Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận levan từ (Bacillus subtilis) và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1-14 ngày tuổi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

LÊ ANH TÚ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN LEVAN TỪ (Bacillus subtilis) VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI CHO GÀ CẢNH GIAI ĐOẠN 1-14 NGÀY TUỔI CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. VŨ KIM DUNG

Hà Nội, 2020

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự

hướng dẫn của TS. Vũ Kim Dung. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là

trung thực, có nguồn gốc rõ ràng và được trích dẫn đầy đủ theo quy định. Công

trình chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2020

Người cam đoan

Lê Anh Tú

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Lâm nghiệp, bằng sự

biết ơn và kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo đã

nhiệt tình hướng dẫn, giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện đề tài nghiên cứu này.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Kim Dung - Bộ môn

Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm

nghiệp, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề

tài. Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn sinh viên

phòng Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại

học Lâm nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo bộ phận Feed Technology - Công ty Cổ

phần Chăn nuôi CP Việt Nam, chi nhánh Xuân Mai, Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi

được tham gia học tập, nghiên cứu trong 2 năm học và giúp đỡ tôi trong việc thực

hiện phần ứng dụng của đề tài nghiên cứu.

Một lần nữa cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng

nghiệp đã động viên, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.

Tuy nhiên điều kiện về năng lực bản thân còn hạn chế, luận văn chắc chắn

không tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các

thầy cô giáo, bạn bè và đồng nghiệp để bài luận văn của tôi được hoàn thiện hơn.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2020

Học viên

Lê Anh Tú

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii

MỤC LỤC ................................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... v

DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... vii

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

Chương 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ....................................... 3

1.1. Tổng quan về levan ........................................................................................... 3

1.1.1. Giới thiệu về levan ..................................................................................... 3

1.1.2. Tính chất ..................................................................................................... 6

1.1.3. Nguồn thu nhận levan ................................................................................ 7

1.1.4. Một số môi trường nuôi cấy kích thích B. subtilis sinh levan .................... 8

1.1.5. Ứng dụng của levan ................................................................................. 10

1.2. Thức ăn chăn nuôi gà cảnh ............................................................................. 12

1.2.1. Giới thiệu về một số giống gà cảnh ......................................................... 12

1.2.2. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi ...... 15

Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 22

2.1. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 22

2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 22

2.3. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 22

2.3.1. Vi sinh vật ................................................................................................. 22

2.3.2. Môi trường ............................................................................................... 22

2.3.3. Hóa chất ................................................................................................... 23

2.3.4. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 23

2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 23

2.4.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp levan (Jothi và

cs, 2019) ............................................................................................................. 23

2.4.2. Phương pháp tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng

hợp levan theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken (Bruna và cs, 2013) .............. 24

2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện thu nhận levan ................................. 25

2.4.4. Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất cám gà cảnh bổ sung levan

(giai đoạn 1-14 ngày tuổi) .................................................................................. 26

2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 30

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 31

3.1. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

levan ...................................................................................................................... 31

3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose .............................................................. 31

3.1.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu ..................................................................... 32

3.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nito ....................................................................... 33

3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ nito .................................................................... 34

3.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp ................................................................ 36

3.1.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc ........................................................................ 36

3.2. Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp levan ............................................................. 38

3.3. Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan ............................................................. 41

3.3.1. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng levan thu được ......... 41

3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và dung môi đến hàm lượng

levan thu được .................................................................................................... 43

3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu được ............. 44

3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu được ............ 45

3.4. Nghiên cứu quy trình sản xuất cám gà cảnh từ chế phẩm levan (giai đoạn 1 -

14 ngày tuổi) .......................................................................................................... 46

3.4.1. Xác định tỷ lệ levan phối trộn .................................................................. 46

3.4.2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ ép viên ...................................................... 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 52

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ

B. subtilis Bacillus subtilis

Ca Canxi

CP Cruide Protein

CS Cộng sự

Fat Fat

FOS Fructo - oligosaccharides

Fib Fiber

GE Gross Energy

GP Glucose trypton

M Moisture

MTCB Môi trường cơ bản

P Photpho

QC&Lab Quality Control & Laboratory

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TGA Trypton Glucose Agar

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Độ kết dính của một số polymer tự nhiên .................................................. 7

Bảng 2.1. Bảng xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi từng

biến số ....................................................................................................................... 25

Bảng 2.2. Thành phần nguyên liệu trong công thức cám gà con giai đoạn 1 - 14

ngày tuổi .................................................................................................................... 26

Bảng 2.3. Thành phần dinh dưỡng sau khi bổ sung levan theo các tỷ lệ .................. 27

Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến chất lượng cám viên ...................... 27

Bảng 2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến các chỉ tiêu vi sinh ......................... 28

Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng levan thu

được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau ........................................................... 39

Bảng 3.2. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX11 ..... 41

Bảng 3.3. Kết quả phân tích dinh dưỡng cám trong công thức ................................ 47

Bảng 3.4. Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng ................................................ 48

khi bổ sung chế phẩm levan ...................................................................................... 48

Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra cảm quan khi bổ sung chế phẩm levan trong công thức

thức ăn chăn nuôi ...................................................................................................... 49

Bảng 3.6. Kết quả phân tích vi sinh khi bổ sung chế phẩm levan trong thức ăn chăn

nuôi ............................................................................................................................ 49

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của levan ......................................................................... 3

Hình 1.2. Sản phẩm dưỡng da mặt với Proteolea® .................................................... 5

Hình 1.3. Sản phẩm dưỡng thể với Slimexir® ............................................................ 5

Hình 1.4. Các sản phẩm levan trên thị trường (www.realbio.com) ............................ 6

Hình 1.5. Gà rừng đỏ tại miền Trung và Tây Nguyên .............................................. 13

Hình 1.6. Giống gà Quý phi ...................................................................................... 13

Hình 1.7. Giống gà lai cá .......................................................................................... 14

Hình 1.8. Giống gà lông xù ....................................................................................... 14

Hình 1.9. Giống gà Serama ....................................................................................... 15

Hình 1.10. Quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi gà ............................... 16

Hình 1.11. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi ...... 18

Hình 1.12. Lấy mẫu nguyên liệu đầu vào ................................................................. 18

Hình 1.13. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu bằng máy DS2500F ............................ 18

Hình 1.14.Kiểm tra nguyên liệu trước khi lưu silo ................................................... 19

Hình 1.15. Hệ thống bồn chứa nguyên liệu .............................................................. 19

Hình 1.16. Máy móc trong hệ thống sản xuất ........................................................... 20

Hình 1.17. Hình ảnh bao cám gà ............................................................................... 21

Hình 1.18. Hình ảnh cám gà...................................................................................... 21

Hình 3.1. Kết quả ảnh hưởng nồng độ sucrose đến khả năng sinh tổng hợp levan . 31

Hình 3.2. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với các nồng độ sucrose

khác nhau................................................................................................................... 31

Hình 3.3. Kết quả ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp levan ... 32

Hình 3.4. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với các nồng độ pH khác

nhau ........................................................................................................................... 33

Hình 3.5. Kết quả ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng sinh tổng hợp levan .... 34

Hình 3.6. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với các nguồn nito khác

nhau ........................................................................................................................... 34

Hình 3.7. Kết quả ảnh hưởng nồng độ nito đến khả năng sinh tổng hợp levan ........ 35

viii

Hình 3.8. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với các nồng độ nito khác

nhau ........................................................................................................................... 35

Hình 3.9. Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp đến khả năng sinh tổng hợp levan ... 36

Hình 3.10. Kết quả ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp levan .... 37

Hình 3.11. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với tốc độ lắc khác nhau . 37

Hình 3.12. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu sinh tổng hợp levan ........................... 40

Hình 3.13. Ảnh hưởng của các yếu tố đến sinh tổng hợp levan ............................... 40

Hình 3.14. Kết quả ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng levan thu được .. 42

Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và dung môi đến hàm

lượng levan thu được ................................................................................................. 43

Hình 3.16. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với tỷ lệ thể tích levan

và dung môi khác nhau ............................................................................................. 43

Hình 3.17. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu được 44

Hình 3.18. Kết quả ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu được .... 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, những

nguyên liệu sinh học an toàn dần được sử dụng để thay thế cho các nguyên liệu hóa

học. Chúng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong cuộc sống.

Các nguyên liệu đó có khả năng đáp ứng những nhu cầu cần thiết và đảm bảo an

toàn trong các mục đích sử dụng. Vì thế, các nhà khoa học đã và đang tiến hành

nghiên cứu thu nhận các hợp chất có nhiều tính năng vượt trội từ vi sinh vật phục vụ

cho đời sống con người.

Levan là hợp chất polymer sinh học được tổng hợp từ vi khuẩn trên môi

trường có thành phần chính là sucrose. Đây là polymer của fructose được tạo ra bởi

liên kết β - (2 - 6) fructo - furanosidic, có mặt trong nhiều loại thực vật và các sản

phẩm từ vi sinh vật. Levan cung cấp nguyên liệu cho hàng loạt các ngành công

nghiệp trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: y dược, thực phẩm và mỹ phẩm. Ứng

dụng tiềm năng của levan để làm chất nhũ hóa dùng trong sữa, chất ổn định, chất

làm đặc và đặc biệt là khả năng phục hồi sức khỏe và có giá trị trong các liệu pháp

điều trị ung thư...

Levan là một polymer của fructose có thể được sản xuất bởi cả thực vật, nấm

men, nấm và vi khuẩn (Jang và cs, 2001). Levan tổng hợp từ các nguồn vi sinh vật

như: Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola,

Seraria sp. (Oseguera và cs, 1996), Rahnella aquatilis (Kim và cs, 2000),

Acetobacter xylinum NCI 1005 (Tajima và cs, 1998) và B. subtilis (Shin và cs,

2005). Trong đó chủng B. subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp levan cao hơn cả

với hiệu suất 40,4 g/l trên môi trường có chứa 200g/l sucrose (Shin và cs, 2005).

Nhưng nhìn chung, hiệu suất thu levan từ các nguồn vi sinh vật chưa cao. Vì vậy,

các nhà khoa học không ngừng tìm kiếm các nguồn thu nhận mới có khả năng thu

được hàm lượng levan cao hơn.

Ở Việt Nam, phong trào chơi gà cảnh ngày một phát triển. Một con gà cảnh có

trọng lượng 500 g lượng thức ăn tiêu tốn chỉ bằng 1/3 con gà công nghiệp, nhưng giá

trị của nó đem lại có thể cao gấp vài chục lần, thậm chí hàng trăm lần gà công nghiệp.

Việc bổ sung dinh dưỡng trong chế độ ăn cho gà cảnh hay chế phẩm sinh học

trong khẩu phần ăn, đặc biệt là giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi là giai đoạn sức đề kháng

kém, nhạy cảm dễ tăng tỷ lệ chết. Bổ sung dinh dưỡng trong giai đoạn này một cách

hợp lý sẽ phù hợp với sự phát triển của gà và giúp cân bằng được dinh dưỡng, tăng

sức đề kháng, tăng lợi khuẩn cho đường ruột cũng như cân đối về ngoại hình phục

vụ cho mục đích sử dụng.

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu

thu nhận levan từ Bacillus subtilis và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn cho

gà cảnh giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi”.

Chương 1

TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Tổng quan về levan

1.1.1. Giới thiệu về levan

Levan là thuộc một trong hai loại fructans (là các cacbohydrate thường tìm

thấy trong thực vật, tảo, vi khuẩn). Fructans gồm có hai loại chính là levan và

inulins được phân biệt bởi các loại liên kết. Các đơn phân trong phân tử levan liên

kết với nhau bằng liên kết ß (2 - 6) còn trong phân tử inulins là liên kết ß (2 - 1)

(Han và cs, 1990). Theo phân loại levan thuộc nhóm thứ hai của fructans.

Levan là polymer của fructose được tạo ra bởi liên kết β - (2 - 6) fructo -

furanosidic (Ki- Hyo và cs, 2001; Mardo và cs, 2014). Các vi sinh vật có khả năng

tổng hợp levan gồm: Lactobacillus gasseri, B. circulans, E. amylovora, Seraria sp.,

Acetobacter xylinum NCI 1005, Z. mobilis và B. subtilis (Anwar và cs, 2010; Devi

và Alamu, 2013; Oliveira và cs, 2007). Levan là polysaccharide ngoại bào được

tổng hợp từ vi khuẩn trên môi trường có thành phần chính là sucrose. Do các vi

khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp levansucrose để chuyển hóa sucrose thành

levan (Mardo và cs, 2014).

Năm 2012, một nghiên cứu được thực hiện bởi Esawy và cs cho thấy vi

khuẩn Bacillus spp được tách chiết từ mật ong có khả năng sinh tổng hợp levan.

Mặc dù cấu trúc của levan được đặc trưng bởi một mạch thẳng của liên kết ß (2 - 6)

nhưng có nhiều levan được tổng hợp từ vi khuẩn có cấu trúc phân nhánh với liên kết

ß (2 - 1). Các mạch nhánh thường ngắn và đôi khi chỉ có môt đơn phân fructose.

Fructans ngắn nhất là 6 - ketose và đây cũng chính là fructan ngắn nhất trong các

loại levan. Levan là một trong số ít các polyme tự nhiên của carbohydrate tồn tại

dưới dạng furanose.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của levan

Levan được sản xuất từ các sinh vật khác nhau sẽ có sự khác biệt về trong

lượng phân tử và mức độ phân nhánh. Levan được tổng hợp từ vi khuẩn có khối

lượng phân tử lớn hơn levan thu được từ thực vật khoảng 2 - 100 kDa (Pontis và

Campillo, 1985; Keith và cs, 1991). Levan được sản xuất từ thực vật có trong lượng

phân tử khoảng 2 - 33 kDa (Rhee và cs, 2002). Levan được sản xuất từ quá trình lên

men bởi vi khuẩn Zymomonas mobilis có khối lượng phân tử khoảng 107 Da, tương

ứng với 60000 đơn phân của fructose (Viikari và cs, 1986). Bên cạnh đó, levan

được sản xuất từ vi khuẩn B. subtilis Natto có hai loại trọng lượng phân tử khác

nhau, levan có khối lượng phân tử cao 1794 kDa và levan có khối lượng phân tử

thấp 11 kDa. Levan có trọng lượng phân tử khác nhau sẽ cần thiết cho từng mục

đích cụ thể (Shin và cs, 2005).

Trong đó chủng B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp levan cao hơn cả với

40 g/l trên môi trường có chứa 200 g/l sucrose (Shih và cs 2005).

Trong nghiên cứu của Jothi và cs (2019) cho thấy levan được tổng hợp bởi B.

subtilis MTCC 441 sử dụng sucrose làm nguồn carbon. Chiết xuất nấm men (YE) là

nguồn nitơ tốt nhất. Nồng độ sucrose 100 g/l, pH 7, nồng độ YE 2 g/l, tốc độ lắc

150 vòng/phút là giá trị tối ưu cho sản xuất levan. Kết quả cho thấy năng suất levan

thu được tương ứng là 0,395 g/g sucrose.

Các nghiên cứu chỉ ra levan có khả năng chống ung thư (Calazans cs, 2000;

Yoo và cs, 2004). Levan sản xuất từ Microbacterium laevaniformans, Rahnella

aquatilis và Zymomonas mobilis có khả năng chống lại tám dòng khác nhau của tế

bào ung thư (El-Safty và cs, 2012). Nhiều nghiên cứu về levan đã được thúc đẩy bởi

vai trò của chúng trong điều trị sâu răng (Aridson và cs, 2006) và làm giảm

cholesterol (Yamamoto và cs, 1999), điều hòa các hoạt động miễn dịch trong cơ thể

(Calazans và cs, 1997; Yamamoto và cs, 1999). Levan có thể được sử dụng để sản

xuất DFA IV (di - D - fructose - 2,6: 6.2 - dianhydride) với độ ngọt bằng một nửa

độ ngọt của sucrose và có tính ổn định. Vì vậy, levan được ứng dụng như một chất

làm ngọt trong các sản phẩm sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường (Jaecho và cs,

2001). Trong vài thập kỷ qua, một số nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy các

chủng vi khuẩn để tăng cường khả năng tổng hợp levan đã được thực hiện. Oliveira

và cs (2007) tiến hành tối ưu điều kiện nuôi cấy Zymomonas mobilis bằng phương

pháp đáp ứng bề mặt với 2 nhân tố thay đổi, thu được hàm lượng levan cao nhất

21,68 g/l. Santos và cs (2013), cũng tối ưu điều kiện nuôi cấy B.subtilis Natto bằng

phương pháp này cho hàm lượng levan đạt 111,6 g/l với nồng độ sucrose (400 g/l)

và thời gian nuôi 16 giờ.

Hiện nay, levan đang được rất nhiều nhà khoa học và sản xuất quan tâm bởi

các đặc tính vượt trội như: khả năng hòa tan tốt trong dầu và nước, độ kết dính

mạnh, khả năng tương thích sinh học tốt, chống ung thư và khả năng tạo màng

(Santos và cs, 2013). Vì vậy, levan được ứng dụng trong mỹ phẩm, thực phẩm và

dược phẩm (Jaecho và cs, 2001; Santos và cs, 2013).

Levan được sử dụng trong chăm sóc cá nhân, y tế, công nghệ nanno (Gupta

và cs, 2010), nuôi trồng thủy sản và các ứng dụng thực phẩm (Oner và cs, 2016).

Natural Polymers Inc. (Hoa Kỳ); Real Biotech Co., Ltd., (Hàn Quốc) và Advance

Co., Ltd., (Nhật Bản) là những nhà sản xuất chính của levan ở quy mô thương mại.

Hai ví dụ phổ biến của các sản phẩm thương mại dựa trên levan có sẵn trên thị

trường là Proteolea® và Slimexir® (Oner và cs, 2016).

Hình 1.2. Sản phẩm dưỡng da mặt Hình 1.3. Sản phẩm dưỡng thể

với Proteolea® với Slimexir®

Bên cạnh đó, một số các sản phẩm thực phẩm chức năng đã được bày bán tại các hệ

thống siêu thị tại Hàn Quốc, Nhật Bản của công ty RealBiotech (www.realbio.com)

(Beste và cs, 2016).

Hình 1.4. Các sản phẩm levan trên thị trường (www.realbio.com)

1.1.2. Tính chất

Levan là một loại bột tinh thể màu trắng có tính chất như một chất kết dính

mạnh mẽ. Các hạt có dạng hình cầu đường kính 75 - 200 nm. Các thành phần và

tính chất của levan phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp

levan (Khadiga và cs, 2015).

Không giống như polysaccharides được sử dụng như chất nhũ hóa và chất

làm đặc, levan không trương lên trong nước và độ nhớt thấp 0,38 dl/gm ở 250C (In

Young Bae và cs, 2007).

Levan rất dễ tan trong nước nóng và gần như không hòa tan (< 0,5%) trong

nước ở nhiệt độ phòng. Khả năng hòa tan trong nước nóng của levan cao hơn inulin

được đặc trưng bởi liên kết ß (2 - 6) so với liên kết ß (2 - 1) và cấu trúc mạch nhánh

có thể chỉ là một yếu tố hỗ trợ (Justin và cs, 2007).

Levan là một homopolymer của fructose không hòa tan trong hầu hết các

dung môi hữu cơ như (Ashton và cs, 2012):

- Methanol, ethanol, isopropanol, n - propanol;

- Acetone, methylethylketone, toluene;

- Ethyl lactate;

- N, N - dimethyloctanamide, N, N - dimethyl - decanamide;

- Methyl caprylate/caprate, methylpalmitate/ oleate;

- D - limonene;

- Propylene carbonate, methoxypolyethylene glycol, polyethylene glycol;

- Dimethyl formamid;

- Ethoxyethyl acetate, anhydride acetic;

- Furfuryl alcohol;

- Dầu hỏa, xăng.

Levan không bị phân cắt và thủy phân bởi enzyme invertase và amylase,

nhưng rất dễ bị thủy phân bởi acid tạo thành fructose. Levan bị thủy phân hoàn toàn

thành các đơn phân fructose trong HCl 1N ở 700C (Kang và Cottrell, 1979). Levan

cũng được thủy phân bởi axit oxalic 0,5% (Shin và cs, 2005). Theo Szwengiel và cs

(2004) sản phẩm của quá trình thủy phân levan bởi axit yếu là các fructo -

oligosaccharides (FOS) ngắn và các đơn phân fructose.

Độ kết dính của levan rất mạnh. So với các polymer tự nhiên, levan có độ kết

dính mạnh hơn rất nhiều, được thể hiện qua bảng 1.1 (Bruna và cs, 2015).

Bảng 1.1. Độ kết dính của một số polymer tự nhiên

Polymer tự nhiên Độ kết dính (psi)

Levan 991

Carboxymethylcellulose 193

Inulin 124

Guargum 63

Xanthan gum 33

Levan có một số đặc tính sinh học như: ức chế khối u, kích thích và tăng tính

thấm tế bào (Leibovici và Stark, 1984). Hơn nữa, levan còn có khả năng tương thích

sinh học tốt và khả năng tạo màng. Vì vậy, levan được ứng dụng nhiều trong y học

(Shin và cs, 2005).

1.1.3. Nguồn thu nhận levan

Levan là một cacbohydrate có thể được sản xuất bởi cả thực vật, nấm men,

nấm và vi khuẩn (Jang và cs, 2002). Levan được tìm thấy trong một số loại cỏ như:

Dactylis glomerata, Poa secunda và Agropyron cristatum. Levan cũng được chứa

trong lúa mì và lúa mạch (Hordeum vulgare), nấm (Aspergillus sydawi và A.

versicolor) (Han, 1990). Levan được tổng hợp bởi nhiều vi sinh vật như: Zymomonas

mobilis (Muro và cs, 2000), Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia

amylovora, Erwinia herbicola, Seraria sp (Oseguera và cs, 1996), Rahnella aquatilis

(Kim và cs, 2000), Pseudomonas syringae (Hettwer và cs, 1995) và Acetobacter

xylinum NCI 1005 (Tajima và cs, 1998). Levan được sản xuất từ các sinh vật khác

nhau sẽ có sự khác biệt về trọng lượng phân tử và mức độ phân nhánh.

Levan được sản xuất từ vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường có thành

phần chính là sucrose. Dựa trên chất nền bằng phản ứng chuyển gốc fructose của

sucrose trong levan β - 2, 6 - fructan bởi enzyme D - glucose - fructosyl transferare

bởi một số vi sinh vật. Nhưng nguồn vi sinh vật để sản xuất levan ở quy mô công

nghiệp cho năng suất cao rất hiếm.

Gần đây các nhà khoa học đã tìm ra vi khuẩn B. subtilis Natto có khả năng

sản xuất ra một hỗn hợp poly acid glutamic và levan. Khi chúng được nuôi cấy

trong môi trường có thành phần chính gồm đường sucrose và axit amin L -

Glutamic. Tuy nhiên, hỗn hợp poly acid -  - glutamic chủ yếu được sản xuất trong

môi trường có chứa acid -  - glutamic và không có đường sucrose. Ngược lại, levan

chỉ được sản xuất khi vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường có tới 20% (w/w)

đường sucrose nhưng không có glutamate. Các nhà khoa học cho rằng B. subtilis

Natto có tiềm năng sản xuất lượng lớn levan và sản phẩm dễ dàng tinh sạch (Shin

và cs, 2005).

1.1.4. Một số môi trường nuôi cấy kích thích B. subtilis sinh levan

Levan sản xuất từ vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường có thành phần

chính là đường cacbonhydrate như sucrose.

Năm 2004, Szwengiel và cs, đã nuôi cấy B. subtilis DSM 347 trên môi trường

có thành phần như sau: sucrose (150 g/l), acid citric (11,7 g/l), natri sulfat (4,0 g/l),

ammonium hydrogen phosphate (4,2 g/l), cao nấm men (5,0 g/l) và 100 ml/l của dung

dịch muối (với các thành phần: KCl (7,62 g/l), MgCl2 (4,18 g/l), MnCl2 (5,43 g/l),

FeCl3 (0,49 g/l), ZnCl2 (0,21 g/l)). Độ pH của môi trường nuôi cấy đã được điều

chỉnh tới 6,8 bằng dung dịch amoniac 25%. Môi trường được khử trùng ở 121oC

trong 20 phút. Sau 16 giờ nuôi cấy thu được levan với hàm lượng 35 g/l.

Năm 2005, Shin và cs đã tổng hợp được 40,4 (g/l) levan từ B. subtilis (Natto)

sau 21 giờ lên men trên môi trường có sucrose (200 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l),

NaH2PO4.2H2O (3 g/l) và Na2HPO4.12H2O (3 g/l) ở pH 7.

Năm 2007, theo Oliverira và cs sau 24 giờ nuôi cấy Zymomonas mobilis

ATCC 31821 trên môi trường sinh tổng hơp levan có các thành phần như sau:

sucrose (350 g/l), cao nấm men (2 g/l), KH2PO4 (1 g/l), (NH4)2SO4 (1 g/l),

MgSO4.7H2O (0,5 g/l) ở 25oC đã sinh tổng hợp được levan 21,7 g/l.

Nghiên cứu của Santos và cs (2013), cho thấy từ chủng B. subtilis được phân

lập từ thực phẩm Natto thương mại của Nhật Bản có khả năng sinh tổng hợp levan

rất cao so với các nghiên cứu trước đây. Chủng B. subtilis Natto được nuôi cấy trên

môi trường có hàm lượng sucrose cao (400 g/l) ở 370C. Ngoài sucrose môi trường

lên men còn có nhiều thành phần khác như: cao nấm men (2,0 g/l), KH2PO4 (1,0

g/l), (NH4)2SO4 (3,0 g/l), MgSO4. 7H2O (0,06 g/l), MnSO4 (0,02 g/l). Sau 16 giờ

nuôi cấy tác giả đã tổng hợp được 111,6 g/l levan từ B. subtilis Natto.

Gần đây, Jothi và cs (2019), đã nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp levan từ

chủng Bacillus subtilis MTCC 441 trong điều kiện môi trường dịch chiết nấm men

(YE) nồng độ 2 g/l, nồng độ sucrose 100 g/l, pH 7, tốc độ lắc 150 vòng/ phút đã

tổng hợp được hàm lượng levan tương ứng là 0,395 g/g sucrose.

Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật ảnh hưởng tới thành phần và

tính chất của levan. Theo Guilbert và Combes (1996), nồng độ sucrose trong môi

trường nuôi cấy ảnh hưởng đến trọng lượng phân tử của levan. Nồng độ sucrose

trong môi trường nuôi cấy tỷ lệ nghịch với kích thước chuỗi polymer của fructose.

Santos và cs (2013), đã nuôi cấy B. subtilis Natto trên môi trường giàu sucrose (400

g/l) sinh tổng hợp được hai loại levan trọng lượng phân tử khác nhau. Levan có khối

lượng phân tử cao 1794 kDa và levan có khối lượng phân tử thấp 11 kDa. Điều này

được lý giải bởi ban đầu, trong môi trường nuôi cấy nồng độ sucrose cao nên vi

khuẩn sẽ tổng hợp được levan có trọng lượng phân tử thấp 11 kDa, còn sau đó trong

quá trình nuôi vi sinh vât, vi khuẩn sử dụng nhiều sucrose, làm cho nồng độ sucrose

giảm đi rất nhiều nên sẽ tổng hợp được các phân tử levan có trọng lượng cao 1794

kDa (Santos và cs, 2013).

1.1.5. Ứng dụng của levan

Trong những năm gần đây, việc sử dụng loại polysaccharide mới từ vi khuẩn

đang phát triển mạnh, loại polysaccharide mới này được gọi là một polymer sinh

học có tính tương thích sinh học cao, thân thiện với môi trường và polysaccharide

sản xuất từ vi khuẩn này được xem là một nguồn năng lượng tiềm năng trong ngành

công nghệ sinh học.

Levan là một loại polymer sinh học cũng đang được rất nhiều người quan

tâm bởi các đặc tính vượt trội của levan như khả năng hòa tan tốt trong dầu và nước,

độ kết dính mạnh, khả năng tương thích sinh học tốt và khả năng tạo màng. Vì vậy,

levan được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như: mỹ phẩm, thực phẩm, dược

phẩm, y học (Hae và cs, 2003).

Trong lĩnh vực y học, levan được coi là một sản phẩm tuyệt vời của sinh học

bởi khả năng tương thích với hoạt động của cơ thể con người. Do có hoạt tính

polymer sinh học nên levan có thể dùng để sản xuất các fructose tinh khiết dùng

trong y tế, có khả năng chống ung thư (Calazans và cs, 2000; Yoo và cs, 2004).

Levan sản xuất từ Microbacterium laevaniformans, Rahnella aquatilis và

Zymomonas mobilis có khả năng chống lại tám dòng khác nhau của tế bào u (El-Safty

và cs, 2012). Nhiều nghiên cứu về levan đã được thúc đẩy bởi vai trò của chúng trong

điều trị sâu răng (Aridson và cs, 2006) và làm giảm cholesterol (Yamamoto và cs,

1999), điều hòa các hoạt động miễn dịch trong cơ thể (Calazans và cs, 1997). Ngoài

ra, levan còn tạo ra lượng hypocholesterol lớn (Yamamoto, 1999).

Một số levan còn có các hoạt tính sinh học gần giống như huyết tương, vì

vậy có khả năng làm tăng khối huyết tương, hạ đường huyết trong điều trị bệnh tiểu

đường. Levan có thể được sử dụng để sản xuất DFA IV (di - D - fructose - 2,6: 6.2 -

dianhydride). DFA IV thuộc nhóm các hợp chất di - fructose anhydride (DFAs) là

kết quả của một phản ứng transfructosylation intramolecular. DFA IV được đặc

trưng bởi độ ngọt bằng một nửa độ ngọt của sucrose và có tính ổn định. Vì vậy,

levan được ứng dụng như một chất làm ngọt trong các sản phẩm sử dụng cho bệnh

nhân tiểu đường (Jaecho và cs, 2001).

Năm 2009, Kang và cs đã nghiên cứu các khả năng gây độc của levan đối

với dòng tế bào nguyên bào sợi người. Kết quả nghiên cứu cho thấy, levan không có

khả năng gây độc đối với các dòng tế bào với nồng độ levan 100 mg/ml và 1 mg/ml.

Năm 2011, theo Dahech và cs levan có hiệu quả trong việc ức chế tăng

đường huyết gây ra bởi bệnh tiểu đường và nghiên cứu cho thấy khi bổ sung levan

vào chế độ ăn uống có thể hữu ích trong việc ngăn ngừa các biến chứng bệnh tiểu

đường ở chuột trưởng thành.

Năm 2012, Esawy và cs đã nghiên cứu levan được tổng hợp từ Bacillus spp

phân lập từ mật ong có khả năng kháng vi rút H5N1 và 40 loại denovirus.

Trong ứng dụng dược phẩm, levan được dùng làm màng bao của thuốc viên.

Levan có cấu trúc ít phân nhánh thường tạo độ nhớt kém có thể sử dụng như một

chất kết dính trong thuốc viên và dùng làm màng bao bên ngoài của viên thuốc (In

và cs, 2007).

Trong công nghệ thực phẩm, levan được sử dụng làm chất phụ gia thực

phẩm có đặc tính prebiotic và hypocholesterol. Prebiotic là những thành phần thức

ăn không bị tiêu hóa và hấp thụ bởi dịch dạ dày và ruột non mà có khả năng kích

thích sự phát triển và hoạt động của các vi khuẩn có lợi trong đường tiêu hóa (Olano

và cs, 2002). Bên cạnh đó, levan cũng được dùng làm chất tạo ngọt, chất nhũ hóa

trong sữa và chất kết dính. Ban đầu, levan được coi là một sản phẩm phụ của quá

trình lên men sản xuất ethanol, tăng độ nhớt của siro đường mía (Ernandes và

Garcia - Cruz, 2005).

Ngoài ra, levan được bổ sung vào các sản phẩm mỹ phẩm với vai trò làm ẩm

da, giảm các hiệu ứng kích thích da và tăng mùi hương cho sản phẩm (Calazans và

cs, 2000).

