Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ bằng kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

NGÔ ĐỨC DUY

PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

NGÔ ĐỨC DUY

PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS HOÀNG QUỐC KHÁNH

Thành phố Hồ Chí Minh- 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những thông tin đƣợc viết trong luận văn này là do tôi thực hiện và sự hƣớng dẫn nhiệt tình của Ts Hoàng Quốc Khánh. Mọi kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng, cùng với các thông tin nghiên cứu khác đƣợc trích dẫn rõ ràng, cụ thể trong luận văn.

Nội dung trong đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ bất cứ Hội đồng khoa học bảo vệ luận văn Thạc sĩ nào và chƣa đƣợc công bố. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan trên.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019

Ngƣời cam đoan

Ngô Đức Duy

LỜI CẢM ƠN

Luận văn đƣợc hoàn thành nhờ vào sự hƣớng dẫn nhiệt tình của Ts Hoàng Quốc Khánh và tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Thầy. Cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi nhất hoàn thành khóa học, Thầy cô Giảng viên và Học Viện Khoa học và Công nghệ.

Cảm ơn Gs Yasuo Igarashi, Gs Masahura Ishii của Trƣờng GSALS (The Graduate School of Agricultural and Life Sciences), Đại học Tokyo Nhật Bản, đã hỗ trợ kỹ thuật và tài chính cho nghiên cứu này thuộc dự án “Kết hợp bền vững nền nông nghiệp địa phƣơng với công nghiệp chế biến biomass” của JICA (Japan International Cooperation Agency), JST (Japan Science and Technology Agency) và Đại học Bách Khoa TP.HCM. Lời cảm ơn những Anh Chị đồng nghiệp; Ts Kouji Yoshida, Ts Mannix Pedro, Makoto Ato, Chihaya Yamada, Đào Thị Thu Hiền, Hoàng Ngọc Phƣơng Thảo, Nguyễn Hoàng An, Nguyễn Ngọc Liên, Ts Nguyễn Hoàng Dũng và các Em trong phòng Vi sinh đã hỗ trợ nhiều trong nghiên cứu. Với những chia sẽ vui buồn từ các bạn Học viên Cao học là động lực cho tôi hoàn thành luận văn.

Đặc biệt gửi lời cảm ơn tới Mẹ Cha, vợ Trần Thị Hồng Vân, con Ngô Đức Anh, Ngô Đức Dũng rất nhiều và Anh Chị trong Gia đình đã luôn ủng hộ tôi trong mọi điều kiện.

Ngô Đức Duy

LỜI NÓI ĐẦU

Hiện nay định danh chủng vi sinh không còn nhiều khó khăn nhƣ trƣớc, vì sự phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại với những phƣơng pháp đa dạng và độ chính xác cao. Phần lớn định loại loài trƣớc đây luôn dựa vào quá trình phân lập thuần chủng hoặc sàng lọc đặc tính quan trọng cho mục đích nghiên cứu. Tuy nhiên có những nghiên cứu đỏi hỏi biết rõ các thành phần loài vi sinh tồn tại trong mẫu vật, quá trình thay đổi thành phần, số lƣợng chủng loài phụ thuộc nhiều vào thành phần cơ chất, điều kiện sống và quá trình trao đổi chất. Trong tự nhiên vi sinh vật rất đa dạng, mức độ thay đổi theo điều kiện môi trƣờng, phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh thông qua việc xác định gene trƣớc tiên dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử.

Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã và đang đƣợc sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực nghiên cứu về gene của công nghệ sinh học, trong đó có kỹ thuật phân tích PCR-DGGE cơ bản tách độc lập riêng biệt mỗi trình tự gene với độ chuẩn xác khác biệt 1 nuclotide. Chính vì vậy mà có thể sử dụng kỹ thuật DGGE xác định cộng đồng vi khuẩn trong mẫu mà không cần giai đoạn phân lập làm thuần chủng, bên cạnh đó có thể kết hợp với kỹ thuật Tạo dòng trong nghiên cứu sẽ giúp hiệu suất nghiên cứu cao hơn và tăng tính ứng dụng đa dạng phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân tích cộng đồng vi sinh vật.

iii

Mục tiêu nội dung của nghiên cứu là sử dụng phƣơng pháp PCR- DGGE và tạo dòng để xác định cộng đồng vi khuẩn trong rơm trƣớc và sau ủ. Nhằm phân tích đánh giá khả năng biến động đa dạng vi khuẩn có trong nguồn rơm ủ dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử . Tạo nền tảng cho việc phân lập, tuyển chọn những loài vi khuẩn nhƣ chịu nhiệt, sinh cellulase và các định hƣớng nghiên cứu ứng dụng cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học trong tƣơng lai.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

APS: Ammonium Persulfate

BA: Bis-Acrylamine

bp: base pairs

CTAB: Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide

DFB: Diffusion buffer

DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

DNA: Deoxylribonucleic acid

dNTPs: Deoxyrinonucleotide triphosphates

EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

PCR: Polymerase Chain Reaction

PFGE: Pulse Field Gel Electrophoresis

RAPD: Random amplified polymorphic DNA

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms

RNA: Ribonucleic acid

SDS: Sodium dodecyl sulfate

TAE: Tris Acetic

TEMED: Tetramethyl ethylene diamine

UF: Urea Formamide

UV: Ultra violet

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất trên Thế giới. .............................. 1

Bảng 1.2. Thành phần cấu tạo chung của rơm rạ. ............................................. 4

Bảng 1.3. Thành phần hóa học chính của rơm rạ. ............................................ 4

Bảng 1.4. Số liệu thống kê sản lƣợng gạo và rơm rạ trên thế giới. .................. 7

Bảng 1.5. Phƣơng pháp PCR với mồi chuyên biệt xác định một số bệnh trên lúa mì. .............................................................................................................. 17

Bảng 2.1. Các cặp mồi cho vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu. ................... 23

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR . ........................................................... 27

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR. ...................................................... 27

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR vùng gene V3. .................................... 28

Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR gene V3. ........................................... 29

Bảng 2.6. Chuẩn bị cách pha nồng độ bảng gel polyacrylamine. ................... 30

Bảng 2.7. Tỷ lệ phối trộn nồng độ gel polyacrylamide vào hai xilanh. .......... 31

Bảng 2.8: Thành phần Big – dye PCR ............................................................ 35

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1.Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Việt Nam……….3

Hình 1.2. Qui trình phân giải cellulose thành glucose. ................................... 10

Hình 2.1. Một số hình ảnh thu nhận lấy mẫu rơm. ......................................... 22

Hình 2.2. Qui trình thực hiện trong nghiên cứu. ............................................. 25

Hình 2.3. Qui trình ly trích và thu nhận DNA từ mẫu rơm. ........................... 26

Hình 2.4. Qui trình thu nhận gene V3 từ gel polyacrylamdie......................... 33 Hình 2.5. Cấu trúc pGEM@-T Easy vector của hãng Omega. ........................ 34

Hình 3.1. Biểu đồ thay đổi nhiệt độ trong qúa trình ủ rơm. ............................ 38

Hình 3.2. Kết quả ly trích thu nhận DNA bộ gene vi sinh trong mẫu R. ....... 39

Hình 3.3. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu R. ........ 40

Hình 3.4. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu R. ...................................... 41

Hình 3.5. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu Rn. ...... 43

Hình 3.6. Kết quả thu nhận sản phẩm tạo dòng. . ........................................... 44

Hình 3.7. Kết quả 32 sản phẩm PCR đoạn gene V3 . ..................................... 45

Hình 3.8. Kết quả 30 sản phẩm DGGE chạy trên hệ thống BioRad .............. 46

Hình 3.9. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu Rn. .................................... 47

Hình 3.10. Thử khả năng sinh cellulase trên đĩa CMC của mẫu Rn. ............. 48

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii

LỜI NÓI ĐẦU ................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...................................... iv

DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ....................................................... vi

MỤC LỤC ...................................................................................................... vii

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 1

1.RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ .............. 1

1.1. Rơm rạ ............................................................................................... 1

1.2. Thành phần cấu tạo rơm rạ ................................................................ 3

1.3. Giá trị kinh tế của rơm rạ .................................................................. 6

1.2. HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM 9

1.2.1. Hệ Enzyme cellulase và cơ chế phân giải cellulose ........................... 9

1.2.2. Hệ vi sinh phân giải cellulose ........................................................... 11

1.3.KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH LOÀI VI SINH ............... 12

1.3.1. Các phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA vi sinh vật ................... 12

1.3.2.1. Kỹ thuật PCR trong trong định danh vi khuẩn ........................................................ 16

1.3.2.2. Kỹ thuật PCR-DGGE trong định danh vi khuẩn ..................................................... 18

1.3.2.3. Kỹ thuật tạo dòng .................................................................................................... 20

1.3.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong định danh ................................ 14

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 21

2.1.VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................... 22

Hóa chất....................................................................................................... 23

Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 24

vii

2.2.CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 24

2.2.1.Phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA ............................................ 26

2.2.2. Phƣơng pháp PCR nhân bản gene 16S rDNA và vùng gene V3 ...... 27

2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm gene V3 ....................................... 29

2.2.4.1. Qui trình chuẩn bị gel polyacrylamine và thực hiện DGGE ................................... 30

2.2.4.2. Quy trình thu nhận sản phẩm DGGE từ gel polyacrylamide .................................. 32

2.2.4.3. PCR gene V3 sau khi thu nhận từ DGGE với cặp mồi 357F và 517R .................... 33

2.2.4. Phƣơng pháp thực hiện kỹ thuật DGGE ........................................... 30

2.2.5. Phƣơng pháp tạo dòng ...................................................................... 34

2.2.6. Giải trình tự gene V3 và xây dựng cây phát sinh loài ...................... 35

2.3. Khảo sát sinh cellulase phƣơng pháp đĩa CMC ................................... 36

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 38

3.1. Kết quả kiểm tra nhiệt độ ..................................................................... 38

3.2. Kết quả thu nhận DNA genome của vi sinh vật trong mẫu rơm ......... 39

3.3. Kết quả thu nhận gene 16S rDNA và gene V3 của mẫu R .................. 40

3.4. Kết quả phân tích dữ liệu cộng đồng vi khuẩn của mẫu R .................. 41

3.5. Kết quả DNA, gene 16S rDNA và gene V3 mẫu Rn ........................... 42 3.6. Kết quả tạo dòng trên vector pGEM@-T Easy của hãng Promega ...... 43

3.7. Kết quả thu nhận vùng gene V3 sau khi đã tạo dòng .......................... 44

3.8. Kết quả kiểm tra gene V3 sau khi tạo dòng bằng kỹ thuật DGGE ...... 45

3.9. Kết quả sơ bộ định tính enzyme cellulase trong mẫu Rn .................... 48

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 50

4.1. Kết luận ................................................................................................ 50

4.2. Kiến nghị .............................................................................................. 50

viii

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 51

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ

1.1. Rơm rạ

Theo thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng của Liên Hợp Quốc (FAO- Food and Agriculture Organization) [1], sản xuất lúa gạo trên thế giới chạm mức kỷ lục 759,6 triệu tấn lúa (503,9 triệu tấn gạo) trong năm 2017 và năm 2018 tiếp tục tăng sản lƣợng thêm 10,3 triệu tấn lên mức cao mới 769,9 triệu tấn lúa (510,6 triệu tấn gạo). Dự báo sản lƣợng sẽ tăng trƣởng 1,4% trong năm 2019, khu vực sản xuất lúa gạo tập trung ở Châu Á là chính, trong đó 2 vùng sản xuất lớn là Nam Á và Đông Nam Á với mức tăng sản lƣợng tuyệt đối lớn nhất đƣợc dự đoán sẽ là Ấn Độ, sản xuất tăng đáng kể ở các nƣớc nhƣ Bangladesh, Sri Lanka, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Philippines và Thái Lan, Việt Nam xem bảng 1.1. Tƣơng ứng với việc tăng trƣởng sản xuất lúa gạo hàng năm thì sản lƣợng rơm rạ đƣợc thải ra ngoài đồng ruộng trên toàn cầu cực kỳ lớn, nhƣng tới nay chƣa có thống kê chính xác về lƣợng rơm rạ thải ra sau thu hoạch lúa, vì tùy thuộc vào văn hóa bản địa, loại giống lúa trồng trọt, vùng canh tác và điều kiện thổ nhƣỡng. Nhƣng tổng thể ƣớc lƣợng trung bình sản xuất ra 1 tấn gạo thì sẽ thải ra khoảng 1,5 tấn rơm rạ.

Bảng 1.1. Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất trên Thế giới.

Khu vực/Quốc gia Số lƣợng gạo Khu vực/Quốc gia Số lƣợng gạo

(triệu tấn) (triệu tấn)

758.9 Châu Phi 686.4 Ai Cặp 210.1 Nigeria 165.3 Madagascar 74.2 Tanzania 53.1 Mali

Thế giới Châu á Trung Quốc Ấn Độ Indonesia Bangladesh Việt Nam Thai Lan 44 Guinea 33.3 Nam Mỹ 30.7 6.2 5.3 3.5 3.1 2.8 2.2 24.9

28.3 Brazil 18.6 Colombia 10.7 Peru 10.3 Bắc Mỹ 9.7 Mỹ 5.5 Trung Mỹ 5.4 Châu Âu 4 Nga

3.1 Úc 11.9 2.6 3.1 9.1 9.1 2.9 4.1 1.1 0.9

Myanmar Philippines Nhật Bản Pakistan Camphuchia Triều Tiên Nepal Lào Malaysia Sri Lanka 3

Việt Nam đã trở thành một trong những nƣớc xuất khẩu gạo đứng đầu trên thế giới hiện nay, tốc dộ tăng trƣởng sản xuất lúa gạo từ những năm 2012 đạt sản lƣợng 43,7 triệu tấn lúa. Đến năm 2018, sản lƣơng tăng lên khoảng 55 triệu tấn, xuất khẩu gạo đạt 6,1 triệu tấn, nâng giá trị 3,06 tỷ USD. Theo dữ liệu thống kê những năm gần đây của Bộ Nông nghiệp Phát Triển Nông thôn Việt Nam, vụ mùa 2015/16 đạt 44,13 triệu tấn lúa, vụ mùa 2016/17 đạt 44,52 triệu tấn và vụ mùa 2017/18 đạt đƣợc 44,96 triệu tấn. Dự kiến năm 2019 diện tích trồng lúa trên cả nƣớc là 7,53 triệu ha, sản lƣợng gạo dự kiến tƣơng đƣơng năm 2018. Bên cạnh đó thống kê của tổ chức GAIN (Global Agriculture Information Network) của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ về diện tích gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Viêt Nam từ năm 1993 đến 2017 tăng trƣởng liên tục cả về diện tích và năng suất xem hình 1.1.

