LUẬN VĂN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÂY NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ BẰNG KĨ THUẬT PCR VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ

Bé Gi¸o dôc vµ ®µo t¹o

Khoa c«ng nghÖ sinh häc

(cid:70) (cid:9) (cid:71)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

§Ò tµi: Nghiªn cøu, x¸c ®Þnh c©y ng« mang gen kh¸ng

thuèc trõ cá b»ng kÜ thuËt PCR vµ ®¸nh gi¸ ®a d¹ng di

truyÒn tËp ®oµn ng« mang gen kh¸ng thuèc trõ cá

HÀ NỘI - 2008

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

PhÇn I: Më ®Çu

1.1. §Æt vÊn ®Ò

§Çu nh÷ng n¨m 80 thÕ kû XX xuÊt hiÖn nh÷ng c«ng bè ®Çu tiªn vÒ c©y

chuyÓn gen vµ tõ ®ã më ra mét ra ch©n trêi míi, chøa ®ùng mét t−¬ng lai ®Çy

høa hÑn vÒ c¶i tiÕn c©y trång. NhiÒu gièng c©y trång ®· ®−îc chuyÓn gen ®Ó t¹o

ra c¸c ®Æc tÝnh −u viÖt, gióp c¶i thiÖn n¨ng suÊt, chèng chÞu s©u bÖnh, h¹n, mÆn,

l¹nh, t¨ng chÊt l−îng vµ c¶i thiÖn m«i tr−êng. Tõ ®ã kü thuËt gen trë thµnh c«ng

cô h÷u hiÖu ®−îc øng dông trong c¶i tiÕn gièng c©y trång.

Sù ph¸t triÓn nhanh chãng cña C«ng nghÖ Sinh häc ®· ®−a c¸c thùc vËt

chuyÓn gen vµ c¸c s¶n phÈm cña chóng ®Õn víi thÞ tr−êng tiªu dïng. Vµ kÓ tõ

khi kü thuËt gen thùc vËt ®−îc thiÕt lËp, thö nghiÖm thµnh c«ng th× nh÷ng øng

dông cña nã ®· ®−îc ®Çu t− vµ ®−îc tiÕn hµnh mét c¸ch réng r·i ®Ó gi¶i quyÕt

c¸c vÊn ®Ò cßn tån t¹i cña N«ng nghiÖp. V× vËy thùc vËt chuyÓn gen ®· ®−îc

trång phæ biÕn trªn ®ång ruéng ®Ó lµm t¨ng tÝnh kh¸ng bÖnh, kh¸ng s©u, kh¸ng

thuèc trõ cá trong hÖ thèng canh t¸c. Tõ cuèi n¨m 1997, c¸c c©y trång biÕn ®æi

gen vµ c¸c s¶n phÈm cña chóng ®· ®−îc chÊp nhËn th−¬ng m¹i ho¸ ë mét sè

quèc gia. Ngµy nay viÖc s¶n xuÊt vµ sö dông c©y trång chuyÓn gen ®ang ngµy

mét gia t¨ng, vµ kh¼ng ®Þnh tÇm quan träng trong nÒn s¶n xuÊt n«ng nghiÖp vµ

mét sè nghµnh kh¸c. N¨m 2007 diÖn tÝch trång tiÕp tôc t¨ng 2 con sè, ®¹t 12%

t−¬ng ®−¬ng víi 12,3 triÖu hecta (30 triÖu mÉu. Trong ®ã tæng diÖn tÝch trång

trong 12 n¨m (1996-2007) ®¹t 690 triÖu hÐc-ta (1,7 tû mÉu). Víi møc t¨ng ch−a

tõng thÊy gÊp 67 lÇn tõ 1996-2007, trë thµnh c«ng nghÖ c©y trång ®−îc ¸p dông

nhanh nhÊt trong thêi gian gÇn ®©y.

Ngµy nay, c©y chuyÓn gen ®−îc trång ngµy cµng réng r·i ë rÊt nhiÒu n−íc

trªn thÕ giíi. Nh−ng c©u hái vÒ sù an toµn trong viÖc sö dông c¸c s¶n phÈm cña

c©y chuyÓn gen còng ®ång thêi ®−îc ®Æt ra vµ trë thµnh mét vÊn ®Ò nãng báng

víi hµng lo¹t c¸c vÊn ®Ò liªn quan xoay quanh nã, liÖu chóng ®−îc sö dông d−íi

-2-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

d¹ng nµo vµ kh¶ n¨ng rñi ro ®Õn víi søc khoÎ con ng−êi, víi sù ®a d¹ng sinh

häc, tiÒm Èn « nhiÔm m«i tr−êng.... ë ViÖt Nam, ®Õn nay vÉn ®ang trong thêi

gian x©y dùng vµ hoµn thiÖn c¸c quy chÕ vÒ qu¶n lý an toµn sinh häc c¸c c©y

chuyÓn gen vµ kiÓm so¸t c¸c s¶n phÈm biÕn ®æi gen. Tuy nhiªn, ®Ó ®−a nhanh

c¸c c©y chuyÓn gen vµo s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam th× viÖc nghiªn cøu t¹o c©y

chuyÓn gen, trång thö nghiÖm vµ kiÓm so¸t c©y trång biÕn ®æi gen cÇn ph¶i tiÕn

hµnh tr−íc mét b−íc. Trong sè c¸c c©y trång biÕn ®æi gen ®ang thö nghiÖm th×

c©y ng« ®ang rÊt ®−îc quan t©m nhÊt ®Æc biÖt lµ ng« chuyÓn gen kh¸ng thuèc

trõ cá.

§Ó ®¸p øng c¸c chØ tiªu kü thuËt trong viÖc ph¸t hiÖn chÝnh x¸c ng«

chuyÓn gen kh¸ng thuèc trõ cá vµ nhanh chãng sö dông c¸c dßng ng« nµy phôc

vô c«ng t¸c t¹o gièng ng« lai kh¸ng thuèc diÖt cá cña ViÖt Nam. Chóng t«i ®·

thùc hiÖn ®Ò tµi “Nghiªn cøu, x¸c ®Þnh c©y ng« mang gen kh¸ng thuèc trõ cá

b»ng kÜ thuËt PCR vµ ®¸nh gi¸ ®a d¹ng di truyÒn tËp ®oµn ng« mang gen

kh¸ng thuèc trõ cá”.

1.2. Môc ®Ých

– Thu thËp d÷ liÖu vÒ c©y trång biÕn ®æi gen vµ t×m hiÓu mét c¸ch tæng

quan vÒ c©y ng« chuyÓn gen .

– B−íc ®Çu lµm quen víi c¸c kü thuËt nghiªn cøu vÒ c©y chuyÓn gen

– X¸c ®Þnh ®o¹n tr×nh tù ®Æc tr−ng cña promoter CaMV-35S (195bp) cã

trong ng« chuyÓn gen.

– X¸c ®Þnh gen PAT (Phosphinothricin-N-Acetyltransferase) lµ gen kh¸ng

thuèc trõ cá glufosinate cã trong ng« chuyÓn gen b»ng kü thuËt PCR

– §¸nh gi¸ ®Æc ®iÓm h×nh th¸i, chØ tiªu n«ng sinh häc chÝnh vµ ®a d¹ng di

truyÒn ë møc ph©n tö b»ng kÜ thuËt PCR-RAPD cña mét sè dßng ng« thuÇn

mang gen kh¸ng thuèc trõ cá phôc vô cho c«ng t¸c backcross t¹o dßng ng« −u

viÖt mang gen gen kh¸ng thuèc trõ cá.

-3-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

PhÇn II: Tæng QUAN Tμi LiÖu

2.1. Giíi thiÖu vÒ c©y ng« 2.1.1. Vµi nÐt s¬ l−îc vÒ c©y ng«

C©y ng« cã tªn khoa häc lµ Zea mays L., thuéc chi Maydeae, hä

Gramineae. Tõ thÕ kû 16 khi Colombus mang h¹t gièng tõ ch©u Mü vÒ th× s¶n

xuÊt ng« ®· lan trµn kh¾p thÕ giíi vµ trë thµnh lo¹i c©y ngò cèc quan träng cung

cÊp l−¬ng thùc cho loµi ng−êi. HiÖn trªn thÕ giíi ®ang tån t¹i hai hÖ thèng ph©n

Wilkes (1967)

Iltis & Doebly (1984)

Nhãm Euchleana

Nhãm Luxuriantes

Z. penrennis (Hitch) Reeves & Mangelsdorf

Z. diploperennis Iltis Doebly & Guzman

Z. mexicana (Schrader) Kuntze

Z. perennis Hitch Reeves & Mangelsdorf

Nßi Guatemala

Nhãm Zea

Z. mays subsp. Parviglumis Iltis & Doebly

Nßi Huchuetenango

Var. Huchuetenangensis Iltis & Doebly

Nßi Balsas

Var. Parviglumis Iltis & Doebly subsp

Mexicana (Schrader) Iltis

Nßi Chalco

Nßi Cao nguyªn trung phÇn

Nßi Nobogame

Nhãm Zea

Z. mays L.

Z. mays subsp. mays

lo¹i ®èi víi lo¹i Zea.

Tõ loµi Zea mays L, dùa vµo cÊu tróc néi nhò cña h¹t ®−îc ph©n thµnh

c¸c loµi phô, sau ®ã dùa vµo mµu h¹t vµ mµu lâi ®Ó ph©n c¸c thø (varieta).

Nh÷ng loµi phô chÝnh bao gåm:

- ng« ®¸

Zea mays Zea mays Subsp. indurata Subsp. indentata - ng« r¨ng ngùa

-4-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

Zea mays Zea mays Zea mays Zea mays Zea mays Subsp. ceratina - ng« nÕp Subsp. saccharata - ng« nÕp Subsp. everta - ng« bét Subsp. amylacea - ng« bét Subsp. tunecata - ng« bäc

Ng« cã nguån gèc tõ Trung Mü song c©y ng« ®· thÝch nghi nhanh víi

o M¹ch ®Õn vÜ tuyÕn 55P

o P-56P

o P, cßn ë Liªn X« cò vµ Canada tíi vü tuyÕn 58P

P. ë

P (Humlam

o o P-43P Nam b¸n cÇu, ng« ®−îc trång ë New Zealand ®Õn vÜ tuyÕn 42P

nh÷ng ®iÒu kiÖn sinh th¸i rÊt kh¸c nhau. ë B¾c b¸n cÇu, ng« cã thÓ trång ë §an

John, 1942, Necula GH. vµ cs, 1957). Ng« còng lµ c©y trång thÝch øng réng.

o khái xÝch ®¹o th× ®é cao cµng gi¶m. VÝ dô nh− Peru (16P

P nam) ng« trång ®−îc ë

o ®é cao 3900m, ë B¾c Carolia (34P

o P-37P

P b¾c) trång ®−îc ë 1200m, ë Ch©u ¸ nh−

P-48P

o P b¾c) ë ®é cao

o thung lòng Kasmir ë 2000m, cßn ë Ch©u ¢u (kho¶ng 45P

Theo Necula G. H. (1957) ng« cã thÓ trång ë ®é cao 3900m. Tuy nhiªn cµng xa

500-800m.

Trªn ph¹m vi thÕ giíi, c¸c nhµ khoa häc ®· chia sinh th¸i c©y ng« thµnh 4

vïng chÝnh:

– ¤n ®íi

– CËn nhiÖt ®íi

– NhiÖt ®íi cao (trªn ®é cao 2000m so víi mÆt biÓn)

– NhiÖt ®íi thÊp (d−íi 2000m)

Theo ph©n lo¹i nµy, ViÖt Nam n»m trong vïng sinh th¸i nhiÖt ®íi thÊp.

C¸c bé gièng tõ vïng nhiÖt ®íi thÊp biÓu hiÖn sù thÝch øng h¬n c¶ th«ng qua

kh¶ n¨ng chèng chÞu vµ n¨ng suÊt, kÓ c¶ ë c¸c th¶o nguyªn cao phÝa B¾c hoÆc

vô ®«ng ë §ång b»ng B¾c Bé.

2.1.2. Nguån gen vµ ®a d¹ng di truyÒn c©y ng«

Ng« lµ c©y trång ®−îc thu thËp, m« t¶ vµ b¶o tån rÊt tèt tõ c¸c trung t©m

®a d¹ng di truyÒn. Tõ n¨m 1943, quü Rockefeller hîp t¸c víi c¸c n−íc Mü La

tinh ®· thu thËp nguån gen ng« tõ nh÷ng trung t©m ®a d¹ng chÝnh, t¹o c¬ së cho

-5-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

c¸c tËp ®oµn ng« ë Mexico, Colombia vµ Brazil. Ngµy nay cã kho¶ng 15.000

mÉu gièng ng« ®· ®−îc thu thËp tõ c¸c n−íc kh¸c nhau trªn thÕ giíi.

ë ViÖt Nam, nguån gen ng« ®−îc b¶o tån t¹i ViÖn nghiªn cøu ng« víi

kho¶ng 400 mÉu gièng thô phÊn tù do vµ 3.000 dßng [10].

TËp ®oµn ng« Mexico – trung t©m xuÊt cña ng« cã sù ®a d¹ng tèi ®a. ë

®©y cã bèn nßi chÝnh ®−îc x¸c lËp ®ã lµ:

A. Nhãm nßi b¶n ®Þa cæ ®¹i: Ng−êi ta cho r»ng nhãm nµy xuÊt ph¸t tõ

ng« bäc nguyªn thuû ë Mexico. C¸c nßi ë nhãm nµy kh¸c nhau bëi sù ph¸t triÓn

®éc lËp ë nh÷ng ®Þa bµn vµ m«i tr−êng kh¸c nhau tuy chóng cïng mét tæ tiªn.

Bèn nßi chÝnh trong nhãm nµy lµ Palomero toluqueno, Arrocillo amarillo,

Chapalote vµ Nal-tel.

B. Nhãm nhËp néi tiÒn Columbus: C¸c nßi cña nhãm nµy ®−îc nhËp vµo

Mexico tõ Trung vµ Nam Mü vµo thêi tiÒn sö. Bèn nßi nµy lµ: Cacahuacintle,

Harinoso de Ocho, Oloton vµ ng« ngät.

C. Nhãm con lai tiÒn sö: Nhãm nµy bao gåm c¸c nßi ®−îc coi lµ t¹o ra tõ

viÖc lai t¹p gi÷a c¸c nßi b¶n ®Þa cæ ®¹i víi c¸c nßi nhËp néi tiÒn Columbus, hoÆc

gi÷a hai nhãm trªn víi Teosinte. HiÖn nay cßn t¸m nßi lµ: Conico, Reventador,

Tablonicillo, Tehua, Tepecintla, Comiteco, Jala vµ Zapalote chico.

D. Nhãm hiÖn ®¹i: Bao gåm c¸c nßi ph¸t triÓn gÇn ®©y vµ ch−a ®¹t ®Õn

tr¹ng th¸i æn ®Þnh, tuy nhiªn cã nh÷ng ®Æc ®iÓm ph©n biÖt x¸c ®Þnh. Cã bèn nßi

®−îc gäi lµ: Chalqueno, Celaya, Conico Norteno vµ Bolita.

Tõ ®©y ta thÊy râ sù biÕn dÞ to lín ®· ®−îc x¶y ra nh− thÕ nµo. §ã lµ

nh÷ng nßi gièng c¬ b¶n s¶n sinh ra nguån gen ng« thÕ giíi vµ sù ®a d¹ng di

truyÒn cña nã.

Sù ®a d¹ng di truyÒn cña ng« ®−îc thÓ hiÖn ë tÊt c¶ c¸c tÝnh tr¹ng cña c©y

b«ng cê vµ b¾p. ë c¸c ®Æc ®iÓm cña c©y, sù biÕn ®éng thÓ hiÖn ë chiÒu cao c©y,

chiÒu cao ®ãng b¾p vµ ®Æc ®iÓm cña l¸ (dµi l¸, chiÒu réng l¸, sè l¸ trªn c©y, sè l¸

-6-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

trªn b¾p), mµu th©n vµ d¹ng lãng. Sù biÕn ®éng ë cê thÓ hiÖn ë ®é dµi b«ng cê,

cuèng b«ng cê, ®é nh¸nh dµi, sè nh¸nh cÊp hai vµ ba, ®−êng kÝnh b¾p vµ sè

hµng h¹t. §Æc biÖt sù biÕn ®éng rÊt ®a d¹ng ë néi nhò h¹t, tõ ®©y ta ph©n biÖt

c¸c d¹ng r¨ng ngùa, ®¸ r¾n, bét, ®−êng, nÕp, næ vµ bäc. Sù biÕn ®éng cßn thÓ

hiÖn ë kÝch th−íc h¹t, mµu h¹t vµ chÊt l−îng h¹t.

ë ViÖt Nam ng« lµ c©y trång nhËp néi do vËy sù phong phó vÒ nguån gen

cã h¹n hÑp. Theo c¸c nghiªn cøu ph©n lo¹i ng« ®Þa ph−¬ng ViÖt Nam (GS.TS

Ng« H÷u T×nh, 1995) tõ nh÷ng n¨m 60 ®Õn nay cho thÊy, ng« ViÖt Nam tËp

trung chñ yÕu vµo hai loµi phô lµ ®¸ r¾n vµ nÕp.

Ngµy nay ®Ó ®¸nh gi¸ sù ®a d¹ng di truyÒn cña mét loµi, ng−êi ta kh«ng

chØ dùa vµo c¸c ®Æc ®iÓm thùc vËt häc dÔ nhËn biÕt vµ riªng rÏ mµ cÇn ph©n tÝch

trªn c¬ së nhiÒu tÝnh tr¹ng ®Ó ph©n biÖt c¸c nhãm c¸ch biÖt di truyÒn th«ng qua

kho¶ng c¸ch ¥clit hoÆc kho¶ng c¸ch Mahalanobis... GÇn ®©y c«ng nghÖ sinh

häc ®· gãp phÇn rÊt ®¾c lùc trong viÖc x¸c ®Þnh ®a d¹ng di truyÒn th«ng qua kü

thuËt Isozyme hoÆc “sù ®a h×nh ®é dµi c¸c ph©n ®o¹n c¾t h¹n chÕ” (RFLP –

Restriction Flagment Length Polymorphis), RAPD (§a h×nh c¸c ®o¹n khuÕch

®¹i ngÉu nhiªn)…

2.1.3. §Æc ®iÓm h×nh th¸i c©y ng«

RÔ: Ng« cã hÖ rÔ chïm tiªu biÓu cho bé rÔ c¸c c©y hä hßa th¶o. Ng« cã

ba lo¹i rÔ chÝnh: RÔ mÇm, RÔ ®èt (rÔ phô cè ®Þnh), RÔ ch©n kiÒng, chóng gióp

c©y ng« hót n−íc vµ c¸c chÊt dinh d−ìng tõ ®Êt.

Th©n, l¸: Ng« thuéc hä hßa th¶o, song cã th©n kh¸ ch¾c, cã ®−êng kÝnh

tõ 2-4cm tïy thuéc vµo gièng, ®iÒu kiÖn sinh th¸i vµ ch¨m sãc. Th©n cã chiÒu

cao kho¶ng 1,5-4m. Th©n ng« tr−ëng thµnh bao gåm nhiÒu lãng (dãng) n»m

gi÷a c¸c ®èt vµ kÕt thóc b»ng b«ng cê. L¸ ng« ®−îc mäc tõ c¸c ®èt cña th©n

ng«, bÑ l¸ «m chÆt lÊy th©n vµ l−ìi l¸ (th×a l×a).

-7-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

B«ng cê vµ b¾p: Ng« lµ lo¹i c©y cã hoa kh¸c tÝnh cïng gèc. Hai c¬ quan

sinh s¶n ®ùc (b«ng cê) vµ c¸i (b¾p) tuy cïng n»m trªn mét c©y, song ë c¸c vÞ trÝ

kh¸c nhau. Hoa ®ùc th−êng ®−îc gäi lµ b«ng cê n»m ë ®Ønh c©y. Hoa c¸i (b¾p

ng«) ph¸t sinh tõ chåi n¸ch c¸c l¸, song chØ 1-3 chåi kho¶ng gi÷a th©n míi t¹o

thµnh b¾p.

H¹t: H¹t ng« thuéc lo¹i qu¶ dÝnh gåm n¨m phÇn chÝnh: vá h¹t, líp

al¬ron, ph«i, néi nhò vµ ch©n h¹t. Vá h¹t bao quanh h¹t, lµ mét mµng nh½n. Líp

al¬ron n»m d−íi vá h¹t, bao lÊy néi nhò vµ ph«i. Néi nhò lµ phÇn chÝnh cña h¹t

chøa c¸c tÕ bµo dù tr÷ chÊt dinh d−ìng. Néi nhò cã hai phÇn: néi nhò bét vµ néi

nhò sõng. Tû lÖ nµy phôc thuéc vµo chñng ng« vµ c¸c gièng ng« kh¸c nhau.

2.1.4. T×nh h×nh vµ ®Þnh h−íng ph¸t triÓn c©y ng« ë ViÖt Nam

ë ViÖt Nam, ng« lµ c©y l−¬ng thùc quan träng thø hai sau c©y lóa, cã sù

ph¸t triÓn réng kh¾p, liªn tôc vµ ®¹t ®Ønh ®iÓm vµo n¨m 2005. Theo “tæng quan

n«ng nghiÖp n¨m 2005” cña NguyÔn Sinh Cóc (NN vµ PTNT – 1/2006) th× s¶n

xuÊt ng« n¨m 2005 cã tiÕn bé v−ît bËc: DiÖn tÝch ®¹t 1039 ngh×n ha, n¨ng suÊt

®¹t 35,5 t¹/ha vµ s¶n l−îng ®¹t 3,69 triÖu tÊn, ®· lµm thay ®æi tû träng c¬ cÊu

s¶n l−îng thùc tõ 5,7% n¨m 2000 lªn 9% n¨m 2005 [1].

Nh÷ng tiÕn bé vÒ s¶n xuÊt ng« ViÖt nam thÓ hiÖn rÊt râ nÐt trong giai

®o¹n 20 n¨m thùc hiÖn ®−êng lèi ®æi míi cña §¶ng. Trong suÊt 20 n¨m qua

(1985-2004) diÖn tÝch, n¨ng suÊt vµ s¶n l−îng ng« ViÖt Nam t¨ng liªn tôc víi

tèc ®é rÊt cao. Tû lÖ t¨ng tr−ëng b×nh qu©n hµng n¨m trong suèt 20 n¨m vÒ diÖn

tÝch lµ 7,5%/n¨m, n¨ng suÊt 6,7%/n¨m vµ s¶n l−îng lµ 24,5%/n¨m, cao h¬n

nhiÒu 10 n¨m tr−íc ®ã khi ®Êt n−íc ta thèng nhÊt 1975-1985 (c¸c tû lÖ t−¬ng

øng giai ®o¹n nµy lµ 4,2%; 3,9% vµ 10,0%). NÕu chóng ta lÊy sè liÖu tuyÖt ®èi

cña 2 n¨m (1985) vµ sau 20 n¨m ®æi míi (2004) thÊy r»ng diÖn tÝch ng« t¨ng

2,5 lÇn, n¨ng suÊt 2,3 lÇn vµ s¶n l−îng 5,9 lÇn [1].

-8-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

Tuy nhiªn, n¨ng suÊt ng« cña ViÖt Nam n¨m 2004 (34,9 t¹/ha) vÉn cßn

thÊp h¬n n¨ng suÊt b×nh trung b×nh thÕ giíi (48,5 t¹/ha), vÉn thÊp h¬n nhiÒu so

víi Mü (100,0 t¹/ha) vµ Trung Quèc (51,1 t¹/ha) song ®· v−ît ®−îc n¨ng suÊt

b×nh qu©n khèi c¸c n−íc ®ang ph¸t triÓn (31,3 t¹/ha). MÆc dÇu vËy, kh¸ch quan

mµ nãi: S¶n xuÊt ng« ViÖt Nam trong thêi kú ®æi míi ®· cã sù ph¸t triÓn v−ît

bËc, toµn diÖn vµ ®¸ng tr©n träng.

2.2. C©y trång biÕn ®æi gen 2.2.1. Kh¸i niÖm vÒ c©y trång biÕn ®æi gen

C©y trång biÕn ®æi gen hoÆc c©y trång c«ng nghÖ sinh häc lµ c¸c c©y

trång ®· ®−îc biÕn ®æi vÒ mÆt di truyÒn nh»m lµm cho c©y trång mang mét sè

®Æc tÝnh quý gi¸ mµ c©y trång tù nhiªn kh«ng cã. C«ng nghÖ nµy cho phÐp c¸c

gen riªng biÖt ®· chän läc ®−îc chuyÓn tõ mét c¬ thÓ nµy sang mét c¬ thÓ kh¸c

còng nh− gi÷a c¸c loµi kh«ng cã liªn quan víi nhau. C¸c tÝnh tr¹ng th−êng ®−îc

chuyÓn vµo c©y trång nh− tÝnh kh¸ng c«n trïng, kh¸ng nÊm bÖnh, kh¸ng vi

khuÈn, kh¸ng thuèc trõ cá, kh¸ng mÆn, cho n¨ng suÊt cao, chÊt l−îng s¶n phÈm

tèt. §©y lµ mét ph−¬ng h−íng quan träng gi¶i quyÕt vÊn ®Ò an toµn l−¬ng thùc

cho nh©n lo¹i gãp phÇn gi¶m thiÓu c¸c lo¹i n«ng d−îc vµ ph©n bãn ho¸ häc, b¶o

vÖ m«i tr−êng sinh th¸i bÒn v÷ng.

Sù biÕn ®æi vÒ mÆt di truyÒn th−êng bao gåm sù chÌn ®o¹n ADN, t¸i tæ

hîp nh÷ng m¶nh ADN nhá h¬n vµo trong hÖ gen cña c©y trång bÞ biÕn ®æi. CÊu

tróc cña gen chÌn ®iÓn h×nh trong GMC (Genetically Modified Crops) ®−îc t¹o

nªn bëi 3 bé phËn:

1. §o¹n promoter (®o¹n khëi ®éng) cã chøc n¨ng ®iÒu khiÓn ho¹t ®éng

cña gen cÊu tróc, nã ®−îc vÝ nh− chiÕc c«ng t¾c bËt/më ®Ó ®äc gen chÌn vµo.

2. Gen ®· ®−îc chÌn (gen ®· bÞ biÕn ®æi) ®©y thùc chÊt lµ mét gen cÊu

tróc m· ho¸ cho ®Æc ®iÓm ®· chän läc riªng biÖt.

3. §o¹n terminator (®o¹n kÕt thóc) cã chøc n¨ng nh− mét tÝn hiÖu dõng

®Ó ®äc gen ®· chÌn .

-9-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

Ngoµi ra mét vµi yÕu tè kh¸c cã thÓ cã mÆt trong cÊu tróc cña ®o¹n ADN

chÌn vµ chøc n¨ng cña chóng th−êng lµ ®Ó ®iÒu chØnh vµ æn ®Þnh chøc n¨ng cña

gen hoÆc lµ ®Ó chøng minh sù cã mÆt cña cÊu tróc ADN chÌn trong GMC hoÆc

®Ó cã sù kÕt hîp dÔ dµng cña c¸c thµnh phÇn kh¸c nhau trong cÊu tróc ®o¹n

ADN chÌn. CÊu tróc cña ®o¹n ADN chÌn ph¶i t−¬ng hîp víi hÖ gen cña c¬ thÓ

nhËn ®Ó nã cã sù di truyÒn æn ®Þnh.

2.2.2. Nh÷ng vÊn ®Ò liªn quan ®Õn c©y trång biÕn ®æi gen 2.2.2.1. Lîi Ých cña c©y trång biÕn ®æi gen

Thùc tr¹ng ph¸t triÓn nhanh chãng cña c©y trång biÕn ®æi gen trong

nh÷ng n¨m qua ®· chøng tá chóng cã nh÷ng mÆt m¹nh næi tréi h¬n h¼n nh÷ng

c©y trång kh«ng biÕn ®æi gen. Sau ®©y lµ nh÷ng lîi Ých mµ chóng ®em l¹i cho

con ng−êi trong thêi gian kÓ tõ khi c©y trång biÕn ®æi gen ®Çu tiªn xuÊt hiÖn cho

®Õn nay:

– Lîi Ých trong nghiªn cøu c¬ b¶n: ViÖc sö dông GMC ®· gãp phÇn to lín

trong viÖc ph¸t hiÖn c¸c gen quan träng, x¸c ®Þnh ®−îc chøc n¨ng cña mét gen

bÊt kú.

– Lîi Ých trong c¶i t¹o gièng c©y trång: Nhê cã c«ng nghÖ gen mµ nhiÒu

gièng c©y trång míi ®−îc t¹o ra víi c¸c ®Æc tÝnh kh«ng cã ë c©y trång tù nhiªn

nh− kh¶ n¨ng chèng chÞu c¸c ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh, chèng chÞu s©u bÖnh, chèng

chÞu thuèc diÖt cá nh»m n©ng cao s¶n l−îng vµ chÊt l−îng c©y trång.

– Lîi Ých trong ch¨n nu«i gia sóc: C«ng nghÖ chuyÓn gen thùc vËt ®· t¹o ra

c¸c lo¹i thøc ¨n gia sóc chøa c¸c kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu hay v¨cxin t¸i tæ hîp, lµm

t¨ng søc ®Ò kh¸ng cña vËt nu«i ®èi víi bÖnh tËt, t¹o ra c¸c lo¹i thøc ¨n cã chÊt

l−îng dinh d−ìng cao.

– Lîi Ých trong c«ng nghÖ thùc phÈm: RÊt nhiÒu lo¹i thùc phÈm míi cã chÊt

l−îng dinh d−ìng cao, mÉu m· ®Ñp, thêi gian b¶o qu¶n l©u, hay lµm thay ®æi

hµm l−îng acid bÐo trong dÇu thùc vËt nh»m lµm gi¶m nguy c¬ m¾c bÖnh tim

m¹ch ®· ®−îc t¹o ra nhê c«ng nghÖ chuyÓn gen thùc vËt.

-10-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

– Lîi Ých trong c«ng nghÖ d−îc phÈm: Nhê kü thuËt ADN t¸i tæ hîp, ng−êi

ta cã thÓ s¶n xuÊt ra c¸c s¶n phÈm nh− c¸c kh¸ng nguyªn, c¸c protein ng−êi,

hemoglobin, mét sè kh¸ng thÓ ... tõ c©y trång biÕn ®æi gen.

– Lîi Ých vÒ m«i tr−êng: N¨ng suÊt cña c©y trång biÕn ®æi gen cao h¬n rÊt

nhiÒu so víi c¸c c©y trång tù nhiªn do ®ã sù ph¸t triÓn cña GMC sÏ lµm gi¶m

nhu cÇu chuyÓn ®æi ®Êt rõng vµ ®Êt ë thµnh ®Êt n«ng nghiÖp. Lµm gi¶m nhu cÇu

sö dông thuèc trõ s©u, thuèc trõ cá, bãn ®¹m ... nh− vËy sÏ lµm gi¶m « nhiÔm

nguån n−íc vµ nguy c¬ g©y h¹i cho søc khoÎ con ng−êi.

– Lîi Ých vÒ kinh tÕ: GMC ®· vµ ®ang mang l¹i cho ng−êi n«ng d©n nhiÒu

lîi Ých vÒ kinh tÕ, nã lµm gi¶m chi phÝ s¶n xuÊt, gi¶m søc lao ®éng vµ t¨ng gi¸

trÞ s¶n phÈm. N¨m 2007, doanh thu tõ GMC ®¹t 6,9 tû USD vµ dù ®Þnh n¨m

2008 lµ 7,5 tû USD [42].

– Lîi Ých ng−êi tiªu dïng: Nhê cã c«ng nghÖ chuyÓn gen thùc vËt mµ ng−êi

tiªu dïng cã thÓ cã ®−îc c¸c s¶n phÈm thùc phÈm cã lîi h¬n ®èi víi con ng−êi

nh− c¸c s¶n phÈm cã chÊt l−îng dinh d−ìng cao, cã h−¬ng vÞ, cã thêi gian b¶o

qu¶n l©u, hay ®−îc bæ sung mét sè chÊt nh− vitamin A, vitamin E [12, 20].

– Ngoµi nh÷ng lîi Ých to lín kÓ trªn, khi ®−a GMC ra ngoµi m«i tr−êng

ng−êi ta ®Æc biÖt quan t©m ®Õn nh÷ng ¶nh h−ëng cña nã ®èi víi m«i tr−êng vµ

sù c©n b»ng hÖ sinh th¸i... Thùc tÕ ®· cho thÊy c©y trång biÕn ®æi gen cã Ých lîi

tiÒm tµng ®èi víi m«i tr−êng. Chóng gióp b¶o tån c¸c nguån lîi tù nhiªn, sinh

c¶nh vµ c¸c nguån lîi b¶n ®Þa, chóng gãp phÇn gi¶m xãi mßn ®Êt, c¶i thiÖn chÊt

l−îng n−íc, c¶i thiÖn rõng vµ n¬i c− ngô cña ®éng vËt hoang d¹i.

2.2.2.2. Nh÷ng rñi ro cã thÓ cã cña c©y trång biÕn ®æi gen

C©y trång biÕn ®æi gen mang c¸c ®Æc tÝnh ®· ®−îc c¶i biÕn nh»m mang

l¹i nh÷ng lîi Ých tèi ®a cho con ng−êi nh−ng khi ®−a chóng ra m«i tr−êng tù

nhiªn vµ th−¬ng m¹i ho¸ chóng th× kh«ng thÓ kh«ng ®¸nh gi¸ nh÷ng rñi ro cã

thÓ x¶y ra. Nh÷ng rñi ro nµy th−êng ®−îc xem xÐt ë mét sè khÝa c¹nh chÝnh sau:

-11-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

– HiÓm ho¹ cá d¹i: Kh¶ n¨ng x¶y ra lµ c¸c gen míi trong GMC cã thÓ

chuyÓn sang c©y hä hµng sèng hoang d· ngoµi tù nhiªn theo ph−¬ng thøc lan

truyÒn h¹t phÊn, còng nh− kh¶ n¨ng tao ra nh÷ng lo¹i cá míi, kh¸ng thuèc trõ

cá hay kh¸ng c«n trïng [5].

– Kh¶ n¨ng kh¸ng s©u: C©y trång kh¸ng s©u cã kh¶ n¨ng tiªu diÖt c¸c loµi

sinh vËt kh«ng ph¶i lµ sinh vËt cÇn diÖt lµm ¶nh h−ëng ®Õn chuçi thøc ¨n tù

nhiªn, ¶nh h−ëng ®Õn sù ®a d¹ng sinh häc.

– Nguy c¬ ph¸t sinh c¸c mÇm bÖnh: Mét nguy c¬ tiÒm tµng kh¸c lµ kh¶

n¨ng t¸i tæ hîp cña mét gen virus s½n cã trong GMC víi c¸c gen tõ mét virus

kh¸c nhiÔm vµo c©y ®ã vµ t¹o ra mét virus míi [5].

– Sù kh¸ng kh¸ng sinh: Do c¸c GMC th−êng ®−îc chuyÓn c¸c gen quy ®Þnh

tÝnh tr¹ng kh¸ng kh¸ng sinh, v× thÕ g©y ra mèi lo l¾ng r»ng liÖu c¸c gen nµy cã

thÓ ®−îc ph¸t t¸n tõ GMC sang c¸c vi sinh vËt c− tró trong ruét ng−êi vµ lµm

chóng t¨ng kh¶ n¨ng ®Ò kh¸ng ®èi víi kh¸ng sinh. Tuy nhiªn ng−êi ta thÊy r»ng

mèi nguy c¬ nµy x¶y ra víi x¸c suÊt v« cïng nhá vµ nÕu cã x¶y ra th× t¸c ®éng

nµy còng kh«ng ®¸ng kÓ v× gen chØ thÞ ®−îc sö dông trong GMC ®−îc øng dông

rÊt Ýt trong thó y vµ y häc [12].

2.2.2.3. VÊn ®Ò an toµn vµ nh÷ng quy ®Þnh vÒ qu¶n lý c©y trång biÕn ®æi gen

MÆc dï GMC ®ang ®−îc th−¬ng m¹i ho¸ cã nhiÒu ®Æc tÝnh −u viÖt h¬n so

víi c¸c c©y trång cïng lo¹i nh−ng do míi xuÊt hiÖn nªn ng−êi ta ch−a ®¸nh gi¸

hÕt ®−îc nh÷ng ¶nh h−ëng bÊt lîi cña chóng. V× vËy yªu cÇu ®Æt ra khi th−¬ng

m¹i hãa GMC vµ s¶n phÈm cña chóng lµ chóng ta ph¶i ®Æt vÊn ®Ò xem xÐt vÒ

møc ®é an toµn cña c¸c s¶n phÈm nµy lªn hµng ®Çu. V× thÕ bÊt kú mét s¶n phÈm

chuyÓn gen nµo tr−íc khi ®−îc ®−a ra thÞ tr−êng ph¶i ®−îc thö nghiÖm toµn

diÖn, ®−îc c¸c nhµ khoa häc vµ gi¸m ®Þnh viªn ®¸nh gi¸ ®éc lËp xem cã an toµn

hay kh«ng vÒ mÆt dinh d−ìng, ®éc tÝnh, kh¶ n¨ng g©y dÞ øng vµ c¸c khÝa c¹nh

khoa häc thùc phÈm kh¸c. Nh÷ng ®¸nh gi¸ vÒ an toµn thùc phÈm nµy dùa trªn

-12-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

nh÷ng quy ®Þnh cña tõng quèc gia. Chóng bao gåm: mét h−íng dÉn sö dông s¶n

phÈm, mét th«ng tin chi tiÕt vÒ môc ®Ých sö dông s¶n phÈm, c¸c th«ng tin vÒ

ph©n tö, ho¸ sinh, ®éc tÝnh, dinh d−ìng, kh¶ n¨ng g©y dÞ øng...

Do nh÷ng rñi ro vµ nh÷ng lo ng¹i bÊt th−êng xung quanh qu¸ tr×nh biÕn

®æi di truyÒn mµ viÖc b¾t buéc d¸n nh·n c¸c s¶n phÈm GMC ®· trë thµnh mét

yªu cÇu vµ lµ quy ®Þnh cña nhiÒu quèc gia. ViÖc d¸n nh·n GMC cho phÐp ng−êi

tiªu dïng lùa chän s¶n phÈm theo phong tôc, t«n gi¸o, chÕ ®é ¨n hµng ngµy cña

hä v× nhiÒu t«n gi¸o kh«ng thÝch sö dông c¸c s¶n phÈm ®−îc t¹o ra nhê sù biÕn

®æi di truyÒn.

2.2.3. T×nh h×nh s¶n xuÊt, sö dông c©y trång biÕn ®æi gen trªn thÕ giíi

Sau khi nh÷ng kÕt qu¶ nghiªn cøu ®Çu tiªn vÒ c©y trång biÕn ®æi gen ®−îc

c«ng bè nh÷ng n¨m 80 thÕ kû XX, sù ph¸t triÓn cña c©y tr«ng biÕn ®æi gen cã

nh÷ng b−íc ®ét ph¸ quan träng vÒ nh÷ng kÕt qu¶ nghiªn cøu vµ øng dông chóng

vµo s¶n xuÊt:

N¨m 1994, lÇn ®Çu tiªn FDA (C¬ quan qu¶n lý thùc phÈm vµ d−îc phÈm

Mü) chÊp nhËn thùc phÈm ®−îc t¹o ra b»ng CNSH lµ cµ chua. N¨m 1996, c©y

trång biÕn ®æi gen thùc sù bïng næ víi sù øng dông réng r·i trong s¶n xuÊt.

N¨m 1997, c©y trång biÕn ®æi gen lÇn ®Çu tiªn ®−îc th−¬ng m¹i hãa, diÖn tÝch

c©y trång biÕn ®æi gen th−¬ng m¹i ho¸ ®¹t gÇn 11 triÖu hecta (chñ yÕu lµ Mü,

Achentina, Auxtralia, Canada, Trung Quèc vµ Mehico). N¨m 2000, diÖn tÝch

c©y trång biÕn ®æi gen ®¹t 44,2 triÖu ha trªn 13 n−íc. N¨m 2001, chÌn thµnh

c«ng gen ®¬n tõ Arabidopsis vµo c©y cµ chua ®Ó t¹o ra c©y trång ®Çu tiªn cã thÓ

trång trªn ®Êt vµ n−íc mÆn. N¨m 2002, tæng gi¸ trÞ thÞ tr−êng toµn cÇu cña c©y

trång biÕn ®æi gen −íc tÝnh ®¹t kho¶ng 4,5 tû USD. N¨m 2004, diÖn tÝch c©y

trång biÕn ®æi gen ®¹t con sè 81 triÖu hecta. N¨m 2005 diÖn tÝch c©y biÕn ®æi

gen ®· ®¹t 90 triÖu hecta, diÖn tÝch c©y trång biÕn ®æi gen ®· t¨ng h¬n 50 lÇn

trong thËp kû ®Çu tiªn c©y biÕn ®æi gen ®−îc trång ®¹i trµ, sè n−íc trång c©y

biÕn ®æi gen t¨ng lªn tíi 21 n−íc. N¨m 2007 diÖn tÝch c©y CNSH tiÕp tôc t¨ng 2

-13-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

con sè, ®¹t 12% t−¬ng ®−¬ng víi 12,3 triÖu hecta (30 triÖu mÉu). DiÖn tÝch ®Êt

canh t¸c c©y CNSH lªn tíi 114, 3 triÖu hecta [42].

Tæng diÖn tÝch ®Êt trång c©y CNSH tõ n¨m 1996 ®Õn n¨m 2007 ®¹t 690

triÖu hecta (1,7 tû mÉu), t¨ng 67 lÇn so víi n¨m 1996, ®−a CNSH trë thµnh

thµnh tùu ®−îc øng dông nhanh nhÊt trong n«ng nghiÖp. N¨m 2007 còng lµ

n¨m ®Çu tiªn tæng luü kÕ sè n«ng d©n quyÕt ®Þnh canh t¸c c©y trång CNSH v−ît

con sè 50 triÖu ng−êi [42].

H×nh 1: DiÖn tÝch c©y trång CNSH trªn toµn cÇu 1996-2007 (triÖu ha)

Tõ n¨m 1996 ®Õn n¨m 2007, tØ träng diÖn tÝch trång c©y CNSH cña c¸c

n−íc ®ang ph¸t triÓn so víi diÖn tÝch trång trªn toµn thÕ giíi t¨ng ®Òu mçi n¨m.

N¨m 2007, 43% diÖn tÝch c©y trång CNSH trªn toµn cÇu lµ ë c¸c n−íc ®ang ph¸t

triÓn (t¨ng 3% so víi tû träng 40% n¨m 2006), t−¬ng ®−¬ng víi 49,4 triÖu hecta.

Trong kho¶ng thêi gian tõ 2006 ®Õn 2007, diÖn tÝch trång c©y CNSH ë c¸c n−íc

®ang ph¸t triÓn (8,5 triÖu ha hay 21%) t¨ng cao h¬n so víi c¸c n−íc c«ng nghiÖp

(3,8 triÖu ha hay 6%). §¸ng chó ý lµ cã 5 n−íc lín vµ ®ang ph¸t triÓn ®−a c©y

trång CNSH vµo canh t¸c, n»m ë 3 ch©u lôc: Trung Quèc vµ Ên §é ë Ch©u ¸,

Achentina vµ Braxin ë ch©u Mü Latinh, Nam Phi ë ch©u Phi; tæng d©n sè ë c¶ 5

-14-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

quèc gia nµy lµ 2,6 tØ ng−êi, chiÕm 40% d©n sè thÕ giíi, trong ®ã cã 1,3 tØ ng−êi

sèng hoµn toµn dùa vµo n«ng nghiÖp.

B¶ng 1: DiÖn tÝch trång c©y CNSH n¨m 2007 ph©n theo n−íc (®/v: triÖu ha)

TT N−íc trång DiÖn tÝch trång Lo¹i c©y biÕn ®æi gen

1* Hoa Kú 2* Achentina* 3* Brazin* 4* Canada* 5* Ên §é* §Ëu t−¬ng, ng«, b«ng, c¶i, ®u ®ñ, cá alfalfa §Ëu t−¬ng, ng«, b«ng §Ëu t−¬ng, ng« C¶i canola, ng«, ®Ëu t−¬ng B«ng

Céng Hoµ SÐc Bå §µo Nha

Slovakia

B«ng, cµ chua, thuèc l¸, ®u ®ñ, h¹t tiªu §Ëu t−¬ng Ng«, ®Ëu t−¬ng, b«ng §Ëu t−¬ng, ng« Ng« B«ng Ng« B«ng, ®Ëu t−¬ng B«ng, cÈm ch−íng Ng«, ®Ëu t−¬ng, c¶i canola Ng« Ng« Ng« Ng« Ng« Ng« Ng« Ng« 57.7 19.1 15.0 7.0 6.2 3.8 2.6 1.8 0.5 0.3 0.1 0.1 0.1 0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1

6* Trung quèc* 7* Paraguay* 8* Nam phi* 9* Urugoay* 10* Philippin* 11* Australia* 12* Spain* 13* Mexico* 14 Colombia Chile 15 16 Ph¸p 17 Honduras 18 19 20 §øc 21 22 Romania 23 PhÇn Lan * 13 n−íc ®−îc coi lµ cã diÖn tÝch trång lín, tõ 50,000 hÐc-ta trë lªn

Trong sè c¸c c©y trång CNSH ®−îc ®−a vµo th−¬ng m¹i ho¸ tõ n¨m 1996

®Õn n¨m 2007 tÝnh tr¹ng chÞu thuèc trõ cá vÉn lµ tÝnh tr¹ng næi tréi. N¨m 2007,

tÝnh tr¹ng chÞu ®−îc thuèc trõ cá ®−îc triÓn khai trªn c©y ®Ëu t−¬ng, ng«, c¶i

canola, cá alfalfa víi diÖn tÝch trång lµ 72,7 triÖu hecta (chiÕm 63% diÖn tÝch

®Êt trång c©y CNSH toµn cÇu). N¨m 2007, Hoa Kú, Achentina, Braxin, Canada,

Ên §é vµ Trung Quèc tiÕp tôc lµ c¸c n−íc ®−a c©y trång CNSH vµo canh t¸c

-15-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

nhiÒu nhÊt. Hoa Kú vÉn dÉn ®Çu thÕ giíi víi 57,7 triÖu hecta (chiÕm 50% diÖn

tÝch ®Êt trång c©y CNSH trªn thÕ giíi), do nhu cÇu ngµy cµng t¨ng cña thÞ tr−êng

ng« dïng trong s¶n xuÊt cån ethanol, diÖn tÝch trång ng« CNSH t¨ng tíi 40% -

møc t¨ng nµy ®· phÇn nµo bï l¹i møc gi¶m ®«i chót ®èi víi diÖn tÝch trång ®Ëu

t−¬ng vµ b«ng CNSH. §¸ng chó ý lµ 63% ng« CNSH, 78% b«ng CNSH vµ 37%

c¸c lo¹i c©y CNSH kh¸c ë Hoa Kú lµ c¸c s¶n phÈm mang gien ®én (c¸c s¶n

phÈm tËp hîp nhiÒu ®Æc tÝnh) cã chøa hai hay ba ®Æc tÝnh vµ ®em l¹i nhiÒu lîi

Ých trªn mét c©y trång. Xu thÕ cña t−¬ng lai lµ sö dông nh÷ng lo¹i c©y trång

CNSH mang gien ®én kiÓu nµy nh»m ®¸p øng nhu cÇu cña n«ng d©n vµ ng−êi

tiªu dïng.

Nh− vËy, trªn thÕ giíi t×nh h×nh ph¸t triÓn cña c©y trång biÕn ®æi gen rÊt

m¹nh mÏ, nã ®· ®em l¹i rÊt nhiÒu lîi Ých cho con ng−êi, ®Æc biÖt trong lÜnh vùc

n«ng nghiÖp: c©y trång biÕn ®æi gen cho phÐp t¹o ra nh−ng c©y trång cho n¨ng

suÊt cao, chÊt l−îng tèt, cã kh¶ n¨ng chèng chÞu s©u bÖnh, h¹n, mÆn...

2.2.4. T×nh h×nh s¶n xuÊt vµ sö dông c©y trång biÕn ®æi gen ë ViÖt Nam

HiÖn nay ë n−íc ta lÜnh vùc nghiªn cøu t¹o sinh vËt biÕn ®æi gen, ®Æc biÖt

lµ c©y trång biÕn ®æi gen ®ang ®−îc tiÕp cËn, ®Çu t− vµ triÓn khai nghiªn cøu,

øng dông víi sù chó träng ®Æc biÖt. NhiÒu gen quý cã gi¸ trÞ øng dông nh− n¨ng

suÊt cao, chÊt l−îng tèt, cã kh¶ n¨ng chèng chÞu ®· ®−îc ph©n lËp vµ nghiªn cøu

nh»m chuyÓn vµo c©y trång ®Ó t¹o nªn nh÷ng gièng lý t−ëng. CNSH ViÖt Nam

nãi chung vµ lÜnh vùc c©y trång biÕn ®æi gen nãi riªng ®· cã nh÷ng b−íc ph¸t

triÓn ®¸ng chó ý:

§· thµnh c«ng trong viÖc ph©n lËp ®o¹n promoter ®Æc tr−ng h¹t cña gen

Gluteline lóa vµ thiÕt kÕ c¸c gen Cry Xa21 vµo Plasmid pCAMBIA nh»m lµm

chñ nguån gen cã gi¸ trÞ ®Ó t¹o ra chñng vi khuÈn Agrobacterium cho viÖc

chuyÓn gen vµo thùc vËt. Hoµn thiÖn quy tr×nh chuyÓn gen CryIA(b), CryIA(c)

kh¸ng c«n trïng, gen Chitinase kh¸ng bÖnh nÊm, gen Xa21 kh¸ng bÖnh b¹c l¸

-16-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

vi khuÈn vµ gen Bar kh¸ng thuèc diÖt cá th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium vµo

c©y lóa gièng C71, gièng DT10 vµ DT13, c©y c¶i dÇu vµ b¾p c¶i.

§èi víi c©y lóa, ®· t¹o ®−îc lóa biÕn ®æi gen gièng Nµng H−¬ng Chî §µo

vµ 2 dßng c©y biÕn ®æi gen GUS A vµ hph.

KÕt qu¶ ®· thu ®−îc nh÷ng c©y trång biÕn ®æi gen vµ l−u gi÷ chóng trong

®iÒu kiÖn invitro vµ trong ®iÒu kiÖn nhµ kÝnh.

2.3. C©y ng« biÕn ®æi gen 2.3.2. T×nh h×nh s¶n xuÊt c©y ng« biÕn ®æi gen trªn thÕ giíi

Trªn thÕ giíi th× diÖn tÝch c©y ng« biÕn ®æi gen lµ lín thø 2 sau ®Ëu t−¬ng

víi diÖn tÝch 25,2 triÖu ha chiÕm 25% diÖn tÝch c©y trång biÕn ®æi gen trªn thÕ

giíi. C©y ng« biÕn ®æi gen ®−îc trång nhiÒu nhÊt ë Mü, Achentina, Brazin,

Canada, China, Nam Phi, Uruguay, Philippin…C©y ng« chñ yÕu ®−îc nghiªn

cøu, s¶n xuÊt vµ sö dông gièng cã tÝnh tr¹ng chèng chÞu thuèc trõ cá, kh¸ng s©u,

chÞu h¹n.

N¨m 2006, thªm mét sè n−íc thuéc liªn minh Ch©u ¢u (EU) lÇn ®Çu tiªn

®−a ng« Bt vµo trång ®¹i trµ. Tæng diÖn tÝch trång ng« Bt ë 5 n−íc (Ph¸p, Céng

Hoµ SÐc, Bå §µo Nha, §øc vµ Slovakia) ®· t¨ng trªn 5 lÇn tõ xÊp xØ 1.500 ha

n¨m 2005 lªn gÇn 8.500 ha n¨m 2006, diÖn tÝch nµy cßn t¨ng lªn rÊt nhiÒu trong

n¨m 2007.

Ng« lµ c©y trång ®−îc c¸c quèc gia trªn thÒ giíi cÊp phÐp sö dông lµm

thùc phÈm vµ thøc ¨n ch¨n nu«i nhiÒu nhÊt víi tæng sè 35 gièng kh¸c nhau, v−ît

h¼n c©y trång ®øng thø 2 lµ b«ng (víi 19 gièng kh¸c nhau). Gièng ng« ®−îc cÊp

phÐp nhiÒu nhÊt lµ ng« kh¸ng s©u bÖnh (MON 810) vµ ng« kh¸ng thuèc trõ cá

(NK603), c¶ hai gièng ng« ®−îc 18 n−íc cÊp phÐp.

N¨m 2006, theo −íc tÝnh cña h·ng ph©n tÝch thÞ tr−êng Cropnosis, thÞ

tr−êng c©y trång biÕn ®æi gen toµn cÇu trÞ gi¸ kho¶ng 6,15 tû ®« la, chiÕm 16%

thÞ tr−êng c©y trång ®−îc b¶o hé trªn toµn cÇu vµ chiÕm 21% thÞ tr−êng h¹t

-17-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

gièng toµn cÇu. Trong ®ã gi¸ trÞ cña ng« biÕn ®æi gen chiÕm 39% t−¬ng ®−¬ng

kho¶ng 2,39 tû ®« la.

Do ®Æc tÝnh sinh lý cña c©y ng« nªn tû lÖ ®¹t kÕt qu¶ nghiªn cøu chuyÓn

gen trong c©y ng« trªn thÕ giíi lµ rÊt cao vµ ®¹t ®é an toµn cao nhÊt so víi c¸c

lo¹i c©y trång biÕn ®æi gen trªn thÕ giíi. Nh− vËy, víi viÖc ®−a c©y ng« biÕn ®æi

gen vµo s¶n xuÊt ®· gãp phÇn æn ®Þnh l−¬ng thùc trªn thÕ giíi trong hiÖn t¹i vµ

trong t−¬ng lai.

2.3.3. T×nh h×nh s¶n xuÊt vµ sö dông c©y ng« biÕn ®æi gen t¹i ViÖt Nam

ViÖt Nam lµ mét quèc gia víi nÒn kinh tÕ n«ng nghiÖp chñ yÕu. Ng« lµ

mét trong nh÷ng c©y l−¬ng thùc ®ãng vai trß quan träng. V× vËy, viÖc nghiªn

cøu c©y ng« biÕn ®æi gen ®ang ®−îc ®Çu t− m¹nh mÏ.

2 nghiÖm hai lo¹i b¾p chuyÓn gen trªn diÖn tÝch 1.000 mP

P ®Êt ë Q.12. Hai lo¹i ng«

Vµo ngµy 5/09/2005 thµnh phè Hå ChÝ Minh ®· tiÕn hµnh trång thö

chuyÓn gen nãi trªn lµ hai lo¹i ng« ®· ®−îc chuyÓn gen kh¸ng thuèc diÖt cá vµ

kh¸ng s©u [41].

KÕt qu¶ tõ viÖc trång thö nghiÖm b¾p chuyÓn gen sÏ ®−îc so s¸nh víi c¸c

gièng b¾p th«ng th−êng hiÖn ®ang ®−îc trång t¹i thµnh phè Hå ChÝ Minh. Trªn

c¬ së ®ã, c¸c nhµ khoa häc sÏ ®Ò xuÊt nªn hay kh«ng nªn øng dông trång ng«

chuyÓn gen ë ViÖt Nam.

§Æc biÖt míi ®©y, ®Ò tµi/dù ¸n t¹o ng« biÕn ®æi gen kh¸ng s©u vµ kh¸ng

thuèc diÖt cá ®−îc nghiªn cøu t¹i viÖn Di TruyÒn N«ng NghiÖp do TS. NguyÔn

V¨n §ång chñ nhiÖm ®Ò tµi, môc tiªu lµ t¹o dßng ng« kh¸ng s©u vµ kh¸ng thuèc

diÖt cá cã n¨ng suÊt cao vµ thÝch nghi tèt víi c¸c vïng sinh th¸i kh¸c nhau. §©y

lµ ®Ò tµi/dù ¸n thuéc ch−¬ng tr×nh träng ®iÓm “Ph¸t triÓn øng dông c«ng nghÖ

sinh häc trong lÜnh vùc N«ng nghiÖp” thùc hiÖn tõ th¸ng 10 n¨m 2006.

2.4. Nh÷ng vÊn ®Ò liªn quan ®Õn c©y trång kh¸ng thuèc trõ cá vµ mét sè dßng ng« mang gen kh¸ng thuèc trõ cá 2.4.1. Mét sè vÊn ®Ò liªn quan ®Õn c©y trång kh¸ng thuèc trõ cá

-18-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

Khi ®−îc hái, bÊt cø ng−êi n«ng d©n nµo còng tr¶ lêi r»ng cá d¹i lu«n lµ

mét vÊn ®Ò g©y lo l¾ng cho hä. Cá d¹i kh«ng chØ c¹nh tranh víi c©y trång ®Ó lÊy

n−íc, chÊt dinh d−ìng, ¸nh n¾ng mÆt trêi, kho¶ng kh«ng ®Ó mäc mµ cßn lµ n¬i

c− tró cho c«n trïng vµ c¸c lo¹i s©u bä g©y bÖnh, g©y t¾c nghÏn hÖ thèng t−íi

tiªu, lµm gi¶m sót chÊt l−îng mïa mµng, vµ cßn ®em theo c¶ h¹t gièng cá vµo

c©y trång ®−îc thu ho¹ch.

Th«ng th−êng, n«ng d©n sÏ cµy bõa tr−íc khi trång trät nh»m lµm gi¶m

sè l−îng cá d¹i trªn c¸nh ®ång. Sau ®ã hä phun thuèc diÖt cá theo diÖn réng ®Ó

lµm cho cá d¹i kh«ng thÓ mäc ®−îc ngay tr−íc khi geo h¹t. BiÖn ph¸p diÖt cá

nµy rÊt tèn kÐm vµ viÖc cµy xíi ®Êt sÏ khiÕn giã vµ n−íc lµm xãi mßn líp ®Êt

phÝa trªn bÒ mÆt g©y hËu qu¶ nghiªm träng kÐo dµi cho m«i tr−êng. Ngoµi ra,

mét sè thuèc diÖt cá l¹i tån t¹i dai d¼ng trong m«i tr−êng. Sù t¹o thµnh c¸c c©y

trång kh¸ng thuèc diÖt cá lµ mét c¸ch ®Ó kh¾c phôc c¸c yÕu ®iÓm ®ã.

Mét sè c¶i biÕn sinh häc kh¸c nhau cã thÓ lµm cho c©y trång trë nªn

kh¸ng thuèc diÖt cá cã thÓ nªu ra lµ:

– T¹o ra mét lo¹i protein míi gi¶i ®éc thuèc diÖt cá.

– Thay ®æi protein môc tiªu cña thuèc diÖt cá do vËy mµ protein nµy sÏ

kh«ng bÞ t¸c ®éng bëi thuèc diÖt cá.

– S¶n xuÊt qu¸ møc protein môc tiªu nh¹y c¶m thuèc diÖt cá sao cho vÉn cã

d− ®Ó duy tr× c¸c chøc n¨ng tÕ bµo bÊt chÊp sù cã mÆt cña thuèc diÖt cá.

– Cho c©y kh¶ n¨ng bÊt ho¹t vÒ mÆt chuyÓn ho¸ thuèc diÖt cá.

Ba c¸ch ®Çu tiªn lµ nh÷ng c¸ch phæ biÕn nhÊt mµ c¸c nhµ khoa häc dïng

®Ó ph¸t triÓn lo¹i c©y trång chÞu ®−îc thuèc diÖt cá (b¶ng 2).

Trong sè c¸c c©y trång CNSH ®−îc ®−a vµo th−¬ng m¹i hãa tõ n¨m 1996

®Õn n¨m 2007 tÝnh tr¹ng chÞu thuèc trõ cá vÉn lµ tÝnh tr¹ng næi tréi. N¨m 2007,

tÝnh tr¹ng chÞu ®−îc thuèc trõ cá ®−îc triÓn khai trªn c©y ®Ëu t−¬ng, ng«, c¶i

canola, cá alfalfa víi diÖn tÝch trång lµ 72,7 triÖu hecta (chiÕm 63% diÖn tÝch ®Êt

trång c©y CNSH toµn cÇu). C¸c gièng phæ biÕn nhÊt lµ chÞu ®−îc thuèc

-19-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

glyphosate vµ glufosinate [42]. B¶ng d−íi ®©y cho thÊy c¸c n−íc ®· chuÈn y c¸c

lo¹i c©y trång chÞu ®−îc thuèc diÖt cá chÝnh dïng lµm thùc phÈm

B¶ng 2: Mét sè vÝ dô vÒ sù kh¸ng thuèc diÖt cá

Thuèc diÖt cá C¬ chÕ ph¸t triÓn tÝnh kh¸ng thuèc diÖt cá

TÝnh kh¸ng thuèc lµ do sù thay ®æi gen psbA m· ho¸ Triazin

cho ®Ých cña thuèc diÖt cá, protein lôc n¹p D-1.

C¸c gen m· ho¸ c¸c d¹ng kh¸ng cña enzym axetolactat Sulfonylure

synthetaza ®· ®−îc ®−a vµo lóa, c©y d−¬ng, c©y lanh,

c©y c¶i dÇu

C¸c gièng cã c¸c d¹ng enzym axetolactat synthetaza Imidazolimon

kh¸ng ®· ®−îc chän läc trong nu«i cÊy m«.

C¸c thuèc diÖt cá nµy k×m h·m enzym axetyl coenzym Aryloxphenoxypropio

A carboxylaza. Sù kh¸ng ®−îc chän läc trong nu«i cÊy nat

m«, cã ®−îc lµ do enzym thay ®æi kh«ng nh¹y c¶m xyclohexanedion

thuèc diÖt cá hoÆc ph©n huû thuèc diÖt cá.

TÝnh kh¸ng do s¶n xuÊt qu¸ møc EPSPS, ®Ých cña thuèc

diÖt cá nµy. TÝnh kh¸ng thuèc ®−îc c¶i biÕn b»ng biÕn Glyphosat

n¹p ®Æc tr−ng víi gen EPSPS kh¸ng glyphosat vµ thuèc

l¸ víi gen glyphosat oxidoreductaza m· ho¸ enzym ph©n

huû glyphosat.

C©y b«ng vµ thuèc l¸ cã tÝnh kh¸ng ®−îc t¹o thµnh b»ng

tfdA biÕn n¹p víi gen tõ Alcaligenes m· ho¸ Axit

dioxygenaza ph©n huû chÊt diÖt cá nµy. phenoxycarboxylic

H¬n 20 lo¹i c©y kh¸c nhau ®· ®−îc biÕn n¹p víi gen bar (nh− 2,4-D vµ 2,4,5-T)

tõ Streptomyces hygroscopicus hoÆc gen pat tõ S.

Viridochromogenes. Phosphinothrixin axetyltransferaza Glufosinat

mµ c¸c gen nµy m· ho¸ khö ®éc thuèc diÖt cá nµy. (phosphinothrixin)

-20-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

C©y trång N−íc

Canola ¤xtralia, Cana®a, NhËt b¶n, Hoa kú, Achentina

B«ng Achentina, ¤xtralia, Cana®a, NhËt B¶n, Hoa kú

Ng«

Achentina, ¤xtralia, Cana®a, Liªn minh Ch©u ©u, NhËt B¶n, Thuþ sü, Anh, Hoa kú

Lóa Hoa kú

§Ëu t−¬ng

Achentina, ¤xtralia, Braxin, Cana®a, NhËt B¶n, Hµn Quèc, Mªxic«, Hµ Lan, Nga, Nam Phi, Thuþ sü, Hoa kú, Uruguay

¤xtralia, Cana®a, NhËt B¶n, Hoa kú

Cñ c¶i ®−êng

2.4.2. Mét sè gen kh¸ng thuèc trõ cá Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT), Bar

(cid:153) Gen Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT)

Gen Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) lµ mét trong nh÷ng gen

kh¸ng thuèc trõ cá ®· ®−îc chuyÓn vµo mét sè c©y trång nh− ng« vµ ®Ëu t−¬ng.

Gen nµy chèng chÞu ®−îc víi thuèc trõ cá glufosinate, ®−îc ph©n lËp tõ mét lo¹i

x¹ khuÈn ®Êt Streptomycesviridochromogenes. Gen PAT cho phÐp s¶n sinh ra

enzyme phosphinothricine N-acetyltransferase (PAT), enzym nµy cã kh¶ n¨ng

chèng chÞu ®−îc glufosinate.

(cid:153) Gen Bar

Gen Bar lµ mét trong c¸c gen kh¸ng thuèc trõ cá ammonium-glufosinate

(hay phosphinothricin). Ammonium-glufosinate lµ thµnh phÇn ho¹t tÝnh cña

thuèc diÖt cá Basta, Finale, Buster, Harvest vµ Liberty, ®©y lµ lo¹i thuèc trõ cá

cã hÖ thèng ph©n lo¹i râ nÐt mµ nã ®· ®−îc sö dông réng r·i ®Ó kiÓm so¸t kh«ng

chän läc ®èi víi c¸c loµi cá d¹i 1 n¨m vµ l©u n¨m, lµ chÊt diÖt cá cã phæ réng vµ

®−îc sö dông ®Ó kiÓm so¸t vïng cá d¹i réng lín trong qu¸ tr×nh canh t¸c.

Glufosinate lµ hîp chÊt tù nhiªn ®−îc ph©n lËp tõ 2 loµi nÊm Streptomyces, øc

-21-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

chÕ ho¹t tÝnh cña enzym tæng hîp glutamin, enzym cÇn thiÕt cho sù t¹o thµnh

glutamin vµ ®éc tÝnh ammonia. ViÖc sö dông glufosinate dÉn ®Õn lµm gi¶m hµm

l−îng glutamin vµ lµm t¨ng ammonia trong m« thùc vËt. §iÒu nµy lµm cho qu¸

tr×nh quang hîp ngõng vµ c©y chÕt sau vµi ngµy.

Gen Bar m· ho¸ cho enzym phosphinothricin- N- acetyltransferase (PAT)

®−îc ph©n lËp tõ chñng Streptomyces hygroscopicus HP632. Ngoµi viÖc cung

cÊp tÝnh tr¹ng kh¸ng thuèc trõ cá, gen m· ho¸ enzym PAT cßn ®−îc sö dông

nh− marker chän läc ®Ó x¸c ®Þnh c¸c c©y ®· chuyÓn gen trong suèt qu¸ tr×nh t¸i

sinh nu«i cÊy m«. lµm cho thµnh phÇn ho¹t tÝnh trong thuèc trõ cá glufosinate lµ

phosphinothricin kh«ng ho¹t ®éng, cho phÐp c¸c c©y trång sèng sãt trong khi

mµ øng dông kh¸c cña glufosinate cã thÓ g©y chÕt.

2.4.3. Mét sè dßng ng« mang gen kh¸ng thuèc diÖt cá

(cid:153) Event Bt16

Ph−¬ng ph¸p chuyÓn n¹p: Sö dông sóng b¾n gen.

Dßng Bt16 ®−îc c¶i biÕn di truyÒn ®Ó kh¸ng thuèc trõ cá ammonium-

glufosinate (hay phosphinothricin), thμnh phÇn ho¹t tÝnh cña thuèc diÖt cá

Basta, Finale, Buster, Harvest vμ Liberty. Ammonium-glufosinate lμ mét chÊt

diÖt cá cã phæ réng, kh«ng chän läc. Nã ®−îc sö dông ®Ó kiÓm so¸t cá d¹i sau

khi c©y mäc hoÆc kiÓm so¸t th¶m thùc vËt mäc trªn ®Êt mμ chóng kh«ng sö

dông cho môc ®Ých gieo trång. Nã cã thÓ bÞ vi khuÈn ph©n huû ë møc ®é cao,

kh«ng cã ho¹t tÝnh d− thõa, vμ møc ®é ®éc tÝnh ®èi víi con ng−êi vμ ®éng vËt

rÊt thÊp. Kh¶ n¨ng chèng chÞu glufosinate trong dßng nμy lμ do gen bar, gen

nμy m· ho¸ cho enzym phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) mμ cho

phÐp c¸c c©y trång nμy sèng sãt trong khi mμ øng dông kh¸c cña glufosinate cã

thÓ g©y chÕt.

-22-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

H×nh 2: CÊu tróc pDPG165 sö dông trong biÕn n¹p event Bt16

(cid:153) Event GA21

Ph−¬ng ph¸p chuyÓn n¹p: Sö dông sóng b¾n gen.

Dßng GA21 lμ ng« Roundup Ready, chèng chÞu thuèc trõ cá glyphosate.

Glyphosate lμ 1 lo¹i thuèc trõ cá ®−îc biÕt sau nμy, ®©y lμ lo¹i thuèc trõ cá cã

hÖ thèng ph©n lo¹i râ nÐt mμ nã ®· ®−îc sö dông réng r·i ®Ó kiÓm so¸t kh«ng

chän läc ®èi víi c¸c loμi cá d¹i 1 n¨m vμ l©u n¨m. Dßng GA21 cã kh¶ n¨ng

kh¸ng thuèc trõ cá nhê chuyÓn gen EPSPS néi sinh cña ng« vμo genome cña

c©y, enzym m· ho¸ cña gen nμy kh«ng nh¹y víi sù khö ho¹t tÝnh bëi

glyphosate.

H×nh 3: §o¹n ADN cña cÊu tróc pDPG434 sö dông trong biÕn n¹p ®Ó t¹o

ra event GA21

(cid:153) Event T14, T25

Ph−¬ng ph¸p chuyÓn n¹p: ChuyÓn ADN trùc tiÕp vμo genome cña c©y.

T14 vμ T25 ®· ®−îc c¶i biÕn di truyÒn ®Ó chèng chÞu ammonium

glufosinate (phosphinothricin), thμnh phÇn ho¹t tÝnh cña c¸c lo¹i thuèc trõ cá

cña c¸c h·ng Basta, Finale, Buster, Harvest vμ Liberty. TÝnh kh¸ng thuèc trõ cá

ammonium glufosinate cã ®−îc lμ do gen PAT.

-23-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

H×nh 4: Plasmid p35S/Ac ®· ®−îc sö dông ®Ó t¹o ra event T14, T25

(cid:153) Event TC1507

Ph−¬ng ph¸p biÕn n¹p: ChuyÓn n¹p nhê sóng b¾n gen.

TC1507 ®−îc c¶i tiÕn di truyÒn ®Ó kh¸ng c«n trïng vμ thuèc trõ cá

glufosinate. Dßng nμy chøa gen cry1F - lμ protein cry1F cña c«n trïng cã nguån

gèc tõ B. thuringiensis var. aizawai. Protein nμy cã hiÖu qu¶ trong viÖc kiÓm

so¸t Êu trïng cña nhiÒu loμi s©u bä phæ biÕn ë ng« ch¼ng h¹n nh− s©u ®ôc th©n

ng« Ch©u ¢u, s©u ®ôc th©n ng« T©y B¾c, s©u ngμi ®en, s©u c¾n giÐ. Dßng

TC1507 cã kh¶ n¨ng chèng chÞu ammonium glufosinate lμ do chuyÓn gen PAT

vμo genome cña dßng nμy.

H×nh 5: Plasmid PHI8999A ®· ®−îc sö dông ®Ó t¹o ra event TC1507

2.5. C¸c ph−¬ng ph¸p ph¸t hiÖn c©y trång biÕn ®æi gen

ViÖc nhËn biÕt GMC cã rÊt nhiÒu øng dông nh− ®Ó ®¸nh gi¸ møc ®é s¹ch

cña C©y gièng hay ®èi víi viÖc b¾t buéc d¸n nh·n thùc phÈm ë mét sè quèc gia.

Cã rÊt nhiÒu kü thuËt ®· vµ ®ang ®−îc ph¸t triÓn ®Ó ®¸p øng nhu cÇu nµy. NhËn

biÕt GMC vµ dÉn xuÊt cña nã cã thÓ ®−îc thùc hiÖn nhê sù nhËn biÕt ph©n tö mµ

nh÷ng ph©n tö nµy cã nguån gèc tõ gen ®−îc chÌn [13, 14]. Cã 3 ph−¬ng ph¸p

®Ó x¸c ®Þnh GMC ®ã lµ:

-24-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

1. Ph−¬ng ph¸p khuÕch ®¹i dùa trªn c¬ së nucleotit:

Bao gåm kü thuËt PCR (Polymerase Chain Reaction), ph¶n øng LCP

(Ligase Chain Reaction), khuÕch ®¹i dùa trªn tr×nh tù acid nucleic (NASBA),

c¸c kü thuËt RFLP, AFLP, RAPD...

- Dùa trªn c¬ së ARN: Nhê vµo sù liªn kÕt ®Æc hiÖu gi÷a ph©n tö ARN vµ

ph©n tö ADN hoÆc ARN tæng hîp (gäi lµ primer). Th−êng th× sù liªn kÕt gi÷a

ARN vµ primer sÏ dÉn ®Õn sù chuyÓn ho¸ ph©n tö ARN thµnh ADN th«ng qua

qu¸ tr×nh sao chÐp ng−îc. Cuèi cïng ADN cã thÓ ®−îc nh©n lªn nhê kü thuËt

PCR. HoÆc ARN ®−îc phiªn m· thµnh hµng tr¨m b¶n coppy nh− lµ mét mÉu

chuÈn trong kü thuËt NASBA [13].

- Dùa trªn c¬ së ADN: Chñ yÕu lµ nhê vµo sù nhËn ®«i cña ADN ®Æc

hiÖu víi kü thuËt PCR. §©y lµ kü thuËt ®−îc sö dông phæ biÕn ë c¸c phßng thÝ

nghiÖm bëi ®ã lµ mét ph−¬ng ph¸p nh¹y vµ cã tÝnh ®Æc hiÖu cao, cã thÓ ph¸t

hiÖn ®−îc ADN ngay ë hµm l−îng rÊt thÊp. Kü thuËt PCR kh«ng nh÷ng ®−îc sö

dông ®Ó x¸c ®Þnh GMC mµ cßn ®−îc sö dông vµo môc ®Ých ®Þnh l−îng.

2. Ph−¬ng ph¸p dùa trªn c¬ së protein:

Bao gåm ®iÖn di SDS mét chiÒu, ®iÖn di SDS hai chiÒu, ph©n tÝch

Western-blot, kü thuËt ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assays). Lµ

ph−¬ng ph¸p nhê vµo sù liªn kÕt ®Æc hiÖu gi÷a protein vµ kh¸ng thÓ. Kh¸ng thÓ

chÝnh lµ t¸c nh©n b¶o vÖ c¬ thÓ chèng l¹i sù x©m nhËp cña vi khuÈn vµ virus, khi

kh¸ng thÓ nhËn ra ph©n tö l¹ th× nã sÏ liªn kÕt víi ph©n tö nµy vµ trong c¸c ph©n

tÝch nhËn biÕt GMC th× sù phøc t¹p cña mèi liªn kÕt lÇn l−ît ®−îc nhËn biÕt nhê

ph¶n øng h×nh thµnh s¾c tè. §©y chÝnh lµ kü thuËt ELISA. Tuy nhiªn kh¸ng thÓ

cã thÓ kh«ng ®−îc sinh ra nÕu kh«ng nhËn ®−îc protein s¹ch. Protein nµy ph¶i

®−îc lµm s¹ch ngay tõ b¶n th©n GMC hoÆc cã thÓ ®−îc tæng hîp trong th− viÖn

nÕu nh− biÕt thµnh phÇn cña acid amin cña protein. Ph−¬ng ph¸p nµy thÝch hîp

víi viÖc ph©n tÝch ®èi víi nguyªn liÖu th« [13, 19].

-25-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

3. Ph−¬ng ph¸p dùa trªn sù ph¸t hiÖn ho¹t tÝnh cña enzym:

Ph−¬ng ph¸p nµy kh«ng thÝch hîp víi c¸c thùc phÈm ®· qua chÕ biÕn bëi

v× lóc nµy protein ®· bÞ biÕn tÝnh [17].

Cho ®Õn nay c¸c ph−¬ng ph¸p chÝnh ®Ó ph¸t hiÖn GMC vµ c¸c dÉn suÊt

cña nã chñ yÕu dùa trªn sù ph¸t hiÖn ADN, trong khi chØ cã mét vµi ph−¬ng

ph¸p ®−îc ph¸t triÓn ®Ó ph¸t hiÖn ARN hoÆc protein.

2.6. T×nh h×nh nghiªn cøu sö dông PCR ®Ó x¸c ®Þnh c©y trång biÕn ®æi gen

RÊt nhiÒu nghiªn cøu sö dông kü thuËt PCR ®Ó x¸c ®Þnh GMC ®· ®−îc

tiÕn hµnh. Kü thuËt PCR còng ®· ®−îc øng dông rÊt nhiÒu ®Ó ph¸t hiÖn ng« GM

vµ ®Ëu t−¬ng GM. §Ó nhËn biÕt ®Ëu t−¬ng Roundup Ready GM vµ ng« Bt 176,

c¸c nhµ khoa häc §µi Loan ®· sö dông c¸c cÆp måi 35S, NOS, EPSPS vµ LE ®Ó

ph¸t hiÖn ®o¹n promoter 35S, ®o¹n terminator NOS, vïng gen cÊu tróc EPSPS

(enolpyruvyl Shikinate-3-phosphate Synthase) cña ®Ëu t−¬ng Roundup Ready vµ

gen lectin. Sö dông c¸c cÆp måi Cry IA(b), CDPK-cry, IVR ®Ó nhËn biÕt gen

Delta-Endotoxin (®o¹n 184 bp vµ 211bp) vµ gen Invertase trong ng« Bt 176.

Còng víi 2 ®èi t−îng nghiªn cøu trªn vµ sö dông c¸c cÆp måi 35S1/2,

SPA/B, LE1/2, Cry1/2, IVR1/2, mét nghiªn cøu kh¸c cña c¸c nhµ khoa häc Anh

vÒ kh¶ n¨ng nhËn biÕt ng« GM vµ ®Ëu t−¬ng GM trong thùc phÈm nhê PCR

còng ®· ®−îc chÊp nhËn [15]. Mét øng dông kh¸c cña PCR lµ ®Þnh l−îng GMC

còng ®· ®−îc c¸c nhµ khoa häc Argentina nghiªn cøu thö nghiÖm trªn ®èi t−îng

lµ ng« Bt 176. ë nghiªn cøu nµy, c¸c mÉu ng« GM ®−îc trén lÉn víi ng« kh«ng

biÕn ®æi gen ë c¸c tû lÖ kh¸c nhau (0,5%, 1%, 2%, 5%, 20%) vµ nghiªn cøu nµy

cho thÊy ë hµm l−îng GMC lín h¬n 5% cho ph¶n øng d−¬ng tÝnh [14].

2.7. §a d¹ng di truyÒn

C¸c c¸ thÓ trong mét quÇn thÓ th−êng cã bé gen (genom) kh¸c nhau. Sù

®a d¹ng vÒ bé gen cã ®−îc lµ do c¸c c¸ thÓ cã c¸c gen kh¸c nhau, dï chØ lµ rÊt

Ýt. Nh÷ng alen kh¸c nhau cña mét gen cã thÓ ¶nh h−ëng ®Õn sù ph¸t triÓn vµ ®Æc

®iÓm sinh lý cña mçi c¸ thÓ theo c¸ch kh¸c nhau. Nh÷ng c©y trång ®−îc lai

-26-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

ghÐp hay nh÷ng ®éng vËt ®−îc lai t¹o ph¸t huy nh÷ng gen cña m×nh ®Ó h×nh

thµnh nh÷ng gièng c©y con cho n¨ng suÊt cao, cã kh¶ n¨ng chèng chÞu s©u

bÖnh, cá d¹i tèt.

Trong qu¸ tr×nh sinh s¶n h÷u tÝch, kiÓu gen cña c¸c c¸ thÓ trong quÇn thÓ

sÏ t¨ng lªn do kÕt qu¶ t¸i tæ hîp hoÆc do ®ét biÕn.

C¸c gen ®a h×nh lµ nguyªn nh©n dÉn ®Õn sùu tån t¹i c¸c kÓu gen dÞ hîp

trong quÇn thÓ. Sù kh¸c biÖt vÒ kiÓu gen cña c¸c c¸ thÓ trong quÇn thÓ nµy thÝch

nghi h¬n so víi nh÷ng thay ®æi cña m«i tr−êng.

2.7.1. ý nghÜa cña viÖc nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn

§a d¹ng sinh häc rÊt cÇn thiÕt cho sù tån t¹i cña c¸c loµi, c¸c quÇn x· tù

nhiªn vµ rÊt quan träng ®èi víi con ng−êi. Sù ®a d¹ng di truyÒn lµ cÇn thiÕt cho

tÊt c¶ c¸c sinh vËt ®Ó duy tr× kh¶ n¨ng sinh s¶n, kh¶ n¨ng ®Ò kh¸ng víi c¸c lo¹i

dÞch bÖnh vµ kh¶ n¨ng thÝch nghi víi nh÷ng thay ®æi cña m«i tr−êng sèng. Sù ®a

d¹ng di truyÒn ë c©y trång vµ vËt nu«i cã gi¸ trÞ ®Æc bÖt trong chän t¹o gièng

c©y trång, vËt nu«i míi phôc vô cho lîi Ých cña con ng−êi.

2.7.2. Mét sè ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn 2.7.2.1. Ph−¬ng ph¸p sö dông c¸c chØ tiªu h×nh th¸i.

C¸c chØ tiªu h×nh th¸i trong ph©n lo¹i sinh vËt ®−îc sö dông tõ rÊt sím.

Tuy nhiªn, nh÷ng ®Æc tÝnh h×nh th¸i ®−îc sö dông nh− lµ mét chØ thÞ di truyÒn lµ

nh÷ng tÝnh tr¹ng do mét locus gen quy ®Þnh vµ sù thÓ hiÖn cña chóng kh«ng bÞ

¶nh h−ëng cña nh©n tè m«i tr−êng. Trong tr−êng hîp nµy dÊu chØ tiªu h×nh th¸i

®−îc sö dông nh− mét chØ thÞ di truyÒn.

ViÖc sö dông c¸c chØ tiªu h×nh th¸i trong ph©n tÝch ®a d¹ng di truyÒn cã

nh÷ng h¹n chÕ:

– Sè l−îng c¸c chØ tiªu h×nh th¸i cã h¹n

– Chóng bÞ ¶nh h−ëng bëi qu¸ tr×nh t−¬ng t¸c gen vµ c¸c nh©n tè m«i

tr−êng (Staub J.E. vµ Crubaugh., 1995).

-27-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

– C¸c chØ tiªu h×nh th¸i thÓ hiÖn nh÷ng giai ®o¹n nhÊt ®Þnh cña qu¸ tr×nh

ph¸t triÓn c¸ thÓ (Paterson., 1996).

2.7.2.2. Ph−¬ng ph¸p sö dông c¸c chØ thÞ ph©n tö

(cid:153) ChØ thÞ RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism):

Ph−¬ng ph¸p RFLP (§a h×nh chiÒu dµi c¸c ®o¹n ADN c¾t giíi h¹n) do

Botstein vµ cs, ph¸t minh n¨m 1980. Nguyªn lý cña ph−¬ng ph¸p nµy lµ: ADN

cña bé gen sau khi ®−îc xö lý b»ng enzym giíi h¹n sÏ bÞ c¾t thµnh nh÷ng ®o¹n

cã kÝch th−íc kh¸c nhau. Sau khi ®iÖn di, c¸c ®o¹n nµy ph©n bè ë nh÷ng vÞ trÝ

kh¸c nhau trªn gel, qua biÕn tÝnh c¸c ®o¹n nµy sÏ trë thµnh sîi ®¬n vµ ®−îc

chuyÓn lªn mµng celulose hoÆc nylon víi vÞ trÝ kh«ng thay ®æi. Trong qu¸ tr×nh

lai ADN tiÕp theo trªn mÉu dß (thùc chÊt lµ mét ®o¹n ADN) sÏ b¾t cÆp víi

nh÷ng ®o¹n cã tr×nh tù nucleotic t−¬ng ®ång víi nã trªn mµng lai – kü thuËt lai

Southern. Khi ph©n tÝch ®a h×nh di truyÒn, sù ®a d¹ng cña c¸c c¸ thÓ ®−îc thÓ

hiÖn qua sù kh¸c nhau cña c¸c b¨ng lai trªn mµng lai.

(cid:153) ChØ thÞ PCR (Polymerase Chain Reaction):

Ph¶n øng PCR dùa trªn nguyªn t¾c tæng hîp ADN nhê enzym ADN

Polymerase chÞu nhiÖt (Taq, Pfu…) víi sù cã mÆt cña ®o¹n ADN khu«n mÉu,

2+ P

ADN måi, c¸c nucleotit (dNTP) gåm dATP, dCTP, dGTP, dTTP vμ ion MgP

ho¹t ®éng nh− mét chÊt xóc t¸c.

Ph¶n øng PCR gåm c¸c giai ®o¹n sau:

o ®Õn kho¶ng 90-98P PC, nhiÖt ®é nµy th−êng lín h¬n Tm cña ph©n tö ADN, do ®ã

– Giai ®o¹n biÕn tÝnh (Denaturation): Hçn hîp ph¶n øng ®−îc lµm nãng

c¸c ph©n tö ADN m¹ch kÐp ®−îc t¸ch nhau ra hoµn toµn t¹o nªn sîi ®¬n dïng

lµm khu«n cho c¸c ®o¹n måi vµ taq ADN polymerase ho¹t ®éng. Giai ®o¹n nµy

th−êng kÐo dµi trong vßng 30 gi©y ®Õn 1 phót.

– Giai ®o¹n g¾n måi (Annealing): NhiÖt ®é cña giai ®o¹n nµy ph¶i thÝch

hîp cho qu¸ tr×nh b¾t cÆp bæ sung cña måi víi chuçi ADN khu«n, nã nhá h¬n

-28-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

o PC. T¹i ®©y, c¸c ®o¹n måi sÏ g¾n bæ sung víi

Tm cña 2 ®o¹n måi kho¶ng 2-3P

tr×nh tù bæ trî trªn c¸c ph©n tö ADN khu«n. Thêi gian cña giai ®o¹n nµy th−êng

kÐo dµi tõ 30 gi©y ®Õn 1 phót.

– Giai ®o¹n tæng hîp (Extention): NhiÖt ®é ë giai ®o¹n nµy ®−îc t¨ng lªn

®Õn nhiÖt ®é thÝch hîp cho ADN polymerase ho¹t ®éng tæng hîp nªn sîi míi tõ

o lµ kho¶ng 72P

PC. Thêi gian cña giai ®o¹n nµy phô thuéc vµo ®é dµi cña chuçi

phøc hîp måi-khu«n. §èi víi Taq ADN polymerse th× nhiÖt ®é ho¹t ®éng tèi −u

ADN, th−êng kÐo dµi tõ 30 gi©y ®Õn vµi phót.

Mét chu kú ph¶n øng víi 3 giai ®o¹n trªn sÏ ®−îc lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ mçi

o th−êng lµ 20-40 chu kú. Sau khi chu kú cuèi cïng kÕt thóc, gi÷ nhiÖt ®é ë 72P

lÇn lÆp l¹i lµm t¨ng gÊp ®«i l−îng mÉu cña lÇn tr−íc. Sè chu kú ph¶n øng

o ®¬n ADN xo¾n l¹i t¹o s¶n phÈm PCR. Cuèi cïng, nhiÖt ®é ®−îc h¹ xuèng 4P

trong kho¶ng 5-10 phót ®Ó tÊt c¶ c¸c sîi ADN ®−îc tæng hîp xong vµ c¸c sîi

®Ó b¶o qu¶n.

Kü thuËt PCR ®−îc øng dông vµo nhiÒu lÜnh vùc kh¸c nhau nh−: s¶n xuÊt

mÉu dß, ph©n lËp gen, nh©n béi ARN, nhËn d¹ng ë møc ®é ph©n tö, x¸c ®Þnh vµ

chÈm ®o¸n bÖnh... Tuú theo b¶n chÊt cña nh÷ng ®o¹n måi sö dông mμ cã nh÷ng

hÖ thèng chØ thÞ ®Æc tr−ng gåm chØ thÞ RAPD, SSR, AFLP…

-29-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

H×nh 6: C¸c giai ®o¹n cña mét chu kú PCR

(cid:153) ChØ thÞ RAPD (Random Amplified Polymorphism ADN)

RAPD (§a h×nh c¸c ®o¹n khuÕch ®¹i ngÉu nhiªn) ®−îc ®Þnh nghÜa lµ sù

®a h×nh c¸c ®o¹n ADN ®−îc khuÕch ®¹i ngÉu nhiªn. PCR_RAPD thùc hiÖn dùa

trªn c¬ së sù b¾t cÆp ngÉu nhiªn cña c¸c måi ®¬n ng¾n (10 nucleotide) víi m¹ch

khu«n. C¸c ®o¹n måi oligonucleotide nÕu b¾t cÆp ngÉu nhiªn víi c¶ hai m¹ch

®èi diÖn cña m¹ch khu«n ADN trong kho¶ng c¸ch cã thÓ khuÕch ®¹i ®−îc (d−íi

3000bp) sÏ cho ra nh÷ng ®o¹n ADN cã kÝch th−íc kh¸c nhau sau khi khuÕch

®¹i. S¶n phÈm thu ®−îc lµ tËp hîp ®a d¹ng c¸c dßng ®o¹n ADN ®Æc tr−ng cho

mçi loµi thËm trÝ cho mçi c¸ thÓ. William vµ céng sù (1990).

Theo lý thuyÕt 1 måi ngÉu nhiªn gåm 10 nucleotid th× x¸c suÊt b¾t gÆp

P = 1/1.048.576, nghÜa lµ mét ®o¹n ADN khu«n cã 1.048.576 cÆp

b»ng 1/4P

nucleotic cã mét tr×nh tù b¾t cÆp víi måi. Nh− vËy, víi mét ®o¹n måi ngÉu

nhiªn cã thÓ cã 524 vÞ trÝ b¾t cÆp måi, nghÜa lµ cã thÓ cã 262 ®o¹n ADN ®−îc

nh©n béi. Trong thùc tÕ sè l−îng c¸c ®o¹n ®−îc nh©n béi nhá h¬n nhiÒu v× nã

phô thuéc vµo ®é dµi ®o¹n ®−îc nh©n béi vµ sù s¾p xÕp c¸c tr×nh tù b¾t cÆp víi

måi trªn ADN cña bé gen.

Nguyªn t¾c ph¶n øng RAPD còng nh− nguyªn t¾c ph¶n øng PCR th«ng

th−êng. Tuy nhiªn, v× sö dông måi ngÉu nhiªn nªn nhiÖt ®é b¾t cÆp cña måi thÊp

o 30P

PC-36P

o PC. ChÝnh v× yÕu tè ®Æc hiÖu thÊp nªn kÕt qu¶ RAPD th−êng cã ®é lÆp

®Ó t¹o ®iÒu kiÖn b¾t cÆp kh«ng nghiªm ngÆt. NhiÖt ®é b¾t cÆp cña ph¶n øng lµ

l¹i kh«ng cao vµ khã tèi −u ph¶n øng. §©y chÝnh lµ trë ng¹i lín nhÊt cña RAPD

v× kÕt qu¶ phô thuéc rÊt nhiÒu yÕu tè nh− thµnh phÇn ph¶n øng PCR (®Æc biÖt lµ

P vµ chÊt l−îng ADN b¶n mÉu), c¸c thiÕt bÞ còng nh− thao t¸c

thµnh phÇn MgP

thÝ nghiÖm.

Khi ph©n tÝch ®a h×nh di truyÒn b»ng ph−¬ng ph¸p RAPD, nÕu 2 c¸ thÓ cã

bé gen hoµn toµn gièng nhau th× khi tiÕn hµnh ph¶n øng PCR_RAPD víi bÊt kú

måi nµo còng cho b¨ng ADN gièng nhau. NÕu chóng Ýt nhiÒu cã sù kh¸c nhau

-30-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

vÒ bé gen th× víi mét sè måi sÏ cho nh÷ng b¨ng kh¸c nhau gi÷a chóng. Sù kh¸c

nhau nµy thÓ hiÖn sùu ®a h×nh di truyÒn cña c¸c c¸ thÓ cÇn nghiªn cøu. Do ®ã,

nã ®−îc sö dông réng r·i trong c¸c phßng thÝ nghiÖm vÒ di truyÒn ph©n tö.

(cid:153) ChØ thÞ SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates)

ChØ thÞ vi vÖ tinh, lμ nh÷ng ®o¹n ADN lÆp l¹i mét c¸ch cã trËt tù, gåm

nh÷ng ®¬n vÞ lÆp l¹i gåm tõ 1 ®Õn 6 nucleotit, theo kiÓu lÆp l¹i ng¾n. B¶n chÊt

®a h×nh cña SSR cã thÓ ®−îc sinh ra do sù nh©n béi tõ ADN tæng sè cña hÖ gen

nhê sö dông 2 ®o¹n måi bæ trî víi tr×nh tù gÇn kÒ hai ®Çu cña vïng lÆp l¹i. Gi¸

trÞ cña SSR lμ ë chç nã sinh ra ®a h×nh tõ rÊt nhiÒu vïng t−¬ng øng, bao phñ

réng kh¾p hÖ gen vμ cã b¶n chÊt ®ång tréi, dÔ dμng ph¸t hiÖn b»ng PCR. Nh÷ng

chuçi ®a h×nh ®¬n gi¶n nμy ®· ®−îc øng dông trong viÖc lËp b¶n ®å ë c¶ hai ®èi

t−îng ®éng vËt vμ thùc vËt. ë ng−êi, SSR ®−îc gäi lμ thÕ hÖ thø hai cña c¸c chØ

thÞ ph©n tö. ë thùc vËt, tÇn sè vμ sè l−îng SSR ®· ®−îc x¸c ®Þnh trªn c¸c c©y

rõng nhiÖt ®íi, c©y b¾p c¶i, lóa m×, vμ 34 gièng c©y trång kh¸c [38].

2.7.3. T×nh h×nh nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn dùa vµo chØ thÞ RAPD

Còng nh− mét sè ph−¬ng ph¸p sinh häc ph©n tö kh¸c, PCR_RAPD ®·

®−îc øng dông thµnh c«ng vµo nghiªn cøu mèi quan hÖ di truyÒn thùc vËt. Bªn

c¹nh c©y ng«, ®· cã rÊt nhiÒu ®èi t−îng ®−îc nghiªn cøu sö dông ph−¬ng ph¸p

nµy. Kaudun SS vµ CS., dùa trªn kü thuËt PCR_RAPD ®Ó nghiªn cøu 27 dßng

chÌ cã nguån gèc kh¸c nhau tõ Hµn Quèc, NhËt B¶n, §µi Loan. KÕt qu¶ thu

®−îc víi 50 måi ngÉu nhiªn , trong ®ã 17 måi cho 58 b¨ng ®a h×nh. Orozeo vµ

CS, (1994) ®· øng dông kü thuËt RAPD ®Ó kh¶o s¸t mèi quan hÖ di truyÒn vµ

tiÕn hãa cña c¸c gièng cµ phª ®−îc lai t¹o tõ c¸c loµi bè, mÑ ë c¸c vïng sinh

th¸i kh¸c nhau lµm c¬ së cho viÖc ghÐp cÆp lai víi môc ®Ých t¹o con lai cã ®Æc

®iÓm quý ®Ó lai t¹o gièng cµ phª míi... Cßn ë ViÖt Nam, kü thuËt PCR_RAPD

®−îc ¸p dông kh¸ nhiÒu trong ph©n tÝch di truyÒn cña thùc vËt.

-31-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

– NguyÔn V¨n §ång, ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp, ®· dïng 15 måi RAPD

®Ó ph©n tÝch ®a h×nh di truyÒn 19 dßng lóa, thu ®−îc 97 b¨ng ®a h×nh vµ hÖ sè

t−¬ng ®ång tõ 0,67 ®Õn 1,0 [12].

– NguyÔn ThÞ Dung, ViÖn c«ng nghÖ sinh häc ®· ph©n tÝch mèi t−¬ng ®ång

di truyÒn cña 11 c©y v¶i ë c¸c ®é tuæi kh¸c nhau dùa trªn c¬ së ph©n tÝch ®a

h×nh ADN b»ng ph−¬ng ph¸p PCR_RAPD víi 5 måi ngÉu nhiªn [12].

– NguyÔn V¨n Khiªm vµ CS., ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp, ®· dïng 17

®o¹n måi RAPD ®Ó ®¸nh gi¸ mèi quan hÖ di truyÒn cña 20 mÉu kh¸c nhau

thuéc loµi Boswellia sacra flueck [12].

PCR_RAPD ®−îc øng dông thµnh c«ng vµo ph©n tÝch ®a h×nh di truyÒn ë

ng« (tuy cßn h¹n chÕ vÒ sè l−îng c¸c nghiªn cøu) vµ ®· thu ®−îc mét sè kÕt qu¶

– L.L.B.Lanza et al (1997) ®· øng dông kü thuËt RAPD ®Ó x¸c ®Þnh kho¶ng

c¸ch di truyÒn vµ dù ®o¸n cÆp lai ®¬n −u tó cña c¸c dßng ng« tù phèi ®−îc t¹o ra

tõ nguån BR106 vµ BR105 [1].

– Bïi M¹nh C−êng vµ CS, ViÖn nghiªn cøu ng« ®· sö dông chØ thÞ RAPD

víi 60 måi ngÉu nhiªn 29 dßng thuÇn ®Ó nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn cña tËp

®oµn gièng ng« lai [12].

– KhuÊt H÷u Trung vµ CS, ViÖn Di truyÒn n«ng nghiÖp ®· sö dông 20 måi

ngÉu nhiªn ®Ó nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn cña 14 dßng ng« mang gen kh¸ng

s©u. KÕt qu¶ lµ 9 måi cho b¨ng ®a h×nh.

Nh÷ng kÕt qu¶ trªn phÇn nµo cho thÊy sù h÷u Ých cña PCR_RAPD trong

nghiªn cøu ®a h×nh di truyÒn ë sinh vËt nãi chung vµ ë ng« nãi riªng.

-32-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

PhÇn III. VËt LiÖu Vμ PH¦¥NG Ph¸p NGHI£N Cøu

3.1. VËt liÖu nghiªn cøu

VËt liÖu nghiªn cøu lµ mét 180 dßng ng« ®−îc t¹o ra tõ 2 dßng ng« mang

gen kh¸ng thuèc trõ cá thu thËp tõ Achentina ký hiÖu CG3 vµ CG4;

CÆp måi 35S1/35S2 sö dông trong ph¶n øng PCR ®Ó khuyÕch ®¹i ®o¹n

tr×nh tù ®Æc tr−ng cña promoter CaMV-35S (195bp) cã trong ng« chuyÓn gen;

CÆp måi PA01/CM03 dïng ®Ó khuyÕch ®¹i ®o¹n 231 bp cña gen PAT

(phosphinothricin-N-acetyltransferase), lµ gen kh¸ng thuèc trõ cá cã trong c©y

ng« chuyÓn gen;

20 måi kh¸c nhau sö dông trong c¸c ph¶n øng PCR-RAPD cã ®é dµi tõ 8-

10 nucleotit thuéc nhãm OPA, OPM, BIO vµ nhãm S cña h·ng Operon

Technology vµ h·ng Bioneer.

B¶ng 3: Tr×nh tù nucleotic cña c¸c cÆp måi dïng trong ph¶n øng PCR

KÝch th−íc

®o¹n

Tªn cÆp måi

Tr×nh tù

Gen ®Ých

khuÕch ®¹i

5′-CTCCTACAAATGCCATCA- 3′

Promoter

195 bp

35S1/35S2

CaMV 35s

5′-GATAGTGGGATTGTGCGTCA- 3′

5′-AGATCATCAATCCACTCTTGTGGTG- 3′

PA01/CM03

PAT

231bp

5′-CCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATA- 3′

-33-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

B¶ng 4: Tr×nh tù nucleotic cña c¸c primer ®−îc sö dông trong c¸c ph¶n øng PCR_RAPD

STT Primer

Tr×nh tù nucleotit

STT Primer

Tr×nh tù nucleotit

1 OPA1 CAGGCCCTTC S201 11 GGGCCACTCA

2 OPA9 GGGTAACGCC S202 12 GGAGAGACTC

3 OPA10 GTGATCGCAG S208 13 AACGGCGACA

4 OPA12 TCGGCGATAC S211 14 TTCCCCGCGA

5 OPA15 TTCCGAACCC S216 15 GGTGAACGCT

6 OPA18 AGGTGACCGT S256 16 CTGCGCTGGA

17 7 OPA10 GTGATCGCAG BIO3 GAAACGGGTG

8 OPM9 GTCTTGCGGA 18 BIO12 CAATCGCCGT

9 OPM12 GGGACGTTGG 19 BIO16 CTGAGACGGA

10 OPM18 CACCATCCGT 20 BIO27 TGACGCGCTC

C¸c ho¸ chÊt sinh häc ph©n tö cÇn thiÕt: c¸c ho¸ chÊt t¸ch chiÕt ADN, ho¸

chÊt lµm PCR, ho¸ chÊt ch¹y gel agarose.

+ Ho¸ chÊt t¸ch chiÕt AND: Ho¸ chÊt t¸ch chiÕt ADN bao gåm c¸c lo¹i

nh−: Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Chloroform, Isopropanol, Isoamyl

alcohol, Ethanol cña c¸c h·ng Sigma, Merck, Prolabo, ICN, Labscan.

– §Öm t¸ch chiÕt ADN cña mÉu l¸ c©y chuyÓn gen:

200 mM Tris-HCl pH8 250 mM NaCl 25 mM EDTA 0,5% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)

– §Öm TE:

10 mM Tris-HCl pH8 1 mM EDTA

– Phenol : chloroform : isoamyl acohol 70% (25:24:1)

– Ethanol 100% (hoÆc Isopropanol) vµ Ethanol 70%

-34-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

+ Ho¸ chÊt dïng ®Ó ch¹y ph¶n øng PCR:

– §Öm PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2 , 5 mM KCl) hoÆc

®Öm PCR 1X cña Quiagen hoÆc Invitrogen. – MgCl2 cña Fermentas, Invitrogen. – dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP (hoÆc dUTP)) cña Fermentas,

Invitrogen.

– Måi, Marker 1 kb, Marker 100 bp, Marker λ/HindIII cña h·ng Fermentas,

Invitrogen.

– Taq polymerase cña Fermentas, Hot- Start Quiagen hoÆc Platin tõ

Invitrogen

+ Ho¸ chÊt ch¹y ®iÖn di: §iÖn di gel agarose gåm c¸c ho¸ chÊt: TAE 1X, ChÊt nhuém Bromophenol blue (hoÆc Xylene cyanol hoÆc hçn hîp c¶ 2 chÊt nµy), Ethidium bromide, agarose.

+ C¸c thiÕt bÞ:

– M¸y PCR (h·ng Eppendorf) – M¸y ly t©m l¹nh (Eppendorf 5810-R vµ 2K15 Sigma) – M¸y ®iÖn di ngang BIO-RAD GT (Anh) – M¸y soi gel (T2201, Sigma), mÆt n¹ ch¾n tia UV (Sigma) – ThiÕt bÞ Votex (Genie 2 vµ MS1 Minishaker). – Nåi hÊp thanh trïng (05MB1-160T-3 -Nga) – C©n ®iÖn tö Sartorious (§øc) – Lß vi sãng. – Tñ sÊy (Memmert) – Micropipet, èng Eppendorf, b×nh tam gi¸c

3.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

3.2.1. Ph−¬ng ph¸p bè trÝ thÝ nghiÖm ®ång ruéng

C¸c dßng ng« nghiªn cøu ®−îc gieo 3 hµng dµi 5m, kho¶ng c¸ch gieo lµ

70cm x 25cm x 1 c©y/hèc t¹i khu ruéng thÝ nghiÖm ®−îc c¸ch li vµ kiÓm so¸t

chÆt chÏ. ViÖc ®¸nh gi¸ c¸c ®Æc ®iÓm n«ng sinh häc vµ c¸c ®Æc ®iÓm h×nh th¸i

®−îc tiÕn hµnh qua c¸c thÝ nghiÖm so s¸nh, ph−¬ng ph¸p ch¨m sãc c¸c thÝ

nghiÖm theo quy tr×nh cña ViÖn nghiªn cøu Ng«.

-35-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

+ Thêi gian sinh tr−ëng: Theo dâi ngµy gieo ®Õn

– Ngµy tung phÊn: khi cã 75% sè c©y tung phÊn – Ngµy phun r©u: Khi cã 75% sè c©y phun r©u – Ngµy chÝn sinh lý: Khi ch©n h¹t cã ®iÓm ®en ë 100% sè b¾p

+ §Æc ®iÓm h×nh th¸i c©y:

– ChiÒu cao c©y (cm): Chän 10 c©y ngÉu nhiªn, ®o tõ mÆt ®Êt ®Õn ®èt mang

nh¸nh cê ®Çu tiªn.

– ChiÒu cao ®ãng b¾p (cm): Trªn 10 c©y ®· ®−îc ®o chiÒu cao c©y, chiÒu

cao ®ãng b¾p ®−îc ®o tõ mÆt ®Êt ®Õn ®èt mang b¾p trªn cïng

– Sè l¸ thËt: l¸ thø 5 vµ l¸ thø 10 ®−îc ®¸nh dÊu ®Ó tiÖn cho viÖc ®Õm sè l¸

cuèi cïng.

– ChiÒu dµi b«ng cê (chiÒu dµi trôc chÝnh) (cm): §−îc ®o tõ ®èt cã nh¸nh

cê ®Çu tiªn ®Õn hÕt b«ng cê.

– Mµu cê: X¸c ®Þnh mµu s¾c cña r©u lóc r©u dµi 3 cm. – Mµu d¹ng cña h¹t vµ lâi: X¸c ®Þnh mµu, d¹ng cña h¹t vµ lâi lóc kh«.

PC ®Ó lµm nguyªn liÖu cho t¸ch chiÕt ADN.

3.2.2. Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ADN 3.2.2.1. Ph−¬ng ph¸p thu mÉu

C©y ng« chuyÓn gen ®−îc trång trong ®iÒu kiÖn nhµ kÝnh ®−îc kiÓm so¸t chÆt chÏ, khi c©y mäc cao 15 – 25 cm, thu kho¶ng 2,5- 3 g mÉu l¸, mÉu ®−îc 0 röa s¹ch, gi÷ ë - 80P 3.2.2.2. Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt AND tæng sè

0 1. ñ s½n dung dÞch ®Öm chiÕt CTAB vµ SDS ë 60P

PC trong b×nh æn nhiÖt (30

Trong nghiªn cøu nµy, chóng t«i ®· lùa chän ph−¬ng ph¸p cã sö dông CTAB cña Hugo vµ cs. (1995) cã c¶i tiÕn ®Ó tiÕn hµnh t¸ch chiÕt ADN tæng sè tõ 180 dßng ng« nghiªn cøu.

phót).

PC).

2. L¸ ®−îc c¾t nhá cho vµo cèi, nghiÒn cïng nit¬ láng ®Õn khi thµnh bét mÞn

(mÉu ng«, chµy, cèi ®−îc gi÷ tr−íc ë - 20P

3. ChuyÓn bét nghiÒn tõ l¸ sang èng Eppendorf 2 ml, bæ sung 800 ml CTAB

PC trong 40 phót, cã l¾c nhÑ trong qu¸ tr×nh ñ

buffer vµ 56 ml SDS 10%.

4. ñ ë 65P 5. §Ó nguéi ë nhiÖt ®é phßng.

-36-

0 PC) 11000 vßng/phót trong 15 phót.

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

6. Bæ sung 800 ml Chloroform : isoamyl alcohol (24:1), l¾c ®Òu 7. Ly t©m trong m¸y ly t©m l¹nh (4P 8. Thu dÞch næi phÝa trªn èng chuyÓn sang èng Eppendorf míi. 9. Bæ sung 800 ml Chloroform : isoamyl alcohol (24:1), l¾c ®Òu. 10. Ly t©m trong m¸y ly t©m l¹nh (4P 11. Thu dÞch næi chuyÓn sang «ng Eppendorf míi, bæ sung b»ng isopropanol

PC víi 12000 vßng/phót trong 15 phót, thu tña.

theo tû lÖ 1:1.

12. §Ó trong tñ l¹nh s©u 1,5- 2 h. 13. Ly t©m ë 4P 14. Röa tña b»ng cån 70% vµ ly t©m ë 4 P PC víi 11000 vßng/phót trong 10 phót 15. Lµm kh« ADN, hoµ tan ADN b»ng 200μl dung dÞch TE 0,1X hoÆc n−íc

PC trong 3 giê.

0 16. Lo¹i ARN Thªm 2μl RNase 10mg/ml , ñ 37P

®· khö trïng vµ ®Ò ion.

C¸c b−íc tiÕp theo lµm t−¬ng tù tõ b−íc 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. §Ó kiÓm tra nång ®é, tÝnh toµn vÑn cña ADN t¸ch ®−îc chóng t«i sö dông

ph−¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose 1% . 3.2.3. Ph−¬ng ph¸p kiÓm tra sù cã mÆt cña ®o¹n Promoter 35S vµ gen PAT trong c©y ng« kh¸ng thuèc diÖt cá

Sau khi kiÓm tra hµm l−îng ADN ng«, chóng t«i tiÕn hµnh pha lo·ng c¸c mÉu ADN ng« tæng sè cã nång ®é cao ®Ó ®¹t ®−îc hµm l−îng cuèi cïng lµ 50ng/μl ®©y lµ nång ®é thÝch hîp ®Ó lµm ph¶n øng PCR.

C¸c ph¶n øng PCR ®−îc thùc hiÖn trong thiÕt bÞ Eppendorf Mastercycler

gradient (96 giÕng), víi thÓ tÝch cuèi cïng lµ 15 μl/ph¶n øng.

– Thµnh phÇn ph¶n øng cho mét mÉu ADN:

1,5 μl 1 μl 0,6 μl 0,6 μl ®èi víi måi 35S1/35S2 1,2 μl ®èi víi måi PA01/CM03 0,2 μl 1 μl

Buffer 2+ MgP dNTPs 10 mM Måi xu«i vµ måi ng−îc Taq DNA polymerse ADN Bæ sung n−íc cÊt khö trïng ®· lo¹i ion tíi thÓ tÝch cuèi cïng lµ 15 μl

-37-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

0 CÆp måi 35S1/35S2: BiÕn tÝnh ë 94P

PC trong 5 phót (t¸ch m¹ch ADN

0 khu«n), ch¹y 40 chu kú lÆp l¹i víi 94P

0 PC trong 30 gi©y, 58P

PC trong 30 gi©y (g¾n

0 måi), 72P

0 PC trong 30 gi©y (kÐo dµi), cuèi cïng ph¶n øng ®−îc gi÷ ë 72P

PC trong 6

– Ph¶n øng ®−îc ch¹y víi chu tr×nh nhiÖt cña tõng cÆp måi nh− sau:

0 CÆp måi PA01/CM03: BiÕn tÝnh ë 95P

PC trong 5 phót (t¸ch m¹ch ADN

0 khu«n), ch¹y 40 chu kú lÆp l¹i víi 95P

0 PC trong 20 gi©y, 60P

PC trong 40 gi©y (g¾n

0 måi), 72P

0 PC trong 1 phót (kÐo dµi), cuèi cïng ph¶n øng ®−îc gi÷ ë 72P

PC trong 5

phót (hoµn thµnh chuçi ph¶n øng).

S¶n phÈm sau khi thùc hiÖn ph¶n øng PCR ®em ®i ®iÖn di trªn gel agarose

1% (0,4 g agarose, 40ml dung dÞch TAE 1X, 2,5μl Ethidium bromide) víi

marker chuÈn ADN 1kb.

-38-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

3.2.4. Ph−¬ng ph¸p PCR_RAPD

Thµnh phÇn cña hçn hîp ph¶n øng PCR_RAPD gåm:

1,5 μl 1 μl 0,6 μl 1,2 μl 0,2 μl 1 μl

Buffer 2+ MgP dNTPs 10 mM Måi RAPD Taq DNA polymerse ADN Bæ sung n−íc cÊt khö trïng ®· lo¹i ion tíi thÓ tÝch cuèi cïng lµ 15 μl

Ph¶n øng ®−îc ch¹y víi chu tr×nh nhiÖt cña tõng måi nh− sau:

3.2.5. Ph−¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel Agarose

Khi tiÕn hµnh ®iÖn di th× cÇn ph¶i lµm hiÖn h×nh c¸c ph©n tö ADN trªn

gel. §èi víi gel Agarose th× ta dïng thuèc nhuém ethidium bromide. ChÊt nµy

sÏ g¾n xen vµo gi÷a c¸c base cña ph©n tö ADN vµ ph¸t huúnh quang khi chiÕu

tia tö ngo¹i.

PC), bæ sung 2,5 μl EtBr.

C¸ch tiÕn hµnh:

– C©n 0,4g agarose cho vµo b×nh tam gi¸c. – LÊy 40ml dung dÞch TAE 1X cho vµo b×nh tam gi¸c trªn. – §un ®Õn khi agarose tan hÕt vµo dung dÞch. o – §Ó nguéi (kho¶ng 65P – §Æt l−îc vµo khay, ®æ gel vµo ®Ó nguéi ®Õn khi gel ®«ng l¹i th× chuyÓn khay chøa b¶n gel vµo m¸y ®iÖn di vµ cho ®Öm ch¹y TAE 1X vµo buång ®iÖn di sao cho ®Öm ngËp b¶n gel kho¶ng 0,5-1 cm.

-39-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

– Tra mÉu: MÉu ®−îc nhuém víi Xanhmetylen (loading dye), tra vµo giÕng. – Maker ®−îc tra vµo mét trong sè c¸c giÕng ®Ó cã thÓ x¸c ®Þnh chiÒu dµi

c¸c mÉu.

– Ch¹y ®iÖn di: Sau khi tra mÉu ®iÖn di xong, m¸y ®iÖn di ®−îc kÕt nèi víi

bé nguån. §Æt 50V, 90mA. Thêi gian ch¹y kho¶ng 20 -30 phót.

– Quan s¸t: Gel ®−îc soi d−íi ®Ìn tö ngo¹i, ADN sÏ ®−îc ph¸t s¸ng nhê

liªn kÕt víi EtBr. – Chôp ¶nh.

3.2.6. C¸c ph−¬ng ph¸p tÝnh to¸n vµ sö lý sè liÖu

(cid:153) Ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch vµ xö lý sè liÖu: C¸c sè liÖu thu thËp ®−îc xö lý

theo ph−¬ng ph¸p thèng kª sinh häc trªn nÒn Excel version 5.0

(cid:153) Ph©n tÝch kÕt qu¶ PCR_RAPD b»ng NTSYSpc 2.1: C¬ së d÷ liÖu cña NTSYSpc lµ ch−¬ng tr×nh m¸y tÝnh ®Ó tù ®éng thiÕt lËp nªn s¬ ®å c©y biÓu hiÖn mèi quan hÖ hay ®é t−¬ng ®ång di truyÒn gi÷a chóng víi nhau. C¬ së d÷ liÖu cña ch−¬ng tr×nh nµy dùa vµo hÖ m· nhÞ ph©n (0,1) ®Ó ®¸nh gi¸ sù v¾ng mÆt (ghi 0) hoÆc sù cã mÆt (ghi 1) cña c¸c b¨ng ®a h×nh ADN theo thang ADN chuÈn (ADN marker). D÷ liÖu nµy còng cho phÐp thiÕt lËp ma trËn t−¬ng ®ång (Similar matrix) hoÆc ma trËn kho¶ng c¸ch (Distance matrix). ViÖc tÝnh to¸n ma trËn t−¬ng ®ång ®−îc dùa theo c«ng thøc:

2nBijB JBij B= nBi B+nBjB

Trong ®ã nBijB lµ sè b¨ng ADN cã ë c¶ hai mÉu i vµ j nBiB vµ nj lµ tæng sè b¨ng RAPD cña tõng c¸ thÓ i vµ j t−¬ng øng JBijB lµ hÖ sè t−¬ng dång gi÷a hai mÉu i vµ j Tr×nh tù tiÕn hµnh ph©n tÝch kÕt qu¶ PCR_RAPD b»ng NTSYS

– KÕt qu¶ PCR_RAPD ®−îc nhËp vµo ch−¬ng tr×nh excel theo nguyªn t¾c

lµ nÕu kh«ng xuÊt hiÖn b¨ng ghi "0", nÕu xuÊt hiÖn ghi b¨ng "1".

– Sè liÖu ®−îc xö lý tiÕp trong ch−¬ng tr×nh Notepad. – Ma trËn t−¬ng ®ång vµ s¬ ®å h×nh c©y ®−îc x©y dùng sau khi xö lý trong

NTSYSpc 2.1

-40-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

IV. KÕt Qu¶ Vμ Th¶o LuËn

4.1. KÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN

T¸ch chiÕt axit nucleic lμ c«ng viÖc ®Çu tiªn ®ãng vai trß quan träng trong

c«ng nghÖ ADN. Nhê tiÕn bé vμ sù ®æi míi c«ng nghÖ mμ t¸ch chiÕt axit

nucleic ngμy nay ®· trë nªn ®¬n gi¶n. HiÖn nay cã rÊt nhiÒu ph−¬ng ph¸p t¸ch

chiÕt ADN tæng sè cña mÉu thùc vËt. Tuy nhiªn ®èi víi tõng ®èi t−îng mÉu thùc

vËt nhÊt ®Þnh cÇn cã ph−¬ng ph¸p riªng. Do vËy, viÖc lùa chän vμ c¶i tiÕn

ph−¬ng ph¸p cho phï hîp víi ®èi t−îng cña m×nh lμ ®iÒu rÊt cÇn thiÕt vμ quan

träng.

Trong nghiªn cøu nμy, chóng t«i ®· lùa chän ph−¬ng ph¸p cã sö dông

CTAB cña Hugo vµ CS (1995) cã c¶i tiÕn ®Ó tiÕn hμnh t¸ch chiÕt ADN tæng sè

tõ 180 mÉu ng« nghiªn cøu. MÉu ADN sau khi t¸ch chiÕt ®−îc kiÓm tra nång ®é

vµ tÝnh toµn vÑn cña chóng trªn gel agarose 1%, ch¹y trong 30 phót ë hiÖu ®iÖn

thÕ 50V. Sau ®ã kÕt qu¶ ®−îc quan s¸t trªn m¸y soi UV vµ chôp l−u l¹i ¶nh

(h×nh 7).

H×nh 7: KÕt qu¶ kiÓm tra ADN tæng sè cña 34/180 mÉu ng« nghiªn cøu

Qua ph©n tÝch ¶nh ®iÖn di cho thÊy nång ®é ADN cña c¸c mÉu t−¬ng ®èi

lµ ®ång ®Òu vµ kh«ng bÞ ®øt g·y. MÆt kh¸c kh«ng thÊy xuÊt hiÖn c¸c vÕt s¸ng

-41-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

ARN phÝa d−íi, ®iÒu ®ã chøng tá ARN ®· ®−îc lo¹i bá hoµn toµn khái dÞch

chiÕt ADN.

4.2. KÕt qu¶ nhËn biÕt ®o¹n Promoter 35S cã trong c©y ng« kh¸ng thuèc diÖt cá

Sau khi t¸ch chiÕt vµ kiÓm tra nång ®é ADN chóng t«i kiÓm tra sù cã mÆt

cña Promoter 35S víi cÆp måi 35S1/35S2 b»ng ph−¬ng ph¸p PCR (Víi cÆp måi

35S1/35S2 x¸c ®Þnh ®−îc tr×nh tù ®Æc tr−ng cña promoter 35S cã ®é dµi 195 bp).

KÕt qu¶ ch¹y ®iÖn di s¶n phÈm PCR cho thÊy: cã 14/180 mÉu ADN

(14/180 dßng ng« nghiªn cøu) cho kÕt qu¶ d−¬ng tÝnh ®ã lµ c¸c mÉu: CG3-D1,

CG4-D1, CG3-D2, CG3-D3, CG3-D4, CG3-D5, CG3-D6, CG3-D7, CG3-D8,

CG3-D9, CG4-D2, CG3-D10, CG3-D11vµ CG3-D12 (14 mÉu ®−îc kiÓm tra l¹i

vµ ch¹y chung trªn mét b¶n gel - h×nh 8). C¸c mÉu nµy ®Òu xuÊt hiÖn b¨ng cã

kÝch th−íc 195 bp gièng nh− mÉu d−¬ng tÝnh chuÈn (ADN cña plasmid

pART27, plasmid nµy cã chøa promoter CaMV 35S).

M1 kb: Marker chuÈn 1kb

§C (-): MÉu ®èi chøng ©m tÝnh (HB2BO)

§C (+): MÉu ®èi chøng d−¬ng tÝnh

H×nh 8: KÕt qu¶ s¶n phÈm PCR víi cÆp måi 35S1/35S2 cña 14 mÉu ng«

-42-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

4.4. KÕt qu¶ nhËn biÕt sù cã mÆt cña gen PAT kh¸ng thuèc diÖt cá

14 mÉu d−¬ng tÝnh víi cÆp måi 35S1/35S2 tiÕp tôc ®−îc kiÓm tra víi cÆp

måi PA01/CM03 ®Ó x¸c ®Þnh ®o¹n tr×nh tù ®Æc tr−ng cã ®é dµi 231 bp cña gen

kh¸ng thuèc diÖt cá PAT.

Gen PAT (Phospinotricin acetyltransferase) lµ mét trong nh÷ng gen

kh¸ng thuèc trõ cá còng ®· ®−îc chÌn vµo mét sè gièng c©y trång nh− ng«, ®Ëu

t−¬ng vµ mét sè gièng c©y trång kh¸c. Ng−êi ta ®· chøng minh r»ng gen PAT

cã mÆt trong ng« chuyÓn gen T25, gièng ng« nµy ®· ®−îc ph¸t triÓn ®Ó chèng

chÞu thuèc trõ cá Ammonium glufosinate. Gen nµy ®· ®−îc ph¸t hiÖn nhê cÆp

måi 2F/2R khuyÕch ®¹i ®o¹n 262bp th«ng qua PCR multipex (Hugo

R.Permingeat & CS, in press). Vµ mét cÆp måi kh¸c còng ®· ®−îc thiÕt kÕ ®Ó

khuyÕch ®¹i tr×nh tù 231 bp trªn vïng gen cÊu tróc cña gen PAT, ®ã lµ primers

PA01/CM03 vµ chóng t«i còng sö dông cÆp måi nµy ®Ó khuÕch ®¹i ®o¹n tr×nh tù

dµi 231 bp trªn vïng gen cÊu tróc cña gen PAT ë c¸c mÉu ng« thÝ nghiÖm.

S¶n phÈm PCR ®−îc kiÓm tra trªn gel agarose 1% cã ethidium bromide

víi ®Öm TAE 1X, ch¹y ®iÖn di trong 30 phót ë dßng ®iÖn 50V. Sö dông marker

chuÈn ADN 1Kb ®Ó so s¸nh vµ kÕt qu¶ ®−îc quan s¸t trùc tiÕp trªn m¸y soi UV,

chôp ¶nh l−u trong m¸y tÝnh.

KÕt qu¶ kiÓm tra víi cÆp måi PA01/CM03 cho thÊy cã sù xuÊt hiÖn 7

b¨ng kÝch th−íc 231 bp ®ã lµ c¸c mÉu CG3-D1, CG4-D1, CG3-D2, CG3-D3,

CG3-D5, CG3-D8, CG4-D2, (h×nh 14). 7 mÉu d−¬ng tÝnh víi cÆp måi

35S1/35S2 nh−ng ©m tÝnh víi cÆp måi PA01/CM03 (CG3-D4, CG-D6, CG3-D7,

CG3-D9, CG3-D10, CG3-D11, CG3-D12) ®ang tiÕp tôc ®−îc kiÓm tra víi c¸c

cÆp måi kh¸c ®Ó x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng kh¸ng víi nhãm thuèc trõ cá nµo, tr−íc khi

bè trÝ thÝ nghiÖm phun thuèc diÖt cá.

Nh÷ng mÉu c©y ng« d−¬ng tÝnh víi cÆp måi PA01/CM03 (cã gen PAT)

sÏ ®−îc kiÓm tra kh¶ n¨ng kh¸ng thuèc diÖt cá ë ngoµi ®ång ruéng b»ng ph−¬ng

ph¸p thÝ nghiÖm phun thuèc diÖt cá Ammonium glufosinate ®Ó kiÓm tra sù biÓu

-43-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

hiÖn cña gen PAT vµ chän läc nh÷ng dßng ng« kh¸ng thuèc trõ cá phôc vô thÝ

nghiÖm lai backross.

M1kb: Marker chuÈn 1kb

§C (–): MÉu ®èi chøng ©m tÝnh (HB2BO)

H×nh 9: KÕt qu¶ s¶n phÈm PCR víi cÆp måi PA01/CM03 ph¸t hiÖn gen PAT cña c¸c mÉu ng«

4.5. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ®a ®¹ng di truyÒn cña c¸c dßng ng« thuÇn mang gen kh¸ng thuèc diÖt cá ®−îc t¹o ra tõ nguån vËt liÖu ban ®Çu

Tõ c¸c nguån vËt liÖu thu thËp, chóng t«i ®· x¸c ®Þnh ®−îc nguån vËt liÖu

CG4 lµ dßng thuÇn di truyÒn æn ®Þnh qua c¸c thÕ hÖ. Nguån vËt liÖu CG3 di

truyÒn ch−a æn ®Þnh cã thÓ lµ gièng lai hoÆc vËt liÖu ®−îc chuyÓn gen ch−a

thuÇn. §èi víi nguån vËt liÖu CG4 lµ dßng thuÇn võa mang gen kh¸ng s©u võa

mang gen kh¸ng thuèc diÖt cá, chóng t«i tiÕp tôc tù thô vµ sib ®Ó gi÷ dßng. §èi

víi nguån vËt liÖu ch−a thuÇn, chóng t«i tiÕn hµnh tù thô x¸c ®Þnh c¸c vËt liÖu

mang gen kh¸ng thuèc diÖt cá b»ng kü thuËt PCR ë giai ®o¹n sím cña c©y con ë

mçi thÕ hÖ. TÊt c¶ c¸c c©y mang gen kh¸ng thuèc diÖt cá tiÕp tôc ®−îc tù thô vµ

kiÓm tra sù cã mÆt cña gen kh¸ng thuèc diÖt cá ë c¸c thÕ hÖ tiÕp theo, ®Ó t¹o

dßng thuÇn mang gen kh¸ng thuèc diÖt cá. Sau 4 thÕ hÖ tù thô, trong tæng sè

-44-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

180 dßng thu ®−îc cã 14 dßng cã kh¶ n¨ng kh¸ng thuèc trõ cá (b¶ng 5) ®· ®−îc

®¸nh gi¸ mét sè ®Æc ®iÓm n«ng sinh häc chÝnh vµ ®¸nh gi¸ ®a d¹ng di truyÒn

phôc vô c«ng t¸c backcross (lai ng−îc) nh»m t¹o ra c¸c dßng ng« thuÇn mang

gen kh¸ng thuèc diÖt cá cã ®Æc ®iÓm n«ng sinh häc tèt, cã triÓn väng trong c«ng

t¸c t¹o gièng ng« lai kh¸ng thuèc diÖt cá.

B¶ng 5: C¸c dßng gièng ng« thuÇn kh¸ng thuèc diÖt cá ®−îc t¹o ra tõ c¸c nguån vËt liÖu ban ®Çu

TT Tªn dßng §Æc tÝnh Nguån gèc thu nhËp

Tõ nguån CG3 1 CG3-D1 Kh¸ng thuèc diÖt cá

Tõ nguån CG3 3 CG3-D2 Kh¸ng thuèc diÖt cá

Tõ nguån CG3 4 CG3-D3 Kh¸ng thuèc diÖt cá

Tõ nguån CG3 5 CG3-D4 Kh¸ng thuèc diÖt cá

Tõ nguån CG3 6 CG3-D5 Kh¸ng thuèc diÖt cá

Tõ nguån CG3 7 CG3-D6 Kh¸ng thuèc diÖt cá

Tõ nguån CG3 8 CG3-D7 Kh¸ng thuèc diÖt cá

Tõ nguån CG3 9 CG3-D8 Kh¸ng thuèc diÖt cá

Tõ nguån CG3 10 CG3-D9 Kh¸ng thuèc diÖt cá

Tõ nguån CG3 12 CG3-D10 Kh¸ng thuèc diÖt cá

Tõ nguån CG3 13 CG3-D11 Kh¸ng thuèc diÖt cá

Tõ nguån CG3 14 CG3-D12 Kh¸ng thuèc diÖt cá

-45-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

4.5.1. §a d¹ng di truyÒn ë møc h×nh th¸i vµ mét sè ®Æc ®iÓm n«ng sinh häc chÝnh cña c¸c dßng ng« mang gen kh¸ng thuèc diÖt cá

14 dßng nghiªn cøu®−îc bè trÝ theo khèi ngÉu nhiªn trong ®iÒu kiÖn

kiÓm so¸t chÆt chÏ, mçi dßng gieo thµnh 3 hµng dµi 5m, kho¶ng c¸ch gieo lµ

tiÕn hµnh ®¸nh gi¸ qua c¸c thÝ nghiÖm so s¸nh, kÕt qu¶ chØ ra ë b¶ng 6.

B¶ng 6: Mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i vµ ®Æc ®iÓm n«ng sinh häc chÝnh cña c¸c dßng gièng ng« kh¸ng thuèc diÖt cá (vô Thu §«ng 2007)

§Æc ®iÓm kh¸c

Sè l¸ TB

Mµu cê

Mµu r©u

Tªn dßng

Dµi cê TB (cm)

Mµu d¹ng h¹t

Cao b¾p TB (cm)

Thêi gian sinh tr−ëng (ngµy)

CG3-D1

110

104,8

50,3

26,6

Hång

Tr¾ng xanh

§V, LT, RN

CG4-D1

115

89,2

43,3

14,1

N©u

Hång §V, L§

91,8

53,0

24,3

Hång §V, LT

CG3-D2

110

Tr¾ng xanh

102,2

38,2

27,4

Tr¾ng

CG3-D3

110

86,6

44,9

21,6

Hång

CG3-D4

110

§V. LT. BRN

Tr¾ng xanh

CG3-D5

110

105,2

46,4

27,0

Hång §V, LT

Tr¾ng xanh

102,6

51,2

24,8

Tr¾ng

Hång §V, LT

CG3-D6

110

112,1

56,6

33,4

Tr¾ng

CG3-D7

110

111,3

48,8

31,8

Tr¾ng

CG3-D8

110

Hång §V, LT

CG3-D9

110

98,6

57,8

28,4

Tr¾ng xanh

CG4-D2

115

86,2

51,0

13,2

N©u

Hång §V, L§

Hång §V, LT

CG3-D10

110

108,4

54,0

26,0

Tr¾ng xanh

24,3

CG3-D11

110

102,6

52,2

Tr¾ng xanh

CG3-D12

110

112,4

48,6

32,0

Tr¾ng

§V: ®¸ vµng; LT: lâi tr¾ng; L§: lâi ®á; BRN: b¸n r¨ng ngùa

-46-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

Nh×n chung c¸c dßng ng« nghiªn cøu cã thêi gian sinh tr−ëng tõ 110-115

ngµy ë (vô Thu §«ng 2007), c¸c dßng ng« nghiªn cøu cã chiÒu cao trung b×nh

kÐm. C¸c dßng ng« nµy kh«ng thÓ sö dông trùc tiÕp vµo c¸c thÝ nghiÖm t¹o

gièng lai.

+ Måi OPA12

H×nh 10: KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm PCR_RAPD víi ®o¹n måi OPA12 C¸c giÕng tõ 1-14 t−¬ng øng víi thø tù c¸c dßng ng«

KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm PCR_RAPD (h×nh 10) cña 14 dßng ng« víi måi

(CG3-D2) xuÊt hiÖn 2 b¨ng c¸ biÖt kÝch th−íc kho¶ng 400 bp, 1600 bp vµ 4

b¨ng v¾ng mÆt (duy nhÊt) ë c¸c vÞ trÝ 1000 bp, 1100 bp, 1400 bp vµ 1500 bp.

-47-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

TÝnh ®a h×nh ®−îc thÓ hiÖn ë sù xuÊt hiÖn hay kh«ng xuÊt hiÖn b¨ng ADN khi

so s¸nh gi÷a c¸c dßng víi nhau. ë måi OPA12 c¶ 11 b¨ng ®Òu cho ®a h×nh.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 Tæng 7 Thø tù c¸c dßng 9 6 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 8 7 10 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 8 8 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 7 5 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 9 4 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 5 3 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 2 2 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 6 14 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 7 11 12 13 7 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 7 6 7 7 (sè 1 lµ ®o¹n ADN ®−îc nh©n, Sè 0 lµ ®o¹n ADN kh«ng ®−îc nh©n)

+ Måi OPM12

H×nh 11: KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm PCR_RAPD víi ®o¹n måi OPM12

-48-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm PCR_RAPD cña c¸c dßng ng« víi måi OPM12

1 2 3 4 5 Tæng

11 0 0 1 0 0 1

12 0 0 1 0 1 2

10 0 1 1 0 0 2

4 0 0 0 1 0 1

5 1 1 1 0 0 3

2 0 0 1 0 1 2

8 0 0 0 0 0 0

13 0 0 0 1 1 2

14 0 0 1 0 0 1

Thø tù c¸c dßng 9 6 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 3 3 0 0 0 0 0 0

+ Måi S208

H×nh 12: KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm PCR_RAPD víi ®o¹n måi S208

KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm PCR_RAPD cña c¸c dßng ng« víi måi S208 cã

-49-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

biÖt kÝch th−íc kho¶ng 1700 bp.

1 2 3 4 5 6 7 Tæng

11 0 1 1 1 1 1 1 6

10 0 0 0 1 1 0 1 3

2 0 1 0 1 1 0 0 3

3 0 1 1 1 1 0 1 5

4 0 1 0 1 1 0 1 4

5 0 0 0 1 1 0 1 3

8 0 1 0 1 1 1 1 5

1 0 0 0 1 1 0 0 2

13 0 0 0 1 1 0 1 3

14 0 0 1 0 0 0 0 1

Thø tù c¸c dßng 9 6 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 4 4

B¶ng 10: Thèng kª c¸c måi xuÊt hiÖn b¨ng ®a h×nh

Tªn måi

TT 1 OPA12 2 S202 3 OPA15 4 S201 5 OPM12 6 OPM9 7 OPA18 8 BIO12 9 S208 OPM18 10 Sè måi ®a h×nh lµ 10 §¬n h×nh 0 0 1 2 0 0 0 0 2 0 5 §a h×nh 11 3 6 0 5 2 8 4 5 6 46 B¨ng c¸ biÖt 2 0 1 0 1 0 0 0 1 0 5

nhãm OPA, OPM, BIO vµ nhãm S cho thÊy cã 10 måi cho b¨ng ®a h×nh râ nhÊt

-50-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

®ã lµ c¸c måi: OPA12, S202, OPA15, S201, OPM12, OPM9, OPA18, BIO12,

thuËt PCR_RAPD víi 10 måi chØ ra ë b¶ng 11.

B¶ng 11: KÕt qu¶ PCR-RAPD cña c¸c dßng ng« víi 10 måi cho b¨ng ®a h×nh

Sè b¨ng ADN thu ®−îc trªn tõng måi

T T

S202 OPA15

CG3-D1

CG4-D1

CG3-D2

CG3-D3

CG3-D4

CG3-D5

CG3-D6

CG3-D7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 CG3-D8 10 CG3-D9 11 CG4-D2 12 CG3-D10 13 CG3-D11 14 CG3-D12

Tæng

Tªn dßng OPA12 7 6 2 5 9 7 7 7 8 8 7 6 7 7 93

0 1 0 0 0 1 0 0 0 3 0 3 2 1 11

S201 OPM12 OPM9 OPA18 BIO12 S208 OPM18 4 8 4 6 7 7 6 7 0 6 6 6 7 6 80

2 2 0 1 3 3 2 0 1 2 1 2 2 1 22

0 1 0 0 1 1 1 0 0 2 2 1 1 0 10

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 28

3 4 3 1 2 0 2 3 2 3 2 4 3 2 34

2 3 5 4 3 4 4 5 4 3 6 3 3 3 52

0 6 1 1 3 2 0 0 3 5 4 4 3 2 34

Tæng 25 38 19 25 35 32 31 31 27 39 33 33 32 27 427

5 5 2 5 5 5 7 7 7 5 3 2 2 3 63

®−îc tæng sè 427 b¨ng thuéc 56 lo¹i b¨ng cã kÝch cì kh¸c nhau. Trong ®ã, cã

51 b¨ng cho ®a h×nh chiÕm 91,07%, 5 b¨ng ®¬n h×nh chiÕm 8,93%. KÝch th−íc

b¨ng cã chiÒu dµi nhá nhÊt kho¶ng 200 bp vµ b¨ng cã kÝch th−íc lín nhÊt

kho¶ng 4000bp. XuÊt hiÖn 5 b¨ng c¸ biÖt trong ®ã cã 2 b¨ng chØ xuÊt hiÖn duy

nhÊt ë mét mÉu vµ 3 b¨ng khuyÕt ë 1 mÉu duy nhÊt cßn xuÊt hiÖn ë c¶ 13 dßng

sè 3 (CG3-D2) xuÊt hiÖn 2 b¨ng c¸ biÖt kÝch th−íc kho¶ng 400 bp, 1600 bp vµ 4

b¨ng v¾ng mÆt (duy nhÊt) ë c¸c vÞ trÝ 1000 bp, 1100 bp, 1400 bp vµ 1500 bp;

-51-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

mÉu CG3-D12 xuÊt hiÖn b¨ng c¸ biÖt kÝch th−íc kho¶ng 2100 bp; Måi S208

c¶ 10 måi lµ 42,7 b¨ng/måi

phÇn mÒm NTSYSpc 2.02, tõ ®ã chóng t«i thiÕt lËp ®−îc b¶ng hÖ sè t−¬ng

kh¸ng thuèc diÖt cá (h×nh 13).

B¶ng 12: HÖ sè t−¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c dßng ng« kh¸ng thuèc diÖt cá

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 1.00 2 0.57 1.00 3 0.41 0.42 1.00 4 0.51 0.53 0.51 1.00 5 0.57 0.62 0.42 0.50 1.00 6 0.54 0.66 0.41 0.72 0.55 1.00 7 0.69 0.60 0.47 0.64 0.69 0.70 1.00 8 0.64 0.60 0.51 0.64 0.65 0.57 U0.77U 1.00 9 0.57 0.47 U0.35U 0.48 0.63 0.43 0.56 0.56 1.00 10 0.52 0.63 0.41 0.42 0.72 0.47 0.55 0.59 0.57 1.00 11 0.56 0.65 0.48 0.52 0.65 0.54 0.56 0.60 0.50 0.63 1.00 12 0.52 0.65 0.48 0.41 0.58 0.51 0.56 0.48 0.39 0.71 0.60 1.00 13 0.50 0.59 0.50 0.54 0.67 0.56 0.61 0.57 0.43 0.65 0.58 0.75 1.00 14 0.57 0.51 0.48 0.52 0.63 0.55 0.61 0.61 0.50 0.60 0.57 0.66 0.68 1.00

-52-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

Qua b¶ng 12 vµ h×nh 13 cho thÊy hÖ sè t−¬ng ®ång di truyÒn cña 14 dßng

ng« kh¸ng thuèc diÖt cá ë tõng cÆp dao ®éng tõ 0,35 ®Õn 0,77. Hai dßng sè 7

(CG3-D6) vµ sè 8 (CG3-D7) cã hÖ sè t−¬ng ®ång di truyÒn cao nhÊt lµ 0,77.

Dßng sè 2 (CG4-D1) vµ sè 11 (CG4-D2) cã cïng nguån gèc tõ dßng thuÇn CG4

cã hÖ sè t−¬ng ®ång kh¸ cao lµ 0,65 (phï hîp víi c¸c nghiªn cøu ®¸nh gi¸ vÒ

h×nh th¸i). Dßng sè 3 (CG3-D2) cã nguån gèc tõ nguån vËt liÖu CG3 vµ dßng

sè 11 (CG4-D1) cã nguån gèc tõ CG4 cã hÖ sè t−¬ng ®ång thÊp nhÊt lµ 0,35.

HÖ sè t−¬ng ®ång di truyÒn gi÷a c¸c cÆp dßng dao ®éng tõ 0,35 ®Õn 0,77

chøng tá c¸c dßng ng« t¹o ra tõ c¸c nguån vËt liÖu ban ®Çu rÊt ®a d¹ng vµ phong

phó. Qua kÕt qu¶ sö lý sè liÖu cho thÊy ë møc t−¬ng ®ång 55% cã thÓ chia 14

dßng ng« kh¸ng thuèc trõ cá thµnh 4 nhãm −u thÕ lai:

Nhãm 1 gåm 5 dßng: dßng sè 1 (CG3-D1), sè 4 (CG3-D3), sè 6 (CG3-

D5), sè 7(CG3-D6) vµ dßng sè 8 (CG3-D7) ®−îc chia lµm 2 nhãm phô:

Nhãm 1.1: gåm 3 dßng sè 1, sè 7 vµ sè 8. C¶ 3 dßng ®Òu cã nguån gèc tõ

nguån vËt liÖu ban ®Çu lµ CG3. HÖ sè t−¬ng ®ång cña tõng cÆp dßng trong nhãm

-53-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

rÊt cao dao ®éng tõ 0,64-0,77. Trong ®ã hai dßng sè 7 vµ sè 8 cã hÖ sè t−¬ng

®ång di truyÒn cao nhÊt lµ 0,77

Nhãm 1.2 gåm cã 2 dßng sè 4 vµ dßng sè 6 cã nguån gèc tõ nguån vËt

liÖu ban ®Çu lµ CG3 cã hÖ sè t−¬ng ®ång rÊt cao lµ 0,72

Nhãm 2 gåm 7 dßng: dßng sè 2 (CG4-D1), sè 11 (CG4-D2), sè 5 (CG3-

D4), sè 10 (CG3-D9), sè 12 (CG3-D10), sè 13 (CG3-D11) vµ dßng sè 14 (CG3-

D12) trong ®ã dßng sè 2 vµ dßng sè 11 cã nguån gèc tõ CG4, c¸c dßng cßn l¹i

cã nguån gèc tõ CG3, vµ ®−îc chia lµm 3 nhãm phô:

Nhãm 2.1: gåm cã dßng sè 2 vµ dßng sè 11 cã hÖ sè t−¬ng ®ång kh¸ cao

lµ 0,65

Nhãm 2.2: gåm cã dßng sè 5 vµ dßng sè 10 cã hÖ sè t−¬ng ®ång rÊt cao

lµ 0,72

Nhãm 2.3: gåm cã 3 dßng sè 12 , dßng sè 13 vµ sè 14 cã hÖ sè t−¬ng

®ång tõng cÆp rÊt cao dao ®éng tõ 0,66-0,75.

Nhãm 3: chØ cã duy nhÊt dßng sè 9 (CG3-D8) cã hÖ sè t−¬ng ®ång víi

c¸c dßng cßn l¹i dao ®éng tõ 0,35-0,63, trong ®ã hÖ sè t−¬ng ®ång thÊp nhÊt lµ

0,35 gi÷a dßng sè 9 vµ dßng sè 3.

Nhãm 4: chØ cã duy nhÊt dßng sè 3 (CG3-D2) cã hÖ sè t−¬ng ®ång víi

c¸c dßng cßn l¹i rÊt thÊp dao ®éng tõ 0,35-0,51.

nhau vÒ ®Æc ®iÓm h×nh th¸i vμ sù kh¸c biÖt di truyÒn gi÷a c¸c dßng ng«. C¸c

dßng cã cïng nguån gèc th−êng cã quan hÖ gÇn gòi víi nhau vμ ë cïng mét

nhãm. Nh÷ng dßng cã hÖ sè t−¬ng ®ång di truyÒn thÊp lµ nh÷ng dßng cã nguån

gèc kh¸c nhau.

thiÕt kÕ s¬ ®å lai backcross nh»m t¹o ra ®−îc c¸c dßng ng« −u viÖt mang gen

kh¸ng thuèc trõ cá phôc vô c«ng t¸c t¹o gièng ng« lai kh¸ng thuèc trõ cá.

-54-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

PhÇn V. KÕt LuËn Vμ KiÕn NghÞ

5.1. KÕt luËn

– §· t¸ch chiÕt ®−îc 180 mÉu ADN cña 180 dßng ng«.

– §· x¸c ®Þnh ®−îc sù cã mÆt promoter 35S cã kÝch th−íc 195bp cña

14/180 dßng ng« ë thÕ hÖ thø 4 ®−îc t¹o ra b»ng c¸ch tù thô c−ìng bøc tõ 2

nguån vËt liÖu CG3 (mang gen kh¸ng thuèc trõ cá) vµ CG4 (mang gen kh¸ng

– §· x¸c ®Þnh ®−îc sù cã mÆt cña gen PAT (®o¹n tr×nh tù ®Æc tr−ng cã ®é

dµi 231 bp) cña dßng ng«.

– §· ®¸nh gi¸ ®−îc mét sè ®Æc ®iÓm h×nh th¸i, chØ tiªu n«ng sinh häc chÝnh

nghiªn cøu phôc vô cho c«ng t¸c backcross t¹o dßng ng« −u viÖt mang gen gen

kh¸ng thuèc trõ cá.

5.1. KiÕn nghÞ

Trong c¸c vô tiÕp theo:

– TiÕp tôc kiÓm tra sù cã mÆt cña c¸c gen kh¸ng thuèc trõ cá kh¸c cña 7

dßng ng« ph¸t hiÖn cã promoter 35S (nh−ng kh«ng cã gen PAT).

– KiÓm tra kh¶ n¨ng kh¸ng thuèc trõ cá cña 7 dßng ng« mang gen PAT

b»ng ph−¬ng ph¸p phun thuèc trõ cá nhãm glufosinate ë ngoµi ®ång ruéng.

– Gi÷ nguån vËt liÖu lµ dßng thuÇn, tiÕp tôc nghiªn cøu t¹o c¸c dßng ng«

thuÇn mang gen kh¸ng thuèc trõ cá phôc vô c«ng t¸c backcross (lai ng−îc) ®Ó

chuyÓn gen kh¸ng thuèc trõ cá sang c¸c dßng ng« −u viÖt nh»m t¹o ra dßng

dßng ng« mang gen kh¸ng thuèc trõ cá cã c¸c ®Æc ®iÓm n«ng sinh häc tèt, phôc

vô c«ng t¸c t¹o gièng ng« lai kh¸ng thuèc trõ cá.

-55-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

VI. Tμi LiÖu THAM Kh¶o

6.1. Tµi liÖu tiÕng ViÖt

1. Bïi M¹nh C−êng (2007). C«ng nghÖ sinh häc trong chän t¹o gièng Ng«.

NXB N«ng nghiÖp.

2. Bïi M¹nh C−êng, TrÇn Hång Uy, P. W. J. Taylor, R. Ford, NguyÔn ThÞ

Thanh, Lª Quý Kha (2000). Nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn cña mét sè

dßng ng« ®−êng b»ng ph−¬ng ph¸p RAPD marker. T¹p chÝ Di truyÒn häc

vµ øng dông, sè 1/2000, tr. 16-22.

®æi gen. LuËn v¨n th¹c sÜ C«ng nghÖ Sinh häc.

hÖ sè di truyÒn víi n¨ng suÊt c¸c tæ hîp lai ë ng« ®−îc thÓ hiÖn th«ng qua

chØ thÞ SSR. T¹p chÝ N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn N«ng th«n, sè 6/2005, tr.

22-25.

tr−êng. T¹p chÝ Sinh häc ngµy nay, sè 28, tr. 17-19.

6. NguyÔn ThÞ Lang (2002). Ph−¬ng ph¸p c¬ b¶n trong nghiªn cøu c«ng

nghÖ sinh häc. NXB N«ng nghiÖp.

7. Ph¹m B×nh QuyÒn, NguyÔn NghÜa Th×n (1999). §a d¹ng sinh häc. NXB

§H Quèc gia HN.

8. KhuÊt H÷u Thanh (2006). Kü thuËt gen: nguyªn lý vµ øng dông. NXB

KHKT.

9. NguyÔn Quang Th¹ch (2005). Gi¸o tr×nh CNSH N«ng nghiÖp. NXB N«ng

nghiÖp.

-56-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

10. Ng« H÷u T×nh, TrÇn Hång Uy, Bïi M¹nh C−êng, Vâ §×nh Long, Lª Quý

vµ qu¸ tr×nh ph¸t triÓn. NXB N«ng nghiÖp.

11. KhuÊt H÷u Trung vµ cs (2007). Nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn tËp ®oµn

nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n, sè 14/2007, tr. 26-30.

biÕn ®æi gen - T×nh h×nh nghiªn cøu øng dông vµ c¸c quan ®iÓm ph¸t

triÓn. Sè 4/2003.

6.2. Tµi liÖu tiÕng Anh

13. Arne Holst-Jensen (2001). GMO detection methods and vatidation.

National Veterinary Institute, Section of Food & Feed Microbiology,

Ullevaalsveien 68, P.O.Box 8156 Dep. 0033 Oslo, Norway.

14. Bertheau Y., Diolez A., Kobilinsky A., Magin K. (2002). Detection

methods and performance criteria for gennetically modified organisms. J

AOAC Int 2002 May-Jun, 85 (3), pp. 801-808.

15. Brodmann P. D., Ilg EC, Berthoud H., Herrmann A (2002). Real-Time

quantitative polymerase chain reaction methods for four genetically

modified maize varieties and maize DNA content in food. J AOAC Int

2002 May-Jun, 85 (3), pp. 646-653.

16. Devos K. M., and Gale M. D. (1992) - The use of Random Amplified

Polymorphic DNA markers in Wheat. Theor. Appl. Genet 84, pp. 567-

572

17. Hsu Y. L., Lih C., Daniel Y. C. S. (2000). Detection of genetically

modifiedsoybeans and maize by the polymerase chain reaction method.

Journal of Food and Drug Analysis, 8 (3), pp. 200-207.

18. Huebner P., Studer E., Luethy J. (1999). Quantitation of genetically

modified organisms in food. Nature Biotechnol, 17, pp. 1137-1138.

-57-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

19. Jaroslava Ovesna, Lenka Dïdicovµ, Jiri Hor¸cek, Eva Sadilov¸, Ladislav

Kucera, Ludmila MÐskov¸ (2002). Comparison of different PCR-based

protocols for detection of Roundup Ready soybean. Czech J.Genet.Plant

Breed, 38(1)/2002, pp. 55-63.

20. Javed Akhter Mohammed Qutub, Norman Burnham, Mohammed Akhtar

(2001). Genetically modified foods :health and safety issues. Annals of

Saudi Medicine, 21 (3-4), pp. 161-164.

21. Keatley K. L., (2000). Controversy over genetically modified organisms:

the governing laws and regulation. Qual Assur 2000 Jan-Mar, 8(1), pp.

33-36.

22. Love J., M. Knight A. M., Mcaleer M. A., and Todd J. A. (1990).

Towards construction of a high resolution map of the mouse genome

using PCRanalyzed microsatellite. Nucl. Acid. Res. 18 (14), pp. 4123 –

4130.

23. Markus L., Anke B., Fabrice E., Lothar K., Heinz S., Guy V., D., E.,

(2000). Validation of a method based on Polymerase chain reaction for

the detection of genetically modified organisms in various processed

foodstuffs. Eur Food Res. Technol 2001, 212, pp. 497-504.

24. Martens (2000). Safety evaluation of genetically modified foods. Int Arch

Environ Health 2000, 73 (Suppl), pp. 14-18.

25. Matsuoka T., H. Kunbara, H. Akiyama, H. Miura, Y. Goda, Y. Kusakabe,

K. Isshiki, M. Toyoda, A. Hino (2001). A multiplex PCR method of

detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified

maize. J. Food Hyg. Soc. Japan, 42, pp. 24-32.

26. McCough S., R. Chen X., Panaud O., Ternykh S., Xu Y., Cho Y., G.

Huang N., Ishii T., and Blair M. (1997). Microsatellite markers

development mapping and application in rice genetics. and breeding,

Plant Mol. Biol. 35, pp. 89 – 99.

-58-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

27. Melody, M. Aguiba (2003). Congress bills press for labeling of GM

products. Manila Bulletin, 8-Mar-2003.

28. Meyer R, F. Chardonnens, P. Hubner, J. Luthy (1996). Polymerase chain

reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food: detection of

soya in processed meat products. Z. Lebensm. Unters. Forsch , 203, pp.

339-344.

29. Mitten D. H., MacDonald R, Klonus D (1999). Regulation of foods

derived from genetically engineered crops. Curr. Opin. Biotechnol, 10,

pp. 298-302.

30. Morgante M., and Olivieri A. M. (1993). PCR-amplified microsatellites

as markers in plant genetics. Plant J.1, pp. 175 – 182.

31. Moseley B. E., (1999). The safety and social acceptance of novel foods.

Int J. Food Microbiol 1999, 50, pp. 25-31.

32. Nobuaki S., Keiko M., Sachiko O., Wataru H., Makoto K., Shigeru U.,

and Kousaku M. (1998). Safety assessment of genetically engineered

food: Detection and monitoring of Glyphosate-tolerant Soybeans Biosci.

Biotechnol. Biochem 1998, 62(7), pp. 1461-1464.

33. Obara-Okeyo P. & S. Kako, 1998. Genetic diversity and identification of

cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic

DNA (RAPD) markers. Euphytica 99, pp. 95-1001.

34. Ramon D (2000). Genetically modified foods: a case of information or

misinformation. Int Microbiol 2000, 3, pp. 1-2.

35. Stewart C., Richards H., and Halthill M. (2000). Transgenic plants and

biosafety: science, misconceptions and public perceptions. Biotechniques,

29/2000, pp. 832-843.

36. Studer E., C. Rhyner, J. Luthy, P. Hubner (1998). Quantitative

competitive PCR for the detection of genetically modified soybeans and

maize. Z. Lebensm. Unters. Forsch , 207(A), pp. 207-213.

-59-

Khãa luËn tèt nghiÖp Bïi V¨n HiÖu

37. Vos P., Hoggers R., Becker M., rejain M., Lee T., Hornes M., Friejtera

P.J., Peleman J., Kuiper M. and Zabeau M. (1995). AFLP: a new

technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acid. Res. 23, pp. 4407 – 4414.

6.3. Website

38. http://Twww.agbiotech.com.vn/T

39. http://www.cast-science.org/

40. http:// www.gmo.gov.vn

41. http://www.isaaa.org

42. http://www.ncst.ac.vn/index.asp

43. http://www.sciencedirect.com

44. http:// www.sinhhocvietnam.com

45. Hhttp://www.vast.ac.vn/H

46. http://www.worldwatch.org/pubs/vs/2002/economy.html

-60-

LUẬN VĂN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÂY NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ BẰNG KĨ THUẬT PCR VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ

Bé Gi¸o dôc vµ ®µo t¹o

Khoa c«ng nghÖ sinh häc

(cid:70) (cid:9) (cid:71)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

§Ò tµi: Nghiªn cøu, x¸c ®Þnh c©y ng« mang gen kh¸ng

thuèc trõ cá b»ng kÜ thuËt PCR vµ ®¸nh gi¸ ®a d¹ng di

truyÒn tËp ®oµn ng« mang gen kh¸ng thuèc trõ cá

KÝch th−íc

®o¹n

Tªn cÆp måi

Tr×nh tù

Gen ®Ých

khuÕch ®¹i

STT Primer

Tr×nh tù nucleotit

STT Primer

Tr×nh tù nucleotit

§Æc ®iÓm kh¸c

Sè l¸ TB

Mµu cê

Mµu r©u

Tªn dßng

Dµi cê TB (cm)

Mµu d¹ng h¹t

Cao c©y TB (cm)

Cao b¾p TB (cm)

Thêi gian sinh tr−ëng (ngµy)

Sè b¨ng ADN thu ®−îc trªn tõng måi

T T

Tªn dßng OPA12 7 6 2 5 9 7 7 7 8 8 7 6 7 7 93

Tài liệu liên quan

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok