BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------
Lê Văn Nhân NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN, CYTOKININ) TRONG RAU XANH
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 9.44.01.18 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Hà Nội - 2021
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ -
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. Nguyễn Quang Trung
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Vũ Đức Nam
Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp
Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng
… năm 202….
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật được xem là một
trong những giải pháp tốt trong nông nghiệp để thúc đẩy nhanh quá
trình tăng trưởng của cây nhưng nếu lạm dụng các hóa chất này có
thể dẫn đến sự tồn dư trong thực phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe
người tiêu dùng.
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã được các nhà khoa
học trên thế giới quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng từ nhiều năm
nay. Việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sản
xuất nông nghiệp cũng diễn ra khá phổ biến ở Việt Nam, tuy nhiên,
rất ít công trình công bố nghiên cứu về phương pháp phân tích và
đánh giá dư lượng của các chất này trong các sản phẩm nông nghiệp,
đặc biệt là rau xanh. Mặt khác, có nhiều loại thuốc điều hòa sinh
trưởng thực vật không có nhãn mác và nguồn gốc xuất xứ vẫn được
nông dân truyền tai nhau sử dụng do hiệu quả nhanh chóng và vượt
trội của chúng mang lại cho cây trồng. Đây là một trong những
nguyên nhân tiềm ẩn có thể gây nên tình trạng ngộ độc thực phẩm và
ô nhiễm môi trường liên quan đến dư lượng của các hóa chất sử dụng
trong sản xuất nông nghiệp.
Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu sinh đề xuất thực hiện đề
tài “Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích
một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin)
trong rau xanh”. Nghiên cứu này thành công sẽ là tiền đề cho việc
phát triển và ứng dụng phương pháp phân tích đánh giá dư lượng và
thực trạng sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các
loại rau xanh, các sản phẩm nông nghiệp và trái cây.... sản xuất ở
nước ta cũng như nhập khẩu từ các nước trên thế giới. Đây cũng
1
chính là cơ sở giúp các cơ quan chức năng, các nhà quản lý ban hành
các chế tài và có phương thức giám sát việc sử dụng các chất kích
thích sinh trưởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp một cách hiệu
quả, đảm bảo sự phát triển sản xuất, an toàn cho người tiêu dùng và
môi trường sinh thái.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích
đồng thời các hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật trong
rau xanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép
nối với detector khối phổ bẫy ion.
Áp dụng phương pháp xây dựng được để phân tích, đánh giá
hiện trạng sử dụng, mức độ tồn dư và khả năng tích lũy của
một số chất kích thích sinh trưởng thực vật sử dụng trong rau
tại một số quận/ huyện của Hà Nội.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
1) Khảo sát các điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích các
chất kích thích sinh trưởng thực vật trong rau, gồm: các điều
kiện vận hành trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và các điều kiện
của phương pháp xử lý mẫu.
2) Xây dựng phương pháp phân tích và đánh giá các thông s ố của
phương pháp
3) Đánh giá hiện trạng dư lượng các chất kích thích sinh trưởng
thực vật trong các mẫu rau xanh thu thập tại Hà Nội
4) Đánh giá ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thực vật
đến sự sinh trưởng và phát triển của một số loại rau và mức độ
tích lũy của chúng trong rau xanh.
2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng thực vật
Chất kích thích sinh truởng thực vật (KTST) là nhóm các hợp
chất hữu cơ như: auxin, gibberellin, cytokinin, brassinosteroid,
jasmonate, salicyclic acid và strigolactone...; có tác dụng kích thích
quá trình sinh trưởng và phát triển của cây [1]. Những chất này tác
động lên sự sinh trưởng của cây trồng theo cơ chế: (1) Kích thích
tăng trưởng thể tích tế bào ở lá, thân, quả [2-4]; (2) Kích thích hình
thành tế bào mới, làm tăng cường sự nảy chồi, đâm rễ, ra hoa [5-7];
(3) Bổ sung và tăng cường hoạt động của các men trong quá trình
sinh tổng hợp của cây bằng cách cung cấp thêm các chất vi lượng
như Fe, Mn, Cu, Bo, Zn… [1].
1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất kích thích sinh
trƣởng thực vật
- Auxin là một hoocmon thực vật có nguồn gốc từ axit amin
tryptophan, được xác định và phân lập về mặt hóa học vào những
năm 1930. Auxin có trong tất cả các bộ phận của cây với các nồng
độ khác nhau, trong đó, nồng độ auxin ở mỗi vị trí là thông tin quan
trọng của sự phát triển, được điều chỉnh chặt chẽ thông qua cả quá
trình trao đổi chất và vận chuyển trong cây.
- Gibberellin chính là các axit diterpenoid được tổng hợp từ
terpenoid trong thể hạt và sau đó được biến đổi thành dạng hoạt hóa
sinh học trong lưới nội chất và cytosol.
- Cytokinin tham gia vào quá trình phát triển và biệt hóa tế bào,
truyền tín hiệu tại chỗ và các vị trí khác nhau trong cơ thể với cơ chế
vận chuyển tương tự như purin và nucleosit; đồng thời cytokinin ảnh
hưởng đến tính ưu thế đỉnh, sự phát triển chồi nách và sự già đi của
lá.
3
1.3. Vai trò chức năng của các chất kích thích sinh trƣởng thực
vật
- Auxin điều phối nhiều quá trình sinh lý cần thiết trong chu kỳ
sống của thực vật như: sự sinh trưởng, phát triển, sự ra hoa, hình
thành củ, quả, hạt của thực vật....
- GAs điều hòa và ảnh hưởng đến các quá trình phát triển khác
nhau của thực vật như: kéo dài thân, nảy mầm, ngủ của hạt, ra hoa,
phát triển hoa và già đi của lá và quả.
- Cytokinin tương tác trực tiếp với các auxin, kích thích sự phân
chia tế bào và các quá trình chuyển hóa khác nhau của tế bào.
Cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ với các ADN và protein của thực vật,
cho phép cây phát triển các mô khác nhau để thực hiện các mục đích
khác nhau.
1.4. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất kích thích sinh
trƣởng thực vật
- Auxin được nghiên cứu sử dụng trong nhân giống cây trồng,
nuôi cấy mô hoặc tế bào, thuốc diệt cỏ.
- Gibberellin được ứng dụng nhiều trong kích thích sự nảy mầm
của hạt, phản ứng với các điều kiện ức chế của môi trường, thúc đẩy
sự tăng trưởng quả, kéo dài thân, kích thích ra hoa, hình thành hạt...
- Cytokinin được nghiên cứu ứng dụng trong việc gia tăng hàm
lượng diệp lục, làm chậm quá trình già hóa của cây, gia tăng sự phát
triển thân cây...
1.5. Các nghiên cứu về dƣ lƣợng của các chất kích thích sinh
trƣởng thực vật
Ở Việt Nam, hiện chưa có nào công trình công bố về dư lượng
các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các sản phẩm rau xanh
và trái cây. Tuy nhiên, trên thị trường, các thuốc kích thích sinh
4
trưởng thực vật được buôn bán và sử dụng với nhiều tên thương mại
khác nhau như: siêu ra rễ, siêu trái, thuốc kích mầm, thần dược siêu
tăng trưởng... Bên cạnh đó, một số loại phân bón qua lá cho các loại
cây trồng cũng chứa một hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng
thực vật nhất định. Bản chất của các thuốc kích thích sinh trưởng
thực vật chứa các chất như: auxin, gibberellin hoặc cytokinin... có
vai trò kích thích sự phân chia tế bào, thúc đẩy sự sinh trưởng phát
triển, gia tăng sinh khối cho cây trồng...
1.6. Các phƣơng pháp phân tích các chất kích thích sinh trƣởng
thực vật
1.6.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu
1.6.1.1. Thu thập mẫu
1.6.1.2. Chiết tách
1.6.1.3. Làm sạch và tinh chế mẫu
1.6.2. Các phương pháp phân tích
1.6.2.1. Phương pháp phân tích các hợp chất auxin
1.6.2.2. Phương pháp phân tích các hợp chất gibberellin
1.6.2.3. Phương pháp phân tích các hợp chất cytokinin
5
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Thiết bị sắc ký lỏng Ultimate 3000 HPLC và thiết bị phân tích
khối phổ LCQ Fleet MS.
Các thiết bị và dụng cụ phụ trợ khác
2.1.2. Hóa chất thí nghiệm
2.1.2.1. Hóa chất
IAA, IBA, ICA, IP A, GA3, GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR và DHZR, Methanol, Acetonitrile, axit foocmic, axít Hydrochloric,
Dichloromethane, 2-propanol. Thuốc kích thích sinh trưởng thực vật
Gibber4TB.
2.1.2.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc 1000 μg.mL-1, sau đó pha thành các chuẩn trung gian gồm: 100 μg.mL-1; 20 μg.mL-1; 1 μg.mL- 1. Từ chuẩn trung gian tiếp tục pha thành các chuẩn làm việc: 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 và 2000 ng.mL-1. 2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc ba nhóm:
auxin (IAA, IBA, ICA và IPA ), gibberellin (GA3, GA4 và GA7) và cytokinin (BA, iP, iPR, K, DHZR, tZ, tZR).
2.2.2. Đối tượng phân tích
- Các mẫu rau cải xanh (Brassica juncea) được sử dụng để khảo
sát, xây dựng và đánh giá phương pháp phân tích.
- Các mẫu rau xanh thu thập từ các mô hình sản xuất rau quy mô
hàng hóa tại một số quận/huyện thuộc thành phố Hà Nội.
6
- Các mẫu rau của thí nghiệm ứng dụng quy trình phân tích xác
định sự tích lũy của GA3 trong một số loại rau xanh. 2.2.3. Thu thập mẫu
- Mẫu phân tích được thu thập theo Tiêu chuẩn ngành 10TCN
386:1999 về Phương pháp lấy mẫu kiểm định chất lượng và dư
lượng thuốc bảo vệ thực vật [110].
- Các mẫu rau thí nghiệm phục vụ xây dựng và đánh giá phương
pháp phân tích: được thu thập ở ngày phát triển thứ 35 sau khi
chuyển ra trồng trong các thùng xốp, bằng cách nhổ cả gốc, rửa sạch,
cắt bỏ phần gốc, phần còn lại được đông cứng bằng nitơ lỏng cho
đến khi được xử lý và phân tích.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp khảo sát các điều kiện tối ưu của quy trình
phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong rau
2.3.1.1. Phương pháp khảo sát điều kiện phân tích khối phổ
- Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ 1 μg.mL- 1/chất KTST vào detector MS để xác định các ion phân tử và ion sản phẩm của các chất KTST theo các chế độ ion hóa âm (-) và ion hóa
dương (+). Sau đó, khảo sát điều kiện của nguồn ion hóa với sự có
mặt của pha động.
2.3.1.2. Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký lỏng
a) Khảo sát cột phân tích và dung môi pha động:
Các cột nghiên cứu: cột Hypersil và cột Purospher.
Các dung môi pha động: MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch
chứa 0,1% FA và hệ dung môi ACN (+0,1% FA) + nước siêu
sạch chứa 0,1% FA.
b) Khảo sát các điều kiện phân tích khác:
Tốc độ dòng, chế độ gradient...
7
2.3.2. Phương pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu
- Dựa trên cơ sở phương pháp tách chiết các hoocmon thực vật ở
loài cây Arabidopsis thaliana thuộc Họ Cải theo nghiên cứu của
Xiangqing và cộng sự sử dụng dung môi chiết 1-propanol/H2O/HCl (2 : 1 : 0,002, v/v/v) và Dichloromethane.
2.3.3. Phương pháp xây dựng và xác nhận quy trình phân tích
đồng thời các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu
rau
- Xây dựng quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh
trưởng thực vật trong các mẫu rau xanh từ các kết quả nghiên cứu về
điều kiện tách chiết mẫu và điều kiện phân tích của thiết bị sắc ký
lỏng và đầu dò khối phổ.
- Xác nhận và thẩm định quy trình phân tích thông qua các thông
số:
Độ ổn định của chu kỳ đông/ rã đông mẫu
Đường chuẩn
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Ảnh hưởng của nền mẫu
Độ thu hồi và độ chính xác của phương pháp
So sánh liên phòng thí nghiệm
2.3.4. Phương pháp đánh giá dư lượng các chất kích thích sinh
trưởng thực vật trong các mẫu rau xanh thu thập tại Hà Nội
Thu thập các mẫu rau cải xanh ở các quận/huyện thuộc thành
phố Hà Nội gồm: Huyện Đông Anh, Huyện Gia Lâm, Huyện
Mê Linh, Huyện Sóc Sơn, Quận Hoàng Mai và Huyện Phúc
Thọ.
Xử lý và phân tích hàm lượng các chất KTST theo quy trình đã
xây dựng và đánh giá.
8
So sánh với các quy định về giới hạn dư lượng các chất KTST
của Việt Nam và thế giới.
2.3.5. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất kích thích sinh
trưởng thực vật đến sự sinh trưởng và phát triển của một số loại
rau và mức độ tích lũy của chúng trong rau xanh
Các loại rau thí nghiệm: rau cải xanh, rau mồng tơi và rau xà
lách
Hóa chất thí nghiệm: Thuốc kích thích sinh trưởng thực vật
Gibber4TB, có chứa hoạt chất kích thích sinh trưởng GA3 100%.
- Các công thức thí nghiệm xử lý thuốc Gibber4TB gồm các nồng độ thuốc khác nhau: Đối chứng (0 mg.L-1), 10 mg.L-1, 30 mg.L- 1, 50 mg.L-1 và 100 mg.L-1.
Đánh giá các chỉ tiêu về sinh trưởng của cây gồm: chiều cao, số
lượng lá và sinh khối tươi.
Xử lý và phân tích mẫu theo quy trình được nghiên cứu và xây
dựng để đánh giá sự tích lũy của chất PGR trong cây.
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
Hàm lượng chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu
rau xanh được tính toán trên phần mềm Xcalibur 2.0 sử dụng đường
ngoại chuẩn. Kết quả nghiên cứu được trình bày dưới dạng TB ± độ
lệch chuẩn (SD). Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử
dụng biểu đồ hộp (box and whisher plots) sử dụng phần Microsoft
Excel 2016 (Redmond, WA, USA, Microsoft Corp).
9
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát các điều kiện tối ƣu của quy trình phân tích
3.1.1. Khảo sát điều kiện khối phổ
Bảng 3.1. Các điều kiện tối ưu hóa của khối phổ trong phân tích các
Act Q Năng lượng cô lập và các ion sp
Ion mẹ
Hợp chất
Chế độ quét
ISO width (Da)
Ion CE (V) đl
Ion k/đ
CE (V)
26
IAA
-
174
2,0
0,250
146
IBA
-
202
2,0
0,250
23
158
ICA
-
160
2,0
0,250
26
116
IPA
-
188
2,0
0,250
25
144
-
345
2,0
0,250
22
239
GA3
-
331
2,0
0,250
22
313
GA4
-
329
2,0
0,250
23
223
GA7
BA
+
226
2,0
0,250
28
91
+
DHZR
354
2,0
0,250
22
222
iP
+
204
2,0
0,250
23
136
iPR
+
336
2,0
0,250
22
204
K
+
216
2,0
0,250
26
148
tZ
+
220
2,0
0,250
24
202
tZR
+
352
2,0
0,250
22
220
26 30 28 20 22 20 30 27 28 30 24 29 19 30 25 18 28 26 21 18 28 35 20 31 30 28 26 32
131 116 116 144 144 133 116 134 301 283 287 269 267 255 148 209 148 136 148 175 148 136 135 81 136 148 202 136
chất KTST
Ghi chú: (-) chế độ quét ion âm, (+) chế độ quét ion dương
10
Các chất kích thích sinh trưởng thực vật được phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng phổ khối theo chế độ ESI-MS2, trong đó bảy loại chất kích thích sinh trưởng: IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, và GA7 được phân tích theo chế độ ion hóa âm [M-H]−, trong khi bảy loại
chất kích thích sinh trưởng khác gồm BA, iP, iPR, tZ, K, DHZR và tZR được phân tích theo chế độ ion hóa dương [M+H]+. Các ion phân tử và ion sản phẩm tạo thành của mỗi hợp chất kích thích sinh
trưởng thực vật được xác định thông qua các chất chuẩn, và quá trình
chuyển hóa từ ion mẹ sang các ion sản phẩm tương ứng với hướng
phân mảnh chính đặc trưng cho từng chất kích thích sinh trưởng thực
vật được lựa chọn trên cơ sở tối ưu hóa mức năng lượng phân mảnh.
Bảng 3.2. Các thông số của nguồn ion được tối ưu hóa
Đơn vị Giá trị tối ƣu Thông số
oC L/phút L/phút L/phút
TT 1 Nhiệt độ nguồn 2 3 4 100 25 5 0 Tốc độ dòng khí mang Tốc độ dòng khí bổ trợ Tốc độ dòng khí quét buồng ion hóa 5 Điện thế nguồn phun
- Ion âm - Ion dương
6 Nhiệt độ ống mao quản 7 Điện thế ống mao quản
- Ion âm - Ion dương 8 Điện thế thấu kính hội tụ
-3,0 3,6 200 -31 4 -125 70 kV kV oC V V V V - Ion âm - Ion dương
11
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng
Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy rằng, có sự khác nhau về
hiệu quả phân tách các chất kích thích sinh trưởng thực vật khi sử
dụng các hệ dung môi pha động khác nhau trên cùng một cột sắc ký
như nhau; và khi sử dụng cùng một chế độ dung môi pha động, các
cột sắc ký khác nhau có khả năng phân tách các chất kích thích sinh
trưởng thực vật khác nhau. Trong đó, cột sắc ký Hypersil cho hiệu
quả phân tách các chất nghiên cứu ở cả hai chế độ ion hóa âm và ion
hóa dương tốt hơn so với cột Purospher. Việc sử dụng pha động
MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA cho kết quả
phân tách các chất kích thích sinh trưởng thực vật tốt hơn so với pha
động ACN (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA. Sự kết hợp
của cột sắc ký Hypersil và pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu
sạch chứa 0,1% FA cho kết quả phân tích các chất kích thích sinh
trưởng thực vật tốt nhất với tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng,
cường độ tín hiệu cao, chân píc hẹp và sắc nét. Do đó, cột Hypersil
và pha động MeOH (+0,1% FA) + nước siêu sạch chứa 0,1% FA
được lựa chọn và sử dụng để khảo sát các điều kiện phân tích khác
phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu này.
Kết quả khảo sát điều kiện gradient của pha động trong phân
tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật cho thấy: sự thay đổi của
tỷ lệ dung môi MeOH (+0,1% FA) với nước siêu sạch chứa 0,1% FA
và tốc độ dòng dung môi có ảnh hưởng rõ rệt đến tín hiệu của chất
phân tích, hình dạng píc sắc ký và thời gian rửa giải của các chất
kích thích sinh trưởng thực vật. Trong các gradient được khảo sát,
gradient 3 có điều kiện phân tách tốt nhất, với tín hiệu chất phân tích
rõ ràng, sắc nét, chân píc gọn, và các chất được rửa giải hoàn toàn,
12
do đó điều kiện của gradient này được lựa chọn sử dụng cho các
nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.4. Điều kiện gradient tối ưu sử dụng phân tích các chất PGR
trong rau
Thời gian (phút) Tốc độ dòng (mL/phút) H2O (+ 0,1% FA) MeOH (+0,1% FA)
0 0,1 70 30
2 0,1 70 30
10 0,1 10 90
13 0,1 10 90
13.5 0,1 70 30
15 0,1 70 30
3.2. Tối ƣu hóa điều kiện xử lý mẫu
Kết quả nghiên cứu cho thấy, có sự khác nhau về hiệu suất chiết
giữa các chất kích thích sinh trưởng thực vật khác nhau sử dụng cùng
một dung môi chiết; và sự khác nhau về hiệu suất chiết giữa các
dung môi chiết khác nhau đối với cùng một hợp chất phân tích; trong
đó, việc sử dụng dung môi chiết 2-propanol cho hiệu quả chiết cao
hơn so với dung môi chiết 1-propanol ở cùng điều kiện nghiên cứu.
Quy trình được xây dựng và phát triển sử dụng dung môi chiết
2-propanol có hiệu suất chiết trung bình đối với các chất kích thích
sinh trưởng thực vật đạt 85,93±5,28% cao hơn quy trình sử dụng 1-
propanol là 76,00±5,13%. Các giá trị này cao hơn nhiều so với quy
trình tách chiết các chất kích thích sinh trưởng thực vật theo nghiên
cứu của Xiangqing và cộng sự [83] sử dụng 2-propanol và 1-
propanol lần lượt là 78,29±5,78% và 66,93±4,84%. Đặc biệt, có 6
hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật có hiệu suất chiết cao hơn
90% là: GA3 đạt đến 95%, IAA đạt đến 94%, ICA đạt đến 92%, tZR 13
đạt đến 92%, IBA đạt 90% và GA4 đạt 90%; 7 hợp chất có hiệu suất chiết đạt từ 80-87% gồm K, IPA, tZ, iP, GA7, iPR và DHZR; và chỉ có 01 hợp chất là BA có hiệu suất chiết < 80% ở quy trình sử dụng 2-
propanol.
100
Quy trình pt 1-propanol Quy trình pt 2-propanol
)
%
90
70
( i ồ h
80
60
u h t t ấ u s
40
u ệ i H
50
20
30
10
Chất kích thích sinh trưởng thực vật
0
Hình 3.27. Hiệu suất của quá trình chiết mẫu theo quy trình mới xây
dựng và phát triển sử dụng các dung môi 1-propanol và 2-propanol
Trong đó:
- Quy trình pt 1-propanol: quy trình chiết được mô tả theo Hình
3.11 sử dụng dung môi chiết 1-propanol.
- Quy trình pt 2-propanol: quy trình chiết được mô tả theo Hình
3.11 sử dụng dung môi chiết 2-propanol.
14
3.3. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân
tích
3.3.1. Xây dựng quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích
sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau
Hình 3.18. Sơ đồ quy trình tách chiết và phân tích các chất
KTST trong các mẫu rau
15
(Ion âm)
IAA
IPA
ICA
IBA
GA4
GA3
GA7
(Ion dƣơng)
tZ
iP K
BA
tZR
DHZR
iPR
Hình 3.29. Sắc ký đồ của các chất KTST ở điều kiện gradient tối ưu
3.3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích
3.3.2.1. Độ ổn định của chu kỳ đông/ rã đông mẫu
Kết quả nghiên cứu cho thấy có 6/14 chất kích thích sinh trưởng
có độ ổn định đạt trên 100%, trong đó, cao nhất là hợp chất IAA đạt
106,28%; tiếp đến GA3 đạt 105,48% và GA4 đạt 104,10%; sau đó tZ đạt 103,32%, K đạt 101,93% và GA7 đạt 101,48%. Còn 8 hợp chất còn lại có độ ổn định sau chu trình đông/rã đông từ 91,79 đến
16
99,98%; gồm: iP đạt 99,98%; iPR đạt 98,49%; IBA đạt 98,26%; ICA
đạt 96,48%; BA đạt 94,73%; IPA đạt 94,62%; DHZR đạt 94,07% và
tZR đạt 91,79% (Bảng 3.6). Theo nghiên cứu của Frank và cộng sự
[123], độ ổn định của chu kỳ đông/ rã đông trong xác nhận một
phương pháp phân tích mới dao động trong khoảng từ 90-110%.
Điều này cho thấy, chu kỳ đông/ rã đông của phương pháp phân tích
các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau xanh thỏa
mãn yêu cầu của việc xác nhận phương pháp phân tích mới, đồng
nghĩa với quá trình đông và rã đông mẫu không ảnh hưởng đến kết
quả phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu
rau xanh. 3.3.2.2 Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Bảng 3.6. Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích
Hợp chất Đƣờng chuẩn R2
IAA IBA ICA IPA GA3 GA4 GA7 BA DHZR iP iPR K tZ tZR y = 0,19x + 1,99 y = 2,46x + 20,60 y = 4,45x + 127,66 y = 0,44x – 1,39 y = 1,46x + 14,33 y = 4,44x + 144,25 y = 2,12x + 95,66 y = 7,59x + 11,48 y = 49,25x + 145,59 y = 49,32x – 32,74 y = 2,01x – 12,26 y = 30,32x + 7,68 y = 70,48x – 80,36 y = 92,742x + 176,7 0,9997 0,9987 0,9985 0,9992 0,9997 0,9990 0,9961 0,9989 0,9999 0,9995 0,9988 0,9982 0,9999 0,9992 MDL (ng.g-1) 32,6 3,2 2,1 14,3 5,2 4,1 4,3 0,3 0,6 0,5 4,6 1,2 0,2 0,3 MQL (ng.g-1) 108,6 10,8 6,9 47,6 17,2 13,8 10,8 1,0 2,0 1,5 15,2 4,0 0,6 0,9
17
)
%
Khoảng ME chấp nhận được
( u ẫ m n ề n a ủ c g n ứ u ệ i H
3.3.2.3. Ảnh hưởng của nền mẫu
Z
t
R P
R Z
A B
A C
A K i P B
A A
i
t
A P I
I
I
I
4 A G
7 A G
3 A G
R Z H D
Chất kích thích sinh trưởng thực vật
130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Hình 3.31. Ảnh hưởng của nền mẫu đến tín hiệu của các chất phân tích
Giá trị ME cao nhất là 118% được phát hiện ở hợp chất IAA và
thấp nhất là 82% ở hợp chất BA. Đặc biệt, các hợp chất thuộc nhóm
gibberellin có giá trị ME > 100%, trong đó, ME của GA3 là 115%, GA4 là 107% và GA7 là 102%. Nhiều hợp chất có giá trị ME nằm trong khoảng 90-100% như: IBA-97%, K-97%, tZ-93%, iP-92%,
IPA-90% và DHZR-90%; trong khi đó, có 3 hợp chất có giá trị ME
nằm trong khoảng 80-90 (%) là iPR-87%, ICA-85% và tZR-84%.
Điều này cho thấy rằng, nền mẫu ảnh hưởng không đáng kể đến kết
quả phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu
rau cải xanh.
3.3.2.4. Hiệu suất thu hồi và độ chính xác của phương pháp phân
tích
Hiệu suất thu hồi trung bình khác nhau giữa các nồng độ khác
nhau của từng chất kích thích sinh trưởng thực vật, cũng như khác
nhau giữa các PGR khác nhau có cùng nồng độ. Hiệu suất thu hồi
18
dao động từ 68,42% đến 119,47% ở nhóm các chất có nồng độ thấp,
từ 76,81% đến 107,69% ở nhóm các chất có nồng độ trung bình và từ
75,20% đến 102,56% ở nhóm các chất có nồng độ cao. Do đó, hiệu
suất thu hồi trung bình của các chất kích thích sinh trưởng thực vật là
khá cao, dao động từ 82,30% đến 104,50%. Đáng chú ý, hiệu suất
thu hồi cao nhất đạt 104,50% được ghi nhận ở hợp chất GA3, tiếp theo là 103,73% ở IAA. Hiệu suất thu hồi của GA4 và GA7 tương đồng nhau với các giá trị lần lượt là 101,6% và 102,35%, trong khi
đó đối với các chất thuộc nhóm cytokinin như BA, K, iP, iPR, tZ,
tZR, DHZR và các auxin: IBA, ICA, IPA dao động trong khoảng từ
82,30% đến 93,32% (Bảng 3.8). Độ lặp lại của phương pháp phân
tích đối với các chất kích thích sinh trưởng thực vật ở các mức nồng
độ khác nhau lần lượt là thấp, trung bình và cao tương ứng với các
giá trị từ 0,56-17,17%; 0,06-10,79% và 0,02-7,45% (Bảng 3.8).
Theo tài liệu hướng dẫn SANTE/11813/2017 [130], giá trị hiệu
suất thu hồi trung bình có thể chấp nhận được dựa trên các xác nhận
ban đầu nằm trong phạm vi 70 đến 120%, với RSD liên quan là ≤
20%, cho các chất phân tích trong phạm vi của một phương pháp
nhất định. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng phương pháp chiết xuất
phù hợp đảm bảo cho việc phân tích các chất kích thích sinh trưởng
thực vật trong các mẫu rau cải xanh. Đây cũng chính là cơ sở để phát
triển, mở rộng và ứng dụng phương pháp này trong việc phân tích
các chất kích thích sinh trưởng thực vật trên các đối tượng rau xanh
khác cũng như các loại trái cây và các sản phẩm nông nghiệp.
3.3.2.5. Kết quả so sánh liên phòng thí nghiệm
Kết quả so sánh liên phòng thí nghiệm của 3 mẫu nghiên cứu ở
3 mức nồng độ của các hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật,
tương ứng 10, 100 và 1000 ng.mL-1 cho thấy, phương pháp phân tích 19
của Phòng Thí nghiệm Trọng điểm về An toàn Thực phẩm và Môi
trường - Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ thu được
các giá trị tương đồng với các phòng thí nghiệm đối chứng với hệ số
z-score của các chất nghiên cứu đạt ǀzǀ ≤ 2. Điều này có nghĩa các kết
quả phân tích các hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các
mẫu rau cải xanh theo quy trình được xây dựng và đánh giá đảm bảo
độ tin cậy, có thể ứng dụng trong việc phân tích các mẫu thực nhằm
khảo sát hiện trạng sử dụng chất kích thích sinh trưởng thực vật
trong sản xuất rau xanh.
3.4. Đánh giá hiện trạng dƣ lƣợng các chất kích thích sinh
trƣởng thực vật trong các mẫu rau thu thập tại Hà Nội
Hình 3.32 Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh Hình 3.33. Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh ở các huyện nghiên cứu
Kết quả phân tích cho thấy, có 83 mẫu tương đương 74,77% số
mẫu phát hiện dư lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật bằng
hoặc cao hơn giới hạn định lượng trong khi đó chỉ có 11 mẫu tương
ứng với 9,91% số mẫu không phát hiện các chất kích thích sinh
trưởng thực vật. Có 17 mẫu chiếm 15,32%, phân tích có hàm lượng
chất KTST cao hơn MDL và thấp hơn MQL (Hình 3.18).
20
Bảng 3.11. Số lượng các chất KTST phát hiện được trong các mẫu
rau cải xanh
Quận/ Huyện
Hợp chất
Đông Anh Gia Lâm Mê Linh Sóc Sơn Hoàng Mai Phúc Thọ
tZ +
+ + GA3
IBA + + +
IAA + + + +
ICA + + + +
IPA + + + +
+ + + + GA7
+ + + + + + GA4
5 7 5 3 6 2 Số lƣợng chất đƣợc phát hiện
3.5. Đánh giá mức độ tích lũy của chất KTST trong rau
Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ xử lý thuốc kích thích
sinh trưởng thực vật GA3 càng cao thì sự tích lũy của chúng trong các mẫu rau càng nhiều, và cùng một nồng độ xử lý nhưng hàm
lượng GA3 có sự tích lũy khác nhau trong các loại rau, trong đó giá trị cao nhất được tìm thấy ở rau cải xanh (0,302 mg.kg-1), tiếp đến là xà lách (0,265 mg.kg-1) và thấp nhất ở rau mồng tơi (0,190 mg.kg-1).
21
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Luận án đã hoàn thành mục tiêu đề ra và thu được một số kết
quả như sau:
- Đã xây dựng và thẩm định được phương pháp phân tích đồng
thời 14 hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật gồm IAA, IBA, ICA,
IPA, GA3, GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR và DHZR trong các mẫu rau cải xanh trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ bẫy ion HPLC-ESI-MS2. Trong đó, hệ số tương quan R2≥0,9961; giới hạn phát hiện của phương pháp đạt 0,2-32,6 (ng.g-1); giới hạn định lượng: 0,6-108,6 (ng.g-1); và hiệu suất thu hồi đạt 82,30-104,50%.
- Ứng dụng quy trình phân tích đánh giá sơ bộ sự tồn dư của các
chất kích thích sinh trưởng thực vật trong 111 mẫu rau cải xanh thu
thập ở một số quận huyện thuộc thành phố Hà Nội cho thấy có 83
mẫu nghiên cứu có chứa chất KTST. Các hợp chất được phát hiện
gồm: tZ, GA3, GA4, GA7, IAA, IBA, ICA và IPA với hàm lượng trung bình 0,04-0,65 mg.kg-1.
- Sự tích lũy GA3 trong các loại rau xanh gia tăng cùng với nồng độ hóa chất sử dụng và có sự khác nhau về mức độ tích lũy của hợp
chất này giữa các loại rau xanh khác nhau khi sử dụng cùng một
nồng độ xử lý như nhau.
KIẾN NGHỊ
(1) Các cơ quan ban ngành cần cần ban hành các chế tài quản lý
việc sử dụng các chất KTST và dư lượng của chúng trong các sản
phẩm rau xanh. (2) Tiếp tục nghiên cứu và phát triển phương pháp
phân tích các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các loại rau
xanh khác, các loại trái cây và các sản phẩm nông nghiệp….
22
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1) Là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về xây dựng quy trình phân
tích đồng thời các hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật
(IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR và DHZR) trong các mẫu rau xanh sử dụng thiết bị sắc ký lỏng
hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ bẫy ion (LC-ESI- MS2).
2) Quy trình đã nghiên cứu 9 hợp chất kích thích sinh trưởng mới,
chưa có trong danh mục quy định của Cục Bảo vệ thực vật – Bộ
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (CV-2376/BVTV-QLT,
ngày 02/12/2013) như: GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR, DHZR.
3) Là nghiên cứu đầu tiên đánh giá sơ bộ hiện trạng tồn dư của các
chất kích thích sinh trưởng thực vật trong các mẫu rau xanh thu
thập ở một số quận huyện thuộc thành phố Hà Nội, và khảo sát
mức độ tích lũy của chất kích thích sinh trưởng thực vật trong một số loại rau xanh.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Tibor Janda, Gabbriella, Tien Dat Nguyen, Truong Giang Le. Foliage applied Gibberelic acid Influences growth, nutrient contents and quality of Lettuces (Lactuca sativa L.). The Journal of Animal and Plant Sciences, 2021, 31 (6).
2. Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Tien Dat Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Tibor Janda, Gabbriella Szala, Truong Giang Le. The potential health risks and environmental pollution associated with the application of plant growth regulators in vegetable
23
production in several suburban areas of Hanoi, Vietnam. Biologia Futura, 2020. DOI :10.1007/s42977-020-00041-5.
3. Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Truong Giang Le. Analysis of Plant Growth Substances (Auxins, Gibberelins and Cytokinins) in Vegetables Using High- Performance Liquid Chromatography Coupled to Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. The International Journal of Science and Technoledge, 2020, 8(7): 38-46.
4. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Hoàng Thị Thoa, Nguyễn Ngọc Tùng, Quách Thị Sơn. Quy trình phân tích sàng lọc một số chất kích thích tăng trưởng thực vật trong rau xanh. Tạp chí phân tích: Hóa, Lý và Sinh học, 2019, 24 (4B), 45-51.
5. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Phùng Trung Kiên. Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 lên sự sinh trưởng và phát triển của cải bẹ xanh [Brassica Juncea (L.) czern. et coss]. Tạp chí phân tích: Hóa, Lý và Sinh học, 2019, 24 (4B), 97-102. 6. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam, Lê Trường Giang, Đinh Ngọc Huy. Xây dựng các bước nghiên cứu cơ bản trong phân tích thuốc kích thích tăng trưởng trans-zeatin sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ. Tạp chí Phân tích: Hóa, Lý và Sinh học, 2018, 23 (4), 41-49.
7. Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Truong Giang Le, Tibor Janda, Gabbriella Szalai, Yukui Rui. Simultaneous analysis of plant endogenous hormones in green mustard by liquid chromatography tandem mass spectrometry. (Đã phản biện và đang chờ đăng tạp chí Chinese Journal of Analytical Chemistry).
9. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển sinh khối của một số loại rau xanh. (Đã phản biện và đang chờ đăng Tạp chí Hóa học).
8. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam. Phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trưởng Cytokinin trong rau xanh. (Đã phản biện và đang chờ đăng Tạp chí Hóa học).
24
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
VIETNAM ACADEMY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
GRADUATE UNIVERSITY SCIENCE AND
TECHNOLOGY
----------------------------
Le Van Nhan
STUDY AND DEVELOPMENT THE ANALYSIS METHOD OF STIMULATORS SUCH AS AUXIN, GIBBERELLIN AND CYTOKIN IN VEGETABLES
Major: Analytical Chemistry
Code: 9.44.01.18
SUMMARY OF DOCTORAL THESIS
in using (L.) Czern v/v/v) (2/1/0.002
The study described a simultaneous analytical method of 14 stimulators Brassica Juncea 2- and HCl propanol/water/concentrated dichloromethane as extraction solution. The method showed good linearity for all 14 compounds, with regression coefficients R2 > 0.9961. The limit of detection ranged from 0.2 to 32.6 ng g –1, the overall average of recovery ranged from 81.71% to 105.74%, and the repeatability standard deviation was less than 20%. The proposed method is fast, simple, sensitive, accurate, and efficient for the analysis of stimulators in green mustards, which could be the basis to develop the method for determination of plant growth regulators in other vegetables and agricultural products.
