Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa gen fea* làm tăng số hàng hạt vào các dòng bố, mẹ giống ngô lai LVN 10 phục vụ công tác tạo giống ngô lai năng suất cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Họ và tên: Phạm Thùy Chi

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ ĐƢA

GEN fea* LÀM TĂNG SỐ HÀNG HẠT VÀO CÁC DÒNG BỐ, MẸ GIỐNG NGÔ LAI LVN 10 PHỤC VỤ CÔNG TÁC TẠO

GIỐNG NGÔ LAI NĂNG SUẤT CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – Năm 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Họ và tên: Phạm Thùy Chi

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ ĐƢA

GEN fea* LÀM TĂNG SỐ HÀNG HẠT VÀO CÁC DÒNG BỐ, MẸ GIỐNG NGÔ LAI LVN 10 PHỤC VỤ CÔNG TÁC TẠO

GIỐNG NGÔ LAI NĂNG SUẤT CAO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

Cán bộ hƣớng dẫn 1 Cán bộ hƣớng dẫn 2

PGS. Ts Khuất Hữu Trung Ts. Đỗ Tiến Phát

Hà Nội - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Khuất Hữu Trung và TS. Đỗ Tiến Phát. Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung thực. Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó.

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2021

Tác giả

Phạm Thùy Chi

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những thành viên đã giúp đỡ và

hƣớng dẫn tôi hoàn thành luận văn:

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Khuất Hữu Trung – Phó viện trƣởng – Viện Di truyền Nông nghiệp đã hƣớng dẫn, tạo động lực và đƣa ra những lời khuyên quý báu cho tôi trong quá trình làm thí nghiệm và thực hiện đề tài.

Tôi xin đƣợc cảm ơn TS Đỗ Tiến Phát – Phụ trách Phòng Công nghệ tế

bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, ngƣời đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn tôi

hoàn thành luận văn này.

Tôi xin đƣợc cảm ơn các giảng viên của Viện Khoa học và Công nghệ nơi tôi theo học và tập thể cán bộ Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất - trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành khóa học và thực hiện luận văn này.

Đồng thời, tôi xin cảm ơn tập thể nhóm nghiên cứu Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp đã đồng ý cho tôi đƣợc tham gia vào đề tài: “ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa gen fea* làm tăng số hàng hạt vào các dòng bố mẹ của Việt Nam phục vụ tạo giống ngô lai năng suất cao”.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những ngƣời đã luôn bên cạnh, động viên, góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2021

Tác giả

Phạm Thùy Chi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BC 1,2,3... Backcross, lai trở lại lần thứ 1,2,3...

BC5F1 Đời con lai F1 của dòng lai trở lại lần thứ 5

BC5F2 Đời con lai F2 của dòng lai trở lại lần thứ 5

BC6F1 Đời con lai F1 của dòng lai trở lại lần thứ 6

BL10 Dòng đƣợc chọn làm bố trong phép lai tạo LVN10

dCAP Derived Cleavage Amplified Polymorphism

dNTPs Deoxynucleoside triphosphates

DMSO Dimethyl sulfoxide (CH3)2SO.

Allele đột biến lặn của gen FASCITED EAR2 có tác fea* dụng tăng hàng hạt ở ngô.

Marker assisted backcross (lai trở lại có hỗ trợ của chỉ thị MABC phân tử)

MAS Marker-assisted selection (chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử)

ML10 Dòng đƣợc chọn làm mẹ trong phép lai tạo LVN10

PCR Polymerase chain reaction. Phản ứng nhân theo chuỗi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Bắp giống ngô LVN10 ở công ty giống cây trồng Thái Bình................................................................................................................. 9

Hình 1.2: So sánh ảnh hƣởng của đột biến fea* lên bắp ngô..........................11

Hình 1.3: Quá trình backcross qua các thế hệ và tỷ lệ phần trăm gen có trong các đời backcross............................................................................................. 16

Hình 2.1. Sơ đồ và kế hoạch lai tạo backcross................................................21

Hình 2.2. Chu kỳ nhiệt PCR với cặp mồi OSV1 và OSV2.............................25

Hình 3.1. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST1 giữa các

dòng ML10, BL10, và W223 ........................................................................ 34

Hình 3.2. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST2 giữa các

dòng ML10, BL10, và W22 .................................................................... .....34

Hình 3.3. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST3 giữa các

dòng ML10, BL10, và W22 .......................................................................... 35

Hình 3.4. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST4 giữa các

dòng ML10, BL10, và W22 .......................................................................... 35

Hình 3.5. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST5 giữa các

dòng ML10, BL10, và W22 .......................................................................... 36

Hình 3.6. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST6 giữa các

dòng ML10, BL10, và W22 .......................................................................... 36

Hình 3.7. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST7 giữa các

dòng ML10, BL10, và W22 .......................................................................... 37

Hình 3.8. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST8 giữa các

dòng ML10, BL10, và W22 .......................................................................... 37

Hình 3.9. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST9 giữa các

dòng ML10, BL10, và W22 .......................................................................... 38

Hình 3.10 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST9 giữa các

dòng ML10, BL10, và W22 .......................................................................... 38

Hình 3.11: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F1 của tổ hợp lai ML10/W22 sử

dụng cặp mồi OVS1-OVS2 ........................................................................... 39

Hình 3.12: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F1 của tổ hợp lai BL10/W22 sử

dụng cặp mồi OVS1-OVS2 ........................................................................... 40

Hình 3.13. Kết quả kiểm tra nền di truyền nhóm cá thể BC5F1 của 31 chỉ thị

trên 10 nhiễm sắc thể ..................................................................................... 44

Hình 3.14. Kết quả kiểm tra nền di truyền của các cá thể BC5F1 thuộc nhóm

3 với các chỉ thị umc1160 và umc1166 ....................................................... 45

Hình 3.15. Kết quả kiểm tra nền di truyền nhóm các cá thể BC5F1 của 26 chỉ

thị trên 10 nhiễm sắc thể ............................................................................... 48

Hình 3.16. Kết quả kiểm tra nền di truyền của các cá thể BC5F1 thuộc nhóm

1 và nhóm 3 với các chỉ thị umc1160 và phi070 .......................................... 48

Hình 3.17: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F2 của tổ hợp lai ML10/W22 sử

dụng cặp mồi OVS1-OVS2 ........................................................................... 50

Hình 3.18: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F2 của tổ hợp lai BL10/W22 sử

dụng cặp mồi OVS1-OVS2 ........................................................................... 51

Hình 3.19: Hình thái các dòng ngô trên đồng ruộng Thái Bình vụ Xuân 2020

ở giai đoạn tung phấn .................................................................................... 54

Hình 3.20: Hình thái các dòng ngô trên đồng ruộng Thái Bình vụ Xuân 2020

ở giai đoạn tung phấn .................................................................................... 55

Hình 3.21: Biểu đồ mối tƣơng quan năng suất cá thể của các dòng cải tiến

BC5F3 và dòng gốc ....................................................................................... 58

Hình 3.22: Ảnh bắp sau thu hoạch của các dòng ngô thu tại Thái Bình vụ

Xuân 2020 ..................................................................................................... 59

Hình 3.23: Ảnh bắp sau thu hoạch của các dòng ngô thu tại Thái Bình vụ

Xuân 2020 ..................................................................................................... 60

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Các thông tin chi tiết chỉ thị cho đa hình trên 10 nhiễm sắc thể giữa dòng ML10 và W22…................................................................................…31

Bảng 3.2. Các thông tin chi tiết chỉ thị cho đa hình trên 10 nhiễm sắc thể giữa dòng BL10 và W22…....................................................................................33

Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra kiểu gen của các dòng BC5F1 vụ Xuân 2019.................................................................................................................40

Bảng 3.4: Tỉ lệ nền di truyền của các cá thể BC5F1 so với dòng nhận gen ML10...............................................................................................................43

Bảng 3.5. Tỉ lệ nền di truyền của các cá thể BC5F1 so với dòng nhận gen BL10................................................................................................................47

Bảng 3.6: Một số đặc điểm hình thái nông học của các dòng cải tiến BC5F3 và dòng bố mẹ gốc...............................................................................................53

Bảng 3.7: Năng suất cá thể của các dòng cải tiến BC5F3 và dòng gốc............57

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1

1. Lý do chọn đề tài ................................................................................ 1

2. Mục đích nghiên cứu ......................................................................... 3

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ...................................................... 4

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ........................................................... 4

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................. 5

1.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM ................................................................................ 5 1.1.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam ............... 5 1.1.1.1. Sản xuất ngô trên thế giới .............................................. 5 1.1.1.2. Sản xuất ngô tại Việt Nam ............................................. 6 1.1.2. Phƣơng pháp chọn tạo giống ngô ......................................... 7 1.1.2.1. Phƣơng pháp chọn tạo giống ngô trên thế giới .............. 7 1.1.2.2. Nghiên cứu chọn tạo giống trong nƣớc ......................... 7 1.2. GIỚI THIỆU VỀ GIỐNG NGÔ LVN10 .................................................. 8 1.3. KHÁI QUÁT VỀ GEN FEA* ................................................................... 9

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới về QTLs quy định tính trạng

năng suất ngô và gen liên quan đến số hàng hạt trên bắp ngô .................. 9 1.3.2. Gen FEA2 và allele fea* ..................................................... 10 1.4. SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG PHÉP LAI TRỞ LẠI ............ 11

1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống

cây trồng .................................................................................................. 11 1.4.2. Phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai hồi giao (Marker Assited Backcrossing - MABC) ................................. 15

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 19

2.1. VẬT LIỆU .............................................................................................. 19 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................. 19 2.1.2. Các loại hóa chất ................................................................. 19

2.1.3. Máy móc thiết bị sử dụng ................................................... 20 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 20 2.2.1. Bố trí thí nghiệm lai trở lại (BC) ........................................ 21 2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử .................................... 22 2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA- CTAB ......................... 22 2.2.2.2.Phƣơng pháp PCR bằng mồi dCAPs ............................ 23 2.2.2.3. Phƣơng pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn PstI .......... 24 2.2.2.4.Phƣơng pháp PCR với mồi SSR ................................... 25 2.2.2.5. Phƣơng pháp điện di trên gel poly-acrylamide ........... 26 2.2.2.6. Phƣơng pháp điện di trên gel Agarose ........................ 26

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................... 28

3.1. KẾT QUẢ ............................................................................................... 28 3.1.1. Kết quả xác định chỉ thị đa hình giữa các dòng ML10, BL10 và dòng W22 trên 10 NST ...................................................................... 28

3.1.1.1. Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình ngoài vùng gen

fea* giữa dòng ML10 và dòng W22 ..................................................... 28

3.1.1.2. Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình ngoài vùng gen

fea* giữa dòng BL10 và dòng W22 ...................................................... 30 3.1.2. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 mang gen fea* bằng phƣơng pháp chỉ thị phân tử ............................................. 38

3.1.2.1. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 ở dòng ML10 .......................................................................................... 38 3.1.2.2. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 ở dòng BL10 ........................................................................................... 38 3.1.3. Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea* trong quần thể BC5F1 ............................................................................. 40 3.1.3.1. Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea* trong quần thể BC5F1 ở dòng lai ML10 ............................................. 40 3.1.3.2. Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea* trong quần thể BC5F1 ở dòng lai BL10 .............................................. 43

3.1.4. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F2 mang gen fea* bằng chỉ thị phân tử ................................................................... 46

3.1.4.1. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F2 ở dòng ML10 .......................................................................................... 47 3.1.4.2. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F2 ở dòng BL10 ........................................................................................... 48 3.1.5. Đặc điểm hình thái nông sinh học của các dòng BC5F3 mang gen fea* trong vụ Thu Đông năm 2019 ......................................... 49 3.1.5.1. Đặc điểm hình thái nông học của các dòng BC3F3 ..... 49

3.1.5.2. Đánh giá sơ bộ về năng suất của các dòng cải tiến BC5F3 và dòng bố mẹ gốc .................................................................. 53

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................... 59

4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................ 59 4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................. 61

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Ngô (Zea mays L.) thuộc chi Zea, tông Androppogoneae, họ Poaceae, bộ Poales. Ngô là cây ngũ cốc quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu vì nó nuôi sống ít nhất 30% dân số thế giới và là cây lƣơng thực đứng thứ 3 sau lúa mì và lúa. Ngô là nguồn cung cấp lƣơng thực và an ninh dinh dƣỡng chủ yếu cho hàng triệu ngƣời ở các nƣớc đang phát triển, đặc biệt là ở Châu Phi và Châu Mỹ Latinh. Ngô có thể đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau nhƣ đƣợc dùng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và sản xuất công nghiệp (nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học).

Theo số liệu thống kê của USDA (United States Department of

Agriculture) (tháng 1 năm 2017), Mỹ và Trung Quốc vẫn là hai cƣờng quốc

sản xuất ngô lớn nhất thế giới với sản lƣợng lần lƣợt là 384 triệu tấn và 219

triệu tấn (http://worldofcorn.com). Năng suất trung bình ngô của Mỹ là 11.7

tấn/ ha (2016). Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng đứng thứ 2 sau

cây lúa và là cây màu quan trọng nhất đƣợc trồng ở nhiều vùng sinh thái khác

nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác. Cây ngô không

những cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, làm thức ăn cho vật nuôi mà còn giúp

xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn. Tuy nhiên, ngô

lại chỉ đƣợc trồng ở những khu vực không có lợi cho việc trồng cây công

nghiệp. Do ngô chủ yếu đƣợc gieo trồng trong điều kiện không thuận lợi nên

sản lƣợng mặt hàng này của Việt Nam đang rất thấp.Theo số liệu thống kê

của tổng cục thống kê (http://www.gso.gov.vn/) năm 2016, năng suất ngô

trung bình cả nƣớc vào khoảng 45,3 tạ/ha, sản lƣợng đạt khoảng 5,23 triệu tấn

trên diện tích gieo trồng khoảng 1,15 triệu ha.

Theo thống kê của FAO, Hoa Kỳ và Trung Quốc là hai nƣớc sản xuất

ngô hàng đầu thế giới với lần lƣợt là 377,5 triệu tấn và 224,9 triệu tấn.

