Luận án tiến sĩ Y học: Nghiên cứu ứng dụng virus vaccine sởi và quai bị gây ly giải tế bào điều trị ung thu gan và đại trực tràng trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ DUY CƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ

ĐẠI TRÀNG NGƯỜI CỦA VIRUS VACCINE SỞI

VÀ QUAI BỊ TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ DUY CƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ

ĐẠI TRÀNG NGƯỜI CỦA VIRUS VACCINE SỞI

VÀ QUAI BỊ TRÊN THỰC NGHIỆM

Chuyên ngành: Khoa học y sinh

Mã số: 9720101

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Nguyễn Lĩnh Toàn 2. PGS.TS. Hồ Anh Sơn

HÀ NỘI, NĂM 2019

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc!

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám đốc Học Viện, Bộ môn

Sinh lý bệnh, Viện nghiên cứu Y-Dược học quân sự, Phòng Sau đại học, Học

viện Quân y đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh học tế bào, khoa Sinh học và

Phòng Thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzym và Protein (KLEPT),

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều

kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Hình thái, Viện 69, Bộ Tư Lệnh

Lăng Chủ Tịch Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn

thành luận án này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn, PGS.TS.

Hồ Anh Sơn, những người thầy đã tận tình trực tiếp dạy dỗ, dìu dắt, hướng

dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn

thành luận án này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng đến các thầy cô trong hội

đồng chấm luận án đã dành nhiều thời gian và công sức chỉ bảo, giúp đỡ tôi

hoàn thành bản luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên, giúp đỡ vô tư, tận tình của

các anh chị đi trước, đồng nghiệp, bạn bè trong quá trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới công ơn nuôi dạy của cha mẹ tôi,

sự quan tâm giúp đỡ, động viên của vợ, con, anh, chị, em và bạn bè thân thiết

để tôi có được ngày hôm nay.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Lê Duy Cương

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong

đề tài nghiên cứu có tên: “Nghiên cứu ứng dụng virus vaccine sởi và quai bị

gây ly giải tế bào điều trị ung thu gan và đại trực tràng trên thực nghiệm”. Kết

quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là một thành viên

chính. Tôi đã được Chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm

nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài này vào trong luận án để bảo vệ

lấy bằng tiến sĩ. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa

từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Lê Duy Cương

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

1.1. Giới thiệu chung ..................................................................................... 3

1.2. Ung thư đại trực tràng ............................................................................ 5

1.2.1. Tình hình ung thư đại trực tràng ...................................................... 5

1.2.2. Nguyên nhân ung thư đại trực tràng ................................................ 6

1.2.3. Cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng .................................. 7

1.3. Liệu pháp virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư đại trực tràng

người ........................................................................................................... 22

1.3.1. Sinh học virus sởi và quai bị .......................................................... 22

1.3.2. Virus vaccine sởi và quai bị lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư

đại trực tràng ............................................................................................ 24

1.3.3. Các cơ chế virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư

đại trực tràng ............................................................................................ 27

1.4. Các nghiên cứu virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư trên lâm

sàng .............................................................................................................. 35

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 38

2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 38

2.1.1. Động vật ......................................................................................... 38

2.1.2. Chất liệu nghiên cứu ...................................................................... 38

2.1.3. Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu .......................................... 38

2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 40

2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và tăng sinh các dòng tế bào .................... 40

2.2.2. Phương pháp tăng sinh và chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị

từ nguồn virus vaccine ............................................................................. 42

2.2.3. Phương pháp đánh giá virus vavccine sởi và quai bị ly giải tế bào

bằng thử nghiệm 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium

bromide ..................................................................................................... 45

2.2.4. Chuẩn bị mẫu tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị

đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình và tế bào hoại tử bằng

phương pháp dòng chảy ........................................................................... 48

2.2.5. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo

chương trình và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế bào dòng

chảy ........................................................................................................... 51

2.2.6. Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) ........... 54

2.2.7. Phương pháp tạo khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-

29 trên dùi chuột thiếu hụt miễn dịch và tính kích thước khối u .............. 55

2.2.8. Phương pháp điều trị chuột nude bằng virus vaccine sởi và

quai bị ....................................................................................................... 56

2.2.9. Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị bằng virus vaccine sởi và

quai bị trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29..56

2.2.10. Phương pháp phẫu tích lấy mô u và lách chuột thiếu hụt miễn

dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và

quai bị ....................................................................................................... 57

2.2.11. Đánh giá tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột thiếu hụt miễn

dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi và quai bị

bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy ....................................... 59

2.2.12. Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị

bằng virus vaccine sởi và quai bị ............................................................. 61

2.2.13. Phương pháp phân tích kết quả ................................................... 62

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ................................................................................... 64

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 65

3.1. Tăng sinh dòng tế bào HT-29, Vero, virus vaccine sởi và quai bị .......... 65

3.1.1. Tăng sinh các dòng tế bào HT-29 và Vero ....................................... 65

3.1.2. Tăng sinh virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine ..... 66

3.2. Chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị theo phương pháp TCID50 ........ 67

3.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp dòng tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 in vitro .......................................................................... 68

3.3.1. Tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị tạo hợp bào in

vitro ........................................................................................................... 68

3.3.2. Kết quả đánh giá hiệu quả ly giải tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 của virus vaccine sởi và quai bị bằng nghiệm pháp 3- (4,5-

Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide ........................ 69

3.3.3. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo

chương trình và hoại tử sau nhiễm virus vaccine sởi và quai bị in vitro.73

3.4. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng

người HT-29 cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch ............................... 90

3.4.1. Kết quả ghép u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 ........ 90

3.4.2. Kết quả điều trị chuột nude mang khối u tế bào ung thư đại tràng

người HT-29 bằng virus vaccine sởi và quai bị ....................................... 91

3.4.3. Tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột thiếu hụt miễn dịch ở các

nhóm nghiên cứu sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ............. 96

3.4.4. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 sau điều

trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ........................................................ 99

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 101

4.1. Tăng sinh các dòng tế bào Vero và tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 in vitro ........................................................................................... 101

4.1.1. Tăng sinh dòng tế bào Vero ......................................................... 101

4.1.2. Nuôi cấy, tăng sinh dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 .. 102

4.2. Tăng sing virus vaccine sởi, quai bị và Chuẩn độ TCID50 ................ 103

4.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 in vitro ........................................................................................... 107

4.3.1. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 bằng cách tạo hợp bào in vitro ............................... 107

4.3.2. Đánh giá khả năng ly giải tế bào HT-29 của virus vaccine sởi và

quai bị bằng nghiệm pháp 3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) - 2,5 diphenyl

tetrazolium bromide ............................................................................... 109

4.3.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào HT-29 thông qua kích

hoạt con đường tế bào chết theo chương trình in vitro ......................... 112

4.4. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch ....................................................... 123

4.4.1. Đánh giá độc tính của virus vaccine sởi và quai bị trên chuột thiếu

hụt miễn dịch mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 ....... 123

4.4.2. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng

người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch .......................................... 125

4.4.3. Virus vaccine sởi và quai bị kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng

u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch.128

4.4.4. Kết quả siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 ghép trên

chuột thiếu hụt miễn dịch sau điều trị bằng virus vaccine sởi và

quai bị ..................................................................................................... 134

KẾT LUẬN ................................................................................................... 140

1. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả ly giải trực tiếp và kích

hoạt con đường chết tế bào apoptosis in vitro ở dòng tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 .................................................................................... 140

2. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả kháng u dòng tế bào

ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép trên chuột nude........................139

KHUYẾN NGHỊ ........................................................................................... 142

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CỦA ĐỀ TÀI, LUẬN ÁN ............................................................................ 143

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 144

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Adenomatous polyposis coli (Coli polyp tuyến) APC

Apoptosis inducing factor (yếu tố tạo ra chết tế bào theo chương AIF

trình)

CEA Carcinoembryonic Antigen (kháng nguyên ung thư biểu mô phôi)

CIMP CpG island methylator phenotype (kiểu hình methyl hóa đảo CpG)

CPE Cytopathic effect (hiệu ứng gây độc tế bào)

CpG Cytosine – Guanine nucleotide

CRC Colorectal Cancer (ung thư đại trực tràng)

DAMP Damage-Associated Molecular Pattern (kiểu phân tử liên quan đến

các tổn thương)

DC Dedritic Cell (tế bào đuôi gai)

DNA Deoxyribonucleic acid

F Fusion (hòa màng)

HN Hemagglutinin neuraminidase

H Hemagglutinin

HNPCC Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (ung thư đại trực tràng

di truyền không do Polyp)

IFN Interferon

IL Interleukin

LINE-1 (Long interspersed nuclear elements-1) yếu tố nhân kích thước dài

rải rác 1

LLC Lewis Lung Cancer (ung thư phổi chuột)

MeV Mealse vaccine virus (virus vaccine sởi)

MHC Major Histocompatibility Complex (phức hợp tương hợp mô

chính)

MMR Mismatch Repair (sửa chữa ghép đôi không xứng)

Multiplicity of infection MOI

Microsatellite Instability (bất ổn trình tự lặp ngắn của DNA) MSI

3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide MTT

Mumps vaccine virus (virus vaccine quai bị) MuV

Sodium-Iodine Symporter (chất mang iod natri) NIS

Natural Killer (giết tự nhiên) NK

Oncolytic Virus (virus ly giải tế bào ung thư) OV

PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern (kiểu phân tử liên quan đến

tác nhân gây bệnh)

Phosphate buffered saline (dung dịch muối đệm phosphat) PBS

Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) PCR

Plaque forming units (Số hạt virus nhiễm vào một tế bào) PFU

RNA Ribonucleic acid

ROS Reactive Oxygen Species (các gốc tự do chứa oxy hoạt động)

TCID Tissue Culture Infectious Dose (liều nhiễm mô nuôi cấy)

TGFβ Transforming Growth Factor β (yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β)

Tumor necrotic factor (yếu tố hoại tử khối u) TNF

Wingless-related integration (tên của con đường truyền tín hiệu vào Wnt

nội bào thông qua các thụ thể trên bề mặt tế bào)

DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Bảng Trang

1.1. Các thử nghiệm lâm sàng của MeV và MuV………………………36

3.1. Kết quả tạo khối u tế bào HT-29 trên đùi chuột nude…………...…90

3.2. Kết quả theo dõi sức khỏe chuột sau điều trị MeV và MuV ............ 92

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

3.1. KếT quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 3 ............ 69 3.2. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 4 ............. 70 3.3. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 5 ............. 71 3.4. So sánh kết quả MTT các nhóm MuV+MeV ngày 3, 4 và 5 ............ 71 3.5. So sánh kết quả MTT các nhóm MeV ngày 3, 4 và 5....................... 72 3.6. So sánh kết quả MTT các nhóm nhiễm MuV ngày 3, 4 và 5 ........... 72 3.7. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV ............. 74 3.8. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV ............. 74 3.9. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV .......... 75 3.10. Tỉ lệ tế bào HT-29 hoại tử ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV ............. 76 3.11. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV ............. 78 3.12. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV ............. 78 3.13. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV .......... 79 3.14. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 4 nhiễm MuV, MeV ........................ 80 3.15. Tỉ lệ tế bào apoptosis ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV .................... 82 3.16. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV ............. 82 3.17. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV .......... 83 3.18. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV ........................ 84 3.19. So sánh tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 3, 4 và 5 nhiễm

MeV, MuV ........................................................................................ 86

3.20. So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm ở ngày 3, 4 và 5

nhiễm MeV, MuV ............................................................................. 88

3.21. So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis muộn ở ngày 3, 4 và 5

nhiễm MeV, MuV ............................................................................. 89 3.22. Thay đổi trọng lượng chuột sau điều trị bằng MeV, MuV ............... 92 3.23. Kết quả kích thước khối u (mm3) sau điều trị bằng MeV, MuV ...... 93 3.24. So sánh thời gian sống trung bình ở các nhóm chuột sau điều trị

bằng MeV và MuV ........................................................................... 94

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

3.25. Kết quả tỉ lệ chuột còn sống sau điều trị bằng MuV, MeV .............. 95 3.26. Kết quả tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột nude sau điều trị

bằng MeV và MuV. .......................................................................... 98

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang

1.1. Gia đình Paramyxoviridae ................................................................ 23 1.2. MeV, MuV lây nhiễm đặc hiệu tế bào CRC ..................................... 25 1.3. MeV, MuV ly giải tế bào CRC trực tiếp và qua trung gian miễn

dịch…………………………………………………………………30

1.4. Vai trò sialidase của MeV, MuV hoạt hóa tế bào lympho T gây

độc tế bào u. ...................................................................................... 35 2.1. Các máy sử dụng cho nghiên cứu…………………………..………39 2.2. Nuôi cấy và tăng sinh tế bào trong phòng thí nghiệm ...................... 40 2.3. Sơ đồ nhiễm MeV, MuV để chuẩn độ TCID50 ................................. 43 2.4. Sơ đồ pha loãng nồng độ MeV, MuV ............................................... 44 2.5. Sơ đồ các nhóm nhiễm MeV, MuV làm nghiệm pháp MTT ............ 47 2.6. Bộ Kit làm nghiệm pháp MTT .......................................................... 47 2.7. Sơ đồ nhiễm MeV, MuV theo các nhóm đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis và tế bào hoại tử in vitro ................................................... 49

2.8. Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy trên phần mềm BD FACS

Diva đánh giá tỉ tế bào apoptosis và tế bào hoại tử .......................... 53 2.9. Buồng nuôi chuột nude ..................................................................... 54 2.10. Ghép u tế bào HT-29 và đo kính thước u trên đùi chuột nude ......... 56 2.11. Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy trên phần mềm BD FACS

Diva đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột nude ............. 61 3.1. Tế bào HT-29 bám đáy và phát triển……………………………….65 3.2. Tế bào Vero bám đáy và phát triển ................................................... 65 3.3. Tế bào Vero nhiễm MeV, MuV ........................................................ 66 3.4. Kết quả nhuộm xanh methylen chuẩn độ TCID50 ............................. 67 3.5. Hình ảnh tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV tạo hợp bào in vitro ...... 68 3.6. Biến đổi hình thái của tế bào HT-29 chết theo chương trình. ........... 73 3.7. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 5 ............................................ 77

Hình Tên hình Trang

3.8. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 4 ............................................ 81

3.9. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 3 ............................................ 85 3.10. Kết quả ghép u tế bào HT-29 dưới da đùi chuột nude ...................... 91 3.11. Lách và tế bào lách chuột nude ở các nhóm nghiên cứu .................. 96 3.12. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u HT-29 bình thường ......................... 99 3.13. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị MeV, MuV ....... 99

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) là quá trình bệnh lý

phát sinh từ đại trực tràng, gây nên bởi sự tăng bất thường các tế bào có khả

năng xâm lấn hay lan rộng vào các bộ phận khác của cơ thể. Là quá trình

bệnh lý phát triển qua nhiều giai đoạn, hậu quả từ sự tích lũy tăng dần của đột

biến gen, đột biến ngoài gen và kết quả bất thường trong con đường tín hiệu

nội bào Wnt. Số bệnh nhân bị CRC và số ca tử vong do CRC vẫn tăng theo

thời gian. Những năm gần đây, đã có nhiều phương pháp mới, tiến bộ áp dụng

điều trị CRC như: liệu pháp miễn dịch, gen trị liệu, điều trị đích, liệu pháp sử

dụng các hạt nano, …. Mặc dù có các phương pháp điều trị mới với nhiều hứa

hẹn, nhưng kết quả vẫn chỉ là kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, tiên

lượng bệnh nhân CRC đã di căn sống trên 5 năm chỉ dưới 20%.

Sự phát triển của sinh học phân tử đã cho chúng ta hiểu biết hơn về cơ

chế bệnh ung thư và virus. Các nhà khoa học đã tạo ra các chủng virus có khả

năng lây nhiễm và ly giải chọn lọc các tế bào ung thư, kích thích đáp ứng

miễn dịch đặc hiệu kháng ung thư. Sử dụng virus ly giải tế bào u (OV) điều trị

ung thư là một phương thức biến sự sao chép của virus thành vũ khí tiêu diệt

các tế bào ung thư và hầu như không ảnh hưởng đến các tế bào lành. OV có

nhiều lợi thế hơn so với các phương pháp điều trị ung thư truyền thống như:

giảm độc tính tác dụng phụ, có khả năng áp dụng rộng rãi cho nhiều loại ung

thư, là một phương thức tự khuếch đại các hoạt động kháng u bằng cách virus

tự nhân lên ly giải tế bào u lan rộng. Hiện nay, với sự phát triển về sinh học

phân tử, các nhà khoa học có thể thiết kế bộ gen của virus nhằm tăng khả

năng lây nhiễm và ly giải tế bào ung thư đặc hiệu cũng như kiểm soát được

mức độ virus nhân lên trong cơ thể.

Liệu pháp sử dụng các chủng virus vaccine sởi (MeV) và virus vaccine

quai bị (MuV) sống, giảm độc lực điều trị ung thư người đã được chứng minh

có hiệu quả. Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng các virus này bằng các con

đường khác nhau: tiêm nội u, tiêm tĩnh mạch, tiêm phúc mạc… điều trị nhiều

loại ung thư như: u lympho tế bào T ở da, ung thư đại trực tràng, ung thư

buồng trứng, u nguyên bào đệm đa dạng… đã được báo cáo là có kết quả khả

quan (bảng 1.1).

Trong nhiều năm qua, các chương trình tiêm chủng mở rộng với quy

mô toàn cầu bằng MeV và MuV sống, giảm độc lực cũng đã rất thành công,

thiết lập 1 hồ sơ an toàn rộng khắp thế giới. Các chủng MeV và MuV rất khó

gây bệnh trở lại vì hầu hết mọi người đều đã được chủng ngừa. Bên cạch đó,

hầu hết các nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng cũng đã chứng minh sử

dụng MeV, MuV điều trị ung thư là an toàn và rất ít tác dụng phụ.

Sử dụng MeV và MuV điều trị ung thư là liệu pháp có tiềm năng đang

được quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước phát triển. Nhưng cho đến nay vẫn

chưa có nghiên cứu nào đi sâu đánh giá hiệu quả sử dụng phối hợp MeV và

MuV điều trị ung thư đại tràng người. Nghiên cứu phối hợp MeV với MuV

kháng ung thư đại tràng người trên thực nghệm sẽ mở đầu cho việc đi sâu

nghiên cứu, áp dụng một phương pháp mới điều trị ung thư đại tràng người.

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “nghiên cứu tác dụng kháng ung

thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm” với

mục tiêu sau:

1. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương trình

(apoptosis) của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung

thư đại tràng người HT-29 in vitro.

2. Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị

trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) mang khối u dòng tế bào

ung thư đại trực tràng người HT-29.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung

OV gần đây đã được công nhận là một phương pháp điều trị ung thư có

nhiều hứa hẹn. OV có thể là virus tự nhiên hoặc là virus đã biến đổi gen, có

khả năng nhân lên và giết chết các tế bào ung thư một cách chọn lọc mà hầu

như không làm tổn hại các tế bào bình thường xung quanh. Khác với liệu

pháp gen, OV không đơn thuần là một chất mang gen trị liệu, nó là tác nhân

thuốc điều trị ung thư. Giả thuyết nhiễm virus có thể kháng ung thư bắt đầu

bằng phát hiện khối u bị thoái triển trong và sau khi nhiễm virus [1]. Năm

1949, có 22 bệnh nhân bị bệnh Hodgkin được điều trị bằng chế phẩm chiết

xuất từ huyết thanh hoặc mô có chứa virus viêm gan, kết quả cho thấy virus

làm thoái triển các khối [2]. Từ năm 1950 đến 1980, các thử nghiệm lâm sàng

điều trị ung thư được thực hiện bằng các chủng virus hoang dã hoặc các virus

tự nhiên, giảm độc lực, bao gồm cả virus viêm gan, virus West Nile, virus

dengue và các adenovirus… [3] Tuy nhiên, những loại virus này chưa thực sự

chứng minh được hiệu quả điều trị, cũng như chưa kiểm soát được độc tính

với cơ thể cũng như mức độ virus nhân lên trong tế bào ung thư.

Hiện nay, OV đã được công nhận là một phương pháp điều trị ung thư.

Để tăng cường cho virus nhân lên và ly giải đặc hiệu tế bào ung thư, các nhà

nghiên cứu đã lựa chọn loại virus không gây bệnh cho người nhưng lại có khả

năng nhằm đích các tế bào ung thư, hoặc biến đổi bộ gen virus để tăng cường

khả năng nhằm đích tế bào ung thư. Đại diện cho chiến lược này là virus

chủng reolysin, một biến thể của reovirus, có thuộc tính ly giải tế bào u thông

qua hoạt hóa tín hiệu RAS, do đó hạn chế được mức độ gây độc cho các tế

bào bình thường. Vào năm 1994, Mineta T và cộng sự đã chúng minh chủng

virus herpes simplex là hrR3 đột biến mang gen lacZ của Esckerichia coli, có

khả năng điều trị khối u não in vivo hiệu quả hơn nhiều so với các chủng

hoang dã [4]. Tác giả có thể theo dõi được chủng virus này nhân lên rất tốt

trong các tế bào ung thư não và hầu như không có độc tính với tế bào lành.

Phát hiện này đã mở ra một lĩnh vực mới về thiết kế và biến đổi bộ gen của

OV làm tăng hiệu quả ly giải tế bào u.

OV phát triển mạnh mẽ trong suốt ba thập kỷ qua, phát hiện quan trọng

nhất trong quá trình hoạt động ly giải tế bào ung thư là OV có khả năng tạo ra

miễn dịch đặc hiệu chống khối u [5]. Hiện nay, vấn đề này đã được công nhận

đây là tính năng quan trọng của liệu pháp OV. Có hai chủng virus biến đổi

gen đã được chấp thuận để tiếp thị dưới dạng thuốc: một là Oncorine (H101)

hay ONYX-015, một Adenovirus bị mất đoạn gen E1B, đã được các cơ quan

có thẩm quyền phê duyệt cho điều trị ung thư đầu, cổ và ung thư thực quản ở

Trung Quốc năm 2005 [6]. Cho đến nay, việc sử dụng Oncorine trên lâm sàng

vẫn còn hạn chế. Hai là T-Vec, 1 chủng virus herpes biến đổi gen, được cục

quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ chấp thuận cho điều trị u tế bào hắc tố

vào tháng 10 năm 2015, sau đó được phê duyệt ở Châu Âu vào tháng 1 năm

2016 và tại Úc vào tháng 5 năm 2016 [7]. Nhiều thử nghiệm T-Vec trên lâm

sàng hiện đang được các công ty dược phẩm thực hiện trên toàn thế giới nhằm

mở rộng ứng dụng và thị trường.

Trong số các chủng virus ly giải tế bào ung thư, chủng MeV và MuV

cho thấy có nhiều tiềm năng chống ung thư. Đến nay, MeV và MuV đã được

chứng minh là có khả năng kháng nhiều loại tế bào ung thư trong đó có cả

CRC in vitro, in vivo và cả trên lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau. Ngoài

tính lựa chọn đặc hiệu tế bào ung thư, MeV và MuV còn kích hoạt mạnh đáp

ứng miễn dịch của vật chủ góp phần rất quan trọng vào hiệu quả ly giải tế bào

ung thư [8], [9].

1.2. Ung thư đại trực tràng

1.2.1. Tình hình ung thư đại trực tràng

CRC vẫn là một gánh nặng sức khỏe rất lớn cho cộng đồng. Trên thế

giới, nó là loại ung thư phổ biến thứ ba ở nam giới và phổ biến thứ hai ở nữ

giới, là nguyên nhân đứng thứ ba gây tử vong liên quan đến ung thư. Trong

năm 2017, ước tính có khoảng 95.520 trường hợp ung thư đại tràng và 39.910

trường hợp ung thư trực tràng mới được chẩn đoán tại Mỹ. Trong khi số liệu

cho thấy ung thư đại tràng ở nam giới (47.700 trường hợp) và nữ giới (47.820

trường hợp) là khá bằng nhau, nhưng ung thư trực tràng ở nam giới (23.720

trường hợp) lại cao hơn nữ giới (16.190 trường hợp). Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất

ở thổ dân Alaska (91/100.000 người), người Mỹ gốc Phi (49/100.000 người),

thấp nhất ở người Mỹ gốc Á và người dân đảo Thái Bình Dương (32/100.000

người). Ước tính có 27.150 bệnh nhân nam giới và 23.110 nữ giới sẽ chết vì

CRC vào năm 2017 [10].

Tỉ lệ mắc CRC rất đa dạng về tuổi, chủng tộc, sắc tộc và kiểu mắc. Ở

các nước thu nhập cao, tỉ lệ ung thư đại tràng cao hơn ung thư trực tràng và

tăng khởi phát sau tuổi 50 là đặc trưng của ung thư trực tràng. Tỷ lệ mắc CRC

đang có xu hướng trẻ hóa người mắc. Tỉ lệ mắc CRC tiếp tục giảm ở những

người từ 50 tuổi trở lên (giảm 32% kể từ năm 2000). Có được xu hướng này

là do sàng lọc CRC có hiệu quả, có thể ngăn ngừa CRC sớm bằng cách phát

hiện và loại bỏ polyp tiền ung thư. Tỷ lệ mắc CRC giảm nhanh nhất ở những

người từ 65 tuổi trở lên và đối với các khối u nằm ở đại tràng xa. Trong khi

đó tỷ lệ giảm chậm nhất ở những người từ 50-64 tuổi và đối với các khối u

trực tràng (giảm 9% tỷ lệ mắc khối u trực tràng ở nam giới từ 50-64 tuổi và

giảm không đáng kể ở phụ nữ trong độ tuổi này; giảm 38% ở nam giới và

41% nữ giới ở độ tuổi từ 65 tuổi trở lên). Tỷ lệ mắc CRC ở những người từ 50

tuổi trở lên đang giảm ở hầu hết các tiểu bang của Mỹ, với mức giảm hơn 5%

hàng năm từ năm 2009-2013 tại bảy tiểu bang (Nebraska, Maine, Rhode

Island, Delaware, Massachusetts, South Dakota và California). Đáng chú ý,

các bang có tỷ lệ mắc cao nhất như: bang Kentucky, Mississippi và Louisiana.

Trái ngược hoàn toàn với xu hướng tỷ lệ mắc CRC ở những người từ 50 tuổi

trở lên, tỷ lệ mới mắc ở những người dưới 50 tuổi tiếp tục tăng, tăng 22% từ

năm 2000-2013. Tương tự như mô hình tỷ lệ mắc, tỷ lệ tử vong của CRC

giảm 34% ở những người từ 50 tuổi trở lên trong giai đoạn 2000-2014, nhưng

lại tăng 13% ở những người dưới 50 tuổi [10].

Năm 2012, dữ liệu từ GLOBOCAN cho thấy tỉ lệ mắc CRC cao nhất ở

Australia, New Zealand, Europe, Bắc Mỹ, tỉ lệ mắc thấp nhất được tìm thấy ở

Châu Phi và Trung Nam Châu Á. Tỉ lệ mắc CRC ở các khu vực khác nhau về

địa lý có thể là do thay đổi ở chế độ ăn uống, môi trường tiếp xúc kết hợp với

sự nhạy cảm về di truyền đã có từ trước ở từng khu vực [11].

Tình trạng kinh tế xã hội thấp cũng liên quan với việc gia tăng nguy cơ

phát triển CRC, nguy cơ CRC tăng lên ở nơi tình trạng kinh tế xã hội thấp.

Các nguy cơ có khả năng thay đổi được như: không hoạt động thể chất, chế

độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, và béo phì… chiếm một tỉ lệ đáng

kể [12]. Các yếu tố khác, đặc biệt là mạng lưới y tế dự phòng CRC kém ở các

nước điều kiện kinh tế thấp cũng góp phần đáng kể làm tăng tỉ lệ bị CRC.

1.2.2. Nguyên nhân ung thư đại trực tràng

Ung thư đã được xác định là do biến đổi DNA trong tế bào gây ra.

DNA là một chất trong nhân tế bào chứa đựng các gen điều khiển chức năng

tế bào. Hiện nay, hiểu biết về các biến đổi DNA làm cho tế bào bình thường

chuyển thành ung thư đã rõ ràng hơn. Trong DNA có những gen với chức

năng điều khiển tăng trưởng tế bào, chia tách, chết tế bào, có các gen gây ung

thư và gen ức chế khối u… Đáng chú ý, quá trình hình thành ung thư là do

các đột biến DNA làm cho gen gây ung thư hoạt động hoặc làm bất hoạt gen

ức chế khối u. Ngoài ra, sự thay đổi trong một số gen khác cũng có vai trò gây

ra CRC.

1.2.2.1. Đột biến gen di truyền

Bệnh đa polyp tuyến và hội chứng Gardner: là do các đột biến di

chuyền ở gen coli gây polyp tuyến (APC), đây là một gen ức chế khối u, bình

thường nó duy trì tế bào tăng trưởng trong giới hạn kiểm soát. Những người

bị đột biến ở gen này, sự kìm hãm phát triển khối u trong tế bào bị “tắt”, do

đó, hình thành hàng trăm polyp ở đại tràng. Theo thời gian, các đột biến gen

mới tiếp theo sẽ xảy ra ở tế bào trong các polyp này và hình thành ung thư.

Hội chứng Lynch: là do những biến đổi ở các gen hỗ trợ sửa chữa

DNA. Đột biến một trong các gen mã hóa các enzyme sửa chữa DNA làm cho

DNA bắt cặp sai, dẫn đến phát triển ung thư.

Hội chứng Peutz-Jeghers: là do những biến đổi di truyền ở gen ức chế

khối u, làm chúng không hoạt động và kết quả là hình thánh các khối u.

1.2.2.2. Các đột biến gen mắc phải

Một số đột biến gen xảy ra trong thời gian sống và không truyền qua

các thế hệ, chúng chỉ có ở các tế bào sinh ra từ tế bào gốc bị đột biến. Trong

hầu hết các trường hợp bị CRC, đột biến gen mắc phải gây ra ung thư nhiều

hơn so với các đột biến gen di truyền. Các yếu tố nguy cơ CRC đóng một vai

trò quan trọng trong việc tạo ra các đột biến mắc phải. Không có đột biến gen

đơn gây ra CRC, hầu hết đột biến đầu tiên xảy ra ở gen ức chế khối u hay gen

gây ung thư, dẫn đến tế bào đại trực tràng tăng sinh không kiểm soát, các đột

biến tiếp theo có thể xảy ra sau đó ở các gen khác và gây ra CRC.

1.2.3. Cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng

1.2.3.1. Gen, vi môi trường và di truyền ngoại gen (epigenetic)

Các cơ chế bệnh sinh cơ bản của CRC là những vấn đề ở phạm vi rộng

trong lĩnh vực sinh học ung thư. CRC là hậu quả từ tích lũy về cả biến đổi gen

và di truyền ngoại gen làm biến đổi tế bào biểu mô tuyến bình thường thành

ung thư tuyến. Các tế bào biểu mô tuyến có thể bị thay đổi cả cấu hình gen và

ngoại gen để có được khả năng xâm lấn, di căn cơ quan xa, chủ yếu là đến

gan và phổi. Tuy nhiên, cơ chế phân tử của CRC chưa được hiểu biết đầy đủ.

Nhiều mô hình phân tử khác nhau đã được đề xuất cho cơ chế bệnh sinh CRC.

Đầu tiên, mô hình Loeb khẳng định quá trình phát triển khối u được kích

thích bởi sự bất ổn định về gen, tạo ra số lượng lớn đột biến ngẫu nhiên và sự

chọn lọc các đột biến này. Kế tiếp ngay sau đó, công trình của Nowell về vai

trò sai lệch nhiễm sắc thể tạo ra khối u đã dẫn đến giả thuyết về từng kiểu gen

riêng lẻ của ung thư là do các vòng chọn lọc vô tính. Cả 2 giả thuyết này cùng

phù hợp với giả thuyết tạo khối u nhiều bước của Fould. Trong 2 thập kỷ qua,

các nghiên cứu mô hình Darwin Vogelstein về sự tiến triển của u tuyến thành

ung thư biểu mô tuyến, cùng với các công trình nghiên cứu về gen ung thư đại

trực tràng di truyền không do polyp ở người đã cung cấp nhiều hiểu biết về cơ

chế bệnh sinh CRC. Những nghiên cứu này đã đưa ra bằng chứng polyp ống

nhỏ và polyp tuyến hỗn hợp là các dạng tiền ung thư, chúng có thể tiến triển

thành ung thư biểu mô tuyến xâm lấn. Tiến bộ hơn trong lĩnh vực nghiên cứu

CRC, các nhà khoa học đã chứng minh được những phân nhóm nhỏ của polyp

tiền ác tính như polyp có răng cưa, rất dễ biến đổi thành CRC [13], [14]. Tuy

nhiên, kết quả thu được từ các mô hình biến đổi gen gây CRC chỉ đưa ra được

rất ít gen bị đột biến hình thành CRC, khó khăn cho việc chứng minh sự tích

lũy đột biến gen ở các trường hợp CRC lẻ tẻ. Rất ít dữ liệu về giả thuyết biến

đổi gen trong các mô lão hóa để giải thích cho sự gia tăng theo cấp số nhân tỷ

lệ mắc CRC tương xứng với tuổi cao. Hiện nay, có nhiều giả thuyết về cơ chế

phân tử gây ra CRC, những cơ chế này liên quan đến cả đột biến di truyền và

biến đổi ngoại gen. Ví dụ, polyp có răng cưa liên quan đến sự bất ổn trình tự

lặp ngắn (MSI) trong DNA và sự gia tăng quá trình methyl hóa làm bất

thường ngoại gen, cytosine và adenosine trong DNA. Trong khi polyp ống

nhỏ thường gặp hơn do các biến đổi ở gen ức chế khối u đồng thời với bất ổn

nhiễm sắc thể khác gây ra. Hơn nữa, những tiến bộ về công nghệ sinh học,

giải trình tự gen đã cho thấy có hàng ngàn thay đổi phân tử trong hệ gen CRC,

nhưng chỉ có một tập hợp nhỏ những thay đổi trong số này gây ra CRC. Mặc

dù tồn tại các phân nhóm cơ chế phân tử gây CRC, nhưng cho đến nay vẫn

chưa thể xác định được chính xác các phân nhóm này theo kiểu mô học hay

về lâm sàng. Ngược lại, các thay đổi ngoài gen, kiểu hình methyl hóa đảo

CpG có nhiều đóng góp về cơ chế bệnh sinh CRC [14]. Ngoài sự kiện tăng

methyl hóa DNA thường xảy ra ở vùng khởi động của các gen ức chế khối u,

điều tiết ngoại gen trong CRC bao gồm các biến đổi histone sau dịch mã, chủ

yếu là sự acetyl hóa, methyl hóa histone, chúng đóng vai trò quan trọng trong

việc điều hòa biểu hiện gen gây ung thư và gen ức chế khối u.

Đột biến gen gây ra CRC: Giống như các loại bệnh ung thư khác, quan

điểm trước đây cho rằng CRC phát sinh từ hậu quả tích lũy các đột biến ở gen

ức chế khối u hoặc gen gây ung thư, mất chức năng cân bằng nội tại gây ra sự

biến đổi tế bào bình thường thành tế bào ung thư. Phân tích trình tự bộ gen

CRC, người ta đã xác định có khoảng 13.000 gen đột biến trong hệ gen CRC,

chỉ có khoảng 69 đột biến gen điều khiển được đề xuất là các đột biến có vai

trò hình thành CRC [15]. Bộ gen ung thư chứa hàng ngàn đột biến, nhưng đến

nay, các nhà khoa học vẫn chưa xác định được đột biết nào có vai trò quyết

định hình thành ung thư (đột biến điều khiển) và đột biến nào là những hậu

quả của quá trình này (đột biến kéo theo). Một số nghiên cứu phạm vi rộng về

CRC đã chứng minh được phần lớn các đột biến kéo theo đều vô hại, không

có lợi thế chọn lọc. Chỉ có một số đột biến điều khiển là yếu tố quan trọng gây

CRC và được chọn lọc. Những đột biến điều khiển này ảnh hưởng đến một

loạt các chức năng tế bào từ sự tăng sinh, di cư, sự biệt hóa, độ bám dính, chết

tế bào, ổn định và sửa chữa DNA. CRC có thể được phân chia theo nhóm, tùy

thuộc vào loại hình bất ổn định của bộ gen mà chúng hiển thị. Bất ổn nhiễm

sắc thể được đặc trưng bởi tính bội không chỉnh, tăng số lượng nhiễm sắc thể

hoặc mất nhiễm sắc thể. Trong khi đó mất ổn định vùng vi vệ tinh của DNA

được xác định bởi sự hiện diện của đột biến chèn và đột biến đứt đoạn hay

xảy ra trong các trình tự lặp lại của DNA. Loạn sản các cụm ống tuyến có thể

là do đột biến gen APC, dẫn đến hoạt hóa con đường tín hiệu Wnt, đó là một

cơ chế chung cho khởi phát polyp tiến triển thành ung thư. Các đột biến gen

APC kéo theo là đột biến xảy ra ở gen KRAS hoặc TP53, thúc đẩy sự phát

triển các tế bào polyp tuyến chuyển thành ung thư. Quá trình thành ung thư

cũng có liên quan đến các đột biến trong con đường tín hiệu yếu tố tăng

trưởng chuyển dạng beta (TGFβ). Ở CRC, đột biến gen chịu trách nhiệm thụ

cảm thể TGFβ loại II xảy ra khoảng 30%. Ngoài ra, các đột biến gen khác

trong con đường tín hiệu TGFβ, bao gồm cả gen SMAD2, SMAD4, RUNX3 và

TSP1 cũng có vai trò hình thành CRC. Đột biến gen kích hoạt các gen gây

ung thư và bất hoạt gen ức chế khối u, làm thay đổi các con đường phát tín

hiệu tế bào đều góp phần hình thành CRC. Ví dụ, gen KRAS là một gen gây

ung thư, nó phát tín hiệu thông qua protein B-Raf kích hoạt con đường tín

hiệu protein kinase hoạt hoá phân bào. Khoảng 55-60% CRC có các đột biến

trong gen KRAS hoặc gen B-RAF, kích hoạt con đường tín hiệu protein kinase

hoạt hoá phân bào gây tăng sinh tế bào và ức chế con đường chết tế bào theo

chương trình [16].

Ít gặp hơn là đột biến các gen MSH2, MSH6, MLH1 và PMS2 có vai trò

sửa chữa ghép đôi không xứng DNA ở dòng tế bào gốc, tạo ra đột biến dịch

khung và thay thế cặp base trong chuỗi lặp lại song song ngắn của DNA, gây

ra bất ổn trình tự lặp ngắn của DNA, gặp trong hội chứng ung thư đại tràng di

truyền không polyp /hội chứng Lynch. Ngoại trừ đột biến điểm, gần 85%

CRC được đặc trưng bởi mất đoạn nhiễm sắc thể (8p21-pter, 15q11-Q21,

17p12-13, 18q12-21) và mất dị hợp tử. Do đó, những bằng chứng này gần

như đã khẳng định vai trò của đột biến gen trong tế bào CRC, đặc biệt là đột

biến gen có chức năng điều tiết sự tăng sinh, di cư, biệt hóa, độ bám dính,

chết tế bào và ổn định tế bào cũng như các gen sửa chữa DNA.

Biến đổi di truyền ngoại gen gây CRC: Trong hai thập kỷ qua, chúng ta

đã chứng kiến sự bùng nổ về thông tin liên quan đến những thay đổi di truyền

ngoại gen trong hệ gen ở nhiều tế bào ung thư bao gồm cả CRC. Một số

nghiên cứu phạm vi rộng đã tập trung vào miêu tả “bối cảnh di truyền ngoại

gen”. Năm 1980, lần đầu tiên bất thường về di truyền ngoại gen trong CRC

được xác định. Các cơ chế thay đổi di truyền ngoại gen có vai trò quan trọng

trong hình thành ung thư bao gồm sự methyl hóa bazơ cytosine của DNA

trong các dinucleotide ở CpG, những biến đổi sau dịch mã của các protein

histone trung gian cho quá trình DNA cuộn vào trong nhiễm sắc thể, một quá

trình điều tiết biểu hiện gen qua hình thể nhiễm sắc thể.

microRNA là phân tử điều hòa di truyền ngoại gen của CRC: có một số

microRNA tăng lên trong tế bào CRC, đáng chú ý là: microRNA-31,

microRNA-183, microRNA-17-5, microRNA-18a, microRNA-20a và

microRNA-92 cao hơn đáng kể so với tế bào đại trực tràng bình thường.

Nhưng bên cạnh đó, microRNA-143 và microRNA-145 ở tế bào CRC lại thấp

hơn nhiều so với tế bào đại trực tràng bình thường, củng cố thêm giả thuyết tế

bào CRC biểu hiện microRNA-18a cao thường có tiên lượng xấu. microRNA-

18a được chứng minh là một chất gây ung thư, nó kích hoạt gen gây ung

KRAS [17].

Các microRNA ức chế khối u và microRNA gây ung thư: Đánh giá về

vai trò của microRNA, các nhà khoa học đã chứng minh microRNA-135a và

microRNA-135b ảnh hưởng trực tiếp vào vùng 3' chưa được dịch mã của gen

ức chế khối u APC, trấn áp các biểu hiện của gen này và kích hoạt tín hiệu

con đường Wnt tạo ra CRC. Ngược lại, microRNA-122a lại là một

microRNA ức chế khối u, nó làm tăng biểu hiện gen APC trong các dòng tế

bào ống tiêu hóa và ở các mô khác. Những dữ liệu này chứng minh một cơ

chế kiểm soát hoạt động của gen APC qua trung gian microRNA và kích hoạt

con đường tín hiệu Wnt.

Polyp tuyến thường là tiền thân của CRC, polyp tuyến tiến triển thành

CRC là một quá trình biến đổi gen và di truyền ngoại gen qua nhiều giai đoạn.

Biểu hiện microRNA-21 tăng trong tế bào CRC có liên quan đến tiên lượng

xấu và giảm thời gian sống ở bệnh nhân CRC, vì vậy, microRNA-21 có chức

năng như một chất gây ung thư. Hơn nữa, các báo cáo gần đây cho thấy biểu

hiện microRNA-21 trong các u tuyến đại trực tràng cao hơn nhiều so với các

mô bình thường. Như vậy, biểu hiện microRNA-21 tăng trong tế bào ở giai

đoạn sớm CRC. Người ta đã chứng minh rằng microRNA-21 thúc đẩy tế bào

ung thư di căn và xâm lấn bằng cách làm giảm protein 4, bất hoạt con đường

chết tế bào theo chương trình và gen ức chế khối u (tensin homolog) [18].

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy microRNA-143 và microRNA-145

giảm đáng kể trong CRC, các locus mã hóa cho những microRNA này đều

nằm trên đoạn gen 5q23 [19]. Cả microRNA-143 và microRNA-145 đóng

một vai trò quan trọng trong hoạt động ức chế khối u. Gần đây người ta cũng

đã phát hiện ra vai trò ức chế khối u của microRNA-143 thông qua cơ chế tác

động vào gen DNA methyltransferase 3a [20].

Điều hòa biểu hiện microRNA ở cấp độ phân tử trong tế bào CRC: Các

cơ chế phân tử chịu trách nhiệm cho việc điều tiết biểu hiện microRNA trong

tế bào ung thư người chưa rõ ràng. Một nhóm các nhà nghiên cứu Nhật Bản

đã chứng minh gen ức chế khối u P53 làm tăng hoạt hóa một số microRNA,

bao gồm microRNA-16-1, microRNA-143 và microRNA-145 có vai trò ức

chế sau phiên mã của gen ung thư [21]. Ngoài ra, có nghiên cứu cho thấy biểu

hiện của microRNA ức chế khối u cũng có thể bị bất hoạt do bị methyl hóa.

Về vấn đề này, các nhà khoa học đã được chứng minh microRNA-34b,

microRNA-34c, microRNA-9-1, microRNA-129-2 và microRNA-137 gắn

vào trong các đảo CpG, đây là mục tiêu của sự methyl hóa quá mức ở các

dòng tế bào CRC [22].

1.2.3.2. Tăng methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng

Methyl hóa DNA là phản ứng cộng thêm một nhóm methyl vào vị trí 5'

của cytosine dưới xúc tác của enzyme DNA methyltransferase để tạo thành 5-

methyl cytosine. Bình thường, hệ gen có hơn 70% cặp base cytosine của

dinucleotide ở CpG bị methyl hóa, các đảo CpG nằm xung quanh vùng khởi

động của gen thường không bị methyl hóa. Methyl hóa DNA là điều cần thiết

cho sự phát triển ở động vật có vú và có nhiệm vụ quan trọng trong quá trình

khử hoạt tính nhiễm sắc thể X và ghi nhớ di truyền. Ngược lại trong tế bào

ung thư, chúng ta thường quan sát thấy giảm methyl hóa gen trong các vùng

ngoài vùng khởi động và tăng methyl hóa gen ở vùng khởi động, đặc biệt là

các gen ức chế khối u và gen sửa chữa DNA. Tăng methyl hóa góp phần làm

bất hoạt gen, làm bất ổn định bộ gen, giảm quá trình tế bào chết theo chương

trình, sửa chữa DNA và kiểm soát chu trình tế bào.

Tăng mức biểu hiện các enzyme DNA methyltransferase ở tế bào ung

thư người, bao gồm cả CRC so với tế bào bình thường đã được đề cập trong

một số nghiên cứu. Năm 1971, Knudson A.G là người đầu tiên phát hiện tăng

methyl hóa các alen ở gen ức chế khối u nguyên bào võng mạc tạo ra đột biến

gen và mất dị hợp tử (LOH) và đề xuất “giả thuyết cú hích thứ 2”, một cách

thức bất hoạt gen do tăng methyl hóa các gen ở vùng khởi động [23].

Trong CRC, hầu hết việc thay đổi ngoại gen có tính chất đặc trưng, phổ

biến là tăng methyl ở vùng khởi động của các gen, xảy ra trong các đảo CpG,

thường xuất hiện khoảng 60% ở khu vực 5' của gen. Người ta đã quan sát thấy

tăng methyl hóa ở vùng khởi động của nhiều gen ức chế khối u và các gen

chịu trách nhiệm sửa chữa vùng đột biến và đứt đoạn của DNA. Tăng hoạt

động enzyme DNA methyltransferase là một đặc tính của hầu hết các tế bào

ung thư. Ba enzyme DNA methyltransferase đã được chứng minh là chất xúc

tác cho sự methyl hóa DNA trong các tế bào động vật có vú đó là: enzyme

DNA methyltransferase 3a, 3b và enzyme DNA methyltransferase 1 [24].

Ở giai đoạn từ năm 1980 đến đầu năm 1990, các nhà nghiên cứu đã tìm

ra các protein gắn với nhóm methyl của CpG gây ra methyl hóa DNA và làm

thay đổi biểu hiện gen. Các protein này gọi là protein gắn với miền methyl

CpG, có liên kết ái lực cao với methyl của CpG. Protein gắn với miền methyl

CpG có ba nhánh: (1) các protein có chứa vùng gắn với methyl của CpG, (2)

protein ngón tay kẽm gắn với methyl-CpG, (3) các protein có miền ngón tay

nhẫn (RNF) [25]. Các protein có chứa vùng gắn với methyl của CpG là nhóm

lớn với 11 thành viên (MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MBD5,

MBD6, SETDB1, SETDB2, BAZ2A và BAZ2B). Nhóm protein ngón tay

kẽm bao gồm Kaiso, ZBTB4, ZBTB38. Nhóm protein có chứa miền ngón tay

nhẫn gồm UHRF1 và UHRF2. Protein chứa vùng gắn với methyl của CpG tạo

ra methyl hóa DNA có thể ngăn chặn việc gắn yếu tố phiên mã vào các vùng

khởi động của gen, ức chế khởi phát phiên mã. Quá trình gắn này cũng có thể

làm tăng các chất ức chế vùng khởi động của gen, ức chế hoạt động các yếu tố

phiên mã, từ đó ngăn chặn xâm nhập các yếu tố phiên mã đến vùng khởi

động. Trong số các protein chứa vùng gắn với methyl của CpG đã biết thì

MeCP2, MBD1, MBD2, và MBD4 có vai trò nhiều nhất gây ra CRC.

Tăng methyl hóa các gen sửa chữa DNA ghép đôi không xứng trong tế

bào ung thư có thể làm cho đột biến gen nhiều hơn 100 lần so với tế bào bình

thường, hậu quả trực tiếp là tế bào không có khả năng tái tạo chính xác bộ

gen, thường là sai lệch vị trí trong quá trình sao chép DNA, tạo ra đột biến

chèn/mất đoạn, nếu duy trì biến đổi này sẽ sinh ra MSI của DNA một dấu

hiệu của kiểu hình có lỗi sao chép. Các khiếm khuyết đầu tiên trong sửa chữa

ghép đôi không xứng là các đột biến gen MutL và Muts ở tế bào mần tương

đồng với các đột biến gen MHL1 và MSH2, hiếm hơn là các gen MSH6,

PMS1 và PMS2 tiến triển thành polyp tuyến. Năm 2006, lần đầu tiên người ta

đã mô tả methyl hóa ở vùng khởi động của gen MSH2 do di truyền cũng có

thể gây ra hội chứng Lynch [26]. Sau đó, Ligtenberg M.J và cộng sự (2009)

thấy rằng việc đứt đoạn Alu ở bộ ba nucleotic kết thúc của gen mã hóa phân

tử kết dính tế bào biểu mô (EpCAM), gây ra methyl hóa trong các tế bào mầm

và bất hoạt gen MSH2 mã hóa phân tử kết dính tế bào biểu mô [27].

Bên cạnh đó, cũng không thấy tăng methyl hóa gen MHL1 tại vùng

khởi động ở hơn một nửa số CRC có kiểu hình methyl hóa đảo CpG và ở 25%

những người bị CRC có bất ổn trình tự lặp ngắn. Hiện nay, tăng methyl hóa

gen MHL1 có thể chiếm đến 75% các trường hợp CRC lẻ tẻ. Một vài gen ức

chế khối u, cụ thể là gen TGFβ loại II và BAX là các mục tiêu của MSI trong

CRC. Hơn nữa, có nhiều báo cáo gen MHL1 biểu hiện quá mức đã trực tiếp

kích hoạt tế bào chết theo chương trình [28]. Như vậy, methyl hóa gen MHL1

ở vị trí 5' có thể ảnh hưởng đến sự tăng trưởng tế bào. Shen L và cộng sự

(2007) dựa vào phân tích bằng cách đánh dấu methyl hóa đã chứng minh kiểu

hình methyl hóa đảo CpG trong tế bào CRC có thể được chia thành hai nhóm

riêng biệt là kiểu hình methyl hóa đảo CpG1 và kiểu hình methyl hóa đảo

CpG2 [29]. Một nghiên cứu 97 trường hợp bị CRC nguyên phát đã chỉ ra khối

u có kiểu hình methyl hóa đảo CpG1 thường có MSI cao (80%) và có những

đột biến gen BRAF cao (53%), trong khi các khối u kiểu hình methyl hóa đảo

CpG2 có những đột biến gen KRAS rất cao (92%), nhưng hiếm khi có MSI,

gen BRAF hay đột biến gen TP53 [29]. Những khối u không có kiểu hình

methyl hóa đảo CpG có một tần số đột biến gen TP53 cao (71%) và một tần

số các đột biến gen KRAS trung bình (33%) [29]. Sử dụng các phân tích cụm

dựa trên mô hình methyl hóa gen của ADN ở 125 bệnh nhân CRC, đã xác

định được các phân nhóm methyl hóa DNA như kiểu hình methyl hóa đảo

CpG cao, kiểu hình methyl hóa đảo CpG thấp và không có kiểu hình methyl

hóa đảo CpG. Các khối u nhóm kiểu hình methyl hóa đảo CpG cao biểu hiện

tăng methyl hóa DNA đặc hiệu với ung thư và có tỷ lệ đột biến gen BRAF cao

(61%), kiểu hình methyl hóa đảo CpG cao có nhiều gen bị methyl hóa ở đảo

CpG trong khi nhóm kiểu hình methyl hóa đảo CpG thấp có liên quan với đột

Nhìn chung, tăng methyl hóa DNA đã tác động đến con đường tín hiệu

biến KRAS cao hơn (45%).

Wnt, thụ thể tyrosine kinase, chất đồng đẳng locus thần kinh notch, gen TP53,

phosphoinositide 3-kinase, acid retinoic và tín hiệu yếu tố tăng trưởng giống

insulin (IGF), cũng như con đường tín hiệu khác điều chỉnh chu trình tế bào,

sao chép, sửa chữa, ổn định DNA, chết tế bào theo chương trình, độ bám

dính, hình thành mạch, xâm lấn và di căn. Vì vậy, giống như các đột biến gen,

bất hoạt gen qua trung gian methyl hóa DNA cũng nhắm đến nhiều con

đường truyền tín hiệu trực tiếp ở tế bào tham gia hình thành CRC [30].

1.2.3.3. Giảm methyl hóa DNA trong tế bào CRC

Như đã thảo luận ở trên, tăng methyl hóa DNA thường kết hợp với bất

hoạt phiên mã các gen ức chế khối u trong CRC. Tuy nhiên, giảm methyl hóa

DNA cũng đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế phân tử hình thành CRC,

có thể giảm methyl làm mất ổn định hệ gen. Một ví dụ cổ điển của giảm

methyl hóa hình thành CRC là yếu tố nhân kích thước dài rải rác 1 (LINE-1).

Các yếu tố này chiếm khoảng 17% bộ gen người, do đó, tình trạng methyl hóa

của chúng là một chỉ số quan trọng về mức độ methyl hóa toàn bộ DNA. Tuy

nhiên, trong các tế bào bình thường, yếu tố LINE-1 thường được methyl hóa

một cách khó khăn, điều này quan trọng cho việc ức chế hoạt động gen nhảy

và để duy trì sự ổn định của bộ gen. Trong mối liên quan với các gen gây ung

thư, các vị trí CpG trong những phần lặp lại của DNA có xu hướng bị

demethyl hóa, dẫn đến sự giảm methyl hóa gen theo kiểu khuếch tán. Mặc dù

có ý kiến cho rằng CRC khởi phát sớm là do yếu tố di truyền, nhưng chỉ đại

diện cho 15-20% trường hợp CRC, vẫn còn 75-80% trường hợp CRC khởi

phát sớm có liên quan đến giảm methyl hóa yếu tố LINE-1. Mức độ methyl

hóa yếu tố LINE-1 là rất khác nhau giữa các loại ung thư đại trực tràng và có

liên quan với tiên lượng xấu.

Một trong những thay đổi di truyền ngoại gen được công nhận đầu tiên

gây ra CRC là giảm từ từ đến toàn bộ 5-methyl cytosine (giảm methyl hóa

toàn bộ DNA). Quá trình này phụ thuộc vào tuổi và là giai đoạn sớm trong

quá trình hình thành CRC đã được chứng minh bằng thực nghiệm. Giảm

methyl hóa tạo ra các tế bào ung thư với bắt đầu là một kiểu hình gây đột biến

bằng cách làm mất ổn định kiểu nhân và thúc đẩy mất dị hợp tử (LOH). Giảm

methyl hóa toàn bộ DNA xảy ra chủ yếu ở các dinucleotide tại CpG trong các

trình tự lặp lại (trình tự lặp lại satellite và yếu tố LINE-1, các bản sao đoạn

DNA và các yếu tố retrovirus nội sinh), trình tự đơn nhất bao gồm cả gen gây

ung thư và loci ghi nhớ, ít gặp hơn là ở trình tự bảo tồn cao xung quanh các

đảo CpG, được gọi là các trụ đảo CpG. Ngoài ra, giảm methyl hóa có thể làm

kích hoạt gen gây ung thư, giảm methyl hóa DNA gây ra bất ổn định nhiễm

sắc thể.

Với tiến bộ về công nghệ sinh học (giải trình tự gen), cho phép các nhà

khoa học phát hiện được những khác biệt rất nhỏ các mức methyl hóa ở yếu tố

LINE giữa các phân nhóm CRC khác nhau. Dữ liệu thống kê về thời gian

sống của bệnh nhân CRC cho thấy mức độ methyl hóa yếu tố LINE (được xác

định bởi kỹ thuật giải trình tự pyrosequencing) ảnh hưởng đến kết quả lâm

sàng và tiên lượng bệnh nhân [31]. Cả hai kiểu hình methyl hóa đảo CpG cao

và bất ổn trình tự lặp ngắn cao của DNA ở CRC có tương quan nghịch đảo

với methyl hóa yếu tố LINE-1, trong khi ở các khối u có bất ổn trình tự lặp

ngắn của DNA không cao có tương quan thuận với sự giảm methyl hóa yếu tố

LINE-1. Các nhà khoa học đã tìm thấy trong các tế bào CRC có kiểu hình

methyl hóa yếu tố LINE-1 thấp thì càng tăng tính chất ác tính [32]. Hơn nữa,

Ogino và cộng sự (2013) đã chỉ ra những người có tiền sử gia đình bị CRC thì

có nguy cơ bị CRC cao với methyl hóa mức thấp yếu tố LINE-1 [33]. Những

nghiên cứu này đã thiết lập một mối liên quan vững chắc giữa sự giảm methyl

hóa DNA và phát triển CRC.

1.2.3.3. Thay đổi Histone trong tế bào CRC

Ngoài sự bất hoạt phiên mã các gen do methyl hóa DNA, những thay

đổi liên kết cộng hóa trị ở đuôi histone sau dịch mã cũng là một cơ chế biến

đổi ngoại gen quan trọng khác điều tiết cấu trúc nhiễm sắc thể và biểu hiện

gen ung thư người.

Thể nhân là đơn vị cơ bản của nhiễm sắc thể, nó bao gồm một octamer

tạo bởi bốn histone lõi (H3, H4, H2A, H2B) xung quanh có 147 cặp base của

DNA phủ bên ngoài, lõi histone chủ yếu là hình cầu ngoại trừ “các đuôi” N-

tận của chúng. Đuôi N-tận của histone có sự khác nhau về cấu hình. Có ít nhất

tám loại thay đổi histone, bao gồm acetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa,

ubiquityl hóa, sumoyl hóa, ADP-ribosyl hóa, đồng phân proline hóa và

citrulline hóa [34]. Có giả thuyết cho là sự kết hợp của những thay đổi này tạo

thành cái gọi là "mã hóa histone" để xác định hình thái nhiễm sắc thể và các

mức độ biểu hiện gen. Trong 8 thay đổi histone này, acetyl hóa và methyl hóa

là loại phổ biến nhất và liên quan đến cơ chế bệnh sinh CRC.

Acetyl hóa histone là những thay đổi thuận nghịch trong các phần của

lysine tại "đuôi" histone và được kiểm soát bởi các enzym histone

acetyltransferase và histone deacetylase, chúng hoạt động lần lượt như những

chất đồng hoạt hóa phiên mã hoặc đồng ức chế phiên mã. Trong các thay đổi

histone đã biết, acetyl hóa histone là thay đổi làm biểu hiện nhiễm sắc thể tiềm

năng nhất vì nó trung hòa điện tích cơ bản của lysine. Histone

acetyltransferase được chia thành ba họ chính: một là general control

nonderepressible-5-related N-acetyltransferase (GNAT); hai là họ MYST gồm

bốn thành viên MOZ, Ybf2 (Sas3), Sas2, và Tip60; ba là họ p300 và cAMP

gắn với protein (CBP). Hầu hết các vị trí acetyl hóa đặc trưng bởi thay đổi

trong đuôi N- tận của histone. Gần đây, người ta đã tìm thấy một lysine trong

lõi H3 là K56 bị acetyl hóa. Phần còn lại của K56 hướng về phía rãnh chính

của DNA trong thể nhân, vì vậy nó là ở một vị trí đặc biệt cho acetyl hóa

histone. Protein SPT10 của nấm men có thể làm trung gian acetyl hóa vị trí

K56 của lõi H3 tại các các vùng khởi động của histone mà histone RTT109

acetyltransferase xúc tác cho quá trình này, điều chỉnh biểu hiện gen [34].

Có ba họ enzyme histone deacetylase khác nhau là: lớp I, lớp II và lớp

III [34]. Chúng tham gia vào nhiều con đường tín hiệu và có mặt trong rất

nhiều phức chất ức chế nhiễm sắc thể. Nói chung, những enzyme này không

đặc hiệu cho một nhóm acetyl cụ thể. Histone deacetylase là những enzyme

phổ biến nhất trong số các enzyme thay đổi histone, chúng có vai trò quan

trọng hình thành CRC. Một nghiên cứu cho thấy Histone deacetylase tăng với

36,4% histone deacetylase lớp I, 57,9% histone deacetylase lớp II và 72,9%

histone deacetylase lớp III ở các mẫu xét nghiệm của CRC, biểu hiện histone

deacetylase cao đã được chứng minh làm giảm thời gian sống của bệnh nhân

CRC [35]. Biểu hiện histone deacetylase lớp II ở nhân lần lượt được quan sát

thấy ở 81,9% ung thư biểu mô đại trực tràng, 63,1% u tuyến đại trực tràng và

53,1% của các mô bình thường. Biểu hiện histone deacetylase lớp II quá mức

đi kèm với giảm acetyl hóa histone tại H4K12 và H3K18 thấy trong u tuyến

tiến triển thành ung thư biểu mô [36]. Trong một nghiên cứu 485 trường hợp

CRC cho thấy histone deacetylase lớp III, sirtuina 1 (SIRT1) được biểu hiện

quá mức trong 37% CRC kết hợp với các khối u có kiểu hình methyl hóa đảo

CpG cao và bất ổn trình tự lặp ngắn của DNA. Ức chế sirtuina 1 có thể phục

hồi hoạt động các gen bị bất hoạt phiên mã, đó một phương pháp trị liệu có

thể thực hiện được nhằm đảo ngược thay đổi ngoại gen do quá trình bất hoạt

của nhiều gen [37].

Methyl hóa histone là một thay đổi quan trọng ở các histone sau dịch

mã, hiện tượng này xảy ra cả ở phần lysine và arginine còn lại ở đuôi N- tận

của histone. Giống như acetyl hóa histone, methyl hóa histone cũng được đánh

giá là một quá trình thuận nghịch. Cân bằng nội tại của nó nhờ hai nhóm

enzyme đối kháng là histone methyltransferase và histone demethylase, chúng

lần lượt lắp ráp hoặc gỡ bỏ các vị trí methyl hóa đặc hiệu ở histone. Đến nay,

đã xác định được hơn hai mươi enzyme lysine và arginine histone

methyltransferase. Các enzyme histone methyltransferase có thể hoạt động một

mình hoặc phối hợp với nhau xúc tác cho phản ứng methyl hóa histone ở các vị

trí đặc hiệu. Ví dụ, methyl hóa vị trí lysine 4 ở histone H3 (H3K4) là do

enzyme su(var) 3-9, enhancer-of-zeste, trithorax 1 (SET1) và mixed-lineage

leukemia (MLL) [38]. Đối với histone H3, người ta đã quan sát thấy methyl

hóa ở nhiều vị trí lysine, bao gồm H3K4, K9, K27, K36, K79, R2, K20, K5,

R3, H2A.Z, có thể methyl hóa một đến 3 lysine cùng lúc và tạo ra bốn trạng

thái methyl hóa: không methyl hóa, mono methyl hóa, dimethyl hóa và

trimethyl hóa. Các trạng thái methyl hóa histone là một mô hình sắp xếp riêng

biệt trong hệ gen ở động vật có vú [38]. Trimethyl hóa lysine 4 ở histone H3

(H3K4me3) liên quan với hoạt hóa phiên mã, người ta quan sát thấy các vị trí

của gen bắt đầu phiên mã được bộc lộ ở mức cao nhất. Hai vị trí methyl hóa

khác trên histones H3 là H3K36 và H3K79 cũng có liên quan đến sự hoạt hóa

phiên mã. Ngược lại, trimethyl hóa histone H3 ở vị trí H3K27 thường làm bất

hoạt gen, đặc biệt là ức chế không mong muốn các chương trình biệt hóa xác

định nòi giống. Hai vị trí methyl hóa lysine khác cũng ức chế phiên mã là

H3K9 và H4K20 [38].

Có được cấu hình methyl hóa histone phù hợp không chỉ quan trọng đối

với sự phát triển và sự biệt hóa bình thường ở tế bào, mà còn liên quan mật

thiết với việc hình thành và phát triển của khối u. Ví dụ, histone 3 lysine 79

(H3K79) methyltransferase (DOT1L) là một chất hoạt hóa phiên mã phụ

thuộc vào con đường tín hiệu Wnt trong tế bào CRC. Các protein tăng cường

cho gen homolog 2 (EZH2) thuộc nhóm protein polycomb cũng có chức năng

như histone methyltransferase, chúng thường xuyên được biểu hiện quá mức

trong các khối u rắn khác nhau, bao gồm cả CRC [39]. Protein này bất hoạt

gen ức chế khối u, bao gồm INK4B-ARF-INK4a, E-cadherin, P57 KIP2, p2,

BRCA1 và β2 adrenergic làm cho tế bào biến đổi thành ung thư [39]. Mixed-

lineage leukemia 2 là một gen đột biến được tìm thấy đầu tiên trong tế bào u

lympho B lớn, nó mã hóa cho protein mixed-lineage leukemia 2, tăng mức

biểu hiện gen mixed-lineage leukemia 2 thường thấy trong các dòng tế bào

ung thư biểu mô đại tràng biệt hóa kém và dòng tế bào ung thư biểu mô đại

tràng xâm lấn so với biểu mô đại tràng bình thường bên cạnh. Protein mixed-

lineage leukemia 2 là một protein nhân có vai trò chủ yếu để định vị nhân. Ở

các dòng tế bào u đại tràng có khả năng xâm lấn cao, sự thay đổi phân bổ các

cấu trúc dưới tế bào và quá trình thủy phân protein mixed-lineage leukemia 2

nhiều hơn các dòng tế bào bình thường hay tế bào khối u ít xâm lấn. Như vậy,

thay đổi bất thường về sắp xếp cũng như quá trình thủy phân protein mixed-

lineage leukemia 2 có thể liên quan đến các gen tạo ra khối u ở đại tràng,

mixed-lineage leukemia 2 qua trung gian các hoạt động methyl hóa histone

làm gián đoạn lần lượt tín hiệu gen ở phần cuối DNA, liên quan đến chu trình

tế bào hoặc các hoạt động tăng sinh tế bào. Chất ức chế gen homolog 1 khảm

3-9 (SUV39H1) là một enzyme histone methyltransferase xúc tác phản ứng

methyl hóa histone 3 ở vị trí H3K9 quanh thể trung tâm của dị nhiễm sắc chất.

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy tăng mức độ biểu hiện của chất ức chế gen

homolog 1 dạng khảm 3-9 có trong 54/219 mẫu xét nghiệm ở bệnh nhân CRC.

Hơn nữa, cũng có tương quan đáng kể giữa biểu hiện mRNA mã hóa protein

này và mức mRNA mã hóa DNA methyltransferase 1 ở những bệnh nhân

CRC, cho thấy mối liên quan giữa methyl hóa histone H3 ở vị trí H3K9 và

hình thành tế bào CRC. Nhìn chung, các nghiên cứu đã chứng minh rằng thay

đổi biểu hiện và chức năng của enzyme histone methyltransferase là đặc trưng

của bệnh ung thư, bao gồm cả CRC [40].

1.3. Liệu pháp virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư đại trực

tràng người

1.3.1. Sinh học virus sởi và quai bị

Virus sởi và quai bị là các virus thuộc thành viên của họ

Paramyxoviridae (hình 1.1), có đường kính khoảng 100-300 nm, với một lõi

nucleocapsid xoắn chứa sợi RNA đơn (-). Hai protein màng của virus: protein

fusion (F) chịu trách nhiệm cho sự hợp nhất màng của virus với màng tế bào

chủ, tạo điều kiện cho virus xâm nhập vào bên trong tế bào và huyết tán;

protein hemagglutinin (H) hay hemagglutinin neuraminidase (HN) chịu trách

nhiệm việc virus xâm nhập vào tế bào. Kháng thể kháng các protein này có thể

làm giảm nhiễm trùng virus. Protein khác bao gồm các protein mitrix (M) liên kết

các vỏ với lõi plasmid ribonucleo cùng với protein hợp nhất fusion và protein

hemagglutinin hay hemagglutinin neuraminidase tạo nên cấu trúc của vỏ

virus. Nucleoprotein (N) cùng với Phosphoprotein (P) và protein Large (L) tạo

nên ribonucleocapsid chứa đựng genome ARN của virus (hình 1.1) [41].

Virus sởi và quai bị xâm nhập vào tế bào bằng cách gắn protein bám

dính của chúng (protein H, HN) vào thụ cảm thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào.

Vỏ của chúng có thể hòa hợp trực tiếp với màng tế bào dưới sự hỗ trợ của

protein F, quá trình này được kích hoạt bởi glycoprotein bề mặt tế bào có

chứa acid sialic, hoặc virus có thể xâm nhập vào các tế bào thông qua các con

đường nội nhập bào cùng với sự hợp nhất màng xảy ra trong điều kiện toan

hóa bên trong endosome. Kết quả là các nucleocapsid chứa gen của virus

được giải phóng vào bào tương nơi mà diễn ra quá trình virus nhân lên [41].

Nhờ có enzyme RNA polymerase, các virus này sao chép sợi RNA

thành mRNA, sau đó được dịch mã thành các protein cấu trúc và phi cấu trúc.

Sự phiên mã bắt đầu từ vùng khởi động đơn nằm ở đầu 3' của bộ gen và sau

đó có thể chấm dứt trong các khu vực đã được định rõ giữa các gen của virus

hoặc theo xuôi chiều bộ gen. Phương thức phiên mã này chịu trách nhiệm về

sự phân cực các sản phẩm, trong đó các gen gần với đầu 3' của bộ gen nhất

được thể hiện nhiều hơn so với các bản sao ở vị trí xa. Cơ chế này là một cách

đơn giản và hiệu quả để điều chỉnh mức độ phiên mã, tạo ra sự cân bằng cần

thiết cho sản phẩm virus. Nồng độ sản phẩm nucleoprotein quyết định thời

gian mà tại đó RNA polymerase chuyển từ phiên mã gen sang sao chép gen.

Sự nhân lên của virus liên quan đến việc tổng hợp các sợi RNA (+) có độ dài

đầy đủ, sau đó được sao chép thành các sợi RNA (-) thế hệ con cháu (hình

1.1). Các hạt virus trưởng thành lồi ra ngoài màng tế bào rồi sau đó thoát ra

ngoài. Chúng có thể lây nhiễm sang các tế bào khác và bắt đầu chu kỳ sống

mới. Một con đường khác đối với lây truyền virus là sự hợp nhất các tế bào bị

nhiễm virus với các tế bào lân cận và hình thành các hợp bào. Hợp bào tạo

điều kiện cho virus có khả năng lây nhiễm và giết chết hàng chục tế bào mà

không cần phải thoát ra bên ngoài tế bào [41].

Hình 1.1. Gia đình Paramyxoviridae

* Nguồn: theo Matveeva O.V và cộng sự (2015) [41]

MeV thuộc chi Morbillivirus; MuV thuộc chi Rubulavirus

1.3.2. Virus vaccine sởi và quai bị lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư

đại trực tràng

1.3.2.1. Tế bào ung thư đại trực tràng có các thụ cảm thể đặc hiệu với

virus vaccine sởi và quai bị

MuV chủng Urabe sử dụng các sialoglycoprotein có chứa acid sialic

trên bề mặt tế bào ung thư như là thụ cảm thể đặc hiệu. MuV lây nhiễm chọn

lọc vào tế bào CRC có nhiều sialoglycoprotein trên bề mặt và hầu như không

lây nhiễm các tế bào bình thường. Do đó, MuV ly giải có tính chọn lọc các tế

bào u CRC nguyên phát và cả u CRC di căn [42].

MeV chủng Edmonston sử dụng các thụ cảm thể đặc hiệu CD46, đó là

một yếu tố điều hòa hoạt hóa bổ thể có ở bề mặt tất cả các tế bào có nhân của

người, nhưng thường biểu hiện quá mức ở một số dòng tế bào ung thư bao

gồm cả CRC. MeV lây nhiễm và giết chết các tế bào ung thư biểu hiện nhiều

thụ cảm thể này nhưng lại ít ảnh hưởng đối với tế bào bình thường. Gần đây,

Nectin-4 cũng được xác định là thụ cảm thể đặc hiệu của MeV [43]. Đây là

một thành viên các thụ cảm thể bám dính của liên họ globulin miễn dịch nằm

ở vị trí mà các tế bào biểu mô dính với nhau trong đó có cả tế bào CRC.

Nectin-4 có thể được coi là một marker của tế bào khối u vú, ung thư phổi,

ung thư buồng trứng và CRC.

1.3.2.2. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại trực

tràng thông qua protease đặc hiệu

Tính đặc hiệu của các MeV, MuV đối với tế bào CRC còn thông qua

các protease có ở tế bào CRC. Chu trình nhân lên của MuV, MeV đòi hỏi phải

có các protease phân cắt glycoprotein của virus, tạo điều kiện để virus xâm

nhập có hiệu quả vào tế bào (hình 1.2). Các protease này được biểu hiện nhiều

ở các tế bào ung thư, đại diện là các matrix metalloproteinase, những phân tử

này là các endopeptidase, được biểu hiện quá mức ở hầu hết các tế bào ung

thư người bao gồm cả CRC [44], [45]. Người ta vẫn chưa rõ liệu những

protease này có thể hoạt hóa virus chủng hoang dại của MeV và MuV hay

không. Tuy nhiên, MeV chủng Edmonston và MuV chủng Urabe đã biến đổi

gen đều có tính chọn lọc với các tế bào ung thư người mà biểu hiện nhiều

matrix metalloproteinase.

* Nguồn: theo Matveeva O.V và cộng sự (2015) [45]

Hình 1.2. MeV, MuV lây nhiễm đặc hiệu tế bào CRC

1.3.2.3. Virus vaccine sởi và quai bị tận dụng các khiếm khuyết gen ở tế

bào ung thư đại trực tràng

Tính đặc hiệu của MeV, MuV còn có liên quan đến biến đổi di truyền

đặc biệt trong tế bào ung thư. Các khiếm khuyết di truyền này làm cho các tế

bào ung thư dễ bị nhiễm virus và tạo điều kiện cho virus nhân lên tốt hơn mà

hầu như không có ở tế bào bình thường (hình 1.2).

Do có biến đổi di truyền đặc biệt, các tế bào khối u phát triển nhiều

chiến lược để tránh sự phát hiện và tiêu diệt của hệ thống miễn dịch. Trong số

đó, đáng chú ý là khả năng thu hút các tế bào ức chế miễn dịch như tế bào

lympho T điều hòa (tế bào Treg) và đại thực bào M2. Các tế bào này làm giảm

sự xâm nhập của các tế bào lympho T gây độc tế bào khối u, do đó, giảm các

đáp ứng miễn dịch kháng u. Ngoài ra, các khối u còn có khả năng biến đổi vi

môi trường để hạn chết sự xâm nhập các tế bào miễn dịch như: các tế bào

bạch cầu dòng tủy, tế bào tua (tế bào DC), tế vào giết tự nhiên (tế bào NK),

đây là các tế bào rất quan trọng cho cả miễn dịch tự nhiên và miễn dịch thích

ứng. Vi môi trường khối u còn có khả năng che dấu kháng nguyên khối u,

trung hòa các kháng thể kháng tế bào u tạo điều kiện cho khối u thoát khỏi

kiểm soát của hệ miễn dịch. Tất các các cơ chế làm cho khối u thoát khỏi hệ

miễn dịch cũng là điều kiện thuận lợi quan trọng để OV thoát khỏi kiểm soát

của hệ miễn dịch và lây nhiễm bên trong khối u.

Cuddington B.P và cộng sự (2014) đã phát hiện ra OV có khả năng lây

nhiễm tốt hơn ở các tế bào tăng mức độ biểu hiện gen KRAS (tế bào khối u)

[46]. Một gen khác được tìm thấy trong các tế bào khối u là VEGF, có thể ảnh

hưởng đến liệu pháp điều trị ung thư bằng OV. Người ta đã chứng minh gen

VEGF-A làm tăng mức độ xâm nhập và sau đó nhân lên của OV trong tế bào

u. Do đó, OV có thể tận dụng sự đột biến gen làm tăng biểu hiện gen VEGF

để tăng khả năng lây nhiễm và ly giải tế bào u. Ngoài ra, Arulanandam R và

cộng sự (2015) nhận thấy rằng sự gia tăng biểu hiện gen VEGF dẫn đến tăng

sự điều hòa của PRD1-BF1 (một chất ức chế phiên mã) làm tăng độ nhạy cảm

của các tế bào nội mô mạch máu khối u với nhiễm trùng OV thông qua việc

ức chế tín hiệu chống virus loại 1. Sự gia tăng ái lực của virus với tế bào u

cho phép OV lây lan trong khối u hiệu quả hơn và do đó làm tăng hiệu quả

của liệu pháp OV [47]. Các nhà khoa học cũng đã tìm thấy con đường đáp

ứng interferon là một yếu tố quan trọng trong nhiễm trùng virus sởi vào tế bào

u ác tính trung biểu mô màng phổi. Có mối tương quan nghịch giữa khả năng

virus sởi lây nhiễm tế bào với mức độ tạo ra phản ứng interferon. Tế bào ung

thư biến đổi di truyền, mất khả năng cảm ứng interferon nên rất dễ bị lây

nhiễm OV. Ức chế con đường cảm ứng interferon đã được chứng minh làm

tăng hiệu quả ly giải tế bào u của OV.

1.3.3. Các cơ chế virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư

đại trực tràng

1.3.3.1. Hình thành hợp bào (tế bào khổng lồ nhiều nhân)

MeV và MuV có các protein F và protein HN hay H gắn vào thụ thể

tham gia quá trình hợp màng. Khi gắn vào thụ thể, protein HN hay H thay đổi

cấu hình, sự thay đổi này kích hoạt protein hợp màng gây ra quá trình thay đổi

trong protein F. Sự thay đổi này làm cho màng virus và tế bào sát lại rồi hợp

nhất với nhau. Cơ chế chính xác mà protein HN hay H kích hoạt protein F là

chưa rõ ràng. Các protein F của MeV và MuV còn tham gia quá trình hợp

nhất màng tế bào nhiễm virus với màng tế bào bình thường xung quanh,

giống như sự hợp nhất giữa màng virus và tế bào (quá trình nhiễm trùng). Sự

hợp nhất giữa tế bào nhiễm virus và tế bào bình thường lân cận tạo thành hợp

bào (một khối tế bào khổng lồ có nhiều nhân). Một tế bào bị nhiễm virus có

thể hợp nhất 50-100 tế bào lân cận với nhau tạo thành một hợp bào (hình

1.3a) [45]. Đây là một cơ chế lây lan virus mà không cần giải phóng các hạt

virus trưởng thành ra khỏi tế bào ung thư. Quá trình hợp nhất tế bào làm cho

virus giảm tiếp xúc với kháng thể trung hòa của cơ thể vật chủ, chúng lẩn

tránh được sự kiểm soát của hệ miễn dịch dễ dàng lây lan và phát triển. Thông

thường, các hợp bào tồn tại không quá 4-5 ngày.

Hợp bào chết là do hợp nhất hạt nhân, ngưng tụ nhiễm sắc thể sớm,

thoái hóa autophagy, kèm theo giải phóng các túi syncytiosome giống như

exosome nhưng biểu hiện kháng nguyên tế bào u cao. Hợp bào chết tạo ra các

syncytiosome nhiều hơn đáng kể so với các tế bào chết do các nguyên nhân

khác. Syncytiosome là yếu tố làm cho các tế bào DC trưởng thành và trình

diện kháng nguyên hiệu quả hơn so với các exosome từ tế bào chết do các

nguyên nhân khác [48].

Các virus sử dụng protein hợp màng để hình thành hợp bào góp phần

tăng hiệu quả ly giải tế bào u. Vì vậy, MeV và MuV có khả năng trực tiếp giết

chết các tế bào ung thư thông qua hình thành các hợp bào, đây là một thuộc

tính ly giải tế bào u quan trọng (hình 1.3a), khả năng virus tạo hợp bào tương

quan với tiềm năng ly giải tế bào ung thư của chúng.

1.3.3.2. Tạo ra miễn dịch đặc hiệu kháng tế bào u

Ngoài khả năng trực tiếp giết chết tế bào CRC qua hình thành hợp bào,

các virus còn tạo ra phản ứng toàn thân góp phần mạnh mẽ vào hoạt động ly

giải tế bào u. Những phản ứng này bao gồm kích thích miễn dịch bẩm sinh

kháng virus như: sản xuất interferon (IFN), các cytokine, hoạt hóa tế bào giết

tự nhiên (NK), đại thực bào, tế bào tua (DC). Nhiễm virus còn tạo ra phản

ứng miễn dịch thích ứng không chỉ hoạt động để hạn chế sự lây nhiễm virus

bằng cách nhắm vào các hạt virus được giải phóng ra và tế bào bị nhiễm

virus, mà còn làm cho tế bào ung thư tiếp xúc với các tế bào trình diện kháng

nguyên, kích hoạt phản ứng miễn dịch kháng ung thư đặc hiệu (hình 1.3b).

MeV, MuV tạo ra tín hiệu nguy hiểm, các tín hiệu này đóng một vai trò

quan trọng trong việc loại bỏ khối u qua trung gian miễn dịch. Kích hoạt miễn

dịch chống ung thư có thể xảy ra khi không có sự sao chép của virus trong tế

bào khối u và ngay cả khi virus được tiêm dưới da hoặc nội u [49]. Về bản

chất, virus hoạt động như một tín hiệu nguy hiểm, có khả năng thu hút và kích

hoạt các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp như các tế bào DC.

Các tế bào DC hoạt động như một phần của cả miễn dịch bẩm sinh và thích

ứng, chúng kích thích đáp ứng miễn dịch tế bào lympho T đặc hiệu chống lại

các kháng nguyên khối u. Các protein hợp màng của MeV, MuV hình thành

hợp bào, các sản phẩm từ hợp bào bị phân hủy làm cho tế bào DC trưởng

thành và trình diện kháng nguyên khối u có hiệu quả [48].

MeV và MuV tạo ra tín hiệu nguy hiểm, các tín hiệu nguy hiểm chia ra

làm 2 loại là nội sinh và ngoại sinh. Theo quan điểm hiện nay, các tín hiệu

nguy hiểm nội sinh là những phân tử có nguồn gốc từ các tế bào và tổ chức bị

tổn thương (DAMP), các phân tử DAMP bao gồm các calreticulin, các protein

sốc nhiệt (Hsp70, HSP90) … và cả acid uric có nguồn gốc từ tế bào chết. Các

chất này được giải phóng ra trong thời gian từ giữa đến cuối của quá trình tế

bào chết theo chương trình, hoại tử, hoặc autophagy. Các tín hiệu nguy hiểm

ngoại sinh là những phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh (PAMP) như:

vi khuẩn, virus…. DAMP và PAMP kích hoạt các phản ứng miễn dịch chống

lại nhiễm trùng và quá trình bệnh lý do các mầm bệnh gây ra [50].

Tế bào ung thư còn có khả năng điều chỉnh vi môi trường của chúng để

thoái khỏi hệ miễn dịch. Vi môi trường khối u có khả năng sản xuất ra các

cytokine ức chế miễn dịch và thu hút các tế bào ức chế miễn dịch, như tế bào

lympho T điều hòa dòng tủy (Treg), các đại thực bào M2 duy trì dung nạp

miễn dịch trong các khối u…. Sự thay đổi vi môi trường để khối u thoát khỏi

kiểm soát của hệ miễn dịch đã tạo điều kiện cho virus vượt qua hệ miễn dịch,

dễ dàng vượt qua vi môi trường của khối u xâm nhập vào tế bào ung thư và

bộc lộ kháng nguyên virus trên bề mặt tế bào ung thư, cùng với các sản phẩm

do các tế bào chết tạo ra tín hiệu DAMP và PAMP, kích hoạt các đáp ứng

miễn dịch đặc hiệu tiêu diệt tế bào u. Quá trình này có thể giống hoại tử tế

bào, chết tế bào theo chương trình, hoặc autophagy [51].

Các phân tử tín hiệu nguy hiểm chính là các tác nhân làm cho hệ miễn

dịch dễ dàng nhận diện tế bào ung thư. DAMP và PAMP kích hoạt tế bào DC

trình diện chéo các kháng nguyên khối u cho tế bào lympho T CD4+ và T

CD8+ đã biệt hóa. Sau khi tế bào u bị chết do nhiễm virus, các sản phẩm từ tế

bào chết được tế bào DC thực bào và tiêu hóa, hoạt động này lại làm cho tế

bào DC trưởng thành, chúng sản xuất các IFN-α và trình diện chéo kháng

nguyên khối u ở mức cao hơn cho tế bào lympho T, tạo ra các tế bào T CD8+

gây độc tế bào u đặc hiệu. Như vậy, MeV và MuV có thể ly giải các tế bào u

thông qua kích thích hệ miễn dịch kháng tế bào u đặc hiệu [52].

Hình 1.3. MeV, MuV ly giải tế bào CRC trực tiếp và qua trung gian

* Nguồn: theo Matveeva O.V và cộng sự (2015) [45]

miễn dịch

Vai trò của tự thực bào (autophagy): Autophagy là một quá trình tế bào

chết do tự thực bào, được kiểm soát chặt chẽ, làm trung gian cho sự thoái biến

và tái sinh các protein tế bào, các bào quan, cũng như các tác nhân gây bệnh.

Autophagy đóng vai trò quan trọng trong cả miễn dịch bẩm sinh và thích ứng

[53]. MeV và MuV đã được chứng minh là các nhân gây ra autophagy trong

các tế bào ung thư. Như đã đề cập trước đó, hợp bào bị chết là do autophagy.

MeV và MuV có thể gắn với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào u và tạo ra

autophagy [53], [54]. Autophagy làm tăng sinh miễn dịch chống khối u không

chỉ bằng cách giải phóng ra DAMP, PAMP mà còn làm cho tế bào DC trưởng

thành và trình diện chéo các kháng nguyên tế bào ung thư, kích hoạt tế bào

lympho T.

MeV, MuV ức chế đáp ứng IFN ở tế bào CRC: Một trong những cơ chế

quan trọng nhất bảo vệ tế bào chống lại virus là sự cảm ứng IFN, các protein

cảm ứng IFN làm ức chế sự tổng hợp protein cho virus, thiết lập một tình

trạng kháng virus. Tuy nhiên, MeV, MuV là những virus đã phát triển các con

đường khác nhau để trốn tránh hệ miễn dịch hoặc kháng lại các protein tạo ra

đáp ứng IFN kháng virus. MeV và MuV sử dụng một số protein làm cho

chúng có thể thoát khỏi hàng rào bảo vệ tế bào bằng cách ngăn chặn sự sản

xuất và/hoặc tạo ra tín hiệu khích thích IFN. MuV sử dụng protein V [55];

MeV sử dụng protein V, C và P để ngăn chặn các con đường tạo ra IFN [56],

[57], [58].

Trong quá trình hình thành tính chất ác tính, tế bào ung thư biến đổi về

gen và thoát khỏi các chức năng kiểm soát của cơ thể. Cùng với các đột gen

thúc đẩy sự tăng sinh tế bào và xâm lấn, các tín hiệu cảm ứng IFN thường bị

giảm bởi mất đồng hợp tử của vùng nhiễm sắc thể 9p21, vùng này mã hóa các

gen IFN lớp I [59]. Trong các tế bào ác tính, virus không bị ngăn chặn bởi

IFN, vì con đường này đã bị phá vỡ.

MeV, MuV kích thích các cytokine: MuV và MeV có khả năng kích

thích các tế bào lympho máu ngoại vi tổng hợp các interleukins (IL), đại thực

bào viêm tiết ra protein-1 α và β, các chất này có vai trò hóa ứng động bạch

cầu đơn nhân. Tác giả Donnelly O.G và cộng sự (2013) cũng đã chứng minh

chủng MeV-Edmonston có khả năng ly giải tế bào u hắc tố qua trung gian

miễn dịch bằng cách kích thích các tế bào miễn dịch tiết ra các cytokine viêm

(IL-6, IL-8 và IFN loại I) và chemokine (RANTES và HMGB1), các chất này

thu hút bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, tế bào NK, tế bào DC và tế bào

lympho T tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng u [60]. Các chemokine

này cũng kích thích các tế bào lympho T bám dính vào tế bào nội mô mạch

máu và ức chế sự hình thành mạch. Chemokine (motif C-C) ligand 5 và

chemokine motif C-X-C 10 có khả năng kích thích tế bào lympho T hỗ trợ

type 1 (Th1), thu hút tế bào lympho T gây độc tế bào đã được hoạt hóa vào

trong khối u để tiêu diệt tế bào ung thư. MuV và MeV sử dụng protein H, HN

kích thích các tế bào lympho ở máu ngoại vi bài tiết các cytokine như yếu tố

hoại tử khối u ( TNF-), phân tử gây ra apoptosis làm tăng hiệu quả ly giải tế

bào u qua trung gian miễn dịch [61].

MeV, MuV kích thích các tế bào NK: Các tế bào NK cũng là loại tế bào

lympho gây độc tế bào, cầu nối hệ miễn dịch bẩm sinh và thích ứng. Những tế

bào này tương tác với nhiều thành phần khác nhau của hệ miễn dịch, sau đó,

kích hoạt đáp ứng tế bào lympho T và B đặc hiệu với kháng nguyên [62]. Các

tế bào NK tham gia vào kiểm soát sớm chống nhiễm virus và trong giám sát

miễn dịch khối u. Tế bào NK có vai trò phản ứng nhanh bảo vệ cơ thể, chúng

có khả năng tiêu diệt các tế bào bất thường hoặc tế bào bị stress mà thiếu thụ

các kháng thể và phức hợp tương hợp mô chính (MHC). Các tế bào NK cần

được hoạt hóa để có khả năng giết chết các tế bào mà không biểu hiện các

marker "cùng loại" với MHC lớp I. Tế bào NK có các thụ cảm thể gây độc tế

bào, các thụ cảm thể này chịu trách nhiệm kích hoạt chúng. Trong số các thụ

thể này có thụ thể protein NK 46 (NKp46) và protein NK 44 (NKp44) có vai

trò quan trọng nhất. Protein HN của các virus trực tiếp tương tác với hai thụ

thể NKp44 và NKp46, tương tác này gây ra sự kích hoạt tế bào NK và ly giải

tế bào u qua trung gian tế bào NK [63]. Đặc biệt, protein HN của MuV hoạt

hóa thụ thể NKp46 của tế bào NK và loại bỏ khối u qua tương tác chéo giữa

tế bào NK và DC [64].

MeV, MuV kích thích tế bào DC: Tế bào DC là những tế bào trình diện

kháng nguyên chuyên biệt, chúng có thể kích thích rất hiệu quả đáp ứng miễn

dịch bẩm sinh cũng như miễn dịch thích ứng chống lại tác nhân gây bệnh

khác nhau và tế bào ung thư. Sau khi nhận diện được một loại virus hoặc

mầm bệnh, các tế bào DC bắt đầu một quá trình trưởng thành và có khả năng

huấn luyện các tế bào lympho T non thành các tế bào lympho T trưởng thành.

Người ta đã chứng minh đưa tế bào DC trưởng thành vào cơ thể trước khi cấy

ghép khối u có tác dụng dự phòng ung thư nguyên bào thần kinh di căn phổi

và ung thư tuyến tiền liệt di căn phổi [65], [66]. Một chức năng khác của tế

bào DC là chúng có khả năng ngăn chặn vai trò ức chế miễn dịch của các tế

bào lympho T điều hòa (tế bào Treg).

MeV, MuV tái tổ hợp có thể kích hoạt tế bào DC bên ngoài cơ thể sống

tạo ra các tế bào DC trưởng thành, quá trình hoạt hóa tế bào DC chỉ xảy ra

trong 1 giờ. Điều trị bằng tế bào DC đã được hoạt hóa chứa các biến thể khác

nhau của MeV, MuV tái tổ hợp có thể cải thiện đáng kể sự sống của động vật

bị khối u ác tính như: ung thư đại tràng, ung thư biểu mô tế bào vảy, ung thư

tế bào gan, u nguyên bào thần kinh, và ung thư tuyến tiền liệt.

MeV, MuV kích thích tế bào lympho T gây độc tế bào khối u đặc hiệu:

MeV, MuV kích hoạt hệ miễn dịch, hoạt hóa tế bào lympho T CD8+, tăng

cường hoạt động của tế bào T CD4+ hỗ trợ, các tế bào lympho T xâm nhập

vào bên trong khối u ly giải tế bào ung thư là kết quả của hiệu ứng phức tạp,

bao gồm cả giải phóng IFN tại chỗ và toàn thân cũng như các cytokine [52].

Người ta đã tìm thấy hiệu ứng này qua sự hiện diện các phân tử chức năng

hemagglutinin neuraminidase của virus trên bề mặt tế bào khối u, chúng có ái

lực với màng tế bào và do đó có thể làm trung gian bám dính mạnh mẽ của

các tế bào bị nhiễm virus với tế bào lympho T gây độc tế bào.

Virus gắn lên bề mặt tế bào có thể kích thích đáp ứng tế bào lympho T

CD8+ đặc hiệu và tăng cường hoạt động của tế bào lympho T CD4+ tiêu diệt

tế bào ung thư. Các tế bào lympho T gây độc tế bào được kích hoạt và xâm

nhập vào các vị trí khối u là kết quả của những tác động phức tạp do virus

khích thích hệ miễn dịch ngay cả khi tiêm virus tại chỗ (nội u).

Protein Hemagglutinin neuraminidase của MeV và MuV có vai trò như

sialidase: Axit sialic là axit monosaccharide có chín carbon được tìm thấy ở

vị trí cuối của chuỗi glycan. Sialic hóa các phân tử glycoprotein trên bề mặt tế

bào thường xuyên bị thay đổi theo các tế loại bào ung thư. Trên bề mặt các tế

bào ung thư thường biểu hiện mật độ cao glycoprotein giàu axit sialic. Sự

biểu hiệu quá mức axit sialic hình thành một điện tích âm trên bề mặt tế bào

ung thư, tạo ra một lực đẩy giữa các tế bào với nhau, giúp các tế bào ung thư

dễ bong ra, xâm nhập vào dòng máu, tăng khả năng xâm lấn và di căn. Khả

năng di căn của các tế bào ung thư tương quan với mức độ phong phú axit

sialic trên bề mặt của chúng. Tuy nhiên, cho đến nay, một khía cạnh quan

trọng liên quan đến vai trò của axit sialic trong sinh hóa tế bào ung thư vẫn

chưa rõ ràng. Một nghiên cứu gần đây đã chứng minh và đề xuất mức độ axit

sialic trên bề mặt tế bào như là một marker đặc trưng cho tình trạng biệt hóa

của tế bào ung thư phổi nhỏ [67].

Một nghiên cứu sâu hơn đánh giá vai trò của acid sialic trên bề mặt tế

bào u, kết quả cho thấy có sự khác biệt về axit sialic trên bề mặt tế bào ung

thư đại tràng so với tế bào đại tràng bình thường, mức độ axit sialic cũng

tương quan với mức độ di căn và xâm lấn. Axit sialic có liên kết alpha 2, 3 có

nhiều ở các tế bào đại tràng người bình thường, trong khi đó các tế bào ung

thư đại tràng lại có nhiều axit sialic có liên kết alpha 2, 6. Có thể thấy rằng sự

tiến triển ác tính có liên quan với thay đổi của enzyme sialyl-transferase

alpha, enzyme này biến đổi axit sialic có liên kết alpha 2, 3 thành axit sialic

có liên kết alpha 2, 6. Axit sialic có liên kết alpha 2, 6 tỉ lệ thuận với khả năng

tiến triển bệnh ung thư đại trực tràng [42], [68].

Bên cạnh đó, axit sialic hóa bề mặt tế bào còn tạo ra một lớp phủ trên

bề mặt tế bào ung thư, che giấu các kháng nguyên tế bào ung thư và làm cho

các tế bào này thoát khỏi sự giám sát của hệ thống miễn dịch. Các nhà khoa

học đã chứng minh kháng nguyên ung thư tuyến giáp thể tủy lewis bị che

khuất, thoát khỏi kiểm soát của hệ miễn dịch nhờ các phân tử axit sialic có

liên kết alpha 2,3 và liên kết alpha 2,6. Loại bỏ axit sialic khỏi bề mặt tế bào

ung thư bằng enzyme sialidase có thể làm cho hệ thống miễn dịch phát hiện

kháng nguyên ung thư đặc hiệu (hình 1.4). Việc loại bỏ axit sialic khỏi bề mặt

tế bào ung thư làm giảm khả năng di căn, bộc lộ kháng nguyên tế bào u, do

đó, kích hoạt các tế bào NK, giải phóng IFN-γ tiêu diệt tế bào ung thư. Các

protein H, HN của MeV và MuV sở hữu cả hoạt động ngưng kết hồng cầu và

neuraminidase (sialidase). Neuraminidase có khả năng chia tách và loại bỏ

axit sialic khỏi bề mặt các tế bào u, bộc lộ kháng nguyên tế bào u, làm tăng

đáp ứng của tế bào lympho T gây độc tế bào.

Hình 1.4. Vai trò sialidase của MeV, MuV hoạt hóa tế bào lympho T

* Nguồn: theo Matveeva O.V và cộng sự (2015) [45]

gây độc tế bào u.

1.4. Các nghiên cứu virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư

trên lâm sàng

Đã có nhiều thử nghiệm lâm sàng của MeV và Muv ở các giai đoạn

khác nhau. Điều này cho thấy 2 OV này có tiềm năng phát triển thành liệu

pháp điều trị nhiều loại ung thư khác nhau. Bảng dưới đây thống kê các thử

nghiệm lâm sàng đã tiến hành với MeV và MuV.

Bảng 1.1. Các thử nghiệm lâm sàng của MeV và MuV

Bệnh

Kết quả lâm sàng

Năm

Chủng virus

Cách điều trị

Liều, thời gian điều trị

N.C lâm sàng, số bệnh nhân (n)

Virus sởi (MeV)

2005

Tiêm nội u

U lympho T dưới da

Giai đoạn 1 (n = 5)

102–103 TCID50

MeV- EZ

1/5 bệnh nhân thoái triển hoàn toàn u bị tiêm, 3/5 bệnh nhân thoái triển một phần ở u tiêm và 2/3 bệnh nhân này có thoái triển một phần các u ở xa.

2010

Ung thư buồng trứng

Giai đoạn 1 (n = 21)

Tiêm màng bụng

MeV- CEA

103–103 TCID50 (4 tuần/lần, 6 tháng)

14/21 bệnh nhân có đáp ứng: thời gian sống trung bình là 1 năm; 1 bệnh nhân có thời gian sống 3,2 năm.

Tiến triển

U nguyên bào đệm đa dạng Giai đoạn 1

Tiêm nội u

MeV- CEA

Đa u tủy

2014

Giai đoạn 1 (n=2)

Truyền tĩnh mạch

MeV- NIS

Sau truyền virus, quan sát thấy MV-NIS nhân lên có chọn lọc ở khối u, thoái triển hoàn toàn u ác tính đã di căn ở 1/2 số bệnh nhân.

2015

Ung thư buồng trứng

Giai đoạn 1 (n=16)

Tiêm màng bụng

Thời gian sống trung bình của bệnh nhân là 26,5 tháng

MeV- NIS

108–109 TCID50 (4tuần/lần, 6 tháng)

Giai đoạn 1

Đang thực hiện

MeV- NIS

U ác tính trung biểu mô màng phổi

Tiêm màng bụng

2012 đến 2018

Đang thực hiện

Giai đoạn 1 (n=12)

MeV- NIS

Tiêm nội u

2013 đến 2018

Ung thư biểu mô tế bào vảy đầu và cổ hay ung thư vú

Đang thực hiện

U thần kinh ngoại biên

MeV- NIS

Tiêm nội u

Giai đoạn 1 (n=30)

Đang thực hiện

MeV- NIS

Tiêm nội u

Giai đoạn 2 (n=16)

U nguyên bào đa dạng tái phát

2017 đến 2021 2015 đến 2019

Đang thực hiện

Tiêm nội u

Giai đoạn 1 (n=37)

MeV- CEA

2012 đến 2018

U biểu mô buồng trứng hay màng bụng

Đang thực hiện

Tiêm nội u

U biểu mô buồng trứng

Giai đoạn 1 (n=54)

MeV- NIS

2014 đến 2021

Virus quai bị (MuV)

1974

105–107 TCID50

Ung thư tiến triển

Giai đoạn 2 (n = 90)

Chủng Urabe

Tiêm tại chỗ, tĩnh mạch, khí dung

79/90 bệnh nhân đáp ứng với điều trị và 37/79 bệnh nhân có thoái biến khối u đáng kể hay hoàn toàn.

1978

108–109 PFU

Ung thư tiến triển

Giai đoạn 2 (n=200)

Chủng Urabe

26/200 bệnh nhân có thoái biến khối u; đa số bệnh nhân có các triệu chứng khách quan nhẹ

1988

108–109 PFU

Ung thư phụ khoa

Giai đoạn 2 (n = 22)

Chủng Urabe giảm độc lực

Tiên dưới da, màng bụng, trong ngực và nội u

5/7 bệnh nhân đã mất hoàn toàn cổ trướng hoặc tràn dịch màng phổi; Tuy nhiên những bệnh nhân có khối u lớn không đáp ứng. Bệnh nhân tràn dịch màng bụng hoặc màng phổi có đáp ứng (chưa tiêm chủng vaccine virus)

* Nguồn: theo Matveeva O.V và cộng sự (2015) [41]

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Động vật

Có 49 con chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) chủng BALB/c được

nuôi trong phòng sạch, chăm sóc theo quy trình hướng dẫn nuôi chuột nude

tại Viện nghiên cứu Y-Dược học Quân sự, Học viện Quân Y.

2.1.2. Chất liệu nghiên cứu

2.1.2.1. Virus vaccine sởi và quai bị

Virus vaccine sởi chủng Edmonton và virus vaccine quai bị chủng

Urabe có nguồn gốc từ vaccine Priorix (GlaxosmithKline, Anh). Các chủng

virus vaccine này được tăng sinh, bảo quản và duy trì ở phòng thí nghiệm

nghiên cứu ưng thư của Bộ môn Sinh lý bệnh đặt tại Viện nghiên cứu Y-Dược

học Quân sự, Học viện Quân y.

2.1.2.2. Dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 và tế bào thận khỉ

xanh Châu Phi (Vero)

Dòng tế bào Vero và ung thư đại tràng người HT-29 có nguồn gốc từ

trung tâm nuôi cấy các dòng tế bào Mỹ (American Type Culture Collection,

Manassas, Virginia, USA). Quá trình nghiên cứu chúng tôi nuôi cấy, tăng sinh

các dòng tế bào này trong môi trường nuôi cấy đúng theo quy trình, bảo quản

và duy trì tại trung tâm nghiên cứu ưng thư của Bộ môn Sinh lý bệnh đặt tại

Viện nghiên cứu Y-Dược học Quân sự, Học viện Quân y.

2.1.3. Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu

2.1.3.1. Thiết bị sử dụng

Sử dụng các thước kẹp đo u, máy camera, máy đo quang OD làm

nghiệm pháp MTT, kính hiển vi quang học, tủ ấm 370 C và 5% CO2 (hình

2.1) Các máy đo phục vụ cho nghiên cứu đều được chuẩn hóa.

Hình 2.1. Các máy sử dụng cho nghiên cứu

(1) Kính hiển vi điện tử truyền qua; (2) Máy phân tích tế bào theo dòng chảy;

(3) Máy ly tâm; (4) Kính hiển vi; (5) Tủ ấm 370C, 5% CO2;

(6) Máy đo quang MTT

2.1.3.2. Các dụng cụ thí nghiệm tiêu hao

Đĩa nuôi cấy tế bào các kích cỡ khác nhau, các đĩa nuôi cấy tế bào đa

giếng: 6, 12, 24, 96 giếng; pipet các kích cỡ; ống falcon 15ml và 50 ml; ống

effendort 1,5ml và 2ml; các dụng cụ tiêu hao khác...

2.1.3.3. Hóa chất

Môi trường nuôi cấy DMEM có thêm 10% FBS (Foetal Bovine Serum)

và 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin) được lọc qua màng lọc vô

trùng.

Dung dịch đệm PBS, cồn 90 độ, Trypsin-EDTA 1X, dung dịch cố định

tế bào, dung dịch dimethyl sulphoxide (DMSO)….

Bộ kit MTT đánh giá tỉ lệ tế bào sống; kit FITC Annexin V Apoptosis

Detection kit (BD) đáng giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis; các kháng thể gắn chất

phát huỳnh quang phát hiện các tế bào miễn dịch ở lách chuột: kháng thể

Mouse CD11b-FITC, kháng thể Mouse CD49b/Pan-NK Cells FITC DX5,

kháng thể Mouse CD11c APC HL3, Kháng thể Ms CD197 (CCR7) PerCP-

Cy5.5 4B12.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và tăng sinh các dòng tế bào

2.2.1.1. Công tác chuẩn bị

- Tế bào Vero và dòng tế bào ung

thư đại tràng người HT-29 lấy từ nguồn tế

bào được bảo quản ở môi trường âm sâu (-

800C).

- Dung dịch PBS vô trùng.

Hình 2.2. Nuôi cấy và tăng sinh tế bào trong phòng thí nghiệm - Dung dịch môi trường nuôi

cấy tế bào DMEM pha với 10% FBS, 1% kháng sinh (penicilline +

streptomycine) và được lọc qua màng lọc vô trùng đường kính lỗ 0,45µm.

- Dung dịch trysin-EDTA 1X

- Tủ ấm 370C, 5% CO2.

- Pipet, ống nghiệm vô trùng, đĩa nuôi cấy tế bào, máy ly tâm, buồng

đếm tế bào, kính hiển vi quang học…

2.2.1.2. Nuôi cấy dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 và Vero

Tế bào HT-29 và Vero được lấy từ nguồn bảo quản ở môi trường âm

sâu (-800C), rã đông thật nhanh (dưới 1 phút) bằng cách xoay nhẹ ống nghiệm

chứa nguồn tế bào trong nước 370C.

Chuẩn dịch tế bào nồng độ 105 tế bào/ml bằng phương pháp đếm tế bào

ở buồng đếm haemocytometer.

Sau đó, cho 10ml dung dịch tế bào trên vào đĩa nuôi cấy đáy rộng

(20x150mm). Sau 1 ngày gieo tế bào, kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi quang

học, nếu thấy tế bào bám đáy đĩa nuôi cấy và phát triển, thay môi trường nuôi

cấy tế bào (hình 2.2). Hàng ngày, kiểm tra tế bào phát triển cũng như tình

trạng tế bào bị nhiễm các vi sinh vật dưới kính hiển vi quang học, cách 2-3

ngày thay môi trường nuôi cấy một lần, duy trì tế bào trong tủ ấm 370C, 5%

CO2 [69], [70].

2.2.1.3. Tăng sinh dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 và Vero

Sau khoảng 7-10 ngày gieo tế bào, tế bào phát triển gần kín đáy đĩa

nuôi cấy, tiến hành tách tế bào gieo vào nhiều đĩa nuôi cấy theo các bước sau:

- Hút hết dịch môi trường cũ ở đĩa nuôi cấy tế bào, sau đó rửa sạch tế

bào ở các đĩa nuôi cấy bằng dung dịch PBS (tiến hành 2-3 lần).

- Cho vào đĩa nuôi cấy tế bào 3 ml dung dịch trypsin-EDTA 1X, lắc

đều rồi cho vào tủ ấm 370C, CO2 khoảng 2-3 phút.

- Lấy các đĩa nuôi cấy tế bào ra khỏi tủ ấm, kiểm tra mức độ tế bào

bong khỏi đáy đĩa nuôi cấy dưới kính hiển vi quang học. Khi tế bào bong khỏi

đáy đĩa nuôi cấy, tách rời nhau và lơ lửng trong môi trường nuôi cấy, tiến

hành tiếp các bước sau:

- Cho thêm vào mỗi đĩa nuôi cấy tế bào (đã bong hết) 20 ml dung dịch

môi trường nuôi cấy, trộn đều dung dịch môi trường nuôi cấy và tế bào bằng

pipet, dùng pipet hút toàn bộ dịch môi trường có chứa tế bào cho vào ống

fancol 50 ml.

- Đếm tế bào ở buồng đếm haemocytometer, chuẩn nồng độ dịch tế bào

là 104 tế bào/ml.

- Cho 10 ml dung dịch tế bào đã chuẩn nồng độ ở trên vào các đĩa nuôi

cấy 20x150 mm mới (đã chuẩn bị).

- Lưu các đĩa nuôi cấy tế bào mới gieo vào tủ ấm 370C, 5% CO2. Theo

dõi tế bào bám đáy và phát triển hàng ngày, loại bỏ ngay đĩa nuôi cấy bị

nhiễm nấm hay vi sinh vật khác trong quá trình tiến hành.

Khi tế bào phát triển gần kín đáy đĩa nuôi cấy, thu tế bào làm thí

nghiệm hay làm nguồn tế bào bảo quản ở môi trường âm sâu (-800C).

(Chú ý: Cần tiến hành trong tủ cấy vô trùng, lấy tế bào ra khỏi tủ ấm

370C, 5% CO2 phải nhanh chóng không làm ảnh hưởng đến tế bào phát triển)

2.2.2. Phương pháp tăng sinh và chuẩn độ virus vaccine sởi và quai

bị từ nguồn virus vaccine

2.2.2.1. Tăng sinh virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine

- Nhiễm MeV và MuV vào tế bào Vero: Gieo tế bào Vero vào các đĩa

nuôi cấy 20x150 mm với nồng độ 105 tế bào/ml (theo kỹ thuật nuôi cấy tế bào

đã đề cập ở mục 2.2.1), lưu ở tủ ấm 370C, 5% CO2.

Sau 24 giờ, kiểm tra tế bào trên đĩa nuôi cấy dưới kính hiển vi, tế bào

Vero bám đáy tốt, thay môi trường nuôi cấy. Theo dõi tế bào Vero phát triển

hàng ngày, 2-3 ngày thay môi trường nuôi cấy 1 lần. Khi tế bào Vero phát

triển gần kín đáy đĩa nuôi cấy (thường vào ngày thứ 5 hay 6), thay môi trường

nuôi cấy đồng thời tiến hành nhiễm MeV, MuV vào các đĩa tế bào Vero với

nồng độ 1-2 ml dịch stock virus/đĩa nuôi cấy, lưu vào tủ ấm 370C, 5% CO2.

- Thu dung dịch chứa MeV và MuV: Kiểm tra tế bào Vero nhiễm MeV

và MuV ở các đĩa nuôi cấy hàng ngày dưới kính hiển vi. Sau 9-10 ngày nhiễm

virus, quan sát dưới kính hiển vi thường tế bào Vero ở các đĩa nuôi cấy có

hình ảnh: tế bào nhiễm virus hòa màng tạo hợp bào, hợp bào chết vỡ ra tạo

thành mảnh vỡ tế bào. Hút toàn bộ dịch chứa tế bào chết do nhiễm MeV,

MuV ở các đĩa nuôi cấy vào ống falcon 50 ml, ly tâm 5000 vòng/phút, trong 5

phút. Sau đó, lấy phần dịch nổi, bỏ phần cặn bên dưới, tiếp tục lọc phần dịch

nổi vừa thu được bằng màng lọc vi sinh đường kính lỗ 0,45m ta thu được

dịch chứa virus. Bảo quản trong môi trường âm sâu (-800C).

2.2.2.2. Chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị bằng phương pháp TCID50

Chuẩn độ virus TCID50 là phương pháp xác định liều nhiễm 50% nuôi

cấy mô. Đây là phương pháp thường sử dụng để chuẩn độ các virus gây ra

hiệu ứng bệnh lý tế bào đặc trưng in vitro. Ở đây, chúng tôi lựa chọn phương

pháp chuẩn độ virus TCID50 sử dụng tế bào Vero và dung dịch xanh methylen

làm chất biểu hiện màu để nhuộm và đánh giá tế bào nhiễm MeV và MuV ở

các giếng.

- Chuẩn bị 2 đĩa 96 giếng, 1 đĩa cho MeV, một đĩa cho MuV

- Gieo tế bào Vero vào các giếng trên đĩa 96 giếng theo các bước sau:

+ Tăng sinh tế bào Vero đủ số lượng (theo kỹ thuật tăng sinh tế bào đã

nêu ở mục 2.2.1), thu tế bào.

+ Đếm tế bào Vero ở buồng đếm haemocytomyter, chuẩn bị dung dịch

tế bào Vero nồng độ 5 x 104 tế bào/ml.

+ Cho 200l dung dịch tế bào Vero đã chuẩn nồng độ trên vào các

giếng trên đĩa 96 giếng ta được các giếng có nồng độ 104 tế bào/200l/1

giếng, duy trì tế bào trên đĩa 96 giếng ở tủ ấm 370C, 5% CO2.

- Nhiễm MeV, MuV vào các giếng trên đĩa 96 giếng với các nồng độ

pha loãng từ 10-2 đến 10-9: Sau 24 giờ kiểm tra tế bào trên đĩa 96 giếng dưới

kính hiển vi quang học, tế bào Vero bám đáy và phát triển. Tiến hành thay

môi trường nuôi cấy và nhiễm MeV, MuV (đã chuẩn bị các nồng độ pha

loãng) vào các giếng trên đĩa 96 giếng theo hàng ngang A, B, C, D, E, F, I,

tương ứng với nồng độ pha loãng stock virus từ 10-2 đến 10-9, cột 11 và 12 là

các giếng chứng (không nhiễm virus) (hình 2.3).

Hình 2.3. Sơ đồ nhiễm MeV, MuV để chuẩn độ TCID50

Giếng nhiễm virus

- Pha loãng nồng độ virus theo các bước sau:

+ Chuẩn bị 9 ống nghiệm vô trùng kích cỡ 5ml, mỗi ống chứa 2,25ml

môi trường nuôi cấy tế bào, đánh số các ống nghiệm từ 1 đến 9.

+ Lấy 250 l stock virus cho vào ống nghiệm số 1, trộn đền ta được

2,5ml dung dịch stock virus đã pha loãng 10-1 (hình 2.4).

+ Lấy 250 l dung dịch virus ở ống nghiệm số 1 cho vào ống nghiệm

số 2, trộn đều ta được 2,5ml dung dịch virus pha loãng 10-2 (hình 2.4).

+ Lấy 250 l dịch virus ở ống nghiệm số 2 cho vào ống nghiệm số 3,

trộn đều ta được 2,5ml dung dịch virus pha loãng 10-3 (hình 2.4).

+ Lấy 250 l dịch virus ở ống nghiệm số 3 cho vào ống nghiệm số 4,

trộn đều ta được 2,5ml dung dịch virus pha loãng 10-4 (hình 2.4).

+ Cứ như vậy, lặp lại các thao tác trên cho đến ống nghiệm số 9, ta

được 9 ống nghiệm chứa 2,5 ml dung dịch có nồng độ virus từ 10-1 đến 10-9.

Sử dụng các ống chứa dung dịch virus từ số 2 đến 9 tương ứng với

nồng độ pha loãng virus từ 10-2 đến 10-9 cho thử nghiệm này.

Hình 2.4. Sơ đồ pha loãng nồng độ MeV, MuV

Kiểm tra tế bào Vero nhiễm virus ở các giếng trên đĩa 96 giếng hàng

ngày dưới kính hiển vi.

- Tiến hành nhuộm xanh methylen: Sau 5 ngày nhiễm MeV, MuV,

quan sát dưới kính hiển vi thấy các giếng có hình ảnh nhiễm virus rõ. Tiến

hành cho thêm vào mỗi giếng trên đĩa 96 giếng 50l xanh methylen 15%. Sau

đó, cho đĩa 96 giếng vào trong 1 túi nilon sạch rồi để ở nhiệt độ phòng 1-2

giờ. Lấy đĩa 96 giếng ra rửa nhẹ nhàng bằng nước sạch. So sánh màu ở giếng

chứng và giếng nhiễm virus đánh giá kết quả và tính TCID50.

- Đọc kết quả sau nhuộm xanh methylen: Các tế bào còn sống bám đáy

và bắt màu xanh của chất nhuộm xanh methylen, các tế bào chết do nhiễm

virus bong ra và bị rửa trôi đi sau khi rửa nhẹ nhàng đĩa 96 giếng bằng nước

sạch. Do vậy, giếng có màu xanh đậm hơn là giếng có số tế bào sống cao hơn,

giếng có màu xanh nhạt hơn là giếng có số tế bào sống ít hơn, độ nhạt của

màu xanh tỉ lệ thuận với số tế bào chết. So sánh mức độ màu giữa giếng

chứng và giếng nhiễm virus xác định giếng có tế bào nhiễm MeV, MuV.

- Công thức tính TCID50 [71], [72]:

I: Tính khoảng tỉ lệ (PD):

(%CPE ở nồng độ pha loãng có %CPE trên 50%) – (50%)

(% CPE ở nồng độ pha loãng có %CPE>50%) – (%CPE ở nồng độ pha

loãng có %CPE<50%)

II: Tính (-Log) nồng độ pha loãng có %CPE trên 50% (10-3 sẽ là 3)

(CPE: là giếng có tế bào nhiễm virus) TCID50/ml = 10I+II/ml

(Chú ý: Quá trình thí nghiệm, tiến hành từng loại virus trên đĩa 96

giếng riêng biệt, đảm bảo vô trùng và tránh lây nhiễm chéo. Thời gian theo

dõi tế bào nhiễm virus ở các giếng không được thay môi trường nuôi cấy).

2.2.3. Phương pháp đánh giá virus vavccine sởi và quai bị ly giải tế

bào bằng thử nghiệm 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl

tetrazolium bromide

MTT [3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide]

có màu vàng, trong ti thể của tế bào sống chất này được khử thành các tinh

thể formazan có màu tím. Dùng máy quang phổ đo độ hấp thụ quang phổ của

dung dịch MTT màu tím tại một bước sóng cụ thể (thường là 570nm). Độ hấp

thụ quang phổ giảm chứng tỏ các enzym ti thể (như reductase) ít hoạt động,

do đó, tỉ lệ tế bào sống ít. Sự thay đổi này cho chúng ta thấy độ hấp thụ quang

phổ (OD) liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống in vitro. Khi so sánh độ

hấp thụ quang phổ ở các giếng nhóm nhiễm MeV, MuV với nhóm chứng

(không nhiễm MeV, MuV), từ đó, có thể đánh giá hiệu quả gây chết tế bào

của MeV và MuV in vitro.

2.2.3.1. Chuẩn bị dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29

+ Tế bào dòng ung thư đại tràng người HT-29 được lấy từ nguồn bảo

quản trong môi trường âm sâu (-800C), gieo vào 2 đĩa nuôi cấy kích thước

20x150 mm (theo các bước đã nêu ở mục 2.2.1). Cách 2-3 ngày thay môi

trường nuôi cấy một lần.

+ Sau 7-10 ngày, tế bào HT-29 bám đáy và phát triển gần kín đáy đĩa

nuôi cấy. Tiến hành tách tế bào HT-29 (kỹ thuật tách tế bào bằng dung dịch

trypsin-EDTA 1X đã nói ở mục 2.2.1.3)

+ Cho vào đĩa nuôi cấy tế bào HT-29 (đã bong hết) 10 ml dung dịch

môi trường nuôi cấy mới, trộn đều sao cho các tế bào lơ lửng trong môi

trường. Dùng pipet hút toàn bộ dịch môi trường có chứa tế bào HT-29 từ 2 đĩa

nuôi cấy vào 1 ống falcon loại 50 ml.

+ Đếm tế bào HT-29 trên buồng đếm haemocytometer, xác định nồng

độ tế bào, hòa loãng để được dịch tế bào có nồng độ 2x103 tế bào/ml. Tiến

hành cho 200 l dịch tế bào HT-29 vào từng giếng trên 3 đĩa 96 giếng đánh ký

hiệu gồm: đĩa I (đánh giá tỉ lệ tế bào sống sau nhiễm virus ngày thứ 5); đĩa II

(đánh giá tỉ lệ tế bào sống nhiễm virus ngày thứ 4); đĩa III (đánh giá tỉ lệ tế

bào sống sau nhiễm virus ngày thứ 3). Như vậy mỗi giếng trên đĩa 96 giếng

có 104 tế bào HT-29/200l.

+ Lưu 3 đĩa 96 giếng đã gieo tế bào HT-29 vào tủ ấm 370C, 5% CO2.

2.2.3.2. Nhiễm virus vaccine sởi và quai bị vào dòng tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 trên đĩa 96 giếng

- Sau 24 giờ kiểm tra 3 đĩa 96 giếng đã gieo tế bào HT-29 dưới kính

hiển vi, tế bào bám và phát triển.

- Hòa loãng MeV và MuV đã chuẩn độ TCID50 thành các nồng độ từ

10-2 đến 10-8 (như phương pháp hòa loãng virus để chuẩn độ TCID50 ở mục

2.2.2.2). Trên từng đĩa 96 giếng, tiến hành thay môi trường rồi nhiễm virus

theo 4 nhóm: nhiễm MuV, nhiễm MeV, nhiễm MuV+MeV và nhóm chứng.

Như vậy, trên đĩa 96 giếng, hàng đầu tiên là nhóm chứng, mỗi nhóm nhiễm

virus có 4 cột (32 giếng), các hàng thứ 2 đến thứ 8 được nhiễm với nồng độ

virus từ 10-2 đến 10-8 (hình 2.5).

Hình 2.5. Sơ đồ các nhóm nhiễm MeV, MuV làm nghiệm pháp MTT

Hàng ngày, kiểm tra tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ở các giếng trên

đĩa 96 giếng (loại bỏ đĩa nuôi cấy có giếng bị nhiễm nấm hay vi sinh vật khác

trong quá trình tiến hành), đến ngày thứ 3, 4 và 5 sau nhiễm virus thì tiến

hành làm nghiệm pháp MTT và tính kết quả tỉ lệ tế bào sống ở các nhóm

nghiên cứu.

2.2.3.3. Các bước tiến hành nghiệm pháp

- Chuẩn bị dung dịch MTT 10%

+ Cho 3ml PBS 1.M vào lọ chứa MTT (hình

2.6), lắc đều để hòa tan hết các thành phần MTT.

+ Cho 2 ml MTT và 18 ml dịch nuôi

cấy tế bào vào ống falcon để được 20 ml Hình 2.6. Bộ Kit làm nghiệm pháp MTT

dung dịch nuôi cấy 10% MTT.

- Các bước tiến hành nghiệm pháp MTT

+ Lấy nhẹ nhàng các đĩa 96 giếng chứa tế bào HT-29 đã nhiễm MeV,

MuV ra khỏi tủ ấm (370C, 5% CO2), kiểm tra các giếng trên đĩa 96 giếng

bằng kính hiển vi quang học để loại bỏ đĩa nuôi cấy có giếng bị nhiễm nấm

hay vi sinh vật khác trong quá trình tiến hành.

+ Dùng pipet hút nhẹ nhàng loại bỏ hết dịch nuôi cấy tế bào ở các giếng

trên đĩa 96 giếng.

+ Cho 100 l dung dịch nuôi cấy có 10% MTT vào mỗi giếng.

+ Đưa đĩa 96 giếng trở lại tủ ấm 370C, 5% CO2 ủ trong 4 giờ.

+ Sau đó, hút bỏ nhẹ nhàng toàn bộ dịch nổi trong mỗi giếng (tránh hút

cả các tinh thể formazan màu tím), cho 100 l dung dịch hòa tan tinh thể

formazan màu tím (hình 2.6) vào các giếng trên đĩa 96 giếng.

+ Lắc nhẹ để hòa tan hết các tinh thể formazan màu tím.

+ Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 570 nm, tính kết quả.

2.2.4. Chuẩn bị mẫu tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị

đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình và tế bào hoại tử bằng phương

pháp dòng chảy

2.2.4.1. Chuẩn bị dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm

virus vaccine sởi và quai bị in vitro

- Tăng sinh tế bào HT-29 và gieo vào 5 đĩa nuôi cấy 6 giếng: Tế bào

HT-29 được lấy từ nguồn bảo quản âm sâu (-800C), gieo vào 2 đĩa nuôi cấy

kích thước 150x20 mm (theo các bước mục 2.2.1), lưu đĩa nuôi cấy tế bào

trong tủ ấm 370C, 5% CO2, cách 2 ngày thay môi trường một lần. Sau 5-6

ngày, tế bào bám đáy và phát triển. Tiến hành tách tế bào HT-29 (như kỹ

thuật tách tế bào bằng dung dịch Trypsin-EDTA 1X đã nêu ở mục 2.2.1.3).

Sau đó, gieo vào 5 đĩa nuôi cấy 6 giếng theo các bước dưới đây:

+ Cho vào các đĩa nuôi cấy tế bào HT-29 (đã bong hết) 10 ml dung

dịch môi trường nuôi cấy, trộn đều sao cho các tế bào lơ lửng trong môi

trường. Hút toàn bộ dịch môi trường có chứa tế bào HT-29 từ đĩa nuôi cấy

vào ống fancol 50 ml.

+ Đếm tế bào HT-29 trên buồng đếm haemocytometer xác định nồng

độ tế bào, chuẩn dịch tế bào có nồng độ 105 tế bào/ml. Cho 3ml dịch tế bào

trên vào từng giếng trên đĩa 6 giếng. Như vậy tổng số có 30 giếng mỗi giếng

có 3x105 tế bào.

+ Lưu 5 đĩa 6 giếng đã gieo tế bào HT-29 vào tủ ấm 370C, 5% CO2.

2.2.4.2. Nhiễm virus vaccine sởi và quai bị vào dòng tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 trên các đĩa 6 giếng

Sau 24 giờ kiểm tra 5 đĩa 6 giếng đã gieo tế bào HT-29 dưới kính hiển

vi, tế bào bám đáy và phát triển, không bị nhiễm các vi sinh vật khác. Thay

môi trường nuôi cấy tế bào và nhiễm MeV, MuV với nồng độ 1.MOI (liều tỉ

lệ giữa virus gây nhiễm và tế bào là 1:1) theo 4 nhóm: nhóm nhiễm MuV;

nhóm nhiễm MeV; nhóm nhiễm MuV+MeV; nhóm chứng (không nhiễm

virus), mỗi nhóm được lặp lại 3 giếng. Có 3 thời điểm nghiên cứu được đánh

số: I, II, III tương ứng với ngày thứ 5, ngày thứ 4 và ngày thứ 3 sau nhiễm

virus, nhóm chứng được đánh số IV. Như vậy, có 5 đĩa 6 giếng với tổng số 30

giếng được đánh số theo từng nhóm nghiên cứu (hình 2.7).

Hình 2.7. Sơ đồ nhiễm MeV, MuV theo các nhóm đánh giá tỉ lệ tế bào chết

apoptosis và tế bào hoại tử in vitro

(I) tế bào nhiễm virus ngày thứ 5; (II) tế bào nhiễm virus ngày thứ 4;

(III) tế bào nhiễm virus ngày thứ 3; (IV) nhóm chứng

Công thức tính liều nhiễm virus theo PFU [72].

N V: thể tích dịch virus (ml)

N: số tế bào trong giếng

Cho các đĩa loại 6 giếng đã nhiễm virus vào tủ ấm 370C, 5% CO2, kiểm

tra tế bào nhiễm virus hàng ngày.

2.2.4.3. Quy trình thu mẫu tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm

virus vaccine sởi và quai bị

Đến ngày thứ 3 sau nhiễm MeV, MuV, tiến hành thu mẫu tế bào để

đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế

bào dòng chảy (flow cytometry) theo các bước sau:

- Chuẩn bị 10 ống fancol 15 ml vô trùng, đánh số như các giếng nhiễm

virus ngày thứ 3 (9 ống) và một giếng chứng.

- Lấy các đĩa loại 6 giếng chứa tế bào HT-29 (có đánh số các giếng) của

ngày thứ 3 nhiễm virus (9 giếng) và 1 giếng của nhóm chứng ra khỏi tủ ấm

(370C, 5% CO2), kiểm tra tế bào nhiễm dưới kinh hiển vi, chụp ảnh lưu trong

máy vi tính.

- Hút hết phần dịch nổi cùng các tế bào chết lơ lửng ở từng giếng cho

vào các ống fancol vô trùng đã chuẩn bị ở trên (chú ý: các giếng và ống fancol

phải có ký hiệu giống nhau). Sau đó, cho vào mỗi giếng 1 ml dung dịch

Trypsin-EDTA 1X (để tách tế bào), lắc nhẹ rồi đưa các đĩa loại 6 giếng vào tủ

ấm 370C, 5% CO2, lưu khoảng 2-3 phút.

- Kiểm tra các tế bào bong khỏi đáy dưới kính hiển vi, nếu tế bào bong

hết, tiến hành thêm vào mỗi giếng trên đĩa loại 6 giếng 3ml dung dịch môi

trường nuôi cấy tế bào, trộn đều rồi hút dịch tế bào này vào các ống falcon

(chứa phần dịch nổi và tế bào chết sau nhiễm virus ở trên) đã đánh số tương

ứng, ta thu được toàn bộ phần dịch tế bào ở các giếng nhiễm virus ngày thứ 3

và 1 giếng chứng. Ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó, hút bỏ dịch

nổi thay bằng 1ml dung dịch PBS, ta thu được mẫu tế bào HT-29 nhiễm virus

ngày thứ 3 và một mẫu chứng.

Ngày thứ 4 và 5 nhiễm MeV, MuV cũng làm tương tự như ngày thứ 3,

thu được các mẫu tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV và mẫu chứng.

(Ghi chú: Tất cả các thao tác hút dung dịch khác nhau đều được thay

đầu côn hay pipet sau mỗi lần hút, tránh lây nhiễm chéo).

2.2.5. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo

chương trình và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy

2.2.5.1. Nguyên lý

Để kiểm tra tỉ lệ tế bào chết theo chương trình (apoptosis) và tế bào

hoại tử, chúng tôi sử dụng kháng thể anti-annexin V gắn chất phát huỳnh

quang là Fluorescein isothiocyanate (FITC) và chất nhuộm nhân tế bào phát

huỳnh quang là 7-Amino Actinomycin D.

Annexin V là một protein có khả năng tương tác với phosphatidyl

serine nhờ chất xúc tác là ion Ca2+. Phosphatidyl serine là một thành phần

lipit tham gia cấu trúc lớp phospholipid kép của màng tế bào. Mặc dù

phosphatidyl serine không đa dạng trong hầu hết các màng sinh học nhưng nó

lại giữ tầm quan trọng về sinh lý màng tế bào. Trong các tế bào sống bình

thường, chất này nằm trên màng tế bào ở bề mặt tế bào chất. Tuy nhiên, khi tế

bào trải qua quá trình apoptosis thì phosphatidyl serine được chuyển từ mặt

trong ra mặt ngoài của màng tế bào, tiếp xúc trực tiếp với môi trường bên

ngoài. Khi đó, phosphatidyl serine trên màng tế bào sẽ kết hợp với Annexin

V, những tế bào này dễ dàng bị nhận diện khi sử dụng kháng thể kháng

Annexin V có gắn chất phát huỳnh quang Fluorescein isothiocyanate.

7-Amino Actinomycin D là loại thuốc nhuộm nhân phát huỳnh quang,

chúng có khả năng liên kết rất mạnh với DNA của nhân tế bào. Khi tế bào ở

trạng thái bình thường, chất này không thể xâm nhập vào bên trong để gắn với

DNA của nhân tế bào sống. Chỉ khi màng tế bào bị tổn thương 7-Amino

Actinomycin D mới có thể đi vào trong tế bào và liên kết với DNA nhân tế

bào. Do đó, sử dụng chất nhuộm nhân 7-Amino Actinomycin D dễ dàng phát

hiện màng tế bào bị tổn thương.

Vì vậy, kết hợp chất nhuộm nhân 7-Amino Actinomycin với kháng thể

kháng Annexin V có gắn chất phát huỳnh quang Fluorescein isothiocyanate,

chúng ta dễ dàng phát hiện tế bào ở các giai đoạn apoptosis sớm, apoptosis

muộn và hoại tử. Nếu tế bào trong giai đoạn apoptosis sớm chỉ có Annexin V

liên kết với phosphatidyl serine trên bề mặt ngoài màng tế bào nên hiển thị tín

hiệu huỳnh quang của Fluorescein isothiocyanate (màng tế bào còn nguyên

vẹn nên 7-Amino Actinomycin D không xâm nhập được vào bên trong tế bào

để liên kết với DNA). Tế bào ở giai đoạn apoptosis muộn mất tính toàn vẹn

của màng tế bào, nên ngoài Annexin V liên kết với phosphatidyl serine trên

màng ngoài của tế bào, thì còn có 7-Amino Actinomycin D đi vào trong tế

bào, tới nhân gắn với DNA, vì vậy có cả 2 tín hiệu huỳnh quang. Tế bào chết

theo kiểu hoại tử sẽ chỉ biểu hiện tín hiệu huỳnh quang của 7-Amino

Actinomycin D.

2.2.5.2. Quy trình đánh giá tỉ lệ tế bào apoptosis và tế bào hoại tử bằng

phương pháp phân tích tế bào dòng chảy

Tế bào được xử lý và nhuộm theo hướng dẫn thực hiện quy trình kèm

theo bộ kit Fluorescein isothiocyanate, Annexin V Apoptosis Detection kit

(BD) gồm các bước sau:

- Hòa loãng 3 ml dung dịch Binding buffer 10X bằng nước cất tỉ lệ 1:10

để được dung dịch 1X.

- Chuẩn bị mẫu tế bào, rửa sạnh bằng dung dịch PBS, sau đó, loại bỏ

hết dung dịch PBS.

- Rửa sạch mẫu tế bào một lần nữa bằng dung dịch Binding buffer 1X,

ly tâm ở 300 G trong 10 phút, hút hết phần dung dịch Binding buffer ở trên.

- Hòa tan khối tế bào sau ly tâm trong dung dịch Binding buffer 1X sao

cho được dung dịch có nồng độ 106 tế bào/mL.

- Cho 100 μL tế bào trên (nồng độ 105 tế bào) vào các ống nghiệm vô

trùng đã chuẩn bị trước.

- Thêm 5 μL Annexin V-Fluorescein isothiocyanate vào mỗi ống

nghiệm chứa dịch tế bào ở trên.

- Trộn đều, nhẹ nhàng từng ống nghiệm và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ

phòng, để trong buồng tối.

- Thêm 5 μL dung dịch 7-Amino Actinomycin D và ủ trong 5 phút ở

nhiệt độ phòng trong buồng tối, sau đó ly tâm ở 300 G trong 10 phút, loại bỏ

phần dịch nổi phía trên.

- Rửa sạch tế bào bằng dung dịch PBS và hoàn tan tế bào bằng dùng

dịch PBS.

- Chạy flow cytometry trong 1 giờ (sau khi chuẩn bị tế bào) đánh giá tế

bào chết apoptosis.

Đánh giá tỉ lệ tế bào apoptosis trên hệ thống FACS CANTO II (BD)

gồm: xác định quần thể tế bào cần đánh giá, xác định vùng giá trị huỳnh

quang Fluorescein isothiocyanate và 7-Amino Actinomycin D.

Hình 2.8. Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy trên phần mềm

BD FACS Diva đánh giá tỉ tế bào apoptosis và tế bào hoại tử

Trước tiên, chúng tôi tiến hành chạy mẫu đối chứng không nhuộm

(control unstain) để xác định các thông số chuẩn cho máy trên phần mềm BD

FACS Diva. Các tế bào được phân loại theo kích thước (đo độ tán xạ thẳng

của chùm ánh sáng: FSC) và độ phức tạp (đo độ tán xạ bên của chùm ánh

sáng: SSC). Kết quả là xác định vùng tế bào cần đánh giá. Ở đây, chúng tôi

xác định được vị trí phân bố của các tế bào đơn độc là vùng P1 (hình 2.6).

Các vùng nằm ngoài khoảng này sẽ không được tiếp tục khảo sát. Đồng thời,

tín hiệu huỳnh quang ở mẫu đối chứng cũng sẽ được khoanh vùng. Ở đây,

chúng tôi xác định là giá trị nhỏ hơn 103 đối với 7-Amino Actinomycin D và

nhỏ hơn 2.103 đối với Fluorescein isothiocyanate ở mẫu đối chứng. Như vậy

có nghĩa là sau khi ủ với kháng thể, các tế bào có giá trị huỳnh quang 7-

Amino Actinomycin D lớn hơn 103 và Fluorescein isothiocyanate lớn hơn

2.103 sẽ được coi là có biểu hiện huỳnh quang, căn cứ vào tín hiệu huỳnh

quang chúng tôi xác định loại tế bào chết ở các giai đoạn apoptosis hay tế bào

hoại tử.

Quá trình đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử được thực hiện

tại Bộ môn Sinh học tế bào, khoa Sinh học và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm

công nghệ Enzym và Protein (KLEPT), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.2.6. Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude)

Chuột nude chủng BALB/c, được nuôi trong

phòng sạch. Mỗi nhóm 5 chuột được nhốt chung 1

lồng và đánh số để theo dõi. Mỗi lồng chuột có lỗ

cấp và thoát khí qua màng lọc HEPA riêng (hình

2.9). Duy trì ánh sáng theo chu kỳ tự nhiên, tự

động điều khiển bật lúc 7 giờ và tắt lúc 19 giờ.

Hình 2.9. Buồng nuôi chuột nude

Chuột được thay lồng và chất lót 2 lần/tuần, đồng thời kiểm tra tình trạng toàn

thân, phân, tiêu thụ thức ăn, nước uống. Thức ăn được chế biến sạch và nước

uống tinh khiết hấp tiệt trùng. Nhiệt độ duy trì 26±2 độ C, duy trì độ ẩm

không khí bằng máy hút ẩm. Theo dõi ẩm kế để duy trì độ ẩm trung bình

khoảng 60 ± 2%. Hàng tuần, môi trường nuôi chuột được cấy khuẩn để kiểm

tra mức độ nhiễm khuẩn. Chúng tôi thực hiện vệ sinh vô khuẩn hàng tuần.

2.2.7. Phương pháp tạo khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 trên dùi chuột thiếu hụt miễn dịch và tính kích thước khối u

2.2.7.1. Phương pháp tạo khối u

- Tăng sinh tế bào HT-29 trong phòng nuôi cấy tế bào (như đã đề cập ở

mục 2.2.1).

- Đếm số lượng tế bào HT-29 trên buồng đếm haemocytometer, chuẩn

nồng độ dịch tế bào HT-29 là 107 tế bào/ml.

- Chuẩn bị chuột thiếu hụt miễn dịch khỏe mạnh, 6-8 tuần tuổi.

- Tiêm tế bào HT-29 với nồng độ 106 tế bào/chuột (tương đương 0,1ml

dịch virus có nồng độ ở trên) vào dưới da đùi chuột nude (hình 2.10). Theo

dõi các chỉ số đánh giá sức khỏe chuột và phát triển của u hàng ngày.

2.2.7.2. Phương pháp đo và tính kích thước khối u

Theo dõi sức khỏe chuột nude và u phát triển hàng ngày, sau 7-10 ngày

tiêm tế bào HT-29, kích thước khối u đạt khoảng 200-400 mm3, đo thước khối

u bằng thước kẹp, đo 2 chiều, chiều dài và chiều rộng khối u (hình 2.10)

Công thức tính kích thước khối u: V=D x R2 x 0,5 (mm3) [73].

V: thể tích khối u D: chiều dài khối u R: chiều rộng khối u

Hình 2.10. Ghép u tế bào HT-29 và đo kính thước u trên đùi chuột nude

2.2.8. Phương pháp điều trị chuột nude bằng virus vaccine sởi và

quai bị

Có 40 con chuột mang khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-

29 được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm (10 con/1 nhóm), ký hiệu từng nhóm

là: nhóm (1) điều trị phối hợp MuV+MeV; nhóm (2) điều trị MuV; nhóm (3)

điều trị MeV; nhóm (4) là nhóm chứng tiêm dung dịch PBS.

- Chuẩn bị dung dịch MeV và MuV đã chuẩn độ TCID50, tính liều điều

trị theo công thức:

TCID50 = 0,7 x PFU (ml) [72]

- Sát trùng da đùi mặt trên khối u, dùng bơm tiêm nhựa tiêm MeV,

MuV trực tiếp vào khối u với liều 107 PFU/lần/con, 2 lần/tuần, tổng liều là 6

lần (3 tuần điều trị), nhóm chứng tiêm bằng dung dịch PBS [73], [74].

2.2.9. Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị bằng virus vaccine sởi

và quai bị trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29

2.2.9.1. Đánh giá tình trạng sức khỏe của chuột ở các nhóm nghiên cứu

sau điều trị bằng MeV, MuV

Theo dõi tình trạng sức khỏe của chuột nude ở các nhóm nghiên cứu

sau điều trị bằng MuV, MeV theo các tiêu chí: cân nặng, vận động, đáp ứng

kích thích, màu sắc da của chuột, phân chuột. Qua đó đánh giá mức độ gây

độc của MeV, MuV đối với chuột nude cũng như các nguyên nhân khác

(không phải do u tế bào HT-29) gây chết chuột nude ở các nhóm nghiên cứu.

2.2.9.2. So sánh kích thước u ở các nhóm nghiên cứu theo thời gian

điều trị

Đánh giá theo sự tăng, giảm kích thước trung bình khối u của cả nhóm

chuột nghiên cứu theo thời gian điều trị. Thời gian theo dõi tính từ khi bắt đầu

điều trị cho đến khi một nhóm nghiên cứu có chuột bị chết.

So sánh tương quan kích thước khối u trung bình giữa các nhóm.

2.2.9.3. Theo dõi tỉ lệ sống, chết của chuột ở các nhóm nghiên cứu

Theo dõi chuột nude mang khối u tế bào HT-29 được điều trị bằng

MuV và MeV ở các nhóm nghiên cứu cho tới khi kết thúc thí nghiệm (thời

điểm tất cả chuột ở các nhóm nghiên cứu bị chết hết) theo các tiêu chí sau:

- Thời gian sống của từng con chuột và thời gian sống trung bình của cả

nhóm chuột ở các nhóm nghiên cứu, so sánh tương quan giữa các nhóm.

- Số chuột chết ở từng nhóm, so sánh tương quan giữa các nhóm.

2.2.10. Phương pháp phẫu tích lấy mô u và lách chuột thiếu hụt miễn

dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị

Để đảm bảo về tính nhân đạo và chăm sóc động vật trong phòng thí

nghiệm. Tất cả các quy trình liên quan đến động vật nghiên cứu, chúng tôi

tuân thủ theo các tiêu chuẩn hiện hành được nêu trong hướng dẫn chăm sóc và

sử dụng động vật thí nghiệm của nhà sản xuất.

(Chú ý: Quy trình phẫu tích này là không vô trùng).

2.2.10.1. Phẫu tích lấy mô u tế bào HT-29 đánh giá siêu cấu trúc

- Dụng cụ và hóa chất: chuẩn bị một tấm phẳng cứng, sạch, kéo nhỏ

đầu nhọn, nỉa nhỏ có mấu, nỉa nhỏ không mấu, ống eppendorf 2 ml, cồn 700,

dung dịch PBS.

- Các bước tiến hành: Chuột ở 4 nhóm nghiên cứu sau khi kết thúc quá

trình điều trị bằng MuV, MeV được phẫu tích lấy mẫu bệnh phẩm u theo các

bước sau:

+ Làm chuột chết bằng cách kéo giãn cột sống, sau đó để chuột trên

tấm phẳng sạch đã chuẩn bị.

+ Sát trùng vùng da trên bề mặt u ở đùi chuột nude.

+ Dùng nỉa có mấu và kéo nhỏ đầu nhọn bóc tách da phía trên u, cắt

một miếng mô u phía ngoài (không cắt ở giữa khối u tránh phần tổ chức u

hoại tử) kích thước khoảng 2-3 mm. Rửa sạch 3 lần bằng dung dịch PBS.

+ Cho mô u vào ống eppendorf 2 ml, cho thêm dung dịch cố định tế

bào làm siêu cấu trúc là glutaraldehyte 2% trong đệm cacodylate có pH=7,3

với tỉ lệ thể tích mẫu u/thể tích dung dịch là 1:10.

+ Để ở môi trường mát 40C, thời gian duy trì là 2 đến 3 ngày, sau đó

đưa đến Viện 69, Bộ Tư Lệnh Lăng làm siêu cấu trúc.

2.2.10.2. Phẫu tích lấy lách đánh giá tỉ lệ các tế bào miễn dịch

Có 9 con chuột nude mang khối ung thư đại tràng chia làm 4 nhóm:

Nhóm I (nhóm chứng): có 3 con chuột ký hiệu I1; I2; I3

Nhóm II: có 2 con chuột (điều trị MeV) được ký hiệu II1; II2

Nhóm III: có 2 con chuột (điều trị MuV) được ký hiệu III1; III2

Nhóm IV: có 2 con chuột được điều trị MuV+ MeV ký hiệu IV1; IV2

Sau khi kết thúc quá trình điều trị bằng MeV, MuV (thời gian 3 tuần),

chuột ở các nhóm nghiên cứu trên sẽ được phẫu tích lấy lách đánh tỉ lệ tế bào

miễn dịch theo các bước sau:

- Làm chết chuột bằng cách kéo dãn cột sống, sau đó, để chuột trên tấm

phẳng sạch đã chuẩn bị.

+ Rửa sạch vùng da bụng của chuột bằng cồn 700.

+ Dùng nỉa có mấu và kéo nhọn rạch da bụng bộc lộ các tạng trong

bụng, dùng nỉa không mấu tìm và lấy lách ra (lách nằm ở phía trên bên trái

của bụng chuột), tiến hành nhẹ nhàng không làm vỡ lách.

+ Lấy bỏ sạch các tổ chức liên kết bám xung quanh lách chuột, để lách

vào đĩa nuôi cấy tế bào (đã đánh ký hiệu để phân biệt lách ở các nhóm chuột),

rửa sạch 3 lần bằng dung dịch PBS.

2.2.11. Đánh giá tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột thiếu hụt

miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi và quai

bị bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy

2.2.11.1 Phương pháp phân lập tế bào miễn dịch từ lách chuột

Lách là nơi trưởng thành và tập trung của nhiều loại tế bào miễn dịch.

Sự thay đổi tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách sẽ phản ánh sự biến đổi chung

của tỉ lệ các loại tế bào này trong cơ thể. Quy trình thu tế bào từ lách chuột

theo các bước sau:

- Lách sau khi thu sẽ được rửa sạch bằng dung dịch PBS.

- Sử dụng panh kẹp có đầu nhám để nghiền lách (nghiền càng nhỏ càng

tốt), ta thu được dịch chứa các tế bào bên trong lách.

- Ủ dịch tế bào lách thu được với dung dịch Trypsin-EDTA 1X ở nhiệt

độ phòng trong 20-30 phút, sau đó, trộn đều rồi ly tâm ở 5000 vòng trong 5

phút, dùng pipet loại bỏ dịch nổi phía trên, cho dung dịch PBS rửa sạch khối

tế bào lách (lặp lại 2 lần để làm sạch dung dịch Trypsin-EDTA 1X).

- Cho dung dịch PBS vào khối tế bào lách, trộn đều rồi lọc qua màng

lọc kích thước 70µm, ta thu được dịch tế bào lách chuột.

- Cho thêm dung dịch trypan blue, trộn đều, kiểm tra tỉ lệ tế bào sống ở

buồng đếm hemacytometer (tế bào sống phải đạt >95%), xác định số lượng tế

bào cần thiết cho xét nghiệm (106 tế bào).

Quá trình thí nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Sinh học tế bào, khoa

Sinh học và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzym và Protein

(KLEPT), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.2.11.2. Nhuộm tế bào lách chuột bằng kháng thể đặc hiệu

Chuẩn bị 4 ống chứa 106 tế bào lách thu được ở các nhóm chuột theo

quy trình trên. Mỗi ống được ử riêng với từng loại kháng thể dưới đây:

- Kháng thể kháng CD11b gắn huỳnh quang fluorescein isothiocyanate

nhận biết tế bào bạch cầu dòng tủy [75].

- Kháng thể kháng CD49b gắn huỳnh quang fluorescein isothiocyanate

phát hiện tế bào NK chuột [76].

- Kháng thể kháng CD11c gắn huỳnh quang allophycocyanin (APC)

phát hiện tế bào DC chuột [77].

- Kháng thể kháng CD11c gắn huỳnh quang allophycocyanin kết hợp

với kháng thể kháng CD197 (CCR7) gắn huỳnh quang PerCP-Cy5-5 phát

hiện tế bào DC trưởng thành chuột [77].

Hỗn hợp tế bào sau khi ủ với các loại kháng thể sẽ được đếm bằng

máy FACS Canto II (BD). Các tế bào được phân loại theo kích thước (đo độ

tán xạ thẳng của chùm ánh sáng) và độ phức tạp (đo độ tán xạ bên của chùm

ánh sáng). Sau đó, tế bào được phân loại theo các tín hiệu huỳnh quang qua

các bước sau:

+ Trước tiên, chúng tôi tiến hành chạy mẫu đối chứng để xác định các

thông số chuẩn cho máy trên phần mềm BD FACS Diva. Ở đây, chúng tôi xác

định được vị trí phân bố của các tế bào đơn độc là vùng P1 (màu đỏ), đây là

vùng tế bào cần khảo sát (hình 2.8). Các đối tượng có kích thước không nằm

trong khoảng này sẽ không được tiếp tục khảo sát. Đồng thời, tín hiệu huỳnh

quang ở mẫu đối chứng (không ủ với kháng thể) cũng sẽ được khoanh vùng,

chúng tôi xác định là giá trị nhỏ hơn 104 với tất cả các tín hiệu huỳnh quang

(Fluorescein isothiocyanate, allophycocyanin, PerCP-Cy5-5). Như vậy, sau

khi ủ với kháng thể, các tế bào có giá trị fluorescein isothiocyanate lớn hơn

104 sẽ được xác định là có biểu hiện CD11b+ hoặc CD49b+, giá trị

allophycocyanin lớn hơn 104 sẽ được xác định là có biểu hiện CD11c+, giá trị

allophycocyanin và PerCP-Cy5-5 lớn hơn 104 sẽ được xác định là có biểu hiện

CD197+.

Hình 2.11. Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy trên phần mềm BD FACS

Diva đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột nude

+ Tiếp theo, chúng tôi tiến hành chạy mẫu tế bào được ủ với các kháng

thể kháng CD11b, CD49b, CD11c, CD197 của chuột. Kết quả thu được cho

thấy, xuất hiện các tế bào có giá trị huỳnh quang xuất hiện ở vùng dương tính

với các kháng thể CD nêu trên. Tỉ lệ tế bào dương tính với các kháng thể CD

đại điện cho số lượng các tế bào miễn dịch tương ứng (tế bào bạch cầu dòng

tủy, tế bào giết tự nhiên, tế bào DC, tế bào DC trưởng thành) có trong quần

thể tế bào được phân tích.

Quá trình đánh giá tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột nude mang

khối u tế bào HT-29 sau điều trị bằng MeV và MuV bằng phương pháp phân

tích tế bào dòng chảy được thực hiện tại Bộ môn Sinh học tế bào, khoa Sinh

học và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzym và Protein (KLEPT),

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.2.12. Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều

trị bằng virus vaccine sởi và quai bị

Có 12 mẫu u của 4 nhóm nghiên cứu gồm: nhóm điều trị MeV+MuV,

nhóm điều trị MeV, Nhóm điều trị MuV và nhóm chứng sau khi sinh thiết

được tiến hành làm tiêu bản siêu cấu trúc theo các bước sau:

- Rửa 2 lần bằng dung dịch đệm cacodylate với pH = 7,3.

- Cố định bằng dung dịch glutaraldehyte 2% trong đệm cacodylate (pH

= 7,3) với tỉ lệ thể tích mẫu:thể tích dung dịch là 1:10. Thời gian duy trì 2 đến

3 ngày.

- Pha mẫu thành mảnh nhỏ kích thước 1x1x2 mm

- Rửa bằng đệm cacodylate 2-3 lần trong 1 giờ.

- Cố định lại bằng acid osmic 1% trong đệm cacodylate (pH = 7,3): 1

giờ. Sau đó, rửa bằng đệm cacodylate (pH = 7,3): 2-3 lần.

- Khử nước bằng chuyển liên tục qua các dung dịch cồn 500, 600, 700,

800, 900, 1000, duy trì thời gian15 phút/ dung dịch.

- Sau khi khử nước, mẫu được chuyển qua dung dịch cồn propylene +

ethylene với tỉ lệ 1:1 trong 10 phút, sau đó chuyển qua propylene trong 10

phút.

- Tiếp tục chuyển mẫu qua hỗn hợp propylene + epon 812 với tỷ lệ thể

tích là 1:1 trong 15 phút sau đó là hỗn hợp propylene + epon 812 tỉ lệ 1:2

trong 30 phút. Cuối cùng cho mẫu vào epon 812 trong 30 phút.

- Đúc block bằng khuôn.

- Lưu hóa ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.

- Polyme hóa ở nhiệt độ 600C trong 48 giờ.

- Sau khi các block đã hóa cứng hoàn toàn, gọt mẫu, cắt lát mỏng, nhuộm

bằng xanh toluidine, định hướng vị trí nghiên cứu, gọt mẫu và cắt bằng máy

siêu cắt (sản xuất tại Đức) độ dày lát cắt: 50 nm.

- Vớt lát cắt lên lưới đồng 200 lỗ.

- Nhuộm uranyl acetate 2% trong 5 phút, rửa 2 lần bằng nước cất.

- Nhuộm chì citrate 5% trong 5 phút, rửa 2 lần bằng nước cất.

- Soi, đọc kết quả trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400,

JEOL, Nhật Bản (Khoa Hình thái - Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng Chủ tịch Hồ Chí

Minh).

2.2.13. Phương pháp phân tích kết quả

Để phân tích và xử lý số liệu, chúng tôi dùng các thuật toán thống kê sử

dụng phần mềm SPSS.20 và vẽ đồ thị bằng phần mềm GraphPad Prism.

Các số liệu được trình bày bằng giá trị trung bình ( ), độ lệch chuẩn

(SD) và trung vị (Me). Sử dụng phép kiểm định T. Test để so sánh giá trị

trung bình giữa 2 nhóm, phép kiểm định One-Way ANOVA để kiểm định sự

khác nhau của giá trị trung bình khi so sánh nhiều hơn 2 nhóm, phép kiểm

định trung vị independent-samples median test để kiểm định các giá trị trung

vị giữa các nhóm.

Sử dụng phương pháp Kaplan-Meier để phân tích thời gian sống, tỉ lệ

chuột chết sau điều trị bằng MeV, MuV ở các nhóm nghiên cứu.

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi giá trị p<0,05.

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

Nuôi chuột nude (49 con) Nuôi cấy tế bào ung thư đại tràng HT-29

Tăng sinh MeV, MuV và chuẩn độ TCID50

Mục tiêu 1: Đánh giá hiệu quả ly giải tế bào HT-29 của MeV và MuV in vitro

Mục tiêu 2: Đánh giá hiệu quả kháng u tế bào HT-29 trên chuột nude của MeV và MuV

Nhiễm MeV và MuV vào tế bào HT-29 in vitro

Ghép u tế bào HT-29 dưới da đùi chuột nude và điều trị

Đánh giá hiệu quả kháng u

Đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột

Nghiệm pháp MTT

Nhóm điều trị MuV (10 con)

Nhóm điều trị MeV (2 con)

Nhóm điều trị MuV (2 con)

Đánh giá tế bào chết theo chương trình (apoptosis)

Nhóm chứng (10 con)

Nhóm chứng (3 con)

Nhóm điều trị phối hợp (2 con)

Tỉ lệ tế bào sống ở các nhóm NC

Tỉ lệ tế bào apoptosis ở các nhóm NC

Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u HT-29

Sức khỏe chuột, trọng lượng chuột, kích thước u, thời gian sống và chết ở các nhóm NC

Tỉ lệ các tế bào: tế bào bạch cầu dòng tủy, NK, DC và DC trưởng thành ở các nhóm NC

Nhóm điều trị MeV (10 con) Nhóm điều trị phối hợp (10 con)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Tăng sinh dòng tế bào HT-29, Vero, virus vaccine sởi và quai bị

3.1.1. Tăng sinh các dòng tế bào HT-29 và Vero

Hình 3.1. Tế bào HT-29 bám đáy và phát triển

(A) ở vật kính 10X; (B) ở vật kính 20X; (C) ở vật kính 40X

Hình 3.2. Tế bào Vero bám đáy và phát triển

- Tế bào HT-29 phát triển: Quan sát bằng kính hiển vi quang học, tế

(A) ở vật kính 10X; (B) ở vật kính 20X; (C) ở vật kính 40X

bào HT-29 là các loại tế bào dạng biểu mô đại tràng bám đáy, phát triển đơn

lớp, có nhiều hình dạng khác nhau từ hình bầu dục cho đến hình đa giác,

đường kính khoảng 20-40µm. Tế bào HT-29 nhân tế bào to chiếm gần hết

phần tế bào chất, hình ảnh nhân quái, nhân chia (hình 3.1)

- Tế bào Vero phát triển: Quan sát bằng kính hiển vi quang học, là tế

bào dạng biểu mô bám đáy phát triển đơn lớp, đường kính khoảng 17µm, có

nhiều hình dạng khác nhau trên vi trường (hình 3.2)

3.1.2. Tăng sinh virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine

Tế bào Vero có hình ảnh nhiễm MeV, MuV hòa màng tạo hợp bào và

tế bào hoại tử dưới kính hiển vi quang học (hình 3.3).

Hình 3.3. Tế bào Vero nhiễm MeV, MuV

(A), (B) nhiễm MeV, MuV ngày thứ 3, 4: các tế bào nhiễm virus co tròn lại

bong khỏi đáy; (C) nhiễm MeV, MuV ngày thứ 5: tế bào Vero nhiễm virus

hòa màng tạo hợp bào; (D), (E) nhiễm virus ngày thứ 6, 7: tế bào Vero nhiễm

virus hòa màng tạo hợp bào lan rộng; (F) nhiễm MeV, MuV ngày thứ 9: hợp

bào chết tạo ra xác tế bào (chú thích bởi các mũi tên đen)

3.2. Chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị theo phương pháp TCID50

Nhiễm MeV, MuV vào các giếng có tế bào Vero trên đĩa 96 giếng. Sau

5-6 ngày nhiễm virus, tiến hành nhuộm xanh methylen đánh giá màu sắc ở

các giếng. Kết quả thu được như hình 3.4.

Chuẩn độ TCID50 của MuV Chuẩn độ TCID50 của MeV

Hình 3.4. Kết quả nhuộm xanh methylen chuẩn độ TCID50

- Tính TCID50 của MeV: Từ kết quả hình 3.4 chúng tôi thấy ở hàng

tương ứng với nồng độ pha loãng 10-7 của virus có 7 giếng nhạt màu hơn (giếng

có tế bào nhiễm virus) so với nhóm chứng chiếm tỉ lệ 7/10 > 50%. Ở hàng tương

ứng với nồng độ pha loãng 10-6 của virus có 3 giếng nhạt màu, tỉ lệ là

3/10< 50%, như vậy ta có:

Khoảng tỉ lệ (PD)= (7/10-5/10): (7/10-3/10) = 0,5

Log của nồng độ pha loãng có CPE trên 50%: -log (10-7) = 7

TCID50 của MeV= 107+0,5/0,2 ml = 5x107,5/ml

- Tính TCID50 của MuV: Từ kết quả hình 3.4 chúng tôi thấy ở hàng tương

ứng với nồng độ pha loãng 10-6 của virus có 7 giếng nhạt màu hơn so với nhóm

chứng (giếng có tế bào nhiễm virus), chiếm tỉ lệ 7/10 > 50%. Ở hàng tương ứng

với nồng độ pha loãng 10-5 của virus có 2 giếng nhạt màu, tỉ lệ là 2/10 < 50%,

như vậy ta có:

Khoảng tỉ lệ (PD)= (7/10-5/10): (7/10-2/10) = 0,4

Log của nồng độ pha loãng có CPE trên 50%: -log (10-6) = 6

TCID50 của MuV= 106+0,4/0,2 ml = 5x106,4/ml

3.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp dòng tế bào ung

thư đại tràng người HT-29 in vitro

3.3.1. Tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị tạo hợp bào in

vitro

Hình 3.5. Hình ảnh tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV tạo hợp bào in vitro

Từ ngày thứ 2 sau nhiễm MeV, MuV, chúng tôi quan sát thấy bắt đầu

có hình ảnh tế bào HT-29 nhiễm virus thay đổi về hình thái dưới kính hiển vi

thường, một số tế bào co nhỏ có xu hướng bong ra tách khỏi đám tế bào. Đến

ngày thứ 3, hình ảnh tế bào HT-29 nhiễm virus đã rõ ràng, có nhiều tế bào co

nhỏ lại bong ra khỏi đáy đĩa nuôi cấy, lơ lửng, các tế bào bắt đầu hòa màng

với nhau tạo hình ảnh hợp bào (tế bào khổng lồ có nhiều nhân, nổi lên trên).

Ngày thứ 4 và 5, hình ảnh hợp bào nhiều hơn nổi lên trên. Ngày thứ 6, tế bào

HT-29 bong khỏi đáy hình thành hợp bào gần hoàn toàn, các hợp bào có xu thế

phân hủy để lại hình ảnh tế bào chết và các mảnh vỡ tế bào (hình 3.5).

3.3.2. Kết quả đánh giá hiệu quả ly giải tế bào ung thư đại tràng

người HT-29 của virus vaccine sởi và quai bị bằng nghiệm pháp 3- (4,5-

Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide

3.3.2.1. Kết quả ở từng thời điểm nghiên cứu

% tế bào sống

Biểu đồ 3.1. KếT quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 3

- Kết quả nghiệm pháp MTT của dòng tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 ở ngày thứ 3 nhiễm MuV, MeV: Tỉ lệ tế bào sống của các nhóm nhiễm

MeV+MuV, MeV thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng

ở các nồng độ pha loãng virus từ 10-2 đến 10-7, nhóm nhiễm MuV có tỉ lệ tế

bào sống thấp hơn nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ở nồng độ pha

loãng virus từ 10-2 đến 10-4, (biểu đồ 3.1).

Ở tất cả nồng độ pha loãng virus, tỉ lệ tế bào sống ở nhóm nhiễm phối

hợp MeV+MuV thấp hơn nhóm nhiễm đơn virus, tuy nhiên, sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê (p<0,05) chỉ ở các nồng độ pha loãng virus 10-2, 10-3 và 10-4 và

10-5 (biểu đồ 3.1).

% tế bào sống

Biểu đồ 3.2. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 4

- Kết quả nghiệm pháp MTT của dòng tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV: Tỉ lệ tế bào sống của các nhóm nhiễm

MeV, MuV thấp hơn so với nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ở các

nồng độ pha loãng của virus từ 10-2 đến 10-7 (biểu đồ 3.2).

Ở tất cả các nồng độ pha loãng của MeV, MuV, tỉ lệ tế bào sống của

nhóm nhiễm phối hợp virus thấp hơn nhóm nhiễm đơn MuV hay MeV. Tuy

nhiên, sự khác biệt giữa nhóm nhiễm phối hợp virus so với nhóm nhiễm MeV

có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ở nồng độ pha loãng 10-2, 10-6 và 10-7; sự khác

biệt giữa nhóm nhiễm phối hợp virus so với nhóm nhiễm MuV có ý nghĩa

thống kê (p<0,05) ở nồng độ pha loãng 10-2, 10-4 và 10-7 (biểu đồ 3.2).

% tế bào sống

Biểu đồ 3.3. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 5

- Kết quả nghiệm pháp MTT của dòng tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV: Tỉ lệ tế bào sống của các nhóm nhiễm

MuV, MeV thấp hơn so với nhóm chứng, sự khác biệt này có ý nghĩa thống

kê (p<0,05) ở các nồng độ pha loãng virus từ 10-2 đến 10-7. Ở nồng độ pha

loãng virus 10-8 không có khác biệt nhiều về tỉ lệ tế bào sống giữa các nhóm

nghiên cứu (biểu đồ 3.3).

Ở tất cả nồng độ pha loãng của MeV, MuV, tỉ lệ tế bào sống của nhóm

nhiễm phối hợp virus thấp hơn nhóm nhiễm đơn virus, sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê (p<0,05) ở nồng độ 10-2, 10-6, 10-7 (biểu đồ 3.3).

3.3.2.2. So sánh kết quả nghiệm pháp MTT ở các thời điểm nghiên cứu

ngày thứ 3, 4 và 5 sau nhiễm MeV, MuV

% tế bào sống

Biểu đồ 3.4. So sánh kết quả MTT các nhóm MuV+MeV ngày 3, 4 và 5

% tế bào sống

Biểu đồ 3.5. So sánh kết quả MTT các nhóm MeV ngày 3, 4 và 5

% tế bào sống

Biểu đồ 3.6. So sánh kết quả MTT các nhóm nhiễm MuV ngày 3, 4 và 5

So sánh kết quả nghiệm pháp MTT của tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 ở các thời điểm nghiên cứu ngày thứ 3, 4 và 5 sau nhiễm virus, tỉ lệ tế

bào sống cao nhất ở ngày thứ 3, không có khác biệt nhiều ở ngày thứ 4 so với

ngày thứ 5. Nồng độ hòa loãng virus càng cao thì sự khác biệt càng ít, ở nồng

độ 10-7 và 10-8 hầu như không có khác biệt (biểu đồ 3.4, 3.5 và 3.6).

Các nhóm nhiễm phối hợp virus có tỉ lệ tế bào sống ở ngày thứ 3 cao

hơn so với ngày thứ 4 và 5 sau nhiễm virus có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ở

nồng độ hòa loãng 10-2, 10-3, 10-6 và 10-7, (biểu đồ 3.4).

Các nhóm nhiễm MeV có tỉ lệ tế bào sống ở ngày thứ 3 cao hơn có ý

nghĩa thống kê (p<0,05) so với ngày thứ 4 và 5 sau nhiễm virus ở các nồng độ

pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5 (biểu đồ 3.5).

Các nhóm nhiễm MuV có tỉ lệ tế bào sống ở ngày thứ 3 cao hơn so với

ngày thứ 4 và 5 sau nhiễm virus có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ở nồng độ hòa

loãng 10-2 đến 10-6 (biểu đồ 3.6).

3.3.3. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo

chương trình và hoại tử sau nhiễm virus vaccine sởi và quai bị in vitro

3.3.3.1. Biến đổi hình thái tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết

theo chương trình dưới kính hiển vi quang học

Hình 3.6. Biến đổi hình thái của tế bào HT-29 chết theo chương trình.

(A) ở vật kính 20X; (B) ở vật kính 10X; (C), (D) ở vật kính 40X.

Ở thời điểm nghiên cứu ngày thứ 3, 4, 5 sau nhiễm virus, tế bào HT-29

biến đổi hình thái ở các giai đoạn tế bào chết theo chương trình như: tế bào co

tròn, bong ra tách rời nhau, nhân co đặc lại lệch về một phía, nhân tế bào phân

mảnh, vỡ hạt nhân và hoại tử tế bào (hình 3.6, ở mũi tên trắng).

3.3.3.2. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo

chương trình và tế bào hoại tử bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy

Biểu đồ 3.7. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV

% tế bào apoptosis

- Tỉ lệ tế bào chết apoptosis của dòng tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV: Kết quả ở các nhóm nhiễm MeV,

MuV cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng (nhóm MuV

là 6,1±0,96%; nhóm MeV là 8,8±1,14%; nhóm MuV+MeV là 14,4±2,91% so

với nhóm chứng là 1,67±1,02% với p(MuV-Control) = 0,005; p(MeV-Control) = 0,001;

p(MuV+MeV-Control) = 0,002). Nhóm phối hợp virus cao hơn có ý nghĩa thống kê

(p<0,05) so với nhóm điều trị đơn virus (nhóm MuV+MeV là 14,4±2,91% so

với nhóm MuV là 6,1±0,96%; nhóm MeV là 8,8±1,14% với p(MuV-MuV+MeV) =

0,009; p(MeV-MeV+MuV) = 0,036). Sự khác biệt giữa 2 nhóm nhiễm đơn virus

không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (biểu đồ 3.7 và hình 3.7)

% tế bào apoptossis sớm

Biểu đồ 3.8. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV

- Tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm của dòng tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV: Kết quả của các nhóm

nhiễm MeV, MuV cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng

(nhóm MuV là 0,77±0,12%; nhóm MeV là 1,77±0,46%; nhóm MuV+MeV là

2,17±0,65% so với nhóm chứng là 0,17±0,06%; với p(MuV-Control) = 0,001;

p(MeV-Control) = 0,025; p(MuV+MeV-Control) = 0,006). Nhóm nhiễm phối hợp

MeV+MuV cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm nhiễm đơn

virus (nhóm MuV+MeV là 2,17±0,65% so với nhóm MuV là 0,77±0,12%;

p(MuV-MuV+MeV) = 0,021). Nhóm phối hợp MeV+MuV cao hơn nhóm MeV

nhưng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (nhóm MuV+MeV là 2,17±0,65%

so với nhóm MeV là 1,77±0,46% với p(MeV-MeV+MuV) = 0,43). So sánh 2 nhóm

nhiễm đơn virus sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (biểu đồ 3.8

và hình 3.7).

% tế bào apoptosis muộn

Biểu đồ 3.9. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV

- Tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis muộn của dòng tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV: Kết quả ở các nhóm

nhiễm MeV, MuV cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng

(nhóm MuV là 5,3±0,85%; nhóm MeV là 7,03±0,93%; nhóm MuV+MeV là

(MeV-Control) = 0,002; p (MuV+MeV-Control) = 0,003). Nhóm nhiễm phối hợp

12,23±2,75% so với nhóm chứng là 1,5±0,96% với p (MuV-Control) = 0,007; p

MeV+MuV cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm điều trị đơn

virus (nhóm MuV+MeV là 12,23±2,75% so với nhóm MuV là 5,3±0,85%;

nhóm MeV là 7,0±0,93% với p(MuV-MuV+MeV) = 0,014; p (MeV-MeV+MuV) = 0,036).

Sự khác biệt giữa 2 nhóm nhiễm đơn virus không có ý nghĩa thống kê

(p>0,05) (biểu đồ 3.9 và hình 3.7).

Biểu đồ 3.10. Tỉ lệ tế bào HT-29 hoại tử ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV

% tế bào hoại tử

- Tỉ lệ tế bào hoại tử của dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 ở

ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV: Kết quả ở các nhóm nhiễm MeV, MuV so với

nhóm chứng không đồng nhất, cao nhất ở nhóm nhiễm phối hợp virus

(23,3±19,1%), tuy nhiên, nhóm chứng (19,1±6,2%) lại cao hơn các nhóm

nhiễm đơn virus (nhóm MuV: 13,2±1,6% và nhóm MeV: 7,7±0,2%) (biểu đồ

3.10 và hình 3.7)

Hình 3.7. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 5

(I) Nhóm nhiễm MuV; (II) Nhóm nhiễm MeV; (III) Nhóm nhiễm MuV+MeV

(Q1) vùng tế bào apoptosis sớm; (Q2) vùng tế bào apoptosis muộn;

(Q4) vùng tế bào hoại tử

% tế bào apoptosis

Biểu đồ 3.11. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV

- Tỉ lệ tế bào chết apoptosis của dòng tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV: Kết quả ở các nhóm nhiễm virus cao

hơn có nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng (nhóm MuV là

4,37±0,40%; nhóm MeV là 4,87±0,31%; nhóm MuV+MeV là 12,37±1,12%

so với nhóm chứng là 1,67±1,02% với p(MuV-Control) = 0,013; p(MeV-Control) =

0,007; p(MuV+MeV-Control) = 0,0001). Nhóm nhiễm phối hợp MeV+MuV cao hơn

có nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm nhiễm đơn virus (nhóm MuV+MeV

là 12,37±1,12% so với nhóm MuV là 4,37±0,40%; nhóm MeV là 4,87±0,31%

với p(MuV-MuV+MeV) = 0,0001; p(MeV-MeV+MuV) = 0,0001). So sánh kết quả ở 2

nhóm nhiễm đơn virus sự khác biệt không có nghĩa thống kê (p(MeV-MuV) =

0,163>0,05) (biểu đồ 3.11 hình 3.8).

% tế bào apoptosis sớm

Biểu đồ 3.12. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV

- Tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm của dòng tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV: Kết quả ở các nhóm

nhiễm virus cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng (nhóm

MuV là 0,6±0,10%; nhóm MeV là 0,53±0,21%; nhóm MuV+MeV là

Control) = 0,042; p(MuV+MeV-Control) = 0,032). Nhóm nhiễm phối hợp MeV+MuV có

2,97±0,9% so với nhóm chứng là 0,17±0,06% với p(MuV-Control) = 0,003; p(MeV-

tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so

với nhóm nhiễm đơn virus (nhóm MuV+MeV là 2,97±0,9% so với nhóm

MuV là 0,6±0,10%; nhóm MeV là 0,53±0,21% với p(MuV-MuV+MeV) = 0,043;

p(MeV-MeV+MuV) = 0,037). So sánh kết quả của 2 nhóm nhiễm đơn virus, sự khác

biệt không có ý nghĩa thống kê với p(MeV-MuV) = 0,643>0,05 (biểu đồ 3.12 và

hình 3.8)

% tế bào apoptosis muộn

- Tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis muộn của dòng tế bào ung thư đại

Biểu đồ 3.13. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV

tràng người HT-29 ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV: Kết quả ở các nhóm

nhiễm MeV, MuV cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng

(nhóm MuV là 3,77±0,45%; nhóm MeV là 4,33±0,15%; nhóm MuV+MeV là

Control) = 0,034; p(MuV+MeV-Control) = 0,00001). Kết quả ở nhóm nhiễm phối hợp

9,4±0,35% so với nhóm chứng là 1,5±0,96% với p(MuV-Control) = 0,021; p(MeV-

MeV+MuV cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm nhiễm đơn

virus (nhóm MuV+MeV là 9,4±0,35% so với nhóm MuV là 3,77±0,45%;

nhóm MeV là 4,3±0,15% với p(MuV-MuV+MeV) = 0,00001; p(MeV-MeV+MuV) =

0,00001). So sánh kết quả 2 nhóm điều trị đơn virus sự khác biệt không có ý

nghĩa thống kê (p(MeV-MuV) = 0,108>0,05) (biểu đồ 3.13 và hình 3.8).

Biểu đồ 3.14. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 4 nhiễm MuV, MeV

% tế bào hoại tử

- Tỉ lệ tế bào hoại tử của dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 ở

ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV: Kết quả ở các nhiễm MeV, MuV so với nhóm

chứng không đồng nhất, tỉ lệ cao nhất ở nhóm nhiễm MeV (20,3±11,0%),

thấp nhất ở nhóm nhiễm phối hợp MeV+MuV (12,6±1,1%) (biểu đồ 3.14 và

hình 3.8)

Hình 3.8. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 4

(I) Nhóm nhiễm MuV; (II) Nhóm nhiễm MeV; (III) Nhóm nhiễm MuV+MeV

Q1 là vùng tế bào apoptosis giai đoạn sớm; Q2 là vùng tế bào apoptosis giai

đoạn muộn; Q4 là vùng tế bào hoại tử

% tế bào apoptosis

Biểu đồ 3.15. Tỉ lệ tế bào apoptosis ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV

- Tỉ lệ tế bào chết apoptosis của dòng tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV: Kết quả ở các nhóm nhiễm MeV,

MuV cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng (nhóm MuV

là 3,2±0,17%; nhóm MeV là 3,77±0,25%; nhóm MuV+MeV là 5,4±0,32% so

với nhóm chứng là 1,67±1,02% với p(MuV-Control) = 0.118; p(MeV-Control) = 0,026;

p(MuV+MeV-Control) = 0,004). Nhóm nhiễm phối hợp MeV+MuV có tỉ lệ tế bào

apoptosis cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm nhiễm đơn virus

(nhóm MuV+MeV là 5,4±0,32% so với MuV là 3,2±0,17%; MeV là

3,77±0,25% với p(MuV-MuV+MeV) = 0,0001; p(MeV-MeV+MuV) = 0,002). Kết quả ở 2

MuV)>0,05) (biểu đồ 3.15 và hình 3.9).

nhóm nhiễm đơn virus sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p(MeV-

% tế bào apoptosis sớm

Biểu đồ 3.16. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV

- Tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm của dòng tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV: Kết quả ở các nhóm

nhiễm MeV, MuV cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng

(nhóm MuV là 0,6±0,1%; nhóm MeV là 0,5±0,0%; nhóm MuV+MeV là

Control) = 0,01; p(MuV+MeV-Control) = 0,032). Kết quả của nhóm nhiễm phối hợp

0,83±0,35% so với nhóm chứng là 0,17±0,06% với p(MuV-Control) = 0,003; p(MeV-

MeV+MuV cao hơn không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với nhóm điều trị

đơn virus (nhóm MuV+MeV là 0,83±0,35% so với nhóm MuV là 0,6±0,1%;

nhóm MeV là 0,5±0,0% với p(MuV-MuV+MeV) = 0,33; p(MeV-MeV+MuV) = 0,176).

Kết quả của 2 nhóm nhiễm đơn virus khác biệt không có ý nghĩa thống kê

(p(MeV-MuV) = 0,158>0,05) (biểu đồ 3.16 và hình 3.9).

% tế bào apoptosis muộn

Biểu đồ 3.17. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV

- Tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis muộn của dòng tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV: Kết quả của các nhóm

nhiễm MeV, MuV cao hơn nhóm chứng, nhưng chỉ có sự khác biệt giữa

nhóm nhiễm phối hợp MeV+MuV và nhóm MeV so với nhóm chứng là có ý

nghĩa thống kê (p<0,05) (nhóm MuV là 2,6±0,2%; nhóm MeV là

3,27±0,25%; nhóm MuV+MeV là 4,6±0,1% so với nhóm chứng là 1,5±0,96%

với p(MuV-Control) = 0,183; p(MeV-Control) = 0,037; p(MuV+MeV-Control) = 0,03). Kết quả

của nhóm nhiễm phối hợp MeV+MuV cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

so với nhóm nhiễm đơn virus (nhóm MuV+MeV là 4,6±0,1% so với nhóm

MeV+MuV) = 0,001). Khác biệt kết quả của 2 nhóm nhiễm đơn virus không có ý

MuV là 2,6±0,2%; MeV là 3,27±0,25% với p(MuV-MuV+MeV) = 0,0001; p(MeV-

nghĩa thống kê với p(MeV-MuV) >0,05 (biểu đồ 3.17 và hình 3.9).

% tế bào hoại tử

Biểu đồ 3.18. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV

- Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV: Kết quả cho thấy

sự khác nhau ở các nhóm nhiễm virus và nhóm chứng không đồng nhất, cao

nhất ở nhóm chứng (19,1±6,2%), thấp nhất ở nhóm nhiễm MuV (13,6±3,2%)

(biểu đồ 3.18 và hình 3.9)

Hình 3.9. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người

HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 3

(I) Nhóm nhiễm MuV; (II) Nhóm nhiễm MeV; (III) Nhóm nhiễm MuV+MeV

Q1 là vùng tế bào apoptosis giai đoạn sớm; Q2 là vùng tế bào apoptosis giai

đoạn muộn; Q4 là vùng tế bào hoại tử

% tế bào apoptosis

Biểu đồ 3.19. So sánh tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 3, 4 và 5

nhiễm MeV, MuV

- So sánh tỉ lệ tế bào chết apoptosis của dòng tế bào ung thư đại tràng

HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 3, 4 và 5: Kết quả cao nhất ở ngày thứ 5

và thấp nhất ở ngày thứ 3, sự khác biệt giữa các ngày có ý nghĩa thống kê

(p<0,05), nhóm nhiễm MuV ngày thứ 3 là 3,2±0,17%; ngày thứ 4 là

4,37±0,4%; ngày thứ 5 là 6,1±0,96% với p(ngày 3-ngày 4)= 0,01; p(ngày 3-ngày 5)=

0,032; p(ngày 4-ngày 5) = 0,045. Kết quả ở các nhóm nhiễm MeV ngày thứ 3 là

ngày 4) = 0,009; p(ngày 3-ngày 5) = 0,013; p(ngày 4-ngày 5) = 0,004. Kết quả ở các nhóm

3,77±0,25%; ngày thứ 4 là 4,87±0,31%; ngày thứ 5 là 8,8±1,14% với p(ngày 3-

nhiễm phối hợp MeV+MuV ngày thứ 3 là 5,43±0,32%; ngày thứ 4 là

12,37±1,12%; ngày thứ 5 là 14,4±2,91% với p(ngày3-ngày5) = 0,006; p(ngày 4-ngày 5)

= 0,023; p(ngày 4-ngày 3) = 0,001) (biểu đồ 3.19 và hình 3.9).

% tế bào apoptosis sớm

Biểu đồ 3.20. So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm ở ngày 3, 4 và 5

nhiễm MeV, MuV

- So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm của dòng tế bào ung thư

đại tràng người HT-29 nhiễm virus ngày thứ 3, 4 và 5: tỉ lệ tế bào giai đoạn

apoptosis sớm tăng theo thời gian nhiễm virus, cao nhất ở ngày thứ 5 và thấp

nhất ở ngày thứ 3. Tuy nhiên, kết quả ở các nhóm nhiễm MuV, sự khác biệt

không có ý nghĩa thống kê (p>0,05): ngày thứ 3 là 0,6±0,1%; ngày thứ 4 là

0,6±0,1%; ngày thứ 5 là 0,77±0,12% với p(ngày 3-ngày 4) = 1,0; p(ngày 3-ngày 5) =

0,132; p(ngày 4-ngày 5) = 0,132. Kết quả ở các nhóm nhiễm MeV, sự khác biệt có

ý nghĩa thống kê (p<0,05) với ngày thứ 3 là 0,5±0,0%; ngày thứ 4 là

0,53±0,21%; ngày thứ 5 là 1,77±0,46% với p(ngày 3-ngày 4) = 0,808; p(ngày 3-ngày 5) =

0,042; p(ngày 4-ngày 5) = 0,014. Kết quả ở các nhóm nhiễm phối hợp MeV+MuV

ngày thứ 4 và 5 cao hơn ngày thứ 3 có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Tuy nhiên,

thời điểm ngày thứ 4 lại cao hơn ngày thứ 5, gồm ngày thứ 3 là 0,83±0,35%;

ngày thứ 4 là 2,97±0,9%; ngày thứ 5 là 2,17±0,65% với p(ngày 5-ngày 3) = 0.035;

p(ngày 4-ngày 5) = 0,279; p(ngày 4-ngày 3) = 0,018 (biểu đồ 3.20 và hình 3.9).

% tế bào apotosis muộn

Biểu đồ 3.21. So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis muộn ở ngày

3, 4 và 5 nhiễm MeV, MuV

- So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis muộn của dòng tế bào ung

thư đại tràng người HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 3, 4 và 5: Kết quả tỉ lệ

tế bào giai đoạn apoptosis muộn tăng theo thời gian nhiễm virus, cao nhất ở

ngày thứ 5 và thấp nhất ở ngày thứ 3, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê

(p<0,05). Kết quả nhóm nhiễm MuV gồm ngày thứ 3 là 2,6±0,2%; ngày thứ 4

là 3,77±0,45%; ngày thứ 5 là 5,3±0,85% với p(ngày 3-ngày 4) = 0,015; p(ngày 3-ngày 5)

= 0,009; p(ngày 4-ngày 5) = 0,048). Kết quả ở các nhóm nhiễm MeV gồm ngày thứ

3 là 3,27±0,25%; ngày thứ 4 là 4,33±0,15%; ngày thứ 5 là 7,03±0,93% với

p(ngày 3-ngày 4) = 0,003; p(ngày 3-ngày 5) = 0,002; p(ngày 4-ngày 5) = 0,008. Kết quả ở các

nhóm nhiễm MeV+MuV gồm ngày thứ 3 là 4,6±0,1%; ngày thứ 4 là

9,4±0,35%; ngày thứ 5 là 12,2±2,75% với p(ngày3-ngày 5) = 0,041; p(ngày 4-ngày 5) =

0,215; p (ngày 3-ngày 4) = 0,0001) (biểu đồ 3.21 và hình 3.9).

3.4. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u dòng tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch

3.4.1. Kết quả ghép u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29

Bảng 3.1. Kết quả tạo khối u tế bào HT-29 trên đùi chuột nude

Ngày

thứ 1

thứ 3

thứ 5

thứ 7

thứ 8

Số ngày sau tiêm tế bào HT-29

(n = 40)

(n=40)

Các chỉ số theo dõi

Số chuột có u

Tỷ lệ có u (%)

100

Hình 3.10. Kết quả ghép u tế bào HT-29 dưới da đùi chuột nude

(A) ngày thứ 3 sau tiêm tế bào HT-29; (B) ngày thứ 5 sau tiêm tế bào HT-29;

Kết quả cho thấy u xuất hiện bắt đầu vào ngày thứ 3 sau tiêm, đến ngày

thứ 8 thì có 40/40 con chuột đều có u, thể tích đạt khoảng 250-350 mm3 (bảng

3.1) (hình 3.10). Vùng da tại chỗ tiêm bình thường, không có biểu hiện viêm

loét hay hoại tử, sức khỏe chuột ở các nhóm đều tốt, cân nặng không thay đổi

đảm bảo cho quá trình điều trị chuột bằng MuV và MeV.

3.4.2. Kết quả điều trị chuột nude mang khối u tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 bằng virus vaccine sởi và quai bị

3.4.2.1. Tình trạng sức khỏe của chuột sau điều trị

Sau khi tiêm 8 ngày, u phát triển tốt tại vị trí dưới da đùi của 40 chuột

nude, chúng tôi tiến hành điều trị bằng MeV và MuV theo phác đồ và liều

lượng (đã nói ở mục 2.2.8). Bên cạch đó, chúng tôi cũng theo dõi sức khỏe

chuột trong suốt quá trình điều trị. Kết quả cho thấy các chuột sau ghép u tế

bào HT-29 và trong quá trình điều trị bằng MeV và MuV đều có các chỉ số

đánh giá sức khỏe bình thường (bảng 3.2).

Bảng 3.2. Kết quả theo dõi sức khỏe chuột sau điều trị MeV và MuV

Mức độ đánh giá Tiêu chí theo dõi Số TT

1 Vận động 2 Đáp ứng với kích thích 3 Phân chuột 4 Da chuột Bình thường 40 Con 40 Con 40 Con 40 Con Kém 0 0 0 0

3.4.2.2. Trọng lượng chuột ở các nhóm nghiên cứu sau điều trị

Trọng lượng chuột (gam)

Các nhóm N.C

Biểu đồ 3.22. Thay đổi trọng lượng chuột sau điều trị bằng MeV, MuV

Các nhóm chuột có trọng lượng tương đồng nhau (khác biệt không có

nghĩa thống kê p>0,05), (biểu đồ 3.22).

3.4.2.3. Kích thước u ở các nhóm nghiên cứu sau điều trị bằng virus

vaccine sởi và quai bị

A

B

Biểu đồ 3.23. Kết quả kích thước khối u sau điều trị bằng MeV, MuV

(A): So sánh kích thước u ở ngày điều trị thứ nhất

(B): So sánh kích thước u ở ngày điều trị thứ 29

Ngày đầu tiên điều trị, chúng tôi tiến hành so sánh tương quan kích

thước u ở các nhóm nghiên cứu, không có khác biệt nhiều về kích thước u

trung bình giữa các nhóm (p>0,05) (biểu đồ 3.23a).

Sau thời gian điều trị, kết quả cho thấy kích thước khối u phát triển

chậm lại bắt đầu từ ngày thứ 3 cho đến ngày thứ 29. Ở ngày thứ 29 (có chuột

chết, dừng theo dõi kích thước u), kích thước khối u ở các nhóm điều trị

MeV, MuV tăng chậm có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng. Đặc

biệt, kích thước khối u của nhóm điều trị phối hợp MeV+MuV tăng chậm hơn

nhóm điều trị đơn MeV và MuV có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (biểu đồ 3.23b)

Thể tích khối u của 2 nhóm điều trị đơn virus là MeV và MuV khác

biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (biểu đồ 3.23b).

3.4.2.4. Thời gian sống trung bình và tỉ lệ chuột còn sống của các nhóm

nghiên cứu sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị

Các nhóm NC

Biểu đồ 3.24. So sánh thời gian sống trung bình ở các nhóm chuột

sau điều trị bằng MeV và MuV

Biểu đồ 3.25. Kết quả tỉ lệ chuột còn sống sau điều trị bằng MuV, MeV

Một trong những tiêu chí đánh giá hiệu quả kháng khối u tế bào HT-29

trên chuột nude của MeV và MuV là thời gian sống của chuột. Sau thời gian

53 ngày theo dõi, thời gian sống trung bình của chuột nude ở các nhóm tiêm

MeV, MuV dài hơn so với nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (nhóm

MuV+MeV là 51 ± 2,9 ngày; nhóm MeV là 42,4 ± 9,2 ngày; nhóm MuV là

43,2 ± 8,3 ngày so với nhóm chứng là 30,6 ± 2,1 ngày với p(MuV-Control) =

0,001; p(MeV-Control) = 0,003; p(MeV+MuV-Control) = 0,0001) (biểu đồ 3.24). Tỉ lệ

chuột còn sống sau đợt điều trị ở các nhóm tiêm MeV, MuV nhiều hơn so với

nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (nhóm MeV+MuV là 100%; nhóm

MeV là 60%; nhóm MuV là 60% so với nhóm chứng là 0% với p(MuV-Control) =

0,005; p(MeV-Control) = 0,005; p(MeV+MuV-Control) = 0,00001) (biểu đồ 3.25).

Ở nhóm tiêm phối hợp MeV+MuV có thời gian sống trung bình (51 ±

2,9 ngày), dài hơn so với nhóm tiêm đơn MeV hay MuV (nhóm MeV là 42,4

± 9,2 ngày; nhóm MuV là 43,2 ± 8,3 ngày) có nghĩa thống kê (p(MeV-MeV+MuV)

= 0,017; p(MeV+MuV-MuV) = 0,017) (biểu đồ 3.24). Tỉ lệ chuột còn sống ở nhóm

tiêm MeV+MuV (100%) cao hơn nhóm điều trị đơn MeV, MuV (nhóm MeV:

60%; nhóm MuV: 60%) có ý nghĩa thống kê với p(MeV-MeV+MuV) = 0,037;

p(MeV+MuV-MuV) = 0,037 (biểu đồ 3.25).

Thời gian sống và tỉ lệ chuột còn sống ở 2 nhóm tiêm đơn MeV, MuV

khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (biểu đồ 3.24 và 3.25).

3.4.3. Tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột thiếu hụt miễn dịch ở

các nhóm nghiên cứu sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị

3.4.3.1. Phân lập tế bào từ lách chuột thiếu hụt miễn dịch sau điều trị

bằng virus vaccine sởi và quai bị

Chuột sau khi kết thúc quá trình theo dõi điều trị được phẫu tích lấy

lách (hình 3.11). Kết quả cho thấy lách chuột ở nhóm chứng và nhóm điều trị

bằng các OV không khác nhau về kích thước cũng như màu sắc.

Tế bào thu được từ lách chuột sau khi loại bỏ hồng cầu có dạng hình

cầu, kích thước 2-3µm (hình 3.11). Chúng tôi tiến hành khi kiểm tra tỉ lệ sống

của các tế bào này bằng thuốc nhuộm blue trypan. Kết quả cho thấy các tế bào

có tỉ lệ sống cao (>95%), đáp ứng yêu cần làm nghiệm pháp đếm tế bào qua

dòng chảy. Tế bào này được làm sạch bằng cách lọc qua màng lọc kích thước

70µm (màng Corning) trước khi tiến hành đếm tế bào dòng chảy.

Hình 3.11. Lách và tế bào lách chuột nude ở các nhóm nghiên cứu

3.4.3.2. Kết quả tỉ lệ các tế bào miễn dịch đo bằng phương pháp phân

tích tế bào dòng chảy

% CD11b+-Tế bào bạch cầu dòng tủy

A

% CD49b+-Tế bào NK

B

% CD11c+-Tế bào DC

C

% CD11c+-CD197+-Tế bào DC trưởng thành

D

Biểu đồ 3.26. Kết quả tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột nude

sau điều trị bằng MeV và MuV.

(A): Tỉ lệ tế bào bạch cầu dòng tủy; (B): Tỉ lệ tế bào NK

(C): Tỉ lệ tế bào DC; (D): Tỉ lệ tế bào DC trưởng thành

Kết quả đánh giá quần thể tế bào lách chuột cho thấy tỉ lệ tế bào bạch

cầu dòng tủy, tế bào NK, tế bào DC và tế bào DC trưởng thành ở nhóm điều

trị phối hợp virus MeV+MuV (lần lượt là 25,65%; 12,95%; 14,5%; 1,8%),

nhóm điều trị bằng MuV (lần lượt là 16,3%; 5,6%; 9,85%; 1,05%), nhóm điều

trị bằng MeV (lần lượt là 8,4%; 9,35%; 9,45%; 0,05%) cao hơn đáng kể so

với nhóm chứng (lần lượt là 3,27%; 1,23%; 1,6%; 0,0%) (biểu đồ 3.26). Đặc

biệt là kết quả cũng cho thấy tỉ lệ tế bào bạch cầu dòng tủy, tế bào NK, tế bào

DC và tế bào DC trưởng thành ở nhóm điều trị phối hợp MeV+MuV cao hơn

đáng kể so với các nhóm điều trị đơn MeV, MuV. Kết quả không có sự khác

biệt nhiều ở 2 nhóm điều trị đơn MeV, MuV (biểu đồ 3.26).

3.4.4. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 sau

điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị

Hình 3.12. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u HT-29 bình thường

Mũi tên trắng: hình ảnh cấu trúc tế bào HT-29 bình thường

Mũi tên trắng đứt đoạn: các vi nhung mao tế bào bào HT-29

Hình 3. 13. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị MeV, MuV

(A) Tế bào HT-29 bình thường; (B) Tế Bào HT-29 ngưng tụ nhiễm sắc thể;

(C), (D) Tế bào HT-29 phân mảnh nhiễm sắc thể; (E) Tế bào HT-29 xuất hiện

nhiều không bào; (F) Tế bào HT-29 hoại tử.

100

Để đánh giá về biến đổi hình thái tế bào HT-29 trải qua quá trình

apoptosis, chúng tôi sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua để quan sát hình

ảnh siêu cấu trúc tế bào u HT-29 được cấy ghép trên chuột nude sau khi điều

trị bằng MeV và MuV. Kết quả cho thấy hình ảnh tế bào HT-29 bình thường

nằm sát nhau có các vi nhung mao (hình 3.12), có các bào quan còn nguyên

vẹn, với hạt nhân và chromatin nhân bình thường, (mũi tên trắng ở hình 3.12

và 3.13a). Bên cạnh đó, chúng tôi quan sát thấy hình ảnh tế bào HT-29 đang

trong quá trình chết apoptosis bao gồm: tế bào co tròn lại, mất vi nhung mao,

phân mảnh hạt nhân, ngưng tụ chromatin, có các giọt lipid và sự biến đổi của

đường nét hạt nhân (hình 3.13b, 3.13c, 3.13d). Hình ảnh nhiều không bào

trong tế bào chất (hình 3.13e), có các tế bào hoại tử thứ phát (hình 3.13f).

101

CHƯƠNG 4

BÀN LUẬN

4.1. Tăng sinh các dòng tế bào Vero và tế bào ung thư đại tràng

người HT-29 in vitro

Trong quá trình nuôi cấy và tăng sinh tế bào in vitro, chúng tôi luôn

đảm bảo vô trùng, bổ xung thêm 1% kháng sinh (streptomycin và penicillin)

vào môi trường nuôi cấy, kiểm tra tế bào thường xuyên (1-2 ngày/lần) đánh

giá quá trình phát triển của tế bào và kịp thời phát hiện tế bào bị nhiễm vi sinh

vật. Đây là vấn đề quan trọng nhất khi nuôi cấy bất kỳ dòng tế bào nào trong

phòng thí nghiệm, một trong những nguồn lây nhiễm phổ biến nhất là

mycoplasma. Để giảm nguy cơ nhiễm, luôn luôn phải làm việc trong tủ cấy

(Box) hút vô trùng, đảm bảo tất cả các trang thiết bị và dung dịch tiếp xúc với

các tế bào đều vô trùng, sử dụng kỹ thuật thích hợp khi làm việc trong Box

hút vô trùng. Việc nuôi cấy và duy trì các tế bào trong môi trường có một

lượng kháng sinh thấp là cần thiết, phổ biến nhất là hỗn hợp

penicillin/streptomycin, giúp làm giảm nhiễm vi sinh vật nhất là mycoplasma.

Làm công tác khử trùng trước khi bắt đầu nuôi cấy tế bào mới đối với nguồn

tế bào từ môi trường âm sâu để tránh bị nhiễm các vi sinh vật. DMEM là một

môi trường nuôi cấy rất phổ biến, một môi trường được sử dụng thành công

nuôi cấy tế bào Vero và HT-29 [69], [70].

4.1.1. Tăng sinh dòng tế bào Vero

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng dòng tế bào Vero để tăng sinh

và chuẩn độ MeV và MuV. Tế bào Vero được nuôi cấy và duy trì trong môi

trường DMEM có thêm 10% FBS và 1% kháng sinh (penicillin và

streptomycin), lưu trong tủ ấm 370C, 5% CO2 (hình 3.2).

Tế bào Vero có nguồn gốc từ thận khỉ xanh Châu phi (tên khoa học là

Cercopithecus Aethiops) được 2 nhà khoa học Yasumura Y và Kawakita Y

102

(Đại học Chiba ở Chiba, Nhật Bản) tìm thấy năm 1962. Đây là một trong

những dòng tế bào có nguồn gốc từ động vật có vú được sử dụng phổ biến

trong nghiên cứu, nhất là các nghiên cứu về virus. Ngoài ra, tại Mỹ và nhiều

nước trên thế giới, tế bào Vero đã được cấp phép dùng để sản xuất các virus

sống như: rotavirus, đậu mùa sởi, quai bị…, Có một số dòng tế bào Vero có

sẵn trên thị trường (Vero, Vero 76, Vero E6), nhưng tất cả chúng đều xuất

phát từ cùng một nguồn gốc, do đó, việc sử dụng các dòng tế bào Vero là như

nhau [69]. Để lưu trữ lâu dài, các tế bào Vero được giữ trong nitơ lỏng hoặc ở

môi trường -80° C. Sau khi gieo tế bào vào đĩa nuôi cấy từ nguồn lưu trữ,

thường phải mất 2-3 lần gieo thì tế bào mới đạt được tốc độ tăng trưởng bình

thường. Đây là vấn đề rất quan trọng đối với việc lập kế hoạch sử dụng tế bào

trong quá trình nghiên cứu. Một điều quan trọng nữa cần lưu ý, tế bào Vero là

tế bào bám đáy để phát triển, do đó không thể phát triển được trong hệ thống

treo [69].

4.1.2. Nuôi cấy, tăng sinh dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29

Để đánh giá khả năng kháng ung thư đại trực tràng người của MeV,

MuV in vitro và khối u đại trực tràng người cấy ghép trên chuột nude, chúng

tôi lựa chọn dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29. Dòng tế bào này

được nuôi cấy và duy trì trong môi trường DMEM có thêm 10% FBS và 1%

kháng sinh (penicillin và streptomycin), lưu trong tủ ấm 370C và 5% CO2, 2

ngày thay môi trường nuôi cấy 1 lần, kiểm tra tế bào phát triển thường xuyên

1-2 ngày/lần, khoảng 6-7 ngày thu hoạch tế bào (nếu tế bào phát triển tốt)

(hình 3.1). Các bước gieo, duy trì và thu hoạch tế bào chúng tôi làm đúng quy

trình [70].

Tế bào ung thu đại tràng người HT29 được Fogh and Trempe phân lập

từ khối u nguyên phát của bệnh nhân nữ 44 tuổi ở Caucasian vào năm 1964.

Ban đầu, dòng tế bào HT-29 chỉ được sử dụng để nghiên cứu về các khía cạnh

khác nhau của sinh học ung thư người. Tuy nhiên, dòng tế bào này đã đáp ứng

103

được đầy đủ các đặc tính của tế bào ung thư đại tràng người, do đó, nó được

lựa chọn cho các nghiên cứu đánh giá về ung thư đại tràng người cả in vitro

và in vivo [70]. Hiện nay, tế bào HT-29 đang được sử dụng rộng rãi trong các

nghiên cứu đánh giá hiệu quả kháng ung thư của nhiều hợp chất, thuốc khác

nhau. Nó được sử dụng để đánh giá hiệu quả kháng ung thư đại tràng người

của nhiều virus ly giải tế bào ung thư in vitro và in vivo.

Liên quan đến sự biểu hiện của các thụ thể bề mặt tế bào, tế bào HT-29

đã được chứng minh là vẫn giữ nguyên các thụ cảm thể bề mặt như các tế bào

ở đại trực tràng bình thường. Một số thụ thể đối với peptide, chẳng hạn như

peptide đường ruột, hoặc thụ thể khác…., nói chung, các thụ thể này được tìm

thấy ở dòng tế bào này tương đương với các tế bào ở đại trực tràng bình

thường, tế bào HT-29 biểu hiện các các thụ cảm thể CD46 và Nectin-4 cao

[78]. Đây là một đặc trưng của tế bào HT-29, rất quan trọng cho việc đánh giá

hiệu quả ly giải của MeV và MuV đối với ung thư đại trực tràng người, một

yếu tố quan trọng nhất để các virus lây nhiễm đặc hiệu tế bào CRC.

Tuy nhiên, các tế bào này cũng có một số hạn chế: (1) chúng là các tế

bào ác tính với tỉ lệ tiêu thụ glucose cao nhưng lại giảm chuyển hóa glucose

in vitro; (2) chúng là các tế bào nguồn gốc đại trực tràng nhưng mang đặc

điểm như tế bào ở ống tiêu hóa in vitro; (3) chúng không thể giống hoàn toàn

với các tế bào từ đại trực tràng bình thường, vì khi nuôi cấy in vitro, chúng

biểu hiện enzyme hydrolase khác với tế bào ở đại trực tràng bình thường,

không phải tất cả các hydrolase đều có mặt trong tế bào HT-29 (không có

lactase và maltase-glucoamylase) và các đặc tính vận chuyển ion cũng khác.

Người ta cho rằng các tế bào này có các hydrolase và nồng độ tích lũy

glycogen gần giống với các tế bào ruột của thai nhi [70].

4.2. Tăng sing virus vaccine sởi, quai bị và Chuẩn độ TCID50

MeV, MuV được tăng sinh từ nguồn virus vaccine. Sau khi tăng sinh số

lượng tế bào Vero, chúng tôi nhiễm MeV, MuV vào tế bào Vero để tăng sinh

104

virus. Vào những năm 1940, những hiểu biết về virus học đã chứng minh để

giảm độc lực của một virus, người ta có thể bằng cách cấy truyền nhiều lần

qua các vật chủ. Đặc biệt, Fox J.P và cộng sự (1957) đã tạo ra vaccine virus

polio gây bệnh dại qua miệng bằng cách cấy truyền trên phôi gà hoặc chuột

[79]. Tuy nhiên, phương pháp này đã không hiệu quả và chuột không phải là

môi trường vô trùng. Vấn đề đặt ra là các tế bào có thể được nuôi cấy in vitro

và sử dụng như chất nền để tăng sinh virus vaccine. Các tác giả Enders J.F và

cộng sự (1949) đã chứng minh rất nhiều virus có thể phát triển ở các tế bào

nuôi cấy, bao gồm cả virus sởi và quai bị [80]. Sau đó, phương pháp này được

thực hiện rộng rãi để tăng sinh các virus vaccine. Nhiều virus vaccine đã được

tăng sinh và chọn lọc clone theo phương pháp này như: virus sởi, dại, rubella,

quai bị…Vấn đề cấy truyền ở tế bào nuôi cấy in vitro là cách hợp lý để tạo ra

các virus vaccine. Theo cách này, sự đột biến của virus vacine là tốt nhất,

virus thường mất hoặc giảm biểu hiện gen có vai trò lây nhiễm và gây bệnh ở

người. Do vậy, các chủng virus giảm độc lực này hầu như không gây bệnh trở

lại khi chủng ngừa. Môi trường thích hợp để duy trì chủng virus vaccine là ở

370 C (nhiệt độ bình thường trong tế bào người). Có nhiều dòng tế bào dùng

để tăng sinh tạo ra các chủng virus vaccine. Tuy nhiên, tế bào Vero là một

trong những dòng tế bào được sử dụng nhiều cho tăng sinh, sản xuất các virus

vaccine trong đó có virus sởi và quai bị [81].

Chuẩn độ virus là một bước quan trọng trong bất kỳ nghiên cứu nào có

liên qua đến virus, đặc biệt là các nghiên cứu khi cần có lượng virus chính xác

để sử dụng trong quy trình nghiên cứu về virus hay kiểm tra hiệu quả của một

loại thuốc có tiềm năng kháng virus. Cách tiếp cận phổ biến nhất để định

lượng virus là dựa vào chuẩn độ tìm điểm kết thúc 50%, trong đó 50% tế bào

hoặc động vật thí nghiệm bị nhiễm bệnh chết, đây cũng được gọi là liều

nhiễm 50% mô nuôi cấy (TCID50). Ngoài ra còn có các phương pháp khác

như trực tiếp đếm các mảng tổn thương gây ra bởi virus trong các tế bào bị

105

nhiễm bệnh, sử dụng phản ứng PCR, hoặc (RT)–PCR... Việc sử dụng từng

phương pháp có thể do các điều kiện hoàn cảnh cụ thể, tùy đặc điểm từng loại

virus và loại tế bào.

Nghiệm pháp chuẩn độ virus TCID50 theo truyền thống đã được Reed

L.J và cộng sự (1938) mô tả đầu tiên [82]. Đến năm 2001, LaBarre D.D và

cộng sự hoàn thiện và đưa ra công thức tính hoàn chỉnh cho TCID50 theo các

nồng độ pha loãng [83]. Kết quả của một chuẩn độ virus TCID50 thường dựa

trên các quan sát hiệu ứng bệnh lý tế bào dưới kính hiển vi thường, nên có các

lỗi chủ quan, bao gồm xác định sai hiệu ứng bệnh lý tế bào trong một nồng độ

pha loãng và /hoặc giữa các nồng độ pha loãng khác nhau của virus. Ngoài ra,

nghiệm pháp TCID50 thông thường không thể sử dụng hiệu ứng bệnh lý tế bào

như là một yếu tố định lượng virus và tỷ lệ thuận với độ pha loãng virus. Hơn

nữa, có một số tế bào nhiễm virus không hiển thị rõ ràng hiệu ứng bệnh lý tế

bào, dẫn đến tính hữu dụng dựa trên quan sát thông thường để đánh giá kết

quả chuẩn độ TCID50 bị hạn chế. Nhiều tác giả đã đề xuất một số giải pháp để

cải thiện độ tin cậy của phương pháp chuẩn độ TCID50 truyền thống, bao gồm

việc sử dụng các chất hiển thị màu để có thể tăng phát hiện hiệu ứng bệnh lý

tế bào dưới kính hiển vi quang học, giảm các lỗi chủ quan.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật chuẩn độ MeV và

MuV bằng nghiệm pháp TCID50 có sử dụng xanh methylen là chất hiện màu

để đánh giá hiệu ứng bệnh lý tế bào của virus. Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào

về việc sử dụng phương pháp dùng xanh methylen là chất hiện màu để chuẩn

độ MeV và MuV. Nhưng việc sử dụng xanh methylen để nhuộm và phát hiện

hiệu ứng bệnh lý tế bào của virus trong chuẩn độ TCID50 đã được công nhận

(https://www.youtube.com/watch?v=43VeCJbmM2A). Mục đích chính của

chúng tôi là thiết lập một kỹ thuật nhanh chóng và chính xác hơn để xác định

các chuẩn độ MeV và MuV. Sau thời gian nhiễm virus vào tế bào Vero ở các

giếng trên đĩa 96 giếng (thời gian này đã được xác định bằng kết quả thực

106

nghiệm của chúng tôi là 5-6 ngày), cho xanh methylen vào các giếng thì tế

bào sống (không nhiễm virus) vẫn còn bám đáy sẽ bắt màu xanh, các tế bào

nhiễm virus bị chết nổi lên trên không bắt màu xanh và bị rửa trôi đi sau khi

rửa nhẹ nhàng bằng nước sạch. Điều này đã làm cho việc đọc kết quả rễ ràng

và khách quan hơn. Tuy nhiên phương pháp này cũng có nhược điểm là quá

trình nhuộm xanh methylen vào tế bào không được để quá lâu, nếu để quá lâu

tế bào cũng sẽ bị chết bong ra (dung dịch xanh methylen gây độc tế bào) ảnh

hưởng đến độ chuẩn xác của nghiệm pháp. Một điểm chú ý là khi rửa các

giếng tế bào đã nhuộm xanh methylen bằng nước sạnh thì động tác phải nhẹ

nhàng tránh làm tế bào sống bong ra khỏi đáy và phải đọc kết quả ngay.

Để chuẩn độ TCID50 chính xác hơn, ở đây, chúng tôi sử dụng lặp lại 10

giếng ở mỗi nồng độ pha loãng virus, nhóm chứng chúng tôi tăng số giếng lên

đến 24 giếng (hình 2.2), như vậy, sẽ làm tăng độ chính xác của nghiệm pháp.

Khi so sánh màu (nhuộm bằng xanh methylen) giữa giếng nhiễm virus và

giếng chứng, điều này làm cho kết quả có độ chính xác và khách quan hơn.

Trong thực tế, nghiệm pháp chuẩn độ TCID50 chỉ dựa trên các quan sát hiệu

ứng bệnh lý tế bào bằng mắt thường dưới kính hiển vi quang học, do đó, tổng

sai số chủ quan do đánh giá sai hiệu ứng bệnh lý tế bào trong các giếng tăng

lên cùng với số lượng giếng thí nghiệm ở mỗi nồng độ pha loãng virus tăng

lên. Một vấn đề nữa, do một số tế bào ở giai đoạn đầu của nhiễm trùng, chúng

bị tổn thương co tròn lại, tách rời nhau và bong khỏi đáy đĩa nuôi cấy rất khó

quan sát bằng kính hiển vi thường, dẫn đến kết quả âm tính giả. Việc rửa nhẹ

nhàng bằng nước sạnh trong nghiệm pháp nhuộm xanh methylen có thể loại

bỏ các tế bào nhiễm virus khó quan sát bằng mắt thường dưới kính hiển vi

quang học, do đó, hạn chế được lỗi này. Hơn nữa, chúng tôi thực hiện việc so

sánh màu giữa giếng nhiễm virus và các giếng chứng sẽ khách quan hơn, kết

quả có độ chính xác hơn (hình 3.4). Như vậy, kết quả chuẩn độ virus TCID50

của chúng tôi trong nghiên cứu này có độ chuẩn xác và khách quan. Kết quả

107

chuẩn độ virus bằng cách tính TCID50 này sẽ cho thông tin chính xác số lượng

virus cần sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu.

Sophie S.J và cộng sự (2013) đã so sánh nghiệm pháp chuẩn độ virus

TCID50 với nghiệm pháp mảng, ông đã cho thấy có một mối tương quan giữa

kết quả nghiệm pháp mảng và TCID50, TCID50 có hiệu suất cao hơn gấp mười

lần so với giá trị nghiệm pháp mảng trong bất kể điều kiện thí nghiệm nào,

nghiệm pháp TCID50 mang lại hiệu giá cao hơn so với xét nghiệm mảng.

Nghiệm pháp TCID50 cần thời gian một tuần để hoàn thành, trong khi các

nghiệm pháp mảng bám phải mất đến hai tuần để hoàn thành [84]. Thử

nghiệm TCID50 được tiến hành trên đĩa 96 giếng nên có thể đánh giá được

cùng một lúc chín nồng độ pha loãng của stock virus. Nghiệm pháp TCID50

đã được chứng minh là có tiêu chuẩn hóa hơn, vì kết quả mang tính định

lượng và cho kết quả khách quan hơn. Tuy nhiên, nghiệm pháp này có thể bị

ảnh hưởng bởi số lượng tế bào được sử dụng, độ pha loãng của virus và chất

lượng nhuộm màu phát hiện hiệu ứng gây độc tế bào của virus.

4.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại tràng

người HT-29 in vitro

4.3.1. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp tế bào ung thư đại

tràng người HT-29 bằng cách tạo hợp bào in vitro

MuV và MeV lây nhiễm đặc hiệu tế bào CRC, Các thụ cảm thể đặc

hiệu của MeV và MuV biểu hiện cao ở tế bào CRC. MuV chủng Urabe sử

dụng các sialoglycoprotein có chứa acid sialic như là thụ cảm thể đặc hiệu

trên bề mặt tế bào. Sự hiện diện phong phú của các sialoglycoprotein trên bề

mặt tế bào ung thư đại trực tràng làm tăng sự liên kết ưu tiên của virus với tế

bào này. MeV chủng Edmonton sử dụng các thụ cảm thể CD46, đó là một yếu

tố điều hòa hoạt hóa bổ thể được biểu hiện phổ biến ở tất cả các tế bào có

nhân ở người, nhưng thường biểu hiện quá mức ở các tế bào CRC. Nectin-4

gần đây cũng được xác định là thụ cảm thể đặc hiệu của MeV [43]. Nó là một

108

thành viên các thụ cảm thể bám dính của các liên họ globulin miễn dịch nằm

ở vị trí mà các tế bào biểu mô dính với nhau. Bên cạch đó chu trình nhân lên

của virus có vỏ bọc như MuV, MeV đòi hỏi phải có các protease phân cắt

glycoprotein của virus tạo điều kiện để virus xâm nhập vào tế bào có hiệu quả

[85]. Các protease thích hợp với virus được biểu hiện nhiều ở các tế bào CRC.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã cho thấy chủng virus vaccine

MeV và MuV gây độc tế bào HT-29 có hiệu quả và gây ra một hiệu ứng bệnh

lý tế bào rõ ràng ở thời điểm nhiễm virus 2-5 ngày in vitro, rõ nhất là ở thời

điểm ngày thứ 4 và 5 sau nhiễm (hình 3.5). Hiệu ứng gây độc tế bào của MeV

và MuV bắt đầu sau khi protein bám dính H và HN tương tác với thụ cảm thể

của nó trên các tế bào đích. Sự tương tác này thúc đẩy thay đổi hình dạng

trong protein hợp bào của virus, điều này dẫn đến hợp nhất màng tế bào và

màng virus, làm cho virus đi vào trong tế bào. Protein H và HN của virus

tương tác với các thụ cảm thể trên màng các tế bào lân cận và kích hoạt quá

trình hợp màng giữa tế bào nhiễm virus và các tế bào xung quanh. Khi biểu

hiện của protein H, HN và protein hợp màng tăng lên, các tế bào nhiễm virus

sẽ hợp màng với các tế bào u xung quanh. Sự lan truyền hợp màng giữa các tế

bào nhiễm virus và tế bào u lân cận không nhiễm virus hình thành một tế bào

khổng lồ gọi là hợp bào, hợp bào thường chết sau vài ngày [45], [86].

Kết quả tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV đã cho thấy quá trình hình

thành hợp bào rõ, đây là đặc trưng về khả năng ly giải tế bào u của MeV và

MuV (hình 3.5). Hợp bào tạo điều kiện cho virus lây lan từ tế bào này sang tế

bào khác rất nhanh mà không cần giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào. Ngoài

ra, khi các tế bào nhiễm virus chết, chúng giải phóng các hạt virus tự do, các

hạt virus này lại nhiễm sang các tế bào lân cận làm tăng nhanh khả năng lây

nhiễm và ly giải tế vào u.

109

4.3.2. Đánh giá khả năng ly giải tế bào HT-29 của virus vaccine sởi

và quai bị bằng nghiệm pháp 3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) - 2,5 diphenyl

tetrazolium bromide

Đã từ lâu phương pháp đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng nghiệm pháp

MTT đã được nhiều nghiên cứu sử dụng để đánh giá hiệu quả của một tác

nhân gây chết tế bào. Đặc biệt trong thời gian gần đây, nghiêm pháp MTT

được dùng nhiều trong các nghiên cứu virus ly giải tế bào ung thư in vitro, nó

được xem như là một tiêu chí đánh giá virus có khả năng gây chết tế bào u in

vitro. Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi cũng sử dụng nghiệm pháp MTT

đánh giá khả năng ức chết tế bào HT-29 in vitro của virus vaccine sởi và quai

bị ở các thời điểm nhiễm ngày thứ 3, 4 và 5. Để tăng thêm độ tin cậy của

nghiệm pháp, chúng tôi đã tăng thêm dải nồng độ pha loãng của virus từ 10-2

đến 10-8.

Cũng có nhiều tác giả sử dụng nghiệm pháp MTT trong nghiên cứu

đánh giá khả năng ly giải tế bào ung thư của virus vaccine, tuy nhiên, thời

điểm lựa chọn cho nghiên cứu là các thời điểm ngày thứ nhất, thứ 2 và thứ 3

sau nhiễm như Zhao D và cộng sự (2013), nghiên cứu virus vaccine sởi kháng

ung thư phổi in vitro, kết quả nghiệm pháp MTT đã cho thấy MeV gây chết tế

bào A549 và LLC (các tế bào ung thư phổi) lần lượt là 60% và 62%, trong khi

đó MeV gây chết tế bào 293T chỉ là 31% [87]. Yan Y và cộng sự (2015), đã

sử dụng nghiệm pháp MTT đánh giá khả năng gây chết tế bào A549 của virus

tái tổ hợp rL-RVG và NDV hoang dại, kết quả cho thấy tỉ lệ ức chế trong

nhóm nhiễm rL-RVG cao hơn đáng kể so với nhóm nhiễm NDV hoang dại và

3 đến 10-6) [88]. Salimi V và cộng sự (2013) nghiên cứu hiệu quả ly giải tế

tỷ lệ ức chế tăng theo thời gian sau nhiễm 24, 48, 72 giờ (nồng độ virus từ 10-

bào ung thư da người dòng A431 của virus Respiratory Syncytial. Tác giả đã

sử dụng nghiệm pháp MTT đánh giá tỉ lệ sống của dòng tế bào ung thư da

người. Kết quả nghiên cứu cho thấy virus ly giải dòng tế bào A431 phụ thuộc

110

cả về nồng độ virus và thời gian lây nhiễm. Nhiễm virus (nồng độ 1.MOI) ở

các thời điểm nghiên cứu là 24, 36 và 48 giờ cho thấy tỉ lệ sống tế bào A431

giảm đáng kể. Virus Respiratory Syncytial đã ức chế sự phát triển dòng tế bào

A431 với 58.25% tế bào chết sau 48 giờ nhiễm (p=0,0001) và hầu như không

ức chế sự phát triển của tế bào này ở thời điểm nhiễm 24 giờ và 36 giờ. Ở liều

virus là 3.MOI thì tỉ lệ tế bào A431 chết là 32% (p=0,0005) sau 36 nhiễm

virus và 73.5% (p=0,0001) và 48 giờ nhiễm virus [89]. Okunaga S và cộng sự

(2015), nghiên cứu virus Herpes Simplex ly giải tế bào ung thư biểu mô vảy

dưới hỗ trợ bằng siêu âm. Các tác giả đã sử dụng nghiệm pháp MTT chứng

minh hiệu quả ức chế tế bào ung thư biểu mô vảy phát triển in vitro của

Herpes Simplex dưới hỗ trợ bằng sóng siêu âm [90].

Như vậy, nghiệm pháp MTT có thể coi đó là một trong những cách tiếp

cận có giá trị trong nghiên cứu virus ly giải tế bào ung thư in vitro. Điều đó

cho thấy chúng tôi sử dụng nghiệm pháp MTT trong nghiên cứu của mình là

có cơ sở và hoàn toàn đúng đắn. Kết quả đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng

nghiệm pháp MTT của chúng tôi đã khẳng định khả năng ly giải tế bào HT-29

in vitro của MeV và MuV. Tỉ lệ tế bào sống ở các nhóm nhiễm virus thấp hơn

có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng, tỉ lệ tế bào sống ở các nhóm

nhiễm virus tăng tuyến tính với nồng độ virus từ 10-2 đến 10-8, điều này cho

thấy nồng độ virus càng thấp thì khả năng ly giải tế bào u càng ít. Tuy nhiên,

ở nồng độ pha loãng 10-8, MeV và MuV vẫn cho thấy hiệu quả ly giải tế bào u

so với nhóm chứng, tuy nhiên, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05),

điều này có ý quan trọng đối với việc đánh giá nồng độ MeV và MuV có hiệu

quả ly giải tế bào u HT-29 in vitro. (biểu đồ 3.1; 3.2; 3.3).

Kết quả nghiệm pháp MTT của chúng tôi cũng cho thấy khả năng ly

giải tế bào HT-29 của MeV và MuV tăng theo thời gian nhiễm virus, ngày thứ

3 thấp hơn ngày thứ 4 và 5, ở nồng độ pha loãng 10-2 đến 10-6 sự khác biệt

này là có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Bên cạnh đó sự khác biệt tỉ lệ tế bào

111

sống ở ngày thứ 4 và thứ 5 nhiễm OV là không nhiều (không có ý nghĩa thống

kê (p>0,05). Như vậy, có thể nói MeV và MuV có khả năng ly giải tế bào HT-

29 tăng theo thời gian nhiễm virus, thời gian ly giải tế bào HT-29 tốt nhất vào

ngày thứ 4 và 5 sau nhiễm. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả MeV và

MuV ly giải tế bào HT-29 trực tiếp tạo hợp bào tốt nhất vào ngày thứ 4 và 5

sau nhiễm (mục 3.3.1 phần kết quả nghiên cứu). Bên cạnh đó, kết quả này

cũng chỉ ra ở nhiều nồng độ pha loãng của virus tỉ lệ tế bào sống ở ngày thứ 4

lại thấp hơn ngày thứ 5. Cũng có thể là do ngoài việc tế bào chết do OV, tế

bào còn có thể chết do thiểu dưỡng (không thay được môi trường nuôi cấy).

So sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây, nhiều tác giả tiến hành nghiệm

pháp MTT vào các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau nhiễm virus với

nồng độ lây nhiễm là 1.MOI. Kết quả của chúng tôi đã cho thấy hiệu quả ly

giải tế bào HT29 của MeV và MuV kéo dài hơn và cao nhất vào ngày thứ 4

và 5 sau nhiễm. Kết quả này còn gợi ý rằng, hiệu quả ly giải tế bào HT-29 in

vitro của MeV và MuV có cả ở những nồng độ virus thấp hơn 1.MOI, nhưng

phụ thuộc vào chuẩn độ TCID50 của virus.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh nhiễm phối hợp MeV

và MuV cho hiệu quả ly giải tế bào HT-29 in vitro tốt hơn (tế bào sống giảm

có ý nghĩa thống kê p<0,05) so với sử dụng đơn virus ở cả 3 thời điểm nghiên

cứu và ở các nồng độ hòa loãng virus là: 10-2, 10-4 và 10-5. Đây có lẽ là

nghiệm pháp MTT đầu tiên về đánh giá hiệu quả phối hợp MeV và MuV trên

dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29. Cũng đã có tác giả đánh giá hiệu

quả kháng tế bào ung thư của phối hợp MeV và MuV trên dòng tế bào khác

như Zhang L.F và cộng sự (2014), đánh giá hiệu quả phối hợp MeV và MuV

kháng tế bào ung thư máu người đặc biệt là dòng tế bào ung thư bạch cấu cấp,

kết quả phối hợp MeV và MuV kháng tế bào ung thư tốt hơn nhiều so với

dùng đơn virus, tỉ lệ tế bào sống in vitro ở nhóm phối hợp thấp hơn có ý nghĩa

thống kê (p<0,05) so với nhóm đơn virus ở các thời điểm từ ngày thứ 1 đến

112

ngày thứ 6 nhiễm virus [73]. Điều này đã chứng minh một vấn đề phối hợp

MeV, MuV cho hiệu quả ly giải tế bào ung thư tốt hơn nhiều so với dùng đơn

virus ở nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Chúng tôi có thể nhận định rằng

việc phối hợp MeV và MuV là một phát hiện mới cũng là một định hướng tốt,

nhiều hứa hẹn về nghiên cứu điều trị CRC.

4.3.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào HT-29 thông qua

kích hoạt con đường tế bào chết theo chương trình in vitro

4.3.3.1. Hình thái tế bào HT-29 chết theo chương trình dưới kính hiển

vi quang học

Apoptosis, một quá trình tế bào chết theo chương trình, đây là cơ chế

cần thiết cho phát triển bình thường của cơ quan trong cơ thể. Hiện tượng

apoptosis lần đầu tiên được mô tả bởi nhà khoa học Đức Vogt K.C (1842).

Đến năm 1972, thuật ngữ apoptosis lần đầu tiên được sử dụng bởi nhóm

nghiên cứu Kerr J.F.R và cộng sự để mô tả đặc điểm hình thái cụ thể của tế

bào chết ở mô [91]. Giai đoạn tiếp theo là nghiên cứu các vấn đề thay đổi

hình thái tế bào chết apoptosis ở mức độ sinh hóa. Người ta đã chứng minh

được quá trình apoptosis đi kèm với màng tế bào nhăn lại, phân mảnh DNA,

canxi bào tương tăng lên và hình thành vật thể apoptosis. Trong thời gian này,

kính hiển vi thường và kính hiển vi điện tử đóng một vai trò quan trọng trong

nghiên cứu apoptosis. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học bắt đầu

nghiên cứu cơ chế phân tử của quá trình apoptosis và ứng dụng nó vào điều trị

lâm sàng. Người ta đã tìm thấy một số protein chính trong quá trình apoptosis,

chẳng hạn như gia đình protein Bcl-2, caspase-3, caspase-8, caspase-9, Bid,

Bax... Đầu tiên, quá trình apoptosis tập trung vào vai trò của caspase, điển

hình là gia đình cysteine protease, nhưng khi sử dụng các chất ức chế caspase

để ngăn chặn con đường apoptosis thì người ta thấy quá trình apoptosis vẫn

xảy ra. Vì vậy, con đường apoptosis khác độc lập caspase đã được tìm thấy.

113

Apoptosis là cơ chế bảo vệ cơ thể khỏi các yếu tố lạ, các độc tố bên

ngoài hoặc bên trong giúp các sinh vật tồn tại. Hiện nay, apoptosis được phân

loại thành type I, type II, type III: type I là apoptosis cổ điển, là loại apoptosis

phụ thuộc caspase; type II là loại apoptosis có các đặc điểm hình thái học

như: sự xuất hiện không bào; type III là loại apoptosis xảy ra khi có sự ngưng

tụ và phân mảnh chất nhiễm sắc. Loại II và loại III là apoptosis độc lập

caspase. Ví dụ, yếu tố AIF gây ra apoptosis, một flavoprotein liên kết ty thể,

có thể được giải phóng từ ty thể rồi chuyển đến hạt nhân và gây ra phân đoạn

DNA tạo ra nhiều đoạn có phân tử trọng lượng cao và ngưng tụ chromatin

trong tế bào, loại apoptosis này là loại độc lập với caspase.

Apoptosis đã được nghiên cứu rất nhiều, trong tế bào, con đường này

đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo phôi và bệnh lý. Đối với ung thư,

thúc đẩy con đường tế bào chết apoptosis đã được coi là một chiến lược phát

triển thuốc chống ung thư. Về vấn đề này, các nghiên cứu về tác dụng chống

ung thư của MeV và MuV đã cho thấy các virus vaccine này có khả năng

ngăn chặn sự phát triển tế bào ung thư thông qua kích hoạt con đường chết tế

bào apoptosis mà không gây độc cho tế bào bình thường. Các phát hiện của

chúng tôi trong nghiên cứu này cũng đã chứng minh MeV và MuV tạo ra hiệu

ứng bệnh lý tế bào mạnh đối với tế bào HT-29 và tế bào chết apoptosis. Kết

quả cho thấy các virus này gây ra hiệu ứng bệnh lý tế bào thông qua cảm ứng

con đường apoptosis.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi quan sát tế bào HT-29 nhiễm MeV

và MuV ở ngày thứ 3, 4 và 5 (hình 3.6a và 3.6b), tế bào HT-29 chết apoptosis

có hình ảnh co tròn lại tách rởi nhau ra, nổi lên khắp vi trường, nhân của tế

bào kết đặc lại. Ở hình 3.6c và 3.6d có độ phóng đại lớn hơn, chúng ta có thể

nhìn rõ nhân tế bào kết đặc lại nằm lệch về một góc tế bào, phân mảnh hạt

nhân, có những tế bào hoại tử thứ phát, tế bào đang hòa màng tạo hợp bào. Có

thể nói đây là những đặc trưng hình thái của tế bào chết apoptosis. Điều này

114

chứng minh thêm vấn đề là các tế bào HT-29 nhiễm virus sẽ đi vào quá trình

apoptosis sau đó hòa màng tạo hợp bào và tế bào chết hoại tử thứ phát.

Khác với nhiều loại virus đã được nghiên cứu trước đây, hiệu ứng gây

độc tế bào của MeV và MuV in vitro với đặc trưng là tạo ra hợp bào (tế bào

khổng lồ đa nhân). Các tế bào trong cơ thể dễ bị nhiễm virus sởi và quai bị là

các tế bào đơn nhân, các tế bào nội mô và biểu mô. Để xác định vấn đề MeV

và MuV gây chết tế bào và mối liên quan giữa sự hình thành hợp bào với chết

tế bào, các nhà nghiên cứu đã đi sâu nghiên cứu sự tương tác MeV và MuV

với các tế bào mono và tế bào biểu mô in vitro. Mặc dù cơ chế MeV và MuV

kích hoạt con đường chết apoptosis trong tế bào chưa rõ ràng, nhưng các

nghiên cứu này cho thấy các virus gây ra quá trình apoptosis ở các tế bào bị

nhiễm và nhân của các tế bào này được chuyển đến hợp bào, sau đó là quá

trình phân tách DNA của nhiễm sắc thể và tế bào bị hoại tử thứ phát. Về cơ

bản, các đặc điểm hình thái của tế bào chết apoptosis dễ dàng phân biệt với

các tế bào bình thường và hoại tử, những đặc điểm hình thái này vẫn là một

công cụ quan trọng trong nghiên cứu tế bào chết apoptosis. Những đặc điểm

hình thái này bao gồm co tròn và co rút tế bào, màng tế bào, ngưng tụ

chromatin, phân mảnh hạt nhân và hình thành vật thể apoptosis. Do đó, cách

tiếp cận mô tả các đặc điểm hình thái học và phát hiện sự tồn tại của tế bào

chết apoptosis được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu, nhất là các nghiên

cứu về hiệu quả liệu pháp virus điều trị ung thư. Năm 1958, xét nghiệm mô

khám nghiệm tử thi những bệnh nhân tử vong do sởi, người ta đã thấy tế bào

nhiễm virus có nhiễm sắc thể ngưng tụ ngoại vi, co lại và có hình ảnh kết tụ

chất nhiễm sắc. Ngoài ra, Nichols W.W và cộng sự (1965) đã nghiên cứu tổn

thương nhiễm sắc thể tế bào nhiễm virus sởi in vitro và kết quả là ngưng tụ

chất nhiễm sắc trong quá trình tạo hợp bào [92]. Robbins S.J (1983) đã mô tả

tế bào nhiễm virus sởi có hình ảnh phồng lên, nhân bị xâm lấn, có tương quan

115

giữa thoái hóa tế bào và nhân bị xâm lấn. Hình ảnh tế bào nhân bị xâm lấn

đặc trưng cho tế bào chết do nhiễm MeV [93].

Kính hiển vi thường có thể hỗ trợ trong việc xác định những thay đổi

về hình thái khác nhau của tế bào xảy ra trong quá trình apoptosis. Trong giai

đoạn sớm của quá trình apoptosis, tế bào co tròn và kết đặc nhân tế bào có thể

nhìn thấy bằng kính hiển vi quang học. Một số tác giả tiến hành nhuộm tế bào

bằng haematoxylin hay eosin để quan sát dưới kính hiển vi quang học, nhân tế

bào chết apoptosis có hình ảnh như một vòng hoặc khối hình bầu dục với tế

bào chất bắt màu axit đậm và dày đặc, có nhiều mảnh vỡ của nhiễm sắc thể

bắt màu tím. Cùng với tế bào co tròn kích thước tế bào nhỏ lại, tế bào chất cô

đặc và các bào quan dồn đống. Các mảnh vỡ tế bào teo lại, các bào quan tự

tiêu hủy và được thực bào bởi các tế bào liền kề hoặc thoái biến rồi bị đẩy ra

khỏi tế bào [94]. Kerr J.F.R và cộng sự (1972) đã quan sát thấy tế bào thay

đổi hình thái khi trải qua quá trình apoptosis với những thay đổi như: tế bào

co tròn, có kích thước nhỏ hơn, tế bào chất dày đặc và các bào quan dồn đống

lại. Kết đặc nhân tế bào là kết quả của sự ngưng tụ nhiễm sắc thể và đây là

tính năng đặc trưng nhất của quá trình apoptosis [91]. Ziegler U and cộng sự

(2004) cũng sử dụng kính hiển vi quang học quan sát tế bào trải qua quá trình

apoptosis bao gồm các biến đổi: sự ngưng tụ chất nhiễm sắc và phân mảnh hạt

nhân. Ngay khi bắt đầu quá trình apoptosis, các tế bào co tròn lại tách rời

nhau ra, màng tế bào nhô ra sau đó dần đần tách khỏi hình thành các vật thể

apoptosis có thể quan sát thấy dưới kính hiển vi thường. Sự ngưng tụ chất

nhiễm sắc bắt đầu từ bên trong dọc theo màng nhân, tạo thành một cấu trúc

lưỡi liềm hoặc dạng vòng. Ở giai đoạn sau của quá trình apoptosis, hạt nhân

tiếp tục ngưng tụ, cuối cùng nó vỡ ra vào bên trong tế bào chất trong khi

màng tế bào vẫn còn nguyên vẹn [95].

Quá trình apoptosis được kích hoạt theo nhiều con đường với nhiều tín

hiệu và được điều chỉnh bởi các phân tử phức tạp từ nội tại cũng như ngoại lai

116

tế bào. Quá trình này được kiểm soát bởi các con đường tín hiệu tế bào rất đa

dạng và liên quan đến việc điều chỉnh tế bào chết hoặc sống. Dựa vào hoạt

động của caspase, người ta chia ra hai con đường apoptosis lớn là con đường

phụ thuộc và không phụ thuộc vào caspase. Ti thể cũng như các bào quan

khác có mối liên hệ chéo trong quá trình apoptosis, chúng có thể là yếu tố kết

nối các con đường apoptosis khác nhau.

Apoptosis phụ thuộc vào caspase là con đường chết tế bào theo chương

trình cổ điển. Các capase-8, caspase-9, caspase-12, caspase-7, caspase-3

thường tham gia vào loại apoptosis này, có các thụ thể tham gia vào loại con

đường apoptosis này như: thụ thể TNF-alpha, thụ thể FasL, thụ thể TLR, thụ

thể chết…. Một số kênh ion cũng có thể tham gia vào quá trình apoptosis này,

điển hình là kênh canxi, vì nồng độ canxi trong tế bào chất đóng một vai trò

quan trọng trong điều chỉnh truyền tín hiệu và tham gia vào sự phát triển tế

bào và chết tế bào. Số phận tế bào có thể được kiểm soát bằng cách mở hoặc

đóng kênh canxi. TNF-alpha tạo ra con đường apoptosis phụ thuộc caspase-8,

nhờ có thụ thể TNF-alpha caspase-8 được kích hoạt, sau đó kích hoạt protein

Bcl-2. Kích hoạt gia đình protein Bcl-2 có thể tạo ra thay đổi màng ty thể và

kích thích giải phóng cytochrome C. Cytochrome C là phân tử tín hiệu tiền

apoptosis, chúng có thể kích hoạt phản ứng của một loạt caspase và gây ra

apoptosis. Một số tia cực tím hoặc tia X có thể làm cho quá trình khử cực ty

thể và tính thấm màng tế bào thay đổi, sau đó, giải phóng cytochorme C, kích

hoạt caspase-9, caspase-3, Cuối cùng các caspase phân cắt các chất nền và tế

bào đi vào con đường apoptosis.

Một số mầm bệnh có thể kích hoạt con đường apoptosis phụ thuộc

caspase-8. Các tác nhân gây bệnh ngoại lai có thể được nhận diện bởi thụ thể

FasL, sau đó, chiêu mộ protein có miền chết liên quan đến thụ cảm thể Fas

(có tên là FADD) và caspase-8, ví dụ, nhiễm herpervirus gây bệnh nội bào có

thể gây ra apoptosis phụ thuộc caspase-8. Bên cạnh apoptosis phụ thuộc

117

caspase-8, một số tác nhân gây bệnh có thể kích hoạt con đường apoptosis

phụ thuộc caspase khác. Ví dụ, Mycobacterium tuberculosis có thể gây chết tế

bào theo chương trình ở đại thực bào, con đường apoptosis này phụ thuộc

caspase-12. Vi khuẩn lao kích thích tạo ra nitric oxide và các gốc oxy hoạt

động gây ra apoptosis [96]. Quá trình apoptosis cũng có thể là cơ chế loại trừ

các mầm bệnh như vi khuẩn hay virus. Nghiên cứu mới nhất của Prasad A và

cộng sự (2012) cho thấy sự sao chép herpesvirus trong tế bào sarcoma có thể

kích hoạt quá trình apoptosis theo cách phụ thuộc caspase [97]. Ngoài vi

khuẩn và virus, nhiều nghiên cứu đã chứng minh các đoạn RNA và DNA

cũng có thể kích hoạt quá trình apoptosis phụ thuộc caspase, chẳng hạn như

phân đoạn ARN được tạo ra bởi bệnh lao có thể kích hoạt apoptosis phụ thuộc

caspase-8 [98]. Trong cơ thể, DNA bị tổn thương có thể kích hoạt quá trình

apoptosis thông qua việc tăng cường các gốc oxy hoạt động và thay đổi tính

thấm màng ty thể; nhiều protein hoặc peptide cũng có thể tạo ra quá trình

apoptosis, độc tính của amyloid-peptide có thể gây ra sự xáo trộn nồng độ

canxi nội bào, sau đó kích hoạt calpain, calpain, kích hoạt caspase-12 để khử

hoạt tính Bcl -Xl, đây là một quá trình apoptosis phụ thuộc caspase-12 [99].

4.3.3.2. Đánh giá tỉ lệ tế bào apoptosis và tế bào hoạt tử của dòng tế

bào ung thư đại tràng HT-29 bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy

Apoptosis là một quá trình sinh lý quan trọng để bảo vệ cơ thể chống

nhiễm trùng, các cytokine như yếu tố hoại tử khối u và interferon được tế bào

sản xuất ra chống lại quá trình nhiễm virus, các chất này có thể kích hoạt con

đường dẫn đến apoptosis [100]. Con đường apoptosis cung cấp một cơ hội

cho các sinh vật có khả năng đào thải virus bằng cách loại bỏ các tế bào đã bị

nhiễm. Tuy nhiên, mỗi loại virus khác nhau lại có các chiến lược khác nhau,

chúng có thể chống lại con đường apoptosis để kéo dài sự nhiễm trùng ở tế

bào vật chủ hay kích thích con đường apoptosis để tăng khả năng lây lan giữa

các tế bào, ví dụ, virus cowpox có một protein virus là CrmA, ngăn chặn quá

118

trình apoptosis bằng cách ức chế caspase-1 và caspase-3, virus Herpes

simplex 1 có thể ngăn chặn quá trình apoptosis ngoại sinh trong quá trình

nhiễm trùng. Apoptosis đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học

paramyxovirus. Nhiều thành viên của Paramyxoviridae đã được chứng minh

gây ra apoptosis. MeV và MuV kích thích con đường apoptosis trong các tế

bào nó lây nhiễm, apoptosis tạo điều kiện giải phóng các hạt virus từ các tế

bào bị nhiễm bệnh làm tăng khả năng lây lan sang các tế bào lân cận. Người

ta cũng chưa biết rõ ràng cơ chế kích hoạt con đường tế bào chết apoptosis

của MeV và MuV, Bhaskar A và cộng sự (2011) đã chứng minh rằng

nucleoprotein của virus sởi gây chết tế bào apoptosis phụ thuộc vào các gốc

oxy hóa và kích hoạt caspase-3. Nucleoprotein của virus sởi biểu hiện nhiều

trong quá trình virus xâm nhập vào trong tế bào và chúng mang theo cả virion

của virus. Trong quá trình nhân lên của vius sởi, chất này tiếp xúc và tương

tác với nhiều protein nội bào, ảnh hưởng chức năng nội bào và tạo ra quá trình

apoptosis, trực tiếp tối ưu hóa sự lây lan của virus. Tác giả nhận thấy có sự

thay đổi về mức độ biểu hiện của nhiều protein liên quan đến điều chỉnh các

gốc oxy hóa và quá trình apoptosis bao gồm Cofilin, eIF5A, GST, GAPDH,

PRDXs, Hsp70, PARK7, PHB và PA2G4... Các protein này điều chỉnh actin

nội bào và kích hoạt quá trình apoptosis [101].

Trái ngược với các tế bào bình thường, trong tế bào ung thư có sự mất

cân bằng giữa phân chia tế bào và chết tế bào. Vấn đề có thể liên qua đến ức

chế quá trình apoptosis trong tế bào ung thư, ví dụ: suy giảm P53, một gen ức

chế khối u, dẫn đến giảm quá trình apoptosis, làm tăng sinh tế bào quá mức và

phát triển khối u. Do đó, ức chế quá trình apoptosis bất kể bằng cơ chế nào

cũng đều có liên quan đến cơ chế bệnh sinh ung thư. Ngày nay, apoptosis

đóng một vai trò quan trọng trong cả cơ chế hình thành ung thư và điều trị

ung thư. Apoptosis đã được xác định là một quá trình chết tế bào rất quan

trọng đối với nghiên cứu về điều trị và kiểm soát ung thư bao gồm cả CRC.

119

Bất thường về quá trình apoptosis đóng góp về cả sinh bệnh học CRC cũng

như sức đề kháng của nó đối với các phương pháp điều trị ung thư như hóa trị

liệu và xạ trị....

Chúng tôi đã sử dụng phương pháp đếm tế bào qua dòng chảy (flow

cytometry) để đánh giá tỉ lệ tế bào HT-29 chết apoptosis và hoại tử. Kết quả

đã chứng minh MeV và MuV có khả năng ly giải tế bào HT-29 in vitro qua

trung gian kích hoạt con đường tế bào chết apoptosis ở tất cả các thời điểm

nghiên cứu (từ ngày thứ 3 tăng dần đến ngày thứ 4, 5), cả ở giai đoạn sớm và

muộn của quá trình apoptosis. Các virus vaccine này kích hoạt mạnh con

đường apoptosis trong tế bào CRC với kết quả làm tăng tỉ lệ tế bào chết

apoptosis cả giai đoạn sớm và muộn cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm

chứng. Đã có nhiều nghiên cứu trước đây chứng minh MeV và MuV gây ra tế

bào chết apoptosis ở nhiều loại tế bào ung thư khác nhau như: MeV có thể tạo

ra apoptosis trong các tế bào u [102]; MeV đã được chứng minh là làm tăng tế

bào chết apoptosis ở tế bào ung thư buồng trứng [103]; MuV gây ra apoptosis

ở tế bào ung thư biểu mô thận [104]; MuV sử dụng protein V gây thoái biến

STAT3 và ức chế v-Src hay IL-6 làm tăng quá trình chết tế bào apoptosis

[105]. Kết quả của chúng tôi tương đồng với kết quả của Boisgerault N và

cộng sự (2013), nghiên cứu này đánh giá tác dụng ly giải tế bào u của virus

quai bị trên các dòng tế bào ung thư người trong đó có cả dòng tế bào HT-29

[106]. Tuy nhiên, nghiên cứu này khác nghiên cứu của chúng tôi về thời điểm

đánh giá kết quả (ngày thứ 2, 3 và 4 sau nhiễm virus). Điều này càng chứng

minh vấn đề là tác dụng ly giải dòng tế bào HT-29 của MeV và MuV bắt đầu

vào ngày thứ 2 tăng dần đến ngày thứ 5 nhiễm virus, phù hợp với kết quả

quan sát tế bào HT-29 nhiễm virus in vitro của chúng tôi (đã đề cập ở mục

3.3.1 phần kết quả nghiên cứu). Các nghiên cứu khác như nghiên cứu của

Zhao D và cộng sự cũng đã nghiên cứu và chứng minh virus sởi sống, giảm

120

độc lực có khả năng kháng tế bào ung thư phổi bằng cách kích hoạt con

đường apoptosis trong tế bào ung thư [87].

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã khẳng định khả năng ly giải tế bào

HT-29 của MeV và MuV in vitro, đặc biệt là hiệu quả khi kết hợp 2 loại virus

vaccine với nhau cả về ly giải trực tiếp (tạo hợp bào) và làm tăng tế bào chết

apoptosis ở các thời điểm nghiên cứu. Kết quả đã chứng minh khi kết hợp 2

virus thì khả năng ly giải tế bào HT-29 trực tiếp cũng qua trung gian kích hoạt

con đường apoptosis tốt hơn hẳn (có ý nghĩa thống kê p<0,05) so với đơn

virus. Điều này cho thấy có sự cộng hưởng về tác dụng ly giải tế bào HT-29

của 2 loại virus này khi phối hợp với nhau. Cơ chế tác dụng phối hợp này

chưa được hiểu rõ, cần có thêm nhiều nghiên cứu chứng minh vấn đề này.

Tuy nhiên, có lẽ do cả 2 virus này đều có thụ cảm thể đặc hiệu khác nhau trên

bề mặt tế bào HT-29 nên khả năng lây nhiễm và ly giải được cộng hưởng.

Bên cạnh đó, từ lâu 2 virus này đã được phối hợp với nhau trong cùng một

vaccine để tiêm chủng và không có báo cáo nào về sự đối kháng tác dụng.

Việc phối hợp 2 OV này cho thấy hiệu quả mạnh nhất vào ngày thứ 4 và 5 sau

nhiễm. Khi phối hợp 2 virus này, kết quả tăng kích hoạt con đường apoptosis

trong tế bào HT-29 cả ở giai đoạn sớm và muộn của quá trình apoptosis so

với 1 loại virus. Chúng tôi có thể gợi ý rằng phối hợp virus vaccine sởi và

quai bị tăng ly giải tế bào HT-29 thông qua kích hoạt con đường chết tế bào

apoptosis là một cách tiếp cận có nhiều hứa hẹn điều trị CRC trong tương lai.

Chúng tôi cũng đánh giá tỉ lệ tế bào chết do hoại tử ở các thời điểm

nghiên cứu, đây cũng là một trong những cơ chế ly giải tế bào HT-29 của

MeV và MuV. Như chúng ta đã biết, apoptosis được coi là cơ chế chính gây

ly giải tế bào u của các virus này. Tuy nhiên, ngoài cơ chế kích hoạt con

đường tế bào chết apoptosis, MeV, MuV còn giết chết tế bào HT-29 bằng

nhiều cơ chế khác, một trong những cơ chế đó là gây hoại tử tế bào. Trong

nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ tế bào bị hoại tử tăng lên không đồng nhất giữa

121

các nhóm nhiễm virus và nhóm chứng. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở các nhóm nghiên

cứu tăng không tuyến tính, có thời điểm nghiên cứu tỉ lệ tế bào hoại tử ở

nhóm chứng còn cao hơn nhóm nhiễm OV (ở nhóm nhiễm OV ngày thứ 4 và

5). Vấn đề này có thể là do từ ngày thứ 3 trở đi, các giếng không được thay

môi trường nuôi cấy, nên có cả tế bào chết do thiếu nuôi dưỡng. Thêm nữa,

quá trình thu mẫu tế bào đem đi chạy flow cytometry ở một cơ sở thí nghiệm

cách xa có thể đã làm cho các tế bào bị vỡ do yếu tố khách quan như: tác

động cơ học hoặc do bảo quản…

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng đồng nhất với một số nghiên

cứu khác về quá trình apoptosis được quan sát thấy ở giai đoạn tương đối

muộn sau khi nhiễm OV (ở ngày thứ 3, 4 và 5 nhiễm OV). Sử dụng phương

pháp phát hiện đoạn gãy của chuỗi DNA kép trong quá trình apoptosis bằng

cách đánh dấu đầu 3′- hydroxyl tận của đoạn DNA kép bị gãy, (phương pháp

TUNEL), một nghiên cứu cho thấy hơn 70% các tế bào u thần kinh đệm đã

chết sau 2 ngày nhiễm OV, bắt đầu hình thành hợp bào nhưng chưa phát hiện

thấy tế bào chết apoptosis. Đến ngày thứ 4 nhiễm virus, tác giả mới phát hiện

tế bào chết apoptosis. Ngày thứ 6 nhiễm virus, kết quả cho thấy tế bào chết

apoptosis rõ nhất [107]. Trong một nghiên cứu khác (sử dụng phương pháp

TUNEL phát hiện mảnh vỡ DNA trong quá trình apoptossis và xét nghiệm

Western plot để đánh giá hoạt động của caspase-8, caspase-9, caspase-3 ở các

ngày 2, 4, 6 sau nhiễm virus), tác giả đã cho thấy có một lượng lớn tế bào chết

do cơ chế khác trước khi con đường tế bào chết apoptosis được kích hoạt,

hoạt hóa caspase và chất nền apoptosis bị phân cắt vào ngày thứ 4 và thứ 6

sau khi nhiễm OV [108]. Do đó, cần có nhiều nghiên cứu sâu và rộng hơn

đánh giá tế bào chết apopotosis ở thời điểm muộn hơn ngày thứ 2 nhiễm

virus, cũng như các cơ chế giết chết tế bào ung thư ngoài con đường kích hoạt

tế bào chết apoptosis.

122

Chết tế bào có chọn lọc do autophagy đã được chứng minh là có vai trò

kiểm soát sự phóng thích cytochrome C và ức chế quá trình apoptosis tạo điều

kiện cho virus nhân lên trong tế bào ung thư. Các mối tương quan giữa chết tế

bào do autophagy và apoptosis đã được nghiên cứu sâu rộng trong những năm

gần đây. Chết tế bào autophagy là cơ chế bảo vệ tế bào khỏi các hóa chất độc

và yếu tố có hại khi các tế bào bị stress, làm giảm xu hướng các tế bào trải

qua apoptosis. Một nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng autophagy ức chế

apoptosis trong tế bào HeLa nhiễm MeV chủng Edmonston [109]. Tuy nhiên,

cơ chế chết tế bào autophagy chống lại quá trình apoptosis và chết tế bào

autophagy góp phần vào ly giải tế bào u ở những tế bào nhiễm virus vẫn chưa

rõ ràng. Người ta cũng đã chứng minh MeV gây ra chết tế bào theo cơ chế

làm tổn thương ty thể (mitophagy) qua trung gian protein có tên là SQSTM1,

điều này rất quan trọng đối với việc loại bỏ ty thể bị tổn thương trước khi

cytochrome C được giải phóng ra. Vì vậy, chúng tôi đưa ra giả thiết là giai

đoạn đầu OV sử dụng mitophagy để kiểm soát sự giải phóng cytochrome C và

ngăn chặn hoạt động caspase, tạo điều kiện cho OV lây nhiễm. Tuy nhiên,

không loại trừ OV sử dụng tế bào chết autophagy ngăn chặn apoptosis bằng

các cơ chế khác. Điều này cũng cho thấy autophagy được duy trì liên tục và

làm cạn kiệt protein nội bào và gây chết tế bào autophagy, trong đó cạn kiệt

protein SQSTM1 có thể thúc đẩy tín hiệu khởi phát quá trình apoptosis.

Apoptosis được coi là một trong những cơ chế cơ bản mà qua đó tế bào

vật chủ bảo vệ mình chống lại nhiễm virus. OV sử dụng autophagy để chống

lại quá trình apoptosis, do đó, có lợi cho sự sao chép của nó. Đáng chú ý, sự

suy thoái ty thể cũng làm giảm mức độ cảm biến các yếu tố kháng virus liên

quan đến ty thể, loại bỏ các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh kháng virus làm tăng

khả năng virus nhân lên. Duy trì autophagy tạo điều kiện cho virus nhân lên

liên tục nhưng lại gây ra hoại tử tế bào do cạn kiệt ATP. Tuy nhiên, mặc dù

123

OV chống lại tế bào chết apoptosis nhưng quá trình này tương quan với ly

giải tế bào u qua trung gian OV.

Xia M và cộng sự (2014) đã chứng minh giảm autophagy làm giảm

đáng kể hiệu quả ly giải ung thư phổi tế bào nhỏ, tác giả cho thấy autophagy

đã tham gia vào việc điều chỉnh chết tế bào do virus sởi chủng MeV-

Edmonston. Hơn nữa, các ông cũng chứng minh được mức độ nhân lên của

chủng MeV này tương quan với sự cạn kiệt ATP và giải phóng protein

HMGB1, điều này cho thấy chủng MeV gây ra hoại tử tế bào do làm cạn kiệt

ATP [110]. Nghiên cứu này cũng đã loại trừ khả năng hoại tử qua trung gian

các gốc oxy hoạt động. Kết quả này khẳng định thêm autophagy thúc đẩy sự

lây nhiễm MeV, autophagy góp phần vào ly giải tế bào u bằng cách duy trì sự

lây lan của virus dẫn đến hoại tử tế bào do cạn kiệt ATP. Do đó, tế bào chết

do hoạt tử cũng là con đường ly giải tế bào ung thư của MeV.

4.4. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng

người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch

4.4.1. Đánh giá độc tính của virus vaccine sởi và quai bị trên chuột

thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29

Chúng tôi theo dõi độc tính của MeV và MuV trên chuột nude mang

khối u ngay sau khi tiêm. Độc tính được đánh giá bằng những thay đổi về

trọng lượng cơ thể và các chỉ số theo dõi ở bảng 3.2. Chuột ở các nhóm

nghiêm cứu sau khi tiêm OV, hầu như không thay đổi trọng lượng, trọng

lượng giảm nhẹ sau 2-3 tuần tiêm, biến đổi nhiều hơn cả là ở nhóm chứng

(không có ý nghĩa thống kê với p>0,05). Cùng với đó là các chỉ số đánh giá

sức khỏe của chuột đều bình thường (bảng 3.2). Nghiên cứu của chúng tôi đã

sử dụng liều đến 107 PFU của MeV và MuV để điều trị cho chuột nude mang

khối u tế bào HT-29, liều này cao gấp 103 lần so với liều thông thường (103

đến 104 PFU) được sử dụng để tiêm chủng. Quá trình theo dõi cho thấy cả

MeV và MuV không gây độc toàn thân ở chuột nude mang khối u tế bào HT-

124

29. Ngoài ra, một vấn đề cần quan tâm là qua theo dõi sức khỏe chuột trong

quá trình điều trị, chúng tôi đã loại trừ được các nguyên nhân bệnh lý khác

gây chết chuột. Điều này làm kết quả tính toán, đánh giá hiệu quả điều trị

bằng MuV và MeV thông qua chỉ số tỉ lệ chuột sống, chết và số ngày sống

của chuột ở các nhóm có độ tin cậy cao hơn.

Các chương trình tiêm chủng với quy mô lớn bằng các virus sởi và quai

sống, giảm độc lực đã rất thành công. Việc sử dụng chủng virus vaccine sởi

và quai để tiêm chủng đã thiết lập 1 hồ sơ an toàn rộng khắp thế giới trong

nhiều năm qua. Bên cạnh đó, hầu hết các nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm

sàng trước đây sử dụng MeV chủng Edmonston, MuV chủng Urabe điều trị

ung thư đã chứng minh là rất an toàn về độc tính [111]. Các thử nghiệm lâm

sàng sử dụng 2 virus này bằng cách tiêm nội u hay tiêm tĩnh mạch điều trị cho

những bệnh nhân bị u lympho tế bào T dưới da [112], ung thư buồng trứng

[74], [113], hoặc các loại ung thư khác [114] đã được báo cáo với liều tới 107

đến 109 PFU, cao hơn rất nhiều lần liều tiêm chủng (103 đến 104 PFU) nhưng

vẫn không có độc tính đáng kể. Các chủng Edmonston của MeV, chủng

Urabe của MuV rất khó gây bệnh trở lại vì hầu hết mọi người đều đã được

chủng ngừa. Mặc dù dữ liệu lâm sàng và tiền lâm sàng rất đáng khích lệ,

nhưng các nhà nghiên vẫn chưa thực hiện thử nghiệm MuV rộng rãi trên

người. Có thể vẫn là do các mối lo ngại về độ an toàn khi sử dụng cần được

nghiên cứu sâu rộng hơn nữa. Chủng Urabe của MuV có tỉ lệ gây ra các biến

chứng viêm não và viêm màng não trên hệ thần kinh trung ương khi tiêm

trong não khỉ đuôi sóc. Chúng ta đã có rất nhiều kinh nghiệm sử dụng vaccine

đơn hoặc phối hợp trong chương trình chủng ngừa bệnh sởi và quai bị với hồ

sơ an toàn rất cao của hai loại vaccine này trên hàng triệu trẻ em. Tuy nhiên,

cần có những nghiên cứu lớn hơn đánh giá tác dụng phụ và độc tính của các

virus này khi dùng liều cao điều trị ung thư ở người.

125

4.4.2. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng

người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch

Với những tiến bộ của công nghệ sinh học và những hiểu biết về virus

ly giải tế bào ung thư đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu khám phá nhiều chủng

virus kháng ung thư có hiệu quả. Trong nghiên cứu này, để đánh giá hiệu quả

phối hợp MeV và MuV ly giải tế bào ung thư đại tràng người dòng HT-29 in

vivo, chúng tôi đã ghép u tế bào HT-29 ngay dưới da đùi chuột nude, phù hợp

cho liệu pháp điều trị tiêm OV nội u, tăng khả năng virus tiếp xúc và xâm

nhập vào khối u.

Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy MeV và MuV có tác dụng làm

chậm phát triển khối u tế bào HT-29 ghép trên đùi chuột nude bắt đầu vào

ngày thứ 3 sau tiêm, thời gian sống trung bình ở các nhóm điều trị bằng OV

dài hơn và số chuột còn sống nhiều hơn có nghĩa thống kê (p<0,05) so với

nhóm chứng. Khả năng virus lây lan tạo ra hoạt động kháng u là do virus

nhân lên trong tế bào đích và “bắt kịp” với quá trình tăng sinh tế bào u. Thật

vậy, hầu hết các khối u được điều trị bằng MeV và MuV đã cho thấy giảm sự

phát triển kích thước. Kết quả của chúng tôi phù hợp với các kết quả nghiên

cứu khác sử dụng vaccine virus sởi và quai bị sống giảm độc lực điều trị khối

u trên chuột thiếu hụt miễn dịch và cả trên các thử nghiệm lâm sàng [74],

[115]. Bên cạch đó, việc phân chia liều lượng, với liều 107 PFU và liệu trình

điều trị như vậy là cần thiết để tăng khả năng ly giải tế bào u của virus [74],

[115]. Chúng tôi cũng đã qua sát thấy tiêm nội u tạo ra lây nhiễm sớm virus

vào các tế bào khối u và lây lan virus chỉ giới hạn trong khối u, điều này đã

làm tăng khả năng ly giải tế bào khối u. Tiêm virus nội u nhiều lần hiệu quả

hơn so với tiêm tổng liều duy nhất [74], [115]. Kết quả này rất có giá trị định

hướng phương pháp phối hợp MeV và MuV tiêm nội u điều trị ung thư cho

các nghiên cứu trong tương lai. Quá trình theo dõi điều trị, chúng tôi cũng đã

theo dõi các tiêu chí đánh giá sức khỏe chuột để loại bỏ các nguyên nhân khác

126

gây chết chuột. MeV và MuV không gây độc cho chuột nude trong qua trình

điều trị.

Điểm nổi bật ở nghiên cứu của chúng tôi là việc phối hợp MeV và

MuV điều trị khối u tế bào HT-29 trên chuột nude rất có hiệu quả. MeV và

MuV sống, giảm độc lực đã cộng hưởng cơ chế hoạt động kháng ung thư đại

tràng. Cũng có nhiều đề tài nghiên cứu hiệu quả ly giải tế bào u của phối hợp

2 virus vaccine sởi và quai bị đối với nhiều loại ung thư rắn như: ung thư đại

trực tràng, ung thư ruột, ung thư gan, ung thư vú, ung thư thực quản, ung thư

thanh quản, ung thư tế bào máu [73] ung thư buồng trứng [74]. Các nghiên

cứu cũng đã chứng minh được phối hợp 2 virus sởi và quai bị có một phổ

rộng tiềm năng kháng tế bào ung thư rắn ở người cấy ghép trên chuột nude,

khối u chậm phát triển đáng kể sau đợt điều trị, việc điều trị phối hợp 2 virus

có hiệu quả hơn so với đơn virus. Kết quả cũng chứng minh việc điều trị tiêm

nhiều lần tốt hơn liều duy nhất. Do đó, cần có các nghiên cứu liều điều trị

thích hợp trong các thử nghiệm lâm sàng tiếp theo bằng các nghiên cứu đánh

giá sâu rộng hơn khả năng ly giải tế bào u người của virus vaccine sởi và quai

bị, tiến tới phát triển các thử nghiệm lâm sàng trong tương lai.

Số lượng thụ cảm thể đã được chứng minh là yếu tố quan trọng quyết

định đến tính lây nhiễm hay hiệu quả lan truyền của virus vào các tế bào u

đích. Sử dụng nhiều loại tế bào biểu hiện từ thấp đến cao mức thụ cảm thể

CD46, người ta đã xác định khả năng lây nhiễm MeV tăng lên theo số lượng

thụ cảm thể. Hợp bào xảy ra ít ở các tế bào biểu hiện mức thụ cảm thể thấp,

cần có mức tới hạn thụ cảm thể CD46 để tạo hợp bào và gây ly giải trực tiếp

tế bào ung thư nhiều hơn [45]. Chúng ta đã biết CD46, Nectin-4 là các thụ

cảm thể đặc hiệu của MeV và MuV-JL là thụ cảm thể đặc hiệu của MuV, các

thụ cảm thể này biểu hiện cao trên bề mặt nhiều loại tế bào ung thư bao gồm

cả CRC. Ngoài ra, acid sialic có nhiều ở bề mặt tế bào ung thư cũng làm cho

các OV này lây nhiễm tế bào ung thư có tính chọn lọc cao hơn. Mức độ phong

127

phú của thụ cảm thể xác định tính đặc hiệu và hiệu quả lây nhiễm của virus

vào tế bào ung thư. Tính đặc hiệu của OV đối với tế bào ung thư còn xảy ra ở

mức nội bào sau khi virus xâm nhập vào tế bào, các virus có thể tận dụng

được các yếu tố do khiếm khuyết gen như: giảm cảm ứng interferon, kích

hoạt Ras, p53, Rb…, các yếu tố này chỉ có duy nhất ở các tế bào ung thư, làm

cho OV tăng tính chọn lọc các tế bào khối u mà hầu như không xảy ra ở các tế

bào bình thường. Trong khi đó, nhiều tài liệu cho thấy virus ly giải tế bào ung

thư còn có khả năng tận dụng được những khiếm khuyết gen trong tế bào u để

khuếch đại bộ gen của chúng và tăng biểu hiện bộ gen đó. Phạm vi và mức độ

mà MeV, MuV tận dụng con đường khiếm khuyết gen để ly giải tế bào ung

thư vẫn chưa rõ ràng. Vấn đề này cần có nhiều nghiên cứu đánh giá sâu rộng

hơn nữa. Tuy nhiên, đã có nhiều nghiên cứu chứng minh MeV và MuV có

Với MeV, đã có nhiều nghiên cứu đánh giá khả năng kháng ung thư

hiệu quả kháng ung thư in vivo và cả trên lâm sàng [74], [113].

người như: thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I của Heinzerling L và cộng sự

(2005) nghiên cứu MeV chủng Edmonston-Zagreb kháng ung thư trên những

bệnh nhân bị u tế bào lympho T ở da [112]. Khối u ác tính này được đặc trưng

bởi sự tích tụ của các tế bào “bản sao” lympho T ở da, tạo ra các mảng, ban

và các khối u. Nghiên cứu lâm sàng này cho thấy tiêm MeV vào nội u sau khi

điều trị toàn thân bằng IFN-a (để tránh nhiễm trùng MeV trong các tế bào

khỏe mạnh mẫn cảm với IFN-a) gây ra nhiễm trùng tại chỗ, một hiệu ứng ly

giải tế bào đặc trưng của MeV trên các tế bào khối u và MeV không bị loại bỏ

bởi sự hiện diện của các kháng thể kháng MeV có từ trước. Kết quả nghiên

cứu cho thấy MeV làm thoái triển các khối u. Trong nghiên cứu lâm sàng giai

đoạn I, tác giả Galanis E và cộng sự (2013) sử dụng chủng virus sởi là MeV-

CEA điều trị bệnh nhân ung thư buồng trứng tái phát, đây là một MeV chủng

Edmonston biến đổi gen có khả năng sản xuất kháng nguyên tiền ung thư

(CEA), một marker hòa tan để nhận biết virus, theo dõi sự nhân lên của MeV

128

qua liều lượng kháng nguyên CEA đo được trong huyết thanh. Tác giả đã tăng

liều điều trị cho bệnh nhân đã được chủng ngừa bệnh sởi trước đó nhưng vẫn

đảm bảo sự an toàn cho cuộc thử nghiệm. Liều dao động 103 đến 109 TCID50

chưa thấy giới hạn liều độc tính. Kết quả cho thấy có đáp ứng lâm sàng trong

14/21 bệnh nhân với bệnh ổn định trong thời gian trung bình 92,5 ngày. Sự ổn

định của bệnh có liên quan đến sự suy giảm của các marker đặc hiệu khối u

CEA ở bệnh nhân. Thời gian sống trung bình của các bệnh nhân được điều trị

bằng MeV-CEA là 12,15 tháng gấp đôi so với thời gian sống trung bình của

bệnh nhân ở nhóm chứng (6 tháng) [113]. Những kết quả này đã làm nổi bật

tiềm năng đầy hứa hẹn của liệu pháp OV sử dụng MeV biến đổi gen ở bệnh

nhân ung thư.

Boisgerault N và cộng sự (2013) cũng đã nghiên cứu khả năng MeV

kháng tế bào u HT-29 trên chuột nude. Kết quả cho thấy chuột nude mang

khối u đại tràng người HT-29 được điều trị bằng một tiêm nội u MeV (liều

1,5 × 107 TCID50) đã làm giảm phát triển khối u (theo dõi trong 31 ngày).

Ngược lại, sự tăng trưởng khối u là không thay đổi ở nhóm chứng được điều

trị bằng dung dịch PBS, kích thước khối u có sự khác biệt đáng kể giữa chuột

ở nhóm chứng và nhóm điều trị MeV (1434 ± 246 mm3 so với 403 ± 86 mm3;

p <0,05; hoặc khối lượng khối u (960 ± 211mg so với 347 ± 89mg; p<0,05)

[78]. Một nghiên cứu khác về sử dụng MuV điều trị ung thư, kết quả lâm sàng

cho thấy rất ít độc tính trên bệnh nhân, khối u đáp ứng điều trị từng phần hoặc

thoái lui toàn bộ ở 37/90 bệnh nhân ung thư khác nhau và cổ trướng mất đi ở

26/37 bệnh nhân [114].

4.4.3. Virus vaccine sởi và quai bị kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng

u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch

OV có khả năng kích thích tăng sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng

tế bào ung thư, tăng cường khả năng ly giải tế bào u qua trung gian miễn dịch,

1 đặc tính quan trọng của OV tăng cường hiệu quả kháng ung thư [116],

129

[117]. Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào đánh giá khả năng kích thích

đáp ứng miễn dịch của MeV và MuV trên chuột nude bằng cách tiêm trực tiếp

MeV và MuV theo một liệu trình điều trị với liều 107 CFU/lần, 2lần/tuần, 3

tuần vào khối u trên đùi chuột nude, đánh giá tỉ lệ các tế bào bạch cầu dòng

tủy, tế bào NK, tế bào DC và tế bào DC trưởng thành ở lách chuột, đây là

những tế bào có vai trò rất quan trong đáp ứng miễn dịch cả tự nhiên và thích

ứng chống lại tế bào u [118], [119].

Đáp ứng miễn dịch kháng khối u cũng có nhiều điểm tương đồng với

đáp ứng miễn dịch chống nhiễm trùng và các kháng nguyên ngoại lai. Các tế

bào của hệ miễn dịch bẩm sinh như tế bào NK, tế bào bạch cầu dòng tủy và tế

bào DC phản ứng với các phân tử tín hiệu nguy hiểm PAMP và DAMP. Khởi

đầu một quá trình viêm, các tế bào miễn dịch bẩm sinh gồm tế bào DC và đại

thực bào nhận diện kháng nguyên của các phân tử này rồi trình diện cho tế

bào lympho T, kích hoạt các phản ứng miễn dịch thích ứng. Hệ thống miễn

dịch bẩm sinh nhận diện các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt tế bào ung

thư theo cách tương tự như nhận diện kháng nguyên của các tác nhân gây

bệnh. Các tế bào NK được hoạt hóa và tiêu diệt các tế bào ung thư sau khi

nhận diện tế bào này thiếu phân tử bề mặt MHC-I, quá trình này cũng thu hút

các tế bào viêm khác như các tế bào bạch cầu dòng tủy sản xuất các cytokine.

Tế bào NK là loại tế bào lympho quan trọng thứ 3 sau lympho T và B. Chức

năng của tế bào NK là nhận diện và giết chết nhiều loại tế bào đích bao gồm

cả tế bào ung thư và tế bào nhiễm virus. Khả năng vốn có của tế bào NK là

nhận diện và tiêu diệt tế bào khối u, điều này làm cho chúng trở thành ứng

viên đầy triển vọng cho điều trị ung thư. Các tế bào NK hoạt động theo một

cách không đặc hiệu kháng nguyên và liên kết với một số lượng lớn các phối

tử qua đó kích hoạt vào các thụ thể của chúng. Điều này cho phép chúng

nhắm vào nhiều loại tế bào ung thư khác nhau. Thực tế đã chứng minh dùng

phối hợp tế bào NK cùng với các kháng thể đặc hiệu tế bào ung thư đích

130

mang lại kết quả điều trị ung thư đầy hứa hẹn. Với cơ chế gây độc tế bào qua

trung gian tế bào phụ thuộc vào kháng thể, tế bào NK có thể giết chết tế bào

ung thư trên bề mặc có kháng nguyên đặc hiệu. Tế bào NK còn có liên quan

đến tình trạng viêm do virus gây ra thông qua việc nhắm đích và phá hủy các

tế bào chủ bị nhiễm virus và sản xuất ra IFN-γ. Do đó, chúng có thể ảnh

hưởng không tốt đến hiệu quả ly giải tế bào ung thư của OV do ngăn chặn OV

lây lan bên trong khối u.

Các tế bào bạch cầu dòng tủy và tế bào DC đến thực bào tế bào ung thư

và sau đó chúng biểu hiện kháng nguyên tế bào ung thư trên bề mặt, kích hoạt

phản ứng tế bào lympho T đặc hiệu chống lại khối u. Tế bào DC là các tế bào

miễn dịch bẩm sinh quan trọng, có khả năng trình diện kháng nguyên hiệu

quả nhất. Chúng có vai trò tạo ra đáp ứng miễn dịch bằng cách bắt giữ và đưa

kháng nguyên đến các tế bào của hệ miễn dịch thích ứng. Các chemokine

viêm, cytokine và các kháng nguyên ngoại lai làm cho tế bào DC trưởng

thành. Khi tế bào DC trưởng thành, chúng mất khả năng tiếp tục hấp thụ và

xử lý các kháng nguyên, nhưng đạt được khả năng kích hoạt tế bào lympho T

gây độc tế bào. Như vậy, các tế bào DC trưởng thành phải di chuyển đến các

tổ chức lympho thứ yếu, ở đó chúng tương tác với các tế bào lympho T non

tạo ra tế bào lympho T trưởng thành để tạo ra đáp ứng miễn dịch. Ngoài ra, tế

bào DC trưởng thành trải qua thay đổi hình thái cơ bản bằng cách tái cấu trúc

khung tế bào làm cho tế bào to ra, tăng biểu hiện thụ cảm thể CCR7

(CD197+), một thụ thể tăng cường mạnh mẽ khả năng di cư tế bào DC. Sự

trưởng thành là yếu tố cần thiết cho chức năng tế bào DC. Holst K và cộng sự

(2015) đã chứng minh thụ cảm thể CCR7 (CD197+) có liên qua đến sự trưởng

thành của tế bào DC, tác giả đã sử dụng thụ cảm thể CCR7 đánh giá sự trưởng

thành của tế bào DC dưới tác dụng của serotonin [77]. Ngoài ra, biểu hiện thụ

cảm thể 5-Hydroxytryptamine (5-HT) cũng tăng lên trong quá trình tế bào DC

trưởng thành. Người ta đã chứng minh rằng các tế bào DC trưởng thành biểu

131

hiện cao thụ cảm thể 5-Hydroxytryptamine 4 (5-HT4R) và thụ cảm thể 5-

Hydroxytryptamine 4 (5-HT7R).

Tuy nhiên, để thoát khỏi kiểm soát của cơ thể, các tế bào ung thư trải

qua quá trình chọn lọc các tế bào có khả năng né tránh hệ thống miễn dịch,

bằng cách có được một số đặc tính quan trọng bao gồm yếu tố giảm sinh miễn

dịch, có được một vi môi trường ức chế miễn dịch cao, khả năng kích thích

các yếu tố hỗ trợ thu nhận chất dinh dưỡng, tạo mạch và sửa chữa matrix

ngoại bào. Trên thực tế, người ta đã phát hiện ra các tế bào miễn dịch có khả

năng giám sát các tế bào bị biến đổi trở thành ung thư trong một quá trình

được gọi là “giám sát miễn dịch”. Thông qua giám sát miễn dịch, cơ thể có

thể nhận biết và loại bỏ hiệu quả các tế bào ung thư trước khi chúng gây hại

[120]. Bằng chứng cho thấy sự giám sát miễn dịch đóng một vai trò quan

trọng kiểm soát sự phát triển của tế bào ung thư. Do đó, ở những bệnh nhân

được điều trị thuốc ức chế miễn dịch (bệnh nhân ghép tạng) hoặc bệnh nhân

nhiễm HIV có nguy cơ mắc một số bệnh ung thư cao hơn, bao gồm ung thư

đại tràng và ung thư tuyến tụy [121]. Mối quan hệ giữa các tế bào miễn dịch

với các tế bào ung thư trải qua 3 giai đoạn: loại bỏ, cân bằng và trốn thoát. Ở

giai đoạn loại bỏ ung thư, các tế bào miễn dịch tìm kiếm và tiêu diệt các tế

bào ung thư, chúng lựa chọn các tế bào ung thư mà biểu hiện giảm khả năng

sinh miễn dịch trong quá trình được gọi là hiệu chỉnh miễn dịch. Khi một khối

u phát triển, các tế bào miễn dịch dần dần mất khả năng loại bỏ tất cả các tế

bào ung thư nhưng vẫn có thể ngăn ngừa sự gia tăng và di căn, giữ cho khối u

khu trú lại và tạo ra một pha tĩnh gọi là pha cân bằng. Theo thời gian, sự

tương tác giữa khối u và hệ thống miễn dịch cuối cùng dẫn đến việc chọn lọc

các tế bào khối u có thể thoát khỏi hệ thống miễn dịch và sự phát triển của

khối u rõ ràng hơn, đây là giai đoạn tế bào ung thư trốn thoát khỏi hệ miễn

dịch. Dữ liệu từ nghiên cứu cấy ghép khối u trên chuột đã chứng minh cho

chuỗi sự kiện này [122].

132

Trong đề tài này, Chúng tôi sử dụng kháng thể kháng CD11b, CD11c,

CD49b và CD197 (CCR7) để phát hiện lần lượt các tế bào miễn dịch của

chuột là: tế bào bạch cầu dòng tủy, tế DC, tế bào NK và tế bào DC trưởng

thành. Đây là các tế bào hệ miễn dịch bẩm sinh, chúng có vai trò rất quan

trọng trong quá trình đáp ứng miễn dịch chống ung thư. Có thể nói CD11b,

CD11c, CD49b và CD197 (CCR7) là kháng nguyên đặc hiệu lần lượt cho các

tế bào bạch cầu dòng tủy bao gồm cả đại thực bào, tế bào DC, tế bào NK ở

chuột. Ohtsuji M và cộng sự (2018) đã sử dụng chất kháng kháng nguyên

CD11b ở tế bào dòng tủy của chuột, kết quả cho thấy các chất này đã làm

giảm tỉ lệ tế bào bạch cầu dòng tủy ở máu ngoại vi, giảm di cư tế bào bạch

cầu dòng tủy có kháng nguyên CD11b vào tổ chức viêm [75]. Ahn J.O và

cộng sự (2008) đã sử dụng kháng thể kháng CD11b có gắn huỳnh quang phát

hiện các tế bào bạch cầu dòng tủy chuột như: tế bào bạch cầu đơn nhân, đại

thực bào; kháng thể kháng CD11c phát hiện tế bào DC và kháng thể kháng

CD49b phát hiện tế bào NK của chuột [123]. Stenström M và cộng sự (2004)

đã sử dụng kháng thể kháng CD49b để phát hiện tế bào NK xâm nhập vào

khối u trong nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch kháng u cấy ghép trên

chuột thiếu hụt miễn dịch [76]. Nhóm nghiên cứu của Holst K và cộng sự

(2015) cũng đã sử dụng kháng thể kháng CD11c và CD197 (CCR7) để phát

hiện tế bào DC và DC trưởng thành của chuột trong nghiên cứu đánh giá thụ

cảm thể serotonin 5-HT7R điều hòa các đặc tính hình thái và di cư của tế bào

DC [77].

Kết quả đánh giá quần thể tế bào miễn dịch trong lách chuột nude của

chúng tôi cho thấy, tỉ lệ các tế bào bạch cầu dòng tủy, NK, DC và tế bào DC

trưởng thành tăng hơn hẳn ở các nhóm điều trị bằng OV so với nhóm chứng,

đặc biệt hơn là tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở nhóm điều trị phối hợp OV cao

hơn đáng kể so với nhóm điều trị đơn virus. Đã có các nghiên cứu trước đánh

giá hiệu quả phối hợp MeV và MuV kháng tế bào ung thư in vitro ở một số

133

dòng tế bào ung thư: U937, HuT-102, Jurkat,…[73], [74] các kết quả này cho

thấy việc phối hợp MeV và MuV có khả năng tăng cường ly giải tế bào khối u

cả con đường ly giải trực tiếp và gián tiếp qua trung gian kích thích miễn dịch

chống ung thư. Với sự liên quan chặt chẽ giữa đáp ứng kháng u tế bào HT-29

và tăng tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột, chúng tôi đưa ra giả thiết là tế

bào miễn dịch ở lách chuột tăng cao có mối quan hệ chặt chẽ với tăng hiệu

quả ly giải tế bào ung thư trong nhóm điều trị phối hợp 2 virus. Tỉ lệ tế bào

miễn dịch càng tăng thì đáp ứng miễn dịch kháng u trong điều trị phối hợp 2

virus càng tăng.

Thực tế, các nghiên cứu trước đây đã chứng minh nhiễm MeV làm tăng

tỉ lệ tế bào bạch cầu dòng tủy và tăng hiệu quả ly giải tế bào ung thư thông

qua cơ chế tăng cường đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào [124].

Donnelly O.G và cộng sự (2013) cũng đã chứng minh các tế bào u hắc tố da

bị nhiễm MeV thúc đẩy tế bào DC trưởng thành và tăng đáp ứng ly giải tế bào

ung thư [60]. Hơn nữa, các nhà nghiên cứu cũng đã xác định các yếu tố kích

thích miễn dịch được hoạt hóa trong quá trình ly giải tế bào ung thư qua trung

gian miễn dịch. Một nghiên cứu đã tiến hành nuôi cấy tế bào DC cùng với các

tế bào u hắc tố da nhiễm MeV, kết quả cho thấy tế bào DC kích hoạt tế bào

lympho T gây độc và tiêu diệt tế bào u hắc tố. Các nhà khoa học cũng đã

chứng minh các tế bào nhiễm MeV giải phóng protein HMGB1 và nhiều

cytokine viêm như: IFN loại I (IFN-α và IFN-β), IL-6, IL-8, RANTES, IL-28.

Tế bào DC dòng máu là một dạng khác của tế bào DC, một dòng tế bào

chuyên về đáp ứng miễn dịch kháng virus [60]. Nhiều bằng chứng đã cho thấy

kích thích tăng sinh dòng tế bào DC này sẽ tăng hiệu quả ly giải tế bào ung

thư, vì các tế bào DC này có thể gây ra phản ứng miễn dịch thông qua sản

xuất IFN loại I và trình diện kháng nguyên cho các tế bào lympho T trực tiếp

tham gia hoạt động ly giải tế bào ung thư [125], [126].

134

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các tế bào DC và DC trưởng thành của

chuột mang khối ung thư tế bào đại tràng người HT-29 được điều trị bằng

MeV và MuV cũng tăng lên về số lượng, tuy nhiên tỉ lệ vẫn còn thấp. Điều

này có thể là do phần trăm tế bào DC ở điều kiện cơ thể bình thường là rất

thấp, khoảng 2-3%, trong khi số lượng tế bào DC trưởng thành thậm chí còn

thấp hơn là do chúng chỉ tăng cường khi đáp ứng miễn dịch xảy ra. Kết quả

nghiên cứu in vitro của Guillerme J.B và cộng sự (2013) cũng đã chứng minh

nhiễm MeV với liều 1.MOI và không có IL-3, gây ly giải tế bào DC dòng

máu tới 100% sau 72 giờ in vitro, trong khi đó nhiễm MeV liều 50.MOI cộng

thêm với IL-3 mới tạo ra DC trưởng thành [127]. Kết quả này cũng đã ủng hộ

cho giả thuyết là ở liều nhiễm virus rất cao có thể mới tạo ra tín hiệu kích

thích tế bào DC trưởng thành trước khi đáp ứng tế bào chết theo chương trình

(apoptosis). Do đó, từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề nghị với liều tiêm

virus là 107 PFU/chuột nude, đã đủ để kích thích tế bào DC trưởng thành.

4.4.4. Kết quả siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 ghép trên

chuột thiếu hụt miễn dịch sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị

Tế bào chết theo chương trình được đặc trưng bởi một loạt các sự kiện

tế bào ảnh hưởng đến cấu trúc bên trong tế bào, nhân và tế bào chất. Những

thay đổi nhân tế bào là thay đổi đặc trưng nhất, các thay đổi quan trọng khác

xảy ra trong tế bào chất với thay đổi cấu trúc và chức năng của các bào quan.

Gần đây, cấu trúc không bào (hình thành từ lưới nội chất, bộ máy Golgi và

lysosome), những thay đổi về vi sợi trên màng tế bào cũng như các vi ống là

biến đổi hình thái đã được ghi nhận trong tế bào chết apoptosis. Sự xáo trộn

và thay đổi vị trí của bào quan cho thấy tế bào đang chết apoptosis, được điều

chỉnh bởi các yếu tố hòa tan, kinase và enzyme [128]. Nhiều bằng chứng đã

chứng minh việc tổ chức lại bào quan trong quá trình tế bào chết apoptosis là

một quá trình biến đổi do nhiều nguyên nhân khác nhau, không phụ thuộc vào

kích thích gây ra tế bào chết apotosis. Người ta đã thấy rõ vai trò của yếu tố

135

AIF tạo ra apoptosis, chúng là các protein có khả năng tạo ra apoptosis ngay

cả khi các caspase đã bị ức chế [129].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kính hiển vi điện tử truyền

qua đánh giá những thay đổi siêu cấu trúc tế bào u HT-29 trên chuột nude sau

đợt điều trị bằng MeV, MuV. Kết quả cho thấy có hình ảnh tế bào HT-29

đang trong quá trình chết apoptosis bao gồm: sự xuất hiện của hạt nhân kết

đặc lại (ngưng tụ chromatin ở ngoại vi nhân tế bào), phân mảnh nhân và hình

thành vật thể apoptosis (hình 3.13b, 3.13c, 3.13d); Tế bào co tròn lại và bề

mặt trở nên nhẵn (hình 3.13b). Tế bào chất của các tế bào HT-29 trong quá

trình apoptosis xuất hiện khá đặc biệt: có mặt nhiều không bào, hình thành

các tế bào bọt (hình 3.13e); Các không bào được bao xung quanh bởi một

màng kép, có thể do tàn dư của màng ti thể. Như vậy, kết quả chỉ ra quá trình

điều trị bằng MeV và MuV có thể tạo ra tác dụng kháng khối u tế bào HT-29

trên chuột nude qua trung gian con đường chết tế bào apoptosis.

Quá trình apoptosis được điều khiển bởi một mạng tín hiệu, bao gồm

các con đường sau: Các protein kinase kích hoạt bởi phân bào/kinase có hoạt

tính ngoại bào, yếu tố kích thích tế bào/calopain/các yếu tố tạo apoptosis, các

con đường thụ thể ty thể và thụ thể gây chết tế bào. Protein Fas là một protein

xuyên màng tế bào thuộc nhóm các yếu tố hoại tử khối u. Nó đóng một vai trò

quan trọng trong việc làm trung gian kích hoạt apoptosis, kích thích tín hiệu

apoptosis bằng cách liên kết với thụ thể Fas ligand biểu hiện trên bề mặt của

các tế bào lân cận, dẫn đến việc tập trung các protein adapter đặc biệt và kích

hoạt các caspase cascade. Ngoài ra, kích hoạt thụ thể Fas ligand/Fas có thể

làm trung gian kích hoạt caspase-8, tiếp theo là kích hoạt caspases-9 và

caspases-3. Santin G và cộng sự (2011) đã quan sát thấy các biến đổi bào

quan của tế bào trong quá trình chết apoptosis bằng kính hiển vi huỳnh quang

và kính hiển vi điện tử truyền qua [130].

136

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua, chúng tôi còn thấy hình

ảnh tế bào hoại tử (hình 3.13f). Đây có thể là tế bào hoại tử thứ phát hoặc

autophagy sau nhiễm MeV và MuV, một con đường giết chết tế bào u sau

nhiễm virus khác với con đường apotosis. Điều này củng cố thêm rằng MeV

và MuV có thể giết chết tế bào bằng con đường gây hoại tử tế bào hay chết

autophagy.

Dấu hiệu hình thái của nhân tế bào trong quá trình apoptosis là sự

ngưng tụ chất nhiễm sắc và phân mảnh hạt nhân. Sự ngưng tụ bắt đầu từ dọc

bên ngoài theo màng nhân, tạo thành một cấu trúc lưỡi liềm hoặc dạng vòng.

Trong giai đoạn sau của quá trình apoptosis hạt nhân tiếp tục ngưng tụ, và

cuối cùng nó bị vỡ bên trong tế bào với màng tế bào còn nguyên vẹn, một tính

năng được mô tả như vỡ nhân. Sử dụng kính hiển vi điện tử quan sát thấy sự

ngưng tụ và phân mảnh của hạt nhân, nhưng cũng có thể nhìn thấy với kính

hiển quang học ở độ phóng đại cao. Nhiều tác giả đơn giản hóa việc phát hiện

quá trình apoptosis trong nhân bằng cách sử dụng các kỹ thuật Hoechst và

những phương pháp khác để nhuộm DNA bằng 4', 6 diamidino-2-

phenylindole, có thể dễ dàng nhìn thấy ngưng tụ chất nhiễm sắc dưới kính

hiển vi huỳnh quang. Không chỉ quan sát thấy sự ngưng tụ của nhiễm sắc thể,

mà còn có hình ảnh phá vỡ chuỗi DNA bằng cách sử dụng phương pháp dùng

enzym terminal deoxynucleotidyl transferase phát hiện các đoạn DNA đứt

gãy (phương pháp TUNEL) [131]. Những đặc điểm biến đổi hình thái này bắt

đầu do các caspase được kích hoạt (caspases-3 và -6) phân tách các protein

khác nhau có vai trò duy trì tính toàn vẹn cấu trúc của hạt nhân. Một số

caspase có liên quan đến việc sửa chữa và sao chép DNA chịu trách nhiệm

cho sự phân mảnh DNA từ sợi kép thành các đoạn có chiều dài từ 180 đến

200 bp, đáng chú là caspase thuộc nhóm Dnase có thể phân cắt DNA, chúng

là các yếu tố phân mảnh DNA [132]. Ngoài ra, có một số lượng lớn các

endonuclease khác cũng tham gia vào quá trình phân cắt DNA trong quá trình

137

apoptosis. Các protein là sản phẩm từ quá trình apoptosis cũng có vai trò

trong quá trình phân mảnh DNA, chúng gây bất hoạt polymerase (ADP-

ribose) và protein DNA kinase, đây là hai protein tham gia vào các cơ chế sửa

chữa DNA.

Các tế bào trong quá trình chết apoptosis luôn có thay đổi cấu chức

khung tế bào, với sự phân mảnh của các bó vi sợi, đây là yếu tố tạo ra độ dẻo

cho toàn bộ tế bào và làm cho tế bào giảm khối lượng cũng như có thể co rút

lại [133]. Thực tế, nhiều nghiên cứu đã dùng hóa mô miễn dịch để chứng

minh những biến đổi cấu trúc phân tử actin và tubulin dẫn đến việc chuyển

đổi các sợi khung tế bào, các tubulin khung tế bào tổ chức lại thành các bó

dày; các vi sợi actin cũng tạo thành các bó dày hơn, đặc biệt là ở vùng ngoại

vi tế bào khi dùng các chất gây chết tế bào theo con đường apoptosis [134].

Lưới nội bào là một bào quan có cấu trúc đặc biệt được tạo ra từ các

ống dẫn hợp nhất với nhau. Màng của chúng liên tiếp với màng ti thể do đó

tạo thành một phức hợp và tham gia vào việc truyền tín hiệu tế bào. Như đã

đề cập ở trên, người ta đã quan sát thấy những thay đổi hình thái đáng kể của

lưới nội bào trong tế bào chết apoptosis, đó là việc tạo ra hệ thống không bào

do lưới nội bào nở rộng và phồng lên [135].

Một trong những bào quan cũng thay đổi nhiều về hình thái khi tế bào

trong quá trình chết apoptosis, đó là bộ máy golgi. Bào quan này chủ yếu

tham gia vào quá trình đóng gói protein, đưa chúng đến các khoang nhỏ khác

nhau, phối hợp với các bào quan khác bài tiết sản phẩm protein ra ngoài tế

bào. Bộ máy Golgi có vai trò rất quan trọng khi tế bào bị các tác động có hại

của stress, oxy hóa… Chúng được coi là bộ “cảm biến stress”, khi tế bào

trong quá trình apoptosis, bộ máy Golgi có những thay đổi hình thái và chức

năng, bao gồm phân mảnh, căng phồng lên, có thể nhìn thấy trong quá trình

apoptosis muộn. Bộ máy Golgi trải qua sự phân mảnh và phân bố lại trong tế

bào chất, đôi khi hình thành các khối dày đặc [134], [136].

138

Trong quá trình apoptosis, các lysosome dường như nhiều hơn.

Lysosome không liên quan trực tiếp đến quá trình apoptosis, nhưng hàm

lượng enzym của chúng (cathepsin) đóng vai trò quan trọng trong việc phân

hủy protein. Sự bất ổn của màng lysosome (còn gọi là tính thấm hóa màng

lysosome) làm giải phóng các enzyme ở bên trong lysosome vào tế bào chất.

Các protease này phân tách những sản phẩm từ quá trình apoptosis [137].

Ti thể là bào quan then chốt trong việc kiểm soát apoptosis, chúng tham

gia không chỉ ở các con đường kích hoạt apoptosis bên trong mà còn cả con

đường apoptosis bên ngoài tế bào. Các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết rằng

“tính thấm hóa màng ti thể sẽ là một bước quyết định trong quá trình

apoptosis”, thay đổi tính thấm màng ti thể dẫn đến sự thay đổi mật độ và vị trí

nội bào của ty thể cũng như thay đổi điện thế màng ty thể. Trong các tế bào

apoptosis ti thể giảm khoảng 30%, bị phân mảnh, tạo thành khối kết tụ đông

đặc nhiều hơn trong tế bào chất, cũng có ty thể bị căng phồng lên tạo không

bào [138].

Sự thay đổi cấu trúc xảy ra ở ti thể trong quá trình apoptosis làm thay

đổi chức năng của nó, giải phóng các protein ti thể bao gồm cytochrome C,

endonuclease G, protease huyết thanh (HtrA2), còn được gọi là Omi, Smac

(chất kích hoạt ti thể có nguồn gốc từ caspase). Diablo là 1 protein ti thể trực

tiếp gắn và bất hoạt các protein ức chế quá trình apoptosis, thúc đẩy quá trình

apoptosis. Gần đây, người ta đã xác định AIF là yếu tố tạo ra apoptosis, đây là

một flavoprotein ở ti thể có vai trò rất quan trọng làm ngưng tụ nhiễm sắc thể

và phân tách ADN thành các mảnh có trọng lượng phân tử cao [139]. Những

thay đổi trạng thái yếu tố tạo ra apoptosis bên trong tế bào có thể quan sát

bằng kính hiển vi quang học và điện tử. Như đã biết, yếu tố tạo ra apoptosis

chuyển từ ty thể sang hạt nhân không liên quan đến nguyên nhân gây ra

apoptosis. Sự kiện này đã được khẳng định là xảy ra trong giai đoạn đầu giữa

của quá trình apoptosis, yếu tố tạo ra apoptosis có ở cả trong tế bào chất và

139

nhân của các tế bào tiền apoptosis, chúng chỉ còn trong tế bào chất trong quá

trình apoptosis muộn khi hạt nhân bị phân mảnh [139].

Yang L và cộng sự (2016) đã đánh giá siêu cấu trúc tế bào HT-29 bằng

kính hiển vi truyền qua sau điều trị bằng quercetin, là chất gây ra quá trình

apoptosis, ở các nồng độ khác nhau. Kết quả biến đổi siêu cấu trúc hình thái

tế bào HT-29 tương tự như kết quả của chúng tôi [140]. Waziri P.M và cộng

sự (2016) cũng đã nghiên cứu biến đổi hình thái tế bào HT-29 trong quá trình

apoptosis sau điều trị bằng clausenidin. Tác giả cũng đã sử dụng kính hiển vi

điện tử truyền qua quan sát quá trình biến đổi hình thái tế bào chết apoptosis

theo thời gian điều trị clausenidin. Kết quả thu được cũng tương tự như kết

quả nghiên cứu của chúng tôi. Điều này khẳng định thêm vấn đề biến đổi cấu

trúc tế bào trong quá trình apoptosis là đồng nhất không phụ thuộc vào yếu tố

gây chết tế bào theo con đường apoptosis [141].

Như vậy, sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua đánh giá thay đổi

hình thái siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị bằng MeV và MuV, một

lần nữa, chúng tôi khẳng định vai trò ly giải tế bào u HT-29 thông qua kích

hoạt con đường apoptosis của MeV và MuV, một cơ chế ly giải tế bào ung

thư rất quan trọng đang được quan tâm nghiên cứu điều trị ung thư hiện nay.

Bên cạnh đó các OV này còn cho thấy chúng giết chết tế bào u HT-29 bằng

các con đường khác như hoại tử tế bào hay autophagy, từ đó làm giảm sự phát

triển khối u HT-29 trên chuột nude.

140

KẾT LUẬN

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phối hợp MeV và MuV kháng dòng

tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro và u tế bào HT-29 cấy ghép trên

chuột nude với kết quả như sau:

1. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả ly giải trực tiếp

và kích hoạt con đường chết tế bào apoptosis in vitro ở dòng tế bào ung

thư đại tràng người HT-29

MeV và MuV ly giải trực tiếp tế bào HT-29 bằng tạo hợp bào từ ngày

thứ 3, tốt nhất ở ngày thứ 4 và 5 sau nhiễm virus. Tỉ lệ tế bào sống ở các

nhóm nhiễm virus thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng

(ở nồng độ pha loãng virus 10-2-10-6). Nhóm nhiễm phối hợp virus có tỉ lệ tế

bào sống thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm nhiễm đơn virus

(ở nồng độ pha loãng virus 10-2, 10-4 và 10-6) ở cả 3 thời điểm nghiên cứu.

MeV và MuV có khả năng kháng tế bào bằng cách kích hoạt con đường

tế bào chết apoptosis, với kết quả: tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở các nhóm

nhiễm MeV, MuV cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm chứng.

Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở nhóm nhiễm phối hợp MeV+MuV cao hơn các

nhóm nhiễm đơn MeV và MuV có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ở cả 3 thời điểm

nghiên cứu.

2. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả kháng u dòng

tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép trên chuột nude

Phối hợp 2 MeV và MuV có hiệu quả kháng u tế bào đại tràng người

HT-29 ở mô hình cấy ghép u trên chuột nude cả theo cơ chế trực tiếp, kích

hoạt con đường tế bào u chết apoptosis cũng như kích thích tăng sinh các tế

bào miễn dịch kháng tế bào u HT-29. Với kích thước khối u trung bình ở các

nhóm điều trị bằng MeV, MuV tăng chậm hơn so với nhóm chứng có ý nghĩa

thống kê (p<0,05). Nhóm điều trị phối hợp virus có kích thước khối u trung

141

bình tăng chậm hơn các nhóm điều trị đơn virus có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Thời gian sống trung bình và tỉ lệ chuột còn sống sau điều trị của các nhóm

điều trị bằng MeV, MuV nhiều hơn nhóm chứng có ý nghĩa thống kê

(p<0,05). Thời gian sống trung bình và tỉ lệ chuột còn sống sau điều trị của

các nhóm điều trị phối hợp virus nhiều hơn nhóm điều trị đơn virus có ý nghĩa

thống kê (p<0,05).

Các nhóm chuột nude mang khối u tế bào HT-29 được điều trị bằng

MeV, MuV có tỉ lệ các tế bào miễn dịch (tế bào bạch cầu dòng tủy, tế bào

NK, tế bào DC và tế bào DC trường thành) cao hơn đáng kể so với nhóm

chứng. Nhóm điều trị phối hợp MeV và MuV có tỉ lệ các tế bào miễn dịch cao

hơn rõ so với nhóm điều trị đơn MeV, MuV.

Hình ảnh siêu cấu trúc cho thấy tế bào u HT-29 sau điều trị bằng MeV,

MuV chết theo con đường apoptosis.

142

Qua kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi có một số khuyến nghị sau:

KHUYẾN NGHỊ

1. Cần đưa phương pháp chuẩn độ TCID50 sử dụng chất hiện màu là

xanh methylen vào các nghiên cứu về virus thay thế các phương pháp chuẩn

độ TCID50 cổ điển (pháp hiện hiệu ứng gây độc tế bào bằng kính hiển vi

thường).

2. Cần có các nghiên cứu quy mô lớn hơn đánh giá tính an toàn, cơ

chế tác dụng của phối hợp MeV và MuV kháng ung thư đại tràng người cũng

như các dòng tế bào ung thư khác, làm cơ sở tiến tới các thử nghiệm lâm sàng

ở các giai đoạn khác nhau sử dụng phối hợp 2 virus vaccine này điều trị bệnh

nhân ung thư.

143

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ

NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI, LUẬN ÁN

1. Le Duy Cuong, Nguyen Linh Toan, Ho Anh Son, et al. (2016).

Investigation the ability to stimulate immune response by using complex

oncolytic virus measle/mump in nude mouse model bearing human colon

cancer. Journal of Military Pharmaco-medicine, 7:17-21.

2. Lê Duy Cương, Hồ Anh Sơn, Nguyễn Lĩnh Toàn. (2018). Đánh giá

hiệu quả ly giải tế bào u đại trực tràng của vắc xin virut sởi và quai bị dùng

phối hợp in vitro. Tạp chí Y Dược học Quân sự, 2:24-31.

3. Lê Duy Cương, Hồ Anh Sơn, Nguyễn Lĩnh Toàn và cs. (2018). Tác

dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi và quai bị dùng phối hợp trên chuột

thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đạii trực tràng người. Tạp chí Y Dược

học Quân sự, 3:38-44.

4. Ho Anh Son, LiFeng Zhang, Bui Khac Cuong, Hoang Van Tong, Le

Duy Cuong, Ngo Thu Hang, Hoang Thi My Nhung, Naoki Yamamoto &

Nguyen Linh Toan. (2018). Combination of vaccine-strain measles and

mumps viruses enhances Oncolytic Activity against Human Solid

Malignancies. Cancer investigation, 36(2):106–117.

144

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dock G. (1904). The inﬂuence of complicating diseases upon

leukaemia. American journal of medical science, 127:561-592.

2. Hoster H.A., Zanes R.P., Haam E.V. (1949). The association of “viral”

hepatitis and Hodgkin’s disease. Cancer research, 9:473-480.

3. Kelly.E., Russell S.J. (2007). History of oncolytic viruses: genesis to

genetic engineering. Molocular therapy, 15(4):651-659.

4. Mineta T., Rabkin S.D., Martuza R. (1994). Treatment of malignant

gliomas using Ganciclovir-hypersensitive, ribonucleotide reductase-

deficient Herpes Simplex viral mutant. Cancer research, 54:3963-3966.

5. Marelli G., Howells A., Nicholas R., et al. (2018). Oncolytic viral

therapy and the immune system: A double-edged sword against cancer.

Frontiers in immunology, 9 (866):1-8.

6. Yu W., Fang H. (2007). Clinical trials with oncolytic adenovirus in

China. Current cancer drug targets, 7:659-670.

7. Cofﬁn R. (2016). Inventor of T-VEC: the ﬁrst oncolytic immunotherapy

approved for the treatment of cancer. Immunotherapy, 8(2):103-106.

8. Gauvrit A., Brandler S., Sapede P.C., et al. (2008). Measles virus

induces oncolysis of mesothelioma cells and allows dendritic cells to

cross-prime tumor-specific CD8 response. Cancer research, 68(12):

4882-4892.

9. Guillerme J.B., Boisgerault N., Roulois D., et al. (2013). Measles virus

vaccine-infected tumor cells induce tumor antigen cross-presentation by

plasmacytoid dendritic cells. Clinical cancer research, 19(5):1147-1158.

10. Colorectal cancer statistics. (2017). Despite dramatic drops in overall

incidence and mortality, striking disparities remain. Cancer journal for

clinician, doi: 10.3322/caac.21395.

145

11. Jemal A., Bray F., Center M.M., et al. (2011), Global cancer statistics.

CA cancer journal of clinicians, 61(2):69-90.

12. Doubeni C.A., Major J.M, Laiyemo A.O., et al. (2012). Contribution of

behavioral risk factors and obesity to socioeconomic differences in

colorectal cancer incidence. Journal national cancer institute, 104:1353-

1362.

13. Rashtak S., Rrego R., Sweetser S.R., et al. (2017). Sessile serrated polyps

and colon cancer prevention. Cancer prevention research, 1-33.

14. Goldstein N.S. (2006). Serrated pathway and APC (conventional)-type

colorectal polyps: Molecular-morphologic correlations, genetic

pathways, and implications for classification. American journal of

clinical pathology, 125:146-153.

15. Santos P.J.M., Muñoz G.S. (2016). Biomarkers of colorectal cancer: A

genome-wide perspective. Cancer translational medicine., 2(6):182-188.

16. Nosho K., Irahara N., Shima K., et al. (2008). Comprehensive

biostatistical analysis of CpG island methylator phenotype in colorectal

cancer using a large population-based sample. PLoS One, 3(11):1-12.

17. Motoyama K., Inoue H., Takatsuno Y., et al. (2009). Over- and under-

expressed microRNAs in human colorectal cancer. International journal

of oncology, 34:1069-1075.

18. Mima K., Nishihara R., Yang J., et al. (2016). MicroRNA MIR21 (miR-

21) and PTGS2 expression in colorectal cancer and patient survival.

Clinical cancer research, 22(15):3841-3848.

19. Wang C.J., Zhou Z.G., Wang L., et al. (2009). Clinicopathological

significance of micro-RNA-31, -143 and -145 expression in colorectal

cancer. Disease markers, 26:27-34.

146

20. EKO N., Tsang W.P., Ng S.S.M., et al. (2009). Micro RNA-143 targets

DNA methyltransferases 3a in coloractal cancer. British journal of

cancer, 101:699-706.

21. Suzuki H.I., Yamagata K., Sugimoto K., et al. (2009). Modulation of

microRNA processing by p53. Nature, 460:529-533.

22. Bandres E., Agirre X., Bitarte N., et al. (2009). Epigenetic regulation of

microRNA expression in colorectal cancer. International journal of

cancer, 125:2737-2743.

23. Knudson A.G. (1971). Mutation and cancer: Statistical study of

retinoblastoma. Proceedings of the national academy of sciences of the

United States of America, 68(4):820-823.

24. Robertson K.D., Uzvolgyi E., Liang G., et al. (1999). The human DNA

methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: Coordinate mRNA

expression in normal tissues and overexpression in tumors. Nucleic acids

research, 27(11):2291-2298.

25. Parry L., Clarke, A.R. (2011). The roles of the methyl-CpG binding

proteins in cancer. Genes and cancer, 2(6):618-630.

26. Hampel H., Frankel W., Panescu J., et al. (2006). Screening for Lynch

syndrome (hereditary nonpolyposis colorectal cancer) among

endometrial cancer patients. Cancer research, 66(15):7810-7817.

27. Ligtenberg M.J., Kuiper R.P., Chan T.L., et al. (2009). Heritable somatic

methylation and inactivation of MSH2 in families with Lynch syndrome

due to deletion of the 3' exons of TACSTD1. Nature genetics,

41(1):112-117.

28. Fukuhara S., Chang I., Mitsui Y., et al. (2014). DNA mismatch repair

gene MLH1 induces apoptosis in prostate cancer cells. Oncotarget,

5(22):11297-11307.

147

29. Shen L., Toyota M., Kondo Y., et al. (2007). Integrated genetic and

epigenetic analysis identifies three different subclasses of colon cancer.

Proceeding of the national academy sciences, 104(47):18654-18659.

30. Akhtar Z.B., Cowper S.L.R., Corradin O., et al. (2012). Epigenomic

enhancer profiling defines a signature of colon cancer. Science,

336(6082):736-739.

31. Swets M., Zaalberg A., Boot A., et al. (2017). Tumor LINE-1 methylation

level in association with survival of patients with stage II colon cancer.

International journal molecular sciences, 18(36):1-12.

32. Antelo M., Balaguer F., Shia J., et al. (2012). A high degree of LINE-1

hypomethylation is a unique feature of early-onset colorectal cancer. PLOS

One, 7:1-12.

33. Ogino S., Nishihara R., Lochhead P., et al. (2013). Prospective study of

family history and colorectal cancer risk by tumor LINE-1 methylation

level. Journal of the national cancer institute, 105:130-140.

34. Kouzarides T. (2007). Chromatin modification and their funtion. Cells,

128:693-705.

35. Weichert W., Roske A., Niesporek S., et al. (2008). Class I histone

deacetylase expression has independent prognostic impact in human

colorectal cancer: Specific role of class I histone deacetylases in vitro and

in vivo. Clinical cancer research, 14(6):1669-1677.

36. Ashktorab H., Belgrave K., Hosseinkhah F., et al. (2010). Global histone

H4 acetylation and HDAC2 expression in colon adenoma and carcinoma.

Digestive diseases and sciences, 54(10):2109-2117.

37. Nosho K., Shima K., Irahara N., et al. (2010). SIRT1 histone

deacetylase expression is associated with microsatellite instability and

CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Modern

pathology, 22(7):922-932.

148

38. Barski A., Cuddapah S., Cui K., et al. (2007). High-resolution profiling

of histone methylations in the human genome. Cell, 129:823-837.

39. Chi P.C., Allis D., Wang G.G. (2010), Covalent histone modifications:

miswritten, misinterpreted, and miserased in human cancers, Nature

review cancer, 10(7):457-469.

40. Kang M.Y., Lee B.B., Kim Y.H., et al. (2007). Association of the

SUV39H1 histone methyltransferase with the DNA methyltransferase 1

at mRNA expression level in primary colorectal cancer. International

journal of cancer, 121:2192-2197.

41. Matveeva O.V., Guo Z.S., Senin V.M., et al. (2015). Oncolysis by

paramyxoviruses: Preclinical and clinical studies. Molecular therapy

oncolytics, 2:1-14.

42. Kubota M., Takeuchi K., Watanabe S. (2016). Trisaccharide containing

α2,3-linked sialic acid is a receptor for mumps virus. Proceedings of the

national academy sciences, 113(41):11579-11584.

43. Lin L.T., Richardson C.D. (2016). The host cell receptors for measles

virus and their interaction with the viral hemagglutinin (H) protein.

Viruses, 8(250):1-29.

44. Cattaneo R. (2010). Paramyxovirus entry and targeted vectors for cancer

therapy. PLOS pathogens, 6:1-4.

45. Matveeva O.V., Guo Z.S., Shabalina S.A., et al. (2015). Oncolysis by

paramyxoviruses: multiple mechanisms contribute to therapeutic

efficiency. Moleculer therapy oncolytics, 2:1-11.

46. Cuddington B.P., Mossman K.L., (2014). Permissiveness of human

cancer cells to oncolytic bovine herpesvirus 1 is mediated in part by

KRAS activity. Journal of virology, 88(12):6885–6895.

149

47. Arulanandam R., Batenchuk C., Angarita F.A., et al. (2015). VEGF-

mediated induction of PRD1-BF1/ Blimp1 expression sensitizes tumor

vasculature to oncolytic virus infection. Cancer cell, 28(2):210-224.

48. Bateman A.R., Harrington K.J., Kottke T., et al. (2002). Viral fusogenic

membrane glycoproteins kill solid tumor cells by nonapoptotic

mechanisms that promote cross presentation of tumor antigens by

dendritic cells. Cancer research, 62:6566-6578.

49. Zamarin D., Holmgaard R.B., Subudhi S.K., et al. (2014). Localized

oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune

checkpoint blockade immunotherapy. Science translocation medicine,

6(226):1-20.

50. Guo Z.S., Liu Z., Bartlett D.L. (2014). Oncolytic immunotherapy: Dying

the right way is a key to eliciting potent antitumor immunity. Frontiers

in oncology, 4:1-11.

51. Inoue H., Tani. K. (2014). Multimodal immunogenic cancer cell death as

a consequence of anticancer cytotoxic treatments. Cell death and

differentiation, 21:39-49.

52. Guillerme J.B., Marc G., Tangy F., et al. (2013). Antitumor virotherapy

by attenuated measles virus. Biology, 2:587-602.

53. Rozières A., Viret C., Faure M. (2017). Autophagy in measles virus

infection. Viruses, 9:1-13.

54. Delpeut S., Rudd P.A., Labonte P., et al. (2012). Membrane fusion-

mediated autophagy induction enhances morbillivirus cell-to-cell spread.

Journal of virology, 86(16):8527-8535.

55. Gotoh B., Komatsu T., Takeuchi K., et al. (2001). Paramyxovirus

accessory proteins as interferon antagonists. Microbiol. Immunol,

45(12):787-800.

150

56. Takeuchi K., Kadota S.I., Takeda M., et al. (2003). Measles virus V

protein blocks interferon (IFN)-alpha/beta but not IFN-gamma signaling

by inhibiting STAT1 and STAT2 phosphorylation. Federation of

european biochemical societies letters, 545:177-182.

57. Takayama I., Sato H., Watanabe A., et al. (2012). The nucleocapsid

protein of measles virus blocks host interferon response. Virology,

424:45–55.

58. Shaffer J.A., Bellini W.J., Rota P.A. (2003). The C protein of measles

virus inhibits the type I interferon response. Virology, 315:389-397.

59. Haus O. (2000). The Genes of interferons and interferon-related factors:

Localization and relationships with chromosome aberrations in cancer.

Archivum immunologiae et therapiae experimentalis, 48:95-100.

60. Donnelly O.G., Errington-Mais F., Steele L., et al. (2013). Measles virus

causes immunogenic cell death in human melanoma. Gene therapy,

20(1):7-15.

61. Angel K.T., Dewhurst S., Perry S.W., et al. (1995). Tumor necrosis

factor alpha-induced apoptosis in human neuronal cells: Protection by

the antioxidant N-acetylcysteine and the genes bcl-2 and crmA.

Moleculer and cellular biology, 15(5):2359-2366.

62. Vivier E., Raulet D.H., Moretta A., et al. (2011). Innate or adaptive

immunity? The example of natural killer cells. Science, 331(6013): 44-49.

63. Arnon T.I., Achdout H., Lieberman N., et al. (2004), The mechanisms

controlling the recognition of tumor- and virus-infected cells by NKp46.

Blood, 103(2):664-672.

64. Chinnery F., King C.A., Elliott T., et al (2012). Viral antigen mediated

NKp46 activation of NK cells results in tumor rejection via NK-DC

crosstalk. Oncoimmunology, 1(6):874-883.

151

65. Komaru A., Ueda Y., Furuya A., et al. (2009). Sustained and NK/CD4+ T

cell-dependent efficient prevention of lung metastasis induced by

dendritic cells harboring recombinant Sendai virus. Journal of

immunology, 1-9.

66. Kato T., Ueda Y., Kinoh H., et al. (2010). RIG-I helicase-independent

pathway in sendai virus-activated dendritic cells is critical for preventing

lung metastasis of AT6.3 prostate cancer. Neoplasia, 12(11):906-914.

67. Komminoth P., Roth J., Lackie P.M., et al. (1991). Polysialic acid of the

neural cell adhesion molecule distinguishes small cell lung carcinoma

from carcinoids. American journal of pathology, 139(2):297-304.

68. Vierbuchen M.J., Fruechtnicht W., Brackrock S., et al. (1995).

Quantitative lectinhistochemical and immunohistochemical studies on

the occurrence of alpha (2,3)- and alpha (2,6)-linked sialic acid residues

in colorectal carcinomas. Cancer, 76(5):727-735.

69. Ammerman N.C., Beier-Sexton M., Azad A.F. (2008). Growth and

maintenance of Vero cell lines. Curr protocol microbiol, 1-10.

70. Martínez-Maqueda D., Miralles B., Recio I. (2015). HT29 cell line. The

Impact of food bioactives on gut health, 113-124.

71. Grigorov B., Rabilloud J., Lawrence P., et al. (2011). Rapid titration of

measles and other viruses: Optimization with determination of

replication cycle length. PlOS One, 6:1-12.

72. Pourianfar H.R., Javadi A., Grollo L. (2012). A Colorimetric-based

accurate method for the determination of enterovirus 71 titer. Indian

journal virological, 23(3):303-310.

73. Zhang L.F., Tan D.Q.C., Jeyasekharan A.D., et al. (2014). Combination

of vaccine-strain measles and mumps virus synergistically kills a wide

range of human hematological cancer cells: Special focus on acute

myeloid leukemia. Cancer letters, 1-9.

152

74. Myers R., Greiner S., Harvey M., et al. (2005). Oncolytic activities of

approved mumps and measles vaccines for therapy of ovarian cancer.

Cancer gene therapy, 12:593-599.

75. Ohtsuji M., Lin Q., Okazaki H., et al. (2018). Anti-CD11b antibody

treatment suppresses the osteoclast generation, inflammatory cell

infiltration, and autoantibody production in arthritis-prone FcγRIIB-

deficient mice. Arthritis research & therapy, 20(25):1-11.

76. Stenström M., Sköld M., Ericsson A., et al. (2004). Surface receptors

identify mouse NK1.1+ T cell subsets distinguished by function and T

cell receptor type. Euro journal immunology, 34:56-65.

77. Holst K., Guseva D., Schindler S., et al. (2015). The serotonin receptor

5-HT7R regulates the morphology and migratory properties of dendritic

cells. Journal of cell science, 128:2866-2880.

78. Boisgerault N., Guillerme J.B., Pouliquen D., et al. (2013). Natural

oncolytic activity of live-attenuated measles virus against human lung

and colorectal adenocarcinomas. Biology medicine research

international, 1-11.

79. Fox J.P., Koprowski H., Conwell D.P., et al. (1957).

Study of antirabies immunization of man: Observations with HEP

flury and other vaccines, with and without hyperimmune serum, in

primary and recall immunizations. Bull World Health Organization,

17(6):869–904.

80. Enders J.F., Weller T.H., Robbins F.C. (1949). Cultivation of the

lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human

embryonic tissues. Science, 109(2822):85-87.

81. Barrett P.N., Mundt W., Kistner O., et al. (2009). Vero cell flatform in

vaccine production: moving towards cell cuture-based viral vaccine.

Expert reviews vaccine, 8(5):607-618.

153

82. Reed L.J., Muench H. (1938). A simple method of estimating fifty

percent endpoints. American journal of epidemiology, 27(3):493-497.

83. LaBarre D.D., Lowy R.J. (2001). Improvements in methods for

calculating virus titer estimates from TCID50 and plaque assays. Journal

virological methods, 96:107-126.

84. Smither S.J., Lear R.C., Biggins J., et al. (2013). Comparison of the plaque

assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for

measuring filovirus infectivity. Journal of virological methods, 193:565-

571.

85. Cattaneo R. (2010). Paramyxovirus entry and targeted vectors for cancer

therapy. PLOS pathogens, 6:1-4.

86. Peng K.W., Ten E.C.J., Galanis E., et al. (2002). Intraperitoneal therapy

of ovarian cancer using an engineered measles virus. Cancer research,

62:4656-4662.

87. Zhao D., Chen P., Yang H., et at. (2013). Live attenuated measles virus

vaccine induces apoptosis and promotes tumor regression in lung cancer.

Oncology reports, 29:199-204.

88. Yan Y., Liang B., Zhang J., et al. (2015). Apoptotic induction of lung

adenocarcinoma A549 cells infected by recombinant RVG Newcastle

disease virus (rL‑RVG) in vitro. Molecular medicine reports, 11:317-326.

89. Salimi V., Tavakoli Y.M., Mahmoodi M., et al. (2013). The Oncolytic

effect of respiratory syncytial Virus (RSV) in human skin cancer cell

line, A431. Iranian red crescent medical journal, 15(1):62-67.

90. Okunaga S., Takasu A., Meshii N., at el. (2015). Entry of oncolytic

Herpes Simplex virus into human squamous cell carcinoma cells by

ultrasound. Viruses, 7:5610-5618.

154

91. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. (1972). Apoptosis: A basic

biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue

kinetics. Britain journal cancer, 26:239-257.

92. Nichols W.W., Levan A., Aura P., et al. (1965). Chromosome damage

associated with the measles virus in vitro. Hereditas, 54(6):101-118.

93. Robbins S.J. (1983). Progressive invasion of cell nuclei by measles virus

in persistently infected human cells. Journal gene viralogy, 64:2335-

2338.

94. Johnson V.L., Ko S.C.W., Holmstrom T.H., et al. (2000). Effector

caspases are dispensable for the early nuclear morphological changes

during chemical-induced apoptosis. Journal cell science, 113:2941-2953.

95. Ziegler U., Groscurth P. (2004). Morphological features of cell death.

News physiological science, 19:124-128.

96. Lim Y.J., Choi J.A., Choi H.H., et al. (2011). Endoplasmic reticulum

stress pathway mediated apoptosis in macrophages contributes to the

survival of mycobacterium tuberculosis. PLOS One, 6(12):1-10.

97. Prasad A., Lu M., Lukac D.M., et al. (2012). An alternative Kaposi's

sarcoma-associated Herpes virus replication program triggered by host

cell apoptosis. Journal of virology, 1-55.

98. Obregón H.A., Duque C.M.A., Rojas M., et al. (2012). Stable

extracellular RNA fragments of mycobacterium tuberculosis induce

early apoptosis in human monocytes via a caspase-8 dependent

mechanism. PLOS One, 7(1):1-11.

99. Nakagawaa T., Yuana J. (2000). Cross-talk between two cysteine

protease families: Activation of caspase-12 by calpain in apoptosis. The

journal of cell biology, 150(4):887-894.

155

100. Herbein G., Brien W.A.O. (2000). Tumor necrosis factor (TNF)-alpha

and TNF receptors in viral pathogenesis. Proceedings of the society for

experimental biology and medicine, 223:241-257.

101. Bhaskar A., Bala J., Varshney A., et al. (2011). Expression of measles

virus nucleoprotein induces apoptosis and modulates diverse functional

proteins in cultured mammalian cells. PLOS One, 6(4):1-12.

102. Esolen L.M., Park S.W., Hardwick J.M., Griffin D.E. (1995). Apoptosis

as a cause of death in measles virus-infected cells. Journal of virology,

69(6): 3955-3958.

103. Zhou S., Li Y., Huang F., et al. (2012). Live-attenuated measles virus

vaccine confers cell contact loss and apoptosis of ovarian cancer cells via

ROS induced silencing of E-cadherin by methylation. Cancer letters,

318(1):14-25.

104. Miki S., Yamada H., Orita T., et al. (1991). Suicide process of renal cell

carcinoma cells encountering mumps virus. Federation of European

biochemical societies letters, 278(2):179-182.

105. Ulane C.M., Rodriguez J.J., Parisien J-P., et al. (2003). STAT3

ubiquitylation and degradation by mumps virus Suppress cytokine and

oncogene signaling. Journal of virology, 77(11):6385-6393.

106. Boisgerault N., Guillerme J.B., Pouliquen D., et al. (2013). Natural

oncolytic activity of live-attenuated measles virus against human lung and

colorectal adenocarcinomas. Bio-medicine research international, 1-12.

107. Phuong L.K., Allen C., Peng K.W., et al. (2003). Use of a vaccine strain

of measles virus genetically engineered to produce carcinoembryonic

antigen as a novel therapeutic agent against glioblastoma multiforme.

Cancer research, 63(10):2462-2469.

156

108. Liu C., Sarkaria J.N., Petell C.A., et al. (2007). Combination of measles

virus virotherapy and radiation therapy has synergistic activity in the

treatment of glioblastoma multiforme. Clinical cancer research,

13(23):7155-7165.

109. Richetta C., Gregoire I.P., Verlhac P., et al. (2013). Sustained autophagy

contributes to measles virus infectivity. PLOS pathogens, 9(9):1-15.

110. Xia M., Meng G., Jiang A., et al (2014). Mitophagy switches cell death

from apoptosis to necrosis in NSCLC cells treated with oncolytic

measles virus. Oncotarget, 5(11):1-15.

111. Msaouel P., Iankov I.D., Dispenzieri A., Galanis E. (2012). Attenuated

oncolytic Measles Virus strains as cancer therapeutics. Curr

pharmaceutical biotechnology, 13(9):1732-1741.

112. Heinzerling L., Kunzi V., Oberholzer P.A., et al (2005). Oncolytic

measles virus in cutaneous t-cell lymphomas mounts antitumor immune

responses in vivo and targets interferon-resistant tumor cells. Blood,

106(7):2287-2294.

113. Galanis E., Hartmann, L.C., Cliby W.A., et al. (2010). Phase I trial of

intraperitoneal administration of an oncolytic measles virus strain

engineered to express carcinoembryonic antigen for recurrent ovarian

cancer. Cancer research, 70(3):875-882.

114. Asada T. (1974). Treatment of human cancer with mumps virus. Cancer,

34: 1907-1928.

115. Ammayappan A., Russell S.J., Federspiel M.J. (2016). Recombinant

mumps virus as a cancer therapeutic agent. Molecular therapy-

Oncolytics, 3:1-10.

116. Boisgerault N., Tangy F., Gregoire M. (2010). New perspectives in

cancer virotherapy: bringing the immune system into play.

Immunotherapy, 2(2):185-199.

157

117. Chiocca E.A., Rabkin S.D. (2014). Oncolytic Viruses and Their

Application to Cancer Immunotherapy. Cancer immunol research,

2(4):295-300.

118. Ferlazzo G., Thomas D., Lin S.L., et al. (2004). The abundant NK Cells

in human secondary lymphoid tissues require activation to express killer

cell Ig-like receptors and become cytolytic. Journal of immunology, 172:

1455-1462.

119. Michel T., Poli A., Domingues O., et al. (2012). Mouse lung and spleen

natural killer cells have phenotypic and functional differences, in part

influenced by macrophages. PLOS One, 7(12):1-7.

120. Teng L.M.W., Swann J.B., Koebel C.M., et al. (2008). Immune-

mediated dormancy: an equilibrium with cancer. Journal of leukocyte

biology, 84:988-993.

121. Caro D.G., Marchesi F., Laghi L., et al. (2013). Immune cells: plastic

players along colorectal cancer progression. Journal of cellular and

molecular medicine, 17(9):1088-1095.

122. Dunn G.P., Old L.J., Schreiber R.D. (2004). The three Es of cancer

immunoediting. Annual review of immunology, 22:329-360.

123. Ahn G.O., Martin Brown J. (2008). Matrix metalloproteinase-9 is required

for tumor vasculogenesis but not for angiogenesis: Role of bone marrow-

derived myelomonocytic cells. Cancer cell, 13(3):193-205.

124. Grote D., Cattaneo R., Fielding A.K. (2003). Neutrophils contribute to

the measles virus-induced antitumor effect: Enhancement by granulocyte

macrophage colony-stimulating factor expression. Cancer research,

63:6463-6468.

125. Palucka K., Banchereau J. (2013). Cancer immunotherapy via dendritic

cells. Nature reviews cancer, 12(4):265-277.

158

126. Lakomy D., Janikashvili N., Fraszczak J., et al. (2018). Cytotoxic

dendritic cells generated from cancer patients. The journal of

immunology, 1-8.

127. Guillerme J.B., Boisgerault N., Roulois D. (2013). Measles virus

vaccine-infected tumor cells induce tumor antigen cross-presentation by

human plasmacytoid dendritic cells. Clinical cancer research, 1-31.

128. Bras M.L., Rouy I., Brenner C. (2006). The modulation of inter-

organelle cross-talk to control apoptosis. Medicinal chemistry, 2:1-12.

129. Sevrioukova I.F. (2011). Apoptosis-inducing factor: Structure, function,

and redox regulation. Comprehensive invited review, 14(12):2545-2579.

130. Santin G., Scietti L., Veneroni P., et al. (2012). Effects of cisplatin in

neuroblastoma rat cells: damage to cellular organelles. Inernational

journal of cell biology, 1-6.

131. Bastian A.M., Yogesh T.L., Kumaraswamy K.L. (2018). Various

methods available for detection of apoptotic cells-A review. Indian

journal of cancer, 50(3):274-283.

132. Liu X., Li P., Widlak P., (1998). The 40kDa subunit of DNA

fragmentation factor induces DNA fragmentation and chromatin

condensation during apoptosis. Proceedings of the national academy of

sciences USA, 95:8461-8466.

133. Núñez R., Sancho-Martníez S.M., Novoa J.M., et al. (2010). Apoptotic

volume decreases as a geometric determinant for cell dismantling into

apoptotic bodies. Cell death differentiation, 17:1665-1671.

134. Soldani C., Croce A.C., Bottone M.G., et al. (2007). Apoptosis in tumour

cells photosensitized with Rose Bengal acetate is induced by multiple

organelle photodamage. Histochemistry and cell biology, 128:485–495.

135. Grimm S. (2012). The ER-mitochondria interface: the social network of

cell death. Biochimica et biophysica acta, 1823:327-334.

159

136. Bottone M.G., Santin G., Aredia F., et al. (2013). Morphological features of

organelles during apoptosis: An overview. Cells, 2:294-305.

137. Johansson A.C., Appelqvist H., Nilsson C., et al. (2010). Regulation of

apoptosis-associated lysosomal membrane permeabilization. Apoptosis,

15:527-540.

138. Kroemer G., Petit P., Zamzami N., et al. (1995). The biochemistry of

programmed cell death. Federation of American societies for

experimental biology journal, 9:1277-1287.

139. Candé C., Cecconi F., Dessen P., et al. (2002). Apoptosis-inducing factor

(AIF): key to the conserved caspase-independent pathways of cell death.

Journal of cell science, 115:4727-4734.

140. Yang L., Liu Y., Wang M., et al. (2016). Quercetin-induced apoptosis of

HT-29 colon cancer cells via inhibition of the Akt-CSN6-Myc signaling

axis. Molecular medicine reports, 1-8.

141. Waziri P.M., Abdullah R., Yeap S.K., et al. (2016). Clausenidin induces

caspase-dependent apoptosis in colon cancer. Biomedicine central

complementary and alternative medicine, 16:1-12.