng mức hoặc hơi

cao hơn mức biểu bì gồm một vài tế bào. Mô dày góc 1-5 lớp tế bào đa giác hay gần

tròn, kích thước không đều lớn hơn tế bào biểu bì, tập trung nhiều ở bốn góc lồi. Mô

mềm vỏ khuyết 2-4 lớp tế bào hình bầu dục nằm ngang hay gần tròn, to, không đều,

thường bị ép dẹp. Ở thân già tần bì sinh xuất hiện trong lớp mô mềm vỏ sinh bần ở

ngoài lục bì ở trong, tế bào hình chữ nhật vách hơi lượn xếp xuyên tâm. Nội bì khung

Caspary. Trụ bì ít tế bào hóa mô cứng nằm rải rác thường có trên các đám libe gỗ.

Libe ít, tế bào hình đa giác, kích thước nhỏ, vách uốn lượn xếp lộn xộn. Libe tế bào

hình chữ nhật vách lượn xếp xuyên tâm với tế bào gỗ. Gỗ nhiều, mạch gỗ hình đa

giác hay gần tròn, kích thước lớn không đều, xếp lộn xộn, mô mềm gỗ bao quanh

mạch, tế bào hình đa giác kích thước nhỏ, không đều, tẩm chất gỗ, một số vách

cellulose. Mô mềm gỗ tạo thành cụm nằm dưới lớp gỗ, cụm dưới mỗi góc thường có

15-20 bó, cụm ở cạnh thường 1-3 bó, mỗi bó 3-5 mách. Mô mềm gỗ gồm tế bào hình

đa giác, vách tẩm cellulose hoặc tẩm chất gỗ. Tia tủy hẹp 1-2 dãy tế bào và nhiều ở

bốn cạnh tạo các khoảng giang bó, gồm nhiều dãy tế bào hình chữ nhật hoặc đa giác,

kích thước lớn dần từ trong ra ngoài. Mô mềm tủy đạo, tế bào kích thước lớn, không

đều, hình gần tròn đôi khi có vài tế bào hình đa giác dẹp xếp khít nhau. Tinh bột nhiều

ở mô mềm vỏ, nội bì, tia tủy, libe và mô mềm quanh vùng tủy. Hạt tinh bột nhỏ, hình

tròn dẹp, tụ thành đám.

Lá: Cuống lá: mặt trên hơi lõm, mặt dưới lồi, hai bên có tai. Tế bào biểu bì

hình tròn hay đa giác, kích thước nhỏ, không đều. lớp cutin mỏng hơi răng cưa. Trên

biểu bì rải rác có lỗ khí, lông che chở nhiều hơn ở mặt trên và lông tiết đa bào giống

ở thân. Mô dày góc 3-5 lớp dưới biểu bì trên, 1-3 lớp trên biểu bì dưới, thường bị gián

đoạn bởi mô mềm khuyết có lục lạp ở hai bên eo phía dưới tai, tế bào đa giác hoặc

gần tròn, kích thước lớn không đều, đôi khi bị tách lớp. Mô mềm đạo tế bào tròn hay

đa giác gần tròn, kích thước lớn, không đều. Mô dẫn với gỗ ở trên, libe ở dưới, xếp

thành hình cung ở giữa và 2-4 bó nhỏ hơn ở hai bên phia trên và hai tai. Ở bó chính,

mạch gỗ hình tròn hoặc đa giác xếp thành 15-22 dãy, mỗi dạy có 1-6 mạch không

đều, xen kẽ với mô mềm gồm 1-4 dãy tế bào hình chữ nhật hay đa giác vách cellulose.

Libe tế bào hình đa giác nhỏ, không đều, sắp xếp lộn xộn thành nhiều đám không liên

tục xen kẽ với mô mềm vách dày cellulose. Mô mềm vách dày cellulose 2-4 lớp tế

bào đa giác nhỏ, không đều, bao bên ngoài cung libe gỗ. Tinh bột nằm rải rác trong

một vài tế bào mô mềm đạo dưới vùng libe. Hạt tinh bột nhỏ, hình tròn dẹp.

Gân giữa: Mặt trên hơi lồi, mặt dưới lồi nhiều và uốn lượn không đều. Biểu bì

có thể bong tróc khỏi mô dày, tế bào hình tròn hay đa giác, kích thước nhỏ, không

đều, gần giống nhau ở hai mặt, lớp cutin mỏng hơi có răng cưa cạn tách khỏi lớp biểu

bì dưới. Cả hai lớp biểu bì có lỗ khí, lông che chở đa bào và lông tiết đa bào giống ở

thân. Lông che chở đa bào nhiều ở mặt trên, rải rác ở mặt dưới. Mô dày góc 1-5 lớp

biểu bì trên, 1-2 lớp trên biểu bì dưới, tế bào hình tròn hay đa giác, kích thước lớn

hơn tế bào biểu bì, không đều, thường bị tách tạo khuyết. Mô mềm đạo tế bào tròn

hay đa giác gần tròn, to, không đều. Mô dẫn với gỗ ở trên libe ở dưới xếp hình cung

ở giữa và 1-3 bó nhỏ hơn ở hai bên phía trên bó chính. Ở bó chính, mạch chỗ hình

tròn hoặc đa giác gần tròn xếp thành 15-20 dãy, mỗi dãy có 1-6 mạch không đều, xen

kẽ với 1-3 dãy mô mềm tế bào đa giác vách cellulose. Libe ít, tế bào nhỏ, hình đa

giác, sắp xếp lộn xộn thành nhiều đám không liên tục xen kẽ với mô mềm. Bao bên

ngoài cung libe gỗ có 2-4 lớp tế bào mô mềm hình đa giác, không đều, xếp khít nhau.

Tinh bột rải rác trong một vài tế bào mô mềm đạo.

Phiến lá: tế bào biểu bì trên hình bầu dục hoặc đa giác dài, kích thước không

đều. Tế bào biểu bì dưới nhỏ hơn biểu bì trên. Cả hai biểu bì rải rác có lông tiết đa

bào giống ở thân, lông che chwor đa bào thường có ở vùng gân phụ, lỗ khí nhiều hơn

ở mặt dưới. Nhiều chỗ biểu bì lõm xuống dính lông tiết. Mô mềm giậu một lớp tế bào

hình chữ nhật, 2-4 tế bào thẳng góc dưới mỗi tế bào biểu bì trên. Mô mềm khuyết nối

từ mô mềm giậu đến biểu bì dưới, gồm 4-6 lớp tế bào đa giác vách hơi lượn, kích

thước không đều, chứa lục lạp, xếp chừa khuyết to không đều. Nhiều bó gân phụ gỗ

ở trên, libe ở dưới rải rác trong thịt [2].

1.1.2. Vùng phân bố, thu hát và chế biến

1.1.2.1. Vùng phân bố

Elsholtzia ciliata (Kinh giới) được phân bố rộng rãi ở Đông Nam Á như Lào,

Campuchia, Châu Phi, Châu Á như Ấn Độ, Nêpal, Mianma, Trung Quốc, Nhật Bản,

Triều Tiên, Bắc Mỹ và một số quốc gia châu Âu như Nga. Chủ yếu kinh giới mọc

nhiều ở nơi có độ ẩm và nhiều ánh sáng, ở độ cao trên 600 m [1].

Ở Việt Nam, Elsholtzia ciliata được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía bắc như Lào

Cai (Sa Pa), Cao Bằng (Bảo Lạc, Trà Lĩnh), Lạng Sơn (Bắc Sơn), Phú Thọ (Thanh

Sơn, Phù Ninh), Vĩnh Phúc (Vĩnh Yên), Hà Tây (Bà Vì), Hòa Bình (Mai Châu), Hà

Nội (Từ Liêm), Ninh Bình [1] và một số ít phía nam như Lâm Đồng, thành phố Hồ

Chí Minh [2].

Một số loài Elsholtzia khác được phân bố như sau:

Elscholtzia blanda (E. blanda), Kinh giới rừng, phân bố nhiều ở Ấn Độ, Nêpal,

Trung Quốc, Mianma, Lào, Malayxia, Indônêxia. Ở Việt Nam, kinh giới rừng mọc

nhiều ở một số tỉnh Tây Bắc như Lai Châu, Lào Cai, Sơn La (Mộc Châu), và một số

tỉnh Tây Nguyên như Lâm Đồng (Đà Lạt), Khánh Hòa (Nha Trang) [1].

Elsholtzia communis (E. communis), Kinh giới hoa bông và Elsholtzia

penduliflora, Kinh giới rủ có nhiều ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một số vùng

núi phía Bắc Việt Nam như Sa Pa (Lào Cai), Yên Minh (Hà Giang) [1].

Elsholtzia penduliflora (E. penduliflora) phân bố ở nơi có độ cao 800-1100 m

tại một số vùng như Chiang Mai, Phitsanulok (Thái Lan), Trung Quốc, Việt Nam

[10].

Elsholzia pilosa (E. pilosa), Kinh giới lông xuất hiện nhiều nơi có bãi cỏ

hoang, ven rừng, ven đường ở Lào Cai (Việt Nam), Ấn Độ, Nêpal, Trung Quốc.

Elsholzia rugulosa (E. rugulosa), Kinh giới sần tìm thấy ở độ cao trên 800 m

vùng Phó Bảng (Hà Giang) và Trung Quốc.

Elsholtzia winitiana (E. winitiana), Kinh giới đất, mọc ở độ cao trên 600 m,

phân bố ở cá tỉnh Kon Tum (Đác Glaay, Kon Plông), Gia Lai (Plêiku, An Khê), Lâm

Đồng (Đà Lạt), Thái Lan và Trung Quốc [1].

