Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam Hàm Yên - Tuyên Quang và tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chúng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

........................

ĐÀO ÁNH VÂN

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY CAM

HÀM YÊN - TUYÊN QUANG VÀ TIỀM NĂNG SINH

TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG NẤM CỦA CHÚNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Mã ngành :60 42 01 03

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. PHAN THỊ HỒNG THẢO

Hà Nội - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

LỜ I CAM ĐOAN

.Các số liệu, kết

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứ u củ a riêng tôi

quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng mo ̣i sự giú p đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã đươ ̣c cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đươ ̣c chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015

Học viên

Đào Ánh Vân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phan Thị Hồng Thảo –

Trưởng phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam người đã truyền thụ cho tôi những kiến thức chuyên ngành,

hướng dẫn, định hướng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tôitrong suốt quá trình học

tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện

Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập

Xin chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ

Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã động viên, giúp đỡ

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.

Tôi xin cám ơn sự hỗ trợ kính phí thực hiện từ đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng

của xạ khuẩn nội sinh trên cây có múi đặc sản ở miền Bắc Việt Nam và tiềm năng

sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn và kích thích tăng trưởng thực vật của chúng”

Mã số đề tài: VAST.ĐLT.12/15-16 thuộc cấp quản lý Viện Hàn lâm KHCNVN

vàPhòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học đã tạo

điều kiện và cung cấp các thiết bị để tôi có thể tham gia thực hiện đề tài.

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn

quan tâm giúp đỡ và động viên tôi để có được thành quả ngày hôm nay.

Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015

Học viên

Đào Ánh Vân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT Tên viết tắt Tên đây đủ

1 CFU Đơn vị hình thành khuẩn lạc

2 DNA Deoxyribosenucleoic Acid

3 EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid

4 HTKS Hoạt tính kháng sinh

5 ISP Internationl Streptomyces Project

6 KTCC Khuẩn ty cơ chất

7 KTKK Khuẩn ty khí sinh

8 PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng khuếch đại gen

9 rDNA Ribosomal Deoxyribosenucleoic Acid

10 RNA Ribonucleic acid

11 rRNA Ribosomal Ribonucleic acid

12 SDS Sodium dodecyl sulfate

13 TAE Tris-acetat EDTA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

14 VSV Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

1.1 Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội cộng sinh 13

trên thực vật.

3.1 Kết quả phân lập xạ khuẩn nội sinh từ mẫu rễ Cam Hàm Yên Tuyên Quang 27

trên một số môi trường khác nhau

3.2 Tỷ lệ các xạ khuẩn phân lập chia theo đa dạng nhóm màu 30

3.3 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn 30

3.4 Số lượng các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập có khả năng đối kháng với 31

các chủng nấm và vi khuẩn kiểm tra

3.5 Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng sinh của 4 chủng xạ khuẩn lựa chọn được 32

nuôi cấy trên môi trường dịch thể ISP2 sau 5 ngày

3.6 Đặc điểm nuôi cấy của xạ khuẩn nội sinh C12 và R12-4 trên các môi trường 33

ISP

3.7 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau 14 36

ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30C

3.8 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường ban đầu đến khả năng sinh 37

trưởng và phát triển của 4 chủng xạ khuẩn tuyển chọn

3.9 Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 4 37

chủng xạ khuẩn tuyển chọn

3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ 37

khuẩn tuyển chọn

3.11 khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các chủng xạ khuẩn 38

3.12 So sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng R12-4 với gen tương ứng 39

của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank

3.13 Môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của hai chủng 40

xạ khuẩn C12 và R12-4

3.14 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi đến sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm 41

3.15 Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của hai chủng xạ 41

khuẩn lựa chọn

3.16 Lựa chọn dung môi để chiết hoạt chất kháng nấm từ dịch lên men và sinh 42

khối

3.17 Ảnh hưởng của các pH chiết khác nhau đến khả năng chiết chất kháng nấm 43

3.18 Xác định độ bền nhiệt đến hoạt tính kháng nấm của chủng R12-4 44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình

Hình 3.1 Hình ảnh minh họa kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh trên Trang 29

một số môi trường sau 6 tuần nuôi cấy

3.2 29

Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân lập theo bộ phận của cây Cam Hàm Yên – Tuyên Quang

3.3 Khả năng đối kháng của một số chủng xạ khuẩn phân lập với nấm 31

3.4 Xạ khuẩn C12 và R12-4 đối kháng với nấm 32

3.5 3.6 34 34

3.7 35

3.8 35

Khuẩn lạc xạ khuẩn C12 trên các môi trường ISP Khuẩn lạc xạ khuẩn R12-4 trên các môi trường ISP Cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình da ̣ng bào tử của xạ khuẩn nội sinh C12 Cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình da ̣ng bào tử của xạ khuẩn nội sinh R12-4

3.9 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn R12-4 và C12 36

sau 14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 28C

3.10 Điện di đồ DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 trên gel 38

agarose 1,0 %.

3.11 Điện di đồ sản phẩm PCR của chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 với cặp 38

mồi sử dụng 27F và 1492R trên gel agarose 1,0%

3.12 Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng Streptomyces angustmyceticus 39

C12 với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA

3.13 Độ bền của chất kháng nấm với nhiệt 44

3.14 Độ bền của chất kháng nấm với pH 3.15 Khả năng bền với pH của chất kháng nấm 45 45

3.16 Hoạt chất kháng nấm của kháng sinh tinh sạch 46

3.17 Hình ảnh quang phổ hấp thu điện tử UV VIS của kháng sinh tinh sạch 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

3.18 Hình ảnh phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh sạch 47

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3

1.1. Xạ khuẩn nội sinh trong thực vật ......................................................................... 3

1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn .......................................................................... 3

1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ......................................................................... 6

1.1.3. Mối quan hệ giữa thực vật và xạ khuẩn nội sinh .............................................. 8

1.1.4. Con đường xâm nhập của vi sinh vật vào cây chủ ........................................... 8

1.1.5. Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh ................................................. 9

1.1.6. Phân loại xạ khuẩn nội sinh .......................................................................... 10

1.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh và tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh

.................................................................................................................................... 12

1.2.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh ........................................................ 12

1.2.2. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh ................................................... 15

1.3. Cây có múi và khả năng thu nhận các thể nội sinh ............................................ 17

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 20

2.1. Vật liệu ................................................................................................................ 20

2.1.1. Mẫu cây ........................................................................................................ 20

2.1.2. Vi sinh vật kiểm định: .................................................................................... 20

2.1.3. Hóa chất và thiết bị ....................................................................................... 20

2.1.4. Môi trường nghiên cứu.................................................................................. 21

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 22

2.2.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ các mô sống của các mẫu thực vật 22

2.2.2. Đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn .................................................. 22

2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ................................................. 23

2.2.4. Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA ....................................................... 24

2.2.5.Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh ............................................ 24

2.2.6. Phương pháp xác định một số tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn 26

Phần III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 27

3.1. Phân lập và sàng lọc các chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp

hoạt chất kháng nấm trên cây Cam Hàm Yên – Tuyên Quang. .............................. 27

3.1.1. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây cam Hàm Yên – Tuyên

Quang ..................................................................................................................... 27

3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh chất kháng nấm,

kháng khuẩn ........................................................................................................... 30

3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn ....... 32

3.2.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý và đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn lựa

chọn........................................................................................................................ 32

3.2.2. Đặc điểm sinh học của hai chủng xạ khuẩn lựa chọn .................................... 35

3.3. Nghiên cứu môi trƣờng và điều kiện sinh tổng hợp chất kháng nấm của hai

chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn ............................................................................. 40

3.3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng

nấm ........................................................................................................................ 40

3.4. Nghiên cứu một số tính chất hoá lý của hoạt chất kháng nấm thu nhận từ

chủng R12-4. .............................................................................................................. 42

3.4.1. Tách chiết chất khá ng nấm ............................................................................ 42 3.4.2. Khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh ....................................................... 43

3.4.3. Khả năng bền với pH của chất kháng nấm .................................................... 45

3.4.4. Tinh sạch và thu nhận chất kháng sinh ......................................................... 46

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 48

KẾT LUẬN .................................................................................................................... 48

KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 49

PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 53

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

MỞ ĐẦU

Cây có múi là tên gọi chung của nhóm cây cam, chanh, quýt, bưởi... cùng họ

Rutaceae. Cây ăn trái có múi được trồng ở hơn 100 quốc gia. Đây là loại quả có tầm quan

trọng hàng đầu thế giới, với sản lượng năm 2009 đạt hơn 120 triệu tấn, trong đó cam chiếm

54% [15, 42, 46], bao gồm cả Việt Nam, tại vùng cam nổi tiếng Hàm Yên - Tuyên Quang

hiệu quả kinh tế thu về khá cao. Tuy nhiên, việc trồng cây có múi phải đối mặt với một số

vấn đề là cây tăng trưởng chậm, côn trùng, sâu bệnh... [41].Bên cạnh đó, sự phát triển

nhanh chóng các vùng trồng và sử dụng lượng hóa chất nông nghiệp thiếu kiểm soát trong

nước dẫn đến những tác động tiêu cực về sản xuất, môi trường, chất lượng đất, sức khỏe

con người, vật nuôi và ngày càng nhiều vi sinh vật gây bệnh có khả năng kháng các loại

thuốc bảo vệ thực vật thông dụng. Vì vậy, việc tìm kiếm và ứng dụng các vi sinh vật để

kiểm soát sinh học, kích thích tăng trưởng thực vật là một phương pháp thay thế để giảm

sử dụng hoá chất nông nghiệp. Trong số các loài vi sinh vật, xạ khuẩn có vị trí quan trọng

do sự đa dạng cao, khả năng sinh tổng hợp nhiều chất có hoạt tính sinh học như enzym,

chất kích thích sinh trưởng thực vật, thuốc kháng sinh dùng trong nông nghiệp và y học...

Đặc biệt là các loài xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật sống (lá, cành, rễ). Các loài xạ

khuẩn sống nội sinh trong thực vật có khả năng tích hợp với cây chủ và sinh tổng hợp một

số chất chuyển hóa thứ cấp có lợi cho cây chủ của mình. Đó là một trong những hệ sinh

thái đặc biệt và khó tiếp cận, nơi mà xạ khuẩn nội sinh có vai trò quan trọng trong sự phát

triển của cây chủ, chúng có thể ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây bằng con đường đồng

hóa các chất dinh dưỡng, kích hoạt hệ thống miễn dịch và sản xuất các chất chuyển hóa thứ

cấp, giúp cây chủ hạn chế bệnh và kích thích sinh trưởng cho cây[22, 23]. Trong mối quan

hệ tương hỗ với cây chủ, vi sinh vật nội sinh cũng nhận được từ cây chủ các chất dinh

dưỡng để sinh trưởng. Đến nay, đã có nhiều nghiên cứu công bố về khả năng sản sinh các

chất thứ cấp tiêu diệt nhiều loài nấm bệnh và sinh tổng hợp các kháng sinh mới như

munumbicin, kakadumycin và coronamycin của các loài xạ khuẩn nội sinh. Như vậy, xạ

khuẩn nội sinh thực sự là những ứng cử viên tiềm năng trong kiểm soát sinh học cho tương

lai. Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây cam và cây có múi

nói chung tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi thực

hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam Hàm Yên- Tuyên

Quang và tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chúng”

Mục tiêu cơ bản của đề tài:

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

1

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam tại Hàm Yên

Tuyên Quang có tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm cao.

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

1. Phân lậpcác chủng xạ khuẩn nội sinh trên rễ và cành trên các mẫu rễ và cành của

cây cam Hàm Yên- Tuyên Quang.

2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây cam Hàm Yên –Tuyên Quang có

khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm cao.

3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn.

4. Nghiên cứu môi trường và điều kiện sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của các

chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn

5. Nghiên cứu một số tính chất hoá lý của hoạt chất kháng nấm thu nhận từ xạ khuẩn

R12-4.

Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn

lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

2

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Xạ khuẩn nội sinh trong thực vật

1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn

Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc nhóm Prokaryote, thuộc giới

Monera trong 5 giới của Whittaken, còn theo hệ thống phân loại chia sinh giới thành 7 giới

thì xạ khuẩn thuộc giới Prokaryote. Xạ khuẩn có mặt chủ yếu trong đất, trong nước ao hồ,

trong bùn và trong chất hữu cơ khác, thậm trí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn và nấm

mốc không sinh trưởng được [9].

a. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

* Cấu tạo tế bào xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn G(+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế

bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất

nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 ÷ 20 nm

có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp

ngoài cùng dày khoảng 60 ÷ 120Å, khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200Å, lớp giữa rắn chắc,

dày khoảng 50Å, lớp trong dày khoảng 50Å. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp

glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi

các liên kết 1,4 - β glucozit. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và kitin nhưng

chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất

qua màng tế bào[3, 9].

Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm

chính, bao gồm:

Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L -

ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic

(meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các chi : Micromonospora, Actinoplanes,

Ampullarriella…

Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic.

Thuộcnhóm này có các chi: Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia…

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

3

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic,

arabinose và galactose. Thuộc nhóm này gồm các chi: Mycobacterium, Nocardia,

Pseudonocardia…[8,11].

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu

bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong

quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn.

Tế bào chất của xạ khuẩn có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn nhập gồm

các hạt poliphotphat và polixacarit. Nhân của tế bào xạ khuẩn không có cấu trúc điển

hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có 1

nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty…[8, 11].

* Khuẩn lạc, khuẩn ty xạ khuẩn

Hình thái của khuẩn lạc xạ khuẩn rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng

thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm…). Trên môi

trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước thay đổi. Mặt

khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng đá vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo,

có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu [8]. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp:

lớp vỏ ngoài có các sợi bện chặt, lớp trong đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn

lạc xạ khuẩn thường có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, tím, nâu… tùy thuộc vào

từng loại và điều kiện ngoại cảnh như: pH, nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy.

Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong và ngoài môi

trường tạo thành khuẩn ty cơ chất (KTCC) và khuẩn ty khí sinh (KTKS). Các KTCC cắm

sâu vào môi trường để lấy chất dinh dưỡng, còn KTKS thì phát triển ra ngoài không khí,

phần cuối của khuẩn ty này thường biến thành cuống sinh bào tử. Khuẩn ty xạ khuẩn mảnh

hơn khuẩn ty của nấm mốc và có đường kính thay đổi trong khoảng từ 0,2 ÷ 1,0 m đến 2

÷ 3 m. Đa số xạ khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn và không tự đứt đoạn [3].

Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ thể đơn bào,

Gram (+), không có nhân thực và có kích thước giống vi khuẩn. Mặc dù thuộc nhóm sinh

vật nhân sơ nhưng xạ khuẩnthường sinh trưởng dưới dạng sợi và tạo nhiều bào tử. Một bào

tử xạ khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau 1÷ 2 giờ xuất hiện quá trình tổng

hợp ARN, nhân các gen cần thiết từ hệ gen và tiến hành tổng hợp protein hình thành

KTKS. Đầu KTKS kéo dài và phát triển hệ sợi theo phương pháp mọc chồi phân nhánh

(khoảng 30 m phân 1 nhánh). Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đoạn phát triển khoảng

11 m/1 giờ và nhân của xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty [9].

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

4

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

b. Đặc điểm sinh trưởng của xạ khuẩn

Phần lớn xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, nhưng không phải là hiếu khí nghiêm ngặt.

Tùy theo xuất xứ mà chúng là vi sinh vật ưa ấm hoặc ưa nhiệt, thậm chí có loài phát triển

được ở những nhiệt độ bằng hoặc cao hơn 50°C. Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh trưởng

tốt ở dải nhiệt độ từ 25 ÷ 37°C, còn các chủng ưa nhiệt phát triển tốt ở 45 ÷ 50°C. Xạ

khuẩn phát triển tốt ở môi trường trung tính và hơi kiềm, phát triển chậm hoặc không phát

triển khi pH của môi trường quá axit hoặc kiềm. Xạ khuẩn thuộc loài dị dưỡng, chúng sử

dụng nguồn cacbon là tinh bột, các loại đường (glucose, maltose, saccarose…) và các hợp

chất polysacaride. Nguồn nitơ vô cơ thường là: nitrate, muối amon…, nitơ hữu cơ thường

là: pepton, cao ngô, cao nấm men. Khả năng đồng hóa các chất này ở các chủng xạ khuẩn

khác nhau là không giống nhau. Phần lớn xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường có pH trung

tính và hơi kiềm; ở môi trường pH thấp hoặc hơi quá kiềm xạ khuẩn không phát triển hoặc

phát triển kém. Các chủng xạ khuẩn phát triển được ở nồng độ muối 3 ÷ 5% (w/v), còn ở

nồng độ cao hơn có thể bị ức chế hoặc tiêu diệt [3].

c. Đặc điểm của bào tử xạ khuẩn

Cũng như các vi khuẩn sinh bào tử khác, xạ khuẩn thường sinh bào tử khi gặp điều

kiện bất lợi về dinh dưỡng hoặc điều kiện hóa lý của môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, độ pH).

Bào tử của xạ khuẩn có dạng hình cầu hay hình bầu dục, hình que, hình trụ hay hình quả

dưa… Dưới kính hiển vi quang học, hình dạng của bào tử ổn định, nhưng khi quan sát

dưới kính hiển vi điện tử thì hình dạng của chúng không đồng nhất, thậm chí trong một

chuỗi bào tử hình thái của các bào tử cũng có thể khác nhau. Ngược lại, kết cấu bề mặt

ngoài của bào tử (trơn, thô, nhám, nhăn nheo, có mấu lồi hoặc có gai) thì lại là đặc điểm

tương đối ổn định. Dựa vào hình thái, kích thước cuống sinh bào tử và của bào tử ở nhiều

chi xạ khuẩn có thể phân loại được xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử thường có dạng thẳng

hoặc hơi cong (RF), dạng xoắn thật hay xoắn lò xo (S) và chuỗi bào tử không sinh trưởng

hoặc xoắn đơn giản hình móc câu (RA). Cuống sinh bào tử dạng xoắn có chiều dài và số

vòng khác nhau. Cuống sinh bào tử dạng thẳng có thể dài hoặc ngắn hơn với các dạng lỏng

cứng hoặc có thể thon lại, uốn cong hay kéo dài. Những đặc điểm này rất quan trọng khi

xác định tên xạ khuẩn [3]. Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh

bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que

với mép nhẵn hoặc xù xì, ở một số loài, bào tử có hình thành ở các mấu lồi với các dạng

khác nhau. Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh mẽ hơn khi môi trường có chứa

một số nguyên tố vi lượng [9].

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

5

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Cuống sinh bào tử xạ khuẩn hình thành bào tử theo 3 phương thức sau:

 Phương thức sinh trưởng toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình

thành nên thành của bào tử.

- Phương thức sinh trưởng trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng

nguyên sinh chất và thành khuẩn ty. Trường hợp này gặp ở xạ khuẩn thuộc chi

Planomonospora.

- Phương thức sinh trưởng thành bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ty không tham gia

vào quá trình hình thành ra bào tử Thermoactynomyces[3].

1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật

Vi sinh vật nội sinh bắt đầu được nghiên cứu từ giữa thế kỷ XIX, nhưng không

chiếm được sự chú ý do hệ sinh thái của chúng rất đặc biệt[58]. De Bary (1866) lần đầu

tiên đề xuất định nghĩa về endophyte: đó là các VSV cư trú ở các mô bên trong của thực

vật, phân biệt với thực vật biểu sinh (epiphyte) sống ở trên bề mặt thực vật, khái niệm này

đã gây ra nhiều tranh cãi[58]. Năm 1975, Smith và cộng sự đã đưa ra khái niệm xạ khuẩn

nội sinh khi phân lập thành công xạ khuẩn Microsmonospora sp. có khả năng ức chế nấm

gây bệnh Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh [45].Vào năm

1991, Pentrini đưa ra khái niệm về “endophyte”và đã được chấp nhận rộng rãi: Endophyte

là các vi sinh vật sống trong các tổ chức của thực vật trong một giai đoạn nhất định của

cuộc đời và không có khả năng gây bệnh [37]. Sau đó Sikora đã mở rộng định nghĩa của

endophyte: đó là một sinh vật xâm chiếm trong mô của một thực vật trong suốt vòng đời

của chúng, mà không biểu hiện bất cứ triệu chứng bệnh rõ ràng nào cho cây chủ[43]. Theo

định nghĩa được thừa nhận rộng rãi nhất của Bacon và White (2000) thì “các thể nội sinh

(endophytes) là những vi sinh vật sinh trưởng ở các mô sống bên trong thực vật, mà không

gây ra hiệu ứng xấu rõ ràng và trực tiếp nào cho cây”. Theo Bacon và While (2000) thì

định nghĩa này hàm chứa một ý nghĩa rất quan trọng: vì bản chất không gây triệu chứng

bệnh cho cây nên việc các thể nội sinh chiếm cứ mô thực vật đã khiến chúng ta nghĩ đến

mối quan hệ hỗ sinh (mutualistic) giữa thể nội sinh và cây chủ của chúng[16]. Vì vậy, các

VSV nội sinh được mô tả là những VSV thiết lập được mối quan hệ cộng sinh với thực vật

hoặc được định nghĩa là bất cứ VSV nào không gây ra tác động có hại với thực vật, và có

thể được phân lập từ bề mặt của các mô thực vật đã được khử trùng hoặc được chiết xuất

từ phần bên trong của thực vật. Mối liên kết giữa nội sinh và thực vật đã được tìm thấy

trong rất nhiều cơ quan của thực vật như rễ, cuống, lá, quả, hoa và hạt [35].

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

6

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Theo Kandpal1 và cộng sự (2012), trong số gần 300.000 loài thực vật tồn tại trên trái

đất thì mỗi loại cây là cây chủ cho một hoặc nhiều loài VSV nội sinh[29].Các VSV nội

sinh tồn tại rộng rãi trong nhiều cơ quan thực vật mà chưa được biết đến, ước tính lên đến

một triệu loài [58]. Chúng không những không gây bệnh cho cây chủ mà còn có khả năng

thúc đẩy sự phát triển của cây bằng cách sản xuất các chất kích thích tăng trưởng và bảo vệ

thực vật. Tiếp tục đi sâu nghiên cứu, các VSV nội sinh được xác định có khả năng sản xuất

ra nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau có giá trị to lớn trong sinh thái học, y

học và bệnh lý học. Vi sinh vật nội sinh đem lại một triển vọng lớn trong việc ứng dụng để

phát triển các nguồn thuốc và ngăn chặn dịch bệnh, côn trùng trong nông nghiệp và công

nghiệp, có hiệu quả cao, độc tính thấp và thân thiện với môi trường. Thêm nữa, vi sinh vật nội

sinh cũng là nguồn tài nguyên quý giá của vi sinh vật cũng như nguồn gen. Nhiều cây có ý

nghĩa kinh tế quan trọng có chứa các thể nội sinh giúp cây tăng trưởng, chống chịu các tác

động bất lợi bên ngoài như khô hạn, đồng thời cũng như giúp cây chống lại côn trùng và vi

sinh vật gây bệnh [16].

Trong số các VSV nội sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi hơn 70 % các chủng xạ khuẩn

đã biết có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh có thể ức chế nhiều nhóm VSV gây

bệnh[31]. Với các tác dụng nhận được từ xạ khuẩn nội sinh, một số nhà sinh học đã

nghiên cứu sử dụng xạ khuẩn nội sinh như một yếu tố kiểm soát sinh học (Biocontrol)

trong suốt hai thập kỷ qua [47]. Khi sử dụng trong kiểm soát sinh học, vai trò xạ khuẩn đã

được chứng minh giúp tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm

mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau ...

[58].Nói chung, số chủng loại và số lượng VSV nội sinh trong thực vật vùng nhiệt đới và

cận nhiệt đới nhiều hơn vùng lạnh và khô, trong cây tăng trưởng nhanh và lâu năm nhiều

hơn trong cây tăng trưởng chậm và ngắn ngày, trong cây khỏe mạnh nhiều hơn trong cây

phát triển ở môi trường ô nhiễm[58].

Xạ khuẩn đại diện cho một phần lớn cộng đồng vi sinh vật vùng rễ, đây là yếu tố

thuận lợi để chúng xâm nhiễm vào thực vật và trở thành thể nội sinh. Cộng đồng xạ khuẩn

nội sinh bao gồm cả các loài Streptomyces và các loài khác không thuộc Streptomyces, đều

có thể có mặt trong mô thực vật [45].

Theo một số tác giả,tương tự các loài vi sinh vật khác, sự sinh ra hormone thực vật

như IAA ở xạ khuẩn nội sinh là một trong những cơ chế để kích thích sự tăng trưởng của

cây chủ, tăng trọng lượng khô của lá, rễ và chiều dài rễ khiến cho cây phát triển khỏe mạnh

hơn. Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với cây chủ và việc sản sinh ra các sản phẩm tự

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

7

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

nhiên có hoạt tính sinh học tạo ra cơ hội tìm ra các loại chế phẩm đặc hiệu có tiềm năng

ứng dụng trong bảo vệ thực vật và kiểm soát nấm bệnh. Xạ khuẩn nội sinh có khả năng hạn

chế nấm gây bệnh trên cây chủ yếu dựa vào khả năng sinh tổng hợpcác chất có hoạt tính

sinh học như kháng sinh và các enzyme phá hủy thành tế bào. Xạ khuẩn nội sinh cũng

được công bố là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch thực vật (ISR) [34, 43].

1.1.3. Mối quan hệ giữa thực vật và xạ khuẩn nội sinh

Vi sinh vật nội sinh có lợi với thực vật trong hầu hết các trường hợp. Thực vật che

chở và cung cấp chất dinh dưỡng cho thể nội sinh, và thể nội sinh sẽ giúp tăng trưởng thực

vật. Ví dụ, xạ khuẩn nội sinh giúp tăng cường sự phát triển của rễ, hòa tan phosphate làm

tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của thực vật từ đất [58], cố định nitơ và bảo vệ rễ

chống nhiễm nấm [47, 53]Thông qua những hoạt động đó, endophyte có thể thúc đẩy tăng

trưởng cây chủ và giúp cây chủ chống chịu tốt hơn với điều kiện bất lợi của môi trường.

Mối quan hệ cộng sinh khá phổ biến giữa endophytes và thực vật, nhưng mối quan hệ này

có thể biến đổi từ hỗ sinh thành ký sinh, nếu một gen đơn (single gene) bị biến đổi, có thể

ảnh hưởng đến cơ chế hoạt động của VSV nội sinh với cây chủ[58].

1.1.4. Con đường xâm nhập của vi sinh vật vào cây chủ

Có một số cách thức để vi sinh vật xâm nhập vào bên trong cây và trở thành thể nội

sinh. Quá trình này thường bắt đầu từ sự tập trung của chúng ở vùng rễ. Khi đã sinh trưởng

được ở vùng rễ thì vi sinh vật bắt đầu bám lên bề mặt rễ. Đây là bước quan trọng cho quá

trình xâm nhập sau này. Một số tác giả cho rằng vi sinh vật bám được lên bề mặt rễ nhờ

một số thành phần trên bề mặt tế bào như lông tơ (pilli), liposaccharide hoặc

exopolysaccharide v.v. Những vị trí mà vi sinh vật lựa chọn để bám và xâm nhập thường là

vùng đầu rễ, nơi có lớp thành tế bào mỏng của đỉnh sinh trưởng, hoặc vùng lông rễ, hoặc

vùng gốc rễ nơi có những vết nứt nhỏ để rễ phụ trồi ra. Tại những vị trí đó vi sinh vật sinh

trưởng thành các khuẩn lạc siêu nhỏ gồm vài trăm tế bào. Để có thể xâm nhập dễ dàng thì

các vi sinh vật nội sinh phải có hệ enzyme phân hủy cellulose để phá lớp ngoài của thành

tế bào. Các enzyme phân hủy thành tế bào của vi khuẩn cũng được cho là kích thích các cơ

chế bảo vệ trong cây vì rất nhiều protein tham gia vào quá trình bảo vệ và phục hồi đều

nằm ở thành tế bào, được sinh tổng hợp nhằm ngăn chặn sự lan truyền của mầm bệnh trong

cây. Để trở thành thể nội sinh thì các vi sinh vật này phải có khả năng tránh được đáp ứng

miễn dịch của cây, hoặc làm giảm nó một cách đáng kể, một trong những cách đó là xâm

nhập vào cây từ các vết nứt nơi rễ phụ trồi ra, đây là trường hợp được giả thiết cho

Azoacus và Burkholderia vietnamiensis[33].

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

8

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Sau khi tế bào vi sinh vật đã vượt qua được lớp biểu bì ngoài, chúng có thể nằm ngay

tại chỗ, hoặc di chuyển sâu hơn và xâm chiếm khoảng giữa các tế bào (apoplast) trong vỏ

cây. Vi sinh vật nội sinh khác vi khuẩn nốt sần ở cây họ đậu ở chỗ chúng không xâm nhập

vào bên trong tế bào thực vật và tạo ra các tổ chức hình thái đặc biệt như trường hợp của vi

khuẩn nốt sần. Tuy vậy, cũng có trường hợp vi sinh vật nội sinh cũng tạo ra các nốt sần.

Chỉ có một số vi sinh vật có thể đi qua lớp bảo vệ bên trong và xâm nhập hệ mạch

dẫn (xylem) của thực vật. Tại đây vi sinh vật có thể sử dụng các chất dinh dưỡng được vận

chuyển trong hệ mạch như nước, ion và một số chất hữu cơ có phân tử lượng thấp như

đường, axit amin và axit hữu cơ. Mặc dù nồng độ các chất dinh dưỡng trong hệ mạch là rất

thấp nhưng cũng đủ để duy trì sự sinh trưởng của thể nội sinh. Vi sinh vật nội sinh có khả

năng sử dụng các nguồn cac bon mà thông thường vi sinh vật vùng rễ không sử dụng được,

ví dụ D-sorbitol, D-galacturonic acid và L-arabinose là nguồn các bon có sẵn trong hệ

mạch dẫn của cây. Như vậy để trở thành thể nội sinh thì điều kiện tiên quyết là vi sinh vật

đó phải có khả năng sử dụng một số hợp chất trao đổi chất của thực vật [33].

Thông thường thì nồng độ của chất dinh dưỡng trong hệ mao quản thực vật giảm dần

theo độ cao của cây. Điều này giải thích cho thực tế là tính đa dạng và mật độ quần thể vi

sinh vật nội sinh giảm dần theo khoảng cách từ rễ trở lên, và chỉ một phần nhỏ vi sinh vật

đạt tới những phần trên của cây, lá và cơ quan sinh sản (hoa, quả và hạt). Một số vi sinh

vật có thể xâm nhập vào cây qua các vị trí khác như khí khổng trên lá và trở thành nội sinh.

Chúng cũng có thể xâm nhập vào cây từ hoa quả và hạt, nhưng trường hợp này thì thường

là vi sinh vật gây bệnh [33].

1.1.5.Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh

Xạ khuẩn nội sinh cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường

như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng mưa, cường độ ánh

sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ… Thêm vào đó, mật độ xạ khuẩn nội cộng sinh nhìn

chung thấp và phụ thuộc vào loại mô khác nhau trên thực vật[39].

Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố, quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh cần xử

lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt. Vì vậy, phải khử trùng bề

mặt mẫu và cắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử trùng trước khi phân lập.

Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng

để khử trùng bề mặt, mẫu thực vật có thể được ngâm trong ethanol nồng độ 70 ÷ 90 %

trong thời gian 1 ÷ 5 phút, sau đó được ngâm trong dung dịch NaOCl nồng độ 1 ÷ 5 %

trong khoảng thời gian 3 ÷ 20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm loại

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

9

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

bỏ lượng NaOCl còn dư. Ngoài ra, hydroperoxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng

như chất khử trùng bề mặt hiệu quả [43]. Năm 1992, Sardi và cộng sự công bố sử dụng hơi

của propylene oxit để khử trùng bề mặt thay vì hóa chất khử trùng dạng lỏng[41]. Hiệu quả

khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt như Tween

20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của cơ chất khử trùng với bề mặt thực vật

[43].

Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25 ÷ 30oC. Trong quá trình phân lập, các nhà nghiên cứu thường gặp

phải VSV phát triển mạnh trong hai tuần đầu tiên vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần

mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm không mong muốn cũng

như tìm kiếm loại xạ khuẩn mới, một số môi trường chọn lọc đã được sử dụng như: môi

trường humic acid - vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, cao nấm men… bổ sung

thêm các hợp chất kháng sinh như nystatin hoặc cycloheximide - ampicilin, acid nalodixic

và trimethoprim… Để ức chế vi khuẩn, nấm nội cộng sinh và nâng cao khả năng phát triển

chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm ... [43].

1.1.6. Phân loại xạ khuẩn nội sinh

Các phương pháp phân loại xạ khuẩn thường dùng hiện nay là phương pháp phân

loại truyền thống (dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy), phương pháp phân

loại bằng kỹ thuật phân tử (lai AND, ARN và phân tích rADN 16S) và phân loại số (dựa

trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một độ lớn các

đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng với

nhau từng đôi một.

a. Phương pháp phân loại truyền thống

Krainski (1914) lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu về đặc điểm sinh lý và coi đó là mấu

chốt trong nguyên tắc phân loại để sơ loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces. Waksman và

Curtis (1916) đã đề cập đến những dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình và coi

đặc điểm hình thái của bào tử là đặc tính quan trọng của các cá thể. Do vậy họ đã đưa ra

một số loài mới ý nghĩa. Tiếp đó Millard và Burr (1926) tìm ra 17 loài, Jensen (1930-1931)

– hai loài, Dunche (1934) -13 loài. Baldacci và cộng sự đã bắt đầu nghiên cứu xạ khuẩn từ

năm 1936 và cho đến năm 1953 công bố một khóa phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ

sở màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và một số đặc điểm trung gian khác nhau.

Năm 1943, Waksman và Henrici đã đưa ra một số hệ thống phân loại và cho đến năm

1961 có sửa đổi. Trong hệ thống này, xạ khuẩn được xếp thành nhóm gồm 3 họ, chia thành

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

10

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi Streptomyces. Krassilnikov là một trong

những chuyên gia nổi tiếng về nghiên cứu và phát triển khóa phân loại xạ khuẩn. Từ năm

1941 đến năm 1949 ông đã phát hiện thêm 38 loài mới. Năm 1970, ông lại công bố hệ

thống phân loại mới dựa trên hệ thống đã công bố năm 1949 [56].Trong đó xạ khuẩn được

chia thành 6 họ, gồm 26 chi. Theo ông Actinomyces được dùng như một tên gọi chung cho

những loài thuộc chi Streptomyces mà Waksman và Henrici đã phác họa năm 1943.Một số

nhà nghiên cứu người Đức cho rằng chi Streptomyces là một nhóm lớn. Lần đầu tiên họ sử

dụng kính hiển vi điện tử để nghiên cứu đặc điểm bào tử của chi này. Kutzner đã phát triển

một số khóa phân loại Streptomyces dựa trên cơ sở hình dáng cuống sinh bào tử, cấu trúc

hiển vi điện tử của bào tử, sự tạo sắc tố tan, hoạt phổ kháng khuẩn và một số đặc điểm sinh

lí khác.Năm 1957, Gause và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ thống này dựa

vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), hình dạng bào tử và

cuống sinh bào tử. Hệ thống này cũng được chỉnh lý và tái bản năm 1983. Số lượng hệ

thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần đây. Đó là hình thức phân

loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy. Hình thức này hiện nay

vẫn đang được sử dụng phổ biến.

b. Phương pháp phân loại sinh học phân tử

Ngày nay nhờ sự phát triển cao của khoa học kĩ thuật, phương pháp phân loại phân

tử đã được sử dụng vào phân loại xạ khuẩn. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay

người ta vẫn dùng ba phương pháp chính: lai AND, ARN và phân tích rADN 16S. Kết quả

được biểu hiện bằng số phần trăm sự thống nhất (homology). Hiện nay, đại đa số các nhà

khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nêu chúng giống

nhau dưới 70% khi tiến hành lai AND. Phân tích rADN 16S để liệt kê thứ tự nucleotit đặc

trưng của các cá thể và so sánh với bảng liệt kê của các cá thể khác để xác định mức độ

giống nhau của chúng. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa

hai trình tự rADN 16S là 98,6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai AND

thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự rADN 16S được coi

là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá

trị này là 98% [30] .

c. Phân loại số

Phân loại số đã được Williams và cộng sự (1983) sử dụng để phân loại chi

Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi [57]. Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về

số lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số các đặc điểm, chủ yếu là các

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

11

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một, Sneath

(1974) đề nghị tính hệ số giống nhau S (similarity) theo phương trình sau: %S = Ns .100 Ns + Nd

Trong đó:

Ns – tổng số các đặc điểm dương tính của 2 chủng so sánh.

Nd – tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia.

Kết quả phân tích số được biểu diễn bằng sơ đồ nhánh mà trên đó các chủng tùy theo

mức độ giống nhau được nhóm thành từng cụm (Cluster). Bằng phân loại số, người ta chia

xạ khuẩn chi Streptomyces thành 21 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện

duy nhất. Trên cơ sở nhận được, người ta đưa ra thuật toán học để xác định những chuẩn

xạ khuẩn chưa biết. Mặc dù nguyên tắc là giảm số lượng các đặc điểm, nhưng cũng còn tới

139 đặc điểm đã được sử dụng trong phân loại số.

Cả ba phương pháp phân loại trên hiện vẫn còn đang được sử dụng độc lập kết hợp

với nhau để định tên loài một cách chính xác trong phân loại xạ khuẩn hiện nay. Mỗi

phương pháp có một ưu điểm nhất định, tuy nhiên vì lý do thực dụng, người ta chủ yếu vẫn

dựa vào phương pháp phân loại truyền thống.

1.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh và tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh

1.2.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh

1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thế giới

Trong vài thập kỷ qua đã có nhiều thành tựu trong tìm kiếm các loài xạ khuẩn và các

hợp chất mới có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn trong mô tế bào thực vật. Đáng chú ý, hầu

hết mỗi loại thực vật đều là nơi cư trú của rất nhiều vi sinh vật nội sinh tạo nên sự đa dạng

sinh học. Tuy nhiên, mới chỉ có một phần nhỏ thực vậtđã được nghiên cứu và tìm kiếm các

thể nội sinh, nên cơ hội để tìm ra các loài mới và sản phẩm có hoạt tính sinh học có nguồn

gốc tự nhiên còn rất lớn. Do tiềm năng ứng dụng lớn của xạ khuẩn nội sinh nên đối tượng

vi sinh vật này đang được quan tâm và nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới [26, 48, 49,

50, 51, 52].

Sơ lược về tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật trong hơn 10 năm

gần đây được thể hiện trong bảng 1.1.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

12

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội cộng sinh

trên thực vật

Xạ khuẩn nội sinh Cây chủ Tác động Tác giả

Streptomyces Đậu tương [53] Thu nhận các vi lượng (Fe, Mo) và chất kháng khuẩn.

Lúa mì [18, 20] - Chất kháng khuẩn - Tăng trưởng thực vật

Streptomyces spp, Nocardia spp, Mycobacterium sp, Microbispora..

Sinh tổng hợp IAA [35, 43]

Aquilaria crassna Quýt Streptomyces, Microbispora, Micromonospora, Nocardiodes …

[24]

Lô hội, bạc hà, hương nhu tía Streptomyces, Saccharopolyspora, Micromonospora, Actinopolyspora.. - Hòa tan phosphat - Sinh indole-3 axit axetic (IAA), hydroxamate - Tạo ra catechol.

[19] Arabidopsi s thaliana - Tăng sức đề kháng - Đối kháng vsv gây bệnh - Giảm stress cho cây chủ Streptomyses spp EN27 và Micromonospora sp EN43

Cây thuốc Kháng nấm [34]

Streptomyces, Nocardioides spp, Pseudonocardia…

[21] Streptomyces sp Cây Ngô

[17] Streptomyces sp Cây chuối Kháng nấm Fusarium

Xạ khuẩn Sâm [25] Kích thích sinh tổng hợp ginsenosides

[27] Xạ khuẩn Thuốc lá Kháng nấm

Hiện nay, xạ khuẩn nội sinh được phân lập từ nhiều loài cây trồng như lúa mì, gạo,

khoai tây, cà rốt, cà chua, cây gỗ, nho, rêu và dương xỉ … [26, 38, 39] và chi được phân

lập nhiều nhất thuộc chi Streptomyces, chúng thường cư trú trong rễ, thân và lá của cây,

mà nhiều nhất trong rễ. Loài Streptomyces, loài Microbispora là hai loài thường xuyên

nhất phân lập được từ mô thực vật. Inderiati và Muliani (2008) báo cáo rằng phần lớn các

xạ khuẩn nội sinh thu nhận từ cây thuốc lá đã được phân loại là loài Streptomyces [27].

Tương tự như vậy, Sardi và cộng sự (1992) báo cáo rằng 482 trong 499 chủng phân lập từ

một loạt các thực vật là Streptomyces sp [41]. Hơn nữa, Verma và cộng sự (2009) nghiên

cứu cho thấy Streptomyces sp. chiếm khoảng 50 % trong 55 chủng riêng biệt lấy từ cây tử

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

13

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

đinh hương Ấn Độ [55]. Tan và cộng sự (2006) đã phân lập được 619 chủng xạ khuẩn từ

các loại cây cà chua khác nhau và tất cả các chủng đó đều thuộc chi Streptomyces [52]. Từ

36 cây dược liệu ở Thái Lan, nhóm nghiên cứu của Taechowisan đã phân lập được 330

chủng xạ khuẩn thuộc 4 chi khác nhau (Streptomyces, Microbispora, Nocardia,

Micromonospora) [48]. Hơn nữa Verma và cộng sự (2009) cho thấy Streptomyces sp. có

chiếm khoảng 50 % trong tổng số 55 chủng thu nhận từ cây sầu đâu (Azadirachta indica

A.Juss) tại Ấn Độ [55]. Tổng hợp các nghiên cứu trên cho thấy Streptomyces sp. có khả

năng thích ứng, phát triển mạnh hơn so với xạ khuẩn thuộc chi khác. Điều thú vị là, phần

lớn các loài Streptomyces nội sinh thường xuyên phân lập được từ nhiều nước khác nhau là

các loài S. aureus, S. galilaeus, S. caviscabies, S. setonii, S. cyaneus và S.

thermocarboxydus điều này cho thấy các loài này có thể có một khả năng tương thích cao

với một loạt các thực vật so với các loài khác. Bên cạnh chi Streptomyces, nhiều chủng xạ

khuẩn nội sinh thuộc chi Microbispora cũng đã được phân lập. Trong nghiên cứu của De

Arau'jo et al. (2000), trong tổng số 53 xạ khuẩn nội sinh phân lập từ ngô thì có tới 33 là

Microbispora spp. và chỉ 6 là Streptomyces spp[21]. Theo Lee và cộng sự (2008), chi

Microbispora spp. (67 %) là phổ biến nhất trên bắp cải Trung Quốc, tiếp theo là

Streptomyces spp. (12 %) và Micromonospora spp. (11 %) [31]. Takahashi và Omura

(2003) phân lập được 33 chủng Microbispora, 32 Streptomyces và 10 xạ khuẩn hiếm khác

từ lá rụng trong chín chi thực vật bậc cao [51]. Như vậy, các chi Streptomyces và

Microbispora có thể sinh sống được trong cả đất và nội sinh thực vật, mặc dù chỉ có một

số lượng hạn chế của các loài có thể có sinh sống theo hai cách này. Lưu ý rằng

Microbispora spp. được phân lập thường xuyên hơn từ lá cây hơn từ đất. El-Tarabily và

cộng sự (2006) ước tính mật độ xạ khuẩn nuôi cấy được trong dưa chuột (Cucummis sativus) và rễ của cây họ đậu (Glycine max) đạt 105 CFU/g khối lượng củ/rễ tươi [22]. So

với thân và lá, tập hợp các chủng xạ khuẩn phân loại từ rễ nhìn chung đa dạng hơn. Cho

đến nay, hơn 40 loài xạ khuẩn mới đã được tìm thấy bằng nhiều phương pháp phân lập và

phân loại khác nhau, bao gồm 4 chi mới thuộc nhóm Plantactinospora, Actinophytocola,

Phytohabitans và Jishengella [38, 39].

1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật nội sinh trong nước

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh mới chỉ dừng lại ở một số nấm và

vi khuẩn nội sinh. Tuy nhiên, những nghiên cứu này mới chỉ là các phát hiện bước đầu và

ở quy mô thí nghiệm. Nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Giao (1971) về ứng dụng một số chủng

nấm cộng sinh trong nuôi trồng cây non phục vụ cho nghề trồng rừng, quy mô nghiên cứu

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

14

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

dừng lại ở bầu cây ươm [10]. Các nghiên cứu của Lê Thị Xuân, Lê Mai Hương (1997) [6]

về thăm dò khả năng tạo chất taxol từ cây thông đỏ ở Việt Nam, các tác giả này đã tách

được từ lớp lõi của cây thông đỏ chủng nấm Mucor circinolloides var. tieghem và tách

chiết được một chất gần giống với 10-deacetil baceatin III ở cây chủ. Lê Mai Hương và

cộng sự (2005) [5] cũng đã phân lập được chủng nấm nội sinh Aspergillus awamori

Nakazawa trên cây sảng Sterculia lanceolata Cav và trên cây thuốc tại một số vùng trong

nước, đồng thời nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của chủng nấm nội sinh

nói trên. Bên cạnh nấm về vi khuẩn, Cao Ngọc Điệp và Phan Thị Nhã (2011) [2] đã nghiên

cứu vi khuẩn nội sinh trên cây Khóm trên đất phèn Đồng Bằng sông Cửu Long, đã phân

lập được 45 dòng vi khuẩn nội sinh có ba đặc tính tốt như cố định đạm, hòa tan lân, tổng

hợp IAA. Trong đó, hai dòng vi khuẩn có ba đặc tính tốt nhất có độ tương đồng cao với

dòng vi khuẩn Burkholderia tropica đã được thử nghiệm vào sản suất phân bón sinh học

cho cây chủ. Trong một nghiên cứu khác, Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp (2011)

[7] đã phân lập được 37 dòng vi khuẩn nội sinh trên cây cúc xuyên chi, qua phân loại cho

thấy các dòng vi khuẩn chủ yếu là Bacillus sp và Acinetobacter antiviralis. Theo Nguyễn

Văn Minh và cộng sự (2014) [14] đã sàng lọc được 21 chủng vi khuẩn nội sinh và 14

chủng vi nấm nội sinh trên cây cao su từ Thành phố Hồ Chí Minh, tỉnh Bình Phước và tỉnh

Bình Dương. Trong đó chủng Bacillus thuringiensis T9 và T6 có khả năng kiểm soát sinh

học nấm Corynespora cassiicola gây bệnh rụng lá cao su. Hiện nay, hướng nghiên cứu về

các chủng xạ khuẩn nội sinh trong nước chưa nhiều đặc biệt là xạ khuẩn nội sinh trên cây

có múi.

1.2.2. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh

a. Sinh chất kháng sinh

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật có khả năng hình thành nhiều loại CKS sử dụng trong

y học. Có đến 80 % chủng xạ khuẩn phân lập được tiết CKS có giá trị trong y học, trong

đó 1/3 các CKS là do xạ khuẩn hiếm sinh ra [13].

Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng, ức chế ung thư

từ xạ khuẩn nội sinh đang là hướng nghiên cứu mới của các nhà khoa học trên thế giới.

Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội sinh có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây

chủ. Một số giả thuyết nhận định rằng gen liên quan tới tổng hợp các chất có hoạt tính sinh

học được tiếp nhận từ quá trình trao đổi chất giữa VSV và thực vật thông qua hệ thống

chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Nhờ đó các nhà VSV học đã mở ra

triển vọng sản xuất các hợp chất sinh học có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá trình nuôi cấy

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

15

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

VSV. Ví dụ như chất kháng ung thư paclitaxel phổ biến trên cây thông đỏ được tách chiết

từ xạ khuẩn Kitasatopora sp. và một số nấm cộng sinh khác.

Một số nghiên cứ gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh mới trên xạ

khuẩn nội sinh có tỷ lệ khá cao so với xạ khuẩn phân lập từ đất mới trên xạ khuẩn nội sinh

có tỷ lệ khá cao so với xạ khuẩn phân lập từ đất hoặc bề mặt thực vật. Chẳng hạn kháng

sinh mới có tên naphthomycin K (dẫn xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm

chức chlorine) được phát hiện lần đầu tiên từ Streptomyces sp. CS nội cộng sinh trong cây

mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) - loại cây thuốc có tác dụng điều trị ung thư. Kết quả

kiểm tra hoạt tính sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây độc ức chế dòng tế

bào p388 và A - 549 ở nồng độ ức chế lần lượt là 0,07 và 3,17 µM, nhưng không có hoạt

tính kháng Staphylococcus và vi khuẩn lao.

Ngoài năm chất mới thuộc phân lớp 16 của nhóm macrolides được tách chiết và cho

kết quả ức chế mạnh dòng tế bào MDA - MB - 435 trong điều kiện in vitro, hai chất mới

thuộc nhóm macrolides thu nhận từ Streptomyces sp. 131 gần đây được phân lập trên cây

mỹ đăng mộc (M. hookeri), trong đó hợp chất dimeric dinactin có tác động kháng ung thư

mạnh và hoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cao.

Trước đây, hai hợp chất 5,7 - dimetoxy - 4 - phenylcoumari và 5,7 -dimetoxy - 4 - p -

methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng ung thư mạnh, thường thu nhận từ nhiều loại

cây thực vật khác nhau. Nhưng gần đây, nhiều công trình công bố rằng hai hợp chất này

cũng được tìm thấy trong S. aureofaciens CMUAc130 nội cộng sinh. Hoạt tính kháng ung

thư của hai chất trên không chỉ hình thành nhóm nitric oxide, prostaglandin E2 và tác nhân

hoại tử khối u (TNF - α), mà còn cảm ứng nitric oxide synthase và cyclooxygenase - 2

trong lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào RAW 264,7. Tác dụng ức chế phụ thuộc

vào nồng độ chất và ức chế sự hình thành TNF – α[48, 49].

b. Ứng dụng trong kiểm soát sinh học và kích thích tăng trưởng thực vật

Khi đã ổn định trong cây, vi sinh vật nội sinh có thể tác động tích cực đến sự sinh

trưởng và phát triển của cây một cách trực tiếp (kích thích sinh trưởng) hoặc thông qua

kiểm soát bệnh dịch. Vi sinh vật nội sinh trực tiếp kích thích sinh trưởng nhờ cung cấp

dinh dưỡng cho cây, hay sinh tổng hợp hoặc điều hòa các phytohormone, đặc biệt là IAA.

Nhiều chủng vi sinh vật nội sinh sinh tổng hợp IAA (indole-3- acetic acid đồng thời cũng

có khả năng giảm lượng ethylene trong cây nhờ enzyme (1-aminocyclopropane-1-

carboxylate)-deaminase. Điều này rất có ý nghĩa, bởi nồng độ ethylene cao khi cây bị

stress làm ức chế quá trình phát triển của bộ rễ. Ngoài ra, vi sinh vật nội sinh còn có khả

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

16

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

năng sinh tổng hợp các phytohormone khác như abscisic acid (ABA), cytokinin và

gibberellin (GBs) [33].

Khả năng kiểm soát bệnh dịch của vi sinh vật nội sinh dựa trên một số cơ chế như

đối kháng (antibiosis) giúp cây chủ hạn chế bệnh bằng cách chúng sinh ra các chất kháng

khuẩn [34], các enzyme phân hủy thành tế bào của nấm bệnh [43], cạnh tranh về dinh

dưỡng và nơi cư trú, và kích thích tính chống chịu hệ thống của cây chủ [33].

Sự khu trú của vi sinh vật nội sinh trong cây chủ có thể gây ra một số biến đổi của

thành tế bào như tích tụ callose, pectin, cellulose và các hợp chất có phenol, dẫn tới hình

thành một hàng rào cấu trúc tại vị trí bị tác nhân gây bệnh tấn công. Ngoài ra, cây có vi

sinh vật nội sinh khi bị tác nhân gây bệnh tấn công thường có phản ứng là tăng cường sinh

tổng hợp các protein phòng vệ như peroxidase, chitinase và β-1,3-glucanase, có tác dụng

ngăn chặn sự lan truyền của mầm bệnh. Hơn nữa, nhiều loài vi sinh vật nội sinh thưòng thể

hiện kết hợp nhiều cơ chế kháng bệnh, vì một số hợp chất kháng tác nhân gây bệnh cũng

đồng thời kích thích đáp ứng miễn dịch hệ thống [35]. Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh có vai

trò quan trọng trong sự phát triển của cây chủ, do chúng có thể ảnh hưởng đến sinh trưởng

của cây bằng con đường đồng hóa các chất dinh dưỡng (ví dụ, sự tương hỗ về thu nhận các

vi lượng như Fe hoặc Mo hòa tan trong đất cố định nitơ tự do ) [53].Một số tác giả chứng

minh khả năng bảo vệ thực vật chủ chống lại các tác nhân gây bệnh từ đất như Aspergillus

niger, Aspergillus flavus, Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Penicillium digitatum,

Fusarium oxysporum, Penicillium pinophilum, Phytophthora dresclea và Colletotrichum

fulcatum[17, 24]. Gangwar và cộng sự (2014) đã phân lập từ các cây lô hội, bạc hà, hương

nhu tía được 12 chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng hòa tan phosphat, 16 chủng sản xuất

indole-3 axit axetic (IAA), 9 chủng được sản xuất hydroxamate và 4 chủng có thể tạo ra

catechol[24]. Chúng thực sự là các ứng cử viên cho nghiên cứu kiểm soát sinh học nông

nghiệp trong tương lai.

1.3. Cây có múi và khả năng thu nhận các thể nội sinh

Cây có múi là tên gọi chung của nhóm cây cam, chanh, quýt, bưởi... cùng họ

Rutaceae. Cây ăn trái có múi được trồng ở hơn 100 quốc gia. Đây là loại quả có tầm quan

trọng hàng đầu thế giới, với sản lượng năm 2009 đạt hơn 120 triệu tấn, trong đó cam chiếm

54% [42].

Với điều kiện đất đai, khí hậu thuận lợi và hiệu quả kinh tế cao, cây có múi ở nước ta

được trồng từ lâu đời, qua quá trình chọn lọc đã hình thành nên những loại quả đặc sản gắn

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

17

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

chum, cam Canh, bưởi Đoan Hùng, bưởi Diễn, bưởi Phúc Trạch…

với vùng miền như: cam Sành Bố Hạ, Cam Sành Hà Giang - Tuyên Quang - Yên Bái, Quýt

Ở Việt Nam cây có múi được coi là một loạ i cây ăn quả quan tro ̣ng , chủ lực để phát

triển một nền nông nghiệp hàng hóa. Theo báo cáo của Trung tâm Khuyến nông quốc gia,

diện tích trồng cây ăn quả có múi tăng nhanh hàng năm. Năm 1990 cả nước có hơn 19

nghìn ha cam, quýt, với sản lượng 119,238 tấn, đến năm 2011, diện tích trồng cây có múi

đã tăng lên khoảng 138 nghìn ha với sản lượng gần 1,35 triệu tấn(theo Tổng cục thống kê

năm 2011), tâ ̣p trung chủ yếu ở miền Nam , chiếm 70%, khoảng 91.250 ha và sản lượng

hơn 1 triệu tấn miền Bắc chỉ có 47.000 ha và sản lượng 340.000 tấn. Trong số 47.000 ha

cây có múi ở miền Bắc, các tỉnh miền núi phía Bắc (gồm Đông Bắc và Tây bắc) chiếm

18.625 ha, trong đó các tỉnh có diện tích lớn là: Hà Giang, Tuyên Quang, Hòa Bình, Yên

Bái và Lạng Sơn. Diện tích và sản lượng cây có múi tăng đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn,

làm thay đổi bộ mặt nông thôn, góp phần xóa đói, giảm nghèo cho nhiều vùng quê. Và tính

đến năm 2013, diện tích cây có múi cả nước ước khoảng 136 nghìn ha, sản lượng ước đạt

1,4 triệu tấn, riêng diện tích cam khoảng 60 nghìn ha. Các vùng cây có múi rải khắp nhiều

vùng trên cả nước.

Tuy vậy, việc trồng cây có múi trên thế giới và ở Việt Nam phải đối mặt với một số

vấn đề là cây tăng trưởng chậm, côn trùng, sâu bệnh, các nguy cơ khác gây tổn thất trước

và sau thu hoạch, mùa cung cấp và thời gian bảo quản ngắn, từ những năm 60 của thế kỷ

20, Viện Bảo vệ thực vật đã điều tra phát hiện trên cây có múi có tới 19 loại bệnh do nấm,

2 loại bệnh do vi rút, 2 loại do bệnh vi khuẩn, 2 loại bệnh tuyến trùng, 4 loại do thực vật

thượng đẳng và 4 loại bệnh sinh lý. Trong đó, bệnh vàng lá greening, tristeza, loét, chảy

gôm, phấn trắng được xem như những loại bệnh hại nguy hiểm trên cây có múi. Đối với

sâu hại đã phát hiện 169 loài côn trùng gây hại, trong đó đáng chú ý là rầy chổng cánh và

rệp là 2 đối tượng làm môi giới truyền bệnh greening và tristeza. Hiện nay, hầu hết các

vùng trồng cam quýt ở nước ta đều bị nhiễm bệnh vàng lá greening và tristeza, các bệnh do

nấm Phytophthora (bệnh chảy gôm), Capnodium citri (bệnh nấm muội đen) và vi

khuẩn Xanthomonas (bệnh loét) vv… Các nghiên cứu đều cho thấy bệnh vàng lá greening

và tristeza đã tàn phá nhiều vùng trồng cam, quýt. Bệnh là nguyên nhân chính làm giảm

sức sống vườn cây nhanh chóng, thậm chí phải hủy bỏ trước thời gian cây cho quả bói.Có

thể nói sâu, bệnh luôn là vấn đề cản trở lớn nhất đối với sản xuất cây có múi không chỉ ở

trong nước mà với tất cả các nước trồng cây có múi. Thành công của phát triển cây có múi

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

18

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

ngoài việc có giống tốt, kỹ thuật, công nghệ cao thì việc phòng chống sâu, bệnh phá hoại

cần phải được coi là nhiệm vụ hàng đầu.

Hiện nay nhiều nước trên thế giới đã tiến hành nhiều hướng nghiên cứu để tăng năng

suất và chất lượng cây và quả có múi. Trong đó, nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật

nội sinh, xác định hoạt tính sinh học và sử dụng chúng trong kiểm soát sinh học và thử

nghiệm kích thích tăng trưởng cây có múi nhờ các phytohoocmon (IAA) được nhiều tác

giả đề cập. Xạ khuẩn nội sinh và các vi sinh vật nội sinhtrên họ cây có múi được quan tâm

do ưu thế của xạ khuẩn nội sinh trong cạnh tranh dinh dưỡng và nơi cư trú so với các vi

sinh vật khác của chế phẩm sinh học thông thường. Mặt khác xạ khuẩn có khả năng sinh

trưởng trên nhiều loại môi trường và cơ chất khác nhau do sinh tổng hợp nhiều enzyme

phân hủy và đặc biệt có tiềm năng trong kiểm soát sinh học do khả năng sinh tổng hợp

nhiều chất kháng khuẩn và kháng nấm [29, 45]. Trên cây cây quýt nhóm nghiên cứu của

Shutsrirung và cộng sự (2013) tại Thái Lan đã phân lập được các chủng xạ khuẩn có khả

năng sinh tổng hợp IAA giúp kích thích sinh trương thực vật [45]. Bên cạnh đó Kandpal và

cộng sự đã tách chiết được hoạt chất kháng nấm từ xạ khuẩn nội sinh trên lá cây có múi

[29].Việt Nam có nhiều cây có múi đặc sản được trồng tại nhiều vùng đất khác nhau với

khí hậu nóng ẩm mưa nhiều nên khả năng phân lập và sự đa dạng về xạ khuẩn nội sinh trên

cây có múi hứa hẹn nhiều thành công.Nghiên cứu của chúng tôi sẽ là tiền đề cho các

nghiên cứu tiếp sau về xạ khuẩn nội sinh trên cây có múi trong kiểm soát sinh học và phát

triển nông nghiệp bền vững.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

19

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

2.1.1. Mẫu cây

Thu thập các mẫu thực vật (rễ, cành) của cây cam tại Tuyên Quang. Trong đó, có 5

mẫu lấy tại thôn Đèo Ẳng, xã Bình Xa, huyện Hàm Yên (đánh số từ 1-5) và 5 mẫu lấy tại

thôn Hốc Trai, TP Tuyên Quang (đánh số từ 6-10).

2.1.2. Vi sinh vật kiểm định:

Colletotrichum truncatum VSVD 14,Geotrichum candidumVSVĐ 5, Fusarium

oxysporum FO5 và Fusarium udum VSVĐ 2 , Bacillus subtilis HU058 từ bộ sưu tập

giống của Phòng Vi sinh vật đất, Staphylococcus aureus ATCC 25922 và Pseudomonas

aeruginosa ATCC 10145 nhận từ Viện Kiểm nghiệm thuốc.

2.1.3. Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

- Các đoạn mồi khuếch đại gen 16S rDNA do Invitrogen (Hồng Kông) cung cấp.

- Các loại đường chuẩn: Glucose, arabinose, Sucrose, manitol, xylose, fructose, cellulose,

rafinose, rhamnose… Của hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất.

- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, NaCl, (NH4)2SO4,

FeSO4.7H2O… Nhập từ Anh, Trung Quốc.

- Các loại cao: Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone… của hãng Merck Đức

- Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carcoxyl Methyl cellulose)…

Của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất.

Thiết bị

Kính hiển vi quang học Olympius (Model CHD, Nhật Bản).

Kính hiển vi điện tử quét S-4800, Đức.

Máy đo pH (Mettler Toledo, Thụy Sỹ).

Cân điện tử (Mettler Toledo, Thụy Sỹ).

Nồi hấp khử trùng (ALP M-40DP, Nhật Bản).

Tủ ấm (Trung Quốc).

Lò vi sóng (Hàn Quốc).

Máy li tâm (Đức).

Tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật Bản).

Máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc).

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

20

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Máy PCR (Applied Biosytem, Mỹ).

Bộ điện di agarose.

Máy soi gen (Bio-Rad, Mỹ).

2.1.4. Môi trường nghiên cứu

Môi trường phân lập, nuôi cấy:

- Môi trường Humic acid (g/l): K2HPO4 2,0; CaCO3 0.02; KNO3 2,0;FeSO4.7H2O 0.01;

NaCl 2; MgSO4.H2O 0.05; humic acid 1; 10ml NaOH 0,2 N; agar 18,0.

- Môi trường MPA (g/l): Cao thịt 3,0; NaCl 5,0; peptone 10,0; agar 18,0;pH 7,0.

- Môi trường Hansen (g/l): Glucose 20,0; MgSO4.7H2O 2,0; tryptone 10,0; K2HPO4 2,0;

agar 20,0; pH 6,0.

- Môi trường Gause I (g/l): Tinh bột tan 20,0; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0.5; KNO3 0,5;

FeSO4.7H2O 0.01; agar 20,0; pH 7,2-7,4.

- Môi trường Gause II (g/l): Cao thịt 3,0; peptone 5,0; NaCl 5,0; glucose 10,0; agar

20,0; pH 7-7,2.

- Môi trường ISP1 (g/l): Tryptone 5,0; cao nấm men 3,0; agar 18,0; pH 7,0

- Môi trường ISP2 (g/l): Cao nấm men 4,0; glucose 10,0; cao malt 4,0;

agar 18,0; pH 7,0.

- Môi trường ISP3 (g/l): Bột đại mạch 20,0; dung dịch khoáng A 1ml; agar 18,0; pH 7,0.

- Môi trường ISP4 (g/l): Tinh bột tan 10,0; K2HPO4 1,0; MgSO4.7H2O 1,0; NaCl 1,0;

(NH4)2SO4 2,0; CaCO3 2,0; dung dịch muối khoáng A 1ml; agar 20,0; pH 7,2-7,4.

- Môi trường ISP5 (g/l): glyxerin 10,0; asparagin 1,0; K2HPO4 1,0; dung dịch muối

khoáng A 1ml; agar 20,0; pH 7.

- Môi trường ISP 6 (g/l): Peptone 10,0; cao nấm men 1,0; citrat sắt 0,5; agar 25,0; pH 7.

- Môi trường ISP 7 (g/l): Glycerin 15,0; tyrosin 0,5; asparagin 1.0; K2HPO4 0,5; NaCl

0,5; FeSO4.7H2O 0.01; dung dịch muối vi lượng 1ml; agar 20,0; pH 7,0.

- Môi trường ISP8 (g/l): Peptone 1,0; NaCl 0,5; KNO3 1,0; agar 20,0; pH 7,0.

- Môi trường ISP9 (g/l): (NH4)2SO4 2,64; K2HPO4 5,65; KH2PO4 2,38; MgSO4 1; dung

dịch muối khoáng B 1ml; nguồn cacbon 10,0; agar 20; pH 6,8-7,0.

(Nguồn cacbon: glucose, arabinose, sucrose, xylose, manitol, fructose, cellulose, raffinose)

Môi trường phân hủy các hợp chất khó tan

Môi trường Gause-1 điều chỉnh (g/l):20 tinh bột; MgSO4.7H2O, 3; K2HPO4, 3;

KNO3, 1; NaCl 0,5; 0,01 FeSO4.7H2O; 20 agar, nước cất 1000 ml.

Các môi trường khác lần lượt thay tinh bột bằng: CMC, casein, guaiacol, xylan, kitin.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

21

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Các dung dịch khác

Dung dịch muối B (%): CuSO4.5H2O 0,64; FeSO4.7H2O 0,11; MnCl2.4H2O 0,79;

ZnSO4.7H2O 0,15; nước cất 100ml.

Dung dịch muối A (%): FeSO4- 0,1; ZnSO4 - 0,15; MnCl2 - 0,1; nước cất - 100ml.

Các dung dịch sử dụng trong điện di ADN trên gel agarose:

- Dung dịch TAE 50X (g/l): 24,2% trisbase; glacial axetic axit: 5,71ml; EDTA 0,5M

pH 8: 10ml.

- Đệm tra mẫu (6X) (loading dye): 0,25% bromophenol blue; 0,25% xylen cyanol

FF; 30% glycerol.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ các mô sống của các mẫu thực vật

Các mẫu thực vật từ cây cam được lấy và lưu giữ trong túi nilon riêng rẽ. Mỗi mẫu

cây được chia thành 3 phần riêng: Rễ, cành, lá đựng trong túi nilon sạch có ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lí và phân

tích trong vòng 7 ngày.

Phương pháp tiến hành: Mẫu rễ, cành hoặc lá được rửa sạch bề mặt. Sau đó, mẫu lá

được cắt thành các mẩu nhỏ (kích thước 1 x 1 cm), mẫu cành hoặc rễ được cắt thành các

đoạn dài 1 cm. Các mẫu đã cắt được ngâm ngập trong dung dịch 5 % sodium hypochlorite

(NaOCl) trong 1 phút, tiếp đó được xử lý với cồn 70 % trong 5 phút rồi được rửa bằng

nước cất khử trùng 5 lần. Các mẫu thực vật sạch này được giã nhỏ và bổ sung vào đĩa môi

trường khoáng humic, có chứa chất kháng nấm (nystatin 100 mg/lít) và chất kháng khuẩn nalidixic acid (10 mg/lít). Các đĩa thạch được nuôi ở 30oC và phân lập các chủng xạ khuẩn

xuất hiện trên môi trường sau 15 ÷ 60 ngày. Các mẫu xạ khuẩn này được thuần khiết và

giữ trên môi trường ISP2 và sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.

2.2.2. Đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn

Khả năng sinh chất kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn phân lập dựa trên khả

năng đối kháng của các chủng này với một số chủng nấm bệnh trên cây có múi

(Colletotrichum truncatum VSVD 14,Geotrichum candidum VSVĐ 5, Fusarium

oxysporum FO5 và Fusarium udum VSVĐ 2) và một số vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

kiểm định bằng phương pháp cục thạch và phương pháp khuếch tán trên thạch.

Kiểm tra khả năng đối kháng do cạnh tranh nguồn dinh dưỡng

Thí nghiệm được tiến hành song song bằng cách chuyển nấm bệnh được nuôi trên

môi trường PDA từ đĩa giống sang 1 đĩa môi trường PDA mới, nấm được đặt cách vị trí xạ

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

22

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

khuẩn là 3cm ; mẫu thí nghiệm đối chứng được nuôi ủ và theo dõi. Khả năng ức chế nấm

được tính toán theo công thức: AB = B – A. Trong đó AB là hoạt động ức chế sự phát triển

của nấm, A = khoảng cách của nấm tới khuẩn lạc của xạ khuẩn. B = đường kính phát triển

của nấm trên môi trường đối chứng. Tỷ lệ AB sẽ được đánh giá như sau: < 1mm: không có

ức chế; 1 ÷ 9mm (+); 10 ÷ 19mm (++); >20mm (+++) [32].

Sản xuất các chất kháng khuẩn và kháng nấm: Xạ khuẩn được nuôi trên các môi

trường kiểm tra lỏng ở 30°C, 150 vòng/phút trong 4 ngày. Ly tâm thu 5ml dịch, bổ

sung 5ml ethylacetate. Hỗn dịch được huyền phù hóa trong 45 phút, sau đó ly tâm

thu dịch trong ở 12000 vòng/phút, 10 phút. Dịch sau ly tâm cho bay hơi trong một

giờ và thu phần dịch còn lại. Phần dịch (5ml) bổ sung 5ml ethyl acetat và cho bay

hơi trong 30 phút. Đối chứng âm dịch sau lên men được thay bằng nước cất [28].

Hoạt tính kháng nấm được thử bằng phương pháp khuếch tán trên thạch.

2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

Nghiên cứu đặc điểm sinh họctheo phương pháp trong ISP (1974) và khóa phân loại

Bergey. Màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC), khuẩn ty khí sinh (KTKS), sắc tố melanin

và sắc tố tan tiết ra môi trường được đánh giá theo Shirling và Gottlieb (1966) trên bảng

màu của Tresner và Backus. Căn cứ vào màu sắc hệ sợi khí sinh của các chủng mới phân

lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray

(Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh...

[44,54].

Hình dạng cuống sinh bào tử và cấu trúc bề mặt bào tử của xạ khuẩn nghiên

cứu được quan sát dưới kính hiển kính hiển vi điện tử quét JSM-5000 tại Viện Vật

liệu, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chuỗi sinh bào tử có các dạng

thẳng hay hơi lượn sóng ký hiệu là RF (Rectiflexibiles), hình móc câu hay hình xoắn

không hoàn toàn ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S

(Spirales). Bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: nhẵn ký hiệu là Sm (Smooth), dạng mụn

cóc ký hiệu là Wa (Warty), dạng gai ký hiệu là Sp (Spiny) và dạng tóc ký hiệu là Ha

(Hairy) [36].

Sự hình thành sắc tố melanin: Sắc tố melanin được kiểm tra trên môi trường ISP1,

ISP6 và ISP7 sau 7 ÷ 14 và 21 ngày nuôi cấy. Nếu sinh melanin, màu sắc tố xung quanh

khuẩn lạc xạ khuẩn trên môi trường nuôi sẽ chuyển từ màu vàng nâu sang màu đỏ đậm cho

đến màu đen [36].

Khả năng sử dụng các nguồn cacbon: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP 9

có bổ sung thêm 1% các nguồn đường tương ứng: Glucose, Arabinose, Sucrose, Manitol,

Xylose, Fructose, Cellulose, Rafinose, Rhamnose. Kiểm tra sinh trưởng sau 7 ÷ 14 ngày ở

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

23

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

nhiệt độ 28 ÷ 30oC. Môi trường có glucosa được coi là đối chứng dương, môi trường

không đường được coi là đối chứng âm [36].

Xác định nhiệt độ tối ưu: Chủng được nuôi trên môi trường thạch Bennet ở nhiệt độ 10; 15; 22; 28; 30; 35; 37; 40; 45; 50; 55 và 60oC. Sau 7 ÷ 14 ngày quan sát sự sinh trưởng

của các chủng.

Xác định pH tối ưu: Xạ khuẩn nuôi cấy trên môi trường dịch thể Bennet đã chỉnh pH từ

2 ÷ 12. Nuôi lắc 200 vòng/phút ở 28ºC. Sau 5 ÷ 7 ngày thu dịch và tiến hành ly tâm 8000

vòng/phút ở nhiệt độ 4C trong 10 phút, thu sinh khối để từ đó xác định khả năng sinh trưởng.

Khả năng chịu NaCl: Môi trường ISP 2 dịch thể có bổ sung thêm NaCl với các nồng

độ: 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 và 7,0 (%). Nuôi lắc xạ khuẩn 200 vòng/phút ở 28ºC. Sau 7 ngày

thu dịch và tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút ở nhiệt độ 4C trong 10 phút, thu sinh khối và

xác định khả năng sinh trưởng.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa

ISP 2. Sau khi phát triển tốt, dùng que cấy vô trùng cấy chấm điểm lên các đĩa Petri chứa

môi trường Gauze 1 có bổ sung các cơ chất đặc hiệu: tinh bột để xác định hoạt tính

amylase, casein để xác định hoạt tính protease, chitin để xác định hoạt tính chitinase, CMC

(Cacboxyl Methyl Cellulose) để xác định hoạt tính xenlulase. Sau 5 ngày nuôi ở 28ºC, xác

định khả năng sinh tổng hợp các amylase bằng thuốc thử Lugol, protease bằng thuốc thử

tricloacetic, chitinase bằng congo đỏ 0,5%. Khả năng sinh enzym được xác định bằng giá trị

D-d (mm), trong đó D là đường kính vòng thủy phân cơ chất, d là đường kính khuẩn lạc.

2.2.4. Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA

DNA tổng số của chủng C12 được tách chiết theo phương pháp của Sambrook &

Russell (2001) [40].Gen mã hóa 16S rRNA của chủng xạ khuẩn được khuếch đại bằng phản

ứng PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi 27F (5'-TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và 1492R (5'-GG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3') theo chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 60oC trong 60 giây, 72oC trong 90 giây), 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC. Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tích trên máy đọc trình tự ABI

PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, xử lý bằng phần mềm SeqAssem version 01/2005 và

Sequencher version 4.0.5. Mức độ tương đồng của gen 16S rDNA của các chủng vi khuẩn

được so sánh với các trình tự gen 16S rDNA. Mức độ tương đồng di truyền của các chủng

được xây dựng dựa trên phần mềm ClustalX 2.0.11.

2.2.5. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh

Tách chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ. Hoạt chất kháng nấm do xạ

khuẩn sinh tổng hợp có thể nằm trong sinh khối hay trong dịch nuôi cấy. Vì vậy để

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

24

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

tách chiết kháng sinh thì cầnlựa chọn dung môi thích hợp cho từng phương pháp

tách chiết.

Tách chiết kháng sinh từ sinh khối

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường lên men thích hợp trên máy lắc 150v/p ở nhiệt độ 28 ÷ 30oC , sau 120 giờ thu hồi dịch lên men, ly tâm ở 5000 v/p trong 15

phút, loại dịch, thu sinh khối. Rửa sinh khối với nước cất đã khử trùng để loại bỏ

các thành phần môi trường bám quanh sinh khối. Cân 3g sinh khối + 30ml dịch

dung môi, lắc trên máy lắc 150 v/p. Sau 24 giờ ly tâm, thu dịch chiết. Thử hoạt tính

kháng nấm theo phương pháp khoanh giấy lọc.

Tách chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường lên men thích hợp trên máy lắc 150v/p ở nhiệt độ 28 ÷ 30oC , sau 120 giờ thu hồi dịch lên men, ly tâm ở 5000 v/p trong 15

phút, loại sinh khối, thu dịch lọc.Chia dịch thành 4 phần. Chỉnh dịch về 3 pH: 3, 7

và 10 và đối chứng không chỉnh pH. Bổ sung dung môi vào dịch lọc theo tỷ lệ 1:1 lắc trên máy lắc 150 v/p ở 28 oC. Sau 24 giờ để lắng, ly tâm thu lấy dịch chiết. Thử hoạt

tính kháng nấm theo phương pháp khoanh giấy lọc.

Tinh sạch kháng sinh

Dịch chiết kháng sinh từ sinh khối hay dịch nuôi cấy được cho bay hơi dung môi đến khi còn khoảng 1/5 so với lượng dịch ban đầu. Để dịch chiết sau bay hơi ở 4oC, 24 giờ xuất hiện kết tủa. Ly tâm lạnh ở 4oC, 12000 v/p trong 5 phút, tách riêng dịch và tủa. Làm khô

tủa thu được kháng sinh thô dạng bột.

Quy trình tinh sạch kháng sinh thô

- Chuẩn bị cột tách: Cột có đường khính 2cm, chiều dài 30cm. Chất nhồi (pha tĩnh )

silicagel 0,04 ÷ 0,06 mm của Tay Ban Nha. Nhồi cột bằng kỹ thuật nhồi cột khô, cùng bơm

nén và để một ngày cho ổn định cột.Chiều dài của pha tĩnh là khoảng 20cm.

- Chuẩn bị chất cần tách

Cân khoảng 0,5g hỗn hợp chất cần tách hoà tan trong 20ml methanol, cân 1g

silicagel cho vào dung dịch, cô đuổi dung môi trên nồi cách thuỷ chân không đến khô thu

được mẫu bột silicagel hấp phụ các chất cần tách.

- Chuẩn bị pha động để rửa giải

Pha động là hỗn hợp dung môi n-hexan – chloroform – methanol tỷ lệ tương ứng về

thể tích 7:4:2, được trộn đều đồng nhất.

- Quy trình tinh sạch

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

25

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Đưa mẫu silicagel hấp phụ chất lên cột, dung pha động để rửa giải các chất, dung

dịch ra khỏi cột được thu vào ống 10ml (gọi là 1 phân đoạn), thu lấy 44 phân đoạn như

vậy, kiểm tra bằng bản mỏng xác định phân đoạn từ 28 đến 44 chỉ có một chấm tròn sắc

nét có cùng hệ số Rf trên UV 366nm cũng như axit sunfuric đặc đun nóng, từ đó kết luận

phân đoạn 28 ÷ 44 là một chất sạch, gộp các phân đoạn này với nhau và để bay hơi tự

nhiên thu được tinh thể chất rắn. Chất rắn sạch này được đo phổ hấp thu phân tử UV –

VIS, phổ hồng ngoại (Infrared (IR) spectroscopy).

2.2.6. Phương pháp xác định một số tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn

* Xác định khả năng bền trong pH của chất kháng sinh

Xử lý dịch kháng sinh thô ở các pHkhác nhau: pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 và 9 bằng NaOH

0,5M và CH3COOH 0,4M và giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Sau đó chỉnh các mức

pH trên về pH 7 rồi tiến hành thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch.

* Xác định khả năng bền với nhiệt độ của chất kháng sinh

Xử lý dịch kháng sinh thô ở các nhiệt độ khác nhau 40oC, 70oC, 80oC và100oC kéo

dài 30, 60, 90 và 120 phút, sau đó để nguội và xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương

pháp đục lỗ thạch.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

26

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Phần III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập và sàng lọc các chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp hoạt

chất kháng nấm trên cây Cam Hàm Yên – Tuyên Quang.

3.1.1. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam Hàm Yên – Tuyên Quang

Để có thể nghiên cứu và thu nhận được các chủng xạ khuẩn nội sinh có độ đa dạng

cao và thu được các chủng xạ khuẩn quý, tiến hành thu thập các mẫu thực vật (rễ, cành)

của cây cam trồng trên sườn núi và khoảng 7 năm tuổi tại Tuyên Quang. Trong đó, có 5

mẫu lấy tại thôn Đèo Ẳng, xã Bình Xa, huyện Hàm Yên và 5 mẫu lấy tại thôn Hốc Trai, Tp

Tuyên Quang. Các vườn cam này ít được chăm bón và không sử dụng nhiều thuốc hóa

học.

Trên cơ sở tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phân loại các chủng xạ khuẩn nội

sinh chúng tôi lựa chọn một số môi trường nghiên cứu để phân lập xạ khuẩn nội sinh trên

cây cam Hàm Yên Tuyên Quang như sau:Môi trường có chứa axit humic, sodium

propionate, protine, nước chiết lá cam Hàm Yên.

Bảng 3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn nội sinh từ mẫu rễ cam Hàm Yên, Tuyên Quang trên

một số môi trường khác nhau

STT Mẫu Môi trường phân lập Số loại khuẩn lạc xạ khuẩn và đặc điểm

1 R8 Humic acid 5 loại khuẩn lạc Số lượng xạ khuẩn (CFU/g sinh khối thực vật) 223

- 19 khuẩn lạc trắng ngà - 12 khuẩn lạc xám - 7 khuẩn lạc xanh rêu - 4 khuẩn lạc da cam - 8 khuẩn lạc xám có mũ trắng

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

27

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

285 4 loại khuẩn lạc Sodium propionate

- 23 khuẩn lạc xám,vòng tan - 15 khuẩn lạc trắng nhỏ - 19 khuẩn lạc trắng ngà - 7 khuẩn lạc da cam, phấn trắng Protine 196 4 loại khuẩn lạc - 12 khuẩn lạc trắng, phấn nâu - 15 khuẩn lạc nâu, có vòng tan

- 8 khuẩn lạc trắng ngà - 9 khuẩn lạc trong 266 4 loại khuẩn lạc Nước chiết lá

- 33 khuẩn lạc trắng nhỏ - 12 khuẩn lạc xanh rêu - 4 khuẩn lạc da cam - 11 khuẩn lạc xám nâu 2 R4 Humic acid 118 3 loại khuẩn lạc :

- 1 khuẩn lạc màu xám đen - 7 khuẩn lạc màu xám có

mũ trắng ở giữa - 19 khuẩn lạc trắng 109 2 loại khuẩn lạc Sodium propionate - 1 khuẩn lạc trắng xẻ thuỳ - 24 khuẩn lạc trắng Protine 74 3 loại khuẩn lạc - 1 khuẩn lạc màu xám có đốm đen ở giữa

- 1 khuẩn lạc màu da cam - 15 khuẩn lạc trắng 78 2 loại khuẩn lạc Nước chiết lá - 2 khuẩn lạc xám có đốm trắng - 16 khuẩn lạc trắng 3 R10 Humic acid 169 4 loại khuẩn lạc

- 18 khuẩn lạc trắng - 17 khuẩn lạc nâu - 7 khuẩn lạc da cam - 5 khuẩn lạc đen

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

28

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

180 3 loại khuẩn lạc Sodium propionate

- 21 khuẩn lạc trắng - 19 khuẩn lạc nâu - 11 khuẩn lạc da cam Protine 138 3 loại khuẩn lạc

- 14 khuẩn lạc trắng - 15 khuẩn lạc da cam - 10 khuẩn lạc nâu 159 4 loại khuẩn lạc Nước chiết lá

- 23 khuẩn lạc trắng - 12 khuẩn lạc da cam - 6 khuẩn lạc nâu - 4 khuẩn lạc đen

Qua kết quả khảo sát trên các môi trường phân lập cho thấy môi trường có chứa axit

humic cho số lượng chủng loại xạ khuẩn nhận được là đa dạng nhất. Vì vậy môi trường

chúng tôi lựa chọn sử dụng cho phân lập là môi trường có chứa axit humic.

a c d b

Hình 3.1. Hình ảnh minh học kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh trên một số

môi trường sau 6 tuần nuôi cấy, Môi trường humic acid (a), protine (b), sodium propionate

(c), nước chiết lá Cam Hàm Yên (d)

Từ 20 mẫu cành và rễ của cây cam Hàm Yên – Tuyên Quang đã phân lập và

thuần khiết được 40 chủng xạ khuẩn nội sinh. Kết quả phân lập cho thấy, tổng số loại

khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập được chia theo bộ phận thực vật và các nhóm màu thể

hiện được sự đa dạng của các chủng xạ khuẩn.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

29

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Hình 3.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân lập theo bộ phận của cây cam Hàm Yên

Số lượng xạ khuẩn chúng tôi thu nhận được trên các mẫu rễ là đa dạng nhất. Số

lượng xạ khuẩn thu được trên mẫu rễ chiếm tỷ lệ cao hơn rất nhiều so với mẫu cành (rễ

62,5%, cành 37,5%), đồng thời sự đa dạng về chủng loại trên mẫu rễ cũng cao hơn hẳn.

Kết quả nghiên cứu này khá phù hợp với các kết quả nghiên cứu của một số tác giả trên thế

giới. Nhóm nhiên cứu của Zhao và cộng sự (2005) đã phân lập được 560 chủng xạ khuẩn

từ 26 cây dược liệu khác nhau tại vùng cao nguyên Panxi, Trung Quốc. Tỷ lệ phân lập các

chủng xạ khuẩn nội sinh cao nhất ở rễ (58,2 %), thân (27,8 %) và lá (14%) [59]. Điều này

hoàn toàn phù hợp với kết luận của Verma (2009) [55] phần lớn xạ khuẩn nội sinh được

phân lập từ rễ nhiều hơn các cơ quan khác. Và các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây

quýt ở miền Bắc Thái Lan hầu hết đều thuộc chi Streptomyces (chiếm 85,3%) [45].

Bảng 3.2. Tỷ lệ các xạ khuẩn phân lập chia theo đa dạng nhóm màu

Trắng Xám Xanh rêu Da cam Nâu Đen Vàng

11,91 81,44 1,39 0,65 2,59 1,57 0,46

Màu Tỷ lệ xạ khuẩn theo nhóm màu (%) Trên môi trường phân lập xạ khuẩn nội sinh khá đa dạng với 7 màu tương ứng (Bảng

1). Xạ khuẩn màu trắng chiếm tỷ lệ cao nhất (81,44%), gấp 176 lần so với nhóm màu đen –

là nhóm chiếm tỷ lệ thấp nhất (0,46%), và gấp 7 lần so với nhóm có tỷ lệ đứng thứ 2 màu

cam (11,91%).

3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh chất kháng nấm,

kháng khuẩn

Sau khi phân lập và thuần khiết được 40 chủng xạ khuẩn, tiến hành kiểm tra sơ bộ

khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn phân lập đượcbằng phương pháp đặt cục thạch

với các chủng vi sinh vật kiểm định. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.3, 3.4 và hình 3.3

Bảng 3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

30

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Vòng kháng khuẩn D – d, mm STT KH chủng

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 R10-4 R12-4 R8-14 R8-1 R8-11 R8-7 R8-6 R8-3 R12-5 R12-1 C12 C2-3 C2-4 C2-5 R8-5 R12-3 1 20 24 23 24 - 7 8 - - 20 - 7 6 8 6 6 2 15 18 16 15 - - - - - - - - - - - 4 4 26 28 25 15 - - - 10 7 - 20 15 8 10 8 7 5 20 22 19 - 6 - - - - - 14 - - - - - 6 22 23 21 - 7 - - - - - 12 - - - - - 7 27 29 28 16 - - - 8 6 - 22 16 9 11 8 8 3 - - - - - - - - - - - - - - 5 -

Ghi chú: 1. Staphylococcus aureus; 2. Pseudomonas aeruginosa ATCC; 3. Bacillus subtilis; 4. Colletrichum trumcatum; 5. F. oxysporum; 6. Fusarium udum; 7. Geotrichum candidum.

Bảng 3.4. Số lượng các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập có khả năng đối kháng với các

vi sinh vật kiểm định

Chủng vi sinh vật kiểm định Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Fusarium udum F. oxysporum Colletrichum trumcatum Geotrichum candidum Số chủng có hoạt tính đối kháng 12 5 1 5 5 12 12

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

31

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

a b c d

Hình 3.3.Khả năng đối kháng của một số chủng xạ khuẩn phân lập với F. oxysporum (a,

b),Staphylococcus aureus (c) và Colletotrichum sp (d)

Kiểm định khả năng kháng khuẩn của 40 chủng xạ khuẩn thuần khiết được,có 16

chủng có khả năng tổng hợp chất kháng nấm, kháng khuẩn, kết quả cho thấy, có 30% xạ

khuẩn kháng vi khuẩn Sta. aureus, 12,5% kháng P.aeruginosa, 2,5% kháng B.subtilis. Đối

với các chủng nấm kiểm định, có 30% xạ khuẩn nội sinh phân lập được đối kháng với

Geotrichum candidum(nấm gây bệnh thực vật gây thối chua trái cây họ cam quýt, cà chua,

cà rốt và một số rau quả) vàColletotrichum (nấm gây bệnh thán thư trên cây và quả),

12,5% kháng F. udum, F. oxysporum (gây bệnh héo cây, chết cây và thối cổ rễ). Trong đó,

chủng R12-4, R8-14, R10-4 và C12 có khả năng kháng cả bốn nấm khiểm định với vòng

kháng nấm dao động từ 1,2÷ 2,2 cm. Như vậy, hai chủng xạ khuẩn nội sinh này có tiềm

năng ứng dụng trong kiểm soát dịch bệnh sau này. Các chủng này được tiếp tục nghiên cứu

các đặc điểm hình thái, sinh hóa nhằm định tên và sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.

Căn cứ vào kết quả kiểm tra sơ bộ hoạt tính đối kháng một số chủng vi sinh vật kiểm

định, chúng tôi đã chọn ra bốn chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh nhất để tiếp tục sàng lọc

bước 2. Các chủng này ký hiệu là R12-4, R8-14, R10-4 và C12.Kết quả kiểm tra được thể

hiện trên Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch sau lên men của các chủng xạ

khuẩn

Xạ khuẩn

Chủng VSV kiểm định Sta. aureus ATCC 25922 P. aeruginosa ATCC 25932 B. subtilis HU058 G.candidum VSVĐ1 F. oxysporum VSVĐ 3 F. udum C. trumcatum VSVD 14 R12-4 R10-4 + - - + + + + ++ - - ++ + + ++ R8-14 + - - + + + + C12 - - - ++ ++ ++ +

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

32

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Ghi chú: “-” không có hoạt tính kháng;“+” có hoạt tính kháng. vòng kháng dưới 12 mm; (++) Có hoạt tính kháng mạnh, vòng kháng to (12-16 mm) và rõ.

b a d

c Hình 3.4.Xạ khuẩn C12 và R12-4 đối kháng với (a) F. oxysporum, (b)C. trumcatum và (c)Sta. aureus và (d) F. oxysporum

Với mục đích tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng nấm

cao.Chúng tôi lựa chọn 02 chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 để tiến hành các nghiên cứu tiếp

theo. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò của xạ khuẩn nội sinh trên nhiều

đối tượng câytrồng như cây thuốc [23,24],cây sâm [25] cây có múi (cam, quýt) [29, 45]

cây lương thực [20,21] trong thu nhận các chất kháng nấm và kháng khuẩn có tiềm năng

sử dụng trong kiểm soát sinh học. Điều này cũng thật dễ hiểu vì các cơ thể nội sinh này

muốn cùng sinh trưởng với cây chủ chúng cần hỗ trợ cây chủ trong sự phát triển bằng cách

sinh ra các chất kích thích sinh trưởng hoặc kiểm soát sinh học tránh sự xâm nhập chiếm

chỗ và lấy mất nguồn cung cấp dinh dưỡng của chúng của các sinh vật khác. Chính vì vậy,

trong số gần 300.000 loài thực vật tồn tại trên trái đất thì mỗi loại cây sẽ là cây chủ cho

một hoặc nhiều loài vi sinh vật nội sinh [29].

3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn

3.2.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý và đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn lựa chọn

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau để quan sát màu

sắc khuẩn lạc (màu sắc khuẩn ty khí sinh), mặt sau của khuẩn lạc (màu sắc khuẩn ty cơ

chất)theobảng màu của Tresner và Backus (1963), khả năng sinh sắc tố. Các đặc điểm nuôi

cấy được ghi nhận sau 7 và 14 ngày nuôi. Kết quả đặc điểm nuôi cấy của các chủng xạ

khuẩn được thể hiện ở bảng 3.6.

Bảng 3.6.Đặc điểm nuôi cấy của xạ khuẩn nội sinh C12 và R12-4 trên các môi trường

khác nhau

Màu KTKS Màu KTCC Ký hiệu chủng Môi trƣờng Sinh trƣởng Kích thƣớc khuẩn lạc (mm) ISP 1 + ++ 1 vàng nhạt Vàng nghệ Màu sắc tố hòa tan

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

33

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

ISP 2 + + + 2-3 Không Vàng

ISP 3 + + + 1-2 Vàng (73. p. oy) 96.d.Ol.Br Nâu oliu hơi sang vàng 94.l.Ol.Br Nâu oliu

ISP 4 + + + 1-2 Không

ISP5 ++ 1-2 Không

ISP 6 + 1 Không

ISP 7 + + + 2-3 Không

ISP 8 + + + 1-2 Vàng 113.Ol.Gy Xám oliu Trắng nâu (263 Br. white) Trắng vàng (92.y.white) (266.d.Gray) Xám đậm Nâu xám (265.med.Gy) (68. s. oy) 94.l.Ol.Br Nâu oliu hơi sang vàng 265 med.Gy Xám trung bình 113.Ol.Gy Xám oliu Trắng (263 white ) Trắng (263 white) (110.gy.Ol ) Oliu xám đậm Vàng nâu (87. m.y)

ISP 1 + + 1-2 Trắng (White ) Trắng ngà Không

ISP 2 + + 1-2 Không

ISP 3 + 1-2 Nâu

ISP 4 + + + 1-2 không R12-4 C12 vàng (Y.White) Xám nâu (med.gray) Xám nâu (med.Gy) Nâu oliu đậm (d.Ol.Brown)

ISP 5 ISP 6 + + + + + + 1-2 1-2

ISP 7 + + 1-2

ISP 8 ++ 1-2 Nâu nhạt không Xám đậm (d.gray) Xám oliu (Ol.Gy) Xám đậm (d.g.Gray) Trắng (White) Trắng (White) Không Trắng (White) Không Trắng ngà vàng (y.white) Xám đậm (d.Gray) Xám nâu(med.Gy) Đen (Blackish) Đen (Blackish)

Ghi chú: + sinh trưởng yếu, + + sinh trưởng bình thường, + + + sinh trưởng tốt.

a b c d e f g h

Hình 3.5. Khuẩn lạc xạ khuẩn C12 (a) trên môi trường ISP1; (b) trên môi trường ISP2; (c) trên môi trường ISP3, (d) trên môi trường ISP4, (e) trên môi trường ISP6; (f) trên môi trường ISP5; (g) trên môi trường ISP8 và (h) trên môi trường ISP7

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

34

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Chủng C12 có khuẩn ty khí sinh màu xám nâu trên các môi trường ISP 2, 4, 7

và 8. Khuẩn ty cơ chất có màu xám nâu đến đen trên các môi trường ISP2, 3, 4, 7 và

8 và sinh sắc tố màu nâu nhạt trên các môi trường ISP 3,7.

a b c d e f g

Hình 3.6. Khuẩn lạc xạ khuẩn R12-4 (a) trên môi trường ISP1; (b) trên môi trường ISP3; (c) trên môi trường ISP2, (d) trên môi trường ISP5, (e) trên môi trường ISP4; (f) trên môi trường ISP7; (g) trên môi trường ISP8 và (h) trên môi trường ISP8.

Chủng R12-4 có khuẩn ty khí sinh màu nâu oliu trên các môi trường ISP 2, 3,

4 và 7. Khuẩn ty cơ chất có màu vàng nâu đến vàng nâu đậm trên các môi trường

ISP 2, 3, 4, 7 và sinh sắc tố màu vàng trên các môi trường ISP 2,3,7 và 8.

- Đặc điểm cuống sinh bào tử

Dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 40 lần, quan sát được hình dạng

chủng xạ khuẩn C12 có cuống sinh bào tử có dạng xoắn lò xo. Dưới kính hiển vi

điện tử ở độ phóng đại 3000 lần cho thấy trên một cành sinh ra nhiều chuỗi bào tử

dài xoắn lò xo nằm so le nhau, cấu trúc bề mặt bào tử nhẵn với số lượng bào tử trên

một chuỗi từ 30 ÷ 50 (Hình 3.7.).

b a

c Hình 3.7. Cuống sinh bào tử (a), chuỗi bào tử (b) và hình dạng bào tử (c) của xạ

khuẩn nội sinh C12

Xạ khuẩn R12-4 có cuống sinh bào tử có dạng xoắn. Dưới kính hiển vi điện tử ở độ phóng đại 3000 lần cho thấy trên một cành thường sinh ra một chuỗi bào tử,

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

35

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

cấu trúc bề mặt bào tử nhẵn với số lượng bào tử trên một chuỗi từ 10-30 (Hình

3.8.).

a b c

Hình 3.8. Cuống sinh bào tử (a), chuỗi bào tử (b) và hình dạng bào tử (c) của xạ

khuẩn nội sinh R12-4

3.2.2. Đặc điểm sinh học của hai chủng xạ khuẩn lựa chọn

- Khả năng sử dụng nguồn cacbon

Việc nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn cacbon, nito nhằm đánh giá đặc điểm phân

loại của chủng xạ khuẩn, bên cạnh đó giúp định hướng tìm nguồn dinh dưỡng thích hợp

cho quá trình lên men. Khả năng này được đánh giá thông qua sự phát triển trên môi

trường ISP9, trong đó nguồn cacbon được thay thế bởi các loại đường quy định trong khóa

phân loại. Kết quả nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn

tuyển chọn được trình bày dưới bảng 3.7.

(1) (2)

Hình 3.9. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn (1) R12-4, (2) C12

sau 14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 28C

Bảng 3.7. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của2 chủng xạ khuẩn tuyển

chọn sau 14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30C

Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn

Nguồn cacbon(1,0 %, w/v) D-glucose L-arabinose R12-4 ++ ± C12 ++ +

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

36

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Ghi chú: ++: sinh trưởng tốt; +: sinh trưởng trung bình; “±”: sinh trưởng yếu;  : không sinh trưởng.

D-sucrose D- xylose D-manitolse D- fructose D-cellulose D-rafinose D-rhamnose Đối chứng ± ++ ++ ++ ++ - ±  ++ ++ ++ ++ ++ ++ ± 

Xạ khuẩn nội sinh C12 có khả năng đồng hóa tất cả 9 nguồn đường cơ bản: D-

alucose, L-arabinose, D-sucrose, D-xylose, D-manitolse, D-fructose, D-cellulose,

D-rafinose, D-rhamnose. Xạ khuẩn TQR12-4 có khả năng đồng hóa được D-

glucose, L-arabinose, D-sucrose, D-xylose, D-manitolse, D-fructose, D-cellulose,

D-rhamnose, đồng hóa yếu L-arabinose, D-sucrose, D-rhamnose và không đồng hóa

được D-raffinose.

- Ảnh hƣởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả năng phát triển của xạ khuẩn

Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của phản ứng hóa học,

các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ, pH và khả năng chịu NaCl của mỗi tế

bào. Đối với các cơ thể đơn bào như xạ khuẩn, nhiệt độ có tác động trực tiếp đến các hoạt

động sinh lý của tế bào.Mặt khác khả năng chịu được nồng độ NaCl, pH và khoảng nhiệt

độ sinh trưởng cũng là một trong những đặc điểm sinh lí - sinh hóa quan trọng của chủng

vi sinh vật. Sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong môi trường Bennett ở

các điều kiện thí nghiệm thay đổi về nồng độ muối, pH và nhiệt độ được thể hiện trong

bảng 3.8, 3.9 và 3.10.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn

Kí hiệu chủng

R12-4 C12 Khả năng sinh trưởng của các chủng trên môi trường có sự thay đổi của nồng độ NaCl (%) 1 +++ +++ 2 +++ +++ 0 +++ +++ 3 ++ ++ 5 - + 7 - - Chủng C12 có thể phát triển tốt ở các nồng độ muối 0 ÷ 5(%),chủng R12-4sinh

trưởng tốt nhất ở nồng độ muối 0 ÷ 3(%).

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn

Khả năng sinh trường của các chủng trên môi trường ở các pH khác nhau Kí hiệu chủng

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

37

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

2 - - 5 + + 7 6 ++ +++ +++ ++ +++ +++ 9 ++ ++ 10 + + 11 - - 3 - - 4 + - 12 - -

R12-4 C12 Chủng R12-4 có thể sinh trưởng tốt ở pH 4÷10, chủng C12 có thể phát triển tốt ở pH 5÷10.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn

Kí hiệu chủng xạ khuẩn

R12-4 C12 Khả năng sinh trưởng của các chủng trên môi trường ở các nhiệt độ khác nhau (oC) 37 30 ++ +++ ++ +++ 25 +++ +++ 20 ++ ++ 45 - - 40 + + 10 - -

Ghi chú: “-” Không sinh trưởng, “+” sinh trưởng bình thường, “++ sinh trưởng tốt”, “+++” sinh trưởng rất tốt.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, các chủng xạ khuẩn đều có thể sinh trưởng tốt trong khoảng nhiệt độ từ 20 ÷ 40oC, có thể kết luận chủng thuộc nhóm ưa ấm (mesophilic). Hai

chủng xạ khuẩn này phát triển được trên môi trường có dải pH khá rộng, phát triển tốt nhất

ở pH 7 ÷ 8.

-Khả năng sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào

Khả năng sinh enzyme ngoại bào là một trong những đặc điểm cho biết sự thích nghi

của xạ khuẩn đối với môi trường sống.Trong thí nghiệmnày, khả năng sinh tổng hợp một

số nhóm enzyme như: cellulose; amylase; protease; chitosanase; ligninase của hai chủng xạ

khuẩn tuyển chọn.

Bảng 3.11. Khả năng phân giảimột số cơ chất của các hai xạ khuẩn lựa chọn Cơ chất đặc hiệu Đường kính vòng phân giải (D-d mm)

Tinh bột Casein CMC Chitin Guiacol R12-4 25 23 31 21 25 C12 20 21 28 23 20 Hai chủng xạ khuẩn nội sinh nghiên cứu có hệ enzyme ngoại bào phong phú

(cellulase, amylase, protease, xylanase, chitinase).

Tách ADN tổng số và khuếch đại gen 16S rDNA của hai xạ khuẩn nghiên cứu

DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn được tách chiết theophần vật liệu phương

pháp. Kết quả điện di kiểm tra AND tổng số trên gel agarose được trình bày trên hình 3.10.

và 3.11

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

38

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Hình 3.10.Điện di đồ DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 trên gel agarose 1,0 % Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi sử dụng 27F và 1492R trên gel agarose 1,0% (Trong đó Lane 1 là sản phẩn PCR của chủng C12 và Lane 2 là sản phẩm PCR của chủng R12-4. M (thang chủng): Macker Hyper ladder 1kb (Cat. No. Bio-33053) Kết quả trên hình 3.10 cho thấy, quá trình tách chiết ADN tổng số của hai chủng xạ

khuẩncho kết quả tốt, ADN tổng số thu được có băng gọn. ADN tổng số của các chủng này được xử lý với RNase và bảo quản ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.Thực

hiện phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA từ ADN tổng số của hai chủng xạ khuẩn

với cặp mồi đặc hiệu 27F và 1492Rcho một băng ADN duy nhất có kích thước khoảng 1,4

kb (hình 3.11). Kết quả trên cho thấy phản ứng PCR trong thí nghiệm này là đặc hiệu.

- Giải trình tự gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 và phân loại

Nhằm định tên chủng C12 đến loài, bên cạnh các kết quả về đặc điểm sinh

hóa, cần kết hợp thêm trình tự gen 16S rRNA.So sánh trình tự gen 16S rRNA của xạ

khuẩn nội sinh C12với các trình tự tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng

công cụ BLAST trên NCBI cho thấy, gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn nghiên cứu có độ

tương đồng cao với các chủng xạ khuẩn thuộc nhóm Streptomyces sp như: S.

angustmyceticus (KM370068); S. prasinopilosus (99%). Dựa vào các đặc điểm sinh học

và phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy, xạ khuẩn nội sinh C12 có độ tương đồng

cao và có nhiều đặc điểm gần gũi với loài S. angustmyceticus nên chủng xạ khuẩn này

được đặt tên là S. angustmyceticus C12,và được đăng ký trên ngân hàng Genbank(Phụ

lục 1).

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

39

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Hình 3.12.Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng Streptomyces angustmyceticus C12

với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA

Bảng 3.12.Mức độ tương đồng của gen mã hóa 16S rRNA chủng R12-4 với trình tự của

các chủng trên GenBank

Thông tin chủng Mã

S. prasinopilosusN2 S. costaricanus WZ162 Streptomyces sp. MJM3787 Streptomyces sp. MJM3859 Streptomyces sp. MJM3635 Streptomyces sp. GS15 KR703669 FJ812352 FJ799173 EU603347 EU603346 JX679244 Độ tƣơng đồng (%) 99 99 99 99 99 99

Nhằm định tên chủng R12-4 đến loài, bên cạnh các kết quả về đặc điểm sinh

hóa, cần kết hợp thêm trình tự gen 16S rRNA. So sánh trình tự gen 16S rRNA của xạ

khuẩn nội sinh R12-4với các trình tự tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank

bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy, gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn nghiên

cứucó độ tương đồng cao với các chủng xạ khuẩn thuộc nhóm Streptomyces sp như: S.

prasinopilosus N2 (KR703669) 99%; S. costaricanus WZ162 (FJ812352) 99%. (Bảng

3.12.). Dựa vào các đặc điểm sinh học và phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy,

xạ khuẩn nội sinh R12-4 có độ tương đồng cao và có nhiều đặc điểm gần gũi với loài

Streptomyces prasinopilosusnên chủng xạ khuẩn này được đặt tên là Streptomyces

prasinopilosusR12-4,và được đăng ký trên ngân hàng Genbank (Phụ lục 2).

3.3. Nghiên cứu môi trƣờng và điều kiện sinh tổng hợp chất kháng nấm của hai

chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn

3.3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

40

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Để có thể phục vụ cho các hoạt động công nghiệp sản xuất chất kháng nấm từ chủng

nghiên cứu, lựa chọn môi trường lên men là bước có vai trò rất quan trọng. Một môi

trường lên men tốt phải vừa thích hợp cho chủng xạ khuẩn sinh trưởng tốt lại đồng thời

cho hiệu suất sản xuất chất kháng nấm cao. Để lựa chọn được MT lên men đáp ứng cả 2

yêu cầu trên, tiến hành nuôi cấy trên xạ khuẩn nội sinh C12 và R12-4 trên 7 môi trường

nghiên cứu: Gause I, Gause II, A-H4, ISP4, ISP2, 79 và tinh bột casein. Nhiệt độ phòng,

pH 6,5 ÷ 7 và lắc 150 vòng/phút.

Bảng 3.13. Môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm

của hai xạ khuẩn C12 và R12-4

Môi trường Vòng kháng nấm ( D-d, mm ) F. oxysporum F. udum R12-4 C12 R12-4 C12 R12-4 C12

G. candidum C12 4 5 9 7 14 18 15 Gause I Gause II ISP2 ISP4 Tinh bột casein A-H4 79 5 13 17 4 10 19 12 7 4 8 5 9 20 19 6 7 12 6 13 14 15 4 8 13 6 10 17 15 5 6 13 4 14 19 23 4 6 11 7 12 14 10 C. trumcatum R12-4 8 4 6 5 12 19 16 Kết quả cho thấy, chủng xạ khuẩn nội sinh C12 sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất

kháng nấm cao nhất trên môi trường AH4 với vòng kháng nấm dao động từ 14 ÷ 20mm

tùy vào chủng nấm kiểm định (Bảng 3.13.). Chủng R12-4 sinh tổng hợp hoạt chất kháng

nấm thích hợp trên môi trường AH4 và môi trường 79, với vòng kháng nấm dao động từ

15 ÷ 23 mm. Như vậy cả hai chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều sinh tổng hợp hoạt tính

kháng nấm cao nhất trên môi trường giầu có chứa bột đậu tương. Môi trường AH4 sẽ được

lựa chọn trong các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.2. Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm

- Khảo sát pH nuôi cấy

Để tìm ra pH thích hợp cho việc tổng hợp hoạt chất kháng nấm của chủng xạ khuẩn

R12-4 và C12, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ở các pH 6 đến 8, bước nhảy 0,5 với các

điều kiện công nghệ khác được giữ nguyên như trên.

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng nấm

Vòng kháng nấm ( D-d, mm ) pH F. udum

6 G. candidum C12 R12-4 C12 11 10 F. oxysporum R12-4 11 5 C12 8 R12-4 8 C. trumcatum R12-4 8 C12 8

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

41

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

11 18 13 10 10 12 11 8 7 11 10 7 9 13 9 9 16 21 19 15 16 19 18 15 9 13 11 10 15 17 10 8 6,5 7 7,5 8 Khảo sát pH môi trường nuôi cấy cho thấy, xạ khuẩn C12 và R12-4 sinh tổng hợp

hoạt chất kháng nấm thích hợp nhất ở pH 7,0 khi xác định trên cả 04 chủng nấm kiểm

định, pH môi trường thấp hoặc cao hơn đều làm ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

hoạt chất kháng nấm của hai chủng xạ khuẩn nghiên cứu.

- Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy có tác động rất lớn đến hoạt tính kháng nấm của hai chủng xạ

khuẩn nghiên cứu. Với số liệu khảo sát khoảng nhiết độ nuôi cấy trên cho thấy các chủng

xạ khuẩn nghiên cứu đều là các chủng ưa ấm. Nên chúng tôi chọn khoảng nhiệt độ khảo sát cho sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm ở 27, 30 và 37 oC.

Bảng 3.15. Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của hai chủng xạ

khuẩn lựa chọn

Vòng kháng nấm ( D-d, mm ) F. udum Nhiệt độ

Số liệu ở bảng 3.15. cho thấy chủng xạ khuẩn C12 và Chủng R12-4 đều sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm thích hợp ở nhiệt độ 30oC, vòng kháng nấm dao động trong khoảng 20 ÷ 23 mm đối với củng C12 và 20 ÷ 25 với chủng R12-4. Nâng nhiệt độ nuôi cấy lên 37oC, hoạt tính kháng nấm giảm khoảng 40% so với nhiệt độ thích hợp. Nhiệt độ 30oC được lựa chọn trong

27 30 37 G. candidum R12-4 C12 21 19 25 22 15 15 F. oxysporum C12 21 23 14 R12-4 14 20 13 C12 21 23 14 R12-4 10 24 10 C. trumcatum R12-4 C12 18 16 24 20 19 15

các nghiên cứu tiếp sau.

Tuy nhiên do thời gian nghiên cứu hạn chế, chủng R12-4 sinh tổng hợp hoạt tính

kháng nấm ổn định hơn. Nên chúng tôi lựa chọn chủng R12-4 để tiến hành nghiên cứu thu

nhận hoạt tính kháng nấm và nghiên cứu sơ bộ hoạt chất kháng nấm.

3.4. Nghiên cứu một số tính chất hoá lý của hoạt chất kháng nấm thu nhận từ chủng R12-4 3.4.1. Tách chiết chất khá ng nấm

Khả năng hoà tan của chất kháng nấm trong các dung môi khác nhau là một yếu tố

cần đươ ̣c chú ý để thu nhậ n chất kháng nấm . Tuy nhiê n , độ hoà tan củ a chất kháng sinh rất khác nhau trong các loại dung môi . Để xác đi ̣nh đươ ̣c dung mô i thích hơ ̣p cho việ c tách

chiết chất kháng sinh củ a xa ̣ khuẩn , xạ khuẩn được nuôi trên các môi trường lên men AH 4

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

42

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

ở nhiệt độ 30oC và pH 7,0. Dịch kháng nấm thô được chiết bằng 7 loại dung môi khác

nhau (Bảng 3.16). Dịch kháng nấm sau khi chiết rút được tẩm vào khoanh giấy lọc , cho

(VSV kiểm định là F. oxysporum FO5). Kết quả

bay hơivà xác đi ̣nh hoạt tính kháng nấm đươ ̣c thể hiệ n trê n bảng 3.16. Bảng 3.16. Lựa chọn dung môi để chiết hoạt chất kháng nấm từ dịch lên men và sinh khối

STT Dung môi hữu cơ Hoạt tính kháng nấm của chủng R12-4 ( D-d,mm) Sinh khối 6 10 16,5 11,5 10 12,5 5,5 Etyl axetate 1 2 n-butanol 3 Methanol 4 Iso propanol Ethanol 5 6 Aceton 7 Dịch ngoại bào 13 8 7 10 8 11 7 Iso amyl alcohol

Kết quả cho thấy, chất kháng nấm củ a chủ ngR 12-4 nằm trong cả sinh khối và di ̣ch ngoại bào . Cả bảy loại dung mô i trê n đều có thể sử du ̣ng để tách chiết chất kháng nấm . Trong bảy loa ̣i dung môi sử du ̣ng , để chiếtchất kháng nấm từ sinh khối , methanol là dung môi cho hiệ u quả cao nhất , dịch chiết bằng dung môi này có vòng kháng là 16,5 mm. Để tách kháng sinh từ di ̣ch ngoa ̣i bào thì etyl acetate la ̣i cho hiệ u quả cao hơ n . Theo kết quả của nhiều nghiên trước đã công bố , có nhiều loại dung môi được sử dụng để tách chiết

CKS từ xa ̣ khuẩn. Tuy nhiê n , việ c sử du ̣ng loa ̣i dung mô i nào là thích hơ ̣p la ̣i tuỳ thuộ c vào bản chất hoá học của từng loại CKS [1, 12].

Khả năng hoà tan của chất kháng nấm trong dung môi còn phụ thuộc vào pH . Để xác , chúng tôi tiến hành tách chiết

đi ̣nh pH cho hiệ u quả tách chiết chất kháng nấm cao nhất CKS từ di ̣ch ngoa ̣i bào trong 7 loại dung môi trên ở các pH 3, pH 7 vàpH10. Kết quả thể

hiện trên bảng sau:

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của các pH chiết khác nhau đến khả năng chiết chất kháng nấm

STT Dung môi Hoạt tính kháng nấm ( D-d, mm) pH 3 pH 7 pH 10 K.chỉnh pH ĐC (-) ĐC (+)

16,5

1 2 3 4 5 6 7 Etyl Acetate n-butanol Methanol Iso propanol Ethanol Aceton Iso amyl ancohol 10 6 11,5 9 10 12 6 13 8 7 10 7 8 9 11 6 5 6 4 5 11 13 8 7 10 8 11 7 0 0 0 0 0 0 0

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

43

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Kết quả thể hiện trên bảng 3.17.cho thấy, chủng R12-4 ở pH 7, hầu hết di ̣ch chiết đều 3 và pH 10. Điều này đã

chất kháng nấm tốt nhất trong mô i

có hoạt lực cao hơn so với dịch chiết trong các dung môi có pH chứ ng tỏ khả nă ng hoà tan trong dung mô i củ a các trường có pH trung tính (pH 7).

Với dịch lọc pH3, aceton có hiệu quả tách chiết kháng sinh cao nhất.Ethyl acetate là dung môi tốt nhất khi chiết kháng sinh từ dịch lọc pH7 và pH 10. Khi đưa về 4°C, dịch chiết với methanol và ethyl acetate có thể tạo kết tủa (kháng sinh thô) trong khi dịch chiết aceton thì không. Do đó lựa chọn methanol làm dung môi để chiết kháng sinh từ sinh khối và ethyl acetate làm dung môi chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy của xạ khuẩn nội sinh R12-4.

Mộ t điểm cần lưu ý là pH củ a mô i trườ ng cũng có ảnh hưở ng đến việ c chiết kháng sinh đi ra ngoài mô i trườ ng nhiều hay tích tu ̣ trong sinh khối nhiều [4].Vì vậy, để tách chiết chất kháng nấm từ chủ ng R 12-4 có hiệu quả, nên tách chiết ở trong môi trường trung tính . Kiểm tra hoạt tính kháng nấm của phần dịch chiết với dung môi trước và sau khi cho bay hơi, phần kháng sinh thô thu được và dịch dung môi sau khi tách kháng sinh thô ra. Khi tách chiết từ sinh khối bằng dung môi methanol và tách chiết từ dịch lọc bằng dung môi ethyl acetate, hoạt tính kháng nấm sau bay hơi (trước khi tạo kết tủa) đều cao hơn so với trước khi bay hơi dung môi. Đưa các mẫu sau bay hơi dung môi về 4°C để tạo tủa (kháng sinh thô).Ly tâm lạnh tách kháng sinh thô và phần dung môi sau ly tâm. Dung môi sau ly tâm hầu như không còn hoạt tính kháng nấm, chứng tỏ hoạt chất kháng nấm đã kết tinh hoàn toàn. 3.4.2. Khả năng bền nhiệt của chất kháng nấm Để xác đi ̣nh khả nă ng bền nhiệ t củ a chất khá

ng nấm , tiến hành nuô i xa ̣ khuẩn trê n môi trường lên men thích hợp .Thu dịch kháng sinh thô để xử lý với nhiệt độ 40, 70, 80 và 100°Ctrong các khoảng thời gian 30, 60, 90 và 120 phút.Xác định hoạt tính của dịch kháng nấm bằng phương pháp đục lỗ.Kết quả thể hiện trên bảng 3.18.

Chất kháng nấm thu nhận từ chủng R12-4 là tương đối bền với nhiệt. Hoạt chất kháng nấm hầu như không thay đổi theo thời gian xử lý. Khi tăng nhiệt độ xử lý từ 80 ÷ 100 °C, hoạt tính có giảm dần nhưng mức độ giảm không nhiều.Đặc biệt ở 100 °C với thời gian xử lý 120 phút, hoạt chất kháng sinh của dịch chiết vẫn còn khoảng 70 % so với ban đầu.

Bảng 3.18. Xác định độ bền nhiệt đến hoạt tính kháng nấm của chủng R12-4

Thời gian (phút) Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) ở các nhiệt độ ( °C ) 70 40 80 28 100

30 60 90 120 1 22 23 21 22 2 21 20 20 21 1 21 20 19 20 1 21 20 20 21 2 20 19 21 20 2 19 19 16 15 1 20 18 16 14 2 19 17 16 13

2 1 20 21 20 20 19 17 16 20 Ghi chú: (1) F. oxysporum; (2) G. candidum

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

44

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

b a

d c Hình 3.13. Độ bền của chất kháng nấm với nhiệt

(a) 30 phút, (b) 60 phút, (c) 90 phút và (d) 120 phút

Theo kết quả công bố của một số nghiên cứu trước về khả năng bền nhiệt của chất

kháng sinh thu nhận từ xạ khuẩn, có nhiều chất kháng sinh có khả năng bền với nhiệt độ, ở

70°C trong thời gian 60 phút, hoạt chất kháng sinh vẫn hầu như không thay đổi, thậm chí,

ở 100°C và kéo dài đến 60 phút, hoạt chất kháng sinh vẫn còn khoảng 50% hoặc chỉ giảm

đi đôi chút[1, 3]. Tuy nhiên bên cạnh đó, một số chất kháng sinh không bền nhiệt, hoạt tính

kháng sinh bị giảm hoặc mất hoàn toàn ở 50°C[12].Như vậy so sánh với các kết quả

nghiên cứu trước, chất kháng sinh chủng R12-4 thuộc loại bền nhiệt.Đây là một tính chất

rất thuận lợi cho việc tách chiết, tinh chế và bảo quản chất kháng nấm.

3.4.3. Khảnăng bền với pH của chất kháng nấm

Khả năng bền vững của chất kháng nấm với pH là một đặc điểm đáng chú ý vì điều

này không chỉ có ý nghĩa trong công nghệ tách chiết mà còn có ý nghĩa t rong ứ ng du ̣ng .

, dịch kháng nấm thô được điều

Để xác đi ̣nh khả nă ng bền vớ i pH củ a chất kháng nấm chỉnh về các pH 3 ÷ 9 và giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút, sau đó điều chỉnh về pH 7. Hoạt chất kháng nấm củ a di ̣ch chiết đươ ̣c x ác định bằng phương pháp đục lỗ .Kết quả đươ ̣c thể hiệ n trê n hình 3.14 và hình 3.15.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

45

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Hình 3.14. Độ bền của chất kháng nấm với

b pH a

c d

Hình 3.15. Khả năng bền với pH của chất kháng nấm Ghi chú: (a,b) F. oxysporum; (c,d) G. Candidum

Kết quả trên Hình 3.14 và hình 3.15 cho thấy, dịch kháng nấm của chủng R 12-4 vẫn

3 ÷ 9 trong thờ i gian 60 phút đã chứng tỏ : các chất

giữ được hoa ̣t tính ở trong dải pH kháng nấm này đều có khả năng bền vớ i pH . Dịch chiết kháng nấm có hoa ̣t lực ma ̣nh nhất ở pH7, hơi giảm dần trong các môi trườ ng axit và kiềm .Tuy nhiên , mứ c độ giảm không nhiều.Như vậy, từ kết quả trên cho thấy, chất kháng nấm từ chủng R12-4 thuộc loại bền với

pH. Đây là một đặc điểm rất lợi thế trong công nghiệp thu hồi, tinh chế chất kháng sinh, đồng

thời mở rộng khả năng ứng dụng của chất kháng sinh này

3.4.4. Tinh sạch và thu nhận chất kháng nấm

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

46

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Chất kháng nấm thô được tách chiết từ sinh khối hoặc dịch nuôi cấy được tiến hành

tinh sạch theo quy trình mục 2.2.5, phần vật liệu và phương pháp, thu được kháng nấm tinh

sạch. Kiểm tra hoạt tính kháng nấm của kháng sinh tinh sạch thu được cho thấy kháng sinh

vẫn giữ nguyên được khả năng kháng vi sinh vật kiểm định ban đầu.

a c b Ghi chú: (a,b) F. oxysporum; (c) G. candidum

Hình 3. 16. Hoạt chất kháng nấm của kháng sinh tinh sạch

Hình 3. 17. Hình ảnh quang phổ hấp thu điện tử UV VIS của kháng sinh tinh sạch

Trên phổ UV đo trong dung môi methanol xuất hiện 3 đỉnh cực đại hấp thụ ở bước

sóng 322; 338 và 357nm, phổ khá gọn và sắc nét chứng tỏ mẫu kháng sinh đem phân tích

là tinh sạch.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

47

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

Hình 3.18. Hình ảnh phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh sạch Trên phổ IR xuất hiện các dao động đặc trưng của các liên kết (cm-1):

Trên Phổ IR xuất hiện dao động dặc trưng của các liên kết (cm-1): 3313(-OH); 2943;

2831(CH bão hòa); 1448; 1413 (biến dạng CH); 1020(C-O). Qua phổ IR dự đoán chất

kháng nấm củ chúng tôi có chứa nhiều nhóm OH liên kết với C.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

48

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Từ 20 mẫu rễ, cành cây cam thu thập ở Hàm Yên – Tuyên Quang, đã phân lập được

40 chủng xạ khuẩn. Số lượng xạ khuẩn thu được trên mẫu rễ chiếm tỷ lệ cao hơn

rất nhiều so với mẫu cành (rễ 62,5%, cành 37,5%). Trên môi trường phân lập xạ

khuẩn nội sinh khá đa dạng với 7 màu tương ứng trong đó, nhóm trắng chiếm tỷ lệ

cao nhất (81,44%), nhóm vàng cam chiếm 11,91%, nhóm xám 2,59% nhóm xanh

rêu 0,65 và nhóm nâu 1,57, vàng 1,39 và đen 0,46%.

2. Trong số 40 chủng phân lập được có: 30% xạ khuẩn kháng vi khuẩn

Staphylococcus aureus, 12,5% kháng P.aeruginosa, 2,5% kháng B.subtilis. Đối với

các chủng nấm kiểm định, có 30% xạ khuẩn nội sinh phân lập được đối kháng với

G.candidumvà Colletotrichum,12,5% kháng F. udum, F. oxysporum

3. Đã lựa chọn được 2 chủng R12-4 và C12 có hoạt tính kháng nấm cao để nghiên

cứu đặc điểm sinh học và phân loại cho kết quả 2 chủng đều thuộc chi

Streptomyces. Dựa trên phân tích đặc điểm sinh học và trình tự gen 16S rRNA

chủng C12thuộc loàiS. angustmyceticus, được định danh làS. angustmyceticus C12

và chủng R12-4 thuộc loàiStreptomycesprasinopilosus, được định danh làS.

prasinopilosus R12-4

4. Đã nghiên cứu được môi trường và điều kiện sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm

của hai chủng xạ khuẩn nội sinh R12-4 và C12: hoạt chất kháng nấm được sinh

tổng hợp tốt nhất trên môi trường AH4, 28 ÷ 30°C, pH 7,0.

5. Đã nghiên cứu tách chiết sơ bộ hoạt chất kháng nấm từ chủng R12-4: chiết chất

kháng nấm từ sinh khối của chủng R12-4 bằng dung môi methanol ở pH 7,0. Tách

chiết từ dịch lên men bằng dung môi ethyl acetate ở pH 7,0.

6. Đã kiểm tra được tính chất hóa lý của chất kháng nấm từ chủng R12-4: chất kháng

nấm bền ở nhiệt độ dưới 80°C và trong khoảng pH 5 ÷ 9.

7. Đã thu được sản phẩm có hoạt tính kháng nấm tinh sạch. Chất kháng nấm được

phân tích bằng phổ UV VIS và phổ hồng ngoại.

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu đặc tính và xác định cấu trúc hoá học của chất kháng nấm thu

nhận từ chủng xạ khuẩn S. angustmyceticus C12và S. prasinopilosus R12-4.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

49

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất khá ng sinh ch ống nấm gâ y bệnh thực vật ở Việt Nam, Luậ n án Tiến sĩ Sinh ho ̣c , 2006,

2. Cao Ngọc Điệp, Phan Thị Nhã (2011), Phân lập và xác định đặc tính vi khuẩn nội sinh trong cây Khóm (Ananas comosus [L.]) trồng trên đất phèn thị xã vị thanh, tỉnh Hậu Giang, Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(2): 243-250. 3. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Sinh học, Hà Nội. 4. Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh, (2010), Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo dục, Việt Nam.

5. Lê Mai Hương, Lê Minh Hà, Trần Thị Như Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Mai Ngọc Toàn (2005), Chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm từ chủng nấm Aspergillus awamori Nakazawa kí sinh trên cây sảng Sterculia lanceolata Car họ Sterculiaceae, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 43 (6A): 132-136 6. Lê Thị Xuân, Lê Mai Hương (1997), Phân lập nghiên cứu các chất chiết từ nấm nội kí sinh trong cây Taxus chinensis, Kỷ yếu-Annual report, Viện Hóa Học.

7. Lương Thị Hồng Hiệp, Cao Ngọc Điệp (2011), Phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây cúc xuyên chi (Twedelia trilobata (L.) hitche.) bằng kỹ thuật PCR, Tạp chí Khoa học, 18a: 168-176 8. Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia, Hà Nội, Tr. 53 – 71. 9. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm văn Ty (2007) vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội.

10. Nguyễn Sỹ Giao (1971), Nghiên cứu định hướng ứng dụng một số chủng nấm cộng sinh trong môi trường cây non phục vụ nghề trồng rừng, Tập san lâm nghiệp (4): 23-28 11. Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học sư Phạm Hà Nội.

12. Nguyễn Thi ̣ Thu Thuỷ , Hoàng Thị Kim Hồng (2009): Nghiên c ứu xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập từ đất trồng hoa mà u ở Thừa Thiê n Huế. Hộ i nghi ̣ CNSH toàn quốc 2009. 13. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội.

14. Nguyễn Văn Minh, Mai Hữu Phúc, Võ Ngọc Yến Nhi, Dương Nhật Linh, Nguyễn Anh Nghĩa (2014), Sàng lọc vi sinh vật nội sinh cây cao su có khả năng kiểm soát sinh học vi nấm Corynespora cassiicola, Tạp chí Sinh học, 36(1se): 173-179.

Tiếng Anh

15. Alipour H., Hosein B. A., Jahed M., Rahnama H., Sharifnia M., (2013). A Review on Citrus Production and Export Marketing Strategies in Mazandaran Province Iran, Middle-East Journal of Scientific Research, 14 (10): 1375-1380

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

50

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

16. Bacon C.W. and White J.F., 2000. Microbial Endophytes. Marcel Dekker, New York, pp: 341-388

17. Cao L.X., Qiu Z.Q., You J.L., Tan H.M., Zhou S. (2005), Isolation and characterization of endophytic Streptomycete antagonists of Fusarium with phathogen from surface-sterilized banana roots. FEMS Microbiol Lett 247: 147-152

18. Conn V.M. and Franco C.M.M. (2004). Analysis of the endophytic actinobacterial population in the roots of wheat (Triticum aestivum L.) by terminal restriction fragment length polymorphism and sequencing of 16S rRNA clones. Appl Environ Microbiol, 70: 1787-1794.

19. Conn V.M., Walker A. R., Franco C.M.M (2008), Endophytic actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana. Mol Plant Microbe Interact, 21 (2): 208-218.

20. Coombs J.T. and Franco C.M.M. (2003). Isolation and identification of actinobacteria from surface-sterilized wheat root. Appl Environ Microbiol, 69:5603-5608.

21. De Aráujo J M , da Silva A C and Azevedo J L (2000) Isolation of endophytic actinomycetes from roots and leaves of maize (Zea mays L.). Brazilian Archvies of Biology and Technology 43: 447-451 .

22. El-Tarabily, K. A. & Sivasithamparam, K. Non-streptomycete actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters. Soil Biol. Biochem. 38, 15.

23. Gangwar M, S. Dogra, N Sharma (2011), Antagonistic Bioactivity of Endophytic Actinomycetes Isolated from Medicinal Plans, J Advanced Lab Research in Biology 2(4): 154-157.

24. Gangwar M., Dogra S., Gupta U. P., Kharwar R. N. (2014). Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India, African Journal of Microbiology Research, 8(2): 184-191.

25. Hong Y.Z., Quan H.X., Ming T., Guang H.S. (2013), Effect of actinomycetes on ginseng growth and production of ginsenosides, J Food Agr Environ 11(1): 557- 559. 26. Igarashi Y. (2004).Screening of novel bioactive compounds from plant-associated actinomycetes. Actinomycetologica 18:63–66 27. Inderiati S. and Muliani S. (2008). Isolation and characterization of endophytic actinomycetes of tobacco plants. Journal of Agrisistem 4: 82-100.

28. Intra B., Mungsuntisuk I., Nihira T., Igarashi Y., Panbangred W. (2011). Identification of actinomycetes from plant rhizospheric soils with inhibitory activity against Colletotrichum spp., the causative agent of anthracnose disease. BMC Research Notes, 4:98.

29. Kandpal K. C., Jain D. A., Kumar U., Tripathi R., Kumar T. S. (2012). Isolation and screening of endophytic actinomycetes producing antibacterial compound from Citrus aurantifolia Fruit, European Journal of Experimental Biology, 2 (5):1733- 1737.

30. Keswani J., Whitman W. B. (2001). Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 51, 667–678.

31. Lee S. O., Choi G. J., Jang K. S., Park D-J., Kim C-J.and Kim J-C. (2008). Isolation and characterization of endophytic actinomycetes from Chinese cabbage roots as antagonists to Plasmodiophora brassicae. 18 1741-1746

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

51

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

32. Lee. J.Y. and Hwang, B.K. (2002). Diversity of antifungal actinomycetes in various vegetative soils of Korea. Canadian J. Microbiol., 48:407–417

33. Malfanova N., Lugtenberg B., and Berg G. (2013). Chapter 2, in “Molecular microbial ecology of the rhizosphere”, de Bruijn FJ (ed), Wiley-Blackwell. 34. Mini Priya R. (2012). Endophytic Actinomycetes from Indian Medicinal Plants as Antagonists to Some Phytopathogenic Fungi, Open Access Scientific Reports, 1(4):1-5.

35. Nimnoi P., Pongsilp N., Lumyong S. (2010), Endophytic actinomycetes isolated from Aquilaria crassna Pierre ex Lec and screening of plant growth promoters production. World J Microbiol Biotechnol, 26:193–203. 36. Nomomura H. (1974). Key for Classification and Identification of 458 species of the Streptomyces included in ISP, J. Ferment. Technol., 52(2): 78-92

37. Petrini, O. (1991). Fungal endophytes of tree leaves. In: Microbial ecology of the leaves (eds. N.J. Fokkema and 1. van den Heuvel). Cambridge University Press, Cambridge: 185- 187.

38. Qin S., Zhao G.Z., Li J., Zhu W.Y., Xu L.H., Li W.J.(2009) Actinomadura flavalba leaves of Maytenus isolated from sp. nov., an endophytic actinomycete austroyunnanensis. int J Syst Evol Microbiol., 59(10):2453-2457.

39. Qin S., Xing K., Jiang J. H., Xu L. H., Li W. J. (2011). Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89 (3): 457-473. 40. Sambrook J., Russell D. W. (2001). Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

41. Sardi P., Saracchi M., Quaroni S., Petrolini B., Borgonovi E. and Merlit S. (1992).Isolation of endophytic Streptomyces strains from surface-sterilized roots. Applied and Environmental Microbiology 58: 2691-2693

42. Sarma C., Borthakur A., Singh S., Modi M. K., Sen P. (2011), Efficient in vitro plant regeneration from cotyledonary explants of Citrus reticulata L. Blanco. Annals of Biological Research, 2 (6):341-348.

43. Shimizu M. (2011), Endophytic Actinomycetes: Biocontrol Agents and Growth Promoters, in Bacteria in Agrobiology: Plant Growth Responses, Chap. 10, Ed. Maheshwari D.K., Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2011 44. Shirling E. B., Gottlieb D. (1966). Cooperative description of type culture of Streptomyces species. Int. J. Sys. Bacteriol., 19(4): 391-512

45. Shutsrirung A., Chromkaew Y., Pathom-Aree W., Choonluchanon S., Boonkerd N. (2013), Diversity of endophytic actinomycetes in mandarin grown in northern Thailand, their phytohormone production potential and plant growth promoting activity. Soil Science and Plant Nutrition, 59 (3):322- 330.

46. Snoussi H., Duval M-F., Garcia-Lor A., Belfalah Z., Froelicher Y., Risterucci A-M., Perrier X., Jacquemoud-Collet J-P., Navarro L., Harrabi M., Ollitrault P. (2012), Assessment of the genetic diversity of the Tunisian citrus rootstock germplasm, BMC Genetics, 13:16. 47. Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J (2004), Natural products from endophytic microgranisms, J. Nat. Prod. 67: 257-268.

48. Taechowisan T, Lu CH, Shen YM, Lumyong S (2007b) Antitumor activity of 4- arylcoumarins from endophytic Streptomyces aur- eofaciens CMUAc130. J Cancer Res Trer 3:86–91.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

52

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

49. Taechowisan T., C. Lu, Y. Shen and S. Lumyong (2005), Secondary metabolites from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and their antifungal activity Microbiology 151, 1691–1695.

in Boesenbergia rotunda 50. Taechowisan T., Chanaphat S., Ruensamran W., Phutdhawong W. S. (2014), Antibacterial activity of new flavonoids from Streptomyces sp. BT01 an endophyte (L.) Mansf., Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4(4): 8-13.

51. Takahashi Y & Omura S (2003) Isolation of new actinomycete strains for the screening of new bioactive compounds. Journal of General & Applied Microbiology 49: 141-154

52. Tan HM, Cao LX, He ZF, Su GJ, Lin B, Zhou SN (2006) Isolation of endophytic actinomycetes from different cultivars of tomato and their activities against Ralstonia solanacearum in vitro. World J Microbiol Biotechnol 22:1275–1280. 53. Tokala R. K., Strap J. L.,Jung C. M., Crawford D. L.,Salove M. H., Deobald L. A.,Bailey J. F., Morra M. J. (2002). Novel plant microbe Rhizosphere interaction involving Streptomyces lydicus WYEC108 and the Pea Plant (Pisum sativum), Appl Environ Microbiol, 68 (5):2161–2171. 54. Trerner H.D., Buckus E.J. (1963). System of color wheels for Streptomycete taxonomy, Appl Microbiol 11: 335 – 338.

55. Verma V. C., Gond S. K, Kumar A., Mishra A., Kharwar R. N. and Gange A. C. (2009). Endophytic actinomycetes from Azadirachta indica A. Juss.: isolation, diversity, and anti-microbial activity. Microbial Ecology 57: 749.

56. Waksman S.A. (1961) The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA 2. 57. Williams S.T., Goodfellow M., Alderson G., Wellington E.M. H., Sneath P.H.A., Sackin M.J. (1983). Numerical classification of Streptomyces and related genera, J. Gen. Microbiol., 129: 1743–1813.

58. Xu Z. H., Gao D. M. , Song X. L., Xu. (2012). A review of endophyte and its use and function. International Conference on Environmental Engineering and Technology Advances in Biomedical Engineering, 8:124–130.

59. Zhao P.J., Fan L.M., Li G.H., Zhu N., Shen Y.M. (2005). Antibacterial and antitumor macrolides from Streptomyces sp. Is9131. Arch Pharm Res 28:1228 – 1232.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

53

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

PHỤ LỤC

Phụ lục 1

Streptomyces angustmyceticus strain C12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: KT717957.1 FASTA Graphics Go to: LOCUS KT717957 1407 bp DNA linear BCT 26-OCT-2015 DEFINITION Streptomyces angustmyceticus strain C12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. ACCESSION KT717957 VERSION KT717957.1 GI:940414451 KEYWORDS . SOURCE Streptomyces angustmyceticus ORGANISM Streptomyces angustmyceticus Bacteria; Actinobacteria; Streptomycetales; Streptomycetaceae; Streptomyces. REFERENCE 1 (bases 1 to 1407) AUTHORS Hieu,N.V., Van,D.A., Lien,N.T.H. and Thao,P.T.H. TITLE Endogenous actinomycetes isolation from the king mandarin of Tuyen Quang JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1407) AUTHORS Hieu,N.V., Van,D.A., Lien,N.T.H. and Thao,P.T.H. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (04-SEP-2015) Soil Microbiology, Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Ha Noi, Cau Giay, Viet Nam FEATURES Location/Qualifiers source 1..1407 /organism="Streptomyces angustmyceticus" /mol_type="genomic DNA" /strain="C12" /db_xref="taxon:285578" /country="Viet Nam" rRNA<1..>1407 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN 1 ggggggctac catgcagtcg acgatgaacc tccttcggga ggggattagt ggcgaacggg 61 tgagtaacac gtgggcaatc tgcccttcac tctgggacaa gccctggaaa cggggtctaa 121 taccggatac gacctccgac cgcatggtct ggtggtggaa agctccggcg gtgaaggatg 181 agcccgcggc ctatcagctt gttggtgggg tgatggccta ccaaggcgac gacgggtagc 241 cggcctgaga gggcgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 301 gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg 361 atgacggcct tcgggttgta aacctctttc agcagggaag aagcgagagt gacggtacct 421 gcagaagaag cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg 481 ttgtccggaa ttattgggcg taaagagctc gtaggcggct tgtcacgtcg gatgtgaaag 541 cccggggctt aaccccgggt ctgcattcga tacgggcagg ctagagttcg gtaggggaga 601 tcggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc ggtggcgaag

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

54

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

661 gcggatctct gggccgatac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta 721 gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgtt gggaactagg tgtgggcgac attccacgtc 781 gtccgtgccg cagctaacgc attaagttcc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa 841 actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcagcggagc atgtggctta attcgacgca 901 acgcgaagaa ccttaccaag gcttgacata caccggaaaa ccctggagac agggtccccc 961 ttgtggtcgg tgtacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1021 taagtcccgc aacgagcgca acccttgttc tgtgttgcca gcatgccctt cggggtgatg 1081 gggactcaca ggagactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat 1141 catgcccctt atgtcttggg ctgcacacgt gctacaatgg ccggtacaat gagctgcgat 1201 accgcgaggt ggagcgaatc tcaaaaagcc ggtctcagtt cggattgggg tctgcaactc 1261 gaccccatga agtcggagtt gctagtaatc gcagatcagc attgctgcgg tgaatacgtt 1321 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacgt cacgaaagtc ggtaacaccc gaagccggtg 1381 gcccaacccc ttgtggagga atcgtcg// Phụ lục 2 Streptomyces prasinopilosus strain R12-4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: KT751524.1 FASTA Graphics Go to: LOCUS KT751524 1392 bp DNA linear BCT 26-OCT-2015 DEFINITION Streptomyces prasinopilosus strain R12-4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. ACCESSION KT751524 VERSION KT751524.1 GI:940416041 KEYWORDS . SOURCE Streptomyces prasinopilosus ORGANISM Streptomyces prasinopilosus Bacteria; Actinobacteria; Streptomycetales; Streptomycetaceae; Streptomyces. REFERENCE 1 (bases 1 to 1392) AUTHORS Thao,P.T.H., Van,D.A., Lien,N.T.H. and Hieu,N.V. TITLE Endogenous actinomycetes isolation from king mandarin of Tuyen Quang JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1392) AUTHORS Thao,P.T.H., Van,D.A., Lien,N.T.H. and Hieu,N.V. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (15-SEP-2015) Soil Microbiology, Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 1..1392 /organism="Streptomyces prasinopilosus" /mol_type="genomic DNA" /strain="R12-4" /isolation_source="roots of king mandarin"

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

55

Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân

/db_xref="taxon:67344" /country="Viet Nam: Tuyen Quang province, Ham Yen district" /collection_date="2015" rRNA<1..>1392 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN 1 gctaccatgc agtcgaacga tgaagccctt cggggtggat tagtggcgaa cgggtgagta 61 acacgtgggc aatctgccct gcactctggg acaagccctg gaaacggggt ctaataccgg 121 atatgaccat cttgggcatc cttgatggtg taaagctccg gcggtgcagg atgagcccgc 181 ggcctatcag cttgttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgacgggt agccggcctg 241 agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 301 tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg 361 ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg aagaagcgag agtgacggta cctgcagaag 421 aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttgtccg 481 gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gcttgtcacg tcgattgtga aagctcgggg 541 cttaaccccg agtctgcagt cgatacgggc tagctagagt gtggtagggg agatcggaat 601 tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac accggtggcg aaggcggatc 661 tctgggccat tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 721 tggtagtcca cgccgtaaac ggtgggaact aggtgttggc gacattccac gtcgtcggtg 781 ccgcagctaa cgcattaagt tccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa 841 ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgtggc ttaattcgac gcaacgcgaa 901 gaaccttacc aaggcttgac atacaccgga aagcattaga gatagtgccc cccttgtggt 961 cggtgtacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1021 cgcaacgagc gcaacccttg tcccgtgttg ccagcaggcc cttgtggtgc tggggactca 1081 cgggagaccg ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggacg acgtcaagtc atcatgcccc 1141 ttatgtcttg ggctgcacac gtgctacaat ggccggtaca atgagctgcg ataccgtgag 1201 gtggagcgaa tctcaaaaag ccggtctcag ttcggattgg ggtctgcaac tcgaccccat 1261 gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca gcattgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1321 ttgtacacac cgcccgtcac gtcacgaaag tcggtaacac ccgaagccgg tggcccaacc 1381 cctgcgggag gg //

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật