ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
PHẠM THỊ THU HẰNG
PHÂN TÍCH CẤU TRÚC
MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT
TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA)
BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
THÁI NGUYÊN - 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
PHẠM THỊ THU HẰNG
PHÂN TÍCH CẤU TRÚC
MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT
TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA)
BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60.44.01.18
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Thu Hà
THÁI NGUYÊN - 2017
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn
GS.TS. Nguyễn Văn Tuyến và TS. Nguyễn Thị Thu Hà đã giao đề tài và tận
tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng – Viện
Hóa học đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành
luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Hóa Học - Trường Đại Học Khoa Học
Thái Nguyên đã trang bị cho em kiến thức để tiếp cận với các vấn đề nghiên
cứu khoa học, và các anh chị, các bạn học viên lớp K9B- lớp Cao học Hóa đã
trao đổi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè và
đồng nghiệp của tôi - những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này.
Ngày tháng năm 2017
Học viên
a
Phạm Thị Thu Hằng
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................a
MỤC LỤC ........................................................................................................ b
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ......................................................... d
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... f
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... g
DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................. h
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Sơ lược về họ Đậu (Fabaceae), Chi Đậu (Vigna) và loài đỗ xanh
(Vigna radiata) .............................................................................................. 3
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học .......................................................................................... 4
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................... 4
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.................................................... 7
1.3. Hợp chất Flavonoid ................................................................................ 8
1.3.1. Phân loại .......................................................................................... 8
1.3.2. Các phương pháp định tính và định lượng.................................... 12
1.3.3. Các phương pháp chiết xuất flavonoid ......................................... 14
1.3.4. Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid .................................... 15
1.4. Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các
hợp chất tự nhiên ......................................................................................... 20
1.4.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-
NMR ........................................................................................................ 20
1.4.2. Phương pháp phổ khối lượng (MS) .............................................. 22
b
1.4.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ................................................ 23
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 25
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 25
2.1.1. Đối tượng ...................................................................................... 25
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................ 25
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ....................................................................... 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 26
2.2.1. Phương pháp xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật........................... 26
2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên ............................... 27
2.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được ........... 28
2.3.1. Hợp chất vitexin (MB1) ................................................................ 28
2.3.2. Hợp chất isovitexin (MB2) ............................................................ 29
2.3.3. Hợp chất luteolin (MB3) ............................................................... 29
2.3.4. Hợp chất Taxifolin (MB4) ............................................................. 30
2.3.5. Hợp chất Catechin (MB5) ............................................................. 30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 32
3.1. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất vitexin (MB1) ...................... 32
3.2. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất isovitexin (MB2) ................. 37
3.3. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất luteolin (MB3) ..................... 40
3.4. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất Taxifolin(MB4) ................... 43
3.5. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất Catechin (MB5) ................... 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 50
1. Kết luận ................................................................................................... 50
2. Kiến nghị ................................................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 51
c
PHỤ LỤC ......................................................................................................... 1
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
Kí hiệu/ Tên tiếng anh Tên tiếng việt Từ viết tắt
1H-NMR
NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
13C-NMR
Nuclear Magnetic Resonance-1H Phổ cộng hưởng từ proton
Nuclear Magnetic Resonance-1H Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C
Enhancement by DEPT Phổ DEPT Distortionles Polarization Transfer
COSY Homonuclear Correlated Spectroscopy Phổ COSY
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác di hạt nhân qua nhiều liên kết
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác trực tiếp H-C
phun ESI-MS Electron Inoniziation-Mass Spectroscopy Phổ khối sương mù điện tử
IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại
MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng
đnc Điểm nóng chảy
TLC Thin LayerChromatography Sắc ký bản lớp mỏng
d
DMSO Dimethyl sulfoxide
Kí hiệu/ Tên tiếng anh Tên tiếng việt Từ viết tắt
EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat
EtOH Ethanol Ethanol
MeOH Methanol Methanol
δH, δC
Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon
ppm Part per million Phần triệu
e
s: singlet dd: doublet of doublets d: doublet dt: doublet of triplets t: triplet dq: doublet of quartets q: quartet
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB1 ............... 34
f
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB2 ................. 39
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cây Đậu xanh (Vigna radiata) ..................................................... 3 Hình 1.2: Một số hợp chất flavonoid phân lập từ hạt Đậu xanh
(Vignaradiata) .............................................................................. 7 Hình 3.1. Phổ ESI-MS của hợp chất MB1 ................................................. 32 Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất MB1 ................................................ 33 Hình 3.3. Phổ DEPT của hợp chất MB1 ..................................................... 33 Hình 3.4. Phổ HSQC của hợp chất MB1 .................................................... 35 Hình 3.5. Phổ HMBC của hợp chất MB1 ................................................... 36 Hình 3.6. Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC
của chất vitexin ........................................................................... 36 Hình 3.7. Phổ ESI-MS của hợp chất MB2 ................................................. 37 Hình 3.8. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB2 ................................ 38 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB2 ............. 39 Hình 3.9. Phổ 13C-NMR của hợp chất MB2 ............................................... 40 Hình 3.10. Công thức cấu tạo của hợp chất isovitexin ................................. 40 Hình 3.11. Phổ ESI-MS của hợp chất MB3 ................................................. 41 Hình 3.12. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB3 ................................ 42 Hình 3.13. Phổ 13C-NMR của hợp chất MB3 ............................................... 42 Hình 3.14. Công thức cấu tạo của hợp chất luteolin ..................................... 43 Hình 3.15. Phổ ESI-MS của hợp chất MB4 ................................................. 43 Hình 3.16. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB4 ................................ 44 Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của hợp chất MB4 ............................................... 45 Hình 3.18. Công thức cấu tạo của hợp chất taxifolin ................................... 45 Hình 3.19. Phổ ESI-MS của hợp chất MB5 ................................................. 46 Hình 3.20. Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất MB5 ................................. 47 Hình 3.21. Phổ DEPT của hợp chất MB5 ..................................................... 47 Hình 3.22. Phổ HMBC của hợp chất MB5 ................................................... 48 Hình 3.23. Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC
của hợp chất catechin .................................................................. 48
Hình 3.24. Các hợp chất phân lập được từ dịch chiết EtOAc vỏ hạt đỗ
g
xanh (Vigna radiata) ................................................................... 49
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ ngâm chiết vỏ hạt đậu xanh (Vigna radiata) .............. 26
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc của vỏ đậu xanh
h
(Vigna radiata) ........................................................................... 28
MỞ ĐẦU
Từ thời xa xưa ông cha ta đã biết sử dụng và bào chế ra những phương
thuốc Y học cổ truyền từ những dược liệu có nguồn gốc tự nhiên. Ngày nay
cùng với sự phát triển của kỹ thuật tiên tiến và hiện đại, nhiều loại thuốc đã
được ra đời. Nhờ sự phát triển của hóa học và dược học, một số hoạt chất có
trong dược liệu thảo mộc được phân lập, tinh chế, xác định cấu trúc hóa học,
tác dụng dược lý và sử dụng dưới dạng tinh khiết. Tuy nhiên, đối với thuốc có
nguồn gốc hóa dược, ngoài những ưu điểm nổi bật như hiệu quả điều trị cao,
dễ sản xuất, dễ sử dụng và bảo quản, thì vấn đề hạn chế lớn nhất cần phải
quan tâm chính là những tác dụng phụ và độc tính kèm theo, đặc biệt trong
trường hợp điều trị lâu dài đối với các bệnh mãn tính. Vì vậy ngày nay người
ta có xu hướng trở về với tự nhiên.
Do Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và
ẩm, được thiên nhiên ưu đãi nên nước ta được xem là mảnh đất màu mỡ cho
sự phát triển của các chủng loại cây cỏ có thảm thực vật phong phú và đa
dạng, với khoảng hơn 14.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó, không ít loại
cây được sử dụng làm thuốc rất hiệu quả, theo nghiên cứu có khoảng gần
4.000 loài được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền. Nước ta có nền Y
học cổ truyền hết sức đa dạng và đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử,
nền y học dân tộc cũng không ngừng phát triển qua các thời kỳ đó. Có những
loại dược liệu thảo mộc hết sức thông dụng trong dân gian, nhưng lại được
các nhà khoa học chứng minh là có tác dụng trị liệu không thua kém gì so với
các loại thuốc tân dược hiện nay. Chính vì thế việc nghiên cứu để khai thác,
kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là
1
vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta.
Cây Đậu xanh (Vigna radiata) là cây thực phẩm quan trọng thứ 3, sau
cây Đậu tương và cây Lạc. Ngày càng nhiều các nghiên cứu khoa học cho
thấy tác dụng tích cực của hạt Đậu xanh đối với sức khỏe con người. Các
nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy các hợp chất chính hạt Đậu xanh
chứa chủ yếu các hợp chất flavonoid, với nhiều hoạt tính sinh học quí như
chống oxy hóa, kháng viêm, chống miễn dịch, chống dị ứng, ngăn ngừa sinh
tổng hợp và hấp thu cholesterol. Do vậy, sự lựa chọn vỏ của hạt đậu xanh làm
đối tượng nghiên cứu của đề tài “PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP
CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA
RADIATA) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI” được đặt
ra với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:
* Mục tiêu nghiên cứu
1. Phân lập được một số hợp flavonoid từ vỏ của hạt đậu xanh (Vigna
radiata).
2. Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp
hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại
IR; phổ khối lượng MS và đo điểm nóng chảy Mp.
* Nội dung nghiên cứu
1. Thu thập mẫu lớn vỏ của hạt đậu xanh (Vigna radiata) để tiến hành
nghiên cứu.
2. Phân lập một số hợp flavonoid từ vỏ của hạt đậu xanh
3. Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp
hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại
2
IR; phổ khối lượng MS và đo điểm nóng chảy Mp.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về họĐậu(Fabaceae),Chi Đậu (Vigna) và loàiđỗ xanh (Vigna
radiata)
Những cây thuộc họ Đậu, chi Đậu thường là những cây bụi, cỏ, đứng
thẳng hay leo trườn. Lá đơn hoặc kép 1 lần lông chim. Đặc trưng bởi hoa rất
không đều (hoa cánh bướm), tràng tiền khai lợp úp; nhị 10, tất cả dính nhau
thành ống hoặc chỉ 9 dính với nhau còn chiếc thứ 10 tự do; noãn cong hình
móng ngựa và có chân ngắn [1]
Loài Đậu xanh hay đỗ xanh có tên khoa học là Vigna radiata, là loại cây
thảo, mọc đứng cao cỡ 50cm. Lá có 3 lá chét, có lông ở cả hai mặt. Chùm hoa ở
nách lá. Hoa màu vàng lục. Quả đậu hình trụ mảnh, có lông, chứa nhiều hạt nhỏ
hình trụ ngắn, gần hình cầu, thường có màu xanh. Hoa tháng 8 - 10; quả tháng 3-
11. Bộ phận thường dùng là hạt, hay còn gọi là Lục dâu đậu xanh [2].
Hình 1.1: Cây Đậu xanh (Vigna radiata)
Nơi sống và thu hái: Cây của vùng nhiệt đới, được trồng rộng rãi ở
đồng bằng và vùng núi. Ở Việt Nam đậu xanh là loại đậu thường được sử
dụng để làm xôi, làm các loại bánh ngọt, bánh đậu xanh, chè, hoặc được ủ cho
3
lên mầm thành giá đỗ để làm thức ăn.
Tính vị, tác dụng: Đậu xanh có thành phần dinh dưỡng cao, hạt chứa
nước 14%; protid 23,4%, lipid 2,4%, glucid 53,10%, cellulose 4,7%. Còn có
các nguyên tố vi lượng Ca, P, Fe và các vitamin (tiền sinh tố A, B1, B2, PP,C).
Còn có phosphatidyl choline, phosphatidylethanolamine, phosphtidylinositol,
phosphatidylserine; phosphatidicacid.
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học
Đậu xanh (Vigna radiata) là cây thực phẩm quan trọng thứ 3, sau cây
Đậu tương và cây Lạc. Ngày càng nhiều các nghiên cứu khoa học cho thấy
tác dụng tích cực của hạt Đậu xanh đối với sức khỏe con người. Cây Đậu
xanh là một vị thuốc quý giá mà thiên nhiên ban tặng và được mệnh danh là
“Thực phẩm của tương lai”.
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Loài đậu xanh (Vigna radiata) có nguồn gốc ở Ấn Độ và Trung Á, từ
đó lan sang nhiều khu vực khác của châu Á và trên thế giới. Cây đậu xanh có
khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thích nghi với các vùng có
điều kiện khắc nghiệt. Ở châu Á cây đậu xanh được trồng nhiều ở các quốc
gia như: Ấn Độ, Pakistan, Bangladesh, Sri Lanka, Nepal, Trung Quốc,
Mianma, Thái Lan, Việt Nam, Campuchia, Lào, Philippines, Malaysia và
Indonesia. Sau này cây đậu xanh còn được trồng ở Trung Phi, các vùng khô
và nóng ở Nam Âu, phía Đông Bắc châu Úc, Nam Mỹ và miền Nam Hoa
Kỳ. Nó được sử dụng như một thành phần trong các món ăn mặn và ngọt.
Trong Đông y, hạt Đậu xanh có vị ngọt, hơi tanh, tính mát, không
độc, có tác dụng điều hòa ngũ tạng, mát gan và buồng mật, bổ nguyên khí,
chữa lở loét, làm sáng mắt. Theo Y học hiện đại, Đậu xanh có thành phần
dinh dưỡng rất cao với nhiều vitamin, acid folic và các khoáng chất, là nguồn
cung cấp chất xơ hòa tan loại bỏ các độc tố trong cơ thể, ngăn ngừa các bệnh
4
ung thư. Trong đậu xanh còn có thành phần hạ mỡ máu hữu hiệu, giúp cho cơ
thể phòng chống chứng xơ cứng động mạch và bệnh cao huyết áp, đồng thời
làm ổn định lượng đường trong máu nên rất tốt cho người bệnh tiểu đường.
Chuyên gia dinh dưỡng tại Đại học Kentucky - Lexington (Mỹ) và là tác giả
của chương trình “Magic Bean” - hạt đậu xanh kỳ diệu, đã thực hiện rất nhiều
nghiên cứu và ghi nhận nếu sử dụng đậu xanh nấu chín mỗi ngày có thể hạ
thấp 20% lượng cholesterol trong 3 tuần, giảm đến 40% nguy cơ mắc bệnh
tim mạch và huyết áp. Các nghiên cứu trong những năm gần đây đã chỉ mầm
hạt đậu xanh có các chất chuyển hóa thứ cấp phong phú hơn và hoạt tính sinh
học đa dạng hơn dạng hạt ban đầu [3].
Nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy hạt và mầm hạt Đậu xanh
chứa chủ yếu các hợp chất flavonoid, với thành phần chủ yếu là vitexin
(apigenin-8-C-β-glucopyranoside) và isovitexin (apigenin-6-C-β-glucopyranoside),
chiếm hàm lượng khoảng 51,1 và 51,7 mg/g; 12 axit phenolic; 21 axit hữu cơ
và 16 chất béo đã được phát hiện bằng phương pháp sắc ký khí/phổ khối
(GC/MS) [4].
Trong các ghi chép cổ, đậu xanh được biết đến với tác dụng giải độc và
thanh lọc cơ thể. Trên mô hình thực nghiệm, các protein, polypeptide,
polysaccharides và polyphenol từ hạt, mầm và vỏ của đậu xanh đều cho thấy
hoạt tính chống oxy hóa tiềm năng. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết
này trên hệ DPPH và 2,2'-azino-di- (3-etyl-2,3-dihydrobenzthiazoline -6-
sulfonate) (ABTS) lần lượt là 11,33 ± 0,24 và 36,65 ± 0,63 mmol/g [5]. Các
nhà khoa học đã chứng minh khả năng bắt giữ gốc tự do của 100 g đậu xanh
tương đương với 36,3 g trà xanh khô và 1462 mg vitamin C. Hoạt chất
Vitexin ức chế khoảng 60% gốc tự do DPPH ở 100 mg/mL và ngăn chặn hiệu
5
quả các tế bào da chết do tia UV gây ra [6].
Trên mô hình tăng lipid máu, thỏ thử nghiệm được cho ăn một hỗn hợp
70% bột đậu xanh và mầm đậu xanh và kết quả làm giảm triệu chứng của
bệnh động mạch vành [7]. Khi nghiên cứu trên chuột khỏe mạnh được ăn dịch
chiết đậu xanh trong 7 ngày, hàm lượng cholesterol tổng số đã giảm đáng kể.
Tác dụng này được cho là do thành phần phytosterol của đậu xanh, chúng có
khả năng ngăn ngừa sinh tổng hợp và hấp thu cholesterol [8].
Ở liều 600 mg peptide/kg thể trọng, sau khi chuột được tiêm dịch chiết
mầm va hạt đậu xanh từ 3-9 giờ đã làm giảm đáng kể huyết áp tâm thu và
duy trì trong thời gian thử nghiệm từ tuần 1-4 [9].
Tác giả Yao Y và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu năm 2008 về tác
dụng điều trị của dịch chiết mầm và vỏ hạt đậu xanh trên 2 loại chuột bị tiểu
đường. Các lô chuột được uống trong 5 tuần với nồng độ dịch chiết mầm đậu
xanh là 2 g/kg và vỏ hạt đậu xanh là 3 g/kg thể trọng. Kết quả cho thấy có sự
giảm lượng glucose, cholesterol tổng số, triglycerides và urê máu, đồng thời
nồng độ của insulin ở cả 2 lô chuột còn cải thiện rõ rệt [10].
Đậu xanh được chứng minh có khả năng chống tăng sinh tế bào qua thử
nghiệm MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide]
trên dòng tế bào ung thư biểu mô (CAL27) và một số dòng tế bào ung thư
khác như DU145, SK-OV-3, MCF-7, và HL-60) [11]. Ở nồng độ 10 mmol/L
và sau 72 giờ, trypsin phân lập từ hạt đậu xanh có khả năng làm giảm xấp xỉ
50% sự di căn và tăng sinh của dòng tế bào ung thư ruột kết (SW480) so với
nhóm đối chứng [12].
Các nhà nghiên cứu đã phân tích tác dụng chống viêm của dịch chiết
cồn hạt đậu xanh bao gồm các polyphenol, acid gallic, vitexin, và isovitexin
trên đại thực bào của chuột. Kết quả hoạt động của các đại thực bào giảm rõ
rệt thông qua việc ngăn ngừa biểu hiện gen gây viêm [13]. Điều này cho thấy
dịch chiết ethanol có tiềm năng rất lớn để cải thiện các triệu chứng lâm sàng
6
của các bệnh liên quan đến viêm, như bệnh dị ứng và bệnh tiểu đường [14]. Ở
nồng độ 20 mg/mL, genistein, acid phytic và acid syringic đã gây phản ứng
miễn dịch, thúc đẩy sản xuất IFN-γ, mở ra nhiều triển vọng trong việc sử
dụng hạt Đậu xanh để điều chế thuốc miễn dịch [15].
Hình 1.2: Một số hợp chất flavonoid phân lập từ hạt Đậu xanh
(Vigna radiata)
Dịch chiết polyphenol từ mầm đậu xanh cũng được chứng minh có hoạt
tính kháng vi khuẩn Helicobacter pylori và chủng loại nấm như Rhizoctonia
solani, Coprinus comatus, Mycosphaerella arachidicola, Botrytis cinerea và
F. oxysporum [16]. Dịch chiết nước từ vỏ đậu xanh thể hiện khả năng kháng
khuẩn trên mô hình in vitro và in vivo [17].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở nước ta, Đậu xanh đã được trồng từ lâu đời ở các vùng đồng bằng,
trung du và miền núi suốt từ Bắc đến Nam. Đậu xanh không chỉ là thực phẩm
7
mà còn được sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Sách "Nam dược thần hiệu" của
danh Y Tuệ Tĩnh viết: “Đậu xanh không độc, thanh nhiệt, có thể làm sạch mát
nước tiểu, chữa lở loét, làm sáng mắt, trị được nhiều bệnh”… Đề cập đến tác
dụng chữa bệnh của đậu xanh, đặc biệt là vấn đề giải độc, sách "Bản thảo
cương mục" của Lý Thời Trân (đời Minh) có ghi nếu ăn uống bị ngộ độc,
buồn bực trong người, có thể dùng đậu xanh để chữa trị. Loại thực phẩm này
có tác dụng giải độc khi uống nhầm thuốc (thủy ngân, thạch tín...); uống thuốc
quá liều (ô đầu, phụ tử…); giải độc do ngộ độc thức ăn, ngộ độc sắn, nấm...
Các nghiên cứu về vỏ hạt đậu xanh ở nước ta cho đến nay cũng không
có nhiều. Năm 1996, nhóm nghiên cứu của Trần Lê Vân Hiền và cộng sự đã
công bố thành phần hóa học của chủ yếu trong vỏ hạt đậu xanh là flavonoid,
chủ yếu là vitexin và isovitexin có tác dụng bảo vệ cơ thể chống phóng xạ,
chống đột biến nhiễm sắc thể, ức chế rõ các phản ứng peroxide hóa trong cơ
thể. Trong một nghiên cứu khác, tác giả Nguyễn Thị Hương cũng đã phân lập
được hai hoạt chất
vitexin và isovitexin từ vỏ của loài đậu này [18].
1.3. Hợp chất Flavonoid [19]
1.3.1. Phân loại
Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực
vật, có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa
(màu vàng trong hoa hòe...).Về cấu trúc hoá học Flavonoid có khung cơ bản
là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon,
cấu trúc có thể là vòng kín hoặc mở.
Trong đa số trường hợp thì mạch 3 cacbon đóng vòng với vòng A và
tạo nên 1 dị vòng có oxy (vòng C). Tuỳ theo vị trí gắn của vòng bezen B vào
8
dị vòng ở C2 hoặc C3, ta có các hợp chất Flavonoid có nhân Flavan hay
Isoflavan. Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxyl tự do hoặc đã
thay thế một phần, vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính axit.
Trong thực vật, Flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do
(aglycol) và dạng liên kết với glucid (glycozit). Trong đó, dạng aglycol
thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như
không tan trong nước, còn dạng glycozit thì tan trong nước nhưng không tan
trong các dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform.
Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6 đều có 2 vòng thơm. Tuỳ thuộc vào
cấu tạo của mạch C trong bộ khung C6C3C6, flavonoid được phân thành các
nhóm sau:
Eucoflavonoid: Flavon, flavonol, flavanon, flavanol, chalcon,
antocyanin, anthocyanidin.
Isoflavonoid: isolavon, isoflavanon, rotenoid.
Neoflavonoid: calophylloid.
Biflavonoid và triflavonoid.
1.3.1.1. Eucoflavonoid
Eucoflavonoid bao gồm các nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol,
flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, flavanon, 3-hydroxy flavanon, flavon, flavonol,
9
dihydrochalcon, chalcon, auron.
1.3.1.2. Isoflavonoid
Isoflavonoid bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3-ene,
isoflavan-4-ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-
arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon,
homo-isoflavon.
Isoflavonoids tất cả không có màu sắc. Nó được tạo thành từ axetat
theo cơ chế đóng vòng với phenylalamine, cinnamate dẫn xuất được sát nhập
10
vào vòng B và C-2,3, và-4 của dị vòng.
1.3.1.3. Neoflavonoid
Neoflavonoid chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật.
4-arylchroman
Ví dụ chất brasilin có trong cây tô mộc - Caesalpinia sappan
4-aryl coumarin
Ví dụ calophyllolid trong cây mù u - Calophyllum inophyllum.
1.3.1.4. Biflavonoid và triflavonoid
Những flavonoid dimer và trimer đã có nói đến trong phần flavan-3-ol
và flavan 3,4 diol. Những hợp chất đó được gọi là proanthocyanidin. Ở đây là
những biflavonoid tạo thành từ flavon, flavanon, dihydroflavonol, chalcon,
dihydro chalcon, auron, isoflavon. Biflavon cấu trúc gồm 2 đơn vị flavon
được biết trước tiên. Chất điển hình là amentoflavon tạo thành từ 2 phân tử
11
apigenin nối theo dây nối cacbon-cacbon ở vị trí 3', 8''.
1.3.2. Các phương pháp định tính và định lượng
1.3.2.1. Định tính
Một số phản ứng định tính (chủ yếu với nhóm euflavonoid)
- Tác dụng của FeCl3: Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng vị
trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu.
- Tác dụng của kiềm. Nếu hơ một tổ chức thực vật như cánh hoa, nhát
cắt của gỗ hoặc tờ giấy thấm có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ ammoniac thì có
màu vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid.
Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương.
Chalcon và auron có thể cho màu đỏ da cam. Một số nhóm khác như flavan-
3-ol, flavanon, Error! Hyperlink reference not valid.màu không thay đổi. Tuy
nhiên nếu thực hiện trong ống nghiệm với dung dịch alkali thì một số dẫn chất
flavan-3-ol lại cho màu vì dễ bị oxy hoá, còn flavanon dễ bị isomer hoá thành
chalcon nên nếu để một lúc lại cho màu vàng đậm đến đỏ.
- Tác dụng của H2SO4 đậm đặc: Axit H2SO4 khi nhỏ lên các dẫn chất
flavon, flavonol thì cho màu vàng đậm. Đối với chalcon và auron cho màu đỏ,
đỏ thắm, đỏ tươi. Error! Hyperlink reference not valid.cho màu đỏ cam rồi đỏ
thắm, có thể do chuyển flavanon thành chalcon.
- Phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater)
Đây là phản ứng khử hay được sử dụng nhất để tìm sự có mặt của các
dẫn chất nhóm flavonoid. Dung dịch flavonoid trong ethanol, thêm bột Mg rồi
nhỏ từ từ HCl đậm đặc. Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẩm hoặc đỏ
tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon. Màu sắc đôi khi
có thể bị thay đổi tùy theo loại, số lượng, vị trí nhóm thế ví dụ các dẫn chất
methoxy flavon (Tangeretin, Nobiletin) thì âm tính. Để phân biệt giữa
flavonoid glycosid và aglycon của chúng, Bryant đem lắc dung dịch có màu
với octanol, nếu màu ở lớp dưới lên hết ở lớp octanol, chất thử là aglycon,
12
nếu lớp octanol không màu, chất thử là glycosid.
- Tác dụng của chì acetat trung tính hoặc kiềm
Phản ứng thực hiện trên giấy thấm. Nhiều dẫn chất flavonoid tạo thành
muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịch chì acetat trung tính hoặc
kiềm. Màu phụ thuộc vào các dẫn chất flavonoid. Nếu tiến hành trong ống
nghiệm, chì acetat kièm cho tủa màu với hầu hết các flavonoid phenol còn chì
acetat trung tính tạo tủa với những dẫn chất có nhóm dihydroxyphenol.
- Phản ứng ghép đôi với muối diazoni
Các dẫn chất flavonoid có nhóm OH ở vị trí 7 có thể phản ứng với
muối diazoni để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ.
1.3.2.2. Định lượng
Tuỳ vào từng loại Flavonoid mà ta có phương pháp định lượng cụ thể
khác nhau.
Flavon hoặc flavonol
+ Phương pháp cân: ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavon hoặc
flavonol và dịch chất ít tạp chất.
+ Đo màu: bằng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối
diazoni, tạo phức màu với AlCl3, Muối titan, chrom…
+ Phương pháp đo phổ tử ngoại.
Chalcon
Phương pháp phân tích HPLC (sắc kí lỏng cao áp). Với pha động
là dung dịch acetonitrile và acid H3PO4 1% (phương pháp chuẩn trong
13
phân tích).
Phương pháp so màu: có nhiều phương pháp so màu khác.
Ciocalteu: (hỗn hợp muối phức Phương pháp Folin
polyphosphotungstate- molydate).
+ Rất nhạy đối với chất khử, trong môi trường kiềm nhẹ thì sẽ bị khử
thành sản phẩm phức molydenium tungsten có màu xanh.
+ Sau đó đem đo độ hấp thu A (chalcon chỉ hấp thu mạnh ở 400 nm).
Phương pháp Prussian Blue:
+ Hỗn hợp thuốc thử là FeCl3 và K3Fe(CN) 6 bị khử bởi các hợp chất
phenol và tạo thành phức ferric (III) hexacyanoferrate (II) có màu xanh.
+ Để yên dung dịch trong 15 phút, sau đó đem đo độ hấp thu A.
Phương pháp Diazotized
+ Dựa vào khả năng phản ứng ghép đôi với hợp chất diazo trong môi
trường acid tạo thành hợp chất có màu vàng đặc trưng.
+ Lắc đều, để yên dung dịch trong 1 giờ, sau đó đem đo độ hấp thu.
HCl: Tạo thành hợp chất có màu đỏ: Phương pháp Vanillin
1.3.3. Các phương pháp chiết xuất flavonoid
Không có phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng
rất khác nhau về độ tan trong nước và các dung môi hữu cơ. Các flavonoid
glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon
dễ tan trong dung môi kém phân cực. Các dẫn chất flavon, flavonol có OH tự
do ở vị trí 7 hòa tan được trong dung dịch kiềm loãng, dựa vào đó để chiết.
Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các chất
thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hay
etanol. Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần lớn các
flavonoid.
Đôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì để kết
tủa.sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid thì
14
flavonoid được giải phóng. Để phân lập từng chất flavonoid người ta áp dụng
phương pháp sắc ký cột.chất hấp phụ thông dụng nhất là polyamid. Có thể
dùng celluose, silicagel. Silicagel dùng để tách các chất flavanon, isoflavon,
flavonol. Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần .
1.3.4. Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid
1.3.4.1. Hoạt tính chống oxy hóa [20-22]
Quá trình oxi hóa khử là quá trình quan trọng và phổ biến trong mọi cơ
thể sống. Bình thường, các gốc tự do được tạo ra trong cơ thể để chống lại một
số các loại virut và vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên khi ở hàm lượng cao, các gốc
tự do này phản ứng với protein, lipit, ADN là nguyên nhân làm tăng tốc độ quá
trình lão hóa cơ thể con người và là một trong các nguyên nhân của hơn 60
bệnh thường gặp: ung thư, các bệnh tim mạch như cao huyết áp, xơ vữa động
mạch, nhồi máu cơ tim, mất trí nhớ tuổi già và nhất là quá trình lão hóa cơ thể.
Vì vậy, việc đưa các chất chống oxy hoá như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế
bào thì có thể ngăn ngừa hoặc hỗ trợ điều trị các loại bệnh này.
Flavonoid có hai tính chất quan trọng là bẫy gốc tự do và khả năng tạo
phức với kim loại. Cả hai chức năng kể trên đều có tính chất chống oxy hóa
bằng cách cho electron và bẻ gãy chuỗi phản ứng tạo gốc tự do. Cơ sở sinh
hóa quan trọng nhất để flavonoid thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa của
chúng là khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi các
gốc tự do hoạt động. Bên cạnh đó flavonoid có khả năng tạo phức với các ion
kim loại chuyển tiếp như Fe+2, Cu+2… để chúng không thể xúc tác cho phản
ứng Fenton sinh ra các gốc hoạt động nên có tác dụng như những chất xúc tác
ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Các flavonoid có các nhóm hydroxyl ở vị trí
3, 5, 3', 4' có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại tạo phức oxycromon,
oxycacbonyl hoặc 3', 4' orthodioxyphenol.
Khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do của một số
flavonoid theo thứ tự: myricetin > quercetin > rhammetin > morin >
diosmetin > naringenin > apigenin > catechin > 5,7 dihydroxy-3', 4', 5'
15
trimethoxy flavon > robinin > kaempferol > flavon.
1.3.4.2. Tác dụng đối với các bệnh về tim mạch [22-24]
Các flavonoid như catechin và leucoanthocyan rồi đến flavonol,
flavanon và một số chalcon… có thể có tác dụng làm bền thành mạch, làm
tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch, chủ yếu là do khả năng
điều hòa, làm giảm sức thấm vào mao mạch, có tác dụng dự phòng vỡ mao
mạch, gây xuất huyết, gây phù thũng máu.
Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch,
tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, các bệnh trong nhãn khoa như sung
huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc. Các dẫn chất anthocyanoside có tác
dụng tái tạo tế bào võng mạc và có tác dụng tăng thị lực.
Trên hệ tim mạch, nhiều Flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn
hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể
tích phút của tim.... Các flavonoid có tác dụng củng cố, nâng cao sức chống
đỡ và hạ thấp tính thẩm thấu các hồng huyết cầu qua thành mạch thông qua
tác dụng lên các cấu trúc màng tế bào của nó, ứng dụng vào điều trị các rối
loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch.
Các chất kaempferol, quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần
hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những người
có biểu hiện rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung,
hay cáu gắt…
1.3.4.3. Tác dụng đối với enzym [22-24]
Các flavonoid có khả năng tác động đến hoạt động của nhiều hệ
enzym trong cơ thể. Khả năng tương tác với protein là một trong những
tính chất quan trọng nhất của các hợp chất flavonoid, quyết định hoạt tính
sinh học của chúng. Phản ứng xảy ra giữa nhóm oxyphenolic và
oxycacbonyl của các nhóm peptit để tạo thành liên kết hydro. Tính bền
vững của liên kết phụ thuộc vào số lượng và vị trí các nhóm hydroxyl và
16
kích thước phân tử của hợp chất phenol.
Tuy nhiên, có một số tác giả cho rằng giữa phenol và nhóm amin của
protein không có vai trò chính trong việc làm thay đổi hoạt tính enzym, họ đã
nghiên cứu quá trình tiếp nhận một số chất polyphenol vào ty thể của gan
chuột và kết luận rằng: sự liên kết của các polyphenol với các protein thường
kèm theo những thay đổi cấu hình của phân tử protein enzym, bởi vậy một số
polyphenol có hiệu ứng dị lập thể (chất điều hòa dị lập thể) đối với nhiều
enzym trong tế bào động thực vật.
Flavonoid có tác dụng trên nhiều enzym động vật như: protein-tyrozin
kinaza, protein kinaza, lipooxygenaza, cyclooxygenaza, phospholypaza ADN
topoizomeraza, glutathion S transferaza, aldoz reductaza, monoamin oxydaza,
pyruvat kinaza, aldehyd và alcohol dehydrogenaza, amylaza, ARN polymeraza,
AND polymeaza, AND ligaza-I ở người, ribonucleaza, hệ cytocrom P450,
elastaza, nitric oxide syntaza, oxydoreductase, peroxydase, caspase…
Bản thân các chất flavonoid khi ở trong cơ thể sống có thể tồn tại ở
dạng oxy hóa hoặc khử và chịu nhiều biến đổi phức tạp khác nhau cho nên có
thể trong các điều kiện khác nhau nó sẽ thể hiện hoạt tính sinh học khác nhau
như kìm hãm hoặc kích thích hoạt động enzym hoặc kích thích có mức độ và
có điều kiện. Ví dụ như flavonoid có khả năng:
- Làm tăng hoạt tính prolin hydroxylase, là một enzym quan trọng trong
quá trình làm lành vết thương và tạo sẹo.
- Kìm hãm các enzym lypoxygenase và enzym tổng hợp prostaglandin,
chất chuyển các dạng acid béo không no về các dạng dẫn xuất chứa oxy trong
đó phải kể đến luteolin và 3', 4' dihydroxyflavon là các flavonoid có hoạt tính
mạnh đối với cả hai loại enzym này, ở nồng độ 2×10-5M, chúng kìm hãm 50%
họat tính lypoxygenaza.
Nhờ tác dụng sinh học đối với enzym mà các flavonoid có khả năng ức
chế sự phát triển của tế bào ung thư, mau chóng làm lành vết thương, giảm
17
các nguy cơ về bệnh tim mạch.
1.3.4.4. Hoạt tính kháng khuẩn [25-26]
Gần đây, các hợp chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc thảo mộc
đang là đối tượng quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Tác dụng
kháng khuẩn của flavonoid đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế
giới chứng minh.
Về tác dụng kháng khuẩn một số tác giả nghiên cứu tác dụng của
anthocyanin, leucoanthocyanin và acid phenolic lên vi khuẩn Salmonella và
thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt. Hầu hết các chất này có khả năng kìm hãm
sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza.
Các nghiên cứu về cơ chế tác dụng kháng vi sinh của flavonoid còn rất
ít và có thể theo một giả thiết sau:
- Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit (yếu tố đảm bảo
cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc) không tổng hợp được.
- Gắn lên màng nguyên sinh chất của vi khuẩn, làm thay đổi tính thẩm
thấu chọn lọc của màng nguyên sinh chất. Vì vậy, làm một số chất cần thiết
cho đời sống vi khuẩn như nucleotit, pyrimidin, purin lọt qua màng nguyên
sinh chất ra ngoài.
- Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo hai kiểu:
phong tỏa mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong tỏa transferaza chuyển
acid amin từ ARN vào mạch làm mạch không kéo dài thêm được hoặc tạo ra
protein bất thường không có tác dụng đối với đời sống của vi khuẩn, làm
chúng không sử dụng được.
- Ức chế tổng hợp acid nucleic
18
- Tác dụng vào ADN khuôn, ức chế tổng hợp ARN của vi khuẩn.
1.3.4.5. Hoạt tính kháng viêm [27-28]
Flavonoid đã được nghiên cứu và chứng minh có tác động kháng viêm
theo nhiều cơ chế khác nhau. Về hoạt tính kháng viêm của flavonoid, rất nhiều
công trình nghiên cứu đã được công bố và đã chứng minh sự liên quan giữa khả
năng chống oxy hóa với khả năng ức chế enzym cyclo-oxygenase và enzym 5-
lipooxygenase trong hoạt tính kháng viêm.
Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavon,
flavanon, dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcon, isoflavon,
biflavon, 4-aryl coumarin, 4-aryl chroman đều được chứng minh bằng thực
nghiệm là do các chất này ức chế con đường sinh tổng hợp prostagladin. Các
prostaglandin được tổng hợp và sử dụng ngay tại các mô với nồng độ rất thấp
chỉ khoảng vài nanogam/gam. Chúng có mặt ở khắp nơi trong cơ thể, phạm vi
tác dụng sinh lý rất rộng lớn nên còn được gọi là hormon tổ chức. Một số
prostaglandin gây viêm và gây đau, prostaglandin còn làm tăng cảm thụ của
thụ cảm thể với các chất gây đau như bradykinin.
Hiện nay các flavonoid được nghiên cứu có tác dụng tốt đa phần là các
flavonoid thiên nhiên như kaempferol, quercetin, catechin, chrysin… Theo các
nghiên cứu, tác dụng sinh học của chúng nhờ vào sự có mặt của nhiều nhóm
hydroxyl phenol. Tuy nhiên, các nhóm hydroxyl tự do này cũng là nguyên
nhân làm tăng sự phân cực, hấp thu kém nên tác động in vivo thường không
tốt như trong in vitro.
1.3.4.6. Hoạt tính kháng ung thư [29]
Việc tìm kiếm các thuốc chữa ung thư từ thực vật là hướng đi của thời
đại, được khoa học đặc biệt quan tâm. Trong vài thập kỷ gần đây, nhiều loại
thuốc đã được ra đời phục vụ y học song vấn đề tìm ra các loại thuốc có hiệu
19
lực chữa trị ung thư vẫn còn là câu hỏi lớn đối với các nhà khoa học. Trong
các hướng nghiên cứu nhằm tìm ra các hoạt chất có khả nǎng chống ung thư,
flavonoid là một trong những lớp chất được quan tâm bởi chúng là những chất
có hoạt tính chống oxy hóa cao, tác dụng đến nhiều hệ enzym và ít độc đối
với cơ thể sống. Khi đưa vào cơ thể sống, flavonoid có thể tác động lên các
biến đổi sinh hóa học bằng cách trực tiếp hay gián tiếp như thông qua hoạt
động của các enzym hay hệ thống thần kinh, nội tiết... Các kết quả thực
nghiệm cho thấy một số flavonoid có tác dụng chống ung thư thông qua khả
năng hoạt hoá các enzym trong gan có nhiệm vụ chuyển hoá các chất gây ung
thư. Những sản phẩm chuyển hoá thường có tính gây ung thư thấp hơn. Ngoài
ra, các flavonoid còn tham gia trong việc phòng chống ung thư bằng khả năng
chống oxy hoá, loại trừ các gốc tự do có thể gây tổn hại tế bào, chống lại quá
trình sao chép, chống sự tân sinh mạch máu.
1.4. Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các
hợp chất tự nhiên [30-31]
1.4.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN)là phương pháp vật lý hiện đại
nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến được sử
dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có
momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có
thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là spin hạt
nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 .
Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt
nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho
các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt
20
nhân 1H thì:
Trong đó:νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Trong đó:νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân
mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao
quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C
trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến
chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học
của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu
hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn.
Dựa vào độ chuyển dịch hóa học ta biết được loại proton nào có mặt
trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên
mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12
ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm.
Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân
không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân
phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách
tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có
từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J
phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên
kết ngăn giữa các tương tác.
Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa
các hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có
21
thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau.
1.4.2. Phương pháp phổ khối lượng (MS)
Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử
trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e. Sau
đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng. Dựa
vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất
nghiên cứu.
Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng
electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá
nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng eclectron có năng lượng cao để bắn
phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất. Khi bắn phá các phân tử
hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương
hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc. Sự hình thành các ion mang điện tích
+1 chiếm hơn 95%, còn lại là các ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-).
Năng lượng bắn phá các phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhưng với
năng lượng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+),
hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta
thường thực hiện bắn phá các phân tử ở mức năng lượng 70 eV. Sự phá vỡ
này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá.
Quá trình này gọi là quá trình ion hóa. Các ion ion dương hình thành đều có
khối lượng m và mang điện tích e, tỉ số m/e được gọi là số khối z. Bằng cách
nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác
suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có
mặt (hay cường độ I) và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng
Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng
phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định
22
được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những
thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần
nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau.
1.4.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho
nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất.
Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bước
sóng khoảng 10-4 đến 10-6 m. Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến.
Phần của vùng hồng ngoại được sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm
trong giữa 2,5x10-4 và 16x10-6 m. Đại lượng được sử dụng nhiều trong phổ
hồng ngoại là số sóng (cm-1), ưu điểm của việc dùng số sóng là là chúng tỷ lệ
thuận với năng lượng.
Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng
ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao
động cao hơn. Có 2 lại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị
và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết,
dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết.
Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng
ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng
với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định,
Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc
trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân
tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của
các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân
ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn
23
chứng cho hai hợp chất giống nhau.
Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được
chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng. Các
pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì
vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O,
C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức
tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định
nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến
24
hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay .
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng
Vỏ hạt đậu xanh (Vigna radiata) được thu hái tại Hà Nội vào tháng 3
năm 2016. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng Hóa sinh ứng dụng, viện
Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2. Hóa chất
- Các dung môi: n-hexane,dichloromethane, ethylacetate, acetone,
methanol.
- Sắc ký lớp mỏng (TCL) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn
Silica gel
60 Merck F254 có độ dày 0,25 mm. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử
ngoại
ở 2 bước sóng λ= 254 nm và 365 nm.
- Sắc ký cột (CC) sử dụng Silica gel Merck cỡ hạt 40-60 µm.
- Sắc ký cột (CC) với pha tĩnh là Sephadex LH-20.
- Thuốc hiện trong phân tích TLC: FeCl3, Ceri sulfat, Vanilin/ H2SO4 đặc.
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu
- Điểm nóng chảy được đo trên máy HMK 70/3159.
- Phổ hồng ngoại được ghi trên máy FTIR Impact-410.
- Phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy sắc ký lỏng
ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC/MSD Agilen series 1100), sử dụng mode
ESI và đầu dò DAD.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker
25
Avance 500 MHz với TMS là chất chuẩn nội.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật
Vỏ hạt đậu xanh (7 kg) phơi trong bóng mát cho khô tự nhiên. Mẫu
được ngâm chiết với cồn 70% bằng siêu âm trong 30 phút ở 40oC/3 lần, lọc
lấy phần dịch và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn EtOH
tổng. Cặn EtOH tổng được phân bố lại trong hỗn hợp cồn nước, sau đó
chiếtvới dung môi n-hexan/2 lần, thu phần dịch n-hexan để cất loại dung môi
thu được cặn n-hexan (120 g). Tiếp theo, axit hóa phần cồn nước bằng axit
HCl và chiết với ethyl acetat 4 lần, thu lấy phần dịch EtOAc, cất loại dung
môi thu được cặn etyl acetat (680 g). Loại bỏ nước ở phần dịch còn lại thu
được cặn nước (800 g).
Quá trình ngâm chiết vỏ hạt đậu xanh được trình bày trong Sơ đồ 2.1
26
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ ngâm chiết vỏ hạt đậu xanh (Vigna radiata)
2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên
Cặn chiết ethyl acetat vỏ hạt đậu xanh(100 g) được phân tách sơ bộ
trên cột silicagel (150 g) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/EtOAc
gradient rồi đến hệ EtOAc/MeOH gradient, thu được 19 phân đoạn ký hiệu
từ F1 đến F19.
Từ phân đoạn F5 (3 g) được rửa giải trên cột Sephadex LH-20 với dung
môi MeOH thu được 6 phân đoạn nhỏ từ F5.1 - F5.6. Kết tinh phân đoạn F5.2
trong hỗn hợp dung môi n-hexan/EtOAc (8/2) thu được chất MB3 (12 mg)
dưới dạng tinh thể màu vàng. Phân đoạn F7 (20 g) được phân tách trên cột
sillicagel với hệ dung môi n-hexan /EtOAc gradient, thu được 12 phân đoạn
nhỏ kí hiệu từ F7.1-F7.12. Từ phân đoạn F7.3 (80 mg), phân tách trên cột
Sephadex LH-20 dung môi MeOH thu được 4 phân đoạn nhỏ F7.3.1- F7.3.4.
Phân đoạn nhỏ F7.3.1 được tinh chế bằng sắc ký bản mỏng điều chế với hệ
dung môi n-Hexan/EtOAc (3/7) thu được chất rắn màu vàng ký hiệu MB4
(10 mg). Phân đoạn F10 (34 g) được phân tách trên cột sillica gel
CH2Cl2/MeOH gradient, thu được 15 phân đoạn nhỏ kí hiệu từ F10.1-F10.15.
Tinh chế phân đoạn F10.3 trên cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH thu
được chất MB5 (5mg). Phân đoạn F16 (26g) được phân tách trên cột sillica
gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient được 10 phân đoạn nhỏ F16.1-
F16.10. Từ phân đoạn F16.5 (140 mg) tinh chế trên cột Sephadex LH-20 và
sắc ký bản mỏng điều chế thu 3 phân đoạn kí hiệu từ F16.5.1-F16.5.3. ĐCBM
phân đoạn F16.5.2 với hệ dung môi EtOAc/MeOH (9/1) thu được chất MB2
(7 mg) và MB1 (10 mg).
Quá trình phân lập các chất từ cặn EtOAc của vỏ hạt đậu xanh được
27
trình bày trong Sơ đồ 2.2.
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc của vỏ đậu xanh
(Vigna radiata)
2.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được
2.3.1. Hợp chất vitexin (MB1)
28
Chất rắn màu vàng, đnc: 247-249ºC
ESI-MS: m/z 433[M+H]+
FT-IR (KBr)ν max (cm -1):3410, 2924, 1656, 1566, 1415, 1384, 1264,
1179, 1091, 832, 654.
Phổ 1H-NMR và 13C-NMR xem Bảng 3.1
2.3.2. Hợp chất isovitexin (MB2)
Chất rắn màu vàng, đnc: 220-221ºC
ESI-MS: m/z 433 [M+H]+
FT-IR (KBr)ν max (cm -1):3408, 1660, 1623, 1499, 1455, 1359, 1116,
813, 639, 617
Phổ 1H-NMR và 13C-NMR xem Bảng 3.2
2.3.3.Hợp chất luteolin (MB3)
Chất rắn màu vàng, đnc: 330-336ºC
ESI-MS: m/z287 [M+H]+.
FT-IR (KBr)ν max (cm -1):3407, 1655, 1609, 1504, 1361, 1262, 1216,
1171, 1120, 1017, 975, 831, 805, 639
1H-NMR: (CD3OD, 500 MHz) (ppm) 7,40(2H, m, H-2’, 6’);
6,82(1H, d, J =7,5 Hz, H-5’); 6,56(1H, s, H-3); 6,46 (1H, brs, H-8); 6,23
29
(1H, br s, H-6).
13C-NMR: (CD3OD, 125 MHz) (ppm) 183,9 (C-4); 166,4 (C-7);
166,0 (C-2); 163,2 (C-9); 159,4 (C-5); 151,0 (C-4’); 147,0 (C-3’); 123,7 (C-
1’); 120,3 (C-6’); 116,8 (C-5’); 114,2 (C-2’); 105,3 (C-10); 103,9 (C-3);
100,1 (C-6); 95,0 (C-8).
2.3.4.Hợp chất Taxifolin (MB4)
Chất rắn màu vàng nhạt, đnc: 222-224 °C
ESI-MS:m/z305 [M+H]+
FT-IR (KBr)ν max (cm -1):3406, 1639, 1610, 1462, 1382, 1280, 1167,
1080, 995, 807, 781
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH (ppm) 6,99 (1H, br s, H-2’); 6,87
(1H, br d, J = 8,5 Hz, H-6’); 6,82 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 5,93 (1H, d, J =
1,5 Hz, H-8); 5,90 (1H, br s, H-6); 4,92 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-3); 4,51 (1H,
d, J = 11,5 Hz, H-2).
13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC (ppm) 198,2 (C-4); 169,5 (C-7);
165,3 (C-5); 164,5 (C-9); 147,1 (C-4’); 146,3 (C-3’); 129,9 (C-1’); 120,9 (C-
2’); 116,1 (C-6’); 115,9 (C-5’); 101,6 (C-10); 97,5 (C-6); 96,5 (C-8); 85,1 (C-
2); 73,6 (C-3).
30
2.3.5.Hợp chất Catechin (MB5)
Chất rắn màu vàng nhạt, đnc:175-177 °C
ESI-MS: m/z 291[M+H]+
FT-IR (KBr)ν max (cm -1):3387, 1611, 1520, 1455, 1373, 1285, 1252,
1143, 1105, 1032, 868, 819
1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) (ppm): 6,86 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-2’);
6,79 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’); 6,74 (1H, br d, J = 8,0 Hz, H-6’); 5,96 (1H, d,
J = 2,0 Hz, H-8); 5,88 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 4,59 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2);
4,00 (1H, m, H-3); 2,87 (1H, dd, J = 5,0; 16,5Hz, H-4α); 2,53 (1H, dd, J =
8,5; 16,5 Hz, H-4b).
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (ppm) 157, 8 (C-5); 157,5 (C-7);
156,9 (C-9); 146,2 (C-3’); 146,2 (C-4’); 132,2 (C-1’); 120,1 (C-6’); 116,1 (C-
5’); 115,3 (C-2’); 100,9 (C-4a); 96,3 (C-6); 95,5 (C-8); 82,8 (C-2); 68,8 (C-3);
31
28,5 (C-4).
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Từ cặn chiết EtOAc của vỏ hạt đậu xanh, bằng các phương pháp sắc ký
và kết tinh phân đoạn đã phân lập được 5 hợp chất ký hiệu từMB1 đến MB5.
Cấu trúc hóa học của các hợp chất này đã được xác định nhờ phân tích
các dữ liệu phổ bao gồm phổ IR, MS, 1D và 2D NMR, đồng thời so sánh với
các tài liệu đã công bố trước đây đối với các hợp chất đã biết. Việc xác định
cấu trúc của các hợp chất được trình bày dưới đây:
3.1. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất vitexin (MB1)
Hợp chất MB1được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng nhạt, đnc: 247-249ºC. Phổ khối ESI-MScho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 433 [M+H]+.Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm OH và nhóm
carbonyl ở 3410, 1656, 1566cm1.
Hình 3.1. Phổ ESI-MS của hợp chất MB1
Trên phổ 1H-NMR cho tín hiệu của 4 proton dạng AA’BB’ ở H 8,01
(2H, d, J = 8,0 Hz, H-2’, H-6’); 6,89 (2H, dd, J = 8,0 Hz, H-3’, 5’) chứng tỏ
vị trí C-4’ của vòng B bị thế. Ngoài ra, tín hiệu của 2 proton vòng thơm dưới
dạng singlet ở H 6,75 (1H, s, H-3); 6,24 (1H, s, H-6) và 1 proton anomeric ở
32
H 4,71 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-1’) cũng được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR.
Tất cả các dữ liệu phổ trên gợi ý đây là một hợp chất flavone gắn với 1 phân
tử đường glucose tại C8. Hằng số tương tác lớn (J = 9,0 Hz) của proton
anomeric H-1’’ cho phép xác định cấu hình β của phần đường glucose.Tín
hiệu của OH ở H 13,15 đặc trưng cho liên kết cầu hydro nội phân tử ở vị trí C-5 cũng được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR.
Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất MB1
Trên phổ 13C-NMR và phổ DEPT của MB1 cho biết sự có mặt của 21 nguyên tử cacbon trong đó 15 cacbon sp2 và 6 cacbon sp3 tương ứng với 1
nhóm carbonyl ở C 182,1 (C-4), 6 nhóm methin vòng thơm ở C 102,4 (C-
3);98,4 (C-6), 129,7 (C-2’, C-6’); 115,9 (C-3’, C-5’), 1 nhóm methylen ở
C61,4 (C-6’’), 5 nhóm oxymethin và 8 cacbon bậc 4.
33
Hình 3.3. Phổ DEPT của hợp chất MB1
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB1
Hợp chất MB1
δC
#
δC
a, b
δH
a,c (J, Hz)
C
Aglycone
163,9 164,2 - 2
102,4 102,4 6,75 s 3
182,1 182,1 - 4
160,4 160,4 - 5
98,1 98,4 6,24 s 6
162,7 162,8 - 7
104,6 104,7 - 8
156,0 156,1 - 9
104,0 104,7 - 10
121,6 121,1 - 1’
128,9 129,7 8,01 d (8,0) 2’
115,8 115,9 6,89 d (8,0) 3’
161,1 161,1 - 4’
115,8 115,9 6,89 d (8,0) 5’
128,9 129,7 8,01 d (8,0) 6’
13,15 s OH-5
8-C-Glc
73,4 73,9 4,71 d (9,0) 1’’
70,8 69,3 3,85 dd (8,0; 8,5) 2’’
78,7 78,2 3’’
70,5 68,2 3,27-3,53 m 4’’
81,8 80,5 5’’
ađo trong DMSO-d6, b125 MHz, c500 MHz *δC của vitexin [9]
34
61,3 61,4 6’’ 3,76 d (11,0) 3,53 m
Hình 3.4. Phổ HSQC của hợp chất MB1
Các mảnh cấu trúc này sau đó được kết nối nhờ phân tích phổ HMBC.
Tương tác HMBC giữa proton của OH-5 (δH 13,15) và C-5 (δC 160,4) / C-6
(δC 98,4) / C-10 (δC 104,6), tương tác giữa proton H-6 (δH 6,24) với C-5 (δC
160,4) /C-7 (δC 162,8) / C-8 (δC 104,7) / C-10 (δC 104,7) và tương tác giữa
proton H-1’’ (δH 4,71) với C-7 (δC 162,8) / C-8 (δC 104,7) / C-9 ( δC 156,1)
xác nhận cấu trúc của vòng A bị thế ở 5 vị trí và cho phép xác định đường
glucose gắn với khung flavone ở vị trí C-8 của vòng A.Tương tác HMBC
giữa H-2’,H-6’(δH 8,01) với C-2 của vòng C (δC 164,2) và tương tác giữa H-
3’, 5’ (δH 6,89) và C-1’ (δC 121,1) / C-4’ (δC 161,1) xác nhận cấu trúc của
vòng B và liên kết giữa C-1’ và C-2. Ngoài ra, cấu trúc vòng C được thiết lập
qua các tương tác xa trên phổ HMBC giữa H-3 (δH 6,75) với C-2 (δC 164,2) /
35
C-4 (δC 182,1) / C-10 (δC 104,7) (Hình 3.5).
Hình 3.5. Phổ HMBC của hợp chất MB1
Kết hợp các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS, HSQC, HMBC
và so sánh với tài liệu tham khảo [32] cho phép xác định MB1 là vitexin.
Hình 3.6. Công thức cấu tạo và một số tương tác chính
36
trên phổ HMBC của chất vitexin (C21H20O10)
3.2. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất isovitexin (MB2)
Hợp chất MB2 được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng, đnc:
220-221oC. Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z
433.Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm OH và nhóm
carbonyl ở 3408, 1660, 1623 cm1.
Hình 3.7. Phổ ESI-MS của hợp chất MB2
Dữ liệu phổ 13C-NMR, 1H-NMR của hợp chất MB2 rất giống với hợp
chất MB1, chỉ khác về độ chuyển dịch hóa học, đặc biệt là độ chuyển dịch
hóa học của các proton và cacbon ở vị trí C-6 và C-8.
Phổ 13C-NMR của MB2 cho tín hiệu của 21 nguyên tử cacbon trong đó
có 1 nhóm carbonyl ở C 180,3 (C-4), 6 nhóm methin vòng thơm ở C 103,3
(C-3) ; 96,4 (C-8), 129,3 (C-2’, C-6’); 117,2 (C-3’, C-5’), 1 nhóm methylen ở
37
C 62,7 (C-6’’), 5 nhóm oxymethin và 8 cacbon bậc 4.
Phổ 1H-NMR cho tín hiệu của 6 proton vòng thơm trong đó có 4 proton
dạng AA’BB’ ở H 7,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’, H-6’) ; 6,94 (2H, dd, J = 8,5
Hz, H-3’, 5’) chứng tỏ vị trí C-4’ của vòng B bị thế và 2 proton dưới dạng
singlet ở H 6,60 (1H, s, H-3), 6,51 (1H, s, H-8). Giống như chất MB1, trên
phổ 1H-NMR của MB2 cũng có tín hiệu của 1 đơn vị đường glucose tại C-6
với tín hiệu của 1 proton anomeric ở H 4,92 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-1’’) và 6
proton khác nằm trong khoảng H 3,42- 4,21.
38
Hình 3.8. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB2
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB2
Hợp chất MB2
C δC
*
δC
a,b
δH
a,c(J, Hz)
Aglycone
2 165,9 165,7 -
3 103,6 103,3 6,60 s
4 183,8 180,3 -
5 157,5 157,5 -
6 109,5 110,0 -
7 163,0 163,3 -
8 95,7 96,4 6,51 s
9 158,2 159,1 -
10 104,6 104,3 -
1’ 123,0 123,0 -
2’ 129,4 129,3 7,85 d (8,5)
3’ 117,1 117,2 6,94 d (8,5)
4’ 162,0 162,0 -
5’ 117,1 117,2 6,94 d (8,5)
6’ 129,4 129,3 7,85 d (8,5)
6-C-Glc
1’’ 75,4 75,5 4,92 d (10,0)
2’’ 72,5 72,3 4,21 t (8,0)
3’’ 80,3 80,4
4’’ 71,7 71,6 3,42-3,54
5’’ 82,6 82,5
aĐo trongCD3OD, b125 MHz, c500 MHz *δC của isovitexin [9]
39
3,77 dd (5,0; 12,0) 6’’ 62,8 62,7 3,89 dd (2,0; 12,0)
Hình 3.9. Phổ 13C-NMR của hợp chất MB2
Kết hợp các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS, và so sánh với
tài liệu tham khảo [33] cho phép xác định MB2 là isovitexin.(C21H20O10)
Hình 3.10. Công thức cấu tạo của hợp chất isovitexin (C21H20O10)
3.3. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất luteolin (MB3)
Hợp chất MB3 được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng nhạt,
đnc: 330-336ºC. Phổ khối ESI-MS của MB3 cho pic ion phân tử proton
hóa ở m/z 287 [M+H]+. Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụmạnhcủa nhóm OH
40
và nhóm carbonyl ở 3407, 1655, 1609 cm1.
Hình 3.11. Phổ ESI-MS của hợp chất MB3
Trên phổ 1H-NMR cho tín hiệu của 6 proton vòng thơm ở H 7,40 (2H,
m, H-2’, 6’); 6,82 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5’); 6,56 (1H, s, H-3); 6,46 (1H, br s,
H-8); 6,23 (1H, br s, H-6). Các dữ liệu phổ trên gợi ý đây là một hợp chất
tetrahydroxy flavone.
Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất MB3 cho biết sự có
mặt của 15 cacbon sp2 tương ứng với 1 nhóm carbonyl ở C 183,9 (C-4), 6
nhóm methin vòng thơm ở C 103,9 (C-3), 95,0 (C-8), 120,3 (C-6’) ; 116,8
(C-5’); 114,2 (C-2’) và 8 cacbon bậc 4. Dựa vào độ chuyển dịch hóa học
của các cacbon bậc 4 cho phép xác định có 6 cacbon gắn với oxy.
Từ các dữ liệu phổ ESI-MS,13C-NMR và 1H-NMR và so sánh với tài
41
liệu tham khảo [34] cho phép xác định MB3 là luteolin.(C15H10O6)
Hình 3.12. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB3
42
Hình 3.13. Phổ 13C-NMR của hợp chất MB3
Hình 3.14. Công thức cấu tạo của hợp chất luteolin (C15H10O6)
3.4. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất Taxifolin(MB4)
Chất MB4 được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng nhạt, đnc: 222-
224ºC. Phổ khối ESI-MS của MB4 cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 305
[M+H]+. Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm OH và nhóm
carbonyl ở 3306, 1639, 1610cm1.
43
Hình 3.15. Phổ ESI-MS của hợp chất MB4
Phổ 1H-NMR cho tín hiệu của 3 proton vòng thơm tương tác kiểu ABX
ở H 6,99 (1H, br s, H-2’); 6,87 (1H, br d, J = 8,5 Hz, H-6’); 6,82 (1H, d, J =
8,5 Hz, H-5’) và 2 proton ở vị trí meta ở H 5,93 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8);
5,90 (1H, br s, H-6) chứng tỏ vòng B bị thế ở vị trí C-3’ và C-4’, vòng A bị
thế ở vị trí C-5 và C-7. Đồng thời trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 2
doublet ở H 4,92 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-3); 4,51 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-
2). Hằng số tương tác giữa H-2 (δH 4,90) và H-3 (δH 4,48) (J2,3 = 12,0 Hz) xác
nhận cấu hình 2,3-trans của hợp chất này. Các dữ liệu phổ trên đặc trưng cho
một hợp chất khung dihydro flavonol.
Hình 3.16. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB4
Trên phổ 13C-NMR của MB4 cho tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon
trong đó có 13 cacbon sp2 và 2 cacbon sp3 ở C tương ứng với 1 nhóm
cacbonyl ở C 198,2, năm nhóm methin vòng thơm nằm trong khoảng C 96,5
- 121,5, hai nhóm methin gắn với oxy ở C 85,1 (C-2); 73,6 (C-3) và 7
44
cacbon bậc 4.
Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của hợp chất MB4
Kết hợp các dữ liệu phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, và so sánh với tài liệu tham
khảocho phép xác định chất MB4 là 1 Taxifolin (C15H12O7)
[35].
Hình 3.18. Công thức cấu tạo của hợp chất taxifolin (C15H12O7)
3.5. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất Catechin (MB5)
Hợp chất MB5 được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng nhạt, đnc:
175-177 ºC. Phổ khối ESI-MS của MB5 cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z
291 [M+H]+. Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm OH và vòng
45
thơm aromatic ở 3387, 1611, 1520 cm1.
Hình 3.19. Phổ ESI-MS của hợp chất MB5
Phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy sự có mặt của 1 nhóm methylen ở
H 2,87 (1H, dd, J = 5,0; 16,5 Hz, H-4α); 2,53 (1H, dd, J = 8,5; 16,5 Hz, H-
4β); C 28,5 ( C-4) và 2 nhóm methin gắn với oxi ở H 4,59 (1H, d, J = 7,5
Hz, H-2); C 82,8 (C-2 ) và H 4,00 (1H, m, H-3); C 68,8 (C-3) là các tín
hiệu đặc trưng cho vị trí nhóm methylen CH2 - 4 và proton H-2, H-3 của một
hợp chất flavan-3-ol. Hằng số tương tác J = 8,0 Hz của H-2 cho biết H-2 và
H-3 ở vị trí trans-diaxial. Trên phổ 1H-NMR còn có tín hiệu của 3 proton
vòng thơm tương tác kiểu ABX ở H 6,86 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-2’); 6,79 (1H,
d, J = 8,0 Hz, H-5’); 6,74 (1H, br d, J = 8,0 Hz, H-6’) và 2 proton ở vị trí
meta ở H 55,96 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); 5,88 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6) chứng
46
tỏ vòng B bị thế ở vị trí C-3’ và C-4’, vòng A bị thế ở vị trí C-5 và C-7.
Phân tích phổ 13C-NMR và HSQC của MB5 cho biết sự có mặt của 15
nguyên tử cacbon trong đó 12 cacbon sp2 và 3 cacbon sp3 tương ứng với 1
nhóm methylen, 2 nhóm methin có gắn với oxi, 5 nhóm methin của vòng
thơm và 7 cacbon bậc 4.
Hình 3.20. Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất MB5
47
Hình 3.21. Phổ DEPT của hợp chất MB5
Hình 3.22. Phổ HMBC của hợp chất MB5
Phân tích phổ HMBC cho thấy tương tác giữa H-3 (H 4,00) với C-2
(C 82,8) / C-1’ (C 132,2) và tương tác giữa H-2 (H 4,59) với C-4 (C 28,5)
/ C-3 (C 68,8) / C-1’ (C 132,2) / C-2’ ( C 115,3) / C-6’ (C 120,1) cho phép
xác định liên kết giữa C-4 / C-3 / C-2 thuộc vòng C và liên kết giữa C-1’ của
vòng B với C-2 của vòng C.
Kết hợp các dữ liệu phổ ESI-MS, 13C-NMR, HSQC, HMBC với tài liệu
tham khảo [36] cho phép kết luận cấu trúc của chất MB5 là catechin.
Hình 3.23. Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC
48
của hợp chất catechin (C15H14O9)
Như vậy, từ dịch chiết EtOAc của vỏ hạt đỗ xanh đã phân lập và xác
định được cấu trúc 5 hợp chất flavonoid, trong đó có 3 hợp chất khung
flavone là vitexin (MB1), isovitexin (MB2), luteolin(MB3), 1 hợp chất
dihydroflavonol là taxifolin (MB4), 1 hợp chất flavan-3-ol là catechin (MB5).
Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về chi Đậu (Vigna).
Hình 3.24. Các hợp chất phân lập được từ dịch chiết EtOAc vỏ hạt đỗ xanh
49
(Vigna radiata)
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Trong quá trình thực hiê ̣n luâ ̣n văn này, chú ng tôi đã thu đươ ̣c kết quả
nghiên cứ u như sau:
- Từ dịch chiết EtOAc của vỏ hạt đỗ xanh (Vigna radiata) đã phân lập
và phân tích được cấu trúc 5 hợp chất flavonoid, trong đó có 3 hợp chất khung
flavone là vitexin (MB1), isovitexin (MB2), luteolin (MB3), 1 hợp chất
dihydro flavonol là taxifolin (MB4), 1 hợp chất flavan-3-ol là catechin
(MB5).
- Từ các kết quả thu được như trên, chúng tôi đã gửi đăng 01 bài báo
trên tạo chí chuyên ngành của Việt Nam.
2. Kiến nghị
Đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết cũng như các hợp chất phân
lập được nhằm nâng cao giá trị dược dụng của vỏ hạt đậu xanh cũng như
50
giảm tải ô nhiễm môi trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Tiến Bân (1997),Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật
hạt kín, Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 35.
2. http://www.suc khoe cong dong/đau xanh.
3. Kim DK, Jeong SC, Gorinstein S, Chon SU (2012) Total polyphenols,
antioxidant and antiproliferative activities of different extracts in
mungbean seeds and sprouts. Plant Foods Hum Nutr. 67:71-75.
4. Dongyan Tang, Yinmao Dong, Hankun Ren, Li Liand Congfen He
(2014) A review of phytochemistry, metabolite changes, and medicinal
uses of the common food mung bean and its sprouts (Vigna
radiata).Chemistry Central Journal 8:4.
5. Lee JH, Jeon JK, Kim SG, Kim SH, Chun T, Imm JY (2011)
Comparative analyses of total phenols, flavonoids, saponins and
antioxidant activity in yellow soy beans and mung beans. Int J Food Sci
Tech 46: 2513-19.
6. Kim JH, Lee BC, Kim JH, Sim GS, Lee DH, Lee KE, Yun YP, Pyo HB
(2005) The isolation and antioxidative effects of vitexin from acer
palmatum. Arch Pharm Res 28(2): 195-202.
7. Li ZX (1981) Experimental hyperlipidemia and artery effect of mung
bean in rabbit. Chin J Cardiol 3:228-231.
8. Zhang HMH, Cai HS (1995) Discussion on study of lipid-lowering by
traditional Chinese medicine. Lishizhen Med Mat Med Res 6:34-35.
9. Hsu GSW, Lu YF, Chang SH, Hsu SY (2011) Antihypertensive effect of
mung bean sprout extracts in spontaneously hypertensive rats. J. Food
Biochem. 35(1): 278-288.
10. Yao Y, Chen F, Wang M, Wang J, Ren G (2008) Antidiabetic activity of
mung bean extracts in diabetic KK-Ay mice. J Agric Food Chem.
51
56(19): 8869-8873.
11. Xu B, Chang SK (2012) Comparative study on antiproliferation
properties and cellular antioxidant activities of commonly consumed
food legumes against nine human cancer cells. Food Chem. 134(3):
1287-1296.
12. Zhao YR, Li ZW, Zhao C, Fu R, Wang XH, Li ZY (2012) Effects of
recombinant mung bean trypsin inhibitor fragments on migration of
colon cancer cell SW480. Nat Sci Ed 1:29.
13. Yeap SK, AliN M, YusofH M, Noorjahan BA, Boon KB, Wan YH, Soo
PK, Kamariah L (2012) Antihyperglycemic effects of fermented and
nonfermented mung bean extracts on alloxan-induced-diabetic mice.
BioMed Res Int:1-7.
14. Bellik Y, Hammoudi S, Abdellah F, Iguer-Ouada M, Boukraa L (2012)
Phytochemicals to prevent inflammation and allergy. Recent Patents on
Inflammation & Allergy Drug Discovery 6(2): 147-158.
15. Cherng J-M, Chiang W, Chiang L-C (2007) Immunomodulatory
activities of edible beans and related constituents from soybean. Food
Chem. 104(2):613-618.
16. Randhir R, Lin Y-T, Shetty K (2004) Stimulation of phenolics,
antioxidant and antimicrobial activities in dark germinated mung bean
sprouts in response to peptide and phytochemical elicitors. Process
Biochem. 39: 637-646
17. Lee CH, Yoon SJ, Lee SM (2012) Chlorogenic acid attenuates high
mobility group Box 1 (HMGB1) and enhances host defense mechanisms
in murine sepsis. Mol Med. 18(1):1437-1448.
18. Nguyễn Thị Hương (2011), Nghiên cứu thành phần hóa học của vỏ hạt
đậu xanh (Vigna radiata). Khóa luận tốt nghiệp Đại học Dược Hà Nội.
19. Bộ môn Dược liệu (2004) Bài giảng dược liệu, Trường Đại học Dược
52
Hà Nội.
20. W. Bors, W. Heller, C. Michel, M. Saran, Radical chemistry of
flavonoids antioxydant, Antioxydant in therapy and priventive medicine,
Plemum press, New York, 1990,165 - 170,.
21. K.E. Heim, A. R. Tagliaferro, D.J. Bobliya, Flavonoids antioxidants:
Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. The Journal
of Nutritional Biochemistry,2002, 13, 572-584.
22. S. V. Jovanovic, K. S. Steen, Y. Hara, M. G. Simie, Reduction potential
of flavonoids and model phenolxyl radicals with ring in flavonoids is
responsible for antioxydant activity, Journal of chemical Society-perkin,
1996, 2 (11), 2497-2504.
23. J. Mann, Secondary metabolism, Clarendon Press, 1992.
24. J. Peterson, M. Dwyer, Flavonoids: Dietary occurrence and biochemical
activity. Nutrition Research, 1998,18, 1995-2018.
25. Markham K. R., Ternai B., “Carbon-13 NMR studies of flavonoids-I,
Flavones and flavonols”, Tetrahedron, 1976,32(5), 565-569.
26. E.D. Rijke, P. Out, W.A. Niessen, F. Ariese, C. Goojer, U.A.T.
Brinkman, Analytical separation and detection methods for flavonoids.
Journal of Chromatography A;2006,11(12), 31-63.
27. T. P. Cushnie, A. J. Lamb, Antimicrobial activity of flavonoids.
International Journal Of Antimicrobial Agents2005, 26, 343-356.
28. Wenkert E., Gottlieb H. E., “Carbon-13 nuclear magnetic resonance
spectroscopy of flavonoid and isoflavonoid compounds”,
Phytochemistry, 1977, 16(11), 1811-1816.
29. Trần Văn Sung, Trịnh Thị Thủy, Nguyễn Hoàng Anh, Các hợp chất
thiên nhiên từ một số cây cỏ Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo tài
nguyên thiên nhiên và Môi trường Viện Khoa học và Công Nghệ Việt
Nam, 2011.
30. Nguyễn Đình Triệu (2006), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa
53
học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
31. Nguyễn Đình Thành (2011),Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng trong hoá
học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội.
32. Jaya Gupta, Amit Gupta. Isolation and characterization of flavonoid
glycoside from leaves of Abrus precatorius. International Journal of
Chemical Studies, 4(1), 14-17 (2016).
33. Jinyong Peng, Guorong Fan, Zhanying Hong, Yifeng Chai, Yutian Wu.
Preparative separation of isovitexin and isoorientin from Patrinia
villosa Juss by high-speed counter-current chromatography.Journal of
Chromatography,1074, 111-115 (2005).
34. Ki Hyun Kim, Sang Wook Chang, Shi Yong Ryu, Sang Un Choi and
Kang Ro Lee.Phytochemical constituents of Nelumbo nucifera. Natural
product sciences, 15, 90-95(2009).
35. Abdullahi Usman, Vera Thoss , Muhammed Nur-e-Alam.Isolation of
Taxifolin from Trichilia emetica Whole Seeds. American Scientific
Research Journal for Engineering, Technology and Sciences, 21(1), 77-
82 (2016).
36. J. A. Petrus, S.Siva Hemalatha, G.Suguna. Isolation and
Characterisation of the Antioxidant Phenolic Metabolites of Boerhaavia
54
erecta L. Leaves. J. Pharm. Sci. & Res., 4(7), 1856 - 186 (2012).
PHỤ LỤC
1
1
PL1. Phổ ESI-MS của hợp chất MB1
2
PL2. Phổ IR của hợp chất MB1
3
PL3. Phổ 1H-NMR của hợp chất MB1
4
PL4. Phổ 13C-NMR của hợp chất MB1
5
PL5. Phổ DEPT của hợp chất MB1
6
PL6. Phổ HSQC của hợp chất MB1
7
PL7. Phổ HMBC của hợp chất MB1
8
PL8. Phổ ESI-MS của hợp chất MB2
9
PL9. Phổ IR của hợp chất MB2
10
11
PL10. Phổ 1H-NMR của hợp chất MB2
PL11. Phổ 13C-NMR của hợp chất MB2
12
PL12. Phổ ESI-MS của hợp chất MB3
13
PL13. Phổ IR của hợp chất MB3
14
PL14. Phổ 1H-NMR của hợp chất MB3
15
PL15. Phổ 13C-NMR của hợp chất MB3
16
PL16. Phổ DEPT của hợp chất MB3
17
PL17. Phổ ESI-MS của hợp chất MB4
18
PL18. Phổ IR của hợp chất MB4
19
20
PL19. Phổ 1H-NMR của hợp chất MB4
21
PL20. Phổ 13C-NMR của hợp chất MB4
22
PL21. Phổ ESI-MS của hợp chất MB5
23
PL22. Phổ IR của hợp chất MB5
24
PL23. Phổ 1H-NMR của hợp chất MB5
PL24. Phổ 13C-NMR của hợp chất MB5
25
PL25. Phổ DEPT của hợp chất MB5
26
PL26. Phổ HSQC của hợp chất MB5
27
PL27. Phổ HMBC của hợp chất MB5