Ít nhất 33 loài Elsholtzia được tìm thấy ở Việt Nam và Trung Quốc được dùng

1.1.2.2. Thu hái và chế biến

nhiều để chữa các bệnh như cảm cúm, nhức đầu [33].

Ở Việt Nam, kinh giới Elsholtzia ciliata được dùng khả phổ biến để ăn và làm

thuốc. Vào mùa thu nhổ cả cây phơi sấy khô gọi là toàn kinh giới, nhưng có nơi chỉ

cắt hoa và cành, nếu xát hoa phơi khô gọi là kinh giới tuệ, nếu hái toàn cây trừ bỏ

phần rễ thì gọi là kinh giới [3].

1.2. Nghiên cứu về dược lý của kinh giới

1.2.1. Tác dụng trị liệu theo kinh nghiệm dân gian

Loài E. ciliata được dùng để chữa cảm cúm, nhức đầu, viêm dạ dày, viêm ruột

cấp tính, bại liệt, phong thấp, rong kinh, băng huyết. Dùng ngoài trị mụn nhọt, viêm

da có mủ [3].

Trong dân gian, một số đơn thuốc sử dụng kinh giới như chữa bệnh cảm nóng,

cảm ngất khi dùng một nắm kinh giới tươi, chừng 50 g giã nhỏ, thêm vài miếng gừng

tươi, vắt lấy nước cho uống, bã còn lại dùng để dính dọc sống lưng. Cách khác, dùng

20 g kinh giới phơi khô sao hơi vàng, thêm 200 mL nước sắc còn 100 mL uống lúc

còn nóng. Đắp chăn cho ra mồ hôi [3].

Kinh giới tuệ sao đen 15 g, nước 200 mL sắc còn 100 mL cho uống làm 2-3

lần dùng trong chữa chứng băng huyết phụ nữ, bị cháy máu cam ở trẻ con hoặc người

lớn.

Hoa kinh giới, tía tô, hương nhu, ngải cứu, hoắc hương, các vị bằng nhau, dùng

nước sắc nhiều lần, hợp các nước sắc lại, có đặc thành viên bằng hạt ngô. Khi bị cảm

uống chừng 7-8 viên thuốc này. Dùng nước lá tre uống kèm thuốc. Trẻ con chỉ dùng

2 đến 4 viên. Viên thuốc trên có thể dùng chữa lỵ (dùng khi uống kèm với nước sắc

cây mơ lông). Kinh giới tán, Kinh giới tuệ sao vàng tán nhỏ dùng để chữa cảm cúm

khi dùng 6-8 g bột này [3].

1.2.2. Những nghiên cứu khoa học

Nghiên cứu về dược lý cả về phần chiết cũng như hợp chất tinh khiết của chi

Elsholtzia bao gồm có các hoạt tính chống virut, chống khuẩn, chống viêm, chống

oxy hóa, bảo vệ thiếu máu cơ tim, cùng một số hoạt tính khác. Các nhà nghiên cứu

hiện nay càng ngày càng quan tâm nhiều hơn đến hoạt tính sinh học của chi này [3].

Tinh dầu của các loài thuộc chi Elsholtzia có hoạt tính sinh học khá tốt chống

lại một số vi khuẩn thông thường chống gây bệnh cảm cúm như Staphylococcus

aureus, Bacillus typhi, Aeruginosus bacillus, Diplococcus intracellularis.

Ngoài ra, tinh dầu và nước sắc thuốc từ một số loài thuộc chi Elsholtzia có khả

năng chống một số loài vi khuẩn như Escherichia coli, Shigella flexneri,

Staphylococcus epidermidis, beta streptococcus, Bacterium paratyphosum B,

Bacillus typhi murium, Bacillus dysenteriae, Bacillus diphtheriae, Bacillus

meningitidis purulentae, Bacillus proteus, anthrax Bacillus, Neisseria intracellularis

[6].

1.2.2.1. Chống viêm, kháng sinh và khả năng khỏi ốm

Tinh dầu chiết từ E. ciliata chỉ ra khả năng chống viêm với sưng tấy bàn chân

ở chuột gây ra bởi 5-HT hoặc carrageenan, và chống viêm khớp kinh niên gây ra bởi

formaldehyde.

Nghiên cứu về E. ciliata: khả năng chống khuẩn của tinh dầu E. ciliata. Kết

quả nghiên cứu chỉ ra tác động của mỗi bộ phận của loài E. ciliata (lá, hoa và hạt) tới

6 chủng vi khuẩn đường ruột và 1 chủng men. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tốt

nhất là dịch chiết thành phần lá với các chủng vi khuẩn B. subtibillis, E. coli, S.

enteritidis, S. flexneri, S. typhi, S. aureus, và C. albicans. Điều này giúp kinh giới có

khả năng điều trị một số bệnh đường ruột [27].

Tinh dầu của E. ciliata được nghiên cứu có khả năng kháng sinh và gây đột

biến bằng phép phân tích ung thư Ames và có ảnh hưởng kéo dài ngoại độc tố ở khí

1.2.2.2. Khả năng giảm đau và an thần

quản của chuột.

Tinh dầu chiết từ loài E. ciliata chỉ khả năng giảm đau khi được đưa vào bởi

thành phần áp dụng phương pháp đĩa nóng. Bên cạnh đó, có khả năng tăng hiệu suất

1.2.2.3. Độc tính

ngủ của natri pentobarbital. Hiện tượng này đề xuất là sở hữu hiệu ứng an thần.

Không cho thấy sự thay đổi bệnh lý ở tế bào động vật bằng quan sát vĩ mô.

Giá trị LD50 của tinh dầu loài E. ciliata là 4.497±0.368 mL/kg [6].

1.3. Thành phần hóa học của kinh giới

Theo những công trình nghiên cứu của các nhà hóa học trên thế giới, lá và thân

cây của các loài Kinh giới có chứa một số hợp chất sau đây.

Bảng 1.1. Thành phần hóa học được nghiên cứu của chi kinh giới

Loài Thành phần hóa học chính

E. blanda

E. ciliata 5-hydroxy-6,7-dimethoxyflavone; luteolin; luteolin-5-O- 𝛽-D-glucopyranoside; 5-hydroxy-7,8-dimethoxyflavone; luteolin-7-O-beta-D-glucopyranoside 5-hydroxy-6,7-dimethoxyflavone; negletein; acacetin; acacetin- 7-O-β-D-glucopyranoside; limonene; aromadendren; d-carvone

neral; genarial; carvol; 𝛽-pinene E. communis

E. penduliflora

E. pilosa 7-methoxylchrysin,5,7,8-trimethoxyflavanone; acid ferulic; acid betulinic; luteolin; acid caffeic; acid 3β-O-acetyl ursolic; acid hyptadienic và acid euscaphic 1,8-cineole; 𝛾-terpinene; 𝛼-terpinyl acetate; 𝛽-pinene; (E)- ocimene; pinocarvone; myrcenol; thymol

linalool; isopinocamphone; E. rugulosa

thymol; carvacrol; 1,8-cineole; camphor; prunasin; amygdalin; stigmasteol rosefuran; dehydroelsholtzia ketone; cinol; cineole; camphor E. winitiana

1.3.1. Các hợp chất Flavonoid

Flavonoid là các hợp chất thuộc nhóm hợp chất phenolic đa vòng, có cấu trúc

vòng benzene, mang một hoặc nhiều nhóm thế hydroxyl gắn trực tiếp vào vòng thơm.

5-hydroxy-6, 7-dimethoxyflavone, 5-hydroxy-7, 8-dimethoxyflavone, negletein,

acacetin, acacetin 7-O-β-D-glucopyranoside, apigenin, luteolin, 5-hydroxy-7, 4'-

dimethoxyflavanonol, (+) –catechin.

Các flavonoid là những hợp chất có hoạt tính sinh học. Có hơn 30 hợp chất

flavonoids được phân lập từ các chi Kinh giới [27]. Trong đó những chất được phân

lập từ loài E. ciliata được trình bày trong bảng 1.2 và hình 1.2.

Bảng 1.2. Một số hợp chất được phân lập từ loài E. ciliata

Tên hợp chất Công thức phân tử TT

5-hydroxyl-6,7-dimethyl flavone C17H14O5 1

5-hydroxyl-7,8-dimethyl flavone C17H14O5 2

5,7-dimethoxyl-4’-hydroxyl flavone C17H14O5 3

5-hydroxyl-7,4’-dimethoxyl flavanovol C17H16O6 4

C22H24O9 5-hydroxyl-6-methyl-7-O-𝛼-D-galactosyl-dihydroflavonoid 5 glycoside

C22H22O10 6 Acacetin-7-O-𝛽-D-glucoside

1 2 3

Hình 1.2. Cấu trúc của các flavonoid phân lập được từ loài E. ciliata

1.3.2. Terpenoids và steroids

Triterpenoids cũng là thành phần chính của chi Elsholtzia. Các loại triterpen

oleanane được phân lập chủ yếu từ thân và lá của loài E. bodinieri. Nhóm glycosyl

nằm ở vị trí C-28 (-COO-) của acid 23-hydroxyechinocystic bằng liên kết este trong

các hợp chất 7-9. Tại vị trí C-3 đính cafeoyl trong phân tử 7, và liên kết với một nhóm

arabinosyl trong phân tử 8 và 9.

R1 OH

R2 C

R3 OH

R5 CH3

R6 CH2OH

TT 7

O-α-L-ara

CH3

CH2OH

8

O-α-L-ara

CH3

9 R4 O--D-glc (6-1) -D-glc (4-1) α-L- rha O--D-glc (6-1) -D-glc (4-1) α-L- rha O--D-glc (6-1) -D-glc

Ba triterpene loại ursane bao gồm acid ursolic (10), acid corosolic (11) và acid

2α,3β,19α-tri-hydroxyurs-12-en-28-oic (12), thu được từ E. rugulosa, E. ciliata và E.

bodinieri.

R1 H OH OH

R2 H H OH

TT 10 11 12

Hai hợp chất không phổ biến là 18,19-secoursane glycopyranosides,

bodiniosides A (13) và B (14), được phân lập từ loài E. bodinier. Ngoài ra, acid

2,3,19-trihydroxyurs-12-en-28-oic (12) và acid hypadienic (15) cũng đồng thời thu

được từ E. bodiner. Các phân tử 13-15 có thể thu được từ hợp chất 12 bằng con đường

sinh học.

Năm hợp chất diterpenoid 18-22, được phân lập từ E. bodinier. Ludongnin 5

(18), là một diterpenoid kauran 4 vòng, có gắn với γ-lactonic tại vị trị C6-C19. Hợp

chất 18 này cũng có vai trò quan trọng và tăng hiệu ứng chống khuẩn. Diterpenoid

pimarane 3 vòng, sandaracopimar-15-en-8β,12β-diol (19), lần đầu tiên được phân lập

từ E. bodinier [33].

Một diterpenoid loại abietane, (+)-hinokiol (20), là một diterpenoid phụ có

trong loài này. Các hợp này đều có ảnh hưởng đến sự tiêu thụ và ngừng hoạt động

chống lại Staphylococus aureus, Streotococcus, Escherichia coli, và Pseudomonas

aeruginosa thu hút các nhà nghiên cứu.

Chuỗi không thứ tự liên kết OH…π được tìm thấy trong cấu trúc tinh thể của

hợp chất 20 trừ khi có sự tồn tại của liên kết hidro, khi cấu hình và cấu dạng phân tử

của phân tử này được xác định bởi nhiễu xạ tia X.

Hai acid hardwickiic glycopyranosides, acid 6-hydroxy-(-)-hardwickiic 2’-O-

β-D-glucopyranosylbenzyl este (21) và acid 6,7-dihydroxy-(-)-hardwickiic 2’-O-β-

D-glucopyranosylbenzyl este (22) lần đầu tiên được báo trong E. bodinieri. Ba

sesquiterpene glycopyranoside loại eudwsmane, dictamnoside G (23),

3β,5α,11,12,13-pentahydroxy-eudesm-4(15)-ene 3-O-β-D-apiofuranosyl-91-4)-α-L-

rhamnopyranosyl-(1-3)-β-D-glycopyranoside (24) và intergrifoside A (25) thu được

từ rễ cây loài E. bodinieri [16].

Ngoài ra, chỉ có một monoterpenoid, 2,6-dimethyl-8-droxyl-2,6-octandienic

acid-8-O-β-glucoside (26), thu được từ E. bodinieri.

Một số steroid được tìm thấy trong loài E. ciliata. Trong số đã phân lập được

daucosterol [6].

Hình 1.3. Cấu trúc của daucosterol

1.3.3. Acid béo

Một số acid béo phân lập được từ chi Elsholtzia như acid palmic, acid linolic,

acid succinic và acid sorbic. Trong đó có hai acid phân lập được từ acid palmic và

acid linolic từ loài E. ciliata [6].

1.3.4. Một số hợp chất có trong tinh dầu E. ciliata

Sử dụng phương pháp phân tích GC-MS, một số hợp chất chính được tìm thấy

có trong tinh dầu loài E. cilata là β-Dehydroelsholtzia ketone, elsholtzia ketone, 2-

methyl-1,3,5-trimethyl-benzene, aromadendrene, d-carvone, limonene.

1.4. Hoạt tính sinh học

1.4.1. Khả năng chống oxy hóa

Những chất có khả năng chống oxy hóa là những chất giúp ngăn chặn hoặc

làm chậm quá trình oxy hóa chất khác. Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy

này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính

chúng.

Dù phản ứng oxy hóa thuộc loại cơ bản trong đời sống nhưng có thể ngăn chặn

nó, chẳng hạn động thực vật duy trì hệ thống với rất nhiều loại chất chống oxy hóa

như glutathione, vitamin C, vitamin E, enzyme catalase, superoxyde dismutase, acid

citric…v.v.

Hầu như hoa, quả, hạt …đều có chứa các chất có hoạt tính oxy hóa để bảo vệ

chúng khỏi những tác nhân oxy hóa trong điều kiện thường. Nhiều nghiên cứu của

các nhà khoa học trên thế giới cho thấy trong rau quả có chứa nhiều chất chống oxy

hóa tự nhiên như: flavonoid, acid phenolic, tocophenol, carotenoid, acid ascorbic,

hợp chất chứa S, …Các chất chống oxy hóa tự nhiên này có tác dụng ức chế phản

ứng oxy hóa lipit, giảm độc tố và giảm mùi ôi khó chịu. Tuy nhiên các chất chứa

trong các sản phẩm đó là khác nhau và nồng độ cũng khác nhau.

Hai chỉ số có thể dùng để xác định khả năng chống oxy hóa là tổng phenolic

1.4.1.1. Tổng phenolic

và tổng flavonoid.

Trong tự nhiên thường gặp các acid phenolic như vanilic, syringic, p-

hiđroxybenzoic; 3, 4-đihiđroxybenzoic, p-coumaric, caffeic, ferulic, sinapic,

chlorogenic. Các acid phenolic ngoài dạng tự do, nó còn tồn tại dưới dạng este của

acid hữu cơ hoặc glycozide. Hai dạng này phổ biến hơn so với dạng tự do nhưng hoạt

tính chống oxy hóa của chúng thấp hơn [21].

Dẫn xuất của acid benzoic:

Dẫn xuất của acid cinamic:

Dẫn xuất của acid cinamic có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn dẫn xuất của

acid benzoic. Người ta cho rằng do nhóm allyl làm tăng khả năng cộng hưởng của

gốc phenoxyl giống ubiquinon nên hoạt tính chống oxy hóa cũng tăng.

Hoạt tính chống oxy hóa của acid phenolic chủ yếu do hydro của phenol.

Các gốc phenoxy rất ổn định, kém hoạt động, nhờ vậy không có khả năng sinh

mạch oxy hóa tiếp theo. Sự có mặt thêm của nhóm hydroxyl làm tăng hoạt tính chống

1.4.1.2. Tổng Flavonoid

oxy hóa của acid phenolic và khả năng vô hoạt hóa chất trợ oxy hóa là kim loại.

Flavonoid là nhóm lớn các hợp chất mang màu có thể tìm thấy ở nhiều loại

cây. Các flavonoid bao gồm các flavon, flavonol, isoflavon, flavonon và chalcon. Một

số flavonoid phổ biến là: apigenin, chrysin, luteolin, datiscetin, quercetin, myricetin,

morin và kaemferol. Khoảng 90% flavonoid trong thực vật tồn tại dưới dạng liên kết

glucoside.

Các flavonoid có khả năng ức chế sự oxy hóa lipid rất hữu hiệu. Các flavonoid

có thể đóng vai trò là chất chống oxy hóa có khả năng bắt gốc tự do, các gốc này bao

gồm các anion superoxyde, các gốc peoxyde và các gốc hydroxyl. Cơ chế phản ứng

chọn lọc khác của flavonoid còn thể hiện ở khả năng dập tắt các oxy singlet, tạo phức

với ion kim loại chuyển tiếp, cũng như ức chế hoạt tính của enzym lipoxygenaza.

Flavonoid có hydroxy tự do hoạt động làm mất gốc tự do và các nhóm hiđroxy

của vòng B làm tăng hoạt tính chống oxy hóa của flavonoid. Nhóm hiđroxy của vòng

B đóng vai trò tiên phong trong quá trình chống oxy hóa.

1.4.2. Hoạt tính ức chế enzym -glucosidase

-glucosidase là enzym then chốt trong quá trình thủy phân carbohydrate tạo

glucose trong cơ thể người. Do đó, các chất ức chế - glucosidase có thể làm chậm

quá trình giải phóng và hấp thụ glucose, qua đó không làm tăng đường huyết sau ăn.

Vì vậy, một số chất ức chế - glucosidase như Acarbose và Miglitol đã được sử dụng

rộng rãi trong điều trị tiểu đường type 2.

Một số loài cây ở Việt Nam đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết như lá cây

vối Cleistocalyx operculatus cây chó đẻ răng cưa Phyllanthus urinaria L., tầm gửi

trên cây mít Macrosolen Blume, củ chuối hột Musa balbisiana Colla, vỏ thân ổi

Psidium guajava L., lá chè đắng Ilex kaushue. Các chất được phân lập được và có khả

năng ức chế enzyme -glucosidase gồm có 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-

dimethylchalcon, 3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid, triterpenoid khung olean 3β

-hydroxy-olean-12(13)-en-28-oic acid, 2,3β,23- trihydroxy-urs-12en-28-oic acid và

hợp chất tinh sạch từ lá chè đắng là 24-methyl (3- hydroxy-lup-20(29)-en-24-oic

acid) ester [4].

Những nghiên cứu về một số loài thuộc họ bạc hà (Lamicacea) cho thấy hai

hợp chất được phân lập từ phần thân và lá của loài Salvia moorcraftiana Wall là 5,3’-

dihydroxy-6,7,4’-trimethoxy-flavone và oleanolic acid có khả năng ức chế tốt enzym

-glucosidase với nồng độ ức chế 50% (IC50) lần lượt là 4.38 μM ± 0.21 và 5.64 μM

± 0.25 [28]. Cặn chiết clorofom, methanol, nước của lá và hạt của loài Ocimum

tenuflorum, và cặn chiết metanol của lá của loài Origanum majorana đều có khả năng

gây ức chế tốt enzym glucosidase đường ruột thử nghiệm trên chuột [30].

Chương 2 - THỰC NGHIỆM

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là lá và thân của cây kinh giới được sử dụng phổ biến

làm rau thơm ở Việt Nam. Mẫu được thu mua tại siêu thị địa phương vào tháng 9

năm 2015.

Hình 2.1. Mẫu kinh giới thu mua

Cây kinh giới chúng tôi thu nhận có tên khoa học là Elsholtzia ciliata được

xác nhận bởi giáo sư Nguyễn Thế Nhã, Khoa Quản lý tài nguyên rừng và môi trường,

ĐH Lâm Nghiệp, Hà Nội kết hợp với tham khảo tài liệu.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

- Xử lý mẫu cây kinh giới sau khi thu hái bằng phương pháp sấy khô

- Ngâm mẫu cây kinh giới với dung môi thích hợp nhằm thu được dịch chiết

chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ mong muốn.

- Chiết dịch chiết thu được với các dung môi có độ phận cực khác nhau nhằm

thu được các lớp chất từ mẫu cây kinh giới.

- Phân tích định tính thành phần hóa học có trong các dịch chiết thu được.

- Phân tách cặn chiết của cây kinh giới bằng phương pháp sắc ký để phân tách

các cặn chiết thành các nhóm phân đoạn cũng như mong muốn phân lập một số hợp

chất có hoạt tính sinh học có trong các cặn chiết.

- Dự đoán cấu trúc của các hợp chất có thể phân lập được từ mẫu cây kinh giới

- Khảo sát một số hoạt tính sinh học của dịch chiết thu được.

2.3. Thực nghiệm

Các thiết bị được sử dụng trong quá trình nghiên cứu:

- Kiểm tra định tính dùng bản mỏng silica gel tráng sẵn DC Alufolien 60F254 -

Sắc ký bản mỏng điều chế dùng silicagel G.Merck 60 F254 và sắc kí cột

dùng silicagel Merck cỡ hạt 63-200µm.

- Thiết bị GC/MS: Agilent-6890N/5973i, MSD 5973; cột tách mao quản HP-

5MS 30m x 0,25mm ID, 0,25µm); khí mang He (99.999%).

- MS ghi trên máy Agilent 6310 ion trap trong CHCl3.

- Nhiệt độ nóng chảy ghi trên máy BUCHI MP B-545.

- Độ hấp phụ quang đo trên máy Tecan GENios.

- Cộng hưởng từ ghi trên máy Bruker AM500, 13C-NMR (400MHz, CDCl3).

2.3.1. Chiết các lớp chất từ mẫu cây kinh giới

Thân và lá cây kinh giới có khối lượng 5 kg sau khi thu mua được làm sạch và

sấy khô ở 400C thu được 1,3 kg nguyên liệu khô, xay thành bột và ngâm chiết bằng

methanol khan ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày thu được dịch chiết (lặp lại 3 lần), dịch

thu được đem cất loại bỏ bớt dung môi dưới áp suất thấp (Buchi, rotavapor R215).

Dịch chiết methanol được pha loãng với nước cất thu được dịc chiết methanol - nước,

tiến hành chiết dịch methanol - nước với hai dung môi có độ phân cực khác nhau là

n-hexan và etyl acetat. Các phần chiết này được làm khan bằng Na2SO4, sau đó gạn

lọc qua giấy lọc băng đỏ để loại muối. Dịch lọc đem cô quay ở áp suất thấp để loại

bỏ dung môi, thu được cặn chiết ở dạng cao lỏng và ký hiệu tương ứng là EH (20,3

g), EE (151,2 g) (Sơ đồ 2.1). Hiệu suất của 2 phần chiết được trình bày ở bảng 2.1

(khối lượng mẫu ban đầu đã dùng để chiết là 1300 g) (Sơ đồ 2.1).

Bảng 2.1. Hiệu suất của các phần chiết từ mẫu cây kinh giới

TT

Phần chiết

Kí hiệu

Khối lượng (gam)

1 2

n-hexan etyl acetat

EH EE

20,3 151,2

Hiệu suất (%, tính theo khối lượng vỏ khô) 1,56 11,63

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết từ mẫu khô

MẪU KINH GIỚI

KHÔ (1,3 kg)

- Ngâm chiết trong methanol 3 lần (3 ngày/lần) - Lọc bằng giấy lọc.

1. Cất loại dung môi 2. Pha loãng dịch chiết với nước cất

DÞch chiÕt metanol

Dịch chiết

Methanol – nước

Chiết lần lượt bằng:

n- hexan

Phần chiết n-hexan (EH)

Dịch chiết n-hexan

Các dịch chiết được: 1. Làm khô bằng Na2SO4 2. Cất loại dung môi

Phần chiết etyl acetat (EE)

Etyl acetat

Dịch chiết etylaxeta

Dịch chiết methanol - nước

2.3.2. Phân tách phần chiết n-hexan (EH) và phần chiết etyl acetat (EE)

bằng phương pháp sắc ký cột (CC)

Sử dụng bản mỏng silica gel tráng sẵn DC Alufolien 60F254 để khảo sát các

hợp chất có trong phần chiết n-hexan (EH). Sau khi triển khai sắc ký, quan sát sắc ký

đồ dưới ánh sáng tử ngoại (bước sóng  = 254 nm) và phun thuốc thử vanillin sunfat

1% lên lớp mỏng và hơ nóng, đanh dấu các vết tách hiện trên TLC. Sau khi sử dụng

một số hệ dung môi để triển khai sắc ký, chúng tôi nhận thấy rằng hệ dung môi tách

tốt nhất với cặn chiết n-hexan (EH) là n-hexan/ etyl acetat (8:1, v/v), và với cặn chiết

etyl acetat (EE) là n-hexan/etyl acetat/axit axetic (9:1:1, v/v/v).

Sau khi khảo sát các cặn chiết bằng sắc kí lớp mỏng TLC, các cặn chiết được

phân tách thành các phân đoạn trên cột sắc ký nhồi silicagel. Tiến hành rửa giải

gradient với hỗn hợp dung môi khác nhau và triển khai sắc ký mỏng TLC để gom các

phân đoạn giống nhau: cặn chiết EH, n-hexan/etyl acetat (20:1→1:20, v/v), thu được

7 nhóm phân đoạn, ký hiệu EH1-EH7; cặn chiết EE n-hexan/etyl acetat/axit axetic

2.3.2.1. Phân tách cặn chiết n-hexan (EH)

(20:1:1→1:20:1, v/v), thu được 8 nhóm phân đoạn, ký hiệu EE1-EE8.

Pha loãng 10,0 gam phần chiết n-hexan với 5 ml dung môi n-hexan. Cột được

nhồi với 30 g silicagel (cỡ hạt 63-100 µm, Merck) bằng phương pháp nhồi ướt. Khi

cột đã ổn định, đưa mẫu lên cột. Tiến hành rửa giải gradient với hệ dung môi n-

hexan:etyl acetat theo tỉ lệ tăng dần của etyl acetat, bắt đầu từ tỉ lệ 20:1,v/v, cuối cùng

rửa cột bằng etyl acetat 100%. Qua triển khai phân tách bằng sức ký cột thường (CC)

đã phân tách được 62 phân đoạn. Gom các phân đoạn giống nhau trên TLC thu được

7 nhóm phân đoạn, kí hiệu từ EH1  EH7. Tiếp tục tiến hành phân tách nhóm phân

đoạn bằng sắc kí cột nhanh FC trên chất hấp thụ silica gel, dung môi n-hexan/etyl

acetat (5:1, v/v): với nhóm phân đoạn EH2 (EH2.1  EH2.3) và EH 3 (EH3.1 

EH3.4), sau một thời gian để bay hơi hoàn toàn dung môi ở nhiệt độ phòng, ở phân

đoạn EH2.3 và EH3.3 có xuất hiện các tinh thể bám lên thành ống nghiệm, chúng tôi

có thu các tinh thể này vào ống eppendorf, kí hiệu tinh thể thu được là H1 và H2

tương ứng. Quá trình phân tách dịch chiết và các nhóm phân đoạn của cặn chiết EH

được tóm tắt trong sơ đồ 2.2.

Sơ đồ 2.2. Phân tách các phân đoạn dịch chiết n-hexan

2.3.2.2. Phân tách cặn chiết etyl acetat (EE)

Pha loãng 10,4 gram phần chiết etyl acetat với 5 ml dung môi n-hexan:etyl

acetat (2:1, v/v). Cột được nhồi với 30 g silicagel (cỡ hạt 63-100 µm, Merck) bằng

phương pháp nhồi ướt. Khi cột đã ổn định, đưa mẫu lên cột. Tiến hành rửa giải

gradient với hệ dung môi n-hexan:etyl acetat:axit axetic theo tỉ lệ tăng dần của etyl

acetat, bắt đầu từ tỉ lệ 20:1:1, cuối cùng rửa cột bằng etyl acetat 100%. Qua triển khai

phân tách bằng sức ký cột thường (CC) đã phân tách được 68 phân đoạn. Gom các

phân đoạn giống nhau trên TLC thu được 8 nhóm phân đoạn, kí hiệu từ EE1  EE8.

Tiếp tục tiến hành phân tách nhóm phân đoạn bằng sắc kí cột nhanh FC trên chất hấp

thụ silica gel, dung môi n-hexan:etyl acetat:axit axetic tỉ lệ 5:1:1 (v/v/v): với nhóm

phân đoạn EE2 (EE2.1  EE2.2) và EE3 (EE3.1  EE3.4), khi dung môi trong các

ống nghiệm bay hơi hoàn toàn ở nhiệt độ phòng, ở phân đoạn EE2.1 và EE3.2 có xuất

hiện các tinh thể bám lên thành ống nghiệm, các tinh thể này được gom vào ống

eppendorf, kí hiệu tinh thể thu được là E1 và E2 tương ứng. Quá trình phân tách dịch

chiết và các nhóm phân đoạn của cặn chiết EE được tóm tắt trong sơ đồ 2.3.

Sơ đồ 2.3. Phân tách các phân đoạn dịch chiết etyl acetat

2.3.3. Khảo sát định tính các nhóm phân đoạn trên hệ thống sắc ký khổi

phổ GC/MS

2.3.3.1. Khảo sát định tính cặn chiết n-hexan (EH) trên hệ thống GC/MS

Một lượng nhỏ của từng nhóm phân đoạn được hòa tan trong dung môi aceton.

Điều kiện làm việc của thiết bị GC/MS (Agilent-6890N/5973i, MSD 6890; cột tách

mao quản HP-5MS 30m x 0,25mm ID, 0,25µm): khí mang He (99.999%); thể tích

mẫu bơm 1µl, chế độ bơm split (15:1); nhiệt độ injector là 250C; nhiệt độ detector

là 280C; chương trình nhiệt độ lò: 30C giữ trong 2 phút, tăng 4C/phút đến 2500C

tổng thời gian chạy là 50 phút. Năng lượng ion hóa 70 eV, chế độ làm việc scan (0,5

giây) ở vùng m/z 45-550. Các thành phần hóa học có trong mẫu được nhận dạng bằng

cách so sánh phổ khối lượng MS của các chất với phổ MS của các chất chuẩn có trong

hai thư viện phổ Wiley 7n.l and NIST.

Dữ liệu các hợp chất phân lập

Hợp chất H1: khối lượng 12 mg

Tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy nỏng chảy: 135-1360C

Sắc ký bản mỏng: Rf=0,55 (n-hexan:etyl axetat=3:1)

Tín hiệu phổ cộng hưởng từ 13C-NMR

 (ppm)

Đặc điểm Đặc điểm

12,06 36,72 CH3 CH2

19,06 39,82 CH3 CH2

21,12 40,45 C CH3

22,82 42,35 CH3 CH2

23,12 50,03 CH CH3

24,32 51,26 CH CH2

25,32 56,03 CH CH2

28,90 56,90 CH CH2

29,24 CH 71,97 CH

29,71 121,32 CH (nối đôi) CH2

31,71 129,34 CH (nối đôi) CH2

34,01 CH 138,40 CH (nối đôi)

36,16 C 140,94 C (nối đôi)

Hợp chất H2: khối lượng 4 mg

Tinh thể vàng, nhiệt độ nóng chảy 256-2570C.

Thời gian lưu: 26,85 phút

2.3.3.2. Khảo sát định tính cặn chiết etyl acetat (EE) trên hệ thống GC/MS

MS: m/z: 242, 213, 139, 51, 39

Một lượng nhỏ của từng nhóm phân đoạn được hòa tan trong dung môi aceton.

Điều kiện làm việc của thiết bị GC/MS (Agilent-6890N/5973i, MSD 5973; cột tách

mao quản HP-5MS 30m x 0,25mm ID, 0,25µm); khí mang He (99.999%); thể tích

mẫu bơm 1µl, chế độ bơm split (15:1); nhiệt độ injector là 250C; nhiệt độ detector

là 280C; chương trình nhiệt độ lò: 50C giữ trong 4 phút, tăng 5C/phút đến 2800C

tổng thời gian chạy là 45 phút. Năng lượng ion hóa 70 eV, chế độ làm việc scan (0,5

giây) ở vùng m/z 35-450. Các thành phần hóa học có trong mẫu được nhận dạng bằng

cách so sánh phổ khối lượng MS của các chất với phổ MS của các chất chuẩn có trong

hai thư viện phổ Wiley 7n.l and NIST.

Dữ liệu các hợp chất được phân lập

Hợp chất E1: khối lượng 4 mg

Tinh thể màu trắng

Thời gian lưu: 18,78

MS: m/z 149, 125, 83, 47, 28.

Hợp chất E2: khối lượng 3 mg

Tinh thể màu trắng

Thời gian lưu: 25,44 phút

MS: m/z 178, 111, 95, 48, 28.

2.3.4. Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học

2.3.4.1. Xác định hoạt tính chống oxy hóa

Xác định tổng hàm lượng phenolic

Xác định tổng lượng phenolic bằng phương pháp phân tích với thuốc thử

Folin- Ciocalteux. Lấy chính xác 1 mL dịch chiết hoặc dung dịch chuẩn của acid galic

(nồng độ 60, 80, 100, 120 và 140 mg/L) vào bình định mức 25 mL đã có sẵn 9 mL

nước cất. Thêm 1 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu lắc đều. Sau 5 phút, thêm10 mL dung

dịch Na2CO3 7% vào hỗn hợp. Định mức bằng nước cất. Bình định mức được giữ ở

nhiệt độ phòng 90 phút. Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 750 nm. Tổng lượng

Xác định tổng hàm lượng flavonoid

phenolic được tính bằng mg acid galic (GAE)/100 g khối lượng khô [24].

Lấy chính xác 1mL dịch chiết hoặc dung dịch chuẩn của catechin (nồng độ 60,

80, 100, 120, 140 mg/L) vào bình định mức có chứa 4 mL nước cất. Thêm 0,3 mL

dung dịch NaNO2 5%. Sau 5 phút, thêm chính xác 0,3 mL dung dịch AlCl3 10%. Ở

phút thứ 6 thêm 2 mL dung dịch NaOH 1M. Định mức bằng nước cất đến 10 mL.

Lắc đều và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 510 nm. Tổng lượng flavonoid được

xác định bằng số mg catechin/100 g khối lượng khô [24].

2.3.4.2. Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym -glucosidase

Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase được thực hiện

trên đĩa 96 giếng với tổng thể tích phản ứng là 200 µL/giếng. Mẫu thử được pha loãng

bằng DMSO 100% hoặc nước cất vô trùng đến nồng độ cuối cùng trong phản ứng là

256; 64; 16; 4; 1; 0,25 ppm. Acarbose được sử dụng làm chất tham khảo.

Các thành phần phản ứng bao gồm: 40µL đệm phosphate 100 mM pH 6,8;

25µL -glucosidase 0,4 U/mL; 10 µL mẫu thử; 25 µL p-nitrophenyl -D-

glucopyranoside (pNPG) 2,5 mM [14,15].

Ở mẫu đối chứng âm, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng. Thí nghiệm

được ủ ở nhiệt độ 37o C. Sau 30 phút, phản ứng được dừng bằng 100 µL Na2CO3

0,2M. Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên máy Tecan GENios với bước sóng

405 nm (A).

Nguyên tắc xác định khả năng ức chế enzym dựa trên phản ứng

(pNPG) (PNP)

Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ thuận với lượng p-nitrophenol

(PNP).

Khả năng ức chế enzyme - glucosidase của mẫu thử được xác định bằng công

thức:

Độ ức chế (%) = [A(đối chứng âm) – A(mẫu thử)] /A(đối chứng âm) x 100%

IC50 (half maximal inhibitory concentration) là nồng độ chất thử ức chế 50%

hoạt động của enzyme -glucosidase, được tính bằng phần mềm Tablecurve.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát định tính các nhóm phân đoạn trên hệ thống GC/MS

3.1.1. Cặn chiết n-hexan

3.1.1.1. Thành phần các hợp chất hóa học

10,0 gam cặn chiết n-hexan được phân tách phân đoạn như trình bày ở chương

2 thu được 7 nhóm phân đoạn ở dạng dầu, có mùi thơm đặc trưng của chi kinh giới.

Khối lượng cặn thu được của mỗi phân đoạn trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả phân tách cặn chiết n-hexan bằng sắc ký cột

TT Nhóm phân đoạn Trạng thái vật lý Khối lượng (gam)

1 2 3 4 5 6 7 Dầu vàng nhạt Dầu vàng nhạt Dầu vàng nhạt Dầu vàng đậm Dầu xanh nhạt Dầu xanh nhạt Dầu xanh đậm 0,3 0,2 0,3 0,1 0,2 0,1 0,1 EE.1 EE.2 EE.3 EE.4 EE.5 EE.6 EE.7

Với mỗi phân đoạn thu được tiến hành khảo sát thành phần hóa học bằng

phương pháp GC-MS, sắc ký đồ của phân đoạn EH2 trình bày trong hình

Hình 3.1. Sắc ký đồ GC-MS của phân đoạn EH2 cây kinh giới

Thành phần dịch chiết có trong loài E. ciliata được liệt kê trong bảng 3.2. Kết

quả phân tích GC-MS phát hiện hơn 30 hợp chất với 7 acid béo, 4 flavonoid, 20

terpenoid và steroid và một số hợp chất khác. Thành phần chính gồm terpenoid và

steroid như phytol (35,42%), β-sitosterol (15,18%) và nerolidol (9,07%).

