Đồ án tốt nghiệp: Phân lập các loài vi nấm kí sinh trên nấm Linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh gây hại cây trồng của những loài có triển vọng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CÁC LOÀI VI NẤM KÍ SINH TRÊN NẤM LINH CHI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG CỦA NHỮNG LOÀI CÓ TRIỂN VỌNG

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THÁI MINH HIẾU

MSSV: 1051110073 Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả trong

Đồ án là trung thực. Mọi thông tin trích dẫn trong Đồ án đều được ghi rõ nguồn

gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thái Minh Hiếu

LỜI CÁM ƠN

Xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học

Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn

thành tốt khóa học 2010 – 2014.

Xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và Môi

trường đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quan trọng tạo nền tảng

kiến thức vững chắc để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng vào công

việc thực tiễn.

Xin chân thành cám ơn TS. Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ

em trong suốt quá trình thực hiện để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này.

Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khóa và đặc biệt là em Huỳnh

Nhi đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần, cùng em trải qua

những khó khăn trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp.

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn bên cạnh,

cổ vũ, động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hoàn thành tốt Đồ án tốt

nghiệp này.

Tp. HCM, Ngày 31 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thái Minh Hiếu

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

--------------

MỤC LỤC ....................................................................................................................i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................................... v

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... vii

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1

1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................... 1

2. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................... 2

3. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi............................................................................. 3

1.1.1. Phân loại (Sissi Wachtel-Galor và Iris F.F.Benzie, 2011)..................... 3

1.1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2001) .................. 4

1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của nấm Linh chi đỏ ............. 5

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Linh chi trên thế giới và Việt Nam ....... 6

1.1.5. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2005) ................. 7

1.2. Giới thiệu về nấm Trichoderma ..................................................................... 12

1.2.1. Phân loại ................................................................................................. 12

1.2.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 12

1.2.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa (Gary J. Samuels, 2004) ............................... 13

1.2.4. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh

cây trồng (Gary J. Samuels, 2004; Gary E. Harman và cộng sự, 2005) ........ 14

1.2.5. Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma trên thế giới và

ở Việt Nam ....................................................................................................... 18

- i -

Đồ án tốt nghiệp

1.3. Giới thiệu với nấm Aspergillus .................................................................... 20

1.3.1. Phân loại ................................................................................................. 20

1.3.2. Đặc điểm hình thái ................................................................................ 20

1.3.3. Đặc điểm sinh lý, hóa sinh .................................................................... 21

1.3.4. Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Aspergillus trên thế giới và ở

Việt Nam .......................................................................................................... 22

1.4. Bệnh do nấm Rhizoctonia spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas,

2005) .................................................................................................................... 23

1.5. Bệnh do nấm Fusarium spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas,

2005) .................................................................................................................... 25

1.6. Bệnh do nấm Colletotrichum spp. gây ra .................................................... 28

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 31

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................... 31

2.2. Vật liệu ......................................................................................................... 31

2.2.1. Nguồn mẫu phân lập ............................................................................. 31

2.2.2. Nguồn nấm bệnh .................................................................................... 31

2.2.3. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 31

2.2.4. Hóa chất ............................................................................................... 32

2.2.5. Các loại môi trường ............................................................................... 33

2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 33

2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 34

2.4.1.Phương pháp phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi (Agrios,

2005) ................................................................................................................ 34

2.4.2. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) .... 35

- ii -

Đồ án tốt nghiệp

2.4.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh

(Agrios, 2005) ................................................................................................. 36

2.4.4. Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase,

chitinase) của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh (Tô Duy Khương, 2007) 37

2.4.5. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối

với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro (Laila Naher và

cộng sự, 2012) ................................................................................................. 38

2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm .................................................. 39

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 40

3.1. Kết quả phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi ......................... 40

3.1.1. Kết quả phân lập nấm kí sinh trên nấm Linh chi ................................. 40

3.1.2. Đặc điểm hình thái của 3 chủng nấm T1, T2, A1 ................................. 41

3.1.3. Kết quả định danh đến loài của 3 chủng nấm T1, T2 và A1 ................ 44

3.1.4. Kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch ở điều kiện in vitro

......................................................................................................................... 47

3.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và chitinase) của hai

loài Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi 51

3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của 2 loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi đối với các nấm bệnh gây hại

cây trồng trong điều kiện in vitro ........................................................................ 52

3.3.1. Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp. .......................................... 53

3.3.2. Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia sp. ...................................... 55

3.3.3. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp1. ............................... 57

3.3.4. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp2. ............................... 59

3.3.5. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp3. ............................... 61

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 64

- iii -

Đồ án tốt nghiệp

4.1. Kết luận ........................................................................................................ 64

4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 66

PHỤ LỤC

- iv -

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

-------  -------

1. CMC: Carboxymethyl cellulose

2. ĐC: Đối chứng

3. MSM: Minimal Synthetic Medium

4. PGA: Potato D-Glucose Agar

5. TN: Thí nghiệm

6. VSV: Vi sinh vật

- v -

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG -------  -------

Bảng Trang

Bảng 1.1. Một số loài nấm mốc thường gặp trong nuôi trồng nấm .............................. 10

Bảng 2.1. Nguồn nấm Linh chi bị bệnh ..................................................................... 31

Bảng 3.1. Tần suất xuất hiện các chủng nấm phân lập được trên nấm Linh chi bệnh

..................................................................................................................................... 41

Bảng 3.2. Tỷ lệ tai nấm Linh chi bị nhễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo .............. 48

Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của T. virens và T. harzianum phân lập ban đầu ....... 50

Bảng 3.4. Đường kính vòng phân giải của hai loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuôi cấy ............................................................ 52

Bảng 3.5. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Fusarium .. 54

Bảng 3.6. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Rhizoctonia

sp. ................................................................................................................................ 56

Bảng 3.7. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm

Colletotrichum sp1. .................................................................................................... 58

Bảng 3.8. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm

Colletotrichum sp2. .................................................................................................... 60

Bảng 3.9. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm

Colletotrichum sp3. .................................................................................................... 62

- vi -

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

-------  -------

Hình Trang

Hình 1.1. Nấm Linh chi (Gerdonama luciadum). ....................................................... 3 24

Hình 1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi đỏ. ............................................................. 5

Hình 1.3. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm. ...................................................... 9

Hình 1.4. Hình thái nấm Trichoderma harzianum ..................................................... 12

Hình 1.5. Trichoderma kí sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở cây họ đậu

(Nấm Trichoderma (màu vàng) tấn công nấm Pythium (màu xanh)) ....................... 15

Hình 1.6. Trichoderma tiết enzyme chitinase và kháng sinh peptaibols phân hủy

vách tế bào nấm bệnh. ................................................................................................ 16

Hình 1.7. Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh

được tiết ra từ Trichoderma hazianum. ...................................................................... 17

Hình 1.8. Hệ bào tử đính của giống nấm sợi Aspergillus .......................................... 21

Hình 1.9. Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra. ...................................................... 25

Hình 1.10. Héo Fusarium trên cây chuối do F. oxysporum f.sp.cubense. ............... 26

Hình 1.11. Biểu hiện bệnh héo vàng do nấm Fuasarium spp. gây ra trên cây cà

chua ............................................................................................................................ 27

Hình 1.12. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra trên các

loại trái cây nhiệt đới. ................................................................................................. 28

Hình 1.13. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum gây ra trên

trái ớt và lá ớt.. ........................................................................................................... 29

Hình 1.14. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra

trên trái thanh long và cành thanh long ...................................................................... 30

Hình 2.1. Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp ........................................................ 40

Hình 3.1. Hình thái đại thể chủng nấm T1 nuôi cấy trên môi trường PGA .............. 42

Hình 3.2. Hình thái vi thể chủng nấm T1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X

..................................................................................................................................... 42

Hình 3.3. Hình thái đại thể chủng nấm T2 nuôi cấy trên môi trường PGA .............. 43

- vii -

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.4. Hình thái vi thể chủng nấm T2 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X

..................................................................................................................................... 43

Hình 3.5. Hình thái đại thể chủng nấm A1 nuôi cấy trên môi trường PGA.............. 44

Hình 3.6. Hình thái vi thể chủng nấm A1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính

40X.............................................................................................................................. 44

Hình 3.7. Kết quả giải trình tự 28S rRNA vả tra cứu trên BLAST SEARCH của

chủng nấm T1 ............................................................................................................. 45

Hình 3.8. Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của

chủng nấm T2 ............................................................................................................. 46

Hình 3.9. Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của

chủng nấm A1 ............................................................................................................. 47

Hình 3.10. Biểu hiện nhiễm bệnh trên nấm Linh chi sau 15 ngày lây bệnh nhân tạo

..................................................................................................................................... 49

Hình 3.11. Vòng phân giải chitin và CMC của 2 loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuôi cấy ............................................................ 53

Hình 3.12. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Fusarium

sp. ................................................................................................................................ 55

Hình 3.13. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm

Rhizoctonia sp. .......................................................................................................... 57

Hình 3.14. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm

Colletotrichum sp1. .................................................................................................... 59

Hình 3.15. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm

Colletotrichum sp2. .................................................................................................... 61

Hình 3.16. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm

Colletotrichum sp3. .................................................................................................... 63

- viii -

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Nấm Linh chi hiện đã được biết đến là loài nấm có giá trị sử dụng cao để làm

dược liệu và được sản xuất phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Beta glucan và

chitine là thành phần chính cấu tạo nên thành tế bào của nấm Linh chi (Pai-Feng

Kao và cộng sự, 2012). Tuy nhiên, Kumar và cộng sự (2011) cho biết, trong quá

trình sinh trưởng, phát triển, nấm Linh chi bị kí sinh bởi nhiều loài nấm, trong đó có

các loài nấm Trichoderma. Tác giả cũng đánh giá đây là nhóm nấm có triển vọng

trong quản lý bệnh hại cây trồng. Enzyme là nhân tố quan trọng giúp Trichoderma

có khả năng tấn công trực tiếp lên nấm Linh chi các loài nấm khác. Trong số các

enzyme được tiết ra từ nấm Trichoderma spp. thì Endochitinase và Glucanase 1,3-

beta-glucosidase đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động kí sinh của nấm

Trichoderma spp. (Margolles Clark và cộng sự, 1995). Hầu hết vách tế bào nấm

bệnh đều có cấu bởi chitin và glucan (Agrios, 2005). Vì vậy, các loài nấm kí sinh

trên nấm Linh chi sẽ có khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh khác. Một số

chủng Trichoderma cũng đã được thông báo có khả năng phòng trừ được nấm

Colletotrichum (Stanley Freeman và cộng sự, 2004). Đây là loài nấm nguy hiểm

cho sản xuất nông nghiệp vì gây hại trên rất nhiều loại cây trồng và trong bảo quản

sau thu hoạch nhiều loài hoa quả (Agrios, 2005).

Cũng như trên thế giới, nấm Linh chi đang được trồng khá phổ biến ở nhiều

tỉnh thành của Việt Nam. Theo Lê Duy Thắng (2001), nấm Linh chi bị một số loài

nấm kí sinh gây hại. Trong số này có nấm Trichoderma là loài gây hại nghiêm trọng

nhất, nhóm mốc này tấn công trên bịch đã có tơ ăn đầy, thậm chí trên cả tai nấm

Linh chi và ức chế mạnh lên sự phát triển của tơ nấm. Nấm Trichoderma đã được

nghiên cứu và sử dụng nhiều ở Việt Nam nhưng chủ yếu được phân lập từ đất và để

phòng trừ nấm gây hại cây trồng có trong đất (Dương Minh và cộng sự, 2005). Việc

phân lập nấm Trichoderma từ nấm Linh chi và lợi dụng chúng để phòng trừ bệnh

hại cây trồng chưa được quan tâm. Bên cạnh đó, biện pháp quản lý nấm gây hại trên

lá và quả các loài cây trồng chủ yếu nhờ vào các loại thuốc hóa học và chưa có tác

- 1 -

Đồ án tốt nghiệp

nhân sinh học nào tỏ ra có hiệu quả đối kháng với loài nấm bệnh này. Vì vậy, việc

phân lập và lợi dụng các chủng nấm kí sinh trên nấm Linh chi để quản lý một số

bệnh hại cây trồng trên mặt đất là khả thi và rất cần thiết.

Xuất phát từ lý do trên, sinh viên tiến hành đề tài “ Phân lập các loài vi nấm

kí sinh trên nấm Linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh gây hại

cây trồng của những loài có triển vọng”.

2. Mục đích nghiên cứu

Phân lập và định danh đến loài các vi nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh

chi. Tuyển chọn các loài vi nấm có triển vọng ứng dụng kháng nấm bệnh hại cây

trồng.

3. Mục tiêu nghiên cứu

− Phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi và định danh đến loài các

chủng nấm phân lập được.

− Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của một số

chủng nấm kí sinh gây bệnh.

− Khảo sát khả năng đối kháng của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh có tiềm

năng với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro.

- 2 -

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi

1.1.1. Phân loại (Sissi Wachtel-Galor và Iris F.F.Benzie, 2011)

Nấm Linh chi có trên khoa học là Ganoderma lucidum, thường được tìm

thấy ở các nước Á Đông. Từ xưa đến nay, ở Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước

châu Á khác đã sử dụng nấm Linh chi như một loại thảo dược để giúp tăng cường

sức khỏe và kéo dài tuổi thọ của con người. Đây là một loại nấm lớn, màu tối, vỏ

ngoài nhẵn bóng và nhìn giống như một khúc gỗ… Ở mỗi nơi nấm Linh chi được

gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc),

Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan). Ngoài ra còn một số tên gọi khác

như nấm vạn niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc). Theo 2 cuốn sách

rất nổi tiếng mô tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao

Jing” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán) và “Ben Cao Gang

Mil” của Li Shi Zhen (1590 trước Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6

chủng nấm được biết đến tại thời điểm lúc bấy giờ. Trong đó có hơn 250 loại nấm

Linh chi được đề cập.

Nấm Linh chi xuất thân từ loài nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có

hàng trăm loài khác nhau cùng họ nấm gỗ (Ganodermataceae). Trong đó, chi

Ganoderma có đến 80 loài có màu sắc khác nhau thay đổi từ vàng, cam, đỏ tía . .

.rất đa dạng.Vị trí phân loại của nấm Linh chi như sau:

– Giới: Fungi

– Ngành: Basidiomycota

– Lớp: Agaricomycetes

– Bộ: Polyporales

– Họ : Ganodermataceae

– Chi: Ganoderma

– Loài: Ganoderma lucidum

Hình 1.1. Nấm Linh chi

(Gerdonama luciadum)

- 3 -

Đồ án tốt nghiệp

1.1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

Nấm Linh chi là một loại nấm hóa mộc, cứng khi khô nhưng khi tiếp xúc

với nước trở nên hơi mềm. Quả thể nấm Linh chi gồm:

Mũ nấm: mặt trên thường có một lớp bóng màu nâu đỏ, mặt dưới nấm có

nhiều lổ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử nếu cắt ngang có dạng tổ ong. Ngoài

thiên nhiên, nấm luôn có dạng bất đối xứng, tức là cuống nấm thường ở một bên

như vị trí tay quạt. Đối với nấm trồng, mũ nấm tròn và gần như đối xứng, cuống

nấm ở giữa trung tâm do được trồng theo từng đơn vị, không có sự chèn ép và ảnh

hưởng môi trường bên ngoài.

Bào tử: hình thuẩn có gai lõm. Một đầu tròn lớn, một đầu nhỏ có lỗ, nơi đây

bào tử sẽ nảy mầm cho ra khuẩn ty ăn luồn vào thân cây. Bào tử nấm tương tự như

một loại phấn hoặc hạt mầm, có thể phát triển thành một cây nấm hoàn chỉnh,

nhưng khác ở chỗ nó được cấu tạo từ một tế bào duy nhất. Đường kính của bào tử

nấm Linh chi chỉ từ 5 – 8 µm. So sánh cùng trọng lượng, bào tử nấm Linh chi có

dược tính mạnh hơn quả thể 75 lần, gồm các dược chất thiên nhiên như

triterpenoids, polysaccharides (β - D - glucans), germannium và các hoạt chất

khác.

Cuống nấm: cuống nấm đặc và cứng, sậm màu, bám vào đài vật như thân

cây. Chân nấm có thể dài cũng có thể ngắn, là bộ phận giúp nấm lấy chất dinh

dưỡng.

B A

- 4 -

Đồ án tốt nghiệp

C D

Hình 1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi đỏ: A: Nấm mọc tự nhiên; B: Nấm trồng

nhân tạo; C: Bào tử nấm; D: Hình thái cấu trúc giải phẫu nấm.

1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của nấm Linh chi đỏ

Thành phần trong nấm Linh chi tươi thì nước là chủ yếu, chiếm 90% khối

lượng. Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10 - 40%, chất béo chiếm từ 2 - 8%,

carbohydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm lượng tro chiếm 8 -

10%. Ngoài ra, nấm Linh chi còn có các thành phần vi lượng như một số loại

vitamin và các khoáng chất khác nhau như là kali, can-xi, phốt pho, magiê, selen,

sắt, kẽm…(Borchers và cộng sự, 1999). Trong một nghiên cứu của các thành phần

không bay hơi của Linh chi cho thấy rằng nấm chứa tro 1,8%, 26 - 28%

carbohydrate, 3 - 5% chất béo thô, 59% chất xơ thô, và 7 - 8% protein thô (Mau và

cộng sự, 2001).

Hàm lượng của protein trong nấm Linh chi khoảng 7 - 8%, thấp hơn so với

nhiều loại nấm khác (Chang và cộng sự, 1996; Mau và cộng sự, 2001). Đặc biệt

thành phần protein của nấm Linh chi có rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất là

lysine và leucine. Hàm lượng chất béo tổng thấp nhưng chứa nhiều acid béo không

bão hòa nhiều nối đôi, đây là các hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con người

(Chang và cộng sự, 1996 ; Borchers và cộng sự, 1999).

Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt chất

sinh học có tác dụng dược lý trong nấm Linh chi bao gồm các nhóm chính:

polysaccharides, triterpenoids, protein, peptide, adenosine và nucleoside ( Zhou và

- 5 -

Đồ án tốt nghiệp

cộng sự, 2007; Zhang W và cộng sự, 2008).

Đến nay, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào nhóm polysaccharides

và nhóm triterpenoids. Hơn 200 polysaccharides đã được phân lập từ quả thể và

sợi nấm của loại nấm này, trong số đó β - 1 - 3 và β - 1 - 6 D - glucans là những

thành phần có hoạt tính sinh học chính (Bao X và cộng sự, 2002). Nhiều tác dụng

dược lý của chúng chẳng hạn như điều hoà miễn dịch, chống oxy hóa, hoạt động

kháng u…đã được chứng minh trong nhiều mô hình động vật (Gou L và cộng sự,

2009; Chang KC và cộng sự, 2007). Cho đến nay, hơn 130 triterpenes đã được

phân lập từ G. lucidum và các hợp chất này được chú ý do tác dụng bảo vệ gan, ức

chế sự tăng trưởng khối u (Kimura Y và cộng sự, 2002). Đặc biệt trong nấm Linh

chi, có hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 – 8 lần) (Boh B và

cộng sự, 2007).

Ngoài ra, nấm Linh chi cũng có chứa một mạng lưới chitin, đây là thành

phần mà cơ thể người không tiêu hóa được và đóng vai trò tạo nên độ cứng cáp

cho nấm Linh chi (Upton và cộng sự, 2000).

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Linh chi trên thế giới và Việt Nam

Linh chi đã được dùng cách đây hàng ngàn năm và đã được chọn lọc thành

những chủng thương phẩm, trồng nhiều ở các nước Châu Á như Nhật Bản, Trung

Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam…

Năm 1997 sản lượng Linh chi được thống kê trên thế giới như sau: 4.300 tấn

trong đó Trung Quốc sản xuất đã là 3.000 tấn. Hàn Quốc là nước sản xuất Linh chi

nhiều thứ hai trên thế giới sau Trung Quốc, sản lượng của Hàn Quốc năm 1998 là

1307 tấn.

Hơn 90 thương hiệu của các sản phẩm Gerdonama lucidum đã được đăng kí và

bán trên thị trường quốc tế (Lin S, 2000). Tiêu thụ trên toàn thế giới hiện nay ước tính

khoảng vài ngàn tấn và thị trường đang phát triển nhanh chóng. Mặc dù không có

những dữ liệu gần đây công bố liên quan đến tổng giá trị các sản phẩm Linh chi trên

thế giới nhưng năm 1995, tổng giá trị ước tính hàng năm được đưa ra bởi các nguồn

thương mại khác nhau là 1628 triệu USD (Chang và Buswell, 1999). Nhiều sản phẩm

- 6 -

Đồ án tốt nghiệp

Gerdonama lucidum được sản xuất từ các bộ phận khác nhau của nấm, hiện đang có

sẵn trên thị trường (Chang và Buswell, 2008).

Tại Việt Nam, nấm Linh chi thương phẩm được trồng đầu tiên năm 1987 tại

“Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu Tp.HCM”. Sau đó, phong trào

trồng nấm Linh chi dần dần lan rộng khắp cả nước. Sau 25 năm, sản lượng Linh chi

của cả nước ước chừng 50 tấn/ năm. Trong đó, Trung tâm đã là 30 tấn, còn 20 tấn còn

lại là do các trang trại hoặc các hộ nông dân của các tỉnh trồng.

Hiện nay trên thị trường cả nước và nhất là thành phố Hồ Chí Minh bày bán các

sản phẩm được chế biến từ Linh chi và nhiều nhất là tai nấm Linh chi. Linh chi có

nhiều chủng loại, giá bán thị trường tùy thuộc vào chất lượng và giá trị sử dụng của

nấm, hiện nay giá nấm cao nhất là nấm có nguồn gốc Hàn Quốc. Bên cạnh đó, việc

tiêu thụ Linh chi ở Việt Nam tương đối khó do phải bảo đảm chất lượng và giá thành

còn cao so với thu nhập kinh tế của người dân Việt Nam nên phong trào trồng Linh chi

ở Việt Nam không được mạnh so với các nước trong khu vực.

1.1.5. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2005)

Tương tự như bất kì loại vật nuôi hay cây trồng nào khác, nấm cũng có thể bị rất

nhiều bệnh. Trong hầu hết các trường hợp, bệnh làm giảm sản lượng và chất lượng

nấm, nghiêm trọng hơn là gây thất thu cho người trồng. Bệnh có thể xảy ra ở bất kì

giai đoạn nào của quá trình nuôi trồng nấm và có 2 dạng chủ yếu là bệnh sinh lý và

bệnh nhiễm.

Bệnh sinh lý là do sợi tơ nấm rất mỏng manh và yếu ớt nên dễ bị tác động của

các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, pH, oxy...và cả độ ẩm của môi trường.

Thường tơ yếu dần đến khi sức đề kháng giảm, dễ nhiễm bệnh và chết.

Bệnh nhiễm với yếu tố gây bệnh rất đa dạng đa số là các nhóm vi sinh vật như vi

khuẩn, nấm mốc, nấm nhầy… Trong đó, vi khuẩn và nấm mốc có tốc độ sinh sản

nhanh, đặc biệt bào tử nấm mốc phát tán rộng nên khả năng lây nhiễm của chúng

thường nhiều hơn. Các tác nhân này ảnh hưởng gián tiếp đến sinh trưởng và phát triển

của nấm, bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng, sống kí sinh hút dinh dưỡng hay thay đổi

pH của môi trường…Hậu quả là tai nấm mọc chậm, thưa, thậm chí ngừng lại. Quả thể

- 7 -

Đồ án tốt nghiệp

không tạo thành hoặc dị dạng, năng suất giảm. Bên cạnh đó, cơ chất dùng nuôi cấy

hoặc trồng nấm cũng có thể là thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật khác.

Đối với nhiễm bịch phôi có thể gặp mốc cam Neuroora.sp, đây là mốc hoại

sinh, xuất hiện giai đoạn đầu sau cấy giống. Mốc tăng trưởng nhanh sinh tơ ăn đầy

bịch phôi, tơ có màu vàng hoặc hồng. Sau đó xuất hiện khối thịt nấm màu cam qua

miệng bịch hoặc vết rách trên bịch. Bệnh lây lan nhanh nên cần cô lập và dập ngay

nguồn bệnh.

Tác nhân gây bệnh khác có thể gặp trong nuôi trồng là nấm nhầy Exomycetes.

Nguyên nhân do vệ sinh kém, nơi trồng ẩm ướt, nhà trồng hoặc dàn kệ bằng gỗ hay

nguyên liệu xử lý không tốt. Bệnh biểu hiện dạng bọt trắng hay đục sữa, nhưng phổ

biến vẫn là những vết lan thành hình rễ cây màu trắng hoặc vàng. Thể sinh sản gồm

các túi mang bào tử. Bệnh làm giảm chất lượng nấm và cạnh tranh một phần thức ăn,

nhưng nấm vẫn có thể tạo tai và phát triển bình thường.

Ngoài ra, nấm có thể bị bệnh mốc xanh gây ra bởi loài Trichoderma, là một vấn

đề nghiêm trọng cho những người trồng nấm trên toàn thế giới, bao gồm Croatia

(Hatvani L và cộng sự, 2012). Nhiều chủng nấm Trichoderma được phân lập xem như

là tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm nút trắng (Agaricus biorus sp.) và nấm sò

(Pleurotus ostreatus) nhiễm mốc xanh ở Croatia. Một nghiên cứu công bố loài

Trichoderma longibrachiatum là tác nhân gây bệnh nấm mốc xanh làm thiệt hại đáng

kể trong sản xuất nấm trồng, bao gồm nấm nút trắng (Agaricus biorus sp.) và nấm sò

(Pleurotus ostreatus) (Kredics và cộng sự, 2010). Đây là nấm mốc kí sinh và khả năng

gây hại rất lớn, thậm chí trên cả tai nấm (Linh chi) (Lê Duy Thắng, 2005).

Theo A. K. Mukherjee và cộng sự (2014) khi nghiên cứu tiềm năng kiểm

soát sinh học của các chủng Trichoderma phân lập trên nấm hoang dã và vỏ cây

cũng cho thấy chủng Trichoderma harzianum CICR-G được phân lập và xem là

một tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi ngoài tự nhiên.

- 8 -

Đồ án tốt nghiệp

A B C

Hình 1.3. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm: A: Nấm mốc cam Neurospora

sp. nhiễm trên miệng bọc phôi trồng nấm; B: Nấm nhầy Exomycetes sp. nhiễm trên

phôi trổng nấm tạo; C: Nấm Trichoderma sp. kí sinh trên tai nấm Linh chi.

Trong nuôi trồng, nhiều khi xuất hiện những nấm ngoài ý muốn, gọi là nấm dại.

Nấm dại thực ra là một trong những loài nấm lớn. Chúng có sẵn trong nguyên liệu, do

không khử trùng hoặc khử trùng không đúng quy cách, bào tử của những nấm này tồn

tại và phát sinh trở lại trên cơ chất trồng nấm. Bào tử nấm dại cũng có thể xâm nhập

vào qui trình trồng nấm ở một giai đoạn nào đó. Chúng phát triển và cạnh tranh thức

ăn với nấm trồng, kết quả làm sản lượng giảm và đôi khi cản trở sự phát sinh quả thể

của nấm trồng. Thường gặp nhất là loài Coprinus (nấm đậu...). Quả thể nấm tương tự

nấm rơm, tai nấm lúc non dạng búp, trưởng thành có dạng dù, nhưng mau tàn, mũ

nhanh chóng chảy rữa ra thành dịch nước đen, nên còn có tên gọi nấm mực hoặc hắc

thủ… Nấm phát triển tốt trên cơ chất có nhiều urê, pH thấp và độ ẩm cao, là một trong

những đối tượng cạnh tranh với nấm rơm và một số loài nấm trồng khác.

Ngoài Coprinus, nhiều loài nấm phá hoại gỗ khác, như Schizophyllum commun,

Trametes sp., Poria sp., Hypoxylon sp.…. Các loài này chủ yếu cạnh tranh về thức ăn

với nấm trồng và thường xuất hiện khi trồng với gỗ khúc…

- 9 -

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1. Một số loài nấm mốc thường gặp trong nuôi trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2001)

STT Tên nấm mốc Đặc điểm biểu hiện Hậu quả trên nấm

Tơ nấm màu hung xuất hiện vài Tai nấm bệnh không

ngày sau khi quả thể rỉ các giọt bị biến dạng nhưng

Cephalosporium spp. nước màu nâu. Đôi khi thành nơi vết bệnh chuyển

1 (Bệnh gợn sóng lớp màng mỏng bao lấy phiến sang đen, chất lượng

màu hung) nấm. Bào tử sinh ra hom trong giảm.

các dịch nhày. Sống kí sinh

hoặc hoại sinh.

Tơ phủ lên quả thể như mạng Tai nấm, đặc biệt là

nhện ban đầu màu trắng sau đó phiến, bị mềm nhũn,

Dactylium dendroides chuyển sang hơi hồng rồi vàng. đôi khi trở nên cứng. 2 (Bệnh mạng nhện) Đỉnh bào tử hình trứng và sinh Thịt nấm chuyển

theo dạng chùm. Một số kí sinh sang nâu.

nấm lớn.

Tơ mọc dày, màu trắng chuyển Ức chế sự tăng

sang vàng hoặc cam. Cơ quan trưởng của tơ nấm, Monilia spp. sinh sản dạng khối màu cam làm tơ không mọc 3 (Neurospora spp.) (có khi đục thủng cả túi nhựa). được. Nguyên liệu (Bệnh mốc cam) Hoại sinh. phủ trắng sau chuyển

sang vàng và cam.

Tơ ngắn cuộn đầu, màu trắng Quả thể chết non. Tai

quanh tai nấm. Hậu bào tử hình nấm mềm nhũn.Bề

Mycogone permiciosa thành sau vài ngày, màu sẫm mặt tai nấm có 4 (Bệnh nối ruồi) (làm vết bệnh có màu nâu). những giọt màu nâu

Bệnh lan truyền bằng đính bào do nhiễm trùng tạo

tử. Kí sinh trên nấm lớn. mùi hôi khó chịu.

- 10 -

Đồ án tốt nghiệp

Tơ mảnh, mọc sát cơ chất và co Ức chế sự tăng

Penicillium spp. cụm lại. Vết bệnh lúc đầu có trưởng của tơ, nhất là 5 (Bệnh mốc xanh) màu trắng chuyển sang màu lục bào ngư. Làm giảm

tối, sống hoại sinh. sản lượng nấm.

Tơ mảnh, mọc bung dạng bong Ức chế mạnh lên sự

trên cơ chất. Vết bệnh trải rộng tăng trưởng của tơ.

nhanh, bào tử thành dễ, mịn, Trichoderma spp. lúc đầu có màu trắng chuyển 6 (Bệnh mốc xanh) sang lục lam. Nấm sống hoại

sinh, một số kí sinh trên nấm

lớn. Bệnh lan do bào tử.

Tơ phát triển trên bề mặt tại Tai nấm biến dạng và 7

nấm, tạp nhiều lỗ hang và các ngừng tăng trưởng,

vết nứt. Hiện tượng bệnh khác phẩm chất kém.

Verticillium fungicola với vi khuẩn là nhầy nhớt và

hôi thối. Sống kí sinh trên nấm

lớn, bệnh lan do ruồi và người

hái nấm.

- 11 -

Đồ án tốt nghiệp

1.2. Giới thiệu về nấm Trichoderma

1.2.1. Phân loại

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc

định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại

vẫn chưa được biết đầy đủ. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào

sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh

sản bào tử vô tính. Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc phân loại:

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Sordariomycetes

Bộ: Hypocreales

Họ: Hypocreaceae

Chi: Trichoderma

Hình 1.4. Hình thái nấm Trichoderma harzianum

(http://www.mycobank.org/)

1.2.2. Đặc điểm hình thái

Sợi nấm của Trichoderma có tốc độ phát triển rất nhanh, chúng có thể

đạt đường kính khuẩn lạc từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy. Trên môi trường PGA

ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng

hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch

- 12 -

Đồ án tốt nghiệp

của môi trường PGA hóa vàng (Bùi Xuân Đồng, 1982).

Sợi nấm Trichoderma không màu, có vách ngăn, cành bào tử không màu,

cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn

mang các bào tử đính ở đỉnh. Bào tử thường có màu xanh, hình tròn, elip hoặc

hình oval tùy từng loài. Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5 µm.

Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà

Trichoderma harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp

chất dinh dưỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng

sống sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng

nên Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học (Gary

J. Samuels, 2004).

1.2.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa (Gary J. Samuels, 2004)

Nấm Trichoderma phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận

nhiệt đới, chúng hiện diện trong đất, trên rễ cây hay sống trên xác bã hữu cơ hay kí

sinh trên những loại nấm khác. Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở

trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5. Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để

Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 – 300C. Một vài dòng phát triển tốt ở

350C. Một số ít phát triển được ở 400C. Hình thái khuẩn lạc và bào tử của

Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 350C chúng tạo ra

những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường,

ở 370C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy.

Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic

(enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2

enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối

kháng với Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy

mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được nghiên cứu nhiều.

- 13 -

Đồ án tốt nghiệp

1.2.4. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh cây

trồng (Gary J. Samuels, 2004; Gary E. Harman và cộng sự, 2005)

Nấm Trichoderma đã được biết đến từ những năm 1920 là yếu tố kiểm soát

chống lại mậm bệnh gây hại cây trồng. Chi Trichoderma có khả năng đối kháng

nhiều loại nấm gây bệnh thực vật. Các cơ chế chính để kiểm soát nấm hại được

biết đến bao gồm tính kí sinh nấm (giao thao sợi nấm, tiết enzyme phân hủy vách

tế bào), tiết kháng sinh kháng nấm, cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian sống.

Cho đến nay, nấm Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại

nấm Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytis

spp. và Fusarium spp.…gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam

quýt, sầu riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lúa, hồ tiêu, bắp, đậu, cà

rốt, cà chua…(Susanne Zeilinger và Markus Omann, 2007).

a. Kí sinh nấm

Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế. Weidling

(1932) đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma kí sinh nấm gây bệnh và đặt tên

cho hiện tượng đó là “giao thoa sợi nấm”.

Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” là hiện tượng tấn công trực tiếp của

nấm này lên một nấm khác. Nó là một quá trình rất phức tạp bao gồm các bước

chính sau: đầu tiên là nhận biết sự có mặt của nấm bệnh, sau đó là quá trình tấn

công, xuyên qua thành tế bào và cuối cùng giết chết nấm bệnh. Một số chi tiết

của cơ chế này ở Trichoderma đã được nghiên cứu và làm sáng tỏ.

Để giải thích rõ hiện tượng “giao thoa sợi nấm” chúng ta có thể chia quá

trình tấn công của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh làm 3 giai đoạn.

Giai đoạn 1: Bước đầu tấn công nấm bệnh

Tương tác đầu tiên là tơ nấm Trichoderma hướng về tơ nấm kí chủ. Hiện

tượng này là đặc tính hướng hóa của Trichoderma (Elad và cộng sự, 1983). Sau khi

tơ nấm Trichoderma đã đến tơ nấm kí chủ, chúng có xu hướng tiếp xúc và cuộn

quanh tơ nấm kí chủ, ép chặt sợi nấm và phát triển song song với nấm kí chủ. Kết

thúc giai đoạn đầu, nấm Trichoderma bước qua giai đoạn 2 là tiết enzyme.

- 14 -

Đồ án tốt nghiệp

Giai đoạn 2: Giai đoạn tiết enzyme phá hủy vách tế bào

Trichoderma có thể kí sinh trên các loài nấm khác nhau, mọc trên sợi nấm

nhờ tiết ra các enzyme phân giải (như enzyme cellulase, chitinase, Glucanase…)

biến, phá huỷ thành tế bào nấm bệnh (Elad và cộng sự, 1983).

Kết quả của những hoạt động phối hợp nhiều nhân tố này đã tạo thành

những lỗ thủng tại vị trí giác bám trên sợi nấm bệnh.

Giai đoạn 3: Tấn công vào tế bào chất và tiêu diệt nấm bệnh

Các sợi nấm Trichoderma xuyên qua lỗ thủng vào khoang trong của nấm

bệnh, phá huỷ chất nguyên sinh nấm chủ và sinh trưởng trong đó.Sự phá hủy các

chất nguyên sinh của nấm bệnh làm cho chúng bị teo lại và chết đi.

Hình 1.5. Trichoderma kí sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở cây họ đậu

(Nấm Trichoderma (màu vàng) tấn công nấm Pythium (màu xanh))

(Hubbard và cộng sự, 1983)

b. Tiết kháng sinh

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp

xúc và kí sinh đã làm cho nấm bệnh chết. Tuy nhiên, ở những điểm không có sự

tiếp xúc của nấm Trichoderma nhưng nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên

cứu cho là do tác động của chất kháng sinh peptaibols từ nấm Trichoderma sinh ra

- 15 -

Đồ án tốt nghiệp

gây độc cho nấm gây bệnh (Susanne Zeilinger và Markus Omann, 2007)

Hình 1.6. Trichoderma tiết enzyme chitinase và kháng sinh peptaibols phân hủy

vách tế bào nấm bệnh (Susanne Zeilinger và cộng sự)

Mendoza-Mendoza (2003) chỉ ra rằng những chủng T. virens đột biến

mất khả năng kí sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh cho

hiệu quả kiểm soát sinh học chống lại R. solani và hạch nấm của S. sclerotiorum

tương đương với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng kí sinh không là cơ

chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh kháng sinh cũng

là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma. Nó là một trong

những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học. Những kháng sinh này có thể ức

chế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác.

Chất kháng sinh peptaibols là một chuỗi các oligopeptides của 12-22

amino acid có chứa nhiều α -aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus

và chứa một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus do T.

polysporum , hazianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên

kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme

phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh, và kích thích cây

trồng kháng lại mầm bệnh (Francesco Vinale và cộng sự, 2008)

Francesco Vinale và cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng

của Trichoderma từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng

nấm bệnh. Ông sử dụng chất kháng sinh được tiết ra từ T. hazianum bổ sung vào

- 16 -

Đồ án tốt nghiệp

môi trường nuôi cấy của chủng Penicilium ultimum. Kết quả cho thấy ở đĩa (1) môi

trường có chứa kháng sinh thì nấm Pythium ultimum bị ức chế không phát triển

được. Trong khi đó đĩa (2) môi trường không chứa kháng sinh thì nấm Pythium

ultimum phát triển rất mạnh và không bị ức chế.

Hình 1.7. Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được

tiết ra từ Trichoderma hazianum ( Francesco Vinale và cộng sự, 2008)

c. Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống:

Không chỉ có cơ chế kí sinh, sự sinh kháng sinh hay tiết enzyme là hiệu

quả trong kiểm soát sinh học mà cơ chế cạnh tranh cũng được coi là cơ chế có ý

nghĩa hết sức quan trọng vì sự thiếu dinh dưỡng là nguyên nhân gây chết phổ biến

đối với vi sinh vật. Cơ chế này có thể được xem là sự đối kháng gián tiếp, được

ứng dụng nhiều và hiệu quả trong kiểm soát sinh học các bệnh do nấm (Gary E.

Harman và cộng sự, 2005).

Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn cacbon, nitơ và yếu tố tăng trưởng

khác với nấm bệnh Nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. gâ y bệnh cho câ y

bằng cách xâ m nhập v ào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền

tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe. Nấm Trichoderma có khả năng cạnh

tranh, cũng sử dụng những mô già và mô chết của cây làm nguồn dinh dưỡng,

bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của

nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. Sivan và Chet (1989), đã chứng minh

rằng sự cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T. hazianum sử dụng

- 17 -

Đồ án tốt nghiệp

đế kiểm soát nấm bệnh Fusarium oxysporum.

Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm

Pythium spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của

những túi bào tử Pythium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây.

Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp. bằng cách sử dụng dịch

tiết đó vì thế mà các bào tử Pythium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn

đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm

bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh.

Bên cạnh đó, Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ như loại

bỏ mầm bệnh, làm tăng sự sinh trưởng và phát triển của rễ hoặc từ những điểm

mà Trichoderma tác động đến sẽ kích thích cây trồng tăng sản xuất các enzym

bảo vệ và các hợp chất kháng sinh nhờ đó giúp cây đề kháng tốt với mầm bệnh.

1.2.5. Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma trên thế giới và ở

Việt Nam

Trên thế giới, những sản phẩm có chứa Trichoderma rất được quan tâm đưa

vào ứng dụng đối kháng với nấm bệnh gây hại trên một số cây trồng.

Một số sản phẩm thương mại của nấm Trichoderma được sản xuất ở

các thị trường Châu Á, Châu Âu, và Hoa Kỳ để sử dụng trên một loạt các loại

cây trồng. Các dạng được sử dụng hiệu quả như bào tử, sợi nấm và bào tử vách

dày (bào tử hậu) được sản xuất dưới một trong hai trạng thái rắn hoặc chất lỏng

lên men.(Harman và Cs, 2004). Sản phẩm Trichoderma 2000 (Israel) chứa nấm

Trichoderma harzianum sử dụng trong phòng chống nấm Rhizoctonia solani,

Sclerotium rolfssi, Pythium spp. Sản phẩm T22 và T22HB, Bio-Trek (USA) chứa

nấm Trichoderma Harzianum trong phòng chống nấm Rhizoctonia spp.,

Sclerotium spp., Fusarium spp. và một số loại nấm khác. Sản phẩm Ecofit (Ấn Độ)

chứa nấm Trichoderma viride trong phòng chống nấm Fusarium, Pythium ,

Rhizoctonia, Phytophthora spp. trên cây bông vải, cây hướng dương, thuốc lá và

nhiều loại cây rau. Sản phẩm BINAB-T WP ( Thụy Điển) chứa 2 loại nấm

Trichoderma harzianum và Trichoderma polysporum trong phòng chống nấm

- 18 -

Đồ án tốt nghiệp

bệnh gây hại trên rễ cây trồng trong nhà kính. Ngoài ra, còn có rất nhiều sản phẩm

chứa nấm Trichoderma ở nhiều nước trên Thế giới được ứng dụng trong phòng

chống nhiều loại bệnh do nấm gây ra trên cây trồng (CABI, 2001).

Ở Việt Nam, nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma

của nhiều đơn vị khác nhau đã và đang góp phần hạn chế các loại nấm bệnh trên

nhiều loại cây trồng khác nhau như hồ tiêu, ca cao, cà chua, dưa hấu dưa leo, cam

quýt…

Các kết quả nghiên cứu và ứng dụng sử dụng nấm Trichoderma chủ yếu là

dạng rải (thành phẩm sau khi đã trộn nấm Trichoderma với phân hữu cơ, ủ với xác

bã thực vật) hoặc tưới, phun xịt (dạng lỏng, bào tử nấm) để phòng và trừ một số

bệnh trên cây trồng do nấm gây ra.

Năm 2005, Đinh Mạnh Hiệp và cộng sự bước đầu đã hoàn tất việc khảo sát

sự phân bố các chủng nấm Trichoderma tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh

miền Đông Nam Bộ. Đồng thời nhóm nghiên cứu này cũng đã nghiên cứu sâu về

hoạt tính đối kháng của vi nấm Trichoderma đã phân lập đối với các loài nấm gây

bệnh cây trồng phổ biến như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfssi, Phytophthora

primulae và thử nghiệm ứng dụng chế phẩm Trichoderma tại một số nơi như xã

Bầu Lâm (Huyện Xuyên Mộc, Tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu), trạm bảo vệ thực vật Long

Khánh…đã thu được một số kết quả ban đầu khá tốt.

Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. HCM đưa ra thị trường sản phẩm phân

bón BIMA dạng rải và dạng phun chứa nấm đối kháng Trichoderma trong phòng

trị bệnh trên cây cà phê, hồ tiêu, cây ăn trái, rau mau…và ủ chất hữu cơ, phụ phẩm

nông nghiệp như rơm rạ, vỏ cà phê đạt những hiệu quả nhất định. Nhóm nghiên

cứu Đại học Cần Thơ đã phối hợp các chủng nấm Trichoderma thành các sản

phẩm phòng trị hiệu quả theo từng nhóm đối tượng gây bệnh như: Tricô - ĐHCT

có khả năng phòng trị hiệu quả bệnh thối rễ trên cây ăn trái, rau màu do

Rizhoctonia spp. và Fusarium spp. gây ra; Tricô - Lúa Von phòng trị bệnh lúa Von

do F. moniliforme; Tri cô - Phytoph trị bệnh do Phytophthora spp. trên cây sầu

riêng, hồ tiêu, cao su…; Tri cô - Khóm trị được bệnh do nấm Phytopphthora spp.

- 19 -

Đồ án tốt nghiệp

và Fusarium spp. gây hại trên khóm ( Dương Minh và Cs, 2010).

Sử dụng nấm Trichoderma bảo vệ cây trồng khỏi các tác nhân gây bệnh sẽ

giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học để tiêu diệt nấm gây bệnh, giảm thiểu sử

dụng phân bón hóa học, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường.Việc sử dụng

nấm đối kháng đóng vai trò là một tác nhân sinh học bảo vệ cây trồng còn là biện

pháp an toàn và hiệu quả, làm tăng năng xuất cây trồng, giữ được phẩm chất nông

sản.

1.3. Giới thiệu với nấm Aspergillus

1.3.1. Phân loại

Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó

có các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,… có giá trị sử

dụng trong sản xuất enzyme, rượu, axit hữu cơ,…

Vị trí phân loại :

Giới: Nấm

Ngành: Ascomycota

Lớp: Eurotiomycetes

Bộ: Eurotiales

Họ: Trichocomaceae

Chi: Aspergillus

1.3.2. Đặc điểm hình thái

Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt, một số trường

hợp trở nên nâu hay màu sẫm. Bào tử trần không có vách ngăn, khác nhau về hình

dạng, kích thước, màu sắc ... ở các loài khác nhau.

Giống nấm này rất đặc biệt do chúng có hệ bào tử đính. Bào tử đính phát

triển từ thành tế bào dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc. Nó tạo thành sợi

cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi. Xung

quanh túi là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể

bình. Từ bộ cuống đính bào tử ngoài cùng, bào tử được sinh ra, gọi là bào tử đính.

Không có một giống nấm sợi nào khác ngoài giống nấm này có hệ bào tử đính

- 20 -

Đồ án tốt nghiệp

tương tự (Nguyễn Đức Lượng, 2006).

Hình 1.8. Hệ bào tử đính của giống nấm sợi Aspergillus

A- Túi; B- Bộ cuống đính bào tử đầu tiên; C- Bộ cuống đính bào tử thứ hai;

D- Bào tử đính; E- Sợi cuống; F- Tế bào gốc (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Một đại diện là nhóm Aspergillus niger khi nuôi cấy trên môi trường thạch

PDA ở 250C cho khuẩn lạc ban đầu màu trắng, sau nhanh chóng chuyển sang màu

đen với việc tạo vô số bào tử đính, mặt trái khuẩn lạc màu hơi vàng nhạt và khi

trưởng thành có thể tạo đường rãnh phóng xạ trên bề mặt thạch. Aspergillus niger

có bào tử đính trưởng thành hình cầu, phần lớn có kích thước 4,0 - 5,0µm, màu

nâu, hơi đen và có gai. Túi và sợi cuống thường có màu nâu bóng (Bùi Xuân

Đồng, 1984; Nguyễn Đức Lượng, 2006).

1.3.3. Đặc điểm sinh lý, hóa sinh

Nấm Aspergillus có mặt khắp nơi trong tự nhiên, rất nhiều trong các vùng

khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chúng phân bố rộng rãi và dễ thích nghi vì

chúng có thể hình thành khuẩn lạc trên nhiều nguồn cơ chất khác nhau. Nghiên

cứu của Andrea Astoreca và cộng sự cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sự sinh

trưởng của Aspergillus niger, Aspergillus awamori khoảng 25 - 300C. Wainwright

và cộng sự đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm Aspergillus

awamori là khoảng 5,0 – 7,0. Độ pH quá acid (khoảng 2 – 3) sẽ ngăn cản sự tạo

thành bào tử, dẫn đến hệ sợi bị phân tán khi nuôi cấy chìm (Bùi Xuân Đồng,

1982).

Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về enzyme của nấm Aspergillus niger,

gồm amylase, amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase… Ngoài ra

- 21 -

Đồ án tốt nghiệp

chitinase của nấm này cũng được đề cập đến trong Hội nghị Quốc tế về

Aspergillus tại Nertheland vào tháng 3 năm 2010. Theo Takashi và cộng sự

(2002), nhiệt độ thích hợp để Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao

nhất là 370C. “Nguồn: The 7th International Aspergillus Meeting (2010)”.

Vấn đề độc tố của Aspergillus niger cũng được đề cập đến, phần lớn chúng

không có hại, không tạo mycotoxin, nhưng một số có thể tạo độc tố gây hại đến

động vật và con người. Sự an toàn của Aspergillus niger được đề cập đến trong

nhiều bài báo của các tác giả Schuster và cộng sự (2002), Van Dijck và cộng sự

(2003), Blumenthal (2004), Olemsp.ka - Beer và cộng sự (2006), theo thông tin

tóm tắt từ những bài báo của các tác giả này, khoảng 3 – 10% các chủng

Aspergillus niger có khả năng sinh ra độc tố ochratoxin A trong những điều kiện

nuôi cấy xác định (Zofia Olempska - Beer, 2008).

1.3.4. Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Aspergillus trên thế giới và ở Việt

Nam

Các loài nấm thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ chất tự

nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp, ở nhiều vùng địa lý trên thế giới,

được nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt loài

Aspergillus oryzae đã được dùng rộng rãi trong công nghệ lên men truyền thống để

chế biến thực phẩm ở nhiều nước Châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Nhật

Bản…

Hiện nay, công nghệ sinh học sử dụng một số loài thuộc chi Aspergillus chủ

yếu là các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae trong công nghiệp sản xuất

enzyme (α-amylase, pectinase, protease, cellulase), trong công nghệ chế biến thực

phẩm, trong công nghệ sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric, acid

gluconic…

Một số loài có khả năng tạo ra các chất kháng sinh như Aspergillus

candidus tạo thành candidulin, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamatti tạo thành

acid kojic có tác dụng ức chế đối với một số vi khuẩn. Trong đó đã thực sự được

dùng trong công nghiệp dược phẩm chỉ có loài Aspergillus fumigatus để sản xuất

- 22 -

Đồ án tốt nghiệp

fumagilin làm thuốc chữa lị amip. Đặc biệt đáng chú ý là các loài tạo thành các

độc tố gây ung thư gan như các loài Aspergillus flavus, Aspergillus paraticus tạo

thành aflatoxin, Aspergillus versicolor tạo thành sterigmatocystin.

Ở Việt Nam, nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài Aspergillus

awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae có hoạt tính α-amylase và

glucoamylase cao để thủy phân tinh bột sắn (N.B.Ngà và N.L.Dũng, 1984);

Nghiên cứu thu nhận và sử dụng enzyme protease từ Aspergillus oryzae trong sản

xuất nước chấm (Q.V.Thịnh, 1977), để khử lông da súc vật (L.V.Nhương và Cs.,

1977); nghiên cứu sử dụng sinh khối một số chủng thuộc loài Aspergillus niger để

nâng cao chất lượng thức ăn chăn nuôi (N.L.Dũng và Cs, 1984); nghiên cứu khả

năng sinh tổng hợp acid citric của một số chủng thuộc loài Aspergillus niger

(N.T.Hương và N.L.Dũng, 1984); nghiên cứu hoạt tính phân giải phosphate khó

tan và cellulose của Aspergillus japonicus (P.V.Ty và Đ.T.Lương, 1998); nghiên

cứu hệ vi nấm đối kháng với các vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam, trong đó

có 14 loài thuộc chi Aspergillus có hoạt tính này (Bùi Xuân Đồng và Cs, 1978)…

(Trích dẫn bởi Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn, 2000).

1.4. Bệnh do nấm Rhizoctonia spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas,

2005)

Ở Việt Nam có nhiều bệnh do nấm Rhizoctonia gây ra. Một số loài phát

triển, xâm nhiễm, gây bệnh trên thân cây và bề mặt lá trong điều kiện thời tiết ấm,

mưa hoặc ẩm độ cao. Nấm Rhizoctonia thường gây bệnh ở rễ, phần thân sát mặt

đất ở cây non và trên bắp, thân và lá ở cây trưởng thành. Một số triệu chứng

thường gặp do Rhizoctonia gây ra bao gồm: thối rễ, lở cổ rễ cây non, teo thắt thân,

khô vằn và thối nhũn.

Vết bệnh ở cây con thường có màu nâu, thối nhũn và teo thắt lại ở phần

thân sát mặt đất và dẫn tới hiện tượng cây bị đổ rạp trên mặt đất được gọi là lở cổ

rễ cây con. Trên những cây già hơn vết bệnh hóa gỗ rắn chắc và thắt lại tại phần

thân tiếp giáp với mặt đất gọi là hiện tượng teo thắt thân.

Trên lúa và ngô những vết chết loang lổ như hình vân mây trên phiến lá và

- 23 -

Đồ án tốt nghiệp

bẹ lá được gọi là bệnh khô vằn. Bệnh thường xuất hiện khi cây đã lớn và đang

đóng bắp.

Nấm này còn gây bệnh trên cây cải bắp và xà lách gọi là bệnh thối ướt, vết

bệnh lúc đầu là vết lá chết màu nâu vàng ở các lá ngoài, sau đó vết bệnh lan rất

nhanh và gây thối toàn bắp.

Nấm Rhizoctonia solani là một nấm có thể kí sinh trên rất nhiều loại cây

trồng. Nấm phát triển rất nhanh, hạch nấm và sợi nấm có thể tồn tại trên các mô

cây sống hoặc tồn tại trong tàn dư cây trồng và trong đất trong thời gian dài vì

chúng chứa một lượng lớn chất dự trữ. Sự xâm nhiễm của đất bắt đầu từ hạch nấm,

nguồn hạch nấm có thể từ đất, rễ, tàn dư cây trồng, hạt hay củ giống bị bệnh. Hạch

nấm khi nảy nầm có thể tạo thành sợi nấm, sợi nấm tiếp xúc với mô cây, xâm

nhiễm trực tiếp xuyên vào trong tế bào cây. Trong một số trường hợp, sợi nấm

xâm nhiễm qua mô chết hay qua các vết thương cơ giới trên cây. Quá trình xâm

nhiễm làm cản trở quá trình hút nước và trao đổi chất dinh dưỡng, kết quả làm cho

mô cây bệnh chuyển màu nâu hoặc thối và cây bị đổ rạp xuống. Bên cạnh đó, nấm

Rhizoctonia solani còn sản sinh enzyme cellulilitic và pectinolitic và độc tố thực

vật. Độc tố này giết chết mô chủ, khi mô chủ bị chết và bị phân hủy giải phóng

chất hữu cơ làm trăng sự sinh trưởng tiếp tục của nấm. Kết quả làm cho mô cây

bệnh chuyển màu nâu hoặc thối và cây bị đổ rạp xuống.

Rhizoctonia có thể gây hại trên cay rau màu quanh năm, nhưng phổ biến

nhất là trong vụ Xuân. Tại Việt Nam, nấm thường xuất hiện trên bắp cải, ngô và

các loại cây rau màu. Thời tiết nóng ẩm rất thích hợp cho nấm phát triển, triệu

chứng bệnh có thể xuất hiện từ 3 – 7 ngày sau khi diễn ra quá trình xâm nhiễm.

- 24 -

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.9. Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra: (a) triệu chứng nhọn như đầu mác

ở rễ bệnh, (b) bệnh khô vằn trên lúa, (c) hạch nấm trên bắp cải bị bệnh,

(d) bệnh trên vỏ ngô (Burgess LW và cộng sự, 2008)

1.5. Bệnh do nấm Fusarium spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas,

2005)

Nấm Fusarium là một trong những loài nấm gây thiệt hại về kinh tế quan

trọng nhất. Fusarium gồm nhiều loài khác nhau có khả năng gây bệnh trên nhiều

cây trồng khác nhau. Nhiều loài sản sinh ra độc tố có độc tính cao, có ảnh hưởng

đến động vật hoang dã, thú nuôi và con người. Tuy nhiên có nhiều loài nấm

Fusarium là nấm hoại sinh phổ biến trong đất. Nấm này phân bố khắp các nơi trên

thế giới, một vài loài có xu hướng xuất hiện khắp nơi trong khi một số loài chủ yếu

xuất hiện ở nhiệt đới, bán nhiệt đới, ôn đới .

Nấm Fusarium sp. tấn công chủ yếu vào bộ rễ. Đặc biệt, bệnh gây hại nặng nề

trong diều kiện stress nước, dùng phân bón quá nhiều hay rễ cây bị tổn thương.

- 25 -

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.10. Héo Fusarium trên cây chuối do F. oxysporum f. cubense sp.:

(a) các triệu chứng héo trầm trọng, (b) triệu trứng nứt thân, (c) hóa nâu mạch dẫn.

Héo Fusarium trên cẩm chướng do F.oxysporum f. callistephi sp.: (d) héo trầm

trọng gây chết cây, (e) thân héo với nhiều khối bào tử phân sinh màu trắng trên bề

mặt. (Burgess LW và cộng sự, 2008)

Bệnh héo vàng là một trong những bệnh nguy hiểm gây thiệt hại cho cây

trồng ở nước ta, bệnh phổ biến ở hầu hết các vùng trồng cây khoai tây, cà chua, đậu

đỗ. Hầu hết các loài gây héo nằm trong nhóm Fusarium oxysporum complex. Nhóm

Fusarium oxysporum complex có rất nhiều dạng chuyên hóa khác nhau, mỗi nhóm

gây hại trên một nhóm kí chủ nhất định.

Bệnh gây hại ở vị trí gốc thân, cổ rễ của cây khoai tây và cà chua. Ở gốc

cây, vết bệnh màu nâu hoặc xám nhạt bao quanh gốc, gây hiện tượng thối khô tóp

lại, cắt ngang phần thân cây bệnh thấy có đường bó mạch tròn quanh thân màu nâu

xám. Triệu chứng ban đầu là có một vài lá khô héo vàng loang lổ và rụng xuống,

sau đó toàn bộ lá héo rũ vàng dẫn đến chết cây. Lúc đầu trên ruộng chỉ có một vài

cây héo vàng, nếu bị nặng có thể cả ruộng bị héo vàng và chết.

- 26 -

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.11. Biểu hiện bệnh héo vàng do nấm Fusarium spp. gây ra trên cây cà

chua (Steve Bost, 2013)

Các yếu tố khách quan làm tăng sự phát triển của nấm Fusarium sp. là: bón

phân đạm quá nhiều, các yếu tố về hệ vi sinh vật trong đất, ẩm độ của đất, nhiệt độ

tối ưu cho nấm Fusarium sp. Nấm phát triển và gây hại nặng trong điều kiện ấm và

ẩm, khi nhiệt độ đất ở 25 - 300C và độ ẩm cao kết hợp với điều kiện cây sinh trưởng

yếu thì nấm dễ dàng gây bệnh. Nấm xâm nhiễm vào cây trồng qua vết thương cơ

giới trên rễ cây. Nấm gây bệnh có thể tồn tại trong đất trong thời gian rất dài. Chúng

lan truyền từ vùng này sang vùng khác thông qua hạt giống, cây giống, nguồn nước

tưới…

- 27 -

Đồ án tốt nghiệp

1.6. Bệnh do nấm Colletotrichum spp. gây ra

Nhiều nhà nghiên cứu bệnh cây thường dùng từ “thán thư” để chỉ các bệnh

do Colletotrichum gây ra. Triệu chứng của bệnh là việc hình thành các vết đốm

hoại tử màu đậm, lõm xuống, vết bệnh thường có vòng tròn. Nấm Colletotrichum

spp. có khả năng tấn công lên hầu hết những cây trồng vùng nhiệt đới và cận nhiệt

đới, là nguyên nhân gây ra thiệt hại to lớn đối với sự tạo trái hoặc quả của cây

trồng do sự ra hoa của cây giảm khi nấm tấn công lên lá, chồi, hoa, trái của nhiều

loại cây: ca cao, tiêu, cà phê, cà chua,thanh long, chuối, xoài, táo, nho, đu đủ, dâu

tây và một số loại cây trồng khác (Holliday, 1980; Agrios, 2005). Bên cạnh đó,

bệnh này không chỉ gây hại ngoài đồng mà còn gây hại trên quả sau khi thu hoạch

(Hadden và Black, 1989).

A B

C D E

Hình 1.12. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra trên các

loại trái cây nhiệt đới: A. Cam; B. Ổi; C. Xoài; D.Đu đủ; E. Mận (Phoulivong S,

2012)

- 28 -

Đồ án tốt nghiệp

Nấm Colletotrichum coffeanum gây bệnh trên cây cà phê làm trái còn non

bị hư hỏng, hạt cà phê hư hỏng từ 20 – 80%. Khi bệnh mới xuất hiện trên lá, cành,

thân làm rụng lá, cành trơ trụi khô đen. Bệnh thường phát sinh gây hại từ giai đoạn

cà phê ra hoa đến khi quả già, nhất là trong thời tiết ẩm thấp, mưa nhiều.

Bệnh thán thư trên cây tiêu do nấm Colletotrichum gloeosporiodies. Bệnh

thường gây hại ở đầu mép lá tiêu, làm lá bị cháy, trường hợp nhiễm nặng lá sẽ bị

rụng, có thể gây hại thân, nhánh cây tiêu làm tháo đốt, khô cành. Bệnh xuất hiện

quanh năm nhưng thường phát triển vào mùa mưa.

Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum lagenarium là bệnh gây thiệt hại

nghiêm trọng đến năng suất ớt trên toàn cầu (Kim, 2007). Bệnh tấn công lên lá,

thân và quả làm giảm năng suất.

Hình 1.13. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum gây ra trên

trái ớt và lá ớt (Jaw-Fen Wang, 2010)

Năm 2009, Masanto Masyahit được xem là người đầu tiên ở Malaysia báo

cáo bệnh thán thư trên thanh long do tác nhân chính là Colletotrichum

gloeosporioides. Theo kết luận của báo cáo thì bệnh chịu tác động của yếu tố điều

kiện môi trường và kỹ thuật canh tác hơn là những yếu tố khí hậu.

- 29 -

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.14. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây

ra trên trái thanh long và cành thanh long (Masanto Masyahit, 2009).

- 30 -

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

− Thời gian: tháng 4/2014 đến tháng 7/2014

− Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và

Môi trường thuộc trường Đại học Công nghệ Tp.HCM

2.2. Vật liệu

2.2.1. Nguồn mẫu phân lập

Nấm Linh chi bị bệnh được thu nhận tại các cơ sở trồng nấm.

Bảng 2.1. Nguồn nấm Linh chi bị bệnh

Đợt Ngày thu Nơi thu Số lượng (tai nấm)

1 15/4/2014 Bình Dương 20

2 25/4/2014 Bình Dương 20

3 5/5/2014 Bình Dương 20

2.2.2. Nguồn nấm bệnh

❖ Trung tâm kiểm dịch thực vật thuộc Chi cục bảo vệ thực vật Tp.HCM cung cấp:

– Fusarium sp. gây bệnh héo thân cây bắp.

– Rhizoctonia sp. gây bệnh thối lở cổ rễ cây bắp.

– Colletotrichum sp1. gây bệnh thán thư trên gấc.

❖ Nhóm sinh viên thực hiện đề tài bảo vệ thực vật phân lập:

− Colletotrichum sp2. gây bệnh thán thư trên ớt.

❖ Sinh viên tự phân lập:

− Colletotrichum sp3. gây bệnh thán thư trên thanh long.

2.2.3. Dụng cụ và thiết bị

2.2.3.1. Dụng cụ

– Ống nghiệm

– Đĩa petri

– Que cấy

– Đũa thủy tinh

- 31 -

Đồ án tốt nghiệp

– Khoan thạch hình trụ

– Cốc thủy tinh

– Ống đong

– Đèn cồn

2.2.3.2. Thiết bị

− Tủ cấy

− Máy hấp Autoclave

− Tủ lạnh

− Máy đó pH

− Kính hiển vi

− Cân phân tích

− Máy cất nước

− Bếp từ

2.2.4. Hóa chất

− D-Glucose

− CMC

− Chitin huyền phù

− NaNO3

− Casein

− K2HPO4

− MgSO4

− MgSO4.7H2O

− NH4NO3

− MnSO4 − ZnSO4

− KCl

− FeSO4

− Agar

− Đệm phosphate pH = 6,3

- 32 -

Đồ án tốt nghiệp

− Nước cất

− Cồn 700, 960

2.2.5. Các loại môi trường

– Môi trường phân lập:

Môi trường½ Potato D-Glucose Agar (½ PGA)

❖ Môi trường nuôi cấy:

Môi trường Potato D-Glucose Agar (PGA)

❖ Môi trường khảo sát hoạt tính sinh enzyme ngoại bào:

Môi trường Minimal Synthetic Medium (MSM)

2.3. Nội dung nghiên cứu

− Phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi và định danh đến loài các

chủng nấm phân lập được.

− Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase ) của một số

chủng nấm kí sinh gây bệnh.

− Khảo sát khả năng đối kháng của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh có tiềm

năng với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro

- 33 -

Đồ án tốt nghiệp

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1.Phương pháp phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi (Agrios,

2005)

❖ Các bước thu mẫu

Chọn các mẫu mới bị bệnh để phân lập. Mẫu được đựng trong các túi nilon

đã hấp khử trùng. Mỗi mẫu bệnh được cho vào từng túi riêng, ghi nhãn nơi lấy,

ngày lấy. Mẫu lấy về, phân lập sớm nhất trong thời gian có thể hoặc bảo quản trong

tủ mát để tránh bị các loại nấm và vi khuẩn hoại sinh lây nhiễm, phát triển và lan

nhanh.

❖ Các bước phân lập, cấy truyền và làm thuần mẫu nấm bệnh

Khử trùng mẫu cấy: Rửa mẫu bệnh bằng nước để loại bỏ bụi bẩn. Dùng dao

mổ đã khử trùng cắt những mẫu cấy nhỏ từ phần ranh giới giữa mô không có dấu

hiệu bệnh và mô mới bị bệnh. Khử trùng mẫu bệnh bằng cách nhúng nhanh vào cồn

700 trong 30 giây, rửa lại nhiều lần trong nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô

trùng.

Dùng kẹp đã khử trùng gấp giữ và ấn nhẹ những mẫu cấy lên mặt thạch gần

mép đĩa môi trường phân lập ½ PGA. Đặt ngược đĩa cấy để tránh đọng hơi nước

trên bề mặt môi trường ở nhiệt độ phòng.

Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản nấm phát triển từ những mẫu cấy,

dùng que cấy đã khử trùng cấy truyền bằng cách cấy đỉnh đầu sợi nấm sang đĩa môi

trường PGA để tách rời các chủng nấm. Tiến hành làm thuần các mẫu nấm qua

nhiều lần cấy truyền.

Các thao tác đều được tiến hành trong tủ cấy vi sinh dưới ngọn lửa đèn cồn.

❖ Tần suất xuất hiện (%) của chủng nấm phân lập được tính theo công thức:

Tần suất bắt gặp = A/B x 100

Trong đó: A là số lần xuất hiện của chủng nấm.

B là tổng số mẫu phân lập.

- 34 -

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005)

❖ Quan sát đại thể nấm sợi

Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm bằng việc mô tả đặc điểm tản nấm

của chúng khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng. Các chủng nấm phân lập được

sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa môi trường PGA và được ủ 1 tuần.

Quan sát mô tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển;

Dạng sợi nấm, màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; Màu sắc của môi trường do

sắc tố nấm sợi tạo ra; thời gian hình thành bào tử…trong thời gian nuôi ủ.

❖ Quan sát hình thái vi thể nấm sợi dưới kính hiển vi

Quan sát hình thái vi thể các chủng nấm phân lập được bằng phương pháp

tiêu bản phòng ẩm.

Chuẩn bị một đĩa môi trường PGA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa:

mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai

thanh đũa tre.

Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa môi trường PGA

chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy. Dùng dây cấy đã khử

trùng, lấy sinh khối nấm thí nghiệm cấy vào 4 mặt bên của khối thạch.Sau đó đậy

lamelle lên trên khối thạch. Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong

đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy

ra (thường là 4 – 5 ngày).

Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên

một lame sạch có sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở

độ phóng đại 400 lần và mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh

và vách ngăn; Hình dạng cuống bào tử; Đặc điểm hình dạng. màu sắc, kích thước

bào tử…

- 35 -

Đồ án tốt nghiệp

2.4.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh (Agrios,

2005)

Nguyên tắc: Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các tai nấm khỏe

được trồng trong các điều kiện có kiểm soát và được cấy vi sinh vật nghi là gây bệnh.

Khi chọn lựa những tai nấm khỏe mạnh để lây bệnh nhân tạo, nên lưu ý dùng cùng

một giống với nấm bị bệnh mà từ đó tác nhân gây bệnh được phân lập. Bệnh có thể

được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh theo cơ chế xâm nhiễm của tác

nhân đó. Chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh được thí

nghiệm. Luôn luôn bố trí công thức đối chứng (bao gồm các cây không được

lây bệnh).

Tiến hành:

❖ Lây bệnh nhân tạo

Sử dụng các mẫu nấm thuần mới phân lập được để chuẩn bị nguồn lây bệnh.

Lây bệnh lên các nấm Linh chi bằng cách phun trực tiếp dịch bào tử của chúng lên

tai nấm khỏe, không có dấu hiệu bệnh.

Chuẩn bị dịch bào tử lây bệnh: Một cách đơn giản là cạo các bào tử và sợi

nấm ra khỏi đĩa cấy được nuôi ủ 1 tuần ở nhiệt độ phòng và cho bình tam giác có

chứa nước cất vô trùng, chú ý để nút bình vẫn trong điều kiện vô trùng, thao tác này

được thực hiện trong tủ cấy vi sinh dưới ngọn lữa đèn cồn. Lắc bình tam giác sau

khi cấy để đảm bảo nguồn bệnh được phân bố đều trong dịch.

Bố trí lây bệnh tương ứng với mỗi chủng nấm là 10 tai nấm Linh chi thí

nghiệm phun dịch bào tử và 10 tai nấm Linh chi dùng làm đối chứng phun nước vô

trùng.

Đặt các tai nấm thí nghiệm và đối chứng trong cùng điều kiện nhiệt độ phòng

với điều kiện sáng và tối xen kẽ để hoàn thành quá trình lây bệnh.

Kiểm tra và so sánh những tai nấm được lây bệnh với những tai nấm đối

chứng. Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh các triệu chứng biểu hiện

khi lây bệnh nhân tạo với các triệu chứng bệnh ban đầu.

- 36 -

Đồ án tốt nghiệp

❖ Tỷ lệ xuất hiện bệnh (%) sau khi lây bệnh nhân tạo tính theo công thức:

Tần lệ xuất hiện = A/B x 100

Trong đó: A là số mẫu bị nhiễm bệnh.

B là tổng số mẫu lây nhiễm.

❖ Kiểm chứng tác nhân gây bệnh

Các tai nấm thí nghiệm sau khi lây bệnh có biểu hiện bệnh giống tương tự

như quan sát lúc ban đầu trước khi phân lập được phân lập lại nhằm khẳng định tác

nhân gây bệnh.

Phân lập lại từ các tai nấm mới bị bệnh. Tiến hành quan sát kiểm tra và đối

chiếu hình thái đại thể và vi thể của chúng .Mẫu nấm phân lập lại có đặc điểm hình

thái phải giống như mẫu nấm được làm thuần ban đầu.

2.4.4. Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase,

chitinase) của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh (Tô Duy Khương, 2007)

Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa vào sự phân giải cơ chất chitin và cellulose bởi

enzyme chitinase và cellulase. Cơ chất bị phân giải tạo ra các đường khử. Các

đường này không cho phản ứng màu với lugol. Vì vậy có thể khảo sát khả năng sinh

enzyme chitinase và cellulase của các chủng nấm khi nuôi cấy chúng trên môi

trường có nguồn cơ chất cacbon duy nhất lần lượt là CMC và huyền phù chitin. Khả

năng sinh enzyme chitinase và cellulase của các chủng nấm được đánh giá tỷ lệ

thuận với đường kính vòng phân giải chitin và cellulose sau khi nhuộm màu với

thuốc thử lugol.

Tiến hành:

Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm: Cấy điểm các chủng nấm thí nghiệm lên

môi trường PGA và ủ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày.

Dùng khoan thạch hình trụ đục một miếng thạch (từ đĩa môi trường PGA đã

nuôi cấy nấm thí nghiệm) đặt lên tâm đĩa môi trường cảm ứng MSM có chứa 1%

cơ chất (CMC, huyền phù chitin) và ủ trong thời gian 2 ngày.

- 37 -

Đồ án tốt nghiệp

Sau 2 ngày, nhuộm màu môi trường bằng cách đổ dung dịch lugol vào đĩa thí

nghiệm để yên 5 phút và tiến hành đo đường kính vòng phân giải.

Các thí nghiệm được lặp lại 6 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri.

2.4.5. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với

các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro (Laila Naher và cộng sự,

2012)

Nguyên tắc: Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng

Trichoderma với các nấm bệnh khi nuôi cấy đồng thời trên môi trường thạch đĩa PGA.

Tiến hành:

❖ Chuẩn bị nguồn nấm

Đĩa nấm Trichoderma gốc: Cấy điểm các chủng Trichoderma cần khảo sát

vào giữa đĩa thạch PGA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn đối kháng nấm

bệnh.

Đĩa nấm bệnh gốc: Cấy điểm các chủng nấm bệnh cần khảo sát vào giữa đĩa

thạch PGA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn thử khả năng bị ức chế bởi nấm

Trichoderma.

❖ Thí nghiệm đối kháng trực tiếp

Đĩa đối kháng: Dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng

thạch có chứa nấm bệnh từ đĩa nuôi cấy nấm bệnh gốc, đặt khoanh thạch cách mép

đĩa môi trường PGA là 1cm. Sau 2 ngày cấy nấm bệnh, tiến hành tương tự khoan

lấy 1 khoanh thạch có chứa nấm Trichoderma trên đĩa Trichoderma gốc, đặt vào đĩa

có chứa nấm bệnh, cách mép đĩa petri 1cm nhưng ở phía đối xứng với nấm bệnh

qua tâm đĩa thạch.

Đĩa đối chứng: khoanh thạch nấm bệnh, đường kính 5mm đặt tương tự trên

đĩa môi trường PGA cách mép đĩa petri 1cm và không cấy nấm Trichoderma sp.

Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 3 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt

độ phòng. Quan sát ghi nhận kết quả sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy.

Chỉ tiêu theo dõi

− Hiệu quả ức chế (% )sự phát triển nấm bệnh..

- 38 -

Đồ án tốt nghiệp

− Sự phát triển của nấm Trichoderma đối kháng lại nấm bệnh.

❖ Tính toán số liệu

Phần trăm ức chế nấm bệnh được tính theo công thức:

PIMG = (R1 – R2)/ R1 . 100 (%)

Chú thích: R1: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối chứng khi không

có cấy Trichoderma (mm).

R2: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối kháng khi có cấy

Trichoderma (mm).

R2 T R1

Đĩa đối chứng Đĩa đối kháng

Hình 2.1. Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp: R1: tản nấm bệnh trên đĩa đối

chứng; R2: tản nấm bệnh trên đĩa đối kháng cấy chung với nấm Trichoderma;

T: tản nấm Trichoderma trên đĩa đối kháng.

2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm

Số liệu của các thí nghiệm được lấy giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD

và xử lý số liệu bằng phần mềm Excel và Statgraphics.

- 39 -

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi

3.1.1. Kết quả phân lập nấm kí sinh trên nấm Linh chi

Từ mẫu nấm Linh chi bị bệnh thu ở các sơ sở sản xuất, sinh viên đã phân lập

và thu được 4 chủng nấm có đặc điểm hình thái khác nhau được kí hiệu lần lượt là

T1, T2, A1 và A2 với tần suất xuất hiện được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1. Tần suất xuất hiện các chủng nấm phân lập được trên nấm Linh chi bệnh

Tần suất xuất hiện qua 3 đợt phân lập (%) Chủng nấm Trung bình 1 2 3

T2 80 65 75 73,33

T1 55 70 60 61,67

A1 55 50 55 53,33

A2 10 20 0 10

Kết quả trình bày ở bảng 3.1 cho thấy chủng nấm T2 có tần suất xuất hiện

cao nhất là 73,33%, chủng nấm T1 với tần suất xuất hiện đứng thứ hai là 61,67%,

đứng thứ ba với tần suất xuất hiện 53,33% là chủng nấm A1 và cuối cùng là chủng

nấm A2 với tần suất xuất hiện chỉ có 10%.

Ba chủng nấm T1, T2 và A1 với tần suất xuất hiện trên 50% và đều xuất hiện

trong cả 3 đợt phân lập nên chọn để tiếp tục nghiên cứu. Chủng A2 không được

chọn để tiếp tục nghiên cứu vì với tần suất xuất hiện 10% là rất nhỏ và chỉ xuất hiện

hai trên ba đợt phân lập nên chủng nấm này có thể chỉ là nấm hoại sinh nhiễm tạp

vào các mẫu bệnh cũ.

- 40 -

Đồ án tốt nghiệp

3.1.2. Đặc điểm hình thái của 3 chủng nấm T1, T2, A1

3.1.2.1. Đặc điểm hình thái chủng nấm T1

❖ Đại thể: Sợi tơ nấm mảnh, mọc sát mặt thạch, lúc đầu màu trắng nhạt sau

chuyển sang xanh, hướng tia ra ngoài mép đĩa. Tản nấm mọc thành những

vòng tròn đồng tâm, đường kính sau 5 ngày nuôi cấy đạt 90 mm (hình 3.1).

Mặt

trước

Mặt

sau

3 ngày sau cấy 5 ngày sau cấy 7 ngày sau cấy

Hình 3.1. Hình thái đại thể chủng nấm T1 nuôi cấy trên môi trường PGA

❖ Vi thể: Sợi nấm có vách ngăn. Cánh bào tử phân nhánh nhiều. Bào tử đính

có hình cầu méo đến hình oval, màu xanh lục, vách trơn láng (hình 3.2).

A B C

Hình 3.2. Hình thái vi thể chủng nấm T1 quan sát dưới kính hiển vi ở

vật kính 40X: (A) Sợi nấm, (B) Cành bào tử, (C) Bào tử.

- 41 -

Đồ án tốt nghiệp

3.1.2.2. Đặc điểm hình thái chủng nấm T2

❖ Đại thể:. Sợi tơ nấm dạng bông, màu trắng, đan xen nhau dày đặc hướng

dạng tia từ tâm đến ra ngoài mép đĩa. Bào tử màu xanh xuất hiện đan xen

trong lớp tơ dày vào ngày thứ 5. Đường kính tản nấm sau 3 ngày đạt 90 mm

(hình 3.3).

Mặt

trước

Mặt

sau

3 ngày sau cấy 5 ngày sau cấy 7 ngày sau cấy

Hình 3.3. Hình thái đại thể chủng nấm T2 nuôi cấy trên môi trường PGA

❖ Vi thể: Sợi nấm có vách ngăn. Cành bào tử phân nhánh nhiều. Bào tử đính

có hình cầu, màu xanh, vách trơn láng (hình 3.4).

A B C

Hình 3.4. Hình thái vi thể chủng nấm T2 quan sát dưới kính hiển vi ở

vật kính 40X: (A) Sợi nấm, (B) Cành bào tử, (C) Bào tử.

- 42 -

Đồ án tốt nghiệp

3.1.2.3. Đặc điểm hình thái chủng nấm A1

❖ Đại thể: Sợi tơ nấm mảnh, lúc đầu màu trắng vàng nhạt nhanh chóng tạo bào

tử chuyển sang màu đen. Mặt trái tản nấm có màu vàng nhạt. Tản nấm sau 3

ngày nuôi cấy đạt 45 mm (hình 3.5).

Mặt

trước

Mặt

sau

3 ngày sau cấy 5 ngày sau cấy 7 ngày sau cấy

Hình 3.5. Hình thái đại thể chủng nấm A1 nuôi cấy trên môi trường PGA

❖ Vi thể: Cuống sinh túi bào tử. Bào tử đính hình cầu, không có vách ngăn,

màu nâu nhạt.

A B C

Hình 3.6. Hình thái vi thể chủng nấm A1 quan sát dưới kính hiển vi ở

vật kính 40X: (A) Cuống sinh bào tử, (B) Túi bào tử, (C) Bào tử.

- 43 -

Đồ án tốt nghiệp

Dựa trên mô tả đặc điểm hình thái chi nấm Trichoderma của Gary J.

Samuels (2004), so sánh đối chiếu với đặc điểm hình thái của 2 chủng nấm T1 và

T2 có thể nhận định sơ bộ 2 chủng nấm T1 và T2 thuộc chi Trichoderma.

Tương tự, từ các đặc điểm hình thái của chủng nấm A1 cho thấy nấm có

những đặc điểm đặc trưng của chi Aspergillus như Nguyễn Đức Lượng và cộng sự

(2006) mô tả, có thể nhận định sơ bộ chủng nấm A1 thuộc chi Aspergillus.

3.1.3. Kết quả định danh đến loài của 3 chủng nấm T1, T2 và A1

Định danh 3 chủng nấm T1, T2 và A1 xác định chính xác đến loài bằng

phương pháp giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH. Quá trình

giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH được thực hiện tại công ty

Nam Khoa Biotek. Kết quả định danh được trình bày như sau:

❖ Giải trình tự gen 28S rRNA của chủng nấm T1 và thực hiện BLAST

SEARCH từ Ngân hàng gen trên NCBI cho thấy chuỗi rRNA này tương

đồng với nấm Trichoderma virens đến 98% (hình 3.7).

Hình 3.7. Kết quả giải trình tự 28S rRNA vả tra cứu

trên BLAST SEARCH của chủng nấm T1

- 44 -

Đồ án tốt nghiệp

❖ Giải trình tự gen 28S rRNA của chủng nấm T2 và thực hiện BLAST

SEARCH từ Ngân hàng gen trên NCBI cho thấy chuỗi rRNA này tương

đồng với nấm Trichoderma harzianum đến 99% (hình 3.8).

Hình 3.8. Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu

trên BLAST SEARCH của chủng nấm T2

- 45 -

Đồ án tốt nghiệp

❖ Giải trình tự gen 28S rRNA của chủng nấm Á và thực hiện BLAST

SEARCH từ Ngân hàng gen trên NCBI cho thấy chuỗi rRNA này tương

đồng với nấm Aspergillus niger đến 100% (hình 3.9).

Hình 3.9. Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu

trên BLAST SEARCH của chủng nấm A1

Kết quả sau khi giải trình tự gen 28S rRNA và và thực hiện BLAST

SEARCH từ Ngân hàng gen trên NCBI được thực hiện tại công ty Nam Khoa

Biotek đã định danh được T1 thuộc loài Trichoderma virens; T2 thuộc loài

Trichoderma harzianum và A1 thuộc loài Aspergillus niger.

Các mẫu nấm này được cấy lưu giữ và tiến hành kiểm chứng tác nhân gây

bệnh theo quy tắc Koch trong điều kiện in vitro.

- 46 -

Đồ án tốt nghiệp

3.1.4. Kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch ở điều kiện in vitro

Từ kết quả phân lập nêu trên các mẫu nấm được lưu giữ và sử dụng lây bệnh

lại trên nấm Linh chi khỏe để khẳng định tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch. Do

điều kiện thời gian và kinh phí có hạn nên việc lây bệnh lại chỉ được thực hiện với 2

loài nấm có tần suất xuất hiện nhiều nhất là Trichoderma virens và Trichoderma

harzianum. Kết quả sau khi lây bệnh nhân tạo được ghi nhận như sau:

3.1.4.1. Tỷ lệ xuất hiện bệnh

Bảng 3.2. Tỷ lệ tai nấm Linh chi bị nhễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo

Tai nấm Tỷ lệ nhiễm bệnh (%)

Nhiễm nấm Trichoderma virens 90

Nhiễm nấm Trichoderma harzianum 100

Không nhiễm (Đối chứng) 0

Kết quả trình bày ở bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ tai nấm Linh chi bị nhễm bệnh

sau khi lây bệnh nhân tạo với chủng T. virens là 90% và chủng T. harzianum là

100%. Trong khi đó, tỷ lệ nhiễm bệnh ở đối chứng là 0%.

3.1.4.2. Biểu hiện bệnh sau khi lây bệnh lại theo quy tắc Koch

❖ Đối với tai nấm nhiễm nấm T. virens: Triệu chứng nhiễm bệnh xuất hiện ở

ngày thứ 15 sau nhiễm, mốc xanh mọc ở phần rìa mặt trên tai nấm và những

lổ nhỏ li ti là cơ quan sinh bào tử ở mặt dưới tai nấm, cuống nấm và cả trong

bịch phôi nuôi nấm. Triệu chứng này tương tự như triệu chứng nấm Linh chi

bệnh lúc ban đầu (hình 3.10).

❖ Đối với tai nấm nhiễm nấm T. harzianum: Triệu chứng nhiễm bệnh xuất

hiện ở ngày thứ 10 sau nhiễm, mốc xanh mọc ở phần rìa mặt trên tai nấm và

dày đặc trên những lổ nhỏ li ti là cơ quan sinh bào tử ở mặt dưới tai nấm,

cuống nấm và cả trong bịch phôi nuôi nấm, tương tự như triệu chứng được

ghi nhận ở nấm Linh chi bệnh lúc ban đầu (hình 3.10).

❖ Đối với tai nấm không nhiễm (đối chứng): Không xuất hiện bất kì triệu

chứng nhiễm bệnh nào (hình 3.10).

- 47 -

Đồ án tốt nghiệp

Đối chứng T. virens T. harzianum Bệnh ban đầu

Mặt

trên

tai

nấm

Mặt

dưới

tai

nấm

Cuống

nấm

Phôi

nuôi

nấm

Hình 3.10. Biểu hiện nhiễm bệnh trên nấm Linh chi sau 15 ngày lây

bệnh nhân tạo

- 48 -

Đồ án tốt nghiệp

3.1.4.3.Kết quả phân lập sau khi lây bệnh theo quy tắc Kock

Tái phân lập lại tác nhân gây bệnh từ các tai nấm bị nhiễm bệnh, kết quả đặc

điểm hình thái mẫu nấm phân lập lại so sánh với đặc điểm mẫu nấm được phân lập

ban đầu được trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của T. virens và T. harzianum phân lập ban đầu

và sau lây bệnh nhân tạo

Đặc điểm hình thái sau 7 ngày nuôi cấy Nấm lây

bệnh Nấm phân lập lại sau lây bệnh Nấm phân lập ban đầu

Sợi tơ nấm mảnh, mọc sát mặt Sợi tơ nấm mảnh, mọc sát mặt

thạch. Tản nấm mọc thành những thạch. Tản nấm mọc thành những

vòng tròn đồng tâm. Cuống bào tử vòng tròn đồng tâm. Cuống bào tử

phân nhánh nhiều, bào tử đính phân nhánh nhiều, bào tử đính hình

T. hình oval. cầu méo và oval.

virens

Sợi tơ nấm dạng bông. Tản nấm Sợi tơ nấm dạng bông. Sợi nấm đan

mọc dạng tia từ tâm đến ra ngoài xen nhau mọc dày đặc hướng dạng

mép đĩa. Cuống bào tử phân nhánh tia từ tâm đến ra ngoài mép đĩa.

nhiều, bào tử đính hình cầu. Cuống bào tử phân nhánh nhiều,

T. bào tử đính hình cầu.

harzianum

- 49 -

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả trình bày ở bảng 3.3 cho thấy đặc điểm đặc trưng về hình thái tản

nấm, sợi nấm, cuống sinh bào tử và bào tử của 2 chủng nấm phân lập lại được sau

lây bệnh nhân tạo hoàn toàn tương đồng với đặc điểm hình thái của Trichoderma

virens và Trichoderma harzianum phân lập ban đầu.

Như vậy, từ kết quả khảo sát đặc điểm hình thái, kết quả giải trình tự gen và

kết quả kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch cho thấy nấm

Trichoderma virens và Trichoderma harzianum là tác nhân kí sinh gây bệnh trên

nấm Linh chi.

Kết quả này cũng tương đồng với kết quả trong đề tài "Nghiên cứu tiềm năng

kiểm soát sinh học của các chủng Trichoderma phân lập trên nấm Linh chi hoang

dã và vỏ cây” của Mukherjee và cộng sự (2013). Theo tác giả, Trichoderma

harzianum kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi ngoài tự nhiên có hiệu quả đối

kháng với nấm Sclerotium delphinii gây bệnh thối rễ trên cây bông tốt hơn hẵn so

với các loài nấm phân lập trên vỏ cây.

Từ lâu, đất và vùng rễ được xem như là nơi cư trú chính của Trichoderma,

mặc dù sự đa dạng tối đa của loài này có cả ở trên mặt đất như trên vỏ cây và nấm

hoang dã, và khả năng kiểm soát sinh học được xem như là đặc điểm đặc trưng của

chi nấm này (Druzhinina và cộng sự, 2011). Bên cạnh đó chỉ có một vài dòng được

phân lập từ đất và vùng rễ được sử dụng như thuốc trừ nấm sinh học thương mại và

các nguồn nấm Trichoderma trên mặt đất phần lớn vẫn chưa được khai thác trong

nông nghiệp (Mukherjee và cộng sự, 2013). Khai thác các chủng Trichoderma kí

sinh trên nấm Linh chi và vỏ cây mục là hướng khai thác mới và có triển vọng vì

các chủng này có khả năng đối kháng cao với các loài nấm gây bệnh (Mukherjee

và cộng sự, 2013). Đây cũng là định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo của đồ án

này.

- 50 -

Đồ án tốt nghiệp

3.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và chitinase) của hai

loài Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi

Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào chitinase, cellulase của hai loài

Trichoderma virens và Trichoderma harzianum trên môi trường cảm ứng sinh

enzyme MSM có bổ sung 1% cơ chất (Huyền phù chitin và CMC). Kết quả thí

nghiệm được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.11:

Bảng 3.4. Đường kính vòng phân giải của hai loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuôi cấy

Đường kính vòng phân giải (mm) trên cơ chất Nấm thí nghiệm Chitin CMC

Trichoderma harzianum 52,3 ± 1,4 28,6 ± 0,8

Ghi chú: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD

Trichoderma virens 48,2 ± 1,2 22,8 ± 1,7

Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy, cả hai loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum đều có khả năng sinh enzyme chitinase và cellulase ngoại

bào tạo vòng phân giải. Theo Gary J. Samuels (2004) đây là các enzyme phân giải

vách tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với nấm Trichoderma.

Dựa vào kích thước vòng phân giải chitin và CMC sau 2 ngày nuôi cấy cho

thấy nấm Trichoderma harzianum có khả năng sinh enzyme cellulase và chitinase

mạnh hơn nấm Trichoderma virens và khả năng sinh enzyme chitinase ở cả hai

chủng đều cao hơn khả năng sinh enzyme cellulase. Điều này cho thấy tiềm năng

ứng dụng trong phòng trừ nấm bệnh gây hại cây trồng của 2 loài nấm này.

Do đó, sinh viên tiếp tục sử dụng 2 loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum để nghiên cứu khảo sát khả năng đối kháng với một số

nấm bệnh gây hại cây trồng.

- 51 -

Đồ án tốt nghiệp

Vòng phân giải chitin Vòng phân giải CMC

Trichoderma

harzianum

Trichoderma

virens

Hình 3.11. Vòng phân giải chitin và CMC của 2 loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuôi cấy

3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của 2 loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi đối với các nấm bệnh gây

hại cây trồng trong điều kiện in vitro

Thí nghiệm đối kháng trực tiếp hai loài Trichoderma virens và Trichoderma

harzianum (2 loài có hoạt tính sinh enzyme chitinase mạnh) với các nấm gây bệnh

trên cây trồng: Fusarium sp., Rhizoctonia sp., Colletotrichum sp1., Colletotrichum

sp2. và Colletotrichum sp3. trên môi trường PGA, kết quả được trình bày như sau:

- 52 -

Đồ án tốt nghiệp

3.3.1. Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp.

Bảng 3.5. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Fusarium sp.

Ngày Tỷ lệ Nấm Mô tả nấm bệnh Fusarium sp. sau đối kháng Trichoderma bị ức chế (đĩa đối kháng) cấy (%)

Nấm T. virens phát triển nhanh tiếp

xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn chặn 7,96 ± 2,84 3 nấm bệnh phát triển lấn sang vùng

chúng đã mọc.

T.virens Nấm T. virens mọc lan bao phủ một 42,28 ± 1,78 5 phần nấm bệnh

Nấm T. virens mọc lan sang bao phủ 7 toàn bộ bề mặt nấm bệnh. Hệ sợi nấm 54,32 ± 1,41

bệnh co lại và yếu dần.

Nấm T. harzianum phát triển nhanh

tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn 8,96 ± 2,24 3 chặn nấm bệnh phát triển lấn sang

vùng chúng đã mọc.

Nấm T. harzianum phát triển mạnh, T. harzianum 5 42,9 ± 1,4 mọc lan bao phủ hết nấm bệnh.

Nấm bệnh bị bao phủ lụi tàn. Nấm T.

7 harzianum sinh bào tử trên trên hệ sợi 54,81 ± 1,11 nấm bệnh bị lụi tàn và có dấu hiệu bị

Ghi chú: Tỷ lệ (%) đối kháng được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD

tiêu diệt hoàn toàn.

- 53 -

Đồ án tốt nghiệp

Fusarium sp. - Fusarium sp. - Fusarium sp. -

Đối chứng T. virens T. harzianum

5

ngày

sau

cấy

7

ngày

sau

cấy

Hình 3.12. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum

với nấm Fusarium sp.

Như vậy, cả T. virens và T. harzianum đều có khả năng ức chế và tiêu diệt

nấm Fusarium sp. với tỷ lệ ức chế nấm Fusarium sp. của cả 2 loài đều ở khoảng

54% sau 7 ngày đối kháng .

Trong đó, nấm T. harzianum thể hiện hiệu quả đối kháng và tiêu diệt mạnh

hơn so với nấm T. virens. Khi quan sát từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7 cho thấy, T.

virens chỉ mọc lan sang và đan bao phủ kìm hãm nấm bệnh phát triển, sợi nấm bệnh

co lại và yếu dần . Trong khi đó, T. harzianum mọc phủ kín hệ sợi nấm Rhizoctonia

sp. làm hệ sợi nấm teo lại và hình thành bào tử phủ kín trên tản nấm Rhizoctonia sp.

- 54 -

Đồ án tốt nghiệp

3.3.2. Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia sp.

Bảng 3.6. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Rhizoctonia sp.

Ngày Tỷ lệ Nấm Mô tả nấm bệnh Rhizoctonia sp. sau đối kháng Trichoderma bị ức chế (đĩa đối kháng) cấy (%)

Nấm T. virens phát triển nhanh tiếp

xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn chặn 13,2 ± 2,23 3 nấm bệnh phát triển lấn sang vùng

chúng đã mọc.

T. virens Nấm T. virens mọc lan sang và đan 50,56 ± 1,27 5 xen vào hệ sợi nấm bệnh.

Nấm T. virens phát triển bao phủ hết 7 hệ sợi nấm bệnh. Hệ sợi nấm bệnh co 56,17 ± 1,12

lại và nằm rụi.

Nấm T. harzianum phát triển nhanh

tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn 7,58 ± 3,48 3 chặn không cho nấm gây bệnh phát

triển lấn sang vùng chúng đã mọc.

Nấm T. harzianum mọc lan đan xen, 47,25 ± 1,98 5 T. harzianum bao phủ hết hệ sợi nấm bệnh.

Nấm T. harzianum phát triển mạnh và

nấm bệnh bị lụi tàn hoàn toàn. Nấm T. 53,33 ± 1,76 7 harzianum sinh bào tử dày đặc trên hệ

sợi nấm bệnh bị lụi tàn và có dấu hiệu

Ghi chú: Tỷ lệ (%) đối kháng được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD

bị tiêu diệt hoàn toàn.

- 55 -

Đồ án tốt nghiệp

Rhizoctonia sp. - Rhizoctonia sp. - Rhizoctoni sp. -

Đối chứng T. virens T. harzianum

5

Ngày

sau

cấy

7

Ngày

sau

cấy

Hình 3.13. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum

với nấm Rhizoctonia sp.

Tương tự như nấm Fusarium sp., nấm Rhizoctonia sp. cũng bị ức chế và tiêu

diệt bởi cả T. virens và T. harzianum với tỷ lệ ức chế nấm Rizhoctonia sp. của T.

virens ở khoảng 56% và T. harzianum ở khoảng 53% sau 7 ngày đối kháng. Tuy tỷ

lệ đối kháng của T. harzianum thấp hơn so với T. virens nhưng hiệu quả đối kháng

lại cho kết quả tốt hơn hẳn. Từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, T. virens chỉ mọc lan

sang và đan xen vào hệ sợi nấm Rhizoctonia sp., kìm hãm nấm bệnh phát triển, sợi

nấm bệnh yếu dần và co lại. Trong khi đó, T. harzianum thể hiện tính đối kháng

mạnh hơn, mọc phủ kín hệ sợi nấm Rhizoctonia sp. Tiêu diệt hệ sợi nấm và hình

thành bào tử phủ kín trên tản nấm Rhizoctonia sp..

Như vậy, nấm T. harzianum có mức độ đối kháng và tiêu diệt nấm

Rihzoctonia sp. mạnh hơn so với nấm T. virens.

- 56 -

Đồ án tốt nghiệp

3.3.3. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp1.

Bảng 3.7. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm

Colletotrichum sp1.

Ngày Tỷ lệ Nấm Mô tả nấm bệnh Colletotrichum sp1. sau đối kháng Trichoderma bị ức chế (đĩa đối kháng) cấy (%)

Nấm T. virens phát triển nhanh tiếp

xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn chặn 0,50 ± 2,53 3 không cho nấm bệnh phát triển lấn

sang vùng chúng đã mọc.

Nấm T. virens mọc lan sang và ức 37 ± 1,60 5 T.virens chế hệ sợi nấm bệnh.

Nấm T. virens bao phủ hết hệ sợi

nấm bệnh. Nấm T. virens phát triển 7 50,62 ± 1,26 trên bề mặt nấm bệnh. Nấm bệnh co

lại và lụi tàn.

Nấm T. harzianum phát triển nhanh

tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn 10,95 ± 3,84 3 chặn nấm bệnh phát triển lấn sang

vùng chúng đã mọc.

5 Nấm bệnh bị lụi tàn nơi tiếp xúc. 43,62 ± 2,43 T. harzianum Nấm T. harzianum mọc lan sang bao

phủ nấm bệnh và nấm bệnh teo lại. 7 Nấm T. harzianum sinh bào tử trên hệ 55,80 ± 1,91

sợi nấm bệnh bị lụi tàn và có dấu hiệu

Ghi chú: Tỷ lệ (%) đối kháng được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD

bị tiêu diệt hoàn toàn.

- 57 -

Đồ án tốt nghiệp

Colletotrichum sp1.- Colletotrichum sp1.- Colletotrichum sp1.-

Đối chứng T. virens T. harzianum

5

Ngày

sau

cấy

7

ngày

sau

cấy

Hình 3.14. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum

với nấm Colletotrichum sp1.

Sau 3 ngày nuôi cấy, nấm Colletotrichum sp1. và Trichoderma bắt đầu tiếp

xúc nhau. Ở ngày thứ 4 và ngày thứ 5, Trichoderma phát triển mạnh chiếm hết chỗ

trên môi trường, mọc dày đặc quanh tản nấm Colletotrichum sp1. Khi tiếp xúc với

Trichoderma, hệ sơi nấm Colletotrichum sp1. không phát triển được nữa. Từ ngày

thứ 5 đến ngày thứ 7, cả T. virens và T. harzianum đều mọc lan, bảo phủ phủ kín hết

bề mặt nấm Colletotrichum sp1., làm hệ sợi nấm co lại và yếu dần và hình thành

bào tử trên tản nấm Colletotrichum sp1. bị bao phủ. Tỷ lệ ức chế nấm

Colletotrichum sp1. của T. virens ở khoảng 50% và T. harzianum thì cao hơn ở

khoảng 55% sau 7 ngày đối kháng,

Như vậy, cả 2 nấm T. virens và T. harzianum đều có khả năng ức chế và tiêu

diệt nấm Colletotrichum sp1. sau 7 ngày đối kháng.

- 58 -

Đồ án tốt nghiệp

3.3.4. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp2.

Bảng 3.8. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm

Colletotrichum sp2.

Ngày Tỷ lệ Nấm Mô tả nấm bệnh Colletotrichum sp2. sau đối kháng Trichoderma bị ức chế (đĩa đối kháng) cấy (%)

Nấm T. virens phát triển nhanh tiếp

xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn chặn 8,57 ± 4,12 3 không cho nấm bệnh phát triển lấn

sang vùng chúng đã mọc.

T. virens Nấm T. virens mọc lan sang và bao 39,73 ± 2,72 5 phủ một phần hệ sợi nấm bệnh.

Nấm T. virens phát triển bao phủ hết

7 hệ sợi nấm bệnh. Hệ sợi nấm bệnh teo 54,17 ± 2,07

lại và nằm rụi .

Nấm T. harzianum phát triển nhanh

tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn 18,7 ± 3,46 3 chặn nấm bệnh phát triển lấn sang

vùng chúng đã mọc.

Nấm T. harzianum mọc lan đan xen, T. harzianum 5 46,4 ± 2,28 bao phủ một phần hệ sợi nấm bệnh.

Nấm T. harzianum phát triển và nấm

bệnh bị bao phủ teo lại và lụi tàn. Nấm 59,24 ± 1,74 7 T. harzianum sinh bào tử trên phần hệ

Ghi chú: Tỷ lệ (%) đối kháng được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD

sợi nấm bệnh bị bao phủ.

- 59 -

Đồ án tốt nghiệp

Colletotrichum sp2.- Colletotrichum sp2.- Colletotrichum sp2.-

Đối chứng T. virens T. harzianum

5

ngày

sau

cấy

7

ngày

sau

cấy

Hình 3.15. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum

với nấm Colletotrichum sp2.

Tương tự đối kháng với nấm Colletotrichum sp1.,từ ngày thứ 5 đến ngày thứ

7, chủng T virens bắt đấu mọc lan qua và bảo phủ nấm bệnh, kìm hãm hệ sợi nấm

bệnh co lại hoàn toàn không thể phát triển được nữa. Trong khi đó chủng T.

harzianum tuy chỉ mọc lan qua một phần, không mọc phủ kín nấm bệnh nhưng lại

tiêu diệt hình thành bào tử trên tản nấm bệnh bị bao phủ. Sau 7 ngày nuôi cấy, tỷ lệ

đối kháng nấm Colletotrichum sp2. của T. harzianum ở khoảng 59% và của T.

virens ở khoảng 53%.

Như vậy, cả 2 nấm T. virens và T. harzianum đều có khả năng ức chế và tiêu

diệt nấm Colletotrichum sp2.

- 60 -

Đồ án tốt nghiệp

3.3.5. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp3.

Bảng 3.9. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm

Colletotrichum sp3.

Ngày Tỷ lệ Nấm Mô tả nấm bệnh Colletotrichum sp3. sau đối kháng Trichoderma bị ức chế (đĩa đối kháng) cấy (%)

Nấm T. virens phát triển nhanh tiếp

xúc với hệ sợi nấm bệnh, ngăn chặn 9,64 ± 2,38 3 không cho nấm bệnh phát triển lấn

sang vùng chúng đã mọc.

T. virens Nấm T. virens mọc lan, đan xen vào 43 ± 1,50 5 hệ sợi nấm bệnh.

Nấm T. virens phát triển bao phủ một

7 phần hệ sợi nấm bệnh. Hệ sợi nấm 55,45 ± 1,17

bệnh bị bao phủ tàn lụi

Nấm T. harzianum phát triển nhanh 7,29 ± 2,65 3 tiếp xúc với hệ sợi nấm bệnh.

Nấm T. harzianum ngăn chặn nấm

5 bệnh phát triển lấn sang vùng chúng 41,25 ± 1,67

đã mọc.

T. harzianum Nấm T. harzianum phát triển mạnh

mọc lan sang và bao phủ hết hệ sợi

nấm bệnh. Nấm T. harzianum sinh 56,05 ± 1,26 7 bào tử dày đặc trên hệ sợi nấm bệnh

bị bao phủ và có dấu hiệu bị tiêu diệt

Ghi chú: Tỷ lệ (%) đối kháng được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD

hoàn toàn

- 61 -

Đồ án tốt nghiệp

Colletotrichum sp3. - Colletotrichum sp3. - Colletotrichum sp3. -

Đối chứng T. virens T. harzianum

5

ngày

sau

cấy

7

ngày

sau

cấy

Hình 3.16. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum

với nấm Colletotrichum sp3.

Như vậy, cả 2 nấm T. virens và T. harzianum đều có khả năng ức chế và tiêu

diệt nấm Colletotrichum sp3. với tỷ lệ đối kháng của nấm T. virens ở khoảng 55%

và T. harzianum ở khoảng 56% sau 7 ngày đối kháng. Trong đó, chủng T.

harzianum có hiệu quả đối kháng và tiêu diệt mạnh hơn so với T. virens. Quan sát

sau 3 ngày nuôi cấy cho thấy tản nấm bệnh và Trichoderma bắt đầu tiếp xúc nhau.

Ở ngày thứ 4 và ngày thứ 5, Trichoderma phát triển mạnh chiếm hết chỗ trên môi

trường, mọc dày đặc quanh tản nấm bệnh. Khi tiếp xúc với Trichoderma, hệ sợi

nấm bệnh không phát triển được nữa.

Từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, chủng T. virens chỉ kìm hãm, ức chế nấm

bệnh không phát triển được nữa. Trong khi đó chủng T. harzianum mọc lan và phủ

kín nấm bệnh và hình thành bào tử dày đặc hết tản nấm bệnh bị lụi tàn.

- 62 -

Đồ án tốt nghiệp

Như vậy, cả 5 đối tượng nấm bệnh khảo sát bao gồm cả nấm gây bệnh ở đất

(Fusarium sp., Rhizoctonia sp.) và nấm gây hại trên cây (3 chủng nấm

Colletotrichum sp.) đều bị ức chế và tiêu diệt bởi cả 2 chủng nấm T. virens và T.

harzianum với tỷ lệ ức chế đều trên 50% sau 7 ngày nuôi cấy. Trong đó, nấm T.

harzianum thể hiện khả năng tiêu diệt mạnh hơn chủng T. virens. Điều này góp

phần chứng minh mối tương quan thuận giữa khả năng sinh tổng hợp enzyme

chitinase và khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma vì theo kết

quả ở mục 3.3 thì chủng T.harzianum có hoạt tính sinh enzyme chitinase cao hơn so

với chủng T.virens. Kết luận này cũng trùng với nhận định của Silva và cộng sự

(2004) khi các tác giả cho rằng, Trichoderma harzianum là một nhà máy sản xuất

enzyme ngoại bào N-acetyl-beta-D-glucosaminidase (Nagase) khi được nuôi cấy

trong môi trường có chứa chitin, đóng vai trò quan trọng trong việc phá huỷ thành

tế bào nấm bệnh.

Bên cạnh đó, tuy cả 2 loài nấm T. harzianum và T.virens kí sinh trên nấm

Linh chi nhưng lại có hiệu quả đối kháng khác nhau trên 5 loài nấm bệnh khảo sát.

Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của 2 loài nấm T. harzianum và T.virens kí sinh trên

nấm Linh chi không chỉ dừng lại ở mức đối kháng mạnh với các loài nấm bệnh

trong đất (Rihzoctonia sp., Fusarium sp.) mà qua thử nghiệm đối kháng với 3 loài

nấm thán thư gây hại trên cây gấc, thanh long và ớt còn cho thấy đối kháng ở mức

cao, có khả năng ức chế chúng phát triển mà theo những nghiên cứu trước đây về

khả năng đối kháng của Trichoderma phân lập trong đất với các loài nấm gây bệnh

trên cây ở trong và ngoài nước thì ít đề cập đến. Điều này cho thấy 2 loài T.

harzianum và T.virens kí sinh trên nấm Linh chi có phổ kháng nấm bệnh rộng hơn

(cả ở cả hệ sinh thái dưới đất và trên mặt đất) so với các loài nấm Trichoderma phân

lập trong đất.

Như vậy, nấm T. harzianum và T.virens phân lập từ nấm Linh chi có khả

năng đối kháng mạnh với cả 5 chủng nấm bệnh khảo sát, cả nấm gây bệnh trong đất

và bệnh trên cây. Cần có những nghiên cứu để sử dụng các tác nhân này trong

phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng.

- 63 -

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Qua kết quả phân lập và định danh đến loài các vi nấm kí sinh trên Linh chi

cho thấy 3 loài có tần suất xuất hiện cao là Trichoderma harzianum, Trichoderma

virens và Aspergillus niger. Trong đó, kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc

Koch đã xác định được 2 loài nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum

là tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi.

Hai loài nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên

nấm Linh chi đều có khả năng sinh enzyme cellulase và chitinase. Trong đó, nấm

Trichoderma harzianum có khả năng enzyme cellulase và chitinase mạnh hơn nấm

Trichoderma virens và khả năng sinh enzyme chitinase ở cả hai loài đều cao hơn

khả năng sinh enzyme cellulase.

Khảo sát khả năng đối kháng của 2 loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi với nấm bệnh gây hại cây trồng

cả hai đều có khả năng đối kháng mạnh với cả 5 chủng nấm bệnh khảo sát:

Fusarium sp. gây bệnh héo thân cây bắp; Rhizoctonia sp. gây bệnh thối lở cổ rễ cây

bắp; Colletotrichum sp1. gây bệnh thán thư trên gấc; Colletotrichum sp2. gây bệnh

thán thư trên ớt và Colletotrichum sp3. gây bệnh thán thư trên thanh long. Tỷ lệ ức

chế đều trên 50% sau 7 ngày nuôi cấy. Trong đó, nấm T. harzianum thể hiện khả

năng tiêu diệt mạnh hơn chủng T. virens.

4.2. Kiến nghị

Tiếp tục kiểm chứng xác định Aspergillus niger là tác nhân kí sinh gây bệnh

trên nấm Linh chi.

Khảo sát khả năng đối kháng của hai loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum trên nhiều chủng nấm bệnh khác: Pythium, Phytophthora,

Sclerotium…

Khảo sát khả năng đối kháng của 2 loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum với các loài nấm bệnh hại cây trồng trong điều kiện in

vivo.

- 64 -

Đồ án tốt nghiệp

Nghiên cứu kết hợp giữa 2 loài Trichoderma virens và Trichoderma

harzianum với các chủng vi sinh khác tạo ra chế phẩm đa chức năng giúp tăng hiệu

quả phòng trừ các bệnh hại khác nhau trên cây trồng.

- 65 -

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Bùi Xuân Đồng (1982). Nhóm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam, ,tập 1, NXB Khoa

học và Kỹ thuật, Hà Nội.

Bùi Xuân Đồng (1984). Nhóm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam, ,tập 2, NXB Khoa

học và Kỹ thuật, Hà Nội.

Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000). Vi nấm dùng trong công nghệ sinh

học, NXB Khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội.

Đinh Minh Hiệp (2007). Hệ chitinase của Trichoderma và vai trò trong kiểm soát

sinh học, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại Học Khoa Học

Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh.

Đinh Minh Hiệp, Lê Đình Đôn, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương (2007). Khảo

sát hoạt tính các enzym chitinase, β-glucanase, cellulase, pectinase, amylase,

protease của các chủng Trichoderma phân lập tại Việt Nam, Hội nghị khoa

học toàn quốc "Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống",

NXB Khoa học và Kỹ thuật, trang 708-710.

Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng và cộng sự (2005). Điều tra khảo sát sự

phân bố của các chủng nấm Trichoderma tại thành phố Hồ Chí Minh và các

tỉnh Đông Nam Bộ, Đề tài cấp Bộ - Bộ Khoa học và Công Nghệ.

Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương (2008).

Khảo sát khả năng đối kháng in vitro của các chủng nấm Trichoderma đối

với 3 loài nấm gây bệnh cây trồng (Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii,

Phytophthora palmivora), Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 46, số 4A,

trang 93-99.

Dương Minh, Lê Phước Thạnh và Đào Thị Hồng Xuyến (2010), Một số sản phẩm

nghiên cứu từ nấm Trichoderma có triển vọng của Đại học Cần Thơ, Tạp chí

Khoa học 16: 173 – 179.

Huỳnh Văn Phục (2006). Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma spp.

đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúa và

- 66 -

Đồ án tốt nghiệp

bắp, Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học

Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

Lê Duy Thắng (2001). Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập 1, NXB Nông nghiệp, TP.

Hồ Chí Minh.

Lê Duy Thắng (2005). Sổ tay hướng dẫn trồng nấm, NXB Nông nghiệp, TP. Hồ

Chí Minh.

Nguyễn Đức Lượng (2006). Thí nghiệm Công nghệ sinh học: Thí nghiệm vi sinh vật

học, Tập 2, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

Nguyễn Lân Dũng (1983). Một số sản phẩm của vi nấm, NXB Khoa học và Kỹ

thuật, Hà Nội.

Nguyễn Lân Dũng (2001), Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1 và 2. NXB Nông

nghiệp, Hà Nội.

Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đinh Lương (1982).Vi nấm, NXB Khoa

học và Kỹ thuật, Hà Nội.

Roger Shivas và Dr Dean Beasley (2005). Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật,

Bảo tàng bệnh cây, Sở Nông nghiệp và Thủy sản Queensland, Australia.

Tô Duy Khương (2007). Khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp.

và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh thực vật, Luận văn thạc sĩ

sinh học chuyên ngành vi sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí

Minh.

Vũ Triệu Mân (2007). Giáo trình Bệnh cây chuyên khoa, Chuyên ngành Bảo vệ

thực vật, Trường Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội.

- 67 -

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

A. K. Mukherjee, S. Kranthi, A. Sampath Kumar, P. K. Mukherjee (2014).

Original article: Biocontrol potential of three novel Trichoderma strains:

isolation, evaluation and formulation, This article is published with open

access at Sp.ringerlink.com.

Agrios G.N (2005). Plant pathology, 5th edition, Elsevier Academic Press: San

Diego, California.

Bao X, Wang X, Dong Q, Fang J, Li X (2002). Structural features of

immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum,

Phytochemistry.

Boh B, Berovic M, Zhang J, Zhi-Bin L (2007). Ganoderma lucidum and its

pharmaceutically active compounds, Biotechnol Annu Rev.

Borchers A. T, Stern J. S, Hackman R. M, Keen C. L, Gershwin M. E (1999).

Minireview: Mushrooms, tumors and immunity, Proc Soc Exp Biol Med.

Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. and Phan H.T (2008). Diagnostic manual

for plant diseases in Vietnam, ACIAR Monograph No. 129, 210 pp.

ACIAR: Canberra.

Chang S. T, Buswell J. A (1996). Mushroom nutriceuticals, World J Microbiol

Biotechnol.

Chang S. T, Buswell J. A (1999). Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst.

(Aphyllophoromycetideae): A mushrooming medicinal mushroom, Int J

Med Mushrooms.

Chang S. T, Buswell J. A (2008). Safety, quality control and regulational asp.ects

relating to mushroom nutriceuticals, Mushroom Biology and Mushroom

Products.

Chet, L, G.E.Harman, and R.Baker (1981). Trichoderma hamatum: Its hyphal

interactions with Rhizoctonia solani and Pythium spp., Microb. Ecol. 7, pp

28 – 29.

Elad and Y., I.Chet, P.Boyle and Y.Hennis (1983). Parasitism of Trichoderma

- 68 -

Đồ án tốt nghiệp

spp. on Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii scaning electron

microscopy and fluorescence microscopy, Phytopathology 73: pp 85 – 88.

Elad Y, Chet I, Henuls Y (1982). Degradation of plant pathogenic fungi by

Trichoderma harzianum, J. Can. J. Microbiol, 28: 719 – 725.

Esp.osito .E, Silva .D.M (1998). Systematics and environmental application of the

Genus Trichodema, Crical reviews in Microbiology 24 (2), pp. 89 – 98.

Francesco Vinale (2008) Trichoderma–plant–pathogen interactions. Soil Biology

& Biochemistry: p. 1-10.

Gao Y, Zhou S (2009). Cancer prevention and treatment by Ganoderma, a

mushroom with medicinal properties, Food Rev Int.

Gary E. Harman, C. P. Kubicek (2005). Trichoderma And Gliocladium: Enzymes,

Biological Control and commercial applications, Volume 2, This edition

published in the Taylor & Francis e-Library.

Gary J. Samuels (2004). Trichoderma aguide to identification and biology, United

States Department of Agriculture Research Service Systematic Botany and

Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA.

Hadden J. F. and L. L. Black (1989). Anthranose of pepper caused by

Collettotrichum spp. proceeding of the international symposium on

integrated management practices: Tomato and pepper production in the

tropics, Asian Vegetable Research and Development Centre, Taiwan, 189

– 199.

Harman G. E., et al. (2004). Trichoderma sp.ecies--opportunistic, avirulent plant

symbionts, Nat Rev Microbiol, 2(1): p. 43-56.

Hatvani L, et al (2012). Mushroom Green Mould Disease In Croatia, Arh Hig

Rada Toksikol, 63:481-487

Holliday P (1980). Fungus diseases of tropical crops, Published by Cambrige

University Press, England.

Hubbard, et al (1983). Phytopathology ,73:655-659.

Jaw-Fen Wang (2010). Characterization of Colletotrichum spp.Characterization

- 69 -

Đồ án tốt nghiệp

of Colletotrichum spp. causing pepper anthracnose and development of

resistant pepper lines, Asian Seed Congress.

Kim B. S. (2007). Country report of anthranose research in Korea, First

international symposium on chi li anthranose, National hoticultural

research institute, Rural development of administration republic of Korea.

Kimura Y, Taniguchi M, Baba K (2002). Antitumor and antimetastatic effects on

liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum: Mechanism of action

and isolation of an active substance, Anticancer Res.

L. Kredics, L. García Jimenez, S. Naeimi, D. Czifra, P. Urbán, L. Manczinger, L.

Hatvani, C. Vágvölgyi and L. Hatvani (2010). A challenge to mushroom

growers: the green mould disease of cultivated champignons, Department

of Microbiology, Faculty of Science and Informatics, University of Szeged,

Közép fasor 52. H-6726 Szeged, Hungary.

Laila Naher, Umi Kalsom Yusuf, Shafiquzzaman Siddiquee, Jannatul Ferdous and

M. Aminur Rahman. Effect of media on growth and antagonistic activity of

selected Trichoderma strains against Ganoderma, African Journal of

Microbiology Research Vol. 6(48), pp. 7449-7453.

Lin S. C (2000). Beijing, China: Chinese Agricultural Press, Medicinal Fungi of

China-Production and Products Development.

Masanto Masyahit, Kamaruzaman Sijam, Yahya Awang and Mohd Ghazali Mohd

Satar (2009). The First Report of the Occurrence of Anthracnose Disease

Caused by Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. on

Dragon Fruit (Hylocereus spp.) in Peninsular Malaysia, American Journal

of Applied Sciences 6 (5): 902-912.

Mau J. L, Lin H. C, Chen C. C (2001). Non-volatile components of several

medicinal mushrooms, Food Res Int.

Mau J. L, Lin H. C, Chen C. C (2002). Antioxidant properties of several

medicinal mushrooms, J Agric Food Chem.

Mendoza-Mendoza A, Pozo MJ, Grzegorski D, Martínez P, García JM, Olmedo-

- 70 -

Đồ án tốt nghiệp

Monfil V, Cortés C, Kenerley C, Herrera-Estrella A (2003). Enhanced

biocontrol activity of Trichoderma through inactivation of a mitogen-

activated protein kinase, Proc Natl Acad Sci U S A.

Mukherjee PK, Latha J, Hadar R, et al (2004). Role of two G-protein alpha

subunits, TgaA and TgaB, in the antagonism of plant pathogens

by Trichoderma virens, Appl Environ Microbiol.

Pai-Feng Kao, Shwu-Huey Wang, Wei-Ting Hung, Yu-Han Liao, Chun-Mao Lin

and Wen-Bin Yang (2012). Structural Characterization and Antioxidative

Activity of Low-Molecular-Weights Beta-1,3-Glucan from the Residue of

Extracted Ganoderma lucidum Fruiting Bodies, Journal of Biomedicine

and Biotechnology, Volume 2012 (2012), Article ID 673764, 8 pages.

Phoulivong S, McKenzie EHC, Hyde KD (2012). Cross infection of

Colletotrichum sp.ecies; a case study with tropical fruits, Current Research

in Environmental & Applied Mycology 2(2), 99–111, Doi

10.5943/cream/2/2/2.

Silva RN, da Silva SP., Brandão RL, Ulhoa CJ. Regulation of N-acetyl-beta-D-

glucosaminidase produced by Trichoderma harzianum: evidence that

cAMP controls its expression, Laboratório de Enzimologia, Instituto de

Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Brazil.

Sissi Wachtel-Galor and Iris F.F.Benzie (2011). Lingzhi Polyphorous Fungus

(Ganoderma lucidum), Herbal and Traditional Medicine: Biomolecular

and Clinical Asp.ects, ISBN – Master e-book TSBN.

Stanley Freeman, Dror Minz, Inna Kolesnik, Olga Barbul, Aida Zveibil1, Marcel

Maymon, Yehuda Nitzani, Benny Kirshner, Dalia Rav-David, Alon Bilu,

Arnon Dag, Sharoni Shafir and Yigal Elad (2004). Trichoderma biocontrol

of Colletotrichum acutatum and Botrytis cinerea and survival in

strawberry, European Journal of Plant Pathology 110: 361–370.

Steve Bost (2013). Tomato Wilt Problems, Plant deseases, University of

Tennessee Institute of Agriculture, U.S.

- 71 -

Đồ án tốt nghiệp

Susanne Zeilinger and Markus Omann (2007). Trichoderma Biocontrol: Signal

Transduction Pathways Involved in Host Sensing and Mycoparasitism,

Gene Regul Syst Bio. 2007; 1: 227–234.

Susanne Zeilinger, Dr. Kurt Brunner, Dipl. Ing. Barbara Reithner, Isabel Peissl.

Signal transduction in host sensing and mycoparasitic resp.onse of

Trichoderma atroviride.

The 7th International Aspergillus Meeting (2009): “Asp.erfest 7”, NH Conference

Centre Leeuwenhorst, The Netherlans.

Upton R (2000). American Herbal Pharmacopeia and Therapeutic Compendium:

Reishi Mushroom, Ganoderma lucidum, Standards of Analysis, Quality

Control and Therapeutics,U.S.A. Canada: Santa Cruz.

Weindling, R. (1932). Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi,

Phytopathology 22, 837-845.

Zhang L, Zhang M, Chen J (2001). Solution properties of antitumor

carboxymethylated derivatives of a-(1→3)-D-Glucan from Ganoderma

lucidum, Chin J Polym Sci.

Zhang W, Tang Y. J (2008). A novel three-stage light irradiation strategy in the

submerged fermentation of medicinal mushroom Ganoderma lucidum for

the efficient production of ganoderic acid and Ganoderma

polysaccharides, Biotechnol Prog.

Zhou X, Lin J, Yin Y, Zhao J, Sun X, Tang K (2007). Ganodermataceae: Natural

products and their related pharmacological functions, Am J Chin Med.

Zofia Olempska-Beer (2008). Asp.araginase from Aspergillus niger expressed in

A. Niger, Chemical and Technical Assessment.

- 72 -

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU INTERNET

Cổ Đức Trọng (2012), Gía cả các loại nấm Linh chi trên thị trường TP. Hồ Chí

Minh, Công ty TNHH Linh chi Vina.

http://linhchivina.com.vn/?frame=khoahoc&id=&p=6

Hình ảnh nấm Trichderma harzianum CBS 102174

http://www.mycobank.org/BioloMICS.asp.x?Link=T&TargetKey=14682616

000002126&Rec=4818

Nấm Linh chi Việt Nam - Nguồn gốc và thực trạng.

http://www.linhchivietnam.net/linh-chi-viet-nam/nam-linh-chi-viet-nam-

nguon-goc-va-thuc-trang.html

Trương Mạnh Hoài (2012), Phát triển nghề trồng nấm, Báo Nhân dân.

http://linhchivina.com.vn/?frame=news_detail&id=382

Lê Xuân Thám và cộng sự (2011). Nấm Linh chi Việt Nam - Dược tính mới nhất

vừa được phát hiện, Trung tâm Hạt nhân TP. Hồ Chí Minh.

http://www.linhchivietnam.net/linh-chi-viet-nam/nam-linh-chi-viet-nam-

duoc-tinh-moi-nhat-vua-duoc-phat-hien.html

Nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma trên thế giới.

http://www.cabi.org/

- 73 -

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

Phụ lục A. Danh mục thành phần các môi trường sử dụng nghiên cứu

A.1. Môi trường ½ Potato D-Glucose Agar (½ PGA)

Thành phần (g/l):

Khoai tây : 100g

D-Glucose : 10g

Agar : 20g

Nước cất :1000ml

Kháng sinh Chloramphenicol (0,01%)

Môi trường dùng để phân lập nấm bệnh là môi trường PGA giảm hàm lượng

khoai tây và đường xuống một nửa và có bồ sung kháng khuẩn.

A.2. Môi trường Potato D-Glucose Agar (PGA)

Thành phần (g/l):

Khoai tây : 200g

D-Glucose : : 20g

Agar : 20g

Nước cất :1000ml

Môi trường PGA được dùng để nuôi cấy, giữ giống và khảo sát khả năng đối kháng.

A.3. Môi trường Minimal Synthetic Medium (MSM)

Thành phần (g/l):

: 0,2g : 0,002g MgSO4.7H2O MnSO4

: 0,002g

: 0,9g K2HPO4 ZnSO4

KCl : 0,2g Cơ chất : 10g

: 1g Agar : 20g NH4NO3

: 0,002g FeSO4.7H2O

Đệm phosphate 50mM , pH = 6,3

-1-

Đồ án tốt nghiệp

Cơ chất để khảo sát hoạt tính enzyme cellulase và chitinase lần lượt là CMC và

huyền phù chitin với thuốc thử lugol.

Phụ lục B. Bảng số liệu

B.1. Đường kính (mm) vòng phân giải CMC và chitin sau 2 ngày nuôi cấy

Lần lặp Đường kính Đường kính Chủng lại vòng phân giải CMC vòng phân giải chitin

1 50 23

2 49 25

3 48 22 T. virens 4 47 20

5 48 23

6 47 24

1 50 30

2 52 28

T. 3 52 29

harzianum 4 53 28

5 53 29

6 54 28

B.2. Trung bình Đường kính (mm) vòng phân giải CMC và chitin sau 2 ngày nuôi cấy

Summary Statistics for Vong phan giai Chitin

Trichoderma Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness T. harzianum 6

52.3333 1.36626

-0.888766

2.61069%

54.0

50.0

4.0

T. virens Total

6 12

48.1667 1.16905 2.49089 50.25

2.42708% 4.957%

47.0 47.0

50.0 54.0

3.0 7.0

0.667628 0.116046

Summary Statistics for Vong phan giai CMC Trichoderma Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness

T. harzianum 6

28.6667 0.816497

2.84824%

28.0

30.0

2.0

0.857321

T. virens

6

22.8333 1.7224

7.54336%

20.0

25.0

5.0

-0.678436

Total

12

25.75

3.30633

12.8401%

20.0

30.0

10.0

-0.472192

-2-

Đồ án tốt nghiệp

B.3. Đường kính tản nấm Fusarium sp. trên đĩa đối kháng và đối chứng qua các ngày

nuôi cấy đối kháng

Lần nhắc Lần 1 Lần 2 Lần 3

Ngày sau cấy Ngày sau cấy Ngày sau cấy Lặp Công thức lại 3 5 7 3 5 7 3 5 7

1 42 42 42 40 40 40 40 40 40

T. virens 2 42 42 42 39 39 39 43 43 43

3 41 41 41 41 41 41 42 42 42

T. 1 41 41 41 40 40 40 40 40 40

harzianum 2 40 40 40 39 39 39 42 42 42

3 42 42 42 41 41 41 41 41 41

1 45 71 90 46 69 90 44 71 90

Đối chứng 2 43 72 90 45 70 90 43 69 90

3 45 77 90 45 70 90 46 72 90

các ngày nuôi cấy

B.4. Trung bình tỷ lệ (%) đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Fusarium sp. qua

Summary Statistics for Ty le doi khang Fusarium

Tri Fu

Count Average Standard

Coeff. of variation Minimum Maximum Range

Stnd. skewness

deviation

Har-Fu 3 ngay 9

8.95522 2.23881

25.0%

5.97015

12.6866

6.71642 0.131223

Har-Fu 5 ngay 9

42.9017 1.40406

41.0296

45.2418

4.21217 0.131223

3.27273%

Har-Fu 7 ngay 9

54.8148 1.11111

53.3333

56.6667

3.33333 0.131223

2.02703%

Vi-Fu 3 ngay 9

7.9602

2.84171

3.73134

12.6866

8.95522 0.318465

35.6989%

Vi-Fu 5 ngay 9

42.2777 1.78216

39.6256

45.2418

5.61622 0.318465

4.21537%

Vi-Fu 7 ngay 9

54.321

1.41033

52.2222

56.6667

4.44444 0.318465

2.59629%

Total

54

35.2051 19.8041

56.2534%

3.73134

56.6667

52.9353 -1.61012

-3-

Đồ án tốt nghiệp

B.5. Đường kính tản nấm Rihzoctonia sp. trên đĩa đối kháng và đối chứng qua các

ngày nuôi cấy đối kháng

Lần nhắc Lần 1 Lần 2 Lần 3

Ngày sau cấy Ngày sau cấy Ngày sau cấy Lặp Công thức lại 3 5 7 3 5 7 3 5 7

1 40 40 40 39 39 39 40 40 40

T. virens 2 39 39 39 40 40 40 38 38 38

3 38 38 38 41 41 41 40 40 40

T. 1 42 42 42 40 40 40 41 41 41

harzianum 2 43 43 43 42 42 42 43 43 43

3 45 45 45 42 42 42 40 40 40

1 47 80 90 44 80 90 45 80 90

Đối chứng 2 45 79 90 47 79 90 46 81 90

3 46 78 90 44 81 90 45 80 90

qua các ngày nuôi cấy

B.6. Trung bình tỷ lệ (%) đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Rihzoctonia sp.

Summary Statistics for Ty le doi khang Rihzoctonia

Tri Ri

Count Average Standard

Coeff. of variation Minimum Maximum Range

Stnd. skewness

deviation

Vi-Ri 3 ngay 9

13.2029 2.23084

9.77995

16.3814

6.60147 0.331173

16.8966%

Vi-Ri 5 ngay 9

50.5571 1.27077

48.6072

52.3677

3.76045 0.331173

2.51354%

Vi-Ri 7 ngay 9

56.1728 1.12644

54.4444

57.7778

3.33333 0.331173

2.00531%

Har-Ri 3 ngay 9

7.57946 3.47928

0.977995 11.9804

11.0024

-0.597546

45.904%

Har-Ri 5 ngay 9

47.3538 1.98193

43.5933

49.8607

6.26741

-0.597546

4.18537%

Har-Ri 7 ngay 9

53.3333 1.75682

50.0

55.5556

5.55556

-0.597546

3.29404%

Total

54

38.0332 20.0816

0.977995 57.7778

56.7998

-2.10466

52.8001%

-4-

Đồ án tốt nghiệp

B.7. Đường kính tản nấm Colletotrichum sp1. trên đĩa đối kháng và đối chứng qua

các ngày nuôi cấy đối kháng

Lần nhắc Lần 1 Lần 2 Lần 3

Ngày sau cấy Ngày sau cấy Ngày sau cấy Lặp Công thức lại 3 5 7 3 5 7 3 5 7

1 44 44 44 46 46 46 43 43 43

T. virens 2 45 45 45 45 45 45 43 43 43

3 44 44 44 46 46 46 44 44 44

T. 1 37 37 37 39 39 39 40 40 40

harzianum 2 40 40 40 38 38 38 42 42 42

3 42 42 42 39 39 39 41 41 41

1 43 70 90 45 70 90 44 71 90

Đối chứng 2 43 69 90 45 72 90 46 70 90

3 44 71 90 45 72 90 45 70 90

B.8. Trung bình tỷ lệ (%) đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm

colletotrichum sp1. qua các ngày nuôi cấy

Summary Statistics for Ty le doi khang Collettotrichum1

Tri Col 1

Count Average Standard

Minimum Maximum Range

Stnd. skewness

Coeff. of

deviation

variation

Vi-Col1 3 ngay 9

0.497512 2.53072

508.675%

-2.98507 3.73134

6.71642 -0.215349

Vi-Col1 5 ngay 9

37.0079

1.60213

4.32915%

34.8031

39.0551

4.25197 -0.215349

Vi-Col1 7 ngay 9

50.6173

1.25599

2.48134%

48.8889

52.2222

3.33333 -0.215349

Har-Col1 3 ngay 9

10.9453

3.84165

35.0987%

5.97015

17.1642

11.194

0.163527

Har-Col1 5 ngay 9

43.622

2.43204

5.57525%

40.4724

47.5591

7.08661 0.163527

Har-Col1 7 ngay 9

55.8025

1.9066

3.41669%

53.3333

58.8889

5.55556 0.163527

Total

54

33.0821

20.7395

62.6912%

-2.98507 58.8889

61.874

-1.66222

-5-

Đồ án tốt nghiệp

B.9. Đường kính tản nấm Colletotrichum sp2. trên đĩa đối kháng và đối chứng qua các

ngày nuôi cấy đối kháng

Lần nhắc Lần 1 Lần 2 Lần 3

Ngày sau cấy Ngày sau cấy Ngày sau cấy Lặp Công thức lại 3 5 7 3 5 7 3 5 7

1 37 37 37 40 40 40 41 41 41

T. virens 2 38 38 38 37 37 37 40 40 40

3 42 42 42 39 39 39 38 38 38

T. 1 33 33 33 34 34 34 33 33 33

harzianum 2 35 35 35 35 35 35 34 34 34

3 37 37 37 37 37 37 35 35 35

1 43 65 84 44 65 87 41 65 84

Đối chứng 2 43 64 85 43 66 88 42 65 83

3 42 64 85 45 64 86 42 66 86

B.10. Trung bình tỷ lệ (%) đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm colletotrichum

sp2. qua các ngày nuôi cấy

Summary Statistics for Ty le doi khang Colletotrichum2

Tri Col2

Count Average Standard

Coeff. of variation Minimum Maximum Range

Stnd. skewness

deviation

Vi-Col2 3 ngay 9

8.57143 4.12325

1.81818

13.5065

11.6883 -0.383495

48.1046%

Vi-Col2 5 ngay 9

39.726

2.71824

35.274

42.9795

7.70548 -0.383495

6.84246%

Vi-Col2 7 ngay 9

54.1667 2.06699

50.7813

56.6406

5.85938 -0.383495

3.81599%

Har-Col2 3 ngay 9

18.7013 3.46293

13.5065

22.8571

9.35065 -0.593538

18.5171%

Har-Col2 5 ngay 9

46.4041 2.28293

42.9795

49.1438

6.16438 -0.593538

4.91966%

Har-Col2 7 ngay 9

59.2448 1.73598

56.6406

61.3281

4.6875

-0.593538

2.93017%

Total

54

37.8024 18.7396

1.81818

61.3281

59.5099 -1.48897

49.5724%

-6-

Đồ án tốt nghiệp

B.11. Đường kính tản nấm Colletotrichum sp3. trên đĩa đối kháng và đối chứng qua

các ngày nuôi cấy đối kháng

Lần nhắc Lần 1 Lần 2 Lần 3

Ngày sau cấy Ngày sau cấy Ngày sau cấy Lặp Công thức lại 3 5 7 3 5 7 3 5 7

40 40 1 40 39 39 39 39 39 39

T. virens 38 38 2 38 40 40 40 38 38 38

38 38 3 38 37 37 37 38 38 38

T. 39 39 1 39 40 40 40 41 41 41

harzianum 38 38 2 38 38 38 38 40 40 40

40 40 3 40 39 39 39 41 41 41

40 74 1 86 41 63 88 44 68 86

Đối chứng 42 66 2 87 44 70 88 45 65 88

43 64 3 86 43 70 85 42 69 86

ngày nuôi cấy

B.12. Tỷ lệ (%) đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm colletotrichum sp3. qua các

Summary Statistics for Ty le doi khang Colletotrichum3

Tri Col3

Count Average Standard

Coeff. of variation Minimum Maximum Range

Stnd. skewness

deviation

Vi-Col3 3 ngay 9

9.63542 2.37608

24.6598%

6.25

13.2813

7.03125 -0.331173

Vi-Col3 5 ngay 9

43.0213 1.49822

40.8867

45.3202

4.4335

-0.331173

3.4825%

Vi-Col3 7 ngay 9

55.4557 1.17126

53.7869

57.2529

3.46598 -0.331173

2.11207%

Har-Col3 3 ngay 9

7.29167 2.64935

3.90625

10.9375

7.03125 0.215349

36.3339%

Har-Col3 5 ngay 9

41.5435 1.67052

39.4089

43.8424

4.4335

0.215349

4.02114%

Har-Col3 7 ngay 9

54.3004 1.30597

52.6316

56.0976

3.46598 0.215349

2.40508%

Total

54

35.208

19.8802

3.90625

57.2529

53.3466 -1.55807

56.465%

-7-