Sản xuất ngô cả nƣớc qua các năm không ngừng tăng về diện tích,năng

suất, sản lƣợng: năm 2001 tổng diện tích ngô là 730.000 ha, đến năm 2005 đã

tăng lên 1 triệu ha, năm 2010 diện tích ngô cả nƣớc là 1126,9 nghìn ha, năng

suất đạt 40,9 tạ/ha, sản lƣợng trên 4,6 triệu tấn. Tính đến thời điểm năm 2016,

diện tích cả nƣớc gieo trồng giảm chủ yếu do hạn hán không gieo trồng đƣợc,

năng suất ngô năm 2016 đạt 46 tạ/ha (tăng 1,2 tạ/ha so với 2015). Sản lƣợng

ƣớc đạt 5,1 triệu tấn. Năm 2020 , sản lƣợng chỉ còn 4,5 triệu tấn do giảm

mạnh diện tích gieo trồng cả nƣớc ảnh hƣởng của mƣa, bão, lũ lụt tại các địa

phƣơng phía Bắc. [1]

Giống ngô LVN10 của Viện nghiên cứu Ngô, là giống ngô cho năng suất cao nhất hiện nay ở nƣớc ta, màu sắc và dạng hạt đẹp, độ đồng đều cao, chịu hạn, chịu chua phèn, chống đổ tốt, ít nhiễm sâu bệnh. Đây là giống thích ứng với mọi vùng sinh thái trong cả nƣớc. Giống LVN10 có trung bình 10-12 hàng hạt/bắp, bắp dài 18-22cm, năng suất trung bình 55-65 tạ/ha, thâm canh tốt có thể đạt 80-90 tạ/ha.[2]

Do có nhiểu đặc tính tốt và năng suất cao mà LVN10 đƣợc trồng khá

phổ biến ở nƣớc ta. Nhận thấy tiềm năng phát triển của chúng, chúng tôi chọn

cách tiếp cận tăng năng suất ngô hơn nữa bằng cách làm tăng số hàng hạt trên

một bắp ngô nhờ sử dụng đột biến fea* có khả năng làm giảm họat tính của

gen kiểm soát sự phân chia của đỉnh sinh trƣởng ở bắp ngô.[3]

FEA2 (FASCIATED EAR2) là gene điều khiển kích thƣớc mô phân

sinh, do đó có ảnh hƣởng đến số hàng hạt trên bắp ngô. Bommert và cộng sự

đã phát hiện ra 4 đột biến điểm ở gene FEA2, trong đó có một đột biến lặn

fea* làm giảm hoạt tính của gene FEA2 và tăng số hàng hạt trên bắp nhƣng

không gây ảnh hƣởng đến các tính trạng khác trên bắp ngô.

Cho đến nay, ở Việt Nam chƣa tìm thấy kết quả nghiên cứu nào trong

nƣớc công bố về tăng năng suất ngô bằng cách tăng số hàng hạt. Các gen quy

định số hàng hạt trên bắp mới bắt đầu đƣợc phát hiện và làm rõ chức năng.

Do đó mà nguồn vật liệu mang những đột biến tiềm năng trong việc tăng năng

suất ngô bằng cách tăng số hàng hạt là chƣa phổ biến và khó tiếp cận. Việc sử

dụng chỉ thị phân tử ở ngô đã đƣợc sử dụng rất thành công trên thế giới để

chọn tạo giống ngô nhƣng chƣa đƣợc áp dụng ở Việt Nam. Do vậy, việc ứng

dụng chỉ thị phân tử trong việc nghiên cứu đƣa gen fea* làm tăng số hàng hạt

của các dòng ngô bố mẹ ƣu tú sẽ nhanh chóng tạo ra giống ngô lai có năng

suất cao phục vụ cho sản xuất là thực sự cần thiết.

Bằng cách lai tạo chuyển đột biến lặn fea* vào các dòng bố mẹ của tổ

hợp lai ngô LVN10 thông qua phƣơng pháp lai trở lại (MABC: marker

assisted backcross) có thể cải tiến năng suất của giống ngô này. MABC đã

đƣợc áp dụng cho lai tạo ngô trên thế giới [4], là phƣơng pháp lai chuyển một

vài tính trạng ƣu việt (đã biết chỉ thị phân tử) từ dòng cho gene sang dòng

nhận gene (là dòng muốn cải tiến) bằng lai trở lại có sử dụng chỉ thị phân tử

để chọn lọc con lai. Qua mỗi thế hệ lai trở lại (backcross-BC), trong hệ gene

của cây lai thành phần gene (genetic component) của cây cho gene sẽ giảm đi

một nửa 50% (F1) , 75% (BC1), 87.5% (BC2), 93.75% (BC3), 96.88%

(BC4), 98.43% (BC5). Vì thế, độ giống nhau của cây lai so với dòng nhận

gene sẽ tăng dần qua các thế hệ BC.

Dòng BC6F1, BC6F2 mang di truyền của giống ngô LVN10, mang thêm gen đột biến fea* có độ đồng hợp cao (>98%) cho năng suất cao hơn so với dòng bố, mẹ. Tổ hợp lai F1 giữa các dòng bố mẹ cải tiến mang gen fea* se cho năng suất vƣợt trội giống ngô lai LVN10. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để đƣa gen fea* làm tăng số hàng hạt vào các dòng bố, mẹ giống ngô lai LVN10 phục vụ công tác tạo giống ngô lai năng suất cao”.

2. Mục đích nghiên cứu

Mục tiêu chung : Đánh giá khả năng làm tăng hàng hạt và tăng năng

suất của gen fea* trong giống ngô LVN10 phục vụ chọn tạo giống ngô mới có

năng suất cao hơn.

Mục tiêu cụ thể :

Cải tiến đƣợc dòng bố mẹ của LVN10 mang gen fea* bằng phƣơng

pháp chỉ thị phân tử và lai trở lại, từ đó chọn đƣợc dòng bố mẹ cải tiến ƣu tú,

lai tạo đƣợc dòng F1 mới tăng lên 2 hàng hạt, năng suất cao hơn giống

LVN10 thƣơng mại hiện nay ít nhất 10%

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Đối tƣợng nghiên cứu: dòng ngô LVN10 của Việt Nam và 2 dòng bố

mẹ

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 09/2018 tới tháng 10/2020.

Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu thực nghiệm ngoài đồng ruộng tiến

hành tại ruộng ngô Đông Anh, Hà Nội và ruộng ngô tại Viện nghiên cứu cây

trồng- Tập đoàn Thái Bình Seed. Các thí nghiệm sinh học phân tử đƣợc thực

hiện, tại Bộ môn Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học: Thiết kế các chỉ thị phân tử để xác định gen đích và

các gen đồng hợp có mặt trong nền di truyền của cá thể chính xác hơn so với

chọn lọc rút dòng bằng mắt thƣờng, từ đó xây dựng quy trình nghiên cứu trên

các thí nghiệm tƣơng tự để chọn lọc dòng hiệu quả. Phƣơng pháp chọn lọc

dòng dựa trên chỉ thị phân tử nhanh và chính xác hơn, khắc phục đƣợc những

nhƣợc điểm của phƣơng pháp chọn lọc dòng truyền thống.

Ý nghĩa thực tiễn: Chọn đƣợc dòng bố mẹ cải tiến LVN10 mang gen

fea*, từ đó lai tạo đƣợc dòng F1 mới tăng lên 2 hàng hạt, năng suất cao hơn

giống LVN10 thƣơng mại, năng suất tăng ít nhất 10%. Góp phần làm tăng sản

lƣợng ngô cả nƣớc và tạo ra một giống ngô mới đƣa ra thị trƣờng, tạo tiền đề

cho các nghiên cứu lai tạo giống ngô mới ở Việt Nam.

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM

1.1.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam

1.1.1.1. Sản xuất ngô trên thế giới

Ngô là cây ngũ cốc nuôi sống gần 1/3 dân số thế giới. Ở các nƣớc trồng

ngô, nó đƣợc sử dụng làm lƣơng thực với các mức độ khác nhau. Đặc biệt

ngô là cây lƣơng thực đóng vai trò chủ lực tại các nƣớc Nam Á (42.6%), Trung Mỹ (66.3%) và Châu Phi (75%) [5]. Ngoài việc đƣợc sử dụng làm

lƣơng thực, ngô ngày nay còn có thể đƣợc sử dụng nhƣ là nguồn thực phẩm

cho con ngƣời với nhiều cách chế biến khác nhau, hoặc thức ăn cho gia súc và

tạo sinh khối, hay trong công nghiệp sản xuất cồn, bánh kẹo, tinh bột. Gần

đây, ngô còn đƣợc chú trọng hơn trong công nghiệp vì đƣợc sử dụng làm

nguyên liệu sản xuất xăng sinh học thay thế cho các nguồn nhiên liệu hóa

thạch đang cạn kiệt dần. Theo số liệu thống kê của FAOSTAT năm 2018, Mỹ

vẫn đứng đầu trong các cƣờng quốc sản suất ngô trên thế giới với sản lƣợng

392.5 triệu tấn (million metric tons) và đóng vai trò rất quan trọng đóng góp

cho nên kinh tế nƣớc này. Khoảng 20% sản lƣợng ngô hàng năm đƣợc Mỹ

xuất khẩu. Diện tích chuyên canh cho cây ngô ở Mỹ là khoảng 96 triệu ha

phân bố ở hầu hết các bang của Mỹ. Cƣờng quốc thứ hai là Trung Quốc với

sản lƣợng là 257.3 triệu tấn (million metric tons) (năm 2018). Mặc dù lúa gạo

là thực phẩm chính của quốc gia này, nhƣng mấy năm trở lại đây, sản lƣợng

ngô đã tăng lên là do nhu cầu sử dụng ngô trong chăn nuôi tăng lên. Hơn 25

năm qua, sản lƣợng ngô đã tăng 125%, trong khi sản lƣợng lúa chỉ tăng 7%,

và hiện nay, khoảng 60% lƣơng thực đƣợc sử dụng cho chăn nuôi. Brazil

cũng là cƣờng quốc thứ ba trong sản xuất ngô với sản lƣợng hàng năm đạt gần

83 triệu tấn (million metric tons). Tiếp theo là Ấn Độ, với sản lƣợng ngô hàng

năm là 42,3 triệu tấn.Tiếp theo trong bảng xếp hạng là Argentina (40 triệu

tấn), Ukraine (39.2 triệu tấn), Mexico (32,6 triệu tấn), Indonesia (19 triệu tấn,

đứng đầu trong các nƣớc ASEAN, sau đó là Philippines và Việt Nam), Pháp

(17,1 triệu tấn), và Nam Phi (15,5 triệu tấn) [6].

Theo thống kê của ETC Group và NGO, tốp 7 công ty hạt giống chi

phối 71% thị trƣờng hạt giống trên thế giới bao gồm Monsanto, DuPont

Pioneer, Syngenta, Vilmorin, WinField, KWS, và Bayer (theo số liệu báo cáo

năm 2013). Trong đó ba công tyMonsanto, DuPont Pioneer, và Syngenta

chiếm 60% thị trƣờng hạt giống cho bông, đậu tƣơng, và ngô.

1.1.1.2. Sản xuất ngô tại Việt Nam

Tại Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực chính chỉ đứng thứ hai sau lúa gạo.

Cùng với cám gạo, sắn, ngô là nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp sản

xuất thức ăn chăn nuôi. Từ 1990 đến nay, sản xuất ngô trong nƣớc có những

bƣớc nhảy vọt đáng kể do đƣa những giống ngô lai thay thế giống bản địa

ngày càng nhiều, thay đổi phƣơng pháp canh tác phù hợp với các giống ngô

lai. Năng suất ngô Việt Nam có tốc độ tăng nhanh hơn tốc độ trung bình thế

giới trong suốt 20 năm qua. Tuy nhiên, 70% ngô đƣợc trồng trên các vùng có

địa hình phức tạp, đất cao, phụ thuộc vào nƣớc trời, ít đầu tƣ thâm canh, bị

hạn chế việc áp dụng khoa học kĩ thuật vào sản xuất, hoặc trồng xen canh

cùng những cây trồng có giá trị cao, do đó năng suất ngô vẫn còn thấp. Cùng

với đó, côn trùng dịch bệnh gây hại cũng ảnh hƣởng rất nhiều làm giảm sản

lƣợng dẫn đến việc năng suất ngô tại Việt Nam thấp, chƣa đủ đáp ứng nhu

cầu sử dụng ngày càng tăng của ngƣời dân.

Do sản lƣợng ngô trong nƣớc không đủ đáp ứng nhu cầu của thị trƣờng

nên mỗi năm nhà nƣớc phải chi hàng tỉ đồng nhập khẩu ngô từ Ấn Độ, Brazil,

Argentina, Campuchia, Lào và Thái Lan. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển

Nông thôn Việt Nam và Hiệp hội chăn nuôi Việt Nam năm 2013, nƣớc ta phải

nhập khẩu 2,19 triệu tấn ngô. Đến năm 2018, kim ngạch nhập khẩu ngô là 3

triệu tấn.

1.1.2. Phƣơng pháp chọn tạo giống ngô 1.1.2.1. Phương pháp chọn tạo giống ngô trên thế giới

Để tạo đƣợc một giống ngô lai thƣờng trải qua 3 bƣớc: phát triển dòng

thuần, thử khả năng kết hợp giữa các dòng thuần, tạo con lai giữa các dòng

thuần ƣu tú.

Phƣơng pháp tạo các dòng thuần từ truyền thống đến hiện đại: rút dòng

tự thụ phấn, nuôi cấy bao phấn và noãn chƣa thụ tinh, dùng cây kích đơn bội

(haploid inducer) đƣợc các nhà lai tạo và chọn giống áp dụng để tạo ra dòng

thuần. Trong đó, các phƣơng pháp hiện đại nhƣ nuôi cấy bao phấn và noãn

chƣa thụ tinh, và đặc biệt công nghệ inducer rất phát triển, làm rút ngắn thời

gian tạo ra dòng thuần.

Từ những năm 2007-2010, với sự ra đời của công nghệ giải mã genome,

việc chọn tạo giống ngô đã có nhiều bƣớc ngoặt lớn. Nhiều tính trạng số

lƣợng (QTLs) đƣợc tìm ra, ứng dụng chỉ thị phân tử để đƣa các QTL này vào

dòng bố mẹ tốt bằng lai trở lại. Chọn lọc trên cả hệ gen (Genomic selection)

đƣợc đƣa vào ứng dụng mạnh. Chọn lọc trên cả hệ gen (Genomic selection) là

một dạng của chọn lọc dựa trên marker, trong đó có hàng chục, hàng trăm,

hàng nghìn marker bao phủ toàn bộ hệ gen đƣợc sử dụng. Genomic selection

là chiến lƣợc lai tạo giống đầy hứa hẹn cho việc cải tiến nhanh chóng các tính

trạng phức tạp.

