Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thay đổi Lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN NGÂN HÀ

NGHIÊN CỨU THAY ĐỔI LYSYL OXIDASE

CỦA TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU VÕNG MẠC

Ở MÔI TRƢỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN NGÂN HÀ

NGHIÊN CỨU THAY ĐỔI LYSYL OXIDASE

CỦA TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU VÕNG MẠC

Ở MÔI TRƢỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO

Chuyên ngành : Nhãn khoa

Mã số

: 9720157

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. Trần Huy Thịnh

2. TS. Nguyễn Xuân Tịnh

HÀ NỘI – 2020

LỜI CẢM ƠN

Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, cho phép tôi gửi lời

cảm ơn chân thành nhất tới:

Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Mắt Trường Đại học Y Hà Nội, Trường Y Đại học Boston, Ban Giám đốc Bệnh viện Mắt Trung Ương đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình tôi học tập và tiến hành nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Huy Thịnh và TS. Nguyễn Xuân Tịnh – những người thầy đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt tôi trong quá trình học tập, công tác chuyên môn nghề nghiệp và chỉ bảo giúp tôi giải quyết nhiều khó khăn, vướng mắc trong quá trình thực hiện nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành luận án này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Sayon Roy - Trường Y Đại học Boston và PGS.TS. Phạm Trọng Văn - Trưởng Bộ môn Mắt đã cho tôi nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thiện nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng, cùng hai nhà khoa học phản biện độc lập. Các thầy cô đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể anh chị em Phòng nghiên cứu biến chứng mạch máu nhỏ do đái tháo đường - Trường Y Đại học Boston và Bộ môn Mắt - Trường Đại học Y Hà Nội cùng các anh chị đi trước, bạn bè đồng nghiệp đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác.

Sau nữa, tôi xin dành tình yêu thương và lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã chia sẻ và là chỗ dựa vững chắc để tôi thực hiện và hoàn thành luận án.

Hà Nôi, ngày 2 tháng 10 năm 2020

Tác giả luận án

Nguyễn Ngân Hà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn Ngân Hà, nghiên cứu sinh khóa 36, chuyên ngành Nhãn

khoa, Trường Đại học Y Hà Nội, xin cam đoan:

1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn

của PGS.TS. Trần Huy Thịnh và TS Nguyễn Xuân Tịnh.

2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã

được công bố tại Việt Nam.

3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là chính xác, trung thực

và khách quan, đã được cơ sở nơi nghiên cứu xác nhận.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này.

Hà Nội, ngày 02 tháng 10 năm 2020

Người thực hiện

Nguyễn Ngân Hà

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

: Ammonium Persulfate APS

: β-Amin-opropionitrile BAPN

: Bovine serum albumin BSA

Coll IV : Collagen IV

: Connexin Cx

: 4',6-diamidino-2-phenylindole DAPI

DMEM : Dulbecco Medified Eagle Medium

: Fetal Bovine Serum FBS

: Fluorescein isothiocyanate FITC

: Fibronectin FN

: Các yếu tố gây thiếu oxy HIFs

HSPGs : Heparan sulfate proteoglycan

LOX : Lysyl oxidase

LOXsiRNA : LOX small interfering RNA

: Amonium Hydroxide NH4OH

: Photphaste-buffered saline PBS

: Bệnh võng mạc đái tháo đường tăng sinh PDR

: Bệnh dịch kính võng mạc tăng sinh PVR

: Bong võng mạc nguyên phát RRD

TGF- β : Yếu tố chuyển đổi tăng trưởng β

: Tween Tris-buffered saline TTBS

: Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu VEGF

: Western blot WB

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................. 3

1.1. Đặc điểm mô học của mao mạch võng mạc ......................................... 3

1.1.1. Lớp nội mô ..................................................................................... 3

1.1.2. Màng đáy ........................................................................................ 4

1.1.3. Tế bào quanh mạch ........................................................................ 9

1.1.4. Bất thường mao mạch võng mạc ở chuột đái tháo đường ............. 9

1.2. Cơ chế sinh bệnh của các tổn thương mao mạch võng mạc do tình

trạng đường huyết cao. ........................................................................... 11

1.2.1. Dày màng đáy mao mạch võng mạc ............................................ 11

1.2.2. Rối loạn kết nối tế bào-tế bào ...................................................... 14

1.2.3. Thay đổi cấu trúc ti thể ................................................................. 18

1.3. Lysyl oxidase ...................................................................................... 20

1.3.1. Đặc điểm lysyl oxidase ................................................................ 20

1.3.2. Các tình trạng bệnh lý liên quan đến thay đổi mức độ biểu hiện

LOX .............................................................................................. 23

1.4. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới ............................. 26

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 30

2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 30

2.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 30

2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 30

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thử nghiệm ............................. 30

2.3.2. Mẫu ............................................................................................... 30

2.3.3. Phương tiện nghiên cứu ............................................................... 31

2.3.4. Cách thức tiến hành ...................................................................... 32

2.3.5. Các chỉ số nghiên cứu .................................................................. 50

2.4. Phương pháp thu thập số liệu và xử lý số liệu .................................... 52

2.5. Đạo đức nghiên cứu ............................................................................ 52

Chƣơng 3: KẾT QUẢ ................................................................................. 53

3.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu .................................................................. 53

3.2. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô mạch máu

võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao ........................ 54

3.2.1. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao đến mức độ biểu

hiện của LOX ................................................................................ 54

3.2.2. Tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ biểu hiện của LOX . 62

3.2.3. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới hoạt

động của tế bào ............................................................................. 66

3.3. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào

tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ

glucose cao ............................................................................................. 70

3.3.1. Thay đổi sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào . 70

3.2.2. Thay đổi mật độ liên kết của LOX với protein chất nền ngoại bào .... 72

Chƣơng 4: BÀN LUẬN ............................................................................... 80

4.1. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX.............................................. 80

4.1.1. Thay đổi mức độ biểu hiện của LOX ........................................... 80

4.1.2. Thay đổi hoạt động của tế bào liên quan đến thay đổi mức độ biểu

hiện của LOX ................................................................................ 84

4.2. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào . 94

KẾT LUẬN ................................................................................................ 100

HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ................................................... 102

DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN

QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Độ dày màng đáy mạch máu ở các mô khác nhau trên cơ thể người .. 5

Bảng 1.2. Độ dày màng đáy mao mạch võng mạc ở các loài khác nhau ............. 5

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới LOX

trong protein toàn phần ....................................................... 55

Biểu đồ 3.2. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới hàm

lượng LOX tại chất nền ngoại bào. .................................... 56

Biểu đồ 3.3. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới LOX

trong tế bào. ........................................................................ 57

Biểu đồ 3.4. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới mật độ

LOX trong protein toàn phần. ............................................ 60

Biểu đồ 3.5. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới mật độ

LOX trong protein chất nền ngoại bào. .............................. 61

Biểu đồ 3.6. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới hoạt động

của LOX. ............................................................................. 62

Biểu đồ 3.7. Tác động ức chế mức độ biểu hiện LOX của LOXsiRNA. 63

Biểu đồ 3.8. Sự thay đổi mật độ LOX trong protein toàn phần. ............. 64

Biểu đồ 3.9. Tác động ức chế hoạt động LOX của BAPN. .................... 65

Biểu đồ 3.10. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới độ

thẩm thấu của tế bào nội mô mạch máu võng mạc. ........... 66

Biểu đồ 3.11. Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện

tượng chết tế bào theo chương trình biểu thị qua số lượng tế

bào chết/1000 tế bào. .......................................................... 69

Biểu đồ 3.12. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám

dính của LOX với Coll IV và FN trong protein toàn phần. 71

Biểu đồ 3.13. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám

dính của LOX với Coll IV và FN trong protein chất nền

ngoại bào. ............................................................................ 72

Biểu đồ 3.14. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX

liên kết với Coll IV trong protein toàn phần. ..................... 73

Biểu đồ 3.15. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX

liên kết với FN trong protein toàn phần. ............................ 75

Biểu đồ 3.16. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX

liên kết với Coll IV trong protein chất nền ngoại bào. ....... 76

Biểu đồ 3.17. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX

liên kết với FN trong protein chất nền ngoại bào. .............. 79

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc mao mạch võng mạc .................................................... 3

Hình 1.2. Cấu trúc màng đáy mao mạch .................................................... 6

Hình 1.3. Hiện tượng rò mạch máu trong bệnh võng mạc đái tháo đường ở

chuột ......................................................................................... 10

Hình 1.4. Hiện tượng mao mạch không có tế bào ở võng mạc chuột đái

tháo đường ................................................................................ 10

Hình 1.5. Cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường ............................. 13

Hình 1.6. Cấu trúc và vị trí của connexon ................................................ 14

Hình 1.7. Sự ghép cặp của các connexon hình thành mối liên kết khe .... 15

Hình 1.8. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường do dày màng

đáy mao mạch và rối loạn kết nối tế bào-tế bào ....................... 18

Hình 1.9. Cơ chế bệnh sinh bệnh võng mạc đái tháo đường do thay đổi

cấu trúc ti thể ............................................................................. 19

Hình 1.10. Quá trình hình thành LOX trưởng thành .................................. 21

Hình 1.11. Điều hoà quá trình hình thành và hoạt động của LOX ............. 21

Hình 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào ................................... 33

Hình 2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong tủ hút .............................. 33

Hình 2.3. Các tế bào nuôi cấy trong các đĩa môi trường. ......................... 35

Hình 2.4. Các tế bào được nuôi cấy trên các lam kính đặt trong các đĩa tế bào .. 40

Hình 2.5. Chuẩn bị kháng thể sơ cấp ........................................................ 41

Hình 2.6. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang ngày thứ nhất .......... 42

Hình 2.7. Phân tích hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua phần

mềm Image J ............................................................................. 43

Hình 3.1. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong protein toàn phần .. 54

Hình 3.2. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong protein chất nền

ngoại bào ................................................................................... 55

Hình 3.3. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong tế bào. ............. 56

Hình 3.4. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới LOX bên

ngoài tế bào. .............................................................................. 58

Hình 3.5. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein

toàn phần .................................................................................. 59

Hình 3.6. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein

chất nền ngoại bào. ................................................................... 61

Hình 3.7. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX ở các nhóm tế bào. ... 63

Hình 3.8. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein

chất nền ngoại bào. ................................................................... 64

Hình 3.9. Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hoạt động AKT67

Hình 3.10. Hình ảnh nhuộm huỳnh quang thể hiện hiện tượng chết tế bào

theo chương trình ở các nhóm tế bào........................................ 68

Hình 3.11. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và

hàm lượng LOX liên kết với FN trong protein toàn phần. ....... 70

Hình 3.12. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và hàm

lượng LOX liên kết với FN trong protein chất nền ngoại bào. ...... 71

Hình 3.13. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử

thể hiện liên kết của LOX với Coll IV trong protein toàn phần. ... 73

Hình 3.14. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi đồng tiêu

thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần. 74

Hình 3.15. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử

thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần.75

Hình 3.16. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang thể hiện liên kết của

LOX với Coll IV trong protein chất nền ngoại bào. ................. 77

Hình 3.17. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử thể

hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần. ...... 78

Hình 4.1. Giảm LOX giúp ngăn ngừa rò mạch máu võng mạc trong bệnh

đái tháo đường .......................................................................... 85

Hình 4.2. Giảm lượng LOX giúp ngăn ngừa chết tế bào theo chương trình

ở các tế bào mạch máu trong mạng mao mạch võng mạc. ....... 90

Hình 4.3. Tác động của đái tháo đường và giảm nồng độ LOX tới sự

phát triển của mạch máu không có tế bào và chết tế bào ngoại

mạch ở võng mạc chuột ........................................................... 93

Hình 4.4. Hình ảnh cắt ngang mao mạch võng mạc chuột qua sinh hiển vi

điện tử ....................................................................................... 95

Hình 4.5. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới sự kết dính

của LOX với chất nền ngoại vào và LOX quay trở lại tế bào

biến thiên theo thời gian ........................................................... 98

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh võng mạc đái tháo đường là nguyên nhân hàng đầu gây giảm thị

lực trong dân số trong độ tuổi lao động [1-2]. Các giai đoạn đầu của bệnh

võng mạc đái tháo đường được đặc trưng bởi sự hiện diện của mao mạch

không có tế bào và sự chết tế bào ngoại mạch, tiếp đó là sự chết tế bào mạch

máu võng mạc theo chương trình [3-4]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng màng

đáy mao mạch dày lên là dấu hiệu mô học của bệnh võng mạc đái tháo đường

[5-6] và có thể thúc đẩy quá trình chết tế bào mạch máu [7-8]. Ngoài ra, màng

đáy dày góp phần làm tổn thương hàng rào máu võng mạc dẫn đến hiện tượng

tăng tính thấm thành mạch và rò rỉ mạch máu võng mạc [4], một dấu hiệu lâm

sàng của bệnh võng mạc đái tháo đường. Cơ chế bệnh sinh của bệnh lý vi

mạch do đái tháo đường bị ảnh hưởng bởi những thay đổi về chất lượng và số

lượng của màng đáy mao mạch. Mặc dù những thay đổi về mô học và chức

năng đi kèm với bệnh lý vi mạch do đái tháo đường đã được biết khá rõ [9],

nhưng các cơ chế nội bào và ngoại bào cụ thể liên quan đến những thay đổi

này dần dần dẫn đến rối loạn chức năng của bệnh võng mạc đái tháo đường

vẫn chưa rõ ràng.

Lysyl oxidase (LOX) là một enzyme ngoại bào đã được chứng minh là

rất cần thiết cho sự hình thành và chức năng của màng đáy [10]. Ức chế

enzyme này có thể gây ra bệnh loãng xương [11], nhưng đồng thời, các loại tế

bào khối u gây tăng lượng enzyme này có thể thúc đẩy sự di căn của khối u

hiện có, khiến nó trở nên ác tính [12-13]. LOX được tổng hợp và tiết ra dưới

dạng tiền enzyme glycosyl hóa (proLOX, 50 kDa), tiếp tục trải qua quá trình

phân giải protein ngoại bào thành dạng trưởng thành (LOX 32 kDa) [14].

LOX trưởng thành một phần quay trở lại tế bào, một phần bám vào chất nền

ngoại bào thực hiện chức năng sinh học. Enzym LOX xúc tác quá trình khử

oxy hóa lượng peptidyllysine và hydroxylysine dư thừa trong tiền chất

collagen và lượng lysine dư thừa trong elastin. Các aldehyd này trải qua các

phản ứng tự ngưng tụ dẫn đến hình thành chất nền ngoại bào [14-15]. Vì vậy,

LOX đóng vai trò rất quan trọng trong việc duy trì tính ổn định và tính toàn

vẹn của màng đáy.

LOX đã được xác định trong một số mô, bao gồm da, động mạch chủ,

tim, phổi, gan, sụn, xương, thận, vú, võng mạc và não [16-18]. Có khá nhiều

nghiên cứu về LOX tại tim, xương, vú, phổi,... đem lại những hiểu biết sâu

hơn về cơ chế sinh bệnh và mở ra các hướng nghiên cứu biện pháp can thiệp

hiệu quả. Nghiên cứu của Song và cộng sự chỉ ra rằng hàm lượng LOX tăng

trong võng mạc của chuột đái tháo đường và điều hoà LOX giúp ngăn ngừa

tổn thương võng mạc do đái tháo đường [19]. Ngoài ra, báo cáo gần đây cũng

cho thấy LOX được điều hòa bởi các yếu tố gây thiếu oxy (HIFs), một nhân

tố quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình tân mạch võng mạc trong bệnh

võng mạc đái tháo đường [12]. Nghiên cứu mới đây trên mẫu dịch kính bệnh

nhân mắc võng mạc đái tháo đường tăng sinh biểu hiện tăng đáng kể nồng độ

LOX so với người không mắc bệnh đái tháo đường [20]. Tuy nhiên, cơ chế

gây ra những rối loạn này cũng như những bất thường LOX ở cấp độ tế bào

còn chưa rõ ràng.

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu "Nghiên cứu thay đổi Lysyl

oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ

glucose cao" với 2 mục tiêu:

1. Đánh giá thay đổi mức độ biểu hiện LOX của tế bào nội mô mạch máu

võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao.

2. Phân tích sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền

ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường

nồng độ glucose cao.

Chƣơng 1

TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm mô học của mao mạch võng mạc

Thành mao mạch võng mạc mỏng, từ trong ra ngoài gồm có lớp nội mô,

màng đáy và tế bào quanh mạch.

1.1.1. Lớp nội mô

Lớp nội mô là một hàng tế bào đa giác dẹt lợp mặt trong thành mao

mạch. Phần bào tương chứa nhân lồi vào lòng mạch, phần bào tương ở ngoại

vi tế bào toả thành lá mỏng. Các tế bào nội mô liên kết với nhau bởi mối liên

kết khe. Dưới sinh hiển vi điện tử có thể thấy ở lá bào tương tế bào nội mô có

những cửa sổ (lỗ nội mô), màng bào tương ở cả hai mặt tế bào có những vết

lõm siêu vi, trong bào tương có những không bào vi ẩm. Những bào quan như

lưới nội bào, ti thể, ribosom nằm rải rác nhưng tập trung nhiều quanh nhân, bộ

Golgi nhỏ, thường nằm sát nhân [6-21-23].

A B

Hình 1.1. Cấu trúc mao mạch võng mạc [24]

A. Thiết đồ dọc. B. Thiết đồ cắt ngang

1.1.2. Màng đáy

1.1.2.1. Cấu trúc

Màng đáy là lớp màng mỏng dày khoảng 50nm, nằm giữa lớp tế bào

nội mô và tế bào ngoại mạch của mạch máu [25]. Màng đáy mạch máu

chứa các protein chất nền ngoại bào được sắp xếp một cách có tổ chức để

hình thành giá đỡ cho tế bào [25]. Màng đáy là nơi thực hiện nhiều chức

năng quan trọng của tế bào do đó nó rất quan trọng với sự sống còn của tế

bào và cân bằng nội môi võng mạc. Màng đáy mạch máu cung cấp môi

trường vi mô, tại đó tín hiệu hai chiều thông qua các integrin điều chỉnh sự

gắn kết và chức năng của tế bào. Chức năng chính của màng đáy là tạo bộ

khung gắn kết tế bào [26], tạo điều kiện cho kết nối tế bào-tế bào [27], và

điều khiển việc chữa lành vết thương [28]. Màng đáy có cấu trúc nhiều lớp

tạo bởi rất nhiều thành phần trong đó các thành phần chính là collagen IV

(Coll IV), fibronectin (FN), laminin và heparan sulfate proteoglycans được

sắp xếp theo trình tự nghiêm ngặt để đảm bảo chức năng và tính toàn vẹn

của màng đáy. Ở võng mạc, chất nền ngoại bào được sản xuất chủ yếu bởi

các tế bào nội mô mạch máu và tế bào ngoại mạch [6-21-22]. Các loại tế

bào khác cũng sản xuất một lượng nhỏ chất nền ngoại bào là tế bào Muller

[29], tế bào hình sao [30], tế bào hạch [31] và các tế bào biểu mô võng mạc

[32]. Bằng phương pháp đo lường siêu cấu trúc sử dụng sinh hiển vi điện

tử cho thấy có sự khác nhau về độ dày màng đáy mạch máu giữa các mô

(bảng 1) và giữa các lớp động vật (bảng 2). Màng đáy bao gồm 2 vùng

riêng biệt là lá sáng (lamina lucida) và lá đặc (lamina densa), nơi tiếp giáp

phía trước với màng tế bào, phía sau liên tục với mô liên kết của chất nền

ngoại bào [33].

Bảng 1.1. Độ dày màng đáy mạch máu ở các mô khác nhau trên cơ thể

ngƣời [6]

Loại mô Độ dày (nm) Tài liệu tham khảo

250-480 [34] Võng mạc

330±50 [35-36] Tiểu cầu thận

220 [37] Cơ xương

77±4 [38] Cơ tim

[39] Cơ tứ đầu đùi 108-246

Bảng 1.2. Độ dày màng đáy mao mạch võng mạc ở các loài khác nhau [6]

Loài Độ dày (nm) Tài liệu tham khảo

93±19 [40] Chuột nhắt

51-112 [41] Chuột cống

72±12 [42] Mèo

90-140 [43] Chó

250-450 [34] Người

1.1.2.2. Thành phần

Màng đáy bao gồm nhiều thành phần sắp xếp một cách có tổ chức. Một

số thành phần chính tạo nên bộ khung của màng bao gồm Coll IV, FN,

laminin và heparan sulfate proteoglycan. Ngoài ra màng cũng chứa các thành

phần khác như nidogen, tenascin, perlecan, agrin collagen I, II, III và

chondroitin sulfate proteoglycan [44-45].

Collagen IV là thành phần phong phú nhất trong chất nền ngoại bào, và

chỉ được tìm thấy trong màng tế bào. Coll IV có trọng lượng phân tử

khoảng 500 kD với chiều dài trung bình 400 nm [46] và cấu trúc bộ ba

xoắn ốc nguồn gốc từ 3 chuỗi α, bao gồm 2 chuỗi α1 giống hệt nhau và 1

chuỗi α2 [47]. Mỗi chuỗi chứa 3 vùng riêng biệt: đầu amino giàu cysteine

và lysin, vùng amino axit với chuỗi Gly-X-Y lặp lại khoảng 1400 lần và

đầu carboxyl chứa khoảng 230 amino axit [48]. Tổng thể cấu trúc của Coll

IV sắp xếp dạng như mạng tinh thể được tổng hợp khi vùng gen khởi động

tương tác với vị trí NC1 tại đầu tận carboxyl tạo nên các dimer [49]. Các

dimer này sau đó được liên kết chéo với nhau tại vùng 7S nằm tại đầu tận

amino [33]. Collagen có các vị trí kết dính tương tác trực tiếp với các

intergrin α1β1 và α2β1 cho phép tế bào kết nối với màng tế bào và khởi

động các tín hiệu tế bào [50]. Coll IV cũng tạo thành một giá đỡ để liên kết

các thành phần chất nền ngoại bào khác [51].

Hình 1.2. Cấu trúc màng đáy mao mạch [24]

Fibronectin, 1 glycoprotein lớn, là thành phần quan trọng của màng đáy

được biết đến với khả năng hoạt động như một chất keo phân tử và duy trì cấu

trúc phân tử ổn định của màng đáy. FN là một dimer bao gồm 2 tiểu đơn vị

lớn, giống hệt nhau, mỗi đơn vị nặng khoảng 250 kD được liên kết cộng hoá

trị thông qua liên kết disulfide ở đầu tận C [26-52-53]. Sau khi được tổng hợp,

FN tập hợp thành 1 mạng lưới sợi phụ thuộc integrin [26], sử dụng vị trí RGD

(Arg-Gly-Asp) bám vào vị trí α5β1 của integrin [52]. FN tạo điều kiện cho sự

kết dính của tế bào, di chuyển, tăng trưởng tế bào và biệt hoá thông qua các

tương tác đặc hiệu bao gồm các vị trí kết dính cho collagen, heparan và các

proteoglycan khác. FN gắn kết các thành phần chất nền ngoại bào thành một

cấu trúc có tổ chức, do đó đóng góp vào sự toàn vẹn và chức năng của chất

nền ngoại bào [52-54].

Laminin là 1 glycoprotein không chứa collagen, được tìm thấy chủ yếu

trong lớp lá sáng [55]. Laminin có trọng lượng phân tử khoảng 820 kD và

chứa 3 chuỗi polypeptid: α, β, và γ. Cả 3 chuỗi đều chứa nhánh dài xoắn ốc

(dài khoảng 75 nm), ngoài ra chuỗi α có thêm nhánh ngắn (dài khoảng 35 nm)

[56]. Phần cơ bản của nhánh dài là miền G chứa các chuỗi tương tự yếu tố

tăng trưởng biểu bì [56]. Chuỗi ba lần lặp đầu tiên, gọi là G1-3 chịu trách

nhiệm kết dính với các integrin, trong khi chuỗi 2 lần lặp cuối cùng (ví dụ G4-

5) chịu trách nhiệm kết dính với các heparan [57]. Laminin tương tác với

collagen IV bằng cách cùng bám dính vào nhiều thành phần khác của chất nền

ngoại bào bao gồm FN và integrin [58]. Laminin là lớp chất nền ngoại bào

bao quanh bề mặt tế bào và đóng vai trò thiết yếu trong giá đỡ của nhiều mô

khác nhau [59]. Ngoài ra, laminin có vai trò trong kết dính, biệt hoá, di

chuyển của tế bào và sự sống còn của mô [58].

Heparan sulfate proteoglycan (HSPGs) là một trong các thành phần

chính của màng đáy. Đây là loại glycosaminoglycan phổ biến trong các tế bào

nội mô [60]. HSPGs bao gồm các chuỗi glycosaminoglycan (mỗi chuỗi dài

khoảng 100-170 nm, trọng lượng phân tử khoảng 65 kD) liên kết với 1 lõi

protein chứa chuỗi polypeptide đơn (dài khoảng 80 nm, trọng lượng phân tử

khoảng 400 kD) [61]. Glycosaminoglycan đính vào lõi protein thông qua

vùng chứa axit glucuronic, galactose và xylose [33]. Họ HSPGs bao gồm

perlecan, agrin, và collagen XVIII [62] bám vào laminin của chất nền ngoại

bào [63]. Trong màng đáy, heparan sulfate tập trung nhiều nhất ở lá sáng và

có chức năng điều hoà kết dính tế bào bằng cách tương tác với các thành phần

khác của màng đáy [64]. HSPGs tương tác giữa các protein qua mối liên hệ

với anionic [60] và duy trì tính toàn vẹn cấu trúc của chất nền ngoại bào thông

qua hoạt động tương tác tế bào-chất nền ngoại bào [62].

1.1.2.3. Chức năng

Màng đáy mạch máu đóng vai trò là chất nền để gắn các tế bào, tạo

nên hàng rào có tính thấm chọn lọc và điều hoà sự sống của tế bào. Sự kết

dính tế bào được tạo thuận lợi bởi các integrin cho phép các thành phần đặc

hiệu của màng đáy thực hiện các chức năng tế bào bao gồm cả sự sống còn

của tế bào [65]. Tính đặc hiệu của integrin khi liên kết với chất nền phụ

thuộc vào sự kết hợp của integrin và các tiểu đơn vị α và β. Họ integrin

được xác định bởi các tiểu đơn vị β và đặc tính phối tử [66]. Họ integrin β1

chứa 3 phối tử đặc hiệu: α1,2,β1- các thụ thể đặc hiệu cho collagen, α3,4,5β1 -

các thụ thể đặc hiệu cho FN, và α1,2,3,6β1 - các thụ thể đặc hiệu cho laminin

[44-66-67].

Đặc điểm hàng rào có tính thấm chọn lọc được điều hoà một phần bởi

các thành phần màng đáy và khả năng chúng tương tác với nhau để hình

thành lên cấu trúc hoàn chỉnh. Đặc biệt là, các vị trí anionic màng đáy võng

mạc được biết đến bởi vai trò đáng chú ý trong việc duy trì tính thấm mạch

máu võng mạc. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, mất tính đặc hiệu của các vị trí

anionic trong màng đáy mao mạch võng mạc có thể góp phần vào sự tăng tính

thấm trong đái tháo đường [68]. Thêm vào đó, màng đáy điều hoà sự sống

còn của các tế bào mao mạch võng mạc thông qua sự biểu hiện của các thành

phần màng đáy. Các nghiên cứu chỉ ra chất nền ngoại bào từ môi trường

glucose nồng độ cao cung cấp các tín hiệu thúc đẩy chết tế bào theo chương

trình trong các tế bào nội mô mao mạch võng mạc [7].

1.1.3. Tế bào quanh mạch

Tế bào quanh mạch có những nhánh bào tương dài bao quanh thành

mạch và màng đáy bao lấy chúng ở cả phía trong và phía ngoài. Trong

bào tương có những bào quan như bộ Golgi, ti thể, lưới nội bào. Tế bào

quanh mao mạch có khả năng co rút, kiểm soát dòng máu lưu thông trong

các vi mạch [23].

1.1.4. Bất thường mao mạch võng mạc ở chuột đái tháo đường

Hiện nay, chuột được sử dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu trong

phòng thí nghiệm do có kích thước nhỏ, dễ thực hiện các kỹ thuật và chi phí

không cao. Tuổi thọ của chuột ngắn, sự khởi phát tăng đường huyết và các

triệu chứng của bệnh võng mạc đái tháo đường xuất hiện sớm cho phép thực

hiện nghiên cứu trong thời gian ngắn. Thêm vào đó, sự sẵn có của các dòng

chuột biến đổi gen tạo thuận lợi cho nghiên cứu các gen đặc hiệu tham gia

vào cơ chế sinh bệnh và tiến triển của tổn thương võng mạc do đái tháo

đường. Hơn nữa, kỹ thuật bảo quản, nuôi cấy tế bào nội mô mạch máu võng

mạc chuột không quá phức tạp và tỷ lệ thành công cao [69]. Đặc biệt, các

nghiên cứu cơ chế sinh bệnh chủ yếu được thực hiện trên chuột do chúng biểu

hiện tổn thương võng mạc đái tháo đường giai đoạn sớm tương tự con người.

Sau khi khởi phát tăng đường huyết vài tuần, chuột xuất hiện tăng số lượng tế

bào hình sao và thần kinh đệm, đồng thời giảm tốc độ dòng chảy của động

mạch và tĩnh mạch. Khoảng 2 đến 4 tháng sau, chuột xuất hiện tăng tính thấm

thành mạch, rò rỉ mạch máu võng mạc và tăng độ dày màng đáy mao mạch.

Sau 6 đến 9 tháng đái tháo đường, võng mạc chuột xuất hiện mao mạch

không có tế bào và chết tế bào ngoại mạch [69-70].

Hình 1.3. Hiện tượng rò mạch máu trong bệnh võng mạc đái tháo đường

ở chuột [19]

Hình 1.4. Hiện tượng mao mạch không có tế bào ở võng mạc chuột đái

tháo đường [19]

1.2. Cơ chế sinh bệnh của các tổn thƣơng mao mạch võng mạc do tình

trạng đƣờng huyết cao.

1.2.1. Dày màng đáy mao mạch võng mạc

Một chất hoà tan muốn qua hàng rào mạch máu võng mạc phải qua ít

nhất hai lớp là lớp tế bào nội mô mạch máu và lớp màng đáy. Vì vậy bất kỳ

sự thay đổi nào trong cấu trúc hoặc thành phần của màng đáy có thể gây ảnh

hưởng nghiêm trọng tới tính thấm thành mạch. Màng đáy mạch máu dày lên

là dấu hiệu mô học đặc trưng của bệnh võng mạc đái tháo đường [41-71].

Màng đáy võng mạc đái tháo đường không đều và có hình dạng giống "miếng

pho mát Thuỵ Sỹ" [72]. Mặc dù hiện tượng dày màng đáy võng mạc đã được

biết đến từ lâu, những nghiên cứu gần đây mới làm sáng tỏ dần vai trò của nó

trong bệnh võng mạc đái tháo đường thông qua các nghiên cứu trong thí

nghiệm và thực nghiệm. Mạch máu võng mạc dày lên góp phần gây tăng tính

thấm thành mạch quá mức và tăng sinh tân mạch trong bệnh võng mạc đái

tháo đường [6-32-73]. Dưới tác động của tăng đường huyết, quá trình tổng

hợp Coll IV, FN và laminin tăng, góp phần gây dày màng đáy mạch máu.

Những thay đổi sinh học trong thành phần màng đáy mạch máu võng mạc có

thể được phát hiện sớm trước khi xuất hiện những tổn thương hình thái của

bệnh võng mạc đái tháo đường [74-75]. Tăng mức độ biểu hiện của các thành

phần màng đáy có thể là nguyên nhân gây thay đổi cấu trúc của mao mạch

võng mạc bình thường. Nghiên cứu của Oshitari và cộng sự cho thấy sử dụng

antisense oligonucleotide tác động lên chất nền ngoại bào làm giảm độ dày

màng đáy mao mạch có hiệu quả ngăn ngừa dày màng đáy mao mạch, giảm

đáng kể mạch máu không có tế bào, chết tế bào ngoại mạch, và ngăn ngừa rò

rỉ mạch máu ở bệnh võng mạc đái tháo đường [22-74].

Mức độ biểu hiện của Coll IV tăng ở tế bào nội mô mao mạch võng mạc

trong môi trường nồng độ glucose cao, ở võng mạc của động vật đái tháo

đường và tế bào mạch máu võng mạc bệnh nhân đái tháo đường [6-21-22-76].

Ức chế quá trình tăng biểu hiện Coll IV đã được chứng minh là có tác dụng

giảm hiện tượng tăng tính thấm thành mạch ở bệnh võng mạc đái tháo đường

[22]. Cả nghiên cứu trong ống nghiệm và trong thực nghiệm đã chỉ ra rõ rằng

trong bệnh đái tháo đường, tình trạng đường huyết cao gây tăng tổng hợp FN

trong các tế bào mạch máu [41-77]. Tăng mức biểu hiện FN được phát hiện

trong võng mạc của các mô hình chuột mắc đái tháo đường do tiêm

Streptozotocin, chuột mắc đái tháo đường do chế độ ăn giàu glactose và ở

người mắc võng mạc đái tháo đường [74-78]. Trong bệnh đái tháo đường,

tăng mức biểu hiện FN góp phần gây dày màng đáy mạch máu, phá vỡ kết nối

tế bào, và từ đó thúc đẩy sự rò rỉ mạch máu [74-78]. Thí nghiệm trên động vật

mắc đái tháo đường cho thấy ngăn chặn sự biểu hiện quá mức của FN có thể

giúp cải thiện tình trạng rò rỉ mạch máu [22]. Laminin cũng được chỉ ra là

tăng biểu hiện tại tế bào mạch máu võng mạc trong môi trường nồng độ

glucose cao và ở võng mạc của chuột gây đái tháo đường bằng tiêm

Streptozotocin [21-22]. Với chuột đái tháo đường, ức chế sự tăng biểu hiện

của laminin giúp ngăn ngừa tăng tính thấm thành mạch [22]. Ngược lại, họ

HSPG, trừ agrin, giảm biểu hiện trong tình trạng đường huyết cao [79-81].

Các nghiên cứu cũng đã đánh giá ảnh hưởng của tăng đường huyết lên

các thành phần khác của tế bào bao gồm tenascin, nidogen-1, collagen I,

perlecan và agrin. Vai trò của các thành phần này trong quá trình dày màng

đáy là không đáng kể. Tenascin, 1 loại glycoprotein chất nền ngoại bào lớn,

được báo cáo là tăng biểu hiện trong bệnh võng mạc đái tháo đường [82].

Thêm vào đó, trong bệnh nhân bệnh võng mạc đái tháo đường, mRNA

tenascin và mức protein cũng tăng đáng kể so với nhóm không mắc đái tháo

đường [25]. Nidogen, còn gọi là entactin, bám vào mạng lưới Coll IV và

laminin vì vậy cũng đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và sự toàn vẹn của

chất nền ngoại bào [83]. Với chuột đái tháo đường, hoạt động của nidogen

giảm ở màng Bruch và màng giới hạn trong [58]. Bên cạnh đó, thông tin liên

quan collagen I trong cơ chế bệnh sinh võng mạc đái tháo đường rất hạn chế.

Cho đến nay, chỉ có 1 nghiên cứu báo cáo sự tăng biểu hiện của collagen I

trong võng mạc bệnh nhân đái tháo đường [25].

Đái tháo đƣờng Tăng đƣờng huyết

Dày màng đáy

Rối loạn chức năng ti thể

Rối loạn kết nối tế bào-tế bào

Chết tế bào theo chương trình

Mạch máu không có tế bào

Rò mạch máu võng mạc

Bệnh võng mạc đái tháo đƣờng

Hình 1.5. Cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường

1.2.2. Rối loạn kết nối tế bào-tế bào

Sự trao đổi chất qua các mối liên kết khe giữa 2 tế bào được điều hoà bởi

sự kết hợp giữa 2 nửa kênh liên kết connexin (Cx) của 2 tế bào liền kề, hình

thành nên các đường dẫn truyền cho phép trao đổi các tín hiệu điện tử và các

phân tử trọng lượng nhỏ hơn 1 kD giữa 2 tế bào [84-85]. Mỗi Cx gồm 6 tiểu

đơn vị gọi là connexon kéo dài từ bào tương qua màng tế bào ra môi trường

ngoại bào [114, 115]. Mối liên kết khe giữa 2 tế bào đóng vai trò thiết yếu

trong sự duy trì cân bằng nội môi trong mô và sự sống còn của tế bào [86]. Gần

đây, 21 loại Cx đã được xác định ở bộ gen người, đặc trưng bởi trọng lượng

phân tử [84]. Các loại Cx này có thể hình thành nên các kênh đồng nhất, kênh

không đồng nhất, mối liên kết khe đồng nhất hoặc mối liên kết khe không đồng

nhất tuỳ thuộc các tiểu đơn vị Cx tham gia cấu thành. Các nghiên cứu cũng chỉ

ra các loại Cx khác nhau có tương tác với nhau trong mắt [87].

Hình 1.6. Cấu trúc và vị trí của connexon [88]

Hình 1.7. Sự ghép cặp của các connexon hình thành mối liên kết khe [88]

Hiện tượng chết tế bào là tổn thương mao mạch võng mạc đặc trưng cho

giai đoạn sớm của bệnh võng mạc đái tháo đường [89]. Các nghiên cứu cũng

báo cáo hoạt động của các mối liên kết khe điều hoà bởi Cx quyết định sự

sống còn của tế bào bằng cách cho phép các tế bào trao đổi ion, chất chuyển

hoá, tín hiệu thứ 2, phân tử năng lượng, glucose, ATP và các chất khác qua

đường dẫn truyền trong mối liên kết khe [90]. Những phát hiện này nhấn

mạnh tầm quan trọng của kết nối tế bào-tế bào trong điều hoà sự tăng trưởng,

biệt hoá, phát triển và sống còn của tế bào [91-92]. Quan trọng là sự biểu hiện

của Cx và hoạt động của mối liên kết khe tương ứng bị giảm sút do tình trạng

nồng độ glucose cao góp phần gây chết các tế bào mao mạch và các tổn thương

khác tại võng mạc liên quan đến bệnh võng mạc đái tháo đường [93-95].

1.2.2.1. Rối loạn trao đổi chất giữa các tế bào mạch máu võng mạc

Trên bề mặt của các tế bào nội mô mao mạch võng mạc cũng như các tế

bào ngoại mạch có sự xuất hiện của Cx37, Cx40 và Cx43 [96], trong đó Cx43

là loại phổ biến nhất [97]. Tuy nhiên trong tình trạng glucose nồng độ cao, sự

biểu hiện của protein Cx37 và Cx40 không thấy có sự khác biệt trong tế bào

ngoại mạch võng mạc [94]. Trong khi đó, Cx43 đóng vai trò quan trọng trong

thúc đẩy và duy trì các mối liên kết khe ở mạch máu võng mạc. Các nghiên

cứu đã chỉ ra rằng, nồng độ đường cao và đái tháo đường làm giảm mức biểu

hiện của Cx43 ở tế bào nội mô mao mạch và tế bào ngoại mạch võng mạc,

dẫn đến giảm hoạt động của mối liên kết khe, gây chết tế bào nội mô và tế

bào ngoại mạch, dấu hiệu đặc trưng cho bệnh võng mạc đái tháo đường [93-

95-98]. Thêm vào đó, theo nghiên cứu của Fernandes và cộng sự, tăng giáng

hoá Cx43 [93] và giảm các mối liên kết khe có thể góp phần gây tổn thương

chức năng tế bào nội mô, liên quan đến quá trình phá vỡ hàng rào máu võng

mạc [6]. Nghiên cứu của Tien và cộng sự cho thấy giảm mức độ biểu hiện của

Cx43 và mối liên kết khe do nồng độ glucose cao có thể gây giảm mức độ

biểu hiện của các gen liên kết chặt, occludin và ZO-1, và do đó góp phần vào

phá vỡ hàng rào tế bào nội mô [99]. Theo nghiên cứu của Trudeau và cộng sự,

nồng độ glucose cao gây giảm protein Cx43 ở ti thể trong tế bào nội mô võng

mạc khiến hoạt động của mối liên kết khe điều hoà bởi Cx43 giảm và góp

phần vào sự vỡ ti thể, giải phóng cytochrome C khởi động quá trình chết theo

chương trình của các tế bào [100]. Một nghiên cứu khác báo cáo Cx43 cũng

giảm trong tình trạng glucose nồng độ cao ở tế bào nội mô mạch máu võng

mạc chuột, kéo theo giảm hoạt động của các mối liên kết khe. Thêm vào đó,

giảm mức biểu hiện của Cx43 kèm theo tăng số lượng các mao mạch không

có tế bào và chết tế bào ngoại mạch cũng được phát hiện ở võng mạc chuột

mắc đái tháo đường [101]. Gần đây, nghiên cứu của Tien và cộng sự cũng chỉ

ra rằng sự giảm mức biểu hiện Cx43 do đái tháo đường khởi động quá trình

chết tế bào gây mạch máu không có tế bào, chết tế bào ngoại mạch và tăng

tính thấm màng đáy trong võng mạc chuột đái tháo đường [102]. Điều đó cho

thấy Cx43 không chỉ điều hoà sự sống còn của các tế bào mà nó còn tham gia

vào việc duy trì sự toàn vẹn của hàng rào mạch máu võng mạc. Thêm nữa,

mao mạch của chuột đái tháo đường do tiêm Streptozotocin biểu hiện giảm

kết nối tế bào-tế bào giữa các tế bào ngoại mạch thể hiện qua phân tích hoá

mô miễn dịch [103]. Ngược lại, mao mạch của chuột đái tháo đường được

điều trị insulin cho thấy sự trao đổi giữa các tế bào không ảnh hưởng đáng kể.

Điều đó thể hiện đường huyết cao có thể là nguyên nhân của sự mất các mối

liên kết khe giữa các tế bào [88]. Tóm lại, những phát hiện trên đây cho thấy

tầm quan trọng của Cx trong việc duy trì cân bằng nội môi tại mạch máu võng

mạc đái tháo đường.

1.2.2.2. Rối loạn trao đổi chất giữa tế bào mạch máu võng mạc và tế bào thần

kinh đệm

Võng mạc bao gồm 2 thành phần là mạch máu và thần kinh. Ngoài việc

đái tháo đường gây ảnh hưởng mạch máu võng mạc đã được biết đến từ lâu,

các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các tế bào Muller- tế bào chịu trách nhiệm

chính duy trì cân bằng nội môi võng mạc, tế bào hình sao và tế bào hạch cũng

bị ảnh hưởng bởi tình trạng đường huyết cao [88]. Tế bào Muller phụ trách

cung cấp chất nền cho các nơron, bất hoạt và kích hoạt chu trình chuyển hoá

các nơron, vì thế giúp duy trì cân bằng ion trong võng mạc [104]. Tế bào

Muller võng mạc điều hoà quá trình giáng hóa glutamate và GABA [104]. Sự

thiếu hụt Cx43 ảnh hưởng đến sự biểu hiện của GLAST- men điều khiển sự

vận chuyển của glutamate vào trong tế bào Muller, do đó tham gia vào quá

trình khởi động chết theo chương trình của các tế bào [105]. Nghiên cứu của

Muto và cộng sự chỉ ra rằng nồng độ glucose cao gây giảm sự biểu hiện của

Cx43 trong tế bào Muller võng mạc dẫn đến giảm hoạt động của các mối liên

kết khe khiến chết tế bào Muller [106]. Đặc biệt, dưới điều kiện môi trường

glucose nồng độ cao sự giảm biểu hiện của Cx43 trong tế bào Muller được

nuôi cấy cùng các tế bào ngoại mạch dẫn đến tổn thương các mối liên kết khe

khởi động hiện tượng chết tế bào theo chương trình không chỉ ở tế bào Muller

mà cả tế bào ngoại mạch [106]. Điều đó nhấn mạnh tầm quan trọng của việc

trao đổi chất giữa các cặp Cx43 trong sự sống còn tế bào Muller và tế bào

ngoại mạch. Từ những thông tin trên cho thấy, sự sống còn của tế bào nội mô

và tế bào ngoại mạch trong đái tháo đường có thể bị ảnh hưởng bởi hoạt động

của các mối liên kết khe giữa các tế bào mạch máu và tế bào Muller.

 Thành phần chất



β1

 Cx43

nền ngoạ

Dày màng đáy mao mạch võng mạc

 Hoạt động mối liên kết khe

Chết tế bào mạch máu

Tăng tính thấm thành mạch

Đái tháo đƣờng Tăng đƣờng huyết

Bệnh võng mạc đái tháo đƣờng

Hình 1.8. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường do dày màng

đáy mao mạch và rối loạn kết nối tế bào-tế bào

1.2.3. Thay đổi cấu trúc ti thể

Ti thể thực hiện được chức năng khi có cấu trúc và hình thái bình thường. Sự

thay đổi trong hình thái và cấu trúc của ti thể liên quan đến những thay đổi cân bằng

nội môi trong tế bào bình thường như sản xuất năng lượng, sản xuất canxi, phân bố

DNA tinh thể, chết tế bào theo chương trình và mitophagy, cuối cùng gây ra chết tế

bào theo chương trình [107]. Dưới tác động của nồng độ glucose cao, sự phân mảnh

ti thể tăng lên, trong khi sự hợp nhất giảm gây ra hiện tượng chết theo chương trình

các tế bào mao mạch và tế bào Muller võng mạc [108].

Thay đổi hình thái ti thể

Vỡ ti thể

Tăng phân chia, giảm hợp nhất ti thể

Giảm hấp thu Oxy Tổn thương màng ti thể

Giải phóng Cytochrome C

Chết tế bào theo chương trình

Mạch máu không có tế bào, Mất tế bào ngoại mạch

Đái tháo đƣờng Tăng đƣờng huyết

Bệnh võng mạc đái tháo đƣờng

Hình 1.9. Cơ chế bệnh sinh bệnh võng mạc đái tháo đường do thay đổi cấu

trúc ti thể

1.3. Lysyl oxidase

Lysyl oxidase (LOX) là enzym đóng vai trò thiết yếu cho sự ổn định của

mô liên kết và mạch máu [109]. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra vai trò

của LOX trong các bất thường liên quan đến mất cân bằng trong tổng hợp

và/hoặc giáng hoá chất nền ngoại bào bao gồm các tổn thương xơ hoá ở tim

(xơ hóa cơ tim), mạch máu (xơ hoá mạch), phổi (xơ hoá phổi), da (sẹo hoá

phì đại), thận (bệnh thận do đái tháo đường) và gan (xơ hoá gan) [110].

1.3.1. Đặc điểm lysyl oxidase

1.3.1.1. Cấu trúc

LOX còn được gọi là protein-lysine 6-oxidase, là một loại protein được

mã hóa bởi gen LOX nằm trên nhánh dài, vị trí 23.3-31.2 của nhiễm sắc thể

số 5 [111]. LOX trưởng thành được tổng hợp thông qua sự phân tách protein

tiền enzyme N-glycosylated (pro-LOX, 50 kDa), thành một protein có hoạt

tính (LOX 32 kDa) và LOX-propeptide 18 kDa (LOX-PP) dưới sự xúc tác

của pro-collagen C-proteinases và bone morphogenetic protein-1 (BMP-1)

[10-112]. Các dạng khác của LOX, được gọi là các protein giống LOX

(LOXL) với tên gọi LOXL1, -2, -3 và -4, đã được xác định, có đầy đủ chức

năng nhưng khác biệt về mặt di truyền [113]. Mỗi thành viên của họ protein

LOX được đặc trưng bởi một chuỗi axit amin ở đầu tận cùng C của chúng bao

gồm vị trí gắn đồng để hình thành yếu tố carbonyl và vùng giống thụ thể

cytokine. Vùng đầu tận cùng C góp phần kích hoạt amine oxidase, và vùng

đầu N khác nhau giữa các dạng khác nhau giúp xác định các chức năng riêng

biệt [110].

Hình 1.10. Quá trình hình thành LOX trưởng thành

DNA

HIF-1α

LOX mRNA

Prostaglandin E2

TGF-β

Pre- Pro LOX

Procollagen C proteinase Tolloidlloid-like 1 protein Aminopeptidase B Fibronectin

LOX trưởng thành

Reactive oxygen species

Homocystein BAPN

Liên kết chéo

1.3.1.2. Điều hoà

Hình 1.11. Điều hoà quá trình hình thành và hoạt động của LOX

β-amin-opropionitrile (BAPN) là một chất ức chế không thể đảo ngược

của LOX, nó bám vào vị trí hoạt động của LOX [114]. BAPN đã được nghiên

cứu về tác dụng ức chế LOX trong xơ hóa gan [115] và xơ hóa phổi [116] trên

mô hình động vật. Trong khi đó, yếu tố chuyển đổi tăng trưởng β (TGF- β -

Transforming growth factor β) đã được biết đến như chất kích thích trực tiếp

biểu hiện LOX qua các nghiên cứu trong ống nghiệm và trong cơ thể [117].

Các nghiên cứu cũng báo cáo tác động của các yếu tố gây thiếu oxy (Hif-1α)

kích thích quá trình tổng hợp LOX. Do đó rối loạn tổng hợp LOX có liên

quan đến việc hình thành tân mạch trong các khối u thiếu oxy.

1.3.1.3. Vị trí

LOX đã được xác định trong một số mô, bao gồm da, động mạch

chủ, tim, phổi, gan, dạ dày, ruột non, đại tràng, sụn, xương, thận, buồng

trứng, tinh hoàn, vú, và não [18]. Trong mắt, enzym LOX được phát hiện

ở vùng bè, thể mi, thể thuỷ tinh và võng mạc [118]. Gần đây, LOX được

phát hiện ở biểu mô, nhu mô và nội mô của giác mạc người [119]. Mặc dù

LOX được phân loại là enzym ngoại bào, tuy nhiên LOX cũng được tìm

thấy trong nhân của rất nhiều loại tế bào và mô. LOX trưởng thành sau

khi được phân tách ở ngoài tế bào, một phần bám vào chất nền ngoại bào

xúc tác cho quá trình hình thành liên kết chéo, phần còn lại quay trở lại

bào tương và tập trung ở nhân tế bào [120-122].

1.3.1.4. Chức năng

LOX là một enzym oxy hoá khử phụ thuộc đồng khởi tạo liên kết chéo

hóa trị của các protein chất nền ngoại bào, như collagen và elastin. Enzym

LOX xúc tác quá trình oxy hóa khử nhóm amino epsilon của lượng peptidyl

lysine và hydroxylysine dư thừa trong tiền chất collagen và lượng lysine dư

thừa trong elastin. Các aldehyd này trải qua các phản ứng tự cô đặc với các

nhóm amino epsilon hoặc aldehyd khác, chuyển collagen hoặc elastin thành

dạng sợi không hoà tan tạo nên chất nền ngoại bào trưởng thành và bình

thường. Nếu các liên kết chéo qua trung gian LOX quá nhiều có thể dẫn đến

sự hình thành các tổ hợp sợi collagen quá nhỏ gọn, làm tăng không gian giữa

các sợi collagen và tính thấm tăng quá mức [123-124]. Điều đó cũng có thể gây

nên tăng độ dày và độ cứng của màng đáy dẫn đến tổn hại cấu trúc và chức năng

[73-125]. Ngoài ra, sự hoạt động hoàn chỉnh của LOX là cần thiết để hình thành

chất nền ngoại bào bằng cách chỉnh sửa các sợi collagen sau dịch mã để tạo ra

các liên kết cộng hóa trị giúp ổn định collagen không hòa tan [126].

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra vai trò quan trọng của liên kết chéo qua trung

gian LOX đối với tính toàn vẹn và chức năng của mô, đặc biệt là mô mạch máu

và mô liên kết. LOX cũng đã được chứng minh đóng vai trò rất quan trọng trong

việc duy trì tính ổn định và tính toàn vẹn của màng đáy do các liên kết collagen

và elastin qua trung gian LOX giúp màng đáy hoàn thiện chức năng [127-129].

Ngoài ra, LOX làm tăng biểu hiện và bài tiết các yếu tố tăng trưởng nội mô

mạch máu (VEGF) vì thế nó liên quan đến sự hình thành tân mạch [130].

1.3.2. Các tình trạng bệnh lý liên quan đến thay đổi mức độ biểu hiện LOX

1.3.2.1. Các tình trạng bệnh lý liên quan đến giảm mức độ biểu hiện LOX

Liên kết chéo qua trung gian LOX rất cần thiết cho sự ổn định của các

sợi elastin, đảm bảo tính toàn vẹn và độ đàn hồi của elastin trưởng thành.

[110-131]. Tầm quan trọng của liên kết chéo có nguồn gốc từ LOX đã được

khẳng định từ các nghiên cứu trên động vật trong đó LOX bị ức chế do chế độ

dinh dưỡng thiếu đồng hoặc bằng cách bổ sung BAPN [132]. Sự thiếu hụt

LOX gây giảm các liên kết chéo trong collagen và elastin gây bệnh lý

lathyrism, đặc trưng bởi tình trạng giảm hình thành xương, trùng giãn da, yếu

dây chằng và tăng sự xuất hiện của phình động mạch chủ [11].

LOX không chỉ quan trọng đối với sự phát triển tim mạch, nó còn đóng

vai trò chính trong sự phát triển mô liên kết và chức năng thần kinh. Nồng độ

LOX giảm có liên quan đến bệnh Menkes và hội chứng sừng chẩm, hai rối

loạn gen lặn liên kết với X đặc trưng bởi đột biến gen vận chuyển đồng. LOX

cũng đã được chứng minh là rất quan trọng đối với sự phát triển của hệ hô hấp

và da, vì collagen và elastin chiếm 50-60% thành phần của phổi và 75% của

da. Trong các mô hình loại hai alen LOX (LOX- /-), chức năng của LOX đã

giảm tới 80% và biểu hiện của phổi giống bệnh nhân khí phế thũng với đường

dẫn khí giãn [133]. Ngoài ra, LOX cũng đóng một vai trò thiết yếu trong quá

trình tạo tế bào mỡ từ các tế bào gốc đa năng trong quá trình phát triển. Thiếu

LOX có thể gây khiếm khuyết trong họ protein beta của yếu tố phát triển chuyển

dạng, ảnh hưởng đến quá trình phát triển và biệt hóa của tế bào [134].

Giảm biểu hiện LOX cũng góp phần vào cơ chế sinh bệnh của các

bệnh lý trong nhãn khoa. Hoạt động của LOX ở thuỷ dịch giảm khoảng

46% ở các giai đoạn sớm của hội chứng giả bong bao và giảm khoảng 36%

trong giai đoạn muộn so với nhóm đục thể thuỷ tinh đơn thuần [135]. Giảm

toàn bộ hoạt động của enzym có thể đóng góp vào giảm lượng protein LOX

ở thuỷ dịch. Cả huyết tương và thuỷ dịch đều biểu hiện giảm lượng LOX.

