Đồ án tốt nghiệp: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate chịu mặn xử lý nitơ trong nước thải chế biến thủy sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHẢN NITRATE CHỊU MẶN XỬ LÝ NITƠ TRONG NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương

Sinh viên thực hiện

: Thành Quang Hiền

MSSV: 1151110138 Lớp: 11DSH05

TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp

ỜI CAM ĐOAN

Đồ n tốt nghiệp n l ng tr nh nghi n ứu ủ ản th n t i i s h ng

n kho h ủ TS Ngu n Ho i H ng – Kho C ng nghệ sinh h – Th

phẩm – M i tr ờng, Tr ờng Đại H C ng Nghệ Tp Hồ Chí Minh

Những kết quả ó đ ợ trong đồ n n ho n to n kh ng s o hép từ đồ n

tốt nghiệp ủ ng ời kh i ất kỳ h nh thứ n o C số liệu trí h n trong đồ

n tốt nghiệp n l ho n to n trung th T i xin hịu tr h nhiệm ho n to n về đồ

n tốt nghiệp ủ m nh

TP HCM, ng 5 th ng 8 n m 5

Sinh vi n th hiện

THÀNH QUANG HIỀN

Đồ án tốt nghiệp

ỜI CẢM N

ời đầu ti n on xin gửi lời ảm n đến mẹ, mẹ đã sinh th nh, ạ ỗ,

u th ng v he hở ho on, mẹ đã lu n ở n on v nh những điều tốt

nhất ho on trong h tập ũng nh trong uộ sống

Em xin đ ợ tr n tr ng ảm n qu thầ kho C ng nghệ Sinh h – Th

phẩm – M i tr ờng, tr ờng Đại h C ng nghệ TP HCM đã nhiệt t nh giúp đỡ,

tru ền đạt những kiến thứ nền tảng, những kinh nghiệm qu u ho em trong suốt

qu tr nh h tập v l m đồ n tốt nghiệp

Đặ iệt, em xin tỏ lòng iết n s u sắ t i TS Ngu n Ho i H ng,

ng ời thầ đ ng kính, đã tận t nh giúp đỡ, h ng n ho em về nội ung ũng nh

kỹ n ng, ph ng ph p, h thứ tiến h nh thí nghiệm để em ó thể ho n th nh

đồ n tốt nghiệp ủ m nh

Em xin h n th nh ảm n thầ Huỳnh V n Th nh v thầ Ngu n Trung

Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi ho em trong suốt qu tr nh em th hiện đồ n tại

phòng thí nghiệm Kho M i tr ờng v C ng nghệ sinh h , Tr ờng Đại h Kỹ

thuật C ng nghệ TP Hồ Chí Minh

Em xin h n th nh ảm n qu thầ trong hội đồng phản iện đã nh thời

gi n đ v nhận xét đồ n tốt nghiệp ủ em

in ảm n nh hị, ạn v em đã động vi n v giúp đỡ em trong

khoảng thời gi n em h tập ũng nh l m đồ n tốt nghiệp tại tr ờng

Em xin h n th nh ảm n

Tp. Hồ Chí Minh, ng 5 th ng 8 n m 5

n v n t ện

THÀNH QUANG HIỀN

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU............................................................................................................................................ 1

MỤC LỤC

1. Đặt vấn đề: ............................................................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................................. 2

3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................................ 2

4. Ý ng ĩa đề tài ........................................................................................................................ 2

4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................................. 2

4.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................................. 2

5. P ƣơng p áp ng n ứu ..................................................................................................... 2

CHƯ NG TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................ 4

1.1. Tổng quan nƣớc thải chế biến thủy sản (CBTS) ........................................................... 4

1.1.1. Nguồn phát sinh và đặc tính nước thải CBTS .................................................................. 5

1.2. C u trìn n tơ (N) .......................................................................................................... 11

1.2.1. Giới thiệu về chu trình N tự nhiên ................................................................................. 11

1.2.2. Quá trình phản nitrate ở tế bào vi khuẩn ....................................................................... 13

1.3. Tổng quan về một số vi khuẩn phản nitrate ................................................................ 20

1.3.1. Pseudomonas stutzeri .............................................................................................. 20

1.3.2.

Paracoccus denitrificans .......................................................................................... 22

1.3.3.

Bacillus azotoformans .............................................................................................. 23

1.3.4.

Thiobacillus denitrificans ......................................................................................... 23

1.4. Tổng quan p ƣơng p áp p ân lập vi sinh vật [2] ....................................................... 26

1.4.1. Khái niệm ................................................................................................................ 26

1.4.2. Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết ...................................................... 26

1.4.3. Giữ và bảo quản giống ............................................................................................ 27

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 29

2.1. Thờ g an và địa đ ểm th c hiện đề tài ......................................................................... 29

2.2. Vật liệu – thiết bị - hóa chất .......................................................................................... 29

2.2.1.

Vật liệu ..................................................................................................................... 29

2.2.2.

Thiết bị, dụng cụ ....................................................................................................... 29

2.2.3.

Hóa chất ................................................................................................................... 29

2.3.

Bố trí thí nghiệm : Các bước thí nghiệm được trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau ............. 30

2.4.

Ph ng ph p nghi n ứu th c nghiệm ............................................................................. 31

2.4.1.

Phương pháp lấy mẫu .............................................................................................. 31

2.4.2.

Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng VK có khả năng phản nitrate .... 31

2.4.3.

Các thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng VK phân lập [8] ................................. 34

Bố trí thí nghiệm thử nghiệm khảo sát khả năng khử nitrate và khử nitrate của các

2.4.4. chủng VK phân lập được .......................................................................................................... 38

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .............................................................................. 46

3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng có khả năng phản nitrate: ....................... 46

- và NO2

3.1.1.

Tăng sinh VK phản nitrate từ nước thải CBTS trên môi trường Giltay NO3 46

3.1.2.

Phân lập và làm thuần vi khuẩn từ nước thải CBTS: ............................................... 47

3.1.3.

Tăng sinh VK phân lập được trên môi trường Giltay Nitrate và Giltay Nitrite: ...... 49

3.1.4.

Kết quả thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng VK phân lập: ................................ 53

3.2. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ đối với những chủng được tuyển chọn ................................................................................................................................... 55

3.2.1.

Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite của chủng 7.5 trong 48 giờ. ....... 55

3.2.2.

Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ đối với chủng 7.1 ....... 57

3.3. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ đối với những chủng được tuyển chọn. ......................................................................................................................... 60

3.3.1.

Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của chủng 7.5 ........... 60

3.3.2.

Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của chủng 7.1 ........... 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................................................... 68

1. Kết luận ................................................................................................................................ 68

2. Kiến nghị .............................................................................................................................. 69

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC VIÊT TẮT

CBTS Chế biến thủy sản

G Giltay

HK Hiếu khí

HKGT Hiếu khí giá thể

KK Kị khí

KKGT Kị khí giá thể

MT M i tr ờng

N Nit

Amoni NH4

+ - -

Nitrite NO2

Nitrate NO3

VK Vi khuẩn

III

VSV Vi sinh vật

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. S đồ quy trình công nghệ CBTS đ ng lạnh .............................................. 5

Hình 1.2. S đồ quy trình công nghệ xử l n c thải CBTS điển hình ................... 11

Hình 1.3. Chu trình N trong t nhiên ....................................................................... 11

Hình 1.4. Chu trình N thu g n do VK th c hiện ...................................................... 13

Hình 1.5. Quá trình khử nitrate dị hóa và khử nitr te đồng hóa trong chu trình N

của VK nhân th c ......................................................................................................... 15

Hình 1.6. C hế quá trình khử nitrate dị hóa (hô hấp kỵ khí) ................................ 16

Hình 1.7. C hế quá trình khử nitrate dị hóa amôn hóa ......................................... 17

Hình 1.8. Hình thái khuẩn lạc Pseudomonas stutzeri ............................................... 21

Hình 1.9. Hình thái tế bào và khuẩn lạc Paracoccus denitrificans .......................... 22

Hình 1.10. Hình thái tế bào Thiobacillus denitrificans .............................................. 24

Hình 2.1. S đồ tóm tắt bố trí c thí nghiệm ................................................. 31

Hìn 2.2 Mô hình khảo sát khả n ng hu ển hóa N ở điều kiện khác nhau. .... 39

Hình 3.1. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.5 trong mô hình chuyển hóa

nitrite .......................................................................................................... 53

Hình.3.2. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.1 trong mô hình chuyển hóa

nitrite .......................................................................................................... 56

Hình 3.3. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.5 trong mô hình chuyển hóa

nitrate ......................................................................................................... 58

Hình 3.4. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.1 trong mô hình chuyển hóa

nitrate ......................................................................................................... 62

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các thông số ô nhi m tiêu biểu củ n c thải CBTS Việt Nam ................. 4

Bảng 1.2. Tải l ợng ô nhi m n c thải của một số nhà máy CBTS ........................... 4

Bảng 1.3. Nồng độ ô nhi m trung bình trong n c thải của một số loại hình CBTS . 6

Bảng 1.4. Tiêu chuẩn về hàm l ợng nitrate và nitrite trong n c uống ở mốt số tổ

chức ................................................................................................................... 10

Bảng 1.5. Nồng độ methanol sử dụng để khử nitrate hoặc nitrite hoàn toàn ............ 18

Bảng 1.6 Tóm tắt đặc tính hình thái và sinh lý, sinh hóa của các vi khuẩn phản

nitrate tiềm n ng ............................................................................................................ 25

Bảng 2.1. Độ đụ m i tr ờng v l ợng khí sinh ra của các m u m i tr ờng sau

khi t ng sinh VK ph n lập ............................................................................................. 32

Bảng 2.2. Ph ng ph p định tính nồng độ nitrite trong m u .................................... 33

Bảng 2.3. Ph ng ph p định tính nồng độ nitrate ..................................................... 33

Bảng 2.5. Trình t tiến h nh định l ợng NO3

Bảng 2.6. Trình t tiến h nh định l ợng NO2

Bảng 2.4. Ph ng ph p định tính nồng độ amoni: .................................................... 33 - ........................................................... 41 - ........................................................... 42 + .......................................................... 44 Bảng 2.7. Trình t tiến h nh định l ợng NH4

Bảng 3.1 Kết quả định tính N s u 5 ng t ng sinh n c thải CBTS trên môi

tr ờng Giltay ................................................................................................................. 46

Bảng 3.2 Kết quả phân lập VSV từ n c thải CBTS ............................................... 48

Bảng 3.3 Kết quả định tính tr n m i tr ờng Giltay Nitrite sau 5 ngày .................... 49

Bảng 3.4 Kết quả định tính tr n m i tr ờng Giltay Nitrate sau 5 ngày .................... 49

Bảng 3.5. Kết quả thừ nghiêm sinh hóa của các chủng VK phân lập........................ 51

Bảng 3.6. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử Nitrite của chủng 7.5 sau 48

giờ ................................................................................................................... 52

Bảng 3.7. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrite của chủng 7.1 sau 48

giờ ................................................................................................................... 55

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.8. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrate của chủng 7.5 sau 48

giờ ................................................................................................................... 58

Bảng 3.9. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrate của chủng 7.5 sau 48

giờ ................................................................................................................... 61

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề:

Ngành công nghiệp chế biến thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi

nh n củ n t , đóng góp đ ng kể ho GDP n t Đ ũng l ng nh hế biến

có số l ợng doanh nghiệp nhiều nhất trong công nghiệp chế biến, m ng đến việc

làm cho nhiều ng ời dân Bên cạnh những lợi ích về kinh tế và xã hội, ngành CBTS

ũng g r nhiều vấn đề về m i tr ờng nh nhi m không khí, ô nhiềm đất, ô

nhi m chất thải rắn… v nghi m tr ng h n ả là ô nhi m nguồn n Chính điều

này làm ảnh h ởng rất l n đối v i cuộc sống củ on ng ời , ũng nh ảnh h ởng

đến hệ sinh thái gần khu v n c thải đ ợc thải ra.

N c thải của công nghiệp CBTS chứa các thành phần ô nhi m hữu ó

nguồn gốc từ động vật, nh protein v lipi Ngo i r , n c thải này còn có hàm

l ợng BOD, COD và Nitrate khá cao. V i ph ng ph p xử l hó l , ph ng

pháp xử lý hóa h ,… ó thể xử lý hiệu quả đ ợ COD v BOD nh ng v n h xử

lý triệt để đ ợ l ợng Nitr te ó trong n c thải.

Hiện n , ph ng ph p sinh h c trong xử l n c thải sau chế biến đ ợc

các doanh nghiệp CBTS quan tâm và áp dụng rất nhiều N c thải CBTS chứa

l ợng chất hữu o, phân hủy sinh h c b i các vi sinh vật. Sử dụng ph ng

pháp sinh h c trong xử l n c thải có thể khắc phụ đ ợc một vấn đề mà các

ph ng ph p xử lý hóa lý, hóa h th ờng gặp phải là vấn đề tái ô nhi m sau xử lý.

Nhiều chủng VSV có khả n ng th m gi v o hu tr nh nito trong n c,

chuyển hóa các hợp chất N nh mon, nitrite, nitr te để phục vụ cho quá trình trao

đổi chất, tổng hợp nên các thành phần cấu trúc của tế o ũng nh tổng hợp các

chất cần ho qu tr nh sinh tr ởng và phát triển của chúng. D v o đó, nhiều

chủng VSV có khả n ng hu ển hó N đ ợc sử dụng trong nhiều lĩnh v nh ng

nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp th c phẩm, đặc biệt là công nghiệp chế

biến thủy sản. Để ó đ ợc những ứng dụng trên, việc phân lập và tuyển ch n các

chủng VSV mong muốn là một phần quan tr ng trong việc nghiên cứu ũng nh tạo

ra chế phẩm sinh h c có giá trị ứng dụng vào xử l n c thải.

Đồ án tốt nghiệp

Từ những sở trên, th c hiện đề tài “P ân lập và tuyển chọn vi khuẩn

phản nitrate chịu mặn xử lý n tơ trong nƣớc thải chế biến thủy sản” v i mong

muốn sẽ ch n đ ợc các chủng vi khuẩn có khả n ng xử lý hiệu quả nhất, để kết hợp

tạo nên một chế phẩm sinh h c phù hợp v i n c thải chứa nguồn N cao, góp phần

nâng cao hiệu quả xử lý và bảo vệ m i tr ờng trong ngành CBTS.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển ch n các chủng VK có khả n ng xử lý nitrate và nitrite

trong điều kiện có nồng độ muối cao từ n c thải từ công ty CBTS.

3. Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và tuyển ch n các chủng VK có khả n ng xử lý nitrate và nitrite

trong điều kiện có nồng độ muối cao từ n c thải chế biến thủy sản.

- Định l ợng khả n ng xử lý nitrite của các chủng vi khuẩn tuyển ch n

- Định l ợng khả n ng xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn tuyển ch n.

4. Ý ng ĩa đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học

Phân lập đ ợc chủng VSV có khả n ng xử lý N-Nitr te đạt hiệu quả cao, có

thể ứng dụng trong nhiều lĩnh v c.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Tạo thêm một số chế phẩm sinh h c ứng dụng trong xử l n c thải thủy

sản, góp phần bảo vệ m i tr ờng n c.

5. P ƣơng p áp ng n ứu

Ph ng ph p tổng hợp tài liệu:

- Thu thập, nghiên cứu các tài liệu tham khảo, tài liệu internet có liên quan

đến đề tài.

- L a ch n, tổng hợp các tài liệu li n qu n đến mục tiêu đề r trong đề tài.

Ph ng ph p th c nghiệm:

- Phân lập các VK có khả n ng phản nitrate từ n c thải nhà máy CBTS.

Đồ án tốt nghiệp

- Ph ng ph p định tính khả n ng khử nitrate, nitrite của các VK phân lập

đ ợc.

- Th c hiện một số th c nghiệm sinh hó nh : nhuộm gram, OF, MR-VP,

In ol, C t l se, i động đối v i các chủng phân lập đ ợc, từ đó tu ển

ch n chủng VK mong muốn, loại VSV không mong muốn.

- Th c hiện bố trí thí nghiệm khảo sát khả n ng phản nitrate của chủng VK

đã tu ển ch n

Ph ng ph p thu thập và xử lý số liệu:

- Ghi nhận số liệu từ các thí nghiệm khảo sát theo từng thời điểm.

- Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel.

- Xử lý thống kê bằng phần mêm Statgraphic Centurion XV. Các số liệu

s u đó đ ợ ph n tí h ANOVA v đ ợc trắc nghiệm phân hạng LSD v i

mứ nghĩ , 5

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan nƣớc thải chế biến thủy sản (CBTS)

N c thải nh m CBTS đ ợ đặ tr ng ởi h m l ợng ô nhi m chất hữu

v N cao. Nồng độ BOD ≥ 1000mg/l và tổng N ≥ 120mg/l. Tỉ lệ COD/BOD5

nằm trong khoảng 1,1 - 1,3, cho phép xử l n c thải theo ph ng ph p sinh h c

đạt hiệu quả cao.

Bảng 1.1 Các thông số ô nhi m tiêu biểu củ n c thải CBTS Việt Nam

ĐƠN VỊ

GIÁ TRỊ 6 – 8 1500 – 2800 1000 – 1800 388 – 452 150 – 250 120 – 160 6 – 10 QCVN 11:2008, Cột B 5,5 – 9 80 50 100 20 60 - - mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l STT 1 2 3 4 5 6 7

CHỈ TIÊU pH COD BOD SS Dầu mỡ ĐTV Nit tổng Photpho tổng Bảng 1.2. Tải l ợng ô nhi m n c thải của một số nhà máy CBTS

Công suất TT Tên ơ sở công nghiệp Tải lƣợng ô nhiễm SS P BOD5 COD N (TSP/ngày)

1 Cty XNK thủy sản Việt 12 -15 484 3300 3960 198 21

Nam (SEAPRODEX)

2 Cty chế biến hàng xuất 25 – 30 396 2700 3240 162 19

khẩu Q3 (EPCO)

XNXK thủy hải sản 6 – 9 380 1100 1425 110 23 3

Seaspimex XN đ ng lạnh Nhà Bè XN CBTSXK Cần Th Cty XNK thủy sản An Giang 53 200 1028 360 682 900 423 900 - 22 30 40 5 8 10 3,5 - 5 3 – 6 8 - 12 4 5 6

17 - -

Cty CBTSXK Nha Trang 7 Cty Animex Đ Nẵng 8 9 XN đ ng lạnh Huế 10 Cty XNKTS Quảng Ninh 420 351 - - 533 460 428 - 54 810 - 630 717 - 1347 189 47 4 – 6 1 – 2 2 – 3 4 – 6

Đồ án tốt nghiệp

1.1.1. Nguồn phát sinh và đặc tính nước thải CBTS

1.1.1.1. Nguồn phát sinh

Trong sản xuất thủy sản, n c thải ở các khâu chế biến chiếm 85% - 90%

tổng l ợng n c thải, 10 % - 15% còn lại l n c thải sinh hoạt của công nhân

trong nhà máy. Nguồn gây ô nhi m ở khâu chế biến ản :

- S hế nguyên liệu: rửa, phân loại, mổ, rã đ ng…

- Các quá trình chế biến: ng m, t h x ng, ắt khúc, phile, làm sạch, luộ …

- Quá trình vệ sinh thiết bị, nh x ởng và vệ sinh của công nhân.

C c sản xuất ản ó ph t sinh n c thải tại nh m CBTS đ ợc thể

hiện trên hình 1.1.

Hình 1.1 S đồ quy trình công nghệ CBTS đ ng lạnh (Lê Minh Nguyệt, 2003)

Đồ án tốt nghiệp

Ngoài các nguồn gây ô nhi m trên thì các hoạt động đóng hộp nh kh u rót

n c sốt, n c muối, dầu gia vị ũng góp phần gây ô nhi m đ ng kể Đối v i hoạt

động sản xuất bột cá và dầu cá thì nguồn gây ô nhi m l n c máu từ khâu bốc dỡ,

bảo quản cá, ép cá và thời điểm dòng thải đậm đặc nhất l kh u l t m n ng ng

tụ các thiết bị đặc.

Bảng 1.3. Nồng độ ô nhi m trung bình trong n c thải của một số loại hình CBTS

Chỉ tiêu đ nh giá ô nhi m

Loại hình chế biến pH SS BOD COD NTS PTS

800 1100 90 20 Đ ng lạnh 350 7,3

478,8 775,6 24,84 11,82 Đồ hộp 100 7,1

586 7,8 Surimi (sản phẩm n liền) 3120 4890 125 11,32

N c mắm 75 7,5 20 40 - -

7,5 M c khô, tôm khô các loại 250 100 150 6 20

Agar 6,7 9,7 136,6 217,8 413,8 27,5

(Nguồn: Báo cáo hiện trạng M i tr ờng, Cục thùy sản, 2007)

1.1.1.2. Đặc tính nước thải CBTS

N c thải là một trong những vấn đề m i tr ờng l n nhất của ngành CBTS

hiện nay, v i đặ tr ng ởi ô nhi m về màu, mùi, chất rắn l lửng, chất hữu o

và VK gây bệnh, v.v.. Các chất thải ó đặc tính d n hỏng và d thất thoát theo

đ ờng đi ủa dòng thải N c thải trong CBTS ó h m l ợng chất hữu o v

trong đó ó ầu, protein, chất rắn l lửng và chứ l ợng photphat và nitrate cao.

Dòng thải từ CBTS còn chứa những m u vụn thịt, x ng ngu n liệu chế biến,

máu, chất béo, các chất hoà tan từ nội tạng ũng nh những chất tẩy rửa và các tác

nhân làm sạ h kh Trong đó ó nhiều hợp chất khó phân hủy. Mứ độ ô nhi m

củ n c thải tùy thuộc vào s có mặt của một số yếu tố, nh ng qu n tr ng nhất là

ph ng ph p hế biến và loài thủy sản đ ợc chế biến sau :

Nhìn chung, hầu hết n c thải củ nh m CBTS đều có chung đặc

điểm

Đồ án tốt nghiệp

- Có h m l ợng các chất hữu ạng d phân huỷ sinh h c cao. Giá trị

BOD5 th ờng l n, o động trong khoảng 300 – 2000 mg/l, giá trị COD

nằm trong khoảng 500 – 3000 mg/l.

- H m l ợng l n các protein và chất inh ỡng, thể hiện ở 2 thông số tổng

Nit (5 – 200 mg/l) và tổng Photpho (10 – 100 mg/l).

- H m l ợng chất rắn l lửng cao từ 200 – 1000 mg/l.

- pH th ờng nằm trong gi i hạn từ 6,5 – 7,5 do có quá trình phân huỷ đạm

và thải amoniac.

Ngoài ra, các thành phần chất hữu trong n c thải thủy sản khi phân huỷ

tạo ra các sản phẩm trung gian là các axit béo không no nên tạo mùi rất khó chịu và

đặ tr ng, gây ô nhi m về mặt cảm quan và ảnh h ởng tr c tiếp đến sức khoẻ công

nhân làm việc.

1.1.1.3. Tác động của nước thải CBTS đến môi trường nước

Nh đã tr nh , n c thải CBTS ó h m l ợng các chất ô nhi m cao, nếu

kh ng đ ợc xử lý sẽ gây ô nhi m nghiêm tr ng nguồn n c mặt v n c ngầm

xung quanh.

Đối v i nguồn n c ngầm tầng n ng, n c thải CBTS có thể thấm xuống đất

và gây ô nhi m mạ h n c ngầm. Các chất hữu v VSV g ệnh có trong

nguồn n c ngầm nhi m gây cản trở cho việc xử l th nh n c sạch cung cấp cho

sinh hoạt.

Đối v i các nguồn n c mặn, các chất ô nhi m ó trong n c thải CBTS sẽ

làm suy thoái chất l ợng n , t động xấu đến m i tr ờng và thủy sinh vật. Trong

n c thải CBTS chứa các chất nh onh r t, protein, hất béo...là các chất hữu

bị phân hủy, nên khi xả vào nguồn n c t nhiên sẽ làm giảm nồng độ oxy

hòa tan vốn có, do VSV sử dụng để phân hủy các chất hữu ó trong n c thải.

Nồng độ ox hò t n i 50% bão hòa gây ảnh h ởng xấu t i s phát triển của các

loài thủy sinh và làm giảm khả n ng t làm sạch của nguồn n c, d n đến giảm

chất l ợng n c cấp cho sinh hoạt và công nghiệp. Ngoài ra, các chất l lững trong

n c thải CBTS l m ho n đục hoặ ó m u ng n ản ánh sáng chiếu sâu vào

Đồ án tốt nghiệp

lòng thủy v c, ảnh h ởng t i quá trình quang hợp của tảo, rong r u g t động

tiêu c đến tài nguyên thủ sinh, đồng thời gây mất mỹ qu n ho òng n c và

gây bồi lắng lòng sông, cản trở s l u th ng tr n l u v c. Về mặt vi sinh, n c thải

CBTS chứa nhiều VK gây bệnh và trứng giun sán là những tác nhân gây nên dịch

bệnh ở ng ời nh : ệnh lỵ, th ng h n, ại liệt, nhi m khuẩn đ ờng tiết niệu và

tiêu chảy cấp tính…

Trên hết l t động của các hợp chất N v photpho nh g hiện t ợng phì

ỡng trong hệ sinh th i n c, làm cạn kiệt ox trong n , g độc v i hệ sinh vật

n , l m n c ngầm ô nhi m nitrate, ảnh h ởng t i sức khỏe cộng đồng.

- Hiện t ợng ph ỡng trong n l o thừa chất inh ỡng d n t i s

phát triển bùng nổ của các loài tảo và VSV, còn g i là hiện t ợng tảo nở hoa.

Khi đó mật độ thuỷ sinh vật trong hồ rất đặ l m ho n ó độ màu và

độ đục cao. Ngoài ra khi một l ợng l n tảo chết đi sẽ cần l ợng oxy l n

t ng ứng để phân huỷ d n đến h m l ợng ox hò t n trong n c bị cạn

kiệt, làm chết các sinh vật sống trong n c.

- Theo tài liệu « H ng d n về chất l ợng n c uống » của Tổ chức Y tế thế

gi i ũng nh Ti u huẩn 1329/2002 (Bộ Y tế) không xem amoni là chất gây

hại cho sức khỏe on ng ời mà xếp amoni vào nhóm các chất g t động

xấu về mặt cảm quan (mùi, vị) trong n c. Bên cạnh đó, moni òn l ếu tố

cản trở trong công nghệ xử l n c cấp. Thứ nhất : nó làm giảm tác dụng của

clo là tác nhân sát trùng chủ yếu áp dụng ở nh m n c Việt Nam, do

phản ứng v i clo tạo thành monocloamin là chất sát trùng thứ cấp hiệu quả

kém lo h n lần. Thứ hai : amoni cùng v i một số vi l ợng trong n c

(hữu , phốt pho, sắt, m ng n…) l “thứ n” để VK phát triển, gây hiện

t ợng “kh ng ổn định sinh h ” ủa chất l ợng n c sau xử l N c có thể

bị đụ , đóng ặn trong hệ thống d n, chứ n N c bị xuống cấp về các

yếu tố cảm quan.

- Khi nồng độ moni trong n c cao sẽ rất d dàng tạo r nitrite Trong thể

động vật, nitrite và nitrate có thể biến thành N-nitroso - là tiền chất có tiềm

Đồ án tốt nghiệp

n ng g ung th Mặc dù bằng chứng dịch t h h đầ đủ về tác hại đối

v i con ng ời. Ủ n h u Âu qu định mức tối đ ủ nitr te trong n c

uống là 50 mg/l, Mỹ là 45 mg/l, Tổ chức sức khoẻ thế gi i: 100 mg/l, tiêu

chuẩn 1329/2002 (Bộ Y tế) đã đề ra mức gi i hạn 3 v 5 mg/l đối v i nitrite

v nitr te t ng ứng nhằm ng n ngừa bệnh mất sắc tố máu

(meth emoglo in emi ) đối v i trẻ s sinh i 3 tháng tuổi v ung th tiềm

t ng Độc tính củ nitrite đ ợc mô tả nh s u (Sharat và cộng s , 1994)

Chứng máu Methaemo- globinaemia (hội chứng xanh xao trẻ em) :

Trong thể, nitrite (hoặ nitr te i tác dộng của một số VK đuờng ruột

chuyển thành nitrite) kết hợp v i hồng cầu (hemoglo in) trong m u s u đó hu ển

thành methemoglobin, cuối cùng chuyển thành methemoglobinamin.

Methemoglobinamin là chất ng n ản việc liên kết và vận chuyển oxy, gây bệnh

thiếu oxy trong máu và sinh ra bệnh máu trắng:

- + 2H2O → 4H Fe3+OH- + 4NO3

- + O2

4HbFe2+O2 + 4 NO2

Bệnh nhân khi bị ngộ độc nitrite sẽ có những triệu chứng nh nhức đầu, hồi

hộp, hoa mắt, nôn mử … s u đó n đến hôn mê và có thể gây tử vong. Hiện t ợng

n đặc biệt thấy rõ ở trẻ em. Trẻ em mắc chứng bệnh n th ờng xanh xao và d bị

đe a đến cuộc sống đặc biệt là trẻ i 6 tháng tuổi.

Ung t ƣ t ềm tàng :

Ở một khía cạnh khác, trong dạ động vật nitrite kết hợp v i các acid

amin trong th c phẩm làm thành một h chất nitrosamin. Nitrosamin có thể gây tổn

th ng i tru ền tế bào nguyên nhân gây ra bệnh ung th , qu i th i Những thí

nghiệm cho nitrite vào thứ n, n c uống của chuột, thỏ... v i h m l ợng v ợt

ng ỡng cho phép thì sau một thời gian thấy những khối u sinh ra trong gan, phổi,

vòm h ng của vật thí nghiệm. Ở điều kiện pH <4 thì các hợp chất nitroso đ ợc tạo

thành từ amin bậc hai và acid nitro (HNO2) có thể trở nên bền vững h n nhờ tách

loại proton để trở thành nitrosamin:

R2-NH + HNO2 → H2O + R2N-NO (pH<4).

Đồ án tốt nghiệp

Các amin bậ trong m i tr ờng axit yếu ở pH = 3 - 6 v i s có mặt của

ion nitrite chúng d dàng phân huỷ thành aldehyd và amin bậc hai. Sau dó amin bậc

hai tiếp tục chuyển thành nitrosamin.

Do độc tính cao của các hợp chất chứa N (amoni, nitrite, nitrate) nên việc

loại bỏ húng trong n c thải ó h m l ợng N cao là việc quan tr ng, để loại bỏ

đ ợc mối nguy hại khá l n ho m i tr ờng, đặc biệt là bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

S u đ l qu định về h m l ợng nitr te v nitrite trong n c uống của một số tổ

chức

Bảng 1.4. Tiêu chuẩn về hàm l ợng nitrate và nitrite trong n c uống ở mốt số tổ

chức

- (mg/l)

2(mg/l)

Tổ chức Hàm l ợng NO3

Hàm l ợng NO- .. WHO 45

TCVN 5501-91 50 0,1

Canada 10 1

EEC 50 0,1

CHLB Đức 50 0,1

(Nguồn:genome)

1.1.1.4. Hệ thống xử l n c thải cho các nhà máy CBTS

D v o đặ tr ng ủ n c thải CBTS, quy trình xử l n c thải thông

dụng th ờng đ ợc áp dụng tại các nhà máy CBTS Việt Nam gồm ng đoạn

- Tiền xử lý hay xử l s ộ: Tách rác, lắng cát, cân bằng, tách dầu.

- Xử l s ấp hay xử lý bậc 1: Xử lý kỵ khí trong bể UASB.

- Xử lý thứ cấp hay xử lý bậc 2: Xử lý hiếu khí trong bể Aeroten.

- Xử lý bậc 3: Keo tụ, lắng l c, khử trùng.

Bùn lắng tụ s u khi đ ợc gom v o ng n hứa bùn sẽ đ ợ đ qu ể phân

hủy bùn và cuối ùng đ ợc thải vào bãi rác hoặc dùng bón cây.

Dây chuyền công nghệ xử l n c thải CBTS điển hình tại các nhà máy sản

xuất thủy sản ở Việt N m đ ợc mô tả ở hình 2.2.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. S đồ quy trình công nghệ xử l n c thải CBTS điển hình

1.2. C u trìn n tơ (N)

1.2.1. Giới thiệu về chu trình N tự nhiên

Chu kỳ N là một qu tr nh m theo đó N đ ợc chuyển đổi qua lại giữa các

dạng hợp chất hóa h c của nó. Chuyển đổi này có thể đ ợc th c hiện cả hai quá

trình sinh h c và phi sinh h c. Quá trình quan tr ng trong chu trình N bao gồm: s

cố định N, khoáng hóa, quá trình nitrate hóa và khử nitrate.

Hình 1.3. Chu trình N trong t nhiên

S chuyển hoá củ N trong m i tr ờng phụ thuộc vào nhiều yếu tố ảnh

h ởng nh : pH, s phân tầng n c, nhiệt độ, độ mặn...Việc cung cấp N vào các

chu trình vật chất trong t nhiên phụ thuộc nhiều vào quá trình phân huỷ sinh h c

Đồ án tốt nghiệp

các hợp chất chứa N trong môi tr ờng. S tr o đổi và phân huỷ sinh khối khác nhau

đ ng kể giữ n i sống, kích cỡ và hoạt động sống của các quần xã VSV và nấm.

Tỷ lệ trung bình của C:N trong sinh khối VSV xấp xỉ 10:1; Th c vật có tỷ lệ C:N là

40+8 : nghĩ l ó s thiếu hụt N; Động vật duy trì tỷ lệ C:N gần bằng tỷ lệ của

VSV phân huỷ, gây phân hủ nh nh Trong đất, tỷ lệ C:N ổn định nhất là ~10.

+ ó xu h ng đ ợc giải phóng.

Theo Begon (1990), khi một chất ó h m l ợng N < 1.2+ 3% đ ợc bổ sung vào + n o ũng đ ợc hấp thụ, còn khi các chất ó h m l ợng N > đất thì bất kỳ ion NH4

8% đ ợc bổ sung bởi các ion NH4

+), nitrite (NO2

Nit trong m i tr ờng tồn tại ở nhiều dạng hóa h c khác nhau bao gồm N -), nit xit (N2O), nitric ôxit -), nitrate (NO3 hữu nh moni (NH4

(NO), hoặc nit v nh khí N (N2). Các quá trình trong chu trình N chuyển đổi N

từ một dạng này sang dạng khác. Một số qu tr nh n đ ợc tiến hành bởi các VK,

qu qu tr nh đó hoặ để chúng lấ n ng l ợng hoặ để tích tụ N thành một dạng

cần thiết cho s phát triển của chúng. Việc chuyển hóa N hữu gồm 4 gi i đoạn:

- Cố định đạm: cố định N phân tử ngoài không khí thành NH3 i tác dụng

của hệ enzyme nitrogenase và hydrogenase kết hợp N2 v i H2. Sinh vật có

khả n ng ố định đạm là VK và vi tảo, đặc biệt là VK sống cộng sinh trong

+ bằng

nốt sần h đậu nh Azoto ter e e v Rhizo i e e

- Amoni hóa: thủy phân protein và oxy hóa các axit amin thành NH4

enzyme protease do VK Actinomycetes và nấm tạo ra.

- bởi chủng VK Nitrosomonas; Nitrate hóa: NO2

+ thành NO2

- Nitrate hóa: gồm có nitrite hóa và nitrate hóa. Nitrite hóa: oxy hóa NH3, - đ ợc oxy NH4

hóa tiếp do chủng VK Nitrobacter thành NO3-.

- Khử nitr te : trong điều kiện m i tr ờng ít hoặc không có oxy (ngập úng, cặn

lắng...) sẽ di n ra quá trình khử nitr te Trong đó NO3- đ ợc các VK sử dụng

làm chất nhận điện tử cuối cùng (chất gây oxy hoá) và chuyển hóa thành các -, NO, N2O và cuối cùng khử thành N2 trả lại cho khí chất trung gi n nh NO2

quyển. Quá trình này xả r o VK nh Pseudomonas denitrificans,

Bacillus spp ,…

Đồ án tốt nghiệp

Do mụ ti u đề tài, sinh viên th c hiện đề tài chỉ tìm hiểu sâu về quá trình

phản nitrate, các phần còn lại của chu trình N sẽ hạn chế trình bày.

1.2.2. Quá trình phản nitrate ở tế bào vi khuẩn

nhiệm v đ ợc khái niệm là quá trình khử NO3

- → NO2

Phản nitrate là một trong những quá trình chính củ hu tr nh N o VK đảm - thành khí N2 theo 4 gi i đoạn - → NO (k) → N2O (k) → N2(k), thông qua các phản ứng: bản sau: NO3

khử nitrate hô hấp, khử nitrite hô hấp, khử NO hô hấp và khử N2O hô hấp Trong đó -, NO, N2O là các sản phẩm trung gian và mỗi gi i đoạn củ qu tr nh đ ợc xúc NO2

tác bởi 1 hệ enzyme khác nhau. Quá trình khử nitrate dạng này g i l “khử nitrate dị

hó ”

Hình 1.4. Chu trình N thu g n do VK th c hiện (Walter G. Zumft, 1997)

Nh đã tr nh ở trên , số l ợng VK có thể th c hiện quá trình phản nitrate

hoá khá phong phú. Có ít nhất 14 chủng VK đ ợc biết là có khả n ng phản nitrate

hoá. Ví dụ: Bacillus spp., Pseudomonas spp., Methanomonas denitrificans,

Paracoccus denitrificans, Spirillum, Thiobacillu denitrificans ...

Phần l n VK phản nitrate hoá là VK dị ỡng tức là chúng cần nguồn C hữu

(met nol, xit eti , met n, xit itri ) để tổng hợp tế bào, chỉ có một số ít VK

phản nitrate hoá là VK t ỡng, sử dụng nguồn C v để tổng hợp tế bào. Ví dụ:

loài Thiobaccillus denitrificans có khả n ng ox ho l u huỳnh nguyên tố lấ n ng

l ợng và sử dụng nguồn C từ CO2 hoà tan hoặc HCO3- để tổng hợp tế bào.

Đồ án tốt nghiệp

Hầu hết VK phản nitrate hoá là VK hô hấp kỵ khí tuỳ nghi (trừ Pseudomonas

stutzeri, Paracoccus denitrificans là VK phản nitrate hiếu khí), có thể sử dụng O2 - làm chất nhận điện tử cuối cùng trong quá trình hô hấp. Có thể giải thích hoặc NO3

nh s u:

trình hô hấp, g i là hô hấp hiếu khí, khi nguồn O2 cạn kiệt VK sử dụng NO3

Khi có mặt O2, VK sẽ sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng trong quá - hoặc - nh hất nhận điện tử cuối cùng cho quá trình hô hấp, g i là hô hấp có thể là NO2

kỵ khí C hế củ qu tr nh l t ng t nhau, s khác nhau duy nhất giữa hô hấp

hiếu khí và hô hấp kỵ khí là enzyme xúc tác cho s vận chuyển điện tử. O2 phải - đ ợc loại trừ để tạo điều kiện cho quá trình khử nitrate di n ra. Nếu cả O2 và NO3

cùng có mặt thì VSV sẽ u ti n sử dụng O2 làm chất nhận điện tử, do hô hấp hiếu

khí sinh ra nhiều n ng l ợng h n h hấp thiếu khí.

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O (Go’ = - 2,870 kJ/1mol Glucose)

- + 4H+ → 3 CO2+ 12N2 + 42H2O (Go’= - 2,670 kJ/1mol

5 C6H12O6 + 24 NO3

Glucose)

- + 6H+ → 6CO2 + 3 NH4

+ + 3H2O (Go’ = -1,870kJ/1mol

C6H12O6 + 3 NO3

Glucose)

NH4

+, VSV có khả n ng khử NO3

- thành NH4

Các VSV cần N để tổng hợp protein là thành phần cấu trúc của tế bào và + là nguồn N VSV có thể sử dụng tr c tiếp để tổng hợp Trong tr ờng hợp + để sử dụng. Khi không sẵn có nguồn NH4

đó một phần N đã đ ợc chuyển vào trong tế bào, quá trình khử N dạng n đ ợc

g i l “khử nitr te đồng ho ”

1 C hế quá trình phản nitrate

Tìm hiểu sâu về quá trình phản nitr te, th hế của quá trình di n ra theo

hai mụ đí h hính:

+ để tổng hợp nên cấu trúc tế bào, g i là khử

- Tổng hợp n ng l ợng cho quá trình hô hấp kỵ khí, g i là khử nitrate dị hóa.

- Chuyển hóa NO3- thành NH4

nitr te đồng hóa.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.5. Quá trình khử nitrate dị hóa và khử nitr te đồng hóa trong chu trình N

của VK nhân th c (Walter G. Zumft, 1997)

Khử nitrate dị hóa

Trong khử nitrate dị hóa, xả r đồng thời hai quá trình khử nitrate hóa - thành

- → NO (k) → N O (k)

(denitrificans) và amôn hóa (ammonification). Cả h i đều chuyển hóa NO3 - v sinh n ng l ợng ở điểm khởi đầu thông qua quá trình hô hấp kỵ khí. NO2

- Khử nitrate tiếp tục các quá trình khử liên tiếp NO2

và cuối cùng tạo ra N2, v i s xúc tác của các enzyme khử đ ợc mã hóa tổng

hợp bởi các gen: Nap, Nar (hô hấp khử nitrate), Nir (hô hấp khử nitrite), Nor

(hô hấp khử oxit nitric), Nos (hô hấp khử oxit nito) S u đ l s đồ quá

trình khử nitrate dị hóa ở tế bào VK.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.6. C hế quá trình khử nitrate dị hóa (hô hấp kỵ khí)

Trong m i tr ờng kỵ khí O2 vắng mặt, để tiếp tục duy trì s sống VSV buộc

-, SO4

phải t m t nh n kh để thay thế O2 th c hiện quá trình hô hấp, và các tác nhân 2+, … Trong m i tr ờng có

nhiều ion NO3

đó hầu hết là các nguyên tử chứa O2 nh NO3 - thì qu tr nh đ ợc di n r nh s u: - đ ợc hấp thụ qua màng ngoài tế o v đ ợc chuyển hóa thành các Ion NO3

dạng khác nhau tại khoảng không gian ngoại vi bào (periplasm). Ở đ , oxit ủa

N lần l ợt đóng v i trò nh hất nhận điện tử cuối cùng thay cho O2, để tạo nên nấc

th ng điện hóa qua màng sinh chất trong quá trình hô hấp kỵ khí của tế bàoVK .

Sau mỗi phản ứng chuyển hóa, phân tử oxy dần đ ợc lấy ra khỏi oxit N để phục

vụ cho quá trình hô hấp của tế bào và cuối cùng là tạo ra N2 thải ra bên ngoài.

- Khử nitrate dị hó m n hó : qu tr nh n òn đ ợc g i là quá trình khử

độc tế bào.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.7. C hế quá trình khử nitrate dị hóa amôn hóa

Khi nồng độ nitrite trong tế o VK t ng o, ó thể g độc cho tế bào vì

nitrite thành NH4

+ do gen NrfA mã hóa, NO2

- thành NH4

thế trong tế bào VK xả r hế khử độc nitrite cho tế bào bằng cách chuyển hóa + và NH3. Hai hợp chất này có thể phục vụ cho quá trình nitrate - thành hóa. Enzyme xúc tác chuyển hóa NO2

NH3 do hệ gen phức tạp NrfHA mã hóa.

+ là nguồn N cho

Khử n trate đồng hóa

Khử nitr te đồng hó đ ợc di n ra v i mụ đí h tạo ra NH4

quá trình tổng hợp tế bào của VK. Enzyme xúc tác cho s chuyển hóa nitrite thành

amoni và amoniac là do gen NirA và NasB mã hóa.

Cả h i hế khử nitrate dị hóa và khử nitr te đồng hó , đầu đều khử nitrate

về nitrite nh ng enz me xú tác là khác nhau. Ở khử nitr te đồng hóa enzyme xúc

tác do gen Nas mã hóa, trong khi khử nitrate dị hó l o gen N r/N p mã hó Nh

vậy, trong quá trình phản nitrate chỉ có quá trình khử nitrate dị hóa – hô hấp nitrate

kỵ khí m i ó nghĩ xử lý N trong n c thải Đó l sở để tiến hành phân lập

chủng VK mong muốn Nghĩ l hủng VK đó ó khả n ng khử nitrate và khử

nitrite hoàn toàn, tạo thành các phân tử khí N2O, NO, tốt nhất là tạo ra khí N và

không hoặc ít tạo ra amoni. Vì nếu l ợng amoni tạo ra nhiều sau quá trình xử lý thì

Đồ án tốt nghiệp

việc ứng dụng VK đó v o xử l n c thải kh ng òn nghĩ , ng ợc lại còn làm cho

n c ô nhi m nghiêm tr ng h n

1.2.2.2. Các yếu tố ảnh h ởng đến quá trình phản nitrate

Các yếu tố ảnh h ởng mạnh mẽ đến quá trình phản nitrate đã đ ợc tìm hiểu

và nghiên cứu là: nguồn cung cấp C, điều kiện m i tr ờng kỵ khí (s vắng mặt của

oxy phân tử và s hiện diện của ion nitrate), s hiện diện của VK có khả n ng phản

nitr te, điều kiện thích hợp cho s phát triển của VK.

 Nguồn cung cấp carbon v n ng l ợng (C hất):

Để quá trình khử nitrate xảy ra hoàn toàn thì nguồn cung cấp n ng l ợng và

carbon (C) phải l n h n nồng độ ion nitrate hoặ nitrite, đ l ếu tố quan tr ng

quyết định quá trình phản nitrate. Khi nồng độ ox trong m i tr ờng giảm thấp, các

VK kỵ khí tùy nghi hay kỵ khí có s chuyển đổi về hệ thống enzyme từ việc sử

dụng oxy làm chất nhận điện tử sang có thể sử dụng ion nitrate hoặc nitrite là chất

nhận điện tử. Quá trình hô hấp kỵ khí di n ra phức tạp h n h hấp hiếu khí nên

nguồn C v n ng l ợng cần phải nhiều h n Việc khử nitrate hoàn toàn hoặc loại bỏ

tất cả các ion nitrite và các ion nitrate di n ra khi tỷ lệ giữa nguồn cung cấp C và

n ng l ợng v i ion nitrate hoặc ion nitrite vào khoảng 3: , trong n c thải tỷ lệ này

có thể là 3:1.05. Nguồn C v n ng l ợng VK phản nitrate sử dụng th ờng là các

hợp chất hữu phân hủy sinh h nh : meth nol, xit xeti , glu ose, eth nol,

NO3

… Trong đó, xit eti v meth nol l h i hợp chất th ờng sử dụng nhiều nhất. - + 0,85CH3COOH + H+ → , C5H7O2N + 0,45N2 + 1,2CO2 + 2,1H2O - + 1,8CH3OH + H+ → , 65C5H7O2N + 0,47N2 + 0,76CO2 + 2,44H2O NO3

Meth nol l hất đ ợ u ti n sử dụng nhiều h n, o meth nol l hất d

hò t n, nh nh hóng đi v o n trong tế o VK v ũng dàng bị chuyển hóa.

Bảng 1.5. Nồng độ methanol sử dụng để khử nitrate hoặc nitrite hoàn toàn (A)

(Michael H. Gerardi, 2002)

Ion chứa N (A)/(1 mg/l ion chứa N) Tế bào m i N đ ợc dùng tổng hợp tế bào

1,5 mg/l 0,3 mg 0,04 mg NO2

- -

2,5 mg/l 0,5 mg 0,06 mg NO3

Đồ án tốt nghiệp

Đ ều kiện mô trƣờng kỵ khí:

Phân tử oxy hòa tan ức chế quá trình phản nitrate do s cạnh tranh v i các

ion nitrate và nitrite trong vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng cho quá trình phân

hủy chất hữu

Khi ox đi v o tế bào VK, thì việc sử dụng oxy làm chất nhận điện tử cho

quá trình hô hấp sẽ u ti n h n việc sử ion nitrate hoặc nitrite, do việc sử dụng oxy

hòa tan mang lại nhiều n ng l ợng và d tổng hợp tế o h n Nồng độ oxy hòa tan

l n h n , - 0,5 O2 mg/l thì làm giảm đ ng kể tố độ của quá trình khử nit ho n

toàn.

Để quá trình phản nitrate xảy ra thì quá trình nitrate hóa phải xả r , đ l

điều kiện tiên quyết cho quá trình khử nitr te Độ l n của nồng độ nitrate hoặc

nitrite ít ảnh h ởng đến quá trình khử nitrate. Khi nồng độ nitrate > 0,5 mgN/l, thì

s khử nitrate sẽ không phụ thuộc vào nồng độ nitrate.

 S hiện diện của vi khuẩn phản nitrate:

Trong quá trình bùn hoạt tính, khoảng 80% VK là VK kỵ khí tùy nghi và có

khả n ng khử nitrate. Vì trong quá trình này, dung tích hỗn hợp khá l n bao gồm

c hất cần thiết và cả các chất l lững tan hoặc không tan có thể gây ảnh h ởng

đến quá trình, nên cần một l ợng l n VK mụ đí h để đảm bảo quá trình khử nitrate

di n ra thuận lợi. Có thể bổ sung VK khử nitrate vào quá trình xử lý từ các chế

phẩm sinh h đặ tr ng

 Điều kiện thích hợp cho vi khuẩn phát triển:

- pH: Khử nitrate có thể xảy ra trong phạm vi pH rộng 6,5 – 8,5, đ ũng l

khoảng pH thích hợp cho quá trình hình thành bông cặn trong gi i đoạn bùn

hoạt tính. Tố độ khử nitrate sẽ chậm lại khi pH<6,5 hoặc >8,5. Mặt khác,

khi giá trị pH<6 không chỉ ức chế quá trình khử nit , m òn ả quá trình

nitrate hóa, và việc tạo ra khí N là không thể. Khoảng pH tối u ho qu

trình khử nitrate là 7,0 – 7,5.

- Nhiệt độ: Khử nitrate xả r nh nh hóng h n ở nhiệt độ t ng v ng ợc lại sẽ chậm h n khi nhiệt độ giảm, nhiệt độ tối u ho qu tr nh l 4 oC. Khử

Đồ án tốt nghiệp

nitrate bị ức chế trong n c thải ở nhiệt độ < 5oC. Khi nhiệt độ t ng th s

hò t n ox trong n c giảm nhiều h n so v i n c có nhiệt độ giảm. Vì

vậy, oxy hòa tan bị cạn kiệt nh nh h n trong điều kiện n c thải có nhiệt độ

cao nên quá trình khử nitrate xảy ra d ng h n

- Bên cạnh các yếu tố trên, thì s vắng mặt hoặc hiện diện ở nồng độ thấp của

các hợp chất độc hại trong m i tr ờng khử nitrate là một yêu cầu cần nhắc

đến nhằm đảm bảo cho quá trình xảy ra thuận lợi. So sánh s nhạy cảm đối

v i chất độc hại giữa VK t ỡng và VK dị ỡng thì ở VK t ỡng ó độ

nhạy cảm o h n, n n nếu quá trình nitrate hóa có thể xảy ra trong quá trình

bùn hoạt tính, thì hiển nhiên sẽ có quá trình khử nitrate xảy ra.

1.3. Tổng quan về một số vi khuẩn phản nitrate

VK phản nitrate phân bố rộng rãi trong t nhiên. Phần l n chúng thuộc loại

dị ỡng hó n ng hữu , kỵ khí hoặc kỵ khí tùy nghi.

Theo tổng quan về vi khuẩn phản nitrate (denitrifier) trong Prokaryote tập 2,

Shapleigh, 2006 liệt kê một danh sách l n các vi khuẩn phẩn nitrate bao gồm vi

khuẩn Gr m m v Gr m ng S u đ l một số loài VK có khả n ng phản

nitr te đã đ ợc nghiên cứu và có tiềm n ng ứng dụng.

1.3.1. Pseudomonas stutzeri

Đ l VK ó khả n ng khử nitrate thành N phân tử trong m i tr ờng hiếu

khí, vì thế Pseudomonas stutzeri đ ợc ứng dụng khá rộng trong m i tr ờng n c

chứa nhiều chất đạm tại các ao hồ nu i tr , s …v đặc biệt trong xử l n c

thải đặ tr ng

3 Đặ điểm

Pseudomonas stutzeri là VK gram âm, hình que, di chuyển bằng một c c

ti m m o Kí h th c tế bào: dài 1 - 3 µm, rộng 0,5µm. Khuẩn lạc có hình dạng

kh ng ki n định khi đ ợc phân lập tr c tiếp, khuẩn lạc có dạng sần, khô, bám chặc

v i nhau.

Pseudomonas stutzeri là VK dị ỡng hó n ng hữu , kh ng ó sắc tố và

có thể t ng tr ởng trong m i tr ờng amylase, maltose, tinh bột, cho kết quả ng

Đồ án tốt nghiệp

tính v i phản ứng t l se, oxi se, in ol v qu tr nh ox hó nh ng kh ng ph t

triển trong gel tin se, kh ng l n men đ ờng glucose, lactose, sucrose và cho kết

quả âm tính v i thử nghiệm VP-MR . Là VK hiếu khí, phân bố rộng rãi trong t

nhi n nh ng đ ợc tìm thấy chủ yếu trong đất v n c. Nhiều òng đ ợc phân lập từ

các m u bệnh lý. Chúng có khả n ng hu ển hóa, làm giảm các chất độc cho môi

tr ờng và các hợp chất có tr ng l ợng phân tử o nh pol eth lene gl ols.

D a vào các nghiên cứu gen (trình t 16S rRNA) cho thấy Pseudomonas stutzeri

t ng đồng v i lo i nh Pseudomonas mendocinia, Pseudomonas

alcaligenes, Pseudomonas pseudoalcaligenes và Pseudomonas balearica.

Hình 1.8. Hình thái khuẩn lạc Pseudomonas stutzeri

2.3.1.2. Ứng dụng

Pseudomonas stutzeri là loại VK khử nitrate, không phát quỳnh quang. Gần

đ nhiều nhà nghiên cứu khoa h đ ng hú đến khả n ng hu ển hóa chuyên

biệt của nó.

Một vài dòng có thể chuyển hóa các hợp chất th m nh n phthalene và

mathylnapthalenes. Hai hợp chất th m n hiện diện nhiều trong dầu thô, là chất có

tiềm n ng g độc. P.stutzeri đ ợ đề cập nh một hệ thống khử nitrate vì nó có

khả n ng l m giảm nitrate thành khí N2. Một số loài có khả n ng iến đổi t nhiên,

l đối t ợng thích hợp cho các nghiên cứu về s biến đổi gen trong m i tr ờng.

Ở Việt Nam, các chủng VK đị ph ng khử đạm mạnh, phù hợp v i điều

kiện sinh th i đị ph ng ó thể ứng dụng vào xử l m i tr ờng n đã đ ợc các

Đồ án tốt nghiệp

nhà khoa h c nghiên cứu, đặc biệt gần đ nhất l đề tài phân lập VK

Pseudomomas stutzeri có khả n ng khử đạm mạnh trong n c thải ao cá tra ở Đồng

Bằng Sông Cửu ong v đ ng ần đ v o ứng dụng xử l n c thải.

1.3.2. Paracoccus denitrificans

1.3.2.1. Đặc điểm

Paracoccus denitrificans là VK gram âm, hình cầu, kh ng i động Tr c

đ đ ợc biết đến v i tên Micrococcus denitrificans, lần đầu ti n đ ợc phân lập vào

n m 9 ởi M Beijerin k, v o n m 969 đổi tên thành Paracoccus denitrificans

bởi DH Davis. P. denitrificans là một sinh vật mô hình cho việc nghiên cứu quá

trình khử N. Là VK có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí l n kỵ khí.

Paracoccus denitrificans l VK ó qu tr nh tr o đổi chất linh hoạt đ ợc tìm

thấ trong đất và bùn hoạt tính, có thể sử dùng cả hai nguồn n ng l ợng v v

hữu , từ các hợp chất hữu nh meth nol v meth l mine, hợp chất v nh

h ro v l u huỳnh (thiosulfate). Là VK có khả n ng đảm nhiệm vai trò khử hoàn

toàn nitrate thành N phân tử vì chứa cả 3 enzyme quan tr ng trong quá trình khử

nitrate.

Là VSV phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, thể hiện một chuỗi hô hấp rất

giống v i ty thể ó nh n điển hình. P. denitrificans đã v v n tiếp tục là chủ đề của

nhiều nghiên cứu sinh hóa và sinh h c chuyển hó n ng l ợng, tính chất ản của

chuỗi vận chuyển điện tử hiếu khí. Các bằng chứng từ 16S rRNA phân tích chỉ ra

rằng tiền thân tiến hóa của ty thể là một h hàng gần của P. denitrificans.

Hình 1.9. Hình thái tế bào và khuẩn lạc Paracoccus denitrificans

Đồ án tốt nghiệp

1.3.2.2. Ứng dụng

Paracoccus denitrificans tạo r h n 5 protein Trong đó ó nhiều protein

và enzyme rất có ích trong các ứng dụng công nghệ sinh h c. Một số ứng dụng nh

làm chất xúc tác các phản ứng sinh h c, làm màng l vi sinh để loại bỏ N khỏi

n c thải. Paracoccus denitrificans có khả n ng khử nitrate thành khí N hiệu quả.

Trong ứng dụng này, Paracoccus denitrificans kết hợp v i Nitrosomonas europaea

làm giảm amoni thành nitrite. Hệ thống n giúp đ n giản hóa quá trình loại bỏ N

trong n c thải.

Các chủng Paracoccus denitrificans đ ợc phân lập từ bùn hoạt tính có thể

phân hủy một loạt min meth l hó trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí, các

chủng thuộc dạng t ỡng hó n ng v ó khả n ng l m giảm các hợp chất C

bậc bốn nh imeth lm lon te trong điều kiện khử nitrate kỵ khí. Một số chủng có

khả n ng khử N hiếu khí, khử hoàn toàn nitrate thành N phân tử trong điều kiện

t ng tr ởng hiếu khí.

1.3.3. Bacillus azotoformans

1.3.3.1. Đặc điểm

Bacillus azotoformans là một tr c khuẩn gr m ng, i động v đ ợc tìm

thấ trong đất, có khả n ng khử ho n to n nitr te th nh khí N trong điều kiện kỵ

khí. Tế bào B. azotoformans có hình bầu dục v i kí h th c 1,4 x 2 - 2,5 µm, sinh bào tử. Phát triển ở pH 6 – 7, nhiệt độ 42 – 460C, ở 40C VK ng ng ph t triển.

Bacillus azotoformans có kết quả ng tính v i thử nghiệm oxidase, khử

nitr te v itr te nh ng kh ng ó khả n ng l n men, ph n hủy tinh bột, gelatin,

Tween 80 và cho kết quả âm tính v i thử nghiệm VP-MR, catalase, urea, indol.

2.3.3.2. Ứng dụng

Tứ đặc tính trên, Bacillus azotoformans đ ợc ứng dụng trong xử l n c

thải chứ N nh n c thải thủy sản, n c thải chế biến thịt v đ ng ó nhiều nghiên

cứu về việc ứng dụng B. azotoformans trong lĩnh v c cuộc sống.

1.3.4. Thiobacillus denitrificans

1.3.4.1. Đặc điểm

Đồ án tốt nghiệp

Thiobacillus denitrificans là VK gram âm, tế bào có hình que ngắn (0,5 x 1,0

– 3,0 µm). Là VK t ỡng hó n ng v , trong m i tr ờng kỵ khí tùy ý, có khả

n ng ox hó hợp chất l u huỳnh v nh h rogen sulfi e, thiosulf te để

khử các hợp chất N nh nitr te, nitrite đến khí N Điều kiện tối u ho qu tr nh khử N là pH 6,85 ở 32,8oC, trong khi đó điều kiện tốt nhất cho s t ng tr ởng là pH 6,90 ở 29,5oC. Thiobacillus denitrificans có thể khử N trong m i tr ờng có chứa

các hợp chất Fe nh FeS2, FeS.

Hình 1.10. Hình thái tế bào Thiobacillus denitrificans

VK i động đ ợc bằng một c c tiêm mao, khuẩn lạ tr n m i tr ờng

thạch thiosulfat/ nitrate yếm khí cho màu trắng đục. Thiobacillus denitrificans phát

triển chậm, kh ng ó gi i đoạn ổn định rõ r ng Nh ng ph log đạt đ ợc ở gi i đoạn

khử N tối đ , 45 mg/l.

Mặc dù Thiobacillus denitrificans là một sinh vật kỵ khí tù nghi, nh ng nó

có thể sống trong điều kiện hiếu khí. Thiobacillus denitrificans đ ợc tìm thấy trong

đất, ùn, n c ng t, biển trầm tí h, n c thải và bể xử l n c thải trong điều kiện

thiếu khí. Thiobacillus denitrificans đ ợc phân lập đầu tiên bởi Beijerin k v o n m

1904.

1.3.4.2. Ứng dụng

T. denitrificans đ ợc ứng dụng trong việc loại bỏ nitr te thừa trong nguồn

n c ngầm t nhiên. Là VK t ỡng đầu tiên và duy nhất có thể oxy hóa uranium

(IV), oxit ur nium trong điều kiện kỵ khí tù nghi n n đ ợc dùng khắc phục các

Đồ án tốt nghiệp

tầng chứ n c bị ô nhi m uranium. L VK đ ợc ứng dụng trong xử l n c thải có

chứa cả các hợp chất l u huỳnh và N.

Bảng 1.6. Tóm tắt đặc tính hình thái và sinh lý, sinh hóa của các vi khuẩn phản nitrate tiềm n ng

Đặ đ ểm

Pseudomonas stutzeri

Paracoccus denitrificans

Thiobacilus denitrificans

Achromo- bacter xylosoxidans

Bacillus azotofor- mans

Hình thái

Gram

Cầu

Que

Que ngắn

Que

Hình dạng

Que

0,4x1,1

0,5x1,0-1,5

0,4x0,7–1,0

Kí h th c

0,5 x 1,0 - 3,0 m

1,4 x 2- 2,5m

m

Tiên mao

Sinh lý

Yêu cầu oxy

Hiếu khí

Kỵ khí tùy nghi Kỵ khí tùy nghi

Kỵ khí tùy nghi

Di động

M i tr ờng

25oC

M i tr ờng

28 – 32oC

42 – 46oC

Nhiệt độ

Nội bào tử

Sinh hóa

k x đ

Catalase

k x đ

O+/F-

O-/F-

O+/F-

O/F

k x đ

Oxidase

k x đ

Indol

k x đ

Sử dụng citrate

k x đ

Khử nitrate

Đồ án tốt nghiệp

(k x đ = kh ng x định).

1.4. Tổng quan p ƣơng p áp p ân lập vi sinh vật [2]

Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, VSV th ờng tồn tại

ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý,

lý hoá hoặc sử dụng vào th c ti n một lo i n o đó th ần phải đ húng về dạng

thuần khiết.

1.4.1. Khái niệm

Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể n đầu và

đ về dạng thuần khiết Đ l một kh u ó nghĩ rất quan tr ng trong việc

nghiên cứu và ứng dụng VSV. VSV ở dạng thuần khiết là giống VSV đ ợc tạo ra từ

một tế o n đầu.

D a theo nguyên tắc: tách rời các tế bào VSV; nuôi cấy các tế bào trên trong

m i tr ờng inh ỡng đặ tr ng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.

1.4.2. Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết

Gồm ản sau:

- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể VSV n đầu: hóa lỏng m u

phân lập, ph loãng đến nồng độ cần thiết, tiến hành cấy m u trên môi

tr ờng đặ tr ng, để ó đ ợc chủng thuần có thể lập lại nhiều lần pha

loãng đến khi khuẩn lạc xuất hiện tr n m i tr ờng thạ h đều đồng

nhất.

- Phân lập VSV thuần khiết: cấy chuyền nhiều lần đối v i từng loại

khuẩn lạc riêng rẽ, có thể tiến hành cấy ria hoặc cấy trang. Chủng

thuần khi khuẩn lạ tr n m i tr ờng là cùng một loại duy nhất, có

hình thái giống v i khuẩn lạ n đầu. Mỗi khuẩn lạ đ n hỉ chứa

một loại tế bào có hình thái giống nh u trong qu n s t i kính hiển

vi. Khi th c hiện phải tuân thủ nghiêm túc các yêu cầu về thao tác vô

trùng.

Đồ án tốt nghiệp

- Kiểm tr độ tinh khiết của các khuẩn lạc: ch n các khuẩn lạc riêng rẽ

tr n m i tr ờng thạ h, s u đó ph loãng ở các nồng độ cần thiết bằng

n c muối sinh lý vô trùng, tiến hành cấ tr ng đối v i các nồng độ

pha loãng. Ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp, quan sát nếu khuẩn lạc

đồng nhất về màu sắc, hình dạng th đ ợc giữ lại, ng ợc lại khuẩn lạc

không thuần nhất thì loại bỏ. S thuần khiết của khuẩn lạ đồng nghĩ

v i s thuần khiết của giống.

Việc l a ch n nguồn lấy m u ũng kh ần thiết, từ m i tr ờng lấy m u đặc

tr ng t ó thể d dàng phân lập đ ợc chủng VSV mong muốn.

Sau quá trình làm thuần chủng VSV phân lập, c kế tiếp có thể là xác

định hình thái VSV bằng ph ng ph p nh nhuộm gram, nhuộm bào tử, nhuộm

tiêm mao, nhuộm vỏ nhày,... Và th c hiện các thử nghiệm sinh hó nh : kiểm tra

khả n ng l n men, ox hó tr n m i tr ờng OF, thử nghiệm Indol, VP-MR,

Catalase, Oxi se, Citr te,… để từ đó tu ển ch n đ ợc chủng cần phân lập.

1.4.3. Giữ và bảo quản giống

- Ph ng ph p ấy chuyền định kỳ: áp dụng cho tất cả các loại VSV.

Ph ng ph p n đ n giản, d th c hiện nh ng thời gian bảo quản

không lâu, tốn m i tr ờng, thời gian và phẩm chất n đầu của giống

có thể bị th đổi sau mỗi lần cấy chuyền.

- Ph ng ph p giữ giống tr n m i tr ờng thạch có l p dầu khoáng: v i

yêu cầu các chất dầu kho ng nh p r fin lỏng, v z lin phải trung tính, độ nh t o, kh ng độc hại v i VSV và vô trùng (hấp 121oC, 2 giờ; sấy khô trong tủ sấy ở 170oC, 1-2 giờ). Dầu kho ng đ ợc cho lên bề

mặt m i tr ờng đã ấy VSV, cách mép trên ống nghiệm 1 m Đối v i

VSV kỵ khí cần loại bỏ O2 trong m i tr ờng tr c khi cấy chủng vào

và tiến hành cho l p dầu khoáng vào thật nh nh Ph ng ph p n

kh đ n giản nh ng ó hiệu quả cao nhờ khả n ng l m hậm quá trình

biến ỡng và hô hấp, làm cho VSV phát triển chậm lại Ph ng ph p

n kh ng l m m i tr ờng mất n c và khô.

Đồ án tốt nghiệp

- Ph ng ph p giữ giống tr n đất, cát, hạt: Đất và cát l m i tr ờng

dùng bảo quản các chủng có khả n ng tạo bào tử tiềm sinh, thời gian

bảo quản từ một đến nhiều n m Đất, t s u khi s hế (loại bỏ axit

hữu , rửa kỹ, sấ kh , v trùng) th đ ợc cho vào ống nghiệm có

VSV đã ph t triển tr n m i tr ờng thạch, lắ đều, cho toàn bộ vào ống

nghiệm khác và hàn kín miệng sẽ bảo quản đ ợc rất lâu; Hạt là môi

tr ờng ùng để bảo quản các chủng có dạng sợi sinh bào tử hoặc

không. Thời gian bảo quản có thể đến một n m Hạt s u khi đ ợc rửa

sạch, nấu cho vừa nứt, để ráo, cho vào ống nghiệm và phủ một l p

bông thấm n c nấu hạt, cấy giống vào, khi VSV m c dày đặc thì giữ ở nhiệt độ 15 – 20oC.

- Ph ng ph p đ ng kh : l m mất n c tế bào ở trạng thái t do, làm

ng ng hẳn quá trình phân chia của VSV, nhờ đó giống có khả n ng

chịu đ ợc nhiều t động của ngoại cảnh Ph ng ph p n đ ợc áp

dụng trong sản xuất, thời gian bảo quản l n đến vài chụ n m

S l a ch n VSV ở gi i đoạn phát triển thích hợp ũng l ếu tố khá quan

tr ng trong việc bảo quản giống.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thờ g an và địa đ ểm th c hiện đề tài

- Thời gian: Từ ngày 21/4/2015 – 21/7/2015

- Đị điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Công nghệ sinh h c – Th c

Phẩm – M i tr ờng tr ờng Đại H c Công Nghệ TPHCM.

2.2. Vật liệu – thiết bị - hóa chất

2.2.1. Vật liệu

- Nguồn phân lập vi khuẩn: M u n c thải đ ợc thu thập từ bể gom n c

thải của công ty chế biến thủy sản Tân Phú Kiên Giang – số 4 đ ờng

Minh H ng, ấp Hò H ng, xã Minh Hò , hu ện Châu Thành, tỉnh Kiên

Giang.

2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

- Nồi tiệt trùng Autoclave, cân điện tử, m l t m, m đo độ hấp thụ

quang h c, máy lắc.

- Cốc thủy tinh, erlen thủy tinh, pipet, micropipette, ống nghiệm, đĩ petri,

eppen orf, xil nh…

2.2.3. Hóa chất

- M i tr ờng Giltay (Egorov NS,1986)

- M i tr ờng NB (Nutrient Broth) t ng sinh vi khuẩn.

- M i tr ờng OF (Harley, P. et al., 2002).

- M i tr ờng MR-VP (Harley, P. et al., 2002).

- M i tr ờng Indol (Harley, P. et al., 2002).

- Thuốc thử: Griess A, Griess B, Diphenylamine, Nessler (Egorov

NS,1986).

- Các hóa chất định l ợng nitrate, nitrite, amon (Nguy n V n Ph c,

2005).

- Bộ thuốc nhuộm Gram: Crystal Violet, Lugol, Fuchsin.

Đồ án tốt nghiệp

2.3. Bố trí thí nghiệm : Các bước thí nghiệm được trình bày tóm tắt theo sơ đồ

Nƣớc thải CBTS

T ng sinh trong MT Gilt NO3- và Giltay NO2-

Định tính khả n ng khử

Qu n s t m i tr ờng đục, sinh khí

Định tính khả n ng khử NO3- (Diphenylamine)

Định tính khả n ng khử NO2 (Griess, Zn)

+ (Nessler)

NH4

12 ống nghiệm tăng s n đều đục sinh khí, và khử hoàn toàn

- trong mô trƣờng.

NO3- và NO2

- có bổ

Phân lập tr n m i tr ờng Giltay NO2

sung Phenol Red.

L a ch n khuẩn lạc làm hồng môi tr ờng xung quanh.

Làm thuần/ giữ giống trên môi tr ờng Giltay NO3

6 chủng VSV thuần khiết

- và

T ng sinh trong MT Gilt NO3

Giltay NO2

Định tính khả n ng khử

Định tính khả n ng khử NO3

Định tính khả n ng khử NO2

Qu n s t m i tr ờng đục, sinh khí

+ (Nessler)

NH4

định pH môi tr ờng

4 chủng VSV có khả năng k ử cả Nitrite và Nitrate

Thử nghiệm O/F, nhuộm Gram và các thử nghiệm sinh hóa khác.

Khảo sát khả n ng khử NO2 trong 48h

Định l ợng Nitrate, Nitrite, Amon tại các mốc khảo sát

Quan sát thể tích khí sinh ra trong xylanh

định pH m i tr ờng sau khi t ng sinh

Khảo sát khả n ng khử - trong 48h NO3

Định l ợng Nitrate, Nitrite, Amon tại các mốc khảo sát

Quan sát thể tích khí sinh ra trong xylanh

định pH m i tr ờng s u khi t ng sinh

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.1 S đồ tóm tắt bố trí c thí nghiệm

2.4. P ƣơng p áp ng n ứu th c nghiệm

2.4.1. Phương pháp lấy mẫu

M u n c thải đ ợc lấy từu bể thu gom của nhà máy CBTS. Khuấ đều

tr c khi lấy. M u đ ng trong can nh 5 lit đã đ ợc rửa sạ h v đ về phòng thí

nghiệm, s u đó tiến h nh ng c phân lập trong vòng 24 giờ.

2.4.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng VK có khả năng

phản nitrate

2.4.2.1. Phương pháp tăng sinh và phát hiện VSV có khả năng khử

nitrate

 P ƣơng p áp tăng s n

T ng sinh tr n m i tr ờng Giltay có chứa nguồn C là acid citric, nguồn N là

NaNO3/NaNO2 và một số chất quan tr ng kh M i tr ờng Giltay là một trong

những m i tr ờng t ng sinh đặ tr ng ho VK phản nitr te Do trong m i tr ờng

Giltay có chứa một l ợng l n Acid Citric (5,46875g/l) nên phải điều chỉnh pH môi

tr ờng về trung tính tr c khi sử dụng.

- Để sàng l c các VK phản nitrate có khả n ng hịu mặn bổ sung vào môi

tr ờng 1.5 – 3% NaCl.

- M i tr ờng tr n s u khi đ ợc chỉnh pH về khoảng 7 – 7,5 v i KOH 10%

đ ợc phân vào các ống nghiệm (5ml) có ống Durham, nút bông và nắp nh a hoặc nút bông có quấn Parafin, hấp tiệt trùng 121oC/15 phút.

- M u lấy về đ ợc pha loãng bằng n c muối sinh lý (0.85%) ở các nồng độ 10-2 – 10-7. Từ mỗi nồng độ, lần l ợt lấy 1ml m u cấy vào ống nghiệm chứa

m i tr ờng Gilt đã tiệt trùng.. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Ống đối chứng là m i tr ờng không cấy m u. Ủ ở nhiệt độ phòng (28±2oC) trong 7 ngày.

Đồ án tốt nghiệp

Dấu hiệu nhận biết s phát triển của VK khử Nitrate là có sinh khí trong ống

Durh m, đụ m i tr ờng v pH m i tr ờng giảm. Bảng ký hiệu sau giúp d dàng

nhận biết về s phát triển và s sinh khí của VK.

Bảng 2.1. Độ đụ m i tr ờng v l ợng khí sinh ra của các m u m i tr ờng

s u khi t ng sinh VK ph n lập

Độ đục MT

(sinh khối

MT không đục

MT đục ít

MT đục nhiều

MT đục vừa

VK tạo ra)

+

++

+

-

Ký hiệu

+

Sinh khí rất ít Sinh khí ít

Sinh khí vừa

Sinh khí nhiều

Sinh khí

+ ++ Ký hiệu * +

- Không

sinh

+ + Tiến hành kiểm tra nồng nộ nitrate - nitrite trong m i tr ờng s u t ng sinh

khí Griess B và bột kẽm, nồng độ NH4

VK bằng thuốc thử Diphenylamine và nồng độ nitrite bằng thuốc thử Griess A, + sinh ra bằng thuốc thử Nessler đối v i các ống

nghiệm ó m i tr ờng đục, ống Durh m sinh khí nh s u:

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.2. P ƣơng p áp định tính nồng độ nitrite trong mẫu

M u Nhỏ Griess A + Cho ột Kết luận

Griess B Zn (ít)

Không màu Đỏ hồng - D ng tính – có s khử

nitrate thành nitrite

Không màu Không màu Không D ng tính, có s sinh khí

màu trong ống Durham.

Không màu Không màu Đỏ hồng Âm tính – không có s khử

nitrate thành nitrite và không

sinh khí. M u ĐC (+) là môi tr ờng chứa ion NO- 2. ĐC (-) là n ất Bảng 2.3. Ph ng ph p định tính nồng độ nitrate

Mẫu Diphenylamine Kết luận

Không g ọt) Xanh V n còn nitrate trong môi tr ờng. Độ đậm nhạt

màu d a vào nồng độ còn lại ủ nitrate.

Không Không màu Nitrate đã đ ợ chuyển hóa hết

3 (Giltay). ĐC (-) là

màu M u đối chứng d ng ĐC (+) là môi tr ờng có chứa ion NO-

n ất.

Bảng 2.4. Ph ng ph p định tính nồng độ amoni:

Mẫu Nessler(1g ọt) Kết luận

Không Màu vàng , độ đậm nhạt phụ thuộ vào Có s tạo thành NH4 màu

Không Không màu + nồng độ Không ó s tạo thành NH4 màu M u ĐC (+) là dung dịch NH4Cl 0,5%, ĐC (-) là n ất

-/NO2

2.4.2.2. Phương pháp phân lập

Từ các ống ng tính khử nitrate/nitrite ở thí nghiệm tr n (Đục, sinh - (agar 2 – khí,khử nitrate), th c hiện cấ ri s ng m i tr ờng thạch Giltay NO3 2,5%), bổ sung thêm Phenol Red 1 mg/l. Ủ ở nhiệt độ phòng (28±2oC) trong 1 – 3

ngày. L a ch n các khuẩn lạc riêng lẻ, giảm pH m i tr ờng xung quanh khuẩn lạc

(làm hồng m i tr ờng xung quanh). Các khuẩn lạc khác nhau đ ợc cấy ria nhiều lần

- thạch nhiều lần ho đến khi thu đ ợc các chủng VK

Đồ án tốt nghiệp

tr n m i tr ờng Giltay NO3

thuần khiết.

- và NO2

Các chủng VK thuần khiết tr n đ ợc tiến hành cấ v o m i tr ờng GIltay - để tiến hành kiểm tra khả n ng khử nitr te/nitrite nh ở mục sau. NO3

2.4.2.3. Phương pháp tăng sinh VK phân lập trên môi trường Giltay

nitrate và nitrite

- M i tr ờng t ng sinh l m i tr ờng Giltay nitrate và Giltay nitrite. Mỗi

chủng VK lần l ợt đ ợc cấy vào các ống nghiệm chứ m i tr ờng trên (5

- v m i tr ờng Giltay NO2

ml) đ ợc hấp tiệt trùng, có ống durham. Mỗi chủng VK đ ợc cấy vào cả môi -, đậy bằng nắp nh a và quấn tr ờng Giltay NO3

parafin. Ủ ở nhiệt độ phòng, quan sát 5 – 7 ngày.

- Tiến h nh định tính khả n ng khử Nitrite bằng thuốc thử Griess A, Griess B

và bột kẽm theo bảng sau:

- Kiểm tra s chuyển hóa Nitrite thành Nitrate bằng thuốc thử Diphenylanime.

ra s khử nitr te đồng hóa thì NH4

- Sản phẩm của s khử Nitrite là khí trong ống urh m Trong tr ờng hợp xảy + có thể là sản phẩm của s khử nitrite. + sau khi nuôi cấ VK trong m i tr ờng Giltay Định tính s tạo thành NH4

nitrite bằng thuốc thử Nessler.

Các chủng VK đạt yêu cầu trong định tính khả n ng khử nitrite và cho kết

quả lên men âm tính (-) trong thử nghiệm khả n ng l n men, oxi hó đ ờng glucose

(th c hiện ở mụ s u) đ ợc tiến hành giữ giống trong ống thạch nghiêng ở nhiệt độ 4oC.

2.4.3. Các thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng VK phân lập [8]

2.4.3.1. Thử nghiệm khả năng lên men (F) và oxy hóa (O) glucose

Ý nghĩ ủa thử nghiệm này là kiểm tra khả n ng hu ển hóa glucose theo

các cách khác nhau (lên men và oxy hóa). Thí nghiệm này góp phần quan tr ng

trong việc loại bỏ VSV đ ờng ruột, vì hầu hết VSV đ ờng ruột đ u ó khả

n ng l n men, nh ng đối v i hầu hết VK phản nitrate luôn cho kết quả (-) đối v i

Đồ án tốt nghiệp

l n men đ ờng Glucose. Tiến h nh tr n m i tr ờng OF (Rucolph Hugh & Einar

Leifson), chứa bromothymol blue là chất chỉ thị, pH 7,1.

M i tr ờng OF s u khi đun t n g r đ ợ ph n đều vào các ống nghiệm (10ml), s u đó hấp khử trùng 121oC/15 phút. Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối

(sinh khối đ ợ t ng sinh 4 – 48 giờ), đ m s u v o m i tr ờng OF đã đ ợc hấp

khử trùng ở trên. Cho parafin lỏng (vô trùng) vào các ống nghiệm ùng để thử

nghiệm khả n ng l n men glu ose (tạo điều kiện kỵ khí) Đ c kết quả sau 1,2 ngày.

- Kết quả l n men ng tính (+) khi ả hai ống đều chuyển sang màu vàng,

nghĩ l VK ó khả n ng l n men đ ờng glucose trong cả h i m i tr ờng

hiếu khí (ống không có parafin lỏng) và kỵ khí (ống có chứa parafin lỏng).

Các sản phẩm xit trong l n men l m gi m pH m i tr ờng từ pH 7,1 xuống

pH 6,0 d n đến l m th đổi màu chỉ thị của bromothymol blue từ xanh lá

sang vàng.

- Kết quả ox hó ng tính (+) khi hỉ có ống không chứa parafin lỏng

chuyển s ng m u v ng, nghĩ l VK hỉ chuyển hó glu ose theo on đ ờng

ox hó trong m i tr ờng hiếu khí, không lên men trong điều kiện kị khí

Sản phẩm oxy hóa glucose là acid yếu l m th đổi màu chỉ thị chậm.

- Kết quả âm tính (-) (không chuyển hóa glucose): cả hai ống đều không

chuyển sang màu vàng. Trong một số tr ờng hợp màu chỉ thị th đổi từ

x nh l s ng x nh ng o pH m i tr ờng t ng (pH > 7,6) Đó l kết quả

của việc VK sử dụng peptone (tạo m i tr ờng kiềm do s chuyển hóa các

amino acid).

2.4.3.2. Thử nghiệm Catalase

- Mục tiêu: Tìm hệ enzyme catalase ở vi sinh vật v i thuốc thử H2O2.

- Nguyên tắc: H2O2 -> H2O + 1/2 O2 (b t khí)

- Th c hiện: Dùng que cấy lấy sinh khối VK đặt lên lam kính sạch, nhỏ một

gi t H2O2 lên sinh khối VK.

- Kết quả: phản ứng (+) khi xuất hiện b t khí; (-) khi không xuất hiện b t khí.

2.4.3.3. Thử nghiệm MR

Đồ án tốt nghiệp

- M i tr ờng tiến hành: Glucose Photphat (MR-VP broth).

- Mục tiêu: x định VSV có khả n ng tạo ra và duy trì sản phẩm axit bên

trong m i tr ờng từ quá trình lên men glucose v i thuốc thử methyl red.

- Nguyên tắc: VSV lên men glucose tạo sản phẩm axit, làm giảm pH môi

tr ờng, d n đến l m th đổi màu chất chỉ thị pH (methyl red).

- Th c hiện: Cấy sinh khối VSV v o m i tr ờng MR – VP đã tiệt trùng 121oC/15 phút, ủ 37oC trong 24 – 48 giờ Khi đ c kết quả nhỏ 1 – 2 gi t

methyl red vào.

- Kết quả: phản ứng (+) khi m i tr ờng chuyển s ng m u đỏ , phản ứng (-) khi

m i tr ờng không chuyển m u (m u m i tr ờng – màu vàng).

2.4.3.4. Thử nghiệm VP

- M i tr ờng tiến hành: glucose photphat (MR – VP broth).

- Mục tiêu: phát hiện VSV có khả n ng tạo sản phẩm trung tính

acetylmethylcarbinol (acetion) trong quá trình lên men glucose v i thuốc thử

α – Napthol, KOH 40%.

- Nguyên tắ : etoin + α – Napthol -> phức chất m u đỏ.

- Th c hiện: Cấy sinh khối VSV v o m i tr ờng MR – VP đã tiệt trùng

121oC/15 phút. Ủ 37oC trong 24 – 48 giờ.

- Nhỏ 6 gi t α – N pthol, s u đó nhỏ 2 gi t KOH 40%, lắc nhẹ Đ c kết quả

sau 20 phút, chậm nhất là 4 giờ.

- Kết quả: phản ứng (+) khi m i tr ờng chuyển s ng m u đỏ; phản ứng (-) khí

m i tr ờng không chuyển màu.

2.4.3.5. Thử nghiệm Indol:

- M i tr ờng tiến hành: M i tr ờng tryptone (Tryptone broth)

- Mục tiêu: nhằm phát hiện s tạo th nh In ol trong m i tr ờng nuôi cấy VSV

nhờ vào hệ enzyme tryptophanase chuyển tryptophan thành Indol.

- Nguyên tắ : In ol + Kov ’s -> phứ m u đỏ. - Th c hiện: Cấy sinh khối VSV v o m i tr ờng Tryptone, ủ 37oC /24 giờ.

Nhỏ vài gi t thuốc thử Kov ’s ( – 4 gi t), không lắc ống nghiệm.

Đồ án tốt nghiệp

- Kết quả: thử nghiệm (+) khi ó vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt m i tr ờng

nuôi cấy VSV, (-) khi bề mặt m i tr ờng giữ nguyên màu vàng của thuốc

thử.

2.4.3.6. Nhuộm Gram:

- Nhỏ lên lam kính sạch 1 gi t n c muối sinh lý, lấy 1 khuẩn lạ đặ tr ng

n đều trên lam kính và kéo một ít n c muối sinh l v o để tránh làm

loãng m u nhuộm.

- Cố định tiêu bản bằng h để khô t nhiên hoặ h o tr n ng n lử đèn

cồn, kiểm tr độ nóng (nhẹ vừa phải trên mu bàn tay).

- Chú ý: nóng quá, hoặ h l u, vi khuẩn sẽ biến dạng.

- Phủ thuốc nhuộm tím Gentian lên tiêu bản 60 giây

- Rử n để loại bỏ phẩm thừa.

- Phủ dung dịch Lugol lên tiêu bản trong 60 giây nhằm cố định màu cho VK

gr m ng (+)

- Rửa nhanh bằng cồn 95o cho t i khi tiêu bản không còn màu tím Gentian.

- Rử qu n để loại bỏ cồn thừa.

- Phủ thuốc nhuộm Fuchsin lên tiêu bản trong 30 giây.

- Dùng giấy thấm khô lame hoặ để khô t nhiên.

- Qu n s t i kính hiển vi ở vật kính x100 có nhỏ dầu soi kính.

Đọc kết quả: Vi khuẩn Gr m ng ắt màu tím (màu tím Gentian) còn vi

khuẩn Gr m m ó m u đỏ hồng (đỏ Fuchsin).

2.4.3.7. Thử nghiệm khả năng di động:

M i tr ờng Giltay v i ,6% g r Ph n m i tr ờng vào các ống nghiệm (10

– 15ml), hấp tiệt trùng 121oC/15 phút.

Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối VSV cấy sâu v o m i tr ờng thạch bán rắn

trên. Ủ ở nhiệt độ phòng Đ c kết quả sau 2 – 4 ngày.

Kết quả: Thử nghiệm (+) khi VK m c lan rộng xung quanh vết cấy. Kết quả

(-) VK chỉ m theo đ ờng cấy.

Đồ án tốt nghiệp

2.4.4. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm khảo sát khả năng khử nitrate và khử

nitrate của các chủng VK phân lập được

2.4.4.1. Mô hình thí nghiệm khảo sát khả năng khử nitrite của các

chủng VK phân lập:

Một số VK đ ờng ruột và VK gây bệnh có khả n ng phản nitr te nh ng

không thể tiếp tục khử nitrite thành các sản phẩm khí NO, N2O, N2 N n để tiết

kiệm thời gian, hóa chất và dụng cụ, sinh viên th c hiện sẽ tiến hành khảo sát khả

n ng khử nitrite tr đối v i các chủng VK phân lập đ ợc.

Xem xét trong mô hình này v i thể tí h m i tr ờng thí nghiệm l n h n (9

ml) thì hiệu quả khử nitrite của các chủng VK n nh thế nào, di n ra nhanh hay

chậm, thể tích khí tạo thành là bao nhiêu. Sau mô hình thì nghiệm này, loại bỏ các

chủng VK có khả n ng xử lý kém hiệu quả, để khi tiến hành v i m i tr ờng khử

nitrate sẽ d ng h n M h nh thử nghiệm tiến h nh nh s u:

- trong các bình thủy tinh nhỏ thể tích 100 ml/250 ml

- Mô hình thí nghiệm đ ợc th hi n tr n m i tr ờng Giltay có nguồn N là

NO2

- Đối v i mô hình kị khí : sử dụng bình thủy tinh nhỏ thể tích 100ml, có nắp

cao su đậy và gắn ống x l nh để đo l ợng khí tạo thành, quấn p r ffin để

tránh thất thoát khí sinh ra.

- Đối v i mô hình hiếu khí: sử dụng bình thủy tinh 250 ml, nút bông, không

quấn paraffin và lắc 150 vòng/phút.

V i mụ đí h ho VK ph n ố đều trong m i tr ờng thí nghiệm, sinh viên sử

dụng ống hút nh a cắt nhỏ khoảng 1 – 2 cm làm giá thế ho VK m v o Do đ l

mô hình nhỏ, th c hiện trong thời gian ngắn nên việc sử dụng ống hút làm giá thể

không làm ảnh h ởng để quá trình khử nitrate, nitrite.

Tiến h nh định tính, định l ợng nồng độ ban đầu của Nitrite, nitrate, amoni

trong m i tr ờng Gilt tr c khi tiến hành cấy các chủng VK Ph ng ph p định

tính nh tr n Ph ng ph p định l ợng sẽ trình bày ở mục sau.

Thí nghiệm th c hiện tr n 4 điều kiện: Hiếu khí không giá thể (HK), hiếu khí

có giá thể (HKGT), kị khí không giá thể (KK), kỵ khí có giá thể (KKGT).

Đồ án tốt nghiệp

Hìn 2.2 Mô hình khảo sát khả n ng hu ển hóa N ở điều kiện khác nhau.

a) Đối chứng b) Kị khí giá thể c) Kị khí d) Hiếu khí giá thể e) Hiếu khí

M i tr ờng đ ợc phân vào các bình thủy tinh v i thể tí h m i tr ờng là

90ml. Hấp tiệt trùng nh m i tr ờng trên,121oC/15 phút.

Các chủng vi khuẩn khảo s t đ ợ t ng sinh trong m i tr ờng NB 24 giờ tr c khi cấy vào khảo sát. Mật độ vi khuẩn trong khảo s t đ ợc ổn định ở mức 106

fu/ml Để đảm bảo tính đồng nhất trong khảo s t, ho th m m i tr ờng NB t ng

sinh VK vào các bình thủy tinh 100 ml để hấp tiệt trùng M i tr ờng NA này sẽ

đ ợ ùng để pha loãng mật độ vi khuẩn ũng nh ổ sung v o m i tr ờng khảo sát

ùng l m đối chứng.

Dùng pipette hút 10ml huyền phù VK (107 cfu/ml) bổ sung vào các bình khảo s t đã đ ợc tiệt trùng bên trên. Mật độ VK ổn định ở 106 cfu/ml. Dùng parafin

quấn kỹ phần tiếp xúc giữa miệng bình, nắp bình và ống xylanh nhầm mụ đí h hạn

chế s thất thoát khí tạo thành. Ủ ở nhiệt độ phòng. Khảo sát tại các mốc thời gian

0h, 6h, 12h, 24h, 36h, 48h sau khi cấy VK. Mô hình hiếu khí khảo sát tại điều kiện

150 vòng/phút.

+ tại mỗi thời điểm khảo sát. Quan sát

Đồ án tốt nghiệp

-,NO2

-, NH4

Định l ợng nồng độ NO3

và ghi nhận thể tích khí sinh ra trong ống xylanh tại thời điểm.

2.4.4.2. Mô hình khảo sát khả năng khử nitrate của các chủng VK phân

lập đã được tuyển chọn sau các quá trình trên

M h nh đ ợc tiến hành t ng t nh đối v i mô hình khảo sát khả n ng khử - và thời gian khảo sát là 48 nitrite Nh ng nguồn N trong m i tr ờng Giltay là NO3

giờ.

- tác dung v i axit phenoldisulfonic

2.4.4.3. Phương pháp định lượng nitrate.

-: ion NO3

Nguyên tắ x định NO3

- có trong m u. Màu của phức và nồng độ NO3

(PDA) thành nitrophenoldisulfonic axit khi muối nitrate ở dạng kh n), khi đ ợc

nồng độ NO3

kiềm hóa thì dung dịch chuyển th nh m u v ng v ó ờng đ màu phụ thuộc vào - tuân theo định luật - trong khoảng 0,1 – 2 ppm thì Beer trong khoảng 410 – 480 nm, nếu nồng độ NO3

n n đo ờng độ màu ở 410 nm và nồng độ càng l n th c song hấp thụ màu

ng o, c song 480 nm có thể dùng v i m u có nồng dộ l n đến 12 ppm.

 Các yếu tố ảnh h ởng:

- > 0,2 mg/l sẽ ảnh h ởng đến kết quả phân tích, do có thể -. Loại bỏ bằng cách thêm 5 ml urea-acetic vào 50 ml m u hoặc

Khi nồng độ NO2

oxy hóa thành NO3

2 ml dung dịch axit sunfanic 2% vào 50 ml m u.

Nếu độ m u > đ n vị, cần loại bỏ bằng cách cho 2 ml dung dịch Al(OH)3

vào 100 ml m u n đầu. Khuấy kỹ, lắng trong vài phút, tiến hành l c thu dịch

trong để đo nồng độ NO3

S hiện diện của Clorua gây ra sai số âm, loại bỏ bằng cách thêm Ag2SO4

vừ đủ, để kết tủa ion clo trong m u, tiến hành l c thu dị h trong để x định nồng

- theo trình t sau:

độ NO3

 Tiến h nh x định nồng độ NO3

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.5. Trình t tiến h nh định l ợng NO3

Hóa ất ố t ứ t

0 1 2 3

0 10 10 10 Vmẫu (ml)

0 1 1 1 Urea-acetic (ml)

Cô ạn m u đến khô trên nồi cách thủy, để nguội (tránh làm cháy m u)

- tác ụng v i PDA

1 1 1 1 Vdd PDA (ml)

Để yên 10 phút, cho NO3

25 25 25 25 Vnƣớc cất (ml)

Trung hòa axit ằng NaOH 10% đến pH trung tính (dung ị h chuyển sang màu

vàng đối v i m u thí nghiệm)

Chuyển vào bình định mức 100 ml, tráng kỹ bằng n ất v định mức đến

vạ h .Đo độ hấp thụ ủ m u ở sóng 4 nm.

 Lƣu ý:

Ở trung hò xit , tiến hành trung hòa các bình chứa m u thí nghiệm

tr c, nhằm x định đ ợc thể tí h N OH t ng ứng để pH m i tr ờng về trung

tính, s u đó m i tiến hành trung hòa m u trắng (số thứ t 0), do m u trắng không có

Do việc tính toán nồng độ NO3

dấu hiệu điểm dừng rõ ràng (không chuyển sang màu vàng). M u trắng l n c cất. - phụ thuộ v o đ ờng chuẩn nitr te n n tr c - của m u thí nghiệm khí tiến h nh định l ợng nitrate, cần x định nồng độ NO3

phải nằm trong đ ờng chuẩn, bằng cách pha loãng m u v i n c cất để đạt nồng độ - trong các m u sẽ rất khác mong muốn. Ở mỗi mô hình khảo sát trên, nồng độ NO3

nhau, nên thể tích pha loãng sẽ kh nh u nh s u:

- Mô hình khảo sát khả n ng khử nitrite:

- đầu v o (m i tr ờng h ấy vi khuẩn), T=0: do -, phát hiện bằng ph ng ph p định tính, nên

định nồng độ NO3

trong hợp chất NaNO2 có l n ion NO3

- còn lại trong dịch cấy (T=48 giờ): kh ng định l ợng

cần x định nồng độ, thể tích m u dùng thí nghiệm là 10ml (pha loãng 10 lần).

- trong định tính.

định nồng độ NO3

do không phát hiện NO3

Đồ án tốt nghiệp

- Mô hình khảo sát khả n ng khử nitrate:

định nồng độ NO3- tại các thời điểm khảo sát (T=0,6,12,24,36,48 giờ):

m u đ ợc pha loãng 10 lần (1ml m u + 9ml n c cất).

2.4.4.4. Phương pháp định lượng nitrite

Đ ợc th c hiên theo ph ng ph p định l ợng nitrite của tác giả Nguy n V n

Ph trong gi o tr nh “Thí nghiệm Hóa Kỹ thuật m i tr ờng”

Nguyên tắc: ở pH 2 – 2,5 nitrite tác dụng v i axit sunfanic và naphthylanime

tạo th nh zo enjol n phth mine sulfoni ó m u đỏ hồng – đỏ tía (phụ thuộc vào

nồng độ nitrite có trong m u). Và bằng ph ng ph p so m u (ở c sóng 520 nm),

- theo trình t nh ảng sau:

x định đ ợ l ợng nitrite trong m u thí nghiệm.

Tiến h nh x định nồng độ NO2

Bảng 2.6. Trình t tiến h nh định l ợng NO2

ố t ứ t

Hóa ất 0 2 3 1

0 a a A Vmẫu (ml)

25 (25 – a) (25 – a) (25 – a) Vnƣớc cất (ml)

0,5 0,5 0,5 0,5 Vdd EDTA (ml)

0,5 0,5 0,5 0,5 Vdd axit sulfanic

ắ đều,để yên 10 phút (ml)

0,5 0,5 0,5 0,5 Vdd naphthylamine

0,5 0,5 0,5 0,5 (ml) Vdd acetic (ml)

ắ đều, để yên 20 phút

Đo độ hấp thụ các m u ở sóng 520nm

Các yêu tố ảnh h ởng: Độ đụ trong m i tr ờng cần loại bỏ tr c khi làm thí nghiêm (l c, ly tâm); Các ion Sb, Fe3+, Pb2+, Ag+,… tạo tủa ảnh h ởng đến kết quả

đo qu ng loại bỏ bằng ph ng ph p l c: Chlorine, tricloride nếu có trong m u sẽ

gây trở ngại ho ph ng ph p, loại bỏ bằng cách tạo tủa, l c.

Thể tích m u khảo sát ở các mô hình là 0,1 ml (t ng đ ng ph loãng 5

lần)

Đồ án tốt nghiệp

2.4.4.5. Phương pháp định lượng amoni

Đ ợc th c hiện theo ph ng ph p định l ợng amoni của tác giả Nguy n V n

Ph trong gi o tr nh “Thí nghiệm Hóa kỹ thuật m i tr ờng”

 Nguyên tắ : Amoni x định bằng ph ng ph p so m u v i thuốc thử

Nessler. Amoni tác dụng v i Nessler theo phản ứng sau:

Phức (NH2)Hg-O-HgI có m u v ng v ó độ hấp thụ c đại ở c sóng

430 nm.

 Các yếu tố ảnh h ởng:

Sunfur gây kết tủa v i Nessler nên cần loại bằng cacbonat chì. Một số hợp

chất anime mạch thẳng , hợp chất cloramine hữu mạch vòng, acetone, aldehit,

r ợu… ó thể phản ứng v i Nessler cho phức màu vàng, gây sai số nên cần loại bỏ.

Độ đụ v hlori e ũng g s i số nên cần đ ợc loại bỏ tr c khi tiến hành

thí nghiệm

 Tiến hành:

Thể tích m u x định nồng độ amoni trong dịch cấy sau T=0,6,12,24,36,48

giờ: pha loãng 100 lần (1ml m u + 99ml n c cất).

- Loại bỏ độ đục: Thêm 1ml ZnSO4 + 0,5ml NaOH 6N vào 100ml m u thí

nghiệm để n ng pH đến 10,5. Đợi 3 ’ – 1 giờ để tạo tủa và l c lấy dịch trong

bằng giấy l c. Thêm 1 gi t EDTA.

+ theo

- Loại trừ chloride: thêm 1ml Na2S2O3 N/70 vào 50ml m u đã loại bỏ độ đục.

Sau khi loại bỏ độ đục, chloride trong m u, tiến h nh định l ợng NH4

bảng sau:

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.7. Trình t tiến h nh định l ợng NH4

Hóa chất Số thứ t

0 1 2 3

0 50 50 50 Vdd m u đã xử lý (ml)

50 0 0 0 Vn c cất (ml)

2 2 2 2 Vdd Nessler (ml)

Lắc đều để yên 5 phút.Đo độ hấp thụ b c sóng 430nm.

2.4.4.6. Phương pháp tính hiệu suất xử lý N trong mô hình khảo sát khả

- và khử N- NO2

năng khử N- NO3

-, NO2

+ -, NH4

Các giá trị OD ó đ ợ trong ph ng ph p định l ợng NO3

đ ợc lần l ợt thay thế vào hệ số Y củ h ng tr nh đ ờng chuẩn t ng ứng,

suy ra giá trị của hằng số t ng ứng S u đó gi trị đ ợc nhân v i hệ số

pha loãng m u n đầu (nếu có), kết quả tính toán là hàm l ợng N của các hợp chất

có trong m u cần x định (nitrate, nitrite, amoni).

C ph ng tr nh đ ờng chuẩn đ ợc áp dụng o Tr ng C o D ng th c

hiện trong o o đồ án tốt nghiệp “T m hiều khả n ng t ng sinh ph n lập v đ nh

giá hoạt l c của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ n c thải chế biến thủy

-: Y= 0.236X + 0.046 (R2= 0.9937)

sản” Từ ph ng tr nh đ ờng chuẩn t ng ứng suy ra giá trị nh s u:

- Từ ph ng trình đ ờng chuẩn NO3

-: Y= 2.5286X + 0.0084 (R2= 0.999)

 X = (Y- 0.046)/0.236 * hệ số pha loãng (N-NO3- mg/l).

- mg/l)

- Ph ng tr nh đ ờng chuẩn NO2

+: Y= 0.1697X – 0.0005 (R2= 0.9989)

 X = (Y – 0.0084)/2.5286* hệ số pha loãng (N- NO2

+ mg/l)

- Ph ng tr nh đ ờng chuẩn NH4

 X= (Y + 0.0005)/0.1697* hệ số pha loãng (N- NH4

-fin + N- NO2

-fin +ini)]* để tính hiệu suất khử

Các giá trị X lần l ợt thay vào công thức H% = [1 – (N-NO3

+fin)/(N-NO3

-ini + N- NO2

-ini + N- NH4

+ N- NH4

N-nitrite, khử N-nitrate của các chủng VK. (Lu Yu, Yanjun Liu, Gejiao Wang,

2008).

Đồ án tốt nghiệp

-fin, N- NO2

-fin, N- NH4

+fin lần l ợt là các nồng độ N -

Trong đó, N-NO3

-ini,N- NH4

trong nitr te, nitrite, moni đầu r (m i tr ờng sau khi nuôi cấy VK) và N-NO3 +ini lần l ợt là nồng độ N trong nitr te, nitrite, moni đầu vào ini,N- NO2

(T=0).

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng có khả năng phản nitrate:

3.1.1. Tăng sinh VK phản nitrate từ nước thải CBTS trên môi trường Giltay

- và NO2

NO3

VK phản nitrate là vi khuẩn inh ỡng hó n ng hữu ị ỡng T ng

- (hoặc N-NO2

sinh trong m i tr ờng Giltay có chứa nguồn C là acid citric, nguồn N là asparagine -). Các vi khuẩn phản nitr te th ờng kỵ khí tùy nghi, có hai và N-NO3

chuỗi hô hấp, chuỗi hô hấp hiếu khí có O2 là chất nhận điện tử cuối cùng và chuỗi - là chất nhận điện tử cuối ùng Trong điều kiện hiếu khí hô hấp kỵ kí có NO3

th ờng thì VK phản nitr te t ng sinh nh th ờng không khử nitr te Trong điều

kiện thiếu khí chuỗi hô hấp kỵ khí m i hoạt động và phản ứng nitrate xảy ra do

nhận điện tử để thành nitrite.

Trong hầu hết các m u n c thải đều có s phát triển của VK trong cả hai

m i tr ờng Giltay nitrate và Giltay nitrite ở điều kiện kỵ khí tùy nghi. Dấu hiệu

nhận biết l đụ m i tr ờng và có sinh khí trong ống Durham.

Kết quả định tính nitrate d a vào s tạo màu giữa ion NO3

- v i thuốc thử - Diphen l mine (m u x nh) C ờng độ màu phụ thuộc vào nồng độ của ion NO3 - còn lại càng - tạo thành

còn lại trong m i tr ờng s u t ng sinh (m u ng đậm thì ion NO3

- d a vào màu giữa ion NO2

nhiều). Kết quả định tính s tạo thành NO2

v i thuốc thử Griess A, B và bột Zn. Nitrite tạo th nh đ ợc phát hiện bằng thuốc

thử Griess A và B (màu hồng đậm hay nhạt tùy vào nồng độ). Khi nitrite tiếp tục

đ ợc khử tiếp thành khí có thể không xuất hiện màu v i thuốc thử Griess. Khi ấy

thêm vài hạt Zn, nếu sinh màu hồng thì chắc chắn là nitrate không bị khử bởi VK

t ng sinh, nếu v n không màu thì chắc chắn là không còn nitrate trong dị h t ng

sinh. Khi ấy không phát hiện thấy nitrate bằng Diphenylamine nữa.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.1 Kết quả định tính N s u 5 ng t ng sinh n c thải CBTS tr n m i tr ờng

Giltay.

+ pH

- NO2

- NH4

STT M u Đục Sinh NO3

- 1.5% NaCl

khí

- 3% NaCl

+++ ++ - - ++ 10 1 G NO3

- 1.5% NaCl

++ ++ - - +++ 10 2 G NO3

- 3% NaCl

+++ ++ - - ++ 10 3 G NO2

++ ++ - - ++ 10 4 G NO2

+++ - - - - 7 5 ĐC G NO3

- - +++ - - 7 6 ĐC G NO2

Bảng 3.1 cho thấy kết quả t ng sinh n c thải CBTS trên cả bốn điều kiện

kh nh u đều có s phát triển của vi sinh vật (l m đụ m i tr ờng) và sinh nhiều

khí trong ống durham, khi quan sát bằng mắt th ờng ũng thấy s hình thành các

thấy không còn s hiện diện của NO3

bóng khí nổi lên trên. Tiến h nh định tính N trong dị h t ng sinh s u 5 ng ho - trong m i tr ờng và có s tí h lũ - hay NO2 +. pH m i tr ờng tr c khi cấ đ ợc ổn định ở pH 7, s u 5 ng t ng sinh pH NH4

m i tr ờng ở cả bốn nghiệm thứ đều t ng o, pH = Điều này cho thấy trong

n c thải CBTS thu gom đ ợc có mặt các vi khuẩn có khả n ng khử nitrate, nitrite

và chuyển hóa thành NO, N2O.

3.1.2. Phân lập và làm thuần vi khuẩn từ nước thải CBTS:

Tất cả các ống t ng sinh đục, sinh khí trong ống urh m đều đ ợc sử dụng

làm nguồn phân lập bằng cách cấ ri tr n m i tr ờng Giltay Nitrate có bổ sung

thêm chỉ thị Phenol Red 1 mg/l, mỗi ống lặp lại tr n đĩ Có ít nhất hai loại khuẩn

lạc trên mỗi đĩ , tu nhi n hỉ l a ch n những khuẩn lạc có vòng màu hồng/tím

xung quanh (do vi khuẩn làm kiềm hó m i tr ờng xung quanh). Khi xuất hiện các

khuẩn lạc giống nhau giữ đĩ , hỉ ch n loại khuẩn lạc ở một đĩ ấy chuyển

Đồ án tốt nghiệp

s ng m i tr ờng m i. Có 9 chủng VSV đ ợc phân lập từ các ống t ng sinh n c

thải phản nitrate.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.2 Kết quả phân lập VSV từ n c thải CBTS

Tên chủng phân STT Tên ống

lập

- 1.5% NaCl

1 1 G NO3

- 1.5% NaCl

2 6 G NO3

- 1.5% NaCl

3 7.1;7.2 G NO3

- 3% NaCl

4 8 G NO3

- 3% NaCl

5 - G NO3

- 3% NaCl

6 - G NO3

- 1.5% NaCl

7 7.3;7.4 G NO2

- 1.5% NaCl

8 7.5 G NO2

- 1.5% NaCl

- 3% NaCl

9 - G NO2

- 3% NaCl

- 10 G NO2

- 3% NaCl

H1 11 G NO2

- 12 G NO2

3.1.3. Tăng sinh VK phân lập được trên môi trường Giltay Nitrate và Giltay

Nitrite:

Các chủng VK phân lập đ ợc từ n c thải CBTS h hắc có khả n ng

phản nitrate nên cần tiếp tụ t ng sinh hủng VK thuần khiết và kiểm tra khả

n ng phản nitrate của các chủng này. Quá trình phản nitrate là khi Vi khuẩn chuyển

hóa nitrate thành nitrite và từ nitrite tiếp tục chuyển thành N2O/N2.

Do đó, khả n ng khử nitrite của VK là một đặc tính quan tr ng có thể dùng

loại trừ các chủng Vi khuẩn chỉ có khả n ng khử nitrate những không tiếp tục khử

Đồ án tốt nghiệp

nitrite thành N2O/N2 mà khử nitrite thành amon (khử nitr te mon hó ) để khử độc.

Do mụ ti u đề t i h ng đến là khử ho n to n N trong n c thải nên cần loại bỏ

những VK chuyển hóa Nitrate thành Amon.

Các chủng VK phân lập đ ợc sàng l c bằng cách cấ t ng sinh đồng thời vào

h i m i tr ờng Giltay Nitrate và Giltay Nitrite có bổ sung thêm 1,5% N Cl để kiểm

tra khả n ng khử nitrate, khử nitrite và khả n ng h nh th nh mon ủa VK.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.3 Kết quả định tính tr n m i tr ờng Giltay Nitrite sau 5 ngày

STT Mẫu Đục Sinh

-

+

pH NO3 NO2 NH4

khí

+ +++ - + 10 7.5 - 1

+ +++ - ++ 10 7.1 - 2

+ ++ - + 9 6 - 3

+ + - + 9 8 - 4

+ + + ++ 8 7.2 + 5

+ + + ++ 8 7.3 + 6

+ - ++ ++ ++ 8 7.4 7

- - +++ +++ ++ 8 H1 8

* - +++ +++ ++ 8 1 9

ĐC (M i tr ờng - 7 - - +++ - 10

không cấy)

(Ghi chú: Dấu (-): m tính; (*): ng tính ạng vết; (+): ng tính ít; (++):

ng tính vừ ; (+++): ng tính nhiều)

Trong 9 chủng VK phân lập từ NTCBTS sau khi làm thuần tr n m i tr ờng

Gilt Nitr te đ ợc cấ v o m i tr ờng Gilt Nitrite để khảo sát khả n ng hu ển

hóa nitrite,sau 5 ngày có 4 chủng (6;7 ;7 5;8) l m đụ m i tr ờng, sinh khí nhiều,

khử đ ợc hoản to n l ợng nitrite trong m i tr ờng, sinh ra một l ợng nhỏ amon và

- và có s tí h lũ NH4

l m m i tr ờng bị kiềm hóa. Các chủng (7.2;7.3;7.4) có s t ng tr ờng, sinh ít khí +. Hai chủng nh ng kết quả định tính cho thấy còn nhiều NO2

( ;H ) khi t ng sinh trong m i tr ờng có nguồn N là nitrite gần nh kh ng t ng

Đồ án tốt nghiệp

tr ởng, kh ng l m đụ m i tr ờng, không có khí trong ống urh m, l ợng nitrite

đ ợc khử rất ít, sinh r mon t ng đối nhiều, làm kiềm nhẹ m i tr ờng.

Bảng 3.4 Kết quả định tính tr n m i tr ờng Giltay Nitrate sau 5 ngày

STT Mẫu Đục Sinh

-

+

pH NO3 NO2 NH4

khí

- + 10 + +++ - 7.5 1

- ++ 10 + +++ - 7.1 2

- ++ 9 + ++ - 6 3

- + 9 + + - 8 4

+ + 9 + * + 7.2 5

+ + 9 + * + 7.3 6

+ + 8 + - ++ 7.4 7

+ + 9 + - ++ H1 8

+ + 9 * - ++ 1 9

ĐC (MT kh ng - - 7 - - +++ 10

cấy)

(Ghi chú: Dấu (-): m tính; (*): ng tính ạng vết; (+): ng tính ít; (++):

ng tính vừ ; (+++): ng tính nhiều)

Do mụ đí h ủ đề tài là phân lập VK phản nitrate nên th c hiện khảo sát

t ng t nh ng th đổi nguồn N trong m i tr ờng khảo sát là Nitrate. Tất cả các

chủng VK đều l m đụ m i tr ờng, tuy nhiên chủng (1;H1) không sinh khí trong

trong ống durham rất ít, s u 5 ng định tính v n còn NO3

ống durham. Các chủng 7. ;7 3;7 4 l m đụ m i tr ờng nh ng l ợng khí sinh ra - trong m u, có s xuất - v tí h lũ một ít amon. Khi định tính bằng thuốc thử, nhận thấy 4 hiện của NO2

Đồ án tốt nghiệp

chủng (6;7.1;7.5;8) khử hoàn toàn NO3

+, còn chủng 1 và H1 chuyển hóa một ít NO3- thành NO2

- trong m i tr ờng, không tạo ra NO2 -, và +. - và NH4

sinh ra ít NH4

Từ kết quả định tính cho thấy, 4 chủng (6;7.1;7.5;8) có khả n ng phản nitrate nên sẽ

tiếp tục khảo s t định l ợng trong mô hình khủ nitrite/nitrate trong 48 giờ.

3.1.4. Kết quả thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng VK phân lập:

Bảng 3.5. Kết quả thừ nghiêm sinh hóa của các chủng VK phân lập

Chủng O (oxy F (lên Indol MR VP Catalase Oxidase Di Nhuộm

hóa Men Dộng Gram

glucos) glucose)

6 - + - + - + + - + 2

7.1 - - - - - + + + - 3

7.5 - - - - - + + + - 7

8 - - - - - + + - - 8

Các vi khuẩn phân lập đ ợ đ số là gram Âm, trừ chủng 6, t l se đều (+).

Chứng tỏ chúng là các VK có hô hấp hiếu khí. Từ đ tiến hành các thí nghiệm sinh

hó để loại bỏ các vi khuẩn có khả n ng g ệnh trong các chủng phân lập.

Vì các chủng phân lập từ n c phải CBTS, khả n ng nhi m VK gây bệnh là rất cao.

Trong số các VK có khả n ng khử nitrate có thể có VK có tiềm n ng g ệnh nh

VK đ ờng ruột, VK Vi rio spp C VK n th ờng khử nitrate thành nitrite, sau

đó mono hó nitrite tạo th nh Trong điều kiện có oxy các VK này còn có thể hô

hấp hiếu khí sinh CO2 m t thu đ ợc trong ống durham. Vì vậy loại trừ các vi

khuẩn đ ởng ruột và vi khuẩn Virbio spp. là cần thiết để thu các VK phản nitrate

th c s .

Một số đặ điểm sinh hóa khác biệt ản giữa vi khuẩn phản nitrate và vi

khuẩn gây bệnh đ ờng ruột và Vibrio spp. là khả n ng lên men của cúng. VK Phản

nitrate có thể ox hó đ ờng Glucose (O+ hoặc O-) nh ng kh ng o giờ lên men

đ ờng Glucose (F-), trong điều kiện kị khí chúng khử nitr te đều sinh n ng l ợng.

Đồ án tốt nghiệp

Ng ợc lại vi khuẩn đ ờng ruột nh E.coli, Salmonella sp. và Vibrio spp. có phản

ứng O+/F+.

Thử nghiệm lên men O/F sử dụng chất chỉ thị màu là bromothymol

lue,trong m i tr ờng axit pH <6,0 sẽ chuyển sang màu vàng, phát hiện đ ợc hầu

hết tr ờng hợp l n men glu ose sinh i Nh vậ test sinh hó kh nh

MR phát hiện lên mên axit hỗn hợp (pH thấp). Test MR nhằm hỗ trợ khẳng định lên

men glucose sinh acid. Các chủng F+, MR+ đều bị loại bỏ.

Ngoài ra, còn có hình thức lên men trung tính mà sản phẩm tạo ra là con

đ ờng tạo ut ne iol đ ợc phát hiện qua VP test, F-,MR – nh ng VP + ó khả n ng

v n l n men nh ng trung tính

Tất cả các VK phân lập tr n m i tr ng gilt đều sử dụng citrate làm nguồn

C, vì vậ để hoàn tất thử nghi m IMViC, In ol test ũng đ ợc tiến hành.

Các chủng nghi ngờ là VK phản nitrate thật s trong số VK Gram – th ờng catalase

+ và phải có F-, MR- , VP-, Indol- , Citrate +.

Tóm lại qua thử nghiệm sinh hóa loai bỏ đ ợc các chủng 6;8 do có kết quả

F+ và MR+. Các chủng 7.1 và 7.5 do có kết quả F -, MR - n n đ ợc tiếp tục khảo

sát.

Đồ án tốt nghiệp

3.2. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ đối với những

chủng được tuyển chọn

3.2.1. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite của chủng 7.5 trong

48 giờ.

Bảng 3.6. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử Nitrite của chủng 7.5 sau 48 giờ

Kết quả định l ợng

Vkhí pH N- NO2 N- NH4 STT ĐKTN (ml) T=48 T=48 T=0 T=0

giờ giờ

HKGT 9 K Đ 94,01 0 4,9 22,1a 1

HK 9 K Đ 73,8 0 3,3 20,2a 2

89,9

KKGT 8 95,3 0 2,9 86,1b 5 3

KK 8 3,2 94,1b 3 0 4

- trong m i tr ờng đều đ ợc khử hoàn toàn.

Theo kết quả bảng 3.6,trong cả bốn điều kiện thí nghiệm, sau 48 giờ l ợng

NO2

L ợng amon đ ợc tạo thành ở điều kiện hiếu khí (20,2 – 22,1 mg/l) thấp h n

so v i ở điều kiện kị khí (86,1 – 94,1 mg/l). Bên cạnh đó theo xử lý thống kê, việc

bổ sung giá thể không làm ảnh h ởng dến l ợng mon đ ợc tạo thành.

ợng khí sinh ra trong xylanh ở điều kiện kị khí có giá thể (~5 ml) o h n

so v i l ợng sinh r trong điều kiện không có giá thể (~3 ml) ợng khí đo đ ợc

Đồ án tốt nghiệp

m ng tính t ng đối do một phần l ợng khí bị thất thoát ra bên ngoài do phần tiếp

xúc giữa ống xylanh và nắp cao su không kín, bên cạnh đó độ ma sát giữa ống tuýp

- ở tất cả các thời

và thành ống xylanh cao làm cho việ khí đẩy ống l n khó kh n

Trong quá trình khảo sát, không thấy s tạo thành ion NO3

150

100

HKGT

điểm khảo sát.

l / g m

HKGT

l / g m , + 4 H N

-

, - 2 O N N

KKGT

6 12 24 36 48 Thời gian,giờ

6 12 24 36 48 thời gian,giờ

Tốc độ chuyển hóa của chủng 7.5

1.5

ờ g / l / g m

0.5

HKGT

KKGT

- ) Động h c chuyển hóa NH4

Hình 3.1. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.5 trong mô hình chuyển hóa Nitrite + c) Tố độ chuyển hóa )Động h c chuyển hóa NO2

nito trung bình

- tại các thời điểm khảo sát. Ở cả bốn - ó trong m i tr ờng nuôi cấ đều đ ợc khử hoản

Hình 3.1a cho thấy s chuyển hóa NO2

điều kiện thí nghiệm, l ợng NO2

toàn sau 24 giờ nuôi cấy. Xử lý thống kê v i độ tin cậy 0,05 cho thấy không có s

khác biệt giữa bốn điều kiện thí nghiệm trong s chuyển hóa nitrite.

Đối v i h m l ợng moni tí h lũ , xử lý thống kê cho thấy chỉ có s khác

biệt giữ điều kiện oxy hòa tan khác nhau và việc bổ sung giá thể không ảnh h ởng + sinh ra nhiều nhất là sau đến s hình thành amoni. Ở điều kiện hiếu khí, l ợng NH4

Đồ án tốt nghiệp

6 giờ nuôi cấy (31,4 mg/l) s u đó l ợng mon giảm ần đến điểm uối khảo s t l

20,2 mg/l Ở điều kiện hiếu khí ó ổ sung gi thể, tại thời điểm 4 giờ l ợng mon

sinh r o nhất 4 ,9 mg/l s u đó giảm òn , mg/l tại thời điểm 48 giờ ợng

mon tại điều kiện kị khí ó gi thể v kỵ khí kh ng ổ sung gi thể s u 48 giờ lần

l ợt l 86,1 mg/l và 94,1 mg/l.

Khi khảo s t định l ợng nitr te trong m i tr ờng tại thời điểm khảo s t, - trong suốt qu tr nh kết quả ho thấ kh ng ó s hiện iện h h nh th nh NO3

khảo s t

Tố độ hu ển hó ủ hủng 7 tại điều kiện khảo s t kh nh u không

đồng nhất, v i điều kiện hiếu khí ó gi thể, hiếu khí kh ng gi thể, kỵ khí gi

thể v kỵ khí kh ng gi thể tại th i điểm 48 giờ lần l ợt l ,6 mg/l/giờ , 1,2

mg/l/giờ, ,3 mg/l/giờ v mg/l/giờ

Kết quả định l ợng N trong m h nh khử Nitrite trong 48 giờ ủ hủng 7 5

ho thấ hủng 7 5 ó khả n ng khử nitrite o ở tất ả điều kiện khảo s t,

l ợng nitrite trong m i tr ờng đ ợ khử ho n to n s u 4 giờ Tu nhi n l ợng

amoni hình thành và tích lũ ũng l một điều kiện để l h n điều kiện xử l tốt

nhất ho hủng VK Do kh ng ó s kh iệt giữ việ ó ổ sung gi thể h

kh ng, n n kết quả định l ợng moni ho thấ hủng 7 5 tí h lũ moni ở điều kiện

hiếu khí ≤ mg/l đạt ti u huẩn ủ đầu r n thải CBTS loại B

3.2.2. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ đối với

chủng 7.1

Bảng 3.7. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrite của chủng 7.1 sau 48 giờ

STT ĐKTN Kết quả định l ợng

pH Vkhí N- NO2 N- NH4

(ml) T=0 T=48 T=0 T=48

giờ giờ

Đồ án tốt nghiệp

1 HKGT 9 K Đ 94,02 0a 0 137,2c

2 HK 9 K Đ 0 73,0 2,5a 179,3d

3 KKGT 8 3 0 95,3 45,04b 114,2b

4 KK 8 2 0,7118 89,9 33,6a 128,8b

Theo kết quả định l ợng,điều kiện thí nghiệm và thời gian khảo s t đều ảnh

- ở cả h i điều kiện có

h ởng đến quá trình chuyển hóa Nitrite trong mô hình khảo sát.

Ở điều kiện hiếu khí, sau 48 giờ khảo s t, l ợng NO2

bổ sung giá thể và không bổ sung gi đều đ ợc khử gần nh ho n to n, tu nhi n + đ ợc tạo thành nhiều (>100 mg/l), l ợng khí sinh r kh ng x định l ợng NH4

- trong cả h i điều kiện đều t ng,

đ ợ o kh ng thu đ ợc ở điều kiện hiếu khí pH m i tr ờng đều t ng ~9

Ở điều kiện kỵ khí, sau 48 giờ, nồng độ NO2

bên cạnh đó ũng tạo thành một l ợng nhỏ Amon (<50 mg/l), l ợng khí sinh ra

-, không phát hiện s

trong xylanh 2-3 ml, pH m i tr ờng t ng ~8

Khi tiến h nh định tính ũng nh định l ợng N-NO3

150

200

150

100

hiện diện của nitrate trong các m u khảo sát tại tất cả các thời điểm khảo sát.

l / g m

HKGT

100

-

, - 2 O N N

, + 4 H N N

KKGT

6 12 24 36 48

Thời gian, giờ

6 12 24 36 48 Thời gian,giờ

Đồ án tốt nghiệp

Tố độ uyển óa N ủa ủng 7.1

1.5

0.5

ờ g / l / g m

HKGT

KKGT

Hình.3.2. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.1 trong mô hình chuyển hóa Nitrite + - của chủng 7 ) Động h c chuyển hóa N- NH4 ) Động h c chuyển hóa N- NO2

c) Tố độ chuyển hóa nito trung bình

Các số liệu sau khi xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic cho thấy giữa

- chỉ chịu ảnh h ờng của nồng độ oxi hòa tan trong thí nghiệm.

các nghiệm thức khác nhau sẽ có s hình thành amon khác nhau, và s chuyển hóa

NO2

- tại từng thời điểm trong thời gian 48 giờ - trong m i tr ờng đ ợc

Hình 3.2a cho thấy s khử NO2

khảo sát. Có thể thấy ở điều kiện hiếu khí có giá thể, NO2

VK khử hoàn toàn sau 24 giờ nuôi cấy, ở điều kiện không giá thể sau 36 giờ ũng -. Tùy nhiên, ở điều kiện kỵ khí, sau 12 giờ t ng khử đ ợ ho n to n l ợng NO2

sinh, h m l ợng nitrite trong m i tr ờng t ng l n so v i n đầu ở cả hai nghiệm

thức có bổ sung giá thể và không có giá thể lần l ợt là 140,9 mg/l và 137,3 mg/l và - này gần nh kh ng th đổi về mặt thống tại những điểm khảo s t s u, l ợng NO2

+ trong m i tr ờng tại thời

kê.

Hình 3.2b l s h nh th nh v tí h lũ NH4

điểm khảo s t ủ hủng 7 khi khảo s t tr n m i tr ờng Gilt Nitrite Ở điều kiện + t ng o nhất l s u giờ nu i ấ (142,04 mg/l), hiếu khí ó gi thể, l ợng NH4

s u đấ l ợng moni n tu ó giảm (137,2 mg/l tại 48 giờ), ở điều kiện kh ng gi

thể l ợng moni t ng nh nh nhất l s u 4 giờ nu i ấ (106,5 mg/l) v t ng đến

thời điểm 48 giờ l ợng moni tí h lũ đ ợ l 79,3 mg/l. Ở điều kiện kị khí l ợng

moni tí h lũ thấp h n s o v i ở điều kiện hiếu khí, lần l ợt ở điều kiện ó ổ sung + tí h lũ gi thể v kh ng ổ sung gi thể l 45,04 mg/l và 33,7 mg/l v l ợng NH4

s u giờ v ổn định đến uối thời gi n khảo s t

Đồ án tốt nghiệp

Tố độ hu ển hó Nito trung nh ở điều kiện khảo s t đều đạt o nhất

v o s u giờ nu i ấ ,lần l ợt ở điều kiện hiếu khí ó gi thể, kỵ khí ó gi

thể v kỵ khí kh ng gi thể l 9,7 mg/l/giờ ; 6,4 mg/l/giờ; 8,5 mg/l/giờ s u đó tố độ

hu ển hó giảm ần ho đến 48 giờ, tố độ hu ển hó lần l ợt l ,6 mg/l/giờ, ,

mg/l/giờ, ,7 mg/l/giờ Tố độ hu ển hó ở điều kiện hiếu khí kh ng gi thể t ng

giảm kh ng đồng đều, tố độ hu ển hó tại thời điểm 48 giờ đạt ,5 mg/l/giờ

khuẩn 7 ó khả n ng nitr te hó , hu ển hó l ợng moni (NH4

m i tr ờng th nh nitrite (NO2

S t ng l n về l ợng nitrite trong m i tr ờng trong điều kiện kị khí là vi +) tí h lũ trong -), l ợng mon sinh r v tí h lũ s u 48 giờ <5 mg/l - trong m u th kh ng ph t hiện s ó mặt Tu nhi n khí khảo s t h m l ợng NO3

ủ nitr te n n VK n hỉ ó khả n ng th hiện một gi i đoạn ủ qu tr nh

Nitr te hó Ở điều kiện hiếu khí, vi khuẩn s u khi sử ụng hết l ợng Nitrite trong + v vi khuẩn ần m i tr ờng th ắt đầu hu ển N t o trong kh ng khí thành NH4

một l ợng moni để tổng hợp tế o ũng nh t ng tr ờng v ph t triển

Chủng 7 tu ở điều kiện hiếu khí ó khả n ng khử nitrite tốt nh ng lại tí h

lũ một l ợng l n moni ≥ mg/l, v ợt qu ti u huẩn đầu r ủ n thải - thấp h n CBTS (20 mg/l) Ở điều kiện kị khí, hủng 7 lại ó khả n ng khử NO2

rất nhiều so v i điều kiện hiếu khí Tu nhi n, mụ ti u đề t i l vi khuẩn ph n

nitrate nên ần tiếp tụ khảo s t khả n ng khử nitr te ủ hủng VK n

3.3. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ đối với

những chủng được tuyển chọn.

Do mục tiêu củ đề tài là phân lập VK phản nitrate nên VK cần phải có cả

quá trình khử Nitrate và khử nitrite thành khí. Mặc dù hai chủng VK khảo s t đều

có khả n ng xử lý tốt nitrite trong điều kiện hiếu khí nh ng v n cần phải tiếp tục - l sở đề x định khảo sát trên mô hình khử Nitrate. Còn mô hình khử N-NO2

khả n ng khử nitrite thành khí của vi sinh vật.

3.3.1. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của

chủng 7.5

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.8. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrate của chủng 7.5 sau 48

giờ

STT ĐKTN Kết quả định l ợng

pH N-NO3 Vkhí N-NH4

(ml) T=0 T=48 T=0 T=48

giờ giờ

1 HKGT 9 K Đ 155,8 0 12,3 4,98a

2 HK 9 K Đ 160,3 0 19,8 2,3a

KKGT 8 3 167,5 0 16,8 72,7b 5

KK 8 4 177,8 0 18,6 28,97b 3

-.Ở điều kiện hiếu + đ ợc tạo thành (<5 mg/l) và không chênh lệch nhiều dù

Ở cả 4 điều kiện thí nghiệm sau 48 giờ đều không còn NO3

khí có một l ợng nhỏ NH4

ở điều kiện có giá thể hay không có giá thể.

Ở điều kiện kỵ khí, l ợng NH4

+ đ ợc toàn thành nhiều h n so v i điều kiện + tạo thành khoảng 7 ,7 mg/l, l ợng + tạo thành ít

hiếu khí Trong điều kiện có giá thể, l ợng NH4

khí sinh ra trong xylanh là 5 ml Trong điều kiện kỵ khí, l ợng NH4

h n ( 8,9 mg/l), l ợng khí sinh ra trong xylanh khoảng 3 ml.

- thành NO2

Khi tiến h nh định tính v định l ợng Nit trong thời điểm khảo sát, - trong tất cả điều kiện khảo sát không phát hiện s chuyển hóa NO3

khác nhau.

200

150

Đồ án tốt nghiệp

l / g m

HKGT

100

-

, - 3 O N N

, + 4 H N N

KKGT

140 120 100 80 60 40 20 0

0 6 12 24 36 48

Thời gian, giờ

6 12 24 36 48 thời gian,giờ

Hiệu quả xử lý

150

Tốc độ chuyển hóa của chủng 7.5

100

ờ i g / l / g m

HKGT

KKGT

HKGT

KKGT

- )Động h c chuyển hóa NH4

Hình 3.3. Động h c chuyển hóa N của chủng 7.5 trong mô hình chuyển hóa Nitrate + c) Tốc dộ chuyển hóa ) Động h c chuyển hóa NO3

sau 48 giờ, d)Hiệu quả xử lý

Động h c chuyển hóa N cho biết khả n ng hu ển hóa N-NO3 của chủng VK - trong cả 4 tại khác mốc thời gian. Sau 36h khảo sát, không còn phát hiện N-NO3

điều kiện khảo sát. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có s sai biệt giữ điều

nitrate tốt nhất. Do khả n ng khử NO3

kiện thí nghiệm kh nh u, trong đó điều kiện hiếu khí giá thể là có khả n ng khử - ở cả bốn điều kiện đều gấn nh ho n to n + ở điều kiện kh nh u ũng nh nên cần xem xét để khả n ng tí h lũ NH4

hiệu quả và tố độ xử lý của chủng VK để có thể đ nh gi đ ợc khả n ng ứng dụng

của chủng VK này.

Kết quả cho thấ s tí h lũ NH4

+ ở điều kiện kỵ khí và hiếu khí có s + trong khảo sát. Ở cả hai + tí h lũ s u 48 giờ thấp h n điều kiện củ n c thải

khác biệt, giá thể không ảnh h ởng đến s tích lũ NH4

điều kiện hiếu khí, l ợng NH4

Đồ án tốt nghiệp

đầu ra loai A của ngành CBTS là 10 mg/l, lần l ợt ở điều kiện có giá thể và không

giá thể là 4,98 mg/l và 2,34 mg/l.

Hình 3.3c thể hiện tố độ chuyển hó nit trung nh ủa chủng VK 7.5. Ở

điều kiện khả sát, tố độ chuyển hó nito trung h nh đều đạt khoảng 5,2

mg/l/giờ. Tuy nhiên tố độ chuyển hỏa nito trung bình ở điều kiện Kỵ khí giá thể

chỉ đặt 1,1 mg/l/giờ.

Hình 3.3d cho thấy hiệu suất xử lý của chủng 7 5 trong điều kiện khác

nh u đều cao (60 – 98%). Ở điệu kiện hiếu khí giá thể và hiếu khí không giá thể

hiệu quả xử lý không có s sai biệt,lần l ợt đạt 97% và 98.7%. Ở điệu kiện kỵ khí

s có mặt của giá thể có ảnh h ởng đến hiệu quả xử lý của chủng VK 7.5, hiệu quả

xử lý ở điệu kiện có giá thể chỉ đ t 6 ,6% , trong khi đó ở điều kiện không giá thể

hiệu quả xử lý lại đạt đ ợc 85,2%.

Tu nhi n, trong điều điều kiện kỵ khí, l ợng amoni tạo thành lại >20 mg/l

kh ng đạt tiêu chuẩn n c thải đầu ra củ nh m CBTS ợng amoni tạo thành

ở điều hiếu khí thấp h n, mg/l, đạt tiêu chuẩn ho n c thải đầu ra (phụ lục B),

pH từ 8.1 - 9.0.

Đồ án tốt nghiệp

3.3.2. Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của

chủng 7.1

Bảng 3.9. Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrate của chủng 7.5 sau 48

giờ

STT ĐKTN Kết quả định l ợng

pH N-NO3 Vkhí N- NH4

(ml) T=0 T=48 T=0 T=48

174,4

15,8a

giờ giờ

177,5

39,4b

HKGT 9 1 K Đ 0

152,96

74,7c

HK 9 2 K Đ 0

181,01

0,7

81,2c

KKGT 8 3 0 5

KK 8 4 0 3

Bảng 3.9 cho thấy, ở cả 4 điều kiện thí nghiệm đều không còn Nitrate sau 48

giờ khảo s t, l ợng amon sinh ra ở các thí nghiệm có s khác biệt giữ điều kiện

hiếu khí và kỵ khí.Việc bổ sung thêm giá thể không làm ảnh h ởng đến s hình

thành amon khi xử lý. Thể tí h khí đo đ ợc ở điều kiện kỵ khí trong khoảng 3 – 5 + ml/ ml m i tr ờng. pH m i tr ờng sau 48 giờ t ng, pH 8 – 9. Tuy nhiên NH4

tí h lũ s u 48 giờ ở tất cả điều kiện thí nghiệm đều o h n so v i tiêu chuẩn

về đầu ra củ n c thải CBTS.

Đồ án tốt nghiệp

Trong qu tr nh định tính ũng nh định l ợng các chỉ tiêu nit trong m i - tại tất cả tr ờng tại các thời điểm khảo sát, không phát hiện s hình thành N-NO2

điều kiện thí nghiệm tại các mốc thời gian khảo sát.

120

200

100

150

Đồ án tốt nghiệp

l / g m

HKGT

100

-

, 3 O N N

, + 4 H N N

KKGT

0 6 12 24 36 48 Thời gian, giờ

6 12 24 36 48 Thời gian, giờ

Tố độ uyển óa ủa ủng 7.1

H ệu suất xử lý ủa ủng 7.1

100

HKGT

ờ g / l / g m

KKGT

HKGT

KKGT

+ c)Tố độ

- )Động h c chuyển hóa NH4

Hình 3.4. ) Động h c chuyển hóa NO3

chuyển hóa N sau 48 giờ, d)Hiệu quả xử lý của chủng 7.1

- trong - n đầu là 177 mg/l. Không có

Hình 3.4a cho thấy, ở cả 4 điều kiện khảo sát sau 24 giờ l ợng NO3

m i tr ờng đ ợc khử hoản toàn từ h m l ợng NO3

s khác biệt về nghĩ thống kế giữ điều kiện khảo sát khác nhau.

Hình 3.4b biểu hiện s h nh th nh v tí h lũ NH4

+ của chủng VK 7.1 trong + hình thành ở điều kiện khảo sát tại khác thời + chịu ảnh h ởng của nồng độ oxy

48 giờ khảo s t H m l ợng NH4

điểm kh nh u kh ng đồng nhất, s tí h lũ NH4

hòa, việc bổ sung thêm giá thể v o m i tr ờng không ảnh h ởng đến l ợng amon

sinh r trong điều kiện kỵ khí nh ng ó ảnh h ởng đến s hình thành amon ở điều

kiện hiếu khí. Ở điều kiện hiếu khí có giá thể, l ợng amon sinh ra ít nhất so v i + tí h lũ ở cả bốn những điều kiện khác 15,8 mg/l. Sau 48 giờ khảo s t, l ợng NH4

điều kiện đều cao, ở điều kiện hiếu khí giá thể, hiếu khí, kỵ khí giá thể, kỵ khí + tí h lũ lần l ợt là 15,8 mg/l; 39,4 mg/l; 74,7 mg/l ; 81,2 mg/l. Ở h m l ợng NH4

Đồ án tốt nghiệp

điều kiện đều v ợt quy chuẩn về n c thải loại B của ngành CBTS, chỉ ở điệu

kiện Hiếu Khí có giá thể l ợng mon tí h lũ l 5,8 mg/l l đạt tiêu chuẩn (<20

mg/l).

Kết quả hình 3.4c là tố độ chuyển hóa nito trung bình sau 48 giờ của chủng

7.1 lần l ợt tại các thời điểm khảo sát ở điều kiện khảo sát khác nhau. Theo kết quả

xử lý thống kê theo từng mốc thời ở 4 điều kiện khảo sát, có s khác biệt về tố độ

chuyển hóa nito trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí, tốc dộ chuyển hóa Nito trung

bình sau 48 giờ ở điều kiện HKGT, HK, KKGT, KK lần l ợt là 3,3 mg/l/giờ,

- của chủng 7 t ng đối cao, ở tất cả điều kiện đều

2,9 mg/l/giờ; 1,6 mg/l/giờ và 2,1 mg/l/giờ..

Hiệu suất xử lý NO3

>50 %. Ở điều kiện hiếu khí có giá thể hiệu suất xử l đạt cao nhất (90,6 %). Tuy có

hiệu suất xử lý o nh ng l ợng amon h nh th nh v tí h lũ s u 48 giờ o h n

tiêu chuẩn n c thải đầu ra (20 mg/l), chỉ ở điều kiện hiếu khí có giá thể l ợng

amon hình thành <20 mg/l (15,8 mg/l).

- tối u v i khả n ng hu ển hóa hết l ợng NO3

7.1 có khả n ng xử lý NO3

Từ những kết quả trên, ở điều kiện hiếu khí có bổ sung giá thể, chủng VK - trong + sau 48 m i tr ờng sau 24 giờ ,hiệu quả xử l đạt 9 ,6% v tí h lũ 5,8 mg/l NH4

giờ.

Đồ án tốt nghiệp

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

- Từ nguồn n c thải CBTS thu thập đ ợ s u khi t ng sinh tr n m i tr ờng

Giltay nitrate và Giltay nitrite có bổ sung thêm 1,5% NaCl , tất cả các ống

nghiệm đều khử ho n to n nitr te,nitrite ó trong m i tr ờng và sinh khí

trong ống durham.

- Từ các ống t ng sinh, ph n lập đ ợc 9 chủng thuần khiết, trong đó hỉ có 4

chủng khử gần nh ho n to n nitrite trong m i tr ờng gilt nitrite, đồng

thời khử ho n to n nitr te trong m i tr ờng Giltay nitrate, và sinh ra amoni ở

các nồng độ khác nhau.

- Thử nghiệm sinh hó , đặc biệt thử nghiệm O/F, MR, VP giúp loại bỏ vi

-) trong 48 giờ của 2 chủng

khuẩn lên men glucose và giữ lại đ ợc 2 chủng để tiếp tục khảo sát.

- Khảo sát khả n ng khử nitrite (140 mg/l N-NO2

giữ lại cho thấy khả n ng xử lý tốt nitrite và sinh ít amoni của chủng 7.5

trong điều kiện hiếu khí, và khả n ng xử lý tốt nitrite ở điều kiện hiếu khí của

-) trong 48 giờ cho thấy

chủng 7.1.

- Khảo sát khả n ng khử nitrate (200 mg/L N-NO3

chủng 7.5 ở điều kiện hiếu khí (không chịu ảnh h ởng của việc bổ sung giá

thể) có khả n ng khử ho n to n nitr te, kh ng tí h lũ nitrite v xin rất ít +, đạt hiệu suất xử lý từ 97 % đến 98,7 %, thể amon từ 2,3 ≤ mg/ N-NH4

tích khí sinh ra 4 – 5 ml/ ml m i tr ờng s u 48 giờ, pH 8 – 9, đ p ứng ti u

ó khả n ng khử ho n to n nitr te, kh ng tí h lũ NO2

huẩn ủ n thải đầu r loại A Chủng 7 ở điều kiện ó ố sung gi thể - và l ợng moni sinh + ≤ mg/ , hiệu quả xử l đạt 9 ,6% đạt ti u r thấp 5,8 mg/L N-NH4

huẩn ủ n thải đầu r loại B

- định đ ợ điều kiện xử l tối u ủ hủng 7 5 l ở điều kiện hiếu khí,

việ ổ sung gi thể v o m i tr ờng kh ng l m ảnh h ởng đến hiệu quả xử

l ủ hủng VK n

Đồ án tốt nghiệp

- Xác định đ ợ điều kiện xử l tối u ủ hủng 7 l ở điều kiện hiếu khí ó

ổ sung gi thể

v i hủng 7 o hủng 7 5 xử l đ ợ tất ả l ợng N-NO3

-, l ợng N-NH4

- Chủng 7 5 ó khả n ng ứng ụng v o xử l nit trong n thải tốt h n so - trong m i tr ờng + tí h lũ thử nghiệm, kh ng h nh th nh h tí h lũ N-NO2

s u 48 giờ xử l thấp i qu huẩn n thải đầu r loại A v ó hiệu suất

xử l o h n 9 %

- ở nồng độ o h n nhằm

2. K ến ng ị

- m VK ó thể xử l tốt nhất

- Th hiện th m khảo s t khả n ng khử N-NO3

x định đ ợ ng ỡng nồng độ N-NO3

- Khảo s t gi i đoạn t ng sinh nhằm x định đ ợ ph log ủ vi khuẩn

- Th hiện thí nghiệm v i nguồn C kh nh u v tỷ lệ C/N nhằm x

định nguồn C v tỷ lệ C/N thí h hợp nhất ho qu tr nh phản nitr te

- Th hiện khảo s t khả n ng xử l ủ hủng VK ở điều kiện mặn

kh nh u để t m đ ợ nồng độ muối tối u nhất ủ VK

- và + tạo th nh, để từ đó ó những iện ph p thí h hợp ho qu tr nh khửu

- Cần nghi n ứu th m nghi n ứu về qu tr nh giảm nồng độ NO2

NH4

- ủ hủng VK ở qu m l n

nitrite i n r tốt nhất v l ợng moni tí h lũ thấp nhất

- Th hiện khảo s t khả n ng khử N- NO3

h n v qu m th tế

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

[1] Nguy n Thị Hồng Đ o ( ), Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phán nitrate xử

lý nitơ trong nước thải chế biến thủy sản, Đồ án tốt nghiệp, Tr ờng Đại H c Công

Nghệ Tp Hồ Chí Minh, Tp Hồ Chí Mình.

[2] Egorov NS (1986),Thực tập Vi sinh vật học. N B Đại h c quốc gia Moscow.

[3] Nguy n Ho i H ng, Huỳnh V n Th nh ( 4), Phân lập vi khuẩn phản nitrate

từ nước thải và nghiên cứu ứng dụng các vi khuẩn này vào xử lý nước thải giàu

nitơ, Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu khoa h , Tr ờng Đại H c Công Nghệ

Tp Hồ Chí Minh, Tp Hồ Chí Minh.

[4] Nguy n V n Ph c (2005), Thí nghiệm hóa kỹ thuật môi trường – Phần I: Phân

tích chất lượng nước, Nhà xuất bản Đại H c Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.

[5] u n Ph ng Thí nghiệm vi sinh vật N B ĐH B h Kho Đ Nẵng,

[6] Quy chuẩn Việt N m QCVN : 8/BTNMT N c thải chế biến thủy sản.

Tài liệu tiếng Anh

[7] AWWA/APHA/WEF (1999), Standard Methods for the Examination of Water

and Wastewater, 20th Edition – Method 4500-N.

[8] Benson (2001), Microbiological Applications Lab Manual. Eighth Edition. The

McGraw-Hill Companies.

[9] Michael H. Gerardi (2002), Nitriﬁcation and Denitriﬁcation in the Activated

Sludge Process.

[10] Jorge Lalucat, Antoni Bennasar, Rafael Bosch, Elena García-Valdés and

Norberto J. Palleroni. Biology of Pseudomonas stutzeri. Microbiol. Mol.Biol. Rev.

2006

[11] W J Ingledew and R K Poole Microbiol. Rev. 1984. The respiratory chains of

Escherichia coli.

[12] Lu Yu, Yanjun Liu, Gejiao Wang (2008), Identification of novel denitrifying

bacteria Stenotrophomonas sp. ZZ15 and Oceanimonas sp. YC13 and application

for removal of nitrate from industrial wastewater.

Đồ án tốt nghiệp

[13] Sharat D.Gangolli, Piet A.van den Brandt, Victor J.Feron, Christine

Janzowsky, Jan H.Koeman, Gerrit J.A. Speijers, Berthold Spiegelhalder,

Ronald Walker, John S.Wishnok (1994), Nitrate, nitrite and N-nitroso

compounds, European Journal of Pharmacology Environmental Toxicology and

Pharmacology Section 292, 1 - 38.

[14] Walter G. Zumft, 1997. Cell Biology and Molecular Basis of

Denitrification.

Tài liệu internet

[15] http://www.slideshare.net/haholuki/kiem-nghiem-vi-sinh-vat-part1

[16]http://www.genome.jp/kegg/pathway/map/map00910.html

[17]http://i321.photobucket.com/albums/nn378/tuxedomask_photo/Chemistry/

2-26-20098-43-19PM.png

[18]http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongphapthucnghiem

dinhtenvk03.htm

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

+, TÍNH

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐO OD ĐỊNH ƯỢNG NO3

-, NO2

-, NH4

TOÁN HIỆU QUẢ XỬ LÝ, TỐC ĐỘ CHUYỂN HÓA TRONG MÔ HÌNH

KHẢO SÁT,

1. Khảo s t định l ợng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ của chủng

7.5 - H m l ợng Nitrite theo thời gian,

+,mg/l

Nồng độ N-NO2

HKGT HK KKGT KK T

94,01777 73,88146 95,33602 89,9971 0h

76,64979 80,01134 86,27304 83,40584 6h

0,982098 1,970788 3,783385 13,14298 12h

0 0 0,949142 13,14298 24h

0 0 0 0 36h

0 0 0 0 48h

- H m l ợng Amon theo thời gian,

+,mg/l

Nồng độ N- NH4

HKGT HK KKGT KK

4,982292 3,355421 2,948704 3,152062 0h

35,0794 31,41895 19,42077 29,99543 6h

27,75849 27,35177 58,05896 78,5982 12h

40,97681 24,91146 120,6935 78,5982 24h

29,79207 26,33497 117,6431 100,7643 36h

22,06444 20,23421 86,12248 94,05348 48h

- Tố độ chuyển hóa nito trung bình,

Tố độ uyển óa

HKGT HK KKGT KK

Đồ án tốt nghiệp

2,121523 5,6989 1,234847 3,375351 6

5,854957 3,992861 3,036865 0,117332 12

2,417635 2,180226 0,973246 0,058666 24

1,922444 1,413942 0,537733 0,211532 36

1,602826 1,187556 0,25338 0,01884 48

2. Khảo s t định l ng N trong m h nh khử Nitrite trong 48 giờ của

chủng 7.1

- H m l ợng Nitrite theo thời gian

-,mg/l

Nồng độ N- NO2

HKGT HK KKGT KK

109,0788 111,0232 108,0572 78,62717 0

76,64979 80,01134 86,27304 77,50666 6

83,40584 78,29761 140,9476 137,3224 12

0,949142 67,55385 133,2358 137,3224 24

0,553666 0,619579 129,8413 141,4089 36

0 2,465132 114,1541 128,7867 48

- H m l ợng Amon theo thời gian

+,mg/l

Nồng độ N- NH4

HKGT HK KKGT KK

0 0 0 0,711756 0

0 0 0 0 6

142,0462 44,43391 42,40032 43,62048 12

128,6245 106,4584 43,0104 43,62048 24

121,7103 103,2046 50,33132 43,0104 36

137,1656 179,2608 45,04399 33,65589 48

- Tố độ chuyển hóa nito trung bình

Tố độ uyển óa

HKGT HK KKGT KK

Đồ án tốt nghiệp

5,404835 5,168648 3,630687 0,305378 6

9,697767 0,975691 6,274227 8,466993 12

0,853951 2,624541 2,841209 4,233496 24

0,366254 0,199973 2,003207 2,918901 36

0,585141 1,472974 1,065436 1,731326 48

3. Khảo s t định l ợng N trong mô hình khử nitrate trong 48 giờ của

chủng 7.5

- H m l ợng Nitrate theo thời gian

-,mg/l

Nồng độ N- NO3

HKGT HK KKGT KK

167,5141 177,8249 155,791 160,3107 0

171,6102 183,0508 138,2768 165,9605 6

114,9718 132,6271 40,96045 83,61582 12

82,48588 105,6497 27,68362 53,81356 24

0 0 0 0 36

0 0 0 0 48

- H m l ợng amon theo thời gian

+ , mg/l

Nồng độ N- NH4

HKGT HK KKGT KK

16,77711 18,60734 12,30321 19,82749 0

12,30321 15,96367 16,37039 12,30321 6

75,54782 108,492 129,2346 124,1506 12

100,3576 108,492 74,53103 93,4434 24

85,30905 92,83332 64,15972 67,21011 36

72,7008 28,97864 4,982292 2,338627 48

- Tố độ chuyển hóa nito trung bình

TỐC ĐỘ CHUYỂN HÓA N TẠI CÁC ĐIỂM KHẢO SÁT

HKGT HK KKGT KK

Đồ án tốt nghiệp

2,241158 0,312427 0,062975 -0,43039 6 GIỜ

-0,17507 -2,30235 -0,51903 -3,72391 GIỜ

2,74498 1,370053 0,060323 -0,73789 4 GIỜ

2,887068 3,136892 2,749505 2,877746 36 GIỜ

3,398164 3,704158 2,324801 3,488616 48 GIỜ

- Hiệu quả xử lý

HIỆU UẤT XỬ LÝ TẠI CÁC ĐIỂM KHẢO ÁT

HKGT HK KKGT KK

1,040623 0,205029 -1,31461 6 GIỜ 7,999651

-15,3372 -3,37962 -22,7493 GIỜ -1,2498

18,25335 0,785579 -9,01557 4 GIỜ 39,19204

62,6897 53,70966 52,74027 36 GIỜ 61,83108

97,03601 98,70176 60,55114 85,24751 48 GIỜ

4. Khảo s t định l ợng N trong mô hình khử nitrate trong 48 giờ của

chủng 7.1

- H m l ợng Nitrate theo thời gian

-, mg/l

Nồng độ N- NO3

HKGT HK KKGT KK

174,435 177,5424 152,9661 181,0734 0

123,5876 130,9322 119,4915 122,8814 6

36,86441 37,00565 41,66667 50 12

3,672316 4,80226 0 0 24

0 0 0 0 36

0 0 0 0 48

- H m l ợng amon theo thời gian

+, mg/l

Nồng độ N- NH4

HKGT HK KKGT KK

0 0,711756 0 0 0

Đồ án tốt nghiệp

0 0 0 0 6

77,17469 55,00857 59,48247 42,80704 12

93,4434 100,3576 74,53103 42,80704 24

24,30138 91,81653 51,55147 93,4434 36

39,34994 74,73438 15,76031 81,24187 48

- Tố độ chuyển hóa nito trung bình

TỐC ĐỘ CHUYỂN HÓA N TẠI CÁC ĐIỂM KHẢO ÁT

HKGT HK KKGT KK

7,768362 5,579096 8,474576 9,817308 6

4,197307 5,079323 6,507346 8,109291 12

3,504124 2,039008 4,162667 5,590663 2

4,256694 1,698599 3,413432 2,453939 36

2,879009 1,61486 3,292129 2,088611 48

- Hiệu quả xử lý

HIỆU UẤT XỬ LÝ TẠI CÁC ĐIỂM KHẢO ÁT

HKGT HK KKGT KK

26,25298 21,88366 29,1498 32,40299 6

28,36939 39,84666 44,76633 53,53103 12

47,3684 31,99152 57,2729 73,81013 24

86,31235 39,9759 70,4466 48,59681 36

77,83631 50,67349 90,59085 55,14933 48

Đồ án tốt nghiệp

5. Giá trị các thông số l m sở tính toán các giá trị tối đ ho phép trong

n c thải chế biến thủy sản (QCVN 11:2008)

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ

1. Khảo s t định l ợng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ của chủng

7.5

- theo thời gian

- H m l ợng NO2

+ theo thời gian

Đồ án tốt nghiệp

- H m l ợng NH4

2. Khảo s t định l ợng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ của chủng

7.1 - H m l ợng nitrite theo thời gian của chủng 7.1

+ theo thời gian

Đồ án tốt nghiệp

- H m l ợng NH4

Đồ án tốt nghiệp

3. Khảo s t định l ợng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của chủng

7.5 - H m l ợng nitrate theo thời gian của chủng 7.5

+ theo thời gian

Đồ án tốt nghiệp

- H m l ợng NH4

Đồ án tốt nghiệp

4. Khảo s t định l ợng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của chủng

7.1 - H m l ợng nitrate theo thời gian của chủng 7.1

+ theo thời gian

Đồ án tốt nghiệp

- H m l ợng NH4

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC C: HÌNH ẢNH

1. Kết quả t ng sinh n c thải CBTS trên MT Giltay Nitrate và Giltay

Nitrite có bổ sung 1,5% NaCl và 3% NaCl.

MT Giltay Nitrite MT Giltay Nitrate MT Giltay Nitrite MT Giltay

3% NaCl 1,5% NaCl 1,5% NaCl Nitrate 3% NaCl

2. Kết quả định tính m i tr ờng s u 5 ng t ng sinh

Đồ án tốt nghiệp

3. Danh sách các chủng VK phân lập đ ợc từ n c thải CBTS.

7.2 7.4 7.3

Đồ án tốt nghiệp

1 H3 6

7.1 8

4. Kết quả nhuộm Gram các chủng VSV

Chủng 7.5: Tr c khuẩn Gram âm Chủng 1: Tr c khuẩn, Gr m ng Chủng 7.2: Tr c khuẩn Gr m ng

Chủng 7.1 : Tr c khuẩn Gram âm Chủng 6: Tr c khuẩn Gram ng Chủng 8: Tr c khuẩn Gram âm

Đồ án tốt nghiệp

Chủng H1: Tr c khuẩn Gr m ng Chủng 7.4: Tr c khuẩn Gram âm Chủng 7.3: Tr c khuẩn Gram âm

5. Kết quả t ng sinh khi t ng sinh tr n m i tr ờng Giltay Nitrate và Giltay

Nitrite

MT Giltay Nitrate

MT Giltay Nitrite

Chủng

VK

Chủng

7.5 Chủng

7.1

Đồ án tốt nghiệp

Chủng 6

Chủng 8

Chủng

H1

Chủng 1

Đồ án tốt nghiệp

7. Kết quả định tính khi t ng sinh tr n m i tr ờng Giltay Nitrate

Chủng 7.5

MT Giltay - NO3

Chủng 7.1

MT Giltay - NO3

Chủng 6

MT Giltay - NO3

Chủng 8

MT Giltay - NO3

Chủng H1

MT Giltay - NO3

Chủng 1

MT Giltay - NO3

Nitrate Nitrite Amoni pH