Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh đối kháng nấm gây bệnh thực vật trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk

1

MỞ ĐẦU

Hồ tiêu đen (Piper nigrum L.), đồng nghĩa với danh hiệu "vua gia vị", là một loại cây nho có hoa thuộc họ Piperaceae có nguồn gốc từ bờ biển Malabar ở Nam Ấn Độ (Nazeem et al., 2008). Tại Việt Nam, cây hồ tiêu được trồng chủ yếu tại 9 tỉnh trọng điểm của nước ta, với tổng diện tích 100.000 ha, trong đó, Tây Nguyên là vùng có nhiều tiềm năng về đất đai, khí hậu để mở rộng diện tích trồng tiêu (4 tỉnh Tây Nguyên: Gia Lai, Đăk Lăk, Đăk Nông và Lâm Đồng đã chiếm 55.339 ha). Tuy diện tích hồ tiêu chỉ chiếm 2,5% trong tổng số 2 triệu ha trồng cây công nghiệp lâu năm nhưng giá trị xuất khẩu đạt khoảng 7.000 USD/ha, gấp 2,6 lần cà phê, 6 lần cây chè, 3,8 lần cây điều, gấp 4 lần cây cao su.

Tuy có nhiều lợi thế để phát triển, song thực tế trong những năm qua cây hồ tiêu vẫn chưa thực sự đứng vững, thậm chí nhiều thời điểm người sản xuất còn lao đao bởi cây tiêu chết hàng loạt do chạy theo giá thị trường, phát triển cây tiêu không theo quy hoạch, không chú trọng đến việc cải tạo đất, không xử lý mầm bệnh. Một số diện tích tiêu trồng trên những vùng đất không phù hợp, trồng một cách tạm bợ không được chăm sóc theo đúng quy trình kỹ thuật, giống tiêu không rõ nguồn gốc,... khiến tình hình sâu bệnh hại trên cây

hồ tiêu ngày càng phát triển mạnh. Bệnh hại nghiêm trọng nhất hiện nay đối

với hồ tiêu là bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora và bệnh chết chậm có

thể do sự cộng hợp của các tác nhân nấm Fusarium sp., Rhyzoctonia sp., Pythium sp., tuyến trùng Meloidogyne sp., gây ra.

Ở nước ta hiện nay, việc phòng trừ dịch hại trên cây tiêu chủ yếu bằng

biện pháp hóa học thường gặp nhiều khó khăn, vì không những khó tiêu diệt

được bào tử nấm gây bệnh, mà còn ảnh hưởng đến sinh vật, côn trùng có lợi

làm mất cân bằng sinh thái. Hướng sử dụng vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh trong phòng chống bệnh cho cây trồng nói chung và cây hồ tiêu nói

riêng, được xem là giải pháp cần thiết nhằm thay thế các loại thuốc hoá học

gây độc hại môi trường. Đối với bệnh hại trên hồ tiêu đã được nghiên cứu và có nhiều triển vọng ứng dụng vào thực tế sản xuất, như sử dụng một số loài

2

nấm Dactylella oviparasitica, Arthrobotrys oligospore, Verticillium chlamydosporium, Monacrosporium gepgyropagum có khả năng diệt tuyến

trùng hay nấm Trichoderma đang được sử dụng khá phổ biến trong phòng trừ

nấm Phytophthora trên cây hồ tiêu (Ngô Thị Xuyên, 2002).

Sử dụng vi sinh vật đối kháng phân lập từ đất sẽ khống chế kìm hãm các

vi sinh vật gây bệnh, đây chính là hiệu quả của việc quản lý dịch hại dựa trên

cơ sở bảo vệ cân bằng sinh thái trong đất. Tuy nhiên, biện pháp phòng trừ sinh học bằng các vi sinh vật nội sinh đối kháng chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta. Vì vậy, nghiên cứu đa dạng vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu, trên cơ sở đó chọn lựa ra những chủng có khả năng kháng nấm và tuyến trùng là việc làm cấp thiết nhằm hạn chế sử dụng thuốc hóa học, phát triển phong phú quần thể vi sinh vật có lợi sẽ giúp

cho cây trồng phát triển, tăng sức đề kháng sâu bệnh. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh đối kháng nấm gây bệnh thực vật trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk” với mục đích nghiên cứu sự đa dạng, phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu, với các nội dung chính sau đây:

1. Phân lập và đánh giá sự phân bố vi khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu ở

Đắk Lắk;

2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng diệt nấm gây

bệnh trên cây hồ tiêu cao ở Đắk Lắk;

3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại và an toàn sinh học của

chủng được tuyển chọn;

4. Nghiên cứu môi trường và điều kiện nuôi cấy cho sinh trưởng, phát triển của các chủng được tuyển chọn và thử nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh trên lá hồ tiêu.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY HỒ TIÊU, BỆNH NẤM TRÊN CÂY HỒ TIÊU

1.1.1. Cây hồ tiêu và tiềm năng phát triển cây hồ tiêu ở Việt Nam

Hình 1.1: Cây hồ tiêu

Hạt tiêu đen (Piper nigrum L.), đồng nghĩa với danh hiệu "vua gia vị", là một loại cây nho có hoa thuộc họ Piperaceae có nguồn gốc từ bờ biển Malabar ở Nam Ấn Độ (Ravindran, 2000; Nazeem et al., 2008). Hồ tiêu được lan truyền bởi thương nhân Hindu và du khách đến Malaysia và Indonesia. Ngày nay, Hồ tiêu được trồng thương mại ở các vùng nhiệt đới bao gồm Malabar, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Brazil, Sri Lanka, Việt Nam và Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa để hỗ trợ nhu cầu tiêu thụ tiêu đen trên toàn thế giới (Victor R. Preedy, 2016). Tại Việt Nam, cây hồ tiêu được trồng ở nhiều vùng sinh thái như ở miền đồi núi đất đỏ, miền trung như tỉnh Quảng Trị hoặc vùng Đông Nam Bộ và các tỉnh Tây Nguyên. Tuy nhiên, hồ tiêu chủ yếu trồng tại 9 tỉnh trọng điểm của nước ta, với tổng diện tích 100.000 ha, trong đó, Tây Nguyên là vùng có nhiều tiềm năng về đất đai, khí hậu để mở rộng diện tích trồng tiêu (4 tỉnh Tây Nguyên: Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng đã chiếm 55.339 ha). Hồ tiêu là loại cây trồng khó tính, mẫn cảm với sự thay đổi thất thường của thời tiết, mặt khác bộ rễ cây tiêu rất dễ tổn thương bởi các tác động từ bên ngoài và khi bộ rễ đã tổn thương thì không hút được nước, các chất dinh dưỡng, tạo cho các loại sâu bệnh hại thừa cơ xâm nhập để tàn phá. Phytophthora capsici là tác nhân gây bệnh chết nhanh ở thực vật thường được coi là tác nhân gây bệnh thối rữa và bệnh rụng lá ở tiêu (Anandaraj và Sarma, 1995a, Babadoost, 2005, Nguyen, V.L. (2015).

4

1.1.2. Hiện trạng canh tác trồng cây hồ tiêu ở Đắk Lắk

Theo Thống kê của ngành nông nghiệp, hồ tiêu được trồng khoảng 100.000ha chủ yếu là Đông Nam Bộ và Tây Nguyên và là một trong những loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế và giá trị xuất khẩu cao. Tuy diện tích hồ tiêu chỉ chiếm 2,5% trong tổng số 2 triệu ha trồng cây công nghiệp lâu năm, giá trị xuất khẩu đạt khoảng 7.000 USD/ha, gấp 2,6 lần cà phê, 6 lần cây chè, 3,8 lần cây điều, gấp 4 lần cây cao su (Quyết định 1442/QĐ-BNN-TT ngày 3/7/2014 của Bộ NN và PTNN). Tuy có nhiều lợi thế để phát triển song thực tế trong những năm qua cây hồ tiêu vẫn chưa thực sự đứng vững, thậm chí nhiều thời điểm người sản xuất còn lao đao bởi cây tiêu chết hàng loạt do chạy theo giá thị trường, phát triển cây tiêu không theo quy hoạch, không chú trọng đến việc cải tạo đất, không xử lý mầm bệnh. Một số diện tích tiêu trồng trên những vùng đất không phù hợp, trồng một cách tạm bợ không được chăm sóc theo đúng quy trình kỹ thuật, giống tiêu không rõ nguồn gốc,... khiến tình hình sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu ngày càng phát triển mạnh. Bệnh hại nghiêm trọng nhất hiện nay đối với hồ tiêu là bệnh chết nhanh, chết chậm.

1.1.3. Bệnh cây và ảnh hưởng của bệnh nấm đối với cây trồng

Theo thống kê của Tổ chức Nông- Lương thế giới (FAO): Các loại cây trồng trên đồng ruộng hiện nay phải chống đỡ với khoản 100.000 loại sâu hại, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Chính vì vậy, hàng năm khoảng 20% sản lượng lương thực, thực phẩm trên thế giới bị mất trắng.

Trên thế giới bệnh cây đã gây ra những thiệt hại to lớn cho sản xuất nông nghiệp, chúng phá huỷ đến 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới. Riêng lúa chiếm khoảng 9%, ngô 10%, cây rau 12% và cây ăn quả 16,5%. Trong các loại bệnh cây, bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83%.

Theo Ou, 1972, trong số 45 bệnh lúa đã mô tả có tới 60% do nấm gây ra, cũng theo kết quả nghiên cứu khoa học bảo vệ thực vật 1971-1976 của Viện Bảo vệ thực vật, trong số 24 bệnh hại lúa ở Việt Nam có tới 13 bệnh do

5

nấm gây ra, 34 bệnh ngô có 26 bệnh do nấm gây ra và 21 bệnh khoai tây có 8 bệnh do nấm. Những bệnh nấm chủ yếu và có tầm quan trọng nhất, là các bệnh: đạo ôn, khô vằn, tiêm hạch, đốm nâu, thối rễ, mốc sương… Một số bệnh nấm tiêu biểu gây hại cho cây trồng được quan tâm nhiều nhất là bệnh thối thân, rễ ở thực vật do nhiều loài nấm ký sinh gây ra như Phytophthora sp., Pythium sp., Botrytis cinerespers, Diplodia sp., Fusarium sp., Rhizoctonia solani Kuln, Sclerotium batiticola Faud nhưng chủ yếu là F. oxysporum. Chỉ riêng tính ở khoai tây thiệt hại do Fusarium sp. gây bệnh thối củ trên đồng ruộng và trong bảo quản lên tới 20% số củ thu hoạch được. Ngoài ra, chúng còn gây một số bệnh khác như bệnh mốc hồng và thối thân ở ngô. Nấm Fusarium oxysorum còn gây ra bệnh héo mạch dẫn và nhiều bệnh thối thân thối rễ ở nhiều loại cây rau quả và cây lương thực như lạc, cà chua… Bệnh héo thân cây còn do Pseudomonas solanacerium là loài vi khuẩn Gram âm ký sinh đa thực vật, bào gồm nhiều chủng gây bệnh héo rũ trên 35 họ cây trồng khác nhau, rất phổ biến ở nước ta và nhiều nước trên thế giới. Bệnh héo rũ vi khuẩn là loại bệnh gây tắc ống dẫn, sau mấy ngày toàn cây héo rũ, chết khô dần.

1.1.4. Khả năng đối kháng của các vi sinh vật đối với nấm gây bệnh

thực vật

Trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật có thể kháng lại các vi sinh vật gây bệnh cho cây, nhất là đất được canh tác tốt, đúng kỹ thuật sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật có lợi phát triển cạnh tranh với các vi sinh vật có hại gây bệnh cho cây. Trong số các nhóm vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm thì vi khuẩn và xạ khuẩn có tỷ lệ đối kháng cao, có tới 40-60% các chủng xạ khuẩn sống trong đất có khả năng kháng lại các loại nấm gây bệnh cho cây trồng như nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ, nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn ở lúa, nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn ở lúa, ngô...

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, các nhà khoa học ở nhiều nước đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi sinh vật, xạ khuẩn có khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật. Theo Kamada, 1974 khi điều tra xạ khuẩn trong đất ở Nhật Bản cho thấy ở nơi có nhiều xạ khuẩn đối kháng thì ở đó có

6

các dòng Fusarium bị biến mất rất nhanh, ở Bungari những chủng xạ khuẩn chống nấm thường thuộc nhóm xám và các loài S. griseus, S. albus , S. candidus… Thông thường một loại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài loại nấm gây bệnh, nhưng cũng có loài có hoạt phổ kháng khuẩn rộng. Ví dụ, loài S. laveudulae var. huinansis có hoạt tính ức chế mạnh cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm và nấm gây bệnh. Những chủng như vậy có ưu thế làm tác nhân chống bệnh cây bằng biện pháp sinh học. Tuy nhiên khi sử dụng những chủng này phải thận trọng để tránh xạ khuẩn ức chế luôn cả khu hệ vi sinh vật có lợi trong vùng rễ, không phải tất cả các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm in vitro đều thể hiện trong đất (thường từ khoảng 4-5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc làm sạch đất khỏi nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây. Xạ khuẩn chống nấm ngoài tiết ra chất kháng sinh chúng còn tác động lên khu hệ vi sinh vật thông qua enzym dung giải - đây là phức hệ bao gồm nhiều enzym. Ngoài ra, các chủng vi sinh vật còn tiết ra các chất kích thích sinh trưởng của thực vật cũng như khu hệ vi sinh vật có lợi trong vùng rễ.

Hơn nữa, nhiều loại vi sinh vật sống cộng sinh, không gây bệnh cho người, động vật và cây trồng. Vì vậy, việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng cao và tạo chế phẩm kháng sinh kháng nấm áp dụng vào công tác bảo vệ thực vật có tầm quan trọng đặc biệt.

Ngay từ năm 1935 các nhà khoa học Liên Xô (cũ) đã dùng một số loại vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas bám vào đất để chống nấm Sclerotonia và Botrytis bảo vệ nhiều loại cây. Nhiều công trình nghiên cứu dùng nấm đối kháng như Trichoderma chống bệnh cho bông, khoai tây và cây trồng khác.

Ngay từ những năm 1930, ở Trung Quốc đã sử dụng xạ khuẩn và các chất trao đổi của chúng để nghiên cứu hạn chế các bệnh thực vật và từ năm 1950, họ đã chọn được 5406 chủng trong đó 400 chủng xạ khuẩn phân lập được từ đất vùng rễ cây bông và cỏ đinh lăng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillicum alboatrum gây bệnh thối rễ cây bông non và ứng dụng trong phòng chống bệnh cho 6 triệu ha hồng. Trong 30 năm qua Trung Quốc cũng đã dùng phân vi sinh (Yield-increasing bacteria) để phòng chống bệnh và tăng

7

năng suất cây trồng và từ năm 1979 bắt đầu nghiên cứu thử nghiệm trên 50 vụ với diện tích lớn cho kết quả khả quan. Chế phẩm phân vi sinh có thể dạng ướt hoặc nước, chúng có thể dùng để ngâm hạt, phun trên lá trộn vào hạt hoăc bón vào rễ cây. Qua thực tế phân vi sinh làm giảm nhiều loại bệnh như đạo ôn ở lúa do Rhizoctonia solari gây ra, bệnh thối củ cải đường do Gaeceme nomyces, Gramynus var. tnitia, bệnh ghẻ ở củ cải đường do Rhizoctonia cerealis, bệnh đốm lá đen ở khoai lang do Ceratocytis fibriato…

Hệ vi sinh vật trong phân vi sinh tạo ra chất kháng sinh ức chế vi sinh vật gây bệnh, sinh ra các chất có hoạt tính kháng nấm và sinh ra enzym và thúc đẩy hoạt tính enzym trong cây.

Thực tế cho thấy, hiện nay con người ngày một sử dụng rộng rãi nhiều chế phẩm kháng sinh và các chủng vi sinh vật đối kháng làm phân bón vi sinh vật sử dụng trong sản xuất nông, lâm nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao và khắc phục được các yếu tố bất lợi của thuốc hóa học.

1.1.5. Các loại bệnh gây hại trên cây hồ tiêu và biện pháp phòng

chống ở Tây Nguyên

Bảng 1.1: Các tác nhân gây bệnh gây bênh chết nhanh, chết chậm và thán thư trên cây hồ tiêu

Bệnh Tác nhân gây hại Bộ phận gây hại Mức độ phổ biến Mức độ gây hại

Phytophthora sp. +++ +++ Chết nhanh Khu vực gốc, rễ, lá, gié tiêu, quả

Fusarium sp. Rễ +++ +++ Chết chậm

+++ ++ Thán thư Colletotrichum sp. Lá, thân, gié tiêu, quả

Ghi chú: +++ rất phổ biến, rất nghiêm trọng; ++ phổ biến, trung bình; +: ít, nhẹ (Nguồn: Nguyễn Tăng Tôn, 2005)

Theo Nguyễn Tăng Tôn, 2005, trên thế giới người ta đã phát hiện có 105 loài nấm gây bệnh trên cây tiêu được phân lập từ rễ, thân, lá, đất như Pythium, Puccinia, Phytophthora, Fusarium, Alternaria, Colletotrichum,

8

Curvularia, Cylindrocarpon, Corticilium, Lasiodiplodia, Rhizoctonia, Verticillium, Cladosporium, Acremonium, Aphanoascus, Aureobasidium, Cephaliophora, Cephalosporium, Cercosporina, Fusariella, Haplariopsis, Nadsonia, Exobasidium, Didymostilbe, Haplariopsis… Trong số đó, có 3 loài nấm phổ biến Phytophthora, Fusarium và Colletotrichum gây bệnh chết nhanh, chết chậm và thán thư, và gây thiệt hại nặng đến năng suất cây hồ tiêu (Bảng 1.1).

Ngoài ra, trên cây hồ tiêu còn bị một số bệnh ít phổ biến khác mà tác nhân gây ra là nấm hại như bệnh khô cành – khô trái, bệnh nấm chỉ, bệnh nấm hồng, bệnh thối rễ do mốc trắng, bệnh héo do nấm hạch, bệnh bồ hóng.

Đối với hồ tiêu hầu hết các các bộ phận cây thân, lá và quả đều dễ bị nhiễm Phytophthora. Nấm Phytophthora được biết đến như là một loại mầm bệnh phát triển vào mùa mưa khi thời tiết ẩm ướt (Anandaraj và Sarma, 1995, Gevens et al., 2008; Lamour et al., 2012a, 2012b , Fisher et al.,2012). P. capsici thường phát sinh và phát triển lây lan trong thời gian mùa mưa, cao điểm là giai đoạn giữa và cuối mùa mưa độ ẩm tương đối cao hơn 79%, do đó bệnh Phytophthora phổ biến trong thời kỳ ẩm ướt của năm (Babadoost, 2005, Sarma et al., 2013).Sự nhiễm bệnh liên quan đến P. capsici ở Lampung, Indonesia vào năm 1885 và sau đó được xác định bởi Muller vào năm 1936 (Drenth and Guest, 2004, Sarma et al.,2013). Giữa tháng 11 năm 2010 và tháng 1 năm 2011, 13 vườn tiêu ở 4 khu vực tại bang Sarawak, Malaysia đã bị bệnh thối gốc do Phytophthora và tỷ lệ mắc bệnh rất nghiêm trọng trong thời kỳ bùng phát dịch bệnh (Farhana và cộng sự, 2013). Ulu Sarikei ở Sarikei là vùng có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất (75%), sau đó là Pasai Siong ở Sibu (70%) và thấp nhất ở Tatau ở Bintulu (5%) (Farhana et al.,2013). Trong khi đó, mức độ nghiêm trọng của bệnh được ghi nhận ở Ulu Sarikei (70%), sau đó là Pasai Siong (62%) và thấp nhất ở Tatau (4%) (Farhana et al., 2013), tác nhân gây bệnh thối gốc của tiêu được xác định là P. capsici Leonian. Qua giai đoạn dịch bệnh trên, chính quyền tại Malaysia đã khuyến cáo và nâng cao nhận thức của người dân về tác động gây hại của hóa chất diệt nấm hoá học đối với sức khoẻ, môi trường và hệ sinh thái và khuyến khích sử dụng biện pháp

9

phòng ngừa sinh học như là giải pháp an toàn để kiểm soát bệnh Phytophthora (Anandaraj và Sarma, 1995b, Marins et al., 2014). Để giảm thiểu việc áp dụng thuốc trừ nấm, mục tiêu của nghiên cứu này là sàng lọc các vi sinh vật và nấm nội sinh trên cây hồ tiêu để ức chế sự phát triển của P. capsici và nấm bệnh khác.

Hình 1.2: Hình dạng khuẩn lạc (A) và bào tử nấm (B) của nấm Fussarium gây bệnh cây hồ tiêu

Hình 1.3: Bệnh thối rễ cây hồ tiêu do nấm Phytophthora

Hình 1.4: Nấm Phytophthora tấn công dây lươn cây hồ tiêu (Ghi chú: Hình 1.1; 1.2 và 1.3 theo https://phanbondientrang.vn/cong-nghe/nam-gay- benh-tren-cay-ho-tieu-391.html)

10

Ở Việt Nam, nói đến cây hồ tiêu, trước hết là nói đến bệnh hại, đó là vấn đề lớn nhất với người trồng tiêu. Trong những năm gần đây, thiệt hại do dịch

bệnh trên cây tiêu có xu hướng tăng cả về diện tích lẫn mức độ thiệt hại. Dịch

hại phân bố rộng khắp trên các vùng trồng tiêu trong cả nước và là nguyên

nhân chính làm giảm năng suất cây tiêu, giảm tuổi thọ vườn tiêu và thu nhập của nông dân trồng tiêu. Tổng hợp tình hình thiệt hại do dịch bệnh ở 16 tỉnh trồng hồ tiêu, Cục Bảo vệ Thực vật cho biết bệnh chết nhanh, tuyến trùng và rệp sáp là ba loại dịch hại phát sinh từ đất hiện diện phổ biến và gây hại nặng cho cây tiêu ở tất cả các tỉnh, trong đó bệnh gây hại nặng nhất là bệnh chết nhanh, kế đến là tuyến trùng và rệp sáp.

Bệnh chết nhanh (Quick wilt, Phytophthora foot rot) hay còn gọi là thối gốc, rễ, chết dây trên cây tiêu. Có tên gọi như vậy là vì từ khi thấy cây tiêu “ủ rũ”, dây héo, xuống lá bắt đầu chuyển vàng, rụng nhiều lá chỉ để lại dây, sau đó cây tiêu chết rất nhanh trong vòng vài tuần lễ. Quan sát dấu hiệu cây hồ tiêu bị bệnh khi được nhổ lên thì thấy toàn bộ rễ bị thối đen nhất là phần cổ rễ, phần thân sát mặt đất bị thối rã, vỏ cây bong ra, mùi hôi nhẹ. Một khi đã xuất hiện bệnh sẽ làm cây chết hàng loạt nọc tiêu, dẫn đến việc phòng và trị bệnh rất khó khăn, tốn kém và thường không mang lại hiệu quả vì khi triệu chứng đã biểu hiện ra bên ngoài thì bộ rễ tiêu đã bị nấm tấn công trước đó 1 đến 2 tháng. Bệnh thối gốc, chết dây có nguyên nhân do một loại nấm sống dưới đất, ưa ẩm là Phytophthora (Phytophthora palmivora, Phytophthora capsici,…). Các nấm gây bệnh này thường phát sinh và phát triển lây lan trong thời gian mùa mưa, cao điểm là giai đoạn giữa và cuối mùa mưa. Nấm Phytophthora thường kết hợp với các loại nấm ở trong đất khác như Pythium, Fusarium, Rhizoctonia… cùng tấn công cây hồ tiêu làm cây chết rất nhanh. Nấm bệnh có thể xâm nhập được hầu hết tất cả các bộ phận của cây như lá, rễ, thân, nhánh…đặc biệt là phần nằm trong đất và sát mặt đất. Nếu có thêm những tác nhân từ bên ngoài tác động vào, bệnh sẽ dễ dàng phát triển thành dịch. Khi dịch đã phát sinh, sự lây lan nhanh chóng của bệnh theo kiểu vết

dầu loang do nước mưa chảy tràn. Bước vào mùa mưa, mầm bệnh có trong đất

được nước lây nhiễm lên phần trên của cây. Ở một số quốc gia khác như: Ấn

11

Độ, Malaysia, Trung Quốc, Thái Lan, Philippine còn xuất hiện thêm loài nấm P. nicotianae và loài nấm P. palmivora còn xuất hiện ở Indonesia, Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Brazil (Đoàn Nhân Ái, 2007).

Bệnh chết chậm (hay còn gọi bệnh tiêu vàng lá, bệnh tuyến trùng…) vì bệnh làm cho cây tiêu sinh trưởng chậm, lá bị vàng héo trên toàn trụ tiêu và rụng dần, ban đầu là các lá già, sau đó đến rụng đốt. Quan sát trong vườn tiêu thì bệnh xuất hiện thành từng vùng, lúc đầu là một vài cây sau đó lan sang các cây bên cạnh và tạo thành vùng bệnh. Tiêu bị bệnh chết chậm có thể vẫn cho quả nhưng năng suất cực kỳ kém, phần mạch dẫn nhựa của thân dây có màu nâu đen, và quá trình này kéo dài vài ba tháng đến cả năm. Một số cây có điều kiện dinh dưỡng tốt và tiêu tơ bộ rễ đang phát triển mạnh, thì có thể chống chọi với bệnh lên đến 2-3 năm nhưng cuối cùng vẫn chết. Bệnh chết chậm cùng với bệnh tiêu chết nhanh tạo thành cặp “song sát” gây ra nỗi ám ảnh cho người trồng tiêu, một khi tiêu đã mắc bệnh, rất dễ lây lan ra cả vườn tiêu, gây nên dịch và làm tiêu chết hàng loạt. Bộ rễ tiêu bị bệnh chết chậm phát triển kém, khi đào lên quan sát thì thấy các nốt sần nằm rải rác hoặc nằm thành từng chuỗi. Ở tiêu con (tiêu tơ mới trồng được 1-2 năm) các triệu chứng vàng lá do tuyến trùng thường dễ bị nhầm với thiếu dinh dưỡng, để nhận biết nên quan sát nếu thấy lá non teo nhỏ, bạc màu, vàng đồng loạt trên toàn trụ, bứt lá thấy khá dai. thì nên kiểm tra ngay phần rễ, nếu xuất hiện nốt sần thì khả năng cao là tuyến trùng Meloidogyne đã vào làm tổ, cây có thể sinh trưởng chậm nhưng chưa chết ngay, vào giai đoạn kinh doanh sẽ phát bệnh do bắt đầu nhiễm nấm. Theo đánh giá tại Tây Nguyên, nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chết chậm là tuyến trùng Meloidogyne incognita và một số loại nấm (Fusarium sp., Fusarium solani, Phytophthora sp., Pythium sp.) gây ra. Ban đầu tuyến trùng tấn công vào bộ rễ gây ra những vết thương tổn, tạo điều kiện cho nấm tấn công. Rễ tiêu bị nhiễm nấm yếu dần dẫn tới việc cung cấp nước và dinh dưỡng cho phần cành lá bên trên không hiệu quả. Theo thời gian sợi nấm và bào tử sẽ lan dần lên phần thân và cành, rễ bắt đầu thối và cây sẽ chết.

Sở dĩ gọi tuyến trùng là sát thủ giấu mặt vì chúng có kích thước hiển vi nên mắt thường không nhìn thấy được, chỉ có loại tuyến trùng nội ký sinh (Meloydogyne) làm cho rễ bị u bướu thì các nhà khoa học mới biết tác động

12

gây bệnh của tuyến trùng. Thường khi cây bị vàng lá bất thường chúng ta hay nghĩ là do nấm Phytophthora sp. Fusarium sp. Pythium sp… Nhưng một trong những nguyên nhân sâu xa là do tuyến trùng tấn công rễ, làm rễ bị tổn thương, tạo cơ hội cho các loại nấm trên tấn công hại rễ tiêu. Ngoài tuyến trùng Meloidogyne (còn gọi tuyến trùng nốt sần) gây hại hồ tiêu, trên tiêu có nhiều loại tuyến trùng gây hại phổ biến khác như Pratylenchus, Radopholus, Xiphinema, Circonemoides, Tylenchus sp, Rotylenchulus, Paratrichodorus,....

Bệnh chết nhanh trên cây tiêu rất nguy hiểm, nấm gây bệnh tấn công trên

tất cả các phần của cây tiêu, và ở tất cả các thời kỳ sinh trưởng của cây,

trường hợp nấm bệnh tấn công vào rễ hoặc cổ rễ sẽ gây cây chết đột ngột

(Phan Quốc Sủng, 2000). Bệnh thường phát triển nhiều trong mùa mưa,

những lá bên dưới sẽ dễ nhiễm nấm bệnh sau những cơn mưa lớn vào đầu

mùa mưa. Nấm bệnh xâm nhập vào cây trực tiếp qua biểu bì hoặc gián tiếp qua khí khổng. Cây bị nhiễm bệnh ở cổ rễ sẽ chết héo thình lình, lá chuyển

sang màu đen, khô sớm nhưng còn dính lại trên cây. Ngược lại, nếu cây bị nhiễm từ rễ, lá bị héo vàng, và cây rụng lá từ từ. Nguyên nhân gây bệnh là do loài nấm Phytophthora palmivora, Phytophthora capsici, Fusarium sp., Rhyzoctonia sp., Pythium sp., tuyến trùng Meloidogyne sp.,... (Phan Quốc Sủng, 2000)

Ngoài ra, hồ tiêu hiện là cây trồng bị rất nhiều loài tuyến trùng ký sinh gây hại, ví dụ như tại Tân Lâm (Quảng Trị), cây tiêu bị nhiễm đến 49 loài

tuyến trùng, trong đó có 4 loài được đánh giá quan trọng gây nguy hiểm cho cây gồm Meloidogyne incognita gây bệnh nốt sần, Rotylen chulus gây đen rễ, Xiphinema americanum truyền virus gây bệnh vàng lá, Paratrichodorus namus truyền virus gây bệnh xoắn lá (Nguyễn Ngọc Châu, 1995). Nghiên cứu về tình hình dịch hại và đề xuất các biện pháp phòng trừ đối với vùng trồng tiêu thuộc các tỉnh Tây Nguyên (Đào Thị Lan Hoa và cộng sự, 2003; Trần

Kim Loang và cộng sự) cho rằng bệnh hại rễ là các đối tượng xuất hiện phổ biến, gây thiệt hại nghiêm trọng và rất khó phòng trừ là nấm Phytopthora spp. và tuyến trùng Meloidogyne sp. là quan trọng. Sử dụng vi sinh vật đối kháng

13

sẽ khống chế kìm hãm các vi sinh vật gây bệnh, đây chính là hiệu quả của

việc quản lý dịch hại dựa trên cơ sở bảo vệ cân bằng sinh thái trong đất.

1.1.6. Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng trong đấu tranh sinh

học phòng chống bệnh cho cây trồng

Theo Cook JR và Ber KF (1983), “Biện pháp đấu tranh sinh học” (biocontrol) trong bảo vệ thực vật là sử dụng một hay nhiều loại vi sinh vật để kiềm chế bệnh thực vật sinh ra từ đất. Biện pháp này là cơ sở của hệ thống quản lý thống nhất các tai họa (IPM) do tổ chức FAO để xướng. Qua thực tế cho thấy, các loại vi sinh vật đối kháng trong đất phát triển và xâm nhập vào bên trong và trên cây tạo khả năng chống chịu cho cây chủ. Biện pháp này nhằm giải phóng đất khỏi các vi sinh vật gây bệnh.

Để khắc phục tình trạng trên, con người đã tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại. Từ đó ra đời nền công nghiệp hoá học trừ sâu, diệt các mần bệnh cho cây trồng. Cho đến nay, không ai phủ nhận vai trò tích cực của thuốc hoá học trừ sâu bệnh hại cây trồng. Nhưng biện pháp hoá học cũng có những mặt hạn chế của nó. Nhiều trường hợp ô nhiễm môi trường khi dùng thuốc diệt cỏ hoặc thuốc trừ sâu hóa học làm cho người bị ngộ độc, súc vật bị chết và sinh vật đi kèm theo cây trồng cũng bị ảnh hưởng dẫn đến sự mất cân bằng sinh thái. Đáng ngại hơn một số thuốc trừ sâu chậm bị phân huỷ và là mối nguy hại lâu dài trong đất (ví dụ DDT có thể kéo dài 25 năm). Các hợp chất này được tích luỹ trong đất và nồng độ của chúng tăng theo thời gian. Nghiêm trọng hơn là sự tuỳ tiện về liều dùng và thời gian phun thuốc hoá học chống sâu bệnh đã tạo nên dư lượng thuốc lớn trên các loại rau màu và cây lương thực, gây những vụ ngộ độc tại hại ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ con người.

Chính vì vậy, những cuộc tìm kiếm, thử nghiệm các biện pháp mới nhằm phòng chống bệnh cho cây trồng đã được tiến hành và đã thu được kết quả khả quan. Sau một thời gian tìm tòi nghiên cứu, người ta đã phát hiện được vai trò tích cực của vi sinh vật trong việc điều chỉnh cân bằng sinh học của sinh quần. Biện pháp đấu tranh sinh học được hoàn thiện thêm dần khi người ta sử dụng vi sinh vật để phòng chống sâu bệnh cho cây trồng. Ở nhiều nước,

14

chế phẩm vi sinh được sản xuất ở qui mô lớn và được sử dụng rộng rãi trong công tác phòng trừ bệnh cho cây trồng và cây rừng. Có thể nói biện pháp đấu tranh sinh học bằng vi sinh vật đã thực sự trở thành nội dung quan trọng của hệ thống phòng trừ sâu bệnh tổng hợp.

Chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc sinh học nói chung và vi sinh

vật nói riêng có nhiều điểm ưu việt như sau:

- Không gây độc hại cho người, động vật và cây trồng; có khả năng tiêu diệt chọn lọc các loại sâu bệnh và không ảnh hưởng xấu đến khu hệ vi sinh vật trong đất, cho nên nó không phá vỡ cân bằng sinh thái, không gây ô nhiễm môi trường.

- Sử dụng các chế phẩm vi sinh vật, một số loại mang ý nghĩa phòng bệnh lâu dài. Trong đấu tranh sinh học, việc sử dụng các loại vi sinh vật cũng cần cân nhắc kỹ lưỡng trước khi đưa vào áp dụng trong thực tế sản xuất.

Con người đã và đang nghiên cứu mở rộng tác dụng của chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc vi sinh vật bằng nhiều biện pháp. Một trong những biện pháp đó là thực hiện chuyển gen chi phối việc tạo tính độc cho nhiều loại sâu bệnh hại sang cho nhiều loại cây trồng, tạo nên cây trồng tự nó có khả năng kháng được sâu bệnh. Ở Việt Nam cũng đã có thành công trong việc chuyên gene kháng rầy nâu, kháng bệnh đạo ôn cho lúa, kháng sâu hà cho khoai lang. Trong tương lai chắc chắn sẽ mang lại hiệu quả to lớn cho ngành trồng trọt.

Phát triển nông nghiệp bền vững là quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng các chế phẩm sinh học đang là xu hướng chung Việt Nam cũng như các nước trên thế giới. Các chế phẩm công nghệ sinh học ứng dụng cho cây trồng hiện nay cơ bản được chia làm 3 nhóm chính với các tính năng khác nhau như sau: (1) Nhóm chế phẩm công nghệ sinh học dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, chất kích thích tăng trưởng bón cho cây trồng; (2) Nhóm chế phẩm công nghệ sinh học ứng dụng cho việc phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng và (3) Nhóm chế phẩm công nghệ sinh học dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp.

15

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới nóng ẩm nên tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều vi sinh vật phát triển, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh thực vật. Vì vậy, việc sử dụng phân bón, thuốc trừ sâu hóa học nhằm tăng năng suất, sản lượng đã dẫn tới thoái hóa đất, tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất và ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gây ô nhiễm môi trường.

Theo hướng trên, ngay từ năm 1990, KC-08-14: “Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu bệnh bằng các chế phẩm vi khuẩn và nấm” thuộc Chương trình Công nghệ sinh học (1990-1995) đã tuyển chọn được tập hợp các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm, đặc biệt là các loại nấm Piricularia oryzae gây bệnh đạo ôn, Pellicularia oryzae gây bệnh khô vằn, Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cho cây trồng; lên men tạo chế phẩm và thử nghiệm chế phẩm ở quy mô đồng ruộng cho kết quả tốt, giảm bệnh nấm trên cây. Từ đó đã nghiên cứu nâng cao hoạt tính các chủng xạ khuẩn ứng dụng vào phòng chống bệnh cho cây trồng.

Nhiều đề tài nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng ứng dụng phòng chống bệnh cho cây trồng, như các đề tài ở Viện Công nghệ sinh học đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm (tế bào, dịch ngoại bào) từ vi khuẩn đối kháng Burkholderia, Pseudomonas và Bacillus có tác dụng kiểm soát hiệu quả nấm R.solani gây hại cây rau và F. oxysporum gây hại cây cà chua; vi khuẩn đối kháng Pseudomonas sinh tổng hợp chất ngoại bào syringomycin, syringostatin, syringotoxin, cepacin A, cepacin B, phenazine và pyrrolnitrin; Burkholdria sinh tổng hợp chất cepacin và pyrrolnitrin; Bacillus sinh tổng hợp iturin, surfacin, bacilysin, bacillomycin và mycobacillin có hoạt tính diệt nấm R. solani, F. oxysporum gây bệnh thối rễ, thối thân ở nhiều loại cây trồng

quan trọng. Trong các vi sinh vật đối kháng, nhóm vi khuẩn Bacillus được

chứng minh có khả năng đối kháng với nhiều loại nấm như: Rhizoctonia, Sclerotinia, Fusarium, Pythium và Phytophthora và một số vi khuẩn khác nhờ vào khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn.

Hướng phòng trừ bệnh cây bằng biện pháp sinh học đã và đang được nhiều các nhà khoa học trên thế giới và ở Việt Nam nghiên cứu và cho ra các

16

chế phẩm sinh học có nhiều triển vọng. Đây là một trong những biện pháp đấu tranh sinh học có hiệu quả để phòng trừ các loại nấm gây bệnh hại cây

trồng, giúp cây trồng phát triển tốt hơn, làm cho tác nhân gây bệnh không

kháng thuốc, an toàn với môi trường sinh thái, phù hợp với xu hướng an toàn nông nghiệp hiện nay. Tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm bệnh là biện pháp phổ biến của công tác phòng trừ sinh học. Hiện nay nhiều chế phẩm vi sinh vật đối kháng đang được bán và sử dụng trong phòng chống bệnh cho cây trồng.

1.2. VI SINH VẬT NỘI SINH TRÊN CÂY HỒ TIÊU VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT

1.2.1. Vi sinh vật nội sinh (endophytic microorganisms) trên cây hồ

tiêu

Năm 1957, Smith đã phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micro- monospora sp. ở mô tế bào từ 4/20 giống cà chua khỏe mạnh và chủng xạ khuẩn này có khả năng ức chế mạnh nấm Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici. Từ đó, có rất nhiều định nghĩa về vi sinh vật nội sinh (endophytic), trong đó, Bacon và White đã định nghĩa Vi sinh vật nội sinh như sau: “Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra những hiệu ứng xấu tới cây chủ”. Điều đó cũng có nghĩa, các VSVNS cũng giống như vi sinh vật khác có khả năng đối kháng các vi sinh vật gây bệnh cây, nhưng không ảnh hưởng sấu đến cây chủ.

Ngoài ra, các nghiên cứu về VSVNS trên cây hồ tiêu của Conn et al., 2008 và Nascimento và cộng sự, 2015 cho thấy, với sự có mặt VSVNS sẽ tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích tăng trưởng, tăng khả năng miễn dịch cho vật chủ bằng cách sản sinh ra những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp.

1.2.2. Sự đa dạng vi sinh vật nội sinh đối kháng nấm gây bệnh trên

cây hồ tiêu

Bệnh thối rữa do Phytophthora capsici là một trong những trở ngại nghiêm trọng đến sản xuất tiêu ở Việt Nam và các nước khác, đòi hỏi phải

17

là P. putida IISRBP 25

thường xuyên phun thuốc trừ nấm trong nông nghiệp. Để giảm thiểu việc sử dụng các hoá chất độc hại, một số giải pháp quản lý an toàn như các giống kháng bệnh, các tác nhân kiểm soát sinh học đã được đề xuất. Một số vi sinh vật đối kháng ở vùng rễ đã được sử dụng để phòng bệnh thối gốc (Anith et al.,2003; Diby et al.,2005) và một số vi khuẩn nội sinh (Van Buren et al.,1993; Chen et al.,1995; Chanway 1996; Zinniel et al.,2002). Quần thể vi sinh vật nội sinh đã được xác định trong khoai tây (Sturz et al.,1999; Garbeva et al.,2001), ngô (McInroy và Kloepper 1995), bông (Misaghi và Donndelinger 1990, McInroy và Kloepper 1995) và dưa chuột (Mahafee và Kloepper 1997). VSV nội sinh có thể xâm nhập hoặc lan truyền tới các bộ phận khác nhau của thực vật (Hallmann et al.,1997), trong gian bào (Patriquin và Dobereiner 1978) hoặc trong hệ thống mạch nhựa cây (Bell et al.,1995). Vi khuẩn có thể xâm chiếm và tồn tại trong rễ, đi vào trong các mô cây như củ (Hollis, 1951), trái cây (Samish et al.,1961), thân cây (Misaghi và Donndelinger 1990), hạt và noãn (Mundt và Hinkle, 1976). Năm 2008, Aravind và cộng sự đã phân lập được 74 chủng vi sinh vật nội sinh trên cây tiêu đen (Piper nigrum L.) để đánh giá đối kháng đối với P. capsici, trong đó 6 chi thuộc Pseudomonas spp. (20 chủng, Serratia (1 chủng), Bacillus spp. (22 chủng), Arthrobacter spp. (15 chủng), Micrococcus spp. (7 chủng), Curtobacterium sp. (1 chủng) và 8 chủng không xác định đã được phân lập từ các mô, nội mô của rễ và thân. Ba chủng IISRBP 35, IISRBP 25 và IISRBP 17 có khả năng đối kháng Phytophthora tới 70% trong phòng thí nghiệm và nhà lưới. Các chủng IISRBP 35 được định danhlà Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas (Pseudomonas EF568931), EF568932), và IISRBP 17 là Bacillus megaterium (B. megaterium EU071712).

Năm 2015, Nascimento và cộng sự đã phân lập được 28 chủng vi sinh vật nội sinh trên cây tiêu đen (Piper nigrum L.) thuộc 13 chi: Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Enterobacter, Rhizobium, Sinorhizobium, Agrobacterium, Ralstonia, Serratia, Cupriavidus, Mitsuaria, Pantoea, và Staphylococcus. Kết quả cho thấy, hai chủng vi sinh vât nội sinh Pt12 và Pt13, được xác định là Pseudomonas putida và Pseudomonas sp., tương ứng,

18

có thể ức chế F. solani f. sp piperis trong thử nghiệm in vitro. Trước đây, nhóm nghiên cứu này đã mô tả đặc tính phân tử của 23 vi sinh vật nội sinh từ hồ tiêu P. tuberculatum, trong đó có hai loài Pseudomonas có khả năng kiểm soát bệnh thối rễ của tiêu đen ở vùng Amazon.

1.2.3. Khả năng ứng dụng vi sinh vật nội sinh trong phòng chống

nấm gây bệnh cây hồ tiêu

Vi sinh vật nội sinh (endophytic microorganisms) là những vi sinh vật có thể sinh trưởng, phát triển trong các mô của cây. Conn et al., (2008) công bố kết quả nghiên cứu gây nhiễm chủng Streptomyces sp. EN27 và Micromonospora sp. EN43 trên hạt giống cây Arabidopsis thaliana đã làm tăng sức đề kháng lại nấm bệnh Erwinia carotovora và F. oxysporum, kích hoạt biểu hiện gen tổng hợp acid jasmonic, acid salicilic và etylen. Mối liên hệ giữa VSV nội sinh với các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học được sinh ra bởi VSV nội sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng ứng dụng trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng. Mujal et al., (2015) công bố chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ rễ hồ tiêu Bacillus megaterium có hoạt tính kháng nấm bệnh Phytophthora capsici, Pythium, Rhizotocnia mạnh do sản sinh một số hợp chất kháng nấm. Aravildet al., (2009, 2010), đã phân lập 71 chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ và thân cây hồ tiêu và tuyển chọn được 3 chủng có khả năng ức chế nấm thối rễ hồ tiêu Phytophthora capsici tới 70% trong điều kiện phòng thí nghiệm và mô hình trong nhà lưới. Ngoài ra, người ta cũng đã phát hiện nhiều loại vi nấm nội sinh trên thực vật và ký sinh trên tuyến trùng (nấm nội ký sinh): đây là các loài nấm có khả năng dính và xâm nhập vào cơ thể tuyến trùng để ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng. Một số loài nấm như Nematoctonus spp, Meria coniospora đã được thử nghiệm và cho kết quả nhất định.

1.3. NGHIÊN CỨU VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ NẤM GÂY BỆNH CÂY HỒ TIÊU Ở VIỆT NAM

1.3.1. Nghiên cứu bệnh gây hại trên cây hồ tiêu

19

Bệnh hại nghiêm trọng nhất hiện nay đối với hồ tiêu là bệnh chết nhanh

do nấm Phytophthora và bệnh chết chậm có thể do sự cộng hợp của các tác

nhân nấm và tuyến trùng gây ra.

a. Bệnh chết nhanh

Bệnh chết nhanh ở Việt Nam được ghi nhận vào năm 1952, nhưng không được biết đến tác nhân gây bệnh. Tác giả Phạm Văn Biên et al. (1990) ghi nhận tác nhân gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu là nấm Phytophthora palmivora và Diệp Đông Tùng et al. (1999) đã xác định tác nhân gây thối rễ chết cây hồ tiêu tại Phú Quốc là do nấm Phytophthora parasitica var. piperina. Theo Phan Quốc Sủng (2001) xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu do nấm Phytophthora spp. gây nên. Bằng phương pháp PCR, Trần Kim Loang et al.(2006) bước đầu đã xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu tại Tây Nguyên là nấm Phytophthora palmivora. Tác giả Nguyễn Vĩnh Trường (2008), dựa vào triệu chứng gây bệnh, đặc điểm hình thái của các chủng phân lập được từ 4 tỉnh: Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu, Bình Phước và Quảng Trị, đã xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu là do nấm Phytophthora capsici. Kết quả này đã được kiểm tra lại bằng phương pháp PCR-RFLP của vùng ITS, sử dụng primer ITS4 và ITS6.

Tác giả Phạm Ngọc Dung et al. (2010) xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh hồ tiêu ở Đăk Nông là do nấm Phytophthora tropicalis một loài mới được phân tách từ loài Phytophthora capsici bằng kết quả chạy PCR và phân tích chuỗi Internal Transcribed Spacer (ITS).

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu thành công trong sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số bệnh hại cây trồng trong đó có chế phẩm sinh học đa chức năng SH1 của Viện Bảo vệ thực vật ứng dụng trong phòng trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu do nấm Phytophthora sp., chế phẩm Trichoderma spp. phòng trừ bệnh thối quả ca cao do nấm Phytophthora palmivora của Viện Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên, Trần Kim Loang et al.(2008). Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật nội sinh trong phòng và chống bệnh nấm gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu.

20

b. Bệnh vàng lá chết chậm

Theo Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1991) cho biết ở tất cả các vùng trồng tiêu của Việt Nam đều có hiện tượng một số cây hoặc toàn bộ vườn chết toàn bộ, chỉ còn trơ lại cây nọc, gây thiệt hại rất lớn. Bệnh làm chết cả tiêu kiến thiết cơ bản và tiêu kinh doanh. Thông thường, bệnh chết chậm dẫn tới 10 - 30 % diện tích tiêu bị hại nặng không có khả năng cho thu hoạch.

Một số vùng trồng tiêu lâu năm ở Phú Quốc và Quảng Trị, Quảng Bình bệnh này phát triển mạnh tạo thành dịch lớn, gây thiệt hại nặng nề và đe dọa ngành sản xuất tiêu ở đây. Ở Bình Long, Lộc Ninh tỷ lệ tiêu chết và bệnh là 30%, xã Bình Giã, Châu Thành, Đồng Nai có tới 90 % tiêu bị chết (Phạm Văn Biên, 1989). Theo tác giả Nguyễn Ngọc Châu (1995), đã ghi nhận cây hồ tiêu không chỉ bị bệnh do nhiều loại tuyến trùng ký sinh trên rễ như: Meloidogyne, Radophonus, Rotylencholus… mà còn có một số nấm như: Fusarium, Rhizoctonia…cùng tác động gây hại lên bộ rễ của cây tiêu. Những thao tác trong khi bón phân, xới xáo đất và đặc biệt trong mùa mưa nếu tạo ra các vết thương cho bộ rễ là điều kiện cho nấm bệnh xâm nhiễm và gây hại bộ rễ và cuối cùng cây bị chết. Theo Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1993), các loài tuyến trùng Meloidogyne sp.tuy khác nhau về ký chủ song giống nhau về quá trình phát triển. Tốc độ và thời gian phát triển phụ thuộc vào nhiệt độ, ánh sáng, ký chủ mà chúng gây hại.

Theo Nguyễn Ngọc Châu (2003), các loài tuyến trùng ký sinh thực vật cũng bị tấn công bằng nhiều thiên địch tồn tại trong đất như virus, vi khuẩn, nấm, Rickettsia Tardigrade, Tuberlaria, Enchytraeid, ve bét, côn trùng và tuyến trùng ăn thịt. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng thiên địch của tuyến trùng có tầm quan trọng rất lớn trong việc làm giảm mật độ quần thể để hạn chế tác hại do tuyến trùng ký sinh gây ra cho cây trồng.

1.3.2. Biện pháp phòng trừ bệnh cây hồ tiêu bằng biện pháp sinh học

Ở Việt Nam, các nhà khoa học chỉ ra rằng sự chuyển dịch phần lớn nền nông nghiệp sang phương thức canh tác hữu cơ thì mới có thể vừa hạn chế tình trạng đói nghèo trên thế giới, vừa góp phần cải thiện môi trường và biến

21

đổi khí hậu. Hiện nông nghiệp hữu cơ đang được áp dụng trên toàn thế giới. Ở nước ta nông nghiệp hữu cơ đang ở giai đoạn đầu phát triển. Nông nghiệp hữu cơ nhằm tạo ra các sản phẩm hữu cơ có chất lượng cao, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, góp phẩn bảo vệ sức khỏe con người, bảo vệ môi trường sinh thái cộng đồng, giảm thiểu tác hại của biến đổi khí hậu, đáp ứng với yêu cầu hội nhập kinh tế quốc tế. Với định hướng như vậy, trong thời gian gần đây, các hướng nghiên cứu về cây hồ tiêu chỉ tập trung vào các giải pháp khoa học công nghệ và thị trường để phát triển vùng hồ tiêu nguyên liệu phục vụ chế biến và xuất khẩu (Phạm Văn Biên, 2005), giải pháp quản lý tổng hợp dịch hại phát sinh từ đất trên cây hồ tiêu (Nguyễn Tăng Tôn, 2009), biện pháp kỹ thuật tổng hợp trong sản xuất cây tiêu theo hướng bền vững (Đỗ Trung Bình, 2012 Phạm Thị Thùy, 2013), biện pháp quản lý bệnh hại tổng hợp nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu (Nguyễn Văn Tuất, 2012), xây dựng mô hình ứng dụng tổng hợp một số sản phẩm phân bón sinh học-hoá học và thuốc bảo vệ thực vật sinh học-hoá học trong canh tác cây hồ tiêu theo hướng phát triển bền vững tại Tây Nguyên (Nguyễn Thị Thu (2016) v.v…

Sử dụng vi sinh vật đối kháng sẽ khống chế kìm hãm các vi sinh vật gây

bệnh đây chính là hiệu quả của việc quản lý dịch hại dựa trên cơ sở bảo vệ cân bằng sinh thái trong đất. Biện pháp phòng trừ sinh học bằng các vi sinh vật nội sinh đối kháng chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta. Vì vậy, nghiên cứu đa dạng vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu, trên cơ sở đó chọn lựa ra những chủng có khả năng kháng nấm là việc làm cần thiết nhằm hạn chế sử dụng thuốc hóa học, phát triển phong phú quần thể vi sinh vật có lợi sẽ giúp cho cây trồng phát triển, tăng sức đề kháng sâu bệnh.

Như vậy, ở Việt Nam chưa quan tâm nhiều đến nhóm vi sinh vật, đặc biệt là các vi sinh vật nội sinh đối kháng trong việc phòng chống bệnh cho cây hồ tiêu mà mới chỉ dừng lại ở việc sử dụng biện pháp hóa học cũng như các chế phẩm sinh học từ nấm rễ đã hiệu quả mang lại chưa cao. Đây là vấn đề nan giải đòi hỏi các biện pháp giải quyết triệt để nhằm đảm bảo sự phát triển ổn định và bền vững của ngành hồ tiêu Việt Nam.

22

23

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1. Các mẫu cây hồ tiêu và chủng giống vi sinh vật kiểm định

1. Các mẫu cây hồ tiêu thu thập từ Đắk Lắk

12°35’19’’B;

Mẫu cây hồ tiêu (3 mẫu rễ, 3 mẫu thân và 3 mẫu lá cây) được thu thập tại huyện Cư Kuin, Đắk Lắk tại 3 địa điểm với tọa độ như sau: 12°35’18’’B;108°11’7’’Đ, 108°11’8’’Đ, 12°35’24’’B;108°11’5’’Đ vào tháng 07/2017.

2. Chủng giống vi sinh vật kiểm định

Ba chủng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu gồm Fusarium oxysporum CNLM, Phytophthora capsici CNLM và Rhizoctonia solani CNLM được nhận từ Bộ sưu tập giống của phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

1. Hóa chất:

Cao malt Himedia, Ấn Độ;

Cao nấm men Himedia, Ấn Độ;

Cao thịt Himedia, Ấn Độ;

Casein, Sigma, Mỹ;

Thạch Agar Fluka, Đức;

Pepton Fermentas, Mỹ;

Glycerol; MgSO4.7H2O; K2HPO4: Merck, Đức.

2. Thiết bị nghiên cứu:

Tủ cấy vô trùng Nunre, Mỹ

Nồi hấp khử trùng ALP, Nhật Bản

Tủ lạnh Panasonic, Nhật Bản

Cân phân tích SMIC, Trung Quốc

Tủ sấy Sanyo, Nhật Bản

24

Máy ly tâm lạnh Sorvall RC5B, Mỹ

Máy ổn nhiệt N-Biotek, Mỹ

Máy lắc ổn nhiệt New Jersey, Mỹ

Máy đo pH Thermo Scientific, Mỹ

Tủ cấy an toàn sinh học

2.1.3. Môi trường nuôi cấy

1. Môi trường MPA (g/l): Cao thịt: 3; pepton: 5; NaCl: 5; thạch: 20;

H2O: 1000 ml; pH7.

2. Môi trường NA (g/l): Cao thịt: 3; pepton: 5; NaCl: 5; thạch: 20; H2O:

1000 ml; pH: 6,5-7.

3. Môi trường TSA (g/l): NaCl: 5; casein thủy phân: 15; peptone: 5;

thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH: 6,5-7.

4. Môi trường KB (g/l): Casein thủy phân: 20; K2HPO4: 1,5; MgSO4.7H2O: 1,2; glyxerol khử trùng: 20ml; thạch: 18; H2O: 1000 ml; pH: 6,5-7.

5. Môi trường PDA (g/l): Glucose: 20; khoai tây: 300; thạch: 20; H2O:

1000 ml; pH 6,5 - 7.

6. Môi trường MPA + CMC (g/l): Cao thịt: 3; Pepton: 5; NaCl: 5; CMC:

10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH 6,5 - 7 (Živković Set al., 2010).

7. Môi trường MPA + Casein (g/l): Cao thịt: 3; Pepton: 5; NaCl: 5;

Casein: 10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH 6,5 - 7 (Kateka Det al., 2009).

8. Môi trường MPA + Chitin (g/l): Cao thịt: 3; Pepton: 5; NaCl: 5;

Chitin: 10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; pH 6,5 - 7 (Kasana RC et al., 2008).

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp thu mẫu: Theo TCVN 8551: 2010 về cây trồng

Phương pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu, có thể tóm tắt như sau: Các mẫu cây hồ tiêu (hồ tiêu khỏe và hồ tiêu bị bệnh) trong mùa khô và mùa mưa được lấy bằng dao đã khử trùng và lưu giữ trong các túi nilon sạch. Mỗi mẫu cây hồ tiêu được chia thành 3 phần riêng: rễ, thân, lá đựng trong túi nilông sạch có

25

ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lý và phân tích trong vòng 48 giờ.

2.2.2. Khử trùng bề mặt và phân lập vi sinh vật nội sinh

VSVNS được tiến hành phân lập từ các mẫu rễ, thân, lá của cây hồ tiêu theo phương pháp của Aravind và cộng sự, năm 2009. Mẫu rễ, thân, lá được rửa sạch dưới vòi nước để loại bỏ đất, tạp chất và làm khô mẫu. Các mẫu được khử trùng trong dung dịch 5% NaClO, 5 phút, rửa lại mẫu bằng dụng dịch 2% (w/v) Na2S2O3 trong 2 phút để loại bỏ clo dư. Tiếp tục xử lý mẫu trong ethanol 70% (v/v) trong 10 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng để loại bỏ ethanol và nhúng mẫu trong trong dung dịch 10% (w/v) NaHCO3 trong 5 phút để ức chế nấm cộng sinh.

Sau khi khử trùng mẫu xong tiến hành phân lập mẫu trên môi trường dinh dưỡng phân lập vi sinh vật bằng cách rắc mẫu trên bề mặt môi trường phân lập và ủ ở 30oC trong 2-3 ngày. Theo dõi sự xuất hiện của các khuẩn lạc đếm số lượng vi khuẩn có trong đĩa Petri. Dùng que cấy tách ra từng chủng vi sinh vật khác nhau ra các đĩa Petri có chứa môi trường MPA. Bước đầu nhận dạng các loại vi sinh vật khác nhau dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước của khuẩn lạc (Aravind R. et al. 2009).

2.2.3. Xác định hoạt tính đối kháng của các chủng vi sinh vật nội

sinh với nấm bệnh

Hoạt tính đối kháng được xác định theo Gong M et al., 2006 như sau: Sử dụng phương pháp thử nghiệm kép, nấm bệnh và vi sinh vật nội sinh được nuôi cách nhau 3 cm trên đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm) ở 27oC trong 6 ngày. Nếu vi sinh vật nội sinh có có khả năng ức chế nấm bệnh sẽ thấy vùng xung quanh khuẩn lạc vi sinh vật nội sinh, sợi nấm bệnh không sinh trưởng hoặc sinh trưởng yếu. Còn nếu vi sinh vật nội sinh không có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh sẽ thấy nấm bệnh phát triển bình thường. Từ đó sơ bộ lựa chọn được chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh.

2.2.4. Xác định khả năng ức chế nấm bệnh của dịch lọc vi sinh vật

nội sinh

26

Xác định khả năng ức chế nấm bệnh được tiến hành bằng phương pháp đục lỗ như sau: Dịch nuôi cấy các chủng vi sinh được lọc loại bỏ sinh khối và nhỏ dịch lọc vào các lỗ thạch trên môi trường PDA đã cấy nấm gây bệnh (Lê Gia Hy, 2012). Sau 48-72 giờ nuôi trong tủ ấm 30oC, xác định vòng ức chế sinh trưởng của nấm. Từ đó lựa chọn được chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh.

2.2.5. Đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh được mô tả theo phương pháp của Živković cùng cộng sự năm 2010 và Jeyaseelanet năm 2012. Tổng số VSVNS được cấy vệt trên môi trường thạch PDA, khoảng cách vệt cấy xấp xỉ 1cm với mép đĩa petri. Nấm gây bệnh được cắt khoảng 1cm2 và đặt đối diện với vệt cấy VKNS, đĩa không có vệt VKNS là đối chứng. Các mẫu thí nghiệm được lặp lại 3 lần và ủ ở nhiệt độ 30oC trong 3-5 ngày. Phần trăm ức chế tăng trưởng nấm sợi (RI%) được tính như sau:

RI (%) = 𝐷1−𝐷2

x 100%

𝐷1

D1: Chiều dài nấm sợi trên đĩa đối chứng.

D2: Chiều dài nấm sợi trên đĩa có VKNS.

Tỷ lệ ức chế tăng trưởng nấm sợi được đánh giá như sau: ˂ 30% = hoạt động kháng nấm thấp; 30 - 50% = hoạt động kháng nấm vừa phải; 50 - 70% = hoạt động kháng nấm cao; ≥ 70% = hoạt động kháng nấm rất cao.

Những VSVNS có kết quả tỷ lệ kháng nấm gây bệnh lớn hơn 30% được

lựa chọn và lưu giữ để nghiên cứu tiếp.

2.2.6. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh các chủng lựa

chọn (theo Sổ tay Định loại vi sinh vật của Bergey, 1989)

Quan sát hình thái khuẩn lạc: Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về hình dạng khuẩn lạc, hình

dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không). Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn được quan sát, so sánh trên môi trường MPA ở nhiệt độ 35-37°C. Sau

27

24-48 giờ lấy mẫu quan sát kích thước khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường.

Nhuộm Gram: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau theo Trần Thanh Thủy, 1999.

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa theo Sổ tay Định loại vi sinh vật của Bergey,

1989:

- Thử khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của chủng vi sinh vật được

thể hiện khi nuôi trên môi trường khoáng có bổ sung các nguồn carbon (1,0 %, w/v): D-glucose, D-maltose, Myo-inositol, D-mannitol, Saccharose, Cellobiose, D-fructose, tinh bột tan. Sau 24 nuôi cấy, tiến hành đo OD dịch nuôi vi khuẩn.

- Thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ của chủng vi sinh vật được thể

hiện khi nuôi trên môi trường khoáng có bổ sung các nguồn nitơ (1,0 %, w/v): L-arginin, L-lysin, Methionin, Leusin, L-tryptophan, L-valine, L-alanine và glycine. Sau 24 giờ tiến hành đo OD dịch nuôi vi sinh vật và so sánh với môi trường đối chứng âm (môi trường MPA).

Xác định pH nuôi cấy thích hợp: Vi sinh vật được nuôi trên môi trường MPA lỏng có pH môi trường trong khoảng từ pH 4,0 đến pH 8,0. Sau 24 giờ tiến hành đo OD dịch nuôi vi sinh vật và so sánh kết quả từ đó chọn ra pH tối ưu nhất.

Xác định nhiệt độ, nồng độ NaCl thích hợp: Vi sinh vật được nuôi trên môi trường MPA thạch ở các nhiệt độ khác nhau (20; 25; 30; 35; 45 và 45°C) và trên môi trường MPA thạch có bổ sung NaCl với nồng độ tăng dần từ 0,5 - 2,0% (w/v) ở 37°C, sau 24 giờ tiến hành quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật.

2.2.7. Phân loại vi sinh vật dựa trên phân tích trình tự gen

Trình tự gen 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1429R đối với vi khuẩn có trình tự như trong bảng 2.1.

28

DNA tổng số của vi sinh vật và nấm được tách theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001). Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%. Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn 1 kb Thermo scientific, Mỹ. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification Invitrogen, Mỹ và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trình tự gen 16S rDNA được so sánh với các trình tự tương ứng trên GenBank (NCBI) nhờ công cụ BLAST.

Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA

Tên đoạn mồi Trình tự mồi

27F 5’-TAACACATGCAAGTCGAACG-3’

1429R 5’-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3’

Đánh giá an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật

Theo hướng dẫn số 90/679/EWG của Cộng đồng Châu Âu về an toàn sinh học, nhóm tác nhân sinh học vi sinh vật được phân làm 4 cấp độ an toàn, trong đó chỉ các VSV ở cấp độ 1 và 2 được ứng dụng trong sản xuất.

2.2.8. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào

Phương pháp cấy chấm điểm trên thạch theo Mohd và các cộng sự (2015) được tiến hành như sau: Cấy chấm điểm VKNS trên môi trường có 1% cơ chất tương ứng. Ủ đĩa ở nhiệt độ 37oC trong 18-24 giờ. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng và đo đường kính vòng thủy phân trên đĩa thạch môi trường.

Môi trường thử khả năng sinh protease; MPA + cơ chất (1% cazein),

thuốc nhuộm HgCl2 (5%) (Kateka et al., 2009).

Môi trường thử khả năng sinh cellulase: MPA + cơ chất (1% CMC),

thuốc nhuộm lugol (5%) Kasana et al., 2008).

29

Môi trường thử khả năng sinh chitinase: MPA + cơ chất (1% chitin),

thuốc nhuộm lugol (5%) (Usharani et al., 2011).

Đánh giá khả năng sinh enzyme: Hoạt tính enzyme = D-d (cm), trong đó:

D: Đường kính vòng phân giải; d: Đường kính khuẩn lạc.

2.2.9. Lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp

- Các môi trường được sử dụng để lựa chọn môi trường nuôi cấy thích

hợp: MPA, NA, TSA và. KB (xem thành phần môi trường)

- Nghiên cứu thay đổi nguồn cacbon và ni tơ của môi trường được tuyển chọn: Nguồn (glucose, rỉ đường, saccaroza, dextriose, tinh bột tan và manitol), nguồn nitơ (bột đậu tương, cao nấm men, pepton, trypton, cao malt, cao thịt).

- Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp: Chủng được nuôi trên môi trường tuyển chọn với thay đổi điều kiện lên men: các nhiệt độ khác nhau

20C; 25C; 30C; 35C; 40C; pH môi trường trong khoảng từ pH 5,0 đến

pH 8,0; tỷ lệ tiếp giống 1, 3, 5, 7 và 9%; độ thông khí 5; 10; 15; 20; 25%. Sau 72 giờ tiến hành quan sát mức độ sinh trưởng và hoạt tính kháng nấm.

2.2.10. Thử nghiệm khả năng phòng trừ nấm Phytophthora capsici

Thử nghiệm khả năng phòng trừ nấm Phytophthora capsici CNLM trên cây hồ tiêu của chủng được tuyển chọn quy mô phòng thí nghiệm được tiến hành như sau: Phun dịch tế bào của vi sinh vật (108 tế bào/ml), dịch bào tử nấm (105 bào tử/ml) và nước vô trùng lên lá hồ tiêu trong 30’, lá hồ tiêu đặt trên giấy lọc ẩm trong đĩa Petri đã được vô trùng. Dịch huyền phù bào tử của nấm P. capsici chứa khoảng 105 bào tử/ml đã được chuẩn bị và phun lên lá đã được phun vi sinh vật tuyển chọn. Ủ ở 20ᵒC trong 12 giờ sáng/tối trong 10

ngày. Mức độ của mầm bệnh được đánh giá dựa trên mức độ từ 0 đến 4: 0 là không hiện tượng; 1:1-12% vùng lá bị bao phủ bởi nấm bệnh có màu nâu đen; 2: 13-25% vùng lá bị bao phủ bởi nấm bệnh có màu nâu đen; 3: 26-50% vùng lá bị bao phủ bởi nấm bệnh có màu nâu đen; 4: 51-100% vùng lá bị bao phủ bởi mầm bệnh màu nâu đen. Mỗi chủng nghiên cứu bao gồm 5 lá cắt rời thực hiện 3 lần lặp lại (Lee và Hwang, 1996).

30

2.2.11. Xử lý số liệu

Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel năm 2017. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên công thức thống kê:

𝑖=1 I;

𝑛

∑ (𝑋𝑖−𝑋)2

𝑛 𝑖=1

Giá trị trung bình(X): X = ∑ X𝑛

𝑛−1

𝑚

Độ lệch chuẩn (δ): δ = √ ; Sai số (m): 𝑚 = ±

31

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VI SINH VẬT NỘI SINH CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở ĐẮK LẮK

3.1.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật nội sinh từ các mẫu cây

hồ tiêu

Từ 9 mẫu cây hồ tiêu được khử trùng bề mặt theo phương pháp của Aravind và cộng sự, 2009 và phân lập vi sinh vật nội sinh theo phương pháp của theo Gazis và cộng sự, 2012 trên 4 loại môi trường MPA, TSA, NA và KB. Sau thời gian nuôi cấy từ 1-3 ngày, đã phân lập và thuần khiết được 36 chủng vi sinh vật nội sinh được trình bày trên bảng 3.1.

Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi sinh vật nội sinh từ các mẫu rễ, thân, lá trên hồ tiêu tại Đắk Lắk

Vị trí

Môi

Ký hiệu

Vị trí

TT

phân

trường

TT

trường

chủng

phân lập

lập

phân lập

1 HDL01

Rễ

TSA

19 HDL19

Thân

MPA

2 HDL02

Thân

MPA

20 HDL20

Rễ

NA

3 HDL03

Lá

NA

21 HDL21

Rễ

TSA

4 HDL04

Thân

MPA

22 HDL22

Rễ

NA

5 HDL05

Rễ

MPA

23 HDL23

Thân

MPA

6 HDL06

Thân

TSA

24 HDL24

Rễ

TSA

7 HDL07

Rễ

MPA

25 HDL25

Rễ

MPA

8 HDL08

Rễ

KB

26 HDL26

Thân

MPA

9 HDL09

Lá

NA

27 HDL27

Rễ

NA

10 HDL10

Rễ

KB

28 HDL28

Thân

KB

11 HDL11

Thân

MPA

29 HDL29

Lá

KB

12 HDL12

Thân

NA

30 HDL30

Thân

KB

13 HDL13

Lá

MPA

31 HDL31

Lá

MPA

14 HDL14

Rễ

NA

32 HDL32

Thân

TSA

15 HDL15

Rễ

NA

33 HDL33

Thân

MPA

32

16 HDL16

Thân

KB

34 HDL34

Rễ

TSA

17 HDL17

Lá

TSA

35 HDL35

Thân

KB

18 HDL18

Rễ

MPA

36 HDL36

Rễ

TSA

Kết quả trên bảng 3.1 cho thấy, số lượng các chủng vi sinh vật nôi sinh trên cây hồ tiêu khá phong phú, đa dạng và thu thập được cả 3 bộ phận của cây. So sánh với kết quả nghiên cứu của Nascimento và cộng sự năm 2015, nhóm nghiên cứu phân lập được 28 chủng VKNS từ các mẫu rễ, thân, lá trên cây hồ tiêu (Piper nigrum L.), của Vijay và cộng sự, 2011, đã phân lập được 17 chủng VKNS từ rễ, thân, lá của 10 cây tiêu lốt (Piper Longum L.) cùng thuộc họ Piperaceae . Tuy nhiên so sánh với kết quả của Toh và cộng sự, 2016 đã phân lập được 126 chủng VKNS từ rễ của các cây tiêu đen (Piper nigrum L.) hoặc Aravind và cộng sự, 2008, đã phân lập được 74 chủng VKNS từ 10 mẫu cây tiêu đen Ấn Độ (Piper nigrum L.) trong đó có 66 chủng phân lập từ rễ và 8 chủng phân lập từ thân, thì cho thấy tỷ lệ các chủng vi sinh vật nội sinh phân lập được từ cây hồ tiêu ở Cư Kuin, Đắk Lắk ở mức trung bình. Điều này chứng tỏ, mức độ đa dạng của các chủng vi sinh vật trên mẫu phụ thuộc vào phương pháp phân lập và vị trí địa lý vùng phân lập như khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, chất dinh dưỡng, pH môi trường (Bảng 3.1).

3.1.2. Sơ bộ phân nhóm vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu phân

lập được

Trên cơ sở 36 chủng vi sinh vật đã thu nhận được, chúng tôi tiến hành phân tích, đánh giá mức độ phân bố theo vị trí phân lập trên cây hồ tiêu, được thể hiện qua hình 3.1.

Hình 3.1: Vi sinh vật nội sinh theo vị trí phân lập trên cây hồ tiêu.

33

Kết quả Hình 3.2 cho thấy, vi sinh vật có mặt ở tất cả các bộ phận của cây, trong đó vi sinh vật nội sinh từ rễ chiếm số lượng cao nhất với 16 chủng (44,44%), tiếp theo là thân với 14 chủng (38,89%), số lượng được phân lập ít nhất ở lá với 6 chủng chiếm 16,67%.

Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu trên thế giới, ví dụ như Kollakkodan và cộng sự, 2015, phân lập từ các mẫu rễ, thân và lá của hai giống tiêu là P. colubrinum và P. nigrum tại Ấn Độ đã thu được 47 chủng VKNS có hình thái khác nhau, trong đó 17 chủng phân lập từ rễ, 22 chủng phân lập từ thân và và 8 chủng phân lập từ lá và nhóm nghiên cứu Aravind và cộng sự, 2009, đã phân lập được tổng số 110 chủng VKNS, trong đó có 49 chủng từ rễ, 28 chủng từ thân và 33 chủng còn lại từ các bộ phận khác trên cây tiêu đen tại hai bang Karnataka và Kerala, Ấn Độ.

Trong nghiên cứu về đa dạng sinh học, kết quả trong nghiên cứu này có thể khẳng định giả thuyết cho rằng rễ cây là vị trí đầu tiên vi sinh vật xâm nhập và xâm nhiễm vào bên trong cây, tại các vùng rễ có bề mặt màng mỏng. Ví dụ như vùng kéo dài của rễ và vùng lông hút và vùng rễ nền có các khe nhỏ do sự xuất hiện của rễ thứ cấp. Do đó, số lượng vi sinh vật nội sinh ở rễ thường chiếm số lượng cao nhất trong cây, sau đó thân cây thực hiện chức năng vận chuyển thức ăn trên cơ thể thực vật theo các kênh dẫn truyền, đây có thể phân lập được nhiều chủng vi sinh vật nội sinh, còn lá có chức năng quang hợp, trao đổi khí, hô hấp và có sự xuất hiện vị sinh vật nội sinh bên trong các mô lá.

3.1.3. Phân bố vi sinh vật nội sinh theo môi trường phân lập

Kết quả đánh giá phân bố các chủng vi sinh vật phân lập dựa trên 4 loại môi trường đặc hiệu được thể hiện trên bảng 3.2 cho thấy, trên môi trường phân lập, số chủng vi sinh vật phân lập được phân bố đều trên các môi trường. Cụ thể, môi trường MPA là môi trường phân lập được nhiều nhất (36,11%), sau đó đến các môi trường NA và TSA 8 (22,22%) và thấp nhất là môi trường KB (19,45%). Trong nghiên cứu phân bố môi trường phân lập, kết quả trong nghiên cứu này có một chút khác biệt so với một số nghiên cứu, ví dụ như nhóm Nascimento và công sự, 2015 nghiên cứu đã phân lập được 23 chủng

34

VSVNS trên 2 loại môi trường là TSA và NA, trong đó 14 chủng phân lập trên môi trường NA (60,86%) và 9 chủng phân lập trên môi trường TSA (39,1%). Nhìn chung, các nhóm nghiên cứu trên thế giới ưu tiên sử dụng các phương pháp, lựa chọn các loại môi trường đặc hiệu nhằm phân lập các chủng vi khuẩn mới.

Bảng 3.2: Số lượng chủng phân lập được trên các môi trường khác nhau

Môi trường dùng để phân lập Số chủng phân lập được Tỷ lệ (%) so với tổng số chủng

MPA 36,11 13

NA 22,22 8

TSA 22,22 8

KB 19,45 7

3.1.4. Khả năng đối kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu của các

chủng vi sinh vật nội sinh

Từ 36 chủng VSVNS được phân lập tiến hành thí nghiệm đối kháng với từng chủng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu gồm Fusarium oxysporum CNLM, Phytophthora capsici CNLM, Rhizoctonia solani CNLM được trình bày trên bảng 3.3.

Bảng 3.3: Khả năng kháng nấm gây bệnh của vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu

Phần trăm ức chế tăng trưởng sợi nấm (RI%)

STT

Chủng

Rhizoctonia

Phytophthora

Fusarium

solani

capsici

oxysporum

0,23 (± 0,04)

74,36 (± 0,03)

0,23 (± 0,07)

HDL01

1 0,7 (± 0,03)

0,47 (± 0,06)

0,7 (± 0,08)

HDL02

2

3 HDL03

47,67 (± 0,04)

46,15 (±0,02)

51,16 (± 0,04)

HDL04

4 0,23 (± 0,07)

0,7 (± 0,06)

0,47 (± 0,04)

HDL05

5 0,14 (± 0,07)

53,95 (± 0,07)

43,95 (± 0,02)

HDL06

6 0,23 (± 0,08)

57,21 (± 0,09)

55,12 (± 0,04)

7 HDL07

45,12 (± 0,03)

0,23 (± 0,05)

32,56 (± 0,06)

8 HDL08

0,47 (± 0,01)

0,23 (± 0,06)

0,7 (± 0,06)

35

9 HDL09

37,28 (± 0,03)

62,09 (± 0,08)

64,19 (± 0,03)

10 HDL10

45,09 (± 0,08)

71,4 (± 0,04)

63,95 (± 0,02)

11 HDL11

57,91 (± 0,07)

0,7 (± 0,01)

0,23 (± 0,06)

12 HDL12

0,7 (± 0,05)

40,93 (± 0,03)

76,67 (± 0,01)

13 HDL13

72,09 (± 0,09)

58,46 (± 0,08)

44,12 (± 0,03)

14 HDL14

0,7 (± 0,02)

0,7 (± 0,04)

0,47 (± 0,01)

15 HDL15

55,81 (± 0,03)

58,14 (± 0,08)

44,12 (± 0,04)

16 HDL16

21,95 (± 0,04)

61,63 (± 0,09)

30,23 (± 0,01)

17 HDL17

62,79 (± 0,07)

63,85 (± 0,03)

38,24 (± 0,06)

18 HDL18

38,01 (± 0,04)

0,47 (± 0,06)

0,27 (± 0,02)

19 HDL19

53,49 (± 0,09)

66,05 (± 0,05)

54,19 (± 0,04)

20 HDL20

28,32 (± 0,01)

48,84 (± 0,08)

48,14 (± 0,09)

21 HDL21

11,11 (± 0,05)

53,49 (± 0,06)

69,53 (± 0,02)

22 HDL22

31,92 (± 0,05)

88,6 (± 0,07)

66,74 (± 0,08)

23 HDL23

33,96 (± 0,08)

50 (± 0,03)

25 (± 0,02)

24 HDL24

5,66 (± 0,07)

0,47 (± 0,04)

12,56 (± 0,07)

25 HDL25

26,46 (± 0,06)

43,95 (± 0.01)

39,3 (± 0,03)

26 HDL26

35,84 (± 0,04)

55,81 (± 0,07)

47,91 (± 0,04)

27 HDL27

41,62 (± 0,08)

0,47 (± 0,02)

41,86 (± 0,03)

28 HDL28

0,43 (± 0,03)

0,23 (± 0,01)

66,67 (± 0,08)

29 HDL29

0,29 (± 0,07)

0,47 (± 0,06)

30,47 (± 0,03)

30 HDL30

34,1 (± 0,02)

41,4 (± 0,04)

47,67 (± 0,08)

31 HDL31

32,56 (± 0,06)

50,93 (± 0,01)

56,98 (± 0,08)

32 HDL32

34,68 (± 0,03)

0,7 (± 0,08)

51,86 (± 0,03)

33 HDL33

21,82 (± 0,07)

61,54 (± 0,03)

0,27 (± 0,07)

34 HDL34

40,61 (± 0,02)

75,35 (± 0,05)

65,12 (± 0,09)

35 HDL35

34,88 (± 0,03)

55,81 (± 0,04)

69,53 (± 0,02)

36 HDL36

44,19 (± 0,06)

60,23 (± 0,01)

0,93 (± 0,04)

Ghi chú: ˂30%: hoạt động kháng nấm thấp, 30 - 50%: hoạt động kháng nấm trung bình, 50 - 70%: hoạt động kháng nấm cao, ≥70%: hoạt động kháng nấm rất

cao, (±): sai số.

Kết quả nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng chủng nấm kiểm định (Bảng 3.3, Hình 3.2) của 36 chủng phân lập được cho thấy, 32 trên 36 chủng

36

thể hiện hoạt tính kháng ít nhất một loại nấm kiểm định. Trong đó, có 5 chủng kháng được 1 loại nấm kiểm định, 9 chủng kháng hai loại nấm kiểm định và 18 chủng kháng ba loại nấm kiểm định.

Tổng số 36 chủng vi sinh vật nội sinh được đánh giá dựa trên khả năng

ức chế nấm gây bệnh (RI) theo 4 nhóm: ˂30%; 30-50%; 50-70%; ≥70%. Kết quả thống kê cho thấy, 26 chủng kháng nấm Rhizoctonia solani, trong đó 72,22% (n = 25) số chủng có RI (%) trên 30% tập trung đa số ở khoảng hoạt động kháng nấm từ 30 – 50% (57,70% , n = 15); 24 chủng kháng nấm Phytophthora capsici, trong đó 100% số chủng có RI (%) trên 30% tập trung đa số ở khoảng hoạt động kháng nấm từ 50 – 70% (62,50% , n = 15) và 27 chủng kháng nấm Fusarium oxysporum trong đó 92,60% số chủng có RI (%) trên 30% tập trung ở 2 khoảng hoạt động kháng nấm từ 30-50% và 50-70% phần trăm với tỷ lệ bằng nhau (44,44%, n=12).

Hình 3.2: Khả năng kháng nấm gây bệnh của vi sinh vật nội sinh phân lập được: Đối chứng A là Rhizoctonia solani, B- Phytophthora capsici và C- Fusarium oxyporum, D: Chủng HDL13 kháng nấm Rhizoctonia solani, E: Các chủng HDL10, HDL21, HDL22, HDL34 kháng nấm Phytophthora capsici, và F: Chủng HDL07 kháng nấm Fusarium oxysporum.

37

Các chủng vi sinh vật nội sinh thể hiện đa dạng mức độ kháng nấm khác nhau. Gần đây, Toh và cộng sự, 2016, thử nghiệm trên 129 chủng VKNS từ cây hồ tiêu, sàng lọc được 19 chủng có kết quả kháng nấm cao, hai chủng DB(2)7 và SB(2)6 thể hiện khả năng đối kháng cao nhất trên Phytophthora capsicimycelia, phần trăm RI lần lượt là 47,63% và 43,33%. Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Nascimento đã sàng lọc được 28 chủng VKNS cây hồ tiêu thử nghiệm đối kháng trên nấm Fusarium solani, kết quả thí nghiệm cho thấy chủng Pt12 và Pt13 có khả năng ức chế 56,52% đối với chủng F. solani. Có thể thấy, tỷ lệ kháng nấm của các chủng phân lập được khá cao so với các nghiên cứu trước đây.

3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG DIỆT NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU CAO Ở ĐẮK LẮK

3.2.1. Hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh hồ tiêu của các chủng vi

sinh vật nội sinh phân lập từ cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk

Kết quả kiểm tra khả năng kháng các chủng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu (Rhizoctonia solani CNLM, Phytophthora capsici CNLM và Fusarium oxysporum CNLM) của 36 chủng vi sinh vật nội sinh phân lập được (Bảng 3.3, mục 3.1.3) cho thấy, 32 chủng có hoạt tính kháng ít nhất một loại nấm kiểm định, 5 chủng kháng được 1 loại nấm kiểm định, 9 chủng kháng hai loại nấm kiểm định và 18 chủng kháng ba loại nấm kiểm định. Từ đó đã chọn được 6 chủng của các chủng vi sinh vật nội sinh (Bảng 3.4, Hình 3.3) có hoạt tính kháng cả 3 chủng nấm gây bệnh hồ tiêu đặc biệt là nấm gây bệnh thối thân (Phytophthora capsici) và nấm gây bệnh thối cổ rễ (Fusarium oxysporum).

Kết quả này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu gần đây của Toh và cộng sự (2016) tiến hành thử nghiệm 129 chủng vi sinh vật nội sinh từ cây hồ tiêu, sàng lọc được 19 chủng có hiệu quả kháng nấm cao, 2 chủng DB(7) và SB(2) thể hiện đối kháng cao nhất trên Phytophthora capsicimycelia với phần trăm RI lần lượt là 47,63% và 43,33% (Toh SC and Lihan S, 2016). Năm 2007, Dinu và cộng sự đã phân lập được một số chủng vi sinh vật nội sinh có tỷ lệ ức chế dao động từ 4 - 72,5% trên nấm Phytophthora capsici,

38

trong số 19 chủng vi sinh vật nội sinh có 6 chủng (31,58%) được đánh giá là gây ức chế tăng trưởng hơn 50% (Dinu A et al., 2007).

Bảng 3.4: Khả năng kháng nấm trên cây hồ tiêu của các chủng vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk

Phần trăm ức chế tăng trưởng sợi nấm (RI%)

STT Chủng phân lập

HDL10 Rhizoctonia solani CNLM 45,09 ± 0,08 Phytophthora capsici CNLM 57,4 ± 0,04 Fusarium oxysporum CNLM 63,95 ± 0,02 1

HDL19 53,49 ± 0,09 66,05 ± 0,05 54,19 ± 0,04 2

HDL20 28,32 ± 0,01 48,84 ± 0,08 48,14 ± 0,09 3

HDL21 11,11 ± 0,05 53,49 ± 0,06 69,53 ± 0,02 4

HDL22 31,92 ± 0,05 88,6 ± 0,07 66,74 ± 0,08 5

HDL34 40,61 ± 0,02 75,35 ± 0,05 65,12 ± 0,09 6

Hình 3.3: Khả năng đối kháng nấm gây bệnh của các chủng vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu: (A) đối chứng chủng nấm Phytophthora capsici, (B): HDL10, HDL21, HDL22 và HDL34 kháng nấm Phytophthora capsici.

3.2.2. Khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng vi sinh vật nội

sinh phân lập từ cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk

Vi sinh vật nội sinh có khả năng kiểm soát các bệnh do nấm thực vật gây ra, điều này là do khả năng sinh một số enzym ngoại bào, chitinase ức chế sự phát triển của nấm bằng cách thủy phân chitin trong thành tế bào nấm. Protease và cellulase ức chế sự tăng trưởng của nấm như Phytophtora capsici

39

vì thành tế bào của chúng chứa chủ yếu cellulose, protein và một lượng nhỏ chitin (Compant S et al., 2010).

Kết quả nghiên cứ khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng vi sinh vật nội sinh phân lập từ cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk được trình bày trên bảng 3.5 và hình 3.4 cho thấy, các chủng được tuyển chọn có khả năng sinh enzyme ngoại bào, đặc biệt chủng HDL34 sản sinh cả 3 loại enzym: Chitinase, cellulase và protease và cho hoạt tính enzym cao nhất.

Bảng 3.5: Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng vi sinh vật nội sinh trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk

Đường kính phân giải cơ chất D (mm)

STT Chủng phân lập Chitinase Cellulase Protease

HDL10 4,0 ± 0,05 3,2 ± 0,06 2,2 ± 0,04 1

HDL19 0 1,3 ± 0,02 3,7 ± 0,05 2

HDL20 0 2,2 ± 0,06 0 3

HDL21 0 1,7 ± 0,05 1,3 ± 0,04 4

HDL22 1,3 ± 0,06 1,5 ± 0,03 0 5

HDL34 5,1 ± 0,04 3,0 ± 0,02 3,1 ± 0,04 6

(B) (C) (A)

Hình 3.4: Khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng vi sinh vật nội sinh. (A): chitinase; (B): protease; (C): cellulase.

40

Số lượng chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng sinh enzym trong nghiên cứu này khá cao so với một số nghiên cứu trên thế giới. Năm 2014, Vinod và cộng sự đã phân lập được 45 chủng vi sinh vật nội sinh từ hạt cây tiêu đen tại Ấn Độ cho thấy, 7 trên 45 chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng sinh ít nhất một enzyme chiếm 15,5%. Năm 2008, Hardoim và cộng sự khảo sát khả năng sinh enzyme của 4 chủng vi sinh vật nội sinh phân lập từ hạt tiêu đen ở Malaysia cho thấy, cả 4 chủng vi sinh vật nội sinh đều sản sinh cellulase ngoại bào, trong đó chỉ có chủng MPB không thể hiện khả năng sinh protease và không có chủng nào sinh chitinase (Hardoim S et al., 2008).

Từ kết quả nghiên cứu khả năng đối kháng nấm gây bệnh hồ tiêu và khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi sinh vật nội sinh phân lập từ cây hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk, chủng HDL34 vừa có hoạt tính kháng nấm mạnh, vừa có khả năng sinh enzyme ngoại bào cao để nghiên cứu đặc tính sinh học, phân loại và đánh giá mức độ an toàn sinh học theo hướng tạo chế phẩm sinh học trong phòng chống bệnh cho cây hồ tiêu.

3.3. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, PHÂN LOẠI VÀ AN TOÀN SINH HỌC CỦA CHỦNG HDL34

3.3.1. Đặc điểm sinh học

1. Đặc điểm hình thái

A

Hình 3.5: Ảnh nhuộm Gram của chủng HDL34 (A) và hình ảnh khuẩn lạc của chủng HDL34 (B) trên môi trường MPA.

Chủng vi khuẩn HDL34 sau khi tuyển chọn được nuôi cấy trên môi trường thạch MPA để quan sát các đặc điểm hình thái khuẩn lạc cho thấy,

41

chủng này phát triển tốt trên môi trường MPA, khuẩn lạc tròn, bóng, đường kính 3 - 5mm, dạng màng, bề mặt nhăn, khuẩn lạc có viền, viền khuẩn lạc răng cưa không đều, không sinh sắc tố vào môi trường (Hình 3.5B). Kết quả nhuộm Gram (Hình 3.5A) cho thấy, chủng HDL34 thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que.

2. Tính chất nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, nồng độ muối là đặc điểm có ý nghĩa quan trọng đối với việc ứng dụng vi sinh vật trong lên men thu nhận sinh khối để tạo chế phẩm có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh trưởng của chủng HDL34 ở các điều kiện thử nghiệm thay đổi về nồng độ muối, pH và nhiệt độ được thể hiện trong bảng 3.6

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến khả năng phát triển của chủng HDL34

Khả năng sinh trưởng của chủng HDL34 Điều kiện Dải sinh trưởng Sinh trưởng tối ưu

Nhiệt độ (°C) 20 - 40 30

Nồng độ muối (%) 0,5 - 2 1

pH 6 - 8 7

Kết quả trình bày trên bảng 3.6 cho thấy, chủng HDL34 phát triển ở dải nhiệt từ 20 - 40°C, phát triển tối ưu ở 30°C; dải pH từ 6 – 8, tối ưu ở pH 7 và dải nồng độ muối 0,5 - 2%, tốt nhất ở nồng độ 1%, còn khi nồng độ muối ≥ 2,0% chủng này phát triển yếu hoặc không phát triển.

3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Việc nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon, nitơ nhằm đánh giá đặc điểm phân loại của chủng vi sinh vật nội sinh và giúp định hướng tìm nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình lên men. Kết quả nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon, nitơ của chủng vi sinh vật trình bày trên bảng 3.7.

42

Bảng 3.7: Khả năng đồng hóa nguồn carbon và nitơ chủng HDL34

Khả năng sinh trưởng Khả năng sinh trưởng Nguồn carbon (1,0%, w/v) Nguồn nitơ (1,0%, w/v)

HDL34 + HDL34 + D-glucose L-methionin

D-maltose + L-lysin -

D-saccharose ± L-leusin -

D-mannitol ± L-tryptophan -

Myo-inositol - L-valine ±

Cellobiose ± L-alanine -

D-fructose + L-arginine -

Tinh bột tan ± Glycine ±

Đối chứng - Đối chứng -

Ghi chú: (++) Sinh trưởng tốt; (+) Sinh trưởng bình thường; (±) Sinh trưởng kém; (-) Không sinh trưởng.

Qua kết quả trên bảng 3.7 cho thấy, chủng HDL34 có khả năng đồng hóa được nhiều nguồn carbon khác nhau, đồng hóa tốt các nguồn D-glucose, D- maltose, D-fructose, đồng hóa kém các nguồn saccharose, D-mannitol, cellobiose, tinh bột tan và không có khả năng đồng hóa Myo-inositol. Chủng HDL34 có khả năng sinh trưởng với 3 trên 8 nguồn nitơ trong thử nghiệm là L-methionin, L-valine và Glycine.

Từ các kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh lý sinh hóa của chủng HDL34, dựa trên khóa Định loại vi sinh vật của Bergey (1989) có thể kết luận sơ bộ, chủng HDL34 thuộc chi Bacillus.

3.3.2. Phân loại chủng HDL34 dựa trên phân tích trình tự gen 16S

rDNA

Kết quả DNA tổng số của chủng HDL34 được sử dụng làm vật liệu di truyền cho nghiên cứu khuếch đại gen 16S rDNA, được thể hiện ở hình 3.6 cho thấy, hai sản phẩm khuếch đại DNA của phản ứng PCR cho một băng rõ nét và duy nhất có kích thước khoảng 1400 bp. Như vậy, sản phẩm của phản

43

ứng PCR thu được trong thử nghiệm là đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh sạch và giải trình tự gen 16S rDNA của chủng HDL34. Kết quả phân tích trình tự 16S rDNA và so sánh với trình tự gen đã công bố trên Genbank bằng công cụ BLAST (NCBI) cho thấy chủng DL34 thuộc chi Bacillus và có trình tự tương đồng 100% với các loài Bacillus subtilis. Từ kết quả so sánh chủng HDL34 được định danh là Bacillus subtilis HDL34 (Bảng 3.8).

Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel agarose 1,0%. M: Thang DNA chuẩn 1 kb (Thermo scientific, Mỹ); 1: chủng HD34.

Bảng 3.8: Phân tích trình tự gen 16S rDNA của chủng chủng HDL34

Chủng vi

Trình tự gen 16S rDNA của chủng vi khuẩn

Độ tương đồng

khuẩn

(%)

được so sánh Bacillus subtilis IAM12118 (NR_112116.2)

100 Bacillus subtilis JCM1465 (NR_113265.1)

100 HDL34

Bacillus subtilis NBRC13719 (NR_112629.1)

100 Bacillus subtilis BCRC10255 (NR_116017.1)

100 Bacillus subtilis DSM10 (NR_027552.1)

100

3.3.3. Độ an toàn sinh học của chủng HDL34

Theo một số công bố quốc tế, đa số các chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng kháng nấm gây bệnh cũng thuộc chi Bacillus (Kollakkodan N et al., 2017), các loài thuộc Bacillus bài tiết các enzyme thủy phân có khả năng phá

44

vỡ vách tế bào (Chernin L and Chet I, 2002), sinh tổng hợp một loạt các loại thuốc kháng sinh như iturin (Joshi R and M B Gardener, 2006), surfactin (Tsuge K et al., 2001), fengycin (Phister T et al., 2004), bacillomycin và mycosubtilin (Ramarathnam R et al., 2007).

Như vậy, chủng Bacillus subtilis HDL34 thuộc nhóm an toàn sinh học cấp 1, có tiềm năng kiểm soát sinh học ứng dụng trong tạo chế phẩm vi sinh nông nghiệp.

3.4. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHỦNG CHỦNG HDL34

3.4.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy cho sinh trưởng chủng HDL34

1. Lựa chọn môi trường lên men cơ sở

Chủng HDL34 sinh trưởng, phát triển tốt trên cả 4 môi trường thử nghiệm (Hình 3.7), nhưng tốt nhất trên môi trường NB, sau đó đến môi trường MPA, LB và KB, nhưng khả năng kháng nấm gây bệnh, thì môi trường MPA, KB và LB có hoạt tính cao hơn môi trường NB. Từ đó, môi trường MPA là môi trường thích hợp được lựa chọn cho sự sinh trưởng của chủng này. Hơn nữa môi trường MPA có giá thành rẻ hơn môi trường LB. Kết quả này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp sau.

Hình 3.7: Khả năng kháng nấm bệnh của chủng HDL34 trên các môi trường khác nhau

45

2. Ảnh hường của thành phần môi trường đến khả năng sinh trưởng và

kháng nấm của chủng HDL34

a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Trên cơ sở môi trường MPA đã lựa chọn, thay đổi nguồn cacbon khác nhau. Glucose, rỉ đường, saccharose, dextriose, tinh bột tan và manitol để xác định mức độ ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh trưởng và hình thành chất kháng nấm chủng vi sinh vật nội sinh HDL34.

Bảng 3.9: Ảnh hường của nguồn cacbon và nitơ đến khả năng sinh chất kháng sinh của chủng HDL34

Nguồn nitơ Hoạt tính kháng nấm (mm)

Nguồn cacbon Glucose Bột đậu tương Hoạt tính kháng nấm (mm) 13,9±0,23

Rỉ đường 15,0±0,15 14,0±0,13 Cao nấm men 15,0±0,19

Saccharose 12,0±0,11 Pepton 12,5 ±0,12

Dextriose 13,7 ±0,18 Trypton 13,5 ±0,24

Tinh bột tan 12,0±0,22 Cao malt 14,0 ±0,15

Manitol 14,5±0,16 Cao thịt 12,9 ±0,18

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.9 cho thấy, trong các nguồn cacbon sử dụng chủng HDL34 nội sinh phát triển và sinh chất kháng nấm cao nhất trong môi trường có nguồn cacbon là glucose cho các nghiên cứu tiếp theo.

b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các 6 nguồn nitơ khác nhau như: bột đậu tương, cao nấm men, pepton, trypton, cao malt, cao thịt. Kết quả nghiên cứu thể hiện qua Bảng 3.9.

Chủng HDL34 phát triển tốt nhất trên môi trường tuyển chọn với nguồn nitơ là cao nấm men, đường kính kháng nấm cao nhất. Như vậy, trong các nguồn nitơ sử dụng chủng HDL34 phát triển và sinh chất kháng nấm cao nhất trong môi trường có nguồn nitơ là cao nấm men cho các nghiên cứu tiếp theo.

46

3. Ảnh hường của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và kháng

nấm của chủng HDL34

a. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của các chủng tuyển chọn, chúng tôi tiến hành lên men trong môi trường thay thế với nhiệt độ ban đầu thay đổi từ 20-40˚C đối với vi khuẩn và 15-40˚C đối với vi nấm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10.

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chủng HDL34

Nhiệt độ (˚C) pH

20 Hoạt tính kháng nấm (mm) 10,5±0,35 5 Hoạt tính kháng nấm (mm) 11,5±0,2

25 14,6±0,26 6 13±0,15

30 7

37 16,3±0,15 15,6±0,2 8 14,0 ±0,2 7,0 ±0,34

40 7,0 ±0,14

Kết quả thu được ở Bảng 3.10 cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho chủng sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng nấm của chủng HDL34 là 30°C, với đường kính vòng kháng nấm lần lượt đạt tới 16.3 mm.

b. Ảnh hưởng của pH ban đầu

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng HDL34 được tiến hành lên men trong môi trường với pH ban đầu thay đổi từ 5-8. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10 cho thấy, chủng HDL34 nội sinh kháng nấm tốt nhất trên môi trường có pH 7, đường kính vòng kháng nấm cao nhất, tuy nhiên ở pH 6 khả năng kháng nấm của các chủng thấp hơn không đáng kể.

c. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống

47

Lượng giống được tiếp theo tỷ lệ: 1, 3, 5, 7 và 9 % theo thể tích dịch lên men, sau khi lên men với thời gian 24 giờ, xác định hoạt tính kháng nấm đối với Phytophthora capsici CNLM được thể hiện ở bảng 3.11.

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống và độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chủng HDL34 nội sinh

Tỷ lệ tiếp giống % 1 Hoạt tính kháng nấm (mm) 8,5±0,2 Độ thông khí (%, v/V) 5 Hoạt tính kháng nấm (mm) 12,0±0,19

3 13±0,15

10 15 14,5±0,19 14,0 ±0,23

5 7 14,0 ±0,2 13,0 ±0,34 20 12,0 ±0,27

9 10,0 ±0,34 25 13,0 ±0,24

Kết quả trong trên cho thấy tỷ lệ tiếp giống cho quá trình lên men chủng HDL34 thích hợp nhất là 5% với đường kính vòng kháng nấm Phytophthora capsici CNLM đạt cao nhất.

d. Ảnh hưởng của độ thông khí

Độ thông khí được được khảo sát bằng cách lên men chủng HDL34 trong các bình tam giác 500 ml có tỷ lệ thể tích dịch lên men so với thể tích bình khác nhau. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.10.

Hình 3.8: Ảnh hưởng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chủng HDL34 (Trong đó: v: thể tích môi trường lên men (ml); V: thể tích bình lên men (ml))

48

Kết quả trong hình 3.9 cho thấy, nhu cầu sử dụng oxy hòa tan của chủng HDL34 cao, độ thông khí càng cao thì các chủng vi sinh vật nội sinh sinh trưởng và phát triển càng tốt. Ở độ thông khí 10% chủng phát triển và sinh chất kháng nấm Phytophthora capsici CNLM mạnh nhất, ở độ thông khí 10% (v thể tích dịch/V thể tích bình) được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.4.2. Thử nghiệm khả năng kháng nấm của chủng HDL34 ở quy

mô phòng thí nghiệm

Chủng B.subtilis HDL34 được nuôi trên môi môi trường và điều kiên lên men đã lựa chọn, sau 24 giờ, dịch nuôi cấy được thử nghiệm sơ bộ khả năng kháng nấm Phytophthora capsici.

Cách làm: Mẫu đối chứng được nhiễm nấm Phytophthora capsici và mẫu thí nghiệm sau khi nhiễm nấm Phytophthora capsici được xử lý dịch nuôi cấy chủng B.subtilis HDL34 (Hình 3.11).

4 1

Hình 3.9: Khả năng kháng nấm bệnh P. capsici VTN của chủng HDL34. 1: Đối chứng (Nhiễm P. capsici VTN + nước khử trùng); 2: Nhiễm P. capsici VTN + HDL34

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng B.subtilis HDL34 (Hình 3.11) cho thấy, lá nhiễm nấm bệnh có xử lý bị nhiễm ở mức độ 3 (26-50% diện tích lá bị nhiễm nấm) so với mẫu đối chứng bị nhiễm 100% diện tích lá. Như vậy, dịch nuôi cấy chủng B.subtilis HDL34 có khả năng kháng nấm Phytophthora capsici gây bệnh cho cây hồ tiêu.

49

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

1. Nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu ở Đắk Lắk, số chủng phân lập từ rễ là cao nhất (44,44%), sau đó thân (38,89%) và thấp nhất ở lá (16,67%) và số chủng phân lập được cao nhất trên môi trường MPA (36,11%), sau đó đến NA, TSA chiếm tỷ lệ 22,22% và thấp nhất trên môi trường KB chiếm 19,45%.

2. Trong số 36 chủng phân lập được có 32 chủng có hoạt tính kháng ít nhất một loại nấm kiểm định, trong đó, có 5 chủng kháng được 1 loại nấm kiểm định, 9 chủng kháng hai loại nấm kiểm định và 18 chủng kháng ba loại nấm kiểm định.

3. Đã nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật nội sinh cây hồ tiêu có hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật cho thấy, cả 6 chủng vi sinh vật được tuyển chọn đều có khả năng ức chế nấm R. solani, P. capsici và F. oxysporum (RI%) trên 50%; 3/6 chủng có khả năng sinh chitinase, 4/6 chủng sinh protease và cả 6 chủng sinh cellulase; chủng HDL34 được lựa chọn để nghiên cứu tiếp vì vừa có khả năng ức chế mạnh lên sự phát triển sợi nấm, vừa có khả năng sinh protease, cellulase và chitinase ngoại bào.

4. Chủng HDL34 phát triển tốt trên môi trường MPA; dải nhiệt độ từ 20- 40°C; pH 6-8; nồng độ NaCl từ 0,5-2%; tố ưu ở 30°C, pH 7 và nồng độ NaCl thích hợp là 1%; là vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que và sinh bào tử và được định danh là Bacillus subtilis HDL34 và là chủng an toàn sinh học.

5. Đã nghiên cứu môi trường và điều kiên nuôi cấy thích hợp để lên men sản xuất chế phẩm và thử nghiệm dịch lên men lên khả năng kháng nấm Phytophthora capsici trên cây hồ tiêu cho thấy, chủng HDL34 có khả năng ứng dụng tạo chế phẩm sinh học phòng chống bệnh nấm cho cây hồ tiêu.

4.2. KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu quy trình công nghệ lên men sản xuất tạo chế phẩm sinh học và thử nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh cho cây hồ tiêu.

50

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Quyết định 1442/QĐ-BNN-TT ngày 03/07/2014 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn: Quy hoạch phát triển ngành hồ tiêu Việt Nam đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2030

2. Phạm Văn Biên, Nguyễn Văn Tá, Mai Thị Vinh, Trần Minh Tú, Nghiêm Bảo Tuấn, 1990, Kết quả nghiên cứu sâu bệnh hại tiêu (Piper nigrum), Tạp chí nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, số 339: 544 - 548.

3. Phạm Văn Biên, 2005, Nghiên cứu các giải pháp khoa học công nghệ và thị trường để phát triển vùng hồ tiêu nguyên liệu phục vụ chế biến và xuất khẩu, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước, 2005.

4. Đỗ Trung Bình, 2012, Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật tổng hợp trong sản xuất cây tiêu theo hướng bền vững, Báo cáo tổng kết đề tài trọng điểm cấp Bộ, 2012.

5. Nguyễn Ngọc Châu, 1995, Thành phần sâu bệnh hại hồ tiêu ở Quảng Trị.

Tạp chí Bảo vệ thực vật 1 (139): 14-18.

6. Nguyễn Ngọc Châu, 2003, Tuyến trùng thực vật và cơ sở phòng trừ. NXB

KHKT Hà Nội, 302 trang

7. Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 1991, Kết quả bước đầu nghiên cứu phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne incognita ở hồ tiêu”. Những thành tựu khoa học kỹ thuật đưa vào sản xuất, số 1: 11 - 15.

8. Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 1993, Tuyến trùng ký sinh ở cây hồ tiêu và các bệnh do chúng gây ra. Tuyển tập các công trình nghiên cứu sinh thái và tài nguyên sinh vật (1990 – 1992, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật. 265 - 270.

9. Đào Thị Lan Hoa, Phan quốc Sủng, Trần Thị Kim Loang, Tôn Nữ Tuấn Nam, Nguyễn Xuân Hoà và Tạ Thanh Nam, 2003, Nghiên cứu bệnh vàng lá chết chậm trên cây tiêu tại Tây Nguyên và biện pháp phòng trừ, Kỷ yếu hội thảo khoa học bảo vệ thực vật phục vụ cho chủ trương chuyển đổi cơ

51

cấu cây trồng ở các tỉnh phía Nam và Tây Nguyên ngày 26-27/6/2003 tại Vũng Tàu.

10. Lê Gia Hy, 2012, Công nghệ sản xuất kháng sinh, NXB Khoa học và Kỹ

thuật Hà Nội.

11. Trần Kim Loang, Đào Thị Lan Hoa, Lê Đăng Khoa, Hà Thị Mão, Lê Đình Đôn, Tạ Thanh Nam, Ngô Thị Xuân Thịnh, 2006, Nghiên cứu bệnh do nấm Phytophthora trên một số cây công nghiệp và cây ăn quả”, Báo cáo trọng điểm cấp Bộ 2001-2005, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.

12. Trần Kim Loang, Lê Đình Đôn, Tạ Thanh Nam, Ngô Thị Xuân Thịnh, Nguyễn Thị Tiến Sĩ, Trần Thị Xê, 2008, Phòng trừ bệnh do nấm Phytophthora trên cây hồ tiêu bằng chế phẩm sinh học Trichoderma (Tricho-VTN) tại Tây Nguyên, Kết quả nghiên cứu khoa học năm 2008, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp, 307- 315.

13. Phan Quốc Sủng, 2000, Tìm hiểu về Kỹ Thuật Trồng và Chăm Sóc Cây

Hồ Tiêu. Nhà Xuất Bản Nông nghiệp.

14. Phan Quốc Sủng, 2001, Tìm hiểu về kỹ thuật trồng và chăm sóc cây hồ

tiêu, Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, 43tr.

15. Phạm Thị Thùy, 2013, Nông nghiệp hữu cơ ở Việt Nam- hiện trạng- tiêu chuẩn sản xuất và hướng phát triển, Kỷ yếu Hội thảo “Nông nghiệp hữu cơ-Thực trạng và định hướng phát triển” 2013.

16. Nguyễn Tăng Tôn, 2009, “Nghiên cứu các giải pháp quản lý tổng hợp dịch hại phát sinh từ đất trên cây hồ tiêu”, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ, 2009.

17. Nguyễn Vĩnh Trường, 2008, Kỹ thuật bẫy và theo dõi nguồn bệnh Phytophthora gây bệnh thối gốc rễ cây hồ tiêu ở trong đất, Tạp chí bảo vệ thực vật. Số 4: 13 - 16.

52

18. Tuat Nguyễn Văn Tuất, 2012, Nghiên cứu nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu và biện pháp quản lý bệnh hại tổng hợp, Nxb NN, Hà Nội, 2012.

19. Diệp Đông Tùng, Nguyễn Xuân Niệm, Chu Hữu Tín (1999). Điều tra- giám định một số sâu bệnh hại chính trên cây tiêu tại Phú Quốc, Tạp Chí Bảo vệ thực vật, số 6: 20 - 23.

20. Ngô thị Xuyên, 2002, Kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne bằng phương pháp sinh học. Hội thảo bệnh cây và sinh học phân tử, lần thứ nhất, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh ngày 21/6/2002, Nhà xuất bản Nông nghiệp, 113 - 119.

Tài liệu tiếng Anh

21. Anandaraj M. and Sarma IR, 1995, Dseases of black pepper (Piper nigrum

L.) and their management, J Spices and Aromatic Crops, 4: 17-23.

22. Anith, K.N., Radhakrishnan, N.V. and Manomohandas, T.P., 2003)\, Screening of antagonistic bacteria for biologicalcontrol of nursery wilt of black pepper (Piper nigrum L.), Microbiol Res 158: 91–97

23. Aravind R, Kumar A, Eapen S and Ramana K , 2009, Endophytic bacterial flora in root and stem tissues of black pepper (Piper nigrum L.) genotype: isolation, identification and evaluation against Phytophthora capsici, Letters in applied microbiology 48(1): 58-64.

24. Augstburger, F., Berger, J., Censkowsky, U., Heid, P., Milz, J. and Streit, C., 2001, Organic farming in thetropics and subtropics: Pepper (2nd ed.), Germany: Naturlande. V.

25. Babadoost, M. (2005). Phytophthora blight of cucurbits.The Plant Health

Instructor, DOI: 10.1094/PHI-I-2005-0429-01

26. Bacon and White 2000, Physiological adaptation in the evolution of endophytism in the Clavicipitaceae. In: Bacon CW, White JF Jr, eds. Microbial endophytes, New York: Marcel Dekker, Inc. 237–261.

53

27. Bell, C.R., Dickie, G.A., Harvey, W.L.G. and Chan, J.W.Y.F., 1995,

Endophytic bacteria in grapevine, Can J Microbiol 41: 46–53

28. Chanway, C.P., 1996, Endophytes: they’re not just fungi, Can J Bot 74:

321–322.

29. Chen, C., Bauske, E.M., Musson, G., Rodriguez-Cabana, R. and Kloepper, J., 1995, Biological control of Fusarium wilt on cotton by use of endophytic bacteria. Biol Control 5: 83–91.

30. Chernin L and Chet I, 2002, “Microbial enzymes in biocontrol of plant pathogens and pests”, Enzymes in the Environment: Activity, Ecology, and Applications, 171-225.

31. Compant S., Clément C. and Sessitsch A., 2010, “Plant growth-promoting bacterial in the rhizo and endosphere of plant: their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization”, Soil Biol Biochem, 42, 669-678.

32. Cook, J.R. and Baker, K.F., 1983, The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens. American Phytopathological Society, St. Paul.

33. Diby, P., Saju, K.A., Jisha, P.J., Sarma, Y.R., Kumar, A. and Anandaraj, M., 2005, Mycolytic enzymes produced by Pseudomonas fluorescens and Trichoderma spp. Against Phytophthora capsici, the foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum L.). Ann. Microbiol 55: 129–133

34. Dinu A, Kumar A, Aravind R and Eapen SJ, 2007, “Novel in planta assay for selection of antagonistic bacteria against Phytophthora capsici on black pepper (Piper nigrum L.)”, J Spices Aromatic Crops, 16, 1-7.

35. Drenth, A. and Guest, D.I. (Eds.)., 2004, Diversity andmanagement of Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International AgriculturalResearch. Monograph no. 114: 238p.

36. El-Deeb B, Fayez K and Gherbawy Y, 2013, Isolation and characterization of endophytic bacteria from Plectranthus tenuiflorus medicinal plant in

54

Saudi Arabia desert and their antimicrobial activities. Journal of plant interactions 8(1): 56-64.

37. Farhana, S.N.M.D., Bivi, M.R., Khairulmazmi, A.,Wong, S.K. and Sariah, M., 2013, Morphologicaland molecular characterization of Phytophthora capsici, the causal agent of foot rot disease of blackpepper in Sarawak, Malaysia. International Journal ofAgriculture and Biology 15: 1083-1090.

38. Fisher, M.C., Henk, D.A., Briggs, C.J., Brownstein, J.S.,Madoff, L.C., McCraw, S.L., Gurr, S.J., 2012, Emergingfungal threats to animal, plant and ecosystem health. Nature 484 (7393): 186-194.

39. Garbeva, P., Van Overbeek, L.S., Van Vuurde, J.W.L. and Van Elsas, J.D., 2001, Analysis of endophytic bacterial communities of potato by planting and denaturing gradient gelelectrophoresis (DGGE) of 16s rDNA based PCR fragments. Microb Ecol 41: 369–383.

40. Gazis R., Miadlikowska J., Lutzoni F., Arnold A. E., Chaverri P., 2012, Culturebased study of endophytes associated with rubber trees in Peru reveals a new class of Pezizomycotina: Xylonomycetes, Molecular Phylogenetics and Evolution, 65: 294-304.

41. Gevens, A.J., Donahoo, R.S., Lamour, K.H. and Hausbeck, M.K., 2008, Characterization of Phytophthora capsicicausing foliar and pod blight of snap bean in Michigan. Plant Disease 92(2): 201-209

42. Gong M., Wang J. D., Zhang J., Yang H., Lu X. F., Pei Y., Cheng J. Q., 2006, Study of the Antifungal Ability of Bacillus subtilis Strain PY-1 in Vitro and Identification of its Antifungal Substance (Iturin A). Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 38(4): 233-240.

43. Hallmann, J. Hallmann, A. Hallmann, W.F. Mahaffee, KloepperJ.W., 1997, Bacterial endophytes in agricultural crops.Can J Microbiol, 43: 895–914.

44. Hamada M.; S. Kondo; T. Yokoyama; K. Miura; K. Iinuma; H. 1974, Yamamoto; K. Maeda; T. Takeuchi; H. Umezawa,

55

Minosaminomycin, a new antibiotic containing myo-inosamine. J. Antibiotics, 27: 81-93.

45. Hardoim S, Pablo R, Overbeek LS, Elsas Y and Jan Dirk van, 2008, “Properties of bacteria endophytes and their proposed role in plant growth”, Trends in Microbiology, 16(10), 463-471.

46. Hollis, J.P., 1951, Bacteria in healthy potato tissue. Phytopathology 41:

350–366

47. Holt JG, Williams ST and Holt, 1989, Bergey's manual of systematic

bacteriology, Vol. 4. 1989: Lippincott Williams & Wilkins.

48. Jatala, (1986). Biological control of plant parasitic nematodes, Annual

Review of phytopathology, Vol. 24: 453-489.

49. Jeyaseelan E. C. and Jashothan J. P., 2012,” In vitro control of Staphylococcus aureus (NCTC 6571) and Escherichia coli (ATCC 25922) by Ricinus communis L.”, Asian Pac J Trop Biomed, 2(9), pp. 717–721.

50. Joshi R. and M. B. Gardener , 2006, “Identification of genes associated with pathogen inhibition in different strains B. subtilis phytopathology”, Antagonistic Activity of Endophytic, 96, 145-154.

51. Kasana R. C., Salwan R., Dhar H., Dutt S. and Gulati A., 2008, “A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s iodine”, Current Microbiology, 57, pp.503-507.

52. Kateka D., Shannaphimon W., Phichaya T., Prapaporn B., Arunee A., Panupong S. and Ekachai C., 2009, “Comparative study of proteolytic activity of protease-producing bacteria isolated from thuanao”, Journal of Science and Technology, 3(02), pp. 269-276.

53. Kollakkodan N., Anith K. N. and Radhakrishnan N. V., 2017, “Diversity of endophytic bacteria from Piper spp. with antagonistic property against Phytophthora capsici causing foot rot disease in black pepper (Piper nigrum L.)”, Journal of Tropical Agriculture, 9 (125), pp. 531-752.

56

54. Lamour, K.H., Stam, R., Jupe, J. and Huitema, E., 2012b, The oomycete capsici. Molecular Plant

broad-host-range pathogenPhytophthora Pathology13(4): 329-337

55. Lee YK and Hwang BK , 1996, Differential induction and accumulation of

β‐1, 3‐glucanase and chitinase isoforms in the intercellular space and leaf tissues of pepper by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria infection. Journal of Phytopathology 144(2): 79-87.

56. Mahafee, W.F. and Kloepper, J.W., 1997, Bacterial communities of the rhizosphere and endorhiza associated with fieldgrown cucumber plants inoculated with a plant growth promoting rhizobacterium or its genetically-modified derivative. Can J Microbiol 43, 344–353.

57. Marín, F., Diánez, F., Santos, M., Carretero, F., Gea, F.J., Castañeda, C., Navarro, M.J. and Yau, J.A., 2014, Control of Phytophthora capsici and Phytophthoraparasitica on pepper (Capsicum annuum L.) with compost teas from different sources, and theireffects on plant growth promotion. Phytopathologia Mediterranea 53(2): 216-228

58. McInroy, J.A. and Kloepper, J.W., 1995, Survey of indigenous bacterial

endophytes from cotton and sweet corn. Plant Soil 173, 333–342.

59. Misaghi, I.J. and Donndelinger, C.R., 1990, Endophytic bacteria in symptom-free cotton plants. Phytopathology 80: 808–811.Mohd F. K. (2015), “In vitro antagonism of Phytophthora capsici and Fusarium solani by bacterial isolates from Sarawak”, Malaysian Journal of Microbiology, 11(2), pp. 137-143.

60. Mundt, J.O. and Hinkle, N.F., 1976, Bacteria within ovules and seeds.

Appl Environ Microbiol 32: 694–698.

61. Munjal, A., Philipe, J.M., Munro, E., Lecuit, T., 2015, A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature, 524 (7565): 351-355.

62. Nascimento, S.B., Lima, A.M., Borges B.N. and de Souza C.R.B., 2015, Endophytic bacteria from Piper tuberculatumJacq.: isolation, molecular

57

characterization, and in vitro screening for the control of Fusarium solani f. sp piperis, the causalagent of root rot disease in blackpepper (Piper nigrum L.). Genetics and molecular research, 14 (3): 7567-7577.

63. Nazeem P.A., C.R. Achuthan, T.D. Babu, G.V. Parab, D. Girija, R. Keshavachandran, and R.Samiyappan, 2008, Expression of pathogenesis related proteins in black pepper (Piper nigrum L.) in relation to Phytophthora foot rot disease, Journal of Tropical Agriculture 46 (1-2): 45–51.

64. Nguyen Tang Ton and Bui Chi Buu, 2012, How to prevent the most serious diseases of black pepper (Piper nigrum L.)- a case study of Vietnam, Institute of Agricultural Sciences for Southern Vietnam

65. Nguyen, V.L., 2015, Spread of Phytophthora capsici in Black Pepper

(Piper nigrum) in Vietnam. Engineering 7: 506-513.

66. Ou S.H., 1972, Rice Disease. Commonwealth Mycological Institute. Kew,

Surrey, UK, 380 pp

67. Patriquin, D.G. and Do ¨bereiner, J., 1978, Light microscopyobservations of tetrazolium-reducing bacteria in the endorhizosphere of maize and other grasses in Brazil. Can JMicrobiol 24: 734–742.

68. Phister T., D. J. O’sullivam and L. L. Mckay, 2004, “Identification of Bacilysin, Chlorotetaine, and Iturin A Produced by Bacillus sp. Strain CS93 Isolated from Pozol, a Mexican Fermented Maize Dough”, Appl Environ Microbiol, 70(1), 631-634

69. Ramarathnam R, Bo S, Chen Y, Fernando WG, Xuewen G and Kievit T, fengycin- and 2007, “Molecular and biochemical detection of bacillomycin D-producing Bacillus spp., antagonistic to fungal pathogens of canola and wheat”, Can J Microbiol, 53(7), 901-912.

70. Ravindran , S. S., 2000, A reduced‐order approach for optimal control of fluids using proper orthogonal decomposition, International Journal for Numerical Methods in Fluids, 34 (5): 425-448.

58

71. Samish, Z., Etinger-Tulczynska, R. and Blick, M., 1961, Microflora within

healthy tomatoes. Appl Environ Microbiol 9:, 20–25.

72. Sampson R A, 1994, Current systematics of the genus Aspergillus. In: The genus Aspergillus. From taxonomy and genetics to industrial application. Plenum Press, New York, N.Y: 261-276.

73. Sarma, Y.R., Manohara, D., Premkumar, T. and Eapen, S.J.(Eds.), 2013, Diseases and insect pests of black pepper (Piper nigrum L.), Jakarta, Indonesia: InternationalPepper Community (IPC).

74. Sivaraman, K., Kandiannan, K., Peter, K.V. andThankamani, C.K., 1999, Agronomy of black pepper(Piper nigrum L.) - A review. Journal of Spices andAromatic Crops 8(1): 1-18.

75. Smith GE, 1957, Inhibition of Fusarium oxysporum f. Sp. Lycopersici by a species of Micromonospora isolated from tomato. Phytopathology, 47: 429-432.

76. Stanley T. Williams ME. Sharpe and Holt JG. (1989), “Bergey’s Mannual

of Systematic bacteriology”, Williams & Wilkins, 4, 2452-2492.

77. Sturz, A.V., Christie, B.R., Matheson, B.G., Arsenault, W.J. and Buchanan, N.A., 1999, Endophytic bacterial communities in the periderm of potato tubers and their potential to improve resistance to soil-borne pathogens. Plant Pathol 48: 360–369.

78. Toh SC and Lihan S, 2016, “Screening for antifungal-producing bacteria from Piper nigrum plant against Phytophthora capsici”, International Food Research Journal, 23(6), 2616-2622.

79. Trivedi P, Spann T and Wang N, 2011, Isolation and characterization of benefcial bacteria associated with citrus roots in Florida. Microb. Ecol. 62: 324-336.

80. Tsuge K., T. Akiyama and M. Shoda, 2001, “Cloning, Sequencing, and Characterization of the Iturin A Operon”, Journal of bacteriology, 183(21), 6265-6273.

59

81. Usharani T. R. and Gowda T. K., 2011, “Cloning of chitinase gene from Bacillus thuringiensis”, Indian Journal of Biotechnology, 10, pp. 264-269.

82. Van Buren, A.M., Andre, C. and Ishimaru, C.A., 1993, Biological control of the bacterial ring spot pathogen by endophytic bacteria isolated from potato. Phytopathology 83: 1406.

83. Victor R. Preedy (Editer) Essential Oils in food preservation, Flaver and

safety, Elsevier Inc., 2016.

84. Zinniel, D.K., Lambrecht, P.N., Harris, B., Zhengyu, F., Daniel,K., Phyllis, H., Carol, A.I., Alahari, A. et al. ,2002, Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteriafrom agronomic crops and prairie plants. Appl Environ Microbiol 68: 2198–2208.

85. Živković S, Stojanović S, Ivanović Ž, Gavrilović V, Popović T and Balaž J, 2010, “Screening of antagonistic activity of microorganisms against Colletotrichum acutatum and Colletotrichum gloeosporioides”. Archives of Biological Sciences, 62(3), 611-623.