Tuy nhiên, trong thuỷ dịch, LOX giảm đáng kể ở tất cả các giai đoạn của

giả bong bao. Trong khi ở huyết tương, LOX chỉ giảm ở giả bong bao giai

đoạn muộn. Trong khi đó, vai trò của LOX trong bệnh giác mạc chóp được

đưa ra dưới 2 quan điểm đối lập [119-136]. Một số nghiên cứu trước đây

chỉ ra rằng, mức độ biểu hiện của LOX tăng ở giác mạc bệnh nhân giác

mạc chóp so với giác mạc lành [136], đặc biệt là ở biểu mô giác mạc. Tuy

nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng mức độ hoạt động của LOX ở

các tế bào trong bệnh giác mạc chóp giảm so với giác mạc lành. Sự giảm

hoạt động của LOX dẫn đến suy giảm các liên kết chéo, vì thế mất lực liên

kết giữa các sợi collagen, gây giãn giác mạc [119].

Ngoài ra, sự giảm biểu hiện LOX được phát hiện ở rất nhiều rối loạn mô

liên kết, bao gồm hội chứng Ehlers-Danlos và hội chứng Marfan, kết quả của

sự thiếu hụt tổng hợp collagen. Những hội chứng này thường kèm theo tỷ lệ

cao cận thị bệnh lý. Thay đổi điều hoà LOX gây tích luỹ các sợi collagen bất

thường và thay đổi sức bền cơ sinh học, gợi ý rằng enzym liên kết chéo đóng

vai trò quan trọng trong tái cấu trúc củng mạc [137]. Những phát hiện này chỉ

ra rằng điều hoà mức độ biểu hiện LOX ở củng mạc có thể là biện pháp tiềm

năng điều trị cận thị.

1.3.2.2. Các tình trạng bệnh lý liên quan đến tăng mức độ biểu hiện LOX

Sự tăng mức độ biểu hiện và hoạt động của enzyme LOX có liên quan

đến sự xâm lấn của các tế bào khối u, một phần bởi tác động của nó lên cấu

trúc và tính chất vật lý của chất nền ngoại bào [12-114]. Mức độ biểu hiện

LOX được điều chỉnh bởi các yếu tố gây thiếu oxy (HIFs), do đó, LOX

thường tăng biểu hiện trong các khối u thiếu oxy như u vú, đầu và cổ. Bệnh

nhân mắc khối u với mức độ biểu hiện LOX cao có tỷ lệ sống sót thấp. LOX

chịu trách nhiệm cho đặc tính xâm lấn của các tế bào ung thư thiếu oxy thông

qua hoạt động kinase bám dính khu trú và sự kết dính giữa các tế bào với chất

nền [12]. Trên thực tế, nghiên cứu gần đây đã cho thấy sự biểu hiện quá mức

của LOX là yếu tố quyết định để thúc đẩy tăng trưởng khối u và di căn ở một

số bệnh ung thư, bao gồm ung thư vú [138], ung thư hắc tố [139-140], ung

thư phổi không phải tế bào nhỏ [140], và ung thư đại trực tràng [141]. Nghiên

cứu ung thư vú trên mô hình loài gặm nhấm cũng chỉ ra rằng những chất ức

chế LOX có thể ngăn ngừa di căn [13].

Trong các tế bào thiếu thụ thể TGF-β, sự thiếu hụt đặc trưng của ung thư

phổi, LOX được tìm thấy ở nồng độ cao. Nhuộm miễn dịch LOX đã chứng tỏ

rằng biểu hiện LOX cao có liên quan đến mức độ xâm lấn ung thư biểu mô

cao trong các mẫu thu được từ ung thư biểu mô tuyến phổi được phẫu thuật

cắt bỏ. Ngoài ra, mức độ biểu hiện LOX là một chỉ số đánh giá khả năng sống

sót sau 5 năm ở bệnh nhân, với 71% cơ hội sống sót cho bệnh nhân có mức

LOX thấp, so với 43% ở bệnh nhân có mức LOX cao. Do đó, tăng mức độ

biểu hiện của LOX là một yếu tố tiên lượng xấu ở bệnh nhân ung thư biểu mô

tuyến (adenocarcinoma) giai đoạn sớm [142].

Gần đây, LOX được phát hiện có liên quan đến sự hình thành mạch máu

khối u, cả trong thí nghiệm và thực nghiệm. LOX có nguồn gốc từ khối u

dưới da đã được chứng minh là làm tăng biểu hiện và bài tiết yếu tố tăng

trưởng nội mô mạch máu (VEGF), sau đó thúc đẩy sự hình thành mạch

bằng cách phosphoryl hóa protein kinase B, hoặc Akt, thông qua thụ thể

yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu β (PDGFRB). Nồng độ LOX cao

có liên quan đến mật độ mạch máu cao trong các khối u trên bệnh nhân.

Các chất ức chế LOX có liên quan trên lâm sàng có thể giúp làm chậm tiến

triển ung thư bằng cách giảm biểu hiện các yếu tố tăng trưởng quan trọng

thúc đẩy sự tiến triển của khối u rắn [143].

Ngoài ra, LOX cũng được phát hiện trong tế bào tủy xương chịu trách

nhiệm sản xuất tiểu cầu. Nghiên cứu trên mô hình chuột xơ hoá tuỷ xương

(myelofibrosis) phát hiện LOX trong mô tuỷ xương xơ hoá. Do đó, các chất

ức chế enzyme LOX có thể hữu ích trong việc ngăn ngừa sự hình thành

mạch, tiến triển khối u và di căn cũng như điều trị bệnh xơ hoá khác liên

quan đến việc tái cấu trúc chất nền ngoại bào, bao gồm các bệnh thoái hóa

thần kinh và tim mạch [14].

1.4. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới

Hiện nay ở Việt Nam có khá nhiều nghiên cứu về bệnh võng mạc đái

tháo đường, nhưng chủ yếu liên quan đến dịch tễ bệnh, biểu hiện lâm sàng và

hiệu quả điều trị. Rất ít nghiên cứu về cơ chế sinh bệnh bệnh võng mạc đái

tháo đường và chưa có nghiên cứu nào về thay đổi của LOX. Trong các bệnh

lý tại dịch kính võng mạc như bệnh võng mạc đái tháo đường tăng sinh

(PDR) và bong võng mạc nguyên phát (RRD), có sự tái tạo chất nền ngoại

bào trên diện rộng [144]. Bệnh võng mạc đái tháo đường tăng sinh là một

biến chứng của bệnh đái tháo đường đặc trưng bởi tân mạch võng mạc, sự

phát triển của xơ mạch co kéo trước võng mạc và bong võng mạc [145].

Hiện tượng bong võng mạc nguyên phát là một cơ chế sinh bệnh học liền

vết thương phức tạp của bệnh dịch kính võng mạc tăng sinh (PVR) [146].

Nói chung, việc chữa lành vết thương ở PVR liên quan đến viêm, lắng

đọng chất nền ngoại bào và tái tạo mô.

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu liên quan đến sự biến đổi và ảnh hưởng

của LOX trong bệnh đái tháo đường và các bệnh lý khác. Theo nghiên cứu của Erler

và cộng sự, sự tăng biểu hiện LOX trong một số bệnh ung thư xâm lấn có liên quan

đến tăng tính thấm của chất nền ngoại bào trong các bệnh lý này so với chất nền

ngoại bào bình thường [147]. Nghiên cứu của Le Pape và cộng sự đánh giá collagen

màng đáy cầu thận và liên kết chéo qua trung gian LOX trong bệnh đái tháo đường

báo cáo tỷ lệ dihydroxylysinonorleucine so với hydroxylysinonorleucine đã tăng

lên, chứng tỏ có sự thay đổi liên kết chéo trong bệnh đái tháo đường [148]. Mặc

dù sự tăng biểu hiện của các thành phần màng đáy như FN, Coll IV và laminin

trong bệnh đái tháo đường đã được biết đến [22-44], và các nghiên cứu gần đây

cho thấy vai trò của chúng đối với tăng tính thấm của mạch máu võng mạc,

nhưng những biến đổi sinh bệnh học liên quan biến đổi chất nền ngoại bào và

thúc đẩy tăng tính thấm mạch máu vẫn chưa rõ ràng [6-52-58-149]. Nghiên cứu

trên sinh hiển vi điện tử của Ortoland cho thấy có sự biến đổi cấu trúc các sợi

collagen trong bệnh đái tháo đường. Những khác biệt này bao gồm tăng mật độ

bó sợi fibrin, giảm đường kính bó sợi fibrin và hình thái sợi bất thường với biểu

hiện sợi xoắn, cong, chồng chéo, và rối loạn tổ chức, gợi ý đến tăng liên kết chéo

quá mức giữa các sợi fibrin [123]. Nghiên cứu khác về đường kính của bó sợi

fibrin thể hiện rằng đường kính sợi phụ thuộc vào giai đoạn sắp xếp các sợi

fibrin, hoạt động được điều hoà bởi LOX [124].

Mặc dù nhiều nghiên cứu về rò mao mạch võng mạc ở bệnh đái tháo

đường đã tập trung vào các bất thường tế bào mao mạch như tế bào nội mô

[150] và sự sản xuất yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), được

coi là yếu tố chính gây ra sự phát triển rối loạn chức năng mạch, chỉ một số

ít đánh giá mối quan hệ giữa những thay đổi sinh hóa của sự tích lũy bất

thường của chất nền ngoại bào (ECM) và tăng tính thấm màng đáy [77].

Nghiên cứu của Oshitari và cộng sự cho thấy sử dụng antisense

oligonucleotide tác động lên chất nền ngoại bào làm giảm độ dày màng đáy

mao mạch có hiệu quả ngăn ngừa dày màng đáy mao mạch, giảm đáng kể

mao mạch không có tế bào, chết tế bào ngoại mạch, và ngăn ngừa rò rỉ

mạch máu ở võng mạc đái tháo đường [22-74].

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các thành phần thiết yếu cho tính toàn vẹn

của màng đáy bao gồm sự ổn định, sắp xếp các sợi fibrin và sự phân cực, phụ

thuộc phần lớn vào liên kết chéo thích hợp điều hoà bởi LOX. Bất thường hình

thái của màng đáy mao mạch võng mạc của bệnh nhân đái tháo đường phản ánh

sự thay đổi trong cấu trúc do liên kết chéo tăng quá mức. Sự thay đổi này biểu

hiện bởi hiện tượng màng đáy võng mạc dày lên, một trong những đặc điểm nổi

bật của bệnh võng mạc đái tháo đường [77-151]. Theo nghiên cứu của

Rodriguez và Lucero, hiện tượng dư thừa các liên kết chéo phụ thuộc LOX gây

tích lũy chất nền ngoại bào [14-15]. Mặc dù mâu thuẫn nhưng nghiên cứu của

Paszek đã chứng minh sự gia tăng độ cứng của chất nền ngoại bào có thể gây

tăng cường vận chuyển qua chất nền ngoại bào bằng cách thay đổi phức hợp tín

hiệu thụ thể bề mặt tế bào [152]. Gần đây, nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng

hàm lượng LOX tăng trong võng mạc của chuột mắc đái tháo đường và điều hoà

LOX giúp giảm các tổn thương liên quan bệnh võng mạc đái tháo đường [19].

Tuy vậy, những thông tin liên quan đến mức độ biểu hiện, phân bố và điều hoà

LOX trong bệnh võng mạc đái tháo đường không nhiều.

Do tính đa dạng về chức năng sinh học, sự bất thường mức độ biểu hiện

của LOX có vai trò trong cơ chế sinh bệnh của nhiều bất thường liên quan mất

cân bằng tổng hợp và giáng hoá của chất nền ngoại bào. So với những bệnh lý

khác, hiểu biết về LOX trong bệnh võng mạc đái tháo đường vẫn còn rất hạn

chế. Nhiều câu hỏi được đặt ra cho các nghiên cứu trong tương lai như: (1) Tình

trạng đường huyết cao gây rối loạn sự biểu hiện của enzym LOX như thế nào?

(2) Cơ chế tín hiệu tế bào nào điều hoà sự biểu hiện của LOX trong tế bào mao

mạch võng mạc? (3) Những yếu tố nào ảnh hưởng tới sự biểu hiện của enzym

LOX? (4) Điều hoà mức độ biểu hiện của LOX có giúp ngăn ngừa các tổn

thương mao mạch võng mạc do đái tháo đường hay không? Trả lời được những

câu hỏi trên giúp hiểu rõ hơn cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường, từ đó

mở ra hướng dự phòng và điều trị bệnh võng mạc đái tháo đường liên quan đến

rối loạn mức độ biểu hiện của enzym này.

Chƣơng 2

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

- Nhóm nghiên cứu: Các tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột nuôi

cấy trong môi trường nồng độ glucose cao.

- Nhóm đối chứng: Các tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột nuôi

cấy trong môi trường nồng độ glucose bình thường.

2.2. Địa điểm nghiên cứu

Trường Y Đại học Boston, bang Massachusetts, Hoa Kỳ.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thử nghiệm

2.3.2. Mẫu

Dựa trên công thức tính cỡ mẫu theo phương pháp "Resource equation"

áp dụng cho nghiên cứu thử nghiệm:

n= E/(k+1)

Trong đó:

n: số thử nghiệm

E: sai lệch giữa các đối tượng (= 10 đến 20)

k: số đĩa tế bào trong mỗi thử nghiệm (2-4)

Từ đó tính ra giá trị n = 2-7.

Do đó trong nghiên cứu này, mỗi loại thử nghiệm định lượng được lặp

lại 6 lần và mỗi thử nghiệm định tính được chọn ngẫu nhiên 6 vi trường. Tổng

cộng 104 thử nghiệm bao gồm 102 thử nghiệm định lượng và 2 thử nghiệm

định tính.

2.3.3. Phương tiện nghiên cứu

2.3.3.1. Trang thiết bị dùng trong nuôi cấy tế bào

- Trang thiết bị: Đĩa tế bào đường kính 35mm và 60mm, máy hút, sinh

hiển vi, tủ hút, tủ nuôi cấy tế bào, bình lọc môi trường nuôi cấy.

- Hoá chất: Dung dịch môi trường Dulbecco Medified Eagle Medium

(DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS), Amphotericin B, Anti/Anti,

Gentamycin, Glucose 2M, LOX small interfering RNA (LOXsiRNA), β-

aminopropionitrile (BAPN), Amonium Hydroxide (NH4OH), Trypsin-EDTA.

2.3.3.2. Trang thiết bị và hoá chất dùng trong kỹ thuật Western Blot

- Trang thiết bị: Bộ dụng cụ làm gel Sodium dodecyl Sulfate (SDS), máy

lắc (vortex), máy luân nhiệt, máy điện di, máy chuyển màng, máy bộc lộ hình

ảnh film X-quang, màng PVDF, phim X-quang, máy đọc hình ảnh Western

Blot (WB).

- Hoá chất: dH2O, Tris 1.5M pH 8.8, Tris 0.5M pH 6.8, bột Tris,

Polyacrylamide 30%, Temed, SDS 10%, Ammonium Persulfate (APS) 10%,

Isobutanol, Isopropanol, 4X Laemmli, Glycine, Bột sữa không béo, 1X

Tween Tris-buffered saline (TTBS), Methanol, Ponceau-S, Bovine serum

albumin (BSA) 5%, Ethanol 70%, 1X Photphaste-buffered saline (PBS), chất

chỉ thị trọng lượng phân tử, kháng thể sơ cấp (kháng thể kháng AKT, kháng

thể kháng LOX dòng thỏ, kháng thể kháng Coll IV dòng thỏ, và kháng thể

kháng FN dòng thỏ, và kháng thể thứ cấp (kháng thể kháng thỏ).

2.3.2.3. Trang thiết bị dùng trong kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang

- Trang thiết bị: Sinh hiển vi phát huỳnh quang, sinh hiển vi đồng tiêu,

khay ẩm, tủ hút.

- Hoá chất: PBS, methanol, BSA 2%, kháng thể kháng LOX dòng chuột,

kháng thể kháng Collagen IV dòng thỏ, kháng thể kháng Fibronectin dòng

thỏ, kháng thể kháng chuột Fluorescein isothiocyanate (FITC), kháng thể

kháng thỏ Rhodamine Red, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).

2.3.3.4. Trang thiết bị dùng trong phân tích hiện tượng chết tế bào theo

chương trình

- Trang thiết bị: Sinh hiển vi phát huỳnh quang.

- Hoá chất: dH2O, PBS, acridine orange và ethidium bromide.

2.3.3.5. Trang thiết bị dùng trong phân tích độ thẩm thấu tế bào

- Trang thiết bị: Máy quang phổ tử ngoại (SpectraMax GemiGemini Max

Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Hoa Kỳ).

- Hoá chất: dH2O, PBS, FITC-dextran.

2.3.3.6. Trang thiết bị dùng trong phân tách tế bào/chất nền ngoại bào

- Trang thiết bị: Đĩa tế bào đường kính 35mm và 60mm, máy hút, sinh

hiển vi, tủ hút, tủ nuôi cấy tế bào, máy ly tâm.

- Hoá chất: dH2O, NH4OH, Trypsin-EDTA, DMEM, FFBS,

Amphotericin B, Anti/Anti, Gentamycin, Glucose 2M.

2.3.4. Cách thức tiến hành

2.3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy tế bào

a. Thành phần:

- 50 ml môi trường bình thường (nồng độ glucose 5 mmol/l) bao gồm 45

ml DMEM, 5 ml FBS, 100 μl Amphotericin B, 250 μl Anti/Anti, và 50 μl

Gentamycin.

- 50 ml môi trường nồng độ glucose cao (nồng độ glucose 30 mmol/l)

gồm 45 ml DMEM, 5 ml FBS, 100 μl Amphotericin B, 250 μl Anti/Anti, 50

μl Gentamycin, và 650 μl Glucose 2M.

b. Tiến hành

- Chuẩn bị 3 ống 50ml có ghi nhãn.

- Cho vào ống thứ nhất các thành phần kể trên để tạo 50ml môi trường

bình thường.

- Đậy nắp ống, lắc ống để trộn đều các thành phần.

- Dùng ống lọc chuyển môi trường bình thường sang ống thứ hai. Ghi

nhãn ống thứ hai (môi trường nuôi cấy bình thường, ngày pha).

- Cho vào ống thứ nhất các thành phần kể trên để tạo 50ml môi trường

nồng độ glucose cao.

- Đậy nắp ống, lắc ống để trộn đều các thành phần.

- Dùng ống lọc chuyển môi trường glucose cao sang ống thứ ba. Ghi nhãn ống

thứ ba (môi trường nuôi cấy nồng độ glucose cao, ngày pha).

- Bảo quản môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 4°C. Làm ấm môi trường tới

nhiệt độ 37°C và lắc đều ống trước mỗi lần sử dụng.

Hình 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào

Hình 2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong tủ hút

2.3.4.2. Mục tiêu 1: Thay đổi mức độ biểu hiện của Lysyl oxidase

a. Thay đổi hàm lượng LOX

 Hàm lượng LOX trong protein toàn phần, chất nền ngoại bào và trong

tế bào

Nuôi cấy RRECs trong môi trường bình thường hoặc môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày

Phân lập tế bào sử dụng Trypsin- EDTA Phân lập chất nền ngoại bào sử dụng NH4OH

Phân lập protein toàn phần Phân lập protein chất nền ngoại bào Lắng đọng miễn dịch với kháng thể kháng LOX

WB với kháng thể kháng LOX

Sơ đồ 2.1. Các bước xác định hàm lượng LOX trong protein toàn phần,

chất nền ngoại bào và trong tế bào

 Nuôi cấy tế bào: Mỗi thử nghiệm gồm 2 đĩa tế bào. Ngày đầu tiên, mỗi

đĩa đường kính 60mm được cấy 30.000 tế bào. Tiếp đó, 1 đĩa tế bào

được nuôi cấy trong môi trường bình thường và 1 đĩa được nuôi cấy

trong môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày.

N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường glucose nồng độ cao.

Hình 2.3. Các tế bào nuôi cấy trong các đĩa môi trường.

 Phân lập tế bào sử dụng Trypsin-EDTA (Phụ lục 10).

 Phân lập chất nền ngoại bào với Amonium Hydroxide (NH4OH)

(Phụ lục 11).

 Kỹ thuật phân lập protein toàn phần/protein chất nền ngoại bào

(Phụ lục 12).

 Xác định lượng nồng độ protein thu được bằng kỹ thuật BCA (Phụ lục 13).

 Lắng đọng miễn dịch với kháng thể kháng LOX (Phụ lục 14).

 WB với kháng thể kháng LOX (Phụ lục 15).

 Hàm lượng LOX trong môi trường nuôi cấy tế bào

 Nuôi cấy tế bào: Mỗi thử nghiệm gồm 2 đĩa tế bào. Các tế bào được

nuôi cấy trong môi trường bình thường hoặc môi trường nồng độ

glucose cao trong 1, 3, 5, và 7 ngày. Sau đó, môi trường nuôi cấy được

thay thế bằng môi trường không có serum và phenol trong 24 giờ.

 Lắng đọng miễn dịch với kháng thể kháng LOX

- Lấy ở mỗi nhóm 1ml dung dịch môi trường nuôi cấy cho vào các ống

1.5ml có dán nhãn

- Kỹ thuật: Tương tự kỹ thuật E (Phụ lục 14)

Nuôi cấy tế bào trong môi trường bình thường hoặc môi trường nồng độ glucose cao trong 1, 3, 5 và 7 ngày

Thay thế môi trường nuôi cấy bằng môi trường không có serum và phenol trong 24 giờ

Lấy 1ml môi trường nuôi cấy ở mỗi đĩa lắng đọng miễn dịch với kháng thể kháng LOX

WB với kháng thể kháng LOX

Sơ đồ 2.2. Các bước xác định hàm lượng LOX trong môi trường nuôi cấy tế bào

 Kỹ thuật WB với kháng thể kháng LOX

- Chuẩn bị

+ Kháng thể sơ cấp: bao gồm 2.5 μl kháng thể kháng LOX dòng thỏ

pha trong 5ml BSA 5%.

+ Kháng thể thứ cấp: bao gồm 0.625g sữa khô không béo, 12.5ml dung

dịch 1X TTBS và 4 μl kháng thể kháng thỏ.

+ Protein: Protein thu được qua kỹ thuật lắng đọng miễn dịch

- Kỹ thuật: Tương tự kỹ thuật F (Phụ lục 15)

Sơ đồ 2.3. Các bước xác định hàm lượng LOX trong môi trường nuôi cấy

tế bào

b. Thay đổi hoạt động của LOX

 Nuôi cấy tế bào: Tế bào được nuôi cấy trong môi trường bình thường

hoặc môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày. Sau đó môi trường

nuôi cấy được thay thế bằng môi trường không có serum và phenol

trong 24 giờ.

Nuôi cấy tế bào trong môi trường bình thường hoặc môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày

Thay thế môi trường nuôi cấy bằng môi trường không có serum và phenol trong 24 giờ

Nhuộm Amplex Red

Đánh giá sự bắt màu fluorescence sử dụng máy đo quang phổ

Sơ đồ 2.4. Các bước xác định hoạt động tế bào

 Kỹ thuật nhuộm Aplex Red fluorescence:

- Chuẩn bị mẫu: 2ml môi trường nuôi cấy pha thêm 1.2 mol/l urea, 0.05

mol/l sodium borate (pH 8.2), 1 đơn vị/ml of horseradish peroxidase (Sigma),

and 10 mmol/l 1,5-diaminopentane (Cadaverine; Sigma). Dung dịch trên được ủ

ở 37°C trong 30 phút.

- Hoạt động của LOX thể hiện qua mức độ bắt màu fluorescence. Sự bắt

màu fluorescence từ các mẫu được đánh giá qua máy đo quang phổ

fluorescence Hitachi F-2000 với bước sóng kích thích và phát xạ là 568nm

and 587nm, tương ứng.

c. Thay đổi mật độ LOX

Nuôi cấy tế bào trên các lam kính trong môi trường bình thường hoặc môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng LOX dòng chuột

Loại bỏ tế bào, phân lập chất nền ngoại bào sử dụng NH4OH

Chụp Z-stack sử dụng sinh hiển vi đồng tiêu/ Chụp ảnh sử dụng sinh hiển vi điện tử Nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng LOX dòng chuột

Chụp ảnh sử dụng sinh hiển vi điện tử

Sơ đồ 2.5. Các bước xác định mật độ LOX

 Nuôi cấy tế bào: Các tế bào được nuôi cấy trên các lam kính trong môi

trường bình thường hoặc môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày.

N1: Môi trường bình thường. HG1: Môi trường nồng độ glucose cao

Hình 2.4. Các tế bào được nuôi cấy trên các lam kính đặt trong các đĩa tế bào

 Phân lập chất nền ngoại bào với NH4OH: tương tự kỹ thuật B (Phụ lục 11)

 Nhuộm miễn dịch huỳnh quang

- Chuẩn bị:

+ Chuẩn bị kháng thể sơ cấp: Pha 200 μl dung dịch 2% BSA và 4 μl

kháng thể kháng LOX dòng chuột.

+ Chuẩn bị kháng thể thứ cấp (trong buồng tối): Pha 200 μl BSA 2%

và 4 μl kháng thể kháng chuột FITC và 4 μl kháng thể kháng thỏ Rhodamine.

- Ngày thứ nhất:

+ Rửa đĩa tế bào (tế bào được nuôi cấy trên lam kính vuông) 3 lần với PBS

+ Cố định tế bào phía trên lam kính bằng 100 μl methanol lạnh trong 10 giây

+ Hút hết methanol khỏi lam kính

+ Rửa tế bào 3 lần với PBS

+ Chuyển lam kính vuông sang lam kính hình chữ nhật

+ Loại bỏ hết PBS phía trên lam kính vuông sau đó cho 200 μl dung dịch

BSA 2% lạnh lên trên tế bào. Đảm bảo dung dịch dàn đều toàn bộ lam kính vuông

+ Đặt lam kính vào khay ẩm và giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

Hình 2.5. Chuẩn bị kháng thể sơ cấp

+ Loại bỏ BSA 2% khỏi lam kính, cho 208 μl kháng thể sơ cấp lên lam

kính, đảm bảo dung dịch kháng thể dàn đều toàn bộ lam kính.

+ Đặt lam kính vào khay ẩm và giữ qua đêm ở nhiệt độ 4°C

A

B

Hình 2.6. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang ngày thứ nhất

A. Đặt lam kính vuông lên lam kính hình chữ nhật

B. Đặt các lam kính vào khay ẩm

- Ngày thứ hai: Tiến hành trong buồng tối

+ Lấy lam kính ra khỏi khay

+ Rửa tế bào 5 lần với 100 μl dung dịch PBS

+ Loại bỏ hết PBS khỏi lam kính và cho 208 μl kháng thể thứ cấp lên

trên tế bào. Đảm bảo dung dịch dàn đều toàn bộ lam kính vuông

+ Đặt lam kính vào khay ẩm, giữ trong 1 tiếng ở nhiệt độ phòng trong

buồng tối

+ Sau 1 tiếng, rửa tế bào 3 lần với 100 μl dung dịch PBS

+ Nhuộm tế bào với 100 μl DAPI (5ug/ml) trong 3 phút, sau đó rửa tế

bào với 100 μl PBS.

+ Chuẩn bị lam kính chữ nhật mới

+ Chuyển lam kính vuông sang lam kính chữ nhật mới, úp mặt lam

kính vuông xuống phía dưới

+ Dùng keo dán xung quanh lam kính vuông và bảo quản lam kính ở

nhiệt độ 4°C trong buồng tối

- Chụp ảnh các lam kính bằng sinh hiển vi đồng tiêu và sinh hiển vi điện

tử. Phân tích hình ảnh dựa trên phần mềm ImageJ.

Hình 2.7. Phân tích hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua phần

mềm Image J

d. Tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ biểu hiện của LOX

 Nuôi cấy tế bào: Mỗi thử nghiệm gồm 3 đĩa tế bào. Ngày đầu tiên, mỗi

đĩa đường kính 60mm được cấy 30.000 tế bào. Các tế bào được nuôi cấy

trong 1 đĩa môi trường bình thường và 2 đĩa môi trường glucose nồng độ cao

trong 7 ngày. Với thử nghiệm ủ BAPN, trước khi thu nhận mẫu, 3 đĩa tế bào

được thay môi trường không chứa phenol.

 Ủ tế bào với LOX siRNA và β-Aminopropionitrile: Sau 7 ngày, 1 đĩa tế

bào có nồng độ glucose cao được bơm thêm 33nM LOXsiRNA hoặc BAPN

500μM và ủ trong 24 giờ.

 Nhuộm Amplex Red: Xem phần 2.3.4.2b. Hoạt động của LOX

 Phân lập protein: Kỹ thuật C (Phụ lục 12)

Nuôi cấy RRECs trong 1 đĩa môi trường bình thường và 2 đĩa môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày

1 đĩa tế bào có nồng độ glucose cao được ủ với BAPN trong 24 giờ 1 đĩa tế bào có nồng độ glucose cao được ủ với LOXsiRNA trong 24 giờ

Phân lập protein

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng LOX Thay thế môi trường bằng môi trường nuôi cấy không có phenol red

Nhuộm Amplex Red WB với kháng thể kháng LOX Chụp ảnh sử dụng sinh hiển vi điện tử

Phân tích hoạt động của LOX dựa trên sự bắt màu fluorescence sử dụng máy đo quang phổ

Sơ đồ 2.6. Các bước xác định tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ

biểu hiện LOX

 WB với kháng thể kháng LOX:

- Chuẩn bị

+ Kháng thể sơ cấp: bao gồm 2.5 μl kháng thể kháng LOX dòng thỏ

pha trong 5ml BSA 5%

+ Kháng thể thứ cấp: bao gồm 0.625g sữa khô không béo, 12.5ml dung

dịch 1X TTBS và 4 μl kháng thể kháng thỏ.

+ Protein: Protein thu được qua kỹ thuật phân lập protein

- Kỹ thuật: Tương tự kỹ thuật F với kháng thể như trên (Phụ lục 15)

 Nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng LOX: Xem phần

2.2.4.2c/Nhuộm miễn dịch huỳnh quang.

e. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới hoạt động của tế bào

 Tác động của thay đổi LOX tới độ thẩm thấu tế bào

Nuôi cấy RRECs trong 1 đĩa môi trường bình thường và 3 đĩa môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày

1 đĩa tế bào có nồng độ glucose cao được ủ với BAPN trong 24h

1 đĩa tế bào có nồng độ glucose cao được ủ với LOXsiRNA trong 24h

Dung dịch nuôi cấy được thay thế bởi 600 μl FITC-dextran 0.5mg/ml trong 1 giờ

Lấy 200 μl dung dịch FITC-dextran từ mỗi nhóm

Phân tích độ thẩm thấu tế bào qua máy quang phổ tử ngoại

Sơ đồ 2.7. Các bước xác định độ thẩm thấu tế bào

 Nuôi cấy tế bào: Mỗi thử nghiệm gồm 4 đĩa tế bào. Ngày đầu tiên,

30.000 tế bào được cấy vào mỗi đĩa tế bào. Tiếp đó, 1 đĩa tế bào được

nuôi cấy trong môi trường bình thường, 3 đĩa tế bào được nuôi cấy

trong môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày.

 Ủ tế bào với LOXsiRNA và BAPN: Sau 7 ngày, lấy 2 đĩa tế bào có

nồng độ glucose cao. 1 đĩa được bơm thêm 33nM LOXsiRNA và 1 đĩa

được bơm thêm 500μM BAPN và ủ trong 24 giờ.

 Phân tích độ thẩm thấu tế bào: Dung dịch nuôi cấy ở mỗi đĩa tế bào

được thay thế bởi 600 μl FITC-dextran 0.5mg/ml trong 1 giờ. Lấy 200

μl dung dịch FITC-dextran từ mỗi nhóm cho vào các khay đưa vào máy

quang phổ tử ngoại với bước sóng 492 nm và đọc kết quả.

 Tác động của thay đổi LOX tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình

Nuôi cấy RRECs trong 1 đĩa môi trường bình thường và 2 đĩa môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày

1 đĩa tế bào có nồng độ glucose cao được ủ với BAPN trong 24h 1 đĩa tế bào có nồng độ glucose cao được ủ với LOXsiRNA trong 24h

Nhuộm lam kính trong hỗn hợp 25μl/ml acridine orange và 25 μl/ml ethidium bromide trong 10 phútbromide

Quan sát tế bào dưới sinh hiển vi fluorescence

Sơ đồ 2.8. Các bước xác định hiện tượng chết tế bào theo chương trình

 Nuôi cấy tế bào: Mỗi thử nghiệm gồm 3 đĩa tế bào chứa các lam kính.

Ngày đầu tiên, mỗi đĩa đường kính 35mm được cấy 10.000 tế bào. Tiếp

đó, 1 đĩa tế bào được nuôi cấy trong môi trường bình thường, 2 đĩa tế

bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày

 Ủ tế bào với LOX siRNA hoặc BAPN: Sau 7 ngày, 1 đĩa tế bào nuôi

cấy trong nồng độ glucose cao được bơm thêm 33nM LOXsiRNA hoặc

500μM BAPN và ủ trong 24 giờ.

 Đánh giá hiện tượng chết tế bào theo chương trình: Nhuộm lam kính

trong hỗn hợp 25μl /ml acridine orange và 25 μl/ml ethidium bromide

trong 10 phút và quan sát tế bào dưới sinh hiển vi fluorescence. Tế bào

đang xảy ra hiện tượng chết tế bào theo chương trình bắt màu đỏ. Đếm

số tế bào chết theo chương trình trong 6 vi trường bất kì và tính giá trị

trung bình.

2.3.4.3. Mục tiêu 2: Thay đổi mức độ bám dính của LOX

a. Hàm lượng LOX-Coll IV và LOX-FN

 Nuôi cấy tế bào: Mỗi thử nghiệm gồm 2 đĩa tế bào. Ngày đầu tiên, mỗi

đĩa đường kính 60mm được cấy 30.000 tế bào. Tiếp đó, 1 đĩa tế bào

được nuôi cấy trong môi trường bình thường và 1 đĩa được nuôi cấy

trong môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày.

 Phân lập protein toàn phần/protein chất nền ngoại bào: Tương tự kỹ

thuật C (Phụ lục 12).

 Lắng đọng miễn dịch với kháng thể kháng LOX: Tương tự kỹ thuật E

(Phụ lục 14).

 WB với kháng thể kháng Coll IVvà kháng thể kháng FN:

- Kháng thể sơ cấp: bao gồm 5 μl kháng thể kháng Coll IV và 5 μl kháng

thể kháng FN dòng thỏ pha trong 5ml BSA 5%.

- Kháng thể thứ cấp: bao gồm 0.625g sữa khô không béo, 12.5ml dung

dịch 1X TTBS và 4 μl kháng thể kháng thỏ.

- Protein: Protein thu được qua kỹ thuật lắng đọng miễn dịch

- Kỹ thuật: Tương tự kỹ thuật F (Phụ lục 15)

Nuôi cấy RRECs trong môi trường bình thường hoặc môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày

Phân lập protein toàn phần Phân lập chất nền ngoại bào sử dụng dung dịch NH4OH

Phân lập protein chất nền ngoại bào

Lắng đọng miễn dịch với kháng thể kháng LOX

WB với kháng thể kháng Coll IV và kháng thể kháng FN

Sơ đồ 2.9. Các bước xác định lượng LOX liên kết với Coll IV và FN

b. Mật độ liên kết LOX với protein chất nền ngoại bào

 Nuôi cấy tế bào: Mỗi thử nghiệm gồm 2 đĩa tế bào chứa các lam kính.

Ngày đầu tiên, mỗi đĩa đường kính 35mm được cấy 10.000 tế bào. Tiếp

đó, 1 đĩa tế bào được nuôi cấy trong môi trường bình thường, 1 đĩa tế

bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày.

Nuôi cấy tế bào trên các lam kính trong môi trường bình thường hoặc môi trường nồng độ glucose cao trong 7 ngày

Loại bỏ tế bào, phân lập chất nền ngoại bào sử dụng NH4OH

Nhuộm đồng miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng LOX dòng chuột và kháng thể kháng Coll IV hoặc FN dòng thỏ

Chụp Z-stack sử dụng sinh hiển vi đồng tiêu

Nhuộm đồng miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng LOX dòng chuột và kháng thể kháng Coll IV hoặc FN dòng thỏ

Chụp ảnh sử dụng sinh hiển vi điện tử

Sơ đồ 2.10. Các bước xác định mật độ LOX liên kết với Coll IV và FN

 Phân lập chất nền ngoại bào với dung dịch NH4OH: tương tự kỹ thuật

B (Phụ lục 11)

 Nhuộm đồng miễn dịch huỳnh quang: Nhuộm miễn dịch huỳnh quang

với kháng thể kháng LOX dòng chuột và kháng thể kháng Coll IV hoặc

FN dòng thỏ.

a. Chuẩn bị

- Kháng thể sơ cấp:

+ Loại 1: Pha 200μl dung dịch 2% BSA và 4μl kháng thể kháng LOX

dòng chuột và 4μl kháng thể kháng Coll IV dòng thỏ.

+ Loại 2: Pha 200μl dung dịch 2% BSA và 4μl kháng thể kháng LOX

dòng chuột và 4μl kháng thể kháng FN dòng thỏ.

- Chuẩn bị kháng thể thứ cấp (trong buồng tối): Pha 200μl BSA 2% và

4μl kháng thể kháng chuột FITC và 4μl kháng thể kháng thỏ Rhodamine.

b. Kỹ thuật: Xem phần 2.3.4.2c/ Thay đổi mật độ LOX. Hình ảnh thu

được sau kỹ thuật nhuộm đồng miễn dịch huỳnh quang tế bào và chất nền

ngoại bào được quan sát và phân tích dưới sinh hiển vi đồng tiêu và sinh hiển

vi điện tử. 6 vi trường bất kì được chọn lựa, phân tích qua phần mềm ImageJ

và tính giá trị trung bình.

2.3.5. Các chỉ số nghiên cứu

2.3.5.1. Mục tiêu 1: Thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô

mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao

a. Thay đổi hàm lượng LOX

 Hàm lượng LOX trong protein toàn phần

 Hàm lượng LOX trong protein chất nền ngoại bào

 Hàm lượng LOX trong protein tế bào

 Hàm lượng LOX trong môi trường nuôi cấy tế bào

- Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào sau 1 ngày nuôi cấy

- Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào sau 3 ngày nuôi cấy

- Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào sau 5 ngày nuôi cấy

- Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào sau 7 ngày nuôi cấy

b. Thay đổi hoạt động của LOX

c. Thay đổi mật độ của LOX

 Mật độ LOX trong protein toàn phần

 Mật độ LOX trong protein chất nền ngoại bào

d. Tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ biểu hiện của LOX

 Hàm lượng của LOX

 Hoạt động của LOX

e. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới hoạt động của tế bào

 Tính thấm màng tế bào

 Tỷ lệ pAKT/AKT

 Số tế bào chết theo chương trình

2.3.5.2. Mục tiêu 2: Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền

ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ

glucose cao

a. Thay đổi sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào

 Trong protein toàn phần

- Hàm lượng LOX liên kết với Coll IV

- Hàm lượng LOX liên kết với FN

 Trong protein chất nền ngoại bào

- Hàm lượng LOX liên kết với Coll IV

- Hàm lượng LOX liên kết với FN

b. Thay đổi mật độ liên kết của LOX với protein chất nền ngoại bào

 Trong protein toàn phần

- Mật độ LOX liên kết với Coll IV

- Mật độ LOX liên kết với FN

 Trong protein chất nền ngoại bào

- Mật độ LOX liên kết với Coll IV

- Mật độ LOX liên kết với FN

2.4. Phƣơng pháp thu thập số liệu và xử lý số liệu

Số liệu được thu thập bằng các mẫu phiếu và xử lý bằng phần mềm

thống kê SPSS 18.0. Các biến liên tục được trình bày dưới dạng trung bình.

Giá trị của nhóm đối chứng được quy đổi thành 100% và giá trị của nhóm

nghiên cứu được tính theo phần trăm của nhóm đối chứng. So sánh trung bình

bằng thuật toán kiểm định t-student. So sánh tỷ lệ bằng thuật toán điểm định chi2. So sánh giữa các nhóm được tính theo thuật toán ANOVA và Bonferroni

post-hoc. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0.05.

2.5. Đạo đức nghiên cứu

Nghiên cứu đã được sự thông qua của Hội đồng đạo đức Trường Đại học

Y Hà Nội.

Chƣơng 3

KẾT QUẢ

3.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu

Nghiên cứu gồm 104 thử nghiệm bao gồm 102 thử nghiệm định lượng

(17 kỹ thuật, mỗi kỹ thuật lặp lại 6 lần) và 2 thử nghiệm định tính.

 Thử nghiệm định lƣợng

 Hàm lượng LOX trong protein toàn phần

 Hàm lượng LOX trong protein chất nền ngoại bào

 Hàm lượng LOX trong tế bào

 Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào 1 ngày

 Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào 3 ngày

 Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào 5 ngày

 Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào 7 ngày

 Hoạt động của LOX

 Tác động của LOXsiRNA tới hàm lượng của LOX

 Tác động của BAPN tới hoạt động của LOX

 Tác động của LOXsiRNA tới hoạt động AKT

 Tác động của BAPN tới hoạt động AKT

 Tác động của LOXsiRNA tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình

 Tác động của BAPN tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình

 Tác động của chất ức chế LOX tới độ thẩm thấu tế bào

 Sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào trong protein

toàn phần

 Sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào trong chất

nền ngoại bào

 Thử nghiệm định tính

 Mật độ LOX, mật độ LOX liên kết với protein chất nền ngoại bào

và tác động của LOXsiRNA tới mật độ LOX trong protein toàn phần

 Mật độ LOX và mật độ LOX liên kết với protein chất nền ngoại

bào trong chất nền ngoại bào

3.2. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô mạch máu

võng mạc chuột trong môi trƣờng nồng độ glucose cao

3.2.1. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao đến mức độ biểu hiện

của LOX

3.2.1.1. Hàm lượng LOX

* Hàm lượng LOX trong protein toàn phần

Hình ảnh đại diện của kỹ thuật WB và biểu đồ phân tích qua phần mềm

ImageJ cho thấy sự tăng đáng kể lượng LOX trong protein toàn phần của các

tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao so với nhóm tế

bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (145±10% nhóm đối chứng,

p<0.05, n=6) (Hình 3.1, Biểu đồ 3.1).

N

HG

LOX

32 KD

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao.

Hình 3.1. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong protein toàn phần.

180

160

140

120

100

N

HG

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Biểu đồ 3.1. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao với LOX trong

protein toàn phần

* Hàm lượng LOX trong protein chất nền ngoại bào

Kết quả WB chỉ ra rằng lượng LOX tại chất nền ngoại bào tăng đáng

kể trong môi trường nồng độ glucose cao (154±9% nhóm đối chứng, p<0.05,

n=6). (Hình 3.2, Biểu đồ 3.2).

N

HG

LOX

32 KD

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao.

Hình 3.2. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong protein chất nền

ngoại bào

180

160

140

120

100

N

HG

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Biểu đồ 3.2. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao với hàm lượng

LOX tại chất nền ngoại bào.

* Hàm lượng LOX trong tế bào

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng lượng LOX quay trở lại tế bào giảm

đáng kể trong các tế bào được nuôi cấy ở môi trường nồng độ glucose cao so

với nhóm tế bào được nuôi cấy ở môi trường bình thường (62 ± 9% nhóm đối

chứng; p < 0.05, n=6) (Hình 3.3, Biểu đồ 3.3).

N

HG

LOX

32 KD

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao.

Hình 3.3. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong tế bào.

140

120

100

N

HG

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Biểu đồ 3.3. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao với LOX trong

tế bào.

* Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng LOX tăng nhẹ trong môi trường nồng

độ glucose cao 1 ngày (124±8% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) và 5 ngày

(117±6% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6), tăng đáng kể trong môi trường

glucose cao 3 ngày (158±11% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) và giảm

trong môi trường glucose cao 7 ngày (78±5% của nhóm đối chứng, p<0.05,

n=6) (Hình 3.4).

A B C D

N

HG

N

HG

N

HG

N

HG

200

150

100

N

HG

N

HG

N

HG

N

HG

180

160

140

120

100

HG1

HG3

HG5

HG7

Hình 3.4. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao với LOX bên

ngoài tế bào.

A, B, C, D: Hình ảnh đại diện và kết quả WB phân tích qua phần mềm ImageJ

của các nhóm tế bào được nuôi cấy trong môi trường bình thường (N) và môi

trường nồng độ glucose cao (HG) trong 1 ngày (A, HG1), 3 ngày (B, HG3), 5

ngày (C, HG5) và 7 ngày (D, HG7). E: Biểu đồ sự thay đổi hàm lượng LOX

bên ngoài tế bào của nhóm nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao 1

ngày (HG1), 3 ngày (HG3), 5 ngày (HG5) và 7 ngày (HG7) (đường màu

xanh) so với hàm lượng LOX của nhóm nuôi cấy trong môi trường bình

thường (đường màu cam).

Biểu đồ E cho thấy LOX tăng nhẹ sau khi nuôi cấy tế bào trong môi

trường nồng độ glucose cao 1 ngày (HG1), đạt đỉnh sau khi nuôi cấy tế bào

trong môi trường nồng độ glucose cao 3 ngày (HG3), sau đó giảm dần sau khi

nuôi cấy tế bào trong môi trường nồng độ glucose cao 5 ngày (HG5) và 7

ngày (HG7). Số liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch

chuẩn; P < 0.05; n=6.(Hình 3.4E)

3.2.1.2. Mật độ của LOX

+ Mật độ LOX trong protein toàn phần:

N

HG

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao.

Hình 3.5. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein

toàn phần

200

180

160

140

120

100

N

HG

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao.

Biểu đồ 3.4. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao với mật độ LOX

trong protein toàn phần.

Hình ảnh đại diện về mật độ LOX thu được qua kỹ thuật nhuộm miễn

dịch huỳnh quang với kháng thể kháng LOX và biểu đồ phân tích theo kết quả

ImageJ cho thấy mật độ LOX tăng rõ rệt ở các tế bào nuôi cấy trong môi

trường nồng độ glucose cao so với nhóm tế bào nuôi cấy ở môi trường bình

thường (179±7% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.4, Hình 3.5).

+ Mật độ LOX trong protein chất nền ngoại bào:

Kết quả phân tích qua phần mềm ImageJ cho thấy mật độ LOX tăng rõ

rệt tại chất nền ngoại bào của các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ

glucose cao so với các tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (160 ±

7% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.5).

N

HG

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao.

Hình 3.6. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein

180

160

140

120

100

chất nền ngoại bào.

N

HG

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao.

Biểu đồ 3.5. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới mật độ LOX

trong protein chất nền ngoại bào.

3.2.1.3. Hoạt động của LOX:

Kết quả phân tích hoạt động của LOX cho thấy hoạt động của LOX

tăng rõ rệt khi tế bào được nuôi cấy trong điều kiện glucose nồng độ cao

180

160

140

120

100

(153±15% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.6).

N

HG

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao.

Biểu đồ 3.6. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới hoạt động

của LOX.

3.2.2. Tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ biểu hiện của LOX

3.2.2.1. Tác động của LOXsiRNA tới hàm lượng và mật độ LOX

Phân tích dựa trên phần mềm ImageJ các kết quả thu được từ kỹ thuật WB,

cho thấy hàm lượng LOX tại các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ

glucose cao tăng rõ rệt so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường

(158 ± 21% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Tác dụng ức chế LOX của LOXsiRNA

được thể hiện khi tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với

LOXsiRNA, hàm lượng LOX trở về gần mức bình thường (116 ± 13% nhóm đối

chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.7).

+ Hàm lượng của LOX:

N

HG HG+LOXsiRNA

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao,

HG+LOXsiRNA: Môi trường glucose nồng độ ủ với LOXsiRNA.

200

180

160

140

120

100

Hình 3.7. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX ở các nhóm tế bào.

N

HG

HG+LOXsiRNA

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao,

HG+LOXsiRNA: Môi trường glucose nồng độ ủ với LOXsiRNA.

Biểu đồ 3.7. Tác động ức chế mức độ biểu hiện LOX của LOXsiRNA.

+ Mật độ LOX

Phân tích hình ảnh thu được qua kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh

quang cho thấy mật độ LOX tại các tế bào được nuôi cấy trong môi trường

nồng độ glucose cao tăng đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi

trường bình thường (179 ± 7% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Thêm vào đó,

khi các tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với

LOXsiRNA, mật độ LOX trở về gần mức bình thường (114 ± 6% nhóm đối

chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.8).

N

HG

HG+ LOXsiRNA

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao.

HG+LOXsiRNA: Môi trường glucose nồng độ cao ủ với LOXsiRNA.

Hình 3.8. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein

200

150

100

chất nền ngoại bào.

N

HG

HG+LOXsiRNA

N: môi trường bình thường. HG: môi trường nồng độ glucose cao,

HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao ủ với LOXsiRNA.

Biểu đồ 3.8. Sự thay đổi mật độ LOX trong protein toàn phần.

3.2.2.2. Tác động của BAPN tới hoạt động của LOX:

Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt động của LOX tại các tế bào được

nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao tăng đáng kể so với nhóm tế

bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (160 ± 16% nhóm đối chứng,

p<0.05, n=6). Thêm vào đó, khi các tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose

nồng độ cao được ủ với BAPN, hoạt động LOX trở về gần mức bình thường

(120 ± 9% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.9).

200

180

160

140

120

100

N

HG

HG+BAPN

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose 30mmol/l,

HG+BAPN: Môi trường nồng độ glucose 30mmol/l ủ với BAPN.

Biểu đồ 3.9. Tác động ức chế hoạt động LOX của BAPN.

3.2.3. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới hoạt động

của tế bào

350

300

250

200

150

100

3.2.3.1. Độ thẩm thấu tế bào

N: môi trường bình thường. HG: môi trường nồng độ glucose cao,

HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao ủ với LOX siRNA.

Biểu đồ 3.10. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới độ thẩm

thấu của tế bào nội mô mạch máu võng mạc.

Kết quả phân tích độ thẩm thấu cho thấy độ thẩm thấu tế bào tăng đáng

kể (299±18% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) khi được nuôi cấy trong môi

trường nồng độ glucose cao. Khi các tế bào được nuôi cấy trong môi trường

nồng độ glucose cao được ủ với chất ức chế LOX (LOXsiRNA hoặc BAPN),

độ thẩm thấu tế bào giảm rõ rệt (114± 8% nhóm đối chứng và 132±14% nhóm

đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.10).

3.2.3.2. Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết tế

bào theo chương trình

* Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hoạt động AKT

N

HG

HG+LOXsiRNA

N

HG

HG+BAPN

120

100

A B

A: Hình ảnh WB đại diện và biểu đồ thể hiện tác động của LOXsiRNA tới

hàm lượng LOX, B: Hình ảnh WB đại diện và biểu đồ thể hiện tác động của

BAPN tới hoạt động của LOX, N: môi trường bình thường. HG: môi trường

nồng độ glucose cao, HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao ủ với

LOXsiRNA, HG+BAPN: môi trường nồng độ glucose cao ủ với BAPN.

Hình 3.9. Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hoạt động AKT

Phân tích hình ảnh thu được qua kỹ thuật WB cho thấy hoạt động AKT

(biểu hiện qua tỷ lệ pAKT/AKT) tại các tế bào được nuôi cấy trong môi

trường nồng độ glucose cao giảm đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong

môi trường bình thường (63 ± 8% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Thêm vào

đó, khi các tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với

LOXsiRNA hoặc BAPN, hoạt động AKT tăng rõ ràng (87 ± 8% nhóm đối

chứng, và 76 ± 10% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6) (Hình 3.9 ).

* Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết tế bào

theo chương trình

N: môi trường bình thường. HG: môi trường nồng độ glucose cao,

HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao ủ với LOXsiRNA,

HG+BAPN: môi trường nồng độ glucose cao ủ với BAPN. Mũi tên trắng: Tế

bào đang xảy ra hiện tượng chết tế bào theo chương trình.

Hình 3.10. Hình ảnh nhuộm huỳnh quang thể hiện hiện tượng chết tế bào

theo chương trình ở các nhóm tế bào.

B C

A: Tác động của giảm hàm lượng LOX do LOXsiRNA, B: Tác động của giảm

hoạt động của LOX do BAPN, N: môi trường bình thường. HG: môi trường nồng

độ glucose cao, HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao ủ với

LOXsiRNA, HG+BAPN: môi trường nồng độ glucose cao ủ với BAPN.

Biểu đồ 3.11. Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng

chết tế bào theo chương trình biểu thị qua số lượng tế bào chết/1000 tế bào.

Phân tích kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy số lượng tế

bào chết/1000 tế bào tăng rõ rệt trong môi trường nồng độ glucose cao so với

môi trường bình thường (4.68 ± 0.9 và 1.48 ± 0.32, tương ứng, p<0.05, n=6)

và giảm khi tế bào được ủ LOXsiRNA (2.78 ± 0.37, p<0.05, n=6). Tương tự

như vậy, với thử nghiệm BAPN, môi trường nồng độ cao có ủ BAPN ức chế

hoạt động của LOX, số lượng tế bào chết/1000 tế bào giảm đáng kể so với

nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ cao đơn thuần (2.85 ± 0.34

và 4.38 ± 0.84, tương ứng, p<0.05, n=6). (Biểu đồ 3.11).

3.3. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại

bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trƣờng nồng

độ glucose cao

3.3.1. Thay đổi sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào

3.3.1.1. Trong protein toàn phần

Phân tích kết quả thu được qua kỹ thuật WB cho thấy sự tăng đáng kể

lượng LOX liên kết với Coll IV và FN trong protein toàn phần của các tế bào

được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao so với nhóm tế bào nuôi

cấy trong môi trường bình thường (144±12% nhóm đối chứng và 168±11%

nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.12).

N

HG

Collagen IV

300 kD

Fibronectin

262 kD

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Hình 3.11. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và

hàm lượng LOX liên kết với FN trong protein toàn phần.

200

180

160

140

120

100

N

HG

N

HG

A B

A: LOX liên kết Coll IV, B: LOX liên kết FN, N: Môi trường bình thường,

HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Biểu đồ 3.12. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám

dính của LOX với Coll IV và FN trong protein toàn phần.

3.3.1.2. Trong protein chất nền ngoại bào

Kết quả WB chỉ ra rằng lượng LOX liên kết với Coll IV và FN trong

protein chất nền ngoại bào tăng rõ rệt ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường

nồng độ glucose cao (138±20% nhóm đối chứng và 156±21% nhóm đối

chứng, tương ứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.13).

N

HG

Coll IV

300 kD

262 kD

N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Hình 3.12. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và

hàm lượng LOX liên kết với FN trong protein chất nền ngoại bào.

200

180

160

140

120

100

N

HG

N

HG

A B

A: LOX liên kết Coll IV, B: LOX liên kết FN, N: Môi trường bình thường,

HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Biểu đồ 3.13. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám

dính của LOX với Coll IV và FN trong protein chất nền ngoại bào.

3.2.2. Thay đổi mật độ liên kết của LOX với protein chất nền ngoại bào

3.3.2.1. Trong protein toàn phần

* Mật độ LOX liên kết với Coll IV:

Mật độ LOX liên kết với Coll IV trong protein toàn phần tăng rõ rệt ở các

tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (192±21% nhóm đối

chứng, p<0.05, n=6) thể hiện qua hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang đại

diện và biểu đồ phân tích mật độ liên kết (Hình 3.13, biểu đồ 3.14 ).

N

HG

N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Hình 3.13. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện

250

200

150

100

tử thể hiện liên kết của LOX với Coll IV trong protein toàn phần.

N

HG

N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Biểu đồ 3.14. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX

liên kết với Coll IV trong protein toàn phần.

* Mật độ LOX liên kết với FN:

N

HG

N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Hình 3.14. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi đồng

tiêu thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần.

N

HG

N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Hình 3.15. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện

250

200

150

100

tử thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần.

N

HG

N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Biểu đồ 3.15. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX

liên kết với FN trong protein toàn phần.

Mật độ LOX liên kết với FN trong protein toàn phần tăng mạnh ở nhóm tế

bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (183±19% nhóm đối chứng,

p<0.05, n=6) thể hiện qua hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang đại diện (Hình

3.14, hình 3.15) và biểu đồ phân tích mật độ liên kết (Biểu đồ 3.15).

3.3.2.2. Trong protein chất nền ngoại bào

* Mật độ LOX liên kết với Coll IV:

Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang đại diện và biểu đồ phân tích

mật độ liên kết qua phần mềm ImageJ cho thấy mật độ LOX liên kết với Coll

IV trong protein chất nền ngoại bào tăng đáng kể ở các tế bào nuôi cấy trong

môi trường nồng độ glucose cao (143±10% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6)

180

160

140

120

100

(Hình 3.16, biểu đồ 3.16).

N

HG

N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Biểu đồ 3.16. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX

liên kết với Coll IV trong protein chất nền ngoại bào.

N

HG

Coll IV

LOX

Coll IV +LOX

N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Hình 3.16. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang thể hiện liên kết của

LOX với Coll IV trong protein chất nền ngoại bào.

* Mật độ LOX liên kết với FN:

N

HG

LOX

FN +LOX

N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Hình 3.17. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện

tử thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần.

200

180

160

140

120

100

N

HG

N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao.

Biểu đồ 3.17. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX

liên kết với FN trong protein chất nền ngoại bào.

Kết quả miễn dịch huỳnh quang cho thấy mật độ LOX liên kết với FN

trong protein chất nền ngoại bào tăng rõ rệt ở các tế bào nuôi cấy trong môi

trường nồng độ glucose cao (158±15% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Hình

3.17, Biểu đồ 3.17).

Chƣơng 4

BÀN LUẬN

4.1. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX

4.1.1. Thay đổi mức độ biểu hiện của LOX

Màng đáy mao mạch dày lên từ lâu đã được phát hiện trong bệnh võng

mạc đái tháo đường và được chứng minh có liên quan đến cơ chế bệnh sinh

của bệnh này [77-153], nhưng nguyên nhân và hậu quả của sự thay đổi vi cấu

trúc này chưa được hiểu rõ. Chức năng quan trọng của màng đáy là hàng rào

thấm chọn lọc ngăn ngừa các chất từ trong lòng mạch thoát ra ngoài. Hàng

rào này bị thay đổi cấu trúc do đái tháo đường dẫn đến tăng tính thấm mạch

máu [6]. Một vài nghiên cứu đã chỉ ra sự thay đổi trong cấu trúc của màng

đáy có thể gây tổn hại chức năng của nó [154]. Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra

vai trò của hiện tượng dày màng đáy mao mạch trong sự phát triển các mao

mạch không có tế bào và mất tế bào ngoại mạch [74]. Điều nghịch lý là màng

đáy mao mạch dày lên lại gây tăng rò rỉ mạch máu trong bệnh võng mạc đái

tháo đường. Để giải thích cho hiện tượng này, các báo cáo đã đề xuất rằng có

sự thay đổi các liên kết chéo giữa các thành phần của màng đáy gây ảnh

hưởng đến quá trình hình thành và cấu trúc của màng đáy, do đó tổn hại hàng

rào mạch máu võng mạc [155]. Nghiên cứu của Lucero, Rodriguez và

Nishioka cho thấy rằng tính toàn vẹn của màng đáy và cấu trúc chất nền ngoại

bào đòi hỏi lượng thích hợp liên kết chéo phụ thuộc LOX [15-109].

LOX là một enzym liên kết chéo đóng vai trò thiết yếu trong sự phát

triển và trưởng thành của màng đáy [127]. LOX điều hoà quá trình hình thành

liên kết cộng hoá trị giữa các sợi collagen tạo thành dạng collagen không bị

hoà tan và có độ bền kéo cần thiết cho chức năng của mô liên kết bình

thường, từ đó tạo nên lớp chất nền ngoại bào bền vững [127-129]. Sự toàn

vẹn, ổn định và chức năng của màng đáy phụ thuộc phần lớn vào liên kết chéo

giữa các sợi collagen vì các liên kết này tham gia vào cấu trúc vật lý và cơ

học tạo nên màng đáy hoàn chỉnh [156]. Tuy nhiên, nếu các liên kết chéo này

quá nhiều có thể dẫn đến dày và tổn hại chức năng màng đáy do hình thành

các bó sợi collagen bất thường, gây tích luỹ chất nền ngoại bào như trong các

bệnh xơ cơ [157]. Vì màng đáy trải qua quá trình thay đổi về mô học và hoá

sinh do tình trạng đường huyết cao, sự dày màng đáy thúc đẩy hình thành các

mạch máu không có tế bào và mất tế bào ngoại mạch, từ đó tiến triển giai

đoạn sớm của bệnh võng mạc đái tháo đường.

Một vài nghiên cứu sử dụng tế bào hoặc mô hình động vật mắc đái tháo

đường chỉ ra rằng nồng độ glucose cao hoặc đường huyết cao gây tăng đáng

kể hàm lượng và hoạt động của LOX ở thận, phổi [158]. Ở bệnh nhân mắc đái

tháo đường, tăng hoạt động của LOX được phát hiện ở các mô da sinh thiết và

dịch kính biểu hiện bằng tăng các liên chéo collagen qua trung gian LOX và các

sản phẩm glycat hoá giai đoạn sớm, glucitolyllysine và glucitolylhydroxylysine,

các sản phẩm để đo lường gián tiếp hoạt động của LOX [159]. Nghiên cứu

trước đây của chúng tôi cho thấy có sự biểu hiện quá mức enzym LOX ở

võng mạc chuột mắc đái tháo đường [155]. Tuy nhiên sự thay đổi của LOX ở

mức độ tế bào cũng như tác động của sự thay đổi đó tới hoạt động của tế bào

còn chưa biết rõ. Do đó trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá mức độ biểu

hiện, hoạt động của LOX và tác động của sự thay đổi này tới độ thẩm thấu tế bào

và hiện tượng chết tế bào theo chương trình ở tế bào nội mô mạch máu võng

mạc trong điều kiện môi trường nồng độ glucose cao.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng nồng độ glucose cao ảnh

hưởng đáng kể tới mức độ biểu hiện LOX. Đây là nghiên cứu đầu tiên phân

tích chi tiết tác động của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy tới mức

độ biểu hiện của LOX ở bên trong và bên ngoài tế bào. Theo đó, lượng LOX

trong protein toàn phần tăng, trong khi lượng LOX quay trở lại tế bào giảm

sau khi nuôi cấy tế bào trong môi trường nồng độ glucose cao. Thêm vào đó,

nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy tác động của môi trường nồng độ

glucose cao đối với mức độ biểu hiện LOX ở môi trường ngoại bào có sự biến

thiên theo thời gian. Ngoài ra môi trường glucose cao gây tăng mật độ LOX

và hoạt động LOX. Sự rối loạn này được điều chỉnh bởi các chất ức chế LOX

như LOXsiRNA và BAPN. Kết quả này củng cố thêm cho phát hiện trước đây

là nồng độ enzym LOX tăng ở võng mạc chuột mắc đái tháo đường và có sự

tăng các liên kết chéo phụ thuộc LOX ở collagen da trong đái tháo đường [160].

Thông thường, LOX được hình thành ở bên ngoài tế bào và được coi là 1

enzym ngoại bào, nhưng các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng LOX cũng có mặt

trong tế bào ở cả bào tương và nhân [161]. LOX trưởng thành được phát hiện

di chuyển từ môi trường ngoại bào vào trong bào tương và tập trung ở nhân

[161-162]. LOX đã được xác định trong nhân của nhiều loại tế bào và mô

khác nhau để thực hiện chức năng xúc tác của nó [162-163]. Trong bào tương,

LOX được xác định ở bộ khung tế bào và hệ thống vi ống [161]. Đặc biệt là,

mặc dù có sự xuất hiện của BAPN, một chất ức chế LOX, hoạt động của LOX

vẫn diễn ra ở trong nhân tế bào, gợi ý rằng LOX trong nhân tế bào được bảo

vệ và duy trì hoạt tính. Một nghiên cứu chỉ ra rằng, LOX trưởng thành có thể

di chuyển từ môi trường ngoại bào vào trong bào tương tế bào và tập trung ở

trong nhân. Quá trình này có thể diễn ra do sự tương tác giữa vùng xúc tác của

LOX với p66β, một chất ức chế phiên mã. Kết hợp lại, những nghiên cứu này

chỉ ra rằng, LOX quay trở lại tế bào vào trong bào tương và nhân đã được ghi

nhận, tuy nhiên, mục đích và chức năng của nó còn chưa rõ ràng.

Mặc dù chức năng sinh học của LOX trong nhân tế bào còn chưa được

hiểu đầy đủ, các nghiên cứu chỉ ra rằng LOX trong nhân tế bào có thể điều

chỉnh sự biểu hiện collagen, tác động tới sự tổ chức của nhiễm sắc thể, và

ngăn chặn sự phát triển của cyclin D1 và E-cadherin. Các nghiên cứu cũng đề

xuất rằng LOX có thể điều hoà mức độ biểu hiện gen thông qua tương tác của

nó với histon H1 và H2 trong nhân [164]. Quan trọng là, LOX đã được báo

cáo có vai trò khởi động chết tế bào theo chương trình. Một nghiên cứu đã

phát hiện rằng LOX trong nhân tế bào có thể trực tiếp ức chế tốc độ phát triển

của nhân tế bào, thể hiện LOX là chất ức chế tăng trưởng tế bào [165]. Thêm

vào đó, sự tăng biểu hiện LOX do lentivirus được phát hiện đóng vai trò khởi

động chết tế bào theo chương trình ở tế bào cơ trơn mạch máu người [166].

Tóm lại, những phát hiện này chỉ ra rằng sự tăng mức biểu hiện LOX bất thường

có những tác động xấu tới sự sống còn của tế bào và khởi động chết tế bào theo

chương trình.

Bên cạnh tế bào nội mô mao mạch võng mạc, hiện nay chưa rõ mức

độ biểu hiện của LOX có ảnh hưởng ở các loại tế bào võng mạc khác trong

điều kiện đường huyết cao hay không. Tuy nhiên, LOX tìm thấy tăng đáng

kể trên bề mặt tế bào biểu mô sắc tố võng mạc [18]. Một nghiên cứu khác

cũng cho thấy LOX tăng biểu hiện ở mức mRNA trong các tế bào biểu mô

sắc tố võng mạc nuôi cấy ở môi trường nồng độ glucose cao [167]. Các

nghiên cứu sâu hơn cần được thực hiện để làm sáng tỏ ảnh hưởng của tăng

biểu hiện LOX do nồng độ glucose cao hoặc đái tháo đường đến sự thay

đổi của các loại tế bào võng mạc khác.

Hiện nay có rất ít thông tin liên quan đến biểu hiện LOX ở võng mạc

bệnh nhân đái tháo đường. Nghiên cứu gần đây trên mẫu dịch kính bệnh nhân

mắc võng mạc đái tháo đường tăng sinh biểu hiện tăng đáng kể nồng độ LOX

so với người không mắc bệnh đái tháo đường [20]. Không có sự khác biệt

đáng kể về mức LOX trong dịch kính ở nam và nữ của cả 2 nhóm đái tháo

đường và không đái tháo đường [20]. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với các

phát hiện của chúng tôi, thể hiện nồng độ glucose cao hoặc đường huyết cao gây

tăng mức biểu hiện LOX trong các tế bào nội mô mạch máu võng mạc trên thí

nghiệm và trong các tế bào mạch máu võng mạc ở chuột đái tháo đường. Dịch

kính được coi như bể chứa các chất trung gian của quá trình viêm, hình thành

tân mạch võng mạc và các phần khác của mắt [168]. Các nghiên cứu tiếp theo

cần được thực hiện để xác định liệu mẫu dịch kính của LOX có thể sử dụng

như một chất chỉ điểm sinh học và hỗ trợ trong sự xác định quá trình tiến triển

bệnh võng mạc đái tháo đường. Thêm nữa, nó cung cấp thông tin cơ bản cho

các nghiên cứu sâu hơn để xác định liệu ức chế LOX có thể là phương pháp

hữu ích trong ngăn ngừa tổn thương mạch máu võng mạc liên quan tới cơ chế

bệnh sinh của bệnh võng mạc đái tháo đường.

4.1.2. Thay đổi hoạt động của tế bào liên quan đến thay đổi mức độ biểu

hiện của LOX

4.1.2.1. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới độ thẩm thấu

tế bào

Các kết quả từ nghiên cứu này chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức của

LOX trong các tế bào nội mô mao mạch võng mạc liên quan đến môi trường

nồng độ glucose cao có liên quan đến tăng độ thẩm thấu tế bào và thúc đẩy

quá trình chết tế bào theo chương trình. Độ thẩm thấu của tế bào tăng rõ rệt

khi tế bào được nuôi cấy ở môi trường glucose nồng độ cao và được điều

chỉnh khi môi trường này được ủ thêm các chất ức chế LOX như LOXsiRNA

hoặc BAPN. Điều này chỉ ra hàm lượng và hoạt động LOX có tác động tới độ

thẩm thấu của tế bào. Sự dư thừa liên kết chéo xúc tác bởi LOX hình thành

các bó sợi collagen bất thường gây tổn hại sự toàn vẹn siêu cấu trúc màng đáy

[155]. Từ đó gợi ý một cơ chế tiềm tàng gây rò mạch võng mạc liên quan đến

dày màng đáy trong bệnh võng mạc đái tháo đường.

A-D: Hình ảnh nhuộm fluorescence mạng mao mạch của chuột bình thường

(A), chuột đái tháo đường (B), chuột LOX +/- (C), chuột LOX +/- đái tháo

đường (D). (Ảnh chụp qua sinh điển tử, x40)

Hình 4.1. Giảm LOX giúp ngăn ngừa rò mạch máu võng mạc trong bệnh

đái tháo đường [169].

Nghiên cứu trước đây của chúng tôi chỉ ra rằng tăng hàm lượng và hoạt

động LOX trong võng mạc gây tăng tính thấm mạch máu và giảm LOX giúp

ngăn ngừa rò rỉ mạch máu võng mạc [19-155]. Màng đáy mao mạch tổn hại

gây tăng thoát mạch trong bệnh võng mạc đái tháo đường [73-155]. Bằng

cách giảm hàm lượng LOX sự toàn vẹn cấu trúc màng đáy mao mạch được

bảo vệ giúp giảm tính thấm mạch máu. Tăng lượng sản phẩm glycat hoá bền

vững - tác nhân chính trong cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường, được

chỉ ra là gây tăng mức biểu hiện LOX và thúc đẩy hình thành quá nhiều liên

kết collagen, dẫn đến tổn hại cấu trúc màng đáy mao mạch và tăng tính thấm

mạch máu [150-170-171]. LOX cũng được chứng minh có vai trò quan trọng

trong điều hoà quá trình xơ hoá, liên quan với sự tiến triển của bệnh võng mạc

đái tháo đường tăng sinh, đặc trưng bởi sự lắng đọng quá mức chất nền ngoại

bào [172-173]. Nồng độ glucose cao hoặc đái tháo đường thúc đẩy tổng hợp

quá nhiều chất nền ngoại bào và tăng lượng LOX, gây lắng đọng và tăng độ

cứng của chất nền ngoại bào [154-174].

Nghiên cứu đánh giá collagen màng đáy cầu thận và các liên kết chéo

qua trung gian LOX trong bệnh đái tháo đường báo cáo rằng tỷ lệ

dihydroxylysinonorleucine/hydroxylysinonorleucine tăng, thể hiện có sự thay

đổi liên kết chéo trong bệnh đái tháo đường. Hiện tượng dày lên của màng

đáy mao mạch trong mạch máu võng mạc và cầu thận, dấu hiệu mô học đặc

trưng của bệnh lý vi mạch do đái tháo đường, liên quan đến tăng rò mạch.

Nghiên cứu trên mẫu dịch kính bệnh nhân mắc đái tháo đường tăng sinh cũng

cho thấy sự tăng lượng LOX gây tăng độ thẩm thấu tế bào. Nghiên cứu của

Manju và cộng sự chỉ ra rằng sự dư thừa LOX có thể liên quan tới sự phát

triển bệnh võng mạc đái tháo đường tăng sinh do gây tổn hại hàng rào mạch

máu võng mạc và tăng tính thấm mạch máu võng mạc [20]. Sự rò mạch các

thành phần protein và lipid từ võng mạc có thể thẩm thấu dịch từ trong lòng

mạch máu võng mạc ra các lớp võng mạc, và góp phần gây ra những thay đổi

phát hiện được trên lâm sàng, như phù hoàng điểm do đái tháo đường. Các

nghiên cứu trước đây thực hiện trên người cũng cho thấy sự tăng hoạt động

của LOX trong tình trạng đường huyết cao [159].

Tương tự như vậy, tăng mức biểu hiện LOX trong một số ung thư xâm

lấn củng cố thêm bằng chứng rằng tăng lắng đọng chất nền ngoại bào có thể

gây tăng tính thấm qua màng đáy mao mạch [175]. Có thể do sự tăng hàm

lượng LOX gây tăng lượng liên kết chéo tạo nên những bó sợi collagen bất

thường với khoảng cách xa nhau hơn nên tạo điều kiện cho các phần tử thấm

qua chất nền ngoại bào. Phân tích trực tiếp sự toàn vẹn siêu cấu trúc chất nền

ngoại bào sau khi tăng lượng liên kết chéo qua trung gian LOX có thể giúp

hiểu rõ hơn tác động của LOX tới màng đáy và tăng tính thấm.

Ngoài ra, nghiên cứu của Chronopoulos và cộng sự cho thấy VEGF có

thể gây tăng hàm lượng LOX trong các tế bào nội mô mạch máu võng mạc

[155]. Đặc biệt là, tình trạng thiếu oxy gây tăng cả VEGF và LOX, và sự tăng

lượng LOX do thiếu oxy trực tiếp hoặc gián tiếp gây tăng tính thấm vi mạch

võng mạc trong đái tháo đường [176]. Tăng mức VEGF và dày màng đáy

mạch máu do tăng các thành phần chất nền ngoại bào trong đái tháo đường là

đặc điểm đặc trưng nhất của bệnh. Sự gia tăng các thành phần chất nền ngoại

bào như vậy có thể dẫn đến dày màng đáy mao mạch võng mạc, và lần lượt,

góp phần gây tăng tính thấm. Từ những phát hiện trên cho thấy có thể VEGF

phần nào tác động tới biểu hiện của LOX trong tình trạng đường huyết cao.

Tuy nhiên, mối quan hệ này cần được làm rõ ở các nghiên cứu tiếp theo.

4.1.2.2. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết

tế bào theo chương trình

Trong khi LOX được biết đến chủ yếu với vai trò hình thành các liên kết

chéo, các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, tăng lượng LOX có thể khởi động

hiện tượng chết tế bào theo chương trình. Hoạt động và biểu hiện của LOX

tăng lên được gắn liền với một số bệnh lý bao gồm bệnh u xơ, rối loạn chức

năng tim và bệnh thận do đái tháo đường [126-158-177]. Tuy nhiên, cơ chế vì

sao tăng lượng LOX thúc đẩy chết tế bào theo chương trình còn chưa rõ ràng.

Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo một số cơ chế có thể gây ra tăng hiện

tượng chết tế bào theo chương trình do tăng lượng LOX. Nghiên cứu của Xu

và Sung đã chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức LOX ức chế sự tăng sinh tế bào,

làm chậm tốc độ phát triển của tế bào và thúc đẩy chết tế bào theo chương

trình [178-179]. Nghiên cứu của Saad và cộng sự cho thấy rằng hoạt động của

LOX bên trong tế bào có thể trực tiếp ức chế sự phát triển của nhân tế bào và

do đó kìm hãm sự phát triển của tế bào [165]. Đồng thời, nghiên cứu của

Varona cũng chỉ ra rằng sự tăng bài tiết enzym LOX trưởng thành khởi động

hiện tượng chết tế bào theo chương trình ở tế bào cơ trơn ở mạch máu người

[166]. Điều này khẳng định hoạt động của enzym LOX ngoài tế bào cũng góp

phần gây ra hiện tượng chết tế bào theo chương trình. Ngoài ra, nghiên cứu

của Nareshkumar báo cáo rằng phần propeptide của LOX cũng góp phần khởi

động chết tế bào theo chương trình [180]. Đặc biệt là, pro-LOX, tiền thân của

LOX và LOX-PP cũng đã được chỉ ra rằng có tham gia thúc đẩy quá trình này

[175]. Hiện nay, sự khác biệt giữa vai trò của LOX và LOX-PP trong khởi

động chết tế bào theo chương trình cũng đang được nghiên cứu. Gần đây,

nghiên cứu của Xu và cộng sự phát hiện LOX tăng gây tổn hại con đường dẫn

truyền tín hiệu AKT ở tế bào xương ở người, do đó dẫn đến chết tế bào theo

chương trình [178]. LOX cũng được xác định là gen ức chế khối u, do đó gợi

ý rằng sự biểu hiện quá mức của LOX có thể gây ra chết tế bào theo chương

trình [179]. Tuy nhiên, hiện chưa rõ rối loạn LOX có gây chết các tế bào

mạch máu võng mạc liên quan đến bệnh võng mạc đái tháo đường hay không.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá liệu dư thừa lượng LOX do

nồng độ glucose cao có góp phần gây chết tế bào theo chương trình và liệu

các biện pháp giảm lượng LOX có giúp ngăn ngừa hiện tượng này xảy ra ở tế

bào nội mô mạch máu võng mạc hay không. Kết quả nghiên cứu cho thấy

rằng LOX dư thừa góp phần gây chết tế bào theo chương trình bằng cách tổn

thương đường tín hiệu AKT. Đặc biệt là khi lượng LOX được điều chỉnh về

mức gần bình thường nhờ LOXsiRNA hoặc hoạt động của LOX bị kìm hãm

bởi BAPN, hoạt động AKT được cải thiện rõ rệt. Những điều trên chỉ ra rằng

có sự liên quan mật thiết giữa sự biểu hiện của LOX và hoạt động AKT. LOX

biểu hiện quá mức gây giảm Phosphoryl hoá AKT có thể kích hoạt chết tế bào

theo chương trình. Phát hiện này củng cố thêm cho các nghiên cứu trước đó

rằng LOX tăng quá mức làm tổn hại hoạt động AKT góp phần gây chết tế bào

theo chương trình. Tương tự trên mô hình động vật trong nghiên cứu của Kim

và cộng sự, võng mạc của chuột đái tháo đường cũng biểu hiện tăng lượng

LOX và tổn hại hoạt động AKT [169]. Trong khi đó, ở chuột LOX +/- mắc

đái tháo đường do tiêm STZ, hoạt động AKT không bị tổn hại đáng kể [169].

Những phát hiện trên mô hình chuột đái tháo đường do STZ và chuột LOX

+/- chỉ ra rằng tăng hàm lượng LOX đóng vai trò quan trọng trong sự phát

triển các tổn thương mạch máu liên quan đến bệnh võng mạc đái tháo đường.

Nghiên cứu của Muto và cộng sự chỉ ra rằng giảm hoạt động AKT trong điều

kiện đường huyết cao gây khởi động chết tế bào theo chương trình ở tế bào

Muller và tế bào ngoại mạch [106]. Nghiên cứu của Jeay và cộng sự chỉ ra

rằng LOX ngăn cản các tín hiệu Ras và AKT quay trở lại màng bào tương để

kích hoạt AKT [181]. Một nghiên cứu khác báo cáo tăng mức biểu hiện LOX

do adenovirus ức chế hoạt động AKT và khởi động chết tế bào theo chương

trình [178]. Thêm vào đó, nghiên cứu của El Hajj và cộng sự chứng minh

rằng giảm hàm lượng LOX giúp ngăn ngừa chết tế bào theo chương trình ở

tim chuột [182]. Điều thú vị là, LOX-PP 18kDa, sản phẩm của quá tình phân cắt

pro-LOX, cũng khởi động chết tế bào theo chương trình bằng cách bất hoạt AKT

[183]. Do đó, có thể hiểu rằng LOX-PP cũng góp phần gây ra chết tế bào theo

chương trình trong điều kiện môi trường nồng độ glucose cao. Kết hợp lại,

những phát hiện này cho thấy, tăng lượng LOX do môi trường nồng độ glucose

cao có thể góp phần gây chết tế bào nội mô mạch máu võng mạc bằng cách tổn

thương hoạt động AKT cần cho sự sống còn của tế bào.

WT: chuột bình thường, DM: chuột đái tháo đường, LOX +/-: chuột LOX +/-,

DLOX +/-: chuột LOX+/- mắc đái tháo đường. DAPI: hình ảnh nhuộm mạng

mao mạch võng mạc (A-D). TUNEL: Hình ảnh các tế bào có kết quả TUNEL

dương tính thể hiện đang có hoạt động chết theo chương trình (E-H).

MERGED: Hình ảnh kết hợp (I-L). Mũi tên trắng: Hình ảnh tế bào chết theo

chương trình.

Hình 4.2. Giảm lượng LOX giúp ngăn ngừa chết tế bào theo chương trình

ở các tế bào mạch máu trong mạng mao mạch võng mạc [169].

Vai trò của LOX trong duy trì cân bằng nội môi và sự sống còn của tế

bào võng mạc mới được bắt đầu tìm hiểu. Nghiên cứu mới đây của Yang và

cộng sự chỉ ra rằng ức chế LOX liên quan đến giảm hoạt động của yếu tố kB

trong nhân (NF-kB) [154]. Sự hoạt động của NF-kB đã được chứng minh vai

trò trong khởi động hiện tượng chết tế bào theo chương trình trong bệnh võng

mạc đái tháo đường [184]. Thêm vào đó, bất hoạt AKT do môi trường nồng

độ glucose cao có thể dẫn đến giảm sản xuất nitric oxidase, chất có tác dụng

ngăn ngừa các tín hiệu NF-kB khởi động chết tế bào theo chương trình [185].

Hơn nữa , hàm lượng LOX quá cao cũng thúc đẩy tổng hợp LOX-PP, gây ảnh

hưởng việc kích hoạt tiêu điểm bám dính kinase (FAK) và các đường dẫn tín

hiệu qua trung gian RAS, từ đó dẫn đến bất hoạt NF-kB khởi động chết tế bào

theo chương trình [180-186-187]. Những phát hiện này góp phần đem lại cái

nhìn sâu hơn vào cơ chế tiềm tàng là giảm mức biểu hiện LOX có thể giúp

phục hồi hoạt động AKT, và do đó cải thiện sự sống còn của tế bào bằng cách

ngăn cản các tín hiệu khởi động chết tế bào theo chương trình NF-kB trong

các tế bào nội mô mao mạch võng mạc. Một nghiên cứu gần đây cho thấy

LOX biểu hiện quá mức khiến màng đáy tăng độ cứng, góp phần kích hoạt tế

bào nội mô và tích luỹ bạch cầu ở chuột mắc bệnh võng mạc đái tháo đường

[154]. Ngoài ra, ức chế LOX cũng giúp ngăn chặn sự xâm nhập của đại thực

bào gây viêm ở phổi giai đoạn viêm mô [188].

Hiện nay, chúng tôi đang nghiên cứu đánh giá những biện pháp tiềm

năng để giảm mức độ biểu hiện của LOX trong bệnh đái tháo đường, đặc biệt

là đánh giá tác dụng lâu dài của việc điều hoà LOX. Kết quả từ nghiên cứu

này cung cấp thêm bằng chứng cho thấy điều hoà LOX giúp ngăn ngừa mất tế

bào do cải thiện hoạt động AKT. Dữ liệu từ nghiên cứu này bổ sung cho các

báo cáo trước đó là giảm LOX trong bệnh đái tháo đường giúp chống lại hiện

tượng chết tế bào theo chương trình của các tế bào mạch máu võng mạc, phát

triển mao mạch không có tế bào, chết tế bào ngoại mạch và rò rỉ mạch máu

võng mạc. Điều thú vị là, giảm gen biểu hiện LOX 50% không gây ra tác

dụng phụ ở võng mạc hoặc trong các mô khác. Các nghiên cứu sử dụng chuột

LOX+/- cho thấy không có sự khác biệt về hoạt động liên kết chéo và thành

phần collagen tại mô động mạch chủ và phổi giữa chuột LOX +/- và nhóm

đối chứng [17-189]. Những kết quả này cho thấy rằng đái tháo đường gây

tăng mức độ biểu hiện của LOX thúc đẩy các tổn thương võng mạc và điều

chỉnh giảm LOX là an toàn và hiệu quả trong việc ngăn ngừa các tổn thương

liên quan đến bệnh võng mạc đái tháo đường.

Trong khi giảm mức biểu hiện LOX bằng LOXsiRNA hoặc BAPN giúp

ngăn ngừa hiện tượng chết tế bào theo chương trình và tăng độ thẩm thấu tế

bào ở mức độ tế bào trong thời gian ngắn, hiệu quả lâu dài trên động vật/con

người mắc đái tháo đường hiện chưa biết rõ. Các thử nghiệm lâm sàng đã

được thực hiện để đánh giá tác động của siRNA trong điều trị các bệnh mắt

[190-192]. Kết quả của các biện pháp này khá khả quan, đặc biệt là sự kết

hợp của ranibizumab và PF-655 siRNA, 1 loại siRNA tổng hợp ngăn ngừa

sự biểu hiện của RTP801, một tác nhân gây ức chế protein điều hoà đã

được chứng minh hiệu quả hơn ranibizumb đơn độc trong điều trị tân mạch

trong bệnh thoái hoá hoàng điểm tuổi già [192]. Vì thế, tác dụng của

LOXsiRNA trong giảm tổn thương mao mạc võng mạc trong bệnh võng

mạc đái tháo đường có thể được áp dụng trong điều trị bệnh võng mạc đái

tháo đường. Mặc dù tác dụng dài hạn của LOXsiRNA chưa được đánh giá

đầy đủ, kết hợp với các thông tin từ các nghiên cứu trước đây [78-193],

phát hiện từ nghiên cứu này cho thấy LOXsiRNA được xem như liệu pháp

gen ngăn ngừa tổn thương võng mạc do đái tháo đường.

A-D: Hình ảnh nhuộm Hematoxylin mạng mao mạch võng mạc của chuột

bình thường (A), chuột đái tháo đường (B), chuột LOX +/- (C) và chuột LOX

+/- đái tháo đường. Ảnh chụp qua sinh hiển vi điện tử, x20. Mũi tên thân liền:

mạch máu không có tế bào. Mũi tên thân ngắt quãng: hiện tượng chết tế bào

ngoại mạch.

Hình 4.3. Tác động của đái tháo đường và giảm nồng độ LOX tới sự phát

triển của mạch máu không có tế bào và chết tế bào ngoại mạch ở võng

mạc chuột [169].

Ngoài các tế bào mạch máu võng mạc, các tế bào võng mạc thần kinh

cũng biểu hiện tổn thương tín hiệu AKT và chết các tế bào do đái tháo đường

[194]. Nghiên cứu của Muto và cộng sự (2014) chỉ ra rằng giảm hoạt động

AKT trong điều kiện đường huyết cao gây khởi động chết tế bào theo chương

trình ở tế bào Muller và tế bào ngoại mạch [106]. Vì thế, những thay đổi xảy

ra trong các loại tế bào khác ở võng mạc có thể góp phần vào tổn thương ở

võng mạc đái tháo đường. Cần những nghiên cứu tiếp theo đánh giá liệu LOX

thay đổi do tình trạng đường huyết cao có ảnh hưởng tới sự sống còn của các

loại tế bào khác hay không.

Tóm lại, những phát hiện trên đây của chúng tôi chỉ ra rằng, môi trường

nồng độ glucose cao gây tăng hàm lượng và hoạt động của LOX liên quan

đến rối loạn chức năng tế bào nội mô mạch máu võng mạc và tăng độ thẩm

thấu tế bào quá mức. LOXsiRNA và BAPN có tác dụng ức chế sự biểu hiện

và hoạt động của LOX giúp bảo vệ hàng rào mạch máu võng mạc. Do đó

giảm mức độ biểu hiện của LOX có thể là một mục tiêu đích tiềm năng trong

ngăn ngừa các tổn thương liên quan đến bệnh võng mạc đái tháo đường.

4.2. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng màng đáy mạch máu dày lên là một dấu

hiệu mô học của bệnh võng mạc đái tháo đường và có thể thúc đẩy chết tế bào

theo chương trình và mất tế bào mạch máu [6-8]. Ngoài ra sự biểu hiện quá

mức của các thành phần màng đáy và sự dày lên của màng đáy đã được chứng

minh là có liên quan mật thiết tới sự tiến triển của tổn thương hàng rào mạch

máu võng mạc [6]. Hơn nữa, các cytokin và các yếu tố tăng trưởng cũng tham

gia vào quá trình thúc đẩy mạch máu rò rỉ [195-196].

Mặc dù các liên kết chéo không thể thiếu trong sự sắp xếp các sợi

collagen, sự dư thừa các liên kết chéo lại góp phần gây rối loạn cấu trúc các

bó sợi collagen. Quan sát dưới sinh hiển vi điện tử có thể phát hiện những

thay đổi trong sự sắp xếp các bó sợi collagen trong đái tháo đường [123].

Những sự khác biệt này bao gồm tăng mật độ bó sợi, giảm đường kính bó sợi,

hình thái bó sợi bất thường tạo nên các bó sợi collagen xoắn, cong, chồng

chéo và vô tổ chức [123]. Điều này thể hiện sự tăng các liên kết chéo quá mức

gây cuộn chặt bó sợi collagen. Đo đường kính bó sợi trong thời gian khác

nhau cho thấy đường kính bó sợi thay đổi tuỳ giai đoạn điều chỉnh bởi hoạt

động của LOX [124]. Còn nhiều vấn đề chưa biết liên quan đến con đường

phân giải, tổng hợp và sự tự lắp ráp các phân tử collagen thành các bó sợi và

các enzym cần thiết cho quá trình chuyển thành các sợi không hoà tan tạo nên

chất nền ngoại bào ổn định về mặt cơ học và hoá học. Các nghiên cứu tiếp

theo cần được thực hiện để hiểu cơ chế tế bào điều hoà quá trình này, sự lắng

đọng các sợi collagen ở chất nền ngoại bào, vai trò của các thành phần chất

nền ngoại bào và tương tác của chúng trong quá trình này. Vì thế, xác định sự

thay đổi hoạt động của enzym liên kết chéo - enzym tham gia vào sự tổ chức

màng đáy và sự lắp ráp siêu cấu trúc các bó sợi collagen có thể giúp đem lại

cái nhìn mới về mối quan hệ giữa sự lắng đọng chất nền ngoại bào và tăng

tính thấm mạch máu quá mức trong bệnh đái tháo đường.

A: Chuột bình thường; B: Chuột đái tháo đường. Khung tỉ lệ = 100nm

Hình 4.4. Hình ảnh cắt ngang mao mạch võng mạc chuột qua

sinh hiển vi điện tử [6]

Bất thường về hình thái của màng đáy mao mạch võng mạc của bệnh

nhân đái tháo đường phản ánh quá trình tái cấu trúc ít được biết đến. Những

bất thường cấu trúc này có thể là kết quả của sự dư thừa các liên kết chéo biểu

hiện bằng hiện tượng dày màng đáy mạch máu võng mạc, một đặc trưng chủ

yếu của bệnh võng mạc đái tháo đường [77]. Sự tăng các thành phần màng

đáy như FN, Coll IV và laminin trong bệnh đái tháo đường đã được biết rõ, và

những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra vai trò của nó trong tăng tính thấm mạch

máu võng mạc [22-44]. Bất thường màng đáy mạch máu xảy ra do mất cân

bằng quá trình tổng hợp và giáng hoá các thành phần màng đáy. Trong bệnh

võng mạc đái tháo đường, quá trình tổng hợp tăng đáng kể so với quá trình

giáng hoá các thành phần ngoại bào dẫn đến lắng đọng các thành phần màng

đáy, từ đó gây dày màng đáy. Quá trình giáng hoá chất nền ngoại bào được

thực hiện bởi enzym phân giải protein chất nền ngoại bào (MMPs) và

urokinase. Mặc dù cả 2 enzym này đều tăng trong bệnh võng mạc đái tháo

đường, tốc độ giáng hoá cũng không đủ để kìm hãm quá trình tăng tổng hợp.

Các yếu tố khác được coi là có đóng góp vào cơ chế gây dày màng đáy bao

gồm tăng hoạt động các yếu tố tăng trưởng, hoạt động của protein kinase C

(PKC) và lắng đọng các sản phẩm cuối của quá trình glycat hoá. Thêm vào

đó, endothelins cũng góp phần gây tăng các thành phần chất nền ngoại bào

bao gồm Coll IV và FN. Cuối cùng, quá trình viêm và tăng con đường polyol

cũng được báo cáo có liên quan tới dày màng đáy, tuy nhiên cơ chế của các

hiện tượng trên còn chưa rõ ràng [6].

Tuy sự thay đổi sinh hoá chính xác thay đổi chất nền ngoại bào và gây

tiến triển sự tăng tính thấm chưa được hiểu đầy đủ, rõ ràng là sự tăng tính

thấm mạch máu đòi hỏi sự vượt qua 2 lớp của mao mạch là lớp tế bào và lớp

chất nền ngoại bào (màng đáy). Mặc dù các nghiên cứu chỉ ra sự phá huỷ các

mối nối và tăng vận chuyển không bào dẫn đến tăng tính thấm quá mức,

những thay đổi này biểu thị những bất thường ở lớp tế bào [197]. Các cơ chế

khác như glycat hoá không enzym cũng có thể tham gia vào cơ chế tăng

thẩm thấu [198]. Tăng khả năng hoà tan của collagen do nồng độ glucose

cao cũng có thể dẫn đến sự mất cân bằng tổng hợp và quá trình hình thành

tiền chất collagen [199]. Từ đó cho thấy sự thay đổi sinh hoá của các thành

phần chất nền ngoại bào có thể khiến tăng tính thấm trong đái tháo đường.

Mặc dù LOX được xem như 1 enzym ngoại bào, các nghiên cứu cũng

phát hiện LOX ở bên trong nhân và bào tương [161-163]. Vì LOX trưởng

thành di chuyển từ ngoài tế bào vào trong tế bào, nên trong nghiên cứu này

chúng tôi đánh giá liệu môi trường nồng độ glucose cao có làm rối loạn quá

trình này thông qua việc tăng kết dính giữa LOX với protein chất nền ngoại

bào, do đó ảnh hưởng tới LOX quay trở lại tế bào, tạo nên tín hiệu ngược,

kích thích sản sinh thêm LOX. Phát hiện từ nghiên cứu chỉ ra rằng môi trường

nồng độ glucose cao kích thích kết dính giữa LOX với protein chất nền ngoại

bào (FN và Coll IV) bên ngoài tế bào và làm giảm lượng LOX trong tế bào.

Điều này tạo nên tín hiệu ngược gây tăng sản sinh LOX dẫn đến tăng hàm

lượng LOX gặp trong bệnh võng mạc đái tháo đường. Đây là nghiên cứu đầu

tiên chỉ ra sự tăng kết dính giữa LOX với FN và Coll IV có thể giảm lượng

LOX trong tế bào ở tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong môi trường

nồng độ glucose cao.

N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao

Hình 4.5. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới sự kết dính của

LOX với chất nền ngoại vào và LOX quay trở lại tế bào biến thiên theo thời gian

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, các thành phần của màng tế bào

như Coll IV và FN tăng đáng kể sau khi nuôi cấy tế bào trong môi trường

nồng độ glucose cao [74]. Trong nghiên cứu này, kết quả của chúng tôi cho

thấy lượng LOX trong môi trường ngoại bào tăng nhẹ ở môi trường glucose

nồng độ cao 1 ngày, đạt đỉnh ở môi trường nồng độ glucose cao 3 ngày và

giảm dần sau 5 ngày nuôi cấy trong điều kiện glucose nồng độ cao. Kết hợp

kết quả từ các nghiên cứu trước và nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đưa ra giả

thiết rằng sự tăng tổng hợp các thành phần chất nền ngoại bào (như Coll IV và

FN) tạo ra nhiều vị trí cho LOX bám dính để thực hiện chức năng xúc tác cho

việc hình thành liên kết chéo, vì vậy giảm lượng LOX trong môi trường ngoại

bào và lượng LOX quay trở lại tế bào trong môi trường nồng độ glucose cao.

Những phát hiện này mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo và góp phần đem lại

hiểu biết sâu hơn về cơ chế bệnh đái tháo đường gây tổn hại chức năng màng

đáy mao mạch võng mạc.

100

KẾT LUẬN

1. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô mạch máu võng

mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao.

Hàm lượng LOX trong protein toàn phần và protein chất nền ngoại bào

tăng (145±10% nhóm đối chứng và 154±9% nhóm đối chứng, tương ứng),

trong khi hàm lượng LOX trong tế bào giảm (62 ± 9% nhóm đối chứng). Hàm

lượng LOX trong môi trường nuôi cấy tế bào có sự biến thiên theo thời gian.

LOX tăng nhẹ trong môi trường nồng độ glucose cao 1 ngày (124±8% nhóm

đối chứng) và 5 ngày (117±6% nhóm đối chứng), tăng đáng kể trong môi

trường glucose cao 3 ngày (158±11% nhóm đối chứng) và giảm trong môi

trường glucose cao 7 ngày (78±5% của nhóm đối chứng). Hàm lượng LOX

trở về gần mức bình thường (116 ± 13% nhóm đối chứng) khi môi trường

glucose cao được ủ thêm LOXsiRNA.

Mật độ LOX trong protein toàn phần và protein chất nền ngoại bào tăng

(179±7% nhóm đối chứng và 160 ± 7% nhóm đối chứng, tương ứng). Mật độ

LOX được điều chỉnh (114 ± 6% nhóm đối chứng) khi môi trường glucose

cao được ủ thêm LOXsiRNA.

Hoạt động LOX tăng rõ rệt trong môi trường nồng độ glucose cao

(153±15% nhóm đối chứng). Hoạt động LOX được điều hoà (120 ± 9% nhóm

đối chứng) khi môi trường glucose cao được ủ thêm BAPN.

Độ thẩm thấu tế bào tăng đáng kể trong môi trường nồng độ glucose cao

(299±18% nhóm đối chứng) và giảm khi môi trường được ủ thêm LOXsiRNA

(114± 8% nhóm đối chứng) hoặc BAPN (132±14% nhóm đối chứng)

Hiện tượng chết tế bào theo chương trình tăng rõ rệt trong môi trường

glucose cao so với môi trường bình thường (4.68 ± 0.9 tế bào chết/1000 tế

bào và 1.48 ± 0.32 tế bào chết/1000 tế bào, tương ứng) và giảm đáng kể khi tế

101

bào được ủ với LOXsiRNA (2.78 ± 0.37 tế bào chết/1000 tế bào) và BAPN

(2.85 ± 0.34 tế bào chết/1000 tế bào).

2. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại

tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường glucose cao.

Hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và FN tăng đáng kể trong protein

toàn phần (144±12% nhóm đối chứng và 168±11% nhóm đối chứng, tương

ứng) và protein chất nền ngoại bào (138±20% nhóm đối chứng và 156±21%

nhóm đối chứng, tương ứng).

Mật độ LOX liên kết với Coll IV và FN tăng rõ rệt trong protein toàn

phần (192±21% nhóm đối chứng và 183±19% nhóm đối chứng, tương ứng) và

protein chất nền ngoại bào (143±10% nhóm đối chứng và 158±15% nhóm đối

chứng, tương ứng).

102

HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

Hiện tượng tăng sự kết dính giữa LOX với FN và Coll IV có thể được

thúc đẩy do sự hiện diện quá nhiều FN và Coll IV trong điều kiện nồng độ

glucose cao hoặc đái tháo đường. Mặc dù các nghiên cứu trước đây chỉ ra

rằng giảm hàm lượng Coll IV và FN do nồng độ glucose cao có thể giúp cải

thiện tình trạng tăng tính thấm mạch máu ở động vật mắc đái tháo đường, liệu

giảm FN hoặc Coll IV có giúp trực tiếp ngăn ngừa tăng biểu hiện LOX trong

bệnh võng mạc đái tháo đường còn chưa rõ ràng. Những nghiên cứu tiếp theo

cần được tiến hành để hiểu thêm về cơ chế mối liên quan giữa các thành phần

màng đáy với LOX và ảnh hưởng của nó tới tính thấm mạch máu liên quan đến

phá vỡ hàng rào mạch máu võng mạc trong bệnh võng mạc đái tháo đường. Đặc

biệt là, cần thực hiện những nghiên cứu đánh giá hiệu quả lâu dài của giảm nồng

độ LOX trong ngăn ngừa các tổn thương mạch máu võng mạc do đái tháo đường

trên động vật và con người từ đó mở ra những phương pháp mới tiềm năng trong

dự phòng và điều trị bệnh võng mạc đái tháo đường.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ

CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Ngan-Ha Nguyen, Dongjoon Kim, Sayon Roy (2020). High Glucose Increases Binding of Lysyl Oxidase to Extracellular Matrix Proteins: Implications for Diabetic Retinopathy. Investigate Ophthalmology and Visual Science, Vol.61, No.4.

2. Dongjoon Kim, Robert P. Mecham, Ngan-Ha Nguyen, Sayon Roy (2019). Decreased lysyl oxidase level protects against development of retinal vascular lesions in diabetic retinopathy. Experimental Eye Research, 184, 221-226

3. Brian Song, Dongjoon Kim, Ngan-Ha Nguyen (2018). Inhibition of Diabetes-Induced Lysyl Oxidase Overexpression Prevents Retinal Vascular Lesions Associated With Diabetic Retinopathy. Investigate Ophthalmology and Visual Science, December 2018, Vol.59, No.15. 4. Nguyễn Ngân Hà, Trần Huy Thịnh, Nguyễn Minh Phú, Nguyễn Phú Trang Hưng, Sayon Roy (2020). Sự thay đổi hàm lượng lysyl oxidase tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong môi trường nồng độ glucose cao. Tạp chí y học Việt Nam, Tháng 3-số 2, 157-160.

5. Nguyễn Ngân Hà, Nguyễn Minh Phú, Nguyễn Xuân Tịnh, Phạm Trọng Văn, Sayon Roy (2020). Ức chế lysyl oxidase giúp ngăn ngừa tăng tính thấm qua màng tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường glucose nồng độ cao. Tạp chí Y học thực hành, 3 (1128), 23-25.

6. Nguyễn Ngân Hà, Nguyễn Minh Phú, Trần Huy Thịnh, Sayon Roy (2020). Sự thay đổi phân bố lysyl oxidase tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong môi trường nồng độ glucose cao. Tạp chí y học Việt Nam, Tháng 2- số 1&2, 204-207.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Ting D. S. W., Cheung G. C. M., Wong T. Y. (2016). Diabetic

retinopathy: global prevalence, major risk factors, screening practices

and public health challenges: a review. Clinical & experimental

ophthalmology, 44 (4), 260-277.

2. Sivaprasad S., Gupta B., Crosby-Nwaobi R. et al (2012). Prevalence

of diabetic retinopathy in various ethnic groups: a worldwide

perspective. Survey of ophthalmology, 57 (4), 347-370.

3. Cunha-Vaz J., Bernardes R. (2005). Nonproliferative retinopathy in

diabetes type 2. Initial stages and characterization of phenotypes.

Progress in retinal and eye research, 24 (3), 355-377.

4. Hammes H.-P., Lin J., Renner O. et al (2002). Pericytes and the

pathogenesis of diabetic retinopathy. Diabetes, 51 (10), 3107-3112.

5. Hainsworth D. P., Katz M. L., Sanders D. A. et al (2002). Retinal

capillary basement membrane thickening in a porcine model of

diabetes mellitus. Comparative medicine, 52 (6), 523-529.

6. Roy S., Ha J., Trudeau K. et al (2010). Vascular basement membrane

thickening in diabetic retinopathy. Current eye research, 35 (12),

1045-1056.

7. Beltramo E., Buttiglieri S., Pomero F. et al (2003). A study of

capillary pericyte viability on extracellular matrix produced by

endothelial cells in high glucose. Diabetologia, 46 (3), 409-415.

8. Beltramo E., Porta M. (2013). Pericyte loss in diabetic retinopathy:

mechanisms and consequences. Current medicinal chemistry, 20 (26),

3218-3225.

9. Tsilibary E. C. (2003). Microvascular basement membranes in

diabetes mellitus. The Journal of Pathology: A Journal of the

Pathological Society of Great Britain and Ireland, 200 (4), 537-546.

10. Sethi A., Wordinger R. J., Clark A. F. (2012). Focus on molecules:

lysyl oxidase. Experimental eye research, 104, 97.

11. Wilmarth K. R., Froines J. R. (1992). In vitro and in vivo inhibition of

lysyl oxidase byaminopropionitriles. Journal of Toxicology and

Environmental Health, Part A Current Issues, 37 (3), 411-423.

12. Erler J. T., Bennewith K. L., Nicolau M. et al (2006). Lysyl oxidase is

essential for hypoxia-induced metastasis. Nature, 440 (7088), 1222.

13. Erler J. T., Giaccia A. J. (2006). Lysyl oxidase mediates hypoxic

control of metastasis. Cancer research, 66 (21), 10238-10241.

14. Rodríguez C., Rodríguez-Sinovas A., Martínez-González J. (2008).

Lysyl oxidase as a potential therapeutic target. Drug News Perspect,

21 (4), 218-224.

15. Lucero H., Kagan H. (2006). Lysyl oxidase: an oxidative enzyme and

effector of cell function. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS,

63 (19-20), 2304-2316.

16. Gilad G. M., Kagan H. M., Gilad V. H. (2005). Evidence for

increased lysyl oxidase, the extracellular matrix-forming enzyme, in

Alzheimer's disease brain. Neuroscience letters, 376 (3), 210-214.

17. Hornstra I. K., Birge S., Starcher B. et al (2003). Lysyl oxidase is

required for vascular and diaphragmatic development in mice. Journal

of Biological Chemistry, 278 (16), 14387-14393.

18. Hayashi K., Fong K. S., Mercier F. et al (2004). Comparative

immunocytochemical localization of lysyl oxidase (LOX) and the

lysyl oxidase-like (LOXL) proteins: changes in the expression of

LOXL during development and growth of mouse tissues. Journal of

molecular histology, 35 (8-9), 845-855.

19. Song B., Kim D., Nguyen N.-H. et al (2018). Inhibition of Diabetes-

Induced Lysyl Oxidase Overexpression Prevents Retinal Vascular

Lesions Associated With Diabetic Retinopathy. Investigative

ophthalmology & visual science, 59 (15), 5965-5972.

20. Subramanian M. L., Stein T. D., Siegel N. et al (2019). Upregulation

of Lysyl Oxidase Expression in Vitreous of Diabetic Subjects:

Implications for Diabetic Retinopathy. Cells, 8 (10), 1122.

21. Oshitari T., Brown D., Roy S. (2005). SiRNA strategy against

overexpression of extracellular matrix in diabetic retinopathy.

Experimental eye research, 81 (1), 32-37.

22. Oshitari T., Polewski P., Chadda M. et al (2006). Effect of combined

antisense oligonucleotides against high-glucose–and diabetes-induced

overexpression of extracellular matrix components and increased

vascular permeability. Diabetes, 55 (1), 86-92.

23. Trịnh Bình P. P. Đ., Đỗ Kính (2004). Hệ tuần hoàn. Mô học, Nhà

Xuất Bản Y học, 3.

24. Tata D., Anderson B. (2002). A new method for the investigation of

capillary structure. Journal of neuroscience methods, 113 (2), 199-

206.

25. Spirin K. S., Saghizadeh M., Lewin S. L. et al (1999). Basement

membrane and growth factor gene expression in normal and diabetic

human retinas. Current eye research, 18 (6), 490-499.

26. Mao Y., Schwarzbauer J. E. (2005). Fibronectin fibrillogenesis, a cell-

mediated matrix assembly process. Matrix biology, 24 (6), 389-399.

27. Boudreau N. J., Jones P. L. (1999). Extracellular matrix and integrin

signalling: the shape of things to come. Biochemical Journal, 339 (3),

481-488.

28. Valero C., Javierre E., García-Aznar J. M. et al (2014). A cell-

regulatory mechanism involving feedback between contraction and

tissue formation guides wound healing progression. PloS one, 9 (3),

e92774.

29. Davis J. T., Wen Q., Janmey P. A. et al (2012). Müller cell expression

of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by

substrate elastic modulus. Investigative ophthalmology & visual

science, 53 (6), 3014-3019.

30. Stenzel D., Lundkvist A., Sauvaget D. et al (2011). Integrin-

dependent and-independent functions of astrocytic fibronectin in

retinal angiogenesis. Development, 138 (20), 4451-4463.

31. Kuiper E., Witmer A., Klaassen I. et al (2004). Differential expression of

connective tissue growth factor in microglia and pericytes in the human

diabetic retina. British journal of ophthalmology, 88 (8), 1082-1087.

32. Trudeau K., Roy S., Guo W. et al (2011). Fenofibric acid reduces

fibronectin and collagen type IV overexpression in human retinal

pigment epithelial cells grown in conditions mimicking the diabetic

milieu: functional implications in retinal permeability. Investigative

ophthalmology & visual science, 52 (9), 6348-6354.

33. Martinez-Hernandez A. (1983). The basement membrane in

pathology. Lab. Invest, 48, 656-677.

34. Tang J., Mohr S., Du Y.-P. et al (2003). Non-uniform distribution of

lesions and biochemical abnormalities within the retina of diabetic

humans. Current eye research, 27 (1), 7-13.

35. Dische F., Anderson V., Keane S. et al (1990). Incidence of thin

membrane nephropathy: morphometric investigation of a population

sample. Journal of clinical pathology, 43 (6), 457-460.

36. Haas M. (2006). Thin glomerular basement membrane nephropathy:

incidence in 3471 consecutive renal biopsies examined by electron

microscopy. Archives of pathology & laboratory medicine, 130 (5),

699-706.

37. Vick N. A. (1971). Skeletal muscle capillary basement membranes in

humans. Acta neuropathologica, 17 (1), 1-5.

38. Begieneman M. P., Van De Goot F. R., Krijnen P. A. et al (2010). The

basement membrane of intramyocardial capillaries is thickened in

patients with acute myocardial infarction. Journal of vascular

research, 47 (1), 54-60.

39. Lindsay D., Anand I., Bennett J. et al (1994). Ultrastructural analysis

of skeletal muscle: Microvascular dimensions and basement

membrane thickness in chronic heart failure. European heart journal,

15 (11), 1470-1476.

40. Kuiper E. J., Zijderveld R. v., Roestenberg P. et al (2008). Connective

tissue growth factor is necessary for retinal capillary basal lamina

thickening in diabetic mice. Journal of Histochemistry &

Cytochemistry, 56 (8), 785-792.

41. Cherian S., Roy S., Pinheiro A. et al (2009). Tight glycemic control

regulates fibronectin expression and basement membrane thickening

in retinal and glomerular capillaries of diabetic rats. Investigative

ophthalmology & visual science, 50 (2), 943-949.

42. Mansour S., Hatchell D., Chandler D. et al (1990). Reduction of

basement membrane thickening in diabetic cat retina by sulindac.

Investigative ophthalmology & visual science, 31 (3), 457-463.

43. Hood J. C., Savige J., Seymour A. E. et al (2000). Ultrastructural

appearance of renal and other basement membranes in the Bull terrier

model of autosomal dominant hereditary nephritis. American journal

of kidney diseases, 36 (2), 378-391.

44. Ljubimov A. V., Burgeson R. E., Butkowski R. J. et al (1996).

Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic

retinopathy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 44 (12),

1469-1479.

45. Timpl R., Dziadek M., Fujiwara S. et al (1983). Nidogen: A new, self‐

aggregating basement membrane protein. European journal of

biochemistry, 137 (3), 455-465.

46. Khoshnoodi J., Pedchenko V., Hudson B. G. (2009). Collagen IV.

Microscopy research and technique, 71 (5), 357-370.

47. Brazel D., Pollner R., Oberbäumer I. et al (1988). Human basement

membrane collagen (type IV) The amino acid sequence of the α2 (IV)

chain and its comparison with the α1 (IV) chain reveals deletions in

the α1 (IV) chain. European journal of biochemistry, 172 (1), 35-42.

48. Vuorio E., De Crombrugghe B. (1990). The family of collagen genes.

Annual review of biochemistry, 59 (1), 837-872.

49. Khoshnoodi J., Pedchenko V., Hudson B. G. (2008). Mammalian

collagen IV. Microscopy research and technique, 71 (5), 357-370.

50. de Fougerolles A. R., Sprague A. G., Nickerson-Nutter C. L. và cộng

sự (2000). Regulation of inflammation by collagen-binding integrins

α1β1 and α2β1 in models of hypersensitivity and arthritis. The

Journal of clinical investigation, 105 (6), 721-729.

51. Sundaramoorthy M., Meiyappan M., Todd P. et al (2002). Crystal

structure of NC1 domains structural basis for type IV collagen

assembly in basement membranes. Journal of Biological Chemistry,

277 (34), 31142-31153.

52. Pankov R., Yamada K. M. (2002). Fibronectin at a glance. Journal of

cell science, 115 (20), 3861-3863.

53. Lenselink E. A. (2015). Role of fibronectin in normal wound healing.

International wound journal, 12 (3), 313-316.

54. Geiger B., Bershadsky A., Pankov R. et al (2001). Transmembrane

crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton.

Nature reviews Molecular cell biology, 2 (11), 793.

55. Madri J. A., Roll F. J., Furthmayr H. et al (1980). Ultrastructural

localization of fibronectin and laminin in the basement membranes of

the murine kidney. The Journal of cell biology, 86 (2), 682-687.

56. Marinkovich M. P. (2007). Laminin 332 in squamous-cell carcinoma.

Nature Reviews Cancer, 7 (5), 370.

57. Timpl R., Tisi D., Talts J. F. et al (2000). Structure and function of

laminin LG modules. Matrix biology, 19 (4), 309-317.

58. Abari E., Kociok N., Hartmann U. et al (2013). Alterations in

basement membrane immunoreactivity of the diabetic retina in three

diabetic mouse models. Graefe's Archive for Clinical and

Experimental Ophthalmology, 251 (3), 763-775.

59. Yurchenco P. D., Patton B. L. (2009). Developmental and pathogenic

mechanisms of basement membrane assembly. Current

pharmaceutical design, 15 (12), 1277-1294.

60. Si Y. F., Wang J., Guan J. et al (2013). Treatment with hydrogen

sulfide alleviates streptozotocin‐induced diabetic retinopathy in rats.

British journal of pharmacology, 169 (3), 619-631.

61. Laurie G., Inoue S., Bing J. et al (1988). Visualization of the large

heparan sulfate proteoglycan from basement membrane. American

journal of anatomy, 181 (3), 320-326.

62. Sarrazin S., Lamanna W. C., Esko J. D. (2011). Heparan sulfate

proteoglycans. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 3 (7),

a004952.

63. Marneros A. G., Olsen B. R. (2005). Physiological role of collagen

XVIII and endostatin. The FASEB Journal, 19 (7), 716-728.

64. Fransson L., Carlstedt I., Coster L. et al (1986). The functions of the

heparan sulphate proteoglycans. Functions of the Proteoglycans,

Wiley Chichester, 125-142.

65. Frisch S. M., Ruoslahti E. (1997). Integrins and anoikis. Current

opinion in cell biology, 9 (5), 701-706.

66. Brem R.B., Robbins S.G., Wilson D.J. et al (1994).

Immunolocalization of integrins in the human retina. Investigative

ophthalmology & visual science, 35 (9), 3466-3474.

67. Heino J. (2000). The collagen receptor integrins have distinct ligand

recognition and signaling functions. Matrix Biology, 19 (4), 319-323.

68. Chakrabarti S., Ma N., Sima A. A. (1991). Anionic sites in diabetic

basement membranes and their possible role in diffusion barrier

abnormalities in the BB-rat. Diabetologia, 34 (5), 301-306.

69. Lai A. K.W., Lo A. C. (2013). Animal models of diabetic retinopathy:

summary and comparison. Journal of diabetes research, 2013,

70. Feit-Leichman R. A., Kinouchi R., Takeda M. et al (2005). Vascular

damage in a mouse model of diabetic retinopathy: relation to neuronal

and glial changes. Investigative ophthalmology & visual science, 46

(11), 4281-4287.

71. Lee S. E., Ma W., Rattigan E. M. et al (2010). Ultrastructural features

of retinal capillary basement membrane thickening in diabetic swine.

Ultrastructural pathology, 34 (1), 35-41.

72. Powner M. B., Scott A., Zhu M. et al (2011). Basement membrane

changes in capillaries of the ageing human retina. British journal of

ophthalmology, 95 (9), 1316-1322.

73. Chronopoulos A., Trudeau K., Roy S. et al (2011). High glucose-

induced altered basement membrane composition and structure

increases trans-endothelial permeability: implications for diabetic

retinopathy. Current eye research, 36 (8), 747-753.

74. Roy S., Sato T., Paryani G. et al (2003). Downregulation of

fibronectin overexpression reduces basement membrane thickening

and vascular lesions in retinas of galactose-fed rats. Diabetes, 52 (5),

1229-1234.

75. Roy S., Lorenzi M. (1996). Early biosynthetic changes in the diabetic-

like retinopathy of galactose-fed rats. Diabetologia, 39 (6), 735-738.

76. Spiro M., He Q., D'Autilia M. (1995). Effect of high glucose on

formation of extracellular matrix components by cultured rat heart

endothelial cells. Diabetologia, 38 (4), 430-436.

77. Roy S., Cagliero E., Lorenzi M. (1996). Fibronectin overexpression in

retinal microvessels of patients with diabetes. Investigative

ophthalmology & visual science, 37 (2), 258-266.

78. Roy S., Nasser S., Yee M. et al (2011). A long-term siRNA strategy

regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in

retinas of diabetic rats. Molecular vision, 17, 3166.

79. Bhattacharjee P. S., Huq T. S., Potter V. et al (2012). High-glucose-

induced endothelial cell injury is inhibited by a Peptide derived from

human apolipoprotein E. PLoS One, 7 (12), e52152.

80. Nishiguchi K. M., Ushida H., Tomida D. et al (2013). Age-dependent

alteration of intraocular soluble heparan sulfate levels and its

implications for proliferative diabetic retinopathy. Molecular vision,

19, 1125.

81. To M., Goz A., Camenzind L. et al (2013). Diabetes-induced

morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular

basement membranes. Experimental eye research, 116, 298-307.

82. Castellon R., Caballero S., Hamdi H. K. et al (2002). Effects of

tenascin-C on normal and diabetic retinal endothelial cells in culture.

Investigative ophthalmology & visual science, 43 (8), 2758-2766.

83. Aumailley M., Battaglia C., Mayer U. et al (1993). Nidogen mediates

the formation of ternary complexes of basement membrane

components. Kidney international, 43 (1), 7-12.

84. Nielsen M. S., Nygaard Axelsen L., Sorgen P. L. et al (2012). Gap

junctions. Comprehensive Physiology, 2 (3), 1981-2035.

85. Wright J. A., Richards T., Becker D. L. (2012). Connexins and

diabetes. Cardiology research and practice, 2012,

86. Dagli M. L. Z., Hernandez-Blazquez F. J. (2007). Roles of gap

junctions and connexins in non-neoplastic pathological processes in

which cell proliferation is involved. Journal of Membrane Biology,

218 (1-3), 79-91.

87. Vaney D. I., Weiler R. (2000). Gap junctions in the eye: evidence for

heteromeric, heterotypic and mixed-homotypic interactions. Brain

research reviews, 32 (1), 115-120.

88. Roy S., Kim D.,Lim R. (2017). Cell-cell communication in diabetic

retinopathy. Vision research, 139, 115-122.

89. Chistiakov D. A. (2011). Diabetic retinopathy: pathogenic mechanisms

and current treatments. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical

Research & Reviews, 5 (3), 165-172.

90. Decrock E., Vinken M., De Vuyst E. et al (2009). Connexin-related

signaling in cell death: to live or let die? Cell death and

differentiation, 16 (4), 524.

91. Kojima A., Nakahama K.-i., Ohno-Matsui K. et al (2008). Connexin

43 contributes to differentiation of retinal pigment epithelial cells via

cyclic AMP signaling. Biochemical and biophysical research

communications, 366 (2), 532-538.

92. Wei C.-J., Xu X.,Lo C. W. (2004). Connexins and cell signaling in

development and disease. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 20, 811-838.

93. Fernandes R., Girao H., Pereira P. (2004). High glucose down-

regulates intercellular communication in retinal endothelial cells by

enhancing degradation of connexin 43 by a proteasome-dependent

mechanism. Journal of Biological Chemistry, 279 (26), 27219-27224.

94. Li A.-F., Sato T., Haimovici R. et al (2003). High glucose alters

connexin 43 expression and gap junction intercellular communication

activity in retinal pericytes. Investigative ophthalmology & visual

science, 44 (12), 5376-5382.

95. Sato T., Haimovici R., Kao R. et al (2002). Downregulation of

connexin 43 expression by high glucose reduces gap junction activity

in microvascular endothelial cells. Diabetes, 51 (5), 1565-1571.

96. Zahs K. R., Ceelen P. W. (2006). Gap junctional coupling and

connexin immunoreactivity in rabbit retinal glia. Visual neuroscience,

23 (1), 1-10.

97. Evans W. H., Martin P. E. (2002). Gap junctions: structure and

function. Molecular membrane biology, 19 (2), 121-136.

98. Li A.-F., Roy S. (2009). High glucose–induced downregulation of

connexin 43 expression promotes apoptosis in microvascular

endothelial cells. Investigative ophthalmology & visual science, 50

(3), 1400-1407.

99. Tien T., Barrette K. F., Chronopoulos A. et al (2013). Effects of high

glucose-induced Cx43 downregulation on occludin and ZO-1

expression and tight junction barrier function in retinal endothelial

cells. Investigative ophthalmology & visual science, 54 (10), 6518-

6525.

100. Trudeau K., Muto T., Roy S. (2012). Downregulation of mitochondrial

connexin 43 by high glucose triggers mitochondrial shape change and

cytochrome C release in retinal endothelial cells. Investigative

ophthalmology & visual science, 53 (10), 6675-6681.

101. Manasson J., Tien T., Moore C. et al (2013). High Glucose–Induced

Downregulation of Connexin 30.2 Promotes Retinal Vascular

Lesions: Implications for Diabetic Retinopathy. Investigative

ophthalmology & visual science, 54 (3), 2361-2366.

102. Tien T., Muto T., Barrette K. et al (2014). Downregulation of Connexin

43 promotes vascular cell loss and excess permeability associated

with the development of vascular lesions in the diabetic retina.

Molecular vision, 20, 732.

103. Oku H., Kodama T., Sakagami K. et al (2001). Diabetes-induced

disruption of gap junction pathways within the retinal

microvasculature. Investigative ophthalmology & visual science, 42

(8), 1915-1920.

104. Fletcher E. L., Phipps J. A., Wilkinson‐ Berka J. L. (2005).

Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes. Clinical and

Experimental Optometry, 88 (3), 132-145.

105. Unger T., Bette S., Zhang J. et al (2012). Connexin-deficiency affects

expression levels of glial glutamate transporters within the cerebrum.

Neuroscience letters, 506 (1), 12-16.

106. Muto T., Tien T., Kim D. et al (2014). High glucose alters Cx43

expression and gap junction intercellular communication in retinal

Müller cells: promotes Müller cell and pericyte apoptosis.

Investigative ophthalmology & visual science, 55 (7), 4327-4337.

107. Schrepfer E., Scorrano L. (2016). Mitofusins, from mitochondria to

metabolism. Molecular cell, 61 (5), 683-694.

108. Tien T., Zhang J., Muto T. et al (2017). High glucose induces

mitochondrial dysfunction in retinal Müller cells: implications for

diabetic retinopathy. Investigative ophthalmology & visual science, 58

(7), 2915-2921.

109. Nishioka T., Eustace A., West C. (2012). Lysyl oxidase: from basic

science to future cancer treatment. Cell structure and function, 37 (1),

75-80.

110. Csiszar K. (2001). Lysyl oxidases: a novel multifunctional amine

oxidase family.

111. Hämäläinen E.-R., Jones T. A., Sheer D. et al (1991). Molecular

cloning of human lysyl oxidase and assignment of the gene to

chromosome 5q23. 3–31.2. Genomics, 11 (3), 508-516.

112. Smith-Mungo L. I., Kagan H. M. (1998). Lysyl oxidase: properties,

regulation and multiple functions in biology. Matrix biology, 16 (7),

387-398.

113. Molnar J., Fong K., He Q. et al (2003). Structural and functional

diversity of lysyl oxidase and the LOX-like proteins. Biochimica et

Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1647 (1-2), 220-

224.

114. Payne S. L., Hendrix M. J., Kirschmann D. A. (2007). Paradoxical roles

for lysyl oxidases in cancer—a prospect. Journal of cellular

biochemistry, 101 (6), 1338-1354.

115. Kagan H. M. (2000). Intra-and extracellular enzymes of collagen

biosynthesis as biological and chemical targets in the control of

fibrosis. Acta tropica, 77 (1), 147-152.

116. Riley D. J., Kerr J. S., Berg R. A. et al (1982). beta-Aminopropionitrile

prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the hamster.

American Review of Respiratory Disease, 125 (1), 67-73.

117. Potter R. M., Huynh R. T., Volper B. D. et al (2016). Impact of TGF-β

inhibition during acute exercise on Achilles tendon extracellular

matrix. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and

Comparative Physiology, 312 (1), R157-R164.

118. Sethi A., Mao W., Wordinger R. J. et al (2011). Transforming growth

factor–β induces extracellular matrix protein cross-linking lysyl

oxidase (LOX) genes in human trabecular meshwork cells.

Investigative ophthalmology & visual science, 52 (8), 5240-5250.

119. Dudakova L., Liskova P., Trojek T. et al (2012). Changes in lysyl

oxidase (LOX) distribution and its decreased activity in keratoconus

corneas. Experimental eye research, 104, 74-81.

120. Turecek C., Fratzl-Zelman N., Rumpler M. et al (2008). Collagen

cross-linking influences osteoblastic differentiation. Calcified tissue

international, 82 (5), 392-400.

121. Aydin S., Signorelli S., Lechleitner T. et al (2008). Influence of

microvascular endothelial cells on transcriptional regulation of

proximal tubular epithelial cells. American Journal of Physiology-Cell

Physiology, 294 (2), C543-C554.

122. Buchinger B., Spitzer S., Karlic H. et al (2008). Lysyl oxidase (LOX)

mRNA expression and genes of the differentiated osteoblastic

phenotype are upregulated in human osteosarcoma cells by suramin.

Cancer letters, 265 (1), 45-54.

123. Ortolan E., Spadella C. T., Caramori C. et al (2008). Microscopic,

morphometric and ultrastructural analysis of anastomotic healing in

the intestine of normal and diabetic rats. Experimental and clinical

endocrinology & diabetes, 116 (04), 198-202.

124. Grant W. P., Sullivan R., Sonenshine D. E. et al (1997). Electron

microscopic investigation of the effects of diabetes mellitus on the

Achilles tendon. The Journal of foot and ankle surgery, 36 (4), 272-

278.

125. Yang X., Scott H. A., Monickaraj F. et al (2015). Basement membrane

stiffening promotes retinal endothelial activation associated with

diabetes. The FASEB Journal, 30 (2), 601-611.

126. Li T., Wu C., Gao L. et al (2018). Lysyl oxidase family members in

urological tumorigenesis and fibrosis. Oncotarget, 9 (28), 20156.

127. Rucker R. B., Kosonen T., Clegg M. S. et al (1998). Copper, lysyl

oxidase, and extracellular matrix protein cross-linking. The American

journal of clinical nutrition, 67 (5), 996S-1002S.

128. Siegel R. C., Pinnell S. R., Martin G. R. (1970). Cross-linking of

collagen and elastin. Properties of lysyl oxidase. Biochemistry, 9 (23),

4486-4492.

129. Trackman P. C., Bedell-Hogan D., Tang J. et al (1992). Post-

translational glycosylation and proteolytic processing of a lysyl

oxidase precursor. Journal of Biological Chemistry, 267 (12), 8666-

8671.

130. Shih Y. H., Chang K. W., Chen M. Y. et al (2013). Lysyl oxidase and

enhancement of cell proliferation and angiogenesis in oral squamous

cell carcinoma. Head & neck, 35 (2), 250-256.

131. Bruce A., Alexander J., Julian L. et al (2002). Molecular biology of the

cell Garland Science. New York, 749-753.

132. Dawson D. A., Rinaldi A. C., Pöch G. (2002). Biochemical and

toxicological evaluation of agent-cofactor reactivity as a mechanism

of action for osteolathyrism. Toxicology, 177 (2-3), 267-284.

133. Mäki J. M., Sormunen R., Lippo S. et al (2005). Lysyl oxidase is

essential for normal development and function of the respiratory

system and for the integrity of elastic and collagen fibers in various

tissues. The American journal of pathology, 167 (4), 927-936.

134. Huang H.-Y., Chen S.-Z., Zhang W.-T. et al (2013). Induction of

EMT-like response by BMP4 via up-regulation of lysyl oxidase is

required for adipocyte lineage commitment. Stem cell research, 10

(3), 278-287.

135. Gayathri R., Coral K., Sharmila F. et al (2016). Correlation of aqueous

humor Lysyl oxidase activity with TGF-ß levels and LOXL1 genotype in

Pseudoexfoliation. Current eye research, 41 (10), 1331-1338.

136. Nielsen K., Birkenkamp-Demtro der K., Ehlers N. et al (2003).

Identification of differentially expressed genes in keratoconus

epithelium analyzed on microarrays. Investigative ophthalmology &

visual science, 44 (6), 2466-2476.

137. Yuan Y., Li M., Chen Q. et al (2018). Crosslinking enzyme lysyl

oxidase modulates scleral remodeling in form-deprivation myopia.

Current eye research, 43 (2), 200-207.

138. El-Haibi C. P., Bell G. W., Zhang J. et al (2012). Critical role for lysyl

oxidase in mesenchymal stem cell-driven breast cancer malignancy.

Proceedings of the National Academy of Sciences, 201206653.

139. Kirschmann D. A., Seftor E. A., Fong S. F. et al (2002). A molecular

role for lysyl oxidase in breast cancer invasion. Cancer research, 62

(15), 4478-4483.

140. Shi W., Yang B., Li X. et al (2012). The effect of lysyl oxidase

polymorphism on susceptibility and prognosis of nonsmall cell lung

cancer. Tumor Biology, 33 (6), 2379-2383.

141. Baker A.-M., Cox T. R., Bird D. et al (2011). The role of lysyl

oxidase in SRC-dependent proliferation and metastasis of colorectal

cancer. Journal of the National Cancer Institute, 103 (5), 407-424.

142. Wilgus M. L., Borczuk A. C., Stoopler M. et al (2011). Lysyl oxidase:

a lung adenocarcinoma biomarker of invasion and survival. Cancer,

117 (10), 2186-2191.

143. Baker A.-M., Bird D., Welti J. C. et al (2013). Lysyl oxidase plays a

critical role in endothelial cell stimulation to drive tumor

angiogenesis. Cancer research, 73 (2), 583-594.

144. Sivak J. M., Fini M. E. (2002). MMPs in the eye: emerging roles for

matrix metalloproteinases in ocular physiology. Progress in retinal

and eye research, 21 (1), 1-14.

145. Frank R. N. (1991). On the pathogenesis of diabetic retinopathy: a

1990 update. Ophthalmology, 98 (5), 586-593.

146. Hooymans J. M., De Lavalette V. W. R., Oey A. G. (2000). Formation

of proliferative vitreoretinopathy in primary rhegmatogenous retinal

detachment. Documenta ophthalmologica, 100 (1), 39-42.

147. Erler J. T., Weaver V. M. (2009). Three-dimensional context regulation

of metastasis. Clinical & experimental metastasis, 26 (1), 35-49.

148. Le Pape A., Guitton J., Gutman N. et al (1983). Nonenzymatic

glycosylation of collagen in diabetes: incidence on increased normal

platelet aggregation. Pathophysiology of Haemostasis and

Thrombosis, 13 (1), 36-41.

149. Cagliero E., Maiello M., Boeri D. et al (1988). Increased expression of

basement membrane components in human endothelial cells cultured

in high glucose. The Journal of clinical investigation, 82 (2), 735-738.

150. Boyd-White J., Williams J. C. (1996). Effect of cross-linking on matrix

permeability: a model for AGE-modified basement membranes.

Diabetes, 45 (3), 348-353.

151. Roth T., Podesta F., Stepp M. A. et al (1993). Integrin overexpression

induced by high glucose and by human diabetes: potential pathway to

cell dysfunction in diabetic microangiopathy. Proceedings of the

National Academy of Sciences, 90 (20), 9640-9644.

152. Paszek M. J., Zahir N., Johnson K. R. et al (2005). Tensional homeostasis

and the malignant phenotype. Cancer cell, 8 (3), 241-254.

153. Roy S., Maiello M.,Lorenzi M. (1994). Increased expression of

basement membrane collagen in human diabetic retinopathy. The

Journal of clinical investigation, 93 (1), 438-442.

154. Yang X., Scott H. A., Monickaraj F. et al (2016). Basement membrane

stiffening promotes retinal endothelial activation associated with

diabetes. The FASEB Journal, 30 (2), 601-611.

155. Chronopoulos A., Tang A., Beglova E. et al (2010). High glucose

increases lysyl oxidase expression and activity in retinal endothelial

cells: mechanism for compromised extracellular matrix barrier

function. Diabetes, 59 (12), 3159-3166.

156. Pöschl E., Schlötzer-Schrehardt U., Brachvogel B. et al (2004).

Collagen IV is essential for basement membrane stability but

dispensable for initiation of its assembly during early development.

Development, 131 (7), 1619-1628.

157. López B., González A., Hermida N. et al (2010). Role of lysyl oxidase

in myocardial fibrosis: from basic science to clinical aspects.

American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology,

299 (1), H1-H9.

158. Chen J., Ren J., Loo W. T. et al (2018). Lysyl oxidases expression and

histopathological changes of the diabetic rat nephron. Molecular

medicine reports, 17 (2), 2431-2441.

159. Sebag J., Nie S., Reiser K. et al (1994). Raman spectroscopy of human

vitreous in proliferative diabetic retinopathy. Investigative

ophthalmology & visual science, 35 (7), 2976-2980.

160. Buckingham B.,Reiser K. (1990). Relationship between the content of

lysyl oxidase-dependent cross-links in skin collagen, nonenzymatic

glycosylation, and long-term complications in type I diabetes mellitus.

The Journal of clinical investigation, 86 (4), 1046-1054.

161. Guo Y., Pischon N., Palamakumbura A. H. et al (2007). Intracellular

distribution of the lysyl oxidase propeptide in osteoblastic cells. American

Journal of Physiology-Cell Physiology, 292 (6), C2095-C2102.

162. Li W., Nellaiappan K., Strassmaier T. et al (1997). Localization and

activity of lysyl oxidase within nuclei of fibrogenic cells. Proceedings

of the National Academy of Sciences, 94 (24), 12817-12822.

163. Li P.-A., He Q., Cao T. et al (2004). Up-regulation and altered

distribution of lysyl oxidase in the central nervous system of mutant

SOD1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.

Molecular brain research, 120 (2), 115-122.

164. Rodríguez C., Martínez-González J., Raposo B. et al (2008). Regulation of

lysyl oxidase in vascular cells: lysyl oxidase as a new player in

cardiovascular diseases. Cardiovascular research, 79 (1), 7-13.

165. Saad F. A., Torres M., Wang H. et al (2010). Intracellular lysyl

oxidase: effect of a specific inhibitor on nuclear mass in

proliferating cells. Biochemical and biophysical research

communications, 396 (4), 944-949.

166. Varona S., Orriols M., Galán M. et al (2018). Lysyl oxidase (LOX)

limits VSMC proliferation and neointimal thickening through its

extracellular enzymatic activity. Scientific reports, 8 (1), 1-10.

167. Coral K., Madhavan J., Pukhraj R. et al (2013). High glucose induced

differential expression of lysyl oxidase and its isoform in ARPE-19

cells. Current eye research, 38 (1), 194-203.

168. Asencio-Duran M., Vallejo-Garcia J. L., Pastora-Salvador N. et al

(2012). Vitreous diagnosis in neoplastic diseases. Mediators of

inflammation, 2012,

169. Kim D., Mecham R. P., Nguyen N.-H. et al (2019). Decreased lysyl

oxidase level protects against development of retinal vascular lesions

in diabetic retinopathy. Experimental eye research, 184, 221-226.

170. Katagiri M., Shoji J., Inada N. et al (2018). Evaluation of vitreous

levels of advanced glycation end products and angiogenic factors as

biomarkers for severity of diabetic retinopathy. International

ophthalmology, 38 (2), 607-615.

171. Adamopoulos C., Piperi C., Gargalionis A. N. et al (2016). Advanced

glycation end products upregulate lysyl oxidase and endothelin-1 in

human aortic endothelial cells via parallel activation of ERK1/2–NF-

κB and JNK–AP-1 signaling pathways. Cellular and molecular life

sciences, 73 (8), 1685-1698.

172. Harlow C. R., Wu X., van Deemter M. et al (2017). Targeting lysyl

oxidase reduces peritoneal fibrosis. PloS one, 12 (8),

173. Roy S., Amin S., Roy S. (2016). Retinal fibrosis in diabetic retinopathy.

Experimental eye research, 142, 71-75.

174. Roy S., Kim D., Hernández C. et al (2015). Beneficial effects of

fenofibric acid on overexpression of extracellular matrix components,

COX-2, and impairment of endothelial permeability associated with

diabetic retinopathy. Experimental eye research, 140, 124-129.

175. Contente S., Yeh T.-J. A., Friedman R. M. (2009). Tumor suppressive

effect of lysyl oxidase proenzyme. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-

Molecular Cell Research, 1793 (7), 1272-1278.

176. Halberg N., Khan T., Trujillo M. E. et al (2009). Hypoxia-inducible

factor 1α induces fibrosis and insulin resistance in white adipose

tissue. Molecular and cellular biology, 29 (16), 4467-4483.

177. González-Santamaría J., Villalba M., Busnadiego O. et al (2016).

Matrix cross-linking lysyl oxidases are induced in response to

myocardial infarction and promote cardiac dysfunction.

Cardiovascular research, 109 (1), 67-78.

178. Xu X., Wang B., Xu Y. (2013). Expression of lysyl oxidase in human

osteosarcoma and its clinical significance: a tumor suppressive role of

LOX in human osteosarcoma cells. International journal of oncology,

43 (5), 1578-1586.

179. Sung F. L., Cui Y., Hui E. P. et al (2014). Silencing of hypoxia-

inducible tumor suppressor lysyl oxidase gene by promoter

methylation activates carbonic anhydrase IX in nasopharyngeal

carcinoma. American journal of cancer research, 4 (6), 789.

180. Nareshkumar R. N., Sulochana K. N., Coral K. (2018). Inhibition of

angiogenesis in endothelial cells by Human Lysyl oxidase propeptide.

Scientific reports, 8 (1), 1-16.

181. Jeay S., Pianetti S., Kagan H. M. et al (2003). Lysyl oxidase inhibits

ras-mediated transformation by preventing activation of NF-κB.

Molecular and cellular biology, 23 (7), 2251-2263.

182. Milad C, Tetyana G, Mario A et al (2013). Lysyl oxidase inhibition in

the volume overloaded heart prevents adverse collagen remodeling,

apoptosis, and cardiac dysfunction. Federation of American Societies

for Experimental Biology, 4 (6), 789.

183. Min C., Zhao Y., Romagnoli M. et al (2010). Lysyl oxidase propeptide

sensitizes pancreatic and breast cancer cells to doxorubicin‐ induced

apoptosis. Journal of cellular biochemistry, 111 (5), 1160-1168.

184. Qin X., Zhang Z., Xu H. et al (2011). Notch signaling protects retina

from nuclear factor-κB-and poly-ADP-ribose-polymerase-mediated

apoptosis under high-glucose stimulation. Acta Biochim Biophys Sin,

43 (9), 703-711.

185. Ho F. M., Lin W. W., Chen B. C. et al (2006). High glucose-induced

apoptosis in human vascular endothelial cells is mediated through NF-

κB and c-Jun NH2-terminal kinase pathway and prevented by

PI3K/Akt/eNOS pathway. Cellular signalling, 18 (3), 391-399.

186. Sato S., Zhao Y., Imai M. et al (2013). Inhibition of CIN85-mediated

invasion by a novel SH3 domain binding motif in the lysyl oxidase

propeptide. PloS one, 8 (10),

187. Li J., Gu X., Ma Y. et al (2010). Nna1 mediates Purkinje cell dendritic

development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling.

Neuron, 68 (1), 45-60.

188. Cheng T., Liu Q., Zhang R. et al (2014). Lysyl oxidase promotes

bleomycin-induced lung fibrosis through modulating inflammation.

Journal of molecular cell biology, 6 (6), 506-515.

189. Ma ki J. M., Ra sa nen J., Tikkanen H. et al (2002). Inactivation of the

lysyl oxidase gene Lox leads to aortic aneurysms, cardiovascular

dysfunction, and perinatal death in mice. Circulation, 106 (19), 2503-

2509.

190. Nguyen Q. D., Schachar R. A., Nduaka C. I. et al (2012). Dose-

ranging evaluation of intravitreal siRNA PF-04523655 for diabetic

macular edema (the DEGAS study). Investigative ophthalmology &

visual science, 53 (12), 7666-7674.

191. Nguyen Q., Schachar R., Nduaka C. et al (2012). Phase 1 dose-

escalation study of a siRNA targeting the RTP801 gene in age-related

macular degeneration patients. Eye, 26 (8), 1099-1105.

192. Nguyen Q. D., Schachar R. A., Nduaka C. I. et al (2012). Evaluation of

the siRNA PF-04523655 versus ranibizumab for the treatment of

neovascular age-related macular degeneration (MONET Study).

Ophthalmology, 119 (9), 1867-1873.

193. Mao H., Gorbatyuk M. S., Rossmiller B. et al (2012). Long-term

rescue of retinal structure and function by rhodopsin RNA

replacement with a single adeno-associated viral vector in P23H RHO

transgenic mice. Human gene therapy, 23 (4), 356-366.

194. Kim Y.-H., Kim Y.-S., Park C.-H. et al (2008). Protein kinase C-δ

mediates neuronal apoptosis in the retinas of diabetic rats via the Akt

signaling pathway. Diabetes, 57 (8), 2181-2190.

195. Abcouwer S. F. (2013). Angiogenic factors and cytokines in diabetic

retinopathy. Journal of clinical & cellular immunology, (11), 1.

196. Semeraro F., Cancarini A., Rezzola S. et al (2015). Diabetic

retinopathy: vascular and inflammatory disease. Journal of diabetes

research, 2015,

197. Vinores S.A., Derevjanik N. L., Ozaki H. et al (1999). Cellular

mechanisms of blood-retinal barrier dysfunction in macular edema.

Documenta Ophthalmologica, 97 (3-4), 217.

198. Brownlee M. (1992). Glycation products and the pathogenesis of

diabetic complications. Diabetes care, 15 (12), 1835-1843.

199. Ge G., Greenspan D. S. (2006). Developmental roles of the BMP1/TLD

metalloproteinases. Birth Defects Research Part C: Embryo Today:

Reviews, 78 (1), 47-68.

Phụ lục 1

MẪU THEO DÕI TẾ BÀO CHO THỬ NGHIỆM

LOX-COLLAGEN IV VÀ LOX-FIBRONECTIN

Ngày 0

Ngày 1

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Ngày 2

Phân lập protein

WB ngày 2

IP ngày 1

IP ngày 2, WB ngày 1

Thay môi trường nuôi cấy

Chuyển TB (30 nghìn tế bào)

Thay môi trường nuôi cấy

(~2 triệu tế bào)

Chuyển sang môi trường nồng độ glucose cao

MT bình thường

MT nồng độ glucose cao

TRONG PROTEIN TOÀN PHẦN

2 đĩa tế bào đường kính 60mm

Phụ lục 2

MẪU THEO DÕI TẾ BÀO CHO THỬ NGHIỆM

LOX-COLLAGEN IV VÀ LOX-FIBRONECTIN

Ngày 0

Ngày 1

Ngày 3

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 4

Ngày 7

Ngày 2

Phân lập protein

WB ngày 2

IP ngày 1

IP ngày 2, WB ngày 1

Thay môi trường nuôi cấy

Chuyển TB (30 nghìn tế bào)

(~2 triệu tế bào)

Chuyển sang môi trường nồng độ glucose cao

MT bình thường

MT nồng độ glucose cao

TRONG PROTEIN CHẤT NỀN NGOẠI BÀO

2 đĩa tế bào đường kính 60mm

Phụ lục 3

MẪU THEO DÕI TẾ BÀO CHO THỬ NGHIỆM

Ngày 0

Ngày 1

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Ngày 2

Phân lập protein

WB ngày 2

IP ngày 1

IP ngày 2, WB ngày 1

Thay môi trường nuôi cấy

Chuyển TB 10 nghìn tế bào

Thay môi trường nuôi cấy

(~1 triệu tế bào)

Chuyển sang môi trường nồng độ glucose cao

MT bình thường

MT nồng độ glucose cao

NHUỘM MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG LOX-COLLAGEN IV

2 đĩa tế bào đường kính 35 mm

Phụ lục 4

MẪU THEO DÕI TẾ BÀO CHO THỬ NGHIỆM

Ngày 0

Ngày 1

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Ngày 2

Phân lập protein

WB ngày 2

IP ngày 1

IP ngày 2, WB ngày 1

Thay môi trường nuôi cấy

Chuyển TB 10 nghìn tế bào

(~1 triệu tế bào)

Chuyển sang môi trường nồng độ glucose cao

MT bình thường

MT nồng độ glucose cao

NHUỘM MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG LOX-FIBRONECTIN

2 đĩa tế bào đường kính 35 mm

Phụ lục 5

MẪU THEO DÕI THỬ NGHIỆM 1 NGÀY NUÔI CẤY

Ngày 0

Ngày 1

Chuyển TB

IP ngày 1

WB ngày 2

IP ngày 2, WB ngày 1

Chuyển sang môi trường non- Phenol

(750 nghìn tế bào)

Nuôi TB trong môi trường bình thường

Chuyển sang môi trường nồng độ glucose cao

(~2 triệu tế bào)

MT bình thường

MT nồng độ glucose cao

TRONG MÔI TRƢỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO

2 đĩa tế bào đường kính 60mm

Phụ lục 6

MẪU THEO DÕI THỬ NGHIỆM 3 NGÀY NUÔI CẤY

Ngà y 2 Ngà y 3

Ngà y 1

Ngà y 0

IP ngày 1

Chuyển TB

WB ngày 2

Thay môi trường nuôi cấy

IP ngày 2, WB ngày 1

Chuyển sang môi trường Non- Phenol

500 nghìn tế bào

Chuyển sang môi trường nồng độ glucose cao

(~2 triệu tế bào)

MT bình thường

MT nồng độ glucose cao

TRONG MÔI TRƢỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO

2 đĩa tế bào đường kính 60mm

Phụ lục 7

MẪU THEO DÕI THỬ NGHIỆM 5 NGÀY NUÔI CẤY

Ngày 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5

Chuyển TB

WB ngày 2

IP ngày1

Thay môi trường nuôi cấy

IP ngày 2, WB ngày 1

Thay môi trường non- Phenol

Chuyển sang môi trường nồng độ glucose cao

(~2 triệu tế bào)

125 nghìn tế bào

MT bình thường

MT nồng độ glucose cao

TRONG MÔI TRƢỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO

2 đĩa tế bào đường kính 60mm

Phụ lục 8

MẪU THEO DÕI THỬ NGHIỆM 7 NGÀY NUÔI CẤY

Ngày 0

Ngày 1

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Ngày 2

WB ngày 2

IP ngày 1

Thay môi trường nuôi cấy

Thay môi trường Non- Phenol

Thay môi trường nuôi cấy

Chuyển TB 30 nghìn tế bào

IP ngày 2, WB ngày 1

Chuyển sang môi trường nồng độ glucose cao

(~2 triệu tế bào)

MT bình thường

MT nồng độ glucose cao

TRONG MÔI TRƢỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO

2 đĩa tế bào đường kính 60mm

Phụ lục 9

MẪU CHẠY ĐIỆN DI PROTEIN

Thử nghiệm số: Ngày thực hiện:

Nguồn protein:

Lượng protein:

Điện di: ... Volt, Thời gian điện di: ... phút

Chất chỉ thị trọng lượng phân tử:

- Protein chỉ thị trọng lượng phân lượng: ...ul

- Dung dịch ly giải: ...ul

Ngăn 1 Ngăn 2 Ngăn 3 Ngăn 4 Ngăn 5 Ngăn 6 Ngăn 7 Ngăn 8 Ngăn 9

Chất chỉ thị trọng lượng phân tử

- 4X Laemmili: ...ul

Phụ lục 10

KỸ THUẬT A: PHÂN LẬP TẾ BÀO SỬ DỤNG TRYPSIN-EDTA

- Rửa các đĩa tế bào bằng dung dịch PBS trong 3 lần

A

B

C

Hình 1. Trypsin hoá.

A. Dung dịch Trypsin-EDTA

B. Trước khi Trypsin hoá (môi trường nuôi cấy màu hồng)

C. Sau khi Trypsin (môi trường nuôi cấy trong suốt)

- Trypsin hoá:

+ Bơm 1ml Trypsin-EDTA vào mỗi đĩa đường kính 60mm

+ Đặt đĩa vào tủ ấm (37 độ C) trong 3-5 phút cho đến khi môi trường

nuôi cấy trở nên trong suốt.

- Sau 3-5 phút quan sát đĩa dưới sinh hiển vi đảm bảo tế bào đã tách

khỏi đĩa và di chuyển trong môi trường nuôi cấy

- Bơm 1 ml môi trường nuôi cấy vào mỗi đĩa để dừng trypsin hoá

- Lấy toàn bộ dung dịch có chứa tế bào ở mỗi đĩa vào các ống có dán nhãn

- Quay ly tâm dung dịch có chứa tế bào ở tốc độ 800 rpm trong 5 phút ở

nhiệt độ 4 độ C

- Loại bỏ dung dịch phía trên, để lại cặn chứa tế bào phía dưới

- Rửa phần cặn tế bào bằng 1ml dung dịch PBS trong 3 lần, sau đó lấy

bỏ hết dung dịch PBS, để lại cặn tế bào trong ống

- Bơm 250 μl dung dịch lysis buffer vào ống chứa cặn tế bào

- Ủ trong đá trong 15 phút.

B

A

Hình 2. Quay ly tâm dung dịch có chứa tế bào

A. Máy quay ly tâm. B. Dung dịch chứa cặn tế bào sau ly tâm. C. Dung dịch

chưa cặn tế bào sau khi rửa với PBS

- Quay ly tâm dung dịch có chứa tế bào ở tốc độ 800 rpm trong 5 phút ở

nhiệt độ 4 độ C

- Loại bỏ phần cặn phía dưới, lấy dung dịch phía trên sang ống mới có

dán nhãn

Phụ lục 11

KỸ THUẬT B: PHÂN LẬP CHẤT NỀN NGOẠI BÀO VỚI

AMONIUM HYDROXIDE (NH4OH)

- Trong tủ hút, chuẩn bị dung dịch NH4OH 20mM bằng cách pha loãng

dung dịch NH4OH với H2O không ion.

- Lấy đĩa tế bào ra khỏi tủ nuôi cấy. Nhẹ nhàng hút bỏ môi trường nuôi cấy.

- Rửa đĩa tế bào bằng dung dịch PBS không chứa ion Ca/Mg bằng cách

bơm dung dịch PBS vào thành đĩa, lắc nhẹ rồi hút bỏ. Lặp lại 3 lần.

- Lấy bỏ hết PBS, cho 1.5 ml NH4OH 20mM vào mỗi đĩa tế bào 60mm

hoặc 1ml . Giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, lắc nhẹ đĩa tế bào mỗi phút

một lần. Lưu ý có thể sử dụng dung dịch NH4OH 8mM với thời gian ủ là 10

phút.

- Sau 5 phút, lấy bỏ dung dịch bao gồm NH4OH, tế bào đã được tách

khỏi lớp chất nền và H2O không ion. Rửa bằng 10ml nước không ion. Lặp

lại 5 lần để đảm bảo loại bỏ hết NH4OH ra khỏi đĩa tế bào. Thành phần còn

lại ở đĩa tế bào là lớp chất nền ngoại bào. Lưu ý luôn giữ đĩa tế bào ẩm trước

khi thực hiện bước tiếp theo bằng cách lưu lại H2O ở lần rửa cuối.

Phụ lục 12

KỸ THUẬT C: PHÂN LẬP PROTEIN TOÀN PHẦN VÀ PROTEIN

CHẤT NỀN NGOẠI BÀO

- Nhẹ nhàng lấy bỏ môi trường nuôi cấy với pipet thuỷ tinh.

- Rửa đĩa nuôi cấy chứa tế bào hoặc chất nền ngoại bào bằng dung dịch

PBS bằng cách bơm dung dịch PBS vào thành đĩa. Lắc nhẹ rồi hút bỏ dung

dịch PBS. Lặp lại 3 lần.

- Hút bỏ dung dịch PBS khỏi đĩa. Cho vào mỗi đĩa 250 μl dung dịch ly giải.

- Dùng thìa cạo mạnh vào đĩa, từ ngoại vi vào trung tâm, lặp lại nhiều

lần để có thể lấy hết protein ở đĩa.

- Lấy dung dịch ly giải có chứa protein thu được ở tế bào cho vào ống 1.5ml.

- Ủ ống trong khay đá khô trong ít nhất 15 phút.

- Sau 15 phút, quay ly tâm với tốc độ 10000 RPM trong 5 phút.

- Bỏ lại phần cặn phía dưới, lấy dịch phía trên có chứa protein vào ống

1.5 ml mới. Ghi nhãn ống bao gồm tên loại protein phân lập và ngày phân

lập. Protein thu được có thể sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -20°C.

A

B

Hình 1. Phân lập protein

A. Thìa cạo protein. B. Các đĩa tế bào chứa protein sau khi rửa PBS. C. Ống

nghiệm chứa protein được ủ trong đá

Phụ lục 13

KỸ THUẬT D: XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ PROTEIN THU ĐƢỢC BẰNG

KỸ THUẬT BCA

- Lau sạch khay 96 ô với dung dịch ethanol.

- Lấy dung dịch A và B sử dụng trong xác định nồng độ protein.

- Cho 200 μl dung dịch A+B (bao gồm 196 μl dung dịch A và 4 μl dung

dịch B, trộn đều 2 thành phần) vào mỗi ô. Vì vậy nếu muốn xác định nồng

độ protein ở 2 mẫu protein thì cần chuẩn bị 400 μl dung dịch A+B.

- Lấy 2 ống 500 μl và ghi nhãn tương ứng protein phân lập từ tế bào

nuôi cấy trong môi trường bình thường hoặc môi trường nồng độ glucose

máu cao.

- Chuẩn bị dung dịch protein theo tỷ lệ sau:

Bảng 1. Lượng dung dịch protein và dung dịch ly giải trong kỹ thuật BCA

Nồng độ (μg/µL) 0 5 1.5 2.0 1.0

Dung dịch protein (μg/μL) 0 6.25 18.75 25 12.5

Dung dịch ly giải (μL) 18.75 6.25 0 25 12.5

Tổng (μL) 25 25 25 25 25

- Nếu muốn đạt nồng độ 1.0 μg/μl, cho 12.5 μl protein và 12.5 μl dung

dịch ly giải vào mỗi ống. Trộn đều các thành phần.

- Cho 25 μl dung dịch protein (bao gồm protein và dung dịch ly giải)

vào mỗi ô có chứa sẵn 200 μl dung dịch A+B.

- Bọc khay bằng giấy bạc, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 30 phút.

- Cho mẫu vào máy đọc kết quả (EL 340 Bio Kinetics Reader), máy sẽ

hiển thị nồng độ protein trong mỗi mẫu.

Phụ lục 14

KỸ THUẬT E: LẮNG ĐỌNG MIỄN DỊCH

Protein được phân lập từ các tế bào này sẽ được tiến hành kỹ thuật

đồng lắng đọng miễn dịch với kháng thể kháng LOX để thu được protein

LOX trong tế bào

- Chuẩn bị:

+ Chuẩn bị 2 ống 1.5ml có ghi nhãn.

+ Chuẩn bị 250 μg protein vào mỗi ống 1.5 ml.

+ Chuẩn bị dung dịch A (bao gồm 100 μL Protein A Agarose và 100

μL 50 mM Tris-HCL, ph 7.4). Bảo quản dung dịch A ở nhiệt độ 4°C. Trộn

đều dung dịch A mỗi lần sử dụng.

- Ngày 1:

+ Làm sạch protein:

 Lấy 7.5 μL dung dịch A cho vào mỗi ống chứa protein.

 Đặt ống chứa dung dịch trên vào máy xoay trong 2 tiếng ở phòng lạnh

4°C.

 Sau 2 tiếng, quay ly tâm tốc độ 13500 RPM trong 5 phút.

+ Lắng đọng miễn dịch:

 Chuyển dung dịch phía trên sang 1 ống mới, bỏ lại phần cặn phía dưới.

 Lấy kháng thể kháng LOX ở tủ lạnh -20°C.

 Lấy 2.5 μl kháng thể kháng LOX cho vào mỗi ống mới.

✓ Đặt ống chứa dung dịch trên vào máy quay qua đêm ở phòng lạnh 4°C

Hình 1. Các ống chứa protein đặt trong máy quay qua đêm ở phòng lạnh.

- Ngày 2:

 Lấy ống chứa dung dịch protein ra khỏi phòng lạnh.

 Cho 25 μl dung dịch A vào ống chứa dung dịch đã quay qua đêm.

Lưu ý trộn đều dung dịch A trước mỗi lần sử dụng.

 Đặt ống vào máy xoay trong 2 tiếng ở phòng lạnh.

 Quay ly tâm tốc độ 14000 RPM.

 Lấy bỏ phần dịch phía trên, để lại cặn phía dưới.

 Cho 1 mL dung dịch ly giải vào mỗi ống, lắc nhẹ và giữ lạnh trong 5

phút.

 Quay ly tâm tốc độ 14000 RPM và nhẹ nhàng lấy bỏ phần dịch phía trên.

 Lặp lại bước rửa với dung dịch ly giải 3 lần.

 Sau đó, quay ly tâm tốc độ 14000 RPM, loại bỏ phần dung dịch phía

trên. Cho 10 μl dung dịch 4x Lammeli vào phần cặn phía dưới, chuẩn bị tiến

hành kỹ thuật WB ngày 1.

Phụ lục 15

KỸ THUẬT F:WESTERN BLOT VỚI KHÁNG THỂ KHÁNG LOX

- Kỹ thuật WB giúp xác định hàm lượng protein chuyên biệt có trong

dung dịch protein nhằm đánh giá mức độ biểu hiện của LOX thông qua tín

hiệu thu được trên phim Xquang hoặc máy phát tín hiệu điện tử. Tín hiệu

biểu hiện dưới dạng các vạch với đậm độ và kích thước khác nhau phản ánh

hàm lượng của LOX trong các mẫu thử.

- Kháng thể sơ cấp: bao gồm 5 μl kháng thể kháng LOX dòng thỏ pha

trong 5ml BSA 5%.

- Kháng thể thứ cấp: bao gồm 0.625g sữa khô không béo, 12.5ml

dung dịch 1X TTBS và 4 μl kháng thể kháng thỏ.

- Protein:

+ Để xác định hàm lượng LOX trong protein toàn phần hoặc protein

chất nền ngoại bào, chuẩn bị các ống nghiệm chứa 25μg protein ở mỗi nhóm

thu được sau kỹ thuật phân lập protein.

+ Để xác định hàm lượng LOX trong tế bào, chuẩn bị các ống nghiệm

chứa protein thu được sau kỹ thuật lắng đọng miễn dịch.

* Ngày thứ nhất

- Chuẩn bị gel

+ Chuẩn bị đĩa thuỷ tinh và khay chứa gel. Vệ sinh sạch bằng cồn 70°.

Kiểm tra đảm bảo khay kín, không bị rò nước.

+ Chuẩn bị dung dịch APS 10% bằng cách pha 0.1g bột APS vào 1 ml

dH2O.

+ Chuẩn bị lớp gel phía dưới

 Thành phần gồm: 1.9 ml dH2O, 1.7 ml 30% Polyacrylamide, 1.3 ml

1.5M Tris, 50 μl 10% SDS, 50 μl APS 10%, và 7 μl Temed.

 Lưu ý luôn thêm Temed cuối cùng.

 Lắc kỹ để trộn đều các thành phần.

 Đổ gel vào khay chứa gel.

Loại bỏ hết bọt khí bằng cách thêm 50μl isobutanol lên trên lớp gel.

 Để gel đông lại trong vòng 30-45 phút.

+ Chuẩn bị lớp gel phía trên

 Thành phần gồm 1.5 ml dH2O, 625 μl 0.5M Tris, 400μl 30%

Polyacrylamid, 25 μl 10% SDS, 12.5 μl 10% APS, và 5 μl Temed.

 Lưu ý luôn thêm Temed cuối cùng.

 Lắc đều để trộn đều các thành phần.

 Đổ gel lên trên lớp gel phía dưới đã đông đặc.

 Để gel đông lại trong vòng 60 phút.

 Có thể sử dụng gel ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh 4°C dùng vào

ngày hôm sau.

Hình 1. Gel đông trong khay thuỷ tinh

- Chuẩn bị mẫu

+ Chuẩn bị 10 ml dung dịch 4x Laemmili bao gồm các thành phần:

4ml Glycerol 100%, 2.4 ml 1M Tris/HCl (pH 6.8), 0.8g SDS, 4mg

Bromophenol Blue, 3.1 ml dH2O, 500 μl β-Mercaptoethanol.

+ Cho dung dịch bao gồm 4x Laemmili và dung dịch protein ở mỗi

nhóm vào 1 ống 1.5ml có dán nhãn. Cho các ống vào máy luân nhiệt

(thermocycler) đun nóng ở nhiệt độ 95° trong 5 phút.

+ Chuẩn bị chất chỉ thị trọng lượng phân tử bao gồm 1.5 μl Proseive,

19.5 μl dH2O và 7 μl 4x Laemmili.

Hình 2. Chuẩn bị dung dịch protein ở các nhóm.

MW: Chất chỉ thị màu. N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng

độ glucose cao.

Hình 3. Các ống nghiệm chứa dung dịch protein trong máy luân nhiệt

- Điện di protein trên gel

+ Cho chất xác định trọng lượng phân tử và dung dịch protein vào các

ngăn gel tương ứng

+ Điện di protein trên gel với công suất 100V trong 70 phút

Hình 4. Điện di protein trên gel

- Chuyển protein từ gel sang màng

+ Chuẩn bị 3 khay chứa lần lượt: Methanol, dH2O và dung dịch chuyển

+ Chuẩn bị màng: Cho màng qua lần lượt 3 khay Methanol, dH2O và

dung dịch chuyển

+ Chuẩn bị giấy lọc: Cho 2 miếng giấy lọc vào khay dung dịch chuyển

+ Lấy gel protein khỏi máy điện di protein

+ Chuẩn bị tấm gel-màng gồm các lớp lần lượt: miếng giấy lọc - màng

- gel protein - miếng giấy lọc

+ Cho tấm gel-màng vào máy chuyển trong 60 phút

A

B

Hình 5. Chuyển protein từ gel sang màng

A. Tấm gel-màng. B. Tấm gel-màng được đặt trong máy chuyển.

- Nhuộm Ponseau-S

+ Sau khi chuyển protein từ gel sang màng, nhuộm màng với dung

dịch Ponseau-S trong 5 phút

+ Rửa màng với dung dịch dH20 trong 1 phút, lặp lại 2 lần

+ Scan màng

+ Sau khi scan màng, rửa màng với TTBS trong 5 phút, lặp lại 2 lần

để tẩy hết màu Ponseau-S

- Cố định với kháng thể sơ cấp

+ Chuẩn bị dung dịch cố định bao gồm 1.25g sữa khô không béo và

25 ml dung dịch TTBS

+ Đặt màng vào khay có chứa 25ml dung dịch cố định, lắc nhẹ trong 60

phút

+ Chuẩn bị kháng thể sơ cấp

+ Sau khi cố định màng với sữa không béo trong 60 phút, rửa màng

với dung dịch TTBS trong 5 phút, lặp lại 2 lần

+ Đặt màng vào túi giấy bóng hình chữ nhật, dán 3 cạnh túi

+ Cho kháng thể vào túi màng, dán cạnh còn lại. Đảm bảo loại bỏ hết

bóng khí khỏi túi giấy bóng trước khi dán cạnh còn lại

+ Cho túi màng vào phòng lạnh, lắc nhẹ qua đêm

* Ngày thứ hai

- Lấy màng từ phòng lạnh, cho vào khay, rửa với dung dịch 1X TTBS

trong 10 phút, lặp lại 3 lần

- Chuẩn bị kháng thể thứ cấp

- Cố định màng với kháng thể thứ cấp trong vòng 60 phút

- Sau 60 phút, rửa màng với dung dịch 1X TTBS trong 10 phút, lặp lại 3 lần

- Ủ màng với 1 ml dung dịch chất nền (substrate)

A

B

Hình 6. Ủ màng với dung dịch chất nền

A. Chất nền AP-Substrate. B. Màng được ủ trong dung dịch chất nền

- Phát hiện và phân tích hình ảnh sử dụng phim X-quang hoặc máy phát

hình ảnh điện tử. Tín hiệu phát ra dưới dạng các vạch kích thước và đậm độ

khác nhau phản ánh hàm lượng protein trong các mẫu. Phần mềm ImageJ

được sử dụng để phân tích các vạch.