Luận án tiến sĩ Y học: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người

BỘ Y TẾ

VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG

TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO

BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM

Cryptococcus neoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI, 2019

BỘ Y TẾ

VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG

TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO

BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM

Cryptococcusneoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY

Chuyên ngành: Ký sinh trù ng y học Mã số : 62 72 01 16

Hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Cao Trường Sinh

PGS.TS. Nguyễn Thị Hương Bình

HÀ NỘI, 2019

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Cao Trường Sinh,

PGS.TS. Nguyễn Thị Hương Bình, đã nhiệt tình chỉ dẫn giúp đỡ tôi hoàn

thành luận án này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

PGS.TS. Trần Thanh Dương Viện trưởng và Ban Giám đốc Viện Sốt

rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; PGS. TS. Cao Bá Lợi cùng toàn

bộ cán bộ Phòng Khoa học – Đào tạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn

trùng Trung ương;

Ban chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật

sinh học phân tử để chấn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người” Mã

số CK.10.32/11-15.

PGS.TS. Nguyễn Khắc Lực, TS. Đỗ Ngọc Ánh cùng toàn thể cán bộ bộ

môn Ký sinh trùng – Côn trùng Học viện Quân Y; Khoa Sinh học phân tử

Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; Trung tâm nghiên cứu

Sinh Y Dược học Quân sự Học viện Quân Y; Khoa Vi sinh Bệnh Viện Chợ

Rẫy; Khoa Vi sinh Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - Thành phố Hồ Chí Minh;

Bệnh viện Quân y 103; Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung Ương đã tận tình

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu.

GS.TS. Lê Bách Quang, PGS.TS. Nguyễn Mạnh Hùng, PGS. TS

Nguyễn Ngọc San,… đã có những ý kiến đóng góp quý báu giúp tôi hoàn

thiện luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba, Mẹ, Chồng, Con, anh chị

em trong gia đình và bạn bè đồng nghiệp đã động viên khích lệ tôi vượt qua

mọi khó khăn hoàn thành luận án. Luận án chỉ là bước đầu trong sự nghiệp

khoa học. Những lời cảm ơn là chưa đủ vì làm sao kể hết những tình cảm thật

cao quý, những tình cảm đó sẽ theo tôi trong suốt cuộc đời không bao giờ

thay đổi!

Trần Thị Quỳnh Liên

iii

LỜI CAM ĐOAN

Đây là một nhánh của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ

thuật sinh học phân tử để chấn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở

người” Mã số CK.10.32/11-15 mà tôi đã trực tiếp tham gia.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các kết quả, số liệu thu được trong luận án là trung thực và chưa được

công bố trong bất kỳ luận án nào khác.

Các bước tiến hành thực hiện đề tài đúng như đề cương nghiên cứu,

chấp hành đầy đủ các quy định khi tiến hành nghiên cứu.

Nếu có sai sót gì tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

Trần Thị Quỳnh Liên

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AIDS Acquired immunodeficiency syndrome (Hội chứng suy giảm

miễn dịch mắc phải)

Acid Deoxyribonucleic ADN

Antiretroviral (Liệu pháp kháng retro vi rút) ARV

Colony forming units (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CFU

Central nervous system (Hệ Thần kinh Trung ương) CNS

Cộng sự CS

Cerebrospinal fluid (Dịch não tủy) CSF

Dịch não tủy DNT

ELISA Enzyme-Linked immunosorbent Assay (Phản ứng miễn dịch

hấp phụ liên kết enzym)

Enzym immunoassay (thử nghiệm miễn dịch enzym) EIA

False positive (Dương tính giả) FP

False negative (Âm tính giả) FN

GACA Giuzotia abyssinica creatinin agra (Thạch nuôi cấy GACA)

GRHP Ground red hot pepper agar (Thạch ớt đỏ)

Hematoxylin eosin (Nhuộm HE) HE

Human immunodeficinecy Virus (vi rút gây suy giảm miễn HIV

dịch ở người)

K Kappa (Hệ số tương đồng)

LAT Latex agglutination assay test (Thử nghiệm đông kết latex)

LFA Lateral flow assay (Thử nghiệm miễn dịch dòng chảy)

Magnetic resonance imaging (Chụp cộng hưởng từ) MRI

Negative predictive value (Giá trị tiên đoán âm) NPV

Polymerase chairn reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) PCR

Periodic acid schiff (nhuộm PAS) PAS

PPV Positive predictive value (Giá trị tiên đoán dương)

RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình các đoạn

phân cắt giới hạn)

Se Sensitivity (Độ nhạy)

SOP Standard operating procedure (Quy trình các thao tác chuẩn)

Sp Specificity (Độ đặc hiệu)

TN True negative (dương tính giả)

TP True positive (dương tính thật)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................. iv

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

1.1. Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm Cryptococcus neoformans .. 3

1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm C. neoformans. ........................................... 3

1.1.2. Vai trò y học ............................................................................................ 5

1.1.3. Tình hình viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới và Việt

Nam ................................................................................................................... 9

1.2. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans ...... 13

1.2.1. Chẩn đoán trực tiếp ............................................................................... 14

1.2.2. Chẩn đoán miễn dịch học phát hiện kháng nguyên .............................. 16

1.2.3. Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử ........................................... 17

1.3. Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa các bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác

nhân gây bệnh .................................................................................................. 23

1.3.1. Thiết kế và chuẩn hóa nồng độ mồi cho phản ứng PCR ....................... 25

1.3.2. Chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng PCR ....................................... 27

1.3.3. Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương của kỹ thuật ...... 31

1.4. Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm

PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh .................................................................. 32

1.4.1.Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán ........... 32

1.4.2. So sánh tính tương đồng của bộ sinh phẩm .......................................... 35

1.4.3. Đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm ............................................... 36

1.4.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm ...................................... 36

vii

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 37

2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu .............................................. 37

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 37

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 38

2.1.3. Thời gian nghiên cứu: ........................................................................... 39

2.2. Dụng cụ, vật liệu, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................... 39

2.2.1. Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc ............................................. 39

2.2.2. Sinh phẩm hóa chất ............................................................................... 39

2.2.3. Các hóa chất, sinh phẩm khác ............................................................... 40

2.2.4. Dụng cụ, phụ tùng, vật tư tiêu hao ........................................................ 40

2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 40

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm phòng thí nghiệm ....... 40

2.3.2. Mẫu nghiên cứu ..................................................................................... 42

2.3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 44

2.3.4. Các chỉ số nghiên cứu ........................................................................... 50

2.3.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 51

2.4. Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu ....................... 63

2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ................................................... 63

2.6. Đạo đức trong nghiên cứu ........................................................................ 66

2.7. Nhiễm sai số và cách hạn chế .................................................................. 66

2.8. Hạn chế của đề tài .................................................................................... 67

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 68

3.1. Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR

chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans ............................................................. 68

3.1.1. Kết quả giám định loài vi nấm C. neoformans để sử dụng cho nghiên

cứu ................................................................................................................... 68

viii

3.1.2. Kết quả thiết kế/lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán

nhiễm nấm C. neoformans .............................................................................. 71

3.1.3. Kết quả xác định các điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán

nhiễm nấm C. neoformans .............................................................................. 78

3.1.4. Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm

C. neoformans ................................................................................................. 92

3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm chẩn

đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy .......................................... 97

3.2.1. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm

trong phòng thí nghiệm ................................................................................... 97

3.2.2. Kết quả đánh giá của bộ sinh phẩm trong các mẫu DNT lâm sàng .... 102

3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định chất lượng bộ sinh phẩm chế

tạo ra .............................................................................................................. 107

Chương 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 109

4.1. Về kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR

chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans ........................................................... 109

4.1.1. Bàn luận về kết quả giám định loài vi nấm C. neoformans để sử dụng

cho nghiên cứu xây dựng quy trình ............................................................... 109

4.1.2. Về kết quả thiết kế/lựa chọn mồi và xác định các điều kiện cho kỹ thuật

nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans ....................................... 112

4.1.3. Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm

C.neoformans ................................................................................................ 122

4.2. Bàn luận về độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn

đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy. .................................... 124

4.2.1. Bàn luận về kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ

sinh phẩm trong phòng thí nghiệm ............................................................... 125

4.2.2. Bàn luận về kết quả đánh giá bộ sinh phẩm trong đoán nhiễm C.

neoformans ở các mẫu DNT lâm sàng .......................................................... 127

4.2.2.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu nhiễm C.neoformans

phân lập ở Việt Nam. .................................................................................... 127

KẾT LUẬN ................................................................................................... 133

1. Xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán

nhiễm nấm C.neoformans ............................................................................. 133

2. Về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm tạo ra trong chẩn

đoán nhiễm nấm C. neoformans dịch não tủy. .............................................. 134

KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 135

TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI .................................................

Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ..............................................................

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN NỘI DUNG

LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ .....................................................................

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Nấm C. neoformans nhuộm mực tàu, quan sát dưới kính hiển vi .... 4

Hình 1.2. Khuẩn lạc C. neoformans trên môi trường thạch Sabouraud ............ 5

Hình 1.3.Tổn thương não do C. neoformans .................................................... 7

Hình 1.4. Hình ảnh tổn thương phổi do C. neoformans.................................... 8

Hình 1.5. Tổn thương da do nấm C. neoformans.............................................. 8

Hình 2.1. Chủng chuẩn nấm C. neoformans ATCC@ 90113 .......................... 37

Hình 2.2. Môi trường thạch Sabouraud trên đĩa thạch và ống thạch nghiêng 53

Hình 2.3. Phương pháp pha loãng dịch não tủy .............................................. 55

Hình 3.1. Mẫu nấm C. neoformans thu thập tại thực địa Việt Nam ............... 69

Hình 3.2. Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS4 của một số mẫu nấm C.

neoformans ...................................................................................................... 69

Hình 3.3. Kích thước các mảnh cắt giới hạn sản phẩm PCR bằng enzyme

MspI của một số mẫu nấm C. neoformans...................................................... 70

Hình 3.4. Minh họa đoạn gen khuếch đại với 02 cặp mồi được lựa chọn ...... 72

Hình 3.5. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1-ITS4 bằng phần

mềm Primer Blast ............................................................................................ 74

Hình 3.6. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4-CN5 bằng phần

mềm Primer Blast ............................................................................................ 75

Hình 3.7. So sánh trình tự ADN nấm chuẩn được khuếch đại bởi cặp mồi

ITS1, ITS4 và các trình tự C. neoformans trên ngân hàng gen ...................... 76

Hình 3.8. Kết quả PCR theo panel nồng độ .................................................... 79

Hình 3.9. Kết quả phản ứng PCR1 tiến hành theo quy trình tự xây dựng ...... 83

Hình 3.10. Sản phẩm PCR theo nồng độ Mg2+ ............................................... 85

Hình 3.11. Phản ứng PCR theo gradien .......................................................... 86

Hình 3.12. Kết quả PCR theo thời gian kéo dài mồi ...................................... 86

Hình 3.13. Kết quả PCR theo số chu kỳ phản ứng ......................................... 87

Hình 3.14. Kết quả PCR theo nồng độ ADN khuôn ....................................... 88

Hình 3.15. Kết quả PCR2 các mẫu N117 và N132 .......................................... 91 Hình 3.16. Bộ sinh phẩm nested - PCR chẩn đoán C. neoformans ................ 96

Hình 3.17. Kết quả khuếch đại gen đích của nấm C. neoformans bằng kỹ thuật

nested-PCR .................................................................................................... 103

xii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Ngưỡng phát hiện của phương pháp nuôi cấy với các cách xử lý

mẫu khác nhau ................................................................................................. 15

Bảng 1.2. Một số bộ sinh phẩm chẩn đoán C. neoformans của hãng Norgen

Biotek .............................................................................................................. 23

Bảng 1.3. Thành phần phản ứng PCR thông thường với thể tích 50 µl ........ 29

Bảng 1.4. Chu kỳ nhiệt của một phản ứng PCR thông thường ...................... 30

Bảng 2.1. Các mồi chung khuếch đại gen đích vi nấm ................................... 40

Bảng 2.2. Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR .................................... 61

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt PCR1 được thiết lập cho việc nhân bản đoạn gen

kích thước khoảng 100bp - 600 bp.................................................................. 61

Bảng 2.4. Minh họa chạy gradient nhiệt độ và nồng độ Mg2+ ........................ 62

Bảng 3.1. Kết quả thu thập và phân lập nấm C. neoformans ........................... 68

Bảng 3.2. Tỷ lệ tương đồng nucleotide của 06 mẫu trong nghiên cứu với các

trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen ........................................................... 70

Bảng 3.3. Các phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để định loại nấm

C. neoformans 1990 - 2014 ............................................................................. 71

Bảng 3.4. Đánh giá chất lượng của mồi so với tiêu chuẩn ............................. 73

Bảng 3.5. Đánh giá tính đặc hiệu của cặp mồi trên các nền mẫu khác nhau .. 77

Bảng 3.6. Nồng độ AND thu được từ chủng chuẩn C. neoformans ............... 78

Bảng 3.7. Kết quả tạo panel chuẩn dương nấm C. neoformans ...................... 79

Bảng 3.8. Danh mục chứng chuẩn âm ............................................................ 80

Bảng 3.9. Kết quả so sánh phản ứng PCR1 với các điều kiện khác nhau ...... 81

Bảng 3.10. Kết quả chuẩn hóa từng thành phần phản ứng cho PCR1 ............ 82

Bảng 3.11. Kết quả chu trình nhiệt của phản ứng PCR1 ................................ 82

Bảng 3.12. Kết quả lựa chọn nồng độ ADN khuôn cho phản ứng PCR2 ....... 84

xiii

Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR2 ........... 84

Bảng 3.14. Điều kiện của phản ứng PCR2 với cặp mồi CN4 và CN5 ........... 87

Bảng 3.15. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR2 ............................................. 88

Bảng 3.16. Thử nghiệm đánh giá ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested-PCR ...... 89

Bảng 3.17. Kết quả đánh giá kỹ thuật nested-PCR trên chủng nấm

C. neoformans thu thập từ mẫu lâm sàng tại Việt Nam .................................. 90

Bảng 3.18. Thành phần hóa chất của 02 ống dung dịch MX1 ........................ 92

Bảng 3.19. Thành phần hóa chất của 02 ống dung dịch MX2 ........................ 92

Bảng 3.20. Thành phần hóa chất cho ống dung dịch MC-CR1 ...................... 93

Bảng 3.21. Thành phần hóa chất cho ống dung dịch MC-CR2 ...................... 93

Bảng 3.22. Thành phần hóa chất của ống dung dịch CR1 .............................. 93

Bảng 3.23. Thành phần hóa chất của ống dung dịch CR2 .............................. 94

Bảng 3.24. Kết quả đánh giá hoạt động 02 dạng đóng gói ............................. 95

Bảng 3.25.Thành phần bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm

C.neoformans .................................................................................................. 96

Bảng 3.26. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên mẫu C. neoformans chuẩn ....... 98

Bảng 3.27. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các

mẫu chuẩn ....................................................................................................... 98

Bảng 3.28. Kết quả đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm ......................... 99

Bảng 3.29. Kết quả phản ứng nested PCR với các mẫu DNT giả định ........ 100

Bảng 3.30. Kết quả đánh giá của trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ

105CFU/ ml ................................................................................................... 100

Bảng 3.31. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các

mẫu nhiễm giả định nồng độ 102CFU/ ml .................................................... 101

Bảng 3.32. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các

mẫu nhiễm giả định nồng độ từ 102CFU/ ml trở lên ..................................... 102

xiv

Bảng 3.33. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các chủng C.neoformans

phân lập ở Việt Nam ..................................................................................... 102

Bảng 3.34. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các

chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam .................................................. 103

Bảng 3.35. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các mẫu DNT của bệnh

nhân có triệu chứng lâm sàng VMN ............................................................. 104

Bảng 3.36. Độ nhạy, độ đặc hiệu so với phương pháp nuôi cấy .................. 105

Bảng 3.37. Độ tương đồng so với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu .... 106

Bảng 3.38. Độ tương đồng so với bộ sinh phẩm của Norgen ....................... 107

Bảng 3.39. Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở ............................................................. 107

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm não, màng não là tình trạng nhiễm trùng thần kinh trung ương

gây ra bởi các căn nguyên khác nhau như vi khuẩn, virus, vi nấm hoặc ký sinh

trùng. Trong một số trường hợp biểu hiện lâm sàng của viêm não, màng não

do các căn nguyên khác nhau khá giống nhau nên dựa vào lâm sàng khó phân

biệt. Do vậy, để xác định căn nguyên gây viêm não, màng não cần phải dựa

vào các xét nghiệm cận lâm sàng [1],[2],[3].

Trong số các loài vi nấm gây viêm não màng não, nấm Cryptococcus

neoformans được xác định là loài gây viêm màng não phổ biến nhất, đặc biệt

là ở bệnh nhân HIV/AIDS, ung thư, bệnh nhân suy kiệt...,[4],[5],[6]. Theo

nghiên cứu của Safdieh.J.E và cs (2008) về nguyên nhân gây viêm não, màng

não ở bệnh nhân ung thư cho thấy: viêm màng não do Cryptococcus chiếm

7%, viêm màng não do vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao nhất với > 75%[5]. Ở Việt

Nam, điều tra nhiễm trùng cơ hội trên 100 bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh

viện Bệnh Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh năm 2000 của Louie JK và cs (2004)

cho thấy, nhiễm nấm C. neoformans ở dịch não tủy chiếm khoảng 9%[6].

Bệnh do nấm Cryptococcus là nguyên nhân nhiễm trùng gây tử vong xếp

hàng thứ tư ở những bệnh nhân AIDS và khoảng 1/3 bệnh nhân AIDS có mắc

bệnh này [7].

Trên lâm sàng, biểu hiện viêm màng não do nấm C. neoformans rất

giống với các căn nguyên vi sinh vật khác. Ngoài ra, cũng giống như các vi

nấm gây bệnh khác,viêm màng não do C. neoformans thường được nghĩ tới

sau các căn nguyên khác nên thường chẩn đoán muộn, khi các triệu chứng đã

trở nên trầm trọng [10],[11]. Trong khi, viêm màng não do nấm C. neoformans

là một bệnh nguy hiểm, tiến triển nhanh, nếu không được chẩn đoán sớm và

điều trị kịp thời có thể để lại di chứng trầm trọng có khi tử vong nhanh[4],[8].

Chẩn đoán muộn, chẩn đoán nhầm, lựa chọn thuốc không đúng chính là

những nguyên nhân khiến bệnh nhân phải chịu những tổn hại nặng nề về cả

sức khỏe lẫn kinh tế [9].

Các biện pháp truyền thống như soi tươi cho kết quả nhanh nhưng độ

nhạy thấp và dương tính giả có thể xảy ra [8], nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn

vàng trong chẩn đoán nhiễm nấm nhưng phải mất ít nhất 2 ngày mới có kết

quả và tỷ lệ nuôi cấy dương tính cũng chỉ khoảng 70-90% [8]. Nuôi cấy

thường cho kết quả âm tính nếu bệnh nhân trước đó sử dụng thuốc chống nấm

[4],[13],[14]. Kỹ thuật miễn dịch có độ nhạy, độ đặc hiệu cao ≥ 90% [9],

nhưng cũng dễ có phản ứng dương tính giả và chưa phổ biến ở Việt Nam. Các

kỹ thuật sinh học phân tử với thời gian chẩn đoán nhanh và cùng lúc phát hiện

được nhiều mầm bệnh đang được nhiều tác giả nghiên cứu. Các kỹ thuật sinh

học phân tử cho phép xác định căn nguyên gây bệnh ngay cả khi kết quả soi

tươi, nuôi cấy âm tính, đặc biệt trong trường hợp trước đó bệnh nhân sử dụng

kháng sinh, kháng nấm [10], [11], [12].

Trong các kỹ thuật chẩn đoán dựa trên phản ứng PCR, nested – PCR là

một trong những kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao nhất, do đó chúng tôi lựa

chọn tiến hành đề tài "Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ

sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch

não tủy".

Với 02 mục tiêu:

1. Xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR

chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy.

2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm được

tạo ra trong chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm Cryptococcus neoformans

Giống nấm Cryptococcus có khoảng hơn 70 loài được định loại dựa

vào hình thái nhưng loài gây bệnh chủ yếu là C. neoformans chiếm 80% [13],

[14]. Bệnh do nấm C. neoformans gây ra gọi là Cryptococcosis. Triệu chứng

bệnh được Zenker miêu tả đầu tiên năm 1861, nhưng đến năm 1864, hai nhà

bác học Busse và Buschkle người Đức đã phân lập và nuôi cấy được nấm C.

neoformans từ bệnh nhân có triệu chứng giống như đã được Zenker miêu tả

[18],[20],[21]. Ngoài C. neoformans, loài C. albidus và C. laurentii cũng có

khả năng gây bệnh nhưng ít gặp [14].

Trước đây, người ta cho rằng nấm C. neoformans có 2 phân loài, đó là C.

neoformans var. neoformans (gồm các tuýp huyết thanh A, D, AD) và C.

neoformans var. gattii (gồm các tuýp B, C). Hiện nay, người ta đã khẳng định

có 3 phân giống C. neoformans: grubii (tuýp A), gattii (tuýp B, C) và

neoformans (tuýp D) [15]. Trong đó C. neoformans var. gattii được cho là một

loài riêng biệt gây bệnh ở những người bình thường với tên là C. Bacillisporus

[23], [24], [25]. Nấm C. neoformans var. neoformans còn được gọi là

Filobasidiella neoformans [16].

1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm C. neoformans.

1.1.1.1. Đặc điểm hình thể.

C. neoformans là nấm men, đường kính tế bào khoảng 5-10 µm, được

bao ngoài bởi một nang (capsule) hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước

nang thay đổi từ 2-40µm.

Hình 1.1. Nấm C. neoformans nhuộm mực tàu, quan sát dưới kính hiển vi

(Nguồ n: Day J.N, 2013)

1.1.1.2. Môi trường sống

Giống nấm Cryptococcus tồn tại trong môi trường tự do được Kutzing

đặt tên năm 1833, mẫu phân lập được từ bụi kính cửa sổ.

C. neoformans là sinh vật sống hoại sinh, ngoài cơ thể vật chủ, có thể

sống tự do bên ngoài môi trường. Nấm phân bố toàn cầu có thể tìm thấy trong

chất thải của gia cầm, chim bồ câu, vẹt, yến. Trong các hang động, nước trái cây

lên men, sữa, đường ruột của một số động vật ăn cỏ, trên cơ thể dơi, gián, trong

đất và các hốc cây khác nhau. Nấm còn được tìm thấy trong thân gỗ mục của

một số loài cây như: cây bạch đàn, cây cao su màu đỏ [13], [17], [18].

1.1.1.3. Tính chất nuôi cấy

Khinghiên cứu nuôi cấy, phân lập, nấm C. neoformans có thể mọc trên

thạch Sabouraud dextrose, thạch máu cừu, thạch chocolate và các môi trường

khác ở nhiệt độ từ 20-370C. Ở nhiệt độ này nấm bắt đầu mọc trong vòng khoảng

72 giờ, nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 300C [19]. C. neoformans

phát triển tốt trong môi trường chứa khoảng 5 % CO2, pH hơi kiềm và một lượng

nhỏ chất sắt [20].

Trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 25-370C, nấm C.

neoformans mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu trắng hoặc màu kem,

đường kính có thể đến vài milimet [20].

Hình 1.2. Khuẩn lạc C. neoformans trên môi trường thạch Sabouraud

(Nguồ n: trong nghiên cứu này, 2014)

Các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ thẩm thấu, nồng độ CO2, độ pH ảnh hưởng tới sự phát triển của các bao ngoài… [21]. Nhiệt độ cao từ 39 - 400C hoặc quá thấp ức chế sự tăng trưởng của nấm. Nồng độ CO2 ở mức sinh lý làm

tăng tổng hợp và kích thước bao ngoài, nồng độ CO2 cao các nang chỉ có kích thước nhỏ. Môi trường có độ thẩm thấu cao (chứa glucose 16% hoặc NaCl

2,9%), hoặc pH acid sẽ làm giảm sản xuất các bao nang.

1.1.2. Vai trò y học

1.1.2.1. Trên động vật

Nấm C. neoformans có khả năng gây bệnh ở động vật, năm 1895

Sanfelice lần đầu tiên đã phát hiện và nuôi cấy được nấm C. neoformans từ hệ

bạch huyết của bò [13]. Năm 1902, Frothingham đã phân lập được nấm C.

neoformans từ tổn thương trên phổi của ngựa tại Massachuset, Anh.

Cùng với ghi nhận của Busse và Buschkle, các tác giả trên đã khẳng

định nấm C. neoformans có khả năng gây bệnh cả ở trên người và động vật

Những nghiên cứu hiện nay chỉ ra C. neoformans có thể gă ̣p ở mèo,

chó , thỏ , linh trưở ng, chuô ̣t và mô ̣t số loa ̣i chim.

Ở động vật có vú , bê ̣nh do C. neoformans thườ ng liên quan đến tình trạng suy giảm miễn dịch như: mèo bị nhiễm một loại virus tương tự

retrovirus, chuột thí nghiệm bi ̣ gây thiếu hu ̣t miễn di ̣ch… Ở chim bồ câu và

các loài chim thườ ng ít bi ̣ mắc bê ̣nh do C. neoformans do nhiệt độ cơ thể của chim cao 41°C–42°C. Tuy nhiên, ngườ i ta có thể tìm thấy tế bào nấm trong phân chim [13], [22].

1.1.2.2. Bệnh trên người

Do tế bào nấm C. neoformans có thể có mặt trong không khí, trong đất và trong phân gia cầm nên ngườ i rất dễ bi ̣ nhiễm loa ̣i nấm này khi hít vào qua đường hô hấp. Tuy nhiên, không phải cơ thể nào bi ̣ nhiễm cũng biểu hiê ̣n thành bê ̣nh mà bê ̣nh thườ ng biểu hiê ̣n ở những cơ thể có hê ̣ thố ng miễn di ̣ch bi ̣ tổ n thương như bệnh nhân AIDS, phải dùng các thuốc ức chế miễn dịch, ung thư, ghép tạng, ghép tủy xương... Mức độ nặng của các triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào tình trạng

suy giảm miễn dịch của cơ thể ngườ i nhiễm [3], [13], [15], [22]. - Bệnh gây tổn thương ở hệ thần kinh

- Viêm màng não: Đây là bệnh thường gặp nhất. Bệnh thường diễn biến

từ từ, các biểu hiện lâm sàng điển hình bao gồm:

+ Đau đầu, sốt, nôn, rối loạn hành vi, rối loạn cảm giác, đau và cứng

gáy [23],[24],[25].

+ Rối loạn tâm thần bao gồm: mất phương hướng, lú lẫn, thay đổi nhân

cách, mất trí nhớ, loạn thần, trạng thái sững sờ và hôn mê [23], [24].

+ Các triệu chứng ít gặp hơn bao gồm: mất điều hòa, mất phản xạ, triệu

chứng của tổn thương bó tháp, thất ngôn, chứng loạn vận ngôn và động kinh.

+ Các triệu chứng về mắt thường gặp là phù gai thị các triệu chứng

không phổ biến như nhìn mờ, song thị, sợ ánh sáng và đau sau nhãn cầu, có

thể mù [23], [24].

- Viêm màng não - não: Ít gặp, bệnh tiến triển nhanh, thường tiến tới

hôn mê và tử vong trong thời gian ngắn, đáp ứng kém với điều trị.

- U nấm trong não: Hiếm gặp, các tổn thương giả u rắn, khu trú. Triệu

chứng giống khối phát triển trong não.

B A

Hình 1.3.Tổn thương não do C. neoformans

(Nguồ n: British Journal of Radiology, 2009)

A- Tổn thương não do C. neoformans trên CT sọ não

B-Tổn thương não do C. neoformans trên MRI sọ não

- Bệnh gây tổn thương ở phổi

Đường xâm nhập chính của nấm vào cơ thể vật chủ là qua đường hô

hấp, do người bệnh hít phải các bào tử nấm phát tán trong không khí. Viêm

phổi do nấm C. neoformans có các triệu chứng: Ho, đau ngực, khạc đờm, sút

cân, sốt và ho ra máu [25]. Các triệu chứng khác hiếm thấy như khó thở, ra

mồ hôi ban đêm, cản trở gây ứ trệ tĩnh mạch chủ trên.

Hình ảnh X-quang của viêm phối do nấm C. neoformans: Tổn thương

điển hình là một hoặc nhiều nốt, không canci hóa, thâm nhiễm rốn phổi hoặc

trung thất, thỉnh thoảng có tràn dịch màng phổi và đôi khi tạo hang. Thăm

khám thường không đặc hiệu nhưng đôi khi có thể thấy thở nhanh, phổi có

ran, hạch to, lách to…[22].

A B

Hình 1.4. Hình ảnh tổn thương phổi do C. neoformans

(Nguồ n: George R. Robinson, 1995)

A. Tổn thương phổi do nấm C. neoformans trên phim X-quang phổi

B. Tổn thương phổi do nấm C. neoformans trên CT phổi

- Bệnh gây tổn thương ở da

+ Tổn thương nguyên phát: Loét, viêm mô tế bào [26].

+ Tổn thương thứ phát: thường xuất hiện ở đầu, cổ dưới dạng sẩn, cục,

mảng loét, áp xe, tổn thương dạng herpet, u mềm lây hoặc u Kaposi [26],

[27].

Hình 1.5. Tổn thương da do nấm C. neoformans

(Nguồn: Hari Kishan Kumar Yadalla và cs, 2011) [27]

- Bệnh gây tổn thương ở các cơ quan khác:

+ Tổn thương xương: Tổn thương hủy xương, không có phản ứng màng xương,

đau mơ hồ khi vận động, đôi khi có thể viêm khớp nhất là khớp gối [24].

+ Hệ tiết niệu: C. neoformans thường phân lập được ở nước tiểu bệnh

nhân bị bệnh lan tràn, đôi khi có dấu hiệu của viêm bể thận, viêm tiền liệt

tuyến [24], [26].

+ Tổn thương cơ quan khác: ở vỏ thượng thận, viêm nội tâm mạc, viêm gan,

viêm xoang, tổn thương thực quản [24], [26].

1.1.3. Tình hình viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới và

Việt Nam

Viêm màng não do nấm C. neoformans là một trong những nhiễm trùng

cơ hội quan trọng nhất ở bệnh nhân AIDS. Ở những nước có tỉ lệ nhiễm

HIV/AIDS cao, C. neoformans là nguyên nhân phổ biến gây viêm màng não,

thường xuyên hơn cả phế cầu, não mô cầu [13], [28].

Ca bệnh viêm màng não do nấm C. neoformans đầu tiên trên thế giới

được mô tả vào năm 1905 bởi Von Hansemann khi phát hiện nấm men trong

các nang galentin ở não [13].

Như vậy khả năng xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương và gây bệnh

của C. neoformans đã được đề tập từ những năm đầu của thế kỷ 20, nhưng nó

đòi hỏi người bác sỹ phải có nhiều năm kinh nghiệm lâm sàng để đánh giá

mức độ thực sự xu hướng của bệnh.

1.1.3.1. Viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới

Năm 1956, Littman và Zimmerman đã xuất bản sách chuyên khảo về

bệnh viêm màng não do nấm C. neoformans gây ra với những hiểu biết về đặc

điểm lâm sàng, con đường truyền bệnh sau nửa thế kỷ bệnh được phát hiện.

Tại thời điểm đó trên toàn thế giới chỉ ghi nhận 300 trường hợp mắc bệnh.

Trong những năm 1970, cùng với việc sử dụng rộng rãi các thuốc ức chế miễn

dịch trong điều trị bệnh đã làm cho tỷ lệ bệnh này tăng lên nhiều. Riêng trong

năm 1976, ở Mỹ đã có 338 trường hợp bị mắc bệnh. Đặc biệt sau những năm

1980, tỷ lệ Cryptococcosis tăng mạnh cùng với việc xuất hiện của bệnh AIDS

và được xem là yếu tố nguy cơ hàng đầu [13].

Từ cuối những năm 1970 đến đầu những năm 1980, người ta đã chứng

kiến một sự gia tăng mạnh các trường hợp nhiễm nấm C. neoformans tại

Kinshasa và ở những người Zairian nhập cư tại Châu Âu.

Khi dịch HIV phát triển vào những năm 1980, nhiễm nấm C. neoformans

nổi lên như một nhiễm trùng cơ hội quan trọng tại Mỹ, châu Âu và châu Úc,

chiếm 5-10% số bệnh nhân AIDS. Theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới,

viêm màng não do nấm C. neoformans là bệnh chỉ điểm của AIDS. Trước khi

có điều trị bằng ARV, thời gian sống trung bình của một bệnh nhân bị viêm

màng não do nấm C.neoformans chỉ khoảng 9 tháng. Tỉ lệ nhiễm trùng giảm

đi ở thập niên 1990 do việc điều trị diện rộng nấm Candida (liên quan đến

việc sử dụng các thuốc chống nấm, đặc biệt là fluconazole) và do sự phát triển

của liệu pháp kháng retrovirus hiệu lực cao. Tỉ lệ bệnh hàng năm trong những

bệnh nhân AIDS đã giảm từ 66/1000 (1992) xuống còn 7/1000 ( 2000).

Hiện nay, viêm màng não do nấm C. neoformans trên bệnh nhân

HIV/AIDS vẫn còn là vấn đề ở các nước phương Tây trong giai đoạn cuối của

nhiễm HIV. Tại miền Nam và miền Trung châu Phi nhất là vùng sa mạc cận

Sahara [9, 29, 30]. Ngoài việc là nguyên nhân hàng đầu gây viêm màng não, ở

khu vực châu Phi cận Sahara, nó chiếm 13-44% tổng số ca tử vong liên quan

đến AIDS. Và tỷ lệ tử vong do C. neoformans với tỷ lệ tử vong cao tới 50-

70% [31].

Tại Thái Lan, tỉ lệ nhiễm C. neoformans lên tới 20% ở các bệnh nhân

AIDS [46].

Theo kết quả một loạt các nghiên cứu của Park và cs (2009) nhằm ước

tính về gánh nặng của viêm màng não do nấm C. neoformans ở bệnh nhân

HIV/AIDS trên toàn cầu đã cho thấy tỉ lệ mắc thay đổi từ 0,04-12% mỗi năm.

Các nghiên cứu ở một số vùng như Đông Âu, Trung Á, Bắc Phi và Trung

Đông được coi là có tỉ lệ tương tự nhau (1,7% mỗi năm). Vùng biển

Caribbean và Mỹ Latin có tỉ lệ khoảng 3,4% mỗi năm. Dựa vào các tỉ lệ đó

người ta cũng dự tính được trên toàn cầu hàng năm có khoảng 957.900 trường

hợp nhiễm bệnh (thay đổi từ 371.700 - 1.54 triệu). Khu vực có số mắc cao

nhất là khu vực châu Phi cận Sahara, khoảng 720.000 trường hợp (thay đổi từ

144.000 - 1.3 triệu). Vùng Nam và Đông Nam Á là 120.000 (từ 24.000 -

216.000). Các vùng như châu Đại Dương (100 trường hợp), Tây và Trung Âu

(500 trường hợp), Bắc Phi và Trung Đông (6.500 trường hợp), Bắc Mỹ (7.800

trường hợp) được coi là những vùng có tỉ lệ mắc ít nhất [30].

Người ta cũng ước tính rằng có khoảng 624.725 ca (từ 124.956-

1.124.494) tử vong bởi viêm màng não do nấm C. neoformans [30]. Châu Đại

Dương được ước tính là có ít nhất (9 ca tử vong) trong khi khu vực châu Phi

cận Sahara nhiều nhất (504.000 ca (từ 100.800 - 907.200)) [30].

Theo Rajasingham và cs, (2017) Mặc dù đã được điều trị bằng thuốc chống

nấm, nhưng năm 2007 ước tính có đến 223.100 trường hợp viêm màng não do

cryptococcus và 181.100 ca tử vong do bệnh này trên toàn thế giới [32], [33].

Hầu hết các trường hợp gây viêm màng não ở bệnh nhân HIV/AIDS

liên quan đến Cryptococcus neoformans var. grubii (typ A),trong khi

Cryptococcus neoformans var. neoformans (typ D) gây bệnh ở châu Âu, và

C. neoformans var. gatti (typ B, C) là nguyên nhân của một số nhỏ các trường

hợp viêm màng não ở bệnh nhân HIV/AIDS [13], [34], [35]. Khoảng 80 %

các nhiễm trùng do C. neoformans ở bệnh nhân AIDS là do các typ A và D,

typ B và C chủ yếu gây bệnh ở những cá nhân có hệ miễn dịch đầy đủ nhưng

gần đây cũng đã được báo cáo thấy ở bệnh nhân AIDS [13].

1.1.3.2. Viêm màng não do nấm C. neoformans ở Việt Nam

Ở Việt Nam, chưa có con số thống kê rõ ràng về tình hình viêm màng

não do nấm C. neformans của bệnh nhân AIDS trên cả nước.

Năm 1928, tại BV Bệnh Nhiệt Đới có 1 ca nhiễm C. neoformans đầu

tiên được báo cáo với biểu hiện viêm màng não; theo thống kê của các bác sĩ

Khoa Giải Phẫu Bệnh, BV Chợ Rẫy từ tháng 4/1999 đến tháng 10/2001 tỷ lệ

nhiễm nấm Cryptococcus spp. là 5% (2/40 ca). Tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới

vào năm 2003, viêm màng não nấm do C. neoformans chiếm 12,2%, từ

4/2004 - 4/2005 đã thu thập 147 ca nhiễm C. neoformans ở hệ thần kinh trung

ương đi kèm với HIV/AIDS. Qua hồi cứu 151 trường hợp bệnh viêm màng

não trên bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS tại BV Bệnh Nhiệt Đới có 98% nhiễm

C.neoformans.

Trong một nghiên cứu của Trần Phủ Mạnh Siêu và cs, (2006) về tình

hình nhiễm vi nấm nội tạng trên bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh viện Bệnh

Nhiệt đới Thành phố - Hồ Chí Minh từ năm 2003-2005 đã cho thấy C.

neoformans là căn nguyên phổ biến (chiếm trên 90% nhiễm trùng thần kinh ở

bệnh nhân HIV/AIDS) với các con số thống kê được: năm 2003 là 154 ca

(chiếm 99,3%), năm 2004 có 200 ca (chiếm 98,5%), và năm 2005 là 155 ca

(chiếm 99,3%) [36].

Thực tế tình hình nhiễm nấm nội tạng ở bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh viện

Nhiệt đới Tp. HCM năm 2003 có 155/376 ca, năm 2004 có 203/444 ca và 8

tháng đầu năm 2005 có 156/320 ca nhiễm nấm ở hệ thần kinh trung ương, từ

11/2008 đến 6/2009 có 98 trường hợp viêm não, màng não do C. neoformans

tại Bệnh viện Nhiệt đới Tp.HCM [36].

Nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn và nấm gây viêm màng não tại bệnh

viện Bạch Mai từ năm 2008 đến 2010 Tỷ lệ mắc viêm màng não do C.

neoformans ở bệnh nhân HIV chiếm tỷ lệ 71,4%, ở bệnh nhân không nhiễm

HIV chiếm 28,6%.

Theo Lê Tự Phương Thảo, nghiên cứu bệnh nhân HIV/AIDS viêm

màng não điều trị tại BV Bệnh Nhiệt Đới TP. Hồ Chí Minh từ 12/2010 đến

7/2011 Trong 450 mẫu cấy từ bệnh phẩm dịch não tủy (DNT, Cerebrospinal

Fluid - CSF) thì có 74/450 ca (chiếm 16,4%) nhiễm C. neoformans.

Năm 2015, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương ghi nhận có trường

hợp bệnh nhân nữ 35 tuổi không nhiễm HIV viêm màng não do nấm

C. neoformans.

1.2. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans

Như phần trên ta đã thấy viêm màng não do nấm C. neoformans là căn

nguyên gây tử vong ước tính đến hơn 600.000 người chết mỗi năm [28], [30].

Ở Châu Phi, viêm màng não do Cryptococcus chiếm 13% đến 42% tổng số ca

tử vong trong số những người nhiễm HIV [30]. Một nghiên cứu được thực

hiện tại Cameroon cho thấy 42,2% bệnh nhân viêm màng não do

Cryptococcus đã chết trước 21 ngày sau khi chẩn đoán [37]. Do đó việc chẩn

đoán sớm, chính xác và được điều trị kịp là một yêu cầu bức thiết.

Bệnh phẩm để chấn đoán nhiễm nấm C. neoformans phụ thuộc vào vị

trí nấm ký sinh. Bệnh phẩm có thể là máu, dịch não tủy, đờm, dịch soi phế

quản, nước tiểu, mảnh mô bị tổn thương, chất hút từ tổn thương da, chất cạo,

mảnh sinh thiết mô bị tổn thương, dịch khớp, dịch màng tim v.v...

Với nghiên cứu để chẩn đoán viêm màng não do C. neoformans bệnh

phẩm được sử dụng để chẩn đoán là dịch não tủy.

1.2.1. Chẩn đoán trực tiếp

1.2.1.1. Soi phát hiện nang nấm dưới kính hiển vi

Có thể phát hiện nang polysaccharide của nấm Cryptococcus trong mẫu

xét nghiệm nước tiểu não, nước tiểu, đờm, mô hoặc các vật liệu bị nhiễm khác

bằng cách nhuộm mực tàu hoặc các chế phẩm than keo và soi kiểm tra dưới

kính hiển vi. Kết quả quan sát cho hình ảnh nấm C. neoformans là những tế

bào nấm men, hình cầu hoặc hình bầu dục, bao quanh là một lớp vỏ dày. Độ

dày của lớp vỏ rất thay đổi. Nhuộm soi là phương pháp đơn giản nhất cho

chẩn đoán tìm nấm trong dịch não tủy.

Ưu điểm của phương pháp nhuộm mực tàu là kỹ thuật thực hiện đơn

giản, thời gian thực hiện nhanh, chỉ mất một vài phút. Nhược điểm là độ nhạy

kém. Độ nhạy của phương pháp nhuộm mực tàu trong chẩn đoán

Cryptococcus viêm màng não ở bệnh nhân không nhiễm HIV là xấp xỉ 30 đến

72% so với nuôi cấy. Độ nhạy trong chẩn đoán bệnh ở bệnh nhân nhiễm HIV

là dưới 86%. Độ nhạy giảm xuốngchỉ còn42% khi thực hiện với các mẫu bệnh

phẩm có mật độ < 1000 CFU/mL [38]. Giới hạn phát hiện của phương pháp

này khoảng 103 đến 104 tế bào nấm/ml dịch não tủy [22], [38]. Độ nhạy có thể

được tăng lên khi ly tâm dịch não tủy trước khi tiến hành làm tiêu bản và

nhuộm mực tàu.

Với các lát cắt sinh thiết mô để phát hiện nấm Cryptococcus thường sử

dụng các chất nhuộm PAS, HE, hoặc mucicarmine.

1.2.1.2. Nuôi cấy phát hiện nấm trên môi trường chọn lọc

Nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán viêm màng não do

Cryptococcus, nhưng phương pháp này có một số nhược điểm. Các phương

pháp nuôi cấy nấm đòi hỏi cơ sở hạ tầng phòng thí nghiệm, điện, và kỹ thuật

viên được đào tạo bài bản [39]. Nuôi cấy cần 7 ngày để nấm phát triển và ủ

lên đến 10 ngày để có được số liệu đáng tin cậy. Các phương pháp nuôi cấy

cũng có thể tạo ra kết quả âm tính giả khi mật độ nấm thấp, hiệu suất chẩn

đoán có thể được cải thiện bằng cách sử dụng lượng dịch não tủy cao hơn. Sử

dụng 100 μL dịch não tủy không pha loãng so với 10 μl pha loãng ở tỷ lệ 1:10

đã làm tăng độ nhạy từ 82,4% đến 94,2%, với mức tối thiểu đơn vị khuẩn lạc

CFU cần thiết cho sự tăng trưởng giảm từ 100 xuống còn 10 CFU/ml [38].

Nuôi cấy có thể được thực hiện trên nhiều môi trường khác nhau nhưng

phổ biến nhất là môi trường thạch Sabouraud dextrose; hoặc thạch máu, ngày

nay thạch khác như thạch ớt đỏ (Ground red hot Pepper agar - GRHP) hay

thạch GACA (Giuzotia abyssinica Creatinin agra) cũng được sử dụng thường

quy để nuôi cấy máu.

Các bệnh phẩm máu hoặc dịch não tủy được cấy trên môi trường thạch

Sabouraud dextrose ở 300C, đọc kết quả hàng ngày cho đến 14 ngày [19],

[38]. Nấm mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu kem. Cấy máu có độ

nhạy tới hơn 70% ở các trường hợp bệnh nhân AIDS.

Ngưỡng phát hiện của phương pháp nuôi cấy khác nhau phụ thuộc vào

cách thức tiến hành xử lý trước khi nuôi cấy.

Bảng 1.1. Ngưỡng phát hiện của phương pháp nuôi cấy với các cách xử lý

mẫu khác nhau

STT Phương pháp xử lý mẫu Ngưỡng tối thiểu nấm có

thể mọc được (CFU/ml)

Nuôi cấy thông thường (10 ml pha 100 1

loãng 1:10)

100 ml không pha loãng 10 2

Ly tâm mẫu và sử dụng cặn lắng 10 3

Lọc mẫu qua màng milipore 1 4

1.2.2. Chẩn đoán miễn dịch học phát hiện kháng nguyên

Sử dụng kháng thể để phát hiện kháng nguyên vỏ polysaccharide

của nấm trong dịch não tủy được coi là xét nghiệm nhanh có giá trị nhất

trong chẩn đoán nấm tại phòng xét nghiệm. Việc phát hiện kháng nguyên

cryptococcus (CrAg) trong dịch não tủy, huyết thanh hoặc huyết tương đã

trở thành một công cụ chẩn đoán thiết yếu để chẩn đoán viêm màng não

do C. neoformans hoặc bất kỳ triệu chứng thần kinh trung ương (CNS)

[38]. Có rất nhiều phương pháp xét nghiệm để phát hiện CrAg đã được

xây dựng và thương mại hóa trên thị trường như các bộ sinh phẩm ELISA,

ngưng kết latex. Gần đây sự phát triển của các test miễn dịch dòng chảy

CrAg (như LFA; Immy Inc., Norman, OK...) đã tạo ra một cuộc cách

mạng trong chẩn đoán viêm màng não do Cryptococcus.

Độ nhạy của phương pháp này là cao nhất khi xét nghiệm trên mẫu

dịch não tủy, đặc biệt là mẫu dịch não tủy của các bệnh nhân nhiễm HIV.

Hầu hết các bệnh nhân HIV có nhiễm C. neoformans đều có phản ứng

dương tính khi xét nghiệm miễn dịch bằng dịch não tủy [38]. Tuy nhiên tỷ lệ

này chỉ đạt 60% ở các bệnh nhân nhiễm nẫm không có HIV.

Những phương pháp xét nghiệm miễn dịch học thông thường có: Thử

nghiệm đông kết latex (Latex agglutination assay - LAT); thử nghiệm miễn

dịch enzym (enzym immunoassay – IEA), thử nghiệm miễn dịch dòng chảy

(Lateral Flow Assay - LFA).

1.2.2.1. Thử nghiệm ngưng kết latex (LAT)

LAT là thử nghiệm miễn dịch thông dụng nhất để xác định C.

neoformans. Đây là một xét nghiệm nhanh, dễ tiến hành, có thể phát hiện

được tất cả các dạng miễn dịch khác nhau. Một số bộ sinh phẩm đã được

thương mại hóa trên thị trường có độ nhạy từ 90-100% và độ đặc hiệu 97-

100% so với phương pháp nuôi cấy và chẩn đoán lâm sàng. Ngưỡng phát hiện

của hầu hết các bộ sinh phẩm đã được thương mại là khoảng 10 ng

polysaccharide/mL. Phương pháp này có tỷ lệ dương tính giả khoảng 2-5%;

và có tỷ lệ âm tính giả khá cao đối với các trường hợp có tỷ lệ nhiễm thấp

hoặc nhiễm phối hợp nhiều loại nấm khác nhau [40].

1.2.2.2. Thử nghiệm miễn dịch enzym (EIA)

Thử nghiệm theo phương pháp này đắt hơn LAT, yêu cầu có máy

đọc, tuy nhiên độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với LAT, có thể phát hiện

nhiễm nấm ở giai đoạn sớm hơn. Độ nhạy của EIA so với LAT ở các chủng

serum dạng A và B có thể lên tới 12 lần, và tương đương ở các chủng serum

dạng C và D. Độ tương đồng giữa 2 phương pháp này khoảng 92-98%. Cũng

tương tự như LAT, EIA cũng có tỷ lệ dương tính giả nhất định.

1.2.2.3. Thử nghiệm miễn dịch dòng chảy (LFA)

LFA xuất hiện trong vòng 5 năm trở lại đây và được coi là một cuộc

cách mạng cho chẩn đoán nấm. Không giống như LAT và EIA có sinh phẩm

của thử nghiệm: LFA ổn định ở nhiệt độ môi trường, không cần bảo quản

lạnh, không cần các hóa chất, trang thiết bị đắt tiền, thời gian thực hiện phản

ứng nhanh trong vòng 15 phút là có kết quả. CrAg LFA cũng có độ nhạy cao

hơn so với LAT và EIA và độ đặc hiệu cao hơn ở những trường hợp nồng độ

kháng thể thấp. Thử nghiệm tại Uganda và Nam Phi chỉ ra CrAg LFA có độ

nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 99,3% và 99,1% trong DNT [38].

1.2.3. Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Trong hai thập kỷ qua, vô số kỹ thuật phân tử đã được khám phá để phát

hiện nấm gây bệnh. Nhiều kỹ thuật này, so với các kỹ thuật cổ điển, độ nhạy và

độ đặc hiệu cao xác định đặc điểm của phức hệ loài C. neoformans [41].

Sinh học phân tử là một trong những công cụ chẩn đoán bệnh với độ

nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian chẩn đoán nhanh. Các kỹ thuật này có tính

đặc hiệu cao do việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho từng đối tượng nghiên

cứu và có độ nhạy cao vì chỉ cần một lượng rất nhỏ (vài picrogam) ADN cũng

có thể cho kết quả chẩn đoán.

1.2.3.1. Kỹ thuật PCR cơ bản (conventinal PCR)

Mitchell và cs (1994) là những người đầu tiên sử dụng kỹ thuật PCR

để định loại nấm C.neoformans [42]. Prariayachatigul và cs (1996) đã sử dụng

kỹ thuật PCR để định loại nấm này dựa trên trình tự gen đích 18S với ngưỡng

phát hiện 5 tế bào/mL dịch não tủy [43]. Mirhendi và cs (2001), đã sử dụng

kỹ thuật này để phát hiện nấm C.neoformans dựa trên cơ sở gen CAP59 [44].

Paschoal và cs (2004) sử dụng kỹ thuật này để xác định nhiễm nấm C.

neoformans trong dịch não tủy. So với nuôi cấy và soi tươi nhuộm mực tàu,

kỹ thuật này có độ nhạy nhất (92,9% so với 85,7% và 76,8%) [45]. Một số sử

dụng kỹ thuật này với các cặp mồi đặc hiệu để xác định các serotype hay

genotype của nấm C.neoformans [46].

Kỹ thuật này dễ thực hiện, nhanh nhưng cũng có những nhược điểm

nhất định như chỉ phát hiện được một nầm bệnh cùng lúc, nồng độ giới hạn

phát hiện cao hơn so với các kỹ thuật PCR lồng (nested PCR)… Những trình

tự gen đích thường được sử dụng để xây dựng cặp mồi là: URA 5, CAP59,

ITS, 18S, 5.8S, 28S [39].

1.2.3.2. Kỹ thuật PCR lồng (còn gọi là PCR tổ, nested-PCR, PCR hai vòng)

Trong PCR lồng có hai cặp mồi được thiết kế cho 2 lần phản ứng. Sản

phẩm khuếch đại của lần phản ứng thứ nhất (PCR1) sẽ được dùng làm khuôn

cho lần phản ứng thứ 2 (PCR2) [47], [48]. Với cách thiết kế các cặp mồi, sản

phẩm sau 2 lần phản ứng là rất đặc hiệu cho một loại mầm bệnh. Ngoài ra, do

thực hiện hai lần khuếch đại gen nên số lượng đoạn DNA tạo ra sau khi kết thúc

phản ứng thứ hai lớn hơn nhiều so với PCR thường. Chính vì vậy, độ nhạy và độ

đặc hiệu của kỹ thuật nested-PCR rất cao, có khi lên đến 100% [40], [48], [49].

Trong số các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR thì PCR lồng được sử

dụng nhiều nhất để phân biệt C.neoformans và C. Gattii. Theo Shahindokht

Bassiri Jahromi (2006) và Paola Rappelli (1998) ngưỡng phát hiện nấm

C.neoformans trong dịch não tủy là trên 102 tế bào nấm/ml [48], [50].

Bên cạnh những ưu điểm, kỹ thuật nested-PCR có nhược điểm là chỉ xác

định được duy nhất một loại mầm bệnh trong lần phân tích. Ngoài ra, do thực hiện

hai lần chạy PCR để phân tích mẫu nên có thể có nguy cơ bị nhiễm trong các lần

tạo hỗn hợp chạy PCR, điều này có thể dẫn tới dương tính giả... [48], [51].

1.2.3.3. Kỹ thuật PCR-RFLP (Đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn)

Kỹ thuật này được tiến hành với 2 bước. Bước 1 tiến hành phản ứng

PCR, bước 2 cắt sản phẩm khuếch đại của phản ứng PCR bằng các enzyme

giới hạn. Đối với việc xác định loài, cặp mồi thiết kế cho phản ứng PCR

thường đại diện cho một giống, hoặc phân giống sinh vật do vậy chưa đủ cơ

sở để xác định, phân biệt nhiều loài với nhau. Dựa vào sự khác biệt về trình tự

nucleotite của các loài khác nhau, sử dụng các enzymne giới hạn đặc hiệu để

cắt sản phẩm PCR thành các đoạn có kích thước khác nhau, là cơ sở để phân

biệt các loài... [44], [52]. SH Mirhendi và cs, (2001) đã nghiên cứu ứng dụng

kỹ thuật RFLP-PCR xác định, phân biệt một số nấm men Candida spp., nấm

Aspergillus và nấm C.neoformans gây bệnh ở người, hoặc trong xác định các

subtype, kiểu gen (genotype), kiểu huyết thanh (serotype) của nấm

C.neoformans … [44], [53].

Ở trong nước, một số tác giả đã ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác

định nấm C.neoformans hoặc phân biệt C.neoformans với một số nấm men

phân lập từ người. Đỗ Ngọc Ánh và cs, (2015) áp dụng kỹ thuật này để xác

định sự có mặt của nấm C. neoformans và Candida spp. trong dịch não tủy,

có so sánh với kỹ thuật nuôi cấy [54]. Kết quả cho thấy, so với nuôi cấy

RFLP-PCR có độ nhạy 70%, độ đặc hiệu 97,5%. Chỉ số Kappa về mức độ

phù hợp chẩn đoán so với nuôi cấy là 0,70 [54], [55].

Kỹ thuật này có nhược điểm là muốn nhìn rõ kết quả cắt giới hạn khi

điện di thì sản phẩm PCR thu được phải nhiều. Trường hợp số lượng sản

phẩm PCR ít (trên band điện di mờ) thì có thể không nhìn thấy sản phẩm cắt

giới hạn khi chụp hình sản phẩm điện di. Ngoài ra, vị trí cắt giới hạn bằng

enzyme có thể có biến đổi đa hình, xuất hiện một hoặc một vài nucleotide

thay thế làm cho enzyme không cắt giới hạn được dẫn tới kết quả phân tích

trở nên sai khác [44], [52], [56].

1.2.3.4. Kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex-PCR)

Đây là kỹ thuật sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại ADN

nhằm phát hiện nhiều mầm bệnh trong một lần phản ứng. Kỹ thuật này có ưu

điểm là giới hạn chẩn đoán nhanh, cùng lúc xác định được sự có mặt của một

hoặc nhiều mầm bệnh [57], [58]. Tuy nhiên, việc thiết kế để có được cặp mồi

có cùng nhiệt độ gắn mồi dùng cho PCR đa mồi khó. Có nhiều nghiên cứu đã

áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán vi nấm gây bệnh nói chung và các nấm

Cryptococcus nói riêng [57], [58], [59]. Vivians và cs, (2007) sử dụng 2 phản

ứng PCR để xác định trực tiếp 6 loại nấm gây bệnh từ môi trường nuôi cấy

tăng sinh, trong đó có nấm C.neoformans. Tác giả này cho rằng, đây là kỹ

thuật có ưu điểm nhanh, đơn giản, tin cậy và có thể thay thế cho phương pháp

định danh truyền thống bằng nuôi cấy, thử nghiệm sinh hóa. Leal AL và cs,

(2008) đã ứng dụng kỹ thuật multiplex-PCR để xác định và phân biệt 2 loài C.

neoformans và C. gattii [59]. Theo Leal AL và cs, (2008) có 131 mẫu được

phân tích bằng kỹ thuật multiplex-PCR phù hợp hoàn toàn với kết quả định

danh trước đó, trong khi phân biệt C.neoformans và C. gattii bằng môi trường

CGB có 6 chủng kết quả không phù hợp [59]. Như vậy, có thể nói Multiplex-

PCR có nhiều ưu điểm rõ rệt so với các kỹ thuật truyền thống. Tuy nhiên, kỹ

thuật này cũng có một số nhược điểm đó là chi phí thực hiện cao và quá trình

xây dựng thiết lập quy trình kỹ thuật mất nhiều thời gian. Có sự cạnh tranh

giữa các mồi với trình tự đích và các hóa chất có trong thành phần phản ứng.

Ngoài ra, kỹ thuật này yêu cầu nghiêm ngặt kiểm soát sự tự bắt chéo giữa các

mồi tạo ra các dương tính giả.

1.2.3.5. Kỹ thuật PCR lồng đa mồi (nested multiplex-PCR)

Kỹ thuật nested multiplex-PCR hay kỹ thuật khuếch gen lồng đa mồi là

sự kết hợp của 2 kỹ thuật PCR lồng và PCR đa mồi. Ở phản ứng PCR thứ

nhất (PCR1), 01 cặp mồi được thiết kế để khuếch đại được gen của cả 2 hay

nhiều loài thuộc cùng nhóm mầm bệnh (mồi chung). Các cặp mồi ở phản ứng

PCR thứ hai (PCR2) được thiết kế đặc hiệu cho từng mầm bệnh và khuếch đại

đoạn gen nằm trong đoạn DNA được khuếch đại ở phản ứng PCR1 [60]. Kỹ

thuật này đã được nghiên cứu phát triển trong phát hiện một số vi khuẩn, virut

và vi nấm gây bệnh ở người như Đỗ Ngọc Ánh và cs (2017) đã thiết lập và

xây dựng quy trình kỹ thuật nested multiplex-PCR để phát hiện đồng thời 2

nấm C. neoformans và C. albicans. Taira và cs (2014) sử dụng kỹ thuật này

để phát hiện một số nấm Candida gây bệnh nấm máu ở bệnh nhân nhi bị bệnh

nặng [60]. Theo Nguyễn Trọng Chính và cs (2017), độ nhạy của kỹ thuật

nested multiplex-PCR trong phát hiện C. neoformans và C. albicans ở dịch

não tủy 77,78%, độ đặc hiệu 99,1% [61].

Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là nguy cơ bị nhiễm trong các lần

tạo hỗn hợp chạy PCR rất cao, điều này dẫn tới dễ gây ra dương tính giả …[61].

1.2.3.6. Kỹ thuật PCR thời gian thực (real-time PCR)

Hiện nay, một trong những phương pháp tiên tiến nhất sử dụng để chẩn

đoán các mầm bệnh là PCR thời gian thực (real-time PCR). Ở kỹ thuật này quá

trình nhuộm màu phát hiện ADN được diễn ra đồng thời với phản ứng PCR

[62]. Real-time PCR có độ nhạy cao hơn phản ứng PCR và thời gian thực hiện

nhanh hơn. Đây là một trong những kỹ thuật hiện đại nhất áp dụng cho nghiên

cứu bệnh Cryptococcosis và các tác nhân gây bệnh khác. Ngoài ra, kỹ thuật này

còn cho phép đánh giá sự biểu hiện của các gen có liên quan đến độc tính vi

sinh vật [62].

Trong một nghiên cứu so sánh, Bialek và cs, (2002) cho real-time PCR

nhanh hơn PCR lồng để phát hiện nấm, đồng thời cung cấp được kết quả định

lượng [63]. Eberling, (2011) đã phân biệt các mẫu Cryptococcus spp. và

Candida spp. thu được từ các mẫu lâm sàng. Sử dụng PCR thời gian thực với

các mồi đặc hiệu cho loài và đã chứng minh rằng kỹ thuật này nhanh, nhạy và

đặc hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh [64].

Gần đây, Real-time PCR cũng đã được sử dụng thành công để chẩn

đoán xác nhận viêm màng ngoài tim do nấm C. neoformans, với trình tự gen

đích 18S và 28SrRNA [65]. Veron và cs, (2009); Satoh và cs, (2011) đã phát

triển kỹ thuật PCR thời gian thực TaqMan để chẩn đoán cryptococcosis có độ

nhạy và độ đặc hiệu cao [66], [67].

1.2.3.7. Một số bộ sinh phẩm chẩn đoán nấm C. neoformans

Ngày nay, ứng dụng rộng rãi các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn

đoán đang được nhiều quốc gia quan tâm [68]. Chính vì vậy việc tạo ra các bộ

sinh phẩm để có thể áp dụng rộng rãi trong các cơ sở y tế đang là hướng đi mà

nhiều quốc gia, doanh nghiệp nghiên cứu. Đối với chẩn đoán nấm C.

neoformans, nhiều hãng nổi tiếng đã nghiên cứu thành công và thương mại

hóa. Các bộ kit chẩn đoán như GENEKAM Biotechnology AG, Norgen Biotek

(Canada) sản xuất 1 loạt các bộ sinh phẩm realtime chẩn đoán C. neoformans

(bảng 1.2), hay bộ kit BlackLight® Fungal ID Kit phát hiện các một số loài

nấm của hãng Blackbio (Tây Ban Nha), C.neoformans-EASY, Path-

C.neoformans, Path-C.neoformans-standard phát hiện C. neoformans của hãng

Genesig (Anh); AmpliSens Cryptococcus neoformans-FRT; PCRmax Ltd

qPCR test C. neoformans của hãng PCRmax; ViPrimePLUS Cryptococcus

neoformans qPCR Kit của hãng Vivantis; Techne™ PrimePRO QPCR DNA

detection Kit Cryptococcus neoformans của hãng Fisher sicientific…

Bảng 1.2. Một số bộ sinh phẩm chẩn đoán C. neoformans của hãng Norgen

Biotek

Tên thương phẩm Mã số Số lượng

phản ứng

C. neoformans TaqMan PCR Kit TM42720 24

C. neoformans TaqMan Probe/Primer and Control Set TM42730 100

C. neoformans End-Point PCR Kit EP42720 24

C. neoformans Primer and Control Set EP42730 100 rxns

1.3. Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa các bộ sinh phẩm PCR chẩn

đoán tác nhân gây bệnh

Các bộ sinh phẩm đã được thương mại hóa trên thị trường có ưu điểm là

đã được chuẩn hóa, xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện đối với các

tác nhân gây bệnh, hướng dẫn sử dụng rõ ràng dễ thực hiện nhưng cũng có một

số nhược điểm như giá thành cao, thời gian làm thủ tục nhập khẩu lâu nên hạn sử

dụng còn lại ngắn, làm cho các phòng thí không chủ động được các hoạt động

của mình. Do đó hầu hết các phòng thí nghiệm có xu hướng tự phát triển các bộ

sinh phẩm, để có thể chủ động công việc của mình.

Nguyên lý chung khi phát triển các bộ sinh phẩm PCR để chẩn đoán tác

nhân gây bệnh mong muốn cụ thể như sau [69]:

- Thiết kế mồi để xác định tác nhân gây bệnh mong muốn;

- Xây dựng quy trình tiến hành phản ứng PCR (nhiệt độ bám mồi, thời

gian của mỗi giai đoạn trong chu kỳ tiến hành phản ứng, nồng độ của các loại

hóa chất trong cùng một hỗn hợp phản ứng: dNTPs, Taq polymerase, MgCl2,

đệm phản ứng);

- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR;

- Tạo chuẩn dương cho bộ kit;

- So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của kỹ thuật và bộ

sinh phẩm với các phương pháp đã đang được sử dụng với bộ kit chuẩn đã

được thương mại hóa trên thị trường;

- Đóng gói bộ sinh phẩm với thành phần và số lượng phù hợp. Thông

thường đóng gói bộ sinh phẩm cho 25, 50 hoặc 100 phản ứng với các thành

phần như:

+ Hỗn hợp phản ứng (PCR master mix);

+ Mồi phản ứng;

+ Chứng cho phản ứng (chứng âm và chứng dương);

+ Thang chuẩn cho phản ứng PCR;

- Đánh giá độ ổn định của bộ sinh phẩm trên mẫu chuẩn.

Trong quá trình xây dựng bộ sinh phẩm phải tiến hành đồng thời quá

trình chuẩn hóa bộ sinh phẩm bao gồm:

- Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi;

- Tối ưu phản ứng PCR;

+ Thành phần phản ứng

+ Chu trình nhiệt của phản ứng

- Ngưỡng phát hiện;

- Tạo chứng dương chuẩn;

- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm.

1.3.1. Thiết kế và chuẩn hóa nồng độ mồi cho phản ứng PCR

1.3.1.1. Thiết kế mồi cho phản ứng PCR

Mồi (Primers) có thể được coi là một trong những thành phần quan

trọng nhất của phản ứng PCR và là một trong những yếu tố được quan tâm

đầu tiên khi phát triển một kỹ thuật PCR mới. Mồi là yếu tố quyết định tính

đặc hiệu của sản phẩm PCR, nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho

chuỗi ADN đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt

cặp được trên các chuỗi ADN khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng

đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu. Do đó,việc thiết kế mồi phải

được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu

của phản ứng PCR.

Việc lựa chọn hoặc thiết kế mồi cần đảm bảo các yêu cầu sau:

- Độ dài tối ưu của mồi từ 18-24 bazơ nitơ hay nucleotide;

- Tỷ lệ G + C chiếm 35-65%;

- Tránh các nucleotide lặp lại;

- Cặp mồi phải có nhiệt độ nóng chảy (melting Temperatures - Tm) tương tự

nhau, không chênh quá 50C. Nhiệt độ bám mồi được tính theo công thức

Wallace như sau:

Tm = 40C x (G + C) + 20C x (A + T)

Thông thường nhiệt độ nóng chảy thường ở khoảng 550C ± 80C.

- Nhiệt độ bám mồi (amplification Temperatures – Ta) được tính dựa vào nhiệt

độ nóng chảy của mồi. Nhiệt độ bám mồi thấp có thể dẫn đến lượng sản

phẩm PCR được tạo ra thấp, do không đủ số lượng lai giữa mồi và khuôn.

Ngược lại, sản phẩm không đặc hiệu sẽ được tạo ra nhiều nếu nhiệt độ gắn

mồi quá thấp. Người ta thường tính nhiệt độ gắn mồi theo công thức sau: Ta

= 0.3 x Tm (Mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14,9

Khi thiết kế mồi cần chú ý tránh các hiện tượng sau:

- Hiện tượng kết cặp (dimer): Là hiện tương mồi thay vì gắn vào khuôn sẽ gắn

vào mồi ngược với nó hoặc với chính nó, tạo ra các sản phẩm PCR có kích

thước nhỏ và làm giảm lượng mồi bắt cặp với khuôn.

- Cấu trúc kẹp tóc: có thể được hình thành bởi sự tương tác bên trong chính

đoạn mồi làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR.

- Hiện tượng lặp lại nhiều lần trong trình tự mồi ví dụ: trình tự đôi như

ATATATATAT hoặc đơn như GGGGG. Điều này có thể gây bắt cặp nhầm

do đó số lần lặp tối đa của một mồi là 4 lần lặp cho cả hai trường hợp.

- Tương đồng chéo: Là hiện tượng mà cặp mồi sẽ khuếch đại một gen khác có

trong hỗn hợp ban đầu. Để tránh hiện tượng này, mồi sau khi thiết kế cần

được đưa lên BLAST để so sánh và kiểm tra độ đặc hiệu.

Mồi có thể tự thiết kế mồi bằng cách tìm các đoạn trình tự đặc hiệu cho

loài hoặc giống dựa trên các đoạn trình tự trên ngân hàng gen bằng cách gióng

hàng hoặc sử dụng các phần mền chuyên dụng như Primer 3 để thiết kế. Hoặc

có thể lựa chọn các cặp mồi do các tác giả trước đã sử dụng và kiểm tra xác

định lại giá trị sử dụng của cặp mồi với các mẫu lâm sàng trong điều kiện

thực tế của phòng thí nghiệm của đơn vị.

Đối với phản ứng PCR lồng cần chú ý việc thiết kế mồi của phản ứng

PCR 2 phải nằm trong vùng trình tự ADN được khuếch đại từ phản ứng PCR1

[70],[71].

1.3.1.2. Chuẩn hóa nồng độ mồi của phản ứng PCR

Mồi sau khi được tổng hợp, thường được bảo quản ở dạng đông khô,

sau đó có thể được hòa tan để sử dụng trong dung dịch 10mM Tris-HCl pH =

8; TE (10mM Tris-HCl pH = 8), 1 mM EDTA hoặc trong nước tinh khiết.

Tối ưu nồng độ mồi trong PCR cũng đóng vai trò rất quan trọng trong

phản ứng PCR. Nếu nồng độ mồi quá cao, sẽ làm tăng khả năng liên kết

không đặc hiệu hoặc thậm chí bắt cặp lẫn nhau. Thông thường, nồng độ mồi

tổng số thường ở mức 0,1 - 1 µM. Để tăng độ đặc hiệu, có thể giảm xuống

thấp ở mức 0,1 µM, tuy nhiên điều này có thể làm giảm hiệu suất PCR.

Dung dịch mồi gốc có nồng độ 1 mM có thể bảo quản ở nhiệt độ -

200C trong vòng 1 năm. Dung dịch mồi để thực hiện phản ứng có nồng độ

thông thường từ 25-100 µM cũng được bảo quản ở nhiệt độ này, và có thể rã

đông nhiều lần trong vòng 1 tháng mà không ảnh hưởng đến chất lượng mồi

[70], [71].

1.3.2. Chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng PCR

1.3.2.1. Lựa chọn enzym polymerase

Enzyme Taq DNA polymease được sử dụng phổ biến cho phản ứng

PCR. Enzyme Pyrococcus furiosus (PFU) polymerase ngày nay cũng được

sử dụng phổ biến cho PCR có tỉ lệ sai sót thấp hơn so với enzyme Taq

polymerase. Tuy nhiên, các enzyme khác nhau hoạt động ít nhiều hiệu quả

đối với các khuôn khác nhau. Ví dụ, nếu vùng ADN khuôn quan tâm chứa

hàm lượng G-C cao (trên 65%), thì enzyme Accuprime DNA polymerase

giàu G-C sẽ là lựa chọn tốt hơn cho phản ứng PCR. Thông thường tùy vào

loại phản ứng PCR và thể tích phản ứng lượng enzym polymerase thay đổi

từ 0,5 đến 2,5 đơn vị cho một phản ứng [69], [72], [73].

1.3.2.2. Nồng độ của Mg2+ trong dung dịch đệm

Dung dịch đệm cho PCR là một trong những yếu tố quan trọng ảnh

hưởng đến chất lượng phản ứng PCR. Thành phần dung dịch đệm của phản

ứng PCR phụ thuộc vào loại enzym ADN polymerase sử dụng trong PCR.

Đệm PCR thường chứa muối Tris HCl 10 mM, KCl 50mM và

MgCl2 1,5mM. Ngoài ra, đệm PCR còn có thể chứa 0,001% BSA hay

Gelatine và tween hay formamide.

Trong các thành phần trên, ảnh hưởng lên phản ứng PCR nhiều nhất là

nồng độ MgCl2, vì vậy để có được một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao,

phản ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một

nồng độ MgCl2 thích hợp nhất.

Thông thường nên sử dụng đúng loại dung dịch đệm tương ứng với

enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo. Nhiều loại dung dịch đệm đã có sẵn

một lượng nhất định ion Mg2+ nên cần lưu ý khi tối ưu hóa nồng độ Mg2+.

Việc tăng nồng độ ion Mg2+ có thể làm xuất hiện thêm các sản phẩm

không đặc hiệu, nếu thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp.

Dò tìm nồng độ Mg2+ tối ưu thông thường bằng gradien nồng độ từ 0,75 đến

4 mM với các khoảng cách mỗi bước từ 0,2 đến 0,5 mM [70], [71].

1.3.2.3. Nồng độ dNTPs (deoxy nucleoside triphosphate)

Đây là thành phần để tổng hợp nên các bản sao trong phản ứng PCR.

Có 4 loại dNTP dùng trong phản ứng PCR là Adenine (dATP), Thymine

(dTTP), Cytosine (dCTP), Guanine (dGTP). dNTPs là loại hóa chất kém bền

cần lưu ý khi sử dụng và bảo quản, nên chia nhỏ lượng dNTPs để giảm số lần

làm tan, sử dụng lại. Nồng độ của dNTPs có thể ảnh hưởng tới cả độ đặc hiệu

và năng suất của PCR. Nồng độ dNTP quá cao sẽ làm giảm độ đặc hiệu,

trong khi quá thấp sẽ làm giảm hiệu suất. Nồng độ dNTP thông thường từ 50

µM đến 200µM.

1.3.2.4. ADN khuôn

Là ADN mẫu mà chúng ta sẽ khuếch đại: Có thể là ADN kép, đơn

được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu. ADN khuôn cần có độ nguyên

vẹn cao tránh lẫn tạp chất.

Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi đoạn ADN cần khuếch đại không dài

quá, khuếch đại tốt nhất với đoạn ADN dài khoảng 1-1,5kb.

Mẫu ADN tinh sạch sẽ cho kết quả tốt, sử dụng quá nhiều ADN làm

giảm độ đặc hiệu phản ứng và làm tăng sự khuếch đại các sản phẩm không

mong muốn. Do PCR rất nhạy, nên sử dụng mẫu ADN khuôn ít nhất có thể.

Bắt đầu với không quá 1ng ADN khuôn từ plasmid, 10-40ng cho mẫu cDNA

hoặc lên tới 1µg đối với các mẫu ADN tách từ mẫu lâm sàng.

Chú ý có một số hóa chất sử dụng trong quá trình tách chiết ADN như

SDS hay protease có thể ức chế phản ứng PCR. Do đó nếu cần thiết nên tiến

hành thêm bước tủa ADN bằng cồn để loại bỏ các chất ức chế. Thông thường

nồng độ của ADN khuôn từ 0,1 – 1µg.

1.3.2.5. Thể tích của phản ứng

Với các thế hệ máy luân nhiệt mới, thể tích của một phản ứng PCR có

thể thay đổi từ 5-100µl. Thể tích càng nhỏ sẽ khuếch đại lượng ADN khuôn

nhỏ một cách hiệu quả hơn thể tích lớn. Thể tích thông thường được sử dụng

là từ 20 đến 50µl.

Thành phần của một phản ứng PCR thông thường với thể tích 50µl

được thể hiện ở bảng 1.3.

Bảng 1.3. Thành phần phản ứng PCR thông thường với thể tích 50 µl

Số TT Hóa chất Nồng độ hóa chất Thể tích cho 1

phản ứng

Vừa đủ 50µl Nước khử Ion khử Ion 1

5µl Đệm PCR 10X 2

1µl dNTPs 10mM 3

3µl 25mM 4 MgCl2

1µl Mồi xuôi 20µM 5

1µl Mồi ngược 20µM 6

ADN khuôn 0,1-1µg Tùy nồng độ 7

Taq Polymerase 5 đơn vị/µl 0,5µl 8

1.3.2.6. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR

Chu kỳ nhiệt của phẩn ứng PCR thường bao gồm quá trình tách ADN

sợi đôi, 25- 40 chu kỳ khuếch đại phản ứng PCR bao gồm quá trình tách sợi,

bám mồi, kéo dài mồi và cuối cùng là giai đoạn ồn định sản phẩm PCR. Chu

kỳ của một phản ứng PCR thông thường được thể hiện ở bảng 1.4.

Bảng 1.4. Chu kỳ nhiệt của một phản ứng PCR thông thường

STT Các bước của Chu kỳ 3 bước của phản ứng PCR Số chu

chu kỳ nhiệt kỳ Nhiệt độ Thời gian

Tách sợi ban đầu 940C - 950C 2-10 phút 1 1

Tách sợi 940C 10 – 60 giây 25 - 40 2

chu kỳ Bám mồi Thấp hơn 50C 20 - 60 giây 3

so với Tm thông

thường 550C ±

100C

4 Kéo dài mồi 700C - 800C Phụ thuộc vào đoạn

Thông thường ADN cần khuếch đại

720C và enzym

Polymerase sử dụng

5 Ổn định sản 700C 5 - 10 phút 1 chu kỳ

phẩm PCR Thông thường

720C - 800C

6 Bảo quản sản 40C Đến khi điện di 1 chu kỳ

phẩm

- Thời gian tách sợi

Thời gian tách sợi ban đầu khoảng từ 2-5 phút ở nhiệt độ 94 – 950C;

với ADN khuôn từ hệ gen thời gian tách sợi thông thường khoảng 2 phút ở

nhiệt độ 940C. Thời gian tách sợi ở các chu kỳ tiếp theo khoảng từ 20 đến 60

giây thay đổi phụ thuộc vào loại máy PCR, loại ống, kích thước ống phản

ứng và nồng độ GC.

- Thời gian bám mồi

Nhiệt độ bám mồi đã được đề cập ở phần thiết kế mồi. Thông thường nhiệt

độ bám mồi từ 520C đến 620C, thời gian bám mồi thường từ 20 đến 60 giây.

- Thời gian kéo dài mồi

Nhiệt độ kéo dài mồi thông thường được giữ ở 720C, thời gian kéo dài

mồi từ 45 đến 60 giây cho mỗi kb. Đối với những sản phẩm PCR có kích

thước lớn hơn 5 kb thì thời gian kéo dài mồi khoảng 2 phút. Thời gian ổn

định mồi cuối cùng thường khoảng 5 đến 10 phút.

1.3.3. Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương của kỹ thuật

1.3.3.1. Xác định ngưỡng phát hiện

Xác định ngưỡng phát hiện hay độ nhạy của mồi: bằng mẫu chuẩn nấm

C. neoformans – đã biết trước trước nồng độ: pha loãng mẫu ADN đã tách

chiết theo lũy thừa của 10 thành nhiều nồng độ khác nhau. Tiến hành khảo sát

với những điều kiện tối ưu đã được xác định. Nồng độ thấp nhất mà phương

pháp luôn cho kết quả rõ ràng và chính xác được xác định là ngưỡng phát

hiện của kỹ thuật.

1.3.3.2. Xây dựng chuẩn dương, âm của bộ sinh phẩm

Chuẩn dương trong các bộ sinh phẩm PCR thường được xây dựng

bằng cách tách chiết ADN của mẫu chuẩn, khuếch đại bằng cặp mồi bao phủ

chiều dài của đoạn ADN cần khuếch đại (kích thước đoạn ADN lớn hơn

đoạn ADN cần khuếch đại), đo nồng độ và pha thành dãy chuẩn dương theo

cấp số nhân; chuẩn dương thấp nhất thường cao hơn ngưỡng phát hiện 01 bậc

(gấp 10 lần ngưỡng phát hiện).

Chuẩn âm là ADN của người hoặc các ký sinh trùng, vi sinh vật

thường song nhiễm với loài mà chúng ta cần phát hiện.

Trong một số trường hợp để phát hiện các bệnh ở người, người ta

thường thiết kế các bộ mồi có thể phát hiện ADN đặc trưng của người sử

dụng làm chứng nội chuẩn, chứng minh hóa chất hoạt động tốt và quá trình

tách chiết có thu được ADN từ vật chủ là người.

1.4. Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh

phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh

Theo Naeger (2013) [74], kết quả của các xét nghiệm cận lâm sàng

được coi là các bằng chứng xác định cho việc chẩn đoán bệnh. Thực hành

chẩn đoán y học thường dựa trên các bằng chứng trả lời cho những câu hỏi về

chẩn đoán lâm sàng và một trong những bằng chứng quan trọng nhất là xét

nghiệm cận lâm sàng. Do đó trong các trường hợp một kỹ thuật xét nghiệm

hoặc một bộ sinh phẩm mới được đưa ra, bác sỹ lâm sàng thường quan tâm

đến câu hỏi liệu xét nghiệm này có thay thế được cho các xét nghiệm truyền

thống đang được sử dụng hay không, ưu điểm của xét nghiệm này là gì? Một

trong những câu hỏi được đặt ra hàng đầu song song với giá thành và thời

gian xét nghiệm là độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện và tính ổn định

của xét nghiệm và bộ sinh phẩm [75].

Để đánh giá một phương pháp xét nghiệm cũng như một bộ sinh phẩm

trước khi áp dụng vào chẩn đoán lâm sàng thì các chỉ số về độ nhạy, độ đặc

hiệu, ngưỡng phát hiện và tính ổn định của xét nghiệm và bộ sinh phẩm được

coi là các chỉ số tiên phong, bắt buộc phải có [74].

1.4.1. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán

Theo nghiên cứu của Nugent và cs (2005) đánh giá về vai trò của tỷ lệ

hiện hiện mắc, độ nhạy và độ đặc hiệu trong đánh giá độ chính xác,

Nishikawa và cs (2013) trong nghiên cứu ”ước tính độ nhạy, độ đặc hiệu để

đánh giá kỹ thuật dựa vào nghiên cứu quan sát” đã nêu rõ các định nghĩa:

Độ nhạy (Se - sensitivity) [76], [74], [77], [78]: Của một xét nghiệm

chẩn đoán là tỷ lệ người mang bệnh có kết quả xét nghiệm dương tính.

-Độ đặc hiệu (Sp - specificity)[74], [77], [78]: Của một xét nghiệm

chẩn đoán là tỷ lệ người không mang bệnh có kết quả xét nghiệm âm tính.

Để xác định Se, Sp người ta so sánh kết quả chẩn đoán của phương pháp cần

xác định với phương pháp chuẩn (được gọi là chuẩn vàng, gold standard) [74].

Phương pháp chuẩn là phương pháp được xem như độ chính xác cao

(tuy nhiên không phải hoàn toàn tuyệt đối), do đó việc xác định chuẩn vàng

để đánh giá một xét nghiệm mới là vô cùng quan trọng.

Theo định nghĩa trên để đánh giá được độ nhạy, độ đặc hiệu của một

sinh phẩm chuẩn đoán ngoài việc xác định được chuẩn vàng, thì mẫu được sử

dụng để đánh giá xét nghiệm mang tính quyết định về tính chính xác của bộ

sinh phẩm [77],[79].

Xác định mẫu dương tính thật (TP - true positive): hay còn gọi là mẫu

chuẩn dương –là các mẫu đã được xác định dương tính về mặt hình thái, đối

với những nghiên cứu gần đây thì mẫu chuẩn dương phải được thẩm định lại

bằng một kỹ thuật sinh học phân tử đã được công bố trên các tạp chí uy tín

của thế giới hoặc lưu giữ trên ngân hàng gen (Nishikawa, Lakhen 2008).

Mẫu âm tính thật (TN – true negative) – thường là các nền mẫu giống

như mẫu xét nghiệm nhưng không chứa tác nhân gây bệnh, hoặc mẫu chứng

trắng (mẫu nước cất, hoặc dung môi phù hợp hoàn toàn không chứa tác nhân

gây bệnh); Các mẫu âm tính thật cũng cần được thẩm định xác định hoàn toàn

không chứa tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

Sau đó để đánh giá khả năng áp dụng của bộ sinh phẩm này trên mẫu

lâm sàng, yêu cầu phải đánh giá bộ sinh phẩm trên các mẫu lâm sàng thu từ

thực địa. Đối với các mẫu lâm sàng khi xét nghiệm có thêm khái niệm:

Mẫu dương tính giả (FP - false poisitive): Mẫu âm tính nhưng vì một lý

do nào đó khi xét nghiệm cho kết quả dương tính.

Mẫu âm tính giả (FP - false poisitive): Mẫu dương tính nhưng vì một lý

do nào đó khi xét nghiệm cho kết quả âm tính.

Giá trị tiên đoán dương (PPV - positive predictive value): Là tỷ lệ

người có kết quả xét nghiệm dương tính thật sự mang bệnh.

Giá trị tiên đoán âm (NPV - negative predictive value): Là tỷ lệ người

có kết quả xét nghiệm âm tính thật sự không mang bệnh.

Xét nghiệm có độ nhạy cao sẽ cải thiện giá trị tiên đoán âm (ít kết quả

âm tính giả).

Xét nghiệm có độ đặc hiệu cao giúp cải thiện giá trị tiên đoán dương (ít

kết quả dương tính giả) [78], [79], [80].

Hetal và cs, (2011) khi đánh giá tính khả năng áp dụng của que thử

nhanh để chẩn đoán viêm màng não tủy do nấm C. neoformans trên 63 mẫu

dịch não tủy bằng phương pháp nhuộm mực tàu; và nuôi cấy đã xác địnhđộ

nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp nhuộm mực tàu là 83,3% và 96,49%.

Trong khi đó các giá trị này ở phương pháp Latex là 100% và 94,7% so với

phương pháp chuẩn vàng là phương pháp nuôi cấy [81].

Binnicker và cs (2012) khi so sánh thử nghiệm để phát hiện nhiễm nấm

Cryptococcus với 4 loại xét nghiệm miễm dịchvới nhau không so sánh với

phương pháp nuôi cấy đã chỉ ra độ nhạy, độ đặc hiệu của các phương pháp có

sự khác biệt. Thử nghiệm Media Latex có độ nhạy và độ đặc hiệu 100%;

trong khi đó với thử nghiệm miễn dịch ban đầu Premier EIA có độ nhạy thấp

hơn nhiều 55,6%, trong khi độ đặc hiệu vẫn là 100%; Thử nghiệm miễn dịch

với kháng thể alpha CrAg có độ nhạy là 100% và độ đặc hiệu là 99,8% và thử

nghiệm miễn dịch dòng chảy với kháng thể CrAg cũng có độ nhạy và độ đặc

hiệu là 100% [82], [83].

Klauner, 2013 khi nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của thử

nghiệm miễn dịch chảy phát hiện kháng nguyên nấm cryptoccuccus trong

huyết thanh và dịch não tủy đã chỉ ra độ nhạy của phản ứng huyết thanh ở

ngưỡng 100% và độ nhạy là 99,5 đối với huyết thanh và 100% và 97,7% trên

dịch não tủy. Độ nhạy hay ngưỡng phát hiện của LFA so với LA hay ELISA

có thể tăng gấp 200 lần [84].

Wang và cs (2015) khi đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp

LA trên mẫu dịch não tủy của 112 bệnh nhân viêm màng não do nấm

Cryptoccocus và 26 bệnh nhân lao màng não và viêm màng não do virus so

với phương pháp nuôi cấy và soi trực tiếp chỉ ra độ nhạy của 3 phương pháp

tương ứng là 91,1%; 69,6% và 73,2%. Độ đặc hiệu là 96,0%, 100% và 100%.

Shah và cs (2011), khi xét nghiệm trên 63 bệnh nhân HIV nghi ngờ

viêm màng não do nấm dựa theo các chỉ số lâm sàng, đã xác định độ nhạy của

phương pháp LA so với phương pháp nuôi cấy là 100%; độ đặc hiệu là

96,42%. Khi so sánh phương pháp LA với phương pháp nhuộm mực tàu soi

tươi độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 85,7% và 100% [81].

Nghiên cứu của Rivera và cs (2015) khi chuẩn hóa và áp dụng kỹ thuật

sinh học phân tử để xác định nhiễm nấm C. neoformans và C. gatti trên 44

mẫu nhiễm lâm sàng đã được chấn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy; 51 mẫu

chứng âm và 92 mẫu nhiễm các loài ký sinh trùng và vi nấm khác, cho thấy

kỹ thuật được xây dựng có độ nhạy và độ đặc hiệu đều đạt 100% [49].

1.4.2. So sánh tính tương đồng của bộ sinh phẩm

So sánh tính tương đồng của bộ sinh phẩm chẩn đoán mới với chuẩn

vàng, Trong trường hợp xác định nấm C. neoformans thì so sánh với phương

pháp nuôi cấy và nhuộm mực tàu xác định hình thái. Và so sánh bộ sinh phẩm

chẩn đoán mới với một kỹ thuật hoặc một bộ sinh phẩm có ngưỡng phát hiện

tương đương, tùy từng trường hợp nếu đã có những bộ sinh phẩm có ngưỡng

phát hiện tương đương đã được thương mại hóa trên thị trường thì sử dụng bộ

sinh phẩm đã được thương mại hóa.

Tính tương đồng của bộ sinh phẩm được tính bằng mức độ thống nhất

giữa hai bộ sinh phẩm thể hiện qua hệ số kappa (K).

Trị số K biến động từ -1 (hoàn toàn trái ngược) qua điểm 0 (thống nhất

do ngẫu nhiên mà thôi) đến +1 (thống nhất hoàn toàn).

1.4.3. Đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm

Ngoài độ nhạy, độ đặc hiệu, tính tương đồng thì một đặc tính quan trọng để

quyết định khả năng áp dụng của bộ sinh phẩm là tính ổn định của bộ sinh phẩm.

Một bộ sinh phẩm sinh học phân tử, phải có thời hạn sử dụng tối thiểu

trong vòng 6 tháng. Để đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm cần tiến hành

bào quản bộ sinh phẩm trong các điều kiện khác nhau, và hàng tháng tiến

hành thực hiện xét nghiệm trên các mẫu chuẩn, mà mẫu lâm sàng cố định đã

được bảo quản trong các điểu kiện tối ưu đảm bảo không thay đổi bản chất

của mẫu; đánh giá tối thiểu 6 tháng và càng lâu càng tốt, hoạt động đánh giá

được dừng lại khi kết quả đánh giá 2 lần liên tiếp không đảm bảo tính ổn định.

1.4.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm

Sau khi tiến hành quá trình tối ưu hóa thành phần và chu trình phản

ứng PCR, xây dựng được chứng dương, chứng âm chứng nội chuẩn, đánh giá

được độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định của bộ sinh phẩm sẽ tiến hành tập hợp

các số liệu để công bố tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm.

Với hai mục tiêu của để tài chúng tôi tiến hành chuẩn hóa kỹ thuật

nested - PCR và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh

phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C. neoformans trong dịch não tủy theo các

nguyên lý được nêu ra ở mục 1.3 và 1.4 của phần tổng quan tài liệu.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm

- 01 chủng nấm C. neoformanschuẩn ATCC (American Type Culture

Collection - Hệ thống Chủng chuẩn của Mỹ) mã số ATCC® 90113

Hình 2.1. Chủng chuẩn nấm C. neoformans ATCC@ 90113

(Chủng chuẩn phục vụ cho nghiên cứu này)

- 07 chủng C. neoformans nuôi cấy từ dịch não tủy bệnh nhân người Việt Nam

có ký hiệu là Vn_N17, Vn_N41, Vn_N57, VN_N58, Vn_N61, Vn_N117,

Vn_N132.

- Các chủng vi nấm thuộc giống Candida gây bệnh thường gặp như: C.

albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. glabrata.

- Các chủng vi khuẩn gây bệnh ở người: Neisseria meningitidis, Haemophilus

influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Streptococcus suis,

Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa.

2.1.1.2. Đối tượng nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định

của bộ sinh phẩm.

Bộ sinh phẩm nested PCR #A011- 02 sản phẩm của mục tiêu 1;

- 01 chủng nấm C. neoformanschuẩn mã số ATCC@ 90113;

- 30 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có biểu hiện viêm màng não nhưng

không nhiễm nấm C. neoformans thu thập ở Bệnh viện Quân y 103 – đã được

kiểm tra bằng phương pháp nuôi cấy và bộ sinh phẩm C. neoformans PCR Kit

EP-42720 của hãng Norgen. Trong đó:

+ 20 mẫu dịch não tủy được gây nhiễm nấm C. neoformans giả định

(mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm được thêm tế bào nấm C. neoformans

vào) – được sử dụng như mẫu dương.

+10 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm – sử dụng như chứng âm.

- 51 chủng nấm C. neoformans được phân lập từ dịch não tủy của bệnh nhân ở

Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Chợ

rẫy và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch (Đã được khẳng định bằng phương pháp

nuôi cấy, soi xác định hình thái bằng nhuộm mực tàu và định loài bằng sinh

học phân tử).

- 120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng viêm màng

não thu thập ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch.

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thu thập mẫu bệnh phẩm dịch não tủy, nuôi cấy phân lập nấm

C. neoformans

+ Bệnh viện Quân y 103;

+ Khoa Vi sinh - Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch;

+ Khoa Vi sinh - Bệnh viện Chợ Rẫy;

+Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.

- Địa điểm xây dựng quy trình, chế tạo bộ sinh phẩm

+ Labo Trung tâm nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y;

+ Labo nấm Bộ môn Ký sinh trùng côn trùng – Học viện Quân y.

- Địa điểm đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm

+ Bệnh viện Quân y 103;

+ Khoa Vi sinh - Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch;

+ Viện kiểm định Quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế.

2.1.3. Thời gian nghiên cứu: từ 3/2014 – 10/2017

2.2. Dụng cụ, vật liệu, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Nguyên vật liệu và trang thiết bị là các các thiết bị khoa học, sinh phẩm, hóa

chất, vật liệu tiêu hao, môi trường cơ bản phục vụ công việc nuôi cấy tế bào,

phân lập nấm và các thử nghiệm sinh học phân tử.

2.2.1. Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc

Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 2, có đầy đủ các khu vực nuôi cấy

tế bào, xử lý bệnh phẩm, trước PCR, PCR, và sau PCR: Máy ly tâm lạnh

Mikro 22R (Hettech, Đức); Tủ an toàn sinh học (Nuaire, Hàn Quốc); Tủ lạnh

âm sâu (Esco, Singgapore; Sanyo, Nhật); Máy PCR (Eppendorf, Đức; ABI

9700, Mỹ); Máy soi và chụp gel (Biorad, Mỹ); Bộ diện di (Applo CLP 300,

Mỹ); Micropipette (Eppendorf, Đức); Máy vortex (Gyromax 737R, Mỹ); Máy

ủ nhiệt có lắc (Eppendorf); lò vi sóng (Sharp, Trung Quốc)…

2.2.2. Sinh phẩm hóa chất

+ Các hóa chất cơ bản: Cồn Ethanol 700, ETDA, đường Glucose, dung dịch

NaCl 0,9%, dung dịch mực tàu;

+ Môi trường tăng sinh nấm: Sabouraud + Chloramphenicol;

+ Enzyme phá màng lyticase (Sigma);

+ Bộ kít tách chiết ADN QiAamp® DNA mini kit của hãng Qiagen (Code

51304, Mỹ);

+ Bộ kít tách chiết ADN của nấm/nấm men Fungi/Yeast Genomic DNA

Isolation Kit (Cat. # 27300, Norgen Biotek Corp).

+ Hóa chất điện di: gel agarose (Serva, Đức), dung dịch TBE 10X (Corning,

Mỹ), thang DNA chuẩn 100bp hoặc 50bp (Invitrogen), Loading dye

(Promega), redsafe…

+ Các cặp mồi cho các phản ứng PCR do công ty Integrated DNA

Technologies (IDT) - Mỹ cung cấp theo yêu cầu của luận án cụ thể như sau:

Bảng 2.1. Các mồi chung khuếch đại gen đích vi nấm

ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G

Tên Kich thước sản Nguồn tham Trình tự (5’-3’) mồi phẩm khuếch đại khảo

555bp ở Mirhendi SH

ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC

CN4 ATC ACC TTC CCA CTA ACA CATT 135bp của C.

C. neoformans và CS (2001)

Guizhen L.

CN5 GAAGGGCATGCCTGTTTGAGAG

neoformans và CS (2002)

2.2.3. Các hóa chất, sinh phẩm khác

+ PCR Mastermix 2X (Thermofisher, code #K1071);

+ Master mix cho realtime PCR (Thermofisher, #K0351);

+ Dung dịch Mg2+ nồng độ 25mM (Lot: 00097122);

+ Nước khử ion dùng cho sinh học phân tử (Corning, Mỹ);

+ Gel Agarose (Serva, Đức);

+ Môi trường Sabouraud agar (Code: VM241138, Merk, Đức);

+ Dung dịch Redsafe (Intron, Hàn Quốc).

2.2.4. Dụng cụ, phụ tùng, vật tư tiêu hao

+ Ống falcon 15 (Corning, Mỹ); Đầu côn có filter 10 QSP (TF140-20-

Q, Mỹ); Đầu côn có filter 200 QSP (TF140-200-Q, Mỹ); Đầu côn có filter

1000 QSP (TF140-1000-Q, Mỹ); Ống tube chạy PCR, ống tube realtime PCR

(QSP, Mỹ); Eppendorf 1.5ml (QSP, Mỹ); Khay giữ lạnh bằng nhựa; Đĩa petri

nhựa; Khẩu trang Y tế (Việt Nam); Găng tay y tế không bột HD-MED

(Malaysia); Giấy, bút, sổ ghi chép…

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm phòng thí nghiệm

Sơ đồ nghiên cứu

Chủngchuẩn và các chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam

Xác định các điều kiện kỹ thuật nested - PCRphát hiện C. neoformans

Xác định các điều kiện cho PCR1

Xác định các điều kiện cho PCR2

Thiết lập quy trình kỹ thuật nested –PCR chẩn đoán C. neoformans

Xác định tính đặc hiệu trên các mẫu chuẩn âm

Xác định ngưỡng phát hiện trên panel chuẩn dương

Xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested - PCR

Chế tạo bộ sinh phẩm nested – PCR chẩn đoán C. neoformans ở quy mô phòng thí nghiệm

Đánh độ ổn định trên mẫu C. neoformans chuẩn ACTT 90113

Đánh giá độ tương đồng với nuôi cấy, soi tươi và bộ sinh phẩm của Norgen

Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn và mẫu nhiễm C. neoformans giả định

Kiểm định bộ sinh phẩm tại viẹn kiểm đinh QG về vắc xin và sinh phẩm y tế

KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ

2.3.2. Mẫu nghiên cứu

2.3.2.1. Cỡ mẫu nghiên cứu

- Mẫu xây dựng quy trình kỹ thuật nested – PCR chẩn đoán nhiễm nấm

C. neoformans

+ Chủng chuẩn C. neoformans mã số ATCC®90113: 01 chủng

+ C. neoformans được phân lập từ dịch não tủy ở Bệnh viện Quân y 103 và

bệnh viện Phạm Ngọc Thạch: 07 chủng

+ C. albicans: 02 chủng - 01 chuẩn ATCC®90028 và 01chủng Việt Nam;

+ Chủng C. tropicalis: 01 chủng Việt Nam;

+ Chủng C. krusei: 01 chủng Việt Nam;

+ Chủng C. parapsilosis: 01 chủng Việt Nam;

+ Chủng C. glabrata: 01 chủng Việt Nam;

Các chủng trên đã được giải trình tự và đăng ký trên genbank năm 2017

+ Các chủng vi khuẩn gây bệnh ở người có nguồn gốc ở Việt Nam: Neisseria

meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,

Escherichia coli, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Acinetobacter

baumannii, Pseudomonas aeruginosa: Mỗi loài 01 chủng

- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm

+ 20 bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 do Học viện Quân Y sản xuất;

+ 01 chủng nấm C. neoformans chuẩn;

+ 20 mẫu dịch não tủy gây nhiễm giả định;

+ 10 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm;

+ 51 chủng nấm C. neoformans được phân lập từ dịch não tủy người Việt Nam

ở Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ rẫy và

Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương;

+ 120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não thu

thập ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch.

- Đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm

06 bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 do Học viện Quân Y sản xuất

2.3.2.2. Phương pháp chọn mẫu

+ Chủng mẫu chuẩn mua từ ATCC (American Type Culture Collection - Hệ

thống Chủng chuẩn của Mỹ) ký hiệu là: ATCC® 90113 (C. neoformans) và

ATCC®90028 (C. albicans)

+ Phân lập mẫu C. neoformans: Tại 04 bệnh viện là Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới

Trung ương, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện

Quân y 103 sẽ thu thập dịch não tủy của tất cả những bệnh nhân có triệu

chứng lâm sàng viêm màng não từ 4/2013 đến 12/2013. Tất cả mẫu dịch não

tủy này sẽ được soi tươi, nuôi cấy xác định C. neoformans. Các chủng C.

neoformans sau đó sẽ được giám định loài bằng sinh học phân tử trước khi đưa

vào sử dụng để xây dựng quy trình kỹ thuật nested – PCR. Một số chủng vi nấm

đã được giải trình tự và đăng ký trên ngân hàng gen vào năm 2017 và 2018.

+ Mẫu làm chứng âm: Các chủng vi khuẩn và vi nấm sử dụng làm chứng âm

đều được phân lập từ các bệnh nhân ở Việt Nam, định loại dựa vào các dấu

hiệu hình thái điển hình; Định loại bằng sinh học phân tử theo các nghiên cứu

đã được công bố trên các tạp chí Quốc tế.

+ Mẫu phục vụ cho thử nghiệm giả định: Mẫu dịch não tủy không nhiễm

nấm thu từ bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não hoặc nghi ngờ viêm

màng não không do nấm C. neoformans (đã loại trừ bằng phương pháp soi

tươi, nuôi cấy và chạy PCR bằng bộ sinh phẩm của Norgen) ở Bệnh viện

Quân y 103;

+ Chọn mẫu để thử nghiệm bộ sinh phẩm ở thực địa: Dịch não tủy các bệnh

nhân có triệu chứng viêm màng não đến khám tại bệnh viện Phạm Ngọc

Thạch, Bệnh viện Quân y 103 trong giai đoạn 10/2015 đến 10/2017.

2.3.3. Nội dung nghiên cứu

2.3.3.1. Xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán

nấm C. neoformans

- Chuẩn bị mẫu

+ Thu thập 270 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân viêm màng não tại 04 bệnh

viện ở Việt Nam sau đó nuôi cấy phân lập được 51 chủng nấm C.

neoformans, chọn 07 chủng để xây dựng quy trình;

+ Tăng sinh tạo nguồn chủng từ chủng nấm C. neoformans chuẩn ATCC

90113;

+ Tạo panel dịch treo nấm của chủng chuẩn và chủng phân lập ở Việt Nam;

+ Tách chiết ADN của chủng nấm C. neoformans chuẩn và của các chủng

phân lập ở Việt Nam;

+ Tách chiết ADN của vi khuẩn, các nấm men khác Cryptococcus

neoformans, HBV, ADN người để làm ADN chuẩn âm;

+ Giám định phân tử các chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam;

+ Giám định phân tử các vi khuẩn làm chuẩn âm;

+ Tạo panel ADN của chủng chuẩn và chủng phân lập ở Việt Nam.

- Xây dựng quy trình kỹ thuật nested-PCR xác định nấm C. neoformans

Lựa chọn cặp mồi phù hợp, tối ưu hóa thành phần phản ứng và chu

trình nhiệt của kỹ thuật nested-PCR. Các nội dung chủ yếu bao gồm:

+ Lựa chọn cặp mồi phù hợp cho phản ứng PCR1 và PCR2

+ Chuẩn hóa thành phần của phản ứng PCR1 và PCR2 (như mục

2.3.5.17)

+ Chuẩn hóa chu trình nhiệt của phản ứng PCR1 và PCR2

+ Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested-PCR.

- Xây dựng bộ sinh phẩm nested-PCR xác định C. neoformans

Tạo chuẩn dương và chuẩn âm

+ Chuẩn dương của C.neoformans được tạo từ chủng nấm chuẩn ATTC

90113: Cấy chuyển, tách chiết, đo nồng độ, tạo ngân hàng với nồng độ thích

hợp: Lấy 5 mẫu nấm chuẩn đã được cấy chuyển, tách chiết ADN với lượng mẫu

lớn – thu được ít nhất 1ml ADN sau khi đã tách chiết, đo nồng độ trung bình đạt

khoảng 11 ng/µl – Từ nồng ADN nấm chuẩn ban đầu, lấy 1 thể tích nhất định

pha loãng với nước khử ion theo bậc thang 2 (5 lần), bậc thang 5 (3 lần) và

bậc thang 10 (4 lần) để tạo ra dãy chuẩn dương có nồng độ khác nhau. Sử

dụng dãy chuẩn dương tiến hành phản ứng PCR để xác định ngưỡng phát hiện

của phản ứng. Chuẩn dương sử dụng cho bộ kít được lựa chọn cao hơn

ngưỡng phát hiện 1 lần: ví dụ nếu ngưỡng phát hiện của phản ứng là 10-2ng/µl

(10pg/ µl) thì chứng chuẩn dương nên sử dụng ở mức 100 pg/ µl.

+ Chứng chuẩn âm là các ADN được tách chiết từ dịch não tủy của

người không nhiễm nấm C.neoformans, có thể nhiễm các KST khác: Các mẫu

này đã được xác định không nhiễm nấm bằng nuôi cấy và kỹ thuật PCR. Các

mẫu chuẩn âm cũng có nồng độ tương tự với nồng độ của chứng chuẩn dương

nếu có mang các ký sinh trùng khác.

Chuẩn bị hỗn hợp PCR cho bộ kít

Dự kiến xây dựng bộ sinh phẩm cho việc thực hiện 100 phản ứng PCR với hai

hình thức đóng gói.

Dạng 1: Gồm 02 loại hỗn hợp phản ứng (master mix) với đầy đủ các thành

phần của phản ứng PCR lần 1 và phản ứng PCR lần 2; chỉ cần thêm ADN

khuôn vào là thực hiện phản ứng PCR.

Dạng 2: Gồm nhiều loại hỗn hợp phản ứng được chia ra một cách hợp lý các

thành phần trong các tube, khi thực hiện sẽ hướng dẫn trộn các hỗn hợp phản

ứng với nhau theo các tỷ lệ nhất định và thêm ADN khuôn để thực hiện phản

ứng PCR.

Hỗn hợp phản ứng được bảo quản trong các ống nhựa sạch không chứa

DNAase và RNAase thể tích 2,0 ml nắp xoắn.

Số phản ứng là 100 nhưng thực tế chuẩn bị khoảng 120 phản ứng nhằm đảm

bảo cho kiểm tra bộ kít và hao hụt trong quá trình thao tác.

Lựa chọn dạng đóng gói của bộ sinh phẩm

Với mỗi dạng kit lấy 01 bộ kít để đánh giá tính ổn định ngay sau khi

sản xuất sau 1 tuần, 1 tháng với 20 mẫu đã được xác định là dương tính với

dịch não tủy và 10 mẫu âm tính.

Lựa chọn cách đóng gói có tính ổn định cao hơn.

Xây dựng hướng dẫn sử dụng bộ sinh phẩm

Xây dựng hướng dẫn sử dụng cho bộ sinh phẩm bao gồm: Cấu thành

sản phẩm (bao gồm những thành phần nào); Hướng dẫn xử lý mẫu trước khi

xét nghiệm; Quy trình xét nghiệm; Diễn giải kết quả.

Kiểm tra chất lượng bộ sinh phẩm và hoàn thiện sản phẩm

Với mỗi lô sản xuất lấy một lượng từ 5-10 hỗn hợp phản ứng PCR; các loại

chứng để kiểm tra đánh giá chất lượng.

Sau khi kiểm tra chất lượng đạt tiêu chuẩn, các thành phẩn của bộ kit sẽ

được đóng gói cho 100 phản ứng, dán nhãn và bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 20oC.

2.3.3.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm

- Chuẩn bị mẫu để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu

Chuẩn bị ban đầu

Lấy 03 mẫu đã cấy chuyển từ mẫu nấm chuẩn C. neoformans ATCC®

90113 và 51 chủng nấm C. neoformansphân lập từ dịch não tủy tại Việt Nam

(danh sách theo phụ lục 2) sau khi được nuôi cấy xong sẽ lấy 2-3 khuẩn lạc

cho vào dung dịch nước muối sinh lý rồi trộn đều tạo dịch treo. Đo độ đục của

dịch treo để xác định mật độ nấm trong 1 ml; thêm dung dịch NaCl 0,9% để

hiệu chỉnh về độ đục về 0,5 McFarland (tương đương 1-5 x 106CFU/ml).

Chuẩn bị mẫu chuẩn dương

Chọn 02 mẫu nấm chuẩn C. neoformans ATCC® 90113 và 13 chủng

nấm C. neoformans phân lập từ dịch não tủy tại Việt Nam đã được hiệu chuẩn

về nồng độ 1-5 x 106CFU/ml.

Tiếp tục pha loãng các dịch treo trên bằng dung dịch NaCl 0,9% theo

cấp số nhân để tạo các dung dịch có nồng độ từ 106CFU/ml xuống

102CFU/ml (ngưỡng phát hiện đã được xác định ở phần trước).

Sử dụng 02 nồng độ: Nồng độ cao 105CFU/ml và nồng độ thấp

102CFU/ml sử dụng bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 để đánh giá độ

nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm.

Tổng cộng có 30 mẫu chuẩn dương (15 mẫu x 2 nồng độ) được sử dụng

để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu.

Chuẩn bị mẫu dịch não tủy giả định

+ Chọn mẫu nấm chuẩn C. neoformans ATCC® 90113 đã được hiệu

chuẩn về nồng độ 1-5 x 106CFU/ml và 20 mẫu DNT không nhiễm nấm

C.neoformans.

+ Pha loãng mẫu nấm chuẩn vào 20 mẫu dịch não tủy không nhiễm

nấm C. neoformans

+ Tiếp tục pha loãng các dịch treo trên bằng dịch não tủy không nhiễm

nấm để tạo ra các mẫu dịch não tủy giả định có nồng độ nấm C. neoformans

giảm dần theo cấp số nhân 105CFU/ml, 104CFU/ml, 103CFU/ml và

102CFU/ml.

Sử dụng 02 nồng độ: Nồng độ cao 105CFU/ml và nồng độ thấp

102CFU/ml thư nghiệm với bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 để đánh giá

độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm. Mỗi nồng độ thử nghiệm 2 lần.

Như vậy với 20 mẫu dịch não tủy gây nhiễm giả định, thử nghiệm 2

nồng độ, mỗi nồng độ lặp lại 2 lần, tổng có 80 mẫu.

Chuẩn bị mẫu chứng âm

Chọn 20 mẫu chuẩn âm để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật

trong đó có 10 mẫu chuẩn âm là nước muối sinh lý (dung dịch để pha loãng

mẫu chuẩn) và 10 mẫu là dịch não tủy đã được kiểm tra lại bằng bộ sinh phẩm

Norgen khẳng định không có nấm C. neoformans (nền mẫu để chẩn đoán trên

các mẫu lâm sàng).

Chuẩn bị mẫu lâm sàng

120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não thu

thập ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch.

- Thực hiện kỹ thuật nested – PCR để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ

tương đồng với các kỹ thuật xét nghiệm khác

Thực hiện kỹ thuật PCR bằng bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 theo

hướng dẫn. Để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các nền

mẫu đã được chuẩn bị ở phần trên và theo sơ đồ nghiên cứu bao gồm 4 nền

mẫu khác nhau: Mẫu chuẩn, mẫu DNT nhiễm giả định, mẫu dương tính với

nuôi cấy từ mẫu lâm sàng và mẫu lâm sàng trực tiếp. Thực hiện phản ứng

nested PCR ghi lại số lượng mẫu âm tính và dương tính trong quá trình thực

hiện. Tính toán độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm theo mục 2.5 phần tính

độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm.

+ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn

Tiến hành kỹ thuật nested-PCR đối với 100 mẫu bao gồm: 15 mẫu

chuẩn dương như đã chuẩn bị ở trên, mỗi mẫu 2 nồng độ là 105CFU/ml và

nồng độ thấp 102CFU/ml) và 20 mẫu chuẩn âm – mỗi mẫu lặp lại 2 lần.

+ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu DNT nhiễm giả định

Tiến hành kỹ thuật nested-PCR đối với 40 mẫu dịch não tủy (20 mẫu x

2 nồng độ) và 20 mẫu chuẩn âm – mỗi mẫu lặp lại 2 lần. Tổng có 80 mẫu giả

định và 40 mẫu chuẩn âm.

+ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu C. neoformans phân

lập từ DNT tại Việt Nam

Tiến hành kỹ thuật nested-PCR đối với 51 chủng nấm C. neoformans

phân lập từ dịch não tủy tại Việt Nam – không pha loãng nồng độ và 10 mẫu

chứng âm (5 nước muối sinh lý, 5 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm) - mỗi

mẫu lặp lại 2 lần. Vậy tổng thử nghiệm 102 mẫu nhiễm C. neoformans và 20

mẫu chuẩn âm.

+ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu lâm sàng

120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có biểu hiện viêm màng não thu ơ

Bệnh viện Quân Y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch tiến hành đồng thời 2

xét nghiệm là nuôi cấy và kỹ thuật nested-PCR cùng 20 mẫu chứng âm để

đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu. Phương pháp tính độ nhạy và độ đặc hiệu

được tính theo công thức ở mục 2.5.

- Đánh giá độ ổn định của bộ sinh phẩm

Lựa chọn 06 bộ sinh phẩm, cùng lô sản xuất để đánh giá tính ổn định

của bộ sinh phẩm, các bộ sinh phẩm được bảo quản ở các điều kiện khác nhau

(-200C; - 350C và – 800C). Hoạt động đánh giá được tiến hành ngay sau khi

sản xuất và lặp lại hàng tháng, mỗi tháng 1 lần đến khi độ ổn định hạ xuống

dưới 90% thì lặp lại 2 lần liên tiếp để khẳng định hoặc tối thiểu 12 tháng.

Đánh giá tính ổn định trên 10 mẫu chuẩn dương và 10 mẫu chuẩn âm (5

mẫu nước muối sinh lý và 5 mẫu dịch não tủy): các mẫu này được tách chiết

ADN và bảo quản ở - 200C ; - 350C; – 800C và 03 tháng một lần mang ra thử

nghiệm.

- Đánh giá tính tương đồng của bộ sinh phẩm

Tính tương đồng của bộ sinh phẩm được thực hiện trên các mẫu lâm

sàng được thu tại BV Phạm Ngọc Thạch và BV Quân Y 103 bao gồm 120

mẫu dịch não tủy có triệu chứng lâm sàng và 20 mẫu chứng âm.

Trên 1 mẫu tiến hành đồng thời 3 phương pháp chẩn đoán bao gồm: Soi

tươi nhuộm mực tầu, bộ sinh phẩm nested-PCR tự xây dựng và bộ sinh phẩm

nested-PCR của Norgen. Ghi lại kết quả xét nghiệm và tính toán độ tương

đồng của các kỹ thuật dựa vào hệ số Kappa theo mục 2.5.

2.3.4. Các chỉ số nghiên cứu

Đối với kỹ thuật nested-PCR: Tính đặc hiệu của mồi, tính chính xác của các

thành phần phản ứng và của chu trình nhiệt, ngưỡng phát hiện.

+ Tính đặc hiệu: Là khả năng nhận diện ADN của nấm C. neoformans mà

không nhận diện ADN của sinh vật khác như ADN của vi khuẩn, ADN của

các nấm khác với C. neoformans, ADN người;

+ Ngưỡng phát hiện: Là giới hạn nồng độ ADN của nấm C. neoformans thấp

nhất mà kỹ thuật nested PCR còn phát hiện được 100%;

Đối với bộ sinh phẩm nested-PCR: Quy cách đóng gói, chứng âm, chứng

dương, độ nhạy, độ đặc hiệu, sự tương đồng, tính ổn định của bộ sinh phẩm.

+ Quy cách đóng gói phù hợp nhất để sử dụng đảm bảo thời hạn sử dụng,

không gây tạp nhiễm, hoặc nhiễm chéo.

+ Chứng âm, chứng dương đảm bảo tính đặc hiệu của bộ sinh phẩm.

+ Độ nhạy (Se - sensitivity): Là tỷ lệ mẫu bị bệnh có kết quả xét nghiệm

dương tính (ở đây chúng tôi sử dụng mẫu bị bệnh là mẫu chuẩn dương của

chủng chuẩn ATCC 90113 được pha loãng ở các nồng độ khác nhau và các

mẫu nuôi cấy đã được xác định nhiễm C.neoformans)

+ Độ đặc hiệu (Sp - specificity): Là tỷ lệ mẫu không bị bệnh có kết quả xét

nghiệm âm tính (trong nghiên cứu chúng tôi lựa chọn 2 loại mẫu âm tính là

dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% và mẫu dịch não tủy không chứa

nấm C. neoformans đã được khẳng định bằng nuôi cấy và xét nghiệm lại theo

bộ sinh phẩm của hãng Norgen).

Để xác định Se, Sp người ta so sánh kết quả chẩn đoán của phương pháp cần

xác định với phương pháp chuẩn (được gọi là chuẩn vàng, gold standard) hoặc sử

dụng các các mẫu chuẩn để đánh giá. Trong trường hợp của này chúng tôi sử

dụng chuẩn vàng là phương pháp nuôi cấy.

Xác định mẫu dương tính thật (TP - true positive): mẫu dương tính thật trong

nghiên cứu này được xác định bao gồm mẫu chuẩn dương C. neoformans

ATCC 90113 và các mẫu C. neoformans phân lập được ở bệnh nhân người

Việt Nam xác định là C. neoformans bằng phương pháp nuôi cấy sau đó

khẳng định lại bằng sinh học phân tử.

Mẫu âm tính thật (TN – true negative): Là các mẫu không chứa C.

neoformans bao gồm nước cất và mẫu dịch não tủy không chứa C.

neoformans (khẳng định bằng nuôi cấy và sinh học phân tử)

Sau đó để đánh giá khả năng áp dụng của bộ sinh phẩm này trên mẫu

lâm sàng, yêu cầu phải đánh giá bộ sinh phẩm trên các mẫu lâm sàng thu từ

thực địa. Đối với các mẫu lâm sàng khi xét nghiệm có thêm khái niệm:

Mẫu dương tính giả (FP - false poisitive): Mẫu âm tính nhưng vì một lý

do nào đó khi xét nghiệm cho kết quả dương tính.

Mẫu âm tính giả (FN - false negative): Mẫu dương tính nhưng vì một lý

do nào đó khi xét nghiệm cho kết quả âm tính.

Giá trị tiên đoán dương (PPV - positive predictive value): Là tỷ lệ

người có kết quả xét nghiệm dương tính thật sự mang bệnh.

Giá trị tiên đoán âm (NPV - negative predictive value): Là tỷ lệ người

có kết quả xét nghiệm âm tính thật sự không mang bệnh.

Xét nghiệm có độ nhạy cao sẽ cải thiện giá trị tiên đoán âm (ít kết quả

âm tính giả). Xét nghiệm có độ đặc hiệu cao giúp cải thiện giá trị tiên đoán

dương (ít kết quả dương tính giả).

2.3.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.3.5.1. Kỹ thuật thu thập dịch não tủy

+ Bệnh nhân được chọc dịch não tủy theo quy trình của Bộ Y tế. Mỗi bệnh

nhân thu thập 1-3 ống, mỗi ống ít nhất 2 ml dịch não tủy. Tất cả các mẫu dịch

não tủy được mã hóa, ghi chép các thông tin: Họ tên, tuổi, địa chỉ, ngày khởi

bệnh, ngày vào viện, một số thông tin về tiền sử phơi nhiễm, một số hội

chứng nếu cần thiết, ngày thu thập mẫu, loại bệnh phẩm [85].

+ Mẫu dịch não tủy chẩn đoán hình thái, nuôi cấy cần được vận chuyển càng

sớm, càng tốt đến phòng thí nghiệm.

+ Mẫu dịch não tủy sử dụng để phân tích bằng kỹ thuật sinh học phân tử được

bảo quản 4oC ở phòng thí nghiệm cho đến khi phân tích. Nếu trong vòng 24

giờ chưa phân tích được thì chuyển bảo quản dịch não tủy ở nhiệt độ - 20oC

2.3.5.2. Kỹ thuật điều chế môi trường

Điều chế môi trường nuôi cấy nấm

Sử dụng môi trường Sabouraud Dextrose Agar (Merk, Đức) có kháng sinh

gentamycin để nuôi cấy nấm C. albicans và C. neoformans. Cách thức điều

chế 1 lít môi trường tóm tắt trong các bước sau:

- Cân 65g bột môi trường Sabouraud Dextrose Agar cho vào bình tam giác

hoặc chai thủy tinh (có chia vạch thể tích);

- Sử dụng cốc đong nước cất đổ vào bình ở trên sao cho đủ 1 lít;

- Dùng que thủy tinh khuấy đều môi trường trong nước cất rồi đưa bình vào

trong nồi hấp để hấp ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút;

- Khi máy báo nhiệt độ trong nồi hấp còn 65-70o, lấy bình ra và cho kháng

sinh gentamycin (kháng sinh đã được làm tan trước đó), rồi lắc đều;

- Tiếp theo đổ dung dịch vào đĩa thạch hoặc ống thạch;

- Chờ cho thạch đông rồi bảo quản đĩa và ống thạch ở 4oC;

A B

Hình 2.2. Môi trường thạch Sabouraud trên đĩa thạch và ống thạch nghiêng

Đối với vi khuẩn

Trong nghiên cứu này các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm các tác nhân

là vi khuẩn N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumonia,Escherichia coli,

Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,

Pseudomonas aeruginosa không tiến hành tăng sinh trên môi trường. Mẫu

bệnh phẩm thu thập hoặc dịch treo vi khuẩn (trong NaCl 0.9%) được bất hoạt

ở 56oC. ADN được tách chiết từ dịch treo và được bảo quản ở -20oC cho đến

khi sử dụng.

2.3.5.3. Kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường thạch Sabouraud

Ria cấy dày trên mặt thạch Sabouraud theo phương pháp 3 vùng. Nuôi cấy

trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC, trong 3- 5 ngày hoặc có thể lâu hơn. Quan sát

khuẩn lạc hàng ngày trong quá trình nuôi cấy. Mẫu được xác định là dương

tính với C. neoformans khi xuất hiện các khuẩn lạc đặc trưng lồi, mịn nhẵn,

nhày, màu trắng, kem hoặc hồng, vàng [86].

2.3.5.4. Kỹ thuật nhuộm mực tàu (China ink)

Lấy một ít khuẩn lạc cho lên lam kính. Nhỏ 1 - 2 giọt mực tàu, dùng kim cấy

trộn đều mực tàu với khuẩn lạc.Quan sát vi thể: Ở độ phóng đại thấp, các tế

bào C. neoformans giống các đốm sáng nhỏ; quan sát ở độ phóng đại cao hơn

sẽ phát hiện tế bào nấm men có nhân chiết quang rõ, bao quanh bởi một

quầng sáng có các tế bào nấm men hình tròn hoặc bầu dục. Hình ảnh đặc

trưng trên tiêu bản nhuộm mực tàu là các điểm sáng hình cầu với bao ngoài

sáng và có nhân bên trong.

Các mẫu bệnh phẩm sau khi nuôi cấy xác định dương tính với nấm C.

neoformans, sẽ được lưu giữ trong môi trường tryptic soy broth + 15%

glyceron ở -80oC đến khi sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.3.5.5. Kỹ thuật tăng sinh chủng nấm chuẩn từ mẫu chuẩn của nhà cung cấp

Theo hướng dẫn của nhà cung cấp cụ thể như sau

(www.atcc.org/products/all/90113.aspx) (phụ lục):

+ Bẻ ống thủy tinh chứa chủng của nhà cung cấp;

+ Thêm vào trong ống chủng vừa bẻ nắp 0,5 ml đến 1 ml nước cất 2 lần vô

trùng, trộn đều tạo thành dung dịch huyền phù;

+ Hút hết dung dịch huyền phù trên cho vào ống falcon có chứa 5 ml đến 6 ml

nước cất 2 lần nước cất 2 vô trùng;

+ Ủ ở nhiệt độ phòng 250 C tối thiểu 2 giờ;

+ Trộn đều hỗn dịch, sau đó lấy một vài giọt để nuôi cấy trên môi trường thạch

đĩa phù hợp, nhiệt độ ủ từ 240C đến 260C;

+ Kiểm tra đĩa nuôi cấy thường xuyên, thông thường khoảng sau 12 ngày sẽ xuất

hiện khuẩn lạc.

Khuẩn lạc của chủng chuẩn mọc lên trên đĩa thạch được lấy lưu giữ trong môi

trường tryptic soy broth + 15% glyceron ở -80oC.

Khi cần thí nghiệm hoặc tách chiết ADN thì khuẩn lạc của chủng chuẩn được

chuyển sang các điều kiện bảo quản phù hợp từ -80oC sang -20oC sang 0oC,

tiếp tục là 2-8oC mỗi điều kiện nhiệt độ cần lưu giữa khoảng 12 giờ để duy trì

sự phát triển tốt nhất của nấm và cuối cùng để ổn định ở nhiệt độ phòng 250 C

cấy ra ống thạch nghiêng hoặc đĩa thạch.

2.3.5.6. Tạo panel theo nồng độ dịch treo

+ Lấy ống đựng dung dịch lưu giữ các chủng nấm từ tủ ấm sâu ra rồi cho

vào tủ 40C để trong 2 giờ;

+ Đưa dung dịch lưu giữ nấm ở tủ 40C ra để nhiệt độ phòng trong 2 giờ;

+ Dùng que cấy vô khuẩn lấy dịch lưu trữ cấy lên ống thạch nghiêng để tăng

sinh các chủng vi nấm, ghi tên chủng và ngày tháng tăng sinh;

+ Sau 2-3 ngày, thu khuẩn lạc cho vào nước muối sinh lý để tạo thành các

dung dịch treo ban đầu và hiệu chỉnh dịch treo về 0,5 MacFarland (tương

đương với 1-5 x106CFU/ml);

+ Các dịch treo của các vi nấm sau đó được đo quang tính toán mật độ tế bào

nấm theo đơn vị CFU;

+ Hòa loãng bằng nước cất để giảm nồng độ dịch treo và hiệu chỉnh về các

nồng độ 105 CFU/ml, 104CFU/ml, 103CFU/ml, 102 CFU/ml, 10 CFU/ml [87];

+ Tiếp theo lấy 500µl dịch treo của nấm các nồng độ trên để tách ADN.

Hình 2.3. Phương pháp pha loãng dịch não tủy

(Nguồn: Dyal 2016) [87]

2.3.5.7. Tạo panel theo nồng độ ADN các vi nấm để đánh giá độ nhạy và

ngưỡng phát hiện

Các bước tạo panel theo nồng độ ADN các vi nấm:

+ Dùng que cấy vô khuẩn lấy khuẩn lạc vi nấm cho vào 500µl dung dịch nước

muối sinh lý;

+ Tiến hành tách ADN các vi nấm theo các bước của hãng Qiagen;

+ Thu ADN và đo nồng độ ADN thu được bằng thiết bị Nano 1000;

+ Hòa loãng ADN đã biết nồng độ mỗi 2 lần, 5 lần và 10 lần trong nước khử

ion để thu được dung dịch ADN có nồng độ nhỏ hơn nồng độ ban đầu;

+ Mỗi nồng độ được tạo thành 5-10 tube;

+ Tạo 10 mức nồng độ khác nhau của mỗi loại nấm;

+ Lưu giữ nồng độ ADN ở tủ đá cho đến khi sử dụng;

2.3.5.8. Tạo panel để đánh giá độ đặc hiệu

ADN của các chủng vi khuẩn, vi nấm không phải C. neoformans, ADN người

sẽ thêm nước khử ion được tạo ra để làm panel đánh giá độ nhạy. 13 mẫu

panel đã được tạo ra để đánh giá độ nhạy của các kỹ thuật PCR và các bộ sinh

phẩm tạo ra.

2.3.5.9. Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn

ADN tổng số của vi khuẩn được tách chiếtbằng bộ sinh phẩm

QiAamp® DNA mini kit của hãng QIAGEN (Code 51304, Đức). Quy trình

được tóm tắt như sau:

Bước 1. Lấy 1 ml dịch não tủy cho vào ống eppendorf. Ly tâm 13000

vòng/phút trong 10 phút (hoặc 8000 vòng/15 phút), giữ cặn, loại bỏ dịch nổi.

Bước 2. Thêm 180 μl dung dịch đệm ATL vào tube chứa cặn bên trên. Sau đó

tiếp tục thêm 20 μl proteinase K, trộn đều bằng máy vortex và ủ ở nhiệt độ

56oC trong máy lắc rung 10-20 phút. Chuyển bước 3.

Bước 3. Ly tâm ống chứa mẫu trong thời gian ngắn để làm cho những giọt

nước từ trên nắp bên trong tube rơi xuống.

Bước 4. Thêm 200 μl đệm AL vào mẫu, trộn đều bằng máy vortex trong 15

giây và ủ ở 70 oC trong 10 phút. Ly tâm 8000vòng/phút trong thời gian ngắn.

Bước 5. Thêm 200 μl ethanol (96-100%) vào mẫu, trộn đều bằng máy vortex

trong 15 giây. Sau khi trộn, ly tâm 8000vòng/phút trong 15 giây.

Bước 6. Cẩn thận chuyển hỗn dịch thu được ở bước 6 (bao gồm cả cặn) vào

cột lọc QIAamp Mini (loại 2 ml) sao cho không ướt ống. Đóng nắp và ly tâm

ở 8000vòng/phút trong 1 phút. Đặt cột lọc QIAamp trong một ống thu mẫu

sạch loại 2 ml và loại bỏ ống chứa phần nước vừa lọc.

Bước 7. Cẩn thận mở nắp cột lọc QIAamp Mini và thêm 500 μl đệm AW1.

Đóng nắp, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút và loại bỏ cặn vừa ly tâm.

Bước 8. Cẩn thận mở nắp cột lọc và cho vào đó 500 μl AW2. Đóng nắp và ly

tâm ở tốc độ tối đa 14000 vòng/phút trong 3 phút.

Bước 9. Đặt cột lọc trong một ống ly tâm sạch loại 1,5 ml và loại bỏ ống chứa

dịch vừa ly tâm. Cẩn thận mở nắp ống QIAamp Mini và thêm 200 μl đệm AE

hoặc nước khử ion vào tube. Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 - 2 phút sau

đó ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút.

Bước 10. Thu dung dịch ADN bên dưới, ký hiệu mẫu và tiến hành kiểm tra

nồng độ ADN thu được.

2.3.5.10. Kỹ thuật tách chiết ADN vi nấm

ADN của vi nấm được tách chiết bằng bộ sinh phẩm Fungi/Yeast Genomic

DNA Isolation Kit của hãng Norgen (Cat. # 27300, Norgen Biotek Corp).

Quy trình tách chiết tóm tắt như sau:

Chuẩn bị mẫu: Lấy một đến hai khuẩn lạc của nấm C. neoformans sau khi

nuôi cấy pha vào dung dịch nước cất sạch để tạo thành các dung dịch treo.

Các dịch treo sau đó được đo quang theo mẫu chuẩn với một thể tích nhất

định để tính chỉ số CFU và hiệu chỉnh dịch treo về 0,5 MacFarland (tương

đương với 106CFU/ml).

Hòa loãng bằng nước cất để giảm nồng độ dịch treo và hiệu chỉnh về các

nồng độ 105 CFU/ml, 104CFU/ml, 103CFU/ml, 102 CFU/ml.

Tiếp theo tách ADN theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

Bước 1. Lấy 500µl dịch treo nấm C. neoformans của từng nồng độ như trên

để vào 1 ống eppendorf 1.5 ml. Ly tâm 14,000 rpm trong 1 phút, giữ cặn, loại

bỏ dịch nổi.

Bước 2. Thêm 250µl Resuspension Solution A, vortex nhẹ. Thêm 20µl

enzyme Lyticase, ủ 30˚C trong 45 phút. Thường xuyên lắc trong quá trình ủ.

Bước 3. Thêm 500 µl Lysis Buffer L và 5 µl RNase A vào tube rồi vortex để

hòa tan.

Bước 4. Chuyển hỗn hợp vào ống Bead Tube, tiến hành vortex ở tốc độ tối đa

trong 5 phút.

Bước 5. Đưa ống Bead Tube vào bể ổn nhiệt và ủ ở 65˚C trong 10 phút, lắc 2

– 3 lần trong quá trình ủ.

Bước 6. Ly tâm nhẹ ống Bead tube sau đó chuyển tất cả dung dịch nổi phía trên

bao gồm cả các tế bào vào ống eppendorf. (Không được lấy các hạt trong Bead

Tube).

Bước 7. Ly tâm 14,000 rpm/2 phút, chuyển dịch nổi sang ống mới.

Bước 8. Thêm một lượng cồn bằng với lượng dịch nổi vừa hút, trộn đều. Sau

đó tiếp tục thêm 300 µl Solution BX và trộn đều bằng máy vortex.

Bước 9. Hút 650 µl hỗn hợp vào cột lọc, ly tâm 10,000 rpm/1 phút, bỏ dịch

phía dưới. Sử dụng ống cũ, thực hiện như trên với phần hỗn hợp còn lại.

Bước 10. Thêm 500 µl Wash Solution A vào cột lọc. Ly tâm 10,000 rpm

trong 1 phút. Bỏ dịch phía dưới, sử dụng ống cũ. Lặp lại bước trên, sau đó ly

tâm 14,000 rpm trong 2 phút và loại bỏ phần dịch phía dưới.

Bước 11. Chuyển cột lọc vào một ống Elution 1.7 ml. Thêm 100 µl Elution

Buffer B, ly tâm 10,000 vòng trong 2 phút. Nếu không thu được toàn bộ thể

tích thì ly tâm thêm 1 phút nữa.

Thu dung dịch ADN, ký hiệu và kiểm tra nồng độ ADN thu được.

2.3.5.11. Kỹ thuật đo nồng độ ADN

Dung dịch ADN thu được được kiểm ra nồng độ trên máy NanoDrop 2000.

Các bước như sau:

+ Khởi động máy tính kết nối với thiết bị;

+ Click đúp vào biểu tượng phần mềm của thiết bị Nanodrop 1000 trên

Desktop. Một cửa số giao diện của phần mềm hiện ra.

+ Tiếp tục Click vào biểu tượng Nucleotid, khi đó có một cửa sổ giao diện

mới hiện ra;

+ Bật nắp mắt quang của thiết bị, nhỏ 1 µl nước khử ion vào “mắt” của thiết

bị, đóng nắp và click chuột vào vị trí OK trong cửa số mới trên máy tính;

+ Dùng khăn giấy lau nước mắt thiết bị và nhỏ tiếp 1 µl. Đóng nắp mắt thiết bị

và bấm Blank trên cửa số giao diện của phần mềm hiện ra trên máy tính;

+ Dùng khăn giấy khô lau nước trên mắt thiết bị và nhỏ 1 µl dung dịch ADN

cần đo vào đó. Đóng nắp thiết bị và Click chuột vào Measurement. Vài giây

sau, kết quả sẽ hiện ra trên máy tính với các thông số chính: nồng độ, chỉ số

OD (A260nm/A280nm)… Khi A260nm/A280nm nằm trong khoảng 1.8 -2.0,

dịch chiết ADN được xem là có độ tinh sạch tốt.

+ Các mẫu tiếp theo cần đo lặp lại như ở bước trên;

+ Kết thúc đo, kết quả đo được ghi chép và lưu trên máy tính;

ADN thu được được kiểm tra nồng độ sau đó bảo quản ở -20oC cho tới

khi đem sử dụng làm cơ chất cho phản ứng PCR.

2.3.5.12. Kỹ thuật lựa chọn mồi cho phản ứng nested – PCR

Tham khảo các cặp mồi đã được công bố, lựa chọn 02 cặp mồi phù hợp

cho phản ứng nested – PCR đáp ứng các yêu cầu: Độ dài tối ưu của mồi từ

18-24 bazơ nitơ hay nucleotit. Tỷ lệ G + C chiếm 35-65%. Tránh các

nucleotide lặp lại, nhiệt độ nóng chảy (melting Temperatures - Tm) tương tự

nhau, không chênh quá 50C. Mồi của phản ứng PCR lần 2 có trình tự nằm

trong trình tự của sản phẩm PCR lần 1.

Phản ứng PCR lần 1: Chọn và đánh giá cặp mồi theo tác giả Mitchell và cs

(1994) [42]; Mirhendi và cs, (2001) [44] là ITS1 và ITS4.

Phản ứng PCR lần 2: Chọn và đánh giá cặp mồi theo Guizhen Luo và

cs (2002) là CN4 và CN5 [88].

2.3.5.13. Kỹ thuật đánh giá tính đặc hiệu của mồi

Tính đặc hiệu của cặp mồi được khảo sát bằng cách:

+ Sử dụng cặp mồi đã lựa chọn chạy phản ứng PCR với ADN của nấm C.

neoformans, sản phẩm PCR được giải trình tự và so sánh trên ngân hàng gen.

+ Tiến hành thực nghiệm phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đã lựa chọn với các

ADN khuôn khác không phải của nấm C. neoformans.

2.3.5.14. Kỹ thuật PCR với cặp mồi đã lựa chọn

Thực hiện phản ứng PCR theo quy trình thông thường tiến hành để

khuếch đại đoạn gen có kích thước từ 200 đến 800 bp với tổng thể tích 50μl

2.3.5.15. Kỹ thuật điện di

Điện di 45 phút trên thạch Agarose 2% trong môi trường TBE 0,5M ở

điện thế 100V phân tích dựa vào thang ADN chuẩn 100bp. 2.3.5.16. Kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR

+ Tinh sạch sản phẩm PCR chuẩn bị cho giải trình tự: Sử dụng bộ kít tinh

sạch ADN của hãng Omega để tinh sạch ADN từ sản phẩm PCR.

+ Tiến hành phản ứng PCR với bộ sinh phẩm Bigdye theo hướng dẫn của bộ

sinh phẩm:25 chu kỳ: 960C trong 10 giây; 590C trong 5 giây; 600C trong 2

phút và bảo quản ở 40C đến khi sử dụng.

+ Giải trình tự tự động trên máy ABI 3130: Sản phẩm sau khi chạy bigdye

được nạp vào máy đọc trình tự tự động ABI 3130.

+ Trình tự thu được được so sánh với ngân hàng gen để khẳng định gen nhân

được là của C. neoformans.

2.3.5.17. Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng PCR1

Phản ứng PCR1 được thực hiện với tổng thể tích 25μl sử dụng cặp mồi

ITS1 và ITS4 với các thành phần như bảng 2.2 và chu trình nhiệt như bảng 2.3

Bảng 2.2. Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR

TT Thành phần Nồng độ, hàm lượng Thể tích sử dụng

cuối cùng cho 1 phản ứng (µl)

1 Nước khử ion Vừa đủ tới 25 µl 9,5

2 Master Mix 2 X có chứa 1X 12,5

MgCl2 nồng độ 4 mM

3 Mồi xuôi PCR1 0,02 µM 1

4 Mồi ngược PCR1 0,02 µM 1

5 ADN khuôn 100pg – 100ng/25µl 2

Phản ứng PCR được tiến hành theo các bước như bảng sau đây:

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt PCR1 được thiết lập cho việc nhân bản đoạn gen

kích thước khoảng 100bp - 600 bp

Bước phản ứng Nhiệt độ 0C Thời gian Số chu kỳ

Bước 1 94 5 phút 01

94 40 giây

Bước 2 56 40 giây 25

72 45 giây

Bước 3 72 15 phút 01

Bước 4 4 ∞ 01

2.3.5.18. Tối ưu hóa các thành phần của phản ứng PCR2

Sản phẩm PCR lần 1 được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR2 với

tổng thể tích 25 µl.

+ Tối ưu nồng độ MgCl2: Thực nghiệm với 6 nồng độ MgCl2 khác nhau từ

1,5mM đến 4,0 mM với bước nhảy là 0,5 mM trong cùng chu trình nhiệt và

các thành phần phản ứng khác.

+ Tối ưu nhiệt độ gắn mồi: Nhiệt độ gắn mồi được thử nghiệm từ 54 đến 59oC

với bước nhiệt thay đổi là 0,1 - 10C trong cùng các thành phần cố định.

Bảng 2.4. Minh họa chạy gradient nhiệt độ và nồng độ Mg2+

Nồng

Nhiệt độ gắn mồi

độ

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12 Mg2+

1.5mM

54.1 54.2 54.5 55.0 55.7 56.4 57.2 57.9 58.6 59.2 59.6 59.8

2.0mM

54.1 54.2 54.5 55.0 55.7 56.4 57.2 57.9 58.6 59.2 59.6 59.8

2.5mM

54.1 54.2 54.5 55.0 55.7 56.4 57.2 57.9 58.6 59.2 59.6 59.8

3.0mM

54.1 54.2 54.5 55.0 55.7 56.4 57.2 57.9 58.6 59.2 59.6 59.8

3.5mM

54.1 54.2 54.5 55.0 55.7 56.4 57.2 57.9 58.6 59.2 59.6 59.8

4.0mM

54.1 54.2 54.5 55.0 55.7 56.4 57.2 57.9 58.6 59.2 59.6 59.8

+ Tối ưu chu kỳ nhiệt: Chu kỳ nhiệt được thay đổi từ 20 đến 40 chu kỳ với

bước thay đổi là 5 chu kỳ trong cùng điều kiện phản ứng khác

Mỗi lần tối ưu 1 thành phần, kết quả của sản phẩm PCR2 của mỗi lần tối ưu được

điện di và so sánh với nhau. Kết quả nào cho băng rõ nét nhất sẽ được chọn.

2.3.5.19. Xây dựng chứng chuẩn của phản ứng PCR

Chứng chuẩn dương để xác định nấm bằng kỹ thuật nested-PCR được

sử dụng là ADN của chủng nấm C. neoformans chuẩn ATCC® 90113.

Chứng chuẩn âm là ADN của dịch não tủy bệnh nhân không nhiễm C.

neoformans đã được chẩn đoán bằng nuôi cấy và thử nghiệm âm tính bằng một bộ

sinh phẩm PCR xác định C. neoformans đã được thương mại hóa trên thị trường.

2.3.5.20. Kiểm tra ngưỡng phát hiện

Các dịch treo có nồng độ từ 10 đến 106 CFU/ml đươ ̣c tách ADN theo cùng 1

phương pháp rồi chạy PCR trong những điều kiện như nhau. ADN cũng pha

thành các nồng độ 1000pg/ul, 100pg/ul, 10pg/ul và 1pg/ul để kiểm tra ngưỡng

phát hiện. Ngưỡng phát hiện được xác định là ngưỡng có nồng độ ADN khuôn

thấp nhất sau khi thực hiện phản ứng PCR, 100% mẫu có kết quả dương tính.

2.4. Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu

Thực hiện xây dựng các SOP hướng dẫn cụ thể, tuân thủ theo các SOP

đã được xây dựng. Hồ sơ biểu mẫu được ghi chép đầy đủ, nhập số liệu 2 lần

bởi hai người độc lập.

2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Phân tích số liệu dựa trên các phần mềm chuyên biệt cho sinh học phân

tử như Blast và ClustalX để xác định tính đặc hiệu của bộ mồi.

- Kỹ thuật phân tích các trình tự ADN các công cụ tin sinh học như

BioEdit, Mega 7.0.9.

- Kỹ thuật so sánh trình tự gen thu được với trình tự trên ngân hàng gen

sử dụng công cụ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi;

Các số liệu định tính được thu thập qua hình ảnh nuôi cấy, hình ảnh

PCR, tính tỷ lệ dương tính, để xác định nồng độ của các chất tham gia phản

ứng: Mg2+, mồi, ADN khuôn; ngưỡng phát hiện của phản ứng, chu trình nhiệt

của phản ứng: Nhiệt độ bám mồi, số chu kỳ nhiệt....

- Các số liệu được ghi chép, mã hóa và xử lý bằng phần mềm y xã hội học

SPSS 20.0.

- Số liệu được phân tích căn cứ vào số chỉ số: độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên

đoán dương, giá trị tiên đoán âm, chỉ số phù hợp tiên đoán (Kappa)...

- Cách tính độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các nền mẫu khác

nhau như sau [78, 89, 90]:

+ Độ nhạy và độ đặc hiệu lâm sàng (trong xét nghiệm chẩn đoán): Độ nhạy và

độ đặc hiệu lâm sàng của phương pháp được tính toán trên các mẫu chuẩn

dương, chuẩn âm, giả định theo các định nghĩa nêu tại mục 2.6.2

- Độ nhạy: Độ nhạy của một xét nghiệm chẩn đoán được là tỷ lệ dương

tính thật có kết quả xét nghiệm dương tính và được xác định theo công thức sau:

Trong đó: Pse là độ nhạy; TP: số lượng mẫu dương tính thật (true positive);

FN: số lượng mẫu âm tính giả (false negative)

- Độ đặc hiệu: Độ đặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán được định

nghĩa là tỷ lệ âm tính thật có kết quả xét nghiệm âm tính và được tính theo

công thức sau:

Trong đó: P là đặc hiệu; TN: số lượng mẫu âm tính thật (true negative); FP:

số lượng mẫu dương tính giả (false poisitive)

Giá trị tiên đoán dương: Giá trị tiên đoán dương được định nghĩa là tỷ

lệ có kết quả xét nghiệm dương tính thật sự dương tính và được tính theo

công thức sau:

Trong đó: PPV: giá trị tiên đoán dương; TP: số lượng dương tính thật (true

positive); FP: số lượng dương tính giả (false positive)

Giá trị tiên đoán âm (negative predictive value - NPV) được định nghĩa

là tỷ lệ có kết quả xét nghiệm âm tính thật sự âm tính và được tính theo công

thức sau:

- Cách tính chỉ số phù hợp chẩn đoán giữa 2 phương pháp:

Nested-PCR Phương pháp xét nghiệm khác Tổng

(+) (-)

a (dương tính thật) c (dương tính giả) a+c (+)

b (âm tính giả) d (âm tính thật) b+d (-)

Po−Pe

a+b c+d N=a+b+c+d Tổng

1−Pe

𝑎+𝑑

Chỉ số Kappa (K): K=

𝑁

𝑃𝑒(+)+𝑃𝑒(−)

(c+d)x (b+d)

(a+b)x (a+c)

Po=

𝑁

Pe= ; Pe(-)= ; P(e+)=

Trong đó:

K : là chỉ số tương đồng Kappa giữa 2 phương pháp xét nghiệm.

Po: là tỉ lệ 2 phương pháp xét nghiệm cho kết quả giống nhau (cùng âm hoặc

cùng dương).

Pe: là tỉ lệ phù hợp mong muốn

N: là tổng số mẫu nghiên cứu

Độ mạnh của K:

0 – 0,4: yếu ; 0,41 – 0,6: trung bình; 0,61 – 0,8: tốt ; 0,81 – 1: rất tốt (hoàn

toàn thống nhất)

2.6. Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu này tuân thủ các quy định về đạo đức nghiên cứu y học. Đề

cương nghiên cứu đã được thông qua hội đồng y đức của Học viên Quân Y và

Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương.

2.7. Nhiễm sai số và cách hạn chế

Nấm C. neoformans là loài nấm có thể tồn tại ở nhiều môi trường khác

nhau, thậm chí cả trong không khí, bụi và môi trường xung quanh chúng ta,

nên rất dễ tạp nhiễm gây sai số trong quá trình tạp nhiễm. Do đó quá trình

nghiên cứu chẩn đoán được thực hiện trong phòng xét nghiệm vi ký sinh của

các Học viện quân Y, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Phạm

Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ Rẫy là những phòng xét nghiệm đã đạt tiêu chuẩn

an toàn sinh học cấp II. Các phòng xét nghiệm nuôi cấy, xử lý mẫu được xây

dựng theo nguyên lý một chiều phân biệt khu vực sạch và khu vực bẩn để hạn

chế sự tạp nhiễm tới mức tối thiểu.

Đây là một nghiên cứu mà hoạt động thu thập mẫu và xét nghiệm đánh

giá sau khi xây dựng bộ sinh phẩm được tiến hành tại nhiều địa điểm khác

nhau với số lượng cán bộ tham gia lớn, để đảm bảo chất lượng, hạn chế sai số

trước khi tiến hành nghiên cứu đề tài đã xây dựng đề cương nghiên cứu chi tiết,

đưa ra các quy trình thu thập mẫu và tiến hành các xét nghiệm rõ ràng. Các cán

bộ tham gia nghiên cứu từ các địa điểm tham gia nghiên cứu được tập huấn dựa

trên quy trình chuẩn đã được đưa ra nhằm đảm bảo ở tất cả các điểm nghiên

cứu mọi hoạt động của đề tài đều được tiến hành đồng nhất, hạn chế sai sót do

sử dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau một cách tối đa.

Theo tổng kết của các nhà nhiên cứu về quản lý chất lượng xét nghiệm

80% các sai sót có liên quan trực tiếp đến quá trình nhập và xử lý số liệu trước

và sau xét nghiệm. Để hạn chế thấp nhất sai số này, các số liệu của nghiên cứu

trong suốt quá trình được hai người nhập độc lập trên cùng một biểu mẫu thống

nhất, sau đó có sự so sánh làm sạch để thống nhất số lượng trong quá trình

phân tích, xử lý số liệu.

Tuy không thể loại bỏ hoàn toàn các sai số, đề tài đã áp dụng một số biện

pháp cơ bản nhất để có thể giảm sai số xuống mức tối thiểu, để đảm bảo có một

nghiên cứu có tính chính xác cao.

2.8. Hạn chế của đề tài

Số lượng bệnh nhân viêm màng não do nấm C. neoformans khá ít nên

cũng sẽ ảnh hưởng đến việc đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm

tạo ra.

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-

PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans

3.1.1. Kết quả giám định loài vi nấm Cryptococcus neoformans để sử dụng

cho nghiên cứu

Thu thập 270 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng

viêm màng não tại 04 bệnh viện: Bệnh viện (BV) Quân y 103, Bệnh viện

Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Bệnhnhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Chợ Rẫy

từ năm 2013 – 2015 để phục vụ cho nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo bộ

sinh phẩm nested-PCR. Tất cả 270 mẫu được nuôi cấy để phân lập nấm

C.neoformans trên môi trường Sabouraud.

Kết quả cho thấy, có 51 mẫu nuôi cấy dương tính với nấm men và có

hình thái phù hợp với C. neoformans (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Kết quả thu thập và phân lập nấm C. neoformans

TT Địa điểm thu Số mẫu Mẫu nuôi cấy Mẫu lựa chọn để

thập mẫu DTN (+) với xây dựng quy

C.neoformans trình nested - PCR

1 BV Phạm Ngọc 148 14 4

Thạch

2 Bệnh viện Quân 3 3 3

y 103

3 BV Bệnh Nhiệt 20 20

đới Trung ương

4 BV Chợ Rẫy 99 14

Tổng cộng 270 51 7

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy trong tổng số 270 mẫu dịch não tủy thu

thập từ bệnh nhân viêm màng não có 51 bệnh nhân viêm màng não do nấm C.

neoformans chiếm tỷ lệ 18,89%.

Hình 3.1. Mẫu nấm C. neoformans thu thập tại thực địa Việt Nam

Toàn bộ 51 mẫu nấm dương tính tiếp tục được định danh bằng kỹ thuật

PCR-RFLP theo phương pháp mô tả bởi Mirhendi và cs (2006). Kết quả cho

thấy, toàn bộ 51/51 mẫu có kích thước sản phẩm PCR và cắt giới hạn phù hợp

với C. neoformansnhư mô tả của Mirhendi và cs (Hình 3.2 và Hình 3.3).

Hình 3.2. Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS4 của một số mẫu nấm

C. neoformans

Trong hình, giếng số 1 là chứng âm, giếng số 5 là thang ADN chuẩn

100bp, còn lại từ giếng số 1 đến giếng số 11 lần lượt là sản phẩm PCR của các

mẫu nấm có ký hiệu N57, N61, N420, N426, N427, N432, N453, N458, N471.

Hình 3.3. Kích thước các mảnh cắt giới hạn sản phẩm PCR bằng enzyme

MspI của một số mẫu nấm C. neoformans

Trong hình, giếng số 1 là đối chứng dương (nấm C. tropicalis), giếng

số 8 là thang ADN chuẩn kích thước 100 bp, các từ giếng số 2 đến 7 và giếng

số 9 đến 11 lần lượt là sản phẩm cắt giới hạn của các mẫu nấm có ký hiệu

N57, N61, N420, N426, N427, N432, N453, N458, N471.

Kết quả giải trình tự và so sánh trình tự ngẫu nhiên 1 số mẫu cũng cho

kết quả là C. neoformans. Trình tự của 06 mẫu đại diện đã được đăng ký trên

ngân hàng gen ncbi.nlm.nih.gov với các mã số như trong bảng 3.2 dưới đây:

Bảng 3.2. Tỷ lệ tương đồng nucleotide của 06 mẫu trong nghiên cứu với các

trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen

Mã số trên Trình tự Tỷ lệ tương Tên mẫu Loài nấm genbank tham chiếu đồng

N420 MF593934.1 CP025718.1 C. neoformans 100%

N426 MF593935.1 CP025718.1 C. neoformans 100%

N458 MH203395.1 KM085009.1 C. neoformans 100%

N460 MH203396.1 CP025718.1 C. neoformans 99,91%

N461 MH203397.1 JN939455.1 C. neoformans 100%

N591 MF593936.1 KM085009.1 C. neoformans 99,91%

Bảng 3.2 cho thấy, các chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam

được đăng ký trên ngân hàng gen có tỷ lệ tương đồng cao với nucleotide trình

tự tham chiếu (> 99%).

Dựa trên kết quả định loại, 07 mẫu được lựa chọn để xác định các điều

kiện của kỹ thuật nested-PCR phát hiện C. neoformans.

3.1.2. Kết quả thiết kế/lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán

nhiễm nấm C. neoformans

3.1.2.1. Kết quả lựa chọn trình tự cặp mồi cho phản ứng nested PCR

Chúng tôi thống kê các bài báo trong và ngoài nước áp dụng kỹ thuật

PCR để nghiên cứu định loại nấm C. neoformans từ năm 1990 đến 2014, là

thời điểm bắt đầu tiến hành nghiên cứu.

Bảng 3.3. Các phương pháp sinh học phân tử được áp dụng

để định loại nấm C. neoformans 1990 - 2014

STT Tác giả Gen đích Năm Phương pháp

Mitchell và cs ITS rRNA 1994 PCR 1

Rappelli và cs ITS rRNA 1998 Nested - PCR 2

Mirhend ITS + 5,6S RNA 2001 PCR-RFLP 3

Bialek và cs 18S rDNA 2002 Nested PCR + qPCR 4

Guizenluo và cs LAC1, CAP64 2002 Multiplex PCR 5

M. McClelland URA5, ADE2 2002 PCR 6

Meyer và cs URA5 2003 PCR-RFLP 7

Takahashi và cs ITS rRNA 2003 Nested PCR 8

Paschoal và cs ITS + 5,6S RNA 2004 PCR 9

10 Hafner và cs Microsatellitle 2005 PCR finger printing

Shahindokht ITS rRNA 2006 Semi nested PCR 11

Enache-A và cs CAP59 2007 AFLP 12

Levy và cs 18S/28S rRNA 2008 real-time PCR 13

Leal và cs JEC21 2008 Multiplex PCR 14

Capoor và cs Microsatellitle 2008 RADP PCR 15

16 Vincent Veron ITS rRNA 2009 Real-time PCR

17 Saha và cs 18S rRNA 2009 PCR

18 Martins JEC21 2010 Real-time PCR

19 Qishui và cs VAD1 2012 Real-time PCR

20 Reinwald và cs 18S rRNA 2013 Nested PCR

Sau khi xem xét, so sánh đánh giá lựa chọn giữa các cặp mồi đã được

các tác giả trên nghiên cứu, chúng tôi quyết định lựa chọn 02 cặp mồi cho phản

ứng nested – PCR như sau:

Cặp mồi cho phản ứng PCR1 theo Mitchell TG và CS, 1994; SH

Mirhendi và CS, 2001:

ITS1 F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’ -

ITS4 R:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ -

Khuếch đại đoạn gen có kích thước 555-556 bp đặc trưng cho nấmC.

neoformans

Cặp mồi cho phản ứng PCR 2 theo Guizhen Luo và CS, 2002:

- CN4 F: 3’-ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T-5’

- CN5 R: 3’-GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G-5’

Khuếch đại đoạn ADN có kích thước 135-136 bp nằm trong đoạn giao

gen ITS1-ITS2.

Hình 3.4. Minh họa đoạn gen khuếch đại với 02 cặp mồi được lựa chọn

Lựa chọn được cặp mồi ITS1 và ITS4 cho phản ứng PCR1, cặp mồi CN4,

CN5 nằm trong đoạn ITS cho phản ứng PCR2.

Kết quả đánh giá chất lượng của cặp mồi so với tiêu chuẩn:

Bảng 3.4. Đánh giá chất lượng của mồi so với tiêu chuẩn

Các chỉ Yêu cầu Mồi Mồi Mồi Mồi Đánh giá

ITS1 ITS4 CN4 CN5 tiêu chất

lượng

Chiều dài 18-24 nu 19 20 22 22 Đạt

Tỷ lệ CG 35-65% 63,16 40,00 40,91 54,55 Đạt

Tm < 650C 61,4 56,6 59,1 63,2 Đạt

Cặp mồi không 4,8 4,1 Đạt

chênh nhau > 50C

Kết quả bảng 3.4 cho thấy các chỉ tiêu kỹ thuật của mồi ITS1, ITS4 cho

PCR1; CN4, CN5 cho PCR2 đạt tiêu chuẩn chất lượng theo yêu cầu lựa chọn

cặp mồi cho phản ứng PCR lồng.

3.1.2.2. Kết quả đánh giá tính đặc hiệu của mồi

- Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của mồi bằng lý thuyết

Hình 3.5. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1-ITS4 bằng phần

mềm Primer Blast

So sánh trình tự mồi của từng cặp mồi với trình tự gen của nấm

C.neoformans bằng phần mềm Primer-Blast. Kết quả ở hình 3.5 chỉ ra cặp

mồi ITS1, ITS4 của phản ứng PCR1 hoản toàn tương thích với trình tự gen

của loài nấm C. neoformans với kích thước sản phẩm PCR ước tính là 555 bp.

Hình 3.6. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4-CN5 bằng phần

mềm Primer Blast

Kết quả hình 3.6 khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4 và CN5 bằng

phần mềm Primer Blast cũng thể hiện tính tương thích 100% và độ dài sản

phẩm PCR dự kiến là 135bp.

- Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của bộ mồi bằng thực nghiệm

+ Kết quả thực nghiệm giải trình tự

Tiến hành phản ứng PCR bằng cặp mồi đã lựa chọn với ADN của mẫu

chủng chuẩn C. neoformans ATCC® 90113. Sau đó giải trình tự sản phẩm

PCR rồi so sánh kết quả giải trình tự với các trình tự chuẩn đã được công bố

trên GeneBank thông qua phần mềm ClustalX. Sử dụng chương trình Blast

trên NCBI để tìm kiếm trình tự tương đồng với đoạn trình tự đã giải. Kết quả

cho thấy đoạn ADN được khuếch đại bằng cặp mồi lựa chọn có độ tương

đồng 99% đến 100% so với các trình tự của C. neoformans được lưu giữ trên

ngân hàng gen. (Hình 3.7)

Hình 3.7. So sánh trình tự ADN nấm chuẩn được khuếch đại bởi cặp mồi

ITS1, ITS4 và các trình tự C. neoformans trên ngân hàng gen

+ Kết quả thực nghiệm trên các nền mẫu khác nhau

Bảng 3.5. Đánh giá tính đặc hiệu của cặp mồi trên các nền mẫu khác nhau

TT ADN thử nghiệm Băng có kích thước

Khoảng 135 bp

Chủng chuẩn C. neoformansATCC® 90113 1 +

Vn_N17 2 +

Vn_N41 3 +

Vn_N57 4 +

Vn_N58 5 +

Vn_N61 6 +

Vn_N117 7 +

Vn_N132 8 +

C. albicans 9 -

C. tropicalis 10 -

C. krusei 11 -

C. parapsilosis 12 -

C. glabrata 13 -

Neisseria meningitidis 14 -

Haemophilus influenzae 15 -

Streptococcus pneumoniae 16 -

Escherichia coli 17 -

Streptococcus suis 18 -

Staphylococcus aureus 19 -

Acinetobacter baumannii 20 -

Pseudomonas aeruginosa 21 -

Qua bảng 3.5 nhận thấy cặp mồi được lựa chọn có tính đặc hiệu cao với

C. neoformans; Không bắt chéo với các loài vi nấm, vi khuẩn khác.

Như vậy khi khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1, ITS4; cặp mồi

CN4, CN5 cả trên lý thuyết và thực nghiệm nhận thấy 02 cặp mồi được lựa

chọn có độ đặc hiệu cao, chỉ nhân ADN của nấm C. neoformans mà không

nhân ADN của vi nấm, vi khuẩn,...khác.

3.1.3. Kết quả xác định các điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán

nhiễm nấm C. neoformans

Trước khi chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng PCR trên các mẫu

chuẩn cần tạo các dãy (panel) chứng chuẩn dương và chứng chuẩn âm.

Dịch treo nấm có nồng độ 0,5 Marfaland được tách chiết ADN và đo

nồng độ.

Bảng 3.6. Nồng độ AND thu được từ chủng chuẩn C. neoformans

Mẫu nấm Nồng độ ADN (ng/µl) OD(260/280)

C. neoformans ống 1 11,08 2,03

C. neoformans ống 2 10,53 1,98

C. neoformans ống 3 11,20 1,88

C. neoformans ống 4 12,04 1,95

C. neoformans ống 5 11,01 2,01

Trung bình 11,12 1,97

Qua bảng 3.6 cho thấy nồng độ trung bình ADN của mẫu chuẩn là

11,12 ng/µl, độ tinh sạch là 1,97. Như vậy quá trình tách chiết ADN đạt độ

tinh khiết cần thiết.

3.1.3.1. Kết quả tạo panel chuẩn dương

Từ nồng ADN nấm chuẩn ban đầu, lấy 1 thể tích nhất định pha loãng

với nước khử ion theo bậc thang 2 (5 lần), bậc thang 5 (3 lần) và bậc thang 10

(4 lần) để thu được các dung dịch chuẩn dương như bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả tạo panel chuẩn dương nấm C. neoformans

TT Cdd đầu (ng/µl) Vdd (µl) VH20 (µl) Cdd sau (ng/µl) MS panel

11,12 50 50 5,6 Cr1a 1

11,12 20 180 1,112 Cr2a 2

1,112 20 180 0,1112 Cr3a 3

0,1112 40 160 0,02224 Cr4a 4

0,02224 40 160 0,01112 Cr5a 5

0,01112 40 160 0.002224 Cr6a 6

0.002224 100 100 0,001112 Cr7a 7

0,001112 100 100 0,000556 Cr8a 8

0,000556 100 100 0,000278 Cr9a 9

10 0,000278 100 100 0,000139 Cr10a

11 0,001112 20 180 0,0001112 Cr11a

12 0,0001112 20 180 0,00001112 Cr12a

Hình 3.8. Kết quả PCR theo panel nồng độ

Giếng 1: Chứng âm; Giếng 2: chứng dương

Giếng 3 - giếng 7: Nồng độ ADN từ 11,12 đến 0,01112ng

Giếng 8: Thang chuẩn 50 bp

Giếng 9- giếng 13: Nồng độ ADN từ 0,001112đến 0,0001112 ng

3.1.3.2. Kết quả tạo dãy chứng chuẩn âm

Chứng chuẩn âm là dung dịch chứa ADN của người và của vi khuẩn,

virus hoặc các vi nấm khác không phải là C.neoformans. Nồng độ ADN trong

các dung dịch dao động từ 50 pg/µl đến 20 µg/µl.

Bảng 3.8. Danh mục chứng chuẩn âm

TT AND vi khuẩn, vi Ký hiệu Số tube Thể tích mỗi

tube (µl) nấm, người

1 C. albicans VK1 10 30

2 C. tropicalis VK2 10 30

3 C. krusei VK3 10 30

4 C. parapsilosis VK4 10 30

5 C. glabrata VK5 10 30

6 N. meningitidis VK6 10 30

7 H. influenzae VK7 10 30

8 S. pneumoniae VK8 10 30

9 E. coli VK9 10 30

10 S. suis VK10 10 30

11 S. aureus VK11 10 30

12 A. baumannii VK12 10 30

13 P. aeruginosa VK13 10 30

Kết quả bảng 3.8 cho thấy đã tạo ra 13 mẫu chứng chuẩn âm với tổng

số 130 tube, mỗi tube chứa 30 µl ADN.

3.1.3.3. Kết quả xác định các điều kiện cho phản ứng PCR1

Kết quả tối ưu các điều kiện của phản ứng PCR1 phát hiện nấm

C.neoformans với mẫu thực nghiệm là chủng C. neoformans chuẩn.

Thực nghiệm phản ứng PCR1 nhân gen của nấm C. neoformans theo quy

trình của SH Mirhendi và cs (2001) với tổng thể tích 50 µl và số chu kỳ là 30

chu kỳ. Nhận thấy theo các nghiên cứu của các tác giả SH Mirhendi và cs

(2001) sản phẩm của phản ứng PCR1 sau khi khuếch đại sẽ tiến hành phản

ứng cắt bằng enzym giới hạn, do đó yêu cầu số lượng sản phẩm của phản ứng

PCR phải lớn. Trong nghiên cứu của chúng tôi sau phản ứng PCR lần 1, sẽ

tiến hành khuếch đại bằng phản ứng PCR lần 2, nên lượng sản phẩm ADN lần

1 không cần quá nhiều, chúng tôi thực nghiệm giảm tổng thể tích phản ứng

xuống 25µl và số chu kỳ xuống 20 và 25 chu kỳ để so sánh.

Kết quả so sánh sự thay đổi này được thể hiện ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả so sánh phản ứng PCR1 với các điều kiện khác nhau

TT Thể tích và chu kỳ phản ứng Số mẫu thực Số mẫu

nghiệm dương tính

Tổng thể tích 50 µl; 30 chu kỳ 30 30 1

Tổng thể tích 50 µl; 25 chu kỳ 30 30 2

Tổng thể tích 50 µl; 20 chu kỳ 30 30 3

Tổng thể tích 25 µl; 30 chu kỳ 30 30 4

Tổng thể tích 25 µl; 25 chu kỳ 30 30 5

Tổng thể tích 25 µl; 20 chu kỳ 30 28 6

Tổng thể tích 20 µl; 30 chu kỳ 30 29 7

Tổng thể tích 20 µl; 25 chu kỳ 30 28 8

Tổng thể tích 20 µl; 20 chu kỳ 26 30

9 Qua kết quả ở bảng 3.9 chúng tôi lựa chọn quy trình kỹ thuật cho phản

ứng PCR1 với tổng thể tích phản ứng là 25 µl và 25 chu kỳ nhiệt.

Bảng 3.10. Kết quả chuẩn hóa từng thành phần phản ứng cho PCR1

TT Thành phần Nồng độ, hàm lượng Thể tích sử dụng

cuối cùng cho 1 phản ứng (µl)

1 Nước khử ion Vừa đủ tới 25 µl 8,5

2 Master Mix 2 X có chứa 1X 12,5

MgCl2 nồng độ 4 mM

3 Mồi xuôi PCR1 0,02 µM 1

4 Mồi ngược PCR1 0,02 µM 1

5 ADN khuôn 100pg – 100ng/25µl 2

Tổng 25

Bảng 3.11. Kết quả chu trình nhiệt của phản ứng PCR1

Bước phản ứng Nhiệt độ 0C Thời gian Số chu kỳ

Tách sợi ban đầu 94 5 phút 01

Tách sợi 94 40 giây

Bám mồi 56 40 giây 25

Kéo dài mồi 72 40 giây

ổn định mồi 72 7 phút 01

Kết quả của phản ứng PCR1, theo điều kiện tại bảng 3.10 và 3.11 được

thể hiện ở hình 3.9.

Hình 3.9. Kết quả phản ứng PCR1 tiến hành theo quy trình tự xây dựng

Giếng 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10: Mẫu nhiễm nấm C. neoformans

Giếng 5: Thang chuẩn 50 bp

Giếng 6: Chứng âm

Giếng 7: Chứng dương – chủng chuẩn ATCC®90113 C. neoformans

3.1.3.4. Kết quả xác định các điều kiện cho phản ứng PCR2

Khi thực nghiệm phản ứng PCR lần 2 theo quy trình chuẩn của phản

ứng PCR để sản phẩm băng ADN có kích thước từ 100 đến 600 bp với lượng

ADN khuôn ban đầu đưa vào thực nghiệm là 1 ng/1 phản ứng thì kết quả sản

phẩm PCR có các băng dày, đậm. Điều này chứng tỏ lượng ADN khuôn đưa

vào có thể quá lớn. Do đó chúng tôi tiến hành thực nghiệm phản ứng PCR giữ

nguyên các thành phần phản ứng khác, nhưng pha loãng sản phẩm PCR1 theo

tỷ lệ 1:10 từ 1 ng (1000 pg) giảm xuống 100 pg, 10 gp và 1pg để thử nghiệm.

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.12.

Bảng 3.12. Kết quả lựa chọn nồng độ ADN khuôn cho phản ứng PCR2

STT Nồng độ Số lần Sản phẩm PCR – 135 bp Chất lượng

mẫu thử lặp lại băng Có băng Không có băng

nghiệm ADN đúng ADN đúng kích

kích thước thước

1 15 3 1 pg 12 Mảnh, mờ

2 15 12 10 pg 3 Mảnh, mờ

3 15 15 100 pg 0 Băng rõ

4 15 15 1000 pg 0 Băng đậm, nhòe

Qua bảng 3.12 nhận thấy có thể lựa chọn ADN khuôn cho phản ứng

khoảng nồng độ 100 pg (0,1ng) là kết quả phù hợp.

- Kết quả chuẩn hóa nồng độ Mg2+

Thực nghiệm phản ứng PCR2 với 08 mẫu (01 mẫu chuẩn mã ATCC

90113 và 07 chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam) ở 6 nồng độ Mg2+

khác nhau, kết quả được thể hiện ở bảng 3.13

Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR2

TT Nồng độ Số lượng mẫu lên băng 135bp với nồng độ Mg2+ khác

ADN khuôn nhau (mM)

1,0 1,5 2,5 3,0 3,5 2,0

1 1 pg 0/8 6/8 7/8 7/8 7/8 7/8

2 10 pg 1/8 6/8 7/8 7/8 6/8 8/8

3 100 pg 1/8 7/8 7/8 6/8 8/8 8/8

4 1000 pg 1/8 7/8 7/8 6/8 6/8 8/8

Kết quả bảng 3.13 cho thấy ở Mg2+ nồng độ 2,0 mM và nồng độ ADN

≥ 10 pg thì tất cả mẫu xét nghiệm đều có sản phẩm PCR.

Hình 3.10. Sản phẩm PCR theo nồng độ Mg2+

Giếng 1: Mg2+: 3,5 mM; Giếng 2: Mg2+: 3,0 mM

Giếng 3: Mg2+: 2,5 mM Giếng 4: Mg2+: 2,0 mM

Giếng 5: Mg2+: 1,5 mM Giếng 2: Mg2+: 1,0 mM

Giếng 7: Chứng âm Giếng 8: Thang chuẩn 100 bp

Nhận thấy ở hình 3.10 khi điện di sản phẩm PCR của 6 nồng độ Mg2+

khác nhau, kết quả cho thấy sản phẩm PCR ở nồng độ 2,0 mM có băng thanh

mảnh, rõ nét và đẹp nhất.

Qua kết quả phân tích trên bảng 3.13 và hình 3.10 lựa chọn nồng độ

Mg2+, để tiến hành phản ứng PCR là 2,0 mM.

- Kết quả chuẩn hóa chu trình nhiệt của phản ứng PCR 2

+ Chuẩn hóa nhiệt độ bám mồi

Tiến hành chạy Gradien nhiệt bám mồi từ 52 đến 580C.

Hình 3.11. Phản ứng PCR theo gradien

a. Lựa chọn nhiệt độ bám mồi;

b,c. Sản phẩm PCR2 ở các nồng độ Mg2+ khác nhau

Qua hình 3.11 nhận thấy sản phẩm PCR có băng rõ nét nhất ở nhiệt độ

570C – 580C. Lựa chọn nhiệt độ bám mồi là 570C.

+ Chuẩn hóa thời gian kéo dài mồi và số chu kỳ của phản ứng

Điều chỉnh thời gian kéo dài mồi ở phản ứng PCR2 lên 45 giây nhận

thấy sản phẩm PCR có băng rõ nét hơn nhiều so với thời gian kéo dài mồi là

30 giây như thông thường. Hình 3.12.

Hình 3.12. Kết quả PCR theo thời gian kéo dài mồi

Giếng 1: Sản phẩm PCR khi thời gian kéo dài mồi là 45 giây

Giếng 2: Sản phẩm PCR khi thời gian kéo dài mồi là 30 giây

Giếng (-): Chứng âm

Giếng M: Thang chuẩn 100 bp

Giảm số chu kỳ PCR xuống 25 chu kỳ và so sánh với 40 chu kỳ nhận thấy với

số chu kỳ 25 đã có các băng PCR sắc nét đảm bảo nhận biết được kết quả PCR.

Hình 3.13. Kết quả PCR theo số chu kỳ phản ứng

Giếng 1: Sản phẩm PCR khi tiến hành 40 chu kỳ

Giếng 2: Sản phẩm PCR khi tiến hành 25 chu kỳ;

Giếng (-): Chứng âm

Giếng (M): Thang chuẩn 100 bp

Phản ứng PCR2 được lặp lại nhiều lần đều cho kết quả dương tính rõ,

ổn định và không còn băng phụ ở nhiệt độ gắn mồi là 57oC và nồng độ Mg2+

là 2,0mM số chu kỳ nhiệt là 25.

Bảng 3.14. Điều kiện của phản ứng PCR2 với cặp mồi CN4 và CN5

TT Hóa chất tham gia phản ứng Nồng độ cuối cùng Thể tích (µl)

Nước khử ion Vừa đủ đến 25 10,5 1

Master mix 2X 1X 12,5 2

Có MgCl2 nồng độ 4 mM

Mồi CrN410µM 0,2µM 0,5 3

Mồi CrN510µM 0,2µM 0,5 4

ADN khuôn sản phẩm PCR1 100pg 1,0 5

Tổng 25

Bảng 3.15. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR2

Bước phản ứng Nhiệt độ 0C Thời gian Số chu kỳ

Tách sợi ban đầu 95 5 phút 01

Tách sợi 95 30 giây

Bám mồi 57 30 giây 25

Kéo dài mồi 72 45 giây

ổn định mồi 72 15 phút 01

Bảo quản sản phẩm PCR 4 ∞ 01

3.1.3.5. Xác định ngưỡng phát hiện và tính đặc hiệu của kỹ thuật nested-PCR

- Đánh giá ngưỡng phát hiện

Sử dụng ADN của chủng C. neoformans chuẩn pha loãng đến nồng độ

1 ng/µl làm dung dịch chuẩn, sau đó pha loãng tiếp theo thang 2, 5 và 10 tạo

các dung dịch có nồng độ giảm dần. Các dung dịch thu được sẽ được tiến

hành chạy PCR1 và PCR2 trong những điều kiện như nhau sau đó điện di để

đánh giá ngưỡng phát hiện của kỹ thuật.

Hình 3.14. Kết quả PCR theo nồng độ ADN khuôn

Bảng 3.16. Thử nghiệm đánh giá ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested-PCR

STT Nồng độ ADN Tổng số lần xét Kết quả phản ứng PCR

ban đầu nghiệm Dương tính Âm tính

1 ng (1000 pg) 15 1 15 0

10-1 (100 pg) 15 2 15 0

10-2 (10 pg) 15 3 15 0

10-3 (1 pg) 15 4 8 7

10-4 (0,1 pg) 15 5 0 15

10-5 (0,01 pg) 15 6 0 15

Qua bảng 3.16 và hình 3.14 nhận thấy ở nồng độ 1pg 53,33% có sản

phẩm PCR; từ 0,1pg trở xuống không có sản phẩm PCR; từ 10-2 ng (10 pg)

trở lên 100% sản phẩm PCR xuất hiện băng 135bp. Như vậy ngưỡng phát

hiện của kỹ thuật nested -PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong

dịch não tủy ở nghiên cứu này là 10pg/µl.

- Kết quả đánh giá kỹ thuật nested-PCR trên chủng nấm C. neoformans

thu thập từ mẫu lâm sàng tại Việt Nam

Tiến hành kỹ thuật nested – PCR với các điều kiện đã tối ưu với chủng

nấm chuẩn ATCC® 90113 và 7 mẫu dịch não tủy đã được xác định có C.

neoformans dương tính, có đặc điểm định loại hình thái điển hình. Kết quả xét

nghiệm được thể hiện ở bảng 3.17.

Bảng 3.17. Kết quả đánh giá kỹ thuật nested-PCR trên chủng nấm

C. neoformans thu thập từ mẫu lâm sàng tại Việt Nam

Hình thái Nested PCR TT Ký hiê ̣u mẫu Vị trí phân lập

1 ATCC® 90113 Chủng chuẩn, Mỹ Điển hình Băng đặc hiệu 135 bp

2 Vn_N17 Dịch não tủy Điển hình 135 bp

3 Vn_N41 Dịch não tủy Điển hình 135 bp

4 Vn_N57 Dịch não tủy Điển hình 135 bp

5 Vn_N58 Dịch não tủy Điển hình 135 bp

6 Vn_N61 Dịch não tủy Điển hình 135 bp

7 Vn_N117 Dịch não tủy Điển hình 135 bp

8 Vn_N132 Dịch não tủy Điển hình 135 bp

Bảng 3.17 nhận thấy sản phẩm PCR2 chạy với các điều kiện đã tối ưu

của kỹ thuật nested PCR, sau khi điện di đều có băng 135 bp đặc hiệu của nấm

C. neoformans.

Chọn 02 mẫu N117 và N132 để giải trình tự kiểm tra tính đặc hiệu của

sản phẩm trên ngân hàng gen.

Hình 3.15. Kết quả PCR2 các mẫu N117 và N132

a) Sản phẩm PCR2 các mẫu Vn_N117 và Vn_N132 b) Tỷ lê ̣ tương đồ ng củ a mẫu Vn_N117 vớ i ngân hàng gen

Mẫu N117 và N132 xuất hiê ̣n band đă ̣c hiê ̣u kích thướ c 135 bp, bằng kích thướ c củ a chủ ng chuẩn ATCC® 90113. Trình tự nucleotid củ a mẫu N117 có trình tự tương đồ ng 100% vớ i các mẫu KJ459921.1 và KJ371116.1 trên ngân hàng gen.

3.1.4. Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm

C. neoformans

3.1.4.1. Kết quả chế tạo các ống hỗn dịch cho phản ứng PCR

- Chế tạo các ống hỗn dịch cho bộ kít dạng 1: Có 2 loại ống hỗn dịch ký

hiệu là MX1 và MX2 mỗi loại 2 ống

Ống hỗn hợp MX1: Ống hỗn dịch MX1 bao gồm các hóa chất cho

phản ứng PCR 1 với thành phần cụ thể trong bảng sau:

Bảng 3.18. Thành phần hóa chất của 02 ống dung dịch MX1

Tên nguyên liệu Cho 1 phản Thể tích thực tế 120

ứng (µl) phản ứng (µl)

Nước cất khử ion 1188 9,9

1500 Master mix 2X (MgCl2 4 mM) 12,5

Mồi ITS1 (10 pmol/ µl) 36 0,3

Mồi ITS4 (10 pmol/ µl) 36 0,3

2760 (mỗi ống 1380) Tổng 23

Ống hỗn dịch MX2: Ống hỗn dịch MX2 bao gồm các hóa chất thể tích

cụ thể như sau:

Bảng 3.19. Thành phần hóa chất của 02 ống dung dịch MX2

Tên nguyên liệu Cho 1 phản ứng Thể tích thực tế 120

phản ứng (µl) (µl)

Nước cất khử ion 1284 10,7

1500 Master mix 2X (MgCl2 4 mM) 12,5

Mồi CN4 (10 pmol/ µl) 48 0,4

Mồi CN5 (10 pmol/ µl) 48 0,4

Tổng 2880 (mỗi ống 1440) 24

- Chế tạo các ống hỗn dịch cho bộ kít dạng 2:

Có 4 ống mater mix: MC-CR1; MC-CR2, CR1 và CR2

Ống hỗn dịch MC-CR1: Ống hỗn hợp phản ứng PCR MC-CR1 bao

gồm các hóa chất với thể tích cụ thể theo bảng sau.

Bảng 3.20. Thành phần hóa chất cho ống dung dịch MC-CR1

Tên nguyên liệu Cho 1 phản Thể tích thực tế (µl)

ứng (µl)

Nước cất khử ion 4,2 504

12,5 1500 Master mix 2X (MgCl2 4 mM)

Mồi ITS1 (10 pmol/ µl) 0,3 36

Tổng 17 2040 (mỗi ống 1020)

Ống hỗn dịch MC-CR2: Ống hỗn hợp phản ứng PCR MC-CR2 bao

gồm các hóa chất với thể tích cụ thể theo bảng sau.

Bảng 3.21. Thành phần hóa chất cho ống dung dịch MC-CR2

Tên nguyên liệu Cho 1 phản ứng (µl) Thể tích thực tế (µl)

Nước cất siêu sạch 5,7 684

Mồi ITS4 (10pmol/ µl) 0,3 36

Tổng 6 720

Ống hỗn dịch CR1: Ống hỗn hợp phản ứng PCR CR1 bao gồm các

hóa chất với thể tích cụ thể theo bảng sau.

Bảng 3.22. Thành phần hóa chất của ống dung dịch CR1

Cho 1 phản ứng (µl) Thể tích thực tế (µl) Tên nguyên liệu

Nước cất khử ion 4,1 492

1500 Master mix 2X (MgCl2 4 mM) 12,5

Mồi CN4 (10 pmol/ µl) 0,4 48

Tổng 17 2040 (mỗi ống

1020)

Ống hỗn dịch CR2: Ống hỗn hợp phản ứng PCR CR2 bao gồm các

hóa chất với thể tích cụ thể theo bảng sau.

Bảng 3.23. Thành phần hóa chất của ống dung dịch CR2

Tên nguyên liệu Cho 1 phản ứng Thể tích thực tế

(µl) (µl)

Nước cất siêu sạch 792 6,6

Mồi CN5 (10pmol/ µl) 48 0,4

Tổng 840 7

3.1.4.2. Chuẩn bị chứng dương, chứng âm cho bộ kít

Chứng dương là ADN được tách chiết, từ chủng chuẩn ATCC®

90113 Chứng dương được đo nồng độ DNA và được điều chỉnh đến nồng

độ 0,5 ng/µl.

Chứng âm là các mẫu dịch não tủy đã được xác định không nhiễm nấm

C. neoformans.

Thể tích chứng dương và chứng âm là 200 µl chứa trong tube 2ml. Thể

tích này đủ cho 100 lần thử nghiệm với 100 phản ứng PCR của bộ kít.

3.1.4.3. Chuẩn bị thang chuẩn, loading buffer cho bộ kit

Thang chuẩn ADN 100 bp được chia vào các ống 2 ml mỗi ống 200

µl sử dụng 01 ống cho 1 bộ sinh phẩm. Loading buffer cũng được chuẩn bị

tương tự.

3.1.4.4. So sánh đánh giá sơ bộ 02 dạng đóng gói

Tiến hành đánh giá 02 dạng đóng gói bộ sinh phẩm ngay sau khi sản

xuất, sau 01 tuần và 01 tháng kết quả thể hiện ở bảng 3.24.

Bảng 3.24. Kết quả đánh giá hoạt động 02 dạng đóng gói

Stt Dạng đóng Thời gian Kết quả sau thử nghiệm

gói sau sản xuất Dạng kết quả Số lượng đúng/

tổng số

Sau khi sản Dương tính 20/20 1

xuất Âm tính 10/10 2

Sau SX Dương tính 22/20 3 Dạng 1 01 tuần Âm tính 8/10 4

Sau SX Dương tính 23 5

01 tháng Âm tính 7/10 6

Sau khi sản Dương tính 20/20 7

xuất Âm tính 10/10 8

Sau SX Dương tính 20/20 9 Dạng 2 01 tuần Âm tính 10 10/10

Sau SX Dương tính 11 20/20

01 tháng Âm tính 12 10/10

Qua bảng 3.24 nhận thấy dạng đóng gói 1 có tính ổn định kém hơn

dạng đóng gói 02, sau 01 tuần sau khi sản xuất đã xuất hiện hiện tượng

dương tính giả. Do đó chúng tôi quyết định lựa chọn bộ sinh phẩm số 02 để

sản xuất hàng loạt.

Thành phẩn của bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C. neoformans

được thể hiện ở bảng 3.25.

Bảng 3.25. Thành phần bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm

C.neoformans

TT Tên dung dịch Bản chất Số lượng Thể tích/ống (µl)

Dung dịch MC-CR1 Master mix 02 ống 1012 1

Dung dịch MC-CR2 Master mix 01 ống 720 2

Dung dịch CR1 Master mix 02 ống 1012 3

Dung dịch CR2 Master mix 01 ống 840 4

Dung dịch M100 Marker 100bp 01 ống 200 5

Dung dịch LD100 Loading dye 01 ống 200 6

Chứng dương ADN nấm 01 ống 200 7

C.neoformans

Chứng âm ADN người 01 ống 200 8

Hướng dẫn sử dụng 01 tờ 9

Bộ sinh phẩm được đóng gói gồm 08 thành phần với 10 ống hóa chất

kèm theo một bản hướng dẫn sử dụng bằng tiếng Việt (Phụ lục).

Hình 3.16. Bộ sinh phẩm nested - PCR chẩn đoán C. neoformans

Ngoài hộp gồm có nhãn hộp có đầy đủ thông tin về lô sản xuất, ngày hết

hạn, điều kiện bảo quản, nơi sản xuất như sau

D151201 - Lô

2016-12-15 -Ngày sản xuất

100 phản ứng - SL

DNT-C.neoformans - Ký hiệu

RUO-Sửdụng Dùng thử nghiệm

-250C đến -150C - Nhiệt độ bảo quản

Khoa Ký sinh trùng - Đơn vị sản xuất

Học viện quân y

Trên mỗi ống sinh phẩm đều có nhãn ghi đầy đủ thông tin về lô sản

xuất, hạn sử dụng, điều kiện bảo quản và thể tích thực (xem phụ lục).

3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm

chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy

3.2.1. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh

phẩm trong phòng thí nghiệm

3.2.1.1. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh

phẩm trên các ADN mẫu chuẩn

- Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm

Bảng 3.26. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên mẫu

C. neoformans chuẩn

Stt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR

Dương tính Âm tính

((+)/tổng số) ((-)/tổng số)

1 Chuẩn dương nuôi cấy nồng độ 105CFU/ ml 30/30 0/30

2 Chuẩn dương nuôi cấy nồng độ 102CFU/ ml 30/30 0/30

3 Chuẩn âm NaCl 0,9% 0/20 20/20

4 Mẫu DNT không nhiễm C. neoformans 0/20 20/20

Tổng cộng 60/100 40/100

Qua kết quả ở bảng 3.26 nhận thấy với việc đánh giá 30 mẫu chuẩn

dương, ở hai nồng độ khác nhau là nồng độ thấp 102CFU/ml và nồng độ cao

105CFU/ml; 20 mẫu chuẩn âm (10 chuẩn âm không có ADN là NaCl 0,9% và

10 chuẩn âm có ADN là dịch não tủy không có C. neoformans). Mỗi mẫu

chạy lặp lại 2 lần: 100% các mẫu chuẩn dương sản phẩm PCR xuất hiện băng

kích thước 135 bp – đặc hiệu cho C. neoformans, 100% mẫu chuẩn âm không

có sản phẩm PCR.

Bảng 3.27. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm

trên các mẫu chuẩn

Kết quả kit Mẫu chuẩn (kiểm tra bằng nuôi cấy và bộ Tổng số

nested – PCR sinh phẩm Norgen)

Có C. neoformans Không có C. neoformans

Dương tính 60 0 60

Âm tính 0 40 40

Tổng số 60 40 100

Độ nhạy Se = 100%,

Độ đặc hiệu Sp = 100%

Kết quả bảng 3.27 cho thấy bộ sinh phẩm nested PCR chẩn đoán

nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy khi thử nghiệm với các mẫu

nấm C. neoformans của chủng chuẩn và mẫu chuẩn âm có độ nhạy, độ đặc

hiệu đều là 100%.

- Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ sinh phẩm

Bảng 3.28. Kết quả đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm

Loại mẫu thử Thời gian Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm

sau sản nested-PCR

xuất Bảo quản Bảo quản Bảo quản

-200C -350C -800C

(+/TS) (+/TS) (+/TS)

Mẫu dương tính Ngay sau 10/10 1

khi SX Mẫu âm tính 0/10

Mẫu dương tính 3 Tháng sau 10/10 10/10 10/10 2

SX Mẫu âm tính 0/10 0/10 0/10

Mẫu dương tính 6 Tháng sau 10/10 10/10 10/10 3

SX Mẫu âm tính 0/10 0/10 0/10

Mẫu dương tính 9 Tháng sau 10/10 10/10 10/10 4

SX Mẫu âm tính 0/10 0/10 0/10

Mẫu dương tính 12 Tháng 10/10 10/10 10/10 5

sau SX Mẫu âm tính 0/10 0/10 0/10

Qua bảng 3.28 thấy rằng ở cả ba điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm

nested-PCR phát hiện nấm C. neoformans trong dịch não tủy ở nhiệt độ -

200C, -350C và -800C vẫn đảm bảo tính ổn định sau 12 tháng sản xuất.

100

3.2.2.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu DNT nhiễm C. neoformans

giả định

Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR

trên các mẫu dịch não tủy giả định được thể hiện ở bảng 3.29

Bảng 3.29. Kết quả phản ứng nested PCR với các mẫu DNT giả định

tt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR

Dương tính Âm tính

((+)/tổng số) ((-)/tổng số)

1 DNT giả định nồng độ 105CFU/ ml 40/40 0/40

2 DNT giả định nồng độ 102CFU/ ml 34/40 6/40

3 NaCl 0,9% 0/20 20/20

4 DNT không nấm C. neoformans 0/20 20/20

Tổng cộng 74/120 46/120

Kết quả bảng 3.29 cho thấy pha loãng các mẫu dịch não tủy gây nhiễm

nấm C. neoformans giả định ở các nồng độ khác nhau rồi chọn 40 mẫu nồng

độ thấp 102CFU/ml và nồng độ cao 105CFU/ml; 20 mẫu chuẩn âm (10 chuẩn

âm không có ADN hay chuẩn trắng NaCl 0,9% và 10 chuẩn âm có ADN –

dịch não tủy không có C. neoformans). Thử nghiệm với bộ sinh phẩm nested-

PCR #A011-02 kết cho thấy với mẫu nhiễm giả định nồng độ cao 105CFU/ml

40 mẫu dương tính chiếm 100%; với mẫu nhiễm nấm giả định nồng độ thấp

102CFU/ ml có 34/40 mẫu dương tính chiếm 85%, 6/40 mẫu âm tính chiếm

15%; 100% mẫu không nhiễm nấm có kết quả âm tính.

101

Bảng 3.30. Kết quả đánh giá của trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ

105CFU/ ml

Mẫu chuẩn Tổng số Kết quả kit

Nested – PCR Có C. Không có C.

neoformans neoformans

0 40 Dương tính 40

40 40 Âm tính 0

40 80 Tổng số 40

Độ nhạy Se = 100% Độ đặc hiệu Sp = 100%

Qua bảng 3.30 nhận thấy khi gây nhiễm giả định trên dịch não tủy với

nồng độ cao thì độ nhạy và độ đặc hiệu vẫn đảm bảo 100%.

Bảng 3.31. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các

mẫu nhiễm giả định nồng độ 102CFU/ ml

Kết quả kit Mâu chuẩn Tổng số

Nested – PCR Có C. neoformans Không có

C. neoformans

Dương tính 34 0 34

Âm tính 6 40 46

Tổng số 40 40 80

Độ nhạy Se = 85%

Độ đặc hiệu Sp = 100% Bảng 3.31 là kết quả khi gây nhiễm với nồng độ thấp102CFU/ ml xấp xỉ

ngưỡng phát hiện thì độ nhạy giảm đi rõ chỉ là 85%.

102

Bảng 3.32. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm

trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ từ 102CFU/ ml trở lên

Kết quả kit Mẫu chuẩn Tổng số

Nested – PCR Có C. neoformans Không có C. neoformans

Dương tính 74 0 74

Âm tính 6 40 46

Tổng số 80 40 120

Độ nhạy Se = 92,5%

Độ đặc hiệu Sp = 100%

Với các mẫu nhiễm giả định từ ngưỡng phát hiện trở lên bộ sinh phẩm

nested-PCR có độ nhạy 92.5%, độ đặc hiệu 100%. Giá trị tiên đoán dương

100%, giá trị tiên đoán âm 87% với độ tin cậy 95%.

3.2.2. Kết quả đánh giá của bộ sinh phẩm trong các mẫu dịch não tủy

lâm sàng

3.2.2.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu C. neoformans phân lập

ở Việt Nam

Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR

trên 51 mẫu nuôi cấy có mật độ nấm khác nhau.

Bằng bộ sinh phẩm nested-PCR tạo ra, tiến hàng chạy lại với toàn bộ 51

mẫu ADN của 51 chủng nấm C. neoformans khác nhau phân lập ở Việt Nam,

mỗi chủng chạy 2 mẫu. Kết quả cho thấy 100% sản phẩm PCR2 sau khi điện

di đều xuất hiện các băng có kích thước 135 bp. Kết quả này phù hợp với nấm

C. neoformans (bảng 3.33 và hình 3.17)

103

Bảng 3.33. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các chủng C.neoformans

phân lập ở Việt Nam

Stt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR

Dương tính Âm tính

((+)/tổng số) ((-)/tổng số)

C.neoformans phân lập ở 102/102 0/102 1

Việt Nam

5 NaCl 0,9% 0/20 20/20

6 Mẫu dịch não tủy 0/20 20/20

Tổng cộng 102/142 40/142

Hình 3.17. Kết quả khuếch đại gen đích của nấm C. neoformans

bằng kỹ thuật nested-PCR

Trong hình giếng 1: Chứng âm; giếng 2: chứng dương; Các giếng 3-10:

các mẫu ADN thử nghiệm; giếng 11: thang ADN chuẩn loại 100bp.

104

Bảng 3.34. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các

chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam

Kết quả kit C.neoformans phân lập ở VN Tổng số

nested – PCR Có C. neoformans Không có C. neoformans

Dương tính 102 0 102

Âm tính 0 40 40

Tổng số 102 40 142

Độ nhạy Se = 100%

Độ đặc hiệu Sp = 100%

Qua kết quả ở bảng trên nhận thấy với việc đánh giá trực tiếp trên 51

mẫu nuôi cấy và 20 mẫu chuẩn âm (10 chuẩn âm không có ADN hay chuẩn

trắng NaCl 0,9% và 10 chuẩn âm có ADN – dịch não tủy không có C.

neoformans). Bộ sinh phẩm nested – PCR #011 – 02 có độ nhạy và độ đặc

hiệu đều đạt 100%.

3.2.2.2. Kết quả đánh giá độ tương đồng của bộ sinh phẩm trên mẫu DNT

bệnh nhân viêm màng não

Kết quả xét nghiệm bằng các phương pháp khác nhau trên các mẫu

dịch não tủy bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng viêm màng não được thể

hiện ở bảng 3.35.

105

Bảng 3.35. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các mẫu DNT của bệnh

nhân có triệu chứng lâm sàng VMN

Stt Loại mẫu thực hiện Phương pháp xét nghiệm

Soi tươi Nuôi cấy Nested- Kit

nhuộm mực (+/TS) PCR Norgen

tàu (+/TS) (+/TS) (+/TS)

1 DNT thu thập tại BV 5/100 6/100 5/100 5/100

Phạm Ngọc Thạch

2 DNT thu thập tại BV 2/20 2/20 2/20 2/20

Quân Y 103

Tổng cộng 7/120 8/120 7/120 7/120

Kết quả ở bảng trên cho thấy khi xét nghiệm dịch não tủy của 120 bệnh

nhân có biểu hiện lâm sàng viêm màng nào thì có 8/120 mẫu dịch não tủy

dương tính với C. neoformans bằng phương pháp nuôi cấy (chiếm 6,67%),

trong đó có 7 mẫu cùng dương tính với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu,

bộ sinh phẩm nested –PCR #011 – 02 và bộ sinh phẩm của Norgen.

- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu với phương pháp nuôi cấy trên các mẫu

lâm sàng

Bảng 3.36. Độ nhạy, độ đặc hiệu so với phương pháp nuôi cấy

Phương pháp nuôi cấy Tổng số Kết quả kit

nested – PCR Dương tính Âm tính

Dương tính 0 7 7

Âm tính 112 113 1

Tổng số 112 120 8

Độ nhạy Se = 87,5% Độ đặc hiệu Sp = 100%

Giá trị tiên đoán dương: 100%

Giá trị tiên đoán âm: 99,1%

106

So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với phương

pháp nuôi cấy độ nhạy 87,5%; độ đặc hiệu 100%. Giá trị tiên đoán dương là

100% và giá trị tiên đoán âm là 99,1%. Trong thử nghiệm có 01 mẫu dương

tính với nuôi cấy mà âm tính với các phương pháp xét nghiệm khác. Có thể

mẫu này ngoại nhiễm với C. neoformans.

- Đánh giá độ tương đồng với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu

Bảng 3.37. Độ tương đồng so với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu

Kết quả kit Phương pháp soi tươi Tổng số

nested – PCR nhuộm mực tàu

Dương tính Âm tính

Dương tính 5 2 7

Âm tính 2 111 113

Tổng số 7 113 120

Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 96,7%

Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% K = 0,697

So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với phương pháp

soi tươi nhuộm mực tàu cho thấy tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 96,7%, tỷ lệ phù

hợp mong muốn Pe: 89,0%. Hệ số tương đồng giữa 2 phương pháp xét

nghiệm là 0,697 (bảng 3.37).

107

- Đánh giá độ tương đồng với bộ sinh phẩm của Norgen

Bảng 3.38. Độ tương đồng so với bộ sinh phẩm của Norgen

Tổng số

Bộ sinh phẩm Norgen Dương tính 7 0 7 Âm tính 0 113 113 7 113 120

Kết quả kit nested – PCR Dương tính Âm tính Tổng số Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 100% Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% K = 1 So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với bộ sinh phẩm

Norgen tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 100%, tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0%. Hệ

số tương đồng giữa 2 phương pháp xét nghiệm là 1 hoàn toàn tương đồng.

3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định chất lượng bộ sinh phẩm

chế tạo ra

3.2.3.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

Dựa trên kết quả nghiên cứu về độ nhay, độ đặc hiệu, độ ổn định của

phương pháp cũng như quy trình kỹ thuật nested – PCR chẩn đoán nhiễm

nấm C.neoformans xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm.

Bảng 3.39. Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở

TT Chỉ tiêu đánh giá Tiêu chuẩn cơ sở

Nhận dạng 1

Độ nhạy Phản ứng PCR2 cho bang kích thước 135 bp đặc trưng cho nấm C.neoformans ≥ 95% 2

Độ đặc hiệu ≥ 99% 3

Ngưỡng phát hiện ≥ 10pg/µl 4

Thời gian phát hiện Không quá 48 giờ 5

Độ ổn định ≥ 12 tháng 6

Bảo quản - 20oC 7

108

3.2.3.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR tại

Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế

Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế có giấy chứng

nhận kết quả kiểm định số 00515/SPCD-NC kết luận bộ sinh phẩm chẩn đoán

nested-PCR phát hiện nấm C. neoformans loạt số #A011-02 do Học viện quân

y sản xuất có độ nhạy đạt 98,11%; độ đặc hiệu 100%; ngưỡng phát hiện

0,4pg/µl khi thực hiện trên bộ mẫu chuẩn của nhà sản xuất.

109

Chương 4. BÀN LUẬN

4.1. Về kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-

PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans

4.1.1. Bàn luận về kết quả giám định loài vi nấm C. neoformans để sử

dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình

Nghiên cứu này đã sử dụng 01 chủng nấm chuẩn mã số ATCC® 90113

đây là chủng C. neoformans var brutii được thu thập từ mẫu dịch não tủy tại

Pensivalia đã được ngân hàng chủng chuẩn vi sinh vật Hoa Kỳ phân lập, giải

trình tự và miêu tả các thuộc tính một cách đầy đủ.

Bảng 3.1 cho thấy để phục vụ cho nghiên cứu trong năm 2013 chúng tôi

đã tiến hành thu thập 270 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm

sàng viêm màng não từ 04 bệnh viện của Việt Nam, gồm 143 mẫu từ bệnh

viện Phạm Ngọc Thạch; 04 mẫu từ Bệnh viện quân Y 103; 20 mẫu từ Bệnh

viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương; 99 mẫu từ Bệnh viện Chợ Rẫy. Bằng

phương pháp nuôi cấy trên thạch Sabouraud đã xác định có 51 mẫu dịch não

tủy nhiễm nấm C. neoformans chiếm 18,89%. Sau đó 51 chủng C.

neoformans này được định loài lại bằng sinh học phân tử, kết quả cho thấy cả

51 mẫu đều cho kết quả là C. neoformans. Điều này cho thấy tỉ lệ viêm màng

não do nấm C. neoformans chiếm khá cao, tương đồng với nghiên cứu tại

bệnh viện Bệnh Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh từ tháng 12/2010 đến tháng

7/2011 (16,4%) (Nguyễn Như Quỳnh, (2012)). Theo Sousa và cs (2015), tỷ lệ

này ở Brazil là 9,25% [56]. Theo thống kê của bệnh viện Chợ Rẫy từ năm

1999 đến 2001 tỷ lệ này thấp hơn chỉ có 5%. Số lượng mẫu thu thập trong

nghiên cứu này là 167 mẫu tương đương với nghiên cứu của Nguyễn Quang

Trung năm 2004, 2005 tại BV Bệnh Nhiệt Đới đã thu thập được 147 ca nhiễm

C. neoformans ở hệ thần kinh trung ương. Như vậy so với các nghiên cứu

khác trong hay ngoài nước nghiên cứu của chúng tôi có tỷ lệ nhiễm dương

110

tính với C. neoformans khác biệt. Nguyên nhân có thể do cách chọn mẫu,

trong nghiên cứu này chúng tôi thu thập dịch não tủy của tất cả các bệnh nhân

có triệu chứng viêm màng não ở Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện

Chợ Rẫy. Nhưng ở BV Bệnh Nhiệt đới Trung ương và Bệnh viện Quân Y 103

thì lại chọn tất cả bệnh nhân viêm màng não nuôi cấy có nấm. Có thể do cách

thu mẫu này làm cho tỉ lệ viêm màng não dương tính với C. neoformans trong

nghiên cứu bước đầu của chúng tôi tỷ lệ cao hơn so với các nghiên cứu khác.

Viêm màng não do nấm là một bệnh nguy hiểm, tỷ lệ tử vong lại rất

cao nên cần được chẩn đoán và điều trị càng sớm càng tốt, nhất là ở những

người suy giảm miễn dịch.

Nuôi cấy được coi là phương pháp chủ yếu để chẩn đoán vi nấm nói

chung trong đó có cả viêm màng não do Cryptococcus. Nuôi cấy cần 3 – 5

ngày để nấm phát triển và ủ lên đến 10 ngày để có được số liệu đáng tin cậy.

Phương pháp nuôi cấy có thể phát hiện 70% các trường hợp nhiễm nấm, tuy

nhiên ngưỡng phát hiện khá cao.

Các kỹ thuật miễn dịch học phát hiện kháng nguyên như ELISA,

LAT... hiện nay đang được sử dụng phổ biến để phát hiện chẩn đoán nhiễm

nấm C. neoformans tuy nhiên các phương pháp này có nhược điểm là mẫu

phải xét nghiệm ngay sau khi thu thập, quá trình bảo quản mẫu phải trong

điều kiện lạnh, dễ xảy ra nhiễm chéo và dương tính giả.

Trong hai thập kỷ qua, rất nhiều kỹ thuật phân tử đã được khám phá để

phát hiện nấm gây bệnh. Những kỹ thuật này, so với các kỹ thuật cổ điển, độ

nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể xác định đặc điểm sâu về cấu trúc gen của

phức hệ loài C. neoformans, thời gian chẩn đoán nhanh. Các kỹ thuật này có

tính đặc hiệu cao do việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho từng đối tượng

nghiên cứu và có độ nhạy cao vì chỉ cần một lượng rất nhỏ (vài picrogam)

ADN cũng có thể cho kết quả chẩn đoán.

111

Ngoài ra các kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên kỹ thuật PCR là các kỹ

thuật có thể tiến hành nhanh, dễ dàng, tốn ít thời gian hơn so với các kỹ thuật

lai protein. Đồng thời kỹ thuật PCR cũng có thể kết hợp với các kỹ thuật khác

như xác định dấu ấn phân tử, tạo ra các công cụ hữu hiệu cho việc nghiên cứu

dịch tễ học phân tử [48].

Có rất nhiều các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để chẩn đoán

nấm C. neoformans trong đó các kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất là kỹ thuật

PCR, nested – PCR; PCR đa mồi, real-time PCR…[56], [60],[62],[48]. Mỗi

một kỹ thuật trên có các ưu nhược điểm khác nhau như: Kỹ thuật PCR thông

thường dễ thực hiện, nhanh nhưng cũng có những nhược điểm nhất định như

chỉ phát hiện được một nầm bệnh cùng lúc, nồng độ giới hạn phát hiện cao

hơn so với các kỹ thuật PCR lồng (nested PCR)…

Kỹ thuật PCR đa mồi có ưu điểm chẩn đoán nhanh, cùng lúc xác định

được sự có mặt của một hoặc nhiều mầm bệnh, tuy nhiên độ đặc hiệu có thể

thấp hơn kỹ thuật PCR đơn hay nested-PCR. Quá trình chuẩn hóa kỹ thuật

cũng phức tạp hơn nhiều để có thể đảm bảo được tính đặc hiệu của kỹ thuật

khi chẩn đoán cùng một lúc nhiều mầm bệnh khác nhau cũng như trong

trường hợp các mầm bệnh có mật độ khác nhau [60], [91].

Kỹ thuật real-time PCR là một trong những kỹ thuật hiện đại nhất trong

các phương pháp áp dụng cho nghiên cứu, chẩn đoán bệnh Cryptococcosis và

các tác nhân gây bệnh khác hiện nay. Kỹ thuật này có thời gian thực hiện

ngắn, nên có thể phát hiện bệnh nhanh. Đồng thời độ chính xác trong chẩn

đoán C. neoformans cao. Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị chuyên

dụng và đắt tiền hơn so với các kỹ thuật PCR khác [62],[66].

Kỹ thuật nested PCR là kỹ thuật có 2 lần phản ứng với 2 cặp mồi khác

nhau, cặp mồi thứ nhất được sử dụng để khuếch đại một đoạn ADN chứa

đoạn ADN của l phản ứng PCR lần hai nên độ đặc hiệu rất cao. Trong số các

112

kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR thì PCR lồng được sử dụng nhiều nhất, kỹ

thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, ngưỡng phát hiện thấp, tỷ lệ phát

hiện nấm có thể tới hơn 90% [47], [48].

Trong điều kiện thực tế Việt Nam, chúng tôi lựa chọn phát triển kỹ

thuật nested-PCR để phát triển bộ sinh phẩm với hy vọng có thể áp dụng được

ở tất cả những cơ sở y tế có máy PCR để có thể chẩn đoán sớm, chẩn đoán

chính xác nhiễm nấm C. neoformans - một trong những tác nhân nguy hiểm

gây bệnh viêm màng não.

Để phát triển kỹ thuật nested-PCR xác định nhiễm nấm trong dịch não tủy

chúng tôi đã tiến hành thu thập từ 2 ml đến 6 ml dịch não tủy. Mỗi lần tách chiết

cần 500µl dịch não tủy, đủ cho tiến hành lặp lại thí nghiệm nhiều lần. Do đó lượng

mẫu này hoàn toàn đủ cho việc thử nghiệm xây dựng kỹ thuật nested –PCR.

Mẫu được bảo quản khi chưa tách chiết ADN ở nhiệt độ -800C, và sau

khi tách chiết ADN bảo quản ở nhiệt độ -200C theo đúng tiêu chuẩn đảm bảo

chất lượng để xét nghiệm chẩn đoán C. neoformans trong thời gian 2 năm.

4.1.2. Về kết quả thiết kế/lựa chọn mồi và xác định các điều kiện cho kỹ

thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans

4.1.2.1. Kết quả lựa chọn trình tự cặp mồi cho phản ứng nested PCR

Để thực hiện việc lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested – PCR chúng tôi đã

tìm hiểu 20 công trình nghiên cứu chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans bằng

kỹ thuật PCR và real-time PCR từ năm 1990 đến năm 2014 (bảng 3.3) - là

giai đoạn bắt đầu triển khai nghiên cứu. Mồi (Primers) có thể được coi là một

trong những thành phần quan trọng nhất của phản ứng PCR và là một trong

những yếu tố được quan tâm đầu tiên khi phát triển một kỹ thuật PCR mới.

Các nghiên cứu về kỹ thuật PCR chẩn đoán nấm sử dụng nhiều trình tự

gen đích khác nhau như URA5, CAP59, M13, JEC21, VAD-1 nhưng chiếm

tỷ lệ cao nhất là ITS (bao gồm các vùng ITS, 18S; 5.8S và 28S) chiếm tới

113

55% số lượng trình tự gen đích nghiên cứu. Chúng tôi lựa chọn cặp mồi dựa

trên gen đích ITS để phát triển bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C.

neoformans. Thông tin thu được từ các nghiên cứu trước đã phát hiện ra 2 điểm

đặc biệt quan trọng của vùng ITS ở nấm cũng như các loài sinh vật khác đủ tiêu

chuẩnlà mục tiêu để phát triển kỹ thuật PCR phân loại các loài. Đầu tiên, những

vùng này tương đối ngắn, sản phẩm PCR nhân bản giữa ITS và vùng rìa

(thường ngắn hơn 1kb) dễ thực hiện các phản ứng PCR. Hơn nữa, những biến

đổi trong loài của vùng ITS thấp hơn những biến đổi giữa các loài, điều này

cho phép phát triển phản ứng PCR chẩn đoán dựa vào vùng này.

Tuân thủ nguyên tắc của kỹ thuật nested-PCR là trình tự của phản ứng

PCR2 phải nằm trong đoạn khuếch đại của phản ứng PCR1.

Từ danh sách các cặp mồi được khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn được

cặp mồi sử dụng cho nghiên cứu này là ITS1 (mồi xuôi), ITS4 (mồi ngược).

Mồi ITS1 bắt cặp với ADN đầu bên phải gen 18S tiếp giáp với đoạn giao gen

ITS1, mồi ITS4 bắt cặp ở vị trí đầu bên trái gen 28S tiếp giáp với vùng giao

gen ITS2. Cặp mồi này khuếch đại đoạn ADN kích thước giao động từ 400-

900bp, tùy loài nấm, chứa 1 phần gen 18S, toàn bộ đoạn ITS1-5.8S-ITS2, một

phần gen 28S [92], [93] đối với nấm C. neoformans cặp mồi này khuếch đại

đoạn ADN có kích thước 555-556 bp. Đây là các vùng gen có hệ số biến đổi

nhanh, được y văn xác định là có giá trị trong giám định phân tử nấm gây bệnh.

Hiện nay, theo tìm hiểu từ các nghiên cứu trên thế giới, có khoảng 60

mồi chung cho vi nấm đã được thiết kế và sử dụng trong nghiên cứu về nấm.

Các mồi chủ yếu được thiết kế trên các vùng gen LSU của gen 28S, gen SSU

của gen 18S hoặc đoạn các đoạn giao gen (ITS1, 5.8S, ITS2; kích thước

khoảng 450-800bp) [92]. Trong số các vùng gen này, SSU có mức độ biến đổi

thấp nên ít được sử dụng nhất trong phân loại nấm, trong khi các đoạn giao

gen ITS biến đổi nhanh nhất nên thường được sử dụng để xác định và phân

114

biệt các loài có quan hệ gần gũi [92]. Trong vùng LSU của gen 28S chưa

đoạn D1/D2 cũng có mức độ biến đổi cao nên thường được kết hợp với các

vùng giao gen ITS để xác định loài nấm [92].

Trong nghiên cứu này, sở dĩ chúng tôi lựa chọn cặp mồi ITS1, ITS4

cho PCR1 do cặp mồi này khuếch đại toàn bộ đoạn ITS1-5.8S-ITS2. Theo y

văn, đoạn này rất phù hợp để xác định và phân loại nấm. Trên đoạn ITS1-

5.8S-ITS2, một số nghiên cứu đã thiết kể và sử dụng để phát hiện, nhận diện

nấm C. neoformans và một số loài nấm khác [94], [95], [48].

Do khuếch đại các vùng có giá trị trong giám định và phân biệt loài nên

cặp mồi ITS1, ITS4 được khá nhiều tác giả sử dụng. Cặp mồi này cũng được

sử dụng cho phản ứng vòng ngoài của kỹ thuật nested PCR và nested multiplex

PCR phát hiện một số vi nấm gây bệnh ở người... [96], [97]. Ở trong nước, một

số tác giả cũng đã có một số nghiên cứu sử cặp mồi ITS1, ITS4 trong nghiên

cứu vi nấm [98], [99].

Đối với cặp mồi cho phản ứng PCR2 sau khi tổng kết các cặp mồi đã

được sử dụng xác định nấm C. neoformans ở bảng 3.3. và độ đặc hiệu của các

các cặp mồi ở bảng 3.5, chúng tôi quyết định lựa chọn cặp mồi CN4 và CN5

cho phản ứng PCR2. Do cặp mồi này có độ đặc hiệu cao nhất với nấm C.

neoformans [42] và đoạn gen này nằm gọn trong vùng khuếch đại của cặp mồi

sử dụng cho phản ứng PCR1 đáp ứng tiêu chuẩn của phản ứng nested-PCR.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn được cặp mồi cho PCR1

là ITS1, ITS4, các cặp mồi của vòng 2 là CN4, CN5 cho nấm C. neoformans.

Cặp mồi CN4, CN5 nhân đoạn gen nằm trong đoạn khuếch đại bởi cặp mồi

ITS1, ITS4. Đây là cặp mồi được nhiều tác giả sử dụng trong nghiên cứu về

các loài nấm C. neoformans và một số vi nấm gây bệnh khác.

Cặp mồi CN4, CN5 đã được Mitchell TG và cs (1994) nghiên cứu phát

hiện nấm C. neoformans từ năm 1994[42]. Nghiên cứu của Martins MA. và

115

CS (2015) cho thấy, bằng cặp mồi CN4, CN5, 100% các mẫu DNA của nấm

C. neoformans cho kết quả dương tính và trên bệnh phẩm dịch não tủy nhiễm

C. neoformans tỷ lệ dương tính là 94,8% [100]. Cidiane GM và CS (2016) sử

dụng cặp mồi CN4, CN5 trong phản ứng realtime PCR phát hiện nhiễm C.

neoformans, có so sánh với soi tươi và nuôi cấy. Kết quả cho thấy, độ nhạy

của kỹ thuật soi tươi là 85,7%, nuôi cấy 70,8% và realtime PCR là 92,9%

[68]. Một nghiên cứu tương tự của Dharmshale S. và CS (2015) cho thấy, 3

phương pháp là kỹ thuật PCR (với cặp mồi CN4, CN5), phát hiện kháng

nguyên trong dịch não tủy, soi tươi có độ nhạy tương ứng là 100%, 89,19%

và 78,40% [101]… Cặp mồi này được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên

cứu về nấm C. neoformans cho thấy, vị trí của sợi ADN nấm C. neoformans

là các vị trí ít có sự biến đổi. Trình tự các mồi CN4, CN5 lại đặc hiệu cho C.

neoformans. Điều này cũng chỉ ra rằng, lựa chọn cặp mồi này để nhân gen

nấm C. neoformans là rất phù hợp.

Để xây dựng được quy trình kỹ thuật nested PCR phát hiện nấm C.

neoformans, nhiều phương án khác nhau đã được tính toán như:

- Phương án 1: Vòng 1 sử dụng cặp mồi chung cho vi nấm, vòng 2 sử

dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện nấm C. neoformans.

- Phương án 2: Cả vòng 1 và vòng 2 sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đối

với vi nấm C. neoformans.

Trong quá trình triển khai, phương án 2 không khả thi do chưa tham

khảo/thiết kế được các cặp mồi phù hợp. Vì vậy, phương án 1 được nhóm

nghiên cứu lựa chọn để xây dựng quy trình kỹ thuật nested PCR phát hiện

nấm C. neoformans.

Hình 3.4 cho thấy đã lựa chọn ra 2 cặp mồi cho kỹ thuật nested PCR.

Cặp mồi cho PCR1 khuếch đại đoạn ADN nằm giữa vùng ITS1 và ITS4 có

116

kích thước 555bp; cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR2 là CN4 và CN5

khuếch đại đoạn ADN thuộc vùng ITS1 có kích thước 135 bp.

Kết quả bảng 3.4 cho thấy khi đánh giá chất lượng của mồi so với tiêu

chuẩn thì các mồi được lựa chọn đều đạt tiêu chuẩn của cặp mồi sử dụng cho

phản ứng PCR. Các mồi ITS1, ITS4; CN4, CN5 có chiều dài tương ứng là 19,

20, 22 và 22 nucleotit đáp ứng tiêu chuẩn của mồi là kích thước từ 18-28

nucleotit; Tỷ lệ CG từ 40 đến 63,16% nằm trong khoảng tiêu chuẩn từ 35-

65% đối với một mồi chất lượng. Nhiệt độ nóng chảy từ 56,6 đến 63,20C đáp

ứng yêu cầu Tm < 650C vàsự chênh lệch nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi là

4,1 đến 4,80C không vượt quá 50C theo đúng tiêu chuẩn kỹ thuật [70], [71].

Các mồi chúng tôi lựa chọn không có tính tương đồng cao giữa các mồi

trong cùng cặp, do đó đảm bảo không xảy ra hiện tượng kết cặp (dimer). Là

hiện tương mồi thay vì gắn vào khuôn sẽ gắn vào mồi ngược với nó hoặc với

chính nó, tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ và làm giảm lượng mồi

bắt cặp với khuôn.

Đoạn gen đích được lựa chọn để phát triển mồi không có cấu trúc kẹp

tóc do đó không làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR

Không có hiện tượng lặp đôi hoặc lặp đơn của các nucleotit nhiều lần

trong trình tự mồi như ATATATATAT hay GGGGG. Trong cặp mồi chỉ có 1

lần lặp ba ”TCC” lặp lại 2 lần ở mồi của phản ứng PCR1 và 1 lặp đơn ”G” lặp

lại 4 lần ở mồi của phản ứng PCR2 nên tránh được hiện tượng bắt cặp nhầm

và đáp ứng yêu cầu số lần lặp tối đa của một mồi là không quá 4 lần lặp.

Đồng thời mồi cũng đáp ứng tiêu chí không có tương đồng chéo. Là

hiện tượng mà cặp mồi sẽ khuếch đại một gen khác có trong ADN khuôn của

phản ứng.

Trong nghiên cứu xây dựng bộ sinh phẩm nested-PCR này chúng tôi sử

dụng cặp mồi cho PCR1 là cặp mồi ITS1 và ITS4 để phát hiện các loài vi nấm

117

nói chung được Mitchell và cs xây dựng vào năm 1994 [42]. Sau đó cặp mồi

này đã được nhiều tác giả như Rappelli, (1998); Bialek và cs, (2002); Luo và

cs, (2003); Takahashi và cs, (2003) sử dụng để phát hiện nấm Cryptoccocus

neoformans [48], [63], [102].

Trong nghiên cứu ban đầu của mình Mitchell và cs (1994) đã thiết kế

mồi ITS1 và ITS4 như một cặp mồi chỉ thị để phát hiện các loài nấm nói

chung. Sau đó thiết kế một loại các mồi riêng biệt đặc trưng cho C.

neoformans là các mồi CN4, CN5, CN6 và đánh giá 6 cặp mồi khác nhau để

kiểm chứng tính đặc hiệu của các mồi này bao gồm: CN5-CN6; CN4-ITS1,

CN6-ITS4; CN4-CN5 và CN5-CN6 [42]. Mitchell, đã sử dụng kỹ thuật PCR

đơn cho từng cặp mồi riêng lẻ.

Năm 1998, Rappelli và cs là một trong những người đầu tiên đã xây

dựng kỹ thuật nested-PCR để chẩn đoán C. neoformans trực tiếp từ dịch não

tủy với 2 cặp mồi dựa trên các mồi đơn đã được Mitchell phát triển năm 1994

[48]. Cặp mồi cho phản ứng PCR1 là ITS1 và CN4 có kích thước sản phẩm

PCR là 415 bp và cặp mồi CN5 và CN6 khuếch đại đoạn ADN có kích thước

116bp [48].

Mirhendi và cs (2001) đã phát triển kỹ thuậ PCR-RFLP để phân biệt

các nấm y học cơ hội quan trọng gây bệnh trên người bao gồm một số loài

nấm Candida như C. albican; C. tropicalis, C. gabrata, C. krusei;

Cryptoccocus neoformans và Fusarium solani sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4

khuếch đại đoạn ADN chung cho các loài vi nấm này, sau đó cắt bằng enzym

giới hạn HpaII dựa vào kích thước các băng điện di sau khi cắt giới hạn để

phân biệt các loài nấm này với nhau [44].

Năm 2002, Bialek và cs đã phát triển và so sánh kỹ thuật nested PCR và

real-time PCR để chẩn đoán C. neoformans [63]. Với kỹ thuật nested PCR các tác

giả đã dựa trên trình tự gen 18S để thiết kế nên cặp mồi cho phản ứng PCR1 là

118

Fungus I và FungusII khuếch đại đoạn ADN có kích thước 391bp; cặp mồi cho

phản ứng PCR2 là CrypI và CrypII khuếch đại đoạn gen có kích thước 231bp.

Năm 2002 Luo và Mitchell phát triển kỹ thuật PCR đa mồi multiplex

dựa trên các nghiên cứu năm 1994 của Mitchell sử dụng cặp mồi ITS1 và

ITS4 để phát hiện các loài vi nấm nói chung đồng thời kết hợp với các cặp

mồi AFUM1 và AFUM2 để phát tiện A. funigatus; CALB1 và CALB2 để

phát hiện C. albricans; CGL1 và CGL2 để phát hiện C. glabrata; CPA1-

CPA2, 3 phát hiện C. parapsilois; CTR1- CTR2 phát hiện C. tropicals; CN4

– CN5 để phát hiện C. neoformans[88]. Trong nghiên cứu này Luo và Michell

tổ hợp các cặp mồi để phát hiện đồng thời nhiều loài nấm trên một mẫu bệnh

phẩm và chỉ sử dụng kỹ thuật PCR đơn chứ không phải là kỹ thuật nested-

PCR. Những mẫu bệnh phẩm đồng thời xuất hiện cả 02 băng đặc trưng cho

nấm nói chung và đặc trưng cho từng loài nói riêng thì được chẩn đoán là

nhiễm loài nấm đó, ví dụ nếu mẫu bệnh phẩm xuất hiện 2 băng 555bp và

135bp thì được xác định là nhiễm nấm C. neoformans. Kỹ thuật này có ưu

điểm trên một mẫu bệnh phẩm có thể xác định được nhiều loài nấm gây bệnh

khác nhau. Tuy nhiên quá trình phát triển kỹ thuật mất nhiều thời gian và

công sức để chuẩn hóa tỷ lệ các mồi trong hỗn hợp phản ứng. Cũng như trong

việc thiết kế các cặp mồi phải chú ý tránh sự bắt cặp giữa các cặp mồi với

nhau. Và kích thước sản phẩm PCR được tạo ra bởi các cặp mồi riêng biệt

phải có sự cách biệt tương đối rõ ràng thì mới có thể đánh giá được kết quả.

Năm 2003, Takahashi và cs thực nghiệm lại kỹ thuật nested-PCR theo

phương pháp của Rappelli và cs (1998) trên 88 bệnh nhân tại Nhật Bản để

khẳng định tính đặc hiệu của cặp mồi này [102].

Cũng trong năm 2006 Shahindokht và cs, đã phát triển kỹ thuật PCR bán

lồng để phát hiện C. neoformans trong dịch não tủy sử dụng 2 cặp mồi là ITS1

và CN5 cho phản ứng PCR lần 1; CN5 và CN6 cho phản ứng PCR2 [19].

119

Như vậy trên cơ sở phát triển các cặp mồi để chẩn đoán vi nấm đặc biệt

là C. neoformans năm 1994 của Mitchell và cs các tác giả đã phát triển các kỹ

thuật PCR khác nhau như PCR đơn, multiplex PCR, nested – PCR, PCR-

RFLP, semi-nested PCR với các tổ hợp mồi khác nhau để chẩn đoán phân biệt

các loài vi nấm y học cơ hội đặc biệt là C. neoformans.

Nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên kết hợp 02 bộ mồi

ITS1 - ITS4 và CN4 và CN5 trong kỹ thuật PCR lồng (nested-PCR) những

nghiên cứu trước đó 2 cặp mồi này thường được sử dụng đồng thời trong các

phản ứng PCR đơn như trong nghiên cứu của Mitchell, (1994); Mirhendi và

cs (2001); Luo và cs (2002) [42], [44], [88]. Hay sử dụng các bộ mồi khác

như Rappelli và cs (1998); Takahashi và cs (2006); Jahromi và cs (2006) [48],

[102], [19].

4.1.2.2. Về kết quả xác định các điều kiện của kỹ thuật nested PCR phát hiện

C. neoformans gây VMN

Đây là nội dung quan trọng nhất của đề tài với hàng loạt các công việc

tốn nhiều thời gian và công sức như: thu thập mẫu, nuôi cấy tăng sinh mẫu,

tách chiết thu ADN mẫu; tham khảo/thiết kế lựa chọn các cặp mồi nghiên cứu;

xác định các điều kiện cho phản ứng PCR vòng 1 và vòng 2 với hàng loạt các

thử nghiệm khác nhau để có thể chuẩn hóa từng loại hóa chất ở các nồng độ

khác nhau, chuẩn hóa từng mức nhiệt khác nhau; thử nghiệm đánh giá các kỹ

thuật xây dựng được trên panel chuẩn dương…

Từ kết quả lựa chọn các cặp mồi, chúng tôi đã xác định được các điều

kiện cho phản ứng PCR để khuếch đại ADN của các vi nấm. Theo đó, phản

ứng PCR với các cặp mồi ITS1, ITS4 có kết quả tốt khi Mg2+ = 2,0mM, mồi

0,1µM, nồng độ ADN đưa vào phản ứng PCR từ 10pg đến 10ng, nhiệt độ gắn

mồi 56oC. So với các nghiên cứu trên thế giới, các điều kiện có nhiều điểm

phù hợp và không phù hợp [103], [104]. Tuy nhiên, ở hầu hết các nghiên cứu,

120

2 điều kiện quan trọng nhất là nồng độ Mg2+ đều từ 1,5 đến 2,0mM và nhiệt

độ gắn mồi của cả 2 cặp mồi 55oC đến 56oC. Sự khác biệt này là do phản ứng

PCR phụ thuộc vào các yếu tố như thiết bị luân nhiệt (máy PCR), loại enzyme

DNA polymerase sử dụng và các thành phần trong phản ứng PCR. Đây chính

là lý do vì sao khi tham khảo mồi trong các phản ứng PCR ở các nghiên cứu

trước, các nhà khoa học vẫn phải đi xác định các điều kiện.

Từ kết quả xác định các điều kiện cho phản ứng PCR với cặp mồi

ITS1, ITS4, ADN của các mẫu nấm được tiến hành khuếch đại. Hơn 51 mẫu

nấm men có hình thái phù hợp với C. neoformans đã được tách chiết ADN,

sau đó được thực hiện phản ứng PCR. Sản phẩm PCR thu được được cắt giới

hạn và/hoặc giải trình tự nhằm xác định và tuyển chọn được các chủng chuẩn

C. neoformans sử dụng cho các công việc nghiên cứu xây dựng các quy trình

kỹ thuật và nested PCR. Kết quả giám định được 51 chủng nấm C. neoformans.

Trong số này, 6 chủng đã được giải trình tự (2 chiều) và 6 trình tự đã được đăng

ký trên ngân hàng gen với mã số tương ứng là C. neoformans (MF593934,

MF593935, MF593936, MH203395, MH203397, MH203397). Chi tiết các trình

tự các chủng nấm được đăng ký trên ngân hàng gen trong phụ lục.

Phản ứng PCR với cặp mồi ITS1, ITS4 và CN4, CN5 được thực hiện

trong các điều kiện khác nhau để chọn các điều kiện tốt nhất. Sau đó, các cặp

mồi này được sử dụng cho vòng 1 và vòng 2 để xác định các điều kiện trong

phản ứng nested PCR.

Cặp mồi CN4 và CN5 nhân đoạn gen 135bp của nấm C. neoformans

nằm trong đoạn ADN là sản phẩm khuếch đại bởi cặp mồi ITS1, ITS4 (555bp

của nấm C. neoformans). Phản ứng nested-PCR cho kết quả tốt khi nhiệt độ

gắn mồi là 57oC và nồng độ Mg2+ = 2,0mM. Bảng 3.17 cho thấy, sản phẩm

PCR2 cho kích thước 135bp đặc hiệu cho nấm C. neoformans với cả chủng

chuẩn và chủng Việt Nam. Kết quả thử nghiê ̣m cũng chứ ng minh phản ứ ng

121

nested PCR không khuếch đa ̣i gen của các nấm men non-C. albicans, A.

fumigatus, P. marneffei, một số vi khuẩn (H. influenzae, N. meningitidis, S.

pneumoniae, P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli, M. tuberculosis, A.

baumannii, S. Aureus), ADN của người và HBV. Tuy nhiên, do giới hạn

nghiên cứu chúng tôi chưa có điều kiện để thử tính đặc hiệu trên các loài vi

nấm gây bệnh ở người khác. Các kết quả phân tích lý thuyết của các cặp mồi

và thử nghiệm áp dụng trên chủng Việt Nam chỉ ra rằng cặp mồi được sử

dụng khuếch đại đặc hiệu các nấm và các cặp mồi sử dụng nằm ở các vị trí có

tính bảo tồn cao.

Kết quả xác định ngưỡng phát hiện cho thấy, nested - PCR cho phép nhìn

rõ và kết quả ổn định khi lượng ADN nấm đưa vào 25μl phản ứng PCR1 > 1pg.

Một số tác giả đã phát triển kỹ thuật nested-PCR để phát hiện nấm riêng lẻ các

C. neoformans, C. albicans như Paola Rappelli và cs (1998) [48], Jahromi S. B

và cs (2006) [19], Victor A. Makene và cs (2013) [105] cho kết quả ngưỡng phát

hiện nhạy hơn nghiên cứu này (có thể phát hiện khi nồng độ ADN nấm thấp hơn

1pg). Guizhen Luo và cs (2002) sử dụng kỹ nested multiplex-PCR để phát hiện

C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. neoformans và A.

fumigatus [106]; Taira CL và cs (2014) [60] sử dụng kỹ thuật Nested Multiplex-

PCR để phát hiện 7 căn nguyên Candida gây nhiễm nấm máu ở trẻ sơ sinh cũng

cho kết quả ngưỡng phát hiện thấp hơn nghiên cứu của chúng tôi. Điều này có

thể do số chu kỳ trong các phản ứng khác nhau. Các tác giả thường chạy PCR1

với số chu kỳ là 35, PCR2 với 20 chu kỳ. Trong khi đó, số chu kỳ ở cả 2 vòng

trong nghiên cứu này đều là 25... Do đó, cần phải tiếp tục tìm hiểu, đánh giá để

hạ thấp ngưỡng phát hiện và nâng cao hiệu quả chẩn đoán. Mặc dù vậy, đây là

những kết quả cho thấy tiềm năng ứng dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán nhiễm

C. neoformans ở Việt Nam.

122

Chúng tôi thấy rằng, khoảng nồng độ ADN của nấm C. neoformans tốt

nhất để kỹ thuật cho kết quả ổn định từ 1pg đến 1ng ADN (khối lượng ADN

đưa vào 25 μl thể tích phản ứng). Khi nồng độ ADN cao hơn 1ng, làm xuất

hiện các sản phẩm phụ không đặc hiệu. Kết quả này tương tự như ở nghiên cứu

của Hsu MC và cs (2003) [107]. Tuy nhiên, Hsu MC và cs (2003) sử dụng kỹ

thuật multiplex realtime-PCR với số chu kỳ phản ứng là 35. So với một số

nghiên cứu sử dụng kỹ thuật nested-PCR phát hiện C. neoformans như của

Paola Rappelli và cs (1998) [48], Jahromi S. B và cs (2006) [19], Victor A.

Makene và cs (2013) [105] thì ngưỡng phát hiện ở nghiên cứu này kém nhạy

hơn. So với kỹ thuật nested multiplex-PCR trong nghiên cứu của Guizhen Luo

và cs (2002) [106] và Taira CL và cs (2014) [60] thì nghiên cứu này nhạy hơn.

Ngưỡng phát hiện ở các nghiên cứu có sự khác nhau là do số chu kỳ trong các

phản ứng khác nhau. Ngoài ra, sự bắt cặp với DNA đích của các cặp mồi phụ

thuộc vào nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ [12], [99].

4.1.3. Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm

C. neoformans

4.1.3.1. Kết quả chế tạo các ống hỗn dịch cho phản ứng PCR

Sau khi quy trình kỹ thuật phát hiện các nấm được xây dựng, bộ sinh

phẩm được nghiên cứu chế tạo với các dạng đóng gói khác nhau để lựa chọn

dạng phù hợp. Thực tế, 2 dạng đã được chúng tôi thử nghiệm sản xuất. Dạng 1

là master mix với đầy đủ các thành phần, chỉ cần thêm ADN mẫu và chạy PCR

để phân tích (bảng 3.18, 3.19). Dạng 2 là các master mix được chia ra một cách

hợp lý các thành phần trong các tube, khi thực hiện các dung dịch master mix

tương ứng trong hướng dẫn sử dụng sẽ được trộn lại với nhau trước khi thêm

ADN mẫu vào để thực hiện các phản ứng PCR (bảng 3.20, 3.21, 3.22, 3.23).

Qua thử nghiệm đánh giá từ kết quả ở bảng 3.24, chúng tôi thấy rằng

dạng 1 tiện sử dụng, khi thực hiện mất ít thời gian chuẩn bị hơn nhưng kết

123

quả kém ổn định, thời gian bảo quản được ngắn. Dạng 2 khi thực hiện mất

nhiều thời gian chuẩn bị hơn do phải trộn các thành phần và chia ra các tube

PCR nhưng cho kết quả ổn định và thời gian bảo quản được lâu hơn. Chính

vì vậy, dạng 2 được chúng tôi lựa chọn để chế tạo các bộ sinh phẩm. Dạng 2

đóng gói giống với hãng Genekam (Đức) nhưng khác của hãng Norgen

(Canada). Dạng đóng gói bộ sinh phẩm chẩn đoán C. neoformans của hãng

Norgen gồm các thành phần 2X PCR master mix, dung dịch mồi, nước khử

ion, chứng dương, marker 100. Sau khi thực hiện phản ứng PCR, kết quả

được đem điện di để phân tích trực tiếp. Trong khi, dạng đóng gói của chúng

tôi trước khi phân tích sản phẩm PCR cần trộn sản phẩm này với loading

dye. Đây có lẽ là 1 nhược điểm cần khắc phục, nâng cấp và hoàn thiện.

Dựa vào kết quả xây dựng và chuẩn hóa kỹ thuật nested-PCR chẩn

đoán nấm C. neoformans ở các mục trên kết hợp với việc xác định độ nhạy độ

đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm để xây dựng hướng dẫn sử dụng cho

bộ sinh phẩm với các nội dung chính:

- Mô tả bộ sinh phẩm;

- Điều kiện bảo quản của bộ sinh phẩm;

- Các vật liệu cần thiết không cung cấp kèm bộ sinh phẩm;

- Thành phần bộ sinh phẩm;

- Các lưu ý;

- Hướng dẫn sử dụng;

- Điện di kết quả;

- Phiên giải kết quả;

- Các tình huống phát sinh.

Bộ sinh phẩm bao gồm 10 ống hóa chất và 01 bản hướng dẫn sử dụng.

Phương pháp thử là kỹ thuật nested – PCR bao gồm 2 lần phản ứng PCR

124

trong đó kết quả khuếch đại của phản ứng PCR cho băng có kích thước 135

bp đặc trưng cho nấm C.neoformans.

4.1.3.2. Chuẩn bị chứng dương, chứng âm cho bộ kít

Chuẩn dương trong các bộ sinh phẩm nested-PCR xác định nhiễm nấm

C.neoformal được xây dựng bằng cách tách chiết ADN của mẫu chuẩn

ATCC 90113, khuếch đại bằng cặp mồi bao phủ chiều dài của đoạn ADN

cần khuếch đại. Ở đây lựa chọn cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR1 (ITS1

và ITS4), đo nồng độ và pha thành dãy chuẩn dương theo cấp số nhân.

Ngưỡng phát hiện của nested PCR trong nghiên cứu của chúng tôi được xác

định là 10pg/phản ứng 25 µl tương đương với 0,4 pg/ µl. Như vậy chuẩn

dương sẽ được lấy cao hơn ngưỡng phát hiện 01 bậc, tức là gấp 10 lần

ngưỡng phát hiện. Và nồng độ chuẩn dương trong nghiên cứu của chúng tôi

có nồng độ là 102pg/25µl phản ứng của PCR1.

Chuẩn âm là ADN của người hoặc các ký sinh trùng hoặc vi sinh

thường không song nhiễm với loài mà chúng ta cần phát hiện.

Như vậy quá trình nghiên cứu của chúng tôi đã tạo ra bộ sinh phẩm

nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy với 10

ống dung dịch và 01 bản hướng dẫn sử dụng (bảng 2.25, hình 3.16).

4.2. Bàn luận về độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn

đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy.

Để đánh giá được độ nhạy, độ đặc hiệu của một sinh phẩm chẩn đoán

cần so sánh kết quả xét nghiệm bằng bộ sinh phẩm muốn đánh giá với

chuẩn vàng trên các nền mẫu khác nhau. Đồng thời so sánh với các bộ sinh

phẩm, các phương pháp xét nghiệm đã được đánh giá và thương mại hóa

trên thị trường.

Trước hết đánh giá bộ sinh phẩm trên các mẫu chuẩn, đây cũng là cơ sở

để xác định được ngưỡng phát hiện, mẫu chuẩn bao gồm chuẩn dương, chuẩn

125

âm, chuẩn trắng. Bước tiếp theo đánh giá bộ sinh phẩm trên các mẫu nhiễm

giả định trên nền mẫu mà chúng ta tiến hành phân tích đối với các mẫu xét

nghiệm thông thường. Cuối cùng là đánh giá trên các mẫu dịch não tủy thu từ

các bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng viêm màng não.

Các bước đánh giá trên mẫu chuẩn và giả định thường được các nhà sản xuất

tiến hành trong quá trình xây dựng cũng như thử nghiệm lại trên bộ sinh phẩm.

Cũng như hầu hết các nghiên cứu, độ nhạy độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm

chẩn đoán trên các mẫu chuẩn sẽ phản ánh độ nhạy, độ đặc hiệu của phương

pháp tạo nên bộ sinh phẩm. Đối với các bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật PCR độ

nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn phản ánh độ nhạy, độ đặc hiệu của các cặp

mồi và quy trình thực hiện phản ứng PCR. Ở hầu hết các trường hợp, nếu không

có sự nhiễm chéo thì độ nhạy và độ đặc hiệu đều đạt 100%.

4.2.1. Bàn luận về kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định

của bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm

4.2.1.1. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh

phẩm trên các ADN mẫu chuẩn

-Đánh giá về độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các ADN

mẫu chuẩn

Sau khi xây dựng xong bộ sinh phẩm chấn đoán nhiễm nấm C.

neoformans trong dịch não tủy, chúng tôi tiến hành thử nghiệm bộ sinh phẩm

dựa vào panel ADN của chủng chuẩn ACCT@ 90113. Kết quả nghiên cứu của

chúng tôi tại bảng 3.26 nhận thấy với việc đánh giá 30 mẫu chuẩn dương ở

hai nồng độ khác nhau là nồng độ thấp 102CFU/ml và nồng độ cao

105CFU/ml; 20 mẫu chuẩn âm (10 chuẩn âm không có ADN là NaCl 0,9% và

10 chuẩn âm có ADN là dịch não tủy không có C. neoformans. Mỗi mẫu chạy

lặp lại 2 lần thì 100% các mẫu chuẩn dương sản phẩm PCR xuất hiện băng

kích thước 135bp đặc trưng cho nấm C. neoformans, 100% mẫu chuẩn âm

126

không có sản phẩm PCR. Từ bảng 3.27 cho thấy bộ sinh phẩm nested PCR

chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy khi thử nghiệm với

các mẫu nấm C. neoformans của chủng chuẩn và mẫu chuẩn âm có độ nhạy,

độ đặc hiệu đều đạt 100%.

- Về đánh giá độ ổn định của bộ sinh phẩm

Khi lấy 06 bộ sinh phẩm để thử nghiệm ở 03 nhiệt độ bảo quản khác

nhau (-200C, -350C và -800C), mỗi nhiệt độ sử dụng 02 bộ sinh phẩm. Mỗi

tháng chạy thử nghiệm và đánh giá 1 lần ở cả 03 nhiệt độ và mỗi nhiệt độ thử

phản ứng với 10 mẫu ADN của chủng chuẩn. Kết quả ở bảng 3.28 cho thấy

rằng ở cả ba điều kiện bảo quản, bộ sinh phẩm nested-PCR phát hiện nấm C.

neoformans trong dịch não tủy ở nhiệt độ -200C, -350C và -800C vẫn đảm bảo

tính ổn định sau 12 tháng sản xuất.

4.2.1.2. Về đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu DNT nhiễm giả định

Chúng tôi tiến hành đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm

trên 80 mẫu nhiễm giả định (ở hai nồng độ nhiễm cao và thấp khác nhau, mỗi

mẫu lặp lại hai lần), 20 mẫu chuẩn âm, 20 mẫu NaCl 0,9%. Nhận thấy bộ sinh

phẩm vẫn có độ nhạy đạt 92.5%, độ đặc hiệu 100%. Giá trị tiên đoán dương đạt

100%, đảm bảo các cá thể được xét nghiệm dương tính là có nhiễm bệnh. Trong

khi đó giá trị tiên đoán âm tính chỉ đạt 87% nghĩa là trong 100 người được chẩn

đoán âm tính chỉ có 87 người thực sự không nhiễm nấm (bảng 3.32).

Hệ số tương đồng Kappa khi đánh giá trên các mẫu nuôi cấy ở mật độ

cao 105 CFU/ml đạt 1 là hoàn toàn tương đồng. Trong khi giá trị này trên các

mẫu có mật độ thấp 102 CFU/ml chỉ đạt 0,85 ở mức tương đồng cao. Khi

đánh giá hệ số này trên tổng số 120 mẫu là 0,89 ở mức tương đồng cao.

Đây cũng là một kết quả thực tế, phản ánh cho chúng ta thấy những khó

khăn có thể gặp phải đối với các nền mẫu lâm sàng khác nhau và một lần nữa

khẳng định khi chẩn đoán trên các nền mẫu thực, mẫu lâm sàng sẽ gặp khó

127

khăn hơn rất nhiều khi chẩn đoán trên các mẫu chuẩn hay mẫu nuôi cấy.

4.2.2. Bàn luận về kết quả đánh giá bộ sinh phẩm trong đoán nhiễm

C. neoforman sở các mẫu DNT lâm sàng

4.2.2.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu nhiễm C. neoformans

phân lập ở Việt Nam.

Bằng bộ sinh phẩm nested-PCR tạo ra, tiến hàng chạy lại với toàn bộ 51

mẫu ADN của 51 chủng nấm C. neoformans khác nhau phân lập ở Việt Nam,

mỗi chủng chạy 2 mẫu. Kết quả cho thấy 100% sản phẩm PCR2 sau khi điện

di đều xuất hiện các băng có kích thước 135 bp. Kết quả này phù hợp với nấm

C. neoformans (bảng 3.33 và hình 3.17)

Bảng 3.34 cho thấy kết quả đánh giá bộ sinh phẩm trong đoán nhiễm

C. neoformans ở các mẫu DNT lâm sàng độ nhạy và độ đặc hiệu là 100%. Kết

quả này giống hoàn toàn với nghiên cứu của Rivara và cs (2015) khi nghiên

cứu 24 mẫu dịch não tủy nuôi cấy cho thấy nhiễm C. neoformans và thử

nghiệm lại bằng phương pháp nested PCR kết quả 100% là C. neoformans.

Độ nhạy và độ đặc hiệu cũng là 100% [41].

4.2.2.2. Bàn luận về kết quả đánh giá độ tương đồng của bộ sinh phẩm tạo

ra trên mẫu DNT bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng VMN

Hầu hết các công bố về độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật hoặc bộ

sinh phẩm được đánh giá trên các mẫu lâm sàng. Đây cũng là cơ sở để đánh

giá chất lượng của các bộ sinh phẩm.

Sử dụng 120 mẫu dịch não tủy thu thập từ các bệnh nhân có các biểu

hiện lâm sàng viêm màng não từ Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch và Bệnh viện

Quân Y để thử nghiệm chẩn đoán bằng bộ sinh phẩm nested-PCR rồi so sánh

với các phương pháp xét nghiệm truyền thống bao gồm: soi tươi nhuộm mực

tàu, nuôi cấy và 01 bộ sinh phẩm đã được thương mại hóa trên thị trường là

bộ sinh phẩm Cryptococcus neoformans PCR Kit EP-42720 của hãng Norgen.

128

Kết quả ở bảng 3.35 cho thấy trong 120 mẫu nghiên cứu đã xác định có

7/120 mẫu dương tính với nấm C. neoformans bằng phương pháp soi tươi

nhuộm mực tàu; 8/120 mẫu dương tính bằng phương pháp nuôi cấy; tỷ lệ này

ở bộ sinh phẩm nested PCR là 7/120 và bộ sinh phẩm Norgen là 7/120. Trong

đó cả 7 mẫu dương tính với bộ sinh phẩm nested –PCR cũng dương tính với

phương pháp nuôi cấy và dương tính khi thử nghiệm với bộ sinh phẩm của

Norgen. Như vậy có thể đánh giá 7 mẫu dương tính này là kết quả đúng. Có

01 mẫu nuôi cấy dương tính nhưng âm tính với các phương pháp khác, mẫu

chỉ dương tính với phương pháp nuôi cấy này cũng có thể là do trong quá

trình nuôi cấy ngoại nhiễm với C. neoformans, cũng có thể là một loài khác

có hình thái giống với C. neoformans. Tỉ lệ nhiễm C.neoformans trong dịch

não tủy là 6,67% với phương pháp nuôi cấy.

Bảng 3.36 cho thấy kết quả so sánh giữa bộ sinh phẩm nested-PCR

#A011 - 02 với phương pháp nuôi cấy có độ nhạy là 87,5% ; độ đặc hiệu

100% ; giá trị tiên đoán dương là 100%và giá trị tiên đoán âm là 99,1%.

Bảng 3.37 cho thấy kết quả so sánh giữa bộ sinh phẩm nested PCR

#A011-02 với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu cho tỉ lệ phù hợp quan

sát là 96,7% và tỉ lệ phù hợp mong muốn là 89,0%. Hệ số tương đồng giữa 2

phương pháp xét nghiệm là 0,697 ở mức tương đồng.

Bảng 3.38 cho thấy hệ số tương đồng giữa 2 bộ sinh phẩm PCR là 1 ở

ngưỡng tương đồng rất cao hay hoàn toàn tương đồng với tỉ lệ phù hợp quan sát

100%; tỉ lệ phù hợp mong muốn 89,0%.

Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Hetal và cs (2011)

khi đánh giá tính khả năng áp dụng của que thử nhanh để chẩn đoán viêm

màng não tủy do nấm C. neoformans trên 63 mẫu dịch não tủy đã xác định tỷ

lệ nhiễm nấm là 14,28% bằng phương pháp latex; 11,11% bằng phương pháp

nhuộm mực tàu; 9,5% bằng phương pháp nuôi cấy [81]. Độ nhạy và độ đặc

129

hiệu của phương pháp nhuộm mực tàu là 83,3% và 96,49%. Trong khi đó các

giá trị này ở phương pháp Latex là 100% và 94,7% so với phương pháp nuôi

cấy [81]. Tuy nhiên trong nghiên cứu của Hetal thì khả năng phát hiện của

phương pháp nhuộm mực tàu cao hơn phương pháp nuôi cấy. Trong khi

nghiên cứu của chúng tôi thì ngược lại, phương pháp nuôi cấy cho tỷ lệ kết

quả xét nghiệm dương tính cao nhất, sau đó lần lượt là các phương pháp xét

nghiệm bằng kỹ thuật PCR, phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu cho kết quả

thấp nhất.

Binnicker và cs (2012) khi so sánh thử nghiệm để phát hiện nhiễm nấm

Cryptococcus với 4 loại xét nghiệm khác nhau đã chỉ ra độ nhạy, độ đặc hiệu

của các phương pháp có sự khác biệt. Thử nghiệm Media Latex có độ nhạy và

độ đặc hiệu 100%; trong khi đó với thử nghiệm miễn dịch ban đầu Premier

EIA có độ nhạy thấp hơn nhiều 55,6%, trong khi độ đặc hiệu vẫn là 100%;

Thử nghiệm miễn dịch với kháng thể alpha CrAg có độ nhạy là 100% và độ

đặc hiệu là 99,8% và thử nghiệm miễn dịch dòng chảy với kháng thể CrAg

cũng có độ nhạy và độ đặc hiệu là 100% [82], [83]. Tuy nhiên trong nghiên

cứu này tác giả chỉ so sánh giữa các phương pháp với nhau và không so sánh

với các chuẩn vàng truyền thống là nuôi cấy.

Năm 2015, Coovadia và cs khi đánh giá 2 kỹ thuật nhuộm Gram và

nhuộm mực tàu với kỹ thuật nuôi cấy để phát hiện viêm màng não tủy do nấm

Crytoccocus trên 90 bệnh nhân HIV ở Durban đã chỉ ra độ nhạy của phương

pháp nhuộm mực tàu là 89% tỷ lệ này ở phương pháp nhuộm Giemsa là 89%;

độ đặc hiệu của cả hai phương pháp là 100% [108].

Mbae và cs (2017) khi so sánh độ nhạy của phương pháp nhuộm mực tàu

và phương pháp miễn dịch sử dụng kháng nguyên CrAg - bộ sinh phẩm

CALAS cho thấy phương pháp nhuộm mực tàu có độ nhạy thấp 44% so với

CALAS là 94%. Độ đặc hiệu của phương pháp nhuộm mực tàu là 98% hơi

130

thấp hơn so với CALAS là 100% [109]. Kết quả nghiên cứu sử dụng bộ sinh

phẩm CALAS cũng tương đồng với các nghiên cứu tại Bắc Carolina (Tannel

và cs, 1994) tương ứng là 100% và 98% [110]; Nam Phi (Josephs và cs, 2009)

tỷ lệ này 100% và 96% [111]; trong khi đó nghiên cứu Zambia năm 2001 khi

so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của CrAg so với phương pháp nhuộm mực tàu

là 95% và 60%. Tannel và cs (1994) khi so sánh việc sử dụng kháng nguyên

CrAg được sử dụng với các bộ sinh phẩm khác nhau để chẩn đoán bệnh viêm

màng não do nấm Cryptococcus (CALAS, Crypto-LA, Myco-Immune, Immy

và EIA kit) cho thấy độ nhạy thay đổi từ 93 đến 100% và độ đặc hiệu trong

khoảng từ 93% đến 98% [110]. Reiss và cs (2002) đã chỉ ra những sai khác về

độ nhạy độ đặc hiệu này có thể do các chủng nấm khác nhau, giai đoạn

nhiễm, mật độ nấm và các phương pháp thử nghiệm.

Tỷ lệ nhiễm khi phát hiện sử dụng kháng nguyên CrAg gấp 2.12 có

nghĩa là kháng nguyên CrAg có khả năng phát hiện tốt hơn phương pháp

nhuộm mực tàu gấp 2 lần.

Saha và cs (2009) đã tiến hành nghiên cứu ở Ấn Độ trên 359 mẫu dịch

não tủy huyết thanh và nước tiểu trong đó có 46 bệnh nhân dương tính và 30

mẫu chứng âm với C.neoformans trong dịch não tủy để đánh giá độ nhạy, độ

đặc hiệu. Kết quả cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp

tương ứng: Nuôi cấy là 95,7% và 100%; soi tươi nhuộm mực tàu là 93,5% và

100%; PCR là 100% và 100% [40]. Kết quả này cũng tương đồng với các kết

quả của chúng tôi khi thử nghiệm trên dịch não tủy, độ nhạy và độ đặc hiệu

của các phương pháp giao động từ trên 85% đến 100%.

Klausner và cs (2013) đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu của xét nghiệm

miễn dịch dòng chảy trên dịch não tủy có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu

97,7%; tỷ lệ này trên mẫu huyết thanh là 100% và 99,5% [112].

Tang và cs (2015) đã có một báo cáo tổng quan điểm lại các nghiên cứu

131

về việc sử dụng kỹ thuật miễn dịch dòng chảy với kháng nguyên của nấm

Cryptococcus đã chỉ ra độ nhạy độ đặc hiệu của các phương pháp nghiên cứu

trên các nền mẫu khác nhau từ năm 2011- 2014 như sau [113]: Mac Mullan

(2012) độ nhạy đạt trên 91%, độ đặc hiệu 100%; Lindsley và cs (2011), độ

nhạy đạt từ 92%; Boulware và cs (2014), nuôi cấy dịch não tủy có độ nhạy

94,2%, mực tàu 81,6 %, miễn dịch 97%;

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ mẫu dịch não tủy

dương tính với nấm được phát biện bằng bộ sinh phẩm nested-PCR #A011-02

cao hơn kỹ thuật soi tươi nhuộm mực tàu nhưng thấp hơn kỹ thuật nuôi cấy và

tương đương với bộ sinh phẩm của hãng Norgen (Canada). Chúng tôi cũng

nhận định rằng, nếu lượng dịch não tủy quá ít có thể ảnh hưởng tới kết quả

phân tích vì mật độ nấm trong dịch não tủy thường rất thấp [22]. Khi phân

tích bằng kỹ thuật truyền thống đối với soi tươi và nuôi cấy, chúng tôi thường

phải ly tâm, loại bỏ dịch nổi để tập trung nấm thông thường khoảng 3-5 lần

sau đó mới tiến hành kỹ thuật. Hơn nữa, trong thực tế các mẫu dịch não tủy

thường được ưu tiên thực hiện chẩn đoán bằng các kỹ thuật truyền thống

trước sau đó phần còn lại mới tiến hành thử nghiệm bằng kỹ thuật sinh học

phân tử nên lượng bệnh phẩm còn lại có khi rất ít. Đây có thể cũng là một

nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt giữa kết quả của kỹ thuật nested-PCR thấp

hơn so với nuôi cấy.

Các chỉ số giá trị tiên đoán dương tính, giá trị tiên đoán âm tính và

chỉ số phù hợp chẩn đoán K appa đã được sử dụng để đánh giá hiệu quả

của các bộ sinh phẩm.

Với bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02, so với kỹ thuật nuôi cấy ở

bảng 3.36 trong chẩn đoán nhiễm C.neoformans kỹ thuật này cho giá trị

tiên đoán dương 100%, giá trị tiên đoán âm 99,1%. Điều này có nghĩa là

100% những trường hợp chẩn đoán dương tính bằng kỹ thuật nested PCR

132

có thể nghĩ tới nhiễm nấm C.neoformans thực sự và 99,1% không nghĩ tới

nhiễm C.neoformans khi kỹ thuật nested PCR cho kết quả âm tính. Nếu

coi nuôi cấy là phương pháp chuẩn vàng để so sánh thì trong chẩn đoán C.

neoformans ở dịch não tủy, bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 có độ

nhạy Se=87,5%, độ đặc hiệu Sp=100%. K ết quả này chỉ ra bộ sinh phẩm

có tỷ lệ chẩn đoán dương tính ở những bệnh nhân thực sự nhiễm

C.neformans ở dịch não tủy là 100% và tỷ lệ chẩn đoán đúng là âm tính

với C.neformans ở dịch não tủy của bộ sinh phẩm là 99,1%.

133

KẾT LUẬN

1. Xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn

đoán nhiễm nấm C.neoformans

Đã xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm

nấm C.neoformans tóm tắt như sau:

Bước 1. Lựa chọn 2 cặp mồi cho 02 phản ứng PCR với trình tự như sau

ITS4 R:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’

+ Phản ứng PCR1: ITS1 F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’;

CN5 R: 3’-GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G-5’

+ Phản ứng PCR2: CN4 F: 3’-ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T-5’;

Bước 2. Xây dựng các điều kiện cơ bản cho kỹ thuật nested-PCR phát hiện C.

neoformans trong dịch não tủy

+ Điều kiện cho phản ứng PCR1:

Thành phần phản ứng: Nồng độ dNTPs 200µM, mồi 0,02µM, Mg2+ 2,0

mM, nồng độ Taq DNA polymerase là 0,5U trong 25 µl thể tích phản ứng.

Chu trình nhiệt là: 1 chu kỳ 94oC/5 phút; 25 chu kỳ, mỗi chu kỳ 94oC/40 giây,

56oC/40 giây, 72oC/40 giây; 1 chu kỳ 72oC/7 phút.

+ Điều kiện cho phản ứng PCR2:

Thành phần phản ứng: Nồng độ dNTPs 200µM, mồi 0,02µM, Mg2+ 2,0

mM, nồng độ Taq DNA polymerase là 0,5U trong 25 µl thể tích phản ứng.

Chu trình nhiệt như PCR1 nhưng ở nhiệt độ gắn mồi là 57oC.

Bước 3. Xác định ngưỡng phát hiê ̣n củ a kỹ thuật nested-PCR: ≥ 102 CFU/ml trong dịch treo nấm;

Bước 4. Xây dựng chứng dương cho phản ứng PCR: Chứng dương là ADN

được tách chiết, từ chủng chuẩn ATCC® 90113 Chứng dương được đo nồng

độ ADN và được điều chỉnh đến nồng độ 0,5 ng/µl.

134

Bước 5. Xây dựng chứng âm cho phản ứng PCR: Chứng âm là ADN được

tách chiết từ các mẫu dịch não tủy đã được xác định không nhiễm nấm C.

neoformans bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

Bước 6. Đóng gói bộ sinh phẩm: Bao gồm 8 thành phần: 02 ống dung dịch

MC-CR1; 01 ống dung dịch MC-CR2; 02 ống dung dịch CR1, Dung dịch

CR2; Dung dịch M100, Dung dịch LD100, Chứng dương, Chứng âm. Có 01

hướng dẫn sử dụng và tiêu chuẩn cơ sở.

2. Về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm tạo ra

trong chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans dịch não tủy.

- Về độ nhạy độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm:

+Trên chủng chuẩn dương và 51 chủng C. neoformans phân lập ở Việt

Nam độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm đều đạt 100%.

+ Đánh giá trên 20 dịch não tủy giả định từ nồng độ 102CFU/ml đến

105CFU/ml độ nhạy là 92,5%; độ đặc hiệu là 100%. Giá trị tiên đoán dương là

100% và giá trị tiên đoán âm là 87% với mức độ tin cậy 95%.

- Đánh trên 120 mẫu dịch não tủy có biểu hiện lâm sàng viêm màng não:

+ So sánh với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu hệ số tương đồng là 0,697.

+ So sánh kết quả với phương pháp nuôi cấy, độ nhạy đạt 87,5%; độ đặc

hiệu 100%. Giá trị tiên đoán dương 100% và giá trị tiên đoán âm 99,1%.

+ So sánh kết quả với bộ sinh phẩm Norgen hệ số tương đồng là 1.

- Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế kết luận bộ sinh phẩm

chẩn đoán nested-PCR có độ nhạy đạt 98,11%; độ đặc hiệu 100%; ngưỡng

phát hiện 0,4pg/µl khi thực hiện trên bộ mẫu chuẩn của nhà sản xuất.

- Bộ sinh phẩm nested-PCR phát hiện nấmC. neoformans trong dịch não tủy

đảm bảo tính ổn định sau 12 tháng sản xuất khi bảo quản ở nhiệt độ - 200C.

135

KIẾN NGHỊ

Căn cứ vào kết quả nghiên cứu, đề tài có một số kiến nghị sau đây:

Tiếp tục đánh giá bộ sinh phẩm nested-PCR trên các mẫu lâm sàng ở

diện rộng hơn để khẳng định tính hiệu quả của bộ sinh phẩm. Đánh giá giá trị

kinh tế và hiệu quả áp dụng của bộ sinh phẩm trên thị trường Việt Nam.

Nghiên cứu cải tạo cách thức đóng gói bộ sinh phẩm phù hợp với yêu

cầu của các đơn vị sử dụng, đăng ký sở hữu trí tuệ và công nghệ để có thể sản

xuất bộ sinh phẩm cung cấp cho các bệnh viện tuyến Tỉnh, tuyến Trung ương

và các cơ sở nghiên cứu, giảng dạy trong cả nước có trang bi ̣ máy PCR.

TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài đã áp dụng các phương pháp nghiên cứu có tính khoa học chuẩn

mực hiện đang áp dụng rộng rãi tại Việt Nam và Thế giới như:

- Hoàn thiện được quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR định loài

nấm C. neoformans trong dịch não tủy của người Việt Nam.

- Trên cơ sở áp dụng tổng hợp các phương pháp nghiên cứu truyền

thống và hiện đại, phù hợp, bố trí thí nghiệm, tính toán thống kê một cách

khoa học nên các kết quả của để tài có giá trị và độ tin cậy cao.

Đây là nghiên cứu đầu tiên nghiên cứu xây dựng bộ sinh phẩm chẩn đoán

nấm C. neoformans trên dịch não tủy bằng phương pháp nested-PCR ở Việt

Nam. Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm

nested-PCR dựa trên sự kết hợp mới giữa 2 bộ mồi ITS1, ITS4 và CN4, CN5.

Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Kết quả của đề tài đã bước đầu khẳng định việc các cơ sở nghiên cứu

khoa học của Việt Nam có thể sản xuất được các bộ sinh phẩm chẩn đoán có

độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện tương đương với các nghiên cứu

tương tự trên thế giới.

Bộ sinh phẩm đã được đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu tính ổn định tại

phòng thí nghiệm và tại thực địa hẹp (02 bệnh viện) đảm bảo tính chính xác

và khả năng áp dụng trên diện rộng hơn của bộ sinh phẩm.

Là cơ sở để tiếp tục triển khai, sản xuất, ứng dụng bộ sinh phẩm trong

chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans tại các đơn vị xét nghiệm chẩn đoán lâm

sàng, cung cấp kết quả xét nghiệm nhanh, chính xác từ đó đề xuất phương án

điều trị sớm, hiệu quả phù hợp.

Qua đề tài này, các cán bộ nghiên cứu có thể tiếp tục mở rộng xây dựng

các bộ sinh phẩm chẩn đoán với các đối tượng nghiên cứu khác dựa trên kỹ

thuật sinh học phân tử.

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN TRỰC TIẾP

ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ

1. Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong Sinh, Nguyen Thi Huong Binh, Do

Ngoc Anh (2018), “Establish and optimization nested PCR reaction determine

Cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid'', Tạp chí Phòng chống bệnh

sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 6/2018.

2. Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong sinh, Nguyen Thi Huong Binh, Nguyen

Khac Luc (2018), “Evaluation sensitivity, specificity and stable of nested-

PCR kit detect cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid” Tạp chí

Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 6/2018.

3. Trần Thị Quỳnh Liên, Cao Trường Sinh, Nguyễn Thị Hương Bình, Trần

Thanh Dương (2019), "Đánh giá khả năng chẩn đoán Cryptococcus

neoformans trong dịch não tủy của bộ sinh phẩm nested-PCR với kỹ thuật

nuôi cấy, soi tươi và bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán của Norgen'' Tạp chí

Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 61/20194.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nhữ Thị Hoa và CS (2012), "Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của viêm

não-màng não do Cryptococcus neoformans tại Bệnh viện Nhiệt đới Tp.HCM

từ 11/2008 đến 6/2009", Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, chuyên đề Ký sinh

trùng, 16(1/2012), tr. 76-82.

2. Martins M.A; Brighente K.S; Matos T.A. et al (2015), Molecular diagnosis

of cryptococcal meningitis in cerebrospinal ﬂuid: comparison of primer sets

for Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii species complex,

Brazilian Journal of Infectious Diseases, 19(1), pp. 62-67.

3. Bicanic T; Harrison T.S (2004), Cryptococcal meningitis, British medical

bulletin, 72(1), pp. 99-118.

4. Day Jeremy N (2004), Cryptococcal meningitis, Practical neurology,

(11/2004), pp. 274-285.

5. Safdieh J.E; Mead P.A; Sepkowitz K.A. et al (2008), Bacterial and fungal

meningitis in patients with cancer, Neurology, 70(12), pp. 943-947.

6. Louie J.K; Chi N.Huu; Thao L.T.T. et al (2004), Opportunistic infections in

hospitalized HIV-infected adults in Ho Chi Minh City, Vietnam: a cross-

sectional study, International journal of STD & AIDS, 15(11), pp. 758-761.

7. Anil A. Panackal; Simone C. Wuest; Yen-Chih Lin. et al (2015),

Paradoxical Immune Responses in Non-HIV Cryptococcal Meningitis, PLOS

Pathogens, 11(5), e1004884.

8. Eileen K. Maziarz and John R. Perfect (2016), Cryptococcosis, Infectious

disease clinics of North America, 30(1), pp.179-206.

9. Perfect J.R (2013), Fungal diagnosis: how do we do it and can we do

better?, Current medical research and opinion, 29(sup4), pp. 3-11.

10. Khater W.S; Elabd S.H (2016), "Identification of Common Bacterial

Pathogens Causing Meningitis in Culture-Negative Cerebrospinal Fluid

Samples Using Real-Time Polymerase Chain Reaction", International

Journal of Microbiology, 2016, pp. 4197187.

11. Tang Y.W; Stratton C.W (2012), Advanced Techniques in Diagnostic

Microbiology, Springer US.

12. M. Wilks (2012), PCR Detection of Microbial Pathogens, Humana Press.

13. Kwon-Chung K.J; Fraser J.A; Doering T.L. et al (2014), Cryptococcus

neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis,

Cold Spring Harbor perspectives in medicine, 4(7), a019760.

14. Fang W; Fa W; Liao W (2015), Epidemiology of Cryptococcus and

cryptococcosis in China, Fungal Genetics and Biology, 78, pp. 7-15.

15. Kwon-Chung K.J; Varma A (2006), Do major species concepts support

one, two or more species within Cryptococcus neoformans?, FEMS Yeast

Research, 6(4), pp. 574-587.

16. Lin X; Heitman J (2006), The biology of the Cryptococcus neoformans

species complex, Annu. Rev. Microbiol, 60, pp. 69-105.

17. Xiaorong Lin (2009), Cryptococcus neoformans: morphogenesis,

infection, and evolution, Infection, Genetics and Evolution, 9(4), pp. 401-

416.

18. Montagna M.T; Antonella D; Caggiano G. et al (2018), Molecular

characterization of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii from

environmental sources and genetic comparison with clinical isolates in

Apulia, Italy, Environmental research, 160, pp. 347-352.

19. Jahromi S.B; Khaksar A.A (2006), Paranasal sinus mycosis in suspected

fungal sinusitis, Arch Clin Infect Dis, 1, pp. 25-29.

20. Hagen F; Khayhan K; Theelen B. et al (2015), Recognition of seven

species in the Cryptococcus gattii/Cryptococcus neoformans species complex,

Fungal Genetics and Biology, 78, pp. 16-48.

21. Alspaugh J Andrew (2015), Virulence mechanisms and Cryptococcus

neoformans pathogenesis, Fungal genetics and biology, 78, pp.55-58.

22. Infectious Disease Epidemiology Section (2017), Cryptococcosis, Office

http://ldh.la.gov/assets/oph/Center-PHCH/Center-CH/infectious-

epi/EpiManual/CryptococcosisManual.pdf.

of Public Health, Louisiana Department of Health,

23. Edwards V.E; Sutherland J.M; Tyrer J.H (1970), Cryptococcosis of the

central nervous system: epidemiological, clinical, and therapeutic features,

Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 33(4), pp. 415-425.

24. Gliksman F.J (2017), "CNS Cryptococcosis in HIV, Medscape, pp.1-8.

25. Watkins R; Jason S.K; Simon A.J (2017), Nutritional requirements and

their importance for virulence of pathogenic Cryptococcus species,

Microorganisms, 5(4), pp. 65.

26. Colombo F.A; Elsemann R.B; Conde A. et al (2014), Updating:

cryptococcosis diagnostic aspects, Journal of AIDS and Clinical Research,

5(12).

27. Yadalla H.K.K; Rao G.R.R (2011), Cutaneous cryptococcosis: A marker

of life threatening disseminated cryptococcosis in HIV AIDS, Our Dermatol

Online, 2, pp. 203-206.

28. Olszewski M.A; Zhang Y; Huffnagle G.B (2010), Mechanisms of

cryptococcal virulence and persistence, Future microbiology, 5(8), pp. 1269-

1288.

29. Chen Y; Toffaletti D.L; Tenor J.L. et al (2014), The Cryptococcus

neoformans transcriptome at the site of human meningitis, MBio, 5(1),

e01087-13.

30. Park B.J; Wannemuehler K.A; Marston B.J. et al (2009), Estimation of the

current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with

HIV/AIDS, Aids, 23(4), pp. 525-530.

31. Nalintya E; Kiggundu R; Meya D (2016), Evolution of cryptococcal

antigen testing: what is new?, Current fungal infection reports, 10(2), pp.62-

67.

32. Rajasingham R; Smith R.M; Park B.J. et al (2017), Global burden of

disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis, The

Lancet infectious diseases, 17(8), pp. 873-881.

33. Althea Campuzano; Floyd L Wormley (2018), Innate Immunity against

Cryptococcus, from Recognition to Elimination, Journal of Fungi, 4(1), pp.

33.

34. Sorrell Tania C; Sharon C-A Chen; Peter Phillips. et al (2011), Clinical

perspectives on Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii:

implications for diagnosis and management, Cryptococcus, American Society

of Microbiology, pp. 595-606.

35. Perfect J. R; Bicanic T (2015), Cryptococcosis diagnosis and treatment:

what do we know now, Fungal Genetics and Biology, 78, pp.49-54.

36. Trần Phủ Mạnh Siêu; Lê Mạnh Hùng và Trần Văn Hiển (2006), "Tình

hình nhiễm vi nấm nội tạng trên bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh viện Nhiệt

đới 2003-2005", Y học thành phố Hồ Chí MInh, 10, tr. 99-104.

37. Kammalac T.N; Dongtsa J; Kouanfack C. et al (2015), Cryptoccocal

meningitis in Yaoundé (Cameroon) HIV infected patients: Diagnosis,

frequency and Cryptococcus neoformans isolates susceptibility study to

fluconazole, Journal de mycologie medicale, 25(1), pp. 11-16.

38. Boulware D.R; Rolfes M.A; Rajasingham R. et al (2014), Multisite

validation of cryptococcal antigen lateral flow assay and quantification by

laser thermal contrast, Emerging infectious diseases, 20(1), pp.45–53.

39. Kozel T.R; Wickes B (2014), Fungal diagnostics, Cold Spring Harbor

perspectives in medicine, 4(4), a019299.

40. Saha C. D; Immaculata X; Ashutosh B. et al (2009), Detection of

Cryptococcus by conventional, serological and molecular methods, Journal of

medical microbiology, 58(8), pp.1098-1105.

41. Rivera V; Marcela G; Cesar M.C. et al (2015), Validation and clinical

application of a molecular method for the identification of Cryptococcus

neoformans/Cryptococcus gattii complex DNA in human clinical specimens,

The Brazilian Journal of Infectious Diseases, 19(6), pp.563-570.

42. Mitchell T. G; Freedman E. Z; White T. J. et al (1994), Unique

oligonucleotide primers in PCR for identification of Cryptococcus

neoformans, Journal of clinical microbiology, 32(1), pp.253-255.

43. Prariyachatigul C; Chaiprasert A; Meevootisom V. et al (1996),

Assessment of a PCR technique for the detection and identification of

Cryptococcus neoformans, Journal of medical and veterinary mycology,

34(4), pp.251-258.

44. Mirhendi S.H; Kordbacheh P; Kazemi B. et al (2001), A PCR-RFLP

method to identification of the important opportunistic fungi: Candida

species, Cryptococcus neoformans, Aspergillus famigatus and Fusarium

solani", Iranian Journal of Public Health, 30(3-4), pp.103-106.

45. Paschoal R.C; Hirata M.H; Hirata R.C. et al (2004), Neurocryptococcosis:

diagnosis by PCR method, Revista do Instituto de Medicina Tropical de São

Paulo, 46(4), pp.203-207.

46. Diaz M. R; Fell J. W (2005), Use of a suspension array for rapid

identification of the varieties and genotypes of the Cryptococcus neoformans

species complex, Journal of clinical microbiology, 43(8), pp.3662-3672.

47. Sugita T; Masamitsu N; Reiko I. et al (2001), A nested PCR assay to

detect DNA in sera for the diagnosis of deep‐seated trichosporonosis,

Microbiology and immunology, 45(2), pp.143-148.

48. Rappelli P; Are R; Casu G. et al (1998), Development of a Nested PCR

for Detection of Cryptococcus neoformans in Cerebrospinal Fluid, Journal of

clinical microbiology, 36(11), pp.3438-3440.

49. Rivera V; Marcela G; Cesar M.C. et al (2015), Validation and clinical

application of a nested PCR for paracoccidioidomycosis diagnosis in clinical

samples from Colombian patients, Brazilian Journal of Infectious Diseases,

19(4), pp.376-383.

50. Jahromi S.B; Khaksar A.A (2006), Paranasal sinus mycosis in suspected

fungal sinusitis, Arch Clin Infect Dis, 1, pp. 25-29.

51. Bialek R; Michael W; Kubrom B.N. et al (2002), Detection of

Cryptococcus neoformans DNA in tissue samples by nested and real-time

PCR assays, Clinical and diagnostic laboratory immunology, 9(2), pp.461-

469.

52. Velegraki.A; Kiosses V. G; Kansouzidou. A. et al (2001), Prospective use

of RFLP analysis on amplified Cryptococcus neoformans URA 5 gene

sequences for rapid identification of varieties and serotypes in clinical

samples, Medical mycology, 39(5), pp.409-417.

53. Feng X; Yao Z; Ren. et al (2008), Simultaneous identification of

molecular and mating types within the Cryptococcus species complex by

PCR-RFLP analysis, Journal of medical microbiology, 57(12), pp.1481-

1490.

54. Đỗ Ngọc Ánh và CS (2015), "Xác định thành phần loài nấm men phân lập

từ máu người bằng kỹ thuật PCR-RFLP", Tạp chí Y dược lâm sàng 108,

10(9/2015), tr. 51-56.

55. Đỗ Ngọc Ánh và CS (2013), "Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP phát hiện

nấm Cryptococcus neoformans gây bệnh ở người", Tạp chí Y học Việt Nam,

4(1/2013), tr. 79-85.

56. Sousa D.R.T; Santos C.S.S; Wanke B. et al (2015), PCR-RFLP as a useful

tool for diagnosis of invasive mycoses in a healthcare facility in the North of

Brazil, Electronic Journal of Biotechnology, 18(3), pp.231-235.

57. Ito‐Kuwa S; Nakamura K; Aoki S. et al (2007), Serotype identification of

Cryptococcus neoformans by multiplex PCR, Mycoses, 50(4), pp.277-281.

58. Rhein J; Nathan C. B; Andrew C. H. et al (2016), Diagnostic performance

of a multiplex PCR assay for meningitis in an HIV-infected population in

Uganda, Diagnostic microbiology and infectious disease, 84(3), pp.268-273.

59. Leal A.L; Faganello J; Cristina B.M (2008), Cryptococcus species

identification by multiplex PCR, Medical mycology, 46(4), pp.377-383.

60. Taira C.L; Okay T.S; Delgado A.F. et al (2014), A multiplex nested PCR

for the detection and identification of Candida species in blood samples of

critically ill paediatric patients, BMC infectious diseases, 14(1), pp.406.

61. Nguyễn Trọng Chính và Nguyễn Duy Bắc (2017), Nấm Cryptococcus

neoformans Sinh học, bệnh học, chẩn đoán, điều trị, Nhà xuất bản Khoa học

và Kỹ thuật, Hà Nội.

62. Tavares E.R; Azevedo C.S; Panagio L.A. et al (2015), Accurate and

sensitive real-time PCR assays using intergenic spacer 1 region to

differentiate Cryptococcus gattii sensu lato and Cryptococcus neoformans

sensu lato, Medical mycology, 54(1), pp.89-96.

63. Bialek R; Kubrom B.N; Michael W. et al (2002), Detection of

Cryptococcus neoformans DNA in tissue samples by nested and real-time

PCR assays, Clinical and diagnostic laboratory immunology, 9(2), tr.

pp.461-469.

64. Eberling A. J; và Jill B.S; Monica M. R. et al (2011), Development,

optimization, and validation of a Classical swine fever virus real-time reverse

transcription polymerase chain reaction assay, Journal of veterinary

diagnostic investigation, 23(5), pp.994-998.

65. Klein K. R; Hall L; Deml S. M. et al (2009), Identification of

Cryptococcus gattii by use of L-canavanine glycine bromothymol blue

medium and DNA sequencing, Journal of clinical microbiology, 47(11),

pp.3669-3672.

66. Veron V; Simon S; Blanchet D. et al (2009), Real-time polymerase chain

reaction detection of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii in

human samples, Diagnostic microbiology and infectious disease, 65(1),

pp.69-72.

67. Satoh K; Maeda M; Umeda Y. et al (2011), Detection and identification of

probable endemic fungal pathogen, Cryptococcus gattii, and worldwide

pathogen, Cryptococcus neoformans, by real‐time PCR, Microbiology and

immunology, 55(6), pp.454-457.

68. Cidiane G.M; Rocha S.F; Christo P.P. et al (2016), Use of Polymerase

chain Reaction for Cryptococcus neoformans Genome Detection in

Cerebrospinal Fluid for Neurocryptococcosis Diagnosis, Med Mycol Open

Access, 2(2: 13).

69. Abd-Elsalam K.A (2003), Bioinformatic tools and guideline for PCR

primer design, african Journal of biotechnology, 2(5), pp.91-95.

http://hpc.ilri.cgiar.org/beca/training/IMBB/lectures/PCR_Primer_Design_2013.pdf

70. Nelson Ndegwa (2013), PCR Primer Desig

71. Apte A; Daniel S (2009), PCR primer design, Cold Spring Harbor

Protocols, 2009(3), doi. pdb. ip65.

72. Tabone T; Mather D.E; Hayden M (2009), Temperature switch PCR

(TSP): Robust assay design for reliable amplification and genotyping of

SNPs, BMC genomics, 10(1), pp.580.

73. Scott M.C; Harmon J.R; Tsao J.I. et al (2012), Reverse line blot probe

design and polymerase chain reaction optimization for bloodmeal analysis of

ticks from the eastern United States, Journal of medical entomology, 49(3),

pp.697-709.

74. Naeger D.M; Kohi M.P; Webb E.M. et al (2013), Correctly using

sensitivity, specificity, and predictive values in clinical practice: how to avoid

three common pitfalls, American Journal of Roentgenology, 200(6),

pp.W566-W570.

75. Nugent W.R (2005), The role of prevalence rates, sensitivity, and

specificity in assessment accuracy: Rolling the dice in social work process,

Journal of social service research, 31(2), pp.51-75.

76. Nishikawa R.M; Pesce L.L (2013), Estimating sensitivity and specificity

for technology assessment based on observer studies, Academic radiology,

20(7), pp. 825-830.

77. Cruz M.L; Perez A; Domínguez M.et al (2016), Assessment of the

sensitivity and specificity of serological (IFAT) and molecular (direct‐PCR)

techniques for diagnosis of leishmaniasis in lagomorphs using a Bayesian

approach, Veterinary Medicine and Science, 2(3), pp.211-220.

78. Mackenzie D (2017), Statistical aspects of screening tests, including

knowledge of and ability to calculate, sensitivity, specificity, positive and

Https://www.healthknowledge.org.uk.

negative predictive values, and the use of ROC curves

79. Trevethan R (2017), Sensitivity, specificity and Predictive values:

Foundations, Pliabilities, and Pitfalls in research and Practice, Frontiers in

public health, 5, pp. 307.

80. Nugent W R (2005), "The role of prevalence rates, sensitivity, and

specificity in assessment accuracy: Rolling the dice in social work process",

Journal of social service research, 31(2), pp.51-75.

81. Hetal S Shah (2011), Evaluation of conventional and serological methods

for rapid diagnosis of Cryptococcal meningitis in HIV seropositive patients at

tertiary care hospital, National Journal of Community Medicine, 2(3),

pp.354-357.

82. Binnicker M.J; Jespersen D.J; Bestrom J.E. et al (2012), "A comparison of

four assays for the detection of cryptococcal antigen", Clinical and Vaccine

Immunology, CVI. 00446-12.

83. Margaret V.P; Kimberly E.H (2016), Nonculture diagnostics in fungal

disease, Infectious Disease Clinics, 30(1), pp.37-49.

84. Klausner J.D; Vijayan T and Chiller T (2013), Sensitivity and specificity

of a new cryptococcal antigen lateral flow assay in serum and cerebrospinal

fluid, MLO: medical laboratory observer, 45(3), pp.16-20.

85. Bộ Y Tế (2017), Hướng dẫn lấy mẫu, đóng gói, bảo quản và vận chuyển

mẫu bệnh phẩm bệnh truyền nhiễm, Y Học, Hà Nội, 44.

86. Bộ Y tế (2017), Kỹ thuật vi sinh, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội, 303.

87. Dyal J; Akampurira A; Rhein J. et al (2016), Reproducibility of CSF

quantitative culture methods for estimating rate of clearance in cryptococcal

meningitis, Sabouraudia, 54(4), pp.361-369.

88. Luo G; Mitchell T.G (2002), Rapid Identification of Pathogenic Fungi

Directly from Cultures by Using Multiplex PCR, journal of clinical

microbiology, 40(8), pp. 2860–2865.

89. Lalkhen A.G (2008), Clinical tests: sensitivity and specificity, Continuing

Education in Anaesthesia Critical Care & Pain, 8(6), pp.221-223.

90. Carvajal D.N; Rowe P.C (2010), Sensitivity, specificity, predictive values,

and likelihood ratios, Pediatr Rev, 31(12), pp.511-513.

91. Idnurm A; Lin X (2015), Rising to the challenge of multiple Cryptococcus

species and the diseases they cause, Fungal Genetics and Biology, 78, pp.1-6.

92. Raja H.A; Miller A.N; Pearce C.J. et al (2017), Fungal Identification

Using Molecular Tools: A Primer for the Natural Products Research

Community, Journal of Natural Products, 80(3), pp.756-770.

93. Zhao J; Kong F; Li R. et al (2001), Identification of aspergillus fumigatus

and related species by nested PCR targeting ribosomal DNA internal

transcribed spacer regions", Journal of Clinical Microbiology, 39(6),

pp.2261-2266.

94. Kumari S; Verma R.K; SinghD.P. et al (2016), Comparison of Antigen

Detection and Nested PCR in CSF Samples of HIV Positive and Negative

Patients with Suspected Cryptococcal Meningitis in a Tertiary Care Hospital,

Journal of Clinical and Diagnostic Research : JCDR, 10(4), pp. DC12-

DC15.

95. Paschoal RC. et al (2004), Neurocryptococcosis: diagnosis by PCR

method, Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 46(4), pp.203–207.

96. Đỗ Ngọc Ánh và CS (2014), "Nghiên cứu phát hiện nấm Cryptococcus

neoformans bằng kỹ thuật Nested-PCR", Tạp chí phòng chống Sốt rét và các

bệnh Ký sinh trùng, (3/2014), tr.75-80.

97. Guizhen Luo. et al (2002), Rapid Identification of Pathogenic Fungi

Directly from Cultures by Using Multiplex PCR, J Clin Microbiol, 40(8), pp.

2860–2865.

98. Đỗ Ngọc Ánh (2015), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để

phát hiện nhiễm Candida sp. và Cryptococcus neoformans trong dịch não tủy

(Đề tài cấp Bộ Quốc phòng), Học viện Quân y, Hà Nội.

99. Đỗ Ngọc Ánh và CS (2013), "Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP phát hiện

nấm Cryptococcus neoformans gây bệnh ở người", Tạp chí Y học Việt Nam,

4(1/2013), tr.79-85.

100. Martins M.A; Brighente K.B; Matos T.A. et al (2015), Molecular

diagnosis of cryptococcal meningitis in cerebrospinal fluid: comparison of

primer sets for Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii species

complex, The Brazilian Journal of Infectious Diseases, 19(1), pp.62-67.

101. Dharmshale S; Bharadwaj R. (2015), Role of Polymerase Chain reaction

(PCR) amplifying conserved 5.8S and ITS regions of the cryptococcal DNA

in the diagnosis of Cryptococcal meningitis, 2015, 4(2), pp.5.

102. Takahashi T; Goto M; Kanda T. et al (2003), Utility of testing

bronchoalveolar lavage fluid for cryptococcal ribosomal DNA, Journal of

international medical research, 31(4), pp.324-329.

103. Chen Y. C; Eisner J. D; Kattar M. M. et al (2001), Polymorphic internal

transcribed spacer region 1 DNA sequences identify medically important

yeasts, J Clin Microbiol, 39(11), pp.4042-51.

104. Mirhendi S.H. et al (2001), A PCR-RFLP method to Identification of the

Important Opportunistic Fungei: Candida Species, Cryptococcus neoformans,

Aspergillus fumigatus and Fusarium solani, Iranian J. Publ. Health, 30(3-4),

pp. 103-106.

105. Victor A. Ma. et al (2013), Rapid screening of Candida albicans yeasts

associated with vulvovaginal candidiasis in Tanzania using Nested PCR,

International Journal of Research in Biological Sciences, 3(3), pp.136-140.

106. Guizhen Luo. et al (2002), Rapid Identification of Pathogenic Fungi

Directly from Cultures by Using Multiplex PCR, Journal of Clinical

Microbiology, 40(8), pp.2860–2865.

107. Hsu M.C; Chen K.W; Lo H.J. et al (2003), Species identification of

medically important fungi by use of real-time LightCycler PCR, Journal of

medical microbiology, 52, pp.1071-1076.

108. Coovadia Y.M.C; Mahomed S; Dorasamy A. et al (2015), A comparative

evaluation of the Gram stain and India ink stain for the rapid diagnosis of

cryptococcal meningitis in HIV infected patients in Durban, Southern African

Journal of Infectious Diseases, 30(2), pp.61-63.

109. Mbae N.G (2017), Laboratory Diagnosis of Cryptococcal Meningitisin

Human Immunodeficiency Virus Infection and Acquired Immune Deficiency

Syndrome Patients at Moi Teaching and Referral Hospital, International

Journal of Innovative Research and Development, 6(3).

110. Tanner D.C; Weinstein M.P; Fedorciw B. et al (1994), Comparison of

commercial kits for detection of cryptococcal antigen, Journal of clinical

microbiology, 32(7), pp.1680-1684.

111. Josephs K.A; Ahlskog J.K; Parisi J E. et al (2009), Rapidly progressive

neurodegenerative dementias, Archives of neurology, 66(2), pp.201-207.

112. Kabanda T; Siedner M.J; Klausner J.D. et al (2013), Point-of-care

diagnosis and prognostication of cryptococcal meningitis with the

cryptococcal antigen lateral flow assay on cerebrospinal fluid, Clinical

infectious diseases, 58(1), pp.113-116.

113. Tang M.W; Clemons K.V; Katzenstein D.A. et al (2016), The

cryptococcal antigen lateral flow assay: A point-of-care diagnostic at an

opportune time, Critical reviews in microbiology, 42(4), pp.634-642.

Luận án tiến sĩ Y học: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO

BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM

Cryptococcus neoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO

BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM

Cryptococcusneoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY

Chủngchuẩn và các chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam

Xác định các điều kiện kỹ thuật nested - PCRphát hiện C. neoformans

Xác định các điều kiện cho PCR1

Xác định các điều kiện cho PCR2

Thiết lập quy trình kỹ thuật nested –PCR chẩn đoán C. neoformans

Xác định tính đặc hiệu trên các mẫu chuẩn âm

Xác định ngưỡng phát hiện trên panel chuẩn dương

Xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested - PCR

Chế tạo bộ sinh phẩm nested – PCR chẩn đoán C. neoformans ở quy mô phòng thí nghiệm

Đánh độ ổn định trên mẫu C. neoformans chuẩn ACTT 90113

Đánh giá độ tương đồng với nuôi cấy, soi tươi và bộ sinh phẩm của Norgen

Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn và mẫu nhiễm C. neoformans giả định

Kiểm định bộ sinh phẩm tại viẹn kiểm đinh QG về vắc xin và sinh phẩm y tế

KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ

Nồng

Nhiệt độ gắn mồi

độ

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Mg2+

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok