Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ HUYỀN PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SEN HỒNG (NELUMBO NUCIFERA GAERTN.) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ HUYỀN PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SEN HỒNG (NELUMBO NUCIFERA GAERTN.) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ THU HÀ

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn GS.TS.

Nguyễn Văn Tuyến và TS. Nguyễn Thị Thu Hà đã giao đề tài và tận tình hướng

dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện

Hóa học đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành

luận văn.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Hóa Học - Trường Đại Học Khoa Học

Thái Nguyên đã trang bị cho em kiến thức để tiếp cận với các vấn đề nghiên

cứu khoa học, và các anh chị, các bạn học viên lớp K9B- lớp Cao học Hóa đã

trao đổi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè và

đồng nghiệp của tôi - những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này.

Ngày 28 tháng 5 năm 2017

Học viên

Phạm Thị Huyền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. a

MỤC LỤC ................................................................................................................... b

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... d

DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... e

DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... f

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ......................................................................................... g

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

Chương 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về họ Sen (Nelumbonaceae), chi sen (Nelumbo), và loài Sen

hồng (Nelumbo nucifera gaertn.) ................................................................................ 3

1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học của cây Sen hồng (Nelumbo Nucifera gaertn.) ..................................... 4

1.2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu ngoài nước ...................................... 4

1.2.2. Tổng quan tính hình nghiên cứu trong nước ....................................... 7

1.3. Hợp chất Flavonoid .............................................................................................. 8

1.3.1. Phân loại .............................................................................................. 8

1.3.2. Các phương pháp định tính và định lượng flavonoid ....................... 11

1.3.3. Các phương pháp chiết xuất flavonoid ............................................. 13

1.3.4. Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid ........................................ 14

1.4. Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các hợp chất

tự nhiên ...................................................................................................................... 19

1.4.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR. .... 19

1.4.2. Phương pháp phổ khối lượng (MS) .................................................. 20

1.4.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) .................................................... 21

Chương 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 23

2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 23

2.1.1. Đối tượng .......................................................................................... 23

2.1.2. Hóa chất ............................................................................................ 23

2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ........................................................................... 23

2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 23

2.2.1. Phương pháp xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật ............................... 23

2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên ................................... 24

2.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được ......................... 26

2.3.1. Hợp chất catechin (NN1) .................................................................. 26

2.3.2. Hợp chất hyperoside (NN2) .............................................................. 27

2.3.3. Hợp chất quercetin (NN3) ................................................................. 27

2.3.4. Hợp chất kaempferol (NN4) ............................................................. 28

2.3.5. Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide (NN5) ....................... 28

2.3.6. Hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide (NN6) ............................. 29

Chương 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 30

3.1. Phân tích cấu trúc hóa học hợp chất catechin (NN1) ......................................... 30

3.2. Hợp chất hyperoside (NN2) ............................................................................... 34

3.3. Hợp chất quercetin (NN3) .................................................................................. 38

3.4. Hợp chất kaempferol (NN4) ............................................................................. 40

3.5. Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide (NN5) ........................................ 43

3.6. Hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide (NN6) .............................................. 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 52

PHỤ LỤC ............................................................................................................... 56

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên tiếng anh Tên tiếng việt Kí hiệu/ Từ viết tắt

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ cộng hưởng từ proton

1H-NMR

13C-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

Phổ DEPT DEPT

Phổ COSY COSY

HMBC

HSQC

ESI-MS

Nuclear Magnetic Resonance- 1H Nuclear Magnetic Resonance- 1H Distortionles Enhancement by Polarization Transfer Homonuclear Correlated Spectroscopy Heteronuclear Multiple Bond Correlation Heteronuclear Single Quantum Coherence Electron Inoniziation-Mass Spectroscopy Infrared spectroscopy Mass Spectroscopy Thin LayerChromatography Dimethyl sulfoxide Ethyl acetate Ethanol Methanol IR MS đnc TLC DMSO EtOAc EtOH MeOH

δH, δC

Part per million Phổ tương tác di hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ tương tác trực tiếp H- C Phổ khối phun sương mù điện tử Phổ hồng ngoại Phổ khối lượng Điểm nóng chảy Sắc ký bản lớp mỏng Ethyl acetat Ethanol Methanol Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon Phần triệu ppm

dd: doublet of doublets dt: doublet of triplets dq: doublet of quartets s: singlet d: doublet t: triplet q: quartet

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây Sen hồng (Nelumbo nucifera Gaertn.)........................................ 3

Hình 1.2: Một số hợp chất flavonoid phân lập từ cây Sen hồng ........................ 5

Hình 3.1. Phổ ESI-MS của hợp chất NN1 ....................................................... 30 Hình 3.2. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất NN1 ..................................... 31

Hình 3.3. Phổ DEPT của hợp chất NN1 .......................................................... 32

Hình 3.4. Phổ HMBC của hợp chất NN1 ......................................................... 33

Hình 3.5. Phổ HSQC của hợp chất NN1 .......................................................... 34

Hình 3.6. Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp

chất catechin ................................................................................... 34

Hình 3.7. Phổ ESI-MS của hợp chất NN2 ....................................................... 35 Hình 3.8. Phổ 1H-NMRcủa hợp chất NN2 ....................................................... 36 Hình 3.9. Phổ 13C-NMR của hợp chất NN2 ..................................................... 36

Hình 3.10. Phổ DEPT của hợp chất NN2 ........................................................ 37

Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất hyperoside..................................... 38

Hình 3.12. Phổ ESI-MS của hợp chất NN3 ..................................................... 39 Hình 3.13. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất NN3 ................................... 39

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất quercetin ....................................... 40

Hình 3.15. Phổ ESI-MS của hợp chất NN4 ..................................................... 40 Hình 3.16. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất NN4 ................................... 41 Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của hợp chất NN4 ................................................... 42

Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất kaemferol ...................................... 43

Hình 3.19. Phổ ESI-MS của hợp chất NN5 ..................................................... 44 Hình 3.20. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất NN5 ................................... 45 Hình 3.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất NN5 ................................................... 45

Hình 3.22. Phổ DEPT của hợp chất NN5 ........................................................ 46

Hình 3.23. Cấu

trúc hóa học của hợp chất

isorhamnetin-3-O-β-D-

glucuronide ..................................................................................... 46

Hình 3.24. Phổ ESI-MS của hợp chất NN6 ..................................................... 47 Hình 3.25. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất NN6 ................................... 48 Hình 3.26. Phổ 13C-NMR của hợp chất NN6 ................................................... 48

Hình 3.27. Cấu trúc hóa học của hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide ... 50

Hình 3.28. Các hợp chất phân lập được từ dịch chiết EtOAc lá sen hồngNelumbo nucifera ........................................................................................... 50

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất NN1 ............................ 32

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất NN2 ............................ 37

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất NN4 ............................ 42

Bảng 3.4. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất NN6 ............................ 49

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Sen hồng Nelumbo nucifera ............................. 24

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc của lá Sen hồng ................... 26

DANH MỤC PHỤ LỤC

PL1.Phổ ESI-MS của hợp chất catechin (NN1): C15H14O6 ........................................ 1

PL2.Phổ IR của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6 ................................................. 2 PL3. Phổ1H-NMR của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6 ...................................... 3 PL4.Phổ13C-NMR của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6 ...................................... 4

PL5.Phổ DEPT của hợp chất catechin (NN1): C15H14O6............................................ 5

PL6.Phổ HSQC của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6 .......................................... 6

PL7. Phổ HMBC của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6 ........................................ 7

PL8.PhổESI-MS của hợp chất hyperoside (NN2) : C21H20O2 .................................... 8

PL9.Phổ IR của hợp chất hyperoside (NN2) : C21H20O2 ............................................ 9 PL10. Phổ1H-NMR của hợp chất hyperoside (NN2) : C21H20O2 .............................. 10 PL11. Phổ13C-NMR của hợp chất hyperoside (NN2) : C21H20O2............................. 11

PL12. Phổ DEPT của hợp chất hyperoside (NN2) : C21H20O2 ................................. 12

PL13.Phổ ESI-MS của hợp chất quercetin (NN3) : C15H10O7 .................................. 13

PL14. Phổ IR của hợp chất quercetin (NN3) : C15H10O7 .......................................... 14 PL15. Phổ1H-NMR của hợp chất quercetin (NN3) : C15H10O7 ................................ 15

PL16.Phổ ESI-MS của hợp chất (NN4) : C15H10O6 .................................................. 16

PL17.Phổ IR của hợp chất (NN4) : C15H10O6 ........................................................... 17 PL18. Phổ1H-NMR của hợp chất (NN4) : C15H10O6 ................................................ 18 PL19. Phổ13C-NMR của hợp chất (NN4) : C15H10O6 ............................................... 19

PL20.Phổ ESI-MS của hợp chất (NN5) : C22H20O13 ................................................ 20

PL21.Phổ IR của hợp chất (NN5) : C22H20O13 .......................................................... 21 PL22.Phổ1H-NMR của hợp chất (NN5) : C22H20O13 ................................................ 22 PL23. Phổ13C-NMR của hợp chất (NN5) : C22H20O13 .............................................. 23

PL24. Phổ DEPTcủa hợp chất (NN5) : C22H20O13 .................................................... 24

PL25.Phổ ESI-MS của hợp chất NN6 ....................................................................... 25

PL26.Phổ IR của hợp chất NN6 ................................................................................ 26 PL27.Phổ1H-NMR của hợp chất (NN6) :C21H18O13 ................................................. 27 PL28. Phổ13C-NMR của hợp chất (NN6) :C21H18O13 ............................................... 28

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm,

được thiên nhiên ưu đãi nên có thảm thực vật phong phú và đa dạng, với khoảng

hơn 14.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó, có khoảng 4000 loài được sử dụng

làm thuốc trong y học cổ truyền.Nước ta có nền Y học cổ truyền hết sức đa

dạng và đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử, nền y học dân tộc cũng

không ngừng phát triển qua các thời kì đó. Nhiều bài thuốc, vị thuốc có tác

dụng tốt trên lâm sàng nhưng chưa được nghiên cứu sâu về thành phần hóa học,

tác dụng dược lí và độc tính. Nghiên cứu để khai thác, kế thừa, ứng dụng và

phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là vấn đề có ý nghĩa khoa

học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta.

Thực vật là kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên, và rất

nhiều các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra, được nghiên cứu để phục vụ

trong y học.Các hợp chất thiên nhiên giữ vai trò chính trong việc phát hiện và

phát triển các dược phẩm mới. Ngoài ra hàng trăm cây thuốc đã được khoa học

y - dược chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng. Nhiều loại thuốc được

chiết xuất từ dược liệu Việt Nam được sử dụng rộng rãi trong nước và xuất

khẩu.Xu hướng đi sâu nghiên cứu các dược liệu trong Y học cổ truyền và tìm

kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc ngày càng

được thế giới quan tâm.

Việc sử dụng các hợp chất thiên nhiên và các sản phẩm có nguồn gốc

thiên nhiên làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan

tâm của các nhà khoa học cũng như cộng đồng bởi ưu điểm của chúng là độc

tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm

tổng hợp.

Sự lựa chọn cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) làm đối tượng

nghiên cứu của đề tài dựa vào kinh nghiệm sử dụng của nền Y học cổ truyền

dân tộc cũng như các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, với mục

tiêu tiếp tục nghiên cứu sâu hơn và tạo ra chế phẩm ứng dụng trong cuộc sống.

Luận văn: “Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây

Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện

đại” được đặt ra với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:

Mục đích của đề tài:

1. Phân lập được một số hợp flavonoid từ lá cây Sen hồng.

2. Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp

hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại IR;

phổ khối lượng Ms và đo điểm nóng chảy Mp.

Nội dung nghiên cứu:

1. Thu thập mẫu lớn lá cây Sen hồng(Nelumbo nuciferaGaertn.)để tiến

hành nghiên cứu.

2. Phân lập được một số hợp flavonoid từ lá cây Sen hồng.

3. Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp

hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại IR;

phổ khối lượng Ms và đo điểm nóng chảy Mp.

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về họ Sen (Nelumbonaceae), chi sen (Nelumbo), và loài Sen

hồng (Nelumbo nucifera gaertn.)

Đặc điểm của các chi và loài trong họ Sen là cỏ thủy sinh. Lá hình

khiên.Hoa lưỡng tính, xếp xoắn vòng; lá dài 2; cánh hoa nhiều, xếp xoắn, ít

phân biệt với lá đài, nhị nhiều, xếp xoắn.Rất đặc trưng bởi bộ nhụy gồm nhiều

lá noãn rời, xếp vòng, vùi sâu trong đế hoa hình nón ngược nằm vượt lên trên

bộ nhị [1].

Cây Sen hồng có tên khoa học Nelumbo nucifera, thuộc chi Sen

(Nelumbo), họ Sen (Nelumbonaceae). Sen hồng được coi là loài hoa thần thánh

và đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động tín ngưỡng.

Cây mọc ở nước, có thân rễ hình trụ (ngó sen), từ đó mọc lên những lá

có cướng dài.Hoa to, màu trắng hay đỏ hồng, có nhiều nhị (tua sen) và những

lá noãn rời; các lá noãn này về sau thành quả gắn trên một đế hoa hình nón

ngược (gương sen).Mỗi quả chứa một hạt, trong hạt có chồi mầm (tâm sen)

gồm 4 lá non gập vào trong [2].

Hình 1.1: Cây Sen hồng(Nelumbo nuciferaGaertn.)

Trong thế giới thảo dược, ít có loài thực vật nào mà các bộ phận đều là

những vị thuốc quý như cây Sen hồng. Trong Y học cổ truyền nhiều nước trên

thế giới, N. nucifera được dùng để chữa trị bệnh mất ngủ, hôi miệng, rong kinh,

bệnh ngoài ra, nhiễm trùng, béo phì, rối loạn thần kinh, các bệnh tim mạch, và

có công dụng như một loại thuốc bổ, giải độc và lợi tiểu. Theo Đông y, nước

sắc từ lá Sen được sử dụng để chữa nhiều loại bệnh như tiêu chảy, say nắng,

làm mát máu, lợi tiểu, hạ sốt, nôn ra máu, chảy máu cam, băng huyết, điều trị

bệnh phong, bệnh ngoài da, mệt mỏi thần kinh và béo phì [3].

1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học của cây Sen hồng (Nelumbo Nucifera gaertn.)

Do có lịch sử sử dụng lâu đời, nên cây Sen hồng được rất nhiều các nhà

khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như

hoạt tính sinh học, đặc biệt là lá sen.

1.2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu ngoài nước

Phân tích thành phần hóa học, các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều lớp

chất có trong các bộ phận khác nhau của cây Sen như alkaloids, flavonoid,

glycosides. Chúng bao gồm nuciferine, roemerine, anonaine, pronuciferine, N-

nornuciferine, (+) - 1 (R) -coclaurine , (-) - 1 (S) -norcoclaurine, liriodenine , N-

methyl-coclaurine , Dehydroemerine, dehydronuciferine, dehydroanonaine, N-

methylisococlaurine, O-nornuciferine, remerine, asimilobine, lirinidine,

nelumboside, quercetin, leucocyanidin, leucodelphinidin, quercetin-3- O-β-d-

glucuronide, rutin, (+) - catechin, hyperoside, isoquercitrin và astragalin …[4]

(Hình 1.2).

Trên mô hình thực nghiệm, dịch chiết lá Sen thể hiện nhiều hoạt tính sinh

học thú vị. Theo tác giả Kashiwada Y, dịch chiết cồn 95% từ lá Sen có hoạt

tính kháng virus HIV với giá trị EC50< 20 µg/ml. Các chất phân lập từ dịch

chiết này như coclaurine, nuciferine, liensinine, negferine và isoliensinine cũng

thể hiện hoạt tính rất mạnh trên chủng virus HIV với giá trị EC50< 0,8 µg/ml

[5].

Hình 1.2: Một số hợp chất flavonoid phân lập từ cây Sen hồng

Một nghiên cứu của Ono Yuka và cộng sự đã báo cáo tác dụng của

dịch chiết cồn nước của lá Sen lên các enzyme tiêu hóa, chuyển hóa lipid,

cùng với hiệu quả chống béo phì trên chuột, gây ra bởi một chế độ ăn giàu

chất béo. Kết quả cho thấy dịch chiết này có hoạt tính ức chế enzym α-

amylase và lipase với giá trị IC50 lần lượt là 0,48 và 0,82 mg/ml. Nó cũng

ngăn ngừa sự gia tăng trọng lượng cơ thể, trọng lượng mô mỡ và mức

triacylglycerol ở gan [6].

Theo tác giả Onishi E, dịch chiết nước của lá sen được nghiên cứu tác

dụng hạ lipid huyết thanh trên chuột. Chuột được cho ăn một chế độ ăn giàu

chất béo có chứa 1,5% cholesterol và 1% acid cholic, sau đó được uống dịch

chiết nước lá sen. Kết quả cho thấy có sự giảm mạnh cholesterol tổng số,

cholesterol tự do và các phospholipid so với lô đối chứng [7].

Nghiên cứu tác giả Wu và cộng sự cho thấy dịch chiết methanol từ lá sen

có hoạt tính chống oxy hóa tiềm năng [8]. Trong một nghiên cứu khác của Lee

và cộng sự, dịch chiết lá sen có chứa rutin (11.331,3 ± 4.5 mg), catechin

(10,853.8 ± 5,8 mg), acid sinapic (1,961,3 ± 5,6 mg), axit chlorogenic (631,9 ±

2,3 mg), axit syringic (512,3 ± 2,5 mg) và quercetin (415,0 ± 2,1 mg) được

đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan. Kết quả thử nghiệm cho

thấydich chiết này có khả năng loại bỏ gốc tự do tạo bởi hệ DPPH và ABTS

với giá trị IC50từ 4,46 μg/mL đến 5,35 μg/mL. Dịch chiết còn có tác dụng bảo

vệ tế bào gan và sự perox hoá lipid trong màng tế bào [9].

Một số alkaloid như asimilobine và lirinidine đóng vai trò như chất ức

chế sự điều khiển co cơ,gây ra các cơn co thắt ở thỏ thực nghiệm [10];

nelumbine có hoạt tính như một chất gây độc cho tim mạch [11].

Các bộ phận khác của cây như thân, hoa và hạt sen cũng chứa hoạt chất

thuộc nhiều lớp chất như alkaloids, flavonoid, glycosides, triterpenoid, các

vitamin, khoáng chất với hoạt tính chống đông máu, hoạt tính bảo vệ gan, chống

oxy hóa, chống xơ hóa, chống tăng sinh, chống loạn nhịp tim, chống virus,

kháng khuẩn, kháng viêm [12]…

Như vậy, có thể cho rằng, tác dụng dược lý đa dạng của Sen hồng là do

sự có mặt của nhiều lớp hoạt chất trong cây và cần phải có các nghiên cứu sâu

hơn để chứng minh khả năng chữa bệnh của loài thảo dược này.

1.2.2. Tổng quan tính hình nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, cây Sen hồng được trồng trong ao hồ khắp cả nước và rất

quen thuộc với người dân Việt Nam. Lá sen tươi là vị thuốc thông dụng trong

dân gian, dùng để chữa trị các chứng bệnh như: cảm nắng, say nắng, đau bụng

tiêu chảy... Lá sen khô dùng để chữa các chứng xuất huyết [13].

Theo tác giả Đỗ Huy Bích, các công trình nghiên cứu dược lý của cây

Sen Việt nam cho kết quả như sau: Alcaloid toàn phần của lá sen có tác dụng

ức chế loạn nhịp tim thực nghiệm. LD50 của lá sen tiêm phúc mạc chuốt nhắt

trắng là 17g/kg thể trọng. Cao cồn có tác dụng hơn cao nước. Lá sen có tác

dụng chống choáng phản vệ. Tác dụng an thần của tâm sen yếu hơn của lá sen.

Hoạt chất quercetin từ gương sen có tác dụng chống chảy máu. Dịch chiết và

alcaloid toàn phần của tâm sen và lá sen có tác dụng an thần, tăng trương lực

và co bóp cơ tử cung thỏ, chống co thắt cơ trơn ruột gây nên bởi histamin và

acetylcholin. Tâm sen có tác dụng ức chế trạng thái rối loạn thần kinh, có thể

phối hợp với hoạt chất aminazin trong điều trị tâm thần phân liệt.Trên mô hình

invivo, flavonoid toàn phần lá sen có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid

màng tế bào gan chuột một cách rõ rệt [14].

Hiện nay có nhiều sản phẩm từ lá Sen hồng được bán trên thị trường.

Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất Thực phẩm chức năng - Học Viện

Quân Y đã bào chế trà giảm béo SLIMUTEA giúp giảm mỡ máu và hỗ trợ điều

trị béo phì với thành phần chính gồm lá Sen kết hợp với một số thảo dược khác

như Thảo quyết minh, Hoàng cầm, Đinh hương. Công ty Cổ phần Công nghệ

xanh Nhật Minh đã sản xuất viên nang CHOLESSEN có thành phần lá sen và

Táo mèo với các thành phần polyphenol và flavonoid có tác dụng hạ mỡ máu,

gan nhiễm mỡ, hỗ trợ kiểm soát đường huyết trên bệnh nhân tiểu đường. Tinh lá

sen OB thành phần chính là flavonoid có tác dụng để giảm béo, mỡ máu cao,

tăng huyết áp, mất ngủ. Viện Công nghệ thực phẩm kết hợp với Công ty thực

phẩm Hisamitsu Nhật Bản sản xuất tinh lá sen tươi FIRI...

1.3. Hợp chất Flavonoid [15]

1.3.1. Phân loại

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật,

có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa.Về

cấu trúc hoá học Flavonoid có khung cơ bản là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A

và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon, cấu trúc có thể là vòng kín hoặc mở.

Trong đa số trường hợp thì mạch 3 cacbon đóng vòng với vòng A và tạo

nên 1 dị vòng có oxy (vòng C). Tuỳ theo vị trí gắn của vòng bezen B vào dị

vòng ở C2 hoặc C3, ta có các hợp chất Flavonoid có nhân Flavan hay Isoflavan.

Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxyl tự do hoặc đã thay thế

một phần, vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính axit.

Trong thực vật, Flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do

(aglycol) và dạng liên kết với glucid (glycozit). Trong đó, dạng aglycol thường

tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan

trong nước, còn dạng glycozit thì tan trong nước nhưng không tan trong các

dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform.

Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6 đều có 2 vòng thơm. Tuỳ thuộc vào

cấu tạo của mạch C trong bộ khung C6C3C6, flavonoid được phân thành các

nhóm sau:

 Eucoflavonoid: Flavon, flavonol, flavanon, flavanol, chalcon,

antocyanin, anthocyanidin.

 Isoflavonoid: isolavon, isoflavanon, rotenoid.

 Neoflavonoid: calophylloid.

 Biflavonoid và triflavonoid.

1.3.1.1. Eucoflavonoid

Eucoflavonoid bao gồm các nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol,

flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, flavanon, 3-hydroxy flavanon, flavon, flavonol,

dihydrochalcon, chalcon, auron.

1.3.1.2. Isoflavonoid

Isoflavonoid bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3-ene,

isoflavan-4-ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-

arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon,

homo-isoflavon.

Isoflavonoids tất cả không có màu sắc. Nó được tạo thành từ axetat theo

cơ chế đóng vòng với phenylalamine, cinnamate dẫn xuất được sát nhập vào

vòng B và C-2,3, và-4 của dị vòng.

1.3.1.3. Neoflavonoid

Neoflavonoid chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật. Ví dụ chất

brasilin có trong cây tô mộc - Caesalpinia sappan hay calophyllolid trong cây

mù u - Calophyllum inophyllum

1.3.1.4. Biflavonoid và triflavonoid

Những flavonoid dimer và trimer đã có nói đến trong phần flavan-3-ol

và flavan 3,4 diol. Những hợp chất đó được gọi là proanthocyanidin.Ở đây là

những biflavonoid tạo thành từ flavon, flavanon, dihydroflavonol, chalcon,

dihydro chalcon, auron, isoflavon. Biflavon cấu trúc gồm 2 đơn vị flavon được

biết trước tiên. Chất điển hình là amentoflavon tạo thành từ 2 phân tử apigenin

nối theo dây nối carbon-carbon ở vị trí 3', 8''.

1.3.2. Các phương pháp định tính và định lượng flavonoid

1.3.2.1. Định tính

Một số phản ứng định tính (chủ yếu với nhóm euflavonoid)

- Tác dụng của FeCl3: Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng vị

trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu.

- Tác dụng của kiềm. Nếu hơ một tổ chức thực vật như cánh hoa, nhát

cắt của gỗ hoặc tờ giấy thấm có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ ammoniac thì có

màu vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid.

Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương.

Chalcon và auron có thể cho màu đỏ da cam.Một số nhóm khác như flavan-3-

ol, flavanon, isoflavon màu không thay đổi. Tuy nhiên nếu thực hiện trong ống

nghiệm với dung dịch alkali thì một số dẫn chất flavan-3-ol lại cho màu vì dễ

bị oxy hoá, còn flavanon dễ bị isomer hoá thành chalcon nên nếu để một lúc lại

cho màu vàng đậm đến đỏ.

- Tác dụng của H2SO4 đậm đặc: Axit H2SO4 khi nhỏ lên các dẫn chất

flavon, flavonol thì cho màu vàng đậm. Đối với chalcon và auron cho màu đỏ,

đỏ thắm, đỏ tươi.Flavanon cho màu đỏ cam rồi đỏ thắm, có thể do chuyển

flavanon thành chalcon.

- Phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater)

Đây là phản ứng khử hay được sử dụng nhất để tìm sự có mặt của các

dẫn chất nhóm flavonoid. Dung dịch flavonoid trong ethanol, thêm bột Mg rồi

nhỏ từ từ HCl đậm đặc.Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẩm hoặc đỏ

tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon. Màu sắc đôi khi

có thể bị thay đổi tùy theo loại, số lượng, vị trí nhóm thế ví dụ các dẫn chất

methoxy flavon (Tangeretin, Nobiletin) thì âm tính. Để phân biệt giữa

flavonoid glycosid và aglycon của chúng, Bryant đem lắc dung dịch có màu

với octanol, nếu màu ở lớp dưới lên hết ở lớp octanol, chất thử là aglycon, nếu

lớp octanol không màu, chất thử là glycosid.

- Tác dụng của chì acetat trung tính hoặc kiềm

Phản ứng thực hiện trên giấy thấm. Nhiều dẫn chất flavonoid tạo thành

muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịch chì acetat trung tính hoặc kiềm.

Màu phụ thuộc vào các dẫn chất flavonoid.Nếu tiến hành trong ống nghiệm,

chì acetat kièm cho tủa màu với hầu hết các flavonoid phenol còn chì acetat

trung tính tạo tủa với những dẫn chất có nhóm dihydroxyphenol.

- Phản ứng ghép đôi với muối diazoni

Các dẫn chất flavonoid có nhóm OH ở vị trí 7 có thể phản ứng với muối

diazoni để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ.

1.3.2.2. Định lượng

Tuỳ vào từng loại Flavonoid mà ta có phương pháp định lượng cụ thể

khác nhau.

 Flavon hoặc flavonol

+Phương pháp cân: ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavon hoặc

flavonol và dịch chất ít tạp chất.

+ Đo màu: bằng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni,

tạo phức màu với AlCl3, Muối titan, chrom…

+ Phương pháp đo phổ tử ngoại.

 Chalcon

 Phương pháp phân tích HPLC (sắc kí lỏng cao áp). Với pha động là dung

dịch acetonitrile và acid H3PO4 1% (phương pháp chuản trong phân tích).

 Phương pháp so màu: có nhiều phương pháp so màu khác.

 ciocalteu: (hỗn hợp muối phứcPhương pháp Folin polyphosphotungstate -

molydate).

+ Rất nhạy đối với chất khử, trong môi trường kiềm nhẹ thì sẽ bị khử

thành sản phẩm phức molydenium tungsten có màu xanh.

+ Sau đó đem đo độ hấp thu A (chalcon chỉ hấp thu mạnh ở 400 nm).

Phương pháp Prussian Blue:

+ Hỗn hợp thuốc thử là FeCl3 và K3Fe(CN) 6 bị khử bởi các hợp chất

phenol và tạo thành phức ferric (III) hexacyanoferrate (II) có màu xanh.

+ Để yên dung dịch trong 15 phút, sau đó đem đo đọ hấp thu A.

 Phương pháp Diazotized

+ Dựa vào khả năng phản ứng ghép đôi với hợp chất diazo trong môi

trường acid tạo thành hợp chất có màu vàng đặc trưng.

+ Lắc đều, để yên dung dịch trong 1 giờ, sau đó đem đo độ hấp thu.

 HCl: Tạo thành hợp chất có màu đỏ: Phương pháp Vanillin

1.3.3. Các phương pháp chiết xuất flavonoid

Không có phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng

rất khác nhau về độ tan trong nước và các dung môi hữu cơ. Các flavonoid

glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon

dễ tan trong dung môi kém phân cực. Các dẫn chất flavon, flavonol có OH

tự do ở vị trí 7 hòa tan được trong dung dịch kiềm loãng, dựa vào đó để chiết.

Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các chất

thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hay

etanol. Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần lớn

các flavonoid.

Đôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì để kết

tủa.sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid thì flavonoid

được giải phóng. Để phân lập từng chất flavonoid người ta áp dụng phương

pháp sắc ký cột.chất hấp phụ thông dụng nhất là polyamid. Có thể dùng

celluose, silicagel. Silicagel dùng để tách các chất flavanon, isoflavon,

flavonol. Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần .

1.3.4. Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid

1.3.4.1. Hoạt tính chống oxy hóa [16-18]

Quá trình oxi hóa khử là quá trình quan trọng và phổ biến trong mọi cơ

thể sống. Bình thường, các gốc tự do được tạo ra trong cơ thể để chống lại một

số các loại virut và vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên khi ở hàm lượng cao, các gốc

tự do này phản ứng với protein, lipit, ADN là nguyên nhân làm tăng tốc độ quá

trình lão hóa cơ thể con người và là một trong các nguyên nhân của hơn 60 bệnh

thường gặp: ung thư, các bệnh tim mạch như cao huyết áp, xơ vữa động mạch,

nhồi máu cơ tim, mất trí nhớ tuổi già và nhất là quá trình lão hóa cơ thể. Vì vậy,

việc đưa các chất chống oxy hoá như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì

có thể ngăn ngừa hoặc hỗ trợ điều trị các loại bệnh này.

Flavonoid có hai tính chất quan trọng là bẫy gốc tự do và khả năng tạo

phức với kim loại. Cả hai chức năng kể trên đều có tính chất chống oxy hóa

bằng cách cho electron và bẻ gãy chuỗi phản ứng tạo gốc tự do. Cơ sở sinh hóa

quan trọng nhất để flavonoid thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa của chúng

là khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự

do hoạt động. Bên cạnh đó flavonoid có khả năng tạo phức với các ion kim loại

chuyển tiếp như Fe+2, Cu+2… để chúng không thể xúc tác cho phản ứng Fenton

sinh ra các gốc hoạt động nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các

phản ứng oxy hóa. Các flavonoid có các nhóm hydroxyl ở vị trí 3, 5, 3', 4' có

khả năng liên kết tốt với các ion kim loại tạo phức oxycromon, oxycacbonyl

hoặc 3', 4' orthodioxyphenol.

Khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do của một số

flavonoid theo thứ tự: myricetin > quercetin > rhammetin > morin > diosmetin

> naringenin > apigenin > catechin > 5,7 dihydroxy-3', 4', 5' trimethoxy flavon

> robinin > kaempferol > flavon.

1.3.4.2. Tác dụng đối với các bệnh về tim mạch [19-20]

Các flavonoid như catechin và leucoanthocyan rồi đến flavonol, flavanon

và một số chalcon… có thể có tác dụng làm bền thành mạch, làm tăng sức bền

và tính đàn hồi của thành mao mạch, chủ yếu là do khả năng điều hòa, làm giảm

sức thấm vào mao mạch, có tác dụng dự phòng vỡ mao mạch, gây xuất huyết,

gây phù thũng máu.

Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch,

tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, các bệnh trong nhãn khoa như sung

huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc. Các dẫn chất anthocyanoside có tác

dụng tái tạo tế bào võng mạc và có tác dụng tăng thị lực.

Trên hệ tim mạch, nhiều Flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn

hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích

phút của tim.... Các flavonoid có tác dụng củng cố, nâng cao sức chống đỡ và

hạ thấp tính thẩm thấu các hồng huyết cầu qua thành mạch thông qua tác dụng

lên các cấu trúc màng tế bào của nó, ứng dụng vào điều trị các rối loạn chức

năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch.

Các chất kaempferol, quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần

hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những người có

biểu hiện rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung, hay

cáu gắt…

1.3.4.3. Tác dụng đối với enzym

Các flavonoid có khả năng tác động đến hoạt động của nhiều hệ enzym

trong cơ thể. Khả năng tương tác với protein là một trong những tính chất quan

trọng nhất của các hợp chất flavonoid, quyết định hoạt tính sinh học của chúng.

Phản ứng xảy ra giữa nhóm oxyphenolic và oxycacbonyl của các nhóm peptit để

tạo thành liên kết hydro. Tính bền vững của liên kết phụ thuộc vào số lượng và

vị trí các nhóm hydroxyl và kích thước phân tử của hợp chất phenol.

Tuy nhiên, có một số tác giả cho rằng giữa phenol và nhóm amin của

protein không có vai trò chính trong việc làm thay đổi hoạt tính enzym, họ đã

nghiên cứu quá trình tiếp nhận một số chất polyphenol vào ty thể của gan chuột

và kết luận rằng: sự liên kết của các polyphenol với các protein thường kèm

theo những thay đổi cấu hình của phân tử protein enzym, bởi vậy một số

polyphenol có hiệu ứng dị lập thể (chất điều hòa dị lập thể) đối với nhiều enzym

trong tế bào động thực vật.

Flavonoid có tác dụng trên nhiều enzym động vật như: protein-tyrozin

kinaza, protein kinaza, lipooxygenaza, cyclooxygenaza, phospholypaza ADN

topoizomeraza, glutathion S transferaza, aldoz reductaza, monoamin oxydaza,

pyruvat kinaza, aldehyd và alcohol dehydrogenaza, amylaza, ARN polymeraza,

AND polymeaza, AND ligaza-I ở người, ribonucleaza, hệ cytocrom P450,

elastaza, nitric oxide syntaza, oxydoreductase, peroxydase, caspase…

Bản thân các chất flavonoid khi ở trong cơ thể sống có thể tồn tại ở dạng

oxy hóa hoặc khử và chịu nhiều biến đổi phức tạp khác nhau cho nên có thể

trong các điều kiện khác nhau nó sẽ thể hiện họat tính sinh học khác nhau như

kìm hãm hoặc kích thích hoạt động enzym hoặc kích thích có mức độ và có

điều kiện. Ví dụ như flavonoid có khả năng:

- Làm tăng hoạt tính prolin hydroxylase, là một enzym quan trọng trong

quá trình làm lành vết thương và tạo sẹo.

- Kìm hãm các enzym lypoxygenase và enzym tổng hợp prostaglandin,

chất chuyển các dạng acid béo không no về các dạng dẫn xuất chứa oxy trong

đó phải kể đến luteolin và 3', 4' dihydroxyflavon là các flavonoid có hoạt tính

mạnh đối với cả hai loại enzym này, ở nồng độ 2×10-5M, chúng kìm hãm 50%

họat tính lypoxygenaza.

Nhờ tác dụng sinh học đối với enzym mà các flavonoid có khả năng ức

chế sự phát triển của tế bào ung thư, mau chóng làm lành vết thương, giảm các

nguy cơ về bệnh tim mạch.

1.3.4.4. Hoạt tính kháng khuẩn [21-22]

Gần đây, các hợp chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc thảo mộc đang

là đối tượng quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Tác dụng kháng

khuẩn của flavonoid đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới chứng

minh.

Về tác dụng kháng khuẩn một số tác giả nghiên cứu tác dụng của

anthocyanin, leucoanthocyanin và acid phenolic lên vi khuẩn Salmonella và

thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt. Hầu hết các chất này có khả năng kìm hãm sự

hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza.

Các nghiên cứu về cơ chế tác dụng kháng vi sinh của flavonoid còn rất

ít và có thể theo một giả thiết sau:

- Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit (yếu tố đảm bảo

cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc) không tổng hợp được.

- Gắn lên màng nguyên sinh chất của vi khuẩn, làm thay đổi tính thẩm

thấu chọn lọc của màng nguyên sinh chất. Vì vậy, làm một số chất cần thiết cho

đời sống vi khuẩn như nucleotit, pyrimidin, purin lọt qua màng nguyên sinh

chất ra ngoài.

- Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo hai kiểu:

phong tỏa mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong tỏa transferaza chuyển

acid amin từ ARN vào mạch làm mạch không kéo dài thêm được hoặc tạo ra

protein bất thường không có tác dụng đối với đời sống của vi khuẩn, làm chúng

không sử dụng được.

- Ức chế tổng hợp acid nucleic

- Tác dụng vào ADN khuôn, ức chế tổng hợp ARN của vi khuẩn.

1.3.4.5. Hoạt tính kháng viêm [23-24]

Flavonoid đã được nghiên cứu và chứng minh có tác động kháng viêm

theo nhiều cơ chế khác nhau. Về hoạt tính kháng viêm của flavonoid, rất nhiều

công trình nghiên cứu đã được công bố và đã chứng minh sự liên quan giữa khả

năng chống oxy hóa với khả năng ức chế enzym cyclo-oxygenase và enzym 5-

lipooxygenase trong hoạt tính kháng viêm.

Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavon,

flavanon,dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcon, isoflavon,

biflavon, 4-aryl coumarin, 4-aryl chroman đều được chứng minh bằng thực

nghiệm là do các chất này ức chế con đường sinh tổng hợp prostagladin. Các

prostaglandin được tổng hợp và sử dụng ngay tại các mô với nồng độ rất thấp

chỉ khoảng vài nanogam/gam. Chúng có mặt ở khắp nơi trong cơ thể, phạm vi

tác dụng sinh lý rất rộng lớn nên còn được gọi là hormon tổ chức. Một số

prostaglandin gây viêm và gây đau, prostaglandin còn làm tăng cảm thụ của

thụ cảm thể với các chất gây đau như bradykinin.

Hiện nay các flavonoid được nghiên cứu có tác dụng tốt đa phần là các

flavonoid thiên nhiên như kaempferol, quercetin, catechin, chrysin… Theo các

nghiên cứu, tác dụng sinh học của chúng nhờ vào sự có mặt của nhiều nhóm

hydroxyl phenol. Tuy nhiên, các nhóm hydroxyl tự do này cũng là nguyên nhân

làm tăng sự phân cực, hấp thu kém nên tác động in vivo thường không tốt như

trong in vitro.

1.3.4.6. Hoạt tính kháng ung thư [25]

Việc tìm kiếm các thuốc chữa ung thư từ thực vật là hướng đi của thời

đại, được khoa học đặc biệt quan tâm. Trong vài thập kỷ gần đây, nhiều loại

thuốc đã được ra đời phục vụ y học song vấn đề tìm ra các loại thuốc có hiệu

lực chữa trị ung thư vẫn còn là câu hỏi lớn đối với các nhà khoa học. Trong các

hướng nghiên cứu nhằm tìm ra các hoạt chất có khả nǎng chống ung thư,

flavonoid là một trong những lớp chất được quan tâm bởi chúng là những chất

có hoạt tính chống oxy hóa cao, tác dụng đến nhiều hệ enzym và ít độc đối với

cơ thể sống. Khi đưa vào cơ thể sống, flavonoid có thể tác động lên các biến

đổi sinh hóa học bằng cách trực tiếp hay gián tiếp như thông qua hoạt động của

các enzym hay hệ thống thần kinh, nội tiết... Các kết quả thực nghiệm cho thấy

một số flavonoid có tác dụng chống ung thư thông qua khả năng hoạt hoá các

enzym trong gan có nhiệm vụ chuyển hoá các chất gây ung thư. Những sản

phẩm chuyển hoá thường có tính gây ung thư thấp hơn. Ngoài ra, các flavonoid

còn tham gia trong việc phòng chống ung thư bằng khả năng chống oxy hoá,

loại trừ các gốc tự do có thể gây tổn hại tế bào, chống lại quá trình sao chép,

chống sự tân sinh mạch máu.

1.4. Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các

hợp chất tự nhiên [26-27]

1.4.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN)là phương pháp vật lý hiện đại

nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến được sử

dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có

momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có

thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là spin hạt nhân

có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 .

Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt

nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho

các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt

nhân 1H thì:

Trong đó:νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt

nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.

Trong đó:νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân

mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.

Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh

hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C trong

phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng

có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi

hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có

độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn.

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt

trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên

mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12

ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm.

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân

không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân

phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách

tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có

từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J

phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên

kết ngăn giữa các tương tác.

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các

hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút

ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau.

1.4.2. Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử

trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e. Sau đó

phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng. Dựa vào

phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên

cứu.

Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng

electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên

tử nhanh (FAB)… Dùng dòng eclectron có năng lượng cao để bắn phá phân tử

là phương pháp hay được sử dụng nhất. Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu

cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc bị phá vỡ

thành các ion và các gốc. Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn

95%, còn lại là các ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-). Năng lượng bắn

phá các phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhưng với năng lượng cao

thì ion phân tử có thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc,

các gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta thường thực hiện bắn

phá các phân tử ở mức năng lượng 70 eV. Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo

chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá. Quá trình này gọi là quá

trình ion hóa. Các ion ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện

tích e, tỉ số m/e được gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối

khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ

thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z

thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng

Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng

phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định

được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những

thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần

nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau.

1.4.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho nhiều

thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất.

Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bước

sóng khoảng 10-4 đến 10-6m. Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến. Phần

của vùng hồng ngoại được sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm trong

giữa 2,5x10-4 và 16x10-6m. Đại lượng được sử dụng nhiều trong phổ hồng ngoại

là số sóng (cm-1), ưu điểm của việc dùng số sóng là là chúng tỷ lệ thuận với

năng lượng.

Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng

của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân tử. Một

phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân

tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay.

Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho

hai hợp chất giống nhau.

Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được

chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng. Các

pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì

vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O,

C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức

tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định

nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này

đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón

tay.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng

Lá cây Sen hồng (Nelumbo nucifera) được thu hái tại phường Ninh Xá,

thành phố Bắc Ninh vào tháng 3 năm 2016. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại

phòng Hóa sinh ứng dụng, viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

2.1.2. Hóa chất

- Các dung môi: n-hexane,dichloromethane, ethylacetate, acetone,

methanol.

- Sắc ký lớp mỏng (TCL) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn l60

Merck F254 có độ dày 0,25 mm. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoạiở 2

bước sóng λ= 254 nm và 365 nm.

- Sắc ký cột (CC) sử dụng Silica gel Merck cỡ hạt 40-60 µm.

- Sắc ký cột (CC) với pha tĩnh là Sephadex LH-20.

- Thuốc hiện trong phân tích TLC: FeCl3, Ceri sulfat, Vanilin/ H2SO4 đặc.

2.1.3. Thiết bị nghiên cứu

- Điểm nóng chảy được đo trên máy HMK 70/3159.

- Phổ hồng ngoại được ghi trên máy FTIR Impact-410.

- Phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy sắc ký lỏng

ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC/MSD Agilen series 1100), sử dụng mode

ESI và đầu dò DAD.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance

500 MHz với TMS là chất chuẩn nội.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật

Lá cây sen hồng (Nelumbo nucifera)(28 kg) phơi trong bóng mát cho khô

tự nhiên, sau đó nghiền nhỏ thu được 5,5 kg lá khô. Mẫu khô được ngâm chiết

với EtOH 70% trong 5 lần (24 giờ/lần), lọc lấy phần dịch và cất loại dung môi

dưới áp suất giảm thu được cặn EtOH.

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Sen hồng Nelumbo nucifera

Cặn tổng EtOH thêm nước, sau đó chiết phân bố với n-hexan với tỉ lệ 1/1

(4 lần), thu phần dịch n-hexan để cất loại dung môi thu được cặn n-hexan (110

g). Tiếp theo, axit hóa phần nước bằng HCl và chiết với ethylacetat (4 lần), thu

lấy phần dịch EtOAc, cất loại dung môi thu được cặn ethylacetat (800 g). Loại

bỏ nước ở phần dịch còn lại thu được cặn nước (700 g).

Quá trình ngâm chiết lá cây Sen hồng được trình bày trong Sơ đồ 2.1.

2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên

Cặn chiết ethylacetat của lá cây Nelumbo nucifera (50g) được phân tách

trên cột silicagel (150g) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/EtOAc/MeOH

gradient thu được 10 phân đoạn ký hiệu từ F1 đến F10. Phân đoạn F3 (1,1g)

được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH thu được 2 phân

đoạn nhỏ F3.1 và F3.2. Kết tinh phân đoạn F3.2 với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH thu được hợp chất NN3 (30mg) dưới dạng chất rắn màu vàng.

Từ phân đoạn F5 (2,5 g),tinh chế trên cột sillica gel với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH gradient thu được 2 phân đoạn nhỏ F5.1 và F5.2. Phân đoạn

F5.2 được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH thu được

chất NN1 (35 mg). Từ phân đoạn F7 (11 g), tiến hành tinh chế trên cột Sephadex

LH-20 với dung môi MeOH thu được 2 phân đoạn nhỏ F7.1 và F7.2. Phân đoạn

nhỏ F7.1 được tiếp tục tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH

thu được chất NN2 (50mg). Phân đoạn F8 (3,7g) được phân tách trên cột

Sephadex LH-20 với dung môi MeOH thu được 4 phân đoạn nhỏ F8.1-F8.4.

Phân đoạn F8.1 (300 mg) được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với dung môi

MeOH và sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH 10% thu

được chất NN4 (4 mg). Phân đoạn nhỏ F8.2 (1,6 g) được phân tách trên cột

sillica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient và sắc ký bản mỏng điều

chế với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH 20% thu được chất NN5 (15 mg). Phân

đoạn nhỏ F8.3 (220 mg) tiếp tục được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với

dung môi MeOH thu được chất NN6 (11mg).

Quá trình phân lập các chất từ cặn EtOAc của lá cây sen hồng được trình

bày trong Sơ đồ 2.2.

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc của lá Sen hồng

2.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được

2.3.1. Hợp chất catechin (NN1-C15H14O6)

Chất rắn màu vàng, đnc:241-242ºC.

ESI-MS: m/z 291[M+H]+

FT-IR (KBr)ν max (cm -1):3387, 1611, 1520, 1455, 1373, 1285, 1252,

1143, 1105, 1032, 868, 819

1H-NMR (CDCl3 + CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CDCl3 + CD3OD,

125 MHz): Xem bảng 3.1 trang 33

2.3.2. Hợp chất hyperoside (NN2- C21H20O2)

Chất rắn màu vàng, đnc: 233-235ºC

ESI-MS: m/z 465 [M+H]+

FT-IR (KBr)ν max (cm -1):3379, 3294, 1673, 1617, 1514, 1430, 1361,

1317, 1245, 1166, 1013, 1001, 933, 819, 789

1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)và13C-NMR (CD3OD, 125 MHz):xem

bảng 3.2 trang 38, 39

2.3.3.Hợp chất quercetin (NN3- C15H10O7)

Chất rắn màu vàng, đnc.313-315ºC

ESI-MS: m/z 303 [M+H]+.

FT-IR (KBr) ν max (cm -1): 3402, 3251, 2934, 1627, 1523, 1470, 1375,

1289, 1252, 1148, 1113, 1080, 1032, 983, 819, 765

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 7,76 (1H , d, J = 2,0 Hz, H-2’);

7,65 (1H, d, J = 2,0; 8,5 Hz, H-6’); 6,91 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 6,41 (1H, d,

J = 2,0 Hz, H-8); 6,21 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6).

2.3.4. Hợp chất kaempferol (NN4- C15H10O6)

Chất rắn màu vàng, đnc: 276-279oC

ESI-MS:m/z 287[M+H]+

FT-IR (KBr) ν max (cm -1):3448, 3165, 2897, 1659, 1605, 1560, 1495,

1444, 1363, 1310, 1274, 1202, 1131, 1088, 1020, 996, 873, 818, 787

1H-NMR(CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR(CD3OD, 125 MHz): Xem

bảng 3.3 trang 43

2.3.5.Hợp chấtisorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide(NN5-C22H20O13)

Chất rắn màu vàng, đnc:189-190 °C

ESI-MS: m/z 493 [M+H]+

FT-IR (KBr) ν max (cm -1): 3377, 2905, 1737, 1563, 1503, 1455, 1359,

1290, 1207, 1087, 1017, 994, 878, 806.

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 7,60 (1H, br. s, H-2’); 7,59 (1H,

dd, J = 2,0; 8,5 Hz, H-6’); 6,86 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 6,41 (1H, d, J = 2,0

Hz, H-8); 6,22 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 5,24 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’’); 3,77

(1H, d, J = 10,0 Hz, H-5’’); 3,59 (1H, t, J = 9,5 Hz, H-4’’); 3,54 (1H, t, J = 8,0

Hz, H-2’’); 3,47 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-3’’).

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (ppm): 179,2 (C-4); 170,7 (C-6’’); 166,1

(C-7); 163,0 (C-5); 159,4 (C-9); 158,5 (C-2); 149,8 (C-4’); 145,9 (C-3’); 135,4

(C-3); 123,5 (C-6’); 122,9 (C-1’); 117,3 (C-2’); 115,9 (C-5’); 105,6 (C-10);

104,8 (C-1’’); 99,9 (C-6); 94,8 (C-8); 77,3 (C-3’’); 77,1 (C-5’’); 75,3 (C-2’’);

72,7 (C-4’’); 52,8 (OCH3).

2.3.6. Hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide (NN6- C21H18O13)

Chất rắn màu vàng, đnc: 182-183 °C

ESI-MS: m/z 479 [M+H]+

FT-IR (KBr)ν max (cm -1): 3404, 1657, 1604, 1499, 1449, 1359, 1301,

1268, 1200, 1173, 1055, 1013, 930, 799.

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): xem

bảng 3.4 trang 49

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Từ cặn chiết EtOAc của lá sen hồng, bằng các phương pháp sắc ký và

kết tinh phân đoạn đã phân lập được 6 hợp chất ký hiệu từNN1 đến NN6.

Cấu trúc hóa học của các hợp chất này đã được xác định nhờ phân tích

các dữ liệu phổ bao gồm phổ MS, 1D và 2D NMR, đồng thời so sánh với các

tài liệu đã công bố trước đây đối với các hợp chất đã biết. Việc phân tích cấu

trúc của các hợp chất được trình bày dưới đây:

3.1. Phân tích cấu trúc hóa học hợp chất catechin (NN1-C15H14O6)

Hợp chất catechin (NN1-C15H14O6) được phân lập dưới dạng chất rắn

màu vàng, đnc: 241-242ºC. Phổ khối ESI-MS của NN1 cho pic ion phân tử

proton hóa ở m/z 291 [M+H]+. Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm

OH và vòng thơm aromatic ở 3387, 1611, 1520 cm1

Hình 3.1. Phổ ESI-MS của hợp chất catechin (NN1)

Phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy sự có mặt của 1 nhóm CH2 ở H 2,55

(1H, dd, J = 8,5; 16,0 Hz, H-4b); 2,97 (1H, dd, J = 6,0; 16,0 Hz, H-4a); C 27,6

(C-4) và 2 nhóm methin gắn với oxi ở H 4,59 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-2); C 81,7

(C-2) và và H 4,02 (1H, m, H-3); C 67,9 (C-3) là các tín hiệu đặc trưng cho vị

trí nhóm methylen CH2-4 và proton H-2, H-3 của một hợp chất flavan-3-ol.

Hằng số tương tác J = 8,0 Hz của proton H-2 cho biết H-2 và H-3 ở vị trí trans-

diaxial. Trên phổ 1H-NMR còn có tín hiệu của 3 proton vòng thơm tương tác

kiểu ABX ở H 6,79 (1H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz, H-6’); 6,83 (1H, d, J = 8,2 Hz, H-

5’); 6,88 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’) và 2 proton ở vị trí meta ở H 5,95 (1H, d, J

= 2,0 Hz, H-6); 5,96 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) chứng tỏ vòng B bị thế ở vị trí C-

3’ và C-4’, vòng A bị thế ở vị trí C-5 và C-7.

Hình 3.2. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất catechin - C15H14O6

Phân tích phổ 13C-NMR và HSQC của catechin (NN1) cho biết sự có

mặt của 15 nguyên tử cacbon trong đó 12 cacbon sp2 và 3 cacbon sp3 tương

ứng với 5 nhóm methin của vòng thơm ở C 96,2 (C-6); 95,0 (C-8), 119,5 (C-

6’); 115,4 (C-5’); 114,3 (C-2’), 1 nhóm methylen ở C 27,6 (C-4), 2 nhóm

methin có gắn với oxi ở C 81,7 (C-2); 67,9 (C-3) và 7 cacbon bậc 4.

Hình 3.3. Phổ DEPT của hợp chất catechin (NN1)

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất catechin

C 2 3

*a,c δC 82,3 68,3

Hợp chất NN1 b,d δC 81,7 67,9

4 28,2 27,6

5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 156,9 96,2 157,0 95,4 156,3 100,7 131,6 115,0 145,6 145,7 116,0 119,9

b,e (J, Hz) δH 4,59d (2,0) 4,02 m 2,97 dd (6,0; 16,0) 2,55 dd (8,5; 16,0) - 5,95d (2,0) - 5,96 d (2,0) - - - 6,88 d (2,0) - - 6,83 d (8,2) 6,79 dd (2,0; 8,5)

156,2 96,2 156,1 95,0 155,6 100,1 130,5 114,3 145,0 144,8 115,4 119,5

aĐo trong CD3OD, bđo trong CD3OD+CDCl3,c100 MHz, d125 MHz, e500

MHz *δC của catechin.

Các mảnh cấu trúc này sau đó được kết nối nhờ phân tích phổ HMBC.

Phổ HMBC cho tương tác xa giữa H-8 (H 5,96 ) với C-7 (C 157,5 )/C-6 (C

96,3)/C-9 (C 156,9)/C-10 (C 100,9 ) và tương tác xa giữa H-6 với C-7 (C

157,5 )/C-8 (C 95,5)/C-5 (C 157,8)/C-10 (C 100,9 ) cho phép xác nhận cấu

trúc của vòng A bị thế ở vị trí C-5 và C-7.

Trên phổ HMBC cho thấy tương tác giữa H-3 (H 4,02) với C-2 (C

81,7)/C-1’(C 130,5) và tương tác giữa H-2 (H 4,59) với C-4 (C 27,6)/C-3 (C

67,9)/C-1’ (C 130,5)/C-2’(C 114,3)/C-6’ (C 119,5) cho phép xác định liên kết

giữa C-4/C-3/C-2 thuộc vòng C và liên kết giữa C-1’ của vòng B với C-2 của

vòng C.

Hình 3.4. Phổ HMBC của hợp chất catechin ( NN1)

Hình 3.5. Phổ HSQC của hợp chất catechin ( NN1)

Kết hợp các dữ liệu phổ ESI-MS, 13C-NMR, HSQC, HMBC với tài liệu

tham khảo [28] cho phép kết luận cấu trúc của chất NN1 là catechin.

Hình 3.6. Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC

của hợp chất catechin

3.2. Hợp chất hyperoside (NN2)

Hợp chất hyperoside (NN2) được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng,

đnc: 233-235ºC. Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 465.

Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm OH và nhóm carbonyl ở

3379, 1673, 1617cm1.

Hình 3.7. Phổ ESI-MS của hợp chất hyperoside (NN2)

Phổ 1H-NMR cho tín hiệu của 3 proton vòng thơm tương tác kiểu ABX

ở H 7,86 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2’); 7,60 (1H, dd, J = 1,5; 8,5 Hz, H-6’); 6,88

(1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’) và 2 proton ở vị trí meta ở H 6,42 (1H, d, J = 1,5 Hz,

H-8); 6,23 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6) chứng tỏ vòng B bị thế ở vị trí C-3’ và C-

4’, vòng A bị thế ở vị trí C-5 và C-7. Đồng thời trên phổ 1H-NMR xuất hiện

tín hiệu của 1 proton anome ở δH 5,18 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’’), cấu hình β của

phần đường được xác định nhờ hằng số tương tác lớn (J = 8,0 Hz) của proton

anomeric H-1’’.

Phổ 13C-NMR và DEPT của hyperoside (NN2) cho tín hiệu của 21

nguyên tử cacbon trong đó có 6 cacbon của 1 phân tử đường ở C 105,4 (C-

1’77,2 (C-5’’); 75,1 (C-3’’); 73,2 (C-2’’); 70,0 (C-4’’); 62,0 (C-6’’), 1 nhóm

cacbonyl ở δC 179,6 (C-4), 5 nhóm methin vòng thơm ở C99,9 (C-6); 94,7 (C-

8), 117,8 (C-5’), 116,1 (C-2’), 123,0 (C-6’) và 9 cacbon bậc 4.

Hình 3.8. Phổ 1H-NMRcủa hợp chất hyperoside (NN2)

Hình 3.9. Phổ 13C-NMR của hợp chất hyperoside (NN2)

Hình 3.10. Phổ DEPT của hợp chất hyperoside (NN2)

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất hyperoside

Hợp chấthyperoside (NN2)

C δC

*a,b

δH

a,c(J, Hz)

δC

a,b

Aglycone

2 159,3 158,5 -

3 136.6 135,8 -

4 180,3 179,6 -

5 163,8 163,0 -

6 100,7 99,9 6,23 d (1,5)

7 167,0 166,1 -

8 95,5 94,7 6,42d (1,5)

9 159,6 158,8 -

10 106,4 105,7 -

1’ 123,7 122,9 -

2’ 116,9 116,1 7,86 d (1,5)

Hợp chấthyperoside (NN2)

δH

a,c(J, Hz)

C δC

*a,b

δC

a,b

3’ 146,6 - 145,8

4’ 150,8 - 150,4

6,88 d (8,5) 5’ 118,6 117,8

7,60 dd (1,5; 8,5) 6’ 123,7 123,0

Galactose

106,2 105,4 5,18 d (8,0) 1’’

2’’ 73,9 73,2

3’’ 75,9 75,1

4’’ 70,8 70,4 3,48-3,87 5’’ 78,0 77,2

6’’ 62,8 62,0

aĐo trongCD3OD, b125 MHz, c500 MHz *δC của hyperoside [9]

Từ các dữ kiện phổ trên cho phép dự kiến đây là một hợp chất quercetin

gắn với một đường galactose hoặc glucose. Sau khi so sánh tài liệu tham khảo

[29] cho phép xác định chất NN2 là quercetin-3-O-β-galactoside hay còn gọi là

hyperoside. Hợp chất này cũng được phân lập từ lá Sen của Trung Quốc [30].

Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất hyperoside (NN2)

3.3. Hợp chất quercetin (NN3 - C15H10O7)

Hợp chất NN3 được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng, đnc: 313-

315ºC. Phổ khối ESI-MS của NN3 cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 303

[M+H]+. Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm OH và nhóm

carbonyl ở 3402, 1627 cm1.

Hình 3.12. Phổ ESI-MS của hợp chất quercetin (NN3)

Hình 3.13. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất quercetin (NN3)

Phổ 1H-NMR của hợp chất quercetin (NN3) giống với chất hyperoside

(NN2), cho tín hiệu của 3 proton vòng thơm tương tác kiểu ABX ở H 7,76 (1H,

d, J = 2,0 Hz, H-2’); 7,65 (1H, d, J = 2,0; 8,5 Hz, H-6’); 6,91 (1H, d, J = 8,5

Hz, H-5’) và 2 proton ở vị trí meta ở H 6,41 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); 6,21 (1H,

d, J = 2,0 Hz, H-6). Khác với chất NN2, phổ 1H-NMR của quercetin (NN3)

không thấy tín hiệu của đường galactose.

Từ các dữ kiện phổ ESI-MS, 1H-NMR và so sánh với tài liệu tham khảo

[31] cho phép xác định chất NN3 là quercetin. Hợp chất này cũng được phân

lập từ lá sen của Hàn Quốc [32].

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất quercetin (NN3)

3.4. Hợp chất kaempferol (NN4- C15H10O6)

Hình 3.15. Phổ ESI-MS của hợp chất kaempferol (NN4)

Chất kaempferol (NN4) được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng,

đnc. 276-279oC. Phổ khối ESI-MS của kaempferol (NN4) cho pic ion phân tử

proton hóa ở m/z 287 [M+H]+. Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm

OH và nhóm carbonyl ở 3448, 1659, 1605cm1.

Phổ 1H-NMR của hợp chất kaempferol (NN4) cho tín hiệu của của 2

doublet kép với cường độ cho mỗi tín hiệu là 2H ở 8,11 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-

2’, 6’); 6,92 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-3’,5’) chứng tỏ vị trí C-4’ của vòng B bị thế

và 2 proton ở vị trí meta ở H 6,42 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8); 6,23 (1H, d, J = 1,5

Hz, H-6) chứng tỏ vòng A bị thế ở vị trí C-5 và C-7.

Hình 3.16. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất kaempferol (NN4)

Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của hợp chất kaempferol (NN4)

Phổ 13C-NMR của NN4 cho tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon trong đó

có1 nhóm cacbonyl ở δC 174,4 (C-4), 6 nhóm methin vòng thơm ở δC 99,3 (C-

6); 94,5 (C-8), 116,3 (C-3’, C-5’), 130,7 (C-2’, C-6’) và 8 cacbon bậc 4.

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất kaempferol

Hợp chất kaempferol (NN4)

C δC

*a,b

δH

a,d(J, Hz)

δC

a,c

2 146,3 - 148,1

3 135,2 - 136,2

4 175,2 - 174,4

5 160,4 - 162,5

6 98,4 6,21 d (2,0) 99,3

7 163,7 - 165,6

8 93,8 6,42 d (2,0) 94,5

Hợp chất kaempferol (NN4)

C δC

*a,b

δC

a,c

δH

a,d(J, Hz)

9 156,7 158,3 -

10 103,1 104,6 -

1’ 122,1 123,8

2’ 129,4 130,7 8,11 d (8,0)

3’ 115,3 116,3 6,92 d (8,0)

4’ 158,7 160,6

5’ 115,3 116,3 6,92 d (8,0)

6’ 129,4 130,7 8,11 d (8,0)

aĐo trong CD3OD, b75 MHz, c125 MHz,d500 MHz *δC của kaempferol [9]

Từ các dữ kiện phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR và so sánh với tài liệu

tham khảo [33] cho phép xác định chất NN4 là 1 hợp chất flavonol có tên là

kaempferol.

Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất kaempferol (NN4)

3.5. Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide (NN5- C22H20O13)

Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide (NN5) được phân lập

dưới dạng chất rắn màu vàng. Phổ khối ESI-MS của isorhamnetin-3-O-β-D-

glucuronide (NN5) cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 493 [M+H]+. Trên

phổ IR có các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm OH và nhóm carbonyl ở 3379,

1663cm1.

Hình 3.19. Phổ ESI-MS của hợp chấtisorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide

Giống như chất NN2, phổ 1H-NMR của NN5 cho tín hiệu của 3 proton

vòng thơm tương tác kiểu ABX ở H 7,86 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2’); 7,60 (1H,

dd, J = 1,5; 8,5 Hz, H-6’); 6,88 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’) và 2 proton ở vị trí

meta ở H 6,42 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8); 6,23 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6) chứng

tỏ vòng B bị thế ở vị trí C-3’ và C-4’, vòng A bị thế ở vị trí C-5 và C-7. Ngoài

ra trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 5 nhóm oxymethin của 1 phân tử

đường ở δH 5,24 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’’); 3,77 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-5’’);

3,59 (1H, t, J = 9,5 Hz, H-4’’); 3,54 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-2’’); 3,47 (1H, t, J =

9,0 Hz, H-3’’). Cấu hình β của phần đường được xác định nhờ hằng số tương

tác lớn (J = 8,0 Hz) của proton anomeric H-1’’. Từ các dữ liệu phổ nêu trên cho

phép xác định hợp chất chứa 1 phân tử đường β-glucuronide.

Hình 3.20. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất NN5

Hình 3.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất NN5

Hình 3.22. Phổ DEPT của hợp chất isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide

Phân tích phổ 13C-NMR của isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide

(NN5) cho biết sự có mặt của 22 nguyên tử cacbon trong đó có 2 nhóm cacbonyl

ở δC 179,2 (C-4); 170,7 (C-6’’), 1 nhóm methoxy ở δC 52,8 (OCH3), 5 nhóm

methin vòng thơm ở δC 99,9 (C-6); 94,8 (C-8), 117,3 (C-2’), 115,9 (C-5’), 123,5

(C-6’), 5 nhóm oxymethin và 9 cacbon bậc 4.

Kết hợp các dữ liệu phổESI-MS, 13C-NMR với tài liệu tham khảo [34]

cho phép xác định chất NN5 là isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide.

Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của hợp chất isorhamnetin-3-O-β-D-

glucuronide (NN5- C22H20O13)

3.6. Hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide (NN6)

Hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide (NN6)được phân lập dưới

dạng chất rắn màu vàng.Phổ khối ESI-MS của quercetin-3-O-β-D-

glucuronide (NN6)cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z479 [M+H]+. Trên phổ

IR có các đỉnh hấp thụ mạnhcủa nhóm OH và nhóm carbonyl ở 3404, 1657,

1604cm1.

Hình 3.24. Phổ ESI-MS của hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide

Phổ 1H-NMR của hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuroniderất giống

hợp chất NN5 với tín hiệu của 5 proton vòng thơm trong đó có 1 hệ ABX

ởH 7,87 (1H, br. s, H-2’); 7,52(1H, d, J = 8,0 Hz, H-6’); 6,86 (1H, d, J =

8,0 Hz, H-5’), 2 proton ở vị trí meta ở H 6,42 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8); 6,23

(1H, d, J= 1,5 Hz, H-6), 6,38 (1H, s, H-8); 6,20 (1H, s, H-6) và 5 nhóm

oxymetin của đường glucuronide. Khác với chất NN5, trên phổ 1H-NMR của

NN6 thấy mất đi tín hiệu của 1 nhóm methoxy, cho phép dự đoán đây là hợp

chất quercetin gắn với đường glucuronide. Phổ 13C-NMR hoàn toàn trùng

khớp với dữ liệu phổ của hợp chất quercetin-3-O-β-glucuronide với tín hiệu

của 21 nguyên tử cacbon trong đó có 6 carbon thuộc phần đường glucuronide

và 15 carbon của phần aglycol.

Hình 3.25. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất NN6

Hình 3.26. Phổ 13C-NMR của hợp chất NN6

Bảng 3.4. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất NN6

Hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide (NN6)

C δC

*a,b

δH

a,c(J, Hz)

δC

a,b

Aglycone

2 156,3 158,5 -

3 133,2 135,8 -

4 177,2 179,4 -

5 161,3 162,9 -

6 98,8 99,9 6,23 d (1,5)

7 164,3 166,0 -

8 93,6 94,8 6,42 d (1,5)

9 156,3 159,2 -

10 103,9 105,7 -

1’ 120,6 122,8 -

2’ 115,2 116,1 7,87br. s

3’ 144.9 145,9 -

4’ 148,6 149,9 -

5’ 116,2 117,9 6,86 d (8,0)

6’ 120,9 123,0 7,52 d (8,0)

Glucuronide

1’’ 101,4 104,6 5,30 d (7,5)

2’’ 71,4 75,5

3’’ 73,8 77,9

3,49-3,70 4’’ 75,6 73,2

5’’ 75,6 77,9

6’’ 168,7 171,6

aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz *δCcủa quercetin-3-O-β-glucuronide

Hình 3.27. Cấu trúc hóa học của hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide

Kết hợp các dữ liệu phổ ESI-MS, 13C-NMR, HSQC, HMBC với tài liệu

tham khảo [35] cho phép xác định chất NN6 là quercetin-3-O-β-D-glucuronide.

Như vậy, từ dịch chiết EtOAc của lá sen hồng đã phân lập và xác định

được cấu trúc 6 hợp chất flavonoid, trong đó có 1 hợp chất flavan-3-ollà

catechin (NN1) và5 hợp chất khung flavone làhyperoside (NN2), quercetin

(NN3), kaemferol (NN4), isorhamnetin-3-O-β-glucuronide (NN5), quercetin-

3-O-β-glucuronide (NN6).Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây



về chi Nelumbo, cũng như loài Nelumbo nucifera.

Hình 3.28. Các hợp chất phân lập được từ dịch chiết EtOAc lá sen hồng

Nelumbo nucifera

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Trong quá trình thực hiện luâ ̣n văn này, chúng tôi đã thu đươ ̣c các kết

quả nghiên cứu mớ i như sau:

- Từ dịch chiết EtOAc của lá sen hồng (Nelumbo nucifera),đã phân lập

và xác định được cấu trúc 6 hợp chất flavonoid, trong đó có 1 hợp chất flavan-

3-ollà catechin (NN1- C15H14O6) và5 hợp chất khung flavone là hyperoside

(NN2-C21H20O2), quercetin(NN3- C15H10O7), kaemferol (NN4-C15H10O6),

isorhamnetin-3-O-β-glucuronide (NN5- C22H20O13), quercetin-3-O-β-

glucuronide (NN6- C21H18O13).Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước

đây về chi Nelumbo, cũng như loài Nelumbo nucifera.

- Từ các kết quả thu được như trên, chúng tôi đã gửi đăng1 bài báo trên

tạo chí chuyên ngành của Việt Nam.

Kiến Nghị

- Đánh giá các hoạt tính sinh học của dịch chiết cũng như các hợp chất

phân lập được nhằm nâng cao giá trị sử dụng của loài Sen hồng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Tiến Bân (1997). Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật

hạt kín. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 9.

2. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt nam. Nhà xuất bản y học, 2, trang 683.

3. Liu S, Li D, Huang B, Chen Y, Lu X, Wang Y. (2013) Inhibition of

pancreatic lipase, α-glucosidase, α-amylase, and hypolipidemic effects of

the total flavonoids from Nelumbo nucifera leaves.J Ethnopharmacol

149(1): 263-9

4. Pulok K. Mukherjee, Debajyoti Mukherjee, Amal K. Maji, S. Rai and

Michael Heinrich (2009) The sacred lotus (Nelumbo nucifera) -

phytochemical and therapeutic profile. Journal of Pharmacy and

Pharmacology 61: 407-422.

5. Kashiwada Y. et al. (2005) Anti-HIV benzylisoquinoline alkaloids and

flavonoids from the leaves of Nelumbo nucifera, and structure-activity

correlations with related alkaloids. Bioorg Med Chem 13: 443-448.

6. Ono Y. et al. (2006) Anti-obesity effect of Nelumbo nucifera leaves

extract in mice and rats. J Ethnopharmacol 106: 238-244.

7. Onishi E. et al. (1984) Comparative effects of crude drugs on serum

lipids. Chem Pharm Bull 32: 646-650.

8. Wu MJ. et al. (2003) Antioxidant activity of methanol extract of the lotus

leaf (Nelumbo nucifera Geartn.). Am J Chinese Med 31: 687-698.

9. Da-Bin Lee, Do-Hyung Kim,and Jae-Young Je (2015). Antioxidant and

Cytoprotective Effects of Lotus (Nelumbo nucifera) Leaves Phenolic

Fraction. Prev Nutr Food Sci., 20(1), 22-28.

10. Shoji N. et al. (1987) Asimilobine and liridine, serotonergic receptor

antagonists from Nelumbo nucifera. Nat Prod 50:773-774

11. Anon (1966) The Wealth of India: A Dictionary of Indian Raw Materials

and Industrial Products. New Delhi: Council of Scientific and Industrial

Research (7) 7-9.

12. Sasikumar Dhanarasu and Awdah Al-Hazimi (2013) Phytochemistry,

pharmacological and therapeutic applications of Nelumbo nucifera. Asian

Journal of Phytomedicine and Clinical Research 1(2): 123 - 136.

13. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2001) Cây thuốc và đông vật làm thuốc ở Việt

Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật 2: 721-726.

14. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2001) Cây thuốc và đông vật làm thuốc ở Việt

Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật 1: 771-774.

15. Bộ môn Dược liệu (2004) Bài giảng dược liệu, Trường Đại học Dược Hà

Nội.

16. W. Bors, W. Heller, C. Michel, M. Saran, (1990),Radical chemistry of

flavonoids antioxydant, Antioxydant in therapy and priventive medicine,

Plemum press, New York,,165- 170,.

17. K.E. Heim, A. R. Tagliaferro, D.J. Bobliya, (2002)Flavonoids

antioxidants: Chemistry, metabolism and structure-activity relationships.

The Journal of Nutritional Biochemistry, ,13, 572-584.

18. S. V. Jovanovic, K. S. Steen, Y. Hara, M. G. Simie, (1996)Reduction

potential of flavonoids and model phenolxyl radicals with ring in

flavonoids is responsible for antioxydant activity, Journal of chemical

Society-perkin, , 2 (11), 2497-2504.

19. J. Mann, Secondary metabolism (1992)Clarendon Press.

20. J. Peterson, M. Dwyer, 1998,Flavonoids: Dietary occurrence and

biochemical activity. Nutrition Research, 18, 1995-2018.

21. Markham K. R., Ternai B., 1976, “Carbon-13 NMR studies of flavonoids-

I, Flavones and flavonols”, Tetrahedron, 32(5), 565-569.

22. E.D. Rijke, P. Out, W.A. Niessen, F. Ariese, C. Goojer, U.A.T.

Brinkman, 2006,Analytical separation and detection methods for

flavonoids. Journal of Chromatography A;11(12), 31-63.

23. T. P. Cushnie, A. J. Lamb, 2005, Antimicrobial activity of flavonoids.

International Journal Of Antimicrobial Agents26, 343-356.

24. Wenkert E., Gottlieb H. E. (1977) “Carbon-13 nuclear magnetic

resonance spectroscopy of flavonoid and isoflavonoid compounds”,

Phytochemistry,16(11), 1811-1816.

25. Trần Văn Sung, Trịnh Thị Thủy, Nguyễn Hoàng Anh (2011)Các hợp chất

thiên nhiên từ một số cây cỏ Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo tài nguyên

thiên nhiên và Môi trường Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam.

26. Nguyễn Đình Triệu (2006), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa

học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

27. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng trong hoá

học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội.

28. A.P. Rajput and T.A. Rajput.Isolation of Two Phenolic Compounds from

Ethanol Extract of Leavesof Corchorus

fascicularis Lam.Biotechnology,11, 292-295(2012).

29. Sukito A, Tachibana S.Isolation of hyperoside and isoquercitrin from

Camellia sasanqua as antioxidant agents.Pakistan Journal of Biology

Sciences,17(8), 999-1006(2014).

30. Ming-Zhi Zhu, Wei Wu, Li-Li Jiao, Ping-Fang Yang and Ming-Quan

Guo. Analysis of Flavonoids in Lotus (Nelumbo nucifera) Leaves and

Their Antioxidant Activity Using Macroporous Resin Chromatography

Coupled with LC-MS/MS and Antioxidant Biochemical Assays.

Molecules, 20, 10553-10565 (2015).

31. Selvaraj K., Chowdhury R., Bhattacharjee C. Isolation and structural

elucidation of flavonoids from aquatic fern Azolla microphylla and

evaluation of free radical scavenging activity. International Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5(3), 743-9 (2013).

32. Hyun Ryul Goo, Jae Sue Choi, and Dong Hee Na.Simultaneous

Determination of Quercetin and its Glycosides from the Leaves of

Nelumbo nucifera by Reversed-Phase HighPerformance

Liquid Chromatography.Arch Pharm Res., 32(2), 201-206 (2009).

33. .Xiaoqiang Xu,Xiuhong Gao,Linhong Jin,Pinaki S Bhadury,Kai Yuan,D

eyu Hu,Baoan SongandSong Yang. Antiproliferation and cell apoptosis

inducing bioactivities of constituents from Dysosma versipellis in PC3

and Bcap-37 cell lines.Cell Division,6, 14(2011).

34. SebastianGranica, MonikaE.Czerwińska,Barbara Żyżyńska-

Granica,AnnaK.Kiss.Antioxidant and anti-inﬂammatory ﬂavonol

glucuronides fromPolygonumaviculare L.Fitoterapia,91, 180-188(2013).

35. Ouanissa Smara, Audrey Julia, Cécile Moral-Salmi, Claire Vigor, Joseph

Vercauterenand Belgacem Legseir.Flavonoids from Euphorbia

guyoniana Boissier & Reuter. Journal of Life Sciences, 8(6), 544-

551(2014).

PHỤ LỤC

PL1.Phổ ESI-MS của hợp chất catechin (NN1): C15H14O6

PL2.Phổ IR của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6

PL3. Phổ1H-NMR của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6

PL4.Phổ13C-NMR của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6

PL5.Phổ DEPT của hợp chất catechin (NN1): C15H14O6

PL6.Phổ HSQC của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6

PL7. Phổ HMBC của hợp chất catechin (NN1) : C15H14O6

PL8.PhổESI-MS của hợp chất hyperoside (NN2) : C21H20O2

PL9.Phổ IR của hợp chất hyperoside (NN2) : C21H20O2

PL10. Phổ1H-NMR của hợp chất hyperoside (NN2) : C21H20O2

PL11. Phổ13C-NMR của hợp chất hyperoside (NN2) : C21H20O2

PL12. Phổ DEPT của hợp chất hyperoside (NN2) : C21H20O2

PL13.Phổ ESI-MS của hợp chất quercetin (NN3) : C15H10O7

PL14. Phổ IR của hợp chất quercetin (NN3) : C15H10O7

PL15. Phổ1H-NMR của hợp chất quercetin (NN3) : C15H10O7

PL16.Phổ ESI-MS của hợp chất (NN4) : C15H10O6

PL17.Phổ IR của hợp chất (NN4) : C15H10O6

PL18. Phổ1H-NMR của hợp chất (NN4) : C15H10O6

PL19. Phổ13C-NMR của hợp chất (NN4) : C15H10O6

PL20.Phổ ESI-MS của hợp chất (NN5) : C22H20O13

PL21.Phổ IR của hợp chất (NN5) : C22H20O13

PL22.Phổ1H-NMR của hợp chất (NN5) : C22H20O13

PL23. Phổ13C-NMR của hợp chất (NN5) : C22H20O13

PL24. Phổ DEPTcủa hợp chất (NN5) : C22H20O13

PL25.Phổ ESI-MS của hợp chất NN6

PL26.Phổ IR của hợp chất NN6

PL27.Phổ1H-NMR của hợp chất (NN6) :C21H18O13

PL28. Phổ13C-NMR của hợp chất (NN6) :C21H18O13