Ứng dụng của levan là một chất ổn định, chất làm đặc, tác nhân bề mặt, tác

nhân đóng gói, chất làm gia tăng hương vị, màu sắc ngoài ra còn là chất tạo mùi vị

(Selim và cs, 2013).

Một số nghiên cứu chỉ ra một số vi khuẩn có tiềm năng sản xuất lượng lớn

levan có khối lượng phân tử cao và dễ tinh sạch, không lẫn các sản phẩm phụ

polysaccharide khác. Như vậy, chi phí sản xuất levan thấp hơn sẽ làm tăng việc sử

dụng levan (Shin và cs, 2005).

Trong lĩnh vực thức ăn chăn nuôi, nghiên cứu của Sanders và cs (2003), đã

chỉ ra rằng levan có thể được sử dụng làm phụ gia thức ăn chăn nuôi với các đặc

tính prebiotic và hypocholesterol.

Levan được bổ sung vào khẩu phần ăn với hàm lượng 0,1% giúp cải thiện

hiệu suất tăng trưởng, làm tăng khả năng tiêu hóa và tăng số lượng Lactobacillus

trong phân đồng thời tác dụng có lợi đối với hệ thống miễn dịch ở lợn trong giai

đoạn đang phát triển (Li và cs, 2013).

Việc sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trưởng trong thức ăn chăn

nuôi đã bị cấm hoàn toàn hoặc một phần ở một số quốc gia trên thế giới. Xin và cs

(2017), đã nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của levan đến hiệu suất tăng trưởng, khả

năng tiêu hóa chất dinh dưỡng và ảnh hưởng của vi khuẩn Coliform gây bệnh tiêu

chảy ở lợn sau cai sữa. Kết quả chỉ ra rằng bổ sung levan trong chế độ ăn làm tăng

hiệu suất tăng trưởng, cải thiện khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng, tăng số lượng vi

khuẩn axit lactic trong phân và có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng tương tự như

kháng sinh apramycin của lợn sau cai sữa (Zhang và Kim, 2014).

Probiotic là hợp chất vi sinh vật sống được coi là một thay thế tốt cho kháng

sinh, việc sử dụng các sản phẩm probiotic này trong chế độ ăn của gia cầm có tác

động tích cực đến sức khỏe và sự tăng trưởng. Hiện tại có nhiều nghiên cứu cho

thấy rằng sử dụng men vi sinh bổ sung vào chế độ ăn giúp cải thiện chất lượng thịt

gia cầm (Teoroda và cs, 2017). Các nghiên cứu của Yan và cs (2017) cũng cho thấy

khi bổ sung các loại chủng của Bacillus làm tăng trọng lượng của gà, cải thiện mùi

vị đặc trưng và gia tăng sự đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột.

1.2. Thức ăn chăn nuôi gà cảnh

1.2.1. Giới thiệu về một số giống gà cảnh

- Gà rừng cảnh:

Có hai giống chính là gà lôi và gà đỏ, gà rừng hiện là loài vật nuôi được

săn đón trên nhiều hội sinh vật cảnh ở Việt Nam. Đây là giống gà khó nuôi và

khó tìm được cá thể thuần chủng nên người ta có thể chi một số tiền rất lớn để sở

hữu được nó.

Hình 1.5. Gà rừng đỏ tại miền Trung và Tây Nguyên

(Nguồn: Giadinh.net)

- Gà Quý phi:

Giống như tên gọi, đây là giống gà “quý phái” và vô cùng mạnh mạnh mẽ.

Điểm đặc biệt là chiếc mào gà Quý phi giống như quả Phật thủ mà không loại gà

nào có được.

Bộ lông của gà Quý phi cũng rất độc đáo với hai màu đen, trắng, lúc nào

cũng bồng lên như cái nón cùng với đôi mắt đỏ đặc trưng.

Hình 1.6. Giống gà Quý phi

(Nguồn: Giadinh.net)

- Gà lai cá:

Thời gian gần đây, gà vảy cá (gà lai cá), tên quốc tế là gà Sebright, đang trở

thành một vật nuôi “độc” dành cho những người mê sinh vật cảnh Việt Nam.

Hình 1.7. Giống gà lai cá

(Nguồn: Hoisvcvn.org.vn)

Chúng có điểm đặc trưng là những chiếc lông vũ tròn trịa có viền đen bao

quanh, trông rất giống vảy cá. Điều này tạo nên một vẻ quyến rũ đặc trưng cho

những chú “gà lai cá” này.

Không những vậy, gà vảy cá còn có một lịch sử rất đáng tự hào. Giống gà

này được tạo ra từ thế kỷ 19, trong một chương trình nhân giống chọn lọc do nhà

nghiên cứu người Anh John Saunders Sebright (1767 - 1846) tiến hành.

- Gà lông xù:

Gà lông xù hay còn gọi là gà Silkie là giống gà rất đặc biệt bởi chúng sở hữu

một bộ lông xù cực kỳ lạ mắt và đáng yêu. Gà lông xù có đủ các loại màu sắc từ

như màu vàng, trắng, đen... Mỗi con gà trưởng thành nặng từ 1,5 - 2 kg, vòng đời có

thể kéo dài tới 7 - 8 năm, nếu chăm sóc tốt có thể sống được 9 năm.

Hình 1.8. Giống gà lông xù

(Nguồn: Giadinh.net)

Do sở hữu bộ lông tơ mịn, nhỏ nên giống gà lông xù không thể bay nhảy như

các loại gà bình thường. Đây là loại gà này đẻ rất ít trứng, chúng chỉ đẻ từ 7 - 10

quả trong một chu kì. Đây chính là lí do khiến số lượng loại gà này trở nên hiếm hoi

trên thị trường sinh vật cảnh Việt Nam.

- Gà Serama

Hình 1.9. Giống gà Serama

(Nguồn: Giadinh.net)

Được xem là giống gà nhẹ nhất thế giới, mỗi con gà Serama trưởng thành chỉ

có trọng lượng từ 300 - 500g. Tuy nhỏ bé, khó nuôi và rất tốn công tập luyện để có

được dáng đứng chuẩn, đây là giống gà được gây chú ý tới nhiều hội sinh vật cảnh

trên Thế giới.

1.2.2. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi

Do nhu cầu dinh dưỡng nên mỗi loại gà khác nhau đều dùng các loại cám

riêng biệt. Tuy nhiên, đối với gà con giai đoạn từ 1-14 ngày tuổi là giai đoạn còn

nhỏ nên nhu cầu dinh dưỡng của các loại gà trong giai đoạn này là giống nhau.

Dưới đây là quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi gà

Hình 1.10. Quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi gà

 Thuyết minh quy tình công nghệ

- Nguyên liệu nhà máy sử sựng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi bao gồm:

+ Nguyên liệu thô: Ngô, khô đậu tương, sắn lát, bã bia, bã cải;

+ Nguyên liệu mịn: Cám gạo, bột cá, bột thịt, bột lông vũ, nguyên liệu

khóang;

+ Nguyên liệu lỏng: Rỉ mật, dầu cá, dầu cám gạo.

- Dây chuyền tiếp nhận và xử lý nguyên liệu: Đây là công đoạn đầu tiên của

quá trình sản xuất với mục đích tiếp nhận, dự trữ, bảo quản nguyên liệu cho nhà

máy. Sau đó, tiến hành xử lý sơ bộ và làm sạch để đưa vào các công đoạn tiếp theo.

+ Làm sạch: Nguyên liệu được loại bỏ các tạp chất bằng kích thước lưới sàng

5mm, sử dụng hệ thống nam châm để loại bỏ kim loại.

+ Nghiền nguyên liệu: Mục đích để đạt được kích thước theo yêu cầu, tăng

khả năng đồng đều giữa các thành phần nguyên liệu, phân bố đồng đều dinh dưỡng

và khả năng tiêu hóa. Hơn nữa, nguyên liệu được nghiền mịn sẽ thuận lợi cho quá

trình tạo viên, làm cho viên thức ăn có bề mặt bóng, dễ liên kết hơn với các cấu tử

thành phần.

+ Máy trộn: Có nhiệm vụ đảo trộn các loại nguyên liệu giúp tăng tính đồng

đều. Thời gian trộn chia làm 2 giai đoạn: trộn khô (15 giây) và trộn ướt (15 giây).

Ngoài ra máy trộn có nhiệm vụ tăng cường các phản ứng hóa học, sinh học khi chế

biến thức ăn, tăng cường quá trình trao đổi nhiệt khi đun nóng hay làm lạnh. Quá

trình trộn có bổ sung thêm các chất phụ gia, các loại chất lỏng, khóang… Rỉ mật

được bổ sung vào làm tăng độ kết dính viên cám và giúp vật nuôi ngon miệng, rỉ

mật được qua máy phun mật trước khi phun trực tiếp vào cám.

+ Máy ép viên: Sau khi nguyên liệu được phối trộn sẽ vào máy ép viên. Tại

đây, máy ép viên cấp nhiệt khoảng 70 - 800C (tùy theo loại cám) và trong thời gian

30 giây, làm chín đều viên cám. Toàn bộ cám được chạy qua quả lô ép để tạo hình

viên và được cắt bới dao ép để có độ dài thích hợp. Độ ẩm sẽ được kiểm soát và đưa

về mức dưới 12%.

+ Phun enzyme: Các loại enzyme được sử dụng trong thức ăn chăn nuôi giúp

làm tăng việc hấp thụ các loại thức ăn khó tiêu hóa và cải thiện hệ vi sinh vật đường

ruột. Sau quá trình làm mát về nhiệt độ môi trường, enzym được phun trực tiếp vào

viên cám với tỷ lệ thích hợp.

- Thành phẩm

+ Đóng bao: Cám từ bồn chứa thành phẩm được vào trực tiếp các máy đóng

bao với khối lương 25kg/bao. Mỗi bao cám đều được in phun dấu để biết được số

lô, ngày sản xuất, ngày công thức và các loại thuốc sử dụng.

+ Bảo quản: Toàn bộ bao cám sau khi đóng bao được robot xếp gọn vào

pallet và không quá 30 bao/1 pallet. Bảo quản nơi khô ráo, thóang mát, thời gian

bảo quản không quá 90 ngày kể từ ngày sản xuất.

Hình 1.11 dưới đây giới thiệu một số công đoạn trong quy trình sản xuất thức

ăn chăn nuôi gà con giai đoạn 1-14 ngày tuổi tại Công ty cổ phần chăn nuôi CP Việt

Nam, chi nhánh Xuân Mai, Hà Nội.

Hình 1.11. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi

a. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu đầu vào: Nguyên liệu đầu vào được kiểm

tra chặt chẽ theo đúng quy trình và tiêu chuẩn của Công ty cho phép.

Phòng chất lượng sẽ trả về đối với các nguyên liệu không đạt tiêu chuẩn.

Lượng hàng nhập hàng tháng tại công ty vào khoảng 60.000 - 70.000 tấn/tháng và

tùy theo thời điểm.

Hình 1.12. Lấy mẫu nguyên liệu Hình 1.13. Kiểm tra chất lượng

đầu vào nguyên liệu bằng máy DS2500F

b. Khu vực nhập hàng sản xuất: Tại đây kiểm tra 1 lần nữa chất lượng của

nguyên liệu trước khi đưa vào các bồn chứa, silo. Các nguyên liệu này phải đảm

bảo 100% đạt theo tiêu chuẩn của công ty.

Hình 1.14.Kiểm tra nguyên liệu trước khi lưu silo

c. Hệ thống bồn chứa, kho chứa: Bao gồm hệ thống bồn silo dạng xi măng

8.000 tấn/1 bồn và hệ thống bồn thép 4.000 tấn/bồn. Kho chứa bao gồm các loại

nguyên liệu hàng bao, hàng rời, hàng chất lỏng. Tất cả các vị trí đều có kế hoạch vệ

sinh định kỳ, đảm bảo chất lượng trong quá trình lưu kho và bảo quản.

Hình 1.15. Hệ thống bồn chứa nguyên liệu

d. Hệ thống sản xuất: Bao gồm toàn bộ hệ thống máy móc trong quy trình

sản xuất thức ăn chăn nuôi như: máy nghiền, máy trộn, máy ép viên, hệ thống phun

chất lỏng, hệ thống làm mát, hệ thống sàng, lưu kho bảo quản và xuất bán.

a. Máy nghiền b. Máy trộn

c. Máy ép viên d. Hệ thống làm mát

f. Robot xếp pallet e. Đóng bao tự động

g. Kiểm tra chất lượng cám h. Kiểm tra trước khi xuất bán

Hình 1.16. Máy móc trong hệ thống sản xuất

Hình 1.17. Hình ảnh bao cám gà Hình 1.18. Hình ảnh cám gà

(giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi) (giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi)

Chương 2

MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được các điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng B. subtilis sinh tổng hợp

levan cao.

Nghiên cứu được điều kiện thu nhận và tinh sạch levan để ứng dụng trong

lĩnh vực sản xuất thức ăn chăn nuôi gà cảnh giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi.

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố trong môi trường và điều kiện

nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp và thu nhận levan từ B. subtilis: nguồn carbon,

nhiệt độ, pH, tốc độ lắc, thời gian nuôi cấy.

- Tối ưu hóa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy cho chủng B.

subtilis sinh tổng hợp levan cao.

- Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan.

- Bước đầu ứng dụng levan trong sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai

đoạn 1 - 14 ngày tuổi.

2.3. Vật liệu nghiên cứu

2.3.1. Vi sinh vật

Chủng B. subtilis do Viện Công nghệ sinh học lâm nghiệp - Đại học Lâm

nghiệp cung cấp.

2.3.2. Môi trường

- Môi trường hoạt hóa B. subtilis (môi trường L1): Nước chiết thịt bò 3 g/l,

peptone 5 g/l, pH 7.

- Môi trường nhân giống B. subtilis (môi trường L2): Nước chiết thịt bò 3 g/l,

peptone 1,5 g/l, NaCl 5 g/l, nước cất, pH 7.

- Môi trường sinh tổng hơp levan (môi trường L3): Sucrose 100 g/l, cao nấm

men 2 g/l, (NH4)2SO4 3 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4 0,6 g/l, MnSO4 0,2 g/l; pH 7.

- Môi trường xác định mật độ vi sinh vật (TGA): Trypton 5 g/l, glucose 4 g/l,

cao nấm men 2,5 g/l, agar 18 g/l, pH 7.

2.3.3. Hóa chất

- NaOH 1N, ethanol 96o (ethanol thực phẩm nhà máy đường Tuy Hòa), HCl 1%.

- Các loại thuốc nhuộm như: thuốc tím kết tinh, lugon và fuchsin.

- Các hợp chất tinh khiết được sử dụng trong nghiên cứu.

2.3.4. Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị và dụng cụ như: bình tam giác có thể tích 50 ml, 250 ml, đĩa petri,

ống nghiệm, ống đong và cốc đong. Pipetman 100 µl, 200 µl và 1000 µl, que cấy, que

trang. Nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH và cân điện tử. Tủ cấy, tủ lạnh, lò vi sóng máy li

vi sinh, tủ ấm nuôi vi sinh vật, tủ lắc… của phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Công

nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện CNSH Lâm nghiệp trường Đại học Lâm nghiệp.

Máy quang phổ cận hồng ngoại DS 2500F, Kjeltec 8000, AOCS Official

Procedure Am5-04, AOAC Ba-6a 05, máy đo độ cứng Kahl, độ bền, độ bụi… thuộc

Phòng Quản lý chất lượng công ty Cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam chi nhánh

Xuân Mai, Hà Nội.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp levan (Jothi và

cs, 2019)

Phương pháp nghiên cứu được tiến hành theo Jothi và cs (2019), khi xác

định một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp levan. Theo đó, chủng B. subtilis sẽ

được hoạt hóa trên môi trường L1 qua đêm, sau đó nhân giống trên môi trường L2

nuôi ở 370C trong vòng 48 giờ và lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Sau khi hoạt hóa, vi

khuẩn được cấp vào bình 250 ml chứa 50 ml môi trường sinh tổng hợp levan với

các thông số nghiên cứu dưới đây:

2.4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose

Vi khuẩn sẽ được cấp vào môi trường có chứa lần lượt 20, 40, 60, 80, 100 g/l

đường sucrose. Chủng được nuôi lắc 150 vòng/phút, ở 370C, pH 7 trong 24 giờ, nồng

độ nito cấp 1,5g/l và tính hàm lượng levan thu được ở mỗi nồng độ sucrose trên.

2.4.1.2. Ảnh hưởng của pH

Tiến hành nuôi cấy B. subtilis trên môi trường sinh tổng hợp levan có chứa

nguồn sucrose với nồng độ thích hợp như đã xác định ở pH ban đầu thay đổi như sau:

4, 5, 6, 7 và 8 trên máy lắc 150 vòng/phút ở 37oC trong 24 giờ, nồng độ cấp nito

1,5g/l; môi trường YE. Xác định hàm lượng levan ở các nồng độ pH trong thí nghiệm

2.4.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nito

Nuôi vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp levan có bổ sung nguồn

sucrose và điều chỉnh pH thích hợp. Các môi trường được thử nghiệm có chứa YE

(cao nấm men), BE (cao thịt bò), ME (cao thịt lợn). Các thông số khác được giữ ở:

tốc độ lắc 150 vòng/phút ở 370C trong 24 giờ nồng độ nito cấp 1,5 g/l, sau đó xác

định hàm lượng levan thu được ở các nguồn nito khác nhau.

2.4.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ cấp nito

Sau khi nghiên cứu được các khoảng điều kiện thích hợp (nồng độ sucrose,

pH, nguồn nito) chủng vi khuẩn được nuôi cấy ở các nồng độ nito khác nhau. Các

nồng độ nito được lựa chọn nghiên cứu bao gồm: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 g/l. Các

thông số khác được giữ ở: tốc độ lắc 150 vòng/phút ở 370C trong 24 giờ. Tiến hành

xác định hàm lượng levan thu được với các nồng độ cấp nito trong thí nghiệm.

2.4.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp

Sau khi nghiên cứu được các khoảng điều kiện thích hợp (nồng độ sucrose,

pH, nguồn nito, nồng độ nito) chủng vi khuẩn được cấp ở các tỷ lệ giống cấp khác

nhau. Các tỷ lệ giống cấp được lựa chọn nghiên cứu bao gồm: 2,5; 5,0; 7,5; 10,0;

12,5%. Các thông số khác được giữ ở: tốc độ lắc 150 vòng/phút ở 370C trong 24

giờ. Bố trí thí nghiệm và tính hàm lượng levan thu được.

2.4.1.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc

Sau khi xác định được các khoảng điều kiện thích hợp như trên, tiến hành

nuôi cấy chủng B. subtilis và lắc với các tốc độ: 100, 125, 150 và 175 vòng/phút.

Các thông số khác được giữ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ và thí nghiệm được xác

định hàm lượng levan theo các tốc độ lắc khác nhau.

2.4.2. Phương pháp tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp

levan theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken (Bruna và cs, 2013)

Quá trình tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp levan

được tiến hành theo quy hoạch Box-Behnken sử dụng phần mềm Design-Expert

(State - Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ).

2 + b2X2 +

Bước 1. Xây dựng mô hình toán học dạng y = y0 + b1X1 + b11X1

2 + b3X3 + b33X3

2 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3.

b22X2

- Xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ

khảo sát thực nghiệm và tham khảo các tài liệu đã công bố. Các biến số và khoảng

chạy của chúng được thể hiện trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Bảng xác định các biến ảnh hưởng,

các mức và khoảng thay đổi từng biến số

Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1

pH 6 8 X1

Nồng độ nito g/l 1,5 2,5 X2

Tốc độ lắc vòng/phút 100 150 X3

Lập ma trận thực nghiệm theo Box - Behnken: gồm 17 thí nghiệm kết hợp

các yếu tố với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình),

trong đó có 5 thí nghiệm lặp lại ở tâm (các yếu tố đều ở mức 0).

Tiến hành thực nghiệm:

Sinh tổng hợp levan được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy lỏng. Bình

tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường được nuôi trong 24 giờ, sau đó kết tủa và

thu nhận levan.

Bước 2. Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phương pháp hàm kì vọng.

2 + b2X2 + b22X2

Tìm cực trị của phương trình hồi quy y = b0 + b1X1 +b11X1

2 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 bằng phần mềm Design-Expert cho

+ b3X3 + b33X3

kết quả giá trị cực trị tại X1, X2, X3 tương ứng với pH, nồng độ nito và tốc độ lắc.

Do vậy, hàm lượng levan đạt cao nhất tại các giá trị cực trị X1, X2, X3 đó.

2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện thu nhận levan

Levan trong canh trường nuôi cấy B. subtilis được thu nhận bằng phương

pháp kết tủa các loại dung môi: ethanol 960, iso propanol và aceton. Tiến hành kết

tủa theo tỉ lệ thể tích dịch chiết levan với dung môi là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 để hỗn hợp ở

-50C, 00C và 320C trong 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, lọc và thu cặn. Sau đó xác định hàm

lượng levan thu được trong các thí nghiệm.

* Phương pháp xác định hàm lượng levan

Levan thu được sau khi kết tủa cồn được thuỷ phân bằng HCl 1M ở 1000C

trong 1 giờ. Dịch thuỷ phân được trung hoà bằng NaOH 2M và hàm lượng fructose

được xác định bằng phản ứng tạo màu với DNS và đo ở bước sóng 540 nm (Berte

và cs, 2013).

Do levan là polymer của fructose nên hàm lượng levan được tính theo công

thức: L = F × 0,9 (Szwengiel và cs, 2004).

Trong đó:

L: Là hàm lượng levan (g/l);

F: Là hàm lượng fructose (g/l);

0,9: Là hệ số chuyển đổi.

2.4.4. Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất cám gà cảnh bổ sung levan (giai

đoạn 1-14 ngày tuổi)

2.4.4.1. Tỷ lệ levan phối trộn

Sử dụng công thức cám cho gà con giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi như bảng 2.2

tại Công ty Cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam sau đó bổ sung levan trong công thức:

0,1; 0,2 và 0,3% vào thức ăn phối trộn theo công thức trên từ đó lựa chọn chế độ

dinh dưỡng phù hợp. Thí nghiệm được bố trí theo bảng 2.3.

Bảng 2.2. Thành phần nguyên liệu trong công thức

cám gà con giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi

Loại nguyên liệu

Ngô nghiền Khô đậu tương Khô hạt cải Cám gạo Cám mì Đá bột Muối Dầu cá Lysin L-Therionine Premix vitamin + khoáng Tỷ lệ (%) 60,1 12,5 1,8 6,2 14,9 0,8 0,4 0,7 0,04 0,06 2,48

Bảng 2.3. Thành phần dinh dưỡng sau khi bổ sung levan theo các tỷ lệ

Thành phần dinh dưỡng (%)

Công thức đối chứng

Bổ sung 0,3% levan (Công thức 3)

Bổ sung 0,1% levan (Công thức 1)

Bổ sung 0,2% levan (Công thức 2)

M (TCVN 4326:2001) CP (AOAC 2001.11) Fat (Ankom method 201- 30-09) Fib (Ankom method 10,12- 06-06) Năng lượng (kcal/kg) (Caculation) Ca (AOAC 965.16, 2016) P (AOAC 927.02, 2016) Lysin (European diretive 98/64 EC, 2257/16)

2.4.4.2. Phương pháp xác định nhiệt độ ép viên

Sau khi lựa chọn được công thức cám tối ưu sẽ tiến hành phối trộn và ép

viên. Nhiệt độ lựa chọn cho máy ép viên gồm 3 mức: 700C, 800C, 900C để xác định

hàm lượng levan còn lại theo từng mức nhiệt độ trên thông qua hàm lượng đường

tổng số và các chỉ tiêu ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của cám thành phẩm.

Các máy đo độ bền, độ cứng, độ bụi được thực hiện tại phòng kiểm tra chất lượng

và phương pháp xác đinh hàm lượng đường tổng số trong mẫu theo phương pháp

2.4.4.3. Bố trí thí nghiệm và thể hiện kết quả được thực hiện trong bảng 2.4.

Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến chất lượng cám viên

Chỉ tiêu Công thức đối chứng 900C 800C 700C Công thức 1 700C 800C 900C

Hàm lượng đường tổng số (%)

Độ ẩm (%)

CP (%)

Fat (%)

Fib (%)

Năng lượng (Kcal/kg)

Ca (%)

Chỉ tiêu Công thức đối chứng 900C 800C 700C Công thức 1 700C 800C 900C

P (%)

Lysin (%)

Độ ẩm (%)

Độ bền (%)

Độ cứng (kg)

Độ bụi (%)

Bảng 2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến các chỉ tiêu vi sinh

Chỉ tiêu Công thức đối chứng 900C 800C 700C Công thức 1 800C 900C 700C

Tổng khuẩn (CFU/g)

(TCVN 4884:2005)

Tổng mốc (CFU/g)

(TCVN 82752:2010)

Samonella (CFU/25g)

(TCVN 107801:2007 (ISO

6579-1:2017)

E. coli (CFU/g)

(TCVN 9975:2013

(AOAC 991.14)

Clostridium perfringens

(CFU/g)

(TCVN 4991:2005 (ISO

7937:2004)

Staphylococcus aureus (CFU/g) (AOAC 2003.11)

Coliform (CFU/g) (TCVN 9975:2013 (AOAC 991.14)

Cám thành phẩm được kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh theo TCVN tương ứng

với từng loại vi khuẩn trong thức ăn chăn nuôi. Chi tiết các chỉ tiêu theo bảng 2.5.

2.4.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số theo Becrorang

Cân 5 - 20 g mẫu đã chuẩn bị, chuyển toàn bộ vào bình tam giác 250 ml,

tráng kỹ cốc cân bằng nước cất, lượng nước cho vào bình là 1/2 thể tích, đậy bình

bằng nút cao su có gắn ống sinh hàn hoặc ống thủy tinh. Đun trên bếp cách thủy ở

800C trong 15 phút. Lấy ra để nguội, thêm 10 ml chì axetat 10% lắc kỹ để kết tủa

protein có trong mẫu.

Có thể kiểm tra việc loại protein hoàn toàn bằng cách để lắng trong mẫu rồi

rót từ từ theo thành bình một dòng mảnh chì axetat 10%, nếu ở chỗ tiếp xúc giữa hai

dung dịch không hình thành kết tủa là sự loại protein đã hoàn toàn, nếu còn kết tủa

cần thêm dung dịch chì axetat. Để lắng, thêm vào mẫu 5 - 10 ml dung dịch

kalioxalat bão hòa, lắc kỹ để loại chì dư. Để lắng, lọc qua giấy lọc gấp nếp, thu dịch

lọc vào bình định mức 500 ml, rửa kỹ kết tủa, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ.

Hút 50 - 100 ml dịch lọc chuyển vào bình tam giác 250 ml thêm 15 ml axit

clohydric 1/3, đậy nút cao su có cắm ống thủy tinh, đun trên bếp cách thủy sôi trong

15 phút lấy ra để nguội. Trung hòa dung dịch mẫu bằng natri hydroxit 30% thử

bằng giấy chỉ thị. Chuyển toàn bộ dịch mẫu vào bình định mức 250 ml, thêm nước

cất đến vạch, lắc kỹ.

Hút 10 - 25 ml dung dịch mẫu vào bình tam giác 250 ml, cho vào bình hỗn

hợp gồm 25 ml dung dịch pheling A và 25 ml dung dịch pheling B, lắc nhẹ, đặt trên

bếp điện có lưới amiăng và đun 3 phút kể từ lúc sôi. Để nguội bớt và lắng kết tủa

đồng oxit.

Lọc dung dịch qua phễu lọc. Chú ý để lúc nào trên mặt kết tủa cũng có một

lớp dung dịch hay nước cất. Rửa kỹ kết tủa trên phễu lọc vào trong bình tam giác

bằng nước cất đun sôi. Chuyển phễu lọc sang bình tam giác có kết tủa, hòa tan kết

tủa trên phễu vào trong bình bằng 10 - 20 ml dung dịch sắt (III) sunfat 5%.

Chuẩn độ lượng sắt (II) hình thành trong bình tam giác bằng dung dịch kali

pemanganat 0,1N cho đến khi dung dịch có mầu hồng sẫm bền vững trong 1 phút.

Ghi số ml kalipemanganat 0,1N đã dùng.

Từ số ml kalipemanganat 0,1N đã dùng tra bảng Bectrang được số mg

glucoza tương ứng, chuyển ra gam.

Hàm lượng đường tổng số (X) tính bằng % theo công thức:

Trong đó:

a - lượng glucoza tương ứng, g;

V - thể tích bình định mức mẫu để khử protit, ml;

V1 - thể tích mẫu lấy để thủy phân, ml;

V2 - thể tích bình định mức mẫu đã thủy phân, ml;

V3 - thể tích mẫu lấy để làm phản ứng với pheling, ml;

m - lượng cân mẫu, g.

Kết quả là trung bình cộng của kết quả 2 lần xác định song song. Tính chính

xác đến 0,01%. Chênh lệch kết quả giữa 2 lần xác định song song không được lớn

hơn 0,02% (TCVN 4594:1988).

2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm đều được lặp lại ít nhất 3 lần và các số liệu thu được xử lý sai

số bằng phần mềm Excel.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp levan

3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose

Nồng độ sucrose được bổ sung với các tỷ lệ khác nhau vào môi trường nuôi

cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp levan. Vì thế, đề tài tiến hành

nuôi chủng B. subtilis trong môi trường bổ sung sucrose với các nồng độ: 20, 40,

60, 80 và 100 g/l. Sau 24 giờ nuôi cấy, kết quả xác định hàm lượng levan được biểu

diễn trong hình 3.1.

Hình 3.1. Kết quả ảnh hưởng nồng độ sucrose

đến khả năng sinh tổng hợp levan

Hình 3.2. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis

với các nồng độ sucrose khác nhau

Qua hình 3.1 và hình 3.2 cho thấy khi bổ sung vào MTCB sucrose ở các

nồng độ khác nhau thì hàm lượng của levan thu được cũng khác nhau.

Trong môi trường có nồng độ đường sucrose tăng dần (20 - 80 g/l) thì hàm

lượng levan thu được cũng tăng lên (9,06 - 18,71 g/l). Khi tăng lượng sucrose đến

mức 80 g/l thì hàm lượng levan tăng lên gấp hai lần so với mức 20 g/l (hàm lượng

levan trong đó lần lượt là: 18,71 g/l và 9,06 g/l), khi tiếp tục tăng nồng độ sucrose

lên tới 100 g/l thì hàm lượng levan thu được không tăng mà có xu hướng giảm nhẹ

(17,32 g/l).

Nghiên cứu của Jothi và cs (2019) khi xác định hàm lượng levan từ chủng

B. subtilis MTCC 44 với nồng độ sucrose 100g/l thu được hàm lượng levan lớn

nhất. Tuy nhiên, Abdel-Fattah và cs (2005) cho biết nồng độ đường trên 10% có thể

gây ra những vấn đề về sự tăng trưởng của vi khuẩn này trong môi trường có độ

nhớt cao gây ra bởi polymer. Như vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn

nồng độ sucrose 80 g/l (8% sucrose) cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu

pH là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình tăng trưởng của tế bào

vi khuẩn cũng như khả năng sinh tổng hợp levan của B. subtilis. Thí nghiệm nhằm

khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện pH giúp vi sinh vật tổng hợp levan với hàm

lượng cao được thực hiện trên môi trường cơ bản chứa sucrose nồng độ 80 g/l và

pH 5 - 9. Sau thí nghiệm, hàm lượng levan thu được trình bày ở hình 3.3.

Hình 3.3. Kết quả ảnh hưởng của pH ban đầu

đến khả năng sinh tổng hợp levan

Hình 3.4. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis

với các nồng độ pH khác nhau

Qua hình 3.3 và hình 3.4 cho thấy, khoảng pH thích hợp để B. subtilis sinh

tổng hợp levan cao là 6-9. Tuy nhiên, kết quả cho thấy ở pH = 7 thì lượng levan thu

được là cao nhất 18,02 g/l. Nhiều nghiên cứu cho thấy với pH 7 là pH trung hòa

thích hợp cho nhiều vi sinh vật tổng hợp các hợp chất. Đối với chủng B. subtilis là

vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi trường thiếu oxy và sinh

trưởng thích hợp với pH 7,0 - 7,4 (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005).

Nghiên cứu của Patricia và cs (2014), khi thử nghiệm pH của chủng B.

subtilis Natto CCT 7712 sinh tổng hợp đường FOS cho kết quả giá trị pH 7,3 thu

được hàm lượng đường cao nhất.

Kết quả này tương đồng với kết quả pH=7 khi nuôi cấy B. subtilis của tác giả

khác để thu được hàm lượng levan cao nhất. Szwengiel và cs (2004), nuôi cấy B.

subtilis DSM 347 trên môi trường pH 6,7 còn Shih và cs (2005), đã sinh tổng hợp

levan từ chủng B. subtilis Natto Takahashi ở pH 7, Jothi và cs (2019), cũng xác định

ở pH 7 thu được hàm lượng levan cao nhất khi tổng hợp từ chủng B. subtilis MTCC

441. Do đó, lựa chọn pH 7 cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nito

Nguồn nito đóng vai trò lớn trong quá trình chuyển hóa và sinh trưởng của vi

sinh vật. Thí nghiệm kiểm tra khả năng sinh levan của chủng B. subtilis được khảo

sát trên môi trường có chứa 100 g/l đường sucrose, pH 7 và nguồn nito: YE (cao

nấm men), BE (Cao thịt bò), ME (Cao thịt lợn). Hàm lượng levan thu được trong

nghiên cứu này được thể hiện ở hình 3.5.

Hình 3.5. Kết quả ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng sinh tổng hợp levan

Hình 3.6. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis

với các nguồn nito khác nhau

Silbir và cs (2014) đã tiến hành sử dụng các nguồn nito khác nhau để đánh

giá khả năng sinh tổng hợp levan bao gồm bột ngô khô (3,8 g/l), mầm mạch nha

(4,6 g/l), peptone (1,75 g/l), ure (0,56 g/l), tryptone(1,93 g/l), YE (2,5 g/l). Kết quả

cho thấy dùng nguồn nito YE thu được lượng levan cao nhất đạt 15,52 ± 0,23 g/l

sau đó là tới bột ngô khô đạt 13,91 ± 0,27 g/l.

Nguồn nito YE cũng là nguồn nito tối ưu nhất được lựa chọn cho quá trình

sinh tổng hợp levan của chủng B. subtilis MTCC 441 trong nghiên cứu của Jothi và

cs (2019). Kết quả thí nghiệm này tương đương với lựa chọn môi trường YE để thu

được hàm lượng levan cao nhất (18,02 g/l), cao hơn so với môi trường ME và BE

như trong kết quả hình 3.5 và hình 3.6. Chính vì vậy, môi trường YE là môi trường

được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ nito

Mặc dù nồng độ nitơ không tham gia trực tiếp vào quá trình sinh tổng hợp

levan nhưng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn B.

subtilis, vì vậy có ảnh hưởng gián tiếp đến quá trình sinh tổng hợp levan. Thí

nghiệm được sử dụng các yếu tố đã được tối ưu ở trên và nồng độ nito được lựa

chọn cho nghiên cứu này ở mức 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 g/l. Kết quả được thể hiện ở

hình 3.7.

Hình 3.7. Kết quả ảnh hưởng nồng độ nito đến khả năng sinh tổng hợp levan

Hình 3.8. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis

với các nồng độ nito khác nhau

Kết quả ở hình 3.7 và hình 3.8 cho thấy, khi bổ sung nồng độ nito ở mức 2%

thu được hàm lượng levan cao nhất (18,02 g/l), khi bổ sung nhiều hơn 2% thì hàm

lượng levan không còn ở mức cao mà có dấu hiệu giảm dần xuống còn 16,63 g/l ở

nồng độ 2,5 g/l và ở nồng độ 3 g/l hàm lượng levan thu nhận được 15,25 g/l. Vì

vậy, lựa chọn bổ sung nồng độ nito 2 g/l cho các nghiên cứu tiếp theo.

Tác giả Tamer và cs (2018) khi nghiên cứu tăng hàm lượng levan từ chủng

B. subtilis cũng đã lựa chọn nguồn nito YE với nồng độ 2 g/l để thu được 47 g levan

trong thời gian 24 giờ. Kết quả này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của

Jothi và cs (2019) khi lựa chọn nồng độ nito 2 g/l trong quá trình sinh tổng hợp

levan từ chủng B. subtilis MTCC 441 thu được hàm lượng cao nhất.

3.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp

Tỷ lệ giống cấp là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng

và có liên quan đến mật độ vi khuẩn B. subtilis phát triển để đảm bảo sinh tổng hợp

levan cao. Do đó, với các yếu tố đã được tối ưu về nồng độ sucrose, pH, nguồn nito,

nồng độ nito ở trên, tỷ lệ giống cấp được thí nghiệm ở các mức 2,5%; 5,0%; 7,5%;

10,0% và 12;5% để so sánh hàm lượng levan thu nhận được. Kết quả hàm lượng

levan thu nhận được biểu diễn trong hình 3.9.

Hình 3.9. Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp đến

khả năng sinh tổng hợp levan

Theo Jothi và cs (2019), khi nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp chủng

B. subtilis MTCC 441 sinh tổng hợp levan cho kết quả ở mức 10%, kết quả này

tương đồng với nghiên cứu của Khadiga và cs (2015) khi nghiên cứu tỷ lệ giống cấp

chủng Bacillus lentus V8. Tuy nhiên, tác giả Shin và cs (2005) xác định tỷ lệ giống

cấp 5% với chủng B. subtilis Takahashi sinh tổng hợp levan. Kết quả nghiên cứu

được thể hiện ở hình 3.9 cho thấy tỷ lệ giống cấp cho hàm lượng levan có su hướng

tăng dần từ tỷ lệ giống cấp từ 2,5% và đạt cao nhất ở tỷ lệ giống cấp 7,5% và bắt

đầu giảm khi giống cấp 10%. Vì vậy, sử dụng tỷ lệ giống cấp 7,5% cho các nghiên

cứu tiếp theo.

3.1.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc

Tốc độ lắc có vai trò khá quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển

đối với các chủng vi khuẩn hiếu khí. Tốc độ lắc góp phần phân bố đều mật độ vi

sinh vật và cung cấp đủ lượng oxy cho vi sinh vật sử dụng do đó tốc độ lắc có ảnh

hưởng đến khả năng sinh tổng hợp levan của chủng B. subtilis (Santos và cs, 2013).

Sau khi xác định được các điều kiện thích hợp nuôi cấy sinh tổng hợp levan:

hàm lượng sucrose, pH, nguồn nito, nồng độ nito, tỷ lệ giống cấp, đề tài tiến hành

các thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh levan từ

chủng B. subtilis với các tốc độ lắc tương ứng: 100 vòng/phút, 125 vòng/phút, 150

vòng/phút và 175 vòng/phút. Kết quả được trình bày hình 3.10 và hình 3.11.

Hình 3.10. Kết quả ảnh hưởng của tốc độ lắc đến

khả năng sinh tổng hợp levan

Hình 3.11. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis

với tốc độ lắc khác nhau

Kết quả hình 3.10 cho thấy hàm lượng levan cao nhất ở tốc độ lắc 150

vòng/phút (18,71 g/l).

Khi tốc độ lắc thấp 100 vòng/phút hàm lượng levan thu được ít (14,56 g/l).

Khi tốc độ lắc quá cao 175 vòng/phút hàm lượng levan thu được giảm xuống (17,32

g/l) có thể do tốc độ lắc làm vỡ tế bào B. subtilis do đó khả năng sinh tổng hợp

levan của chủng ở tốc độ lắc này có xu hướng giảm dần.

Nghiên cứu của Nguyễn Minh Trí năm 2011 về điều kiện thích hợp nuôi cấy

chủng B. subtilis CB15 sinh protease trên môi trường dịch ép đầu tôm, khi tốc độ

lắc từ 130 vòng/phút trở lên cho kết quả tốt hơn so với tốc độ lắc thấp 100

vòng/phút. Tác giả Shin và cs (2005), cho thấy tốc độ lắc để thu được hàm lượng

levan cao nhất của chủng B. subtilis Takahashi, từ 150 - 200 vòng/phút.

Trong nghiên cứu của Jothi và cs (2019), khi nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ

lắc lên chủng B. subtilis MTCC 441 sinh tổng hợp levan ở các mức 0, 100, 120,

150, 170 và 200 vòng/ phút. Kết quả của tác giả cho thấy, ở tốc độ lắc 150

vòng/phút thu được hàm lượng levan cao nhất và tương đương kết quả nghiên cứu

của Khadiga và cs (2015), với tốc độ lắc 150 vòng/phút đối với chủng B. subtilis V8

sinh tổng hợp levan.

Do vậy, trong nghiên cứu này lựa chọn tốc độ lắc 150 vòng/phút cho quá

trình sinh tổng hợp levan của chủng B. subtilis trên môi trường cơ bản bổ sung

sucrose 80 g/l, ở pH 7, nguồn nito YE, nồng độ nio 2%, tỷ lệ giống cấp 7,5% , ở

nhiệt độ 370C trong thời gian 24 giờ.

3.2. Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp levan

* Xây dựng mô hình

Mục đích của quá trình này là tìm sự tương tác đồng thời của các yếu tố ảnh

hưởng tới quá trình sinh tổng hợp levan để lựa chọn môi trường tối ưu nuôi chủng

B. subtilis cho hàm lượng levan cao nhất.

Do dựa trên cơ sở đã khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sinh

tổng hợp levan, đề tài tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời của 3 yếu tố: pH,

nồng độ nito, tốc độ lắc theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-

Behnken.

Quy hoạch sử dụng 3 mức yếu tố cần tối ưu, ma trận thực nghiệm được thiết

lập gồm 17 thí nghiệm kết hợp các mức (cao, thấp, trung bình) của yếu tố khảo sát,

riêng thí nghiệm kết hợp 3 yếu tố ở mức trung bình (thí nghiệm ở tâm) được lặp lại

5 lần. Sau đó, kết tủa và xác định hàm lượng levan. Kết quả thí nghiệm được thể

hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng levan

thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau

Nồng độ nito Tốc độ lắc Hàm lượng levan TN pH (vòng/phút) (g/l) (g/l)

1 6 1,5 125 15,7

2 8 1,5 125 14,9

3 6 2,5 125 13,3

4 8 2,5 125 20,1

5 6 2 125 15,4

6 8 2 125 15,9

7 6 2 150 13,8

8 8 2 150 20,6

9 7 1,5 100 13,6

10 7 2,5 100 17,5

11 7 1,5 150 16,4

12 7 2,5 150 18,5

13 7 2 125 17,7

14 7 2 125 18,0

15 7 2 125 18,3

16 7 2 125 19,0

17 7 2 125 18,0

Kết quả phân tích phương sai bằng của mô hình tối ưu bằng phần mềm

DX.11(State-Ease) trình bày trong bảng 3.2 (bảng ANOVA) cũng cho thấy cả 3 yếu

tố pH, nồng độ nito và tốc độ lắc đều ảnh hưởng mạnh đến quá trình sinh tổng hợp

levan. Giá trị F của mô hình là 23,57 với p = 0,0002 (p < 0,05) cho thấy dạng mô

hình đã lựa chọn là đúng. Giá trị p của “Lack of Fit” là 0,2364 (p > 0,05) cho thấy

mô hình này tương hợp với thực nghiệm.

Phương trình hồi quy biểu hiện hàm lượng levan mô tả ảnh hưởng của các

yếu tố độc lập và các môi tương tác giữa chúng được biểu diễn như sau:

Hàm lượng Levan = +18,18 + 1,66X1 + 1,11X2 + 0,90X3 + 1,88X1X2 +

2 – 1,10X2

2 – 0,627X3

1,55X1X3 – 0,45X2X3 – 1,15X1

Trong đó: X1 – pH, X2 – nồng độ nito, X3 – tốc độ lắc.

Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy B. subtilis sử dụng phương pháp hàm kì vọng

để tối ưu hóa hàm lượng levan thu được sau quá trình nuôi cấy bằng phần mềm

Design – Expert 11. Kết quả tìm được 100 phương án thí nghiệm trong đó phương

án tốt nhất để cực đại hàm mục tiêu dự đoán là: pH 7,8, nồng độ nito 2,3 g/l và tốc

độ lắc 120 vòng/phút. Khi đó, hàm lượng levan đạt được trong các điều kiện theo

tính toán là 21,5 g/l.

Hình 3.12. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu sinh tổng hợp levan

Hình 3.13. Ảnh hưởng của các yếu tố đến sinh tổng hợp levan

Bảng 3.2. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX11

Thông số Phương sai Chuẩn F Mức ý nghĩa p

Mô hình 23,57 76,68 0,0002

61,17 22,11 0,0001 X1

27,39 9,90 0,0012 X2

17,93 14,06 0,0039 X3

38,90 9,61 0,0004 X1X2

26,58 0,81 0,0013 X1X3

2,24 5,59 0,1781 X2X3

15,47 5,12 0,0057 X1

14,16 1,66 0,0071 X2

4,59 2,53 0,0695 X3

Tiến hành kiểm tra bằng thực nghiệm tại pH 7,8; nồng độ nito 2,3 g/l và tốc

2,15 1,56 0,2364 Không tương thích

độ lắc 120 vòng/phút, hàm lượng levan thu được 20,82 g/l, kết quả này có độ tương

thích cao so với lý thuyết.

Hàm lượng levan thu được theo phương án kết hợp 3 yếu tố: pH, nồng độ

nito và tốc độ lắc đạt 21,05 g/l đã cải thiện được hàm lượng levan so với trước khi

tối ưu (2,34 g/l) tương đương mức tăng 11,1%. Tỷ lệ tăng này cao hơn so với kết

quả nghiên cứu của tác gia Bruna và cs (2013) khi sử dụng phần mềm DX với 23 thí

nghiệm đã làm tăng 4,1% hàm lượng levan so với thực tế trên chủng B. subtilis

Natto CCT7712.

3.3. Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan

3.3.1. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng levan thu được

Các loại dung môi ảnh hưởng mạnh đến khả năng kết tủa và chất lượng levan

thu được. Theo Kang và cs (1979), việc thu nhận các hợp chất polysaccharides từ

thực vật ảnh hưởng rất lớn bởi các loại dung môi. Chính vì thế, tiến hành nghiên

cứu đối với ba loại dung môi: ethanol 960, iso propanol, aceton đến khả năng tạo kết

tủa của levan và việc lựa chọn các loại dung môi này đều có hằng số điện môi nhỏ

nên không làm phân tán tới các phân tử trong dung dịch (Beste và cs, 2014).

Thí nghiệm thực hiện sau khi nuôi cấy B. subtilis trong điều kiện đã được tối

ưu và cho kết quả được thể hiện ở hình 3.14.

Hình 3.14. Kết quả ảnh hưởng của các loại dung môi

đến hàm lượng levan thu được

Từ hình 3.14 cho thấy khả năng kết tủa levan của ethanol 960 hiệu quả hơn

so với iso propanol và aceton. Mặt khác, khi kết tủa levan bằng ethanol 960 có nhiều

thuận lợi do ethanol 96o là hợp chất an toàn cho sản phẩm thu được (Kang và cộng

sự, 2009). Hơn nữa, ethanol 960 có sẵn ở dạng tinh khiết với ít tạp chất gây nhiễm

độc hay ức chế. Nhiệt độ bay hơi của dung môi ethanol thấp nên dễ tách bỏ dung

môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.

Nghiên cứu của Jothi và cs (2019), đã thử nghiệm ảnh hưởng của các dung

môi khác nhau: ethanol, isopropanol, acetone, methanol lên hàm lượng levan thu

được, kết quả đã cho thấy dung môi kết tủa bằng ethanol cho hàm lượng levan lớn

nhất. Năm 2018, Ni và cs cũng đã có nghiên cứu về các điều kiện sinh tổng hợp

levan từ chủng Lactobacillus reuteri LTH5448 đã lựa chọn dung môi ethanol để kết

tủa sinh tổng hợp levan. Cũng trong năm này, tác giả Bersaneti và cs (2018) đã lựa

chọn dung môi ethanol là dung môi kết tủa thu nhận levan và fructooligosaccharides

từ chủng B. subtilis natto để ứng dụng ngành công nghiệp thực phẩm. Kết quả này

tương đồng với kết quả thí nghiệm khi lựa chọn dung môi ethanol 960 để kết tủa

sinh tổng hợp levan. Vì vậy, đề tài sử dụng dung môi ethanol 960 cho các nghiên

cứu tiếp theo.

3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và dung môi đến hàm lượng

levan thu được

Sau khi đã lựa chọn được dung môi kết tủa ethanol 960 cho hàm lượng levan

cao nhất, tiếp tục lựa chọn các tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và dung môi lần lượt

1:1, 1:2, 1:3 và 1:4 để xác định hàm lượng levan thu được theo từng tỷ lệ này. Kết

quả hàm lượng levan thu được thể hiện ở hình 3.15.

Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và

dung môi đến hàm lượng levan thu được

Ghi chú: giá trị 0 – không lọc được kết tủa.

Hình 3.16. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis

với tỷ lệ thể tích levan và dung môi khác nhau

Qua kết quả ở hình 3.15 và hình 3.16 cho thấy, khi thể tích dịch chiết levan

và dung môi ở tỷ lệ 1:1 và 1:2 thì không thể lọc được kết tủa. Khi tỷ lệ thể tích dịch

chiết levan và dung môi 1:3 cho hàm lượng levan thu được là cao nhất (18,02 g/l)

cao hơn so với tỷ lệ 1:4 (16,63 g/l).

Năm 2013, tác giả Bruna và cộng sự khi nghiên cứu các điều kiện sinh tổng

hợp levan của chủng B. subtilis Natto CCT 7712 cho thấy với tỷ lệ thể tích levan và

dung môi ethanol 96o là 1:3, điều kiện nhiệt độ 40C trong thời gian 12 giờ thu được

hàm lượng levan cao nhất. Cũng trong nghiên cứu của Gabrielly và cộng sự (2017)

đã lựa chọn tỷ lệ 1:3 (tỷ lệ thể tích levan và dung môi ethanol) cho quá trình sinh

tổng hợp levan và fructooligosaccharides từ chủng B. subtilis Natto.

Những kết quả đạt được trong nghiên cứu này cũng phù hợp với công bố của

tác giả Jothi và cs (2019) khi lựa chọn tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và dung môi

ethanol (tỷ lệ 1:3) khi sinh tổng hợp levan từ chủng B. subtilis MTCC411và cũng

tương đương với nghiên cứu của Santos và cs (2013). Vì vậy, lựa chọn tỷ lệ thể tích

dịch chiết levan và dung môi là 1:3 cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu được

Ở mỗi mức nhiệt độ kết tủa khác nhau đều có ảnh hưởng trực tiếp đến hàm

lượng levan thu được. Do đó với các điều kiện thu nhận levan đã được xác định

bằng cách sử dụng dung môi kết tủa ethanol 960, tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và

dung môi bằng 1:3, tiếp tục xác định nhiệt độ kết tủa hỗn hợp lỏng này ở các nhiệt

độ: -50C, 00C và 320C. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan

được thể hiện ở hình 3.17.

Hình 3.17. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ kết tủa

đến hàm lượng levan thu được

Khi nghiên cứu tối ưu các điều kiện sinh tổng hợp levan từ chủng B. subtilis

Natto của Santos và cs (2013) cho thấy hàm lượng levan thu được cao nhất khi lựa

chọn kết tủa levan bằng dung môi ethanol ở nhiệt độ -50C.

Kết quả ở hình 3.17 cho thấy, khi kết tủa ở nhiệt độ -50C cho hàm lượng

levan thu được là cao nhất (18,02 g/l). Nhiệt độ kết tủa 00C bắt đầu cho hàm lượng

levan giảm dần (16,63 g/l) và ở nhiệt độ môi trường (320C) hàm lượng levan thu

được là thấp nhất (12,48 g/l). Vì vậy lựa chọn nhiệt độ kết tủa -50C cho nghiên cứu

tiếp theo.

3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu được

Nghiên cứu này lựa chọn các thời gian kết tủa 1 giờ, 3 giờ và 5 giờ với các

điều kiện đã xác định: sử dụng dung môi kết tủa ethanol 960, tỷ lệ thể tích dịch chiết

levan và dung môi bằng 1:3 và nhiệt độ kết tủa -50C. Kết quả hàm lượng levan thu

được thể hiện ở hình 3.18.

Hình 3.18. Kết quả ảnh hưởng của thời gian kết tủa

đến hàm lượng levan thu được

Trong nghiên cứu của Manel và cộng sự (2018) khi đánh giá hiệu quả của

việc sử dụng kết tủa bằng ethanol của exopolysaccharides có sử dụng ba loại vi

khuẩn acid lactic nhận thấy, khi tăng thời gian lên thì hiệu suất kết tủa không tăng.

Tương tự quy luật thay đổi đối với độ tinh sạch cũng tăng khi tăng thời gian. Tuy

nhiên, khi tăng thời gian đến mức tới hạn thì độ tinh sạch giảm. Điều này có thể do

thời gian càng kéo dài thì càng tạo điều kiện cho sự tập hợp của các phân tử tại

vùng pH đẳng điện và làm tăng lượng kết tủa. Tuy vậy, kéo dài đến một thời gian

xác định thì không làm tăng số lượng kết tủa, nên cũng không làm tăng hiệu suất kết

tủa. Ngoài ra, một số polysaccharide cũng có thể bị kết tủa khi pH thay đổi trong

thời gian dài cũng làm giảm độ tinh sạch của sản phẩm. Do đó, trong nghiên cứu

này, khi tăng thời gian kết tủa lên 5 giờ cũng không làm tăng hàm lượng levan thu

được. Vì vậy, lựa chọn thời gian kết tủa 3 giờ để thu nhận levan.

Qua kết quả từ các hình 3.14, 3.15, 3.17 và 3.18 đã xác định được điều kiện thu nhận levan khi sử dụng dung môi ethanol 960, tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và dung môi là 1:3, nhiệt độ kết tủa -50C và thời gian kết tủa 3 giờ cho hàm lượng

levan thu được là cao nhất.

3.4. Nghiên cứu quy trình sản xuất cám gà cảnh từ chế phẩm levan (giai đoạn 1

- 14 ngày tuổi)

3.4.1. Xác định tỷ lệ levan phối trộn

Gà con trong giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi có lượng tế bào tăng lên mạnh mẽ

nên quá trình sinh trưởng diễn ra rất nhanh, một số cơ quan chưa phát triển hoàn

chỉnh như các men tiêu hóa chưa đầy đủ, khả năng điều tiết thân nhiệt kém, gà con

dễ bị ảnh hưởng bởi thức ăn và quá trình nuôi dưỡng. Vì vậy, thức ăn có đủ hàm

lượng dinh dưỡng ảnh hưởng rất lớn đến gà con trong thời kì này.

Công thức ở bảng 2.2 được xem là công thức tối ưu được sử dụng trong phối

trộn thức ăn cho gà con từ 1 - 14 ngày tuổi dựa trên tình hình sản xuất tại Công ty.

Với công thức này, gà con trong giai đoạn đã được xác định có hàm lượng dinh

dưỡng tối ưu, gà con sinh trưởng nhanh, trao đổi chất mạnh và phù hợp với giai

đoạn 1 - 14 ngày tuổi.

Với mục đích tăng cường sức đề kháng cho hệ tiêu hóa và sự phát triển của

gà trong giai đoạn này, tỷ lệ levan bổ sung trong giai đoạn này từ 0,1%; 0,2%; 0,3%

trong công thức ở bảng 3.9.

Nghiên cứu của Li và cs (2013), cho thấy levan được bổ sung vào khẩu phần

ăn của lợn với hàm lượng 0,1% giúp cải thiện hiệu suất tăng trưởng, làm tăng khả

năng tiêu hóa và tăng số lượng Lactobacillus trong phân, đồng thời tác dụng có lợi

đối với hệ thống miễn dịch ở lợn trong giai đoạn đang phát triển. Trong nghiên cứu

của tác giả Yitbarek và cs (2012), việc bổ sung chế phẩm prebiotic ở gà giúp làm

tăng hệ vi sinh vật đường ruột, cải thiện chất lượng thịt và tăng cường đáp ứng miễn

dịch ở giai đoạn còn non khi bổ sung tỷ lệ prebiotic 0,2%. Cũng trong năm 2012,

nghiên cứu của Lensing và cs khi bổ sung tỷ lệ prebiotic 0,075% vào gà đẻ giai

đoạn 1 - 35 ngày tuổi giúp làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và tổn thương do Eimeria

maxima gây ra. Vì vậy, nghiên cứu lựa chọn các tỷ lệ levan 0,1; 0,2 và 0,3% trong

công thức để phù hợp với thực tế.

Các mẫu được lấy sau giai đoạn trộn đều các loại nguyên liệu trong máy

trộn, sau đó được phân tích dinh dưỡng qua máy quang phổ cận hồng ngoại

DS2500F cho kết quả như sau:

Bảng 3.3. Kết quả phân tích dinh dưỡng cám trong công thức

Thành phần Công thức Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3 dinh dưỡng (%) đối chứng

M 11,5 ± 0,03 11,5 ± 0,03 11,4 ± 0,03 11,4 ± 0,03

CP 21,8 ± 0,03 21,8 ± 0,03 21,9 ± 0,03 22,0 ± 0,03

Fat 4,7 ± 0,02 4,7 ± 0,02 4,6 ± 0,02 4,7 ± 0,02

Fib 2,3 ± 0,011 2,3 ± 0,011 2,4 ± 0,011 2,4 ± 0,011

GE (kcal/kg) 3120 ± 1,5 3140 ± 1,5 3158 ± 1,5 3177 ± 1,5

Ca 0,71 ± 0,005 0,70 ± 0,005 0,71 ± 0,005 0,72 ± 0,005

P 0,77 ± 0,005 0,77 ± 0,005 0,76 ± 0,005 0,77 ± 0,005

Dựa vào kết quả ở bảng 3.9 cho thấy ở tất cả các công thức khi bổ sung levan

Lysin 0,04 ± 0,001 0,04 ± 0,001 0,04 ± 0,005 0,04 ± 0,005

đều không có sự thay đổi đáng kể với các chỉ tiêu: M, CP, Fat, Fib, Ca, P, Lysin.

Trong dinh dưỡng gia cầm thì năng lượng được xem là nguồn dinh dưỡng

giới hạn nhất vì nhu cầu lớn so với các chất dinh dưỡng khác. Nhu cầu năng lượng

của gia cầm có thể xác định là mức năng lượng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát

triển và cho duy trì mọi hoạt động sống của cơ thể. Thiếu năng lượng dẫn đến sự

suy giảm các quá trình trao đổi và các hoạt động chức năng cơ thể khiến gia cầm còi

cọc, chậm lớn, năng suất giảm.

Năng lượng trong công thức 3 đạt mức cao nhất (3.177 kcal/kg) cao hơn so

với công thức đối chứng (3.120 kcal/kg), công thức 1 (3.140 kcal/kg), công thức 2

(3.148 kcal/kg). Tuy nhiên, xét về mức độ giá thành cho chế phẩm levan bổ sung

vào thức ăn chăn nuôi thì tỷ lệ 0,1% trong công thức 1 đem lại hiệu quả hơn do

không làm tăng giá nhiều trong cám thành phẩm. Kết quả này cũng khá tương đồng

với việc bổ dung các chế phẩm prebiotic (0,1%) vào trong thức ăn cho lợn trong

giai đoạn nhỏ (Li và cs, 2013) hay việc bổ sung tỷ lệ 0,0075% chế phẩm prebiotic

vào giai đoạn gà đẻ giai đoạn 1 - 35 ngày tuổi (Lensing và cs, 2012).

3.4.2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ ép viên

Trong toàn bộ quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi, hệ thống ép viên có vai

trò quan rất quan trọng, quyết định tính chất dinh dưỡng, hình dạng, độ bền, độ

cứng, độ bụi của viên cám. Ngoài ra, nhiệt độ trong máy ép viên cũng có ảnh hưởng

tới hoạt động của vi sinh vật, các chất dinh dưỡng, enzyme trong nguyên liệu,

enzyme bổ sung thêm vào thức ăn chăn nuôi.

Chính vì vậy, trong quá trình ép viên khi nhiệt độ quá cao sẽ ảnh hưởng đến

hàm lượng levan còn lại trong cám thành phẩm, gây hao hụt và mất chất dinh

dưỡng. Trong nghiên cứu này sẽ giúp lựa chọn được nhiệt độ ép viên thích hợp để

giữ được hàm lượng levan cao nhất sau khi ép viên.

Thí nghiệm nhiệt độ máy ép viên ở các mức 700C, 800C, 900C được thực

hiện tại máy cám viên thuộc phòng sản xuất Công ty cổ phần chăn nuôi C.P Việt

Nam, phân tích hàm lượng levan dựa trên xác định hàm lượng đường tổng số trong

mẫu cám thành phẩm, phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng, chỉ tiêu cảm quan và các

chỉ tiêu vi sinh cho kết quả theo các bảng dưới đây:

Bảng 3.4. Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng

khi bổ sung chế phẩm levan

Chỉ tiêu (%) Đường tổng số

Fat Công thức đối chứng 800C 6,28 ± 0,01 11,0 ± 0,05 21,5 ± 0,05 4,5 ± 0,1

Fib 2,2 ± 0,05

GE (Kcal/kg)

Lysin 700C 6,29 ± 0,01 11,5 ± 0,05 21,8 ± 0,05 4,8 ± 0,1 2,3 ± 0,05 3120 ± 2,5 0,71 ± 0,05 0,77 ± 0,05 0,04 ± 0,001 900C 6,29 ± 0,01 10,8 ± 0,05 20,9 ± 0,05 4,3 ± 0,1 2,0 ± 0,05 3123 ± 2,5 0,69 ± 0,05 0,70 ± 0,05 0,02 ± 0,001 700C 6,35 ± 0,01 11,5 ± 0,05 21,9 ± 0,05 4,8 ± 0,1 2,3 ± 0,05 3140 ± 2,5 0,70 ± 0,05 0,77 ± 0,05 0,04 ± 0,001 Công thức 1 800C 6,36 ± 0,01 11,1 ± 0,05 21,5 ± 0,05 4,6 ± 0,1 2,1 ± 0,05 3141 ± 2,5 0,70 ± 0,05 0,72 ± 0,05 0,03 ± 0,001 900C 6,36 ± 0,01 10,8 ± 0,05 21,0 ± 0,05 4,2 ± 0,1 2,0 ± 0,05 3140 ± 2,5 0,69 ± 0,05 0,70 ± 0,05 0,02 ± 0,001 3121 ± 2,5 0,70 ± 0,05 0,72 ± 0,05 0,03 ± 0,001

Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra cảm quan khi bổ sung chế phẩm levan

trong công thức thức ăn chăn nuôi

Công thức đối chứng Công thức 1 Chỉ tiêu 700C 800C 900C 700C 800C 900C

Độ bền (%) 98,0± 0,5 95,6± 0,6 94,3± 0,5 98,0± 0,6 95,6± 0,5 94,4± 0,5

Độ cứng (kg) 2,0± 0,1 2,2± 0,1 2,5± 0,1 2,0± 0,1 2,2± 0,1 2,5± 0,1

Độ bụi (%) 2,0± 0,1 4,6± 0,1 5,7± 0,1 2,0± 0,1 4,4± 0,1 5,6± 0,1

Bảng 3.6. Kết quả phân tích vi sinh khi bổ sung chế phẩm levan

trong thức ăn chăn nuôi

Chỉ tiêu Công thức đối chứng 900C 800C 700C Công thức 1 800C 700C 900C

3.2x104 <103 <103 3x104 <103 <103

<102 <102 <102 <102 <102 <102

Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFU/g) Tổng nấm men, nấm mốc (CFU/g) Samonella (CFU/25g) E. coli (CFU/g) Aspergillus (CFU/1g) Coliform (CFU/g) 0 <101 0 <101 0 <101 0 <101 0 <101 0 <101 0 <101 0 <101 0 <101 0 <101 0 <101 0 <101

Ghi chú: Kết quả hiển thị <101CFU/g khi không có khuẩn lạc mọc trên đĩa.

Từ kết quả bảng 3.4 nhận thấy các thành phần dinh dưỡng cơ bản bao gồm:

CP, Fat, Fib, GE, Ca, P, Lysin đều không có sự thay đổi. Tuy nhiên, do nhiệt độ ép

viên tăng cao từ 70 - 900C làm cho độ ẩm cám bị giảm dần từ 11,5% (700C) xuống

còn 10,8% (900C) nguyên nhân do tác dụng của nhiệt cao làm khô nguyên liệu đồng

thời lượng nước bốc hơi nhanh qua tác động của khuôn ép. Hàm lượng đường tổng

số của công thức đối chứng và công thức 1 đều không bị ở mức nhiệt độ 700C đến

900C. Ở cả 3 mức nhiệt vẫn đảm bảo giữ được hàm lượng đường tổng số trong mẫu

cám là 6,35 - 6,36% và cao hơn so với cùng nhiệt độ này ở công thức đối chứng.

Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy tiêu chuẩn cảm quan và tính chất vật lý, khi tăng

nhiệt độ ép viên lên cao dần từ 800C đến 900C làm cho viên cám có màu sẫm hơn so

với mức 700C, điều này có thể lý giải do mức nhiệt quá cao làm các chất trong

nguyên liệu như đường, tinh bột, cellulose… bị phá hủy và làm ảnh hưởng tới mùi

vị của cám thành phẩm. Các chỉ tiêu về độ bền, độ cứng, độ bụi cũng cho thấy, khi

tăng nhiệt độ lên cao làm cho viên cám bị mất dần độ ẩm, ở mức nhiệt độ 800C và

900C làm cho viên cám cứng lại nhưng lại dễ bị gãy do va đập, chính vì vậy không

đạt tiêu chuẩn về độ bền và độ bụi cho phép. Vì vậy, ở mức nhiệt độ ép viên 700C

đạt yêu cầu chất lượng về cảm quan và chất lượng sản phẩm.

Khi sản phẩm cám có bổ sung levan ép viên ở các nhiệt độ khác nhau (700C,

800C, 900C), kết quả bảng 3.6 nhận thấy các vi khuẩn E. coli, Coliform đều nằm

trong giới hạn của TCVN (QCVN 01 - 190), tổng lượng vi khuẩn hiếu khí, tổng

nấm men, nấm mốc nằm trong khoảng 103 đến 3,2x104 CFU/g và nằm trong TCVN

cho phép (QCVN 01 - 190). Các vi khuẩn Salmonella và Aspergillus nhận thấy

không có sự xuất hiện của khuẩn lạc mọc trên đĩa.

Vì vậy, nhiệt độ 700C đều cho kết quả đạt tiêu chuẩn theo quy định chất

lượng cám ép viên, đồng thời khi bổ sung 0,1% levan trong công thức cũng không

làm ảnh hưởng đến chỉ tiêu vi sinh trong loại cám này.

Vì vậy, mức nhiệt 700C là mức nhiệt an toàn để sản xuất thức ăn chăn nuôi

khi bổ sung tỷ lệ levan 0,1%.

Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của tác giả Ward và cs (2020) khi

đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến thành phần dinh dưỡng của cám ép viên, mức

nhiệt được tác giả lựa chọn thích hợp mức 70 - 770C để tiêu diệt được hết các vi

khuẩn có hại nhưng vẫn đảm bảo được hàm lượng amino acid, enzyme trong thành

phẩm và mức nhiệt trên 850C được chứng minh là làm giảm khả năng tiêu hóa chất

dinh dưỡng ở gà thịt (Boroojeni và cs, 2014).

Thêm vào đó, nhiệt độ trên 700C cũng làm giảm khả năng hoạt động của

enzyme phytase có trong nguyên liệu và enzyme bổ sung vào cám thành phẩm

(Jongbloed và cs, 1990) làm enzyme bị biến tính, có ảnh hưởng đến khả năng tiêu

hóa của động vật (Gehring và cs, 2011).

Qua các nghiên cứu trên đã xác định được tỷ lệ levan phối trộn trong công

thức cám là 0,1% và nhiệt độ ép viên thích hợp là 700C.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Qua quá trình nghiên cứu nghiên cứu các điều kiện thu nhận levan từ B.

subtilis và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1-

14 ngày tuổi chúng tôi đưa ra một số các kết luận sau:

- Xác định được ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và điều kiện nuôi

cấy đến quá trình sinh tổng hợp và thu nhận levan từ B. subtilis: Nồng độ sucrose

80 g/l, pH 7, nguồn nito YE, nồng độ nito 2 g/l, tỷ lệ giống cấp 7,5%; tốc độ lắc 150

vòng/phút với hàm lượng levan thu được là 18,71 g/l;

- Xác định được điều kiện tối ưu hóa cho quá trình sinh tổng hợp levan của

chủng B. subtilis: nồng độ sucrose 80 g/l, pH 8, nguồn nito YE, nồng độ nito 2,3 g/l,

tỷ lệ giống cấp 7,5%; tốc độ lắc 120 vòng/phút cho hàm lượng thu được: 21,05 g/l;

- Đã xác định được dung môi hữu cơ kết tủa levan là ethanol 96o với tỷ lệ thể

tích dịch levan và dung môi là 1:3, nhiệt độ kết tủa -5 oC trong thời gian 3 giờ;

- Xác định được tỷ lệ bổ sung levan trong thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai

đoạn 1 - 14 ngày tuổi là 0,1% và nhiệt độ ép viên cám thành phẩm 700C.

2. Kiến nghị

Đề tài đưa ra một số kiến nghị như sau:

- Xác định sự sinh trưởng của gà cảnh giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi sử dụng

thức ăn chứa 0,1% levan;

- Tinh sạch chế phẩm levan thu được để ứng dụng rộng hơn trong thực phẩm;

- Nghiên cứu tính chất và xác định khối lượng phân tử của levan thu được.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

1. Nguyễn Đức Duy Anh (2005), Phân lập và khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn

Latobacillus acidophilus và Bacillus subtilis, Khóa luận tốt nghiệp, đại học nông -

lâm TP. HCM.

2. Tô Minh Châu (2000), Giáo trình vi sinh vật ứng dụng trong chăn nuôi.

3. Nguyễn Duy Khánh (2006), Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử từ vi khuẩn

Bacillus subtilis, Khóa luận tốt nghiệp, đại học nông - lâm TP. Hồ Chí Minh.

4. QCVN 01 - 190: 2020/BNNPTNT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia thức ăn chăn nuôi

- hàm lượng tối đa cho phép các chỉ tiêu an toàn trong thức ăn chăn nuôi và nguyên

liệu sản xuất thức ăn thủy sản.

5. Phạm Hồng Sơn (2006), Giáo trình kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử, Nxb đại

học Huế.

6. Vũ Thị Thứ (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng ụng của một số

chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis, Luận văn phó tiến sĩ khoa học sinh học,

Viện sinh học nhiệt đới.

7. Nguyễn Thanh Thủy (2007), Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận enzyme α -

amylase và ứng dụng trong công nghiệp sản xuất Detrin, Khóa luận tốt nghiệp, đại

học Nông - lâm TP. Hồ Chí Minh.

8. Nguyễn Thị Thúy (2012), Biểu hiện β - Galactosidase trong vi khuẩn Bacillus

subtilis, Luận văn thạc sỹ sinh học, ĐH Khoa học tự nhiên - ĐHQGHN.

9. Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nxb giáo dục.

10. Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 4326:2001), Thức ăn chăn nuôi, xác định độ ẩm và

hàm lượng chất bay hơi khác.

11. Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 4594:1988), Đồ hộp - phương pháp xác định đường

tổng số, đường khử và tinh bột.

12. Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 8128:2015), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn

chăn nuôi và nước - chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường

nuôi cấy.

13. Nguyễn Minh Trí (2011), Điều kiện thích hợp nuôi cấy chủng Bacillus subtilis

CB15 sinh protease trên môi trường dịch ép đầu tôm.

14. Tống Ngọc Triêm (2010), Tổng quan về enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis,

Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội - ĐHQGHN.

15. Đặng Ngọc Phương Uyên (2007), Phân lập vi khẩn Bacillus subtilis từ đất và khảo

sát tính đối kháng với vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, Tạp chí khoa

học đại học Nông - lâm TP. HCM.

16. Nguyễn Thị Bảo Uyên, Trần Thị Thu Hà, Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Hồng

Châu, Lê Thị Hồng Ánh, Trần Chí Hải (2018), Khảo sát quá trình kết tủa protein từ

dịch trích ly rong mền Chaetomorpha sp. bằng acid và cồn.

17. Hà Thị Thụy Vy, Trần Thanh Trúc và Nguyễn Văn Mười (2016), Ảnh hưởng của

dung môi và thời gian kết tủa đến hiệu quả tinh sạch sơ bộ enzyme protease trích ly

từ thịt đầu tôm, Tạp chí khoa học trường đại học Cần Thơ, Số chuyên đề: Nông

nghiệp (Tập 1): 9-17.

Tài liệu tiếng anh

1. Abdel - Fattah, D. Mahmoud & M. Esawy (2005), Production of levansucrase from

Bacillus subtilis NRC 33 and enzymic synthesis of levan and fructo –

oligosaccharides, Curr Microbiol, 51, 402 - 407.

2. Abdel - Fattaha, A. G. Eldeenb, W. A. Helmya & M. A. Esawy (2012), Antitumor

and antioxidant activities of levan and its derivative from the isolate Bacillus

subtilis NRC1aza, Carbohydrate Polymers, 89, 314 - 322.

3. Ammar, T. Matsubara, K. Ito, M. Izuka, T. Limpaseni, P. Pongsasdi & N.

Minnamiura (2002), Characterion of a thermostable levansucrase from Bacillus sp

TH4 - 2 capable of producing high molecular weight levan at high temperature, J

Biotechnol, 99, 111 - 119.

4. Ankom technology method 10,12-06-06 (AOCS approved produre Ba 6a -05),

Crude Fiber in Feed by Filter Bag Technique.

5. Ankom technology method 2 01-30-09 (AOCS official produre Am5-04),Rapid

Determination of Oil/Fat Utilizing High Temperature Solvent Extraction.

6. AOAC 924.05 (2012), Determination of Ash in Animal Feed.

7. AOAC 927.02 (2016), Dertermination of calcium content.

8. AOAC 965.17 (2016), Phosphorus in animals feed and pet food.

9. Aridson, B. T. Rinehart, B. T. Rinehart & F. Cadala - Maria (2006), Concentraion

regimes of solutions of levan polysaccharide from Bacillus spp, Carbohyd Polymes,

65, 144 - 149.

10. Arvidson S.A., Rinehart B.T., Gadala M.F (2006), Concentraion regimes of solutions of

levan polysaccharide from Bacillus spp, Carbohyd Polymes, 65, 144 - 149.

11. Ashson acton (2012), Advances in halomonadaceae research and application.

Scholarly editions, ISBN: 987-1-4816-3994-8.

12. Berte, D. Borsato, P. S. Sila, J. A. Rignoli & M. A. P. C. Celligoi (2013), Statistical

optimization of levansucrase production from Bacillus subtilis ATCC 6633 using response

surface methodology, African Journal of Microbiology Rseach, 7 (10), 898 - 905.

13. Bersaneti, G.T., Pan, N.C., Baldo, C., Celligoi, M.A.P.C. (2018), Co-production of

fructooligosaccharides and levan by levansucrase from Bacillus subtilis natto with

potential application in the food industry, Appl. Biochem. Biotechnol. 184 (3), 838–851.

14. Beste calimlioglu (2014), Purification and Characterization of Levansucrase by

Halomonas smyrnensis AAD6T.

15. Boroojeni F.G, Mader A., Knorr F., I. Ruhnke I., Röhe I., Hafeez A., Männer K.,

Zentek J. (2014), The effects of different thermal treatments and organic acid levels

on nutrient digestibility in broilers Poult, Poult Sci, 93(5):1159-71. doi:

10.3382/ps.2013-03563.

16. Boroojeni, A. Mader, F. Knorr, I. Ruhnke, I. Röhe, A. Hafeez, K. Männer,

J. ZentekThe effects of different thermal treatments and organic acid levels on nutrient

digestibility in broilers Poult. Sci, 93 (2014), pp. 1159-1171.

17. Bruna Caroline Marques Goncalves, Cristiani Baldo, Maria Antonia Pedrine

Colabone Celligoi (2015), Levan And Levansucrase Mini Review.

18. Bruna Caroline Marques Gonçalves, Janaina Mantovan, Mara Lúcia Luis Ribeiro,

Dionísio Borsato, Maria Antonia Pedrine Colabone Celligoi (2013), Optimization

production of thermo active levansucrase from Bacillus subtilis Natto CCT 7712, Journal

of Applied Biology & Biotechnology Vol. 1 (02), pp. 001-008, July - Aug. 2013.

19. Calazans, C. E. Lopez, R. M. O. C. Lima & F. P. Franca (1997), Antitumour

activities of levans produced by Zymomonas mobilis strains. Biotechnology Letter,

19, 19 - 21.

20. Devi & A. Alamu (2013), Production of Biopolymer Levan by Bacillus subtilis

using Non-Ionic Surfactants, Asian J. Pharm. Tech, 3, 37 - 41.

21. El-Safty E., Ahmed E.F., Helmy W.A., Mansour N.M., El-Senousy W.M. (2012),

Antiviral levans from Bacillus spp. isolated from honey, Intech DoI, 10: 5772 -

5248.

22. European directive 98/64EC, 2257/16, Watera acquiry UPLC H-class aminoacid

analysis system guide, Revision A-2012.

23. Euzenat, A. Guilbert & D. Combes (1996), Production of fructo -oligosaccharides

by levansucrease from Bacillus subtilis C4, Process Biochem, 32, 237-243.

24. Gabrielly T.B., Nicole C.P., Cristiani B., Maria A.P.C.C. (2017), Co-production of

fructooligosaccharides and levan by levansucrase from Bacillus subtilis natto with

potential application in the food industry, Appl Biochem Biotechnol, 184(3):838-

851. DOI 10.1007/s12010-017-2587-0.

25. Gehring C.K., Lilly K.G.S., Shires L.K., Beaman K.R., Loop S.A., Moritz J.S.

(2011), Increasing mixer-added fat reduces the electrical energy required for

pelleting and improves exogenous enzyme efficacy for broiler, J. Appl. Poult. Res,

20: 75-89.

26. Han, & A. M. Clarke (1990), Production and characterization of microbial levan,

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 38, 393-396.

27. In Young Bae , Im-Kyung Oh, Suyong Lee, Sang-Ho Yoo, Hyeon Gyu Lee (2007),

Rheolo gical Characterization of Levan Polysaccharides from Microbacterium

Laevaniformans.

28. ISO 5983-2, AOAC 2011.11, Protein determanation in animals feed using

colorimetric titration.

29. Jaecho C., Hee P.N., Jae Y.S., Ho L.T. (2001), Molecular and enzymatic

characterization of levan fructotransferase from Microbacterium sp, AL - 210. J

Biotechnol, 91: 49 - 61.

30. Jaecho, P. N. Hee, Y. S. Jae & L. T. Ho (2001), Molecular and enzymatic

characterization of levan fructotransferase from Microbacterium sp, AL - 210. J

Biotechnol, 91 49 - 61.

31. Jang, K. B. Song, C. H. Kim, B. H. Chung, S. A. Kang, U. H. Chun, R. W. Choue

& S. K. Rhee (2001), Comparison of characteristics of levan produced by diferent

preparations of levansucrase from Zymomonas mobilis, Biotechnology Letter, 23,

339 - 344.

32. Jongbloed A.W., Kemme P.A. (1990), Effect of pelleting mixed feeds on phytase

activity and the apparent absorbability of phosphorus and calcium in pigs Anim,

Feed Sci. Technol, 28: 233-242.

33. Jothi S.C.A.C., Bhuvaneshwari V., Kartik K.S., Krishna P.M., Saravanan R.S.,

Ponnusami V. (2019), Studies on solvent precipitation of levan synthesized using

Bacillus subtilis MTCC 441, Heliyon, 5(10): 02678. https://doi.org/10.1016/

j.heliyon.2019.e02414.

34. Justin Barone, Maria Medynets (2007), Thermally processed levan

polymer(https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S014486170700046X).

35. Kang & I. W. Cottrell (1979), Polysaccharides. In H. J. Peppler and D. Perlman

(ed), Microbial technology, 2nd ed. Academic Press, Inc, New York, 418 - 481.

36. Kang, (2009), "Levan: Applications and Perspectives", Microbial Production of

Biopolymers and Polymer Precursors. Caister Academic Press, ISBN 978-1904455-36-3.

37. Khadiga Abou-taleb, Mohamed Abdel-Monem, Mohamed H. Yassin and Amal A.

Draz (2015), Production, Purification and Characterization of Levan Polymer from

Bacillus lentus V8 Strain.

38. Ki-Hyo J., Ki-Bang S., Chul H.K., Bong H.C., Soon A.K., Uck-Han C., Ryo W.C.,

Sang-Ki R. (2001), Comparison of characteristics of levan produced by diferent

preparations of levansucrase from Zymomonas mobilis. Biotechnol Lett, 23: 339 -

344.

39. Kim, J. W. Seo, K. B. Song, K. H. Jang, B. H. Jung, S. K. Rhee (2000), Molecular

cloning of a gene encoding the thermoactive levansucrase from Rahnella aquatilis and

its growth phasedependent expression in Escherichia coli, J Biotechnol, 81, 63 - 72.

40. Kunst, N. Ogasawara, I. Moszer, A. M. Albertini, G. Alloni, V. Azevedo, M. G.

Bertero, P. Bessières, A. Bolotin, S. Borchert, R. Borriss, L. Boursier… (1997), The

complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis,

Nature, 390, 249 - 256.

41. Lensing M., Klis J., Yoon I., Moore D.T. (2012), Efficacy of Saccharomyces

cerevisiae fermentation product on intestinal health and productivity of coccidian-

challenged laying hens, Poult Sci, 91:1590–7.

42. Li J., Kim H. (2013), Effects of Levan-type fructan supplementation on growth

performance, digestibility, blood profile, fecal microbiota, and immune responses

after lipopolysaccharide challenge in growing pigs, Journal of animal science,

91(11):5336-43. doi: 10.2527/jas.2013-6665.

43. Manel Z., Taroub B., Sana M., Kaouther Z., Ferid M., Mokhtar H., Claire B.H.

(2018), Evaluation of the efficiency of ethanol precipitation and ultrafiltration on

the purification and characteristics of exopolysaccharides produced by three lactic

acid bacteria, BioMed Research International, doi: 10.1155/2018/1896240.

44. Mardo K., Visnapuu T., Gromkova M., Aasamets A., Viigand K., Vija H., Alamäe

T. (2014), High- throughput assay of levansucrase variants in search of feasible

catalysts for the synthesis of fructooligosaccharides and levan, Molecules, 19: 8434-

8455; doi:10.3390/molecules19068434.

45. Mrudula, Kokila (2009), Production of Thermostable a-amylase by Bacillus cereus

MK in solid state fermentation: Partial purification and characterization of the enzyme.

46. Ni, D., Xu, W., Bai, Y., Zhang, W., Zhang, T., Mu, W. (2018), Biosynthesis of

levan from sucrose using a thermostable levansucrase from Lactobacillus reuteri

LTH5448, Int. J. Biol. Macromol. 113, 29–37.

47. Olano, G. R. E. Gibson & R. A. Rastall (2002), Comp - arison of the in vitro

bitidogenic properties of pectin and pectin – oligosaccharides, Journal of Applied

Microbiology, 93, 505 – 5111.

48. Oliveira, R. S. Silva, J. B. Buzato & M. A. P. C. Celligol (2007), Study of levan

production by Zymomonas mobilis using regional low - cost carbohydrate sources,

Biochem Eng J, 37, 177 - 183.

49. Oner, LazaroHernandez, JoanCombie (2016), Review of Levan polysaccharide:

From a century of past experiences to future prospects, 34, 827 – 844.

50. Oseguera, L. Guereca L & A. Lopez - Munguia (1996), Properties of levansucrase

from Bacillus circulans, Appl Microbiol Biotechnol, 45, 465 – 471.

51. Patricia Bittencourt da Silva, Dionisio Borsato and Maria Antonia Pedrine Colabone

Celligoi (2014), Optimization of High Production of Fructooligosaccharides by

Sucrose Fermentation of Bacillus subtilis Natto CCT 7712. American Journal of

Food Technology, 9: 144-150.

52. Poli A., Kazak H., Gürleyendağ B., Tommonaro G., Pieretti G., Toksoy Ö.E.

(2009), High level synthesis of levan by a novel Halomonas species growing on

defined media, Carbohydr Polym 78:651–657.

53. Queiroz Santos, Vidiany Aparecida; Garcia Cruz, Crispin Humberto (2016),

Ethanol and Levan production by sequential bath using Zymomonas mobilis

immobilized on alginate and chitosan beads. Acta Scientiarum

Technology 38(3):263 June 2016, DOI: 10.4025/ actascitechnol. V 38i3.27646.

54. Santos, F. Melo, W. J. M. Paiva, D. Borsato, M. Dasilva & M. Celligoi (2013),

Characterization and optimization of levan production by Bacillus subtilis (Natto),

Romanian Biotechnological Letters, 18, 8413 - 8422.

55. Selim, Seval, Sirma, Taner (2013), Levan production by Zymomonas mobilis

inbatchand continous fermantation system.

56. Shin, Y. T. Yu, C. J. Shienh & C. Y. Hsien (2005), Selective Production and

Characterization of Levan by Bacillus subtilis (natto) Takahashi. J. Agric, Food

Chem, 53 (21), 8211 - 8215.

57. Szwengiel, M. Czarnecka, H. Roszyk & Z. Czarnecki (2004), Levan production by

Bacillus subtilis DSM 347 strain, Food Sicence and Technology, 2, 7-12.

58. Tamer I.M. Ragab, Roslinda Abd Malek, Islam A. Elsehemy, Mohamed M.S.

Farag, Bassem M. Salama, Mohamed A. Abd EL-Baseer, Amira M. Gamal-Eldeen,

Hesham A. El Enshasy, and Mona A. Esawy (2018), Scaling up of levan yield in

Bacillus subtilis M and cytotoxicity study on levan and its derivatives, Journal of

Bioscience and Bioengineering, DOI: 10.1016/j.jbiosc.2018.09.008.

59. Tajima, N. Uenishi, M. Fujiwara, T. Erata & M. Munekata (1998), The production of a

new water - soluble polysaccharide by Acetobacterxylinum NCL 1005 and its structural

analysis by NMR spectroscopy, Carbohydr Res, 305, 117 -122.

60. Ward N.E, Ayres L.A.E., Moritz J.S. (2020), The effect of varying steam

conditioning temperature and time on pellet manufacture variables, true amino acid

digestibility, and feed enzyme recovery, J. Appl. Poult. Res. 29:328-338.

61. Xin J.L., Yong M.K., Jae H.P., Dong H.B., Charles M.N., In H.K. (2017), Effects of

levan-type fructan on growth performance, nutrient digestibility, diarrhoea scores,

faecal shedding of total lactic acid bacteria and Coliform bacteria, and faecal gas

emission in weaning pig, J Sci Food Agric, 98 (4): 1539-1544.doi: 10.1002/

jsfa.8625.

62. Yamamoto Y., Takahashi Y., Kawano M., Iizuka M., Saeki S., Yamaguchi H.

(1999), In vitro digestibility and fermentability of levan and its hypocholesterolemic

effects in rat, J. Nutr. Blochem, 10:13-18.

63. Yan Wang et al (2017), Effect of probiotics on the meat flavour and gut microbiota

of chicken.

64. Yitbarek A, Echeverry H, Brady J, et al, Innate immune response to yeast derived

carbohydrates in broiler chickens fed or-ganic diets and challenged with

Clostridium perfringens Poult Sci 2012;91:1105-12.

Tài liệu website

65. http://biomedia.vn/review/tua-adn-ethanol-va-isopropanol.html.

66. http:// hoisvcvn.org.vn.

67. http://giadinh.net.

68. http://realbio.co.

PHỤ LỤC

1. Đặc điểm hình dạng tế bào

B. subtilis sau 24 giờ hoạt hóa trong môi trường lỏng được sử dụng làm tiêu

bản nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi. Kết quả quan sát dưới kính hiển vi

cho thấy chủng này có dạng hình que ngắn, nhỏ, đứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi

ngắn, bắt màu tím nên là vi khuẩn Gram dương. Kết quả được ghi lại ở hình 4.1.

Hình 1.1. Hình dạng tế bào của chủng B. subtilis

2. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

B. subtilis sau 24 giờ hoạt hóa trong môi trường L1 và nhân giống trong môi

trường L2 được pha loãng từ nồng độ 10-1 đến 10-12.

Cấy trải dịch pha loãng lên các đĩa pettri chứa môi trường TGA. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37OC trong 24 giờ. Khi khuẩn lạc phát triển tới mức có thể phân biệt bằng mắt thường quan sát thấy nồng độ pha loãng 10-10 cho khuẩn lạc có số lượng thích hợp, hình thái rõ nét.

Tính kết quả:

Từ số khuẩn lạc ta có thể suy ra số lượng tế bào (CFU) có trong 1 ml dung

dịch gốc:

Trong đó:

a = Số lượng khuẩn lạc trung bình trên các đĩa ở cùng nồng độ pha loãng; K = (10-) độ pha loãng của dịch được cấy trải trên đĩa;

V = Thể tích dịch pha loãng được cấy trải trên đĩa.

3. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng B.subtilis

Kết quả thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trường của vi khuẩn B.

subtilis trên môi trường L2, nhằm mục đích nghiên cứu định tính vi sinh vật theo

thời gian và xác định thời điểm tế bào đạt cực đại để từ đó tiếp giống vào môi

trường lên men phù hợp nhằm chuyển hóa sucrose thành levan sao cho đạt hàm

lượng cao nhất.

Bảng 3.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng B. subtilis

STT Nồng độ pha loãng Mật độ vi sinh vật OD600nm

1 10-7

2 10-8

3 10-9

4 10-10

Từ kết quả thu được ở trên xây dựng đường cong sinh trường của vi khuẩn B.

Subtilis ở hình 4.2.

4. Khảo sát hàm lượng levan thu được

Tiến hành xây dựng đường chuẩn fructose làm cơ sở cho xác định hàm

lượng levan. Kết quả thu được biểu diễn ở bảng 4.2.

Bảng 4.1. Khảo sát hàm lượng levan thu được

Ống nghiệm

Hóa chất

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Thể tích Fructose

(ml) từ ống gốc

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

10 mg/ml)

Thể tích nước cất

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

(ml)

Nồng độ fructose

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

(mg/ml)

Thể tích DNS

0,097 0,278 0,396 0,498 0,667 0,834 0,935 1,050 1,161 1,274

OD540(nm)

Hình 4.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn B. subtilis

Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử fructose với thuốc thử

DNS (3,5-Dinitrolicylic acid). Cường độ màu của hỗn hợp tỉ lệ thuận với nồng độ

đường khử trong phạm vi nhất định. Ta có phương tình đường tuyến tính giữa nồng

độ đường khử fructose (g/l) với mật độ quang: OD540 nm là y = 0,1301x – 0,0005. Từ

phương trình đồ thị đường chuẩn ta tính được nồng độ đường khử fructose trong

dung dịch.

Hàm lượng đường khử fructose:

y = 0,1301x – 0,0005 => x = = F

Hàm lượng levan: L = F x 0,9 = x 0,9

5. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn

Chủng B. subtilis được hoạt hóa trên môi trường L1, nuôi lắc 120 vòng/phút

ở 37oC trong 24 giờ. Bảo quản giống B. subtilis trong ngăn mát tủ lạnh và cấy

truyền định kỳ lên môi trường mới sau 1 - 2 tháng.

5.1. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Từ việc xác định mật độ tế bào trong các dịch giống, qua đó ta có thể đánh

giá khách quan khả năng sinh tổng hợp levan của các chủng vi sinh vật nhờ vào ban

đầu cùng cấp một thể tích giống và cùng mật độ tế bào có trong dịch giống.

Các bước tiến hành:

- Pha loãng mẫu: Để tách rời các tế bào, cần pha loãng mẫu kèm theo lắc

mạnh dịch đã pha loãng;

- Cấy trải dịch pha loãng lên các đĩa pettri chứa môi trường TGA;

- Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Khi khuẩn lạc phát triển tới

mức có thể phân biệt bằng mắt thường thì tiến hành đếm số khuẩn lạc;

- Đếm số khuân lạc mọc trên đĩa thạch: đếm số lượng khuẩn lạc bằng cách

úp sấp đĩa peptri, trên mặt đáy phía ngoài của đĩa, dùng bút viết kính đánh dấu

những khuẩn lạc đã đếm. Nếu số lượng khuẩn lạc nhiều, dùng bút chia nhỏ đĩa ra

thành các phần nhỏ. Đếm số khuẩn lạc trong từng phần sau đó cộng lại.

- Tính kết quả:

Theo lý thuyết, mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào riêng rẽ. tuy

nhiên, trên thực tế khó có thể xác định được một khuẩn lạc được hình thành từ một

hay nhiều tế bào. Vì vậy, để tính số tế bào trong một đơn vị thể tích người ta thường

dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn lạc trong một đơn vị thể tích” (CFU -

Colony Forming Unit).

Như vậy, từ số khuẩn lạc đếm được ta có thể suy ra số lượng tế bào (CFU) có

trong 1 ml dịch nuôi cấy một cách tương đối:

CFU/ml = a.1/K.1/V

Trong đó:

a: Là số lượng khuẩn lạc trung bình trên các đĩa ở cùng độ pha loãng;

K: Độ pha loãng của dịch được cấy trải trên đĩa;

V: Thể tích của dịch pha loãng được cấy trải trên đĩa.

5.2. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng B. subtilis

Chủng B. sutilis được hoạt hóa trên môi trường L1. Nuôi lắc 120 vòng/phút ở

37OC trong 24 giờ. Vi sinh vật sau khi hoạt hóa sẽ được tiếp giống vào môi trường

L2, ủ ở 37OC, pH 7 và lắc 120 vòng phút.

Tại các mốc thời gian khác nhau, lấy dịch nuôi đem đo OD ở bước sóng 600

nm và cấy trải để đếm khuẩn lạc.

Dịch nuôi cấy ở các mốc thời gian khác nhau, được pha loãng ở các nồng độ

pha loãng thích hợp, sau đó lấy dịch pha loãng cấy trải lên các đĩa pettri chứa môi

trường L1 có bổ sung thạch.

Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37OC trong 24 giờ. Tiến hành đếm số khuẩn lạc.

Theo dõi số lượng vi sinh vật theo thời gian và kết quả được trình bày ở bảng 4.3.

Bảng 4.3. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng B.subtilis

Thời gian Mật độ B.

subtilis 0 4 6 8 12 16 20 24 28 32 36 48 60 72

(CFU/ml)

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận levan từ (Bacillus subtilis) và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1-14 ngày tuổi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

LÊ ANH TÚ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN LEVAN TỪ (Bacillus subtilis) VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI CHO GÀ CẢNH GIAI ĐOẠN 1-14 NGÀY TUỔI CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phần dinh dưỡng (%)

Công thức đối chứng

Bổ sung 0,3% levan (Công thức 3)

Bổ sung 0,1% levan (Công thức 1)

Bổ sung 0,2% levan (Công thức 2)

Cám thành phẩm được kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh theo TCVN tương ứng

PHỤ LỤC

Ống nghiệm

Hóa chất

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok