Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm Cordyceps takaomontana từ rừng tự nhiên Việt Nam có khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐỖ TIẾN MẠNH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN

CHỦNG NẤM CORDYCEPS TAKAOMONTANA

TỪ RỪNG TỰ NHIÊN VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP

MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC GIÁ TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐỖ TIẾN MẠNH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN

CHỦNG NẤM CORDYCEPS TAKAOMONTANA

TỪ RỪNG TỰ NHIÊN VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP

MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC GIÁ TRỊ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Bình

Hà Nội - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu được trình bày

trong Luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ

công trình nghiên cứu nào khác.

Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ

nguồn gốc.

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

Học viên

Đỗ Tiến Mạnh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Quý Thầy, Cô đã giảng dạy

trong chương trình Cao học khóa 17 - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật -

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người đã truyền đạt

cho tôi kiến thức hữu ích làm cơ sở giúp tôi thực hiện tốt luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Bình,

người Thầy luôn tận tình hướng dẫn, dìu dắt và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể

hoàn thành luận văn thạc sĩ khoa học.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cô chú, anh chị đang làm việc tại Phòng

Công nghệ Gen Động vật – Viện Công nghệ Sinh học đã quan tâm và giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình thực tập tại phòng thí nghiệm của Viện.

Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã tạo

điều kiện, động viên để tôi hoàn thành khóa học và thực hiện luận văn thạc sĩ

với kết quả tốt nhất.

Học viên

Đỗ Tiến Mạnh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii

DANH MỤC BẢNG .................................................................................... vi

DANH MỤC HÌNH .................................................................................... vii

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ......................................................................... 3

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 4

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ............................ 4

1.1. Tổng quan về nấm Cordyceps spp......................................................................... 4

1.1.1. Giới thiệu về nấm Cordyceps spp. ............................................................. 4

1.1.2. Quá trình xâm nhiễm của nấm Cordyceps spp. vào cơ thể côn trùng .... 6

1.1.3. Tình hình nghiên cứu chi Cordyceps trên thế giới .................................. 6

1.1.3.1. Đa dạng và phân bố ................................................................................ 6

1.1.3.2. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. trên thế giới.......................... 8

1.1.4. Tình hình nghiên cứu Cordyceps tại Việt Nam ........................................ 9

1.1.4.1. Đa dạng và phân bố ................................................................................ 9

1.1.4.2. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. ở Việt Nam ......................... 12

1.1.5. Thành phần hóa học, hoạt chất sinh học và giá trị dược liệu của nấm

Cordyceps spp. .................................................................................................... 13

1.1.5.1. Thành phần hóa học và hoạt chất sinh học .......................................... 13

1.1.5.2. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps spp. ........................................... 14

1.2. Sơ lƣợc về hoạt chất Adenosine ........................................................................... 16

1.2.1. Cấu trúc hóa học của Adenosine ............................................................ 16

1.2.2. Ứng dụng của Adenosine .......................................................................... 16

1.3. Sơ lƣợc về hoạt chất Beauvericine ...................................................................... 17

1.3.1. Cấu trúc hóa học của Beauvericine ........................................................ 17

1.3.2. Ứng dụng của Beauvericine .................................................................... 18

CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20

2.1. Nguyên liệu .............................................................................................................. 20

iii

2.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 20

2.1.2. Hóa chất sử dụng ..................................................................................... 20

2.1.3. Thiết bị sử dụng ....................................................................................... 21

2.1.4. Môi trường nuôi cấy ................................................................................ 21

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 22

2.2.1. Phương pháp vi sinh vật .......................................................................... 22

2.2.1.1. Phân lập và thuần khiết vi nấm ............................................................. 22

2.2.1.2. Hoạt hóa giống ...................................................................................... 22

2.2.1.3. Nghiên cứu khả năng tổng hợp các hoạt chất sinh học trên môi trường

lỏng và môi trường rắn của chủng nấm nghiên cứu ........................................... 23

2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử ............................................................... 24

2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 24

2.2.2.2. Định lượng DNA bằng quang phổ kế.................................................... 26

2.2.2.3. PCR ....................................................................................................... 26

2.2.2.4. Điện di kiểm tra DNA tổng số và sản phẩm PCR ................................. 27

2.2.2.5. Xác định trình tự gen ............................................................................ 27

2.2.3. Phương pháp phân tích hóa lý (HPLC) .................................................. 28

2.2.4. Xử lý số liệu .............................................................................................. 29

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 30

3.1. Thu thập, phân lập và tuyển chọn chủng nấm ................................................ 30

3.2. Đánh giá khả năng tạo thể quả của các chủng nấm phân lập ..................... 33

3.3. Xác định tên khoa học của chủng nấm phân lập bằng trình tự ITS ........... 34

3.4. Lựa chọn môi trƣờng thạch thích hợp cho nhân giống ................................ 36

3.5. Lựa chọn môi trƣờng lỏng thích hợp cho nhân giống ................................... 38

3.6. Nghiên cứu nhân nuôi sinh khối tạo hoạt chất sinh học ................................ 40

3.6.1. Nhân nuôi trên môi trường lỏng tĩnh ..................................................... 40

3.6.2. Nhân nuôi trên môi trường rắn .............................................................. 42

3.7. Nghiên cứu khả năng tổng hợp Adenosine và Beauvericine trong môi

trƣờng lỏng tĩnh và môi trƣờng rắn. ........................................................................... 44

3.7.1. Kết quả trên hệ thống LC/MS. ................................................................. 44

3.7.1.1. Định lượng Adenosine. ........................................................................... 44

3.7.1.2. Định lượng Beauvericine ....................................................................... 47

3.7.2. Nghiên cứu khả năng tổng hợp Adenosine và Beauvericine trong môi

trường lỏng tĩnh và môi trường rắn .................................................................. 48

3.7.2.1. Trong môi trường lỏng tĩnh .................................................................... 48

3.7.2.1. Trong môi trường rắn ............................................................................ 49

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................... 52

4.1. Kết luận ..................................................................................................................... 52

4.2. Kiến nghị ................................................................................................................... 52

PHỤ LỤC .................................................................................................... 53

Tài liệu tham khảo ....................................................................................... 54

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng ................................................................... 20

Bảng 2.2. Các thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu ....................... 21

Bảng 2.3. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu (g/l) ......... 21

Bảng 2.4. Thành phần PCR .......................................................................... 27

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt PCR ..................................................................... 27

Bảng 2.6. Gradient nồng độ thiết lập ............................................................ 28

Bảng 3.1. Khả năng tạo thể quả của các chủng nấm đã phân lập .................. 33

Bảng 3.2. Khả năng sinh bào tử của chủng A9 trên các môi trường hoạt hóa lỏng . 39

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh khối lỏng tĩnh ......... 41

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên quá trình tạo thể quả .... 42

Bảng 3.5. Các nồng độ Adenosine sử dụng trong xây dựng đường chuẩn định

lượng ............................................................................................................ 46

Bảng 3.6. Các nồng độ Beauvericine sử dụng trong xây dựng đường chuẩn

định lượng .................................................................................................... 48

Bảng 3.7. Hàm lượng Adenosine, Beauvericine trong sinh khối lên men lỏng

tĩnh ............................................................................................................... 49

Bảng 3.8. Hàm lượng Adenosine và Beauvericine trong sinh khối lên men

rắn ................................................................................................................ 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Nấm C.takaomontana /thể vô tính và hữu tính ............................... 5

Hình 1.2. Nấm Isaria tenuipes / thể vô tính của C.takaomontana .................. 5

Hình 1.3. Nấm Cordyceps crinalis. ................................................................ 7

Hình 1.4. Nấm Cordyceps sinensis (Beck). .................................................... 7

Hình 1.5. Nấm Cordyceps militaris ................................................................ 8

Hình 1.6. Nấm C.nutans. .............................................................................. 11

Hình 1.7. Nấm C.sphecocephala. ................................................................. 11

Hình 1.8. Nấm Cordyceps prolifica. ............................................................. 12

Hình 1.9. Nấm Cordyceps pseudomilitaris. .................................................. 12

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của Adenosine ...................................................... 16

Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của Beauvericin .............................................. 17

Hình 3.1. Mẫu VN3...................................................................................... 30

Hình 3.2. Mẫu VN4...................................................................................... 30

Hình 3.3. Mẫu VN6...................................................................................... 30

Hình 3.4. Mẫu VN7...................................................................................... 30

Hình 3.5. Mẫu VN8...................................................................................... 30

Hình 3.6. Mẫu VN9...................................................................................... 30

Hình 3.7. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A3 ................... 32

Hình 3.8. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A6 ................... 32

Hình 3.9. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A7 ................... 32

Hình 3.10. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A8 ................. 32

Hình 3.11. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A9 ................. 33

Hình 3.12. Ảnh điện di DNA của chủng A9 ................................................. 34

Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR ......................................................... 35

Hình 3.14. Trình tự ITS của chủng A9 ......................................................... 35

Hình 3.15. Sơ đồ cây phân loại chủng C.takaomontana A9 ......................... 36

Hình 3.16. Biểu đồ tốc độ tăng trưởng đường kính khuẩn lạc của chủng

C.takaomontana A9 ................................................................................... 37

vii

Hình 3.17. Hình ảnh khuẩn lạc chủng A9 trên các môi trường ..................... 38

Hình 3.18. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9 dưới kính hiển vi

quang học (độ phóng đại 400 lần) ................................................................ 40

Hình 3.19. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9 dưới kính hiển vi

quang học (độ phóng đại 400 lần) ................................................................ 40

Hình 3.20. Chủng nấm A9 nuôi lỏng tĩnh trên các môi trường ..................... 42

Hình 3.21. Sinh khối tươi của chủng A9 trên các môi trường ....................... 42

Hình 3.22. Chủng C.takaomontana A9 nảy mầm trên các môi trường DD ...... 43

Hình 3.23. Thể quả tươi của chủng A9 trên các môi trường DD .................. 44

Hình 3.24. Sắc kí đồ HPLC UV 260 nm của chất chỉ thị Adenosine (A) và của

mẫu (B) ........................................................................................................ 45

Hình 3.25. Sắc kí đồ MS ESI Positive của chất chỉ thị Adenosine ............... 46

Hình 3.26. Sắc kí đồ Sim 806,0 của chất chỉ thị Beauvericine (A) và

của mẫu (B) ............................................................................................... 47

Hình 3.27. Sắc kí đồ MS - ESI Positive của chất chỉ thị Beauvericine .... 48

viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MT : Môi trường

LT : Lỏng tĩnh

HHL : Hoạt hóa lỏng

: Các mẫu thu thập tại Việt Nam VN3,4,6,7,8,9

: Các chủng nấm đã phân lập A3,6,7,8,9

DD : Môi trường dinh dưỡng

OD : Opfical Density

PCR : Polymerase Chain Reaction

ITS : Internal transcribed spacer

HPLC : High-performance liquid chromatography

MỞ ĐẦU

Cordyceps spp. là nhóm các loài nấm gây bệnh ở côn trùng, còn được gọi

là Đông trùng Hạ thảo dựa vào đặc điểm sinh trưởng và phát triển của chúng,

theo đó mùa đông nấm ký sinh trên vật chủ ở giai đoạn hệ sợi, mùa hè mọc

thành cây nấm.

Cordyceps spp. được biết đến là dược liệu quý sử dụng trong y học cổ

truyền Trung Hoa. Đông trùng hạ thảo có nhiều hoạt chất sinh học có giá trị quý

như Adenosine, Cordycepin, Cordyceptic acid, D manitol, Beauvericin, nhóm

hoạt chất HEAA (Hydroxy Ethyl Adenosine Analogs)… với tác dụng tăng

cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư, điều trị hen suyễn, viêm phế quản, hạn

chế khả năng suy thận, tiêu viêm, ức chế nhiều loại vi sinh vật có hại… Không

chỉ được sử dụng trong dược phẩm, Đông Trùng Hạ thảo còn được dùng làm

thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị một số bệnh trong đó có ung thư và tăng

cường sức khỏe.

Trên thị trường Việt Nam hiện đang lưu hành một số sản phẩm Đông trùng

Hạ thảo như Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana

xuất xứ Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật Bản nhưng đa phần là của Trung Quốc.

Trong thực tế, C.sinensis mới chỉ tìm thấy ở Tây Tạng, việc nghiên cứu

nhân nuôi nhân tạo cho đến nay chưa hiệu quả, sản phẩm vẫn phải khai thác

từ tự nhiên nên giá thành rất cao. C.militaris đã được nghiên cứu nuôi nhân

tạo trên nhiều quy mô từ nhỏ đến lớn ở Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Hàn

Quốc… Việt Nam cũng đã tiến hành nhân nuôi ở quy mô nhỏ, nhưng chưa

chủ động được giống, còn phụ thuộc vào nước ngoài, nên không chủ động và

khó kiểm soát được chất lượng của giống cũng như sản phẩm tạo ra.

Trong khi đó, các nghiên cứu cho thấy, C.takaomontana có gần như đầy đủ

các hợp chất sinh học quý như C.militaris và C.sinensis tuy hàm lượng thấp hơn.

Đặc biệt, dẫn xuất nhóm acetoxyscirpenol chỉ có trong C.takaomontana có

tác dụng diệt nhiều loại tế bào ung thư với giá trị IC50 ở mức mg/ml [20,30],

mạnh hơn so với thuốc chữa ung thư cisplatin từ 4 đến 6,6 lần [36] và

Beauvericin với 12 tác dụng gây độc nhiều dòng tế bào ung thư người với các

liều gây độc khác nhau, kháng được 10 loại vi khuẩn gram dương và 9 loại vi

khuẩn gram âm gây bệnh trên người... [42].

Ở Việt Nam, Phạm Quang Thu và cộng sự năm 2009 và 2010 đã phát hiện

C.takaomotana tại vườn Quốc gia Tam Đảo. Ở khu bảo tồn tự nhiên Pù Huống,

Nghệ An cũng thu thập được 29 mẫu, trong đó có C.takaomontana. Trần Ngọc

Lân và cộng sự năm 2008 đã xác định được trong hơn 200 mẫu có chi nấm

Cordyceps gồm 15 loài, đặc biệt chi C.takaomontana có 11 loài, trong đó

Isaria tenuipes (thể vô tính của C.takaomontana) là loài phổ biến ở vườn Quốc

gia Pù Mát [12].

Có thể thấy rằng, nguồn gen nấm C.takaomontana ở Việt Nam rất phong phú,

có thể khai thác nên chủ động được giống. Ngoài ra, thời gian nhân nuôi ngắn,

nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu và sản xuất loại nấm này như gạo, nhộng

tằm... ở Việt Nam rất dồi dào. Vì vậy, việc nghiên cứu khai thác, phát triển

nguồn gen nấm C.takaomontana chứa hoạt chất sinh học quý làm dược liệu có

tính khả thi, có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn, góp phần nâng cao sức khỏe

cộng đồng, mở ra khả năng phát triển một số ngành nghề mới, đầy tiềm năng.

Với những lý do như trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu

tuyển chọn chủng nấm Cordyceps takaomontana từ rừng tự nhiên Việt Nam có

khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị”.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu tuyển chọn được chủng nấm Cordyceps takaomontana từ rừng

tự nhiên Việt Nam có khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Thu thập, mô tả đặc điểm hình thái mẫu nấm, thuần khiết một số chủng

nấm C.takaomontana.

- Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và phát triển của chủng thuần khiết ( hệ sợi,

khả năng sinh bào tử).

- Nghiên cứu trình tự ITS của chủng nấm C.takaomontana tuyển chọn.

- Nghiên cứu môi trường thạch thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển

của nấm C.takaomontana.

- Nghiên cứu môi trường lỏng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển

của nấm C.takaomontana.

- Nghiên cứu khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học có giá trị

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1. Tổng quan về nấm Cordyceps spp.

1.1.1. Giới thiệu về nấm Cordyceps spp.

Cordyceps spp. (tên gọi khác là Đông trùng Thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo

Đông trùng), là các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành

của một số loài côn trùng. Vào mùa đông, sâu non, sâu trưởng thành của một số

loài nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm, gây

chết và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm nguồn dinh dưỡng để nấm

phát triển. Ở giai đoạn này, nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng

hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển giai đoạn, hình

thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu.

Theo hệ thống phân loại, Cordyceps spp. thuộc chi Cordyceps, họ

Clavicipataceae, bộ Hypocreales, lớp nấm Ascomycotes, ngành Ascomycota

[52]. Cordyceps spp. là loại nấm dược liệu quý và được sử dụng rộng rãi trong y

học cổ truyền. Hiện nay, Cordyceps có hơn 400 loài khác nhau, tính riêng ở

Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông Trùng Hạ Thảo như Cordyceps

liangshanensis Zhang, Cordyceps gansuensis Zhang, C. Shanxiensis Liu,…

Ngoài ra, còn có các chủng Cordyceps militaris, Cordyceps nutans Pat,

C.tricentri Yasuda, C.gunnii Berk. Tuy nhiên cho đến nay, các nước trên thế giới,

mới chỉ nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng nhân tạo một số loại nấm như

Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana,…Theo một

số nghiên cứu cho thấy, các chủng nấm Cordyceps spp. khác cũng được tìm thấy

tại một số nước châu Âu ( Pháp, Nga, Đức), và một số nước Châu Á khác (Nhật Bản,

Hàn Quốc, Thái Lan, Việt Nam).

Cordyceps takaomontana được phát hiện và mô tả lần đầu tiên bởi Yakush.

và Kumaz. (1941) tại đảo Honshu - tỉnh Musashi (nay là quận Saitm và Kanagawa

- Tokyo - Nhật Bản). C.takaomontana tồn tại ở 2 thể hữu tính và vô tính (hình 1.1),

còn được gọi bằng nhiều tên khác là Paecilomyces tenuipes hoặc Isaria

japonica [9].

Hình 1.1. Nấm C.takaomontana/ thể vô tính và hữu tính (nguồn: Cordyceps.us)

+ Thể hữu tính: Nấm (stromata) mọc đơn lẻ hoặc mọc thành cụm, chùm

trên nhộng thuộc bộ Cánh vảy, nấm màu vàng chanh nhạt, cuống nấm hình trụ,

kích thước 10 - 45 x 1 - 1,5mm. Thể quả dạng chai (perithecia), có hình dạng

bình nổi trên bề nặt của phần chóp nấm. Túi bào tử hình chùy, kích thước 1100 -

1200 x 2,2 - 3,0µm, phần mũ của túi bào tử có hình trứng đến gần cầu, kích

thước 2,5 x 3,0µm. Bào tử túi dài, mảnh và dễ bị gãy thành đoạn bào tử, đoạn

bào tử có kích thước 6 - 8 x 0,5 - 0,8µm [9].

+ Thể vô tính: Hình thái của thể quả nấm (synnemata) bao gồm 2 phần

chính: Cuống nấm và tế bào sinh bào tử vô tính (conidiogenous structure).

Cuống của nấm màu vàng chanh, kích thước rất biến động tùy thuộc vào điều

kiện mọc và số lượng thể quả có trên một ký chủ, thường có chiều dài từ 0,5

đến 4,5cm. Phía trên của cuống nấm là các tế bào sinh bào tử vô tính được

phân thành nhiều nhánh và căng phồng chứa đầy bào tử bụi màu trắng, khô và

rất dễ rời khỏi tế bào sinh bào tử. Bào tử vô tính có hình hạt đậu, hơi cong ở

giữa, có kích thước nhỏ 0,5 - 1,0 x 2,5 - 3,0µm [9] (hình 1.2).

Hình 1.2. Nấm Isaria tenuipes/ thể vô tính của C.takaomontana (nguồn: Daniel Guez, 1989)

1.1.2. Quá trình xâm nhiễm của nấm Cordyceps spp. vào cơ thể côn trùng

Quá trình xâm nhiễm nấm vào côn trùng trải qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn xâm nhập: Bắt đầu từ khi bào tử nấm nảy mầm đến lúc kết thúc

việc xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng. Bào tử nấm sau khi mọc mầm, phát

sinh mầm bệnh, giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần

chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như protease,

chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, cenlulolase.

Các enzyme nay được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục với mức độ khác

nhau giữa các loài và ngay cả trong một loài. Enyzm protease và chitinase hình

thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng và lớp biểu bì

(thành phần chính là protein). Quan trọng nhất là enzyme phân hủy protein

(protease) và enzyme phân hủy chitin (chitinase) của côn trùng. Hai enzyme này có

liên quan trực tiếp đến hiệu quả diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng.

Giai đoạn sống ký sinh của nấm: Hệ sợ nấm trong khoang cơ thể tiếp tục

phát triển, hình thành nhiều sợi nấm ngắn. Khi hệ sợi hình thành trong cơ thể, nó

phân tán khắp nơi, theo dịch máu, phá hủy và làm giảm tốc độ lưu thông máu.

Toàn bộ các bộ phân nội quan bị xâm nhiễm.nấm thường xâm nhiễm vào hệ hô

hấp, làm giảm khả năng hô hấp của ấu trùng khiến hoạt đông của côn trùng trở

nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài. Kết quả

làm vật chủ mất khả năng kiếm soát hoạt động sống và dẫn đến chết [41].

Ở giai đoạn cuối cùng (sau khi vật chủ chết), sợi nấm phát triển rất nhanh

đồng thời tiết độc tố phá hủy hệ thống miễn dịch của côn trùng. Trong giai đoạn

gây độc vật chủ, một số loài nấm giết chết vật chủ trước khi gây độc toàn bộ cơ

thể côn trùng [12].

1.1.3. Tình hình nghiên cứu chi Cordyceps trên thế giới

1.1.3.1. Đa dạng và phân bố

Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994) đã mô tả 33 loại nấm Đông Trùng Hạ

Thảo tại Nhật Bản gồm: C.arigota, C.Longissisma, C.yakushimensis, C.sobolifera,

C.heteropoda, C.tricentri, C.coccidiicola, C.nutans, C.ruinosa, C.crilalis, C.militaris,

C.takaomontana, C.neovolkiana, C.nakazawai, C.purpureostroma, C.ferruginosa,

C.annullata, C.clavata, C.atrovirens, C.gracilioides, C.stylophora, C.macularis,

C.discoideocapitata, C.spheciceophala, C.japonensis, C.japonica, C.ophioglossoides,

C.capita, C.nigripoda, C.roeostroma, C.michiganensis, C.subbssesilli [54].

Hình 1.3. Nấm Cordyceps crinalis (nguồn: cordyceps.us)

Năm 2000, Mao X.L và cộng sự đã mô tả đặc điểm hình thái, ảnh minh họa

và công dụng cho 13 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, gồm

các loài C.hawkesii Gray, Cordyceps barnesii Thwaites, C.nutans Pat, C.capiata

(Holmsk; Fk) Link, C.crassiora Zang, Yang et Li, C.gunii (Berk), C.kyushensis

Kobayasi, C.martialis Gray, C.tubeculata (Leb), C.ophoglossoides (Ehrenb) Link,

C.sobolifera (Hill).Berk, C. sinensis (Beck) Sacc, C.militaris Link [35].

Hình 1.4. Nấm Cordyceps sinensis (Beck) (nguồn: nepl.com.np)

Tại Hàn Quốc, Sung Jae Mo và cộng sự (2000) đã mô tả đặc điểm hình

thái của 25 loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm các loài: C.adaesanensis,

C.agriota Kawamura, C.bifisispora, C.crassispora, C.scarabaeicola, C.sinensis,

C.discoideocapiata, C.formicarum, C.gemiculata, C.gracilis, C.heteropoda,

C.ishikariensis, C,kyushuensis, C.yongmoones, C.nutans, C.ochraceostroma,

C.ophoglossoides, C.pentatoni, C.pruinosa, C martialis, C.militaris, C.resea,

C.sphecocephala, C.tricentri [50].

Hình 1.5. Nấm Cordyceps militaris (nguồn: Daniel Winkler, 2013)

1.1.3.2. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. trên thế giới

Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps spp. được tiến hành ở nhiều

nước trên thế giới như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ,… Tại Hàn Quốc, một

số phòng thí nghiệm đã sử dụng giá thể là tằm, nhộng để nuôi trồng thể quả [27]. Tại

thành phố Hayward, Bang California, Mỹ, Công ty Công nghệ sinh học BIOKEN đã

nuôi trồng quy mô công nghiệp C.militaris trên giá thể gạo. Sản phẩm của các khu

nuôi của các nước được tiêu thụ tại nội địa và xuất ra nước ngoài.

Tại Trung Quốc, thủ phủ của Đông trùng hạ thảo, hình thành một số khu

nuôi chuyên biệt cho loại nấm Cordyceps tại một số tỉnh như: Thượng Hải, Quảng

Châu, Vân Nam…và cho ra thị trường mỗi năm hàng trăm kilogram sản phẩm.

Năm 2005, Dong và cộng sự tiến hành nghiên cứu thành phần môi trường

nhân giống lỏng tĩnh cho sự phát triển của sợi nấm C.sinensis. Các tác giả đã chỉ

ra rằng, điều kiện môi trường tối ưu để thu được sinh khối sợi nấm cao nhất gồm

5% đường sucrose, 1% peptone và 0.3% cao nấm men. Sau 40 ngày nuôi cấy

trên môi trường tối ưu, sinh khối nấm tươi thu được đạt trên 20 mg/l [21].

Đã có nhiều công trình công bố trên thế giới về lựa chọn môi trường tối

ưu cho nhân giống cấp I nấm Cordyceps spp.. Trong nghiên cứu của mình,

Bhushan kết luận chủng nấm C.militaris được tối ưu trên các môi trường giàu

dinh dưỡng như SDAY, SMAY, CZYA có thể đảm bảo được các yêu cầu về

sinh trưởng của sợi nấm. Năm 2013, Rupesh tiến hành so sánh môi trường

SDAY với các môi trường khác nhằm tìm được môi trường nhân giống tối ưu

cho sợi nấm C.sinensis [43]. Kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng, trong tổng số 6

môi trường nghiên cứu, khuẩn lạc của chủng C.sinensis đạt tốc độ sinh trưởng

lớn nhất trên môi trường SDAY (tốc độ sinh trưởng 3.74mm/ngày). Tác giả 8

cũng nghiên cứu các mức nhiệt độ và pH khác nhau đối với tốc độ sinh trưởng

của nấm trên môi trường SDAY. Kết quả nghiên cứu khẳng định SDAY có tác

dụng hỗ trợ tối đa cho sự sinh trưởng của sợi nấm C.sinensis [43].

1.1.4. Tình hình nghiên cứu Cordyceps tại Việt Nam

1.1.4.1. Đa dạng và phân bố

Kết quả nghiên cứu của Trịnh Tam Kiệt và cộng sự cho thấy, ở Việt Nam

có 3 loài thuộc chi Cordyceps đó là Cordyceps marialis Speg., Cordyceps

sinensis (Berk) Sacc. và loài C.sobolifera (Hill) Berk & Br. Kết quả nghiên cứu

của nhóm tác giả cũng chỉ ra rằng, có 21 tỉnh của Việt Nam có sự phân bố của

nấm Đông trùng Hạ thảo gồm: Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc

Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình,

Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh Hòa,

Ninh Thuận, Bình Thuận, Tây Ninh [15,16].

Năm 2009, Phạm Quang Thu đã phát hiện ở 2 tỉnh Vĩnh Phúc và Bắc

Giang có sự xuất hiện của 2 loài nấm Đông trùng hạ thảo mới, đó là Cordyceps

nutants và Cordyceps gunnii [6,7].

Phạm Thị Thùy (2009) tiến hành thu thập nấm Cordyceps ở vườn quốc

gia Cúc Phương, tỉnh Ninh Bình. Kết quả đã phát hiện được loài Đông trùng

Cordyceps militaris - loài lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam. Loài

nấm này phân bố ở rừng tự nhiên có độ cao từ 1.900m đến 2.100m so với mực

nước biển. Ký chủ của loài này là nhộng thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, nấm

dài 2 - 6,5cm, hình chùy, phần thân và cuống nhỏ, phần đầu phình to có chiều

rộng đến 0,6cm. Màu sắc của phần cuống nấm và phần sinh sản khác nhau, phần

cuống nấm nhẵn và có màu da cam nhạt, phần sinh sản có màu da cam đậm và có

nhiều mụn nhỏ. Thể quả dạng chai được cắm rất lỏng lẻo hoặc cắm sâu một phần

vào mô của nấm ở phần sinh sản. Túi bào tử có kích thước 300 - 510µm x 3,50 -

5µm, phần mũ gắn trên túi thể quả có kích thước 3,50 - 5µm [10].

Năm 2010, nấm Cordyceps takaomontana được phát hiện và ghi nhận lần

đầu tiên tại Việt Nam bởi Phạm Quang Thu và Nguyễn Mạnh Hà. Trong nghiên

cứu của mình, các tác giả đã mô tả đặc điểm hình thái và sự phân bố của nấm

C.takaomontana. Kết quả chỉ ra rằng, loài nấm này phân bố ở rừng nhiệt đới lá rộng

thường xanh, ở độ cao từ 800 – 1000m so với mặt nước biển tại Vườn Quốc gia Ba

Vì (Hà Nội) và Vườn Quốc gia Tam Đảo (Vĩnh Phúc). C.takaomontana là loài

nấm ưa ẩm, phân bố dọc theo khe cạn, nấm hình thành quả thể trong điều kiện có

ánh sáng tán xạ yếu, độ tàn che thích hợp từ 0,7 - 0,8. Màu sắc và kích thước của

thể quả thay đổi theo độ che phủ của rừng. Ký chủ của nấm C.takaomontana là

nhộng của côn trùng thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera [9].

Trần Ngọc Lân và cộng sự (2011) đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của

nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes (Peck) Samson ở vườn Quốc gia Pù Mát

và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống, Nghệ An. Kết quả cho thấy, sinh cảnh

sống của I.tenuipes thường là những nơi ẩm như trong tàn dư thực vật hay lớp

đất mặt trong rừng tự nhiên. Về hình thái synnema, kiểu hình hoa lục bình trắng

là phổ biến nhất với tần suất bắt gặp 52.85%. Tác giả cũng chỉ ra rằng,

I.tenuipes sinh trưởng trên môi trường PDA, khuẩn lạc đạt đường kính lớn nhất

23,66mm sau 10 ngày và độ dày đạt 2,09mm sau 6 ngày. Khuẩn lạc có màu

trắng đến vàng, sau 4 đến 7 ngày xuất hiện bào tử dạng bột, màu trắng [13].

Nguyễn Thị Thúy (2015) đã tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm của

loài nấm ký sinh côn trùng Isaria javanica (Frider. & Bally) Samson & Hywel-

Jone ở vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An. Sau 3 năm khảo sát (từ năm 2011 đến

2013) tại vườn Quốc gia Pù Mát, nhóm tác giả đã thu thập, phân lập và định

loại được 18 chủng nấm Isaria javanica, gồm 6 chủng ký sinh trên sâu non bộ

Cánh vảy 8 chủng nấm ký sinh trên sâu trưởng thành bộ Cánh màng và 4

chủng ký sinh trên sâu trưởng thành bộ Nhện lớn. Mẫu vật được tìm thấy trong

tàn dư thực vật chiếm 66.67%, mặt dưới lá cây chiếm 33.33%. Nấm màu trắng

sau chuyển sang màu xám nhạt hoặc xám tro bao phủ một số phần hoặc toàn

bộ cơ thể vật chủ. Cuống bào tử đính dạng đơn hoặc phân nhánh, thể bình có

dạng hình trụ, cổ thon dài; lích thước 8,40 – 14,20 x 2,20 – 2,80 μm; bào tử

đính hình thoi, đôi khi hình trụ, trơn nhẵn, màu trong suốt sau chuyển màu kem, khi

thành thục có màu xám nhạt đến xám tro, kích thước 4,50 – 7,40 x 1,40 – 1,70 μm. Khuẩn lạc trên môi trường PDA ở 250C mọc tương đối nhanh, đường kính đạt

23,14 mm sau 9 ngày. Bào tử xuất hiện vào ngày thứ 3 sau nuôi cấy, màu trắng

sau chuyển sang màu kem đến xám nhạt hoặc xám tro khi thành thục [5].

Cordyceps nutans: nấm mọc ở phần đầu, ngực và phần cuối bụng bọ

xít, nhưng chủ yếu ở phần đầu và ngực. Ký chủ của nấm là bọ xít vẫn còn

nguyên hình dạng hoặc còn một phần nhưng rất dễ nhận dạng, nằm ngay dưới

lớp thảm mục [11].

Hình 1.6. Nấm C.nutans (nguồn: Tô Quang Huyên, 2012)

Cordyceps sphecocephala: Nấm mọc từ phần đốt ngực trước của ký chủ.

Nấm ký sinh trên ong và phân bố ven đường mòn, đường lô trên rừng tự nhiên

(độ cao 1200m), dưới tán rừng cây gỗ lá rộng (thành ngạnh, chẹo, trám, lim, dẻ,

gụ, sến). Sợi nấm mọc nhô lên khỏi lớp lá khô, thảm mục, ký chủ của nấm nằm

ngay dưới lớp thảm mục rừng [11].

Hình 1.7. Nấm C.sphecocephala (nguồn: Tô Quang Huyên, 2012)

Cordyceps elongatostromata: Nấm có màu vàng, thuôn dài, chiều dài 60 -

130mm, chiều ngang thân nấm từ 1 - 2,50mm. Nấm ký sinh trên ong và được

tìm thấy trong rừng tự nhiên (độ cao từ 900m), độ ẩm cao, độ tàn che chủ yếu từ

0,7-0,8; sinh cảnh gồm: rừng gỗ lá rộng trám, chẹo, ngát. Nấm mọc lên khỏi lớp

thảm mục rừng, nổi trên lớp lá khô, thảm mục [11].

Cordyceps prolifica: Nấm dài và mảnh, mọc thành cụm trên ký chủ và trên

mỗi một cây lại phân thành nhiều nhánh nhỏ. Nấm ký sinh trên sâu non vủa ve và

được tìm thấy ven đường mòn, dưới đất xen lẫn với lớp thảm khô trên rừng tự

nhiên (đô cao 1000m), dưới tán rừng cây gỗ lá rộng (chẹo, trám, lim, sến, giổi);

độ ẩm cao, độ tàn che 0,8. Nấm mọc nhô lên khỏi lớp thảm mục rừng, trong lớp

thảm mục [11].

Hình 1.8. Nấm Cordyceps prolifica (nguồn: Tô Quang Huyên, 2012)

Cordyceps pseudomilitaris: Nấm có màu đỏ da cam, phía dưới gốc nấm

sát với ký chủ có màu trắng, xung quanh gốc nấm với ký chủ có một lớp màu

trắng (dày khoảng 1-3mm) bao phủ lên ký chủ. Nấm ký sinh trên nhộng, được

tìm thấy trong rừng tự nhiên (độ cao từ 950-1100m), dưới tán rừng hỗn giao cây

gỗ lá rộng, xen lẫn nứa, vầu, giàng. Ký chủ của nấm nămg trong thân nứa, lá

mục, một phần thân nấm và thể quả màu đỏ da cam nối lên khỏi lớp lá khô [11].

Hình 1.9. Nấm Cordyceps pseudomilitaris (nguồn: Tô Quang Huyên, 2012)

1.1.4.2. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. ở Việt Nam

Năm 2012, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng

đã nghiên cứu nhân nuôi thành công nấm đông trùng hạ thảo tằm dâu (Paeclomyces

tenuipes hay Cordyceps takaomontana) chủng Hàn Quốc và chế biến một số sản

phẩm như rượu, viên nang, viên nén.

Lê Văn Vẻ và cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu công nghệ nuôi

trồng nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris L.ex Fr.) ở Việt Nam. Tác giả tiến

hành nuôi trồng nấm C.militaris trên 4 môi trường MT1, MT2, MT3, MT4, kết

quả cho thấy môi trường MT4 là môi trường có năng suất sinh học cao nhất

(11.36 ± 1.34%). Kết quả cũng chỉ ra rằng, trong bốn loại cơ chất nền (3 loại

gạo lứt A, B, C và thóc D) được đánh giá với năng suất sinh học đạt 10,92 ±

1,96%, gạo B được xem là cơ chất nền phù hợp nhất để nuôi trồng C.militaris.

Ảnh hưởng của số lần nuôi cấy đến thoái hóa giống cho thấy F1 vẫn có các

tính trạng tương tự F0, F5 bắt đầu có hiện tượng thoái hóa giống, F8 có các dấu

hiệu thoái hóa giống rõ ràng như màu sắc quả thể thay đổi, mật độ hệ sợi thưa,

số mầm quả thể ít và năng suất sinh học chỉ đạt 0,95 ± 0,14% [1].

1.1.5. Thành phần hóa học, hoạt chất sinh học và giá trị dược liệu của nấm

Cordyceps spp.

1.1.5.1. Thành phần hóa học và hoạt chất sinh học

Các phân tích hoá học cho thấy, trong sinh khối (biomass) của Đông trùng

Hạ thảo chứa 17 loại acid amin khác nhau. Ngoài ra còn có D-mannitol, lipid và

nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na...). Quan trọng hơn là trong Đông trùng

Hạ thảo có nhiều chất mang hoạt tính sinh học cao đang được các nhà khoa học

dần khám phá ra nhờ các tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất tự nhiên. Nhiều

hoạt chất trên được chứng minh là có giá trị dược liệu thần kỳ. Trong đó phải kể

đến cordiceptic acid, cordycepin, adenosine và nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy -

Ethyl - Adenosine - Analogs).

Năm 2007, In - Pyo Hong tiến hành nghiên cứu xác định các hợp chất của

chủng Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson. Kết quả cho thấy, các đường hòa

tan được tìm thấy là glycerol, glucose, mannitol, sucrose với hàm lượng 24 mg/g

khô. Arginine, glycine, proline và tyrosine là các axit amin chính được phát

hiện. Kết quả nghiên cứu còn chỉ ra rằng quả thể của P.tenuipes là nguồn cung

cấp axit béo như oleic, linoneic và có thể sử dụng như một nguồn thực phẩm có

lợi cho sức khỏe [27].

Nguyễn Mậu Tuấn (2011) phân tích về thành phần sinh hóa trong nấm

“Đông trùng hạ thảo tằm dâu” (Paecilomyces tenuipes) cho thấy, hàm lượng

protein 59.61 - 70.45%, hàm lượng mannitol 1.21 - 1.78%, tổng acid amin 27.75

- 48.02% với các thành phần vi lượng và vitamin cao.

1.1.5.2. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps spp.

Cordycepin: là một dạng analoge của Adenosine (3’-deoxyadenosine). Chất

này có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn, chống sự xâm nhiễm của virus, ngăn ngừa ung

thư và có tác dụng rất tốt cho những người mắc bệnh lao.

Adenosine: Adenosine có tác dụng giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và

tim mạch, cải thiện năng lực cơ bắp, giúp điều hòa lại nhịp tim, khắc phục các hiện

tượng loạn nhịp, chậm nhịp tim. Bên cạnh đó, adenosine còn có tác dụng chống

thiếu dưỡng khí, góp phần quan trọng vào quá trình thúc đẩy giấc ngủ, điều hòa quá

trình sinh hóa giúp giấc ngủ sâu và ngon hơn, giúp nâng cao sức khỏe con người.

Nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy - Ethyl - Adenosine - Analogs): đây là

nhóm các hợp chất có hoạt tính sinh học rất mạnh, đang được các nhà khoa học

quan tâm do khả năng hỗ trợ hệ miễn dịch, chống lại sự xâm nhiễm của một số

retrovirus như virus HIV...

Beauvericine: là một loại độc tố được sản xuất bởi nhiều loại nấm như

Beauveria basiana, Isaria tenuipes,… Beauvericine được sử dụng trong kiểm

soát các bệnh của cây trồng nhờ hoạt tính kháng khuẩn (kháng lại các tác nhân

gây bệnh: nấm, vi khuẩn…) [39] và khả năng ức chế tế bào ung thư [42].

Các tài liệu của y học Trung Hoa đã chỉ ra rằng, quả thể của nấm P.

tenuipes có giá trị cao về mặt dược liệu do các tác dụng về dược lý và sinh học

của chúng như Leucinostatins A, D, Polygalactosamine kháng khối u, Saintopin,

Sphingofungins E và F, UCE1002, Paeciloquinones A, B, C, D, E và F,

Ergosterol peroxide,… Các hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol

tách chiết từ nấm P. tenuipes nuôi cấy nhân tạo có khả năng ức chế các dòng

ung thư ở người như tế bào khối u dạ dày, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư

ruột kết - ruột thẳng với giá trị IC50 rất thấp (thậm chí ở mức ng/ml) (Lee và

cộng sự, 2006 [30], Bunyapaiboonsri và cộng sự, 2009) [20] và mạnh hơn so với

thuốc chữa ung thư cisplatin từ 4 đến 6,6 lần (Nam và cộng sự, 2001) [36].

Ngoài ra lớp chất này cũng có tác dụng ức chế protein vận chuyển SGLT-1 liên

quan đến bệnh tiểu đường.

Y học phương Tây cũng đã công nhận tính năng bổ dưỡng của nấm

Cordyceps spp., dịch chiết của loại nấm này có khả năng nâng cao thể lực, điều

hòa khí chất, đặc biệt những người do tính chất công việc phải ngồi liên tục và

ít vận động. Dựa trên kết quả nghiên cứu về tác dụng nâng cao sức luyện tập,

khả năng chịu đựng và làm giảm mệt mỏi ở những người trong độ tuổi trung

niên 40 đến 70, các nhà khoa học thuộc trung tâm Pharmanex, California đã

phát triển một loại thuốc lấy tên là Cordymax chứa chiết xuất của nấm

Cordyceps và được thử nghiệm trên 131 người tình nguyện trong 12 tuần và

cho kết quả khả quan [47].

Các nghiên cứu y học và dược học đã chứng minh được nấm Đông trùng Hạ

thảo có những giá trị sử dụng như: giảm thiểu tác dụng xấu của các tân dược đối

với thận, thí dụ đối với độc tính của Cephalosporin A; tăng cường lưu thông

máu, điều tiết nồng độ đường và điều hòa huyết áp; khắc phục hiện tượng thiếu

máu cơ tim và giữ ổn định nhịp tim; tăng cường hệ miễn dịch; làm chậm quá

trình lão hóa của cơ thể, hạn chế bệnh tật ở người cao tuổi; giảm tác hại của tia

gamma đối với cơ thể; hạ cholesteron trong máu và chống xơ vữa động mạch;

tăng cường chức năng tiêu hóa và hấp thu các chất dinh dưỡng; kháng viêm và

tiêu viêm…

Năm 2009, Nguyễn Mậu Tuấn và cộng sự tiến hành đánh giá hiệu quả của

dịch chiết nấm Đông trùng Hạ thảo tằm dâu (Paecilomyces tenuipes) đến khả

năng bơi của chuột. Chuột thí nghiệm được cho uống dịch nấm với lượng

250µl/chuột/ngày tương đương với 890mg nấm khô/kg trọng lượng cơ thể, trong

khi nhóm chuột đối chứng được uống nước lọc trong 4 tuần. Kết quả cho thấy,

thời gian bơi cho tới khi kiệt sức của nhóm chuột được cho uống dịch chiết nấm

(Paecilomyces tenuipes) dài hơn so với nhóm đối chứng. Không có sự khác

nhau về trọng lượng của cơ thể chuột thí nghiệm và đối chứng [4].

1.2. Sơ lƣợc về hoạt chất Adenosine

1.2.1. Cấu trúc hóa học của Adenosine

Adenosine là một hợp chất hữu cơ gồm 1 phân tử adenine liên kết với phân tử

đường ribose (ribofuranose) bởi liên kết β-N9-glycosidic [29].

Công thức hóa học: C10H13N5O4, trọng lượng phân tử: 267.241 g/mol. Tên

theo IUPAC: (2R, 3R, 4R, 5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)

oxolane-3,4-diol.

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của Adenosine

1.2.2. Ứng dụng của Adenosine

Adenosine đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình sinh hóa như

trao đổi năng lượng (ATP, A, ADP), truyền tín hiệu (cAMP), đồng thời cũng có

vai trò trong điều hòa giấc ngủ [29]. Dưới điều kiện sinh lý, nồng độ Adenosine

bên trong tế bào tương đối thấp (<1mM) và các enzyme điều tiết chính chủ yếu

là adenosine kinase (AK), qua trung gian là các bước phosphoryl hóa ban đầu,

qua AMP và trở lại ATP. Bằng cách này, nucleoside được giữ bên trong tế bào.

Nồng độ Adenosine được tăng lên theo sự gia tăng hoạt động của phosphatase,

trong ức chế tế bào, các mô bị tổn thương, hoạt động mạnh hoặc ngừng hoạt

động của tế bào. Một phương thức chuyển hóa tự nhiện khác của Adenosine là

không thể đảo ngược để trở thành inosine, có nghĩa là tiếp tục bị phân chia thành

hypoxanthine, xanthine và axit uric. Quá trình này không chỉ thực hiện được bên

trong tế bào mà còn trong cả trong huyết tương [29].

Adenosine cũng đã được chứng minh là có tác dụng giảm kích thích thần

kinh, có nồng độ thấp bất thường ở bệnh nhân bị động kinh. Trong nghiên cứu

của mình, nhóm chuyên gia thuộc Viện nghiên cứu di sản của tiểu bang

Oregon, Đại học Khoa học và Y tế Oregon cùng Đại học Tufts ở Boston đã

thiết kế một mảnh ghép nhỏ như tơ có cấu trúc phân hủy sinh học và hoàn toàn

vô hại, với chức năng lưu trữ và giải phóng Adenosine để hạn chế các cơn co

giật. Sau khi cấy ghép, Adenosine sẽ liên tục giải phóng trong 10 ngày và tự

hòa tan vào cơ thể. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhóm chuột được ghép tơ

chứa Adenosine trong não có cường độ tái phát co giật ít hơn 4 lần so với

nhóm không được cấy ghép.

Một vai trò quan trọng phải kể đến của thụ thể Adenosine là sự hiện diện

trong tế bào tạo xương. Adenosine hoạt động dựa trên liên kết của 4 thụ thể A1,

A2A, A2B, A3, có khả năng điều chỉnh mức cAMP nội bào [29]. A1 của

Adenosine thúc đẩy sự hợp nhất bạch cầu đơn nhân của người trong ống nghiệm

hình thành nên thông tin và chức năng của tế bào xương [29]. Hiện nay, có

nhiều bằng chứng cho thấy sự hiện diện của Adenosine trong cân bằng nội môi

của xương, điều đó liên quan đáng kể tới các bệnh về xương như viêm khớp và

loãng xương [29].

1.3. Sơ lƣợc về hoạt chất Beauvericine

1.3.1. Cấu trúc hóa học của Beauvericine

Beauvercine là hoạt chất thuộc nhóm kháng sinh, chứa hai tiểu phần D-

hydroxyisovaleryl và N-methylphenylalanyl.

Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của Beauvericin

Công thức hóa học: C45H57N3O9, trọng lượng phân tử: 783.96 g/mol

Tên theo IUPAC: (3S, 6R, 9S, 12R, 15S, 18R)-3,9,15-Tribezyl-6, 12, 18-

triisopropyl - 4,10,16 trimethyl - 1,7,13 – trioxa - 4,10,16 - triazacyclooctadecane-

2,5,8,11,14,17-hexone.

Về mặt hóa học, beauvericin là một hexadepsipeptide cyclic xen kẽ

methyl-phenylalanyl và hydroxy-iso-valeryl dư lượng, có khả năng tạo phức

ion cho phép beauvericin vận chuyển kim loại kiềm thổ và các ion kim loại

kiềm qua màng tế bào.

1.3.2. Ứng dụng của Beauvericine

Beauvericin là hoạt chất sinh học có khả năng kháng mạnh lên các vi

khuẩn gây hại cho con người, động vật và vi khuẩn gây độc lên cây trồng.

Không giống như những kháng sinh khác (như penicillin) là ngăn cản sự tổng

hợp peptidoglucan của vi khuản gram (+), Beauvericin ức chế theo hướng có thể

tấn công vào bào quan của vi khuẩn hoặc hệ thống enzyme của vi khuẩn đó. Dựa

vào tính kháng khuẩn kháng lại các tác nhân gây bệnh trên thực vật, hoạt chất

này có thể sử dụng trong kiểm soát các bệnh của cây trồng [53]. Bên cạnh đó,

theo báo cáo của Qinggui Wang và cộng sự, Beauvericin có tác dụng diệt nấm,

Beauvericin kết hợp với ketoconazole ở liều lượng 0,1 mg/ml trên chuột bị

nhiễm nấm Candida parapsilosis, kết quả cho thấy tỷ lệ sống sót của chuột tăng

lên. Về hoạt tính kháng virus với mức gây độc tế bào là IC50 là 1.9 µmol [42].

Bên cạnh đó, Beauvericin còn có khả năng ức chế ung thư nguyên bào sợi

thận ở khỉ xanh châu Phi Vero (IC50 10µg/ml), ung thư vú ở người BC-1 1 (IC50

15µg/ml), ung thư thần kinh trung ương ở người (glioma) SF-268 (IC50 1.8

µg/ml), ung thư tế bào phổi ở người NCI-H460, ung thư nhân biểu mô tuyến tụy

MIA Pa Ca-2,... Ngoài một số dòng tế bào kể trên, Beauvericin còn có khả năng

ức chế một số dòng tế bào ung thư khác như ung thư hạch, tế bào lympho B, tế

bào lympho T, bệnh Hodgkin, bệnh bạch cầu dòng tủy, ung thư bàng quang, ung

thư não, ung thư hệ thống thần kinh, đầu và ung thư cổ, ung thư biểu mô tế bào

vảy ở đầu và cổ, ung thư thận, ung thư phổi như ung thư phổi tế bào nhỏ và

không nhỏ ung thư phổi tế bào, neuroblastoma, ung thư tuyến tụy, ung thư tuyến

tiền liệt, ung thư da, ung thư gan, u ác tính, ung thư biểu mô tế bào vảy của thư

miệng, họng, thanh quản, ung thư ruột kết, ung thư cổ tử cung, ung thư biểu mô

cổ tử cung, ung thư máu, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư tuyến tụy. Như vậy,

có thể nhận thấy phổ ức chế lên các dòng tế bào ung thư của Beauvericin là

khá rộng, trên nhiều dòng tế bào. Vì vậy, việc nghiên cứu khả năng kháng các

dòng tế bào ung thư của Beauverincin đang được các nhà khoa học tập trung

nghiên cứu.

CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành từ 08/2014 đến 08/2015 tại Phòng Thí nghiệm

trọng điểm quốc gia về Công nghệ Gen đặt tại Viện Công nghệ Sinh học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Nguyên liệu

06 mẫu nấm ký sinh côn trùng được thu thập từ rừng Quốc gia Hoàng

Liên – Lào Cai, ký hiệu là VN3, VN4, VN6, VN7, VN8 và VN9.

Gạo lứt, khoai tây, nhộng tằm có nguồn gốc Việt Nam.

2.1.2. Hóa chất sử dụng

Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng

STT Tên hóa chất Hãng sản xuất

Trung Quốc 1 Glucose

Trung Quốc 2 Maltose

Ấn Độ 3 Cao nấm men

Peptone Ấn Độ 4

Ấn Độ 5 KH2PO4

Ấn Độ 6 MgSO4.7H2O

Trung Quốc 7 Amonicitate

Trung Quốc 8 CaCl2

Trung Quốc 10 Amonicitate

Ấn Độ 11 Thiamine hydrochloride (vitamin B1)

Merk, Đức 12 EDTA

Merk, Đức 13 SDS

Merk, Đức 14 Tris – HCl

Merk, Đức 15 Bromophenol Blue

Sigma 16 Choloroform

2.1.3.Thiết bị sử dụng

Bảng 2.2. Các thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị Xuất xứ

Tủ ấm Trung Quốc 1

Việt Nam 2 Máy lắc

Trung Quốc 3 Box cấy vô trùng

Trung Quốc 4 Nồi hấp khử trùng

Thụy Sỹ 5 Cân phân tích

Nhật Bản 6 Kính hiển vi Quang học

Mỹ 7 Máy PCR

Nhật Bản 8 Bể điện di

Nhật bản 9 Máy soi gel

Trung Quốc 10 Tủ vi khí hậu

2.1.4.Môi trường nuôi cấy

Bảng 2.3. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu (g/l)

Môi

trƣờng PDA SDAY SMAY HHL 1 HHL 2 HHL 3 DD 1 DD 3 DD 2

Thành phần Glucose 20 40 25 15 60 20

Fructose 20

Maltose 40 20

Peptone 10 2 5 5 5 5

Cao nấm men 20 20 5 5 5 5

1 2 2 1,5 1,5 1,5 KH2PO4

0.5 1,5 50 0,5 0,5 0,5 MgSO4.7H2O

Khoai tây 200

Amoni Citrate 1,5 1,5

1 CaCl2

Agar 20 20 20

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp vi sinh vật

2.2.1.1. Phân lập và thuần khiết vi nấm

Các mẫu thu thập được phân lập theo phương pháp của Kobayashi [24],

Samson và cộng sự [45].

- Tạo các khuẩn lạc riêng rẽ từ các mẫu ban đầu: Mẫu nấm thu về được cắt thành miếng và đặt lên đĩa môi trường PDA, nuôi ở 250C trong 5 đến 7 ngày.

Quan sát thấy trên đĩa có nấm và có thể có các vi sinh vật khác mọc lên. Dùng

que cấy chuyển phần nấm không nhiễm từ đĩa vừa nuôi cấy sang đĩa khác, tiếp

tục nuôi ở điều kiện và thời gian trên, để tạo ra được các khuẩn lạc riêng rẽ.

- Hòa tan 0,1 mm mẫu nấm từ đĩa petri trong 1 ml nước cất, hút 100µl dịch

vào ống eppendorf chứa 1ml nước cất và đảo đều.

- Hút 10 µl cho lên đĩa môi trường PDA và ria theo chiều ngang 1/3 đĩa,

xoay ngang ria vuông góc với lần ria trước hoặc ria theo bốn góc thành hình tam giác. Nuôi các đĩa nấm ở 250C trong 7 ngày.

- Tách khuẩn lạc và tiếp tục nuôi trên các đĩa môi trường PDA nhằm thu

được chủng thuần khiết.

- Quan sát sự sinh trưởng của vi nấm qua vết cấy trên môi trường PDA, giữ

lại các mẫu nấm có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất.

Phương pháp tuyển chọn chủng nấm (dựa vào sinh trưởng phát triển của

hệ sợi, khả năng sinh bào tử và sinh thể quả của chủng đã phân lập): Nuôi mẫu đã được phân lập trên môi trường gạo, nuôi tại nhiệt độ 250C, có chiếu sáng,

quan sát sự hình thành thể quả của các chủng. Chủng có khả năng sinh trưởng,

phát triển, tạo thể quả tốt sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.2.1.2. Hoạt hóa giống

Giống được hoạt hóa trên 2 môi trường: môi trường thạch và môi trường

lỏng lắc.

 Trên môi trường thạch: giống được cấy chuyển lên môi trường PDA

(glucose 20g/l, khoai tây 200g/l, agar 20g/l), SDAY (glucose 40g/l, cao nấm

men 20g/l, agar 20g/l), SMAY (maltose 40g/l, cao nấm men 20g/l, agar 20g/l)

nuôi tại nhiệt độ 250C, quan sát theo dõi tốc độ phát triển của hệ sợi, và đặc

điểm của hệ sợi hình thành đến khi phủ kín đĩa, lựa chọn môi trường thạch thích

hợp cho hoạt hóa giống. Tiến hành cấy chấm điểm trên đĩa petri và cấy ziczac

trên ống nghiệm.

- Quan sát hàng ngày các chỉ tiêu màu sắc, sự phát triển của sợi nấm cả mặt

trước và mặt sau của khuẩn lạc để xác định sắc tố.

- Đo đường kính khuẩn lạc ở cả 2 mặt của đĩa sau 3, 5, 7,…25 ngày. Tính trị

số trung bình theo công thức:

D1 + D2

D = ------------- 2

Trong đó: D: đường kính trung bình của khuẩn lạc

D1, D2: đường kính khuẩn lạc của hai đường vuông góc

 Trên môi trường lỏng lắc: sau khi hoạt hóa giống trên môi trường thạch, để

nâng cao hiệu suất tạo bào tử, tiếp tục đem hoạt hóa giống trên môi trường lỏng.

- Khuẩn lạc trên môi trường thạch được cấy vào bình tam giác 250ml chứa

100ml môi trường hoạt hóa lỏng HHL1 (glucose 25g/l, cao nấm men 5g/l,

pepton 10g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4 0,5g/l), HHL2 (glucose 15g/l, pepton 2g/l,

KH2PO4 2g/l, MgSO4 1,5g/l, Amoni Citrate 1,5g/l, CaCl2 1g/l), HHL3 (glucose

60g/l, pepton 5g/l, KH2PO4 2g/l, MgSO4 50g/l, Amoni Citrate 0,5g/l).

- Các mẫu được nuôi tại 25°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút.

- Kiểm tra mật độ bào tử bằng buồng đếm hồng cầu vào các ngày nuôi 3, 5,

7, 9, 11 lựa chọn môi trường có mật độ bào tử cao hơn cho các nghiên cứu tiếp

theo. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.

2.2.1.3. Nghiên cứu khả năng tổng hợp các hoạt chất sinh học trên môi trường

lỏng và môi trường rắn của chủng nấm nghiên cứu

 Trên môi trƣờng lỏng tĩnh: Chủng nấm sau khi được hoạt hóa trên môi

trường nhân giống cấp II được tiếp tục nuôi trên môi trường lỏng tĩnh. Thu sinh

khối và phân tích hoạt chất sinh học. Phương pháp và các bước tiến hành được

áp dụng theo Aphidech Sangdee và cộng sự [18], có cải tiến để phù hợp với điều

kiện thí nghiệm.

+ Chuẩn bị 3 bình tam giác 500ml, mỗi bình chứa 200ml môi trường

tương ứng với 3 công thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần: LT1 (glucose 25g/l,

peptone 10g/l, cao nấm men 5g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4.7H2O 0,5g/l), LT2

(glucose 60g/l, peptone 5g/l, KH2PO4 2g/l, MgSO4.7H2O 50g/l, amoni citrate

1,5g/l), LT3 (glucose 15g/l, peptone 2g/l, KH2PO4 2g/l, MgSO4.7H2O 1,5g/l,

amoni citrate 1,5g/l, CaCl2 1g/l).

+ Bổ sung 10ml dung dịch đã được hoạt hóa trên môi trường nhân giống

cấp 2 vào mỗi bình.

+ Nuôi lỏng tĩnh các công thức thí nghiệm ở nhiệt độ 250C – 280C,

không chiếu sáng trong 45 ngày.

+ Tiến hành thu sinh khối và làm khô tại nhiệt độ 1050C trong 24 giờ.

+ Đánh giá khả năng tổng hợp Adenosin và Beauvericine bằng định

lượng trên sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

 Trên môi trƣờng rắn: Sau khi được hoạt hóa, chủng giống được nhân

nuôi trên môi trường dinh dưỡng + gạo lứt + bột nhộng tằm trong bình thủy tinh

với dung tích 500ml.

Thành phần môi trường dinh dưỡng gồm: DD1 (fructose 20g/l, peptone

5g/l, cao nấm men 5g/l, KH2PO4 1,5g/l, MgSO4.7H2O 0,5g/l), DD2 (glucose

20g/l, peptone 5g/l, cao nấm men 5g/l, KH2PO4 1,5g/l, MgSO4.7H2O 0,5g/l),

DD3 (maltose 20g/l, peptone 5g/l, cao nấm men 5g/l, KH2PO4 1,5g/l,

MgSO4.7H2O 0,5g/l).

Sau khi mẫu được cấy vào môi trường, đem nuôi ở nhiệt độ 250C trong

tối, đến khi phủ kín thì chuyển sang chế độ chiếu sáng kích thích nảy mầm tạo

thể quả. Thể quả được thu hoạch sau 45 ngày nuôi, được đông khô và được

phân tích hoạt chất sinh học tại viện Hóa Sinh Biển, đơn vị tham gia nghiên

cứu của đề tài.

2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử

2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số

Mẫu nấm được tách chiết DNA tổng số. Phương pháp tách chiết tiến hành

theo Gardes và cộng sự, có cải tiến để phù hợp với điều kiện thí nghiệm.

- Dùng bộ cối chày sứ nghiền mẫu nấm trong nitơ lỏng thành dạng bột

mịn, thêm vào lysis cell solution và chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml.

- Bổ sung 8 µl proteinase K rồi đảo đều, ủ mẫu ở 560C qua đêm (đây là

nhiệt độ thích hợp cho proteinase K hoạt động). Hỗn hợp lysis cell solution và

proteinase K sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi

trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.

- Kiểm tra độ đồng nhất của mẫu sau khi ủ, sau đó bổ sung thêm 4,5 µl RNase đề loại bỏ RNA. Đảo đều và ủ mẫu ở 370C trong khoảng 2 – 3 giờ (đây là

nhiệt độ hoạt động thích hợp của RNase).

- Sau 3 giờ tiến hành lấy mẫu ra khỏi bể ổn nhiệt, bổ sung thêm 450 µl

muối CH3COONH4, tủa mẫu trong lạnh khoảng 3 giờ. Protein sẽ bị loại bỏ khỏi

dung dịch dưới dạng tủa.

- Ly tâm 13000 vòng trong 15 phút, bỏ tủa và hút dung dịch phía trên

sang ống eppendorf mới.

- Bổ sung 450 µl phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), dung

dịch này có tác dụng làm biến tính protein nhưng không hòa tan DNA. Đảo đều

và ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút. Khi đó hỗn hợp dịch phân thành 3

pha: pha trên cùng là DNA, pha giữa là protein và pha dưới là phenol:

chloroform : isoamyl alcohol. Pha dịch DNA sẽ được thu bằng cách hút và

chuyển dịch sang ống eppendorf mới.

- Bổ sung 450 µl chloroform : isoamyl alcohol và tiến hành các bước

giống như bổ sung hỗn hợp (25:24:1) ở trên.

- Dịch DNA thu được cho vào eppendorf chứa 850 µl cồn 100% và 40 µl

CH3COONa, đảo đều và để tủa trong ngăn đá qua đêm (-200C).

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút, thu tủa DNA.

- DNA được rửa trong 400µl cồn 70% để loại bỏ các muối và chloroform

isoamyl alcohol.

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.

- DNA sau khi thu được làm khô bằng máy Speed Vac từ 5 - 7 phút. - Bảo quản DNA trong 50µl TE và giữ ở nhiệt độ -200C.

2.2.2.2. Định lượng DNA bằng quang phổ kế

 Nguyên tắc của phƣơng pháp: Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử

ngoại ở bước sóng λ = 260nm của các base purine và pyrimidine của các axit

nucleic. Dựa trên nguyên tắc này, cho phép xác định được nồng độ và độ tinh

sạch của DNA được tách chiết.

- Nồng độ DNA

260nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương

Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm - Opfical Density

quan: Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là: 50 (µg/ml) cho một

dung dịch sợi đôi.

Nồng độ tương ứng của DNA được tính theo công thức:

C = OD260nm x d0 x S0 (*)

Trong đó: C: Nồng độ tương đối của DNA

d0: Độ pha loãng

S0: Hệ số đối với dung dịch DNA sợi kép, S0 = 50

Sau khi tách chiết, DNA có thể lẫn tạp với protein, để đánh giá độ tinh sạch

của DNA, người ta kiểm tra ở bước sóng là 280nm là phổ hấp phụ cực đại của

protein. Xét tỷ số OD260nm/OD280nm (**), DNA được xem là sạch nếu tỷ số

OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0

 Các bƣớc tiến hành:

- Pha loãng DNA 200 lần.

- Lấy 1ml nước khử ion vô trùng làm đối chứng.

- Đo lần lượt các mẫu DNA đã pha loãng ở các bước sóng 260nm và

280nm.

- Tính nồng độ và độ sạch của DNA theo (*) và (**)

2.2.2.3. PCR

Sản phẩm DNA tinh sạch được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi ITS1 và

ITS2 (do Genset Singapore Biotech và Invitrogen tổng hợp). Trình tự cặp mồi:

ITS1: 5’-GTTCCGTAGGTGAACCTG-3’,

ITS2: 5’-ATATGCTTAAGTTCAGCG-3’.

Thực hiện PCR trên máy luân nhiệt GeneAmp PCR System 9700

(bảng 2.4).

Bảng 2.4. Thành phần PCR

Thành phần Thể tích (µl)

7,5 H2O

14,5 Master Mix (2X)

1,0 ITS1

1,0 ITS2

1,0 DNA

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt PCR

Bƣớc Chu trình Giai đoạn Thời gian

Nhiệt độ (0C) 95 1 Biến tính ban đầu 7 phút

95 Biến tính 50 giây

48 Gắn mồi 50 giây Lặp lại 35 2 chu kỳ 72 Kéo dài mạch 50 phút

72 Hoàn tất kéo dài mạch 10 phút

4 3 Kết thúc phản ứng 10 phút ∞

2.2.2.4. Điện di kiểm tra DNA tổng số và sản phẩm PCR

Kết quả tách chiết DNA tổng số và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng

điện di trên gel agarose 1 % sau đó quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, chụp ảnh bằng

máy ảnh kỹ thuật số.

2.2.2.5. Xác định trình tự gen

Việc xác định trình tự được thực hiện trên máy tự động ABI PRISM 3100

– Avant Data Collection v1.0 của Mỹ, sau đó được phân tích bằng phần mềm

CLUSTALX (1.81) và so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen bằng chương

trình BLAST.

2.2.3. Phương pháp phân tích hóa lý (HPLC)

Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography) là kỹ thuật

sắc ký sử dụng để phân tách một hỗn hợp trong lĩnh vực hóa phân tích

(analytical chemistry) và sinh hóa (biochemistry) với mục đích xác định, định

lượng và tinh khiết từng thành phân riêng lẻ của hợp chất. Sự phân tách HPLC

ảnh hưởng bởi điều kiện của các dung môi lỏng (áp suất và nhiệt độ), sự tương

tác hóa học giữa hỗn hợp mẫu với dung môi lỏng và tương tác hóa học giữa các

hợp chất mẫu và nguyên tử đặc rắn bên trong cột phân tích (như ái lực ligand,

trao đổi ion,…).

Pha động sử dụng hệ dung môi: MeOH/H2O với gradient được thiết lập

trình bày trong bảng 2.6.

Bảng 2.6. Gradient nồng độ thiết lập

0 5 12 15 17 29 30 40 Thời gian (phút)

8 8 50 50 90 50 100 100 % MeOH

92 92 50 50 10 10 0 0 % H2O

- Lượng mẫu bơm:1µl, tốc độ dòng: 0,5 ml/phút - Áp suất đầu phun: 60 psi, nhiệt độ làm khô: 2500C

- Các mẫu thô được cân chính xác, chiết 3 lần trong MeOH với thể tích

xác định, dịch chiết được gom, định mức và lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi

bơm vào hệ thống LC/MS.

- Định lượng Adenosine: Kiểm tra trên hệ thống LC, bước sóng lựa chọn:

260nm. Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của Adenosine được phát

hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 13,5 - 13,6 phút đối với các mẫu chất

chỉ thị dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic

ion phân tử của Adenosine tại thời điểm 13,6 - 13,7 phút với pic ion phân tử 268 [M+H]+.

- Định lượng Beauvericine: Định lượng bằng khối phổ, chế độ quét ion mảnh tại m/z 806 [M+H]+ của Beauvericine, chế độ quét ion tổng được thiết lập

chạy đồng thời để phân tích, đối chiếu với ion tổng của các mẫu phân tích. Trên

sắc ký đồ, pic ion phân tử của Beauvericine xuất hiện ổn định với cường độ cao

nhất tại thời gian lưu 27,1 - 27,3 phút.

2.2.4. Xử lý số liệu

Số liệu thống kê được xử lý bằng ứng dụng Excel trong Microsoft Office

2010.

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thu thập, phân lập và tuyển chọn chủng nấm

Tiến hành thu thập các mẫu trong lớp lá cây mục tại rừng Quốc gia Hoàng

Liên, Lào Cai. Các mẫu thu được ký hiệu là VN3, VN4, VN6, VN7, VN8, VN9

và được trình bày ở các hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6.

Hình 3.1. Mẫu VN3 Hình 3.2. Mẫu VN4

Hình 3.3. Mẫu VN6 Hình 3.4. Mẫu VN7

Hình 3.5. Mẫu VN8 Hình 3.6. Mẫu VN9

Thể quả của mẫu Cordyceps spp. thu thập được đều mọc trên nhộng của

côn trùng họ cánh vảy, với thể quả đa phần phân nhánh, ở phần đỉnh thể quả có

lớp phần trắng mịn bao phủ phía trên. Vật chủ của quả thể có lớp bông xốp

trắng, hoặc hơi vàng.

Mẫu VN3, quả thể thu thập được trên vật chủ có dạng thân khá mảnh,

vàng nhạt, đỉnh các quả thể chia làm nhiều nhánh nhỏ, bao phủ xung quanh là

các hạt phân mịn màu trắng, dễ dàng tách khỏi quả thể. Bên cạnh đó, mẫu VN4

có đặc điểm tương tự so với VN3, nhưng quả thể to, số lượng nhánh ở phía đầu

và quả thể ít hơn. Mật độ hệ sợi bao phủ xung quanh vật chủ mẫu VN4 thưa.

Chiều cao quả thể ở mẫu VN3 khoảng 3 - 4 cm, VN4 từ 6 - 7 cm. Trong khi đó,

mẫu thu thập VN6 có các nhánh nhỏ bắt đầu xuất hiện ở 1/3 chiều dài quả thể,

tạo hình dáng hơi to và rộng ở phía trên, chiều cao quả thể đạt tới 10 cm, mật độ

phấn mịn và bao xung quanh các nhánh nhỏ trên đầu thể quả thấp. Mẫu VN7,

với chiều cao 4 - 7cm, số lượng nhánh nhỏ mọc tập trung nhiều từ 1/3 đến 1/2

chiều dài thể quả, lượng phấn trắng bao phủ dày, tạo nên tán rộng cho phần đỉnh

quả thể. Quả thể của mẫu VN7 mập hơn rất nhiều so với VN3, VN4 và VN6.

Thân quả thể của mẫu VN8 có màu vàng hơi đậm hơn so những mẫu còn lại,

mật độ thể quả mọc nhiều 13 thể quả/vật chủ (trong khi VN7 có 8 quả thể và các

mẫu còn lại có số lượng quả thể ít hơn). Tỷ lệ lượng phấn trắng phủ ít, 2/3 chiều

dài thể quả phía trên to hơn phần thân và cuống. Thể quả thấp từ 2 - 5 cm nhưng

có thân dày. Nổi bật nhất là mẫu VN9, với mẫu quả thể thu thập được có chiều

cao vượt trội hơn 5 mẫu thu thập còn lại (khoảng 10 - 12 cm), thân mảnh, phần

đỉnh chia thành nhiều nhánh nhỏ kích thước tương đối đồng đều, mật độ phấn

trắng mịn bao phủ nhiều, xung quang phần đỉnh thể quả giống như những bông

hoa tuyết nhỏ.

Tiến hành phân lập 6 mẫu Cordyceps spp. theo phương pháp của Samson và cộng sự (1988), các mẫu được cắt thành miếng và nuôi từ 5 – 7 ngày ở 250C

trên môi trường PDA. Các mẫu nấm thu được sau khi cấy ria, xuất hiện các bào tử đơn riêng rẽ, cấy chuyển sang môi trường PDA mới và tiếp tục nuôi ở 250C

trong điều kiện không chiếu sáng. Kết quả được thể hiện ở các hình 3.7, 3.8, 3.9,

3.10, 3.11.

Hình 3.7. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A3

Hình 3.8. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A6

Hình 3.9. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A7

Hình 3.10. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A8

Hình 3.11. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A9

Kết quả phân lập được 5 chủng ký hiệu lần lượt là A3, A6, A7, A8, A9 tương

ứng với các mẫu VN3, VN6, VN7, VN8, VN9. Các chủng sau khi phân lập có đặc

điểm chung là dạng bông xốp mịn, nổi lên trên bề mặt thạch và mọc tỏa tròn.

Từ các hình 3.7, 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 cho thấy màu sắc hệ sợi đa phần là

tương tự nhau nhưng khác nhau rõ rệt nhất là mật độ hệ sợi của chủng phân lập

được. Về sắc tố hệ sợi, A3, A6, A7, A9 có màu trắng tinh, chủng A8 thì cho

màu sắc trắng ngà.

Các hình đều quan sát thấy các khuẩn lạc đồng nhất, đĩa ria có các khuẩn

lạc riêng rẽ, thể hiện các chủng phân lập được là chủng thuần khiết.

3.2. Đánh giá khả năng tạo thể quả của các chủng nấm phân lập

Tiến hành hoạt hóa các chủng thuần khiết trong môi trường lỏng tại 250C

với tốc độ lắc 150 vòng/phút. Sau 7 ngày, chuyển các chủng đã hoạt hóa sang

lên men bề mặt trên môi trường gạo lứt (40g) + bột nhộng (5g), có bổ sung nguồn dinh dưỡng và nuôi ở 250C có chiếu sáng với cường độ 150 - 200 lux,

quan sát và đánh giá khả năng mọc quả thể của các chủng tại ngày nuôi thứ 45.

Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Khả năng tạo thể quả của các chủng nấm đã phân lập

A9 A8 A7 A6 A3

Chủng nấm Chỉ tiêu đánh giá

Tạo thể quả

+

Thời gian tạo thể quả (ngày)

21

Số lượng quả thể tạo ra

41

(+) : Tạo được thể quả (-) : Không tạo được thể quả 33

Kết quả bảng 3.1 cho thấy, trong 4 chủng nhân nuôi, có 2 chủng không

tạo được thể quả là chủng A8 và chủng A3, 3 chủng cho thể quả là chủng A9,

chủng A7, chủng A6 tuy nhiên thời gian mọc và số lượng quả thể khác nhau.

Chủng A9 có thể quả sớm nhất tại ngày thứ 21, trong khi đó chủng A6 xuất hiện

thể quả tại ngày thứ 24 và muộn nhất là chủng A7 với thời gian nảy mầm tạo thể

quả là 28 ngày. Ngoài ra, số lượng thể quả tạo ra ở các chủng cũng không giống

nhau, cao nhất là chủng A9 với 41 thể quả/lọ, tiếp theo là chủng A6 với 31 thể

quả/lọ và thấp nhất là chủng A7 với 26 thể quả/lọ. Từ kết quả nghiên cứu trên,

thấy rằng chủng A9 có số lượng thể quả nhiều nhất trong thời gian ngắn nhất so

với 2 chủng còn lại. Chính vì vậy, chủng A9 được lựa chọn cho các nghiên cứu

tiếp theo.

3.3. Xác định tên khoa học của chủng nấm phân lập bằng trình tự ITS

Mẫu sau khi thu thập được phân lập, thuần khiết, tuyển chọn theo khả

năng tạo và phát triển thể quả. Chủng A9 có khả năng sinh thể quả trong thời

gian ngắn nhất và có số lượng thể quả nhiều nhất, do đó được chọn để tách chiết

DNA và xác định tên khoa học bằng giải trình tự ITS.

DNA tổng số của mẫu nấm được tách chiết và làm sạch theo phương pháp

dùng lysis. Sản phẩm được điện di kiểm tra, đánh giá trên gel agaroza 1% và

hình 3.12 là kết quả thu được.

Hình 3.12. Ảnh điện di DNA của chủng A9

M: Marker λ DNA /EcoRI + HindIII

1: DNA của chủng A9

Kết quả hình 3.12 cho thấy, sản phẩm điện di thu được vạch gọn, không

bị đứt gãy, có kích thước khoảng 21,26 kb. Tỉ lệ OD260 nm/OD280 nm (không dẫn

bảng) của mẫu 1 tương ứng là 1,98 cho thấy DNA tách chiết đảm bảo chất

lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Sản phẩm DNA của chủng A9 sau tinh sạch được dùng làm khuôn để

nhân đoạn gen ITS với cặp mồi ITS1 và ITS2. Thành phần phản ứng và chu trình

nhiệt như mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả thu được 1 băng có

kích thước khoảng 560bp, phù hợp với tính toán theo lý thuyết (hình 3.13).

Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR

1: Sản phẩm PCR của chủng A9

M: Maker của Fermentas

Sản phẩm PCR được tinh sạch và được xác định trình tự trên máy tự động

ABI PRISM 3100 – Avant Data Collection v1.0. Kết quả được trình bày trên

hình 3.14.

Hình 3.14. Trình tự ITS của chủng A9

Hình 3.14 cho thấy, đoạn gen của chủng A9 có kích thước 591bp. Kết quả

được phân tích bằng phần mềm Clustalx (1.81), sau đó được so sánh với các

trình tự trên ngân hàng gen bằng chương trình Blast, theo đó với mức tương

đồng 99% có 5 trình tự Cordyceps takaomontana, 34 trình tự Isaria tenuipes, 9

trình tự Paecilomyces tenuipes và 2 trình tự Isaria japonica. Nhiều nghiên cứu

và phân tích trình tự DNA đã khẳng định Isaria tenuipes, Paecilomyces tenuipes,

Isaria japonica đều là thể vô tính của Cordyceps takaomontana. Do đó, có thể kết

luận chủng A9 là Cordyceps takaomontana.

Hình 3.15. Sơ đồ cây phân loại chủng C.takaomontana A9

3.4. Lựa chọn môi trƣờng thạch thích hợp cho nhân giống

Chủng C.takaomontana A9 được nuôi trên các môi trường thạch khác nhau, trong điều kiện 250C và không chiếu sáng, để chọn môi trường thích hợp

cho nhân giống cấp 1. Ba môi trường sử dụng cho nhân giống cấp I gồm: PDA

(khoai tây, thạch, glucose), SMAY (maltose, thạch, cao nấm men), SDAY

(glucose, thạch, cao nấm men). Tiến hành đánh giá tốc độ tăng trưởng đường

kính khuẩn lạc chủng A9 theo thời gian. Kết quả được thể hiện trong hình 3.16.

Môi trường PDA

Môi trường SMAY

Môi trường SDAY

Hình 3.16. Biểu đồ tốc độ tăng trưởng đường kính khuẩn lạc

của chủng C.takaomontana A9

Tốc độ phát triển khuẩn lạc của chủng C.takaomontana A9 trên 3 môi

trường PDA, SDAY, SMAY có sự khác nhau theo ngày nuôi. Sau 3 ngày tính từ

thời điểm nuôi, kích thước khuẩn lạc của chủng C.takaomontana A9 có giá trị lớn

nhất khi nuôi trên môi trường SDAY đạt 1,51 cm và nhỏ nhất trên môi trường

PDA đạt 1,15 cm. Tại ngày nuôi thứ 5, kích thước khuẩn lạc chủng A9 đạt 2,33

cm trên môi trường PDA trong khi trên môi trường SMAY và SDAY đạt lần lượt

là 2,70 cm và 2,80 cm. Kích thước khuẩn lạc tiếp tục tăng, đạt 3,75 cm trên môi

trường SDAY tại ngày nuôi thứ 7, theo sau là môi trường SMAY đạt 3,45 cm và

môi trường PDA đạt 3 cm. Sau 9 ngày tính từ thời điểm nuôi, kích thước khuẩn

lạc chủng nấm C.takaomontana A9 vẫn đạt giá trị nhỏ nhất trên môi trường PDA

là 3,70 cm và lớn nhất trên môi trường SDAY là 4,69 cm. Tại ngày nuôi thứ 11,

13, 15, kích thước khuẩn lạc đạt giá trị tương ứng trên môi trường PDA là 4,51

cm, 5,24 cm và 6 cm, trên môi trường SMAY là 5,38 cm, 6,21 cm và 7,03 cm, trên

môi trường SDAY lần lượt là 5,67 cm, 6,82 cm và 7,69 cm. Tiếp tục theo dõi tốc

độ phát triển của khuẩn lạc, nhận tại ngày nuôi thứ 17, môi trường SDAY vẫn cho

giá trị về kích thước khuẩn lạc và lớn nhất đạt 8,16 cm, tiếp theo là môi trường

SMAY đạt 7,80 cm và môi trường PDA đạt 6,89 cm. Nhận thấy, từ ngày thứ 3 đến

ngày thứ 17 tính từ thời điểm nuôi, khuẩn lạc chủng C.takaomontana A9 liên tục

tăng trưởng về kích thước, đạt giá trị lớn nhất trên môi trường SDAY và nhỏ nhất

trên môi trường PDA. Mặc dù vậy, khuẩn lạc vẫn chưa phủ kín đĩa thạch trên 3 môi

trường nghiên cứu. Tuy nhiên, vào ngày nuôi thứ 19, khuẩn lạc chủng A9 đã phủ

kín đĩa thạch môi trường SDAY với kích thước 8,50 cm, trong khi đó thời gian để

khuẩn lạc phủ kín đĩa thạch SMAY và PDA lần lượt là 21 ngày và 25 ngày.

Hình 3.17. Hình ảnh khuẩn lạc chủng A9 trên các môi trường

1: Môi trường PDA; 2: Môi trường SMAY; 3: Môi trường SDAY

Kết quả hình 3.17 cho thấy, khuẩn lạc trên cả 3 môi trường có dạng bông

xốp, mịn, hệ sợi mọc dày nhất trên môi trường SDAY, theo sau là môi trường

SMAY và thưa nhất trên môi trường PDA. Điều này được giải thích là do trong

thành phần của môi trường SMAY và SDAY được bổ sung nguồn cung cấp nitơ

là cao nấm men, và cũng chính nguồn cung cấp nitơ này giúp khuẩn lạc phát

triển nhanh hơn so với môi trường PDA. Bên cạnh đó, khi thay đổi nguồn

cacbon và giữ nguyên nguồn nitơ hữu cơ, nhận thấy chủng A9 có mật độ hệ sợi

trên môi trường đường đơn chức – môi trường SDAY mọc dày hơn trên môi

trường đường đa chức – môi trường SMAY. Do vậy, môi trường SDAY được lựa

chọn để nhân giống cấp I cho chủng C.takaomontana A9.

3.5. Lựa chọn môi trƣờng lỏng thích hợp cho nhân giống

Môi trường lỏng là môi trường nhân giống cấp II, có vai trò trong hoạt

hóa giống, tăng khả năng sinh bào tử của chủng giống. Sau khi đã chọn lựa được

môi trường nhân giống cấp I chủng A9, tiến hành hoạt hóa giống trên môi

trường lỏng. Sợi nấm từ môi trường thạch được đưa sang môi trường lỏng với tỷ

lệ theo thể tích dịch nuôi/ thể tích bình là 1:5 (v/v), tốc độ lắc 150 vòng/phút tại 250C. Tiến hành kiểm tra số lượng bào tử của các công thức sau 3 ngày, 5 ngày,

7 ngày, 9 ngày, 11 ngày nuôi. Dựa vào các số liệu thu được, có thể xác định thời

gian nuôi lỏng giống cấp II, khi nồng độ bào tử đạt yêu cầu để chuyển sang môi

trường rắn. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2, hình 3.18 và 3.19.

Bảng 3.2. Khả năng sinh bào tử của chủng A9 trên các môi trường hoạt hóa lỏng

Ngày nuôi thứ 3

Ngày nuôi thứ 5

Ngày nuôi thứ 7

Ngày nuôi thứ 9

Ngày nuôi thứ 11

Mật độ bào tử theo ngày (bào tử/ml)

Môi trƣờng

HHL1

3,70±0,3x103

6,30±0,3x104

5x106

6,70±0,3x108

4x1010

HHL2

1,70±0,3x103 4,70±0,3x104

HHL3

102

3±0,5x103

4x106 4,30±0,3x104

5 x 107 4±0,5x105

3,30±0,6x108 2,70±0,3x106

Số liệu xử lý trên Anova one – way có P < 0,05, nên các giá trị thu được

có ý nghĩa thống kê.

Kết quả của bảng 3.2, hình 3.18 và 3.19 cho thấy, vào ngày thứ 3, mật độ bào tử trên môi trường hoạt hóa lỏng HHL3 là ít nhất, chỉ đạt 102 bào tử/ml. Trong khi đó, mật độ bào tử trên môi trường HHL1 là 3,70 x 103 bào tử/ml và trên môi trường HHL2 là 1,70 x 103 bào tử/ml. Đến ngày nuôi thứ 5, mật độ bào tử trên môi trường HHL1 đạt giá trị là 6,30 x 104 bào tử/ ml, theo sau là môi trường HHL2 với mật độ bào tử đạt 4,70 x 104 bào tử/ ml, và môi trường HHL3 với 3 x 103 bào tử/ml. Tại ngày nuôi thứ 7, mật độ bào tử trên môi trường HHL3 vẫn đạt giá trị nhỏ nhất là 4,30 x 104 bào tử/ ml, đạt giá trị lớn nhất trên môi trường HHL1 là 5 x 106 bào tử/ ml. Tại thời điểm ngày nuôi thứ 5 và thứ 7, mật

độ bào tử chủng C.takaomontana A9 của môi trường HHL1 và HHL2 có giá trị gần tương đương nhau, tương ứng với 104 bào tử/ ml và 106 bào tử/ ml. Giá trị

này của môi trường HHL1 và HHL2 gấp 10 và 100 lần so với môi trường HHL3 (tương ứng là 103 bào tử/ ml và 104 bào tử/ ml). Đến ngày nuôi thứ 9, mật độ bào tử trên môi trường HHL1 đạt 6,70 x 108 bào tử/ ml, trong khi môi trường HHL2 đạt 5 x 107 và môi trường HHL3 đạt 4 x 105 bào tử. Tại ngày thứ

11 tính từ thời điểm nuôi, mật độ bào tử vẫn đạt giá trị lớn nhất trên môi trường HHL1 là 4x 1010 bào tử/ ml, đạt giá trị nhỏ nhất trên môi trường HHL3 là 2,70 x 106 bào tử/ ml. Bảng thành phần của các môi trường nghiên cứu (bảng 2.3) cho

biết, thành phần môi trường của HHL3 có hàm lượng đường 60g/l và muối

khoáng MgSO4 50g/l. Vì nồng độ đường và nồng độ muối khoáng cao, gây ức

chế khả năng sinh bào tử của chủng nấm, do vậy nồng độ bào tử của môi

trường HHL3 thấp nhất so với hai môi trường còn lại. Hai môi trường HHL1

và HHL2 với nồng độ các chất trong môi trường gần giồng như nhau, nhưng

môi trường HHL1 giàu nguồn N hữu cơ (pepton, cao nấm men) hơn so với môi

trường HHL2 chính vì lý do này nên nồng độ bào tử của môi trường HHL1 cao

hơn so với môi trường HHL2. Như vậy, tỷ lệ thành phần các chất trong môi trường

hoạt hóa lỏng HHL1 là thích hợp cho quá trình phát triển sinh bào tử của

Cordyceps takaomontana nên được lựa chọn để hoạt hóa giống cho chủng

C.takaomontana A9.

Hình 3.18. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9

dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần)

Hình 3.19. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9

dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần)

3.6. Nghiên cứu nhân nuôi sinh khối tạo hoạt chất sinh học

3.6.1. Nhân nuôi trên môi trường lỏng tĩnh

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trong việc phát triển các sản phẩm giàu hoạt

chất sinh học có giá thành cạnh tranh từ Cordyceps takaomontana. Chủng nấm

A9 được nuôi lỏng tĩnh và so sánh khả năng sinh hoạt chất của sinh khối nuôi

lỏng tĩnh với thể quả. Sau khi được hoạt hóa trên môi trường thạch và môi trường lỏng, tiếp tục được lên men trên môi trường lỏng tĩnh ở 250C, trong

điều kiện không chiếu sáng, ẩm độ 80%, sinh khối được thu hoạch sau 45

ngày. Kết quả trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh khối lỏng tĩnh

LT1 LT2 LT3 Môi trƣờng lỏng tĩnh Chỉ tiêu

Thời gian phủ kín (ngày) 5,33±0,47 13,67±1,25 9,00±0,82

Khối lượng sinh khối tươi/ bình (g) 33,30±0,67 9,87±0,54 27,23±0,87

Số liệu xử lý trên Anova one – way có P < 0,05, nên các giá trị thu được

có ý nghĩa thống kê.

Kết quả bảng 3.3 cho thấy, nhân nuôi chủng A9 trong các công thức môi

trường lỏng tĩnh khác nhau thì khối lượng sinh khối tươi thu được trên bình nuôi

cũng khác nhau. Thời gian chủng A9 phủ kín bề mặt dịch lỏng trong bình nhanh

nhất khi nuôi trong môi trường LT1 là 5,33 ngày, theo sau là LT3 và LT2 lần

lượt là 9 ngày và 13,67 ngày (hình 3.20). Không những vậy, khối lượng sinh

khối tươi thu được khi nuôi tại môi trường LT1 cũng đạt lớn nhất với 33,33g

tươi/bình, trong khi nuôi tại hai môi trường còn lại là LT2 – 9,87g và LT3 đạt

27,23g tươi/bình (hình 3.21). Giải thích cho sự khác nhau về thời gian phủ kín

và khối lượng sinh khối tươi nêu trên là do sự khác nhau về thành phần môi

trường và nồng độ các chất có trong 3 môi trường. Từ bảng thành phần môi

trường nghiên cứu (bảng 2.3) thấy được rằng, nồng độ glucose trong môi trường

2 là 60 g/l và nồng độ muối MgSO4 là 50 g/l. Nhận thấy, vì nồng độ đường và

nộng độ muối trong môi LT2 cao, ức chế sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi

nên dẫn tới lượng thời gian phủ kín bề mặt chậm và lượng sinh khối thu được

thấp. Và trong môi trường LT1, lượng nitơ hữu cơ trong thành phần môi trường

nhiều hơn so với hai môi trường còn lại, do đó sinh khối chủng A9 sinh trưởng

LT2

và phát triển tốt hơn hai môi trường LT2 và LT3.

LT 1

LT 2

LT 3

Hình 3.20. Chủng nấm A9 nuôi lỏng tĩnh trên các môi trường

Hình 3.21. Sinh khối tươi của chủng A9 trên các môi trường

3.6.2. Nhân nuôi trên môi trường rắn

Chủng C.takaomontana A9 sau khi được hoạt hóa trên môi trường lỏng, tiến

hành lên men bề mặt trong môi trường gạo lứt bổ sung 5g bột nhộng, 50 ml môi trường dinh dưỡng trong điều kiện 250C, pH 7, độ ẩm 80%, cường độ chiếu sáng là

200 lux và thu hoạch sau 45 ngày lên nhân nuôi. Kết quả được thể hiện ở bảng

3.4, hình 3.22 và 3.23.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên quá trình tạo thể quả

Môi trƣờng

dinh dƣỡng DD1 DD2 DD3

Chỉ tiêu

13±0,82 8,33±0,47 9,67±0,47

Thời gian phủ kín (ngày) Thời gian mọc mầm (ngày) Khối lượng thể quả tươi/lọ (g) 18,67±0,94 14,67±0,47 12,63±1,64 16,6±0,54 14,6±0,73

Số liệu xử lý trên Anova one – way có P < 0,05, nên các giá trị thu được

có ý nghĩa thống kê.

Kết quả bảng 3.4 cho thấy, trong môi trường DD1 nấm phủ kín bề mặt tại

thời điểm ngày thứ 13, trong khi đó môi trường DD2 và DD3 nấm phủ kín sớm

hơn DD1 ở thời điểm hơn 8 ngày và gần 10 ngày. Thời gian nảy mầm tạo thể

quả dẫn đầu là trong môi trường DD2 (dưới 15 ngày), DD3 với thời gian 15

ngày, theo sau là DD1 với gần 19 ngày (hình 3.22).

DD1 DD2 DD3

Hình 3.22. Chủng C.takaomontana A9 nảy mầm trên các môi trường DD

Đặc biệt, khối lượng thể quả có sự chênh lệch rõ ràng. Khối lượng thể

quả trong môi trường dinh dưỡng DD2 đạt 16,6g tươi/lọ, theo sau là DD3 với

14,6g tươi/lọ, cuối cùng là DD1 với khối lượng thể quả 12,63g thể quả tươi/lọ.

Có thể thấy, nguồn carbon trong dinh dưỡng bổ sung có ảnh hưởng tới sự sinh

trưởng và phát triển của thể quả. Môi trường DD1 sử dụng nguồn cacbon là

fructose thì thời gian phủ kín và thời gian nảy mầm đều chậm hơn so với 2 môi

trường sử dụng nguồn cacbon là glucose và maltose, khi thay đổi nguồn

cacbon từ đường đơn (đường 5 cacbon, đường 6 cacbon), sang đường đa chức

(maltose), hệ sợi nấm Cordcyeps takaomontana thích hợp với cấu trúc đường

đơn 6 cacbon hơn đường đơn chức 5 cacbon và đường đa chức maltose.

DD3

DD1

DD2

Hình 3.23. Thể quả tươi của chủng A9 trên các môi trường DD

3.7. Nghiên cứu khả năng tổng hợp Adenosine và Beauvericine trong môi

trƣờng lỏng tĩnh và môi trƣờng rắn

Các mẫu sinh khối từ môi trường lỏng và thể quả từ môi trường rắn sau

khi thu hoạch được định lượng Adenosine và Beauvericine tại Viện Hóa Sinh

Biển,Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam, là đơn vị tham gia đề tài.

3.7.1. Kết quả trên hệ thống LC/MS

3.7.1.1. Định lượng Adenosine

Các mẫu được bơm vào hệ thống LC/MS với điều kiện phân tích được

thiết lập trình bày ở phần phương pháp. Tín hiệu của Adenosine được phát

hiện dựa trên sự trùng thời gian lưu Rt giữa hệ thống LC và hệ thống MS,

theo đó Pic của hoạt chất Adenosine được phát hiện dựa trên sự trùng khớp về

thời gian lưu Rt và số khối MS so với chất chỉ thị, thể hiện ở hình 3.24 và

hình 3.25.

Adenosine A

Adenosine

Hình 3.24: Sắc kí đồ HPLC UV 260 nm của chất chỉ thị Adenosine (A)

và của mẫu (B)

Hình 3.25: Sắc kí đồ MS ESI Positive của chất chỉ thị Adenosine

Hình 3.24 và 3.25 cho thấy, thời gian lưu bắt đầu xuất hiện pic là 13,4

phút đến 13,8 phút, pic phân tử của Adenosine xuất hiện với cường độ cao nhất

tại thời gian lưu 13,6 - 13,7 phút, không xuất hiện pic tương tự tại thời gian lưu

khác. Đối chiếu với pic của Adenosine chuẩn, pic Adenosine C.takaomontana

A9 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của Adenosine chuẩn.

Đường chuẩn định lượng của Adenosine được tính toán dựa trên diện tích

pic UV 260 nm tại thời gian lưu Rt 13.5-13.6 phút (phụ lục 1)

Bảng 3.5. Các nồng độ Adenosine sử dụng trong xây dựng

đường chuẩn định lượng

Mức nghiên cứu 1 2 3 4 5

Nồng độ Adenosine (g/ml) 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5

Dựa trên các kết quả thu được, chúng tôi thiết lập phương trình đường

chuẩn adenosine có dạng: y = 2309.5x + 8.5

3.7.1.2. Định lượng Beauvericine

Các mẫu được bơm vào hệ thống LC/MS với điều kiện phân tích được

thiết lập trình bày ở phần phương pháp. Trên sắc kí đồ bắt ion mảnh (SIM), pic

ion phân tử của Beauvericine xuất hiện ổn định với cường độ cao nhất tại thời

gian lưu 27,1 - 27,3 min, không xuất hiện pic này tại thời gian lưu khác; đồng

thời trên sắc kí đồ ion tổng (TIC) cho kết quả MS phù hợp với phổ khối của

Beauvericine, kết quả trình bày ở hình 3.26 và hình 3.27.

Từ hình 3.26 và hình 3.27thấy rằng, thời gian lưu bắt đầu xuất hiện pick là

26,9 phút chi đến 27,7 phút. Pick phân tử của Beauvericine xuất hiện với cường

độ cao nhất tại thời gian lưu 27,2 – 27,3, không xuất hiện pick tương tự tại thời

gian lưu khác. Đối chiếu với pick của Beauvericine chuẩn, pick Beauvericine

chiết từ C.takaomontana A9 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của

Beauvericine chuẩn.

A Beauvericine

Beauvericine

Hình 3.26. Sắc kí đồ Sim 806,0 của chất chỉ thị Beauvericine (A)

và của mẫu (B)

Hình 3.27. Sắc kí đồ MS - ESI Positive của chất chỉ thị Beauvericine

Đường chuẩn định lượng của Beauvericine được xây dựng dựa trên phương

pháp tính lượng ion tổng tại m/z 806,0 trên sắc ký đồ SIM tại thời gian lưu 27.1

– 27,3 phút (phụ lục 2).

Bảng 3.6. Các nồng độ Beauvericine sử dụng trong xây dựng

đường chuẩn định lượng

Mức nghiên cứu 1 2 3 4 5

Nồng độ Beauvericine (g/ml) 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2

Dựa trên các kết quả thu được, chúng tôi thiết lập được phương trình

đường chuẩn của Beauvericine có dạng: y = 1.54652E7x + 58972

3.7.2. Nghiên cứu khả năng tổng hợp Adenosine và Beauvericine trong môi

trường lỏng tĩnh và môi trường rắn

3.7.2.1. Trong môi trường lỏng tĩnh

Sinh khối nấm thu hoạch trên 3 môi trường lỏng tĩnh LT1, LT2, LT3 ở

thí nghiệm trên được làm khô ở nhiệt độ độ 500C và được tiến hành định lượng

2 hoạt chất Adenosine và Beauvericine. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Hàm lượng Adenosine, Beauvericine

trong sinh khối lên men lỏng tĩnh

Môi trƣờng LT1 LT2 LT3 Chỉ tiêu

Adenosine (mg/g khô) 0,425±0,001 0,025±0,001 0,289±0,003

Beauvericine (mg/g khô) 4,817±0,013 0,642±0,002 3,525±0,002

Số liệu xử lý trên Anova one – way có P < 0,05, nên các giá trị thu được

có ý nghĩa thống kê.

Kết quả bảng 3.7 cho thấy, hàm lượng Adenosine của sinh khối thu được

từ các môi trường lỏng tĩnh không giống nhau. Sinh khối thu được từ môi trường

LT1 cao nhất, đạt 0,425 mg/g, sau đó đến của sinh khối thu được từ môi trường

LT3, đạt 0,289 mg/g. Thấp nhất là sinh khối thu từ môi trường LT2, chỉ đạt

0,025 mg/g.

Kết quả từ bảng 3.7 cũng cho thấy, sinh khối thu được từ môi trường LT2

có hàm lượng Beauvericine thấp nhất, chỉ đạt 0,642 mg/g. Trong khi đó tại môi

trường LT3 hàm lượng này cao hơn 5 lần, đạt 3,525 mg/g và hàm lượng

Beauvericine lớn nhất khi nuôi trong môi trường LT1 là 4,817 mg/g. Như vậy

trong các môi trường lên men lỏng tĩnh, môi trường LT1 là thích hợp cho sự

tổng hợp Adenosine và Beauvericine của chủng A9. Sự khác nhau về hàm lượng

các hoạt chất được giải thích bởi sự khác nhau về thành phần môi trường và hàm

lượng các chất trong môi trường nuôi lỏng tĩnh.

3.7.2.1. Trong môi trường rắn

Thể quả sau khi được thu hoạch, được làm khô bằng thiết bị đông khô (bổ

sung thêm chiếu sáng ở bao nhiêu lux), sau đó tiến hành định lượng Adenosine

và Beauvericine. Kết quả được trình bày ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Hàm lượng Adenosine và Beauvericine

trong sinh khối lên men rắn

Môi trƣờng DD1 DD2 DD3 Chỉ tiêu

Adenosine (mg/g khô) 0,032±0.001 0,073±0.002 0,059±0.002

Beauvericine(mg/g khô) 0,807±0.015 1,344±0.034 1,023±0.023

Số liệu xử lý trên Anova one – way có P < 0,05, nên các giá trị thu được

có ý nghĩa thống kê.

Kết quả bảng 3.8 cho thấy, hàm lượng Adenosine của sinh khối thu được

từ môi trường DD1 có giá trị thấp nhất, chỉ đạt 0,032 mg/g. Trong khi đó, ở môi

trường DD3, hàm lượng Adenosine thu được gấp 1,8 lần so với môi trường

DD1, đạt 0,059 mg/g. Môi trường DD2 cho hàm lượng Adenosine thu được cao

nhất, đạt 0,073 mg/g.

Bảng 3.8 cũng cho thấy, hàm lượng Beauvericine thu được từ sinh khối

trên môi trường DD2 là cao nhất, đạt 1,344 mg/g. Tiếp theo là môi trường DD3,

đạt 1,023 mg/g và thấp nhất là môi trường DD1, chỉ đạt 0,807 mg/g. Dữ liệu thu

được từ bảng 3.8 cũng cho thấy, trong 3 môi trường DD1, DD2, DD3 thì môi

trường dinh dưỡng DD2- với nguồn carbon là glucose cho khối lượng thể quả và

hàm lượng Adenosin, Beauvericine cao hơn so với hai môi trường DD1 và DD3.

So sánh hàm lượng hai hoạt chất Adenosine và Beauvericine từ sinh khối

lên men chủng A9 trên môi trường lỏng tĩnh và từ thể quả lên men bề mặt trên

môi trường gạo lứt (có bổ sung dinh dưỡng DD), nhận thấy trong sinh khối của

môi trường lên men lỏng tĩnh, hàm lượng Adenosin và Beauvericine cao hơn so

với trong thể quả phát triển trên môi trường gạo lứt.

Trong môi trường lên men lỏng tĩnh, hàm lượng Adenosin và

Beauvercicin đạt lần lượt là 0,425 và 4,817 mg/g ở môi trường LT1. Trong khi

lượng Adenosine trong thể quả nhỏ hơn gần 6 lần, chỉ đạt 0,073 mg/g, lượng

Beauvericine thấp hơn 3,5 lần, chỉ đạt 1,344 mg/g ở DD2 so với hàm lượng

hoạt chất có trong sinh khối nuôi lỏng tĩnh. Giá thành sinh khối nhân nuôi lỏng

tĩnh thấp hơn nhân nuôi rắn, do điều kiện nuôi đơn giản hơn. Kết quả gợi mở

khả năng phát triển sản phẩm nuôi lỏng tĩnh tạo hoạt chất Adenosine và

Beauvercicine.

Từ thể quả, hàm lượng beauvericin của chủng Cordyceps takaomontana A9

trung bình khoảng 1,058 mg/g, cao hơn so với chủng có nguồn gốc Thái Lan

(0,915 mg/g) khi cùng lên men trên môi trường rắn. Trong khi đó, chủng tự nhiên

Thái Lan hàm lượng Beauvericine dao động từ 0,0056 đến 0,038 mg/g (theo

Sumalee Supothina và cộng sự, 2011). Như vậy, hàm lượng Beauvericine từ

Cordyceps takaomontana A9 Việt Nam cao hơn so với chủng C. takaomontana

có nguồn gốc Thái Lan khi lên men trên môi trường rắn.

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

1. Từ sáu mẫu Cordcyeps spp. thu thập ở vườn Quốc gia Hoàng Liên, Lào

Cai, phân lập được 5 chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt, ba chủng

tạo được thể quả, trong đó chủng A9 tạo được nhiều thể quả nhất. Bằng phương

pháp xác định trình tự ITS và so sánh trên Ngân hàng gen. Tên khoa học của

chủng A9 được xác định là Cordyceps takaomontana A9.

2. Môi trường thạch SDAY (glucose 40g/l, cao nấm men 20g/l, agar 20 g/l) là

môi trường thích hợp nhất cho nhân giống cấp I. Môi trường HHL1 (glucose

25g/l, cao nấm men 5g/l, pepton 10g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4 0,5g/l) là môi

trường tốt nhất cho quá trình hoạt hóa lỏng chủng Cordyceps takaomonta A9.

3. Môi trường lỏng tĩnh LT1 (glucose 25g/l, peptone 10g/l, cao nấm men

5g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4.7H2O 0,5g/l) cho sinh khối và hoạt chất cao nhất,

tương ứng với trọng lượng tươi 33,30g/bình, Adenosine 0,425mg/g khô,

Beauvericine 4,817 mg/g khô.

4. Môi trường rắn với dinh dưỡng DD2 (glucose 20g/l, peptone 5g/l, cao nấm

men 5g/l, KH2PO4 1,5g/l, MgSO4.7H2O 0,5g/l), gạo lứt và bột nhộng tằm tạo

được thể quả và tổng hợp được hoạt chất nhiều nhất, tương ứng với trọng lượng

tươi 16,60g/lọ, Adenosine 0,073mg/g khô, Beauvericine 1,334 mg/g khô.

4.2. Kiến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu xác định một số hoạt chất có khả năng hỗ trợ hệ tim

mạch, ức chế tế bào ung thư, tăng cường khả năng miễn dịch.

2. Nghiên cứu đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sản

phẩm: sinh khối lỏng tĩnh và thể quả.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Đƣờng chuẩn định lượng Adenosine trong các mẫu phân tích

Phụ lục 2: Đƣờng chuẩn định lượng Beauvericine trong các mẫu phân tích

Tài liệu tham khảo

Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Văn Vẻ, Trần Thu Hà, Nguyễn Thị Bích Thủy, Ngô Xuân Nghiễn (2015). Bước

đầu nghiên cứu công nghệ nuôi trồng nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris L.ex Fr.)

ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 13(3): 445-454.

2. Nguyễn Lân Dũng (1981). Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại cây trồng. Nxb

Khoa học kỹ thuật.

3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Liên Hoa, Lê Hoàng Yến, Nguyễn Văn Bắc (2005),

Chương trình Vi sinh vật học - Nấm sợi. Nxb Nông nghiệp.

4. Nguyễn Mậu Tuấn, Trương Phi Hùng, Nguyễn Thái Huy, Dương Thị Ngọc (2009).

Hiệu quả của dịch chiết nấm Đông trùng Hạ thảo tằm dâu, Paecilomyces tenuipes đến

khả năng bơi của chuột. Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp Việt Nam 2(15):

110-115.

5. Nguyễn Thị Thúy (2015). Một số đặc điểm sinh vật học của loài nấm ký sinh côn

trùng Isaria javanica (Frider. & Bally) Samsom & Hywel-Jones ở vườn Quốc gia Pù

Mát, Nghệ An. Tạp trí Khoa học và Phát triển, 13(5): 687 – 693.

6. Phạm Quang Thu (2009). Điều tra phát hiện nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps

nutants Pat. phân bố ở khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử, Sơn Động, Bắc Giang.

Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ NN & PTNT, 4: 91-94.

7. Phạm Quang Thu (2009). Phát hiện nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps gunnii

(Berk) tại vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển

Nông thôn, Bộ NN & PTNT, 4: 96-99.

8. Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân (2011). Thành phần loài nấm ký sinh côn trùng tại

vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Bộ NN

& PTNT, 22: 97-102.

9. Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà (2010). Phát hiện nấm đông trùng hạ thảo

Cordyceps takaomontana Yakushiji và Kumazawa ở Việt Nam. Tạp chí Nông nghiệp

và Phát triển Nông thôn, 06: 127-130.

10. Phạm Thị Thùy (2004). Công nghệ sinh học trong Bảo vệ thực vật. Nxb Đại học

Quốc gia Hà Nội.

11. Tô Quang Huyên, Lê Thị Xuân (2012). Thành phần loài nấm ký sinh côn trùng tại

khu rừng di tích lịch sử và cảnh quan môi trường Mường Phăng huyện Điện Biên, tỉnh

Điện Biên. Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp.

12. Trần Ngọc Lân (2008). Đa dạng sinh học nấm ký sinh côn trùng ở vuồn Quốc Gia

Pù Mát và đành giá khả năng ký sinh của một số loài nấm đối với loài sâu hại cây

trồng. Đề tài cấp bộ Giáo dục và đào tạo. Mã số: B2007-27-25.

13. Trần Ngọc Lân, Thái Thị Ngọc Lam, Nguyễn Thị Thúy, Trần Văn Cảnh, Nguyễn

Thị Thu (2011). Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm ký sinh côn trùng Isaria

tenuipes (Peck) Samson ở vườn Quốc gia Pù Mát và khu bảo tồn thiên nhiên Pù

Huống, Nghệ An. Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên

Sinh vật, lần thứ 4: 1185 – 1191.

14. Trần Văn Mão (2002). Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích, tập 2. Nxb Nông

nghiệp, Hà Nội.

15. Trịnh Tam Kiệt (1996), “Danh mục các loài nấm lớn ở Việt Nam” Nhà Xuất bản

Nông Nghiệp, Hà Nội.

16. Trịnh Tam Kiệt, Đặng Vũ Thanh, Hà Minh Trung (2001). Lớp Ascomycetes, Danh

mục các loài thực vật Việt Nam. Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

17. Trịnh Thị Xuân, Trần Văn Hai và Bùi Xuân Hùng Trường, Đặng Thị Cúc và

Huỳnh Thanh (2009). Ứng dụng chế phấm nấm xanh Metarhizium anisopliae trong

phòng trừ rầy nâu hại lúa tỉnh Sóc Trăng. Thông tin Khoa học và Công nghệ Sóc

Trăng, 3/2009.

Tài liệu tiếng Anh 18. Aphidech Sangdee and Kusavadee Sangdee (2013). Isolation, identification,

culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with

entomopathogenic fungi in Thailand. African Journal of Microbiology Research, 7(2):

137-146.

19. Bhushan Shrestha, Won-Ho Lee, Sang-Kuk Han and Jae-Mo Sung (2006).

Observations on Some of the Mycelial Growth and Pigmentation Characteristics of

Cordyceps militaris Isolates. Entomopathogenic Fungal Culture Collection (EFCC):

Mycobiology 34(2): 83-91.

20. Bunyapaiboonsri T, Yoiprommarat S, Intereya K, Rachtawee P, Hywel-Jones

NL, Isaka M (2009). Isariotins E and F, spirocyclic and bicyclic hemiacetals from the

entomopathogenic fungus Isaria tenuipes BCC 12625. J Nat Prod. 72(4): 756-759.

21. Dong C.H., Yao Y.J. (2005). Nutritional requirements of mycelial growth of

Cordyceps sinensis in submerged culture. Journal of Applied Microbiology 99: 483-

492.

22. Gi-Ho Sung, Nigel L. Hywel-Jones, Jae-Mo Sung, J. Jennifer Luangsa-ard,

Bhushan Shrestha and Joseph W. Spatafora (2007). Phylogenetic classification of

Cordyceps and the clavicipitaceous fungi. Studies in Mycology, (57): 5–59.

23. Gu YX, Wang ZS, Li SX, Yuan QS (2007). Effect of multiple factors on

accumulation of nucleosides and bases in Cordyceps militaris. Food Chem., 102: 1304-

1309.

24. Guo C, Zhu J, Zhang C, Zhang LJ (1998). Determination of adenosine and 3'-

deoxyadenosine in Cordyceps militaris (L.) Link. by HPLC. J.Chinese Med., 23: 236-

237.

25. Guo FQ, Li A, Huang LF, Liang YZ, Chen BM (2006). Identification and

determination of nucleosides in Cordyceps sinensis and its substitutes by high

performance liquid chromatography with mass spectrometric detection. J. Pharmaceut.

Biomed., 40: 623-630.

26. Hung LT, Keawsompong S, Hanh VT, Sivichai S, Hywel-Jones NL (2009). Effect of

temperature on cordycepin production in Cordyceps militaris. Thai. J. Agric. Sci., 42(4):

219-225.

27. In-PyHong et al. Synema production by isariatenuipes using Corlloed cocoon Silk

Worm, Golden Silk. Int J. Indust.(1): 1-4.

28. Kobayashi Y., (1982). Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Toruiella.

Trans Mycol. Soc. Jpn., 23: 329-364.

29. Laurentia Lellia MiHai, Ioanina Parlatescu, Carmen Larisa Gheorghe, Luminita

Lazar, Edwin Sever Bechir, Mircea Suciu, Grigore Lazarescu (2015). Biochemical

effects on Adenosine in the treatment of Oral Acute Ulcers. REV. CHIM (Bucharest),

6(8): 1190 – 1192.

30. Lee H., Kim Y. J., Kim H. W., Lee D. H., Sung M..K., Park T. (2006). Introduce

off apoptosis by Cordyceps Militaris though actication off caspase-3 leukemia HL-60

cels. Biol.Pharm.Bull, (29): 670-674.

31. Lei Huang, Qizhang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang and Xuanwei Zhou (2009).

Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the products of Cordyceps

spp..African Journal of Microbiology Research, 3(12): 957 - 961.

32. Li Cui, Ming Sheng Dong, Xiao Hon chen, Mei Jiang, Xin Lv, Guijun Yan.

(2008). A novel fibrinolytic enzyme from Cordyceps militaris, a Chinese traditional

medicinal mushroom.World J Microbiol biotechol, (24): 483 - 489.

33. Li SP, Yang FQ, Tsim KW (2006). Quality control of Cordyceps sinensis, a

valued traditional Chinese medicine. J. Pharmaceut. Biomed., (41): 1571- 1584.

34. Luangsa-ard J.J., Tasanathai K., Monkolsamrit S., and Hywel – Jones, N. L.

(2007). Atlas of Invertebratepathogenic Fungi of Thailan, 1(82): 229-522.

35. Mao X.L 2000. The macrofungi in China, Henam Technical and Science

Publication House.

36. Nam K.S., Jo Y.S., Kim Y.H., Hyun J.W., Kim H.W. (2001). Cytotoxic activities of

acetoxyscirpenediol and ergosterol peroxide from Paecilomyces tenuipes. Life Sci., 69(2):

229-233.

37. Nan J.X, Park E.J, Yang B.K, Song C.H, Ko G., Sohn D.H, (2001). Antibiotic

effect of extra cellula biopolymer from submerged mycelial cultures of cordyceps

militariss on liver fibrosis induced by bile cut ligation ans scission in rats. Arch.

Phram.Rres. (24): 327-322.

38. Oh, G. S., K. H. Hong, H. O. Pae, I. K. Kim, N. Y. Kim, T. O. Kwon, M. K. Shin

and H. T. Chung (2001). 4-Acetyl-12,13-epoxy1-9-trichothecene-3,15-diol isolated

from the fruiting bodies of Isaria japonica Yasuda induces apoptosis of human

leukemia cell (HL-60). Bio. Pharm. Bull. 24: 785-789.

39. Peeters, H.; Zocher, R.; Madry, N.; Kleinkauf, H. Incorporation of radioactive

precursors into beauvericin produced by Paecilomyces fumoso-roseus, (22): 1719–

1720.

40. Peng L, Song X, Shi X, Li J, Ye C (2008). An improved HPLC method for

simultaneous determination of phenolic compounds, purine alkaloids and theanine in

Camellia species. J. Food Compos. Anals., 21:559-563.

41. Pramer D. (1965). Fungal Parasites of Insects and Nematodes Bacteriological

Review, (29): 382 – 387.

42. Qinggui Wang and Lijian Xu (2012). Beauvericin, a bioactive compound

produced by fungi: short review. Molecules., 17(3): 2367-2377.

43. Rupesh Kumar Arora, Nimisha, and R.P.Singh (2013). Characteriziation of an

Entomophagous medicinal fungus Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc of Uttarakhand,

India. The bioscan 8(1): 195-200.

44. Samson, R.A., and H.C. Evans. (1982). Two new Beauveria spp. from South

America. Journal of Invertebrate Pathology, 39(1): 93-97.

45. Samson, R.A., H.C. Evans, and J.P. Latgé. (1988). Atlas of Entomopathogenic

Fungi. Springer-Verlag, Berlin. Heidelberg, New York. 187pp.

46. Shih IL, Tsai KL, Hsieh C (2007). Effects of culture conditions on the mycelial

growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps

militaris. Biochem. Eng. J., 33: 193-201.

47. Shin C.G., An D.G., Song H.H., Lee C. (2009). Beauvericin and enniatins H, I

and MK1688 are new potent inhibitors of human immunodeficiency virus type-1

integrase. J. Antibiot, (62): 687–690.

48. Shoemake. R.H,. Scudiero. D.A, Suasville.E.A (2002). Application of high-

throughput, molecular – targeted screening to anticancer drug discovery. Curr. Top.

Med. Chem. 2(3): 229 – 246.

49. Sun HC, Jong CK, Jung SL, Chul SY, Jong HK, Hyo IC, Seung WK. (2006).

Morphological chaharacteristic of Cordyceps sinensis 16 and production of mycelia and

exo-biopolyner from molasses in submerged culter. Journal of industrial and

Engineering Chemisstry, 12(1): 115 -120.

50. Sung Hak Lee, Hwang H.S., Yun J.W. (2009). Antitumor activity of water extract

of a mushroom, Inonotus obliquus, against HT-29 human colon cancer cells. Phytother

Res, 23(12): 1784-1789.

51. Sung Jae Mo (2000). Insect – born fungus of Korea. Kangwon National

University, Korea.

52. Sung. G. H. (2007). Phylogenetic classification of Cordyceps and

the

clavicipitaceous fungi. Studies in Mycology (57): 55–59.

53. Thungrabeab M. and Tongma S. (2007). Effect of entomopathogenic fungi,

Beauveria bassiana (Balsam) and Metarhizium anisopliae (Metsch) on non target

insects, KMITL Science technology.

54. Tsuguo Hongo và Masana Izawa, 1994, Mushroom in Japan, Yama – Kei

Publisher, Japan.

55. Wang Y, Guo Y, Zhang L, Wu J (2012). Characterizations of a new Cordyceps

cicadae isolate and production of adenosine and cordycepin. Braz. J. Microbiol: 449-

455.

56. Won S.Y. and Park E.H. (2005). Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris. J. Ethnopharmacol., 96: 555- 561.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm Cordyceps takaomontana từ rừng tự nhiên Việt Nam có khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị

Mục tiêu chính của đề tài là nghiên cứu tuyển chọn được chủng nấm Cordyceps takaomontana từ rừng tự nhiên Việt Nam có khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

ĐỖ TIẾN MẠNH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN

CHỦNG NẤM CORDYCEPS TAKAOMONTANA

TỪ RỪNG TỰ NHIÊN VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP

MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC GIÁ TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

ĐỖ TIẾN MẠNH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN

CHỦNG NẤM CORDYCEPS TAKAOMONTANA

TỪ RỪNG TỰ NHIÊN VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP

MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC GIÁ TRỊ

MỤC LỤC

A9 A8 A7 A6 A3

Chủng nấm Chỉ tiêu đánh giá

+

21

41

Ngày nuôi thứ 3

Ngày nuôi thứ 5

Ngày nuôi thứ 7

Ngày nuôi thứ 9

Ngày nuôi thứ 11

Mật độ bào tử theo ngày (bào tử/ml)

Môi trƣờng

HHL1

3,70±0,3x103

6,30±0,3x104

5x106

6,70±0,3x108

4x1010

HHL2

HHL3

Beauvericine

Tài liệu tham khảo

Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Văn Vẻ, Trần Thu Hà, Nguyễn Thị Bích Thủy, Ngô Xuân Nghiễn (2015). Bước

Tài liệu tiếng Anh 18. Aphidech Sangdee and Kusavadee Sangdee (2013). Isolation, identification,

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok