Luận án Tiến sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA để canh tác rau ở Sóc Trăng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THỊ XÃ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ TỔNG HỢP IAA ĐỂ CANH TÁC RAU Ở SÓC TRĂNG

LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINH

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH 62420201

NĂM 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THỊ XÃ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ TỔNG HỢP IAA ĐỂ CANH TÁC RAU Ở SÓC TRĂNG

LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINH

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH 62420201

NGƢỜI HƢỚNG DẪN

PGS.TS. NGUYỄN KHỞI NGHĨA

TS. PHẠM NGỌC TÚ

NĂM 2021

PHẦN KÝ DUYỆT

Cần Thơ, ngày tháng năm 2021

NGƢỜI HƢỚNG DẪN CHÍNH

NGHIÊN CỨU SINH

PGS.TS. NGUYỄN KHỞI NGHĨA

LÊ THỊ XÃ

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành luận án tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của nhiều cá nhân và tập thể. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến tập thể và những cá nhân có tên dưới đây đã góp sức để giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu trong luận án này.

Đầu tiên và quan trọng nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân yêu vì sự đồng hành, chia sẻ, nhẫn nại, tình yêu và cả sự hỗ trợ về tinh thần, tài chính trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu của tôi trong bốn năm qua.

Xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến hai cán bộ hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Khởi Nghĩa-Phó trưởng bộ môn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ và TS. Phạm Ngọc Tú-Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu long. Đặc biệt là PGS.TS. Nguyễn Khởi Nghĩa- người Thầy đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu, hỗ trợ phương tiện nghiên cứu, đồng thời truyền đạt kinh nghiệm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án cũng như quá trình viết báo khoa học.

Xin gửi lời cảm ơn đến các em Nguyễn Thị Kiều Oanh, Ngô Thị Phương Thảo, Đỗ Thành Luân, Đặng Thị Yến Nhung, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Hoàng Kim Nương là cán bộ nghiên cứu thuộc phòng thí nghiệm Vi sinh vật Đất, bộ môn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ cùng các em sinh viên ngành Khoa học Đất khoá 41 thuộc bộ môn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ gồm Giang Yến Anh, Thị Hạnh Nguyên, Nguyễn Thị Thuý Cầm và em học viên cao học Quách Thị Trúc Ly ngành Sinh thái học khoá 24 thuộc bộ môn Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ tôi thực hiện các thí nghiệm trong nghiên cứu này.

Xin cảm ơn các em Nguyễn Thị Kiều Anh nghiên cứu viên phòng thí nghiệm vi sinh vật đất, bộ môn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ, em Trần Hoàng Ty học viên cao học lớp Sinh thái học khoá 25 thuộc bộ môn Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ, em Lâm Thanh Tâm sinh viên ngành khoa học đất khoá 41 bộ môn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ, cùng các em sinh viên lớp Bảo vệ Thực vật khoá 43 thuộc bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ tôi trong các thí nghiệm nhà lưới và ngoài đồng.

Xin cảm ơn các anh chị em nghiên cứu sinh khoá 2016-2020 thuộc viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là em nghiên cứu sinh Trần Võ Hải Đường đã động viên, chia sẻ kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành quyển luận án nghiên cứu sinh cũng như các loại hồ sơ trong suốt quá trình học tập.

Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, quý Thầy/Cô thuộc viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu, động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Xin cảm ơn tập thể cán bộ, giảng viên, nghiên cứu viên phòng thí nghiệm Vi sinh vật Đất và phòng thí nghiệm Hoá học Đất thuộc bộ môn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ đã chia sẻ kinh nghiệm, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các nghiên cứu trong luận án.

Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo các Sở Giáo dục và Đào tạo, Sở Nội Vụ tỉnh Sóc Trăng và Uỷ ban Nhân dân tỉnh Sóc Trăng đã tạo điều kiện để tôi được học tập và nghiên cứu nâng cao trình độ.

Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Khoa Sau Đại học và Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt năm năm qua dưới mái trường thân yêu này.

Xin cảm ơn Ban giám hiệu, tập thể giảng viên và cán bộ trường Cao đẳng Sư phạm Sóc Trăng, trường Cao đẳng Cộng đồng Sóc Trăng đã động viên và tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu trong thời gian qua.

Xin trân trọng cảm ơn với tấm lòng thành kính nhất!

LỜI BẢN QUYỀN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân nghiên cứu sinh dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Khởi Nghĩa và TS. Phạm Ngọc Tú. Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu hay luận văn nào trước đây.

Cán bộ hƣớng dẫn 1

Cán bộ hƣớng dẫn 2 Tác giả luận án

PGS.TS. Nguyễn Khởi Nghĩa TS. Phạm Ngọc Tú

Lê Thị Xã

TÓM LƢỢC

Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm đánh giá hai chức năng cố định đạm và tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) của một số hệ vi sinh vật bản địa (indigenous microorganism-IMO) thu thập từ các hệ thống canh tác cây trồng khác nhau ở Sóc Trăng đồng thời phân lập, tuyển chọn những dòng vi khuẩn có 2 chức năng này trong các IMO có khả năng kích thích sinh trưởng, làm tăng năng suất rau muống và cải xanh trồng ở Sóc Trăng. Môi trường Burks khuyết đạm đã được sử dụng để phân lập vi khuẩn cố định đạm và phương pháp so màu phản ứng với thuốc thử phenol nitroprusside và Salkowski lần lượt để xác định hàm lượng đạm và IAA trong môi trường lỏng ở bước sóng 636 nm và 530 nm. Khả năng kích thích hạt nảy mầm và kích sinh trưởng cây rau muống và cây cải xanh của các dòng vi khuẩn và IMO tuyển chọn được đánh giá ở các điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các hệ IMO thu thập từ các hệ thống cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng có sự đa dạng vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. Trong đó vi khuẩn là nhóm hiện diện với mật số cao và đa dạng hơn hai nhóm còn lại. Ngoài ra, kết quả đã chỉ ra rằng không có sự hiện diện của nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột cho người như Salmonella, Shigella, E. coli và Coliform trong các hệ IMO thu thập. Đặc biệt, tất cả các hệ IMO khảo sát còn cho thấy chúng có chức năng tổng hợp IAA và cố định đạm vì có sự hiện diện của nhóm vi khuẩn mang gen nifH với mật số vi khuẩn cố định đạm dao động từ 106-108 cfu.g-1. Trong đó, Luận án đã phân lập được 44 dòng vi khuẩn có 2 chức năng cố định đạm, tổng hợp IAA và đã tuyển chọn được 10 dòng vi khuẩn tốt nhất chúng thuộc 5 chi: Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Paraburkholderia và Pseudomonas. Kết quả đánh giá ở điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy 5 hệ IMO tuyển chọn và 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn gồm Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP-1.4, Bacillus megaterium MQ-2.5, Klebsiella pneumoniae MT-16.5, và Bacillus megaterium OM-17.5, cho hiệu quả tương đương nhau trong kích thích gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống (14-15%) và hạt cải xanh (3-5%), cũng như làm tăng chiều cao thân, chiều dài rễ và sinh khối tươi cây rau. Kết quả thí nghiệm nhà lưới cho thấy dòng vi khuẩn tuyển chọn cho hiệu quả kích thích sinh trưởng tốt hơn các hệ IMO và trong đó 3 dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4 và MQ-2.5 giúp giảm 25% lượng phân đạm bón theo khuyến cáo nhưng vẫn cho năng suất cây rau tương đương với nghiệm thức bón 100% NPK khuyến cáo. Đặc biệt, ở điều kiện ngoài đồng ba dòng vi khuẩn tuyển chọn giúp tăng năng suất rau muống và cải xanh từ 10- 20% dù bón giảm 25% lượng đạm theo khuyến cáo, đồng thời còn giúp giảm lượng nitrate lưu tồn trong rau từ 40-60% so với nghiệm thức đối chứng. Tóm lại, có thể ứng dụng 3 dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5 và hỗn hợp của chúng trong canh tác rau sạch và rau an toàn ở tỉnh Sóc Trăng.

Từ khoá: cải xanh, kích thích sinh trưởng cây trồng, rau muống, vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn tổng hợp IAA, vi sinh vật bản địa

ABSTRACT

The main objective of this study was to evaluate some of basic functions of several indigenous microorganism (IMOs) collected from different crop farming systems in Soc Trang as well as to isolate and select indigenous bacteria capable of fixing nitrogen and synthesizing IAA from these IMOs for plant growth promotion, yield enhancement of water spinach, mustard green in Soc Trang province. N-free Burk’s medium was used to isolate nitrogen-fixing bacteria. Nitrogen and IAA concentrations in liquid media were determined by phenol nitroprusside and Salkowski's reagent method at a wavelength of 636 and 530 nm with the help of spectrophotometer, respectively. The seed germination rate, growth and yield performance testes were carried out under laboratory, greenhouse and field conditions. The results showed that all collected IMOs had a diversity of three main microbial groups including bacteria, fungi and actinomyces. In which, bacterial group was the most predominant one. Moreover, there was no presence of bacterial group causing human intestinal infections such as Salmonella, Shigella, E. coli and Coliform in all collected IMOs. Besides, all IMOs revealed their good abilities in biological nitrogen fixation, IAA synthesis. Especially, all IMOs were found the sequence of nifH gene with the number of N-fixing bacteria varied 106-108 cfu.g-1. Therefore, a total of 44 bacterial strains capable of both fixing nitrogen and synthesizing IAA were isolated and identified the most 10 outstanding bacteria, they belonged to 5 different genera including Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Paraburkholderia, and Pseudomonas. The results of laboratory conditions test indicated that five selected IMO and the best 5 selected isolates included Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP- 1.4, Bacillus megaterium MQ-2.5, Klebsiella pneumoniae MT-16.5 and Bacillus megaterium OM-17.5, equally effective in stimulating germination of water spinach seeds (14-15%) and mustard green seeds (3-5%), Besides, they also helped to increase stem height, root length and fresh biomass of water spinach and mustard green. The pot experiment showed that isolated strains were more effective than IMOs in stimulating growth, in which 3 strains, TP-1.3, TP-1.4, and MQ-2.5 were the best bacterial isolates identified as bio-stimulant agents in order to reduce 25% of the recommended chemical N fertilizer formula, but the yields, growth and development of vegetables were remained similar as 100% recommended NPK formula treatment. Particularly, in the field, three selected bacterial strains showed their benefit in increasing the vegetable yield by 10-20% and reducing of 25% chemical N fertilizer and also helped to reduce from 40 to 60% of the total nitrate in fresh vegetables. In short, these three outstanding bacterial isolates and their mixture can be exploited for safe and clean vegetable cultuvation in Soc Trang province.

Key words: IAA synthesizing bacteria, indigenous microorganisms, mustard green, nitrogen fixing bacteria, plant growth promotion, water spinach

MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................. .....i DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................................vii DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. .....x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................xii CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU ...................................................................................... .....1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu của đề tài .................................................................................................. 2 1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................... 2 1.4 Nội dung nghiên cứu................................................................................................ 3 1.5 Tính cấp thiết của luận án ...................................................................................... 3 1.6 Đóng góp mới của luận án ...................................................................................... 3 1.7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ........................................................... 4 CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................................... 6 2.1 Điều kiện địa lí và tự nhiên tỉnh Sóc Trăng .......................................................... 6 2.2 Định hƣớng phát triển cây rau ở Sóc Trăng ......................................................... 7 2.3 Tổng quan về cây rau .............................................................................................. 8 2.3.1 Giá trị dinh dưỡng .................................................................................................. 9 2.3.2 Giá trị kinh tế .......................................................................................................... 9 2.3.3 Yêu cầu về đất trồng, dinh dưỡng, phân bón và nước trong canh tác rau ............ 10 2.3.4 Nhu cầu đạm của rau ăn lá ................................................................................... 10 2.3.5 Cây rau muống ..................................................................................................... 11 2.3.6 Cây cải xanh ......................................................................................................... 11 2.4.Vai trò của vi sinh vật kích thích sinh trƣởng thực vật đối với cây trồng ....... 13 2.4.1 Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật ............................................................. 13 2.4.2 Cố định đạm ......................................................................................................... 14 2.4.2.1 Định nghĩa quá trình cố định đạm .................................................................... 14 2.4.2.2 Enzyme nitrogenase trong quá trình cố định đạm ............................................ 15 2.4.2.3 Gen nif trong cố định đạm ................................................................................. 16 2.4.2.4 Cơ chế của quá trình cố định đạm .................................................................... 18 2.4.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm ............................................ 19 2.4.2.6 Vi sinh vật cố định đạm ..................................................................................... 19 2.4.3 Tổng hợp indole-3-acetic acid .............................................................................. 26 2.4.3.1 Vai trò sinh lý của auxin .................................................................................... 26 2.4.3.2 Vi sinh vật tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) ................................................ 27 2.4.3.3 Các con đường tổng hợp IAA ở vi sinh vật ....................................................... 28 2.4.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp IAA........................................... 29 2.4.4 Các nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA trong và ngoài nước .................................................................................................................... 31 2.4.4.1 Ngoài nước ........................................................................................................ 31

2.4.4.2 Trong nước ........................................................................................................ 32 2.5 Hệ vi sinh vật bản địa IMO .................................................................................. 34 2.5.1 Lịch sử nghiên cứu ............................................................................................... 34 2.5.2 Vai trò và chức năng của IMO đối với cây trồng ................................................. 34 2.5.3 Các nghiên cứu và ứng dụng IMO trong và ngoài nước ...................................... 36 2.5.3.1 Nghiên cứu và ứng dụng IMO ở các nước ........................................................ 36 2.5.3.2 Nghiên cứu và ứng dụng IMO ở Việt Nam ........................................................ 38 2.6 Đa dạng vi sinh vật ................................................................................................ 39 2.6.1 Khái niệm đa dạng vi sinh vật và vai trò đa dạng vi sinh vật trong đất ............... 39 2.6.2 Phương pháp đánh giá đa dạng vi sinh vật ........................................................... 40 2.6.2.1 Phương pháp truyền thống trong đánh giá đa dạng vi vinh vật ....................... 40 2.6.2.2 Phương pháp sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng vi sinh vật ................. 41 2.6.2.3 Phương pháp phân tích đa dạng vi sinh vật dựa vào giải trình tự acid nucleic

đoạn gen mã hóa 16S-rRNA ............................................................................... 41 2.6.2.4 Phương pháp điện di theo gradient biến tính (DGGE và TGGE) ..................... 42 CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................... 45 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu ........................................................................................ 45 3.1.1 Thời gian và địa điểm ........................................................................................... 45 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu............................................................................................... 45 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị và hoá chất ................................................................................ 45 3.1.3.1 Dụng cụ.............................................................................................................. 45 3.1.3.2 Thiết bị ............................................................................................................... 45 3.1.3.3 Hoá chất ............................................................................................................ 46 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................... 46 3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự đa dạng nhóm vi sinh vật trong các hệ IMO thu thập .. 47 3.2.1.1 Thu thập nguồn vi sinh vật bản địa IMO ........................................................... 47 3.2.1.2 Khảo sát sự đa dạng của các nhóm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ

IMO bằng phương pháp PCR ............................................................................. 48

3.2.1.3 Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập

bằng phương pháp nested-PCR kết hợp DGGE ................................................. 50 3.2.1.4 Khảo sát mật số vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập ......... 52 3.2.1.5 Khảo sát sự hiện diện của một số vi khuẩn gây bệnh (Coliform, E. coli, Salmonella và Shigella) trong các hệ IMO thu thập .......................................... 53 3.2.2 Nội dung 2: Khảo sát và đánh giá một số chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các hệ IMO thu thập ........................................................................... 54 3.2.2.1 Khảo sát khả năng tổng hợp hormone thực vật IAA của các hệ IMO thu thập 54 3.2.2.2 Khảo sát khả năng cố định đạm của các hệ IMO thu thập ............................... 55 3.2.3 Nội dung 3: Phân lập, tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn bản địa có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ IMO thu thập .................... 56

3.2.3.1 Phân lập các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm từ các hệ IMO

thu thập ............................................................................................................... 56 3.2.3.2 Khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn bản địa phân lập từ các hệ IMO trong môi trường nuôi cấy lỏng ............................................................ 57 3.2.3.3 Khảo sát sự hiện diện của gen nifH đối với các dòng vi khuẩn phân lập ......... 57 3.2.3.4 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn cố định đạm đã tuyển

chọn..................................................................................................................... 58

3.2.3.5 Giải trình tự gen 16S-rRNA của 10 dòng vi khuẩn có đồng thời hai chức năng

cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn ........................................................... 58 3.2.4 Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và các hệ IMO chứa những dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khả năng nảy mầm và sinh trưởng cây rau trong điều kiện phòng thí nghiệm .. 58

3.2.4.1 Ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khả năng nảy mầm và

sinh trưởng cây rau muống và cây cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm ....... 59

3.2.4.2 Ảnh hưởng của một số hệ IMO tuyển chọn lên khả năng nảy mầm và sinh

trưởng cây rau muống và cây cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm .............. 60 3.2.5 Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn và 5 hệ IMO chứa những dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khả năng sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới ............................................................................. 60 3.2.5.1 Chuẩn bị đất thí nghiệm .................................................................................... 60 3.2.5.2 Chuẩn bị nguồn vi sinh vật ................................................................................ 61 3.2.5.3 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 62 3.2.5.4 Các chỉ tiêu theo dõi .......................................................................................... 64 3.2.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn và 2 IMO tuyển chọn lên sinh trưởng, năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện ngoài đồng ............ 64 3.2.6.1 Chuẩn bị nguồn vi sinh vật ................................................................................ 64 3.2.6.2 Chuẩn bị đất thí nghiệm .................................................................................... 65 3.2.6.3 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 65 3.2.6.4 Các chỉ tiêu theo dõi .......................................................................................... 67 3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................................... 69 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..................................................................... 70 4.1 Nội dung 1: Sự đa dạng về nhóm vi sinh vật trong các hệ IMO thu thập........ 70 4.1.1 Đặc điểm sinh hóa của các hệ vi sinh vật bản địa thu thập .................................. 70 4.1.2 Sự hiện diện của vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập ............ 70 4.1.3 Sự đa dạng hệ vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong IMO ......................................... 72 4.1.3.1 Đa dạng quần thể vi khuẩn ................................................................................ 72 4.1.3.2 Đa dạng quần thể nấm ...................................................................................... 74 4.1.3.3 Đa dạng quần thể xạ khuẩn ............................................................................... 75 4.1.4 Mật số vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập............................ 76 4.1.4.1 Mật số vi khuẩn ................................................................................................. 77

iii

4.1.4.2 Mật số nấm ....................................................................................................... 78 4.1.4.3 Mật số xạ khuẩn ................................................................................................ 78 4.1.5 Sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh trong hệ IMO thu thập ................................ 79 4.2 Nội dung 2: Chức năng kích thích sinh trƣởng cây trồng của các hệ IMO thu thập..................................................................................................................... 81 4.2.1 Tổng hợp IAA ...................................................................................................... 81 4.2.2 Cố định đạm ......................................................................................................... 84 4.2.2.1 Gen chức năng nifH trong các hệ IMO ............................................................. 84 4.2.2.2 Khả năng cố định đạm sinh học của 20 hệ IMO trong môi trường Burk's lỏng85 4.3 Nội dung 3: Phân lập tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn bản địa có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ IMO thu thập ............. 87 4.3.1 Mật số vi khuẩn cố định đạm trong các hệ IMO .................................................. 87 4.3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm từ các hệ IMO thu thập ......................... 88 4.3.3 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập ................. 90 4.3.3.1 Hàm lượng đạm tổng số (Nts) ............................................................................ 90 +) .................................................................... 91 4.3.3.2 Hàm lượng đạm hữu dụng (NH4 4.3.4 Gen nifH trong cấu trúc di truyền của một số dòng vi khuẩn cố định đạm tuyển

chọn..................................................................................................................... 93

4.3.5 Khả năng tổng hợp IAA của 50 dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập được tuyển

chọn..................................................................................................................... 95 4.3.6 Kết quả giải trình tự gen 16S-rRNA của 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn .............. 98 4.4 Nội dung 4: Ảnh hƣởng của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn và các IMO chứa các dòng vi khuẩn này lên khả năng kích thích nảy mầm và sinh trƣởng rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm .................. 102 4.4.1 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống của 8 dòng vi khuẩn tuyển chọn ......................................................................................................... 102 4.4.1.1 Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn lên khả năng nảy mầm hạt rau muống ........ 102 4.4.1.2 Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khả năng kích thích sinh

trưởng rau muống ............................................................................................. 104

4.4.2 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây cải xanh của 5 dòng vi khuẩn106 4.4.2.1 Ảnh hưởng của các mức mật số vi khuẩn khác nhau lên khả năng nảy mầm hạt cải xanh ............................................................................................................. 106 4.4.2.2 Ảnh hưởng của 5 dòng vi khuẩn thử nghiệm lên sinh trưởng cây cải xanh .... 107 4.4.3 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống của 5 hệ IMO tuyển chọn................................................................................................................... 109 4.4.3.1 Ảnh hưởng của mức pha loãng lên tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống .................. 109 4.4.3.2 Ảnh hưởng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên khả năng sinh trưởng cây rau muống110 4.4.4 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây cải xanh của 5 hệ IMO tuyển

chọn................................................................................................................... 111 4.4.4.1 Ảnh hưởng của mức pha loãng khác nhau lên tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh .... 111

4.4.4.2 Ảnh hưởng của các hệ IMO lên khả năng sinh trưởng của cây cải xanh ở điều

kiện phòng thí nghiệm ....................................................................................... 114 4.5 Nội dung 5: Hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn và 5 IMO chứa các dòng vi khuẩn tuyển chọn lên sinh trƣởng, năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lƣới ............................................................................... 117 4.5.1 Sinh trưởng và năng suất rau muống trong nhà lưới .......................................... 117 4.5.1.1 Chiều cao cây rau muống ................................................................................ 117 4.5.1.2 Số lá rau muống ............................................................................................... 119 4.5.1.3 Đường kính thân .............................................................................................. 120 4.5.1.4 Hàm lượng chlorophyll tổng số trong lá ......................................................... 121 4.5.1.5 Sinh khối tươi/chậu .......................................................................................... 122 4.5.2 Sinh trưởng và năng suất cải xanh trong nhà lưới .............................................. 125 4.5.2.1 Vụ cải xanh thứ nhất ........................................................................................ 125 4.5.2.2 Vụ cải xanh thứ hai .......................................................................................... 127 4.6 Nội dung 6: Hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn và 2 IMO lên sinh trƣởng, năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện đồng ruộng ........... 131 4.6.1 Sinh trưởng và năng suất rau muống ở điều kiện đồng ruộng ........................... 131 4.6.1.1 Vụ rau muống thứ nhất .................................................................................... 131 4.6.1.2 Vụ rau muống thứ hai ...................................................................................... 135 4.6.2 Sinh trưởng và năng suất cải xanh ở điều kiện ngoài đồng ................................ 139 4.6.2.1 Vụ cải xanh thứ nhất ....................................................................................... 139 4.6.2.2 Vụ cải xanh thứ hai .......................................................................................... 142 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 150 5.1 Kết luận ................................................................................................................ 150 5.2 Kiến nghị .............................................................................................................. 151 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 152 PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 1 Danh mục các hóa chất sử dụng và nguồn gốc .............................................................. 2 Thành phần một số môi trường nuôi cấy vi sinh vật trong luận án ................................ 3 Thành phần các dung dịch sử dụng trong luận án .......................................................... 4 Thông tin chế phẩm vi sinh thương mại làm đối chứng ................................................. 5 pH của các IMO theo thời gian ...................................................................................... 6 Kết quả phân tích số nhóm loài vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn trong IMO ........................... 7 Hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào 83 dòng vi khuẩn phân lập ............................. 8 Hình dạng tế bào 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn ở độ phóng đại 100X .......................... 9 Trình tự đoạn gen 16S-rRNA của 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn ................................... 10 Ghi nhận tổng quan 5 vụ rau thí nghiệm trong nhà lưới .............................................. 11 Tổng hợp năng suất rau muống và cải xanh trong nhà lưới ......................................... 12 Kết quả đánh giá vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa trong rau qua 5 vụ rau trong

nhà lưới ...................................................................................................................

13 Ghi nhận tổng quan 4 vụ rau thí nghiệm ngoài đồng ................................................... 14 Tổng hợp năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện ngoài đồng ........................... 15 Tổng hợp hàm lượng nitrate trong 4 vụ rau thí nghiệm ở ngoài đồng ......................... 16 Kết quả đánh giá vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa trong rau qua 4 vụ thí nghiệm ngoài đồng ..............................................................................................................

DANH SÁCH BẢNG Tên bảng

Bảng 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 3.4

Trang 16 17 48 51 61 61

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

3.10

3.11

4.1

4.2

4.3

4.4 4.5 4.6

87 88 92

4.7

So sánh 2 hợp phần của enzyme nitrogenase Vai trò của các gen nif trong quá trình cố định nitơ Vị trí và địa điểm thu thập 19 hệ vi sinh vật bản địa IMO Thành phần của PAGE 8% với nồng độ chất biến tính 40-60% Một số đặc tính đất thí nghiệm nhà lưới Thời gian bố trí các thí nghiệm rau muống và cải xanh trong nhà lưới Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ Các nghiệm thức thí nghiệm cho cây rau muống được bố trí trong nhà lưới Các nghiệm thức thí nghiệm cho cây cải xanh được bố trí trong nhà lưới Lịch bón phân cho cây rau muống và cây cải xanh được bố trí trong nhà lưới Một số đặc tính đất trước khi bố trí thí nghiệm ngoài đồng tại xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng Thông tin về thời gian bố trí các thí nghiệm rau muống và cải xanh ngoài đồng tại xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng Thông tin chi tiết về các nghiệm thức thí nghiệm ngoài đồng cho cây rau muống và cây cải xanh Lịch bón phân cho cây rau muống và cải xanh trong thí nghiệm ngoài đồng tại xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng Mật số vi sinh vật của 20 hệ IMO thu thập trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng sau 38 ngày lên men Nồng độ IAA (mg.L-1) trong môi trường NBRIP lỏng bổ sung tryptophan được tổng hợp bởi 20 hệ IMO thu thập sau 6 ngày nuôi cấy Hàm lượng đạm tổng số tăng thêm trong môi trường Burks lỏng sau 5 ngày nuôi cấy của các IMO thu thập Mật số vi khuẩn cố định đạm trong các hệ IMO thu thập Kết quả phân lập vi khuẩn trong 19 hệ IMO thu thập Hàm lượng đạm tổng số và đạm hữu dụng tổng hợp bởi 83 dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập trong môi trường Burks lỏng Nồng độ IAA tổng hợp bởi 50 dòng vi khuẩn cố định đạm tuyển chọn trong môi trường Burks lỏng khuyết đạm có bổ sung 100 mg.L-1 tryptophan sau 10 ngày nuôi cấy

vii

4.8

4.9

102

4.10

105

4.11

106

4.12

108

4.13

110

4.14

111

4.15

112

4.16

114

4.17

118

4.18

120

4.19

121

4.20

122

4.21

123

Sự tương đồng giữa 10 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA được tuyển chọn so với các dòng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI Ảnh hưởng mật số vi khuẩn lên tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống sau 6 ngày thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên một số chỉ tiêu sinh trưởng cây rau muống trên môi trường agar 1% ở điều kiện phòng thí nghiệm Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn lên tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh sau 6 ngày chủng ở điều kiện phòng thí nghiệm Ảnh hưởng của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên một số chỉ tiêu sinh trưởng cây cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm Ảnh hưởng các mức pha loãng hệ IMO lên tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống sau 6 ngày chủng ở điều kiện phòng thí nghiệm Ảnh hưởng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên một số chỉ tiêu sinh trưởng cây rau muống ở mức nồng độ pha loãng 1000 lần ở điều kiện phòng thí nghiệm Ảnh hưởng của các mức pha loãng hệ IMO lên tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh sau 6 ngày chủng ở điều kiện phòng thí nghiệm Ảnh hưởng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên một số chỉ tiêu sinh trưởng cây cải xanh ở nồng độ pha loãng 1000 lần ở điều kiện phòng thí nghiệm Chiều cao cây rau muống qua 3 vụ thí nghiệm ở phòng thí nghiệm Số lá rau muống qua 3 vụ thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm Đường kính cây rau muống qua 3 vụ thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm Hàm lượng chlorophyll tổng số trong lá rau muống qua 3 vụ thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm Trọng lượng tươi của rau muống (g/chậu) qua 3 vụ thí nghiệm ở điều kiện nhà lưới

4.22 Một số chỉ tiêu nông học và sinh khối cây cải xanh qua 2 vụ thí

126

nghiệm trong chậu ở trong điều kiện nhà lưới

133

4.23 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây rau muống trong vụ thí nghiệm 1 ở ngoài đồng tại Trường Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 30 ngày gieo hạt

136

4.24 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây rau muống trong vụ thí nghiệm 2 ở ngoài đồng tại Trường Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 26 ngày gieo hạt

viii

140

4.25 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây cải xanh trong vụ thí nghiệm 1 ở ngoài đồng tại Trường Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 30 ngày gieo hạt

143

4.26 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây cải xanh trong vụ thí nghiệm 2 ở ngoài đồng tại Trường Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 33 ngày gieo hạt

DANH SÁCH HÌNH Tên hình

Hình 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9

Trang 14 15 18 18 21 23 29 36 42

3.1 3.2 3.3 3.4

46 47 48 66

3.5

4.1 4.2

70 71

4.3

4.4

4.5

4.6

4.7

4.8

4.9

Các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của vi khuẩn Cấu tạo và cơ chế hoạt động của enzyme nitrogenase Bản đồ gen nif của vi khuẩn Klebsiella pneumoniae Sơ đồ giả thuyết về hai con đường của quá trình cố định N2 Các dạng vi khuẩn Burkholderia Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Các con đường tổng hợp IAA ở vi khuẩn Các bước thu thập IMO từ môi trường đất Các bước thực hiện phân tích đa dạng hệ vi sinh vật trong DGGE Sơ đồ tóm tắt các nội dung nghiên cứu của luận án Tóm tắt quy trình thu mẫu IMO Sơ đồ vị trí thu mẫu các hệ IMO Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng tại xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng Vị trí thu mẫu để xác định năng suất rau muống và cải xanh trên mỗi lô thí nghiệm Hình thái bên ngoài của hệ vi sinh vật bản địa IMO Kết quả sản phẩm PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu để nhận diện nhóm vi sinh vật trong hệ IMO Kết quả phân tích đa dạng thành phần vi khuẩn trong 14 hệ IMO thu thập Kết quả phân tích đa dạng thành phần nấm trong 14 hệ IMO thu thập Kết quả phân tích đa dạng thành phần xạ khuẩn trong 14 hệ IMO thu thập Kết quả kiểm tra sự hiện diện nhóm vi sinh vật gây bệnh trong các hệ IMO thu thập Nồng độ IAA được tổng hợp cao nhất bởi 20 hệ IMO thu thập trong môi trường NBRIP có bổ sung tryptophan (100 mg.L-1) trong thời gian 6 ngày nuôi cấy Kết quả PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu polF/polR dùng để nhận diện gen chức năng cố định đạm sinh học NifH của 20 hệ IMO thu thập Sự đa dạng kích thước và hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn cố định đạm đại diện trên môi trường Burks sau 5 ngày nuôi cấy

4.10

4.11

4.12

101

4.13

104

4.14

107

4.15

113

4.16

114

4.17

128

Sự đa dạng hình thái tế bào của một số dòng vi khuẩn cố định đạm đại diện trên môi trường Burks sau 5 ngày nuôi cấy ở độ phóng đại 100X Kết quả PCR với cặp mồi polF/polR chuyên biệt cho gen nifH có chức năng cố định đạm sinh học của 22 dòng vi khuẩn cố định đạm Mối quan hệ di truyền giữa 10 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn dựa trên phương pháp phân tích UPGMA Sự khác biệt về mặt hình thái giữa nghiệm thức có chủng và không chủng vi khuẩn ở hạt và cây rau muống mầm Tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn ở mật số 107cfu.mL-1 sau 2 ngày thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm Tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh chủng IMO ở mức pha loãng 1.000 lần sau 2 ngày chủng Sự xuất hiện nhiều lông hút ở rễ mầm cây cải khi được chủng với IMO Cây cải xanh ở các nghiệm thức thí nghiệm khác nhau ở thời điểm 33 ngày sau khi gieo hạt của vụ cải thứ 2

Viết tắt

ADN APS DGGE ĐBSCL IAA IAM IAN IMO ITS KNF LSB PDA PCR TAM TAE TSB TEMED TSO

Acid Deoxyribonucleic Ammonium persulfate Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Đồng bằng sông Cửu Long Indole-3-Acetic Acid Indole-3-acetamide Indole-3-acetonitrile Indigenous Microorganism (hệ vi sinh vật bản địa) Internal transcribed spacer Korean Natural Farming Lauryl Sulphate Broth Potato Dextrose Agar Polymerase Chain Reaction Tryptamine Tris-Acetic-EDTA Tryptone Soya Broth Tetramethylethylenediamine Tryptophan side-chain oxidase

xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết đầy đủ

CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Rau là thực phẩm quan trọng không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày của các gia đình người Việt Nam vì rau cung cấp những dưỡng chất cần thiết cho con người. Trung bình mỗi người cần 400 g rau xanh/ngày (FAO/WHO, 2004). Trong đó, các loại rau ăn lá như: rau muống, mồng tơi, cải xanh, cải ngọt, xà lách… được ưa chuộng và tiêu thụ nhiều vì chúng dễ trồng, dễ chế biến và giàu dinh dưỡng. Tỉnh Sóc Trăng với điều kiện thuận lợi cho việc trồng rau màu quanh năm, từ lâu đã hình thành nhiều vùng đất chuyên canh cây rau điển hình như Thành phố Sóc Trăng, xã Đại Tâm, huyện Mỹ Xuyên, xã Phú Tâm, Phú Tân và An Hiệp, huyện Châu Thành, thị xã Ngã Năm và thị xã Vĩnh Châu với tổng diện tích trồng rau và màu trên toàn tỉnh hằng năm trên 50.000 ha. Các loại rau chủ lực mang lại giá trị kinh tế cao và có xu hướng phát triển ở Sóc Trăng gồm cải xanh, cải ngọt, cải thìa, cải xà lách pháp, mồng tơi, rau muống, hẹ, hành tím, dưa leo, ớt, bí, khổ qua… trong đó có các rau ăn lá được tiêu thụ thường xuyên với số lượng lớn như mồng tơi, rau muống, cải xanh... Trong canh tác rau ăn lá, để đạt năng suất tối đa, mẫu mã đẹp, dễ bán và thu được lợi nhuận cao, nông dân ở nhiều vùng chuyên canh rau ăn lá đã lạm dụng phân hóa học đặc biệt là phân đạm và các chất kích thích sinh trưởng (Trần Ngọc Hiếu, 2017). Thêm vào đó, rau ăn lá có thời gian sinh trưởng ngắn, thiếu thời gian cách ly an toàn nên dễ dẫn đến việc tồn dư các chất độc hại ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng, đặc biệt là dư lượng nitrate và các chất kích thích sinh trưởng trong rau. Ngoài ra việc lạm dụng phân hóa học, chất kích thích sinh trưởng trong canh tác rau đã và đang tác động tiêu cực lâu dài, nghiêm trọng đến môi trường sinh thái và làm gia tăng tiến trình suy thoái, bạc màu đất (Stinner, 2007). Do đó, nhu cầu rau sạch, rau an toàn, và rau hữu cơ ở cả nước nói chung và ở Sóc Trăng nói riêng hiện nay là rất lớn.

Một trong những chiến lược quan trọng trong canh tác rau sạch và an toàn trong phát triển nông nghiệp bền vững nhằm hạn chế ô nhiễm môi trường và tác động tiêu cực đến sức khỏe người tiêu dùng là canh tác rau theo hướng sinh học và hữu cơ trong đó chú trọng đến sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ sinh học hữu cơ và vi sinh có các chức năng có lợi cho cây trồng có nguồn gốc bản địa (Alves et al., 2004; Adesemoye et al., 2009; Hungria et al., 2010, 2013). Trong đó ứng dụng hệ vi sinh vật bản địa (indigenous microorganisms (IMO)) có sẵn trong đất để phục vụ cho phát triển nông nghiệp bền vững đã được nghiên cứu và phát triển từ lâu bởi Cho Han Kyu vào những năm 1960 (Reddy, 2011). Tại một số nước, nghiên cứu và sử dụng hệ IMO đã được chứng minh và cho thấy chúng có hiệu quả cao trong việc tăng sinh trưởng, năng suất cây trồng và chất lượng của nông sản (Phạm Chí Thành và Y Ka Nin H’ Dok, 2002; Pham Tien Dung and Y Ka Nin H’ Dok, 2009; Chiemela et al., 2013b; Koon et al., 2013; Mbouobda et al., 2013; Sekhar and Gopal, 2013). Ngoài ra, hệ IMO còn có hiệu quả trong việc cải tạo, phục hồi, duy trì và bảo vệ sức khoẻ của đất (Phạm Chí

Thành và Y Ka Nin H’ Dok, 2002; Pham Tien Dung and Y Ka Nin H’ Dok, 2009; Illani et al., 2012; Sumathi et al., 2012; Mbouobda et al., 2013; Kumar and Gopal, 2015). Tuy nhiên, nghiên cứu về thành phần vi sinh vật có các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các hệ vi sinh vật bản địa ở Sóc Trăng nhằm khai thác và ứng dụng chúng trong canh tác rau ở tỉnh Sóc Trăng giúp nâng cao năng suất và chất lượng cây rau vẫn chưa được nghiên cứu một cách bài bảng và có hệ thống. Đặc biệt là các nghiên cứu về phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn có 2 chức năng cố định đạm và tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) từ các hệ IMO để ứng dụng trên cây rau nhằm giảm lượng phân đạm hóa học bón còn nhiều hạn chế ở phạm vi cả trong và ngoài nước. Do đó nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA để canh tác rau ở Sóc Trăng” cần thiết được thực hiện.

1.2 Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu của nghiên cứu nhằm phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn bản địa có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA trong các hệ IMO thu thập từ đất canh tác các loại cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng giúp kích thích sinh trưởng và gia tăng năng suất cây rau muống và cây cải xanh.

Trong đó, có các mục tiêu cụ thể như sau: - Xác định được sự đa dạng các nhóm vi sinh vật và đánh giá được chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các hệ IMO thu thập. - Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có 2 chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ vi sinh vật bản địa IMO thu thập. - Đánh giá được ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn lên tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng của cây rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm. - Đánh giá được hiệu quả của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn lên sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng.

1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các hệ vi sinh vật bản địa (IMO) và vi khuẩn

có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA được phân lập từ các hệ IMO này.

Phạm vi nghiên cứu của đề tài là các hệ IMO thu thập ở các hệ thống canh tác cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng và các thí nghiệm được bố trí dựa trên cơ sở ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng ở tỉnh Sóc Trăng.

Giới hạn nghiên cứu của đề tài là chỉ khảo sát khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của hệ IMO và dựa trên cơ sở đó tiến hành phân lập các dòng dòng vi khuẩn có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA trong các hệ IMO nghiên cứu và chỉ ứng dụng chúng trên 2 đối tượng cây rau muống và cây cải xanh tại xã Trường Khánh huyện Long Phú tỉnh Sóc Trăng.

1.4 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát sự đa dạng các nhóm vi sinh vật trong các hệ IMO từ đất

canh tác các loại cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng.

Nội dung 2: Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng gồm cố định

đạm và tổng hợp IAA của các hệ IMO thu thập.

Nội dung 3: Phân lập, tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn bản địa có hai

chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ IMO thu được.

Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và các IMO chứa những dòng vi khuẩn này lên khả năng nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm.

Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và 5 IMO chứa những dòng vi khuẩn này lên sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới.

Nội dung 6: Đánh giá hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và 2 IMO chứa những dòng vi khuẩn này lên sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện ngoài đồng.

1.5 Tính cấp thiết của luận án

Hiện nay việc áp dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật trong trồng trọt đang được quan tâm, nghiên cứu, ứng dụng và phát triển mạnh trên thế giới cũng như trong nước. Tại tỉnh Sóc Trăng phát triển cây rau theo xu hướng an toàn sinh học được chú trọng trong đó khuyến khích sử dụng phân bón hữu cơ, các sản phẩm có nguồn gốc hữu cơ, sinh học, hoặc vi sinh vật an toàn cho con người và môi trường sinh thái. Đặc biệt là nhóm vi sinh vật bản địa đa chức năng có lợi cho cây trồng trong phạm vi tỉnh Sóc Trăng vẫn chưa được khai thác và tận dụng. Do đó việc khai thác vi sinh vật bản địa ở tỉnh để ứng dụng vào sản xuất nông nghiệp trong đó có cây rau giúp giảm thiểu việc bón các hóa chất nông nghiệp như phân bón hóa học, chất kích thích sinh trưởng tổng hợp nhằm giảm lưu tồn hóa chất trong nông sản và giảm thiểu các tác động làm ô nhiễm môi trường là việc làm rất quan trọng và cần thiết. Mặc khác, việc nghiên cứu các vi sinh vật có lợi ở tỉnh Sóc Trăng ứng dụng trong canh tác rau ở tỉnh này sẽ góp phần tăng sản lượng và diện tích sản xuất rau sạch, rau an toàn cho tỉnh Sóc Trăng nói chung và cho Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng. Từ đó cho thấy đề tài "Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA để canh tác rau ở Sóc Trăng" là thật sự cần thiết để thực hiện.

1.6 Đóng góp mới của luận án

Hướng nghiên cứu đánh giá thành phần vi sinh vật, chức năng kích thích sinh trưởng của IMO cũng như khai thác nhóm vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp các IAA trong các IMO của luận án là hướng nghiên cứu mới do đó đã mang lại một số đóng góp mới sau:

Luận án đã cung cấp những kết quả nghiên cứu khoa học mới về một số đặc tính của 20 hệ vi sinh vật bản địa IMO trên các hệ thống canh tác cây trồng tại tỉnh Sóc Trăng. Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự đa dạng về các nhóm vi sinh vật chính bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO. Tuy nhiên, không có sự hiện diện những vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa ở người như Salmonella, Shigella, Coliform, E. coli. Bên cạnh đó các IMO còn cho thấy chúng có các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng như cố định đạm và tổng hợp IAA.

Ngoài ra các kết quả nghiên cứu về các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA phân lập trong các hệ vi sinh vật bản địa cũng như hiệu quả của chúng trong kích thích nảy mầm, sinh trưởng và làm tăng năng suất rau, giảm nitrate tồn dư trong rau trong khi bón giảm lượng phân đạm theo công thức khuyến cáo là những kết quả nghiên cứu mới về các dòng vi khuẩn đa chức năng trong các hệ IMO tại Việt Nam và là nghiên cứu đầu tiên, chính quy trong tuyển chọn các dòng vi khuẩn kích thích sinh trưởng, làm tăng năng suất cây rau muống và cải xanh tại tỉnh Sóc Trăng. Điều này rất có ý nghĩa trong phát triển sản xuất rau sạch, rau an toàn cho tỉnh Sóc Trăng nói riêng và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long nói chung.

Tính mới của luận án còn thể hiện ở kết quả so sánh hiệu quả kích thích nảy mầm, sinh trưởng cây rau giữa hệ IMO thu thập tại Sóc Trăng với các dòng vi khuẩn có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA được phân lập từ các hệ IMO này và đã cho thấy rằng cả hai (IMO và dòng vi khuẩn) cho hiệu quả kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây rau là tương đương nhau, tuy nhiên khi so sánh về chức năng chuyên biệt như cố định đạm thì các dòng vi khuẩn phân lập cho hiệu quả kích thích sinh trưởng cao hơn các hệ IMO. Ngoài ra, 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn được định danh là những dòng vi khuẩn có độ an toàn sinh học cao.

Kết quả nghiên cứu của luận án là tài liệu tham khảo tốt cho các nghiên cứu tiếp theo và làm tài liệu tham khảo trong giảng dạy cho các ngành công nghệ sinh học, vi sinh vật đất, nông nghiệp và sinh học khác.

1.7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Về mặt ý nghĩa khoa học, các kết quả nghiên cứu của đề tài này là tài liệu tham khảo có ý nghĩa khoa học, đáng tin cậy có thể dùng trong giảng dạy và trong nghiên cứu khoa học về lĩnh vực nông nghiệp, vi sinh vật đất, công nghệ sinh học và sinh học. Luận án cũng đã cung cấp kiến thức sâu rộng về vai trò và chức năng của các hệ vi sinh vật bản địa nói chung và hệ vi sinh vật bản địa thu thập tại các hệ thống canh tác cây trồng ở tỉnh Sóc Trăng nói riêng về sự đa thành phần vi sinh vật chính có trong hệ IMO gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn cũng như các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của chúng bao gồm cố định đạm và tổng hợp IAA. Bên cạnh đó nghiên cứu cũng đã cho thấy sự có hiện diện của nhóm vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA trong các hệ vi sinh vật bản địa IMO, đồng thời có sự đa dạng của nhóm vi sinh vật cố định đạm trong các hệ IMO thu thập tại các địa điểm khác nhau trong tỉnh Sóc Trăng. Ngoài ra kết quả so sánh hiệu quả kích thích nảy mầm và kích thích sinh trưởng của

các hệ vi sinh vật bản địa với các dòng thuần vi khuẩn phân lập về mặt lý thuyết là tương đương nhau, tuy nhiên khi so sánh về chức năng chuyên biệt là cố định đạm và tổng hợp IAA thì các dòng vi khuẩn thuần cho hiệu quả kích thích sinh trưởng cây rau muống và cải xanh tốt hơn.

Về mặt ý nghĩa thực tiễn, luận án hỗ trợ cho ngành nông nghiệp trong việc sử dụng phân bón vi sinh học hoặc chế phẩm vi sinh vật để trồng rau giúp tăng thu nhập cho người nông dân, giảm ô nhiễm môi trường, tạo sản phẩm rau sạch và an toàn trong canh tác rau. Trên cơ sở nghiên cứu về các hệ IMO cho thấy IMO là nguồn vi sinh vật rất phong phú và có tính đa dạng cao về chức năng, trong đó có các chức năng cố định đạm và tổng hợp hormone thực vật IAA, do đó, hoàn toàn có thể ứng dụng các hệ IMO trong canh tác rau để góp phần thay thế, giảm thiểu lượng phân đạm hoá học. Vì vậy, trong tương lai, đối với 3 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn hiệu quả cao nhất sau khi hoàn thiện được quy trình sản xuất chúng sẽ có tiềm năng ứng dụng rất cao nhằm bổ sung vào các nguồn vi sinh vật có lợi cho cây trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh vật góp phần giảm thiểu sử dụng phân đạm hoá học trong sản xuất rau theo hướng an toàn, thân thiện và bền vững ở tỉnh Sóc Trăng và các tỉnh khác ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long.

CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Điều kiện địa lí và tự nhiên của tỉnh Sóc Trăng

Sóc Trăng là tỉnh ven biển nằm ở phía nam cửa Sông Hậu thuộc Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) diện tích tự nhiên khoảng 3.311 km2 (chiếm 1% diện tích cả nước và 8,3% diện tích khu vực ĐBSCL). Tỉnh được thành lập từ cuối năm 2009, hiện có 11 đơn vị hành chính trực thuộc gồm Thành phố Sóc Trăng và các huyện Châu Thành, Kế Sách, Mỹ Tú, Cù Lao Dung, Long Phú, Mỹ Xuyên, Ngã Năm, Thạnh Trị, Vĩnh Châu và Trần Đề (UBND tỉnh Sóc Trăng, 2009).

Theo UBND tỉnh Sóc Trăng (2009) Sóc Trăng có địa hình tương đối thấp và bằng phẳng bao gồm phần đất bằng, xen kẽ những vùng đất trũng và đất giồng cát. Khí hậu tỉnh Sóc Trăng có đặc điểm khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo và được chia làm hai mùa rõ rệt. Mùa mưa bắt đầu từ tháng 5 đến tháng 11. Mùa khô bắt đầu từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau.

- Nhiệt độ: nhiệt độ trung bình năm là 26,6°C (năm 2008). Nhiệt độ cao nhất

trong năm vào tháng 4 (28,2°C) và nhiệt độ thấp nhất vào tháng 1 (25,4°C).

- Nắng: tổng lượng bức xạ trung bình trong năm tương đối cao, đạt 140-150 kcal/cm2. Tổng giờ nắng bình quân trong năm 2.293 giờ (khoảng 6,28 giờ/ngày), cao nhất thường vào tháng 3 là 282 giờ, thấp nhất thường vào tháng 9 là 142 giờ.

- Mưa: lượng mưa trung bình hàng năm là 1.660-2.230 mm, chênh lệch lớn theo

mùa, mùa mưa chiếm 90% tổng lượng mưa, mùa khô rất ít, có tháng không mưa.

- Độ ẩm: độ ẩm trung bình cả năm là 84% (cao nhất 89% vào mùa mưa, thấp

nhất 75% vào mùa khô).

- Gió: nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, tỉnh Sóc Trăng có các hướng gió chính như sau: Tây, Tây Nam, Đông Bắc, Đông Nam và gió được chia làm hai mùa rõ rệt là gió mùa Đông Bắc và gió mùa Tây Nam. Mùa mưa chịu ảnh hưởng của gió mùa Tây Nam là chủ yếu; còn mùa khô chịu ảnh hưởng của gió mùa Đông Bắc là chủ yếu với tốc độ gió trung bình là 1,77 m/s.

- Nguồn nước trên hệ thống sông rạch tỉnh Sóc Trăng là kết quả của sự pha trộn giữa lượng mưa tại chỗ, nước biển và nước thượng nguồn sông Hậu đổ về. Vì vậy, nước trên sông trong năm có thời gian bị nhiễm mặn vào mùa khô, vào mùa mưa nước sông được ngọt hóa có thể sử dụng cho tưới tiêu nông nghiệp. Phần sông rạch giáp biển thì bị nhiễm mặn quanh năm do đó không thể phục vụ tưới cho nông nghiệp, nhưng bù lại nguồn nước mặn, lợ ở đây lại tạo thuận lợi trong việc nuôi trồng thủy sản. Theo UBND tỉnh Sóc Trăng (2009) phân loại đất toàn tỉnh có 6 nhóm đất chính:

gồm đất cát, đất phù sa, đất gley, đất mặn, đất phèn và đất nhân tác.

- Đất cát: diện tích 8.491 ha chiếm 2,65% diện tích tự nhiên, phân bố theo các giồng cát chạy dọc ven biển thuộc các huyện Vĩnh Châu, Mỹ Xuyên. Đất có thành phần cơ giới nhẹ, sử dụng trồng rau màu.

- Đất phù sa: diện tích 6.372 ha, chiếm 2% diện tích tự nhiên, phân bố tập trung ở các huyện Kế Sách, Mỹ Tú. Đất có thành phần cơ giới từ thịt pha sét đến sét pha thịt, thích hợp cho trồng lúa tăng vụ, cây ăn trái đặc sản.

- Đất gley: diện tích 1.076 ha chiếm 0,33% diện tích tự nhiên, phân bố ở vùng trũng, ngập nước mùa mưa thuộc các xã phía Bắc huyện Kế Sách. Đất có thành phần cơ giới lớp mặt là sét, lớp dưới là thịt pha sét, hiện được sử dụng để trồng lúa một vụ và nuôi thủy sản.

- Đất mặn: diện tích 158.547 ha, chiếm 49,5% diện tích tự nhiên, phân bố ở tất cả các huyện, trong đó tập trung với diện tích lớn ở các huyện Vĩnh Châu, Trần Đề và Mỹ Xuyên. Đất mặn từ nhiều đến ít, thành phần cơ giới từ thịt đến thịt pha sét và thịt pha cát, hiện đang được sử dụng trồng lúa, rau màu, cây ăn trái và chủ yếu cho nuôi trồng thủy sản.

- Đất phèn: diện tích 75.823 ha, chiếm 23,7% diện tích đất tự nhiên, phân bố rải rác ở các huyện, tập trung thành diện tích lớn ở các huyện Mỹ Tú, Ngã Năm, Mỹ Xuyên và một phần ở huyện Thạnh Trị, Vĩnh Châu. Đất chua có hàm lượng mùn thấp, thành phần cơ giới từ trung bình đến nặng. Hiện đất được sử dụng chủ yếu để trồng lúa, cây ăn trái và nuôi trồng thủy sản.

- Đất nhân tác: diện tích 46.146 ha, chiếm 21,8% diện tích đất tự nhiên, phân bố ở tất cả các huyện, tập trung nhiều nhất ở Kế Sách và Long Phú. Đất phát triển trên nền đất phù sa cổ do canh tác lâu đời nên bạc màu, độ phì thấp, hiện phần lớn được sử dụng để trồng lúa 2-3 vụ và rau màu.

2.2 Định hƣớng phát triển cây rau ở tỉnh Sóc Trăng

Là một trong những tỉnh trọng điểm sản xuất nông nghiệp của vùng ĐBSCL và cả nước, trong những năm gần đây, Sóc Trăng đã tích cực cơ cấu lại ngành nông nghiệp theo hướng sản xuất thân thiện với môi trường, nâng cao giá trị sản phẩm để phát triển bền vững trong đó ưu tiên phát triển nông nghiệp công nghệ cao. Tỉnh Sóc Trăng với điều kiện thuận lợi cho việc trồng rau màu quanh năm, từ lâu đã hình thành nhiều vùng đất chuyên canh cây rau màu điển hình như Thành phố Sóc Trăng, xã Đại Tâm huyện Mỹ Xuyên, xã Phú Tâm, Phú Tân và An Hiệp huyện Châu Thành, thị xã Ngã Năm và thị xã Vĩnh Châu. Tổng diện tích trồng rau màu trên toàn tỉnh hằng năm ước tính trên 50.000 ha (Nguyễn Phong, 2020).

Các loại rau, màu có xu hướng phát triển ở Sóc Trăng gồm các loại như: cải xanh, cải ngọt, cải thìa, xà lách pháp, mồng tơi, rau muống, hẹ, hành tím, dưa leo, ớt, bí, khổ qua,… Trong những năm qua, để đạt năng suất tối đa, nhiều vùng chuyên canh rau màu sử dụng phân bón hoá học quá mức tạo điều kiện cho dịch hại phát triển ngày càng mạnh, dư lượng phân, thuốc hoá học để lại trong nông phẩm cao. Điều đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người sản xuất và người tiêu dùng và là hồi chuông báo động cho toàn xã hội. Ngoài ra, tại các vùng chuyên canh rau, sự lạm dụng về phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật làm cho đất ngày càng bị suy thoái, các chất độc hại tích tụ ngày càng nhiều ảnh hưởng tới năng suất, chất lượng cây trồng,

gây ô nhiễm môi trường đất, nước và không khí, từ đó ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến chính cuộc sống và sức khỏe của người sản xuất và tiêu dùng (Trần Ngọc Hiếu, 2017)

Trước nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về chất lượng và mức độ an toàn của rau, các sản phẩm rau sản xuất theo hướng an toàn, chất lượng sẽ có khả năng cạnh tranh với các sản phẩm trồng thông thường. Vì thế, tổng kết ngành Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm 2018, Tỉnh Sóc Trăng đặt mục tiêu phát triển 60.000 ha rau màu và cây công nghiệp ngắn ngày. Trong sản xuất rau màu, tỉnh quy hoạch, định hướng người dân sản xuất rau sạch theo hướng hiệu quả, an toàn và bền vững. Để đạt được mục tiêu trên, ngành nông nghiệp tỉnh chỉ đạo mỗi địa phương phải có ít nhất một mô hình điểm sản xuất rau an toàn trên rau màu, từ đó làm cơ sở để nhân rộng mô hình. Mỗi huyện, thị xã, thành phố có ít nhất một điểm hoặc cửa hàng kinh doanh sản phẩm rau sạch để phục vụ người dân trên địa bàn. Trên cơ sở đó Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Sóc Trăng đã đề ra phương hướng, nhiệm vụ trong những năm tiếp theo cho cây rau như sau: tập trung phát triển sản xuất rau an toàn, áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuất. Chuyển dần theo hướng sản xuất an toàn sinh học, nâng cao chất lượng và giá trị sản phẩm và góp phần giảm phát thải khí nhà kính. Duy trì và mở rộng mô hình sản xuất rau an toàn ở các địa phương (Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Sóc Trăng, 2018). Trong quá trình cơ cấu lại ngành nông nghiệp, trong giai đoạn phát triển nông nghiệp công nghệ cao từ 2020 đến 2025, Tỉnh Sóc Trăng chú trọng cơ cấu lại giống cây trồng, trong đó có cây rau, tỉnh sẽ mở rộng mô hình sản xuất rau an toàn ở các địa phương, chuyển giao tiến bộ kỹ thuật công nghệ sản xuất theo quy trình GAP, VietGAP, GlobalGAP... (Sở Khoa Học và Công Nghệ Tỉnh Sóc Trăng, 2019).

Đối với các hoạt động ứng dụng khoa học trong chăm sóc và canh tác rau, từ năm 2017 ngành nông nghiệp tỉnh Sóc Trăng đã chú trọng ứng dụng khoa học kỹ thuật trong phát triển rau sạch, rau an toàn trong sản xuất thông qua các hoạt động như liên kết với trường Đại học Cần Thơ để sản xuất rau sạch chỉ sử dụng phân khoáng hữu cơ tại xã Đại Hải, huyện Kế Sách nhằm tìm ra những phương pháp sản xuất rau sạch hiệu quả; Ứng dụng chế phẩm vi sinh từ nấm Trichoderma tự sản xuất phân hữu cơ phục vụ rau màu tại nông hộ trên địa bàn xã An Ninh; Tỉnh chú trọng nhân rộng các mô hình sản xuất rau an toàn, mô hình trồng rau trong nhà lưới, rau thuỷ canh, mô hình ứng dụng các hệ thống tưới nước tiết kiệm vào sản xuất rau an toàn tại các cơ sở sản xuất rau an toàn trong tỉnh (Hoài Thu, 2017; Trần Ngọc Hiếu, 2017). Tuy nhiên những ứng dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật có nguồn gốc ở Sóc Trăng trong lĩnh vực canh tác rau an toàn còn hạn chế cần có nhiều nghiên cứu.

2.3. Tổng quan về cây rau

Rau là cây hoặc một phần của thực vật có thể ăn được và thường là mọng nước, ngon và bổ được sử dụng như là món ăn chính hoặc đồ phụ gia để nấu hoặc ăn sống (Lê Thị Khánh, 2009). Rau rất đa dạng và phong phú, do vậy khi khái niệm về rau chỉ

có thể dựa trên công dụng của nó. Rau xanh là loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày của mọi người khắp nơi trên thế giới, đặc biệt khi lương thực và các loại thức ăn giàu đạm đã được đảm bảo thì nhu cầu về rau xanh lại càng gia tăng, như một nhân tố tích cực trong cân bằng dinh dưỡng và kéo dài tuổi thọ của con người (Lê Thị Khánh, 2009). Giá trị của cây rau được thể hiện nhiều mặt trong cuộc sống mà trước hết là giá trị dinh dưỡng, giá trị kinh tế của cây rau.

2.3.1 Giá trị dinh dưỡng của cây rau

Rau là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể và bình quân hàng ngày của mỗi người cần khoảng 250-300g rau xanh/ngày, có nghĩa là khoảng 90- 110kg/người/năm (Lê Thị Khánh, 2009). Rau cung cấp cho cơ thể con người các chất dinh dưỡng quan trọng như các loại vitamin, muối khoáng, acid hữu cơ, các hợp chất thơm, cũng như protein, lipit, chất xơ... Trong rau xanh hàm lượng nước chiếm 85-95%, chỉ có 5-15% là chất khô. Trong chất khô lượng carbon chiếm rất cao. Giá trị dinh dưỡng cao nhất ở rau là hàm lượng đường (chủ yếu đường đơn) chiếm tỷ lệ lớn trong thành phần carbon. Nhờ khả năng hoà tan cao, chúng làm tăng sự hấp thu và lưu thông của máu, tăng tính hoạt hoá trong quá trình oxy hoá năng lượng của các mô tế bào (Lê Thị Khánh, 2009). Bên cạnh đó, rau là nguồn cung cấp nhiều loại vitamin cho cơ thể. Trong rau có chứa các loại vitamin A (tiền vitamin A), B1, B2, C, E và PP... Rau là nguồn cung cấp chất khoáng cho cơ thể: Rau chứa các chất khoáng chủ yếu gồm Ca, P, Fe,.. là những thành phần cấu tạo của xương và máu. Rau cũng là nguồn cung cấp các dinh dưỡng khác: các acid hữu cơ, các hợp chất thơm, các vi lượng, các cellulose (chất xơ) giúp cơ thể tiêu hoá thức ăn dễ dàng, phòng ngừa các bệnh về tim mạch và áp huyết cao. Ngoài ra nhiều loại rau còn chứa các kháng sinh thực vật có tác dụng như dược liệu cho cơ thể (Lê Thị Khánh, 2009).

Lượng tiêu thụ rau trung bình của mỗi người dân trong 1 năm ở Nam Triều Tiên là 141,1 kg, Newzealands hay New Zealands là 136,7 kg, Hà Lan là 202 kg và ở Canada là 227 kg. Ở Việt Nam, lượng rau tiêu thụ trên đầu người hàng năm vẫn còn thấp so với các nước khác trên thế giới và được tiêu thụ nhiều chủ yếu ở các thành phố lớn (Lê Thị Khánh, 2009).

2.3.2 Giá trị kinh tế của cây rau

Rau là một mặt hàng xuất khẩu mang lại giá trị kinh tế cao. Trong những năm gần đây thị trường xuất khẩu rau được mở rộng. Năm 2001 tổng kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam là 329.972 ngàn USD cho ngành rau. Rau còn là nguyên liệu của ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Rau được sử dụng trong công nghiệp chế biến xuất khẩu dưới dạng tươi, dưa muối, làm tương, sấy khô, xay bột, đồ hộp (gồm dưa chuột, cà chua, bắp, măng tây, nấm...), bánh kẹo (gồm bí xanh, cà rốt, khoai tây, cà chua...), nước giải khát (gồm cà chua, cà rốt...), dược liệu (gồm tỏi, hành, rau gia vị...), làm hương liệu (gồm hạt ngò, hạt mùi, ớt, tiêu...) (Lê Thị Khánh, 2009).

Rau là loại cây trồng giúp tăng thu nhập so với một số loại cây trồng khác. Cây rau có thời gian sinh trưởng ngắn và tương đối dễ trồng, cho năng suất cao, có thể gieo trồng nhiều vụ trong năm, tận dụng được quỹ đất đai, thời tiết khí hậu, công lao động nhàn rỗi, quay vòng đồng vốn nhanh, chuyển đổi cơ cấu cây trồng và mang lại lợi nhuận cao so với một số cây trồng khác. Giá trị kinh tế và lợi nhuận của 1 ha canh tác rau cao hơn 2 – 3 lần so với canh tác lúa. Thống kê 2 năm (2002-2004) cho thấy ở vùng chuyên canh rau khu vực Hà Nội có thu nhập bình quân 76-83 triệu đồng/ha/năm, riêng ở nhà lưới thu nhập cao hơn và dao động 124-153 triệu đồng/ha/năm. Nông dân trồng rau có thu nhập cao hơn so với nông dân trồng cây trồng khác (Lê Thị Khánh, 2009).

2.3.3 Yêu cầu về đất trồng, dinh dưỡng, phân bón và nước trong canh tác rau

Đất trồng rau phải nên là nền đất chân cao, dễ tiêu thoát nước, không bị ngập úng, nhưng phải có nguồn nước chủ động để tưới khi cần thiết vì nhu cầu về nước của tất cả các loại rau đều rất cao. Đất trồng rau tốt nhất là đất cát pha đến thịt nhẹ hoặc đất thịt trung bình có tầng canh tác từ 20-30 cm, độ chua từ hơi chua đến trung tính (pH 5- 7) là phù hợp cho đa số các loại rau (Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1999).

Trong rau chứa 80-95% nước nên nhu cầu nước của các loại rau là rất lớn. Nhu cầu nước của rau diễn ra liên tục từ lúc gieo hạt đến khi thu hoạch. Thiếu nước hoặc thừa nước đều dẫn đến năng suất và chất lượng rau bị giảm. Các loại rau khác nhau và ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì nhu cầu nước của cây rau cũng khác nhau (Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1999).

Rau là loại cây ngắn ngày nhưng lại cho khối lượng sản phẩm rất lớn vì năng suất cao so với những loại cây trồng khác. Để tạo ra khối lượng sản phẩm lớn như vậy, cây rau đã lấy đi từ đất một lượng khá lớn các chất dinh dưỡng trong suốt thời gian sinh trưởng phát triển trên đồng ruộng. Lượng các chất dinh dưỡng này chủ yếu do phân bón đưa vào đất bao gồm cả phân hữu cơ lẫn các loại phân vô cơ và khoáng và một phần do đất tự cung cấp. Mặt dù chất dinh dưỡng có trong phân hữu cơ tự nhiên là rất thấp nhưng lại có một vai trò rất quan trọng vì ngoài cung cấp chất dinh dưỡng phân hữu cơ, đặc biệt là phân chuồng còn có nhiều tác dụng khác như làm tơi xốp đất, cải tạo dinh dưỡng đất, giữ ẩm cho đất lúc khô hạn, giữ cho các loại phân hóa học bón vô đất không bị rửa trôi, làm tăng khả năng hòa tan khoáng chất để cây trồng sử dụng do đó làm tăng hiệu quả sử dụng phân hóa học. Tuy nhiên, cần phải bón kết hợp phân vô cơ với phân hữu cơ, đặc biệt là phân chuồng trong quá trình trồng rau (Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1999).

2.3.4 Nhu cầu đạm của cây rau ăn lá

Nhìn chung trong quá trình phát triển, cây rau hấp thu 70% đạm, 20% lân và 80% kali bón vào đất trong suốt vụ trồng. Rau là loại cây trồng có hàm lượng dinh dưỡng phong phú, thời gian sinh trưởng ngăn, tốc độ sinh trưởng nhanh và cho năng suất cao, vì vậy chúng cần lượng dinh dưỡng cao từ đất trong quá trình sinh trưởng.

Các chất dinh dưỡng đa lượng cần thiết nhất cho cây rau là đạm, lân, kali và canxi, và các chất vi lượng khác như Mn, Bo, Mg...Sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng này làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển và làm giảm năng suất cây rau (Tạ Thu Cúc, 2007).

Đối với cây rau, đặc biệt là các loại rau ăn lá phân đạm là yếu tố dinh dưỡng đặc biệt cần thiết, quyết định mạnh mẽ đến năng suất và chất lượng cây rau. Chất đạm tham gia cấu tạo các chất hữu cơ quan trọng trong đời sống cây rau như protein, acid nucleic, nucleo-protein, chlorophyll, alkaloid... Ngoài ra, đạm giúp cây rau tăng trưởng nhanh và quyết định chất lượng của rau ăn lá. Dạng đạm thích hợp nhất cho cây rau là Urê (Tạ Thu Cúc, 2007; Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2019). Các loại rau khác nhau có nhu cầu đạm cho quá trình sinh trưởng không giống nhau và tùy thuộc vào từng loại đất. Các giai đoạn sinh trưởng của cây rau khác nhau có nhu cầu về lượng đạm cũng sẽ khác nhau. Trong điều kiện đất ở Đồng bằng sông Cửu Long nhu cầu lượng đạm cần cung cấp cho cây rau muống và cây cải xanh tương ứng là 100 và 70 kg/ha (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2011; Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2019).

Bón thừa và thiếu đạm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây rau đều ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng rau. Khi thiếu đạm, cây rau tăng trưởng kém, lá nhỏ, màu xanh nhạt, ít chồi, cây rau còi cọc, lá già toàn thân biến vàng, toàn bộ quá trình sinh trưởng của cây sẽ bị trì trệ do thiếu chất hình thành tế bào, các quá trình sinh hóa cũng bị ngưng trệ, năng suất kém và giảm chất lượng rau. Tuy nhiên khi thừa phân đạm cây rau sẽ lớn nhanh, đẻ nhánh nhiều, tế bào chứa nhiều nước, thân lá non mềm, cây dễ bị đổ ngã, cây chậm ra hoa và khó đậu quả, tăng mức độ lây nhiễm sâu bệnh do lá mềm, màu sắc xanh đậm của lá thu hút các loại côn trùng và nấm bệnh gây hại, khả năng chống chịu của cây với điều kiện ngoại cảnh như hạn, mặn, phèn, nấm bệnh cũng kém đi. Bón thừa đạm sẽ giảm độ giòn và hương vị của rau, khó vận chuyển và bảo quản, nhanh bị thối hỏng, giảm thời gian tồn trữ của rau sau thu hoạch trong kho vựa. Đặc biệt là khi bón thừa đạm dẫn đến sự tích lũy NO3 trong rau, hay NO2 quá ngưỡng an toàn sẽ gây ngộ độc mãn tính hoặc gây ra các bệnh ung thư, đường tiêu hóa cho người tiêu dùng. Do đó việc bón nhiều phân đạm dẫn đến năng suất và phẩm chất rau bị giảm xuống (Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2019).

2.3.5 Cây rau muống

Rau muống

tên khoa học

là Ipomoea aquatica

thuộc họ bìm bìm (Convolvulaceae) và là một loại rau ăn lá. Rau muống là cây ngắn ngày, sinh trưởng nhanh, cho năng suất cao, sống được ở nhiệt độ cao và đủ ánh sáng. Rau muống thích hợp với nhiều loại đất như: đất sét, đất cát, đất pha cát, đất ẩm giàu mùn hoặc đất được bón phân hữu cơ, có độ pH khoảng 5,3-6,0. Trong 100 g rau muống có 78,2 g nước; 2,70 g protein; 85,0 mg canxi; 31,5 mg photpho; 1,20 mg sắt và 20,0 mg vitamin C (Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2009).

Ở Việt Nam, rau muống được trồng ở rất nhiều nơi. Có hai giống rau muống cơ bản được sử dụng trong canh tác gồm giống thân tím và thân trắng. Giống rau muống

được thị trường ưa chuộng nhất là giống thân trắng nên được trồng khá phổ biến ở Việt Nam. Một loại rau muống khác được trồng phổ biến và tiêu thụ ở các chợ và siêu thị là rau muống hạt, được trồng trên đất khô không ngập nước và được bán chủ yếu trong các siêu thị. Thời gian gieo trồng ngắn, cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao (Tạ Thu Cúc, 2007).

Rau muống có thể trồng quanh năm và nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C. Yêu cầu về nước tưới của cây rau muống khá cao để cây phát triển tốt và do rễ rau muống ăn vào đất cạn dẫn đến khả năng chịu hạn của rau muống rất kém. Tuy nhiên, trong mùa mưa cây thường bị nhiễm bệnh nhiều hơn trong mùa khô. Trong quá trình sinh trưởng cây rau muống cần lượng ánh sáng trung bình và thời gian chiếu sáng trong ngày ngắn, do đó, rau muống có thể sinh trưởng tốt dưới bóng râm hoặc dưới tán cây lớn. Nhiệt độ cao và ánh sáng mạnh làm cây rau muống bị héo, sinh trưởng kém và cằn cỗi (Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2009).

Lượng hạt giống rau muống trồng dao động từ 80-100 kg/ha. Do là loại rau ăn thân và lá nên rau muống cây cần nhiều chất dinh dưỡng, đặc biệt là đạm. Đạm kích thích sự sinh trưởng của thân, lá do đó đạm có tác dụng quyết định đến năng suất và chất lượng rau muống. Lân và kali làm tăng chất lượng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường (Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2019).

Rau muống là loại rau ăn thân lá và cho năng suất cao. Vì vậy loại rau này cần nhiều chất dinh dưỡng đặc biệt là đạm. Đạm kích thích sự sinh trưởng thân, lá do đó có tác dụng quyết định đối với năng suất và chất lượng rau muống. Ngoài ra, nguyên tố lân và kali góp phần làm tăng chất lượng và làm tăng khả năng chống chịu của rau với các điều kiện bất lợi của môi trường (Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2011). Theo Trung tâm Nghiên Cứu khoa học kỹ thuật và Khuyến Nông Thành phố Hồ Chí Minh (2006) công thức bón phân cho cây rau muống phụ thuộc vào loại đất. Trung bình lượng phân bón cho 1000 m2 gồm phân chuồng hoai 1,5-2 tấn, super lân 10-15 kg, kali 3-4 kg, urê 15-20 kg. Tuy nhiên, lần cuối bón phân urê cho rau chậm nhất 1 tuần trước khi thu hoạch để bảo đảm cách ly an toàn cho người tiêu dùng.

2.3.6 Cây cải xanh

Rau họ Cải (Brassicaceae) gồm bắp cải, súp lơ, su hào, củ cải, các loại cải không cuốn… là một trong những loại rau được trồng nhiều nhất ở Việt Nam, trong đó cải xanh (Brassica juncea L.) được trồng khá phổ biến do nhóm cải này có khả năng thích ứng rộng và cho hiệu quả kinh tế cao. Cải xanh có khả năng chịu được nóng và mưa to, nhóm cải này có khả năng thích nghi rộng, thường được trồng quanh năm đặc biệt trong vụ Xuân Hè và vụ Thu Đông. Cải xanh có cuống hơi tròn, nhỏ và ngắn. Phiến lá nhỏ và hẹp, bản lá mỏng, cây thấp, nhỏ, lá có màu xanh vàng đến xanh đậm ăn có vị cay nên gọi là cải cay (Nguyễn Cẩm Long, 2014).

Cây cải thuộc rễ chùm, phân nhánh, bộ rễ ăn cạn trên tầng đất màu, tập trung nhiều nhất ở tầng đất 0-20 cm. Lá cải mọc đơn và không có lá kèm. Những lá dưới thường tập trung, bẹ lá to và lá lớn. Bộ lá khá phát triển, lá to nhưng mỏng nên chịu

hạn kém và dễ bị sâu bệnh tấn công. Hoa cải có dạng chùm và không có lá bắc. Hoa nhỏ, đều và mẫu 2. Đài hoa và tràng hoa đều 4 và xếp xen kẽ nhau. Hoa có 6 nhị, trong đó 2 nhị ngoài có chỉ nhị ngắn hơn 4 nhị bên trong. Bộ nhị gồm 2 noãn dính bầu trên, một ô về sau có một vách ngăn giả chia bầu noãn thành 2 ô, mỗi ô có 2 hoặc nhiều noãn. Quả thuộc loại quả giác, hạt có phôi lớn và cong, ít nội nhũ (Lê Thị Khánh, 2009).

Về yêu cầu ngoại cảnh, cây cải có nguồn gốc ôn đới nên yêu cầu ánh sáng thích hợp với thời gian chiếu sáng ngày dài, cường độ ánh sáng yếu. Nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển là từ 15-22oC. Lượng nước trong cây rất cao chiếm từ 75% đến 95% do đó cây cải cần nhiều nước để sinh trưởng phát triển. Tuy nhiên, nếu mưa kéo dài hay đất úng nước cũng ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng, phát triển của cây cải (Lê Thị Khánh, 2009).

Cây cải thích hợp trồng trên nhiều loại đất, có thể sinh trưởng và phát triển, cho năng suất cao ở các loại đất khác nhau, từ đất cát pha đến đất thịt nặng, nhưng thích hợp nhất là đất giàu dinh dưỡng và khả năng giữ ẩm tốt. Cải cần nhiều đạm, lân và kali, trong đó đạm được sử dụng nhiều nhất. Phân hữu cơ có tác dụng rất lớn trong quá trình sinh trưởng phát triển cây cải. Tuy nhiên, do cải có thời gian sinh trưởng ngắn nên cần các loại phân dễ tiêu, dễ phân giải, cung cấp dần những yếu tố dinh dưỡng cần thiết cho cây (Nguyễn Cẩm Long, 2014).

2.4 Vai trò của vi sinh vật kích thích sinh trƣởng thực vật đối với cây trồng

2.4.1 Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật

Trong đất, vi sinh vật tập trung nhiều xung quanh rễ cây, rễ cây tác động lên sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật và ngược lại thực vật cũng chịu tác động của vi sinh vật vùng rễ. Theo Souza et al. (2015) vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Microorganisms (PGPMs)) là vi sinh vật trong đất, sinh sống tự do hoặc liên kết hoặc cộng sinh hoặc sống nội sinh với thực vật trực tiếp hoặc gián tiếp tham gia vào việc kích thích sinh trưởng và phát triển của thực vật. Cơ chế cho các hoạt động kích thích tăng trưởng thực vật khác nhau giữa các loài và chủng vi sinh vật. Do đó, có nhiều hoạt động và cơ chế kích thích sinh trưởng cây trồng khác nhau (Souza et al., 2015). Theo Gupta et al. (2015) sự kích thích sinh trưởng cây trồng có thể chia thành 2 cơ chế (Hình 2.1): (1) Kích thích sinh trưởng cây trồng trực tiếp thông qua hoạt động cố định đạm, hòa tan lân, hòa tan kali, tiết siderophore, tổng hợp các hormone thực vật như indole-3-acetic acid (IAA), giberellins… và (2) Kích thích sinh trưởng cây trồng gián tiếp thông qua hoạt động tiết các enzyme thủy phân, chất kháng sinh, các hợp chất polysaccharids…. Trong đó, chức năng cố định đạm của vi sinh vật là một trong những chức năng quan trọng nhất trong hoạt động kích thích sinh trưởng cây trồng (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2001).

Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Rhizobacteria-PGPR)

Trực tiếp kích thích sinh trưởng thực vật

Gián tiếp tiếp kích thích sinh trưởng thực vật

Cố định đạm Tiết kháng sinh

Hòa tan lân Tiết enzyme thủy phân

Hòa tan kali

Tổng hợp siderophore Tổng hợp siderophore Tạo ra hệ thống kháng

Tổng hợp hormone thực vật Tiết polysaccharides ngoại bào

IAA Ethylene Cytokinins và gibberellins

Hình 2.1 Các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của vi khuẩn (Gupta et al., 2015)

2.4.2 Cố định đạm

2.4.2.1 Định nghĩa quá trình cố định đạm

+/NO3

Theo Vance (1997) đạm là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho cây trồng. Sự hấp thu và chuyển hóa đạm cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng cũng quan trọng không kém so với quá trình quang hợp. Hầu hết sinh vật trong đó có cả thực vật không thể sử dụng N2 trong không khí cho quá trình biến dưỡng của chúng, thực vật chỉ có thể sử dụng nitơ dạng khử, do đó N2 trong không khí phải được cố định -) sau đó thực vật mới có thể hấp thu (Smil, và chuyển thành dạng liên kết (NH4 2001).

Quá trình chuyển N2 thành các dạng liên kết của nó nhờ các vi sinh vật gọi là quá trình cố định đạm. Theo Harekrushna and Abhijita (2013) có khoảng 2,5x1011 kg NH3 được cố định hằng năm bằng con đường sinh học và con đường này cao hơn rất nhiều so với con đường cố định đạm bằng vật lí. Trong đó, vi sinh vật đóng vai trò chủ yếu trong quá cố định đạm sinh học (Hubell and Kidder, 2003).

+ và NO3

Vi sinh vật cố định đạm là những vi sinh vật có khả năng cố định đạm tự do (N2) trong không khí và trong đất để chuyển hóa N2 thành dạng đạm dễ tiêu cung cấp cho đất và cho cây trồng thông qua hệ enzyme nitrogenase giúp khử N2 thành NH3. -, Ammonia (NH3) sau khi được tạo ra tiếp tục được chuyển hóa thành NH4 khi đó cây trồng hấp thu các dạng đạm này và được tham gia vào chuỗi carbon để

đồng hóa thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng (Nguyễn Lân Dũng, 1984).

Trong tự nhiên quá trình cố định đạm xảy ra theo con đường vật lí dưới các điều kiện đặc biệt như núi lửa, sấm chớp và ngày nay con người có thể tạo ra các điều kiện vật lí tương tự nhưng rất tốn kém (nhiệt độ 1.000oC đến 4.000oC; áp suất 200-1.000 atm và những chất xúc tác đắt tiền) để phá vỡ mối liên kết bền vững trong phân tử N2. Trong khi đó vi sinh vật dưới sự trợ giúp của enzyme nitrogenase, N2 bị phá vỡ liên kết 3 một cách dễ dàng ngay trong điều kiện bình thường về áp suất và nhiệt độ. Phân tử nitơ có năng lượng 9,4.105 J/mol nên quá trình khử nitơ cần tiêu tốn nhiều năng lượng ATP ở vi sinh vật. Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản ứng cố định N2 được giảm nhiều, khoảng 16-20 Kcalo/M, tuy nhiên, năng lượng này vẫn còn lớn hơn so với năng lượng trong cơ thể sinh vật. Tốc độ phản ứng nhanh chóng trong tế bào vi sinh vật ở nhiệt độ thấp và nhờ có hệ thống enzyme hydrogenase và nitrogenase (Nguyễn Lân Dũng, 1984). Trong quá trình cố định đạm, vấn đề then chốt của toàn bộ quá trình là việc phá vỡ liên kết của N2 để chuyển thành NH3 nhờ vào nguồn năng lượng ATP và phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase. Phức hệ enzyme này nằm trong tế bào chất của vi khuẩn (Yan et al., 2008).

2.4.2.2 Enzyme nitrogenase trong quá trình cố định đạm

thermoautotrophicus (Hoffman-Findeklee et al., 2000)

Nitrogenase là phức hợp metalloenzyme đóng vai trò quan trọng trong việc khử nitơ sinh học (Hình 2.2). Có 4 phức hệ nitrogenase chính được mô tả (Eady, 1996), trong đó ba phức hệ có đặc điểm gần giống nhau, chỉ khác biệt bởi nguyên tử heterometal có trong cụm kim loại (Mo, V hoặc Fe). Loại thứ tư được phân lập từ Streptomyces là một nitrogenase phụ thuộc vào nguyên tố Mo. Nitrogenase phụ thuộc vào nguyên tố Mo và là enzyme quan trọng nhất và được nghiên cứu nhiều nhất. Đây là loại enzyme phân bố rộng rãi nhất (Burgess and Lowe, 1996).

α-Nif D Nif H

β-Nif K

Hình 2.2 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của enzyme nitrogenase (Ahmed et al., 2014)

Enzyme nitrogenase bao gồm 2 hợp phần protein được gọi là hợp phần I và hợp phần II (Bảng 2.1). Các protein này hòa tan trong tự nhiên. Hợp phần I còn được gọi là

Mo-Fe-protein hoặc dinitrogenase và hợp phần II được gọi là Fe-protein hoặc dinitrogenase reductase (Burris, 1991).

Hợp phần I (MoFe-protein) chứa trung tâm hoạt động để khử cơ chất. Nó có trọng lượng phân tử khoảng 250 kDa (Christiansen et al., 2001). Protein này liên kết với hai nguyên tử Mo, 30 nguyên tử Fe không heme và 32 acid sulfide vô cơ (Rees et al., 2005). Các protein Mo, Fe và S của hợp phần I được tổ chức thành hai nhóm kim loại riêng gọi là cụm P (hoặc [8Fe-7S]) và Fe-Mo-cofactor (Santos et al., 2004). Sự khử thực tế xảy ra ở trung tâm Fe-Mo (Rees et al., 2005). Thành phần của đồng phân Fe-Mo là MoFe7S9 homocitrate và nó có mặt trong hai bản sao cho mỗi phân tử nitơ. Một số sinh vật có nitrogenase không molibden được thay thế bằng Vanadium. Tính đặc hiệu và hiệu quả của enzyme Fe-Mo- nitrogenase cao hơn nitrogenase thay thế (Raymond et al., 2003). Cụm P bổ trợ làm trung gian cho sự truyền electron từ Fe protein thành FeMo-cofactor (Hoffmann-Findeklee et al., 2000). Bảng 2.1 So sánh 2 hợp phần của enzyme nitrogenase (Harekrushna and Abhijita, 2013)

Thành phần Hợp phần I Hợp phần II

Hợp phần II có khối lượng phân tử 55.000-65.000 Da (Christiansen et al., 2001) Fe-Protein là một homodimer bao gồm 2 tiểu đơn vị γ (Nif H protein), chứa bốn nguyên tử Fe không heme và bốn acid sulfide vô cơ được gọi là cụm [4Fe-4S] được nối giữa dimer (Howard et al., 1989). Hai vị trí liên kết nucleotide (mỗi tiểu đơn vị) cũng có trong protein Fe. Protein Fe cung cấp điện tử một lần cho thành phần I (Hoffmann-Findeklee et al., 2000).

2.4.2.3 Gen nif trong cố định đạm

Các gen mã hóa các enzyme tham gia vào việc cố định đạm được gọi là gen nif. Cấu trúc của gen nif đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả trong một số vi sinh vật nhưng các thành phần cấu trúc gen nif của Klebsiella pneumoniae được nghiên cứu kỹ nhất (Shamseldin, 2013). Gen nif của K. neumoniae kéo dài 24 kb và chứa khoảng 20 gen với các chức năng khác nhau (Bảng 2.2) được sắp xếp trong một số đơn vị phiên mã (Hình 2.3).

Dinitrogenase là một protein phức tạp bao gồm tiểu đơn vị α và β. Tiểu đơn vị α là sản phẩm của gen nif D trong khi tiểu đơn vị β là sản phẩm của gen nif K (Beringer and Hirsch, 1984). Nif H mã hóa gen cho protein reductase dinitrogenase là một dimer protein gồm hai tiểu đơn vị γ (Roberts et al., 1978) hay nói khác hơn phức hợp

Trọng lượng phân tử Số tiểu đơn vị Trọng lượng của tiểu đơn vị Số nguyên tử Fe trong phân tử Số nguyên tử S2- trong phân tử Số nguyên tử Mo trong phân tử Mg2+, Ca2+ 200.000-250.000 Da 4 595.000 Da và 52.000 Da 30-34 18-19 2 Có 55.000-73.000 Da 2 đều 27.500 Da 4 4 Không Không

nitrogenase gồm có MoFe-protein được mã hóa bởi các gen nif D, nif K và Fe-protein được mã hóa bởi gen nif H (Bullock, 2006; Ahmed et al., 2014). Bên cạnh ba gen cấu trúc này, việc lắp ráp hoàn chỉnh nitrogenase đòi hỏi các sản phẩm của gen nif khác cũng tham gia vào quá trình tổng hợp FeMo-co, cũng như sự hình thành các cụm FeS và sự trưởng thành của các thành phần nitrogenase. Bảng 2.2 Vai trò của các gen nif trong quá trình cố định nitơ (Klipp et al., 2004)

Vai trò

Gen nif Nif H Nif D

Nif K

Nif T Nif Y Nif E

Nif N Nif X

Nif U

Nif S

Nif V Nif W

Nif Z Nif M Nif F Nif L Nif A Nif B

Nif N Nif Q

Nif J

Tổng hợp dinitrogenase reductase Tổng hợp tiểu đơn vị α (α-subunit) của enzyme dinitrogenase, hình thành phức hợp 4 α2β2 (α2β2 tetramer) với tiểu đơn vị β. Vị trí khử cơ chất FeMo- cofactor được bao gọn trong chính tiểu đơn vị α này của enzyme dinitrogenase Tổng hợp tiểu đơn vị β (β-subunit) của enzyme dinitrogenase. Các nhóm P (P-clusters) hiện diện tại mặt phân giới của tiểu đơn vị β. Chưa xác định Nif Y hỗ trợ sự chèn FeMo-cofactor vào enzyme apodinitrogenase. Hình thành phức hợp 4 α2β2 (α2β2 tetramer) với nifN. Bắt buộc trong quá trình tổng hợp FeMo-cofactor Cần thiết cho quá trình tổng hợp FeMo-cofactor Được bao gồm trong sự tổng hợp FeMo-cofactor. Tuy nhiên, vai trò cụ thể của nó chưa được xác định Được bao gồm trong sự huy động về nguồn sắt cho sự tổng hợp cũng như sửa chữa nhóm Fe-S Được bao gồm trong sự huy động về nguồn lưu huỳnh cho sự tổng hợp cũng như sửa chữa nhóm Fe-S Tổng hợp homocitrate, bao gồm trong sự tổng hợp FeMo-cofactor Góp phần ổn định enzyme dinitrogenase. Chức năng dự đoán của nifW là bảo vệ enzyme dinitrogenase khỏi bị bất hoạt bởi O2 Chưa xác định Cần thiết cho sự hoàn thiện chức năng của nif H Flavodoxin. Nguồn cung ứng electron sinh lý cho nifH Nhân tố điều hòa âm tính quá trình cố định đạm Nhân tố điều hòa dương tính quá trình cố định đạm Cần thiết cho sự tổng hợp FeMo-cofactor. Sản phẩm chuyển hóa của nifB còn là nguồn cung ứng Sắt và lưu huỳnh cho FeMo-cofactor Ferredoxin là nguồn cung ứng electron cho nitrogenase Được bao gồm trong quá trình tổng hợp FeMo-cofactor, dự đoán nifQ còn tham gia vào giai đoạn sớm của quá trình xử lý MoO4 Pyruvate: flavodoxin (ferredoxin) oxidoreductase. Là thành phần của chuỗi truyền electron tới enzyme nitrogenase

Hình 2.3 Bản đồ gen nif của vi khuẩn Klebsiella pneumoniae

2.4.2.4 Cơ chế của quá trình cố định đạm

Trước đây, cơ chế hóa sinh của quá trình cố định đạm chưa được sáng tỏ hoàn toàn, nhưng đa số các nhà nghiên cứu đồng ý với giả thuyết cho rằng N là sản phẩm đồng hóa sơ cấp của N2 và nêu ra 2 giả thuyết về 2 con đường cố định N của vi sinh vật sống tự do trong đất. Quá trình cố định đạm sinh học được mô tả qua Hình 2.4.

Hình 2.4 Sơ đồ giả thuyết về hai con đường của quá trình cố định N2 (Nguyễn Thành Đạt và Nguyễn Duy Thảo, 1986)

Quá trình cố định nitơ phân tử theo hai hướng cơ bản: con đường khử và con đường oxy hóa. Con đường khử theo chuỗi biến hóa: N2HN=NHH2N- NH2NH3NH4OH; con đường oxy hóa: N2 N2O  HNO2NH4OH.

Các hợp chất khử được phát hiện khi nuôi các vi sinh vật cố định đạm bằng phương pháp đồng vị phóng xạ. Qua đó cho thấy con đường khử có nhiều khả năng xảy ra hơn. Nguồn hydro để khử N2 có thể là phân tử hydro (H2) (Bunden, 1966 trích dẫn bởi Nguyễn Thành Đạt và Nguyễn Duy Thảo, 1986).

Hiện nay sơ đồ phản ứng của quá trình cố định đạm có thể tóm tắt bằng phương

trình phản ứng:

N2 + 8H+ + 8e- + 16 ATP = 2NH3 + 2H2 + 16ADP + 16Pi (Postgate, 1998) Tuy nhiên việc cố định N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ đồ phức tạp hơn. Trong các nốt sần có một chất có bản chất heme rất giống với hemoglobin trong máu gọi là leghemoglobin. Chất này dễ dàng liên kết với O2 để biến thành oxyhemoglobin. Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ đậu, còn khi nuôi cấy riêng các Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cố định được N2. Những nghiên cứu gần đây về quá trình cố định N2 cho thấy quá trình cố định đạm này đòi hỏi có sự tham gia của nguyên tố vi lượng, tiến hành trong điều kiện yếm khí và cần rất nhiều năng lượng (cần 16 ATP để khử 1 N2).

Trong quá trình cố định đạm, khâu then chốt của toàn bộ quá trình là sự khử liên kết của N2 thành NH3 nhờ vào nguồn năng lượng ATP và phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase. Phức hệ enzyme này nằm trong tế bào chất của vi khuẩn (Yan et al., 2008).

2.4.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm

Theo Monica et al. (2013) các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm sinh học là độ mặn, ẩm độ và nhiệt độ. Ảnh hưởng của nguồn carbon, lân, kali, pH, molybden,… Abdullah and Al-Falih (2002) cho thấy các yếu tố như độ ẩm, vi sinh vật, chất hữu cơ và kết cấu đất là các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của việc cố định đạm cộng sinh của vi khuẩn Rhizobium với nhóm cây họ đậu. Tương tự, Mohammadi et al. (2012) chứng minh cho thấy sự thay đổi về pH, hàm lượng dinh dưỡng hữu dụng, nhiệt độ và nước là những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự tăng trưởng, tỷ lệ sống và hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn cố định đạm. Sự tích tụ oxy trong các vùng bị xâm nhiễm dẫn đến ức chế enzyme nitrogenase, dẫn đến việc giảm tính thấm của nốt sần. Theo Ngô Thế Dân và ctv. (2016) việc cố định đạm cũng có xu hướng giảm theo tuổi cây họ đậu, chủ yếu là do sự gia tăng hàm lượng đạm trong đất. Việc thiếu canxi trong đất ảnh hưởng đến pH đất và sự gắn kết của rhizobia với lông rễ.

2.4.2.6 Vi sinh vật cố định đạm

Theo Saharan and Nehra (2011) vi sinh vật tham gia vào tiến trình cố định đạm

bao gồm 3 nhóm chính như sau:

Nhóm cố định đạm sống cộng sinh với rễ cây họ đậu gồm: chi Rhizobium, Bradyrhizobium, Burkholderia, Sinorhizobium và Mesorhizobium cộng sinh bắt buộc với câu họ đậu.

Nhóm cố định đạm sống cộng sinh với rễ cây không phải họ đậu gồm

Frankia, vi khuẩn lam.

Nhóm vi khuẩn cố định đạm sống tự do chúng có thể liên kết hoặc nội sinh vào bên trong các bộ phận của cây như: Azospirillum, Azotobacter, Acetobacter diazotrophicus, Azoarcus, Pseudomonas, Klebsiella, Clostridium…

a) Cố định đạm cộng sinh: Vai trò cố định N2 trong đất quan trọng nhất thuộc về nhóm vi sinh vật cộng sinh. Hiện nay, có hơn 600 loài cây trong rễ có vi sinh vật sống cộng sinh và cố định N2 thuộc nhiều họ khác nhau (Saharan and Nehra, 2011). Trong nông nghiệp cây họ đậu vẫn có giá trị nhất, chúng có thể cố định được lượng đạm từ 80-300 kg N/ha/năm. Cỏ Linh Lăng có thể cố định 300 kg N/ha/năm, đậu cove cố định từ 80-120 kg/ha/năm. Vi khuẩn thuộc chi Rhizobium là nhóm vi khuẩn chính sống cộng sinh trong rễ cây họ đậu (Leguminosales). Tuy nhiên, hiện nay vi khuẩn sống cộng sinh cây họ đậu tạo nốt sần được chia thành 2 nhóm (Saharan and Nehra, 2011):

- Nhóm sinh trưởng nhanh gồm các vi khuẩn cố định đạm, cộng sinh với rễ và tạo nốt sần với cỏ ba lá, đậu Hòa Lan, mục túc,… thuộc chi Rhizobium. Đây là nhóm vi sinh vật có hoạt động cố định N2 mạnh nhất.

- Nhóm sinh trưởng chậm gồm các vi khuẩn cố định đạm, cộng sinh với rễ tạo

nốt sần với cây đậu phộng, đậu nành... thuộc chi Bradyrhizobium.

* Rhizobium Là một chi vi khuẩn Gram âm, hình que, hiếu khí sống trong đất có vai trò cố định đạm. Rhizobium hình thành một nhóm vi khuẩn cộng sinh cố định đạm sống trong rễ của các cây họ đậu và Parasponia. Beijerinck là người đầu tiên phân lập và nuôi dưỡng vi sinh vật từ các nốt của cây họ đậu vào năm 1888 và loài này được định danh là Bacillus radicicola, theo phân loại của Bergey, dòng vi khuẩn này thuộc chi Rhizobium. Rhizobium là nhóm vi khuẩn sinh trưởng nhanh, có khả năng cố định đạm nhờ hệ thống gen nif H, nif D và nif K trên cùng một operon (Cao Ngọc Điệp và Ngô Thanh Phong, 2016).

Một số chủng vi khuẩn trong chi Rhizobium có khả năng xâm nhiễm rễ cây trồng khác không phải cây họ đậu, khi đó các chủng vi khuẩn này chức năng giúp kích thích sinh trưởng cây trồng. Việc chủng Rhizobium sp. vào trong đất giúp cây họ đậu tăng trưởng tốt hơn và cho năng suất cũng như số lượng nốt sần cao hơn so với không chủng Rhizobium sp. ở điều kiện đồng ruộng (Saharan and Nehra, 2011).

* Bradyrhizobium Vi khuẩn thuộc chi Bradyrhizobium là trực khuẩn Gram âm (hình que) hay còn gọi là vi khuẩn nốt sần rễ có sức tăng trưởng chậm. Chúng có thể hình thành các mối quan hệ cộng sinh với các loài thực vật họ đậu và khi đó chúng sẽ cố định đạm đồng thời trao đổi carbohydrate với các tế bào rễ cây. Giống như Rhizobium khác, chúng có khả năng cố định đạm trong khí quyển thành dạng hữu dụng cho các sinh vật khác sử dụng. Chúng sở hữu hệ gen nif D và nif K trên cùng 1 operon và nif H trên một operon khác (Cao Ngọc Điệp và Ngô Thanh Phong, 2016). Chúng phát triển chậm hơn so với các loài thuộc chi Rhizobium. Trong môi trường lỏng, cần khoảng 3-5 ngày để các loài thuộc chi Bradyrhizobium tạo sinh khối vừa đủ và cần 6-8 giờ để sinh khối tăng gấp đôi về mật số. Chúng tăng sinh khối tốt nhất trong môi trường có bổ sung carbon từ pentoses (Somasegaran, 1994). Một số nghiên cứu còn cho thấy việc chủng các dòng

vi khuẩn thuộc chi Bradyrhizobium kết hợp với một số vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng khác tác động tích cực đến tiến trình cố định đạm cộng sinh thông qua việc gia tăng số lượng và trọng lượng của nốt sần, thành phần năng suất, năng suất hạt cây họ đậu và tăng độ phì nhiêu đất (Son et al., 2006).

* Burkholderia Vi khuẩn thuộc chi Burkholderia (Hình 2.5) là nhóm vi khuẩn gram âm, có khả năng cố định đạm, hình que ngắn, di chuyển nhờ các chiên mao, sống được cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí nhưng phát triển tốt trong môi trường ít oxy. Burkholderia có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần với cây họ đậu, đồng thời chúng cũng có khả năng cộng sinh với các cây trồng khác không phải họ đậu như bắp, mía, lúa, khóm, chuối… (Cao Ngọc Điệp và Ngô Thanh Phong, 2016).

Hình 2.5 Các dạng vi khuẩn Burkholderia

b) Cố định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu: Hai nhóm cố định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu được nghiên cứu rộng rãi là Frankia và vi khuẩn lam. Frankia hình thành nốt sần với trên hơn 280 loài cây gỗ từ 8 họ khác nhau (Schwintzer and Tjepkema, 1990). Tuy nhiên, mối quan hệ cộng sinh của nó thì chưa được rõ. Frankia được biết là tạo ra sự cộng sinh hiệu quả với các loài Alnus và Casuarina (Wheeler and Miller, 1990; Huss-Danell, 1990). Một số loài có thể cải thiện dinh dưỡng thực vật bằng cách giải phóng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, siderophores và hydrogen cyanide hoặc có thể làm tăng phosphate hữu dụng (Antoun et al., 1998).

Rất nhiều loài vi khuẩn lam sống trong ruộng, trong nước đã được chứng minh là có khả năng cố định đạm, chúng đã góp phần không nhỏ vào cân bằng nitơ trong nông nghiệp ở nhiều nước, nhất là các nước nhiệt đới. Nhờ hoạt động cố định đạm của vi khuẩn lam mà nitơ trong đất qua một vụ có thể tăng lên 18-33 kg ở Philippins (Alimagno, 1977), 25-30 kg ở Ấn Độ (Venkataraman, 1979), 50-80 kg ở Mali (Traore at al., 1978) (trích dẫn bởi Nguyễn Lân Dũng, 1984). Vi khuẩn lam cộng sinh với bèo hoa dâu như Anabaena asollae rất có ý nghĩa trong việc làm tăng nguồn nitơ cho cây lúa ở Việt Nam (Nguyễn Lân Dũng, 1984).

c) Vi khuẩn cố định đạm sống tự do: Vi khuẩn cố định đạm tự do có vai trò quan trọng trong quá trình tạo ra nguồn đạm cho cây trồng sử dụng. Trong đó, nhóm vi khuẩn cố định đạm sống tự do có thể tạo ra lượng chất hữu cơ đáng kể. Một hạn chế chính mà vi khuẩn nhóm này gặp phải đó là sự thiếu hụt nguồn carbon và nguồn năng lượng cho quá trình cố định đạm vì tiến trình cố định đạm cần nhiều năng lượng. Tuy nhiên, giới hạn này có thể được khắc phục bằng cách một số vi khuẩn nhóm này có thể di chuyển gần rễ cây để liên kết hoặc nội sinh bên trong rễ cây. Một số vi khuẩn cố định đạm không cộng sinh rễ cây như: Azoarcus sp., Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbasprillium sp., Azotobacter sp. (Vessey, 2003; Barriuso and Solano, 2008), Acharomobacter, Acetobacter, Arthrobacter, Azospirillum, Azomonas, Bacillus, Clostridium, Beijerinckia, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas. Corynebacterium, Derxia, Rhodosprillum, Rhodopeudomonas, Xanthobacter (Saxena and Tilak, 1998).

* Azotobacter Theo Saharan and Nehra (2011) họ Azotobacteriaceae gồm 2 giống là Azomonas với 3 loài là A. agillis, A. insignis và A. macrocytogenes và giống Azotobacter gồm 6 loài là A. chroococcum. A. vinelandii, A. beijerinckii, A. nigricans, A. armeniacus và A. paspali. Azotobacter được cho là vi khuẩn sống tự do cố định đạm hiếu khí. Azotobacter là chi vi khuẩn hình trứng, gram âm, có khả năng sinh nha bào, hiếu khí, khuẩn lạc trắng trong, lồi, nhày và khi già có màu vàng lục (Stanier, 2003). Ngoài ra Azotobacter đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường đôi, 1 g glucose có thể đồng hóa được 8-18 g N. Ngoài ra Azotobacter còn có khả năng tiết ra một số vitamin nhóm B như B1, B6, một số acid hữu cơ như: acid nicotinic, pantotenic, biotin và auxin giúp tăng tỷ lệ nảy mầm và phát triển của hạt. Vì nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định đạm mạnh nên vào cuối thế kỷ 18 nhiều nước đã nghiên cứu sử dụng chúng làm phân vi sinh và được gọi là phân Azobaterin (Chu Thị Thơm và ctv., 2006).

* Azospirillum

Azospirillum được Beijerinck phân lập đầu tiên vào năm 1923 trên vùng đất nghèo dinh dưỡng và đặt tên là Spirillium lipoferum. Sau đó được đặt tên lại là Azospirillium. Azospirillium là vi khuẩn vi hiếu khí, gram âm, hình que. Azospirillum thuộc nhóm cố định đạm ngoại sinh hoặc nội sinh. Chúng xâm nhập lên bề mặt rễ, sau đó nội sinh vào bên trong rễ và một số loài có thể hội sinh với những cây không thuộc họ đậu đặc biệt là các cây ngũ cốc trong đó có cây lúa (Cao Ngọc Điệp và Ngô Thanh Phong, 2016). Azospirillium có khả năng cố định từ 20-40 kg/ha/năm khi liên kết với rễ cây (tương đương 20-40 gN/g malate trong phòng thí nghiệm). Ngoài ra chúng còn tiết các hormone thực vật như IAA, GA, cetokinin và một số vitamin khác (Stanier, 2003). Azospirillum trực tiếp mang lại lợi ích cho cây trồng như tăng số lông hút và rễ cây dẫn đến làm tăng khả năng hút nước và muối khoáng của rễ. Azospirillum lipoferum cũng đã được phân lập từ cây lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (Cao Ngọc Điệp và Ngô Thanh Phong, 2016).

* Acetobacter Acetobacter là vi khuẩn gram âm, có khả năng chuyển động, dạng hình que ngắn, chúng có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và các chất dinh dưỡng khác (Cao Ngọc Điệp và Ngô Thanh Phong, 2016). Acetobacter và các chế phẩm chứa nhóm vi khuẩn này được xem như là chế phẩm quan trọng cho cây mía (Muthukumarasamy et al., 2000). Họ Acetobacteriaceae bao gồm chi, Acetobacter, Gluconobacter, Gluconoacetobacte và Acidomonas (Yamada et al., 1997). Dựa trên phân tích trình tự 16S-rRNA, loài Acetobacter diazotrophicus đã được thay đổi thành Gluconoacetobacter diazotrophicus. G. diazotrophicus là nhóm vi khuẩn gram âm sinh trưởng tốt trong môi trường hiếu khí. Chúng có khả năng cố định đạm, tổng hợp auxin, gibberelline, hòa tan lân… (Cao Ngọc Điệp và Ngô Thanh Phong, 2016). G. diazotrophicus phân lập từ nhiều nguồn khác nhau khi phân loại bằng hình thái và sinh hóa thì không có nhiều biến đổi trong đa dạng di truyền. Tuy nhiên, khi phân tích bằng dấu phân tử random amplified polymorphic ADN (RAPD) thì Suman et al. (2001) nhận thấy rằng có sự đa dạng của các chủng phân lập G. diazotrophicus.

* Pseudomonas Pseudomonas là vi khuẩn gram âm, hình que, có chiên mao ở cực nên, có khả năng di chuyển và không có khả năng tạo thành bào tử. Pseudomonas sống tự do, có thể hiếu khí hay kỵ khí và pH trung tính. Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật như tổng hợp auxin, cytokinin, hòa tan lân, cố định đạm,…Chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri (Hình 2.6) là một trong một số chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả năng cố định đạm (Cao Ngọc Điệp và Ngô Thanh Phong, 2016). Islam et al. (2013) đã xác định 2 chủng Pseudomonas sp phân lập từ đất trồng lúa có khả năng sinh IAA và cố định đạm với lượng ethylen sinh ra là 35,3 nM/h/g. Tương tự, Li et al. (2017) đã phân lập được 100 dòng Pseudomonas từ đất vùng rễ mía ở Quảng Tây, Trung Quốc, trong đó 30 dòng tuyển chọn cho thấy các chủng Pseudomonas có khả năng sinh IAA dao động 13,12-312,07 µg/mL trong điều kiện có bổ sung tryptophan và có khả năng sinh C2H2 là 6,16-108,30 µmol/h/mL. Thí nghiệm của Ke et al. (2019) đã đánh giá chủng Pseudomonas stutzeri A1501 nội sinh trên cây bắp bằng cách sử dụng đồng vị phóng xạ 15N cho thấy chúng cải thiện đáng kể sự phát triển của cây và làm tăng hàm lượng nitơ trong cây cũng như làm thay đổi cộng đồng vi sinh vật xung quanh rễ.

Hình 2.6 Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri

* Bacillus Chi Bacillus thuộc chi vi khuẩn Gram dương, hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc, catalase dương tính và hầu hết có khả năng di động, có khả năng tạo bào tử tự do hoặc bên trong tế bào. Nhiều loài trong chi Bacillus được xác định là có khả năng cố định đạm như Bacillus megaterium (Ding et al,, 2005; Aslam et al., 2016; Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp, 2018), Bacillus cereus (Ding et al., 2005). Yousuf et al. (2017) đã phân lập phân lập từ một cửa sông nhiệt đới và ven biển. Kết quả nghiên cứu cho thấy hầu hết các loài có khả năng cố định đạm trong khu vực nghiên cứu thuộc chi Bacillus. Các mẫu phân lập từ cửa sông cho thấy sự tương đồng cao với Bacillus megaterium, B. cereus, B. safencis, B. licheniformis, B. aerophilus, B. oceanisediminis, B. flexus, B. aquimaris, B. vietnamensis và B. subterraneaus, trong khi các mẫu ven biển có tương đồng cao với B. subtilis, B. megaterium, B. circulans, B. aerophilus, B. flexus và B. oceanisediminis. Khả năng cố định đạm cao nhất được ghi nhận ở B. megaterium (210,05±7,0 nmol C2H4/mg protein/ngày) sau đó là B. flexus (108,76±3,66 nmol C2H4/mg protein/ngày) và B. circulans (98,28±4,32 nmol C2H4/mg protein/ngày). Phân tích phân tử ADN của các chủng Bacillus này cho thấy có sự hiện diện của gen nifH trong chúng. Gần đây, một số nghiên cứu đã được công bố về phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn Bacillus có khả năng cố định đạm và chịu mặn cao để ứng dụng canh tác trong điều kiện xâm nhập mặn của nước biển hiện nay (Nguyễn Khởi Nghĩa, 2017; Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp 2018).

* Paenibacillus Trước đây các loài Paenibacillus thuộc chi Bacillus, theo lịch sử được xác định dựa trên các đặc điểm về mặt sinh vật học chung với các loài Bacillus subtilis, được phân lập vào năm 1872. Chúng có dạng hình que, hiếu khí hoặc hiếu khí tuỳ ý hình thành nội bào tử trong điều kiện khắc nghiệt. Tuy nhiên, những đặc điểm này không phù hợp để phân nhóm các loài này thành một chi duy nhất (Zeigler, 2013). Sau đó, một nghiên cứu khác vào năm 1988 sử dụng phân loại số dựa trên đoạn trình tự 188 nucleotic đã đề xuất tách chi Bacillus thành nhiều chi (Priest et al., 1988). Một phương pháp chính xác hơn về mối quan hệ phát sinh gen giữa các vi khuẩn này đã được nghiên cứu vào năm 1991, khi trình tự gen 16S-rRNA được xác định cho 51 loài sau đó được xác định là Bacillus (Priest et al., 1988; Ash et al., 1991). Các phân tích phát sinh gen cho thấy các trình tự này phân tách thành ít nhất năm nhóm riêng biệt, một trong số đó là chi mới Paenibacillus được tách riêng vào 1993 (Ash et al., 1993). Tên Paenibacillusis bắt nguồn từ trạng từ paene có nghĩa là gần như; bởi vì nó gần như giống Bacillus (Ash et al., 1993).

Vi khuẩn thuộc chi Paenibacillus đã được phân lập từ nhiều môi trường khác. Phần lớn trong số chúng được tìm thấy trong đất, đất vùng rễ: những vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật và có thể được khai thác để sử dụng trong nông nghiệp. Theo đặc điểm đa dạng của chúng, các thành viên của Paenibacillus đã được phát hiện

trong môi trường sống khác biệt, từ các vùng cực đến vùng nhiệt đới và từ môi trường nước đến sa mạc khô cằn nhất (Grady et al., 2016).

+ và NO3

Chi Paenibacillus rất đa dạng, gồm ít nhất 240 loài được xác định (Dai et al., 2019). Theo Xie et al. (2014) có hơn 20 loài Paenibacillus có thể cố định nitơ, các chủng này bao gồm cả hai nhóm diazotrophic và non-diazotrophic (Eastman et al., 2014; Xie et al., 2016; Puri et al., 2016). Chi Paenibacillus có nhiều loài được biết đến để thúc đẩy sự phát triển của thực vật bao gồm bắp (Sheela and Usharani, 2013), cây dương (Han et al., 2014) bí ngô (Fürnkranz et al., 2012), lúa (Souza et al., 2014), cỏ kê (Ker et al., 2014) và nhiều loài khác (Grady et al., 2016). Do đó, tiềm năng sử dụng Paenibacillus spp. cố định N2 được đề xuất làm phân bón sinh học để tăng cường sự -) và các quá phát triển của cây trồng thông qua việc tăng hấp thụ nitơ (NH4 trình trao đổi chất khác (Liu et al., 2019; Li et al., 2019). Giống như các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật khác, chúng thực hiện điều này thông qua nhiều phương thức và cơ chế khác nhau. Các loài Paenibacillus kích thích trực tiếp đến sự phát triển của thực vật bằng cách sản xuất axit indole-3-acetic (IAA) và các phytohormone khác, hòa tan lân khó tan để cây hấp thụ một số loài cũng có thể cố định nitơ trong khí quyển. Ngoài ra, Paenibacillus đã kiểm soát mầm bệnh thực vật bằng cách kích hoạt tính kháng hệ thống kháng thể của cây và/hoặc sản xuất nhiều loại hợp chất diệt khuẩn.

Cụm gen nif được bảo tồn cao trong các loài Paenibacillus cố định đạm, với hầu hết chứa 9 gen trong khoảng 10,5-12,0 kb và thể hiện hơn 80% tương đồng (Xie et al., 2014). Hầu hết các gen nif xuất hiện đơn thể, có khả năng bắt nguồn từ chuyển gen ngang duy nhất, sau đó là sự sao chép và mất đoạn gen ở một số dòng (Xie et al., 2016; Fernandes et al., 2014). Ít nhất hai chủng, P. riograndensis SBR5T và P. durus DSMZ1735, có thêm gen nif từ quá trình chuyển ngang, các nghiên cứu gần đây cho thấy các gen này có thể không hoạt động (Fernandes et al., 2014). Nitogenase Vnf được mã hóa trong bộ gen của P. zanthoxyli JH29 và P. azotofixans ATCC 35681, trong khi Anf được mã hóa bởi P. sophorae S27, P. forsythia T98 và P. riograndensis SBR5T; tất cả chúng cũng chứa nif cluster. Trong các loài Paenibacillus có các lựa chọn thay thế cho Mo trong các hợp phần cấu trúc của enzyme nitrogenase, là vanadi và sắt (Vnf) hoặc chỉ có sắt (Anf) (Boyd and Peters, 2013). Ngoài các gen chức năng nif, có thêm Vnf hoặc Anf có thể mang lại lợi thế chọn lọc cho các dòng vi khuẩn trong một số trường hợp nhất định, vì Anf cho thấy biểu hiện cao hơn trong điều kiện thiếu molypden (Fernandes et al., 2014). Khả năng cố định nitơ của các loài Paenibacillus cố định đạm như P. zanthoxyli DSM 18202 tạo ra hoạt động tăng gấp 140 lần so với P. peoriae DSM 8320 (Wang et al., 2013).

* Paraburkholderia Chi Burkholderia, được mô tả dựa trên việc chuyển 7 loài từ Pseudomonas, được đề xuất bởi Yabuuchi et al. (1992). Về mặt hình thái học, chi Burkholderia thuộc họ Burkholderiaceae thuộc họ Etaproteobacteria. Tuy nhiên, các nghiên cứu phát sinh gen dựa trên 16S-rRNA và một số gen bảo tồn cho thấy chi Burkholderia chứa ít nhất

(Lv et al., 2016). Một số

loài

hai chi: chi Burkholderia và một chi mới Paraburkholderia (Dobritsa and Samadpour, 2016). Chi Paraburkholderia lần đầu tiên được đề xuất bởi Sawana et al. (2015) với Paraburkholderia graminis là loài. Các thành viên của chi Paraburkholderia được đặc trưng là Gram âm, hình que thẳng và có hàm lượng G + C trong khoảng 58,9-65,0% (Dobritsa and Samadpour, 2016). Hiện tại, chi Paraburkholderia bao gồm 60 loài được công nhận (Euzeby, 1997) được phân lập từ các môi trường khác nhau (đất, thực vật và nước), bao gồm Paraburkholderia caffeinilytica (Gao et al., 2016) và Paraburkholderia pallidirosea thuộc chi Paraburkholderia đã được xác nhận là có khả năng cố định đạm (Sheu et al., 2013; Chen et al., 2006) đã chủng vi khuẩn Paraburkholderia azotifigens sp. phân lập từ đất lúa được chứng minh là đại diện cho một loài cố định đạm mới của chi Paraburkholderia (Choi and Im., 2018).

* Klebsiella Klebsiella thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hình que, ít chuyển động, có khả năng kết bào xác, kỵ khí không bắt buộc, sống tự do trong đất hoặc xâm nhập và nội sinh trong cây trồng. Chủng vi khuẩn Klebsiella oxytoca phân lập từ cỏ đuôi mèo có khả năng tổng hợp IAA và cố định đạm tốt. Sơ đồ hệ thống cấu trúc các gen nif của K. pneumoniae được nghiên cứu kỹ (Shamseldin, 2013). Khoảng 30% loài Klebsiella pneumonia có khả năng cố định nitơ (Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2012).

2.4.3 Tổng hợp indole-3-acetic acid

2.4.3.1 Vai trò sinh lý của auxin

Hormone thực vật là những tín hiệu hóa học do thực vật tiết ra làm tăng khả năng phản ứng của thực vật đối với môi trường. Hormone thực vật có hiệu quả ở nồng độ rất thấp, chúng tương tác với mô đích để tạo ra phản ứng sinh lý. Mỗi phản ứng thường là kết quả của hai hoặc nhiều hormone hoạt động cùng nhau. Hormone thực vật có 2 tác động chính là kích thích hoặc ức chế sự phát triển của thực vật. Có 5 nhóm hormone thực vật chính: auxins, gibberellins, ethylene, cytokinins và abscisic acid (Saharan and Nehra, 2011).

Indole-3-acetic acid là một thành viên được cho là quan trọng nhất trong nhóm hormone thực vật Auxin (Ashrafuzzaman et al., 2009). Nó hoạt động như một phân tử tín hiệu quan trọng trong việc điều hòa sự phát triển của cây trồng bao gồm: điều khiển sự ra hoa, phản ứng hướng động, phản ứng tế bào như gia tăng kích thước và phân chia tế bào, biệt hóa, và điều hòa gen (Ryu and Patten, 2008), gia tăng hô hấp và hình thành rễ (Frankenberger and Arshad, 1995).

IAA kích thích sự sinh trưởng của tế bào, làm cho tế bào dài ra. Hiệu quả đặc trưng của auxin là tác động lên sự giãn của thành tế bào; Auxin gây ra sự giảm độ pH trong thành tế bào nên hoạt hóa các enzyme phân giải các polysacharid liên kết giữa các sợi cellulose làm cho chúng lỏng lẻo và tạo điều kiện cho thành tế bào giãn ra dưới tác dụng của áp suất thẩm thấu của không bào trung tâm. Ngoài ra IAA cũng kích

thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào đặc biệt là các cellulose, pectin, hemicellulose... Bên cạnh đó IAA còn ảnh hưởng đến sự phân chia của tế bào, tuy nhiên ảnh hưởng của auxin lên sự giãn và sự phân chia tế bào trong mối tác động tương hỗ với các phytohormone khác như gibberellin và cytokinin. (Cao Ngọc Điệp, 2007).

IAA gây ra tính hướng động của cây (hướng quang và hướng địa). Bằng cách sử dụng nguyên tử đánh dấu cho thấy IAA phóng xạ được phân bố nhiều hơn ở phần khuất ánh sáng cũng như phần dưới của bộ phận nằm ngang và gây nên sự sinh trưởng không đều ở hai phía của cơ quan. Phía khuất ánh sáng bao giờ cũng tích điện dương, trong khi phía chiếu sáng bao giờ cũng tích điện âm. IAA trong cây thường bị ion hóa (IAA-) và do đó phân bố ở phía điện dương nhiều hơn và kích thích sự sinh trưởng ở phía khuất ánh sáng mạnh hơn ở phía chiếu sáng. Kết quả làm cây uốn cong về phía chiếu sáng (Lương Minh Châu, 2004 trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2011).

IAA điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn: Hiện tượng ưu thế ngọn là đặc tính quan trọng và phổ biến ở thực vật. Khi chồi hoặc rễ chính sinh trưởng sẽ ức chế sự sinh trưởng của chồi bên. Đây là một sự ức chế tương quan vì khi loại trừ ưu thế ngọn bằng cách cắt chồi ngọn rễ chính thì chồi bên rễ bên được giải phóng khỏi ức chế và lập tức sinh trưởng. Hiện tượng này được giải thích IAA được hình thành trong đỉnh ngọn với hàm lượng cao hơn được vận chuyển xuống dưới, trên con đường đi xuống nó sẽ ức chế sự sinh trưởng của các chồi bên. Nếu cắt ngọn thì làm giảm hàm lượng auxin nội sinh và sẽ kích thích chồi sinh trưởng. (Cao Ngọc Điệp, 2007).

IAA kích thích sự hình thành rễ: Trong sự hình thành rễ, đặc biệt là rễ phụ, hiệu quả auxin là rất đặc trưng. Sự hình thành rễ phụ có thể chia làm 3 giai đoạn: phân hóa tế bào trước tầng phát sinh, tiếp theo là xuất hiện mầm rễ và cuối cùng là rễ sinh trưởng thành rễ phụ chọc thủng vỏ và phát triển ra ngoài (Frankenberger and Arshad, 1995).

2.4.3.2 Vi sinh vật tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)

Trong quá trình sinh trưởng của thực vật, ngoài IAA nội sinh, sự tăng trưởng của thực vật chịu tác động không nhỏ của lượng auxin bên ngoài mà một trong những nguồn đó được tổng hợp bởi vi sinh vật. Có nhiều loài vi khuẩn có khả năng sản sinh hormone thực vật IAA (Saharan and Nehra, 2011). Khoảng 80% vi sinh vật sống ở vùng rễ các loài cây trồng có khả năng tổng hợp auxin (Loper and Schroth, 1986), trong khi nghiên cứu trên đậu xanh, Joseph et al. (2007) đã cho thấy tất cả các chủng Bacillus, Pseudomonas và Azotobacter sản xuất IAA, trong khi chỉ 85,7% Rhizobium đã có thể sản xuất IAA. Theo Patten and Glick (1996) các dòng vi khuẩn thuộc các giống Azospirilium, Pseudomonas, Rhizobium, Xanthomonas, Bradyrhizobium japonicum, Gluconobacter diazotrophicus đã được xác định là có khả năng tổng hợp IAA. Ngoài ra còn có Azotobacter vinelandii, Agrozobacter tumerfaciens, Azotobacter chroococcum, Arthrobacter spp., Bacillus cereus, Bacillus subtilus, Nostoc rivular, Pseudomonas spp., Rhizobium melioti… (Frankenberger and Arshad, 1995).

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh auxin do vi sinh vật tổng hợp có tác động tích cực lên sự sinh trưởng của cây trồng như: gia tăng chiều dài rễ, chiều cao của chồi, tăng khả năng hấp thu lân của cây cải dầu, đặc biệt khi chủng với dòng vi khuẩn Pseudomonas putida GR12-2 (Lifshitz et al., 1987), giúp phát triển rễ và tăng năng suất lúa (Malik et al., 1994), tăng chiều cao cây, tăng số nhánh, tăng đường kính thân, tăng số trái trên 1 cây, tăng hàm lượng dầu trong hạt, tăng năng suất ở cải Brassica juncea (Asghar et al, 2002), tác động đến đặc tính sinh trưởng và năng suất rau muống và rau mồng tơi, gia tăng có ý nghĩa thống kê chiều cao cây, khối lượng thân lá và rễ tươi, khối lượng chất khô của cây bắp trồng trong chậu (Đặng Thị Ngọc Thanh và ctv., 2016).

Ảnh hưởng của IAA lên mỗi giống thực vật phụ thuộc vào nồng độ của nó, ở nồng độ thấp có thể kích thích sinh trưởng nhưng lại có thể gây ức chế ở nồng độ cao (Frankenberger and Arshad, 1995). Chính sự tập trung của vi khuẩn đặc hiệu xung quanh rễ sẽ quyết định nồng độ auxin đó. Thực vật khác nhau đáp ứng khác nhau với nồng độ auxin biến động (Sarwar and Frankenberger, 1994) và loại vi sinh vật (Ahmad et al., 2005). Các chủng vi sinh vật tổng hợp 2 dạng auxin phổ biến là IAA và indole acetamide (IAM) trong đất ở môi trường bình thường làm cho tốc độ tăng trưởng và năng suất của lúa mì đạt mức tối đa (Khalid et al., 2004). Ngay cả các chủng vi sinh vật sản xuất IAA thấp hơn nhưng liên tục và ổn định cũng sẽ giúp cải thiện năng suất thực vật (Tsavkelova et al., 2007).

2.4.3.3 Các con đường tổng hợp IAA ở vi sinh vật

Có nhiều phương thức tổng hợp sinh học IAA ở vi khuẩn đã được xác định. Theo Spaepen et al. (2007) tryptophan đã được xác định là tiền chất chính cho quá trình tổng hợp IAA ở vi khuẩn. Việc xác định các chất trung gian dẫn đến có 5 con đường tổng hợp IAA phụ thuộc tryptophan bao gồm tổng hợp từ indole-3-acetamide, indole- pyruvate, tryptamine, tryptophan side-chain oxidase, indole-3-acetonitrile, và con đường không phụ thuộc vào tryptophan (Hình 2.7).

Con đường tổng hợp IAA từ indole-3-acetamide (IAM) là con đường phổ biến nhất ở vi khuẩn. Trong quá trình tổng hợp IAA theo con đường này, tryptophan được chuyển thành IAM bởi enzyme tryptophan-2-monooxygenase (IaaM) được mã hóa bởi gen IaaM, sau đó IAM bị phân cắt bởi enzyme IAM hydrolase (IaaH) tạo thành IAA. enzyme IAM hydrolase được mã hóa bởi gen IaaH (Spaepen et al. 2007).

Con đường indole-3-pyruvate (IpyA) được cho là con đường chính tổng hợp IAA ở thực vật, tuy nhiên các enzyme và gen mấu chốt cho quá trình này thì chưa xác định được ở thực vật. Ở vi khuẩn quá trình này đã được xác định có ở: Bradyrhizobium, Azospirillum, Rhizobium và Enterobacter cloacae và tảo lam. Con đường tổng hợp IAA này gồm 3 giai đoạn được mô tả ở Hình 2.7 khi tryptophan được chuyển thành IpyA, sau đó thành indole-3-acetaldehyde và cuối cùng tạo thành IAA (Spaepen et al. 2007).

Hình 2.7 Các con đường tổng hợp IAA ở vi khuẩn (Spaepen et al., 2007) Con đường tryptamine (TAM) được xác định ở vi khuẩn Bacillus cereus (Perley and Stowe, 1966) và Azospirillum (Hartmann et al., 1983). Quá trình tổng hợp theo con đường này tương tự như quá trình IpyA nhưng được thay thế IpyA bởi tryptamine. Con đường tryptophan side-chain oxidase (TSO) được tìm thấy ở Pseudomonas fluoescens CHA0, quá trình tổng hợp theo con đường này được tiến hành khi tryptophan được chuyển trực tiếp thành indole-3-acetaldehyde mà không qua sự hình thành IpyA (Oberhansli et al., 1991).

Con đường indole-3-acetonitrile (IAN) khi ở giai đoạn cuối IAN được chuyển

thành IAA (Spaepen et al., 2007).

Một con đường không phụ thuộc tryptophan ở vi khuẩn được chứng minh là dòng vi khuẩn Azotobacter brasilense có khả năng này. Con đường này chiếm ưu thế trong trường hợp không cung cấp tryptophan trong môi trường nuôi cấy: 90% IAA được tổng hợp thông qua con đường không phụ thuộc tryptophan, trong khi 0,1% được tạo ra thông qua con đường IAM (Prinsen et al., 1993). Vì các enzyme cụ thể của con đường này chưa được xác định, sự tồn tại của con đường này hiện đang được tiếp tục nghiên cứu.

2.4.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp IAA

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn có thể phân thành

2 nhóm chính là các yếu tố môi trường và các yếu tố liên quan đến di truyền.

a) Các yếu tố môi trường: Yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp IAA ở các vi khuẩn có liên quan đến các yếu tố stress môi trường bao gồm: pH acid, tính thẩm thấu và chất nền, và sự hạn chế nguồn carbon. Ona et al. (2003 và 2005) đã chỉ ra rằng vi khuẩn Azotobacter brasilense có khả năng gia tăng tổng hợp IAA khi thiếu hụt nguồn carbon

và giảm khả năng tổng hợp IAA ở điều kiện pH có tính acid. Kết quả tương tự cũng tìm thấy trong nghiên cứu của Broek et al. (2005). Ngoài ra, trong môi trường đất, các chất hoặc hợp chất do thực vật tiết cũng tác động đến quá trình tổng hợp IAA của vi sinh vật (Spaepen et al., 2007).

Acid amin tryptophan là một tiền chất quan trọng và nó ảnh hưởng mạnh mẽ lên quá trình tổng hợp IAA của vi sinh vật. Khi bổ sung tryptophan trong quá trình nuôi cấy sẽ làm tăng có ý nghĩa lượng IAA ở nhiều vi khuẩn khác nhau (Prinsen et al., 1993; Brandl and Lindow, 1996; Patten and Glick, 2002; Theunis et al., 2004). Ngoài tryptophan, quá trình tổng hợp IAA còn được điều chỉnh bởi sản phẩm cuối cùng là IAA và các chất trung gian trong quá trình tổng hợp. Đối với Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi hoạt động của enzyme đầu tiên IaaM trong con đường IAM nhận tín hiệu ức chế ngược từ sản phẩm là IAM và IAA (Hutcheson and Kosuge, 1985). Tryptophan kích thích khả năng sản xuất IAA ở vi khuẩn Azospirillum, nhưng anthranilate, tiền thân của tryptophan, lại làm giảm khả năng tổng hợp IAA. Bởi vì cơ chế sinh tổng hợp IAA được điều chỉnh bởi tryptophan ức chế sự hình thành anthranilate do một quy trình điều hòa ngược ức chế tiến trình tổng hợp anthranilate, do đó dẫn đến ức chế gián tiếp lên tiến trình tổng hợp IAA (Hartmann and Zimmer, 1994).

b) Các yếu tố di truyền: Các yếu tố di truyền khác nhau đã được chứng minh là có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp IAA bởi vi khuẩn. Thứ nhất, vị trí của gen sinh tổng hợp auxin trong bộ gen, hoặc plasmid hoặc nhiễm sắc thể, đã được chứng minh là điều chỉnh khả năng tổng hợp IAA. Plasmid thường có mặt trong nhiều bản sao khác nhau trong tế bào vi khuẩn, nên tổng hợp IAA cao hơn so với các gen sinh tổng hợp IAA phân bố trên nhiễm sắc thể (Brandl and Lindow, 1996; Patten and Glick, 1996). Ở loài vi khuẩn Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi có chứa các gen sinh tổng hợp IAA nằm trên một plasmid, trong khi ở Pseudomonas syringae pv. syringae các gen tương đồng được mã hóa trên nhiễm sắc thể ADN. Ở các loài này, lượng IAA tổng hợp được thấp hơn nhiều. Khi vi khuẩn Pseudomonas có số plasmid bản sao thấp các gen mã hóa tổng hợp IAA, thì lượng IAA tạo ra tăng gấp bốn lần (Mazzola and White, 1994), cho thấy tầm quan trọng của vị trí gen hoặc số lượng bản sao của gen hoặc cả hai yếu tố này ảnh hưởng mạnh đến lượng IAA tổng hợp được ở vi sinh vật. Thứ hai, các yếu tố thuộc về loài vi khuẩn và con đường tổng hợp IAA của loài vi khuẩn đó. Hơn nữa quá trình điều hòa phiên mã của gen còn chịu tác động của các yếu tố môi trường (Spaepen et al., 2007).

2.4.4 Các nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA trong và ngoài nước

2.4.4.1 Ngoài nước

Smith et al. (1978) đã sử dụng Azospirillum chủng cho cây trồng để đánh giá khả năng bổ sung nguồn đạm cho đất và cây trồng. Kết quả nghiên cứu cho thấy chúng làm tăng protein, tăng trọng lượng khô của hạt ngũ cốc và làm tăng năng suất. Azospirillum là nhóm vi khuẩn có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và các chất khác. Nhiều nghiên cứu về vi khuẩn thuộc các chi Azospirillum trên đối tượng ngũ cốc, cỏ (Patriquin et al., 1983) rau cải, cà chua (Bashan et al., 1989) cũng cho thấy chúng làm tăng trọng lượng khô, tăng sự tích tụ N tổng số, tăng tỷ lệ nảy mầm hạt, tăng chiều dài rễ,…

Trên cây bắp, các thí nghiệm trồng trong chậu của Egamberdiyeva (2007) cho thấy hạt bắp được xử lý với hỗn hợp các chủng vi khuẩn Pseudomonas alcaligenes PsA15, Bacillus polymyxa BcP26 và Mybacterium phlei MbP18 có các chức năng cố định đạm, tổng hợp IAA và đối kháng nấm bệnh đã giúp cây bắp sinh trưởng tốt hơn, kích thích rễ cây sinh trưởng tốt, tăng cường khả năng hấp thu nitơ, kali của rễ cây, đồng thời lượng N, P, K trong đất tăng lên đáng kể. Cũng trên đối tượng cây bắp các thí nghiệm khác tiến hành trên cả ở nhà lưới và ngoài đồng ruộng của Ferreira et al. (2013) đã cho thấy khi xử lý hạt với dòng đơn vi khuẩn Azospirillum brasilense Ab-v5 có chức năng cố định đạm tổng hợp IAA làm gia tăng sinh trưởng của cây bắp trong chậu khi chủng A. brasilense ở nồng độ 1011cell.mL-1. Trên đồng ruộng cho thấy sản lượng hạt bắp đã tăng lên thêm 29% khi bón phân hóa học kết hợp chủng A. brasilense so với nghiệm thức chỉ bón N.

Trên cây lúa mì, Díaz-Zorita and Fernández-Canigia (2009) đã báo cáo kết quả nghiên cứu ứng dụng chủng A. brasilense INTA Az-39 có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA tại 297 địa điểm thử nghiệm ở vùng Pampas của Argentina từ 2002 - 2006 cho thấy 70% các khu vực khảo nghiệm cho năng suất tăng thêm bình quân 8% và sinh khối khô của của cây lúa mì tăng lên đáng kể. Bên cạnh đó các nghiên cứu của Gholami et al. (2009) cho thấy năng suất lúa mì tăng lên đến 30% cao hơn khi chủng với vi khuẩn Azotobacter so với nghiệm thức đối chứng không chủng. Kết quả được giải thích là do các chủng Azotobacter có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây con (Shaukat et al., 2006) và ngoài ra chúng có khả năng đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường đa, có khả năng tiết ra một số vitamin nhóm B như B1, B6, …, một số acid hữu cơ như: acid nicotinic, pantotenic, biotin, auxin nâng cao tỷ lệ nảy mầm và phát triển của mầm (Chu Thị Thơm và ctv., 2006). Tương tự năm 2010, Hungria et al. đã tiến hành các nghiên cứu xử lý hạt giống lúa mì và bắp với các chủng vi khuẩn có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA là Azospirillum brasilense Ab-v5 và A. brasilense Ab-v6 làm gia tăng năng suất lúa mì và bắp thêm tương ứng là 27% và 31% so với năng suất ở nghiệm thức chỉ bón phân hóa học.

Một nghiên cứu khác trên cây đậu nành cho thấy khi xử lý hạt đậu nành với vi khuẩn Bradyrhizobium japonicum (B. japonicum SEMIA 5079, B. japonicum SEMIA 5080), có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA đã làm tăng thêm 8,4% năng suất ở điều kiện ngoài đồng. Trong khi xử lý hạt kết hợp tưới A. brasilense ở nồng độ 2,5x105 (A. brasilense Ab-v5 và A. brasilense Ab-v6) trên đồng ruộng làm năng suất tăng thêm 16,1% và chỉ xử lý hạt với hỗn hợp vi khuẩn đã làm năng suất tăng thêm 14,1% so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (Hungria et al., 2013).

Trên cây lúa, Isawa et al. (2010) đã tiến hành nghiên cứu ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng cho thấy khi sử dụng chủng Azospirillum sp. B510 có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA làm tăng số nhánh và tăng năng suất hạt so với nghiệm thức không chủng trong điều kiện ngoài đồng. Kết quả tương tự được ghi nhận trong kết quả nghiên cứu của Bao et al., (2013).

Trên cây đậu xanh, khi xử lý từng chủng đơn lẻ hoặc kết hợp chủng 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas jessenii (hòa tan lân) và Mesorhizobium ciceri (cố định đạm) đều cho thấy số nốt sần hình thành nhiều hơn, các nốt có khối lượng tươi lớn hơn trong khi nếu chỉ dòng đơn P. jessenii kết quả đã không ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của cây đậu xanh. Năng suất hạt cây đậu xanh cao nhất khi tổ hợp cả 2 chủng vi khuẩn (Valverde et al., 2006).

Trên cây mía, Govindarajan et al. (2006) đã thử nghiệm và cho thấy sinh khối mía tăng 20% đối với nghiệm thức chỉ chủng vi khuẩn Burkholderia vietnamienis MG43 so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Năm 2016, Rodrigues et al. đã phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn vùng rễ và nội sinh trong cây mía có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA và đã tiến hành thử nghiệm cho thấy chúng có khả năng làm tăng diện tích lá, khối lượng lá, thân cũng như chiều cao cây, khối lượng khô của rễ và đã đề xuất 5 dòng có tiềm năng sản xuất phân bón vi sinh bao gồm: Klebsiella sp. KFA 1.3; Klebsiella sp. KRC 2.2; Pantoea sp. KRZ5; Enterobacter sp. KRZ6; và Enterobacter sp. KRZ23.

2.4.4.2 Trong nước

Ở Việt Nam, nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong nông nghiệp cũng sớm thu hút được nhiều sự quan tâm. Phân vi sinh cố định đạm cộng sinh với rễ cây họ đậu đã được nghiên cứu từ năm 1960, tuy nhiên, cho mãi đến năm 1987, phân Nitragin trên nền chất mang than bùn mới được hoàn thiện. Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh (Phạm Văn Toản, 2002). Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu theo hướng phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn hoặc xạ khuẩn có các chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA và đồng thời đánh giá 2 khả năng này của chúng ở điều kiện phòng thí nghiệm đã được thực hiện (Nguyễn Hữu Hiệp và ctv. 2005; Nguyễn Hữu Hiệp và Hà Anh Đức, 2009; Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Mai Khanh, 2010; Nguyễn Thị Phương Oanh và ctv., 2013; Nguyễn Thị Huỳnh Như và ctv., 2013; Nguyễn Thị Pha và ctv., 2014a; Nguyễn Thị Thu Hằng và

Nguyễn Thị Thủy, 2015; Trần Thị Xuân Phương và ctv., 2017; Nguyễn Khởi Nghĩa, 2017; Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp, 2018). Bên cạnh các nghiên cứu phân lập tìm kiếm nguồn vi sinh vật cố định đạm, tổng hợp IAA, nhiều nghiên cứu khảo nghiệm khả năng ứng dụng các vi sinh vật này ở nhà lưới hoặc trên đồng ruộng cũng được tiến hành. Cao Ngọc Điệp và Bùi Thị Kiều Oanh (2006) đã sử dụng vi khuẩn Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm, hòa tan lân tổng hợp IAA đã giúp cây mía phát triển tốt trên vùng đất phèn của tỉnh Long An, tiết kiệm được 50% phân đạm hóa học, không cần đến phân lân nhưng năng suất và lượng đường vẫn cao hơn so với mía ở nghiệm thức chỉ bón phân hóa học theo khuyến cáo. Tương tự, trong nghiên cứu đánh giá hiệu quả của vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân lên năng suất cây đậu phộng trồng tại tỉnh Trà Vinh của Nguyễn Hữu Hiệp và Trần Thị Tuyết Linh (2009) đã cho thấy trồng đậu phộng có chủng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân giúp tiết kiệm 80 kg N và 80 kg P2O5 cho mỗi hecta.

Trần Văn Chiêu và Nguyễn Hữu Hiệp (2010a) đã tuyển chọn được 3 dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum phân lập được từ rễ lúa, có khả năng tổng hợp IAA trong môi trường không bổ sung tryptophan, những thử nghiệm trong điều kiện nhà lưới cho thấy khi chủng các vi khuẩn này giúp tăng chiều dài rễ lúa và tăng số lượng rễ phụ. Trong các thử nghiệm trên đồng ruộng tại Bạc Liêu cho thấy khi chủng vi khuẩn Azospirillum lipoferum làm tăng số hạt chắc trên bông, có thể giảm được 50-75% lượng đạm bón cho cây lúa mà năng suất vẫn tương đương với nghiệm thức bón 100N (Trần Văn Chiêu và Nguyễn Hữu Hiệp, 2010b). Kết quả này tương tự các nghiên cứu trong nhà lưới của Nguyễn Hữu Hiệp và ctv., (2012), cho thấy việc chủng dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum R29B1và bón 50N giúp các chỉ tiêu về thành phần năng suất tương đương với nghiệm thức chỉ bón 100N.

Trong các thí nghiệm ở nhà lưới và đồng ruộng tại Tiền Giang, Nguyễn Thị Ngọc Trúc (2011) đã cho thấy khi sử dụng chế phẩm hỗn hợp các vi sinh vật cố định đạm và tổng hợp IAA được phân lập và tuyển chọn tại đất trồng rau ở Tiền Giang giúp tăng chiều dài rễ và chiều cao cây rau muống và rau mồng tơi, đồng thời giảm được 50% lượng phân hóa học nhưng năng suất cao hơn so với thí nghiệm chỉ bón phân hóa học, đồng thời cũng làm giảm lượng nitrate tồn dư trong rau. Lai Quốc Chí và ctv. (2012) đã đánh giá khả năng cố định đạm của hỗn hợp ba dòng vi khuẩn cố định đạm Rhizobium tropici, Bacillus subtilis và Rhizobium multihospitium trên hành lá (Allium fistulosum sp.) và mồng tơi (Basella alba L.) cho thấy các dòng vi khuẩn này giúp cây phát triển chiều cao, trọng lượng và năng suất. Trên cây lúa, Nguyễn Thị Pha và ctv. (2014b) đã khảo sát ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn cố định đạm ở điều kiện đồng ruộng cho thấy khi chủng các dòng vi khuẩn PH27 tiết kiệm được 50% lượng phân đạm nhưng vẫn cho năng suất lúa tương đương với bón đầy đủ 100% đạm không chủng vi khuẩn.

Trong một đánh giá tổng hợp hiệu quả phân vi sinh gồm nhiều dòng vi khuẩn với nhiều chức năng như cố định đạm, hòa tan lân, kali, tổng hợp IAA Cao Ngọc Điệp và

Ngô Thanh Phong (2016) cho thấy chúng có hiệu quả tốt trong việc làm gia tăng các chỉ tiêu nông học, các chỉ tiêu cấu thành năng suất và năng suất của nhiều đối tượng cây trồng như mía, lúa, bắp, đậu, rau ăn lá, rau ăn quả, rau gia vị… tại nhiều tỉnh thành thuộc Đồng bằng sông Cửu Long đồng thời giảm được đáng kể lượng phân bón hóa học sử dụng.

Nguyễn Khởi Nghĩa (2017) đã đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật có khả năng chịu mặn với các chức năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA lên cây lúa trồng ở các vùng nhiễm mặn ở Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy chế phẩm vi sinh này giúp kích thích sinh trưởng và làm tăng 13% năng suất lúa so với công thức chỉ bón phân hóa học theo khuyến cáo đồng thời giảm được 20% lượng phân hóa học.

2.5 Hệ vi sinh vật bản địa IMO

2.5.1 Lịch sử nghiên cứu

Thông thường các chế phẩm hoặc phân bón vi sinh thương mại dùng trong nông nghiệp có mặt trên thị trường phải qua công đoạn phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có lợi cho cây trồng. Tuy nhiên, công đoạn phân lập và tuyển chọn tốn nhiều chi phí và cần phải có phòng thí nghiệm, do vậy nông dân không thể tự sản xuất các chế phẩm vi sinh ở quy mô nông hộ. Đây là yếu tố giới hạn làm hạn chế việc sử dụng các chế phẩm vi sinh đặc biệt là vi sinh vật bản địa, có lợi trong nông dân. Tuy nhiên, việc tận dụng các nguồn vi sinh vật bản địa có chức năng có lợi cho cây trồng vẫn còn hạn chế, cho mãi đến năm 1965, Cho Han Kyu người Hàn Quốc đưa ra và đặt nền móng cho việc nghiên cứu và ứng dụng hệ vi sinh vật bản địa (IMO-indigenous microoganism) đầu tiên. Kết quả cho thấy việc thu thập và tận dụng nguồn vi sinh vật bản địa có sẵn trong tự nhiên gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, tuyến trùng, động vật nguyên sinh… để khai thác tiềm năng ứng dụng của chúng nhằm giúp gia tăng phân hủy chất hữu cơ trong đất, cải thiện năng suất cây trồng, giảm thiểu các vi sinh vật gây bệnh và tăng khả năng phòng vệ của cây trồng (Kyu and Kyoyama, 1997).

Vi sinh vật bản địa là một nhóm các vi sinh vật tự nhiên sống trong đất và bề mặt đất có khả năng phân hủy sinh học, cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp các chất tăng trưởng thực vật, cải thiện khả năng phục hồi độ phì nhiêu đất… (Kalsom and Sariah, 2006). Theo Kyu and Koyama (1997), bằng cách thu thập và tận dụng nguồn vi sinh vật bản địa IMO và sử dụng vào trong các nông trại tự nhiên ở Hàn Quốc (KNF- Korean Natural Farming) giúp tăng lượng mùn, độ phì nhiêu đất để phục vụ sản xuất nông nghiệp giúp tăng năng suất và sản lượng cây trồng mà không cần sử dụng thuốc bảo vệ thực vật và phân bón hoá học. Nông nghiệp tự nhiên đã tận dụng IMO để khai thác tiềm năng ứng dụng của hệ vi sinh vật bản địa từ các hệ sinh thái khác nhau giúp gia tăng phân hủy xác bã hữu cơ trong đất, cải thiện năng suất cây trồng, giảm thiểu các vi sinh vật gây bệnh và tăng khả năng phòng vệ của cây (Kyu and Koyama 1997). Việc sử dụng có hiệu quả vi sinh vật bản địa trong nông nghiệp có ý nghĩa thiết thực

trong việc cải thiện kinh tế và các lợi ích xã hội cũng như môi trường và đây là một trong những phương pháp hiệu quả giúp bảo vệ môi trường sinh thái (Cai et al., 2013).

2.5.2 Vai trò và chức năng của IMO đối với cây trồng

Vi sinh vật bản địa IMO giúp gia tăng hàm lượng dinh dưỡng trong đất và làm tăng năng suất cây trồng. Các nguồn chính của vi sinh vật bản địa là vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn với vai trò cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, làm tăng sức đề kháng với mầm bệnh cũng như côn trùng và tăng cường khả năng chịu đựng của cây với các điều kiện bất lợi về khí hậu và môi trường. Trong hệ sinh thái đất, enzyme do vi sinh vật đất tiết ra cần thiết cho quá trình biến dưỡng của vi sinh vật, đồng thời gia tăng tốc độ phân hủy chất hữu cơ, tham gia vào các chu trình dinh dưỡng cũng như sự hình thành mùn và giúp gia tăng cấu trúc của đất. Vi sinh vật có vai trò chính trong tiến trình phân hủy các độc chất hữu cơ thường xuyên được sử dụng trong nông nghiệp như thuốc bảo vệ thực vật và các hoạt chất này ảnh hưởng trực tiếp đến việc tổng hợp và phân huỷ chất hữu cơ trong đất. Các enzyme trong đất có chức năng riêng biệt tham gia vào quá trình trao đổi chất của đất (McLaren and Thornton, 1975).

Hệ vi sinh vật bản địa đã tiến hóa hàng ngàn năm để tồn tại và thích nghi với các điều kiện môi trường sống của bản địa. Chúng có thể chịu đựng và sống sót ở các điều kiện khí hậu và môi trường sống bất lợi của địa phương. Hơn nữa chúng có mối quan hệ và sự sắp xếp vai trò, vị trí và nhiệm vụ giữa chúng, chúng sẽ thực hiện tốt chức năng của mình một cách mạnh mẽ trong khi đó các vi sinh vật ngoại lai được nuôi trong các điều kiện nhân tạo chưa thích nghi được điều kiện môi trường mới khắc nghiệt chúng dễ dàng bị chết đi hoặc chỉ thể hiện chức năng của chúng trong thời gian ngắn và hiệu lực thấp. Do đó, không có sự thay thế nào tốt hơn so với vi sinh vật bản địa (Reddy, 2011). Theo Reddy (2011) IMO có rất nhiều ưu điểm và các ưu điểm này có thể được liệt kê như sau:

- Bảo vệ sự tái sinh lâu dài của đất bằng cách duy trì hàm lượng chất hữu cơ, kích

thích hoạt động sinh học trong đất, và giúp gia tăng cấu trúc đất.

- Cung cấp dinh dưỡng gián tiếp cho cây trồng bằng cách sử dụng hòa tan các

nguồn dinh dưỡng bị cố định trong đất nhờ hoạt động của vi sinh vật trong đất.

- Cung cấp đạm cho đất và cây trồng thông qua việc cố định đạm sinh học và

phân hủy các vật liệu hữu cơ bao gồm xác thực vật và phân chuồng.

- Kiểm soát cỏ dại, bệnh tật và sâu bệnh hại cây trồng. - Làm cho hệ thống canh tác tác động nhẹ nhàng và an toàn lên môi trường sinh

thái.

- Tác động lên các vật chất hữu cơ của đất cũng như tính chất vật lí, hóa học và sinh học của đất, bên cạnh đó vi sinh vật bản địa còn duy trì hệ enzyme quan trọng trong đất như: amylase, cellulase, phosphatase, protease, urease…

Theo Kyu (2003) IMO có thể được thu thập bằng nhiều cách khác nhau, trong đó việc dùng gạo nấu chín đặt ở các ngọn đồi, núi, lá bị phân hủy, gốc tre…để mồi các vi sinh vật bản địa chỉ mất 3-5 ngày tùy vào điều kiện nhiệt độ môi trường và thời tiết.

Có thể kết hợp IMO từ nhiều vị trí khác nhau. Việc nuôi cấy IMO có thể tiến hành liên tục và bất kỳ thời điểm nào trong năm. Tuy nhiên vào mùa mưa thì IMO thu được có nhiều vi khuẩn hơn nấm. Có thể tóm tắt quy trình thu thập IMO tạo phân sinh học trong canh tác nông nghiệp của Kyu theo sơ đồ thể hiện ở Hình 2.8.

Công nghệ IMO được ứng dụng trong các trang trại tự nhiên và kết quả quan sát cho thấy có sự cải thiện đáng kể trong cấu trúc đất, sức khoẻ cây trồng. Nuôi trồng với công nghệ IMO là một cách tiếp cận đặc biệt trong canh tác hữu cơ và nó đã được thực hiện ở hơn 30 quốc gia ở quy mô nông hộ và quy mô thương mại (Reddy, 2011).

Hình 2.8 Các bước thu thập IMO từ môi trường đất (Reddy, 2011) (1) Gạo nấu chín để nguội; (2) Giấy bao phủ hộp gỗ chứa cơm; (3) Đặt hộp vào đất và lấp bằng lá mục xung quanh; (4) Sử dụng tấm cao su đậy bên trên vào mùa mưa; (5) Sau 3-5 ngày thu phần cơm chứa mốc (IMO); (6) Trộn IMO với 1 lượng đường tương ứng; (7) Trộn đều, để nơi thoáng mát (IMO); (8) Pha loãng 500 lần rồi trộn với cám gạo đến độ ẩm 50%-60% (IMO3)

2.5.3 Các nghiên cứu và ứng dụng IMO trong và ngoài nước

2.5.3.1 Nghiên cứu và ứng dụng IMO ở các nước

Tại Ấn Độ, Sumathi et al., (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của IMO lên các đặc tính lý, hóa và sinh học đất và các enzyme trong đất. Kết quả cho thấy khi sử dụng IMO đã làm giảm pH của đất từ 7,2 xuống 6,8, trong khi EC đất tăng từ 0,36 lên 1,21 (µS/cm), khả năng giữ nước của đất tăng lên từ 0,36 thành 2,2 mL/g, các kết cấu và thành phần hóa học đất như sét, lân, kali cũng tăng lên một cách đáng kể, đồng thời hoạt động của enzyme protease và urease cũng tăng khi đất được xử lí với IMO. Khi so sánh ảnh hưởng của IMO và phân bón hóa học lên sự tăng trưởng của lá mầm và hàm lượng chlorophyll trong lá cây đậu bắp, đậu đũa và hạt kê, tác giả Sekhar and Gopal (2013) đã cho thấy khi xử lí hạt với IMO giúp hạt nảy mầm sớm hơn và nhanh hơn, đồng thời cây mầm khỏe hơn so với hạt được xử lí bằng phân hóa học và đối chứng không xử lí với IMO. Hàm lượng chlorophyll cao nhất được xác định ở lá của

các cây được xử lí IMO, điều này cũng tương tự với năng suất. Các tác giả đã kết luận rằng ở mức bón IMO với hàm lượng 50 mg/kg đất làm tăng sinh trưởng của cây/lá, hạt nảy mầm sớm hơn, tăng năng suất hạt và tăng hàm lượng chlorophyll trong lá. Ngoài ra tác giả còn ghi nhận số nốt sần ở rễ và kích thước rễ lớn nhất ở các cây được xử lí với IMO.

Tại Hawai, khi áp dụng phương pháp Korea Natural Farming (KNF) trên cây đậu nành, cây ngưu bản, cây hành tây và cây bí ngô, Koon-Hui et al. (2013) cho thấy IMO đã cải thiện được sức khỏe và năng suất cây trồng trong đó hiệu quả tốt nhất là trên cây đậu nành. Mặt dù cây bí ngô không có hiệu quả đáp ứng tốt khi chủng với IMO như cây đậu nành nhưng việc chủng IMO giúp quả có màu xanh hơn. Ngoài ra, các chỉ số về sức khỏe của đất ở lô thí nghiệm trồng đậu nành được cải thiện rất nhiều trong khi ở các nghiệm thức còn lại chỉ số về chất lượng đất không được cải thiện, tuy nhiên, nghiên cứu cũng cho thấy KNF không bảo vệ được cây bí ngô khỏi mầm bệnh và côn trùng gây hại trong mùa mưa.

Tại Malaysia, Illani et al. (2012) đánh giá hiệu quả của việc sử dụng IMO kết hợp nước lên men từ trái cây không bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng khác từ phân hóa học trên 3 loại rau ăn lá cho thấy IMO và EM cho năng suất thấp hơn nghiệm thức bón phân urê và phân compost đồng thời cũng không hiệu quả trong việc làm gia tăng hàm lượng chất chống oxi hóa trong rau. Tuy nhiên các chế phẩm EM và IMO làm tăng hàm lượng N tổng số, K và Mg trong đất.

Tại Philippines, Chiemela et al. (2013a) đã phân lập được 8 dòng vi khuẩn và 3 dòng nấm từ IMO thu ở rừng tre làm cơ sở cho các nghiên cứu tạo phân bón hữu cơ vi sinh. Tác giả cũng cho thấy IMO có hiệu quả trong việc thúc đẩy sự phân hủy nhanh các chất thải nông nghiệp và xác thực vật tạo ra hàm lượng lớn các nguyên tố đa lượng, vi lượng ở dạng dễ hòa tan do đó có thể sử dụng trong sản xuất phân hữu cơ (Chiemela et al., 2013b).

Ở Cameroon, Fotso et al. (2013) cho thấy IMO có hiệu quả trong việc cải thiện năng suất khoai môn Colocassia esculenta và cải tạo sức khỏe của đất, nhưng không hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh hại.

Gần đây, một nghiên cứu khác ở Hawaii đã nghiên cứu sử dụng IMO để đánh giá chức năng kiểm soát bệnh chết nhanh cho các cây Ohia do nhiễm loài nấm gây bệnh Ceratocystis. Kết quả cho thấy những cây chết có thể hồi phục và sống lại, các nhà khoa học còn có kế hoạch giải cứu các khu rừng cây Ohia đang bị nhiễm loài nấm gây bệnh này bằng cách sử dụng IMO (Board of Land and Natural Resources State of Hawaii, 2018).

Theo Reddy (2011) những lợi ích của IMO trong nông nghiệp tự nhiên được người Nhật áp dụng từ lâu và đến nay đã có nhiều nước áp dụng như Mỹ, Ấn Độ, Mông Cổ, Trung Quốc, Malaysia, Thái Lan, Congo, Tanzania, Philippines, Việt Nam,… Ngoài lĩnh vực nông trại nông nghiệp tự nhiên (Natural Farming) IMO còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như: phân bón sinh học (Bio-fertilizer); phân

ủ compost sinh học (Bio-composting); xử lí ô nhiễm đất với độc chất hữu cơ (Bio- remediation); phân hủy sinh học (Bio-degradation) và mỗi lĩnh vực đều đem lại hiệu quả rất tốt (Kumar and Gopal, 2015). Ngoài ra trước đó IMO còn được sử dụng để phân hủy plastic (Victorio et al., 1996) và paraffins phân tử lớn trong nước thải dầu của các động cơ xe (Daisuke et al., 2001).

2.5.3.2 Nghiên cứu và ứng dụng IMO ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong nông nghiệp cũng sớm thu hút được nhiều sự quan tâm, tuy nhiên đa số các tác giả nghiên cứu theo hướng phân lập tuyển chọn các dòng vi khuẩn hoặc nấm hoặc xạ khuẩn có đơn hoặc đa chức năng cố định đạm, hòa tan lân, phân hủy cellulose, tiết IAA... (Phạm Thị Ngọc Lan và Lý Kim Bảng, 2004; Hà Thanh Toàn và ctv., 2008; Phạm Thị Ngọc Lan Và Trần Thị Thanh Nhàn, 2008; Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp, 2011; Lai Quốc Chí và ctv., 2012; Võ Thị Ngọc Cẩm và ctv., 2015) mà có rất ít có công trình nghiên cứu ứng dụng cộng đồng vi sinh vật.

Công trình nghiên cứu ứng dụng IMO đầu tiên được thực hiện chăm sóc cây Cà phê ở Đắk Lak của tác giả Phạm Chí Thành và Y Ka Nin H’ Dok (2002). Trong nghiên cứu này các tác giả đã chỉ ra rằng bón phân vi sinh vật bản địa IMO giúp cải thiện độ phì nhiêu, đặc tính lý, hóa của đất tương đương với nghiệm thức bón phân chuồng. Ngoài ra, IMO có tác dụng cải thiện quần thể vi sinh vật trong đất, tăng số lượng vi sinh vật và nấm hữu ích lên một cách đáng kể so với bón phân chuồng. Bên cạnh đó IMO giúp cây cà phê sinh trưởng, phát triển tốt, tăng tốc độ ra cành, giảm tỷ lệ rụng trái và cho năng suất cao, giảm được lượng phân khoáng hóa học nên thu được lợi nhuận cao cho nông dân. Sau đó năm 2009, Pham Tien Dung và Y Ka Nin H’ Dok đã nghiên cứu sử dụng IMO trong sản xuất cà phê an toàn ở Đắk Lak. Kết quả cho thấy bên cạnh việc cải thiện đặc tính lý, hóa sinh học của đất, khi sử dụng IMO có thể giảm 75% phân bón hóa học trên cây cà phê nhưng vẫn cho năng suất hạt và năng suất trái tương đương với nghiệm thức bón 100% phân hóa học kết hợp với phân chuồng. Điều này mở ra hướng mới cho sản xuất cà phê theo hướng an toàn của vùng Tây Nguyên.

Như vậy, có thể thấy rằng việc tận dụng nguồn vi sinh vật bản địa IMO trong sản xuất nông nghiệp mang lại nhiều lợi ích cho cả con người, sinh vật và môi trường, tuy nhiên ở nước ta cũng như các nước khác nguồn IMO ít được nghiên cứu và ứng dụng đặc biệt là trong sản xuất nông nghiệp hữu cơ. Do IMO chỉ là số ít trong vô số vi sinh vật thu được trong tự nhiên nên thành phần, bản chất, chức năng đối với đất, cây trồng và môi trường sinh thái… chưa có nhiều nghiên cứu và cần được làm sáng tỏ. Vì vậy nghiên cứu thành phần, chức năng của IMO là cần thiết để có thể ứng dụng vi sinh vật bản địa vào sản xuất một cách hiệu quả và an toàn.

2.6 Đa dạng vi sinh vật

2.6.1 Khái niệm đa dạng vi sinh vật và vai trò đa dạng vi sinh vật trong đất

Thuật ngữ đa dạng sinh học đã được xác định theo nhiều cách khác nhau (Garbeva et al., 2004). Theo Harpole (2010) đa dạng sinh học bao gồm đa dạng sinh học ở cả 3 mức độ: đa dạng sinh học trong thành phần loài, đa dạng về số lượng loài và sự đa dạng sinh thái của cộng đồng sinh vật. Thuật ngữ đa dạng thành phần loài bao gồm 2 phần: phần thứ nhất bao gồm tổng số loài hay còn gọi là sự phong phú loài và phần thứ hai là sự phân bố cá thể trong số các loài còn được gọi là tính đồng đều hoặc là tính không ổn định. Tính đồng đều không được biết đến trong các cộng đồng vi khuẩn bởi vì các tế bào riêng lẻ hiếm khi được xác định ở cấp độ loài (Fakruddin and Mannan, 2013). Đối với vi sinh vật, đa dạng vi sinh vật mô tả số lượng các loài và sự phong phú tương đối của chúng trong cộng đồng ở một môi trường sống nhất định. Trong sinh học phân tử, nó có thể được định nghĩa là số lượng, thành phần và trật tự sắp xếp khác nhau của các nucleotic trong ADN của các loài được trích từ cộng đồng trong môi trường (Garbeva et al., 2004).

Mức độ đa dạng của vi sinh vật trong đất được xem là quan trọng đối với việc duy trì sức khỏe và chất lượng của đất vì vi sinh vật đất tham gia nhiều chức năng quan trọng của đất như: hình thành cấu trúc đất, phân hủy chất hữu cơ, loại bỏ độc tố, tham gia vào các chu trình carbon, nitơ, lân và lưu huỳnh, ức chế mầm bệnh hại cây trồng trong đất và thay đổi thảm thực vật trên mặt đất (Melaliani et al., 2012; Elsas and Treevors, 1997; Doran et al., 1996). Hiện nay có sự quan tâm rõ rệt về sự đa dạng của các cộng đồng vi sinh vật có chức năng sinh thái và có khả năng phục hồi các hệ sinh thái đất. Trong đất, mối quan hệ giữa mức độ đa dạng vi sinh vật trong đất với chất lượng của đất và chất lượng cây trồng cũng như tính bền vững của hệ sinh thái đất luôn được quan tâm (Abawi and Widmer, 2000). Bởi vì sự đa dạng các loài vi sinh vật trong cộng đồng vi sinh vật đất có liên quan tới mức độ ổn định của cộng đồng, đa dạng chức năng và giúp gia tăng khả năng chống chịu của đất trước các yếu tố bất lợi của môi trường hoặc các yếu tố khác tác động vào trong đất, giúp dự đoán tốt hơn về chức năng của hệ sinh thái đất, lựa chọn giống cây trồng phù hợp cho từng loại đất cũng như lựa chọn các giải pháp cải tạo đất phù hợp (Fakruddin and Mannan, 2013).

Mặc dù các nhà vi sinh học đã nghiên cứu tác động của sự đa dạng của vi sinh vật đất đến tính ổn định của chức năng hệ sinh thái đất từ những năm 1960 (Hairston et al., 1968), tuy nhiên hiểu biết của con người về đa dạng của vi sinh vật trong đất còn bị giới hạn do những hạn chế về phân loại vi sinh vật và các phương pháp liên quan đến việc nghiên cứu vi sinh vật trong đất (Kirk et al., 2004). Trước khi hiểu biết rõ hơn về sự đa dạng vi sinh vật đất và những thay đổi trong cấu trúc cộng đồng vi sinh vật, rất cần có các phương pháp tin cậy và chính xác để nghiên cứu vi sinh vật đất, đặc biệt là các phương pháp nghiên cứu đa dạng vi sinh vật đất (Kirk et al., 2004).

2.6.2. Phương pháp đánh giá đa dạng vi sinh vật

Trong những thập kỷ qua các phương pháp sử dụng để xác định đa dạng của cộng đồng vi sinh vật trong đất luôn thay đổi từ phương pháp phân lập và nuôi cấy đến phương pháp nuôi cấy tổng thể cộng đồng vi sinh vật mẫu. Bên cạnh đó, những tiến bộ trong hóa học và sinh học phân tử đã mang lại các phương pháp đầy hứa hẹn trong việc ước lượng, đánh giá sự đa dạng vi sinh vật mà không cần phải nuôi cấy, phân lập vi sinh vật (Giovannoni et al., 1990). Các phương pháp để đánh giá sự đa dạng vi sinh vật trong đất có thể được phân loại thành hai nhóm như sau: nhóm các phương pháp sinh lý - sinh hóa và nhóm các phương pháp sinh học phân tử mà trước hết phải kể đến phương pháp truyền thống nhất để đánh giá sự đa dạng của vi sinh vật là nuôi cấy và phân lập vi sinh vật (Fakruddin and Mannan, 2013).

2.6.2.1 Phương pháp truyền thống trong đánh giá đa dạng vi sinh vật

Phương pháp truyền thống là phương pháp tách riêng vi sinh vật từ mẫu hoặc quần thể vi sinh vật ban đầu để thu ở dạng dòng thuần. Phần lớn các phương pháp phân lập vi sinh vật đều dựa trên các kỹ thuật pha loãng và gồm các bước chính gồm: chuẩn bị mẫu, tăng sinh mẫu, pha loãng mẫu, nuôi cấy mẫu lên môi trường đặc trưng, nuôi ủ trong điều kiện thích hợp, kiểm tra và nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng, chọn khuẩn lạc đặc trưng để tạo dòng thuần và kiểm tra dòng thuần (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2003). Trong phương pháp này, có thể kiểm tra số lượng vi sinh vật bằng các phương pháp trực tiếp hoặc gián tiếp. Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv. (2003) xác định số lượng vi sinh vật trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu được áp dụng cho tế bào vi sinh vật kích thước lớn như nấm men, nấm mốc và bào tử nấm. Đối với tế bào vi khuẩn và xạ khuẩn có kích thước nhỏ phải sử dụng buồng đếm Petroff-Hause. Ngoài ra, có thể xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch hoặc bằng phương pháp đo mật độ quang. Khi nghiên cứu hình thái vi sinh vật, phần lớn các vi sinh vật không thể quan sát bằng mắt thường mà phải nhờ đến độ phóng đại của kính hiển vi. Sử dụng kính hiển vi và làm tiêu bản tạm thời để nghiên cứu đặc tính hình thái, sinh lí của vi sinh vật như hình dáng, kích thước, sự di động, hình thành bào tử, sinh sản, nhuộm gram… trên môi trường chuyên biệt (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2003).

Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi sinh vật có ưu điểm là cho kết quả nhanh chóng, dễ thực hiện và ít tốn kém, chính vì vậy mà phương pháp này được sử dụng phổ biến để nghiên cứu quần xã vi sinh vật. Tuy nhiên, việc phân loại và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật dựa trên nuôi cấy và phân lập còn nhiều hạn chế vì các vi sinh vật có kích thước nhỏ bé, dẫn đến sự khó khăn trong phân biệt hình thái của chúng; và vì số lượng vi sinh vật nuôi cấy được là rất thấp, chỉ có khoảng 1% trong tổng số vi sinh vật có trong đất (Amann et al., 1995, Muyzer, 1999) hoặc không quá 5% tổng số vi sinh vật có trong đất (Borneman and Triplett, 1997). Hơn nữa, phương pháp này chỉ phù hợp đối với các vi sinh vật có tốc độ tăng trưởng nhanh và nấm tạo bào tử. Vì thế

khi nghiên cứu phải nắm được đối tượng vi sinh vật để lựa chọn môi trường và phương pháp cho phù hợp (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm sợi,… (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2003).

2.6.2.2 Phương pháp sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng vi sinh vật

Các phương pháp truyền thống dùng để mô tả đặc điểm của quần thể vi sinh vật đất được dựa trên phương pháp phân tích thành phần vi sinh vật có thể nuôi cấy được. Do đó, không thể giải quyết được trong trường hợp nghiên cứu về quần thể vi sinh vật trong tự nhiên và cấu trúc tổng thể của cộng đồng vi sinh vật (Dokić et al., 2010). Các nghiên cứu gần đây đã mô tả tính đa dạng của vi sinh vật dựa vào sự đa dạng di truyền phân tử.

Nghiên cứu loài vi sinh vật bằng sinh học phân tử là một cơ sở tham chiếu nhằm mô tả sự đa dạng vi sinh vật dựa theo trình tự của các gen có thể được sử dụng để xác định và định danh vi sinh vật (Amann et al.,1995). Một số phương pháp phân tử đã được phát triển để nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật bao gồm lai ADN-ADN và lai mARN-ADN, nhân bản và giải trình tự ADN và các phương pháp dựa trên PCR khác như denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), phân tích Spacer Ribosomal Spacer (RISA) và phân tích tự động spaceric spaceric space (ARISA)…(Fakruddin and Mannan, 2013).

2.6.2.3 Phương pháp phân tích đa dạng vi sinh vật dựa vào giải trình tự acid nucleic đoạn gen mã hóa 16S-rRNA

Nghiên cứu so sánh các gen mã hóa ARN ribosom (rRNA) ở vi sinh vật nhân sơ được xem là một công cụ để hỗ trợ phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn được nhiều lựa chọn nghiên cứu hiện nay. Chuỗi trình tự 16S được sử dụng như là một công cụ mạnh mẽ để đánh giá sự đa dạng di truyền của các vi khuẩn ở các mẫu môi trường (Barker et al., 2003). Phương pháp này cơ bản gồm các khâu: (1) Trích ADN tổng số của vi sinh vật; (2) Khuếch đại trình tự đoạn gen mã hóa 16S-rRNA bằng phản ứng PCR (polymerase chain reaction) với các mồi chuyên biệt cho từng nhóm vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn) và kích thước trình tự cần khuếch đại. (3) Kiểm tra kết quả PCR bằng điện di trên gel agarose. Điện di là kỹ thuật bao gồm sự tách các phân tử dựa trên điện tích, kích thước và hình dạng của chúng. Trong trường hợp này kích thước của đoạn ADN sẽ quyết định nồng độ agarose phù hợp. So sánh kích thước sản phẩm PCR với thang chuẩn để nhận diện dòng vi khuẩn (Khuất Hữu Khanh, 2006). (4)Tinh sạch và giải trình tự gen. Để có được độ chính xác cao, sản phẩm PCR trước khi đem giải trình tự cần phải được tinh sạch sau đó mới tiến hành giải trình tự. Có thể giải trình tự bằng phương pháp hóa học hoặc, phương pháp dideoxy có đánh dấu phóng xạ hoặc phương pháp giải trình tự gen tự động. Trong đó giải trình tự gen bằng máy giải trình tự bằng máy tự động là được chọn phổ biến bởi tính tiện lợi của nó (Khuất Hữu Khanh, 2006). (5) Sử dụng các phần mềm phân tích sau khi giải trình tự để phân tích kết quả.

Trong những năm gần đây lượng thông tin liên quan đến ADN được xác định ở các loài sinh vật khác nhau đã được quản lí dưới dạng ngân hàng dữ liệu mà lớn nhất là ở Châu Âu (EMBL) và ở Mỹ (NCBI). BLAST là chương trình cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm ADN hoặc Protein quan tâm có tương cận với đoạn ADN hoặc Protein của VSV nào trong ngân hàng gen hay không. Trong đó BLAST N cho phép ta so sánh cấu trúc chuỗi nucleotide với cấu trúc nucleotide trong ngân hàng dữ liệu (Ken, 2002).

2.6.2.4 Phương pháp điện di theo gradient biến tính (DGGE) và (TGGE)

Trong những năm gần đây các phương pháp sinh học phân tử dựa trên phân tích các acid nucleic được chiết tách từ những mẫu trong môi trường được lựa chọn và áp dụng rộng rãi. So với việc nhân dòng và giải trình tự thì các kỹ thuật này nhanh hơn, ít tốn công sức, thời gian, chi phí thấp nếu nhiều mẫu được phân tích cùng lúc, trong đó có kỹ thuật phản ứng PCR kết hợp điện di có các yếu tố biến tính như chất biến tính (DGGE-denaturant gradient gel electrophoresis) và nhiệt biến tính (TGGE-temperature gradient gel electrophoresis) (Valášková and Baldrian, 2009). Trong điện di gel gradient (DGGE) hoặc điện di gradient nhiệt độ (TGGE) các đoạn ADN có cùng độ dài nhưng với thành phần chuỗi khác nhau có thể được tách ra. ADN được chiết xuất từ các mẫu trong môi trường và khuếch đại sử dụng mồi phổ quát cho PCR nhắm vào một phần của chuỗi 16S hoặc 18S rRNA. Sự thay đổi trình tự trong các đoạn khác nhau sẽ di chuyển và định vị ở các vị trí khác nhau trong gel theo nồng độ của chất biến tính (Muyzer et al., 1996) (Hình 2.9).

Trích ADN mẫu

Vi sinh vật trong mẫu Khuếch đại bằng mồi có gắn kẹp GC

Điện di theo gradient chất biến tính

Mỗi giếng là một hệ vi sinh vật

Vi sinh vật chung giữa các hệ

Nồng độ chất biến tính tăng dần

Những vi sinh vật riêng của hệ

Hình 2.9 Các bước thực hiện phân tích đa dạng hệ vi sinh vật trong DGGE

Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại đoạn gen mong muốn từ những cộng đồng vi sinh vật có mật độ tế bào thấp hoặc phát hiện cả những loài vi sinh vật khó hoặc không thể nuôi cấy được trong điều kiện in vitro (Boon et al., 2002).

DGGE là kỹ thuật sinh học phân tử được công bố lần đầu tiên bởi Fischer and Lerman vào 1983. Phương pháp này dựa trên sự thay đổi và biến đổi về thành phần và trật tự nucleotide trong cấu trúc mạch ADN. Các đoạn ADN giống nhau hoặc khác nhau về kích thước nhưng khác nhau về các biến thể của trình tự (tức là sự khác nhau về hàm lượng GC và sự phân bố) sẽ được phân tách trong sự biến tính của gradient trong gel. Sự phân tách này dựa trên sự giảm tốc độ di chuyển của các sợi ADN đôi có thành phần khác nhau, bị biến tính trong gel polyacrylamide với nồng độ chất biến tính tăng dần (chất biến tính là hỗn hợp urea và formamide), qua đó chúng sẽ dừng lại tại các điểm khác nhau trên gel. Nhằm tăng độ đặc hiệu quá trình phân tách các đoạn ADN có trình tự khác nhau và hạn chế sự biến tính hoàn toàn ADN, đầu cuối 5’ của 1 đoạn ADN mồi được thêm vào trình tự giàu guanine và cytonine (kẹp GC) thông qua một mồi trong phản ứng PCR, thông thường các kẹp GC có độ dài từ 30-50 nucleotide. DGGE đã được sử dụng trong phân tích quần xã vi sinh vật, hoặc chỉ dẫn sự thay đổi của quần thể vi sinh vật, hoặc phát hiện các trình tự ADN không tương đồng (Muyzer et al, 1993; Muyzer, 1999; Muyzer and Smalla, 1998; Valášková and Baldrian, 2009). Về mặt lý thuyết, các trình tự ADN có sự khác biệt chỉ trong một cặp base có thể được phân tách bởi DGGE (Miller et al., 1999). Do đó, DGGE tỏ ra đặc biệt hiệu quả khi sử dụng để phân tích so sánh trình tự gen 16S-rRNA của vi khuẩn. Trình tự 16S- rRNA được sử dụng rộng rãi trong phân loại vi khuẩn. Vùng 16S-rRNA có 9 vùng biến động (ký hiệu từ V1-V9) đã được chứng minh là có mức độ đa dạng trình tự cao giữa các vi khuẩn khác nhau và có thể sử dụng cho phân loại các loài. Ví dụ, vùng V2 và V3 có kích thước khoảng 200 bp có khả năng phân biệt được 110 loại vi khuẩn khác nhau tới mức độ chi. Tuy nhiên, các vùng này thường ngắn và không thể sử dụng duy nhất một vùng biến động để phân biệt được tất cả các loại vi khuẩn (Muyzer, 1999; Chakravorty et al., 2007).

Thông thường vi khuẩn và xạ khuẩn có trình tự vùng V3-V8 được khuếch đại với các cặp mồi chuyên dụng cho PCR-DGGE như cặp mồi 341F-GC/U758 khuếch đại vùng V3–V4 (Phillips et al., 2008), cặp mồi 341F/907-GC khuếch đại vùng V4–V5 (Muyzer et al., 2004), cặp mồi 968F-GC/1378R khuếch đại vùng V6–V8 (Kozdrój and Elsas, 2001), cặp mồi F984-GC/1378R khuếch đại vùng V6–V8 (Gelsomino et al., 2006),… Đối với nấm có thể dựa vào các vùng trình tự gen 18S-rRNA, 28S-rRNA và các vùng ITS (Valášková and Baldrian, 2009). Tuy nhiên khi so sánh giữa vùng 18S rRNA và ITS bằng các cặp mồi chuyên dụng cho PCR_DGGE Liu et al. (2015) đã chỉ ra rằng việc sử dụng mồi ITS1F-GC/ITS2R giúp đánh giá hiệu quả hơn các cặp mồi NS1/GCFung và cặp mồi FF390/FR1-GC trên vùng 18S rRNA của cộng đồng nấm trong cùng mẫu đất. Có nhiều nghiên cứu đã áp dụng cặp mồi ITS1F-GC/ITS2 để khuếch đại và đánh giá vùng ITS (Bougoure and Cairney, 2005; Dung et al., 2016;

Xu-Cong et al., 2017), cặp mồi ITS1/ITS2-GC (Yao et al. (2006), cặp mồi ITS3/ITS4- GC (Arenz et al., 2006), cặp mồi ITS1F/ITS4 nested ITS1F-GC/ITS2 (Anderson et al., 2003) và cặp mồi ITS1/ITS4A nested ITS1/ITS2-GC (Larena et al., 1999; Yao et al., 2006).

TGGE sử dụng nguyên tắc tương tự như DGGE nhưng trong phương pháp này gradient là nhiệt độ thay cho hóa chất biến tính. Ưu điểm của DGGE/TGGE bao gồm độ tin cậy cao, chính xác cao, ít tốn thời gian và chi phí thấp. Vì nhiều mẫu có thể được phân tích đồng thời cùng một lúc và có thể theo dõi những thay đổi trong quần thể vi sinh vật để đáp ứng với các điều kiện môi trường (Muyzer, 1999). Hạn chế của DGGE/TGGE là bị ảnh hưởng bởi phản ứng PCR (Wintzingerode et al., 1997), cần rất nhiều thời gian cho việc xử lý mẫu (Muyzer, 1999) và phụ thuộc vào hiệu quả trích ADN (Theron and Cloete, 2000). Ước tính DGGE chỉ có thể phát hiện 1–2% mật số vi khuẩn đại diện cho các loài ưu thế có trong mẫu môi trường (Mac-Naughton et al., 1999). Ngoài ra, các đoạn ADN có các trình tự khác nhau có thể có các đặc tính di động tương tự trong gel polyacrylamide. Do đó, một band trên gel có thể không đại diện cho một loài (Gelsomino et al., 1999) và một loài vi khuẩn cũng có thể có nhiều band vì trình tự 16S-rRNA có thể khác nhau giữa các cá thể (Niemi et al., 2001).

CHƢƠNG 3

PHƢƠNG TIỆN PHƢƠNG PHÁP

3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ tháng 9 năm 2017 đến tháng 8 năm 2020 tại các Phòng thí nghiệm Vi sinh vật Đất, Hoá học Đất, và nhà lưới thuộc Bộ môn Khoa học Đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. Các thí nghiệm đồng ruộng được thực hiện tại ấp Trường An, xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng.

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Gạo IR50404 5% tấm, đường mía để thu thập và lên men các hệ vi sinh vật bản địa (IMO). Các hệ vi sinh vật bản địa được thu thập từ đất trồng tre, đất ruộng lúa, đất trồng rau xen canh, đất trồng rau muống, mồng tơi, xà lách, ớt, hành tím, dưa hấu, ngò gai, củ lùn, bắp đất trồng màu luân canh, đất trồng bưởi, cam, ổi, mía và đất đồng cỏ,… ở các huyện thuộc tỉnh Sóc Trăng.

Hạt rau muống được sử dụng trong thí nghiệm là hạt rau muống lá tre do công ty Trang Nông sản xuất có độ tinh sạch >97% và tỷ lệ nảy mầm >70%, thời gian thu hoạch 25-30 ngày. Hạt cải xanh được chọn trong thí nghiệm là hạt cải xanh mỡ do công ty Trang Nông sản xuất có độ tinh sạch >98% và tỷ lệ nảy mầm >80%, thời gian thu hoạch là 30-35 ngày.

3.1.3 Dụng cụ, thiết bị và hoá chất

3.1.3.1 Dụng cụ

Rổ nhựa vuông (kích thước 25x15x8 cm), vải mùng, giá đào đất, dây cột, keo thủy tinh (loại 10 kg), chai thuỷ tinh 1 L, chai thuỷ tinh 250 mL cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, micropipette ở các thể tích khác nhau, ống nghiệm, đĩa Petri, đèn cồn, đũa thủy tinh, Eppendorf, các loại đầu pipette…

3.1.3.2 Thiết bị

Thiết bị sử dụng cho đề tài gồm: tủ cấy vô trùng (ESCO, Hoa Kỳ), nồi khử trùng nhiệt ướt (Hirayama, Hoa kỳ), tủ sấy (Memmer, Đức), tủ ủ (Memmer, Đức), cân điện tử (Mettle Toler, Thụy Sĩ), kính hiển vi (Olympus, Nhật Bản), tủ lạnh (Sharp, Nhật Bản), máy đo quang phổ (Thermo Scientific Multiskan Spectrum, Hoa Kỳ), máy ly tâm (Mikro 220R, Đức), máy lắc (GFL 3017 và GFL 3018, Thụy Sĩ), máy PCR (Perkin Elmer 9700, Hoa Kỳ), bộ điện di đứng Dcode (BIORAD, Hoa Kỳ) máy chụp hình gel (BIORAD UV 2000, Hoa Kỳ), máy đo quang phổ hấp thu nguyên tử iCE 3500 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ)...

3.1.3.3 Hoá chất

-) trong rau được trình bày ở Phụ lục 3.

Bộ kit PowerSoil® trích ADN (MOBIO Laboratories, Inc). Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu được trình bày ở Phụ lục 1. Các loại môi trường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật bao gồm môi trường Burks khuyết đạm dùng để nuôi cấy vi sinh vật cố định đạm, môi trường NBRIP nuôi cấy vi sinh vật hoà tan lân, môi trường TSA nuôi cấy vi khuẩn, môi trường PDA nuôi cấy nấm, môi trường Starch nuôi cấy xạ khuẩn, môi trường SS agar nuôi cấy Salmonella và Shigella, môi trường LSB nuôi cấy Coliform, môi trường EC broth nuôi cấy E. coli, thành phần các môi trường nuôi cấy được trình bày ở Phụ lục 2. Các dung dịch đệm buffer phosphate, dung dịch vô cơ mẫu, dung dịch xúc tác vô cơ, thuốc thử acid ascorbic ammonium molybdate, thuốc thử nitroprusside, thuốc thử phenol-nitroprusside, thuốc thử Salkowski, dung dịch hiện màu nitrate (NO3

3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

Nội dung và phương pháp nghiên cứu của luận án được tóm tắt theo sơ đồ được trình bày ở Hình 3.1 với tổng cộng có 6 nội dung nghiên cứu.

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt các nội dung nghiên cứu của luận án

3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự đa dạng các nhóm vi sinh vật trong hệ IMO thu thập

Mục tiêu: nhằm khảo sát mức độ đa dạng về nhóm vi sinh vật gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn, đồng thời kiểm tra sự hiện diện của một số vi khuẩn gây bệnh như Coliform, E. coli, Salmonella, Shigella trong các hệ IMO thu thập từ các hệ thống canh tác cây trồng như: ruộng lúa, rau màu, vườn cây ăn trái, đồng cỏ, bụi tre,…

3.2.1.1 Thu thập nguồn vi sinh vật bản địa IMO

. Việc thu thập các hệ vi sinh vật bản địa IMO được thực hiện theo phương pháp của Kyu and Koyama (1997) (Hình 3.2) và được tóm tắt như sau: Gạo nấu chín để nguội, cân 1.0 kg cho vào rổ nhựa vuông. Dùng vải mùng và dây buộc để bao xung quanh bên ngoài rổ chứa cơm tránh côn trùng chui vào. Dùng leng hay xẻng đào hố đất với chiều sâu 20-30 cm, chiều dài và chiều rộng tương ứng với kích thước của rổ. Đặt rổ vào trong hố đất, phủ lên trên rổ cơm bằng xác lá cây hoặc đất hiện diện tại vị trí đặt mẫu. Sau 3-4 ngày ủ, vi sinh vật phát triển khắp bề mặt cơm, tiến hành thu rổ cơm có chứa vi sinh vật xâm nhiễm cho vào bình thủy tinh có nắp đậy và trộn đều mẫu cơm xâm nhiễm vừa thu thập. Mẫu IMO hỗn hợp được tạo ra bằng cách cân khối lượng bằng nhau (200 g) của tất cả các IMO vừa thu thập được trộn đều cho vào bình thuỷ tinh và trộn đều lại với nhau. Sau đó, cho đường mía (đã đun sôi để nguội) vào trong từng keo thủy tinh chứa mẫu IMO với tỷ lệ 1:1 (w/w) và trộn đều cho đến khi hỗn hợp chuyển thành dạng sánh đặc và đồng nhất. Đậy nắp kín và để yên ở nơi thoáng mát, tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp chiếu vào trong 1 tuần để lên men vi sinh vật chứa trong mẫu cơm vừa thu thập.

Hình 3.2 Tóm tắt quy trình thu mẫu IMO Việc thu các hệ vi sinh vật bản địa IMO trong nghiên cứu này được thực hiện ở 19 mô hình cây trồng khác nhau ở các huyện trong tỉnh Sóc Trăng. Địa điểm thu mẫu được trình bày ở Bảng 3.1. Thu 5 điểm khác nhau ở mỗi vị trí thu mẫu cho mỗi mô hình cây trồng. Đối với điểm thu mẫu là ruộng trồng lúa, ruộng rau, hành tím, ngò, củ lùn, bắp, mía và vườn bưởi, cam, ổi thì 5 vị trí thu mẫu IMO được thu như mô tả trong

Hình 3.3A và riêng đối hệ IMO thu ở bụi tre 5 vị trí thu mẫu được thu như mô tả trong Hình 3.3B.

Hình 3.3 Sơ đồ vị trí thu mẫu các hệ IMO (A: vị trí thu mẫu cho các hệ IMO trong mô hình cây trồng cây ăn trái, rau màu và đồng cỏ và B: vị trí thu mẫu cho hệ IMO trong bụi tre) Bảng 3.1 Vị trí và địa điểm thu 19 hệ vi sinh vật bản địa IMO khu vực tỉnh Sóc Trăng

Ký hiệu mẫu

Loại đất trồng

Địa điểm thu IMO

Đất trồng tre Đất luân canh Đất trồng chuối Đất trồng hành tím Đất trồng xà lách Đất trồng lúa Đất trồng dưa hấu Đất cỏ hoang Đất trồng bắp

Xã Xuân Hoà, huyện Kế Sách Xã Xuân Hoà, huyện Kế Sách Xã Xuân Hoà, huyện Kế Sách Xã Đại Ân II, huyện Cù Lao Dung Phường 8, thành phố Sóc Trăng

TP-1 Xã Phú Tâm, huyện Châu Thành MQ-2 Phường 5, thành phố Sóc Trăng CP-3 Phường 7, thành phố Sóc Trăng HV-4 Xã Vĩnh Phước, huyện Vĩnh Châu Phường 3, thành phố Sóc Trăng RP-5 Thị trấn Mỹ Xuyên, huyện Mỹ Xuyên LM-6 DL-7 Xã Trường Khánh, huyện Long Phú CL-8 Xã Trường Khánh, huyện Long Phú BT-9 Xã Thạnh Trị, huyện Thạnh Trị RM-10 CK-11 BK-12 OK-13 MC-14 MP-15 MT-16 OM-17 CP-18 NM-19 IMO hỗn hợp

Xã An Ninh, huyện Mỹ Tú Phường 7, thành phố Sóc Trăng Xã An Ninh, huyện Mỹ Tú Hỗn hợp của 19 hệ IMO

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Đất trồng rau xen canh Xã Thạnh Quới, huyện Mỹ Xuyên 11 Đất trồng cam 12 Đất trồng bưởi 13 Đất trồng ổi 14 Đất trồng mía 15 Đất trồng rau muống 16 Đất trồng rau mồng tơi Xã Viên Bình, huyện Trần Đề 17 Đất trồng ớt 18 Đất trồng củ lùn 19 Đất trồng ngò gai IMO hỗn hợp 20

3.2.1.2 Khảo sát sự đa dạng của các nhóm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập bằng phương pháp PCR

a) Trích ADN tổng số trong các hệ IMO Việc trích DNA vi sinh vật trong các hệ IMO thu thập được thực hiện theo quy trình trích DNA của bộ kít PowerSoil® trích ADN (MOBIO Laboratories, Inc). Trước tiên, cân 0,5 g mẫu từng hệ IMO cho vào Eppendorf 2 mL chứa hạt thủy tinh dùng để công phá tế bào vi sinh vật, vortex thật đều trong 2 phút. Kiểm tra dung dịch C1 (nếu C1 kết tủa thì tiến hành đun nóng ở 60oC trước khi sử dụng). Cho 60 µL dung dịch C1, vortex nhanh trong 30 giây, đậy chặt nắp Eppendorf chứa mẫu, vortex một lần nữa ở tốc độ cao nhất trong 10 phút. Li tâm ở 10.000 g trong 30 giây ở nhiệt độ phòng.

Chuyển 0,5 mL dung dịch vào Eppendorf 2 mL mới. Cho thêm 0,25 mL dung dịch C2, vortex nhanh, ủ ở 4oC trong tủ lạnh trong 5 phút. Li tâm 10.000 g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Chuyển hết dung dịch bên trên (0,6 mL) qua Eppendorf 2 mL mới. Cho thêm 0,2 mL dung dịch C3, vortex nhanh, ủ ở 4oC trong trong 5 phút. Li tâm 10.000 g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Chuyển 0,75 mL dung dịch vào Eppendorf 2 mL mới. Lắc đều dung dịch C4, hút 1,2 mL C4 vào Eppendorf chứa ADN và vortex trong 5 giây. Cho 0,675 mL dung dịch chứa ADN vào spin filter, li tâm 10.000 g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch đi qua spin filter, tiếp tục lặp lại các thao tác rửa qua spin filter thêm 2 lần nữa. Cho 0,5 mL dung dịch C5 vào spin filter li tâm 10.000 g trong 30 giây ở nhiệt độ phòng và loại bỏ nước. Li tâm 10.000 g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, chuyển spin filter vào ống nhựa 2 mL mới (tránh dung dịch C5 dính vào spin filter). Cho 100 µL C6 trực tiếp vào spin filter. Li tâm 10.000 g trong 30 giây, loại bỏ spin filter và trữ ADN vi sinh vật ở -30oC. Hỗn hợp ADN của các hệ vi sinh vật được bảo quản ở -30oC và sử dụng cho các phản ứng PCR tiếp theo.

b) Phản ứng PCR Sử dụng các cặp mồi 27F/1492R cho phản ứng PCR để khuếch đại 1.500 bp chuỗi 16S-rRNA của vi khuẩn (Lane, 1991), trình tự nucleotide của cặp mồi như sau:

27F: 5’ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’ 1492R: 5’ GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3’ Phản ứng PCR bao gồm (thể tích 20 µL/1 phản ứng): 10 µL Green mastermix (2x); 1 µL mồi xuôi 27F (10 µM); 1 µL mồi ngược 1492R (10 µM); 2 µL ADN tinh sạch được pha loãng 100 lần; 6 µL nước khử khoáng. Khuếch đại gen 16S-rRNA của các dòng vi khuẩn với chu trình nhiệt: biến tính 95oC trong 5 phút, 30 chu kỳ gồm biến tính ở 94oC trong 60 giây, gắn mồi ở 53oC trong 60 giây, kéo dài chuỗi polynucleotic ở 72oC trong 90 giây rồi ổn định chung trong 7 phút ở 72oC (Lane, 1991).

Ngoài ra, cặp mồi ITS1/ITS4 đã được sử dụng cho phản ứng PCR để khuếch đại 675 bp trình tự vùng gen ITS của nấm (Tao et al., 2008) với trình tự nucleotide như sau:

ITS1: 5’-CTT GGT CAT TTA GA GGA AGT AA-3’ ITS4: 5’ -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ Phản ứng PCR bao gồm (thể tích 35 µL/1 phản ứng): 17,5 µL Green mastermix (2x); 2 µL mồi xuôi ITS1 (10 µM); 2 µL mồi ngược ITS4 (10 µM); 2 µL ADN tinh sạch được pha loãng 100 lần; 11,5 µL nước. Khuếch đại vùng gen ITS của quần thể nấm với chu trình nhiệt biến tính 94oC trong 3 phút, 30 chu kỳ gồm biến tính ở 94oC trong 50 giây, gắn mồi ở 56oC trong 50 giây, kéo dài chuỗi polynucleotic ở 72oC trong 60 giây rồi ổn định chung trong 10 phút ở 72oC (Tao et al., 2008).

Cặp mồi 243F/1378R đã được sử dụng cho phản ứng PCR để khuếch đại 1175 bp

chuỗi 16S-rRNA xạ khuẩn (Heuer et al., 1997) có trình tự như sau:

243F: 5’ –GGATGAGCCCGCGGCCTA- 3’ 1378R: 5’-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG- 3’.

Phản ứng PCR bao gồm (thể tích 20 µL/1 phản ứng): 10 µL Green mastermix (2x); 1 µL mồi xuôi 243F (10 µM); 1 µL mồi ngược 1378R (10 µM); 2 µL ADN tinh sạch được pha loãng 100 lần; 6 µL nước khử khoáng. Khuếch đại gen 16S-rRNA của các dòng xạ khuẩn với chu trình nhiệt gồm các giai đoạn biến tính 95oC trong 5 phút, 30 chu kỳ gồm biến tính ở 94oC trong 60 giây, gắn mồi ở 63oC trong 60 giây, kéo dài chuỗi polynucleotic ở 72oC trong 120 giây rồi ổn định chung trong 10 phút ở 72oC (Heuer et al., 1997).

Các đoạn gen sau khi khuếch đại được kiểm tra trên gel agarose 1,5% để kiểm tra

sản phẩm.

c) Điện di kiểm tra sản phẩm PCR Cân 1,5 g agarose cho vào chai thuỷ tinh 250 mL, thêm 100 mL dung dịch TAE 1X. Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng khoảng 1 phút cho agarose hòa tan hoàn toàn. Dung dịch agarose để nguội khoảng 50oC. Sau đó, đổ nhẹ dung dịch vào khuôn đã chuẩn bị sẵn có gắn lược, để khuôn nguội khoảng 30 phút cho gel đặc lại, sau đó, lấy lược ra khỏi khuôn.

Đặt gel vào khay điện di chứa dung dịch đệm TAE (1X) sao cho TAE ngập bề mặt gel. Cho 5 μL thang chuẩn và sản phẩm trích ADN của vi khuẩn vào giếng của gel cùng với loading dye 6X (5 μL). Mở nguồn điện ở 150 V, 500 mA trong 30 phút. Sau khi điện di, gel agarose được nhuộm với ethium bromide (nồng độ 15-20 µL ethium bromide trong 400 mL TAE 1X) trong 20 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra thông qua quan sát sự xuất hiện các band ADN trên gel dưới hệ thống chụp hình gel Logic 1500 Imaging System.

3.2.1.3 Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập bằng phương pháp nested-PCR kết hợp DGGE

a) Sự đa dạng thành phần vi khuẩn trong các hệ IMO Sự đa dạng của thành phần vi khuẩn trong các hệ IMO thu thập được đánh giá dựa trên kết quả điện di có chất biến tính trên gel polyariamine sản phẩm nested-PCR với cặp mồi 27F/1492R và cặp mồi 341F-GC/534R nhằm vào vùng V3 trên gen 16S- rRNA của vi khuẩn (Lane, 1991; Muyzer et al., 1993).

ADN của vi khuẩn vừa được khuếch đại (mục 3.2.1.2) được tiếp tục thực hiện

phản ứng PCR với cặp mồi 341F-GC/534R với trình tự nucleotide như sau: 341F-GC: GC-5’ CCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 534R: 5’- ATTACCGCGGCTGCTGG- 3’

Phản ứng PCR bao gồm (thể tích 35 µL/1 phản ứng): 17,5 µL Green mastermix (5x); 1 µL mồi xuôi 341F-GC (10 µM); 1 µL mồi ngược 534R (10 µM); 2 µL ADN tinh sạch được pha loãng 100 lần; 11,5 µL nước (không có ADN). Khuếch đại vùng V3 của gen 16S-rRNA của các dòng vi khuẩn với chu trình nhiệt như sau: biến tính 95oC trong 5 phút, 30 chu kỳ gồm biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 53oC trong 30 giây, kéo dài chuỗi polynucleotic ở 72oC trong 120 giây rồi ổn định chung trong 10 phút ở 72oC. Các đoạn gen sau khi khuếch đại được kiểm tra trên gel agarose

1,5% ở hiệu điện thế 150 V trong 30 phút, kiểm tra sản phẩm PCR bằng cách so với thang chuẩn 100 bp. Tiếp theo tiến hành điện di biến tính trên gel acrylamide 8% nồng độ chất biến tính urea 40-60%, điện thế 45 V trong 16h, trên máy Biorad Dcode trong môi trường TAE 1X, nhiệt độ 60ºC (Muyzer et al., 1993). Thành phần của PAGE 8% được trình bày trong Bảng 3.2. Bảng 3.2. Thành phần của PAGE 8% với nồng độ chất biến tính 40-60%

Dung dịch

60% 7,2 mL 2,16 mL 2,4 mL 0,24 mL 12 mL 40% 4,8 mL 4,56 mL 2,4 mL 0,24 mL 12 mL Stacking 0 mL 3,32 mL 0,6 mL 0,08 mL 4 mL

Sự đa dạng của thành phần nấm trong các hệ IMO thu thập được đánh giá dựa trên kết quả điện di có chất biến tính trên gel polyariamine sản phẩm nested-PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 và cặp mồi ITS1/ITS4-GC nhằm vào vùng ITS của nấm (Tao et al., 2008).

ADN của nấm vừa được khuếch đại (mục 3.2.1.2) được thực hiện phản ứng

nested-PCR với cặp mồi ITS1/ITS4-GC với trình tự nucleotide như sau:

ITS1: 5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’ ITS4-GC: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ Kẹp GC có trình tự như sau: CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG CACGGGTCCTCCGCTTATTGATATG Thành phần 1 phản ứng PCR (35 µL): 17,5 µL Green mastermix (5X); 1 µL mồi xuôi ITS1 (10 µM); 1 µL mồi ngược ITS4-GC (10 µM); 1 µL ADN tinh sạch được

DS 100% Nước khử khoáng PAGE 40% TAE 50% Tổng Thêm 100 µL APS 10% (Ammonium Persulfate Solution) cho cả 2 ống 60% và 40%, Thêm 7 µL TEMED (N,N,N',N' –tetramethylenediamine) vào ống 60% trộn đều và cho vào cột High. Thêm 7 µL TEMED vào ống 40% trộn đều và cho vào cột Low. Bơm gel vào khuôn, cho 1 mL butanol lên bề mặt đỉnh gel. Để yên ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Tiến hành chuẩn bị dung dịch stacking (Bảng 3.2) và thêm 33 µL APS 10% và 7 µL TEMED vào 4 mL hỗn hợp stacking, trộn đều dung dịch và cho lên trên bề mặt gel, để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Tiến hành hút 30 µL loading dye 2X cho vào tuýp đựng mẫu ADN và trộn đều bằng pipette. Hút 60 µL hỗn hợp ADN và loading dye cho vào giếng trên gel polyacrylamide. Tiến hành điện di trên bộ điện di đứng Dcode (Biorad) trong dung dịch TAE 1X ở nhiệt độ 60oC, hiệu điện thế 45 V trong 16 giờ. Sau khi điện di gel được nhuộm với ethidium bromide trong 30 phút và được chụp hình dưới đèn UV của hệ thống chụp hình Gel Logic 1500 (Kodak). Các sản phẩm PCR có kích thước trình tự, khác nhau bị biến tính trong quá trình điện di. Sự hiện diện của các band ở các vị trí khác nhau thể hiện sự đa dạng của quần thể vi khuẩn trong các hệ IMO thu thập thông qua phân tích bằng phần mềm Gel Compare II. .b) Sự đa dạng thành phần nấm trong IMO

pha loãng 100 lần; 14,5 µL nước (không có ADN). Khuếch đại vùng gen ITS của các dòng nấm với chu trình nhiệt như sau: biến tính 94oC trong 3 phút, 30 chu kỳ gồm biến tính ở 94oC trong 40 giây, gắn mồi ở 57oC trong 40 giây, kéo dài chuỗi polynu ở 72oC trong 60 giây rồi ổn định chung trong 10 phút ở 72oC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% để kiểm tra chất lượng ADN của các mẫu.

Sau đó sản phẩm PCR được điện di biến tính trên gel polyacrylamide 6%, nồng độ urea 50%-70%, điện thế 45V trong 16h, trên máy Biorad Dcode trong môi trường TAE 1X, nhiệt độ 60ºC (Muyzer et al., 1993). Sau khi điện di gel được nhuộm với ethidium bromide trong 30 phút. Gel được chụp hình dưới đèn UV của hệ thống chụp hình Gel Logic 1.500 (Kodak). Các sản phẩm PCR có kích thước trình tự, khác nhau bị biến tính trong quá trình điện di. Sự hiện diện của các band ở các vị trí khác nhau thể hiện sự đa dạng của quần thể nấm trong hệ IMO thu thập.

c) Sự đa dạng thành phần xạ khuẩn trong IMO Sự đa dạng của thành phần xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập được đánh giá dựa trên kết quả điện di có chất biến tính trên gel polyariamine sản phẩm nested-PCR với cặp mồi 243F/1378R và cặp mồi 984F-GC/1378R nhằm vào vùng V6-V8 trên gen 16S-rRNA của xạ khuẩn (Heuer et al., 1997; Muyzer et al., 1997).

ADN của xạ khuẩn vừa được khuếch đại (mục 3.2.1.2) được thực hiện phản ứng

PCR tiếp tục với cặp mồi 341F-GC/534R với trình tự nucleotide như sau:

1378R: 5’-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG- 3’. 984F-GC: GC-5’-AACGCGAAGAACCTTAC- 3’ Kẹp GC có trình tự như sau: 5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGG-3’ Phản ứng PCR bao gồm (thể tích 20 µL/1 phản ứng): 10 µL Green mastermix (2x); 1 µL mồi xuôi 243F (10 µM); 1 µL mồi ngược 1378R (10 µM); 2 µL ADN tinh sạch được pha loãng 100 lần; 6 µL nước khử khoáng. Khuếch đại vùng V6 – V8 của gen 16S-rRNA của các dòng xạ khuẩn với chu trình nhiệt như sau: biến tính 94oC trong 5 phút, 30 chu kỳ gồm biến tính ở 94oC trong 60 giây, gắn mồi ở 53oC trong 60 giây, kéo dài chuỗi polynu ở 72oC trong 120 giây rồi ổn định chung trong 10 phút ở 72oC. Sản phẩm PCR được điện di và kiểm tra trên gel agarose 1,5%. Sau đó, điện di biến tính trên acrylamide gel 6%, nồng độ urea 50-70%, điện thế 45 V trong 16h, trên máy Biorad Dcode trong môi trường TAE 1X, nhiệt độ 60ºC (Muyzer et al., 1993). Sau khi điện di gel được nhuộm với ethidium bromide trong 30 phút. Gel được chụp hình dưới đèn UV của hệ thống chụp hình Gel Logic 1500 (Kodak). Các sản phẩm PCR có kích thước trình tự, khác nhau bị biến tính trong quá trình điện di. Sự hiện diện của các band ở các vị trí thể hiện sự đa dạng của quần thể xạ khuẩn trong các mẫu IMO thu thập.

3.2.1.4 Khảo sát mật số vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập

Cân 10 g mẫu của từng hệ IMO cho vào chai thuỷ tinh 250 mL đã khử trùng và thêm 90 mL nước cất đã khử trùng (2 lần lặp lại cho mỗi hệ IMO tương ứng với 2 chai

thủy tinh). Mẫu được đặt lên trên máy lắc ngang với tốc độ 150 vòng/phút trong 1 giờ, sau khi lắc tiến hành để yên 5 phút. Sau đó tiến hành pha loãng dãy nồng độ khác nhau với độ hòa loãng 10 lần (100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4) trong tủ cấy. Hút 50 µL mẫu (ở độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4) nhỏ lên giữa đĩa thạch chứa các môi trường đã chuẩn bị trước (PDA cho nấm có bổ sung hợp chất kháng khuẩn streptomycin (50 mg.L-1), TSA cho vi khuẩn có bổ sung hợp chất kháng nấm nystatin (50 mg.L-1) và môi trường Starch cho xạ khuẩn có bổ sung chất kháng nấm nystatin (50 mg.L-1). Mỗi nồng độ pha loãng được thực hiện với 4 lần lặp lại tương ứng với 4 đĩa petri. Dùng que thủy tinh tiệt trùng trải đều mẫu trên bề mặt môi trường. Các đĩa petri chứa mẫu được đặt trong tủ ủ 30oC trong 3-7 ngày. Cuối cùng, đếm mật số vi sinh vật hiện diện trên từng môi trường để xác định mật số vi sinh vật cfu.g-1 mẫu. Trên môi trường TSA xác định số lượng khuẩn lạc vi khuẩn, trên môi trường Starch xác định số lượng khuẩn lạc xạ khuẩn và trên môi trường PDA xác định khuẩn lạc nấm. 3.2.1.5 Khảo sát sự hiện diện của một số vi khuẩn gây bệnh (Coliform, E. coli, Salmonella, Shigella) trong các hệ IMO thu thập

Theo Molina et al. (2015) bảo vệ sức khỏe cộng đồng là cần thiết và đã yêu cầu đánh giá kịp thời các vi sinh vật trong thực phẩm, nước uống mà đặc biệt là phân bón sinh học để ngăn chặn sự bùng phát các nhóm vi khuẩn gây bệnh. Trong đó tác giả nhấn mạnh Salmonella, Shigella, Coliform, đặc biệt là Escherichia coli gây bệnh cho con người. Do đó cần có các đánh giá về nhóm vi khuẩn Salmonella, Shigella, Coliform và Escherichia coli trong các mẫu IMO.

Mật số vi khuẩn Coliform và E. coli tổng số trong các hệ IMO thu thập được xác định bằng phương pháp Most Probable Number (MNP) (Trần Linh Thước, 2006). Cách thực hiện như sau: Mười gram mẫu IMO của từng hệ được cho vào trích với 90 mL dung dịch buffer phosphate chứa trong chai thuỷ tinh 250 mL trong thời gian 1 giờ trên máy lắc ngang với tốc độ 150 vòng/phút, sau khi trích mẫu được để yên trong 5 phút. Sau đó, tiến hành pha loãng theo dãy nồng độ khác nhau đến nồng độ 10-5. Mẫu sau khi pha loãng đến nồng độ 10-5, hút 0,4 mL các nồng độ pha loãng cho vào ống nghiệm 20 mL (5 lặp lại cho mỗi nồng độ), mỗi lặp lại chứa sẵn 3,6 mL môi trường LSB có ống durham úp ngược đã qua thanh trùng và không có bọt khí. Các ống nghiệm này được ủ ở nhiệt độ 34,5oC, trong 48 giờ, sau đó quan sát và ghi nhận sự xuất hiện bọt khí trong ống durham và độ đục môi trường của các ống nghiệm. Mẫu không xuất hiện bọt khí hoặc dung dịch nuôi cấy không bị đục chứng tỏ mẫu âm tính với vi khuẩn Coliform và ngược lại mẫu có xuất hiện bọt khí chứng tỏ mẫu dương tính với vi khuẩn Coliform.

Để định tính sự hiện vi khuẩn E. coli trong mẫu, tiến hành hút 0,4 mL các ống nghiệm chứa mẫu thể hiện dương tính với vi khuẩn Coliform cho vào ống nghiệm mới 20 mL chứa 3,6 mL môi trường EC broth có chứa ống durham úp ngược đã được thanh trùng và không có bọt khí. Các ống nghiệm được ủ trong tủ ủ 24 giờ ở nhiệt độ 44,5oC, quan sát và ghi nhận sự xuất hiện bọt khí trong ống durham và các ống nghiệm

có môi trường nuôi cấy bị đục. Các mẫu không xuất hiện bọt khí và môi trường nuôi cấy vẫn trong suốt chứng tỏ mẫu âm tính với E. coli và ngược lại, những mẫu xuất hiện bọt khí chứng tỏ mẫu dương tính với vi khuẩn E. coli. Ghi nhận kết quả số ống có bọt khí, số ống nghiệm xuất hiện bọt khí của mỗi nồng độ pha loãng dùng để xác định mật số vi khuẩn Coliform và E. coli dựa vào phần mềm MNP.

Mật số vi khuẩn Salmonella và Shigella được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Salmonella và Shigella trên đĩa petri chứa môi trường agar chuyên biệt cho Salmonella và Shigella (SS agar) (Taylor and Harris, 1965). Cách thực hiện như sau: Hút 100 µL dung dịch huyền phù vi sinh vật của các hệ IMO được chuẩn bị ở trên trải lên bề mặt đĩa môi trường SS agar (3 lần lặp lại cho mỗi hệ IMO và tương ứng với 3 đĩa petri). Các đĩa agar chứa mẫu được ủ trong tủ cấy ở 37oC và ghi nhận sự xuất hiện của các khuẩn lạc vi khuẩn Salmonella và Shigella sau 3 ngày ủ.

3.2.2 Nội dung 2: Khảo sát và đánh giá một số chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các hệ IMO thu thập

Mục tiêu: nhằm khảo sát, đánh giá các chức năng có lợi cây trồng gồm khả năng

tổng hợp IAA và khả năng cố định đạm của các hệ IMO thu thập.

3.2.2.1 Khảo sát khả năng tổng hợp hormone thực vật IAA của các hệ IMO

Khả năng tổng hợp IAA của các hệ IMO thu thập được xác định theo phương pháp của Brick et al., (1991) và dựa trên nguyên lí so màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 530 nm. IAA do vi sinh vật tiết ra phản ứng với thuốc thử Salkowski cho màu hồng và lượng IAA tiết ra càng cao dẫn đến màu hồng tạo ra càng đậm.

Khả năng tổng hợp IAA của các hệ IMO thu thập được thực hiện trong môi trường NBRIP lỏng có bổ sung 100 mg.L-1 tryptophan. Cách thực hiện như sau: Hút 1 mL dung dịch huyền phù chứa IMO pha loãng 10 lần được chuẩn bị ở mục 3.2.1 cho vào bình tam giác 100 mL chứa sẵn 30 mL môi trường NBRIP lỏng có bổ sung 100 mg.L-1 tryptophan tiệt trùng. Thí nghiệm được thực hiện với 3 lặp lại cho mỗi hệ IMO và tương ứng với 3 bình tam giác. Mẫu được nuôi trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút ở điều kiện tối và nhiệt độ phòng thí nghiệm. Hàm lượng IAA tổng hợp bởi vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy lỏng được xác định vào các thời điểm: 0, 1, 2, 3, 5, và 6 ngày sau khi chủng.

Phương pháp xác định hàm lượng IAA tổng hợp trong môi trường nuôi cấy lỏng bởi vi sinh vật được thực hiện như sau: Hút 1,0 mL dung dịch nuôi vi sinh vật, ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 8 phút. Sau đó hút 500 µL dung dịch trong cho vào cuvet chứa sẵn 1 mL thuốc thử Salkowski đã chuẩn bị sẵn. Để yên 20 phút trong tối cho phản ứng xảy ra hoàn toàn. Đo màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 530 nm. Tính lượng IAA có trong mẫu dựa vào đường chuẩn IAA có nồng độ xác định. Đường chuẩn được thiết lập với nồng độ IAA tăng dần 0, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 mg.L-1. Dựa vào đường chuẩn IAA để tính lượng IAA do vi sinh vật tổng hợp.

3.2.2.2 Khảo sát khả năng cố định đạm của các hệ IMO thu thập

a) Khảo sát sự hiện diện của gen nifH có chức năng cố định đạm trong các hệ

IMO thu thập

ADN của các hệ IMO thu thập đã được ly trích (mục 3.2.1.2) được sử dụng cho phản ứng PCR với cặp mồi polF/polR (Poly et al., 2001a và 2001b). Các primer có trình tự nucleotide như sau:

polF: 5’ -TGC GAY CCS AAR GCB GAC TC-3’ polR: 5’- ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA-3’ Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần cho 1 phản ứng có thể tích 25 µL như sau: 12,5 µL Green mastermix (2x); 1 µL primer polF (10 µM); 1 µL primer polF (10 µM); 2 µL ADN tinh sạch; 8,5 µL nước khử khoáng và được gia nhiệt như sau: biến tính 94oC trong 5 phút, 30 chu kỳ gồm biến tính ở 94oC trong 60 giây, gắn mồi ở 55oC trong 60 giây, kéo dài chuỗi polynucleotic ở 72oC trong 120 giây rồi ổn định chung trong 10 phút ở 72oC. Nhận diện đoạn trình tự gen nifH (~360 bp) được khuếch đại ở vị trí 300-500 bp.

b) Đánh giá khả năng cố định đạm của các hệ IMO thu thập Khả năng cố định đạm của cộng đồng vi sinh vật trong các IMO thu thập được thực hiện trong môi trường chuyên biệt Burks lỏng tiệt trùng. Theo nguyên lý hàm lượng nitơ tổng số trong hệ vi sinh vật được xác định bằng phương pháp vô cơ mẫu, sau đó, cho phản ứng màu với nitroprusside tạo màu xanh sau đó so màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 650 nm (Keeney and Nelson, 1982). Cách thực hiện như sau: Hút 1 mL dung dịch IMO pha loãng 10 lần (mục 3.2.2.1) cho vào bình tam giác 100 mL chứa 50 mL dung dịch môi trường Burks lỏng tiệt trùng. Mẫu được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút trong 5 ngày. Chuyển 1 mL dung dịch nuôi sang bình tam giác chứa dung dịch môi trường Burks mới và được nuôi trên máy lắc. Lặp lại quy trình nuôi cấy thêm một lần nữa (tổng cộng 3 lần). Đây là nguồn vi sinh vật dùng để bố trí thí nghiệm. Hút 0,5 mL dung dịch vi sinh vật ở thế hệ thứ 3 cho vào bình tam giác 100 mL có chứa 14,5 mL môi trường Burks lỏng (không chứa đạm). Nghiệm thức đối chứng âm được thực hiện tương tự nhưng không bổ sung IMO vào và thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại tương ứng với 3 bình tam giác. Mẫu được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút. Tiến hành định lượng hàm lượng đạm tổng số vào các thời điểm 0, 1, 2, 3, 4 và 5 ngày sau khi bố trí thí nghiệm. Phương pháp xác định đạm tổng số (Nts) trong môi trường nuôi cấy lỏng được thực hiện như sau: Cho 5 mL H2SO4 đậm đặc và 1,5 mL dung dịch xúc tác (Phụ lục 3) vào bình tam giác chứa 15 mL dung dịch nuôi vi sinh vật. Các bình tam giác ở các thời điểm thu mẫu được nung ở 200oC trong 3 giờ (quá trình nung kết thúc khi mẫu trong suốt và không tạo khói trắng khi phản ứng với H2O2 30% (nhỏ vài giọt vào). Để mẫu nguội, sau đó, chuyển sang bình định mức 50 mL và định mức lên 50 mL và để ổn định trong 24 giờ. Hút 1 mL mẫu cho vào ống nghiệm 30 mL, thêm 1 mL NaOH 3,6M vào và vortex đều mẫu. Cho thêm 0,5 mL dung dịch A, tiếp tục cho thêm 0,5 mL dung dịch B. Tiến hành

+ theo phương trình x = (y – b)/a.

vortex các ống nghiệm và để ở nhiệt phòng trong khoảng thời gian từ 15-20 phút cho phản ứng tạo màu xảy ra kết thúc hoàn toàn và tiến hành so màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 650 nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD của mẫu tính ra hàm lượng NH4

3.2.3 Nội dung 3: Phân lập, tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn bản địa có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ IMO thu thập

Mục tiêu: nhằm phân lập các dòng vi khuẩn chức năng vừa cố định đạm và vừa

tổng hợp IAA của các hệ IMO thu thập.

3.2.3.1 Phân lập các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm từ các hệ IMO thu thập

Cân 10 gam mẫu từng hệ IMO cho vào chai thuỷ tinh 250 mL có chứa sẵn 90 mL buffer phosphate. Mẫu được lắc đều trên máy lắc ngang tốc độ 150 vòng/phút trong 1 giờ. Sau đó, để ổn định trong 5 phút và tiến hành chuẩn bị dãy nồng độ pha loãng với hệ số hòa loãng 10-1, 10-2, 10-3 và 10-4. Hút 50 µL dịch huyền phù vi khuẩn ở mỗi nồng độ pha loãng trải đều lên các đĩa thạch của môi trường Burks khuyết đạm. Các đĩa petri chứa mẫu được ủ 5-7 ngày ở điều kiện phòng thí nghiệm. Tiến hành quan sát sự xuất hiện các khuẩn lạc của vi khuẩn cố định đạm hiện diện trên bề mặt thạch và chọn các khuẩn lạc có kích thước, hình dạng, màu sắc, độ nỗi, dạng bìa khác nhau để tiến hành tách ròng trên cùng môi trường Burks liên tục trong 5 lần. Các dòng vi khuẩn sau khi tách ròng tiến hành nhân mật số và bảo quản trong glycerol 30% để giữ nguồn vi khuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Mô tả hình thái khuẩn lạc, gram và hình dạng tế bào các dòng vi khuẩn phân lập. Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được mô tả hình thái thông qua các đặc điểm: kích thước (mm), màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Đối với những vi khuẩn có khuẩn lạc nhỏ thì việc mô tả các chỉ tiêu hình thái khuẩn lạc được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi.

Phương pháp mô tả hình dạng tế bào: dùng đầu tăm tre sạch tiệt trùng lấy một khuẩn lạc và trải mỏng lên trên Lame có sẵn giọt nước cất tiệt trùng. Mẫu được đưa qua đèn cồn để cố định tế bào vi khuẩn. Sau đó, một giọt thuốc nhuộm Fuchsin acid 0,5% được nhỏ lên vị trí vi khuẩn cố định, dùng Lamelle đặt lên vị trí vi khuẩn và thuốc nhuộm. Hình dạng tế bào vi khuẩn được quan sát và ghi nhận dưới kính hiển vi quang học.

Gram của vi khuẩn được xác định theo phương pháp của Suslow et al. (1982). Cách thực hiện như sau: nhỏ một giọt dung dịch KOH 3% lên Lame, dùng tăm tre tiệt trùng lấy một phần khuẩn lạc của vi khuẩn, sau đó, trộn đều khuẩn lạc với dung dịch KOH trong vài giây. Vi khuẩn được xác định là gram âm nếu khuẩn lạc vi khuẩn và dung dịch KOH phản ứng tạo sợi chỉ khi tăm tre được đưa lên trên khỏi Lame và vi khuẩn được xem như là gram dương nếu dịch vi khuẩn KOH và tăm tre không hình thành sợi chỉ khi tăm tre được đưa lên khỏi Lame.

3.2.3.2 Khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn bản địa phân lập từ các hệ IMO trong môi trường nuôi cấy lỏng

a) Xác định hàm lượng đạm tổng số (Nts) Một khuẩn lạc vi khuẩn phát triển tốt trên môi trường Burks thạch được chuyển sang bình tam giác 100 mL chứa 50 mL môi trường Burks lỏng không chứa đạm tiệt trùng và được nuôi cấy trong 5 ngày trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút. Tiến hành hút 0,5 mL dịch huyền phù vi khuẩn này vào bình tam giác 100 mL có chứa 14,5 mL môi trường Burks lỏng khuyết đạm tiệt trùng. Mẫu đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn vào. Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại cho mỗi dòng vi khuẩn, tương ứng với 3 bình tam giác. Các bình tam giác chứa mẫu được đặt trên máy lắc tròn ở tốc độ 90 vòng/phút trong tối ở điều kiện phòng thí nghiệm trong 5 ngày. Hàm lượng Nts được xác định sau 0, 1, 2, 3, 4 và 5 ngày nuôi cấy bằng phương pháp vô cơ mẫu và hiện màu nitroprusside được mô tả bởi Keeney and Nelson (1982) (tham khảo ở mục 3.2.2.3).

+) trong môi trường nuôi cấy

b) Xác định hàm lượng đạm hữu dụng (NH4 Việc xác định lượng đạm hữu dụng (NH4

+) được cố định bởi các dòng vi khuẩn phân lập được thực hiện trong môi trường chuyên biệt Burks lỏng khuyết đạm dựa + tạo ra được xác định bằng cách cho phản ứng màu với theo nguyên lý hàm lượng NH4 phenol nitroprusside tạo màu xanh và sau đó được đo trên máy đo quang phổ tại bước sóng 636 nm (Keeney and Nelson, 1982). Thí nghiệm được thực hiện như sau: Hút 0,5 mL dịch huyền phù vi khuẩn được chuẩn bị ở mục 3.2.3.2a cho vào bình tam giác 100 mL chứa 29,5 mL môi trường Burks lỏng (không chứa đạm). Nghiệm thức đối chứng âm được thực hiện tương tự nhưng không bổ sung vi khuẩn. Thí nghiệm được thực hiện với 3 lặp lại, tương ứng với 3 bình tam giác. Các bình tam giác chứa mẫu được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút, trong tối và ở điều kiện phòng + hữu dụng do vi khuẩn cố định thí nghiệm. Tiến hành định lượng hàm lượng NH4 trong môi trường nuôi cấy lỏng vào các thời điểm 0, 1, 2, 3, 4 và 5 ngày sau khi nuôi + hữu dụng trong môi trường nuôi cấy lỏng cấy. Phương pháp định lượng nồng độ NH4 được thực hiện như sau: Hút 1,5 mL dịch vi khuẩn trong các bình tam giác cho vào các Eppendorf 2 mL. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút lần lượt 1 mL dung dịch lỏng đã ly tâm, 4 mL H2O, 5 mL buffer phosphate và 5 mL thuốc thử cho vào ống nghiệm 30 mL. Trộn đều hỗn hợp, để yên trong 20 phút cho phản ứng xảy ra hoàn toàn và tiến hành so màu ở bước sóng 636 nm trên máy đo quang phổ. Từ giá trị OD + hữu dụng do vi khuẩn cố dựa vào phương trình đường chuẩn tính hàm lượng NH4 định đạm tạo ra theo phương trình x = (y – b)/a.

3.2.3.3 Khảo sát sự hiện diện của gen nifH đối với các dòng vi khuẩn phân lập

Chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm thông qua hàm lượng đạm tổng số và đạm h74u dụng cao để kiểm tra sự hiện diện của gen nifH trong cấu trúc di truyền. ADN của từng dòng vi khuẩn phân lập được chọn đã được ly trích bằng bộ kit

PowerSoil MO BIO (tham khảo mục 3.2.1.2), sau đó, dùng cặp mồi polF/polR (Poly et al., 2001a) cho phản ứng PCR để khuếch đại chuỗi mục tiêu có kích thước 360 bp của gen nifH. Thể tích của 25 μL phản ứng PCR bao gồm 12,5 μL Green mastermix (2X), 2 μL polF (10 μM), 2 μL polR (10 μM), 2 μL ADN tinh khiết và 6,5 µL nước khử ion. Các phản ứng được thực hiện như sau: Biến tính ADN ban đầu trong 5 phút ở 94°C, sau đó là 35 chu kỳ biến tính 1 phút ở 94°C, gắn mồi 1 phút ủ 57oC và kéo dài 1 phút ở 72°C. Sự khuếch đại được hoàn thành bởi bước ổn định cuối cùng ở 72°C trong 10 phút.

3.2.3.4 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn cố định đạm tuyển chọn

Các dòng vi khuẩn thể hiện khả năng cố định đạm cao ở mục 3.2.3.2 được tuyển chọn để khảo sát khả năng tổng hợp IAA của chúng dựa vào nguyên lý và phương pháp của Brick et al. (1991). Thí nghiệm được thực hiện như sau: Hút 1 mL dung dịch huyền phù vi sinh vật đã được chuẩn bị giống mục 3.2.3.2 cho vào bình tam giác 100 mL chứa sẵn 49 mL môi trường Burks lỏng có bổ sung 100 mg.L-1 tryptophan với 3 lặp lại cho mỗi dòng vi khuẩn, tương ứng với 3 bình tam giác. Bình tam giác chứa mẫu được nuôi trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút trong tối ở điều kiện phòng thí nghiệm. Hàm lượng IAA được tổng hợp bởi vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng được xác định vào các thời điểm: 0, 2, 4, 6, 8 và 10 ngày nuôi cấy. Phương pháp xác định hàm lượng IAA tổng hợp bởi vi khuẩn tham khảo mục 3.2.2.2.

3.2.3.5 Giải trình tự gen 16S-rRNA của một số dòng vi khuẩn có đồng thời hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn

Các đĩa petri chứa khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn tuyển chọn được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa (Tp. Hồ Chí Minh) bằng phương pháp giải trình tự tự động. Sử dụng chương trình BLAST N để so sánh trình tự ADN của dòng vi khuẩn cần định danh với trình tự ADN trong bộ gen của các loài vi khuẩn có sẵn trong trong cơ sở dữ liệu NCBI. Kết hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào, Gram tế bào và độ tương đồng của dòng vi khuẩn được BLAST để định danh các dòng vi khuẩn. Xác định mối quan hệ di truyền giữa các dòng vi khuẩn đã giải trình tự theo phương pháp UPGMA.

3.2.4 Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và các hệ IMO chứa những dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khả năng nảy mầm và sinh trưởng cây rau trong điều kiện phòng thí nghiệm

Mục tiêu: nhằm đánh giá khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống và cây cải xanh trong điều kiện phòng thí nghiệm của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn và một số hệ IMO chứa các dòng vi khuẩn tuyển chọn.

3.2.4.1 Ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khả năng nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm

a) Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn lên tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống và cải

xanh

- Chuẩn bị nguồn vi khuẩn: Các dòng vi khuẩn tuyển chọn có 2 chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA được nuôi tăng sinh riêng biệt trong bình tam giác 100 mL chứa 50 mL môi trường Tryptone Soya Broth (TSB) trong 3 ngày. Sau đó, tiến hành thu sinh khối vi khuẩn bằng cách chuyển dung dịch vi khuẩn sang Falcon 50 mL, ly tâm 6.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ phần nước bên trên. Tiếp tục cho 20 mL nước khử khoáng tiệt trùng vào, tiến hành ly tâm loại bỏ phần nước bên trên, thu sinh khối vi khuẩn bên dưới, lặp lại 3 lần để loại bỏ hoàn toàn môi trường nuôi cấy. Đối với mỗi dòng vi khuẩn tiến hành hiệu chỉnh dung dịch vi khuẩn về mật số 105, 106, 107, 108 và 109 cfu.mL-1 bằng nước khử khoáng tiệt trùng. Sử dụng phương pháp nhỏ giọt trên môi trường TSA để xác định mật số của vi khuẩn (Hoben and Somasegaran, 1982).

- Bố trí thí nghiệm: Trước tiên, ngâm hạt rau muống hoặc hạt cải xanh trong 30 mL dung dịch huyền phù dòng các vi khuẩn tương ứng với mật số vi khuẩn đã được chuẩn bị trước trong 4 giờ, sau đó chuyển 30 hạt rau vào đĩa Petri chứa sẵn giấy lọc đã tiệt trùng và được làm ướt sẵn với nước cất tiệt trùng. Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng hạt rau chỉ được ngâm với nước cất tiệt trùng thay cho dịch huyền phù vi khuẩn. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại cho mỗi mật số vi khuẩn tương ứng với 3 đĩa petri. Các đĩa petri chứa hạt được để yên ở điều kiện tối của phòng thí nghiệm. Quan sát và ghi nhận số hạt nảy mầm trong trong tổng số 30 hạt thử nghiệm trong thời gian 6 ngày thí nghiệm.

b) Đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn ở mật số vi khuẩn phù hợp nhất lên khả năng kích thích sinh trưởng mầm rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm

- Chuẩn bị nguồn vi khuẩn: tham khảo mục 3.2.4.1a. - Bố trí thí nghiệm: Tiến hành ngâm hạt rau muống và cải xanh trong Falcon 50 mL tiệt trùng chứa 30 mL dung dịch huyền phù các dòng vi khuẩn với mật số tối ưu nhất (kết quả từ mục 3.2.4.1a) trong 4 giờ, sau đó, chuyển 10 hạt vào 10 ống nghiệm 30 mL tiệt trùng chứa 10 mL agar 1% không bổ sung dinh dưỡng. Các ống nghiệm được đậy nắp không kín hoàn toàn và đặt ở vị trí thoáng mát trong điều kiện phòng thí nghiệm trong 10 ngày. Sau đó, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: chiều cao thân (được đo từ gốc đến chóp lá cao nhất), chiều dài rễ (được đo từ gốc đến chóp rễ dài nhất) và sinh khối tươi.

3.2.4.2 Ảnh hưởng của một số hệ IMO tuyển chọn lên khả năng nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm

a) Ảnh hưởng của các nồng độ pha loãng của IMO lên tỷ lệ nảy mầm của hạt rau

muống và cải xanh

Các hệ IMO tuyển chọn tiến hành pha loãng với nước cất tiệt trùng thành dãy các nồng độ pha loãng khác nhau gồm 50, 100, 300, 500, 700 và 1000 lần với thể tích của từng nồng độ pha loãng là 100 mL. Ngâm hạt rau trong 50 mL dung dịch IMO ở các nồng độ pha loãng khác nhau, sau đó chuyển 30 hạt vào đĩa Petri chứa sẵn giấy lọc đã tiệt trùng và được làm ẩm với nước cất tiệt trùng. Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng hạt rau chỉ được ngâm với nước cất tiệt trùng thay cho dịch IMO pha loãng. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại cho mỗi nồng độ pha loãng và tương ứng với 3 đĩa petri. Các đĩa petri chứa hạt rau được đặt ở điều kiện tối trong phòng thí nghiệm. Quan sát và ghi nhận số hạt nảy mầm trong trong tổng số 30 hạt thử nghiệm trong thời gian 6 ngày thí nghiệm.

b) Đánh giá hiệu quả của các hệ IMO tuyển chọn ở nồng độ pha loãng phù hợp nhất lên khả năng kích thích sinh trưởng mầm rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành cùng lúc với thí nghiệm đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn ở mật số vi khuẩn phù hợp nhất lên khả năng kích thích sinh trưởng mầm rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm ở mục 3.2.4.1b. các bước thực hiện tham khảo tại mục 3.2.4.1b.

3.2.5 Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn và 5 hệ IMO chứa những dòng vi khuẩn tuyển chọn lên sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới

Mục tiêu: nhằm đánh giá hiệu quả của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn và hệ IMO chứa các dòng vi khuẩn tuyển chọn này lên sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới.

3.2.5.1 Chuẩn bị đất thí nghiệm

Đất thí nghiệm được thu thập từ đất canh tác rau chuyên canh tần đất mặt (0-30 cm) tại xã Tài Văn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng. Thông tin về các đặc tính đất thí nghiệm đầu vụ được trình bày trong Bảng 3.3.

-), amonium (NH4

Đất sau khi thu được trộn đều với nhau thành một mẫu lớn. Sau đó cho 6 kg đất (khối lượng khô kiệt) vào các chậu nhựa (kích thước 30 cm (cao) x 30 cm (đường kính). Đất được làm tơi bề mặt trước khi gieo hạt. Ngoài ra, mẫu đất cũng được phân tích một số chỉ tiêu về lý, hóa và sinh học đất gồm pH, EC, chất hữu cơ (CHC), nitrate +), đạm tổng số (Nts), lân tổng số (Pts), kali tổng số (Kts), mật số (NO3 vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong đất. Kết quả phân tích cho thấy đất có thành phần phù hợp để tiến hành các thí nghiệm trồng rau trong nhà lưới.

Bảng 3.3 Một số đặc tính đất thí nghiệm trong nhà lưới

Các chỉ tiêu

- (mg/kg) + (mg/kg)

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

pH EC (mS/cm) CHC (%) NO3 NH4 Nts (%) Pts (%P2O5) Kts (%K2O) Vi khuẩn (106 cfu.g-1) Nấm (102 cfu.g-1) Xạ khuẩn (104 cfu.g-1)

Giá trị 6,12 0,195 1,81 3,01 8,84 0,105 0,098 1,21 1,53 17,0 2,33

Thời gian sinh trưởng Ngày thu hoạch Ngày gieo

Thí nghiệm nhà lưới được thực hiện liên tục qua 3 và 2 vụ trên cùng một nền đất thí nghiệm cho lần lượt cây rau muống và cải xanh. Thông tin về thời gian bố trí các thí nghiệm nhà lưới được trình bày trong Bảng 3.4. Bảng 3.4 Thời gian bố trí các thí nghiệm rau muống và cải xanh trong nhà lưới Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ Rau muống Vụ 1 Vụ 2 Vụ 3 Cải xanh Vụ 1 Vụ 2

3.2.5.2 Chuẩn bị nguồn vi sinh vật

a) Chuẩn bị nguồn vi khuẩn: tham khảo mục 3.2.4.1a cho chuẩn bị dung dịch

huyền phù vi khuẩn để chủng vào trong hạt giống.

b) Chuẩn bị nguồn IMO: tham khảo mục 3.2.4.2a để chuẩn bị dung dịch huyền

phù IMO để chủng vào trong hạt giống.

c) Cách chủng vi khuẩn vào xỉ than để chủng vào trong đất: Cách chủng vi khuẩn vào trong xỉ than theo phương pháp của Nguyễn Khởi Nghĩa và ctv. (2015) được thực hiện như sau: xỉ than tổ ong (phế phẩm được nghiền nhỏ qua rây kích thước 2 x 2 mm đã tiệt trùng) được xác định ẩm độ, sau đó, 50 g xỉ than được cho vào bình tam giác có thể tích 250 mL chứa 100 mL môi trường Burks, đồng thời, bổ sung 2 mL dung dịch vi khuẩn đã được chuẩn bị trước (mục 3.2.4.1a), tuy nhiên hiệu chỉnh độ đục của dung dịch chứa vi khuẩn với nước khử khoáng tiệt trùng bằng máy đo quang phổ về OD 600 nm = 1,2 (tương đương 1011 cfu.mL-1). Bình tam giác chứa mẫu được lắc trên máy mắc tròn với tốc độ 100 vòng/phút trong 24 giờ ở điều kiện phòng thí nghiệm. Cuối cùng, thu xỉ than chứa vi khuẩn với mật số cuối cùng của từng dòng vi khuẩn đạt 1011 cfu.g-1.

23/08/2019 11/10/2019 14/12/2019 10/02/2020 04/04/2020 26/07/2019 13/09/2019 16/11/2019 05/01/2020 04/03/2020 27 ngày 28 ngày 28 ngày 35 ngày 33 ngày

d) Cách chủng IMO vào trong xỉ than để chủng vào trong đất: thực hiện tương tự

mục 3.2.5.2c tuy nhiên cho 60 ml dung dịch IMO pha loãng 5 lần với nước

3.2.5.3 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí trong chậu tại nhà lưới (không có nóc lưới) Bộ môn Khoa học Đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại gồm 24 nghiệm thức cho rau muống và 26 nghiệm thức cho cải xanh. Mỗi lặp lại tương ứng với 1 chậu thí nghiệm. Mỗi chậu thí nghiệm chứa 6 kg đất trồng rau (tính theo trọng lượng khô) đã được chuẩn bị trước. Bảy ngày trước khi gieo hạt tiến hành chủng vi khuẩn vào trong đất qua chất mang xỉ than theo từng nghiệm thức vào trong đất thí nghiệm để đạt mật số 106 cfu.g-1 đất khô đối với rau muống và 107 cfu.g-1 đối với cải xanh, riêng các hệ IMO được chủng vào đất với nồng độ pha loãng 1000 lần cho cả rau muống và cải xanh. Việc chủng vi khuẩn và hệ IMO vào trong đất qua chất mang xỉ than được thực hiện một lần duy nhất vào thời điểm 3-5 ngày trước khi gieo hạt giống vào chậu bằng cách trộn đều 50 g (khối lượng khô kiệt) xỉ than chứa vi khuẩn theo từng nghiệm thức trên bề mặt đất (tương ứng 1% khối lượng đất khô trong chậu). Các nghiệm thức thí nghiệm cho cả 2 loại rau gồm rau muống và cải xanh được liệt kê và trình bày trong Bảng 3.5 và Bảng 3.6. Sau khi thu hoạch rau, đất trong chậu được để phơi tự nhiên 1 tuần sau đó tiến hành chủng vi khuẩn, bón phân và gieo hạt cho vụ kế tiếp. Bảng 3.5 Các nghiệm thức thí nghiệm cho cây rau muống được bố trí trong nhà lưới STT Nghiệm thức

Nội dung nghiệm thức

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 NT1 NT2 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 NT11 NT12 NT13 NT14 NT15 NT16 NT17 NT18 NT19 NT20 NT21 NT22 NT23 NT24 NT25 NT26 Đối chứng âm (không bón phân và không chủng vi sinh vật) Đối chứng 100N-48P2O5-24K2O 75N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn TP-1.3 75N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn TP-1.4 75N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn MQ-2.5 75N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn OM-17.5 75N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn MT16.5 75N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn 75N-48P2O5-24K2O + IMO Củ lùn 75N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 75N-48P2O5-24K2O + IMO Ớt 75N-48P2O5-24K2O + IMO Tre 75N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp IMO 50N-48P2O5-100K2O + vi khuẩn TP-1.3 50N-48P2O5-100K2O + vi khuẩn TP-1.4 50N-48P2O5-100K2O + vi khuẩn MQ-2.5 50N-48P2O5-100K2O + vi khuẩn OM-17.5 50N-48P2O5-100K2O + vi khuẩn MT16.5 50N-48P2O5-100K2O + hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn 50N-48P2O5-100K2O + IMO Củ lùn 50N-48P2O5-100K2O + IMO Mồng tơi 50N-48P2O5-100K2O + IMO Ớt 50N-48P2O5-100K2O + IMO Tre 50N-48P2O5-100K2O + hỗn hợp IMO

Bảng 3.6 Các nghiệm thức thí nghiệm cho cây cải xanh được bố trí trong nhà lưới STT Nghiệm thức

Nội dung nghiệm thức

Hạt rau được ngâm với dung dịch huyền phù vi khuẩn với mật số 106 cfu.mL-1 cho hạt rau muống và 107 cfu.mL-1 cho hạt cải xanh. Riêng nghiệm thức chủng các hệ IMO, hạt được ngâm trong dung dịch IMO pha loãng ở nồng độ 1.000 lần trong 4 giờ, sau đó hạt được gieo trực tiếp vào chậu với mật độ 30 hạt/chậu. Sau khi cây con phát triển được 5 ngày tiến hành tỉa và giữ lại còn 10 cây/chậu đối với rau muống và 5 cây/chậu đối với cải xanh. Vào các thời điểm 7, 14 và 21 ngày sau khi gieo hạt tiến hành chủng tiếp vi khuẩn và IMO vào đất bằng cách tưới dung dịch vi khuẩn và IMO theo nghiệm thức, mật số và nồng độ pha loãng phù hợp cho từng loại rau. Phân bón hóa học cho cây rau muống và cải xanh được bón lần lượt theo công thức 100N- 48P2O5-24K2O và 70N-48P2O5-24K2O (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2011; Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2019). Lịch bón phân và thành phần mỗi đợt bón cụ thể cho cây rau muống và cải xanh được trình bày trong Bảng 3.7.

Cỏ dại và sâu hại được quản lý thường xuyên bằng phương pháp cơ học. Sử dụng thuốc trừ sâu sinh học để phòng trị rầy mềm hại cải (Phụ lục 11). Thí nghiệm được kéo dài trong khoảng từ 27-30 ngày cho cây rau muống và 30-35 ngày cho cây cải xanh.

Hai tuần sau khi thu hoạch rau, đất trong chậu được làm tơi xốp và chuẩn bị cho các vụ rau tiếp theo. Cách tiến hành bố trí các vụ rau tiếp theo được thực hiện tương tự như nội dung được trình bày ở trên.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 NT11 NT12 NT13 NT14 NT15 NT16 NT17 NT18 NT19 NT20 NT21 NT22 NT23 NT24 NT25 NT26 Đối chứng âm (không bón phân và không chủng vi sinh vật) Đối chứng 70N-48P2O5-24K2O Đối chứng 52,5N-48P2O5-24K2O Đối chứng 35N-48P2O5-100K2O 52,5N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn TP-1.3 52,5N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn TP-1.4 52,5N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn MQ-2.5 52,5N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn OM-17.5 52,5N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn MT16.5 52,5N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn 52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Củ lùn 52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Ớt 52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Tre 52,5N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp IMO 35N-48P2O5-100K2O + vi khuẩn TP-1.3 35N-48P2O5-100K2O + vi khuẩn TP-1.4 35N-48P2O5-100K2O + vi khuẩn MQ-2.5 35N-48P2O5-100K2O + vi khuẩn OM-17.5 35N-48P2O5-100K2O + vi khuẩn MT16.5 35N-48P2O5-100K2O + hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn 35N-48P2O5-100K2O + IMO Củ lùn 35N-48P2O5-100K2O + IMO Mồng tơi 35N-48P2O5-100K2O + IMO Ớt 35N-48P2O5-100K2O + IMO Tre 35N-48P2O5-100K2O + hỗn hợp IMO

Bảng 3.7 Lịch bón phân cho cây rau muống và cây cải xanh được bố trí trong nhà lưới

Loại phân bón Công thức kg/ha

100/75/50 48 24 Bón lần 1 (3NTKG) (%) 20 100 50 Bón lần 2 (10NSKG) (%) 30 0 20 Bón lần 3 (20NSKG) (%) 30 0 20 Bón lần 4 (25NSKG) (%) 20 0 10

P2O5

K2O

Rau muống N P2O5 K2O Cải xanh

3.2.5.4 Các chỉ tiêu theo dõi

a) Các chỉ tiêu về sinh trưởng và năng suất cây rau: Ghi nhận và phân tích các chỉ tiêu về sinh trưởng của cây như: chiều cao cây, số lá, đường kính thân đối với cây rau muống và chiều cao thân, số lá, chiều dài lá, chiều rộng lá đối với cây cải xanh vào thời điểm thu hoạch rau, trọng lượng tươi/chậu vào thời điểm kết thúc thí nghiệm. ở tại thời điểm thu mẫu, mỗi chậu thí nghiệm được chọn ra 5 cây ngẫu nhiên, và trên mỗi cây chọn 1 lá tẻ để đo đạc các chỉ tiêu nông học). Hàm lượng chlorophyll tổng tố tương đối trong lá rau ở thời điểm thu hoạch bằng máy đo Chlorophyll CCI 200 plus (đơn vị CCI). Đối với chỉ tiêu chỉ tiêu về năng suất rau được tính bằng tổng khối lượng tươi của rau trên chậu.

b) Chỉ tiêu về vi khuẩn gây bệnh đường ruột ở người có trên rau: vi khuẩn gây bệnh E. coli, Coliform, Salmonella, Shigella trong rau cũng được kiểm tra vào thời điểm kết thúc thí nghiệm theo phương pháp đếm mật số MNP của Trần Linh Thước (2006) và phương pháp đếm mật số khuẩn lạc trên môi trường SS agar của Taylor and Harriss (1965).

70/52,5/35 48 24 20 100 50 30 0 20 30 0 20

3.2.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn và 2 hệ IMO tuyển chọn lên sinh trưởng, năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện ngoài đồng

Mục tiêu: nhằm đánh giá hiệu quả của một số dòng vi khuẩn có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA và hệ IMO tuyển chọn lên sinh trưởng, năng suất của rau muống, cải xanh ở điều kiện thực tế ngoài đồng.

3.2.6.1 Chuẩn bị nguồn vi sinh vật

a) Chuẩn bị nguồn vi khuẩn: tham khảo mục 3.2.4.1a cho việc chuẩn bị dung

dịch huyền phù vi khuẩn để chủng vào trong hạt giống.

b) Chuẩn bị nguồn IMO: tham khảo mục 3.2.4.2a cho việc chuẩn bị dung dịch

huyền phù IMO để chủng vào trong hạt giống.

c) Cách chủng vi khuẩn vào xỉ than để chủng vào trong đất: tham khảo mục

3.2.5.2c cho công việc chủng vi khuẩn vào trong xỉ than để bón vào đất.

d) Cách chủng IMO vào trong xỉ than để chủng vào trong đất: tham khảo mục

3.2.5.2d cho công việc chủng IMO vào trong xỉ than để bón vào đất.

3.2.6.2 Chuẩn bị đất thí nghiệm

Đất được cuốc và lên luống với diện tích 7,5 m2 (1,5 m x 5 m) cho mỗi lô thí nghiệm và chiều cao mặt liếp so với mặt đất là 30 cm, khoảng cách giữa 2 lô thí nghiệm là 0,5 m và khoảng cách giữa 2 khối là 0,5 m. Sau đó, đất mặt được làm nhuyễn, làm tơi xốp và làm sạch cỏ trước khi bố trí thí nghiệm.

3.2.6.3 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm ngoài đồng được tiến hành tại xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng. Đặc tính của đất thí nghiệm được trình bày trong Bảng 3.8. Thí nghiệm được thực hiện liên tục trong 2 vụ trên cùng 1 nền đất. Bảng 3.8 Một số đặc tính đất trước khi bố trí thí nghiệm ngoài đồng tại xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng

Các chỉ tiêu

- (mg/kg) + (mg/kg)

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Giá trị 5,88 1,45 1,90 1,96 8,12 0,101 1,68 6,47 3,10 14,2 2,84

pH EC (mS/cm) CHC (%) NO3 NH4 Nts (%) Pts (%P2O5) Kts (%K2O) Vi khuẩn (106 cfu.g-1) Nấm (102 cfu.g-1) Xạ khuẩn (104 cfu.g-1)

Ngày thu hoạch Ngày gieo

Thông tin về thời gian bố trí thí nghiệm các vụ rau muống và cải xanh được trình bày trong Bảng 3.9. Hạt giống rau muống và cải xanh được ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn ở mật số lần lượt 106 cfu.mL-1 và 107 cfu.mL-1 và hệ IMO với nồng độ pha loãng 500 lần trong 4 giờ. Sau đó, hạt được giao trực tiếp vào đất với mật độ gieo sạ 12 kg giống/1.000 m2 đối với cây rau muống và 500 g giống/1.000 m2 đối với cải xanh. Bảng 3.9 Thông tin về thời gian bố trí các thí nghiệm rau muống và cải xanh ngoài đồng tại xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng (04/2020-07/2020) Thời gian sinh trưởng Rau muống Vụ 1 Vụ 2 Cải xanh Vụ 1 Vụ 2

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối với 9 nghiệm thức và 3 lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Thông tin về các nghiệm thức thí nghiệm và sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng được trình bày lần lượt ở Bảng 3.10 và Hình 3.4.

27/05/2020 18/07/2020 27/05/2020 25/07/2020 27/04/2020 23/06/2020 27/04/2020 23/06/2020 30 ngày 26 ngày 30 ngày 33 ngày

Bảng 3.10 Thông tin chi tiết về các nghiệm thức thí nghiệm ngoài đồng cho cây rau muống và cây cải xanh

STT Nghiệm thức Nội dung nghiệm thức Rau muống

1 2 3 4 5 6 7 8 9 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 Cải xanh

1 2 3 4 5 6 7 8 9 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 Đối chứng 100N- 48P2O5-24K2O Đối chứng 75N-48P2O5-24K2O 75N-48P2O5-24K2O + chế phẩm sinh học EMpb 75N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn TP-1.3 75N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn TP-1.4 75N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn MQ-2.5 75N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn 75N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 75N-48P2O5-24K2O + IMO Tre Đối chứng 70N- 48P2O5-24K2O Đối chứng 52,5N-48P2O5-24K2O 52,5N-48P2O5-24K2O + chế phẩm sinh học EMpb 52,5N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn TP-1.3 52,5N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn TP-1.4 52,5N-48P2O5-24K2O + vi khuẩn MQ-2.5 52,5N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn 52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Tre

18 m

5,0 m

NT 3 NT5 NT2 1,5 m

NT2 NT8 NT5

NT8 NT5 NT7

NT9 NT7 NT9 20 m NT4 NT6 NT1

NT3 NT1 NT2

NT7 NT9 NT8

NT6 NT4 NT6

Lặp lại 1 Lặp lại 2 Lặp lại 3

NT1 NT3 NT4

Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng tại xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng (từ tháng 04 đến tháng 07 năm 2020)

Chế phẩm sinh học EMpb gốc của công ty TNHH Trung tâm Chế phẩm Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh được sử dụng như nghiệm thức vi sinh đối chứng. Thành phần vi sinh của chế phẩm sinh học này chứa nhóm vi khuẩn cố định đạm. Liều lượng

sử dụng theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Thông tin về chế phẩm sinh học này được trình bày ở Phụ lục 4.

Vi khuẩn và IMO được cố định trước trong xỉ than (mục 3.2.6.1c và mục 3.2.6.1d), sau đó được chủng vào đất ở thời điểm 3 ngày trước khi bố trí thí nghiệm với lượng 40 kg cho 1.000 m2 để đạt mật số 106 cfu.g-1 đất và 107 cfu.g-1 đất cho lần lượt rau muống và cải xanh.

Dung dịch vi khuẩn với nồng độ 106 cfu.mL-1 đối với cây rau muống và 107 cfu.mL-1 đối với cải xanh và dung dịch IMO được pha loãng ở nồng độ 500 lần được tưới vào đất theo từng nghiệm thức tương ứng vào các thời điểm 7, 14 và 21 ngày sau khi gieo hạt.

Phân bón hóa học cho cây rau muống và cải xanh được bón lần lượt theo công thức 100N-48P2O5-24K2O kg/ha và 70N-48P2O5-24K2O kg/ha (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2011; Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2019). Lịch bón phân và thành phần mỗi đợt bón cụ thể cho cây rau muống và cải xanh được trình bày trong Bảng 3.11. Bảng 3.11 Lịch bón phân cho cây rau muống và cải xanh trong thí nghiệm ngoài đồng tại xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng (04/2020-07/2020)

Loại phân bón Công thức kg/ha

100/75 48 Bón lần 1 (3NTKG) (%) 0 100 Bón lần 2 (10NSKG) (%) 50 0 Bón lần 3 (15NSKG) (%) 30 0 Bón lần 4 (20NSKG) (%) 20 0

24 50 20 20 10 Rau muống N P2O5 K2O

Cải xanh

N 70/52,5 0 50 30 20

48 100 0 0 0 P2O5

24 50 20 20 10

3.2.6.4 Chỉ tiêu theo dõi

a) Chỉ tiêu về sinh trưởng cây rau: Ghi nhận và phân tích các chỉ tiêu về sinh trưởng của cây rau gồm chiều cao cây, số lá, đường kính thân đối với cây rau muống và chiều cao cây, số lá, chiều dài lá, chiều rộng lá đối với cây cải xanh vào thời điểm thu hoạch rau và hàm lượng chlorophyll tương đối trong lá rau được thu ở thời điểm thu hoạch được xác định bằng máy đo Chlorophyll CCI 200 plus (đơn vị CCI).

b) Chỉ tiêu về năng suất rau: vào thời điểm thu hoạch, ở mỗi lô thí nghiệm tiến hành thu hoạch 3 vị trí (Hình 3.5) và mỗi vị trí có tổng diện tích là 0,25 m2 (0,5 m x 0,5 m) thu hoạch phần rau trên mặt đất trong khung nhựa đã thiết kế tại mỗi vị trí trong

K2O Quản lý cỏ dại và sâu hại trong suốt thời gian thí nghiệm bằng biện pháp cơ học và sử dụng thuốc sâu sinh học để phòng trừ sâu và rầy mềm (tham khảo Phụ lục 11 và Phụ lục 13 cho các loại thuốc sinh học sử dụng đề phòng trị sâu hại). Tiến hành thu hoạch rau muống và cải xanh lần lượt sau 25-30 ngày và 30-35 ngày sau khi gieo hạt.

lô. Trước khi tiến hành thu sinh khối rau tươi tại mỗi vị trí đo đạc các chỉ tiêu nông học của 4 cây rau theo hình vuông bên trong khung nhựa. Cân khối lượng rau tươi (KLRT) thu được tại 3 vị trí.

Khối lượng rau tươi trung bình trong mỗi 0,25 m2 = (KLRTở vị trí 1 + KLRTở vị trí 2

+ KLRTở vị trí 3)/3

5 m

Hình 3.5 Vị trí thu mẫu để xác định năng suất rau muống và cải xanh trên mỗi

lô thí nghiệm

c) Chỉ tiêu về chất lượng của rau: Hàm lượng NO3

- và N tổng số trong thân lá được phân tích vào thời điểm thu hoạch. Ngoài ra, các chỉ tiêu về vi khuẩn gây bệnh E. coli, Coliform, Salmonella và Shigella trên rau cũng được kiểm tra và đánh giá.

- Hàm lượng nitrate (NO3

-) trong rau: được phân tích bằng phương pháp trích với nước cất và hiện màu với dung dịch thuốc thử C (tham khảo thành phần dung dịch tại phụ lục 3), sau đó đem so màu trên máy hấp thu quang phổ ở bước sóng 540 nm. Quy trình thực hiện như sau: mẫu rau sau khi thu hoạch được rửa sạch dưới vòi nước để loại bỏ đất và bụi bám trên bề mặt lá và thân cây, sau đó rửa sạch lại bằng nước khử khoáng. Mẫu được cắt nhỏ, trộn đều mẫu và nghiền nhỏ bằng máy nghiền thực vật tươi. Cân 10 g mẫu sau khi nghiền cho vào Falcon 50 mL, thêm nước khử khoáng đến 50 mL. Chưng cách thuỷ ở 100oC trong 10 phút và để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Ly tâm loại bỏ sinh khối, dung dịch còn lại được lọc qua giấy lọc Whatman kích thước 20 μm. Dung dịch sau khi lọc cho phản ứng qua đêm với dung dịch C (Phụ lục 3) và sau đó đem so màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 540 nm.

- Hàm lượng đạm tổng số (Nts) trong sinh khối rau: được xác định bằng phương pháp vô cơ mẫu và chưng Kjeldahl sau đó chuẩn độ bằng H3BO3 2% có chỉ thị màu. Quy trình được thực hiện như sau: Mẫu rau sau khi thu hoạch được rửa sạch bằng nước thường để loại bỏ đất và bụi bám trên bề mặt lá và rễ cây, sau đó rửa sạch lại bằng nước khử khoáng. Mẫu sau khi rửa sạch được cho vào túi giấy sạch và được sấy ở nhiệt độ 65oC trong 48 giờ trong tủ sấy. Mẫu sau khi sấy khô sẽ được nghiền mịn bằng máy nghiền mẫu thực vật. Sau khi nghiền, mẫu được rây qua rây 1mm. Cân 0,3g mẫu thực vật vào bình tam giác 100mL chịu nhiệt. Thêm 3,3 mL dung dịch công phá mẫu gồm H2SO4 đậm đặc và acid salysilic và để mẫu qua đêm. Sau đó, tiến hành nung mẫu ở nhiệt độ 180oC trong 2 giờ, để nguội và thêm 5 giọt H2O2 30% vào và tiếp tục đun nóng từ trong 10 phút nữa cho đến khi xuất hiện khói trắng. Lặp lại tiến trình này cho đến khi mẫu trắng hoàn toàn. Để nguội mẫu ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và lên định mức đến 50mL bằng nước khử khoáng và lắc đều mẫu. Dung dịch sau định mức được dùng để xác định hàm lượng đạm tổng số bằng phương pháp chưng Kjeldahl.

1,5 m

- Xác định mật số vi khuẩn E. coli, Coliform, Salmonella và Shigella trên rau: Mẫu rau sau khi được nghiền mịn được dùng để xác định mật số vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp MNP (Trần Linh Thước, 2006) và phương pháp đếm mật số khuẩn lạc trên môi trường SS agar (Taylor and Harriss, 1965). Tham khảo mục 3.2.1.5 cho phương pháp phân tích.

3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu

Các số liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm MINITAB 16.2, phân tích đa dạng vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn các hệ IMO trên gel polyarcryamide bằng phần mềm Gel Compare II, phân tích mối liên hệ di truyền theo phương pháp UPGMA bằng phần mềm MEGA_X_10.1.8.

CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Nội dung 1: Sự đa dạng về nhóm vi sinh vật trong các hệ IMO thu thập

4.1.1 Đặc điểm sinh hóa của các hệ vi sinh vật bản địa thu thập

Tổng cộng có 20 hệ vi sinh vật bản địa đã được thu thập trong đó 19 hệ được thu thập tại 19 địa điểm khác nhau trong tỉnh Sóc Trăng (Bảng 3.1) và 1hệ IMO hỗn hợp được tạo ra từ hỗn hợp của các hệ vi sinh vật này. Ghi nhận chung về sự phát triển vi sinh vật trong các mẫu cơm khi bẫy vi sinh vật ở điều kiện thực tế đồng ruộng như sau: xung quanh vị trí đặt các rổ cơm để bẫy vi sinh vật có mùi thơm của nấm mốc, phần cơm trong rổ sau 3 ngày đặt có nấm mốc màu trắng phủ đầy cả bên ngoài và bên trong rổ cơm (Hình 4.1). Nhiệt độ các khối cơm ủ khá cao dao động từ 40oC đến 45oC và khối lượng cơm giảm xuống đáng kể. Tuy nhiên, nhiệt độ của quá trình lên men tạo IMO trong bình thủy tinh ở điều kiện phòng thí nghiệm thấp hơn, dao động khoảng 30oC đến 35oC và các mẫu IMO cuối cùng sau khi lên men có mùi thơm. Trong quá trình lên men pH của các mẫu IMO giảm xuống nhanh chóng, sau 1 tuần lên men pH của tất cả các mẫu dao động trong khoảng pH 3,2 đến pH 4,4 (Phụ lục 5). Những đặc điểm này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Khalib et al, (2018) và Novia et al. (2019) cho thấy nhiệt độ trong quá trình lên men của hệ IMO lên đến 48oC và pH của các mẫu IMO dao động trong khoảng từ 3,83 đến 4,28.

A

B

Hình 4.1 Hình thái bên ngoài của hệ vi sinh vật bản địa IMO (A: sự phát triển của vi sinh vật trên giá thể cơm và B: Hệ IMO sau quá trình lên men)

4.1.2 Sự hiện diện của vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập

Hai mươi hệ IMO thu thập được thực hiện phản ứng PCR để kiểm tra sự hiện diện của 3 nhóm vi sinh vật chính bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. Kết quả phản ứng PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn được trình bày

trong Hình 4.2 cho thấy cả 3 nhóm vi sinh vật chính được phát hiện trong tất cả 20 mẫu IMO thu thập. Đối với vi khuẩn, cặp mồi 27F/1492R đã khuếch đại thành công một đoạn ADN của gen mã hoá 16S-rRNA với chiều dài ~1.500 bp của vi khuẩn trong 20 mẫu IMO thu thập (Hình 4.2A). Kết quả này cho thấy có sự hiện diện của quần thể vi khuẩn trong 20 hệ IMO thu thập từ 19 hệ thống cây trồng khác nhau. Tương tự, hai mươi mẫu IMO thu thập cũng ghi nhận là có sự hiện diện kích thước của chuỗi mục tiêu (~650 bp) khi phản ứng PCR bằng cặp mồi ITS1/ITS4 khuếch đại thành công vùng ITS của nấm trong 20 mẫu IMO (Hình 4.2B). Do đó, quần thể nấm cũng có mặt trong tất cả 20 mẫu IMO thu thập. Ngoài ra, cặp mồi đặc hiệu cho xạ khuẩn là 243F/1378R cũng khuếch đại thành công các chuỗi mục tiêu có kích thước ~1.100 bp của gen 16S-rRNA của xạ khuẩn trong IMO (Hình 4.2C). Điều này đã chứng minh rằng trong 20 mẫu IMO thu thập và khảo sát đều có sự hiện diện của xạ khuẩn.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

A

Kích thước mục tiêu vi khuẩn (1500 bp)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

B

Kích thước tiêu mục nấm (~650 bp)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

500 bp

C

Kích thước mục tiêu xạ khuẩn (~1100 bp)

Hình 4.2 Kết quả sản phẩm PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu để nhận diện nhóm vi sinh vật trong hệ IMO (A: vi khuẩn; B: nấm và C: xạ khuẩn) *Ghi chú: giếng 1 và giếng 16: thang chuẩn 100 bp; giếng 2: IMO tre; giếng 3: IMO luân canh; giếng 4: IMO chuối; giếng 5: IMO hành tím; giếng 6: IMO xà lách; giếng 7: IMO lúa; giếng 8: IMO dưa hấu; giếng 9: IMO cỏ hoang; giếng 10: IMO bắp; giếng 11: IMO rau xen canh; giếng 12: IMO cam; giếng 13: IMO bưởi; giếng 14: IMO ổi; giếng 15: IMO mía; giếng 17: IMO rau muống; giếng 18: IMO mồng tơi; giếng 19: IMO ớt; giếng 20: IMO củ lùn; giếng 21: IMO ngò; giếng 22: IMO hỗn hợp

Như vậy, tóm lại, trong 20 mẫu IMO thu thập có chứa tổng cộng 3 hệ vi sinh vật chính gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn, tuy nhiên, đề tài chưa thể nhận biết được là chúng thuộc chi hay loài nào. Kết quả nghiên cứu này tương tự như nhận định của Kyu and Koyama (1997), và các nghiên cứu của Kalsom and Sariah (2006) và Reddy (2011) cho thấy các thành phần vi sinh vật chính trong các hệ IMO gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, tuyến trùng, nguyên sinh động vật... bởi vì các vi sinh vật trong IMO có nguồn gốc từ thành phần các vi sinh vật trong đất. Do đó, các nghiên cứu tiếp theo về mật số của 3 nhóm vi sinh vật chính này gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn cũng như có hay không sự hiện diện của nhóm vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu IMO là thật sự cần thiết.

4.1.3 Sự đa dạng hệ vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong IMO

Do giới hạn về kích thước và số lượng giếng load mẫu trên gel polyacryamide và để thuận tiện cho phần mềm Gel Compare II phân tích kết quả điện di nên 14 IMO thu thập theo thứ tự từ 1 đến 14 được chọn để thực hiện đánh giá đa dạng vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử DGGE. Kết quả đánh giá sự đa dạng của 3 nhóm vi sinh vật chính trong 14 IMO thu thập bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn bằng sinh học phân tử với việc ứng dụng phương pháp nested-PCR kết hợp điện di DGGE và phân tích tương quan bằng phần mềm Gelcompare II cho thấy có sự đa dạng cao về thành phần của hệ vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong 14 mẫu IMO khảo sát.

4.1.3.1 Đa dạng quần thể vi khuẩn

Kết quả khảo sát về sự đa dạng của quần thể vi khuẩn trong các hệ IMO thu thập được trình bày ở Hình 4.3 và Phụ lục 6A cho thấy có sự đa dạng cao về số lượng nhóm vi khuẩn bản địa. Cụ thể, kết quả phân tích cho thấy số band trong các giếng dao động trong khoảng từ 15-27 band và được phân bố ở nhiều vị trí khác nhau trên các giếng trong gel polyacrylamide 8%. Chứng tỏ có ít nhất từ 15 đến 27 nhóm vi khuẩn khác nhau trong các mẫu IMO thu thập được. Trong đó hệ IMO thu thập từ đất trồng tre tại huyện Châu Thành (giếng 1) và IMO thu thập từ đất trồng lúa ở Mỹ Xuyên (giếng 6) cho thấy có sự đa dạng về nhóm vi khuẩn cao nhất, với 27 band xuất hiện trong cả 2 hệ IMO này, tuy nhiên chỉ số tương đồng về thành phần nhóm vi khuẩn của 2 hệ IMO này chỉ đạt 46,9%, kế đến là IMO thu từ đất trồng rau màu luân canh (giếng 2) có 26 band với chỉ số tương đồng về thành phần vi khuẩn với các hệ IMO còn lại là 25,5% và cũng là hệ IMO có thành phần vi khuẩn khác với các hệ còn lại nhiều nhất. Các hệ IMO còn lại có số band dao động từ 15–25 band, điều này chứng tỏ chúng có khoảng 15-25 nhóm vi khuẩn khác nhau trong các hệ IMO này. Hai hệ vi sinh vật bản địa IMO có chỉ số tương đồng thành phần vi khuẩn cao nhất là hệ IMO thu từ đất trồng rau ở Mỹ Xuyên (giếng 10) và hệ IMO thu từ đất trồng bắp ở Thạnh Trị (giếng 9) với chỉ số tương đồng là 94%. Đáng chú ý là các hệ vi sinh vật bản địa thu thập ở đất trồng cam, bưởi và ổi tại Kế Sách (giếng 11,12 và 13) cho thấy dù được thu ở các vườn lân cận nhau nhưng có thành phần vi khuẩn khác nhau với chỉ số tương đồng của IMO bưởi và

IMO ổi là 75,4% và tương đồng với IMO cam là 46,9%. Tương tự, IMO của ruộng dưa hấu và IMO đất cỏ hoang thu thập tại Long Phú có thành phần loài vi khuẩn tương đồng nhau 56,1%.

Hình 4.3 Kết quả phân tích đa dạng thành phần vi khuẩn trong 14 hệ IMO thu thập *Chú thích: TP-1: IMO tre; MQ-2: IMO luân canh; CP-3: IMO chuối; HV-4: IMO hành tím; RP-5: IMO rau;LM- 6: IMO lúa; DL-7: IMO dưa hấu; CL-8: IMO cỏ hoang; BT-9: IMO bắp; RM-10: IMO rau; CK-11: IMO cam; BK-12: IMO bưởi; OK-13: IMO ổi; MC-14: IMO mía.

Kết quả phân tích mối tương quan về thành phần vi khuẩn của các hệ IMO cho thấy chúng thuộc 5 nhóm chính (Hình 4.3). Nhóm 1 gồm có các IMO thu thập từ đất trồng mía tại Cù Lao Dung, cam tại Kế Sách, rau xen canh ở Mỹ Xuyên, bắp tại Thạnh Trị và cỏ hoang lại Long Phú. Các IMO trong nhóm này có thành phần vi khuẩn tương đồng nhau và dao động từ 68 đến 94%; Nhóm 2 gồm các hệ IMO thu thập từ đất trồng rau xà lách Pháp tại phường 3, Thành phố Sóc Trăng, hành tím tại Vĩnh Châu và dưa hấu tại Long Phú. Các IMO trong nhóm này cũng có thành phần vi khuẩn tương đồng nhau với độ tương đồng dao động trong khoảng 68-78%; Nhóm 3 chỉ có IMO thu thập từ đất trồng lúa tại Mỹ Xuyên, thành phần vi khuẩn của hệ này tương đồng về thành phần vi khuẩn với nhóm 1 và 2 là 51%; Nhóm 4 gồm các IMO thu thập từ đất trồng ổi, bưởi tại Kế Sách, chuối tại phường 7, Thành phố Sóc Trăng và đất trồng tre ở Châu Thành với chỉ số tương đồng về thành phần loài vi khuẩn trong các hệ IMO này dao động trong khoảng từ 53 đến 75% và Nhóm 5 có IMO thu thập từ đất trồng rau màu luân canh tại phường 5, Thành phố Sóc Trăng và thành phần vi khuẩn trong hệ vi sinh vật này rất khác biệt so với thành phần vi khuẩn của các IMO còn lại với chỉ số tương đồng về thành phần vi khuẩn là 25,5%.

Ngoài ra, kết quả phân tích còn cho thấy mật số vi khuẩn của từng nhóm trong một IMO cũng khác biệt nhau rõ rệt và được thể hiện qua độ đậm nhạt hay cường độ sáng của các band xuất hiện trong gel và có trung bình có từ 2 đến 4 nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong mỗi IMO do sự hiện diện của chúng với số lượng lớn. Như vậy, có

thể thấy rằng các hệ vi sinh vật thu thập có chứa sự đa dạng cao về thành phần và mật số các nhóm vi khuẩn, điều này do vị trí thu thập tại các điểm khác nhau cũng như loại cây trồng trên đất khác nhau đã ảnh hưởng đến thành phần vi khuẩn trong các mẫu IMO thu được.

Kết quả trong nghiên cứu này tương tự với nghiên cứu nhằm đánh giá thành phần vi sinh vật trong các hệ IMO thu thập trong các hệ thống canh tác cây trồng khác nhau trong mô hình canh tác hữu cơ ở Philippines bằng phương pháp PCR-DGGE. Kết quả cho thấy thành phần các nhóm loài vi khuẩn và nấm không thay đổi ở các thời điểm khảo sát gồm 0, 15 và 30 ngày sau khi lên men. Tuy nhiên, có sự thay đổi về mật số của các nhóm vi sinh vật hiện diện trong IMO thông qua cường độ sáng của các band ở cùng vị trí trên gel polyacryamide (http://organic.da.gov.ph).

4.1.3.2 Đa dạng quần thể nấm

Kết quả khảo sát sự đa dạng về quần thể nấm trong các hệ IMO thu thập được trình bày trong Hình 4.4 và Phụ lục 6B cho thấy có sự đa dạng về quần thể nấm trong các IMO và giữa các IMO có sự tương đồng khá cao về thành phần trong quần thể nấm. Số nhóm nấm được phát hiện trong mỗi hệ vi sinh vật bản địa dao động trong khoảng từ 10 đến 17 loài và mức độ tương đồng về thành phần loài dao động từ 39,2 đến 99,2%. Ngoại trừ hệ vi sinh vật bản địa thu thập từ đất trồng bắp, các hệ IMO còn lại có chỉ số tương đồng về thành phần nấm khá cao và dao động từ 75,9 đến 99,2%, trong khi hệ IMO thu từ đất trồng bắp có chỉ số tương đồng về thành phần nấm với các hệ IMO khác là 39,2%. Trong đó 2 hệ IMO thu thập từ đất trồng tre tại Châu Thành (giếng 1) và IMO thu thập từ đất trồng cam tại Kế Sách (giếng 11) có sự đa dạng về thành phần nấm cao nhất và tương ứng với số band được phát hiện lần lượt là 17 và 16 band, tuy nhiên, chỉ số tương đồng thành phần nấm giữa 2 hệ này là 89,9%. Các hệ IMO thu thập từ đất trồng bưởi, trồng ổi tại Kế Sách (giếng 13) và hệ IMO thu được từ đất trồng mía tại Cù Lao Dung (giếng 14) có số nhóm nấm bằng nhau (10 nhóm) và có độ tương đồng về thành phần nhóm loài khoảng 97,2%. Các IMO còn lại số nhóm nấm dao động trong khoảng từ 11 đến 15 loài nấm với chỉ số tương đồng thành phần nấm dao động từ 75,9 đến 97%. Tương tự như vi khuẩn, mật số nấm của từng nhóm loài trong cùng một hệ IMO khác biệt nhau rõ rệt thể hiện qua sự xuất hiện các band có cường độ sáng (độ đậm nhạt) khác nhau. Tuy nhiên, so với vi khuẩn thì số nhóm nấm trong các hệ vi sinh vật bản địa thu thập được thấp hơn và giữa các IMO với nhau có thành phần nấm tương đồng nhau cao hơn, chứng tỏ sự đa dạng về thành phần trong quần thể nấm là ít hơn so với vi khuẩn.

Hình 4.4 Kết quả phân tích đa dạng thành phần nấm trong 14 hệ IMO thu thập *Chú thích: TP-1: IMO tre; MQ-2: IMO luân canh; CP-3: IMO chuối; HV-4: IMO hành tím; RP-5: IMO rau;LM- 6: IMO lúa; DL-7: IMO dưa hấu; CL-8: IMO cỏ hoang; BT-9: IMO bắp; RM-10: IMO rau; CK-11: IMO cam; BK-12: IMO bưởi; OK-13: IMO ổi; MC-14: IMO mía. MIX: IMO hỗn hợp

4.1.3.3 Đa dạng quần thể xạ khuẩn

Kết quả phân tích đa dạng quần thể nấm trong các hệ IMO thu thập được trình bày trong Hình 4.5 và Phụ lục 6C cho thấy có sự đa dạng về thành phần xạ khuẩn trong 14 IMO thu thập với số lượng nhóm xạ khuẩn dao động từ 5 đến 14 nhóm trong các hệ IMO và giữa các IMO có thành phần xạ khuẩn tương đồng nhau với tỷ lệ tương đồng dao động từ 61,9 đến 95,5%. Phân tích mối quan hệ tương đồng về thành phần nhóm xạ khuẩn có trong các hệ IMO cho thấy chúng được nhóm lại thành 4 nhóm chính. Nhóm 1 gồm các hệ IMO thu thập từ đất trồng chuối tại Phường 7, Thành phố Sóc Trăng (giếng 3) và rau xen canh tại xã Thạnh Quới, huyện Mỹ Xuyên (giếng 10). Hai hệ IMO này có chỉ số tương đồng về thành phần nhóm loài đạt tỷ lệ 81,9%; Nhóm 2 gồm các hệ IMO thu thập từ đất trồng lúa tại huyện Mỹ Xuyên, bắp tại huyện Thạnh Trị, rau xà lách Pháp tại Phường 3, Thành phố Sóc Trăng, cỏ hoang và dưa hấu tại huyện Long Phú (giếng 5, 6, 7, 8 và 9). Các IMO trong nhóm này có thành phần xạ khuẩn tương đồng nhau với tỷ lệ tương đồng dao động trong khoảng 86-92%; Nhóm 3 gồm các hệ IMO thu thập tại đất trồng ổi, cam tại huyện Kế Sách và mía tại huyện Cù Lao Dung (giếng 11, 13 và 14) với chỉ số tương đồng về thành phần nhóm xạ khuẩn trong các hệ IMO này dao động từ 86-95% và Nhóm 4 bao gồm 4 hệ IMO thu thập từ đất trồng màu luân canh tại Phường 5, Thành phố Sóc Trăng, bưởi tại huyện Kế Sách, tre tại huyện Châu Thành và hành tím tại huyện Vĩnh Châu (giếng 2, 12, 1 và 4). Thành phần xạ khuẩn trong nhóm 4 này có độ tương đồng với nhóm 1 và 2 với tỷ lệ tương đồng đạt 51%. Độ tương đồng về thành phần xạ khuẩn của 4 nhóm này dao động trong khoảng từ 61,9-77,7%.

Hình 4.5 Kết quả phân tích đa dạng thành phần xạ khuẩn trong 14 hệ IMO thu thập *Chú thích: TP-1: IMO tre; MQ-2: IMO luân canh; CP-3: IMO chuối; HV-4: IMO hành tím; RP-5: IMO rau;LM- 6: IMO lúa; DL-7: IMO dưa hấu; CL-8: IMO cỏ hoang; BT-9: IMO bắp; RM-10: IMO rau; CK-11: IMO cam; BK-12: IMO bưởi; OK-13: IMO ổi; MC-14: IMO mía.

Nhìn chung, hệ vi sinh vật trong các hệ IMO thu thập rất phong phú chứa các thành phần khác nhau của các quần thể vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn, tuy nhiên chúng chỉ là một phần nhỏ trong tổng số vi sinh vật trong đất, chúng góp phần quan trọng trong quá trình hình thành, cải tạo đất, quá trình phân hủy hợp chất hữu cơ, chu trình chuyển hóa các chất quan trọng trong đất, cung cấp nguồn dinh dưỡng cho cây trồng. Trong các hệ IMO thu thập sự tương đồng về thành phần xạ khuẩn là khá cao với chỉ số tương đồng về các nhóm trong quần thể xạ khuẩn giữa các hệ IMO dao động từ 61- 95,5%, trong khi vi khuẩn và nấm có thành phần nhóm trong quần thể vi khuẩn và nấm thấp hơn và lần lượt tương ứng với 25-94% cho vi khuẩn và 39-99% cho nấm. Tóm lại, vi sinh vật trong đất trồng trọt rất đa dạng nói chung và trong các hệ IMO thu thập từ đất trồng nói riêng, bao gồm sự đa dạng về quần thể vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm. Trong các hệ IMO này có thể chứa nhiều vi sinh vật có lợi cho cây trồng có chức năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật cho cây trồng do đó việc khảo sát đánh giá mật số vi sinh vật và đánh giá các chức năng có lợi của chúng trong các hệ IMO là cần thiết.

4.1.4 Mật số vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập

Kết quả khảo sát mật số vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong 20 hệ IMO khác nhau được trình bày trong Bảng 4.1 cho thấy mật số của 3 nhóm vi sinh vật chính trong các hệ IMO khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) và trong cùng một hệ IMO mật số của vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn cũng khác nhau. Nhìn chung, trong mỗi hệ IMO, quần thể vi khuẩn có mật số cao hơn so với hai nhóm quần thể vi sinh vật còn lại (nấm và xạ khuẩn) và là thành phần vi sinh vật chính trong các hệ IMO thu thập.

4.1.4.1 Mật số vi khuẩn

Kết quả khảo sát mật số trong các hệ IMO thu thập ở Bảng 4.2 cho thấy mật số vi khuẩn trong các hệ IMO thu từ các hệ thống canh tác cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau. Bảng 4.1 Mật số vi sinh vật của 20 hệ IMO thu thập trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng sau 38 ngày lên men

Mật số vi sinh vật STT Nguồn gốc hệ IMO thu thập Nấm (105 cfu.g-1) Xạ khuẩn (105 cfu.g-1)

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Nhìn chung, mật số vi khuẩn trong các hệ IMO dao động trong khoảng từ 1,90 x 107 đến 2,13 x 109 cfu.g-1 IMO, trong đó hệ IMO thu thập từ đất trồng ổi có mật số vi khuẩn cao nhất (2,13 x 109 cfu.g-1 IMO) và cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với mật số vi khuẩn của các hệ IMO còn lại. Kế đến là hệ IMO thu thập từ đất trồng ớt với mật số đạt 5,85 x 108 cfu.g-1, cũng khác biệt có ý nghĩa so với các hệ IMO còn lại (p<0,05). Tiếp theo, các hệ IMO thu thập từ đất trồng bắp, rau xen canh và đất trồng mía có mật số vi khuẩn cao đứng hàng thứ 3 với mật số vi khuẩn cho cả ba hệ này đạt 3,2 x 108 cfu.g-1 IMO. Ngược lại, mật số vi khuẩn thấp nhất được tìm thấy trong hệ IMO thu thập từ hệ thống luân canh cây trồng, đất trồng chuối, hành tím, bưởi, mồng tơi, củ lùn và đất trồng ngò gai với số lượng vi khuẩn dao động trong khoảng từ 2,15 x107-8,45 x107 cfu.g-1 IMO, trong khi các hệ IMO còn lại có số lượng vi khuẩn cao hơn và dao động trong khoảng từ 1,18 x 108 đến 2,84 x 108 cfu.g-1 IMO.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Đất trồng tre Đất luân canh Đất trồng chuối Đất hành tím Đất xà lách pháp Đất trồng lúa Đất dưa hấu Đất cỏ hoang Đất trồng bắp Đất rau xen canh Đất trồng cam Đất trồng bưởi Đất trồng ổi Đất trồng mía Đất rau muống Đất mồng tơi Đất trồng ớt Đất trồng củ lùn Đất trồng ngò IMO hỗn hợp F CV (%) Vi khuẩn (107 cfu.g-1 ) 13,3cde 3,70e 2,15e 4,75e 13,6cde 13,2cde 24,9cde 21,1cde 32,5c 32,4c 28,4cd 8,5de 212,5a 32,5c 13,5cde 1,90e 58,5b 5,55de 5,20de 11,8cde * 381 144a 20,5cd 91,5b 27,0cd 2,05d 51,5c 140a 2,05d 3,00d 3,55d 2,65d 24,0cd 93,5b 32,5cd 1,35d 3,60d 2,60d 8,00d 1,35d 30,5cd * 137 3,67f 2,80f 1,93f 2,93f 51,3bcd 113a 118a 61,3bc 30,0def 24,7def 2,60f 2,60f 3,27f 18,0ef 24,0def 36,7cde 6,33f 70,0b 39,3cde 24,0def * 111

4.1.4.2 Mật số nấm

Đối với quần thể nấm kết quả khảo sát mật số trong các hệ IMO được trình bày trong Bảng 4.2 cũng cho thấy mật số nấm trong tất cả IMO thấp hơn so với mật số vi khuẩn và trong các hệ IMO khác nhau thì mật số nấm khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Mật số nấm của hệ IMO được thu thập từ đất trồng tre và dưa hấu cao nhất với mật số nấm lần lượt đạt 1,43 x 107 và 1,40 107 cfu.g-1 IMO và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các hệ IMO còn lại. Kế đến là hệ IMO thu thập từ đất trồng chuối và đất trồng ổi với mật số nấm đạt lần lượt 9,15 x 106 và 9,35 x 106 cfu.g-1 IMO. Tiếp theo là các IMO thu thập từ đất luân canh, đất trồng hành tím, lúa, bưởi, mía có mật số nấm dao động trong khoảng từ 2,10 x 106-5,15 x 106 cfu.g-1 IMO. Trong khi, các IMO còn lại được thu thập từ đất trồng xà lách Pháp, rau muống, mồng tơi, củ lùn, ngò gai, ớt, bắp, rau xen canh, vườn cam và đất đồng cỏ có mật số nấm thấp nhất với mật số dao động từ 1,35 x 105 đến 8,00 x 105 cfu.g-1 IMO.

Như vậy, Mật số nấm trong các hệ IMO dao động từ 105 – 107 cfu.g-1 IMO, thấp

hơn rất nhiều so với mật số vi khuẩn (dao động từ 107-109 cfu.g-1 IMO).

4.1.4.3 Mật số xạ khuẩn

Mật số xạ khuẩn của 20 hệ vi sinh vật bản địa IMO thu thập được trình bày trong Bảng 4.2. Kết quả cho thấy hai hệ IMO được thu thập từ ruộng lúa và dưa hấu có mật số xạ khuẩn cao nhất với số lượng tương ứng là 1,13 x 107 và 1,180 x 107 cfu.g-1 IMO. Trong khi mật số xạ khuẩn thấp nhất được tìm thấy trong hệ IMO từ tre, đất luân canh, chuối, hành tím, cam, bưởi, ổi và ớt với mật số xạ khuẩn dao động từ 1,93 x 105 đến 6,33 x 105 cfu.g-1. Các IMO còn lại có mật số xạ khuẩn dao động trong khoảng 1,80 x 106 và 6,13 x 106 cfu.g-1

So với vi khuẩn (mật số từ 107-109 cfu.g-1) mật số xạ khuẩn thấp hơn và dao động từ 105-107 cfu.g-1. Tuy nhiên mật số xạ khuẩn hiện diện trong các hệ IMO tương đương với mật số nấm.

Trong nghiên cứu trước đây của Chiemela et al. (2013a) đã cho thấy hệ IMO thu thập từ đất trồng tre có sự đa dạng về quần thể vi khuẩn với mật số 2,8 x 109 cfu.g-1, tiếp theo là nấm ở mức 4,2 x 104 cfu.g-1. Trong nghiên cứu của chương trình hữu cơ quốc gia Philippines năm 2017 đã chỉ ra rằng trong các hệ IMO thu thập vi khuẩn là nhóm chiếm số lượng lớn nhất và là thành phần vi sinh vật chính trong các mẫu IMO, trong đó chi vi khuẩn Bacillus, Sphigomonas, vi khuẩn lên men lactic hiện diện với mật số cao, tiếp theo là các nhóm nấm men, và cuối cùng là nấm sợi (http://organic.da.gov.ph). Tương tự, Abu-Bakar and Ibrahim (2013) đã sử dụng hệ vi sinh vật bản địa IMO để ủ phân hữu cơ và có mật số vi khuẩn đạt 109 cfu.g-1 trong khi số lượng nấm dao động trong khoảng từ 1,6 x 106-1,8 x108 cfu.g-1. Tổng mật số xạ khuẩn được duy trì ở mức độ cao trong suốt quá trình ủ phân với mức 109 cfu.g-1 IMO. Cũng theo các tác giả này có sự khác biệt lớn giữa các hệ IMO và trong cùng 1 IMO về thành phần các nhóm vi sinh vật được cho là do nhiều yếu tố. Nghiên cứu của

Chiemela et al. (2013a) đã cho thấy sự phát triển của vi sinh vật trong các hệ IMO phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như nguồn gốc hay địa điểm thu IMO, các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, thời gian đặt mẫu thu các IMO, độ ẩm trong đất,…cũng ảnh hưởng đến thành phần vi sinh vật trong từng hệ IMO. Ngoài ra, Kyu and Koyama (1997) còn cho rằng thời tiết của các mùa trong năm và loại gạo sử dụng để thu thập IMO cũng ảnh hưởng đến số lượng và thành phần vi sinh vật thu được trong hệ vi sinh vật bản địa. Tỷ lệ đường sử dụng để lên men tạo IMO cũng ảnh hưởng đến thành phần vi sinh vật của hệ IMO. Cụ thể, việc sử dụng 100% molasses giúp nhóm vi khuẩn Bacillus chiếm ưu thế hơn, trong khi việc sử dụng 20% đường molasses giúp kích thích nhóm vi khuẩn lactic chiếm đa số. Bên cạnh đó, các giai đoạn khác nhau trong quá trình lên men chứa các nhóm vi sinh vật khác nhau (http://organic.da.gov.ph). Thêm vào đó nghiên cứu của Novia et al. (2019) đã cho thấy pH của hệ IMO trong quá trình lên men IMO bị giảm xuống và pH của IMO quyết định thành phần vi sinh vật hiện diện trong hệ IMO đó.

Tóm lại, kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy có sự hiện diện số lượng lớn ba nhóm vi sinh vật chính trong 20 hệ IMO khảo sát và do đó cả 20 hệ IMO này có thể được coi là các nguồn vi sinh vật dồi giàu có thể sử dụng để cải tạo đất cũng như kích thích sinh trưởng cây trồng. Tuy nhiên, việc xác định sự hiện của các nhóm vi khuẩn gây bệnh cho người như Coliform, E. coli, Salmonella và Shigella trong các hệ IMO thu thập là cần thiết để đảm bảo an toàn trong canh tác cũng như tiêu dùng rau. 4.1.5 Sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh trong hệ IMO thu thập

Kết quả phân tích sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn gây bệnh cho người Salmonella và Shigella trên môi trường chuyên biệt SS agar cho thấy không phát hiện khuẩn lạc màu đen của vi khuẩn Salmonella hay màu nâu của vi khuẩn Shigella trên môi trường SS agar trong tất cả 20 hệ IMO được phân tích (Hình 4.6A). Do đó, có thể kết luận rằng đã không có sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh cho người nhóm Salmonella và Shigella trong 20 hệ IMO thu thập. Điều này có thể giải thích là do nhiệt độ và pH của các hệ IMO trong quá trình lên men để tạo ra các IMO đã ức chế sự sinh trưởng và phát triển của các nhóm vi khuẩn gây bệnh này trong các hệ IMO thu thập.

Tương tự, đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh Coliform và E. coli, kết quả của thí nghiệm khảo sát cũng cho thấy không có sự hiện diện của chúng trong tất cả 20 mẫu IMO thu thập thông qua việc tất cả các mẫu được thử nghiệm đều không có độ đục trong môi trường nuôi cấy lỏng và bọt khí không xuất hiện trong ống durham (Hình 4.6B). Do đó, có thể kết luận rằng nhóm vi khuẩn gây bệnh Coliform và E. coli không tồn tại trong 20 mẫu của các hệ IMO thu thập. Điều này có thể được giải thích là do các điều kiện môi trường lên men của các hệ IMO như nhiệt độ, pH và các yếu tố khác trong quá trình lên men IMO không phù hợp để các nhóm vi khuẩn gây bệnh này tồn tại và phát triển.

Hình 4.6 Kết quả kiểm tra sự hiện diện nhóm vi sinh vật gây bệnh trong các hệ IMO thu thập (A: các đĩa môi trường SS agar không có sự hiện diện các khuẩn lạc Salmonella (màu đen) và Shigella (màu nâu) sau 48 giờ nuôi cấy; B: các ống nghiệm có môi trường LSB chứa các ống durham úp ngược không có bọt khí bên trong sau 48 giờ nuôi cấy)

Theo Molina et al. (2015) để đảm bảo an toàn thì việc kiểm tra và đánh giá sự hiện diện các vi sinh vật gây bệnh trong chế phẩm hay phân bón vi sinh như Salmonella, Shigella, Coliform và E. coli là cần thiết. Và kết quả phân tích trong nghiên cứu này cho thấy mặt dù quần thể vi khuẩn trong IMO có sự đa dạng và mật số cao trong mỗi hệ IMO, tuy nhiên, không phát hiện bất kỳ sự hiện diện của nhóm vi khuẩn gây bệnh nào như Salmonella, Shigella, Coliform và E. coli. Điều này có thể do nhóm vi sinh vật này không xâm nhiễm vào trong các hệ IMO hoặc do nhiệt độ được sinh ra trong quá trình lên men IMO trong khoảng 40oC – 45oC cùng với việc pH giảm xuống trong quá trình lên men tạo IMO (pH 3,2 - pH 4,4) đã ức chế và giết chết nhóm vi sinh vật gây bệnh này nên không có sự hiện diện của chúng trong các hệ IMO thu thập (mục 4.1.1). Kết quả nghiên cứu này tương tự như nghiên cứu của Khalib et al, (2018) và tác giả đã chỉ ra nhiệt độ lên đến 48oC của khối ủ IMO đã tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh. Trong khi nghiên cứu của Novia et al. (2019) cũng đã chúng minh rằng pH trong hỗn hợp IMO dao động từ pH 3,83 đến pH 4,28 đã ức chế hoàn toàn các vi sinh vật gây bệnh trong hệ IMO. Ngoài ra, bằng phương pháp truyền thống Chiemmela et al. (2013a) và Desire et al. (2018) đã phân lập vi khuẩn và nấm trong các hệ IMO đã chỉ ra rằng không có thành phần vi khuẩn và nấm gây bệnh trong các hệ IMO khảo sát. Đáng lưu ý là bằng phương pháp hiện đại các nghiên cứu của Tomaru et al. (2014), Kelikuli (2018) và Novia et al. (2019) đã sử dụng kỹ thuật nested PCR kết hợp DGGE rồi tiến hành thu hồi và giải trình tự ADN vi khuẩn và nấm trong IMO cho thấy không có sự hiện diện nhóm vi khuẩn hay nấm gây bệnh nào trong các hệ IMO. Như vậy, kết quả nghiên cứu này cho thấy tất cả 20 hệ IMO được khảo sát không có bất kỳ sự nhiễm vi khuẩn gây bệnh nhóm Salmonella, Shigella, Coliform và E. coli.

Tóm lại nghiên cứu về sự đa dạng vi sinh vật trong 20 mẫu IMO thu thập ở các hệ thống canh tác cây trồng khác nhau ở Sóc Trăng đã xác định có sự đa dạng nhóm vi

sinh vật trong các hệ IMO, bao gồm sự hiện diện của nhóm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. Trong đó, vi khuẩn được xem là nhóm vi sinh vật chiếm ưu thế nhất. Ngoài ra trong từng nhóm vi sinh vật cũng cho thấy có sự đa dạng về thành phần các nhóm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. Nghiên cứu cũng đã xác định rằng sự đa dạng trong địa điểm thu mẫu, loại cây trồng trên đất thu thập IMO khác nhau dẫn đến thành phần các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm trong các hệ IMO khác nhau. Điều này có thể ảnh hưởng đến chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của IMO. Bên cạnh đó kết quả nghiên cứu còn cho thấy không có sự hiện diện của nhóm vi khuẩn gây bệnh cho người như Coliform, E. coli, Salmonella và Shigella trong tất cả 20 hệ IMO thu thập nên các hệ IMO này được xem là nguồn vi sinh vật bản địa an toàn có thể dùng trong canh tác rau. Theo Reddy (2011) vi sinh vật bản địa IMO là nguồn vi sinh vật tốt cho canh tác do chúng đã tồn tại và thích nghi với điều kiện chuyên biệt của địa phương và chúng được coi là nguồn vi sinh vật bản địa giúp cải thiện đất và cây trồng an toàn, hiệu quả nhất. Hơn nữa, giữa các nhóm vi sinh vật trong các hệ IMO có mối quan hệ rất chặt chẽ và hỗ trợ nhau, có sự sắp xếp về vai trò, vị trí và nhiệm vụ rất rõ ràng để thực hiện tốt chức năng của mình một cách hài hoà trong cộng đồng. Vì vậy đánh giá các chức năng có lợi cho cây trồng như cố định đạm và tổng hợp IAA của 20 hệ IMO thu thập cũng thật sự cần thiết.

4.2 Nội dung 2: Chức năng kích thích sinh trƣởng cây trồng của các hệ IMO thu thập

Kết quả nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp IAA của 20 hệ IMO được trình bày trong Bảng 4.2 và Hình 4.7. Kết quả cho thấy tất cả 20 hệ IMO thu thập đều có khả năng tổng hợp IAA, khả năng tổng hợp IAA của các hệ IMO khảo sát khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,01) và lượng IAA tổng hợp được thay đổi theo thời gian nuôi cấy.

Hoạt động tổng hợp IAA của các hệ IMO được xảy ra rất sớm (sau 1-2 ngày thí nghiệm) và hàm lượng IAA tổng hợp bởi các hệ IMO dao động mạnh trong khoảng từ từ 9,23 đến 74,0 mg.L-1 IAA. Lượng IAA cao nhất sau hai ngày chủng được tìm thấy ở hệ IMO thu thập từ ruộng rau muống với nồng độ đạt 74,0 mg.L-1 IAA và khác biệt có ý nghĩa so với các hệ IMO còn lại. Khả năng tổng hợp IAA cao thứ 2 thuộc về IMO được thu thập từ đất ruộng lúa với nồng độ IAA đạt 56,6 mg.L-1. Các hệ IMO thu thập từ đất trồng bắp, cam, mồng tơi và hỗn hợp có khả năng tổng hợp IAA khá tốt với nồng độ IAA được ghi nhận trong môi trường NBRIP nuôi cấy lỏng dao động từ 40,6 mg.L-1 đến 44,3 mg.L-1. Khả năng tổng hợp IAA thấp nhất được tìm thấy ở 3 hệ IMO được thu thập từ đất luân canh cây trồng, đất trồng chuối và đất trồng rau xen canh, với lượng IAA tổng hợp lần lượt đạt 9,66 mg.L-1, 9,23 mg.L-1 và 10,7 mg.L-1. Ngoài ra, 11 hệ IMO còn lại có khả năng tổng hợp IAA dao động trong khoảng 12,0 - 35,4 mg.L-1. Đặc biệt, hệ IMO hỗn hợp thể hiện khả năng tổng hợp IAA khá cao và ổn định

4.2.1 Tổng hợp IAA

trong suốt thời điểm khảo sát, với nồng độ IAA tổng hợp trong môi trường nuôi cấy cao nhất đạt 42,6 mg.mL-1.

Hình 4.7 Nồng độ IAA được tổng hợp cao nhất bởi 20 hệ IMO thu thập trong môi trường NBRIP có bổ sung tryptophan (100 mg.L-1) trong thời gian 6 ngày nuôi cấy Bảng 4.2 Nồng độ IAA (mg.L-1) trong môi trường NBRIP lỏng bổ sung tryptophan được tổng hợp bởi 20 hệ IMO thu thập sau 6 ngày nuôi cấy

Nồng độ IAA tổng hợp (mg.L-1)

*Lưu ý: trong cùng một cột các giá trị có phần chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,01) theo phương pháp kiểm định Tukey.

STT Nguồn gốc IMO Đất trồng tre Đất luân canh Đất trồng chuối Đất hành tím Đất xà lách pháp Đất trồng lúa Đất dưa hấu Đất cỏ hoang Đất trồng bắp Đất rau xen canh Đất trồng cam Đất trồng bưởi Đất trồng ổi Đất trồng mía Đất rau muống Đất mồng tơi Đất trồng ớt Đất trồng củ lùn Đất trồng ngò Hỗn hợp F CV (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ngày 3 27,0de 4,67jk 8,17ij 13,4ghi 33,1bc 40,3a 24,6ef 24,2ef 43,6a 0,00k 22,5ef 18,9fg 14,4gh 38,8ab 31,2cd 23,1ef 12,0hi 25,7de 12,2hi 27,2de * 52,9 Ngày 5 27,7b 8,27ghi 2,33jk 13,4fg 34,7a 34,7a 35,9a 1,33k 23,6bcd 0,00k 36,4a 21,0cde 12,8fgh 15,5ef 20,4de 16,8ef 7,29hij 26,6bc 4,84ijk 25,1bcd * 64,7 Ngày 6 17,5hij 4,11kl 0,70l 7,15k 29,9bc 32,8b 28,5bcd 3,63kl 23,8efg 0,00l 41,8a 23,0fgh 15,0j 17,0ij 19,9ghi 15,7ij 4,2kl 24,4def 6,33k 27,9cde * 68,7 Ngày 1 18,6ab 6,54gh 3,07ij 17,3b 3,29ij 8,12cfg 17,3b 1,40j 2,48j 10,7def 13,6cd 11,3de 16,2bc 5,79ghi 13,6cd 15,7bc 3,45hij 20,7a 19,8def 7,86fg * 57,7 Ngày 2 28,8ef 9,66i 9,23i 17,2gh 27,8ef 56,6a 30,5de 25,4ef 23,7f 0,00j 24,9ef 23,6f 16,0h 23,2fg 74,0a 42,2c 3,63ij 35,4d 24,9ef 42,6c * 63,9

Về xu hướng tổng hợp IAA của các hệ vi sinh vật bản địa khảo sát cho thấy các hệ IMO thu thập có khả năng tổng hợp IAA cao và sớm. Trong đó, lượng IAA tổng hợp cao nhất được ghi nhận ở thời điểm 1 và 2 ngày sau khi nuôi cấy (16 hệ IMO). Trong khi 2 hệ IMO thu từ đất trồng bắp và ớt có hàm lượng IAA tổng hợp đạt cao nhất vào thời điểm 3 ngày sau khi nuôi cấy. Hệ IMO thu từ đất trồng dưa hấu đạt cao nhất vào ngày 5 và hệ IMO từ đất trồng cam đạt cao nhất vào thời điểm 6 ngày thí nghiệm. Việc tổng hợp IAA sớm có thể giúp vi sinh vật trong hệ thích nghi tốt hơn trong môi trường nuôi cấy mới hoặc có thể do các vi sinh vật tiết chất kích thích sinh trưởng nhằm hỗ trợ lẫn nhau giữa các nhóm vi sinh vật trong quá trình sinh trưởng.

Nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên đánh giá chức năng tổng hợp IAA của các hệ vi sinh vật bản địa và kết quả cho thấy 20 hệ vi sinh vật bản địa thu thập tại Sóc Trăng có khả năng tổng hợp IAA tốt. Khi so sánh với các nghiên cứu về khả năng tổng hợp IAA của các dòng đơn vi sinh vật được phân lập cho thấy các hệ IMO của nghiên cứu này có khả năng tổng hợp IAA tương đương với các dòng thuần vi sinh vật phân lập đã được nghiên cứu và công bố trước đây. Cụ thể, các kết quả nghiên cứu trước đây của Ahmad et al. (2005) khi khảo sát khả năng tổng hợp IAA của 10 dòng Azotobacter sp. và 11 dòng Pseudomonas sp. trong môi trường chứa tryptophan (0, 1, 2 và 5 µg/mL) đã cho thấy 7 dòng vi khuẩn Azotobacter sp. cho khả năng tổng hợp IAA cao và dao động từ 7,3 đến 32,8 µg.mL-1 khi thêm 5 µg/mL tryptophan trong khi các dòng Pseudomona sp. có khả năng tổng hợp IAA dao động từ 41,0 µg.mL-1 đến 53,2 µg.mL-1 IAA. Hơn nữa, Ahmad et al. (2008) đã phân lập và khảo sát vi khuẩn vùng rễ sống tự do cho thấy khả năng tổng hợp IAA cao nhất của chúng khi môi trường nuôi cấy được bổ sung với 500 μg.mL-1 tryptophan và lượng IAA dao động trong khoảng từ 7,03 µg.mL-1 đến 22,0 µg.mL-1. Tại Việt Nam, Nguyễn Thị Phương Oanh và ctv. (2013) đã phân lập từ đất vùng rễ lúa và đã tuyển chọn được 5 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA dao động từ 28,6-42,1 µg.mL-1. Cùng thời điểm đó, Nguyễn Thị Huỳnh Như và ctv. (2013) đã đánh giá khả năng tổng hợp IAA của 2 dòng vi khuẩn nội sinh trong cây chuối cho thấy hàm lượng IAA tổng hợp cao nhất đạt 3,16 µg.mL-1 và 3,07 µg.mL-1. Tương tự, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thị Thủy (2015) đã phân lập và tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn Azotobacter có khả năng sinh tổng hợp IAA cao nhất đạt 10,1 µg.mL-1 và 12,9 µg.mL-1. Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp (2018) đã đánh giá các dòng vi khuẩn chịu mặn và cho thấy chúng có khả năng tổng hợp IAA dao động trong khoảng từ 45,3 đến 46,5 µg.mL-1. Như vậy so với các kết quả nghiên cứu trước đây, có thể thấy rằng các hệ IMO trong nghiên cứu này có khả năng tổng hợp IAA bằng hoặc cao hơn các dòng thuần vi sinh vật phân lập và tuyển chọn. Do đó tiềm năng sử dụng các hệ IMO trong canh tác nông nghiệp nhằm giúp kích thích sinh trưởng cây trồng là rất lớn.

4.2.2 Cố định đạm

4.2.2.1 Gen chức năng nifH trong các hệ IMO

Kết quả phản ứng PCR dò tìm gen chức năng nifH trong 20 hệ IMO được trình bày ở Hình 4.8 cho thấy cả 20 giếng đều có 1 band rõ nét ở vị trí kích thước đặc trưng cho gen chức năng này (khoảng 360 bp). Điều này chứng tỏ trình tự mục tiêu 360 bp của gen nifH được phát hiện có trong ADN tổng của 20 hệ IMO mặc dù không có sự thay đổi rõ ràng về kích thước của các sản phẩm gen nifH giữa chúng. Điều này chứng tỏ các hệ IMO có chứa các vi khuẩn mang gen nifH, hay nói cái khác là có sự hiện diện của vi khuẩn cố định đạm trong 20 hệ IMO thu thập này.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Kích thước mục tiêu (360 bp)

500 bp

Hình 4.8 Kết quả PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu polF/polR dùng để nhận diện gen chức năng cố định đạm sinh học NifH của 20 hệ IMO thu thập *Ghi chú: giếng 1 và giếng 21: thang chuẩn 100 bp ; giếng 2: IMO tre; giếng 3: IMO luân canh; giếng 4: IMO chuối; giếng 5: IMO hành tím; giếng 6: IMO xà lách; giếng 7: IMO lúa; giếng 8: IMO dưa hấu; giếng 9: IMO cỏ hoang; giếng 10: IMO bắp; giếng 11: IMO rau xen canh; giếng 12: IMO cam; giếng 13: IMO bưởi; giếng 14: IMO ổi; giếng 15: IMO mía. giếng 16: đối chứng âm; giếng 17: IMO rau muống ; giếng 18: IMO mồng tơi; giếng 19: IMO ớt; giếng 20: IMO củ lùn; giếng 22: IMO ngò; giếng 23: IMO hỗn hợp

tốt như Azospirillum brasilense, Azospirillum

Kích thước của trình tự mục tiêu của gen nifH xấp xỉ 360 bp, phù hợp với nghiên cứu trước đây của Poly et al. (2001a và 2001b) cũng đã sử dụng cặp mồi polF/polR để phát hiện gen chức năng nifH và cho thấy các mồi này rất nhạy với 5 dòng vi khuẩn cố định N2 lipoferum, Rhizobium leguminosarum, Sinorhizobium và Frankia alu. Tương tự, Nguyễn Hữu Hiệp và ctv. (2005) đã phân lập được 20 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm từ rễ và thân lúa hoang, lúa trồng và một số loại cỏ ở ruộng lúa có các đặc tính giống như vi khuẩn Azospirillum và sử dụng cặp mồi chuyên biệt polF/polR để nhận diện chúng bằng kỹ thuật PCR. Kết quả cho thấy có 8/20 dòng có các band ADN ở vị trí 360 bp giống như dòng vi khuẩn đối chứng Azospirillum lipoferum.

Kết quả nghiên cứu này chứng tỏ trong các hệ vi sinh vật thu thập được tại các hệ thống canh tác cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng có chứa những vi khuẩn mang gen tiềm năng và chức năng lớn trong cố định đạm sinh học.

4.2.2.2 Khả năng cố định đạm sinh học của 20 hệ IMO trong môi trường Burk's lỏng

Kết quả khảo sát về khả năng cố định đạm trong môi trường Burks lỏng theo thời gian nuôi cấy của 20 hệ IMO khảo sát được trình bày trong Bảng 4.3 cho thấy hầu hết các hệ IMO khảo sát đều có khả năng cố định đạm và có sự khác biệt đáng kể giữa các hệ IMO về khả năng này. Bảng 4.3 Hàm lượng đạm tổng số tăng thêm trong môi trường Burks lỏng sau 5 ngày nuôi cấy của các IMO thu thập

STT Nguồn gốc IMO thu thập Nồng độ N (mg.L-1) Ngày 3 Ngày 2 Ngày 1 Cao nhất

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ngày 5 0,00 0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 0,00 0,28 0,00 0,00 0,00 0,25 0,00 0,00 2,72 0,86 2,01 0,00 4,33 0,00 6,26 4,09 4,62 5,42 0,98 4,12 3,12 2,88 0,10 0,00 0,55 0,90 0,31 0,93 6,57 8,13 8,09 5,33 4,33 0,03 6,26 4,09 4,62 5,42 0,98 4,12 3,12 2,45 0,00 0,00 0,40 0,16 0,31 0,43 3,97 2,67 2,48 1,69 0,00 0,00 6,21 1,41 2,92 2,99 0,01 1,34 0,36 2,88 0,10 0,00 0,28 0,90 0,19 0,93 1,78 2,85 1,30 2,57 1,91 0,00 Đất trồng tre Đất luân canh Đất trồng chuối Đất hành tím Đất xà lách Đất trồng lúa Đất dưa hấu Đất cỏ hoang Đất trồng bắp Đất rau xen canh Đất trồng cam Đất trồng bưởi Đất trồng ổi Đất trồng mía Đất rau muống Đất mồng tơi Đất trồng ớt Đất trồng củ lùn Đất trồng ngò Hỗn hợp

0,42 0,00 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,55 0,74 0,00 0,92 6,57 8,13 8,09 5,33 3,97 0,03 Có 12 trong tổng số 20 hệ IMO có khả năng cố định đạm thêm hơn 2 mg.L-1 N sau 5 ngày nuôi cấy và lượng N cố định được dao động từ 0,03 đến 8,13 mg.L-1. Lượng đạm cố định được cao nhất được tìm thấy ở hệ IMO thu thập từ đất trồng mồng tơi sau hai ngày nuôi cấy, kế đến là hệ IMO thu thập từ đất trồng ớt với khả năng cố định đạm cao thứ 2 và đạt 8,09 mg.L-1 N. Khả năng cố định đạm cao thứ 3 và thứ 4 thuộc về các hệ IMO thu thập trên đất trồng rau muống và đất trồng tre với lượng N cố định tương ứng là 6,56 và 6,26 mg.L-1. Lượng N được cố định bởi các hệ IMO thu thập từ đất luân canh, đất trồng chuối, lúa, dưa hấu, cỏ hoang, củ lùn và đất trồng ngò gai tương đối cao với lượng đạm cố định dao động từ 2,88 đến 5,42 mg.L-1. Tám hệ IMO còn lại có lượng đạm cố định thấp hơn 1 mg.L-1 N và thấp nhất là hệ IMO thu từ đất xen canh. Điều này có thể giải thích là do trong 8 hệ vi sinh vật này có thể có các nhóm vi sinh vật chuyển hoá đạm để tạo các hợp chất đạm dạng khí bay hơi NO, N2O và N2, hoặc nhóm vi sinh vật phân huỷ hoạt động mạnh hơn nên phân giải các vi sinh

vật trong môi trường nuôi cấy để lấy nguồn đạm. Ngoài ra kết quả khảo sát cũng cho thấy khả năng cố định đạm của các hệ IMO thu thập không chỉ khác nhau mà còn biến động đáng kể trong thời gian bố trí thí nghiệm.

Như vậy rõ ràng các hệ IMO thu thập trong nghiên cứu này có mang gen chức năng cố định đạm nifH và trong điều kiện môi trường sống khuyết đạm các gen này đã hoạt động giúp vi khuẩn có thể duy trì được hoạt động sống thông qua hoạt động cố định đạm từ không khí. Tuy nhiên, so với các nghiên cứu trước đây trên các đối tượng là dòng/chủng vi khuẩn cố định đạm phân lập của Davis et al. (1964), Thavasi et al. (2006) Mazumdar and Deka (2013), Smita and Goyal (2017), Nguyễn Thị Phương Oanh và ctv. (2013), Nguyễn Thị Huỳnh Như và ctv. (2013), Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thị Thủy (2015), Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp (2018) cho thấy lượng đạm mà các hệ IMO cố định được thấp hơn nhiều so với các dòng vi sinh vật đơn. Điều này có thể giải thích là do các nhóm vi khuẩn tiêu thụ N, đặc biệt là các + hoặc nhóm khử nitơ trong mỗi hệ IMO có thể làm giảm N bằng cách chuyển NH4 - thành các dạng N khác như khí NO, N2O và N2. Điều này cũng giải thích cho sự NO3 biến động mạnh mẽ của hàm lượng đạm tổng số trong môi trường Burks lỏng theo thời gian nuôi cấy và sự tồn tại các hoạt động cạnh tranh của hai nhóm vi sinh vật: cố định N và tiêu thụ N trong tất cả các hệ IMO khảo sát (Robertson and Groffman, 2015). Mặc dù các hệ IMO khảo sát chứa nhóm sinh vật chỉ cố định một lượng nhỏ N, nhưng chúng có thể có vai trò quan trọng trong việc duy trì các quần thể trong hệ sinh thái tự nhiên và cung cấp đạm cho các hệ sinh thái này (Hillel, 2007).

Những kết quả đánh giá về chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các hệ IMO trong nghiên cứu này đã cung cấp thêm kiến thức và thông tin mới về các hệ vi sinh vật bản địa về 3 chức năng có lợi cho cây trồng gồm tổng hợp IAA, cố định đạm và trong đó một số hệ IMO có những chức năng này tương đương hoặc cao hơn so với các dòng vi sinh vật thuần được phân lập trong các nghiên cứu trước đây. Ngoài ra chúng còn có khả năng đối kháng sinh học với nấm bệnh và phân huỷ sinh học các vật liệu hữu cơ như rơm rạ, xác mía,… Điều này phù hợp với các nhận định của Kyu and Koyama (1997), Jensen et al., (2006), Kalsom and Sariah (2006), Reddy (2011) Kumar and Gopal (2015). Đặc biệt, nghiên cứu của tổ chức nông nghiệp hữu cơ quốc gia Philiphines đã chỉ ra rõ trong các hệ IMO có 82% vi khuẩn có khả năng cố định đạm, 8,7% vi khuẩn có khả năng hoà tan kali và 65,2% vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp IAA (http://organic.da.gov.ph).

Qua kết quả đánh giá các đặc điểm về đa dạng vi sinh vật và các chức năng có lợi cho cây trồng của các hệ IMO thu thập của nghiên cứu này cho thấy các hệ vi sinh vật bản địa có thể là nguồn cung cấp vi sinh vật có lợi cho cây trồng tiềm năng trong canh tác nông nghiệp. Bên cạnh việc cung cấp nguồn dinh dưỡng đa lượng, trung lượng và vi lượng cho đất và cây trồng, chúng còn cung cấp các chất kích thích sinh trưởng sinh học an toàn cho cây trồng. Trong đó hai yếu tố cung cấp N và tổng hợp hormone thực vật IAA là quan trọng. Do đó, vi sinh vật cố định đạm và tổng hợp IAA được quan tâm

đặc biệt nhằm thay thế hoặc giảm thiểu lượng phân bón hoá học và chất kích thích sinh trưởng hoá học đang sử dụng với mức độ lạm dụng như hiện nay trên cây trồng mà nhất là cây rau. Rõ ràng qua nghiên cứu này, bên cạnh chức năng tổng hợp IAA, các hệ IMO còn mang gen chức năng nifH là một trong những gen chức năng quan trọng trong quá trình cố định đạm sinh học của vi khuẩn. Do đó, tiến hành phân lập các dòng vi khuẩn cố định đạm có thêm chức năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA từ 20 hệ IMO trong nghiên cứu này là cần thiết.

4.3 Nội dung 3: Phân lập tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn bản địa có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ IMO thu thập

4.3.1 Mật số vi khuẩn cố định đạm trong các hệ IMO

Kết quả khảo sát mật số vi khuẩn cố định đạm trong các hệ IMO sau 40 ngày lên men được trình bày ở Bảng 4.4 cho thấy các hệ IMO có mật số vi khuẩn cố định đạm khác nhau và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau. Bảng 4.4 Mật số vi khuẩn cố định đạm trong các hệ IMO thu thập

STT Ký hiệu Nguồn gốc IMO Mật số vk cố định đạm (106 cfu.g-1)

Đất trồng tre Đất luân canh Đất trồng chuối Đất hành tím Đất xà lách Đất trồng lúa Đất dưa hấu Đất cỏ hoang Đất trồng bắp Đất rau xen canh Đất trồng cam Đất trồng bưởi Đất trồng ổi Đất trồng mía Đất rau muống Đất mồng tơi Đất trồng ớt Đất trồng củ lùn Đất trồng ngò 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 TP-1 MQ-2 CP-3 HV-4 RP-5 LM-6 DL-7 CL-8 BT-9 RM-10 CK-11 BK-12 OK-13 MC-14 MP-15 MT-16 OM-17 CP-18 NM-19 IMO hỗn hợp Hỗn hợp

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Mật số vi khuẩn cố định đạm trong các hệ IMO dao động từ 106 đến 108 cfu.g-1 IMO, trong đó hệ IMO thu thập từ đất trồng ổi có số lượng vi khuẩn cố định đạm cao nhất và đạt 7,78 x 108 cfu.g-1 và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các hệ IMO còn lại. Kế đến, các hệ IMO thu thập từ vườn bưởi có mật số vi khuẩn cố định đạm là 1,53

F CV (%) 14,5def 3,50f 10,5def 73,5c 12,5def 29,5d 23,5cdef 27,5de 25,5de 19,5def 17,5def 152,5b 778a 69,0c 2,95f 12,5def 20,0def 15,5def 5,90ef 16,0def * 252

x 108 cfu.g-1. Hai hệ IMO có mật số vi khuẩn cố định đạm cao thứ 3 là hệ IMO thu từ ruộng hành tím và mía với mật số lần lượt là 7,35 x 107 và 6,95 x 107 cfu.g-1. Mật số vi khuẩn cố định đạm thấp nhất được tìm thấy trong hệ IMO được thu thập từ hệ thống luân canh, rau muống và ngò gai với số lượng vi khuẩn dao động từ 2,15 x106 – 5,90 x106 cfu.g-1 IMO, trong khi các hệ IMO còn lại có số lượng vi khuẩn cố định đạm cao hơn và dao động từ 1,5 x 107 đến 2,95 x 107 cfu.g-1 IMO. Như vậy so với tổng mật số vi khuẩn tồn tại trong các hệ IMO trung bình là 269.825.000 cfu.g-1 thì vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong các hệ IMO có mật số trung bình là 66,467,500 cfu.g-1 và chiếm 24,63%. Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của tổ chức nông nghiệp hữu cơ quốc gia Philiphines cho thấy mật số vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong các hệ IMO chiếm 82% (http://organic.da.gov.ph).

4.3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm từ các hệ IMO thu thập

Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc

STT Ký hiệu mẫu Nguồn gốc IMO Tỷ lệ (%)

được trình bày ở Bảng 4.5 và Phụ lục 7. Bảng 4.5 Kết quả phân lập vi khuẩn trong 19 hệ IMO thu thập Số dòng vi khuẩn phân lập 8 7 7 3 6 4 6 4 3 3 5 3 6 4 1 5 5 2 1

Kết quả cho thấy, trong số 83 dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập được có 8 dòng được phân lập từ hệ IMO thu trên đất trồng tre ở huyện Châu Thành, chiếm tỷ lệ 9,64%. Hai hệ IMO thu thập trên đất luân canh ở Phường 5 và đất trồng chuối tại Phường 7, Thành phố Sóc Trăng đã phân lập được 7 dòng vi khuẩn cố định đạm, chiếm tỷ lệ 8,43%. Hệ IMO thu thập trên đất trồng rau tại Phường 3, Thành phố Sóc Trăng và hệ IMO thu thập trên đất trồng ổi tại Kế Sách đã phân lập được 6 dòng vi khuẩn cố định đạm, chiếm tỉ 7,23%. Các hệ IMO thu thập trên đất trồng cam tại Kế Sách, mồng tơi tại Trần Đề và ớt tại Mỹ Tú đều phân lập được 5 dòng vi khuẩn cố

Đất trồng tre Đất luân canh Đất trồng chuối Đất hành tím Đất xà lách Đất trồng lúa Đất dưa hấu Đất cỏ hoang Đất trồng bắp Đất rau xen canh Đất trồng cam Đất trồng bưởi Đất trồng ổi Đất trồng mía Đất rau muống Đất mồng tơi Đất trồng ớt Đất trồng củ lùn Đất trồng ngò TP-1 MQ-2 CP-3 HV-4 RP-5 LM-6 DL-7 CL-8 BT-9 RM-10 CK-11 BK-12 OK-13 MC-14 MP-15 MT-16 OM-17 CP-18 NM-19 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 9,64 8,43 8,43 3,61 7,23 4,82 7,23 4,82 3,61 3,61 6,02 3,61 7,23 4,82 1,20 6,02 6,02 2,41 1,20

định đạm, chiếm tỷ lệ 6,02%. Các hệ IMO thu thập tại đất trồng lúa ở huyện Mỹ Xuyên, đất cỏ hoang tại Long Phú và đất trồng mía ở Cù Lao Dung đã phân lập được 4 dòng vi khuẩn cố định đạm, chiếm tỷ lệ 4,82%. Các hệ IMO thu thập tại đất trồng hành tím Vĩnh Châu, trồng bắp ở Thạnh Trị, trồng rau xen canh ở Mỹ Xuyên và trồng bưởi ở Kế Sách đã phân lập được 3 dòng vi khuẩn cố định đạm, chiếm tỷ lệ 3,61%. Trong khi chỉ có 2 dòng vi khuẩn cố định đạm được phân lập từ hệ IMO thu từ đất trồng củ lùn tại Phường 7, Thành phố Sóc Trăng, chiếm tỷ lệ 2,41% và 1 dòng vi khuẩn cố định đạm được phân lập từ hệ IMO thu tại đất trồng rau muống ở Phường 8, Thành phố Sóc Trăng và đất trồng ngò gai ở Mỹ Tú, chiếm tỷ lệ 1,20%.

Kết quả mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào của 83 dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập cho thấy có sự đa dạng về màu sắc, hình dạng, kích thước, độ nỗi, dạng bìa và bề mặt của khuẩn lạc cũng như hình dạng tế bào vi khuẩn (Hình 4.9 và Phụ lục 7). Trong số đó, vi khuẩn có khuẩn lạc hình tròn, bìa nguyên, màu trắng sữa và mặt nhẵn là chủ yếu. Kích thước của các khuẩn lạc vi khuẩn phát triển trên môi trường thạch Burks sau 5 ngày nuôi cấy cho thấy chúng rất đa dạng và dao động từ 1 đến 7 mm, khuẩn lạc hình tròn chiếm 75%, khuẩn lạc bề mặt bóng màu trắng sữa chiếm 56,3% và 82,5% khuẩn lạc dạng nổi trên bề mặt thạch.

Quan sát trên kính hiển vi cho thấy hình dạng tế bào vi khuẩn có 2 dạng chủ yếu là hình que và hình cầu (Hình 4.10 và Phụ lục 8). Tổng số có 54 dòng vi khuẩn phân lập có dạng hình que và chiếm tỷ lệ 66,3% bao gồm cả que ngắn và dài, trong khi 28 dòng vi khuẩn phân lập có dạng hình cầu và chiếm 33,7%. Trong đó gram âm và gram dương chiếm tỷ lệ gần bằng nhau, với 39 dòng vi khuẩn phân lập là vi khuẩn gram âm (chiếm 47%) và 44 dòng vi khuẩn phân lập là vi khuẩn gram dương (chiếm 53%).

Hình 4.9 Sự đa dạng kích thước và hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn cố định đạm đại diện trên môi trường Burks sau 5 ngày nuôi cấy

Hình 4.10 Sự đa dạng hình thái tế bào của một số dòng vi khuẩn cố định đạm đại diện trên môi trường Burks sau 5 ngày nuôi cấy ở độ phóng đại 100X

4.3.3 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập

4.3.3.1 Hàm lượng đạm tổng số (Nts)

Kết quả khảo sát hàm lượng đạm tổng số (Nts) tăng thêm cao nhất trong 5 ngày nuôi cấy trong môi trường Burks lỏng của 83 dòng vi khuẩn phân lập được trình bày trong Bảng 4.6 cho thấy có sự khác giữa các dòng vi khuẩn về hàm lượng đạm tổng số tăng thêm so với nghiệm thức đối chứng chứa vi khuẩn ở ngày 0 với hàm lượng đạm tổng số dao động từ 0,58 đến 22,55 mg.L-1 N, chứng tỏ các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm sinh học từ trong không khí để sinh trưởng và làm gia tăng đạm tổng số của chúng trong môi trường nuôi cấy. Trong đó có 37 dòng vi khuẩn cố định đạm được phân lập có khả năng cố định hơn 10 mg.L-1 N và lượng N cố định tối đa trong môi trường lỏng là 22,55 mg.L-1 được ghi nhận ở dòng vi khuẩn ký hiệu TP-1.3 phân lập từ hệ IMO tre sau hai ngày nuôi cấy, kế đến là dòng vi khuẩn MP -15.1 và TP-1.7 với lượng đạm tổng số tăng thêm cao nhất của 2 dòng vi khuẩn này lần lượt là 20,81 và 18,35 mg.L-1. Ngoài ra, ở các nghiệm thức chủng 42 dòng vi khuẩn phân lập khác có lượng N tăng thêm dao động từ 1,02 đến 9,76 mg.L-1. Tuy nhiên, nghiệm thức

chủng riêng lẻ 4 dòng vi khuẩn ký hiệu CP-3.6, RP-5.1, CK-11.4 và MC-14.3 có lượng đạm tăng thêm thấp nhất và thấp hơn 1 mg.L-1 N.

4.3.3.2 Hàm lượng đạm hữu dụng (NH4

Hàm lượng NH4

+ hữu dụng cao nhất sau 3 ngày nuôi cấy (4,23 mg.L-1 NH4

+ hữu dụng trong môi trường Burks lỏng khuyết đạm được tổng hợp bởi 83 dòng vi khuẩn phân lập trong 5 ngày nuôi cấy được trình bày trong Bảng 4.6. Không giống như đạm tổng số, hàm lượng đạm hữu dụng trong môi trường Burks lỏng được ghi nhận là thấp hơn so với lượng đạm tổng số và có sự khác biệt ý nghĩa thống kê giữa các dòng vi khuẩn thử nghiệm. Trong đó, 20 dòng vi khuẩn phân lập cố định đạm trong không khí và tạo ra đạm hữu dụng cao trong môi trường nuôi cấy lỏng + dao động từ 1,00 đến 4,23 mg.L-1. Dòng vi khuẩn kí hiệu TP-1.4 tạo với nồng độ NH4 +), tiếp theo là ra lượng NH4 + cao nhất lần lượt đạt 2,79 mg.L-1 dòng vi khuẩn TP-1.2 và RP-5.6 với nồng độ NH4 và 2,43 mg.L-1 sau 1 ngày nuôi cấy. Ngoài ra, các dòng vi khuẩn kí hiệu CP-3.1, OK- + với hàm lượng lên đến 1 mg.L-1. 13.2, BT-9.1 và CL-8.4 cũng đã tổng hợp được NH4 Ngoài ra, 65 dòng vi khuẩn phân lập khác cũng đã cố định được lượng đạm trong không khí, nhưng lượng đạm hữu dụng tạo ra trong môi trường nuôi cấy lỏng thấp hơn 1 mg.L-1 và dao động trong khoảng từ 0,1 đến 0,99 mg.L-1. Tóm lại, dòng vi khuẩn TP-1.2, TP-1.4 và RP-5.6 được xác định là ba dòng vi khuẩn cố định đạm cao nhất trong môi trường Burks lỏng khuyết đạm sau 5 ngày nuôi cấy trong tổng số 83 dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập được.

So với các nghiên cứu trước đây, lượng đạm hữu dụng được tổng hợp bởi các dòng vi khuẩn phân lập trong nghiên cứu này cho kết quả tương đương. Điển hình như nghiên cứu của Davis et al. (1964) đã cho thấy dòng vi khuẩn Pseudomonas methanitrificans cố định được 70 mg.L-1 NH4 + trong hai tháng. Sau đó, Thavasi et al. (2006) cũng cho thấy vi khuẩn Azotobacter chroococcum phân lập từ môi trường biển + trong 96 giờ. Mazumdar bị nhiễm dầu thô có thể cố định được lượng 4,2 mg.L-1 NH4 and Deka (2013) đã đánh giá lượng đạm cố định bởi các dòng vi khuẩn cố định đạm sống tự do được phân lập từ đất bị nhiễm dầu thô dao động trong khoảng từ 9,74 đến + trong thời gian hai tháng. Tương tự, Smita and Goyal (2017) đã 17,45 mg.L-1 NH4 cho thấy lượng đạm cố định bởi vi khuẩn cố định đạm sống tự do từ đất kiềm được tìm thấy cao nhất sau 9-12 ngày nuôi cấy, với nồng độ đạm tổng số dao động từ 14,44 đến 18,73 mg.L-1.

So với các hệ vi sinh vật bản địa trong nghiên cứu này cho thấy hàm lượng đạm tổng số tăng thêm của các dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập cao hơn (lượng đạm cố định dao động trong khoảng 0,58 – 22,55 mg.L-1 N của các dòng vi khuẩn so với 0,03 – 8,13 mg.L-1 của các hệ IMO). Điều này có thể thấy do trong môi trường nuôi cấy khuyết đạm các dòng vi khuẩn cố định đạm đã cố định đạm hiệu quả hơn. Mặt khác trong môi trường nuôi cấy khuyết đạm của các IMO ngoài các vi sinh vật cố định đạm còn có các nhóm vi sinh vật tiêu thụ nitơ khác hoặc nhóm vi sinh vật chuyển hoá đạm

thành các hợp chất đạm dạng khí bay hơi (NO, N2O và N2) nên lượng đạm tổng số tăng thêm trong các hệ IMO thấp hơn. Bảng 4.6 Hàm lượng đạm tổng số và đạm hữu dụng tổng hợp bởi 83 dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập trong môi trường Burks lỏng

+ NH4 (mg.L-1)

STT Ký hiệu STT Ký hiệu Nts (mg.L-1) Nts (mg.L-1)

+ NH4 (mg.L-1) 0,55 2,79 0,86 4,23 0,43 0,28 0,20 0,11 1,37 0,42 0,27 0,12 0,12 0,99 0,01 1,28 0,30 0,16 0,00 0,15 0,51 1,19 0,06 0,63 1,00 0,08 0,24 0,60 0,87 0,00 2,43 0,30 0,21 0,30 0,08 0,61 1,20 0,22 0,40 0,20 1,01 0,42

43 CL-8.2 44 CL-8.3 45 CL-8.4 46 BT-9.1 47 BT-9.2 48 BT-9.3 49 RM-10.1 50 RM-10.2 51 RM-10.3 52 CK-11.1 53 CK-11.2 54 CK-11.3 55 CK-11.4 56 CK-11.5 57 BK-12.1 58 BK-12.2 59 BK-12.3 60 OK-13.1 61 OK-13.2 62 OK-13.3 63 OK-13.4 64 OK-13.5 65 OK-13.6 66 MC-14.1 67 MC-14.2 68 MC-14.3 69 MC-14.4 70 MP-15.1 71 MT-16.1 72 MT-16.2 73 MT-16.3 74 MT-16.4 75 MT-16.5 76 OM-17.1 77 OM-17.2 78 OM-17.3 79 OM-17.4 80 OM-17.5 81 CP-18.1 82 CP-18.2 83 NM-19.1 2,99 12,3 8,58 16,2 8,27 4,63 6,00 14,2 5,87 10,8 8,75 9,09 0,58 6,53 8,52 10,9 10,7 7,21 14,1 13,1 12,9 7,70 16,2 9,65 12,6 0,83 17,6 20,8 7,61 10,1 9,20 3,87 4,40 8,35 12,7 5,57 8,58 15,2 9,76 12,4 17,4 1,12 0,14 1,27 1,01 0,93 0,68 0,33 0,35 1,00 0,49 0,33 0,15 0,27 1,06 0,87 0,32 0,29 0,15 1,23 0,79 0,12 0,90 0,07 0,24 0,10 0,00 0,16 0,27 0,46 0,23 0,22 1,15 1,15 0,05 1,76 1,09 0,85 1,83 0,75 0,23 0,37 11,3 9,46 22,6 14,6 16,9 2,07 18,4 16,5 9,70 10,7 15,5 8,82 8,89 3,37 9,33 5,93 8,41 4,28 9,50 12,1 5,89 2,58 2,51 4,77 3,58 0,80 10,9 8,51 8,52 1,02 10,2 9,25 10,3 10,8 11,1 15,4 13,3 14,8 9,29 10,0 2,90 11,5 TP-1.1 1 TP-1.2 2 TP-1.3 3 TP-1.4 4 TP-1.5 5 TP-1.6 6 TP-1.7 7 8 TP-1.8 9 MQ-2.1 10 MQ-2.5 11 MQ-2.3 12 MQ-2.4 13 MQ-2.2 14 MQ-2.6 15 MQ-2.7 16 CP-3.1 17 CP-3.2 18 CP-3.3 19 CP-3.4 20 CP-3.5 21 CP-3.6 22 CP-3.7 23 HV-4.1 24 HV-4.2 25 HV-4.3 26 RP-5.1 27 RP-5.2 28 RP-5.3 29 RP-5.4 30 RP-5.5 31 RP-5.6 32 LM-6.1 33 LM-6.2 34 LM-6.3 35 LM-6.4 36 DL-7.1 37 DL-7.2 38 DL-7.3 39 DL-7.4 40 DL-7.5 41 DL-7.6 42 CL-8.1

Đặc biệt, kết quả trong nghiên cứu này cũng tương tự với các nghiên cứu khác ở trong nước. Trong đó, nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương Oanh và ctv. (2013) đã phân lập từ đất vùng rễ lúa và đã tuyển chọn 5 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm + cố định dao động từ 3,75 đến 4,67 và tổng hợp IAA khá cao, với hàm lượng NH4 mg.L-1. Thêm vào đó, Nguyễn Thị Huỳnh Như và ctv. (2013) đã đánh giá khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây chuối cho thấy hàm lượng được cố +. Tương tự, Nguyễn Thị Thu Hằng và định dao động từ 3,16 đến 4,85 mg.L-1 NH4 Nguyễn Thị Thủy (2015) đã phân lập và tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn Azotobacter với khả năng cố định đạm tương ứng là 3,36 và 3,32 mg.L-1 NH4 +. Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp (2018) đã đánh giá 2 dòng vi khuẩn chịu mặn và cho thấy chúng có khả năng cố định đạm lên đến 2,71 và 3,73 mg.L-1 NH4

Tóm lại cả 83 dòng vi khuẩn phân lập đều cho thấy có khả năng cố định đạm sinh học trong quá trình sinh trưởng trong môi trường Burks lỏng khuyết đạm, trong số đó có các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao và tạo ra lượng đạm hữu dụng trong môi trường nuôi cấy khá. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng đối với cây trồng khi mà các vi khuẩn này sống nội sinh hoặc sống trong đất vùng rễ của chúng. Để đảm bảo khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập và tuyển chọn cần đánh giá, kiểm tra có hay không sự hiện diện gen nifH trong cấu trúc di truyền của chúng.

4.3.4 Gen nifH trong cấu trúc di truyền của một số dòng vi khuẩn cố định đạm tuyển chọn

Do giới hạn về kích thước và số giếng trên gel agarose, hai mươi hai dòng vi khuẩn có hàm lượng đạm tổng số, đạm hữu dụng cố định được cao đã được chọn để kiểm tra sự hiện diện của gen nifH trong cấu trúc di truyền vi khuẩn. Kết quả khuếch đại trình tự chuỗi mục tiêu 360 bp của gen nifH có chức năng cố định đạm sinh học của 22 dòng vi khuẩn cố định đạm tuyển chọn được trình bày ở Hình 4.11 cho thấy cặp mồi polF/polR được sử dụng trong nghiên cứu này đã thành công trong việc khuếch đại gen chức năng nifH từ ADN của 22 dòng vi khuẩn cố định đạm được chọn để kiểm tra và còn cho thấy có sự khác biệt rõ ràng về kích thước của các sản phẩm gen nifH giữa các dòng được thử nghiệm. Kích thước của chuỗi mục tiêu của gen nifH tương đương 400 bp phù hợp với nghiên cứu trước đây của Poly et al. (2001a, 2001b) và Nguyễn Hữu Hiệp và ctv. (2005). Điều này cho thấy 22 dòng vi khuẩn được chọn để kiểm tra gen chức năng nifH cho thấy chúng có tiềm năng cố định đạm sinh học. Kết quả này phù hợp với kết quả khảo sát gen nifH trong các hệ IMO trong nghiên cứu này. Do đó, vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiện môi trường nuôi cấy thiếu nguyên tố đạm, vì các gen chức năng hoạt động để chúng có thể cố định đạm từ không khí để sử dụng cho quá trình sinh trưởng.

500 bp

band mục tiêu

Hình 4.11 Kết quả PCR với cặp mồi polF/polR chuyên biệt cho gen nifH có chức năng cố định đạm sinh học của 22 dòng vi khuẩn cố định đạm *Ghi chú: giếng 1, 15: thang chuẩn 100 bp; giếng 2, 17: đối chứng âm (H2O); giếng 3: TP-1.2; giếng 4: TP-1.3; giếng 5: TP-1.4; giếng 6: TP-1.5; giếng 7: MQ-2.1; giếng 8: MQ-2.5; giếng 9: CP3.1; giếng 10: CL-8.2; giếng 11: DL-7.2; giếng 12: DL-7.3; giếng 13: OM-17.2; giếng 14: OM-17.5; giếng 16: MT-16.5; giếng 18: CK-11.1; giếng 19:RP-5.4; giếng 20: BK-12.3; giếng 21: MC-14.4; giếng 22: CP-18.2; giếng 23: BT-9.1; giếng 24:CL-8.4; giếng 25: HV-4.3; giếng 26: MP-15.1.

Ngoài ra kết quả phân tích cũng cho thấy trong cấu trúc di truyền gen chức năng nifH của 22 dòng vi khuẩn này có thể thấy chúng có sự đa dạng di truyền trong kích thước gen nifH và có thể xếp thành 8 nhóm: Nhóm 1: nhóm chứa các dòng vi khuẩn chỉ có 1 band mục tiêu với kích thước 400 bp gồm các giếng 10, 11, 12,19, 20, 21, 22 và 26 thuộc dòng các dòng vi khuẩn kí hiệu theo thứ tự CL-8.2, DL-7.2, DL-7.3, RP- 5.4; BK-12.3; MC-14.4; CP-18.2 và MP-15.1; Nhóm 2: nhóm chứa các dòng vi khuẩn có 1 band 400 bp và 1 band kích thước 600 bp gồm giếng 16 thuộc dòng vi khuẩn MT- 16.5; Nhóm 3: nhóm chứa các dòng vi khuẩn có 1 band 400 bp và 1 band kích thước 800 bp gồm các giếng 3, 6, 7, 8, 14, 18 và 23 thuộc các dòng vi khuẩn TP-1.2, MQ- 2.1, MQ-2.5, OM-17.5, RP-5.4, CK-11.1, BT-9.1; Nhóm 4: nhóm chứa dòng vi khuẩn có 1 band mục tiêu 400 bp, và 1 band > 1.500 bp gồm giếng 4 và 24 thuộc dòng vi khuẩn TP-1.3 và CL8.4; Nhóm 5: nhóm chứa các dòng vi khuẩn có 1 band mục tiêu 400 bp, 1 band 900 và 1 band kích thước 1200 bp gồm giếng 25 thuộc dòng vi khuẩn HV-4.3; Nhóm 6: nhóm chứa các dòng vi khuẩn có 1 band 400 bp, 1 band kích thước 600 bp, 1 band kích thước >1500 bp gồm giếng 13 thuộc dòng vi khuẩn OM-17.2; Nhóm 7: nhóm chứa các dòng vi khuẩn có 1 band 400 bp và 1 band kích thước 700 bp và 1 band > 1.500 bp gồm giếng 5 thuộc dòng vi khuẩn TP-1.4; Nhóm 8: nhóm chứa các dòng vi khuẩn có 1 band 400 bp, 1 band kích thước 800 bp, 1 band kích thước 1200 và 1 band kích thước >1.500 pb gồm giếng 9 thuộc dòng vi khuẩn CP-3.1.

Trên cơ sở đánh giá khả năng sinh trưởng mạnh trong điều kiện môi trường nuôi cấy khuyết đạm của các dòng vi khuẩn nhờ khả năng cố định dựa vào hàm lượng đạm tổng số và đạm hữu dụng cao nhất đã tuyển chọn 50 dòng vi khuẩn để tiếp tục đánh giá khả năng sinh tổng hợp IAA của chúng trong môi trường Burks khuyết đạm có bổ sung 100 mg.L-1 tryptophan.

4.3.5 Khả năng tổng hợp IAA của 50 dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập được tuyển chọn

Khả năng tổng hợp IAA của 50 dòng vi khuẩn cố định đạm tuyển chọn trong môi trường Burks khuyết đạm có bổ sung 100 mg.L-1 tryptophan trình bày trong Bảng 4.6 cho thấy hàm lượng IAA được sinh ra bởi các dòng vi khuẩn khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05) và có sự biến động lớn về nồng độ IAA tổng hợp ở các thời điểm thu mẫu. Bảng 4.7 Nồng độ IAA tổng hợp bởi 50 dòng vi khuẩn cố định đạm tuyển chọn trong môi trường Burks lỏng khuyết đạm có bổ sung 100 mg.L-1 tryptophan sau 10 ngày nuôi cấy

Nồng độ IAA (mg.L-1) STT Cao nhất

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Ký hiệu dòng VK TP-1.1 TP-1.2 TP-1.3 TP-1.4 TP-1.5 TP-1.7 TP-1.8 MQ-2.1 MQ-2.5 MQ-2.3 CP-3.1 CP-3.5 CP-3.7 HV-4.3 RP-5.2 RP-5.6 LM-6.2 LM-6.3 LM-6.4 DL-7.1 DL-7.2 DL-7.3 DL-7.5 DL-7.6 CL-8.1 CL-8.2 CL-8.3 CL-8.4 BT-9.1 RM-10.2 RM-10.3 CK-11.1 CK-11.5 BK-12.2 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 Ngày 10 - - 27,5 21,9 23,8 12,9 - 15,1 19,0 19,8 - - 1,99 6,58 - - 21,4 2,84 4,30 - - 3,25 1,70 4,50 20,3 12,9 1,90 12,7 1,52 - 9,65 3,80 1,90 - - - 1,90 15,4 18,3 0,91 - 14,6 20,9 16,7 - - 3,19 - - - 4,59 - - - - 1,29 2,92 - 0,29 20,6 - - - - 1,99 14,5 1,90 - 4,40 - 10,2 27,0 27,6 5,95 - 24,0 35,3 31,2 - - 5,37 0,60 - - 7,47 - 1,35 - - 6,29 - 3,19 - 24,4 - 5,72 - - 2,10 14,3 - - 4,42 - 19,9 23,3 26,1 9,9 - 22,1 22,1 26,1 - 0,23 6,11 - 17,3 - - 3,16 3,89 - - 6,08 - 2,37 11,6 9,59 1,43 12,5 1,67 0,85 - 9,53 - - - 1,75 2,19 2,78 1,61 0,18 - 8,54 7,69 7,40 - 2,05 - 1,67 0,61 - 0,94 3,51 2,75 - - 39,3 1,40 1,90 0,94 20,8 0,29 0,53 0,35 - - 18,2 0,35 - 4,42 1,75 27,5 27,0 27,6 12,9 0,00 24,0 35,3 31,2 0,00 2,05 6,11 6,58 17,3 0,00 21,4 3,51 4,30 0,00 0,00 39,3 2,92 4,50 20,3 24,4 1,90 12,7 5,64 0,85 9,65 18,2 3,22 0,00

Nồng độ IAA (mg.L-1) STT Cao nhất

*Ghi chú: “-” không phát hiện IAA

Tổng cộng có 44 trong số 50 dòng vi khuẩn cố định đạm khảo sát có khả năng tổng hợp IAA trong môi trường Burks lỏng bổ sung 100 mg.L-1 tryptophan, với hàm lượng IAA tổng hợp dao động mạnh từ 0,85 đến 58,0 mg.L-1 và thời gian để đạt lượng IAA cao nhất là rất khác nhau giữa các dòng vi khuẩn. Trong đó có 18 dòng vi khuẩn tổng hợp được IAA cao hơn 20 mg.L-1 trong môi trường lỏng, 7 dòng vi khuẩn tổng hợp được lượng IAA dao động từ 10 đến 20 mg.L-1, 20 dòng vi khuẩn tổng hợp IAA với lượng thấp hơn 10 mg.L-1 IAA và 6 dòng vi khuẩn không có khả năng sản sinh IAA trong điều kiện môi trường khuyết đạm có bổ sung 100 mg.L-1 tryptophan. Đặc biệt, lượng IAA được tổng hợp cao nhất được ghi nhận tại thời điểm sau 2 ngày nuôi cấy với dòng vi khuẩn MT-16.5, phân lập từ IMO mồng tơi và đạt 58,0 mg.L-1, tiếp theo là dòng vi khuẩn OM-17.2 phân lập từ hệ IMO ớt với nồng độ IAA trong môi trường nuôi cấy đạt 41,9 mg.L-1 cao nhất ở thời điểm 2 ngày sau nuôi cấy. Bên cạnh đó, 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn khác ký hiệu là DL-7.3, BK-12.3 và MT-16.2 tổng hợp được lượng IAA cao nhất lần lượt là 39,3; 31,2 và 28,9 mg.L-1. Dòng vi khuẩn CP-18.2 được phân lập từ hệ IMO củ lùn đạt nồng độ IAA cao nhất sau 4 ngày nuôi cấy với lượng 34,6 mg.L-1. Trong khi 4 dòng vi khuẩn cố định đạm khác ký hiệu TP- 1.4, TP-1.5, MQ-2.1 và MQ-2.5 tổng hợp được lượng IAA cao nhất sau 6 ngày nuôi cấy với nồng độ lần lượt 27,0; 27,6; 35,3 và 31,2 mg.L-1. Hàm lượng IAA được tổng hợp thấp nhất được tìm thấy ở các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn ký hiệu OK- 13.2, DL-7.1 và CL-8.3 được phân lập từ các hệ IMO ổi, dưa hấu và cỏ hoang với nồng độ IAA thấp hơn 2 mg.L-1. Đặc biệt, không phát hiện IAA trong môi trường nuôi cấy Burks lỏng chủng các dòng vi khuẩn TP-1.8, TP-1.2, CP-3.1 RP-5.6 RM-10.2 và BK-12.2. Tóm lại, trong số 50 dòng vi khuẩn cố định đạm tuyển chọn được khảo sát

35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Ký hiệu dòng VK BK-12.3 OK-13.2 OK-13.3 OK-13.4 OK-13.6 MC-14.4 MC-14.5 MP-15.1 MT-16.2 MT-16.3 MT-16.5 OM-17.2 OM-17.3 OM-17.5 CP-18.2 NM-19.1 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 Ngày 10 22,8 - 16,0 4,21 15,6 15,8 9,42 - 16,5 20,5 25,2 30,5 24,9 20,9 20,5 7,81 20,5 - - - 4,30 -4,04 2,11 - 27,8 13,6 30,3 37,4 6,05 11,4 34,6 0,76 21,8 - 1,58 2,37 6,67 16,2 9,21 3,54 19,1 27,5 29,4 33,1 32,6 29,5 23,9 7,81 31,2 1,14 2,08 2,66 6,08 2,19 3,33 3,42 28,9 7,19 58,0 41,9 4,36 6,70 26,9 1,46 26,6 - 1,61 0,43 6,35 12,8 3,39 - 21,6 25,8 32,8 37,3 21,0 19,2 23,2 0,40 31,2 1,14 16,0 4,21 15,6 16,2 9,42 3,54 28,9 27,5 58,0 41,9 32,6 29,4 34,6 7,81

chỉ có dòng vi khuẩn MT-16.5 và OM-17.2 cho hoạt động tổng hợp IAA diễn ra sớm, hàm lượng IAA cao và ổn định tại các thời điểm khảo sát.

Kết quả nghiên cứu này cho thấy khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập từ các hệ vi sinh vật bản địa IMO tương đương với các dòng vi khuẩn Azotobacter sp., Pseudomonas sp. và Bacillus sp. trong nghiên cứu trước đây của Ahmad et al. (2005) và Ahmad et al. (2008) hay các dòng vi khuẩn Bacillus magisterium, Lactobacillus casei, Bacillus subtilis, Bacillus cereus và Lactobacillus acidophilus của tác giả Mohite, (2013). So với các nghiên cứu gần đây thì các dòng vi khuẩn của nghiên cứu này cũng cho kết quả tương tự với các dòng vi khuẩn Rhizobium sp. với nồng độ IAA được tổng hợp cao nhất dao động từ 20,4 đến 165,6 mg.L-1 trong nghiên cứu của Kucuk and Cevheri, (2016) và các dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập tại vùng rễ cây cỏ ngọt Stevia rebaudiana trong nghiên cứu của Chandra et al. (2018) hay các dòng vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ cây dừa Serratia marcescens subsp và Rhodocococus aff. qingshengii tổng hợp IAA cao nhất dao động từ 18,06 đến 64,75 mg.L-1 trong nghiên cứu của Hasuty et al. (2018) hay dòng Streptomyces fradiae NKZ-259 tổng hợp được 42,35 mg.L-1 IAA của Myo et al. (2019) hoặc các dòng vi khuẩn Arozobacter choococcum, Pseudomonas sp., Bacillus sp, Rheinhemera sp., Klebsiella sp., Agrobacter sp. và Raoultella sp. trong nghiên cứu của Wang et al., (2020).

So với các nghiên cứu trong nước cho thấy khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn cố định đạm tuyển chọn khảo sát trong nghiên cứu này tương đương với các dòng vi khuẩn nội sinh hoặc các dòng vi khuẩn ở vùng rễ của các cây trồng tại việt nam đã được phân lập, đánh giá và công bố (Nguyễn Thị Phương Oanh và ctv., 2013 ; Nguyễn Thị Huỳnh Như và ctv., 2013; Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thị Thủy,2015; Nguyễn Khởi Nghĩa, 2017; Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp, 2018) Kết quả so sánh với 20 hệ IMO về khả năng tổng hợp IAA trong nghiên cứu này cho thấy các khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập được từ các hệ IMO thấp hơn so với các hệ IMO. Cụ thể như sau, cả 20 hệ IMO đều tổng hợp IAA với hàm lượng IAA dao động từ 9, 23 đến 74, 01 mg.L-1, cao hơn so với khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập (hàm lượng IAA tổng hợp dao động từ 1,14 đến 58,04 mg.L-1). Nghiên cứu trước đây của Phua et al. (2012) đã phân lập được 56 dòng vi khuẩn từ 5 hệ vi sinh vật bản địa IMO và kết quả đánh giá chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của chúng đã cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập này có các chức năng khác nhau về khả năng hoà tan lân, tổng hợp IAA, cố định đạm, đối kháng sinh học…cũng như sự đa chức năng của các dòng vi khuẩn trong các mẫu IMO. Như vậy so với các kết quả nghiên cứu trước đây, có thể thấy rằng các vi khuẩn cố định đạm được phân lập từ các hệ IMO trong nghiên cứu này có khả năng tổng hợp IAA tương đương và phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả trước đó. Do đó các dòng vi khuẩn này có tiềm năng ứng dụng rất cao giúp kích thích sinh trưởng cây trồng vì theo Saharan and Nehra, (2011), quá trình sinh trưởng của thực vật

không những chịu sự chi phối bởi IAA nội sinh mà con chịu tác động không nhỏ của lượng auxin bên ngoài trong đó có một phần đóng góp không nhỏ từ vi sinh vật. Có nhiều loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp hormone thực vật IAA. Nồng độ của IAA ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật. IAA ở nồng độ thấp có thể kích thích sinh trưởng của cây trồng nhưng lại có thể gây ức chế khi ở nồng độ cao (Frankenberger and Arshad, 1995). Mật số của vi khuẩn tổng hợp IAA xung quanh rễ sẽ quyết định nồng độ auxin. Các cây trồng khác nhau sẽ đáp ứng khác nhau với sự thay đổi về nồng độ auxin (Sarwar and Frankenberger, 1994) và loại vi sinh vật (Ahmad et al., 2005). Các chủng vi sinh vật tổng hợp IAA và IAM trong đất ở điều kiện môi trường đất bình thường và chúng giúp tăng tốc độ tăng trưởng và năng suất của lúa mì đạt mức tối đa (Khalid et al., 2004). Tuy nhiên, các chủng vi sinh vật sản xuất IAA thấp hơn nhưng liên tục và ổn định cũng sẽ giúp cải thiện năng suất cây trồng (Tsavkelova et al., 2007).

Tóm lại, kết quả nghiên cứu này cho thấy có 18 dòng vi khuẩn thể hiện không chỉ có chức năng cố định đạm sinh học tốt mà còn có chức năng sản sinh IAA khá cao. Trong số đó, 9 dòng vi khuẩn tuyển chọn thể hiện khả năng cố định đạm và sinh tổng hợp IAA cao và ổn định gồm các dòng vi khuẩn ký hiệu TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.1, MQ- 2.5, BK-12.3, MT-16.5, OM-17.2, OM-17.5 và CP-18.2 và các dòng vi khuẩn này đã được chọn để thực hiện giải trình tự các chuỗi 16S-rRNA. Ngoài ra dòng vi khuẩn TP- 1.2 cũng được chọn giải trình tự gen 16S-rRNA vì có khả năng cố định đạm và tạo ra lượng đạm hữu dụng cao trong môi trường nuôi cấy. Như vậy tổng cộng có 10 dòng vi khuẩn vừa có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA được chọn để giải trình tự gen 16S-rRNA.

4.3.6 Kết quả giải trình tự gen 16S-rRNA của 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn

Kết quả giải trình tự gen 16S-rRNA của 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn được trình bày trong Phụ lục 9. Khi so sánh 1 đoạn gen mã hoá gen 16S-rRNA của 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen thế giới BLAST N (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast .cgi.) kết quả cho thấy chúng thuộc 5 chi khác nhau (Bảng 4.8) gồm: Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Paraburkholderia và Pseudomonas.

Đặc biệt, kết hợp với các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng và gram tế bào, 3 dòng vi khuẩn phân lập từ hệ IMO đất trồng tre là TP-1.2, TP-1.3 và TP-1.4 có chỉ số tương đồng 99% lần lượt với 3 dòng vi khuẩn Pseudomonas veronii, Paraburkholderia tropica và Paenibacillus cineris. Do đó, chúng được xác định là có mối quan hệ gần gũi với các dòng vi khuẩn này và được định danh lần lượt như là Pseudomonas veronii TP-1.2, Paraburkholderia tropica TP-1.3 và Paenibacillus cineris TP-1.4. Ba dòng vi khuẩn này thuộc 3 chi vi khuẩn khác nhau cho thấy các vi khuẩn cố định đạm phân lập từ mẫu IMO đất trồng tre có sự đa dạng cao về thành phần loài vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA. Ngoài ra, 2 dòng vi khuẩn ký hiệu MQ-2.5 và OM-17.5 phân lập từ hệ IMO đất luân canh và đất trồng ớt có độ tương

đồng di truyền 99% với dòng vi khuẩn Bacillus megaterium và do đó, chúng được xác định là có mối quan hệ gần gũi với các dòng vi khuẩn này và được định danh lần lượt như là Bacillus megaterium MQ-2.5 và Bacillus megaterium OM-17.5. Trong khi dòng vi khuẩn MQ-2.1 có chỉ số tương đồng cao (99%) với loài vi khuẩn Bacillus aryabhattai, do đó, dòng vi khuẩn MQ-2.1 có mối quan hệ gần gũi với vi khuẩn Bacillus aryabhattai và dòng vi khuẩn này được định danh như là Bacillus aryabhattai MQ-2.1. Dòng vi khuẩn BK-12.3 phân lập từ hệ IMO đất vườn bưởi có trình tự tương đồng 99% với dòng vi khuẩn Bacillus cereus nên được định danh là Bacillus cereus BK-12.3. Hai dòng vi khuẩn MT-16.5 và OM-17.2 được phân lập từ hệ IMO mồng tơi và ớt có trình tự tương đồng cao (99%) với dòng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae và chúng được xác định là Klebsiella pneumoniae MT-16.5 và Klebsiella pneumoniae OM-17.2. Dòng vi khuẩn CP-18.2 có trình tự tương đồng cao (99%) với dòng Pseudomonas boreopolis và được định danh là Pseudomonas boreopolis CP-18.2. Bảng 4.8 Sự tương đồng giữa 10 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA được tuyển chọn so với các dòng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI

Dòng vi khuẩn trên NCBI

Định danh

Số đăng kí

Dòng vi khuẩn

Ký hiệu dòng vi khuẩn

MH190219.1 Pseudomonas veronii TP-1.2

Paraburkholderia tropica TP-1.3

Bacillus cereus BK-12.3

MF662488.1 Paenibacillus cineris TP-1.4 MH041178.1 Bacillus aryabhattai MQ-2.1 MK966390.1 Bacillus megaterium MQ-2.5 FJ483513.1 MN691704.1 Klebsiella pneumoniae MT-16.5 MK834722 Klebsiella pneumoniae OM-17.2 MN826385.1 Bacillus megaterium OM-17.5

TP-1.2 TP-1.3 TP-1.4 MQ-2.1 MQ-2.5 BK-12.3 MT-16.5 OM-17.2 OM-17.5 CP-18.2

Chỉ số tương đồng (%) Pseudomonas veronii 99,0 Paraburkholderia tropica MK336433 99,0 Paenibacillus cineris 99,0 Bacillus aryabhattai 99,0 Bacillus megaterium 99,0 99,0 Bacillus cereus 99,0 Klebsiella pneumoniae 99,0 Klebsiella pneumoniae 99,0 99,0

Bacillus megaterium Pseudomonas boreopolis AJ864722.1

Pseudomonas boreopolis CP-18.2

Nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA hiệu quả thuộc các chi Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Paraburkholderia, Pseudomonas,… Điển hình như nghiên cứu của Ahmad et al. (2005), Ahmad et al. (2008) và Mohite, (2013) đã cho thấy các dòng vi khuẩn Bacillus sp., Bacillus magisterium, Bacillus subtilis và bacillus cereus đã cố định đạm và tổng hợp IAA khá tốt. Ngoài ra, Pankaj et al. (2012) đã phân lập và tuyển chọn được dòng vi khuẩn Bacillus sp. BPR7 đa chức năng từ vùng rễ cây đậu, trong đó chủng BPR7 có khả năng sinh tổng hợp IAA, siderophore, phytase, acid hữu cơ, các enzyme ACC deaminase, cyanogens, enzyme lytic, oxalate oxyase, cellulose,…. Gần đây Wang et al., (2020) đã báo cáo các dòng vi khuẩn Pseudomonas sp., Bacillus sp., Klebsiella sp. có tiềm năng lớn trong cố định đạm và tổng hợp IAA. Nghiên cứu khác của Dhara et al. (2009) đã tuyển chọn được các dòng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae phân lập từ thân rễ của lúa mì có khả năng tổng hợp IAA cao. Đặc biệt, Klebsiella pneumoniae K8 có thể tổng hợp IAA tối đa ở mức 27,5 mg.L-1 trong môi trường có bổ sung tryptophan 1 mg.mL-1 sau 72 giờ nuôi cấy. Wang et al., 2020 đã cho thấy 8 dòng vi khuẩn cố định đạm

Klebsiella có khả năng tổng hợp IAA từ mạnh đến rất mạnh. Nghiên cứu trước đây của Ding et al. (2005) đã phân lập vi khuẩn cố định đạm từ vùng rễ của lúa mì, ngô, lúa mạch và liễu ở Beijing và kết quả cho thấy 2 trong số 7 dòng vi khuẩn phân lập cho thấy khả năng cố định nitơ cao và thuộc các dòng vi khuẩn Paenibacillus sp. và 3 trong số chúng được xác định là Bacillus megaterium với chỉ số tương đồng cao là 98% và 100%. Tương tự, Rivas et al. (2005) đã phân lập được 3 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm lớn từ thân rễ của cây họ đậu (Cicer arietinum) ở Argentina. Kết quả cho thấy cả 3 dòng vi khuẩn đều thuộc chi Paenibacillus và xác định chúng là Paenibacillus cineris LMG 18439T với chỉ số tương đồng là 99,6%, Paenibacillus favisporus LMG 20987T với chỉ số tương đồng là 99,4% và chỉ số tương tự cho Paenibacillus azoreducens DSM 13822T. Tiếp theo, Liu et al. (2019) đã phân lập được 179 dòng vi khuẩn cố định đạm trong đất vùng rễ các loại cây trồng khác nhau trong đó có 25 dòng vi khuẩn thuộc chi Paenibacillus và 22 trong 25 dòng vi khuẩn cố định đạm này có khả năng tổng hợp IAA và 21 trong số chúng có khả năng đối kháng 6 loại nấm gây bệnh cho cây trồng. Trong đánh giá tổng quan về chi vi khuẩn Paenibacillus, Grady et al. (2016) đã chứng minh bằng nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các dòng vi khuẩn trong chi này có đa chức năng như cố định đạm, hoà tan lân, tổng hợp IAA, hoà tan sắt, đối kháng sinh học, phân huỷ sinh học… Vì thế Tiwari et al. (2019) đã nhận định và chỉ ra vai trò và tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của phát triển nông nghiệp bền vững của các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA. Ngoài ra, đối với vi khuẩn thuộc chi Paraburkholderia, nghiên cứu của Rojas- Rojas et al.(2017) đã phân lập được dòng vi khuẩn cố định đạm sống tự do trong đất vùng rễ cây cà chua là Paraburkholderia caballeronis TNe-841T. Nhiều dòng vi khuẩn cố định đạm thuộc chi Paraburkholderia đã được phân lập và đánh giá bởi Choi and Im, (2018), cùng thời gian đó Silva et al. (2018) đã phân lập và giải trình tự genome của vi khuẩn cố định đạm Paraburkholderia tropica Ppe8. Islam et al. (2013) đã xác định 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas sp. và 1 dòng vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ đất trồng lúa có khả năng sinh IAA và cố định đạm với lượng ethylen sinh ra là 35,3 nM/h/g. Tương tự, Li et al. (2017) đã phân lập được 100 dòng vi khuẩn Pseudomonas từ đất vùng rễ mía ở Quảng Tây, Trung Quốc, trong đó 30 dòng tuyển chọn cho thấy có khả năng sinh IAA dao động từ 13,12 đến 312,07 µg.mL-1 trong điều kiện có bổ sung tryptophan và có khả năng sinh ethylen là 6,16-108,30 µmol/h/mL.

Kết quả phân tích tương quan di truyền của 10 dòng vi khuẩn này bằng phương pháp UPGMA được trình bày ở Hình 4.12 cũng cho thấy chúng có mối quan hệ di truyền chặt chẽ với nhau và có thể thấy chúng thuộc 2 nhóm quan hệ di truyền. Trong nhóm thứ nhất, các dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus bao gồm Bacillus aryabhattai MQ-2.1, Bacillus megaterium MQ-2.5 và Bacillus megatrium OM-17.5 có mối quan hệ gần gũi với nhau và quan hệ gần với dòng Bacillus cereus BK-12.3 dù chúng được thu thập ở 3 địa điểm khác nhau và tất cả chúng có mối quan hệ gần với Paenibacillus cineris TP-1.4. Trong nhóm thứ 2, có 2 nhóm nhỏ, nhóm gồm các dòng vi khuẩn

100

Klebsiella pnemoniae OM-17.2 và dòng Klebsiella pnemoniae MT-16.5 và nhóm 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas veronii TP-1.2 và Pseudomonas boreopolis CP-18.2 cả 2 nhóm nhỏ này có mối quan hệ gần nhau và quan hệ di truyền mật thiết với dòng Paraburkholderia tropica TP-1.3. Nhìn chung, có sự đa dạng về di truyền của 10 dòng vi khuẩn cố định đạm và sinh tổng hợp IAA trong các hệ IMO thu thập từ các hệ thống cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng.

Bacillus arybhattai MQ-2.1

Bacillus megaterium OM-17.5

Bacillus megaterium MQ-2.5

Bacillus cereus BK-12.3

Paenibacillus cineris TP-1.4

Paraburkholderia tropica TP-1.3

Pseudomonas boreopolis CP-18.2

Pseudomonas veronii TP-1.2

Klebsiella pneumoniae OM-17.2

Klebsiella pneumoniae MT-16.5

Hình 4.12 Mối quan hệ di truyền giữa 10 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn dựa trên phương pháp phân tích UPGMA

Tóm lại, có 44 dòng vi khuẩn có cả 2 chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA được phân lập từ 19 hệ vi sinh vật bản địa ở tỉnh Sóc Trăng. trong đó có 18 dòng vi khuẩn cho thấy khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA cao. Trong số các dòng vi khuẩn này, 10 dòng vi khuẩn ký hiệu là TP-1.2, TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.1, MQ-2.5, BK-12.3, MT-16.5, OM-17.2, OM-17.5 và CP-18.2 được xác định về mặt di truyền thuộc các chi Paraburkholderia, Paenibacillus, Bacillus, Klebsiella và Pseudomonas. Chúng có thể có tiềm năng lớn trong việc kích thích tăng trưởng cây trồng và do đó chúng có thể có tiềm năng cho canh tác nông nghiệp bền vững ở tỉnh Sóc Trăng.

Nhằm tuyển chọn các dòng vi khuẩn có cả 2 chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA khá tốt và ổn định cũng như đảm bảo an toàn trong canh tác và tiêu dùng rau, 8 dòng vi khuẩn được tuyển chọn tiếp tục đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng và nảy mầm hạt rau muống và hạt cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm gồm Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP-1.4, Bacillus aryabhattai MQ-2.1, Bacillus megaterium MQ-2.5, Klebsiella pneumoniae MT-16.5, Klebsiella pneumoniae OM-17.2, Bacillus megaterium OM-17.5 và Pseudomonas boreopolis CP-18.2. Trong khi, 2 dòng vi khuẩn còn lại gồm Pseudomonas veronii TP-1.2 chỉ có chức năng cố định đạm và dòng Bacillus cereus BK-12.3 có thể sinh nội bào tử có độc

101

tố (Bottone, 2010; McDowell et al., 2020) do đó 2 dòng vi khuẩn này không được chọn để thực hiện cho các nghiên cứu tiếp theo ở điều kiện phòng thí nghiệm.

Tám dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA cao ký hiệu TP- 1.3, TP-1.4, MQ-2.1, MQ-2.5, MT-16.5, OM-17.2, OM-17.5 và CP-18.2 và hỗn hợp 8 dòng vi khuẩn được tuyển chọn để bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chúng lên sự nảy mầm và sinh trưởng rau muống và cải xanh. Đồng thời 5 hệ IMO có khả năng cố định đạm khá tốt, chứa 8 dòng vi khuẩn này bao gồm hệ IMO tre, củ lùn, mồng tơi, ớt, hỗn hợp cũng được tuyển chọn để đánh giá ảnh hưởng của chúng lên sự nảy mầm và sinh trưởng rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới. đây cũng là các IMO có khả năng cố định đạm tốt trong các đánh giá bên trên (mục 4.2.2).

4.4 Nội dung 4: Ảnh hƣởng của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn và các IMO chứa các dòng vi khuẩn này lên khả năng kích thích nảy mầm và sinh trƣởng cây rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm

Kết quả đánh giá 8 dòng vi khuẩn và 5 IMO tuyển chọn cho thấy chúng có hiệu quả kích thích nảy mầm của hạt cũng như kích thích sinh trưởng của rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm.

4.4.1 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống của 8 dòng vi khuẩn tuyển chọn

4.4.1.1 Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn lên khả năng nảy mầm hạt rau muống

Kết quả khảo sát ảnh hưởng mật số của 8 dòng vi khuẩn lên tỷ lệ nảy mầm của

hạt rau muống sau 6 ngày thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.9. Bảng 4.9 Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn lên tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống sau 6 ngày thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm

Tỷ lệ nảy mầm (%)

Nghiệm thức (cfu.mL-1)

TP- 1.3

TP- 1.4

MQ- 2.1

MQ- 2.5

MT- 16.5

OM- 17.2

OM- 17.5

CP- 18.2

Đối chứng 105 106 107 108 109

66,0d 75,6b 82,3a 74,8b 68,9c 75,6b

66,0f 83,7b 85,5a 72,2e 77,8c 74,5d

66,0d 72,6b 77,8a 69,6c 65,9b 65,2d

66,0e 76,7c 83,0a 78,9b 83,3a 73,3d

66,0c 64,4d 83,7a 64,4d 77,0b 63,3e

66,0c 75,6a 76,6a 72,7b 76,7a 60,7d

66,0e 67,8d 84,1a 85,6a 72,2c 77,8b

66,0c 74,8a 75,9a 75,4a 75,2a 72,2b

Hỗn hợp 8 dòng VK 66,0d 75,6a 76,0a 74,1b 68,9c 75,6a

CV(%)

7,30

8,97

6,71

8,00

8,69

10,3

11,4

4,89

5,46

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có phần chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Kết quả cho thấy khi chủng vi khuẩn vào hạt rau muống giúp gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với

102

nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Mật số vi khuẩn khác nhau cũng ảnh hưởng lên tỷ lệ nảy mầm của hạt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau. Trong đó, các dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.1 và MT-16.5 cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất ở mật số 106 cfu.mL-1 và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức chủng các mật số còn lại trong cùng 1 dòng vi khuẩn. Trong khi đó, các dòng vi khuẩn MQ-2.5, OM-17.2, OM-17.5 và CP-18.2 cho tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh các nghiệm thức có mật số vi khuẩn khác nhau của cùng 1 dòng vi khuẩn. Như vậy, mật số 106 cfu.mL-1 là mật số vi khuẩn thích hợp nhất cho cả 8 dòng vi khuẩn thử nghiệm giúp kích thích gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống ở điều kiện phòng thí nghiệm.

Kết quả phân tích ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn thử nghiệm ở cùng mật số ngâm hạt là 106 cfu.mL-1 lên tỷ lệ nảy mầm của rau muống sau 6 ngày thí nghiệm cho thấy cả 8 dòng vi khuẩn đều giúp gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn với tỷ lệ nảy mầm cao hơn dao động từ 9,9 đến 19,5 %. Trong đó, năm dòng vi khuẩn TP-1.4, OM-17.5, MT-16.5, MQ-2.5 và TP-1.3 cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất, lần lượt đạt 85,5%; 84,1%; 83,7%; 83,0% và 82,3%, khác biệt thống kê (p<0,05) khi so sánh với các dòng vi khuẩn còn lại và nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn.

Như vậy, 5 dòng vi khuẩn hiệu quả nhất trong nghiên cứu này gồm TP-1.3, TP- 1.4, MQ-2.5, MT-16.5 và OM-17.5 giúp kích thích tăng thêm tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống trung bình từ 16,3 đến 19,5% so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Ngoài ra, khi quan sát về hình thái hạt và cây rau mầm còn cho thấy khi chủng các dòng vi khuẩn thử nghiệm trong nghiên cứu này còn giúp hạt rau muống nảy mầm sớm hơn (Hình 4.13A) và gia tăng số rễ bên so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (Hình 4.13B). Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Nhu and Riddech (2016) và Trần Bảo Trâm và ctv. (2017) ). Theo Cao Ngọc Điệp và Ngô Thanh Phong (2016) vi khuẩn đã xâm nhập lên bề mặt rễ, nội sinh vào bên trong hoặc tiết các hormone thực vật làm tăng số rể bên, số lông hút, và chiều dài rễ dẫn đến tăng khả năng hấp thu nước và muối khoáng của rễ (Stainer, 2003).

Tóm lại, kết quả nghiên cứu cho thấy khi chủng 8 dòng vi khuẩn vào hạt rau muống giúp gia tăng tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống so với đối chứng không chủng vi khuẩn trung bình là 15%. Rõ ràng việc chủng 8 dòng vi khuẩn tuyển chọn trong nghiên cứu này đã mang lại hiệu quả rất tích cực trong việc làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống. Trong đó 5 dòng vi khuẩn kí hiệu TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5, MT-16.5 và OM-17.5 cho hiệu quả tốt hơn và mật số vi khuẩn 106 cfu.mL-1 là mật số chuẩn được chọn để thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo trên cây rau muống trong nghiên cứu này.

103

Hình 4.13 Sự khác biệt về mặt hình thái giữa nghiệm thức có chủng và không chủng vi khuẩn ở hạt và cây rau muống mầm (A: hạt nảy mầm sớm hơn ở nghiệm thức có chủng vi khuẩn so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn và B: chiều cao cây, chiều dài rễ và số rễ ở nghiệm thức chủng với dòng vi khuẩn TP-1.4 cao và nhiều hơn so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn)

4.4.1.2 Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khả năng kích thích sinh trưởng rau muống

Kết quả đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng cây rau muống của 8 dòng vi khuẩn trên môi trường agar 1% ở điều kiện phòng thí nghiệm sau 10 ngày thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.10. Kết quả cho thấy cả 8 dòng vi khuẩn đều có khả năng kích thích sinh trưởng cây rau muống cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn.

Đối với chỉ tiêu chiều cao cây mầm, tất cả các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn thử nghiệm đều có chiều cao cây mầm cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Trong đó các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn MQ-2.5, OM-17.5 và CP-18.2 cho chiều cao cây cao hơn, dao động từ 15,7-17,3 cm và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức chủng vi khuẩn còn lại và nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (p<0,05). Các nghiệm thức còn lại có chiều cao cây dao động từ 13,3 đến 15,3 cm, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (11,1 cm).

Tương tự như chiều cao cây, chiều dài rễ của tất cả nghiệm thức có chủng vi khuẩn đều dài hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Đặc biệt, 3 nghiệm thức chủng 3 dòng vi khuẩn TP- 1.3, MQ-2.1 và MQ-2.5 cho chiều dài rễ dài nhất và lần lượt đạt 8,06; 8,67 và 10,2 cm so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (5,20 cm) và các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn còn lại (nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn TP-1.4, MQ-

104

2.1, OM-17.2, OM-17.5, MT-16.5 và CP-18.2) có chiều dài rễ dao động từ 6,75-7,79 cm. Bảng 4.10 Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên một số chỉ tiêu sinh trưởng cây rau muống trên môi trường agar 1% ở điều kiện phòng thí nghiệm

STT Nghiệm thức Chiều cao thân (cm) Chỉ tiêu sinh trưởng Chiều dài rễ (cm) Sinh khối tươi (mg)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Đối với chỉ tiêu sinh khối tươi cây rau muống, các nghiệm thức chủng 4 dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5 và OM-17.5 cho kết quả sinh khối tươi cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn còn lại (là các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn MQ-2.1, OM-17.2, MT- 16.5 và CP-18.2) với khối lượng dao động từ 927 đến 995 mg và với tỷ lệ tăng thêm trung bình là 68% khối lượng tươi khi so sánh với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (564 mg). Đặc biệt, nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn MQ-2.5 có chiều cao thân, chiều dài rễ và sinh khối tươi của cây mầm rau muống cao nhất và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại trong số 8 dòng vi khuẩn thử nghiệm. Trong khi nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.3 chỉ có hiệu quả trong việc kích thích tăng chiều dài rễ và sinh khối tươi. Tương tự, dòng vi khuẩn OM-17.5 chỉ có hiệu quả trong gia tăng chiều cao thân và sinh khối tươi cây mầm. Dòng vi khuẩn TP-1.4 và MT-16.5 chỉ giúp tăng sinh khối tươi cây mầm.

Tóm lại, kết quả cho thấy trong số 8 dòng vi khuẩn thử nghiệm trên cây rau muống thì 5 dòng vi khuẩn kí hiệu TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5, OM-17.5 và MT-16.5 giúp kích thích gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống, tăng sinh trưởng và trọng lượng tươi cây rau muống tốt hơn so với 3 dòng vi khuẩn còn lại (MQ-2.1, OM-17.2 và CP-18.2). Do đó 5 dòng vi khuẩn này được chọn để đánh giá ảnh hưởng của chúng lên khả năng nảy mầm và kích thích sinh trưởng của hạt cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm, đồng thời cũng là cơ sở để chọn và đánh giá tiếp tục khả năng kích thích sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới.

105

ĐC TP-1.3 TP-1.4 MQ-2.1 MQ-2.5 OM-17.2 OM-17.5 MT-16.5 CP-18.2 F CV (%) 11,1f 13,4e 15,3cd 13,9e 16,1b 13,3e 17,3a 15,0d 15,7bc * 12,2 5,20e 8,06bc 7,58bcd 8,67b 10,21a 7,79bcd 7,25cd 6,75d 7,19cd * 17,7 564f 995a 927b 697e 943b 705e 935b 884c 851d * 16,7

4.4.2 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây cải xanh của 5 dòng vi khuẩn

Năm dòng vi khuẩn tuyển chọn có ký hiệu lần lượt là TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5, MT-16.5, OM-17.5 và hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn này được chọn để đánh giá khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng hạt cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm và kết quả cho thấy chúng làm gia tăng đáng kể tỷ lệ nảy mầm và kích thích cây cải mầm sinh trưởng tốt hơn.

4.4.2.1 Ảnh hưởng của các mức mật số vi khuẩn khác nhau lên khả năng nảy mầm hạt cải xanh

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các mức mật số vi khuẩn khác nhau của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên tỷ lệ nảy mầm của hạt cải xanh sau 6 ngày thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.11. Nhìn chung, mật số vi khuẩn khác nhau ảnh hưởng lên tỷ lệ nảy mầm của hạt cải xanh khác nhau và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau. Kết quả cho thấy khi chủng vi khuẩn vào hạt cải xanh cho tỷ lệ nảy mầm hạt cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Trong đó dòng vi khuẩn MT- 16.5 và OM-17.5 cho tỷ lệ nảy mầm cao hơn nghiệm thức đối chứng ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn có mật số từ 105 đến 109 cfu.mL-1 với tỷ lệ nảy mầm cao hơn 90% cho tất cả các nồng độ. Trong khi đó, dòng vi khuẩn TP-1.3 ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn ở mật số 106, 107 và 108 cfu.mL-1 cho tỷ lệ nảy mầm tốt nhất với tỷ lệ nảy mầm dao động từ 93,7 đến 95,6%. Bên cạnh đó, dòng vi khuẩn MQ-2.5 cho tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh lớn hơn 90% ở các nghiệm thức chủng mật số vi khuẩn 105, 107 và 109 cfu.mL-1. Bảng 4.11 Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn lên tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh sau 6 ngày chủng ở điều kiện phòng thí nghiệm

Tỷ lệ nảy mầm (%)

TP-1.3

TP-1.4

MQ-2.5

Hỗn hợp 5 dòng VK

Nghiệm thức (cfu.mL-1) Đối chứng 105 106 107 108 109 F CV (%)

MT-16.5 88,9d 94,1b 90,7c 93,3b 96,7a 96,7a * 3,20

OM-17.5 88,9d 94,1b 91,1c 94,4b 91,1c 98,9a * 3,60

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1,4 và hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn thử nghiệm ở mật số 107 cfu.mL-1 giúp kích thích tỷ lệ nảy mầm hạt cao nhất (> 90%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức chủng các mật số vi

106

88,9d 92,2c 86,3f 93,3b 87,1e 95,6a * 3,80 88,9b 84,4d 81,1e 95,6a 85,6c 80,4f * 6,20 88,9d 84,4e 95,6a 94,4b 93,7c 82,6f * 5,70 88,9b 81,1f 87,1c 92,6a 85,6d 83,7e * 4,40

khuẩn còn lại. Như vậy, kết quả cho thấy mật số 107 cfu/mL là mật số vi khuẩn thích hợp chung cho cả 5 dòng vi khuẩn thử nghiệm giúp tăng tỷ lệ nảy mầm tốt nhất đối với hạt cải xanh.

Ngoài ra kết quả thí nghiệm cũng ghi nhận vào thời điểm 2 ngày sau khi chủng vi khuẩn vào hạt, có sự khác biệt rõ rệt nhất về tỷ lệ nảy mầm của hạt ở các nghiệm thức chủng các mức mật số vi khuẩn khác nhau. Nghiệm thức chủng vi khuẩn với mật số 107 cfu.mL-1 cho tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh cao hơn và khác biệt thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức chủng các mức mật số vi khuẩn còn lại cho cả 5 dòng vi khuẩn và hỗn hợp của 5 dòng vi khuẩn này. Kết quả phân tích thống kê ảnh hưởng của 5 dòng vi khuẩn ở ở mật số 107 cfu.mL-1 lên tỷ lệ nảy mầm của hạt cải xanh sau 2 ngày thí nghiệm được trình bày trong Hình 4.14 cho thấy cả 5 dòng vi khuẩn thử nghiệm đều có tỷ lệ nảy mầm của hạt cải xanh cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn, với tỷ lệ nảy mầm dao động từ 85,6 đến 92,2% (tăng thêm so với nghiệm thức đối chứng từ 16,7 đến 23,5 %).

Hình 4.14 Tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn ở mật số 107cfu.mL-1 sau 2 ngày thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm

Đặc biệt, 2 dòng vi khuẩn TP-1.3 và OM-17.5 có tỷ lệ hạt nảy mầm hạt cao nhất, lần lượt đạt 92,2% và 90,0%, khác biệt thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn còn lại ở cùng mật số vi khuẩn và so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Kết quả này cho thấy mật số 107 cfu.mL-1 là mật số vi khuẩn chủng tối ưu nhất giúp 5 dòng vi khuẩn thử nghiệm thể hiện khả năng kích thích tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh và hạt cải nảy mầm sớm hơn và mật số vi khuẩn 107 cfu.mL-1 là mật số chuẩn được chọn để thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo trên cây cải xanh trong nghiên cứu này.

4.4.2.2 Ảnh hưởng của 5 dòng vi khuẩn thử nghiệm lên sinh trưởng cây cải xanh

Tương tự cây rau muống, sự sinh trưởng của cây cải xanh cũng cho thấy có sự kích thích sinh trưởng tốt hơn ở các nghiệm thức khi được chủng với 5 dòng vi khuẩn

107

thử nghiệm bởi vì cả 5 dòng vi khuẩn thử nghiệm đều cho các chỉ tiêu về nông học và sinh khối tươi cây mầm cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (Bảng 4.12). Bảng 4.12 Ảnh hưởng của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên một số chỉ tiêu sinh trưởng cây cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm

STT Nghiệm thức Chiều cao thân (cm) Chiều dài rễ (cm) Sinh khối tươi (mg)

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Đối với chiều cao cây mầm, tất cả các nghiệm thức chủng vi khuẩn đều có chiều cao cây mầm cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Trong đó các nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.3 và MT-16.5 cho chiều cao cây cao thứ nhất và thứ hai với chiều cao lần lượt là 7,51 và 7,11 cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn còn lại và nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Các nghiệm thức còn lại có chiều cao cây dao động từ 6,46 đến 6,67 cm, vẫn cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn có chiều cao là 5,13 cm.

Tương tự như chiều cao cây, chiều dài rễ mầm của các nghiệm thức có chủng vi khuẩn đều cho chiều dài rễ dài hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Đặc biệt nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn MQ-2.5, MT-16.5 và hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn cho chiều dài rễ dài nhất tương ứng đạt 7,30; 7,17 và 7,55 cm so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn có chiều dài rễ là 6,10 cm. Trong khi đó 3 nghiệm thức chủng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4 và OM-17.5 có chiều dài rễ dao động từ 6,22-6,86 cm, tuy nhiên, cả 3 nghiệm thức này có chiều dài rễ khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho chiều dài rễ thấp nhất (6,22cm).

Đối với chỉ tiêu sinh khối tươi cây cải mầm sau 10 ngày thí nghiệm cho thấy các nghiệm thức chủng vi khuẩn cho kết quả sinh khối tươi cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê khi so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (p<0,05). Đặc biệt, nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn MQ-2.5 làm gia tăng chiều cao thân và chiều dài rễ tốt hơn dẫn đến sinh khối tươi của cây mầm ở nghiệm thức này đạt cao nhất (125 mg)

108

1 2 3 4 5 6 7 Đối chứng TP-1.3 TP-1.4 MQ-2.5 OM-17.5 MT-16.5 Hỗn hợp VK F CV(%) 5,13d 7,51a 6,46c 6,53c 6,67c 7,11b 6,46c * 10,8 6,10c 6,86abc 6,22c 7,30ab 6,73bc 7,17ab 7,55a * 8,3 89,0e 110b 100cd 125a 108b 103c 98,7d * 10,2

so với nghiệm thức đối chứng là 89,0 mg. Kế đến nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.3 do có hiệu quả cao trong việc kích thích gia tăng chiều cao thân nên tăng đáng kể sinh khối tươi cây mầm. Trong khi nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn OM-17.5 cho kết quả sinh khối tươi cao hơn do làm tăng khá tốt cả 2 chỉ tiêu về chiều cao và chiều dài rễ. Tuy nhiên, nghiệm thức chủng hỗn hợp vi khuẩn chỉ kích thích chiều dài rễ nên sinh khối cây mầm thấp hơn các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn đơn lẽ, mặc dù vậy nghiệm thức này vẫn cho sinh khối tươi cây mầm cao hơn 9,7 mg và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn.

Như vậy, rõ ràng khi chủng các dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5, MT-16.5 và OM-17.5 vào hạt rau muống và hạt cải xanh giúp gia tăng tỷ lệ nảy mầm thêm 17,2% so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn, đồng thời cũng giúp gia tăng chiều cao cây, chiều dài rễ và sinh khối tươi của cây rau muống và cây cải mầm, tạo điều kiện cho cây rau sinh trưởng tốt hơn trong các giai đoạn kế tiếp. Tóm lại 5 dòng vi khuẩn kí hiệu TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5, OM-17.5 và MT-16.5 có hiệu quả tốt nhất giúp kích thích gia tăng tỷ lệ nảy mầm, sinh trưởng và làm gia tăng sinh khối tươi cây rau muống cũng như cây cải xanh. Do đó 5 dòng vi khuẩn này được chọn để tiếp tục đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh trong điều kiện nhà lưới.

4.4.3 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống của 5 hệ IMO tuyển chọn

4.4.3.1 Ảnh hưởng của mức pha loãng lên tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các mức pha loãng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên khả năng nảy mầm hạt rau muống sau 6 ngày thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm được trình bày trong Bảng 4.13 cho thấy giữa các nghiệm thức pha loãng khác nhau cho tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau và cao hơn so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Bốn hệ IMO có nguồn gốc từ đất trồng củ lùn, ớt, tre và IMO hỗn hợp có tỷ lệ nảy mầm cao nhất ở nghiệm thức pha loãng 1000 lần và với tỷ lệ nảy mầm dao động từ 80,0 đến 86,7% tăng 15,1 đến 20,8% so với đối chứng không chủng IMO (65,9%). Trong khi nghiệm thức chủng hệ IMO mồng tơi ở mức pha loãng 1000 lần có tỷ lệ nảy mầm thấp hơn (71,1%) nhưng vẫn cao hơn so với đối chứng. Ngoài ra mặc dù các mức pha loãng 50, 100, 300 lần của các hệ IMO tuyển chọn cho tỷ lệ nảy mầm cao hơn so với nghiệm thức đối chứng vào thời điểm 6 ngày thí nghiệm, tuy nhiên tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống ở các thời điểm 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày sau khi chủng thấp hơn so với các nghiệm thức chủng với các mức pha loãng 500, 700, 900 và 1000 lần và với đối chứng không chủng IMO. Điều này có nghĩa là khi được chủng ở các mức nồng độ pha loãng thấp (tức là nồng độ IMO đậm đặc hơn) các hạt rau muống được chủng vào thể hiện nảy mầm muộn hơn. Kết quả này tương đương thí nghiệm của Sangakara and Attanayake (1993) và tác giả đã giải thích cho hiện tượng này là do nồng độ đường

109

hoặc các hợp chất sinh học trong hỗn hợp lên men của các hệ IMO cao làm ức chế hoặc làm chậm quá trình nảy mầm của hạt rau muống. Bảng 4.13 Ảnh hưởng các mức pha loãng hệ IMO lên tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống sau 6 ngày chủng ở điều kiện phòng thí nghiệm

Tỷ lệ hạt nảy mầm (%)

Nồng độ pha loãng IMO Ớt

Đối chứng 50 100 300 500 700 900 1000

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Kết quả thí nghiệm và những quan sát được ghi nhận trong thí nghiệm này cho thấy nồng độ hòa loãng IMO phù hợp đối với hạt rau muống để kích thích tỷ lệ nảy mầm hạt ra muống là từ 500 đến 1.000 lần. Tuy nhiên để hiệu quả nảy mầm tốt nhất nồng độ pha loãng 1.000 lần là phù hợp nhất và nồng độ pha loãng 1000 lần là nồng độ pha loãng chuẩn được chọn để thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo cho các hệ IMO tuyển chọn trên cây rau muống ở điều kiện nhà lưới.

Khi so sánh tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ pha loãng 1.000 lần với nhau của các hệ IMO cho thấy các hệ IMO khác nhau cho khả năng kích thích tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống khác nhau, đều cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng không chủng IMO với tỷ lệ nảy mầm của hạt dao động từ 71,1 đến 86,7%, trong khi nghiệm thức đối chứng không chủng IMO là 65,9%. Khi so sánh khả năng kích thích tỷ lệ nảy mầm của các dòng vi khuẩn đơn và IMO lên hạt rau muống cho thấy chúng có tỷ lệ nảy mầm gần như tương đương nhau. Cụ thể, khi chủng 8 dòng vi khuẩn và hỗn hợp 8 dòng vi khuẩn này giúp tăng tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống tăng trung bình 14,6% so với nghiệm thức đối chứng trong khi 5 hệ IMO cho tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống cao hơn trung bình 14,4 % so với nghiệm thức đối chứng. Như vậy các dòng vi khuẩn và các hệ IMO tuyển chọn có hiệu quả như nhau trong việc kích thích gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống ở mật số vi khuẩn 106 cfu/mL và nồng độ pha loãng IMO 1000 lần.

4.4.3.2 Ảnh hưởng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên khả năng sinh trưởng cây rau muống

Bảng 4.14 trình bày kết quả về ảnh hưởng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên khả năng sinh trưởng cây rau muống ở điều kiện phòng thí nghiệm sau 10 ngày chủng cho thấy

110

F CV (%) IMO Củ lùn 65,9d 72,2c 75,6b 72,2c 71,1c 72,2c 76,3b 86,7a * 7,76 IMO Mồng tơi 65,9c 70,0ab 68,9b 70,0ab 65,6cd 68,9b 64,5d 71,1a * 3,47 IMO Tre Hỗn hợp IMO 65,9e 67,8d 73,3c 72,2c 75,6b 76,6b 76,7b 80,0a * 6,19 65,9d 63,0e 60,7f 72,1bc 71,1c 72,6b 65,6d 82,6a * 9,61 65,9e 64,5e 64,5e 69,2d 74,4b 72,8c 70,0d 81,2a * 7,83

Sinh khối tươi (mg) Chiều dài rễ (cm)

cả 5 hệ IMO đều có khả năng kích thích sinh trưởng cây rau muống cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng không chủng IMO. Bảng 4.14 Ảnh hưởng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên một số chỉ tiêu sinh trưởng cây rau muống ở mức nồng độ pha loãng 1000 lần ở điều kiện phòng thí nghiệm Nghiệm thức Đối chứng IMO-Củ lùn IMO-Mồng tơi IMO-Ớt IMO-Tre IMO hỗn hợp

Chiều cao thân (cm) 10,3e 15,2a 13,1c 11,8d 14,9a 14,2b 510c 1.160a 1.033b 1.087ab 1.037b 1.150a 6,10c 7,53a 7,33a 6,60b 7,76a 6,50bc

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Đối với chỉ tiêu chiều cao thân, tất cả các nghiệm thức chủng các hệ IMO đều cho chiều cao cây cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng không chủng hệ IMO ở nồng độ pha loãng 1000 lần, với chiều cao cây dao động từ 11,8-15,2 cm và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (10,3 cm). Tương tự, chiều dài rễ của tất cả nghiệm thức có chủng các hệ IMO đều cho rễ dài hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng không chủng IMO, với chiều dài rễ dao động từ 6,50 đến 7,76 cm và ở nghiệm thức đối chứng là 6,10 cm. Đặc biệt đối với chỉ tiêu sinh khối tươi, các nghiệm thức chủng các hệ IMO hầu như có khối lượng tăng thêm tương đương 100% so với nghiệm thức đối chứng. Kết quả này tương tự như kết quả khảo sát ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn tuyển chọn được phân lập từ 5 hệ IMO thử nghiệm này. Điều này có thể giải thích do các hệ IMO có chứa các các vi sinh vật đặc biệt là các vi sinh vật cố định đạm và tổng hợp IAA có khả năng tổng hợp các chất hoặc hợp chất có hoạt tính sinh học giúp kích thích quá trình phát triển chiều cao cây mầm, chiều dài rễ cây mầm tốt dẫn đến làm tăng khối lượng tươi của cây mầm.

F CV (%) * 13,7 * 9,11 * 23,2

4.4.4 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây cải xanh của 5 hệ IMO tuyển chọn

4.4.4.1 Ảnh hưởng của mức pha loãng khác nhau lên tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các mức pha loãng khác nhau của 5 hệ IMO tuyển chọn lên khả năng nảy mầm hạt cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm được trình bày trong Bảng 4.15 cho thấy tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh của các nghiệm thức chủng các nồng độ IMO pha loãng khác nhau thì khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05).

111

Bảng 4.15 Ảnh hưởng của các mức pha loãng hệ IMO lên tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh sau 6 ngày chủng ở điều kiện phòng thí nghiệm

Tỷ lệ nảy mầm (%)

Hỗn hợp IMO

Nồng độ pha loãng (lần) Đối chứng 50 100 300 500 700 900 1000

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Cụ thể, ở các mức pha loãng thấp (50, 100 và 300 lần) tỷ lệ hạt nảy mầm thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng, tuy nhiên khi tăng nồng độ pha loãng lên 500, 700, 900 và 1.000 lần tỷ lệ hạt nảy mầm tăng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng. Trong đó các nghiệm thức chủng với bốn hệ IMO có nguồn gốc từ đất trồng củ lùn, mồng tơi, tre và IMO hỗn hợp có tỷ lệ nảy mầm hạt cao nhất ở nồng độ pha loãng 1.000 lần và với tỷ lệ nảy mầm hơn 93% so với nghiệm thức đối chứng chỉ 88,9%. Kế đến, nghiệm thức chủng với hệ IMO thu từ đất trồng ớt có tỷ lệ nảy mầm hạt là 85,6% nhưng vẫn cao hơn so với nghiệm thức đối chứng không chủng hệ IMO (Hình 4.15). Ngược lại, ở các nghiệm thức chủng các hệ IMO có nồng độ pha loãng 50, 100 và 300 lần có tỷ lệ nảy mầm hạt thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng vào thời điểm 6 ngày thí nghiệm, đồng thời thí nghiệm còn ghi nhận ở thời điểm 2 và 4 ngày sau khi chủng số hạt nảy mầm của các nghiệm thức chủng các nồng độ pha loãng này thấp hơn so với các nghiệm thức chủng nồng độ pha loãng 500, 700, 1.000 lần và so với nghiệm thức đối chứng. Có thể giải thích cho hiện tượng này là do nồng độ đường hoặc các hợp chất sinh học trong hỗn hợp lên men của các hệ IMO đã ức chế hoặc làm chậm quá trình nảy mầm của hạt cải xanh. Do đó, dựa vào kết quả thí nghiệm và quan sát ghi nhận được trong thí nghiệm cho thấy nồng độ pha loãng các hệ IMO từ 500 đến 1.000 lần là thích hợp nhất để giúp kích thích tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh. Tuy nhiên, để hạt cải xanh đạt tỷ lệ nảy mầm cao nhất, nồng độ pha loãng của các hệ IMO 1.000 lần là phù hợp nhất.

112

F CV (%) IMO Củ lùn 88,9b 83,3d 86,7c 89,1b 89,9b 93,3a 93,3a 93,3a * 5,7 IMO Mồng tơi 88,9b 78,9d 75,6e 79,9d 88,9b 84,4c 93,4a 93,3a * 7,9 IMO Ớt 88,9e 83,3c 82,2d 84,4b 83,2c 82,2d 79,0e 85,6a * 2,8 IMO Tre 88,9c 87,8e 88,9d 89,1d 89,9c 87,8e 93,3b 94,1a * 5,0 88,9bc 78,9e 81,1d 84,5c 90,0b 91,1b 91,1b 94,4a * 6,9

Hình 4.15 Tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh chủng IMO ở mức pha loãng 1.000 lần sau 2 ngày chủng

Khi so sánh với hiệu quả kích thích tỷ lệ nảy mầm của các hệ IMO lên hạt rau muống và hạt cải xanh cho thấy các hệ IMO thử nghiệm giúp kích thích gia tăng tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống cao hơn so với hạt cải xanh với tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống cao hơn so với nghiệm thức đối chứng trên hạt rau muống là 15% trong khi hạt cải là 3,24%. Điều này có thể do đặc thù hạt cải có tỷ lệ nảy mầm cao nên hiệu quả của các hệ IMO lên tỷ lệ nảy mầm thể hiện chưa rõ. Kết quả này tương tự như các thí nghiệm trên các dòng vi khuẩn đơn trong nghiên cứu này. Khi so sánh khả năng kích thích tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh của các dòng vi khuẩn và IMO với nhau cho thấy các dòng vi khuẩn đơn và IMO kích thích gia tăng tỷ lệ nảy mầm tương đương nhau. Cụ thể, trong khi các nghiệm thức chủng 8 dòng vi khuẩn và hỗn hợp của chúng có tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh cao hơn nghiệm thức đối chứng là 5,03% thì các nghiệm thức chủng 5 hệ IMO tuyển chọn có tỷ lệ nảy mầm cao hơn so với nghiệm thức đối chứng là 3,24 %. Như vậy các dòng vi khuẩn đơn và các hệ IMO tuyển chọn đều có hiệu quả tương đương nhau trong việc kích thích gia tăng có ý nghĩa tỷ lệ nảy mầm của hạt cải xanh.

Ngoài ra thí nghiệm khảo sát khả năng kích thích tỷ lệ nảy mầm còn ghi nhận được khi chủng IMO giúp hạt cải nảy mầm sớm hơn, số lông hút ở rễ mầm xuất hiện nhiều hơn so với nghiệm thức đối chứng hạt rau muống và hạt cải chỉ ngâm với nước ở cùng thời điểm (Hình 4.16). Kết quả nghiên cứu này tương tự với nghiên cứu của Nhu and Riddech (2016). Theo Cao Ngọc Điệp và Ngô Thanh Phong (2016) vi khuẩn đã xâm nhập lên bề mặt rễ, nội sinh vào bên trong hoặc tiết các hormone thực vật (Stainer, 2003) làm tăng số lông hút, và chiều dài rễ dẫn đến tăng khả năng hấp thu nước và muối khoáng của rễ.

113

Hình 4.16 Sự xuất hiện nhiều lông hút ở rễ mầm cây cải khi được chủng với IMO (A: đối chứng hạt cải ngâm nước; B: hạt cải ngâm dung dịch IMO pha loãng 500 lần)

4.4.4.2 Ảnh hưởng của các hệ IMO lên khả năng sinh trưởng của cây cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm

Bảng 4.16 trình bày kết quả ảnh hưởng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên khả năng sinh trưởng cây cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm sau 10 ngày chủng cho thấy cả 5 hệ IMO đều thể hiện khả năng kích thích sinh trưởng cây cải xanh tốt hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau và với nghiệm thức đối chứng không chủng IMO. Bảng 4.16 Ảnh hưởng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên một số chỉ tiêu sinh trưởng cây cải xanh ở nồng độ pha loãng 1000 lần ở điều kiện phòng thí nghiệm

Nghiệm thức

Đối chứng IMO-Củ lùn IMO-Mồng tơi IMO-Ớt IMO-Tre Hỗn hợp IMO

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Đối với chiều cao cây mầm, tất cả các nghiệm thức chủng các hệ IMO đều có chiều cao cây mầm cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng không chủng IMO. Trong đó các nghiệm thức chủng IMO thu từ đất tre có chiều cao cây cao nhất, đạt 5,75 cm và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức chủng các hệ IMO còn lại và nghiệm thức đối chứng. Các nghiệm thức còn lại có chiều cao thân dao động từ 4,50 đến 5,33 cm, cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng không chủng IMO (4,00 cm).

Tương tự như chiều cao cây, chiều dài rễ mầm của các nghiệm thức có chủng các hệ IMO đều cho rễ dài hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Đặc biệt ở nghiệm thức chủng hệ IMO củ lùn và mồng tơi cho chiều dài rễ cao nhất, lần lượt đạt 7,67 và 7,50 cm so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (5,00 cm). Trong khi các nghiệm thức chủng các hệ

114

F CV (%) Chiều cao thân (cm) 4,00d 5,30b 5,33b 4,50c 5,73a 5,33b * 12,2 Chiều dài rễ (cm) 5,00e 7,67a 7,50a 6,50d 7,17b 6,83c * 13,5 Sinh khối tươi (mg) 61,0e 95,0b 80,0d 89,0c 109a 82,0d * 17,7

IMO ớt, tre và hỗn hợp IMO có chiều dài rễ dao động từ 6,50-7,17 cm, tuy nhiên, vẫn cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng.

Đối với chỉ tiêu sinh khối tươi cây cải mầm sau 10 ngày chủng cho thấy các nghiệm thức chủng với hệ IMO cho kết quả sinh khối tươi cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê khi so với nghiệm thức đối chứng không chủng IMO. Đặc biệt, nghiệm thức chủng hệ IMO tre làm gia tăng chiều cao thân, chiều dài rễ và đường kính thân tốt nhất, dẫn đến tăng sinh khối tươi của cây mầm cao nhất, đạt 109,0 mg và cao hơn 48 mg và tăng 78% so với nghiệm thức đối chứng là 61,0 mg. Kế đến là nghiệm thức chủng hệ IMO củ lùn có hiệu quả trong việc kích thích tăng đáng kể sinh khối cây mầm (95,0 mg) và cao hơn 34 mg so với nghiệm thức đối chứng. Trong khi các nghiệm thức chủng các hệ IMO còn lại cho kết quả sinh khối tươi tốt hơn so với nghiệm thức đối chứng với sinh khối tươi dao động từ 80,0 đến 89,0 mg và cao hơn từ 19 đến 28 mg so với nghiệm thức đối chứng, tương ứng với tỷ lệ 31-55% do các chỉ tiêu về chiều cao thân, đường kính thân và chiều dài rễ ở các nghiệm thức này cũng được tăng lên.

Như vậy, rõ ràng 5 hệ IMO tuyển chọn chứa 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn có khả năng kích thích gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống và hạt cải xanh, đồng thời cũng giúp gia tăng chiều cao thân, chiều dài rễ dẫn đến tăng sinh khối tươi cây mầm của cây rau muống và cây cải xanh.

Một số nghiên cứu trước đây khảo sát trên các dòng vi khuẩn kích thích sinh trưởng được tuyển chọn ở điều kiện phòng thí nghiệm cũng cho kết quả tương tự với nghiên cứu này. Điển hình như nghiên cứu của Harrper and Lynch (1980) đã báo cáo rằng khi ngâm hạt lúa mạch trong dung dịch vi khuẩn kích thích sinh trưởng cây trồng trong 4 giờ giúp gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt. Đặc biệt trên hạt rau muống, Nhu and Riddech (2016) đã tiến hành chủng 3 dòng vi khuẩn kích thích sinh trưởng vào hạt rau muống ở điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy chúng đã giúp tăng tỷ lệ nảy mầm, tăng chiều cao cây mầm, tăng chiều dài rễ và tăng số lông hút của rễ. Trên cà chua và ớt, nghiên cứu của Islam et al. (2013) cũng cho thấy khi chủng 13 dòng vi khuẩn cố định đạm vào hạt ở đĩa Petri đã làm tăng tỷ lệ nảy mầm hạt cà chua và hạt ớt cũng như chiều dài rễ, chiều cao cây mầm, sức sống của hạt và sinh khối khô cây mầm so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Nghiên cứu của Cruz et al. (2014) đã cho thấy khi chủng dòng vi khuẩn Burkholderia sabiae có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA đã giúp tăng tỷ lệ nảy mầm hạt ớt thêm 100% đối với giống ớt Jalapeño và 50% đối với giống ớt Manzano ở điều kiện phòng thí nghiệm. Tương tự, nghiên cứu của Hanapi et al. (2014) đã cho thấy khi chủng vi khuẩn Nitromonas europaea hoặc hỗn hợp của nó với các dòng vi khuẩn khác đã thúc đẩy sự phát triển tốt nhất của chiều dài rễ mầm. Trong khi hỗn hợp hai dòng vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris và Acinetobacter sp. giúp kích thích tỷ lệ nảy mầm và chiều cao cây mầm của hạt lúa tốt nhất. Các thí nghiệm chủng dòng vi khuẩn Bacillus aoagulans và Pseudomonas cho thấy chúng làm tăng tỷ lệ nảy mầm có ý nghĩa thống kê (p<0,05) hạt đậu que, đậu

115

đũa, đậu bắp và hạt củ dền (Kapilan and Thavaranjit, 2015). Theo các tác giả này mức độ kích thích hay ức chế tỷ lệ nảy mầm của hạt và sự sinh trưởng cây mầm sau khi chủng với vi khuẩn tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có các yếu tố như loại hạt, loài vi khuẩn chủng, mật số vi sinh vật khi chủng và các yếu tố vật lý và hoá học khác ở bên trong hay bên ngoài hạt (Carrillo-Castanada et al., 2002; Krishnaswamy and Seshu, 1990; Sturz and Nowak, 2000; Islam et al., 2013; Kapilan and Thavaranjit, 2015)

Đối với hỗn hợp nhiều dòng vi khuẩn hay hệ vi sinh vật hữu ích (Effective Microorganisms (EM)) các thử nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm cũng cho kết quả tương tự. Bakonyi et al. (2013) đã ngâm hạt với các chế phẩm vi sinh đã giúp hạt tăng tỷ lệ nảy mầm thêm 20%, sinh khối khô của rễ mầm và thân mầm tăng thêm 7% so với nghiệm thức đối chứng không xử lí với chế phẩm. Đặc biệt, nghiên cứu của Sangakkara and Attanayake, (1993) đã cho thấy khi sử dụng chế phẩm EM ở dung dịch gốc hoặc pha loãng 100 lần cho thấy chúng ức chế tỷ lệ nảy mầm của hạt lúa nhưng ở mức pha loãng 500 lần thì tỷ lệ nảy mầm hạt lúa đạt cao nhất đồng thời cũng ở mức pha loãng này làm tăng mạnh nhất khối lượng thân và rễ mầm cây lúa.

Ở trong nước, các nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm về khả năng kích thích nảy mầm và cây mầm cũng cho kết quả tương tự. Nghiên cứu của Vũ Thành Công (2009) đã báo cáo rằng khi chủng dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm Azospirillum sp. phân lập từ rễ cây rau muống giúp kích thích tăng tỷ lệ nảy mầm hạt đậu xanh, đậu đũa, đậu cove và hạt cà chua có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn và đồng thời giúp gia tăng chiều dài rễ cây lên 1,19 lần so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Nghiên cứu của Kiều Phương Nam và ctv. (2010) đã chỉ ra rằng khi chủng các dòng vi khuẩn Methylobacterium ssp. kích thích sinh trưởng thực vật giúp tăng tỷ lệ nảy mầm hạt đậu xanh, đậu đũa, đậu cove và hạt cà chua có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Ngoài ra, Trần Bảo Trâm và ctv. (2017) đã cho thấy khi chủng dung dịch vi khuẩn tổng hợp IAA (Kluyvera cryocrescens) giúp tỷ lệ nảy mầm của hạt dưa leo tăng mạnh, đạt 93,3% và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không chủng (80%) và sau 10 ngày chủng giúp cây dưa leo sinh trưởng nhanh và đồng đều, có chiều dài thân, chiều dài rễ và khối lượng cây mầm cũng như số rễ phụ phát triển tốt hơn so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn.

Tóm lại, các kết quả đánh giá và khảo sát ở điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn có khả năng giúp gia tăng tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống và hạt cải xanh đồng thời kích thích hạt nảy mầm sớm hơn, gia tăng số lông hút của rễ. Ngoài ra chủng các dòng vi khuẩn vào hạt còn cho thấy chúng làm tăng chiều cao cây, chiều dài rễ mầm và làm tăng sinh khối tươi cây mầm so với đối chứng không chủng vi khuẩn. Mật số 106 và 107 cfu.mL-1 là hai mật số tối ưu nhất dùng để chủng các dòng vi khuẩn tuyển chọn lần lượt vào trong hạt rau

116

muống và hạt cải xanh giúp kích thích tỷ lệ nảy mầm hạt và sinh trưởng cây rau. Các hệ IMO tuyển chọn cũng cho thấy có hiệu quả tốt trong việc kích thích làm tăng tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống và hạt cải xanh cũng như tăng sinh trưởng của 2 loại cây mầm này. Khi so sánh hiệu quả kích thích sinh trưởng của các dòng thuần với các hệ IMO cho thấy chúng có hiệu quả tương đương nhau ở các mật số và nồng độ pha loãng phù hợp. Do đó 5 dòng vi khuẩn hiệu quả nhất gồm TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5, MT-16.5 và OM-17.5 và 5 hệ IMO từ đất trồng củ lùn, mồng tơi, ớt, tre và IMO hỗn hợp được tuyển chọn để đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng cây rau muống và cây cải xanh trong điều kiện nhà lưới với mật số các dòng vi khuẩn áp dụng cho rau muống là 106 cfu.mL-1, cải xanh là 107 cfu.mL-1 và nồng độ IMO pha loãng cho rau muống và cải xanh là 1000 lần.

4.5 Nội dung 5: Hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn và 5 IMO chứa các dòng vi khuẩn tuyển chọn lên sinh trƣởng, năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lƣới

4.5.1 Sinh trưởng và năng suất rau muống trong nhà lưới

Sự sinh trưởng và phát triển của cây rau muống được thể hiện qua các chỉ tiêu như chiều cao cây rau, số lá, đường kính thân và các chỉ tiêu nông học khác từ đó góp phần làm tăng sinh khối và tăng năng suất cây rau, là một trong những chỉ tiêu quan trọng mà người trồng rau mong muốn đạt được. Do đó, để xác định vai trò của các dòng vi khuẩn có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và các hệ IMO trong khả năng kích thích sinh trưởng và gia tăng năng suất cây rau muống cần theo dõi các chỉ tiêu nông học của cây rau muống.

4.5.1.1 Chiều cao cây rau muống

Chiều cao cây là một trong những đặc trưng quan trọng giúp đánh giá khả năng sinh trưởng và hình thành năng suất rau muống. Kết quả khảo sát khả năng kích thích sự gia tăng chiều cao cây rau muống của 5 dòng vi khuẩn và 5 IMO tuyển chọn trồng trong chậu ở nhà lưới qua ba vụ thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.17. Kết quả cho thấy các nghiệm thức chủng vi sinh vật kết hợp bón giảm các mức phân đạm khác nhau cho chiều cao thân rau muống cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau và so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Nhìn chung, trong suốt 3 vụ rau thí nghiệm liên tục việc giảm phân đạm ở mức 25% và 50% làm giảm chiều cao cây rau muống so với nghiệm thức bón 100% NPK theo khuyến cáo, tuy nhiên ở các nghiệm thức bón 75N và 50N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn hoặc hệ IMO giúp chiều cao cây rau muống vẫn duy trì ở mức bằng hoặc cao hơn so với nghiệm thức bón đầy đủ 100N-48P2O5-24K2O khuyến cáo. Cụ thể trong vụ rau muống thứ nhất, các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4, MQ-2.5, MT-16.5 và OM-17.5 cho chiều cao cây cao nhất và đạt lần lượt 43,3 và 43,1, 42,1 và 41,2 cm và khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng dương, bón phân 100%NPK theo khuyến cáo

117

(42,6 cm). Bên cạnh đó các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các hệ IMO củ lùn, mồng tơi, ớt và tre dù chiều cao thân có giảm và dao động từ 38,3-39,7 cm nhưng vẫn khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức bón phân 100%NPK theo khuyến cáo. Tuy nhiên trong vụ 2 chỉ có nghiệm thức bón 75N- 48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 có chiều cao cây ở mức 54,0 cm, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so với nghiệm thức bón 100%NPK khuyến cáo (51,9 cm), trong khi các nghiệm thức còn lại cho chiều cao cây thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức bón 100%NPK theo khuyến cáo. Bảng 4.17 Chiều cao cây rau muống qua 3 vụ thí nghiệm ở phòng thí nghiệm

Chiều cao thân (cm) STT Nghiệm thức

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Đáng lưu ý trong vụ rau muống thứ 2 là nghiệm thức bón 50N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho chiều cao cây đạt 48,0 cm, tuy nhiên, không khác biệt thống kê (p<0,05) khi so sánh với nghiệm thức đối chứng bón 100N-48P2O5- 24K2O theo khuyến cáo (51,9 cm). Sang vụ rau muống thứ 3 kết quả có sự khác biệt rõ rệt hơn giữa các nghiệm thức, đặc biệt là ở các nghiệm thức bón 2 mức phân đạm là 75N và 50N-48P2O5-24K2O có chiều cao cây khác nhau và khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Cụ thể, chiều cao thân ở nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết

118

1 Đối chứng 0NPK 2 Khuyến cáo 100N-48P2O5-24K2O 75N-48P2O5-24K2O + TP-1.3 3 75N-48P2O5-24K2O + TP-1.4 4 5 75N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5 75N-48P2O5-24K2O + OM-17.5 6 75N-48P2O5-24K2O + MT-16.5 7 75N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp vk 8 75N-48P2O5-24K2O + IMO Củ lùn 9 75N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 10 75N-48P2O5-24K2O + IMO Ớt 11 75N-48P2O5-24K2O + IMO Tre 12 75N-48P2O5-24K2O + IMO hỗn hợp 13 50N-48P2O5-24K2O + TP-1.3 14 50N-48P2O5-24K2O + TP-1.4 15 50N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5 16 50N-48P2O5-24K2O + OM-17.5 17 50N-48P2O5-24K2O + MT 16.5 18 50N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp vk 19 50N-48P2O5-24K2O + IMO Củ lùn 20 50N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 21 50N-48P2O5-24K2O + IMO Ớt 22 50N-48P2O5-24K2O + IMO Tre 23 50N-48P2O5-24K2O + IMO hỗn hợp 24 F CV(%) Vụ 1 24,5f 42,6ab 37,6bcde 43,3a 43,1a 41,2abcd 42,1abc 39,9abcd 36,7abcd 38,3abcde 39,7abcd 39,5abcd 37,9bcde 38,5abcde 38,3abcde 39,9abcd 36,9de 37,5cde 40,1abcd 34,0e 41,0abcd 37,1cde 37,1cde 36,3de * 10,3 Vụ 2 Vụ 3 30,3e 27,6o 51,9ab 45,5b 47,7bcd 37,5fghi 54,0a 50,5a 46,9cd 38,7fg 43,3c 46,9cd 46,4cd 36,9ghijk 41,7cd 44,1cd 34,1lmn 46,9cd 38,4fgh 46,1cd 35,2klm 47,5bcd 40,8de 48,7bc 35,8ijkl 48,0bcd 37,0ghij 44,3cd 39,3ef 48,0bcd 33,3n 45,2cd 33,9mn 43,6d 33,8mn 46,4cd 44,1cd 34,7lmn 45,1cd 35,3jklm 36,8hijk 45,1cd 38,1fgh 46,2cd 37,0ghij 47,3bcd 38,7fg 47,0cd * * 12,0 9,42 Trung bình (cm) 27,5b 46,7a 40,9ab 49,3a 42,9ab 43,8a 41,8ab 41,9ab 39,2ab 40,9ab 40,8ab 43,0ab 40,6ab 39,9ab 41,9ab 39,5ab 38,1ab 39,2ab 39,6ab 38,1ab 41,0ab 40,5ab 40,5ab 40,7ab * 13,8

hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho chiều cao thân cao nhất (50,5 cm), cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức bón 100N-48P2O5- 24K2O theo khuyến cáo và so với các nghiệm thức còn lại. Bên cạnh đó, ở các nghiệm thức bón 50N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 này cho chiều cao cây tương đương hoặc cao hơn một số nghiệm thức khác bón ở mức 75N-48P2O5- 24K2O.

Kết quả phân tích qua 3 vụ rau muống cũng đã cho thấy các nghiệm thức bón giảm phân đạm kết hợp chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA cho chiều cao cây cao hơn các nghiệm thức bón giảm phân đạm kết hợp chủng các hệ IMO. Trong các vụ rau thí nghiệm 1 và 2 vai trò của các dòng vi khuẩn trong kích thích tăng chiều cao cây là chưa rõ rệt. Cụ thể, ở vụ rau thứ nhất các nghiệm thức bón phân 75N và 50N-48P2O5-24K2O có chiều cao cây rau không khác biệt thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau, tuy nhiên qua vụ rau thứ 2 bắt đầu có sự khác biệt và khác biệt này thể hiện rõ rệt hơn trong vụ rau thứ 3. Điều này có thể giải thích do ở vụ thứ nhất các thành phần dinh dưỡng cần thiết, đặc biệt là đạm trong đất lưu tồn nhiều từ các vụ canh tác trước đây của nông dân trên đồng ruộng và điều này giúp cây rau ở tất cả các nghiệm thức phát triển tốt, tuy nhiên trong các vụ rau tiếp theo các thành phần dinh dưỡng này giảm xuống, đặc biệt là nguyên tố đạm vì vậy vai trò của các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA có điều kiện để thể hiện rõ vai trò hơn. Ngoài ra do điều kiện thí nghiệm trồng trong chậu do đó lượng đất hạn chế dẫn đến hàm lượng các chất hữu cơ và vô cơ trong đất bị giới hạn và cũng qua đó hiệu quả của các dòng vi khuẩn có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA được thể hiện rõ hơn.

4.5.1.2 Số lá rau muống

Kết quả khảo sát số lá rau muống giữa các nghiệm thức trong suốt 3 vụ rau muống được trình bày ở Bảng 4.18 cho thấy hầu hết giữa các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh giữa các nghiệm thức với nhau và với nghiệm thức đối chứng bón phân theo khuyến cáo. Giữa các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn và hệ IMO ở cùng một mức phân bón cũng không khác biệt nhau và tương tự cho các nghiệm thức bón hai mức phân 75N và 50N-48P2O5-24K2O cũng không khác biệt nhau về số lá. Như vậy, việc chủng các dòng vi khuẩn tuyển chọn và hệ IMO kết hợp bón giảm phân N (25-50% N theo khuyến cáo) đã không ảnh hưởng đến số lá cây rau muống.

119

Bảng 4.18 Số lá rau muống qua 3 vụ thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm

Số lá (lá) STT Nghiệm thức

10,6a

Đối chứng (0NPK) Khuyến cáo 100N-48P2O5-24K2O 75N-48P2O5-24K2O + TP-1.3 75N-48P2O5-24K2O + TP-1.4 75N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5 75N-48P2O5-24K2O + OM-17.5 75N-48P2O5-24K2O + MT-16.5 75N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp vk 75N-48P2O5-24K2O + IMO Củ lùn 75N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 75N-48P2O5-24K2O + IMO Ớt 75N-48P2O5-24K2O + IMO Tre 75N-48P2O5-24K2O + IMO hỗn hợp 50N-48P2O5-24K2O + TP-1.3 50N-48P2O5-24K2O + TP-1.4 50N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5 50N-48P2O5-24K2O + OM-17.5 50N-48P2O5-24K2O + MT 16.5 50N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp vk 50N-48P2O5-24K2O + IMO Củ lùn 50N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 50N-48P2O5-24K2O + IMO Ớt 50N-48P2O5-24K2O + IMO Tre 50N-48P2O5-24K2O + IMO hỗn hợp

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

4.5.1.3 Đường kính thân

Kết quả khảo sát đường kính thân rau muống của 5 dòng vi khuẩn và 5 hệ IMO tuyển chọn trồng trong chậu ở điều kiện nhà lưới qua ba vụ thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.19. Nhìn chung trong cả 3 vụ rau muống thí nghiệm các nghiệm thức chủng vi khuẩn và hệ IMO kết hợp bón giảm các mức phân đạm khác nhau (25 và 50% N khuyến cáo) có ảnh hưởng đến đường kính thân rau muống không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau. Tuy nhiên ở các nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn hoặc hệ IMO có hiệu quả trong việc duy trì đường kính thân ở mức bằng hoặc cao hơn so với nghiệm thức bón đủ 100%NPK khuyến cáo. Đặc biệt, nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 kết hợp bón 75N-48P2O5-24K2O cho đường kính thân cao hơn so với nghiệm thức đối chứng bón 100%NPK theo khuyến cáo trong vụ 1 và vụ 3 với đường kính thân tương ứng của nghiệm thức này lần lượt là 5,74 và 6,20 mm so với nghiệm thức đối chứng bón 100%NPK khuyến cáo là 5,35 cm ở vụ 1 và 5,59 cm ở vụ 3. Các nghiệm thức còn lại có đường kính thân dao động trong khoảng 4,44 đến 5,90 mm.

120

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 F CV(%) Vụ 2 Vụ 3 Vụ 1 7,93d 7,85d 7,53e 10,7a 10,0abc 9,50abc 9,80abc 10,1abc 9,85abc 9,80abc 10,8a 10,1abc 9,67abcd 10,4abc 10,1abc 10,5a 10,6abc 9,90abc 10,7ab 10,1abc 10,1ab 9,09abcd 10,4abc 10,0abc 10,7ab 10,0abc 9,20abcd 10,3abc 10,4a 9,80abc 10,5abc 10,1abc 10,4a 10,7ab 9,30abcd 9,40abcd 10,4abc 9,85abc 8,60bcd 10,1abc 9,60abc 9,07abcd 10,6abc 10,2ab 9,00abcd 10,3abc 9,85abc 9,67abcd 9,7abc 9,68c 9,29abcd 9,75bc 10,0abc 8,40bcd 9,85abc 9,50abc 9,20c 8,30de 8,13cd 8,35de 9,65abc 9,67abcd 9,40bc 8,65d 9,31abcd 9,25bc 8,15de 8,40bcd 9,20c 8,05de 8,01cd * * * 6,20 10,6 9,70 Trung bình (lá) 7,77e 10,1abcd 9,92abcd 10,2abc 10,1abcd 10,3a 10,3ab 9,81abcd 10,4a 10,0abcd 10,1abcd 10,1abcd 9,88abcd 9,47abcde 9,96abcd 9,72abcd 9,65abcd 9,68abcd 9,25abcde 8,54cde 9,22abced 9,12abcde 8,60bcde 8,44de * 8,50

Bảng 4.19 Đường kính cây rau muống qua 3 vụ thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm

Đường kính thân (mm) STT Nghiệm thức Trung bình (cm)

Vụ 1 3,20e 5,35abc 5,11abcd 5,74a

5,11abcd Đối chứng (0NPK) Khuyến cáo 100N-48P2O5-24K2O 75N-48P2O5-24K2O + TP-1.3 75N-48P2O5-24K2O + TP-1.4 75N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5 75N-48P2O5-24K2O + OM-17.5 75N-48P2O5-24K2O + MT-16.5 75N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp vk 75N-48P2O5-24K2O + IMO Củ lùn 75N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 75N-48P2O5-24K2O + IMO Ớt 75N-48P2O5-24K2O + IMO Tre 75N-48P2O5-24K2O + IMO hỗn hợp 50N-48P2O5-24K2O + TP-1.3 50N-48P2O5-24K2O + TP-1.4 50N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5 50N-48P2O5-24K2O + OM-17.5 50N-48P2O5-24K2O + MT 16.5 50N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp vk 50N-48P2O5-24K2O + IMO Củ lùn 50N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 50N-48P2O5-24K2O + IMO Ớt 50N-48P2O5-24K2O + IMO Tre 50N-48P2O5-24K2O + IMO hỗn hợp

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

4.5.1.4 Hàm lượng chlorophyll tổng số trong lá

Chlorophyll hay còn gọi là chất diệp lục hoặc diệp lục tố là thành phần quan trọng của lá cây, chính nhờ có chlorophyll mà quá trình quang hợp được thực hiện giúp cây sinh trưởng tốt. Do đó hàm lượng chlorophyll trong lá rau đóng vai trò quan trọng quyết định sự sinh trưởng và năng suất của cây rau và là một trong những chỉ tiêu đánh giá gián tiếp lượng đạm hấp thu từ đất bởi cây trồng. Bảng 4.20 trình bày kết quả khảo sát hàm lượng chlorophyll trong lá rau muống trong 3 vụ thí nghiệm cho thấy hàm lượng chlorophyll trong lá rau muống khác nhau giữa các nghiệm thức và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau giữa các nghiệm thức. Trong đó nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho hàm lượng chlorophyll cao nhất trong cả 3 vụ rau thí nghiệm với hàm lượng chlorophyll dao động từ 13,5 đến 15,7 CCI so với nghiệm thức đối chứng bón 100%NPK theo khuyến cáo là 13,2 CCI đến 14,7 CCI. Các nghiệm thức còn lại ở cùng

121

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 F CV(%) Vụ 3 Vụ 2 3,73g 3,40e 6,58a 5,59bcd 6,43ab 5,32cdef 6,20a 6,45ab 5,35abc 5,92abcd 5,49bcde 5,61bcd 5,18abcd 5,89abcd 5,37ab 5,91abcd 5,28cdef 5,44cd 5,30cdef 4,84bcd 5,29abcd 6,12abcd 4,97ef 4,95abcd 5,93abcd 5,48bcde 4,94abcd 5,89abcd 5,27cdef 5,09abcd 5,89abcd 5,96ab 6,26abc 5,68abcd 4,81bcd 5,84abc 5,06abcd 5,77abcd 5,84abc 5,11abcd 5,84abcd 5,475cd 5,37cdef 4,86bcd 5,58bcd 5,05abcd 5,25d 5,20def 5,27abcd 5,43cd 5,39cd 5,39cdef 4,90abcd 5,58bcd 5,62bcd 4,50cd 5,24def 5,26d 5,07abcd 4,94ef 4,48d 5,71abcd 5,64bcd 4,87f 5,20def 4,49cd 5,66abcd * * 9,37 11,8 * 10,6 3,44b 5,84a 5,62a 6,13a 5,59a 5,56a 5,52a 5,19a 5,46a 5,45a 5,37a 5,65a 5,58a 5,56a 5,60a 5,24a 5,29a 5,30a 5,23a 5,23a 5,19a 5,04a 5,21a 5,12a * 11,3

mức phân bón 75N-48P2O5-24K2O có hàm lượng chlorophyll dao động trong khoảng 11,3 đến 15,2 CCI, trong khi ở mức phân bón 50N-48P2O5-24K2O có hàm lượng chlorophyll thấp hơn và dao động trong khoảng từ 9,79 đến 13,3 CCI.

Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Sekhar and Gopal (2013), khi nghiên cứu đã so sánh ảnh hưởng của các hệ IMO và phân bón hóa học lên sự tăng trưởng của lá mầm và hàm lượng chlorophyll trong lá đậu bắp, đậu đũa và hạt kê đã cho thấy khi xử lý hạt với IMO giúp hàm lượng chlorophyll trong lá đạt cao nhất so với hạt được ngâm với phân hóa học và đối chứng chỉ ngâm nước. Bảng 4.20 Hàm lượng chlorophyll tổng số trong lá rau muống qua 3 vụ thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm

Hàm lượng Chlorphyll tổng số trong lá (CCI) STT Nghiệm thức

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

4.5.1.5 Sinh khối tươi/chậu

Kết quả phân tích sinh khối tươi cây rau muống trồng trong chậu ở điều kiện nhà lưới trong ba vụ thí nghiệm được trình bày trong Bảng 4.21. Kết quả cho thấy các nghiệm thức khác nhau cho khối lượng tươi/chậu của rau muống khi thu hoạch khác nhau và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau. Nhìn chung, trong

122

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 F CV(%) Vụ 1 7,43g 14,7abc 13,2abcd 15,7a 12,6abcde 15,2ab 13,2abcd 13,4abcd 11,3def 12,0bcdef 12,4abcde 11,3def 13,2abcd 9,79efg 10,3defg 11,9bcdef 10,4defg 10,5defg 12,7abcde 11,7cdef 12,0bcdef 12,1bcde 13,3abcd 10,1defg * 17,8 Vụ 3 Vụ 2 9,3j 8,38c 13,8ab 13,2abc 13,3ab 11,5defgh 13,5a 14,5a 13,8ab 12,5abcde 14,2a 12,1cdefg 13,4ab 12,3abcde 13,6ab 12,4abcde 12,9ab 12,7abcde 13,7ab 12,7abcd 13,4ab 12,4abcde 13,2abc 14,7a 13,2ab 13,4ab 12,5ab 12,2bcdef 12,7abcd 12,9ab 11,0fgh 12,8ab 10,7hi 11,1bc 12,0ab 11,0ghi 11,5efgh 11,8ab 10,8hi 13,0ab 10,5hi 12,4ab 11,0ghi 12,4ab 13,2ab 9,8ij 12,6ab 11,6defgh * 10,1 * 12,18 Trung bình (CCI) 8,4c 13,9ab 12,7ab 14,6a 13,0ab 13,8ab 13,0ab 13,1ab 12,3ab 12,8ab 12,7ab 13,1ab 13,3ab 11,5abc 12,0ab 11,9ab 10,7bc 11.2bc 12,0ab 11,8ab 11,6abc 11,8ab 12,1ab 11,4abc * 12,2

Nghiệm thức STT

cả 3 vụ rau thí nghiệm các nghiệm thức chỉ bón phân đạm ở mức 75N và 50N-48P2O5- 24K2O làm giảm lượng sinh khối tươi rau muống một cách mạnh mẽ so với nghiệm thức bón 100%NPK theo khuyến cáo, tuy nhiên ở các nghiệm thức bón giảm phân đạm ở mức 75N và 50N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn hoặc hệ IMO đều cho khối lượng tươi của rau ở mức bằng hoặc cao hơn so với nghiệm thức bón đủ 100%NPK khuyến cáo. Cụ thể trong vụ thí nghiệm 1, bốn nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4, OM-17.5, MT-16.5, và hệ IMO thu thập từ đất trồng củ lùn cho sinh khối tươi rau muống lần lượt là 31,3, 28,9, 29,5 và 29,2 g so với nghiệm thức đối chứng bón phân 100% NPK theo khuyến cáo là 28,3 g. Các nghiệm thức còn lại đều cho sinh khối tươi thấp hơn và dao động từ 18,7- 26,9 g. Tuy nhiên trong vụ 2 chỉ có nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 vẫn duy trì sinh khối tươi thu được ở mức cao (52,1 g), tương đương và khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức bón 100%NPK khuyến cáo (52,9 g). Các nghiệm thức còn lại có sinh khối tươi/chậu thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng chỉ bón 100N- 48P2O5-24K2O theo khuyến cáo. Bảng 4.21 Trọng lượng tươi của rau muống (g/chậu) qua 3 vụ thí nghiệm ở nhà lưới Trọng lượng tươi rau muống (g.chậu-1) Vụ 1

Vụ 2

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

123

1 Đối chứng (0NPK) 2 Khuyến cáo 100N-48P2O5-24K2O 75N-48P2O5-24K2O + TP-1.3 3 75N-48P2O5-24K2O + TP-1.4 4 75N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5 5 75N-48P2O5-24K2O + OM-17.5 6 75N-48P2O5-24K2O + MT-16.5 7 75N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp vk 8 75N-48P2O5-24K2O + IMO Củ lùn 9 75N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 10 75N-48P2O5-24K2O + IMO Ớt 11 75N-48P2O5-24K2O + IMO Tre 12 75N-48P2O5-24K2O + IMO hỗn hợp 13 50N-48P2O5-24K2O + TP-1.3 14 50N-48P2O5-24K2O + TP-1.4 15 50N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5 16 50N-48P2O5-24K2O + OM-17.5 17 50N-48P2O5-24K2O + MT 16.5 18 50N-48P2O5-24K2O + hỗn hợp vk 19 50N-48P2O5-24K2O + IMO Củ lùn 20 50N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng tơi 21 50N-48P2O5-24K2O + IMO Ớt 22 50N-48P2O5-24K2O + IMO Tre 23 50N-48P2O5-24K2O + IMO hỗn hợp 24 F CV (%) 9,33g 28,3abc 24,3abcde 31,1a 27,6abc 28,9ab 29,5ab 16,0fg 29,2ab 20,7cdef 23,4abcdef 23,2abcdef 23,5abcdef 22,6bcdef 24,4abcde 23,5abcdef 22,6bcdef 22,2bcdef 26,9abcd 18,7ef 29,6ab 19,2def 24,6abcde 22,3bcdef * 22,1 Vụ 3 14,3h 13,7l 52,9a 42,7b 44,6ab 34,6e 52,1a 46,2a 40,1abc 34,0ef 36,6bcde 38,2c 31,9g 41,5bc 31,7defg 37,7cd 37,1bcde 28,2hij 36,0bcdef 37,6cd 27,3j 37,7bcde 38,7bcde 36,3d 36,5bcde 32,5fg 29,4h 33,7cdefg 39,2bcd 37,2cd 23,6k 29,5efg 24,7k 25,9g 24,7k 31,6defg 24,9k 26,6fg 24,3k 28,2efg 27,2j 28,7efg 29,1i 33,8cdefg 23,5k 36,2bcdef 27,8ij 36,3bcde * * 23,4 25,6 Trung bình 12,4b 41,3a 34,5ab 43,1a 33,9ab 34,6ab 34,3ab 28,5ab 31,5ab 31,4ab 29,5ab 32,7ab 30,8ab 28,6ab 33,6ab 25,5ab 24,4ab 26,2ab 26,1ab 23,7ab 28,5ab 27,4ab 28,1ab 28,8ab * 28,0

Đáng lưu ý trong vụ rau muống thí nghiệm thứ 2 này là nghiệm thức bón 50N- 48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho sinh khối tươi cao nhất (39,2 g) trong số các nghiệm thức bón 50N-48P2O5-24K2O, tương đương và khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.3, MQ-2.5 và MT-16.5. Sang vụ rau thí nghiệm thứ 3 kết quả có sự khác biệt rõ rệt hơn giữa các nghiệm thức và các nghiệm thức bón 2 mức phân đạm là 75N và 50N-48P2O5-24K2O cho sinh khối tươi rau muống khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Đặc biệt trong vụ rau thứ 3 này, nghiệm thức bón 75N- 48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho sinh khối tươi đạt 46,2 g, cao hơn nghiệm thức đối chứng bón phân 100%NPK theo khuyến cáo (42,7 g) và các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức bón 50N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho khối lượng tươi khá tốt, tương đương hoặc cao hơn một số nghiệm thức khác bón 75N-48P2O5-24K2O.

Như vậy sự gia tăng năng suất rau muống của nghiệm thức bón 75N-48P2O5- 24K2O kết hợp với chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 trong 3 vụ rau muống là do dòng vi khuẩn Paembacillus cineris TP-1.4 đã cố định đạm và tạo ra lượng đạm hữu dụng cao nhất so với các dòng vi khuẩn còn lại trong thí nghiệm này và điều này được minh chứng thông qua kết quả về khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn thử nghiệm được trình bày ở mục 4.3.3.2. và ngoài ra trong kết quả thí nghiệm ở mục 4.3.5 cho thấy lượng IAA được tổng hợp bởi dòng vi khuẩn TP-1.4 ổn định trong suốt thời gian thí nghiệm. Do đó, khi chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 vào trong đất dòng vi khuẩn này đã duy trì ổn định khả năng kích thích sinh trưởng cây rau muống tốt hơn so với các nghiệm thức còn lại. Bên cạnh đó, kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm hạt rau muống của dòng vi khuẩn này trình bày ở mục 4.4.1.1 cho thấy dòng vi khuẩn TP- 1.4 này đã giúp gia tăng tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống tốt nhất, ngoài ra còn làm gia tăng chiều dài thân và sinh khối tươi rau muống tốt hơn so với các dòng vi khuẩn còn lại thông qua kết quả kích thích sinh trưởng được trình bày trong mục 4.4.1.2. Điều này đã làm tăng năng suất rau muống/chậu của nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP- 1.4 cao nhất ở điều kiện thí nghiệm nhà lưới.

Đối với các nghiệm thức chủng các hệ IMO, mặt dù ở điều kiện phòng thí nghiệm các IMO cho hiệu quả kích thích sinh trưởng tương đương các dòng vi khuẩn, tuy nhiên trong điều kiện trồng nhà lưới các hệ IMO cho hiệu quả kích thích sinh trưởng thấp hơn dẫn đến sinh khối tươi thu được trên chậu của các nghiệm thức chủng các hệ IMO thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn đơn ở cùng 1 điều kiện thí nghiệm về mức độ phân đạm và so với nghiệm thức đối chứng bón 100N-48P2O5-24K2O khuyến cáo.

Tóm lại, kết quả phân tích 3 vụ rau muống thí nghiệm trồng trong điều kiện nhà lưới đã cho thấy các nghiệm thức bón giảm phân đạm kết hợp chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA cho sinh khối tươi cao hơn các nghiệm thức bón

124

giảm phân đạm kết hợp chủng các hệ IMO. Trong vụ rau thứ nhất vai trò của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trong việc giúp gia tăng sinh khối rau muống là chưa rõ rệt, tuy nhiên qua vụ rau thí nghiệm thứ 2 bắt đầu có sự khác biệt và khác biệt này thể hiện rõ hơn khi sang vụ rau thí nghiệm thứ 3. Nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho hiệu quả trong kích thích sinh trưởng cây rau muống tốt nhất dẫn đến làm tăng sinh khối tươi cây rau so với nghiệm thức bón 100N-48P2O5- 24K2O khuyến cáo. Ngoài ra các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn TP-1.3, MQ-2.5, OM-17.5, MT-16.5 và hệ IMO tre cho các chỉ tiêu sinh trưởng và sinh khối khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng bón 100% NPK khuyến cáo.

4.5.2 Sinh trưởng và năng suất cải xanh trong nhà lưới

Khả năng kích thích sinh trưởng và năng suất rau cải xanh của 5 dòng vi khuẩn và 5 hệ IMO tuyển chọn trồng trong chậu ở điều kiện nhà lưới qua hai vụ thí nghiệm được trình bày ở trong Bảng 4.22 cho thấy kết quả về các chỉ tiêu nông học và năng suất của 2 vụ rau muống có xu hướng tương tự nhau.

4.5.2.1 Vụ cải xanh thứ nhất

Kết quả sinh trưởng và năng suất cải xanh ở vụ 1 trồng trong nhà lưới được trình bày trong Bảng 4.22 cho thấy các nghiệm thức khác nhau cho các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất cây cải xanh khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau. Nhìn chung, các chỉ tiêu về sinh trưởng và năng suất của các nghiệm thức chủng vi khuẩn kết hợp bón 52,5N-48P2O5-24K2O cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức bón 35N-48P2O5-24K2O.

Đối với chiều cao thân, các nghiệm thức bón phân 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn tuyển chọn cho chiều cao cây tương đương và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng bón 70N- 48P2O5-24K2O khuyến cáo, nhưng cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức bón 35N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn. Trong đó các nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 ở cả 2 mức phân đạm (35N và 52,5N-48P2O5-24K2O) và nghiệm thức chủng hệ IMO hỗn hợp kết hợp bón 52,5N- 48P2O5-24K2O cho chiều cao cây tương đương với nghiệm thức bón 70N-48P2O5- 24K2O khuyến cáo, trong khi nghiệm thức không bón phân NPK và nghiệm thức chỉ bón 35N-48P2O5-24K2O nhưng không chủng vi khuẩn là 2 nghiệm thức cho chiều cao cây thấp nhất. Các nghiệm thức bón 35N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng hệ IMO hoặc vi khuẩn cho chiều cao cây cao hơn nghiệm thức chỉ bón 35N-48P2O5-24K2O.

125

Bảng 4.22 Một số chỉ tiêu nông học và sinh khối cây cải xanh qua 2 vụ thí nghiệm trong chậu ở trong điều kiện nhà lưới STT

Chiều cao thân (cm)

Số lá (lá)

Dài lá (cm)

Rộng lá (cm)

Sinh khối tươi

Nghiệm thức

Vụ 2 10,9m 18,3fghi 8,60abcde

Vụ 1 10,8k 17,1abc 16,6abcd 12,8j

17,7a 16,4abcdef 16,5abcde 16,7abcd 16,7abcd 16,3abcdefg 15,7bcdefg 14,9efghi 16,6abcd 17,3ab 15,6cdefgh 17,1abc 15,1defghi 14,7ghi 14,7ghi 13,6ij 14,8fghi 15,1defghi

Đối chứng (0NPK) Khuyến cáo 70N 52,5N Khuyến cáo 35N Khuyến cáo 52,5N + TP-1.3 52,5N + TP-1.4 52,5N + MQ-2.5 52,5N + OM-17.5 52,5N + MT-16.5 52,5N + Mix 5 VK 52,5N + IMO Củ lùn 52,5N + IMO Mồng tơi 52,5N + IMO Ớt 52,5N + IMO Tre 52,5N + hỗn hợp IMO 35N + TP-1.3 35N + TP-1.4 35N + MQ-2.5 35N + OM-17.5 35N + MT 16.5 35N + Mix 5 VK 35N + IMO Củ lùn 35N + IMO Mồng tơi 35N + IMO Ớt 35N + IMO Tre 35N + hỗn hợp IMO

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

F CV (%)

Vụ 2 Vụ 1 5,65f 7,27iklmn 9,65ab 17,3ij 8,25bcde 8,05defgh 16,0l 8,40abcde 7,75efghi 10,1a 16,7abcd 19,4 bcde 8,35abcde 9,05bc 9,30ab 21,1a 18,7defg 6,33n 9,50a 18,6defg 8,70abcde 7,48fghikl 8,15bcde 7,50fghik 18,4efgh 7,90efgh 9,00abc 19,1cdef 8,85bcd 19,6bcd 8,85abcd 8,5cde 20,4ab 8,40abcde 8,8bcd 19,0cdef 8,45abcde 8,3cdef 19,9bc 9,05abc 19,7bc 8,65abcde 7,8efghi 6,975i-n 8,05cde 18,7defg 8,15bcde 7,35ghikl 19,2cdef 7,60e 17,6hij 6,45mn 7,60e 6,70klmn 17,6hij 6,60lmn 17,2jk 8,30abcde 17,8ghij 8,05cde 6,80jklmn 16,2kl 8,58abcde 6,70klmn 7,85cde 8,20cdefg 8,15bcde 8,05defgh 8,00cde 7,70efghi 7,6fghij 7,70de * * 12,8 9,87

18,9cdef 14,0hij 18,5defgh 15,8bcdefg 19,5bcd 16,7abcd 18,8cdefg * 10,5

* 9,75

Vụ 1 Vụ 2 Vụ 1 8,30j 9,30p 4,73f 15,0ab 18,3bc 8,90a 10,0cde 15,0mn 8,88a 10,2i 13,5o 6,93e 14,5bcd 17,6cde 8,60ab 15,5a 19,3a 8,98a 14,4bcd 16,3ghij 8,18abcd 8,15abcd 16,1hijk 14,4bcd 14,5bcd 15,8ijklm 7,95abcde 16,5fghi 15,2ab 8,25abcd 17,6cde 8,00abcde 14,3bcd 18,7ab 7,85abcde 13,2efg 17,4cdef 8,00abcde 13,0fg 17,8bcd 8,00abcde 14,4bcd 8,35abc 15,9hijkl 14,5bcd 7,33cde 16,2hij 13,8defg 8,15abcd 16,5ghi 15,0abc 7,33cde 14,7n 13,0fg 7,08de 11,9h 14,6n 6,93e 15,3klmn 11,7h 7,53bcde 10,3hi 15,5jklmn 7,33cde 11,9h 15,1lmn 7,18cde 11,8h 15,7jijklm 7,30cde 11,5h 15,7ijklm 8,25abcd 16,8efgh 13,0g 8,25abcd 17,2defg 14,0def * * * 12,1 12,0 12,5

Hàm lượng chlorophyll ts (CCI) Vụ 2 10,3p 15,1a 14,5bcd 12,6jkl 14,1def 13,6fgh 13,8efgh 14,8abc 12,1lmn 12,5jkl 13,5gh 14,2de 14,0defg 14,9ab 14,4cd 14,1def 13,0ij 12,7jk 12,0mn 11,3o 11,3o 12,4klm 11,2o 11,7no 13,3hi 12,9ij * 9,79

Vụ 1 6,03h 14,2a 13,5abcd 13,2abcdef 11,8fg 13,2abcdef 12,6bcdef 13,7abc 12,1defg 12,7abcdef 13,8ab 13,5abcd 13,0abcdef 13,4abcde 13,4abcd 13,2abcdef 12,3bcdef 11,8fg 10,7g 13,5abcd 11,8efg 12,5bcdef 12,2cdefg 12,3bcdef 13,4abcd 12,7abcdef * 12,76

Vụ 2 5,36m 10,6a 7,33l 8,06jk 9,97bc 10,4ab 9,18defg 8,75ghi 8,98efgh 8,98efgh 9,96bc 9,94bc 9,69cd 9,38cdef 9,43cde 9,08efgh 9,40cde 8,50hijk 8,33ijk 8,19ijk 8,67ghij 7,90kl 8,67ghij 8,78fghi 9,13defg 9,03efgh * 11,90

Vụ 1 25,3o 119c 110de 75,9n 127b 144a 114cd 106ef 98,9ghi 102fg 102fgh 103fg 105ef 106ef 125b 91,0jk 108e 86,2klm 85,3lm 82,0m 88,9kl 90,4jk 87,8kl 86,1klm 88,32kl 93,9ij * 21,9

Vụ 2 24,3r 129i 107k 84,8q 148b 161a 140d 132h 130i 126j 129i 147c 137e 136f 134g 127j 133gh 100l 93,5n 96,5m 88,3p 87,5p 90,4o 97,5m 93,7n 97,7m * 25,0

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

126

Tương tự, kích thước lá cải xanh gồm chiều dài và chiều rộng lá cũng khác biệt nhau có ý nghĩa (p<0,05) giữa các nghiệm thức thí nghiệm. Trong đó các nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn và hệ IMO cho chiều dài và chiều rộng lá tương đương với nghiệm thức bón 70N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo. Đặc biệt, nghiệm thức bón 52,5N và 35N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho kích thước lá lớn nhất (chiều dài lá và 15,5 cm và chiều rộng lá là 8,98 cm). Tuy nhiên số lá và hàm lượng chlorophyll trong lá của các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau.

Đối với năng suất cải xanh (sinh khối tươi/chậu) kết quả cho thấy nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4 và hệ IMO hỗn hợp kết hợp bón 52,5N-48P2O5- 24K2O cho khối lượng rau tươi cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với các nghiệm thức còn lại, với khối lượng rau tươi lần lượt của 3 nghiệm thức này là 127, 144 và 125 g/chậu so với nghiệm thức đối chứng bón 100%NPK theo khuyến cáo là 119 g/chậu. Bên cạnh đó, thí nghiệm cũng ghi nhận nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 kết hợp bón 35N-48P2O5-24K2O cho các chỉ tiêu về sinh trưởng, năng suất và sinh khối tươi tương đương và khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với một số nghiệm thức bón phân 52,5N-48P2O5-24K2O.

4.5.2.2 Vụ cải xanh thứ hai

Vụ cải xanh thí nghiệm thứ 2 cũng ghi nhận kết quả tương tự như vụ cải xanh thí nghiệm thứ 1 trồng ở điều kiện nhà lưới. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn và hệ IMO lên sinh trưởng và năng suất cải xanh thí nghiệm trong chậu ở nhà lưới được trình bày trong Bảng 4.22 và Hình 4.17 cho thấy các nghiệm thức chủng vi khuẩn tuyển chọn kết hợp bón 52,5N-48P2O5-24K2O cho các chỉ tiêu về sinh trưởng, hàm lượng chlorophyll trong lá và năng suất cải xanh cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức còn lại. Trong đó, nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn và nghiệm thức chủng 5 IMO kết hợp bón 52,5N-48P2O5-24K2O cho chiều cao cây cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng bón 70N-48P2O5-24K2O khuyến cáo. Trong khi các chỉ tiêu về số lá, dài lá, rộng lá và hàm lượng chlorophyll của các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn kết hợp bón 52,5N-48P2O5-24K2O khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức chỉ bón 100%NPK theo khuyến cáo. Đặc biệt nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho các chỉ tiêu về chiều cao thân, số lá, dài lá cao nhất, dẫn đến khối lượng cải xanh thu hoạch trên chậu cao nhất (161 g/chậu) và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với tất cả các nghiệm thức còn lại. Bên cạnh đó, 3 nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O chủng dòng vi khuẩn TP-1.3, MQ-2.5 và hệ IMO mồng tơi là 3 nghiệm thức cho sinh khối tươi thu hoạch lần lượt là 148, 140 và 147 g/chậu, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so với nghiệm thức đối chứng 100N khuyến cáo (129 g/chậu).

127

Hình 4.17 Cây cải xanh ở các nghiệm thức thí nghiệm khác nhau ở thời điểm 33 ngày sau khi gieo hạt của vụ cải thứ 2

Tương tự rau muống, kết quả khảo sát trên cây cải xanh cũng cho thấy các hệ IMO cho hiệu quả kích thích sinh trưởng thấp hơn so với các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA đơn được tuyển chọn.

Như vậy năng suất cây cải xanh ở nghiệm thức bón 75N-48P2O5- 24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cao nhất được giải thích là do dòng vi khuẩn TP-1.4 có chức năng cố định đạm tốt và điều này tạo ra lượng dạm hữu dụng cao nhất so với các dòng vi khuẩn khác trong thí nghiệm này và được minh chứng thông qua kết quả thí nghiệm được trình bày ở mục 4.3.3.2, đồng thời lượng IAA được tổng hợp bởi dòng vi khuẩn TP-1.4 cũng ổn định trong suốt thời gian thí nghiệm và được chứng minh thông qua kết quả thí nghiệm được trình bày ở mục 4.3.5. Do đó, khi chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 vào trong đất giúp bổ sung thêm nguồn đạm cũng như giúp kích thích sinh trưởng cây cải xanh tốt hơn dẫn đến năng suất cải xanh/chậu của nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn này tăng cao nhất ở điều kiện thí nghiệm nhà lưới.

Qua 2 vụ cải xanh thí nghiệm ở nhà lưới cho thấy việc giảm lượng phân đạm làm ảnh hưởng mạnh lên sự sinh trưởng của cây cải xanh, tuy nhiên khi kết hợp giảm lượng phân đạm cùng với chủng các dòng vi khuẩn tuyển chọn hoặc các hệ IMO cho hiệu quả kích thích sinh trưởng tốt và ổn định lên sự sinh trưởng của cây cải xanh dù chỉ bón 52,5N-48P2O5-24K2O. Qua đó cho thấy các dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5, hệ IMO mồng tơi, ớt, tre và IMO hỗn hợp có hiệu quả cao trong việc kích sinh trưởng cải xanh trong điều kiện bón giảm 25%N khuyến cáo thông qua hoạt động cố định đạm từ nguồn khí trời thay thế nguồn đã đạm giảm trừ. Ngoài ra, các dòng vi khuẩn hoặc hệ IMO còn có đặc tính tổng hợp IAA ổn định cũng là một yếu tố giúp cây cải xanh tăng cường hấp thu dinh dưỡng và sinh trưởng tốt trong môi trường thiếu hụt nguồn đạm.

128

Nhìn chung, kết quả 5 vụ rau thí nghiệm (3 vụ rau muống và 2 vụ cải xanh) trong nhà lưới cho thấy cho rằng chủng vi khuẩn cố định đạm có thể giảm được đáng kể lượng phân đạm mà vẫn cho năng suất rau bằng hoặc cao hơn so với nghiệm thức chỉ bón phân hoá học (Phụ lục 11). Kết quả này tương tự với kết quả của một số nghiên cứu trước đây. Trong các thí nghiệm ở nhà lưới tại Tiền Giang, nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Trúc (2011) đã cho thấy khi sử dụng chế phẩm vi sinh tổ hợp các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA được phân lập và tuyển chọn từ đất trồng rau ở Tiền Giang giúp tăng chiều dài rễ và chiều cao cây rau muống và rau mồng tơi. Nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng việc sử dụng chế phẩm vi sinh vật cố định đạm có chức năng tổng hợp IAA không những giảm 50% lượng phân hóa học mà còn cho năng suất rau cao hơn so với nghiệm thức chỉ bón phân hóa học, đồng thời giúp giảm lượng nitrate tồn dư trong rau. Tương tự, Nhu et al. (2018) cho thấy việc chủng dòng vi khuẩn cố định đạm Kblepsiella oxytoca vào cây rau muống trồng trong chậu giúp giảm được 50% lượng phân bón hoá học đồng thời làm tăng suất rau muống thêm 45,83% và các chất dinh dưỡng trong đất tuy nhiên hàm lượng chlorophyll trong lá rau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi so sánh với nghiệm thức bón NPK khuyến cáo. Ngoài ra Khan et al. (2010) đã nghiên cứu khả năng kích thích sinh trưởng của 2 dòng vi khuẩn Azotobacter và Azosporillum và hỗn hợp của 2 dòng vi khuẩn này lên cây cải xanh cho thấy chủng Azospirillum giúp gia tăng các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất cao hơn so với chủng Azotobacter. Tuy nhiên, sự kết hợp Azotobacter và Azospirillum cho kết quả tốt nhất trong việc kích thích sinh trưởng và gia tăng năng suất của cây so với chủng riêng lẻ. Đặc biệt, Phua et al. (2012) đã phân lập các dòng vi khuẩn có chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng như tổng hợp IAA, hoà tan lân, đối kháng sinh học trong các hệ vi sinh vật bản địa IMO và đã tuyển chọn được 8 dòng vi khuẩn để thử nghiệm lên sinh trưởng của cây bắp cải (Chinese cabbage) ở điều kiện nhà lưới. Kết quả cho thấy cả 8 dòng vi khuẩn đều giúp gia tăng sinh khối khô cây cải bắp so với nghiệm thức bón phân hoá học. Ngoài ra, Desiré et al. (2018) đã so sánh hiệu quả kích thích sinh trưởng ở cùng một mức phân bón của IMO, EM và đối chứng không chủng vi khuẩn lên cây khoai tây và kết quả cho thấy nghiệm thức bón IMO cho sinh khối tươi cây cao hơn nghiệm thức bón EM và đối chứng chỉ bón phân hóa học, đồng thời nghiệm thức bón IMO và EM làm tăng năng suất khoai tây và tăng mật số vi sinh vật trong đất.

Trên các đối tượng cây trồng khác, nghiên cứu của Kiều Phương Nam và ctv. (2010) ở điều kiện vườn ươm cho thấy khi chủng các dòng vi khuẩn Methylobacterium spp. giúp gia tăng chiều cao cây mầm, chiều dài rễ, sinh khối tươi và sinh khối khô của cây đậu xanh và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Ngoài ra, nghiên cứu của Lai Quốc Chí và ctv. (2012) cho thấy 3 dòng vi khuẩn Rhizobium tropici, Bacillus subtilis và Rhizobium multihospitium giúp tăng chiều cao và năng suất cây hành lá và mồng tơi so với nghiệm thức đối chứng bón phân hóa học theo khuyến cáo. Nghiên cứu của Islam et

129

al., 2013 đã cho thấy chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm giúp gia tăng hàm lượng chlorophyll trong lá cà chua và ớt cũng như làm tăng khả năng hấp thu các nguyên tố đa lượng và vi lượng vào trong cây. Trên cây cải bó xôi (Spinacia oleracea L.) Jiménez-Gómez et al. (2018) đã công bố rằng chủng vi khuẩn Rhizobium giúp cây cải tăng số lá, kích thước, trọng lượng lá, hàm lượng chlorophyll và năng suất thu hoạch cũng như tăng hàm lượng đạm trong lá so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Tương tự, Liu et al (2019) cũng đã tiến hành thử nghiệm khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng của 8 dòng vi khuẩn Paenibacillus có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA trên cây lúa mì, dưa leo và cây cà chua. Kết quả đã cho thấy các dòng vi khuẩn này làm tăng chiều cao cây, chiều dài rễ, sinh khối khô và năng suất cả 3 loại cây trồng thử nghiệm. Kết quả cũng tương tự cũng được tìm thấy trong các nghiên cứu của Malik et al., 1985; Akbari et al., 2007; Nguyễn Thị Pha và ctv., 2014b; Chukwudozie et al., 2020).

Ngoài ra, kết quả quan sát qua 5 vụ rau thí nghiệm trong chậu ở điều kiện nhà lưới cho thấy khi chủng vi khuẩn hoặc IMO giúp cho hạt rau muống và cải xanh nảy mầm sớm hơn, đồng đều hơn so với các nghiệm thức không chủng vi khuẩn hoặc IMO (Phụ lục 10). Kết quả phân tích cũng đã cho thấy chủng các hệ IMO cho hiệu quả kích thích sinh trưởng và sinh khối tươi cây rau muống và cải xanh thấp hơn so với các dòng vi khuẩn đơn mặc dù hiệu quả kích thích sinh trưởng và nảy mầm tương đương nhau ở điều kiện phòng thí nghiệm. Điều này có thể giải thích do mật số vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn cố định đạm trong các hệ IMO dao động từ 106–107 cfu.g-1 nên khi pha loãng 1000 lần khi chủng vào đất trồng rau thì mật số của các dòng vi khuẩn cố định đạm không đủ để chúng có thể thực hiện chức năng cố định lượng đạm sinh học để tạo ra lượng đạm thay thế cho lượng đạm giảm trừ từ 25% đến 50%N trong công thức phân bón khuyến cáo. Do đó, thí nghiệm ngoài đồng nên chọn nồng độ pha loãng IMO là 500 lần khi chủng vào đất.

Ngoài ra kết quả đánh giá sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn gây bệnh cho người gồm Coliform, E. coli, Salmonella và Shigella của 5 vụ rau thí nghiệm trồng trong chậu ở điều kiện nhà lưới (Phụ lục 12) cho thấy không có sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn gây bệnh này trong các mẫu rau của các nghiệm thức ở thời điểm thu hoạch. Kết quả này chứng tỏ việc chủng các dòng vi khuẩn phân lập hoặc các hệ IMO tuyển chọn không gây nhiễm vi sinh vật gây bệnh như Coliform, E. coli, Salmonella và Shigella trên rau. Vì thế các dòng vi khuẩn phân lập và IMO tuyển chọn trong nghiên cứu này có thể tiếp tục được tuyển chọn để đánh giá hiệu quả của chúng ở điều kiện thực tế đồng ruộng.

Tóm lại, đối với rau muống thì dòng vi khuẩn TP-1.4 và MQ-2.5 cho hiệu quả kích thích sinh trưởng tốt và ổn định nhất dẫn đến làm tăng năng suất rau muống trong cả 3 vụ rau thí nghiệm và hệ IMO mồng tơi cũng cho hiệu quả kích thích sinh trưởng cây rau muống khá tốt. Đối với cải xanh, các dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4 và MQ-2.5 cho hiệu quả kích thích sinh trưởng và năng suất cao nhất. Đồng thời, hệ IMO tre và

130

IMO mồng tơi cho hiệu quả kích thích sinh trưởng khá tốt và ổn định trong cả 2 vụ cải xanh thí nghiệm. Những kết quả này cũng cho thấy chúng phù hợp với kết quả đánh giá khả năng cố định đạm bên trên của các IMO và dòng vi khuẩn (mục 4.2.3 và mục 4.3.3.2). Do đó, 3 dòng vi khuẩn có khả năng kích thích sinh trưởng hiệu quả nhất được chọn để bố trí thí nghiệm ở thực tế đồng ruộng là 3 dòng vi khuẩn kí hiệu TP-1.3, TP-1.4 và MQ-2.5, đồng thời 2 hệ IMO cho hiệu quả tốt là hệ IMO tre và IMO mồng tơi được chọn để tiếp tục khảo sát ở điều kiện thực tế đồng ruộng nhưng ở nồng độ pha loãng là 500 lần.

4.6 Nội dung 6: Hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn và 2 IMO lên sinh trƣởng, năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện đồng ruộng

4.6.1 Sinh trưởng và năng suất rau muống ở điều kiện đồng ruộng

Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng và năng suất rau muống của 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn và 2 hệ IMO trồng ở điều kiện ngoài đồng trong 2 vụ rau muống thí nghiệm cho thấy cả 2 vụ rau muống có xu hướng tương tự nhau và các dòng vi khuẩn cũng như hệ IMO đã cho hiệu quả kích thích sự sinh trưởng cây rau tốt hơn so với nghiệm thức chỉ bón phân bón hóa học.

4.6.1.1 Vụ rau muống thứ nhất

Kết quả sinh trưởng và năng suất rau muống trong vụ rau thí nghiệm thứ nhất ở ngoài đồng được trình bày trong Bảng 4.23 cho thấy các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn tuyển chọn và các hệ IMO khác nhau cho khả năng sinh trưởng và năng suất cây rau muống cũng khác nhau và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau.

Đối với chiều cao thân cây rau muống, các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng 3 dòng vi khuẩn hoặc 2 hệ IMO hoặc chế phẩm vi sinh thương mại đều cho chiều cao thân cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức chỉ bón 75N-48P2O5-24K2O và 100%NPK theo khuyến cáo. Trong đó nghiệm thức bón phân 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn cho chiều cao cây cao nhất, đạt 51,1 cm, kế đến là nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 và MQ-2.5 với chiều cao tương đương 50 cm cho hai nghiệm thức. Ba nghiệm thức này cho chiều cao cây rau muống cao nhất và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức còn lại và nghiệm thức đối chứng chỉ bón 100N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo và đối chứng chỉ bón 75N-48P2O5-24K2O. Các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.3, hệ IMO mồng tơi, tre và chế phẩm vi sinh thương mại cho chiều cao cây dao động trong khoảng 47,1-49,3 cm, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức bón 100%NPK theo khuyến cáo (42,7 cm) và nghiệm thức chỉ bón 75N- 48P2O5-24K2O (39,3 cm).

Đối với chỉ tiêu về số lá rau trên thân cây rau muống, các nghiệm thức cũng cho số lá khác biệt nhau về ý nghĩa thống kê (p<0,05). Trong đó các nghiệm thức bón

131

75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5, hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn, hệ IMO mồng tơi và hệ IMO tre cho số lá tương đương nhau, dao động từ 13-14 lá, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) khi so với các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng chế phẩm vi sinh thương mại và 2 nghiệm thức đối chứng (75N-48P2O5-24K2O và 100N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo là 12 lá).

Đối với đường kính thân cây rau muống và hàm lượng chlorophyll trong lá rau, kết quả ghi nhận tương tự, có nghĩa là ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn TP-1.3, TP- 1.4, MQ-2.5, hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn, hệ IMO tre và IMO mồng tơi đều cho các kết quả các chỉ tiêu này cao hơn so với hai nghiệm thức đối chứng chỉ bón phân hoá học (75N-48P2O5-24K2O và 100N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo) hoặc nghiệm thức đối chứng chủng chế phẩm vi sinh thương mại.

Đối với năng suất tươi rau muống ở thời điểm thu hoạch, kết quả cho thấy nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn MQ-2.5 kết hợp bón 75N-48P2O5-24K2O cho năng suất cao nhất với khối lượng rau tươi thu hoạch trung bình đạt 5,15 kg/m2, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức còn lại, kế tiếp là 2 nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 và chủng hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn cho khối lượng rau đạt lần lượt là 4,57 và 4,52 kg/m2. Trong khi các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.3, hệ IMO mồng tơi và hệ IMO tre cho năng suất rau tươi tương đương nhau, dao động khoảng 4-4,25 kg/m2, cao hơn so với nghiệm thức đối chứng bón 100N-48P2O5-24K2O là 3,52 kg/m2 và nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng chế phẩm vi sinh thương mại là 3,84 kg/m2. Như vậy việc giảm 25% lượng phân bón đạm khuyến cáo kết hợp chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA giúp gia tăng năng suất rau muống ở điều kiện thực tế đồng ruộng so với nghiệm thức chỉ bón 100N- 48P2O5-24K2O theo khuyến cáo.

Đặc biệt trong vụ rau thứ nhất dưới điều kiện thời tiết nắng hạn kéo dài không mưa, kết quả cho thấy ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA giúp cây rau chống chịu hạn tốt hơn và sinh trưởng tốt hơn, đặc biệt ở ba nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.4, MQ-2.5 và hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn kết hợp bón 75N-48P2O5-24K2O cho hiệu quả kích thích sinh trưởng cây rau muống tốt nhất. Nghiệm thức chủng các hệ IMO cũng giúp cây sinh trưởng tốt hơn 2 nghiệm thức chỉ bón phân đạm hoá học trong điều kiện nắng hạn kéo dài. Tuy nhiên, khi so sánh hiệu quả kích thích sinh trưởng giữa các dòng vi khuẩn đơn và hệ IMO cho thấy các dòng vi khuẩn cho hiệu quả kích thích sinh trưởng tốt hơn so với hệ IMO.

132

Bảng 4.23 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây rau muống trong vụ thí nghiệm 1 ở ngoài đồng tại Trường

Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 30 ngày gieo hạt (từ 27 tháng 4 năm 2020 đến ngày 27 tháng 5 năm 2020)

Hàm lượng đạm trong thân Chỉ tiêu nông học

STT Nghiệm thức Năng suất tươi (kg/m2) Số lá (lá) Nts (g.kg-1) NO3 (mg.kg-1) TCVN-2008 (300 mg.kg-1) Đường kính thân (cm) Chlorophyll tổng số (CCI)

Chiều cao thân (cm) 42,7d 12,7c 8,28a 18,8cd 3,52e 32,2 1.232a K đạt 1 Đối chứng 100N-48P2O5-24K2O

39,2e 12,1d 8,12a 18,3d 3,16f 31,8 1.097a K đạt

75N-48P2O5-24K2O + Chế phẩm VSTM

47,1c 12,2cd 6,41b 19,7bcd 3,84de 32,7 384bc K đạt 2 Đối chứng 75N-48P2O5-24K2O 3

75N-48P2O5-24K2O + TP-1.3

47,4c 13,3b 8,11a 20,7ab 4,08cd 31,9 363bc K đạt 4

75N-48P2O5-24K2O + TP-1.4

50,0ab 13,5ab 8,09a 20,8ab 4,57b 31,0 245c Đạt 5

75N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5

50,2ab 14,0a 7,89a 19,9bcd 5,15a 32,3 440b K đạt 6

29,6 K đạt 7

75N-48P2O5-24K2O + Hỗn hợp 3 dòngVK 75N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng Tơi

51,1a 13,6ab 14,0a 47,3c 7,81a 7,11ab 20,1abc 21,8a 4,52b 4,17c 31,9 481b 348bc K đạt 8

75N-48P2O5-24K2O + IMO Tre

49,4b 13,7ab 7,09ab 19,8bcd 4,25bc 31,0 406bc K đạt 9

* * * * * ns *

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

133

F CV (%) 7,97 5,45 9,32 5,67 13,9 4,28 61.9

Kết quả phân tích hàm lượng đạm tổng số (Nts) trong rau muống trong vụ 1 cho thấy hàm lượng đạm tổng số trong cây rau khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh giữa các nghiệm thức thí nghiệm. Mặc dù việc bón giảm 25% lượng đạm hóa học theo công thức khuyến cáo dẫn đến giảm hàm lượng đạm tổng số trong rau, tuy nhiên đối với các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn hiệu quả như TP-1.4 và MQ-2.5 thì hàm lượng đạm tổng số vẫn tương đương với nghiệm thức bón 100N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo với hàm lượng đạm tổng số dao động từ 29,6 đến 32,7 g.kg-1.

Đáng chú ý, kết quả phân tích hàm lượng nitrate (NO3

-) trong thân và lá rau muống ở thời điểm thu hoạch rau trong vụ 1 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) giữa các nghiệm thức chủng và không chủng vi khuẩn về chỉ tiêu này. Nhìn chung, các nghiệm thức chỉ bón phân hóa học có lượng nitrate trong rau khác biệt ý không nghĩa thống kê (p<0,05), trong khi đó, các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn, IMO và chế phẩm vi sinh thương mại đã làm giảm mạnh hàm lượng nitrate tích lũy trong rau một cách đáng kể. Với hàm lượng nitrate dao động trong khoảng 245-481 mg.kg-1 thấp hơn có ý nghĩa (p<0,05) so với các nghiệm thức chỉ bón phân hóa học có hàm lượng nitrate dao động trong khoảng 1.097-1.232 mg.kg-1. Như vậy trung bình Lượng nitrate giảm đến 68% so với nghiệm thức bón phân hóa học, trong đó nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho thấy có hiệu quả tốt nhất trong việc làm giảm lượng nitrate tích lũy trong rau (hàm lượng nitrate trong rau chỉ còn 245 mg.kg-1 giảm được 78% lượng nitrate tích lũy trong rau). Khi so sánh các nghiệm thức có chủng vi sinh còn lại với nhau cho thấy có hàm lượng nitrate trong rau muống thấp hơn so với nghiệm thức chỉ bón phân hóa học, dao động trong khoảng từ 348 đến 481 mg.kg-1 và tỷ lệ giảm lượng nitrate tích lũy trong rau muống dao động từ 62-71% so với nghiệm thức bón phân hóa học. Đối với hàm lượng nitrate trong rau, chuẩn khuyến cáo của WHO (1996) và TCVN-2008 (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn- - đối với rau muống là 300 mg/kg. 2008), mức giới hạn tối đa cho phép hàm lượng NO3 Kết quả phân tích trong nghiên cứu này cho thấy hàm lượng nitrate trong các mẫu rau muống của nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 đã được giảm xuống dưới ngưỡng an toàn (245 mg.kg-1), các nghiệm thức chủng vi sinh vật còn lại cũng cho thấy hàm lượng nitrate giảm mạnh so với các nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn nhưng bón 100N theo khuyến cáo và 75N và có xu hướng giảm về ngưỡng tiêu chuẩn cho phép tối đa (300 mg.kg-1) tuy nhiên vẫn chưa đạt. Kết quả nghiên cứu này tương tự các kết quả nghiên cứu của Phạm Xuân Lân (2007); Nguyễn Cẩm Long (2014); Nguyễn Lệ Phương và ctv. (2018); Don and Diep (2019) khi các tác giả chỉ ra rằng việc chủng các dòng vi khuẩn kích thích sinh trưởng cây trồng hoặc bón phân vi sinh hoặc chế phẩm vi sinh vật giúp giảm hàm lượng nitrate trong rau một cách hiệu quả.

134

4.6.1.2 Vụ rau muống thứ hai

Bảng 4.24 trình bày kết quả về ảnh hưởng của 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên sinh trưởng và năng suất rau muống trong vụ 2 ở điều kiện ngoài đồng cho thấy các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn và hệ IMO khác nhau cho khả năng kích thích sinh trưởng và năng suất cây rau muống khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Đối với chiều cao cây rau muống, nghiệm thức bón phân 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 và chủng hệ IMO mồng tơi cho chiều cao cây cao nhất, lần lượt đạt 62,4 cm và 61,7 cm, cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê khi so sánh với nghiệm thức đối chứng bón 100N-48P2O5-24K2O khuyến cáo, kế theo là các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn MQ-2.5 và hệ IMO tre cho chiều cao cây lần lượt đạt 60,2 và 61 cm, tương đương với nghiệm thức đối chứng bón 100N khuyến cáo (60,4 cm) và cao hơn so với nghiệm thức bón 75N là 52,4 cm. Các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP- 1.3, hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn và chế phẩm vi sinh thương mại cho chiều cao cây dao động trong khoảng từ 58,4-59,5 cm, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O, tuy nhiên, thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng bón 100N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo. Như vậy có thể thấy trong vụ rau thí nghiệm thứ 2 này các dòng vi khuẩn đơn, hỗn hợp vi khuẩn, chế phẩm vi sinh thương mại và các hệ IMO đều thể hiện vai trò kích thích tăng sinh trưởng cây rau của chúng rất tốt, thông qua hoạt động cố định đạm sinh học để thay thế 25% lượng phân đạm hoá học đã được giảm đi trong công thức phân bón. Trong đó dòng vi khuẩn TP-1.4 cho thấy có hiệu quả cao nhất trong kích thích sinh trưởng cây rau muống, đặc biệt là kích thích làm tăng chiều cao cây cao hơn so với nghiệm thức bón 100N-48P2O5-24K2O khuyến cáo.

Đối với đường kính thân cây rau muống, kết quả cũng ghi nhận tương tự khi các nghiệm thức chủng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5 và hệ IMO mồng tơi đều cho đường kính thân lớn hơn so với các nghiệm thức chỉ bón phân hóa học hoặc đối chứng chủng chế phẩm vi sinh thương mại.

Đối với số lá rau trên thân cây rau muống, trong vụ rau muống thí nghiệm thứ 2 khác biệt không ý nghĩa thống kê (p>005) nhau giữa các nghiệm thức với số lá trên thân cây rau dao động từ 10-11 lá. Tuy nhiên hàm lượng chlorophyll trong lá rau của nghiệm thức bón 100N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo trong vụ 2 này đạt giá trị cao nhất (16,8) và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức chỉ bón 75N-48P2O5-24K2O có hàm lượng chlorophyll trong lá rau thấp nhất (14,7).

135

Bảng 4.24 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây rau muống trong vụ thí nghiệm 2 ở ngoài đồng tại Trường Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 26 ngày gieo hạt (từ 23 tháng 6 năm 2020 đến ngày 18 tháng 7 năm 2020)

Hàm lượng đạm trong thân Chỉ tiêu nông học

STT Nghiệm thức Năng suất tươi (kg/m2) Số lá (lá) Nts (g.kg-1) NO3 (mg.kg-1) TCVN-2008 (300 mg.kg-1) Chiều cao thân (cm) Đường kính thân (cm) Chlorophyll tổng số (CCI)

Đối chứng 100N-48P2O5-24K2O

1 60,4cd 10,8 7,60bc 16,8a 5,21cd 41,7b 2.186a K đạt

Đối chứng 75N-48P2O5-24K2O

2 52,4g 10,4 6,88d 14,7d 3,39g 32,6c 348f K đạt

75N-48P2O5-24K2O + Chế phẩm VSTM

3 58,4f 11,0 6,89d 15,7bc 4,87ef 37,5bc 1.348c K đạt

75N-48P2O5-24K2O + TP-1.3

4 59,3e 11,0 8,22ab 16,1bc 4,84f 78,1a 1.535b K đạt

75N-48P2O5-24K2O + TP-1.4

5 62,4a 11,4 8,23ab 14,6d 5,87a 41,5b 1.250c K đạt

75N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5

6 61,0bc 11,2 8,00abc 16,3bc 5,71ab 42,9b 1.644b K đạt

75N-48P2O5-24K2O + Hỗn hợp 3 VK

7 59,5de 11,1 7,47cd 16,5b 5,06de 36,7bc 757e K đạt

75N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng Tơi

8 61,7ab 11,4 8,40a 15,4cd 5,59b 41,0bc 1.636b K đạt

75N-48P2O5-24K2O + IMO Tre

9 60,2cde 11,1 7,43cd 15,4cd 5,31c 38,6bc 987d K đạt

F ns * * * * * *

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

136

CV (%) 4,3 4,7 7,6 7,9 13,9 6,86 3,25

Đối với năng suất rau tươi khi thu hoạch, kết quả cho thấy nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 và MQ-2.5 kết hợp bón 75N-48P2O5-24K2O cho sinh khối rau tươi cao nhất, đạt lần lượt 5,87 và 5,71 kg/m2, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức còn lại. Kế đến là 3 nghiệm thức bón 75N- 48P2O5-24K2O kết hợp chủng hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn, hệ IMO mồng tơi và IMO tre, với khối lượng rau thu hoạch trên diện tích 1 m2 dao động từ 5,06-5,59 kg/m2. Trong khi các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.3 và chủng chế phẩm vi sinh thương mại cho năng suất sinh khối tươi thấp hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức đối chứng bón 100N-48P2O5-24K2O khuyến cáo, tuy nhiên vẫn cao hơn so với nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O. Như vậy khi giảm 25% lượng đạm bón cho cây rau muống thì việc chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA hoặc các hệ IMO giúp gia tăng năng suất rau muống tăng thêm 14,47% so với nghiệm thức chỉ bón 100N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo.

Nhìn chung ở vụ rau muống thí nghiệm thứ hai, khi so sánh giữa các nghiệm thức chủng 3 dòng vi khuẩn với hệ IMO cho thấy các nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.4, MQ-2.5 và hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn cho hiệu quả kích thích sinh trưởng trên cây rau muống tương tự với các nghiệm thức chủng hệ IMO mồng tơi, dẫn đến năng suất rau thu được giữa các nghiệm thức cũng tương đương nhau. Trong khi đó, nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.3 cho hiệu quả kích thích sinh trưởng và năng suất tương đương với nghiệm thức chủng hệ IMO tre và chế phẩm vi sinh thương mại. Tuy nhiên khi so sánh năng suất rau giữa nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP- 1.4 và dòng vi khuẩn MQ-2.5 trong 2 vụ rau muống thí nghiệm cho thấy nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn MQ-2.5 cho năng suất rau muống ổn định hơn so với nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-4.1 và năng suất rau muống qua 2 vụ của nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn MQ-2.5 lần lượt đạt 5,15 và 5,71 kg/m2, trong khi nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 cho năng suất rau muống ở vụ 2 cao hơn so vụ 1 và lần lượt đạt 5,87 kg/m2 ở vụ 2 so 4,57 kg/m2 ở vụ 1. Kết quả này không giống như kết quả thí nghiệm trong nhà lưới có thể là do khả năng tồn tại và phát triển của dòng vi khuẩn TP-1.4 để thực hiện chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng dưới các điều kiện bất lợi của môi trường như nắng nóng và hạn mặn trong vụ rau thứ nhất không tốt bằng dòng vi khuẩn MQ-2.5.

Kết quả phân tích hàm lượng đạm tổng số trong thân và lá rau muống ở vụ 2 cho thấy hàm lượng đạm tổng số trong cây rau muống khác biệt nhau ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh giữa các nghiệm thức với nhau. Cụ thể, nghiệm thức bón 75N- 48P2O5-24K2O làm giảm hàm lượng Nts trong rau so với nghiệm thức bón 100N- 48P2O5-24K2O, tuy nhiên cũng ở mức bón phân này nhưng khi kết hợp chủng các dòng vi khuẩn đơn, hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn, hệ IMO và chế phẩm vi sinh thương mại giúp hàm lượng Nts trong thân lá cao hơn, dao động từ 36,7 đến 41,5 g.kg-1 và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức chỉ bón 75N-48P2O5-24K2O

137

Đối với hàm lượng NO3

- trong rau, kết quả phân tích cho thấy có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) giữa các nghiệm thức về chỉ tiêu này. Nhìn chung hàm lượng nitrate trong rau ở nghiệm thức bón 100% NPK là cao nhất, đạt 2186 mg.kg-1 rau tươi và các nghiệm thức bón 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn đơn, hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn, hệ IMO và chế phẩm vi sinh thương mại đã làm giảm mạnh hàm lượng nitrate tích luỹ trong rau, với hàm lượng nitrate dao động trong khoảng 757-1644 mg.kg-1 rau tươi, trong đó nghiệm thức chủng hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn, hệ IMO tre và dòng vi khuẩn TP-1.4 cho hiệu quả giảm nitrate trong rau rất tốt. Hay nói khác hơn nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn, hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn, hệ IMO và chế phẩm vi sinh thương mại đã làm giảm từ 24,8% đến 65,4% lượng nitrate tích lũy trong rau so với nghiệm thức chỉ bón phân hóa học và kết quả này cũng tương tự như kết quả ở vụ rau muống thí nghiệm 1. Tuy nhiên, so với khuyến cáo TCVN-2008 (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn-2008), mức giới hạn tối đa cho phép hàm - đối với rau là 300 mg.kg-1, hàm lượng nitrate trong các mẫu rau của các lượng NO3 nghiệm thức trong vụ thí nghiệm 2 này mặc dù đã đạt thấp hơn so với nghiệm thức chỉ bón phân hóa học nhưng hàm lượng nitrate tích lũy trong thân lá vẫn còn cao hơn so với tiêu chuẩn qui định an toàn về nitrate cho cây rau. Điều này được giải thích do trong vụ 2 này, điều kiện thời tiết mát, mưa nhiều thuận lợi cho việc hấp thu nitrate từ đất vào trong rau tăng lên, và hạn chế quá trình làm mất nitrate do nhiệt. Ngoài ra, thời điểm thu hoạch rau muống là 26 ngày sau khi gieo hạt ở vụ 2, thời điểm thu hoạch này có thời gian cách ly chỉ là 6 ngày tính từ đợt bón phân hóa học lần cuối, thay vì phải là 10 ngày của vụ 1, do đó, đã làm ảnh hưởng đến tiến trình chuyển hóa nitrate trong rau cũng như hiệu quả chuyển hoá nitrate của các dòng vi khuẩn (Bùi Thị Khuyên và ctv, 2002; Phạm Xuân Lân, 2007; Gorenjak and Cencic, 2013; Nguyễn Cẩm Long, 2014; Nguyễn Lệ Phương và ctv., 2018; Don and Diep 2019).

Trong vụ 2 này hàm lượng nitrate thấp nhất ở nghiệm thức chỉ bón 75%N- -, chứng tỏ việc bón giảm 25% lượng đạm khuyến 48P2O5-24K2O, đạt 348 mg.kg-1 NO3 cáo cho rau muống giúp giảm đáng kể hàm lượng nitrate tích lũy trong rau, tuy nhiên, hàm lượng Nts trong rau ở nghiệm thức này đã bị giảm xuống, đồng thời năng suất rau của nghiệm thức này cũng giảm mạnh. Do đó, nghiệm thức này không phù hợp trong canh tác rau.

Khi so sánh kết quả thí nghiệm giữa nhà lưới và ngoài đồng cho thấy cả hai điều kiện thí nghiệm cho kết quả tương tự, phù hợp nhau và có cùng xu hướng khi cả hai điều kiện thí nghiệm đều cho thấy dòng vi khuẩn TP-1.4 là dòng vi khuẩn có hiệu quả kích thích sinh trưởng và năng suất rau muống tốt nhất. Đáng chú ý là các chỉ tiêu sinh

138

(348 g.kg-1 N), nhưng tương đương và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nghiệm thức bón 100N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo (41,7 g.kg-1 N). Đặc biệt trong vụ rau này nghiệm thức 75N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.3 đã làm tăng hàm lượng Nts trong lá rau, đạt 78,1 g.kg-1 và tăng thêm 87% lượng đạm tổng số so với nghiệm thức bón 100N-48P2O5-24K2O khuyến cáo.

trưởng và năng suất cây rau muống của các nghiệm thức được chủng dòng vi khuẩn MQ-2.5 và hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn có sự khác biệt nhau giữa 2 điều kiện thí nghiệm nhà lưới và ngoài đồng. Đối với các nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn MQ-2.5 và hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn kết hợp bón 75N-48P2O5-24K2O cho hiệu quả kích thích sự phát triển của cây rau muống tốt nhất đặc biệt là trong điều kiện nắng hạn kéo dài ở trong vụ rau thí nghiệm thứ nhất. Điều này có thể giải thích do dòng vi khuẩn MQ-2.5 này tồn tại, chịu đựng, sinh trưởng tốt và phát huy được chức năng kích thích sinh trưởng cả trong điều kiện nắng hạn. Đối với chỉ tiêu chlorophyll của cây rau muống, hàm lượng chlophorphyll của cây rau muống ở điều kiện ngoài đồng cao hơn, dao động từ 18,3 đến 21,8 CCI so với ở điều kiện nhà lưới (dao động từ 9,8 đến 14,7 CCI). Có sự khác biệt lớn này về hàm lượng chlorophyll có thể là do cường độ chiếu sáng ở điều kiện nhà lưới thấp hơn ở điều kiện ngoài đồng, hơn nữa thời điểm bố trí vụ rau thứ nhất ở ngoài đồng là thời gian từ 27 tháng 4 năm 2020 đến 27 tháng 5 năm 2020 là thời điểm nắng nóng mạnh kéo dài của mùa nắng nên ảnh hưởng đến hàm lượng chlorophyll trong lá rau và ngoài ra việc chủng 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn và hệ IMO cũng giúp làm gia tăng hàm lượng chlorophyll trong lá rau muống.

Tóm lại đối với cây rau muống việc giảm 25% phân đạm theo khuyến cáo kết hợp chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn hoặc hệ IMO hoặc chế phẩm vi sinh thương mại giúp kích thích sinh trưởng cây rau tốt hơn dẫn đến duy trì hoặc làm tăng năng suất cây rau. Đặc biệt, chủng dòng vi khuẩn TP-1.4, MQ- 2.5, hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4 và MQ-2.5 kết hợp bón 75N-48P2O5- 24K2O không những giúp tăng năng suất rau muống thêm từ 15% đến 30% so với nghiệm thức bón 100N-48P2O5-24K2O khuyến cáo mà còn giúp giảm được hàm lượng nitrate tích trong rau nhưng duy trì được lượng đạm tổng số trong rau.

4.6.2 Sinh trưởng và năng suất cải xanh ở điều kiện ngoài đồng

4.6.2.1 Vụ cải xanh thứ nhất

Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng và năng suất cây cải xanh của 3 dòng vi khuẩn và 2 hệ IMO tuyển chọn ở điều kiện ngoài đồng trong vụ 1 được trình bày trong Bảng 4.25 cho thấy các nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA, chủng hệ IMO cho các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất cây cải xanh cao hơn, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau và với nghiệm thức chỉ bón phân hóa học 70N-48P2O5- 24K2O và 52,5N-48P2O5-24K2O. Nhìn chung, các chỉ tiêu về sinh trưởng và năng suất của các nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng vi khuẩn cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5- 24K2O kết hợp chủng các hệ IMO và chế phẩm vi sinh thương mại và 2 nghiệm thức chỉ bón phân hoá học.

139

Bảng 4.25 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây cải xanh trong vụ thí nghiệm 1 ở ngoài đồng tại

Trường Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 30 ngày gieo hạt (từ 27 tháng 4 năm 2020 đến ngày 27 tháng 5 năm 2020)

Chlorophyll tổng số (CCI)

Chỉ tiêu nông học Hàm lượng đạm trong thân STT Nghiệm thức Năng suất tươi (kg/m2) Số lá (lá) Nts (g.kg-1) TCVN-2008 (500 mg.kg-1)

- NO3 (mg.kg- 1) 2.368a

Chiều cao thân (cm) 16,6de Chiều dài lá (cm) 14,8b Chiều rộng lá (cm) 9,39bc 6,97 2,14bc 46,1ab K đạt 18,2b 1 Đối chứng 70N-48P2O5-24K2O

14,6f 13,1c 8,31d 6,86 1.874b 1,60f 43,0b K đạt 14,7de 2 Đối chứng 52,5N-48P2O5-24K2O

52,5N-48P2O5-24K2O + Chế phẩm VSTM

3 17,2d 15,3b 9,54bc 7,53 1.438c 2,02e 41,7b K đạt 15,3cd

52,5N-48P2O5-24K2O + TP-1.3

4 19,3a 17,3a 11,0a 7,67 1.671c 2,37a 48,6a K đạt 20,1a

52,5N-48P2O5-24K2O + TP-1.4

5 18,4bc 17,3a 10,9a 7,61 1.336f 2,16cd 42,5b K đạt 14,0ef

52,5N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5

6 18,9ab 17,3a 10,8a 7,44 2,35ab 43,8ab 1.585cde K đạt 13,8f

52,5N-48P2O5-24K2O + Hỗn hợp 3 VK

7 18,2c 15,2b 9,98b 7,36 2,30ab 41,1b 1.640cd K đạt 13,7f

52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng Tơi

8 16,3e 14,7b 9,23c 7,42 1,64f 43,9ab 1.473def K đạt 18,6b

52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Tre

9 K đạt 16,0c 16,7de 6,94 15,2b 9,29bc 2,05de 42,5b 1.324f

* F * ns * * * * *

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

140

14,2 CV (%) 8,28 7,23 9,25 9,09 13,4 10,3 22,6

Cụ thể, nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP- 1.3, MQ-2.5 và hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn cho các chỉ tiêu sinh trưởng như chiều cao cây, chiều dài lá, rộng lá, hàm lượng chlorophyll và sinh khối tươi cao nhất. Nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O không chủng vi sinh vật cho các chỉ tiêu nông học và năng suất thấp nhất. Trong khi các chỉ tiêu về số lá và năng suất tươi giữa các nghiệm thức còn lại khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Tương tự như cây rau muống, khi so sánh giữa các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn đơn với hệ IMO về sinh trưởng và năng suất cho thấy các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5 và hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn cho hiệu quả kích thích sinh trưởng cải xanh cao hơn các nghiệm thức chủng các hệ IMO tre, IMO mồng tơi và chế phẩm vi sinh thương mại dẫn đến năng suất rau thu được của các nghiệm thức này cũng cao hơn, trong đó, dòng vi khuẩn TP-1.3 cho hiệu quả kích thích sinh trưởng và năng suất cải xanh tốt nhất. Trong 2 hệ IMO thử nghiệm, hệ IMO tre cho hiệu quả kích thích sinh trưởng cao hơn so với hệ IMO mồng tơi.

Kết quả phân tích chỉ tiêu năng suất vụ cải thứ nhất cho thấy các nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết chủng các dòng vi khuẩn giúp gia tăng sinh trưởng của cây cải xanh tốt hơn so với nghiệm thức chỉ bón phân hoá học, và giúp năng suất cải xanh tăng lên thêm 10% so với nghiệm thức 70N-48P2O5-24K2O khuyến cáo. Trong đó nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.3 cho hiệu quả làm tăng năng suất cao nhất. Điều này có thể giải thích do vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA được chủng vào giúp bổ sung vào đất nguồn đạm đã giảm trừ từ công thức phân bón hóa học, đồng thời tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng như IAA giúp cây sinh trưởng tốt hơn.

Kết quả phân tích hàm lượng đạm tổng số trong cây cải xanh cho thấy hàm lượng đạm tổng số trong cây khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh giữa các nghiệm thức với nhau. Nhìn chung, nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O làm giảm hàm lượng đạm tổng số trong rau, tuy nhiên ở các nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5- 24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4, MQ-2.5 và IMO tre, mồng tơi có hàm lượng đạm tổng số tương đương và khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức bón 70N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo. Tuy nhiên hàm lượng đạm tổng số ở nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.3 cho hàm lượng đạm tổng số cao hơn.

Kết quả phân tích hàm lượng nitrate (NO3

-) trong cây cải xanh cho thấy có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) về chỉ tiêu này giữa các nghiệm thức. Nhìn chung khi giảm 25% hàm lượng đạm bón cho rau từ công thức bón phân hóa học khuyến cáo đã dẫn đến việc giảm lượng nitrate tích lũy trong rau và việc chủng các dòng vi khuẩn, hệ IMO và chế phẩm vi sinh thương mại đã giúp giảm mạnh hàm lượng nitrate tích lũy trong rau hơn, với hàm lượng nitrate dao động từ 1.324 đến 1.671 mg.kg-1, trung bình giảm từ 29,4-44,1% so với nghiệm thức bón phân 70N-48P2O5-24K2O khuyến cáo. Trong đó, nghiệm thức chủng dòng vi khuẩn TP-1.4, hệ IMO tre, giúp làm giảm lượng nitrate tích lũy trong rau lên đến 44% so với nghiệm thức bón 70N-48P2O5-24K2O

141

khuyến cáo. Các nghiệm thức chủng vi sinh còn lại kết hợp bón 52,5N-48P2O5-24K2O có hàm lượng nitrate tích lũy trong rau dao động từ 1.473 đến 1.671 mg.kg-1, tương ứng giảm từ 30-39% lượng nitrate tích lũy trong rau so với nghiệm thức bón 70N- 48P2O5-24K2O khuyến cáo.

Ngưỡng nitrate khuyến cáo của WHO (1996) và TCVN-2008 là 500 mg.kg-1 cho rau cải xanh. Hàm lượng nitrate trong cải xanh của các nghiệm thức bón 52,5N- 48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn, hệ IMO và chế phẩm vi sinh thương mại đều cao hơn so với mức khuyến cáo (500 mg.kg-1) và dao động từ 1324-1640 mg.kg-1, mặc dù thấp hơn rất nhiều so với nghiệm thức chỉ bón phân hóa học (70N- 48P2O5-24K2O khuyến cáo và 52,5N-48P2O5-24K2O) không chủng vi sinh vật, lần lượt là 2368 và 1874 mg.kg-1. Điều này có thể giải thích là do các yếu tố ảnh hưởng - tích luỹ trong sản phẩm rau như giống rau (Tạ Thu Cúc, 2007; lên hàm lượng NO3 Nguyễn Cẩm Long và ctv., 2012), phân bón (Hoàng Thị Thái Hòa, 2009), mật độ gieo trồng (Cantlife, 1972, Nguyễn Cẩm Long và ctv, 2013), thời gian cách ly từ lần bón đạm cuối đến thu hoạch (Nguyễn Cẩm Long, 2014), chế phẩm vi sinh (Phạm Xuân Lân, 2007; Nguyễn Cẩm Long, 2014; Nguyễn Lệ Phương và ctv., 2018; Don and Diep 2019), mùa vụ gieo trồng (Bùi Thị Khuyên và ctv, 2002; Nguyễn Cẩm Long, 2014), cường độ ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, loại đất, giai đoạn sinh trưởng của thực vật, thời gian lưu trữ, nguồn nitơ... (Gorenjak and Cencic, 2013) đã ảnh hưởng lên quá trình tích lũy nitrate trong rau.

4.6.2.2 Vụ cải xanh thứ hai

Bảng 4.26 trình bày kết quả về sinh trưởng và năng suất rau cải xanh trong vụ thí nghiệm thứ 2 ở điều kiện ngoài đồng cho thấy các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn và hệ IMO tuyển chọn khác nhau cho khả năng sinh trưởng và năng suất cây cải xanh khác nhau và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau.

142

Bảng 4.26 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây cải xanh trong vụ thí nghiệm 2 ở ngoài đồng tại

Trường Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 33 ngày gieo hạt (từ 23 tháng 6 năm 2020 đến ngày 25 tháng 7 năm 2020)

Chlorophyll tổng số (CCI)

Chỉ tiêu nông học Thành phần hoá học trong thân STT Nghiệm thức Năng suất tươi (kg/m2) Số lá (lá) Nts (g.kg-1) NO3 (mg.kg-1) TCVN-2008 (500 mg.kg-1) Chiều cao thân (cm)

18,0c 7,57bcd Chiều dài lá (cm) 16,7bc Chiều rộng lá (cm) 7,73bc 14,4a 1,97c 40,6abc 885a K đạt 1 Đối chứng 70N-48P2O5-24K2O

17,6c 7,50bcd 16,4c 7,14d 12,5b 1,70d 36,4c 15f Đạt 2 Đối chứng 52,5N-48P2O5-24K2O

52,5N-48P2O5-24K2O + Chế phẩm VSTM

3 18,2bc 7,53bcd 16,7bc 7,47cd 12,9ab 2,13bc 42,6a 250d Đạt

52,N-48P2O5-24K2O + TP-1.3

4 19,9a 7,84abc 17,6abc 8,00b 10,8c 2,35ab 43,5a 506b K đạt

52,5N-48P2O5-24K2O + TP-1.4

5 19,3ab 8,16a 18,6a 8,61a 12,7b 2,32ab 43,5a 136e Đạt

52,5N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5

6 20,0a 7,97ab 18,4ab 8,54a 12,4bc 2,50a 39,8abc 357c Đạt

52,5N-48P2O5-24K2O + Hỗn hợp 3 VK

7 18,4bc 7,28d 17,5abc 7,44cd 12,2bc 2,01c 39,6abc 136e Đạt

52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng Tơi

8 12,2bc Đạt 18,8abc 7,45cd 17,2abc 8,54a 1,97c 38,1bc 169de

52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Tre

9 18,5bc 7,8abc 16,9bc 7,70bc 13,4ab 2,13bc 42,6a 591b K đạt

F * * * * * * * *

*Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

143

CV (%) 4,71 4,02 5,08 6,81 8,36 11,3 2,92 7,55

Đối với các chỉ tiêu chiều cao thân, số lá, chiều dài và chiều rộng lá 3 nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4 và MQ-2.5 cho kết quả cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại. Điều này dẫn đến năng suất sinh khối tươi của cây rau của 3 nghiệm thức này đạt cao nhất và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với các nghiệm thức còn lại. Bên cạnh đó, các chỉ tiêu về số lá, chiều dài lá và chiều rộng lá của 3 nghiệm thức này cũng cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức bón 70N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo. Trong khi nghiệm thức chỉ bón 52,5N-48P2O5-24K2O không chủng vi khuẩn cho các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất cải thấp nhất. Ngoài ra, các nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn, chế phẩm vi sinh thương mại và chủng các hệ IMO cho các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất rau tương đương và khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nghiệm thức bón 70N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo. Như vậy có thể thấy chủng các dòng vi khuẩn TP-.3, TP-1.4 và MQ-2.5 không những giúp tăng sinh trưởng và năng suất cây cải thêm 20% mà còn giảm được 25% lượng phân đạm hoá học và chủng các hệ vi sinh vật bản địa giúp giảm 25% phân đạm bón cho cây cải xanh nhưng vẫn đảm bảo duy trì năng suất tương đương và khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức bón 70N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo. Kết quả phân tích hàm lượng đạm tổng số trong cây cải xanh ở vụ thí nghiệm thứ 2 cho thấy hàm lượng đạm tổng số trong cải xanh có sự khác biệt ý nghĩa thống kê khi so sánh với nhau giữa các nghiệm thức. Nhìn chung, khi giảm 25% lượng phân đạm theo khuyến cáo làm giảm hàm lượng đạm tổng số trong rau, tuy nhiên đối với các nghiệm thức có kết hợp chủng các dòng vi khuẩn và hệ IMO hàm lượng đạm tổng số vẫn được duy trì tương đương và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nghiệm thức bón 70N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo. Tuy nhiên hàm lượng đạm tổng số trong các nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4 và hệ IMO tre có hàm lượng đạm tổng số cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so với nghiệm thức bón 70N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo.

Kết quả phân tích hàm lượng nitrate (NO3

-) trong cây cải xanh ở vụ 2 cho thấy có khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) giữa các nghiệm thức khi so sánh với nhau về chỉ tiêu này. Cụ thể, nghiệm thức bón 70N-48P2O5-24K2O theo khuyến cáo có hàm lượng nitrate đạt 885 mg.kg-1, cao nhất trong các nghiệm thức và khác biệt ý nghĩa thống kê khi so với các nghiệm thức còn lại (p<0,05), trong khi các nghiệm thức còn lại có hàm lượng nitrate trong cải xanh dao động từ 136 đến 591 mg.kg-1. Trong đó nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng dòng vi khuẩn TP-1.4 và hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn có hàm lượng nitrate đều là 136 mg.kg-1. Trong khi đó, các nghiệm thức bón 52,5N-48P2O5-24K2O kết hợp chủng các dòng vi khuẩn còn lại (TP-1.3 và MQ-2.5) và hệ IMO có hàm lượng nitrate trong rau thấp hơn đối chứng bón 70N, với hàm lượng nitrate tích lũy trong cải xanh dao động từ 357 đến 591 mg.kg-1. Như vậy nghiệm thức

144

chủng dòng vi khuẩn TP-1.4, hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn và hệ IMO mồng tơi giúp giảm lượng nitrate tích lũy trong cải xanh tốt nhất, giúp giảm lượng nitrate tích lũy trong cải xanh với tỷ lệ dao động trong khoảng từ 80,9- 4,6% so với nghiệm thức bón 70N- 48P2O5-24K2O khuyến cáo, trong khi các nghiệm thức có chủng vi khuẩn còn lại có hàm lượng nitrate tích luỹ giảm từ 33,3% đến 71,8%. Đặc biệt, hàm lượng nitrate tích lũy trong cải xanh thấp nhất được tìm thấy ở nghiệm chỉ bón 52,5N-48P2O5-24K2O, với hàm lượng nitrate tích lũy được ghi nhận là 15 mg.kg-1. Kết quả này cho thấy việc bón giảm hàm lượng đạm trong công thức bón phân cho cải xanh giúp giảm đáng kể hàm lượng đạm tổng số và nitrate trong rau, tuy nhiên, hàm lượng Nts trong rau đã bị giảm đáng kể đồng thời năng suất rau của nghiệm thức này cũng giảm mạnh. Kết quả này tương tự như kết quả phân tích hàm lượng nitrate trong vụ rau muống thí nghiệm thứ 2. Đồng thời, so sánh hàm lượng nitrate trong cải xanh ở 2 vụ cải xanh cho thấy hàm lượng nitrate tích lũy trong cải xanh ở vụ 2 thấp hơn đáng kể so với vụ 1. Điều này có thể giải thích là do thời điểm thu hoạch cải xanh trong vụ 2 là 33 ngày sau khi gieo, thời điểm thu hoạch này có thời gian cách ly là 13 ngày tính từ đợt bón phân hóa học lần cuối, thay vì chỉ là 10 ngày của vụ 1, do đó, đã giúp cây rau chuyển hóa nitrate trong thân cũng như hiệu quả chuyển hoá nitrate của các dòng vi khuẩn được tốt hơn (Bùi Thị Khuyên và ctv, 2002; Phạm Xuân Lân, 2007; Gorenjak and Cencic, 2013; Nguyễn Cẩm Long, 2014; Nguyễn Lệ Phương và ctv., 2018; Don and Diep 2019).

So sánh tổng hợp kết quả phân tích hàm lượng NO3

- trong 2 vụ rau thí nghiệm ngoài đồng của 2 loại rau trong nghiên cứu này với nhau (Phụ lục 15) cho thấy hàm lượng nitrate trong rau là 1 chỉ tiêu rất phức tạp và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: (1) loại rau; (2) hàm lượng phân đạm bón cho rau; (3) thời điểm thu hoạch; (4) thời gian cách ly tính từ lúc bón phân lần cuối; (5) điều kiện thời tiết khí hậu; (6) hiệu quả chuyển hóa của vi sinh vật chủng trong quá trình trồng rau. Mặc dù qua 2 vụ rau thí nghiệm liên tục ở ngoài đồng cho kết quả hàm lượng nitrate trong rau ở các nghiệm thức có chủng vi khuẩn vẫn còn ở ngưỡng cao trên mức an toàn theo quy định của TCVN 2008 (< 300 mg.kg-1 đối với rau muống và < 500 mg.kg-1 đối với cải xanh), tuy nhiên trong cùng 1 điều kiện thí nghiệm như nhau các nghiệm thức chủng các dòng vi khuẩn tuyển chọn hoặc IMO hoặc chế phẩm vi sinh thương mại giúp giảm mạnh hàm lượng nitrate lưu tồn trong rau so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Để hàm lượng nitrate trong rau thấp hơn và đạt ngưỡng an toàn cần có thêm nhiều nghiên cứu khác cho từng loại rau. Tuy nhiên, trong các thí nghiệm này lượng nitrate lưu tồn trong rau cao hơn ngưỡng cho phép của đa số các nghiệm thức có thể giải thích một phần là do thời gian cách ly tính từ lúc bón phân hóa học NPK lần cuối đến khi thu hoạch trong đó có phân đạm cho cả cây rau muống và cải xanh là ngắn, chưa đủ yêu cầu về thời gian cách ly an toàn là ít nhất 10 ngày sau khi bón phân đạm lần cuối cho rau.

So sánh hai vụ cải với nhau cho thấy hai vụ cải xanh thí nghiệm cho kết quả tương tự nhau vì khi chủng các dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5 và hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn này giúp tăng sinh trưởng và năng suất cải xanh thêm 10-20% so với

145

nghiệm thức bón 100% NPK khuyến cáo, đồng thời giảm được 25% lượng đạm hoá học bón cho cây cải xanh. Trong khi các nghiệm thức chủng các hệ vi sinh vật IMO giúp giảm 25% lượng phân đạm nhưng vẫn duy trì sinh trưởng và năng suất cây cải xanh tương đương và khác biệt không ý nghĩa thống kê (p<0,05) với nghiệm thức bón 100%NPK theo khuyến cáo không chủng vi sinh vật. Khi so sánh 2 hệ IMO với nhau trong cùng vụ 2 cho thấy hệ IMO thu thập từ đất trồng tre cho hiệu quả kích thích sinh trưởng và năng suất tốt hơn so với hệ IMO mồng tơi. Kết quả này tương tự và có cùng xu hướng như các kết quả thí nghiệm trong nhà lưới. Như vậy, ở cả 2 điều kiện ngoài đồng và trong nhà lưới đều cho thấy các dòng vi khuẩn tuyển chọn có hiệu quả kích thích sinh trưởng tốt hơn các hệ IMO tuyển chọn.

Ngoài ra kết quả đánh giá sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột cho người gồm Coliform, E. coli, Salmonella và Shigella của 4 vụ rau thí nghiệm (2 vụ rau muống và 2 vụ cải xanh) trồng ở điều kiện ngoài đồng (Phụ lục 16) cho thấy không có sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn gây bệnh này trong các mẫu rau của các nghiệm thức ở thời điểm thu hoạch. Kết quả này chứng tỏ việc chủng các dòng vi khuẩn phân lập hoặc các hệ IMO tuyển chọn không gây nhiễm vi sinh vật gây bệnh như Coliform, E. coli, Salmonella và Shigella trên rau. Kết quả này tương tự kết quả khảo sát sự hiện diện các vi khuẩn gây bệnh Coliform, E. coli, Salmonella và Shigella trong rau ở điều kiện nhà lưới bên trên. Vì vậy các dòng vi khuẩn phân lập và IMO trong nghiên cứu này có thể ứng dụng trong canh tác rau.

So sánh hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn lên sự sinh trưởng, năng suất giữa cây rau muống và cây cải xanh trong 4 vụ rau thí nghiệm (Phụ lục 14) cho thấy dòng vi khuẩn TP-1.4, MQ-2.5 và hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn cho hiệu quả kích thích sinh trưởng cây rau muống tốt hơn trong khi đối với cây cải xanh, dòng vi khuẩn TP-1.3, MQ-2.5, cho hiệu quả kích thích sinh trưởng tốt hơn. Nói cách khác, dòng vi khuẩn TP-1.4 phù hợp cho cây rau muống và dòng vi khuẩn TP-1.3 phù hợp cho cây cải xanh trong kích thích sinh trưởng và gia tăng năng suất, trong khi dòng vi khuẩn MQ-2.5 và hỗn hợp 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn phù hợp cho cả rau muống và cải xanh. Ngoài ra do đặc điểm cây cải xanh dễ bị sâu, bệnh hại và thời tiết không thuận lợi làm giảm sinh trưởng và năng suất (Phụ lục 10 và Phụ lục 13) nên việc chủng các dòng vi khuẩn tuyển chọn có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA sẽ mang lại nhiều lợi ích cho quá trình sinh trưởng của cây cải xanh.

So sánh hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA trong nghiên cứu này với các nghiên cứu khác trước đây cho thấy chúng cũng có hiệu quả đáng kể trong việc kích thích sinh trưởng và năng suất rau. Cụ thể, các thí nghiệm ở nhà lưới và đồng ruộng tại Tiền Giang của Nguyễn Thị Ngọc Trúc (2011) đã cho thấy khi sử dụng chế phẩm hỗn hợp các vi sinh vật cố định đạm và tổng hợp IAA đã làm tăng chiều dài rễ và chiều cao cây rau muống và rau mồng tơi đồng thời giảm được 50% lượng phân hóa học nhưng năng suất vẫn cao hơn so với các nghiệm thức chỉ bón phân hóa học đồng thời cũng làm giảm lượng nitrate tồn dư trong rau. Trên cây rau

146

muống và cải xanh, Cao Ngọc Điệp và ctv. (2011) đã cho thấy bón phân hữu cơ vi sinh cố định đạm và hoà tan lân giúp giảm được 50% lượng phân bón hoá học và hàm lượng nitrate trong rau nhưng vẫn cho năng suất tương đương với nghiệm thức bón phân hoá học. Nghiên cứu của Don and Diep (2019) đã chỉ ra rằng khi chủng dòng vi khuẩn đa chức năng trong đó có chức năng cố định đạm của dòng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus NT30 giúp tăng chiều cao cây, số lá và sinh khối và giảm được hàm lượng nitrate trong cây cải xuống mức an toàn. Nghiên cứu của Dinesh et al. (2011) trên cây cải xanh chủng kết hợp 2 dòng vi khuẩn cố định đạm Sinorhizobium meliloti và Pseudomonas aeruginos không những giúp giảm được 50% lương phân bón mà còn giúp sinh khối và năng suất cây cải duy trì tương đương với nghiệm thức bón phân đạm 100%. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Pandey and Maheshwari (2007).

Trên các đối tượng cây rau khác nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm làm tăng sinh trưởng và năng suất cây rau. Nghiên cứu của Jiménez-Gómez et al. (2018) trên cây cải bó xôi cho thấy việc chủng các dòng vi khuẩn cố định đam giúp tăng số lá, kích thước và trọng lượng, hàm lượng chlorophyll và hàm lượng đạm trong lá rau dẫn đến làm tăng năng suất và chất lượng của rau. Kết quả tương tự cũng được tìm thấy trong nghiên cứu của El-Assiouty and Abo-Sedera (2005). Tương tự, năm 2012, Lai Quốc Chí và ctv. đã đánh giá khả năng cố định đạm của hỗn hợp ba dòng vi khuẩn cố định đạm Rhizobium tropici, Bacillus subtilis, Rhizobium multihospitium trên hành lá (Allium fistulosum sp.) và mồng tơi (Basella alba L.) cho thấy các dòng vi khuẩn này giúp cây phát triển chiều cao, trọng lượng và tăng năng suất. thêm vào đó Adissie et al. (2020) cho thấy chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm vào cây đậu faba cho thấy chúng làm tăng chiều cao cây, sinh khối cây và tăng năng suất hạt. Ngoài ra, các thí nghiệm ngoài đồng khi xử lý hạt đậu nành với vi khuẩn Bradyrhizobium japonicum SEMIA 5079, B. japonicum SEMIA 5080) có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA làm tăng thêm 8,4% năng suất. Trong khi xử lý hạt kết hợp tưới vi khuẩn trên đồng ruộng làm năng suất tăng thêm 16,1% so với đối chứng không chủng (Hungria et al., 2013). Tương tự, trên cây đậu, tại tỉnh Trà Vinh, Nguyễn Hữu Hiệp và Trần Thị Tuyết Linh (2009) đã cho thấy trồng đậu phộng có chủng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân giúp tiết kiệm 80 kgN và 80 kg P2O5 cho mỗi hecta.

Trên các đối tượng cây trồng khác, Cao Ngọc Điệp và Bùi Thị Kiều Oanh (2006) đã sử dụng vi khuẩn Pseudomonas spp. như là những vi sinh vật có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA đã giúp cây mía phát triển tốt trên vùng đất phèn của tỉnh Long An, tiết kiệm được 50% phân đạm hóa học, không cần bón thêm phân lân nhưng năng suất vẫn cao hơn so với nghiệm thức chỉ bón phân hóa học theo khuyến cáo. Trên cây lúa, các nghiên cứu đã cho thấy khi chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA giúp tăng năng suất lúa đồng thời có thể giảm được 20- 75% lượng phân đạm (Trần Văn Chiêu và Nguyễn Hữu Hiệp, 2010b; Isawa et al.,

147

2010; Nguyễn Hữu Hiệp và ctv., 2012); Bao et al., 2013; Nguyễn Thị Pha và ctv., 2014b; Nguyễn Khởi Nghĩa và ctv., 2017). Trên cây lúa mì, Nghiên cứu của Díaz- Zorita and Fernández-Canigia (2009) đã cho thấy việc chủng dòng vi khuẩn A. brasilense INTA Az-39 có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA tại 297 địa điểm thử nghiệm trên cây lúa mì ở vùng Pampas của Argentina từ 2002-2006 giúp năng suất tăng thêm bình quân 8% so với nghiệm thức bón phân hóa học theo khuyến cáo và sinh khối khô của của cây lúa mì tăng lên đáng kể. Bên cạnh đó các nghiên cứu của Gholami et al. (2009) cho thấy năng suất lúa mì tăng lên đến 30% cao hơn nghiệm thức bón phân NPK theo khuyến cáo nhưng không chủng vi khuẩn khi chủng với vi khuẩn Azotobacter. Bởi vì các chủng Azotobacter có thể ảnh hưởng tốt đến sự nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây con (Shaukat et al., 2006). Tương tự năm 2010, Hungria et al. đã tiến hành các nghiên cứu xử lý hạt giống lúa mì và bắp với các chủng vi khuẩn có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA là Azospirillum brasilense Ab-v5 và A. brasilense Ab-v6 và kết quả cho thấy hai dòng vi khuẩn này làm gia tăng năng suất lúa mì và bắp thêm lần lượt 27% và 31% so với năng suất ở nghiệm thức chỉ bón phân hóa học.

Đối với các nghiên cứu trên IMO, ở điều kiện đồng ruộng nhiều nghiên cứu đã cho thấy IMO có hiệu quả trong việc kích thích sinh trưởng, gia tăng năng suất và phẩm chất cây trồng. Khi so sánh ảnh hưởng của IMO và phân bón hóa học lên sự tăng trưởng của lá mầm và hàm lượng chlorophyll trong lá đậu bắp, đậu đũa, và lá cây hạt kê, tác giả Sekhar and Gopal (2013) đã chỉ ra rằng khi xử lí hạt với IMO giúp hạt nảy mầm sớm và nhanh hơn, đồng thời cây mầm khỏe hơn so với hạt được xử lí bằng phân hóa học và đối chứng không xử lí. Hàm lượng chlorophyll cao nhất được xác định ở lá của các cây được xử lí với hệ IMO, điều này cũng tương tự với năng suất. Các tác giả đã kết luận rằng ở hàm lượng bón 50 mg.kg-1 IMO vào trong đất làm tăng sinh trưởng của cây, lá, hạt nảy mầm sớm, tăng năng suất hạt và tăng hàm lượng chlorophyll trong lá. Ngoài ra tác giả còn ghi nhận số nốt sần ở rễ và kích thước rễ lớn nhất ở các cây được xử lí với IMO. Tương tự, Koon-Hui et al. (2013) cho thấy IMO đã cải thiện được sức khỏe và năng suất cây đậu nành, cây ngưu bản, cây hành tây và cây bí ngô trong đó hiệu quả tốt nhất là trên cây đậu nành. Mặt dù cây bí ngô không hiệu quả với phương pháp này nhưng làm quả xanh hơn. Bên cạnh đó, các chỉ số về sức khỏe của đất trồng đậu nành được cải thiện rất nhiều trong khi đất ở các nghiệm thức không chủng với IMO thì không được cải thiện hoặc cải thiện không đáng kể. Tương tự, Fotso et al. (2013) cho thấy IMO có hiệu quả trong việc cải thiện năng suất khoai môn Colocassia esculenta và cải tạo sức khỏe của đất, nhưng không hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh hại trên cây này. Nghiên cứu của Sanchez et al. (2018) cho thấy việc bổ sung 1L dung dịch IMO với tần suất 4 tuần/1 lần sẽ giúp tăng đáng kể chiều cao cây và các yếu tố cấu thành năng suất lúa basmati và dẫn đến tăng năng suất thực tế khi thu hoạch của giống lúa này. Kết quả tương tự cũng được tìm thấy trong nghiên cứu trên cây lúa của Sakimin et al. (2017) và Chukwudozie et al. (2020). Đặc biệt khi

148

so sánh hiệu quả của các IMO với nhau trong việc kích thích sinh trưởng cây cải dưa (Brassica juncea), Keli’ikuli (2018) đã báo cáo rằng IMO thu thập từ tre cho hiệu quả kích thích sinh trưởng và cho năng suất cao nhất so với các IMO thu thập từ đất trồng cây khác và so với đối chứng không chủng IMO.

Cải xanh và rau muống là các loại rau ăn lá được sử dụng phổ biến trong các bữa ăn hàng ngày ở nước ta (Nguyễn Minh Chung và ctv., 2013). Các nghiên cứu cho thấy, cả hai loại rau này đều có khả năng tích lũy nitrate cao khi được bón phân vô cơ (Nguyễn Minh Trí và ctv., 2013; Đặng Trần Trung và ctv., 2018). Do đó trong canh tác rau, việc làm giảm lượng phân đạm lên đến 25% lượng khuyến cáo kết hợp chủng vi các dòng vi khuẩn cố định đạm TP-1.3, TP-1.4 và MQ-2.5 là cần thiết để giảm hàm lượng nitrate tích lũy trong rau hiệu quả nhưng vẫn đảm bảo cây rau sinh trưởng tốt, cho năng suất cao hơn nghiệm thức bón phân hóa học theo khuyến cáo.

Tóm lại, qua 5 vụ rau trong nhà lưới và 4 vụ rau ở ngoài đồng trên hai đối tượng là rau muống và cải xanh cho thấy việc bón giảm 25% lượng phân đạm khuyến cáo cho hai loại rau này kết hợp chủng các dòng vi khuẩn tuyển chọn hoặc hỗn hợp các dòng vi khuẩn tuyển chọn cho hiệu quả kích thích sinh trưởng và năng suất cây rau rất tốt so với nghiệm thức chỉ bón phân hoá học theo khuyến cáo. Dòng vi khuẩn TP-1.4 phù hợp kích thích sinh trưởng phát triển và tăng năng suất của cây rau muống, trong khi dòng vi khuẩn TP-1.3 phù hợp cho cây cải xanh, dòng vi khuẩn MQ-2.5 và hỗn hợp cả 3 dòng vi khuẩn này phù hợp cho cả 2 đối tượng là rau muống và cải xanh. Chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn trong nghiên cứu này không những giúp giảm được 25% lượng phân đạm hoá học tho khuyến cáo mà còn làm tăng năng suất rau thêm từ 10-20% đồng thời giảm từ 40-60% lượng nitrate tích lũy trong rau trong khi vẫn duy trì được lượng đạm tổng số trong rau khi so với nghiệm thức bón phân NPK theo khuyến cáo. Công thức phân bón cho cây rau muống và cây cải xanh trồng có chủng các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA trong nghiên cứu này lần lượt là 75N-48P2O5-24K2O và 52,5N-48P2O5-24K2O.

149

CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 Kết luận

Có 3 nhóm vi sinh vật chính được tìm thấy trong tổng cộng 20 hệ IMO bản địa được thu thập từ các mô hình cây trồng khác nhau trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. Trong đó, vi khuẩn được đánh giá là nhóm vi sinh vật chiếm ưu thế hơn về mật số và nhóm loài so với hai nhóm còn lại. Ngoài ra, không phát hiện sự tồn tại của các vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa cho người như Salmonella, Shigella, E. coli và Coliform trong 20 hệ IMO bản địa được thu thập. Tất cả 20 hệ IMO trong nghiên cứu này còn có chức năng tổng hợp hormone thực vật IAA và cố định đạm sinh học với khả năng và cường độ khác nhau và tất cả các hệ IMO này có chứa gene chức năng nifH cố định đạm sinh học.

Tổng cộng có 44 dòng vi khuẩn phân lập được từ các hệ IMO thu thập có cả hai chức năng là cố định đạm sinh học và sinh tổng hợp hormone thực vật IAA, trong đó 10 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA cao nhất ký hiệu TP-1.2, TP-1.3, TP- 1.4, MQ-2.1, MQ-2.5, BK-12.3, MT-16.5, OM-17.2, OM-17.5 và CP-18.2 thuộc 5 chi Pseudomonas, Paraburkholderia, Paenibacillus, Bacillus và Klebsiella và được định danh lần lượt là Pseudomonas veronii TP-1.2, Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP-1.4, Bacillus aryabhttai MQ-2.1, Bacillus megaterium MQ- 2.5, Bacillus cereus BK-12.3, Klebsiella pneumoniae MT-16.5, Klebsiella pneumoniae OM-17.2, Bacillus megaterium OM-17.5 và Pseudomonas boreopolis CP-18.2 dựa vào kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA kết hợp hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào, và Gram vi khuẩn.

Các hệ IMO thu thập và dòng vi khuẩn tuyển chọn có hiệu quả tương đương nhau trong kích thích làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống (14%) và hạt cải xanh (3–5%), cũng như làm gia tăng chiều cao cây mầm, chiều dài rễ và sinh khối tươi của cây mầm ở điều kiện phòng thí nghiệm. Mật số 106 cfu.mL-1 và 107 cfu.mL-1 là mật số tối ưu trong việc chủng vào hạt cho hiệu quả kích thích nảy mầm và sinh trưởng cao nhất lần lượt cho cây rau muống và cải xanh, trong khi đó đối với các hệ IMO, mức pha loãng từ 500 đến 1.000 lần là mức pha loãng phù hợp nhất giúp kích thích tỷ lệ nảy mầm hạt và sinh trưởng cao nhất cho cả 2 loại rau.

Các dòng vi khuẩn có hai chức năng cố định đạm sinh học và tổng hợp IAA phân lập được tuyển chọn cho hiệu quả kích thích sinh trưởng và năng suất cây rau muống và cải xanh tốt hơn so với các hệ IMO mà chúng được phân lập ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. Hai dòng vi khuẩn TP-1.4 và TP-1.3 giúp kích thích sinh trưởng, phát triển và gia tăng năng suất tốt nhất lần lượt cho cây rau muống và cải xanh, trong khi dòng vi khuẩn MQ-2.5 và hỗn hợp cả 3 dòng vi khuẩn này kích thích làm tăng sinh trưởng, phát triển và năng suất tốt nhất cho cả 2 loại rau muống và cải xanh.

150

Việc chủng 3 dòng vi khuẩn cố định đạm sinh học và tổng hợp IAA tuyển chọn gồm TP-1.4, TP-1.3 và MQ-2.5 giúp giảm được ít nhất 25% lượng phân đạm hoá học đồng thời giúp tăng năng suất rau thêm 10-20%, đồng thời giúp giảm từ 40-60% lượng nitrate lưu tồn trong rau khi so sánh với nghiệm thức đối chứng chỉ bón phân NPK theo khuyến cáo.

5.2 Kiến nghị

Có thể tiến hành khai thác các hệ vi sinh vật bản địa như là nguồn vi sinh dồi

giàu tham gia kích thích sự phát triển cây trồng và cải tạo đất.

Cần có các nghiên cứu đánh giá hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP-1.4 và Bacillus megaterium MQ-2.5 trên nhiều đối tượng cây rau ở điều kiện ngoài đồng cũng như đánh giá thêm khả năng thích nghi và sống sót của 3 dòng vi khuẩn này ở các nhóm đất có đặc tính khác nhau trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng.

Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP-1.4 và Bacillus megaterium MQ-2.5 trong việc giảm hàm lượng nitrate tích lũy trong các loại rau góp phần tham gia vào quá trình sản xuất rau an toàn ở tỉnh Sóc Trăng.

Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học hoặc phân sinh học của 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn giúp giảm sử dụng phân bón đạm hóa học, kích thích sinh trưởng và làm tăng năng suất cây rau trong địa bàn tỉnh Sóc Trăng, từ đó gia tăng hiệu quả kinh tế, góp phần tham gia sản xuất nông nghiệp bền vững của tỉnh Sóc Trăng.

Có thể mở rộng đánh giá hiệu quả các dòng vi khuẩn trên các đối tượng cây trồng khác trong tỉnh Sóc Trăng nhằm phục vụ nhu cầu trồng trọt theo xu hướng thích ứng với biến đổi khí hậu và xâm nhập mặn của tỉnh Sóc Trăng.

151

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Abawi, G.S and T.L Widmer, 2000. Impact of soil health managment practices on soilborne

pathogens, nematodes and root diseases of vegetable crops.Appl. Soil Ecol. 15:37–47.

Abdullah, M.K. and Al-Falih, 2002. Factor affecting the efficiency of symbiotic nitrogen fixation by Rhizobium. Pakistan Journal Biologycal Sciences 5(11): 1277-1293. Abu-Bakar, N. and A. Ibrahim, 2013. Indigenous microorganism production and the effect on 283-286; Proceedings Conference 1571, process, AIP

composting https://doi.org/10.1063/1.4858669.

Adesemoye, A.O., H.A Torbert and J.W. Kloepper, 2009. Plant growth-promoting rhizobacteria allow reduced application rates of chemical fertilizers. Microb Ecol, 58:921-929.

Food & Agriculture, 6:

Adissie, S., E Adgo and T. Feyisa, 2020. Effect of rhizobial inoculants and micronutrients on yield and yield components of faba bean (Vicia faba L.) on vertisol of Wereillu district, South Wollo, Ethiopia. Cogent 1747854. https://doi.org/10.1080/23311932.2020.1747854.

Ahmad, F., I. Ahmad and M.S. Khan, 2005. Indole acetic acid production by the indigenous isolates of Azotobacter fluorescent and Pseudomonas in the presence and absence of tryptophan. Turk. J. of Biol., 29(1): 29-34.

Ahmad, F., I. Ahmad and M.S. Khan, 2008. Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities. Microbiol. Res., 163(2): 173-181. Ahmed, A. Issa, M.H. Abd-Alla and T. Ohyama, 2014. Nitrogen Fixing Cyanobacteria: Future Prospect in “Advances in Biology and Ecology of Nitrogen Fixation”, Edited by Takuji Ohyama, ISBN 978-953-51-1216-7, 282 p.

Akbari, G., S.A. Sanavy and S. Yousefzadeh, 2007. Effect of auxin and salt stress (NaCl) on seed germination of wheat cultivare (Triticum aestivum L.). Pakistan Journal of Biological Sciences, 10(15): 2557-2561.

Alves, B.J.R., R.M. Boddey and S. Urquiaga, 2004. The success of BNF in soybean in Brazil.

Plant Soil, 252:1-9.

Amann, R.I., W. Ludwig, and K.H. Schleifer, 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Reviews. 59(1): 143-69.

Anderson, I.C., C.D. Campbell and J.I. Prosser, 2003. Diversity of fungi in organic soils under moorland Scots pine (Pinus sylvestris L.) gradient. Environmental Microbiology. 5: 1121–1132.

Antoun, H, C.J. Beauchamp, N. Goussard, R. Chabot and R. Lalande, 1998. Potential of Rhizobium and Bradyrhizobium species as plant growth promoting rhizobacteria on non-legumes: Effect on radishes (Raphanus sativus L). Plant and Soil, 204(1): 57–67.

Arenz, B.E., B.W. Held, J.A. Jurgens, R.L. Farrell and R.A. Blanchette, 2006. Fungal diversity in soils and historic wood from the Ross Sea Region of Antarctica. Soil Biology and Biochemistry, 38: 3057–3064.

152

Asghar, H.N., Z.A. Zahir, M. Arshad, and A. Khaliq, 2002. Relationship between in vitro production of auxin by rhizobacteria and their growth-promoting activities in Brassica juncea L. Biology and Fertil Soil, 35: 231-237.

Ash, C., F. Priest and M.D. Collins, 1993. Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow, Wallbanks and Collins) using a PCR probe test. Antonie Van Leeuwenhoek, 64:253–60.

Ash, C., J. Farrow, S. Wallbanks and M. Collins, 1991. Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small‑subunit‑ribosomal RNA sequences. Lett Appl Microbiol.,13: 202–206.

Ashrafuzzaman, M., F.A Hossen, M.R Ismail, M.A Hoque, M.Z Islam, S.M Shahidullah and S. Meon, 2009. Efficiency of plant growth promoting Rhizobacteria (PGPR) for the enhancement of rice growth. African Journal of Biotechnology, 8(7): 1247-1252. Aslam, S., Ali Hussain, Javed Iqbal Qazi, 2016. Dual action of chromium-reducing and nitrogen-fixing Bacillus megaterium-ASNF3 for improved agro-rehabilitation of chromium-stressed soils. 3 Biotech, 6: 125-135.

Bakonyi, N., S. Bott, É. Gajdos, A. Szabó, A. Jakab, B. Tóth, P. Makleit, Sz. Veres, 2013. Using Biofertilizer to improve seed germination and early development of maize. Polish Journal of Environmental Studies. 22(6):1595-1599.

Bao, Z., K. Sasaki, T. Okubo, S. Ikeda, M. Anda, E. Hanzawa, K. Kaori, S. Tadashi, M. Hisayuki and K. Minamisawa, 2013. Impact of Azospirillum sp. B510 inoculation on rice-associated bacterial communities in a paddy field. Microbes Environ 28:487-490.

Barker, G.C., J.J. Smith and D.A. Cowwam, 2003. Review and re analysis of domain specific

16S primers. Journal of Microbiological Method, 55: 541-555.

Barriuso, J. and B.R. Solano, 2008. Ecology, genetic diversity and screening strategies of

plant growth promoting rhizobacteria (PGPR). Journal of Plant nutrition: 1-17.

Bashan, Y., M. Singh and H. Levanovy, 1989. Contribution of Azospirillum brasilence Cd to growth of tomato seeding is not through nitrogen fixation, Can. J. Bot., 67: 2429-24-34. Beringer, J.E. and P.R. Hirsch, 1984. Genetic engineering and nitrogen fixation. Biotechnol.

Gen. Engin. Rev., 1: 65-88.

Bharucha, U., U.B. Trivedi and K. Patel, 2013. Optimization of indole acetic acid production by Pseudomonas putida UB1 and its effect as plant growth-promoting rhizobacteria on mustard (Brassica nigra). Agric. Res., 2(3): 215–22.

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2008. Quyết định số 99/2008/QĐ-BNN về việc ban

hành “Quy định quản lý, sản xuất , kinh doanh rau, quả và chè an toàn.

Board of Land and Natural Resources State of Hawaii, 2018. Project issuance of right-of- entry permit to big island resource conservation and development council for the purpose of conducting research on the efficacy of indigenous microorganisms to confer resistance to Ohia against rapid Ohia death on State Lands. Puna, Hawaii;.

Boon, N., W.D. Windt, W. Verstraete and E.M. Top, 2002. Evalution of nested PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) with group-specific 16S-rRNA primer for analysis of bacterial communities from different wastewater treatment plants. FEMS Microbiol Methods 52: 389-393.

153

Borneman, J. and E.C Triplett, 1997. Molecular microbial diversity in soils from eastern Amazonia: Evidence for unusual microorganisms and microbial population shifts associated with deforestation. Applied and Environmental Microbiology 63(7): 2647 - 2653

Bottone, E.J., 2010. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clinical Microbiol Reviews,

23(2):382–398.

Bougoure, D.S.and J.W.G. Cairney, 2005. Fungi associated with hair roots of Rhododendron lochiae (Ericaceae) in an Australian tropical cloud forest revealed by culturing and culture-independent molecular methods. Environmental Microbiology, 7: 1743–1754.

Boyd, E.S., J.W. Peters, 2013. New insights into the evolutionary history of bio‑logical

nitrogen fixation. Front Microbiol., 4: 201.

Brandl, M.T. and S.E. Lindow, 1996. Cloning and characterization of a locus encoding an indolepyruvate decarboxylase involved in indole-3-acetic acid synthesis in Erwinia herbicola. Appl Environ Microbiol 62: 4121–4128.

Brick, J.M., R.M. Bostock and S.E. Silverstone, 1991. Rapid in situ assay for indole acetic acid production by bacteria immobilized on nitrocellulose membrane. Appl. Environ. Microbiol., 57: 535–538.

Broek, A., P. Gysegom, O. Ona, N. Hendrickx, E. Prinsen, J. Van Impe and J. Vanderleyden, 2005. Transcriptional analysis of the Azospirillum brasilense indole-3-pyruvate decarboxylase gene and identification of a cis-acting sequence involved in auxin responsive expression. Mol Plant–Microbe Interact, 18: 311–323.

Bùi Thị Khuyên, Hubert Debon và Tô Thị Thu Hà, 2002. Ảnh hưởng của liều lượng đạm đến năng suất và chất lượng rau cải ngọt, xây dựng đường cong hòa loãng đạm tới hạn cho rau cải ngọt. Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ về rau quả giai đoạn 2000 -2002. NXB Nông nghiệp, 218 -225.

Bullock, B., 2006. The role of molybdenum in nitrogenase. Literature seminar, Shelby Hall. Burgess, B.K. and D.J. Lowe, 1996. The mechanism of molybdenum nitrogenase. Chem.

Rev., 96: 2983-3011.

Burris, R.H., 1991 Nitrogenase. J. Biol. Chem., 266: 9339-9342. Cai M., J. Yao, H. Yang, R. Wang and K. Masakorala, 2013. Aerobic biodegradation process of petroleum and pathway of main compounds in water flooding well of dagang oil field. Bioresour Technol., 144:100–106.

Cantlife, D.J., 1972. Nitrate accumulation in spinach under different light intensities.

J.Am.Soc.Hortic.Sci. 97:152-154.

Cao Ngọc Điệp và Bùi Thị Kiều Oanh, 2006. Hiệu quả vi khuẩn Pseudomonas spp. trên năng suất và trữ lượng đường trong cây mía đường (Saccharum officinarum L. giống vđnl-7) trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 6:69-76.

Cao Ngọc Điệp và Ngô Thanh Phong, 2016. Công nghệ sản xuất phân sinh học. NXB Đại học

Cần Thơ.

Cao Ngọc Điệp, 2007. Phân lập vi sinh vật tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật (phytohormone) và ứng dụng vào sản xuất nông nghiệp, Báo cáo khoa học, Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.

154

Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Vân Anh và Trần Thị Giang, 2011. Hiệu quả của phân hữu cơ – vi sinh trên năng suất và chất lượng rau xanh trồng trên đất phù sa tại tỉnh Long An. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ.18b:18-28.

Carrillo-Castañeda G, J.J Muños, J.R. Peralta-Videa, E. Gomez, K.J. Tiemannb, M. Duarte- Gardea, and J.L. Gardea-Torresdey, 2002. Alfalfa growth promotion by bacteria grown under iron limiting conditions. Advances in Environmental Research, 6(3):391-399 Chakravorty, S., S. Chakravorty, D. Helb, M. Burday, N. Connell and D. Alland, 2007. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. Journal Microbiol Methods. 69(2): 330-339.

Chandra, S., K. Askari and M. Kumari, 2018. Optimization of indole acetic acid production by isolated bacteria from Stevia rebaudiana rhizosphere and its effects on plant growth. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 16: 581–586.

Chen, W.M., E.K. James, T. Coenye, J.H. Chou, E. Barrios, 2006. Burkholderia mimosarum sp. nov., isolated from root nodules of Mimosa spp. from Taiwan and South America. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 56:1847–1851.

Chiemela, F.A., L.N. Serafin, L.I. Ricardo and L.N Joseph, 2013b. Application of indigenous microorganisms (IMO) for bio-conversion of agricultural waste. International Journal of Science and Research (IJSR) ISSN (Online) 4(5): 2319-7064.

indigenous microorganism (IMO) from

Chiemela, F.A., L.N. Serafin, L.I. Ricardo and L.N. Joseph, 2013a. Isolation and ifugao bamboo Characterization of (Phyllostachys Aurea) forest. International Journal of Science and Research (IJSR), ISSN (Online) 4(2): 2319-7064.

Choi, G.M., and W.T. Im, 2018. Paraburkholderia azotifigens sp. nov., a nitrogen-fixing isolated from paddy soil. International Journal of Systematic and

bacterium Evolutionary Microbiology, 68(1):310-316.

Christiansen, J., D.R. Dean and L.C. Seefeldt, 2001. Mechanistic features of the Mo- containing nitrogenase. Annu. Rev. Plant physiol. Plant Mol. Biol. 52: 269-295.

Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài và Nguyễn Văn Tố, 2006. Tìm hiểu về chế phẩm vi sinh vật

dùng trong nông nghiệp. NXB Lao Động Hà Nội.

Chukwudozie, O.S., A. Bruno, O. Ikechukwu, U.I. Ude, E. elom, 2020. Study on the effect of indigenous microorganisms (IMO) and system of rice intensification (SRI) on the growth of rice plant in nigeria, International Journal of Biology, Pharmacy and Allied Sciences (IJBPAS), 9(4): 690-705.

Costacurta, A. and J. Vanderleyden, 1995. Synthesis of phytohormones by plant associated

bacteria. Crit. Rev. Microbiol., 21: 1-18.

Cruz, R., G.Yañez-Ocampo and A.Wong-Villarreal, 2014. Effect of nodulating bacteria on the seed germination of Capsicum spp. African Journal of Microbiology Research, 8(7): 659-663.

Dai, X., K. Shi, X. Wang, J. Fan, R. Wang, S. Zheng, G. Wang, 2019. Paenibacillus flagellate ssp. nov., isolated from selenium mineral soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 69:183– 188.https://doi.org/10.1099/ijsem.0.003125.

Daisuke, K., H. Fumihiko, Y. Etsuo, O. Toshiya, C. Seon-Yong and K. Motoki, 2001. Biodegradation of long chain n-paraffins from waste oil of car engine by Acinetobacter sp. Journal of Bioscience and Bioengineering, 91(1): 94-96.

155

Đặng Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Thị Xuân Mỵ và Cao Ngọc Điệp, 2016. Sự sản xuất IAA và siderophore của các dòng vi khuẩn liên hiệp thực vật và ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của cây bắp (Zea mays L.) trồng trong chậu. Tạp chí trường ĐH Cần Thơ, 47: 59-67.

Đặng Trần Trung, Nguyễn Quang Thạch, Đỗ Tấn Dũng, 2018. Thực trạng dư lượng nitrate -) trong một số loại rau tại tỉnh Bắc Ninh. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt

(NO3 Nam, 16(1): 1-8.

Davis, J.B., V.T. Coty and J.P. Stanley, 1964. Atmospheric nitrogen fixation by methane

oxidizing bacteria. Journal of Bacteriology, 88: 468-472.

Desiré, T.V., M.R. Fosah, M.H. Desiré and Fotso, 2018. Effect of indigenous and effective microorganism fertilizers on soil microorganisms and yield of Irish potato in Bambili, Cameroon. African Journal of Microbiology Research, 12(15): 345-353.

Dhara, P.S., G.C. Hemangi, M.K. Vijay, D.D. Dilip and A.C. Balu, 2009. Isolation and characterization of indole acetic acid (IAA) producing Klebsiella pneumoniae strains from rhizophere of wheat (Triticum aestivum) and their effect on plant growth. Indian Journal of Experimental Biology, 7: 993-1000.

Díaz-Zorita, M. and M.V. Fernández-Canigia, 2009. Field performance of a liquid formulation of Azospirillum brasilense on dryland wheat productivity. Eur J Soil Biol 45:3-11.

Dinesh K. Maheshwari, S. Kumar, B. Kumar, P. Pandey, 2010, Co-inoculation of urea and DAP tolerant Sinorhizobium meliloti and Pseudomonas aeruginosaas integrated approach for growth enhancement of Brassica juncea. Indian J Microbiol. 50(4):425– 431. DOI 10.1007/s12088-011-0085-6.

Ding, Y., J. Wang, Y. Liu and S. Chen, 2005. Isolation and identification of nitrogen-fixing bacilli from plant rhizospheres in Beijing region. Journal of Applied Microbiology, 99: 1271–1281

Dobritsa, A.P., M. Samadpour, 2016. Transfer of eleven species of the genus Burkholderia to the genus Paraburkholderia and proposal of Caballeronia gen. nov. to accommodate twelve species of the genera Burkholderia and Paraburkholderia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,66: 2836–2846.

Dokić, L., M. Savić, T. Narančić, and B. Vasiljević, 2010. Metagenomic Analysis of Soil Microbial Communities. Archives of Biological Science-Belgrade 62(3): 559-564. Don N.T. and C.N Diep, 2019, Effect of P-K solubilizing bacteria and nitrogen chemical fertilizer on growth, yield and nitrate leaf of Brassica juncea L. cultivated on acid sulphate soils. International Journal of Innovations in Engineering and Technology, 14(1):20-28.

Doran, JW, M. Sarrantonio, M.A Liebig, 1996. Soil health and sustainability, Advanced

Agronomy. 56:2–54.

Dung T.V, N. M. Dong and D. M. Vien, 2016. The effect of crop rotation on the structure of the fungal community colonising rice straw residues in paddy rice cultured soil in the mekong delta of vietnam. Can Tho University Journal of Science 4: 52-62.

Eady, R.R., 1996. Structure-function relationships of alternative nitrogenases. Chem. Rev. 96:

3013-3030.

156

Eastman, A.W., D.E. Heinrichs, Z.C. Yuan, 2014. Comparative and genetic analysis of the four sequenced Paenibacillus polymyxa genomes reveals a diverse metabolism and conservation of genes relevant to plant‑growth promotion and competitiveness. BMC Genom.,15:851.

Egamberdiyeva, D., 2007. The effect of plant growth promoting bacteria on growth and

nutrient uptake of maize in two different soils. Appl Soil Ecol 36:184-189.

El-Assiouty F.M.M., S.A. Abo-Sedera, 2005. Effect of bio and chemical fertilizers on seed production and quality of spinach (Spinacia oleracea L.) Int J Agric Biol 7:947–949. Elsas, J.D.V and J.T Trevors, 1997. Modern Soil Microbiology, New York: Marcel Dekker. Euzeby, J.P., 1997. List of bacterial names with standing in nomenclature: a folder available

on the Internet. Int. J. Syst. Bacteriol., 47:590–592.

Fakruddin, M. and S.B.K. Mannam, 2013. Methods for Analyzing Diversity of Microbial Communities in Natural Environments. Ceylon Journal of Science (Bio. Sci.) 42(1): 19- 33.

FAO/WHO, 2004. Fruit and Vegetables for Health. Report of a joint FAO/WHO workshop 1

-3 September 2004, Kobe, Japan, pp: 7.

Fernandes, G.D.C., L.J. Trarbach, S.D. De Campos, A. Beneduzi, L.M.P. Passaglia, 2014. Alternative nitrogenase and pseudogenes: unique features of the Paenibacillus riograndensis nitrogen fixation system. Res. Microbiol., 165: 571–80.

Ferreira, A.S., P.R. Pires, P.Q. Rabelo, R.C. Oliveira, J.M.Q. Luz and C.H Brito, 2013. Implications of Azospirillum brasilense inoculation and nutrient addition on maize in soils of the Brazilian Cerrado under greenhouse and field conditions. Appl Soil Ecol 72:103-108.

Fischer, S.G and L.S. Lerman 1983. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels – correspondence with melting theory. Proc Natl Acad Sci USA 80:1579–1583.

Fotso, H.D.M, Djeuani C.A., Fai K. and Omokolo N.D., 2013. Impact of effective and indigenous microorganisms manures on Colocassia esculenta and enzymes activities. African Journal of Agricultural Research., 8(12):1086-1092.

Frankenberger, W.T., M. Arshad, 1995. Phytohormones in soil: Marcel Dekker, Inc Fürnkranz, M., E. Adam, H. Müller, M. Grube, H. Huss, J. Winkler, 2012. Pro‑motion of growth, health and stress tolerance of Styrian oil pumpkins by bacterial endophytes. Eur. J. Plant Pathol., 134: 509–19.

Gao, Z., Y. Yuan, L. Xu, R. Liu, M. Chen, 2016. Paraburkholderia caffeinilytica sp. nov.,

isolated from the soil of a tea plantation. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 66: 4185–4190.

Garbeva, P., J.A. van Veen, and J.D. van Elsas, 2004. Microbial diversity insoil: Selection of implications for disease doi: type and Phytopathol. 42:243–70. Annu. Rev.

microbial populations by plant and soil suppressiveness. 10.1146/annurev.phyto.42.012604.135455.

Gelsomino A., L. Badalucco, R. Ambrosoli, C. Crecchio, E. Puglisi , Salvatore M. Meli, 2006. Changes in chemical and biological soil properties as induced by anthropogenic disturbance: A case study of an agricultural soil under recurrent flooding by wastewaters. Soil Biology & Biochemistry 38: 2069–2080.

Gholami, A., S. Shahsavani. and S. Nezarat, 2009. The effect of Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) on germination, seedling growth and yield of maize. International Journal of Biological Life Sciences, 1(1): 35-40.

Giovannoni, S.J., T.B. Britschgi, C.L Moyer and K.G Field, 1990. Genetic diversity in

157

Saragasso Sea Bacterioplankton. Nature 345: 60-62.

Gorenjak, H.A and A. Cencic, 2013. Nitrate in vegetables and their impact on human health.

A Review. Acta Alimentaria, 42 (2):158 -172.

Govindarajan, M., J. Balandreau, R. Muthukumarasamy, G. Revathi, C. Lakshminarasimhan, 2006. Improved yield of micropropagated sugarcane following inoculation by endophytic Burkholderia vietnamiensis. Plant Soil, 280: 239–252.

Grady, E.N., MacDonald J., Liu L., Richman A. and Yuan Z.C., 2016. Current knowledge and review. Microb Cell Fact, 15:203. DOI

perspectives of Paenibacillus: a 10.1186/s12934-016-0603-7.

Gupta G., S.S. Parihar, N.K. Ahirwar, S.K. Snehi and V. Singh, 2015. Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR): Current and future prospects for development of sustainable agriculture. Journal of Microbial & Biochemical Technology, 7 (2): 96-102. Hà Thanh Toàn, Cao Ngọc Điệp, Trần Lê Kim Ngân, Nguyễn Thu Phướng, Mai Thu Thảo và Bùi Thế Vinh, 2008. Phân lập vi khuẩn phân giải cellulose, tinh bột và protein trong nước rỉ từ bãi rác ở Thành phố Cần Thơ. Tạp chí trường Đại Học Cần Thơ, 10: 195 – 202.

Hairston, N.G., J.D. Allan, R.K. Colwell, D.J. Futuyma, J. Howell, M.D. Lubin, J. Mathias, J.H. Vandermeer, 1968. The Relationship between Species Diversity and Stability: An Experimental Approach with Protozoa and Bacteria. Ecology, 49(6):1091-1101.

Han, Z., Z. Zhang, Y. Dong, M. Yang, 2014. Effects of endophytic bacteria P22 and S16 in Populuson the rooting and growth of the relative species plants. J. Northeast For Univ.,42:117–21.

Hanapi, S.Z., N. Supari, S.A.Z. Alam, 2014. Microbial effects on seed germination in Malaysian rice (Oryza sativa L.). Proceeding of the Asia-Pacific Advanced Network, 37: 42-51.

Harekrushna, S. and S. Abhijita, 2013. Nitrogen fixation and its improvement through genetic

engineering. Journal of Global Biosciences, 2(5): 98-112.

Harper S.H.T. and J.M Lynch, 1980. Microbial effects on the germination and seedling groth

of barley. New Phytol, 84: 473-481.

Harpole, W., 2010. Neutral theory of species diversity. Nature Education Knowledge. 1: 31. Hartmann, A. and W. Zimmer, 1994. Physiology of Azospirillum. Azospirillum/Plant

Associations (Okon Y, ed). 15–39.

Hasuty, A., A. Choliq and I. Hidayat, 2018. Production of Indole Acetic Acid (IAA) by subsp. marcescens and Rhodococcus aff. oingshengii.

Serratia marcescens International Journal of Agricultural Technology, 14(3):299-312.

Heuer, H., M. Krsek, P. Baker, K. Smalla and E.M. Wellington, 1997. Analysis of actinomycete communities by specific amplification of genes encoding 16S-rRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradients. Applied environmental microbiology, 63(8): 3233-3241.

triển sản xuất rau sạch. (https://bnews.vn/soc-trang-quy-hoach-phat-trien-san-xuat-rau-sach/ ngày đăng 11/9/2017 ngày truy cập 20/5/2020)

158

Hillel, D., 2007. Soil in the Environment, 1st Edition crucible of terrestrial life. Hoài Thu, 2017. Sóc Trăng quy hoạch, phát

Hoàng Thị Thái Hòa, 2009. Nghiên cứu ảnh hưởng của sử dụng các loại phân bón đến hàm lượng nitrate trong đất và trong một số loại rau ăn lá chính trên đất phù sa huyện Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế. Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp bộ, Đại học Nông Lâm Huế.

Hoben, H. and Somasegaran P., 1982. Comparison of the pour, dpread, and drop plate methods for enumeration of Rhizobium spp. in inculants made from presterilized peat. Applied and Environmental Microbiology, 44: 1246-1247.

Hoffmann-Findeklee, C., D. Gadkari and O. Meyer, 2000. Superoxide dependent nitrogen fixation. In nitrogen fixation: From molecules to crop productivity (ed.) F.O Pedrosa, M. Hungaria, M.G Yates. Kluwer, W.E. Newton, Boston, 23-30.

Howard, J.B., R. Davis, B. Moldenhauer, V.L. Cash and D. Dean, 1989. FeS cluster ligands are the only cysteines required for nitrogenase Fe-protein activities. J. Biol. Chem., 264: 11270- 11274. http://dx.doi.org/10.21172/ijiet.141.04.

Hubell, D.H and G. Kidder, 2003. Biological nitrogen fixation. Soil and Water Science Department, Florida Cooperative Extension Servece, Institute of Food and Agriculture Sciences, University of Florida.

Hungria, M., M.A. Nogueira and R.S. Araujo, 2013. Co-inoculation of soybeans and common beans with rhizobia and azospirilla: Strategies to improve sustainability. Biol Fertil Soils 49: 791-801.

Hungria, M., R.J. Campo, E.M. Souza and F.O. Pedrosa, 2010. Inoculation with selected strains of Azospirillum brasilense and A. lipoferum improves yields of maize and wheat in Brazil. Plant and Soil 331:413-425.

Huss-Danell, K., 1990. The physiology of actinorhizal roots. In The Biology of Frankia and Actinorrhizal Plants. Academic press San Diego, USA. Edited by C.R Schwintzer, J.D Tjepkema, 128–156.

Hutcheson, S.W. and T. Kosuge, 1985. Regulation of 3-indoleacetic acid production in Pseudomonas syringae pv. savastanoi– purification and properties of tryptophan 2- monooxygenase. J. Biol. Chem., 260: 6281–6287.

Ian, L.P; P.G. Charles, 2004. Environmental microbiology. Elsevier Academic Press Illani, I.Z., Z. Aini and M. Faridah, 2012. Effects of IMO and EM application on soil nutrients, microbial population and crop yeld. J. Trop. Agric. and Fd. Sc., 40(2): 257- 263.

Isawa, T., M. Yasuda, H. Awazaki, K. Minamisawa, S. Shinozaki and H. Nakashita, 2010. Azospirillumsp. strain B510 enhances rice growth and yield. Microbes Environ 25:58- 61.

Islam, M.R., T. Sultana, M.M Joe, W. Yim, J.C. Cho and T. Sa, 2013. Nitrogen-fixing bacteria with multiple plant growth-promoting activities enhance growth of tomato and red pepper. J. of Basic Microbiol., 53: 1004–1015.

159

Jensen, H., L. Guilaran, R. Jaranilla and G. Garingalao, 2006. Nature farming manual a handbook of preparations, techniques and organic amendments inspired by Nature Farming and adapted to locally available materials and needs in the Western Visayas region of the Philippines. Los Baños Laguna, The Philippines.

Jiménez-Gómez, A., J. David Flores-Félix, P. García-Fraile, P.F. Mateos, E. Menéndez, E. Velázquez and R. Rivas, 2018. Probiotic activities of Rhizobium laguerreae on growth and quality of spinach. Scientific Reports 8:295 DOI:10.1038/s41598-017-18632 Joseph, B., R.R. Patra and R. Lawrence, 2007. Characterization of plant growth promoting

rhizobacteria associated with chickpea Cicer arietium. Int. J. plant Prod., 2: 141-152.

Kalsom, U. and M. Sariah, 2006. Utilization of microbes for sustainable agriculture in Malaysia: current status. Bio prospecting and management of microorganisms. National Conference on Agro biodiversity conservation and sustainable utilization, pp 27–29. Kapilan, R. and A.C. Thavaranjit, 2015. Promotion of vegetable seed germination by soil

borne bacteria. Archives of Applied Science Research, 7(8):17-20.

Ke, X., S. Feng, J. Wang, W. Lu, W. Zhang, M. Chen, M. Lin, 2019. Effect of inoculation with nitrogen-fixing bacterium Pseudomonas Stutzeri A1501 on maize plant growth and the microbiome indigenous to the rhizosphere. Syst. Appl. Microbiol., 42(2):248-260. doi: 10.1016/j.syapm.2018.10.010

Keeney and Nelson, 1982. Method in applied soil microbiology and biochemistry. Edited by

Kassem Alef and Paolo Nannipieri. Harcourt brace and company, pp79.

Keli’ikuli, A., 2018. Unraveling the mystery of the natural farming system (Korean): isolation of bacteria and determining the effects on growth. Thesis for the degree of master of Science, the university of Hawai’i at Manoa.

Ken, W.J., 2002. BLAST-the BLAST like Alignment Tool. Genome Reseach, 12(4): 656-664. Ker, K., P. Seguin, B.T. Driscoll, J.W. Fyles, D.L. Smith, 2014. Switchgrass establish‑ment and seeding year production can be improved by inoculation with rhizosphere endophytes. Biomass Bioenergy, 47: 295–301.

Khalib, S.N.B., I.A. Zakarya, T.N.T. Izhar., 2018. Composting of garden waste using indigenous microorganisms (IMO) as organic additive. International Journal of Integrated Engineering: Special Issue 2018: Innovations in Civil Engineering, 10(9):140-145.

Khalid, A., M. Arshad and Z.A. Zahir, 2004. Screening plant growth-promoting rhizobacteria for improving growth and yield of wheat. Journal of Applied Microbiology, 96 (3): 473- 480.

Khamna, S., A. Yokota, J.F. Peberdy, S. Lumyong, 2010. Indole-3-acetic acid production by Streptomyces sp. isolated from some Thai medicinal plant rhizosphere soils. Eur. Asia J. BioSci., 4: 23-32.

Khan, I., A. Masood and A. Ahmad, 2010. Effect of nitrogen fixing bacteria on plant growth

and yield of Brassica juncea. Journal of Phytology, 2(9): 25-27.

Khuất Hữu Khanh, 2006. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. NXB Khoa Học Kỹ Thuật

Hà Nội.

160

Kiều Phương Nam, Bùi Văn Lệ, Trần Minh Tuấn, Hồ Lê Trung Hiếu và Quách Việt Duy, 2010. Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Methylobacterium ssp. trong việc gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt giống cây trồng. Báo cáo tổng kết kết quả nghiên cứu khoa học đề tài cấp Đại học Quốc gia. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Kirk, J.L, L.A Beaudette, M. Hart, P. Moutoglis, J.N. Klironomos, H. Lee and J.T. Treevors, 2004. Method of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Method 58: 169-188.

Klipp, W., B. Masepohl, O.R. Gallon and W.E Newton, 2004. Genetics and regulation of nitrogen fixation in free living bacteria, edited by Werner symbiosis by Klipp, B Masepohl, R. Ohn, Gallon and W.E. Newton. Kluwar Academic publishers, Dordrecht. Koon-Hui, W., M. Duponte and K. Chang, 2013. Use of Korean natural farming for vegetable

crop production in Hawai’i. Hanai’ai/The Food Provider.

Kozdrój, J. and J.D. Elsas, 2001. Structural diversity of microbial communities in arable soils of a heavily industrialised area determined by PCR-DGGE fingerprinting and FAME profiling. Applied Soil Ecology, 17: 31–42.

Krishnaswamy V. and D.V Seshu, 1990. Germination after accelerated ageing and associated

characters in rice varieties. Seed Science and Technology, 18:147-15.

Kucuk, C. and C. Cevheri, 2016. Indole acetic acid production by Rhizobium sp. isolated from pea (Pisum sativum L. ssp. arvense) Bezelye (Pisum sativum L. ssp. arvense)’den izole edilen Rhizobium sp. Tarafından İndol Asetik Asit Üretimi. Turk. J. Life Sci., 1(1): 043- 045.

Kumar, B.L. and D.V.R Sai Gopal, 2015. Effective role of indigenous microorganism for

sustainable environment. Biotech., 5: 867-876.

Kyu, C.H. and A. Koyama, 1997. Korean nature farming. Indigenous microorganisms and vital power of crop/livestock. Korean Nature Farming Association Publisher. 173 pages. (Special issue on Agriculture): 39-48.

Kyu, C.H., 2003. Natural farming. Janong Natural Farming Institute, Chungbuk, Republic of

Korea.

Lai Quốc Chí, Nguyễn Thị Dơn và Cao Ngọc Điệp, 2012. Tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn cố định đạm (có khả năng hòa tan lân và kali) phân lập từ vật liệu phong hóa của vùng núi đá hoa cương tại núi cấm, tỉnh an giang. Tạp chí trường Đại Học Cần Thơ, 10: 605- 618.

Lane. D.J., 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Editors by Stackebrandt E., Goodfellow M., . Chichester, United Kingdom: John Wiley & Sons, 115–175.

Larena, I., O. Salazar, V. Gonzalez, M.C. Julian and V. Rubio, 1999. Design of a primer for ribosomal DNA internal transcribed spacer with enhanced specificity for ascomycetes. Journal of Biotechnology 75(2-3): 187-194.

rhizosphere, Front. Microbiol. (1-20). 1268 8:

Lê Thị Khánh, 2009. Giáo trình Cây rau. Trường Đại Học Nông Lâm Huế. Li, H.B., R.K. Singh, P. Singh, Q.Q. Song, Y.X. Xing, L.T. Yang and Y.R. Li, 2017. Genetic diversity of nitrogen-fixing and plant growth promoting Pseudomonas species isolated doi: sugarcane from 10.3389/fmicb.2017.01268

161

Li, Y., Y. Li, H. Zhang, M. Wang, S. Chen, 2019. Diazotrophic Paenibacillus beijingensis BJ-18 provides nitrogen for plant and promotes plant growth, nitrogen uptake and metabolism. Front Microbiol 10:1119. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01119.

Lifshitz, R., J.W. Kloepper, M. Kozlowski, C. Simson, J. Carlson, B. Tipping and I. Zeleska, 1987. Growth promotion of calona (rapeseed) seedling by straint of Pseudomonas putida under gnobiotic conditions, Can J Microbiol, 33: 390-395.

Liu, J., Y. Yu, Z. Cai, M. Bartlam, Y. Wang, 2015. Comparison of ITS and 18S rDNA for estimating fungal diversity using PCR–DGGE. World Jour Microbiol Biotechnology, DOI 10.1007/s11274-015-1890-6.

Liu, X., Q. Li, Y. Li, G. Guan and S. Chen, 2019. Paenibacillus strains with nitrogen fixation and multiple beneficial properties for promoting plant growth. PeerJ, DOI 10.7717/peerj.7445.

Loper, J.E. and M.N. Schroth, 1986. Influence of bacterial source of indole-3-acetic acid on

root elongation of sugar beet, Phytopathology, 76: 386-389.

Lv Y.Y., M.H. Chen, F. Xia, J. Wang, L.H. Qiu, 2016. Paraburkholderia pallidirosea sp. nov., isolated from a monsoon evergreen broad-leaved forest soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 66:4537–4542.

MacNaughton, S.J., J.R. Stephen, A.D. Venosa, G.A. Davis, Y.J. Chang and D.C. White, 1999. Microbial population changes during bioremediation of an experimental oil spill. Applied and Environmental Microbiology 65: 3566–3574.

Malik, K.A., and Y. Zafar, 1985. Quantification of root associated nitrogen fixation in kallar grass as estimated by 15N isotope dilution. Nitrogen and the Environment (Malik. M.A., S.H.M. Nagvi. and M.I.H Aleem. Eds). NIAB. Faisalabad, Pakistan, 21:161-171. Malik, K.A., G. Rasul, U. Hassan, S. Mehnaz and M. Ashraf, 1994. Role of the N2-fixing and growth hormones producing bacteria in improving growth of wheat and rice In N. A. Hegazi; fayez, Monib (eds.), Nitrogen Fixation with non legumes. Cairo University Press, Giza, Egypt. pp 409-420.

Mazumdar, A. and M. Deka, 2013. Isolation of free living nitrogen fixing bacteria from crude oil contaminated soil. International Journal of Bio-Technology and Research., 3: 69-76. Mazzola, M. and F.F. White, 1994. A mutation in the indole-3-aceticacid biosynthesis in phaseolus vulgaris and

pathway of Pseudomonas syringae affects growth syringomycin production. J. Bacteriol., 176: 1374–1382.

Mbouobda, H.D., Fotso, C.A. Djeuani, K. Fai1 and N.D. Omokolo, 2013. Impact of effective and indigenous microorganisms manures on Colocassia esculenta and enzymes activities. African Journal of Agricultural Research, 8(12): 1086-1092.

McDowell, R.H., E.M. Sands and H. Friedman, 2020. Bacillus Cereus. StatPearls Publishing

LLC.

McLaren, A.D. and J. Thornton, 1975. Enzymatic characterization of soil evidence. Journal of

Forensic Sciences, 20(4): 674-692.

Mehta, S. and C.S. Nautiyal, 2001. An efficient method for qualitative screening of

phosphate-solubilizing bacteria. Current Microbiology, 43: 51-56.

162

Meliani, A., A. Bensoltane and K. Mederbel, 2012. Microbiol diversity and abundance in soil: related to plant and soil type. American Journal of Plant Nutrition and Fertilization Technology 2 (1): 10-18.

Miller, K.M., T.J. Ming, A.D. Schulze and R.E. Withler, 1999. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE): a rapid and sensitive technique to screen nucleotide sequence variation in populations. BioTechniques 27: 1016– 1030.

Mohammadi, K., Y. Sohrabi, G. Heidari, S. Khalesro and M. Majidi, 2012. Effective factors on biological nitrogen fixation. African Journal of Agricultural Research, 7(12): 1782- 1788.

Mohite, B., 2013. Isolation and characterization of indole acetic acid (IAA) producingbacteria from rhizospheric soil and its effect on plant growth. J Soil Sci Plant Nutr;13(3):638– 49.

Molina, F., E. López-Acedo, R. Tabla, I. Roa, A. Gómez and J.E. Rebollo, 2015. Improved detection of Escherichia coli and Coliform bacteria by multiplex PCR. BMC Biotechnology, 15:48, DOI 10.1186/s12896-015-0168-2 15(48): 1-9.

Monica, N., V. Roxana, P. Rodica and R. Loan, 2013. Stress factors affecting symbiosis activity and nitrogen fixation by Rhizobium cultured in vitro. ProEnvironment, 6: 42 – 45.

Muthukumarasamy, R., G. Revathi and M. Vadivelu, 2000. Acetobacter diazotrophicus: prospects and potentialities– an overview. In recent advances in biofertilizer technology, society for promotion & utilization resources & technology, New Delhi. Edited by Yadav AK, Motsara MR, Ray Chaudhury S, 126–153.

Muyzer G., T. Brinkhoff, U. Nubel, C. Santegoeds, H. Schafer and C. Wawer, 2004. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology. In: Kowalchuk G.A., de Bruijn F.J., Head I.M., Akkermans A.D.L., van Elsas J.D. (eds): Molecular Microbial Ecology Manual. Kluwer Academic Publishers Dordrecht, 743–769.

Muyzer, G. and K. Smalla, 1998. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie Van Leeuwenhoek. 73(1): 127-141.

Muyzer, G., 1999. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems.

Current Opinion in Microbiology. 2(3): 317-322.

Muyzer, G., E.C de Waal, A.G. Uitterlinden, 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S-rRNA. Appl Environ Microbiol. 59(3):695- 700.

Muyzer, G., S. Hottentrfiger, A. Teske and C. Wawer, 1996. Denaturant gradient gel electrophoresis of PCR amplified l6S rDNA - A new molecular approach to analyse the genetic diversity of mixed microbial communities. In: Molecular microbial ecology manual. A.D.L. Akkermans, J.D. van Elsas and F.J. DeBruijn (Eds.). Dordrecht, kluwer Academic publishers.

Myo, E.M., B. Ge, J. Ma, H. Cui, B. Liu, L. Shi, M. Jiang and K. Zhang, 2019. Indole-3- acetic acid production by Streptomyces fradiae NKZ-259 and its formulation to enhance plant growth. BMC Microbiology, 19:155, https://doi.org/10.1186/s12866-019-1528-1.

Ngô Thế Dân, Nguyễn Ngọc Quyên, Nguyễn Kim Vũ, 2016. Phân vi khuẩn nốt sần và cách

163

sử dụng cho cây đậu đỗ. NXB Nông nghiệp.

Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp, 2018. Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn chịu mặn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ đất sản xuất lúa - tôm ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 54 (1b): 7-12.

Nguyễn Cẩm Long, 2014. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất cải xanh an toàn theo

hướng VietGap ở tỉnh Quảng Bình. Luận án tiến sĩ nông nghiệp. Trường Đại học Huế.

Nguyễn Cẩm Long, Nguyễn Minh Hiếu, Trần Đăng Hòa, 2012. Khảo nghiệm một số giống cải xanh (Brassica juncea L.) phục vụ sản xuất rau tại Quảng Bình. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 3:141 – 146.

Nguyễn Cẩm Long, Nguyễn Minh Hiếu, Trần Đăng Hòa, 2013. Ảnh hưởng của mật độ trồng đến sinh trưởng, năng suất và hàm lượng nitrate đối với cải xanh (Brasica juncea L.) tại Quảng Bình, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 7:61-67.

Nguyễn Đức Lượng, Phạm Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết., 2003. Thí nghiệm vi sinh vật

học. NXB ĐH Quốc Gia TPHCM.

Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2012. Vi sinh vật học môi trường. NXB Đại học Cần

Thơ.

Nguyễn Hữu Hiệp và Hà Anh Đức, 2009. Phân lập các dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân cho đậu phộng trồng ở Trà Vinh. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 11:123-133.

Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Mai Khanh, 2010. Phân lập và nhận diện một số chủng vi khuẩn cố định nitơ trên cây bắp. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 16a:151- 156.

Nguyễn Hữu Hiệp và Trần Thị Tuyết Linh, 2009. Hiệu quả của vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân lên năng suất đậu phộng trồng trên đất giồng cát tỉnh Trà Vinh. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 11:134-145.

Nguyễn Hữu Hiệp, Ngô Ngọc Hưng và Lâm Bạch Vân, 2012. khả năng cố định đạm của chủng vi khuẩn Azospirillum lipoferum R29b1 có kết hợp các liều lượng phân đạm khác nhau lên sự sinh trưởng và năng suất trên cây lúa trong điều kiện nhà lưới. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ :21b 171-178.

Nguyễn Hữu Hiệp, Phạm Thị Khánh Vân, Trần Văn Chiêu, Đào Thanh Hoàng và Nguyễn Khắc Minh Loan, 2005. Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn Azospirillum bằng kỹ thuật PCR. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 4: 119-126.

Nguyễn Khởi Nghĩa, 2017. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi khuẩn chịu mặn làm tăng năng suất lúa ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp bộ.

Nguyễn Khởi Nghĩa, Đỗ Hoàng Sang, Nguyễn Thị Kiều Oanh, Nguyễn Thị Tố Quyên, Lâm Tử Lăng và Dương Minh Viễn, 2015. Hiệu quả phân hủy sinh học hoạt chất propoxur trong đất bởi dòng vi khuẩn phân lập Paracoccus sp. P23-7 cố định trong biochar. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 40: 90-98.

Nguyễn Lân Dũng, 1984. Vi sinh vật đất và sự chuyển hóa các hợp chất cacbon, nitơ. NXB

Khoa học và Kỹ thuật.

Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty, 2001. Vi sinh vật học. NXB Giáo

164

Dục.

Nguyễn Lệ Phương, Nguyễn Võ Châu Ngân, Nguyễn Hữu Chiếm, 2019. Khảo sát sự tích lũy nitrate trong rau muống (Ipomoea aquatica)và cải xanh (Brassica juncea L.) khi tưới bằng nước thải từ hầm ủ biogas. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 61(2):47- 54.

Nguyễn Minh Chung, Trần Khắc Thi, Nguyễn Khắc Thái Sơn, Hoàng Minh Châu, Nguyễn Thị An, 2012. Xác định loại dung dịch dinh dưỡng thích hợp để trồng thủy canh một số loại rau ăn lá. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 10(2):37-42.

Nguyễn Phong, 2020. Sóc Trăng tận dụng lợi thế phát triển nông nghiệp.

https://nhandan.org.vn (ngày đăng 8/1/2020, ngày truy cập 20/5/2020) Nguyễn Thành Đạt và Nguyễn Duy Thảo, 1986. Vi sinh vật học. NXB Giáo Dục. Hà Nội. Nguyễn Thị Huỳnh Như, Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Minh Đời, Trần Nguyễn Nhật Khoa và Thái Trần Phương Minh, 2013. Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp IAA và cố định đạm trên cây chuối. Tạp chí Trường Đại học Cần thơ, phần B Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học, 27: 24-31.

Nguyễn Minh Trí, Nguyễn Hạnh Trinh, Nguyễn Việt Thắng, Nguyễn Thị Hoàng Phương, 2013. Khảo sát tình hình sản xuất và dư lượng nitrate trên một số sản phẩm rau xanh vụ xuân - hè tại hợp tác xã Hương Long, Thành phố Huế, Hội nghị Khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, Hà Nội.

Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2009. Khảo sát ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn vùng rễ có khả năng tổng hợp IAA, được phân lập từ vùng đất trồng rau tại Tiền Giang đến sinh trưởng của cây rau muống. Báo cáo đề tài cấp trường. Trường ĐH Cần Thơ.

Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2011. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA, để làm phân bón cho rau ở Tiền Giang. Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường ĐH Cần Thơ.

Nguyễn Thị Pha, Nguyễn Thị Phương Oanh và Nguyễn Hữu Hiệp, 2014a. Khả năng đối kháng nấm Pyricularia oryzae của vi khuẩn sinh chitinase phân lập từ đất vùng rễ lúa. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 31: 7-11.

Nguyễn Thị Pha, Trần Đình Giỏi và Nguyễn Hữu Hiệp, 2014b. Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn vùng rễ PH27 và TN20 đến sinh trưởng, phát triển và năng suất giống lúa OM10424 ở điều kiện ngoài đồng. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 32: 27- 32.

Nguyễn Thị Phương Oanh, Trần Bửu Minh và Nguyễn Thị Pha, 2013. Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn đất vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA. Tạp chí Trường Đại học Cần thơ, phần B Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 26: 82-88.

Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1999. Sổ tay người trồng rau. NXB Nông

Nghiệp Hà Nội.

Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thị Thủy, 2015. Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả năng cố định nitơ và sinh tổng hợp IAA. Tập chí Khoa học và công nghệ lâm nghiệp, 4: 3-9.

Nhu, N.T.H and N. Riddech, 2016. Effects of rhizobacteria on seed germination of water

165

spinach (Ipomoea aquatica). KKU Res.J. 21(2): 280-290.

Nhu, N.T.H, N.L. Chuen and N. Riddech, 2018. The effects bio-fertilizer and liquid organic fertilizer on the growth of vegetables in the pot experiment. Chiang Mai J. Sci. 45(3): 1257-1273.

Niemi, R. Maarit; Heiskanen, Ilse; Wallenius, Kaisa and lindström, Kristina, 2001. Extraction and purification of DNA in rhizosphere soil samples for PCRDGGE analysis of bacterial consortia. Journal of Microbiological Methods, 45(3):155-165.

Novia,D., A. Rakhmadi, E. Purwati, I. Juliyarsi, R. Hairani and F. Syalsafilah, 2019. The characteristics of organic fertilizer made of cow feces using the indigenous micro- organisms (IMO) from raw manures.

Oberhansli, T., G. Défag and D. Haas, 1991. Indole-3-acetic acid (MA) synthesis in the biocontrol strain CHAO of Pseudomonas fluorescens: role of tryptophan side chah oxidase. J. Gen. Microbiol., 37(1): 2273-2279.

Ona, O., I. Smets, P. Gysegom, K. Bernaerts, J. Van Impe, E. Prinsen and J. Vanderleyden, 2003. The effect of pH on indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis of Azospirillum brasilense Sp7. Symbiosis, 35: 199–208.

Ona, O., J. Van Impe, E. Prinsen and J. Vanderleyden, 2005. Growth and indole-3-acetic acid biosynthesis of Azospirillum brasilense Sp245 is environmentally controlled. FEMS Microbiol. Lett., 246: 125–132.

Pandey, P., and D.K. Maheshwari, 2007. Commensalism between Sinorhizobium and Burkholderia in binary-culture consortium for plant growth promotion. Curr. Sci. 92: 1137–1142.

Pankaj, K., R.C. Dubey and D.K. Maheshwari, 2012. Bacillus strains isolated from rhizosphere showed plant growth promoting and antagonistic activity against phytopathogens. Microbiological Research, 167(8): 493-499.

Patriquin, D.G., J. Dobereiner and D. K Jain, 1983. Sites and processes of association

between diazotrophs and grasses, Can. J. Microbiol., 29: 900-915.

Patten, C. and B.R. Glick, 1996. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid Canadian

Journal of Microbiology, 42: 207-220.

Patten, C.L. and B.R. Glick, 2002. Role of Pseudomonas putida indole acetic acid in

development of the host plant root system. Appl, Environ, Microbiol., 68: 3795–3801.

Perley, J.W. and B.B. Stowe, 1966. The ability of Taphrina deformans to produce

indoleacetic acid from tryptophan by way of tryptamine. Plant Physiol., 41: 234-237.

Phạm Chí Thành và Ka Nin H’dok, 2002. Sử dụng phân vi sinh vật bản địa trong việc trồng

và chăm sóc cà phê ở Dak Lak. Khoa học-ứng dụng. 52-52.

Phạm Thị Ngọc Lan, Lý Kim Bảng, 2004. Bước đầu tìm hiểu vi khuẩn cố định nitơ trong đất

trồng lúa ở Thừa Thiên Huế, Tạp chí sinh học, 25(1A): 164-168.

Phạm Thị Ngọc Lan, Trần Thị Thanh Nhàn, 2008. Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng và phát triển của một số chủng nấm mốc hòa tan phosphate vô cơ. Tạp chí khoa học Đại học Huế, 48: 103-108.

166

Pham Tien Dung and Y ka Nin H’ dok. 2009. Microbial organic fertilizer application for safe coffee production at Daklak, Vietnam. International Society for Southeast Asian Agricultural Sciences. 15(1): 22-31.

Phạm Văn Toản, 2002. Báo cáo kết quả đề tài KHCN.02.06: Nghiên cứu áp dụng công nghệ mới nhằm mở rộng việc sản xuất, ứng dụng phân VSV cố định đạm và phân giải lân phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững. Hội nghị tổng kết các chương trình khoa học và công nghệ cấp Nhà nước giai đoạn 1996-2000. Hà Nội.

Phạm Xuân Lân, 2007. Luận Văn Thạc Sỹ. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại phân hữu - của rau cải bắp và hóa tính đất trồng rau tại

cơ vi sinh tới năng suất, hàm lượng NO3 Thị xã Hà Giang. Đại học Nông lâm Thái Nguyên.

Phillips, L.A., J.J Germida, R.E Farrell and C.W. Greer, 2008. Hydrocarbon degradation potential and activity of endophytic bacteria associated with prairie plants. Soil Biology and Biochemistry, 40: 3054–3064.

Phua, C.K.H., A.N.A Wahid and K.A Rahim, 2012. Development of multifunctional biofertilizer formulation from indigenous microorganisms and evaluation of their n2- fixing capabilities on Chinese cabbage using 15N tracer technique. Pertanika J. Trop. Agric. Sci., 35(3): 667 – 674.

Poly, F., L. Ranjard, S. Nazaret, F. Gourbière and L.J. Monrozier, 2001b. Comparison of nifH gene pools in soils and soil microenvironments with contrasting properties. Applied and Environmental Microbiology, 67(5): 2255-2262.

Poly, F., L.J. Monrozier and R. Bally, 2001a. Improvement in the RFLP procedure for studying the diversity of nifH genes in communities of nitrogen fixers in soil. Res. Microbial., 152: 95-103.

Postgate, J., 1998. Nitrogen fixation. 3rd Edition, Cambridge university Press, Cambridge

UK.

Priest, F.G., M. Goodfellow, C. Todd, 1988. A numerical classification of the genus Bacillus.

J, Gen, Microbiol., 134: 1847–82.

Prinsen, E., A. Costacurta, K. Michiels, J. Vanderleyden and H. Van Onckelen. 1993. Azospirillum brasilense indole-3-acetic acid biosynthesis: evidence for a non-tryptophan dependent pathway. Mol. Plant Microbe. Interact., 6: 609–615.

Puri, A., K.P. Padda, C.P. Chanway, 2016. Evidence of nitrogen fixation and growth promotion in canola (Brassica napus L.) by an endophytic diazotroph Paenibacillus polymyxa P2b-2R. Biol. Fertil. Soils 52: 119-125. https://doi.org/10.1007/s00374-015- 1051-y

Raymond, J., J.L. Siefert, C.R. Staples and R.E. Blankenship, 2003. The Natural History of

Nitrogen Fixation. Mol. Biol. Evol., 21(3): 541-554.

Reddy, R., 2011. Cho’s Global natural Farming. South Asia rural reconstruction association.

(SARRA), Karnataka, India.

Rees, D.C., F. A. Tezcan, C.A. Haynes, M.Y. Walton, S. Andrade, O. Einsle and J.B. Howard, 2005. Structural basis of biological nitrogen fixation. Royal Soc., 1829: 971- 984.

167

Rivas, R., G. Carmen, A. Abril, P.F. Mateos, M. Eustoquio, A. Ventosa, A and V. Encarn, 2005. Paenibacillus rhizosphaerae sp. nov., isolated from the rhizosphere of Cicer arietinum. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55: 1305–1309.

Roberts, G.P., T. Macneil, D. Macneil and W.J. Brill, 1978. Regulation and characterization of protein products coded by the nif genes of Klebsiella pneumoniae. J. Bacteriol., 136: 267- 279.

Robertson, G.P. and P.M. Groffman, 2015. Nitrogen transformations. In: E. A. Paul, (Ed.). Soil microbiology, ecology and biochemistry. Fourth edition. Academic Press, Burlington, Massachusetts, USA. pp. 421-446.

Rodrigues, A.A., M.V. Forzani, R.S.Soares, S.T. Sibov and J.D.G. Vieira, 2016. Isolation and selection of plant growth-promoting bacteria associated with sugarcane. Agropec. Trop., Goiânia, 46(2): 149-158.

Rojas-Rojas F.U., E.Y. Tapia-García, M. Maymon, E. Humm, M. Huntemann , A. Clum, M. Pillay, K. Palaniappan, N. Varghese, N. Mikhailova, D. Stamatis , T.B.K. Reddy, V. Markowitz, N. Ivanova, N. Kyrpides, T. Woyke, N. Shapiro, A.M. Hirsch, and P.E.-de los Santos, 2017. Draft genome of Paraburkholderia caballeronis TNe-841T, a free- living, nitrogen-fixing, tomato plant-associated bacterium. Standards in Genomic Sciences 12:1-8.

Ryu, R. and C.L Patten, 2008. Aromatic amino acid-dependent expression of indole-3- pyruvate decarboxylase is regulated by 4 TyrR in Enterobacter cloacae UW5. American Society for Microbiology, 190 (21): 1-35.

Saharan, B.S. and V. Nehra, 2011. Plant Growth Promoting Rhizobacteria: A Critical Review.

Life Sciences and Medicine Research, 21: 1-30.

Sakimin, S.Z., N.A. Rahim, A.S. Raimi, M.A Alam and F. Aslani, 2017. Effects of indigenous microorganism and system of rice intensification formulation on growth, physiology, nutrient uptake and rice yield. Bangladesh J. Bot. 46(1): 433-438.

Sanchez, R. G., D.S. Barrientos and J.L. Galindez, 2018. Effect of indigenous microorganism extended solution (IMO-ES) on basmati rice. International Journal of Agricultural Technology, 14(7): 1871-1882.

Sangakkara, U.R. and A.M.U. Attanayake, 1993. Effect of EM on gernination and seedling growth of rice. In J. F. Parr, S. B. Hornick, M.E. Simpson (ed) Third International Conference on Kyusei Naturing farming. California, U.S.A. 223-227.

Santos, P.C.D., D.R. Dean, Y.L. Hu and M.W Ribbe, 2004. Formation and insertion of

nitrogenase iron-molybdenum cofactor. Chem. Rev.,104: 1159-1173.

Sarkar, A., P.K. Ghosh, K. Pramanik, S. Mitra, T. Soren, S. Pandey, M.H. Mondal and T.K. Maiti, 2018. A halotolerant Enterobacter sp. displaying ACC deaminase activity promotes rice seedling growth under salt stress. Research in Microbiology, 169: 20-32.

Sarwar, M. and W.T.Frankenberger, 1994. Influence of L-tryptophan and auxins applied to the rhizosphere on the vegetative growth of Zea mays L. Plant and Soil, 160(1): 97-104. Sawana A, Adeolu M, Gupta RS., 2015. Molecular signatures and phylogenomic analysis of the genus Burkholderia: proposal for division of this genus into the emended genus Burkholderia containing pathogenic organisms and a new genus Paraburkholderia gen. nov. harboring environmental species. Frontiers in genetics 5:429

168

Saxena, A.K and K.V.B.R Tilak, 1998. Free-living nitrogen fixers: Its role in crop production. In microbes for health, wealth and sustainable environment, malhotra publ co, New Delhi. Edited by Verma AK, 25–64.

Schwintzer, R. and J.D. Tjepkema, 1990. The Biology of Frankia and Actinorrhizal Plants.

Academic Press Inc. San Diego, USA, 99. 39.

Sekhar, M.S., and V.R.S. Gopal, 2013. Studies on indigenous microorganisms (IMOs) increasing growth of leaves germination, chlorophyll content and differentiation between IMOs and chemical fertilizers in various crop plants. International Journal of Emerging Technologies in Computational and Applied Sciences (IJETCAS) 4(3): 313- 318.

Shamseldin, 2013. The role of different genes involved in symbiotic nitrogen fixation-review.

Global Journal of Biotechnology and Biochemistry, 8(4): 84-94.

Shaukat, K., S. Afrasayab and S. Hasnain, 2006. Growth responses of Helianthus anus to plant growth promoting rhizobacteria used as a biofertilizer. Journal of Agricultural Research, 1(6): 573-581.

Sheela, T., P. Usharani, 2013. Influence of plant growth promoting rhizobac‑teria (PGPR) on

the growth of maize (Zea mays L.). Gold Res Thoughts, 3:629–40.

of Agronomy, Volume Journal 2012,

Shekhawat, K., S.S. Rathore, O.P. Premi, B.K. Kandpal and J.S. Chauhan, 2012. Advances in agronomic management of indian mustard (Brassica juncea (L.) Czernj. Cosson): An 1-14. International Overview. doi:10.1155/2012/408284.

Sheu, S.Y., J.H. Chou, C. Bontemps, N.Geoffrey, Elliott, E. Gross, F. B.D.R Junior, R. Melkonian, L. Moulin, E.K. James, J.I. Sprent, J.P.W. Young and W.M Chen, 2013. Burkholderia diazotrophic sp. nov., isolated from root nodules of Mimosa spp. Int J Syst Evol Microbiol;63:435–441.

Silvaa, D.R.A., J. L. Simões-Araújo, M.S. Vidal, L.M. Cruz, E. M. de Souzab, J.I. Baldani, 2018. Draft genome sequence of Paraburkholderia tropica Ppe8 strain, a sugarcane endophytic diazotrophic bacterium. Brazilian Journal of Microbiology, 49: 210–211. Smil, V., 2001. Enriching the Earth: Fritz Haber, Carl Bosch, and the transformation of world

food production. Cambridge, MA, The MIT Press, ISBN 0-262-19449-X

Sở Khoa Học Và Công Nghệ Tỉnh Sóc Trăng, 2019. Tổng kết ngành Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm 2018. (https://sokhcn.soctrang.gov.vn ngày đăng ngày 13/2/2019 truy cập ngày truy cập 20/5/2020)

Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Sóc Trăng, 2018. Tổng kết ngành nông

nghiệp năm 2018, phương hướng, nhiệm vụ năm 2019.

Smita, M., and D. Goyal, 2017. Isolation and characterization of free-living nitrogen fixing bacteria from alkaline soils. International Journal of Scientific World, 5(1): 18-22. Smith, R.L., S,C. Schank, J.H. Bouton and K.H. Quesenberry, 1978. Yield increases of tropical grasses after inoculation with Spirillum lipoferum, Ecological Bulletins. 26: 380-385.

Somasegaran, P., 1994. Handbook for rhizobia: methods in legume-rhizobium technology.

New York: Springer-Verlag. 1–6, 167.

169

Son, T.T.N., C.N. Diep, T.T.M. Giang, 2006. Effect of Bradyrhizobia and Phosphate solubilizing bacteria application on soybean in rotational system in the Mekong delta. Omonrice, 14: 48-57.

Souza, R., J. Meyer, R. Schoenfeld, P.B. da Costa, L.M.P. Passaglia. 2014. Char‑acterization of plant growth‑promoting bacteria associated with rice cropped in iron‑stressed soils. Ann. Microbiol., 65: 951–64.

Souza, R.D., A. Ambrosini and L.M.P. Passaglia, 2015. Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genetics and Molecular Biology, 38(4): 401-419. Spaepen, S., J. Vanderleyden and R. Remans, 2007. Indole-3-acetic acid in microbial and

microorganism-plant signaling. FEMS Microbiol. Rev., 31(4): 425-448.

Sridevi M., N.C.S. Yadav, K.V. Mallaiah, 2008. Production of indole acetic acid by

Rhizobium isolates from Crolataria species. Res. J. Microbiol., 3(4): 276–81.

Stanier, R.Y., 2003. General Microbiology. Fifth edition. Replika Press. Stinner, D.H, 2007. The science of organic farming. In William Lockeretz. Organic Farming: An international history. Oxfordshire, UK & Cambridge, Massachusetts: CAB International (CABI). ISBN 978-1.

Sturz, A.V., and J. Nowak, 2000. Endophytic communities of rhizobacteria and the strategies required to create yield enhancing associations with crops. Applied Soil Ecology, 15(2):183-190.

Suman, A., A.K. Shasany, M. Singh, H.N. Shahi, A. Gaur, and S.P.S. Khanuja, 2001. Molecular assessment of diversity among endophytic diazotrophs isolated from subtropical Indian sugarcane. World J. Microbiol. Biotechnol., 17: 39–45.

Sumathi T., A. Janardhan, A. Srilakhmi, D.V.R Sai Gopal and Narasimha, 2012. Impact of indigenous microoganisms on soil microbial and enzyme activities. Archives of Applied Science Research, 4(2): 1065-1073.

Suslow, T.V., M.N. Schroth and M. Isaka, 1982. Application of rapid method for gram differentiation of plant pathogenic and saprophytic bacteria without staining. Phytopathology, 72: 917- 918.

Tạ Thu Cúc, 2007. Kỹ thuật trồng rau sạch- rau ăn lá. NXB Phụ nữ, Hà Nội. Tao, G., Z.Y. Liu, K.D. Hyde, X.Z. Lui and Z.N.Yu, 2008. Whole rDNA analysis reveals novel and endophytic fungi in Bletilla ochracea (Orchidaceae). Fungal Diversity 33: 101-122.

Taylor, W.I. and B. Harris, 1965. Isolation of Shigellae. II. Comparison of plating media and

enrichment broths. American Journal of Clinical Pathology, 44(4): 476-479.

Thavasi, R., S. Jayalaxmi, T. Balasubramanian and I.M. Banat, 2006. Biodegradation of crude oil by nitrogen fixing marine bacteria Azotobacter chroococcum. Research journal of microbialogy, 5: 401-40.

Theron, J. and T.E Cloete, 2000. Molecular techniques for determining microbial diversity and community structure in natural environments. Critical Reviews in Microbiology 26: 37– 57.

Theunis, M., H. Kobayashi, W.J. Broughton and E. Prinsen, 2004. Flavonoids, NodD1, NodD2, and nod-box NB15 modulate expression of the y4wEFG locus that is required for indole-3-acetic acid synthesis in Rhizobium sp. strain NGR234. Mol. Plant–Microbe Interact, 17: 1153–1161.

Tiwari, S., V. Prasad, C. Lata, 2019. Bacillus: Plant Growth Promoting Bacteria for

170

Sustainable Agriculture and Environment, Publisher: Elsevier.

Tomaru, A., M. Kawachi, M. Demura, Y. Fukuyo, 2014. Changes in microbial communities, including both uncultured and culturable bacteria, with Mid-Ocean Ballast-Water exchange during a Voyage from Japan to Australia. PLoS ONE 9(5): e96274. doi:10.1371/journal.pone.0096274.

Trần Bảo Trâm, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Hương Sơn, Nguyễn Thị Thanh Mai, Võ Thu Giang và Phạm Thế Hải, 2017. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp IAA (indole acetic acid) từ đất trồng sâm Việt Nam ở Quảng Nam, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. 33(2S): 219-226.

Trần Linh Thước. 2006. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm, mỹ phẩm.

Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội.

Trần Ngọc Hiếu, 2017. Ứng dụng tưới tiết kiệm nước vào sản xuất rau an toàn tại Thị xã Ngã Năm, tỉnh Sóc Trăng. Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ tỉnh Sóc Trăng.

Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2019. Giáo trình trồng rau. Khoa Nông nghiệp và Sinh học

Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Trần Thị Xuân Phương, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Thị Thuận và Lê Xuân Diễm Ngọc, 2017. Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả năng cố định nitơ và sinh tổng hợp IAA trong đất trồng lúa ở tỉnh thừa thiên huế. Tạp chí Khoa Học & Công Nghệ Nông Nghiệp, Tập 1(1): 111-118.

Trần Văn Chiêu và Nguyễn Hữu Hiệp, 2010a. Ảnh hưởng của indole acetid acid (IAA) do vi khuẩn Azospirillum tổng hợp lên sự phát triển của rễ lúa trồng ở điều kiện nhà lưới. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 15b: 132-140.

Trần Văn Chiêu và Nguyễn Hữu Hiệp, 2010b. Ứng dụng chủng vi khuẩn Azospirillum trong canh tác lúa cao sản (OM 4644) tại tỉnh Bạc Liêu. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 15a: 92-96.

Trung tâm Nghiên Cứu khoa học Kỹ thuật và Khuyến Nông Thành Phố Hồ Chí Minh, 2006. Cẩm nang trồng rau an toàn tại Thành phố Hồ Chí Minh. Sở Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn Thành phố Hồ Chí Minh.

Tsavkelova, E.A, T.A. Cherdyntseva, S.Y. Klimova, A.I. Shestakov, S.G. Botina and A.I Netrusov, 2007. Orchid-associated bacteria produce indole-3-acetic acid, promote seed germination, and increase their microbial yield in response to exogenous auxin. Archives of Microbiology, 188 (6): 655-664.

Ủy Ban Nhân Dân tỉnh Sóc Trăng, 2009. Quy hoạch phát triển KTXH tỉnh Sóc Trăng đến

năm 2020.

Valášková, V. and P. Baldrian, 2009. Denaturing gradient gel electrophoresis as a fingerprinting method for the analysis of soil microbial communities. Plant Soil environ., 55 (10): 413–423.

Valverde, A., A. Burgos, T. Fiscella, R. Rivas, E. Velázquez, C. Rodríguez-Barrueco, E. Cervantes, M. Chamber and J-M. Igual, 2006. Differential effects of coinoculations with Pseudomonas jessenii PS06 (a phosphate-solubilizing bacterium) and Mesorhizobium ciceri C-2/2 strains on the growth and seed yield of chickpea under greenhouse and field conditions. Plant and Soil 287: 43-50.

Vance, C.P., 1997. Nitrogen fixation. In biotechnology and the improvement of forage

171

legumes McKerse B.D and Brown D.C.W (eds), CAB international, UK.

Vessey, J.K., 2003. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil,

255(2): 571–586.

Victorio, L., D.G. Allen, K.A. Gilbride and S.N. Liss, 1996. Rapid monitoring of metabolic and biodegradation activity of microbial communities in wastewater treatment systems. Water Res. 30: 1077–1086.

Võ Thị Ngọc Cẩm, Nguyễn Thị Kiều Oanh, Đỗ Hoàng Sang, Nguyễn Thị tố Quyên, Đỗ Thị Xuân, Dương Minh Viễn và Nguyễn Khởi Nghĩa, 2015. Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm bản địa phân hủy một số vật liệu hữu cơ từ nền đất thâm canh lúa tại xã phong hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp. Tạp chí Trường Đại Học Cần Thơ, 36: 1- 11.

Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp, 2011. Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải

cellulose. Tạp chí Khoa học, 18a: 177-184.

Vũ Thành Công, 2009. Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) cao trong rễ cây rau muống (Ipomoea aquatica) ở tỉnh Đồng Tháp. Đề tài nghiên cứu khoa học.

Wang, J., R. Li, H. Zhang, G. Wei and Z. Li, 2020. Beneficial bacteria activate nutrients and promote wheat growth under conditions of reduced fertilizer application. BMC Microbiology, 20:38. https://doi.org/10.1186/s12866-020-1708-z

Wang, L.Y., J. Li, Q.X. Li, S.F. Chen, 2013. Paenibacillus beijingensis sp. nov., a rhizosphere soil. Antonie Van from wheat isolated

nitrogen‑fixing species Leeuwenhoek, 104: 675–83.

Wheeler, C.T. and J.M. Miller, 1990. Current and potential uses of actinorrhizal plants in Europe. In The Biology of Frankia and Actinorrhizal Plants. Academic Press, San Diego, USA. Edited by C.R. Schwintzer, J.D. Tjepkema: 365–389.

WHO, 1996. Toxicological evaluation of certain food additives and contaminants. Prepared by the FortyFourth Meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA). Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety (WHO Food Additives Series 35).

Wintzingerode F.V, U.B Göbel, E.Stackebrandt, 1997. Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-based rRNA analysis. FEMS Microbiology Reviews, 21, 213–229. doi: 10.1111/j.1574-6976.1997.tb00351.x.

Xie, J., H. Shi, Z. Du, T. Wang, X. Liu, S. Chen, 2016. Comparative genomic and functional analysis reveal conservation of plant growth promoting traits in Paenibacillus polymyxa and its closely related species. Scientific Reports 6:213-29, DOI 10.1038/srep21329 Xie, J.B., Z. Du, L. Bai, C. Tian, Y. Zhang, J.Y. Xie, 2014. Comparative genomic analysis of N2‑fixing and non‑N2‑fixing Paenibacillus spp.: organization, evolution and expression of the nitrogen fixation genes. PLoS Genet., 10:e1004231.

172

Xu-Cong, Lc, Y.J Jiang, J. Liu, W.L Guo, Z.B Liu, W. Zhang, P.F Rao and L. Ni, 2017. Evaluation of different PCR primers for denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of fungal community structure in traditional fermentation starters used for Hong Qu glutinous rice wine. Int J Food Microbiol. 16,255:58-65.

Yabuuchi, E., Y. Kosako, H. Oyaizu, I. Yano, H. Hotta, 1992. Proposal of Burkholderia gen. nov. and transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group II to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia (Palleroni and Holmes 1981) comb. nov. Microbiol Immunol, 36:1251–1275.

Yamada, Y., K. Hoshino and T. Ishikawa, 1997. The phylogeny of acetic acid bacteria based on the partial sequences of 16S ribosomal RNA: The elevation of the subgenus Gluconoacetobacter to generic level. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 61(8):1244–1251.

Yan, Y., J. Yang, Y. Dou, M. Chen, S. Ping, J Peng, W. Lu and W. Zhang, 2008. Nitrogen fixation island and rhizosphere conpentence straits in the genome of root-associated Pseudomonas stutzeri A1501. The nationnal Academy of Sciences of USA, 105:7564- 7569.

Yao S., I.A. Merwin, G.S. Abawi and J.E. Thies, 2006. Soil fumigation and compost amendment alter soil microbial community composition but do not improve tree growth or yield in an apple replant site. Soil Biology and Biochemistry, 38:587–599.

Yi, Y., Huang W. Ge Y., 2008. Exopolysaccharide: a novel important factor in the microbial dissolution of tricalcium phosphate. World J Microbiol Biotechnol, 24:1059–1065 DOI 10.1007/s11274-007-9575-4.

Yousuf, J., T. Jabir, R. Mujeeb, K. Soumya, P.A. Aneesa, H. Mohamed, A. Abdulla, 2017. Nitrogen fixing potential of various heterotrophic Bacillus strains from a tropical estuary and adjacent coastal regions. Journal of basic microbiology, 57(11):922-932. Zeigler, D.R., 2013. The family Pae nibacillacea. In: Strain catalog and reference. Columbus:

Bacillus Genetic Stock Center, p. 1–32.

Website tham khảo http://www.asahi-net.or.jp (truy cập ngày 20/5/2020) http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast .cgi (truy cập ngày 20/5/2020 http://organic.da.gov.ph (truy cập ngày 18/1/2020) https://sokhcn.soctrang.gov.vn (truy cập ngày 20/5/2020 https://nhandan.org.vn (truy cập ngày 20/5/2020)

173

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Danh mục các hóa chất sử dụng và nguồn gốc

Hóa chất (NH4)2SO4

EC broth EDTA sodium Ethanol 96o FeCl3 FePO4 FeSO4.7H2O

Ladder 100bp L-ascorbic acid Loading dye L-Tryptophan LSB Agar

Xuất xứ Đức Việt Nam Hoa Kỳ Đức Đức Đức Đức Trung Quốc Đức Trung Quốc Ấn Độ Đức Trung Quốc Trung Quốc Đức Trung Quốc Đức Hoa Kỳ Đức Trung Quốc Trung Quốc Đức Trung Quốc Trung Quốc Đức Đức Trung Quốc Đức Hoa Kỳ Ấn Độ Hoa Kỳ Ấn Độ Ấn Độ Đức Đức Hoa Kỳ Hoa Kỳ Hoa Kỳ Hoa Kỳ Hoa Kỳ Hoa Kỳ Hoa Kỳ Hoa Kỳ Hoa Kỳ Hoa Kỳ Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Trung Quốc STT 1 2 Agar 3 Amonium molypdate ((NH4)6Mo7O24) 4 Bacto agar 5 Ca3(PO4)2 6 CaCl2.2 H2O 7 Ca3CO3 8 CH3COOH 9 CH3COONH4 10 CuSO4.5H2O 11 12 13 14 15 16 17 Glucose 18 Green master mix 2X 19 H2MoO4.H2O 20 H2O2 21 H2SO4 22 H3BO3 23 HCl 24 K2HPO4 25 K2Sb2(C4H2O6)2 26 K2SO4 27 KCl 28 KOH 29 30 31 32 33 34 MgSO4.7H2O 35 MnCl.4H2O 36 Mồi 27F 37 Mồi 1492R 38 Mồi 341F-GC 39 Mồi 534R 40 Mồi ITS1 41 Mồi ITS4 42 Mồi ITS4-GC 43 Mồi 243F 44 Mồi 1378R 45 Mồi 984F-GC 46 Mồi polF 47 Mồi polR 48 Na2CO3 49 Na2HPO4.12H2O

Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Nhật Đức Trung Quốc Đức Đức Đức Đức Ấn Độ Đức Ấn Độ Ấn Độ Hoa Kỳ Đức Ấn Độ Trung Quốc 50 Na2SO3 51 NaCl 52 NaClO 53 NaH2PO4.2H2O 54 NaHSO3 55 NaOH 56 NH4NO3 57 Phenol 58 Sodium citrate 59 Sodium tartrate 60 Sodium salyxylate 61 Salmonella Sighella agar 62 Sodium nitroprusside dehydrate 63 Starch 64 Sucrose 65 TEMED 66 Trisodium citrate dehydrate 67 Tryptone Soya Broth (TSB) 68 ZnSO4.7H2O

Phụ lục 2 Thành phần một số môi trường nuôi cấy vi sinh vật trong luận án

A. Môi trƣờng TSA nuôi cấy vi khuẩn

Hàm lƣợng trong 1 L (g/L) 15 15 5,0 15 Hóa chất Trypton Papaic digest of Soybean NaCl Agar Điều kiện pH7,3±0,2

B. Môi trƣờng PDA nuôi cấy nấm

Hóa chất Dextrose Potato Extract Agar Hàm lƣợng trong 1 L (g/L) 20,0 4,0 15

C. Môi trƣờng lỏng Starch nuôi cấy xạ khuẩn

Hàm lƣợng trong 1 L (g/L) 10,0 1,31 2,0 1,0 1,0 2,0 1 ppm 1 ppm 1 ppm Hóa chất Starch K2HPO4 Ca3CO3 MgSO4 NaCl (NH4)2 SO4 FeSO4. MnCl2 ZnSO4 Điều kiện pH7,2±0,2

Hàm lƣợng trong 1 L (g/L) 10,0 5,0 5,0 0,25 0,2 0,1

D. Môi trƣờng lỏng NBRIP (Mehata and Nautiyal, 2001) nuôi cấy vi sinh vật hoà tan lân Hóa chất D-Glucose Ca3(PO4)2 MgCl2.6 H2O MgSO4.7H2O KCl (NH4)2 SO4 Điều kiện pH7,0

E. Môi trƣờng lỏng Burks (Mehata and Nautiyal, 2001) nuôi cấy vi khuẩn cố định đạm

Hóa chất Sucrose K2HPO4.4H2O KH2PO4 CaCl2.2 H2O MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O H3 BO3 Mo Hàm lƣợng trong 1 L (g/L) 10 0,41 1,05 0,1 0,1 0,015 0,0025 0.0025

F. Môi trƣờng SS Agar (Taylor and Harris, 1965) nuôi cấy Salmonella và

Shigella

Hàm lƣợng trong 1 L (g/L) 5,0 5,0 10 8,5 10 8,5 1,0 0,00033 0,025 15 Hóa chất Lab-Lemco’ powder Peptone Lactose Bile salts n°3 Sodium citrate Sodium thiosulphate Ferric citrate Brilliant green Neutral red Agar Điều kiện pH7,0±0,2

G. Môi trƣờng LSB nuôi cấy Coliform

Hóa chất Tryptose Lactose NaCl KH2PO4 K2HPO4 Sodium lauryl sulfate Điều kiện pH6,8±0,2 Hàm lƣợng trong 1 L (g/L) 20,0 5,0 5,0 2,75 2,75 0,1

H. Môi trƣờng EC broth nuôi cấy E. coli

Hàm lƣợng trong 1 L (g/L) 10,0 5,0 1,5 1,5 4,0 5,0

Hóa chất Tryptose Lactose Bile salts n°3 KH2PO4 K2HPO4 NaCl Điều kiện pH7,0

31,2 g 39,3 g 1,0 L

Phụ lục 3 Thành phần các dung dịch sử dụng trong luận án A. Sodium phosphate buffer (Martelli and Russo, 1984) - NaH2PO4.2H2O - Na2HPO4.12H2O - Nước khử khoáng B. Dung dịch vô cơ mẫu cho hiện màu đạm

Dung dịch H2SO4 đậm đặc Dung dịch xúc tác: 1 g CuSO4 và 10 g K2SO4 trong 100 mL nước khử

+ (5 mg.L-1).

khoáng. C. Dung dịch hiện màu đạm tổng số Dung dịch NaOH 3,6 M Dung dịch A: 0,05 g sodium nitroprusside dehydrate, 13 g sodium salicylate và 10 g trisodium citrate, 10 g sodium tartrate định mức lên 100 mL bằng nước khử khoáng. Dung dịch B: 6 g NaOH định mức lên 100 mL, sau đó thêm 2 mL NaClO. D. Dung dịch hiện màu xác định ammonium hữu dụng

Dung dịch chuẩn NH4 Thuốc thử phenol nitroprusside: Hoà tan 5 g phenol và 0,025 g nitroprusside trong nước và định mức đến 500 mL. Hypocloride buffer: Hoà tan 15 mL NaOCl thêm 5 g NaOH vào nước và

định mức đến 500 mL. E. Dung dịch hiện màu xác định hàm lượng nitrate

- 10 ppm

Dung dịch C: Cho 200ml HCl 0.5M vào chai và cho 0.5g vanadium (III) chloride vào. Thêm 0.2g sulfanilamide và 0.01g N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride vào. Dung dịch chuẩn NO3

F. Hóa chất kiểm tra IAA (Thuốc thử R2 (Salkowski), Glickmann and Dessaux, 1995) Thuốc thử Salkowski 1 L: dung dịch H2SO4 10,8 M và 4,5 g FeCl3. G. Dung dịch xác định lân tổng số

Dung dịch P2O5 chuẩn 10 ppm Dung dịch A: 12 g (NH4)6Mo7O24.4H2O hòa tan trong 250 mL nước khử khoáng; 0,2098 g K2Sb2(C4H2O6)2 hòa tan trong 100 mL nước khử khoáng và 140 mL H2SO4. Dung dịch B: 1,056 g L-ascorbic acid và 200 mL dung dịch A.

Phụ lục 4 Thông tin chế phẩm vi sinh thương mại làm đối chứng

Tên chế phẩm: chế phẩm sinh học EMpb Gốc của công ty TNHH Trung tâm Chế phẩm Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. Công dụng:

- Phân hủy chất hữu cơ từ các nguồn than bùn, phụ phế phẩm nông nghiệp, phân gia súc/gia cầm tạo phân bón phục vụ cây trồng. - Dùng trong ủ phân cho trồng trọt: Rau màu, cây ăn quả, cây dược liệu… - Giảm phát sinh ruồi nhặn. - Ức chế vi sinh vật gây bệnh.

EM- Gốc PB: bao gồm vi sinh vật hữu ích: vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, xạ khuẩn và nấm sợi, vi khuẩn cố định đạm, enzyme (amylase, protease…), nước, rỉ đường.

Thành phần trong 1 lít: Lactobacillus sp. (≥109 cfu/mL), Saccharomyces cerevisiae (≥106 cfu/mL), Trichoderma sp. (≥108 cfu.g-1), Streptomyces spp. (≥107 cfu.g-1) Azotobacter sp. (≥106 cfu.g-1), Pseudomonas sp. (≥106 cfu.g-1), Bacillus sp. (≥107 g), các enzyme amylase, protease,…nước, rỉ đường vừa đủ 01 lít.

Cách sử dụng: Cần phải hoạt hóa trước khi sử dụng vì EM gốc ban đầu hệ vi sinh vật hữu ích đang ở dạng bị ức chế. Cần phải nuôi cấy trong môi trường giàu dinh dưỡng để nhân sinh khối và sinh hoạt tính mạnh. Cách thực hiện (Tạo EM1):

- Trộn 1 lít EM gốc + 18 lít H2O + 1 kg rỉ đường + 20g DAP + 100ml nước mắm. - Đậy kín 3-5 ngày, sau đó mở nắp cho xì gas và đậy tiếp - Sau 7-10 ngày đem ra sử dụng. Chú thích: 1 lít EM gốc ủ được 20 lít EM1. Quy trình ủ tương tự ta có EM2 từ EM1, EM3 từ EM2… 1 lít E.M hoạt hóa pha vào nước phun tưới cho 1000 m2 đất canh tác.

Phụ lục 5 pH của các IMO theo thời gian

pH (ngày sau lên men) STT Nguồn gốc IMO 17 ngày 22 ngày

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Đất trồng tre Đất luân canh Đất trồng chuối Đất hành tím Đất xà lách pháp Đất trồng lúa Đất dưa hấu Đất cỏ hoang Đất trồng bắp Đất rau xen canh Đất trồng cam Đất trồng bưởi Đất trồng ổi Đất trồng mía Đất rau muống Đất mồng tơi Đất trồng ớt Đất trồng củ lùn Đất trồng ngò IMO hỗn hợp 7 ngày 3,539 3,438 3,320 4,176 3,754 4,239 4,180 3,795 3,711 3,821 3,972 4,290 4,286 3,717 4,112 4,191 4,123 4,081 4,385 3,737 12 ngày 3,422 3,239 3,245 3,820 3,744 4,063 4,033 3,779 3,529 3,724 3,919 4,020 4,247 3,442 4,020 4,013 3,859 3,927 4,118 3,439 3,380 3,364 2,996 3,692 3,753 4,118 4,039 3,837 3,618 3,626 3,903 3,702 4,159 3,558 4,110 4,002 3,901 3,963 4,200 3,691 3,419 2,756 3,063 3,662 3,733 4,139 3,919 3,741 3,559 3,673 3,848 3,946 3,950 3,628 4,096 3,932 3,921 3,956 4,205 3,689

Phụ lục 6 Kết quả phân tích số nhóm loài vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn trong IMO

A. Vi khuẩn

*Chú thích: 1: IMO tre; 2: IMO luân canh; 3: IMO chuối; 4: IMO hành tím; 5: IMO rau; 6: IMO lúa; 7: IMO dưa hấu; 8: IMO cỏ hoang; 9: IMO bắp; 10: IMO rau; 11: IMO cam; 12: IMO bưởi; 13: IMO ổi; 14: IMO mía.

B. Nấm

*Chú thích: 1: IMO tre; 2: IMO luân canh; 3: IMO chuối; 4: IMO hành tím; 5: IMO rau; 6: IMO lúa; 7: IMO dưa hấu; 8: IMO cỏ hoang; 9: IMO bắp; 10: IMO rau; 11: IMO cam; 12: IMO bưởi; 13: IMO ổi; 14: IMO mía. 15: IMO hỗn hợp

C. Xạ khuẩn

*Chú thích: 1: IMO tre; 2: IMO luân canh; 3: IMO chuối; 4: IMO hành tím; 5: IMO rau; 6: IMO lúa; 7: IMO dưa hấu; 8: IMO cỏ hoang; 9: IMO bắp; 10: IMO rau; 11: IMO cam; 12: IMO bưởi; 13: IMO ổi; 14: IMO mía.

Phụ lục 7 Hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào 83 dòng vi khuẩn phân lập sau 5

ngày nuôi cấy trên môi trường Burks.

Hình thái khuẩn lạc trên môi trường Burks

Tế bào VK

STT

Ký hiệu

Hình dạng

Màu sắc

Rìa

Nổi/lài

Bề mặt

Hình dạng

Gram

Kích thước

Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

que dài

TP-1.1

0.2

Tròn

nổi

Trắng trong

nguyên

bóng trơn

que ngắn

TP-1.8

0.3

Tròn

nổi

Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

que ngắn

TP-1.2

0.3

Tròn

nổi

TP-1.3

<0.1

Trắng sữa

nguyên

bóng trơn

cầu

Tròn

nổi

Trắng trong

nguyên

bóng trơn

que ngắn

TP-1.6

0.2

tròn

nổi

Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

que ngắn

TP-1.4

0.2

tròn

nổi

không đều

Trắng sữa

chia thùy

vân

que ngắn

TP-1.5

0.2

nổi

Trắng trong

nguyên

có vân

que ngắn

TP-1.7

0.1

tròn

nổi

MQ-2.1

0.15

Trắng mờ

nguyên

tròn

nổi

MQ-2.5

0.2

tròn

nổi

nguyên

Trắng sữa

lồi có nhân lồi có nhân

MQ-2.3

0.2

tròn

nổi

nguyên

bóng trơn

Trắng sữa

Que kết chuỗi Que kết chuỗi Que kết chuỗi

MQ-2.4

0.3

tròn

nổi

nguyên

bóng trơn

Cầu

MQ-2.2

0.3

tròn

nổi

nguyên

bóng trơn

Cầu

MQ-2.6

0.2

tròn

nổi

nguyên

lỏm chỏm

Que ngắn

MQ-2.7

0.1

tròn

nổi

nguyên

lỏm chỏm

Cầu

CP-3.1

0.1

tròn

nổi

Trắng sữa Trắng sữa Trắng sữa Trắng sữa Trắng trong

nguyên

bóng trơn

que ngắn

tròn

nổi

bóng trơn

cầu

CP-3.2

<0.1

Trắng trong

nguyên

CP-3.3

0.1

tròn

nổi

Trắng trong

nguyên

bóng trơn

cầu

CP-3.4

0.1

tròn

nổi

Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

que ngắn

CP-3.5

0.2

tròn

nổi

Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

Que ngắn

CP-3.6

0.2

tròn

nổi

Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

que ngắn

Hình thái khuẩn lạc trên môi trường Burks

Tế bào VK

STT

Ký hiệu

Hình dạng

Màu sắc

Rìa

Nổi/lài

Bề mặt

Hình dạng

Gram

Kích thước

CP-3.7

0.1

Trắng trong

nguyên

bóng trơn

que dài

tròn

nổi

Trắng sữa

nguyên

bóng trơn

cầu

<0.1

HV-4.1

tròn

nổi

không đều

Trắng trong

chia thùy

bóng trơn

que ngắn

<0.1

HV-4.2

lài

0.4

HV-4.3

lài

không đều

chia thùy

bóng trơn

que ngắn

0.1

RP-5.1

tròn

nổi

nguyên

bóng trơn

cầu

0.3

RP-5.2

tròn

nổi

nguyên

bóng trơn

Que dài

0.2

RP-5.3

nổi

không đều

chia thùy

nhám

cầu

0.1

RP-5.4

tròn

nổi

nguyên

nhám

cầu

0.1

RP-5.5

tròn

nổi

nguyên

bóng trơn

cầu

RP-5.6

<0.1

tròn

lài

nguyên

bóng trơn

que

0.1

LM-6.1

nổi

không đều

chia thùy

bóng trơn

cầu

Trắng mờ Trắng sữa Trắng sữa Trắng sữa Trắng sữa Trắng sữa Trắng trong Trắng sữa

0.1

LM-6.2

nổi

không đều

chia thùy

cầu

Trắng sữa

Bóng trơn

0.1

LM-6.3

tròn

nổi

nguyên

bóng trơn

que ngắn

0.3

LM-6.4

lài

không đều

chia thùy

bóng trơn

que ngắn

Trắng sữa Trắng sữa

DL-7.1

<0.1

Trắng trong

nguyên

bóng trơn

que ngắn

tròn

nổi

0.1

DL-7.2

tròn

nổi

Trắng trong

nguyên

bóng trơn

que ngắn

0.1

DL-7.3

tròn

nổi

Trắng sữa

nguyên

bóng trơn

cầu

DL-7.4

<0.1

tròn

nổi

nguyên

bóng trơn

que ngắn

0.3

DL-7.5

lài

không đều

chia thùy

có vân

que ngắn

0.3

DL-7.6

lài

không đều

chia thùy

bóng trơn

que ngắn

0.1

CL-8.1

tròn

nổi

Trắng trong Trắng sữa Trắng sữa Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

que ngắn

tròn

nổi

CL-8.2

<0.1

Trắng sữa

nguyên

bóng trơn

cầu

0.2

CL-8.3

tròn

nổi

Trắng trong

nguyên

bóng trơn

cầu

0.2

CL-8.4

tròn

nổi

Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

cầu

0.2

BT-9.1

tròn

nổi

Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

que ngắn

0.2

BT-9.2

lài

không đều

Trắng sữa

chia thùy

bóng trơn

que kết chuỗi

0.5

BT-9.3

lài

không đều

Trắng sữa

chia thùy

que ngắn

lồi/có nhân

0.2

RM-10.1

tròn

nổi

Trắng trong

nguyên

bóng trơn

que ngắn

0.3

RM-10.2

tròn

nổi

Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

que ngắn

0.1

RM-10.3

tròn

nổi

nguyên

bóng trơn

que ngắn

0.1

CK-11.1

tròn

nổi

nguyên

có vân

que ngắn

Trắng trong Trắng sữa

0.1

CK-11.2

chia thùy

không đều

bóng trơn

que ngắn

Trắng sữa

lài/ có nhân

0.4

CK-11.3

lài

chia thùy

không đều

gồ ghề

que ngắn

0.1

CK-11.4

lài

chia thùy

không đều

bóng trơn

que ngắn

Trắng sữa Trắng sữa

0.5

CK-11.5

nổi

không đều

Trắng mờ

chia thùy

nhám

que kết chuỗi

0.4

BK-12.1

tròn

nổi

Trắng trong

nguyên

cầu

BK-12.2

tròn

Trắng trong

nguyên

bóng trơn

que ngắn

0.1 - 0.4

0.4

BK-12.3

tròn

Trắng sữa

nguyên

bóng trơn

bằng phẳng nổi/ có nhân

que kết chuỗi

0.4

OK-13.1

tròn

nổi

nguyên

bóng trơn

cầu

Trắng trong

0.2

OK-13.2

tròn

nổi

nguyên

bóng trơn

Trắng trong

que kết chuỗi

Hình thái khuẩn lạc trên môi trường Burks

Tế bào VK

STT

Ký hiệu

Hình dạng

Màu sắc

Rìa

Nổi/lài

Bề mặt

Hình dạng

Gram

Kích thước

OK-13.3

0.3-0.4

nguyên

bóng trơn

que ngắn

tròn

nổi

OK-13.4

0.1-0.2

Trắng trong Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

que ngắn

tròn

nổi

Trắng mờ

nguyên

bóng trơn

que ngắn

OK-13.5

0.1

tròn

nổi

Trắng sữa

sợi tia

bóng trơn

cầu

OK-13.6

0.2

tròn

ăn xuống agar

MC-14.1

0.1

tròn

nguyên

nổi

bóng trơn

que ngắn

MC-14.2

0.1

tròn

nguyên

nổi

bóng trơn

que ngắn

MC-14.3

0.1

tròn

nguyên

nổi

bóng trơn

que ngắn

Trắng trong Trắng sữa Trắng sữa

không đều

chia thùy

MC-14.4

0.2

nổi

que ngắn

Trắng sữa

có nếp nhăn

không đều

chia thùy

phẳng

bóng trơn

MP-15.1

0.5

cầu

MT-16.1

0.4

tròn

nguyên

nổi

bóng trơn

cầu

MT-16.2

0.4

tròn

nguyên

nổi

bóng trơn

cầu

MT-16.3

0.2

tròn

nguyên

nổi

bóng trơn

que ngắn

Trắng sữa Trắng trong Trắng trong Trắng sữa

MT-16.4

<0.1

tròn

nguyên

nổi

bóng trơn

Trắng sữa

que kết chuỗi

MT-16.5

0.4

tròn

Trắng trong

nguyên

nổi

bóng trơn

cầu

OM-17.1

0.3

tròn

Trắng trong

nguyên

nổi

bóng trơn

cầu

OM-17.2

0.3

tròn

Trắng trong

nguyên

nỗi

bóng trơn

cầu

OM-17.3

0.7

tròn

nguyên

nổi

bóng trơn

Trắng sữa

que kết chuỗi

OM-17.4

0.4

tròn

nguyên

nổi

bóng trơn

cầu

OM-17.5

0.2

không đều

chia thùy

nổi

bóng trơn

cầu

CP-18.1

<0.1

tròn

nguyên

nổi

bóng trơn

que ngắn

CP-18.2

<0.1

tròn

nguyên

nổi

bóng trơn

que ngắn

NM-19.1

0.2

không đều

Trắng sữa Trắng sữa Trắng trong Trắng trong Trắng sữa

chia thùy

nổi

bóng trơn

que ngắn

Phụ lục 8 Hình dạng tế bào 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn ở độ phóng đại 100X

Pseudomonas veronii TP-1.2

Paraburkholderia tropica TP-1.3

Paenibacillus cineris TP-1.4

Bacillus aryabhattai MQ-2.1

Bacillus megaterium MQ-2.5

Bacillus cereus BK-12.3

Klebsiella pneumoniae MT-16.5

Klebsiella pneumoniae OM-17.2

Bacillus megaterium OM-17.5

Pseudomonas boreopolis CP-18.2

Phụ lục 9 Trình tự đoạn gen 16S-rRNA của 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn Dòng vi khuẩn Pseudomonas veronii TP-1.2 27F chiều xuôi 897 nu CTGATCACCGTGGTACCGTCCCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACC CACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCG ACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGAC TGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTCTGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCA ACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGA TGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGT GCCCACCATTACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTT AACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATG TTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTA AGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCC CGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAA TGCGTTAGCTGCGCCACTAAGAGCTCAAGGCTCCCAACGGCTAGTTGACATCGTT TACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCT CAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATC TACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGTCA

GTCAGTTTTGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTCACATCCACTTAACT AACCACCTACGC Dòng vi khuẩn: Paraburkholderia tropica TP-1.3 27F chiều xuôi 493 nu TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCA CGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTG TCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCTAC GGATGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATAGGGGCGGCCGATGGCGGA TTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGA GAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC AGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTG TGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCCTGGT CCTAATATGGCCGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACG TGC Dòng vi khuẩn: Paenibacillus cineris TP-1.4 27F chiều xuôi 911 nu CCTGTCGGCGGCTGGCTCCTTGCGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGTAAACTC TCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATG CTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAA TCCGAACTGAGACCAGCTTTGATAGGATTGGCTCCACCTCGCGGCTTCGCTTCCC GTTGTACTGGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGAT TTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCATTCTAGAGTGCCC ACCCGAAGTGCTGGCAACTAAAATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCC AACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTCCTCTGTCCC GAAGGAAAGGTCTATCTCTATACCGGTCAGAGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTT CTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCA ATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGTGT TAACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCATTCATCGTTTACG GCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGC GTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATATCTAC GCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCACCCA GTTTCCAGTGCGAACCAAGGTTGAGCCTGGGCCTTAACACCAGACTAAATGACGC CTGCCGCGCTTACGCCATATTCGGA Dòng vi khuẩn: Bacillus aryabhattai MQ-2.1 27R chiều xuôi 789 nu CTATCATGCAGTCGAGCGAACTGATTATAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCG GACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGCGATAACTTCGGG AAACCGAAGCTAATACCGGCATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAG ATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAG GTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGCTAGGGAATC TTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTT TCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGT ACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCA GGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTG GAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGT GAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAACGCGGCTTTTTGGTCTGT

AACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCACACAGGATTAGATACCCTGGT AGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA Dòng vi khuẩn: Bacillus megaterium MQ-2.5 27f chiều xuôi 630 nu TCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGT AACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTA ATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTA TCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC AAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAG ACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACG AAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAAC TCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACC TAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTG GCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGT CTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACT TGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACG Dòng vi khuẩn: Bacillus cereus BK-12.3 27F chiều xuôi 836 nu GTGCTATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAG CGGCGGACGGGTGNNTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTC CGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGA AAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGT GAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGG CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAA TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGC TTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCT GGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGC GCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCA TTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGC GGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGT CTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC TGGTAGTCCACGCCGTAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTCCGCCCTTTAG TGCTGAAGTTAACGCATTAA Dòng vi khuẩn: Klebsiella pnemoniae MT-16.5 27F chiều xuôi 840 nu AGCCTACGATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAG CGGCGGACGGGTGCGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTAC TGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTC GGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACG GCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA ACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAA TGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGT AAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACCTTGTCGATTGAC GTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG GAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCT GTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGG CAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCG TAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGAC

GCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCT AACGCGTTAATCGACCGCCTGGGGA Dòng vi khuẩn: Klebsiella pnemoniae OM-17.2 27F chiều xuôi 793 nu GAACGCGCTACCATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGA CGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAA CTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGAC CTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGT AACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACA CTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG CACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCG GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACCTTGTCGA TTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGC GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAA ACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAA ATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGA CTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGGTGT Dòng vi khuẩn: Bacillus megaterium OM-17.5 27F chiều xuôi 777 nu AACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT GGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGG ATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTAC AGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAA CGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCT GACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGT TAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCG TTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGT GAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGC AGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAG GAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAA AGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGA GTGCTAAGTGTTAGAG Dòng vi khuẩn: Pseudomonas boreopolis CP-18.2 27F chiều xuôi 880 nu GCTACCATGCAAGTCGAACGGCAGCACAGGAGAGCTTGCTCTCTGGGTGGCGAG TGGCGGACGGGTNNAGGAATACATCGGAATCTACCTTGTCGTGGGGGATAACGT AGGGAAACTAACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGACCTT CGGGCCTTGCGCGATTAGATGAGCCGATGTCCGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAA GGCCCACCAAGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTG GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGAC AATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGT TGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAAAGCAATCGGTTAATACCCGGTTGTTCTG ACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGT

GATTTAAGTCCGTTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAATTGCAGTGGATACT GGGTCACTAGAATGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATG CGTAGAGATCAGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGACCAACATTG ACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC ACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAACTTGGCACGCAGTATCGAA GCTAACGCGTTAGTTCGCCGCCTGGGGNTTACGGTCGCAGACTGAACTCAAGGAA TTGACGGGGCC Phụ lục 10 Ghi nhận tổng quan 5 vụ rau thí nghiệm trong nhà lưới

Các thí nghiệm trong nhà lưới trên cây rau muống và cây cải xanh đều ghi nhận sự khác biệt trong quá trình nảy mầm giữa các nghiệm thức có chủng vi khuẩn, IMO so với đối chứng không chủng. Trong đó các nghiệm thức chủng vi khuẩn giúp hạt nảy mầm sớm hơn, đồng đều hơn so với đối chứng

Hình C Sự khác biệt giữa nghiệm thức chủng vi khuẩn và đối chứng không chủng

Đối vối cây rau muống trong 3 vụ thí nghiệm cho thấy cây rau muống sinh trưởng và phát triển tốt, ít bị sâu bệnh gây hại. Chỉ xuất hiện sâu ăn tạp/sâu keo (Spodoptera litura) ăn lá rau từ 7 đến 15 ngày sau khi gieo và được bắt để loại trừ nên không ảnh hưởng đến năng suất, trong vụ 3 rau muống có xuất hiện bệnh gỉ sắt trên lá nhưng không đáng kể và không xử lí thuốc hoá học.

Hình D Sâu ăn tạp Spodoptera litura ăn lá rau được loại trừ

Đối với cây cải xanh, trong vụ cải 1 ghi nhận có xuất hiện xâu xanh hại cải và chúng đã được loại bỏ bằng phương pháp bắt sâu, ngoài ra trên cây cải vụ này cũng có xuất hiện rầy mềm (Aphis gossypii) hại cải thời điểm 18 ngày sau khi gieo có làm ảnh hưởng đến hình dạng lá rau, tuyên nhiên do cây cải đã lớn nên ít ảnh hưởng đến năng suất. Tương tự vụ trong vụ cải xanh thứ 2 cũng có xuất hiện rầy mềm hại cải ở thời điểm 7 ngày sau khi gieo và thời điểm 15 ngày sau khi gieo còn xuất hiện bọ nhảy (Phyllotrera spp.) ăn lá cải. Rầy mềm hại cải được xử lí bằng dầu khoáng SK Enspray 99EC của công ty Cổ Phần Bảo Vệ Thực Vật Sài Gòn. Thuốc sâu sinh học Chim Ưng 5.0WG của công ty TNHH thương mại và dịch vụ An Đô cũng đã được sử dụng trong quá trình phòng trừ sâu, bọ hại cải. Vụ cải thứ 2 sâu và rầy hại cải đã được phòng trừ sớm nên không ảnh hưởng đến sinh trưởng và năng suất cải.

Hình E Rầy mềm (Aphis gossypii) hại cải ở thời điểm 20 ngày và 7 ngày sau khi gieo

Hình F Vụ cải xanh 2 ở điều kiện nhà lưới

Phụ lục 11 Tổng hợp năng suất rau muống và cải xanh trong nhà lưới

STT

Nghiệm thức

Trọng lƣợng tƣơi rau muống (g.chậu-1) Vụ 2

Vụ 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

9,33g 28,3abc 24,3abcde 31,1a 27,6abc 28,9ab 29,5ab 16,0fg 29,2ab 20,7cdef 23,4abcdef 23,2abcdef 23,5abcdef 22,6bcdef 24,4abcde 23,5abcdef 22,6bcdef 22,2bcdef 26,9abcd 18,7ef 29,6ab 19,2def 24,6abcde 22,3bcdef *

Vụ 3 13,7l 14,3h 42,7b 52,9a 34,6e 44,6ab 46,2a 52,1a 34,0ef 40,1abc 38,2c 36,6bcde 31,9g 41,5bc 31,7defg 37,7cd 37,1bcde 28,2hij 37,6cd 36,0bcdef 27,3j 37,7bcde 36,3d 38,7bcde 32,5fg 36,5bcde 29,4h 33,7cdefg 37,2cd 39,2bcd 23,6k 29,5efg 24,7k 25,9g 24,7k 31,6defg 24,9k 26,6fg 24,3k 28,2efg 27,2j 28,7efg 29,1i 33,8cdefg 23,5k 36,2bcdef 27,8ij 36,3bcde * *

Trọng lƣợng tƣơi cải xanh (g.chậu-1) vụ 1 TB 25,3o 12,4b 119c 41,3a 127b 34,5ab 144a 43,1a 114cd 33,9ab 106ef 34,6ab 98,9ghi 34,3ab 102fg 28,5ab 102fgh 31,5ab 103fg 31,4ab 105ef 29,5ab 106ef 32,7ab 125b 30,8ab 91,0jk 28,6ab 108e 33,6ab 25,5ab 86,2klm 85,3lm 24,4ab 82,0m 26,2ab 88,9kl 26,1ab 90,4jk 23,7ab 87,8kl 28,5ab 27,4ab 86,1klm 28,1ab 88,32kl 93,9ij 28,8ab * *

vụ 2 TB 24,3r 24,8 129i 124 148b 138 161a 153 140d 127 132h 119 130i 114 126j 114 129i 116 147c 120 137e 121 136f 121 134g 130 127j 109 133gh 121 100l 93,1 93,5n 89,5 96,5m 89,3 88,3p 88,6 87,5p 89,0 90,4o 89,1 97,5m 91,8 93,7n 91,0 97,7m 95,8 *

25,0

CV (%)

25,6

23,4

28,0

21,9

22,1 *Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey. Phụ lục 12 Kết quả đánh giá vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa trong rau qua 5 vụ rau trong nhà lưới

Cải Xanh STT Vi sinh vật

1 Coliform E. coli 2 Salmonella 3 Shigella 4 Rau Muống Vụ 2 - - - - Vụ 1 - - - - Vụ 3 - - - - Vụ 1 - - - - Vụ 2 - - - -

*Lưu ý: "-" : không phát hiện trong các mẫu rau Phụ lục 13 Ghi nhận tổng quan 4 vụ rau thí nghiệm ngoài đồng

Ghi nhận sơ bộ tình hình thời tiết các vụ rau thí nghiệm ngoài đồng cho thấy trong vụ rau muống và cải xanh thứ nhất (gieo hạt ngày 27.4.2020 đến 27.5.2020) là thời điểm nắng hạn, nóng kéo dài, nước mặn xâm nhập và có xuất hiện 1 cơn mưa vào ngày 25.5.2020. Điều kiện nắng nóng trong thời gian thí nghiệm vụ rau thứ nhất đã ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và năng suất của cây rau mà nhất là cây cải xanh. Tuy nhiên trong vụ rau thứ 2 gieo hạt từ ngày 23.6.2020 đến 25.7.2020 là thời điểm mưa nhiều nhất là giai đoạn 15 đến 25 tháng 7 năm 2020 mưa lớn liên tục. Thời tiết như thuận lợi cho sự phát triển của cây rau muống, đối với cây cải xanh giai đoạn đầu cây rau sinh trưởng rất thuận, tuy nhiên giai đoạn 25-33 ngày

không thuận lợi vì xuất hiện hiện tượng nấm bệnh gây úng lá rau, và hiện tượng này diễn ra nhanh và mạnh ở các lô nghiệm thức chỉ bón phân đạm hóa học nhất là nghiệm thức bón đủ 100%N.

Đối với thí nghiệm cây rau muống trong 2 vụ được ghi nhận cụ thể như sau: trong vụ rau muống 1 do thời điểm gieo hạt 27.4.2020 nắng nóng, dù lượng hạt gieo theo khuyến cáo của nhà sản xuất tuy nhiên tỷ lệ hạt nảy mầm có giảm không đáng kể đặc biệt là các nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn. Ngoài ra có xuất hiện côn trùng (dế) ăn cây mầm giai đoạn 3-7 ngày sau khi gieo và đã được xử lí bằng thuốc diệt côn trùng. Ghi nhận cũng cho thấy ở các lô thí nghiệm chỉ bón phân hóa học cây rau có dấu hiệu còi cọc do thiếu đạm do lượng đạm bón cho rau có thể bị mất do nắng gắt và nắng nóng. Cây rau lúc thu hoạch quan sát cảm quan cho thấy chúng sơ cứng, ít mượt mà hơn các nghiệm thức có chủng các dòng vi khuẩn hoặc IMO hoặc chế phẩm vi sinh thương mại.

Hình G Thu sinh khối tươi vụ rau muống 1 ở ngoài đồng

Đối với cây cải xanh vụ 1 do thời tiết nóng hạn kéo dài không thuận lợi cho cây cải phát triển đặc biệt là giai đoạn cây trải lá kéo dài kích thước lá nhỏ, cây cải thấp, tuy nhiên thời điểm 25 ngày sau khi gieo có xuất hiện mưa nên cây cải phát triển nhanh sau đó. Trong vụ cải 2 điều kiện mưa liên tục nên khu vực bố trí trồng cải xanh xuất hiện ruồi đục lá (Liriomyza sp.), và đã được phòng trị bằng thuốc NeemNim xoan xanh green 0,3 EC của công ty GreeNeem Agri Ấn Độ. Ngoài ra thí nghiệm cũng ghi nhận xuất hiện bệnh úng và chết cây ở cải xanh đặc biệt là các nghiệm thức chỉ bón phân hoá học và đã làm giảm năng suất của các nghiệm thức này.

Hình H Khu thí nghiệm cải xanh vụ 2 trồng ở điều kiện ngoài đồng

Phụ lục 14 Tổng hợp năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện ngoài đồng

Năng suất rau (kg/m2)

Nghiệm thức

Trung bình 2,06 1,65 2,08 2,36 2,24 2,43 2,16

1,81

Đối chứng 70N-48P2O5-24K2O Đối chứng 52,5N-48P2O5-24K2O 52,5N-48P2O5-24K2O + CP VSTM 52,N-48P2O5-24K2O + TP-1.3 52,5N-48P2O5-24K2O + TP-1.4 52,5N-48P2O5-24K2O + MQ-2.5 52,5N-48P2O5-24K2O + Hỗn hợp 3 VK 52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Mồng Tơi 52,5N-48P2O5-24K2O + IMO Tre

CX Trung Vụ 1 bình 4,37 2,14bc 1,60f 3,28 2,02e 4,36 2,37a 4,46 5,22 2,16cd 5,43 2,35ab 4,79 2,30ab 1,64f 4,88 4,78 2,05de * 13,4

RM Vụ 2 5,21cd 3,39g 4,87ef 4,84f 5,87a 5,71ab 5,06de 5,59b 5,31c * 13,9

CX Vụ 2 1,97c 1,70d 2,13bc 2,35ab 2,32ab 2,50a 2,01c 1,97c 2,13bc * 11,3

F CV (%)

RM Vụ 1 3,52e 3,16f 3,84de 4,08cd 4,57b 5,15a 4,52b 4,17c 4,25bc 2,09 * 13,9 *Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey.

Phụ lục 15 Tổng hợp hàm lượng nitrate trong 4 vụ rau thí nghiệm ở ngoài đồng

Nghiệm thức

STT

Thời gian cách li so với thời điểm bón phân lần cuối

1 2 3 4 5 6 7 8 9 2.368a 1.874b 1.438c 1.671c 1.336f 1.585cde 1.640cd 1.473def 1.324f * 22,6 6 Ngày 2.186a 348f 1.348c 1.535b 1.250c 1.644b 757e 1.636b 987d * 3,25 F CV (%)

Hàm lượng nitrate (mg.kg1) RM Vụ 1 RM Vụ 2 CX Vụ 1 CX Vụ 2 10 Ngày 13 Ngày 10 Ngày 885a 1.232a 15f 1.097a 250d 384bc 506b 363bc 136e 245c 357c 440b 136e 481b 169de 348bc 591b 406bc * * 7,55 61,9 *Lưu ý: trong cùng một cột các số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo phương pháp kiểm định Tukey. Phụ lục 16 Kết quả đánh giá vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa trong rau qua 4 vụ thí nghiệm ngoài đồng

Rau Muống Cải Xanh STT Vi sinh vật Vụ 1 Vụ 2 Vụ 1 Vụ 2

1 Coliform - - - -

2 E. coli - - - -

3 Salmonella - - - -

- - - 4 Shigella

- *Lưu ý: "-" : không phát hiện trong các mẫu rau