Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi cá hồi vân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐẶNG VIỆT ANH

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUY TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM GIÀU

CANTHAXANTHIN TỪ VI KHUẨN ƯA MẶN Paracoccus

carotinifaciens VTP20181 VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG

TRONG CHĂN NUÔI CÁ HỒI VÂN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Hà Nội - 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐẶNG VIỆT ANH

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUY TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM GIÀU

CANTHAXANTHIN TỪ VI KHUẨN ƯA MẶN Paracoccus

carotinifaciens VTP20181 VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG

TRONG CHĂN NUÔI CÁ HỒI VÂN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

Mã số chuyên ngành: 9.52.03.01

Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Phạm Quốc Long

2. TS. Phạm Hồng Hải

Hà Nội - 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của

GS. TS Phạm Quốc Long và TS Phạm Hồng Hải. Các kết quả và số liệu thu được

trong luận án là hoàn toàn trung thực, chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào

khác.

Tác giả luận án

Đặng Việt Anh

1

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Với sự kính trọng, cùng tấm lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin

bày tỏ sự biết ơn tới GS.TS. Phạm Quốc Long và TS. Phạm Hồng Hải là những

người thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian

thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện Hóa học

các hợp chất thiên nhiên, Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện để tôi

hoàn thành luận án.

Tôi cũng xin cảm ơn tới tập thể cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển các Sản phẩm thiên nhiên, phòng Công nghệ và thiết bị hóa học - Viện Hóa học các hợp

chất thiên nhiên, Bộ môn Công nghệ Enzyme và Protein - Viện công nghiệp thực

phẩm, Trung tâm công nghệ sinh học - Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản 1 đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Cuối cùng, tôi xin gửi lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến gia đình, người

thân và bạn bè đã luôn quan tâm, giúp đỡ, khích lệ và tạo điều kiện cho tôi trong quá

trình làm luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Tác giả luận án

Đặng Việt Anh

2

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... 1 LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ 2

MỤC LỤC ...................................................................................................................... 3

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................. 8

DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. 9 DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... 11 MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 13

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ....................................................................................... 14

1.1. Vài nét về Carotenoid ........................................................................................... 14

1.2. Giới thiệu về Canthaxanthin ............................................................................... 14

1.2.1. Tính chất vật lý của canthaxanthin ................................................................. 15

1.2.2. Tính chất hóa học của canthaxanthin.............................................................. 15

1.2.3. Tính chất dược lý của canthaxanthin đối với động vật thủy sản .................. 16

1.2.4. Ứng dụng của canthaxanthin ........................................................................... 16

1.3. Tổng quan về quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin...................................... 17

1.3.1. Giới thiệu chung về chi Paracoccus ................................................................. 17

1.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp canthaxanthin ............................................................... 18

1.3.3.1. Nhu cầu về NaCl ............................................................................................. 19

1.3.3.2. Nguồn carbon và nitơ ..................................................................................... 20

1.3.3.3. Nguyên tố vi lượng .......................................................................................... 20

1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin............................................................................................................... 21

1.3.4.1. Tỷ lệ giống ....................................................................................................... 21

1.3.4.2. Nhiệt độ ............................................................................................................ 21

1.3.4.3. Sự cung cấp oxy .............................................................................................. 21

1.3.4.4. Độ pH môi trường........................................................................................... 22

1.3.4.5. Thời gian lên men ........................................................................................... 22

1.3.4.6. Phương pháp lên men .................................................................................... 22

1.4. Thu hồi sản phẩm ................................................................................................. 24

1.4.1. Kỹ thuật tách sinh khối vi sinh vật .................................................................. 24

1.4.1.1. Phương pháp lọc ............................................................................................. 25

3

1.4.1.2. Phương pháp ly tâm ....................................................................................... 25

1.4.1.3. Phương pháp lắng........................................................................................... 25

1.4.2. Sấy thu hồi sinh khối vi sinh vật ...................................................................... 26

1.5. Các phương pháp trích ly và tinh chế canthaxanthin ....................................... 27

1.5.1. Các phương pháp phá hủy thành tế bào ......................................................... 27

1.5.1.1. Các phương pháp cơ học gián đoạn .............................................................. 27

1.5.1.2. Các phương pháp cơ học không gián đoạn .................................................. 28

1.5.2. Nguyên lý hoạt động của quá trình chiết xuất bằng siêu âm ........................ 31

1.5.3. Ảnh hưởng các thông số chiết siêu âm ............................................................ 31

1.5.3.1. Thông số vật lý ................................................................................................ 31

1.5.3.2. Thông số môi trường ...................................................................................... 33

1.6. Giới thiệu về liposome và ứng dụng của liposome ............................................ 35

1.6.1. Giới thiệu về liposome ....................................................................................... 35

1.6.1.1. Lịch sử liposome ............................................................................................. 35

1.6.1.2. Cấu tạo của liposome ..................................................................................... 35

1.6.1.3. Ứng dụng của liposome .................................................................................. 36

1.6.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất liposome .............................................. 37

1.6.2. Nghiên cứu và ứng dụng liposome trong nuôi cá hồi vân .............................. 38

1.7. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng trong tối ưu hóa ........... 38

1.8. Giới thiệu về cá hồi vân và nghề nuôi cá hồi nước lạnh ................................... 40

1.8.1. Phân loại ............................................................................................................. 40

1.8.2. Tình hình nuôi cá hồi tại trên thế giới và Việt Nam....................................... 40

1.8.2.1. Tình hình nuôi cá hồi vân trên thế giới ........................................................ 40

1.8.2.2. Tình hình nuôi cá hồi vân tại Việt Nam ....................................................... 40

1.8.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến chăn nuôi cá hồi ................................................... 41

1.8.3.1. Nhiệt độ ............................................................................................................ 41

1.8.3.2. Nồng độ oxy hoà tan, muối, pH ..................................................................... 41

1.8.3.3. Nhu cầu dinh dưỡng và thức ăn của cá hồi vân .......................................... 42

1.8.3.4. Nhu cầu protein .............................................................................................. 42

1.8.3.5. Nhu cầu về lipid acid béo ............................................................................... 42

1.8.3.6. Nhu cầu vitamin và khoáng chất................................................................... 43

1.8.3.7. Nhu cầu carotenoids ....................................................................................... 44

4

1.8.3.8. Phát triển thức ăn cho cá hồi ở Việt Nam .................................................... 44

1.8.4. Nghiên cứu bổ sung canthaxanthin vào thức ăn thủy sản ở Việt Nam ........ 45

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

....................................................................................................................................... 46

2.1. Nguyên vật liệu ..................................................................................................... 46

2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn ... 46

2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men ............. 46

2.1.3. Nguyên vật liệu nghiên cứu tổng hợp liposome .............................................. 46

2.2. Thiết bị máy móc .................................................................................................. 46

2.2.1. Thiết bị nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn ................. 46

2.2.2. Thiết bị nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men ........................... 47

2.2.3. Thiết bị nghiên cứu tổng hợp liposome ........................................................... 47

2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 47

2.3.1. Phương pháp lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn ........................... 47

2.3.1.1. Phương pháp định lượng sinh khối vi sinh vật ............................................ 47

2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng canthaxanthin ...................................... 47

2.3.1.3. Phương pháp xác định sản lượng canthanxanthin...................................... 49

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men ................. 49

2.3.2.1. Xác định hàm lượng tổng carotenoid ........................................................... 49

2.3.2.2. Xác định hàm lượng canthaxanthin bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ..... 50

2.3.2.3. Phương pháp sắc kí lớp mỏng ....................................................................... 50

2.3.2.4. Phương pháp sắc kí cột .................................................................................. 50

2.4. Phương pháp nghiên cứu tạo sản phẩm thức ăn cho cá hồi chứa

canthaxanthin .............................................................................................................. 51

2.4.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp bổ sung chế phẩm canthaxanthin ........ 51

2.4.2. Phương pháp xác định liều lượng bổ sung canthaxanthin vào thức ăn cá hồi

....................................................................................................................................... 51

2.5. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình công nghệ ..... 52

2.6. Phân tích thống kê ................................................................................................ 54

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM ............................................................................... 55

3.1. Lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn ..................................................... 55

3.1.1. Lựa chọn thành phần môi trường .................................................................... 55

5

3.1.2. Khảo sát tìm tâm thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp

canthaxanthin .............................................................................................................. 57

3.1.3. Sàng lọc điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin ............................. 57

3.1.4. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin ......................... 58

3.1.5. Lựa chọn mô hình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin ............................. 59

3.1.6. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men .............................. 60

3.2. Xây dựng quy trình chiết xuất canthaxanthin ................................................... 61

3.2.1. Định lượng canthaxanthin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp .............. 61

3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất quá trình chiết xuất canthaxanthin ...................................................................................................... 62

3.2.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết ........................... 62

3.2.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến quá trình chiết

....................................................................................................................................... 63

3.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết .............................. 63

3.2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm đến quá trình chiết ............... 63

3.2.3. Xây dựng mô hình nghiên cứu và ma trận kế hoạch thực nghiệm ............... 64

3.3. Đặc điểm và quá trình tổng hợp liposome ......................................................... 66

3.3.1. Quá trình tổng hợp liposome ............................................................................ 66

3.3.2. Kích thước hạt ................................................................................................... 66

3.3.3. Quá trình đưa canthaxanthin lên liposome .................................................... 67

3.3.4. Thử nghiệm giải phóng thuốc ........................................................................... 67

3.3.5. Thí nghiệm phối trộn liposome vào thức ăn cho cá hồi vân .......................... 67

3.3.5.1. Cá và chế độ ăn ............................................................................................... 67

3.3.5.2. Tiến hành đo khối lượng ................................................................................ 69

3.3.5.3. Xác định thành phần canthaxanthin trong cơ của cá hồi ........................... 69

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 70

4.1. Tối ưu quá trình lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn ......................... 70

4.1.1. Khảo sát thành phần môi trường sinh tổng hợp canthaxanthin................... 70

4.1.2. Nghiên cứu tối ưu điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin ..................... 78

4.1.2.1. Sàng lọc mức ảnh hưởng của điều kiện lên men sinh tổng hợp

canthaxanthin .............................................................................................................. 78

6

4.1.2.2. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin bằng mô hình RSM-

CCD. ............................................................................................................................. 81

4.1.3. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men .............................. 90

4.1.4. Quy trình công nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ vi

khuẩn ưa mặn quy mô 80-100 lít/mẻ ......................................................................... 91

4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất chiết xuất ................................................................................................................................ 95

4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết .................................................. 95

4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới quá trình chiết .................... 96

4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết .................................................. 97

4.2.4. Ảnh hưởng của công suất siêu âm tới quá trình chiết ................................... 98

4.2.5. Kết quả quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa các thông số công nghệ quá trình chiết xuất ............................................................................................................. 99

4.2.6. Kiểm tra sự tương hợp của mô hình .............................................................. 100

4.2.7. Tối ưu hóa quá trình chiết xuất ..................................................................... 105

4.2.8. Kết quả chiết xuất, phân lập canthaxanthin ................................................. 107

4.3.2. Quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol ...... 112

4.3.3. Sự tăng trưởng của cá với chế độ ăn có bổ sung chế phẩm canthaxanthin

..................................................................................................................................... 113

4.3.3. Màu sắc cơ của cá hồi ...................................................................................... 115

KẾT LUẬN ................................................................................................................ 119

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................... 121

NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN .................................................................... 121

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .. 122

BÀI BÁO QUỐC TẾ ................................................................................................. 122 BÀI BÁO TRONG NƯỚC ........................................................................................ 122 SÁNG CHẾ ................................................................................................................ 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 123

7

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu Diễn giải Tiếng Anh

ANOVA Phân tích phương sai Analysis of Variance

Chất hoạt động bề mặt Glycerol monostearate CMS

Cộng sự CS

Tải lượng thuốc Drug loading DL

DMAPP Dimethylallyl pyrophosphate Dimethylallyl pyrophosphate

Hiệu suất đóng gói Encapsulation Efficiency EE

Geranylgeranyl pyrophosphate Geranylgeranyl pyrophosphate GGPP

HMG-CoA 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA

HPCL Sắc ký lỏng cao áp High-performance chromatography liquid

IC Nồng độ ban đầu Initial concentration

MeOH Methanol CH3OH

Dụng dịch đệm phosphate Phosphate-buffered saline PBS

Chỉ số phân tán Polydispersity Index PDI

Phần triệu Parts per million ppm

Phương pháp bề mặt đáp ứng Response surface methodology RSM

Độ lệch chuẩn Standard deviation SD

Sinh khối khô SKK

Số thứ tự STT

Hợp chất trung gian Tricarboxylic acid TCA

Tetra hydro furan Tetrahydrofuran THF

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography TLC

TLTK Tài liệu tham khảo Reference

Hàm lượng phenolic tổng Total phenolic content TPC

Cường độ siêu âm Ultrasound intensity UI

Tia cực tím Ultraviolet UV

8

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.8. 1. Nhu cầu một số vitamin của cá hồi vân .................................................... 43

Bảng 1.8. 2. Nhu cầu một số khoáng chất của cá hồi vân ............................................. 44

Bảng 1.8.3. Công thức thức ăn cho cá hồi giai đoạn nuôi thương phẩm ...................... 44 Bảng 2.5.1. Các thông số kế hoạch ............................................................................... 53

Bảng 3.1.1. Thành phần môi trường và nồng độ sử dụng thí nghiệm ........................... 56

Bảng 3.1.2. Các yếu tố được khảo sát và mức khảo sát ................................................ 57

Bảng 3.1.3. Ma trận Factorial minium Run Resolution IV screening ........................... 57

Bảng 3.1.4. Bố trí ma trận kế hoạch thực nghiệm ......................................................... 58

Bảng 3.1.5. Lựa chọn điều kiện tối ưu sinh tổng hợp canthaxanthin ............................ 59

Bảng 3.1.6. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men ........................... 60

Bảng 3.2.1. Bảng ma trận kế hoạch thực nghiệm .......................................................... 64

Bảng 3.2.2. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ ..................................... 65

Bảng 3.3.1. Thành phần thức ăn cho cá được sử dụng trong thử nghiệm ..................... 68

Bảng 4.1.1. Đánh giá nồng độ NaCl đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của

chủng vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181 ................................................................ 73

Bảng 4.1.2. Thành phần môi trường .............................................................................. 77

Bảng 4.1.3. Ma trận Min Run Screening và mức ảnh hưởng đến hàm đáp ứng Cx và

Biomass ......................................................................................................................... 80

Bảng 4.1.4. Giá trị biến thực và biến mã hóa trong kế hoạch thực nghiệm Box –

Hunter (CCD) ................................................................................................................ 81

Bảng 4.1.5. Ma trận kế hoạch thực nghiệm điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin .... 82

Bảng 4.1.6. Kết quả phân tích thống kê ANOVA đối với 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2 .. 82

Bảng 4.1.7. Điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin ...................................................... 88

Bảng 4.1.8. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men ........................... 90

Bảng 4.2.1. Biến mã hóa và các mức thí nghiệm .......................................................... 99

Bảng 4.2.2. Bảng kết quả ma trận kế hoạch thực nghiệm ............................................. 99

Bảng 4.2.3. Bảng phân tích hồi quy các hàm mục tiêu Y1 và Y2 ................................ 100

Bảng 4.2.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ .................................................... 105 Bảng 4.3.1. Giá trị EE và DL của liposome đối chứng, liposome chứa canthaxanthin,

liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng thời canthaxanthin và α-tocopherol

liposome với các tỉ lệ IC = 0.1%; IC = 0.5% và IC = 1%. Các số là kết quả của các

phép đo ba lần và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. ........ 110

9

Bảng 4.3.2. Thành phần của cơ cá hồi vân sau 3 tháng thí nghiệm (n=3, đơn vị: % khối

lượng ướt) .................................................................................................................... 115

Bảng 4.3.3. Giá trị đo màu của philê lấy từ cá hồi vân được thí nghiệm bằng các chế

độ ăn khác nhau tại thời điểm ban đầu và sau một, hai và ba tháng cho ăn thử nghiệm

(n=3) ............................................................................................................................ 116

10

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2.1. Công thức cấu tạo hóa học của canthaxanthin (β,β-Carotene-4,4'-dione) . 14

Hình 1.3.1. Sơ đồ sinh tổng hợp canthanxanthin ......................................................... 19

Hình 1.3.2. Sơ đồ lên men liên tục và lên men liên tục có lắng tế bào và lấy bổ sung . 24

Hình 1.5.1. Sơ đồ hệ thống chiết siêu âm quy mô công nghiệp .................................... 30

Hình 1.6.1. Sơ đồ liposome được hình thành bởi phospholipid trong dung dịch nước 36

Hình 1.8.1. Cá hồi vân ................................................................................................... 40

Hình 2.3.1. Quy trình xử lý mẫu xác định hàm lượng canthaxanthin ........................... 48

Hình 3.2.1. Đồ thị đường chuẩn của canthaxanthin ...................................................... 61

Hình 3.3.1. Cấu trúc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol ...................... 66

Hình 3.3.2. Máy đo màu DSM SalmoFan ..................................................................... 69

Hình 4.1.1. Ảnh hưởng của cơ chất các bon và ni tơ đến sự sinh tổng hợp

canthanaxanthin của P.carotinifaciens VTP 20181 ....................................................... 70

Hình 4.1.2. Ảnh hưởng của hợp chất trung gian, vitamin và acid amin đến sự sinh tổng

hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181 ..................................................... 71

Hình 4.1.3. Ảnh hưởng của hợp chất vô cơ đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của

P.carotinifaciens VTP20181 .......................................................................................... 72

Hình 4.1.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin

của P.carotinifaciens VTP20181 ................................................................................... 77

Hình 4.1.5. Thực nghiệm lên men sinh tổng hợp canthaxanthin .................................. 78

Hình 4.1.6. Ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin 80

Hình 4.1.7. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2 ....... 84

Hình 4.1.8. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin (a) và hiệu suất tạo

canthaxanthin (b) ........................................................................................................... 88

Hình 4.1.9. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của hàm mục tiêu Y1 và Y2 ...................... 89

Hình 4.1.10. Điều kiện tối ưu quá trình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin theo mô

hình xây dựng được ....................................................................................................... 89

Hình 4.1.11. Quy trình công nghệ sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ Paracoccus

carotinifaciens VTP 20181 quy mô 80-100 lít/mẻ ........................................................ 92

Hình 4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới quá trình chiết ....................................... 95

Hình 4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới quá trình chiết .................. 96

Hình 4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết ............................................... 97

11

Hình 4.2.4. Ảnh hưởng của công suất siêu âm tới quá trình chiết ................................ 98

Hình 4.2.5. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của hàm Y1 ........ 102

Hình 4.2.6. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của hàm Y2 ........ 102

Hình 4.2.8. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin (a) và hàm lượng carotenoid tổng (b)....................................................................................................... 104

Hình 4.2.9. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất ........................... 106

Hình 4.2.10. Điều kiện tối ưu các biến công nghệ và kết quả tối ưu hóa hàm mục tiêu Y1 và Y2 ....................................................................................................................... 106

Hình 4.2.11. Thực nghiệm chiết canthaxanthin ứng dụng điều kiện tối ưu hóa trong phòng thí nghiệm ......................................................................................................... 107

Hình 4.2.12. Công thức hóa học của hợp chất canthaxanthin ..................................... 107

Hình 4.2.13. Sắc ký đồ hợp chất canthaxanthin sạch .................................................. 108

Hình 4.2.14. Canthaxanthin sạch ................................................................................. 108

Hình 4.2. 15. Sắc ký lớp mỏng canthaxanthin ............................................................ 108 Hình 4.3.1. Kích thước trung bình và giá trị PDI của liposome đối chứng, liposome

chứa canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng canthaxanthin

và α-tocopherol ở các tỉ lệ IC = 0,1%; IC = 0,5% và IC = 1%. .................................. 109

Hình 4.3.2. Thí nghiệm invitro giải phóng canthaxanthin từ liposome chứa

canthaxanthin, liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol tại IC = 0.1%; IC = 0.5%

và IC = 1% trong PBS ở pH 7.4 .................................................................................. 111

Hình 4.3.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol

..................................................................................................................................... 112

Hình 4.3.4. Sự thay đổi trọng lượng của các nhóm cá hồi vân được nuôi bằng các chế

độ ăn khác nhau. .......................................................................................................... 114

Hình 4.3.5. Màu sắc cơ của cá khi kết thúc thí nghiệm .............................................. 117

Hình 4.3.6. Hàm lượng canthaxanthin trong các mẫu cơ ............................................ 118

12

MỞ ĐẦU

Canthaxanthin được sử dụng như một loại phụ gia, chất tạo màu cho thực phẩm

và thuốc nhuộm trong mỹ phẩm. Ngoài ra nó cũng được phép cho thêm vào thức ăn

cho gia cầm và thuỷ sản. Canthaxanthin được tìm thấy trong tự nhiên ở một số loài

động vật, thực vật và vi sinh vật, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo

màu cho cơ thịt động vật trưởng thành, chống lại các gốc tự do oxy hóa [1], chống

khối u [2], ngăn ngừa bệnh tim mạch [3], [4], bảo vệ gan [5], chống tiểu đường [6],

chống bức xạ tia cực tím [7], chống viêm [8], thoái hóa điểm vàng [9]. Trong hệ sinh

thái biển, canthaxanthin được tìm thấy trong tảo, vi khuẩn và giáp xác.

Cá không có khả năng tự sinh tổng hợp carotenoid nhưng có khả năng tích lũy

các chất này trong cá khi chúng ăn các loại trên. Trong nuôi thủy sản, hoàn toàn có thể

gia tăng màu sắc thịt của chúng bằng cách bổ sung canthaxanthin vào thức ăn. Ngày

nay, canthaxanthin được sử dụng khá phổ biến trong việc nuôi cá hồi thương phẩm khi

chúng là nguồn bổ sung cần thiết trong thức ăn cho cá giúp nâng cao chất lượng giá trị

cá hồi thương phẩm.

Cho đến nay, có nhiều con đường khác nhau để thu nhận canthaxanthin từ

nguyên liệu tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học. Trong số đó, con đường thu nhận

canthaxanthin từ quá trình sinh tổng hợp của một số chủng vi khuẩn ưa mặn như

Dietzia natronolimnaea, Halobacterium, Paracoccus sp, Micrococcus roseus đã và

đang được áp dụng có hiệu quả nhất, việc sử dụng, các sản phẩm từ vi sinh vật ngày

càng nhiều do chúng có tính an toàn cao, hiệu quả và thân thiện với môi trường. Do đó

việc nghiên cứu xây dựng quy trình sinh tổng hợp, làm sạch và tinh chế canthaxanthin

từ vi khuẩn có ý nghĩa lớn về khoa học và thực tiễn. Từ những vấn đề nêu trên, chúng

tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm giàu

canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 và bước

đầu ứng dụng trong chăn nuôi cá hồi vân”

Nội dung nghiên cứu của luận án gồm:

- Nghiên cứu, tối ưu hóa quá trình lên men thu sinh khối giàu canthaxanthin từ

vi khuẩn ưa mặn

- Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối vi

khuẩn ưa mặn.

- Tổng hợp liposome có chứa canthxanthin và ứng dụng bổ sung vào thức ăn

nhằm nâng cao chất lượng và mầu sắc thịt cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss).

13

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Vài nét về Carotenoid

Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ tự nhiên trong các loài sinh vật quang hợp

như là tảo, một vài loài nấm, một vài loài vi khuẩn và thực vật. Đến nay đã tìm được

hơn 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai nhóm, xanthophyl và carotene [10].

Carotenoid thuộc nhóm tetraterpenoid (phân tử chứa 40 nguyên tử carbon) được

tạo nên bởi 8 đơn vị isoprene. Khác với thực vật, con người không thể tự tổng hợp ra

carotenoid mà sử dụng thực phẩm có chứa carotenoid trong bữa ăn để tăng sức đề

kháng và bảo vệ bản thân mình. Carotenoid còn có tác dụng chống lại các tác nhân oxy

hóa từ bên ngoài.

Carotenoid được chia thành 2 loại là: carotene và xanthophyll.

+ Các carotene: có màu da cam, đỏ, là những hydrocác bon (C40H58) có 1 mạch

chính 18 carbon mang 4 nhóm CH3 và 9 liên kết đôi mạch nhánh, chúng khác nhau ở

các đầu chuỗi. Ví dụ: α-carotene, β-carotene và lycopene.

+ Xanthophyl: là các phân tử chứa oxi, thường có màu vàng. Ví dụ: lutein và

zeaxanthin.

Một số carotenoid tìm thấy trong thuỷ sản như: canthaxanthin, astaxanthin,

zeaxanthin, tuna xanthin, lutein, beta carotene, doradexanthin, erichinenone.

1.2. Giới thiệu về Canthaxanthin

Hình 1.2.1. Công thức cấu tạo hóa học của canthaxanthin (β,β-Carotene-4,4'-dione)

Canthaxanthin có tên khoa học là β-β carotene-4,4’- dione, là một trong những

dẫn xuất của β-carotene có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thậm chí trội hơn β-

carotene. Hoạt chất này thuộc nhóm diketo-carotenoid (4,4’-oxo-carotenoid) với nhóm

keto đối xứng ở vị trí 4 và 4’ của vòng β-ionone, 9 nhóm liên kết đôi C=C ở trung tâm

phân tử hoạt động như cấu tử hấp phụ ánh sáng, tạo ra màu đỏ-cam của hoạt chất [11],

[12].

Công thức phân tử của canthaxanthin: C40H52O2

14

Khối lượng phân tử M=564.82g/mol

Nhiệt độ nóng chảy: 211  2120C (kèm phân hủy)

Hấp phụ cực đại tại bước sóng λmax: 482 nm (CHCl3); 474 nm (C2H5OH); 466

nm (ete dầu hỏa).

Cúng giống như các carotenoid khác, canthaxanthin là chất chống oxi hóa mạnh,

dễ bị phân hủy khi để trong không khí, hoà tan tốt trong các dung môi kém phân cực.

Công thức phân tử của canthaxanthin thì tương tự như β-caroten nhưng phức tạp hơn.

canthaxanthin có 13 nối đôi trong khi β-caroten chỉ có 7 nối đôi vì vậy khả năng chống

oxi hóa của nó cũng cao hơn β-caroten.

Canthaxanthin tồn tại tương đối phổ biến trong tự nhiên, được phân lập đầu tiên

từ, loài nấm ăn được Cinnabarinus cantharellus vào năm 1950 bởi Haxo [11].

Canthaxanthin cũng được tạo ra ở một số loài tảo xanh ở giai đoạn cuối của chu kỳ

sinh trưởng cùng với một số các caroten khác [12]. Ngoài ra, nó còn được phát hiện ở

các loài vi khuẩn [10], động vật giáp xác [13] và ở nhiều loài cá như cá chép [14], cá

đối vàng, cá tráp biển [15]. Canthaxanthin không được tìm thấy ở loài cá hồi hoang dã

Đại Tây Dương nhưng được tìm thấy ở loài cá hồi hoang dã Thái Bình Dương và một

số loài cá hồi khác [13].

1.2.1. Tính chất vật lý của canthaxanthin

Tính tan: canthaxanthin rất ít tan trong nước vì nó là hợp chất không phân cực,

nó tan trong các dung môi hữu cơ như ete, cồn, pyridine, dầu mỏ, dầu thực vật.

Khả năng hấp thụ ánh sáng và màu sắc: canthaxanthin hấp thụ rất mạnh bức xạ

trong vùng 470÷510 nm nên tạo màu đỏ cam.

Khả năng hấp thụ ánh sáng của canthaxanthin có thể bị thay đổi khi

canthaxanthin liên kết với các chất khác. Trong các động vật giáp xác như cua, tôm

canthaxanthin thường liên kết với phân tử protein (crutacyanin) có max = 628nm tạo

nên màu xanh đặc trưng của các loài giáp xác sống. Khi có tác dụng của nhiệt, liên kết

bị phá hủy các canthaxanthin được giải phóng dưới dạng tự do có màu đỏ cam.

1.2.2. Tính chất hóa học của canthaxanthin

Trong phân tử canthaxanthin có chuỗi polyen, liên kết với các nhóm keto,

hydroxyl gắn với các vòng ở đầu mạch nên canthaxanthin rất nhạy với nhiệt độ cao,

ánh sáng và các tác nhân oxy hóa, axít, bazơ… Tốc độ oxy hóa canthaxanthin diễn ra

nhanh khi có sự xuất hiện của ion kim loại, sunfit, độ ẩm, hoặc để trong không khí.

15

Tính chất oxy hóa: canthaxanthin ở dạng tự do dễ bị oxy hóa bởi tác nhân

electrophil như oxy phân tử. Nhưng khi canthaxanthin tạo phức với protein hay ở dạng

este hóa thì chúng trở nên bền hơn. Tính chất chống oxy hóa của canthaxanthin trong

cơ thể được giải thích bởi khả năng giữ lại các gốc tự do tạo thành gốc cacbon trung

tâm bền vững nhờ hiệu ứng cộng hưởng.

Phản ứng với axít: canthaxanthin phản ứng với, axít yếu làm dịch chuyển cực đại

hấp thụ của phân tử về phía bước sóng dài, nhưng trung hòa bằng bazơ yếu, cấu trúc

phân tử canthaxanthin lại được phục hồi, tuy nhiên khi phản ứng với axít mạnh như:

HCl, H2SO4… thì có thể xảy ra sự phân hủy chuỗi polyen của canthaxanthin làm giảm

màu đỏ cam.

1.2.3. Tính chất dược lý của canthaxanthin đối với động vật thủy sản

- Canthaxanthin có vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệ tế bào, tạo mầu sắc

cho cơ thịt, tăng cường khả năng đề kháng, tăng khả năng tăng trưởng, tăng cường

năng suất sinh sản, chống lại sự oxy hóa và chống lại các tia tử ngoại của một số loài

thủy sản.

1.2.4. Ứng dụng của canthaxanthin

Trong thực phẩm thì màu sắc bên ngoài là yếu tố quan trọng thu hút người tiêu

dùng.

- Canthaxanthin là chất màu chính trong vỏ và các cơ quan bên trong của các loài

động vật giáp xác, nó chiếm từ 86 ÷ 98% của tổng lượng carotenoid. Màu đỏ tạo ra do

quá trình gia nhiệt, protein bị biến tính làm đứt các liên kết giữa phức hợp

carotenprotein làm giải phóng canthaxanthin tự do. Màu sắc cuối cùng phụ thuộc vào

hàm lượng của canthaxanthin còn lại trong thịt cơ và vỏ của các loài giáp xác.

- Với một số thực phẩm có nguồn gốc từ các loài giáp xác sau chế biến bị giảm

mầu hoặc mất mầu, có thể bổ sung canthaxanthin như một phụ gia sẽ làm tăng giá trị

cảm quan của thực phẩm.

- Mục đích của việc bổ sung chất màu vào thực phẩm nhằm:

+ Khôi phục lại màu sắc đã bị mất trong quá trình bảo quản, chế biến (khi tiếp

xúc với nhiệt độ, độ ẩm, không khí …).

+ Làm tăng màu của thực phẩm trong giới hạn cho phép.

+ Điều chỉnh màu sắc tự nhiên của thực phẩm, khi màu tự nhiên không đủ để thể

hiện màu sắc cho sản phẩm.

16

+ Làm đồng nhất màu sắc thực phẩm

+ Làm thực phẩm có màu hấp dẫn đối với người tiêu dùng

Đến nay, có rất nhiều tài liệu đã chứng minh rằng canthaxanthin là một chất an

toàn về mặt thực phẩm.

1.3. Tổng quan về quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin

1.3.1. Giới thiệu chung về chi Paracoccus

Năm 1992, các tác giả đã mô tả Paracoccus là một Prokaryote gồm có 2 loài là

P.denitrificans và P.halodenitrificans [16]. Sau đó, chủng Paracoccus

halodenitrificans bị loại trừ bởi vì nó được chứng minh là một thành viên của chi

Halomonas thuộc ngành Proteobacteria [17]. Tính đến năm 2006, tổng cộng đã phát

hiện 14 loài mới của Paracoccus dựa trên mô tả và phân tích trình tự gen bao gồm các

loài: vi khuẩn hóa tự dưỡng lưu huỳnh P.pantotrophus và P.Versutus

Các chủng thuộc chi Paracoccus thuộc cầu khuẩn có đường kính từ 0,4 ÷ 0,9µm,

hoặc trực cầu khuẩn (coccobacilli) có chiều dài lên đến 2 µm ở dạng tế bào đơn, tế bào

đôi, chuỗi tế bào. Paracoccus là vi khuẩn gram âm và hầu hết các loài đều không di

động. Các loài thuộc Paracoccus là vi khuẩn hiếu khí, phát triển nhanh trên môi

trường các chất hữu cơ, một số loài có khả năng phát triển trọng môi trường yếm khí

với nitrate hoặc oxide ni tơ là tác nhân oxy hóa và tạo ra sản phẩm cuối cùng là dinito.

Khả năng lên men của Paracoccus chưa được biết đến nhiều trong các công bố.

Paracoccus sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25-37°C, pH= 6,5-8,5, ngoại trừ P.alcaliphilus

phát triển ở pH=8-9.5 và phát triển yếu ở pH= 7.0 [18]. Tất cả các chủng Paracoccus

được kiểm tra cho đến nay đều chứa ubiquinone-10 là một quinone hô hấp, như mong

đợi đối với các thành viên thuộc phân lớp α-3 của Proteobacteria, ngoài ra còn một

lượng nhỏ ubiquinone-9 và ubiquinone-11 cũng được báo cáo ở một số chủng. Một số

chủng có thể tích lũy poly-β-hydroxybutyrate trong điều kiện đủ các bon và có hoạt

tính catalase và oxydase. Để mô tả các đặc điểm chung của chi là xuất phát từ các đặc

tính của P.denitrificans, P.pantotrophus và P.versutus, không áp dụng cho một số

chủng được phân lập gần đây.

Các quy trình nuôi cấy làm giàu (tăng mật độ giống) một số chủng Paracoccus

phụ thuộc vào việc lựa chọn một trong hai con đường là tự dưỡng hoặc chuyển hóa

methan (methylotrophic) trong môi trường oxy hóa với hydro hoặc methylamine (với

sự có mặt của các bon dioxide) hoặc của các chủng khử nitơ trong điều kiện anoxic

17

(nitrat hóa và khử nitrat) với nitrat là chất oxy hóa và các hợp chất hữu cơ như là

nguồn các bon và năng lượng [19].

Sự tăng, trưởng của hầu hết các vi khuẩn oxy hóa hydro tự dưỡng ưa ấm trung

bình (mesophilic) là chậm hoặc không thể phát triển trong điều kiện nuôi cấy khử nitơ

và kỵ khí [20]. Một số, chủng cũng có khả năng tăng trưởng tự dưỡng tốt trên formate

và trong số đó có ba chủng là P.denitrificans, P.versutus và P. kocurii. Do đó, làm giàu

lượng giống bằng lên men kỵ khí với formate, các bon dioxide và nitrate (hoặc nitrous

oxide) có thể phù hợp với 2 chủng P.denitrificans và P.versutus. P.denitrificans tăng

trưởng tự dưỡng yếu trên methanol trong điều kiện khử nitrat. Một số chủng

Paracoccus có thể phát triển tự dưỡng bằng cách sử dụng quá trình oxy hóa thiosulfate

để cung cấp năng lượng, trong khi P.pantotrophus có thể sử dụng, các hợp chất cacbon

disulfide (CS2) và methyl hóa hợp chất sulfur [21] và P.thiocyanatus có thể phát triển

tự dưỡng hiếu khí trên thiocyanate [22]. Những cơ chất này đã giúp làm giàu mẫu và

phân lập, được các chủng Paracoccus mới.

Hiện nay, các chủng Paracoccus là nguồn sản phẩm sinh học tiềm năng chưa

được khai thác một cách hiệu quả, khai thác thương mại mới sử dụng một số chủng.

Hỗn hợp tế bào cố định 2 chủng P.denitrificans và Corynebacterium đã dùng để sản

xuất liên tục L-phenylalanine từ acid acetamidocinnamic và 2 chủng P.carotinifaciens

và P.marcusii sản xuất quy mô công nghiệp canthaxanthin [16], [23].

Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi sử dụng chủng: Paracoccus

carotinifaciens VTP20181 được sàng lọc, tuyển chọn bởi Bộ môn Công nghệ Enzyme

- Viện Công nghiệp Thực phẩm để tiến hành thực hiện các nghiên cứu.

1.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp canthaxanthin

Quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin bắt đầu bởi sự chuyển hóa, acetyl CoA

thành 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA, (HMG-CoA) xúc tác bởi HMG-CoA

synthase. HMG-CoA tiếp tục được chuyển hóa thành mevalonic acid (MVA), tiền chất

đầu tiên của chu trình sinh tổng, hợp terpenoid. Các bước chuyển hóa tiếp theo gồm 2

xúc tác kế tiếp phosphoryl hóa bởi mevalonate kinase và phosphomevalonate

decarboxylase để tạo thành IPP. 3 phân tử IPP được isome hóa thành dimethylallyl

pyrophosphate (DMAPP) xúc tác bởi prenyltranssferase, tạo thành geranylgeranyl

pyrophosphate (GGPP). Phản ứng trùng hợp 2 phân tử GGPP tạo thành phytoene

(carotene C40 đầu tiên của chu trình chuyển hóa canthaxanthin) sau đó bị khử tạo thành

18

lycopene. Lycopene được chuyển hóa tiếp thành beta carotene và các dẫn xuất khác

như torulene, torularhodin, astaxanthin, zeaxanthin và canthaxanthin [15].

Hình 1.3.1. Sơ đồ sinh tổng hợp canthanxanthin [24]

1.3.3. Ảnh hưởng của các nhân tố môi trường đến sự sinh trưởng của vi khuẩn ưa

mặn đến quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin

1.3.3.1. Nhu cầu về NaCl

Tất cả vi khuẩn ưa mặn đều đáp ứng yêu cầu phát triển trong môi trường muối và

khả năng chịu đựng, muối của chúng ở nồng độ muối cao. Yêu cầu muối đối với

chủng là khác nhau và một số yếu tố khác như: dinh dưỡng và nhiệt độ trong môi

trường nuôi cấy. Do vậy, phụ thuộc vào nồng độ muối của môi trường mà có thể phân

19

ra vi khuẩn đó là ưa mặn hay chịu mặn [23; 25]. Môi trường có độ mặn trung bình

thích hợp cho nuôi cấy sinh khối và carotenoid của vi khuẩn, tùy thuộc vào từng chủng

mà có độ mặn thích hợp khác nhau [26]. Một số các vi sinh vật cực kỳ ưa mặn sinh

canthaxanthin như là vi khuẩn cổ Hfx. alexandrinus, để tế bào phát triển bình thường

thì hàm lượng NaCl tối thiểu là 10% (w/v), để tăng hàm lượng canthaxanthin cần tăng

nồng độ NaCl đến 25% [27]. Tỷ lệ canthaxanthin/ astaxanthin cũng tăng trong các tế

bào khi phát triển trong điều kiện ánh sáng yếu (50 μmol/m2s) và nồng độ muối gây ức

chế. Tuy nhiên, sinh khối và canthaxanthin sản xuất bởi chủng vi khuẩn D.

Natronolimnaea HS-1 không bị ảnh hưởng khi môi trường không có NaCl [28].

1.3.3.2. Nguồn carbon và nitơ

Một số, loại vi khuẩn ưa muối có thể tăng trưởng trong môi trường dinh dưỡng

tối thiểu. H.halophila phát triển tốt trên môi trường có chứa muối vô cơ, kể cả nitrat

như nguồn nitơ, glucose là nguồn carbon duy nhất. H.halodenitrifican có thể phát triển

hiếu khí trên một số nguồn carbon hữu cơ và thiamine. Hầu hết, vi khuẩn ưa mặn trung

bình đòi hỏi về dinh dưỡng khắt khe hơn khi nuôi cấy ở nồng độ muối cao.

Sucrose và glucose là nguồn cung cấp carbon, cao nấm men, cao malt, và

peptone là nguồn cung cấp nitơ trong quá trình sản xuất carotenoid. Trong những năm

gần đây, một số nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng nguyên liệu thô từ nông nghiệp

cũng có thể được sử dụng hiệu quả cho nguồn carbon và nitơ. Tùy thuộc vào từng

chủng mà sử dụng nguồn carbon và nitơ thích hợp khác nhau [28].

1.3.3.3. Nguyên tố vi lượng

Nguyên tố vi lượng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp sắc

tố từ vi sinh vật. Chúng là tác nhân kích thích một số enzyme tham gia vào quá trình

sinh tổng hợp carotenoid, tăng giá trị chất chuyển hóa ở nồng độ nhất định. Nasri

Nasrabadi và Razavi đã công bố, nếu bổ sung ở mức tối ưu: Fe3+ (30 ppm), Cu2+

(28,75 ppm) và Zn2+ (27 ppm) có thể đạt được sản lượng canthaxanthin cao nhất

(8,923 ± 0,018 mg/l) đối với chủng D. natronolimnaea HS-1. Chủng H. pluvialis có

thể làm tăng đáng kể về hàm lượng AX khi bổ sung muối sắt (Fe3+) vào môi trường lên

men. Sự tích lũy ion Fe3+ có thể đồng thời hình thành gốc hydroxyl thông qua "phản

ứng Fenton" (H2O2 + Fe2 + → Fe3+ + OH− + • OH), tăng cường sinh tổng hợp

carotenoid tế bào [29]. Mặt khác, Liu và Lee đã cho rằng ion sắt là chất kích thích để

tăng sản xuất carotenoid và có thể giảm chi phí chiếu sáng bằng các muối vô cơ. Một

20

lượng nhỏ lượng Fe3+, Mg2+ và Cu2+ làm tăng khả năng sinh tổng hợp carotenoid của

Blakeslea trispora [30].

1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp

canthaxanthin

1.3.4.1. Tỷ lệ giống

Nếu tỷ lệ giống quá ít, thời gian lên men sẽ kéo dài, trong giai đoạn đầu của quá

trình lên men. Ngoài ra lượng giống quá ít cũng dễ gây nhiễm các vi sinh vật làm ảnh

hưởng xấu đến năng suất, chất lượng của sản phẩm.

Ngược lại nếu lượng giống nuôi cấy quá nhiều làm thay đổi tỷ lệ sản phẩm phụ

tạo ra trong quá trình lên men, làm cho giá trị của sản phẩm sẽ thay đổi theo chiều

hướng tiêu cực. Ngoài ra lượng giống nhiều cũng sẽ làm tăng chi phí cho quá trình sản

xuất.

Chính vì vậy trong sản xuất cần xác định tỷ lệ giống phù hợp bằng thực nghiệm

và bằng các phần mềm tối ưu hoá.

1.3.4.2. Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng, sự trao đổi chất của vi sinh vật

và chất lượng của sản phẩm lên men.

Thường quá trình lên men ở nhiệt độ thấp thì thời gian lên men sẽ kéo dài.

Ngược lại, lên men ở nhiệt độ cao sẽ làm giảm tốc độ quá trình trao đổi chất 2

chiều của vi sinh vật. Nếu chúng ta lên men thực phẩm ở nhiệt độ cao sẽ làm giảm

hoặc làm mất hương vị của sản phẩm.

Chính vì vậy trong sản xuất cần làm thực nghiệm và các phầm mềm tối ưu để

chọn nhiệt độ lên men thích hợp, nhằm để tăng năng suất, chất lượng sản phẩm, đồng

thời tiết kiệm được chi phí sản xuất.

1.3.4.3. Sự cung cấp oxy

Trong môi trường lên men hiếu khí, nhu cầu oxy tối thiểu là 1mg/l, nếu lượng

oxy thấp hơn thì xảy ra lên men yếm khí, làm cho tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật

giảm.

Với quá trình lên men hiếu khí, sự phát triển của vi sinh vật thường tỷ lệ thuận

với lượng oxy được cung cấp. Với môi trường canh tác là môi trường lỏng, thường sử

dụng phương pháp sục khí vô trùng trực tiếp vào canh trường kết hợp với khuấy trộn.

Với môi trường nuôi cấy là rắn, thường thổi khí vô trùng qua lớp canh trường trong

21

thiết bị nuôi cấy. Vì vậy cần xác định nồng độ cấp không khí trong quá trình nuôi cấy

bằng phương pháp thực nghiệm.

Với quá trình lên men kỵ khí, sự có mặt của oxy có thể gây độc và ức chế sự

phát triển của vi sinh vật, vì vậy không được cấp oxy cho quá trình này. Với môi

trường canh tác là môi trường lỏng, thường sử dụng phương pháp sục khí trơ (ví dụ:

nitơ, argon) vô trùng trực tiếp vào canh trường kết hợp với khuấy trộn. Với môi trường

nuôi cấy là rắn, thường thổi khí trơ vô trùng qua lớp canh trường trong thiết bị nuôi

cấy.

1.3.4.4. Độ pH môi trường

Trong quá trình lên men, pH ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng của vi

sinh vật.

Nhưng pH cũng thay đổi liên tục trong quá trình lên men do sự trao đổi chất

giữa các vi sinh vật, từ đó làm thay đổi ion H+ trong canh trường, hoặc một số vi sinh

vật sinh tổng hợp acid hữu cơ rồi tiết vào canh trường. Trong trường hợp này, một số

phân tử protein hoà tan trong canh trường có thể bị đông tụ.

Nếu giá trị pH cao quá hoặc thấp quá đều dễ làm giảm sự phát triển của vi sinh

vật trong quá trình lên men.

Do trong quá trình lên men, canh trường luôn thay đổi pH, vì vậy phải điều

chỉnh pH trong suốt quá trình lên men để thu được sản phẩm có chất lượng và sản

lượng cao nhất.

1.3.4.5. Thời gian lên men

Thời gian lên men phụ thuộc vào giống vi sinh vật, yêu cầu sản phẩm thu nhận

và nhiều yếu tố khác. Khi sản phẩm là các chất như acid amin, acid hữu cơ, dung môi

hữu cơ, enzyme… thời gian lên men thường kéo dài từ 1 đến 3 ngày. Ngược lại, đối

với nhóm thực phẩm lên men, thời gian lên men có thể kéo dài hàng tuần, hàng tháng,

hàng năm (ví dụ sản xuất nước mắm: thời gian lên men đến 2 năm).

Vì các lý do nêu trên, trong sản xuất cần xác định thời gian lên men bằng thực

nghiệm và các phần mềm tối ưu.

1.3.4.6. Phương pháp lên men

Phương pháp lên men phụ thuộc vào bản chất của quá trình lên men, có rất

nhiều quá trình lên men được thể hiện sau:

Lên men chìm trong môi trường lỏng:

22

Lên men chìm là phương pháp được phổ biến rộng nhất trong quy trình lên men

công nghiệp, nó có rất nhiều ưu điểm so với phương pháp lên men bề mặt:

- Có thể kiểm soát được toàn bộ các khâu trong quá trình.

- Giảm thể tích lên men

- Dễ tự động hoá

Tuy nhiên nó cũng có các nhược điểm:

- Kinh phí đầu tư cho thiết bị cao.

- Trong quá trình lên men mà bị nhiễm khuẩn phải huỷ bỏ cả mẻ, gây tốn kém

cho nhà đầu tư.

Phương pháp này dùng cho cả vi sinh vật kị khí và hiếu khí. Với lên men kỵ

khí: cần khuấy trộn định kỳ hoặc liên tục. Với lên men hiếu khí: cần sục khí vô trùng

và khuấy trộn trong suất qúa trình lên men.

Đây là phương pháp hiện đại đã được dùng trong khoảng nửa cuối thế kỉ XX

cho đến nay và cho hiệu suất cao trong công nghiệp cũng như trong nghiên cứu.

Lên men gián đoạn:

Lên men gián đoạn phương pháp lên men theo mẻ. Cung cấp dinh dưỡng trước

nuôi cấy và thu sản phẩm ở cuối quy trình. Hầu hết các thông số quy trình không thay

đổi trong suốt thời gian lên men.

Phương pháp nuôi gián đoạn được sử dụng rộng rãi vì kỹ thuật đơn giản, chi

phí ban đầu thấp, dễ dàng nâng quy mô bằng các mô hình toán học.

Lên men liên tục:

Lên men liên tục là quá trình cân bằng động giữa việc cấp dinh dưỡng vào và

thu sản phẩm ra một cách liên tục. Do đó, môi trường nuôi cấy có thể tích không thay

đổi. Nhờ việc cung cấp dinh dưỡng và thu sản phẩm liên tục, vi sinh vật sẽ có khả

năng kéo dài được pha cân bằng, sản phẩm được thu liên tục và năng suất cao.

F F F

F

V V

23

a. Lên men liên tục b. Lên men liên tục có lắng tế bào và lấy bổ sung

Hình 1.3.2. Sơ đồ lên men liên tục và lên men liên tục có lắng tế bào và lấy bổ sung

Hệ thống lên men liên tục có thể kiểm soát được tất cả quá trình bằng các thiết

bị đo, các thiết bị điều khiển, các phần mềm điều khiển và mô phỏng quá trình vì vậy

hệ thống có ý nghĩa công nghiệp,

1.4. Thu hồi sản phẩm

Quá trình lên men vi sinh vật có thể tạo ra các sản phẩm phong phú. Do sự đa

dạng này, một phổ rộng các kỹ thuật phân tách phải được áp dụng. Tuy nhiên, đối với

gần như tất cả các sản phẩm, người ta bắt đầu với dịch sau lên men và cố gắng tạo ra

một sản phẩm khô có độ tinh khiết cao. Trong trường hợp các sản phẩm ngoại bào,

chất rắn trong dịch huyền phù này có thể bao gồm tế bào vi sinh vật, các cơ chất không

hòa tan, hoặc các sản phẩm không hòa tan tạo thành trong dịch sau lên men. Đối với

các sản phẩm nội bào, chất rắn cũng bao gồm cả tế bào vi sinh vật khi phá vỡ để thu

hồi sản phẩm. Do vậy, các bước chính của việc thu hồi sản phẩm bao gồm các bước

sau:

- Loại bỏ các phần không hòa tan

- Phân tách thu hồi sản phẩm

- Tinh chế

1.4.1. Kỹ thuật tách sinh khối vi sinh vật

Trong sản xuất sinh khối vi sinh vật có hai dạng sinh khối thu được sau:

- Sinh khối là các tế bào sống: Loại sinh khối này bao gồm vi sinh vật dùng trong

sản xuất bánh mì, trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, vaccine dùng cho người và

động vật. Các loại sinh khối này bắt buộc phải đảm bảo tế bào ở dạng sống và có hoạt

tính sinh học theo yêu cầu của sản phẩm. Vì vậy khi thu nhận sinh khối bắt buộc phải

đảm bảo các đặc tính của vi sinh vật không bị thay đổi.

- Sinh khối gồm những tế bào vi sinh vật chết. Loại sinh khối này được sử dụng

vào hai mục đích: làm thực phẩm cho người, gia súc. Sinh khối bao gồm các tế bào

chết không cần đến sự hoạt động tiếp tục của các vi sinh vật, vì vậy việc thu nhận sinh

khối đơn giản hơn.

Dựa vào tinh chất của các sinh khối trên, có thể sử dụng các phương pháp cơ bản

sau để thu hồi sinh khối từ dịch lên men.

24

1.4.1.1. Phương pháp lọc

Lọc là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất dựa vào kích thước khác

nhau của chúng qua các lớp vật liệu lọc. Phần không lọc qua nằm trên lớp vật liệu lọc,

dung dịch và những phần qua vật liệu lọc xuống dưới. Lọc là quá trình vật lý đơn

thuần. Trong thu nhận sinh khối, thông thường áp dụng cho các chủng vi sinh vật có

kích thước lớn. Vi sinh vật càng có kích thước lớn, càng giúp ta lọc nhanh. Tuy nhiên,

phương pháp lọc chỉ áp dụng trong việc thu nhận sinh khối tảo, còn các vi sinh vật

khác ít được sử dụng vì kích thước của tảo đơn bào rất lớn, các vi sinh vật khác lại quá

nhỏ.

Với những quy trình sản xuất thu nhiều sản phẩm, có thể dung nhiều loại vật liệu

lọc có các kích thước khe lọc khác nhau để phân riêng chúng, có thể ứng dụng các

phương pháp lọc đa dạng như: lọc chân không, lọc dòng ngang, lọc có chất trợ lọc…

1.4.1.2. Phương pháp ly tâm

Dựa trên trọng lượng riêng của vật chất, người ta dùng lực ly tâm tạo ra hiện

tượng tách pha lỏng và pha rắn trong dịch nuôi cấy. Có hai kiểu ly tâm đang sử dụng

trong công nghệ vi sinh sau:

- Ly tâm lắng có ưu điểm rất thuật lợi cho việc thu sinh khối vi sinh vật có kích

thước nhỏ.

- Ly tâm lọc rất thuận lợi cho việc thu sinh khối có kích thước lớn. Hiệu suất làm

việc của máy ly tâm phụ thuộc rất nhiều ở tốc độ ly tâm. Do đó tế bào vi sinh vật có

kích thước và trọng lượng riêng càng nhỏ càng đòi hỏi sử dụng máy ly tâm có tốc độ

quay lớn.

Trong quá trình ly tâm có thể tách các pha khác nhau dựa vào tỷ trọng của chúng,

ví dụ nhưa pha dầu, pha nước, pha bã đều được tách riêng trong 1 thiết bị ly tâm.

Với các pha cùng lỏng – lỏng cũng có thể tách riêng nếu tỷ trọng của chúng khác

nhau.

1.4.1.3. Phương pháp lắng

Lắng là phương pháp cơ học phân riêng một hỗn hợp không đồng nhất. Trong

công nghiệp người ta thường dùng những biện pháp sau trong phương pháp lắng tế bào

vi sinh vật để vừa thu nhận sinh khối vừa thu nhận dịch lên men. Để thu nhận các dịch

đồ uống (bia, rượu vang, nước quả lên men) người ta thường hạ nhiệt độ xuống

khoảng từ 240C. Ở nhiệt độ này các tế bào vi sinh vật rất dễ kết lắng xuống đáy thiết

25

bị lên men. Nếu chỉ thu nhận các sản phẩm trao đổi chất bậc hai, người ta có thể dùng

các biện pháp kết tủa nhờ một phản ứng hóa học tương ứng. Sau đó người ta thu nhận

các sản phẩm kết tủa này mà không sợ lẫn sinh khối vi sinh vật (phương pháp này

thường áp dụng trong sản xuất các axít hữu cơ).

1.4.2. Sấy thu hồi sinh khối vi sinh vật

Vi sinh vật được thu hồi sau quá trình lên men hoặc quá trình lắng, lọc, ly tâm

được sấy khô để bảo quản hoặc tiếp tục quá trình chiết tách các để thu hồi các hoạt

chất sinh học.

Sấy là quá trình tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng phương pháp nhiệt. Nhiệt được

cung cấp cho vật liệu ẩm bằng tiếp xúc, đối lưu, bức xạ hoặc bằng năng lượng điện

trường có tần số cao. Mục đích của quá trình sấy là làm giảm khối lượng vật liệu, tăng

độ bền và tăng thời gian bảo quản sản phẩm. Trong quá trình sấy, nước được bay hơi ở

nhiệt độ bất kỳ do chênh lệch độ ẩm tại bề mặt và bên trong vật liệu (khuyếch tán ẩm)

hoặc sự chênh lệch áp suất hơi riêng phần của nước tại bề mặt vật liệu và môi trường

xung quanh.

Sấy là một quá trình không ổn định, độ ẩm của vật liệu sấy thay đổi theo cả

không gian và thời gian.

Dựa vào các đặc tính của quá trình sấy có thể chia ra các phương pháp sấy sau:

- Sấy đối lưu: Sấy đối lưu là phương pháp cho vật liệu sấy tiếp xúc trực tiếp với

tác nhân sấy, trong đó tác nhân sấy có thể là khói lò, không khí nóng, không khí khô

(không khí có độ ẩm thấp). Đặc trưng của quá trình này là không khí được chuyển

động liên tục trong buồng sấy, nhiệt độ của không khí sấy thay đổi trong từng vị trí

của buồn sấy. Không khí sẽ lấy ẩm từ vật liệu sấy thải ra ngoài môi trường, làm giảm

độ ẩm của vật liệu sấy.

- Sấy gián tiếp: Sấy gián tiếp là phương pháp sấy không cho tác nhân sấy tiếp xúc

trực tiếp vật liệu sấy, mà tác nhân sấy truyền nhiệt cho vật liệu sấy qua một vật liệu

trung gian.

- Sấy hồng ngoại: Sấy hồng ngoại là phương pháp sấy dùng năng lượng của tia

hồng ngoại có bước sóng: 760 nm đến 1 mm phát ra do nguồn nhiệt truyền trực tiếp

cho vật liệu sấy.

26

- Sấy vi sóng: Là phương pháp sấy cấp nhiệt bằng sóng vi ba có bước sóng 1mm

đến 1m, bước sóng được phát ra do điện trường, vi sóng được tiếp xúc trực tiếp và

truyền nhiệt cho vật liệu sấy.

- Sấy lạnh: Là phương pháp sấy trực tiếp, tác nhân sấy là không khí khô có độ ẩm

10-15%, nhiệt độ sấy thấp: 30-500C, đây là phương pháp sấy hiện đại, nhiệt độ sấy

thấp, có thể giữ nguyên được các hoạt tính có sẵn trong sản phẩm. Phương pháp này

được áp dụng phổ biến trên thế giới.

- Sấy thăng hoa: Là quá trình sấy dựa trên nguyên lý thăng hoa của nước, nước

trong nguyên liệu được chuyển sang dạng rắn, khuếch tán ra bên ngoài bằng dạng hơi,

sấy thăng hoa được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm do giưa nguyên được

chất lượng, mầu sắc của sản phẩm.

1.5. Các phương pháp trích ly và tinh chế canthaxanthin

Vi khuẩn sinh tổng hợp carotenoid nói chung hay canthaxanthin nói riêng có thể

tạo thành bên trong tế bào hay tiết ra bên ngoài dưới dạng "giọt béo" (vescicle). Do đó

có thể phải thu hồi canthaxanthin từ sinh khối hay từ cả môi trường. Đối với sinh khối,

sau khi lên men cần thu hồi sinh khối bằng phương pháp thích hợp. Phương pháp ly

tâm cao tốc, có làm lạnh, có nhiều ưu điểm về độ an toàn, có thể ly tâm liên tục/bán

liên tục và hoàn toàn có thể nâng quy mô và công nghiệp hóa, hiện là phương pháp

được ưa chuộng nhất để thu hồi sinh khối vi khuẩn.

Từ sinh khối thu được, việc phá tế bào, trích ly, tinh chế, hoàn thiện sản phẩm là

các khâu vô cùng quan trọng, chiếm 60÷80% chi phí sản phẩm lên men.

1.5.1. Các phương pháp phá hủy thành tế bào

Sự phá vỡ thành tế bào là một bước cần thiết để tăng lượng thu hồi carotenoid

được tối đa. Do đó, mặc dù nó làm tăng chi phí sản xuất nhưng các bước tiền xử lý này

vẫn được coi là bắt buộc. Kim và cộng sự báo cáo rằng khoảng 95% fucoxanthin trong

Isochrysis galbana có thể được giải phóng bởi chiết đơn dung môi [31]. Nhưng với

nhiều loại carotenoid, thành tế bào dày cứng đòi hỏi phải phá vỡ tế bào để thu hồi các

chất bên trong. Nếu không phá vỡ tế bào, kết quả chiết xuất sẽ kém hiệu quả [32].

1.5.1.1. Các phương pháp cơ học gián đoạn

Các phương pháp nghiền, nghiền bi và đồng nhất áp suất cao là các kỹ thuật

phá vỡ tế bào được áp dụng phổ biến nhất cho cả quy mô phòng thí nghiệm. Chúng dễ

27

mở rộng quy mô hơn các phương pháp khác [33]. Tuy nhiên, yêu cầu năng lượng cao,

trong quá trình nghiền dễ phát sinh nhiệt gây sự phân hủy carotenoid.

a) Phương pháp nghiền

Phương pháp nghiền thủ công với sinh khối ướt được báo cáo là có thể chiết

xuất các chất màu từ vi tảo một cách hiệu quả [34]. Tuy nhiên, rất tốn thời gian và hầu

như không thể mở rộng quy mô công nghiệp [35]. Nghiền đông lạnh, hoặc nghiền với

nitơ lỏng, được báo cáo là hiệu quả cao, nhưng nó cũng có những hạn chế do chi phí

cao khiến nó không thực tế đối với các ứng dụng quy mô công nghiệp.

b) Phương pháp nghiền bi

Phương pháp nghiền bi là phương pháp tiềm năng cho các hoạt động sản xuất

quy mô lớn hơn so với nghiền thông thường. Phương pháp nghiền bi đã được chứng

minh là hiệu quả nhất để chiết xuất carotenoid trong số các phương pháp khác như:

hấp tiệt trùng, nghiền bi, vi sóng, sóng siêu âm, sốc thẩm thấu, đông lạnh và rã đông

và đông khô [33]; [35]. Hai loại máy nghiền bi hiện có sẵn trên thị trường, máy nghiền

bi loại đập để sử dụng trong phòng thí nghiệm và loại máy nghiền bị loại trống quay

thường sử dụng trong công nghiệp và sản xuất lớn. Trong cả hai loại, tốc độ quay của

bi cao dẫn đến va chạm hoặc ma sát của các tế bào. Điều này có lợi thế là hiệu quả cao

và giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm từ môi trường do không dùng đến dung môi. Nhưng

phương pháp này cho hiệu quả thấp khi xử lý vi tảo có kích thước micromet nhỏ như

C.vulgaris [36]. Hình dạng thùng chứa, tốc độ nghiền, số lượng bi, khối lượng mẫu,

kích thước bi và loại bi đều có ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình phá vỡ tế bào.

c) Phương pháp sử dụng nồi hấp

Nồi hấp sử dụng hơi nước ở nhiệt độ cao và có thể phá vỡ thành tế bào vi sinh

vật và chiết xuất một cách hiệu quả. Tuy nhiên, do tính chất nhạy cảm với nhiệt độ của

carotenoid, các phương pháp như vậy có thể không hiệu quả để chiết xuất carotenoid.

1.5.1.2. Các phương pháp cơ học không gián đoạn

Các phương pháp cơ học không gián doạn bao gồm chiết xuất bằng sóng siêu

âm (UAE), chiết xuất với áp suất cao (HPE), và chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE).

UAE và MAE đã được sử dụng trong sự thu hồi carotenoid [37].

a) Chiết xuất với áp suất cao (HPE)

HPE hoặc chiết xuất dung môi (ASE), hoặc chiết xuất với chất lỏng áp suất cao

(PLE), được sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm. Áp suất cao tăng cường

28

sự xâm nhập của dung môi và cải thiện các tương tác vật lý giữa các phân tử và rút

ngắn thời gian chiết xuất, nhiệt độ cao cải thiện sự khuếch tán của dung môi vào mẫu

bằng cách giảm độ nhớt của dung môi [38].

b) Chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE)

Giống như HPE, MAE sử dụng lượng dung môi nhỏ và thời gian chiết xuất

ngắn hơn so với phương pháp chiết bằng dung môi thông thường [39]. Hỗn hợp dung

môi và mẫu được làm nóng thông qua chiếu xạ, giảm sự phân hủy nhiệt của

carotenoid. Tuy nhiên, vẫn có khả năng sự suy giảm nhiệt có thể ảnh hưởng đến sự

đồng phân cis-trans của carotenoid ở một mức độ nào đó [40]. MAE hoạt động tốt hơn

trong chiết xuất carotenoid so với các quy trình thông thường [40]. Hiệu suất MAE

được điều khiển bằng công suất vi sóng, đặc tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu và tỷ lệ gián

đoạn (phần α của thời gian bức xạ đến tổng thời gian xử lý trong một chu kỳ).

c) Thủy phân bằng enzyme

Quá trình thủy phân bằng enzyme là một quá trình tốn kém do chi phí của

enzyme cao. Ưu điểm chính của quá trình thủy phân bằng enzyme là nó làm giảm

năng lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học, giảm nhiệt độ, áp suất cho quá trình. Hơn

nữa, độ chọn lọc cao hơn, dẫn đến việc hình thành sản phẩm phụ ít hơn và có thể đạt

được năng suất cao hơn. Những lợi ích này làm cho cách tiếp cận này trở nên hấp dẫn

đối với việc chiết xuất carotenoids [41]. Tuy nhiên, giá thành cao của các enzyme và

yêu cầu duy trì điều kiện ổn định là các hạn chế của phương pháp này [42].

d) Phương pháp chiết Soxhlet, xử lý bằng axit, kiềm và chất lỏng ion

Ưu điểm của phương pháp: ứng dụng được trong quy mô công nghiệp, chi phí

năng lượng và chi đầu tư thiết bị thấp [31]. Tuy nhiên, chiết Soxhlet không có khả

năng tách sắc tố đối với những tế bào có thành tế bào cứng. Ngược lại mặc dù quá

trình phá vỡ tế bào đạt được hiệu quả cao bằng cách xử lý axit/kiềm, nhưng các

carotenoid dễ bị phá hủy [43]. Chất lỏng ion có khả năng hòa tan sinh khối vượt trội và

gần đây đã được nghiên cứu rộng rãi. Chất lỏng ion hoạt động như chất làm mất ổn

định tế bào trong huyền phù tảo [44], nhưng giá thành cao của chất lỏng ion, yêu cầu

năng lượng cao và độc tính hiện đã ngăn cản các ứng dụng trong quy mô công nghiệp

của chúng. Ngoài ra, các chất lỏng ion sẽ làm cho carotenoid bị phân hủy vì chúng

không phải là dung môi trơ. Do đó, chất lỏng ion không thích hợp với quá trình chiết

xuất carotenoid.

29

e) Chiết xuất bằng sóng siêu âm (UAE)

UAE được thực hiện bằng sóng siêu âm trong môi trường lỏng (dung môi),

sóng siêu âm sẽ phá hủy các thành tế bào [45]. Các yếu tố ảnh hướng đến quá trình

bao gồm công suất siêu âm, cường độ, nhiệt độ và tỷ lệ mẫu trên dung môi [42]. Các

nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các loại dung môi thân thiện với môi trường,

chẳng hạn như chất lỏng ion ở UAE, có thể chiết xuất chọn lọc các hoạt chất trong

nguyên liệu, sản lượng và chất lượng sản phẩm được nâng cao.

Ngoài ra nhiều phương pháp như sử dụng sóng siêu âm cũng được kết hợp nhằm

gia tăng hiệu quả trích ly. Khi đó, một thiết bị phát siêu âm được tích hợp vào hệ thống

giúp cho quá trình trích ly được nhanh chóng, thuận tiện và khép kín như hình dưới

đây.

Hình 1.5.1. Sơ đồ hệ thống chiết siêu âm quy mô công nghiệp

30

1.5.2. Nguyên lý hoạt động của quá trình chiết xuất bằng siêu âm

Chiết bằng siêu âm các sản phẩm tự nhiên đã được nghiên cứu rộng rãi với nhiều,

có thể tìm thấy trong các tài liệu. Đã có nhiều công trình nghiên cứu chuyên sâu trong

lĩnh vực này được công bố trong thời gian gần đây. Tuy nhiên trong các tài liệu này và

các tài liệu tham khảo, cơ chế dẫn đến việc chiết sử dụng siêu âm còn ít được nghiên

cứu. Một số bài báo tham khảo có miêu tả ảnh hưởng của siêu âm truyền trong pha

rắn/lỏng [46]. Hiện tượng xâm thực (tạo lỗ hổng) dẫn đến lực cắt mạnh trong hệ. Việc

nổ vào trong của các bong bóng xâm thực trên bề mặt khiến cho các tia nhỏ được sinh

ra và gây nên các ảnh hưởng như tách bề mặt, bào mòn và vỡ thành các mảnh nhỏ.

Hơn nữa, sự nổ các bong bóng trong môi trường nước dẫn đến sự chuyển động nhiễu

loạn ở phạm vi lớn vĩ mô và sự trộn lẫn phạm vi nhỏ vi mô. Trong hầu hết các bài báo

liên quan đến chiết siêu âm đều là các sản phẩm thiên nhiên.

Toma và cộng sự [47] đã chứng minh sự phân mảnh của gian bào trong quá trình

siêu âm và tăng cường hydrat hóa do siêu âm. Các tác giả đã cho thấy sự tăng các chỉ

số chiết của các mẫu siêu âm so với các mẫu không siêu âm. Phần sau đây nhằm mục

đích làm nổi bật các tác động vật lý lên gian bào động thực vật, việc này có thể liên

quan đến việc tăng hiệu suất chiết. Tất cả các nghiên cứu này đều đề cập đến việc siêu

âm với năng lượng cao tương đương với tần suất 20 hoặc 25 kHz.

1.5.3. Ảnh hưởng các thông số chiết siêu âm

1.5.3.1. Thông số vật lý

Vì siêu âm là một sóng cơ học, các đặc tính của nó như tần số, bước sóng và

biên độ có thể ảnh hưởng đến sự tạo ra sóng âm. Công suất đầu vào, cũng như thiết kế

thiết bị phản ứng và hình dạng của đầu dò có thể ảnh hưởng đến quá trình chiết siêu

âm. Tác động của các thông số đó sẽ được xem xét trong phần này

a) Công suất và tần số

Phép đo công suất âm thanh trong quá trình siêu âm không thường xuyên được

công bố, mặc dù một số phương pháp vật lý cho phép đo trực tiếp hoặc gián tiếp năng

lượng sử dụng đã có sẵn. Những phương pháp này ước lượng năng lượng truyền bằng

cách đo các thay đổi hóa học hay vật lý trong môi trường khi siêu âm. Phương pháp

vật lý phổ biến nhất là đo áp suất âm thanh sử dụng thiết bị đo tần số hoặc kính hiển vi

quang học, phương pháp lá nhôm và phương pháp đo nhiệt lượng [48].

31

Nói chung, hiệu quả lớn nhất của chiết siêu âm có thể đạt được bằng cách tăng

công suất siêu âm, giảm độ ẩm của gian bào thực phẩm để tăng cường tiếp xúc với

dung môi và tối ưu hóa nhiệt độ để có thời gian chiết ngắn. nhưng trong một số nghiên

cứu cho thấy sự thay đổi công suất siêu âm có thể dẫn đến sự lựa chọn chọn lọc các

phân tử mục tiêu, tỷ lệ của một số phân tử là một hàm của công suất áp tiêu thụ [49].

b) Cường độ

Cường độ siêu âm được biểu thị bằng năng lượng truyền trong 1 giây và trên 1

mét vuông bề mặt phát ra. Thông số này liên quan trực tiếp với biên độ của đầu do và

biên độ áp suất của sóng âm [50]. Với việc tăng biên độ áp suất, sự vỡ của bong bóng

sẽ càng mạnh mẽ hơn. Để đạt được ngưỡng xâm thực, giá trị nhỏ nhất của UI được yêu

cầu. Về vấn đề chiết, việc xác định cường độ siêu âm (UI) là giá trị đầu vào thích hợp

có tác động mạnh mẽ đến hiệu quả chiết. UI được tính toán sử dụng công suất tính

toán được chia cho môi trường được thể hiện trong phương trình sau

UI =

Trong đó: UI là: cường độ siêu âm (W/cm2);

P: là công suất siêu âm (W)

S: là diện tích bề mặt ảnh hưởng của đầu phát siêu âm

Sự tăng cường độ siêu âm (UI) nói chung dẫn đến việc tăng tác dụng sóng siêu

âm [46]. Tuy nhiên, nên tăng lên biên độ khi hoạt động trong chất lỏng có độ nhớt cao

như là dầu [50]. Kết quả biên độ siêu âm được đánh giá ở 16,4; 20,9 và 47,6 W/cm2 ở

20 kHz đối với việc chiết dầu đậu nành [51]. Nghiên cứu cho thấy hiệu suất tối ưu ở

20,9 W/cm2, khi tăng tiếp cường độ siêu âm hiệu suất không tăng. Một xu hướng

tương tự được ghi nhận bởi Wang và cộng sự [52], nó nghiên cứu về chiết siêu âm

pectin ở 20 kHz và cho thấy rằng biên độ siêu âm (thay đổi giữa 10,18 và 14,26

W/cm2). Do đó UI là thông số cần được nghiên cứu để tối ưu của quá trình chiết siêu

âm.

c) Hình dạng và kích thước của thiết bị siêu âm

Sóng siêu âm được phản xạ lại khi bề mặt chất rắn, trong trường hợp chiết sử

dụng bể siêu âm, hình dạng của thiết bị phản ứng là quan trọng. Sự lựa chọn tốt nhất là

bình đáy phẳng như bình tam giác để có thể đạt được sự phản xạ nhỏ nhất của sóng

[53]. Độ dày của bình nên giữ nhỏ nhất để giảm phản xạ [51]. Cần phải tính toán kích

thước tối ưu của thiết bị phản ứng và vị trí bộ phát sóng để có thể chuyển hóa năng

32

lượng đến mức tối đa vào môi trường [54]. Trong thiết bị phản ứng, áp suất không

đồng nhất, vì vậy đây cũng là yếu tố được đưa vào tính toán để tối ưu hóa quá trình

[55]. Trong trường hợp cường độ siêu âm giảm nhanh theo cả hướng từ tâm ra và

hướng trục, vì vậy phải có khoảng cách tối thiểu từ đầu dò và vỏ thiết bị phản ứng, để

tránh bị hư hỏng vò và đầu dò siêu âm [50]. Trong trường hợp sử dụng đầu dò siêu âm,

hình dạng và đường kính của đầu dò có ảnh hưởng đến việc chiết. Đầu dò bước cho sự

phóng đại biên độ cao nhất (công suất, mức tăng biên độ (D/d)2) của hình được hiển

thị. Tuy nhiên, hình dạng đầu dò theo cấp số nhân tạo đường kính nhỏ, điều này làm

cho nó đặc biệt phù hợp với các ứng dụng vi mô [50].

Hầu hết các bộ phát đầu dò được làm từ hợp kim titan, do nguyên liệu này chịu

nhiệt và họat động tốt trong điều kiện ăn mòn. Sự ăn mòn của nguyên liệu làm đầu dò

đưa các hợp chất kim loại loại vào trong môi trường chiết. Một số nguyên liệu mới đã

được nghiên cứu cho đầu dò siêu âm, như là thạch anh và Pyrex, những thứ có thể giải

quyết vấn đề giảm thiểu sự ăn mòn đầu dò [56].

1.5.3.2. Thông số môi trường

Môi trường có các đặc điểm bên trong cần phải xem xét để đạt được kết quả cao

trong quá trình chiết bằng siêu âm.

a) Dung môi

Dung môi được lựa chọn trong chiết siêu âm phụ thuộc vào: khả năng hòa tan

của chất chuyển hóa, sức căng bề mặt, áp suất hơi và độ nhớt của dung môi. Những

thông số vật lý đó sẽ ảnh hưởng đến hiện tượng xâm thực sóng âm, cụ thể hơn là

ngưỡng xâm thực. Sự bắt đầu xâm thực trong chất lỏng yêu cầu áp suất âm trong suốt

chu kỳ giãn phải vượt qua lực kết dính giữa các phân tử trong chất lỏng. Sự gia tăng

sức căng bề mặt, dẫn đến sự tăng tác động lẫn nhau của các phân tử, do đó tăng một

cách đáng kể ngưỡng xâm thực. Theo cách này, biên độ nên được tăng khi làm việc

với mẫu có độ nhớt cao. Do đó nên sử dụng cường độ cao để đạt được các rung động

cơ học cần thiết để dẫn đến hiện tượng xâm thực [50]. Dung môi với áp suất hơi thấp

được sử dụng phổ biến cho chiết siêu âm, do sự vỡ của bong bóng xâm thực mạnh hơn

so với dung môi có áp suất hơi cao [57]. Tuy nhiên, áp suất hơi phụ thuộc vào nhiệt độ

môi trường lỏng.

b) Nhiệt độ

33

Nhiệt độ có tác động mạnh đến tính chất dung môi. Tăng nhiệt độ dẫn đến việc giảm

độ nhớt, giảm sức căng bề mặt và làm áp suất hơi tăng. Việc áp suất tăng hơi khiến

cho nhiều dung môi dạng hơi đi vào trong lỗ hổng bong bóng và nhiều bong bóng xâm

thực sẽ vỡ với lực nhẹ và giảm hiệu ứng siêu âm tế bào [50]. Kết quả là, ở nhiệt độ

cao, hiệu suất siêu âm tế bào gây ra bởi sự vỡ của bong bóng xâm thực có thể giảm.

Do đó, hiện tượng siêu âm tế bào phù hợp với chiết xuất ở nhiệt độ thấp và có thể

kiểm soát được nhiệt độ trong quá trình chiết [58].

Đối với quá trình chiết, nhiệt độ góp phần vào hiệu suất chiết. Thông thường, khi

tăng nhiệt độ dẫn đến tăng hiệu suất chiết [59]. Trong trường hợp chiết siêu âm, một

số tác giả báo cáo về lợi ích tác dụng của nhiệt độ tăng từ 200C đến 700C so sánh với

chiết không siêu âm. Tuy nhiên, hiệu quả giảm khi nhiệt độ gần với điểm sôi của dung

môi và nhiều tác giả báo cáo tác dụng có lợi của nhiệt độ thấp (dưới 30ºC) trong

trường hợp chiết siêu âm [60]. Cấn thiết phải lựa chọn nhiệt độ chiết cho phù hợp dung

môi chiết [61]. Việc chọn nhiệt độ chiết cấn phải phù hợp với sản phẩm chiết, nếu

nhiệt độ chiết cao làm biến tính các sản phẩm không bền nhiệt. Việc tối ưu hóa nhiệt

độ để đạt được hiệu suất cao của sản phẩm là hàm mục miêu, do thông số này có thể

thay đổi phụ thuộc vào tính chất của sản phẩm.

c) Ảnh hưởng của khí hòa tan và áp suất bên ngoài

Sự vắng mặt của khí gây khó khăn cho việc hình thành bọt, vì bọt được hình

thành từ khí hòa tan trong chất lỏng. Khí hòa tan trong dung môi đóng vai trò như hạt

nhân tạo bong bóng [46]. Tuy nhiên, sử dụng siêu âm có xu hướng khử chất lỏng. Bọt

khí có thể được sử dụng để kiểm soát thành phần của bong bóng xâm thực và có thể

ảnh hưởng đến hiện tượng siêu âm tế bào. Nói chung, trong lĩnh vực chiết, thành phần

của khí hòa tan trong dung môi là không kiểm soát được.

Nếu áp suất bên ngoài tăng thì cần có áp suất âm thanh lớn hơn để sinh ra xâm

thực. Nhưng một khi ngưỡng xâm thực đạt được dưới áp suất bên ngoài (> 1atm),

cường độ của bong bóng xâm thực vỡ cao hơn so với không có áp lực, do đó, sự tăng

cường hiện tượng hóa siêu âm đạt được [50].

d) Ảnh hưởng của gian bào

Phụ thuộc vào mục đích của chiết siêu âm và các phần tử mục tiêu, gian bào thực

vật có thể sử dụng dạng tươi (như nấm men, tảo…) hoặc khô (như hoa, hạt có dầu...).

Quá trình tiền xử lý của gian bào rất quan trọng và có thể tác động đến hiệu suất chiết.

34

e) Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và nguyên liệu chiết

Độ hòa tan và ổn định của các hợp chất mục tiêu trong dung môi được chọn và

nhiệt độ của môi trường lỏng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình chiết. Hiệu

suất chiết có thể thay đổi do cấu trúc nguyên liệu thực vật, độ dẻo hay sự khác biệt về

thành phần sẽ dẫn đến mức độ ảnh hưởng khác nhau từ hiện tượng xâm thực, tỷ lệ

dung môi và nguyên liệu chiết có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất quá trình chiết.

1.6. Giới thiệu về liposome và ứng dụng của liposome

1.6.1. Giới thiệu về liposome

1.6.1.1. Lịch sử liposome

Từ “liposome” bắt nguồn từ hai từ Hy Lạp: lipo ("chất béo") và soma ("cơ

thể"); Nó được đặt tên như vậy vì thành phần của nó chủ yếu là phospholipid.

Liposome được nhà huyết học người Anh Alec D Bangham [62] mô tả lần đầu tiên

vào năm 1961 (xuất bản năm 1964), tại Viện Babraham, ở Cambridge. Chúng được

phát hiện khi Bangham và R. W. Horne đang thử nghiệm kính hiển vi điện tử mới của

viện bằng cách thêm vết âm vào phospholipid khô. Hình ảnh kính hiển vi là bằng

chứng đầu tiên cho thấy màng tế bào là một cấu trúc lipid kép [63]. Weissmann - trong

một cuộc thảo luận ở Cambridge với Bangham - lần đầu tiên đặt tên cho cấu trúc là

"liposome" theo tên lysosome, mà phòng thí nghiệm của ông đã nghiên cứu: một bào

quan đơn giản, độ trễ liên kết cấu trúc có thể bị phá vỡ bởi chất tẩy rửa và streptolysin

[64]. Có thể dễ dàng phân biệt liposome với các pha lipid và pha lipid lục giác bằng

kính hiển vi điện tử truyền màu âm tính [65]. Chính Weissmann đã đề xuất thuật ngữ

liposome cho đến ngày nay [65].

1.6.1.2. Cấu tạo của liposome

Liposome là một túi hình cầu có ít nhất một lớp lipid kép. Liposome có thể

được sử dụng như một phương tiện phân phối thuốc để tải các chất dinh dưỡng và

dược phẩm [67]. Liposome thường bao gồm các phospholipid, đặc biệt là

phosphatidylcholine, nhưng cũng có thể bao gồm các lipid khác, chẳng hạn như

phosphatidylethanolamine của trứng, miễn là chúng tương thích với cấu trúc lớp lipid

kép [68]. Một cách tạo ra liposome có thể sử dụng các phối tử bề mặt để gắn vào các

mô không lành mạnh [69].

35

Hình 1.6.1. Sơ đồ liposome được hình thành bởi phospholipid trong dung dịch nước

Liposome là cấu trúc tổng hợp được tạo ra từ các phospholipid và có thể chứa

một lượng nhỏ các phân tử khác. Mặc dù liposome có thể có kích thước khác nhau từ

phạm vi micromet thấp đến hàng chục micromet, liposome thường ở phạm vi kích

thước thấp hơn với các phối tử nhắm mục tiêu khác nhau được gắn vào bề mặt của

chúng cho phép chúng bám vào bề mặt và tích tụ trong các khu vực bệnh lý để điều trị

bệnh tật [70].

1.6.1.3. Ứng dụng của liposome

Liposome được sử dụng làm mô hình cho các tế bào nhân tạo.

Liposome cũng có thể được thiết kế để phân phối thuốc theo những cách khác.

Các liposome có độ pH thấp (hoặc cao) có thể sản xuất các loại thuốc dạng nước hòa

tan sẽ được tích điện trong dung dịch (tức là độ pH nằm ngoài phạm vi đẳng điện của

thuốc). Khi độ pH trung hòa tự nhiên trong liposome, thuốc cũng sẽ được trung hòa,

cho phép nó tự do đi qua màng. Các liposome này hoạt động để phân phối thuốc bằng

cách khuếch tán chứ không phải bằng cách dung hợp tế bào trực tiếp [70].

Thuốc chống ung thư như doxorubicin (Doxil) và daunorubicin có thể được sử

dụng qua liposome. Liposomal cisplatin đã nhận được chỉ định thuốc điều trị ung thư

tuyến tụy cho trẻ em [71].

Liposome được sử dụng như một loại thuốc tẩy độc: Một cách tiếp cận tương tự

có thể được khai thác trong quá trình oxy hóa sinh học của thuốc bằng cách tiêm vào

các liposome rỗng với gradient pH xuyên màng. Trong trường hợp này, các mụn nước

đóng vai trò như bồn rửa để hút thuốc trong tuần hoàn máu và ngăn chặn tác dụng độc

hại của nó [72].

Đã có nghiên cứu sử dụng liposome làm "chất mang nano" để bón chất dinh

dưỡng để điều trị cây trồng bị suy dinh dưỡng hoặc ốm yếu. Kết quả cho thấy rằng các

36

hạt tổng hợp này "ngấm vào lá cây dễ dàng hơn các chất dinh dưỡng thường", xác

nhận thêm việc sử dụng công nghệ nano để tăng năng suất cây trồng [73].

Một nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng liposome có thể được sử dụng như các

hạt nano kháng khuẩn cho các bề mặt tiếp xúc với thực phẩm. [74]

Liposome có thể được sử dụng làm chất mang để phân phối thuốc nhuộm cho

ngành dệt, thuốc trừ sâu cho thực vật, enzym và chất bổ sung dinh dưỡng cho thực

phẩm, và mỹ phẩm cho da [73]. Liposome cũng được sử dụng làm vỏ ngoài của một

số chất cản quang microbubble được sử dụng trong siêu âm tăng cường chất cản quang

[80].

Ngoài ra liposome còn được ứng dụng trong bổ sung dinh dưỡng: Các ứng dụng

lâm sàng của liposome là để phân phối thuốc mục tiêu, nhưng các ứng dụng mới để

phân phối đường ăn uống của một số chất bổ sung dinh dưỡng đang được phát triển

[75]. Ứng dụng mới này của liposome một phần là do tỷ lệ hấp thụ và sinh khả dụng

thấp của các viên nén và viên nang dinh dưỡng trong chế độ ăn uống truyền thống.

Khả năng ứng dụng đường uống cao, sự hấp thụ nhiều chất dinh dưỡng đã được ghi

nhận trên lâm sàng [76]. Do đó, sự bao bọc tự nhiên của các chất dinh dưỡng ưa nước

và ưa nước trong liposome sẽ là một phương pháp hiệu quả để bỏ tránh hiện tượng

viêm loét dạ dày khi sử dụng thuốc, cho phép chất dinh dưỡng được bao bọc được

phân phối một cách hiệu quả đến các tế bào và mô [77].

1.6.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất liposome

Việc lựa chọn phương pháp sản xuất liposome phụ thuộc vào các yếu tố sau

[71].

- Các đặc tính hóa lý của vật liệu được đưa vào liposome và các đặc tính của

các thành phần liposomal;

- Bản chất của môi trường trong các túi lipid được phân bố chất bị hấp thụ;

- Quy trình bổ sung liposome;

- Kích thước tối ưu, độ phân tán và thời hạn sử dụng của các liposome;

- Khả năng sản xuất hàng loạt và khả năng sản xuất quy mô lớn các sản phẩm

liposomal an toàn và hiệu quả;

Các liposome hữu ích hiếm khi hình thành một cách tự phát. Chúng thường

hình thành sau khi cung cấp đủ năng lượng cho sự phân tán của lipid (phospho) trong

một dung môi phân cực, chẳng hạn như nước, để phá vỡ các tập hợp đa sao thành các

37

lipid kép. [69]; [70]. Do đó, liposome có thể được tạo ra bằng cách tạo phân tán các

lipid lưỡng tính, chẳng hạn như phospholipid, trong nước [78]. Tỷ lệ hấp thụ cao tạo ra

các liposome đa sao. Các tập hợp ban đầu, có nhiều lớp giống như một chum rễ, do đó

hình thành các liposome ngoài sao nhỏ dần và cuối cùng là các liposome ngoài sao

(thường không ổn định, do kích thước nhỏ và các khuyết tật tạo ra). Phương pháp phân

tán lipid lưỡng tính thường được coi là một phương pháp bào chế "thô" vì nó có thể

làm hỏng cấu trúc của thuốc sau đóng gói. Các phương pháp mới hơn như ép đùn, trộn

vi mô [79] và phương pháp Mozafari [73] được sử dụng để sản xuất thuốc và thực

phẩm cho con người. Sử dụng các chất béo khác ngoài phosphatidylcholine có thể sản

xuất liposome [68].

1.6.2. Nghiên cứu và ứng dụng liposome trong nuôi cá hồi vân

Trong nghiên cứu này sẽ xây dựng phương pháp sản xuất liposome chứa các

hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên, tiếp theo là đánh giá tác động của việc bổ sung

canthaxanthin được chứa trong các liposomes trong chế độ ăn đối với sự tăng trưởng,

màu sắc, sự lắng đọng cơ và thành phần dinh dưỡng của thịt cá hồi vân (Oncorhynchus

mykiss).

Việc sử dụng liposome được coi là một chiến lược hiệu quả để cung cấp các

loại thuốc có sinh khả dụng thấp vì nó cho phép hấp thụ tốt hơn các hợp chất phân cực

không tan trong lipid qua đường miệng, do đó cải thiện hiệu quả của thuốc.

Canthaxanthin được chiết xuất từ vi khuẩn Paracoccus carotinifaciens, một

nguồn tự nhiên mới nổi được biết đến với sự tích tụ canthaxanthin ở năng suất cao,

khoảng 0.4% [80]. Nhưng trong liposome có chứa chỉ canthaxanthin thì hiệu quả giải

phóng canthaxnthin không cao, khi liposome có chứa α-tocopherol cùng canthaxanthin

thì giải phóng canthaxnthin cao hơn, chất lượng và màu sắc của thịt cũng tăng cao

[81],

1.7. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng trong tối ưu hóa

Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology) hay còn gọi là

quy hoạch thực nghiệm là tổng hợp các kỹ thuật toán học và thống kê để xây dựng mô

hình thực nghiệm thống kê được George E. P. Box và K. B. Wilson [82]. Bằng cách

thiết kế một cách cẩn thận, có hệ thống các thí nghiệm, chúng ta có thể đánh giá kết

quả đầu ra (hàm mục tiêu) thông qua ảnh hưởng của các thông số đầu vào. Mô hình

thực nghiệm được đánh giá qua phân tích phương sai ANOVA dựa trên các kết quả

38

thực nghiệm thu được. Cuối cùng, từ dữ liệu được phân tích, chúng ta sẽ tìm được

phương trình hồi quy tổng quát thể hiện mối liên hệ giữa hàm đầu ra và các biến đầu

vào. Tiếp đó, tiến tới việc tối ưu hóa hàm mục tiêu thông qua công cụ toán học [82];

[83]

Việc áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để tối ưu hóa quá trình công

nghệ giúp giảm đáng kể số thí nghiệm cần thiết, hàm lượng thông tin nhiều hơn rõ rệt

nhờ đánh giá được vai trò qua lại giữa các yếu tố công nghệ đầu vào và ảnh hưởng của

chúng đến hàm mục tiêu. Bên cạnh đó, mô hình cho phép xác định được điều kiện tối

ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu một cách khá chính xác bằng các công cụ toán

học hiện đại. Một số mô hình toán học được áp dụng cho phương pháp bề mặt đáp

ứng như:

+ Kế hoạch bậc 1 hai mức tối ưu

+ Kế hoạch trực giao bậc 2 Box - Wilson

+ Kế hoạch bậc 2 Box-Behnken

+ Kế hoạch chu bản bậc 2 Box - Hunter

+ Kế hoạch bậc 2 Kiefer

Tối ưu hóa là quá trình tìm kiếm điều kiện tốt nhất (điều kiện tối ưu) của hàm

số được nghiên cứu, hay nói cách khác chính là bài toán tìm cực trị của hàm mục tiêu

với các biến là các yếu tố công nghệ của quá trình trong giới hạn nghiên cứu [84];

[85].

Giả sử một hệ thống công nghệ được biểu diễn bằng mô tả toán học dưới dạng:

Y = F(x1,x2,...xk) với x1, x2, xk : thành phần của vectơ thông số đầu vào.

Hàm mục tiêu: I = I (x1,x2,…xk)

Bài toán được biểu diễn:

Iopt = opt I (x1 ,x2 ,…xk ) =I (x1 opt,x2 opt,…xk opt )

hoặc Iopt = max I ( x1,x2,…xk) : đối với bài toán tìm cực đại

Iopt = min I (x1,x2,…xk) : đối với bài toán tìm cực tiểu

opt,x2

opt,…xk opt là nghiệm tối ưu hoặc phương

Với Iopt: là hiệu quả tối ưu; x1

án tối ưu.

Các điều kiện ràng buộc là :

Trong đó : và ;

39

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phần mềm Design Expert 11.0 để xây

dựng mô hình và tối ưu hóa quá trình công nghệ cần nghiên cứu.

1.8. Giới thiệu về cá hồi vân và nghề nuôi cá hồi nước lạnh

1.8.1. Phân loại

Cá hồi vân (loài cá di nhập vào nước ta hiện đang nuôi tại Sapa, Lào Cai) tên

tiếng Anh Rainbow trout, và tên khoa học Onchorhynchus mykiss.

Hình 1.8.1. Cá hồi vân

Bộ: Salmoniformes

Họ: Salmonidae

Giống: Oncorhynchus

Loài: O.mykiss

1.8.2. Tình hình nuôi cá hồi tại trên thế giới và Việt Nam

1.8.2.1. Tình hình nuôi cá hồi vân trên thế giới

Sản lượng cá hồi tăng mạnh từ những năm 1950 khi chủ động sản xuất được thức

ăn. Cá được di nhập và nuôi ở nhiều nước châu Âu từ những năm 1980. Theo thống kê

của FAO năm 2020, hiện có 64 quốc gia trên thế giới nuôi cá hồi, sản lượng cá hồi ước

tính đạt 3.8 triệu tấn. Những quốc gia và khu vực đóng góp sản lượng lớn trên thế giới:

châu Âu; Bắc Mỹ; Chi Lê; Nhật Bản; và Úc.

1.8.2.2. Tình hình nuôi cá hồi vân tại Việt Nam

Cá Hồi lần đầu tiên được Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 đưa vào nuôi

thử nghiệm tại miền Bắc Việt Nam năm 2005 trong khuôn khổ dự án do chính phủ

Phần Lan tài trợ, phối hợp với Trung tâm Khuyến ngư quốc gia - Bộ Thủy Sản (nay là

Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn) triển khai. Theo đó, năm 2005 Viện Nghiên

cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 đã nhập 50.000 trứng cá Hồi ở giai đoạn điểm mắt từ Phần

Lan để thử nghiệm tại Trung tâm Nghiên cứu Thủy sản nước lạnh Sa Pa - Lào Cai.

40

Trong điều kiện nhiệt độ nước 8-120C, trứng nở với tỷ lệ 95%. Sau 2 năm nuôi thử

nghiệm, cá Hồi thương phẩm lần đầu tiên được sản xuất thành công tại Việt Nam. Đến

nay cá Hồi đã được nuôi phổ biến ở 14 tỉnh trên cả nước là những nơi có nguồn nước

lạnh. Sản lượng cá Hồi thương phẩm hàng năm ước đạt 3720 tấn vào năm 2020 (Tổng

cục thủy sản - Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn).Trong tương lai, diện tích

cũng như quy mô nuôi cá hồi sẽ được tăng lên tại các vùng sinh thái có điều kiện phù

hợp cùng với nhu cầu ngày càng cao của thị trường tiêu thụ trong nước.

1.8.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến chăn nuôi cá hồi

1.8.3.1. Nhiệt độ

Cá hồi vân có nhiều nhóm, các nhóm có đặc điểm sinh sống khác nhau. Nhóm cá

hồi sinh trưởng và phát triển trong thuỷ vực nước ngọt (sông & hồ), nhóm sống ngoài

biển. Loài cá được thuần hoá và nuôi thành công sớm nhất trong các thuỷ vực nước

ngọt có tên cá hồi vân “Rainbow trout”. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của cá hồi

vân trong khoảng 180C và không vượt quá 220C [86]. Khi nhiệt độ dao động trong

khoảng từ 250C tới 270C cá giảm hoặc bỏ ăn và tỷ lệ chết cao [86]. Gibson cho rằng

nên giảm khẩu phần ăn của cá khi nhiệt độ vượt quá 180C [87]. Như vậy đối với nước

ta, những tiểu vùng như Sapa, Đà Lạt, Tây Nguyên có dải nhiệt độ phù hợp với cá hồi

vân.

1.8.3.2. Nồng độ oxy hoà tan, muối, pH

Nhu cầu về oxy hoà tan trong nước của Cá hồi vân khá cao. Theo tác giả

Bromage & Shepherd, cần duy trì hàm lượng oxy hoà tan cho nuôi cá hồi vân trên

5mg/l (5ppm.) [88]. Khi nhiệt độ tăng thì hàm lượng oxy trong nước giảm gây stress

cho cá hồi trong các tháng mùa hè của vùng Tây Úc (trên 200C). Stress này được khắc

phục khi cung cấp thêm hàm lượng oxy trong nước. Gibson cho rằng khi hàm lượng

oxy thấp dưới 7mg/l (7ppm.) cá hồi sẽ giảm về tốc độ sinh trưởng mặc dù cho ăn tối

đa [87]. Bromage & Shepherd cho rằng các trang trại nuôi cá hồi rất cần có nguồn cấp

nước tốt đảm bảo đủ hàm lượng oxy trong nước [88]. Như vậy, hàm lượng ô xy hoà

tan trong nước đóng vai trò quyết định đến sinh trưởng của cá hồi vân.

Cá hồi vân có thể chịu được giải nồng độ muối cao tới 35ppt (g/lít). Cá hồi có thể

di cư ra biển để sinh sống và tới khi cá thành thục di cư vào nước ngọt để sinh sản

[88]. Tác giả cho rằng cá hồi giai đoạn 6 tháng tuổi đến 2 năm có thể nuôi hoàn toàn

trong điều kiện nước mặn hoặc nước biển. Đối với nước ta hầu hết các trang trại nuôi

41

cá hồi vân đều dùng nước ngọt. Do vậy, nghiên cứu của đề tài sẽ tập trung thăm dò

khả năng sinh trưởng và sinh sản trong một môi trường nước ngọt.

Bromage & Shepherd và Sedgwick cho rằng giải pH phù hợp cho cá hồi sinh

trưởng tốt dao động trong khoảng 6,4 đến 8,4 nhưng thích hợp nhất trong khoảng 7,0

đến 7,5 [86; 88]. Trong trường hợp pH và hàm lượng amonia cao sẽ gây nguy hiểm

cho cá hồi.

1.8.3.3. Nhu cầu dinh dưỡng và thức ăn của cá hồi vân

Trong tự nhiên, thức ăn cá hồi giai đoạn nhỏ thường là ấu trùng, giáp xác nhỏ,

động vật phù du. Cá hồi giai đoạn trưởng thành thường ăn giáp xác (ốc, trai...), côn

trùng và cả cá con. Cá hồi vân được xếp vào loài ăn động vật và có thể gây ảnh hưởng

đến các loài thuỷ sản khác trong thuỷ vực.

1.8.3.4. Nhu cầu protein

Với cá hồi vân, giai đoạn cá hương, nhu cầu về protein từ 45-50%. Nhu cầu về

protein giai đoạn cá giống và cá thương phẩm từ 42-48% [89]. Nhưng theo tác giả [90]

cho rằng nhu cầu protein của cá hồi vân ở giai đoạn cá hương và giống là 50%, với cá

thương phẩm thì nhu cầu protein dao động từ 38-45%. Tuy nhiên, trong thực tế thức

ăn công nghiệp sử dụng cho cá hồi vân tại Việt Nam thường chứa hàm lượng protein

dao động từ 42-48% tùy theo giai đoạn phát triển của cá [89; 92].

1.8.3.5. Nhu cầu về lipid acid béo

Lipid là thành phần quan trọng trong thức ăn của cá. Lipid giúp cung cấp năng

lượng cao cho cá và là dung môi để hòa tan một số vitamin. Các nghiên cứu đã khẳng

định lipid có ảnh hưởng tốt đến sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của nhiều loài

cá [93]. Nếu protein ở mức 38% và hàm lượng dầu ở mức 25-45% thì cá sử dụng

protein và chuyển hóa thức ăn tốt nhất ở mức dầu cao nhất [94]. Tác giả cũng cho biết

khi tăng hàm lượng lipid trong thức ăn từ 9-11% (48% protein) lên 17-18% lipid và

protein là 44-45% dùng cho cá có khối lượng từ 5g trở lên sẽ cải thiện được sức sinh

trưởng. Đối với cỡ cá 250-500g, khi tăng hàm lượng lipid trong thức ăn thì sẽ giảm

hàm lượng protein. Steffens khi thí nghiệm ở 2 mức lipid là 12% và 24% (dầu cá trích)

với 3 mức protein tương ứng là 30%, 43% và 52% [93]. Kết quả cho thấy, không có sự

khác biệt về tốc độ tăng trưởng giữa 2 công thức (24% lipid & 43% protein) và (24%

lipid & 52% protein). Nhưng ở lô thí nghiệm (12% lipid & 30% protein) thì tốc độ

tăng trưởng của cá chậm hơn đáng kể. Ở thí nghiệm khác tác giả cho biết cá hồi vân có

42

tốc độ tăng trưởng tốt nhất khi thức ăn có chứa 47% protein và 15% lipid (4,5% lipid

từ động vật máu nóng và 4,5% lipid là dầu đỗ tương). Trong thực tế, hàm lượng lipid

trong thức ăn của cá hồi vân dao động từ 16-24%, tùy theo giai đoạn phát triển của cá

[89].

1.8.3.6. Nhu cầu vitamin và khoáng chất

McLaren cho rằng vitamin là dinh dưỡng đầu tiên cần thiết trong thức ăn của cá

hồi vân [95]. Halver khi thực hiện các nghiên cứu về thức ăn đã khẳng định rằng

thiamine, riboflavin, pyridoxine, pantothenic acid, niacin, inositol, folic acid, biotin

and choline là những vitamin cần thiết cho cá hồi vân [96]. Trong những vitamin hoà

tan trong dầu (Vitamin A, D, E & K), các nghiên cứu chỉ tập trung về nhu cầu vitamin

E của cá hồi vân. Nhu cầu các vitamin của cá hồi vân được các tác giả thể hiện trong

bảng 1.8.1.

Bảng 1.8. 1. Nhu cầu một số vitamin của cá hồi vân

Số lượng vitamin trong 1kg thức ăn

TT

Vitamin

Hardy, R.W

Liều lượng

Nguồn

(2002)

Steffens (1989)

10-20 mg

1

R

Thiamine (B1)

20-35 mg

2

Nt

4

Riboflavin (B2)

10-20 mg

3

nt

3

Pyridoxin (B6)

50-60 mg

4

nt

20 mg

Pantothenic acid (B5)

50-200 mg

nt

10 mg

5 Niacin (B3)

Biotin (H)

0,35-1,35 mg

6

nt

0,15 mg

5-15 mg

7

nt

1 mg

Folic acids (B9)

9

1000 mg

Choline

50-100 mg

Rumsey (1991)

nt

500 mg

11 Vitamin C

200-400 mg

2400 IU

12 Vitamin D

1600-2400 IU

Barnett et al. (1982)

50 IU

13 Vitamin E

20-30 mg *

Steffens (1989)

nt

R

14 Vitamin K

10-40 mg

nt

2500 IU

15 Vitamin A

2500 IU

Chú thích: R- Vitamine cần thiết nhưng chưa xác định được nhu cầu cụ thể

Hardy cho rằng nhu cầu về khoáng chất của cá hồi vân tương tự như các động vật

khác [89]. Hàm lượng khoáng chất từ môi trường nước, trừ phosphorus và iodine là

43

không có hoặc không đủ lớn so với nhu cầu của cá hồi. Hardy đã đề xuất nhu cầu về

khoáng chất của cá hồi được trình bày ở bảng 1.8.2

Bảng 1.8. 2. Nhu cầu một số khoáng chất của cá hồi vân

(g/kg khoáng chất)

Vi lượng

Đơn vị

Thành phần

Ppm

40000

Iron (FeSO4.7H2O)

Ppm

10000

Manganese MnSO4

Ppm

4000

Copper (CuSO4.5H2O)

Ppm

40000

Zinc (ZnSO4.7H2O )

1800

Iodine (KIO3 hoặc C2H8N2. 2HI) Ppm

Ppm

Cobalt

20

Ppm

Selenium

200

1.8.3.7. Nhu cầu carotenoids

Rất ít công trình nghiên cứu nào công bố chính thức sự cần thiết bổ sung sắc tố

carotenoids trong thức ăn cho cá hồi vân. Christiansen [97] cho biết sắc tố carotenoids

rất cần thiết cho cá hồi Atlantic (Atlantic salmon) đặc biệt là sắc tố Canthaxanthin rất

cần thiết trong thức ăn cho cá bố mẹ để đảm bảo sự phát triển tốt cho cá giai đoạn

giống. Cá hồi hương Atlantic sinh ra từ đàn cá bố mẹ được bổ sung Canthaxanthin

trong thức ăn có tỷ lệ sống cao.

1.8.3.8. Phát triển thức ăn cho cá hồi ở Việt Nam

Trên cơ sở tham khảo các kết quả nghiên cứu ngoài nước và phân tích thành

phần dinh dưỡng của thức ăn nhập ngoại, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản đã phát

triển thức ăn cho cá hồi từ các nguyên liệu sẵn có trong nước và sản xuất trên máy ép

đùn 300kg/h của Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 [98].

Bảng 1.8.3. Công thức thức ăn cho cá hồi giai đoạn nuôi thương phẩm

Nguyên liệu

Thành phần (%)

Protein (%)

Lipid (%)

Đậu tương Ấn Độ (44%/3,4%)

0,66

0,05

1,5

Bột cá (60%/ 6,5% )

36,0

3,

60,0

Bột mì (12%/1,7%)

0,48

0,07

4,0

Gluten ngô (60%/0,5%)

5,1

0,03

8,5

Vitamin hỗn hợp (F1

0

0,40

Hỗn hợp khoáng (F2)

0

0

0,25

Vitamin C chịu nhiệt (35%)

0

0

0,07

44

Chất chống ô xy hoá

0,01

0

0

Chất chống mốc

0,10

0

0

Decanxi Phosphate (27%)

1,0

0

Bột sắn (2%/1%)

4,2

0,08

0

Dầu gan mực

20,0

0

20,0

Thành phần dinh dưỡng của thức ăn sản xuất (tính theo vật chất khô) Trung bình ± SD

13,3 ± 0,2

Tro (%)

12,7 ± 0,1

Độ ẩm (%)

42,3 ± 0,6

Chất xơ (%)

4,7 ± 0,2

Protein (%)

23,9 ± 0,5

Lipid (%)

Trong giai đoạn từ 2011-2013, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 đã triển

khai đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme để sản xuất thức ăn nuôi cá hồi và cá tầm”.

Thức ăn cho cá hồi có bổ sung enzym với hàm lượng protein/lipid là 42/20 mang

lại tỷ lệ sống lớn hơn 92%, tốc độ tăng trưởng 5,9 g/con/ngày và FCR nhỏ hơn 1,4. Đề

tài cũng đã phối hợp triển khai sản xuất thức ăn tại Trung tâm Tư vấn thiết kế và

chuyển giao công nghệ thủy sản - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1 và nhà máy

chế biến thức ăn chăn nuôi Kinh Bắc với tổng sản lượng là 28.157 kg. Thức ăn đảm

bảo được yêu cầu về chất lượng dinh dưỡng cũng như cảm quan của viên thức ăn và

được thử nghiệm tại các tỉnh Lai Châu, Lào Cai, Sơn La. Mô hình sản xuất thức ăn cho

cá hồi và cá tầm mang lại hiệu quả kinh tế cho đơn vị sản xuất là từ 500-1500VNđ/kg

thức ăn. Giá thành thức ăn là 35.000 VNđ/kg thức ăn cá hồi rẻ hơn so với giá của thức

ăn nhập ngoại (tại thời điểm nghiên cứu là >40.000VNđ/kg thức ăn) [99].

1.8.4. Nghiên cứu bổ sung canthaxanthin vào thức ăn thủy sản ở Việt Nam

Nghiên cứu của Trình Mai Duy Lưu và cộng sự đã xác định được ba chủng vi

khuẩn có khả năng tổng hợp canthaxanthin, tuy nhiên mới dừng ở mức độ phòng thí

nghiệm [100].

Ở Việt Nam, có rất ít nghiên cứu về việc bổ sung canthaxanthin vào thức ăn

trong nuôi trồng thủy sản. Năm 2011-2013, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 đã

tiến hành bổ sung các sắc tố astaxanthin và canthaxanthin đến màu sắc cơ thịt cá hồi

vân. Kết quả cho thấy, việc sử dụng các loại thức ăn với tỷ lệ khác nhau về sắc tố

astaxanthin và cantaxanthin không cho thấy sự khác biệt nào về khối lượng cá tăng lên

và tỷ lệ sống. Thức ăn bổ sung tỷ lệ astaxanthin/cantaxanthin là 40/40 mg cho hiệu quả

cao hơn về màu sắc và giá thành thức ăn so với tỷ lệ 60/20 và 80/0 [99].

45

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu

2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn

Vi sinh vật

Chủng Paracoccus carotinifaciens VTP20181 được sàng lọc, tuyển chọn bởi

Bộ môn Công nghệ Enzyme - Viện Công nghiệp Thực phẩm.

Môi trường thí nghiệm

Môi trường giữ giống và phân lập: Marine Broth, Marine agar

Môi trường cơ bản: Nutrition Broth 01-Merck

2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men

- Canthaxanthin chuẩn: hãng TRC Canada

- Ethanol thực phẩm 96% (Việt Nam)

- Urê công nghiệp 98% (Việt Nam)

- Glycerol Monostearate: thường được gọi là GMS, là một monoglyceride

thường được sử dụng làm chất nhũ hóa trong thực phẩm. Nó có dạng bột mịn, không

mùi và vị ngọt có tính hút ẩm. Về mặt hóa học, nó là este glycerol của axit stearic.

- Na2SO4 (Việt Nam): Dùng để làm khan nước

- Nước cất 2 lần

2.1.3. Nguyên vật liệu nghiên cứu tổng hợp liposome

Dung môi metanol (MeOH), axeton, n-hexan, diclometan, tetrahydrofuran

(THF), 2-propanol và axetonitril được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa

Kỳ). Chất chuẩn canthaxanthin được mua từ TRC Canada; lecithin đậu nành –

Australia.

2.2. Thiết bị máy móc

2.2.1. Thiết bị nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn

- Thiết bị lên men BioFlo 510 SIP Bench, Mỹ

- Thiết bị ly tâm bán liên tục CEPA Z61, Đức

- Thiết bị lên men 3l: Marubishi-Nhật

- Thiết bị lên men 500l: Marubishi-Nhật

- Thiết bị ly tâm lọc: Maximizer 41 Green, WaterSep, Bioseparations, Mỹ

- Các thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm: tủ cấy, tủ nuôi, máy lắc, tủ

sấy…

46

2.2.2. Thiết bị nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men

- Máy cô quay chân không: Buchi Rotavapor R - 210

- Thiết bị phát siêu âm UP200St - Hielscher – Đức

- Bản sắc ký lớp mỏng silicagel Merck 60 F254 dày 0.2 mm

- Bình triển khai bản mỏng

- Tủ sấy, máy sấy

- Máy hiện UV-Vis

- Tủ hút

- Bơm hút chân không HBS 2RS-0.5 – Việt Nam

- Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC

2.2.3. Thiết bị nghiên cứu tổng hợp liposome

- Máy cô quay chân không: Buchi Rotavapor R - 210

- Bơm hút chân không

- Máy đùn mini màng polycác bonate 100nm

- Máy đo kích thước hạt nano SZ-100 (Horiba, Nhật Bản)

- Máy phân tích thế zeta (Horiba, Nhật Bản)

- Máy đo màu DSM SalmoFan (Kaiseraugst, Thụy Sĩ)

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn

2.3.1.1. Phương pháp định lượng sinh khối vi sinh vật

Hàm lượng sinh khối của vi sinh vật được xác định theo phương pháp của Mira

de Orduna [101].

Tiến hành: 10ml môi trường chứa vi sinh vật được ly tâm thu sinh khối tại điều

kiện 5000 rpm/min/10 phút. Sinh khối thu được được rửa bằng nước cất với thể tích

dịch 10ml/2 lần. Sinh khối sau đó được sấy đến trọng lượng không đổi tại 1050C.

Trọng lượng sinh khối vi sinh vật (g sinh khối khô/l) được tính qua sự chênh lệch khối

lượng của cốc đựng trước và sau khi sấy.

2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng canthaxanthin

Hàm lượng canthaxanthin tổng số được xác định theo phương pháp của Dan

Qiu [102].

- Thuyết minh quy trình xử lý mẫu: Lấy 100ml mẫu canthaxanthin, cho them

10ml nước, đun trong bình thủy tinh ở 600C trong 5 phút, cho them 100ml EtOH và

47

250ml chloroform, đưa vào máy ly tâm, thu được dịch trích ly sơ bộ (dung dịch A).

Lấy 5ml dung dịch A cô quay chân không ở 550C/150mmHg, thu cặn, hòa tan cặn

bằng: 0.5ml ethanol, 0.5ml chloroform và 99ml cyclohexane thu dung dịch phân tích

(dung dịch B) (xem hình 2.3.1)

100 mg mẫu

Đun 600C, trong 5 phút

10ml nước

Ly tâm

100ml EtOH

250ml chloroform

Dung dịch A (5ml)

Cô quay chân không (550C; 150mmHg)

Dịch cô

0.5ml etanol 0.5ml chloroform

99ml cyclohexane

Hòa tan

Dung dịch B (Dung dịch phân tích)

Hình 2.3.1. Quy trình xử lý mẫu xác định hàm lượng canthaxanthin

48

- Quy trình phân tích canthaxanthin: khởi động thiết bị đo UV, chỉnh bước sóng

đến =470nm, sử dụng mẫu blank là cyclohexane. Đo dịch phân tích B tại bước sóng

470nm. Hàm lượng canthaxanthin trong dịch mẫu được xác định theo công thức:

=

Trong đó:

A: độ hấp phụ của dung dịch mẫu tại bước sóng 470nm

5000: hệ số pha loãng

A(1%): độ hấp phụ của dung dịch canthaxanthin 1% pha trong cyclohexane xác

định bằng thực nghiệm, A= 2100

M: trọng lượng mẫu phân tích

2.3.1.3. Phương pháp xác định sản lượng canthanxanthin

Sản lượng canthaxanthin được xác định theo công thức:

=

Trong đó:

msk: hàm lượng sinh khối vi sinh vật (g sinh khối khô/l)

Cx (g/g): hàm lượng canthaxanthin vi sinh vật

SCX ((g/l): sản lượng canthaxanthin vi sinh vật

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men

2.3.2.1. Xác định hàm lượng tổng carotenoid

Để xác định hàm lượng tổng carotenoids, lấy 15 gam mẫu đem chiết với 25ml

acetone sau đó tiến hành lọc chân không ba lần, quá trình chiết được thực hiện 3 lần

đến khi dịch chiết nhạt màu. Dịch chiết này sau đó được chuyển đến bình chiết phân

bố dung tích 500 ml có chứa 40 ml ete dầu hỏa. Acetone được loại bỏ bằng cách bổ

sung chậm nước tinh khiết để ngăn chặn sự hình thành nhũ tương. Các thành phần

carotenoid sẽ chuyển sang pha ete dầu hỏa, pha nước hòa tan acetone được loại bỏ

dần. Quá trình lặp được thực hiện lặp lại bốn lần cho tới khi không còn acetone. Pha

ete dầu hỏa chứa carotenoid được chuyển sang bình 50 ml có chứa natri sulfat khan để

loại bỏ hoàn toàn nước. Dịch ete dầu hỏa chứa carotenoid được so quang ở bước sóng

450 nm. Lượng carotenoid tổng được tính theo công thức:

49

Trong đó:

A: độ hấp thụ

V: tổng thể tích mẫu

P: khối lượng mẫu

: β-carotene Extinction Coefficient trong ete dầu hỏa ( : =2592)

2.3.2.2. Xác định hàm lượng canthaxanthin bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Mẫu được chiết tách bằng phương pháp chiết siêu âm (chiết có hỗ trợ của sóng

siêu âm) với hệ dung môi là chloroform-methanol (2:1; v/v), hiệu suất chiết đạt

khoảng 95%. Cô đặc dịch chiết và tiến hành đông khô mẫu thu được cao chiết tổng.

Hàm lượng canthaxanthin trong cao tổng được định lượng bằng phương pháp sắc ký

lỏng cao áp (HPLC). Điều kiện chạy máy gồm: pha động là hệ dung môi axetonitril:

methanol (95:5; v/v), Cột phân tích C18 (4.6mm x 250mm, cỡ hạt 5µm), Detector

PDA hoặc UV-Vis, bước sóng 475nm. Trong đó thể tích bơm mẫu 20 µl, tốc độ dòng

1ml/phút, nhiệt độ buồng chạy mẫu: 300C.

Từ chất chuẩn canthaxanthin, sử dụng phương pháp HPLC tiến hành xây dựng

đồ thị đường chuẩn thể hiện tương quan giữa hàm lượng canthaxanthin và diện tích

peak. Dựa vào đồ thị đường chuẩn sẽ xác định được hàm lượng canthaxanthin trong

các mẫu thử.

2.3.2.3. Phương pháp sắc kí lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254

(Merck 1.05715) và RP-18 F254s (Merck).

Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở 2 bước sóng 254nm và 365nm. Sử dụng là

dung dịch H2SO4 5% phun lên bản mỏng và hơ nóng trên bếp điện đến khi hiện màu

các hợp chất, một số thuôc thử khác như dung dịch vanilin/ H2SO4 (1%), dung dịch

Fe3+/H2SO4 (1%), thymol/ H2SO4 (0,5%).

2.3.2.4. Phương pháp sắc kí cột

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo.

Silicagel pha thường có cỡ hạt 0.04  0.063 mm (240 ÷ 430 mesh). Silicagel pha đảo

ODS hoặc YMC (30  50µm). Selphadex LH-20 (Merck).

50

2.4. Phương pháp nghiên cứu tạo sản phẩm thức ăn cho cá hồi chứa canthaxanthin

2.4.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp bổ sung chế phẩm canthaxanthin

Chế phẩm giàu canthaxanthin được tiến hành bổ sung vào thức ăn cho cá hồi

bằng các phương pháp sau:

- Phương pháp phối trộn vào nguyên liệu trước khi ép đùn: Cân một lượng

chính xác chế phẩm chứa canthaxanthin được làm giàu từ đề tài bổ sung vào hỗn hợp

nguyên liệu trong qúa trình phối trộn các nguyên liệu của nhà máy. Hỗn hợp nguyên

liệu chứa chế phẩm canthaxanthin này sẽ trải qua các bước sản suất của nhà máy:

Trộn, nghiền, cấp hơi nấu chín, ép đùn, sấy khô và áo dầu. Nhiệt độ trong buồng trộn:

80950C và trong thời gian 3 phút, tiếp sau đó hỗn hợp nguyên liệu sẽ được di chuyển

sang vị trí đầu ép viên với nhiệt độ lên tới 120÷1350C, 2040 bar và trong thời gian 30

giây.

- Phương pháp trộn chế phẩm canthaxanthin vào viên thức ăn (phủ ngoài viên

thức ăn): Cân một lượng chính xác chế phẩm canthaxanthin được làm giàu, hòa tan

trong dầu ở nhiệt độ 65÷700C. Sử dụng hỗn hợp chất lỏng này phun lên thức ăn (áo

dầu thức ăn). Thức ăn sau khi được áo dầu sẽ được làm khô và đóng bao.

- Phương pháp trộn liposome có chứa canthaxanthin vào thức ăn: trộn thức ăn

không chứa cantaxanthin và liposome có chứa các hàm lượng canthaxanthin khác

nhau.

Thức ăn thành phẩm của các phương pháp bổ sung sẽ được thu mẫu và phân tích

tại phòng thí nghiệm dinh dưỡng thủy sản thuộc trung tâm Công nghệ Sinh học nhằm

xác định hàm lượng canthaxanthin chứa trong thức ăn sau quá trình gia công.

2.4.2. Phương pháp xác định liều lượng bổ sung canthaxanthin vào thức ăn cá hồi

Tiến hành bổ sung chế phẩm canthaxanthin vào thức ăn cho cá Hồi vân với các

liều lượng khác nhau và trộn thức ăn với liposome có chứa canthaxanthin với tỷ lệ

khác nhau và tiến hành cho cá ăn với cách bố trí thí nghiệm như sau:

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 công thức

và mỗi công thức được lặp lại 3 lần. 270 con cá hồi có khối lượng trung bình 150g/con

được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên vào 9 bể ximăng 4m3 với hệ thống nước chảy tràn

liên tục.

Chăm sóc quản lý cá: Cá được cho ăn ngày 2 lần sáng và chiều, định kỳ tắm

muối và kháng sinh cho cá. Các yếu tố môi trường như oxy, nhiệt độ được theo dõi

51

hàng ngày vào lúc 6h và 14h. NO2, NH3, H2S và NO2 được test vào lúc 6h hàng ngày.

Định kỳ 1 tháng cân mẫu 1 lần để kiểm tra tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống.

Các chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ sống, khối lượng cá tăng lên, tốc độ tăng trưởng

bình quân ngày, hệ số chuyển đổi thức ăn, màu sắc, hàm lượng canthaxanthin và hàm

lượng chất dinh dưỡng trong cơ thịt cá.

Đánh giá hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng trưởng của cá nuôi:

Tỷ lệ tăng trưởng tuyệt đối (SGR) (% khối lượng thân/ngày)=[(ln Wf (g) - ln Wi

(g))/thời gian nuôi (ngày)]×100

Hệ số thức ăn (FCR): Tổng lượng thức ăn (kg)/Tổng khối lượng cá tăng thêm

(kg)

Tỷ lệ sống (S) (%)=(Tổng số cá thu/Tổng số cá)×100

Phương pháp đánh giá màu sắc cơ thịt và hàm lượng canthaxanthin trong cơ thịt

cá:

- Số lượng mẫu thu: 10 mẫu /1 lô thí nghiệm. Vị trí lấy mẫu so màu: cơ thịt cá vị

trí giữa thân. Thời gian thu mẫu định kỳ: 30 ngày/lần.

- Phương pháp so màu: sử dụng thước đo màu SalmoFan Lineal để cho điểm theo

thang điểm từ 20 đến 34 và điểm trung bình của 3 người quan sát khác nhau sẽ là điểm

sử dụng để đánh giá [103].

Xác định nồng độ canthaxanthin trong cơ thịt: mẫu cơ thịt cá được thu tại cùng

một vị trí trên cơ lưng, 10 mẫu/lô thí nghiệm sẽ được tách chiết bằng dung môi hữu cơ,

làm sạch và phân tích bằng máy sắc khí lỏng cao áp HPLC.

2.5. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình công nghệ

Sau khi lựa chọn được các yếu tố công nghệ chính cần nghiên cứu và khảo sát

ảnh hưởng đơn yếu tố của chúng tới quá trình. Tiếp theo sẽ tiến hành thiết kế ma trận

kế hoạch thực nghiệm theo mô hình kế hoạch trực giao bậc hai của Box-Willson, kế

hoạch chu bản bậc hai Box-Hunter hoặc kế hoạch Box-Behnken [82; 83]. Tùy vào yêu

cầu của từng bài toán cụ thể và sự hiểu biết sơ bộ về ảnh hưởng của các biến mà lựa

chọn mô hình khảo sát để nghiên cứu và tối ưu hóa quá trình công nghệ. Số thí nghiệm

của ma trận kế hoạch được tính theo công thức sau:

- Đối với mô hình bậc 2 của Box-Willson:

N = 2k + 2k + n0 với k < 5 và k=5

N = 2k-1 + 2k + n0 với k > 5

52

(N: số thí nghiệm; k: số yếu tố công nghệ; n0: số thí nghiệm tại tâm)

Các mức của kế hoạch thực nghiệm sau khi được mã hóa bao gồm (-α; -1; 0; +1;

+α). Trong đó α gọi là cánh tay đòn và được tính theo công thức:

α 4 + 2k α2 – 2k-1(k + 0.5 n0) = 0 với k < 5

α 4 + 2k-1 α2 – 2k-2(k + 0.5 n0) = 0 với k > 5

Sau khi tính toán được giá trị cánh tay đòn α, ta sẽ thiết lập được ma trận kế

hoạch thực nghiệm. Dựa vào đây ta có các thí nghiệm để tính toán giá trị các hàm mục

tiêu Y.

- Đối với mô hình bậc 2 của Box – Hunter

N = 2k + 2k + n0 với k < 5 và k=5

N = 2k-1 + 2k + n0 với k > 5

(N: số thí nghiệm; k: số yếu tố công nghệ; n0: số thí nghiệm tại tâm)

Các mức của kế hoạch thực nghiệm sau khi được mã hóa bao gồm (-α; -1; 0; +1;

+α). Trong đó α gọi là cánh tay đòn và được tính theo công thức:

α = 2k/4 (khi nhân kế hoạch 2k)

α = 2(k-1)/4 (khi nhân kế hoạch 2k-1)

Số điểm ở tâm kế hoạch n0 được tăng lên để ma trận không suy biến, các giá trị α

và n0 với số biến k khác nhau được cho ở bảng sau:

Bảng 2.5.1. Các thông số kế hoạch

Các thông số K

của kế hoạch 2 3 4 5* 5 6* 6

Nhân kế hoạch 22 23 24 25-1 25 26-1 26

α 1.414 1.628 2 2 2.378 2.378 2.828

5 6 7 6 10 9 15 n0

- Đối với mô bình bậc 2 của Box – Behnken:

N = 22. + n0

(N: số thí nghiệm; k: số yếu tố công nghệ; n0: số thí nghiệm tại tâm)

Các mức của kế hoạch thực nghiệm sau khi được mã hóa gồm (-1; 0; +1).

Sau khi các giá trị hàm mục tiêu có được bằng thực nghiệm đầy đủ cho ma trận

kế hoạch thực nghiệm, các bước thực hiện tiếp theo bao gồm:

• Tính các hệ số của phương trình hồi quy

53

• Kiểm định sự có nghĩa của các hệ số hồi quy

• Kiểm định sự tương thích của mô hình đã chọn

• Tối ưu hóa đồng thời nhiều hàm mục tiêu

Phương pháp tối ưu hóa hàm đa mục tiêu (phương pháp hàm nguyện vọng

theo Harrington):

- Tối ưu hóa hàm mục tiêu đã chọn bằng phương pháp hàm nguyện vọng,

phương pháp này gồm ba bước thực hiện

+ Thiết lập hàm mục tiêu: Yi = fi(X1, X2,..., Xk) có dạng tổng quát

+ + Yk = b0 +

+ Chuyển đổi hàm mục tiêu thành hàm vi phân: di = Ti(Yi)

+ Thiết lập hàm mong đợi: D = g(d1, d2,...,dm)

- Harrington đã đưa ra phương thức tối ưu hóa đa mục tiêu bằng việc xây dựng

hàm nguyện vọng, sau đó Derringer và Suich đã cải tiến việc tính toán hàm nguyện

vọng và được sử dụng trong phần mền Design Expert. Hàm nguyện vọng D được tính

như sau:

D =

- Trong trường hợp các hàm mục tiêu di có tầm quan trọng hay thứ bậc khác

nhau, thì hàm D được tính như sau, có tính đến thứ bậc quan trọng (wi) của các mục

tiêu:

D = W =

- Các hàm di được tính như sau:

di = exp [- exp (Yi)] Khoảng chấp nhận một phía (phía trái hoặc phải)

di = exp (- Yi) Khoảng chấp nhận 2 phía

2.6. Phân tích thống kê

Dữ liệu thử nghiệm được tính toán với sai số trung bình và tiêu chuẩn. Dữ liệu

trung bình của các công thức được xử lý trên phần mềm Minitab 16. So sánh Duncan

được sử dụng để phân biệt từng thí nghiệm. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa khi giá

trị p <0.05.

54

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM

3.1. Lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn

Môi trường giữ giống thạch và hoạt hóa giống Marine Agar 2216 như đã trình

bày.

Môi trường nhân giống thạch YTN: (NH4)2SO4: 1.00g/l; Sucrose: 17.50g/l; Bột

nấm men: 30.00g/l; NaCl: 17.50 g/l; Mono sodium glutamate: 6.47g/l; FeSO4: 1.00g/l;

MgSO4: 1,00 g/l; Sodium malate (C4H4Na2O5): 1.89 g/l; KH2PO4: 4,50g/l; CoCl2:

2mg/l; Biotin: 0.10g/l; pH = 7; Agar: 25g/l.

Môi trường nhân giống lỏng các cấp và lên men YTN: (NH4)2SO4: 1.00g/l;

Sucrose: 17.50g/l; Bột nấm men: 30.00g/l; NaCl: 17.50g/l; Mono sodium glutamate:

6.47g/l; FeSO4: 1.00g/l; MgSO4: 1.00g/l; Sodium malate (C4H4Na2O5): 1.89g/l;

KH2PO4: 4.50g/l; CoCl2: 2.00mg/l; Biotin: 0.10 g/l; pH = 7; Dầu phá bọt antifoarm

204: 0.01% (Nhân giống trên thiết bị lên men 50 lít và lên men trên thiết bị 500 lít).

3.1.1. Lựa chọn thành phần môi trường

Nguồn cơ chất carbon được lựa chọn dựa trên nghiên cứu của Cyplik [104]. Thí

nghiệm được tiến hành trên môi trường cơ bản NB 01 thay thế glucose bằng cơ chất

carbon thí nghiệm ở cùng nồng độ. Thông số đánh giá thí nghiệm là hàm lượng

canthaxanthin (mg/g); Hàm lượng sinh khối (g/l) và hiệu suất tạo Canthaxanthin

(mgCx/l).

Nguồn cơ chất Nitơ được lựa chọn dựa trên nghiên cứu của Cyplik [104]. Thí

nghiệm được tiến hành trên môi trường cơ bản NB 01 thay thế pepton + cao nấm men

bằng cơ chất nitơ thí nghiệm ở cùng nồng độ. Thông số đánh giá thí nghiệm là hàm

lượng canthaxanthin (mg/g); Hàm lượng sinh khối (g/l) và hiệu suất tạo Canthaxanthin

(mgCx/l).

Hợp chất trung gian trong chu trình TCA (Hợp chất trung gian) được lựa chọn,

đánh giá dựa trên kết quả nghiên cứu của Cyplik [104]. Thí nghiệm được tiến hành

trên môi trường NB 01 bổ sung hợp chất trung gian.

Chất khoáng và chất vô cơ được lựa chọn, đánh giá dựa trên kết quả và quy

trình thực hiện của Hirasawa; Cyplik và Nasri [104]. Thí nghiệm được tiến hành trên

môi trường NB 01 bổ sung chất khoáng/chất vô cơ được đánh giá.

55

Vitamin và acid amin được lựa chọn, đánh giá dựa trên kết quả và quy trình

thực hiện của Calegari-Santos và Cyplik [104]; [105]. Thí nghiệm được tiến hành trên

môi trường NB 01 bổ sung vitamin/acid amin được đánh giá.

Nồng độ cơ chất thí nghiệm được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.1.1. Thành phần môi trường và nồng độ sử dụng thí nghiệm

Thành phần

Thành phần

Hàm lượng

Hàm lượng

Glucose

1 (g/l)

Glutamate

5mM

Sucrose

1 (g/l)

Aspartate

5 mM

Starch

1 (g/l)

Glutamine

5 mM

Glycerol

1 (g/l)

Asparagine

5 mM

Carbon

Lactose

1 (g/l)

Alanine

5 mM

Maltose

1 (g/l)

Glycine

5 mM

Acid amin

Fructose

1 (g/l)

Threonine

5 mM

Mannose

1 (g/l)

Arginine

5 mM

Maltodextrin

1 (g/l)

Tyrosine

5 mM

18 (g/l)

Proline

5 mM

NH4SO4

Urea

18 (g/l)

Phenylalanine

5 mM

18 (g/l)

Leucine

5 mM

KNO3

Soy pepton

18 (g/l)

Acetate

5 mM

Polypepton

18 (g/l)

Citrate

5 mM

Nitơ

Trypton

18 (g/l)

Fumarate

5 mM

Hợp chất trung gian

Yeast extract

18 (g/l)

Alpha ketoglutarate

5 mM

Dried extract

18 (g/l)

Malate

5 mM

chu trình TCA

Casein pepton

18 (g/l)

Oxaloacetaet

5 mM

Meat extract

18 (g/l)

Succinate

5 mM

Mg

20 (mg/l)

Ascorbic acid

1 mM

Fe

20 (mg/l)

Riboflavin

1 mM

Ca

20 (mg/l)

Nicotinic acid

1 mM

Mn

20 (mg/l)

Pantothenic acid

1 mM

Co

Pyridoxine

1 mM

20 (mg/l)

Vitamin

Khoáng

Zn

20 (mg/l)

Thiamine

1 mM

chất

Mo

20 (mg/l)

Cyanocobalamin

1 mM

Ni

20 (mg/l)

Pp

1 mM

Se

20 (mg/l)

Biotin

1 mM

Bo

20 (mg/l)

K

20 (mg/l)

56

3.1.2. Khảo sát tìm tâm thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp

canthaxanthin

Mục đích: Khảo sát, tìm tâm thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng

hợp canthaxanthin dựa trên kết quả nghiên cứu của Kelly; Hirasawa; Tanaka; Tsuboka

và Calegari Santos [105; 106]. Các yếu tố được khảo sát và mức khảo sát được trình

bày ở bảng sau:

Bảng 3.1.2. Các yếu tố được khảo sát và mức khảo sát

Mức

pH Nhiệt

Tỷ lệ giống

Tốc độ

Thời

Ghi chú

độ (0C)

(%)

khuấy (rpm)

gian (h)

TN

M1

6

15

5

100

24

Môi

trường giữ giống:

Marine Broth/Agar 2206

M2

6.5

20

7.5

150

36

Môi trường nhân giống:

M3

7

25

10

200

48

BTN

M4

7.5

30

12.5

250

60

Môi trường lên men: YTN

M5

8

35

15

300

72

M6

8.5

40

350

96

M7

9

400

105

M8

500

120

3.1.3. Sàng lọc điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin

Mục đích của thí nghiệm sàng lọc nhằm xác định mức ảnh hưởng của các điều

kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens

VTP20181. Thí nghiệm được thiết kế theo ma trận Factorial minium Run Resolution

IV screening, mức thấp (-1) và cao (+1) của các yếu tố được liệt kê trong các bảng sau.

Bảng 3.1.3. Ma trận Factorial minium Run Resolution IV screening

Mức thấp

Mức cao

Ghi chú

Yếu tố

Đơn vị

(-1)

(+1)

Mức tín hiệu sai khác signal =20;

pH 6 8

Độ nhiễu Noise =5

0C

Nhiệt độ 20 30

Tỷ lệ tín hiệu/độ nhiễu

Tốc độ khuấy rpm 100 500

(signal/noise ratio)=4

Tỷ lệ giống % 2.5 15

α =0.05: mức đánh giá sự có

Thời gian h 48 72

nghĩa của mô hình/hàm đáp ứng.

Yếu tố được chọn là yếu tố có p-value < 0.05, có mức độ ảnh hưởng có ý nghĩa

thống kê đến hàm đáp ứng Cx và Yield của mô hình phân tích.

57

3.1.4. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin

Từ kết quả sàng lọc bằng ma trận, các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng

sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181 được xác định giá trị tối

ưu và đánh giá ở 5 mức (-α; -1; 0; +1; +α) trong CCD. Số liệu được phân tích bằng

chương trình Design Expert 7.0.0 của Công ty Stat-Ease, Inc.USA. Đối với số yếu tố

công nghệ là 5 (k=5), ta xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm như bảng sau:

Bảng 3.1.4. Bố trí ma trận kế hoạch thực nghiệm

Y1 (mg/g) Y2 (mg Cx/l)

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 A -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 - α + α 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 0 0 -α + α 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 0 0 0 0 -α + α 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0 0 0 0 0 0 -α + α 0 0 0 0 0 0 0 0 E +1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 +1 0 0 0 0 0 0 0 0 -α + α 0 0 0 0 0 0

Trong đó Y1 (Cx) là hàm lượng canthaxanthin (mg/g) và Y2 là hiệu suất tạo

Canthaxanthin (mgCx/l).

58

Từ kết quả phân tích xác định mức tối ưu của các yếu tố cho sản lượng

canthanxanthin cực đại. Giá trị hàm đáp ứng theo thực nghiệm và tiên đoán theo mô

hình được đánh giá qua phân tích phương sai ANOVA. Phương trình hồi quy được

dùng như mô hình tiên đoán hàm lượng canthaxanthin, hàm lượng sinh khối và sản

lượng hoạt chất thu được.

3.1.5. Lựa chọn mô hình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin

- Lựa chọn mô hình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin phù hợp, đáp ứng yêu

cầu về kinh tế, khả năng ứng dụng ở quy mô công nghiệp, sản lượng canthaxanthin

cao.

Tiến hành: Các mô hình lên men được thiết lập theo kết quả nghiên cứu của

Zhang và Bae [106; 107].

Lên men theo mẻ: lên men trên môi trường YTN, thời gian lên men 72h.

Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất: lên men 24 h sau đó bổ sung cơ chất tại các

thời điểm: 24h (+5g/l sucrose); 36h (+5g/l sucrose), 48h (+5g sucrose, 5g bột nấm

men), 60h (+5g sucrose, 5g bột nấm men) và 72h (+5g sucrose, 5g bột nấm men). Quá

trình lên men kết thúc sau 92h.

Lên men liên tục: lên men 24 h sau đó bổ sung cơ chất với nồng độ (0.52g

sucrose + 0.32g bột nấm men/h trong 48h. Quá trình lên men kết thúc sau 92h.

Các thông số đánh giá quá trình lên men gồm: Hàm lượng canthaxanthin

(mg/g), hàm lượng sinh khối (g/l), năng suất sinh tổng hợp canthaxanthin (mgCx/l),

năng suất sinh tổng hợp canthaxanthin (mgCx/l.h).

Thí nghiệm lựa chọn điều kiện tối ưu sinh tổng hợp canthaxanthin trên mô hình

lên men theo mẻ bổ sung cơ chất được thực hiện như sau:

Bảng 3.1.5. Lựa chọn điều kiện tối ưu sinh tổng hợp canthaxanthin

Hàm lượng

Thí

Số lần

Thời gian bổ

Ghi chú

nghiệm

bổ sung

sung (h)

cơ chất bổ sung (g/lần)

Cố định: số lần bổ sung, thời

3

35h, 45h

Bổ sung sucrose

3g/lần; 4g/lần; 5g/lần, 6g/lần

gian bổ sung, thông số đánh giá: Cx (mg/g), Biomass(g/l)

Bổ sung

2

3g/lần; 4g/lần;

24h, 35h, 45h

Cố định: số lần bổ sung, thời

59

bột nấm

5g/lần, 6g/lần

gian bổ sung, thông số đánh giá:

men

Cx (mg/g), Biomass(g/l)

2

30h, 45h

5g sucrose, 6g bột nấm men

Cố định: 5g sucrose/lần bổ sung; 6g bột nấm men/lần bổ

5g sucrose, 6g

3

24h, 36h, 48h

bột nấm men

Số lần bổ sung

sung. Không bổ sung bột nấm men thời điểm 24h. Thông số

5g sucrose, 6g

24h, 35h, 45h,

4

đánh giá: Cx (mg/g); Biomass (g/l)

bột nấm men

55h

3.1.6. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men

Mục đích: lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối vi sinh vật sau lên men.

Bảng 3.1.6. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men

Thí nghiệm Điều kiện thí nghiệm Thông số đánh giá

Hiệu suất thu nhận sinh Lựa chọn phương

khối pháp thu nhận sinh

khối

- Lắng, ly tâm: lắng sinh khối ở 40C/24h, ly tâm 10000 rpm, thiết bị ly tâm CEPA, Đức. - Lọc màng: khe lọc 0,6nm, tốc độ

dịch:180-200l/h

- Ly tâm bán liên tục: tốc độ ly

tâm: 15000 rpm, tốc độ dịch:

600l/h

Lựa chọn tốc độ ly 10000, 12000, 15000, 17000 rpm Hiệu suất thu nhận sinh

tâm khối

Tỷ lệ sinh khối/nước 1 /2; 1 /3; 1 /4; 1 /5; 1 /6 Hiệu suất thu nhận sinh

rửa sinh khối (m/V) khối, Bx dịch rửa

1 lần, 2 lần, 3 lần Hiệu suất thu nhận sinh Số lần rửa

khối, Bx dịch rửa

1/1; 1/2; 1/3

Tỷ lệ nước bổ sung vào sinh khối trước sấy phun Hiệu suất thu hồi chế phẩm, hàm lượng Cx, cảm quan chế phẩm

Chế độ sấy

Hiệu suất thu hồi chế phẩm, hàm lượng Cx, cảm quan chế phẩm 1550C/800C /2l/h/20000rpm; 1650C/850C /2.5l/h/20000rpm; 1750C/900C /2.5l/h/20000rpm;

60

3.2. Xây dựng quy trình chiết xuất canthaxanthin

Bột sinh khối khô 100(g) được chiết xuất với dung môi ethanol 96% có bổ sung

0.5% chất hoạt động bề mặt Glycerol Monostearate (GMS). Bốn thông số công nghệ

của quá trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối được khảo sát để đưa ra điều kiện

tối ưu gồm: nhiệt độ chiết (0C), tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w), thời gian chiết (phút)

và công suất siêu âm (W). Sau khi chiết xuất, dịch chiết được cô quay đuổi dung môi

ta thu được cao chiết tổng. Hàm lượng carotenoid tổng và hàm lượng canthaxanthin

được xác định lần lượt bằng phương pháp đo quang và phương pháp sắc ký lỏng cao

áp (HPLC). Kết quả hàm lượng carotenoid tổng và canthaxanthin xác định được từ cao

chiết tổng được sử dụng làm hàm mục tiêu để tối ưu quá trình chiết xuất.

Cao chiết tổng thu được ở quá trình chiết xuất tiếp tục được xử lý loại tạp chất

béo bão hòa bằng phương pháp kết tinh ure sau đó tiến hành sắc ký cột pha thường với

hệ dung môi n-hexan/acetone (4/1, v/v) để phân lập canthaxanthin. Sử dụng sắc ký lớp

mỏng (TLC) để kiểm tra các phân đoạn thu được trong quá trình sắc ký cột, gom các

phân đoạn có chứa hợp chất canthaxanthin sạch. Cô quay đuổi dung môi ta thu được

hợp chất canthaxanthin độ tinh sạch trên 98%. Tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt

nhân 1H-NMR và 13C-NMR của chất sạch phân lập được. So sánh với tài liệu tham

khảo để khẳng định hợp chất thu được chính là canthaxanthin.

3.2.1. Định lượng canthaxanthin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp

Dựa vào phương trình đường chuẩn thể hiện mối liên hệ tương quan giữa nồng

độ canthaxanthin chuẩn và diện tích peak đã được xây dựng tại Phòng Phân tích Hóa

học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên để xác định nồng độ canthaxanthin trong

các mẫu cao chiết tổng cần phân tích.

Hình 3.2.1. Đồ thị đường chuẩn của canthaxanthin

61

Đồ thị đường chuẩn được biểu diễn trên hình 3.2.1. Phương trình đường chuẩn

có dạng: Y =12389X + 453 với R2 = 0.9979.

3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất quá trình chiết

xuất canthaxanthin

Bốn thông số công nghệ gồm nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất, tỷ lệ

dung môi trên nguyên liệu và công suất siêu âm sẽ được khảo sát đơn biến và đánh

giá, lựa chọn điều kiện phù hợp bằng hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng

carotenoid tổng trong cao chiết.

Trong đó:

+ Hàm lượng canthaxanthin (mg/g) =

+ Hàm lượng carotenoid tổng (mg/g)

Dựa trên một số khảo sát sơ bộ ban đầu, chúng tôi lựa chọn các mức cơ bản

(mức gốc) cho các yếu tố công nghệ như sau:

+ Nhiệt độ chiết: 35 (0C)

+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 9/1 (v/w)

+ Thời gian chiết: 90 (phút)

+ Công suất siêu âm: 160 (W)

Khi khảo sát sự phụ thuộc của từng biến độc lập thì 3 biến còn lại được giữ cố

định ở các mức gốc hoặc mức tốt nhất ở khảo sát trước đó, biến được khảo sát sẽ được

thử nghiệm ở các điều kiện khác nhau để lựa chọn điều kiện thích hợp nhất.

3.2.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết

Nhiệt độ chiết xuất được khảo sát ở các mức 300C, 350C, 400C, 450C và 500C.

Các biến độc lập còn lại được cố định là:

+ Thời gian chiết: 90 phút

+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w): 9/1

+ Công suất siêu âm: 160 W

+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam

+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS

Nhiệt độ chiết cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng cho các thí nghiệm

tiếp theo.

62

3.2.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến quá trình chiết

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) được khảo sát ở các tỷ lệ: 5/1; 7/1; 9/1; 11/ và

13/1. Ba biến độc lập còn lại được cố định là:

+ Nhiệt độ chiết: 350C

+ Thời gian chiết: 90 phút

+ Công suất siêu âm: 160 W

+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam

+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu chiết cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng

cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết

Thời gian chiết xuất được khảo sát ở các mức 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút

và 150 phút. Ba biến độc lập còn lại được cố định là:

+ Nhiệt độ chiết: 350C

+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w): 9/1

+ Công suất siêu âm: 160 W

+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam

+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS

Thời gian chiết cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng cho các thí

nghiệm tiếp theo.

3.2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm đến quá trình chiết

Công suất siêu âm được khảo sát ở các mức: 100 W, 120 W, 140 W, 160 W và

180 W. Ba biến độc lập còn lại được cố định là:

+ Thời gian chiết: 90 phút

+ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w): 9/1

+ Nhiệt độ chiết: 350C

+ Khối lượng mẫu đem chiết xuất là 100 gam.

+ Dung môi chiết sử dụng ethanol 96% bổ sung 0.5% GMS

Công suất siêu âm cho hiệu suất chiết xuất cao nhất được sử dụng cho các thí

nghiệm tiếp theo.

63

3.2.3. Xây dựng mô hình nghiên cứu và ma trận kế hoạch thực nghiệm

Các thông số công nghệ sau khi khảo sát đã lựa chọn được các thông số tốt nhất.

Dựa vào các thông số này, nhóm nghiên cứu tiếp tục xây dựng ma trận kế hoạch thực

nghiệm để tìm thông số tối ưu cho quá trình chiết xuất. Sử dụng kế hoạch bậc 2 của

Box-Behnken để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm. Trong đó Z1, Z2, Z3, Z4 là

các biến thực; A, B, C, D tương ứng là các biến mã hóa; Y1(mg/g) là hàm mục tiêu thể

hiện hàm lượng canthaxanthin trong cao chiết tổng và Y2(mg/g) là hàm mục tiêu thể

hiện hàm lượng carotenoid tổng trong cao chiết. Y1 và Y2 càng lớn chứng tỏ hiệu suất

quá trình chiết xuất là tốt. Thực hiện 27 thí nghiệm theo ma trận kế hoạch dưới đây:

Bảng 3.2.1. Bảng ma trận kế hoạch thực nghiệm

TT Biến mã hóa Hàm mục tiêu

A B C D Y1 (mg/g) Y2 (mg/g)

-1 1 -1 0 0

+1 2 -1 0 0

-1 3 +1 0 0

+1 4 +1 0 0

0 5 0 -1 -1

0 6 0 +1 -1

0 7 0 -1 +1

0 8 0 +1 +1

-1 9 0 0 -1

+1 10 0 0 -1

-1 11 0 0 +1

+1 12 0 0 +1

0 13 -1 -1 0

0 14 +1 -1 0

0 15 -1 +1 0

0 16 +1 +1 0

-1 17 0 -1 0

+1 18 0 -1 0

-1 19 0 +1 0

64

+1 +1 20 0 0

21 0 -1 0 -1

22 0 +1 0 -1

23 0 -1 0 +1

24 0 +1 0 +1

25 0 0 0 0

26 0 0 0 0

27 0 0 0 0

Trong đó, các giá trị biến thực và biến mã hóa tương ứng được thể hiện theo

bảng sau:

Bảng 3.2.2. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ

Biến thực Biến Khoảng biến Mức nghiên cứu

mã thiên (Δ) -1 0 1

A Z1: Nhiệt độ chiết (0C)

B Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

(v/w)

C Z3: Thời gian chiết (phút)

D Z4: Công suất siêu âm (W)

Các kết quả Y1, Y2 và các giá trị biến thực, biến mã hóa sẽ được tính toán và thể

hiện ở phần kết quả nghiên cứu. Tối ưu hóa các thông số công nghệ của quy trình chiết

xuất được thực hiện trên phần mềm Design Expert 7.0.0.

Phương trình hồi quy mô tả mô tả ảnh hưởng của các biến độc lập đối với hàm

mục tiêu có dạng hàm đa thức bậc 2 (Hàm mục tiêu Y là chênh lệch khối lượng dầu

béo trước và sau phản ứng). Phương trình tổng quát như sau:

+ + (*) Yk = b0 +

Trong đó:

Yk: Biến phụ thuộc (k = 1 - 4)

Xi,j : Nhân tố mã hóa của biến độc lập ảnh hưởng đến Yk

b0: Hệ số hồi quy thành phần tự do

bj: Hệ số hồi quy (hiệu ứng) tuyến tính mô tả ảnh hưởng tuyến tính đến Yk

65

buj: Hệ số hồi quy(hiệu ứng) tương tác đôi mô tả ảnh hưởng kép của biến Xi và Xj

đến Yk

2 đến Yk

bjj: Hệ số hồi quy (hiệu ứng) bình phương mô tả ảnh hưởng của biến Xj

3.3. Đặc điểm và quá trình tổng hợp liposome

3.3.1. Quá trình tổng hợp liposome

Canthaxanthin và α-tocopherol được đưa lên liposomes bằng phương pháp bay

hơi màng mỏng như đã mô tả trước đây [108]. Hỗn hợp canthaxanthin và α-tocopherol

có tỷ lệ khối lượng cố định 1:9 (hỗn hợp A) được hòa tan trong 2ml diclometan cùng

với lecithin đậu nành. Các nồng độ ban đầu (IC = mcanthaxanthin/mlipid, %wt/wt) của

canthaxanthin được chọn lần lượt là 0.1%; 0.5% và 1.0%. Sau khi hòa tan, màng mỏng

thu được bằng cách loại bỏ dung môi hữu cơ trong nồi cách thủy ở 300C dưới áp suất

bình 250 mbar và tốc độ quay cấp 2. Nước cất (4ml) được thêm vào để bóc màng, tạo

thành liposome có chứa canthaxanthin. Để có được kích thước cố định, liposome được

đưa qua màng polycacbonate 100nm trong máy đùn mini 50 lần. Mẫu cuối cùng được

đựng trong eppendorf và giữ trong tủ lạnh (khoảng 40C trong bóng tối). Tất cả các mẫu

khác (liposome, liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol) được

chuẩn bị với cùng một quy trình và tỷ lệ nguyên liệu tương ứng. Cấu trúc của liposome

chứa canthaxanthin và α-tocopherol được thể hiện trong Hình 3.3.1.

Hình 3.3.1. Cấu trúc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol

3.3.2. Kích thước hạt

Chỉ số z trung bình, kích thước trung bình và chỉ số phân tán (PDI) của các mẫu

liposome được theo dõi bằng cách sử dụng máy đo kích thước hạt nano SZ-100 và

66

máy phân tích thế zeta (Horiba, Nhật Bản) với laser He/Ne (λ=633 nm) và tán xạ góc

900. Kết quả thu được là giá trị trung bình của ít nhất ba lần đo.

3.3.3. Quá trình đưa canthaxanthin lên liposome

Hiệu suất đóng gói (EE%) và khối lượng tải thuốc (DL%) được xác định bằng

máy quang phổ UV-Vis. Canthaxanthin dư thừa đã được loại bỏ bằng thẩm tách

(14000Da, 10 cm x 10 cm). Huyền phù được thẩm tách trong 24 giờ với 1 lít nước cất.

Nước cất được thay sau mỗi 2 giờ kể từ khi bắt đầu cho 4 lần. Liposome được hòa tan

trong 3.5ml hexan và được siêu âm trong 2 phút để phá hủy huyền phù liposome. Sau

đó 100 µl hỗn hợp liposome được trộn với 2900µl hexan và được lắc trong 30 giây.

Lượng canthaxanthin tự do được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ bằng

máy quang phổ Hitachi U-2900 (Hitachi, Tokyo, Nhật Bản) ở bước sóng 474nm với n-

hexan làm mẫu đối chứng. (EE%) và (DL%) được xác định tương ứng bằng các

phương trình sau:

3.3.4. Thử nghiệm giải phóng thuốc

Lấy 1 ml liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol được đặt vào túi

thẩm tách (ngưỡng trọng lượng phân tử =14000 Da), tiếp theo là ủ trong 50ml dung

dịch đệm phosphat (PBS) (pH=7.4) có chứa Tween 80 (0.5%) (wt) ở 370C và lắc nhẹ

(100 vòng/phút). Sau một khoảng thời gian nhất định, 1ml mẫu được lấy từ túi và một

thể tích đệm mới giống hệt được thêm vào. Môi trường được lấy ra và phân tích bằng

cách sử dụng máy quang phổ UV-Vis để tính lượng canthaxanthin được giải phóng.

Mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần và được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch

chuẩn (SD).

3.3.5. Thí nghiệm phối trộn liposome vào thức ăn cho cá hồi vân

3.3.5.1. Cá và chế độ ăn

Ảnh hưởng của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol trong chế độ ăn

bổ sung cho cá hồi vân đã được khảo sát tại Trung tâm Nghiên cứu Cá nước lạnh Sa

Pa, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản (Lào Cai, Việt Nam). Tổng cộng có 900

con cá được cân riêng và phân bổ ngẫu nhiên vào 30 bể (mỗi bể 280 lít). Mỗi bể chứa

30 con cá và mỗi lần nhân rộng bao gồm 10 bể. Một tháng trước khi bổ sung chế độ ăn

67

uống, cá được nuôi với thức ăn không có màu để màu cơ của chúng trở lại màu ban

đầu. Sau đó, mỗi bể trong mỗi nhóm được cho ăn một trong mười khẩu phần thí

nghiệm trong 3 tháng (Bảng 3.3.1). Thức ăn thô sử dụng trong thí nghiệm do Nhà máy

thức ăn chăn nuôi Kinh Bắc, tỉnh Bắc Ninh, Việt Nam sản xuất với thành phần dinh

dưỡng cơ bản như sau: đạm 40%, chất béo 18%, chất xơ thô 5%, năng lượng

3800kcal/kg. Cá được cho ăn lúc 6 giờ sáng, 10 giờ sáng, 2 giờ chiều và 6 giờ chiều

hàng ngày cho đến khi no. Nước trong bể được thay liên tục bằng nước ngọt với tốc độ

4l/phút. Nhiệt độ nước và oxy hòa tan được duy trì trong khoảng từ 6 đến 17.50C và từ

10 đến 11ppm tương ứng. Máy bơm không khí được sử dụng để sục khí vào nước.

Bảng 3.3.1. Thành phần thức ăn cho cá được sử dụng trong thử nghiệm

Khối lượng (mg)

Khẩu phần dinh dưỡng

Lecithin

Canthaxanthin

α- tocopherol -

Chế độ I Khẩu phần thức ăn thương mại - -

Chế độ II Khẩu phần thức ăn thương mại 1000 - - bổ sung 1g/kg lecithin

- 100 -

- - 20

- 100 20

Chế độ III Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α-tocopherol Chế độ IV Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 20mg/kg canthaxanthin Chế độ V Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α-tocopherol và 20mg/kg canthaxanthin

- Chế độ VI Khẩu phần thức ăn thương mại 990 10

990 - 10 Chế độ VII

990 9 1 Chế độ VIII

bổ sung 1 g/kg α-tocopherol loaded liposomes Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin trên liposomes (IC=1%) Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes (IC=0.1%)

5 950 45

Chế độ IX Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes (IC=0.5%)

900 90 10

Chế độ X Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes (IC=1%)

68

3.3.5.2. Tiến hành đo khối lượng

Trong quá trình thử nghiệm, cá được cân định kỳ hàng tháng bằng cách lấy

trọng lượng trung bình của ba con cá được bắt ngẫu nhiên từ mỗi nhóm. Các chỉ số

sinh trưởng của cá được xác định như sau:

Trọng lượng tăng (WG, %) = (Wf - Wi)/Wi) × 100

Tốc độ tăng trưởng cụ thể (SGR) g/ngày = 100 (ln Wf - ln Wi)/t

Trong đó:

Wf là trọng lượng cơ thể cuối cùng (g), Wi là trọng lượng cơ thể ban đầu (g) và

t là thời gian thí nghiệm (ngày).

3.3.5.3. Xác định thành phần canthaxanthin trong cơ của cá hồi

Sau ba tháng với chế độ ăn thử nghiệm, phi lê cá được thu thập và đo màu bằng

máy so màu Salmofan Lineal (DSM Nutritional Products, Kaiseraugst, Thụy Sĩ) trên

thang điểm từ 20 đến 34, đây là tiêu chuẩn quốc tế được chấp nhận cho màu cá hồi

(Hình 3.3.2). Điểm số được ghi lại cho mỗi mẫu được ba nhà nghiên cứu thống nhất.

Hình 3.3.2. Máy đo màu DSM SalmoFan

Sự phân bố canthaxanthin trong mô cơ của cá được xác định như sau. Đầu tiên,

các mẫu cơ được thu thập trên lưng cá và bảo quản ở -200C. Sau đó, canthaxanthin

được chiết xuất theo quy trình được mô tả trước đó. Tóm lại, sau khi được nghiền bằng

thiết bị đồng nhất ULTRA-TURRAX® của IKA, các mẫu được chiết xuất bằng dung

môi hữu cơ, sau đó làm sạch và phân tích bằng máy sắc ký HPLC với chất chuẩn

canthaxanthin của Sigma Aldrich. Hệ thống sắc ký khí lỏng sử dụng cột phân tích C-

18 Hypersil Gold (5 µm, 150mm x 4.6 mm), tốc độ dòng được cài đặt 1ml/phút. Thời

gian lưu là 6 phút. Quy trình được thực hiện tại phòng phân tích của Viện Hóa học các

hợp chất thiên nhiên.

69

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Tối ưu quá trình lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn

4.1.1. Khảo sát thành phần môi trường sinh tổng hợp canthaxanthin

Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên

men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin bởi vi khuẩn P.carotinifaciens. Các

thành phần môi trường và nồng độ mỗi thành phần được khảo sát, đánh giá gồm, cơ

chất carbon, cơ chất nitơ, hợp chất trung gian thuộc chu trình Kreb chuyển hóa beta

carotene thành canthaxanthin; vitamin, acid amin và muối khoáng được lựa chọn dựa

trên các kết quả nghiên cứu của Cyplik; Bhosale; Nasri và Tanaka [104]; [33]. Kết quả

khảo sát, chọn miền khảo sát sử dụng trong tối ưu hóa thành phần môi trường lên men

sinh tổng hợp canthaxanthin được trình bày sau.

Hình 4.1.1. Ảnh hưởng của cơ chất carbon và nitơ đến sự sinh tổng hợp

canthanaxanthin của vi khuẩn P.carotinifaciens VTP 20181

- Đối với cơ chất carbon cho thấy mẫu thí nghiệm sử dụng sucrose có sản lượng

canthaxanthin cao nhất so với mẫu đối chứng.

- Đối với nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ, mẫu thí nghiệm sử dụng NH4SO4 có sản

lượng canthaxanthin cao nhất so với mẫu đối chứng.

Kết quả này phù hợp với công bố của Cyplik và Tsuboka [104] về khả năng

đồng hóa các cơ chất carbon, nitơ của chủng P.carotinifaciens VTP 20181. Chế phẩm

từ nấm men chứng tỏ là nguồn cơ chất thích hợp cung cấp chất dinh dưỡng, vitamin,

acid amin, các thành phần vi lượng cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn thích hợp

hơn các nguồn cơ chất nitơ khác. Đánh giá về tính kinh tế và khả năng ứng dụng sản

xuất canthaxanthin quy mô công nghiệp, nhóm nghiên cứu lựa chọn sucrose là cơ chất

carbon và cơ chất nitơ là NH4SO4 và bột nấm men trong các thí nghiệm tối ưu hóa tiếp

theo.

70

Hình 4.1.2. Ảnh hưởng của hợp chất trung gian, vitamin và acid amin đến sự sinh tổng

hợp canthaxanthin của vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181

Các nghiên cứu của Misawa [109] cho thấy canthaxanthin được sinh tổng hợp

bởi chủng Paracoccus theo chu trình Krebs. Kết quả nghiên cứu của Misawa và

Chougle chứng tỏ các hợp chất trung gian như malate, citrate, acetate, succinate,

fumarate…thúc đẩy sinh tổng hợp beta carotene, gián tiếp thúc đẩy quá trình sinh tổng

hợp các hợp chất xanthophyll carotene như astaxanthin, canthaxanthin,

zeaxanthin…[104; 110].

71

- Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của các hợp chất trung gian đến khả năng sinh

tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181, mẫu thí nghiệm bổ sung

malate có hàm lượng canthaxanthin và sinh khối cao nhất so với mẫu đối chứng.

- Các kết quả đánh giá ảnh hưởng của vitamin và acid amin đối với sự sinh tổng

hợp canthaxanthin bằng P.carotinifaciens VTP20181 cho thấy Biotin và glutamate là

hai tác nhân có ảnh hưởng lớn nhất đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất của

P.carotinifaciens VTP 20181 lần lượt đối với nhóm vitamin và acid amin.

Kết quả này phù hợp với công bố của Cyplik và cộng sự [104] nghiên cứu về

ảnh hưởng của Biotin đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất của P.carotinifaciens và

nghiên cứu của Misawa và cộng sự [109], đánh giá ảnh hưởng của glutamate trên P.

carotinifaciens đột biến sinh tổng hợp canthaxanthin.

Hình 4.1.3. Ảnh hưởng của hợp chất vô cơ đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của

P.carotinifaciens VTP20181

Các ion kim loại là tác nhân quan trọng đối với sự phát triển và sinh tổng hợp

hoạt chất sinh học của vi khuẩn ưa muối, sử dụng nitrate, nitrite cho quá trình hô hấp

[110]. Kết quả khảo sát cho thấy K, Fe, Co và Mg có hàm lượng canthaxanthin và hiệu

suất sinh tổng hợp canthaxanthin cao nhất so với mẫu đối chứng, được lựa chọn sử

dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

72

Bảng 4.1.1. Đánh giá nồng độ NaCl đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của

chủng vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181

Nồng độ NaCl Đơn vị P.carotinifaciens VTP 20181

17.5 g/l +

50 g/l ±

100 g/l -

150 g/l -

200 g/l -

250 g/l -

300 g/l -

350 g/l -

(Ghi chú: - không phát triển, ± phát triển yếu, + phát triển. Tế bào chết được xác

định bằng nhuộm xanh methylen, đếm tế bào chết bằng buồng đếm hồng cầu)

Từ bảng 4.1.1 cho thấy để chủng vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181 phát

triển tốt cần môi trường có hàm lượng muối NaCl 17.5g/l.

Từ các kết quả khảo sát trên, tiến hành các thí nghiệm tìm hàm lượng tối ưu của

thành phần môi trường: NH4SO4, KH2PO4, MgSO4, Biotin, monosodium glutamate,

CoCl2, FeSO4, bột nấm men, Sucrose, Sodium malate, và NaCl đến sự sinh tổng hợp

canthaxanthin:

73

74

75

76

Hình 4.1.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh tổng hợp

canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181

Từ kết quả khảo sát các thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp

canthaxanthin chúng tôi lựa chọn thành phần môi trường như bảng 4.1.2:

Bảng 4.1.2. Thành phần môi trường

Nồng độ

STT

Thành phần môi trường

Môi trường sinh tổng hợp canthaxanthin

(YTN)

1

0.8

NH4SO4 (g/l)

2

4.5

KH2PO4 (g/l)

3

1

MgSO4 (g/l)

Biotin (g/l)

4

0.1

Monosodium Glutamate (g/l)

5

6.47

6

2

CoCl2 (mg/l)

7

1

FeSO4 (g/l)

Bột nấm men (g/l)

8

30

Sucrose (g/l)

9

17.5

Sodium malate (g/l)

10

1.89

NaCl (g/l)

11

17.5

12

Canthaxanthin dự đoán (mg/g)

7.82

13

Sinh khối dự đoán (g/l)

12.12

Nhóm nghiên cứu tiến hành thực nghiệm lên men sinh tổng hợp canthaxannthin

bằng chủng P.carotinifaciens VTP20181 sử dụng các công thức môi trường đề xuất

77

thu được từ kết quả với thể tích dịch lên men 3 lít, nhiệt độ 280C, pH=7, thời gian lên

men 48h. Kết quả thực nghiệm được trình bày ở hình sau:

Hình 4.1.5. Thực nghiệm lên men sinh tổng hợp canthaxanthin

Biểu đồ trên cho thấy sản lượng canthaxanthin sinh tổng hợp bằng

P.carotinifaciens VTP20181 trên môi trường YTN có kết quả xấp xỉ theo tính toán,

với hàm lượng canthaxanthin trung bình đạt 7.62 mg/g sinh khối khô, hàm lượng sinh

khối đạt 11.9 g sinh khối khô/lít.

4.1.2. Nghiên cứu tối ưu điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin

4.1.2.1. Sàng lọc mức ảnh hưởng của điều kiện lên men sinh tổng hợp

canthaxanthin

Nhóm nghiên cứu tiến hành tìm tâm thí nghiệm khảo sát các điều kiện lên men

sinh tổng hợp canthaxanthin bởi chủng P.carotinifaciens VTP20181. Kết quả thí

nghiệm được trình bày ở hình sau:

78

79

Hình 4.1.6. Ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin

Kết quả thu được cho thấy điều kiện thích hợp sinh tổng hợp canthaxanthin bởi

P.carotinifaciens VTP20181 là pH 7÷8; nhiệt độ từ 25300C; tỷ lệ giống từ 0.75÷1%;

tốc độ lắc từ 100300 rpm; thời gian từ 60÷72 giờ. Kết quả này phù hợp với các

nghiên cứu trước đó về P.carotinifaciens của Martín [110].

Mức độ ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp

canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181 được sàng lọc và đánh giá sơ bộ trên

ma trận Factorial Min-Run Resolution IV với 2 mức thí nghiệm thấp và cao sử dụng

tâm thí nghiệm đã khảo sát ở thí nghiệm trước đó. Kết quả khảo sát được trình bày ở

bảng sau:

Bảng 4.1.3. Ma trận Min Run Screening và mức ảnh hưởng đến hàm đáp ứng Cx và

Biomass

Cx (mg/g)

Biomass (g/l)

Tham số

F-value

p-value

Coefficient

F-value

p-value Coefficient

305.15

<0.0001

696.69

99.57

< 0.0001

9.42

Model

88.04

< 0.0001

425.48

< 0.0001

3.33

- 44.42

A - pH

18.37

0.0052

0.7150

B - Nhiệt độ

515.09

< 0.0001

110.97

8.4152

0.0432

0.8075

C - Thời gian

103.61

< 0.0001

- 49.77

11.00

0.0224

0.7231

D - Tỷ lệ giống

42.39

0.0006

30.82

12.51

0.0123

0.5900

E - Tốc độ lắc

109.24

< 0.0001

51.10

Mô hình có p-value <0.05, chứng tỏ mô hình có ý nghĩa thống kê. Các yếu tố tỷ

lệ giống, nhiệt độ và thời gian có ảnh hưởng lớn đến hàm đáp ứng Cx trong khi tất cả

các yếu tố được khảo sát đều có ảnh hưởng đến hàm đáp ứng Biomass.

80

Từ các kết quả khảo sát, 5 yếu tố pH, nhiệt độ, tốc độ lắc, tỷ lệ giống và thời

gian được sử dụng trong các thí nghiệm tối ưu hóa.

4.1.2.2. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin bằng mô hình RSM-

CCD.

Thí nghiệm tối ưu hóa các yếu tố môi trường lên men sinh tổng hợp

canthaxanthin bằng P.carotinifaciens VTP20181 sử dụng phương pháp đáp ứng bề

mặt, kế hoạch chu bản bậc hai Box-Hunter. Dựa vào các kết quả đã được khảo sát ở

phần trước, chúng tôi lựa chọn các biến công nghệ được nghiên cứu gồm pH, nhiệt độ,

tốc độ lắc, tỷ lệ giống và thời gian lên men mức thí nghiệm (-α; -1; 0; +1; + α). Trong

đó số thí nghiệm tại tâm n0 = 6 và cánh tay đòn α = 2. Kết quả được thể hiện ở bảng

sau:

Bảng 4.1.4. Giá trị biến thực và biến mã hóa trong kế hoạch thực nghiệm Box –

Hunter (CCD)

Biến Khoảng Mức khảo sát

mã biến -α -1 0 +1 +α Biến thực hóa thiên

(Δ)

A Độ pH 0.75 5.75 6.5 7.25 8 8.75

B Nhiệt độ (0C) 5 15 20 25 30 35

C Thời gian (giờ) 12 36 48 60 72 84

D Tỷ lệ giống (%) 2.5 2.5 5 7.5 10 12.5

E Tốc độ lắc 100 100 200 300 400 500 (vòng/phút)

Với α = 2.0

Hai hàm mục tiêu được nghiên cứu tối ưu bao gồm Y1 (mg/g) là hàm lượng

canthaxanthin trong sinh khối và Y2 (mg Cx/l) là hiệu suất tạo canthaxanthin. Kết quả

ma trận kế hoạch thực nghiệm xây dựng được thể hiện ở bảng sau:

81

Bảng 4.1.5. Ma trận kế hoạch thực nghiệm điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin

Biến mã hóa Y2 (mg Cx/l)

B C -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 0 0 - 2 + 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 A -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 - 2 + 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E +1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 +1 0 0 0 0 0 0 0 0 - 2 + 2 0 0 0 0 0 0 -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 0 0 0 0 - 2 + 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Y1 (mg/g) Tính toán 1.97 1.37 4.13 2.39 2.61 1.35 4.02 3.29 3.01 1.54 3.96 3.48 2.75 2.31 5.38 3.22 1.97 -0.24 0.67 3.90 4.91 5.68 5.68 6.81 6.18 5.09 8.63 8.63 8.63 8.63 8.63 8.63 Thực nghiệm 2.01 1.31 4.11 2.28 2.65 1.31 4.01 3.18 3.02 1.47 3.92 3.34 2.78 2.24 5.34 3.09 1.87 0.033 0.64 4.41 5.01 5.75 5.72 6.94 6.28 5.17 8.41 8.53 8.64 8.78 8.55 8.67 Thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Thực nghiệm 11.42 8.14 30.37 18.81 16.67 9.2 33.32 26.97 18.03 10.47 33.12 29.63 20.32 16.2 48.22 28.86 6.19 0.15 3.45 40.79 50.2 65.84 59.49 84.25 73.73 62.09 108.02 115.11 114.06 115.25 115.77 117.05 Tính toán 9.83 8.92 29.97 19.29 16.78 10.19 33.12 29.14 19.23 12.56 34.02 32.90 21.73 19.98 50.81 32.33 6.81 -5.73 1.69 37.28 49.47 61.31 60.95 77.53 69.61 60.95 114.73 114.73 114.73 114.73 114.73 114.73

D -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0 0 0 0 0 0 - 2 + 2 0 0 0 0 0 0 0 0 Kết quả phân tích phương sai ANOVA được thể hiện ở bảng sau

Bảng 4.1.6. Kết quả phân tích thống kê ANOVA đối với 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2

Hàm Y1 (mg/g) Hàm Y2 (mgCx/l) Nguồn F-value p-value F-value p-value

Mô hình 335.60 < 0.0001* 102.49 <0.0001*

A 229.51 < 0.0001* 10.36 0.0082*

82

B 489.77 < 0.0001* < 0.0001* 83.39

C 27.72 0.0003* 9.23 0.0113*

D 59.70 < 0.0001* 18.10 0.0014*

E 55.55 < 0.0001* 4.94 0.0481*

AB 3.60 0.0842NS 0.92 0.3576

AC 0.18 0.6835 NS 0.36 0.5622 NS

AD 0.094 0.7645 NS 0.095 0.7642 NS

AE 0.45 0.5167 NS 0.0062 0.9384 NS

BC 1.25 0.2880 NS 0.34 0.5723 NS

BD 0.028 0.87 NS 0.32 0.5840 NS

BE 2.03 0.1823 NS 0.50 0.4958 NS

CD 0.13 0.7236 NS 0.067 0.8010 NS

CE 0.028 0.87 NS 0.044 0.8375 NS

DE 2.11 0.1745 NS 0.27 0.6140 NS

A² 3443.86 < 0.0001* 1049.44 < 0.0001

B² 2296.70 < 0.0001* 730.04 < 0.0001

C² 635.47 < 0.0001* 283.42 < 0.0001

D² 324.98 < 0.0001* 165.56 < 0.0001

E² 510.79 < 0.0001* 196.82 < 0.0001

Lack of fit 2.74 0.1443 NS 3.58 0.0915 NS

R2 0.9984 0.9947

Adj- R2 0.9954 0.9850

Adeq 61.136 31.156 Precision

*p < 0.05: Các giá trị có ý nghĩa; NSp > 0.05: các giá trị không có ý nghĩa

Kết quả phân tích của mô hình ở bảng 4.1.4 cho thấy mô hình này là hoàn toàn

tương hợp với thực nghiệm, điều này được chứng minh với các chuẩn F (Fisher) của

mô hình có giá trị với hàm Y1 (335.6) và Y2 (102.49). Các mô này có ý nghĩa thống kê

với độ tin cậy cao với các giá trị p-value đều nhỏ hơn 0.0001.

Sự phù hợp của mô hình thực nghiệm cũng được kiểm chứng bằng hệ số xác

định R2. Giá trị R2 càng gần 1 thì giá trị thực nghiệm càng gần với giá trị dự đoán của

của 2 mô hình Y1 và

mô hình. Theo số liệu phân tích ở bảng 4.1.4, hệ số xác định R2

83

Y2 lần lượt có giá trị là 0.9984 (99.84%); và 0.9947 (99.47%), Bên cạnh đó giá trị Adj-

của mô hình Y1 và Y2 lần lượt có giá trị là 0.9954 (99.54%) và 0.9850 (98.50%).

R2

Theo Guan and Yao (2008) và Zabeti et al. (2009) thì mô hình có tính tương hợp cao

lớn hơn 0,8 cùng với đó chỉ số Adeq Precision

với thực nghiệm khi giá trị R2 và Adj-R2

lớn hơn 4 là cần thiết. Từ các kết quả thu được ta có thể khẳng định mô hình đã xây

dựng là có tính tương hợp cao với thực nghiệm.

Một cách khác, chúng tôi có thể đánh giá sự tương hợp của mô hình thông qua

các biểu đồ thực nghiệm và dự đoán (predicted and actual value plots) và các biểu đồ

phân bố ngẫu nhiên của các lần thí nghiệm (residuals versus runs models) thể hiện ở

hình 4.7.1. Mô hình có sự tương hợp cao giữa thực nghiệm và lý thuyết khi các điểm

thí nghiệm tập trung theo dạng đường chéo thẳng ở đồ thị thứ nhất và phân bố của các

điểm thí nghiệm là ngẫu nhiên trong phạm vi (-3, 3) ở đồ thị thứ 2.

Hình 4.1.7. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2

Sau khi loại bỏ các biến không có ý nghĩa (p> 0.05). Hàm mục tiêu Y1 và Y2

của mô hình cũng được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như

sau:

Y1 = 8.63 - 0.55A + 0.81B + 0.19C + 0.28D - 0.27E – 1.94A² - 1.58B² - 0.83C² -

0.6D² - 0.75E² (1)

84

Y2 = 114.73 - 3.14A + 8.90B + 2.96C + 4.14D - 2.17E - 28.55A² - 23.81B² -

14.84C² - 11.37D² - 12.36E² (2)

Sự ảnh hưởng của các yếu tố tuyến tính (A, B, C, D, E) đến giá trị hàm mục tiêu

là lớn nhất, sau đó là ảnh hưởng của các hiệu ứng tương tác chập đôi (AB, AC, AD,

BC, BD, CD) và ảnh hưởng ít nhất đến giá trị hàm mục tiêu là các yếu tố bình phương (A2, B2, C2, D2 và E2). Trong 2 phương trình hồi quy (1) và (2) đều không thể hiện sự ảnh hưởng của các hiệu ứng tương tác chập đôi.

+ Từ phương trình hồi quy (1) ta có thể thấy ngay ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng canthaxanthin). Ta thấy cả 4 yếu tố A, B, C và D đều ảnh hưởng tương tác dương (ảnh hưởng đồng biến) với hàm Y1. Trong đó mức độ ảnh

hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần B > D > C tương ứng với các hệ

số của chúng trong phương trình hồi quy (1). Ngược lại thì 2 yếu tố công nghệ A và E lại ảnh hưởng tương tác âm (ảnh hưởng nghịch biến) với hàm Y1. Mức độ ảnh hưởng của yếu tố công nghệ A lớn hơn yêu tố công nghệ E tương ứng với các hệ số của

chúng trong phương trình hồi quy (1).

+ Tương tự như vậy, phương trình hồi quy (2) cho thấy ngay ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm mục tiêu Y2 (hiệu suất tạo canthaxanthin). Ta thấy 3 yếu tố B, C và D ảnh hưởng tương tác dương (ảnh hưởng đồng biến) với hàm Y2. Trong đó mức độ ảnh

hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần B > D > C tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình hồi quy (2); Trong khi đó 2 yếu tố công nghệ A và E lại ảnh hưởng tương tác âm (ảnh hưởng nghịch biến) với hàm Y2. Mức độ ảnh hưởng của yếu tố công nghệ A lớn hơn yêu tố công nghệ E tương ứng với các hệ số của

chúng trong phương trình hồi quy (2).

Khi quy đổi sang biến thực, chúng tôi có một số nhận xét như sau: + Đánh giá hàm đáp ứng Y1, nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ giống có ảnh hưởng tích cực đến hàm lượng canthaxanthin sinh tổng hợp khi tăng tuyến tính còn độ pH và tốc độ lắc có ảnh hưởng tiêu cực đến hàm đáp ứng Y1 với mức ảnh hưởng bậc 2. Kết quả

này phù hợp với nghiên cứu trước đó về quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin bởi vi khuẩn P.carotinifaciens [111].

+ Đối với hàm đáp ứng Y2 cũng tương tự, nhiệt độ, tỷ lệ giống và thời gian có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tạo sinh khối của P.carotinifaciens VTP20181 khi tăng tuyến tính nồng độ trong môi trường, gián tiếp tăng hiệu suất sinh tổng hợp hoạt chất. Độ pH và tốc độ lắc có ảnh hưởng tiêu cực đối với hàm đáp ứng này chứng tỏ các mức thí nghiệm có giá trị pH cao gây ức chế khả năng tạo hoạt chất chức năng của vi khuẩn.

85

Ảnh hưởng của các cặp yếu tố công nghệ thể hiện ở hiệu ứng tương tác đôi đến

các hàm mục tiêu được biểu thị thông qua các bề mặt đáp ứng của hàm lượng Y1 và Y2 thể hiện ở hình 4.1.8

86

(a)

87

(b)

Hình 4.1.8. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin (a) và hiệu suất tạo

canthaxanthin (b)

Trên các bề mặt đáp ứng, vùng màu đỏ sẫm là vùng tối ưu. Tại đó, các giá trị hàm mục tiêu Y1 và Y2 nằm trong vùng giá trị lớn nhất. Điểm tối ưu (giá trị lớn nhất của 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2) sẽ được xác định dựa trên các vùng tối ưu, từ đó xác định được điều kiện tối ưu của 5 yếu tối công nghệ ảnh hưởng đến quá trình lên men

sinh khối.

Điều kiện tối ưu sinh tổng hợp canthaxanthin bởi P.carotinifaciens VTP20181

theo mô hình dự đoán được tính toán dựa trên phần mềm Design Expert 7.0.0 được thể

hiện ở bảng 4.1.7

Bảng 4.1.7. Điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin

TT Giá trị biến mã Giá trị Biến Biến mã hóa Biến thực hóa thực

-0.06 pH 7.2 1 A

0.2 Nhiệt độ 26 2 B

0.11 Thời gian 61.32 3 C

0.19 Tỷ lệ giống 7.97 4 D

-0.1 Tốc độ lắc 290 5 E

88

6 Hàm lượng mg/g 8.81 Canthaxanthin

7 Hiệu suất tạo mgCx/l 116.36 canthaxanthin

Hình 4.1.9. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của hàm mục tiêu Y1 và Y2

Hình 4.1.10. Điều kiện tối ưu quá trình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin theo mô

hình xây dựng được

Tiến hành nghiên cứu thử nghiệm lại quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin ở

quy mô 3 lít với các điều kiện tối ưu được dự đoán theo mô hình ở trên. Kết quả thực

nghiệm thu được hàm lượng canthanxanthin: 8.76 ± 0.17 (mg/g) và hiệu suất tạo

89

canthaxanthin đạt 115.88 ± 1.12 (mgCx/l). Sự khác biệt giữa kết quả thực nghiệm và

kết quả mô hình dự đoán là không đáng kể. Do đó, có thể khẳng định mô hình tính

toán tối ưu là tương hợp với thực nghiệm và có độ chính xác cao.

4.1.3. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men

- Mục đích: lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối vi sinh vật sau lên men.

- Qua quá trình khảo sát các phương pháp thu nhận sinh khối sau sinh tổng hợp

bằng các thiết bị sẵn có, chúng tôi đưa ra các thông số thu hồi sinh khối được thể hiện

ở bảng 4.1.8.

Bảng 4.1.8. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men

Thí nghiệm Điều kiện thí nghiệm Thông số đánh giá

Lựa chọn phương - Lắng, ly tâm: lắng sinh khối ở Hiệu suất thu nhận sinh

pháp thu nhận sinh 40C/24h, ly tâm 10000 rpm, thiết bị khối

khối ly tâm CEPA, Đức.

- Lọc màng: khe lọc 0,6nm, tốc độ

dịch: 180200l/h

- Ly tâm bán liên tục, tốc độ ly

tâm: 15000 rpm, tốc độ dịch:

600l/h

Lựa chọn tốc độ ly 400; 500; 600; 700 vòng/phút Hiệu suất thu nhận sinh

tâm khối

Tỷ lệ sinh khối/nước 1 /2; 1 /3; 1 /4; 1 /5; 1 /6 Hiệu suất thu nhận sinh

rửa sinh khối (m/V) khối, Bx dịch rửa

Số lần rửa 1 lần, 2 lần, 3 lần Hiệu suất thu nhận sinh

khối, Bx dịch rửa

Hiệu suất thu hồi chế Tỷ lệ nước bổ sung 1/1; 1/2; 1/3

phẩm, hàm lượng Cx, vào sinh khối trước

cảm quan chế phẩm sấy phun

1550C/800C /2l/h/20000rpm; Hiệu suất thu hồi chế Chế độ sấy

1650C/850C /2.5l/h/20000rpm; phẩm, hàm lượng Cx,

1750C/900C /2.5l/h/20000rpm; cảm quan chế phẩm

Sau khi làm thí nghiệm, thu được điều kiện tối ưu cho thu nhận sinh khối:

90

- Ly tâm bán liên tục:

➢ Tốc độ: 700 vòng/phút

➢ Số lần ly tâm: 02 lần

➢ Tỷ lệ sinh khối/dịch rửa: 1/5

- Chế độ sấy phun:

➢ Tỷ lệ sinh khối/nước: 1/2 (w/v)

➢ Nhiệt độ đầu vào/ra: 1650/850C

➢ Tốc độ đĩa quay: 20.000 vòng/phút

➢ Tốc độ tiếp liệu: 2.5 lít/h

4.1.4. Quy trình công nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ vi

khuẩn ưa mặn quy mô 80-100 lít/mẻ

Dựa trên các kết quả nghiên cứu đã có chúng tôi xây dựng hoàn thiện quy trình

công nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ chủng Paracoccus

carotinifaciens VTP 20181 quy mô 80-100 lít/mẻ sau:

91

Chủng giống

Paracoccus carotinifaciens VTP 20181

Nhân giống cấp I

(pH=7.280C, lắc 200v/ph, 48 giờ)

Nhân giống cấp II

(pH=7.280C, lắc 200v/ph, 35÷38 giờ)

Nhân giống cấp III

(TB 50 lít, pH=7.280C, sục khí 1l/ph,

Tiếp

thêm bột

khuấy150 v/ph, 28÷30 h)

NM 6g/l tại 36h;

48h

Lên men trên thiết bị 500 lít

Tiếp thêm sucrose

(pH=7.280C, khuấy 150v/ph, cấp khí 1 l/ ph, 64 giờ)

5g/l tại 24h; 36h;

48h

Thu hồi sinh khối

(Li tâm 700 v/ph, công suất 600 lít/h)

Dịch thải

Bổ sung nước: sinh

khối: H2O=1:5 (w/v)

Dịch thải

Làm sạch sinh khối (Khuấy 200 v/ph, 10 phút, li tâm 700 v/ph, rửa 2 lần)

Sấy phun

Bổ sung nước: sinh

(Nhiệt độ đầu vào/ra: 1650C/850C; tốc độ tiếp liệu

khối: H2O=1:2 (w/v)

2.5 lít/giờ, tốc độ đầu đầu quay 20000 v/ph)

Sinh khối khô giàu

Bổ sung nước: sinh khối:H2O =1:2 (w/v) canthaxanthin

Hình 4.1.11. Quy trình công nghệ sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ

Sinh khối khô giầu canthaxanthin

độ đầu đầu quay 35.000 v/ph)

Paracoccus carotinifaciens VTP 20181 quy mô 80-100 lít/mẻ

92

Thuyết minh quy trình công nghệ

1. Chủng giống: Paracoccus carotinifaciens VTP 20181

- Chủng vi khuẩn Paracoccus carotinifaciens VTP 20181 được phân lập từ đất

cánh đồng muối khu vực Diêm Điền, Thái Bình. Chủng được nuôi trên môi trường

Marine Agar 2216.

- Điều kiện bảo quản: Bảo quản trong ống thạch nghiêng dưới lớp parafin vô

trùng, bảo quản ở 40C. Định kỳ 6 tháng kiểm tra, hoạt hóa và bảo quản lại một lần.

Bảo quản trong dung dịch glycerol 10% ở -800C. Định kỳ 12 tháng kiểm tra, hoạt hóa

và bảo quản lại một lần.

2. Nhân giống các cấp

- Điều kiện nhân tăng sinh: lấy 1 vòng que cấy giống từ ống thạch nghiêng cấy

vào môi trường tăng sinh Marine broth 2216.5ml môi trường/ống nghiệm, nhiệt độ

nuôi cấy ở 280C lắc 200 v/ph, 48 giờ. Sau khi tăng sinh, xác định mật độ giống bằng

phương pháp đo quang, giá trị OD(600nm) = 2.53 (tương đương mật độ giống đạt

khoảng (2.53)x108 CFU/ml).

- Nhân giống cấp I: Môi trường nhân giống YTN, nhân giống trên bình tam giác

100 ml, thể tích dịch nhân giống 25 ml, tỷ lệ tiếp giống hoạt hóa 10%, nuôi ở 280C, lắc

200 vòng/phút, thời gian nhân giống 48 giờ. Kết thúc nhân giống cấp I, xác định mật

độ giống bằng phương pháp đo quang, giá trị OD(600nm) = 2.53 (tương đương mật độ

giống đạt khoảng (2.53)x108 CFU/ml)

- Nhân giống cấp II: Môi trường nhân giống YTN, nhân giống trên bình tam

giác 1000 ml, thể tích dịch nhân giống 250 ml, tỷ lệ tiếp giống cấp I 10%, nuôi ở 280C,

lắc 200 vòng/phút, thời gian nhân giống 38÷40 giờ. Kết thúc nhân giống cấp II, xác

định mật độ giống bằng phương pháp đo quang, giá trị OD(600nm)= 2.53 (tương đương

mật độ giống đạt khoảng (2.53) x 108 CFU/ml).

- Nhân giống cấp III: Môi trường nhân giống YTN, nhân giống trên thiết bị lên

men FM-50 Fermentation tank B.E.Marubishi, thể tích dịch nhân giống 10 lít. Dịch

nhân giống được điều chỉnh pH trước khi bổ sung muối, dầu phá bọt (được hấp riêng)

bổ sung sau khi dịch nhân giống đã thanh trùng. Tỷ lệ tiếp giống cấp II 10%, nuôi ở

280C, khuấy 150 vòng/phút, sục khí 1 lít không khí/lít môi trường/phút, thời gian nhân

giống 2830 giờ. Kết thúc nhân giống cấp III, xác định mật độ giống bằng phương

93

pháp đo quang, giá trị OD(600nm) = 2.53 (tương đương mật độ giống đạt khoảng

(2.53)x108 CFU/ml).

3. Lên men

- Lên men trên thiết bị FM-500 Fermentation tank B.E.Marubishi, thể tích dịch

lên men 100 lít

- Môi trường lên men YTN, dịch lên men được điều chỉnh pH trước khi bổ sung

muối, biotin (lọc qua màng lọc) và dầu phá bọt (được hấp riêng) bổ sung sau khi dịch

lên men đã thanh trùng

- Điều kiện lên men: Tỷ lệ giống cấp III là 10%, khuấy 150 vòng/phút, sục khí 1

lít không khí/lít môi trường/phút. Cố định pH = 7,2 trong suốt quá trình lên men bằng

NaOH 20% và HCl 6N, thời gian 64 giờ. Dầu phá bọt, biotin được hấp riêng và tiếp

vào thiết bị lên men sau khi đã thanh trùng dịch lên men

- Tiếp thêm môi trường:

+ Tiếp thêm sucrose: Nồng độ 5 g/lít dịch lên men tại 24; 36; 48 giờ lên men

+ Tiếp thêm bột nấm men: Nồng độ 6 g/lít dịch lên men tại 36; 48 giờ lên men

4. Thu hồi sinh khối ướt

Kết thúc lên men, lắp đường ống dẫn dịch lên men kết nối trực tiếp với máy ly

tâm CEPA Z61. Tiến hành ly tâm 100 lít dịch sau lên men với vận tốc 700 v/ph, công

suất 10 lít/ph. Thu sinh khối trữ trong thùng đựng sản phẩm. Hàm lượng sinh khối ướt

≥ 3.1 kg/mẻ, hàm ẩm khoảng 80%, hàm lượng canthaxanthin trong sinh khối ướt ≥ 2

mg/g.

5. Làm sạch sinh khối

Sinh khối thu được bổ sung nước theo tỷ lệ: sinh khối:H2O =1:5 (w/v), khuấy

200 v/ph, 10 phút, li tâm 700 v/ph, rửa 2 lần. Thu sinh khối sạch. Tỷ lệ hao hụt khi rửa

khoảng 10%.

6. Sấy phun

Bổ sung nước vào sinh khối ướt theo tỷ lệ: sinh khối ướt/nước = 1:2 (w/v), sấy

phun nhiệt độ đầu vào/ra là 1650C/850C; tốc độ tiếp liệu là 2.5 lít/giờ, tốc độ đầu đầu

quay 20000 vòng/phút. Hiệu suất thu hồi 95% (≥0,6 kg skk/mẻ lên men, độ ẩm 3÷5%).

7. Sinh khối khô vi khuẩn giàu canthaxanthin

Sinh khối khô giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens

VTP 20181 thu được sau sấy phun, đạt các chỉ tiêu an toàn về hóa lý, vi sinh. Không

94

phát hiện có Coliforms, E.coli, Salmonella, tổng số bào tử NM-NM, hàm lượng các

kim loại nặng như chì, cadimi, thủy ngân, asen nằm trong giới hạn cho phép. Hàm

lượng canthaxanthin ≥ 10 mg/g skk, sinh khối khô được đóng trong túi thiếc, bảo quản

ở nhiệt độ phòng.

4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất chiết

xuất

Sau khi thu hồi được sinh khối khô giàu canthaxanthin, tiến hành quá trình chiết

và làm sạch để thu hồi canthaxanthin, các thông số ảnh hưởng đến quá trình chiết được khảo sát và tối ưu hóa được bao gồm:

- Nhiệt độ chiết.

- Tỷ lệ: dung môi/nguyên liệu.

- Thời gian chiết.

- Công suất siêu âm

4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết

Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới hai hàm mục tiêu là Hàm lượng canthaxanthin

và hàm lượng carotenoid tổng được thể hiện ở hình 4.2.1.

Hình 4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới quá trình chiết

Dựa vào kết quả ở hình 4.2.1 ta thấy nhiệt độ ảnh hưởng khá nhiều tới khả năng

chiết xuất canthaxanthin cũng như hàm lượng carotenoid tổng. Ở nhiệt độ chiết xuất là

300C, hàm lượng carotenoid tổng thu được là 17.6(mg/g) và hàm lượng canthaxanthin

thu được là 14.2(mg/g). Khi nhiệt độ chiết xuất tăng từ 30÷350C thì hiệu suất tăng

nhanh và đạt cực đại ở 350C với hàm lượng carotenoid tổng thu được là 18.1(mg/g) và

95

hàm lượng canthaxanthin thu được là 14.9 (mg/g). Khi ta tiếp tục tăng nhiệt độ lên

400C và 500C thì hàm lượng carotenoid tổng và hàm lượng canthaxanthin đều có xu

hướng giảm dần đạt giá trị thấp nhất lần lượt là 15.7 (mg/g) và 12.5 (mg/g) tại nhiệt độ

chiết 500C. Có thể thấy rằng nhiệt độ chiết từ 400C trở lên có thể làm phân hủy hoặc

oxy hóa các hợp chất carotenoid nên làm giảm hàm lượng của carotenoid trong quá

trình chiết. Do đó, để đảm bảo cho quá trình chiết xuất canthaxanthin và carotenoid

tổng đạt hiệu quả cao nhất chúng tôi lựa chọn nhiệt độ chiết xuất ở mức cơ bản là là

350C để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Mức thấp (-1) và mức cao (+1) lần lượt là

300C và 400C.

4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới quá trình chiết

Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới hai hàm mục tiêu là hàm

lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng được thể hiện ở hình 4.2.2.

Hình 4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới quá trình chiết

Từ kết quả chỉ ra ở hình 4.2.2 ta thấy rằng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cũng ảnh

hưởng nhiều tới khả năng chiết xuất canthaxanthin và carotenoid tổng. Trong quá trình

thí nghiệm ta thấy ở tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là thấp (5/1; v/w) thì hiệu quả quá

trình chiết xuất còn thấp, hàm lượng canthaxanthin đạt 10.2 (mg/g) và hàm lượng

carotenoid tổng đạt 14.7 (mg/g). Khi tăng tỷ lệ chiết lên (7/1; v/w) và (9/1, v/w) thì

hiệu suất thu hồi canthaxanthin và carotenoid tổng cũng tăng lên và đạt lớn nhất tại tỷ

lệ (9/1; v/w). Tại tỷ lệ (9/1; v/w), hàm lượng camthaxanthin đạt 15.1 (mg/g) và hàm

lượng carotenoid tổng đạt 18.2 (mg/g). Tiếp tục tăng tỷ lệ chiết lên (11/1; v/w) và

(13/1; v/w) thì hàm lượng thu hồi canthaxanthin và carotenoid tổng gần như không

96

thay đổi. Điều này có thể giải thích là ở tỷ lệ dung môi thấp, nồng độ cao chiết trong

dung môi nhanh đạt đến trạng thái bão hòa hơn vì vậy cản trở quá trình trích ly các

hợp chất trong nguyên liệu, do đó hiệu suất chiết sẽ thấp hơn ở các tỷ lệ cao hơn. Do

đó, chúng tôi chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 9/1 làm mức cơ bản để tiến hành các

thí nghiệm tổng hợp tiếp theo. Mức thấp (-1) và mức cao (+1) lần lượt là 7/1 và 11/1

(v/w).

4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết

Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ thời gian chiết tới hai hàm mục tiêu là hàm lượng

canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng được thể hiện ở hình 4.2.3.

Hình 4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết

Dựa vào kết quả ở hình 4.2.3 ta thấy thời gian chiết xuất cũng ảnh hưởng nhiều

tới khả năng chiết xuất canthaxanthin và carotenoid tổng. Khi tăng dần thời gian chiết

từ 30 phút đến 90 phút thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng tăng tuyến tính

lần lượt từ 6.415.0 (mg/g) và 9.318.2 (mg/g). Khi tăng tiếp thời gian chiết xuất lên

120 phút và tiếp đến là 150 phút thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng thay

đổi không đáng kể. Điều này có thể giải thích là khi thời gian chiết còn thấp, thời gian

thẩm thấu và khuếch tán vật chất là ngắn nên chưa thể vận chuyển hết vật chất từ

nguyên liệu ra môi trường. Khi tăng thời gian đủ dài thì lượng vật chất sẽ được vận

chuyển tối đa ra môi trường. Thời gian chiết quá dài cùng không làm tăng thêm hàm

lượng vật chất được chiết ra. Do đó, để đảm bảo về hiệu quả chiết xuất cũng như tối

ưu về mặt năng lượng và thời gian của quá trình, chúng tôi lựa chọn thời gian chiết

97

xuất là 90 phút làm mức cơ bản cho thí nghiệm tiếp theo. Mức thấp (-1) và mức cao

(+1) lần lượt là 60 phút và 120 phút.

4.2.4. Ảnh hưởng của công suất siêu âm tới quá trình chiết

Kết quả ảnh hưởng của công suất siêu âm tới hai hàm mục tiêu là hàm lượng

canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng được thể hiện ở hình 4.2.4.

Hình 4.2.4. Ảnh hưởng của công suất siêu âm tới quá trình chiết

Dựa vào kết quả ở hình 4.2.4 có thể thấy công suất siêu âm là một trong 4 yếu

tố công nghệ ảnh hưởng chính tới quá trình chiết xuất. Khi công suất siêu âm tăng từ

100÷140 (W) thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng tăng mạnh tương ứng

lần lượt từ 12.3÷15.2 (mg /g) và 14.5÷18.3 (mg/g). Tiếp tục tăng công suất siêu âm lên

160 (W) thì hàm lượng canthaxanthin và carotenoid tổng bắt đầu có xu hướng giảm

nhẹ tương ứng còn 15.1 (mg/g) và 18.1 (mg/g). Công suất tăng lên 180 (W) thì cả hàm

lượng canthaxanthin và carotenoid tổng giảm nhanh hơn xuống còn 14.8 (mg/g) và

17.7 (mg/g). Điều này chứng tỏ công suất vi sóng ảnh hưởng cả tích cực lẫn tiêu cực

đến quá trình chiết xuất. Cơ chế này được giải thích là sóng siêu âm đóng vai trò như

tác nhân phá bỏ các lớp màng tế bào của vật liệu chiết thông qua việc tạo thành các

bong bóng khí nhỏ và liên lục bị vỡ tạo ra lực cắt cực lớn, điều này giúp quá trình

khuếch tán vật chất từ vật liệu ra dung môi dễ dàng hơn. Tuy nhiên khi công suất siêu

âm vượt ngưỡng lên mức quá cao thì quá trình trích ly lại bị cản trở do số bong bóng

khí hình thành quá nhiều, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi bị giảm đi làm

hiệu suất chiết giảm đi. Do đó, cần chọn mức công suất siêu âm phù hợp cho quá trình

98

này. Từ kết quả khảo sát, công suất siêu âm ở các mức cơ bản là 140 (W), mức thấp (-

1) và mức cao (+1) được chọn lần lượt là 120 (W) và 160 (W).

4.2.5. Kết quả quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa các thông số công nghệ quá

trình chiết xuất

Dựa vào các kết quả khảo sát đơn biến các thông số công nghệ của quá trình

chiết xuất sinh khối thu canthaxanthin và carotenoid tổng, chúng tôi lựa chọn mức thí

nghiệm cơ bản (mức 0), mức cao (+1) và mức thấp (-1) của các biến công nghệ và xây

dựng bảng mã hóa các yếu tố công nghệ như sau:

Bảng 4.2.1. Biến mã hóa và các mức thí nghiệm

Biến thực Biến Khoảng biến Mức nghiên cứu

mã thiên (Δ) -1 0 1

A 5 30 35 40 Z1: Nhiệt độ chiết (0C)

B 2 7 9 11 Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

(v/w)

C 30 60 90 120 Z3: Thời gian chiết (phút)

D 20 120 140 160 Z4: Công suất siêu âm (W)

Bảng 4.2.2. Bảng kết quả ma trận kế hoạch thực nghiệm

TT Biến mã hóa Hàm mục tiêu

A B C D Y1 (mg/g) Y2 (mg/g)

-1 1 -1 0 0 11,08 12,86

+1 2 -1 0 0 11,39 14,33

-1 3 +1 0 0 12,73 15,79

+1 4 +1 0 0 12,60 14,86

0 5 0 -1 -1 12,35 15,02

0 6 0 +1 -1 9,68 11,61

0 7 0 -1 +1 12,17 14,87

0 8 0 +1 +1 12,45 15,27

-1 9 0 0 -1 12,06 14,40

+1 10 0 0 -1 12,01 14,43

-1 11 0 0 +1 13,21 15,60

99

12 +1 0 0 +1 13,26 16,20

13 0 -1 -1 0 11,72 14,69

14 0 +1 -1 0 11,58 15,30

15 0 -1 +1 0 8,87 9,67

16 0 +1 +1 0 11,81 14,01

17 -1 0 -1 0 11,22 13,58

18 +1 0 -1 0 12,74 15,41

19 -1 0 +1 0 12,55 15,18

20 +1 0 +1 0 11,31 13,69

21 0 -1 0 -1 11,93 14,44

22 0 +1 0 -1 10,51 12,72

23 0 -1 0 +1 10,17 12,31

24 0 +1 0 +1 13,26 16,05

25 0 0 0 0 14,39 17,42

26 0 0 0 0 15,21 18,41

27 0 0 0 0 15,20 18,40

4.2.6. Kiểm tra sự tương hợp của mô hình

Sự tương hợp giữa thực nghiệm và lý thuyết của mô hình và tìm các hệ số có ý

nghĩa được xác định thông qua việc phân tích hồi quy (ANOVA) của các hàm Y1 (hàm

lượng canthaxanthin) và hàm Y2 (hàm lượng carotenoid tổng) được thể hiện ở bảng

4.2.3.

Bảng 4.2.3. Bảng phân tích hồi quy các hàm mục tiêu Y1 và Y2

Nguồn Y1 (mg/g) Y2 (mg/g)

F - Value P - Value F - Value P - Value

Model 22.07 < 0.0001* 17.84 < 0.0001*

A 0.096 0.7620NS 0.034 0.8560NS

B 25.74 0.0003* 22.96 0.0004*

C 12.51 0.0041* 12.47 0.0041*

D 17.12 0.0014* 15.37 0.0020*

AB 0.28 0.6050NS 0.63 0.4450NS

100

AC 10.86 0.0064* 8.6 0.0126*

AD 0.013 0.9113 NS 0.09 0.7694 NS

BC 13.59 0.0031* 8.09 0.0148*

BD 29.21 0.0002* 23.12 0.0004*

CD 12.49 0.0041* 10.15 0.0078*

A2 29.17 22.22 0.0005* 0.0002*

B2 127.2 98.30 < 0.0001* < 0.0001*

C2 115.01 92.81 < 0.0001* < 0.0001*

D2 56.73 46.41 < 0.0001* < 0.0001*

R2 0.9626 0.9542

Adj-R2 0.9190 0.9007

Adeq-Precision 18.589 16.489

*p < 0.05: Các giá trị có ý nghĩa; NSp > 0.05: các giá trị không có ý nghĩa

Kết quả phân tích của mô hình ở bảng 4.2.3 cho thấy mô hình này là hoàn toàn

tương hợp với thực nghiệm (hay mô hình là hội tụ) điều này được chứng minh với các

chuẩn F (Fisher) của mô hình có giá trị với hàm Y1 (22.07), Y2 (17.84). Các mô này có

ý nghĩa thống kê với độ tin cậy cao với các P đều có giá trị (< 0.0001).

Sự phù hợp của mô hình thực nghiệm cũng được kiểm chứng bằng hệ số xác

định R2. Giá trị R2 càng gần 1 thì giá trị thực nghiệm càng gần với giá trị dự đoán của

mô hình. Theo số liệu phân tích ở bảng 4.2.3 hệ số xác định của 2 mô hình Y1 và Y2

lần lượt có giá trị là 0.9626 (96.26%) và 0.9542 (95.42%), bên cạnh đó giá trị hệ số

xác định hiệu chỉnh Adj-R2 của Y1 và Y2 lần lượt có giá trị là 0.9190 (91.90%) và

0.9007 (90.07%) và giá trị Adeq Precision lần lượt là 18.589 và 16.489. Điều này cho

thấy giá trị của hàm mục tiêu phụ thuộc vào các biến ảnh hưởng là rất lớn, mô hình

thiết lập là tương hợp với thực nghiệm.

Chúng ta cũng có thể đánh giá sự hội tụ của mô hình thông qua các biểu đồ

thực nghiệm và dự đoán (predicted and actual value plots) và các biểu đồ phân bố

ngẫu nhiên của các lần thí nghiệm (residuals versus runs models) thể hiện ở hình 4.2.5

và hình 4.2.6. Mô hình có sự tương quan tốt giữa thực nghiệm và lý thuyết khi các

điểm thí nghiệm tập trung theo dạng đường chéo thẳng ở mô tả (A) và phân bố của các

điểm thí nghiệm là ngẫu nhiên trong phạm vi (-3, 3) ở mô tả (B).

101

Dự đoán so với thực tế

Phần dư và phần hoạt động

30.25

ư d

26.50

n á o đ ự D

n ầ h P

22.75

34.00

19.00

-3.00

19.60

30.13

23.11

1

25

29

13

5

33.64

26.62 Thực tế

17 21 9 Phần hoạt động

3.00 1.50 0.00 -1.50

Hình 4.2.5. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của hàm Y1

Dự đoán so với thực tế

Phần dư và phần hoạt động

3.00

1.50

ư d

0.00

n á o đ ự D

n ầ h P

-1.50

18.00

-3.00

12.00

12.70

29.75

35.44

18.39

29

1

13

25

5

24.07 Thực tế

17 21 9 Phần hoạt động

36.00 30.00 24.00

Hình 4.2.6. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của hàm Y2

Sau khi loại bỏ các biến không có ý nghĩa (p > 0.05) Hàm mục tiêu Y1, Y2 của

mô hình cũng được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:

Y1 = 14.94 + 0.61B – 0,43C + 0.5D – 0.69AC + 0.77BC + 1.13BD + 0.74CD –

0.98A2 – 2.04B2 – 1.94C2 – 1.36D2 (1)

Y2 = 18.07 + 0.79B – 0.58C + 0.64D – 0.83AC + 0.81BC + 1.36BD + 0.9CD –

1.16A2 – 2.44B2 – 2.37C2 – 1.67D2 (2)

Sự ảnh hưởng của các yếu tố tuyến tính (A, B, C, D) đến giá trị hàm mục tiêu là lớn nhất, sau đó là ảnh hưởng của các yếu tố chập (AB, AC, AD, BC, BD, CD) và ảnh hưởng ít nhất đến giá trị hàm mục tiêu là các yếu tố bình phương (A2, B2, C2, D2).

Từ phương trình hồi quy (1) và (2) ta có thể thấy ngay ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng canthaxanthin) và Y2 (hàm lượng carotenoid tổng), có các nhận xét sau”

- Ta thấy chỉ có 3 yếu tố B, C và D ảnh hưởng chính đến hàm Y1 và Y2. Yếu tố

A thể hiện mức độ ảnh hưởng yếu hơn thông qua các tương tác chập và tương tác bình phương (AC, A2).

102

- Trong đó mức độ ảnh hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần

B>D>C. Hai yếu tố B và D thì ảnh hưởng đồng biến (tương tác dương) với Y1 và Y2 còn yếu tố C ảnh hưởng nghịch biến (tương tác âm) với Y1 và Y2 tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình hồi quy (1).

Ảnh hưởng của các tương tác cặp yếu tố công nghệ đến các hàm mục tiêu được biểu thị thông qua các bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng

carotenoid tổng biểu diễn 3D ở hình 4.2.7.

(a)

103

(b)

Hình 4.2.7. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin (a) và hàm lượng

carotenoid tổng (b)

Trên các bề mặt đáp ứng, vùng màu đỏ sẫm là vùng tối ưu. Tại đó, các giá trị

hàm mục tiêu Y1, Y2 nằm trong vùng giá trị lớn nhất. Từ các bề mặt đáp ứng ở hình

4.2.7 có thể đưa ra nhận xét như sau:

Với các bề mặt đáp ứng biểu diễn hàm Y1, và Y2: 3 cặp yếu tố tương tác đôi

(BC, BD, CD) ảnh hưởng lớn hơn 3 cặp yếu tố còn lại (AB, AC, AD). Trong 3 cặp yếu

tố (BC, BD, CD) thì thứ tự ảnh hưởng mạnh đến hàm Y1 được sắp xếp lần lượt BD >

BC > CD. Điều này hoàn phù hợp với kết quả thể hiện ở phương trình hồi quy (1) và

(2).

104

4.2.7. Tối ưu hóa quá trình chiết xuất

Quá trình chiết xuất sinh khối cần được tối ưu sao cho cả 2 hàm mục tiêu Y1

(hàm lượng canthaxanthin) và Y2 (hàm lượng carotenoid tổng) đều đạt giá trị lớn nhất.

Để thực hiện điều này, tiến hành giải bài toán tối ưu bằng phần mềm Design

expert 11.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5).

Với các mục tiêu đặt ra là hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng cáo

nhất, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau:

+ Hàm lượng canthaxanthin Y1 (mức 4)

+ Hàm lượng carotenoid tổng Y2 (mức 3)

Kết quả tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0 cho ta 1 giải pháp tương ứng

với 1 bộ số liệu công nghệ. Bộ thông số công nghệ tối ưu được trình bày ở bảng 4.2.4

Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.2.4, giá trị dự đoán của các hàm mục

tiêu lần lượt là Y1= 15.07 (mg/g) và Y2=18.26 (mg/g).

Mức độ đáp ứng theo hàm nguyện vọng được thể hiện ở hình 4.2.8. Theo đó

với giải pháp này thì đạt được yêu cầu sau:

- Đối với 4 yếu tố ảnh hưởng đều đạt 100% nguyện vọng

- Mục tiêu về hàm canthaxanthin đạt 97.81% nguyện vọng

- Mục tiêu về hàm lượng carotenoid tổng đạt 98.13% nguyện vọng

- Nguyện vọng tổng thể đạt 97.94%.

Bảng 4.2.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ

Biến mã hóa Biến thực

A B C D Nhiệt độ Tỷ lệ dung Thời gian Công suất

chiết siêu môi/nguyên chiết chiết siêu

âm (0C) liệu (v/w) (phút) âm (W)

0.01 0.23 -0.02 0.27 35 9.5 90 145

105

Kết hợp

Hình 4.2.8. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất

Hình 4.2.9. Điều kiện tối ưu các biến công nghệ và kết quả tối ưu hóa hàm mục tiêu Y1

và Y2

Kết quả trên được thực nghiệm lại với quá trình chiết canthaxanthin với quy mô

phòng thí nghiệm được trình bày ở hình sau:

106

Hình 4.2.10. Thực nghiệm chiết canthaxanthin ứng dụng điều kiện tối ưu hóa trong

phòng thí nghiệm

Kết quả thực nghiệm thu được hàm lượng canthanxanthin: 14.9 ± 0.12 (mg/g)

và hàm lượng tổng carotenoid: 18.1 ± 0.17 (mg/g) sau quá trình chiết siêu âm đạt xấp

xỉ kết quả dự đoán của mô hình. Sự khác biệt giữa điều kiện thực nghiệm và mô hình

có thể do sự không ổn định của các điều kiện chiết xuất.

4.2.8. Kết quả chiết xuất, phân lập canthaxanthin

Kết quả từ 100g bột sinh khối khô ban đầu, trải qua các công đoạn chiết xuất và

phân lập đã thu được 125mg canthaxanthin tinh sạch. Các dữ kiện hoá lý cho phép

khẳng định hợp chất phân lập được chính là canthaxanthin có độ tinh sạch tới 98.5%.

Hình 4.2.11. Công thức hóa học của hợp chất canthaxanthin

Hợp chất này có các thông số hóa lí sau:

+ Phổ khối ESI-MS: m/z = 565 [M+H]+

+ Công thức phân tử: C40H52O2

+ Trạng thái: chất rắn màu đỏ

+ Điểm nóng chảy: 2112130C

+ Hấp thụ cực đại ở bước sóng λmax=470 nm

107

+ Khả năng hoà tan: Không tan trong nước, tan tốt trong acetone, chloroform.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: được xác định trên máy cộng hưởng từ hạt nhân

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.86 (2H, m, H-2,2’), 2.51 (2H, m, H-3,3’), 6.25 (2H,

Brucker 500 MHz tại viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

m, H-7,7’), 6.36 (2H, d, H-8,8’), 6.27 (2H, m, H-10,10’), 6.68 (2H, m, H-11,11’), 6.40 (2H, d,

H-12,12’), 6.29 (2H, m, H-14,14’), 6.65 (2H, m, H-15,15’), 1.20 (6H, s, H-16,16’), 1.20 (6H,

s, H-17,17’), 1.88 (6H, s, H-18,18’), 2.00 (6H, s, H-19,19’), 2.18 (6H, s, H-20,20’)

13C NMR: δ 198.7 (C=O), 160.9 (C-6,6’), 141.1 (C-8,8’), 139.3 (C-12,12’), 136.6 (C-

13,13’), 134.8 (C-9,9’), 134.3 (C-10,10’), 133.6 (C-14,14’), 130.5 (C-15,15’), 129.9 (C-5,5’),

124.7 (C-11,11’), 124.2 (C-7,7’), 160.9 (C-6,6’), 37.7 (C-2,2’), 35.7 (C-1,1’), 34.3 (C-3,3’),

27.7 (C-16,16’), 27.7 (C-17,17’), 13.7 (C-18,18’), 12.7 (C-20,20’), 12.5 (C-19,19’).

Hình 4.2.12. Sắc ký đồ hợp chất canthaxanthin sạch

Hình 4.2.14. Sắc ký lớp mỏng Hình 4.2.13. Canthaxanthin sạch

canthaxanthin

Dựa vào sắc ký đồ HPLC ta có thể thấy, với điều kiện chạy máy (như ở mục

phương pháp nghiên cứu) thì canthaxanthin xuất hiện ở thời gian lưu là Rt =12.27

phút. Dựa vào diện tích peak đã xác định được độ tinh sạch của sản phẩm đạt 98.5%.

4.3. Tổng hợp và ứng dụng liposome

4.3.1. Quá trình tổng hợp và các đặc điểm của liposome chứa canthaxanthin và α-

tocopherol

108

Liposome được tạo ra bằng phương pháp hydrat hóa màng mỏng đã được thiết

lập sau đó là ép đùn. Các đặc tính hóa lý của mẫu liposome đối chứng, liposome chứa

canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol và hệ thống liposome chứa đồng thời

canthaxanthin và α-tocopherol đã được nghiên cứu. Như thể hiện trong hình 4.3.1,

kích thước trung bình của liposome đối chứng là 105.53 ± 9.02 (trung bình ± SD; n =

3) trong khi kích thước trung bình của liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa

α-tocopherol là 97.33 ± 4.64 và 103.80 ± 6.95 (trung bình ± SD; n = 3), tương ứng.

Trong trường hợp liposome chứa đồng thời canthaxanthin và α-tocopherol, kích thước

trung bình của liposome có nồng độ canthaxanthin IC = 0.1%, IC = 0.5% và IC = 1%

là 109.70 ± 6.36; 105.10 ± 8.41 và 109.20 ± 5.66 (trung bình ± SD; n = 3). Chỉ số

polydispersity (PDI), một chỉ số về tính đồng nhất phân tán, của tất cả các liposome có

công thức dao động từ 0 đến 0.2, cho thấy rằng các thành phần hoạt tính được phân tán

đồng nhất trên các liposome. Giá trị PDI của liposome chứa α-tocopherol thấp nhất là

0.150 ± 0.044 (trung bình ± SD; n=3). Tất cả các liposome khác có giá trị PDI cao hơn

nhưng vẫn thấp hơn 0.2. Không có sự khác biệt đáng kể về kích thước trung bình và

)

m m

(

h n ì b

g n u r t c ớ ư h t

h c í K

Liposome lecithin

Liposome canthaxanthin

Liposome α-tocopherol

Kích thước trung bình

Liposome canthaxanthin α-tocopherol IC=1%

Liposome canthaxanthin α-tocopherol IC=0.1%

Liposome canthaxanthin α-tocopherol IC=0.5%

Chỉ số đồng nhất phân tán

PDI giữa liposome đối chứng và canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol.

Hình 4.3.1. Kích thước trung bình và giá trị PDI của liposome đối chứng, liposome

chứa canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng canthaxanthin

và α-tocopherol ở các tỉ lệ IC = 0,1%; IC = 0,5% và IC = 1%.

109

Hiệu suất quá trình đóng gói (EE%) và khối lượng tải thuốc (DL%) của

liposome chứa canthaxanthin lần lượt là 59.6 ± 2.3% (trung bình ± SD; n = 3) và 2.39

± 0.23% (trung bình ± SD; n = 3) (Bảng 4.3.1). Hiệu quả bao bọc của liposome chứa

canthaxanthin và α-tocopherol giảm khi tăng nồng độ canthaxanthin trong lecithin

liposome. Giá trị EE% của liposome chứa canthaxanthin tại IC = 0.1%, IC = 0.5% và

IC = 1% lần lượt là 85.3 ± 2.1; 72.9 ± 1.8 và 55.3 ± 2.6.

Bảng 4.3.1. Giá trị EE và DL của liposome đối chứng, liposome chứa canthaxanthin,

liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng thời canthaxanthin và α-tocopherol

liposome với các tỉ lệ IC = 0.1%; IC = 0.5% và IC = 1%. Các số là kết quả của các

phép đo ba lần và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.

Liposome EE (%) DL (%)

Liposome đối chứng - -

Liposomes chứa canthaxanthin 59.6 ± 2.3 2.39 ± 0.23

Liposome chứa α-tocopherol - -

Liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol IC = 0.1% 85.3 ± 2.1 1.87 ± 0.35

Liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol IC = 0.5% 72.9 ± 1.8 2.09 ± 0.13

Liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol IC = 1% 55.3 ± 2.6 2.23 ± 0.21

Vai trò của lớp lipid trong việc bảo vệ các vật liệu bên trong của liposome được

nhấn mạnh bởi thực tế là các thành phần hoạt tính như carotenoid dễ dàng phân hủy

trong môi trường vi mô có tính axit và do ảnh hưởng của các enzym. Quá trình giải

phóng invitro của canthaxanthin từ liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa

canthaxanthin và α-tocopherol với IC=0.1%; IC=0.5% và IC=1% trong PBS ở pH 7.4

được thể hiện trong hình 4.3.2. Trong vòng 4 giờ đầu tiên, sự giải phóng canthaxanthin

từ các liposome mà không có α-tocopherol dường như nhanh hơn các liposome khác.

Ngược lại, liposome chứa canthaxanthin ở IC=0.1% cho thấy tốc độ giải phóng chậm

hơn, bền vững, đạt 0.46 sau 4 giờ. Ngoài ra, việc tăng nồng độ canthaxanthin được nạp

vào dường như làm giải phóng canthaxanthin nhanh hơn trong vòng 1 giờ đầu tiên.

Sau 4 giờ ủ, khoảng 68% canthaxanthin được giải phóng khỏi liposome chứa 1%

canthaxanthin. Những dữ liệu này cho thấy rằng canthaxanthin có thể được bao bọc tốt

trong liposome và được giải phóng trong một thời gian dài.

110

g n ó h p i ả i g

ộ đ

c ố T

Thời gian (h) Liposome canthaxanthin

Liposome canthaxanthin và α- tocopherol IC=1%

Liposome canthaxanthin và α- tocopherol IC=0.5%

Liposome canthaxanthin và α- tocopherol IC=0.1%

Hình 4.3.2. Thí nghiệm invitro giải phóng canthaxanthin từ liposome chứa

canthaxanthin, liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol tại IC = 0.1%; IC =

0.5% và IC = 1% trong PBS ở pH 7.4

111

4.3.2. Quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol

Canthaxanthin +

α-tocopherol (1/9; w/w)

Khuấy trộn đồng nhất

Hỗn hợp A

1. Bổ sung 2 ml CH2Cl2

3. Khuấy trộn đồng nhất

2. Bổ sung lecithin

Hỗn hợp B

Cô quay đuổi dung môi

Hỗn hợp C

1. Bổ sung 4 ml nước cất

2. Bóc màng

Liposome thô

1. Đùn ép 50 lần qua màng

kích thước lỗ 100 nm

2. Để lạnh 40C, 12 giờ

Liposome thành phẩm

Hình 4.3.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol

Thuyết minh quy trình

Canthaxanthin và α-tocopherol được đưa lên liposomes bằng phương pháp bay

hơi màng mỏng như đã mô tả trước đây. Một cách ngắn gọn, hỗn hợp canthaxanthin và

112

α-tocopherol có tỷ lệ khối lượng cố định 1:9 (hỗn hợp A) được hòa tan trong 2 ml

diclometan cùng với lecithin đậu nành. Các nồng độ ban đầu

(IC=mcanthaxanthin/mlipid, % wt / wt) của canthaxanthin được chọn lần lượt là 0.1%,

0.5% và 1.0%. Sau khi hòa tan, màng mỏng thu được bằng cách loại bỏ dung môi hữu cơ trong nồi cách thủy ở 300C dưới áp suất bình 250 mbar và tốc độ quay cấp 2. Nước

cất (4ml) được thêm vào để bóc màng, tạo thành liposome có chứa canthaxanthin. Để

có được kích thước cố định, liposome được đưa qua màng polycác bonate 100 nm

trong máy đùn mini 50 lần. Mẫu liposome thành phẩm cuối cùng được đựng trong eppendorf và giữ trong tủ lạnh 12 giờ ở 40C trong bóng tối. Tất cả các mẫu khác

(liposome, liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol) được chuẩn

bị với cùng một quy trình và tỷ lệ nguyên liệu tương ứng.

4.3.3. Sự tăng trưởng của cá với chế độ ăn có bổ sung chế phẩm canthaxanthin

Việc nuôi cá hồi vân được thực hiện vào mùa đông để đảm bảo các điều kiện

sinh trưởng và nhiệt độ nước thích hợp. Oxy hòa tan trong thí nghiệm được kiểm soát

và dao động từ 7.1 đến 10.9 mg/l, với mức trung bình là 8.2mg/l [111; 112].

Ban đầu, trọng lượng của cá là 309.43±12.98 g trước khi được nuôi và không

có sự khác biệt giữa các nhóm. Trọng lượng ướt trung bình của cá được ghi lại hàng

tháng trong quá trình thử nghiệm cho ăn và một lần trước khi lọc. Trong quá trình thí

nghiệm, cá vẫn khỏe mạnh và tỷ lệ chết là 0%. Vào cuối thử nghiệm, cá được cho ăn

với chế độ ăn có bổ sung 1g/kg canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol

(IC=0.5%) cho thấy trọng lượng trung bình cao hơn đáng kể so với các nhóm đối

chứng thí nghiệm khác (p<0.05) (hình 4.3.3).

Cá hồi vân được nuôi bằng chế độ ăn bổ sung canthaxanthin ở 20mg/kg (chế độ

ăn IV) cho thấy trọng lượng ướt thấp hơn đáng kể (p <0.05) sau hai, ba và bốn tháng

so với các nhóm khác. Phát hiện này phù hợp với báo cáo của Murphy và cộng sự khi

tăng liều lượng canthaxanthin cho ăn dẫn đến tăng trọng lượng thấp hơn ở cá hồi vân

[112]. Trọng lượng cuối cùng của cá ở các nhóm được cho ăn với khẩu phần bổ sung

1g/kg lecithin hoặc 100mg/kg α-tocopherol cao hơn, mặc dù không có ý nghĩa thống

kê (p> 0.05), so với những con được nuôi bằng khẩu phần ăn công nghiệp thông

thường. Trong trường hợp các nhóm được cho ăn với chế độ ăn bổ sung canthaxanthin

và α-tocopherol trên liposome (Chế độ ăn VII, IX và X), mức tăng trọng của chúng

cao hơn khi tăng nồng độ canthaxanthin từ 0.1% lên 0.5% nhưng gần như không tăng

khi tiếp tục tăng nồng độ canthaxanthin từ 0.5 ÷ 1% (chênh lệch không đáng kể).

113

Các kết quả hiện tại tương tự như các báo cáo trước đây chỉ ra rằng việc đưa

các carotenoid như canthaxanthin hoặc astaxanthin vào thức ăn cho cá ảnh hưởng đến

tốc độ tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn của cá hồi nước ngọt hoặc cá vẹt [47].

Ngoài ra, một số nghiên cứu cũng báo cáo rằng carotenoid có thể tăng cường sự tăng

trưởng bằng cách hoạt động như hormone thụ tinh nhưng cho đến nay, chức năng sinh

) g k ( t ớ ư á c

) g n á h t ( n ă á c o h c n a i g

g n ợ ư l g n ọ r T

i ờ h T

CĐ I CĐ II CĐ III CĐ IV CĐ V CĐ VI CĐ VII CĐ IIX CĐ IX CĐ X Các chế độ nuôi cá hồi vân (CĐ: chế độ ăn)

học của carotenoid trong cá vẫn chưa được xác nhận.

Hình 4.3.4. Sự thay đổi trọng lượng của các nhóm cá hồi vân được nuôi bằng các chế

độ ăn khác nhau.

Bảng 4.3.2 cho thấy kết quả về thành phần cơ của cá hồi vân sau 3 tháng nuôi

với các chế độ ăn khác nhau. Không có sự khác biệt đáng kể giữa 10 nhóm xử lý ở tất

cả các chỉ tiêu (protein thô, lipid thô, tro và độ ẩm). Những phát hiện này không phù

hợp với các báo cáo trước đây chứng minh rằng thiếu hụt canthaxanthin trong chế độ

ăn uống có thể ảnh hưởng đến tiêu hóa và hấp thụ lipid. Cụ thể, người ta thấy rằng việc

bổ sung carotenoid trong chế độ ăn uống đã ảnh hưởng đến quá trình tiêu hóa và hấp

thụ lipid ở chuột. Tương tự đối với thủy sản, Brizio ghi nhận rằng canthaxanthin ảnh

hưởng đến quá trình tiêu hóa lipid ở cá. Tuy nhiên, ảnh hưởng của canthaxanthin và α-

tocopherol đối với thành phần cơ cá vẫn còn nhiều tranh cãi và phức tạp, và cần có các

nghiên cứu sâu hơn để tìm hiểu cơ chế của chúng.

114

Bảng 4.3.2. Thành phần của cơ cá hồi vân sau 3 tháng thí nghiệm (n=3, đơn vị: % khối lượng ướt)

Thí nghiệm Protein thô Tro Độ ẩm

20.19 ± 1.15

Chế độ I

Lipid thô 6.79 ± 1.10

1.83 ± 0.12

73.79 ± 1.73

18.89 ± 1.12

Chế độ II

7.43 ± 1.09

1.75 ± 0.37

73.25 ± 0.81

19.22 ± 1.32

Chế độ III

7.42 ± 1.04

1.57 ± 0.22

72.21 ± 0.64

20.07 ± 2.37

Chế độ IV

8.67 ± 2.33

1.72 ± 0.17

71.57 ± 1.12

19.86 ± 1.86

Chế độ V

7.51 ± 1.56

1.68 ± 0.34

73.13 ± 0.79

20.25 ± 1.06

Chế độ VI

6.32 ± 1.18

1.23 ± 0.23

72.13 ± 1.46

19.29 ± 1.19

Chế độ VII

7.29 ± 1.24

1.97 ± 0.28

70.22 ± 0.91

19.57 ± 1.28

Chế độ VIII

7.12 ± 1.06

1.72 ± 0.21

73.15 ± 0.94

20.25 ± 2.17

Chế độ IX

8.13 ± 2.43

1.65 ± 0.12

74.75 ± 1.02

19.26 ± 1.69

Chế độ X

7.91 ± 1.96

1.83 ± 0.24

71.03 ± 0.94

Khẩu phần thức ăn thương mại Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1 g/kg lecithin Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100 mg/kg α- tocopherol Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 20mg/kg canthaxanthin Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100 mg/kg α- tocopherol và 20mg/kg canthaxanthin Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg α- tocopherol trên liposomes Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin trên liposomes (IC=1%) Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α- tocopherol trên liposomes (IC=0.1%) Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α- tocopherol trên liposomes (IC=0.5%) Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α- tocopherol trên liposomes (IC=1%)

Các số liệu là kết quả của các phép đo ba lần và được trình bày dưới dạng giá trị

trung bình ± SE.

4.3.3. Màu sắc cơ của cá hồi

Khi bắt đầu thí nghiệm, màu sắc cơ thịt cá đồng đều giữa các nhóm thí nghiệm

với điểm màu dao động từ 20.1 đến 20.9. Sau 1 tháng nuôi, màu sắc bắt đầu có sự

khác biệt giữa các nghiệm thức (p<0.05). Điểm cao nhất (27.0) được ghi nhận ở nhóm

115

được nuôi bằng chế độ ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α-tocopherol và 20mg/kg

canthaxanthin (Chế độ ăn V), theo sau là chế độ ăn IV và chế độ ăn IX (26.9). Mức

thấp nhất là 23.1 được ghi nhận trong chế độ ăn I, không có canthaxanthin. Sau 2

tháng, sự khác biệt về màu sắc của cơ trở nên rõ ràng hơn. Tuy nhiên, về cuối thử

nghiệm, sự cải thiện về điểm màu ít hơn, điều này phù hợp với các nghiên cứu trước

đó. Kết quả này tương tự với các nghiên cứu trước đây với việc bổ sung astaxanthin và

canthaxanthin với tỷ lệ 40:40mg/kg thức ăn. Điều này phù hợp với nghiên cứu được

thực hiện bởi Choubert và Torrissen rằng màu sắc của cơ cá sẽ không tăng dần và đạt

đến độ bão hòa, ngay cả khi tăng nồng độ hoặc cho ăn lâu hơn [25].

Bảng 4.3.3. Giá trị đo màu của philê lấy từ cá hồi vân được thí nghiệm bằng các chế

độ ăn khác nhau tại thời điểm ban đầu và sau một, hai và ba tháng cho ăn thử nghiệm

(n=3)

Thí nghiệm

Ban đầu

Chế độ I Khẩu phần thức ăn thương

mại

Chế độ II Khẩu phần thức ăn thương

mại bổ sung 1g/kg lecithin

Tháng thứ nhất 23.11 ± 1.10 23.22 ± 1.20

Tháng thứ hai 24.67 ± 1.10 24.78 ± 1.20

Tháng thứ ba 25.00 ± 1.41 25.22 ± 1.39

20.56 ± 0.88 20.33 ± 0.71

23.22 ± 1.00

24.44 ± 1.00

25.11 ± 1.27

20.56 ± 1.13

Chế độ III Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α- tocopherol

Chế độ IV Khẩu phần thức ăn thương 20mg/kg bổ

sung

20.89 ± 0.78

26.67 ± 1.00

28.33 ± 1.00

29.78 ± 1.20

mại canthaxanthin

20.11 ± 0.78

27.00 ± 1.1

29.11 ± 0.80

30.56 ± 1.01

Chế độ V Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α- 20mg/kg và tocopherol canthaxanthin

20.44 ± 1.01

23.33 ± 0.70

24.89 ± 1.10

25.11 ± 1.54

độ

bổ

Chế VII

sung

20.33 ± 1.00

25.89 ± 0.80

28.11 ± 0.80

29.11 ± 0.78

độ

Chế VIII

sung

bổ

20.33 ± 1.00

25.00 ± 1.40

27.11 ± 1.30

28.78 ± 1.30

trên

Chế độ VI Khẩu phần thức ăn thương sung 1g/kg α- mại bổ tocopherol loaded liposomes Khẩu phần thức ăn thương mại 1g/kg canthaxanthin trên liposomes (IC=1%) Khẩu phần thức ăn thương 1g/kg mại và canthaxanthin α- tocopherol liposomes (IC=0.1%)

sung

20.67 ± 1.00

26.67 ± 0.70

28.89 ± 0.80

30.00 ± 0.71

Chế độ IX Khẩu phần thức ăn thương 1g/kg bổ và α- liposomes

mại canthaxanthin tocopherol

trên

116

(IC=0.5%)

sung

20.44 ± 1.13

26.89 ± 0.80

29.33 ± 1.10

30.22 ± 1.39

Chế độ X Khẩu phần thức ăn thương 1g/kg bổ và α- liposomes

trên

mại canthaxanthin tocopherol (IC=1%)

Giá trị màu sắc cho mỗi cơ đã được ba nhà nghiên cứu thống nhất. Các số liệu là

kết quả của các phép đo ba lần và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SE.

Chế độ I Chế độ II Chế độ III Chế độ IV Chế độ V

Chế độ VI Chế độ VII Chế độ VIII Chế độ IX Chế độ X

Hình 4.3.5. Màu sắc cơ của cá khi kết thúc thí nghiệm

Hàm lượng canthaxathin tích lũy trong cơ của cá ở các thí nghiệm khác nhau

sau 90 ngày nuôi được thể hiện trong Hình 4.3.5. Sau 90 ngày nuôi, cá được ăn các

chế độ khác nhau cho thấy hàm lượng canthaxanthin tích lũy trong cơ là khác nhau

(p<0.05). Hàm lượng canthaxanthin trong cơ cao nhất (2.91mg/kg) ở nhóm với chế độ

ăn bổ sung 1g/kg canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol (IC=0.5%), tiếp theo

là chế độ ăn bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposome (IC=1%)

(2.90mg/kg), chế độ ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α-tocopherol và 20mg/kg

canthaxanthin (2.75mg/kg). Hàm lượng canthaxanthin trong cơ thấp nhất là nhóm

được cho ăn chế độ ăn thương mại có bổ sung 1g/kg lecithin (0.99mg/kg). Tuy nhiên,

giữa chế độ ăn IX và chế độ ăn V, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về lượng

canthaxanthin.

117

Hình 4.3.6. Hàm lượng canthaxanthin trong các mẫu cơ

Theo Torrissen và cộng sự, sự phân bố canthaxanthin trong cơ cá hồi vân tỷ lệ

thuận với tỷ lệ canthaxanthin bổ sung trong thức ăn [25]. Tuy nhiên, với việc bao gồm

canthaxanthin ở nồng độ cao hơn 50mg/kg, sự tích tụ của canthaxanthin trong cơ cá

hồi vân giảm dần và dừng lại khi đạt đến độ bão hòa.

Sự tích lũy canthaxanthin trong thịt cá tăng lên khi có mặt của α-tocopherol

trong thức ăn (chế độ ăn V), phù hợp với kết quả báo cáo của Choubert đề xuất rằng,

so với chỉ cho ăn bằng canthaxanthin, việc sử dụng liposome được hình thành từ

lecithin và α-tocopherol có thể làm giảm lượng canthaxanthin cần thiết để đạt được

cùng một kết quả.

Với chế độ ăn trực tiếp canthaxanthin (V) cần 20mg canthaxanthin và 100mg α-

tocopherol/kg thức ăn thì hàm lượng canthaxanthin trong cơ thịt cá hồi chỉ tương

đương liposome có chứa 1g canthaxanthin và α-tocopherol. Ta nhận thấy rõ sự khác

biệt khi dùng trực tiếp canthaxanthin và dùng liposome có chứa canthaxanthin.

118

KẾT LUẬN

Luận án đã thực hiện được những kết quả bao gồm:

1. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin từ vi khuẩn ưa

mặn

- Đã khảo sát được các thành phần dinh dưỡng có ảnh hưởng đến sự sinh tổng

hợp canthaxanthin của chủng P.carotinifaciens VTP20181 gồm:

0.8 (g/l) ➢ NH4SO4

4.5 (g/l) ➢ KH2PO4

1 (g/l) ➢ MgSO4

➢ Biotin 0.1 (g/l)

➢ Monosodium Glutamate 6.47 (g/l)

2 (mg/l) ➢ CoCl2

1 (g/l) ➢ FeSO4

➢ Bột nấm men 30 (g/l)

➢ Sucrose 17.5 (g/l)

1.89 (g/l) ➢ Sodium malate (C4H4Na2O5)

➢ NaCl 17.5 (g/l)

- Tối ưu hóa được điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn

với các thông số sau:

➢ pH 7.2

➢ Nhiệt độ 26 (0C)

➢ Thời gian 61,32 (h)

➢ Tỷ lệ giống 7,97 (%)

➢ Tốc độ lắc 290 (rpm)

➢ Hiệu suất tạo canthaxanthin

➢ Hàm lượng canthaxanthin 8.66 ± 0.17 (mg/g sinh khối khô)

15.88 ± 1.22 (mg Cx/lít)

- Xây dựng được quy trình sinh tổng hợp canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn

chủng P.carotinifaciens VTP20181 với quy mô 100 lít/mẻ.

2. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết xuất canthaxanthin bằng phương pháp siêu âm

- Tối ưu hóa được điều kiện chiết xuất canthaxanthin bằng phương pháp siêu

âm sau quá trình sinh tổng hợp với các thông số sau:

119

➢ Nhiệt độ 35.0 (0C)

➢ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1/9.5 (v/w)

➢ Thời gian chiết 90 (Phút)

➢ Công suất siêu âm 145 (W)

➢ Hàm lượng Canthaxanthin 15.07 (mg/g cao chiết)

➢ Hàm lượng Caroteniod 18.26 (mg/g cao chiết)

- Xây dựng được quy trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối vi khuẩn ưa

mặn.

3. Nghiên cứu tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và bổ sung vào thức ăn

cho cá hồi vân

- Tổng hợp được liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol với các tính

chất sau:

+ Kích thước trung bình của liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa α-

tocopherol là 97.33 ± 4.64 và 103.80 ± 6.95 (trung bình ± SD; n = 3).

+ Giá trị PDI của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol thấp nhất là

0.150 ± 0.044 (trung bình ± SD; n=3).

- Xây dựng được quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-

tocopherol quy mô phòng thí nghiệm.

- Ứng dụng chế phẩm liposome trong nuôi cá hồi, kết quả thu được như sau:

+ Về tốc độ tăng trường, tỷ lệ sống: không có sự khác nhau.

+ Màu sắc và sự phân bố canthaxanthin trong cơ của cá được nuôi bằng khẩu

phần có chứa 1g/kg liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol (IC = 0.5%) tương

tự như ở cá được nuôi bằng khẩu phần công nghiệp có bổ sung 20mg/kg

canthaxanthin.

- Kết quả nghiên cứu cho thấy tính khả thi của việc sử dụng kỹ thuật liposome

trong sản xuất chất bổ sung chế độ ăn cho cá hồi vân.

120

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp và chiết xuất

canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn trên quy mô công nghiệp (3000 lít/mẻ).

2. Tiếp tục nghiên cứu đánh giá thêm các chế độ ăn cho cá hồi vân có bổ sung

liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol với các chế độ khác nhau,

nhằm tối ưu hóa sản phẩm thức ăn cho cá hồi vân.

NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Đã tối ưu hóa được quy trình sinh tổng hợp canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn.

2. Đã tối ưu hóa được quy trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối có sử dụng

công nghệ chiết siêu âm.

3. Tổng hợp được liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol

4. Đã tiến hành nghiên cứu thức ăn cho cá hồi có bổ sung liposome có chứa

canthaxanthin và α-tocopherol

121

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

BÀI BÁO QUỐC TẾ

1. Tran Quoc Toan, Dang Viet Anh, Pham Quoc Long, Nguyen Phi Hung, Trinh Thu

Huong, Tran Thuy Ha, Do Van Thinh, Le Van Khoi, Ngo Xuan Long, Phan Tri Nhut,

Pham Thi Hai Ha, Do Van Manh and Nguyen Thanh Duong. “Effects of Dietary Inclusion

of Canthaxanthin and α-tocopherol Loaded Liposome on Growth and Mucsle Pigmentation

of Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss)”. Hindawi Journal of Food Quality 2021 (2021), Article ID 6653086, 11 pages. (ISI – Q2). 2. Duy Le Xuan, Toan Tran Quoc, Anh Dang Viet, Hung Nguyen Phi, Huong Trinh Thi

Thu, Long Pham Quoc, Dat Nguyen Manh, Le Do Thi Thuy, Pham Dung Thuy Nguyen,

Nhan Nguyen Phu Thuong, Manh Do Van. “Optimization of canthaxanthin extraction

from fermented biomass of Paracoccus carotinifacuens VTP20181 bacteria strain isolated

in Vietnam”. Foods and raw materials. (2021). 9(1), 117-125.

BÀI BÁO TRONG NƯỚC

3. Trần Thị Mai Hương, Đỗ Văn Thịnh, Cao Thị Linh Chi, Lê Văn Khôi, Đặng Việt

Anh, Trần Quốc Toàn, Trần Thị Thủy Hà. “Ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm

canthaxanthin có nguồn gốc từ vi khuẩn ưa mặn vào thức ăn đến sinh trưởng và màu

sắc thị cơ cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss)”. Tạp chí Khoa học và Nông nghiệp Việt

Nam số 11 năm 2020.

4. Đặng Việt Anh, Trần Quốc Toàn, Lê Xuân Duy, Nguyễn Mạnh Đạt, Đỗ Thị Thủy

Lê, Trần Thị Thúy Hà, Đỗ Văn Thịnh, Lê Văn Khôi, Phạm Quốc Long. “Process

extraction and isolation of Canthaxanthin from saline bacteria biomass Paracoccus

Carotinifation VTP20181 isolated in Vietnam”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ biển -

Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Tập 20 số 4 năm 2020.

5. Đặng Việt Anh, Nguyễn Minh Châu, Trần Quốc Toàn, Phạm Quốc Long, Lê Văn

Trọng, Trần Hoàng Quyên, Đỗ Thị Thủy Lê, Nguyễn Mạnh Đạt. “Nghiên cứu ảnh

hưởng của một số thành phần môi trường đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin từ

vi khuẩn Paracoccus Carotinifation VTP20181”. Tạp chí Dinh dưỡng và thực phẩm.

Tập 17 - số 1 - tháng 3 - năm 2021

SÁNG CHẾ

6. Tên sáng chế: “Quy trình sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa

mặn”, số đơn: 1-2019-05322. Cục Sở hữu trí tuệ - Bộ Khoa học và Công nghệ. Đã

chấp nhận đơn hợp lệ theo quyết định số: 108548/QĐ-SHTT ngày 02 tháng 12 năm

2019.

122

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Peng, J., Yuan, J. P., & Wang, J. H. (2012). Effect of diets supplemented with different sources of astaxanthin on the gonad of the sea urchin Anthocidaris crassispina. Nutrients, 4(8), 922–934.

2. Nagendraprabhu, P., & Sudhandiran, G. (2011). Astaxanthin inhibits tumor invasion by decreasing extracellular matrix production and induces apoptosis in experimental rat colon carcinogenesis by modulating the expressions of ERK-2, NFkB and COX-2. Invest New Drugs

for oxidative stress and inflammation treatment

3. Pashkow, F. J., Watumull, D. G., & Campbell, C. L. (2008a). Astaxanthin: A in novel potential cardiovascular disease. The American Journal of Cardiology, 101(10), S58– S68.

4. Fassett, R. G., & Coombes, J. S. (2012). Astaxanthin in cardiovascular health

and disease. Molecules. 17(2): 2030–2048.

5. Kang, J. O., Kim, S. J., & Kim, H. (2001). Effect of astaxanthin on the hepatotoxicity, lipid, peroxidation and antioxidative enzymes in the liver of CCl4-treated rats. National library of medicine.

6. Uchiyama, K., Naito, Y., Hasegawa, G., Nakamura, N., Takahashi, J., & Yoshikawa, T. (2002). Astaxanthin protects β-cells against glucose toxicity in diabetic db/db mice. Redox Report, 7(5), 290–293.

7. W. Müller, J. Vergauwen, M. Eens, J.D. Blount (2012). Environmental effects shape the maternal transfer of carotenoids and vitamin E to the yolk. Front Zool., 9, p. 17.

(2003). Effects of astaxanthin on

8. Kazuhiro, O., Kenji, S., Satoshi, K., Tomomi, N., Nobuhisa, M., Kazunaga, Y., et al. lipopolysaccharide-induced inflammation in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 44(6), 2694–2701.

9. Sajilata M. G, Singhal R. S, Kamat M.Y (2008), The Carotenoid Pigment

Zeaxanthin—A Review. Comp. Rev. Food Sci. Food Saf. 7, 29.

10. Saperstein S., Starr M.P., (1954) The ketonic carotenoid canthaxanthin isolated from a colour mutant of Corynebacterium michiganense. Biochem. J., 57: 273. 11. Haxo F., (1950). Carotenoids in the mushroom Cantharellus cinnabarinus.

Botan. Gaz., 112: 228-232.

12. Czygan F.C., (1968). Sekundär-Carotinoide

in Grünalgen. I. Chemie, Vorkommen und Faktoren welche die Bildung dieser Polyene beeinflussen. Acta Mikrobiol., 61: 81-102.

13. Thommen H., Wackernagel H., (1964) Zum Vorkommen von Keto-

Carotinoiden in Crustacean. Naturwiss., 51: 87-88.

123

14. Katayama T., Miyahara T., Tanaka Y., Sameshima M., (1973). Carotenoids in the yellow-golden carp, Cyprinus carpio. Kagoshima Daigaku Suisan Gakubu Kiyo, 22: 39-45.

15. Czeczuga B., (1973). Carotenoids and vitamin A in some fish from the coastal

region of the black sea. Hydrobiol., 41: 113-125.

16. Harker M., Hirschberg J., Oren A. (1998). Paracoccus marcusii sp. nov., an

orange gram-negative coccus. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 543-548.

17. Dobson, S. J., and P. D. Franzmann. 1996. Unification of the genera Deleya and the species Paracoccus halodenitrificans into a single genus. Bacteriol. 46 550– 558

18. Teizi Urakami, 1* Jin Tamaoka, *Ken-Ichiro Suzuki, 3 and Kazuo Komagata2. International Journal of systematic bateri~logy, Apr. 1989, p. 116-121 Copyright, International Union of Microbiological Societies. Vol. 39, No. 2. Paracoccus alcaliphilus sp. nov., an Alkaliphilic and Facultatively Methy lo trop hic Bacterium.

19. Nei F. Saunders,1 Jorrit J. Hornberg, 1 Willem N.M. Reijnder, 1 Hans V. Westerhoff, 1 Simon De Vries,2 And ob J.M Van Spanning1 (2000). The NosX and NirX Proteins of Paracoccus denitrificans Are Functional Homologues: Their Role in Maturation of Nitrous Oxide Reductase. *Journal of Bacteriology, 0021-9193/00/$04.0010 Sept. 2000, p. 5211–5217 Vol. 182, No. 18 Copyright © 2000, American Society for Microbiology

20. H. Stouthamer. (1991). Metabolic Regulation Including Anaerobic Metabolism and Bioenergetics denitrificans. Paracoccus Journal of

in Biomembranes volume 23, pages163–185.

transfer of Thiobacillus versutus to

21. Sarah L. Jordan · Ian R. McDonald · Anna J. Kraczkiewicz-Dowjat· Donovan P. Kelly · Frederick A. Rainey · J. Colin Murrell · Ann P. Wood. (1997). Autotrophic growth on carbon disulfide is a property of novel strains of Paracoccus denitrificans. Archives of Microbiology volume 168, pages225–236. 22. Yoko Katayama1, Akira Hiraishi1, Hiroshi Kuraishi3. First Published: (01 June 1995). Paracoccus thiocyanatus sp. nov., a new species of thiocyanate-utilizing facultative chemolithotroph, and the genus Paracoccus as Paracoccus versutus comb. nov. With emendation of the genus. MICROBIOLOGY Volume 141, Issue 6.

23. Tsubokura A, Yoneda H, Mizuta H. (1999) Paracoccus carotinifaciens sp. nov., a new aerobic gram-negative astaxanthin-producing bacterium. Int J Syst Bacteriol, 49, 277-282.

24. Seyed Mohammad Taghi, Gharibzahedi, Seyed Hadi Razavi, Seyed Mohammad Mousavi (2013). Microbial canthaxanthin: Perspectives on biochemistry and biotechnological production. Eng. Life Sci. 2013, 13, 408– 417.

124

25. Vreeland, R. H., C. D. Litchfield, E. L. Martin, and E. Elliot. (1980). Halomonas elongata, a new genus and species of extremely salt-tolerant bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 30:485–495.

26. Quesada, E., V. Bejar, M. J. Valderrama, and A. Ramos-Cormenzana. (1987). Growth characteristics and salt requirement of Deleya halophila in a defined medium. Curr. Microbiol. 16:21–25.

27. Khodaiyan, F., Razavi, S. H., Mousavi, S. M., (2008). Optimization of canthaxanthin production by Dietzia natronolimnaea HS-1 from cheese whey using statistical experimental methods. Biochem. Eng. J. 2008, 40, 415–422. 28. Khodaiyan, F.,Razavi, S. H., Emam-Djomeh,Z., Mousavi, S.M.A. et al., (2007). Effect of culture conditions on canthaxanthin production by Dietzia natronolimnaea HS-1. J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17, 195–201.

29. Nasri Nasrabadi, M. R., Razavi, S. H., (2010). High levels lycopene accumulation by Dietzia natronolimnaea HS-1using lycopene cyclase inhibitors in a fed-batch process. Food Sci. Biotechnol.2010, 19, 899–906.

30. Liu, B., Lee, Y. (2000). Secondary carotenoids formation by the green alga Chlorococcum sp.. Journal of Applied Phycology 12, 301–307 (2000). https://doi.org/10.1023/A:1008185212724.

31. Kim, D.-Y., Vijayan, D., Praveenkumar, R., Han, J.-I., Lee, K., Park, J.-Y., Chang, W.-S., Lee, J.-S., Oh, Y.-K., (2015). Cell-wall disruption and lipid/astaxanthin extraction from microalgae: Chlorella and Haematococcus. Bioresour. Technol. 199, 300–310.

32. Chan, M.M.C., Ho, S.S.H., Lee, D.D.J., Chen, C.C.Y., Huang, C.C., Chang, J.S., (2013). Characterization, extraction and purification of lutein produced by an indigenous microalga Scenedesmus obliquus CNW-N. Biochem. Eng. J. 78, 24–31.

33. Taucher, J., Baer, S., Schwerna, P., Hofmann, D., Hümmer, M., Buchholz, R., Becker, A., (2016). Cell Disruption and Pressurized Liquid Extraction of Carotenoids from Microalgae. Thermodyn. Catal. 7, 1–7.

34. Hu, Y.-R., Wang, F., Wang, S.-K., Liu, C.-Z., Guo, C., (2013). Efficient harvesting of marine microalgae Nannochloropsis maritima using magnetic nanoparticles. Bioresour. Technol. 138, 387–390.

35. Utomo, R.P., Chang, Y.-R., Lee, D.-J., Chang, J.-S., (2013). Lutein recovery from Chlorella sp. ESP-6 with coagulants. Bioresour. Technol. 139, 176-180. 36. Lee, S.-H., Qian, Z.-J., Kim, S.-K., (2010). A novel angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide from tuna frame protein hydrolysate and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats. Food Chem. 118, 96–102.

37. Li, Y., Fabiano-Tixier, A. S., Tomao, V., Cravotto, G., & Chemat, F. (2013). Green ultrasound-assisted extraction of carotenoids based on the bio-refinery

125

concept using sunflower oil as an alternative solvent. Ultrasonics Sonochemistry, 20(1), 12–18. https://doi.org/10.1016/j.ultsonch.2012.07.005. 38. Irna, C., Jaswir, I., Othman, R., & Jimat, D. N. (2018). Comparison between highpressure processing and chemical extraction: Astaxanthin yield from six species of shrimp carapace. Journal of Dietary Supplements, 15(6), 805–813. https://doi.org/ 10.1080/19390211.2017.1387885.

Engineering, peels. 126, of

39. Hiranvarachat, B., & Devahastin, S. (2014). Enhancement of microwave- assisted extraction via intermittent radiation: Extraction of carotenoids from carrot 17–26. Food Journal https://doi.org/10.1016/j. jfoodeng.2013.10.024.

Engineering, Journal 95(2), Food of

40. Sahena, F., Zaidul, I. S. M., Jinap, S., Karim, A. A., Abbas, K. A., Norulaini, N. A. N., et al. (2009). Application of supercritical CO2 in lipid extraction - a 240–253. review. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2009.06.026

41. Deenu, A., Naruenartwongsakul, S., Kim, S.M., (2013). Optimization and economic evaluation of ultrasound extraction of lutein from Chlorella vulgaris. Biotechnol. Bioprocess Eng. 18, 1151–1162.

42. Kadam, S.U., Tiwari, B.K., O’Donnell, C.P., (2013). Application of novel extraction technologies for bioactives from marine algae. J. Agric. Food Chem. 61, 4667–4675.

43. Halim, R., Danquah, M.K., Webley, P. a., (2012a). Extraction of oil from microalgae for biodiesel production: A review. Biotechnol. Adv. 30, 709–732. 44. Park, J.-Y., Park, M.S., Lee, Y.-C., Yang, J.-W., (2015). Advances in direct transesterification of algal oils from wet biomass. Bioresour. Technol. 184, 267–275.

45. J. Mason, T., Chemat, F., & Vinatoru, M. (2011). The extraction of natural products using ultrasound or microwaves. Current Organic Chemistry, 15(2), 237–247. https://doi. org/10.2174/138527211793979871.

46. Pico, Y. (2013). Ultrasound-assisted extraction for food and environmental 84–99. in Analytical Chemistry, 43, - Trends

samples. TrAC https://doi.org/10.1016/j. trac.2012.12.005.

47. T.J. Mason, J.P. Lorimer (Eds.). (2002). Applied Sonochemistry: Uses of Power Ultrasound in Chemistry and Processing. Wiley-VCH Verlag, Germany (2002), pp. 25-74.

48. M. Toma, M. Vinatoru, L. Paniwnyk, T.J. Mason. (2001). Investigation of the effects of ultrasound on vegetal tissues during solvent extraction. Ultrason. Sonochem., 8 (2001), pp. 137-142

49. C.J. Martin, A.N.R. Law. (1983). Design of thermistor probes for measurement

of ultrasound intensity distributions. Ultrasonics, 21 (1983), pp. 85-90.

126

50. X. Wei, M. Chen, J. Xiao, Y. Liu, L. Yu, H. Zhang, Y. Wang.

(2010). Composition and bioactivity of tea flower polysaccharides obtained by different methods. Carbohydr. Polym., 79 (2010), pp. 418-422.

51. H.M. Santos, C. Lodeiro, J.-L. Capelo-Martínez.

(2009). The power of ultrasound. J.- Capelo-Martínez (Ed.), Ultrasound in Chemistry: Analytical Applications, Wiley-VCH Verlag, Germany (2009), pp. 1-16

52. H. Li, L. Pordesimo, J. Weiss. (2004). High intensity ultrasound-assisted

extraction of oil from soybeans. Food Res. Int., 37 (2004), pp. 731-738.

53. W. Wang, X. Ma, Y. Xu, Y. Cao, Z. Jiang, T. Ding, X. Ye, D. Liu.

(2015). Ultrasound-assisted heating extraction of pectin from grapefruit peel: optimization and comparison with the conventional method. Food Chem., 178 (2015), pp. 106-114.

54. J.P. Lorimer, T.J. Mason’ (1987). Sonochemistry. Part 1-The physical aspects.

Chem. Soc. Rev., 16 (1987), pp. 239-274.

55. Y. Sun, D. Liu, J. Chen, X. Ye, D. Yu. (2011). Effects of different factors of ultrasound treatment on the extraction yield of the all-trans-β-carotene from citrus peels. Ultrason. Sonochem., 18 (2011), pp. 243-249

56. M.D. Esclapez, V. Sáez, D. Milán-Yáñez, I. Tudela, O. Louisnard, J. González- García. (2010). Sonoelectrochemical treatment of water polluted with trichloroacetic acid: from sonovoltammetry to pre-pilot plant scale. Ultrason. Sonochem., 17 (2010), pp. 1010-1020

57. G. Cravotto, L. Boffa, S. Mantegna, P. Perego, M. Avogadro, P. Cintas. (2008). Improved extraction of vegetable oils under high-intensity ultrasound and/or microwaves. Ultrason. Sonochem., 15 (2008), pp. 898-902

58. D.J. Flannigan, K.S. Suslick. (2010). Inertially confined plasma in an imploding

bubble. Nat. Phys., 6 (2010), pp. 598-601

59. M. Sališová, Š. Toma, T.J. Mason. (1997). Comparison of conventional and ultrasonically assisted extractions of pharmaceutically active compounds from Salvia officinalis. Ultrason. Sonochem., 4 (1997), pp. 131-134.

60. Z.-S. Zhang, L.-J. Wang, D. Li, S.-S. Jiao, X.D. Chen, Z.-H. Mao.

(2008). flaxseed. Sep. Purif. of oil from

Ultrasound-assisted extraction Technol., 62 (2008), pp. 192-198

61. Q.-A. Zhang, Z.-Q. Zhang, X.-F. Yue, X.-H. Fan, T. Li, S.-F. Chen.

(2009). Response surface optimization of ultrasound-assisted oil extraction from autoclaved almond powder. Food Chem., 116 (2009), pp. 513-518.

62. Bangham, A. D.; Horne, R. W.; Glauert, A. M.; Dingle, J. T.; Lucy, J. A. (1962). "Action of saponin on biological cell membranes". Nature. 196 (4858): Bibcode:1962 952.955. Natur.196..952B. doi:10.1038/196952a0. PMID 13966357. S2CID 4181517.

127

Biol. 13 (1):

63. Bangham A.D.; Standish M.M.; Weissmann G. (1965). "The action of steroids and streptolysin S on the permeability of phospholipid structures to cations". J. Molecular 253–259. doi:10.1016/s0022-2836(65)80094- 8. PMID 5859040.

64. Sessa G.; Weissmann G. (1970). "Incorporation of lysozyme into liposomes: A latency". J. Biol. Chem. 245 (13): 3295– structure-linked for

model 3301. doi:10.1016/S0021-9258(18)62994-1. PMID 5459633.

65. YashRoy R.C. (1990). "Lamellar dispersion and phase separation of chloroplast membrane lipids by negative staining electron microscopy" (PDF). Journal of Biosciences. 15 (2): 93–98. doi:10.1007/bf02703373. S2CID 39712301.

66. Geoff Watts (2010-06-12). "Alec Douglas Bangham". The Lancet. 375 (9731): 2070. doi:10.1016/S0140-6736(10)60950-6. S2CID 54382511. Retrieved 2014- 10-01.

67. Kimball's Biology Pages, Archived 2009-01-25 at the Wayback Machine "Cell

Membranes."

therapy". Journal Release. 160(2): Controlled of

68. Jump up to:a b c Cevc, G (1993). "Rational design of new product candidates: the next generation of highly deformable bilayer vesicles for noninvasive, 135– targeted 146. doi:10.1016/j.jconrel.2012.01.005. PMID 22266051.

69. Torchilin, V (2006). "Multifunctional nanocarriers". Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (14): 1532–55. doi:10.1016/j.addr.2006.09.009. PMID 17092599. 70. Jump up to:a b Barenholz, Y; G, Cevc (2000). Physical chemistry of biological surfaces, Chapter 7: Structure and properties of membranes. New York: Marcel Dekker. pp. 171–241.

71. Gomezhens, A; Fernandezromero, J (2006). "Analytical methods for the control of liposomal delivery systems". TrAC Trends in Analytical Chemistry. 25 (2): 167–178. doi:10.1016/j.trac.2005.07.006.

Nano. 4 (12):

72. Bertrand, Nicolas; Bouvet, CéLine; Moreau, Pierre; Leroux, Jean-Christophe (2010). "Transmembrane pH-Gradient Liposomes to Treat Cardiovascular Drug 7552– Intoxication". ACS 8. doi:10.1021/nn101924a. PMID 21067150.

73. 62. doi:10.1080/08982100802354665. PMID 18770074. S2CID 137500401. 74. Meure, LA; Knott, R; Foster, NR; Dehghani, F (2009). "The depressurization of an expanded solution into aqueous media for the bulk production of liposomes". Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 25 (1): 326– 37. doi:10.1021/la802511a. PMID 19072018.

75. Dogra, N; Choudhary, R; Kohli, P; Haddock, JD; Makwana, S; Horev, B; Vinokur, Y; Droby, S; Rodov, V (11 March 2015). "Polydiacetylene nanovesicles as carriers of natural phenylpropanoids for creating antimicrobial

128

food-contact surfaces". Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (9): 2557–65. doi:10.1021/jf505442w. PMID 25697369

(2004). "Nutraceutics and Delivery

76. Yoko Shojia; Hideki Nakashima Systems". Journal of Drug Targeting.

Suppl): of

77. Williamson, G; Manach, C (2005). "Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. II. Review of 93 intervention studies". The American 243S– Nutrition. 81 (1 Clinical Journal 255S. doi:10.1093/ajcn/81.1.243S. PMID 15640487.

78. Bender, David A. (2003). Nutritional Biochemistry of Vitamins. Cambridge,

U.K.

79. 27. doi:10.1080/08982100802465941. PMID 18951288. S2CID 98836972.

Jump up to:a b Stryer S. (1981) Biochemistry, 213

a

80. López, Rubén R.; Ocampo, Ixchel; Sánchez, Luz-María; Alazzam, Anas; Bergeron, Karl-F.; Camacho-León, Sergio; Mounier, Catherine; Stiharu, Ion; Nerguizian, Vahé (2020-02-25). "Surface Response Based Modeling of Disturbance Periodic in Characteristics Liposome Mixer". Micromachines. 11 (3): 235. doi:10.3390/mi11030235. ISSN 2072- 666X. PMC 7143066. PMID 32106424.

Vitaminol 1995, 41, Vitaminology, Nutr Sci J

81. Tokuda, M.; Takeuchi, M. (1995). Effects of Excess Doses of a-Tocopherol on the Lipids and Function of Rainbow Trout Liver. Journal of Nutritional Science 25–32, and doi:10.3177/jnsv.41.25.

82. Box, G.E.P.; Wilson, K.B. (1951). "On the Experimental Attainment of Optimum Conditions". Journal of the Royal Statistical Society, Series B. 13 (1): 1–45. doi:10.1111/j.2517-6161.1951.tb00067.x.

83. George E. P (2006). Box Almost Anything: Improving Ideas and Essays,

Revised Edition (Wiley Series in Probability and Statistics)

84. Nguyễn Minh Tuyển (2005), Quy hoạch thực nghiệm. Nhà Xuất Bản Khoa học

và Kỹ thuật.

85. Phạm Hồng Hải, Ngô Kim Chi. (2007). Xử lý số liệu và quy hoạch thực nghiệm trong nghiên cứu Hóa học. Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 2007

86. Segdwick S.D (1995). Trout farming handbook 4th edition. Fishing News

Books Ltd., Farnham. 160p.

87. Gibson, R.J. & Haedrich, R.L. (1988). The exceptional growth of juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) in the city waters of St. John’s, Newfoundland, Canada. Polish Archives of Hydrobiology, 35, 385– 407

88. Bromage N. R. & C. J. Shepherd (1990). Fish, their requirements and site evaluation. In: Shepherd, C. J. & Bromage, N.R. (eds), Intensive Fish Farming. BSP Professional Books, Oxford. 17-49

129

89. Hardy, R.W., Fornshell, G.C.G. & Brannon, E.L. (2000). Rainbow trout culture. In: R. Stickney (ed.) Fish Culture, pp. 716-722. John Wiley & Sons, New York, USA.

90. Hinshaw, J. M. (1999). Trout production: feeds and feeding methods. Southern

Regional Aquaculture Center.

91. Satia, B. P. (1974). Quantitative protein requirements of rainbow trout. Progr.

Fish. Cult. 36: 80-85

92. Steffens, W. (1989). Protein digestion. In: Principle of fish nutrition. Ellis

Harwood, Chichester, pp. 47-51.

93. Austreng E. (1978) Digestibility determination in fish using chromic oxide marking and analysis of contents from different segments of the gastro- intestinal tract. Aquaculture 13, 265-272

94. Tacon A. G. J, J. V. Haastler, P. B. Featherstone, K. Kerr & Jackson A. J. (1983). Studies on the utilization of full fat soybean and solvent extracted soybean in a complete diet for rainbow trout, Bull Jpn. Sot. Sci. Fish. 49: 1437- 1443.’

95. McLaren, B.A., Keller, E., O'Donnell, D.J. and Elvehjem, C.A., (1947). The nutrition of rainbow trout. I. Studies of vitamin requirements. Archives of Biochemistry and 178.Biophysics, 15, 169

96. Halver J.E. (2002) The vitamins. In: Fish Nutrition, 3rd edn (ed. by J.E. Halver

& R.W. Hardy), pp. 61–141. Academic Press, San Diego, CA.

97. Nguyễn Việt Nam. (2012). Hiện Trạng và tiềm năng phát triển cá nước lạnh Việt Nam. Báo cáo tham luận tại Hội Thảo phát triển nuôi trồng thủy sản nước lạnh Việt Nam. 20/2012.

98. Đinh Văn Trung. (2009). Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi thương phẩm cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) và cá tầm (Acippenser baeri)”. Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1.

99. Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Tiến Hóa. (2013). "Ảnh hưởng của thức ăn có bổ sung astaxanthin và canthaxanthin với tỷ lệ khác nha đến màu sắc thịt cá hồi vân" (Oncorhynchus mykiss). Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1

100.

Trình Mai Duy Lưu, Lê Hồng Phúc, Kiều Phương Nam, Ngô Đại Nghiệp. (2010). "Sàng lọc và nghiên cứu các chủng có khả năng tổng hợp canthaxanthin". Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8 (3B): 1601- 1608, 2010.

101.

E Li, R Mira de Orduña. (2010). A rapid method for the determination of microbial biomass by dry weight using a moisture analyser with an infrared heating source and an analytical balance. Letters in applied microbiology

130

102.

Dan Qiu & Wen-Li Zhu & Cheng-Ke Tang & Li-Fang Shi & Hao-Qi Gao. (2013). Identification of the Composition of Isomeric Canthaxanthin Sample by NMR, HPLC, and Mass Spectrometry. Food Anal. Methods.

103.

104.

Martin G. L., Skovlund B., Michael E.N, Bjarne K.E., Line H.C., Stina F. (2012). Classication of Astaxanthin Colouration of Salmonid Fish using Spectral Imaging and Tricolour Measurement. IMM-Technical Report-2012-08 Cyplik, P., et al. (2007). Effect of macro/micro nutrients and source over the denitrification rate of Haloferax denitrificans archaeon. Enzyme and Microbial Technology, 2007. 40(2): p. 212-220.

105.

Calegari-Santos, R., et al. (2016+). Carotenoid Production by Halophilic Archaea Under Different Culture Conditions. Curr Microbiol, 2016. 72(5): p. 641-51.

106.

Bae, S. and M. Shoda. (2004). Bacterial cellulose production by fed- batch fermentation in molasses medium. Biotechnol Prog, 2004. 20(5): p. 1366- 71.

107.

Zhang, H. (2017). Thin-Film Hydration Followed by Extrusion Method for Liposome Preparation. In Liposomes: Methods and Protocols; D’Souza, G.G.M., Ed.; Methods in Molecular Biology; Springer: New York, NY, 2017; pp. 17–22 ISBN 9781493965915.

108. Fraser, P.D., Miura, Y., Misawa, N. (1997). In vitro characterization of

astaxanthin biosynthetic enzymes. J. Biol. Chem. 272, 6128-6135.

109.

Misawa, N. (2011). Carotenoid β-ring hydroxylase and ketolase from marine bacteria-promiscuous enzymes for synthesizing functional xanthophylls. Marine drugs, 2011. 9(5): p. 757-771.

110.

Martín, J.F., E. Gudiña, and J.L. Barredo. (2008). Conversion of β- carotene into astaxanthin: Two separate enzymes or a bifunctional hydroxylase- ketolase protein. Microbial Cell Factories, 2008. 7(1): p. 3.

111.

Physiology 2018, 219–220, 10–18,

Onukwufor, J.O.; Wood, C.M. (2018). The osmorespiratory compromise in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): The effects of fish size, hypoxia, temperature and strenuous exercise on gill diffusive water fluxes and sodium net loss rates. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & doi: Integrative 10.1016/j.cbpa.2018.02.002.

112.

Murphy, P.; Houston, A.H. (1977). Temperature, photoperiod, and trout, Salmo gairdneri. Can. J. rainbow in

water–electrolyte balance Zool. 1977, 55, 1377–1388, doi: 10.1139/z77-180.

131