1.1.2.2. Nghiên cứu chọn tạo giống trong nước

Hiện nay, ở Việt Nam, chọn tạo giống ngô vẫn chủ yếu bằng phƣơng

pháp rút dòng và lai tạo truyền thống. Gần đây, kĩ thuật nuôi cấy bao phấn và

noãn chƣa thụ tinh, dùng cây kích đơn bội (haploid inducer) đã đƣợc áp dụng

để nhanh chóng tạo ra dòng thuần, nhƣng kết quả vẫn còn khá khiếm tốn. Ngô

lai ở Việt Nam đƣợc chọn tạo cho đến nay chủ yếu dựa vào 4 phƣơng pháp

chính:

Rút dòng bằng tự thụ phấn, tạo dòng thuần kết hợp với chọn lọc: từ các

phép lai giữa các dòng thuần, hoặc từ các dòng F1 thƣơng mại của nƣớc

ngoài, qua việc tự thụ phấn 8 thế hệ kết hợp với chọn lọc dòng thuần và lai

thử (testcross) sẽ chọn ra những dòng bố mẹ để tham gia vào tổ hợp lai mới.

Rút dòng bằng nuôi cấy bao phấn: Phấn của cây ngô tạo ra từ các phép

lai giữa các dòng thuần, hoặc từ các dòng F1 thƣơng mại của nƣớc ngoài sẽ

đƣợc nuôi cấy và đa bội hóa để tạo ra dòng thuần sau 1-2 thế hệ.

Tạo dòng thuần bằng inducer: Bất kì một cây ngô nào khi nhận phấn

của các dòng tạo đơn bội (female haploid inducer) này có thể tạo ra các hạt

đơn bội (8% số hạt sẽ là đơn bội). Cây từ hạt này sẽ đƣợc xử lí đa bội hóa để

tạo ra cây nhị bội thuần chủng 100%.

Dùng các chỉ thị SSR để xác định khoảng cách di truyền giữa các dòng bố

mẹ tiềm năng: Dùng các chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ về di truyền giữa

các dòng ngô từ đó có thể giới hạn chỉ tiến hành lai những dòng ngô nào xa cách

về di truyền để có thể tạo ƣu thế lai.

1.2. GIỚI THIỆU VỀ GIỐNG NGÔ LVN10

Giống ngô lai LVN10 của Viện nghiên cứu Ngô đƣợc Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn cho phép khu vực hoá và quy trình sản xuất hạt lai

LVN10 đƣợc công nhận là tiến bộ ky thuật mới vào tháng 8/1994.

Giống LVN10 thuộc nhóm chín muộn, thời gian sinh trƣởng vụ xuân

125 - 135ngày, vụ hè thu 95 - 100 ngày, vụ thu đông 110 - 120 ngày. Cây cao

200 - 240cm, cao đóng bắp 100 - 140cm có 20 - 21 lá. Bắp dài trung bình 18 -

22cm, đƣờng kính bắp 4,5 - 5,5cm, có từ 10 - 12 hàng hạt, số hạt/hàng từ 35 -

45 hạt, tỷ lệ hạt/bắp từ 82 - 84%, khối lƣợng 1.000 hạt khoảng 300 - 330

gram, hạt bán răng ngựa, màu vàng da cam. Năng suất trung bình 55 - 65

tạ/ha, thâm canh tốt có thể đạt 80 - 90 tạ/ha. Đặc biệt LVN10 chịu hạn, chịu

chua phèn tốt, khả năng chống đổ khá, ít nhiễm các loài sâu bệnh. [7]

Hình 1.1: Bắp giống ngô LVN10 ở công ty giống cây trồng Thái Bình.[2]

1.3. KHÁI QUÁT VỀ GEN FEA*

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới về QTLs quy định tính trạng

năng suất ngô và gen liên quan đến số hàng hạt trên bắp ngô

Tính trạng năng suất (grain yield-GY) ở ngô là một trong những tính

trạng quan trọng và phức tạp nhất trong chƣơng trình lai tạo giống ngô. Trên

thế giới đã tìm đƣợc 8 QTLs liên quan đến 4 đặc điểm liên quan đến năng

suất: năng suất hạt (GY), khối lƣợng 100 hạt (HKW), chiều dài 10 hạt (10-

kernel length-KL), và chiều rộng của hàng 10 hạt (10-kernel length width

(KW). [8]

So với các tính trạng nhằm tăng năng suất của ngô, số hàng hạt của bắp

ngô có tầm quan trọng và tiềm năng rất lớn. Bắp ngô trung bình có 12-14

hàng hạt, nếu tăng thêm hai hàng (mà không làm giảm chiều dài bắp) tức là

năng suất đã tăng lên hơn 10%.

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy hệ số di truyền của tính trạng số

hàng hạt (kernel row number KRN) khá cao (0.97 [4]; hay 0.89 [3]). Đo đạc

trong cùng một nghiên cứu, đã xác định hệ số di truyền của số hàng hạt là

0.94, cao hơn so với năng suất hạt (0.87) hay khối lƣợng hạt (0.76) hay độ sâu

cay (0.9) [4]. Điều này đồng nghĩa với việc tính trạng KRN ít chịu ảnh hƣởng

của môi trƣờng và việc cải thiện gene sẽ có hiệu quả mạnh hơn ở tính trạng

này so với các tính trạng khác.

Những năm gần đây, rất nhiều QTL liên quan đến số hàng hạt và năng suất ở

ngô đã đƣợc tìm ra và lập bản đồ (Yang et al 2015 [8], Mendes-Moreira et al 2015

[9], Liu et al 2016 [10], Huo et al 2016 [11], Chen et al 2016 [12]).

1.3.2. Gen FEA2 và allele fea*

Gene FEA2 (FASCIATED EAR 2) đƣợc phân lập đầu tiên từ dòng ngô

đột biến toè đỉnh bắp vào năm 2001 bởi nhóm nghiên cứu của GS. Dave

Jackson và cộng sự. Một nghiên cứu năm 2013 tại phòng thí nghiệm của giáo

sƣ David Jackson, viện Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Mỹ đã

lần đầu tiên lập bản đồ chi tiết tính trạng số lƣợng và tìm ra gene FEA2 qui

định làm tăng số hàng hạt [13]. Gene FEA2 qui định một protein thụ quan lặp

giàu leucine trên màng tế bào (Leucine rich repeat receptor). FEA2 là gene

tƣơng đồng với CLAVATA2 ở Arabidopsis. Gene FEA2 đƣợc biểu hiện

mạnh trên đỉnh sinh trƣởng của cây ngô (cờ, bắp) và có chức năng làm hạn

chế sự phát triển của định sinh trƣởng.

Allele đột biến fea* đƣợc tạo ra bởi phƣơng pháp gây đột biến bằng EMS, gây đột biến C->T ở vị trí nucleotide 1430, làm thay đổi amino acid Proline ở vị trí 477 thành Leucine trên protein) gây ra tăng hàng hạt rõ nhất trên bắp so với các đột biến khác. Cây ngô mang đột biến fea* này có bắp với 18-20 hàng hạt và đến 289 hạt/bắp so với cây không đột biến của cùng một nền di truyền chỉ có 14-16 hàng hạt và 256 hạt/bắp. Nhƣ vậy đột biến fea* làm tăng năng suất lên 13% (hình 1.2).

Hình 1.2: So sánh ảnh hƣởng của đột biến fea* lên bắp ngô

Ghi chú: (A) Bắp của cây mang đột biến fea* (đột biến làm gen FEA2 bị bất hoạt): bắp ngô có tới 30 hàng hạt nhƣng bắp ngắn và hàng hạt lộn xộn, (B) Bắp của cây hoang dại mang FEA2 (bắp có 14 hàng hạt), (C) Bắp mang đột biến fea* (đột biến làm gen FEA2 bị yếu đi): bắp có 18 hàng thẳng và chiều dài bắp không đổi so với giống không đột biến của cùng một nền di truyền hình B.[14] Ảnh dƣới là mặt cắt ngang của bắp với số hàng hạt đƣợc ghi chú ở giữa.

1.4. SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG PHÉP LAI TRỞ LẠI

1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống

cây trồng

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng nhƣ một phƣơng tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Thay vì đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, ngƣời nghiên cứu chỉ cần tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó. Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lƣợng không nhiều, còn những chỉ thị “may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn tạo giống gặp nhiều hạn chế. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn tới vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection = MAS) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới. So với chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử có những ƣu thế sau:

 Kiểu gen của các locus chỉ thị phân tử có thể đƣợc xác định tại bất kỳ

giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể,

trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân

biệt đƣợc trong những giai đoạn nhất định và thƣờng ở mức độ toàn bộ

cơ thể.

 Số lƣợng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lƣợng các chỉ

thị hình thái rất hạn chế.

 Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thƣờng không liên kết với các

hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thƣờng

hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn.

 Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép

phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của

các chỉ thị hình thái thƣờng tƣơng tác theo kiểu trội - lặn, do đó bị

hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai.

 Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thƣờng làm sai lệch việc

đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối

với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp.

* Các giả thuyết mô hình MAS

Trong những năm gần đây, một vài mô hình MAS đã đƣợc các nhà khoa học đƣa ra và đƣợc phân tích cặn kẽ. Theo một số mô hình, chỉ cần tiến hành lai trở lại qua 4 thế hệ, chứ không cần đến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thể chọn lọc có kích thƣớc nhỏ và các giữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế. Hơn thế nữa, Frisch M. (1999) đã đƣa ra chiến lƣợc “chọn lọc hai giai đoạn” để áp dụng trong trƣờng hợp chƣa biết các thông tin về bản đồ liên kết của các chỉ thị phân tử. [15]

Theo Robert Koebner (2003), những tính toán dựa trên cơ sở máy tính để so sánh các chiến lƣợc chọn lọc 2 bƣớc, 3 bƣớc và 4 bƣớc (stage) về tỷ lệ kiểu gen bố mẹ phục hồi (recurrent parent genotype-RPG) cho thấy:

 Với chiến lƣợc lấy mẫu 4 bƣớc và quần thể từ 50-100 cá thể, tỷ lệ kiểu

gen giống bố mẹ (RPG) có thể đạt 96% với độ tin cậy 90%. Trong

khi chọn giống truyền thống phải cần tới 6 thế hệ và với rủi ro lớn hơn.

 Việc tăng số lƣợng chỉ thị để đánh giá kiểu gen ở mỗi thế hệ có rất ít

tác dụng. Khi ngƣỡng 1 chỉ thị/20cM đạt đƣợc, việc thêm chỉ thị nữa

là không cần thiết (ngoại trừ các chỉ thị xung quanh locus quan

tâm). Tỷ lệ tái tổ hợp chứ không phải số lƣợng chỉ thị là yếu tố hạn

chế trong việc giảm các cản trở liên kết. Điều đó cho thấy, việc lấy

mẫu quần thể lớn hơn với ít chỉ thị hơn có tác dụng hơn việc làm

ngƣợc lại.[16]

Nhƣ vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các

chƣơng trình chọn giống với các ƣu điểm sau:

 Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi

nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng đƣợc biểu hiện ở

những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng

phƣơng pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lƣợng quả và hạt, tính bất

dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang).

 Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc điểm này

khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ nhƣ hình thái rễ, tính kháng

nhiễm đối với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc

hiệu, hay tính kháng những điều kiện gây sốc sinh học nhƣ hạn, mặn,

thiếu muối, các chất độc).

 Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của nhiều

locus trong cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau.

 Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do

vậy mà có thể đƣa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví

dụ đƣa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau. Trong

trƣờng hợp này, các phƣơng pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông

qua sự lây nhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần lƣợt từng thể gây bệnh

hay từng côn trùng gây hại) rất khó đạt đƣợc kết quả. Nhƣng nếu áp

dụng công nghệ chỉ thị phân tử có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt

của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt.

 Ứng dụng MAS (Marker Assisted Selection) đã đƣợc sử dụng phổ biến

ở lúa nhƣng ít đƣợc dùng cho ngô do nghiên cứu di truyền ở ngô rất

khó và phức tạp, chỉ có rất ít các gen của ngô đƣợc tìm ra. Từ khi công

nghệ giải mã hệ gen thế hệ mới (next gene sequencing) ra đời (sau

2007), các gen ở ngô đã đƣợc tìm ra và công bố rất nhiều, và đang tiếp

tục tăng. Nhiều gene tham gia qui định tính trạng số lƣợng đƣợc tìm ra

nhƣ: gen qui định thời gian ra hoa DWARF8 [14]; góc lá đứng

LIGULELESS [17]; số hàng hạt FASCIATED EAR [3] đã thúc đẩy

mạnh ứng dụng của MAS và MABC (marker assisted backcrossing) để

đƣa các gen quy định tính trạng số lƣợng này vào dòng bố mẹ tốt bằng

back-cross.

1.4.2. Phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai

hồi giao (Marker Assited Backcrossing - MABC)

Thông thƣờng, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, ngƣời ta đƣa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phƣơng pháp lai trở lại liên tục qua 5-6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo. Bằng phƣơng pháp này việc đƣa gen lặn vào tổ hợp lai hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào một dòng ƣu việt thƣờng gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện đƣợc [18].

Trong trƣờng hợp ta có 1 giống cây trồng ƣu tú nhƣng cần đƣa thêm một vài gen mong muốn vào giống đó, ngƣời ta sử dụng quy trình lai trở lại nhiều lần với giống ƣu tú nhằm thu đƣợc 1 giống cây trồng mới mang gen mong muốn nhƣng vẫn gữ nguyên nền di truyền của giống ƣu tú. Theo quy trình lai trở lại truyền thống, phải ít nhất 6-8 thế hệ mới thu đƣợc cây mang gen mong muốn nhƣng giữ đƣợc gần 100% nền gen di truyền của giống ƣu tú.

Quy trình tổng quát quá trình lai tạo sử dụng phƣơng pháp lai trở lại qua các thế hệ và tỷ lệ phần trăm gen có trong dòng BC qua các thế hệ đƣợc minh họa ở dƣới đây (hình 1.3).

Hình 1.3: Quá trình backcross qua các thế hệ và tỷ lệ phần trăm gen có trong

các đời backcross

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, các nhà khoa học đã đƣa ra một phƣơng pháp chọn giống phân tử mới – đó là “Chọn giống lai trở lại nhờ chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Backcrossing – MABC). MABC là phƣơng pháp thiết thực, hiệu quả trong việc đƣa locus gen quy định tính trạng di truyền số lƣợng hay gen mong muốn vào giống ƣu tú nhằm chọn tạo giống mới mang gen/tính trạng di truyền số lƣợng mong muốn nhƣng vẫn giữ nguyên (gần 100%) nền gen di truyền của giống ƣu tú với thời gian chọn giống rất ngắn: quy trình chọn giống kết thúc ở thế hệ BC3, thậm chí BC2.

Nguyên lý của phƣơng pháp MABC là chuyển một tính trạng di truyền số lƣợng/gen từ dòng cho gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc sự hội nhập của dòng cho thông qua phần còn lại của hệ gen [19,20]. Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng cƣờng nền di truyền qua mỗi thế hệ. Ƣu điểm chính của phƣơng pháp MABC là:

 Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với locus gen đích

 Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây bố mẹ tái tổ hợp

 Tiến gần đến locus quan tâm trên bản đồ liên kết

 Chọn giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan

tâm

Hiệu quả của các sản phẩm MABC sẽ đƣợc thể hiện trên đồng ruộng [19].

Thông qua phƣơng pháp MABC tốc độ của quá trình chọn lọc đƣợc đẩy nhanh lên gấp đôi, thậm chí gấp ba (chỉ cần đến thế hệ BC2 hoặc BC3 là đạt kết quả tƣơng đƣơng với BC6 theo phƣơng pháp thông thƣờng). Chọn giống qua phƣơng pháp BC nhờ chỉ thị phân tử còn giúp khắc phục đƣợc những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờ loại bỏ đƣợc các tác động gây nhiễu do các tƣơng tác trong cùng một alen hay giữa các alen gây ra. Những tƣơng tác này thƣờng không thể phát hiện đƣợc bằng cách phân tích kiểu hình. Phƣơng pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trƣờng hợp cần đƣa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ƣu việt.

* Ứng dụng MABC trong chọn lọc ngô.

Ở ngô MABC đã đƣợc ứng dụng thành công để cải tiến những tính trạng phức tạp nhƣ tính trạng năng suất hạt. Sử dụng MABC, 6 đoạn NST từ Tx303 và Oh43 đƣợc chuyển sang 2 dòng thuần B73 và Mo17 qua 3 thế hệ lai trở lại và 2 thế hệ tự phối. Những dòng đƣợc cải tiến đƣợc lựa chọn dựa trên những đánh giá. Sau đó, phép lai đơn giữa dòng cải tiến B73 và dòng cải tiến Mo17 cho dòng lai tăng năng suất 12-15%. [20]

Ribaut et al., 2007 đã mô tả kết quả MABC trong cải tiến năng suất ngô trong điều kiện khô hạn của ngô nhiệt đới và so sánh với các phƣơng pháp thay thế MAS [21]. Việc đƣa các alleles từ 5 vùng đích mà tham gia vào sự biểu hiện của các yếu tố cấu thành năng suất và đặc điểm ra hoa đã làm tăng năng suất hạt và làm giảm sự chênh lệch thời gian ra hoa đực và hoa cái trong điều kiện thiếu nƣớc. Khoảng 85% kiểu gen của bố mẹ (recurrent parent) ở ngoài vị trí target đã đƣợc phục hồi sau 4 thế hệ MABC bằng việc sàng lọc quần thể phân ly với số lƣợng cá thể lớn (2200 cá thể) cho 3 thế hệ đầu. Các

dòng BC2F3 đƣợc lai với 2 tester và đánh giá ở những chế độ nƣớc khác nhau cho thấy năng suất của các dòng lai chọn lọc từ MABC cao hơn so với đối chứng trong điều kiện thiếu nƣớc, ít nhất là 50% (dựa trên năng suất trung bình của 5 dòng lai từ MABC tốt nhất). Kết quả cũng chỉ ra rằng việc chọn lọc khoảng 10-20 kiểu gen ở mỗi chu kì MABC là hiệu quả nhất [21].

Theo báo cáo của Zhao et al., 2012, locus tính trạng số lƣợng chính (qHSR1) trên NST số 2 (bin 2.09) quy định khả năng kháng bệnh than (head smut) đã đƣợc tích hợp thành công vào 10 dòng ngô thuần năng suất cao (dòng mẫn cảm với bệnh than). Mỗi dòng thuần này đƣợc lai với dòng cho gen Ji1037, rồi đƣợc lai trở lại với dòng nhận gen tƣơng ứng qua 5 thế hệ. Việc chọn lọc foreground đƣợc tiến hành với các marker liên kết với qHSR1. Việc chọn lọc tái tổ hợp (recombinant selection) đƣợc tiến hành ở thế hệ BC4 bằng flanking marker để giảm những liên kết kéo theo. Việc chọn lọc background (chọn lọc nền di truyền) đƣợc thực hiện ở thế hệ BC5 với các marker SSR bao phủ khắp hệ gen. Các cá thể BC5 đƣợc chọn lọc sẽ đƣợc cho tự thụ phấn qua hai thế hệ. Cả 10 dòng thuần đƣợc cải tiến mang qHSR1 đều thể hiện tăng tính kháng với bệnh than. Thế hệ lai từ các dòng thuần này tăng tính kháng rõ rệt và đảm bảo duy trì đƣợc các đặc tính nông học ƣu tú khác. [22, 23]

Gupta et al., 2013 đã sử dụng phƣơng pháp MABC để tạo ra giống ngô lai Vivek Quality Protein Maize (QPM) 9 từ phép lai giữa hai dòng thuần CM 212 và CM 145 mà đã đƣợc cải tiến khả năng tổng hợp lysin và trypyophan bằng cách tích hợp alen opaque-2 từ dòng cho gen là CML 180 và CML170. Giống ngô lai Vivek Quality Protein Maize (QPM) 9 tăng khả năng tổng hợp tryptophan và lysin lên lần lƣợt là 41 và 30% so với giống ngô lai ban đầu [24].

Gần đây, Zhang et al., 2017 đã lập bản đồ của tính trạng số lƣợng Qgls8 cho khả năng kháng bệnh đốm lá (gray leaf spot - GLS) ở ngô với vùng rộng khoản 130 kb nằm trên NST số 8 bao gồm 5 genes (predicted genes). [25]

Ở Việt Nam, phƣơng pháp MABC cũng đã đƣợc áp dụng thành công để cải tiến một số giống lúa nhƣ Bắc Thơm kháng bạc lá, BC15 kháng đạo ôn, lúa chịu ngập AS996.

Nguyễn Thị Lệ., 2014, sử dụng dòng chuẩn kháng IRBB21 mang gen kháng bệnh Xa21 lai tạo với giống Bắc Thơm 7 tạo ra giống cải tiến kháng 3 chủng bạc lá do Bộ môn bệnh cây- Khoa Nông học phân lập: Chủng 3 (Isolate: 981.HUA10146); chủng 5 (Isolate: 996.HUA10147); chủng 14 (Isolate: 1035.HUA10153) cho năng suất tƣơng đƣơng với giống Bắc Thơm 7. [26]

Năm 2017, Trần Thị Thúy và các cộng sự đã thiết kế mồi nhận biết gen ứng viên (candidate gene) kháng đạo ôn Pik-p ở một số giống lúa địa phƣơng. Tầm soát trình tự gen Pik-p của 36 giống lúa địa phƣơng và xác định giống OM5629 có trình tự, thành phần Nucleotide, amino acid ở vùng CDS (Coding DNA Sequence) tƣơng tự nhƣ gen tham chiếu. Cặp mồi Pikpdel16 đã đƣợc thiết kế có thể khuếch đại đoạn gen với kích thƣớc 14 bp (ở các giống có gen ứng viên Pikp) và 190 bp (ở các giống có trình tự sai khác với trình tự gen Pikp). Sự dụng phƣơng pháp lai hồi giao, tiến hành tích hợp gen ứng viên pik-p vào giống BC5. [27]

Doãn Thị Hƣơng Giang và các cộng sự (2017) cũng đã ứng dụng chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) đã đƣợc sử dụng để cải tiến giống lúa AS996 phổ biến thành giống lúa có thể chịu ngập mà vẫn duy trì các đặc tính ban đầu đang đƣợc nông dân và ngƣời tiêu dùng đón nhận. QTL chịu ngập Sub1 giữ vai trò tới 70% tính chịu ngập. Gen này đƣợc quy tụ vào giống AS996 bằng lai trở lại và hỗ trợ của chỉ thị phân tử. Nghiên cứu đã sử dụng 460 chỉ thị phân tử để đánh giá đa hình của bố mẹ. [28]

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

Dòng bố (BL10) và dòng mẹ (ML10) của giống lai đơn LVN10, không mang allen đột biến fea* (Giống ngô lai đơn LVN10 có nguồn gốc của Viện Nghiên Cứu Ngô, đƣợc công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật tháng 8 năm 1994. Mặc dù đã đƣợc tạo ra cách đây 26 năm nhƣng hiện giống LVN10 vẫn là giống đƣợc nhiều hộ nông dân chọn lựa vì năng suất cao và khả năng thích ứng với mọi vùng sinh thái trong cả nƣớc).

Dòng cho gene fea2-1328 (W22) cung cấp bởi phòng thí nghiệm của giáo sƣ Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory-Mỹ), mang allen đột biến fea*.

Kế thừa các kết quả nghiên cứu của nhóm đề tài từ 2018-2019, sử dụng cá thể backcross BC5F1, BC5F2, BC5F3 làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu này

2.1.2. Các loại hóa chất

Một số hóa chất thông dụng dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử của các hãng QiAgen, Sigma, Merck, ...bao gồm: CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, EDTA, 6X orange loading dye solution, Taq Polymerase, Ethanol, isoamyalcohol, 2-propanol, Acetic acid glacial, Phenol, Chloroform, Ribonuclease A, Formaldehyde 37%, AgNO3, Bind Silane, Sigma Code, Acrylamide, Bis-Acrylamide, Sodium thiosunfate, Urea...;

Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: bốn loại deoxynucleotide triphosphat (dNTPs) của hãng Sigma; Taq-DNA Polymerase của hãng Fermentas

+ 300 mồi SSR nằm trên 10 nhiễm sắc thể đƣợc tìm trên website

http://www.maizegdb.org.

+ Cặp mồi dCAPs (OVS1-OVS2:

GCAACCTCCCCATGCCCCCAAGCCCCGCA-3`; 5`- 5`-

GTTTGTGTCAGCTTCTGTGGAC-3`) đƣợc thiết thiết kế dựa trên trình tự của gen FEA2 Bommert et al., 2013.

2.1.3. Máy móc thiết bị sử dụng

Máy PCR Eppendorf AQ Mastercycle 22331 Hamburg, máy điện di ngang SGU-030T-02 (Mỹ), máy điện di đứng cỡ lớn MGV-102-33 (Mỹ), máy ổn nhiệt (Memmert), tủ lạnh sâu -200C (Frigor -Đan Mạch, -300C (MDF- U537 - Nhật Bản), tủ lạnh bảo quản 40C (SRF64M - Nhật Bản), máy soi gel (T2201, Sigma), mặt nạ chắn tia UV (Sigma), tủ sấy (Memmert), máy ly tâm lạnh (Eppendorf 5810-R vµ 2K15 Sigma).

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Bố trí thí nghiệm lai trở lại (BC)

BC3F1

Dòng nhận gene

MAS

BC4F1

Dòng nhận gene

Kế thừa từ giai đoạn trƣớc

Vụ 1

BC5F1

Vụ 2

BC5F2 @

BC5F3

Thí nghiệm cải tiến tổ hợp lai dòng bố (BL10), mẹ (ML10) tạo giống LVN10 mang allele fea* bằng phƣơng pháp lai trở lại có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử đƣợc khái quát trong sơ đồ lai dƣới đây. Cụ thể thí nghiệm thể hiện trong hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ và kế hoạch lai tạo backcross.

Ở vụ Xuân 2019, bố trí thí nghiệm với 2 tổ hợp lai BC5F1- ML10/W22

và BC5F1- BL10/W22, mỗi tổ hợp lai 140 cá thể, trồng 10 hàng, mỗi hàng 14 cây.

Ở vụ Thu 2019, tiếp tục bố trí thí nghiệm cho 2 tổ hợp lai BC5F2- ML10/W22 và BC5F2- BL10/W22 tƣơng tự giống vụ thu 2019, mỗi tổ hợp lai 140 cá thể, trồng 10 hàng, mỗi hàng 14 cây.

Vụ Xuân 2020, trồng 5 dòng ƣu tú, bố trí thí nghiệm với mỗi dòng 2 hàng, mỗi hàng 14 cây, chọn 20 cây mỗi dòng không có bệnh đánh giá hình thái nông sinh học.

2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử

2.2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN- CTAB

Lấy mẫu lá ngô để kiểm tra chỉ thị phân tử ở giai đoạn thời kỳ 3-6 lá , cắt

2 lá non/cây ở các cá thể ở mỗi tổ hợp lai.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp có sử dụng

CTAB có cải tiến để tiến hành tách chiết ADN từ các dòng BC

1. Cắt 2 cm2 mẫu lá cho vào ống eppendoft 2ml đã có bi và viết ống đầy

đủ.

2. Thêm 100 µl dung dịch buffer CTAB, nghiền mẫu ở 26000 vòng/ 1,5p,

đổi chiều khay nghiên mẫu để nghiền lại lần 2.

3. Thêm 700 µl dung dịch CTAB 4% và 60µl SDS 10% vào mỗi ống eppendoft 2ml vừa nghiền xong, chú ý không đƣợc để đầu pipet chạm vào thành ông, đóng nắp ống và lắc đều.

4. Ủ mẫu ở 65 độ C trong 20 phút. 5. Bổ sung 800 µl chlorofom vào ống mẫu trong tủ hút. 6. Đóng nắp ống, lắc đều sau đó cho vào ly tâm 13000 rmp trong 15 phút. 7. Lấy ống ra khỏi máy ly tâm, lúc này ống chia tành 3 lớp, dịch trên cùng trong suốt màu hơi xanh hoặc vàng, ở giữa là lớp bã lá, cuối cùng là chlorofom có màu xanh đậm. Hút 400 µl dịch tách trên cùng cho vào ống eppendoft 1,5 µl đã bổ sung 400 µl isopropanol.

8. Lắc đều ống, ủ mẫu trong tủ lạnh -40 C ít nhất 1 giờ đồng hồ. 9. Lấy mẫu ra từ tủ lạnh, lắc đều, ly tâm 13000 rpm trong 15 phút. 10. Đổ bỏ dịch bên trên, giữ lại kết tủa ở đáy ống nghiệm. 11. Rửa tủa bẳng EtOH 70%, đổ bỏ dịch và phơi phô trong 15 -20 phút. 12. Thêm 100 µl nƣớc cất khử trùng vào mỗi ống, vortex cho tan hết tủa

sau đó cất mẫu vào tủ lạnh ngăn mát.

2.2.2.2.Phương pháp PCR bằng mồi dCAPs

Phƣơng pháp nghiên cứu sử dụng PCR kiểm tra sự có mặt của gene fea*

trong các con lai. Sử dụng chỉ thị phân tử dCAPs đặc hiệu cho đột biến điểm

của allele fea*. Bommert et al., 2013, tác giả đã có sẵn trình tự các cặp mồi

kiểm tra gene fea* (allele fea2-1328). Cặp mồi này khi nhân tạo ra sản phẩm

PCR, sản phẩm PCR nhân lên từ allele đột biến sẽ bị cắt bằng enzyme SmlI,

còn sản phẩm PCR nhân lên từ allele hoang dại không đột biến sẽ không bị

cắt. Ngoài ra chúng tôi cũng sẽ thiết kế thêm các cặp mồi OVS1 – OVS2 dựa

trên trình tự của gene FEA2. Cặp mồi OVS1 – OVS2 khi nhân tạo ra sản

phẩm PCR, sản phẩm PCR nhân lên từ allele đột biến sẽ bị cắt bằng enzyme

PstI

Trình tự cặp mồi sử dụng cho kiểm tra đột biến fea* bởi Bommert et al.,

2013

Tên mồi Trình tự

Fea*F 5’-GTTTGTGTCAGCTTCTGTGGAC-3’

Fea*R 5’GCAACCTCCCCATGCCCCCTCA-3’

- Trình tự cặp mồi dCAPs dùng trong PCR:

Trình tự Tên mồi

OVS1 –F

5’-GCAACCTCCCCATGCCCCCAAGC CCCGCA-3’

OVS1 –R 5’-GTTTGTGTCAGCTTCTGTGGAC-3’

- Thành phần dung dịch phản ứng PCR với mồi dCAPS

Tên thành phần Thể tích (µl)

DNA 2

Nƣớc cất 4.45

Buffer fx 10 0.8

dNTP 0.25

Taq 0.7

OSV 1 0.4

OSV 2 0.4

DMSO 1

Tổng cộng: 10

Phản ứng PCR đƣợc chạy với chu kỳ nhiệt với cặp mồi OSV1 và OSV2

đƣợc trình bày cụ thể 2 bƣớc nhƣ sau:

• Bƣớc 1: Cặp mồi OSV1/OSV2 biến tính ở 940 C trong 3 phút (tách mạch DNA khuôn), chạy 5 chu kỳ lặp lại với 940 C trong 20 giây, 52 0C trong 30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 30 giây (kéo dài).

• Bƣớc 2: Chạy 39 chu kỳ lặp lại với 940 C trong 20 giây, 59 0C trong 30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 30 giây (kéo dài), cuối cùng giữ ở 72 0C trong 5 phút (hoàn thành chuỗi phản ứng).

Hình 2.2. Chu kỳ nhiệt PCR với cặp mồi OSV1 và OSV2

2.2.2.3. Phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn PstI

Sử dụng cặp mồi OSV1 và OSV2 trong PCR khuếch đại đƣợc đoạn DNA dài 212bp, sau đó sản phẩm PCR đƣợc cắt bởi enzyme cắt giới hạn PstI tại điểm không đột biến trên đoạn DNA nhờ đó phân biệt đƣợc các kiểu gen khác nhau của các cá thể đồng hợp trội (không đột biến), dị hợp và đồng hợp lặn (gen đột biết). Phản ứng cắt DNA nhờ eyme cắt giới hạn PstI trong điều kiện 370C trong 2 giờ, dƣới đây là bảng thành phần dung dịch phản ứng cắt PCR bằng PstI.

- Thành phần dung dịch phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới

hạn Pst I

Tên thành phần Thể tích (µl)

Sản phẩm PCR (DNA)

Buffer Cs 2

Pst I 0.5

Nƣớc cất 7.5

Tổng cộng 20

Enzyme giới hạn PstI cắt sản phẩm PCR, sau khi điện di trên gel agarose 3% và nhuộm sẽ quan sát thấy 2 băng với kích thƣớc 212 bp và 192bp, còn băng kích thƣớc 20bp kích thƣớc quá nhỏ nên không thể hiện trong bản gel. Nhƣ vậy, cá thể có kiểu gen đồng hợp trội sẽ thể hiện 1 băng trên bản gel với kích thƣớc 192 bp, cá thể mang kiểu gen đồng hợp lặn (không bị Pst I cắt) sẽ thể hiện trên bản gel 1 băng với kích thƣớc 212 bp và cá thể mang kiểu gen dị hợp sẽ có 2 băng trên bản gel kích thƣớc 212bp và 192 bp

2.2.2.4.Phương pháp PCR với mồi SSR

Thành phần dung dịch phản ứng PCR với mồi SSR

Tên thành phần Thể tích (µl)

DNA 2

Nƣớc cất 3.65

Buffer fx 10 0.8

dNTP (10mM) 0.25

Primer (10mM) 1.6

Taq 0.7

DMSO 1

Tổng cộng: 10

Phản ứng PCR đƣợc chạy với chu kỳ nhiệt:

• Bƣớc 1: Cặp mồi SSR biến tính ở 940 C trong 3 phút (tách mạch DNA

khuôn.

• Bƣớc 2: Chạy 39 chu kỳ lặp lại với 940 C trong 30 giây, 55 0C trong 30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 40 giây (kéo dài), cuối cùng giữ ở 72 0C trong 5 phút (hoàn thành chuỗi phản ứng).

2.2.2.5. Phương pháp điện di trên gel poly-acrylamide

Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 6,0% và đƣợc

phát hiện dƣới tia cực tím bằng phƣơng pháp nhuộm ethidium bromide.

Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích thƣớc

30cm x 12cm):

29,2 ml Nƣớc cất khử ion

2 ml TBE 10X

6 ml Dd acrylamide 40%

400 µl Dung dịch APS 10%

25 µl Dung dịch TEMED

40ml Tổng thể tích gel

Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính. Sau 30 phút gel đƣợc polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di, tiến hành điện di sản phẩm PCR cùng với thang marker có trọng lƣợng chuẩn ở điều kiện 150V. Thời gian điện di khoảng 50 - 60 phút. Lấy gel ra khỏi kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nƣớc sạch. Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It.

2.2.2.6. Phương pháp điện di trên gel Agarose

Khi tiến hành điện di gel agarose chúng tôi dùng thuốc nhuộm ethydium bromide để hiện hình các băng DNA trên gel. Chất này sẽ gắn vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang khi chiếu tia tử ngoại.

Sản phẩm sau khi sử dụng enzyme cắt giới hạn sẽ đƣợc điện di trên gel

agarose 3% để phân tách các đoạn DNA cùng với marker 100bp.

Cách tiến hành:

1. Cân 1.2g agarose cho vào bình tam giác, bổ sung 40 ml dung dịch TAE

1X lắc nhẹ cho agarose hòa lẫn trong dung dịch.

2. Đun bình trong lò vi sóng 1-2 phút, dung dịch sôi và trở thành trong

suốt.

3. Đổ gel vào khay (đã đặt sẵn lƣợc), để gel đông lại sau đó chuyển khay

chứa bản gel vào máy điện di, đổ đệm TAE 1X ngập bản gel khoảng 0.5 cm.

4. Tra mẫu: Mẫu đƣợc đánh dấu bằng cách bổ sung thêm loading dye, tra

10 µl mẫu vào từng giếng

6. Chạy điện di: sau khi tra mẫu điện di xong, kết nối máy điện di với bộ

nguồn, đặt 120V, chạy khoảng 30 phút.

7. Chụp ảnh gel: gel đƣợc soi dƣới đèn tử ngoại, băng DNA sẽ phát sáng

nhờ liên kết với ethydium bromide. Chụp ảnh gel.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ

3.1.1. Kết quả xác định chỉ thị đa hình giữa các dòng ML10, BL10

và dòng W22 trên 10 NST

3.1.1.1. Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình ngoài vùng gen fea* giữa

dòng ML10 và dòng W22

Để kiểm tra xác định chỉ thị phân tử đa hình nằm ngoài vùng locus gen

fea* trên toàn bộ 10 NST phục vụ công việc xác định nền di truyền các cá thể

trong quần thể chọn tạo. Thí nghiệm đã sử dụng 300 chỉ thị SSR kiểm tra xác

định đa hình giữa dòng ML10 và W22 (bảng 3.1, hình 3.1 đến hình 3.10), kết

quả cho thấy:

300 mồi SSR nằm rải rác trên 10 nhiễm sắc thể đƣợc tham khảo và sử dụng dựa trên cơ sở dữ liệu. Các chỉ thị đƣợc đánh giá về mức độ đa hình giữa dòng ML10, BL10 với W22 để sàng lọc các chỉ thị cho đa hình, đƣợc sử dụng để đánh giá nền di truyền.

Từ 300 chỉ thị SSR đƣợc sử dụng để xác định mức tính đa hình giữa ML10 và W22, kết quả đã xác định đƣợc tổng số 31 chỉ thị cho đa hình rải rác trên 10 nhiễm sắc thể (NST). Trên Nhiễm sắc thể số 1 (NST1), đã xác định đƣợc 4 chỉ thị đa hình không liên kết locus gen fea* là umc1754, umc1160, umc1166, umc1630. Bốn chỉ thị cho kết quả đa hình: bnlg381, umc1506, umc1947, umc1633 trên NST2; 4 chỉ thị đa hình: umc2101, umc1030, phi053, bnlg1035 trên NST3. Trên NST4, NST5, đều xác định số lƣợng chỉ thị đa hình bằng nhau.Tại NST4 có 3 chỉ thị phi072, umc1847, phi021. Tƣơng tự trên NST5, các chỉ thị umc1097, umc1591, umc1349. Trên NST6 có 2 chỉ thị (umc1143, phi070) cho đa hình trên tổng số chỉ thị đƣợc khảo sát. Tại NST7 xác định các chỉ thị đa hình là: umc2177, umc1407. Các chỉ thị đa hình trên NST8: umc1974, umc1904, phi233376. Trên NST9, các chỉ thị đa hình là: umc1137, phi027, phi061, bnlg1129. Trên NST10 xác định đƣợc 2 chỉ thị (umc1380, umc1239) đa hình trên tổng số chỉ thị đã khảo sát giữa hai

dòng ML10 và W22. Các chỉ thị cho đa hình giữa ML10 và W22 trên 10 nhiễm sắc thể đƣợc sử dụng để đánh giá nền di truyền của các dòng bố mẹ cải tiến mang gen fea*.

Bảng 3.1. Các thông tin chi tiết chỉ thị cho đa hình trên 10 nhiễm sắc

thể giữa dòng ML10 và W22

STT

Tên mồi SSR

Mồi xuôi

Mồi ngƣợc

Vị trí NST

umc1160

CGTTTGATATGATGTGGAGATTCG

AAGCTTGTGAATGTTCTGGATGTC

1.01

umc1166

CGATCAGATCATACACAACCTTGC

GAGGATCGATTCTTGGCGAGT

1.02

umc1754

ATAGGGATCGACCCGTTCGT

AATATCTCCGATCCACCAACAAAA

1.06

umc1630

CAGACCTTCGAGGGCAAGAACT

AGTTTTGGCTTCTTCTCCCAAGTC

1.11

bnlg381

TCCCTCTTGAGTGTTTATCACAAA

GTTTCCATGGGCAGGTGTAT

2.02

umc1506

AAAAGAAACATGTTCAGTCGAGCG

ATAAAGGTTGGCAAAACGTAGCCT

2.07

umc1947

GGATCTCACCCCCTGCTGTC

ATCACGCGCTCACTCTCCTCT

2.08

umc1633

GTCCTTCCTCTCCTTCGTGCATA

CAGAGGCTGTTGTTCCCCAC

2.08

umc1030

TCCAGAGAATGAGATGACAAGACG

CAGAATAACAGGAGATGAGACGCA

3.04

phi053

CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGAC

AACCCAACGTACTCCGGCAG

3.05

umc2101

CCCGGCTAGAGCTATAAAGCAAGT

CTAGCTAGTTTGGTGCGTGGTGAT

3.00

bnlg1035

TGCTTGCACTGTCAGGAATC

CAGCTCTGACACACCACACA

3.05

phi072

ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT

GACAGCGCGCAAATGGATTGAACT

4.00

phi021

TTCCATTCTCGTGTTCTTGGAGTGGTCCA

CTTGATCACCTTTCCTGCTGTCGCCA

4.03

GCCCAAGGTAGATTTTTACTCTCCA

AAGTCGTAGAGCTCGTCGTGATG

umc1847

4.07

CTCGTCAACGTCAACCCAAGTAAG

CTGTTAGATGTGCGACAACAGAGC

umc1097

5.00

GAGGTCTCTCTCGGTCGACATC

CAACCAACTGGCAACTACTCGAC

umc1591

5.04

ACGACCAGTGCTTCGCTCAC

AGTTTCCATCGTATGATGTCGAGG

umc1349

5.04

GACACTAGCAATGTTCAAAACCCC

CGTGGTGGGATGCTATCCTTT

umc1143

6.00

GCTGAGCGATCAGTTCATCCAG

CCATGGCAGGGTCTCTCAAG

phi070

6.07

ACCATGCATGTCTCACGTCACT

GGGTACGTGCTGTGGAGGAC

umc2177

7.00

AGGCTTACCTCCTGAGAAGCAGTT

AGGCTTAGCATCGGTGGAGAG

umc1407

7.05

ACAAGGAGACCCTCCTCAGCTAGT

GTAAGCTGTGGCCATACTACCACC

umc1974

8.02

CAGCCACTCGTTTATGGAGGTTTA

TGTTACTAGTCGATCTGATGCCCA

umc1904

8.03

phi233376

CCGGCAGTCGATTACTCC

CGAGACCAAGAGAACCCTCA

8.09

umc1137

ATCAGTCACTCTTCTGCCTCCACT

GGCTGGATAATGTTGTAGCTGGTC

9.00

CGGGATCAGTCGTTACAAACATAG

GCGTACGTACGACGAAGACAC

phi027

9.03

GACGTAAGCCTAGCTCTGCCAT

AAACAAGAACGGCGGTGCTGATTC

phi061

9.03

GAGAGTATGCTACTCGCCGC

GACGAGTTTGGAGTGCCATT

bnlg1129

9.08

CTGCTGATGTCTGGAAGAACCCT

AGCATCATGCCAGCAGGTTTT

umc1380

10.00

ATCAACACACCTTTCGATTTCTGG

CGGTGATTAGTCGATGAAGAGTGA

umc1239

10.03

3.1.1.2. Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình ngoài vùng gen fea* giữa

dòng BL10 và dòng W22

Trong 300 chỉ thị SSR đƣợc sử dụng xác định đƣợc 26 chỉ thị cho kết quả đa hình giữa BL10 và W22, chiếm 8,7 % số cặp mồi tham gia phản ứng (bảng 3.2). Trên nhiễm sắc thể 1, 2 và 6 có nhiều chỉ thị đa hình với 4 chỉ thị trên NST1 (bnlg439, umc1160, umc1976, umc1819), trên NST2 gồm phi083, umc1875, umc1635, umc1506 và NST6 gồm umc0241, phi299852, umc1143, phi070. Nhóm nhiễm sắc thể có số lƣợng chỉ thị cho kết quả đa hình tƣơng đƣơng nhau là NST3, NST5 và NST9; NST4 và NST10. Cụ thể, trên NST3 xác định đƣợc các chỉ thị đa hình gồm: umc2101, umc1030, trên NST5 gồm umc1097, umc1349 và trên NST9 chỉ thị đa hình là umc2340, phi022. Tƣơng tự, chỉ thị đa hình trên NST4 là 3 chỉ thị: phi072, bnlg1217, bnlg2162 và trên NST10 với 3 chỉ thị gồm: phi041, umc1380, umc1239. Nhóm nhiễm sắc thể có ít chỉ thị đa hình là NST7 (umc2177) và NST8 (umc1904). Các chỉ thị cho đa hình giữa BL10 và W22 trên 10 nhiễm sắc thể đƣợc sử dụng để đánh giá nền di truyền của các dòng bố mẹ cải tiến mang gen fea*

Các chỉ thị phân tử đa hình trên 10 NST sẽ đƣợc sử dụng để xác định

nền di truyền giữa các cá thể trong quần thể chọn tạo giống.

Bảng 3.2. Các thông tin chi tiết chỉ thị cho đa hình trên 10 nhiễm sắc

thể giữa dòng BL10 và W22

Vị

STT

Tên mồi SSR

Mồi xuôi

Mồi ngƣợc

trí

NST

TTGACATCGCCATCTTGGTGACCA

TCTTAATGCGATCGTACGAAGTTGTGGAA

1.03

bnlg439

CGTTTGATATGATGTGGAGATTCG

AAGCTTGTGAATGTTCTGGATGTC

umc1160

1.01

TGCCGAGGCTTCTAGTAGACCAA

CGCTATATCTATCCCGCAGCAAC

umc1976

1.02

umc1819

GCTGCTCTAAAATCATGCTGATAAAA

TATTCAGCAATGTATTCCCCCTGT

1.12

phi083

CAAACATCAGCCAGAGACAAGGAC

ATTCATCGACGCGTCACAGTCTACT

2.04

umc1635

GCTGAGCAGATCTTTCCTTGTTTC

AAGGAGCAGAACTCGGAGACG

2.05

umc1875

AAGCGACAGTTGGTTTCAGTTTTC

AGTTGCATGACCTTGTCAACCTTT

2.06

umc1506

AAAAGAAACATGTTCAGTCGAGCG

ATAAAGGTTGGCAAAACGTAGCCT

2.07

umc1030

TCCAGAGAATGAGATGACAAGACG

CAGAATAACAGGAGATGAGACGCA

3.04

umc2101

CCCGGCTAGAGCTATAAAGCAAGT

CTAGCTAGTTTGGTGCGTGGTGAT

3.00

bnlg1217

AGCTGATCTGCACGTTGTTG

GCAGATCCACGCCATTTAAA

4.05

phi072

ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT

GACAGCGCGCAAATGGATTGAACT

4.00

bnlg2162

GTCTGCTGCTAGTGGTGGTG

CACCGGCATTCGATATCTTT

4.08

umc1097

CTCGTCAACGTCAACCCAAGTAAG

CTGTTAGATGTGCGACAACAGAGC

5.00

umc1349

ACGACCAGTGCTTCGCTCAC

AGTTTCCATCGTATGATGTCGAGG

5.04

umc1143

GACACTAGCAATGTTCAAAACCCC

CGTGGTGGGATGCTATCCTTT

6.00

umc0241

TATATCCGTGCATTTACGTTT

CATCGCTTGTCTGTCGA

6.05

phi299852

GATGTGGGTGCTACGAGCC

AGATCTCGGAGCTCGGCTA

6.07

phi070

GCTGAGCGATCAGTTCATCCAG

CCATGGCAGGGTCTCTCAAG

6.07

umc2177

ACCATGCATGTCTCACGTCACT

GGGTACGTGCTGTGGAGGAC

7.03

umc1904

CAGCCACTCGTTTATGGAGGTTTA

TGTTACTAGTCGATCTGATGCCCA

8.03

umc2340

GCTAGCTCACCTACTCTGTGGCTG

ACAGGGAGTAGAGGACGAGCG

9.03

phi022

TGCGCACCAGCGACTGACC

GCGGGCGACGCTTCCAAAC

9.03

umc1380

CTGCTGATGTCTGGAAGAACCCT

AGCATCATGCCAGCAGGTTTT

10.00

phi041

TTGGCTCCCAGCGCCGCAAA

GATCCAGAGCGATTTGACGGCA

10.00

umc1239

ATCAACACACCTTTCGATTTCTGG

CGGTGATTAGTCGATGAAGAGTGA

10.03

Nhƣ vậy trong tổng số 300 chỉ thị phân tử trên 10 NST sử dụng trong

khỏa sát đa hình xác định đƣợc 31 chỉ thị phân tử cho kết quả đa hình giữa

ML10 và W22, 26 chỉ thị phân tử cho kết quả đa hình giữa BL10 và W22.

Những chỉ thị phân tử đa hình này sẽ đƣợc sử dụng xác định nền di truyền các cá

thể trong quần thể chọn tạo giống bằng phƣơng pháp chỉ thị phân tử và lai trở lại

Hình 3.1. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST1 giữa

các dòng ML10, BL10, và W22 (Tên mồi đƣợc hiển thị phía trên của bản giếng. Thứ tự các mẫu từ trái qua phải: ML10-BL10-W22, sử dụng Ladder 20bp )

Hình 3.2. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST2 giữa các

dòng ML10, BL10, và W22

(Tên mồi đƣợc hiển thị phía trên của bản giếng. Thứ tự các mẫu từ trái

qua phải: ML10-BL10-W22, sử dụng Ladder 20bp)

Hình 3.3. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST3 giữa các dòng ML10, BL10, và W22

(Tên mồi đƣợc hiển thị phía trên của bản giếng. Thứ tự các mẫu từ trái

qua phải: ML10-BL10-W22, sử dụng Ladder 20bp)

Hình 3.4. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST4 giữa các

dòng ML10, BL10, và W22

(Tên mồi đƣợc hiển thị phía trên của bản giếng).

Thứ tự các mẫu từ trái qua phải: ML10-BL10-W22, sử dung Ladder 20bp)

Hình 3.5. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST5 giữa các dòng ML10, BL10, và W22

(Tên mồi đƣợc hiển thị phía trên của bản giếng. Thứ tự các mẫu từ trái

qua phải: ML10-BL10-W22, sử dụng Ladder 20bp)

Hình 3.6. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST6 giữa

các dòng ML10, BL10, và W22

(Tên mồi đƣợc hiển thị phía trên của bản giếng. Thứ tự các mẫu từ trái

qua phải: ML10-BL10-W22, sử dụng Ladder 20bp)

Hình 3.7. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST7 giữa

các dòng ML10, BL10, và W22

(Tên mồi đƣợc hiển thị phía trên của bản giếng. Thứ tự các mẫu từ trái

qua phải: ML10-BL10-W22, , sử dụng Ladder 20bp)

Hình 3.8. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST8 giữa

các dòng ML10, BL10, và W22

(Tên mồi đƣợc hiển thị phía trên của bản giếng. Thứ tự các mẫu từ trái

qua phải: ML10-BL10-W22, sử dụng Ladder 20bp)

Hình 3.9. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST9 giữa

các dòng ML10, BL10, và W22

(Tên mồi đƣợc hiển thị phía trên của bản giếng. Thứ tự các mẫu từ trái

qua phải: ML10-BL10-W22, sử dụng Ladder 20bp)

Hình 3.10 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST10 giữa

các dòng ML10, BL10, và W22

(Tên mồi đƣợc hiển thị phía trên của bản giếng. Thứ tự các mẫu từ trái

qua phải: ML10-BL10-W22, sử dụng Ladder 20bp)

3.1.2. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 mang gen

fea* bằng phƣơng pháp chỉ thị phân tử

Với mục tiêu chọn lọc cá thể mang gen fea* từ giống ngô W22 vào các dòng ML10, BL10. Những cá thể BC4F1 đƣợc chọn lọc mang gen fea* đƣợc tiến hành lai trở lại với các dòng trên tạo quần thể BC5F1

3.1.2.1. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 ở dòng

ML10

Trong thí nghiệm này, 91 cá thể lai ở tổ hợp lai ML10/W22 đƣợc xác định với chỉ thị OVS1-2 để chọn cá thể mang gen đích. Kết quả chọn lọc thể hiện qua hình 3.11 và bảng 3.3

Trong tổ hợp lai ML10/W22, kết quả xác định đƣợc 40/91 cá thể mang gen fea* dị hợp có số thứ tự là: ML10-5.1, 2, 3, 7, 10, 11, 13, 15, 21, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 38, 40, 45, 57, 48, 49, 61, 62, 65, 67, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90.

Hình 3.11: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F1 của tổ hợp lai ML10/W22

sử dụng cặp mồi OVS1-OVS2 ( sử dụng Ladder 100bp)

3.1.2.2. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 ở dòng

BL10

Trong thí nghiệm này, 82 cá thể lai ở tổ hợp lai BL10/W22 đƣợc xác định với chỉ thị OVS1-2 để chọn cá thể mang gen đích. Kết quả chọn lọc thể hiện qua hình 3.12 và bảng 3.3

Tổ hợp lai BL10/W22, kết quả xác định đƣợc 40/82 cá thể mang gen fea* dị hợp có số thứ tự là: BL10-5.1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 15, 18, 28, 29, 36, 37, 40, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 56, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 70, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 82.

Hình 3.12: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F1 của tổ hợp lai BL10/W22 sử dụng cặp mồi OVS1-OVS2( sử dụng Ladder 100bp)

Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra kiểu gen của các dòng BC5F1 vụ Xuân 2019

Kết quả kiểm tra

Số cá thể TT Dòng BC Số cá thể đồng Số cá thể kiểm tra kiểu gen Tên cá thể BC5F1 dị hợp hợp trội

ML10 91 1 40 51 ML10-5.1- ML10-5.91 BC5F1

82 2 41 41 BL10 BC5F1 BL10-5.1- ML10- BL10-5.82 5.91

- BL10-

5.82

Nhƣ vậy, với mục tiêu chọn lọc cá thể mang gen fea* từ giống W22 mang nguồn cho gene fea* lai tạo với dòng bố BL10 và mẹ ML10 của giống ngô lai LVN10. Trong thí nghiệm này, 91 cá thể BC5F1 ở tổ hợp lai ML10/W22 và 82 cá thể BC5F1 ở tổ hợp lai BL10/W22 đƣợc lựa chọn để xác định cá thể mang gen fea* bằng chỉ thị OVS1-OVS2. Kết quả xác định đƣợc 40/91 cá thể BC5F1 mang gen fea* dị hợp ở tổ hợp lai ML10/W22 và 41/82 cá thể BC5F1 mang gen fea* dị hợp ở tổ hợp lai dòng bố BL10/W22. Các con lai

mang kiểu gen di hợp nghĩa là mang cả alen của dòng cho và alen của dòng nhận. Các cá thể BC5F1 mang kiểu gen dị hợp có kiểu hình tƣơng đồng với giống nền và sạch bệnh đƣợc lựa chọn để kiểm tra nền di truyền.

3.1.3. Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea*

trong quần thể BC5F1

3.1.3.1. Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea* trong

quần thể BC5F1 ở dòng lai ML10

Sau khi kiểm tra xác định đƣợc 40 cá thế BC5F1 mang kiểu gen fea* dị

hợp, lựa chọn 28 cá thể kiểm tra nền di truyền so với dòng nhận gen ML10

bằng chỉ thị phân tử. Sử dụng 31 chỉ thị đa hình giữa dòng cho gen W22 và

dòng nhận gen ML10 rải trên 10 NST để xác định nền di truyền ML10 của 28

cá thể mang gen fea* trong quần thể BC5F1 (bảng 3.1). Để tiết kiệm thời gian

thực hiện thí nghiệm, 28 cá thể đƣợc thành 3 nhóm sau đó hỗn ADN của các

cá thể theo 3 nhóm để tiến hành thực hiện phản ứng PCR. Danh sách chia

nhóm nhƣ sau:

Nhóm DNA Các cá thể BC5F1 trong nhóm

Nhóm 1 ML10-5.1, 2, 10, 11, 13, 15, 21, 26,

30, 31

Nhóm 2 ML10-5.32, 38, 40, 45, 47, 48, 49,

61, 62, 65

Nhóm 3 ML10-5.67, 71, 73, 74, 75, 83, 86,

Kết quả xác định nền di truyền các cá thể mang locus gen fea* trong quần

thể BC5F1 với 31 chỉ thị đa hình trên 10 nhiễm sắc thể đƣợc thể hiện qua hình

3.13.

Trong số 31 chỉ thị xác định đƣợc 29 chỉ thị xuất hiện băng đồng đồng hợp

của cả nhóm 1, nhóm 2 và nhóm 3. Hai chỉ thị umc1160, umc1066 xuất hiện cá

thể nhóm 3 băng dị hợp. Các cá thể nhóm 3 tiếp tục đƣợc PCR từng cá thể trong

nhóm với hai chỉ thị trên (hình 3.14). Kết quả trên đƣợc thể hiện bảng sau:

Tên cá thể

% Recover

Số chỉ thị đồng hợp/Tổng số chỉ thị đa hình

Tên chỉ thị xuất hiện cá thể dị hợp

Bảng 3.4: Tỉ lệ nền di truyền của các cá thể BC5F1 so với dòng nhận gen ML10

ML10

Nhóm 1

100

31/31

ML10-5.1

100

31/31

ML10-5.2

100

31/31

ML10-5.10

100

31/31

ML10-5.11

100

31/31

ML10-5.13

100

31/31

ML10-5.15

100

31/31

ML10-5.21

100

31/31

ML10-5.26

100

31/31

ML10-5.30

100

31/31

ML10-5.31

100

Nhóm 2

31/31

ML10-5.32

100

31/31

ML10-5.38

100

31/31

ML10-5.40

100

31/31

ML10-5.45

100

31/31

ML10-5.47

100

31/31

ML10-5.48

100

31/31

ML10-5.49

100

31/31

ML10-5.61

100

31/31

ML10-5.62

100

31/31

ML10-5.65

100

Nhóm 3

31/31

ML10-5.67

100

31/31

ML10-5.71

100

29/31

ML10-5.73

93,5

umc1160, bumc1166

30/31

ML10-5.74

96,7

umc1160

30/31

ML10-5.75

96,7

31/31

ML10-5.83

100

30/31

ML10-5.86

96,7

umc1160

29/31

ML10-5.88

93,5

umc1160, umc1166

(-): cá thể không có chỉ thị xuất hiện băng dị hợp

Trong số 31 chỉ thị xác định đƣợc 29 chỉ thị xuất hiện băng đồng hợp của cả nhóm 1, nhóm 2 và nhóm 3. Hai chỉ thị umc1160, umc1066 xuất hiện băng dị hợp ở các cá thể thuộc nhóm 3. Các cá thể nhóm 3 tiếp tục đƣợc PCR từng cá thể trong nhóm với hai chỉ thị trên. Dựa vào tính toán trên 31 chỉ thị rải đều trên toàn bộ hệ genome. Kết quả đã xác định đƣợc cá thể có nền di truyền tƣơng đƣơng dòng mẹ ML10 nhất, đạt 31/31 số chỉ thị (tỷ lệ 100%) xuất hiện băng ADN tƣơng tự với dòng ML10 là các cá thể thuộc nhóm 1 (ML10-5.1, 2, 10, 11, 13, 15, 21, 26, 30, 31), nhóm 2 (ML10-5.32, 38, 40, 45, 47, 48, 49, 61, 62, 65) và nhóm 3 gồm các cá thể: ML10-5.67, 71, 83. Các cá thể ML10-5.74, 75, 86 đạt 30/31 (tỷ lệ 96,7%) số chỉ thị xuất hiện băng ADN giống với dòng ML10. Cá thể ML10-5.73 và ML10-5.88 đạt 29/31 (tỷ lệ 93,5%) số chỉ thị xuất hiện băng ADN giống với dòng ML10 (bảng 3.5, hình 3.13, 3.14).

Hình 3.13. Kết quả kiểm tra nền di truyền nhóm cá thể BC5F1 của 31

chỉ thị trên 10 nhiễm sắc thể

(Thứ tự các mẫu từ trái qua phải: Nhóm 1-Nhóm 2- Nhóm 3- ML10- W22,

sử dụng Ladder 20bp)

Chr1 – Nhóm 3

Hình 3.14. Kết quả kiểm tra nền di truyền của các cá thể BC5F1 thuộc

nhóm 3 với các chỉ thị umc1160 và umc1166

3.1.3.2. Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea* trong

quần thể BC5F1 ở dòng lai BL10

Đối với tổ hợp lai BL10/W22 ở thế hệ BC5F1 xác định đƣợc 41 cá thể mang kiểu gen dị hợp fea*. Lựa chọn 27 cá có kiểu hình đẹp để xác định nền di truyền so với dòng nhận gen BL10 bằng 26 chỉ thị đa hình giữa dòng cho gen W22 và dòng nhận gen BL10 (bảng 3.2). Để tiết kiệm thời gian thực hiện thí nghiệm, 27 cá thể đƣợc thành 3 nhóm sau đó hỗn ADN của các cá thể theo 3 nhóm để tiến hành thực hiện phản ứng. Ba nhóm ADN hỗn nhƣ sau:

Nhóm ADN Các cá thể trong nhóm

Nhóm 1 BL10-5.1, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 14, 15, 29

Nhóm 2 BL10-5.36, 37, 40, 43, 45, 46, 47,

49, 50, 51

Nhóm 3 BL10-5.62, 69, 70, 74, 79, 81, 82.

Kết quả xác định nền di truyền của các nhóm cá thể so với giống nền thể hiện hình 3.15. Kết quả cho thấy, trong 26 chỉ thị, xác định đƣợc 24 chỉ thị xuất hiện băng đồng hợp ở cả 3 nhóm cá thể. Còn lại 2 chỉ thị umc1160 trên NST1 xuất hiện băng dị hợp ở cá thể nhóm 1 và chỉ thị phi070 (NST6) xuất hiện ở

nhóm cá thể số 3. Các cá thể trên tiếp tục đƣợc PCR từng cá thể trong nhóm với hai chỉ thị trên (hình 3.16). Dựa vào kết quả hình 3.15, hình 3.16 và bảng 3.5, cho thấy:

Xác định đƣợc 21 cá thể có nền di truyền cao nhất 100% so với dòng BL10, 26/26 số chỉ thị (đạt tỉ lệ 100%) xuất hiện băng đồng hợp tƣơng tự dòng bố BL10, cụ thể là 7 cá thể thuộc nhóm 1 (BL10-5.3, 4, 5, 7, 12, 15, 29) và toàn bộ cá thể thuộc nhóm 2 (BL10-5.36, 37, 40, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51) và 4 cá thể thuộc nhóm 3 (BL10-5.62, 69, 70, 79). Còn lại các cá thể BL10- 5.1, BL10-5.6, BL10-5.12, BL10-5.62, BL10-5.74, BL10-5.81, BL10-5.82 đạt 25/26 số chỉ thị tƣơng đồng với dòng bố BL10, có tỷ lệ nền di truyền so với giống nhận gen BL10 đạt 96,7%.

Bảng 3.5. Tỉ lệ nền di truyền của các cá thể BC5F1 so với dòng nhận

STT

Tên cá thể

% Recover

Số chỉ thị đồng hợp/Tổng số chỉ thị đa hình

Tên chỉ thị xuất hiện cá thể dị hợp

26/26

gen BL10

BL10

Nhóm 1

BL10-5.1

25/26

96,7

umc1160

BL10-5.3

26/26

100

BL10-5.4

26/26

100

BL10-5.5

26/26

100

BL10-5.6

25/26

96,7

umc1160

BL10-5.7

26/26

100

BL10-5.12

25/26

96,7

umc1160

BL10-5.14

26/26

100

BL10-5.15

26/26

100

BL10-5.29

26/26

100

Nhóm 2

BL10-5.36

26/26

100

BL10-5.37

26/26

100

BL10-5.40

26/26

100

BL10-5.43

26/26

100

BL10-5.45

26/26

100

BL10-5.46

26/26

100

BL10-5.47

26/26

100

BL10-5.49

26/26

100

BL10-5.50

26/26

100

BL10-5.51

26/26

100

Nhóm 3

BL10-5.62

25/26

96,7

phi070

BL10-5.69

26/26

100

BL10-5.70

26/26

100

BL10-5.74

25/26

96,7

phi70

BL10-5.79

26/26

100

BL10-5.81

25/26

100

phi70

BL10-5.82

25/26

96,7

phi70

Hình 3.15. Kết quả kiểm tra nền di truyền nhóm các cá thể BC5F1 của

26 chỉ thị trên 10 nhiễm sắc thể

(Thứ tự các mẫu từ trái qua phải: Nhóm 1-Nhóm 2- Nhóm 3- BL10-

W2, sử dụng Ladder 20bp)

Hình 3.16. Kết quả kiểm tra nền di truyền của các cá thể BC5F1 thuộc

nhóm 1 và nhóm 3 với các chỉ thị umc1160 và phi070

Lựa chọn cá thể ML10-5.61 ở thế hệ BC5F1 của tổ hợp lai ML10/W22

và cá thể BL10-5.4 ở thế hệ BC5F1 của tổ hợp lai BL10/W22 có nền di truyền

100% so với giống nền, tự thụ và thu hạt gieo vào vụ Thu 2019.

3.1.4. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F2 mang gen fea* bằng chỉ thị phân tử

Lựa chọn cá thể BC5F1 ở 2 tổ hợp lai ML10/W22, BL10/W22 có nền di

truyền 100% so với giống nền, tự thụ và thu hạt gieo vào vụ Thu 2019.

3.1.4.1. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F2 ở dòng

ML10

Ở vụ Thu 2019, gieo trồng các cá thể BC5F2 ở hai tổ hợp lai

ML10/W22. 107 cá thể BC5F2 của tổ hợp lai ML10/W22 có kí hiệu từ

ML10-5.61.1 đến ML10-5.61.107 đƣợc lựa chọn thu mẫu lá để tiến hành xác

định cá thể mang gen fea*. Dựa vào hình 3.17 có kết quả cụ thể nhƣ sau:

24/107 cá thể BC5F2 ở tổ hợp lai ML10/W22 có kiểu gene đồng hợp về

ML10: 10, 16, 20, 22, 31, 37, 40, 45, 50, 53, 57, 58, 61, 63, 71, 72, 76, 81, 82,

86, 90, 95, 96, 106

16/107 cá thể BC5F2 ở tổ hợp lai ML10/W22 có kiểu gene đồng hợp về

gene fea*: số 5, 9,11, 24, 36,39,44, 46,52, 66, 70, 74, 77,79, 80, 85, 88

67/107 cá thể BC5F2 còn lại có kiểu gene dị hợp

Nhƣ vậy trong 107 cá thể đƣợc chọn lọc bằng phân tử, xác định đƣợc 16 cá

thể có kiểu gene đồng hợp về gene fea* và có nền di truyền giống với ML10

100%.

Hình 3.17: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F2 của tổ hợp lai ML10/W22 sử dụng cặp mồi OVS1-OVS2 (sử dụng Ladder 100bp)

3.1.4.2. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F2 ở dòng

BL10

Ở vụ Thu 2019, gieo trồng các cá thể BC5F2 ở hai tổ hợp lai BL10/W22. 120 cá thể BC5F2 có kí hiệu từ BL10-5.4.1 đến BL10-5.4.120 đƣợc lựa chọn thu mẫu lá để tiến hành xác định cá thể mang gen fea*. Dựa vào hình 3.18 có kết quả cụ thể nhƣ sau:

29/120 cá thể BC5F2 ở tổ hợp lai BL10/W22 có kiểu gene đồng hợp về BL10: 6, 14, 20, 26, 31, 35, 39, 40, 45, 47, 49, 54, 60, 69, 73, 75, 80, 81, 86, 92, 95, 97, 103, 105, 106, 108, 112, 115, 116

26/120 cá thể BC5F2 ở tổ hợp lai BL10/W22 có kiểu gene đồng hợp về gene fea*: số 1, 2, 4, 5, 7, 12, 13, 17, 33, 34, 38, 46, 55, 56, 65, 68, 82, 83, 84, 96, 112, 114, 118, 119, 120 (hình 3.18)

65/120 cá thể BC5F2 còn lại có kiểu gene dị hợp

Nhƣ vậy trong 120 cá thể đƣợc chọn lọc bằng phân tử, xác định đƣợc 26 cá thể có kiểu gene đồng hợp về gene fea* và có nền di truyền giống với BL10 100%.

Hình 3.18: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F2 của tổ hợp lai BL10/W22 sử dụng cặp mồi OVS1-OVS2 ( sử dụng Ladder 100bp)

Các cá thể BC5F2 ƣu tú mang kiểu gene đồng hợp lặn fea* đƣợc chọn

lọc trong vụ Thu Đông 2019, đƣợc đánh giá kiểu hình để tự thụ BC5F3. Kết

quả đã chọn lọc đƣợc 5 cá thể ƣu tú ở mỗi tổ hợp lai. Cụ thể mã hóa các cá

thể BC5F3 nhƣ sau:

Tổ hợp lai ML10/W22: ML10-5.61.5 (Q116), ML10-5.61.24 (Q117),

ML10-5.61.5.44 (Q118), ML10-5.61.52 (Q119), ML10-5.61.5.85 (Q120).

Tổ hợp lai BL10/W22: BL10-5.4.12 (Q211), BL10-5.4.33 (Q211),

BL10-5.4.38 (Q211), BL10-5.4.46 (Q211), BL10-5.4.65 (Q211).

3.1.5. Đặc điểm hình thái nông sinh học của các dòng BC5F3 mang

gen fea* trong vụ Xuân năm 2020

3.1.5.1. Đặc điểm hình thái nông học của các dòng BC5F3

Theo lý thuyết khi cải tiến giống ngô thông qua backcross tới BC5 bộ

gene dòng cải tiến sẽ giống 98.4% của dòng nhận gen. Vì vậy xét về kiểu hình

của các mã trồng trên ruộng sẽ giống với dòng gốc trên 90%. Kết quả đánh

giá hình thái nông học đƣợc thể hiện trong bảng 3.6. ảnh chụp cây ở giai đoạn

trỗ hoặc tung phấn của mỗi dòng đƣợc thể hiện từ hình 3.19 và 3.20.

Từ các thế hệ BC3-BC5 nhóm nghiên cứu đã đánh giá và nhận thấy

đƣợc các cá thể đã có sự thay đổi về số hàng hạt , đã tăng 20% số hàng hạt so với dòng bố mẹ LVN10, từ 11-12 hàng hạt lên tới 13-14 hàng hạt. Cho nên ở thế hệ BC5F3 , nhóm nghiên cứu không đánh giá hàng hạt nữa và chỉ đánh giá về các chỉ tiêu chiều cao, năng suất của các dòng để chọn đƣợc dòng bố mẹ cải tiến có năng suất cao hơn dòng bố mẹ LVN10.

Bảng 3.6: Một số đặc điểm hình thái nông học của các dòng cải tiến BC5F3

và dòng bố mẹ gốc

Mã dòng Kiểu gene Số cây Chiều cao cây (cm)

ML10 20 119,7

Q116 20 131,4

Q117 20 109,5

Q118 20 125,3

Q119 20 120,1

Q120 20 121,4 fea* ML10 BC5F3 fea* ML10 BC5F3 fea* ML10 BC5F3 fea* ML10 BC5F3 fea* ML10 BC5F3

BL10 20 156,3

Q211 20 155,4

Q212 20 151,9

Q213 20 147,1

Q214 20 156,7

Q215 20 167,5 fea* BL10 BC5F3 fea* BL10 BC5F3 fea* BL10 BC5F3 fea* BL10 BC5F3 fea* BL10 BC5F3

Hình 3.19: Hình thái cây các dòng ngô trên đồng ruộng tại Thái Bình

vụ Xuân 2020 ở giai đoạn tung phấn

A: Q119 (ML10 cải tiến BC5F3)

B: ML10 đối chứng

Hình 3.20: Hình thái cây các dòng ngô trên đồng ruộng tại Thái Bình

vụ Xuân 2020 ở giai đoạn tung phấn

A: Q214 (BL10 cải tiến BC5F3)

B: BL10 đối chứng

*So sánh đặc điểm hình thái nông học của dòng cải tiến ML10 BC5F3 với dòng gốc

Dựa vào bảng 3.8 chúng tôi nhận thấy rằng chiều cao cây của các dòng

cải tiến chênh lệch khá ít so với ML10. Sự khác biệt về chiều cao cây của dòng

cải tiến không lớn, chỉ chênh lệch trong khoảng 10% so với dòng gốc. Cụ thể, 2

dòng có sự chênh lệch lớn nhất về chiều cao với dòng gốc là dòng Q116 cao hơn

dòng gốc gần 9.7% và dòng Q117 thấp hơn dòng gốc 8.5%. 3 dòng cải tiến còn

lại (Q118, Q119, Q120) có chiều cao xấp xỉ ML10 đối chứng, chỉ chênh 1-5%.

* So sánh đặc điểm hình thái nông học của dòng cải tiến BL10 BC5F3 với dòng gốc

Cả 5 dòng BL10 cải tiến đều có chiều cao tƣơng đƣơng dòng gốc.

Q213 và Q215 có độ chênh lệch chiều cao với dòng gốc cao nhất (94.1% và

107.2%). Q211, Q212 và Q214 xấp xỉ với BL10 đối chứng, chênh lệch không

đáng kể. Nhƣ vậy, chiều cao cây của các dòng cải tiến chỉ khác biệt so với

dòng BL10 từ 1% - 7%, đây là sự khác biệt không đáng kể, thấp hơn so với sự

khác biệt ở dòng cải tiến sử dụng dòng nhận gen ML10.

Nhƣ vậy, cả dòng cải tiến của ML10 và BL10 đều có sự khác biệt

không đáng kể so với dòng gốc và phù hợp với lý thuyết (mang 98.4% bộ gen

của dòng nhận gen), tức là quá trình backcross với tổ hợp lai dòng bố (BL10),

mẹ (ML10) tạo LVN10 đã thành công, dòng đƣợc lựa vừa mang allele đột

biến fea* đồng thời cũng mang kiểu hình của dòng nhận gen.

3.1.5.2. Đánh giá sơ bộ về năng suất của các dòng cải tiến BC5F3 và

dòng bố mẹ gốc

Bên cạnh việc đánh giá đặc điểm nông học của, chúng tôi còn đánh giá năng suất của các dòng cải tiến và dòng gốc. Số liệu về liệu tính năng suất của các dòng cải tiến BC5F3 và dòng bố mẹ gốc đƣợc tóm tắt trong bảng 3.7 và biểu đồ thể hiện mối tƣơng quan giữa năng suất các dòng đƣợc trình bày ở

hình 3.21. Hình ảnh so sánh bắp giữa dòng cải tiến và dòng gốc đƣợc thể hiện ở hình 3.22, 3.23

Bảng 3.7: Năng suất cá thể của các dòng cải tiến BC5F3 và dòng gốc

Mã dòng Kiểu gene Năng suất cá thể (gam)

ML10 62,64

Q116 65,85

Q117 73,65

Q118 62,24

Q119 70,90

Q120 63,32 fea* ML10 BC5F3 fea* ML10 BC5F3 fea* ML10 BC5F3 fea* ML10 BC5F3 fea* ML10 BC5F3

BL10 56,34

Q211 44,73

Q212 46,11

Q213 65,12

Q214 63,22

Q215 55,77 fea* BL10 BC5F3 fea* BL10 BC5F3 fea* BL10 BC5F3 fea* BL10 BC5F3 fea* BL10 BC5F3

80.00

70.00

60.00

50.00

40.00

30.00

20.00

10.00

0.00

ML10 Q116 Q117 Q118 Q119 Q120 BL10 Q211 Q212 Q213 Q214 Q215

Năng suất cá thể (gam)

Hình 3.21: Biểu đồ mối tƣơng quan năng suất cá thể của các dòng cải

tiến BC5F3 và dòng gốc

A

B

Hình 3.22: Ảnh bắp sau thu hoạch của các dòng ngô

thu tại Thái Bình vụ Xuân 2020

A: Q119 (ML10 cải tiến BC5F3)

B: ML10 đối chứng

A

B

Hình 3.23: Ảnh bắp sau thu hoạch của các dòng ngô

thu tại Thái Bình vụ Xuân 2020

A: Q214 (BL10 cải tiến BC5F3)

B: BL10 đối chứng

Giá trị năng suất đƣợc quyết định bởi nhiều yếu tố, ngoài yếu tố số hàng

hạt tăng dẫn tới năng suất tăng, còn có vai trò của những yếu tố khác tác động

nhƣ chiều dài bắp, kích thƣớc và chất lƣợng hạt. Dựa vào số liệu ở bảng 3.9

và biểu đồ hình 3.21 chúng tôi thấy rằng, tất cả các dòng ML10 cải tiến đều

có năng suất cá thể xấp xỉ hoặc cao hơn dòng gốc, trong đó Q117 và Q119 có

năng suất vƣợt trội hơn cả, cao hơn dòng gốc gần 20%. Các dòng cải tiến

BL10 có chỉ số năng suất không ổn định bằng ML10. Cụ thể, có 2 dòng năng

suất thấp hơn BL10 gốc 10-20% và có 2 dòng cải tiến có năng suất cao hơn

đối chứng 10-15%.

Từ kết quả này có thể chọn lọc đƣợc một số dòng ƣu tú có năng suất cao,

chỉ số nông học tốt nhƣ Q119(ML10 BC5F3), Q214(BL10 BC5F3) để tạo các

tổ hợp lai triển vọng.

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Chọn đƣợc 300 mồi SSR ở các vị trí trên 10 nhiễm sắc thể xác định đa

hình giữa dòng cho và nhận gen fea*, kiểm tra cho thấy 31 chỉ thị đa hình

giữa dòng cho W22 và dòng nhận ML10, 26 chỉ thị đa hình giữa dòng cho

W22 và dòng nhận BL10. .Các chỉ thị cho đa hình giữa dòng cho và nhận

gene đƣợc sử dụng để đánh giá nền di truyền của các dòng bố mẹ cải tiến

mang gene fea*.

Xác định và chọn lọc đƣợc các cá thể mang kiểu gen fea* dị hợp ở 2 tổ

hợp lai BC5F1 ML10/W22 và tổ hợp lai BL10/W22 có kiểu hình tƣơng

đƣơng với giống nền. Đồng thời xác định đƣợc nền di truyền và giống nền di

truyền.

Xác định và chọn lọc đƣợc các cá thể mang kiểu gen fea* đồng hợp và

có kiểu hình tƣơng đƣơng với giống nền ở tổ hợp lai BC5F3 ML10/W22 và

BL10/W22

Các cá thể BC5F3 đánh giá kiểu hình, chọn dòng ƣu tú mang kiể gen

fea, chọn đƣợc 2 dòng bố mẹ cải tiến ƣu tú dòng Q119 (ML10 BC5F3) và

dòng Q214 (BL10 BC5F3) cho năng suất cao hơn dòng gốc để tiếp tục kiểm

tra khả năng kết hợp và tạo ra dòng F1 có thể đƣa đi gửi khảo nghiệm

4.2. KIẾN NGHỊ

Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi đƣa ra một số kiến nghị sau:

- Lai các dòng bố mẹ cải tiến ƣu tú, thử khả năng kết hợp, đánh giá năng suất của các dòng F1 mới và so sánh với LVN10 gốc. Từ đó có thể gửi các dòng F1 triển vọng đăng kí khảo nghiệm và nhân dòng sản xuất dòng bố mẹ cải tiến.

- Mở rộng việc sử dụng các vật liệu có mang gen fea* làm tăng hàng hạt ứng dụng phƣơng pháp MABC chọn giống ngô để tạo ra các giống ngô cải tiến mới có năng suất cao hơn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1].http://nhachannuoi.vn/tinh-hinh-san-xuat-mat-hang-ngo-cua-viet-nam-

nam-2016-va-du-bao-nam-2017/

[2].http://thaibinhseed.com.vn/vi-vn/san-pham/giong-ngo/giong-ngo-lai-lvn-

10.aspx

[3]. Brown PJ, Upadyayula N, Mahone GS, Tian F, Bradbury PJ, et al. 2011.

Distinct genetic architectures for male and female inflorescence traits of

maize. PLoS Genetics 7: e1002383

[4]. Ross AJ, Hallauer AR, Lee M. 2006. Genetic analysis of traits correlated

with maize ear length, Maydica: pp 301-313

[5].FAOSTAT (2010), http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx

[6]. http://worldofcorn.com

[7]. Trần Hồng Uy và cộng sự (1994), “Kết quả nghiên cứu tạo giống ngô lai

LVN10”, Tạp chí Nông nghiệp và Công nghiệp thực phẩm, 12/1994, tr 447 –

449.

[8]. Yang C, Tang D, Zhang L, Liu J, Rong T. 2015, Identification of QTL for

ear row number and two-ranked versus many-ranked ear in maize across four

environments, Euphytica, 206, pp 33-47.

[9]. Mendes-Moreira P, Alves ML, Satovic Z, Dos Santos JP, Santos JN, et al

[10]. Liu C, Zhou Q, Dong L, Wang H, Liu F, et al. 2016. Genetic

architecture of the maize kernel row number revealed by combining QTL

mapping using a high-density genetic map and bulked segregant RNA

sequencing, BMC Genomics, 17: pp 915

[11]. Huo D, Ning Q, Shen X, Liu L, Zhang Z. 2016. QTL Mapping of Kernel

Number-Related Traits and Validation of One Major QTL for Ear Length in

Maize, PLoS One 11: e0155506

[12]. Chen L, Li YX, Li C, Wu X, Qin W, et al. 2016. Fine-mapping of

qGW4.05, a major QTL for kernel weight and size in maize, BMC Plant Bio,

pp 16-81

[13]. Bommert P, Nagasawa NS, Jackson D. 2013. Quantitative variation in

maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus,

Nature Genetics, pp 334-337

[14]. Thornsberry JM, Goodman MM, Doebley J, Kresovich S, Nielsen D,

Buckler ESt. 2001, Dwarf8 polymorphisms associate with variation in

flowering time, Nature Genetics, 28, pp286-289.

[15] Frisch M., Martil Bolhn and Albrecht E. Melchinger (1999).

Combrarisian of selection strategies for marker assisted backcrossing of

gene, Crop Science, 39, Pp 1295- 1391.

[16]. Robert Koebner (2003). Marker assisted selection in the cereals: the

dream and the reality, Biomedical and Science, pp. 317-329.

[17]. Feng Tian, Peter J Bradbury, Patrick J Brown, Hsiaoyi Hung, Qi Sun,

Sherry Flint-Garcia, Torbert R Rocheford, Michael D McMullen, James B

Holland, Edward S Buckler (2011), Genome-wide association study of leaf

architecture in the maize nested association mapping population, Nature

genetics, 43.2, pp 159-162.

[18]. Mohan, M., S. Nair, A. Bhagwat, T.G. Krishna, Y. Masohiro, C.R.

Bhatia and T. Sasaki. (1997). Genome mapping, molecular markers and

marker assisted selection in crop plants, Molecular Breeding, 3, pp 87-103..

2015. Genetic Architecture of Ear Fasciation in Maize (Zea mays) under QTL

Scrutiny, PLoS One 10: e0124543

[19]. Ribaut JM, Ragot M (2007). Marker-assisted selection to improve

drought adaptation in maize: the backcross approach, perspectives,

limitations, and alternatives, Journal of Experimental Botany, 58, pp. 351-60.

[20]. Thomson MJ., Ocampo M., Egdane J., Rahman M.A., Saiise AG.,

Adorada DL., Raiz E.T. (2010), Characterizing the Salton quantitative trait

locus for salinity tolerance in rice, Rice, 3, pp 148-160.

[21]. Sarkar P, Bosneaga E, Auer M (2009), Plant cell walls throughout

evolution: towards a molecular understanding of their design principles,

Journal of Experimental Botany, 60, pp 3615–3635.

[22]. Zhao X, Tan G, Xing Y, Wei L, Chao Q, et al. (2012a), Marker-assisted

introgression of qHSR1 to improve maize resistance to head smut, Molecular

Breeding, 30, pp 1077-1088.

[23]. Zhao Y, Gowda M, Liu W, Wurschum T, Maurer HP, et al. (2012b),

Accuracy of genomic selection in European maize elite breeding populations,

Theory Apply Genetic, 124, pp 769-776.

[24]. Gupta HS, Raman B, Agrawal PK, Mahajan V, Hossain F, Nepolean

Thirunavukkarasu (2013). Accelerated development of quality protein maize

hybrid through marker-assisted introgression opaque-2allele, Plant Breeding,

132, pp 77-82.

[25]. Zhang X, Yang Q, Rucker E, Thomason W, Balint-Kurti P (2017), Fine

mapping of a quantitative resistance gene for gray leaf spot of maize (Zea

mays L.) derived from teosinte (Z. mays ssp.parviglumis), Theory Apply

Genetic, 130, pp 1285-95.

[26]. Nguyễn Thị Lệ, Vũ Hồng Quảng, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thị Huế, Nguyễn Văn Hoan, Nguyễn Chí Dũng (2014). Kết quả chọn tạo giống lúa Bắc Thơm số 7 kháng bệnh bạc lá, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2014, tập 12, số 2: 131-138

[27]. Trần Thị Thúy, Nguyễn Thúy Điệp, Nguyễn Trƣờng Khoa, Nguyễn Thị Phƣơng Đoài, Kiều Thị Dung, Nguyễn Thị Ly, Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thái Dƣơng, Trần Đăng Khánh, Khuất Hữu Trung (2017), Thiết kề mồi nhận biết gen ứng viên (candidate gene) kháng đạo ôn Pik-p ở một số giống lúa địa

phương của Việt Nam và ứng dụng trong lai tạo giống, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam- số 4 (77)/2017

[28]. Doãn Thị Hƣơng Giang, Lƣu Minh Cúc, Lê Huy Hàm (2017), Nghiên cứu ứng dụng phương pháp MABC trong chọn tạo giống lúa chịu ngập AS996, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(76)/2017

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa gen fea* làm tăng số hàng hạt vào các dòng bố, mẹ giống ngô lai LVN 10 phục vụ công tác tạo giống ngô lai năng suất cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ ĐƢA

GEN fea* LÀM TĂNG SỐ HÀNG HẠT VÀO CÁC DÒNG BỐ, MẸ GIỐNG NGÔ LAI LVN 10 PHỤC VỤ CÔNG TÁC TẠO

GIỐNG NGÔ LAI NĂNG SUẤT CAO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ ĐƢA

GEN fea* LÀM TĂNG SỐ HÀNG HẠT VÀO CÁC DÒNG BỐ, MẸ GIỐNG NGÔ LAI LVN 10 PHỤC VỤ CÔNG TÁC TẠO

GIỐNG NGÔ LAI NĂNG SUẤT CAO

STT

Tên mồi SSR

Mồi xuôi

Mồi ngƣợc

Vị trí NST

Vị

STT

Tên mồi SSR

Mồi xuôi

Mồi ngƣợc

trí

NST

ML10

BL10

A

B

A

B

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok