ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
NGUYỄN THỊ KIM CHI
PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
\
THÁI NGUYÊN - 2018
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
NGUYỄN THỊ KIM CHI
PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM
Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8.42.01.14
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm
THÁI NGUYÊN - 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi
rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và
chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018
Tác giả
Nguyễn Thị Kim Chi
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã
tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công
trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Di truyền &
Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng DNA ứng dụng, Phòng thí nghiệm
Trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiệm
của đề tài.
Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt
thời gian học tập và thực hiện đề tài luận văn.
Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học của
Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm
- Đại học Thái Nguyên.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018
Tác giả
Nguyễn Thị Kim Chi
ii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC .......................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Phân loại thực vật học và đặc điểm sinh học của cây quýt .......................... 3
1.1.1. Phân loại thực vật học cây quýt ................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây quýt ................................................................ 3
1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt ....................................................... 4
1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid và một số gen, enzyme tham
gia tổng hợp ascorbic acid ở thực vật .................................................................. 6
1.2.1. Ascorbic acid ............................................................................................. 6
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vitamin C ......................................................... 7
1.3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền ....... 11
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 17
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ....................................................................... 17
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 17
2.1.2. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 17
2.2.1. Phương pháp thu mẫu .............................................................................. 17
iii
2.2.2. Phương pháp xác định trình tự gen.......................................................... 17
2.3. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 22
2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn ............................................ 22
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 23
3.1. Nhân bản và giải trình tự gen GDP-D từ DNA của giống quýt BS-LS ..... 23
3.1.1. Kết quả nhân bản gen GDP-D bằng kỹ thuật PCR ................................. 23
3.1.2. Kết quả tách dòng gen GDP-D ................................................................ 24
3.1.3. Đặc điểm của trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS ......... 25
3.2. Sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của
gen GDP-D ........................................................................................................ 30
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 34
1. Kết luận .......................................................................................................... 34
2. Đề nghị ........................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 35
iv
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tiếng Anh
bp base pair
CIAA 24 Chloroform: 1 isoamylalcol
CTAB Cetyl trimetyl amomnium bromide
DEPC Diethyl Pyrocarbonate
DNA Deoxyribonucleotide acid
DNTPs Deoxynucleotide triphosphate
GDP-D GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase
kb kilo base
NCBI National Center for Biotechology Information
PCR Polymerase Chain Reaction
TAE Tris - Acetate - EDTA
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen GDP-D ............................. 19
Bảng 2.2. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen GDP-D ....................... 19
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen GDP-D vào vector tách dòng pBT ..... 20
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng colony - PCR ............................................. 21
Bảng 3.1. Những vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự nucleotide
của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946 ................. 27
Bảng 3.2. Những vị trí amino acid sai khác giữa hai trình tự protein suy
diễn của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946 ........ 29
Bảng 3.3. Trình tự gen mang mã số trên GenBank được sử dụng phân tích .... 30
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của trình tự nucleotide của
gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và các trình tự trên
GenBank ........................................................................................ 31
Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của BS-LS và các trình tự
trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen
GDP-D ........................................................................................... 32
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình1.1. Các dạng Ascorbic acid trong tự nhiên .......................................... 7
Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp Ascorbic acid ............................................. 8
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của mẫu quýt
BS-LS với cặp mồi GDP-D-F và GDP-D-R ................................. 23
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc ................ 24
Hình 3.3. Đặc điểm trình tự nucleotide của mẫu BS-LS thu được bằng
máy xác định trình tự nucleotide tự động ..................................... 25
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D phân lập
từ giống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D trên GenBank
mang mã số HQ224946 ................................................................. 27
Hình 3.5. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự nucleotide của
gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với một số trình tự
gen đã công bố trên GenBank ....................................................... 28
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen GDP-D
phân lập từ giống quýt BS-LS và từ gen GDP-D mang mã số
HQ224946 trên GenBank. ............................................................. 29
Hình 3.7. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của BS-LS với các trình tự
đã công bố trên GenBank dựa trên trình tự nucleotide của gen
GDP-D ........................................................................................... 31
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của BS-LS với các trình tự
đã công bố trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn
của gen GDP-D ............................................................................. 32
vi
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) là giống cây ăn quả được nhiều
người biết đến với vị ngọt thanh, mùi thơm đặc trưng, chứa nhiều vitamin,
khoáng chất và dinh dưỡng cần thiết cho con người. Quýt được khuyến khích
sử dụng hằng ngày bởi các chuyên gia dinh dưỡng.
Quýt không chỉ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng mà còn đóng vai trò
tích cực trong phát triển kinh tế ở nhiều địa phương.Trồng quýt đem lại thu nhập
cao cho các hộ làm vườn so với các cây nông nghiệp khác, trung bình từ 80 - 100
triệu đồng/ha/năm.
Cây quýt được trồng lâu đời ở miền núi phía Bắc Việt Nam có sự thích
nghi sinh thái ở diện hẹp, do đó đòi hỏi khá kỹ tính về điều kiện canh tác, nông
hóa thổ nhưỡng hay tiểu vùng khí hậu. Điều này dễ nhận thấy mỗi loại quýt chỉ
trồng phù hợp trên một địa bàn đặc hữu với các giống thường gặp như quýt sen
(Phú Thọ), quýt hồng (Hà Giang), quýt đường (Lào Cai), quýt Quang Thuận
(Bắc Kạn), quýt Bắc Hà (Lào Cai), quýt giấy (Tuyên Quang), quýt Bắc Sơn
(Lạng Sơn) [4].
Quả quýt chứa hàm lượng vitamin C cao, khoảng 30mg- 36mg vitamin C
trong 100gram quả. Vitamin C tốt cho tóc, da, tiêu hóa, hệ thống miễn dịch và
cân bằng trọng lượng cơ thể. Mỗi giống quýt lại có hàm lượng vitamin C khác
nhau, điều này ảnh hưởng đến mùi vị, độ chua ngọt của mỗi giống quýt.
Nghiên cứu đặc điểm trình tự các gen tham gia tổng hợp vitamin C, và tìm
hiểu sự đa dạng của trình tự các gen này ở các giống quýt địa phương là cơ sở
đề xuất sử dụng đa dạng hóa trong việc chọn giống cho vùng trồng chuyên canh.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Phân lập gen
mã hóa enzyme GDP-D-mannose-3’.5’- epimerase liên quan đến tổng hợp
vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt Nam.”
1
2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá được đặc điểm trình tự gen liên quan đến tổng hợp vitamin C ở
mẫu quýt khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen liên quan đến tổng
hợp vitamin C ở mẫu quýt miền núi phía Bắc.
3.2. So sánh trình tự gen, trình tự amino acid suy diễn của enzyme liên
quan đến tổng hợp vitamin C ở mẫu quýt nghiên cứu với một số trình tự đã công
bố trên GenBank.
2
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phân loại thực vật học và đặc điểm sinh học của cây quýt
1.1.1. Phân loại thực vật học cây quýt
Cây quýt có tên khoa học là Citrus recutilata Blanco (tên khác: Citrus
suhuiensis Hort. ex Tanaka hoặc: Citrus deliciosa Tennre) [6], [11]. Quýt thuộc
chi Cam chanh (Citrus), họ Cam quýt (Rutaceae), bộ Cam quýt (Rutales).
Tập đoàn quýt trồng khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam được xác định
với nhiều giống quýt (Variele) trong loài Citrus recutilata Blanco với bộ nhiễm
sắc thể 2n = 18, quýt mang những đặc tính đặc trưng của chi quả có múi Citrus ở
đặc điểm có các túi chứa tuyến dầu và hoa lưỡng tính, thụ phấn nhờ sâu bọ [11].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây quýt
Cây quýt có tuổi thọ trung bình từ 20 - 50 năm, trong đó thời kỳ cho thu
hoạch quả tập trung khoảng 15 - 25 năm.
Quýt là cây thân gỗ, thường xanh, thiết diện tròn, màu nẫu thâm, cao 2-
3m, hình dạng ngoài của cây thường có hình chóp, thân cây có gai, phần trong
vỏ cây chứa nhiều túi tiết tinh dầu thơm. Cây trồng bằng hạt thường có một gốc
lớn, cây trồng bằng cành chiết thì có nhiều cành gốc.
Quýt có rễ cọc khỏe , lan rộng, rễ phát triển tối ưu ở nhiệt độ 10-37oC,
khi nhiệt độ cao hơn hay thấp hơn cộng với độ ẩm của đất là 1% thì sự phát
triển của rễ sẽ ngừng lại hoặc tỷ lệ oxy trong đất từ 1,2 -1,5% thì rễ cũng ngừng
phát triển.
Lá quýt là đơn mọc cách, không có eo lá, trên lá chứa nhiều túi tiết dầu
thơm, dưới dạng điểm, có thể quan sát được bằng mắt thường khi soi qua ánh
sáng cường độ đủ lớn. Lá thay nhau rụng trong lúc lá mới xuất hiện nên cây lúc
nào cũng xanh lá.
Hoa quýt được hình thành ở nách lá, có cấu tạo là hoa cụm, lưỡng tính,
cánh hoa rời nhau, hoa mẫu bốn, trong hoa thường có đĩa mật, một đặc điểm
3
thích nghi với thụ phấn nhờ sâu bọ. Đài hoa gồm các mảnh dính nhau ở phía
dưới làm thành đài hợp hình đấu. Nhị hoa có số lượng gấp ba đến bốn lần cánh
hoa (do sự phân nhánh), chỉ nhị dính thành nhiều bó. Bộ nhụy đôi, một đầu vòi
và một đầu nhụy với nhiều lá noãn dính lại thành bầu trên, nhiều ô, mỗi ô tương
ứng với số lá noãn đính trụ giữa. Kích thước hoa khi nở trung bình từ 0,2 - 0,25
cm. Cây quýt miền Bắc ra lộc đầu tiên vào tháng 2 hoặc tháng 3 hằng năm, phần
lớn sinh cành cho quả, đợt 2 vào tháng 5 và tháng 6 ra hoa, đợt 3 vào tháng 7 và
tháng 8 đợt lộc này sinh ra cành khỏe dài, lá to màu nhạt. Trong các lứa ra hoa
thì lứa hoa tháng 2 và tháng 3 là tốt nhất.
Quả quýt là quả mọng với ba lớp vỏ, lớp vỏ ngoài chứa các túi dầu, lớp vỏ
giữa trắng xốp (cùi), vỏ quả giữa mỏng dai, phía trong có nhiều lông đơn bào
chứa nhiều nước mà người ta thường gọi là “tép”.
Sự sinh trưởng của quả quýt trải qua các giai đoạn: Giai đoạn ra hoa hình
thành quả (từ tháng 12 đến giữa tháng 3 năm sau), rụng quả sinh lý đợt một (cuối
tháng 4), rụng quả sinh lý đợt hai (đầu tháng 6), quả chắc xanh (cuối tháng 8) và
cho thu hoạch (đầu tháng 10 đến tháng 1 năm sau).
Quả quýt có hình dẹt (trừ quýt chum), vỏ màu vàng và mỏng, trọng lượng
của quả đạt khoảng 35 gam đến 145 gam. Vị quả ngọt sắc, chua nhẹ đặc biệt có
hương thơm đậm, đặc trưng rất dễ phân biệt với bất kỳ quả trong nhóm cây ăn
quả có múi khác. Quả trung bình có từ 8 đến 16 múi, số hạt trung bình của quả
giao động từ 10 đến 40 hạt. Hạt quýt có 2 lá mầm, đa phôi hay đơn phôi, hạt có
2 lớp màng vỏ, màng ngoài cứng do thấm nhiều lignin, màng trong mỏng.
Hạt thường chín cùng quả, nảy mầm ở nhiệt độ từ 10-30oC, nhiệt độ tối ưu
là 25-30oC [14].
1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt
Trong quả quýt có nhiều chất dinh dưỡng, vitamin, khoáng chất cần thiết
cho con người, đặc biệt chứa vitamin C giúp chống lại một số bệnh tật, tăng
cường sức đề kháng. Mỗi 100 gram quả quýt có thành phần dinh dưỡng gồm:
4
87,6 gram nước; 1,104 mg carotene - một loại vitamin chống oxy hóa, 30mg
vitamin C, 93mg kali, 26 mg canxi, 9mg magnesium, 0,3g chất xơ, 4,5 mg
natri, 7mg Chromium, 20mg phốt pho, 0,32 mg sắt và giá trị năng lượng là 48
kcal, protein chiếm 0,6 %, lipid chiếm 0,4 %, đường khoảng 8,6 %...Trong đó,
tinh dầu vỏ quýt (có tên thương phẩm là Mandarin oil), là chất lỏng màu vàng
đỏ có huỳnh quang xanh nhẹ. Thành phần chính tinh dầu vỏ quýt là limonen
(hơn 90 %), methylan - thranilat (1 %).
Trong quýt ngoài vitamin C, chất khoáng thì còn có một lượng chất xơ.
Chất xơ khi vào ống tiêu hóa sẽ trương lên do hút nước trong ruột, giúp cặn bã
của quá trình tiêu hóa dễ dàng thải ra ngoài. Chất xơ khi vào ruột kết hợp với
đường và acid tạo thể đông có tác dụng làm chậm quá trình hấp thụ một số chất
dinh dưỡng từ đó làm lượng đường trong máu tăng vừa phải, duy trì ở mức cần
thiết, nhờ đó mà cơ thể không thừa đường, không chuyển hóa thành mỡ dư thừa
dự trữ ở các mô gây béo phì.
Quả quýt không chứa chất béo hay cholesterol nhưng chứa nhiều vitamin
C. Quả quýt được chứng minh có tác dụng chống viêm, chống khối u, ức chế
đông máu và chống oxy hóa mạnh. Trên thực tế, hàm lượng vitamin C chỉ
chiếm 15 - 20% tổng số các chất kháng oxy hóa trong quả, trong khi những hợp
chất khác có khả năng chống oxy hóa cao gấp 6 lần vitamin C đó là hesperidin
từ flavanoid có nhiều trong lớp vỏ xơ trắng, màng bao múi của quả và một
lượng nhỏ trong tép [14].
Ăn cam quýt còn giúp chữa lành các vết thương nhanh hơn bởi vitamin
C đảm nhiệm vai trò quan trọng trong cơ thể để sản xuất collagenprotein chịu
trách nhiệm tạo ra các mô liên kết, giúp vết thương, vết cắt hay xước da mau
lành, thiếu hụt collagen khiến các tế bào trong mạch máu thiếu sự gắn kết, cho
phép máu rò rỉ trong các mô, cơ quan dễ dẫn đến chảy máu nướu răng và xuất
hiện đốm màu đỏ đặc trưng của bệnh Scorbut [28].
5
Quả quýt có vị chua tính ấm. Người bị cao huyết áp, bệnh mạch vành,
đau dạ dày, suy dinh dưỡng, cơ thể suy nhược sau khi ốm ăn quýt rất tốt. Vỏ
quýt khô gọi là trần bì, có tính ấm, có tác dụng làm khỏe dạ dày, long đờm, trị
ho, trị phong, lợi tiểu, chữa ợ hơi, đau thượng vi. Y học đã chứng minh, tinh
dầu thơm trong vỏ quýt có tác dụng hưng phấn tim, ức chế vận động của cơ dạ
dày, phòng xuất huyết. Vỏ quýt còn dùng để điều trị cao huyết áp, nhồi máu cơ
tim, có tác dụng tốt đối với các chứng bệnh đầy bụng, rối loạn tiêu hóa, kém ăn,
buồn nôn, ho nhiều đờm. Hạt quýt có vị đắng tính bình, vào hai kinh can và
thận, có tác dụng kiện tì, lý khí, táo thấp hóa đờm. Lá quýt vị đắng tính bình,
vào đường can kinh, có tác dụng trợ gan, hành khí, tiêu thủng, tan u cục, chữa
đau mạn sườn, sa nang, u cục ở vú [29].
1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid và một số gen, enzyme tham gia
tổng hợp ascorbic acid ở thực vật
1.2.1. Ascorbic acid
Ascorbic acid (vitamin C) có nhiều trong cây xanh, rau quả, đặc biệt trong
chanh, cam, bưởi, quýt, bắp cải và trong thịt, nhất là ở cây hồng gai và một số
giống ớt đỏ (có thể đạt tới 1% - 2 % khối lượng khô). Lần đầu tiên vitamin C
được tách chiết từ chanh, cam vào năm 1920. Đến năm 1933, vitamin C được
điều chế thành công bằng con đường tổng hợp hóa học không cần phải tách chiết
từ thực vật. Ngày nay, vitamin C được biết tồn tại trong tự nhiên dưới dạng khử
(L. ascorbic acid) và dạng oxy hoá (dehydroascorbic acid). Tuy nhiên, dạng oxy
hóa không phổ biến bằng dạng khử. Cả hai dạng đều tan trong nước, dễ bị phân
huỷ khi tiếp xúc với các chất oxy hoá hoặc bazơ. Cả hai dạng khử và dạng oxy
hoá đều có hoạt tính sinh học và đều tồn tại trong các dịch cơ thể. Hoạt tính của
vitamin C chủ yếu là do nhóm endiol của axit ascorbic, vì nhóm này làm nhiệm
vụ tham gia vận chuyển hydro [25].
6
(- C ===== C -)
| |
Dạng khử (L. ascorbic acid)
Dạng oxy hoá (dehydroascorbic acid)
OH OH
Hình1.1. Các dạng ascorbic acid trong tự nhiên [19]
So với các vitamin khác, vitamin C là chất duy nhất không có ở dạng phức hợp với các nucleotide hoặc coenzym. Đặc tính cơ bản của ascorbic acid là tác dụng khử.
Đặc tính này để định lượng vitamin C khi cho nó tác dụng với một chất có
màu, rồi xác định bằng phương pháp so màu.
Trong cơ thể người hoàn toàn không tự tổng hợp được vitamin C mà phải lấy từ các nguồn thức ăn bên ngoài vào. Vitamin C dễ tìm, có nhiều ở rau quả. Trong cơ thể, vitamin C có nồng độ khác nhau ở mô và thể dịch, nơi nào chuyển hoá mạnh nhất thì nồng độ vitamin C ở đó cao nhất.
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vitamin C
Nghiên cứu về cơ chế tổng hợp vitamin C ở thực vật gần đây được công bố năm 1998 bởi Steven Clarke tại phòng thí nghiệm UCLA (University of California, Los Angeles, Hoa Kỳ). Theo ông, các nghiên cứu từ năm 1998 đến nay đã xác minh được phần lớn cơ chế này, mặc dù gen thực hiện bước thứ bảy(g) trong sơ đồ hình 1.2 trong tổng số 10 bước chuyển hóa glucose thành vitamin C được đề xuất vẫn còn là một ẩn số và đang tiếp tục nghiên cứu.
Quá trình nghiên cứu bắt đầu từ việc tìm ra vai trò của một gen có trong loài giun C. elegans, một loài giun nhỏ được nhà nghiên cứu Tara Gomez từ phòng thí nghiệm UCLA của Clarke sử dụng làm mẫu vật để nghiên cứu quá
7
trình lão hóa. Trình tự sắp xếp của gen cho thấy nó có mối quan hệ với một họ gen bị biến đổi trong bệnh ung thư.
Mạng lưới nội chất hạt, polysacarit và glycoprotein thành tế bào
Ty thể
Quan điểm hiện tại về Sinh học thực vạt
Sự cộng tác từ nhiều phòng thí nghiệm đã khám phá ra điểm tương đồng trong gen của loài giun này với sản phẩm là gen GDP-L-galactose phosphorylase (GGP hay VTC2) của một loài cải dại có tên Arabidopis thaliana, một loại thực vật hoang dại mà bộ gen của chúng đã được biết rõ. Trước đây, các nhà khoa học đã tìm thấy mối tương quan giữa những đột biến trong gen của loài thực vật này với hàm lượng vitamin C thấp. Chính vì thế, một số nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc xác định cách mà sản phẩm của gen này góp phần vào quá trình tổng hợp vitamin C [26].
Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid, Nicholas Smirnoff (2000) [21]
8
Steven Clarke tái hiện lại bước thứ 7(g) trong hình 1.2, một ẩn số trong
suốt một thời gian dài, trong quá trình tổng hợp vitamin C trong phòng thí
nghiệm, một phản ứng mà được miêu tả là bước khơi mào. Sau đó, so sánh 6
bước đầu tiên của quá trình tổng hợp vitamin C với một bản đồ gồm nhiều quá
trình chuyển hóa từ đường glucose đến các hợp chất tế bào mà có thể xảy ra. Tuy
nhiên, một khi sản phẩm của bước (f) là một hợp chất có tên GDP-L-galactose
có thể thoát ra ở nơi có mặt gen VTC2 thì các nguyên tử sẽ được hoàn thiện cấu
trúc để hướng đến việc tổng hợp vitamin C, đặc biệt là tạo ra một số các loại
vitamin khác. Enzyme VTC2 đã được biểu hiện và tinh chế từ vi khuẩn. Tác giả
và nhóm nghiên cứu đã chứng minh được rằng gen VTC2 chịu trách nhiệm ở
bước (g), bước mà các nhà nghiên cứu đã tìm kiếm rất lâu trong quá trình tổng
hợp vitamin C. Bởi vì, các enzyme xúc tác cho các bước thực hiện khơi mào
trong quá trình tổng hợp cho thấy các vị trí điều hòa sinh học nên các nhà nghiên
cứu hi vọng khám phá này có thể đưa đến những chiến lược mới khi mong muốn
của con người là tăng hàm lượng vitamin C trong cây trồng thực vật [21].
Trên cây ăn quả có múi, khi so sánh hàm lượng vitamin C giữa cam và
quýt (Citrus unshiu Marc và Citrus sinensis Osb.) của Trung Quốc, Xiao Y. Y.
và cs (2011) đã chỉ ra hàm lượng vitamin C ở cam nhiều hơn so với quýt. Đồng thời
tìm ra 4 gen mã hóa cho 4 loại enzyme (GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase; GDP-L-
galactose-pyrophosphatase; L-galactose dehydrogenase và L- galactono - 1,4 -
lactone dehydrogenase) liên quan đến con đường hình thành ascorbic acid trong
quả. Các tác giả đã giải mã thành công gen mã hóa GDP-D-mannose-3’.5’-
epimerase (mã số HQ224946) liên quan đến hoạt động của enzyme ascorbate
oxidase và ascorbate peroxidase. Khi quả chín, sự có mặt của GDP-D-mannose-
3’.5’-epimerase đã góp phần nâng cao hàm lượng vitamin C của cam nhiều hơn
1,5 lần so với quýt [21].
Cũng theo Xiao – Y.Y. và cs (2011), gen mã hóa GDP-D-mannose-3’.5’-
epimerase tìm thấy trên Citrus unshiu (một loài cam ngọt), gen có tổng chiều dài
9
1086 bp. Gen mã hóa quy định trình tự phân tử protein GDP - D - mannose -
3’.5’- epimerase với 361 amino acid. GDP - D - mannose - 3’.5’- epimerase điều
phối vào quá trình hoạt hóa từ enzyme GDP - D – manose thành GDP - L -
galactose, bước chuyển hóa (e) trong hình 1.2 trên con đường sinh tổng hợp
ascorbic acid ở thực vật được công bố trên GenBank với mã số HQ224946 [22].
Nghiên cứu của Xiao – Y. Y. và cs (2011) cũng đã chỉ ra rằng, trên gen
hình thành 03 vùng để quy định bảo toàn chức năng protein gồm: (1) Vùng được
đặt tên “M1P -guanylylT_B_like_N”, từ vị trí amino acid thứ nhất đến 234, quy
định enzyme pyrophosphorylase GDP – mannose một trong số các enzyme
tham gia trực tiếp trong chu trình hình thành ascorbic acid; (2) Vùng có tên
“LbetaH - LbH”, từ vị trí amino acid thứ 256 đến 335, mã hóa enzyme
acyltransfase liên quan đến sự chuyển hóa ion trong tế bào; và (3) Vùng “other”
từ vị trí amino acid thứ 303 đến 330, vị trí hình thành sự liên kết giữa các chuỗi
polypeptide [22], [21].
Cũng theo Junjie T. và cs (2018) ascorbic acid phổ biến đóng một vai trò
quan trọng trong sự phát triển của cây trồng và khả năng chịu stress phi sinh học,
nhưng nồng độ ascorbic acid rất khác nhau giữa các cây khác nhau. GDP-D-
mannose epimerase (GDP-D), xúc tác GDP-D-mannose đến GDP- L -galactose
hoặc GDP- L -gulose, là một enzyme quan trọng trong con đường sinh tổng hợp
ascorbic acid thực vật. Các chức năng và mô hình biểu hiện của GDP-D đã
được nghiên cứu kỹ trong các công trình trước đó, tuy nhiên, ít thông tin được
biết về các mô hình tiến hóa của gen. Trong nghiên cứu này, cấu trúc gen GDP-
D , các mô hình protein được bảo tồn tương ứng và các mối quan hệ tiến hóa đã
được phân tích một cách hệ thống. Tổng số 111trình tự gen GDP-D được lấy từ
59 bộ gen thực vật, đại diện cho hầu như tất cả các dòng chính của thực vật
xanh: dicotyledons, monocotyledon, thực vật hạt trần, pteridophytes, bryophytes
và chlorophytes. Kết quả cho thấy rằng homologs của GDP-D đã có mặt rộng rãi
trong thực vật xanh. Cấu trúc gen GDP-D được bảo thủ ở cây cao hơn, trong khi
10
rất đa dạng trong các phân nhóm cơ bản của phylogeny bao gồm lycophytes,
bryophytes và chlorophytes, cho thấy cấu trúc gen GDP-D có thể đã trải qua sự
phân hóa sâu sắc ở thực vật thấp hơn và sau đó dần dần cố định như sự tiến hóa
của thực vật. Các trạng thái cơ bản của GDP-D được bảo tồn mạnh mẽ trong
thực vật xanh, cho thấy chức năng bảo tồn của protein. Một vài nhánh và địa
điểm được lựa chọn và hầu hết các nhánh nằm trong phân nhóm chlorophyte,
cho thấy sự lựa chọn đa dạng ở một số nhánh và địa điểm có thể đóng vai trò
trong sự phát triển của GDP-D và đa dạng hóa sự lựa chọn giai đoạn đầu của
thực vật xanh. Kết quả này cung cấp thông tin chi tiết mới về bảo tồn chức năng
và sự phát triển của GDP-D[23].
Nghiên cứu của Gilbert L. và cs (2009) đã sử dụng các dòng cà chua biến
đổi gen đã được RNAi-slienced cho GDP-D, qua đó xác nhận rằng GDP-D thực
sự đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa sinh tổng hợp ascorbate trong
thực vật. Ngoài ra, các dòng cà chua chuyển gen biểu hiện các khuyết tật tăng
trưởng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và sự phát triển tế bào. Một tính năng
đáng chú ý hơn nữa của cây chuyển gen là sự mong manh và mất độ săn chắc
của trái cây. Phân tích thành phần thành tế bào của lá và phát triển quả cho thấy
hàm lượng monosaccharide thành tế bào được thay đổi trong các dòng chuyển
gen, đặc biệt là những liên kết trực tiếp với hoạt động của GDP-D như: mannose
và galactose. Khi được xem xét cùng nhau, những phát hiện này cho thấy mối
liên hệ mật thiết giữa sinh tổng hợp polysaccharide của ascorbate và tế bào
không chứa cellulose trong thực vật, giúp giải thích các yếu tố phổ biến trong các
đặc điểm không liên quan như độ cứng trái cây và hàm lượng ascorbate[24].
1.3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền
Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền được các nhà nghiên cứu sử dụng
bằng nhiều phương pháp khác nhau, mỗi phương pháp cung cấp các loại thông
tin khác nhau. Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của
người nghiên cứu. Có hai phương pháp sử dụng rộng rãi để nghiên cứu, đánh giá
11
đa dạng di truyền là: phương pháp xác định đa dạng di truyền dựa trên hình thái
(kiểu hình) và thông qua các chỉ thị phân tử (kiểu gen) [8].
Xác định đa dạng di truyền dựa trên kiểu hình là phương pháp cổ điển,
hiện nay vẫn được sử dụng phổ biến. Phương pháp này giúp các nhà nghiên cứu
nhận biết và phân biệt các giống khác nhau bằng mắt thường trên thực địa một
cách nhanh chóng. Các đặc điểm chính về hình thái như dạng thân cây, dạng lá,
màu sắc lá, hoa... được xem là những trạng thái cơ bản để nhận biết giữa các
giống với nhau. Những tính trạng chất lượng thường là những cặp tính
trạng tương phản được duy trì đơn gen, mỗi tính trạng có hai hay nhiều
dạng tương phản.
Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử sử dụng chủ
yếu trong nghiên cứu các phân tử protein và DNA.
Chỉ thị dựa vào protein là chỉ thị isozyme. Isozyme là các dạng khác nhau
của cùng một enzyme. Enzyme có bản chất là protein và là chất đa điện li nên
trong dung dịch nó là trạng thái phân tử. Dưới tác động của dòng điện một chiều,
các phân tử protein khác nhau về khối lượng kích thước, lực tĩnh điện.. sẽ
chuyển động với tốc độ khác nhau và phân bố ở vị trí khác nhau trên gel, các
băng đa hình từ các enzyme đặc hiệu đặc trưng cho sản phẩm protein có thể cung
cấp thông tin di truyền như các chỉ thị đồng trội. Khi nghiên cứu đa hình protein
trên các giống lúa, Mohd A. A. và cs (2012) chỉ ra được nhược điểm của phương
pháp này là bị phụ thuộc vào số lượng các loại enzyme có thể phát hiện, vì thế số
lượng chỉ thị/genome bị hạn chế. Các loại enzyme được cấu tạo từ nhiều kiểu
đơn vị sẽ làm cho việc phân tích trở nên phức tạp [10].
Chỉ thị DNA có thể hiểu đơn giản chúng như các cột mốc nằm trên trình
tự DNA trong hệ gen. Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đối
giữa chúng phản ảnh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống hay một loài trong
quần thể. Sinh vật có khả năng nhân bản DNA của chúng với độ chính xác cao
nhưng có nhiều cơ chế xảy ra có thể làm biến đổi cấu trúc DNA, đơn giản như
12
các cặp base hay phức tạp như đảo đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn.. do đó, chỉ thị
phân tử được xem là công cụ hiệu quả cho việc đánh giá tính đa dạng di truyền
phục vụ cho công tác chọn giống.
Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị sinh học phân tử được đưa ra
nhiều phương pháp, kỹ thuật khác nhau như: RFLP (Retriction fragment length
plymorphism - Đa hình về chiều dài phân cắt hạn chế), RAPD (Ramdom
amplified polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên),
AFLP (Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các phân
đoạn được nhân bản), STS (Sequence tagged site - Điểm trật tự được đánh dấu),
SSR (Simple sequence repeat - Trình tự lặp lại đơn giản)…[10].
+ Kỹ thuật sử dụng chỉ thị phân tử RFLP:
RFLP (Restriction fragment length polymorphisms - đa hình độ dài các
đoạn cắt giới hạn). Nguyên lý của phương pháp là dựa trên sự sai khác của phổ
điện di và độ dài của các phân đoạn bị cắt bởi enzyme giới hạn.
Nghiên cứu trên cây ăn quả có múi tại Pakistan, Sadaf A. và cs (2014)
thông qua kỹ thuật RFLP đã cho thấy chỉ với 15 giống quýt trồng khác nhau theo
vùng địa lý đã chia ra làm 06 nhóm quýt có mối quan hệ họ hàng khác nhau về
di truyền, ông cũng chỉ ra nhược điếm của RFLP là tốn kém và mất thời gian,
phương pháp này đòi hỏi một lượng DNA lớn [11].
Sadaf A. và cs (2014) cũng đã chỉ ra ưu điểm của RFLP là tận dụng được
biến dị tự nhiên, phát hiện tính biến dị của DNA trong các giai đoạn phát triển
hoặc ở các cơ quan khác nhau của thực vật, không phụ thuộc vào hiệu quả kiểu
hình, môi trường và tương tác gen.
+ Kỹ thuật sử dụng chỉ thị phân tử AFLP:
Chỉ thị AFLP (Amplified fragment length polymorphism - đa hình độ dài
các đoạn được nhân bản có chọn lọc). Đề xuất bởi Vos và cs đề xuất năm 1995,
là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR.
13
Nghiên cứu gần đây trên cây có múi của Kinley D. và Chinawat Y. (2015)
bằng chỉ thị AFLP trên 23 giống quýt trồng của Bhutan đã minh chứng được
quýt ở đây gồm 02 nhóm quần thể phụ khác nhau về di truyền. Các tác giả cho
biết, chỉ thị AFLP có thể phân tích bất kỳ hệ gen nào từ đơn giản đến phức tạp,
có thể nhân bản chọn lọc nhiều đoạn giới hạn, thu được nhiều băng DNA cho
mỗi mẫu nghiên cứu, phân tích đa hình di truyền trong khoảng thời gian ngắn,
đòi hỏi lượng DNA ít, cho sự đa hình cao. Nghiên cứu của Kinley cũng chỉ ra
hạn chế của kỹ thuật này thể hiện đối với hệ gen của thực vật tương đối lớn và
phức tạp nên khi xử lý bằng enzyme giới hạn sẽ thu được số phân đoạn DNA lớn
nên rất khó phân tích. Chỉ thị tiến hành qua nhiều bước nên rất tốn kém và phức
tạp [18].
+ Kỹ thuật chỉ thị RAPD (Random amplified polymorphic DNA)
Kỹ thuật RAPD dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, nhưng sử
dụng mồi ngẫu nhiên để nhân bản những đoạn DNA hoàn toàn ngẫu nhiên
trong hệ gen.
Kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân
tích di truyền hệ thống sinh học. Nó là phương pháp hiệu quả trong việc xác định
kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản
đồ di truyền. Nghiên cứu cây có múi ở Đồng bằng sông Cửu Long, Nguyễn Hữu
Hiệp và cs (2004) đã tìm ra sự sai khác về mặt di truyền của một loạt quýt trồng
tại Gò Quao - Kiên Giang với các giống quýt tiều, quýt xiêm, quýt xiêm đen…
với khoảng cách di truyền biến động từ 0 - 43 % [2].
Kỹ thuật RAPD có ưu việt thực hiện nhanh, dễ làm, ít tốn kém nên được
ứng dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu quan hệ di truyền, lập bản đồ di truyền,
xác định chủng loại phát sinh của thực vật. Khi hệ gen của cây trồng có những
thay đổi như đột biến gen, đột biến nhiễm sắc thể… đều làm thay đổi kích thước
của đoạn nhân bản. Tuy nhiên, hạn chế là số băng DNA nhân bản thu được nhiều
14
và không chắc chắn khi có băng DNA giống nhau thể hiện cùng kích thước trên
bản gel có thực sự ở cùng một vị trí trên hệ gen hay không.
+ Kỹ thuật chỉ thị SSR (Simple sequence repeat - trình tự lặp lại đơn giản)
Kỹ thuật này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc
của phản ứng PCR. Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một
loạt các trình tự nucleotide lặp lại, chúng đặc trưng cho loài. SSR gồm 2 đến 5
nucleotide lặp lại nhiều lần.
Điểm nhấn của phương pháp này đòi hỏi ở việc thiết kế đoạn mồi cho
phản ứng SSR, đoạn mồi được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ ở hai đầu của đoạn
SSR. số lần lặp lại nhiều lần làm cho các phân đoạn DNA được nhân có độ dài
ngắn khác nhau. Các trình tự lặp lại thường có ở vùng dị nhiễm sắc trên mỗi
nhiễm sắc thể. Chúng có vai trò điều hòa hoạt động của các gen, góp phần làm
tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong phân bào, nó có thể mang thông
tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật.
Thiết kế các cặp mồi SSR cho nghiên cứu đa hình di truyền đối với cây có
múi được công bố bởi nhóm tác giả Behruoz G., Masoumeh N. và Babak B.
(2012), khi nghiên cứu trên quýt trồng tại Iran, các tác giả đã cho thấy tính
chính xác và hữu hiệu trong xác định quan hệ di truyền, phân loại thực vật,
xây dựng bản đồ liên kết và chẩn đoán cặp lai cho ưu thế lai, thực hiện thí
nghiệm tương đối đơn giản, dễ thực hiện, có khả năng phát hiện tính đa hình
rất cao khi sử dụng kỹ thuật SSR. Dẫu rằng khó khăn của phương pháp là ở
việc thiết kế mồi cho phản ứng nhân các đoạn SSR, nó đòi hỏi chi phí giá
thành cao [20].
Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà số
đơn vị lặp lại xuất hiện sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản. Mức độ đa
hình được xác định sau khi điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide hoặc
gel agarose. SSR được phân tích nhờ PCR nên chỉ cần đòi hỏi một lượng mẫu
DNA rất nhỏ.
15
Kỹ thuật SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây
trồng vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao. Trong
thực tế, chỉ thị này đã được sử dụng nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến
năng suất, bệnh hại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ
gen. Bằng kỹ thuật này, Goh P. S. E. và cs (2011) tìm thấy sự đa dạng của hơn
100 mẫu quýt trồng ở Mailaysia, theo ông tập đoàn quýt ở vùng nghiên cứu chia
làm 04 nhóm chính có những biến đổi ở mức độ alen và tính di truyền hoàn toàn
độc lập [18].
16
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu trên mẫu quýt Bắc Sơn (Ký hiệu: BS-LS) trồng tại Bắc
Sơn, Lạng Sơn.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất
Sử dụng các hoá chất: EDTA, Tris-HCl, isopropanol, X-gal,
kanamycin, agar, agarose, cồn tuyệt đối, vector tách dòng pBT, Bộ Kit dùng
cho phản ứng PCR, bộ Kit tách plasmid tái tổ hợp “Accuprep TM Plasmid
Mini Extraction Kit” do hãng Bioneer cung cấp, các cặp mồi đặc hiệu nhân
gen GDP-D. Ngoài ra còn một số hóa chất khác.
Thiết bị
Máy li tâm lạnh Eppendorf của Đức, máy PCR Eppendorf (Đức), bộ điện
di DNA của hãng Bio - Rad, máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@
3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) và một số thiết bị khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu quýt BS-LS được thu thập vào giai đoạn ra lộc tháng 7 tháng 8. Cây
để thu mẫu là cây khỏe mạnh, được trồng ở nơi có cường độ ánh sáng vừa đủ,
thu hoạch lá non để tiến hành tách DNA. Mẫu sau thu được đựng vào túi gắn
phiếu ghi đầy đủ tên mẫu, thời gian và địa điểm thu mẫu bằng loại bút không
nhòe. Mẫu mang về có thể xử lý phân tích ngay hoặc bảo quản ở -20oC.
2.2.2. Phương pháp xác định trình tự gen
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết, tinh sạch DNA tổng số theo phương pháp CTAB do Gawel và
cs đưa ra năm 1991, quy trình tách chiết được tóm tắt như sau:
17
1) Nghiền nhanh mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ thành bột mịn, cho
vào ống eppendorf.
2) Thêm 700µl dung dịch đệm CTAB đảo trộn đều bằng máy vortex, ủ ở
65oC trong 1 giờ bằng máy lắc ổn nhiệt, cứ 10 phút lấy ra đảo nhẹ.
3) Sau 1 giờ lấy ống eppendorf chứa mẫu ra, bổ sung 700µl CIAA,
đảo đều.
4) Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu 500 µl dịch nổi cho vào ống
1,5ml đã khử DEPC
5) Bổ sung 500µl isopropanol lạnh, đảo đều 15 phút ở nhiệt độ thường. Để
tủ âm 20oC trong 2 giờ.
6) Ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ toàn bộ phần dung dịch,
thu cặn.
7) Bổ sung cồn 70o, đảo trộn, ly tâm 10000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ
cồn, thu tủa.
8) Làm khô DNA bằng cách mở nắp ống eppendorf trong box vô trùng
9) Hòa tan DNA trong nước khử ion vô trùng và bảo quản trong tủ
âm 20oC.
2.2.2.2. Phân lập gen bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu
Gen mã hóa GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase được phân lập bằng kỹ
thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự của gen GDP-D
mã số HQ224946, Xiao - Y.Y. (2011) [22].
Cặp mồi được thiết kế có trình tự nucleotide là:
GDP-D-F: 5’-GTCCCTAAGCCACTTGTTGAATTTGC-3’
GDP-D- R: 5’-AGAAACCTGGAAGAACCATCGCGA-3’
Gen GDP-D được nhân có kích thước dự tính khoảng 1000bp.
18
Phản ứng PCR được tiến hành với thành phần và chu trình nhiệt được
trình bày ở bảng 2.1, 2.2.
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen GDP-D
STT Thành phần Thể tích (l)
1 Dream taq buffer 10X 2,5
2 dNTPs (10mM) 1,5
3 DNA khuôn (10 - 20 ng/µl) 1,0
4 Primer F (10pmol/µl) 1,0
5 Primer R (10pmol/µl) 1,0
6 DNA taq polymerase (5 đơn vị/µl) 1,0
7 Nước khử ion 17,0
Tổng thể tích 25,0
Bảng 2.2. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen GDP-D
Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 Biến tính 2 phút 1 95
2 Biến tính 30 giây 94 Lặp lại 35 3 Gắn mồi 30 giây 55 chu kỳ 4 Kéo dài chuỗi 40 giây 72
5 Hoàn tất kéo dài 5 phút 1 72
6 Kết thúc phản ứng ∞ 8
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose
0,8% trong đệm TAE 1X , nhuộm bằng Ethidium bromide (1µg/ml) với sự có
mặt của thang DNA chuẩn 1 kb và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
2.2.2.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Cần thu nhận gen ở dạng tinh sạch và không lẫn gel agarose. Vì vậy, cần
phải tiến hành thôi gel.
19
Sản phẩm PCR được tinh sạch (thôi gel) theo bộ Kit DNA extraction Kit
K05013 của hãng Fermentas.
2.2.2.4. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng
ligase. Thành phần của phản ứng gắn
Sản phẩm PCR nhân gen GDP-D sau khi được làm sạch được gắn trực
tiếp vào vector pBT nhờ enzyme nối T4
gen vào vector tách dòng pBT được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen GDP-D vào vector tách dòng pBT
Thể tích (l) STT Thành phần Nồng độ
1 T4 DNA Ligase Buffer 10X 1,0
5 u/l 2 T4 DNA Ligase 1,0
100 ng/l 3 GDP-D 5,0
100ng/l 4 pBT 1,0
5 Nước khử ion - 2,0
Tổng thể tích 10,0
Hỗn hợp trên được ủ ở nhiệt độ là 22oC trong 3 giờ và sau đó được biến
nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α.
2.2.2.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5
Tế bào khả biến được lấy từ tủ -80oC chuyển sang môi trường -4oC. Sau
30 phút biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt.
Bổ sung 15µl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến E.coli
DH5α và trộn nhẹ. Hỗn hợp trên được để trong bình đá 10 phút, sau đó ủ ở
42oC (trong 1 phút 30 giây). Sau đó chuyển nhanh vào đá lạnh trong 5 phút. Bổ
sung 500µl LB lỏng (trypton, cao nấm men, NaCl) nuôi lắc 200 vòng/phút ở
37oC trong 1 giờ.
Cấy trải
Sau khi nuôi phục hồi, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch nổi
giữ lại 150-250µl, trộn nhẹ.
20
Sử dụng que cấy đã khử trùng cấy trải 150 - 250µl dịch khuẩn trên môi
trường LB đặc (Trypton, cao nấm men, NaCl và agar) có bổ sung kháng sinh
carbenicilin (100mg/l), IPTG (0,1mM) và X - gal (40mg/l). Nuôi qua đêm ở 37o
trong 16 giờ.
Chuyển khuẩn lạc sang pha nuôi lỏng
Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng (có bổ sung
carbenicilin 100mg/l) nuôi ở 37oC trong khoảng 3 giờ.
Chọn dòng và kiểm tra sản phẩm chọn dòng
Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc màu trắng và kiểm tra sản phẩm chọn
dòng bằng kĩ thuật colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen GDP-D. Thành
phần phản ứng colony-PCR được thể hiện ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng colony - PCR
Thể tích (l) STT Thành phần Nồng độ
1 PCR Masster Mix 2X 7,5
10 pmol/l 2 GDP-D-F 0,5
10 pmol/l 3 GDP-D-R 0,5
200 ng/l 4 DNA 0,5
5 Nước khử ion - 6,0
Tổng thể tích 15,0
Chu trình nhiệt được đặt như sau: 95oC trong 2 phút; lặp lại 35 chu kỳ với
nhiệt độ là: 94oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây, 72oC trong 40 giây; sau đó
để ở 72oC trong 5 phút và lưu giữ ở 8oC.
Sản phẩm colony-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%
trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong Ethidium bromide 1% và chụp ảnh
dưới ánh sáng đèn cực tím.
Tách plasmid
Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, tiến hành tách plasmid từ các dòng
khuẩn lạc dương tính với PCR bằng bộ kit Plasmid Extraction Kit. Kiểm tra sản
21
phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong
ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.2.6. Phương pháp xác định trình tự gen GDP-D
Trình tự của gen được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động
ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ
hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu gen GDP-D được xử lý bằng các phần mềm Tin sinh học. Phần
mềm BLAST trên NCBI sử dụng trong so sánh mức độ tương đồng nhằm khẳng
định gen GDP-D đã phân lập. Phần mềm BioEdit sử dụng trong so sánh trình tự
nucleotide và trình tự amino acid suy diễn. Phần mềm DNAstar sử dụng trong
phân tích đa dạng di truyền dựa trên trình tự nucleotide của gen GDP-D.
2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn
Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam.
Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh
học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm -Đại học Thái Nguyên.
22
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nhân bản và giải trình tự gen GDP-D từ DNA của giống quýt BS-LS
3.1.1. Kết quả nhân bản gen GDP-D bằng kỹ thuật PCR
Cặp mồi GDP-D-F/GDP-D-R được thiết kế dựa trên trình tự đoạn mã hóa
của gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank.
Giống quýt BS-LS có chất lượng quả tốt, sinh trưởng khỏe được sử dụng
làm đối tượng phân lập gen GDP-D. Tiến hành thu mẫu mô vùng sinh trưởng
của ngọn cây để phục vụ thí nghiệm tách chiết DNA. DNA tổng số được tách
chiết, gen GDP-D được nhân bản bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi GDP-D-
F/GDP-D-R và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
0,75kb →
~1kb
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của mẫu quýt
BS-LS với cặp mồi GDP-D-F và GDP-D-R; 1: mẫu BS-LS; M: thang chuẩn
DNA 1kb
Kết quả thu được ở hình 3.1 cho thấy, mẫu quýt BS-LS cho sản phẩm
PCR là một băng DNA với kích thước ước tính khoảng 1 kb, phù hợp theo tính
toán lý thuyết khi thiết kế mồi và tương ứng với kích thước của đoạn mã hoá
GDP-D ở cây cam ngọt mang mã số HQ224946 trên GenBank. Tuy nhiên, để
23
khẳng định chính xác sản phẩm thu được là gen GDP-D chúng tôi tiến hành tách
dòng, xác định trình tự nucleotide và so sánh với trình tự GDP-D mang mã số
HQ224946 trên GenBank.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ Kit DNA extraction Kit K05013
của hãng Fermentas và nhân dòng bằng PCR để thu lượng sản phẩm đủ lớn phục
vụ giải trình tự nucleotide.
3.1.2. Kết quả tách dòng gen GDP-D
Sản phẩm PCR kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và được tiến hành
tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBT rồi biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng sốc nhiệt (42oC trong 1 phút 30 giây). Tiến hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc màu trắng với cặp mồi đặc hiệu.
Chọn ngẫu nhiên ở đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chứa vector
tái tổ hợp mang đoạn gen GDP-D phân lập từ mẫu BS-LS 4 khuẩn lạc màu trắng
để thực hiện phản ứng colony-PCR. Sản phẩm colony-PCR được kiểm tra bằng
điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong Ethidium
bromid 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. Kết quả cho thấy, tất cả 4
dòng khuẩn lạc được kiểm tra đều dương tính với phản ứng PCR.
Những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR đã được chọn để
tách plasmid tái tổ hợp và đem đi giải trình tự. Sản phẩm tách plasmid được
kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 1X, nhuộm gel
~1kb
trong Ethidium bromid 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc
(1, 2, 3, 4: GDP-D khuếch đại từ khuẩn lạc BS-LS; M: thang DNA chuẩn 1 kb)
24
3.1.3. Đặc điểm của trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS
Kết quả xác định trình tự gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS bằng máy xác
định trình tự nucleotide tự động được trình bày ở hình 3.3.
Hình 3.3: Đặc điểm trình tự nucleotide của mẫu BS-LS thu được bằng máy
xác định trình tự nucleotide tự động
25
26
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D phân lập từ
giống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D trên GenBank mang mã số
HQ224946
Kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit cho thấy, trình tự gen GDP-D
phân lập từ giống quýt BS-LS có 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base
loại C, 295 base loại G. Tỷ lệ A+T= 53,19%; G+C= 46,81%.
So sánh trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tự
gen GDP-D mã số HQ224946 trên GenBank sử dụng thiết kế mồi trên hình 3.4
cho thấy có 1083 vị trí nucleotide giống nhau, chỉ sai khác ở 3 vị trí nucleotide,
đó là các vị trí 370, 371, 984 (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Những vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự nucleotide của gen
GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946
TT
Vị trí nucleotide 370 Gen GDP-D phân lập từ giống BS-LS - Gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank T 1
2 371 T -
3 984 A -
27
Ngoài ra, bằng BLAST trong NCBI cho thấy trình tự gen GDP-D phân
lập từ mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng so với trình tự gen GDP-D mang mã
số HQ224946 sử dụng để thiết kế cặp mồi PCR là 99%. Bên cạnh đó, trình tự
gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS còn có tỷ lệ tương đồng với một số
trình tự khác mang mã số XM 025101133, XM 006486355, XM 006435547 là
95%; FJ643600 là 87%; XM021440285, XM021440284 là 85% (Hình 3.5).
Hình 3.5. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự nucleotide của gen
GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với một số trình tự gen đã công bố
trên GenBank
Như vậy, chúng tôi đã tách dòng thành công và giải trình tự gen
GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn với
chiều dài 1083bp trong đó 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C,
295 base loại G.
Tiếp tục so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen GDP-D phân
lập từ giống quýt BS-LS và với protein suy diễn từ trình tự gen GDP-D mang mã
số HQ224946 trên GenBank bằng phần mềm BioEdit được thể hiện ở hình
3.6. Kết quả cho thấy, protein do gen GDP-D mã hóa đều có 361 amino
acid. So với protein suy diễn từ trình tự gen mang mã số HQ224946 trên
GenBank thì trình tự amino acid của mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng là
28
99%. Tuy nhiên, các trình tự amnio acid của protein GDP-D cũng có sự
khác nhau ở 2 amino acid (Bảng 3.2).
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen GDP-D phân lập
từ giống quýt BS-LS và từ gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank.
Bảng 3.2. Những vị trí amino acid sai khác giữa hai trình tự protein suy diễn
của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946
Protein suy diễn từ Protein suy diễn từ gen Vị trí amino gen GDP-D phân lập GDP-D mang mã số TT acid từ giống BS-LS HQ224946 trên GenBank
1 124 F X
2 328 G X
29
Từ hình 3.6 và bảng 3.2 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn của gen
GDP-D giữa giống quýt BS-LS và trình tự protein suy diễn của gen GDP-D đã
công bố trên GenBank mang mã số HQ224946 có 358 vị trí amino acid giống
nhau, chỉ khác ở 2 vị trí acid amin, đó là các vị trí 124, 328.
3.2. Sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của
gen GDP-D
Tiến hành so sánh trình tự nucleotide gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS với
7 trình tự gen GDP-D đã công bố trên GenBank để xác định hệ số tương đồng
và hệ số sai khác của các trình tự gen GDP-D, đồng thời thiết lập sơ đồ hình cây
để phân tích sự đa dạng của các mẫu quýt thông qua trình tự gen GDP-D.
Bảng 3.3. Trình tự gen mang mã số trên GenBank được sử dụng phân tích
Giống / Mã số trên TT Năm công bố Đối tượng GenBank
1 XM_025101133 2018 Cam đỏ
2 XM_006486355 2018 Cam đỏ
3 FJ643600 2009 Quả Dương đào
4 XM_006435547 2018 Cam đỏ
5 XM_024064261 2007 Cam đỏ
6 XM_021440284 2017 Cam đỏ
7 XM_021440285 2017 Cam đỏ
Các trình tự gen được sử dụng để so sánh có 7 mẫu (mang mã số
XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, XM_021440284,
XM_021440285, XM_024064261, FJ643600) và 1 mẫu BS-LS. Kết quả ở
bảng 3.4 cho thấy hệ số tương đồng giữa các cặp so sánh dao động từ 69,0%
đến 99,5%; còn hệ số sai khác từ 0,0% đến 40,1%.
30
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của trình tự nucleotide của gen
GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và các trình tự trên GenBank
Mối quan hệ di truyền của 8 mẫu quýt trên cơ sở phân tích gen GDP-D
được thể hiện ở sơ đồ hình cây trên hình 3.7.
Hình 3.7. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của BS-LS với các trình tự đã
công bố trên GenBank dựa trên trình tự nucleotide của gen GDP-D
Sơ đồ hình cây (Hình 3.7) dựa trên kết quả so sánh trình tự nucleotide của
gen GDP-D cho thấy, 8 mẫu được phân thành hai nhóm chính, nhóm I gồm 7
mẫu chia thành hai nhóm phụ, nhóm phụ 1 gồm 6 mẫu: XM_025101133,
XM_006435547, XM_006486355, XM_021440284, XM_021440285, BS-LS;
nhóm phụ 2 gồm 1 mẫu là XM_024064261. Nhóm phụ 1 lại chia thành 2
nhóm nhỏ: nhóm nhỏ 1 gồm 4 mẫu là XM_025101133, XM_006435547,
XM_006486355, BS-LS; nhóm nhỏ 2 gồm 2 mẫu XM_021440284,
31
XM_021440285; nhóm nhỏ 1 chia thành 2 nhánh: nhánh 1 gồm 3 mẫu:
XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355; nhánh 2 gồm 1 mẫu BS-
LS; nhánh 1 chia thành 2 nhánh nhỏ: nhánh nhỏ 1 gồm 2 mẫu:
XM_006435547, XM_006486355; nhánh nhỏ 2 gồm 1 mẫu XM_025101133.
Nhóm II gồm 1 mẫu là FJ643600. Như vậy, mẫu quýt BS-LS mà chúng tôi
nghiên cứu thuộc nhóm chính I.
Tiếp tục phân tích mối quan hệ của 8 mẫu dựa trên trình tự amino acid suy
diễn, kết quả thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của BS-LS và các trình tự trên
GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, hệ số tương đồng giữa các cặp so sánh dao
động từ 94,8% đến 99,9%; còn hệ số sai khác từ 0,0% đến 3,1%.
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của BS-LS với các trình tự đã
công bố trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn
của gen GDP-D
32
Khoảng cách di truyền được tính trên cơ sở so sánh trình tự nucleotide
của gen GDP-D giữa 2 nhóm là 30.5% (Hình 3.7), còn dựa trên trình tự amino
acid thì khoảng cách di truyền giữa các nhóm là 1,4% (Hình 3.8). Kết quả phân
tích này cho thấy các trình tự nucleotide của gen GDP-D ở các mẫu quýt khác
nhau tương đối nhiều, chúng mã hóa nhiều amino acid khác nhau, dẫn tới tổng
hợp các enzyme GDP-D có chức năng xúc tác khác nhau. Vì vậy, khả năng
tổng hợp vitamin C ở các mẫu cũng khác nhau.
33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1 Gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS đã được nhân bản thành
công bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu GDP-F/GDP-R có kích thước
1083bp.
1.2 Trình tự gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS có 282 base
loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G. Tỷ lệ A+T=
53,19%; G+C= 46,81%.
1.3 Trình tự nucleotide của gen GDP-D của giống quýt BS-LS tương
đồng với trình tự nucleotide của gen GDP-D mang mã số HQ224946 là 99% và
tương đồng trình tự mang mã số FJ643600 là 87,3%.
1.4 Trình tự amino acid suy diễn từ gen GDP-D của giống quýt BS-LS
giống trình tự amino acid của protein mang mã số ADV59923 (do HQ224946
mã hóa) là 99% và giống protein mang mã số ACN38266 (do FJ643600 mã
hóa) là 95,9%.
1.5 Hệ số tương đồng của trình tự gen GDP-D ở mẫu quýt nghiên cứu
so với 7 mẫu trên GenBank dao động từ 69,0% đến 99,5%, hệ số sai khác là
0,1% đến 4,7%. Hệ số tương đồng về trình tự amino acid suy diễn của 8 mẫu so
sánh dao động từ 98,4% đến 99,9%.
2. Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu trình tự đoạn mã hóa gen GDP-D làm cơ sở cho việc
thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc GDP-D phục vụ chuyển gen để cải
thiện hàm lượng vitamin C ở cây quýt.
34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt
1. Đường Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi và kỹ thuật trồng, Nxb Lao
động - Xã hội.
2. Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn và Nguyễn Văn Được
(2004), “Đa dạng sinh học giống cây có múi ở huyện Gò Quao, tỉnh Kiên
Giang”, Tạp chí Khoa học, số 1: 111-121.
3. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong
chọn giống cây trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên.
4. Trần Đình Long (1997), Chọn giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp.
5. Hoàng Trọng Phán (2008), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Đại
học Huế.
6. Hoàng Thị Sản (2004), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục.
7. Khuất Hữu Thanh (2003), Cơ sở di truyền phân tử và kĩ thuật gen, Nhà xuất
bản khoa học kĩ thuật.
8. Nguyễn Duy Thành (2000), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Khoa
học Kỹ thuật.
9. Lê Duy Thành (2003), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Nông nghiệp.
10. Quyền Đình Thi (2005), Những kỹ thuật cơ bản trong phân tích DNA, Nhà
xuất Bản Khoa học và Kỹ thuật.
11. Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (2000), Phân loại học thực vật, Nxb
ĐHQGHN.
12. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tố kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân
Sâm (2003), Công nghệ Enzym, Nxb Khoa học và Kỹ thuật.
13. Nguyễn Văn Uyển, Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Tập 1
(1995), Tập 2 (1996), Nxb Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh.
14. Đào Thanh Vân, Ngô Xuân Bình (2003), Giáo trình cây ăn quả (Giáo trình
Sau đại học), Nxb Nông nghiệp.
15. Đỗ Năng Vịnh (2008), Cây ăn quả có múi - Công nghệ sinh học chọn tạo
giống, Nxb Nông nghiệp.
35
II. Tài liệu tiếng Anh
16. Mohd Anwar Ahmad, Rashmi Gaur (2012) “Comparative biochemical and
RAPD analysis in two varieties of rice (Oryza sativa) under arsenic stress by
using various biomarkers”, Journal of Hazardous Materials, Volumes 217-
218, Pages 141-148.
17. Sadaf Altaf, Muhammad M. K. (2014), “Morphogenetic characterization of
seeded and seedless varieties of Kinnow Mandarin (Citrus reticulata
Blanco)”, Australian Jounal of Crop Science (AJCS, (11): 1542-1549.
18. Goh Pik Seah ELCY , Mansor Clyde MAHANI, Yong-Jin PARK, Normah
Mohd NOOR (2011), “Simple Sequence Repeat (SSR) profiling of ultivated
Limau Madu (Citrus reticulata Blanco) in Malaysia”, Biotechnol. Fac. Sci.
Technol., Univ.Kebangsaan Malaysia, 43600UKM Bangi, Selangor,
Malaysia, Fruits, 67-74. DOI:10.1051/fruits/2011070.
19. Kinley Dorji, Chinawat Yapwattanaphun (2015), “Assessment of the
genetic variability amongst mandarin (Citrus reticulata Blanco) accessions
in Bhutan using AFLP marker”, BMC Genetics, 16:39 DOI 0.1186/s12863-
015-0198-8.
20. Behrouz Golein, M Nazeryan, B Babakhani (2012), “Assessing genetic
variability in male sterile and low fertile citrus cultivars utilizing simple
sequence repeat markers (SSRs)”, African Journal of Biotechnology, 11(7),
1632-1638.
21. Nicholas Smirnoff, Glen L.Wheeler (2000), “Ascorbic Acid in Plants
Biosynthesis and Functio”, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular
Biology. UK, 291-314.
22. Xiao-Yan Yang Jin-Xia Xie, Fang-Fang Wang, Jing Zhong, Yong-Zhong
Liu, Shu-Ang Peng (2011), “Comparison of ascorbate metabolism in fruits of
36
two citrus species with obvious difference in ascorbate content in pulp”,
Journal of Plant Physiology, 168 (02) 2196-2205.
23. Junjie Tao, Han Wu, Zhangyun Li, Chunhui Huang and Xiaobiao Xu
(2018) “Molecular Evolution of GDP-D-Mannose Epimerase (GME), a Key
Gene in Plant Ascorbic Acid Biosynthesis”, Front Plant Sci
DOI: [10.3389/fpls.2018.01293]
24.Gilbert L, Alhagdow M, Nunes-Nesi A, Quemener B, Guillon
F, Bouchet B, Faurobert M, Gouble B, Page D, Garcia V, Petit J, Stevens
R, Causse M, Fernie AR, Lahaye M, Rothan C, Baldet P.(2009) “GDP-D-
mannose 3,5-epimerase (GME) plays a key role at the intersection of ascorbate
and non-cellulosic cell-wall biosynthesis in tomato”,Plant J, 60(3):499-508,
DOI: 10.1111/j.1365-313X.2009.03972.
III. Trang web tham khảo
25. https://vi.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C
26.http://khoahoc.tv/tim-ra-bi-an-cua-co-che-tong-hop-vitamin-c-o-thuc-vat-
15341
27.http://thegioicaygiong.vn/san-pham/giong-cay-quyt-ngot.html/
28.http://www.hoahocngaynay.com/vi/hoa-hoc-va-doi-song/hoa-thuc-
pham/239-vitamin-c.html
29. http://suckhoedoisong.vn/vo-quyt-vi-thuoc-da-nang-n115235.html
37
