Luận án Tiến sĩ Vi sinh vật học: Phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HOÀNG MINH TÂM

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH VÀ VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY MÍA (Saccharum spp L.) TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM TỈNH TÂY NINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC

Mã số: 62 42 01 07

Cần Thơ, 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HOÀNG MINH TÂM PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH VÀ VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY MÍA (Saccharum spp L.) TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM TỈNH TÂY NINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 42 01 07 Người hướng dẫn khoa học GS. TS. CAO NGỌC ĐIỆP PGS. TS. NGUYỄN BẢO TOÀN Cần Thơ, 2021

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên xin được gửi lời cám ơn đến Thầy, GS. TS. Cao Ngọc Điệp và Thầy, PGS. TS Nguyễn Bảo Toàn, đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện luận án tiến sĩ.

Chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học đã truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức bổ ích, kinh nghiệm quý báu, phục vụ quá trình nghiên cứu thực hiện luận án.

Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Khoa Sau Đại học và các Phòng Ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.

Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Lãnh đạo các đơn vị của Trường Đại học Sài Gòn đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt thời gian làm nghiên cứu sinh.

Chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ và Trường Đại học Sài Gòn đã quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian làm nghiên cứu sinh.

Chân thành cảm ơn các em sinh viên, học viên cao học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ và các em sinh viên Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Sài Gòn đã cộng tác cùng tôi trong thời gian thực hiện thí nghiệm.

Chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, Tây Ninh đã hỗ trợ và giúp tôi triển khai thực hiện các thí nghiệm trong chậu và ngoài đồng.

Đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc đến em Nguyễn Thị Xuân Mỵ, Nguyễn Tây Khoa, Lê Đức Toàn người đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình triển khai và thực hiện nghiên cứu.

Sau cùng xin được gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, những người thân trong gia đình, vợ và các con đã ủng hộ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm nghiên cứu sinh.

Hoàng Minh Tâm

i

TÓM TẮT

Luận án nhằm phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và sản xuất siderophore. Các đặc tính này giúp thúc đẩy sự tăng trưởng và năng suất của mía, đồng thời giảm thiểu lượng phân đạm, lân hóa học cũng như sự ảnh hưởng tiêu cực lên môi trường và sức khỏe con người. Vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía có khả năng cố định đạm và hòa tan lân đã được phân lập trên môi trường Burk, LGI không đạm và môi trường NBRIP chứa phosphate khó tan. Đánh giá khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA, siderophore của các dòng vi khuẩn đã được thực hiện thông qua phương pháp so màu. Định danh các dòng vi khuẩn đã chọn dựa trên trình tự gene 16S rRNA bằng phương pháp sinh học phân tử và công cụ tin sinh học. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật đã được đánh giá trên cây mía trồng trong điều kiện nhà lưới, trong chậu và ngoài đồng. Kết quả là đã phân lập được 422 dòng vi khuẩn, trong đó có 246 dòng vi khuẩn vùng rễ và 176 dòng vi khuẩn nội sinh có cả hai khả năng cố định đạm và hòa tan lân, 101 dòng có khả năng tổng hợp IAA, và 81 dòng có khả năng sinh siderophore. Ba mươi sáu dòng tuyển chọn đã được định danh dựa trên trình tự gene 16S rRNA với mức tương đồng trình tự từ 95 – 100% so với các chủng vi khuẩn có trong cơ sở dữ liệu của Genbank, NCBI. Các dòng vi khuẩn này thuộc về các chi Enterobacter, Burkholderia, Bacillus, Stenotrophomonas, Kosakonia, Serratia, Advenella, Paraburkholderia, Chitinophaga, Herbaspirillum, và Acinetobacter. Mười hai trong số 36 dòng đã định danh được tiếp tục chọn lựa để đánh giá khả năng thúc đẩy sự phát triển của cây mía nuôi cấy mô trồng trong bình Leonard. Hai dòng tốt nhất là vi khuẩn nội sinh cây mía CT4bd (Serratia oryzae) và vi khuẩn vùng rễ cây mía TPD3b (Bacillus subtilis) đã được tiếp tục đánh giá sự thúc đẩy tăng trưởng của cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng. Sự kết hợp của 2 dòng CT4bd và TP3b cho thấy khả năng thúc đẩy sinh trưởng của cây mía cao nhất. Đối với mía trồng trong chậu và ngoài đồng, khi sử dụng phối hợp 2 dòng vi khuẩn với 75% lượng phân N và P đã cho kết quả về năng suất mía ngang bằng với nghiệm thức sử dụng 100% phân N và P hóa học. Ngoài ra, năng suất đường cũng tăng 14%, tương đương 1,02 tấn/ha trong điều kiện trồng ngoài đồng. Hai dòng vi khuẩn tiềm năng CT4bd và TP3b đã được đề xuất tiếp tục khảo nghiệm khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật trên nhiều giống mía khác nhau ở cả vụ mía tơ và mía gốc ở các vùng mía nguyên liệu khác nhau của tỉnh Tây Ninh.

Từ khóa: cố định đạm, đất xám, hòa tan phosphate, mía, thúc đẩy tăng

trưởng thực vật, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn vùng rễ.

ii

ABSTRACT

The thesis aims to isolate, characterize and identify endophytic bacteria and rhizospheric bacteria from sugarcane (Saccharum spp L.) grown on acrisols in Tay Ninh province with capacities of nitrogen fixation, phosphate solubilization, IAA synthesis and siderophore production. These characteristics help promote the growth and yield of sugarcane, while minimizing the amount of chemical nitrogenous and phosphorus fertilizer as well as negative impacts on the environment and human health. Endophytic and rhizospheric bacteria of sugarcane capable of nitrogen fixation and phosphate solubilization were isolated on N-free Burks’ and LGI media and NBRIP media containing insoluble phosphate. Evaluation of nitrogen fixation, phosphorus solubility, IAA and siderophore synthesis of bacterial strains was done through colorimetric method. Identification of selected bacterial strains based on 16S rRNA gene sequence by molecular biology method and bioinformatics tool. The ability to promote plant growth was assessed in sugarcane grown in net houses, pots and field. As a result, 422 bacterial strains were isolated, including 246 rhizospheric isolates and 176 endophytic isolates capable of nitrogen fixation and phosphorus solubilization, 101 isolates are capable of synthesizing IAA, and 81 isolates are capable of producing siderophore. Thirty-six selected strains were identified based on the 16S rRNA gene with sequence similarity from 95 to 100% compared with strains found in Genbank database, NCBI. These strains belong to the genera Enterobacter, Burkholderia, Bacillus, Stenotrophomonas, Kosakonia, Serratia, Advenella, Paraburkholderia, Chitinophaga, Herbaspirillum, and Acinetobacter. Twelve of the 36 identified isolates were selected to evaluate their ability to promote the growth of sugarcane grown in Leonard jars. The two best bacterial strains, the endophytic bacteria CT4bd (Serratia oryzae) and the rhizospheric bacteria TPD3b (Bacillus subtilis), were further evaluated for their ability to promote the growth of potted and field sugarcane plants. The combination of these two isolates showed the highest ability to promote the growth of sugarcane. In terms of sugarcane grown in pots and in the field, when using a combination of the two bacterial isolates and 75% of N and P fertilizer amount, the result was equal to the sugarcane yield of the treatment of 100% chemical N and P fertilizer. In addition, sugar yield also increased by about 14%, equivalent to about 1.02 tons/ha in field trial. These two potential isolates CT4bd and TPD3b have been proposed to continue testing their ability to promote plant growth on many different sugarcane varieties in both plant-cane and ratoon crops in different raw material sugarcane areas of Tay Ninh province.

Key words: acrisols, endophytic bacteria, phosphate solubilization, nitrogen

fixation, plant growth promotion, sugarcane, rhizospheric bacteria.

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................. i

TÓM TẮT...................................................................................... ii

MỤC LỤC ...................................................................................... v

DANH MỤC BẢNG ....................................................................... ix

DANH MỤC HÌNH........................................................................ xii

Chương 1: GIỚI THIỆU ................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề ................................................................................ 1

1.2. Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu ................................................. 2

1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................... 2

1.2.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 3

1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................. 3

1.4. Ý nghĩa nghiên cứu ................................................................... 4

1.5. Thời gian thực hiện và địa điểm nghiên cứu ................................ 4

1.6. Các điểm mới của nghiên cứu..................................................... 5

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................. 6

2.1. Hiện trạng sản xuất mía đường của tỉnh Tây Ninh ........................ 6

2.1.1. Đặc điểm khí hậu, đất đai của tỉnh Tây Ninh ...................................... 6

2.1.2. Đặc điểm vùng mía đường Tây Ninh ................................................ 10

2.2. Các vấn đề về môi trường và sức khoẻ phát sinh từ việc trồng mía13

2.2.1. Đối với thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ .............................................. 13

2.2.2. Đối với phân bón hoá học ................................................................ 15

2.3. Đa dạng các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía ....................................................................... 17

2.3.1. Các khái niệm vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn liên kết thực vật và vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật .................................... 17

2.3.2. Các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía ..................................................................................................... 19

2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất

v

xám ........................................................................................................... 25

2.4.1. Tình hình nghiên cứu về các đặc tính của vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất xám ............................................................................................... 25

2.4.2. Tình hình nghiên cứu về hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn liên kết trên cây mía ...................................................................... 29

2.5. Các phương pháp thường được sử dụng trong nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá và nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía .................... 36

2.5.1. Xử lý mẫu để phân lập vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật ......... 36

2.5.2. Xác định khả năng cố định đạm của vi khuẩn ................................... 40

2.5.3. Xác định khả năng hoà tan lân của vi khuẩn ..................................... 43

2.5.4. Xác định khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn ......................... 46

2.5.5. Xác định khả năng sản xuất siderophore của vi khuẩn ...................... 48

2.5.6. Định danh vi khuẩn liên kết cây mía dựa trên trình tự gene 16S rRNA ....... 49

2.6. Nuôi cấy mô thực vật và một số kết quả trong vi nhân giống mía 51

2.6.1. Một số nguyên lý và vai trò của nuôi cấy mô thực vật ...................... 51

2.6.2. Quy trình và một số kết quả trong vi nhân giống mía ....................... 52

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 55

3.1. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm ................................................. 55

3.1.1. Mẫu đất và cây mía trong thí nghiệm phân lập và khảo sát đặc tính vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật .......................................................... 55

3.1.2. Các giống mía dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vivo của vi khuẩn ..................................................................... 55

3.1.3 Đất trồng mía dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở quy mô trong chậu và ngoài đồng .............................................. 56

3.1.4. Phân bón hoá học dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở quy mô trong chậu và ngoài đồng .................................. 56

3.1.5. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ......................................................... 56

3.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................... 57

3.2.1 Thu thập và xử lý mẫu đất và cây mía ............................................... 57

3.2.2. Phân tích một số chỉ tiêu dinh dưỡng của đất ................................... 58

3.2.3. Xác định mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân trong đất vùng rễ

vi

cây mía và sự tương quan với các chỉ tiêu dinh dưỡng đất ......................... 58

3.2.4. Phân lập và bảo quản các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân từ đất vùng rễ cây mía ............................................................. 60

3.2.5. Phân lập và bảo quản các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân nội sinh trong cây mía ............................................................. 61

3.2.6. Mô tả hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn thu được .................................................................................................... 63

3.2.7. Định lượng khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sản xuất IAA in vitro của các dòng vi khuẩn thu được ................................................................. 64

3.2.8. Định tính khả năng sản xuất siderophore của một số dòng vi khuẩn . 67

3.2.9. Định danh một số dòng vi khuẩn có đặc tính tốt bằng phương pháp sinh học phân tử ........................................................................................ 68

3.2.10. Đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía con trồng trong điều kiện nhà lưới......................... 72

3.2.11. Đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng . 74

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................... 79

4.1. Đặc tính dinh dưỡng của đất trồng mía tại tỉnh Tây Ninh và sự tương quan với mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân trong đất .... 79

4.2. Nguồn gốc và đặc tính phân lập của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng tại tỉnh Tây Ninh ........................ 84

4.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng tại tỉnh Tây Ninh ............ 86

4.4. Kết quả định lượng khả năng cố định đạm, hoà tan lân và sản xuất IAA in vitro của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh .................................................................... 88

4.5. Kết quả định tính khả năng sinh siderophore của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh ...................... 93

4.6. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây mía đã tuyển chọn ......................................................................... 95

4.6.1. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn đất vùng rễ .................... 97

4.6.2. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn nội sinh....................... 102

4.6.3. Nhận xét chung về kết quả định danh các dòng vi khuẩn liên kết

vii

cây mía và sự chọn lọc dòng cho các thí nghiệm in vivo .................. 107

4.7. Kết quả đánh giá hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới ............................................................... 109

4.7.1. Kết quả nuôi cấy mô cây mía ......................................................... 109

4.7.2. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới ...................... 114

4.8. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu ................ 120

4.9. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tuyển chọn trên cây mía trồng ngoài đồng ................ 125

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................... 132

5.1. Kết luận ............................................................................... 132

5.2. Đề xuất ................................................................................ 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................. 133

PHỤ LỤC .................................................................................. - 1 -

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Sản lượng mía của tỉnh Tây Ninh qua các năm (2015 – 2018), phân theo đơn vị hành chính ................................................................................................ 7

Bảng 2.2: Phân loại và quy mô của các loại đất xám ở Tây Ninh ................................ 8

Bảng 2.3: Diện tích trồng mía của tỉnh Tây Ninh qua các năm (2015 – 2018), phân theo đơn vị hành chính ...................................................................................... 10

Bảng 2.4: Sản lượng mía của tỉnh Tây Ninh qua các năm (2015 – 2018), phân theo đơn vị hành chính .............................................................................................. 11

Bảng 2.5: Liều lượng phân N, P, K cho từng loại đất, mức độ thâm canh ở mỗi vụ mía tơ ................................................................................................................... 12

Bảng 3.1: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường Burk.............................. 59

Bảng 3.2: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường NBRIP .......................... 59

Bảng 3.3: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường TYGA .......................... 62

Bảng 3.4: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường LGI .............................. 62

Bảng 3.5: Thành phần các chất tham gia phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn đất vùng rễ cây mía ..................................................... 69

Bảng 3.6: Thành phần các chất tham gia phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn nội sinh cây mía .......................................................... 70

Bảng 4.1: Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng trong đất trồng mía của tỉnh Tây Ninh tại 41 điểm thu mẫu ............................................................................ 79

Bảng 4.2: Kết quả xác định mật số vi khuẩn cố định đạm/ hòa tan lân trong đất trồng mía của tỉnh Tây Ninh tại 41 điểm thu mẫu ...................................................... 81

Bảng 4.3: Tương quan tuyến tính giữa mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân với pH, N tổng số, P dễ tiêu và hàm lượng chất hữu cơ trong đất vùng rễ cây mía trồng ở Tây Ninh ......................................................................................... 83

Bảng 4.4: Nguồn gốc của 422 dòng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ và nội sinh cây mía ...................................................................................................................... 84

Bảng 4.5: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 422 dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh ......................................................................................... 86

+, P2O5 và IAA của 30 dòng vi khuẩn đất

Bảng 4.6: Kết quả định lượng NH4 vùng rễ tuyển chọn .................................................................................................... 89

ix

+, P2O5 và IAA của 36 dòng vi khuẩn nội

Bảng 4.7: Kết quả định lượng NH4 sinh tuyển chọn ......................................................................................................... 90

Bảng 4.8: Thông tin về trình tự gene 16S rRNA và các chủng tương đồng với 17 dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây mía tuyển chọn ..................................................... 97

Bảng 4.9: Thông tin về trình tự gene 16S rRNA và các chủng tương đồng với 19 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía tuyển chọn ........................................................ 102

Bảng 4.10 A: Tóm tắt đặc tính của 12 dòng vi khuẩn được tuyển chọn cho các thí nghiệm in vivo ................................................................................................... 108

Bảng 4.10 B: Tóm tắt đặc tính 12 dòng vi khuẩn được tuyển chọn cho các thí nghiệm in vivo (tiếp theo) ....................................................................................... 109

Bảng 4.11: Ảnh hưởng BA lên sự tạo chồi của mẫu cấy đỉnh sinh trưởng của giống mía VN85 – 1859 .......................................................................................... 110

Bảng 4.12: Ảnh hưởng của Kin và BA lên sự nhân nhanh chồi ở giống mía VN85 – 185 ............................................................................................................. 112

Bảng 4.13: Ảnh hưởng NAA lên sự tạo rễ và cây con hoàn chỉnh ở giống mía VN85 – 185 ............................................................................................................. 114

Bảng 4.14: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên số rễ, số lá và chiều cao cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới ........................................................................................................... 115

Bảng 4.15: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khối lượng tươi của rễ, thân, lá và toàn cây ở cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới. ........................................................................... 117

Bảng 4.16: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khối lượng khô của rễ, thân, lá và toàn cây ở cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới............................................................................ 118

Bảng 4.17: Tóm tắt hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn TPD3b và CT4bd trên các chỉ tiêu tăng trưởng của cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới........... 118

Bảng 4.18 A: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 6 tháng trồng trong chậu ..................................................................... 120

Bảng 4.18 B: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 6 tháng trồng trong chậu (tiếp theo) .................................................... 121

x

Bảng 4.19: Tổng hợp một số kết quả của 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 6 tháng trồng trong chậu .................................................... 124

Bảng 4.20 A: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 12 tháng trồng ngoài đồng .................................................................. 125

Bảng 4.20 B: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 12 tháng trồng ngoài đồng (tiếp theo) ................................................. 126

Bảng 4.21: Tổng hợp một số kết quả của 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 12 tháng trồng ngoài đồng .................................................. 129

Bảng 4.22: Kết quả phân tích một số chỉ tiêu dinh dưỡng đất sau khi thu hoạch ....................................................................................................................... 130

xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Các kiểu liên kết giữa vi khuẩn đất có lợi và rễ cây ................................... 17

Hình 2.2: Sơ đồ về các cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn ............... 19

Hình 2.3: Ảnh SEM của chủng B. amyloliquefaciens TF28 có khả năng kháng nấm ........................................................................................................................... 21

Hình 2.4: Ảnh TEM của chủng B. tropica sp. nov. BM27 ........................................ 22

Hình 2.5: Ảnh SEM của Serratia marcescens B4...................................................... 23

Hình 2.6: Hiệu quả của các vi khuẩn hoà tan lân trên cây mía trồng trong điều kiện nhà kính ............................................................................................................. 30

Hình 2.7: Cây mía được chủng P. agglomerans 33.1 so với đối chứng không được chủng sau 30 ngày trồng ................................................................................... 31

Hình 2.8: Tác động của các vi khuẩn vùng rễ cây mía trên sự tăng trưởng của cây bắp ...................................................................................................................... 34

Hình 2.9: Tác động của các vi khuẩn vùng rễ cây mía trên sự nảy mầm của cây đậu Guar, đậu xanh và đậu đũa ........................................................................... 35

Hình 2.10: Hệ vi sinh vật liên kết rễ và phương pháp lấy mẫu tương ứng ................. 37

Hình 2.11: Sơ đồ quy trình nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm liên kết thực vật ở cây không họ Đậu................................................................................................... 38

Hình 2.12: Ảnh hiển vi laser quét kết quả lai tại chỗ phát huỳnh quang của một số vi khuẩn liên kết cây mía ............................................................................... 40

Hình 2.13: Màng mỏng (pellicle) do vi khuẩn cố định đạm tạo thành trong môi trường JNFb không N bán đặc sau 7 ngày nuôi cấy ............................................ 41

Hình 2.14: Sự chuyển màu môi trường trong nuôi cấy trên môi trường đặc và bán đặc với chất chỉ thị BTB ..................................................................................... 42

Hình 2.15: Sự chuyển màu môi trường khi có chất chỉ thị pH và vòng halo chứng minh khả năng hòa tan phosphate của vi khuẩn ............................................... 45

Hình 2.16: Thí nghiệm định tính và định lượng khả năng sản xuất IAA với thuốc thử Salkowski .................................................................................................. 48

Hình 2.17: Màu sắc chỉ thị của siderophore trong phản ứng với CAS lỏng và CAS đặc .................................................................................................................... 49

xii

Hình 2.18: Các giai đoạn cơ bản của một quy trình nhân nhanh giống mía ............... 53

Hình 3.1: Phương pháp đếm sống nhỏ giọt và minh họa kết quả thu được sau khi ủ .......................................................................................................................... 60

Hình 3.2: Phản ứng màu của ammonia, phosphate và IAA với thuốc thử, tương ứng với nống độ các ống chuẩn là 0-1-2-3-4-5 µg/L ........................................ 66

Hình 3.3: Minh họa khảo nghiệm siderophore trên thạch đĩa CAS thông qua phương pháp khuếch tán thạch với đĩa giấy và các kết quả có khả năng thu được .......................................................................................................................... 68

Hình 3.4: Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn đất vùng rễ cây mía ............................................................. 70

Hình 3.5: Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn nội sinh cây mía .................................................................. 71

Hình 3.6: Cụm chồi đã cảm ứng tạo rễ và cây con hoàn chỉnh đã được tách rời ........ 73

Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng mía trong chậu theo kiểu lô phụ .................. 76

Hình 3.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng mía ngoài đồng theo kiểu lô phụ.................. 78

Hình 4.1: Xác định mật số vi khuẩn trên môi trường Burk, môi trường NBRIP, và sự tạo vòng hòa tan lân trên môi trường NBRIP ...................................... 81

Hình 4.2: Một số đặc tính phân lập vi khuẩn của vi khuẩn vùng rễ và nội sinh cây mía ..................................................................................................................... 85

Hình 4.3: Hình thái khuẩn lạc và đường kính khuẩn lạc qua kính hiển vi soi nổi của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía .......................................................... 87

+, P2O5 và IAA của 8 dòng vi khuẩn tốt

Hình 4.4: Kết quả định lượng NH4 nhất ........................................................................................................................... 91

Hình 4.5: Kết quả định tính và định lượng khả năng sản xuất IAA sau 2 ngày nuôi cấy của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh .............. 92

Hình 4.6: Khả năng sản xuất siderophore của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh thông qua khảo nghiệm CAS lỏng ............................. 93

Hình 4.7: Khả năng tạo vòng halo của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh trong khảo nghiệm CAS đặc ................................................... 94

Hình 4.8: Băng 1.500 bp của các sản phẩm khuếch đại trình tự 16S rDNA với cặp mồi 8F và 1492R dành cho vi khuẩn đất vùng rễ ................................................. 95

xiii

Hình 4.9: Băng 900 bp của các sản phẩm khuếch đại trình tự 16S rDNA với cặp mồi p515FPL và p13B dành cho vi khuẩn nội sinh ............................................. 95

Hình 4.10: Kết quả nhuộm Gram và ảnh chụp SEM của một số dòng vi khuẩn. ....................................................................................................................... 96

Hình 4.11: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ tiến hoá giữa 17 dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây mía và 17 chủng tương đồng có trong cơ sở dữ liệu GenBank, NCBI .......... 101

Hình 4.12: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ tiến hoá giữa 19 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía và 17 chủng tương đồng có trong cơ sở dữ liệu GenBank, NCBI. ............... 105

Hình 4.13: Tỷ lệ các chi tương đồng của 17 dòng vi khuẩn vùng rễ và 19 dòng vi khuẩn nội sinh đã định danh. ............................................................................... 107

Hình 4.14: Sự tạo chồi ở mẫu cấy đỉnh sinh trưởng của mía VN85 – 1859 dưới ảnh hưởng của BA........................................................................................... 110

Hình 4.15: Kết quả nhân nhanh chồi ở mía VN85 – 1859 dưới ảnh hưởng của BA và Kin ............................................................................................................... 111

Hình 4.16: Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ ở giống mía VN85 – 185 ............ 113

Hình 4.17: Các cây mía in vitro trên môi trường nuôi cấy có bổ sung than hoạt tính .......................................................................................................................... 115

Hình 4.18: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên số rễ, số lá và chiều cao cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới ........................................................................................................... 116

Hình 4.19: Cây mía giống K95-156 trồng trong chậu dưới ảnh hưởng của tổ hợp vi khuẩn CT4bd và TPD3b và các mức bón phân N, P ..................................... 123

Hình 4.20: Cây mía giống K95-156 sau 3 tháng trồng ngoài đồng dưới ảnh hưởng của vi khuẩn TPD3b và mức bón 50% phân N, P so với đối chứng không chủng vi khuẩn ............................................................................................. 126

xiv

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1. Đặt vấn đề

Mía là một cây công nghiệp có giá trị kinh tế quan trọng được trồng tại hơn 110 nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Ngày nay, ngoài sản xuất đường, nhiều sản phẩm có giá trị khác đã được tạo ra từ cây mía như ethanol, nhựa, xơ sợi; đặc biệt là nhiên liệu sinh học (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020). Chính vì thế, việc duy trì và gia tăng năng suất mía đã trở thành trọng tâm nghiên cứu của nhiều quốc gia (Mehnaz, 2011). Nhìn chung tổng diện tích trồng mía trên thế giới tăng dần qua các năm, từ 44.000 nghìn ha ở năm 1961 lên đến 269.434 ha ở năm 2018. Ở một số năm như 1999, 2002, 2003, diện tích trồng mía tăng hơn 300 nghìn ha. Tuy nhiên, trong những năm gần đây diện tích trồng mía đường có phần giảm nhẹ (FAOSTAT, 2020).

Trong công nghiệp sản xuất đường, đường mía hiện chiếm trên 60% tổng sản lượng đường thô của toàn thế giới. Ở Việt Nam, nghề trồng mía để sản xuất đường bắt đầu từ những năm 1990. Do thích nghi với điều kiện tự nhiên, cây mía có thể được trồng ở nhiều vùng, miền khắp nước ta (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020). Năng suất mía bình quân của cả nước vào năm 2018 là khoảng 66,6 tấn/ha và sản lượng là 17.945.204 tấn (FAOSTAT, 2020). Năm 2018, theo thống kê sơ bộ từ các Cục thống kê, tổng diện tích trồng mía ở Đông Nam Bộ là khoảng 24.494 ha. Trong đó, Tây Ninh là tỉnh có diện tích trồng mía lớn nhất, gồm 14.669 ha (Cục thống kê tỉnh Tây Ninh, 2019; Tổng cục thống kê, 2018). Chính vì vậy, Tây Ninh có cơ sở để trở thành một vùng mía đường quan trọng của cả nước và của khu vực.

Hiện nay, phương thức tổ chức sản xuất và cải tiến kỹ thuật mà các nước, trong đó có Việt Nam, đã áp dụng thành công để tăng năng suất mía là: sản xuất tập trung chuyên canh, cải thiện giống mía, hóa học hóa, thủy lợi hóa và cơ giới hóa, trong đó đặc biệt coi trọng công tác nghiên cứu khoa học. Tuy vậy, theo Thaweenut và cộng sự (2011), ở các nước đang phát triển vẫn có tập quán bón nhiều phân hóa học cho cây mía ở giai đoạn sớm nhằm tăng cường sản lượng và chữ đường. Ở Việt Nam, nghiên cứu cho thấy năng suất mía tơ tăng lên tỷ lệ thuận với lượng phân bón. Lượng phân NPK bón cho 1 ha mía tơ đạt năng suất 70 – 80 tấn là: 180– 200 kg N, 60 – 80 kg P2O5 và 150 – 180 kg K2O. Nếu muốn năng suất tăng lên 90 – 100 tấn/ha, thì lượng phân tương ứng sẽ là: 200 – 250, 80 – 100, và 180 – 220. Ngoài ra, tùy theo loại đất và mức độ thâm canh mà phân bón hoá học được sử dụng với hàm lượng khác nhau. Với đất xám cát và đất xám bạc màu có mức độ thâm canh cao, lượng NPK/ha khuyến cáo là khoảng 200 – 250 kg N, 90 – 100 kg P2O5 và 180 – 200 kg K2O (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020).

1

Việc sử dụng quá nhiều phân hóa học cũng như các chất bảo vệ thực vật không những làm tăng chi phí sản xuất mà còn gây bất lợi đối với cây trồng, ảnh hưởng đến hệ sinh thái, môi trường và sức khỏe con người. Chính vì thế, việc nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn có lợi là một phần trong chiến lược nông nghiệp sinh thái hiện nay. Theo Singh và Singh (2012), việc sử dụng các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật như là các chế phẩm chủng cho cây trồng có khả năng thay thế hoặc bổ sung một phần cho phân bón hóa học, thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ, đồng thời giúp duy trì tính bền vững của năng suất cây trồng và sự an toàn của môi trường. Thực tế đã chứng minh hiệu quả của việc sử dụng phân bón hợp lý và tăng cường ứng dụng vi khuẩn có lợi liên kết thực vật, đặc biệt là các vi khuẩn cố định đạm ở các cây không họ Đậu như lúa, khoai lang và mía. Trong đó, Brazil là một ví dụ điển hình cho các quốc gia sản xuất mía hàng đầu trên thế giới với lượng phân đạm hóa học được sử dụng ở mức thấp nhất (Ridge, 2013; Yoneyama et al., 2017).

Mặc dù triển vọng của phân bón vi sinh trong sản xuất nông nghiệp bền vững là rất lớn, song các nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn liên kết thực vật trên cây mía nói chung và cây mía trồng trên đất xám vẫn còn ít được công bố. Trong bối cảnh trên, đề tài nghiên cứu thuộc luận án tiến sĩ “Phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh” đã được thực hiện nhằm tìm kiếm những dòng vi khuẩn bản địa với các đặc tính quý như cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA. Những dòng vi khuẩn này sẽ là nguồn giống cho các nghiên cứu sản xuất các loại phân bón sinh học vừa có khả năng bổ sung các nguyên tố phân bón đa lượng như N và P, vừa có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng của cây trồng nói chung và cây mía nói riêng thông qua sự sản xuất các hormone thực vật. Đây là một hướng nghiên cứu nhằm đảm bảo sử dụng bền vững và hiệu quả các nguồn tài nguyên thiên nhiên trong chiến lược phát triển nông nghiệp bền vững.

1.2. Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu

1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu

1.2.1.1 Mục tiêu chung

Nghiên cứu nhằm tìm kiếm và khai thác tiềm năng của các giống vi khuẩn bản địa có khả năng thúc đẩy tăng trưởng cây mía trong lĩnh vực sản xuất phân bón vi sinh, hướng tới một nền nông nghiệp phát triển bền vững.

2

1.2.1.2 Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu

 Phân lập, nhận diện, tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh và vùng rễ cây mía có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sản xuất hormone tăng trưởng thực vật IAA.

 Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía

trồng trong chậu và ngoài đồng.

1.2.2. Phạm vi nghiên cứu

 Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu đất vùng rễ và mẫu mô thân, rễ của cây mía trồng tại 7 huyện của tỉnh Tây Ninh (trừ Hoà Thành và thành phố Tây Ninh).

 Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía nuôi cấy mô, giống VN-85-1859, trồng trong điều kiện nhà lưới ở giai đoạn 3 tháng tuổi.

 Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên các yếu tố cấu thành năng suất, năng suất, và chữ đường của cây mía giống K95-156 trồng trong chậu và ngoài đồng tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, ấp Bình Hòa, xã Thái Bình, huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh.

1.3. Nội dung nghiên cứu

(1) Phân lập các dòng vi khuẩn có cả hai khả năng cố định đạm và hòa tan lân trong đất vùng rễ và nội sinh cây mía trên môi trường LGI, Burk’s không đạm và NBRIP.

(2) Định lượng khả năng cố định đạm và hòa tan lân in vitro của các

dòng vi khuẩn đã phân lập.

(3) Đánh giá hoạt tính sản xuất IAA và siderophore in vitro của một số

dòng vi khuẩn có cả hai khả năng cố định đạm và hòa tan lân.

(4) Nhận diện và tìm hiểu quan hệ phát sinh của các dòng có các đặc tính tốt qua kết hợp hình thái tế bào, khuẩn lạc, sinh học phân tử và công cụ tin sinh học.

(5) Nhân giống in vitro đối với giống mía VN-85-1859 để tạo nguồn nguyên liệu cây mía con sạch khuẩn. Đánh giá hiệu quả của các vi khuẩn có đặc tính tốt trên các cây mía con trồng trong bình Leonard trong điều kiện nhà lưới.

3

(6) Đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn có hiệu quả tốt sau thí nghiệm ở nội dung thứ 5, dựa trên các yếu tố cấu thành năng suất, năng suất, và chữ đường của mía trồng trong chậu và trồng ngoài đồng.

1.4. Ý nghĩa nghiên cứu

Về mặt lý luận

Nghiên cứu này nhằm dò tìm và nhận diện vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh có đặc tính thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía trồng trên loại đất xám của tỉnh Tây Ninh. Dựa trên trình tự gene 16S rRNA, xây dựng cây phả hệ để tìm hiểu mối quan hệ giữa các dòng vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh phân lập được từ cây mía trồng ở các địa phương khác nhau của tỉnh Tây Ninh. Kết quả thu được của đề tài sẽ góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về lĩnh vực nông học của Tây Ninh và vùng Đông Nam Bộ về mối quan hệ tương tác của bộ ba “đất, cây trồng và vi sinh vật đất”.

Về mặt thực tiễn

Đất xám là loại đất có hàm lượng dinh dưỡng thấp nhưng chiếm trên 81% tổng diện tích tự nhiên của tỉnh Tây Ninh. Loại đất này đã được sử dụng để trồng hoa màu và cây công nghiệp, trong đó có cây mía. Chi phí phân bón cho sản xuất mía trên đất xám và đất bạc màu thường cao hơn so với các loại đất khác. Chính vì vậy, nguồn vi khuẩn bản địa mà đề tài đã thu thập được cùng với các thông tin nghiên cứu cơ bản sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu chế tạo và sản xuất phân bón sinh học thân thiện với cây trồng và môi trường của địa phương.

1.5. Thời gian thực hiện và địa điểm nghiên cứu

Thu mẫu mía và phân lập, tuyển chọn, nhận diện các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía có khả năng cố định đạm, hòa tan lân được tiến hành từ tháng 10/2015 đến tháng 4/2017. Đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía nhân giống in vitro trồng trong điều kiện nhà lưới được thực hiện từ tháng 4/2017 đến tháng 5/2018. Đánh giá hiệu quả của vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng được thực hiện từ tháng 5/2019 đến tháng 1/2020.

Các nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật được thực hiện ở phòng thí nghiệm Vi sinh vật học, phòng thí nghiệm Sinh hóa và phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô (trường Đại học Sài Gòn), phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Vi sinh vật môi trường và phòng thí nghiệm Sinh học phân tử (Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ).

4

Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía giai đoạn 3 tháng tuổi, trồng trong điều kiện nhà lưới, được thực hiện tại khu thí nghiệm A trường Đại học Sài Gòn. Các thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía 6 tháng tuổi và 12 tháng tuổi, trồng trong chậu và ngoài đồng, được thực hiện tại khu thực nghiệm có diện tích khoảng 3.000m2 thuộc Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, ấp Bình Hòa, xã Thái Bình, huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh.

1.6. Các điểm mới của nghiên cứu

Về phương pháp, việc thu thập mẫu vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía được thực hiện trên hầu hết các huyện của tỉnh Tây Ninh (7/9 huyện thị, trừ Hòa Thành và TP. Tây Ninh là nơi có diện tích trồng mía nhỏ lẻ). Mía là cây không gieo trồng bằng hạt, do vậy bước nuôi cấy mô cây mía đã được tiến hành nhằm cung cấp nguyên liệu cho nghiên cứu khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vivo trong điều kiện nhà lưới, trước khi thử nghiệm ở quy mô bán thực địa (trong chậu) và thực địa (ngoài đồng). Cây nuôi cấy mô còn tạo ra điều kiện kiểm soát vi sinh vật (gnotobiotic), cho phép loại trừ ảnh hưởng của các vi khuẩn ngoại nhiễm đến sự tăng trưởng của cây.

Về kết quả, có 422 dòng vi khuẩn có cả hai khả năng cố định đạm và hòa tan lân đã được phân lập, trong đó có 101 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA và 81 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp siderophore. Trong số đó, 36 dòng vi khuẩn có đặc tính tốt đã được định danh dựa trên trình tự gene 16S rRNA. Đặc biệt, dòng vi khuẩn CT4bd nội sinh thân cây mía trồng tại Hảo Đước, huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh được nhận diện như là vi khuẩn Serratia oryzae sp. nov., một loài mới được phát hiện nội sinh cây lúa trồng ở Trung Quốc và công bố lần đầu vào năm 2017 bởi Zhang và cộng sự (2017). Dòng CT4bd (Serratia oryzae) cùng với TPD3b (Bacillus subtilis) có hiệu quả thay thế 25% phân hóa học N và P trên khía cạnh năng suất mía và làm tăng 14% chữ đường khi thử nghiệm trên cây mía trồng ở quy mô ngoài đồng.

5

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Nội dung của chương này là sự tổng hợp và bàn luận các tài liệu đã công bố có liên quan đến lĩnh vực nghiên cứu của đề tài, chủ yếu bao gồm: (1) Hiện trạng sản xuất mía đường của tỉnh Tây Ninh; (2) Các vấn đề về môi trường và sức khoẻ phát sinh từ việc trồng mía; (3) Đa dạng các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía; (4) Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất xám; (5) Các phương pháp thường được sử dụng trong nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá và nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía; (6) Nuôi cấy mô thực vật và một số kết quả trong vi nhân giống mía.

2.1. Hiện trạng sản xuất mía đường của tỉnh Tây Ninh

Ở Việt Nam, Viện Nghiên cứu mía đường (Sugarcane Research Institute) đã phân tích các đặc điểm tự nhiên và xã hội, loại cây trồng cạnh tranh và thực tiễn trồng mía của 7 vùng sinh thái nông nghiệp trong cả nước nhằm đánh giá tiềm năng của ngành mía đường “hiện đại”. Qua đó, có 2 vùng đã được xếp loại tốt bao gồm vùng Duyên hải miền Trung và Đông Nam Bộ. Vùng Đông Nam Bộ bao gồm 6 tỉnh: Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, và TP. Hồ Chí Minh. Đặc điểm đất đai chủ yếu của vùng này bao gồm: tầng đất dày (độ dày trên 70 cm chiếm 80%), bằng phẳng (độ dốc dưới 15° chiếm 92%), ít chia cắt và tập trung thành vùng lớn. Chính đặc điểm thuận lợi cho sự cơ giới hóa và giao thông này đã tạo ra điều kiện để xây dựng các khu công nghiệp mía đường lớn trong vùng (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020). Trong số 12 nhóm đất chính của Đông Nam Bộ có 3 nhóm đất đóng vai trò quan trọng trong canh tác mía, đó là đất xám bạc màu, đất đỏ Bazal và đất phù sa. Riêng tỉnh Tây Ninh, nơi được xem là thủ phủ đất xám của Đông Nam Bộ, loại đất này chiếm đến hơn 81% diện tích tự nhiên của tỉnh (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020; Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004).

2.1.1. Đặc điểm khí hậu, đất đai của tỉnh Tây Ninh

Tây Ninh là một trong 6 tỉnh thuộc miền Đông Nam bộ, có tọa độ từ 10°57’08” đến 11°46’36” vĩ độ Bắc và từ 105°48’43” đến 106°22’48” kinh độ Đông. Khí hậu Tây Ninh tương đối ôn hòa, có 2 mùa rõ rệt. Mùa nắng bắt đầu từ tháng 12 năm trước đến tháng 4 năm sau; và mùa mưa bắt đầu từ tháng 5 cho đến tháng 11. Tây Ninh có chế độ nhiệt cao và ổn định, nhiệt độ trung bình năm là 27,4°C. Lượng bức xạ và ánh sáng quanh năm dồi dào, trung bình mỗi ngày có 6 giờ nắng. Tây Ninh có lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.800 – 2.200 mm, độ ẩm trung bình trong năm vào khoảng 70 – 80%. Tây

6

Ninh chịu ảnh hưởng của 2 loại gió chủ yếu là gió Tây – Tây Nam vào mùa mưa và gió Bắc – Đông Bắc vào mùa khô. Tốc độ gió trung bình là 1,7 m/s và thổi điều hoà trong năm (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004).

Theo Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp (2004), tỉnh Tây Ninh có tổng diện tích tự nhiên là 402.960 ha. Tổng diện tích các thuỷ vực như ao hồ, sông suối là 29.770 ha; phần còn lại là đất đai chiếm diện tích 373.190 ha, bao gồm 4 nhóm đất và 12 loại đất (12 đơn vị chú dẫn bản đồ). Trong tài liệu này, tên gọi của 12 loại đất theo hệ thống phân loại đất của Việt Nam đều có chú dẫn tên tương ứng với danh pháp của WRB/FAO (Phụ lục 2.1). Trong đó, nhóm đất xám bạc màu có diện tích 330.033 ha, là nhóm lớn nhất trong 4 nhóm đất; chiếm đến 88,4% tổng diện tích đất và 81,9% tổng diện tích tự nhiên của tỉnh (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004).

Vì đất xám là nhóm đất phân bố rộng rãi trong tất cả các huyện thị của tỉnh Tây Ninh và được sử dụng chủ yếu trong canh tác nông nghiệp, trong đó có cây mía (Bảng 2.1), hơn nữa đây cũng là giới hạn thu mẫu của đề tài luận án, do vậy phần tổng quan tài liệu sau đây sẽ tập trung trước tiên vào các thông tin về đất xám của tỉnh.

Bảng 2.1: Diện tích đất xám bạc màu theo địa giới hành chính tỉnh Tây Ninh

Huyện/thành phố Diện tích (ha)

Huyện/thành phố

Diện tích (ha)

20,447 14,828 10,442 7,114

Tân Châu Tân Biên Châu Thành Dương Minh Châu Trảng Bàng

83,428 79,789 46,203 42,294 25,486

Gò Dầu Bến Cầu Tây Ninh Hòa Thành

(Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004)

Các loại đất hình thành trên các đá mẹ lớn tuổi thường có thành phần cơ giới nhẹ. Đối với đất xám, do phân bố trong điều kiện khí hậu nhiệt đới có đủ ẩm hoặc dư ẩm bề mặt đã khiến cho các quá trình phá hủy khoáng sét và rửa trôi-tích tụ sét xảy ra; từ đó giúp giữ lại một phần các cấp hạt cát, thịt trong các lớp bề mặt, làm cho đất có màu chủ đạo là xám cho đến xám nhạt. Các loại đất xám ở Tây Ninh đều hình thành trên nền phù sa cổ, có tuổi từ Pliocene đến Pleistocene thượng. Thành phần cơ giới chủ yếu là cát- thịt-sét gắn kết yếu, có thể có thêm cuội-sỏi hoặc kết von laterite với mức độ và độ sâu khác nhau. Tùy theo địa hình phân bố, chế độ thoát nước cũng như mức độ tác động của các quá trình ngoại sinh đã dẫn đến những biểu hiện biến đổi thứ cấp. Dựa vào đó, đất xám ở Tây Ninh được chia ra thành 3 đơn vị phân loại, gồm đất xám trên phù sa cổ, đất xám có tầng loang lổ

7

gley và đất xám gley (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004). Phân loại và quy mô của các loại đất xám ở tỉnh Tây Ninh được trình bày qua Bảng 2.2.

Bảng 2.2: Phân loại và quy mô của các loại đất xám ở Tây Ninh

Loại đất

Tên tương đương WRB/FAO

Ký hiệu

Diện tích (ha)

Tỷ lệ (%)

Đất xám trên phù sa cổ Haplic Acrisols

X

230,323

69,79

Xf

50,526

15,31

Đất xám có tầng loang lổ gley

Stagni-Plinthic Acrisols

Đất xám gley

Gleyic Acrisols

Xg

49,184

14,90

(Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004) (có hiệu chỉnh)

Đất xám trên phù sa cổ có sự phân bố trên toàn tỉnh Tây Ninh. Trong đó, 2 huyện có diện tích lớn nhất là Tân Châu (70.770 ha, chiếm 31%) và Tân Biên (63.505 ha, chiếm 28%). Loại đất này có thành phần cơ giới nhẹ, chua và thường có hàm lượng dinh dưỡng thấp. Trong các phẫu diện, cấp hạt cát ở tầng đất mặt chiếm khoảng 58 – 64% trong khi cấp hạt sét chỉ khoảng 30 – 33%. pH nước đạt 4,4 – 4,7. Tỷ lệ mùn rất thấp, chỉ khoảng 1,4 – 2,2% OM; có nơi chỉ đạt khoảng 0,8% OM. Đạm, lân và kali tổng số và dễ tiêu đều rất thấp. Ở tầng đất mặt, đạm tổng số chỉ đạt 0,06 – 0,10%; lân tổng số đạt 0,018 – 0,046%; kali tổng số đạt 0,023 – 0,036%. Lân dễ tiêu đạt 1,3 – 3,6 mg/100 g đất và kali dễ tiêu đạt 1,9 – 3,5 mg/100 g đất. Do có cơ giới nhẹ, dễ cải tạo, lại phân bố ở địa hình khá bằng phẳng thuận lợi cho việc cung cấp nước tưới cũng như thực hiện các biện pháp canh tác, đất xám phù sa cổ tỏ ra thích hợp cho các loại cây trồng cạn nhiệt đới. Tuy nhiên, cần chú ý bổ sung phân hữu cơ và bón đủ các loại phân hóa học theo nhu cầu của mỗi loại cây trồng (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004).

Đất xám có tầng loang lổ gley có quy mô lớn thứ hai, sau đất xám trên nền phù sa cổ. Tuy phân bố trên toàn tỉnh nhưng loại đất này thường tập trung ở phía Nam, tại những khu vực bằng phẳng và tương đối thấp, nơi có mực nước mạch lên xuống nông và có thể bị đọng nước ở bề mặt tại một số thời điểm trong năm. Đất xám có tầng loang lổ gley thường nằm đan xen với đất xám phù sa cổ. Theo địa giới hành chính, 2 tỉnh có diện tích đất xám có tầng loang lổ gley lớn nhất là Châu Thành (11.623 ha; chiếm 23%) và Dương Minh Châu (10.002 ha; chiếm 19,8%). Loại đất này có thành phần cơ giới trung bình đến nhẹ, chua vừa và có độ phì khá. Cấp hạt sét ở tầng đất mặt thay đổi trong khoảng 29 – 33%, cấp hạt cát nằm trong khoảng 40 – 60%. pH nước đạt 4,6 – 5,0. Thành phần dinh dưỡng trong đất được đánh giá ở mức khá nhưng không

8

cân đối. Mùn và đạm thường ở mức khá đến giàu (4,3 – 8,5% OM và 0,21 – 0,22%); lân ở mức trung bình thấp (0,05 – 0,13% P2O5); và kali ở mức thấp (0,022 – 0,041% K2O). Nhìn chung, đất xám có tầng loang lổ gley cũng là một trong những loại đất có nhiều ưu điểm về đặc tính lý-hóa học, lại được phân bố ở địa hình khá bằng phẳng, thuận lợi cho việc cung cấp nguồn nước tưới và thực hiện các biện pháp canh tác nông nghiệp. Hiện tại, phần lớn diện tích đất xám có tầng loang lổ gley là đất trồng lúa 2 – 3 vụ có tưới, một số là đất trồng mía và hoa màu, và rất ít diện tích là đất trồng cây ăn quả trên mô hoặc liếp (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004).

Đất xám gley ở Tây Ninh có quy mô nhỏ nhất, phân bố hầu hết ở các thung lũng ven suối hoặc các trũng thấp trong vùng phù sa cổ. Theo địa giới hành chính, đất xám gley phân bố nhiều nhất ở 3 huyện Tân Biên, Châu Thành và Trảng Bàng, với tỷ lệ tương ứng là 21%, 18,6% và 12%. Đất xám gley phân bố trên bề mặt địa hình thấp, có mực nước ngầm nông, thường bị đọng nước vài tháng mỗi năm, và có gley trung bình đến mạnh xuất hiện trong khoảng độ sâu 0 – 50 cm. Đất xám gley thường có mùn và đạm cao. Các đặc tính khác tương tự với đất xám có tầng loang lổ gley: thành phần cơ giới trung bình đến nhẹ, chua vừa và có độ phì khá. Cấp hạt sét ở tầng đất mặt thay đổi trong khoảng 30 – 36% và cấp hạt cát trong khoảng 50 – 52%. pH nước khoảng 4,5 – 4,6. Thành phần dinh dưỡng trong đất thường không cân đối. Mùn và đạm đạt mức khá đến giàu (2,1 – 17,5% OM; 0,14 – 0,50% N); lân trung bình thấp (0,15 – 0,16% P2O5); kali nghèo (0,025 – 0,036% K2O). Mặt khác, giữa các khoanh đất xám gley cũng có những sai khác rõ về hàm lượng dinh dưỡng, đặc biệt là mùn và đạm. Đất xám gley cũng là một trong những loại đất có nhiều ưu điểm cho sử dụng nông nghiệp: đất chua vừa và hàm lượng dinh dưỡng khá cao, phân bố ở địa hình thấp và bằng phẳng, thuận lợi cho việc tưới nước. Hiện nay, phần lớn diện tích đất xám gley ở Tây Ninh là đất chuyên canh lúa hoặc luân canh lúa- màu; một phần nhỏ là đất chuyên màu. Cần chú ý tăng cường đầu tư thủy lợi cho mục đích trồng lúa và lúa-màu, đặc biệt là ở những khu vực phía Bắc của tỉnh (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004).

Như vậy, nhìn chung ở Tây Ninh, đất xám trên phù sa cổ có diện tích lớn nhất nhưng lại nghèo dinh dưỡng nhất. Hai loại đất xám còn lại là đất xám có tầng loang lổ gley và đất xám gley do có sự phân bố ở địa hình trũng, đọng nước nên hàm lượng mùn và đạm đều đạt mức khá. Cả 3 loại đất xám của tỉnh đều có thành phần cơ giới nhẹ, tính chua và nghèo lân, kali. Đất xám gley thích hợp trồng lúa và màu; trong khi đất xám có tầng loang lổ gley và đất xám trên phù sa cổ có thể được sử dụng cho canh tác mía và các cây trồng cạn khác.

9

2.1.2. Đặc điểm vùng mía đường Tây Ninh

Ở Tây Ninh có hai vụ mía chính: vụ đông-xuân và vụ hè-thu. Trong vụ đông-xuân, mía thường được trồng vào cuối mùa mưa, khoảng từ tháng 11 đến tháng 2. Thời điểm cụ thể tùy thuộc vào điều kiện độ cao của đất, ẩm độ đất, khả năng tiêu thoát nước, điều kiện tưới. Mía trồng ở vụ này tuy có thời gian sinh trưởng dài nhưng thường cho năng suất cao. Ở vụ hè-thu, mía thường được trồng vào đầu mùa mưa, khoảng từ tháng 4 đến tháng 6 và chỉ trồng được trên các vùng đất triền gò không ngập nước. Đây là nguồn hom giống cho vụ đông-xuân tiếp theo. Những nơi đất trũng thấp thường không trồng vụ hè-thu (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004).

Theo số liệu của Cục Thống kê Tây Ninh (2019), diện tích đất dành cho trồng mía trên toàn tỉnh là 14.668 ha, xếp thứ ba sau diện tích trồng lúa và khoai mì. Diện tích mía đường của Tây Ninh chiếm 5,4% diện tích mía cả nước và chiếm 60% diện tích mía ở Đông Nam Bộ. Điều này cho thấy, mía đường là cây có vị trí quan trọng trong phát triển kinh tế của tỉnh. Mặt dù diện tích mía năm 2018 có giảm đi so với năm 2017, nhưng tăng khoảng 2.000 ha so với năm 2016. Năm 2018, trong 9 đơn vị hành chính của tỉnh, 2 huyện có diện tích trồng mía lớn nhất là Châu thành và Tân Châu, với diện tích tương ứng khoảng 6.044 ha và 4.053 ha. Hai huyện kế đến có diện tích trồng mía trên 1.000 ha là Tân Biên và Bến Cầu với diện tích tương ứng khoảng 2.341 ha và 1.254 ha (Bảng 2.3) (Cục thống kê tỉnh Tây Ninh, 2019).

Bảng 2.3: Diện tích trồng mía của tỉnh Tây Ninh qua các năm (2015 – 2018), phân theo đơn vị hành chính

Diện tích (ha)

Huyện/thành phố

2015

2016

2017

2018

Tân Biên Tân Châu Châu Thành Dương Minh Châu Trảng Bàng Gò Dầu Bến Cầu Tây Ninh Hòa Thành

2.096 4.509 4.746 602 674 345 1.181 76 17

1.756 4.451 4.707 199 472 399 911 30 7

3.075 4.785 5.651 414 146 457 1.038 30 6

2.341 4.053 6.044 358 182 403 1.254 30 3

Tổng số

14.246

12.932

15.602

14.668

(Cục thống kê tỉnh Tây Ninh, 2019)

10

Năm 2018, năng suất mía bình quân của tỉnh Tây Ninh đạt khoảng 77,18 tấn/ha, cao hơn so với năng suất bình quân của cả nước (khoảng 66,6 tấn/ha) và của Đông Nam Bộ (khoảng 72,6 tấn/ha) (Cục thống kê tỉnh Tây Ninh, 2019). Năng suất này (77,18 tấn/ha) cũng cao hơn so với một số nước trên thế giới ví dụ như Brazil, Trung Quốc, Thái Lan, Pakistan và Philipines; trong năm 2018 năng suất mía bình quân của các nước này lần lượt là 74, 76, 66, 60 và 56 tấn/ha (FAOSTAT, 2020).

Năm 2018, sản lượng mía của tỉnh Tây Ninh đạt 1.132.011 tấn, chiếm 6,7% của cả nước và chiếm 62% của Đông Nam Bộ. Trong đó, sản lượng mía của huyện Châu Thành là cao nhất: 484.382 tấn, chiếm khoảng 42% sản lượng mía của cả tỉnh. Các huyện có sản lượng cao tiếp theo lần lượt là: Tân Châu (304.926 tấn), Tân Biên (174.888 tấn), và Bến Cầu (95.027 tấn) (Bảng 2.4). Nhìn chung, sản lượng mía của cả tỉnh tương đối ổn định qua các năm (Cục thống kê tỉnh Tây Ninh, 2019).

Bảng 2.4: Sản lượng mía của tỉnh Tây Ninh qua các năm (2015 – 2018), phân theo đơn vị hành chính

Sản lượng (tấn)

Huyện/thành phố

2015

2016

2017

2018

Tân Biên Tân Châu Châu Thành Dương Minh Châu Trảng Bàng Gò Dầu Bến Cầu Tây Ninh Hòa Thành

Tổng số

147.722 337.756 350.368 44.968 44.122 25.664 89.110 5.080 1.213 1.046.003

130.019 333.480 363.456 15.471 30.214 30.358 68.951 2.012 503 974.464

228.864 372.904 447.831 32.514 9.211 34.797 78.566 2035 432 1.207.153

174.888 304.926 484.382 28.834 11.057 30.644 95.027 2.037 216 1.132.011

(Cục thống kê tỉnh Tây Ninh, 2019)

Như đã đề cập bên trên, vì phần lớn tài nguyên đất của tỉnh Tây Ninh là đất xám có dinh dưỡng thấp hoặc mất cân đối, do vậy trong canh tác nông lâm nghiệp trên đất xám, cần phải chú ý đầu tư phân bón để đạt được năng suất cao. Theo Công ty cổ phần Mía đường Thành Thành Công, năm 2012, lượng phân NPK cần cho 1 ha mía tơ là 200 kg N, 160 kg P2O5 và 240 kg K2O, và cho mía gốc là 220 kg N, 180 kg P2O5, 260 kg K2O. Đây cũng là mức phân mà Viện Mía đường Việt Nam khuyến cáo cho mía trồng trên đất xám cát và đất xám bạc màu. Lượng phân khuyến cáo này xấp xỉ lượng phân khuyến cáo

11

trong canh tác mía trên đất phèn và cao hơn nhiều so với các loại đất giàu dinh dưỡng khác (Bảng 2.5) (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020). Bên cạnh đó, tập quán tăng năng suất dựa trên tăng phân bón hoá học cũng thường được áp dụng. Đối với mía tơ, để đạt năng suất 70 – 80 tấn/ha cần lượng phân bón là 180 – 200 kg N, 60 – 80 kg P2O5 và 150 – 180 kg K2O. Nếu muốn tăng năng suất lên 90 – 100 tấn/ha, lượng phân tương ứng sẽ là 200 – 250, 80 – 100, 180 – 220; và để tăng năng suất lên trên 100 tấn/ha, lượng phân tương ứng sẽ là 250 – 280, 100 – 120, 220 – 240 (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020).

Mức độ thâm canh Cao

Bảng 2.5: Liều lượng phân N, P, K cho từng loại đất, mức độ thâm canh ở mỗi vụ mía tơ Lượng bón (kg/ha) Loại đất trồng mía Đạm (N) Lân (P2O5) Kali (K2O) 180 - 200 90 - 100 200 - 250 Đất xám cát và xám bạc màu

Trung bình

160 - 200

60 - 90

150 - 180

Đất cát pha

Cao

180 - 220

80 - 100

160 - 180

Trung bình

140 - 180

50 - 80

140 - 160

Đất đồi (đỏ vàng)

Cao

200 - 230

80 - 100

150 - 180

Trung bình

150 - 200

60 - 80

120 - 150

Cao

Đất phèn

200 - 250

100 - 120

180 - 220

Trung bình

160 - 200

80 - 100

150 - 180

Đất phù sa cổ

Cao Trung bình

180 - 220 140 - 180

70 - 90 50 - 70

160 - 180 120 - 160

(Viện Nghiên cứu mía đường, 2020)

Nhìn chung, lượng phân bón hoá học dùng cho cây mía trồng trên đất Tây Ninh nói riêng và đất xám cát và xám bạc màu của Việt Nam nói chung cao hơn một số vùng mía trên thế giới. Mặc dù lượng phân đạm ở một số vùng mía của Ấn Độ có thể xấp xỉ Việt Nam nhưng lượng phân lân và kali được sử dụng khá hạn chế, dưới 50 kg/ha P và dưới 100 kg/ha K. Tuy vậy, các nước này vẫn duy trì được năng suất trung bình là 79,7 tấn/ha. Ở Úc, lượng NPK dành cho mía tơ lần lượt là 140 – 160, 20, và 0 nhưng năng suất vẫn đạt 75,6 tấn/ha. Riêng đối với Brazil, nhờ áp dụng nhiều công nghệ mới trong trồng công nghiệp mía đường, kể cả sự tận dụng lợi ích từ hệ thống cố định đạm tự nhiên, lượng NPK thường dùng dưới 100 kg/ha, thậm chí một số vùng không bón P hoặc K nhưng năng suất trung bình vẫn đạt 74,4 tấn/ha (Phụ lục 2.2). Trong khi đó, tăng năng suất dựa trên phân hoá học sẽ làm gia tăng giá thành sản xuất, giảm năng lực cạnh tranh trong xuất khẩu, đồng thời gây ra nhiều tác hại cho môi trường và sức khoẻ con người. Phần trình bày sau đây sẽ chủ yếu tập trung vào tác hại của các hóa chất bảo vệ thực vật như thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu, và các loại phân bón hoá học, đặc biệt là phân N và P.

12

2.2. Các vấn đề về môi trường và sức khoẻ phát sinh từ việc trồng mía

Ở Việt Nam, hiện nay nghề trồng mía chưa thật ổn định, chủ yếu là do giá thành của đường mía nhập khẩu còn thấp hơn nhiều so với đưởng sản xuất trong nước. Trong khi đó, ở một số nước sản xuất mía hàng đầu như Brazil, công nghiệp trồng mía không chỉ nhắm tới việc sản xuất đường mà còn mở rộng sang các sản phẩm mới, có giá trị kinh tế như ethanol và nhiên liệu sinh học (Tatsch et al., 2009). Chính vì thế, các nước này cũng đã thực hiện được việc nghiên cứu công nghiệp sản xuất mía đường một cách toàn diện, bao gồm cả sự tác động tiêu cực của canh tác mía đến môi trường sinh thái.

2.2.1. Đối với thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ

Canh tác mía đường trên quy mô công nghiệp đã gây ra các vấn đề môi trường bao gồm sự tiêu thụ năng lượng của hệ thống sản xuất, sự xả thải các khí nhà kính như methane và nitrogen oxide, sự thay đổi tính chất vật lý, hóa học và sinh học của đất trồng, sự tăng tỷ lệ sử dụng phân bón vô cơ gây ô nhiễm đất và sự xuống cấp của chất lượng nước mặt và không khí (Hartemink, 2008).

Cây mía là cây trồng có thời gian mùa vụ tương đối dài và thường bị ảnh hưởng bởi sự cạnh tranh của cỏ dại, có thể gây thiệt hại đến 20 – 25% năng suất (Hussain et al., 2017). Có đến 50% các loại thuốc diệt cỏ hiện có trên thế giới đang được sử dụng cho mía đường thương mại; trong đó, atrazine, diuron, 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), và alachlor là các chất phổ biến nhất. Các thuốc diệt cỏ này có khả năng hòa tan trong nước, do vậy có khả năng gây ô nhiễm đất, đới nông (vadose zone), nước bề mặt và nước ngầm (Hartemink, 2008). Tuy vậy, atrazine và ametryne hầu hết bị phân hủy bởi ánh sáng mặt trời và alachlor bị tiêu hủy nhanh hơn atrazine (Javaroni et al., 1999). Southwick và cộng sự (1992) đã đo lượng atrazine trong đất trồng mía ở Louisiana. Nồng độ tối đa đo được trong vòng 11 ngày sau khi phun là 82 đến 403 mg/L. Sau 20 – 30 ngày chỉ còn là 3 mg/L, đạt giới hạn cho phép trong nước uống của Hoa Kỳ) (Southwick et al., 1992). Southwick và cộng sự (1995, 2002) cũng đã nghiên cứu về nồng độ của atrazine và metribuzin rửa trôi. Mặc dù ở các vùng mía, nồng độ metribuzin trong nước chưa vượt ngưỡng cho phép nhưng dữ liệu thu thập được qua nhiều năm cho thấy nồng độ atrazine đã vượt quá mức gây ô nhiễm đối với nước uống. Tại Brazil, Lanchote và cộng sự (2000) cũng đã đo dư lượng của atrazine, simazin và ametryne trong nước mặt và nước ngầm ở khu vực trồng mía gần Sao Paulo. Dư lượng atrazine được phát hiện trong 17/250 mẫu, tuy nhiên nồng độ của nó còn thấp hơn khuyến cáo (Lanchote et al., 2000). Bengtson và cộng sự (1998) đã nhận định chính phương pháp sử dụng là yếu tố có tính quyết định đối với tỷ lệ thất thoát của thuốc diệt cỏ.

13

Trong canh tác mía, thuốc trừ sâu được ít sử dụng hơn so với thuốc diệt cỏ. Thành phần hoạt chất của các thuốc trừ sâu được sử dụng ở Úc ít hơn khoảng 11 lần so với thành phần hoạt chất của các thuốc diệt cỏ (Arthington et al., 1997). Thuốc trừ sâu chứa chlorine hữu cơ (organochlorine) đã được sử dụng rộng rãi ở Úc trong các thập niên 1950 – 1980 nhưng sau đó đã bị cấm sử dụng. Tuy các mẫu bề mặt và lõi trầm tích không chứa chlorine hữu cơ ở mức khuyến cáo người ta vẫn e ngại sự di chuyển của chúng từ đất trồng mía đến môi trường biển gần bờ do sự tràn nước và xói mòn đất (Cavanagh et al., 1999). Tại Brazil, mãi đến năm 1985, các hoạt chất chlorine hữu cơ như aldrin và heptachlor cũng thường được sử dụng để trừ sâu cho mía. Dấu vết của các chất này được tìm thấy trong đất, lở tích (colluvium), trầm tích lắng, và các sinh vật như giun, ấu trùng tại các lưu vực trong vùng mía. Hợp chất chlorine hữu cơ và các hoạt chất trừ sâu khác được lưu hành trên thị trường sau năm 1985 có thể được tìm thấy trong môi trường với số lượng đáng kể cho thấy sự cần thiết phải có một lệnh cấm lưu hành để tránh sự phát tán của chúng (Sparovek et al., 2001).

Đối với thuốc diệt cỏ có chứa atrazine và 2,4-D, nghiên cứu Lerro và cộng sự (2017) cho thấy tác hại của việc tiếp xúc với các chất này trong quá trình canh tác của nông dân có thể gây ra các căn bệnh mãn tính liên quan đến stress oxy hóa, trong đó bao gồm cả khả năng gây tổn thương DNA bởi 2,4-D (Lerro et al., 2017). Khi tiếp xúc với 2,4-D, động vật và con người có thể gặp phải các hiệu ứng độc hại tùy thuộc vào liều lượng, tần suất tiếp xúc và tính nhạy cảm của chúng (Islam et al., 2018). Tương tự, Singh và cộng sự (2016) cũng đã công bố một tài liệu điểm báo về tác hại của thuốc trừ sâu, đặc biệt là nhóm chứa chlorine hữu cơ. Qua đó cho thấy khả năng gây đột biến, gây u và gây chết tế bào động vật, cũng như sự ngộ độc cấp tính xảy ra ở gan, thận và tinh hoàn của chuột bạch thí nghiệm.

Như vậy, dựa trên mô hình nghiên cứu của Islam và cộng sự (2018) về tình hình phơi nhiễm của người dân khi tiếp xúc với 2,4-D, có thể khái quát về nguy cơ tiềm ẩn của các chất độc hại có nguồn gốc từ thuốc diệt cỏ và trừ sâu khi phát tán vào môi trường, cho dù ở hàm lượng thấp hơn ngưỡng. Cần thiết phải có các nghiên cứu nhằm khám phá thêm về sự chuyển hóa, sự tích lũy và tác động của các chất này, ngay cả khi tiếp xúc ở mức độ thấp, nhằm tạo ra cơ sở dữ liệu đáng tin cậy và là chìa khóa trong việc soạn thảo các quy định và chính sách mới để bảo vệ con người và môi trường khỏi sự phơi nhiễm.

14

2.2.2. Đối với phân bón hoá học

Ngoài những lý do như nguồn giống chưa đạt chất lượng, hệ thống tưới không phù hợp, việc kiểm soát sâu bệnh và cỏ dại kém, thì việc bón phân NPK mất cân đối và không hợp lý cũng đã được nhận định như là một tác nhân gây ra tình trạng năng suất và chất lượng cây trồng kém, trong đó có cây mía (Hussain et al., 2017; Li et al., 2019; Soomro et al., 2014). Ở Pakistan, chỉ có 4% người trồng mía sử dụng phân NPK, và 73% số người được khảo sát cho biết họ chỉ sử dụng phân N và P (Hussain et al., 2017). Trong khi đó, các nghiên cứu về sự bón phân cân đối dã cho thấy phân kali đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng cây trồng và làm giảm ô nhiễm môi trường do sự thất thoát của N và P. Khi có đủ các ion K, nguyên tố này sẽ giúp thúc đẩy đáng kể sự hấp thụ và sử dụng N và P của cây trồng, thúc đẩy chuyển hóa carbohydrate và N và do đó cải thiện chất lượng nông sản (Li et al., 2019). Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng việc nâng cao năng suất dựa trên tăng cường phân bón có xu hướng tạo ra chất lượng cây trồng thấp hơn và sự thất thoát chất dinh dưỡng lớn hơn. Sự mất mát chất dinh dưỡng từ phân bón có thể làm tăng chi phí sản xuất và tác động xấu đến môi trường và sức khỏe con người (Glick, 2012; Li et al., 2019).

Đối với tác hại của sự mất cân đối trong bón phân N, bón thiếu N có thể làm giảm năng suất mía. Trong khi bón thừa N sẽ gây ra dư lượng N trong mía chín và làm giảm chất lượng của nước ép (Hussain et al., 2017). Bên cạnh đó, người ta đã quan sát được sự rửa trôi N xảy ra ở hầu hết các khu vực trồng mía, những nơi có lượng mưa cao hoặc thủy lợi dồi dào và mức thu hồi sử dụng N thấp. Tại Úc, N được bón ở mức 150 – 300 kg/ha và dư lượng N dưới dạng nitrate đã gây ra sự ô nhiễm nguồn nước cũng như góp phần phát thải khí nhà kính (Hartemink, 2008). Khi tỷ lệ bón phân N vượt quá 150 – 180 kg/ha, quá trình thấm lọc nitrate đã tăng lên đáng kể. Sự tạo thành khí nhà kính N2O cũng gia tăng khi tỷ lệ này vượt quá 180 kg/ha (Li et al., 2019). Để giảm thiệt hại về N trong vùng trồng mía ở Mauritius (Hoa Kỳ), người ta đã sử dụng phương pháp tưới nhỏ giọt, giúp làm giảm 30% lượng phân bón N. Tuy nhiên, việc đầu tư cho biện pháp tưới nhỏ giọt là rất lớn và có thể không khả thi về mặt kinh tế và kỹ thuật cho tất cả các vùng sản xuất mía đường (Hartemink, 2008). Đối với sức khoẻ con người, nước uống hoặc nông sản có hàm lượng nitrate vượt ngưỡng có khả năng làm tăng nguy cơ mắc bệnh tăng methemoglobin huyết và sự dị tật ống thần kinh ở trẻ sơ sinh. Nghiên cứu ở Hoa Kỳ cho thấy các bệnh ung thư đại trực tràng, bàng quang và ung thư vú, bệnh về tuyến giáp, sự giảm chức năng sinh sản ở người trưởng thành cũng có xu hướng gia tăng do sự hình thành các hợp chất N-nitroso lên khi phơi nhiễm nitrate từ nước uống (Ward et al., 2018).

15

Đối với phân lân, theo Hartemink (2008), tỷ lệ áp dụng theo khuyến cáo thường không xem xét đến tính chất của đất, một yếu tố vốn có liên quan đến khả năng phát tán hoặc hấp thụ P. Tại Úc, mức bón vượt quá khuyến cáo (15 – 50 kg P/ha) thường được áp dụng nhằm tránh nguy cơ hạn chế sản lượng do lân (Hartemink, 2008). Một đánh giá được thực hiện trên 105 khu vực trồng mía của Úc có mức bón 20 kg P/ha đã cho thấy có đến 84% số mẫu đất thu được có dư lượng P cao, và sẽ mất một thời gian dài để làm giảm lượng P này trong đất (Bloesch and Rayment, 2006). Phân lân vô cơ sau một thời gian bón vào đất thường bị cố định dưới dạng khó tan như nhôm phosphate, sắt phosphate trong đất chua phèn hay calcium phosphate trong đất kiềm (Cao Ngọc Điệp, 2011). Ở Brazil, việc bón phân P liên tục đã dẫn đến sự gia tăng của hàm lượng lân vô cơ và lân hữu cơ ở lớp đất mặt (Ball-Coelho et al., 1993). Ở Hoa Kỳ, một nghiên cứu đã chỉ ra rằng mức độ P trong đất cao có thể làm tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh gỉ sắt (Johnson et al., 2007). Đối với thất thoát phân bón P, sự xói mòn đất canh tác mía và sự thấm lọc P vào nước ngầm có thể dẫn đến sự tăng trưởng quá mức của vi khuẩn lam và tảo trong các thuỷ vực (Arthington et al., 1997). Sự nở hoa của nước ở các vùng mía của Everglades (Hoa Kỳ) cũng tăng lên khi xảy ra hiện tượng giảm dòng chảy do sự tích tụ P từ phân bón (Anderson and Rosendahl, 1997). Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy sự gia tăng nồng độ cadmium (Cd) trong đất trồng mía cao gấp 7 lần so với đất không canh tác (Arthington et al., 1997). Kirkham (2006) cho rằng nguồn ô nhiễm Cd thường đến từ phân bón P vô cơ. Một tấn super lân chứa 50 – 170 g Cd (Phạm Thị Thùy, 2010). Thời gian bán hủy của Cd trong cơ thể rất lâu, từ 7 – 30 năm. Cadmium có thể gây ra các bệnh về hô hấp và tiêu hóa; sự tiếp xúc lâu dài với chất này có thể gây bệnh ở phổi, xương, và thậm chí gây ung thư (Nguyễn Đức Khiển, 2002).

Như vậy, hạn chế cơ bản nhất trong sản xuất mía đường hiện nay là vấn đề liên quan đến phân bón, đặc biệt là phân N hóa học. Do vậy, cần thiết phải xem xét các phương pháp tiếp cận hiện có, sao cho có thể vừa làm tăng năng suất nông nghiệp vừa duy trì tính thân thiện với môi trường, trong đó có việc tăng cường sử dụng cây biến đổi gene và ứng dụng các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật; hai hướng tiếp cận mà Glick (2012) đã đặc biệt nhấn mạnh. Trong điều kiện của Việt Nam và đặc biệt là của Tây Ninh hiện nay, đối với mục tiêu sản xuất đường mía bền vững, cần thiết phải có sự cân nhắc các biện pháp tăng cường nghiên cứu và khai thác ứng dụng của các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía.

16

2.3. Đa dạng các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía

2.3.1. Các khái niệm vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn liên kết thực vật và vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật

Trong các vi sinh vật hiện diện ở vùng rễ, vi khuẩn là nhóm phong phú nhất, có ảnh hưởng lớn đến sinh lý thực vật và có khả năng cạnh tranh cao trong quá trình tương tác và liên kết với cây chủ. Bị thu hút bởi các hợp chất do rễ tiết ra, các vi khuẩn đất có thể di chuyển đến vùng rễ, định cư trên bề mặt rễ hoặc xâm nhập vào bên trong rễ và di chuyển lên các bộ phận khác của cây (Compant et al., 2010). Căn cứ mức độ cận kề của vi khuẩn với đất hoặc rễ cây, quan hệ tương tác của vi khuẩn-thực vật đã được chia thành các dạng: cộng sinh, nội sinh hoặc liên kết (Hình 2.1) (Souza et al., 2015).

Hình 2.1: Các kiểu liên kết giữa vi khuẩn đất có lợi và rễ cây (Souza et al., 2015)

Vi khuẩn liên kết thực vật (Plant Associated Bacteria – PAB) có thể được phân thành 3 nhóm: vi khuẩn đất vùng rễ, vi khuẩn biểu sinh rễ và vi khuẩn nội sinh tuỳ theo vị trí cư trú; hoặc được chia làm 2 nhóm: PAB gây bệnh và PAB có lợi tùy theo tác động của chúng lên vật chủ. Đối với nhóm PAB có lợi, lợi ích chủ yếu của chúng là khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng của cây chủ (Fuente and Burdman, 2011; Hardoim et al., 2012; Jha et al., 2013). Các vi khuẩn thúc đẩy

17

tăng trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Bacteria - PGPB) còn có thể được chia ra thành một nhóm nhỏ hơn, gọi là “PGPB-kiểm soát sinh học”, bao gồm các lợi khuẩn có khả năng làm tăng cường sự khỏe mạnh của cây. Khi các PGPB sống trong vùng rễ cây, chúng được gọi tên là “vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật” (Plant Growth Promoting Rhizobacteria - PGPR) (Bashan and de-Bashan, 2005; Bashan and Holguin, 1998).

Kloepper và Schroth (1978, 1981) là những người đầu tiên đề cập đến khái niệm “vi khuẩn vùng rễ” (rhizopheric bacteria) và “vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật” (Plant Growth Promoting Rhizobacteria - PGPR). Đây là các vi khuẩn sống trong đất có khả năng cạnh tranh tốt trong quá trình xâm chiếm rễ cây, chúng có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật và từ đó làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh của cây (Bhattacharyya and Jha, 2012). Như vậy, theo định nghĩa ban đầu, các vi khuẩn vùng rễ chỉ giới hạn trong các vi khuẩn sống tự do. Về sau, khái niệm PGPR đã được mở rộng, bao hàm cả đối tượng vi khuẩn cộng sinh và vi khuẩn nội sinh (Agrawal et al., 2014). Các PGPR có thể được phân thành 2 loại: PGPR ngoại bào (extracellular plant growth promoting rhizobacteria) và PGPR nội bào (intracellular plant growth promoting rhizobacteria). Các ePGPR thường gặp là các vi khuẩn sống tự do hiện diện trong vùng rễ, trên bề mặt rễ hoặc trong không gian giữa các tế bào của vỏ rễ, ví dụ như Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas. Trong khi các iPGPR thường nằm trong các cấu trúc chuyên biệt của rễ, chẳng hạn như nốt rễ. Các iPGPR bao gồm các vi khuẩn cộng sinh có trong nốt sần của cây họ Đậu, ví dụ như Rhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, và các vi khuẩn Frankia spp. cộng sinh với cây Tống quá sủ (Alnus spp.) (Agrawal et al., 2014; Gupta et al., 2015; Martínez-Viveros et al., 2010).

Từ vùng rễ, nhiều vi khuẩn có khả năng xâm nhập vào bên trong mô thực vật mà không gây ra bất cứ triệu chứng nhiễm trùng nào cho cây. Các vi khuẩn này được gọi tên là “vi khuẩn nội sinh” (endophytic bacteria) (Agrawal et al., 2014; Hallmann et al., 1997; Schulz and Boyle, 2006). Vi khuẩn nội sinh còn có thể được định nghĩa là: vi khuẩn sống trong mô thực vật, có thể được phân lập từ thực vật sau khi khử trùng bề mặt. Các vi khuẩn này không gây ra tác động tiêu cực lên thực vật mà ngược lại, chúng còn có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng của cây. Đây là khái niệm “Plant-growth-promoting bacterial endophytes - PGPBEs” mà Gaiero và cộng sự (2013) đã đề cập. Ngoài vùng rễ, vi khuẩn nội sinh thực vật có thể xuất phát từ không khí và từ các vật liệu nhân giống như hạt, cành giâm. Bên cạnh nội mô thực cật, các vi khuẩn liên kết thực vật cũng có thể cư trú tại vùng đất bao quanh hạt đang nảy mầm (spermosphere) hay bề mặt lá cây (phyllosphere) (Compant et al., 2010; Hardoim et al., 2012).

18

Như vậy, có thể thấy một sự phong phú trong định nghĩa, phân loại và cách tiếp cận với các lợi khuẩn có sự tương tác với thực vật. Dựa trên đối tượng và giới hạn nghiên cứu, phần lược khảo tài liệu và thảo luận của luận án sẽ tập trung vào vi vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật có tác động tốt trên sự tăng trưởng của cây, đặc biệt là cây mía. Phương pháp phân lập đã sử dụng không bao hàm các vi khuẩn biểu sinh rễ.

Tuy vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ có thể nguồn gốc từ đất song giữa chúng cũng có những khác biệt căn bản về thành phần loài, sức chống chịu với các nhân tố sinh thái, và đặc biệt là sự tác động của chúng trên thực vật. Không có cơ chế chung nhất cho tất cả, mà mỗi loài, mỗi chủng vi khuẩn có thể sử dụng nhiều cơ chế khác nhau trong sự tương tác với các vi sinh vật khác cũng như trong sự tương tác với cây chủ (de Santi Ferrara et al., 2012; Gupta et al., 2015; Jha et al., 2013). Do vậy, sự phân lập, dò tìm, tuyển chọn và phối hợp các chủng vi khuẩn để đưa vào ứng dụng nhất thiết phải trải qua nhiều công đoạn nghiên cứu cơ bản.

2.3.2. Các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía

Về cơ chế thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật, sơ đồ sau đây của Gupta và cộng sự (2015) có thể tóm tắt các đặc tính mà một khi các vi khuẩn sở hữu, chúng có thể tác động trực tiếp hay gián tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây chủ (Hình 2.2).

Hình 2.2: Sơ đồ về các cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn (Gupta et al., 2015)

19

Cơ chế trực tiếp được thực hiện thông qua: sự cung cấp, bổ sung dinh dưỡng như N, P, K, và các khoáng khác, hoặc/và sự điều chỉnh, bổ sung các hormone thực vật. Cơ chế gián tiếp được thực hiện thông qua sự kiểm soát sinh học, tức là sự giảm thiểu tác hại do mầm bệnh gây ra cho cây chủ, hoặc/và sự hình thành một khu hệ các vi sinh vật có lợi định cư ở rễ, ức chế sự cạnh tranh và xâm lấn của các sinh vật có hại (Gupta et al., 2015). Ngoài ra, nhiều vi khuẩn vùng rễ còn có khả năng giúp thực vật chống chịu hoặc đề kháng với stress. Đây cũng có thể được xem là đặc tính gián tiếp góp phần thúc đẩy tăng trưởng thực vật tại những nơi có điều kiện bất lợi cho canh tác nông nghiệp như nhiễm mặn hay nhiễm kim loại nặng (Jha et al., 2013). Các đặc tính này thường được ứng dụng trong khử độc môi trường, trong một lĩnh vực được gọi là “phục hồi sinh học” (bioremediation).

Về sự đa dạng của các vi khuẩn liên kết với cây mía, Mehnaz (2011) đã liệt kê một danh sách khá đầy đủ bao gồm tên Latin, nguồn phân lập, xuất xứ, và tài liệu tham khảo của 81 loài (Phụ lục 2.3). Các vi khuẩn này đã được phân lập từ vùng rễ, kẽ gian bào hay nội mô của các cây mía trồng tại nhiều nước trên thế giới như Tây Ban Nha, Philippines, Brazil, Ấn Độ, Ai Cập. Các chi vi khuẩn liên kết cây mía đã phân lập được gồm có: Azospirillum, Azotobacter, Herbaspirillum, Bacillus, Burkholderia, Pseudomonas, Rhizobium, Gluconacetobacter, v.v… Tuy nhiên, theo giới hạn của luận án, phần trình bày sau đây sẽ tập trung chủ yếu vào một số vi khuẩn mà đề tài nghiên cứu này đã phân lập được và cũng là các loài thường gặp ở cây mía.

2.3.2.1. Bacillus

Các vi khuẩn hiếu khí hình thành nội bào tử (Aerobic Endospore Forming Bacteria - AEFB) như Bacillus, Brevibacillus, Paenibacillus từ lâu đã được biết đến như các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật. Do đặc tính thành tế bào dày, có khả năng hình thành nội bào tử, có khả năng tổng hợp các kháng sinh peptide, các phân tử tín hiệu và các enzyme ngoại bào mà các vi khuẩn Gram dương thuộc ngành Firmicutes này có thể tồn tại trong các điều kiện bất lợi và phát tán rộng rãi (Kumar et al., 2011). Bacillus megaterium là loài vi khuẩn đất phổ biến, có khả năng hòa tan lân tốt và đã được ứng dụng trong sản xuất phân lân vi sinh ở nhiều nước. Bacillus và Paenibacillus spp. đã biểu hiện khả năng ức chế các tác nhân gây bệnh cây quy mô in vitro và in vivo và do vậy đã mở ra triển vọng ứng dụng chúng trong lĩnh vực kiểm soát sinh học (Borriss, 2011). Bacillus amyloliquefasciens, B. methylotrophicus là các vi khuẩn đã được chứng minh về khả năng đối kháng sinh học bên cạnh khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Hình 2.3).

20

Hình 2.3: Ảnh SEM của chủng B. amyloliquefaciens TF28 có khả năng kháng nấm

(Zhang et al., 2016)

Nhiều loài AEFB vốn chỉ được tìm thấy trong đất như Bacillus cereus, B. pumilus, B. subtilis, Paenibacillus azotofixans, P. polymyxa nay đã được phân lập từ rễ, thân và apoplast của cây mía đường (Mehnaz, 2011). Brevibacillus sp. cũng đã được phân lập từ thân và lá của các giống mía trồng ở Brazil (Magnani et al., 2010). Năm 2008, Rivas và cộng sự đã phân lập được từ dịch apoplast của cây mía một loài vi khuẩn mới, được đặt tên là Saccharibacillus sacchari. Chi Saccharibacillus cho thấy có quan hệ họ hàng gần gũi với Paenibacillus (Rivas et al., 2008). Sử dụng kỹ thuật khuếch đại trình tự 16S rDNA từ DNA tổng số thu được trong các mẫu đất trồng mía tại Brazil, Dini- Andreote và cộng sự (2010) nhận thấy có 10,2% tổng trình tự thu được thuộc về Firmicutes, trong đó Bacillus chiếm ưu thế, với tỷ lệ 19,7% (Dini-Andreote et al., 2010).

Ở Việt Nam, khi nghiên cứu vi khuẩn nội sinh cây mía trồng tại Bến Tre và Long An, Ngô Hồng Thanh và cộng sự (2014) đã tiến hành nhận diện 10 dòng trong tổng số 28 dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR đoạn 16S rDNA. Kết quả giải trình tự và so sánh cho thấy 10 dòng này có tỷ lệ tương đồng 98 – 100% với các loài Bacillus có trong cơ sở dữ liệu của NCBI như B. subtilis, B. tequilensis, B. cereus và B. amyloliquefaciens. Trong khi đó, nghiên cứu vi khuẩn trong đất vùng rễ cây mía trồng tại tỉnh Đồng Nai của Hoang và Cao (2015) cũng thu được kết quả là 7 trong số 12 dòng (chiếm 58,3%) là các Bacillus. Trong đó, dòng B6 tương đồng với Bacillus megaterium đã bộc lộ tốt khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vitro, bao gồm cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA (Hoang and Cao, 2015).

21

2.3.2.2. Burkholderia

Kể từ năm 1992, khi Yabuuchi và cộng sự lần đầu tiên đề nghị tách một số loài vốn đang được xem là Pseudomonas và Bacilli ra thành chi một chi riêng gọi là Burkholderia, đã có hơn 60 loài Burkholderia khác nhau đã được mô tả (Suárez-Moreno et al., 2012). Burkholderia là các vi khuẩn Gram âm phổ biến thuộc β-Proteobacteria, dạng que ngắn, di động được, có khả năng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí. Nhiều loài hiện diện trong đất và trầm tích, biến dưỡng linh hoạt, có khả năng phân hủy nhiều hợp chất khác nhau và do vậy thể hiện vai trò quan trọng trong lĩnh vực môi trường (Suárez-Moreno et al., 2012). Một số Burkholderia có tác động tốt trong tăng trưởng thực vật của cây mía như: B. vietnamiensis, B. kururiensis, B. tropica giúp cố định đạm; B. vietnamiensis, B. ambifaria, B. phytofirmans là tác nhân giúp cây trồng phát triển thông qua sự tổng hợp vitamin và phytohormone (Mehnaz, 2011).

Hình 2.4: Ảnh TEM của chủng B. tropica sp. nov. BM27 (Reis et al., 2004)

Năm 1990, trong một khảo sát trên các vi khuẩn cố định đạm liên kết với rễ mía trồng tại Brazil, kết quả phân tích trình tự một phần gene 23S rRNA đã xác nhận chúng thuộc chi Burkholderia (Schmid and HartMann, 2007). Từ đó đến nay, ngày càng có nhiều loài Burkholderia đã được công bố như các vi khuẩn liên kết cây mía. Có hàng chục loài Burkholderia đã được phân lập từ cây mía trồng tại Nam Phi, Brazil, Papua New Guinea… Riêng ở các giống mía trồng tại Ấn Độ, tổ hợp các loài B. tropica, B. unamae và B. cepacia đã được bắt gặp thường xuyên hơn so với sự có mặt riêng lẻ của loài B. vietnamiensis (Mehnaz, 2011). Trong nghiên cứu về sự đa dạng của các Burkholderia, bên cạnh B. tropica và B. unamae là loài ưu thế, B. vietnamiensis và B. caribensis cũng đã được phát hiện với số lượng ít hơn (Castro-González et al., 2011).

22

Nghiên cứu vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở Việt Nam cũng cho thấy Burkholderia như B. acidipaludis, B. ambifaria là các loài hiện diện trong vùng rễ (Hoang and Cao, 2015). Đối với đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên quan đến hormone thực vật, hoạt động ACC desaminase được xem như một dấu chỉ quan trọng, và dòng Burkholderia CZ152S đã được phân lập từ đất vùng rễ cây mía giống ROC22 trồng ở Guangxi, Trung Quốc cũng đã được xác nhận hoạt tính này (Li et al., 2011). Ngoài ra, nhiều loài Burkholderia liên kết cây mía cũng đã được xác nhận hoạt tính đối kháng, bao gồm kháng nấm Fusarium và Ustilago (van Antwerpen et al., 2001) và kháng tuyến trùng Melaidogynae (Guyon et al., 2003).

2.3.2.3. Các Enterobacteria

Nhiều đại diện của họ Enterobacteriaceae đã được tìm thấy trong các nghiên cứu về sự đa dạng của các PGPR và vi khuẩn nội sinh cây mía cũng như các cây trồng khác (de Santi Ferrara et al., 2012). Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae thường có hình que, Gram âm, kỵ khí tùy nghi, di chuyển hoặc không di chuyển. Hầu hết các đại diện đều có khả năng khử nitrate, hoặc cố định đạm (Samina Mehnaz, 2011; Octavia and Lan, 2014). Các vi khuẩn thuộc chi Enterobacter và Klebsiella đã được mô tả như là vi khuẩn cố định đạm ưu thế trong vùng rễ mía với các loài phổ biến như Enterobacter cloacae, E. oryzae, E. aerogenes, Klebsiella pneumonia, K. variicola, và K. oxytoca. Các chi vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae như Serratia và Pantoea cũng đã được phân lập từ cây mía trồng tại nhiều nước trên thế giới như Brazil, Úc, Ấn Độ, Pakistan, và Việt Nam (Mehnaz, 2011; Hoang and Cao, 2014).

Hình 2.5: Ảnh SEM của Serratia marcescens B4 (Zarei et al., 2010)

23

Tất cả 21 chủng vi khuẩn vùng rễ và 25 chủng nội sinh cây mía trồng phổ biến ở các đồn điền Brazil mà Ferrara và cộng sự (2012) đã phân lập được đều thuộc về chi Klebsiella và Enterobacter. Các chủng này đều có khả năng cố định đạm, sinh tổng hợp IAA và kiểm soát sinh học các nấm bệnh. Trong khi đó, khi nghiên cứu vi khuẩn liên kết cây mía thuộc 3 giống thương mại trổng phổ biến trên đất Argisol vùng Đông Bắc Brazil, Michelangelo và cộng sự (2016) đã phân lập được 54 chủng biểu sinh rễ và 88 chủng nội sinh trong lá và rễ với 79 chủng có khả năng cố định đạm và 51 chủng có khả năng hòa tan lân. Kết quả giải trình tự và nhận diện thông qua gene 16S cho thấy nhiều chi vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae như Pantoea, Enterobacter, Klebsiella, trong đó có 9 chủng thuộc về chi Pantoea.

Trước đó, da Silva et al. (2015) cũng đã phân lập được vi khuẩn Pantoea ananatis dòng SCB4789F-1 từ cây mía trồng ở Brazil. Dòng vi khuẩn này đã được xác nhận khả năng hòa calcium phosphate, oxide kẽm, sản xuất IAA và siderophore, kháng kháng sinh, và có thấy hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật trên cây mô hình Arabidopsis thaliana (da Silva et al., 2015).

2.3.2.4. Các chi vi khuẩn liên kết cây mía khác

Khi nghiên cứu quần xã vi khuẩn đất vùng rễ cây mía trồng tại Brazil, Pisa và cộng sự (2011) đã thu được một sự đa dạng cao của các trình tự 16S rDNA khuếch đại từ DNA tổng số phân lập từ đất. So sánh tương đồng trình tự với cơ sở dữ liệu của NCBI cho thấy 29,6% trình tự thu được thuộc về Proteobacteria, kế đó là Acidobacteria (23,4%), Bacteroidetes (12,1%), Firmicutes (10,2%), và Actinobacteria (5,6%). Đối với các vi khuẩn sống tự do, ngoài trình tự của Bacillus chiếm ưu thế với 19,7%, còn có sự hiện diện của Azospirillum, và Burkholderia. Bên cạnh đó, các vi khuẩn cộng sinh cố định đạm như Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Rhizobium cũng cho thấy có sự hiện diện trong đất (Pisa et al., 2011).

Rhizobium sp. cũng đã phân lập được từ rễ cây mía trồng tại Pakistan và R. rhizogenes được phân lập từ apoplast của cây mía trồng tại Cuba thông qua phương pháp nuôi cấy (Mehnaz, 2011). Trong khi đó, nghiên cứu đa dạng vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất nhiễm mặn của Ấn Độ, có 43 dòng vi khuẩn đã được định danh như Azospirillum, Alcaligens, Arthrobacter, Bacillus, Flavobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia và Streptomyces dựa trên Hệ thống phân loại của Bergey (Bergeys Mannual of Systematic bacteriology) và phần mềm Micro IS. Đáng chú ý là với khả năng đáp ứng độ mặn/độ thẩm thấu đã được báo cáo của các loài như Azospirillum và Azotobacter đã chỉ ra tiềm năng của PGPR trong mở rộng canh tác nông nghiệp tại các vùng đất khắc nghiệt hay chống lại sự xâm nhập của nước biển dưới tác động của biến đổi khí hậu (Nakade, 2014).

24

Bên cạnh Azospirillum, Rhizobium, Streptomyces như đã kể trên, nhiều vi khuẩn Gram dương như Microbacterium hay vi khuẩn Gram âm như Gluconoacetobacter, Herbaspirillum, Acinetobacter cũng đã được báo cáo về sự liên kết với cây mía và khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Mehnaz, 2011). Gluconoacetobacter diazotrophicus được xem là vi khuẩn cố định đạm sinh học có tiềm năng thay thế cho mức bón khoảng 150 kg N/ha cho mía mỗi năm. Trong khi vi khuẩn Acinetobacter đã được sử dụng như một chế phẩm chủng cho cây mía trồng ở Ấn Độ, nơi có thể thay thế phân đạm hoá học hoàn toàn bằng phân hữu cơ trong hai năm liên tiếp (Jha et al., 2013; Saharan and Nehra, 2011). Tuy vậy, tần suất bắt gặp các loài vi khuẩn này trong vùng rễ và cây mía không cao như một số loài khác. Đặc biệt là khả năng gây bệnh cơ hội của một số vi khuẩn như Acinetobacter baumanii hay BCC (Burkholderia Cepacia Complex) khiến cho sự ứng dụng chúng trong nông nghiệp hay lĩnh vực môi trường cần có sự cân nhắc và đánh giá kỹ càng (Mendes et al., 2007).

Như đã trình bày bên trên, có thể thấy sản xuất mía đường hiện nay là một ngành công nghiệp lớn của nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt là trong tình hình chuyển hướng ứng dụng sang lĩnh vực nhiên liệu sinh học. Chính vì vậy, khối lượng tài liệu liên quan đến đề tài nghiên cứu của luận án khá phong phú nhưng chủ yếu xuất phát từ các nước trồng mía lớn với sự dàn trải trên nhiều vùng mía có điều kiện đất đai khác nhau. Để có sự gần gũi nhất đối với đối tượng nghiên cứu của đề tài luận án, phần lược khảo tài liệu sau đây tập trung chủ yếu vào các công trình nghiên cứu và ứng dụng trên cây mía trồng tại các địa phương có đất xám và các loại đất gần gũi với đất xám theo danh pháp Việt Nam.

2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất xám

2.4.1. Tình hình nghiên cứu về các đặc tính của vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất xám

Hiện nay, có rất ít thông tin về sự đa dạng của đất trồng mía, ngoại trừ tài liệu của Halliday (1956) cung cấp thông tin về vùng trồng chủ lực và các đặc điểm phân loại đất trồng tại một số nước như Úc, Ấn Độ, Nam Phi, Hoa Kỳ, Cu ba và Brazil. Dữ liệu về đất ở Colombia được cung cấp bởi Guerrero (1991) và bởi Ocampo (1991) (trích dẫn của Ridge, 2013). Riêng vùng mía thương mại của Hawaii (Hoa Kỳ) được bổ sung thông tin về đất từ tài liệu của Tirado-Corbalá và cộng sự (2015). Qua đó cho thấy mặc dù “Ultisols” không phải là loại đất có ưu điểm cao trong nông nghiệp của các nước nói trên nhưng đều có mặt trong các vùng mía chủ yếu. “Ultisols” là tên gọi của một bộ trong hệ thống phân loại đất (Soil Taxonomy) của USDA (Hoa Kỳ). Đất “Ultisols”

25

có đặc điểm chính là có một tầng argilic (tích lũy nhiều sét), độ no base thấp (<35%), có chứa ít khoáng mica, không có các đặc điểm của tầng oxide. “Utisols” tương đương với “Acrisols” trong hệ thống của WRB/FAO, với “Argissollos” trong hệ thống phân loại đất SiBCS của Brazil, và với “Sols ferralitiques fortement désaturés” (đất ferralit đã bão hoà mạnh) trong hệ thống phân loại đất của Pháp (Landon, 1984; Santos et al., 2018). Ngược lại, “Acrisols” theo danh pháp của WRB/FAO tương ứng với các bộ phụ “aquult”, “udults” “ustults” (đặc tính ẩm) và “humults” (đặc tính mùn) của bộ “Ultisols” và bộ “Oxisols” có tầng tích lũy sét (kandic horizon) và một số “Alfisols” (ở đặc tính tích lũy oxide nhôm và sắt).

Ở Việt Nam, nhóm “đất xám” được phân loại theo trường phái phát sinh gồm có: đất xám đỏ vàng, đất xám bạc màu, đất nghèo hữu cơ và có đốm rỉ sắt. Trong “Utisols” có 2 bộ phụ đã được xác định là “aquult” (có ít chất hữu cơ và có đốm rỉ), và “ochrult” (có màu sáng, ít chất hữu cơ, mỏng và có thể kết von). “Ochrult” bao gồm “rhodochrult” (đất Leptosols) và “typochrult” (đất xám vàng đỏ và đất xám bạc màu) (Dahlgren et al., 2008; Đỗ Nguyên Hải, 2007). Đối với Brazil, theo các tài liệu thu thập được về phân loại đất, đất “Argissollos” (hay Argisols) (theo SiBCS) gần gũi với đất Acrisols, Lixisols và Alisols (theo FAO) và với Ultisols, Oxisols (Kandic) và Alfisols (theo USDA). Loại đất này chiếm 20% diện tích Brazil và phân bố chủ yếu ở phía Bắc, Đông Bắc, Đông Nam và Nam (Benedetti et al., 2011; Guerra et al., 2013; Santos et al., 2018).

Như vậy, các loại đất Utisols, Oxisols, Alfisols theo USDA, hay đất Argissollos/Argisols (theo SiBCS) là những loại đất có nhiều điểm tương đồng với đất xám của Việt Nam. Mặc dù, hiện nay có nhiều công bố mới về vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía trồng tại các nước trên thế giới và trong khu vực như Trung Quốc, Thái Lan, nhưng hầu hết các công bố này đều không nêu rõ thành phần đất thu mẫu hoặc thực nghiệm. Trong giới hạn lược khảo về tình hình nghiên cứu cơ bản trên vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất xám, có một số công bố liên quan đến chủ đề, chủ yếu đến từ Brazil và Việt Nam.

Nghiên cứu vi khuẩn liên kết cây mía trổng trên đất Argisols của vùng Đông Bắc Brazil, Michelangelo và cộng sự (2016) đã sử dụng môi trường TSA (Trypticase Soy Agar) có bổ sung chất chống nấm để phân lập và làm thuần các dòng vi khuẩn. Vi khuẩn nội sinh được phân lập từ mô lá và rễ tươi của 3 giống mía thương mại được trồng phổ biến trong vùng. Trong khi đó, vi khuẩn biểu sinh rễ được tách rời khỏi bề mặt rễ bằng cách lắc trong đệm PBS (phosphate-buffered saline) trước khi cấy vào môi trường TSA. Môi trường

26

NFb bán đặc đã được sử dụng để tuyển chọn các dòng có khả năng cố định đạm, trong khi môi trường đặc có chứa 4 g/L mono-calcium phosphate không tan đã được sử dụng như môi trường cải biên để xác nhận khả năng hòa tan phosphate vô cơ của các dòng vi khuẩn. Mật số vi khuẩn cũng đã được xác định. Kết quả cho thấy có 103 – 108 CFU/g sinh khối tươi. Mật số vi khuẩn biểu sinh rễ cao gấp 1,4 lần vi khuẩn nội sinh rễ và gấp 2,2 lần vi khuẩn nội sinh lá. Kết quả này cho thấy rễ là môi trường ưa thích đối với quần xã vi khuẩn liên kết cây mía. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng cho thấy mật số vi khuẩn liên kết ở 2 giống mía RB 92579 và RB 863129 là tương đương nhau, cùng cao hơn so với mật số vi khuẩn liên kết ở giống mía RB 867515. Các tác giả cho rằng có thể do mức thuốc diệt cỏ sử dụng trên giống mía RB 867515 đã tổn hại đến quần xã vi khuẩn liên kết thực vật.

Michelangelo và cộng sự (2016) đã phân lập tổng cộng 142 chủng vi khuẩn, trong đó có 54 chủng biểu sinh rễ và 88 chủng nội sinh trong lá và rễ. Có 79 chủng (56%) có khả năng phát triển trong môi trường NFb chứng tỏ chúng có khả năng cố định đạm. Có chủng 51 (36%) tạo vòng halo trên môi trường chứa phosphate vô cơ khó tan, trong đó có hơn một nửa đến từ vùng rễ. Michelangelo và cộng sự (2016) cũng đã chọn ra 27 chủng có tiềm năng tốt để tách chiết DNA và khuếch đại trình tự 16S rDNA bằng cặp mồi P027F và 1378R. Giải trình tự và phân tích trình tự bằng công cụ BLASTn (NCBI) cho thấy mức tương đồng trên 90% với các chủng vi khuẩn có trong cơ sở dữ liệu, bao gồm Pantoea sp., Burkholderia sp., Pseudomonas sp., Enterobacter sp., Klebsiella sp., Pantoea stewartii và Burkholderia cenocepacia. Các chủng đã giải trình tự chủ yếu thuộc về 2 chi Pantoea (9 chủng) và Burkholderia (9 chủng), trong đó Burkholderia là chi vi khuẩn đã được nghiên cứu rộng rãi trên nhiều loại cây trồng, nhiều hệ sinh thái và được xác nhận khả năng cố định đạm cũng như hòa tan lân.

Tại Brazil, Piracicaba cũng được biết đến như một thủ phủ mía đường nổi tiếng của bang São Paulo. Loại đất chủ yếu ở đây là Latossolo Vermelho- Amarelo và Podzólico Vermelho-Amarelo, tương ứng với Oxisols và Utisols của USDA. Mendes và cộng sự (2007) đã phân lập từ vùng rễ và bên trong rễ và thân các cây mía 3 tháng tuổi thuộc giống SP80-1842 được trồng tại Piracicaba. Vi khuẩn đất vùng rễ được thu nhận bằng cách lắc rễ trong môi trường đệm PBS, sau đó cấy trên môi trường thạch đĩa TSA có chứa chất chống nấm. Sau khâu khử trùng bề mặt, mẫu thân và rễ cũng được thu dịch chiết và cấy chuyển vào môi trường TSA để phân lập, làm thuần. Đa dạng di truyền của các dòng vi khuẩn được tìm hiểu thông qua PCR, giải trình tự, phân tích BLASTn, phân tích cây phả hệ cũng như phân tích sự tiến hóa phân tử của

27

các gene 16S rRNA và recA. Đặc tính hóa kiểu hình của các vi khuẩn trên khả năng chống nấm F. moniliforme, khả năng sản xuất IAA trên môi trường có bổ sung tryptophan, và khả năng sản xuất protease ngoại bào. Các tác giả cũng đã phân tích sự hiện diện của các gene tổng hợp kháng sinh, đặc biệt là prnD chuyển hóa aminopyrrolnitrin thành pyrrolnitrin, Phát hiện các kháng sinh bằng các kỹ thuật sắc ký cũng như gây đột biến điểm trên gene này cũng đã được thực hiện (Mendes et al., 2007).

Kết quả phân tích mật số của nghiên cứu trên cho thấy số lượng vi khuẩn trong đất vùng rễ cao gấp 20 lần so với bên trong rễ. Mật số vi khuẩn nội sinh rễ cao hơn hàng nghìn lần so với vi khuẩn nội sinh thân. Trong số 154 dòng vi khuẩn được chọn ngẫu nhiên, phân tích đa dạng kiểu gene cho thấy 61 dòng vi khuẩn vùng rễ chia thành 25 nhóm, 44 dòng vi khuẩn nội sinh rễ chia thành 23 nhóm vi khuẩn, và 49 dòng vi khuẩn nội sinh thân chia thành 24 nhóm. Trong số các vi khuẩn vùng rễ, có 13% có khả năng sản xuất IAA, 25% có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. moniliforme; trong khi đó ở vi khuẩn nội sinh rễ, các con số này lần lượt là 46% và 39%, và ở vi khuẩn nội sinh thân, các con số này lần lượt là 74% và 20%. Dựa vào đa dạng kiểu gene và khả năng chống nấm, có 11 dòng vi khuẩn nội sinh rễ và 7 dòng vi khuẩn nội sinh thân đã được giải trình tự và nhận diện thông qua trình tự 16S. Kết quả cho thấy có đến 13 dòng thuộc về chi Burkholderia, 3 dòng thuộc về Pantoea, 1 dòng được nhận diện như Pseudomonas fluorescens, và 1 dòng được nhận diện như Microbacterium testaceum. Trong 18 dòng tuyển chọn, phần lớn các dòng có khả năng kháng nấm bệnh, sản xuất IAA, protease; hơn 50% số dòng sản xuất được pyrrolnitrin. Tuy vậy, với sự phân tích phả hệ dựa trên trình tự 16S và recA đã cho thấy nhiều dòng tương đồng với BCC (Burkholderia cepacia complex) và B. cenocepacia gv. III, một vi khuẩn gây bệnh cơ hội cho người nên cần phải có sự cẩn trọng khi ứng dụng các vi khuẩn này (Mendes et al., 2007).

Ở Việt Nam, như đã trình bày trước đây, có 2 vùng sinh thái đã được đánh giá tốt về tiềm năng trồng mía, đó là vùng Duyên hải miền Trung và vùng Đông Nam Bộ. Đất xám ở Duyên hải miền Trung chiếm khoảng 9,56% diện tích. Đất xám bạc màu vùng Đông Nam Bộ chiếm 40,5% diện tích tự nhiên, khoảng 904.551 ha. Trong đó, Tây Ninh và Đồng Nai là 2 tỉnh có diện tích trồng mía lớn nhất ở vùng Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu vi khuẩn liên kết với cây mía đường trồng trên đất xám ở Việt Nam cho thấy có một sự đa dạng trên đối tượng này. Hoang và Cao (2014) đã nghiên cứu sự đa dạng của các vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân sống trong đất vùng rễ cây mía trồng tại 3 huyện của tỉnh Đồng Nai; trong đó đất trồng mía của huyện Trảng Bom là loại đất xám. Các mẫu đất vùng rễ mía đã được phân tích tính

28

chất lý hóa, cũng như xác định số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt. Phân lập vi khuẩn trên hai loại môi trường Burk's N-free và NBRIP. Dựa vào kết quả định lượng để tuyển chọn và định danh vi khuẩn. Kết quả cho thấy số lượng vi khuẩn có mối liên hệ chặt chẽ với hàm lượng chất hữu cơ và hàm lượng P2O5 trong đất. Có 12/31 dòng có khả năng cố định đạm và hòa tan lân cao đã được lựa chọn để định danh qua trình tự gene 16S rRNA. Trong số đó có dòng B17, phân lập từ đất xám, cho thấy sự tương đồng cao với Bacillus megaterium, một loài vi khuẩn thường có khả năng hoà tan lân tốt.

Trong một nghiên cứu khác trên đối tượng vi khuẩn nội sinh cây mía, bằng cách tiếp cận tương tự, Hoang và Cao (2015) đã chọn ra được 10/27 dòng có các đặc tính cố định đạm, hoà tan lân và tổng hợp IAA tốt. Trong đó có 4 dòng xuất phát từ cây mía trồng trên đất xám của huyện Trảng Bom. Kết quả định danh cho thấy dòng LR2 tương đồng với Sphingomonas sp., dòng LR4 tương đồng với Raoultella planticola, dòng T16 tương đồng với Achromobacter xylosoxidans, và dòng LT1 tương đồng với Klebsiella pneumonia. Đây là các vi khuẩn đã được báo cáo về khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật gặp ở nhiều loại cây trồng trên thế giới.

2.4.2. Tình hình nghiên cứu về hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn liên kết trên cây mía

rubrisubalbicans

và H.

Trước năm 2010, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy và hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các loại vi khuẩn không cộng sinh. Hầu hết các thí nghiệm kiểm tra hiệu quả của vi khuẩn thường được tiến hành trong điều kiện kiểm soát vi sinh (gnotobiotic condition). Đối với cây mía, những nghiên cứu này bao gồm nuôi cấy mô, thử nghiệm hiệu quả in vivo của một số vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPB) ở quy mô trong chậu và ngoài đồng (Mehnaz, 2011). Có 3 hình thức thử nghiệm ảnh hưởng của các PGPB liên quan đến cây mía đã được tiến hành: (1) sử dụng vi khuẩn được phân lập từ cây mía chủng trở lại cho cây mía, (2) sử dụng vi khuẩn được phân lập từ cây trồng khác để chủng cho cây mía, (3) sử dụng vi khuẩn được phân lập từ cây mía để chủng cho cây trồng khác. Các dòng vi khuẩn như Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae, Azospirillum amazonense, Burkholderia vietnamiensis, Klebsiellea sp. thường được sử dụng đơn lẻ hay phối hợp để chủng vào cây mía. Các nghiên cứu này cho thấy khả năng làm gia tăng sinh khối 19 – 50% trong thí nghiệm chậu, gia tăng 26 – 35% khối lượng chất khô khi trồng cây trong nhà kính, hay tăng năng suất thêm 5 – 12% trong các thí nghiệm ngoài đồng (Mehnaz, 2011).

29

Trong giới hạn lược khảo các công bố từ năm 2010 trở đi, phần viết sau đây được trình bày theo 2 nhóm: (1) Các PGPB được thử nghiệm trên cây mía; (2) Các PGPB phân lập từ cây mía được thử nghiệm trên các cây trồng khác.

2.4.2.1. Thử nghiệm hiệu quả của các PGPB trên cây mía

Lân là một yếu tố quan trọng giúp ổn định hàm lượng đường cũng như làm tăng sản lượng mía. Trong xu hướng tìm kiếm và ứng dụng các vi khuẩn hòa tan phosphate (Phosphate Solubilizing Bacteria - PSB), Sadiq và cộng sự (2013) đã phân lập từ vùng rễ của các loại cây trồng ở bang Lahore, trong đó có cây mía, được 12 dòng PSB. Sáu dòng có khả năng hòa tan lân tốt nhất, gồm PRI, PR2, PR4, BR1, BR2 và SR1 đã được đánh giá hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật trên hai giống mía biến đổi gene là CAMB I và CAMB II, trồng trong chậu trong điều kiện nhà kính. Kết quả cho thấy cả 6 dòng PSB đều làm gia tăng chiều cao cây, chiều dài bộ rễ và số lượng lá so với các cây đối chứng không chủng vi khuẩn (Hình 2.6). Trong đó, dòng BR2 tương đồng với Citrobacter freundii có tác dụng tốt nhất trên giống mía CAMB I và dòng PR2 tương đồng với Enterobacter aerogenes có tác dụng tốt nhất trên giống mía CAMB II. Kết quả này đã góp phần chứng minh hiệu quả của các PSB có khả năng bù đắp nguồn phân bón P vô cơ đắt tiền, có ý nghĩa kinh tế và thân thiện với môi trường (Sadiq et al., 2013).

Hình 2.6: Hiệu quả của các vi khuẩn hoà tan lân trên cây mía trồng trong điều kiện nhà kính (Sadiq et al., 2013)

30

Năm 2012, Quecine và cộng sự đã khảo sát sự thúc đẩy tăng trưởng trên cây mía trồng trong điều kiện nhà kính dưới tác động của vi khuẩn Pantoea agglomerans 33.1 có nguồn gốc từ cây Eucalyptus grandi. Hoạt động tái nhiễm của vi khuẩn đã được theo dõi bằng đánh dấu huỳnh quang và quan sát hiển vi. Qua đó cho thấy mật độ vi khuẩn đã xâm nhiễm vào vùng rễ, bên trong rễ và các mô khí sinh là tương tự nhau. Trong điều kiện nhà kính, P. agglomerans 33.1 có tác dụng làm gia tăng sinh khối toàn bộ cây sau 30 ngày chủng (Hình 2.7). Có lẽ sự tăng trưởng quan sát thấy ở thực vật có liên quan đến khả năng tổng hợp IAA và hòa tan phosphate của P. agglomerans 33.1. Ngoài ra, các tác giả còn quan sát thấy có sự kích hoạt việc sản xuất chitinase và cellulase ở rễ, biểu thị sự cảm ứng của hệ thống phòng vệ thực vật. Tuy nhiên, mức độ xâm nhiễm của các vi khuẩn bản địa không khác biệt giữa các cây mía được chủng và không được chủng vi khuẩn P. agglomerans 33.1, điều này đã chứng minh rằng sự hiện diện của P. agglomerans 33.1 không gây ảnh hưởng đến quần xã vi sinh vật vùng rễ (Quecine et al., 2012).

Hình 2.7: Cây mía được chủng P. agglomerans 33.1 (bên phải) so với đối chứng không được chủng (bên trái) sau 30 ngày trồng (Quecine et al., 2012)

Trong sự nỗ lực tìm kiếm các dòng vi khuẩn có khả năng sử dụng như thuốc trừ sâu vi sinh, Hassan và cộng sự (2014) đã sử dụng 4 dòng PGPR vốn phân lập từ cây mía bệnh có trong bộ sưu tập để đánh giá khả năng sản sinh các hợp chất đối kháng in vitro và khả năng kháng nấm Colletotrichum falcatum gây bệnh thối đỏ ở mía. Các dòng này gồm có Ochrobactrum intermedium NH-5, Stenotrophomonas maltophilia NH-300, và 2 dòng Pseudomonas sp. NH-203, NH-276. Cả 4 dòng đều có khả năng sản xuất HCN, và VOCs. Ngoài ra, O. intermedium NH-5 còn có khả năng tạo ra siderophores và kháng sinh phổ rộng 2,4-diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG),

31

Pseudomonas sp. NH-203 tạo được siderophores, và Pseudomonas sp. NH- 276 tạo được protease. Hai dòng O. intermedium NH-5 và S. maltophilia NH- 300 biểu thị hoạt động kiểm soát sinh học tốt, ức chế bệnh thối đỏ đến 44 – 52% trên hai giống mía SPF-234 và Co-1148 trên quy mô ngoài đồng. Kết quả kháng bệnh này cũng đã được ổn định trong ba năm liên tiếp nên cho thấy tiềm năng sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học của chúng (Hassan et al., 2014).

Mặc dù trong khả năng đối kháng sinh học, các chi Stenotrophomonas và Ochrobactrum ít được biết đến so với Pseudomonas nhưng trong một nghiên cứu của González và cộng sự (2015), 4 dòng vi khuẩn thuộc hai chi này cùng với một dòng Pseudomonas đã được phát hiện là các vi khuẩn có khả năng sinh indole tổng số cao (O. anthropi N208 và IMP311, P. luteola IMPCA244) và khả năng hòa tan calcium phosphate tốt (S. maltophilia CA158 và 79). Ngoài 5 dòng này, 20 dòng khác cũng có hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng cây mía trồng trong nhà kính trong vòng 90 ngày nuôi trồng. Nhìn chung, chiều cao cây tăng 27,75%, đường kính thân tăng 30,75%, số chồi tăng 38,5%, diện tích lá tăng 49%, khối lượng chất khô của thân lá tăng 59,75% và khối lượng chất khô của rễ tăng 59,5%. Pseudomonas luteola IMPCA244, P. fluorescens N50, O. anthropi IMP311, Aeromonas salmonicida N264, Burkholderia cepacia N172, và S. maltophilia 79 là các dòng hầu như đứng đầu trong các chỉ tiêu phân tích, do vậy chúng đã được khuyến nghị cho nghiên cứu chế tạo phân bón sinh học cho cây mía (González et al., 2015).

Nhằm mục đích nghiên cứu tác dụng phối hợp của các vi khuẩn vùng rễ trong việc tối ưu hóa hiệu quả sử dụng phân hữu cơ và phân khoáng để bổ sung dinh dưỡng cho đất và làm tăng chất khô cũng như năng suất của cây trồng, Santos và cộng sự (2018) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá hiệu quả kết hợp của Bacillus subtilis và Bacillus pumilus với các phụ phẩm của ngành công nghiệp đường mía trên cây mía. Nghiên cứu được thực hiện theo 2 giai đoạn. Giai đoạn một là phát triển cây con từ chồi (60 ngày) trồng trong điều kiện nhà kính, và giai đoạn 2 là chuyển cây con vào trồng tiếp trong chậu (thêm 60 ngày). Giai đoạn hai gồm 4 nghiệm thức: bổ sung Bacillus subtilis, bổ sung Bacillus pumilus, bổ sung tổ hợp 2 vi khuẩn này, và đối chứng không bổ sung vi khuẩn. Giai đoạn hai là thí nghiệm với hai nhân tố, ngoài yếu tố vi khuẩn còn có sự phối hợp của yếu tố phân khoáng và phụ phẩm ngành đường. Yếu tố này gồm 4 nghiệm thức: chỉ bổ sung phân khoáng, bổ sung phân khoáng và bã mía, bổ sung phân khoáng và bánh lọc, bổ sung phân khoáng và bánh lọc qua ủ (compost). Kết quả cho thấy, trong giai đoạn một, B. subtilis là yếu tố tốt nhất trong việc thúc đẩy sự tăng trưởng của bộ rễ khi làm tăng 23,0% chất khô tổng số so với đối chứng. Trong giai đoạn hai, ứng dụng B.

32

pumilus giúp tăng chất khô tổng số khoảng 13%, tăng số lượng chồi bên đến 37%, tăng đường kính của tược khoảng 48% khi kết hợp với bón phân khoáng. Các nghiệm thức kết hợp của B. subtilis và B. pumilus làm tăng hàm lượng lân trong đất lên 13% trong nghiệm thức có bổ sung phân khoáng và bánh lọc qua ủ. Kết quả của nghiên cứu này đã dẫn đến việc đề xuất sử dụng B. subtilis và B. pumilus cùng với các sản phẩm phụ ngành đường mía có thể giúp cải thiện các thông số về độ phì của đất và giảm các tác động bất lợi liên quan đến bã thải, bên cạnh tác dụng thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Santos et al., 2018).

2.4.2.2. Thử nghiệm hiệu quả của PGPB phân lập từ cây mía trên các loại cây trồng khác

Tác động của các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật được cho rằng có hiệu quả tốt nhất khi ứng dụng trở lại cây chủ và loại đất bản địa. Tuy vậy, trong sự thương mại hóa các chế phẩm vi sinh trong nông nghiệp, người ta mong muốn tìm được nguồn giống vi sinh có phổ vật chủ rộng và thích ứng với các điều kiện đa dạng của môi trường. Đây chính là lý do cho các thí nghiệm khảo sát tác động của các vi khuẩn phân lập từ cây mía trên sự tăng trưởng của các loại cây trồng khác hoặc ngược lại.

Năm 2016, Rodrigues và cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu phân lập và xác đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía giống mía thương mại RB 867515 trồng tại Brazil. Các đặc tính PGP in vitro đã đánh giá bao gồm sự sản xuất IAA, khả năng hòa tan phosphate, cố định N2, sản xuất HCN, sản xuất ammonia, và sản xuất các enzyme pectinase, cellulase và chitinase. Kết quả thu được bao gồm 136 dòng vi khuẩn đã được phân lập, trong đó có 83 dòng biểu thị khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật. Có 47% số dòng có thể hòa tan phosphate, 26% số dòng có khả năng cố định đạm. Đối với sự sản xuất các chất, có 57% số dòng sản xuất được IAA; 0,7% số dòng sản xuất được HCN; tỷ lệ các dòng sản xuất được chitinase, ammonia, cellulose và pectinase lần lượt là 0,7%, 45%, 30%, và 8%. Bảy dòng tốt nhất đã được thử nghiệm về khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của chúng trên cây bắp trồng trong chậu, giai đoạn 0 – 40 ngày tuổi. Các chủng vi khuẩn đã thử nghiệm đều thuộc họ Enterobacteriaceae, bao gồm Klebsiella, Enterobacter và Pantoea. Bốn dòng trong số chúng làm tăng diện tích là và khối lượng thân lá khô. Năm dòng trong số chúng làm tăng chiều cao thân từ 12,9 – 38%. Đặc biệt 2 dòng Klebsiella sp. và Pantoea sp. có khả năng làm tăng khối lượng khô của rễ lên thêm 57,83 % và 41,47 %. Tổng hợp kết quả thu được, có 5 dòng đã được các tác giả đề xuất như các dòng tiềm năng cho sản xuất phân bón sinh học, đó là: Klebsiella sp. KFA 1.3, Klebsiella sp. KRC 2.2, Pantoea sp. KRZ5, Enterobacter sp. KRZ6, và Enterobacter sp. KRZ23 (Rodrigues et al., 2016).

33

Trong một thí nghiệm khác, Armanhi và cộng sự (2018) đã tiến hành nghiên cứu đa dạng các nhóm vi khuẩn có lợi cho thực vật từ hệ vi sinh vật vùng rễ cây mía thông qua nuôi cấy và các kỹ thuật không phụ thuộc nuôi cấy. Phương pháp phân lập giúp thu thập được 399 dòng vi khuẩn, trong đó có 15,9% từ vùng rễ và 61,6 – 65,3% của nội sinh thân cây. Bằng cách tham khảo chéo kết quả đa dạng vi sinh vật thu được từ phương pháp phụ thuộc nuôi cấy với hồ sơ về đa dạng vi sinh vật thu được từ các kỹ thuật không phụ thuộc nuôi cấy (khuếch đại và phân tích trình tự 16S rDNA, các phần mềm phân tích), các tác giả đã thiết kế được mô hình về một quần xã bao gồm các nhóm vi khuẩn có số lượng lớn hiện diện tự nhiên ở rễ và thân cây. Hầu hết kết quả này vốn ít được khám phá trước đây. Tiếp tục sử dụng cây bắp làm mô hình để thăm dò chế phẩm vi khuẩn đã tổng hợp dựa trên sự phong phú vi sinh vật đã khám phá. Các kết quả đã chỉ ra rằng khi được cấy vào cây bắp, các thành viên của cộng đồng tổng hợp này có hiệu quả xâm chiếm các cơ quan thực vật, thay thế các vi sinh vật tự nhiên và chiếm ưu thế trong quần xã vi sinh vật vùng rễ. Bên cạnh đó, sự tương tác của vi khuẩn với cây bắp đã làm tăng sinh khối gấp 3,4 lần so với cây không được bổ sung vi khuẩn (Hình 2.8). Kết quả này đã cho thấy chế phẩm phối hợp nhiều loại vi sinh vật nếu dựa trên sự phong phú trong quần xã từ nhiên có thể được áp dụng thành công trong lĩnh vực thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Armanhi et al., 2018).

Hình 2.8: Tác động của các vi khuẩn vùng rễ cây mía trên sự tăng trưởng của cây bắp i, ii,iv: không vi khuẩn; iii, v: chủng vi khuẩn (Armanhi et al., 2018)

Trong một nghiên cứu về tác động của các vi khuẩn trong đất vùng rễ cây mía trên sự nảy mầm của các loại cây đậu như đậu xanh, đậu đũa, đậu Guar (Cyamopsis tetragonoloba) trồng tại Ấn Độ, Bhardwaj và cộng sự (2017) đã tiến hành đánh giá các đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật quan trọng gồm hòa tan phosphate, sản xuất IAA, và sự nhạy cảm với kháng sinh.

34

Dựa trên các kết quả đó, dòng vi khuẩn VRE36 đã được chọn lựa trong số 108 dòng phân lập từ đất vùng rễ các giống mía khác nhau của vùng Bardoli để nhận diện qua gene 16S rRNA. Kết quả giải trình tự xác nhận dòng này là Klebsiella pneumoniae. Dòng này có chỉ số hòa tan phosphate là 3,9 và hòa tan phosphate ở mức 17,4 ± 1,78 µg/mL trong môi trường NBRIP lỏng. Lượng IAA cao nhất thu được là 45,32 ± 2,46 µg /mL sau 96 giờ ủ ở 37°C. Trong thử nghiệm trên sự nảy mầm của hạt giống, các nghiệm thức được bổ sung Klebsiella pneumoniae cho kết quả tốt (97,78% đối với đậu xanh). Bổ sung vi khuẩn còn hỗ trợ cho chiều cao cây, khối lượng chất khô và sinh khối tươi khi so sánh với các mẫu đối chứng (Hình 2.9) (Bhardwaj et al., 2017). Các thông số của cây trồng được cải thiện dưới tác động của Klebsiella pneumoniae VRE36 đã cho thấy tiềm năng ứng dụng các PGPR được phân lập từ cây mía nói riêng và từ thực vật nói chung trong các loại phân bón sinh học nhằm hướng tới một nền sản xuất nông nghiệp bền vững.

Hình 2.9: Tác động của các vi khuẩn vùng rễ cây mía trên sự nảy mầm của cây đậu Guar, đậu xanh và đậu đũa (từ trên xuống) (Bhardwaj et al., 2014)

35

2.5. Các phương pháp thường được sử dụng trong nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá và nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía

Trong một công trình nghiên cứu về vi khuẩn liên kết thực vật, từ việc phân lập, xác định đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn cho đến khâu tuyển chọn và nhận diện các dòng có đặc tính tốt để thử nghiệm trên cây trồng thường trải qua nhiều giai đoạn. Tuy có thể thay đổi linh hoạt tuỳ theo đối tượng nghiên cứu nhưng một quy trình cơ bản và thông suốt cũng đã được nhiều tác giả đề xuất. Phần trình bày sau đây sẽ đi vào sự tổng hợp các tài liệu đó, làm cơ sở cho các phương pháp thí nghiệm mà đề tài đã lựa chọn thực hiện. Trong phạm vi giới hạn của đề tài, các nội dung được lược khảo bao gồm phương pháp phân lập và dò tìm các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật một cách trực tiếp thông qua khả năng cố định đạm, hòa tan phosphate vô cơ, sản xuất IAA. Riêng sự sản xuất siderophore, vừa có thể xem như cơ chế giúp thực vật tăng cường dinh dưỡng Fe trong điều kiện thiếu hụt, vừa có thể xem như cơ sở của đối kháng sinh học bởi vì khi vi khuẩn có khả năng cạnh tranh sắt với nấm và các các nhân gây bệnh cây cũng có nghĩa là chúng có khả năng ức chế sự phát triển của các đối tượng này.

2.5.1. Xử lý mẫu để phân lập vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật

Xử lý mẫu là khâu quan trọng đầu tiên, có tính chất quyết định đối với loại vi khuẩn mà nhà nghiên cứu muốn thu thập. Dựa trên sự tương tác và gắn kết của vi khuẩn và rễ cây, vi khuẩn liên kết vùng rễ thực vật thường được phân làm 3 loại, bao gồm: vi khuẩn sống trong đất vùng rễ, vi khuẩn sống trên bề mặt rễ (biểu sinh), và vi khuẩn sống bên trong rễ (nội sinh). Các phương pháp xử lý đối với bộ rễ của cây, trong đó bao gồm cả đất khối (ngoài vùng rễ), đất vùng rễ và rễ cây đã được nhiều tài liệu đề cập, có thể kể đến như các tài liệu của Luster and Finlay, 2006 và Viện thổ nhưỡng nông hóa, 1998. Hirsch và Mauchline (2012) cũng đã định nghĩa và hướng dẫn một cách tóm tắt về phương pháp lấy mẫu từ bộ rễ cây qua Hình 2.10.

36

Hình 2.10: Hệ vi sinh vật liên kết rễ (a) và phương pháp lấy mẫu tương ứng (b) (Hirsch and Mauchline, 2012)

Đối với cây mía, năm 2014, Baldani và cộng sự đã xuất bản một bài điểm báo (review) về các phương pháp thực hành nhằm phân lập các vi khuẩn cố định đạm sinh học (Biological Nitrogen Fixation – BNF) trên cây mía và các cây không họ Đậu khác, trong đó đặc biệt nhấn mạnh đến vai trò của các loại môi trường bán đặc không N. Tiến trình phân lập, xác định mật số cũng như nhận diện các vi khuẩn trong đất vùng rễ, biểu sinh trên bề mặt rễ hay nội sinh trong mô thực vật đã được trình bày chi tiết, kể cả sự mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào của các vi khuẩn BNF thường gặp trên cây mía, lúa miến và các loại ngũ cốc trồng ở Brazil. Quy trình nghiên cứu các vi khuẩn BNF sống nội sinh, liên kết với cây hay sống tự do cũng đã được các tác giả tóm tắt qua sơ đồ Hình 2.11. Baldani và cộng sự (2014) cũng đã đề cập đến các yếu tố có tác động đến cấu trúc của quần xã vi khuẩn liên kết với thực vật, chẳng hạn như loài cây chủ, kiểu gene, tuổi cây, cũng như vị trí của mô lấy mẫu. Nhìn chung, mật số vi khuẩn trên bề mặt rễ là cao nhất, tiếp theo là các mô bên trong rễ, và sau cùng là các mô khí sinh. Nồng độ pha loãng từ 10-7 đến 10-9 phù hợp cho việc đếm và phân lập vi khuẩn cố định đạm từ rễ và nồng độ từ 10-5 đến 10-6 phù hợp cho vi khuẩn sống bên trong các mô khí sinh.

37

(*) môi trường chuyên biệt cho chi vi khuẩn cần dò tìm Hình 2.11: Sơ đồ quy trình nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm liên kết thực vật ở cây không họ Đậu (Baldani et al., 2014)

Đối với nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm sống trong đất vùng rễ, có thể lấy đầy một vòng que cấy hay một lượng mẫu đất nặng từ 1 – 10 g để chủng trực tiếp vào môi trường bán đặc không N. Cũng có thể tạo ra dịch đất pha loãng 10 lần với dung dịch đệm gồm các muối khoáng và FeEDTA, đôi khi sử dụng dung dịch đường sucrose 40% cho các cây giàu đường như mía. Tween 80 có thể được thêm vào (với lượng 1 g/L) nhằm tạo tạo điều kiện cho sự khuếch tán của vi khuẩn vào trong dịch đất (Baldani et al., 2014 a).

Đối với vi khuẩn nội sinh, mẫu thực vật sau khi được thu thập sẽ được tách riêng thành các phần thân, lá và rễ và rửa dưới vòi nước chảy để loại bỏ bụi bẩn và đất. Mẫu vật được cắt thành các mảnh nhỏ, thấm khô trên giấy và đưa vào công đoạn khử trùng với Chloramine-T ở nồng độ thông thường là 10 g/L, và thời gian ngâm trong dung dịch tùy thuộc độ tuổi và loại cây. Thông

38

thường, ngâm từ 30 đến 60 phút đối với rễ cây bắp và lúa miến, và ngâm từ 5 đến 15 phút đối với rễ lúa gạo và lúa mì. Sau khi ngâm trong Chloramine T, các mẫu rễ cây thường được ngâm lần lượt trong nước cất vô trùng, dung dịch đệm phosphate (50 mM, pH 7,0) và ngâm lại trong nước cất vô trùng, với tổng thời gian của 3 công đoạn này bằng thời gian đã áp dụng cho ngâm khử trùng. Các mẫu đối chứng được xử lý theo cách tương tự nhưng ngâm trong nước cất vô trùng (Baldani et al., 2014). Ngoài ra, đối với xử lý mẫu thân của thực vật có sáp như mía, hoặc cỏ voi (Pennisetum purpureum), sau khi được rửa sạch bụi bẩn và sáp trên thân cây bằng nước, thân cây tiếp tục được xịt cồn 70% và đốt. Dùng dao để tước bỏ lớp mô bên ngoài và lặp lại thao tác trên một lần nữa để đảm bảo hiệu quả khử trùng (Videira et al., 2011). Việc kiểm tra hiệu quả khử trùng bề mặt được thực hiện bằng cách bịt 2 đầu mẫu rễ hoặc thân bằng paraffin, sau đó ngâm mẫu vào trong môi trường bán đặc. Sau 3 ngày ủ, những mẫu không có sự biểu hiện sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt mẫu được xem là khử trùng thành công và tiếp tục được chuyển sang công đoạn nghiền mẫu. Một lượng mẫu nặng 10 g được nghiền trong 90 mL NaCl 0,8% có chứa FeEDTA hay dung dịch đường sucrose 40%. Sau khi nghiền, để yên trong vòng 30 – 60 phút nhằm tạo điều kiện cho vi khuẩn khuếch tán ra môi trường rồi khuấy đều trong 5 – 10 phút để tạo dịch chiết (Baldani et al., 2014a).

Đối với tiêu chí để công nhận một vi khuẩn nội sinh “thật”, Reinhold- Hurek và Hurek (1998) đã đề xuất 2 điều kiện như sau: (1) phải được phân lập từ các mô sau khi khử trùng bề mặt, (2) có bằng chứng hiển vi về sự hiện diện của vi khuẩn bên trong mô thực vật. Nếu điều kiện thứ hai không được đáp ứng thì vi khuẩn nội sinh đó được xem như là “giả định” (Reinhold-Hurek and Hurek, 1998). Một vi khuẩn nội sinh cũng có thể được công nhận là “thật” khi nó có khả năng tái nhiễm vào một cây chủ vô trùng (Rosenblueth and Martínez- Romero, 2006). Có một số phương pháp đã được phát triển nhằm kiểm tra sự xâm chiếm của các PGPB khi tái chủng vào cây chủ. Với kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (Fluorescence in situ Hybridization - FISH) kết hợp với đếm mật số tế bào bằng phương pháp MPN (Most Probable Number), Oliveira và cộng sự (2002) đã đánh giá được sự cạnh tranh và đối kháng giữa các vi khuẩn BNF (gồm Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae, H. rubrisubalbicans, Azospirillum amazonense và Burkholderia sp.) khi tái nhiễm chúng vào cây mía dưới hình thức các tổ hợp khác nhau; từ đó chọn ra tổ hợp vi khuẩn tốt nhất (Hình 2.12) (Oliveira et al., 2002). Nghiên cứu này do vậy đã nhấn mạnh tầm quan trọng của việc chọn lựa tổ hợp các PGPB thích hợp nhằm tối đa hóa hiệu quả thu được trên cây trồng.

39

(A): Tổ hợp H. seropedicae và H. rubrisubalbicans nhuộm với EUB-338-I, II, III- Fluos, Hsero-445-Cy3 và Hrubri-445-Cy5 (B): Tổ hợp G. diazotrophicus, H. seropedicae và H. rubrisubalbicans nhuộm với ALF-1B-Fluos, Hrubri-445-Cy5 và Herso-445-Cy3

Hình 2.12: Ảnh hiển vi laser quét kết quả lai tại chỗ phát huỳnh quang của một số vi khuẩn liên kết cây mía (Oliveira et al., 2002)

2.5.2. Xác định khả năng cố định đạm của vi khuẩn

Đạm (N) là một trong những nguyên tố chính của protein, và chịu trách nhiệm cho sự phát triển và mở rộng của lá. Đạm cần thiết cho sự quang hợp và sự tích tụ đường ở mía. Khi thiếu N, sự tăng trưởng của toàn bộ cây trồng từ thân, lá, rễ cho đến sự mọc tược đều bị ảnh hưởng (Calcino et al., 2018). Trong canh tác nông nghiệp, phân đạm hóa học chiếm khoảng 30% tổng số phân bón (Mohanta et al., 2010). Trong hầu hết các tình huống, tăng cường bón đạm cho mía có thể cho sản lượng và đường cao hơn so với các loại phân khác. Đáp ứng này thường thấy rõ ở mía gốc và thường ít rõ ràng đối với mía trồng xen vụ với đậu (Ridge, 2013). Điều này cho thấy vai trò quan trọng của việc khai thác cố định đạm sinh học nhằm thay thế một phần phân bón urea trong trồng trọt (Canellas et al., 2013). Đây là cơ sở của sự khai thác các vi khuẩn BNF liên kết thực vật từ cây mía và các cây trồng khác.

2.5.2.1. Sử dụng môi trường bán đặc và đặc không chứa nitrogen để phân lập và chứng minh khả năng cố định đạm của vi khuẩn

Cho đến đầu những năm 1970, các báo cáo về vi khuẩn BNF chỉ đề cập đến việc các vi khuẩn này có thể phát triển trong điều kiện nồng độ oxygen khí quyển (pO2 = 0,21 kPa). Tuy nhiên, phức hợp nitrogenase chịu trách nhiệm chủ chốt cho việc khử N2 trong khí quyển rất nhạy cảm với oxygen và có thể bị mất hoạt tính không thể phục hồi khi phân áp oxygen cao. Ban đầu, môi

40

trường thạch mannitol-nấm men (Yeast Mannitol Agar - YHA) được sử dụng để phân lập các rhizobium cộng sinh. Bên cạnh đó, chỉ có một vài vi khuẩn sống tự do được mô tả như vi khuẩn cố định đạm, ví dụ như Beijerinckia fluminensis, Derxia indica, Azotobacter paspali (Baldani et al., 2014 a).

Phương pháp sử dụng môi trường bán đặc trong phân lập vi khuẩn cố định đạm do Döbereiner và Day (1976) đề xuất là thành tựu tiếp nối và phát triển các công trình của nhiều tác giả từ những năm 1920 đến thập niên 1960 với các mục đích nghiên cứu khác nhau. Cải tiến cơ bản nhất của Döbereiner và Day (1976) và nhóm nghiên cứu của Döbereiner sau này là giảm nồng độ agar từ 2 – 3 g/L xuống còn 1,4 – 1,8 g/L theo gợi ý của Whittenbury (1963) (trích dẫn của Baldani et al., 2014). Một môi trường thạch mềm như vậy sẽ tạo nên một gradient nồng độ oxygen từ hiếu khí cho đến kỵ khí và do vậy các vi khuẩn được chủng vào có thể tìm thấy vị trí thích hợp nhất cho sự phát triển của chúng (Kirchhof et al., 1997) và phát triển thành một màng mỏng (Hình 2.13). Môi trường NFb mà Döbereiner và Day (1976) dùng để phân lập Azospirillum còn có một cải tiến quan trọng khác đó là trong thành phần môi trường không có N (trích dẫn của Baldani et al., 2014). Đây chính là chìa khoá cho phép các tác giả phân lập và nhận diện nhiều vi khuẩn cố định đạm liên kết với các cây không họ Đậu, chẳng hạn như các cây Hòa thảo. Từ môi trường đầu tiên này, nhiều loại môi trường biến đổi đã được phát triển bằng cách thay đổi pH và nồng độ thẩm thấu, bổ sung vitamin, muối, acid amin, chiết xuất thực vật, v.v… sao cho giống môi trường ưa thích của vi khuẩn. Dựa trên những môi trường không đạm như NFb và JNFb, LGI và LGI-P, JMV, Baz và Bac mà nhiều loài BNF trong các chi Azospirillum, Herbaspirillum, Sphingomonas, Gluconacetobacter, Burkholderia đã được phân lập và nhận diện (Baldani et al., 2014a).

Hình 2.13: Màng mỏng (pellicle) do vi khuẩn cố định đạm tạo thành trong môi trường JNFb không N bán đặc sau 7 ngày nuôi cấy (Ribeiro and Cardoso, 2012)

41

Ngoài môi trường bán đặc, vốn được xem như một khâu không thể thiếu trong việc phân lập các vi khuẩn nội sinh với nhu cầu oxygen thấp nhằm thể hiện hoạt tính cố định đạm, nhiều loại môi trường đặc không N khác nhau cũng đã được nhiều tác giả sử dụng trong phân lập vi khuẩn cố định đạm sống tự do, ví dụ như Burk’s không N, Burk’s biến đổi (modified), Winogradsky, Bridges và WAT4C (Mandimba et al., 1986; Matthews and Suhaimi, 2010; Navarro-Noya et al., 2012). Bên cạnh đó, nhiều tác giả đã bổ sung bromothymol blue (BTB) như là chất chỉ thị pH. Sự đổi màu của môi trường nuôi cấy ban đầu từ xanh lục (ứng với pH trung tính) sang màu xanh dương (ứng với pH kiềm) khi có ammonia sinh ra như là một dấu chỉ cho sự cố định đạm (Miladiarsi et al., 2017). Điều này cũng được quan sát thấy trong sự phát triển của vi khuẩn cố định đạm khi nuôi cấy trong môi trường bán đặc (Baldani et al., 2014 a; Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2005).

Hình 2.14: Sự chuyển màu môi trường trong nuôi cấy trên môi trường đặc (A) và bán đặc (B và C) với chất chỉ thị BTB (Miladiarsi et al., 2017; Baldani et al., 2014 a)

2.5.2.2. Các phương pháp chứng minh khác

Bên cạnh việc chứng minh khả năng cố định đạm của các vi khuẩn khi chúng có thể phát triển trên môi trường không N, các phương pháp khác cũng đã được phát triển nhằm chứng minh trực tiếp hay gián tiếp khả năng này. Kỹ thuật biến loãng với N15 thường được sử dụng trong đánh giá hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn khi chủng cho cây mía (Asis et al., 2002; Umrit et al., 2009). Trong khi đó, xét nghiệm khử acetylene (Acetylene Reduction Assay - ARA) thường được xem là một trong những phương pháp nhạy cảm trong việc chứng minh hoạt động cố định đạm sinh học. Phương pháp này thường được sử dụng để so sánh hoạt động của nitrogenase trong các thí nghiệm in vitro và cả thí nghiệm ngoài đồng. Đây được xem là một phương pháp gián tiếp vì không thể được chuyển đổi định lượng sự khử acetylene thành lượng N2 cố định được (Muangthong et al., 2015; Mirza et al., 2001).

42

Một phương pháp khác đó là đo hàm lượng ammonia sinh ra trong quá trình nuôi cấy lỏng thông qua phép so màu bằng một loại thuốc thử đặc hiệu như Nessler’s hay sodium nitroprusside cũng được nhiều tác giả sử dụng trong nghiên cứu cố định đạm của các PGPR (Abdelwahab and Nabti, 2017, 2017; Cao Ngọc Điệp, 2011; Chrouqi et al., 2017). Sau cùng là các phương pháp dựa trên sự hiểu biết về gene và sinh học phân tử. Một trong số đó là phương pháp dò tìm và khuếch đại bằng kỹ thuật PCR đối với trình tự của các gene nif mã hóa cho các tiểu phần của nitrogenase như nifH, nifD và nifK. Phương pháp này cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm liên kết với cây mía (Li et al., 2017; Rodrigues et al., 2018; Yoneyama et al., 2017).

2.5.3. Xác định khả năng hoà tan lân của vi khuẩn

2- và HPO4

Lân (P) là nguyên tố dinh dưỡng đa lượng đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế tăng trưởng của thực vật tiếp theo nguyên tố N. Mặc dù trữ lượng của các hợp chất hữu cơ và vô cơ chứa P hiện diện trong đất là rất lớn nhưng có đến 95 – 99% phosphate tồn tại dưới dạng không hoà tan, vô định và kết tủa. Do đó, đa số cây trồng vẫn thiếu P vì thực vật chỉ có khả 3- năng hấp thụ phosphate chỉ có ở 2 dạng ion hòa tan là H2PO4 (Gupta et al., 2015). Trong khi đó, trong đất tồn tại nhiều loài vi khuẩn hòa tan phosphate (PSB) có thể chuyển đổi dạng phosphate không tan thành dạng hòa tan (Satyaprakash et al., 2017). Các vi sinh vật hòa tan lân sống trong vùng rễ đã được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1903. Nhiều PSB có vai trò tích cực đối với việc hòa tan phosphate tự nhiên có trong đất cũng như phosphate từ phân bón vô cơ bị tái kết tủa, bao gồm Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Micrococcus, Flavobacterium, Burkholderia, Achromobacter, Erwinia và Agrobacterium (Sadiq et al., 2013).

Cơ chế hòa tan phosphate của các PSB đã được nghiên cứu bao gồm: (1) phóng thích các hợp chất hòa tan khoáng sản hoặc phức chất khác ví dụ như các anion của acid hữu cơ, proton, ion hydroxyl, hoặc CO2, (2) giải phóng các enzyme ngoại bào có tác dụng khoáng hoá phosphate hữu cơ thông qua phản ứng sinh hóa, và (3) giải phóng phosphate trong suốt quá trình phân hủy các chất nền hay còn gọi là quá trình khoáng hoá phosphate sinh học (Gupta et al., 2015). Tuy vậy, trong giới hạn nghiên cứu của đề tải luận án, phần trình bày sau đây chủ yếu vào sự phân lập và xác định đặc tính các vi khuẩn hoà tan phosphate vô cơ.

43

2.5.3.1. Nuôi cấy trên môi trường đặc và đánh giá khả năng hoà tan phosphate thông qua sự tiết acid hữu cơ

Phân lân hóa học là nguồn cung cấp P chủ yếu cho cây trồng, nhưng có đến khoảng 70 – 90% lượng phân bón phosphate khi bón vào đất sẽ nhanh chóng bị cố định dưới dạng các hợp chất với nhôm và sắt trong đất chua phèn hay dưới dạng calcium phosphate trong đất kiềm và không còn khả năng hữu dụng cho cây (Bindraban et al., 2020). Để tận dụng nguồn lân vô cơ này, khả năng hòa tan lân khoáng của các vi khuẩn đặc biệt được chú trọng tìm kiếm và khai thác.

Trong số các acid hữu cơ khác nhau do các vi khuẩn hòa tan phosphate (Phosphate Solubilizing Bacteria - PSB) sản xuất, các acid gluconic và acid keto-gluconic được xem các chất chủ yếu. Sự sản sinh các acid này đã được ghi nhận ở Pseudomonas, Enterobacter, và Burkholderia. Các acid hữu cơ khác bao gồm citric, lactic, isovaleric, isobutyric, malonic, oxalic, glycolic, tartaric, pyruvic và succinic cũng liên quan đến cơ chế này (Kumar, 2016). Đã có bằng chứng thực nghiệm về vai trò của các acid hữu cơ trong hòa tan lân khoáng. Trong môi trường nuôi cấy Rhizobium leguminosarum có khả năng hoà tan phosphate, lượng acid hữu cơ và lượng P hòa tan thu được gần như bằng nhau (Halder et al., 1990; trích dẫn của Kumar, 2016). Hơn nữa, việc bổ sung sodium hydroxide vào dịch nuôi cấy làm mất khả năng hòa tan phosphate. Trong khi đó, nếu bổ sung các chất như pepsin hoặc acetone có tác dụng phân giải hoặc biến tính protein thì đều không gây ảnh hưởng đến sự hoà tan phosphate, chứng tỏ cơ chế hoà tan này không dựa vào enzyme (Kumar, 2016).

Các hoạt động hòa tan lân của các vi sinh vật đã được chứng minh thông qua sự phát triển của chúng trên các môi trường nuôi cấy có bổ sung tricalcium phosphate, dicalcium phosphate, hydroxyapatite hay các khoáng chất có chứa P không hòa tan khác như là nguồn cung cấp P duy nhất (Kalayu, 2019). Sự hòa tan phosphate vô cơ được đánh giá thông qua khả năng tạo vòng hòa tan xung quanh khuẩn lạc khi các vi sinh vật phát triển trên môi trường thạch đĩa như Pikovskaya, NBRIP, NBRIP-BPB, GELP (Chakdar et al., 2018; Li et al., 2019; Sadiq et al., 2013). Nhiều nghiên cứu vi khuẩn hoà tan phosphate liên kết cây mía đã sử dụng phương pháp này (Atekan et al., 2014; Kaur and Putatunda, 2018; Patel et al., 2017). Cơ chế giải thích cho sự hòa tan lân là do sự tiết acid hữu cơ của vi sinh vật. Khi bổ sung một chất chỉ thị như BTB vào môi trường nuôi cấy, sự chuyển màu môi trường từ xanh dương sang vàng sẽ chứng minh cho sự giảm pH trong hoạt động hòa tan lân của các vi khuẩn (Gupta et al., 2015; Sadiq et al., 2013). Tính chỉ số hòa tan (Solubilisation Index - SI) theo phương pháp của Berraquero et al. (1976) cho phép đánh giá khả năng hòa tan của các dòng vi khuẩn (Marra et al., 2011).

44

Hình 2.15: Sự chuyển màu môi trường khi có chất chỉ thị pH và vòng halo chứng minh khả năng hòa tan phosphate của vi khuẩn (Sadiq et al., 2013)

2.5.3.2. Đánh giá sự hoà tan phosphate vô cơ thông qua các phương pháp khác

Tổng hợp acid hữu cơ không phải là cơ chế hòa tan phosphate vô cơ duy nhất. Người ta quan sát thấy mức độ giải phóng lân và sự giảm pH trong môi trường nuôi cấy không phải lúc nào cũng tương quan thuận (Gulati et al., 2008; Yang et al., 2012). Trong nghiên cứu của Altomare và cộng sự (1999) (trích dẫn của Kumar, 2016), Trichoderma harzianum đã không sản xuất được bất kỳ loại acid hữu cơ nào đã được biết đến. Nấm mốc này và các PSB có thể hòa tan phosphate bằng cách sản sinh ra các hợp chất như calcium chelate, siderophore để khử các hợp chất chứa P và bắt giữ P. Các siderophore và exopolysaccharide có lẽ cũng giúp đưa P về dạng hòa tan thông qua các tương tác liên quan đến điện tích, mặc dầu vai trò và cơ chế của chúng chưa được hiểu rõ (Kumar, 2016; Saharan and Nehra, 2011). Các nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra rằng cơ sở hóa sinh của sự hòa tan phosphate ở nhiều PSB là do oxide hóa trực tiếp (Chauhan et al., 2015). Ngoài ra, các hợp chất mùn với thành phần chứa acid humic và acid fulvic, các enzyme esterase, các siderophore, H2S, CO2, và cơ chế tiết proton đều có liên quan đến sự hòa tan phosphate của các vi sinh vật hòa tan lân (Kumar and Pathak, 2000).

Để định lượng khả năng hoà tan phosphate, phương pháp nuôi cấy lỏng trong môi trường chứa hợp chất chứa lân khó tan, chẳng hạn như Pikovskaya, cũng đã được Nautiyal (1999) đề xuất và phân tích cơ sở khoa học. Người ta thường đo lượng phosphate hoà tan có trong môi trường nuôi cấy thông qua phản ứng màu với thuốc thử xanh molybdate theo phương pháp của Murphy và Riley (1962) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm (Wang et al., 2017). Sự tương quan và hồi quy tuyến tính giữa pH và phosphate tan cũng được nghiên cứu (Liu et al., 2016; Suleman et al., 2018). Bên cạnh đó, hồ sơ về các acid hữu cơ được sinh ra trong dịch nuôi cấy cũng được thiết lập thông qua phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Ngay cả gene mã hoá cho glucose dehydrogenase,

45

vốn được xem là chịu trách nhiệm cho sự hoà tan phosphate, cũng đã được dò tìm (Suleman et al., 2018). Bên cạnh việc định lượng lân hoà tan được tạo ra trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, người ta còn có thể đánh giá khả năng hoà tan lân giữa các nghiệm thức thông qua sự so sánh lượng P còn lại trong các vật liệu chứa phosphate khó tan ban đầu với sự hỗ trợ của một phương pháp chiết rút lân chẳng hạn như phương pháp Olsen (Adnan et al., 2017; Mathivanan et al., 2014).

2.5.4. Xác định khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn

2.5.4.1. Cơ sở của việc nghiên cứu IAA nguồn gốc vi khuẩn

Bên cạnh tác dụng tăng độ phì cho đất và tăng cường dinh dưỡng cho cây thông qua cố định đạm sinh học, hoà tan phosphate và các khoáng khác, các vi khuẩn liên kết thực vật còn được chú ý đến nhờ vào khả năng sản xuất các phytohormone và các hợp chất có tác động lên sự tăng trưởng của cây.

Trong số các phytohormone, acid indole-3-acetic (IAA) do vi khuẩn sản xuất chính là loại auxin đầu tiên được xác định vai trò trong sự tăng trưởng thực vật. IAA được tạo ra bởi rất nhiều loài vi khuẩn nhưng nó lại là một hợp chất không có chức năng rõ ràng trong tế bào của chúng như đối với thực vật. Từ đó, có thể suy đoán rằng có thể vi khuẩn sản xuất ra IAA để cải thiện sự phù hợp trong tương tác giữa vi khuẩn và cây chủ. Bằng việc tạo ra IAA, vi khuẩn đã làm giảm tín hiệu IAA trong thực vật, từ đó làm suy yếu cơ chế bảo vệ của cây chủ bao gồm hệ thống các polysaccharide bề mặt, các hệ thống chất kháng oxy hoá, các chất ức chế tổng hợp ethylene và các gene gây độc của thực vật. IAA còn làm nới lỏng vách tế bào biểu mô rễ, tạo điều kiện cho sự tiết xuất dịch tiết rễ dồi dào hơn, cung cấp các chất cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn vùng rễ (Etesami et al., 2015). Hiệu quả của IAA nguồn gốc vi khuẩn đối với thực vật chủ yếu phụ thuộc vào độ nhạy cảm của cây đối với IAA vi khuẩn và lượng IAA do thực vật tự sản xuất trong mối liên quan đến sự thúc đẩy sản xuất các phytohormone khác (Agrawal et al., 2014).

Các hợp chất indole (Indolic Compounds - ICs) bao gồm IAA hiện diện rộng rãi trong các vi khuẩn liên kết thực vật. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các vi khuẩn vùng rễ có khả năng sản xuất ICs cao hơn là các vi khuẩn sống tự do trong đất ngoài vùng rễ. Các vi khuẩn nội sinh cũng có khả năng này, đặc biệt là các thành viên của họ Enterobacteriaceae như Enterobacter, Escherichia, Grimontella, Klebsiella, Pantoea, và Rahnella (da Costa et al., 2014). Sự tổng hợp ICs của vi khuẩn phụ thuộc vào sự có mặt của các tiền chất trong dịch tiết rễ. Trong đó, L- tryptophan là tiền chất chủ yếu cho con đường sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn. Có sự tương đồng cao giữa lộ trình sinh tổng hợp IAA của thực vật và vi khuẩn. Các vi khuẩn có lợi chủ yếu tổng hợp IAA thông qua lộ trình “acid indole-3-pyruvic” phụ

46

thuộc vào L-tryptophan (trp); trong khi các vi khuẩn gây bệnh cây thường sử dụng lộ trình “indol-acetoamide” phụ thuộc trp. Ngoài 2 lộ trình vừa nêu, một số vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật ví dụ như Azospirillum brasilense có sự tổng hợp IAA không phụ thuộc vào trp (Souza et al., 2015).

Vai trò của IAA có nguồn gốc vi khuẩn trong sự thúc đẩy tăng trưởng thực vật chủ yếu là do tăng cường phát triển hệ thống rễ của cây chủ, từ đó làm gia tăng sự hấp thu nước và chất dinh dưỡng. IAA còn có vai trò quan trọng trong sự hình thành nốt sần và khả năng cố định đạm của các vi khuẩn cộng sinh như rhizobium (Souza et al., 2015). Một khía cạnh rất ít được đề cập chính là khả năng thoái dưỡng IAA của các vi khuẩn ví dụ như Bradyrhizobium japonicum, Pseudomonas putida. Khi đó, IAA trở thành nguồn cung cấp C và N cho vi khuẩn. Khi đồng tái chủng P. putida 1290 với các vi khuẩn gây bệnh như Rahnella aquaticus và Pseudomonas syringae vào cây cải củ, kết quả cho thấy P. putida 1290 phân giải IAA do các vi khuẩn gây bệnh này sinh ra. Từ đó, tác động tiêu cực do nồng độ IAA cao lên cây chủ của các vi khuẩn gây bệnh như Rahnella aquaticus và Pseudomonas syringae cũng bị giảm thiểu (Agrawal et al., 2014; Souza et al., 2015). Dựa trên nghiên cứu này, có thể thấy nếu biết sử dụng và phối hợp các vi khuẩn có khả năng chuyển hóa (tổng hợp hoặc phân giải) IAA một cách hợp lý thì đều có thể khai thác và ứng dụng chúng như là các tác nhân thúc đẩy tăng trưởng thực vật.

2.5.4.2. Các phương pháp sàng lọc vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA

Etesami và cộng sự (2015) đã đề xuất một quy trình sàng lọc và tuyển chọn nhanh các vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây lúa có đặc tính sinh tổng hợp IAA và các đặc tính PGP khác như hòa tan P, sản xuất siderophore và enzyme 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase. Trong đó thí nghiệm sàng lọc các vi khuẩn sản xuất IAA dựa trên khảo sát phản ứng màu của các hợp chất indole với thuốc thử Salkowski, một loại thuốc thử do Gordon và Weber (1951) đề xuất và sau này được nhiều tác giả khác cải tiến và sử dụng (Etesami et al., 2015; Gordon and Weber, 1951).

Thí nghiệm định tính thường tiến hành với việc nhỏ thuốc thử trực tiếp vào dịch huyền phù nuôi cấy vi khuẩn hay trên khuẩn lạc (Raj and Rex, 2014; Shrivastava and Kumar, 2011; Dang and Do, 2018). Thí nghiệm định lượng thường dựa trên phép so màu thông qua việc đo OD ở bước sóng 530 nm (Modi and Patel, 2017; Pandya et al., 2011). Tuy vậy, tùy thuộc lộ trình IAA mà vi khuẩn sử dụng, việc bổ sung hay không bổ sung L-tryptophan vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng nhất định đến lượng IAA sinh ra (Ahmad et al., 2005; Đặng Thị Ngọc Thanh và cộng sự, 2016) (Hình 2.16).

47

Hình 2.16: Thí nghiệm định tính (bên trái) và định lượng khả năng sản xuất IAA với thuốc thử Salkowski (bên phải) (Dang and Do, 2018).

2.5.5. Xác định khả năng sản xuất siderophore của vi khuẩn

Sắt (Fe) là một vi chất thiết yếu cho sự phát triển của cây trồng và vi sinh vật, đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học như quang hợp, hô hấp, sinh tổng hợp chlorophyll và cố định đạm sinh học. Trong đất acid và yếm khí, nồng độ ion Fe2+ thường tăng cao do sự khử ion Fe3+; điều này có thể dẫn đến sự hấp thụ Fe đến mức gây độc. Ngược lại, trong điều kiện hiếu khí, độ hòa tan của sắt thấp, nồng độ ion Fe3+ cao vượt trội dưới dạng các polymer oxyhydroxide, đặc biệt là trong đất giàu calcium; từ đó hạn chế cung cấp Fe cho các hoạt động sống.

Để đối phó với trình trạng thiếu Fe hữu dụng, nhiều vi sinh vật đã phát triển chiến lược việc hấp thụ Fe tích cực. Vi khuẩn có thể sử dụng các siderophore để bắt giữ Fe3+, vận chuyển chúng vào trong tế bào vi khuẩn. Đây là các hợp chất vòng càng (chelator) có khối lượng phân tử thấp, dưới 1000 Dalton, có độ đặc hiệu cao và ái lực cao với sắt. Siderophore thường được chia làm các nhóm chính là catecholate (phenolate), hydroxamate và carboxylate (Souza et al., 2015; Sullivan et al., 2012). Trong các nghiên cứu về vi khuẩn liên kết cây mía, siderophore cùng với hydro cyanide (HCN) và các enzyme thuỷ phân như chitinase, protease thường được kết hợp dò tìm (Modi and Patel, 2017; Shastri et al., 2020). Nhiều tác giả cho rằng có mối liên hệ giữa các hoạt chất này với khả năng kiểm soát sinh học của các PGPB, trong đó có hoạt động đối kháng nấm (Jadhav et al., 2017; Saharan and Nehra, 2011; Souza et al., 2015).

Để sàng lọc vi khuẩn có khả năng sản xuất siderophore, thuốc nhuộm CAS (Chrome Azurol Sulfonate) do Schwyn và Neilands (1987) đề xuất thường được sử dụng phổ biến nhất (Schwyn and Neilands, 1987). Sự đổi màu của thuốc thử CAS (màu xanh dương) khi trộn với dịch nuôi cấy vi khuẩn đã qua ly tâm là một dấu chỉ cho sự có mặt của siderophore (Arora and Verma, 2017;

48

Estela Silva-Stenico et al., 2005; Dang and Do, 2018). Nhiều tác giả cũng đã sử dụng phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch CAS hoặc các loại môi trường cải biên và quan sát sự xuất hiện của vòng halo như sự biểu thị của siderophore (Hu and Xu, 2011; Milagres et al., 1999; Srivastava et al., 2013). Màu sắc chỉ thị cho sự hiện diện của siderophore trong môi trường nuôi cấy có mặt của thuốc thử CAS khá đa dạng, từ cam, hồng, tím cho đến vàng và xanh lục, do sự tương tác phức tạp của hỗn hợp CAS, Fe3+ và Fe2+ (Hình 2.17).

Hình 2.17: Màu sắc chỉ thị của siderophore trong phản ứng với CAS lỏng (bên trái) và CAS đặc (bên phải) (Sullivan et al., 2012; Dang et al., 2019; Dang and Do, 2018)

2.5.6. Định danh vi khuẩn liên kết cây mía dựa trên trình tự gene 16S rRNA

Đối với việc định danh vi khuẩn, có nhiều phương pháp đã được phát triển. Trong các phương pháp truyền thống hay còn gọi là phương pháp phụ thuộc nuôi cấy, sự phân loại được dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, dinh dưỡng và phát triển của vi khuẩn và các cẩm nang phân loại như Cẩm nang vi khuẩn học hệ thống của Bergey (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology), Cẩm nang về vi khuẩn học lâm sàng (Manual of Clinical Microbiology). Tuy nhiên, các phương pháp truyền thống này có thể gặp phải 2 hạn chế lớn. Một là, nó không thể áp dụng cho các vi sinh vật không nuôi cấy được, ví dụ như Tropheryma whippelii. Hai là, trong một số trường hợp, đặc tính sinh hóa của một số vi sinh vật không phù hợp với bất kỳ mô hình của một chi/loài nào đã biết (Woo et al., 2000). Ước đoán trong 1 gram đất chứa khoảng 2.000 đến 8,3 triệu vi sinh vật, đại diện cho hàng nghìn loài nhưng chỉ có khoảng 1% trong số chúng có thể được nuôi cấy bằng các kỹ thuật tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm (Arruda et al., 2014). Do vậy, các phương pháp không qua nuôi cấy đã được phát triển, chẳng hạn như phân tích trình tự gene vi khuẩn thu được từ DNA tổng số tách chiết từ mô thực vật, phân tích đa dạng di truyền gene 16S rRNA bằng DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) từ

49

DNA tổng số thu từ thực vật hay từ đất, phân tích vân tay (fingerprints) PCR- DGGE (Dini-Andreote et al., 2010). Đối với phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reation - PCR), trình tự gene 16S, cả 2 phương pháp phụ thuộc và không phụ thuộc nuôi cấy đều có thể áp dụng.

Trình tự gene 16S rRNA cũng như 18S rRNA đã được Woose và các đồng sự sử dụng từ thập niên 1980 để xây dựng hệ thống phân loại gồm 3 lãnh giới. Gene 16S RNA hiện diện trong các vi khuẩn và vi sinh vật cổ với chức năng được bảo tồn qua thời gian. Sự thay đổi trong trình tự gene này là thước đo chính xác cho thời gian tiến hóa. Với kích thước khoảng 1.500 bp, gene 16S RNA được xem là đủ lớn cho mục đích tin sinh học và là tiêu chuẩn vàng cho sự xác định tên loài vi khuẩn (Janda and Abbott, 2007; Lau et al., 2002). Các trình tự trong vùng biến đổi của gene 16S rRNA cung cấp dữ liệu để phát triển các mẫu dò hoặc mồi chuyên biệt cho việc phát hiện các vi khuẩn cụ thể. Ngược lại, thông tin trình tự từ các vùng bảo tồn của gene 16S rRNA là hữu ích cho việc nghiên cứu các mối quan hệ phát sinh chủng loại, cho việc thiết kế các mẫu dò oligonucleotide trong kỹ thuật lai phân tử, cũng như cho việc thiết kế mồi dùng trong PCR (Mehnaz et al., 2001).

Công dụng và sự thuận tiện của các phương pháp khuếch đại trên nền tảng PCR và việc giải trình tự tự động các sản phẩm PCR đã mở rộng cơ sở dữ liệu về rRNA trong nhiều năm qua. Hiện nay, đã có trên 16.000 trình tự phân tử rRNA từ các sinh vật khác nhau đã được thống kê phân loại. Trong đó có 8.168 tên loài đã được xác định và công bố dựa trên trình tự 16S rRNA. Sự phong phú của thông tin trình tự 16S rRNA thu thập được hiện nay đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định các chủng vi khuẩn mới bằng cách so sánh trình tự chuỗi với cơ sở dữ liệu có trong các ngân hàng gene (Janda and Abbott, 2007; Mehnaz et al., 2001). Tuy nhiên, nhiều dữ liệu trình tự đã được công bố lại có kích thước quá ngắn so với cỡ 1.500 bp của gene 16S. Do vậy, gần đây một nghiên cứu của Větrovský and Baldrian (2013) đã xác nhận con số 7.081 trình tự 16S rRNA, chiết xuất in silico từ 1.690 bộ gene vi khuẩn hoàn chỉnh hiện có trong GenBank của Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia, Hoa Kỳ (National Center for Biotechnology - Information NCBI).

Độ chính xác của các phân tích khuếch đại gene 16S RNA phụ thuộc rất lớn vào sự lựa chọn cặp mồi. Có 3 kích cỡ khuếch đại (amplicon) phù hợp, đó là: trình tự ngắn (100 – 400 bp), trung bình (400 – 1.000 bp), và dài (≥1.000 bp) (Klindworth et al., 2013). Dựa trên cơ sở này, các cặp mồi phổ quát hoặc chuyên biệt đã được thiết kế nhằm khuếch đại các trình tự gene 16S theo mục tiêu mong muốn. Theo Galkiewicz and Kellogg (2008), trong khi các mồi xuôi 8F, 27F và 63F được xem như là mồi chuyên cho vi khuẩn thì các mồi ngược 1492R và 1542R lại được xem như các mồi phổ quát (Galkiewicz and Kellogg, 2008). Việc

50

sử dụng một trong các cặp mồi xuôi và ngược này trong PCR sẽ cho băng khuếch đại có kích thước gần như tối đa. Cặp mồi 8F và 1492R đã được sử dụng cho phân tích phả hệ của một số vi khuẩn (Eden et al., 1991; Turner et al., 1999). Cũng bằng phương pháp này nhưng với cặp mồi 27F và 1492R cho sản phẩm của PCR có kích thước khoảng 1.500 bp, Pisa và cộng sự (2011) đã sử dụng trong phân tích đa dạng gene 16S rRNA của các vi khuẩn đất vùng rễ cây mía trồng ở Brazil. Tương tự, trong nghiên cứu vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở Brazil, Magnani và cộng sự (2010) đã sử dụng phương pháp khuếch đại bằng PCR với cặp mồi Y1và Y2 và giải trình tự gene 16S rRNA, kết hợp so sánh với dữ liệu của NCBI để định danh vi khuẩn. Ngoài ra, một dấu hiệu nhận diện vi khuẩn nội sinh đã được đề xuất dựa trên công trình của Zinniel và cộng sự (2002), đó là sự hiện băng của 900 bp khi điện di sản phẩm PCR khi khuếch đại gene 16S rRNA với cặp mồi p515FPL và p13B do Relman và cộng sự (1992) đề xuất kết hợp với mồi PCR-1 của các tác giả. Zinniel và cộng sự (2002) đã phân lập và nhận diện hàng trăm dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ hàng chục loại thực vật thân thảo ở Trung Tây Hoa Kỳ. Đây chính là cơ sở cho việc sử dụng các cặp mồi này trong nghiên cứu trình tự gene 16S rRNA các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía của đề tài luận án.

2.6. Nuôi cấy mô thực vật và một số kết quả trong vi nhân giống mía

Cái khó trong thử nghiệm hiệu quả in vivo của các PGPB trên cây mía trồng trong ống nghiệm là sự tạo nguồn nguyên liệu gnotobiotic, bởi vì đây là một loại cây không gieo trồng bằng hạt. Cây mía trong ống nghiệm có thể được tạo ra nhờ các quy trình tạo cây sạch đã công bố, ví dụ như quy trình của Lee và Bressan (2005). Từ đây, các dòng vi khuẩn đã qua xác định đặc tính sẽ tiếp tục được tái chủng vào cây mía dưới hình thức đơn lẻ từng dòng hay phối hợp. Cây mía sau khi chủng có thể được đặt tiếp trong điều kiện nuôi cấy in vitro hay chuyển sang trồng trong bình Leonard trong nhà lưới để nghiên cứu tác dụng của vi khuẩn lên cây trồng ở giai đoạn sớm. Đối với các thí nghiệm đánh giá trên năng suất mía, các cây mía được tạo ra từ hom tỏ ra phù hợp hơn.

2.6.1. Một số nguyên lý và vai trò của nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô thực vật hay còn gọi là vi nhân giống cây là nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng đối với các tế bào, mô, cơ quan hoặc toàn bộ thực vật. Xuất phát từ nguồn vật liệu vô tính ban đầu, trong điều kiện dinh dưỡng và môi trường được kiểm soát, kết quả thu được thường là các dòng thực vật giống nhau về kiểu gene và đồng đều về sự tăng trưởng. Trong điều kiệm kiểm soát bao gồm chất dinh dưỡng đầy đủ, độ pH vừa phải, nhiệt độ, môi trường khí và lỏng thích hợp, mô thực vật đã được cung cấp một môi trường thuận lợi, đảm bảo cho sự sinh trưởng và nhân bản (Hussain et al., 2012).

51

Nuôi cấy mô thực vật dựa trên tính toàn năng của thực vật, khả năng của tế bào có thể tạo nên cây hoàn chỉnh trong điều kiện thích hợp. Các tế bào đơn hay các bộ phận như lá, thân rễ, chồi ngọn đều có thể được sử dụng như là nguyên liệu để tái tạo cây mới trong điều kiện môi trường dinh dưỡng khoáng và liều lượng phytohormone thích hợp.

Thành phần chính của môi trường dinh dưỡng bao gồm khoáng đa lượng và vi lượng, đường, vitamin và một số hợp chất hữu cơ khác. Agar có thể được thêm vào để tạo ra môi trường đặc hoặc bán đặc tuỳ theo mục đích nuôi cấy. Môi trường khoáng được dùng phổ biến nhất hiện nay là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962). Các phytohormone thường được dùng trong nuôi cấy mô là các auxin, cytokinin và gibberellin với nồng độ thích hợp. Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh về mức 5,4 – 5,8 (Hussain et al., 2012).

Nuôi cấy mô thực vật cho mục đích nhân giống có một số ưu điểm so với nhân giống truyền thống và hơn thế, nó còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Vi nhân giống cho phép sản xuất số lượng lớn cây con trong một thời gian ngắn. Các mẫu cấy được khử trùng và làm sạch các vi sinh tạp nhiễm, do vậy các cây con được tạo ra trong vi nhân giống là cây sạch bệnh. Mặt khác, vi nhân giống có thể áp dụng đối với các loại cây có hạt khó nảy mầm hoặc thời gian nảy mầm kéo dài. Trong trường hợp các cây không có hạt, cây con cũng có thể được tạo ra từ các bộ phận khác nhau của cây bằng phương pháp vi nhân. Vi nhân giống có thể được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: cung cấp cây giống cho sản suất nông nghiệp, nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thực vật, tương tác thực vật với môi trường (Idowu et al., 2009).

2.6.2. Quy trình và một số kết quả trong vi nhân giống mía

Một quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô thường gồm 4 giai đoạn: Thiết lập điều kiện nuôi cấy vô trùng; Nhân giống vô tính in vitro; Chuyển cây ra vườn ươm; Trồng cây ngoài đồng ruộng. Trong đó, giai đoạn “nhân giống in vitro” đối với cây mía thường trải qua các bước sau đây: Kích hoạt sự nhân giống in vitro từ vật liệu ban đầu (mô phân như đỉnh sinh trưởng hay mắt mầm; các mô khác như lá non, trục lá) (Hình 2.18 A); Khởi xướng tạo chồi trực tiếp từ vật liệu ban đầu (Hình 2.18 B); Nhân nhanh chồi tạo cụm chồi và cảm ứng tạo rễ (Hình 2.18 C); Làm cứng cây và tách rời các cây con (Hình 2.18 D) trước khi đưa ra vườn ươm (Hình 2.18 E) (Kaur and Sandhu, 2015; Nguyễn Viết Hưng và cộng sự, 2012).

52

Hình 2.18: Các giai đoạn cơ bản của một quy trình nhân nhanh giống mía (Kaur and Sandhu, 2015 - có sửa đổi)

Đối với vi nhân giống mía, mục đích chính là để cung cấp một số lượng lớn cây con sạch bệnh cho sản xuất hoặc nghiên cứu. Do vậy, các nghiên cứu thường tập trung vào phát triển môi trường nuôi cấy, đặc biệt là thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng sao cho đạt hệ số nhân chồi cao và các cây con phát triển tốt. Phần trình bày sau đây sẽ tập trung vào một số kết quả đạt được trong nhân giống in vitro cây mía trên thế giới và ở Việt Nam sau năm 2000 làm cơ sở cho việc lựa chọn nguồn vật liệu ban đầu và chương trình hormone phù hợp cho sự tạo chồi, tạo rễ và tạo cây hoàn chỉnh.

Vật liệu khởi đầu cho nhân giống mía khá đa dạng, từ mô phân sinh như đỉnh sinh trưởng (Mekonnen et al., 2014) hay đầu rễ (Sabaz et al., 2008), cho đến các tế bào trục lá (Kaur and Sandhu, 2015), hay từ lá non và thông qua mô sẹo (Kambaska and Santilata, 2009). Các nghiên cứu này cho thấy trong chương trình tạo chồi, các cytokinin như BAP, kinetin thường được dùng riêng lẻ hay phối hợp với các gibberellin như GA3. Trong khi đó, các auxin như NAA, IBA thường được sử dụng cho sự tạo rễ. Nếu tạo chồi thông qua mô sẹo thì tổ hợp các auxin (2,4-D, IBA, NAA) thường được sử dụng trước. Sau đó tái sinh chồi từ mô sẹo với tổ hợp các cytokinin (BAP, kinetin) và auxin (IBA, NAA) (Kambaska and Santilata, 2009). Ngoài ra thành phần dinh dưỡng khoáng MS là toàn phần hay bán phần, nồng độ sucrose cũng ảnh hưởng đến sự biệt hoá tạo chồi và tạo rễ.

Đối với sự tạo chồi, nếu xuất phát từ đỉnh sinh trưởng thì tổ hợp cytokinin có tác dụng nhân chồi tốt nhất là 2 mg/L BAP và 0,25 – 0,5 mg/L kinetin và tuỳ thuộc vào giống mía (Mekonnen et al., 2014; Ramanand and Lal, 2004). Nếu xuất phát từ rễ thì tổ hợp giữa cytokine và gibberellin có tác dụng nhân chồi tốt nhất; trong đó nồng độ thích hợp là 0,5 – 1,0 mg/L BAP và 0,1 – 0,5 mg/L GA3 tuỳ thuộc vào giống mía (Ramanand and Lal, 2004; Sabaz et al., 2008).

53

Đối với cảm ứng tạo rễ từ cụm chồi để tạo cây hoàn chỉnh, nghiên cứu cho thấy hormone thích hợp là NAA, với các nồng độ từ 0,5 – 7,0 mg/L. Một số nghiên cứu khác cho thấy IBA phù hợp với sự tạo rễ, với nồng độ sử dụng từ 0,5 – 1,5 mg/L. Ngoài ra, loại hormone và liều lượng còn tuỳ thuộc vào nguồn vật liệu và giống mía khảo sát (Abu, 2014; Ramanand et al., 2007; Sabaz et al., 2008; Shafique et al., 2015). Ở Việt Nam, nghiên cứu trên giống mía VN84-4137 cho thấy môi trường MS có bổ sung 1 mg/L NAA (1 ppm) là phù hợp nhất cho cảm ứng tạo rễ từ chồi (Lê Phi Long và Phan Thị Thu Hiền, 2014); trong khi ở hai giống mía ROC26 và HB1, nồng độ NAA thích hợp là 0,5 mg/L (Hà Thị Thuý và cộng sự, 2013).

Như vậy, qua các công trình nghiên cứu vi nhân giống mía, có thể thấy chương trình biệt hoá tạo chồi xuất phát từ mô phân sinh đỉnh là sự phối hợp BAP và kinetin, và sự tạo rễ từ cụm chồi thường sử dụng NAA. Điều đáng chú ý là mặc dù loài mía đường thường được trồng phổ biến hiện nay trên thế giới là loài mía quý Saccharum officinarum L., nhưng giữa các giống khác nhau lại có một sự đáp ứng hormone khác nhau. Do vậy, trên nền tảng của các tổ hợp hormone thường dùng, cần triển khai các nghiên cứu nhằm tìm ra một chương trình vi nhân phù hợp với giống mía cụ thể của địa phương.

54

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Như đã trình bày ở chương 2, các phương pháp phân lập, nhận diện, và đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn liên kết cây mía đã được phát triển và vận dụng tại nhiều nước trên thế giới. Chương này trình bày chi tiết việc vận dụng các phương pháp trên một cách phù hợp với điều kiện, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài luận án.

3.1. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm

3.1.1. Mẫu đất và cây mía trong thí nghiệm phân lập và khảo sát đặc tính vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật

Các mẫu đất vùng rễ, các mẫu rễ và mẫu thân cây mía được thu từ 41 địa điểm khác nhau thuộc 29 xã ở 7 huyện của tỉnh Tây Ninh. Các giống mía thu thập là các giống được trồng phổ biến ở Tây Ninh bao gồm K95-84, K95-156, K88-92, K88-65 và Khonkaen 3.

3.1.2. Các giống mía dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vivo của vi khuẩn

Các giống mía dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn là giống VN-85-1859 và K95-156. Giống mía VN85-1859 được dùng thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở quy mô trồng trong bình Leonard. Giống K95-156 được dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở quy mô trồng trong chậu và ngoài đồng.

VN85-1859 là một giống mía do Viện Nghiên cứu Mía Đường lai tạo, chọn lọc từ năm 1985, có năng suất cao, chất lượng khá, chín trung bình - sớm. Mía có thân to, lóng hình chùy, nối nhau theo kiểu zig-zag, màu tím ẩn vàng. Lá trên ngọn thẳng đứng, dưới gốc hơi cong ở ngọn lá. Phiến lá xanh đậm, rộng; bẹ lá màu phớt tím, có nhiều lông, dễ bóc lá. Mía mọc mầm nhanh và đều; đẻ nhánh mạnh. Mật độ cây hữu hiệu khá cao, lưu gốc tốt. Giống này chịu hạn khá, ít bị sâu hại. Năng suất bình quân 80 tấn/ha, đạt trên 120 tấn/ha ở những vùng đủ ẩm và chữ đường khoảng 11 % (Trung tâm Khuyến nông Quốc gia, 2003).

K95-156 là giống mía có nguồn gốc Thái Lan, được trồng phổ biến ở Tây Ninh. Cây mọc mầm khỏe, đồng đều, đẻ nhánh khá, tốc độ vươn lóng nhanh, mật độ cây cao. Cây có khả năng chống chịu sâu đục thân, chống bệnh than, chịu hạn, ít bị đổ ngã, lưu gốc tốt. Giống mía K95-156 khi trồng tại Tây Ninh trong điều kiện không tưới nước bổ sung có thể cho năng suất 88,1 tấn/ha/vụ, chữ đường đạt 11,53%, thu hoạch khi cây đạt khoảng 11 – 12 tháng tuổi (http://tsri.com.vn/chuyen-muc-cay-mia-ct/giong-mia-k95-156/333.aspx).

55

3.1.3 Đất trồng mía dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở quy mô trong chậu và ngoài đồng

Đất trồng mía trong chậu được thu từ lớp đất mặt có độ sâu từ 0 – 20 cm, tại khu C1-TSX thuộc Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, số 99 Bình Hòa, Châu Thành, Tỉnh Tây Ninh. Đây cũng là khu đất sử dụng cho thí nghiệm trồng mía quy mô ngoài đồng.

3.1.4. Phân bón hoá học dùng trong thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở quy mô trong chậu và ngoài đồng

Các loại phân bón hoá học đã sử dụng để bón cho mía là do Công ty Cổ phần Phân bón Miền Nam sản xuất. Ba loại phân và tỷ lệ sử dụng là: NPK (16- 16-8) và NPK (17-7-17), và phân kali (KCl) với thành phần K2O khoảng 61%.

3.1.5. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

Dụng cụ chủ yếu dùng trong nghiên cứu gồm: chày, cối sứ, đĩa Petri, chai lọ thủy tinh, ống nghiệm thủy tinh có nắp đậy, ống Falcon, ống nghiệm, ống đong, cốc đong, bình tam giác, ống ly tâm, ống nhỏ giọt, burette, các loại pipette Eppendorf (0,5-10 μL, 10-100μL, 100-1000μL, 0,1-5 mL), que cấy các loại, lame thường và lõm, lamelle, trắc vi thị kính và vật kính, kính lúp, đèn cồn, găng tay cao su và một số dụng cụ khác như tấm nylon, bọc nylon, thước đo, chậu nhựa trồng cây, các loại cân từ 1 kg đến 50kg.

Thiết bị đã sử dụng chủ yếu là thiết bị dùng trong nghiên cứu vi sinh, sinh hóa và sinh học phân tử, gồm: kính hiển vi quang học Olympus CX22, kính hiển vi soi nổi INSIZE ISM-ZS30, máy đếm khuẩn lạc LEICA QUEBEC, cân phân tích Sartorius Bp210s, máy đo pH Mettler Toledo Quattro MP220 Basic, máy khuấy từ gia nhiệt IKA RH Basic 2, máy vortex Labnet VX100, máy cất nước Taisaite TT98-II, tủ lạnh âm sâu KW Apparecchi Scientifici, máy lắc Hoefer Pharmacia Biotech Red Rotor, nồi khử trùng nhiệt ướt Tomy ES-315, tủ cấy ESCO Labculture Class II Type A2 Biohazard Safety Cabinet, tủ ấm Memmert INB400, tủ sấy Binder ED115, máy đo quang phổ Pharmacia Biotech Novaspec II, máy đo quang phổ acid nucleic Eppendorf BioSpectrometer basic, bồn ủ Grant SUB Aqua Pro SAP5, máy PCR Bio-Rad Thermoal Cycler C1000, bộ điện di Hoefer SUB15 Standard Submarine Gel, hệ thống chụp hình gel Maestrogen Mini- imager™ Gel Documentation System-UV/LED, máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C, lò vi sóng Sanyo, máy đo độ Brix cầm tay.

56

3.2. Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thu thập và xử lý mẫu đất và cây mía

3.2.1.1. Thu thập mẫu đất và cây mía

Căn cứ số liệu thống kê diện tích trồng mía của Cục thống kê tỉnh Tây Ninh và các vùng phân bố mía nguyên liệu của Công ty cổ phần Mía Đường Thành Thành Công Tây Ninh, chọn 7 huyện của tỉnh Tây Ninh để lấy mẫu. Mẫu được thu tại 41 cánh đồng mía trồng trên đất xám thuộc 7 huyện này. Ở mỗi huyện, mẫu được lấy ít nhất ở 3 xã khác nhau. Ở các huyện có diện tích trồng mía lớn, số mẫu được thu nhiều hơn so với các huyện có diện tích trồng mía nhỏ hơn.

Tùy theo hình dạng và của ruộng mía, lấy ít nhất tại 4 điểm phân bố đều trên toàn diện tích theo quy tắc lấy theo đường chéo. Không lấy mẫu ở các vị trí đặc thù như gần bờ, vị trí quá trũng hay quá cao (Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998). Trên mỗi ruộng mía, tiến hành thu ít nhất 4 cây theo nguyên tắc ngẫu nhiên. Chọn cây mía đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh, khoảng 6 tháng tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh gạt bỏ lớp đất bề mặt (1 – 3 cm) quanh gốc, thu toàn bộ đất vùng rễ và cây mía (khoảng 30 cm từ gốc) cho vào túi nylon, ghi và dán nhãn bao gồm ký hiệu mẫu, thời gian, địa điểm, người lấy mẫu. Mẫu sau khi thu thập, vận chuyển về phòng thí nghiệm để xử lý trong vòng 24 giờ (Viện thổ nhưỡng nông hóa, 1998). Có tổng cộng 135 mẫu cây mía và đất bao quanh rễ đã được thu thập.

Mẫu đất dành cho nghiên cứu thành phần dinh dưỡng, sau khảo nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật, cũng đã được tiến hành thu thập theo nguyên tắc ngẫu nhiên trên toàn diện tích. Dùng khoan thu lấy 3 mẫu đất trên mỗi lô phụ ở độ sâu 0 – 30 cm theo TCVN 7538 - 2: 2005 (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2005). Mỗi mẫu đất được cho vào túi nylon, ghi và dán nhãn, trữ lạnh và vận chuyển tới phòng thí nghiệm để xử lý trong vòng 24 giờ.

3.2.1.2. Xử lý mẫu đất và mẫu cây mía

Đối với mẫu đất bao quanh mỗi bộ rễ, lắc mạnh bộ rễ để tách rời đất khối ra khỏi bộ rễ và vỏ rễ (Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998). Các mẫu đất khối trong cùng một đồng mía (một địa điểm thu mẫu) được trộn chung với nhau và tiến hành lấy mẫu trung bình (mẫu diện rộng) (TCVN 7538 - 2:2005). Theo cách này, có tổng cộng 41 mẫu đất khối đã được sử dụng cho thí nghiệm phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng và đếm mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân. Các mẫu đất được bảo quản trong lọ sạch ở 5 oC và được sử dụng tối đa trong vòng một tháng.

57

Đối với đất vùng rễ, dùng dụng cụ vô trùng và găng tay cao su để thu lấy phần đất còn lại ở bộ rễ (Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998). Mỗi mẫu đất được thu từ vùng rễ của mỗi cây mía là một mẫu đơn, nguyên (TCVN 7538 - 2:2005). Theo cách này, có tổng cộng 135 mẫu đất đã được sử dụng cho thí nghiệm phân lập vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân có trong vùng rễ. Các mẫu đất được bảo quản trong lọ sạch ở 5oC và được sử dụng tối đa trong vòng một tháng (Cao Ngọc Điệp, 2011).

Đối với các mẫu đất dùng để phân tích thành phần dinh dưỡng đất sau khi trồng mía ngoài đồng, 3 mẫu đất thu thập trong cùng một lô phụ được xáo trộn với nhau và tiến hành lấy mẫu trung bình (TCVN 7538 - 2:2005). Theo cách này, có tổng cộng 16 mẫu đất tương ứng với 16 nghiệm thức khác nhau về thành phần phân bón và vi khuẩn bổ sung (xem thêm mục bố trí thí nghiệm ngoài đồng). Các mẫu đất được bảo quản trong lọ sạch ở 5oC và được sử dụng tối đa trong vòng một tháng.

Đối với mẫu mô mía, sau khi xử lý để thu các loại mẫu đất, phần cây mía còn lại được cắt riêng rẽ thành từng phần thân và rễ, rửa thật sạch dưới vòi nước chảy để loại bỏ đất, bụi bẩn và để ráo tự nhiên. Thân và rễ mía không có dấu hiệu nhiễm bệnh tiếp tục được cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 1 cm, cho vào lọ sạch, bảo quản trong tủ lạnh ở -5oC và sử dụng trong vòng 10 ngày (Cao Ngọc Điệp, 2011). Mẫu mô từ mỗi cây mía được trữ riêng lẻ; theo cách này có 135 mẫu thân và 135 mẫu rễ đã được sử dụng cho thí nghiệm phân lập vi khuẩn nội sinh cố định đạm.

3.2.2. Phân tích một số chỉ tiêu dinh dưỡng của đất

Các thí nghiệm này được dùng để phân tích, xác định một số đặc tính dinh dưỡng cơ bản của đất trồng mía. Mỗi mẫu đất thu được (như đã trình bày ở phần 3.2.1.1) được xem là một nghiệm thức và được phân tích 3 lần với 3 lần trích từ mẫu lưu trữ.

Các chỉ tiêu phân tích và phương pháp sử dụng bao gồm: pHH2O, chất hữu cơ tổng số (phương pháp Walkley-Black), đạm tổng số (phương pháp Kjendahl), lân dễ tiêu (chiết rút theo phương pháp Bray 2) (Viện thổ nhưỡng nông hóa, 1998).

3.2.3. Xác định mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân trong đất vùng rễ cây mía và sự tương quan với các chỉ tiêu dinh dưỡng đất

Mục đích của thí nghiệm nhằm đánh giá độ phong phú của các vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân có trong đất vùng rễ cây mía và sự tương quan giữa chúng với các chỉ tiêu dinh dưỡng của đất. Trong môi trường Burk không N, vi khuẩn nào phát triển được chứng tỏ chúng có khả cố định đạm sinh học. Ngược lại, trong môi trường NBRIP chứa calcium orthophosphate như nguồn P duy nhất, để phát triển được vi khuẩn cần có khả năng hoà tan nguồn lân này để sử dụng.

58

Thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn được thực hiện theo phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop Plate Counts) do Hoben và Somasegaran (1982) đề xuất và được mô tả bởi Cao Ngọc Điệp (2011). Phân tích hồi quy tuyến tính đơn được thực hiện nhờ Microsoft excel 2010.

3.2.3.1. Xác định mật số vi khuẩn

Đất khối thu được trong ruộng mía đã trải qua khâu xử lý đã được nghiền mịn trong cối sứ. Cân 10 g mẫu đất vùng rễ được cho vào bình tam giác chứa 90 mL nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 30 phút. Dịch khuẩn được pha loãng thành một dãy liên tiếp với hệ số pha loãng là 10.

Đối với mỗi mẫu đất, tiến hành song song 2 lô thí nghiệm: (1) sử dụng môi trường thạch đĩa Burk không đạm (Park et al., 2005) (Bảng: 3.1) cho việc xác định mật số vi khuẩn cố định đạm, và (2) sử dụng môi trường thạch đĩa NBRIP (Nautiyal, 1999) (Bảng: 3.2) cho việc xác định mật số vi khuẩn hòa lân.

Bảng 3.1: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường Burk (Park et al., 2005)

Tên môi trường Nồng độ (g/l) Hóa chất Sucrose 10

Môi trường Burk

KH2PO4 K2HPO4 Na2SO4 CaCl2 MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O Agar pH 0,41 0,52 0,05 0,2 0,1 0,005 0,0025 15 (đặc) 1,8 (bán đặc) 7,0 ± 0.1

Bảng 3.2: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999)

Hóa chất

Tên môi trường

Nồng độ (g/l)

Môi trường NBRIP

Glucose Ca3(PO4)2 MgCl2.6H2O MgSO4.7H2O KCl (NH4)2SO4 Agar pH

10 5 5 0,25 0,2 0,1 15 (đặc) 7,0

59

Mỗi đĩa thạch được chia làm 3 ô (hoặc nhiều hơn). Trong mỗi ô ứng với một nồng độ pha loãng, tiến hành nhỏ 5 giọt dịch huyền phù vi khuẩn với thể tích 10 µL/giọt. Ủ các đĩa ở 28 ± 2oC. Sau 24 – 48 giờ tiến hành quan sát, chọn ô phù hợp và đếm số khuẩn lạc (Hình 3.1). Tính số khuẩn lạc trung bình theo công thức: Số CFU/1 mL mẫu = số khuẩn lạc trung bình x 102 x độ pha loãng (Cao Ngọc Điệp, 2011).

Hình 3.1: Phương pháp đếm sống nhỏ giọt (A) và minh họa kết quả thu được sau khi ủ (B) (Cao Ngọc Điệp, 2011; Hoben and Somasegaran, 1982)

3.2.3.2. Xác định tương quan và hồi quy tuyến tính đơn giữa các chỉ tiêu

Tương quan và hồi qui tuyến tính đơn (Simple Linear Regression Analysis) giữa mật số vi khuẩn cố định đạm, mật số vi khuẩn hòa tan lân với các chỉ tiêu dinh dưỡng đất được xác định. Trong đó, mỗi chỉ tiêu dinh dưỡng đất là một biến độc lập và mật số vi khuẩn là biến phụ thuộc. Đường thẳng hồi quy, phương trình hồi quy và hệ số tương quan R (sample correlation coefficent) được xác định thông qua sự hỗ trợ của Microsoft excel 2010.

3.2.4. Phân lập và bảo quản các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân từ đất vùng rễ cây mía

Các thí nghiệm này cho phép thu nhận các dòng vi khuẩn vùng rễ có cả 2 khả năng là cố định đạm và hòa tan phosphate vô cơ bằng cách phân lập và nuôi cấy trên môi trường Burk không N và môi trường NBRIP chứa calcium phosphate khó tan. Dòng vi khuẩn nào phát triển được trên cả hai loại môi trường này chứng tỏ chúng có cả 2 khả năng. Hơn thế, trên môi trường NBRIP đặc, vòng halo xuất hiện quanh khuẩn lạc còn là một dấu chỉ quan trọng của sự hòa tan calcium phosphate.

60

Đất vùng rễ mía đã qua khâu xử lý được nghiền mịn trong cối sứ. Cân 10 g mẫu đất vùng rễ được cho vào bình tam giác chứa 90 mL nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 3 giờ. Lọc qua giấy lọc đã hấp khử trùng, thu lấy dịch lọc. Dung dịch trên được tiến hành pha loãng theo hệ số 10.

Lấy 0,1 mL dung dịch đất ở độ pha loãng 10-7 đến 10-9 (Baldani et al., 2014 a) và cấy trải trên đĩa Petri chứa môi trường Burk không N (công thức theo Park et al., 2005) (Phụ lục 3.1) và môi trường NBRIP (công thức theo Nautiyal, 1999) (Phụ lục 3.2). Các đĩa Petri tiếp tục được ủ ở 28 ± 2oC, trong vòng 24 – 48 giờ.

Sau 24 – 48 giờ, xuất hiện các khuẩn lạc khác nhau trên bề mặt môi trường. Chọn khuẩn lạc nằm rời trên đường cấy để tiếp tục cấy chuyển cho đến khi thuần. Kiểm tra dòng thuần dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại x400 bằng phương pháp giọt ép (Cao Ngọc Điệp, 2011).

Để thu được các dòng vi khuẩn có cả 2 khả năng, các dòng thuần phân lập được trên môi trường Burk đã được cấy chuyển sang môi trường NBRIP và ngược lại. Chọn lọc những dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên cả hai loại môi trường Burk và NBRIP để lưu trữ và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Mỗi dòng thuần được lưu trữ bằng phương pháp cấy chuyển định kỳ trên môi trường thạch nghiêng ở 5°C để giữ giống, phục vụ cho các thí nghiệm về sau. Lưu trữ dài hạn bằng phương pháp bổ sung dầu khoáng trên bề mặt khuẩn lạc. Đậy kín ống nghiệm và trữ trong tủ đông ở -20oC (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2003; Trần Linh Thước và cộng sự, 2001).

3.2.5. Phân lập và bảo quản các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân nội sinh trong cây mía

Các thí nghiệm sau đây cho phép phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm bằng cách chủng dịch chiết mô thực vật vào môi trường LGI bán đặc không N. Tiêu chí của một vi khuẩn nội sinh là phải được phân lập từ bên trong mô thực vật đã qua công đoạn khử trùng bề mặt do Reinhold- Hurek và Hurek (1998) đề xuất đã được bảo đảm. Kế đến, sự xuất hiện của lớp màng mỏng (pellicle) trong môi trường bán đặc không N đã chứng minh cho sự có mặt của các vi khuẩn cố định đạm vi hiếu khí theo mô tả của Baldani cộng sự (2014 a). Việc cấy chuyển các dòng thuần sang môi trường NBRIP cho phép chọn lọc những dòng có cả 2 khả năng cần tìm.

3.2.5.1. Khử trùng bề mặt mô thân, rễ của cây mía

Các mẫu rễ và thân mía đã qua xử lý được cắt thành từng đoạn khoảng 1 cm, cho vào bình tam giác 250 mL. Cho cồn 70o vào bình tam giác vừa ngập mẫu, lắc nhẹ bình trong thời gian 3 phút. Sau đó, mẫu rửa sạch 4 lần bằng nước

61

cất vô trùng. Tiếp tục cho calcium hypochloride 2,5% vào bình vừa ngập mẫu, lắc nhẹ bình trong 5 phút. Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần (5 phút/lần).

Lấy 100 µL nước rửa lần thứ 5 của mỗi mẫu đem cấy trải trên các đĩa chứa môi trường TYGA (trypton - yeast extract - glucose - agar) (Bảng 3.3) và ủ ở 28 ± 2oC. Sau 3 ngày, nếu trên các đĩa môi trường TYGA không xuất hiện khuẩn lạc thì các mẫu tương ứng được xem là đã khử trùng bề mặt thành công (Cao Ngọc Điệp, 2011). Các mẫu này tiếp tục được đưa vào công đoạn trích dịch chiết. Các mẫu khử trùng không đạt hiệu quả sẽ bị loại bỏ.

Bảng 3.3: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường TYGA

Tên môi trường

Hóa chất Trypton Nồng độ (g/l) 10

Môi trường TYGA

Yeast extract Glucose Agar 5 1 15

3.2.5.2. Ly trích dịch chiết từ mô mía và chủng vào môi trường không đạm bán đặc

Mẫu mía đã khử trùng bề mặt thành công đã được cho vào cối vô trùng, nghiền nhuyễn trong điều kiện vô trùng. Cho thêm 0,5 – 1 mL nước cất vô trùng vào cối trộn đều. Sau đó, dịch trích được chuyển sang trữ trong ống Eppendorf 2 mL. Hút 500 µL dịch trích mẫu chủng vào các ống nghiệm chứa 5 mL chứa môi trường LGI không N bán đặc (Bảng 3.4). Các ống nghiệm được đậy kín và ủ ở 28 ± 2oC, trong vòng 2 – 4 ngày (Cao Ngọc Điệp, 2011).

Bảng 3.4: Thành phần và nồng độ hóa chất của môi trường LGI (Cavalcante et al., 1988)

Tên môi trường

Môi trường LGI

Hóa chất Sucrose KH2PO4 K2HPO4 MgSO4.7H2O CaCl2 FeCl3 Na2MoO4.2H2O Bromothmol blue 0.5% trong KOH 0,2N Agar

pH Nồng độ (g/l) 100 0,6 0,2 0,2 0,02 0,01 0,002 5 ml 15 (đặc) 1,8 (bán đặc) 6.0

3.2.5.3. Chọn lọc, làm thuần và bảo quản các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân

Sau 2 – 4 ngày, nếu trong ống nghiệm chứa môi trường LGI không N bán đặc có sự xuất hiện của một lớp màng mỏng màu vàng, đục, cách bề mặt môi trường khoảng 0,5 – 1,0 cm thì chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh

62

cố định đạm trong dịch trích mẫu mía. Dùng que cấy lấy một vòng dịch trong lớp màng mỏng này và cấy ria sang đĩa Petri chứa môi trường LGI đặc và tiếp tục ủ ở 28 ± 2oC, trong vòng 2 – 4 ngày (Cao Ngọc Điệp, 2011).

Sau thời gian ủ, trên bề mặt môi trường LGI đặc sẽ xuất hiện các khuẩn lạc khác nhau. Lựa chọn khuẩn lạc có hình thái khác nhau, nằm rời trên đường ria để tiếp tục cấy chuyển sang môi trường LGI đặc cho đến khi thu được dòng thuần. Kiểm tra dòng thuần bằng kính hiển vi quang học (Cao Ngọc Điệp, 2011).

Cấy chuyển các dòng thuần thu được sang đĩa Petri chứa môi trường NBRIP đặc. Các khuẩn lạc phát triển được trên môi trường NBRIP với sự xuất hiên vòng halo là dấu chỉ cho sự hòa tan lân. Thu nhận các dòng này để bảo quản và tiếp tục nghiên cứu (thực hiện như mục 3.2.3 nêu trên).

3.2.6. Mô tả hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn thu được

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn là một trong những tiêu chí quan trọng để phân biệt giữa các dòng. Hơn thế, profile của mỗi dòng được lưu trữ sẽ là một phương tiện đối chiếu với kết quả nhận diện (định danh) vi khuẩn về sau.

Hình thái khuẩn lạc được xác định bao gồm: kích thước, màu sắc, hình dạng, độ nổi, dạng bìa. Hình dạng tế bào và khả năng chuyển động của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1.000 lần (Cao Ngọc Điệp, 2011).

Phương pháp nhuộm Gram được thực hiện trên mẫu vi khuẩn qua nuôi cấy trong vòng 24 giờ; tiến hành thao tác theo mô tả của Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (2003) với đối chứng Gram âm là vi khuẩn E. coli do Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Hoá chất nhuộm Gram được trình bày ở Phụ lục 3.1.

Việc chụp ảnh hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopes - SEM) và nhuộm Gram được thực hiện giới hạn trong các dòng có đặc tính tốt, cần bổ sung thêm các đặc điểm hình thái - cấu tạo nhằm củng cố cho kết quả định danh bằng phương pháp sinh học phân tử.

Các thao tác chuẩn bị mẫu cho chụp ảnh SEM bao gồm: nuôi cấy vi khuẩn trong vòng 48 giờ, lấy mẫu, làm vết bôi và cố định mẫu trên slide. Gửi mẫu đến Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh (Quận 12) để được chụp SEM và đo kích thước tế bào.

63

3.2.7. Định lượng khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sản xuất IAA in vitro của các dòng vi khuẩn thu được

Các thí nghiệm này được thiết lập nhằm định lượng khả năng cố định đạm, khả năng hòa tan lân và sản xuất IAA in vitro của các dòng vi khuẩn. +, sự hoà tan calcium phosphate Việc khảo sát định lượng sự tạo thành NH4 (được quy đổi ra thành P2O5) và sự sản xuất IAA của các dòng vi khuẩn là cơ sở cho việc tuyển chọn các dòng có hoạt tính tốt, phục vụ cho các thí nghiệm phân tích sâu hơn. Điều này đặc biệt hữu ích cho sự thu gọn dần các nghiệm thức, tiến tới đánh giá hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vivo trên cây mía, giới hạn ở một số dòng nổi trội.

Vì các dòng vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh đã được phân lập và cấy chéo giữa hai loại môi trường chỉ thị, môi trường kiểm tra khả năng cố định đạm (LGI, Burk không N) và môi trường kiểm tra khả năng hoà tan lân (NBRIP), nên tất cả các dòng thu được đều có được 2 khả năng này. Riêng đối với khả năng sản xuất IAA, cần thiết phải có một khảo sát định tính khả năng này trước khi tiến hành thí nghiệm định lượng. Dựa trên phương pháp của Shrivastava và Kumar (2011), tiến hành nhỏ 100 μL thuốc thử Salkowski (1 mL FeCl3 0,5 M trong 50 mL HClO4 35%) lên bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn, ủ tối 30 phút. Dòng nào có khuẩn lạc chuyển sang màu cam, hồng, nâu nhạt là dòng có khả năng sinh IAA.

Đối với các thí nghiêm định lượng, quy trình thực hiện cơ bản là giống nhau, bao gồm hai giai đoạn: chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn và tiến hành +, P2O5 và IAA (Cao Ngọc Điệp, 2011). phản ứng so màu để định lượng NH4 Mỗi thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại.

3.2.7.1. Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn và dịch nổi vô bào

Giai đoạn này cơ bản là giống nhau đối với cả 3 thí nghiệm định lượng +, P2O5 và IAA. Sự khác biệt trong khâu chuẩn bị giữa 3 thí nghiệm định NH4 lượng chính là: (1) loại môi trường dùng để nuôi cấy vi khuẩn, (2) thời gian của một chu trình khảo sát và thời điểm tiến hành lấy mẫu để định lượng.

Môi trường Burk lỏng không đạm được sử dụng cho nuôi cấy vi khuẩn + và IAA, trong khi môi trường NBRIP trong 2 thí nghiệm định lượng NH4 lỏng được sử dụng cho nuôi cấy vi khuẩn trong thí nghiệm định lượng phosphate hoà tan (Cao Ngọc Điệp, 2011).

Sau 1 – 2 ngày nuôi cấy, dịch huyển phù vi khuẩn sẽ được kiểm tra độ đục bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm và đối chiếu với chuẩn McFarland để điều chỉnh về mức 0,5 tương ứng với mật số là 1,5x108 tế bào/mL (Ventorino et al., 2016).

64

Tiến hành thu 500 µL dịch huyền phù vi khuẩn có mật số 1,5x108 tế bào/mL nói trên để chủng vào các ống Falcon chứa 20 mL môi trường nuôi cấy tương ứng. Tiếp tục nuôi cấy vi khuẩn trong vòng một chu trình định lượng trong điều kiện nuôi cấy lỏng, lắc 120 vòng/phút, ở 28 ± 2oC.

Một chu kỳ nuôi cấy hay một chu trình khảo sát định lượng là 8 ngày đối + hoặc IAA; và là 20 ngày đối với thí nghiệm với thí nghiệm định lượng NH4 định lượng phosphate hoà tan. Thời điểm lấy mẫu để tiến hành phân tích, đối + và thí nghiệm định lượng IAA là 2 ngày một với thí nghiệm định lượng NH4 lần; và đối với thí nghiệm định lượng phosphate hoà tan là 5 ngày một lần.

Tại mỗi thời điểm phân tích, tiến hành hút 5 mL dịch nuôi cấy từ ống Falcon chuyển sang ống Eppendorf, ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút để lắng tế bào vi khuẩn. Thu phần dịch nổi vô bào để sử dụng trong phần thí nghiệm định lượng tiếp theo.

3.2.7.2. Định lượng NH4

+, P2O5 và IAA

a. Nguyên lý chung

Thí nghiệm định lượng NH4

+, P2O5 và IAA có trong dịch nổi vô bào vừa có tác dụng chứng minh khả năng cố định đạm, hoà tan phosphate khó tan và sinh tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn, vừa có tác dụng giúp chọn ra nhưng dòng nổi trội hơn các dòng khác ở các đặc tính PGP in vitro này. Nguyên tắc thí nghiệm dựa trên một phản ứng tạo màu của thuốc thử với chất cần tìm kiếm (định tính). Hơn nữa, bằng kỹ thuật đo mật độ quang thông qua một máy đo quang phổ ở bước sóng thích hợp, có thể cung cấp số liệu (định lượng) về nồng độ các chất cần tìm nhờ đối chiếu với một đường chuẩn đã biết. Đây gọi là phương pháp so màu quang phổ hay còn gọi là phân tích trắc quang.

Nhiều phương pháp so màu được phát triển để xác định nồng độ các +

chất cần tìm. Trong các thí nghiệm này, sự phát hiện và định lượng NH4 có trong dịch nuôi cấy được dựa trên phương pháp phenol-hypochlorite (Solarzano, 1969). Trong khi đó sự định lượng phosphate hoà tan (quy đổi ra P2O5) được dựa trên phương pháp so màu phosphomolybdate (Murphy và Riley, 1962), và sự định lượng IAA sinh ra được dựa trên phản ứng màu với thuốc thử Salkowski (Gordon và Weber, 1951). Bước sóng khuyến nghị cho các phức màu nói trên khi đo mật độ quang (OD - Optical Density) lần lượt là 640, 882 và 530 nm (Gordon and Weber, 1951; Murphy and Riley, 1962; Solarzano, 1969).

65

b. Thao tác

Chuẩn bị thuốc thử

Thuốc thử dùng cho thí nghiệm định lượng NH4

+ là một hỗn hợp của ba dung dịch: dung dịch A (phenol-ethanol), dung dịch B (sodium nitroprusside 0,5%) và dung dịch C (dung dịch oxide hóa). Các dung dịch này được pha chế riêng lẻ, bảo quản trong lọ tối màu và sử dụng trong vòng một tháng. Công thức và cách pha chế các hoá chất được trình bày ở Phụ lục 3.2.

Các hoá chất dùng cho thí nghiệm định lượng phosphate hoà tan bao gồm 3 dung dịch: H2SO4 5N, ammonium molybdate, và potassium antimonyl tartrate được phối trộn theo tỷ lệ 10:3:1 để tạo thành dung dịch 1. Dung dịch 2 là dung dịch acid ascorbic 0,1 M, cần được pha chế và sử dụng ngay trong ngày. Khi tiến hành phản ứng màu, cần phối trộn dung dịch 1 với dung dịch 2 theo tỷ lệ 7:3 để tạo thành thuốc thử đầy đủ. Công thức và cách pha chế các hoá chất được trình bày ở Phụ lục 3.3.

Thuốc thử Salkowski dùng cho thí nghiệm định lượng IAA trong nghiên cứu này là dung dịch Fe-HClO4 (1 mL FeCl3 0,5 M trong 50 mL HClO4 35%).

Xây dựng đường chuẩn và thực hiện phản ứng màu

Đường chuẩn cho cả ba thí nghiệm đều bao gồm 6 nồng độ chuẩn từ 0 đến 5 µg/mL (Hình 3.2). Cách phối trộn và liều lượng thuốc thử được trình bày qua Phụ lục 3.8. Trong đó, các hoá chất đã sử dụng để pha chế các dung dịch chuẩn gồm có: Ammonium Standard Solution 119812, Phosphate Standard Solution 119898 (Certipur® Merck Millipore), và IAA 1 mg (Daejung, Hàn Quốc).

Hình 3.2: Phản ứng màu của ammonia (A), phosphate (B) và IAA (C) với thuốc thử, tương ứng với nống độ các ống chuẩn là 0-1-2-3-4-5 µg/L (từ trái qua phải)

Phản ứng màu giữa mẫu và thuốc thử tương ứng được tiến hành theo các thao tác và trình tự giống như thực hiện đường chuẩn. Trong đó, tỷ lệ mẫu và thuốc thử của thí nghiệm định lượng ammonia và phosphate hoà tan là 5:1, tỷ lệ mẫu và thuốc thử Salkowski Fe-HClO4 của thí nghiệm định lượng IAA là 1:2. Thời gian ổn định phản ứng màu là 30 phút.

66

Đo OD, tính toán số liệu và xử lý thống kê

Sau 30 phút, tiến hành đo độ hấp thụ quang (Absorbance - Abs) của các dung dịch sau phản ứng tạo màu và dãy đường chuẩn. Bước sóng sử dụng trong đo OD ở 3 thí nghiệm nói trên lần lượt là 640, 880 và 530 nm (Cao Ngọc Điệp, 2011).

Bằng phần mềm Microsoft Excel 2010, thiết lập phương trình đường chuẩn (Y= a.X + b) và quy đổi các giá trị hấp phụ quang thu được thành số liệu định lượng tương ứng với từng nghiệm thức, với X là nồng độ của chất tạo màu có trong mẫu và Y là giá trị OD đo được. Các số liệu định lượng được kiểm định giả thuyết thống kê và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SPSS 20.0 với độ tin cậy 95%.

3.2.8. Định tính khả năng sản xuất siderophore của một số dòng vi khuẩn

Thí nghiệm này được giới hạn ở các dòng vi khuẩn có kết quả định +, P2O5 và IAA tốt. Thuốc thử được dùng để kiểm tra sự có mặt của lượng NH4 siderophore là Chrome Azurol Sulfonate (CAS) do Schwyn và Neilands (1987) đề xuất. Công thức và quy trình pha chế thuốc thử CAS được trình bày ở Phụ lục 3.5 (công thức của Chaitanya et al., 2014).

Thí nghiệm định tính khả năng siderophore được thực hiện thông qua phương pháp khảo nghiệm CAS lỏng (Estela Silva-Stenico et al., 2005). Dịch khuẩn được chuẩn bị bằng cách chủng 500 µL dịch huyền phù vi khuẩn có độ đục tương ứng chuẩn McFarland 0,5 vào các ống Falcon chứa 20 mL môi trường PS lỏng (peptone 10 g/L, sucrose 20 g/L) (Mew and Misra, 1999) và ủ ở 28 ± 2oC, 120 vòng/phút, trong vòng 48 giờ. Thu 1 mL dịch huyền phù đem ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu 0,5 mL dịch nổi chuyển sang ống mới và trộn với 0,5 mL CAS lỏng, ủ ống trong điều kiện tối trong vòng 30 phút và sau đó quan sát sự thay đổi màu sắc của dung dịch. Sự thay đổi màu của thuốc thử CAS màu xanh sang màu khác như cam, tím, xanh lục biểu thị sự hiện diện của siderophore.

Các dòng vi khuẩn có khả năng làm đổi màu thuốc thử CAS tiếp tục được nghiên cứu về sự tạo vòng halo trên thạch đĩa CAS thông qua phương pháp khuếch tán thạch với đĩa giấy (paper-disc agar diffusion) (Chaitanya et al., 2014). Dịch huyền phù vi khuẩn nuôi trong môi trường PS lỏng có độ đục tương ứng chuẩn McFarland 0,5 được đem ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút để lắng bớt tế bào vi khuẩn. Dùng micropipette hút lấy 5 μL dịch nổi đem nhỏ vào các đĩa giấy lọc vô trùng có đường kính 5 mm. Đặt các đĩa giấy lọc lên bề mặt thạch CAS. Ủ các đĩa ở nhiệt độ 28 ± 2oC trong vòng 48 giờ và tiến hành quan sát. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với đối chứng âm được chuẩn bị tương tự nhưng thay dịch nổi từ huyền phù vi khuẩn bằng môi trường PS lỏng.

67

Theo Chaitanya và cộng sự (2014), sau khi ủ các đĩa giấy trên mặt thạch CAS, có 3 khả năng xảy ra: vi khuẩn không tăng trưởng; có sự tăng trưởng nhưng không có vòng halo bao quanh khuẩn lạc; và tăng trưởng, tạo ra vòng halo với kích thước khác nhau (Hình 3.3). Tiến hành đo đường kính vòng halo để ước lượng khả năng sản xuất siderophore của các dòng.

Hình 3.3: Minh hoạ khảo nghiệm siderophore trên thạch đĩa CAS thông qua phương pháp khuếch tán thạch với đĩa giấy (A) và các kết quả có khả năng thu được (B) (Chaitanya et al., 2014)

3.2.9. Định danh một số dòng vi khuẩn có đặc tính tốt bằng phương pháp sinh học phân tử

Từ kết quả khảo sát các khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vitro của các vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía, chọn ra những dòng nổi trội để giải trình tự gene 16S rRNA và định danh.

Phần thí nghiệm này bao gồm các kỹ thuật sinh học phân tử như tách chiết DNA, PCR và giải trình tự. Các công cụ tin sinh học đã sử dụng cho việc xác định tên loài và xây dựng cây phả hệ (phylogeny tree) gồm có BLASTn (nucleotide BLAST) của NCBI và phần mềm MEGA X (Molecular Evolution Genetics Analysis Ver. X).

3.2.9.1. Tách chiết DNA của vi khuẩn

Quy trình tách chiếc DNA từ vi khuẩn được thực hiện theo mô tả của

Neumann và cộng sự (1992), gồm các bước sau:

Nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm chứa 6 mL môi trường LB lỏng (Phụ lục 3.6), ủ ở 28 ± 2oC trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy, chuyển 2 mL dịch huyền phù sang ống Eppendorf, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ phần dịch nổi. Thêm 250 µL dung dịch TE pH 8,0 vào ống và dùng máy xoáy (vortex) để đánh tan sinh khối vi khuẩn.

Thêm sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% vào mỗi ống, bổ sung 5 µL proteinase K (20 mg/mL) và đem ủ ở 65oC trong 20 phút để loại bỏ protein Đảo ống mỗi 5 phút một lần. Thêm 400 µL hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10%/NaCl 0,75 M, trộn đều và tiếp tục ủ ở 65oC trong 20 phút.

68

Sau 20 phút, bổ sung 600 µL chloroform-isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), lắc đều ống, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Thu phần dịch nổi và chuyển sang ống mới. Tiếp tục thêm 1 mL isopropanol vào ống, lắc đều, và ủ ở -20oC trong vòng 30 phút.

Sau 30 phút, đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Đổ nhẹ lớp dịch nổi bên trên, chừa lại phần DNA nằm ở đáy ống. Rửa DNA 2 lần bằng cồn 70%. Sau đó, đem ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút để loại cồn.

Để DNA khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, rồi hòa tan DNA với

30 µL nước cất khử khoáng vô trùng. Trữ lạnh ở ở -20oC.

3.2.9.2. Khuếch đại gene 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR

PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại và được áp dụng phổ biến

để dò tìm và khuếch đại trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn từ DNA tổng.

Trong thí nghiệm này, sản phẩm DNA được tách chiếc từ các dòng vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ đã được khuếch đại gene mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi 8F và 1492R (Turner et al., 1999) và cặp mồi p515FPL và p13B (Zinniel et al., 2002). Đối chứng âm trong phản ứng PCR này là nước khử khoáng vô trùng thay cho DNA.

Thành phần các chất tham gia và chu trình luân nhiệt trong phản ứng PCR khuếch đại gene 16S rRNA của vi khuẩn đất vùng rễ được mô tả qua Bảng 3.5 và Hình 3.4 sau đây.

Bảng 3.5: Thành phần các chất tham gia phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn đất vùng rễ cây mía

Hóa chất

Lượng

Milli-Q water (Merck Millipore)

26,0 μL

Spermidine (Sigma-Aldrich) 5 mM

4,0 μL

0,5 μL

Taq Buffer với (NH4)2SO4 (10X) (Fermentas)

3,0 μL

MgCl2 25mM (Ampliqon)

dNTP Mix R0912 (0,01 mM/μL mỗi loại) (Fermentas)

5,0 μL

Mồi xuôi 8F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) (25μM)

1,0 μL

Mồi ngược 1492R (TACGGTTACCTTGTTACGACTT) (25μM)

1,0 μL

DMSO (Dimethyl sulfoxide) (Sigma-Aldrich)

5,0 μL

Taq DNA polymerase (500U, 5U/μL) (Fermentas)

0,5 μL

DNA vi khuẩn (5 ng/μL)

4,0 μL

69

95oC

95oC

5’

72oC

30’’

72oC

10’

55oC

10oC

1’30’’

30’’

∞

30 chu kỳ

Hình 3.4: Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn đất vùng rễ cây mía

Thành phần các chất tham gia và chu trình luân nhiệt trong phản ứng PCR khuếch đại gene 16S rRNA của vi khuẩn nội sinh được mô tả qua Bảng 3.6 và Hình 3.5 sau đây.

Bảng 3.6: Thành phần các chất tham gia phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn nội sinh cây mía

Hóa chất

Lượng

Milli-Q water (Merck Millipore)

23,0 μL

Spermidine (Sigma-Aldrich) 5 mM

4,0 μL

0,5 μL

Taq Buffer với (NH4)2SO4 (10X) (Fermentas)

3,0 μL

MgCl2 25mM (Ampliqon)

dNTP Mix R0912 (0,01 mM/μL mỗi loại) (Fermentas)

10,0 μL

Mồi xuôi p515FPL (GTGCCAGCAGCCGCGGTAA) (5μM)

1,0 μL

Mồi ngược p13B (AGGCCCGGGAACGTATTCAC) (5μM)

1,0 μL

DMSO (Dimethyl sulfoxide) (Sigma-Aldrich)

5,0 μL

Taq DNA polymerase (500U, 5U/μL) (Fermentas)

0,5 μL

DNA vi khuẩn (5 ng/μL)

2,0 μL

70

94oC

94oC

60’’

3’

72oC

72oC

4’

57oC

2’

10oC

60’’

∞

30 chu kỳ

Hình 3.5: Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene 16S rRNA của vi khuẩn nội sinh cây mía

3.2.9.3. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng kỹ thuật điện di

Chuẩn bị gel agarose 1% bằng cách cân 0,48 g agarose cho vào bình tam giác chứa sẵn 45 mL dung dịch TAE 1X. Dùng lò vi sóng để đun tan hoàn toàn agarose trong khoảng 3 phút. Lấy ra để nguội tự nhiên trong khoảng 10 phút, bổ sung 5 µL GelRed® 10.000X (Biotium) và lắc nhẹ để hòa đều. Đổ nhẹ hỗn hợp gel vào khuôn, tránh tạo bọt khí.

Khi gel đã định hình, chuyển gel vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE 1X. Dùng micropipette hút 10 µL sản phẩm PCR đã trộn sẵn với 2 µL DNA Gel Loading Dye 6X (Thermo Fisher Scientific) để bơm vào mỗi giếng. Cài đặt hiệu điện thế 95 volt và thời gian 45 phút.

Sử dụng hệ thống Gel Documentation System UV/LED – Mini-imager™ (Maestrogen) để chụp hình bản gel. Xác nhận kích thước các băng 1.500 bp với 100 bp PLUS™ DNA Ladder (GoldBio); và xác nhận kích thước các băng 900 bp với 100 Bp Dna Ladder (Thomas Scientific) (Phụ lục 3.7).

3.2.9.4. Giải trình tự và định danh các dòng vi khuẩn

a. Giải trình tự

Sau khi xác nhận kết quả PCR của các dòng vi khuẩn qua hình ảnh điện di, tiến hành chuẩn bị mẫu cho việc tinh sạch và giải trình tự bằng phương pháp Sanger bởi công ty First BASE Laboratories Sdn Bhd (Malaysia).

Mỗi mẫu cần chuẩn bị bao gồm 30 μL DNA có nồng độ 50 ng/μL trích từ sản phẩm PCR, gửi kèm với 15 μL mồi xuôi có nồng độ 5 pmol/μL (8F đối với vi khuẩn đất vùng rễ; p515FPL đối với vi khuẩn nội sinh).

71

b. Định danh các dòng được giải trình tự

Sử dụng công cụ BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) để so sánh trình tự gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn với cơ sở dữ liệu trong “GenBank” của NCBI; từ đó truy xuất tên loài và trình tự tương đồng, đáp ứng được 2 tiêu chí cơ bản là độ tương đồng và độ phủ.

Các trình tự đã lựa chọn tiếp tục được phân tích cây phả hệ theo phương pháp Neighbor-joining bằng phần mềm MEGA X với bootstrap 1.000 lần lặp lại (Kumar et al., 2018). Một cây phả hệ cho thấy sự phù hợp giữa tên loài và quan hệ phát sinh chủng loại giữa các cụm, nhánh cho phép xác nhận tên của các dòng vi khuẩn. Kết quả nhuộm Gram của mỗi dòng cùng với đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào cũng hỗ trợ cho việc kiểm tra tên loài đã được xác định bằng phương pháp sinh học phân tử nêu trên.

3.2.10. Đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía con trồng trong điều kiện nhà lưới

Mục tiêu của thí nghiệm này nhằm đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh lên cây mía con ở giai đoạn sớm. Cây mía con dùng trong thí nghiệm là sản phẩm nhân giống vô tính từ đỉnh sinh trưởng (chồi ngọn) của giống mía VN85-1859 nhằm tạo ra nguyên liệu đồng đều về mặt di truyền và được kiểm soát vi sinh (gnotobiotic). Kết quả của thí nghiệm này còn cho phép thu gọn nghiệm thức, giảm số dòng vi khuẩn được đánh giá hiệu quả PGP trên cây mía trong các thí nghiệm trên quy mô chậu và ngoài đồng.

3.2.10.1. Chuẩn bị cây mía con bằng nhân giống in vitro và chuẩn bị dịch vi khuẩn

Vật liệu thí nghiệm là các cây mía con in vitro thuộc giống VN85-1859 đã được tạo ra bằng phương pháp nhân giống vô tính từ đỉnh sinh trưởng dựa trên một số công trình đã được công bố (Ramanand et al., 2007; Ramanand and Lal, 2004) (Phụ lục 3.8). Đây là cây con hoàn chỉnh có đủ thân lá, rễ đã được tách ra từ cụm chồi trải sau khi trải qua cảm ứng tạo rễ (Hình 3.6).

72

Hình 3.6: Cụm chồi đã cảm ứng tạo rễ (A) và cây con hoàn chỉnh đã được tách rời (B)

Để kiểm tra sự sạch khuẩn của vật liệu tức là tạo điều kiện gnotobiotic (Mehnaz et al., 2009), chọn 5 cây khỏe mạnh có kích thước tương đương nhau để cấy chuyển sang bình tam giác chứa sẵn 50 mL môi trường MS 1/10 bán đặc và không chứa phytohormone (công thức MS 1/10 theo Reis et al., 1999). Sau 2 – 4 ngày nuôi cấy, những cây trong bình nào không có dấu hiệu nhiễm trùng sẽ được dùng để chủng với các dòng vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPB) đã tuyển chọn.

Các dòng PGPB có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh IAA tốt sau khi định danh đã được nuôi trong môi trường LGI lỏng, ở 28 ± 2oC, trong 48 giờ. Dịch huyền phù vi khuẩn sau đó được kiểm tra mật số tế bào và điều chỉnh về chuẩn McFarland 0,5. Dịch khuẩn này có mật số tế bào tương đương 1,5x108 tế bào/mL (Ventorino et al., 2016) và được sử dụng để chủng cho các cây mía con sạch khuẩn nêu trên.

3.2.10.2. Chủng dịch vi khuẩn vào cây mía con, trồng cây vào bình Leonard và bố trí thí nghiệm

Trong thí nghiệm này, mỗi nghiệm thức là một dòng vi khuẩn. Trong đó, nghiệm thức đối chứng âm có dịch khuẩn được thay thế bằng môi trường LGI trong giai đoạn chủng vi khuẩn vào cây. Các cây mía con sạch khuẩn (đã chuẩn bị như mục 3.2.10.1) được chuyển sang bình tam giác dung tích 1 L chứa sẵn 100 mL dịch huyền phù vi khuẩn với mật số 1,5x108 tế bào/mL. Dịch khuẩn chỉ vừa ngập rễ của các cây con. Ủ các bình chứa cây con trong vòng 5 ngày, ở 28 ± 2oC (Reis et al., 1999).

73

Sau thời gian ủ, tiến hành chuyển các cây con sang trồng trong bình Leonard cải tiến, dung tích khoảng 500 mL được làm từ hai bình nhựa. Phần trồng cây chứa 300 cm3 cát và được giữ ẩm tự động bởi dây bấc cotton nối với phần bình chứa bên dưới. Trong phần bình chứa có 300 mL dung dịch nuôi cây là môi trường MS 1/10.

Cát, bấc cotton, và dung dịch nuôi cây được khử trùng bằng phương pháp nhiệt ướt ở 121oC trong 30 phút. Các phần trồng cây và bình chứa bằng nhựa được khử trùng bằng ethanol 70o và chiếu UV. Các thao tác lắp ráp bình Leonard và trồng cây mía được thực hiên trong tủ cấy vô trùng. Quấn giấy đen quanh phần trồng cây để tạo điều kiện tối cho bộ rễ. Tráng paraffin trên bề mặt cát để hạn chế sự ngoại nhiễm (Njoloma et al., 2006; Zakria et al., 2008).

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Các bình trồng cây được đặt trong nhà lưới, bình cách bình 5 cm. Chế độ chiếu sáng tự nhiên.

3.2.10.3. Thu hoạch và xử lý kết quả

Các chỉ tiêu đánh giá hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn lên cây mía con trồng trong điều kiện nhà lưới bao gồm: số lá, chiều cao cây, chiều dài rễ, khối lượng tươi và khối lượng khô. Số liệu được thu thập vào 90 ngày sau khi trồng.

Thu toàn bộ cây mía, rửa sạch bộ rễ, để khô tự nhiên. Chiều cao cây (cm) được đo từ cổ rễ cho đến chóp lá cao nhất. Chiều dài rễ (cm) được xác định từ cổ rễ đến chóp rễ dài nhất. Khối lượng tươi (g) là cân nặng của toàn bộ cây mía. Khối lượng khô (g) là cân nặng của toàn bộ cây mía sau khi sấy khô ở 60oC khoảng 4 – 5 ngày cho đến khi cân nặng không đổi.

Các số liệu định lượng được kiểm định giả thuyết thống kê và trắc

nghiệm phân hạng bằng phần mềm SPSS 20.0 với độ tin cậy 95%.

3.2.11. Đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng

Mục tiêu của thí nghiệm này nhằm đánh giá khả năng khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh lên cây mía trồng trong điều kiện bán thực địa (trồng trong chậu) và thực địa (trồng ngoài đồng). Thí nghiệm trồng trong chậu giúp thu gọn nghiệm thức trước khi bố trí thực địa ngoài đồng. Kết quả thí nghiệm cho phép tìm ra tổ hợp vi khuẩn và phân bón phù hợp với cây mía của địa phương (Tây Ninh), tạo tiền đề cho nghiên cứu phát triển phân bón vi sinh phục vụ nông nghiệp sạch và bền vững.

74

Vật liệu xuất phát của cả 2 thí nghiệm trong chậu và ngoài đồng đều là hom của cây mía giống K95-156. Vi khuẩn được sử dụng để chủng cho mía là 2 dòng vi khuẩn cho kết quả tốt nhất trên sự tăng trưởng của cây mía con trồng trong bình Leonard (thí nghiệm 3.2.10 nêu trên). Thao tác chuẩn bị dịch khuẩn tương tự như mục 3.2.10. Các thao tác chủng dịch khuẩn vào hom mía, loại phân bón hoá học được sử dụng và cách bố trí thí nghiệm trong 2 thí nghiệm trong chậu và ngoài đồng là như nhau. Khác biệt căn bản giữa 2 thí nghiệm chính là số nghiệm thức và quy mô thí nghiệm.

3.2.11.1. Chủng dịch khuẩn cho hom mía

Hai dòng vi khuẩn bao gồm một dòng vi khuẩn vùng rễ và một dòng vi khuẩn vùng rễ được chọn từ kết quả thí nghiệm 3.2.10. đã được nhân nuôi sinh khối trong môi trường LGI lỏng và điều chỉnh cho đạt mật số 1,5x108 tế bào/mL theo chuẩn McFarland 0,5. Hai dòng vi khuẩn này được chủng riêng lẻ và chủng phối hợp, cùng với một nghiệm thức đối chứng trong đó thay dịch khuẩn bằng môi trường LGI, như vậy đã tạo ra 4 nghiệm thức về nhân tố vi khuẩn. (B0): không chủng vi khuẩn; (B1): vi khuẩn nội sinh; (B2): vi khuẩn vùng rễ; (B3): tổ hợp vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ.

Hom được thu từ cây mía giống K95-156 đạt 6 tháng tuổi. Chọn lựa các hom có 3 mắt mầm phát triển tốt và không có dấu hiệu bệnh. Hom được bỏ trong các chậu dung tích 200 L, sau đó được ngâm ngập bởi dịch khuẩn đã chuẩn bị như đã nêu trên. Ủ hom với dịch khuẩn trong vòng 2 giờ (Cruz et al., 2012).

3.2.11.2. Chế độ bón phân

Phân bón được sử dụng theo khuyến cáo của Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, gồm 200 kg N, 160 kg P2O5, 240 kg K2O cho một hectare mía thuộc giống K95-156, trồng trên đất xám thuộc khu C1-TSX của Trung tâm.

Chế độ bón chia làm 3 đợt. Bón lót tiến hành khi đặt hom: bón toàn bộ phân lân, 1/3 lượng phân đạm và 1/3 lượng phân kali. Bón thúc lần đầu (thúc đẻ nhánh) được tiến hành khi mía có 4 – 5 lá, cây khoảng 1,5 tháng tuổi: bón 1/3 lượng phân đạm và 1/3 lượng phân kali. Bón thúc lần thứ hai được tiến hành khi mía có 9 – 10 lá, cây khoảng 4 – 5 tháng tuổi: bón toàn bộ phân đạm và phân kali còn lại.

Áp dụng 5 mức bón phân đạm và lân cho thí nghiệm trồng cây trong chậu. (F0): không N và không P; (F1): 25% N và 25% P; (F2): 50% N và 50% P; (F3): 75% N và 75% P; (F4) 100% N và 100% P. Trong thí nghiệm ngoài đồng, có 4 mức phân bón N và P được áp dụng, kế thừa kết quả của thí nghiệm trong chậu.

75

Riêng phân kali, sử dụng 100% của mức khuyến cáo cho toàn bộ các nghiệm thức vì không liên quan đến khả năng bổ sung dinh dưỡng (N và P) của các dòng vi khuẩn đã phân lập và khảo sát trong khuôn khổ đề tài luận án.

3.2.11.3. Bố trí thí nghiệm trồng cây trong chậu, thu hoạch và xử lý kết quả

Hom mía sau khi chủng dịch khuẩn và hom đối chứng (không chủng vi khuẩn) được trồng vào trong các chậu nhựa có kích thước 40 x 30 x 20 cm3 chứa sẵn 20 dm3 đất lấy từ khu khu thí nghiệm C1-TSX thuộc Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, số 99 Bình Hòa, Châu Thành, Tỉnh Tây Ninh. Phủ lên hom một lớp đất dày khoảng 2 – 3 cm. Tưới nước khoảng 2 – 3 lần/tuần. Các chậu cây được đặt ngay tại khu thí nghiệm C1- TSX thuộc Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, số 99 Bình Hòa, Châu Thành, Tỉnh Tây Ninh.

Các chậu cây được bố trí theo kiểu lô chính phụ (Split-Plot Design) (Gomez and Gomez, 1984). Trong đó, có 4 khối tương ứng với 4 lần lặp; mỗi khối có 5 lô chính ứng với 5 mức phân bón: (F0): không N và không P; (F1): 25% N và 25% P; (F2): 50% N và 50% P; (F3): 75% N và 75% P; và (F4) 100% N và 100% P; mỗi lô chính có 4 lô phụ ứng với 4 mức vi khuẩn: (B0): không chủng vi khuẩn; (B1): vi khuẩn nội sinh; (B2): vi khuẩn vùng rễ; (B3): tổ hợp vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ. Tổng cộng có 20 chậu trong mỗi khối, sắp xếp theo khuyến cáo của Nguyen Thi Mui và cộng sự (1997): chậu cách chậu là 30 cm x 15cm (Hình 3.7). Cả khu thí nghiêm có 80 chậu ứng với 80 đơn vị thí nghiệm.

(F0): không N và không P; (F1): 25% N và 25% P; (F2): 50% N và 50% P; (F3): 75% N và 75% P; (F4) 100% N và 100% P. (B0): không chủng vi khuẩn; (B1): vi khuẩn nội sinh; (B2): vi khuẩn vùng rễ; (B3): tổ hợp vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ.

Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng mía trong chậu theo kiểu lô chính phụ

76

Kết quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn trên cây mía trồng trong chậu đã được đánh giá khi cây đạt 180 ngày tuổi. Cây mía được chặt sát gốc, chặt bỏ ngọn, bỏ rễ và lá. Tiến hành đo đạc các chỉ tiêu bao gồm: số lóng, chiều cao thân, đường kính thân, năng suất mía (tấn/ha), độ Brix, chữ đường (CCS %) và năng suất đường (tấn/ha).

Chiều dài thân cây (cm) được đo bằng thước dây, đường kính thân (cm) được đo ở khoảng giữa cây, bằng thước cặp. Đếm số lóng mía. Đo độ Brix (Bx %) bằng Brix kế cầm tay (Hand Refractometer). Giá trị Brix được xác định là trung bình cộng độ Brix ở ngọn và gốc. Năng suất tổng được tính theo khối lượng thân mía (kg/chậu). Chữ đường được tính theo công thức của Viện nghiên cứu Mía đường; từ đó suy ra năng suất đường (tích của năng suất tổng và chữ đường). Công thức tính chữ đường như sau:

Các số liệu định lượng được kiểm định giả thuyết thống kê và trắc nghiệm phân hạng theo phương pháp LSD áp dụng cho kiểu bố trí lô phụ với độ tin cậy 95% (Gomez và Gomez, 1984) bằng Microsoft Excel 2010.

3.2.11.4. Bố trí thí nghiệm trồng cây ngoài đồng, thu hoạch và xử lý kết quả

Hom mía sau khi chủng dịch khuẩn và hom đối chứng (không chủng vi khuẩn) được gieo theo kiểu hàng đơn ngay tại khu thí nghiệm C1-TSX thuộc Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, số 99 Bình Hòa, Châu Thành, Tỉnh Tây Ninh. Đầu hom sau tiếp giáp gốc hom trước, mắt mầm hướng về hai bên, mật độ khoảng 3 – 5 hom/m. Phủ lên hom một lớp đất dày khoảng 3 – 5 cm. Tưới nước khoảng 2 – 3 lần/tuần.

Thí nghiệm ngoài đồng cũng được bố trí theo kiểu lô chính phụ, với 4 lần lặp. Yếu tố vi khuẩn vẫn gồm 4 nghiệm thức (B0): không chủng vi khuẩn; (B1): vi khuẩn nội sinh; (B2): vi khuẩn vùng rễ và (B3): tổ hợp vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ ứng với 4 lô phụ. Yếu tố phân bón giảm còn 4 mức: (F0): không N và không P; (F1): 50% N và 50% P; (F2): 75% N và 75% P; (F3): 100% N và 100% P, ứng với 4 lô chính. Diện tích mỗi lô phụ (ô thí nghiệm) là 42 m2; bên trong có 2 hàng mía. Mỗi hàng dài 15m và cách nhau 1,5 m. Rạch hàng sâu khoảng 30 cm. Tổng cộng có 64 đơn vị thí nghiệm ứng với 64 ô (Hình 3.8).

77

(F0): không N và không P; (F1): 50% N và 50% P; (F2): 75% N và 75% P; (F3): 100% N và 100% P. (B0): không chủng vi khuẩn; (B1): vi khuẩn nội sinh; (B2): vi khuẩn vùng rễ; (B3): tổ hợp vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ.

Hình 3. 8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng mía ngoài đồng theo kiểu lô phụ

Kết quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn trên cây mía trồng ngoài đồng đã được đánh giá khi cây đạt 12 tháng tuổi, lá mía sít lại và ngả màu hơi vàng, các đốt ở phần trên ngọn cây ngắn lại.

Cây mía được chặt sát gốc, chặt bỏ ngọn, bỏ rễ và lá. Tiến hành đo đạc các chỉ tiêu bao gồm: số lóng, chiều cao thân (cm), năng suất mía thực tế (tấn/ha), độ Brix (%), chữ lượng đường (CCS %) và năng suất đường (tấn/ha). Cách thu hoạch mía và xác định các chỉ tiêu: xem mục 3.2.11.3.

Các nghiên cứu nêu trên được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Sinh hóa, trường Đại học Sài Gòn; phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Sinh học phân tử, viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ; phòng thí nghiệm và khu nghiên cứu thực nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu và Ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, tỉnh Tây Ninh. Các kết quả thu được sẽ được trình bày và thảo luận trong cương 4 tiếp theo.

Các số liệu định lượng được kiểm định giả thuyết thống kê và trắc nghiệm phân hạng theo phương pháp LSD áp dụng cho kiểu bố trí lô phụ với độ tin cậy 95% (Gomez và Gomez, 1984) bằng Microsoft Excel 2010.

78

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Đặc tính dinh dưỡng của đất trồng mía tại tỉnh Tây Ninh và sự tương quan với mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân trong đất

Tổng số mẫu đất khối đã được thu thập tại các đồng mía thuộc 29 xã, 7 huyện của tỉnh Tây Ninh là 41 mẫu. Kết quả phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng trong đất được trình bày qua Bảng 4.1.

Bảng 4.1: Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng trong đất trồng mía của tỉnh Tây Ninh tại 41 điểm thu mẫu

Nơi thu mẫu pH H2O N tổng số (%) P dễ tiêu (mg/100g đất) Chất hữu cơ (%)

6,71 d-h 6,6 f-l 6,77 c-g 6,75 c-g ± 0,01 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,01 0,209 b ± 0,02 0,138 fgh ± 0,01 0,070 n ± 0,01 0,139 fgh ± 0,01 1,89 kl 4,73 b 4,41 c 5,61a ± 0,14 ± 0,08 ± 0,13 ± 0,17 3,33 f 2,97 g 2,77 hi 5,11 a ± 0,06 ± 0,05 ± 0,05 ± 0,07

6,81 b-f ± 0,01 6,50 j-n ± 0,01 6,71 d-h ± 0,01 6,65 e-k ± 0,01 6,81 b-e ± 0,01 6,85 bcd ± 0,03 6,55 h-l ± 0,03 6,36 mno ± 0,02 4,27 c ± 0,13 1,81 l ± 0,14 3,11 f ± 0,10 3,92 d ± 0,02 2,61 h ± 0,18 3,48 e ± 0,03 3,34 e ± 0,20 1,56 mn ± 0,13 0,069 n ± 0,01 0,139 fg ± 0,00 0,205 b ± 0,00 0,279 a ± 0,01 0,070 n ± 0,01 0,138 fgh ± 0,01 0,139 fgh ± 0,01 0,203 b ± 0,01 1,97 p 1,85 pq 4,22 d 1,71 q 4,86 b 2,02 np 4,61 c 3,92 e ± 0,17 ± 0,17 ± 0,06 ± 0,14 ± 0,10 ± 0,09 ± 0,03 ± 0,08

6,67 d-j 6,70 d-i 6,67 d-j 6,81 b-e 6,76 c-g 6,55 h-l ± 0,03 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,02 ± 0,04 ± 0,04 1,33 n-q ± 0,10 1,14 qr ± 0,12 1,58 m ± 0,13 1,42 m-p ± 0,18 2,26 i ± 0,22 2,05 ijk ± 0,06 0,070 n ± 0,01 0,152 ef ± 0,00 0,208 b ± 0,01 0,138 fgh ± 0,01 0,070 n ± 0,00 0,068 n ± 0,00 2,51 jkl ± 0,05 2,45 klm ± 0,05 2,57 jk ± 0,05 2,36 lm ± 0,05 3,48 f ± 0,06 2,63 ij ± 0,04

6,24 o ± 0,04 6,66 d-k ± 0,06 6,47 k-n ± 0,08 6,58 g-l ± 0,10 6,84 bcd ± 0,05 6,33 mno ± 0,06 3,45 e 3,02 f 3,55 e 3,39 e 2,96 fg 3,49 e ± 0,21 ± 0,03 ± 0,12 ± 0,20 ± 0,06 ± 0,08 0,102 lm ± 0,01 0,128 ghi ± 0,00 0,139 fgh ± 0,01 0,147 ef ± 0,01 0,155 e ± 0,01 0,168 cd ± 0,00 1,89 p 2,14 n 2,55 jk 2,98 g 2,87 gh 2,54 jk ± 0,15 ± 0,04 ± 0,04 ± 0,06 ± 0,08 ± 0,24

79

Trảng Bàng Gia Bình Gia Lộc Lộc Hưng Hưng Thuận Châu Thành An Bình a An Binh b Hảo Đước a Hảo Đước b An Cơ a An Cơ b Đồng Khởi a Đồng Khởi b Gò Dầu Phước Thạnh Hiệp Thạnh Phước Trạch a Phước Trạch b Thanh Phước Phước Đông Bến Cầu An Thạnh Lợi Thuận Long Giang Long Phước a Long Phước b Long Chữ Dương Minh Châu Truông Mít a Truông Mít b Phước Ninh Chà Là a Chà Là b Phan a Phan b Phước Minh a Phước Minh b 6,77 c-g ± 0,11 6,44 lmn ± 0,13 6,49 j-n ± 0,19 6,35 mno ± 0,16 6,32 no ± 0,19 6,77 c-g ± 0,11 6,36 mno ± 0,08 6,64 e-k ± 0,21 6,34 mno ± 0,22 5,44 a ± 0,15 4,80 b ± 0,26 2,12 ij ± 0,09 2,01 jl ± 0,02 1,25 pqr ± 0,05 1,04 r ± 0,11 2,77 gh ± 0,05 2,01 jkl ± 0,09 1,12 pqr ± 0,09 0,112 jkl ± 0,01 0,148 ef ± 0,01 0,119 ijk ± 0,01 0,157 de ± 0,01 0,125 hij ± 0,00 0,178 c ± 0,01 0,123 ij ± 0,00 0,213 b ± 0,01 0,133 ghi ± 0,01 1,91 p 2,34 m 2,65 ij 2,98 g 2,89 gh 2,94 gh 2,64 ij 2,14 n 1,22 st ± 0,10 ± 0,05 ± 0,05 ± 0,06 ± 0,05 ± 0,08 ± 0,06 ± 0,14 ± 0,15

6,59 g-l 6,93 abc 6,98 ab ± 0,10 ± 0,06 ± 0,08 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 0,108 kl 0,094 m 0,099 lm 1,43 m-p ± 0,08 1,27 pq ± 0,14 1,28 opq ± 0,12 ± 0,06 ± 0,09 ± 0,06 1,22 st 1,31 s 1,28 s

1,54 mn ± 0,07 1,53 mn ± 0,06 1,46 m-p ± 0,13 1,47 m-p ± 0,13 1,51 mno ± 0,06 ± 0,08 ± 0,13 ± 0,11 ± 0,13 ± 0,08 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,06 ± 0,29 ± 0,04 ± 0,09 ± 0,10 6,49 j-n 6,51 i-m 7,08 a 7,05 a 7,11 a 0,123 ij 0,124 ij 0,211 b 0,212 0,215 b 1,47 r 1,47 r 1,08 t 1,09 t 1,11 t

Tân Châu Thạnh Đông Tân Hưng Tân Phú Tân Biên Trà Vong Mỏ Công Tân Phong Thạnh Bình a Thạnh Bình b Kết quả trình bày trong Bảng là giá trị trung bình của 4 đợt đo mẫu. Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

Về pHH2O, trong 41 mẫu đất có 12 mẫu đạt 6,24 – 6,5 (chiếm 29,27%) và 28 mẫu đạt 6,51 – 7,11 (chiếm 68,3%). Như vậy, phần lớn mẫu đất thuộc loại chua nhẹ, thuận lợi cho sự phát triển của cây mía. Kết quả này có phần sai khác so với công bố của Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp (2004) về đặc tính chua của đất xám Tây Ninh: đất xám gley và đất xám trên phù sa cổ có pHH2O 4,4 – 4,7 và đất xám có tầng loang lổ gley có pHH2O 4,6 – 5,0. Sự khác biệt về chỉ số pHH2O này có thể được giải thích là do tập quán bón vôi trong canh tác mía cũng như hầu hết các cây trồng khác, trừ những cây thích đất chua như trà, dâu tây, nam việt quất. Tác dụng chính của vôi là khử chua, giúp cho cây hấp thu tốt chất dinh dưỡng. Bên cạnh đó, vôi còn có tác dụng cải thiện đặc tính vật lý của đất, khiến cho các hoạt động phân giải các chất hữu cơ của vi sinh vật đất trở nên tốt hơn. Lượng khuyến cáo là từ 500 – 1.000 kg CaO (bột vôi nung) cho một ha đất có pH 4 – 5 (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020).

Kết quả phân tích dinh dưỡng của 41 mẫu đất đã thu thập cho thấy thành phần chất hữu cơ, N tổng số và P dễ tiêu lần lượt đạt 1,08 % – 5,11%; 0,068 % – 0,279%; 1,04 – 5,61 mg/100 g đất. Số liệu này cho thấy đất xám trồng mía ở Tây Ninh có hàm lương chất hữu cơ từ thấp đến mức trung bình, hàm lượng N tổng từ mức rất thấp đến trung bình, và hàm lượng P2O5 ở mức trung bình khá. Kết quả phân tích này có sự tương đồng với công bố về thành phần dinh dưỡng của đất xám của tỉnh Tây Ninh của Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp (2014).

Mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân có trong 41 mẫu đất trồng mía của tỉnh Tây Ninh đã được xác định thông qua phương pháp đếm sống nhỏ giọt. Đặc biệt, sự xuất hiện của vòng halo trên môi trường NBRIP như dấu chỉ cho khả năng hòa tan calcium phosphate cũng đã được quan sát thấy (Hình 4.1).

80

Hình 4.1: Xác định mật số vi khuẩn trên môi trường Burk (A), môi trường NBRIP (C và D), và sự tạo vòng hòa tan lân trên môi trường NBRIP (D)

Qua thí nghiệm “đếm sống nhỏ giọt”, số liệu về mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân quy về log 10 và số lượng CFU (đơn vị 10^6) đã được xử lý thống kê và trình bày qua Bảng 4.2.

Bảng 4.2: Kết quả xác định mật số vi khuẩn cố định đạm/ hòa tan lân trong đất trồng mía của tỉnh Tây Ninh tại 41 điểm thu mẫu

Mật số vi khuẩn cố định đạm (/1g đất) Mật số vi khuẩn hoà tan lân (/1g đất) Nơi thu mẫu lg CFU CFU (10^6) lg CFU CFU (10^6)

6,255 7,881 6,505 6,643 ± 0,03 ± 1,47 ± 0,09 ± 0,17 6,903 7,093 7,903 8,193 7,99 d 12,39 d 80,00 cd 156,00 cd ± 0,25 ± 0,55 ± 0,95 ± 9,09 1,80 e 76,06 c 3,20 e 4,39 de

81

Trảng Bàng Gia Bình Gia Lộc Lộc Hưng Hưng Thuận Châu Thành An Bình a An Binh b Hảo Đước a Hảo Đước b An Cơ a An Cơ b Đồng Khởi a Đồng Khởi b 6,079 6,978 6,991 6,000 7,459 6,681 9,369 8,342 1,20 e ± 0,07 9,50 de ± 0,33 9,79 de ± 0,11 1,00 e ± 0,09 28,78 d ± 0,62 4,79 de ± 0,22 2.340,67 a ± 79,86 219,73 b ± 5,06 5,778 6,919 8,049 5,301 9,723 6,415 8,465 8,447 0,60 d 8,31 d 112,00 cd 0,20 d 5.280,00 a 2,60 d 292,00 b 280,00 b ± 0,10 ± 0,37 ± 4,00 ± 0,00 ± 321,87 ± 0,07 ± 18,33 ± 7,21

6,681 6,653 6,663 6,079 6,663 6,914 4,80 de ± 0,09 4,49 de ± 0,28 4,60 de ± 0,33 1,20 e ± 0,14 4,60 de ± 0,31 8,21 de ± 0,28 1,20 d 3,10 d 2,20 d 1,80 d 2,80 d 6,20 d 6,079 6,491 6,342 6,255 6,447 6,792 ± 0,05 ± 0,11 ± 0,10 ± 0,11 ± 0,07 ± 0,69

Gò Dầu Phước Thạnh Hiệp Thạnh Phước Trạch a Phước Trạch b Thanh Phước Phước Đông Bến Cầu An Thạnh Lợi Thuận Long Giang Long Phước a Long Phước b Long Chữ 6,687 6,647 6,125 6,258 6,589 6,478 4,86 de ± 0,25 4,43 de ± 0,24 1,33 e ± 0,11 1,77 e ± 0,10 3,88 de ± 0,27 3,01 e ± 0,12 1,40 d 4,61 d 1,81 d 3,87 d 7,83 d 7,54 d 6,147 6,664 6,258 6,587 6,894 6,877 ± 0,11 ± 0,12 ± 0,12 ± 0,26 ± 0,20 ± 0,05 Dương Minh Châu

7,177 6,505 6,352 6,741 5,741 6,607 6,691 6,227 6,531 15,02 de ± 0,11 3,20 e ± 0,20 2,25 e ± 0,17 5,51 de ± 0,24 0,55 e ± 0,03 4,05 de ± 0,19 4,91 de ± 0,19 1,69 e ± 0,09 3,40 e ± 0,16 2,25 d 10,01 d 2,41 d 1,30 d 1,15 d 0,25 d 17,82 d 3,40 d 0,60 d 6,352 7,001 6,381 6,113 6,061 5,392 7,251 6,531 5,778 ± 0,05 ± 0,22 ± 0,14 ± 0,04 ± 0,08 ± 0,01 ± 0,66 ± 0,27 ± 0,07

Truông Mít a Truông Mít b Phước Ninh Chà Là a Chà Là b Phan a Phan b Phước Minh a Phước Minh b Tân Châu Thạnh Đông Tân Hưng Tân Phú 6,525 6,462 6,466 3,35 e 2,90 e 2,93 e ± 0,26 ± 0,27 ± 0,07 1,05 d 1,25 d 1,29 d 6,021 6,097 6,112 ± 0,07 ± 0,07 ± 0,04 Tân Biên

6,321 6,322 6,607 6,611 6,621 2,09 e ± 0,08 2,10 e ± 0,21 4,05 de ± 0,15 4,08 de ± 0,26 4,18 de ± 0,30 3,87 d 3,85 d 0,15 d 0,15 d 0,16 d ± 0,22 ± 0,20 ± 0,01 ± 0,00 ± 0,00 6,588 6,585 5,176 5,188 5,212

Trà Vong Mỏ Công Tân Phong Thạnh Bình a Thạnh Bình b Kết quả trình bày trong Bảng là giá trị trung bình của 4 đợt đo mẫu. Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

Qua Bảng 4.2 cho thấy, mật số vi khuẩn cố định đạm trong các mẫu đất khá cao, dao động trong khoảng lg CFU/g đất từ 5.74 đến 9.37 tương ứng khoảng 5 x 105 – 2,2 x 109 CFU/g đất. Mật số vi khuẩn cố định đạm trung bình khoảng lg CFU/g đất là 6,53, tương ứng 3,4 x10 6 CFU/g đất. Mật số vi khuẩn hòa tan lân dao động trong khoảng lg CFU/g đất từ 5,17 đến 9,72 tương ứng khoảng 1,6 x 105 – 5 x 109 CFU/g đất. Trung bình, mật số vi khuẩn hòa tan lân thấp hơn mật số vi khuẩn cố định đạm, khoảng lg CFU/g đất là 6,45, tương ứng 2,8 x106 CFU/g đất. Kết quả này là cao hơn so với mật số của 2 nhóm vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân có trong đất xám trồng mía của tỉnh Đồng Nai đã được công bố (lg CFU/g đất đạt từ 5,01 – 8,18) (Hoang and Cao, 2014).

82

Kết quả phân tích sự tương quan tuyến tính giữa mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân với pHH2O, N tổng số, P dễ tiêu và hàm lượng chất hữu cơ trong đất vùng rễ cây mía trồng ở Tây Ninh được trình bày qua Bảng 4.3.

Bảng 4.3: Tương quan tuyến tính giữa mật số vi khuẩn cố định đạm, hoà tan lân với pH, N tổng số, P dễ tiêu và hàm lượng chất hữu cơ trong đất vùng rễ cây mía trồng ở Tây Ninh.

Đặc tính của đất Mật số tế bào (lg CFU/g đất) Vi khuẩn cố định đạm Vi khuẩn hoà tan lân

pH R = 0,075 ns Y = - 0,2189 X + 8,1414 R = 0,135 ns Y = - 0,5917 X + 10,506

N tổng số (%) R = 0,03 ns Y = - 0,3726 X + 6,4619 R = 0,30* Y = - 5,7452 X + 7,3901

R = 0,176 ns Y = 0,0889 X + 6,4619 R = 0,423 ** Y = 0,3026 X + 5,8866 P dễ tiêu (mg P2O5/100 g đất)

Chất hữu cơ (%) R = 0,449 ** Y = 0,3423 X + 5,8017 R = 0,765 ** Y = 0,7247 X + 4,8158

Y: Mật số vi khuẩn cố định đạm hoặc mật số vi khuẩn hòa tan lân; X: Chỉ tiêu dinh dưỡng đất; R: Hệ số tương quan; ns (not “statistically significant”): tương quan không có ý nghĩa về mặt thống kê; **: tương quan mạnh.

Kết quả trình bày ở Bảng 4.3 cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa mật số vi khuẩn cố định N2 và vi khuẩn hòa tan phosphate với pH đất là tương quan không có ý nghĩa về mặt thống kê. Trong khi đó, sự tương quan và hồi quy tuyến tính giữa 2 chỉ tiêu này với hàm lượng chất hữu cơ trong đất là có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức alpha 0,01; đặc biệt là có sự tương quan mạnh giữa hàm lượng chất hữu cơ với mật số vi khuẩn hoà tan lân (Y = 0,7247x + 4,8158; R=0,765). Tương quan tuyến tính thuận giữa mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân với hàm lượng chất hữu cơ trong đất vùng rễ mía (trồng ở Đồng Nai) đã được báo cáo (Hoang and Cao, 2015). Việc bổ sung vi khuẩn hoà tan lân (Bacillus subtilis) và phosphate hữu cơ sinh học cũng đã cho thấy tác động tích cực lên sản lượng cây trồng (lúa mỳ), đồng thời giúp tiết kiệm chi phí dành cho phân bón hóa học (Tahir et al., 2018).

Về sự tương quan thuận giữa mật số vi khuẩn có lợi với hàm lượng các chất dinh dưỡng, cơ chế này đã được giải thích dựa trên sự tương tác của bộ 3 “đất - cây trồng - vi sinh vật”. Chất dinh dưỡng dồi dào trong đất cung cấp nguồn sống cho cây và vi sinh vật đất. Cây phát triển tốt thì dịch tiết từ rễ cây góp phần thu hút sự liên kết của các vi khuẩn có lợi. Sau cùng, nhờ vào hoạt động phong phú của quần xã vi sinh vật tại vùng rễ mà các đặc tính lý-hoá-sinh học của đất được cải thiện, đặc biệt là ở đất vùng rễ (Basirat et al., 2019; Marasco et al., 2018). Đây chính là cơ sở khoa học cho việc dò tìm và ứng dụng các vi khuẩn đất có lợi phối hợp với các nguồn vật liệu hữu cơ trong việc chế tạo phân bón sinh học cho cây.

83

4.2. Nguồn gốc và đặc tính phân lập của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng tại tỉnh Tây Ninh

Từ 135 mẫu đất vùng rễ cây mía trồng tại 7 huyện của tỉnh Tây Ninh, trải qua 2 giai đoạn là phân lập trên môi trường Burk không N và môi trường NBRIP chứa calcium phosphate khó tan và cấy chuyển qua lại giữa 2 loại môi trường này, đã có 246 dòng vi khuẩn đất vùng rễ có khả năng cố định N và hoà tan P được thu thập. Trong khi đó, xuất phát từ dịch trích nội mô của 135 mẫu thân và 135 mẫu rễ cây mía, sau khi chủng vào môi trường LGI bán đặc không N để thu thập các dòng vi khuẩn cố định đạm rồi tiếp tục cấy chuyển sang môi trường NBRIP để chọn lọc, đã có 176 dòng vi khuẩn nội sinh có cả hai khả năng được thu thập. Như vậy, tổng cộng đề tài luận án đã phân lập được 422 dòng vi khuẩn liên kết cây mía với 2 đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật cơ bản đầu tiên là cố định đạm và hoà tan lân. Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn và số lượng từng loại đã được tổng kết qua Bảng 4.4.

Bảng 4.4: Nguồn gốc của 422 dòng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ và nội sinh cây mía

Nguồn gốc Số dòng theo môi trường phân lập

Tổng số dòng phân theo địa phương Loại mẫu LGI Burk NBRIP Tổng số dòng phân theo loại vi khuẩn

26 Nơi thu (số mẫu) Trảng Bàng (12 mẫu) 44 18 30

51 21 23 Châu Thành (24 mẫu) Gò Dầu (18 mẫu) 44 21 63 Bến Cầu (24 mẫu) 105 42 28

50 22 30 Dương Minh Châu (27 mẫu) Tân Châu (13 mẫu) 53 23 46 Tân Biên (17 mẫu) Đất vùng rễ Rễ Thân Đất vùng rễ Rễ Thân Đất vùng rễ Rễ Thân Đất vùng rễ Rễ Thân Đất vùng rễ Rễ Thân Đất vùng rễ Rễ Thân Đất vùng rễ Rễ Thân 9 9 10 11 9 12 32 10 12 10 11 12 16 13 15 23 13 39 12 10 25 11 7 10 24 16 20 21 29 75

176 137

109 dòng 422 dòng 422 dòng 135 mẫu 313 dòng

84

Cố định đạm Tổng số dòng theo cột Hoà tan lân

Qua số liệu Bảng 4.4 cho thấy, so với tổng số dòng thu được, tỷ lệ vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh lần lượt là 58,3% (246 dòng) và 41,7% (176 dòng). Về vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hoà tan lân, so với tổng số dòng thu được, tỷ lệ này lần lượt là 74,2% (313 dòng) và 25,8% (109 dòng). Trung bình, số dòng vi khuẩn cố định N và hoà tan P phân lập được từ một mẫu đất vùng rễ là 1,8 dòng/mẫu; trong khi đó ở đối tượng vi khuẩn nội sinh, con số này là 1,3 dòng/mẫu. Có 109 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường NBRIP (chiếm 25,8%), 137 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường Burk (chiếm 32,5%) và 176 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường LGI (chiếm 41,7%).

Về môi trường phân lập, đối với vi khuẩn nội sinh, trong môi trường LGI không N bán đặc, sự xuất hiện trước tiên của màng mỏng (pellicle) là một dấu hiệu cho thấy sự hiện diện của loại vi khuẩn có khả năng tổng hợp đạm từ N2 và có nhu cầu thấp về oxy phân tử (Hình 4.2 A). Đối với vi khuẩn đất vùng rễ, trên môi trường Burk không N, một số dòng có khuẩn lạc màu trắng trong, nhày ướt, kích thước nhỏ nên khó phân biệt. Cần sử dụng kính hiển vi soi nổi và trắc vi để xác định đường kính khuẩn lạc và phân biệt một số dòng (Hình 4.2 B). Riêng đối với sự phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường NBRIP có bổ sung bromothymol blue, còn quan sát được sự hòa tan calcium phosphate tạo ra vòng trong suốt và sự đổi màu chất chỉ thị từ xanh qua vàng chứng tỏ sự tiết acid của vi khuẩn (Hình 4.2 C và D).

(A) Màng mỏng xuất hiện trong môi trường LGI bán đặc không N; (B) Nhiều khuẩn lạc nhỏ, trắng trong hiện diện trên môi trường Burk không N; (C) Sự tạo vòng hòa tan calcium phosphate trên môi trường NBRIP; (D) Sự chuyển màu của bromothymol blue do sự sinh acid của vi khuẩn.

Hình 4.2: Một số đặc tính phân lập vi khuẩn của vi khuẩn vùng rễ và nội sinh cây mía

85

Baldani và cộng sự (2014) đã đúc kết một quy trình hoàn chỉnh để phân lập vi khuẩn diazotrophic sống tự do, liên kết hoặc nội sinh với cây mía. Sự xuất hiện của các màng mỏng (pellicle) được hình thành trong môi trường bán đặc không có N chẳng hạn như LGI chính là một dấu hiệu đầu tiên của đối tượng này (Baldani et al., 2014). Tương tự, Nautiyal cũng đã đề xuất một số loại môi trường nuôi cấy để sàng lọc các vi sinh vật hòa tan phosphate; trong đó, môi trường NBRIP được cho là có hiệu quả hơn môi trường PVK (Pikovskaya). Mặc dù sự tạo ra vòng halo trên các tấm thạch có chứa phosphate vô cơ khó tan là một tiêu chí xác nhận nhưng không phải là bắt buộc. Thay vào đó, một phép đo trực tiếp quá trình hòa tan phosphate trong các kiểm nghiệm với NBRIP lỏng được cho là đáng tin cậy hơn (Nautiyal, 1999). Do vậy, sau các thí nghiệm phân lập và bước đầu xác định đặc tính cố định đạm và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn liên kết cây mía, bước kế tiếp sẽ là thí nghiệm định lượng các khả năng này nhằm chọn lọc các dòng nổi trội.

4.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng tại tỉnh Tây Ninh

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 246 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và 176 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh đã được tổng kết qua Bảng 4.5 sau.

Bảng 4.5: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 422 dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh

Đặc điểm

Hình thái khuẩn lạc

Màu sắc Hình dạng Dạng bìa Độ nổi Đường kính (mm) Trắng đục Trắng trong Cam Vàng nhạt Tròn đều Không đều Nguyên Răng cưa Mô Lài 0,1 – 0,5 0,6 – 1,0 1,1 – 1,5 1,6 – 2,0 > 2,0 Vi khuẩn vùng rễ Tỷ lệ 37,0% 17,1% 5,7% 40,2% 85,8% 14,2% 72,8% 27,2% 93,5% 6,5% 54,0% 21,0% 13,6% 11,4% 0% Số dòng 91 42 14 99 211 35 179 67 230 16 95 37 24 20 0 Vi khuẩn nội sinh Số dòng Tỷ lệ 45,5% 80 5,7% 10 2,8% 5 46,0% 81 92,0% 162 8,0% 14 89,8% 158 10,2% 18 90,9% 160 9,1% 16 46,7% 115 24,8% 61 15,0% 37 11,4% 28 2,0% 5

Tế bào

86

Hình dạng Di động Que ngắn Que dài Có Không 238 8 202 44 96,7% 3,3% 82,1% 17,9% 113 63 160 16 64,2% 35,8% 90,9% 9,1%

Qua Bảng 4.5 cho thấy, màu sắc chủ yếu của khuẩn lạc các dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng tại tỉnh Tây Ninh khi phát triển trên môi trường phân lập là trắng đục (37,0 – 45,5%) và vàng nhạt (40,2 – 46,0%). Các đặc điểm chủ yếu khác gồm có: dạng tròn đều (85,8 – 92,0%), bìa nguyên (72,8 – 89,8%), độ nổi mô ((0,9 – 93,5%) (Hình 4.3 A). Về đường kính khuẩn lạc, đa số khuẩn lạc có rất nhỏ. Có trên 70% khuẩn lạc các dòng có đường kính dưới 1 mm, cần đo qua kính hiển vi soi nổi với trắc vi vật kính và thị kính (Hình 4.3 B). Đối với đặc điểm tế bào, đa số có dạng que ngắn (64,2 – 96,7%) và có khả năng di động (82,1 – 90,0%). Đây cũng là các đặc điểm chủ yếu của các vi khuẩn liên kết thực vật của nhiều loài cây trồng ở Việt Nam đã được các tác giả công bố (Ngô Hồng Thanh và cộng sự, 2014; Hoang and Cao, 2014, 2015; Dang and Do, 2018).

Thanh trong Hình 4.3 B có chiều dài tương đương 150 µm.

Hình 4.3: Hình thái khuẩn lạc (A) và đường kính khuẩn lạc qua kính hiển vi soi nổi (B) của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía

87

Sự điều tra về đặc điểm phân bố, sinh thái, hình thái và sự nhận diện các quần thể vi khuẩn bản địa có trong vùng rễ của một loại cây trồng cụ thể là rất quan trọng (Majeed et al., 2015). Những hiểu biết cơ bản về đặc hình thái khuẩn lạc và tế bào của 422 dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh cung cấp kiến thức cơ bản về đối tượng này. Hơn nữa, profile của mỗi dòng là dữ liệu để củng cố kết quả định danh về sau. Đặc điểm về Gram của các dòng vi khuẩn được giới hạn trong các dòng cần nhận diện và kết quả nhuộm Gram sẽ được trình bày ở phần sau.

Các dòng vi khuẩn được tuyển chọn cho bước khảo sát định danh và đánh giá hiệu quả tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật tiếp theo sẽ dựa vào kết quả khảo sát định lượng khả năng cố định đạm, hoà tan lân, sản xuất IAA, siderophore in vitro được trình bày tiếp theo đây.

4.4. Kết quả định lượng khả năng cố định đạm, hoà tan lân và sản xuất IAA in vitro của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh

Đối với khả năng cố định đạm của vi khuẩn vùng rễ, trong tổng số 246 dòng có 46 dòng biểu thị kết quả định lượng tốt; trong đó có 19 dòng + trung bình ≥1 mg/L. Dòng tốt nhất là TPD3d đạt 2,45 mg/L đạt mức NH4 +. Đối với khả năng hoà tan phosphate, có 64 dòng biểu thị kết quả NH4 định lượng tốt; trong đó có 19 dòng đạt mức P2O5 trung bình ≥200 mg/L. Dòng tốt nhất là TAC4a đạt 344,68 mg/L P2O5. Đối với khả năng sản xuất IAA, trong tổng số 246 dòng vi khuẩn đất vùng rễ, chỉ có 60 dòng biểu thị khả năng sản xuất IAA trong điều kiện không có tryptophan (chiếm 30,5%). Trong đó có 40 dòng đạt mức IAA trung bình ≥5 mg/L. Dòng tốt nhất là BCA37 và đạt 12,1 mg/L IAA (Phụ lục 4.1, 4.2, 4.3).

Dựa trên kết quả đo NH4

+, P2O5 và IAA, có 30 dòng vi khuẩn đất vùng rễ đã được chọn lựa cho các thí nghiệm PCR và giải trình tự gene 16S rRNA về sau (Bảng 4.6). Số liệu trình bày trong Bảng 4.6 là trung bình của 3 lần lặp và đã được kiểm định thống kê ở độ tin cậy 95% (Phụ lục 4.4).

88

+, P2O5 và IAA của 30 dòng vi khuẩn đất vùng rễ

Bảng 4.6: Kết quả định lượng NH4 tuyển chọn

Kết quả định lượng (mg /L) Tên dòng Môi trường phân lập

+

IAA NH4 P2O5

Burk Burk Burk Burk Burk 103,62i ± 219,61de ± 114,94hi ± 114,55hi ± 110,10hi ± 4,80 8,66 6,57 2,52 1,66 6,53ij ± 12,14a ± 3,01no ± 3,21n ± 5,66k ± 0,50 0,16 0,20 0,33 0,20 1,35f ± 1,44e ± 0,34no ± 0,60l ± 1,00h ± 0,15 0,14 0,01 0,04 0,01

132,32g ± 26,0 mn ± 111,41hi ± 52,86l ± 123,20gh ± 9,80 1,95 2,20 1,11 8,93 3,11no ± 8,07fg ± 3,82lmn ± 8,29fg ± 3,50mn ± 0,30 0,21 0,27 0,37 0,26 0,69k ± 0,79j ± 0,1 rst ± 0,20qr ± 0,07t ± 0,01 0,01 0,01 0,02 0,01

70,08j ± 51,58l ± 55,49kl ± 31,47m ± 67,40jk ± 1,95 1,80 1,97 1,94 1,54 8,46efg ± 10,74b ± 8,20fg ± 8,04fg ± 4,19lm ± 0,70 0,94 0,27 0,30 0,31 1,70c ± 1,44e ± 0,14rs ± 2,28b ± 1,42ef ± 0,02 0,00 0,00 0,01 0,06

Burk Burk NBRIP NBRIP 259,43c ± 19,85 0,41 2,10 2,05 71,02j ± 44,78l ± 75,62j ± 11,96a ± 4,38l ± 8,27fg ± 4,08lm ± 0,26 0,41 0,36 0,23 0,11st ± 0,26opq ± 0,91i ± 0,26opq ± 0,01 0,01 0,02 0,01

NBRIP NBRIP NBRIP 17,63n ± 26,87mn ± 265,10c ± 1,34 10,31bc ± 11,02b ± 1,14 9,73cd ± 6,95 0,78 0,85 0,90 1,22g ± 0,25pq ± 2,45a ± 0,01 0,01 0,10

NBRIP NBRIP Burk 337,84a ± 20,29 344,69a ± 10,01 286,53b ± 19,70 8,58ef ± 7,06hi ± 6,63ij ± 0,74 0,19 0,20 0,30no ± 0,18qrs ± 0,86ij ± 0,02 0,01 0,04

Burk Burk NBRIP NBRIP NBRIP 207,11ef ± 212,22ef ± 204,68f ± 205,67f ± 228,20d ± 7,62gh ± 9,13de ± 9,76cd ± 6,12jk ± 2,34o ± 0,65kl ± 0,06t ± 0,45m ± 0,38mn ± 1,59d ± Bến Cầu BCA12 BCA37 BCA07 BCA17 BCD1a Châu Thành Burk CHT1a CHT1d Burk CHT2f NBRIP NBRIP CHT4c CHT4e NBRIP Dương Minh Châu NBRIP DMC1a NBRIP DMC2a NBRIP DMC2c DMC5e NBRIP MCD1a Burk Gò Dầu GOD1c GOD1f GOD2c GOD2f Tân Biên TAB01 TAB5d TPD3b Tân Châu TAC3b TAC4a TCD2b Trảng Bàng TRB1b TRB1d TRB2b TRB4d TBD2e CV(%) 2,54 5,37 3,32 4,79 6,05 5,59 0,11 0,35 0,65 0,30 0,32 6,49 0,02 0,00 0,01 0,01 0,05 5,85

89

Kết quả trình bày trong Bảng là giá trị trung bình của 4 đợt đo mẫu. Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

Đối với khả năng cố định đạm của vi khuẩn nội sinh, trong tổng số 176 dòng có 44 dòng biểu thị kết quả định lượng tốt; trong đó có 10 dòng đạt mức +. + trung bình ≥1 mg/L. Dòng tốt nhất là CT4bd và đạt 1,94 mg/L NH4 NH4 Đối với khả năng hoà tan phosphate, có 56 dòng biểu thị kết quả định lượng tốt; trong đó có 22 dòng đạt mức P2O5 trung bình ≥200 mg/L. Dòng tốt nhất là CR4c và đạt 311,63 mg/L P2O5. Riêng đối với khả năng sản xuất IAA, trong tổng số 176 dòng vi khuẩn nội sinh, chỉ có 41 dòng biểu thị khả năng sản xuất IAA trong điều kiện không có tryptophan (chiếm 23,3%). Trong đó có 19 dòng đạt mức IAA trung bình ≥20 mg/L. Dòng tốt nhất là TAC4a và đạt 68 mg/L IAA (Phụ lục 4.5, 4.6, 4.7).

Dựa trên kết quả đo NH4

+, P2O5 và IAA, có 36 dòng vi khuẩn nội sinh đã được chọn lựa cho các thí nghiệm PCR và giải trình tự gene 16S rRNA về sau (Bảng 4.7). Số liệu trình bày trong Bảng 4.7 là trung bình của 3 lần lặp và đã được kiểm định thống kê ở độ tin cậy 95% (Phụ lục 4.8).

+, P2O5 và IAA của 36 dòng vi khuẩn nội sinh

Bảng 4.7: Kết quả định lượng NH4 tuyển chọn

Kết quả định lượng (mg /L) Tên dòng Mô phân lập

+

IAA NH4 P2O5

Bến Cầu BT1 BR1e BCR3a BCR5a Thân Rễ Rễ Rễ 0,11 op ± 0,12 nop ± 0,26 k ± 1,43 b ± 0,00 0,00 0,01 0,01 83,47 l ± 2,65 96,46 k ± 1,82 224,21 c ± 3,80 141,43 fg ± 14,44 4,59 ij ± 0,61 4,49 j ± 0,41 2,86 n ± 0,20 6,61 g ± 0,50

Châu Thành CR2d CR4e CT4a CT4b CT4bd Rễ Rễ Thân Thân Thân 0,47 h ± 0,98 d ± 0,98 d ± 0,90 e ± 1,94 a ± 130,83 h ± 69,83 m ± 147,03 f ± 72,93 m ± 205,31d ± 0,00 0,02 0,01 0,00 0,01 2,34 1,61 2,01 1,87 5,41 12,14 b ± 0,89 0,01 u ± 0,00 5,08 i ± 0,06 0,81 rst ± 0,10 9,31 d ± 0,71

Dương Minh Châu MT1b MT2b MR4a MR4c MCR1a Thân Thân Rễ Rễ Rễ 0,17 mn ± 0,30 jk ± 0,10 op ± 0,14 no ± 1,30 c ± 28,36 o ± 16,43 p ± 70,85 m ± 51,54 n ± 114,25 ij ± 0,00 0,01 0,01 0,01 0,02 2,72 1,60 1,83 2,68 3,91 0,54 tu ± 0,05 0,54 tu ± 0,02 0,54 tu ± 0,06 0,38 tu ± 0,02 1,93 op ± 0,03

90

Thân Thân Thân Thân Rễ Rễ Gò Dầu GT1e GT2 GT3a GT3b GR1g GR3 0,62 g ± 0,40 i ± 0,64 fg ± 0,61 g ± 0,90 e ± 1,31 c ± 289,16 a ± 114,36 ij ± 206,98 d ± 121,11 i ± 140,15 fg ± 182,32 e ± 0,03 0,01 0,02 0,04 0,04 0,10 2,84 3,37 4,01 1,87 1,96 5,95 9,76 d ± 0,27 1,16 qrs ± 0,16 1,57 pq ± 0,10 5,63 h ± 0,27 0,51 tu ± 0,02 5,68 h ± 0,20

Thân Thân

Tân Biên ET1b ET5b ER4a Rễ 0,08 p ± 0,17 mn ± 0,17 mn ± 176,01 e ± 117,45 ij ± 137,46 gh ± 0,01 0,01 0,01 3,62 4,17 6,03 3,09 mn ± 0,09 7,38 ef ± 0,38 3,45 klm ± 0,18

Tân Châu AT2a AT2b AR4b TCT1a TCR1b Thân Thân Thân Rễ Rễ 0,25 kl ± 0,25 kl ± 0,20 lm ± 0,25 k ± 0,49 h ± 71,14 m ± 129,90 h ± 136,32 gh ± 175,50 e ± 205,31 d ± 0,02 0,02 0,02 0,01 0,03 2,66 2,10 4,29 4,31 4,96 3,66 kl ± 0,27 3,90 k ± 0,16 3,18 lmn ± 0,28 4,76 ij ± 0,29 5,78 h ± 0,32

Thân Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ 0,62 g ± 0,33 j ± 0,51 h ± 0,47 h ± 0,50 h ± 0,68 f ± 0,98 d ± 0,403 i ± 116,12 ij ± 203,95 d ± 220,56 c ± 68,84 m ± 111,49 j ± 181,33 e ± 262,46 b ± 117,18 ij ± Trảng Bàng TT1a TR2c TR2a TR2e TR3a TR3c TBR3a TPR4b CV(%) 6,00 5,04 3,23 4,47 5,51 8,67 8,95 7,12 3,56 2,29 o ± 0,26 7,06 g ± 0,19 0,77 st ± 0,07 7,62 e ± 0,55 10,41 c ± 0,53 1,36 qr ± 0,08 12,83 a ± 0,30 3,92 k ± 0,27 7,48 0,03 0,03 0,02 0,02 0,03 0,01 0,11 0,02 5,49

Kết quả trình bày trong Bảng là giá trị trung bình của 4 đợt đo mẫu. Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

Kết quả kiểm định thống kê về khả năng cố định đạm, hoà tan lân, sản xuất IAA in vitro của 66 dòng liên kết cây mía tuyển chọn cho thấy có 8 dòng gồm: BCA37, GOD1c, TPD3b, TBD2e (vi khuẩn đất vùng rễ); CT4bd, GT1e, GR3, TBR3a (vi khuẩn nội sinh) đã thể hiện tốt về cả 3 khả năng nói trên hoặc 2 trong số 3 khả năng đó. Hình 4.4 sau đây cho thấy kết quả định lượng của 8 dòng.

+, P2O5 và IAA của 8 dòng vi khuẩn tốt nhất

91

Hình 4.4: Kết quả định lượng NH4

Qua đó cho thấy hàm lượng NH4

+ của 3 dòng dao động CT4bd, TPD3b và TBD2e dao động quanh mức 2 mg/L. Kết quả này không cao như một số nghiên cứu khác đã đạt được. Tuy vậy, khả năng hoà tan phosphate của 8 dòng này khá tốt, dao động từ 182,3 – 289,2 mg/L P2O5. Nghiên cứu của González và cộng sự (2015) trên 24 dòng vi khuẩn liên kết cây mía cho thấy khả năng hoà tan phosphate của -). Một các dòng sau 5 ngày nuôi cấy dao động từ 0,13 – 222,43 mg/L (H2PO4 nghiên cứu khác của Rodrigues và cộng sự (2018) trên 81 dòng vi khuẩn liên kết với cây mía cho thấy lượng phosphate hoà tan đo được sau 7 ngày nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường NBRIP lỏng đạt từ 1,82 – 53,78 mg/L (H2PO4

-).

Về khả năng sản xuất IAA, khi nhỏ thuốc thử Salkowski lên khuẩn lạc sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường đặc, có 116 dòng (chiếm 27,5%) làm đổi màu môi trường nuôi cấy chứng tỏ khả năng sản xuất IAA (Hình 4.5). Lượng IAA cao nhất đo được ở ngày 2 là 22,74 mg/L (dòng GD2cd, Phụ lục 4.3). Kết quả này có sự tương đồng với một số nghiên cứu khác. Tỷ lệ các dòng vi khuẩn liên kết cây mía có khả năng sản xuất IAA trong các nghiên cứu thường dao động từ 27,2 – 57,0%. Lượng IAA đo được dao động từ 0,11 – 117,34 mg/L (Rodrigues et al., 2016, 2018; Pereira et al., 2019; Patel et al., 2019).

Hình 4.5: Kết quả định tính (A) và định lượng (B) khả năng sản xuất IAA sau 2 ngày nuôi cấy của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh

92

Ngoài việc khảo sát định lượng khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA, một số nghiên cứu trên đối tượng vi khuẩn liên kết cây mía còn chú ý đến các đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật gián tiếp của các vi khuẩn như khả năng sinh các enzyme ngoại bào (chitinase, cellulose, pectinase), HCN, và siderophore (Rodrigues et al., 2016;. Đặc biệt, khả năng sinh siderophore được khảo sát dựa trên cơ sở lý thuyết cho rằng khả năng này giúp các PGPR hấp thu các vi chất dinh dưỡng như Fe để tồn tại và tăng cường khả năng cạnh tranh trong quá trình xâm chiếm vùng rễ; siderophore góp phần tăng cường bảo vệ sự khỏe mạnh của cây thông qua sự ức chế vi khuẩn và nấm gây bệnh cây (Patel et al., 2019).

4.5. Kết quả định tính khả năng sinh siderophore của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh

Thí nghiệm khảo sát định tính khả năng sinh siderophore của các dòng vi khuẩn đã được thực hiện. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong tổng số 422 dòng phân lập có 44 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh có khả năng sinh siderophore thông qua thử nghiệm CAS lỏng, chiếm 10,4%. Màu sắc của phản ứng giữa siderophore và thuốc thử CAS cũng khá đa dạng như mô tả của một số tác giả trước đó (Sullivan et al., 2012; Thanh and Tram, 2018) (Hình 4.6).

Hình 4.6: Khả năng sản xuất siderophore của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh thông qua khảo nghiệm CAS lỏng

93

Riêng khả năng phát triển và tạo vòng halo trên môi trường CAS đặc, chỉ có 38 dòng thể hiện khả năng này (chiếm 9,0%) (Phụ lục 4.9). Một số dòng có đưòng kính vòng halo khá lớn và vi khuẩn phát triển được trên môi trường thạch CAS như TBR3a, DMC5a, GR3; nhưng cũng có những dòng mọc được trên môi trường mà này không có sự tạo thành vòng halo giống như mô tả trước đây của Chaitanya và cộng sự (2014) (Hình 4.7).

Thanh trong Hình 4.7 có chiều dài tương đương 1 cm.

Hình 4.7: Khả năng tạo vòng halo của một số dòng vi khuẩn liên kết cây mía trồng ở tỉnh Tây Ninh trong khảo nghiệm CAS đặc

Theo các tài liệu hiện hành, có rất ít nghiên cứu về khả năng sinh siderophore của các vi khuẩn liên kết cây mía đã được báo cáo. Trong một nghiên cứu của Logeshwaran và cộng sự (2009) thực hiện chuyên biệt cho 9 dòng vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus nội sinh cây mía trồng ở Ấn Độ, phản ứng màu của siderophore tạo ra với thuốc thử CAS đã cho thấy các chất này thuộc nhóm hydroxamate. Vì màu sắc được tạo ra trong phản ứng của CAS với các loại siderophore khác nhau khá đa dạng nên không có một bước sóng chung cho tất cả các phép so màu. Do vậy, hiện có rất ít nghiên cứu định lượng khả năng sinh siderophore đã được công bố. Thí nghiệm định lượng cũng dành cho một loại siderophore nhất định đã được biết trước, ví dụ như nigrinbactin trong nghiên cứu của Nielsen và cộng sự (2012). Các đánh giá khả năng sinh siderophore trên môi trường CAS đặc cho thấy tỷ lệ các dòng có khả năng này chiếm 20 – 85,7% nhưng thường giới hạn trong một số dòng có đặc tính tốt đã qua tuyển chọn (Singh et al., 2012; Chauhan et al., 2012; Patel et al., 2019; da Silveira et al., 2019).

Mặc dù khả năng cố định đạm, hòa tan phosphate và sản xuất IAA là những cơ chế được nghiên cứu nhiều nhất, việc tìm kiếm các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật cũng cần được đánh giá dưới góc độ các cơ chế gián tiếp như sự sản xuất siderophores, HCN và các enyme. Bước sàng lọc các yếu tố thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vitro là cực kỳ quan trọng vì nó cho phép lựa chọn các vi sinh vật có tiềm năng nông học tốt hơn trước khi thử nghiệm chúng trên thực vật (Rodrigues et al., 2016). Tuy vậy, một giai đoạn trung gian trước khi đưa vào thử nghiệm trên cây

94

trồng là định danh các dòng tuyển chọn cũng đã được các nhà nghiên cứu quan tâm. Bước nghiên cứu này, ngoài việc giúp đặc tính hoá đối tượng nghiên cứu còn giúp loại trừ các vi khuẩn không an toàn sinh học ra khỏi các thí nghiệm in vivo về sau.

4.6. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây mía đã tuyển chọn

Kết quả điện di sản phẩm PCR của trình tự gene 16S rRNA với cặp mồi 8F và 1492R dành cho vi khuẩn đất vùng rễ và với cặp mồi p515FPL và p13B dành cho vi khuẩn nội sinh đã cho các băng tương ứng với kích thước 1.500 bp và 900 bp (Hình 4.8 và Hình 4.9).

M: 100 bp PLUS™ DNA Ladder (GoldBio); C: Đối chứng âm; 1 – 14: Sản phẩm PCR của các dòng BC12, BC37, CHT2f, GOD1c, GOD2f, DMC2a, DMC2c, DMC5e, TAB01, TPD3b, TAC4a, TCD2b, TDB2e, TRB1b.

Hình 4.8: Băng 1.500 bp của các sản phẩm khuếch đại trình tự 16S rDNA với cặp mồi 8F và 1492R dành cho vi khuẩn đất vùng rễ

M: 100 Bp Dna Ladder (Thomas Scientific); C: Đối chứng âm; 1 – 10: Sản phẩm PCR của các dòng BCR5a, CT4bd, MR4c, GT1e, GT3b, GR3, TPR4b, TCT1a, TR3a, TBR3a.

Hình 4.9: Băng 900 bp của các sản phẩm khuếch đại trình tự 16S rDNA với cặp mồi p515FPL và p13B dành cho vi khuẩn nội sinh

95

Các sản phẩm PCR sau khi khuếch đại đã được gửi giải trình tự một chiều. Kết quả là có 17 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và 19 dòng vi khuẩn nội sinh đã được định danh trên cơ sở tương đồng trình tự 16S rDNA và xây dựng cây phát sinh loài. Hình dạng tế bào, kết quả nhuộm Gram và ảnh chụp hiển vi điện tử quét (SEM) của các dòng cũng đã được kiểm tra để xác nhận kết quả định danh bằng phương pháp sinh học phân tử (Hình 4.10).

Hình 4.10: Kết quả nhuộm Gram và ảnh chụp SEM của một số dòng vi khuẩn

96

4.6.1. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn đất vùng rễ

Thông tin về chủng tương đồng của 17 dòng vi khuẩn đất vùng rễ tuyển chọn được trình bày qua Bảng 4.8 sau đây. Kết quả dò tìm dựa trên cơ sở dữ liệu có trong GenBank, NCBI tính đến tháng 5/2020.

Bảng 4.8: Thông tin về trình tự gene 16S rRNA và các chủng tương đồng với 17 dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây mía tuyển chọn

Chủng tương đồng và dữ liệu trích từ NCBI Dòng vi khuần đất vùng rễ tuyển chọn

STT Tên chủng Mã truy vấn Tóm tắt đặc Tên dòng tính Độ dài trình tự (base) Độ phủ (%) Độ tương đồng (%)

Bến Cầu 1 BC12 1173 99 95,48 Herbaspirillum sp. SC-N056 FJ233846.1 Vi khuẩn cố định N phân lập từ mô và đất vùng rễ cây mía (Ấn Độ)

99 KP743003.1 95,48 Herbaspirillum sp. ZX1

Vi khuẩn nội sinh cây chè Camellia sinensis (Trung Quốc)

2 BC37 1270 99 99,21 Bacillus

subtilis F2-2- 18 KX350026.1 Vi khuẩn phân lập từ hệ sinh thái lau sậy (Trung Quốc)

99 99,21 Bacillus KC197815.1 subtilis EB31 Vi khuẩn phân lập từ đất đồng cỏ ven bờ (Trung Quốc)

Châu Thành 3 CHT1a 796 99 MT111023.1 Vi khuẩn phân lập từ đất (Ấn Độ) 99,25 Bacillus subtilis MN733170.1 99 99,25 Bacillus KJ870046.1 subtilis PR38

Vi khuẩn vùng rễ có tiềm năng phân huỷ kim loại nặng (Ấn Độ)

4 CHT2f 857 98 99,29 Enterobacter

hormaechei CPO 4.204 MN733032.1 Vi khuẩn nội sinh cây Scaptotrigona pectoralis (Mexico)

98 99,29 Enterobacter

MN696244.1 Vi khuẩn sinh tổng hợp IAA phân lập từ đất (Trung Quốc)

97

hormaechei subsp. xiangfangensis BHW6

CHT4c 857 99 MH297589.1 Vi khuẩn có khả 5 98,95 Acinetobacter sp. DB1

năng khử N2O phân lập từ đất trồng lúa (Trung Quốc)

99 98,95 Acinetobacter JX657679.1 sp. XS21

6 CHT4e 855 98 Vi khuẩn có khả năng oxide hoá arsenite phân lập từ đất mỏ vàng (Trung Quốc) GQ245971.1 Vi khuẩn phân 99,52 Acinetobacter sp. GG2

huỷ N- Acylhomoserine Lactone phân lập từ vùng rễ cây gừng (Malaysia)

98 99,52 Acinetobacter HQ638093.1 Vi khuẩn có khả sp. JH250-8

năng phân huỷ dầu phân lập từ đất ô nhiễm dầu mỏ (Trung Quốc)

Dương Minh Châu 7 DMC2a 1277 96 97,25 Burkholderia cepacia B03 DQ387437.1 Vi khuẩn cố định N phân lập từ cây lúa (Hàn Quốc)

96 HQ607778.1 97,25 Burkholderia cepacia SD7

Vi khuẩn đối kháng nấm trên chuối sau thu hoạch (Trung Quốc)

8 DMC2c 1146 97 99,82 Bacillus

subtilis subsp. stercoris EGI119

MN704430.1 Vi khuẩn nội sinh cây kinh giới cay Origanum vulgare có khả năng đối kháng sinh học (Trung Quốc)

MT111083.1 97 Vi khuẩn phân lập từ đất (Ấn Độ)

9 DMC5e 1062 98 99,82 Bacillus subtilis MK736112.1 99,14 Burkholderia cepacia KK8 MK680073.1 Vi khuẩn phân lập từ rễ cây hành (Ấn Độ)

98 99,04 Burkholderia cepacia HR5

98

MG818726.1 Vi khuẩn cố định đạm phân lập từ nốt sần cây đậu phộng (Việt Nam)

Gò Dầu 10 GOD1c 881 98 99,65 Bacillus subtilis B18 KJ870198.1

Vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ cây hoa màu có khả năng kháng nấm (Ấn Độ)

97 99,65 Bacillus MH057216.1 subtilis TE5 PGPB cây lúa mì (Mexico)

11 GOD2f 857 98 99,29 Enterobacter

MN696244.1 Vi khuẩn sinh tổng hợp IAA phân lập từ đất (Trung Quốc) hormaechei subsp. xiangfangensis BHW6

857 98 99,29 Enterobacter

MN689678.1 Vi khuẩn sinh tổng hợp IAA phân lập từ đất (Trung Quốc) hormaechei subsp. xiangfangensis PB18

Tân Biên 12 1020 99 KT964806.1 TAB01 99,21 Acinetobacter sp. M05

Vi khuẩn hoà tan phosphate phân lập từ xác bã nấm (Trung Quốc)

99 KT964805.1 99,02 Acinetobacter sp. M04

13 TPD3b 1365 99 95,94 Bacillus subtilis S5 MH997650.1 Vi khuẩn hoà tan phosphate phân lập từ xác bã nấm (Trung Quốc) Vi khuẩn phân lập từ đồng mía (Ấn Độ)

99 95,82 Bacillus KC433738.1 subtilis A2

Vi khuẩn có hoạt tính sinh học phân lập từ vịnh Palk (Ấn Độ)

Tân Châu 14

1129 99 98,84 Acinetobacter MK675646.1 TAC4a sp. EX-1 PGPR phân lập từ cây đậu phộng (Ấn Độ)

98 98,75 Acinetobacter KY704098.1 Vi khuẩn phân sp. ZX01

15 TCD2b 1438 84 97,62 Bacillus subtilis KA9 MT491101.1 huỷ thuốc trừ sâu phân lập đất nông nghiệp (Trung Quốc) PGPR phân lập từ đất vùng rễ cây ớt (Ấn Độ)

84 97,62 Bacillus MN077147.1

99

Vi khuẩn nội sinh cây Waltheria indica (Ấn Độ) subtilis DSM 10

Trảng Bàng 16

TRB1b 872 98 99,42 Acinetobacter KF668456.1 sp. IHB B 6803

Vi khuẩn nội sinh cây gió trầm Aquilaria agallocha (Ấn Độ)

98 99,30 Acinetobacter EF522130.1

Vi khuẩn nội sinh cây mía (Cuba) sp. CU27 17 TBD2e 1261 91 NR 152004.1 Acinetobacter 98,70 Acinetobacter

lactucae NRRL lactucae sp. nov., phân lập từ cây xà lách (USA)

Theo đó, số base giải được của 17 dòng vi khuẩn đất vùng rễ dao động từ 796 – 1.438 trên tổng số khoảng 1.500, chiếm 53,1% đến 95,9%. Ngoại trừ dòng TCD2b có độ phủ của trình tự 16S rDNA so với các chủng tương đồng Bacillus subtilis KA9 và DMS10 là 84%, 16 dòng vi khuẩn tuyển chọn còn lại có độ phủ đạt trên 90%. Kết quả về độ tương đồng của 17 dòng vi khuẩn tuyển chọn so với 33 chủng tương đồng có trong cơ sở dữ liệu của NCBI đạt từ 95,48% - 99,82%. Các chủng tương đồng thuộc về 6 loài, bao gồm: Bacillus subtilis, Herbaspirillum sp., Enterobacter hormaechei, Acinetobacter sp., Acinetobacter lactucae, Burkholderia cepacia. Đây là các loài vi khuẩn đất, vi khuẩn đất vùng rễ, vi khuẩn nội sinh nhiều loại cây dại và cây trồng, trong đó có cây mía; và đã được công bố từ nhiều quốc gia châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Hàn Quốc, Malaysia và các nước châu Mỹ như Hoa Kỳ, Cuba, Mexico. Các vi khuẩn này có các đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật như cố định đạm, hoà tan phosphate, sản xuất IAA, kháng nấm. Ngoài ra, một số chủng có khả năng phân huỷ các chất độc hại như thuốc trừ sâu, dầu khí, N-acylhomoserine lactone, có thể được ứng dụng trong lĩnh vực phục hồi sinh học và khử độc môi trường.

Cây phả hệ biểu thị quan hệ di truyền xét trên gene 16S rRNA của 17 dòng vi khuẩn vùng rễ cây mía cùng với các chủng tương đồng cũng đã được thiết lập bằng phương pháp Neighbor-Joining. Cây tối ưu với tổng chiều dài nhánh bằng 0,89 đã được hiển thị. Tỷ lệ phần trong thử nghiệm bootstrap (1.000 lần lặp lại) được hiển thị bên cạnh các nhánh của cây. Khoảng cách tiến hóa được tính toán bằng phương pháp khả năng tổng hợp tối đa (Maximum Composite Likelihood) và được tính theo đơn vị số lượng base thay thế trên mỗi vị trí và thể hiện qua thanh ngang trong Hình 4.11. Phân tích này liên quan đến 34 trình tự nucleotide. Có tổng cộng 1.613 vị trí trong bộ dữ liệu cuối cùng.

100

)

A

m â m a r G

a i r e t c a b o e t o r p - a m m a G

B

( a i r e t c a b o e t o r P

C

- a t e B

D

a i r e t c a b o e t o r p

E

s u l l i c a B

s e t u c i m r i F

F

) g n ơ ư d m a r G

(

Hình 4.11: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ tiến hoá giữa 17 dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây mía và 17 chủng tương đồng có trong cơ sở dữ liệu GenBank, NCBI

Qua Hình 4.11 bên trên cho thấy 34 trình tự đã khảo sát được sắp xếp vào 6 nhánh nhỏ và 2 cụm lớn. Trong cụm Proteobacteria (Gram âm) có 2 cụm nhỏ là Gamma-proteobacteria và Beta-proteobacteria. Cụm nhỏ Gamma- proteobacteria chứa 2 nhánh A và B; trong đó nhánh A chứa các chủng thuộc chi Acinetobacteria và nhánh B chứa các chủng thuộc chi Enterobacter. Cụm nhỏ Beta-proteobacteria chứa 2 nhánh C và D; trong đó nhánh C chứa các chủng thuộc chi Herbaspirillum và nhánh B chứa các chủng thuộc chi Enterobacter. Trong cụm Firmicutes (Gram dương) chứa 2 nhánh E và F, tất cả đều là Bacillus subtilis.

Như vậy, cây phả hệ này đã góp phần xác nhận kết quả định danh của 17 dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây mía như sau: Acinetobacter sp. gồm 5 dòng là TAB01, TAC4a, TRB1b, CHT4e, CHT4c; Acinetobacter lactucae gồm một

101

dòng TBD2e; Enterobacter hormaechei gồm 2 dòng là CHT2f, GOD2f; Herbaspirillum sp. gồm một dòng BC12; Burkholderia cepacia gồm 2 dòng là DMC2a, DMC5e; Bacillus subtilis gồm 6 dòng là TCD2b, TPD3b, BC37, DMC2c, CHT1a, GOD1c.

4.6.2. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn nội sinh

Thông tin về các chủng tương đồng của 19 dòng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn được trình bày qua Bảng 4.9 sau đây. Kết quả dò tìm dựa trên cơ sở dữ liệu có trong GenBank, NCBI tính đến tháng 5/2020.

Bảng 4.9: Thông tin về trình tự gene 16S rRNA và các chủng tương đồng với 19 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía tuyển chọn

Chủng tương đồng và dữ liệu trích từ NCBI Dòng vi khuần nội sinh tuyển chọn

STT Tên chủng Mã truy vấn Tóm tắt đặc Tên dòng tính Độ dài trình tự (base) Độ phủ (%) Độ tương đồng (%)

Bến Cầu 1 BCR3a 875 89

79,72 Chitinophaga polysaccharea MRP-15

NR_125662.1 Vi khuẩn sản xuất exopolysaccharide phân lập từ cây khoai núi Nhật Dioscorea japonica

2 BCR5a 852 98 99,41 Serratia MN615709.1 Vi khuẩn vùng rễ

cây cỏ ba lá đỏ Trifolium pratense plymuthica P35

Châu Thành 3 CT4bd 842 97 99,76 Serratia NR_157762.1 Loài mới Serratia oryzae J11-6

oryzae sp. nov. phân lập từ thân cây lúa, Trung Quốc

Dương Minh Châu 4 MT2b 617 100 98,54 LN827668.1

Bacillus subtilis CEES, CEES#19 Đa dạng vi khuẩn ứng dụng trong phục hồi sinh học, Ả Rập Saudi

100 98,54

KM875553.1 Vi khuẩn vùng rễ cây bông vải, Ấn Độ

5 MCR1a 592 98 97,11 MF197704.1 Vi khuẩn vùng rễ chống lại bệnh đạo ôn, Malaysia Bacillus subtilis subsp. Inaquosorum, OUN3RKSP Stenotrophom onas maltophilia UPMPR8

98 97,11 KT427903

102

Vi khuẩn phân lập từ cây lúa dại, Ấn Độ Stenotrophom onas maltophilia LP05_05

6 MR4c 640 97 Bacillus cereus S3-13 99,36

MF111945.1 Đa dạng của vi khuẩn sản xuất nano selenium trong vùng rễ các cây Cardamine, Trung Quốc

97 99,36 MK192048.1 Vi khuẩn phân lập từ đất Ấn Độ Bacillus cereus IIPR- cpb10

GT1e 837 99 100 KP969066.1 Gò Dầu 7 Burkholderia tropica 171 Vi khuẩn phân lập từ rễ cây mía, Brazil 8 GT2 839 98 99,76 Kosakonia oryzae APP47

MT533823.1 Vi khuẩn phân lập từ rễ cây đậu triều Cajanus cajan, Ấn Độ

98 MN156288.1 99,76 Kosakonia oryzae LA

Vi khuẩn phân huỷ polyoxyethylene phân lập từ đất, Việt Nam 9 GT3a 838 99 99,88 LC066142.1 Vi khuẩn phân lập từ đất Ai Cập Enterobacter aerogenes MF102

99 99,88 JQ682634.1

Enterobacter aerogenes KNUC5009

10 GT3b 844 98 99,88 JX088114.1 Enterobacter oryzae NB2 Vi khuẩn vùng rễ kiểm soát bệnh đốm lá trên cây ớt, Hàn Quốc Vi khuẩn vùng rễ cây cà chua, Ấn Độ

98 99,88 KC843380.1 Vi khuẩn nội sinh Enterobacter oryzae 22

cây dương Populus euphratica, Trung Quốc 11 GR3 673 98 99,55 MN935186.1 Vi khuẩn phân lập

Burkholderia ubonensis M15 (37-1) từ đất Oxisols, Colombia

98 99,55

Burkholderia ubonensis CP01 MN841975.1 Vi khuẩn có khả năng kháng nấm phân lập từ cây cọ dầu, Indonesia

Tân Biên 12 TPR4b 853 97 99,52 Burkholderia cenocepacia AR-30

KY992359.1 Vi khuẩn cố định đạm, kháng arsen phân lập từ vùng rễ cây đậu phộng, Ấn Độ

96 99,40 KP974661.1

103

Vi khuẩn cố định đạm phân lập từ rễ cây mía, Brazil Burkholderia cenocepacia 163-A

Tân Châu 13

TCT1a 868 83 79,81 Chitinophaga polysaccharea MRP-15

NR_125662.1 Vi khuẩn sản xuất exopolysaccharide phân lập từ cây khoai núi Nhật Dioscorea japonica

83 79,67 MO-0016

Vi khuẩn phân lập từ đất đảo Jeju, Hàn Quốc

14 TCR1b 855 98 99,29

Chitinophaga polysaccharea strain JBRI- Bacillus subtilis CLS- BA8-7 HQ334981.1 Vi khuẩn đối kháng phân lập từ đất, Ấn Độ

Trảng Bàng TR2a 15

836 98 99,03

16 TR2c 840 99 99,64 MN007139.1

Enterobacter sp. RY11902 Enterobacter hormaechei ZSH-W3

MT355798.1 Vi khuẩn phân lập từ rừng ngập mặn PGPB cây thuốc lá, kháng nấm Fusarium oxysporum, Trung Quốc

99 99,64 MN826152.1

PGPB phân lập từ cây diêm mạch Chenopodium quinoa, Peru

17 TR3a 847 98 99,40 KU049652.1 Vi khuẩn nội sinh lá

Enterobacter hormaechei subsp. Oharae, ILQ104 Paraburkhold eria tropica S23-9 cây cọ dầu, Singapore

98 99,40 MK336433.1 PGPR phân lập vùng rễ lúa, Ấn Độ

18 TR3c 836 99 99,76 KJ482738.1 Paraburkhold eria tropica SA9 Advenella sp. MM53Nov Vi khuẩn đất nông nghiệp, Ý

99 99,76 DQ643090.1 Vi khuẩn kháng Advenella sp. CR12 kim loại nặng, Trung Quốc 19 TBR3a 843 97 99,76 MK883181.1 Đa dạng vi khuẩn

Serratia plymuthica D78_CV7R phân lập từ cây trồng ở vùng sa mạc, Chile

Theo đó, số base giải được của 19 dòng vi khuẩn nội sinh dao động từ 592 – 868 trên tổng số 900, chiếm 65,78% đến 96,4%. Ngoại trừ 2 dòng BCR3a và TCT1a, 17 dòng vi khuẩn còn lại có độ phủ đạt 97 – 100 % và độ tương đồng đạt 97,11 – 100%. Các chủng tương đồng thuộc về 16 loài, bao gồm: Bacillus subtilis, B. cereus, Chitinophaga polysaccharea, Advenella sp., Stenotrophomonas maltophilia, Enterobacter sp., Enterobacter aerogenes, E. hormaechei, E. oryzae, Kosakonia oryzae, Serratia oryzae, S. plymuthica, Paraburkholderia tropica, Burkholderia tropica, B. cenocepacia, B. ubonensis.

104

Đây là các loài vi khuẩn đất, vi khuẩn đất vùng rễ, vi khuẩn nội sinh nhiều loại cây trồng, trong đó có cây mía; và đã được công bố từ nhiều quốc gia châu Á, châu Phi, châu Mỹ và cả châu Âu. Ngoài khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật, một số chủng vi khuẩn còn có các lợi ích khác như kháng kim loại nặng, kháng arsen, sản xuất exopolysaccharide, sản xuất nano selenium.

Cây phả hệ biểu thị quan hệ di truyền xét trên gene 16S rRNA của 19 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía cùng với các chủng tương đồng được trình bày qua Hình 4.12.

s e t u c i m r i F

s e l a i r e d l o h k r u B

) a i r e t c a b o e t o r P à v s e t u c i m r i F (

A m ụ C

s e l a r e t c a b o r e t n E

Xanthomonadales Stenotrophomonas Cụm B (Bacteroidetes)

Hình 4.12: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ tiến hoá giữa 19 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía và 17 chủng tương đồng có trong cơ sở dữ liệu GenBank, NCBI

105

Hình 4.12 đã được thiết lập bằng phương pháp Neighbor-Joining. Cây tối ưu với tổng chiều dài nhánh bằng 1.33 đã được hiển thị. Tỷ lệ phần trong thử nghiệm bootstrap (1.000 lần lặp lại) được hiển thị bên cạnh các nhánh của cây. Khoảng cách tiến hóa được tính toán bằng phương pháp khả năng tổng hợp tối đa (Maximum Composite Likelihood) và được tính theo đơn vị số lượng base thay thế trên mỗi vị trí và thể hiện qua thanh ngang. Phân tích này liên quan đến 36 trình tự nucleotide và có tổng cộng 1.616 vị trí trong bộ dữ liệu cuối cùng.

Qua Hình 4.12 bên trên cho thấy 36 trình tự đã khảo sát được sắp xếp vào 2 cụm lớn. Trong đó cụm B chỉ gồm 2 dòng BCR3a và TCT1c và chủng tương đồng Chitinophaga polysaccharea MRP-15; đây là các vi khuẩn Gram âm thuộc Bacteroidetes. Đối với cụm A, đây là một cụm lớn chứa 17 dòng vi khuẩn nội sinh còn lại cùng với các chủng tương đồng của chúng, thuộc về 2 taxa là Firmicutes (Gram dương) và Proteobacteria (Gram âm). Trong cụm A, cụm nhỏ Xanthomonadales chỉ gồm một dòng MCR1a và chủng tương đồng với nó là Stenotrophomonas maltophilia UPMPR8 nằm tách rời với các cụm khác. Các nhánh còn lại của cụm được sắp xếp trong 3 cụm nhỏ, trong đó bao gồm hai cụm (1) Enterobacterales (với các chi Enterobacter, Kosakonia, Serratia) và (2) Burkholderiales (với các chi Burkholderia, Paraburkholderia, Advenella) nằm tách biệt với cụm (3) là Firmicutes (các Bacillus). Cả 3 bộ Xanthomonadales, Enterobacterales, và Burkholderiales hiện được xếp trong lớp Proteobacteria.

là TPR4b; Burkholderia ubonensis gồm một dòng

Như vậy, sự hợp lý của cây phả hệ này đã góp phần xác nhận kết quả định danh của 19 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía như sau: Chitinophaga là BCR3a, TCT1c; Stenotrophomonas polysaccharea gồm 2 dòng maltophilia gồm một dòng là MCR1a; Enterobacter hormaechei gồm một dòng là TR2c; Enterobacter sp. gồm một dòng là TR2a; Enterobacter aerogenes gồm một dòng là GT3a; Enterobacter oryzae gồm một dòng là GT3b; Kosakonia oryzae gồm một dòng là GT2; Serratia oryzae gồm một dòng là CT4bd; Serratia plymuthica gồm 2 dòng là TBR3a, BCR5a; Advenella sp. gồm một dòng là TR3c; Burkholderia cenocepacia gồm một dòng là GR3; Burkholderia tropica gồm một dòng là GT1e; Paraburkholderia tropica gồm một dòng là TR3a; Bacillus cereus gồm một dòng là MRC4c, và Bacillus subtilis gồm 2 dòng là MT2b, TCR1b.

106

4.6.3. Nhận xét chung về kết quả định danh các dòng vi khuẩn liên kết cây mía và sự chọn lọc dòng cho các thí nghiệm in vivo

Kết quả định danh bên trên cho thấy sự đa dạng của các vi khuẩn nội sinh cao hơn so với các vi khuẩn đất vùng rễ ở cả mức độ chi và loài. Hình 4.13 sau đây sẽ tóm tắt tỷ lệ các chi tương đồng của 17 dòng vi khuẩn vùng rễ và 19 dòng vi khuẩn nội sinh đã định danh.

Hình 4.13: Tỷ lệ các chi tương đồng của 17 dòng vi khuẩn vùng rễ và 19 dòng vi khuẩn nội sinh đã định danh

Qua đó, cho thấy 3 chi Enterobacter, Burkholderia và Bacillus cùng hiện diện ở cả hai đối tượng; trong đó Bacillus ở đất vùng rễ (35%) phong phú hơn so với trong nội mô (16%). Đây cũng là chi duy nhất trong các chi đã nhận diện thuộc Firmicutes GC thấp, Gram dương, thành dày, và có khả năng sinh nội bào tử; một đặc tính thuận lợi cho sự phát tán và chống chịu với điều kiện khắc nghiệt của môi trường. Đối với các Proteobacteria mà cả hai nhóm đều có, Acinetobacter chiếm ưu thế (35%) và chỉ hiện diện trong các vi khuẩn đất vùng rễ đã nhận diện, trong khi Enterobacter chiếm ưu thế trong các vi khuẩn nội sinh (21%).

Đặc biệt, trong các vi khuẩn nội sinh có 2 dòng TCT1a và BCR3a tương đồng trình tự 16S rDNA với vi khuẩn Chitinophaga polysaccharea sp. nov., một loài có khả năng tiết exopolysaccharide mới được công bố gần đây (Han et al., 2013). Mặc dù chưa có nhiều thông tin về khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của Chitinophaga polysaccharea nhưng nhiều bằng chứng cho thấy các loài trong chi Chitinophaga có khả năng liên kết thực vật, ví dụ như được phân lập từ bề mặt rễ cây Dioscorea japonica hoặc nội sinh cây Tylosema esculentum (Han et al., 2013; Chimwamurombe et al., 2016). Bằng chứng về khả năng cố định đạm của Chitinophaga đã được công bố bởi Chimwamurombe và cộng sự (2016), Rilling và cộng sự (2018) và khả năng tiết exopolysaccharide đã được xác nhận là ưu điểm trong sự liên kết của các vi khuẩn cộng sinh cây họ Đậu như Rhizobium, Bradyrhizobium, và cả các vi

107

khuẩn cố định đạm sống tự do như Beijerinckia Burkholderia (Bomfeti et al., 2011). Tương tự, dòng vi khuẩn nội sinh CT4bd cũng có sự tương đồng trình tự 16S rDNA với vi khuẩn Serratia oryzae sp. nov., một loài mới được phân lập từ thân cây lúa trồng ở Trung Quốc (Zhang et al., 2017). Như vậy, các đặc tính cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA của 3 dòng vi khuẩn nội sinh TCT1a, BCR3a và CT4bd mà đề tài luận án đã nghiên cứu và xác nhận sẽ góp phần bổ sung dữ liệu cho 2 loài mới Chitinophaga polysaccharea sp. nov. và Serratia oryzae sp. nov.

Nhìn chung, các dòng vi khuẩn liên kết cây mía mà đề tài luận án đã định danh thuộc về các chủng, loài vi khuẩn được công bố trong cùng lĩnh vực (vi khuẩn có lợi và vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật). Một số loài có khả năng gây bệnh cơ hội từng được khuyến cáo, chẳng hạn như các Burkholderia cepacia complex (BCC), cần phải được cân nhắc và hạn chế khi ứng dụng ra môi trường. Bên cạnh đó, khả năng tăng sinh của các dòng cũng cần được nghiên cứu thêm bởi vì mật số vi khuẩn cũng như điều kiện bảo quản là các yếu tố có tính quyết định trong việc sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh.

Dựa trên kết quả định lượng khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA, sinh siderophore, kết quả định danh, và kết quả theo dõi sự tăng sinh khối trong nuôi cấy lỏng (đạt hơn 108 tế bào/mL sau 48 giờ nuôi cấy trong môi trường LGI, so sánh với chuẩn McFarland), có 12 dòng vi khuẩn tiếp tục được lựa chọn cho các thí nghiệm đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vivo về sau (Bảng 4.10 A và B).

Bảng 4.10 A: Tóm tắt đặc tính của 12 dòng vi khuẩn được tuyển chọn cho các thí nghiệm in vivo

TT Tên định danh Địa phương Nguồn gốc vi khuẩn

Herbaspirillum sp. Bacillus subtilis Bacillus subtilis Serratia plymuthica

108

Tên dòng vi khuẩn BC12 1 2 BC37 3 MT2b BCR5a 4 DMC5e Bacillus subtilis 5 TCT1a 6 TCR1b 7 TR3c 8 CT4bd 9 TAC4a 10 TBD2e 11 TPD3b 12 Chitinophaga polysaccharea Bacillus subtilis Advenella sp. Serratia oryzae Acinetobacter sp. Acinetobacter lactucae Bacillus subtilis Bến Cầu Bến Cầu Dương Minh Châu Bến Cầu Dương Minh Châu Tân Châu Tân Châu Trảng Bàng Châu Thành Tân Châu Trảng Bàng Tân Biên Đất vùng rễ Đất vùng rễ Thân cây mía Rễ cây mía Đất vùng rễ Thân cây mía Rễ cây mía Rễ cây mía Thân cây mía Đất vùng rễ Đất vùng rễ Đất vùng rễ

Bảng 4.10 B: Tóm tắt đặc tính 12 dòng vi khuẩn được tuyển chọn cho các thí nghiệm in vivo (tiếp theo)

Kết quả định lượng in vitro

(mg/L) Tên dòng vi khuẩn Đường kính vòng halo (cm)

+

IAA NH4 P2O5

BC12 BC37

MT2b BCR5a

DMC5e

TCT1a

TCR1b TR3c

CT4bd

TAC4a TBD2e

TPD3b 1,35 f ± 0,15 1,44 e ± 0,14 0,30 jk ± 0,01 1,43 b ± 0,01 2,28 b ± 0,01 0,25 kl ± 0,02 0,49 h ± 0,03 0,68 f ± 0,01 1,94 a ± 0,01 0,18 qrs ± 0,01 1,59 d ± 0,05 2,45 a ± 0,01 103,62 i ± 4,80 219,61 d ± 8,66 16,43 p ± 1,60 141,43 fg ± 14,44 31,47 m ± 1,94 175,50 e ± 4,31 205,31 d ± 4,96 181,33 e ± 8,67 205,31 d ± 5,41 344,69 a ± 10,01 228,20 d ± 6,05 265,10 c ± 6,95 6,53 ij ± 0,50 12,14 a ± 0,16 0,54 tu ± 0,02 6,61 g ± 0,50 8,04 fg ± 0,30 4,76 ij ± 0,29 5,78 h ± 0,32 1,36 qr ± 0,08 9,31 d ± 0,71 7,06 hi ± 0,19 2,34 o ± 0,32 9,73 cd ± 0,90 (-) 2,53 c ± 0,06 (-) (-) 3,77 a ± 0,25 (-) (-) 0,77 l-o ± 0,06 (-) 0,43 p ± 0,06 1,60 g ± 0,10 2,47 c ± 0,12

(-) Dòng không có khả năng sinh siderophore Kết quả trình bày trong Bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

4.7. Kết quả đánh giá hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới

4.7.1. Kết quả nuôi cấy mô cây mía

BA hay BAP (6-benziylaminopurine) thuộc nhóm cytokinin có khả năng thúc đẩy tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp ở thực vật cũng như trên mẫu mô thực vật nuôi cấy in vitro. Trong sinh trưởng thực vật, BA hoạt hóa sự phân chia tế bào, thúc đẩy sự sinh trưởng của các chồi bên và điều tiết quá trình sinh tổng hợp trong tế bào. Trong nuôi cấy mô, sử dụng với nồng độ BA phù hợp có tác dụng thúc đẩy quá trình hình thành chồi và số chồi trên mẫu cấy. Trong thí nghiệm chuẩn bị nguồn vật liệu là các cây mía con in vitro, đỉnh sinh trưởng của giống mía VN85-1859 đã được nuôi cấy trên môi trường MS biến đổi với nồng độ BA bổ sung là 1,0 đến 2,5 mg/L (Hình 4.14).

109

(a): MS bổ sung 1,0 mg/L BA, (b): MS bổ sung 1,5 mg/L BA (c): MS bổ sung 2,0 mg/L BA, (d): MS bổ sung 2,5 mg/L BA

Hình 4.14: Sự tạo chồi ở mẫu cấy đỉnh sinh trưởng của mía VN85 – 1859 dưới ảnh hưởng của BA

Sau 3 tuần nuôi cấy, nghiệm thức bổ sung 1,5 mg/L BA cho kết quả tốt nhất về cả 3 chỉ tiêu là tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi, số chồi trung bình trên một mẫu cấy và chiều cao trung bình của chồi (Bảng 4.11; Phụ lục 4.10). Tỷ lệ tạo chồi của mẫu cấy đạt 81%; số chồi bình quân trên mỗi mẫu cấy đạt 2,95; và chiều cao trung bình của chồi đạt khoảng 1,87 cm.

Bảng 4.11: Ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi của mẫu cấy đỉnh sinh trưởng của giống mía VN85 – 1859

Nghiệm Nồng độ Tỷ tệ mẫu Số chồi/ Chiều cao chồi

thức BA (mg/L) tạo chồi (%) mẫu cấy (cm)

1,0 1

1,5 10 d ± 0,00 81 a ± 5,09 1,00 c ± 0,00 2,95 a ± 0,30 0,01d ± 0,01 1,87 a ± 0,05 2

2,0 54,4 c ± 3,85 2,00 b ± 0,00 0,48 c ± 0,05 3

2,5 65,5 b ± 6,94 2,33 b ± 0,20 0,58 b ± 0,07 4

11,99 11,99 6,80

110

CV % Kết quả trình bày trong Bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

Ảnh hưởng của BA và các phytohormone khác lên sự tạo chồi còn chịu tác động của yếu tố kiểu gene của giống mía và thời gian cấy. Tolera và cộng sự (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi của mẫu cấy đỉnh sinh trưởng mía ở hai giống mía B41-227 và N14. Nồng độ thích hợp của BA đối với sự tạo chồi ở giống N14 là 2 mg và ở giống B41-227 là 1 mg/L kết hợp với 0,5 mg/L kinetin. Sau 30 ngày nuôi cấy, bình quân số chồi trên mẫu cấy trong môi trường MS bổ sung 2 mg BA ở giống N14 là 21 chồi, trong khi ở B41-227 là 14 chồi.

Sau bước khảo sát sự tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng của giống mía VN85- 1859, chồi thu được từ nghiệm thức tốt nhất tiếp tục được tách rời và chuyển sang môi trường MS biến đổi có bổ sung BA với nồng độ từ 1 – 2mg/L và kinetin (Kin) với nồng độ 0,25 – 0,75 mg/L. Mỗi nghiệm thức lặp lại trên 10 bình. Mỗi bình cấy 2 chồi. Sau 30 ngày nuôi cấy, chồi đã phát triển thành cụm chồi như Hình 4.15.

Khoáng nền MS, bổ sung Kin và BA với nồng độ (mg/L) tương ứng là: (a): 0,25 và 1,0; (b): 0,25 và 1,5; (c): 0,25 và 2,0; (d): 0,5 và 1,0 ; (e): 0,5 và 1,5; (f): 0,5 và 2,0; (g): 1,0 và 1,0; (h): 1,0 và 1,5; (i): 1,0 và 2,0.

Hình 4.15: Kết quả nhân nhanh chồi ở mía VN85 – 1859 dưới ảnh hưởng của BA và Kin

111

Số lượng cụm chồi, số chồi trung bình của một cụm chồi và chiều cao trung bình của chồi được trình bày trong Bảng 4.12 và Phụ lục 4.11. Qua Bảng 4.12 cho thấy sự phối hợp của BA và Kin đều có tác dụng thúc đẩy chồi đơn phát triển thành một cụm chồi. Tuy nhiên, đối với giống mía VN85 – 1859, sự kết hợp 2 mg/L BA và 0,5 mg/L Kin là phù hợp nhất. Có 93,34% số mẫu cấy hình thành cụm chồi từ chồi đơn; mỗi cụm chồi trung bình có 3,83 chồi với chiều cao trung bình là 3,94 cm.

Bảng 4.12: Ảnh hưởng của Kin và BA lên sự nhân nhanh chồi ở giống mía VN85 – 1859

Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) Số chồi/ cụm chồi Chiều cao chồi (cm) Nồng độ Kin (mg/L)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 CV % 0,25 0,25 0,25 0,50 0,50 0,50 0,75 0,75 0,75 Nồng độ BA (mg/L) 1,0 1,5 2,0 1,0 1,5 2,0 1,0 1,5 2,0 83,34 b ± 1,92 74,44 c ± 3,33 93,34 a ± 1,92 84,44 b ± 1,92 91,10 a ± 1,92 93,34 a ± 1,92 85,57 b ± 1,92 82,24 b ± 3,33 44,44 d ± 3,33 3,61 2,40 cd ± 0,07 1,85 e ± 0,03 3,36 b ± 0,17 2,22 d ± 0,10 2,58 c ± 0,33 3,83 a ± 0,12 2,64 c ± 0,07 2,50 c ± 0,08 1,30 f ± 0,13 5,78 1,83 d ± 0,11 1,32 g ± 0,04 2,72 b ± 0,05 1,44 f ± 0,05 2,43 c ± 0,10 3,94 a ± 0,06 1,71 e ± 0,04 1,68 e ± 0,02 0,45 h ± 0,04 3,17

Kết quả trình bày trong Bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

Tương tự như ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi, tác động của sự phối hợp BA và Kin lên sự nhân nhanh chồi cũng bị ảnh hưởng bởi kiểu gene của giống mía. Trong một nghiên cứu nhằm tìm kiếm quy trình nhân nhanh hai giống mía thương mại ở Ethiopia là Co449 và Co678, Mekonnen và cộng sự (2014) đã tìm thấy môi trường MS bổ sung 2 mg/L BA và 0,25 mg/L Kin là thích hợp nhất cho sự nhân chồi của giống Co678. Trong đó, có đến 90% mẫu cấy phát sinh chồi và đạt trung bình 9 chồi mỗi trên mỗi mẫu cấy.

Bước kế tiếp của việc nhân nhanh chồi tạo nguồn nguyên liệu là tìm kiếm môi trường nuôi cấy phù hợp cho sự tạo rễ để hình thành cây con hoàn chỉnh (Hình 4.16). Từ nghiệm thức tốt nhất của sự nhân chồi, tách rời chồi từ các cụm chồi và chuyển sang môi trường thúc đẩy sự tạo rễ. Môi trường này là MS có bổ sung NAA với nồng độ từ 0,25 – 0,75 mg/L. Để hạn chế tiết sự phenol của mẫu cấy, môi trường được bổ sung thêm 1% than hoạt tính.

112

Khoáng nền MS, bổ sung NAA với nồng độ (mg/L) tương ứng là: (a): 0,25 (b): 0,50; (c): 0,75; (d): 1,0 ; (e): 1,25; (f): 1,5.

Hình 4.16 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ ở giống mía VN85 – 1859

Kết quả cho thấy (Bảng 4.13, Phụ lục 4.12 ) môi trường MS biến đổi bổ sung 0,25 mg/L NAA là thích hợp cho sự thúc đẩy tạo rễ và hình thành cây con hoàn chỉnh in vitro ở giống mía VN85 – 1859. Sau 6 tuần nuôi cấy, chiều cao thân đạt 12, 47 cm, số rễ trung bình đạt 6,33 rễ và chiều dài trung bình của rễ đạt 5,5 cm. Ở các nồng độ NAA cao hơn, kết quả này có xu hướng giảm dần.

113

Bảng 4.13: Ảnh hưởng NAA lên sự tạo rễ và cây con hoàn chỉnh ở giống mía VN85 – 1859

Chiều cao thân (cm) Số rễ Chiều dài rễ (cm) Nghiệm thức

Nồng độ NAA (mg/L) 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 5,55 a ± 4,80 b ± 4,30 b ± 3,34 c ± 3,34 c ± 2,23 d ± 1 2 3 4 5 6 CV % 12,47 a ± 1,02 9,75 b ± 0,43 9,69 b ± 0,12 9,11 bc ± 0,42 8,47 cd ± 0,41 7,81 d ± 0,34 5,57 6,33 a ± 0,67 4,35 b ± 0,15 4,33 bc ± 0,35 4,48 bc ± 0,12 3,67 bc ± 0,29 3,94 c ± 0,42 8,03 0,05 0,05 0,02 0,01 0,02 0,01 8,40

Kết quả trình bày trong Bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

Nồng độ NAA 0,25 mg/L dành cho sự tạo rễ là thấp hơn so với các nghiên cứu trước đây về ảnh hưởng của auxin lên sự tạo rễ của cây mía con in vitro. Ở mía, nồng độ auxin sử dụng trong nuôi cấy tạo rễ phổ biến là 0,5 – 3 mg IBA, hoặc 0,5 – 7 mg NAA cho 1 L môi trường (Getnet, 2017). Việc tạo rễ in vitro ở mía còn phụ thuộc vào thành phần các chất và nồng độ trong khoáng nền. Khan và cộng sự (2009) nhận thấy môi trường MS có bổ sung 6% sucrose và 1mg/L IAB là sự kết hợp tốt nhất cho tạo sự rễ ở mẫu cấy; trong khi nghiên cứu của Sahoo và cộng sự (2011) cho thấy môi trường tạo rễ tốt là MS ½ bổ sung 50 g/L sucrose và 5mg/L NAA. Mặc khác, sau 30 ngày nuôi cấy, hơn 90% mẫu cấy phát triển rễ khi nuôi cấy trên môi trường MS không có chất điều hòa sinh trưởng.

Qua thí nghiệm tạo cây con từ vật liệu là đỉnh sinh trưởng ngọn của giống mía VN85 – 1859, nguồn vật liệu gnotobiotic là các cây mía con in vitro sạch khuẩn đã được chuẩn bị cho các nghiên cứu khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các dòng vi khuẩn tuyển chọn. Nhìn chung, khả năng phát sinh chồi và nhân chồi của mẫu cấy trong thí nghiệm này là chưa cao và cần được nghiên cứu thêm nhưng đã tạo ra được nguồn vật liệu phù hợp cho hướng nghiên cứu.

4.7.2. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trên cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới

Mười hai dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và siderophore tốt đã được chọn để tiếp tục được đánh giá đặc tính thúc đẩy tăng tưởng thực vật trên cây mía con trồng trong bình Leonard ở điều kiện nhà lưới, giai đoạn từ khi trồng đến 90 ngày tuổi. Chọn các cây mía con in vitro có kích thước đồng đều, có khoảng 3 lá và 3 rễ để làm nguyên liệu cho thí nghiệm này (Hình 4.17).

114

Hình 4.17: Các cây mía in vitro trên môi trường nuôi cấy có bổ sung than hoạt tính

Sau khi chủng vi khuẩn vào rễ và chuyển các cây con sang trồng trong bình Leonard trong điều kiện nhà lưới trong vòng 90 ngày, kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn có tác động khác nhau lên sự hình thành rễ, số lá và chiều cao cây mía sau nuôi cấy mô (Bảng 4.14; Phụ lục 4.13).

Bảng 4.14: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên số rễ, số lá và chiều cao cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới

Nghiệm thức

Số rễ

Số lá

Đối chứng âm BC12 BC37 MT2b BCR5a DMC5e TCT1a TCR1b TR3c CT4bd TAC4a TBD2e TPD3b CV (%)

13,50 e ± 0,58 17,25 d ± 0,96 14,25 e ± 1,50 18,75 d ± 1,26 18,50 d ± 1,29 22,50 b ± 1,73 21,75 bc ± 2,06 19,25 cd ± 2,22 9,50 f ± 1,73 29,75 a ± 3,50 21,50 bc ± 1,29 23,25 b ± 1,26 24,00 b ± 0,82 9,77

5,50 f ± 0,58 8,25 ab ± 0,50 7,50 bc ± 0,58 6,25 def ± 0,50 5,75 ef ± 0,50 9,00 a ± 0,82 8,00 b ± 0,00 7,50 bc ± 0,58 6,50 de ± 0,58 6,75 cd ± 0,50 8,25 ab ± 0,50 6,75 cd ± 0,50 5,75 ef ± 0,50 7,61

Chiều cao thân (cm) 34,00 f ± 2,16 54,38 bc ± 1,89 35,25 f ± 2,22 47,00 d ± 3,37 51,75 c ± 1,85 53,00 bc ± 1,41 48,50 d ± 1,91 24,25 h ± 1,26 21,50 h ± 0,91 55,50 b ± 1,47 39,25 e ± 4,50 46,00 d ± 1,08 59,00 a ± 1,32 4,96

Kết quả trình bày trong Bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

Kết quả ở Bảng 4.14 cho thấy, ngoại trừ dòng TR3c, tất cả các dòng vi khuẩn còn lại đều làm gia tăng số rễ ở mía. Trong đó, các dòng vi khuẩn có tác động tốt nhất là CT4bd với 29,75 rễ, TPD3b với 24 rễ, TBD2e với 23,25 rễ, và DMC5e với 22,5 rễ; làm tăng so với đối chứng âm không chủng vi khuẩn từ 67 – 120% (Hình 4.18).

115

(A) Từ 1 – 6 tương ứng với các dòng vi khuẩn: BC12, BC37, MT2b, BCR5a, DMC5e, TCT1a; (B) Từ 7 – 12 tương ứng với các dòng vi khuẩn: TCR1b, TR3c, CT4bd, TAC4a, TBD2e, TPD3b KVK: Đối chứng âm không sử dụng vi khuẩn

Hình 4.18: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên số rễ, số lá và chiều cao cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới

Đối với số lượng lá, cả 12 dòng vi khuẩn đều có tác động tốt trên cây mía thử nghiệm. Trong khi nghiệm thức đối chứng âm có số lá trung bình trên mỗi cây mía là 5,5 thì kết quả này ở các nghiệm thức sử dụng các dòng vi khuẩn DMC5e, TCT1a, TAC4a và BC12 lần lượt là 9 lá; 8 lá; 8,25 lá; và 8,25 lá. Đây là các dòng làm gia tăng số lượng lá tốt nhất; tỷ lệ gia tăng đạt từ 50 – 64% so với đối chứng âm không sử dụng vi khuẩn.

116

Về tác động của vi khuẩn lên chiều cao cây, ngoại trừ dòng TR3c và TCR1b, tất cả các dòng còn lại đều làm gia tăng từ 0,25 – 35 cm. Trong đó, các nghiệm thức tương ứng với các dòng TPD3b, CT4bd, DMC5e, BC12 và BCR5a có chiều cao cây lần lượt là 59 cm; 55,5 cm; 53 cm; 54,38 cm và 51,75 cm; tỷ lệ gia tăng so với đối chứng không chuẩn vi khuẩn từ 116 – 145%.

Về khối lượng tươi của cây, Bảng 4.15 (Phụ lục 4.14) sau đây sẽ tóm tắt hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn lên cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới. Qua đó cho thấy, ngoại trừ dòng TR3c, tất cả các dòng vi khuẩn đều làm gia tăng về khối lượng tươi của rễ, thân, lá và toàn cây so với đối chứng âm không sử dụng vi khuẩn.

Bảng 4.15: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khối lượng tươi của rễ, thân, lá và toàn cây ở cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới

Nghiệm thức

Đối chứng âm BC12 BC37 MT2b BCR5a DMC5e TCT1a TCR1b TR3c CT4bd TAC4a TBD2e TPD3b CV (%) Khối lượng tươi của lá (g) 0,09 f ± 0,01 0,79 b ± 0,02 0,24 e ± 0,02 0,48 c ± 0,04 0,58 c ± 0,04 0,17 ef ± 0,03 0,55 c ± 0,06 0,17 ef ± 0,02 0,14 f ± 0,03 1,02 a ± 0,09 0,39 d ± 0,08 0,37 d ± 0,15 0,71 b ± 0,05 10,28 Khối lượng tươi của thân (g) 0,14 fg ± 0,01 0,29 d ± 0,02 0,18 ef ± 0,01 0,28 d ± 0,04 0,34 c ± 0,07 0,16 f ± 0,04 0,38 b ± 0,02 0,22 e ± 0,01 0,11 g ± 0,02 0,40 b ± 0,01 0,21 e ± 0,01 0,39 b ± 0,02 0,54 a ± 0,03 10,55 Khối lượng tươi toàn cây (g) 0,45 h ± 0,01 1,72 c ± 0,07 0,68 g ± 0,04 1,20 f ± 0,08 1,42 e ± 0,12 0,64 g ± 0,04 1,82 c ± 0,06 0,75 g ± 0,05 0,65 g ± 0,08 2,37 b ± 0,19 1,07 f ± 0,11 1,57 d ± 0,15 2,83 a ± 0,09 7,21

Khối lượng tươi của rễ (g) 0,22 i ± 0,01 0,64 d ± 0,07 0,27 hi ± 0,01 0,44 ef ± 0,01 0,51 e ± 0,03 0,31 gh ± 0,02 0,89 b ± 0,07 0,37 fg ± 0,03 0,40 f ± 0,07 0,95 b ± 0,13 0,48 e ± 0,03 0,81 c ± 0,03 1,58 a ± 0,03 8,62 Kết quả trình bày trong Bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

Qua Bảng 4.15 cho thấy tất cả các nghiệm thức đều làm gia tăng khối lượng tươi của rễ, thân, lá và toàn cây so với đối chứng âm không chủng vi khuẩn. Trên cả 4 chỉ tiêu, 3 dòng có tác động tốt nhất là TPD3b, CT4bd, và TCT1a. Trong đó, khối lượng tươi của rễ đạt 0,89 – 1,58 g; khối lượng tươi của thân đạt 0,38 – 0,54 g; khối lượng tươi của lá đạt 0,55 – 1,02 g; khối lượng tươi của toàn cây đạt 1,82 – 2,83 g. Các dòng có tác động tốt trên các chỉ tiêu vừa kể còn có TBD2e, BCR5a, MT2b, và BC12. Ba dòng tốt nhất là TPD3b, CT4bd, và TCT1a đã làm tăng khối lượng tươi của toàn cây so với đối chứng âm từ 4,0 đến 6,3 lần.

117

Về khối lượng chất khô của rễ, thân, lá và toàn cây, Bảng 4.16 (Phụ lục 4.15) sau đây sẽ tóm tắt hiệu quả của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới.

Bảng 4.16: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khối lượng khô của rễ, thân, lá và toàn cây ở cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới

Nghiệm thức

Đối chứng âm BC12 BC37 MT2b BCR5a DMC5e TCT1a TCR1b TR3c CT4bd TAC4a TBD2e TPD3b CV (%) Khối lượng khô của lá (g) 0,04 hi ± 0,01 0,15 c ± 0,01 0,07 g ± 0,01 0,14 cd ± 0,02 0,13 cde ± 0,01 0,04 h ± 0,02 0,13 cde ± 0,01 0,04 h ± 0,02 0,02 i ± 0,01 0,17 b ± 0,01 0,12 ef ± 0,02 0,11 f ± 0,01 0,19 a ± 0,03 13,57 Khối lượng khô của thân (g) 0,02 gh ± 0,01 0,05 de ± 0,01 0,02 gh ± 0,01 0,05 d ± 0,01 0,05 d ± 0,01 0,02 gh ± 0,01 0,08 b ± 0,01 0,03 eg ± 0,01 0,01 h ± 0,01 0,08 b ± 0,01 0,04 ef ± 0,01 0,06 c ± 0,01 0,19 a ± 0,01 13,53 Khối lượng khô toàn cây (g) 0,11 fg ± 0,02 0,27 d ± 0,02 0,12 f ± 0,01 0,27 d ± 0,03 0,28 d ± 0,01 0,10 fg ± 0,02 0,42 c ± 0,03 0,11 fg ± 0,03 0,07 g ± 0,02 0,50 b ± 0,04 0,23 e ± 0,03 0,28 d ± 0,01 0,72 a ± 0,05 9,41

Khối lượng khô của rễ (g) 0,05 gh ± 0,01 0,08 ef ± 0,02 0,03 h ± 0,01 0,08 e ± 0,01 0,09 de ± 0,01 0,04 h ± 0,01 0,21 c ± 0,02 0,04 gh ± 0,01 0,04 gh ± 0,01 0,26 b ± 0,03 0,06 fg ± 0,01 0,11 d ± 0,02 0,33 a ± 0,02 13,50 Kết quả trình bày trong Bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

Qua Bảng 4.16 cho thấy, ngoại trừ 4 dòng BC37, DMC5e, TCR1b và TR3c có kết quả tương đương với đối chứng âm không chủng vi khuẩn ở một hoặc vài chỉ tiêu, 8 dòng vi khuẩn còn lại đều có tác dụng tốt lên các chỉ tiêu đã khảo sát. Đối với các chỉ tiêu gồm khối lượng khô của rễ, khối lượng khô của thân và khối lượng khô của toàn cây, 3 dòng TCT1a, CT4bd, và TPD3b có tác động tốt nhất khi làm tăng lần lượt từ 4,2 – 6,6 lần, 4,0 – 9,5 lần, và 3,8 – 6,5 lần, một cách tương ứng. Riêng chỉ tiêu khối lượng khô của lá, 3 dòng tốt nhất là BC 12 b, CT4bd, và TPD3 có tác dụng làm tăng từ 3,8 – 4,8 lần so với đối chứng âm. Hai dòng làm tăng trọng lượng khô rễ mạnh nhất là các dòng TPD3b và CT4bd. Dòng TBD2e cũng có tác động tốt trên khối lượng khô của thân (0,06 g) khi làm tăng chỉ tiêu này lên gấp 3 lần so với đối chứng không sử dụng vi khuẩn (0,02 g).

Theo các tài liệu hiện hành, các dòng vi khuẩn bản địa khi được chủng trở lại cho cây trồng thì thường tạo ra được hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật. Tuy vậy, trong thực nghiệm, có những trường hợp hiệu quả này không được xác nhận. Trong nghiên cứu của Oliveira và cộng sự (2002), cây mía con nhân giống in vitro đã được chủng với các dòng vi khuẩn bao gồm Gluconacetobacter diazotrophicus, Azospirillum amazonense, và Burkholderia sp. vốn được phân lập từ mô rễ và thân cây

118

mía. Trong điều kiện trồng trong chậu, sau 45 ngày, kết quả cho thấy chỉ có Gluconacetobacter diazotrophicus tạo ra sự gia tăng đáng kể về khối lượng khô của rễ. Ngược lại, 2 dòng Burkholderia sp. và Azospirillum amazonense đã không cho thấy hiệu quả này. Một nghiên cứu khác về hiệu quả của Bacillus subtilis và Bacillus pumilus phân lập từ đất vùng rễ lên sự tăng trưởng của cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà kính cũng cho thấy Bacillus subtilis có tác động tốt lên sự tăng trưởng của bộ rễ khi làm tăng 23% chất khô tổng số so với đối chứng. Dòng vi khuẩn Bacillus pumilus không cho hiệu quả ngang bằng (Satos et al., 2018).

Phân tích bên trên cho thấy giữa hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các dòng vi khuẩn trong các thí nghiệm in vitro có thể không đồng nhất với các thí nghiệm in vivo. Thật sự, sự tương tác giữa vi khuẩn với cây trồng còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài như chế độ chăm sóc, chế độ phân bón và các yếu tố bên trong như tuổi cây, giống (kiểu gene) cây và loại vi khuẩn (nội sinh, biểu sinh, hay sống tự do). Như vậy, sau khi tuyển chọn các dòng có đặc tính PGP in vitro tốt, nhất thiết phải tiếp tục xác định đặc tính này trong các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng trên cây trồng.

Thí nghiệm đánh giá hiệu quả của 12 dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía nhân giống in vitro trồng trong điều kiện nhà lưới đã giúp loại trừ ảnh hưởng của vi khuẩn ngoại lai và cho phép tuyển chọn lại các dòng tốt hơn để thu gọn nghiệm thức, tiến tới thử nghiệm bán thực địa (trong chậu) và thực địa (ngoài đồng). Qua kết quả thí nghiệm, 2 dòng vi khuẩn có hiệu quả tốt nhất trên hầu hết các chỉ tiêu đánh giá là vi khuẩn đất vùng rễ TPD3b (Bacillus subtilis) và vi khuẩn nội sinh CT4bd (Serratia oryzae) (Bảng 4.17) tiếp tục được tuyển chọn. Dòng vi khuẩn nội sinh CT4bd vốn được phân lập từ thân cây mía trồng tại xã Hảo Đước, huyện Châu Thành và dòng vi khuẩn TPD3b vốn được phân lập từ đất vùng rễ cây mía trồng tại xã Tân Phong, huyện Tân Biên, tỉnh Tây Ninh.

Bảng 4.17: Tóm tắt hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn TPD3b và CT4bd trên các chỉ tiêu tăng trưởng của cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới Chỉ tiêu

Số rễ Số lá Chiều cao thân (cm) Khối lượng tươi của rễ (g) Khối lượng tươi của thân (g) Khối lượng tươi của lá (g) Khối lượng tươi toàn cây (g) Khối lượng khô của rễ (g) Khối lượng khô của thân (g) Khối lượng khô của lá (g) Khối lượng khô toàn cây (g)

Kết quả thu được TPD3b (Bacillus subtilis) CT4bd (Serratia oryzae) 29,75 a ± 3,50 6,75 cd ± 0,50 55,50 b ± 1,47 0,95 b ± 0,13 0,40 b ± 0,01 1,02 a ± 0,09 2,37 b ± 0,19 0,26 b ± 0,03 0,08 b ± 0,01 0,72 a ± 0,01 0,50 b ± 0,04

24,00 b ± 0,82 5,75 ef ± 0,50 59,00 a ± 1,32 1,58 a ± 0,03 0,54 a ± 0,03 0,71 b ± 0,05 2,83 a ± 0,09 0,33 a ± 0,02 0,19 a ± 0,01 0,08 b ± 0,01 0,17 b ± 0,01

119

4.8. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu

Hai dòng vi khuẩn CT4bd (Serratia oryzae) và TPD3b (Bacillus subtilis) đã được đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật trên cây mía trồng trong chậu khi bón riêng lẻ hay phối hợp cùng với phân N và P hóa học ở các mức bón khác nhau (Bảng 4.18 A và B). Sự tương tác giữa 2 yếu tố “vi khuẩn” và “phân bón” là có ý nghĩa thống kê ở mức P=95%.

Bảng 4.18 A: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 6 tháng trồng trong chậu

Số lóng Nghiệm thức Đường kính thân (cm)

9,00 h ± 0,82 10,13 fg ± 0,95 10,13 fg ± 0,48 12,13 bcd ± 0,63 11,88 b-e ± 0,63 9,88 gh ± 0,63 11,88 b-e ± 0,63 12,75 ab ± 0,29 11,50 cde ± 0,71 11,13 e ± 0,48 10,00 g ± 0,41 12,25 bcd ± 0,50 11,00 ef ± 0,58 12,50 ab ± 0,58 12,50 ab ± 0,41 10,13 fg ± 0,85 12,38 abc ± 0,48 11,38 de ± 0,48 13,50 a ± 0,41 13,25 a ± 1,26 6,7 Chiều cao thân (cm) 1,99 h ± 0,11 58,75 i ± 7,59 4,43 2,42 acb ± 0,10 87,50 bcd ± 2,18 fg ± 0,06 86,50 cde ± 2,89 2,40 a-d ± 0,12 84,50 def ± 6,14 2,20 efg ± 0,16 90,50 bcd ± 7,59 2,24 c-g ± 0,07 80,25 d-h ± 4,27 2,33 b-f ± 0,10 71,25 gh ± 5,56 98,50 ab ± 2,45 ab ± 0,07 8,70 73,25 fgh ± 12,76 2,23 d-g ± 0,10 2,50 ab ± 0,16 80,50 d-h ± 9,47 2,10 gh ± 0,23 70,25 h ± 15,90 7,68 2,16 fgh ± 0,22 88,75 bcd ± 2,13 gh ± 0,06 71,75 gh ± 8,66 2,50 ab ± 0,07 94,00 bc ± 3,65 2,38 a-e ± 0,05 87,25 b-e ± 7,80 2,20 efg ± 0,23 82,00 d-g ± 9,20 2,18 fg ± 0,10 76,00 e-h ± 6,00 3,56 2,23 d-g ± 0,10 80,00 d-h ± 2,54 a ± 0,11 109,50 a ± 9,47 2,60 a ± 0,08 116,25 a ± 12,61 6,73 11,75

120

Năng suất mía (tấn/ha) 23,48 i ± 3,75 B0F0 53,63 g ± 4,55 B0F1 65,60 def ± 3,11 B0F2 68,73 b-e ± 1,45 B0F3 75,90 a ± 4,42 B0F4 62,73 f ± 8,26 B1F0 66,02 c-f ± 3,49 B1F1 71,13 abc ± 0,77 B1F2 64,78 ef ± 3,87 B1F3 63,23 f ± 3,13 B1F4 45,90 h ± 6,04 B2F0 64,18 ef ± 4,69 B2F1 55,10 g ± 5,78 B2F2 70,98 a-d ± 0,57 B2F3 72,98 ab ± 1,61 B2F4 41,10 h ± 3,23 B3F0 63,18 f ± 0,84 B3F1 66,53 c-f ± 3,60 B3F2 79,40 a ± 1,00 B3F3 76,13 a ± 3,63 B3F4 CV % 7,6 Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm LSD. Chú thích nghiệm thức: (F0): 0% NP; (F1): 25% NP; (F2): 50% NP; (F3): 75% NP ; (F4): 100% NP; (B0): 0 VK; (B1): Serratia oryzae CT4bd; (B2): Bacillus subtilis TPD3b; (B3): Serratia oryzae CT4bd + Bacillus subtilis TPD3b.

Bảng 4.18 B: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 6 tháng trồng trong chậu (tiếp theo)

CCS (%) Độ Brix (%)

Nghiệm thức B0F0 B0F1 B0F2 B0F3 B0F4 B1F0 B1F1 B1F2 B1F3 B1F4 B2F0 B2F1 B2F2 B2F3 B2F4 B3F0 B3F1 B3F2 B3F3 B3F4

14,82vhi ± 0,56 15,76vc-h ± 0,63 15,02vf-i ± 1,38 15,47 d-h ± 1,24 15,68 c-h ± 0,67 15,60 c-h ± 0,10 14,75 hi ± 0,62 14,85 ghi ± 0,33 17,22 a ± 0,24 14,50 i ± 0,70 17,02 ab ± 0,34 15,76 c-h ± 0,63 15,99 cde ± 0,22 15,15 e-i ± 0,56 15,93 c-f ± 0,61 16,14 bcd ± 0,25 16,41 abc ± 0,40 15,61 c-h ± 0,57 17,37 a ± 0,93 15,36 d-i ± 0,10 5,15 6,28 hi ± 0,37 6,90 c-g ± 0,42 6,41 f-i ± 0,91 6,71 d-h ± 0,82 6,85 c-h ± 0,44 6,80 c-h ± 0,06 6,24 hi ± 0,41 6,30 ghi ± 0,22 7,87 a ± 0,16 6,07 i ± 0,46 7,73 ab ± 0,22 6,90 c-g ± 0,41 7,05 cde ± 0,14 6,50 e-i ± 0,37 7,01 c-f ± 0,40 7,15 bcd ± 0,16 7,33 abc ± 0,27 6,80 c-h ± 0,38 7,96 a ± 0,61 6.64 d-i ± 0,07 7,78 CV %

Năng suất đường (tấn/ha) 1,46 k ± 0,15 3,69 gh ± 0,26 4,21 efg ± 0,66 4,62 a-e ± 0,64 5,20 a ± 0,50 4,27 efg ± 0,58 4,12 e-h ± 0,38 4,48 de ± 0,16 5,10 abc ± 0,37 3,85 gh ± 0,43 3,55 h ± 0,46 4,43 ef ± 0,47 3,89 fgh ± 0,42 4,61 b-e ± 0,28 5,12 ab ± 0,34 2,94 i ± 0,24 4,63 a-e ± 0,14 4,53 cde ± 0,37 6,33 a ± 0,54 5,05 a-d ± 0,23 11,93 Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm LSD. Chú thích nghiệm thức: (F0): 0% NP; (F1): 25% NP; (F2): 50% NP; (F3): 75% NP ; (F4): 100% NP; (B0): 0 VK; (B1): Serratia oryzae CT4bd; (B2): Bacillus subtilis TPD3b; (B3): Serratia oryzae CT4bd + Bacillus subtilis TPD3b.

Qua Bảng 4.18 A và B cho thấy trong các nghiệm thức không sử dụng vi khuẩn (B0F0, B0F1, B0F2, B0F3, B0F4), khi tăng mức bón từ 0% đến 100% phân N và P, có thể quan sát thấy sự gia tăng thuận trên tất cả các chỉ tiêu theo dõi bao gồm số lóng, chiều cao thân, đường kính thân, năng suất mía, độ Brix, chữ đường, và năng suất đường. Điều này cho thấy vai trò không thể phủ nhận của phân bón hoác học đối với cây trồng nói chung, cũng như vai trò của phân N, P hóa học trong sự sinh trưởng và năng suất của mía.

Về vai trò của vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật, so với nghiệm thức không sử dụng vi khuẩn và phân hóa học (đối chứng âm - B0F0), tất cả các nghiệm thức có sử dụng vi khuẩn CT4bd, TPD3b riêng lẻ hay kết hợp

121

(B1F0, B2F0, B3F0) đều cho kết quả tốt hơn. Điều này đã được quan sát thấy trong thí nghiệm trên cây mía nuôi cấy mô trồng trong điều kiện nhà lưới và tiếp tục được khẳng định trong thí nghiệm ở quy mô chậu: 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn có ảnh hưởng tích cực đến các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của cây mía.

Đối với các chỉ tiêu sinh trưởng của mía, bao gồm số lóng, chiều cao thân và đường kính thân, hầu hết các nghiệm thức phối hợp chủng vi khuẩn cho mía và phân bón hóa học đều cho kết quả thấp hơn so với nghiệm thức sử dụng 100% phân N, P hóa học và không sử dụng vi khuẩn (đối chứng dương – B0F4). Tuy vậy, khi sử dụng vi khuẩn TPD3b kết hợp với mức bón 75% phân N, P (nghiệm thức B2F3) đã làm gia tăng số lóng thêm 5,9% so với đối chứng dương B0F4. Khi sử dụng vi khuẩn CT4bd kết hợp với phân N, P hóa học ở tất cả các mức bón đều có tác dụng làm gia tăng đường kính thân so với nghiệm thức đối chứng dương B0F4. Đặc biệt, sử dụng CT4bd kết hợp với 75 – 100% N, P (nghiệm thức B1F4) đã làm tăng đường kính thân thêm 1,36 – 13,6%.

Đối với các chỉ tiêu năng suất mía, khi sử dụng vi khuẩn CT4bd kết hợp với phân N, P ở mức 25 – 50% (B1F1 và B1F2) đều cho kết quả về độ Brix và chữ đường thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng dương sử dụng 100% phân N, P. Khi tăng mức bón lên 75% thì sự kết hợp của phân hóa học và vi khuẩn CT4bd (B1F3) có tác dụng làm tăng độ Brix và chữ đường thêm 1,54% và 1,02% so với đối chứng dương B0F4. Riêng dòng TPD3b, khi sử dụng phối hợp với mức bón 25 – 50% phân N, P (nghiệm thức B2F1 và B2F2), có tác dụng làm tăng độ Brix và chữ đường thêm 0,08 – 0,31% và 0,05 – 0,2% so với đối chứng dương B0F4.

Về việc sử dụng phối hợp 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b (B3F0), so với đối chứng âm không sử dụng phân hóa học và chủng vi khuẩn (B0F0), tác động của vi khuẩn trên sự sinh trưởng và năng suất của mía làm gia tăng 12,6% đối với số lóng, 39,6% đối với chiều cao thân, 9,5% đối với đường kính thân, 75% đối với năng suất mía, 0,09% về độ Brix, 13,9% về chữ đường và 101,4% về năng suất đường. Đặc biệt, trên tất cả các chỉ tiêu, sự phối hợp 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b với 75% phân bón N, P (B3F3) cho kết quả tốt nhất: số lóng đạt 13,5 lóng; chiều cao thân đạt 109,5 cm; đường kính thân đạt 2,54 cm; năng suất mía quy đổi đạt 79,4 tấn/ha; độ Brix đạt 17,37%; chữ đường đạt 7,96%; và năng suất đường đạt 6,33 tấn/ha. So với nghiệm thức đối chứng dương (B0F4), nghiệm thức B3F3 có tác dụng làm tăng 13,6% đối với số lóng, 21% đối với chiều cao thân, 15,5% đối với đường kính thân, 4,6% đối với năng suất mía, 10,8% về độ Brix, 16,2% về chữ đường và 21,7% về năng suất đường (Hình 4.19).

122

Chú thích nghiệm thức: (F0): 0% NP; (F1): 25% NP; (F2): 50% NP; (F3): 75% NP ; (F4): 100% NP; (B0): 0 VK; (B3): Serratia oryzae CT4bd + Bacillus subtilis TPD3b.

Hình 4.19: Cây mía giống K95-156 trồng trong chậu dưới ảnh hưởng của tổ hợp vi khuẩn CT4bd và TPD3b và các mức bón phân N, P

Như đã đề cập trước đây, sự tương tác giữa vi khuẩn với cây trồng khi thử nghiệm hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật invivo chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố, trong đó sự tương tác của các dòng vi khuẩn khi sử dụng phối hợp chúng cũng cần được cân nhắc. Trong nghiên cứu của Govindarajan và cộng sự (2006), sự sử dụng phối hợp của chủng Burkholderia vietnamiensis MG43 với Gluconacetobacter diazotrophicus và Herbaspirillum seropedicae cho hiệu quả thấp hơn về sinh khối cây mía trồng trong chậu so với nghiệm thức chỉ sử dụng vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis MG43.

Đối với sự tương tác của vi khuẩn và phân bón hóa học, sự gia tăng hàm lượng phân hóa học không phải lúc nào cũng tương quan tuyến tính thuận với hiệu quả thu được trên cây trồng. Qua Bảng 4.17 B, có thể thấy nghiệm thức sử dụng phối hợp 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn CT4bd và TPD3b với 100% phân hóa học N và P làm giảm độ Brix, chữ đường và năng suất đường so với khi sử dụng mức bón 75% phân. Điều này cũng từng được ghi nhận bởi Suman và cộng sự (2009) khi nghiên cứu hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các 7 vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus trên cây mía giống

123

CoSe92423 trồng trong điều kiện nhà lưới. Ở mức bón 75 kg N/ha, cả 7 dòng vi khuẩn được sử dụng riêng lẻ đều có tác dụng làm tăng khối lượng chất khô từ 18,3 – 79,86% so với đối chứng âm không sử dụng vi khuẩn. Tuy nhiên, ở mức bón 150 kg N/ha, chỉ có 3 trong số 7 dòng nói trên (IS100, 113 và 120) có tác dụng làm gia tăng khối lượng chất khô từ 21,28 – 25,44%, và hiệu quả này cũng đã giảm đi so với mức bón 75 kg N/ha.

Qua thí nghiệm đánh giá hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn CT4bd và TPD3b trên cây mía giống K95-156, có thể rút ra một số tổng kết sau. (1) Trong trường hợp không sử dụng phân bón hóa học, cả 2 dòng vi khuẩn đều có tác động tốt trên tất cả các chỉ tiêu so với nghiệm thức không sử dụng vi khuẩn. (2) Mức bón 25% phân N và P kết hợp với vi khuẩn không có tác dụng đáng kể trên sự sinh trưởng và năng suất của cây mía nên có thể giảm bớt các nghiệm thức này trong thí nghiệm bố trí ngoài đồng về sau. (3) Dòng CT4bd khi sử dụng kết hợp với phân bón N, P có tác dụng làm tăng đường kính thân, độ Brix và chữ đường. (4) Dòng TPD3b khi sử dụng kết hợp với phân bón N, P có tác dụng làm tăng số lóng, độ Brix và chữ đường. (5) Nghiệm thức sử dụng 2 dòng vi khuẩn phối hợp với 75% phân bón N, P cho hiệu quả tốt nhất trên tất cả các chỉ tiêu theo dõi (Bảng 4.18). Như vậy, 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b sử dụng riêng lẻ hay phối hợp tiếp tục được nghiên cứu ảnh hưởng trên sự sinh trưởng và năng suất của cây mía giống K95-156 trong sự kết hợp với phân bón hóa học N và P ở các mức 0%, 50%, 75% và 100%.

Bảng 4.19: Tổng hợp một số kết quả của 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95- 156 sau 6 tháng trồng trong chậu

CT4bd (nghiệm thức B1F-) CT4bd và TPD3b (nghiệm thức B3F-)

- - 13,60% (B1F4) - 1,54% (B1F3) 1,02% (B1F3) TPD3b (nghiệm thức B2F-) 5% (B2F3) - - - 0,31% (B2F2) 0,20% (B2F2) 13,60% (B3F3) 21,0% (B3F3) 15,5% (B3F3) 4,6% (B3F3) 10,8% (B3F3) 16,2% (B3F3) 21,7% (B3F3) Số lóng Chiều cao thân Đường kính thân Năng suất mía Độ Brix Chữ đường Năng suất đường

124

Số liệu trình bày trong Bảng là tỷ lệ % tăng thêm của mỗi nghiệm thức so với đối chứng dương B0F4 không chủng vi khuẩn và bón 100% phân N, P hóa học. Chú thích nghiệm thức: (F0): 0% NP; (F1): 25% NP; (F2): 50% NP; (F3): 75% NP ; (F4): 100% NP; (B0): 0 VK; (B1): Serratia oryzae CT4bd; (B2): Bacillus subtilis TPD3b; (B3): Serratia oryzae CT4bd + Bacillus subtilis TPD3b.

4.9. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tuyển chọn trên cây mía trồng ngoài đồng

Hai dòng vi khuẩn CT4bd (Serratia oryzae) và TPD3b (Bacillus subtilis) đã tiếp tục được đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật trên cây mía trồng ngoài đồng khi bón riêng lẻ hay phối hợp cùng với phân N và P hóa học ở các mức bón khác nhau (Bảng 4.20 A và B). Sự tương tác giữa 2 yếu tố “vi khuẩn” và “phân bón” là có ý nghĩa thống kê ở mức P=95%. Tương tự như trong thí nghiệm chậu, ở các nghiệm thức không sử dụng vi khuẩn để chủng cho cây (B0F0, B0F1, B0F2 và B0F3), sự sinh trưởng và năng suất cây mía gia tăng theo sự gia tăng của mức bón N, P. Trong điều kiện không bón phân N và P hóa học, tất cả các nghiệm thức có sử dụng vi khuẩn CT4bd và TPD3b, riêng lẻ hay kết hợp, đều cho thấy có sự sinh trưởng tốt của cây mía và năng suất cao hơn so với nghiệm thức đối chứng không sử dụng vi khuẩn (B0F0).

Bảng 4.20 A: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 12 tháng trồng ngoài đồng

Số lóng Chiều cao thân (cm)

17,80 g ± 23,55 b-f ± 24,13 a-e ± 24,75 abc ± 22,45 ef ± 24,55 a-d ± 25,80 a ± 27,10 a ± 22,65 def ± 25,55 ab ± 24,15 a-e ± 25,80 a ± 21,60 f ± 23,10 c-f ± 26,83 a ± 27,03 a ± 241,55 a ± 247,55 a ± 1,24 0,41 0,71 0,96 1,92 1,52 1,07 0,93 2,26 1,56 1,05 1,85 0,95 1,31 1,74 0,39 9,29 181,30 f ± 13,27 206,40 cde ± 8,10 209,15 bcd ± 7,20 235,30 a ± 4,65 189,55 ef ± 4,33 222,20 abc ± 14,72 223,85 ab ± 8,16 234,45 a ± 13,18 204,60 de ± 15,30 203,65 de ± 10,48 202,50 de ± 8,61 211,20 bcd ± 21,43 212,65 bcd ± 6,32 214,00 bcd ± 14,54 7,72 9,32 8,68

125

Năng suất thực tế Nghiệm (tấn/ha) thức 49,11 e ± 3,33 B0F0 57,27 cd ± 2,68 B0F1 57,45 cd ± 5,72 B0F2 69,38 a ± 2,09 B0F3 51,14 de ± 1,45 B1F0 60,81 bc ± 2,11 B1F1 74,19 a ± 8,82 B1F2 69,13 a ± 8,53 B1F3 51,67 de ± 4,48 B2F0 62,89 abc ± 2,27 B2F1 64,55 ab ± 2,12 B2F2 64,20 ab ± 2,38 B2F3 57,61 cd ± 6,71 B3F0 64,66 ab ± 2,57 B3F1 72,29 a ± 3,56 B3F2 73,65 a ± 3,25 B3F3 CV % 11,35 Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm LSD. Chú thích nghiệm thức: (F0): 0% NP; (F1): 50% NP; (F2): 75% NP; (F3): 100% NP ; (B0): 0 VK; (B1): Serratia oryzae CT4bd; (B2): Bacillus subtilis TPD3b; (B3): Serratia oryzae CT4bd + Bacillus subtilis TPD3b.

Bảng 4.20 B: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95-156 sau 12 tháng trồng ngoài đồng (tiếp theo)

Độ Brix (%) CCS (%)

4,23 i ± 5,53 gf ± 5,77 efg ± 7,09 bc ± 4,41 i ± 5,97 ef ± 7,76 a ± 7,64 ab ± 4,78 hi ± 6,33 de ± 6,28 de ± 7,05 bc ± 5,23 gh ± 6,75 cd ± 8,11 a ± 8,33 a ± 8,64 f ± 9,66 cde ± 10,02 bc ± 10,22 bc ± 8,63 f ± 9,83 bcd ± 10,48 ab ± 11,07 a ± 9,25 def ± 10,06 bc ± 9,71 cde ± 10,98 a ± 9,09 df ± 10,45 ab ± 11,22 a ± 11,33 a ± Năng suất đường (tấn/ha) 0,22 0,09 0,78 0,41 0,39 0,11 0,79 0,74 0,53 0,31 0,44 0,40 0,53 0,28 0,56 0,39 2,71 Nghiệm thức B0F0 B0F1 B0F2 B0F3 B1F0 B1F1 B1F2 B1F3 B2F0 B2F1 B2F2 B2F3 B3F0 B3F1 B3F2 B3F3 CV % 18,39 f ± 1,12 19,95 cde ± 0,58 20,49 bc ± 0,81 20,78 bc ± 0,61 18,38 f ± 1,04 20,2 bcd ± 0,78 21,19 ab ± 0,35 22,08 a ± 0,44 19,32 def ± 0,67 20,55 bc ± 0,28 20,01 cde ± 0,60 21,94 a ± 0,43 19,07 ef ± 0,51 21,14 ab ± 0,78 22,30 a ± 0,85 22,47 a ± 1,06 5,75 0,74 0,38 0,53 0,40 0,68 0,51 0,23 0,29 0,44 0,18 0,40 0,28 0,34 0,51 0,56 0,70 7,15

Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm LSD. Chú thích nghiệm thức: (F0): 0% NP; (F1): 50% NP; (F2): 75% NP; (F3): 100% NP ; (B0): 0 VK; (B1): Serratia oryzae CT4bd; (B2): Bacillus subtilis TPD3b; (B3): Serratia oryzae CT4bd + Bacillus subtilis TPD3b.

Chú thích nghiệm thức: (F1): 50% NP; (B0): 0 VK; (B2): Bacillus subtilis TPD3b.

Hình 4.20: Cây mía giống K95-156 sau 3 tháng trồng ngoài đồng dưới ảnh hưởng của vi khuẩn TPD3b và mức bón 50% phân N, P so với đối chứng không chủng vi khuẩn

126

Về các chỉ tiêu sinh trưởng cây mía, các nghiệm thức sử dụng vi khuẩn và 75 – 100% phân N, P đều cho hiệu quả vượt hơn hoặc bằng so với đối chứng dương (B0F3) chỉ sử dụng 100% phân hóa học (Bảng 4.19 A). Cụ thể là khi sử dụng dòng vi khuẩn CT4bd kết hợp với 75% phân N, P (B1F2) cho số lóng đạt 25,8; tăng 15,2% so với đối chứng dương B0F3. Tương tự, kết quả sử dụng dòng TPD3b hoặc phối hợp 2 dòng cùng với 75% phân N, P (B2F2 và B3F2) đều làm tăng số lóng lên 4,2 – 8,4%. Đối chiều cao thân, nghiệm thức sử phối hợp 2 dòng vi khuẩn với 75% N, P (B3F2) cho hiệu quả ngang bằng với nghiệm thức đối chứng dương (B0F3): 241,55 cm so với 235,30 cm, khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05. Đối với năng suất mía, sử dụng riêng lẻ dòng CT4bd hoặc tổ hợp 2 dòng vi khuẩn cùng với 75% phân N, P (B1F2, B3F2) đều cho năng suất ngang bằng với đối chứng dương B0F3: 74,19 tấn/ha và 72,29 tấn/ha so với 69,38 tấn/ha, khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05. Như vậy, dòng CT4bd hoặc tổ hợp 2 dòng CT4bd và TPD3b có hiệu quả ngang bằng với 25% phân N, P hóa học đối với chỉ tiêu năng suất thực tế của giống mía K95-156 sau 12 tháng thí nghiệm ở quy mô ngoài đồng.

Đối với các tiêu chí độ Brix, chữ đường và năng suất đường thực tế, các nghiệm thức sử dụng vi khuẩn cùng với 100% phân N, P đều hiệu quả vượt hơn so với đối chứng dương B0F3 chỉ sử dụng 100% phân hóa học (Bảng 4.19 B). Cụ thể là các nghiệm thức B1F3, B2F3 và B3F3 đều có tác dụng nâng độ Brix lên 21,08 – 22,47%, So với 20,78% của nghiệm thức đối chứng dương B0F3, các nghiệm thức này đã làm tăng độ Brix thêm 1,4 – 8,1%, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05. Điều này cũng được quan sát thấy trên tiêu chí chữ đường. Khi sử dụng riêng lẻ hay phối hợp 2 dòng CT4bd và TPD3b cùng với 100% phân N, P có tác dụng làm tăng chữ đường thêm 10,98 – 11,33%. So với đối chứng dương sử dụng 100% phân hóa học (10,22%), tỷ lệ tăng thêm về chữ đường của 3 nghiệm thức vừa nêu đạt 7,4 – 10,9%.

Đặc biệt, đối với năng suất đường nghiệm thức B1F2 sử dụng dòng vi khuẩn CT4bd kết hợp với 75% phân N, P đã cho năng suất đạt 7,76 tấn/ha; so với nghiệm thức đối chứng dương B0F3 (7,09 tấn/ha) đã làm tăng thêm 9,4%. Việc sử dụng tổ hợp 2 dòng vi khuẩn với 75% phân N, P (B3F2) cũng cho hiệu quả tương tự. Trong khi nếu sử dụng đơn lẻ dòng TPD3b với 100% phân N, P thì cho hiệu quả ngang bằng với việc chỉ sử dụng phân hóa học. Như vậy, đối với năng suất đường, dòng CT4bd hoặc tổ hợp 2 dòng CT4bd và TPD3b có hiệu quả ngang bằng với 25% phân N, P hóa học đối với chỉ tiêu năng suất đường thực tế của giống mía K95-156 sau 12 tháng thí nghiệm ở quy mô ngoài đồng.

127

Một số nghiên cứu trên cây mía cho thấy việc sử dụng riêng lẻ hay phối hợp các dòng vi khuẩn cũng cho hiệu quả khác nhau, tương tự như các quan sát đã được ghi nhận ở thí nghiệm chậu. Nghiên cứu trong điều kiện ngoài đồng của Govindarajan và cộng sự (2006) cho thấy dòng vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis MG43, khi kết hợp với mức bón 140 kg N/ha, giúp tăng năng suất mía thêm khoảng 19 – 20%. Trong khi đó, sử dụng riêng lẻ dòng Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037 chỉ làm tăng năng suất khoảng 13 – 16%; dòng Herbaspirillum ATCC35892 chỉ làm tăng khoảng 12%; và tổ hợp cả 3 dòng chỉ làm tăng 14%. Một thử nghiệm khác của Chauhan và cộng sự (2012) cũng cho thấy việc chủng vi khuẩn nội sinh trở lại cho cây mía giúp gia tăng khối lượng cây, chiều cao cây, hàm lượng chlorophyll và hàm lượng N tổng số. Trong đó, năng suất mía tăng thêm 40% khi chủng với Bacillus sp. H15 và tăng thêm 42% khi chủng với Gluconacetobacter diazotrophicus thương mại.

Ngoài yếu tố giống và sự tương tác của các dòng vi khuẩn, đối với cây mía, tính chất tuổi cây thể hiện qua loại “mía tơ” hay “mía gốc” cũng có ảnh hưởng đến năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất. Nghiên cứu của Schultz và cộng sự (2014) trên giống mía RB72454 cho thấy ở vụ mía tơ và vụ mía gốc đầu tiên, việc chủng vi khuẩn cho năng suất thân ngang bằng với mức bón 120 kg/ha (đối chứng dương). Tuy nhiên, ở vụ mía gốc thứ hai, năng suất thân của các nghiệm thức có chủng dịch khuẩn kém hơn so với đối chứng dương mặc dù khối lượng chất khô tương tự như ở vụ mía tơ và vụ mía gốc thứ nhất.

Từ các phân tích và dẫn liệu bên trên cho thấy kết quả thí nghiệm ngoài đồng phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau, ngoài hai yếu tố chính là vi khuẩn và phân bón. Đối với giống mía K95-156 trồng trên đất xám của tỉnh Tây Ninh, cả hai dòng vi khuẩn tuyển chọn là CT4bd (Serratia oryzae) và TPD3b (Bacillus subtilis) đều cho thấy khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật trong điều kiện ngoài đồng. Cụ thể là: (1) Dòng vi khuẩn CT4bd kết hợp với 75 – 100% phân N, P có hiệu quả tốt trên các chỉ tiêu bao gồm số lóng, năng suất mía thực tế, độ Brix, chữ đường và năng suất đường thực tế; (2) Dòng vi khuẩn TPD3b kết hợp với 75 – 100% phân N, P có hiệu quả tốt trên các chỉ tiêu bao gồm số lóng, độ Brix, chữ đường và năng suất đường thực tế; (3) Tổ hợp 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với 75% phân N, P có hiệu quả tốt trên các chỉ tiêu số lóng, độ Brix, chữ đường và năng suất đường thực tế (Bảng 4.20).

128

Bảng 4.21: Tổng hợp một số kết quả của 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với các mức phân bón trên các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của giống mía K95- 156 sau 12 tháng trồng ngoài đồng

CT4bd (nghiệm thức B1F-)

TPD3b (nghiệm thức B2F-)

CT4bd và TPD3b (nghiệm thức B3F-)

4,24% (B1F2) - - 1,97% (B1F2) 2,54% (B1F2) 9,45% (B1F2)

4,24% (B2F3) - - 5,58% (B2F3) 7,43% (B2F3)

8,4% (B3F2) - - 7,3% (B3F2) 9,8% (B3F2) 14,4% (B3F2)

Số lóng Chiều cao thân Năng suất mía Độ Brix Chữ đường Năng suất đường Số liệu trình bày trong Bảng là tỷ lệ % tăng thêm của mỗi nghiệm thức so với đối chứng dương B0F4 không chủng vi khuẩn và bón 100% phân N, P hóa học. Chú thích nghiệm thức: (F0): 0% NP; (F1): 50% NP; (F2): 75% NP; (F3): 100% NP ; (B0): 0 VK; (B1): Serratia oryzae CT4bd; (B2): Bacillus subtilis TPD3b; (B3): Serratia oryzae CT4bd + Bacillus subtilis TPD3b.

Như vậy, nghiệm thức tốt nhất được đề xuất lựa chọn cho các thí nghiệm ở quy mô lớn hơn là sự phối hợp 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b kết hợp với 75% phân N, P. Nghiệm thứ này có khả năng tiết kiệm 25% phân bón N, P hóa học và đã làm tăng thêm 8,4% về số lóng; 7,3% về độ Brix; 9,8% về chữ đường; và 14,4% về năng suất đường thực tế.

4.10. Phân tích thành phần dinh dưỡng đất trồng sau thu hoạch

Sau khi thu hoạch mía, thành phần dinh dưỡng trong đất trồng của mỗi nghiệm thức đã được phân tích (Bảng 4.21). Về N tổng số, cùng một mức phân bón (cùng lô chính), các nghiệm thức có sử dụng vi khuẩn (lô phụ B1, B2, B3) đều cho kết quả cao hơn so với nghiệm thức không sử dụng vi khuẩn (B0). Tuy vậy, ở mức phân bón càng cao (F0 cho đến F3), hàm lượng N tổng số trong đất sau thu hoạch có xu hướng giảm dần. Ở mức bón 0% (lô chính F0), các nghiệm thức có sử dụng vi khuẩn có khả năng làm tăng N tổng số lên 0,002% – 0,028%. Ở mức bón 50% (lô chính F1), tỷ lệ gia tăng trong các nghiệm thức có sử dụng vi khuẩn là 0,02% đến 0,028%. Trong khi đó, ở các nghiệm thức sử dụng 75% và 100% phân N và P (lô chính F2 và F3), tỷ lệ này lần lượt là 0,002% – 0,005% và 0,009% – 0,023%.

129

Bảng 4.22: Kết quả phân tích một số chỉ tiêu dinh dưỡng đất sau khi thu hoạch

N tổng (%)

P dễ tan (ppm)

CHC (OM) %

pHH2O

Nghiệm thức

B0F0

0,030 ij ± 0,001

165,83 g ± 1,09

1,51 jk ± 0,05

6,55 def ± 0,06

B1F0

0,058 c ± 0,001

167,47 g ± 2,47

1,65 fg ± 0,03

6,57 de ± 0,03

B2F0

0,038 h ± 0,002

224,25 d ± 1,59

2,13 a ± 0,03

6,70 cd ± 0,20

B3F0

0,032 i ± 0,001

273,23 a ± 1,30

1,69 ef ± 0,04

6,67 cd ± 0,01

B0F1

0,026 k ± 0,004

185,95 f ± 0,00

1,55 hij ± 0,02

6,83 abc ± 0,03

B1F1

0,036 h ± 0,003

255,93 b ± 2,31

1,87 c ± 0,03

6,96 a ± 0,02

B2F1

0,028 ik ± 0,003

193,62 e ± 2,02

1,99 b ± 0,01

6,87 ab ± 0,02

B3F1

0,054 de ± 0,003

244,52 c ± 1,00

1,90 c ± 0,11

6,92 a ± 0,03

B0F2

0,050 f ± 0,002

128,88 k ± 0,47

1,54 ij ± 0,02

6,68 cd ± 0,02

B1F2

0,052 ef ± 0,002

148,28 i ± 0,80

1,61 gh ± 0,03

6,67 cd ± 0,02

B2F2

0,042 g ± 0,002

142,21 j ± 1,07

1,61 gh ± 0,00

6,47 def ± 0,03

B3F2

0,055 cde ± 0,001

168,30 g ± 0,98

1,58 hi ± 0,02

6,71 bcd ± 0,03

B0F3

0,058 c ± 0,002

112,52 m ± 1,65

1,47 jk ± 0,04

6,05 g ± 0,05

B1F3

0,081 a ± 0,003

157,81 h ± 1,05

1,73 de ± 0,02

6,45 def ± 0,05

B2F3

0,056 cd ± 0,002

103,35 n ± 2,69

1,76 d ± 0,02

6,40 f ± 0,20

B3F3

0,067 b ± 0,002

115,68 l ± 2,64

1,60 ghi ± 0,02

6,20 g ± 0,20

Những giá trị trong cùng một cột có các chữ cái theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=95% theo trắc nghiệm Duncan.

Bên cạnh đó, hàm lượng N tổng số trong đất sau thu hoạch còn phụ thuộc vào dòng vi khuẩn được sử dụng. Trong đó, các nghiệm thức B1 (CT4bd) và B3 (CT4bd và TPD3b) có đóng góp lớn nhất vào hàm lượng N tổng của đất sau thu hoạch. Vi khuẩn CT4bd giúp gia tăng khoảng 0,028%, 0,006% và 0,023% đạm tổng số ứng với các mức phân bón sử dụng 0%, 50% và 100%. Trong khi tổ hợp vi khuẩn CT4bd và TPD3b giúp gia tăng khoảng 0,002%, 0,028%, 0,005% và 0,037% tương ứng với các mức phân 0%, 50%, 75% và 100%. Như vậy, hỗn hợp vi khuẩn CT4bd và TPD3b có tác động tốt nhất đối với hàm lượng đạm tổng số trong đất sau thu hoạch.

Về hàm lượng phosphate dễ tan trong đất sau thu hoạch, xu hướng tác động của các dòng vi khuẩn tương tự như đối với hàm lượng N tổng số. Các nghiệm thức sử dụng vi khuẩn có tác dụng làm tăng hàm lượng phosphate dễ tan trong đất từ 1 – 64,7%, 4 – 36%, 10 – 30% và 2,8 – 40% tương ứng với các mức phân bón 0%, 50%, 75% và 100% phân N, P. Trong đó, vi khuẩn CT4bd có tác dụng gia tăng hàm lượng phosphate dễ tan cao nhất, khoảng 37% và 40% tương ứng với mức bón 50% và 100% phân N, P. Tổ hợp vi khuẩn CT4bd và TPD3b giúp gia tăng hàm lượng phosphate dễ tan khoảng 31% và 30% tương ứng với mức bón 50% và 75% phân N, P.

130

Đối với chất hữu cơ tổng trong đất, việc sử dụng vi khuẩn có tác dụng tăng cường so với nghiệm thức đối chứng không sử dụng vi khuẩn. Trong cùng một mức phân bón (cùng lô chính), sử dụng 2 dòng vi khuẩn CT4bd và TPD3b riêng lẻ hay kết hợp đều có xu hướng gia tăng hàm lượng chất hữu cơ tổng. Ở trường hợp không bón phân N, P (B0), tỷ lệ gia tăng của hàm lượng chất hữu cơ tổng đối với nghiệm thức sử dụng vi khuẩn B1 (CT4bd), B3 (CT4bd và TPD3b), và B2 (TPD3b) lần lượt là 9,2%, 11,9% và 41,1%. Trong đó, dòng vi khuẩn đất vùng rễ TPD3b (Bacillus subtilis) cho hiệu quả tốt nhất. Đối với chất pHH2O của đất sau thu hoạch, ở mức bón 50% phân N, P (lô chính F1), sự bổ sung vi khuẩn giúp làm tăng từ 0,04 đến 1,13 đơn vị, tương ứng với 0,58 – 16,54%, theo hướng kiềm hóa đất. Xu lướng thay đổi hàm lượng chất hữu cơ tổng và pHH2O trong đất sau thu hoạch cũng diễn ra tương tự đối với các trường hợp bón 50%, 70% hay 100% lượng phân N, P hóa học.

Bên cạnh tác dụng thúc đẩy tăng trưởng thực vật và duy trì sự khỏe mạnh của cây, các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn liên kết thực vật còn có tác động tich cực đến dinh dưỡng và các tính chất lý hóa sinh học của đất. Điều này đã được chứng minh bằng thực nghiệm trên các loại cây trồng khác nhau như phúc bồn tử, mía và lúa mỳ. Các vi khuẩn được thử nghiệm khá đa dạng, bao gồm các chi Azotobacter, Klebsiella, Rhizobium và Bacillus. Đặc biệt, vi khuẩn Bacillus subtilis và B. pumilus đã được báo cáo về khả năng làm tăng hàm lượng lân trong đất trồng mía lên đến 13%. Ngoài P, các khoáng chứa K, Ca, Fe cũng được các vi khuẩn chuyển thành dạng dễ tan. N tổng số và đạm thủy phân kiềm trong đất cũng tăng lên đáng kể (Orhan et al., 2006; Santos et al., 2018; Wang et al., 2020). Riêng thông tin về tác dụng của Serratia oryzae trong sự tăng trưởng của thực vật và tăng cường dinh dưỡng cho đất hiện nay còn hiếm.

Qua phân tích dữ liệu bên trên, cho thấy việc sử dụng vi khuẩn có tác động tích cực đến thành phần N, chất hữu cơ tổng và lân dễ tan trong đất. Trong đó, vi khuẩn CT4bd hoặc tổ hợp vi khuẩn CT4bd và TPD3b có tác dụng tốt trên thành phần N tổng số và P dễ tan của đất sau thu hoạch; trong khi vi khuẩn TPD3b có hiệu quả cao nhất trong sự cải thiện thành phần chất hữu cơ tổng của đất sau thu hoạch. Kết hợp với các kết quả đã đạt được trong sự thúc đẩy tăng trưởng thực vật trên cây mía giống K95-156 trồng trên đất xám của tình Tây Ninh, 2 dòng CT4bd Serratia oryzae và TPD3b Bacillus subtilis được đề xuất tiếp tục thử nghiệm hiệu quả trên cây mía thuộc các giống khác ở quy mô lớn hơn.

131

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1. Kết luận

Từ 135 mẫu mía trồng trên đất xám của 7 huyện ở tỉnh Tây Ninh, có 246 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và 176 dòng vi khuẩn nội sinh với cả hai khả năng cố + trung bình đo được định đạm và hòa tan lân đã được phân lập. Hàm lượng NH4 dao động từ 1 đến 2,454 mg/L; và hàm lượng lân hòa tan trung bình đo dược dao động từ 50 đến 300,52 mg P2O5/L.

Trong tổng số 422 dòng vi khuẩn phân lập được, có 101 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA và 81 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp siderophore. Hàm lượng IAA trung bình cao nhất đo được là 12,141 mg/L; và đường kính vòng halo lớn nhất được tạo ra do sự tiết siderophore là 3,77 cm.

Các dòng vi khuẩn đã được định danh bao gồm 17 dòng vi khuẩn vùng rễ và 19 dòng vi khuẩn nội sinh, thuộc về các chi Enterobacter, Burkholderia, Bacillus, Stenotrophomonas, Kosakonia, Serratia, Advenella, Paraburkholderia, Chitinophaga, Herbaspirillum, Acinetobacter.

Mười hai dòng vi khuẩn đã được đánh giá hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật trên cây mía nuôi cấy mô trồng trong bình Leonard trên quy mô nhà lưới. Trong đó có 2 dòng cho hiệu quả tốt nhất là CT4bd (Serratia oryzae CT4bd) và TPD3b (Bacillus subtilis TPD3b).

Trong thí nghiệm trong chậu và ngoài đồng, sự kết hợp hai dòng TPD3b và CT4bd cùng với 75% phân N, P cho năng suất mía vượt 4,6% và năng suất đường vượt 14,4 – 21,7% so với nghiệm thức bón 100% lượng phân N, P và không sử dụng vi khuẩn.

5.2. Đề xuất

Tiếp tục đánh giá hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng cây mía của hai dòng vi khuẩn Bacillus subtilis TPD3b và Serratia oryzae CT4bd trên các giống mía khác nhau trồng ở tỉnh Tây Ninh ở cả vụ mía tơ và mía gốc.

132

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Abdelwahab, R and E. Nabti, 2017. Plant Growth-Promoting Bacteria: for

in Vegetable Production. In Microbial Strategies

Importance Vegetable Production,23-48.

Abu, G., 2014. Effect of Genotype on In Vitro Propagation of Elite Sugarcane (Saccharum officinarum L.) Varieties of Ethiopian Sugar Estates. International Journal of Technology Enhancements and Emerging Engineering Research, 2: 123–128.

Adnan, M., Z Shah, S. Fahad, M. Arif, M. Alam, I.A. Khan, I.A. Mian, A. Basir, H. Ullah, M. Arshad, I. urRehman, S. Saud, M.Z. Ihsan, Y. Jamal, Amanullah, H. M. Hammad and W. Nasim, 2017. Phosphate-Solubilizing Bacteria Nullify the Antagonistic Effect of Soil Calcification on Bioavailability of Phosphorus in Alkaline Soils. Scientific Reports, 7: 1-13.

Agrawal, P.K., A. Shruti, K. Rishi and B. Manoj, 2014. Application and perpective of plant growth promoting rhizobacteria in development of sustainable agriculture. International Journal of Current Research, 6(10): 9044–9051.

Ahmad, F., I. Ahmad and M. Khan, 2005. Indole Acetic Acid Production by the Indigenous Isolates of Azotobacter and Fluorescent Pseudomonas in the Presence and Absence of Tryptophan. Turkish Journal of Biology, 29: 29–34.

Anderson, D.L. and P.C. Rosendahl, 1997. The development and application of environmental policy: The Everglades and Florida sugar industry. In Intensive Sugarcane Production: Meeting the Challenges Beyond 2000 (BA Keating and JR ilson, CAB International: 381–402.

Armanhi, J. S. L., R.S.C. de Souza, N. de B Damasceno, L.M. de Araújo, J. Imperial and P. Arruda, 2018. A Community-Based Culture Collection for Targeting Novel Plant Growth-Promoting Bacteria from the Sugarcane Microbiome. Frontiers in Plant Science, 8: 2191.

Aron D., 1949. Copper enzymes isolated chloroplasts, polyphenoloxidase in

Beta vulgaris. Plant Physiology, 24: 1-15.

Arora, N.K. and M. Verma, 2017. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech, 7(6): 381.

133

Arruda, L., A Beneduzzi, B. Lisboa, L. Passaglia and L.K. Vargas, 2014. Diversity of Plant-Growth-Promoting Rhizobacteria Associated with Maize (Zea mays L.). In D. K. Maheshwari (Ed.), Bacterial Diversity in Sustainable Agriculture. Springer International Publishing: 167–189.

Arthington, A.H., J.C. Marshal, G.E. Rayment, H.M. Hunter and S.E. Bunn, 1997. Potential impact of sugarcane production on riparian and freshwater environments. In Intensive Sugarcane Production: Meeting the Challenges Beyond 2000 (B. A. Keating and J. R. Wilson, CAB International: 403–412.

Atekan, A., Y. Nuraini, E. Handayanto and S. Syekhfani, 2014. The potential of phosphate solubilizing bacteria isolated from sugarcane wastes for solubilizing phosphate. Journal of Degraded and Mining Lands Management, 1(4): 175–182.

Baldani, J. I., V.M. Reis, S.S. Videira, L.H. Boddey and V.L.D. Baldani, 2014a. The art of isolating nitrogen-fixing bacteria from non-leguminous plants using N-free semi-solid media: A practical guide for microbiologists. Plant and Soil, 384(1): 413–431.

Baldani, J. I., V.M. Reis, S.S Videira, L.H. Boddey and V.L.D Baldani, 2014b. The art of isolating nitrogen-fixing bacteria from non-leguminous plants using N-free semi-solid media: A practical guide for microbiologists. Plant and Soil, 384(1): 413–431.

Ball-Coelho, B., H. Tiessen, J. Stewart and I. Salcedo, 1993. Short and Long- Term Phosphorus Dynamics in a Fertilized Ultisol under Sugarcane. Soil Science Society of America Journal - SSSAJ: 57.

Bashan, Y. and L.E de-Bashan, 2005. Bacteria/Plant Growth-Promoting. In Encyclopedia of soils in the environment. (Editor-in-Chief) D. Hillel). Elsevier, 1.

Bashan, Y. and G. Holguin, 1998. Proposal for the division of plant growth- promoting Rhizobacteria into two classifications: Biocontrol-PGPB (Plant growth-promoting bacteria) and PGPB. Soil Biology and Biochemistry (United Kingdom), 30(8):1225-1228.

Benedetti, M.M., N. Curi, G. Sparovek, A. de C Filho and S.H. Silva, 2011. Updated Brazilian’s Georeferenced Soil Database – An Improvement for International Scientific Information Exchanging. Principles, Application and Assessment in Soil Science, 309–332.

Bengtson, R.L., H.M. elim and R. Ricaud, 1998. Water quality from sugarcane

134

production on alluvial soils. Transactions of the ASAE, 41(5): 1331– 1336.

Bhardwaj, G., B. Shah, B. Joshi and P. Patel, 2017. Klebsiella pneumoniae VRE36 as a PGPR isolated from Saccharum officinarum cultivar Co99004. Journal of Applied Biology and Biotechnology, 5: 47–52.

Bhattacharyya, P. N., and D.K. Jha, 2012. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Emergence in agriculture. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 28(4): 1327–1350.

Bindraban, P. S., C.O Dimkpa and R. Pandey, 2020. Exploring phosphorus improved human and

fertilization strategies

for

fertilizers and environmental health. Biology and Fertility of Soils, 56(3): 299–317.

Bloesch, P., and G. Rayment, 2006. Phosphorus Fertility Assessment of Intensively Farmed Areas of Catchments Draining to the Great Barrier Reef World Heritage Area; 2: Potential of Soils to Release Soluble Phosphorus. Communications in Soil Science and Plant Analysis - Commun Soil Sci Plant Anal, 37: 2265–2276.

Bộ Khoa học và Công nghệ. (2005). Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7538-2:2005 (ISO 10381—2: 2002) về Chất lượng đất—Lấy mẫu—Phần 2: Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành. https://vanbanphapluat.co/tcvn-7538-2-2005-chat-luong-dat-lay-mau- huong-dan-ky-thuat-lay-mau

Borriss, R., 2011. Use of Plant-Associated Bacillus Strains as Biofertilizers and Biocontrol Agents in Agriculture. In D. K. Maheshwari (Ed.), Bacteria in Agrobiology: Plant Growth Responses. Springer: 41–76.

Calcino, D., B. Schroeder, J. Panitz, A. Hurney, D. Skocaj, A. Wood, and B. Salter, 2018. Australian sugarcane nutrition manual. Sugar Research Australia: 122.

Canellas, L. P., D. M Balmori, L.O Médici, N.O Aguiar, E. Campostrini, R.C Rosa, A.R. Façanha and F.L. Olivares, 2013. A combination of humic substances and Herbaspirillum seropedicae inoculation enhances the growth of maize (Zea mays L.). Plant and Soil, 366(1): 119–132.

Cao Ngọc Điệp, 2011. Sách chuyên khảo Vi khuẩn nội sinh thực vật. Nhà xuất

bản Đại học Cần Thơ.

Castro-González, R., L. Martínez-Aguilar, A. Ramírez-Trujillo, P. Estrada-de los Santos and J. Caballero-Mellado, 2011. High diversity of culturable

135

Burkholderia species associated with sugarcane. Plant and Soil, 345: 155–169.

Cavalcante, V.A and J. A. Döbereiner, 1988. New acid-tolerant nitrogen-fixing

bacterium associated with sugarcane. Plant Soil, 108:23–31.

Cavanagh, J. E., K.A Burns, G.J. Brunskill and R.J. Coventry, 1999. Organochlorine Pesticide Residues in Soils and Sediments of the Herbert and Burdekin River Regions, North Queensland – Implications for Contamination of the Great Barrier Reef. Marine Pollution Bulletin, 39(1): 367–375.

Chaitanya, K., Ranakausar, and N.S. Sunilkumar, 2014. Polymer producing bacteria showing siderophore activity with chrome azurol S (CAS) agar plate assay. International Journal of Scientific and Research Publications, 4(12): 1-3.

Chakdar, H., S.G. Dastager, J.M. Khire, D. Rane and M.S Dharne, 2018. Characterization of mineral phosphate solubilizing and plant growth promoting bacteria from termite soil of arid region. 3 Biotech, 8(11): 463.

Chauhan H., D. J. Bagyaraj and A. Sharma, 2013. Plant growth-promoting bacterial endophytesfrom sugarcane and their potential inpromoting growth of the host under field conditions. Experimental Agriculture, 49 (1), 43–52

Chauhan, A., C.K. Shirkot, R. Kaushal and D.L.N. Rao, 2015. Plant Growth- Promoting Rhizobacteria of Medicinal Plants in NW Himalayas: Current Status and Future Prospects. In D. Egamberdieva, S. Shrivastava, and A. Varma (Eds.), Plant-Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) and Medicinal Plants. Springer International Publishing: 381–412.

Chrouqi, L., O. Lahcen, I. Jadrane, T. Koussa and M.N. Alfeddy, 2017. Screening of soil rhizobacteria isolated from wheat plants grown in the Marrakech region (Morocco, North Africa) for plant growth promoting activities. JMES, 8: 3382–3390.

Compant, S., C. Clément and A. Sessitsch, 2010. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biology and Biochemistry, 42(5): 669–678.

Cruz, C., C. Bird and M. Isulat, 2012. Sprouting, survival and growth of young sugarcane (Saccharum officinarum L.) treated with diazotrophic

136

bacteria (Gluconacetobacter diazotrophicus). Philippine Agricultural Scientist, 95: 106–111.

Cục thống kê tỉnh Tây Ninh, 2019. Niên giám thống kê tỉnh Tây Ninh 2019.

Nhà xuất bản Thống kê.

da Costa, P. B., C. E Granada, A. Ambrosini, F. Moreira, R. de Souza, J.F.M dos Passos, L. Arruda and L.M.P Passaglia, 2014. A Model to Explain Plant Growth Promotion Traits: A Multivariate Analysis of 2,211 Bacterial Isolates. PLoS ONE, 9(12):

da Silva, J. F., R.R Barbosa, A.N de Souza, O.V da Motta, G.N. Teixeira, V.S. Carvalho, A.L.S.R de Souza and G.A de Souza Filho, 2015. Isolation of Pantoea ananatis from sugarcane and characterization of its potential for plant growth promotion. Genetics and Molecular Research: GMR, 14(4): 15301-153011.

Dahlgren, R. A., F. Macías, C.M. Arbestain, W. Chesworth, W.P. Robarge and F. Macías, 2008. Acrisols. In W. Chesworth (Ed.), Encyclopedia of Soil Science. Springer Netherlands: 22–24.

Dang T.N.T., M.T. Hoang and T. H. Chau, 2019. Effects of Plant Associated Bacteria on Growth of Maize and Rice in Leonard Jar Experiments. International Journal of Innovations in Engineering and Technology, 13(3): 9.

Dang T.N.T. and T.T.T, Do, 2018. Isolation and Characterization of Plant Growth Promoting Rhizobacteria in Black Pepper (Piper nigrum L.) Cultivated in Chon Thanh and Loc Ninh Districts of Binh Phuoc Province, Vietnam. International Journal of Innovations in Engineering and Technology, 10(1), 1–10.

Đặng Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Thị Xuân Mỵ và Cao Ngọc Điệp, 2016. Sự sản xuất IAA và siderophore của các dòng vi khuẩn liên hiệp thực vật và ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của cây bắp (Zea mays L.) trồng trong chậu. Tạp Chí Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ, 47a: 59–67.

de Santi Ferrara, F. I., Z. M. Oliveira, H. H.S. Gonzales, E.I.S Floh and H.R. Barbosa, 2012. Endophytic and rhizospheric enterobacteria isolated from sugar cane have different potentials for producing plant growth- promoting substances. Plant and Soil, 353(1): 409–417.

DFID Research Strategy 2008-2013. Working Paper Series: Sustainable https://www.gov.uk/dfid-research-

(2008). GOV.UK.

Agriculture. outputs/dfid-research-strategy-2008-2013-working-paper-series-

137

sustainable-agriculture

Dini-Andreote, F., F.D Andreote, R. Costa, R.G Taketani, J. D. van Elsas and W. L Araújo, 2010. Bacterial soil community in a Brazilian sugarcane field. Plant and Soil, 336(1): 337–349.

Đỗ Nguyên Hải, 2007. Phân loại đất và xây dựng bản đồ đất. NXB Đại học

Nông nghiệp.

Eden, P. A., T.M. Schmidt, R.P Blakemore and N.R Pace, 1991. Phylogenetic analysis of Aquaspirillum magnetotacticum using polymerase chain reaction-amplified 16S rRNA-specific DNA. International Journal of Systematic Bacteriology, 41(2): 324–325.

Estela Silva-Stenico, M., F.T.H Pacheco, J.L.M Rodrigues, E. Carrilho and S.M. Tsai, 2005. Growth and siderophore production of Xylella fastidiosa under iron-limited conditions. Microbiological Research, 160(4): 429– 436.

Etesami, H., H.A Alikhani and H.M Hosseini, 2015. Indole-3-acetic acid (IAA) production trait, a useful screening to select endophytic and rhizosphere competent bacteria for rice growth promoting agents. MethodsX, 2: 72–78.

FAOSTAT. 2020. Food and Agriculture Organization of the United Nations:

Statistics Division. http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC

Support

of

Fuente, L. D. L., and S. Burdman, 2011. Pathogenic and beneficial plant- associated bacteria. In Agricultural Sciences In: Lal, R. (ed.). Encyclopedia Systems Life (EOLSS).https://www.semanticscholar.org/paper/pathogenic-and- beneficial-plant-associated-bacteria-fuente Burdman/6d7b70091d3e971162a79d8dd53a446d49c4ce61#citing-papers

Gaiero, J.R., C.A. McCall, K.A. Thompson, N.J. Day, A.S. Best and K.E. Dunfield, 2013. Inside the root microbiome: Bacterial root endophytes and plant growth promotion. American Journal of Botany, 100(9): 1738– 1750.

Galkiewicz, J. P. and C.A Kellogg, 2008. Cross-kingdom amplification using bacteria-specific primers: Complications for studies of coral microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology, 74(24): 7828–7831.

Glick, B. R., 2012. Review article: Plant Growth-Promoting Bacteria: Mechanisms and Applications. Hindawi Publishing Corporation

138

Scientifica; Hindawi, 2012: 1-15

Gomez, K. A. and A.A Gomez, 1984. Statistical Procedures for Agricultural

Research. John Wiley and Sons.

González, A., D. Victoria and F. Gómez-Merino, 2015. Efficiency of plant sugarcane. Terra

(PGPR)

in

growth promoting rhizobacteria Latinoamericana, 33 (4): 321–330.

Gordon, S.A. and R.P. Weber, 1951. Colorimetric estimation of indoleacetic

acid. Plant Physiology, 26(1): 192–195.

Govindarajan, M., J. Balandreau, R. Muthukumarasamy, G. Revathi and C. Improved yield of micropropagated Burkholderia

inoculationby

endophytic

following

Lakshminarasimhan, 2006. sugarcane vietnamiensis. Plant and Soil, 280 (1):239–252.

Guerra, A. T. J., M. A. Fullen, M.D.C.O Jorge and S.T. Alexandre, 2013. Soil Instituto de

in Brazil. Anuário Do

Erosion and Conservation Geociências, 37(1): 81–91.

Gulati, A., P. Rahi and P. Vyas, 2008. Characterization of Phosphate- Solubilizing Fluorescent Pseudomonads from the Rhizosphere of Seabuckthorn Growing in the Cold Deserts of Himalayas. Current Microbiology, 56(1): 73–79.

Gupta, G., S.P. Shailendra, K.A. Narendra, K. S Sunil and S. Vinod, 2015. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR): Current and Future Prospects for Development of Sustainable Agriculture. Journal of Microbial and Biochemical Technology, 7(2): 96–102.

Guyon, S., J.L Vogel, J. Omarjee and T.V. Antwerpen, 2003. Burkholderia tropicalis, a potential bacterial inoculant to control nematodes and improve sugarcane growth. Proc S Afr Sug Technol Ass, 7, 118–123.

Hà Thị Thuý, Trần Thị Hạnh, Vũ Anh Tuấn và Đỗ Năng Vịnh, 2013. Nghiên cứu xây dựng và phát triển quy trình sản xuất giống mía sạch bệnh theo quy mô công nghiệp bằng công nghệ tế bào. Hội Thảo Quốc Gia về Khoa Học Cây Trồng Lần Thứ Nhất.

Hallmann, J., A. Quadt-Hallmann, W.F Mahaffee and J.W Kloepper, 1997. in agricultural crops. Canadian Journal of

Bacterial endophytes Microbiology, 43(10): 895–914.

Hardoim, P., R. Nissinen and J.D. van Elsas, 2012. Ecology of Bacterial Endophytes in Sustainable Agriculture. In D. K. Maheshwari (Ed.),

139

Bacteria in Agrobiology: Plant Probiotics. Springer Berlin Heidelberg: 97–126.

Hartemink, A. E., 2008. Sugarcane for Bioethanol: Soil and Environmental

Issues. Advances in Agronomy, 99, 125–182.

Hassan, M., S. Afghan, Z. Hassan and F. Hafeez, 2014. Biopesticide activity of sugarcane associated rhizobacteria: Ochrobactrum intermedium strain NH-5 and Stenotrophomonas maltophilia strain NH-300 against red rot under field conditions. Phytopathologia Mediterranea, 53: 27–37.

Hirsch, P. R., and T.H Mauchline, 2012. Who’s who in the plant root

microbiome? Nature Biotechnology, 30(10):961–962.

Hoang, M.T. and N.D. Cao, 2014.

Isolation, Characterization and Identification of Endophytic Bacteria in Sugarcane (Saccharum spp. L.) Cultivated on Soils of the Dong Nai Province, Southeast of Vietnam. American Journal of Life Sciences, 2 (6): 361–368.

Hoang, M.T. and N.D. Cao, 2015. Isolation and Identification of Rhizospheric Bacteria in Sugarcane (Saccharum spp. L.) Cultivated on Acrisols and Ferrasols of Dong Nai Province, the Southeast of Vietnam. American Journal of Life Sciences, 3 (2): 109–118.

Hoben, H. J., and P. Somasegaran, 1982. Comparison of the Pour, Spread, and Drop Plate Methods for Enumeration of Rhizobium spp. In Inoculants Made from Presterilized Peat. Applied and Environmental Microbiology, 44(5): 1246–1247.

Hu, Q.-P., and J.G. Xu, 2011. A simple double-layered chrome azurol S agar (SD-CASA) plate assay to optimize the production of siderophores by a potential biocontrol agent Bacillus. African Journal of Microbiology Research, 5(25): 4321–4327.

Hussain, A., I.A Qarshi, H. Nazir and I. Ullah, 2012. Plant Tissue Culture: Current Status and Opportunities. Recent Advances in Plant in Vitro Culture: 1-29.

Hussain, S., M. Anwar-ul-Haq, S. Hussain, Z. Akram, M. Afzal and I. Shabbir, 2017. Best suited timing schedule of inorganic NPK fertilizers and its effect on qualitative and quantitative attributes of spring sown sugarcane (Saccharum officinarum L.). Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences, 16(1): 66–71.

Idowu, P. E., D. Ibitoye and O. Ademoyegun, 2009. Tissue culture as a plant

140

technique for horticultural crops. African Journal of

production Biotechnology, 8 (16): 3783-3788.

Islam, F., J. Wang, M. A. Farooq, M.S.S Khan, L. Xu, J. Zhu, M. Zhao, S.Li. Q. X. Muños and W. Zhou, 2018. Potential impact of the herbicide 2,4- dichlorophenoxyacetic acid on human and ecosystems. Environment International, 111: 332–351.

Jadhav, H. P., S.S. Shaikh, and R.Z. Sayyed, 2017. Role of Hydrolytic Enzymes of Rhizoflora in Biocontrol of Fungal Phytopathogens: An Overview. In Samina Mehnaz (Ed.), Rhizotrophs: Plant Growth Promotion to Bioremediation. Springer, 2: 183–203.

Janda, J. M. and S.L. Abbott, 2007. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology, 45(9): 2761–2764.

Javaroni, R. de C. A., M. Landgraf and M.O. Oliveira, 1999. Behavior of the herbicides atrazine and alachlor after application on soils prepared to sugar cane plantation. Química Nova, 22(1): 58–64.

Jha, P., G. Gupta, P. Jha and B. Mehrotra, 2013. Association of rhizospheric/ endophytic bacteria with plants: A potential gateway to sustainable agriculture. Greener J Agri Sci, 3: 73–84.

Johnson, R. M., M.P. Grisham and E.P. Richard, 2007. Relationship between sugarcane rust severity and soil properties in Louisiana. Phytopathology, 97(6): 748–755.

Kalayu, G, 2019. Phosphate Solubilizing Microorganisms: Promising Approach as Biofertilizers. International Journal of Agronomy, 2019: 1- 7.

Kambaska, B. H. and S. Santilata, 2009. Rapid In vitro Micro propagation of Sugarcane (Saccharum officinarum L. cv- Nayana) Through Callus Culture. Nature and Science, 7(4): 1–10.

Kaur, A. and J. Sandhu, 2015. High throughput in vitro micropropagation of sugarcane (Saccharum officinarum L.) from spindle leaf roll segments: Cost analysis for agri-business industry. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 120: 339–350

Kaur, R. and C. Putatunda, 2018. In vitro Phosphate Solubilization by Sugarcane (Saccharum officinarum) Rhizosphere Bacteria. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 7(06): 1557–1564.

141

Kimutai, R., D Okun, F. Khamis and G. Godfrey, 2018. Characterization and Efficacy of Lactobacillus Species as Bio Control Agent against Latent Fungal Endophyte in Beans. Life Sciences, 6(1): 9-22.

Kirchhof, G., V. M Reis, J.I. Baldani, B. Eckert, J. Döbereiner and A. Hartmann, 1997. Occurrence, physiological and molecular analysis of endophytic diazotrophic bacteria in gramineous energy plants. Plant and Soil, 194(1): 45–55.

Kirkham, M. B., 2006. Cadmium in plants on polluted soils: Effects of soil factors, hyperaccumulation, and amendments. Geoderma, 137(1): 19–32.

Klindworth, A., E. Pruesse, T. Schweer. J. Peplies, C. Quast, M. Horn and F.O Glöckner, 2013. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research, 41(1): 1-11.

Kumar, A., A. Ankit, A. Prakash and B.N. Johri, 2011. Bacillus as PGPR in Crop Ecosystem. In D. K. Maheshwari (Ed.), Bacteria in Agrobiology: Crop Ecosystems. Springer Berlin Heidelberg: 37–59.

Kumar, A., 2016. Phosphate Solubilizing Bacteria

In Agriculture Biotechnology: Diversity, Mechanism And Their Role In Plant Growth And Crop Yield. International Journal of Advanced Research, 4: 116– 124.

Kumar, S., G.L.M. Stecher, C. Knyaz and K. Tamura, 2018. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Molecular Biology and Evolution, 35(6): 1547–1549.

Kumar, V., and D.V. Pathak, 2000. Use of PSM for Enhancement of Crop Productivity—A Review. Agricultural Reviews, 21(4): 266-274–274.

Lanchote, V. L., P. S. Bonato, A.L. Cerdeira, N.A.G. Santos, D. de Carvalho and M. A. Gomes, 2000. HPLC Screening and GC-MS Confirmation of Triazine Herbicides Residues in Drinking Water from Sugar Cane Area in Brazil. Water, Air, and Soil Pollution, 118(3): 329–338.

Landon, J. R., 1984. Booker tropical soil manual: A handbook for soil survey and agricultural land evaluation in the tropics and subtropics. Booker Agriculture International Ltd: 535.

Lau, S. K. P., P.C.Y. Woo, J.L.L Teng, K.W. Leung and K.Y. Yuen, 2002. Identification by 16S ribosomal RNA gene sequencing of Arcobacter butzleri bacteraemia in a patient with acute gangrenous appendicitis.

142

Molecular Pathology: MP, 55(3): 182–185.

Lê Phi Long và Phan Thị Thu Hiền, 2014. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống mía VN84 – 4137 bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Tạp Chí Khoa Học Công Nghệ Nghệ An, 4: 1–5.

Lee, T. S. G., and E. A. Bressan, 2005. Clean cane with nitrogen fixing

bacteria. Sugar Tech, 7(1): 11–16.

Lerro, C. C., L.E.B. Freeman, L. Portengen, D. Kang, K. Lee, A. Blair, C.F Lynch, B. Bakke, A. J. De Roos and R.C.H.Vermeulen, 2017. A longitudinal study of atrazine and 2,4-D exposure and oxidative stress markers among Iowa corn farmers. Environmental and Molecular Mutagenesis, 58(1): 30–38.

Li, H.B., R. K Singh, P. Singh, Q-Q Song, Y.X. Xing, L.T Yang, and Y.R Li, (2017). Genetic Diversity of Nitrogen-Fixing and Plant Growth Promoting Pseudomonas Species Isolated from Sugarcane Rhizosphere. Frontiers in Microbiology, 8. 1268.

Li, Y., J. Zhang, J. Zhang, W. Xu and Z. Mou, 2019. Characteristics of Inorganic Phosphate-Solubilizing Bacteria from the Sediments of a Eutrophic Lake. International Journal of Environmental Research and Public Health, 16(12):

Li, Z., S. Chang, L. Lin, Y. Li and Q. An, 2011. A colorimetric assay of 1- aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) based on ninhydrin reaction for rapid screening of bacteria containing ACC deaminase. Letters in Applied Microbiology, 53(2): 178–185.

Li Z., Zhang, R., S. Xia, S., L. Wang, C. Liu, R. Zhang, Z. Fan, F. Chen and Y Liu, 2019. Interactions between N, P and K fertilizers affect the environment and the yield and quality of satsumas. Global Ecology and Conservation, 19: e00663.

rhizospheres

Liu, M., X. Liu, B.-S. Cheng, X.-L Ma, X.T Lyu, X.-F Zhao, Y. Ju, Z. Z.W. Zhang, and Y. Fang, 2016. Selection and evaluation of phosphate- solubilizing bacteria for use as from grapevine biofertilizers. Spanish Journal of Agricultural Research, 14, e1106.

Luster, J., and R. inlay, 2006. Handbook of Methods Used in Rhizosphere

Research. Swiss Federal Research Institute WSL.

Magnani, G. S., C. M Didonet, L. M. Cruz, C.F. Picheth, F.O. Pedrosa and E. M. Souza, 2010. Diversity of endophytic bacteria in Brazilian sugarcane.

143

Genetics and Molecular Research: GMR, 9(1):250–258.

Mandimba, G., T Heulin, R. Bally, A. Guckert and J. Balandreau, 1986. towards maize

Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria mucilage. Plant and Soil, 90(1): 129–139.

Marra, L. M., S. M. de Oliveira, C. R. F. S Soares and F. M. de S Moreira, 2011. Solubilisation of inorganic phosphates by inoculant strains from tropical legumes. Scientia Agricola, 68(5): 603–609.

Martínez-Viveros, O., M. A. Jorquera, D. E. Crowley, G. Gajardo and M. L Mora, 2010. Mechanisms and Practical Considerations Involved In Plant Growth Promotion By Rhizobacteria. Journal of Soil Science and Plant Nutrition, 10(3): 293–319.

Mathivanan, S., S. Priyanka and R. Sridar, 2014.

Isolation and Characterization of Phosphate solubilising Burkholderia spp from the crops rhizosphere. Journal of Innovative Agriculture. 1(1): 1–6.

Matthews, S.and M, Suhaimi, 2010. Selection of suitable growth medium for free-living diazotrophs isolated from compost. J Trop Agric Food Sci, 38: 211–219.

Mehnaz, S., M.S. Mirza, J. Haurat, R. Bally, P. Normand, A Bano and K. A. Malik, 2001. Isolation and 16S rRNA sequence analysis of the beneficial bacteria from the rhizosphere of rice. Canadian Journal of Microbiology, 47(2): 110–117.

Mehnaz, S., 2011. Plant Growth-Promoting Bacteria Associated with Sugarcane. In D. K. Maheshwar. i (Ed.), Bacteria in Agrobiology: Crop Ecosystems. Springer: 165–187.

effect of

and

Mehnaz, S., B. Weselowski, F. Aftab, S. Zahid and J. Iqbal, 2009. Isolation, fluorescent pseudomonads on characterization, micropropagated sugarcane. Canadian Journal of Microbiology, 55(8): 1007–1011.

Mekonnen, T., M. Diro, M. Sharma and T. Negi, 2014. Protocol optimization for in vitro mass propagation of two sugarcanes (Saccharum officinarum L.) clones grown in Ethiopia. African Journal of Biotechnology, 13(12): 1358-1368.

Mendes, R., A.A Pizzirani-Kleiner, W. L Araujo and J.M Raaijmakers, 2007. Diversity of Cultivated Endophytic Bacteria from Sugarcane: Genetic and Biochemical Characterization of Burkholderia cepacia Complex

144

Isolates. Applied and Environmental Microbiology, 73(22): 7259–7267.

Mew, T. W.and J. Misra, 1999. A Manual of Rice Seed Health Testing. Int.

Rice Res. Inst 113

Michelangelo, de. F. J., K.M. Júlia, C. Emídio, M.B Freire and V. Apolinário, 2016. Bacteria associated with sugarcane in Northeastern Brazil. African Journal of Microbiology Research, 10: 1586–1594.

Miladiarsi, N.R., N.R. Mubarik and R. Widyastuti, 2017. Selection, Characterization and Application of Rhizobacteria and its Effect on Chili (Capsicum annuum L.) Plant Growth. Research Journal of Microbiology, 12(3): 161–169.

Milagres, A. M., A. Machuca and D. Napoleão, 1999. Detection of siderophore production from several fungi and bacteria by a modification of chrome azurol S (CAS) agar plate assay. Journal of Microbiological Methods, 37(1): 1–6.

Mirza, S.M., W. Ahmad, F. Latif, J. Haurat, R. Bally, P. Normand and K.A Malik, 2001. Isolation, partial characterization, and the effect of plant growth-promoting bacteria (PGPB) on micro-propagated sugarcane in vitro. Plant and Soil, 237(1): 47–54.

Modi, K., and P. Patel, 2017. Isolation and Characterization of Plant Growth Promoting Rhizobacteria Associated with Saccharum officinarum L. Current Synthetic and Systems Biology, 5(1): 4.

Mohanta, S., G. d, Sharma and B. Deb, 2010. Diversity of Endophytic Diazotrophs in Non-Leguminous Crops-A Review. Assam University Journal of Science and Technology: Biological and Environmental Sciences Number I, 6: 109–122.

Muangthong, A., S. Youpensuk and B. Rerkasem, 2015. Isolation and Characterisation of Endophytic Nitrogen Fixing Bacteria in Sugarcane. Tropical Life Sciences Research, 26(1): 41–51.

Murashige, T.and F. Skoog, 1962. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 15(3): 473–497.

Murphy, J., and J.P. Riley, 1962. A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters. Analytica Chimica Acta, 27: 31–36.

Nakade, D. B., 2014. Bacterial diversity

in sugarcane (Saccharum

145

officinarum) rhizosphere of saline soil. International Research Journal of Biological Sciences, 2(2): 60–64.

Nautiyal, C. S., 1999. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms. FEMS Microbiology Letters, 170(1): 265–270.

Navarro-Noya, Y. E., E. Hernández-Mendoza, J. Morales-Jiménez, J. Jan- Roblero, E. Martínez-Romero and C. Hernández-Rodríguez, 2012. Isolation and characterization of nitrogen fixing heterotrophic bacteria from the rhizosphere of pioneer plants growing on mine tailings. Applied Soil Ecology, 62: 52–60.

Neumann, B., A. Pospiech and H.U. Schairer, 1992. Rapid isolation of genomic DNA from gram-negative bacteria. Trends in Genetics: TIG, 8(10): 332–333.

Ngô Hồng Thanh, Hoàng Minh Tâm và Cao Ngọc Điệp, 2014. Xác định đặc tính vi khuẩn nội sinh trong cây mía trồng ở tỉnh Bến Tre và Long An. Tạp Chí Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 233: 41–48.

Nguyễn Đức Khiển, 2002. Môi trường và sức khỏe. Nhà xuất bản Lao động và

xã hội.

Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học, Tập 2: Thí nghiệm vi sinh vật học. NXB Đại học Đại học Quốc gia TP. HCM.

Nguyễn Hữu Hiệp, Phạm Thị Khánh Vân, Trần Văn Chiêu, Đào Thanh Hoàng và Nguyễn Khắc Thanh Loan, 2005. Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn Azospirillum bằng kỹ thuật PCR. Tap chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 4: 119–126.

Nguyen Thi Mui, T. R. Preston and I. Ohlsson, 1997. Responses of four varieties of sugar cane to planting distance and mulching. Livestock Research for Rural Development, 9(3).

Nguyễn Viết Hưng, Đinh Thế Lộc, Nguyễn Viết Ngụ và Nguyễn Thế Huấn,

2012. Giáo trình cây mía. NXB Nông nghiệp Hà Nội.

Nielsen, A., M. Mansson, M. Wietz, A. N. Varming, R. K. Phipps, T. O. Larsen, L. Gram and H. Ingmer, 2012. Nigribactin, a Novel Siderophore from Vibrio nigripulchritudo, Modulates Staphylococcus aureus Virulence Gene Expression. Marine drug, 10(11):2584-95.

Njoloma, J., K. Tanaka, T. Shimizu, T. Nishiguchi, M. Zakria, R. Akashi, M.

146

Oota, and S. Akao, 2006. Infection and colonization of aseptically micropropagated sugarcane seedlings by nitrogen-fixing endophytic bacterium, Herbaspirillum sp. B501gfp1. Biology and Fertility of Soils, 43(2): 137–143.

Octavia, S., and R. Lan, 2014. The Family Enterobacteriaceae. In E. Rosenberg, E. F. DeLong, S. Lory, E. Stackebrandt, and F. Thompson (Eds.), The Prokaryotes: Gammaproteobacteria. Springer: 225–286.

Oliveira, A. L. M., S. Urquiaga, J. Döbereiner and J.I. Baldani, 2002. The effect of inoculating endophytic N2-fixing bacteria on micropropagated sugarcane plants. Plant and Soil, 242(2): 205–215.

Orhan, E., A. Esitken, S. Ercisli, M. Turan and F. Sahin, 2006. Effects of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on yield, growth and nutrient contents in organically growing raspberry. Scientia Horticulturae, 111: 38–43.

Pandya, N. D., P. V. Desai and R. Z. Sayyed, 2011. Antifungal and ability of plant growth promoting phytohormone production rhizobacteria associated with the rhizosphere of sugarcane. J. Microb. World, 13(1): 112–116.

Park, M., C. Kim, J. Yang, H. Lee, W. Shin, S. Kim and T. Sa, 2005. Isolation and characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricultural crops of Korea. Microbiological Research, 160(2): 127–133.

Patel, P., R. Shah, and K. Modi, 2017. Isolation and characterization of plant growth promoting potential of Acinetobacter sp. RSC7 isolated from Saccharum officinarum cultivar Co 671. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences, 5: 483–491.

Patel, P. R. Shah, B. Joshi, K. Ramar, A. Natarajan, 2019. Molecular identification and biocontrol activity of sugarcane rhizosphere bacteria falcatum. Biotechnology against red rot pathogen Colletotrichum Resport, 21: e0031.

Pereira, L. B., G. S. Andrade, S. P. Meneghin, R. Vicentini and L.M.M. Ottoboni, 2019. Prospecting Plant Growth-Promoting Bacteria Isolated from the Rhizosphere of Sugarcane Under Drought Stress. Current Microbiology, 76: 1345–1354.

Phạm Thị Thùy, 2010. Sản xuất rau an toàn theo tiêu chuẩn Thực hành nông

nghiệp tốt (GAP). Nhà xuất bản Nông nghiệp.

147

Pisa, G., G.S Magnani, H. Weber, E.M Souza, H Faoro, R.A Monteiro, E Daros, V Baura, J.P. Bespalhok, F. Pedrosa, and L.M Cruz, 2011. Diversity of 16S rRNA genes from bacteria of sugarcane rhizosphere soil. Brazilian Journal of Medical and Biological Research = Revista Brasileira De Pesquisas Medicas E Biologicas, 44(12): 1215–1221.

Quecine, M. C., W. L Araújo, P. B. Rossetto, A. Ferreira, S. Tsui, P.T Lacava, M. Mondin, J. L Azevedo and A.A Pizzirani-Kleiner, 2012. Sugarcane growth promotion by the endophytic bacterium Pantoea agglomerans 33.1. Applied and Environmental Microbiology, 78(21): 7511–7518.

Raj, R. S. D. P., and G. R. Rex, 2014. Modified medium for isolation and preliminary screening of indole acetic acid (IAA) producing bacteria from soil samples. International Journal of Modern Research and Reviews, 2(9): 275–276.

Rajalakshmi, K. and N. Banu, 2015. Extraction and Estimation of Chlorophyll from Medicinal Plants. International Journal of Science and Research, 4 (11): 209-212.

forin vitro

Ramanand and M. Lal, 2004. An efficient protocol micropropagation of sugarcane. Sugar Tech, 6(1): 85–87.

Ramanand, M. Lal, S.B Singh and V.P. Singh, 2007. Optimization of rooting in micropropagated shoots of sugarcane. Sugar Tech, 9(1): 95–97.

Reinhold-Hurek, B., and T. Hurek, 1998. Interactions of Gramineous Plants with Azoarcus spp. and Other Diazotrophs: Identification, Localization, and Perspectives to Study their Function. Critical Reviews in Plant Sciences, 17(1): 29–54.

Reis, V., F.B. Olivares, A. L.M. de Oliveira, B.d.R.F. Junior, J.I, Baldani and J. Döbereiner, 1999. Technical approaches to inoculate micropropagated sugar cane plants were Acetobacter diazotrophicus. Plant and Soil, 206(2): 205–211.

Reis, V.M., P.E.L. Santos, S. Tenorio-Salgado, J. Vogel, M. Stoffels, S. Guyon, P. Mavingui, V.L.D. Baldani, M. Schmid, J.I. Baldani, J. Balandreau, A. Hartmann and J. Caballero-Mellado, 2004. Burkholderia tropica sp. Nov., a novel nitrogen-fixing, plant-associated bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54(Pt 6): 2155– 2162.

Relman, D. A., T. M. Schmidt, R.P. MacDermott, and S. Falkow, 1992. Identification of the uncultured bacillus of Whipple’s disease. The New

148

England Journal of Medicine, 327(5) = 293–301.

Ribeiro, C.M., and E.J.B.N. Cardoso, 2012. Isolation, selection and characterization of root-associated growth promoting bacteria in Brazil Pine (Araucaria angustifolia). Microbiological Research, 167(2): 69–78.

Ridge, R., 2013. IPI Bulletin No. 21: Fertilizing for High Yield and Quality

Sugarcane. International Potash Institute.

Rivas, R., P. Garcia-Fraile, J.L. Zurdo-Pin˜eiro, P.F. Mateos, E. Martı´nez- Molina, E.J. Bedmar, J. Sa´nchez-Raya, and E. Vela´zquez, 2008. Saccharibacillus sacchari gen. Nov., sp nov., isolated from sugar cane. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58: 1850–1854.

Rodrigues, A.A., M.V.F. Araújo, R.S. Soares, B.F.R.D. Oliveira, I.D.A. Ribeiro, S.T. Sibov, J.D.G Vieira, A.A. Rodrigues, M.V.F. Araújo, R.S. Soares, B.F.R.D Oliveira, I.D.A Ribeiro, S.T. Sibov and D.G.J, Vieira, 2018. Isolation and prospection of diazotrophic rhizobacteria associated with sugarcane under organic management. Anais Da Academia Brasileira de Ciências, 90(4): 3813–3829.

Rodrigues, A., M. Forzani, R. Soares, S. Sibov and J. Vieira, 2016. Isolation and selection of plant growth-promoting bacteria associated with sugarcane. Pesquisa Agropecuária Tropical, 46 (2): 149–158.

Rosenblueth, M. and E. Martínez-Romero, 2006. Bacterial endophytes and their interactions with hosts. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI, 19(8): 827–837.

Sabaz, A., S.A. Khan, H. Rashid, F. Chaudhary, Z. Chaudhry and A. Afroz, 2008. Rapid micropropagation of three elite Sugarcane (Saccharum officinarum L.) varieties by shoot tip culture. African Journal of Biotechnology, 7: 2174–2180.

Sadiq, H.M., G.Z. Jahangir, I.A. Nasir, M. Iqtidar and M. Iqbal, 2013. Isolation from and Characterization of Phosphate-Solubilizing Bacteria Rhizosphere Soil. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 27(6): 4248–4255.

Saharan, B. and V. Nehra, 2011. Plant Growth Promoting Rhizobacteria: A Critical Review. Life Sciences and Medicine Research, Volume 2011 LSMR-21: 30.

Santos, H.G.d. Jacomine, L.H.C.d. Anjos, V.A.de Oliveira, J.F. Lumbreras,

149

M.R. Coelho, J.A.de. Almeida, J.C.de Araujo Filho, J.B.de Oliveira and Cunha, 2018. Brazilian Soil Classification System.

Santos, R.M., S. Kandasamy and E.C. Rigobelo, 2018. Sugarcane growth and nutrition levels are differentially affected by the application of PGPR and cane waste. Microbiologyopen. Dec; 7(6): e00617. Published online 2018, Apr 13. doi: 10.1002/mbo3.617

Satyaprakash, M., E.U.B. Sadhana and S. Vani, 2017. Phosphorous and Phosphate Solubilising Bacteria and their Role in Plant Nutrition. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 6: 2133–2144.

Schmid, M. and A. HartMann, 2007. Molecular Phylogeny and Ecology of Root Associated Diazotrophic α- and β-Proteobacteria. In C. Elmerich and W. E. Newton (Eds.), Associative and Endophytic Nitrogen-fixing Bacteria and Cyanobacterial Associations. Springer Netherlands: 21–40.

Schulz, B. and C. Boyle, 2006. What are Endophytes? In B. J. E. Schulz, C. J. C. Boyle, and T. N. Sieber (Eds.), Microbial Root Endophytes. Springer. :1-13

Schwyn, B., and J. B. Neilands,1987. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry, 160(1): 47–56.

Shafique, M., S.J. Khan, and N.H. Khan, 2015. Appraisal of nutritional status and in vitro mass propagation of sugarcane (saccharum officinarum l. Cv. Us-633) through callus culture. Pak. J. Biochem. Mol. Biol, 48(2): 48–52.

Shastri, B., R. Kumar and R.J. Lal, 2020. Isolation, Characterization and Identification of Indigenous Endophytic Bacteria Exhibiting PGP and Antifungal Traits from the Internal Tissue of Sugarcane Crop. Sugar Tech, 19: 293–299.

Shrivastava, U.P. and B. Kumar, 2011. A Simple and Rapid Plate Assay for the Screening of Indole-3-acetic Acid (IAA) Producing Microorganisms. International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology, 2(1): 120–123.

Silveira A. P. D. da, R.de P. F. Iório, F. C.C. Marcos, A.O. Fernandes, S.A.C.D.de Souza, EE. Kuramae, and M.A. P. Cipriano, 2019.Exploitation of New Endophytic Bacteria and Their Ability to Promote Sugarcane Growth and Nitrogen Nutrition. Springer, 112, 283–295

150

Singh. D, A. Sharma and G.K. Saini, 2013. Biochemical and molecular characterisation of the bacterial endophytes from native sugarcane varieties of Himalayan region. 3 Biotech 3 (3): 205–212.

Singh, J., and D.P Singh, 2012. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR): Microbes in sustainable agriculture In: Management of Microbial Resources in Environment. Springer, Dordrecht: 361–386.

Singh, Z., J. Kaur, R. Kaur and S. Hundal, 2016. Toxic Effects of Organochlorine Pesticides: A Review. American Journal of BioScience, 4(3): 11.

Solarzano, L., 1969. Determination of ammonia in natural waters by the phenolhypochlorite methods. Limnology and Oceanography, 14(5): 799– 801.

Soomro, A.F., S. Tunio, M.I. Keerio, I. Rajper, Q. Chachar and M.I. Arain, 2014. Effect of inorganic NPK fertilizers under different proportions on growth, yield and juice quality of sugarcane (Saccharum officinarum L). Pure Appl. Bio., 3(1): 10–18.

Southwick, L.M., B.C. Grigg, T.S. Kornecki and J.L. Fouss, 2002. Potential influence of sugarcane cultivation on estuarine water quality of Louisiana’s gulf coast. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50 (15): 4393–4399.

Southwick, L. M., G.H. Willis, D.C. Johnson and H.M. Selim, 1995. Leaching of Nitrate, Atrazine, and Metribuzin from Sugarcane in Southern Louisiana. Journal of Environmental Quality, 24(4): 684–690.

Southwick, L.M., G. Willis and H. Selim, 1992. Leaching of atrazine from sugarcane in southern Louisiana. Journal of Agricultural and Food Chemistry -, 40 (7): 1264–1268.

Souza, R.de., A. Ambrosini and L.M.P. Passaglia, 2015. Plant growth- promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genetics and Molecular Biology, 38(4): 401–419.

Sparovek, G., M.A Anisimova, M. Kolb, M. Bahadir, H. Wehage, and E. Schnug, 2001. Organochlorine compounds in a Brazilian watershed with sugarcane and intense sediment redistribution. Journal of Environmental Quality, 30(6): 2006–2010.

Srivastava, M.P., R. Tiwari and N. Sharma, 2013. Effect of different cultural variables on siderophores produced by Trichoderma spp. International

151

Journal of Advanced Research, 1(7): 1–6.

Suárez-Moreno, Z. R., J. Caballero-Mellado, B.G. Coutinho, L. Mendonça- Previato, E. K. James and V. Venturi, 2012. Common features of environmental and potentially beneficial plant-associated Burkholderia. Microbial Ecology, 63(2): 249–266.

Suleman, M., S. Yasmin, M. Rasul, M. Yahya, B.M. Atta and M.S. Mirza, 2018. Phosphate solubilizing bacteria with glucose dehydrogenase gene for phosphorus uptake and beneficial effects on wheat. PLOS ONE, 13(9): e0204408.

Sullivan, T.S., S. Ramkissoon, V.H. Garrison, A. Ramsubhag and J.E. Thies, 2012. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia, 28 (3): 391–401.

Tatsch, J. D., M. Bindi and M. Mariondo, 2009. A preliminary evaluation of the CropSyst model for sugarcane in the Southeast of Brazil. In Impact of Climate Change on Agricultural and Natural Ecosystems (edited by Marco Bindi, G. Brandani, A. Dessì, R. Ferrise, M. Moriondo, and G. Trombi). Firenze University Press: 74–84.

Thaweenut, N., Y. Hachisuka, S. Ando, S. Yanagisawa and T. Yoneyama, 2011. Two seasons’ study on nifH gene expression and nitrogen fixation by diazotrophic endophytes in sugarcane (Saccharum spp. hybrids): Expression of nifH genes similar to those of rhizobia. Plant and Soil, 338(1): 435–449.

Tổng cục thống kê, 2018. Niên giám thống kê 2018. Nhà xuất bản Thống kê:

491–580.

Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phương Trang và Phạm Thị Hồng Tươi, 2001. Thực tập vi sinh vật học. NXB Đại học Đại học Quốc gia TP. HCM.

rRNA

Turner, S., K.M. Pryer, V.P. Miao and J.D. Palmer, 1999. Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit sequence analysis. The Journal of Eukaryotic Microbiology, 46(4): 327–338.

Van Antwerpen, T., R. Rutherford and J. Vogel, 2001. Assessment of sugarcane endophytic bacteria and rhizospheric Burkholderia species as antifungal agents. Proc Annu Congr S Afr Sugar Technol Assoc, 76: 301– 304.

152

Ventorino, V., E. Ionata, L. Birolo, S. Montella, L. Marcolongo, A. de Chiaro, F. Espresso, V. Faraco and O. Pepe, 2016. Lignocellulose-Adapted Endo- Cellulase Producing Streptomyces Strains for Bioconversion of Cellulose-Based Materials. Frontiers in Microbiology, 7: 1-15.

Větrovský, T., and P. Baldrian, 2013. The Variability of the 16S rRNA Gene in Bacterial Genomes and Its Consequences for Bacterial Community Analyses. PLoS ONE, 8(2): e57923, 1-8.

Videira, S., D. Oliveira, R. Morais, W. Borges, V. Baldani and J. Baldani, 2011. Genetic diversity and plant growth promoting traits of diazotrophic bacteria isolated from two Pennisetum purpureum Schum. Genotypes grown in the field. Plant and Soil, 356: 51–66.

Viện Nghiên cứu mía đường, 2020. Ngân hàng kiến thức trồng mía.

http://www.vienmiaduong.vn/vi/ngan-hang-kien-thuc/

Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004. Thuyết minh Bản đồ đất tỉnh

Tây Ninh (kèm theo Bản đồ đất tỷ lệ 1/100.000).

Viện thổ nhưỡng nông hóa, 1998. Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón, cây

trồng. NXB Nông nghiệp.

von Graevenitz, A. and C. Bucher, 1983. Accuracy of the KOH and reaction of non-

in determining

the Gram

tests

vancomycin enterobacterial rods. Journal of Clinical Microbiology, 18(4): 983–985.

Wang, Z., G. Xu, P. Ma, Y. Lin, X. Yang and C. Cao, 2017. Isolation and Characterization of a Phosphorus-Solubilizing Bacterium from Rhizosphere Soils and Its Colonization of Chinese Cabbage (Brassica campestris ssp. Chinensis). Frontiers in Microbiology, 8: 1-12.

Wang, J., R. Li, H. Zhang, G. Wei and Z. Li, 2020. Beneficial bacteria activate nutrients and promote wheat growth under conditions of reduced fertilizer application. BMC Microbiology, 20, 38.

Ward, M. H., R.R. Jones, J.D. Brender, T.M. de Kok, P. J. Weyer, B.T Nolan, C.M. Villanueva and S.G. van Breda, 2018. Drinking Water Nitrate and Human Health: An Updated Review. International Journal of Environmental Research and Public Health, 15(7): 1557.

Woo, P.C., P.K. Leung, K.W. Leung and K.Y. Yuen, 2000. Identification by 16S ribosomal RNA gene sequencing of an Enterobacteriaceae species from a bone marrow transplant recipient. Molecular Pathology: MP, 53(4): 211–215.

153

Yang, P.X., L. Ma, M.H. Chen, J.Q. Xi, F. He, C.Q. Duan, M.H Mo, D.H. Fang, Y.Q. Duan and F.X. Yang, 2012. Phosphate Solubilizing Ability and Phylogenetic Diversity of Bacteria from P-Rich Soils Around Dianchi Lake Drainage Area of China. Pedosphere, 22(5): 707–716.

Yoneyama, T., J. Terakado-Tonooka and K. Minamisawa, 2017. Exploration of bacterial N2-fixation systems in association with soil-grown sugarcane, sweet potato, and paddy rice: A review and synthesis. Soil Science and Plant Nutrition, 63(6): 578–590.

Zakria, M., K. Udonishi, T. Ogawa, A. Yamamoto, Y. Saeki and S. Akao, 2008. Influence of inoculation technique on the endophytic colonization of rice by Pantoea sp. Isolated from sweet potato and by Enterobacter sp. Isolated from sugarcane. Soil Science and Plant Nutrition, 54(2): 224– 236.

Zarei, M., S. Aminzadeh, H. Zolgharnein, A. Safahieh, A. Ghoroghi, A. Motallebi, M. Daliri and A. Sahebghadam Lotfi, 2010. Serratia marcescens B4A chitinase product optimization using Taguchi approach. Iranian Journal of Biotechnology, 8(4): 252–262.

Zhang, C.W., J. Zhang, J.J. Zhao, X. Zhao, D. F. Zhao, H. Q. Yin and X.X. Zhang, 2017. Serratia oryzae sp. nov., isolated from rice stems. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 67(8):2928–29.

Zhang, P., S. Qin, B. Yuan, Y. Chen, X. Cao and J. Jiang, 2016. [Diversity and bioactivity of actinomycetes isolated from medicinal plant Taxus chinensis and rhizospheric soil]. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica, 56(2): 241–252.

Zinniel, D.K., P. Lambrecht, N.B. Harris, Z. Feng, D. Kuczmarski, P. Higley, C.I. shimaru, A. Arunakumari, R.G. Barletta and A.K. Vidaver, 2002. Isolation and Characterization of Endophytic Colonizing Bacteria from Agronomic Crops and Prairie Plants. Applied and Environmental Microbiology, 68(5): 2198–2208.

Internet:

Cục thống kê TP. HCM: http://www.pso.hochiminhcity.gov.vn/web/guest/nam-

2018. Truy cập: 02/3/2020

Cục thống kê tỉnh Đồng Nai:

http://thongke.dongnai.gov.vn/Pages/newsdetail.aspx?NewsId=966andC atId=32. Truy cập: 02/3/2020

154

Cục thống kê tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu: http://thongkebariavungtau.gov.vn/bai- viet-thong-ke/tinh-hinh-kinh-te--xa-hoi-6-thang-nam-2018-124.html. Truy cập: 02/3/2020

FAOSTAT—Food and Agriculture Organization of the United Nations:

Statistics Division (2020). http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC. Truy cập: 29 Feb 2020

Tổng Cục Thống kê Việt Nam. www.gso.gov.vn. Accessed 02/3/2020

Viện mía đường Việt Nam: www.vienmiaduong.vn. Truy cập: 02/3/2020

155

PHỤ LỤC

A. Phụ lục dùng cho chương 2

Tên đất Diện tích

Phụ lục 2.1: Phân loại và quy mô diện tích các loại đất ở Tây Ninh Thứ tự

Kí hiệu

Việt Nam ha %

Tên tương đương FAO/WRB

Tổng diện tích tự nhiên Nhóm đất phèn I. 402.960 6.822 100,00 1,69

1. Đất phèn tiềm tàng sâu Sp2 2.633 0,65

2. Đất phèn hoạt động sâu Sj2 4.189 1,04

II. Nhóm đất phù sa 21.867 5,43

3. Đất phù sa glây Pg 9.799 2,43

4. Pg/S 10.237 2,54 Đất phù sa glây trên nền phèn

5. Đất phù sa có nền loang lổ Pf 1.831 0,45

330.033 81,90 Endoprotothionic Fluvisols Endoorthithionic Fluvisols Gleyi- Umbric Fluvisols Bathiprotothionic Fluvisols Gleyi- Fluvic Cambisols Haplic Acrisols X 230.323 57,16

7. Stagni-Plinthic Acrisols Xf 50.526 12,54

Xg III. Nhóm đất xám bạc màu Đất xám trên phù sa cổ 6. Đất xám có tầng loang lổ glây 8. Đất xám glây IV. Nhóm đất đỏ vàng 49.184 14.468 12,21 3,59

9. Đất nâu đỏ trên đá Bazan Fk 3.812 0,95

10. Fs 546 0,14

11. Fa 1.553 0,39 Đất đỏ vàng trên đá sét và biến chất Đất vàng đỏ trên đá mác ma axít Gleyic Acrisols Rhodi/ Humi- Acric Ferralsols Endolithi- Chromic Acrisols Epi/Endolithi-Chromic Acrisols

(Nguồn: Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn, Viện Quy Hoạch và Thiết Kế Nông Nghiệp-Phân Viện Quy Hoạch và Thiết Kế Nông Thôn, 2004).

Fp Sp2 12. Đất nâu vàng trên phù sa cổ Chromic Acrisols V. Ao-hồ, sông suối 8.557 29.770 2,12 7,39

Phụ lục 2.2: Tỷ lệ NPK đề xuất cho các vùng mía đường của một số quốc gia (năm 2018)

N P K Năng suất

Quốc gia Vùng Úc Burdekin Miền Trung Vùng khác Loại mía Mía tơ Mía gốc Mía tơ Mía gốc Mía tơ Mía gốc 140-160 210-250 150 170 140 160 20 0 20-50 0-30 20-50 0-30 (kg ha-1) 0 0-50 50-80 70-100 50-100 100-120 Tấn ha-1 75.6434

Brazil Đông Bắc Đông Nam Trung-Tây Miền Nam Mía tơ Mía gốc Mía tơ Mía gốc Mía tơ Mía gốc Mía tơ Mía gốc 60-80 60-80 50-90 50-90 30-40 40-60 40-100 20-40 35-79 9-44 22-48 11-22 13-52 7-26 0-52 9-26 25-100 33-116 17-100 8-66 25-100 17-75 25-100 0-50 74.369

Colombia Mía tơ Mía gốc 50-70 50-100 22-44 26-44 50-125 50-125 88.7580

Ấn Độ Cận nhiệt đới Mía tơ Nhiệt đới Mía gốc 100-250 150-300 26 35-52 66 90 79.6829

(Nguồn: Ridge, 2013 và FAOSTAT, 2020.)

Nam Phi Mía tơ Mía gốc 60-140 100-200 20-80 20-40 75-250 125-250 675451

Phụ lục 2.3: Danh sách các loài vi khuẩn phân lập từ cây mía (từ năm 2000 – 2010) (trích dẫn Mehnaz et al., 2011) Vi khuẩn

Tham khảo Quốc gia

Nguồn phân lập Apoplast Acinetobacter baumanii Cuba Velázquez et al. (2008)

Agrobacterium tumefaciens Thân Trung Quốc Xing et al. (2006)

Vùng rễ, rễ, thân, lá

Azospirillum sp., A. brasilense, A. lipoferum, A. amazonense

Ấn Độ, Pakistan, Brazil, Tây Ban Nha

Gangwar và Kaur (2009), Mehnaz et al. (2010), Reis et al. (2000), Tejera et al. (2005), Reinhardt et al. (2008)

Azotobacter chroococum Rễ Tây Ban Nha Tejera et al. (2005)

Vùng rễ, rễ, thân, apoplast

Bacillus spp., B. cereus, B. pumilus, B. subtilis

Nam Phi, Ấn Độ, Pakistan, Cuba Antwerpen et al. (2002), Gangwar và Kaur (2009), Hassan et al. (2010), Velázquez et al. (2008)

Brevibacillus sp. Thân, lá Brazil Magnani et al. (2010)

Vùng rễ, rễ, thân, lá

Nam Phi, Brazil, Papua New Guinea, Mexico, Ấn Độ

Burkholderia spp., B. ambifaria, B. cepacia, B. cenocepacia, B. fungorum, B. graminis, B. gladioli, B. glumae, B. plantarii, B. sacchari, B. silvatlantica, B. tropica, B. unamae, B. vietnamiensis

Vùng rễ, rễ, thân Brazil, Pakistan

Enterobacter sp., E. aerogenes, E. cloacae, E. oryzae Antwerpen et al. (2002), Perin et al. (2006), Omarjee et al. (2004; 2008), Luzivotto et al. (2010), Mendes et al. (2007), Bramer et al. (2001), Perin et al. (2006a, b), Reis et al. (2004), Caballero- Mellado et al. (2004), Govindrajan et al. (2007) Magnani et al. (2010), Mehnaz et al. (2010), Mirza et al. (2001)

Gluconacetobacter diazotrophicus Vùng rễ, rễ, thân, lá

Asis et al. (2000), Prabudoss và Stella (2009), Velázquez et al. (2008), Youssef et al. (2004)

Philippines, Brazil, Cuba, Ấn Độ, Ai Cập Philippines Lá Asis et al. (2000)

Herbaspirillum seorpedaceae, H. rubrisubulbicans Klebsiella spp., K. oxytoca K. pneumonia, K. variicola Vùng rễ, rễ, thân

Brazil, Nam Phi, Ấn Độ, Mexico

Antwerpen et al. (2002), Magnani et al. (2010), Mehnaz et al. (2010), Mirza et al. (2001), Govindrajan et al. (2007), Rosenblueth et al. (2004)

Thân, apoplast Brazil, Cuba Mendes et al. (2007),

Velázquez et al. (2008)

Thân, lá

Cuba, Brazil

Microbacterium oleivorans, M. testaceum Pantoea sp., P. ananatis, P. stewartii Loiret et al. (2004), Magnani et al. (2010), Mendes et al. (2007)

Vùng rễ, rễ, thân, lá

Pseudomonas spp., P. aeruginosa, P. fluorescence, P. putida, Brazil, Nam Phi, Ấn Độ, Antwerpen et al. (2002), Gangwar và Kaur (2009), Magnani et al. (2010),

P. reactans Pakistan

Rễ, apoplast

Viswanathan et al. (2003), Mehnaz et al. (2009a,b; 2010), Mendes et al. (2007), Viswanathana và Samiyappan (2002) Mehnaz et al. (2010), Velázquez et al. (2008) Rhizobium sp., R. rhizogenes Pakistan, Cuba

Serratia spp. Thân Nam Phi Antwerpen et al. (2002)

Thân, lá, apoplast Brazil, Cuba Magnani et al. (2010), Velázquez et al. (2008)

Staphylococcus sp. S. epidermidis, S. saprophyticus

Vùng rễ, thân

Pakistan, Brazil

Stenotrophomonas maltophilia, S. pavanii Xanthomonas spp., X. campestris, X. oryzae

Thân, apoplast Nam Phi, Pakistan, Cuba Hassan et al. (2010), Mehnaz et al. (2010), Ramos et al. (2010) Antwerpen et al. (2002), Mehnaz et al. (2010), Velázquez et al. (2008)

(Nguồn: Mehnaz, 2011)

Zymomonas sp. Thân Nam Phi Antwerpen et al. (2002),

Lượng

Gram’s iodine

B. Phục lục dùng cho chương 3 Phụ lục 3.1: Công thức các hóa chất dùng trong nhuộm Gram (1) Hóa chất Thuốc nhuộm Dung dịch A: Tím kết tinh Hucker’s (2) Crystal violet (Sigma Aldrich) Ethanol 95% Dung dịch B: Ammonium oxalate Nước cất Iod tinh thể KI Nước cất Safranin O (Sigma Aldrich) Ethanol 95%

2 g 20 ml 0,8 g 80 ml 1 g 2 g 300 ml 2,5 g 100 ml

Hucker’s counterstain (3) (100 ml stock 10X) (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2003)

Phụ lục 3.2: Công thức hoá chất và pha chế thuốc thử dùng cho thí nghiệm định lượng + NH4

Thuốc thử là một hỗn hợp của ba dung dịch: dung dịch 1, dung dịch 2 và dung dịch 3, được kết hợp theo tỉ lệ nhất định. Các dung dịch này được chuẩn bị riêng lẻ và phối trộn khi sử dụng. Cách pha các dung dịch được thực hiện như sau:

-Dung dịch 1 (Phenol (C6H5-OH)-Nitroprosside (Na2Fe(CN)5NO(2H2O))): hòa tan

5g phenol và 0,025g nitroprusside vào nước cất để cho đủ thể tích 500ml

-Dung dịch 2: Sodium hypochlorite: hòa tan 100/Cml dung dịch hypochlorite và 15g NaOH vào trong nước cất cho đủ 1000ml.

+ 1mg/l

-Dung dịch 3: Dung dịch chuẩn NH4

Phụ lục 3.3: Công thức hoá chất và pha chế thuốc thử dùng cho thí nghiệm định lượng P2O5

Thuốc thử là một hỗn hợp của ba dung dịch: dung dịch, A, dung dịch B và dung dịch C, được kết hợp theo tỉ lệ nhất định. Các dung dịch này được chuẩn bị riên lẽ và phối trộn khi sử dụng. Cách pha các dung dịch được thực hiện như sau:

- Dung dịch A: (1) 12g ammonium molybdate ((NH4)6MoO24.4H2O) hòa tan trong 250ml H2O. (2) 0,2908g potassium antymonyl tartrate (KSbOC4H2O6) hòa tan trong 100ml H2O (3) 140ml H2SO4 đậm đặc cho từ từ vào nước để có thể tích 1000ml. (4) cho (1), (2) vào (3) và thêm nước để có thể tích 2000ml.

- Dung dịch B: hòa tan 1,05g ascorbic acid vào 200ml dung dịch A

- Dung dịch lân chuẩn có nồng độ 1 mg/l P2O5

Phụ lục 3.4: Đường chuẩn của các thí nghiệm định lượng

+

Thành phần thuốc thử và nồng độ của đường chuẩn NH4

+ chuẩn 100 ppm (mL)

+ (mg/L)

0 4,00 0,00 0,25 0,25 0,50 0,00

2 3,90 0,10 0,25 0,25 0,50 2,00

3 3,85 0,15 0,25 0,25 0,50 3,00

4 3,80 0,20 0,25 0,25 0,50 4,00

5 3,75 0,25 0,25 0,25 0,50 5,00

1 3,95 0,05 0,25 0,25 0,50 1,00

Ống Nước DI (mL) NH4 Phenol-ethanol (mL) Sodium nitroprusside (mL) Dung dịch oxide hóa (mL) Nồng độ NH4

Thành phần thuốc thử và nồng độ của đường chuẩn P2O5

0 5,00 0,00 0,70 0,30 0,00

2 4,88 0,12 0,70 0,30 2,00

3 4,82 0,18 0,70 0,30 3,00

4 4,76 0,24 0,70 0,30 4,00

5 4,70 0,30 0,70 0,30 5,00

1 4,94 0,06 0,70 0,30 1,00

Ống Nước DI (mL) P2O5 chuẩn 100 ppm (mL) Thuốc thử A (mL) Acid ascorbic 0,1 M (mL) Nồng độ P2O5 (mg/L)

Thành phần thuốc thử Fe-HClO4 và nồng độ của đường chuẩn IAA

Ống Nước DI (mL) IAA chuẩn 100 ppm (mL) Thuốc thử Fe-HClO4 (mL) Nồng độ IAA (mg/L)

0 1,00 0,00 2,00 0,00

2 0,94 0,06 2,00 2,00

3 0,91 0,09 2,00 3,00

4 0,88 0,12 2,00 4,00

5 0,85 0,15 2,00 5,00

1 0,97 0,03 2,00 1,00

Phụ lục 3.5: Quy trình chuẩn bị môi trường CAS Blue Agar theo Schwyn and Neilands (Louden et al., 2014).

a. Thuốc nhuộm xanh (Blue Dye):

- Dung dịch 1: hòa tan 0.06 g of CAS (Fluka Chemicals) vào 50 ml nước cất khử ion.

- Dung dịch 2: hòa tan 0.0027 g of FeCl3-6 H2O vào 10 ml HCl 10 mM.

- Dung dịch 3: hòa tan 0.073 g of HDTMA vào 40 ml nước khử ion.

- Trộn dung dịch 1 với 9 ml dung dịch 2 và sau đó với dung dịch 3 được thuốc nhuộn màu xanh. Thuốc nhuộn này được khử trùng và chứa trong bình plastic.

b. Dung dịch hỗn hợp (Mixture solution):

- Stock dung dịch muối môi trường tối thiểu MM9 [Minimal Media 9 (MM9) Salt Solution Stock]: hòa tan 15 g KH2PO4, 25 g NaCl, and 50 g NH4Cl vào 500 ml nước khử ion.

- Stock Glucose 20% (20%Glucose Stock): hòa tan 20 g glucose vào 100 ml nước khử ion.

- Stock NaOH: hòa tan 25 g NaOH vào 150 ml H2O khử ion; pH =12.

- Dung dịch Casamino Acid: hòa tan 3 g of Casamino acid vào 27 ml nước khử ion. Chiết xuất với 8-hydroxyquinoline 3% trong chloroform để loại bỏ tất cả Fe sót lại (any trace iron). Sau đó, dung dịch loc được khử trùng.

c. Chuẩn bị CAS agar (CAS agar Preparation):

- Thêm 100 ml of MM9 vào 750 ml nước cất khử ion

- Hòa tan 32.24 g piperazine-N,N’-bis (2-ethanesulfonic acid) PIPES.

Ghi chú: PIPES không tan khi pH < 5. Tăng pH dung dịch đến 6 và khuấy đền. khi PIPES tan, pH sẽ giảm. Tiếp tục tang pH đến 6.8.

- Thêm 15 g Bacto agar

- Khử trùng và làm nguội đến 50OC

- Thêm 30 ml dung dịch Casamino acid vô trung và 10 ml dung dịch glucose 20% vô trùng vào MM9/PIPES mixture.

- Thêm từ từ 100 ml dung dịch thuốc nhuộm xanh dọc thành chai lắc nhe trộn đều.

- Đổ vào đĩa petri.

Phụ lục 3.6: Thành phần môi trường LB

Tên môi trường Nồng độ (g/l) Hóa chất

Trypton 10

Môi trường LB

Yeast extract Glucose NaCl Agar pH 5 1 10 15 (đặc) 1,5 (bán đặc) 7,0

(Nguồn: Cao Ngọc Điệp, 2011)

Phụ lục 3.7: 100 bp PLUS™ DNA Ladder (GoldBio) và 100 Bp Dna Ladder (Thomas Scientific)

Phụ lục 3.8: Phương pháp nhân giống cây mía in vitro

1. Thu và xử lý mẫu

- Chọn những cây mía to khỏe, không bị sâu bệnh.

- Cắt lấy ngọn mía không sâu bệnh

- Bóc bỏ tất lá già và các lá, lau sạch ngọn bằng cồn ethanol 70o.

- Tiếp tục bóc bỏ lần lượt các lá non bên ngoài cho đến khi chỉ còn lại phần ngọn, đỉnh sinh trưởng (Được thực hiện trong tủ cấy vô trùng).

- Lấy phần đỉnh sinh trưởng làm vật liệu nuôi cấy.

2. Môi trường nuôi cấy

2.1 Môi trường cảm ứng tao chồi

MS bổ sung +30 g sucrose + 8 g agar + 1,5 mg/L BA; pH= 5,8

Mội trường được hấp tiệt trùng theo phương pháp Pasteur ở 121 OC, 1 atm trong 20 phút

2.2 Môi trường nhân chồi

MS bổ sung +30 g sucrose + 8 g agar + 2 mg/l BA và 0,5 mg/l kinetin, pH = 5.8

Mội trường được hấp tiệt trùng theo phương pháp ở 121 OC, 1 atm trong 20 phút

2.3 Môi trường tạo cây con hoàn chỉnh

MS bổ sung +30 g sucrose + 8 g agar + 0,25 mg NAA, pH = 5.8

Mội trường được hấp tiệt trùng theo phương pháp ở 121 OC, 1 atm trong 20 phút

Thành phần môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962)

Thành phần hóa chất

Hàm lượng hóa chất (mg/l) Nồng độ hóa chất (mg/l)

(Nguồn: Nguyễn Bảo Toàn, 2012);

33000 38000 8800 7400 3400 166 1240 4460 1720 50 5 5 556 7460 20000 200 200 2000 1650 1900 440 370 170 0,83 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 27,8 37,3 100 1 1 10 30 8 Dung dịch khoáng đại lượng (Stock 1) NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4. 7H2O KH2PO4 Dung dịch khoáng vi lượng (Stock II) KI H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2 Dung dịch sắt (Stock III) FeSO4.7H2O NA2.EDTA.2H2O Vitamins B5 (Stock – IV) Myo-inositol Nicotinic acid Pyridoxine HCl Thiamine HCl Sucrose (g) Agar (g)

3. Lưu đồ vi nhân giống mía từ đỉnh chồi ngọn

3.1 Cảm ứng tạo chồi

Cắt lấy phần chồi non đường kính 1,5cm, độ dày 1,5cm, đặt vào bình thủy tinh có sẵn 20-30 ml môi trường cảm ứng tạo chồi Bảng 3.1.1

Mỗi bình được cấy một mẫu và đặt trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 1500 – 2000 lux, nhiệt độ 26 ± 2OC. Sau 21 ngày nuôi cấy, đánh giá khả năng tạo thúc đẩy tạo chồi của môi trường. Chọn môi trường cho tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi, số chồi trung bình trên mẫu cấy và chiều cao chồi là cao, cung cấp nguyên liệu cho thí nghiệm nhân chồi.

Nghiệm thức cảm ứng tạo chồi

BA (mg/l)

Thứ tự 1 2 3 4 Nghiệm thức BN2 BN3 BN4 BN5 1 1,5 2 2,5

3.2. Nhân chồi

Sau 21 ngày nuôi cấy, chồi phát triển từ đỉnh sinh trưởng trong ở môi trường tối ưu (phần 3.1) được cắt bỏ phần hóa đen, bóc phần bẹ lá già, chuyển sang bình thủy tinh có sẵn 20-30 ml môi trường nhân chồi theo Bảng 3.1.2. Đánh giá các chỉ tiêu: tỉ lệ tạo cụm chồi, số chồi trên cụm và chiều cao chồi sau 21 ngày nuôi cấy. Nghiệm thức được chọn cho tỉ lệ tạo cụm chồi, số chồi trên cụm chồi và chiều cao chồi cao, cung cấp nguyên liệu cho việc tạo cây con in vitro.

Nghiệm thức nhân chồi

Kin (mg/l)

Nghiệm thức BK1 BK2 BK3 BK4 BK5 BK6 BK7 BK8 BK9 BA (mg/l) 1 1,5 2 1 1,5 2 1 1,5 2 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75 Thứ tự 1 2 3 4 5 6 7 8 9

3.3. Tạo cây hoàn chỉnh

Sau 21 ngày nuôi cấy, chồi phát triển từ đỉnh sinh trưởng trong ở môi trường tối ưu (phần 3.2) được cắt bỏ phần hóa đen, bóc phần bẹ lá già, chuyển sang bình thủy tinh có sẵn 20-30 ml môi trường nhân chồi. Sau sáu tuần nuôi cấy, đánh giá các chỉ tiêu: chiều cao thân, số rễ và chiều dài rễ. Chọn nghiệm thức cho cây mía con đều, cao, rễ tốt làm môi trường nhân giống cung cấp mía con in vitro cho thí nghiệm đánh giá khả năng thúc đẩy thức vật của các dòng vi khuẩn nội sinh, vùng rễ được tuyển chọn.

Nghiệm thức tạo cây hoàn chỉnh

Thứ tự 1 2 3 4 5 6 Nghiệm thức NB0 NB1 NB2 NB3 NB4 NB5 NAA (mg/l) 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50

3.4 Xử lý số liệu

Số liệu được phân tích thống kê bằng Microsoft excel 2010 và phần mềm SPSS 20, p= 95%, trắc nghiệm phân hạng giá trị trung bình Duncan.

+ tổng hợp được của 46 dòng vi khuẩn vùng rễ cây mía cho

C. Phụ lục dùng cho chương 4 Phụ lục 4.1: Lượng NH4 kết quả tốt

Lượng NH4 Nguồn gốc Tên dòng Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8

BCD1a BCA12 BCA22 BCA23 BCA25 BCA37 0,354 0,523 0,795 0,455 1,515 0,096

+ (mg /L) Trung bình 1,005 1,350 0,704 0,846 1,083 1,439

2,773 3,528 1,444 1,489 2,397 5,435 0,003 0,377 0,540 0,505 0,380 0,216 0,890 0,973 0,037 0,933 0,038 0,009

CHT1a 0,117 0,685 0,862 1,084 0,675

Bến Cầu ChâuThành

Dương Minh Châu

Gò Dầu Tân Biên

Tân Châu CHT1b CHT1c CHT1d CHT3b CHT4 DMC1a DMC1c DMC3c DMC5a DMC5d DMC5e MCD1a GOD2a GOD2b GOD2c GOD2d GOD3a GOD3b TAB01 TAB3b TAB4b TAB5a TAB1b TAB4a TPD3b TAC2b TAC3a TAC3b TAC1 TAC3 0,121 0,150 0,298 0,243 0,128 0,303 0,085 0,028 0,022 0,075 0,099 0,391 0,088 0,457 0,088 0,394 0,145 0,081 0,754 0,205 0,913 1,215 1,074 0,099 2,442 0,491 0,061 0,022 0,061 0,081 0,214 0,601 0,786 0,189 0,166 1,702 1,892 1,882 1,932 2,132 2,283 1,423 0,183 1,058 0,905 0,274 0,162 0,143 1,222 0,953 1,410 2,341 1,065 0,316 2,454 0,208 0,089 0,302 0,366 0,311 0,140 0,732 0,937 0,083 0,100 3,545 4,930 5,232 5,275 5,937 6,221 4,351 0,158 1,673 2,373 0,055 0,119 0,125 0,060 0,225 0,445 0,055 0,029 0,870 2,545 0,140 0,191 0,922 0,941 0,811 0,279 0,900 1,092 0,182 0,155 2,951 2,550 2,264 2,263 2,442 2,763 0,563 0,229 1,032 0,282 0,290 0,132 0,187 3,915 3,339 4,258 8,056 3,138 0,038 3,773 0,160 0,022 0,073 0,052 0,082 0,314 0,622 0,816 0,248 0,281 0,007 0,004 0,005 0,169 0,072 0,049 0,386 0,256 1,071 0,876 0,356 0,252 0,179 0,159 0,041 0,024 0,036 0,018 0,258 1,057 0,041 0,081 0,191 0,411 0,271

Trảng Bàng

TAC4b TCD2b TRB1b TRB2 TRB3 TRB4a TRB4b TRB4c TBD2e 0,341 1,043 1,006 0,248 0,213 0,223 0,878 0,142 3,129 0,452 1,448 0,181 0,020 0,055 0,065 0,119 0,058 0,086 0,092 0,305 1,282 0,160 0,159 0,115 1,210 0,056 0,014 0,083 0,641 0,128 0,120 0,058 0,186 1,862 0,036 3,129 0,242 0,859 0,649 0,137 0,121 0,147 1,017 0,073 1,590

Số liệu trình bày trong bảng là bình quân của 3 lần lặp. Kiểm định kết quả qua phân tích phương sai một nhân tố, và trắc nghiệm phân hạng theo phương pháp Duncan ở độ tin cậy 95% theo từng nhóm thí nghiệm.

Phụ lục 4.2: Lượng P2O5 tổng hợp được của 64 dòng vi khuẩn vùng rễ cây mía cho kết quả tốt

Nguồn gốc Tên dòng Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Ngày 20

BCA06 BCA07 BCA13 BCA17 BCA29 BCA30 BCA34 BCA37 BCA38 BCA39 BCD1a BCD1d BCD2b BCD2c BCD3a CHT2f CHT3b CHT3c CHT4a CHT4c CHT4f CHT4e CTD1d DMC1a DMC2a DMC5e DMC2c Bến Cầu ChâuThành Dương Minh Châu 93,350 81,380 70,820 82,660 109,450 59,530 27,480 158,170 85,880 84,180 189,900 90,000 34,834 43,275 161,624 19,570 257,900 77,380 16,310 23,570 69,760 54,670 10,091 20,590 11,020 47,020 21,470 Lượng P2O5 (mg /L) Trung bình 327,000 133,480 150,160 114,943 196,950 143,605 147,340 114,550 263,620 188,058 287,000 172,663 94,910 198,690 156,380 219,613 127,530 158,860 385,570 280,103 226,500 265,100 163,700 134,100 240,370 103,735 168,593 111,633 199,337 178,226 193,680 112,078 59,200 132,990 85,030 121,395 197,860 122,463 82,670 52,860 112,980 115,975 212,850 123,200 32,798 104,773 70,075 112,260 51,575 73,480 31,468 14,030 55,490 72,290 238,650 146,100 218,090 149,110 224,560 225,350 255,160 203,570 163,330 388,140 245,400 184,200 97,235 179,596 233,488 134,910 100,600 175,630 175,970 74,160 188,560 147,210 25,534 95,040 72,090 35,100 45,280 104,920 82,130 88,560 79,090 154,600 118,770 417,210 360,330 258,700 262,520 398,500 98,600 42,500 55,069 118,455 100,150 114,260 147,540 99,710 31,040 92,600 78,070 350,669 52,410 49,710 29,720 82,920

340,360 259,430 182,360 123,343 71,023 92,610 75,623 146,870 26,033 24,380 40,700 26,868 143,800 117,100 226,500 265,100 8,000 115,000 6,671 158,484 308,034 272,817 5,286 269,004 5,010 286,527 348,593 172,728 239,259 127,143 540,148 207,664 438,222 165,948 394,667 191,820 5,220 113,945 346,090 169,248 3,830 266,945 3,560 284,468 5,470 236,955 378,940 344,688 4,600 229,725 3,340 187,240 37,940 170,393 492,740 187,920 297,960 207,110 178,000 103,728 229,350 212,223 268,770 204,678 134,300 117,435 182,580 117,183 339,900 205,670 161,700 137,700 6,900 228,200 198,950 86,450 44,700 43,570 6,630 27,780 187,200 398,500 215,900 143,760 431,710 571,990 610,420 89,890 63,430 48,970 43,810 103,520 14,970 131,310 613,120 651,540 533,330 529,940 547,010 406,940 254,250 28,940 192,870 65,610 202,720 52,140 124,250 64,270 74,830 114,700 458,900 296,030 134,190 109,420 88,990 61,330 32,580 121,900 245,400 155,900 460,160 287,520 439,540 463,750 183,700 161,930 190,520 143,700 192,000 424,810 195,890 404,190 428,400 353,350 414,950 315,400 277,430 383,110 195,260 245,760 147,070 340,150 293,850 125,050 189,000 330,990 184,000 378,700 Gò Dầu Tân Biên Tân Châu Trảng Bàng GOD1c GOD1d GOD1f GOD2f TAB2d TAB5d TPD3a TPD3b TPD4b TCD1a TCD1b TCD2a TCD2b TCD3a TCD3b TCD4a TCD4b TCD4c TAC1c TAC2c TAC3a TAC3b TAC3c TAC4a TAC4b TAC4c TAC4d TAC4a TRB1b TRB1c TRB1d TRB2b TRB3b TRB4a TRB4d TBD2b TBD2e 202,380 90,370 37,360 23,060 11,790 6,410 15,400 189,900 80,000 23,340 64,000 59,200 66,930 68,730 43,960 51,020 38,050 77,090 10,780 3,700 46,640 54,370 55,670 54,920 51,890 61,250 6,270 34,740 91,850 24,230 76,670 203,950 86,140 32,880 76,960 90,400 68,200

Số liệu trình bày trong bảng là bình quân của 3 lần lặp. Kiểm định kết quả qua phân tích phương sai một nhân tố, và trắc nghiệm phân hạng theo phương pháp Duncan ở độ tin cậy 95% theo từng nhóm thí nghiệm.

Phụ lục 4.3: Lượng IAA tổng hợp được của 60 dòng vi khuẩn vùng rễ cây mía cho kết quả tốt

Lượng IAA (mg /L) Nguồn gốc Tên dòng Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 Trung bình Ngày 2

Bến Cầu

BCD1a BCD1d BAC07 BAC17 BAC12 BAC25 BCA34 3,460 1,820 5,667 7,615 9,667 8,744 9,916 7,740 9,640 6,964 6,369 5,536 5,417 18,761 9,347 6,973 2,980 5,455 6,768 8,283 10,309 2,083 6,077 2,796 2,849 4,140 4,140 7,738 5,658 6,128 4,602 5,572 6,527 6,646 11,681

BCA37 CTH1 11,392 7,975 19,957 7,308 10,350 9,527 6,865 7,460 12,141 8,067

0,127 0,545 0,281 8,641 5,865 4,641 4,795 8,231 6,026 7,793 0,155 1,210 3,333 1,548 3,274 8,155 3,313 1,084 0,100 3,434 4,259 3,485 4,596 8,333 1,905 3,030 0,128 1,989 3,889 0,161 1,452 8,441

8,143 8,087 9,718 6,692 12,743 8,949 10,084 1,646 8,692 1,987 3,720 10,417 5,536 15,855 8,869 9,444 5,214 7,308 5,790 5,717 7,020 7,020 6,934 8,586 8,827 5,782 7,510 0,830 1,987 6,667 1,882 7,421 6,398 6,548 2,103 8,651

ChâuThành CHT1a CHT1d CHT4 CHT2f CHT3a CTH3b CHT4 CHT4c Dương Minh Châu MCD1a MCD2a DMC1a DMC1b DMC2a DMC2c DMC3 DMC5d DMC5e Gò Dầu

GD2cd GOD1c GOD1e GOD1f GOD1h GOD2c GOD2f GOD3a GOD3b 22,737 9,620 5,667 6,026 7,154 8,282 3,418 5,051 13,460 11,430 18,077 2,679 3,333 2,143 9,226 4,231 3,393 7,735 3,370 11,132 3,081 6,010 4,141 9,697 5,576 3,485 9,444 7,903 9,008 1,505 2,151 3,656 6,290 3,095 0,538 9,524

Tân Biên TPD3a TPD3b 8,703 11,243 9,247 12,477 15,127 7,100 5,247 8,097 2,842 3,113 0,166 3,819 4,337 2,459 3,529 8,290 4,188 4,878 8,455 5,282 10,738 8,200 8,726 3,686 8,040 11,360 11,959 3,233 4,380 4,274 8,374 4,080 3,117 10,041 9,581 9,729

TPD4b TAB01 TAB1b TAB3b TAB4a TAB5c TAB5d 3,900 10,897 11,923 8,608 6,692 6,203 13,249 3,150 11,667 11,313 7,510 6,970 4,547 8,827 2,990 9,464 9,583 17,222 7,440 4,573 13,889 3,890 9,225 7,312 8,413 5,699 2,143 8,095

Tân Châu

TCD1a TCD2b TCD4a TAC1 TAC1c TAC3b TAC4a TAC4b 1,277 3,747 2,617 4,436 4,008 10,042 5,564 6,077 6,750 6,713 7,957 3,434 4,342 9,321 10,808 3,939 8,580 8,770 8,613 3,631 8,547 7,821 6,369 4,405 4,820 7,290 7,380 0,269 3,135 7,143 5,484 0,484

Trảng Bàng

TBD2b TBD2e TRB1a TRB1b TRB1d TRB2 TRB3 TRB4d 0,383 0,750 6,897 8,590 9,198 12,490 5,154 8,538 6,513 5,807 6,667 11,263 7,469 7,757 7,424 6,263 3,753 2,347 7,440 8,512 11,838 11,838 5,595 4,940 0,730 0,463 4,462 2,097 8,016 6,944 2,957 4,731 3,483 10,313 10,033 10,438 6,700 4,366 11,015 5,357 6,630 6,642 2,943 5,008 8,582 7,056 3,726 2,845 2,342 6,367 7,615 9,130 9,757 5,283 6,118

+ tổng hợp được của 44 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía cho

Số liệu trình bày trong bảng là bình quân của 3 lần lặp. Kiểm định kết quả qua phân tích phương sai một nhân tố, và trắc nghiệm phân hạng theo phương pháp Duncan ở độ tin cậy 95% theo từng nhóm thí nghiệm.

Phụ lục 4.5: Lượng NH4 kết quả tốt

Lượng NH4 Nguồn gốc Tên dòng Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8

BR3d 0,007 0,261 0,104 0,183

+ (mg /L) Trung bình 0,139

Bến Cầu

BR1c BR1b BR3e BR1e BCR5a CR3a 0,006 0,075 0,120 0,059 0,517 0,621 0,330 0,125 0,334 0,272 4,953 2,419 0,147 0,181 0,146 0,124 1,432 0,838 0,148 0,498 0,025 0,072 0,133 0,311 0,104 0,027 0,105 0,093 0,123 0,000 ChâuThành

CR2e CT4b CR4e 0,209 0,762 0,872 2,087 2,535 2,499 0,659 0,902 0,977 0,341 0,309 0,537 0,000 0,000 0,000

CT3d CT4bd CTR4b

0,258 0,323 0,307 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,050 0,083 0,258 0,475 0,359 1,442 0,372 0,423 0,393 0,352 0,722 0,406 0,159 0,155 0,393 0,437 0,116 0,255 0,142 0,175 0,051 0,388 0,313 0,433 0,640 0,210 1,155 1,940 1,647 0,126 0,803 0,102 0,136 0,184 1,304 1,316 0,893 0,896 0,638 1,308 0,399 1,327 1,195 0,262 0,284 0,169 0,454 0,159 1,385 0,978 0,378 0,111 0,248 0,137 0,043 0,503 0,509 0,678 0,469 0,618 3,578 6,783 4,880 0,234 2,538 0,146 0,221 0,303 4,953 4,803 2,494 2,280 0,944 2,990 0,662 2,987 3,943 0,015 0,080 0,039 0,047 0,094 4,353 2,617 0,005 0,003 0,039 0,189 0,054 0,873 1,216 1,356 0,253 0,766 0,000 0,000 0,000 0,232 0,670 0,223 0,224 0,238 0,213 0,227 0,000 0,000 0,000 0,000 0,022 1,067 0,000 0,290 0,185 0,169 0,166 0,289 0,010 0,000 1,365 0,182 0,779 0,182 0,065 0,000 0,000 0,000 0,459 0,572 0,782 0,653 1,400 0,037 0,002 0,037 0,100 0,193 - 0,150 0,821 0,829 1,247 0,801 0,539 0,830 0,443 0,392 0,149 0,060 1,442 0,098 0,783 0,857 0,025 0,003 0,031 0,002 0,002 0,749 0,508 0,923 0,522 0,923 Dương Minh Châu MT2a MT2b MR4a MR4c MR5a MCR1a MCR1b GR1c Gò Dầu GR1g GT3a GR3 GT2 GDT2b GDT4a ET1a Tân Biên ET2b ER4a ET5b ER5b TBR2c TBR3a AT1a Tân Châu AT1b AT2b AR2 AR3a TR3a Trảng Bàng TR2a TR3c TR2e TT1a

0,261 0,104 BR3d 0,007 0,183 0,139

Số liệu trình bày trong bảng là bình quân của 3 lần lặp. Kiểm định kết quả qua phân tích phương sai một nhân tố, và trắc nghiệm phân hạng theo phương pháp Duncan ở độ tin cậy 95% theo từng nhóm thí nghiệm.

Phụ lục 4.6: Lượng P2O5 tổng hợp được của 56 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía cho kết quả tốt

Nguồn gốc Tên dòng Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Ngày 20

Bến Cầu ChâuThành Dương Minh Châu BR1e BR2c BR3c BT1 BT3b BCR3a BCR5a CT1 CR4b CT3a CR4c CT3d CR3a CT3bd CT4bd CT1 Lượng P2O5 (mg /L) Trung bình 96,465 124,340 119,803 83,468 104,028 224,211 141,425 234,900 240,893 253,283 311,633 179,263 184,628 143,939 205,306 234,900 98,790 59,490 125,340 96,310 105,790 222,347 126,953 285,020 278,660 301,510 329,380 217,880 285,370 196,510 276,330 285,020 118,250 115,930 122,050 102,180 112,870 311,977 93,097 205,180 155,920 222,430 256,850 174,550 200,850 153,830 114,400 205,180 146,020 143,640 191,670 114,320 161,790 142,773 256,713 282,910 378,460 292,320 323,840 240,900 116,860 189,200 342,920 282,910 22,800 178,300 40,150 21,060 35,660 219,747 88,937 166,490 150,530 196,870 336,460 83,720 135,430 36,217 87,573 166,490

278,660 301,510 329,380 270,500 204,460 222,300 165,010 306,550 387,720 298,260 141,963 213,253 223,937 267,483 240,893 253,283 311,633 206,980 213,833 221,345 228,783 248,930 289,155 153,676 127,888 188,385 176,570 213,524 155,920 222,430 256,850 115,010 167,620 190,730 178,040 254,430 256,380 111,937 173,500 202,173 191,217 269,297 378,460 292,320 323,840 326,270 333,330 354,120 228,790 365,900 336,220 159,437 106,033 236,817 192,603 238,860 150,530 196,870 336,460 116,140 149,920 118,230 343,290 68,840 176,300 45,070 90,057 101,297 98,523 78,457

50,270 88,310 313,140 252,330 176,013

Gò Dầu Tân Biên Tân Châu CR4b CT3a CR4c GT3a GT1b GR1b GR1d GT1c GR1e GDT1b GDT2a GDT3b GDR3a GDT4a ET1b ET2a ER4b ER2a ET5c TPR4b TPT5b TPR5b AT1b 349,530 255,060 122,140 147,790 112,777 147,657 164,793 244,060 232,393 183,328 103,263 144,043 117,184 139,442 163,141 130,703 93,720 93,720 70,240 93,720 142,417 114,400 113,580 125,720 360,460 320,440 181,760 208,520 129,847 208,617 226,500 123,720 125,860 64,090 38,910 126,140 83,697 87,093 147,690 29,310

AT2b AT2c AR2 AR4b TCT1a TCR1b TCT2b TR2a TR1c TT2a TR2i TR2f TT1b TBR2c TBR3a TBT3d 77,190 222,800 107,160 53,980 148,767 87,573 87,093 114,490 219,140 169,650 244,910 145,290 289,390 93,097 91,283 106,163 76,040 124,440 105,600 125,720 113,580 114,400 114,400 143,980 163,240 207,660 209,190 179,760 222,580 210,887 308,787 228,907 152,910 145,800 145,330 145,800 251,193 342,920 208,617 356,860 280,440 330,190 251,070 376,270 312,120 279,680 339,710 214,713 213,460 178,880 402,300 219,780 188,450 276,330 147,657 266,900 247,050 206,020 274,780 286,930 299,920 120,750 310,063 221,390 129,900 167,980 190,098 136,320 175,498 205,306 139,442 220,558 227,468 228,380 244,988 247,063 281,003 176,103 262,461 192,793 Trảng Bàng

+ tổng hợp được của 36 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía cho

Số liệu trình bày trong bảng là bình quân của 3 lần lặp. Kiểm định kết quả qua phân tích phương sai một nhân tố, và trắc nghiệm phân hạng theo phương pháp Duncan ở độ tin cậy 95% theo từng nhóm thí nghiệm.

Phụ lục 4.7: Lượng NH4 kết quả tốt

Lượng NH4 Nguồn gốc Tên dòng Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8

+ (mg /L) Trung bình 5,836 5,218 5,749 6,349 6,057 5,149 5,079

Bến Cầu ChâuThành BR1c BR1d BR4b BR4c BR4d BR6b BR6c 8,471 8,394 9,701 7,609 8,563 6,552 9,085 10,833 8,598 9,183 14,256 10,178 11,410 7,564 2,321 1,865 2,127 1,804 2,018 1,972 2,052 1,719 2,013 1,983 1,728 3,468 0,661 1,615

5,001 5,739 5,353 5,714 5,981 6,240 7,326 7,796 5,049 5,087 6,124 5,884 8,161 6,877 8,864 10,514 10,984 7,084 12,250 12,700 12,574 5,566 5,748 9,940 9,038 10,769 0,319 4,312 2,936 6,130 7,888 3,074 0,844 4,668 3,786 5,380 1,635 2,489 8,060 4,006 5,946 3,756 4,080 3,790 2,882 0,391 2,978 2,978 1,171 2,820 4,167 4,023 4,057 7,988 5,086 11,620 3,896 9,722 11,984 5,236 BT3b BT4 ET3 ET5b ER5a AT1b Dương Minh Châu AT2a AT2b AT2c AT3 AR1 AR2

Gò Dầu Tân Biên Tân Châu Trảng Bàng AR3b TBR2c TBR3a TBT3d TPR5b BCR5a MCR1b MCT2a TCR1b GDR1a GDT1b GDT2a GDT2b GDR2a CT3bd CT4bd CTR4b 3,968 15,127 13,353 5,253 1,823 5,000 6,263 8,650 7,140 0,833 0,953 0,910 1,727 0,833 0,803 11,280 8,547 5,958 11,583 12,363 7,017 9,143 13,817 8,010 8,163 8,673 16,477 7,150 13,817 15,127 10,763 8,097 10,237 8,693 8,168 15,813 15,383 15,213 10,053 5,537 3,077 2,997 1,550 8,747 8,167 6,810 5,573 8,097 10,357 9,643 12,617 11,466 8,097 10,237 3,333 0,593 2,083 3,010 3,720 5,770 4,323 4,367 3,137 7,777 3,333 10,053 6,077 8,280 7,390 12,655 12,834 7,704 5,403 6,609 5,090 5,883 5,783 7,595 5,159 6,168 7,551 5,757 7,327 9,309 9,534

Số liệu trình bày trong bảng là bình quân của 3 lần lặp. Kiểm định kết quả qua phân tích phương sai một nhân tố, và trắc nghiệm phân hạng theo phương pháp Duncan ở độ tin cậy 95% theo từng nhóm thí nghiệm.

Phụ lục 4.8: Phân tích NOVA và trắc nghiệm Dumcan kết quả định lượng NH4

+, P2O5 và IAA của 30 dòng vi khuẩn đất vùng rễ tuyển chọn

ANOVA

df Mean Square

F

Sig.

Sum of Squares

38.951

1.343

636.404

.000

29

Between Groups

.127

60

.002

Dam

Within Groups

466.568

.000

Lan

28199.752 60.441

39.077 817792.802 3626.448 821419.251 715.743

89 29 60 89 29

24.681

115.088

.000

Total Between Groups Within Groups Total Between Groups

12.867

60

.214

IAA

Within Groups

728.610

89

Total

Homogeneous Subsets

Đạm

Duncan

treat N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

.0630 .0747 .1047 .1417 .1460

.1047 .1417 .1460 .1787

25 8 14 11 6 22 7

3 3 3 3 3 3 3

.1417 .1460 .1787 .2010

.1787 .2010

.2477 .2610 .2613

.2477 .2610 .2613 .3020

.2610 .2613 .3020 .3390

.3020 .3390 .3793

.3793 .4480

.6040 .6493

.6493 .6850

.786

1.222

1.3503 1.4230 1.423 1.437 1.439

1.5903

1.702

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

.8593 .8593 .9053

.9983

2.283 2.454 1.000 1.000 1.000 1.000

.051

.075

.155

.052

.193

.061

.055

.072

.232

.345

.055

.225 1.000 1.000

.057

.691

19 17 15 21 1 27 26 2 24 4 5 23 16 3 18 29 13 10 30 28 9 12 20 Sig.

CV% = 5,85

Lân

Duncan

treat N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

44.7827 51.5750 52.8600 55.4900 55.4900

67.4003 67.4003 70.0750 71.0227 75.6230

103.6233 110.1000 110.1000 111.4113 111.4113 114.5500 114.5500 114.9433 114.9433

123.2000 123.2000 132.3170

204.6780 205.6703

18 5 19 12 16 10 7 11 13 9 15 17 29 3 6 2 1 8 4 26 27

3 17.6300 3 26.0530 26.0530 3 26.8677 26.8677 3 31.4683 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

207.1100

3

24

212.2230

3

25

3

30

207.110 0 212.223 0 219.612 5

3

28

219.612 5 228.200 0

259.4300 265.1000

14 20

3 3

3

23

286.527 0

3

21

3

22

Sig.

.175

.427

.129

.065

.245

.117

.069

.156

.286

.067

.181

.375

1.000

337.835 0 344.688 0 .285

CV% = 5,59 Duncan IAA

treat N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

5.6580 6.1180 6.1180

6.5273 6.5273 6.6300 6.6300

7.0560 7.0560

3 2.3420 3 3.0103 3.0103 3 3.1130 3.1130 3.2113 3 3.5293 3.5293 3 3.8187 3.8187 3.8187 3 4.0800 4.0800 3 4.1880 4.1880 3 4.3803 3 3 3 3 3 3 3

7.6150 7.6150

28 1 4 2 8 6 17 13 15 3 27 29 23 22 24

8.0397 8.0397 8.0673 8.0673 8.2000 8.2000 8.2740 8.2740 8.2900 8.2900 8.4550 8.4550 8.4550 8.5820 8.5820

12 5 11 16 7 9 21 25 20 26

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

9.1303 9.1303

9.7290 9.7290 9.7570 9.7570

3

10.3130

18

10.313 0

10.7377 11.0150

10 19

3 3

3

14

3

30

11.959 3 12.141 0 .633

Sig.

.058

.060

.117

.182

.229

.207

.193

.145

.058

.224

.096

.123

.150

.084

CV% = 6,49

+, P2O5 và IAA của 36 dòng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn

Phân tích NOVA và trắc nghiệm Dumcan kết quả định lượng NH4

ANOVA

Sum of Squares

df Mean Square

F

Sig.

Between Groups

20.250

35

.579 621.501

.000

dam

Within Groups

.067

72

.001

12231.897 512.015

.000

428116.407 1720.061

lan

Total Between Groups Within Groups Total Between Groups

20.317 107 35 72 429836.468 107 35

1271.494

23.890 36.328 347.868

.000

iaa

Within Groups

7.519

72

.104

Total

1279.014 107

Homogeneous Subsets

Đạm

Duncan

rep

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

.07610 .10267 .10826 .12433

.10267 .10826 .12433 .13600

.12433 .13600 .16533 .16900 .17027

21 12 1 2 13 22 23 10 26

3 3 3 3 3 3 3 3 3

.16533 .16900 .17027 .19800

.19800

.24500 .24800

.24500 .24800 .25300 .26095 .29467

.29467 .33133

24 25 27 3 11 30

3 3 3 3 3 3

16

3

36

3

.46900 .46998 .48633 .50300 .50867

.60967 .61700 .61800

32 5 28 33 31 18 15 29

.39 867 .40 300

3 3 3 3 3 3 3 3

.63833

17

3

34

3

.638 33 .678 00

19

3

8

3

.896 33 .902 33

.97700 .97800 .97858

6 35 7

3 3 3

3

14

3

20

1.303 87 1.308 00

1.43153

4

3

3

9

Sig.

.080

.229

.105

.239

.061

.079

.145

.162

.302

.116

.810

.953

.869

1.000

.86 2

1.94 030 1.00 0

CV% = 5,49

Lân

Duncan

rep

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

28.35750

51.54250

68.84100 69.83300 70.84467 71.14300 72.92600

83.46747

96.47

3 16.42753 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

111.489 114.247 114.361 116.121

114.24 114.36 116.121

11 10 13 32 6 12 24 8 1 2 33 14 16 29

117.18 117.45

117.184 117.45 121.11

129.90 130.833 136.32 136.32 137.455 137.455

140.15 140.15000 141.425 141.42533 147.02587

175.50 176.01 181.33 182.32

203.95 205.31 205.31 206.98

220.558 224.211

262.46

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

1.000 1.000

1.000

1.000

1.000

.371

.199

.138

.087

.251

.108

.123

.497

.363

289.16 1.000 1.000

36 22 18 25 5 26 23 19 4 7 27 21 34 20 30 9 28 17 31 3 35 15 Sig.

CV% = 3,56

IAA

Duncan

Subset for alpha = 0.05

rep

N

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

.00767 .38300 .51400 .53500 .53667 .54200

.38300 .51400 .53500 .53667 .54200 .77000 .80600

.77000 .80600 .80600 1.15667 1.15667 1.15667 1.35467 1.35467

1.57400 1.57

1.93 1.93 2.29

2.86 3.09 3.09 3.18 3.18 3.18

3.45 3.45 3.449 3.66 3.663 3.898 3.918

4.49 4.59 4.594 4.76 4.756 5.079

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

5.631

6 13 19 10 11 12 31 8 16 34 17 14 29 3 21 26 23 24 25 36 2 1 27 7 18

5.676 5.783

6.609 7.056 7.056

7.383 7.383 7.615

9.31 9.76

10.41

12.14

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

12.8 .094 1.000 1.000 1.000

.079

.173

.171

.052

.140

.184

.179

.250

.203

.089

.109

.338

.086

.593

.095

.219

.382

20 28 4 30 22 32 9 15 33 5 35 Sig.

CV% = 7,

Phụ lục 4.9: Các dòng vi khuẩn có khả năng sản xuất siderophore

Huyện Vi khuẩn Số lượng dòng Tên dòng

Bến Cầu Đất vùng rễ

11 BCA06, BCA07, BCA28, BCA29, BCA30, BCA35, BCA38, BCA39, BCA44, BCA48, BCA51

Nội sinh 8 BR1a, BR1b, BR1e, BR6b, BR6C

BT1, BT3a, BT3b

Châu Thành Đất vùng rễ 6 CTH1c, CTH1d, CTH2c, CTH3b,

CTH4c

Nội sinh 8 CR2a, CR2b, CR3a, CR4e, CT1,

CT2c, CT3b, CT3c

Đất vùng rễ

6 DMC1b, DMC3a, DMC3b, DMC3c, DMC5d, DMC5e

Dương Minh Châu Gò Dầu Nội sinh Đất vùng rễ 1 MCT1b 6 GOD2b, GOD1b, GOD1e, GOD2c,

GOD1d, GOD3a,

Nội sinh 5 GR1e, GT1b, GT1c, GT1d, GT1a

Phụ lục 4.10: Phân tích ANOVA và trắc nghiệm Duncan ảnh hưởng BA lên sự tạo chồi, mẫu cấy đỉnh sinh trưởng mía VN85 – 1859 in vitro

Descriptives

N

Mean

Minimum Maximum

Std. Error

Std. Deviation

95% Confidence Interval for Mean

Lower Bound

Upper Bound

1

3

3.0000

.00000

.00000

3.0000

3.0000

3.00

3.00

2

3

24.3333

1.52753

.88192

20.5388

28.1279

23.00

26.00

3

3

16.3333

1.15470

.66667

13.4649

19.2018

15.00

17.00

Số mẫu tạo chồi

4

3

19.6667

2.08167

1.20185

14.4955

24.8378

18.00

22.00

Số chồi

Total 1 2 3 4 Total 1

12 3 3 3 3 12 3

15.8333 1.0000 2.9467 2.0000 2.3267 2.0683 .0133

8.37565 .00000 .30353 .00000 .19655 .75161 .00577

2.41784 .00000 .17525 .00000 .11348 .21697 .00333

10.5117 1.0000 2.1926 2.0000 1.8384 1.5908 -.0010

21.1550 1.0000 3.7007 2.0000 2.8149 2.5459 .0277

3.00 1.00 2.62 2.00 2.10 1.00 .01

26.00 1.00 3.22 2.00 2.45 3.22 .02

2

3

1.8733

.04933

.02848

1.7508

1.9959

1.84

1.93

3

3

.4800

.05000

.02887

.3558

.6042

.43

.53

Chiều cao chồi

4

3

.5767

.07095

.04096

.4004

.7529

.50

.64

.7358

.72238

.20853

.2769

1.1948

.01

1.93

Total

12

ANOVA

Sum of Squares

df

Mean Square

F

Sig.

755.667

3

125.944

.000

Between Groups

16.000

8

Within Groups

251.889 2.000

Số ,ẫu tạo chồi

771.667

Total

5.953

11 3

60.695

.000

Between Groups

.262

Within Groups

Số chồi

6.214

Total

1.984 .033

5.720

8 11 3

1.907

762.679

.000

Between Groups

.020

8

Within Groups

.002

Chiều cao chồi

5.740

Total

11

Số mẫu tạo chồi

Duncan

NT

N

Subset for alpha = 0.05

2

3

4

1

1 3.0000

3

16.3333

4

19.6667

2

24.3333

3 3 3 3

Sig.

1.000

1.000

1.000

1.000

CV = 11.99

Số chồi

Duncan

NT

N

Subset for alpha = 0.05

2

3

1

1 1.0000

3

4

2.0000 2.3267

2

2.9467

3 3 3 3

Sig.

1.000

1.000

.058

CV = 11.987

Chiều cao chồi

Duncan

NT

N

Subset for alpha = 0.05

2

3

4

1

1 .0133

3

.4800

4

.5767

2

1.8733

3 3 3 3

Sig.

1.000

1.000

1.000

1.000

CV = 6,8

Phục lục 4.11: Phân tích ANOVA và trắc nghiệm Duncan ảnh hưởng BA lên sự tạo chồi, mẫu cấy đỉnh sinh trưởng mía VN85 – 1859 in vitro

ANOVA

df

F

Sig.

Sum of Squares

Mean Square

492.519

8

61.565

79.155

.000

Between Groups

14.000

18

.778

Within Groups

Số mẫu tạo chồi

78.144

.000

Số chồi

1.657 .021

506.519 13.258 .382 13.640 23.456

26 8 18 26 8

2.932

769.338

.000

Total Between Groups Within Groups Total Between Groups

.069

18

.004

Within Groups

Chiều cao chồi

23.525

26

Total

Số mẫu tạo chồi

Duncan

NT

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

22.3333

24.6667 25.0000 25.3333 25.6667

NT9 NT2 NT8 NT1 NT4 NT7

3 13.3333 3 3 3 3 3

3

NT5

3

NT3

3

NT6

27.33 33 28.00 00 28.00 00 .393

Sig.

1.000

1.000

.218

Số chồi

Duncan

NT

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

1.8500

2.2233 2.4000

3 1.2967 3 3 3 3

2.4000 2.4967

NT9 NT2 NT4 NT1 NT8

2.5833 2.6400

3.3600

3 3 3 3

3.8033 1.000

1.000

1.000

.155

.079

1.000

NT5 NT7 NT3 NT6 Sig.

Chiều cao chồi

Duncan

NT

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

8

.4500

1.3167

1.4433

1.6800 1.7133

1.8267

2.4267

2.7200

3 3 3 3 3 3 3 3 3

NT9 NT2 NT4 NT8 NT7 NT1 NT5 NT3 NT6 Sig.

1.000

1.000

1.000

.517

1.000

1.000

1.000

3.9367 1.000

Phụ lục 4.12: Ảnh hưởng của nồng độ NAA lên tạo rễ cây mía con giống VN85 – 1859 in vitro

Descriptives

N

Mean

Std. Deviation

Std. Error

95% Confidence Interval for Mean

Minimu m

Maximu m

Lower Bound

Upper Bound

12.4667

1.01943

.58857

9.9343

14.9991

11.33

13.30

3

NT1

9.7533

.43547

.25142

8.6716

10.8351

10.20

9.33

3

NT2

9.6933

.12097

.06984

9.3928

9.9938

9.83

9.60

3

NT3

9.1133

.41789

.24127

8.0752

10.1514

9.50

8.67

3

NT4

Chiều cao thân

8.4667

.40723

.23511

7.4551

9.4783

8.75

8.00

3

NT5

7.8100

.34220

.19757

6.9599

8.6601

8.20

7.56

3

NT6

Số rễ

9.5506 6.3333 4.3500 4.3333 4.4833 3.6667 3.9433 4.5183 .5500

1.57712 .66501 .15000 .35119 .12583 .28868 .41789 .93826 .05000

.37173 .38394 .08660 .20276 .07265 .16667 .24127 .22115 .02887

8.7663 4.6814 3.9774 3.4609 4.1708 2.9496 2.9052 4.0517 .4258

10.3348 7.9853 4.7226 5.2057 4.7959 4.3838 4.9814 4.9849 .6742

13.30 7.00 4.50 4.70 4.60 4.00 4.33 7.00 .60

7.56 5.67 4.20 4.00 4.35 3.50 3.50 3.50 .50

18 3 3 3 3 3 3 18 3

Total NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Total NT1

.4800

.05292

.03055

.3486

.6114

.52

.42

3

NT2

Chiều dài rễ

.4333

.01528

.00882

.3954

.4713

.45

.42

3

NT3

.3333

.01528

.00882

.2954

.3713

.35

.32

3

NT4

NT5

3

.3367

.01528

.00882

.2987

.3746

.32

.35

NT6

3

.2300

.01000

.00577

.2052

.2548

.22

.24

Total

18

.3939

.11210

.02642

.3381

.4496

.22

.60

ANOVA

df

F

Sig.

Sum of Squares

Mean Square

Between Groups

38.882

7.776 27.429

.000

5

Within Groups

3.402

12

.284

Chiều cao than

.000

Số rễ

Total Between Groups Within Groups Total Between Groups

42.284 13.242 1.724 14.966 .201

17 5 12 17 5

2.648 18.437 .144 .040 39.625

.000

Within Groups

.012

12

.001

Chiều dải rễ

Total

.214

17

Chiều cao thân

Duncan

NT

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

7.8100 8.4667

8.4667 9.1133

9.1133 9.6933 9.7533

3 3 3 3 3 3

NT6 NT5 NT4 NT3 NT2 NT1 Sig.

.157

.163

.186

12.4667 1.000

Số rễ

Duncan

NT

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

3.6667 3.9433 4.3333 4.3500

3.9433 4.3333 4.3500 4.4833

3 3 3 3 3 3

NT5 NT6 NT3 NT2 NT4 NT1 Sig.

.063

.131

6.3333 1.000

Chiều dài rễ

Duncan

NT

N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

.2300

.3333 .3367

.4333 .4800

3 3 3 3 3 3

NT6 NT4 NT5 NT3 NT2 NT1 Sig.

1.000

.900

.098

.5500 1.000

Phụ lục 4.13: Phân tích số liệu thống kê tác động thúc đẩy sinh trưởng của 12 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tuyển chọn lên sinh trưởng của cây mía con in vitro giống VN85 – 1859 trồng trong bình Leonard

ANOVA

of

df

F

Sig.

Sum Squares

Mean Square

109.228

37.286

.000

1310.731

12

Between Groups

Root

Within Groups

114.250

39

2.929

1424.981

51

6936.442

12

578.037 122.594

.000

Stem

183.888 7120.330

39 51

4.715

59.577

12

4.965

17.211

.000

Leave

11.250 70.827

39 51

.288

6.784

12

.565 208.681

.000

Romass

.106 6.889

39 51

.003

.741

12

.062

71.929

.000

Stmass

.034 .775

39 51

.001

3.880

12

.323

84.795

.000

Lemass

Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups

.149

39

.004

4.029

51

2.108 233.082

.000

25.300

12

Tomass

.009

.353 25.653

39 51

.037 172.018

.000

.439

12

Drromass

.000

.008 .448

39 51

.009 168.710

.000

.105

12

Drstmass

.000

.002 .107

39 51

.012

61.862

.000

.148

12

Drlmass

.000

.008 .156

39 51

.140 224.148

.000

1.681

12

Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups

Todrmass

.001

.024

39

Within Groups

1.705

51

Total

Root Duncan

Bac N

Subset for alpha = 0.05

3

4

5

6

1

2

9.5000

13.5000 14.2500

17.2500 18.5000 18.7500 19.2500

19.2500 21.5000 21.7500

21.5000 21.7500 22.5000 23.2500 24.0000

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

V8 V0 V2 V1 V4 V3 V7 V10 V6 V5 V11 V12 V9 Sig.

1.000

.539

.139

.057

.071

29.7500 1.000

CV (%): 9.77

Stem Duncan

Vac N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

4

V8

4

V7

21.500 0 24.250 0

34.0000 35.2500

39.2500

46.0000 47.0000 48.5000

51.7500 53.0000 54.3750

53.0000 54.3750 55.5000

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

V0 V2 V10 V11 V3 V6 V4 V5 V1 V9 V12 Sig.

.081

.421

1.000

.132

.114

.132

59.0000 1.000

CV (%): 4.96

Leave Duncan

Bac N

Subset for alpha = 0.05

6

1

2

3

4

5

5.5000 5.7500 5.7500 5.7500 5.7500 6.2500 6.2500 6.5000

6.2500 6.5000 6.7500 6.7500

6.7500 6.7500 7.5000 7.5000

7.5000 7.5000 8.0000 8.2500 8.2500

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

V0 V4 V12 V3 V8 V9 V11 V2 V7 V6 V1 V10 V5 Sig.

8.2500 8.2500 9.0000 .068

.077

.077

.238

.077

.084

CV (%): 7.61

Rootmass Duncan

Bac N Subset for alpha = 0.05

1

2

4

5

6

7

8

9

3

.2150 .2700

.3650 .4000 .4350

.4350 .4800 .5050

.8075

.8850 .9500

4 V0 4 V2 4 V5 4 V7 4 V8 V3 4 V10 4 4 V4 V1 4 V11 4 4 V6 4 V9

.2700 .3100

.3100 .3650

.6425

V12 4

.143

.284

.143

.079

.079

1.000

1.000

.085

Sig.

1.5 80 0 1.0 00

Cv (%): 8.62

Stemmass Duncan

Bac N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

.1125 .1425

.2775 .2850

.1425 .1600 .1750

.1750 .2050 .2175

.3350

.3800

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

V8 V0 V5 V2 V10 V7 V3 V1 V4 V6

.3850 .4000

4 4 4

.5350 1.000

.156

.146

.059

.719

1.000

.370

V11 V9 V12 Sig.

CV (%): 10.55

Leavemass Duncan

Bac N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

.0900 .1375 .1650 .1700

.1650 .1700 .2350

.3725 .3875

.7125 .7875

V0 V8 V5 V7 V2 V11 V10 V3 V6 V4 V12 V1 V9

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

.094

1.0150 1.000

.4825 .5525 .5750 .051

Sig.

.101

.138

.733

CV (%): 10.28 Biomass Duncan

Bac N

Subset for alpha = 0.05

4

5

6

7

8

1

2

3

.4475

.6350 .6500 .6800 .7525

1.7150

1.0725 1.1950

1.4150

1.5650

V0 V5 V8 V2 V7 V10 V3 V4 V11 V1

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

V6

4

1.8175

V9

4

2.365 0

V12

4

2.827 5 1.000 1.000

Sig.

1.000

.118

.076

1.000

1.000

.136

CV (%): 7.21

Drrootmass Duncan

Bac N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

8

.0600

4 4 4 4 4 4 4 4

V2 V5 V7 V8 V0 V10 V1 V3

.0325 .0350 .0375 .0375 .0400 .0400 .0475 .0475 .0600

4

V4

.0775 .0775 .0825 .0925

.0925

.1075

4 4 4 4

.2050

.2550

V11 V6 V9 V12 Sig.

.203

.051

.098

.178

.154

.3325 1.000 1.000 1.000

CV (%): 13.50

Drstemmass Duncan

Bac N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

8

.0125 .0175 .0175 .0225 .0225 .0225 .0225

.0625

.0250 .0250 .0350

.0775 .0825

.0350 .0450 .0450 .0500 .0500

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

.1900 .332 1.000

.362 1.000

.079

.188

.057

.057

V8 V5 V0 V2 V7 V10 V1 V3 V4 V11 V9 V6 V12 Sig.

CV (%): 13.53 Drleavemass Duncan

Bac N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

8

.0200 .0400

.0400 .0425 .0425

.0675

4 4 4 4 4

V8 V0 V5 V7 V2

4

V11

V10

4

.1200

.1275

.1275

4

V6

.1325

.1325

4

V4

.112 5 .120 0 .127 5 .132 5

.1400

.1400 .1475

4 4

V3 V1

.1700

4 4

.816 1.000

.1925 1.000 1.000

.052

.074

.074

.074

V9 V12 Sig.

CV (%): 13.57 drbiomass Duncan

Bac N

Subset for alpha = 0.05

1

2

3

4

5

6

7

.0725 .0950 .1050 .1100

.0950 .1050 .1100 .1225

.2150

.2700 .2725 .2750 .2825

.4150

.5025

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

.058

.164

1.000

.526 1.000

1.000

.7150 1.000

V8 V5 V7 V0 V2 V10 V1 V3 V4 V11 V6 V9 V12 Sig.

CV (%): 9.41

Phụ lục 4.14: Phân tích số liệu thống kê tác động thúc đẩy sinh trưởng của 02 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tuyển chọn và kiểu bón phân N, P lên sinh trưởng của cây mía giống K95-156 trồng trong châu. Năng suất thực tế ANOVA

Tabbular F

Sum of Squares

Mean Square

Computed F

Source of Variance

Degree of Freedom

0,05

0,01

145,91 3,260 5,410

3 4 12

0,00000001 0,000000003 0,00000086 0,000000215 0,00000002 0,000000001

19,78 3,490 5,960 23,56 1,975 2,610

Replication Main factor (A) Error (a) Subplot factor (B) A *B Error (b) Total

3 12 45 79

Sum

Variance 1,40758E-09 2,07358E-09 9,66667E-10 2,10917E-10 1,95533E-09 6,81558E-09 1,22092E-09 5,89167E-11 1,49692E-09 9,81583E-10 3,64467E-09 2,20225E-09 3,34E-09 3,29167E-11 2,5825E-10 1,046E-09 7,025E-11 1,29892E-09 1,00667E-10 1,31758E-09

0,00000009 0,000000029 0,00000041 0,000000034 0,00000007 0,000000001 0,00000144 CV(A)= 6,13; CV (B) = 6.08; CV(A*B) = 7.6 Trung bình toàn thể (Phân*Vi khuẩn) Groups Count Average 4 0,000939 0,000235 B0F0 4 0,002145 0,000536 B1F0 4 0,002624 0,000656 B2F0 4 0,002749 0,000687 B3F0 4 0,003036 0,000759 B0F1 4 0,002509 0,000627 B1F1 4 0,002641 B2F1 0,00066 4 0,002845 0,000711 B3F1 4 0,002591 0,000648 B0F2 4 0,002529 0,000632 B1F2 4 0,001836 0,000459 B2F2 4 0,002567 0,000642 B3F2 4 0,002204 0,000551 B0F3 0,00071 4 0,002839 B1F3 4 0,002919 B2F3 0,00073 4 0,001644 0,000411 B3F3 4 0,002527 0,000632 B0F4 4 0,002661 0,000665 B1F4 4 0,003176 0,000794 B2F4 4 0,003045 0,000761 B3F4 LSD = 5,42

Độ Brix ANOVA

Tabbular F

Source of Variance

Mean Square

Degree of Freedom

Sum of Squares

Computed F

0,05

0,01

Replication

3

0,22

0,07

5,11

3,260

5,410

8,28 5,85

3,490 1,975

5,960 2,610

Main factor (A) Error (a) Subplot factor (B) A *B Error (b)

4 12 3 12 45

9,93 5,83 10,44 29,53 18,91

2,48 0,49 3,48 2,46 0,42

Total

79

74,85

cv(A) = 4,43; CV (B) = 4,12; CV (A*B) = 5,15

Trung bình toàn thể (Phân*Vi khuẩn)

Average Variance Sum 14,815 0,318433 59,26 63,05 15,7625 0,395825 60,08 1,9158 15,02 61,89 15,4725 1,535625 62,7 15,675 0,448367 62,41 15,6025 0,009558 59,01 14,7525 0,378892 59,4 14,85 0,106933 68,89 17,2225 0,057292 58,01 14,5025 0,484892 68,08 0,1158 17,02 63,05 15,7625 0,393558 15,99 0,048267 63,96 60,58 15,145 0,316633 63,71 15,9275 0,367892 0,0606 16,14 64,56 65,64 16,41 0,163267 62,45 15,6125 0,327358 0,8648 17,37 69,48 61,45 15,3625 0,010358

Groups Count 4 B0F0 4 B1F0 4 B2F0 4 B3F0 4 B0F1 4 B1F1 4 B2F1 4 B3F1 4 B0F2 4 B1F2 4 B2F2 4 B3F2 4 B0F3 4 B1F3 4 B2F3 4 B3F3 4 B0F4 4 B1F4 4 B2F4 B3F4 4 LSD = 0,92

Chiều cao thân ANOVA

Tabbular F

Source of Variance

Mean Square

Degree of Freedom

Sum of Squares

Computed F

0,05

0,01

Replication

10,87

3,260

5,410

Main factor (A)

Error (a)

Subplot factor (B)

10,07 10,13

3,490 1,975

5,960 2,610

A *B

Error (b)

190,84 3 4.268,68 4 1.178,22 12 1.903,24 3 7.656,82 12 45 2.834,69 79 18.032,49

63,61 1.067,17 98,19 634,41 638,07 62,99

Total

cv(A)= 11,75; cv(B) = 9,41; cv (A*B) = 11,76

Sum

Average Variance 58,75 57,58333 87,5 19,66667 86,5 8,333333 84,5 37,66667 90,5 57,66667 80,25 18,25 71,25 30,91667 98,5 75,66667 73,25 162,9167 80,5 89,66667 70,25 252,9167 88,75 58,91667 71,75 74,91667 94 13,33333 87,25 60,91667 82 84,66667 36 76 80 12,66667 109,5 89,66667 116,25 158,9167

235 350 346 338 362 321 285 394 293 322 281 355 287 376 349 328 304 320 438 465

Trung bình toàn thể (phân * vi khuẩn) Groups Count 4 B0F0 4 B1F0 4 B2F0 4 B3F0 4 B0F1 4 B1F1 4 B2F1 4 B3F1 4 B0F2 4 B1F2 4 B2F2 4 B3F2 4 B0F3 4 B1F3 4 B2F3 4 B3F3 4 B0F4 4 B1F4 4 B2F4 4 B3F4 LSD = 11,30

Số lóng thân ANOVA

Tabbular F

Source of Variance

Mean Square

Degree of Freedom

Sum of Squares

Computed F

0,05

0,01

Replication

3

1,31

0,44

31,79

3,260

5,410

Main factor (A) Error (a)

4 12

70,54 6,66

17,64 0,55

19,86 5,68

3,490 1,975

5,960 2,610

Subplot factor (B) A *B Error (b)

3 12 45

22,71 26,01 17,16

7,57 2,17 0,38

Total

79

144,39

CV(A)= 6,50; CV(B) = 5,39; CV(A*B) = 6,73

Sum

11,5

12,25

Average Variance 9 0,666667 10,125 0,895833 10,125 0,229167 12,125 0,395833 11,875 0,395833 9,875 0,395833 11,875 0,395833 12,75 0,083333 0,5 11,125 0,229167 10 0,166667 0,25 11 0,333333 12,5 0,333333 12,5 0,166667 10,125 0,729167 12,375 0,229167 11,375 0,229167 13,5 0,166667 13,25 1,583333

36 40,5 40,5 48,5 47,5 39,5 47,5 51 46 44,5 40 49 44 50 50 40,5 49,5 45,5 54 53

Trung bình tổng thể (phân * vi khuẩn) Groups Count 4 B0F0 4 B1F0 4 B2F0 4 B3F0 4 B0F1 4 B1F1 4 B2F1 4 B3F1 4 B0F2 4 B1F2 4 B2F2 4 B3F2 4 B0F3 4 B1F3 4 B2F3 4 B3F3 4 B0F4 4 B1F4 4 B2F4 B3F4 4 LSD = 0,88

Đường kính thân ANOVA

Tabbular F

Source of Variance

Mean Square

Degree of Freedom

Sum of Squares

Computed F

0,05

0,01

Replication Main factor (A)

3 4

0,07 0,96

0,02 0,24

12,62

3,260

5,410

4,75 5,15

3,490 1,975

5,960 2,610

Error (a) Subplot factor (B) A *B Error (b)

12 3 12 45

0,23 0,22 0,95 0,69

0,02 0,07 0,08 0,02

Total

79

3,11

cv(A)= 6,01; cv(B) = 5,39; cv(A*B) = 6,74

Sum

2,5 2,375

Average Variance 1,9875 0,012292 2,4125 0,010625 2,175 0,004167 2,4 0,015 2,2 0,026667 2,2375 0,005625 2,325 0,009167 2,45 0,005 2,225 0,009167 2,5 0,026667 2,1 0,053333 2,1625 0,048958 2,125 0,004167 0,005 0,0025 2,2 0,053333 2,175 0,009167 2,225 0,009167 2,5375 0,012292 2,6 0,006667

7,95 9,65 8,7 9,6 8,8 8,95 9,3 9,8 8,9 10 8,4 8,65 8,5 10 9,5 8,8 8,7 8,9 10,15 10,4

Trung bình tổng thể (phân * vi khuẩn) Groups Count 4 B0F0 4 B1F0 4 B2F0 4 B3F0 4 B0F1 4 B1F1 4 B2F1 4 B3F1 4 B0F2 4 B1F2 4 B2F2 4 B3F2 4 B0F3 4 B1F3 4 B2F3 4 B3F3 4 B0F4 4 B1F4 4 B2F4 B3F4 4 LSD = 0,18

Hàm lượng Chlorophyll tổng ANOVA

Tabbular F

Source of Variance

Mean Square

Degree of Freedom

Computed F

Sum of Squares

0,05

0,01

0,03

3

0,09

Replication

19,92

3,260

5,410

3,68 6,12

3,490 1,975

5,960 2,610

1,49 0,07 0,38 0,63 0,10

4 12 3 12 45

5,95 0,90 1,13 7,51 4,60

Main factor (A) Error (a) Subplot factor (B) A *B Error (b)

79

20,18

Total

cv(A) = 6,50; cv(b) = 7,61; cv(a*b) = 9,51

Sum

16,7572

Average Variance 4 14,88531 3,721328 0,018242 4 15,01637 3,754093 0,041219 4 15,93585 3,983963 0,457083 4 15,87448 3,96862 0,093106 4 19,19001 4,797503 0,019189 4 14,46055 3,615137 0,067702 4 4,1893 0,075508 4 16,85291 4,213228 0,066703 4 19,14307 4,785768 0,019471 4 19,27824 4,81956 0,029093 4 15,45055 3,862637 0,323591 4 16,07918 4,019795 0,107476 4 15,59875 3,899687 0,020668 0,01987 4 16,86977 4,217442 4 18,60322 4,650805 0,062293 4 15,52588 3,88147 0,064284 4 14,77817 3,694543 0,008644 4 16,95309 4,238272 0,062067 4 19,35807 4,839518 0,028418 4,89636 0,280053 4 19,58544

Trung bình tổng thể (phân * vi khuẩn) Groups Count B0F0 B1F0 B2F0 B3F0 B0F1 B1F1 B2F1 B3F1 B0F2 B1F2 B2F2 B3F2 B0F3 B1F3 B2F3 B3F3 B0F4 B1F4 B2F4 B3F4 LSD = 0,46

Phụ lục 4.15: Phân tích số liệu thống kê tác động thúc đẩy sinh trưởng của 02 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tuyển chọn và kiểu bón phân N, P lên sinh trưởng của cây mía giống K95-156 trồng ngoài đồng Năng suất thực tế ANOVA

Tabbular F

Degree of Freedom

Source of Variance

Sum of Squares

Mean Square

Computed F

0,05

0,01

40,62

3,860

6,990

11,08 2,60

3,860 2,150

6,990 2,940

3 3 9 3 9 36 63

483,48 47.510,40 3.509,24 12.096,10 8.503,02 13.094,64 85.196,89

161,16 15.836,80 389,92 4.032,03 944,78 363,74

Replication Main factor (A) Error (a) Subplot factor (B) A *B Error (b) Total

Average

Variance

Sum

Count

196,4286 229,0952 229,7857 277,5 204,5476 243,2381 296,7619 276,5 206,6667 251,5714 258,2143 256,7857 230,4286 258,619 289,1429 294,5952

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

49,10714 57,27381 57,44643 69,375 51,1369 60,80952 74,19048 69,125 51,66667 62,89286 64,55357 64,19643 57,60714 64,65476 72,28571 73,64881

11,11206 7,174036 32,76809 4,388275 2,088955 4,442555 77,83296 72,7046 20,08428 5,172147 4,505811 5,660384 45,08144 6,617725 12,70824 10,54889

CV(A)= 7,52; CV(B)= 7,27 ; CV(A*B) = 11,35 Trung bình toàn thể (Phân*Vi khuẩn) Groups B0F0 B1F0 B2F0 B3F0 B0F1 B1F1 B2F1 B3F1 B0F2 B1F2 B2F2 B3F2 B0F3 B1F3 B2F3 B3F3 LSD = 27,35

Độ Brix ANOVA

Tabbular F

Degree of Freedom

Mean Square

Source of Variance

Sum of Squares

Computed F

0,05

0,01

75,49

3,860

6,990

3 3 9

1,54 78,60 3,12

0,51 26,20 0,35

8,53 1,84

3,860 2,150

6,990 2,940

3 9 36 63

14,60 9,46 20,53 127,86

4,87 1,05 0,57

Replication Main factor (A) Error (a) Subplot factor (B) A *B Error (b) Total

Average

Variance

Sum

Count

73,55 79,78 81,96 83,12 73,49 80,78 84,73 88,29 77,26 82,17 80,04 87,75 76,27 84,54 89,18 89,87

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

18,3875 19,945 20,49 20,78 18,3725 20,195 21,1825 22,0725 19,315 20,5425 20,01 21,9375 19,0675 21,135 22,295 22,4675

1,255358 0,3379 0,6538 0,3682 1,075825 0,608633 0,123092 0,192492 0,446767 0,075692 0,364867 0,184358 0,259692 0,6047 0,7187 1,129158

CV(A) = 2,87 CV(B) = 3,68; CV(A*B) = 0,057525587 Trung bình toàn thể (Phân*Vi khuẩn) Groups B0F0 B1F0 B2F0 B3F0 B0F1 B1F1 B2F1 B3F1 B0F2 B1F2 B2F2 B3F2 B0F3 B1F3 B2F3 B3F3 LSD = 1,08

Năng suất đường ANOVA

Tabbular F

Mean Square

Degree of Freedom

Source of Variance

Sum of Squares

Computed F

0,05

0,01

3 3

0,72 74,69

0,24 24,90

70,75

3,860

6,990

Replication Main factor (A)

9

3,17

0,35

29,52 4,07

3,860 2,150

6,990 2,940

3 9 36

17,91 7,40 7,28

5,97 0,82 0,20

Error (a) Subplot factor (B) A *B Error (b)

111,16

Total

63 CV(A) = 9,38; CV(B) = 7.11; CV (A*B) = 11,10

Trung bình tổng thể (phân bón * vi khuẩn) Count

Groups

Sum

Average

Variance

4 16,90371257

4,225928143 0,047496

B0F0

22,1097411 4 4 23,07287471

5,527435274 0,008396 5,768218679 0,609403

B1F0 B2F0

4 28,35458871 4 17,64980905

7,088647179 0,166035 0,15402 4,412452262

B3F0 B0F1

4 23,87504781 4 31,05600462

5,968761952 0,012722 7,764001155 0,624853

B1F1 B2F1

4 30,53012586 4 19,13036667

7,632531464 0,551889 4,782591667 0,285598

B3F1 B0F2

4 25,31007629 25,083411 4

6,327519071 0,095823 6,27085275 0,192413

B1F2 B2F2

4 28,20253043 4 20,89962643

7,050632607 0,156053 5,224906607 0,278171

B3F2 B0F3

4 26,99942848 4 32,42303743

6,749857119 0,076965 8,105759357 0,309777

B1F3 B2F3

4 33,32889938

8,332224845 0,151263

B3F3 LSD: 0,64

Chiều cao thân ANOVA

Tabbular F

Degree of Freedom

Mean Square

Computed F

Source of Variance

Sum of Squares

0,05

0,01

54,92

3,860

6,990

161,87 3.447,21 62,76

485,61 10.341,62 564,88

3 3 9

Replication Main factor (A) Error (a)

12,67 3,26

3,860 2,150

6,990 2,940

1.810,83 465,42 142,96

5.432,49 4.188,81 5.146,59

3 9 36

26.160,00

Subplot factor (B) A *B Error (b) Total

Average

Variance

Sum

181,3 206,4 209,15 235,3 189,55 222,2 223,85 234,45 204,6 203,65 202,5 211,2 212,65 214 241,55 247,55

176,12 65,68 51,77 21,58667 18,75667 216,5867 66,51667 173,6633 234,0533 109,7433 74,14667 459,3333 39,93 211,3867 59,58333 86,83667

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

725,2 825,6 836,6 941,2 758,2 888,8 895,4 937,8 818,4 814,6 810 844,8 850,6 856 966,2 990,2

63 CV(F)= 3,68; CV(B)= 5,56; CV(A*B)= 8,6896546 Trung bình toàn thể (phân * vi khuẩn) Count Groups B0F0 B1F0 B2F0 B3F0 B0F1 B1F1 B2F1 B3F1 B0F2 B1F2 B2F2 B3F2 B0F3 B1F3 B2F3 B3F3 LSD = 17,15

Số lóng thân ANOVA

Tabbular F

Mean Square Computed F

Degree of Freedom

Source of Variance

Sum of Squares

0,05

0,01

87,08

3,860

6,990

9,30 2,91

3,860 2,150

6,990 2,940

1,57 76,69 0,88 19,23 6,01 2,07

3 3 9 3 9 36 63

4,72 230,08 7,93 57,69 54,09 74,40 428,91

Replication Main factor (A) Error (a) Subplot factor (B) A *B Error (b) Total

Average

Variance

Sum

Count

17,8 23,55 24,125 24,75 22,45 24,55 25,8 27,1 22,65 25,55 24,15 25,8 21,6 23,1 26,825 27,025

1,546667 0,17 0,5025 0,916667 3,69 2,303333 1,146667 0,866667 5,103333 2,436667 1,103333 3,44 0,906667 1,72 3,015833 0,149167

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

71,2 94,2 96,5 99 89,8 98,2 103,2 108,4 90,6 102,2 96,6 103,2 86,4 92,4 107,3 108,1

CV(A) = 3,88; CV(B) = 5,95; CV (A*B) = 9,29 Trung bình tổng thể (phân * vi khuẩn) Groups B0F0 B1F0 B2F0 B3F0 B0F1 B1F1 B2F1 B3F1 B0F2 B1F2 B2F2 B3F2 B0F3 B1F3 B2F3 B3F3 LSD = 2,06

Hàm lượng Chlorophyll tổng ANOVA

Tabbular F

Computed F

Degree of Freedom

Source of Variance

Sum of Squares

Mean Square

0,05

0,01

84,60

3,860 6,990

3 3 9

0,26 14,06 0,50

0,09 4,69 0,06

14,23 3,74

3,860 6,990 2,150 2,940

3 9 36

1,84 1,45 1,56

0,61 0,16 0,04

63

19,67

Replication Main factor (A) Error (a) Subplot factor (B) A *B Error (b) Total

Sum

Count

Average

Variance

14,24319 16,03605 16,80675 20,28217 14,69344 15,38301 17,45931 20,28277 14,31679 16,91998 17,08906 18,73752 16,03175 17,15992 20,19709 20,26933

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

3,560797 4,009013 4,201688 5,070543 3,67336 3,845752 4,364828 5,070693 3,579197 4,229995 4,272265 4,68438 4,007937 4,28998 5,049272 5,067333

0,003862 0,01556 0,008327 0,030401 0,115684 0,165628 0,071841 0,033339 0,040296 0,023796 0,064977 0,085805 0,027538 0,015438 0,054731 0,015475

CV(F) = 5,46; CV(B)= 4,82; CV (A*B) = 7,53 Trung bình tổng thể (phân * vi khuẩn) Groups B0F0 B1F0 B2F0 B3F0 B0F1 B1F1 B2F1 B3F1 B0F2 B1F2 B2F2 B3F2 B0F3 B1F3 B2F3 B3F3 LSD = 0,298

D. Phụ lục về Địa điểm thu mẫu đất

TT Huyện

Xã

Ấp

Số mẫu

Tổng số mẫu thu

Số ruộng mía thu mẫu

Trảng Bàng

4

Gia Bình Gia Lộc Lộc Hưng Hưng Thuận

Phước Hậu Lộc Trát Lộc Hòa Tân Thuận

1 1 1 1

1 1 1 1

Châu Thành

8

An Bình a An Binh b Hảo Đước a Hảo Đước b An Cơ a An Cơ b Đồng Khởi a Đồng Khởi b

An Điền Cây Xiêng Bàu Sen Trường An Lộc Vịnh Tua Hai Chòm Dừa

1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1

Gò Dầu

6

Phước Hội Cây Đa

Phước Thạnh Hiệp Thạnh Phước Trạch a Cây Nính Phước Trạch b Báu Vững Xóm Đồng Thanh Phước Suối Cao Phước Đông

1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1

Bến cầu

6

An Thạnh Lợi Thuận Long Giang Long Phước a Long Phước b Long Chữ

Chánh Bến Cầy Tây Long Tân Phước Trung Phước Đông Long Hòa 1

1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1

Dương Minh Châu

9

Thuận Hòa Thuận Phước Bàu Dải Bình Linh Ninh Hưng 2 Phước Tân Phước Long

Truông Mít a Truông Mít b Phước Ninh Chà Là a Chà Là b Phan a Phan b Phước Minh a Ấp 4 Phước Minh b

Phước Lộc A

1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1

Tân Châu

3

Thạnh Đông Tân Hưng Tân Phú

Thạnh Hưng Tân Tây Tân Xuân

1 1 1

1 1 1

Tân Biên

5

Trà Vong Mỏ Công Tân Phong Thạnh Bình a Thạnh Bình b

Suối Ông Đình Gò Đá Xóm Mới Thạnh An Thạnh lợi

Tổng cộng

1 1 1 1 1 41

1 1 1 1 1 41

41

E. Phụ lục hình ảnh thí nghiệm

Hình ảnh trồng cây trong bình Leonard cải tiến

Một tuần sau khi trồng

3 tuần sau khi trồng

Hai tháng sau khi trồng

Khác biệt giữa các nghiệm thức sử dụng dòng vi khuẩn khác nhau

Hình ảnh trồng cây trong chậu và ngoài đồng

Một góc khu thí nghiệm chậu

Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn CT4bd (B1), TPD3b (B2) lên cây mía sau 3 tháng trồng

Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn CT4bd (B1), TPD3b (B2) lên cây mía sau 6 tháng trồng

Tạo luống và phân lô

Ngâm hom mía với dịch khuẩn

Đặt hom mía

Một góc đồng mía thực nghiệm, 1 tháng sau gieo trồng

Một số nghiệm thức, 1 tháng sau gieo trồng

Một góc đồng mía thực nghiệm, 12 tháng sau gieo trồng

Các dụng cụ đo đường kính và độ Brix (A) thước kẹp, (B) Brix kế; (C) Dụng cụ lấy nước đường

Một số khâu đo đạc các chỉ tiêu (A) Đo đường kính thân, (B) Thao tác lấy nước mía, (C) Kết quả đo Brix (%), (D) Đo chiều cao thân mía

F. Phụ lục trình tự 16S rDNA của các dòng đã định danh

Trình tự vi khuẩn đất vùng rễ cây mía và các chủng tương đồng sau khi sắp gióng bằng phần mềm MEGA X

>FJ233846.1 Herbaspirillum sp. SC-N056 16S ribosomal RNA gene partial sequence -------------------------------------TGGCGGATGCCTT-ACC-ATGCAAGTCG--AACGGCAGCATA-- GGAGCTTGCTCC-----TG-ATG-GCGAGTGGCGAACGGCTGTGTAATATATCGG----AA- CGTGCCCTAGAGTG--GGGGATAACTAGTCGAAA---GACTAGCTAAT--ACC------------------ GCATACGATCTACGGATGAAAGTGGGGGATCGCAAGACCTCATGCTCC--TGGAGCGG-- CCGATATCTGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAAG-CCTACCAA- GGCAACGATCAGTAGCTGGTCT-GAGAGGACGACCAG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGG TTGTAAAGCTCTTTTGTCAGGGAAGAAACGGTAGTAGCTAATATCTACTACTAAT- GACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGG TGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTGTGTAAGTCAGATG TGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGAGACTGCACGGCTAGAGTGTGTCAGAG GGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCCCCTGGGATAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCTACTAG-TTGTC--GGGT-CTTAAT- TGACTTGGTAACGCAGCTAACGCGTGAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGA-- CCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG- AAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGATGG- AATCCCGAAGAGATTTGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCATCACACAGGTGCTGCATGGCTGTC GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTT GCTACGAAA-------GGGCACTCT-AATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGT- ACATACAGAGGGCCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAGTGTATCGTAGTCCG GATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAAGG CGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGACAGACCATGGG- AGCGGGTTTTACCA-GAAGTGGGTAGCCTAACCGCAAGG----------------------- AGGGCGCTCA------------------------------------------------------------------------------ >TRB1b_Acinetobacter_sp._B1_TP1b --------------------------------------------------ACAC-ATGCAAGTCG--AGCGGG-------- GAAGGTTGCTTCGGTAACTGAC---CTAGCGGCGGACGGGTGAYTAATGCTTAGG----AA- TCTGCCATTTAGTG--GGGGACAACATTCCGAAA---GGAATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--ATGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGGACAATGGGCGGAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTCTCTTAGTTAATACCTAAGATGAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGC GTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTTTTAAGTCGGATGTGAAATCC CCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGGAAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAG AATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT-GGAGGAATACCGATGGCG-

AAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGKGAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCCGTT-GGGGC-CTTTGA- GGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CTGTCGCAAGACTAAAAC------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ CATCAT------------------------------------------------------------------------------------------------------ --------------------------AATTGGAAT---------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------- >CHT4e_Acinetobacter sp._B2_CP4e ---------------------------------------------GGCTTACAC-ATGCAAGTCG--AGCGGAGAGAG--- GTAGCTTGCTAC-----TGATC---TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGG----AA- TCTGCCTATTAGTG--GGGGACAACATCTCGAAA---GGGATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--TAGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCG TTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCC CGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGAGGATGGTAGA ATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG-CCGTTGGGGGC-CCTTGA- GGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTACGACCG-CCTGGTGCAGATACCGCTCGCC----- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------- >CHT4c_Acinetobacter sp._B3_CP4c -----------------------------------------------------C-ATGC-AGTCG--AGCGGAGAGAG--- GTAGCTTGCTAC-----TGATC---TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGG----AA- TCTGCCTATTAGTG--GGGGACAACATCTCGAAA---GGGATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--TAGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCG TTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCC CGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGAGGATGGTAGA

ATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT- GGAGGAATACCGATGGCGAAAGGCAGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAG CATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG- CCGTTTGGGGC-CTTTGA--GCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTA-GACCGTCCTGATG- -AGTACCGGGCGCA-GACTAAAACTTCA--------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------- >BC12_Herbaspirillium_robiniae_V4 ---------------------------------------AAGGGCGCCTTAACC-ATGCAAGTCG--AACGGCAGCATA-- GGAGCTTGCTCC-----TGTATGTGCTAGTGGCGAACGGGTGAGTAATATATCGG----AA- CGTGCCCTAGAGTG--GGGGATAACTAGTCGAAA---GACTATCTAAT--ACC------------------ GCATACGATCTACGGATNAAAGTGGGGGATCGCAAGACCTCATGCTCC--TGGAGCGG-- CCGATATCTGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAAG-CCTACCAA- GGCAACGATCAGTAGCTGGTCT-GAGAGGACGACCAG-CCACACTGGGAC-TGACACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TTTTGGACAATGGGGGCAACCGTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGG TTGTAAAGCTCTTTTGTCAGGGAAGAAACGGTAGTAGCTAATATCTACTACTAAT- GACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGG TGCACGCGTTAATCAGACTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTGTGTAAGTCAGATG TGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGAGACTGCACGGCTAGAGTGTGTCAGAG GGGGGTAGAATTCCACGTGTATCAGTGAAATGCGTATATATGT-GGAGGAATACCGATGGCG- AACGCAGCCCCCTGGCATAACACTGACGCTCATGCACGAGAGCGTGGGGAGCACACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCGCTACACGATGTCTACTAG-TTGTC--GGGT-CTTAGT- TGACTTGGTAACGCACCTAACGCGTGAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGATTAAGACTCAAANGAATTGACGGGGA-- CCCGCACAAGCGGTGCATGATGTGGATTAATTCTATGCATCGCG- TACAACCTTACCTACCCTTGACATGGATGGCATCCCANCATAGATTTGGGAGTGCTCTAAAGA GAACCATCACACGGGTGCTGCATGGGTGTCGTCAGCTCGTGTCGAGAGATGTTGGGTTAAAT CCCGCAACGAGCGCA--CCNTTGTCATANTTGCTACGAAA-------GGGCCCTCT-- ATGATACTGCC-GTGACAACC--GGAGCAGGT-GGGGATGACGTCAAGTCCTCATG- CCCTTAAGGGTAGGGCTC------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------- >BC37_Bacillus_sutilis_V1 ------------------------------------AAGAAGGGGTGCTAATAC-ATGCAAGTCG-- AGCGGACAGATG--GGAGCTTGCTCC-----CTGAT-- GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG----TAACCTGCCTGTAAGAC-- TGGGATAACTCCGGGAAA---CCGGGGCTAAT--ACCGGATGGTTGTTTGAA--- CCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGG----CTTCGG--CTACCACTTA--CAGATGGA-- CCCGCGGCGCATTAGC-TAGTTGGTG-AGGTAACGG-CTCACCAA- GGCAACGATGCGTAGCCGACCT-GAGAGGGTGATCGG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTAGGGAA-

TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT CGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGC GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGC CCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAG TGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA-GTGTTAGGGGG-TTTCCG- CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG- AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG-ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT-- CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC--ATTCAGTTGGGCACTCT- AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT-GGGGATGACGTCAA- TCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTAC-CACGTGCTAC-ATGGA-CAGAACA- AGGGCAGCGAAC---CGCAGGTTAACCAATCCC-CAAATCTGTTCNCATTTCGGAT--------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------ >TAB01_Acinetobacter_sp._C17 -----------------------------------------------GCTACAC-ATGC-AGTCG--AGCGGGGGAG---- GTAGCTTGCTAC-----CGGAC---CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGG----AA- TCTGCCTATTAGTG--GGGGACAACATCTCGAAA---GGGATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--TAGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTCTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGC GTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTATTAAGTCGGATGTGAAATCC CCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTGAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAG AATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTACAGATCT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGTGGAGCAAACAGGATT AGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG-CCGTT-GCGGC-CTGTGA- GGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTAAGACTCATATGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCG- TAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACTAGA-AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT-- CGGGAATCTAGATACAGGTGCTGCATGACTGTCGTCAGCTCCGG--------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------- >CHT1a_Bacillus_subtilis_BC1_CU1a

--------------------------------------------------ATATAATGCAAGTCG--AGCGGACAGATG-- GGAGCTTGCTCC-----CTGAT--GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG---- TAACCTGCCTGTAAGAC--TGGGATAACTCCGGGAAA---CCGGGGCTAAT-- ACCGGATGGTTGTTTGAA---CCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGG----CTTCGG-- CTACCACTTA--CAGATGGA--CCCGCGGCGCATTAGC-TAGTTGGTG-AGGTAACGG- CTCACCAA-GGCAACGATGCGTAGCCGACCT-GAGAGGGTGATCGG-CCACACTGGGAC- TGAGACACGG-CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTAGGGAA- TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAA--- CGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGT TCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGG CGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGG GAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATG TGGGAGGAACACCAGTGGCG- AGGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGA TTAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA-GTGTTACGGGG---------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------- >CHT2f_Enterobacter_hormaechei__CP2f ----------------------------------------GGCGGGCCTAACAC-ATGCAAGTCG-- AACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGC----- TTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGG----AA-ACTGCCTGATGGAG-- GGGGATAACTACTGGAAA---CGGTAGCTAAT--ACC------------------ GCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCAT--CGGATGTG-- CCCGGATGGGATTAGC-TAGTAGGTG-GGGTAACGG-CTCACCTA- GGCSACGATCCCTAGCTGGGCT-GAAAGGATGACCAG-CCACACTGAAAC-TGAGACACGG- TCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGT TGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACC- TTGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTC AAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAG TCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT- GGAGGAATACCGGTGGCG- AAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA TTAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTT--GTGC-CCTTGA- GGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTC-GACCG-CCTGGGG-------CGAGC--------------- ------------------------------------------------------------------------TACC--------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -- >DMC2a_Burkholderia_cepacia_M7_MP2a --------------------------------------------CTGCTTACAC-ATGCAAGTCG--AACGGCAGCACG-- GGTGCTTGCACC-----TGGTG--GCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGG----AA- CATGTCCTGTAGTG--GGGGATAGCCCGGCGAAA---GCCGGATTAAT--ACC------------------ GCATACGATCTACGGATGAAAGCGGGGGACCTTCTGGCCTCGCGCTAT--AGGGTTGG-- CCGATGGCTGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCAGTAGCTGGTCT-GAGAGGACGACCAG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGT TGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGCTCTAATACAGCCGGGGGAT- GACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTACGG TGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAGACCGATG TGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGTATGGCAGAG GGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAATACCGATGGCA- AAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACAAAAGCATGCGGAGCAAACAGGATT ACATACCCT-GGTAGTCCACGCCCTAGACGATGTCAACTAG-TTGTT--GGGG-ATTCAT- TTCCTTAGTAACGTACCTAACGCGTGAAGTT-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGA-- CCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG- TAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGG- AATCCTGAAAAGATTCGGGAGTGCTCCAAAAAAAACCCGCTCCCAGGTGCTGCATGGCTGTC GTCAACTCCTGTCCTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGGACGCCACCCTTGTCCTTAGTT GCTACCCAA-------GAGCCCCCT-AAGGAAACTGCCGGTGACCAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCAACCAATGGTCC GGAACAAAGGGTTGCCCACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCTTACTTAAACC----- ---------------------------------------------------------------TGTATAC-------- TCCTTCTAGATCCCGCTTT-------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------- >DMC2c_Bacillus_subtilis_C16_MU2c ------------------------------------------CGGGTGCTATAC-ATGC-AGTCG--AGCGGACAGATG-- GGAGCTTGCTCC-----CTGAT--GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG---- TAACCTGCCTGTAAGAC--TGGGATAACTCCGGGAAA---CCGGGGCTAAT-- ACCGGATGGTTGTTTGAA---CCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGG----CTTCGG-- CTACCACTTA--CAGATGGA--CCCGCGGCGCATTAGC-TAGTTGGTG-AGGTAACGG- CTCACCAA-GGCAACGATGCGTAGCCGACCT-GAGAGGGTGATCGG-CCACACTGGGAC- TGAGACACGG-CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTAGGGAA- TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT CGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGC GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGC CCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAG TGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTA-ACGATGAGTGCTAA-GTGTTAGGGGG-TTTCCG- CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG-CCTGGGG--AGTA-

CGGTCGCAAGACTGAAACTCATAGGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG- AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG-ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT-- CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC--ATTCAGTTGGGCACTCT- AAGGTGACTG--------------------GACCGGGTGCGAC------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------GAA------------------------ ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ >DMC5e_Burkholderia_cepacia_MP5e -----------------------------------------------------C-ATGCAAGTCG--AACGGCAGCACG-- GGTGCTTGCACC-----TGGTG--GCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGG----AA- CATGTCCTGTAGTG--GGGGATAGCCCGGCGAAA---GCCGGATTAAT--ACC------------------ GCATACGATCCACGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTAT--AGGGTTGG-- CCGATGGCTGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCAGTAGCTGGTCT-GAGAGGACGACCAG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGT TGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGACTCTAATACAGTCGGGGGAT- GACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGG TGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAGACCGATG TGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGTATGGCAGAG GGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAG-TTGTT--GGGG-ATTCAT- TTCCTTAGTAACGTAGCT-ACGCGTGAAGTT-GACCGCCCTGGGG-GAGTA- CGGTCGCAAGATTAAAACTCA- AGGAATTGACGGGGGACCCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG AAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTSGG- AATCCTGCTGAGAGGCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGGTTC----------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------CCCGGCAAAACGTAAGC------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- >DQ387437.1_Burkholderia_cepacia_strain_B03 ----------------------------TTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACAC-ATGCAAGTCG-- AACGGCAGCACG--GGTGCTTGCACC-----TGGTG-- GCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGG----AA-CATGTCCTGTAGTG-- GGGGATAGCCCGGCGAAA---GCCGGATTAAT--ACC------------------ GCATACGATCTACGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTAT--AGGGTTGG-- CCGATGGCTGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCAGTAGCTGGTCT-GAGAGGACGACCAG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGT TGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGCTCTAATACAGCCGGGGGAT- GACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGG

TGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAGACCGATG TGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGTATGGCAGAG GGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAG-TTGTT--GGGG-ATTCAT- TTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTT-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGA-- CCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG- AAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGG- AATCCTGAAGAGATTCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAG TTGCTACGCAA-------GAGCACTCT-AAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGT- CGGAACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCG GATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCC GCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG- AGTGGGTTTTACCA-GAAGTGGCTAGTCTAACCGCAAGG----------------------- AGGACGGTCACC-ACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGT-------------------------------------- --------- >EF522130.1_Acinetobacter_sp._CU27 -------AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACAC-ATGCAAGTCG- -AGCGGG--------GAAGGTTGCTTCGGTAACTGAC--- CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGG----AA-TCTGCCATTTAGTG-- GGGGACAACATTCCGAAA---GGAATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--ATGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGGACAATGGGCGGAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTCTCTTAGTTAATACCTAAGATGAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGC GTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTTTTAAGTCGGATGTGAAATCC CCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGGAAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAG AATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG-CCGTT-GGGGC-CTTTGA- GGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCG- AAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACTAGA-AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT-- CGGGAATCTAGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTACTTGCCAGC-ATTTCGGATGGGAACTTT- AAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGC- GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTTCGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGT- CGGTACAAAGGGTTGCTACCTAGCGATAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGA TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG-

AGTTTGTTGCACCA-GAAGTAGCTAGCCTAACTGCAAAG----------------------- AGGGCGGTTACC- ACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGTGGCT GGATCACCTCCTTA >GOD1c_Bacillus_subtilis_11_GP1c --------------------------------------------GTCCTAATAC-ATGCAAGTCG--AGCGGACAGATG-- GGAGCTTGCTCC-----CTGAT--GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG---- TAACCTGCCTGTAAGAC--TGGGATAACTCCGGGAAA---CCGGGGCTAAT-- ACCGGATGGTTGTTTGAA---CCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGG----CTTCGG-- CTACCACTTA--CAGATGGA--CCCGCGGCGCATTAGC-TAGTTGGTG-AGGTAACGG- CTCACCAA-GGCAACGATGCGTAGCCGACCT-GAGAGGGTGATCGG-CCACACTGGGAC- TGAGACACGG-CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTAGGGAA- TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT CGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGC GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGC CCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAG TGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA- GTGTTAGGGGGGTTTCCGCCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG- CCTGGGGGCAGTA-CGGT-----------------------------------TCCGC------------------------------------ -CA-AGGAACCTGA--------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------- >GOD2f_Enterobacter_hormaechei_6_GP2f ----------------------------------------GGCGGGCCTAACAC-ATGCAAGTCG-- AACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGC----- TTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGG----AA-ACTGCCTGATGGAG-- GGGGATAACTACTGGAAA---CGGTAGCTAAT--ACC------------------ GCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCAT--CGGATGTG-- CCCGGATGGGATTAGC-TAGTAGGTG-GGGTAACGG-CTCACCTA- GGCGACGATCCCTAGCTGGGCT-GAAAGGATGACCAG-CCACACTGAAAC-TGAGACACGG- TCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGT TGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACC- TTGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCASCAGCCGCGGTAAT ACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCA AGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGT CTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT- GGAGGAATACCGGTGGCG- AAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA TTAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTT--GTGC-CCTTGA- GGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTC-GACCG-CCTGGGG-------CGAGC---------------

------------------------------------------------------------------------TACC--------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -- >GQ245971.1_Acinetobacter_sp._GG2 -------AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACAC-ATGCAAGTCG- -AGCGGAGAGAG---GTAGCTTGCTAC-----TGATC--- TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGG----AA-TCTGCCTATTAGTG-- GGGGACAACATCTCGAAA---GGGATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--TAGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCG TTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCC CGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGAGGATGGTAGA ATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG-CCGTT-GGGGC-CTTTGA- GGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCG- AAGAACCTTACCTGGCCTTGACATAGTAAG-AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT-- CGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTTT- AAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGC- GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGT- CGGTACAAAGGGTTGCTACACAGCGATGTGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGA TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG- AGTTTGTTGCACCA-GAAGTAGCTAGCCTAACTGCAAAG----------------------- AGGGCGGTTACC-ACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGC------------ --------------------- >HQ638093.1_Acinetobacter_sp._JH250-8 -------AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACAC-ATGCAAGTCG- -AGCGGAGAGAG---GTAGCTTGCTAC-----TGATC--- TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGG----AA-TCTGCCTATTAGTG-- GGGGACAACATCTCGAAA---GGGATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--TAGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA-

TATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCG TTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCC CGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGAGGATGGTAGA ATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG-CCGTT-GGGGC-CTTTGA- GGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCG- AAGAACCTTACCTGGCCTTGACATAGTAAG-AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT-- CGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTTT- AAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGC- GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGT- CGGTACAAAGGGTTGCTACACAGCGATGTGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGA TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG- AGTTTGTTGCACCA-GAAGTAGCTAGCCTAACTGCAAAG----------------------- AGGGCGGTTACC- ACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCT GGATCACCTCCTT- >MN704430.1 Bacillus subtilis subsp. stercoris strain EGI119 16S ribosomal RNA gene partial sequence -----------------------------------ACCGTGGCGGGTGCTATAC-ATGC-AGTCG-- AGCGGACAGATG--GGAGCTTGCTCC-----CTGAT-- GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG----TAACCTGCCTGTAAGAC-- TGGGATAACTCCGGGAAA---CCGGGGCTAAT--ACCGGATGGTTGTTTGAA--- CCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGG----CTTCGG--CTACCACTTA--CAGATGGA-- CCCGCGGCGCATTAGC-TAGTTGGTG-AGGTAACGG-CTCACCAA- GGCAACGATGCGTAGCCGACCT-GAGAGGGTGATCGG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTAGGGAA- TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT CGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGC GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGC CCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAG TGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA-GTGTTAGGGGG-TTTCCG- CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG- AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG-ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT-- CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC--ATTCAGTTGGGCACTCT-

AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGA- CAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGG ATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAG- AGTTTGTAACACCC-GAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAG----------------------- GAGCCAGCCGCCGAAAGGGGGAACCGGG---------------------------------------------------------- -- >KC197815.1 Bacillus subtilis strain EB31 16S ribosomal RNA gene partial sequence ------------------------------------CGGGCGGGGTGCTAATAC-ATGCAAGTCG-- AGCGGACAGATG--GGAGCTTGCTCC-----CTGAT-- GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG----TAACCTGCCTGTAAGAC-- TGGGATAACTCCGGGAAA---CCGGGGCTAAT--ACCGGATGGTTGTTTGAA--- CCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGG----CTTCGG--CTACCACTTA--CAGATGGA-- CCCGCGGCGCATTAGC-TAGTTGGTG-AGGTAACGG-CTCACCAA- GGCAACGATGCGTAGCCGACCT-GAGAGGGTGATCGG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTAGGGAA- TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT CGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGC GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGC CCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAG TGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA-GTGTTAGGGGG-TTTCCG- CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG- AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG-ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT-- CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC--ATTCAGTTGGGCACTCT- AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGA- CAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGG ATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAG- AGTTTGTAACACCC-GAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAG----------------------- GAGCCAGCCGCCGAAGGGGACAG----------------------------------------------------------------- >KC433738.1_Bacillus_subtilis_strain_A2 -------------------------------------------------------CCTTGATTTA--AGCGG---------------------------- --------------GGACGGGGCGTAAACACGGTGG----AA-ACCCCCCGTAAGAC-- CGGGGAAATCCCGGGAAA--CCGGGGGTTAAT--CCCGGATGGTTTTTTGAA--- CCCCATGGGTTAAAACTTAAAAGGGGG---TTTTGG--GTACCAATTA--CAGATGGA-- CCCGGGGCGCATTAGC-TAGTTGGGG-AGGTAACGG-CTCACCAA- GGCAACGATGCGTAGCCGACCT-GAGAGGGTGATCGG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTAGGGAA- TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT

CGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGC GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGC CCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAG TGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA-GTGTTAGGGGG-TTTCCG- CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG- AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG-ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT-- CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC--ATTCAGTTGGGCACTCT- AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGA- CAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGG ATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACAACACGAG- AGTTTGTAACACCC-GAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAG----------------------- GAGCCAGCCGCCAAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCTGAACAAGGGGACCCGTA ACGG------------------------ >KJ870198.1_Bacillus_subtilis_strain_B18 ----------------------------------AATATGGGGCGTCCTAATAC-ATGCAAGTCG-- AGCGGACAGATG--GGAGCTTGCTCC-----CTGAT-- GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG----TAACCTGCCTGTAAGAC-- TGGGATAACTCCGGGAAA---CCGGGGCTAAT--ACCGGATGGTTGTTTGAA--- CCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGG----CTTCGG--CTACCACTTA--CAGATGGA-- CCCGCGGCGCATTAGC-TAGTTGGTG-AGGTAACGG-CTCACCAA- GGCAACGATGCGTAGCCGACCT-GAGAGGGTGATCGG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTAGGGAA- TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT CGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGC GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGC CCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAG TGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA-GTGTTAGGGGGGTTTCCG- CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG- AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG-ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT-- CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC--ATTCAGTTGGGCACTCT- AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGA- CAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGG

ATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAG- AGTTTGTAACACCC- GAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGATTACAGCGCGACTTTGTTACAAGCCCAACCACTGTG GGCC--------------------------------------------------------------------- >MK675646.1_Acinetobacter_sp._strain_EX-1 ------------------------------CGGAAGGGGCGGGCAGGCTTACAC-ATGCAAGTCG-- AGCGGGGGAAG---GTAGCTTGCTAC-----CGGAC--- CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGG----AA-TCTGCCTATTAGTG-- GGGGACAACATCTCGAAA---GGGATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--TAGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGC GTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTATTAAGTCGGATGTGAAATCC CCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTGAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAG AATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG-CCGTT-GGGGC-CTTTGA- GGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCG- AAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACTAGA-AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT-- CGGGAATCTAGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTACTTGCCAGC- ATTTCGGATGGGAACTTTAAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGGACGA CGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGT- CGGTACAAAGGGTTGCTACACAGCGATGTGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGA TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG- AGTTTGTTGCACCA-GAAGTAGCTAGCCTAACTGCAAAG----------------------- AGGGCGGTTACCACGGTTGCCGAGGCGGGT-------------------------------------------------------- -- >MH297589.1_Acinetobacter_sp._strain_DB1 -----------------------------------------------------C-ATGC-AGTCG--AGCGGAGAGAG--- GTAGCTTGCTAC-----TGATC---TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGG----AA- TCTGCCTATTAGTG--GGGGACAACATCTCGAAA---GGGATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--TAGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCG

TTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCC CGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGAGGATGGTAGA ATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG-CCGTT-GGGGC-CTTTGA- GGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCG- AAGAACCTTACCTGGCCTTGACATAGTAAG-AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT-- CGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTTT- AAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGC- GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGT- CGGTACAAAGGGTTGCTACACAGCGATGTGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGA TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG- AGTTTGTTGCACCA-GAAGTAGCTAGCCTAACTGCAAAG-----------------------AGGGCGG------ --------------------------------------------------------------------------- >KT964806.1_Acinetobacter_sp._strain_M05 ---------------------------------CCTTTGCGGGCGGGCT-ACAC-ATGC-AGTCG--AGCGGGGGAG- ---GTAGCTTGCTAC-----CGGAC---CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGG----AA- TCTGCCTATTAGTG--GGGGACAACATCTCGAAA---GGGATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--TAGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTCTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGC GTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTATTAAGTCGGATGTGAAATCC CCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTGAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAG AATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG-CCGTT-GGGGC-CTTTGA- GGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCG- AAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACTAGA-AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT-- CGGGAATCTAGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTACTTGCCAGC-ATTTCGGATGGGAACTTT- AAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGC- GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGT- CGGTACAAAGGGTTGCTACACAGCGATGTGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGA TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG- AGTTTGTTGCACCA-GAAGTAGCTAGCCTAACTGCAAAG----------------------- AGGGCGGTTACCACCGGTGACCCCGATTT-----------------------------------------------------------

>KX350026.1_Bacillus_subtilis_strain_F2-2-18 -----------------------------------AATGGGGGGGTGCTAATAC-ATGCAAGTCG-- AGCGGACAGATG--GGAGCTTGCTCC-----CTGAT-- GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG----TAACCTGCCTGTAAGAC-- TGGGATAACTCCGGGAAA---CCGGGGCTAAT--ACCGGATGGTTGTTTGAA--- CCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGG----CTTCGG--CTACCACTTA--CAGATGGA-- CCCGCGGCGCATTAGC-TAGTTGGTG-AGGTAACGG-CTCACCAA- GGCAACGATGCGTAGCCGACCT-GAGAGGGTGATCGG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTAGGGAA- TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT CGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGC GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGC CCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAG TGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA-GTGTTAGGGGG-TTTCCG- CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG- AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG-ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT-- CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC--ATTCAGTTGGGCACTCT- AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGA- CAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGG ATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAAGTTTGTAACAC CCGGAAGTCGGTGGAGGTAACCTTTAG----------------------- GAGCCAGCCGCCGAAGTGACAGTTGT-------------------------------------------------------------- >TAC4a_Acinetobacter_sp._M1_AP4a -----------------------------------------GCGCGGCTTACAC-ATGCAAGTCG--AGCGGGGGAAG--- GTAGCTTGCTAC-----CGGAC---CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGG----AA- TCTGCCTATTAGTG--GGGGACAACATCTCGAAA---GGGATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--TAGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGC GTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTATTAAGTCGGATGTGAAATCC CCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTGAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAG AATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAAGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG-CCGTT-GGGGC-CTTTGA- GGCTTTATTGGCGCAGCTAACGCGATAATTA-GACCC-CCTGGGG--AGTA-

CGGTCGCAAGACTAAAACTCAGATAAATTGACGGGGG-- CCCGCACAGGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCTATTCAACGCG- AAGAACCTTACCTGGCCTTGACGTACTAGA-AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT-- CGGGAATCTAGATACAGGTGCTGCAGGGCTGTCGACAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTACTTGCCAGC-ATTTCGGATGGGAACTTT- AAGGATACGGCCAGTGGCCGAGCGT------------------------------------------------------------------ --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- >MH997650.1_Bacillus_subtilis_strain_S5 ---------------------------------------- TTGGGCTTGTCTACAATCAAACTTGGCGGCGGACAAGTGGGGACTTTTTCCCC----- CTTAGTTTTAGGCGGGCGAGGGGGGAGTTAAACCCGGGGGGAAACCCCCCCCGTAAAAACT GGGGATAATTCCCGGGAAACCCGGGGGCTTATTCCCCGGATGGTTGTTTTGAACCGCCCAGG TTTCAAACCTAAAAAGGGGGG--CTTCGG- CTTACCACTTACCCAGATGGACCCCCGGGGCCCTTTAGCTTAGTTGGTG- AGGTAACGGGTTCACCAAGGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGGAAAGGGTGATCGGCCCAC ACTGGGACTTGAGACCCGGCCCCAGATTCCTTACGGGAGGCAGCCAGTAGGGAATCTTTCG GCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCCTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAA GCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAAC CAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTC CGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGG CTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAAT TCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA-GTGTTAGGGGG-TTTCCG- CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG- AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG-ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT-- CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC--ATTCAGTTGGGCACTCT- AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGA- CAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGG ATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAG- AGTTTGTAACACCC-GAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAG----------------------- GAGCCAGCCGCCGAAGTGGACAGGATTGT---------------------------------------------------------- - >MN077147.1 Bacillus subtilis strain DSM 10 16S ribosomal RNA gene partial sequence -------------------------AGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATAC-ATGCAAGTCG-- AGCGGACAGATG--GGAGCTTGCTCC-----CTGAT-- GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG----TAACCTGCCTGTAAGAC-- TGGGATAACTCCGGGAAA---CCGGGGCTAAT--ACCGGATGGTTGTTTGAA--- CCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGG----CTTCGG--CTACCACTTA--CAGATGGA--

CCCGCGGCGCATTAGC-TAGTTGGTG-AGGTAACGG-CTCACCAA- GGCAACGATGCGTAGCCGACCT-GAGAGGGTGATCGG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTAGGGAA- TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT CGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGC GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGC CCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAG TGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA-GTGTTAGGGGG-TTTCCG- CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG- AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG-ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT-- CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC--ATTCAGTTGGGCACTCT- AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGA- CAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGG ATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAG- AGTTTGTAACACCC-GAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAG----------------------- GAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATC GGAAGGTGCGGT--------------- >MK680073.1_Burkholderia_cepacia_strain_KK8 -----------------------------------------------CCTTAAC-ATGCAAGTCG--AACGGCAGCACG-- GGTGCTTGCACC-----TGGTG--GCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGG----AA- CATGTCCTGTAGTG--GGGGATAGCCCGGCGAAA---GCCGGATTAAT--ACC------------------ GCATACGATCCACGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTAT--AGGGTTGG-- CCGATGGCTGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCAGTAGCTGGTCT-GAGAGGACGACCAG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGT TGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGCTCTAATACAGTCGGGGGAT- GACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGG TGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAGACCGATG TGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGTATGGCAGAG GGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAG-TTGTT--GGGG-ATTCAT- TTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTT-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGA-- CCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG- AAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGG- AATCCTGCTGAGAGGCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAG

TTGCTACGCAA-------GAGCACTCT-AAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGT- CGGAACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCG GATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCC GCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG- AGTGGGTTTTACCA-GAAGTGGCTAGTCTAACCGCAAGG----------------------- AGGACGGTCACC---------------------------------------------------------------------------- >MN696244.1_Enterobacter_hormaechei_subsp._xiangfangensis_strain_BHW6 TTTAAGAGTTTTGAAATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACAC- ATGCAAGTCG--AACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGC----- TTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGG----AA-ACTGCCTGATGGAG-- GGGGATAACTACTGGAAA---CGGTAGCTAAT--ACC------------------ GCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCAT--CGGATGTG-- CCCAGATGGGATTAGC-TAGTAGGTG-GGGTAACGG-CTCACCTA- GGCGACGATCCCTAGCTGGTCT-GAGAGGATGACCAG-CCACACTGGAAC-TGAGACACGG- TCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA- TATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGT TGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACC- TTGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTC AAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAG TCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT- GGAGGAATACCGGTGGCG- AAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA TTAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTT--GTGC-CCTTGA- GGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTC-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCG- AAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAG-AACTTAGCAGAGATGCATTGGTGCCTT-- CGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTA AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCG-GTCCGGCCGGGAACTCA- AAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGC- GCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCG GATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCC ACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG- AGTGGGTTGCAAAA-GAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGG-----------------------AGGGCGC- TACC-ACTTTGATC------------------------------------------------------------------ >NR_152004.1_Acinetobacter_lactucae_strain_NRRL_B-41902 -------AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACAC-ATGCAAGTCG- -AGCGGGGTGAT---GGTGCTTGCACT-----ATCAC--- CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGG----AA-TCTGCCTATTAGTG-- GGGGACAACATTTCGAAA---GGAATGCTAAT--ACC------------------ GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAA--TAGATGAG-- CCTAAGTCGGATTAGC-TAGTTGGTG-GGGTAAAGG-CCTACCAA- GGCGACGATCTGTAGCGGGTCT-GAGAGGATGATCCG-CCACACTGGGAC-TGAGACACGG- CCCAGACTCC-TACGGGAGGCAG-CAGTGGGGAA-

TATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGATAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCG TTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCC CGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGAGGATGGTAGA ATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT-GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG-CCGTT-GGGGC-CTTTGA- GGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCG- AAGAACCTTACCTGGCCTTGACATAGTAAG-AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT-- CGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTTT- AAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGC- GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGT- CGGTACAAAGGGTTGCTACCTAGCGATAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGA TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG- AGTTTGTTGCACCA-GAAGTAGCTAGCCTAACTGCAAAG----------------------- AGGGCGGTTACC- ACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCT GGATCACCT----- >TBD2e_Acinetobacter_lactucae_D2 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------TG--GGGGGTAAAGCCNCCCAG---GGGNNG------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------TNTNTAG-NGGTTT-GAN-GNATGTTCCC-CCCCCNTGGA---TGGAACCCGG- CCC-GATTCC-TACGGAAGGCAG-CAGT-GGGAA-TTTTGGAC- ATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCNNGGGTG- GAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGATAATACCTA GAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTA AGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGT GGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT- GGAGGAATACCGATGGCG- AAGGCAGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAG-CCGTT-GGGGC-CTTTGA- GGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTA-GACCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCG- AAGAACCTTACCTGGCCTTGACATAGTAAG-AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT-- CGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTTT- AAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGC- GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGT- CGGTACAAAGGGTTGCTACACAGCGATGTGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGA

TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG- AGTTTGTTGCACCA-GAAGTAGCTAGCCTAACTGCAAAG-----------------------AGGGCGG- TACC-ACGGNTGGCC----------------------------------------------------------------- >TCD2b_Bacillus_subtilis_D12 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- GGGGGGGGGGGGGGAAAACCCTGGG----TAACCCCCCCTTAA--A-- GGGGGAAATTTCCGGAAA---CCGGGGTTNNT--CCCGGAANNGTTTT------- NAACCCNNNGTTTNAANNAAAAAGGGGG---TTTGGGTT---CCCTTT--ANAGTGGC-- CCCGGGGGCCTNTNNN-TNTT--GGG-AGGTAAGGG-TTCCCCAA-GGCANCNATGGGTA- CNNNCCN-GNNAGGG-GATTGG-CCCCCCTGGGAC-TGNGACCCGG-CCCANATTCC- TTCGGGAGGCAG-CAGTAGGGAA- TCTTCCGCAATGAACGAAAGTCCGACGGAGCAACCCCGC-TGAATGATGAA- GTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTAC CTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTA GGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTG ATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGA AGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT- GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA-GTGTTAGGGGG-TTTCCG- CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG- AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG-ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT-- CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC--ATTCAGTTGGGCACTCT- AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGA- CAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGG ATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAG- AGTTTGTAACACCC-GAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAG----------------------- GAGCCAGCCGCCGAAGNTNG-------------------------------------------------------------------- >TPD3b_Bacillus_subtillis_D8 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------G----AACCCCCCCTTAAAGGG--GGGGAAAATTCCGGGAAA-- ACCGGGGTTANA--ACCCGGAGGGNTTTTTTAACCCCCAGGTTTCAAC--- CNAAAAAGGGGG--CTTGGG--TTNCCANTTT--ACAAAGGGACCCCGGGGGCCTTTAGC- TAGTTGGGGAGGGTAACGGNTCCCCCAA-GGCAACGATGGGTAGCCGACNT- GANANGNGGATTGG-CCCCCTTGGGAC-TGAGACCCGGCCCCAGATTCC- TACGGGAGGCAGCCAGTAGGGAATTTTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCC GCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTNTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTT CGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGC GGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGG GAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATG

T-GGAGGAACACCAGTGGCG- AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCT-GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA-GTGTTAGGGGG-TTTCCG- CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA-CTCCG-CCTGGGG--AGTA- CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG-- CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG- AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG-ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT-- CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC--ATTCAGTTGGGCACTCT- AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT- GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGA- CAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGG ATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAG- AGTTTGTAACACCC-GAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAG----------------------- GAGCCAGCCGCCGAAGNNGNCA------------------------------------------------------------------

Trình tự vi khuẩn nội sinh cây mía và các chủng tương đồng sau khi sắp gióng bằng phần mềm MEGA X

#mega !Title Phylogenetic Analysis; !Format DataType=DNA indel=-; #3390997_N1_Pri_1 ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ --------GGCGGTG?AAACGTT-TCCGGAATTACTGGGGCGTAAAGGGTCGCGTAGGCG GACTTACTTAAGTCCGAGGTGAAATCCCCGGGCTCAACCCGGGAACTGCCTTGGATACTG TTGGTCTTGAGTGTGG??GAGGTGAGTGGAATTCCTCGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAT ATGAG??AGAACACCGATGGCGAAGGCAGCTGGCTG??C??CTATTGACGCTGAGGCACG AAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGAATG CTCGATGTTTGCGAG-----ATACCGCAAGTGTCTGAGCGAAAGCATTAAGTATCCACCC T?GGAAGTGCGACCGC??GG??GAAACTCACAGGAATTGACAGGGG?CCGCACACACGCT GGAGCATGTGTGTTATTTCTATGATACCCGCGGAAA?TTACCTGGGCTATAATGATGTCT GACCAATGCTGAAAAGAGTCTTTGTCCCAATA--CACAGATT??AGA?----?GGTGC?? GATGGTTGTCATCTCCT??CGT???GAGATGTTGTG????CTCCCGCAACCAGCGCCCCC CTTGCTATTAGCTGCCA---CTTCTGAT-GTGAACTCTCTTAAAACTGCGGTCGTAACAC A??AGGA--AGGAGGGGATGATGTCA?GTCATCATGG-GCTTTATGTCAA??GCTACACA CATGCGTACAAT?GGTAACAGACAAACAGGCTGCTACTTGCTACGCAAGCTGATAC----

TCTCACACA??CTATCTCACATCTCATAGAGGTCCTGCTGCCTCT-ACC?TCATG--TGA ?GTAGTCTCTAGTAATCT?ACATCATCAACT?G?TCCGCGTGGATTCCTTTCCCCCGGGG CCAAAAAAA--------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ -------------------- #3391004_N16_Pri_1 ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------TTCGGATCGCGTATCGG-ATTACTG-GGCGT-AAGCG-CACGCAGGCG G--TTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGCGCTTAACGTGGGAACTGCATTTGAAACTG GCAAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGA TTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCT----TGACATCC AGAGAATTCGCTAGAGATAGCTTAGTGCCTTC--GGGAACTCTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCCTTACGAGTAGGGCTACACA CATGC-TACATTGGGC-GTATACAAA-GAAAAGCGACTT----CCCGAGAGCCAGCTGAA CTTCATAAAGTGC----------------------------------------------- --------------------------------------------------------GGGC TT---------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ -------------------- #3391006_N20_Pri_1 ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------ATCGG-ATTACTG-GGCGT-AAGCG-CACGCAGGCG G--TTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGCGCTTAACGTGGGAACTGCATTTGAAACTG

GCAAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGA TTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCT----TGACATCC AGAGAATTCGCTAGAGATAGCTTAGTGCCTTC--GGGAACTCTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGAGTAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GTATACAAA-GAGAAGCGAACT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTA-GATCAGAATGCTAC-GGTGAATAC??CCCCC--GGGG CCTAAAAAA--------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ -------------------- #3391005_N18_Pri_1 ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------CGTT-GTCGG-ATTATTG-GGCGT-AAGGG-CTCGCAGGCG G--TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTG GGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCG AAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG C-TAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT----TGACATCC TCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTC--GGGGACAGAGTGAC----AGGTGGTG CATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGATCTTAGTTGCCAGC-ATTCAGTT-GGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGC-CCCTTATGACCTGGGCTACACA CGTGC-TACAATGGAC--AGAACAAA-GGGCTGCGAGAC----CGCAAGGTTTAGC-CAA TCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGT----CTGCAACTCGACTGCGTG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGCCGC-GGTG-ATACTTCCCCC--GGGC CCAAAAAA---------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ -------------------- #3677077_T5_p515

------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------CCGGA?ACGTTAATCGGAATTACTGTGGCGT-AAGCG-CACGCAGGCG G--TTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGCGCTTAACGTGGGAACTGCATTTGAAACTG GCAAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGA TTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCT----TGACATCC AGAGAATTCGCTAGAGATAGCTTAGTGCCTTC--GGGAACTCTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGAGTAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GTATACAAA-GAGAAGCGAACT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTA-GATCAGAATGCTAC-GGTGAATACTCCCCC---GGGC CTAAA------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ -------------------- #Bacillus_cereus_MR4c ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------CGT--ATCGG-ATTATTG-GGCGA-AAGCG-CGCGCAGGTG G--TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTG GGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG C-TAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT----TGACATCC TCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTC--GGGAGCAGAGTGAC----AGGGGGTG

CATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGATCTTAGTTGCCATC-ATTAAATT-GGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGGCTGGGGGGGGGTG---------------------------------------- ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------- #Bacillus_sp._MR4a ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------CGTTGTCCGGAATTATTG-GGCGT-AAGGG-CTCGCAGGCG G--TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTG GGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCG AAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG C-TAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT----TGACATCC TCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTC--GGGGGCAGAGTGAC----AGGTGGTG CATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGATCTTAGTTGCCAGC-ATTCAGTT-GGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCCAATCATCATGC-CCCT------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------- #Bacillus_subtillus_MT2b ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------

------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------GTCGGCATTATTG-GGCGT-AAGGG-CTCGCAGGCG G--TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTG GGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCG AAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG C-TAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCRAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT----TGACATCC TCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTC--KGGGGCAGAKTGAC----ASGTGGTG CATGGTTGTCATCAGCTCGTGTCSTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCGACC CTTGATCTTATTTGCCAGC-ATTCAGTTGGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAA-- ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------- #3390998_N4_Pri_1 ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -----------------------TATCGG-ATTACTG-GGCGT-AAGCG-TGCGCAGGCG G--TTTGCTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTG GCAGGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA C-TAGTTGTT--GGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGT GGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT----TGACATGG TCGGAATCCTGCTGAGAGGCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGTCCTTAGTTGCTA------CGCAA-GAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGG-CCCTTATGGGTAGGGCTTCACA CGTCA-TACAATGGTC--GGAACAGA-GGGTTGCCAACC----CGCGAGGGGGAGC-TAA TCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACT----CTGCAACTCGAGTGCATG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGCCGC-GGTGAA-ACGTCCCCC--GGGG CTAAAAAAA---------------------------------------------------

------------------------------------------------------------ -------------------- #KY992359.1_Burkholderia_cenocepacia_strain_AR- 30_16S_ribosomal_RNA_gene_partial_sequence ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------CTATAC AGTCGGGGGATGACGGTACCGGAAGAT--AGCACTGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTTATCGGAATTACTG-GGCGT-AAGCG-TGCGCAGGCG G--TTTGCTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTG GCAGGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA C-TAGTTGTT--GGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGT GGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT----TGACATGG TCGGAATCCTGCTGAGAGGCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGTCCTTAGTTGCTA------CGCAA-GAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGG-CCCTTATGGGTAGGGCTTCACA CGTCA-TACAATGGTC--GGAACAGA-GGGTTGCCAACC----CGCGAGGGGGAGC-TAA TCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACT----CTGCAACTCGAGTGCATG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGCCGC-GGTGAATACGTTCCC---GGGT CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAT-GGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAGTCT AACCGCAAGGAGGACCTGTTTCAACC---------------------------------- -------------------- #Burkholderia_tropica_CT4a ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------CGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-TGCGCAGGCG G--TGATTTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTG CATCGCTTGAGTATGGAARAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGTCAATACTGACGCTCATGCACG

AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA C-TGGTTGTC--GGGTCTTCATTGACTTGGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCSCACAAGCGGG GGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT----TGACATGT ACGGAGTCCTGCTGAGAGGTGGGAGTGCCCGAAAGGGAGCCGTAACAC----AGGTGCTG CAT--------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------- #Burkholderia_tropica_TR3a ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ----------------AAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-TGCGCAGGCG G--TGATGTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTG CATCGCTTGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGTCAATACTGACGCTCATGCACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA C-TGGTTGTC--GGGTCTTCATTGACTTGGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGT GGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT----TGACATGT ACGGAATTCCGCTGAGAGGYGGRAGTGCCCGAAAGGGAGCCGTAACAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGTCCCTAGTTGCTA------CGCAA-GAGCACTCCAGGGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTTATGGGTAGGGCTTCACA CGTCA-TACAATGGTC-GGAAACAGA-GGGTTGCCAAGC----CGCGAGGTGGAGCCCAA TCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGT----CTGCAACTCGACTGCGTG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGCCGC-GGTGAATACGTG------GGGG CCCTTAAAA--------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ -------------------- #Burkholderia_ubonensis_GR3 ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------

------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------ATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-TGCGCAGGCG G--TTTGCTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTG GCAGGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA C-TAGTTGTT--GGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGT GGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT----TGACATGG TCGGAATCCTGAARAGATTCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGTCCTTAGTTGCTA------CGCAA-GAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--ATGGGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGG-CCCTTATGGGTAGGGCTGCAAA CC---------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------- #Enterobacter_oryzae_GT3b ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ----------------------TTATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-CACGCAGGCG G--TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTG GCAGGCTGGAGTCTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA TTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCT----TGACATCC ACAGAACCTGGCAGAGATGCCGGGGTGCCTTC--GGGAACTGTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC

TGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGACCAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GCATACAAA-GAGAAGCGACCT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTG-AATCAGAATGTCAC-GGTGAATACGTTCCCC--GGGG CCCATA------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------- #GT1e_Burkholderia_tropica_837nt ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ --------------------GTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-TGCGCAGGCG G--TGATGTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTG CATCGCTTGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGTCAATACTGACGCTCATGCACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA C-TGGTTGTC--GGGTCTTCATTGACTTGGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGT GGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT----TGACATGT ACGGAATCCTGCTGAGAGGCGGGAGTGCCCGAAAGGGAGCCGTAACAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGTCCCTAGTTGCTA------CGCAA-GAGCACTCCAGGGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGG-CCCTTATGGGTAGGGCTTCACA CGTCA-TACAATGGTC--GGAACAGA-GGGTTGCCAAGC----CGCGAGGTGGAGC-CAA TCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGT----CTGCAACTCGACTGCGTG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGCCGC-GGTGAATACGTTCCCGGGGGGC ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------- #GT2_Kosakonia_oryzae_839nt ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------

----------------CGACTCGTATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-CACGCAGGCG G--TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTG GCAGGCTGGAGTCTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA TTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCT----TGACATCC ACAGAACCTGGCAGAGATGCCGGGGTGCCTTC--GGGAACTGTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC TGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGACCAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GCATACAAA-GAGAAGCGACCT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATGAAAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTGAAATCAGAATGTCAC-GGTGAATACGTAA--------- ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------- #GT3a_Enterobacter_aerogenes ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------ATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-CACGCAGGCG G--TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTG GCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA CTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCT----TGACATCC AGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTC--GGGAACTCTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCAGGCC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC TGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGAGTAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-ATATACAAA-GAGAAGCGACCT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTA-GATCAGAATGCTAC-GGTGAATACGTTYCCC------ -----------C--CCCCC----------------------------------------- ------------------------------------------------------------ --------------------

#GU434369.1_Bacillus_subtilis_strain_TYj5- 1_16S_ribosomal_RNA_gene_partial_sequence ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------CTTCGCATGGACGAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTG ATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAG GGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTG-GGCGTAAAGGG-CTCGCAGGCG G--TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTG GGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCG AAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG C-TAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT----TGACATCC TCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTC--GGGGGCAGAGTGAC----AGGTGGTG CATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGATCTTAGTTGCCAGC-ATTCAGTT-GGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGC-CCCTTATGACCTGGGCTACACA CGTGC-TACAATGGAC--AGAACAAA-GGGCAGCGAAAC----CGCGAGGTTAAGC-CAA TCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGT----CTGCAACTCGACTGCGTG-AAGC TGGAATCGCTAGTATC---GCG-GATCAGCATGCCGC-GGTGAAGACGTTCC----TGGG CTTGTACACACC-TGCCCGTCACACCAC-GAGAGTTTGTAACACCCGAGTCGTGAGTACT TTTGGAGCCAGCCGCCGATGTGGACAGATGAATGGGGTGAGTCGTACCAAGGTAGCCGTA -------------------- #HQ334981.1_Bacillus_subtilis_strain_CLS-BA8- 7_16S_ribosomal_RNA_gene_partial_sequence --------------------------------------TTGGCCTTTCGTCTAGTCCTGG CTCTTCACACCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA CACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGA TAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATG GACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGC CGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTG ATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAAC-T GCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGTGGCAAGCGAT-GTCGGGATTATTG-GGCGT-AAGGG-CTCGCAGGCG G--TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTG GGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCG AAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG

C-TAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT----TGACATCC TCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTC--GGGGACAGAGTGAC----AGGTGGTG CATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGATCTTAGTTGCCAGC-ATTCAGTT-GGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGC-CCCTTATGACCTGGGCTACACA CGTGC-TACAATGGAC--AGAACAAA-GGGCTGCGAGAC----CGCAAGGTTTAGC-CAA TCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGT----CTGCAACTCGACTGCGTG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGCCGC-GGTGAATACGTTCCC---GGGC CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAC-GAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGT AACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGCAGATGATTGGGGGAAGTCGTAACAAAG GAACC--------------- #JX088114.1_Enterobacter_oryzae_16S_ribosomal_RNA_gene_partial_sequence ------------------------------------TGGCGGCAGGCCTAACACATGCAA GTCGAACGGTAGCACAGAGAG--CTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA TGTCT-GGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCA TAACGTCGCA---------AGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATG TGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGGGGTAATGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGC TGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTG AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTACGGTTAATA-A CCGTGCTGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-CACGCAGGCG G--TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTG GCAGGCTGGAGTCTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA TTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCT----TGACATCC ACAGAACCTGGCAGAGATGCCGGGGTGCCTTC--GGGAACTGTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC TGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGACCAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GCATACAAA-GAGAAGCGACCT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTG-AATCAGAATGTCAC-GGTGAATACGTTCCC---GGGC CTTGTACACACC--GCCCGTCTACTCCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAG-CT AACCTTCGGGAGGGCGCTTACCA------------------------------------- -------------------- #KJ482738.1_Advenella_sp._MM53Nov_16S_ribosomal_RNA_gene_partial_sequenc e -------------------------------------------------------TGCAG TCGACGGCAGCGGGAAAGTAGCTTGCTACTTTTGCCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAA

TGTAT-CGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACGCGAAAGCGTGGCTAATACCGCA TACGCCCTAC---------GGGGGAAAGGGGGGGATCTTAGGACCTCTCACTATTGGAGC GGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAGC TGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTGCG ATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCAGGGAAGAAAAGGTTTCGGATAATA-C CCGGAACTGATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-TGCGCAGGCG G--TTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTC CCGAACTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAT ATGTGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCATGCACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA C-TAGCTGTT--GGGCCCTTCGGGGCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGT GGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT----TGACATGT CTGGAATCCTGAAGAGATTTAGGAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGTCATTAGTTGCTAC--ATTTAGTT-GAGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGG-CCCTTATGGGTAGGGCTTCACA CGTCA-TACAATGGTC--GGGACAGA-GGGTTGCCAAGC----CGCAAGGTGGAGC-TAA TCTCATAAACCCGATCGTAGTCCGGATTGCAGG----CTGCAACTCGCCTGCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGTCGC-GGTGAATACGTTCCC---GGGT CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAT-GGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCT AACCGCAAGGGGGGCGATA----------------------------------------- -------------------- #KP974788.1_Burkholderia_tropica_strain_PPe5_16S_ribosomal_RNA_gene_partial_ sequence ---------------------------------------GCGTGGGGGGGGCCCTATACT GCCAGTCCGACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAA TACAT-CGGAACGTGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCA TACGATCTAC---------GGATGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATAGGGGC GGCCGATGGCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGC TGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTG AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCCTGGTCCTAATA-T GGCCGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-TGCGCAGGCG G--TGATGTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTG CATCGCTTGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGTCAATACTGACGCTCATGCACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA C-TGGTTGTC--GGGTCTTCATTGACTTGGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGT GGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT----TGACATGT ACGGAATTCCGCTGAGAGGTGGAAGTGCCCGAAAGGGAGCCGTAACAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC

CTTGTCCCTAGTTGCTA------CGCAA-GAGCACTCCAGGGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGG-CCCTTATGGGTAGGGCTTCACA CGTCA-TACAATGGTC--GGAACAGA-GGGTTGCCAAGC----CGCGAGGTGGAGC-CAA TCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGT----CTGCAACTCGACTGCGTG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGCCGC-GGTGAATACGTTCCC---GGGT CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAT-GGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTGGCTAGTCT AACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGCAGGATTCATGACTGGGGGAAGTCGAAACCAGGG CCCC---------------- #KT390891.1_Burkholderia_tropica_strain_BRUESC674_16S_ribosomal_RNA_gene_ partial_sequence ---------------------------------------------------CTTACACAT GCAAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAA TACAT-CGGAACGTGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCA TACGATCTAC---------GGATGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATAGGGGC GGCCGATGGCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGC TGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTG AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCCTGGTCCTAATA-T GGCCGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-TGCGCAGGCG G--TGATGTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTG CATCGCTTGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGTCAATACTGACGCTCATGCACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA C-TGGTTGTC--GGGTCTTCATTGACTTGGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGT GGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT----TGACATGT ACGGAATCCTGCTGAGAGGTGGGAGTGCCCGAAAGGGAGCCGTAACAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGTCCCTAGTTGCTA------CGCAA-GAGCACTCCAGGGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGG-CCCTTATGGGTAGGGCTTCACA CGTCA-TACAATGGTC--GGAACAGA-GGGTTGCCAAGC----CGCGAGGTGGAGC-CAA TCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGT----CTGCAACTCGACTGCGTG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGCCGC-GGTGAATACGTTCCC---GGGT CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAT-GGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTGGCTAGTCT AACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGCAGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAAC---- -------------------- #LC066142.1_Enterobacter_aerogenes_gene_for_16S_ribosomal_RNA_partial_sequ ence_strain:_MF102 ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------

------------------GGGAGCATGGGCGCAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATG AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAGGCGTTAAGGTTAATA-A CCTTGGCGATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-CACGCAGGCG G--TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTG GCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA CTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCT----TGACATCC AGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTC--GGGAACTCTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCAGGCC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC TGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGAGTAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-ATATACAAA-GAGAAGCGACCT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTA-GATCAGAATGCTAC-GGTGAATACGTTCCCC--GGGC CTTGTACAACACCGCCCGTCCACACCATGGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGTAGCTTA ACCTTCCGGGAGGGCGCTTACCCACTTTGTGATTCATGACTGGTGTG------------- -------------------- #LC485468.1_Bacillus_sp._KST15_gene_for_16S_ribosomal_RNA_partial_sequence ------------------------------------------------------------ -AGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA CACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGA TAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATG GGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGC CGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTG ATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAAC-T GCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTG-GGCGTAAAGCG-CGCGCAGGCG G--TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTG GGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG C-TAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT----TGACATCC TCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGAC----AGGTGGTG CATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGATCTTAGTTGCCAGC-ATTTAGTT-GGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGC-CCCTTATGACCTGGGCTACACA CGTGC-TACAATGGAT--GGTACAAA-GGGCTGCAAGAC----CGCGAGGTCAAGC-CAA TCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGG----CTGCAACTCGCCTACATG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGCCGC-GGTGAATACGTTCCC---GGGC

CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAC-GAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGT AACCGTAAGGAGCTAGCCGC---------------------------------------- -------------------- #MF111945.1_Bacillus_cereus_strain_S3- 13_16S_ribosomal_RNA_gene_partial_sequence ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ --GGTCGACACCCGTGGAACGT--ATCGGA--TATTG-GGCGT-AAGCG-CGCGCAGGTG G--TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTG GGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG C-TAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT----TGACATCC TCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTC--GGGAGCAGAGTGAC----AGGTGGTG CATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGATCTTAGTTGCCATC-ATTAAGTT-GGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGC-CCCTTATGACCTGGGCTACACA CGTGC-TACAATGGAC--GGTACAAA-GAGCTGCAAGAC----CGCGAGGTGGAGC-TAA TCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAG-----CTGCAACTCGCCTACATG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGCCGC-GGTGAATACGTTCCC---GGGT CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAC-GAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGTGGG--T ACCCTTTATGGAGCCAGCCGCCTATGTGGGACAGATGATTGGGTTGAGTCGTACAAGGTA GCCCTTTGA----------- #NR_114158.1_Serratia_plymuthica_strain_NBRC_102599_16S_ribosomal_RNA_par tial_sequence ---------------------------ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAA GTCGAGCGGTAGCACAGGAGAGCTTGCTCTCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAA TGTCT-GGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCA TAACGTCTAC---------GGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCACGCCATCAGATG TGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGC TGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTG AAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGGCAGTGTGTTAATA-G CACATTGCATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-CACGCAGGCG G--TTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGCGCTTAACGTGGGAACTGCATTTGAAACTG

GCAAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGA TTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCT----TGACATCC AGAGAATTCGCTAGAGATAGCTTAGTGCCTTC--GGGAACTCTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGAGTAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GTATACAAA-GAGAAGCGAACT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTA-GATCAGAATGCTAC-GGTGAATACGTTCCC---GGGC CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAT-GGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTT AACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAG----------- -------------------- #MN007139.1_Enterobacter_hormaechei_strain_ZSH- W3_16S_ribosomal_RNA_gene_partial_sequence ---------------------------------CCCTTTGCGGCAGGCCTAACACATGCA GTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA TGTCT-GGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCA TAACGTCGCA---------AGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATG TGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGC TGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATG AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGAGGTTAATA-A CCTTGGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-CACGCAGGCG G--TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTG GCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA CTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCT----TGACATCC AGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTC--GGGAACTCTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC TGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGAGTAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GCATACAAA-GAGAAGCGACCT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTG-GATCAGAATGCCAC-GGTGAATACGTTCCC---GGGC CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAT-GGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTT AACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACCTTGGATACATGG----------------------- --------------------

#MN935186.1_Burkholderia_ubonensis_strain_M15_(37- 1)_16S_ribosomal_RNA_gene_partial_sequence --------------------GGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAA GTCGAACGGCAGCACGGG------CTTCGGCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAA TACAT-CGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCA TACGATCTAC---------GGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTT GGCCGATGGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGC TGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTG AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGTCCTAATA-T GGCCGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-TGCGCAGGCG G--TTTGCTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTG GCAGGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAG ATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA C-TAGTTGTT--GGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGT GGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT----TGACATGG TCGGAATCCTGAAGAGATTCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGTCCTTAGTTGCTA------CGCAA-GAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGG-CCCTTATGGGTAGGGCTTCACA CGTCA-TACAATGGTC--GGAACAGA-GGGTCGCCAACC----CGCGAGGGGGAGC-TAA TCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACT----CTGCAACTCGAGTGCATG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATC--GCG-GATCAGCATGCCGC?GGTGAATACGTTCCC---GGGT CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCATGGGAAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAGTCT AACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGGTGAAGTC-------- -------------------- #MT355798.1_Enterobacter_sp._strain_RY11902_16S_ribosomal_RNA_gene_partial _sequence --------------------GGTTCAGGGTCAACGCTGGAGCGAGGCATTAGTCATGCAA GTCTAGCGGTAACTTAAAGTATCTTGCTACTTTGCTGGCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA TGTCT-GGGAATCTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCA TAACGTCGCA---------AGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATG TGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGC TGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATG AAGAAGGCCTTAGGGTTGTAGAGGACTTTCAGCGGGGAAGAAGGTGATAAGGTTAATA-C CGTCAGCGATTGACGTTACGCGGAGGAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-CACGCAGGCG G--TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTG GCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA CTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCC

TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCT----TGACATCC AGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTC--GGGAACTCTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC TGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGAGTAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GCATACAAA-GAGAAGCGACCT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTA-GATCAGAATGCTAC-GGTGAATACGTTCCC---GGGC CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAT-GGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTT AACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGG TAACCGTAG----------- #MT533823.1_Kosakonia_oryzae_strain_APP47_16S_ribosomal_RNA_gene_partial_s equence ------------------------------------------------------------ ------------------GAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA TGTCT-GGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCA TAACGTCGCA---------AGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATG TGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGC TGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTG AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTCCGGTTAATA-A CCGTGCTGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-CACGCAGGCG G--TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTG GCAGGCTGGAGTCTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA TTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCT----TGACATCC ACAGAACCTGGCAGAGATGCCGGGGTGCCTTC--GGGAACTGTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC TGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGACCAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GCATACAAA-GAGAAGCGACCT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTG-AATCAGAATGTCAC-GGTGAATACGTTCCC---GGGC CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAT-GGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTT AACCT------------------------------------------------------- -------------------- #NR_125662.1_Chitinophaga_polysaccharea_strain_MRP- 15_16S_ribosomal_RNA_partial_sequence --------------------------------------------------------TACA TGCAGTCGAGGGGCAGCACAGGTAGCAATACTGGGTGGCGACCGGCAAACGGGTGCGGAA

CACGTACGCAACCTTCCTTTAAGCGGGGAATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAATACCCCA TAAGAATGTGGA-------AAGGCATCTTTCAGCATTTAAAGATTTATCACTTAAAGATG GGCGTGCGTCTGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGCCGACGATCAGTAAC TGGCGTGAGAGCGCGACCAGTCACACGGGCACTGAGACACGGGCCCGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTAAGGAATATTGGTCAATGGACGCAAGTCTGAACCAGCCATGCCGCGTGGAGG ATGAAGGCCCTCTGGGTTGTAAACTTCTTTTATCTGGGACGAAACACTCTTTTTCTAA-- ----GGAGCTTGACGGTACCAGGTGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTCACTG-GGTTTAAAGGG-TGCGTAGGCG G--ACACTTAAGTCCGTGGTGAAATCTCTGGGCTTAACCCAGAAACTGCCATGGATACTA TTTGTCTTGAATGTTGTGGAGGTTAGCGGAATATGTCATGTAGCGGTGAAATGCATAGAT ATGACATAGAACACCAATTGCGAAGGCAGCTGGCTACACAAATATTGACGCTGAGGCACG AAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATTA CTCGACATACGCGA-----TATACAGTGTGTGTCTGAGCGAAAGCATTAAGTAATCCACC TGGGAAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGTCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCTGGGCTAGAATGCAGTCT GACCGATGCTGAAAGG---------TGTCTTTGTAGCAATACACAGATTGTAAGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CCTATCACTAGTTGCCAGCACGTAAAGGTGGGAACTCTAGTGAAACTGCCGTCGTAAGAC GCGAGGA--AGGAGGGGATGATGTCAAGTCATCATGG-CCTTTATGCCCAGGGCTACACA CGTGC-TACAATGGTA--GAGACAAA-GGGCTGCTACTT----GGTAACAAGCTGC-TAA TCTCAAAAACTCTATCTCAGTTCGGATTGAGGT----CTGCAACTCGACCTCATG-AAGC TGGAATCGCTAGTAATCGTATATCAGCA--ATGATAC-GGTGAATACGTTCCC---GGAC CTTGTACACACC--GCCCGTCAAGCCAT-GAAAGCCGGGGGGACCTGAAGTCGGCAACCG CAAGGAACCGCCTA---------------------------------------------- -------------------- #NR_157762.1_Serratia_oryzae_strain_J11-6_16S_ribosomal_RNA_partial_sequence CGCCCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAA GTCGAGCGGCAGCGGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCCGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAA TGTCT-GGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCA TAGCGTCGCA---------AGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCACGCCATCGGATG TGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGC TGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTG AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGCATCACACTTAATA-C GTGTGGTGATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-CACGCAGGCG G--TTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGCGCTTAACGTGGGAACTGCATTTGAAACTG GCAAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGA CTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCATATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCT----TGACATCC ACGGAACTTGCCAGAGATGGCTTGGTGCCTTC--GGGAACCGTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCACTTCGGGT-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAAC

CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGAGTAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GTATACAAA-GAGAAGCAAACT----CGCGAGAGCCAGC-GGA CCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTA-GATCAGAATGCTAC-GGTGAATACGTTCCC---GGGC CTTGTACACACC--GCCCGTCACACCAT-GGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTT AACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGG TAACCGTAAAGGGCGATCCC #TR2a_Enterobacter_sp. ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -----------------------------------TG-GGCGT-AAGCG-CACGCAGGCG G--TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTG GCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA CTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTGCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCCGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCT----TGACATCC AGAAAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTT--GGGAACTCTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGGAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGGCAGCGGTTCGGCC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC TGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGAGTAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GCATACAAA-GAGCAGCGACCT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTA-GATCAGAATGCTAC-GGTGAATACGTTCCCG--GGGA CCTTACAAAGTG------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------- #TR2c_Enterobacter_hormaechei ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------

--------------------GTTAATCGG-ATTACTG-GGCGT-AAGCG-CACGCAGGCG G--TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTG GCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGA CTTGGAGGTT--GTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCT----TGACATCC AGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTC--GGGAACTCTGAGAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCC-GGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC TGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG-CCCTTACGAGTAGGGCTACACA CGTGC-TACAAT-GGC-GCATACAAA-GAGAAGCGACCT----CGCGAGAGCAAGC-GGA CCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGT----CTGCAACTCGACTCCATG-AAGT CGGAATCGCTAGTAATC--GTG-GATCAGAATGCCAC-GGTGAATACGTCCCCCCGGGGG ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------- #TR3c_Advenella_sp._836nt ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ -------------------CGTA-ATCGGAATTACTG-GGCGTAAAGCG-TGCGCAGGCG G--TTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTC CCGAACTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAT ATGTGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCATGCACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA C-TAGCTGTT--GGGCCCTTCGGGGCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGT GGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT----TGACATGT CTGGAATCCTGAAGAGATTTAGGAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACAC----AGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC CTTGTCATTAGTTGCTAC--ATTTAGTT-GAGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGA--AGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGG-CCCTTATGGGTAGGGCTTCACA CGTCA-TACAATGGTC--GGGACAGA-GGGTTGCCAAGC----CGCAAGGTGGAGC-TAA TCTCATAAACCCGATCGTAGTCCGGATTGCAGG----CTGCAACTCGCCTGCATG-AAGT CGGA-TCGCTAGTAATC--GCGGAATCAGCATGTCGC-GGTGAATACGTTC-----GGGA ------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------ --------------------