Bảng 3.2. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan

TT Hợp chất Thành phần(%)

1 phytol 35,42

2 β-sitosterol 15,18

3 nerolidol 9,07

4 farnesol 9,01

5 limonene 7,99

6 (Z)-β-farnesene 6,58

7 α-pinene 3,19

β-caryophyllene 8 2,76

geraniol 9 2,14

p-cymene 10 1,80

1,8-cineole 11 1,41

selinene 12 0,94

8,1-octadecadienoic acid 13 0,84

palmitic acid 14 0,74

2,3-octadecadienoic acid 15 0,64

16 α-humulene 0,45

heneicosylic acid 17 0,29

sabinene 18 0,28

β-cubebene 19 0,25

β-bisabolene 0,22 20

linoleic acid 21 0,19

oleic acid 22 0,19

germacrene B 23 0,16

β-pinene 24 0,11

eicosanoic acid 25 0,07

t-muurolol 26 0,04

(Z)-β-ocimene 27 0,04

1-Octen-3-ol 28 <0,01

3-octanol 29 <0,01

3-octanone 30 <0,01

acacetin 31 Dạng vết

apigeniun 32 Dạng vết

luteoin 33 Dạng vết

34 5-hydroxy-6-dimethoxyflavon Dạng vết

Kết quả khảo sát các acid béo được tìm thấy trong kinh giới gồm cả acid béo

bão hòa, không bão hòa mạch ngắn, trung bình và dài. Các dạng của acid béo mạch

dài như acid oleic và hay omega-6 có trong dịch chiết kinh giới, đây là những hợp

chất cần thiết để duy trì vận động cho cơ thể, vì cơ thể không tự tổng hợp được những

acid này [25]. Acid palmitic là acid béo đầu tiên được tạo ra trong quá trình tổng hợp

acid béo, là dạng tích trữ chất béo cho cơ thể. Trong sinh học, quá trình biến đổi

protein gắn nhóm palmitoyl đóng vai trò quan trọng cho định vị màng [9].

Hình 3.2. Các acid béo mạch dài trong dịch chiết kinh giới

Một số terpenoid và steroid được tìm thấy trong dịch chiết kinh giới như

phytol, tiền chất của vitamin E và vitamin K1, hợp chất này giữ vai trò quan trọng

trong quá trình chuyển hóa hóa học của cơ thể cũng được tìm thấy trong dịch chiết

kinh giới [7]. Nerolidol có khả năng chống nấm vi sợi Microsprorum gyseum trên

chuột lang. Thử nghiệm dùng eugenol và nerolidol của Lee và cộng sự cho thấy, với

nồng độ 10% của hợp chất này dùng với nền kem bôi là vaseline, sau 3 tuần sử dụng

thuốc tại vị trị bị bệnh, nấm Microsporum gyseum được loại bỏ [26]. Các dạng đồng

phân 𝛼 và 𝛽 caryophyllene được nhận định là có khả năng chống viêm, chống oxy

hóa, đặc biệt, theo Legault và Pichette thì khả năng chống ung thư được thử nghiệm

trên hai chủng MCF-7 và DLD-4. Theo nghiên cứu, sự có mặt 𝛽-caryophyllene làm

tăng khả năng chống ung thư của đồng phân 𝛼-caryophyllene [17].

Hình 3.3. Tecpenoid trong dịch chiết kinh giới

1-octen-3-ol được tìm thấy trong kinh giới có vai trò trong chữa bệnh

Parkinson. A.A Inamar và cộng sự phát hiện ra rằng, 1-octen-3-ol có khả năng làm

giảm lượng dopamine và gây ra thoái hóa nơron dopamine bằng cách làm gián đoạn

quá trình vận chuyển dopamine [8].

Hình 3.4. Flavonoid trong dịch chiết kinh giới

3.1.1.2. Các hợp chất được phân lập

Hợp chất phân lập được từ dịch chiết n-hexan là H1 và H2 được định bằng

GC-MS và 13C-NMR đối với H1.

 Hợp chất H1

Hình 3.5. Phổ NMR của hợp chất H1

Từ phân đoạn EH 3.1 thu được 12 mg hợp chất H1 kết tinh trong n-hexan dưới

dạng tinh thể màu trắng, có điểm nóng chảy 135-1360C. Hợp chất H1 chỉ cho một vết

tròn trên sắc ký lớp mỏng TLC, giá trị Rf=0,55 (n-hexan:etyl acetat=3:1), không thể

tiếp tục tách tiếp bằng sắc ký đồ. Phổ 13C-NMR cho thấy đây là hỗn hợp của β-

sitosterol (C29H50O) và stigmasterol (C29H48O).

Hình 3.6. Cấu trúc của H1

Trên phổ, độ chuyển dịch hóa học là 140,94 ppm và 121,32 ppm tương ứng là

tín hiệu phổ của C-5 và C-6 trong nối đôi của vòng sitosterol. Độ chuyển dịch hóa

học tại 19,06 ppm là tín hiệu phổ của C-19, tại 138,404 ppm là tín hiệu của C-22, tại

129,34 ppm là tín hiệu của C-23. Các tín hiệu cụ thể được trình bày như bảng 3.3.

Bảng 3.3. Các tín hiệu phổ của H1

Độ chuyển dịch Tín hiệu Cacbon Bản chất Cacbon

hóa học (ppm) tương ứng

12,06 C18 CH3

12,06 C29 CH3

19,06 C19 CH3

21,12 C26 CH3

22,82 C27 CH3

23,12 C21 CH3

24,32 C11 CH2

24,32 C15 CH2

25,32 C28 CH2

28,90 C16 CH2

29,24 CH C8

29,71 C2 CH2

31,71 C7 CH2

34,01 CH C25

36,16 C C10

36,72 C1 CH2

39,82 C12 CH2

39,82 CH C20

40,45 C C13

42,35 C4 CH2

50,03 CH C9

51,26 C24 CH

56,03 C17 CH

56,90 C14 CH

71,97 C3 CH

121,32 C6 CH (nối đôi)

129,34 C23 CH (nối đôi)

138,40 C22 CH (nối đôi)

140,94 C5 C (nối đôi)

So sánh với hợp chất β-sitosterol có nhiệt độ nóng chảy là 134-1350C, và

stigmasterol có nhiệt độ nóng chảy là 174-1760C [29]. Mặc dù nhiệt độ nóng chảy

của H1 khá gần với điểm nóng chảy của β-sitosterol, nhưng tín hiệu phổ NMR tại vị

trí C-22 và C-23 của H1 có độ chuyển dịch hóa học là đặc trưng của tín hiệu phổ

tương ứng với cacbon tham gia liên kết đôi. Điều này cho thấy đây là hỗn hợp của β-

sitosterol và stigmasterol.

 Hợp chất H2

Hình 3.7. Sắc ký đồ của H2

Hợp chất H2 được phân lập từ phân EH3, có tinh thể màu vàng, nhiệt độ nóng

chảy 256-2570C.

Hình 3.8. Phổ khối của H2

Emodin (tên khoa học là l,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone, C15H10O5)

là một anthraquinon là một hợp chất được tìm thấy trong loài dược liệu như đại hoàng

(Rhizoma Rhei) [5] có tác dụng chống viêm, chống khuẩn, chống ung thư [19].

Emodin có tác dụng bảo vệ gan, phục hồi hoạt động tế bào gan nhiễm mỡ, cải thiện

tuần hoàn gan, giảm các biểu hiện bệnh lý của gan [32]. Trong nghiên cứu của Kim

JR và cộng sự, còn cho thấy khả năng chống khuẩn trực tiếp của emodin đối với

Vibrio vulnificus [18].

3.1.2. Cặn chiết etyl acetat

3.1.2.1. Thành phần các hợp chất hóa học

10,4 gam cặn chiết etyl acetat được phân tách phân đoạn như trình bày ở

chương 2 thu được 8 nhóm phân đoạn nhóm phân đoạn đều thu được ở dạng dầu, có

mùi thơm đặc trưng của chi kinh giới. Khối lượng cặn thu được của mỗi phân đoạn

trình bày trong bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả phân tách cặn chiết etyl acetat bằng sắc ký cột

TT Nhóm phân đoạn Trạng thái vật lý Khối lượng (gam)

1 2 3 4 5 6 7 8 Dầu vàng nhạt Dầu vàng đậm Dầu vàng đậm Dầu xanh nhạt Dầu xanh nhạt Dầu xanh đậm Dầu xanh đậm Dầu xanh đậm 0,7 0,4 0,7 0,2 0,4 0,2 0,2 0,4 EE.1 EE.2 EE.3 EE.4 EE.5 EE.6 EE.7 EE.8

Với mỗi phân đoạn thu được tiến hành khảo sát thành phần hóa học bằng

phương pháp GC-MS, sắc ký đồ của phân đoạn EE2 trình bày trong hình 3.9.

Hình 3.9. Sắc ký đồ GC-MS của phân đoạn EE2 cây kinh giới

Thành phần dịch chiết etyl acetat có trong loài E. ciliata được liệt kê trong

bảng 3.5. Kết quả phân tích GC-MS phát hiện 24 hợp chất. Thành phần chính gồm

methyl linolenate (25,43%), β-sitosterol (18.18%), acid palmitic (12,07%) và acid

linoleic (10,46%).

Bảng 3.5. Thành phần hóa học trong dịch chiết etyl acetat

TT Hợp chất Thành phần (%)

1 Methyl linolenate 25,43

2 β-sitosterol 18,15

3 Acid palmitic 12,07

4 Acid linoleic 10,46

5 limonene 7,60

6 (Z)-β-farnesene 6,48

7 α-pinene 5,21

8 β-caryophyllene 2,76

9 geraniol 2,14

10 p-cymene 1,49

11 1,8-cineole 1,19

12 selinene 1,28

13 8,1-octadecadienoic acid 1,25

14 2,3-octadecadienoic acid 0,86

15 α-humulene 0,67

16 2-butanal 0,67

17 sabinene 0,55

18 β-cubebene 0,50

19 β-bisabolene 0,38

20 2-pentanal 0,33

21 2,4-heptandienal 0,25

22 germacrene B 0,19

23 β-pinene 0,06

3.1.2.2. Các hợp chất được phân lập

Hợp chất phân lập được từ dịch chiết etyl acetat được kí hiệu là E1 và E2

được xác định định tính bằng phương pháp GC-MS.

 Hợp chất E1

Hợp chất E1 được phân lập từ phân đoạn EE1, tinh thể màu trắng. Cấu trúc

của E1 được phỏng đoán là cyclopropanenonanoic acid [2-(2-butylcyclopropyl)

methyl] methyl ester (Hình 3.10).

Hình 3.10. Cấu trúc của E1

Kết quả phân tích sắc ký khí-khối phổ của E1 thu được như Hình 3.11 và

Hình 3.12.

Hình 3.11. Sắc ký đồ của hợp chất E1

Cyclopropanenonanoic acid [2-(2-butylcyclopropyl) methyl] methyl ester là

một methyl ester của cyclopropan fatty acid (FAME). Phospho lipid của các

cyclopropanoic acid béo đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp màng sinh chất của

một số loại vi khuẩn như Escherichia coli [11]. Cyclopropan acid béo có thể tìm thấy

trong dầu loài Litchi sinensis, hoặc trong dầu chiết từ hạt một số cây thuộc họ

Sterculiaceae, Malvalaceae, Bombaceae và Tiliaceae [13].

Hình 3.12. Phổ khối lượng của E1 so sánh với thư viện MS

 Hợp chất E2

Hợp chất E2 được phân lập từ phân đoạn EE3, tinh thể hình kim màu trắng

được xác định là loliolide (C11H16O3) theo tên IUPAC là (6S,7aR)-6-hydroxy-4,4,7a-

trimethyl-6,7-dihydro-5H-1-benzofuran-2-one (Hình 3.13).

Hình 3.13. Cấu trúc của E2

Hình 3.14. Sắc ký đồ GC của E2

Loliolide thu được từ lolium perenne và là lacton phổ biến nhất. Loliolide là

một hợp chất không chứa nitơ và có thể liên kết với các chất khác theo nhiều cách

khác nhau để ức chế hợp chất có chứa nitơ.

Hình 3.15. Phổ khối của E2 so sánh với thư viện MS

Loliolide đã được tìm thấy ở động vật (côn trùng) và thực vật (hoa, cây bụi,

cây) cả trên đất liền và biển, như tảo và san hô. Nhiều năm nghiên cứu về thực vật

được sử dụng trong y học dân gian truyền thống của các quốc gia khác nhau đã dẫn

đến kết luận rằng hợp chất này có nhiều đặc tính sinh học như chống ung thư, kháng

khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa. Hơn nữa, các cây có chứa loliolide được sử

dụng trong y học cổ truyền trong điều trị bệnh tiểu đường và trầm cảm. Còn trong

dịch chiết từ lá cây vòi voi ở phía đông nam Mexico nó được sử dụng như một tác

nhân chống viêm, tăng tốc chữa lành vết thương và cũng được áp dụng để điều trị

bệnh lỵ và tiêu chảy. Các nhà nghiên cứu ở Nhật Bản cho thấy loliolide là một trong

những hợp chất có trong cây trân châu tía, được biết đến và sử dụng nhiều năm trong

y học. Nó có khả năng hạ sốt, chống viêm và giãn mạch. Trong thử nghiệm in vitro

cho thấy loliolide gây độc các dòng tế bào chuột lymphoma L5187Y (ED50 = 4,7

mg/ml) và có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis,

Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Neisseria gonorrhoeae. Trong các nghiên

cứu trong ống nghiệm, loliolide có ái lực cao với một loại vận chuyển serotonin, do

đó thể hiện một đặc tính chống trầm cảm. Loliolide có tác dụng nổi bật là chống oxy

hóa và tác dụng bảo vệ tế bào, chống lại DPPH, các gốc tự do H2O2 và tế bào ROS.

Các tế bào bảo vệ của Loliolide chống lại các tế bào chết do H2O2 gây ra, thiệt hại có

thể được quan sát bằng cách tăng cường khả năng tồn tại của tế bào. Loliolide phân

lập từ S. coreanum, cho thấy hoạt động chống oxy hóa chống lại nhiều gốc tự do và

tác dụng bảo vệ tế bào chống lại H2O2-gây tổn thương tế bào hay apoptosis. Đây là

nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học của tảo nâu biển, S. coreanum [24].

3.2. Khảo sát hoạt tính sinh học

3.2.1. Hoạt tính chống oxy hóa

Tổng hàm lượng Phenolic, độ hấp thụ quang đo tại bước sóng 750nm

Bảng 3.6. Kết quả độ hấp thụ quang

Nồng độ galic (mg/L) 60 80 100 120 140

Độ hấp thụ quang 0,236 0,334 0,419 0,492 0,561

160

y = 246,17x - 0,5366

R² = 0,994

120

L / g m c i l a G ộ đ g n ồ N

0.2

0.25

0.3

0.45

0.5

0.55

0.6

0.35 0.4 Độ hấp thụ quang (Abs)

Xác định phương trình biểu diễn mối quan hệ như sau

Hình 3.16. Đường chuẩn phenolic

Hàm lượng phenolic trong dịch chiết kinh giới được tiến hành tương tự, kết

quả thu được như Hình 3.17.

Hình 3.17. Tổng phenolic của các dịch chiết từ kinh giới

Kết quả thực nghiệm cho thấy, các hợp chất phenolic đều có thể tan vào trong

etyl acetat và n-hexan. Ta có thể dự đoán các dịch chiết từ hai dung môi này đều có

tiền chống oxy hóa. Chỉ số tổng phenolic của dịch chiết etyl acetat và n-hexane tương

đối cao, lần lượt là 79,20 và 48,98 mg acid galic/100g nguyên liệu khô. Tổng lượng

phenolic của loài E. ciliata trong nghiên cứu này nhiều hơn so với loài E. densa trong

nghiên cứu của Misba Khan và cộng sự [22] với tổng lượng cao nhất là trong dịch

chiết etanol 50% là 77,5 mg. Mặc dù vậy, khi so sánh với loài E. cilata trong nghiên

cứu của Xiangping Liu và cộng sự lại thấp hơn rất nhiều [7].

Tổng hàm lượng flavonoid, đo tại bước sóng 510 nm. Phương trình xác định

tổng lượng flavonoid bằng chất chuẩn: y = 312,84x + 3,897 (giá trị R2 =0,984). Kết

quả xác định tổng lượng flavonoid của hai dịch chiết lần lượt là 23,15 mg và 10,42

mg catechin trên 100 g mẫu khô (Hình 3.18). Kết quả cho thấy sự phù hợp với tổng

lượng phenolic. Có thể nhận thấy sự phân bố của các flavonoid trong etyl acetat cao

hơn so với n-hexan. So sánh với hàm lượng flavonoid trong loài E. blanda theo nghiên

cứu của O. Gangarani Devi [33], thì loài E. ciliata có tổng hàm lượng flavonoid thấp

hơn.

Hình 3.18. Tổng lượng flavonoid trong dịch chiết kinh giới

3.2.2. Hoạt tính ức chế enzym -glucosidase.

Cặn chiết etyl acetat và n-hexan đóng vai trò là mẫu thử được khảo sát hoạt

tính tại các giá trị nồng độ là 0; 0,25; 1,0; 4,0; 16; 64; 256 ppm. Kết quả độ hấp thụ

quang thu được như bảng 3.7.

Bảng 3.7. Khả năng ức chế enzym 𝛼-glucosidase của cặn chiết kinh giới

etyl acetat n-hexan

Nồng độ chất ức chế (ppm) 0,0 0,25 1,0 4,0 16 64 256 Abs 0,102 0,096 0,093 0,091 0,087 0,073 0,070 % Ức chế 0 5,88 8,82 10,78 14,71 28,43 31,37 Abs 0,102 0,136 0,104 0,097 0,093 0,093 0087 % Ức chế 0 -33,33 -1,96 4,90 8,82 8,82 14,71

Giá trị ức chế 50% của mẫu thử thu được qua đồ thị sự phụ thuộc của nồng độ

mẫu thử với phần trăm ức chế. Giá trị IC50 của chất tham chiếu arcabose là 175,89

ppm.

Hình 3.19. Đồ thị khảo sát khả năng ức chế enzym 𝛼-glucosidase

Từ kết quả khảo sát đối với cả hai cặn chiết etyl acetat và n-hexan của kinh

giới cho thấy khả năng ức chế của enzym 𝛼-glucosidase khá thấp, với nồng độ của

vượt quá 256 ppm nhưng vẫn chưa đạt được khả năng ức chế 50%. Điều này chứng

tỏ, cả hai cặn chiết của kinh giới đều có tiềm năng rất thấp cho tác dụng điều trị bệnh

tiểu đường type 2.

KẾT LUẬN

Loài kinh giới không chỉ là loại rau thơm được dùng phổ biến trong dân gian, làm

nhiều bài thuốc chữa bệnh, mà còn giá trị thí nghiệm sinh học. Qua quá trình nghiên

cứu về loài Elsholtzia ciliata ở Việt Nam, chúng tôi đã thu được các kết quả sau:

1. Lần đầu tiên khảo sát các thành phần hóa học dễ bay hơi có trong dịch chiết

cây kinh giới tại Hà Nội, Việt Nam.

2. Đã xây dựng được một quy trình chiết chọn lọc các lớp chất từ thân và lá cây

kinh giới theo độ phân cực tăng dần của dung môi chiết. Kết quả thu được hai phần

chiết: phần chiết n-hexan (EH) và phần chiết etyl acetat (EE) với hiệu suất của các

phần chiết 1,56% và 11,63%.

3. Đã khảo sát sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan (EH) và chọn được hệ dung

môi n-hexan:etyl acetat (5:1,v/v), phần chiết etyl acetat (EE) và chọn được hệ dung

môi n-hexan:etyl acetat:axit axetic (5:1:1, v/v/v) là các hệ cho kết quả phân tích tốt

trên lớp mỏng.

4. Kết quả phân tích trên hệ thống GC-MS các thành phần hóa học cho kết quả

loài kinh giới bao gồm các hợp chất từ acid béo bão hòa và acid không bão hòa, các

flavonoid, đến các terpenoid và steroid cùng một số hợp chất khác. Trong đó, phần

chiết n-hexan có thành phần chính gồm terpenoid và steroid như phytol (35,42%), β-

sitosterol (15,18%) và nerolidol (9,07%). Trong phần chiết etyl acetat có thành phần

chính gồm methyl linolenate (25,43%), β-sitosterol (18,18%) và acid palmitic

(12,07%).

5. Đã nhận dạng được các hợp chất kết tinh ở phân đoạn EH2, EH3, EE2 và EE3

lần lượt là:

Chất H1 là hỗn hợp của β-sitosterol và stigmasterol

Chất H2 là emodin

Chất E1 là cyclopropanenonanoic acid[2-(2-butylcyclopropyl)methyl] methyl

ester

Chất E2 là loliolide

6. Đã khảo sát một số hoạt tính sinh học của các phần chiết của kinh giới ở Việt

Nam cho kết quả:

Về hoạt tính chống oxy hóa thì cho thấy tiềm năng chống oxy hóa cao với cả phần

cặn chiết n-hexan và etyl acetat. Tổng hàm lượng phenolic ở hai cặn chiết lần lượt là

79,20 và 48,98 mg acid galic/100g nguyên liệu khô. Giá trị tổng hàm lượng flavonoid

lần lượt là 23,15 mg và 10,42 mg catechin trên 100 g mẫu khô.

Tuy nhiên, khả năng ức chế enzym -glucosidase của cả hai cặn chiết đều thấp.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Tiến Bân (2005), Danh mục các loài thực vật Việt Nam, tập III, NXB Nông

Nghiệp, Hà Nội.

2. Trương Thị Đẹp (2007), Thực vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội.

3. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.

4. Hà Thị Bích Ngọc (2012), Điều tra, nghiên cứu một số thực vật Việt Nam có tác

dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường trong máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo

đường type 2, Luận án tiến sĩ ngành Hóa sinh học, Khoa Sinh học-ĐH KHTN, Hà

Nội

5. Phan Tống Sơn, Phan Minh Giang (2016), Hóa học các hợp chất thiên nhiên, tập

1, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội

Tiếng Anh

6. Ai-Lin Liu, Simon M.Y. Lee, Yi-Tao Wang, Guan-Hua Du (2007), “Elsholtzia:

review of tradutuibak uses, chemistry and pharnacology”, Journal of Chinese

Pharmaceutical Sciences, vol 2, pp. 73-78.

7. Alison M. D., Richard J. P., Mark E. H., Andrew D. A (2003), “The synthesis of

naturally occurring Vitamin K and Vitamin K analogues”, Current Organic

Chemistry, vol 7, pp. 1625-1634.

8. Arati A. Inamder, Muhammed M. Hossain, Alison I. Bernstein, Gary W. Miller,

Jason R. Richardson, and Wennstrom Bennett (2013), “Fungal-derived

semiochemical 1-octen-3-ol disrupts dopamine packaging and causes

neurodegeneration”, Proc. National academy of sciences of the U.S.A, vol 110, pp.

19561-19566.

9. A.V. Zhukov (2015), “Palmitic acid and its role in the structure and functions of

plant cell membranes”, Russian Journal of plant physiology, vol 62, pp. 706-713.

10. B. Boncheewin, P. Chantanranothai, A. Paton (2015), “Elsholtzia (Lamiaceae) in

Thailand”, Blumea, 59, pp. 209-214.

11. Chang YY, Cronan JE Jr (1999), “Membrane cyclopropane fatty acid content is

a major factor in acid resistance of Escherichia coli”, Mol Microbiol, 33, pp. 249-59.

12. Elena A. Korolyuk, Wilfried Konig, Alexey V. Tkachev (2002), “Composition of

essential oil of Elsholzia ciliata (Thunb,) Hyl. From the Novosibirsk region, Russia”,

Khimiya Rastitel'nogo Syr'ya, vol 1, pp. 31-36.

13. Gerhard Knothe (2006), “NMR charaterization of dihydrosterculic acid and ít

methyl ester”, Lipids, 41, pp 393-396.

14. Haimin Chen, Xiaojun Yan, Wei Lin, Li Zheng, Weiwei Zhang (2004), “A New

Method for Screening a-Glucosidase Inhibitors and Application to Marine

Microorganisms”, Pharmaceutical Biology, vol 6, pp. 416–421.

15. Hakamata W, Kurihara M, Okuda H, Nishio T, Oku T. (2009), “Design and

screening strategies for alpha-glucosidase inhibitors based on enzymological

information”, Curr. Top. Med. Chem., 9(1), pp. 3-12.

16. Hu HB, Zheng XD, Hu HS, Zhang YQ (2006), “Studies on chemical constituents

from Elsholzia bodinieri vaniot in Ganzu, China”, J. Baoji Univ Arts Sci, 26, pp. 196-

199.

17. Jean Legault and Andre Pichette (2007), “Potentiating effect of β-caryophyllene

on anticancer activity of α-humulene, isocaryophyllene and paclitaxel”, Journal of

Pharmacy and Pharmacology, vol 59, pp. 1643-1647

18. Jong Ro Kim, Dool-Ri Oh, Mi Hye Cha, Byoung Sik Pyo, Joon Haeng Rhee,

Hyon E. Choy, Won Keun Oh, Young Ran Kim (2008), “Protective effect of polygoni

cuspidate radix and emodin on Vibrio vlnificus cytotoxycity and infection”, The

journal of Microbiology, pp. 737-743.

19. Li Wing-yan (2007), Pharmacological studies on Radix et Rhizoma Rhei (Da

huang) and its active component, emodin, The Hong Kong polytechnic university,

Hong Kong.

20. Marinova D., Ribarova F., Altanassova (2005), “Total phenolics and total

flavonoids in Bulgarian fruits and vegetables”, Jounal of the university of Chemical

Technology and Metallurgy, vol 40, pp. 255-260.

21. Marsden S. Blois (1958), “Antioxydant determinations by the use of a stable free

radical”, Nature, 181, pp. 1199-1200.

22. Misa Khan, Showkat Ahmad Ganie, Ishfak Hussain Wani, Bashir Ahmad Ganai,

Akbar Masood, Mohmmad Afzal Zargar, Akhter Hussain Malik, Rabia Hamid

(2012), “Free radical Scavenging activity of Elsholtzia densa”, Jounal of

Acupuncture and Meridian studies, vol 5, pp. 104-111.

23. O. Gangarani Devi, T. Chand Singh, O. Ibeton Devi, E. J. Singh (2016),

“Phytochemical analysis of six aromatic plants”, International journal of scientific

research, vol 5, pp. 389-391.

24. R. Hodges, A. L. Porte (1964), “Structure of loliolide: A terpene from Lolium

perenne”, Tetrahedron, 20, pp. 1463-1467.

25. Robert S., Goodhart and Maurice E., Shils (1980), Modern Nutrition in Health

and Disease, Lea and Febinger, Philadelphia, pp. 134-138.

26. Sook-Jin Lee, Je-Ik Han, Geun-Shik Lee, Mi-Jin Park, In-Gyu Choi, Ki-Jeong

Na, Eui-Bae Jeung (2007), “Antifungal effect of eugenol and nerolidol against

Microsporum gypseum in a guinea pig model”, Biol. Pharm. Bull, vol 30 (1), pp. 184-

188.

27. Tian Guang-hui (2013), “Chemical constituents in essential oils from Elsholtzia

ciliata and their antimicrobial activities”, Chinesse herbal medicines, vol 5(2),

pp.104-108.

28. T. Khan, M. Zahid , M. Asim, Shahzad-ul Hussan, Z. Iqbal, M. Iqbal Choudhary,

V. Uddin Ahmad (2002), “Pharmacological actitivites of crude acetone extract and

purified constituents of Salvia moorcraftiana Wall”, Phytomedicine, 9, pp. 749-752.

29. Venkata Sai Prakash Chaturvedula (2012), “Isolation of stigmasterol and β-

sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus”, International

Current Pharmaceutical Journal, 1, pp. 239-242.

30. Wafaa Benalla, Said Bellahcen, Mohamed Bnouham (2010), “Antidiabetic

medicinal plants as a source of alpha glucosidase inhibitors”, Current, Diabetes

Reviews, 6, pp. 247-254.

31. Xiangping Liu, Jia Jia, Lei Yang, Fengjian Yang, Hongshuang Ge, Chunjian

Zhao, Lin Zhang and Yuangang Zu (2012), “Evaluation of antioxydant activities of

aqueous extracts and fractionation of different parts of Elsholtzia ciliata”, Molecules,

vol 17, pp. 5430-5441.

32. Yan Ding, Lei Zhao, Hong Mei, Shu-Ling Zhang, Zhi-Hua Huang, Yan-Ying

Duan, Pian Ye (2008). “Exploration of emodin to treat alpha naphthylisothiocyante-

induced cholestic hepatitis via anti-inflammatory pathway, European journal of

Pharmacology, 590, pp. 377-386.

33. Zhiqin Guo, Zizhen Liu, Xiaohong Wang, Weirui Liu, Rui Jiang, Ruiyang Cheng,

Gaimei She (2012), “Elsholtzia: Phytochemistry and biological activities”, Chemistry

central jounal, vol 6.

PHỤ LỤC

Phổ NMR của H1

Phổ GC-MS của E1

Phổ GC-MS của H2

Phổ GC-MS của E2