Những nỗ lực đem lại lợi ích từ sản xuất lúa gạo ngày càng gia tăng và tăng thu nhập cho nông dân, nhƣng song song với đó là lƣợng rơm rạ thải ra hàng năm ở nƣớc ta trung bình khoảng 55 triệu tấn. Đây cũng là một thách thức cho việc xử lý giảm thiểu ô nhiễm rơm, bên cạnh đó tận dụng nguồn tài nguyên phế phụ phẩm nông nghiệp ở nƣớc ta. Trong 55 triệu tấn Rơm thải ra hàng năm có khoảng 20% đƣợc sử dụng cho gia sức gia cầm, trồng nấm rơm, phân ủ, còn lại là đốt hoặc bỏ lại trên đồng ruộng gây ô nhiễm môi trƣờng đồng ruộng và lãng phí nguồn tài nguyên tái sinh dồi dào.

Hình 1.1. Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Việt Nam

Vấn đề đặt ra làm nhƣ thế nào và làm sao để tận dụng nguồn tài nguyên tái tạo và dồi dào nhƣ rơm rạ. Để đạt hiệu quả cao thì trƣớc tiên sẽ phân tích phân tích về thành phần cấu tạo và dinh dƣỡng trong rơm.

1.2. Thành phần cấu tạo Rơm

Thành phần cellulose, lignocellulose và lignin là nguồn sinh khối chính của tế bào thực vật nói chung và rơm rạ nói riêng. Rơm là nguồn nguyên liệu đƣợc tái sinh trong tự nhiên, các thành phần cấu tạo rơm có sự thay đổi dựa vào sự phát triển trong các chủng loại lúa, điều kiện thổ nhƣỡng canh tác khác nhau, các yếu tố môi trƣờng khắc nghiệt, côn trùng và mầm bệnh. Thành phần hóa học của rơm tính theo khối lƣợng khô gồm cellulose 60%, lignin 14%, đạm hữu cơ (protein) 3%, chất béo (lipid) 2%. Nếu tính theo nguyên tố thì cacbon (C) chiếm 44%, hydro (H) 5%, oxygen (O) 49%, nitơ (N) khoảng 0,92%, một lƣợng rất nhỏ photpho (P), lƣu huỳnh (S) và kali (K). Theo kết quả phân tích thành phần đƣờng cơ bản chính trong rơm bao

gồm hexose (glucose, galactose, mannose), pentose (xyloza, arabinose), lignin (cả axit hòa tan và không hòa tan), tro, silica. Ngoài ra còn có các thành phần phi cấu trúc chủ yếu bao gồm protein (khoảng 3%) và pectin (khoảng 2,8%) cùng với một lƣợng nhỏ đƣờng tự do, diệp lục, chất béo, dầu và sáp đƣợc nêu trong bảng Bảng 1.2 và 1.3 [2, 3, 4, 5] .

Bảng 1.2. Thành phần cấu tạo chung của rơm rạ.

Hàm lƣợng (w/w%) 34.0 - 43.7 19.0 - 22.0 2.0 - 3.6 1.8 -2.0 0.4 2.2 - 6.0 13.0 - 22.7 7.8 - 20.3 16.1- 19.3

Thành phần Glucose Xylose Arabinose Mannose Galactose Acid soluble lignin Acid insoluble lignin Ash and silica Extractive (i.e., protein, pectin,) other nonstructural components)

Bảng 1.3. Thành phần hóa học chính của Rơm.

Thành phần Đơn vị tính Hàm lƣợng

47.92 6.54 0.53 0.09 44.80 100.00 1,109.4 0.0 0.0

Carbon Hydrogen Nitrogen Sulphur Oxygen Tổng Thành phần hóa học Nguyên tố halogen Chlorine (Cl) Bromine (Br) Fluorine (F) Nguyên tố chính Aluminium (Al) Potassium (K) Sodium (Na) Calcium (Ca) 143.0 8,668.0 162.0 3,899.0 wt% wt% wt% wt% wt% wt% mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry)

6,734.0 571.0 100.0 558.0 3.6

0.0 15.0 1.7 3.0 17.0 1.5 1.0 0.3 6.6 22.5

Silicon (Si) Magnesium (Mg) Iron (Fe) Phosphorus (P) Titanium (Ti) Nguyên tố phụ Cadmium (Cd) Cobalt (Co) Chromium (Cr) Copper (Cu) Manganese (Mn) Nickel (Ni) Lead (Pb) Vanadium (V) Zinc (Zn) Barium (Ba) Nguyên tố khác Strontium (Sr) Boron (B) Tungsten (W) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) 26.0 2.7 13.0

Những kết quả đã phân tích cho thấy rằng thành phần chất xơ trong rơm rạ chủ yếu là cellulose, hemicellulose và lignin. Cellulose gồm nhiều chuỗi thẳng ghép nhau thành bó dài nhờ mạch nối hydrogen tạo cấu tạo dạng sợi, có cấu trúc phân tử là một polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharide gọi là cellobiose, có cấu tạo từ hai phân tử D-glucose.

Các đơn vị D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 và đƣợc giữ chặt bởi liên kết hydro liên chuỗi và liên chuỗi mạnh để tạo thành các vi sợi. Chúng cung cấp độ bền cơ học cho thành tế bào thực vật và có thể dài vài µm trong rơm và đƣờng kính khoảng 12-35nm [6, 7]. Các công bố cho thấy mức độ trùng hợp D-glucose của rơm rạ cao hơn một chút so với dƣ lƣợng nông nghiệp khác nhƣ rơm lúa mì và bã mía nhƣng nó thấp hơn đáng kể so với gỗ cứng và gỗ mềm [8].

Hemicellulose là những heteropolysaccharide cùng với cellulose có ở màng tế bào thực vật, không hòa tan đƣợc trong nƣớc nhƣng hòa tan đƣợc trong dung dịch kiềm và bị thủy phân bởi acid dễ dàng hơn so với cellulose.

Hemicellulose liên kết một phần với lignin bởi các liên kết cộng hóa trị, trong khi đó mối liên kết giữa hemicelluloses và cellulose là thông qua liên kết hydro. Trong dạ cỏ loài động vật nhai lại có những vi khuẩn đặc biệt chứa enzyme cellulase phân giải đƣợc cellulose. Cellulose và hemicellulose là những hợp chất có thể tiêu hóa đƣợc.Nhƣng cấu tạo cellulose trong của vách tế bào rơm rạ qua nhiều liên kết và cấu trúc không gian phức tạp, nên enzyme của hệ vi sinh vật không dễ dàng tác động đƣợc. Lớp ngoài thành tế bào đƣợc tạo thành chủ yếu từ các phức chất lignohemicellulose mà các enzyme vi sinh dạ cỏ phân giải chậm làm cản trở những lớp cellulose bị tác động của hệ enzyme vi sinh vật. Để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa của rơm rạ và các chất xơ khác, các nhà nghiên cứu đã tiến hành xử lý rơm bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ: lý học, hóa học, vi sinh vật [9, 10].

Thành phần thứ ba đáng chú ý trong xơ là lignin, lignin luôn đi kèm với cellulose và hemicellulose trong thành phần tế bào, không hòa tan trong nƣớc, trong các dung môi hữu cơ bình thƣờng và rất bền vững bởi enzyme của hệ sinh vật dạ cỏ. Nhƣng dƣới tác dụng của kiềm thì lignin một phần bị phân giải và chuyển vào dung dịch. Lignin là polymer có nhiều thứ hai trên trái đất sau cellulose, lignin chủ yếu bao gồm ba loại cấu trúc chủ yếu là monolignols, hydroxycinnamyl (p- coumaryl, coniferyl và rƣợu sinapyl) liên kết với nhau bằng các loại liên kết ether và carbon-carbon khác nhau nhƣ β-O-4, 4-O- 5, -, β- 1 và β- 5 để tạo ra các đơn vị phenylpropanoid nhƣ p - hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) và syringyl (S). Trong số này, liên kết β-O-4 là liên kết ether chiếm ƣu thế nhất (khoảng 40 - 60%) trong rơm rạ. Lignin đƣợc gắn vào carbohydrate bởi este benzyl, ete benzen và phenyl glycoside. Do các mối liên kết hóa học và liên kết vật lý chặt chẽ này, rất khó để loại bỏ lignin ở dạng nguyên sinh của nó [11].

1.3. Giá trị kinh tế của rơm rạ

Thành phần đã phân tích ở trên cho thấy nguồn giá trị từ rơm chƣa đƣợc quan tâm đúng mức trong thời gian dài, phần lớn rơm rạ thƣờng để mục, tự phân hủy ở ngoài đồng ruộng hay đốt tại chỗ để trả lại khoáng chất cho ruộng, phần còn lại đƣợc đem về làm thức ăn cho gia súc, phục vụ đun nấu

trong gia đình hay trồng nấm rơm. Hơn 20% rơm đƣợc sử dụng trong khi khoảng 50% rơm bị đốt cháy hoặc để lại trên đồng ruộng, họ sẵn sàng cho vụ mùa tiếp theo. Đốt rơm không những ảnh hƣởng khí nhà kính mà còn ô nhiễm độc hại đã đƣợc báo cáo mà còn góp phần đến hen suyễn và các rối loạn hô hấp khác ở trẻ nhỏ và ngƣời già [12, 13]. Do đó, cần phải phát triển các giải pháp nghiên cứu mới nhằm tận dụng rơm để nông dân nhận đƣợc lợi nhuận cao hơn cho việc thu gom từ ruộng và kềm chế đốt rơm gây thêm ô nhiễm môi trƣờng.

Năm 2009, dữ liệu báo cáo của Tổ chức Nông Lƣơng của Liên Hợp Quốc lúa đƣợc trồng chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, tuy nhiên một số ít sản xuất lúa ở vùng khí hậu Địa Trung Hải. Khu vực sản xuất lúa gạo tập trung ở Châu Á là chính, trong đó 2 vùng sản xuất lớn là Nam Á và Đông Nam Á. Đối với lúa mì, các nhà sản xuất chính đƣợc đặt tại Nam Á, Đông Âu, Bắc Mỹ và Đông và Trung Á. Đối với Liên minh châu Âu, lúa mì là loại cây trồng chiếm ƣu thế hơn so với trồng lúa gạo.Thống kê sản lƣợng lúa gạo và sản lƣợng rơm đƣợc tạo ta trên toàn thế giới nêu trong bảng 1.4.

Bảng 1.4. Số liệu thống kê sản lƣợng gạo và rơm rạ trên thế giới (FAO).

Diện tích(ha) Gạo (tấn) Rơm rạ (tấn)

Thế giới 684,595 158,511 727,400

Nam Á 202,889 59,449 215,600

Đông Nam Á 197,777 48,203 210,100

Tây Á 216,630 32,999 230,200

Đông Á 10,392 5,114 11,000

Nam Mỹ 25,568 5,253 27,200

Đông Phi 6,701 3,147 7,100

Trung Phi 663 691 700

Bắc Phi 5,593 590 6,000

3,152 462 3,350 Liên Minh Châu

Âu

Caribbean 1,246 1,300 456

Nam Âu 2,906 3,100 418

Trung Mỹ 1,228 1,300 326

Đông Âu 1,183 1,250 225

Trung Á 696 740 193

Tây Á 927 990 153

Tây Âu 138 150 24

Châu Đại Dƣơng 82 90 14

Nam Phi 3 3 1

Lƣợng lớn rơm hàng năm trên toàn cầu xem nhƣ là nguồn nhiên liệu vô cùng lớn. Nhiều khía cạnh phân tích đã công bố về thành phần rơm đã cho thấy những giá trị kinh tế nguồn phụ phẩm nông nghiệp đem lại rất lớn và đa dạng để sản xuất dầu sinh học, than sinh học và khí sinh học từ rơm rạ. Dầu sinh học rơm rạ đã đƣợc báo cáo bao gồm một số thành phần phụ nhƣ ketone, aldehyd, axit carboxylic, phenol, furfural và levoglucosan, ngoài ra than sinh học đƣợc sản xuất từ rơm tạo độ phì của đất, tăng lƣu trữ carbon và giảm phát thải khí nhà kính. Năng suất, chất dinh dƣỡng, hàm lƣợng chất dễ bay hơi, khả năng trao đổi ion dƣơng, kali và phốtpho có sẵn hàm lƣợng than sinh học giảm khi tăng nhiệt độ nhiệt phân, độ kềm và hàm lƣợng chất thơm. Than sinh học có nguồn gốc từ rơm cho thấy khả năng hấp thụ ion Cu (II) và cyromazine, một loại thuốc trừ sâu hữu cơ [14, 15, 16]. Quá trình khí hóa rơm rạ để xử lý chất thải gần đây đã thu hút đƣợc sự quan tâm để sản xuất khí Hydro và Metan. Rơm cũng đƣợc sử dụng làm nhiên liệu cho nồi hơi để sản xuất điện và phân tích kinh tế kỹ thuật cho thấy rằng đó là một lựa chọn khả thi để tạo ra điện nông thôn dựa trên lƣới điện nhỏ ở vùng sâu vùng xa và các Quốc gia đang phát triển.

Khi mà vấn đề biến đổi khí hậu toàn cầu trở nên nóng bỏng thì việc sử dụng khối lƣợng lớn rơm cho hợp lí là điều mà các nhà khoa học đang quan

tâm đến, trong đó các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc tận dụng nguồn nhiên liệu cellulose trong rơm để nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học (biofuels) cho tƣơng lai nhằm thay thế nguồn tài nguyên dầu mỏ ngày cạng kiệt.

Trong thành phần chính của rơm chủ yếu vẫn là cellulose và sản phẩm phân giải cuối cùng có giá trị là D-glucose, cho nên việc phân giải và thu nhân sản phẩm glucose làm nguồn nguyên liệu khác đã đƣợc quan trong nhiều nghiên cứu. Trong đó có phƣơng pháp hóa học là phân hủy và thu nhận cellulose mà còn phƣơng pháp sinh học là sử dụng sự phân giải tự nhiên của hệ enzyme đƣợc sinh ra từ hệ vi sinh vật đƣợc quan tâm nhiều hơn.

1.2. HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM RẠ

1.2.1. Hệ Enzyme cellulase và cơ chế phân giải cellulose

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật trong điều kiện yếm khí và hiếu khí trong thời gian dài và sản phẩm phân giải cuối cùng là glucose. Quá trình này diễn ra do nhiều nhóm vi sinh vật sinh tổng hợp các loại enzyme có trong phức hệ enzyme cellulase phân giải cellulose. Chính vì thế, sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thƣờng rất chậm và không triệt để. Sự tham gia enzyme phân hủy cellulose đƣợc các nhà khoa học chia ra làm ba nhóm chủ yếu nhƣ sau [17, 18].

1,4 β-D-Glucan cellobiohydrolase: enzyme cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzyme này còn có một loạt tên khác nhƣ: cellobiosehydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase. Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng.

1,4β-D-glucan 4 glucanohydrolase: enzyme này tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin và β-Dglucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose.Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh.

Enzyme này còn có tên khác nhƣ: endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase và C- cellulase.

β-D-glucoside glucohydrolase: enzyme này tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose. Trong các tài liệu khoa học chúng còn có tên là cellobiase và β-glucosidase.

Sự thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzyme exoglucanase, endoglucanase, β-glucosidase. Trong những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đều đƣa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay nhau thủy phân cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose xem hình 1.2.

Hình 1.2. Qui trình phân giải cellulose thành glucose.

Phân giải cellulose cơ bản là quá trình sinh học đƣợc tạo ra và kiểm soát bởi các enzyme cellulase. Cellulase là enzyme đa dạng với chức năng xúc tác cho một phản ứng đơn, nó đóng vai trò trong phản ứng thủy phân cầu

nối β-1, 4 giữa hai phân tử glucose cấu tạo nên cellulose. Hệ thống enzyme cellulase bao gồm ba lớp enzyme ngoại bào có thể hòa tan là: 1, 4-β- endoglucanase, 1, 4-β-exoglucanase, và β-glucosidase (β-D-glucoside, glucohydrolase hoặc cellobiase). Endoglucanase chịu trách nhiệm trong sự phân cắt ngẫu nhiên liên kết β-1, 4-glycosidic dọc theo chuỗi cellulose. Exoglucanase thì cần thiết cho sự phân cắt đoạn cuối chuỗi không biến đổi và phân tách các sợi cơ bản của tinh thể cellulose, và β-1, 4-glucosidase thủy phân cellubiose và cellodextrin hòa tan thành glucose. Trên thực tế, mặc dù đều sử dụng cơ chất cellulose nhƣng cơ chế phân giải cellulose của các loài vi sinh vật rất khác nhau [19, 20, 21].

1.2.2. Hệ vi sinh phân giải cellulose

Nhiều nghiên cứu phân lập dòng vi sinh sản sinh enzyme cellulase và khả năng phân giải cellulose từ các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm là chủ yếu. Đa số các nghiên cứu tập trung vào nhóm vi sinh vật phân giải cellulose chủ yếu đƣợc phân lập từ hệ tiêu hóa động vật ăn cỏ nhƣ bò, trâu, cừu, dê và côn trùng nhƣ bọ cánh cứng, mối, trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nƣớc thải [22, 23, 24].

Siphonobacter ruminatium,

Nhóm Vi khuẩn phân giải cellulose tập trung ở các loài vi khuẩn yếm khí, chúng đƣợc phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng nguồn thức ăn chính là cỏ, cây, rơm rạ các nhóm chính sau; Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Pseudomonas nitroreducens. Ngoài ra còn một số nhóm đƣợc phân lập từ đất nhƣ; Brevibacillus, Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus [25, 26].

Nhóm Xạ khuẩn đƣợc biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh nhƣ streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin. Bên cạnh đó xạ khuẩn còn có vai trò quan trọng trong công nghiệp dƣợc phẩm cũng nhƣ trong nông nghiệp. Trong đó số loài đáng chú ý lividans, Streptomyces reticuli, thuộc giống này nhƣ Streptomyces tích nhƣ Streptomyces drozdowiczii. Còn nhóm thu nhận trầm từ

Thermoactimnomyces, Streptosporangium cũng là những loài có khà năng phân hủy cellulose [27, 28, 29, 30, 31].

Nhóm Nấm đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy cellulose do các cellulase từ nấm thƣờng có hoạt lực cao hơn và ít có các dạng vật lý phức tạp nhƣ enzyme này từ vi khuẩn nhƣ; Acremonium sp., Chaetomium sp., Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Penicillium pinophilum, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus và Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy cellulose ở nhiều điều kiện môi trƣờng khác nhau. Trong đó nhóm đáng chú ý nhất là nhóm Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Mucor hầu nhƣ các loài này sống hoại sinh trong xác thực vật nhƣ trên tre, nứa, gỗ tạo thành lớp mốc màu xanh phá hủy các vật liệu trên. Mỗi nhóm tiết ra mỗi loại enzyme trong hệ enzyme cellulase, chúng phối hợp với nhau để phân giải cơ chất trong mối quan hệ hỗ sinh [32].

1.3. KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH LOÀI VI SINH

1.3.1. Các phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA vi sinh vật

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lƣợng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận đƣợc các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trƣờng khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần đƣợc tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (Desoxyribonuclease - DNase và Ribonuclease- RNase) [33, 34].

Nhiều phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA bộ gene của vi sinh vật, nhằm mục đích phục vụ cho các nghiên cứu ở cấp độ gene. Tuy nhiên đa số các mẫu ly trích thu nhận DNA bộ gene của mỗi chủng loài dựa trên dòng thuần chủng nhằm trách sự tạp nhiễm gene của các loài với nhau. Do đó, giai

đoạn tách chiết và thu nhận DNA vi sinh vật phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Quá trình này cần phải đảm bảo về độ tinh khiết, nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện đƣợc các khâu nghiên cứu tiếp theo. Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phƣơng pháp ly trích thu nhận DNA cho phù hợp.

Phƣơng pháp Benzyl Chloride: Đây là phƣơng pháp ly trích DNA tƣơng đối hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến 650C. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại kết quả khá cao. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để ly trích DNA của cả thực vật, nấm và vi khuẩn [35].

Phƣơng pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): đƣợc xem là phƣơng pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với hiệu quả cao, ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyl trimethyl ammonium bromide, proteinase K.

Bên cạnh đó phƣơng pháp sốc nhiệt: Phƣơng pháp này sử dụng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở - 650C trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trƣờng tự nhiên [36].

Phƣơng pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phƣơng pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic với nồng độ muối cao (1,5 M NaCl). vì vậy mà CTAB đƣợc dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic và độ phá hủy vách tế bào rất cao, tuy nhiên CTAB mang tính chất độc với môi trƣờng và sức khỏe. [37].

So sánh các phƣơng pháp ly trích DNA từ vi khuẩn trong đất, vùng rễ, phƣơng pháp SDS cho kết quả tốt nhất cả về khối lƣợng lẫn độ tinh sạch. Phƣơng pháp SDS cho kết quả tốt là do sử dụng proteinase K phá vỡ hiệu quả thành tế bào của vi sinh vật để giải phóng DNA dễ dàng. Phƣơng pháp CTAB mặc dù không làm giảm khối lƣợng DNA chiết xuất từ đất vùng rễ nhƣng độ tinh sạch chƣa cao và DNA bị ảnh hƣởng bởi nồng độ muối cao. Phƣơng pháp

đóng băng và tan băng it gây đứt gãy DNA nhƣng hiệu quả ly trích lại thấp. báo cáo rằng sự kết hợp giữa việc nghiền, phƣơng pháp đóng băng và tan băng, và phƣơng pháp SDS có thể thu đƣợc khối lƣợng DNA cao hơn nhiều mà không ảnh cũng loại hƣởng đến độ nguyên vẹn về cấu trúc DNA [38].

Nhiều nghiên cứu phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA bộ gene vi khuẩn trực tiếp từ mẫu rơm nhằm để giữ nguyên cộng đồng vi sinh hiện diện trong mẫu, trong các điều kiện hiều khí và yếm khí đang đƣợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Việc ủ rơm và phân tích trong các giai đoạn khác nhau sẽ cho ra các kết quả về cộng đồng vi sinh khác nhau. Ngoài ra, pH của mẫu cũng làm thay đổi cộng đồng vi sinh đã đƣợc kiểm tra bằng cách sử dụng phƣơng pháp in vitro [39, 40]. DNA vi khuẩn có trong rơm trƣớc khi ủ và trong các giai đoạn ủ dài ngày, sử dụng kết hợp các phƣơng pháp nghiền mẫu trong nitơ lỏng, dùng đệm ly trích CTAB, đóng băng và tan băng, sau đó bổ sung proteinase K và SDS [41]. DNA tổng số thu đƣợc đem tinh sạch bằng phƣơng pháp của sử dụng Sephadex G-200. Một nghiên cứu khác về ly trích DNA của vi sinh vật phân giải cellulose bằng phƣơng pháp Benzyl Chloride, sau đó để loại bỏ thành phần tạp có trong mẫu chiết xuất bằng cách sử dụng Genclean spin kit (BIO101, Carlsbad, Calif.) ở giai đoạn tinh sạch [42].

1.3.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử và vùng gene trong định danh

Để xác định tất cả các loài đã sống hoặc tồn tại trên hành tinh trái đất này, một số tiêu chí ban đầu nhƣ đặc điểm hình thái hình thành nên cơ sở của nhận dạng nhƣng sau đó các tính năng khác nhƣ sinh hóa, sinh lý và sinh học phân tử đƣợc ghi nhận phải có. Cho đến nay, hơn 1,5 triệu loài động vật, thực vật và vi sinh vật đã đƣợc định danh và ƣớc tính số lƣợng các loài sống chƣa đƣợc mô tả có thể là hơn 3 triệu, đa số là nhóm vi sinh vật. Các nhà phân loại học cho rằng ít nhất 50 triệu loài sinh vật khác nhau đã bị tuyệt chủng trong quá trình tiến hóa. Mỗi loài sinh vật có thể tồn tại ở nhiều dạng khác nhau, chúng có thể đƣợc tìm thấy ở hai giới tính khác nhau, nhóm tuổi, hình thức theo mùa và các biến thể kiểu hình khác.

Trong phân loại phân tử, có thể nghiên cứu cả DNA và RNA, các kỹ thuật chính đã đƣợc sử dụng trong hệ thống bao gồm xây dựng bản đồ giới

hạn và phân tích RAPD, RFLP, lai DNA-DNA, lai DNA-RNA và giải trình tự bộ gene. Kỹ thuật RFLP đƣợc coi là phƣơng pháp nhạy cảm nhất để xác định chủng và một số sinh vật đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi bằng cách sử dụng kỹ thuật này. RFLP là một kỹ thuật khai thác các biến thể trong chuỗi DNA tƣơng đồng. Phƣơng pháp PFGE và PCR đƣợc sử dụng để mô tả các loài sinh vật, trong đó PFGE sử dụng các enzyme cắt giới hạn phân tử DNA để tạo ra một kiểu đặc trƣng nhằm so sánh hai loài khác nhau dựa trên tính tƣơng đồng hoặc không giống nhau giữa chúng. Phƣơng pháp PCR, một đoạn DNA duy nhất đƣợc khuếch đại có thể là một gen mã hóa protein hoặc gen rRNA cụ thể hoặc một phần của nó trong vùng gene bảo tồn phân loại. Lai phép DNA với DNA dựa trên mức độ tái tổ hợp hai mạch với nhau với các thành viên của cùng một loài cho thấy sự lai tạo cao nhất và xa loài cho tỷ lệ lai ít hơn. Trình tự RNA cũng cung cấp cơ sở cho việc xác định hai loài riêng biệt, 16S rRNA và 18 SrRNA là một phần của tiểu đơn vị ribosome của tế bào nhân sơ và tế bào nhân chuẩn đƣợc phân lập và giải trình tự [43, 44].

Phân loại gene RNA ribosome là tiêu chuẩn vàng cho nghiên cứu phân loại phân tử trong nhiều thập kỷ. Đặc biệt, gene tiểu đơn vị ribosome 16S (16S rRNA), đã đƣợc sử dụng rộng rãi để nghiên cứu và mô tả các thành phần cộng đồng vi khuẩn trong nhiều loại hệ sinh thái bao gồm các cộng đồng liên kết với vật chủ, nhƣ hệ vi sinh vật nội sinh của con ngƣời, vật chủ các cộng đồng tự do, nhƣ môi trƣờng đất và đại dƣơng. Đầu tiên, nó có mặt khắp nơi trong cuộc sống thuộc nhóm Prokaryotic. Thứ hai, kích thƣớc và mức độ bảo tồn chức năng cao của nó dẫn đến tỷ lệ đột biến trong suốt quá trình tiến hóa của sinh vật nhân sơ. Thứ ba, và quan trọng nhất, gen 16S rRNA bao gồm cả các khu vực đƣợc bảo tồn, có thể đƣợc sử dụng để thiết kế các đoạn mồi khuếch đại trên khắp các đơn vị phân loại, cũng nhƣ 9 khu vực (V1 - V9), có thể đƣợc sử dụng một cách hiệu quả để phân biệt giữa các đơn vị phân loại.

Hiện nay các nghiên cứu hiện đại thƣờng dựa vào phân tích các chuỗi RNA ribosome 16S để xác định phân loại các chủng vi khuẩn, loại phân tích này đã trở thành một tiêu chuẩn thực tế cho phân loại sinh vật nhân sơ. Trong đó gene rRNA 16S dài khoảng 1600bp và bao gồm 9 vùng có khả năng bảo

tồn khác nhau (V1-V9). Trong đó các khu vực bảo thủ hơn rất hữu ích để xác định các phân loại cao hơn, trong khi các khu vực tiến hóa nhanh hơn có thể giúp xác định chi hoặc loài. Phân tích so sánh các cộng đồng vi khuẩn từ các vùng sinh thái riêng biệt ở hồ Baikal đƣợc tiết lộ bằng phân tích siêu dữ liệu sử dụng các đoạn V2-V3 và V3-V4 của gen rRNA 16S. Tổng DNA đƣợc chiết xuất từ các mẫu sinh học, đƣợc khuếch đại độc lập bằng cách sử dụng các cặp mồi đƣợc thiết kế cho các đoạn V2-V3 và V3-V4 và đƣợc giải trình tự, sau đó ƣớc tính thành phần cộng đồng và đa dạng vi khuẩn bằng phƣơng pháp tin sinh học. Kết quả của nghiên cứu cho thấy rằng để ƣớc tính cộng đồng vi khuẩn đa dạng phân loại bằng cách sử dụng 16S rRNA, trong đó đoạn V2-V3 có độ phân giải cao nhất cho các phân loại bậc thấp (loài và chi). Điều này cho biết rằng các công bố sự dụng gene 16S rRNA và vùng gene V3 cho việc định danh loài có độ chính xác cao [73].

Kỹ thuật sinh học phân tử ngày nay đã phát triển mạnh và giúp đƣa những nghiên cứu đi sau vào vai trò chứng năng nguồn gốc của gene, trong đó đóng góp rất lớn trong định danh loài ngày càng chính xác hơn ở các vùng gene phân loại loài.

1.3.2.1. Kỹ thuật PCR trong trong định danh vi khuẩn

Ở lĩnh vực sinh học phân tử thì PCR là một kỹ thuật có mặt khắp nơi đƣợc sử dụng rộng rãi cho mục đích chẩn đoán và nghiên cứu sinh học phân tử. PCR là sự khuếch đại trong ống nghiệm của các chuỗi axit nucleic cụ thể bằng enzyme DNA polymerase. Kỹ thuật PCR đƣợc Kary Mullis chuyển đổi vào năm 1983, khi ông mở rộng việc sử dụng một loại polymerase bền nhiệt với chu kỳ nhiệt độ. Phổ biến của PCR là nó khuếch đại một lƣợng nhỏ các chuỗi axit nucleic mục tiêu, thu đƣợc một lƣợng sản phẩm có thể phát hiện đƣợc bằng các phƣơng pháp trực tiếp quan hóa axit nucleic trên gel agarose và kết quả là hàng triệu bản sao của mẫu gốc [45, 46].

Kỹ thuật PCR ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và cả y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, nhƣ phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng vân tay DNA, phát hiện vi khuẩn hay virus ở nồng độ thấp trong các mẫu môi trƣờng và bệnh phẩm, tách dòng gen, và xác định

huyết thống. Đó là những ƣu điểm mà từ khi kỹ thuật PCR đƣợc ứng dụng cho tới ngày nay.

Trong một số trƣờng hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện đƣợc với nhiều loài vi sinh vật hoặc virus hoặc trong trƣờng hợp khác là cần thời gian nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho việc lai hoặc xác định loài. PCR ra đời đã khắc phục đƣợc những khó khăn này, khuếch đại những đoạn gen đặc trƣng của các loài vi sinh vật nghiên cứu dựa trên những cặp mồi đặc trƣng của từng loài vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật đều có những cặp mồi chuyên biệt để có thể dựa vào đó chúng ta có thể dễ dàng xác định đƣợc chúng. Ví dụ phƣơng pháp PCR xác định một số bệnh nấm trên lúa mì đƣợc nêu trong bảng 1.5 [47].

Gene mục tiêu

Chiều dài gene

Cặp mồi Fusarium graminearum

Trình tự đoạn mồi

SCAR

332

GCAGGGTTTGAATCCGAGAC

AGAATGGAGCTACCAACGGC

UBC85F410 UBC85R410

400 –

SCAR

CTCCGGATATGTTGCGTCAA

500

Fg16F Fg16R

GGTAGGTATCCGACATGGCAA

IGS

500

GTTGATGGGTAAAAGTGTG

Fgr-F Fgc-R

CTCTCATATACCCTCCG

gaoA

435

ACCTCTGTTGTTCTTCCAGACGG

CTGGTCAGTATTAACCGTGTGTG

GOFW GORV Fusarium culmorum

SCAR

472

ATGGTGAACTCGTCGTGGC

CCCTTCTTACGCCAATCTCG

OPT18F470 OPT18R470

SCAR

570

ATGGTGAACTCGTCGTGGC

Fc01F Fc01R

CCCTTCTTACGCCAATCTCG

SCAR

340

TCGATATACCGTGCGATTTCC

TACAGACACCGTCAGGGGG

Fcg17F Fcg17R 175F

ITS

245

Tác giả Schilling et al., 1996 Nicholson et al., 1998 Jurado et al., 2005 Biazio et al., 2008 Schilling et al., 1996 Nicholson et al., 1998 Nicholson et al., 1998 Mishra et al.,

TTTTAGTGGAACTTCTGAGTAT

Bảng 1.5. Phƣơng pháp PCR với mồi chuyên biệt xác định một số loài gây bệnh trên lúa mì.

430R

AGTGCAGCAGGACTGCAGC

IGS

200

GACTATCATTATGCTTGCGAGAG

Fcu-F Fgc-R

CTCTCATATACCCTCCG

SCAR

144

TTCTTGCTAGGGTTGAGGATG

Fc03 Fc02

2003 Jurado et al., 2005 Sanoubar et al., 2015

GACCTTGACTTTGAGCTTCTTG

Tƣơng tự ứng dụng PCR cho định danh trên nhóm vi khuẩn, sử cặp mồi 27F và 1495R để khảo sát vùng 16S-rDNA của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ nho [48], cũng sử dụng cặp mồi này khảo sát vùng 16S-rDNA của họ vi khuẩn Azotobacteraceae gồm 7 loài thuộc chi Azotobacter và 3 loài thuộc chi Azomonas [49]. PCR với một cặp mồi, U1 (5’- CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’) và U2 (5’- ATC GG(C/T) TAC CTT GTT CAG ACT TC-3’) có khả năng khuếch đại một phần của gen 16S rRNA của Eubacteria [50]. Với cặp mồi Xan1330 đƣợc thiết kế trên vùng 16S-23S xác định Xanthomonas sp [51]. Tuy nhiên phƣơng pháp PCR cũng còn nhiều hạn chế vì tính đặc hiệu phân loại chƣa cao, cùng với nhiều phƣơng pháp mới có độ đặc hiệu cao hơn.

1.3.2.2. Kỹ thuật PCR-DGGE trong định danh vi khuẩn

PCR-DGGE là kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản, đƣợc công bố lần đầu đầu tiên bởi Fischer và Lerman [52], phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi về nucleotide trong cấu trúc mạch DNA. Phƣơng pháp PCR-DGGE là sự kết hợp của kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại các gene đặc hiệu và kỹ thuật DGGE điện di biến đổi liên tục nồng độ gel acrylamide cho phép phân tách các sản phẩm PCR có sự thay đổi nucleotides trong mạch DNA. Kỹ thuật DGGE cho phép phân tách các sản phẩm đoạn gene có cùng kích thƣớc nhƣng có sự thay đổi nucleotides trong mạch gene đó. Phƣơng pháp này cũng đã đƣợc ứng dụng khá phổ biến trong việc xác định đa dạng cộng đồng vi sinh vật trong môi trƣờng với các điều kiện sinh thái khác nhau.

Phân tích cộng đồng vi khuẩn bằng kỹ thuật DGGE đƣợc áp dụng rộng rãi để nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn bằng sinh học phân tử liên quan đến đoạn gen 16S-rDNA, những đoạn gen thể hiện cả cộng đồng vi sinh nên tránh

việc phân tích một hệ vi sinh quá rộng, ngƣời ta thƣờng thực hiện nghiên cứu trên đoạn ngắn đặc hiệu hơn cho vi khuẩn là vùng V3 của đoạn 16S-rDNA đƣợc chọn trong phân tích DGGE [53]. Các nghiên cứu cộng đồng vi khuẩn liên quan đến các vùng biến đổi trên đoạn gen16S-rDNA với những cặp mồi đã đƣợc ứng dụng rất đa dạng nhƣ phân tích cộng đồng vi sinh vật trong hồ chứa dầu nhiệt độ cao [54]. Một số nghiên cứu gần đây nhƣ, xác định cộng đồng xạ khuẩn trong đất Antarctic từ vùng Barrientos của Island bằng PCR- DGGE [55]. Phân tích cộng đồng tuyến trùng từ đất bằng kỹ thuật DGGE [56]. So sánh trực tiếp phƣơng pháp SSCP và DGGE tới đặc điểm cộng đồng vi sinh dựa trên đọan gene 16S rRNA [57]. Khảo sát sự đa dạng hệ vi sinh vật trong biểu mô dạ cỏ của bò bằng phƣơng pháp DGGE [58]. Sử dụng DGGE phân tích đoạn 16S rDNA cộng đồng vi sinh vật cổ sinh khí methan từ đất ruộng [58]. Ngoài ra tác giả Cheon đã ứng dụng phƣơng pháp Tạo dòng ngẫu nhiên phân tích cộng đồng vi khuẩn trong phân giải kỵ khí ở quy mô công nghiệp [59]. Một nghiên cứu của đã thành công khi sử dụng kỹ thuật PCR - DGGE phân tích hệ vi sinh vật lên men kỵ khí rơm rạ. Cùng nghiên cứu về hệ vi sinh phân giải rơm rạ có báo cáo cũng đã sử dụng kỹ thuật này xác định và giải trình tự các chủng vi khuẩn lên men kỵ khí rơm rạ trong quá trình phát triển của chúng [60]. Sử dụng cặp mồi 357F-GC và 517R xây dựng cây di truyền cộng đồng vi khuẩn có trong mẫu rơm rạ trƣớc khi ủ và trong quá trình ủ lâu ngày [61]. Còn nhiều nghiên cứu cặp mồi 341F-GC và 581R cho sản phẩm khuếch đại ở cả 6 dòng vi khuẩn nuôi thuần chủng. Sau đó, cặp mồi này đƣợc dùng để nghiên cứu về cộng đồng vi khuẩn có trong thức ăn, ruột và phân giun. Kích thƣớc trung bình của sản phẩm khuếch đại là 600bp có thể quá dài để phân tích DGGEđạt hiệu quả, cho nên việc dùng cặp mồi 341F-GC và 581R là phù hợp hơn cho kỹ thuật này vì sản phẩm khuếch đại khoảng 240bp của vùng V3 trên đoạn gen 16S-rDNA.Từ những nghiên cứu tƣơng tự đó, có thể so sánh hệ vi khuẩn trong các nghiên cứu và làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo.

Các công trình công bố trong nƣớc hiện nay về kỹ thuật DGGE trong những năm gần đây đã đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng vi sinh ở các mẫu vật và hệ sinh cảnh khác nhau cũng nhƣ; xác định đa dạng vi khuẩn trong

bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ thuật PCR-DGGE [62], sử dụng kỹ thuật điện di trên gel gradient biến tính để nghiên cứu đa dạng vi sinh vật [63], sử dụng phƣơng pháp điện di gel gradient biến tính để xác định mức độ đa dạng của vi sinh vật trong các công thức thử nghiệm xử lý đất ô nhiễm chất độc hóa học [64], phân tích cộng đồng vi khuẩn trong phân ủ bằng phƣơng pháp DGGE và sử dụng kỹ thuật PCR- DGGE phân tích cộng đồng vi khuẩn trong Rơm rạ tại huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp [65,66]. Những dữ liệu nghiên cứu đã công bố trên đây cho thấy tính hữu dụng của phƣơng pháp DGGE ngày càng đƣợc nhiều sự quan tâm nghiên cứu ứng dụng đa dạng hơn, trong đó có ứng dụng trong định loài tính đa dạng của cộng đồng vi sinh.

1.3.2.3. Kỹ thuật tạo dòng

Phƣơng pháp tạo dòng chủ yếu tập trung vào các nghiên cứu phân lập và kiểm tra sự biểu hiện gene. Xác định thành phần, cấu trúc của protein đƣợc mã hóa bởi đoạn DNA cụ thể, biểu hiện gen của eukaryote trong tế bào prokaryote, nghiên cứu sự biểu hiện của mRNA, cDNA (complementary DNA, copy DNA) đƣợc tạo từ mRNA trƣởng thành (mature mRNA) sử dụng enzyme phiên mã ngƣợc là Reverse transcriptase.

Thƣ viện cDNA nhất thiết phải tạo dòng cDNA tức là tạo số lƣợng lớn bản sao cDNA dựa vào cấu trúc của mRNA hoặc lƣợng nhỏ cDNA. Việc thực hiện công việc tổng hợp cDNA nguồn từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR, chủ yếu dựa vào 2 phƣơng pháp tạo dòng cDNA: phƣơng pháp tạo dòng cDNA bằng plasmid với vật chủ là E.coli, và phƣơng pháp tạo dòng cDNA bằng bacteriophage lambda [67].

Ứng dụng tạo dòng trong nhân bản gen đã tạo ra một tác động to lớn đến tốc độ nghiên cứu sinh học và nó đang gia tăng sự hiện diện của nó trong một số lĩnh vực của cuộc sống hàng ngày nhƣ; nhân bản vô tính là phƣơng pháp tạo ra các gen giống hệt nhau. Ứng dụng y tế nhƣ trong y học, trị liệu ung thƣ, sinh học phân tử, lập bản đồ gen và genom ở động vật, di truyền cây và bộ gen, bộ gen chuột, nghiên cứu bộ gen, tiến bộ trong hóa học protein và sinh học cấu trúc, tổng hợp vitamin, hormone và kháng sinh. Ứng dụng nông

nghiệp: nhân bản vô tính trong vi khuẩn tạo điều kiện cố định đạm trong cây, chuyển gene kháng bệnh.

Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tạo dòng hiện nay chủ yếu dùng vào việc chuyển gene nhằm sản xuất sản phẩm thứ cấp hay kiểm tra biểu hiệu gene mục tiêu là chủ yếu. Hiện nay sự kết nghiên cứu sử dụng kỹ thuật tạo dòng và PCR-DGGE để phân tích cộng đồng vi khuẩn chƣa công bố. Mục tiêu của nghiên cứu này là sử dụng cả hai kỹ thuật PCR- DGGE và tạo dòng trong cùng một phân tích cộng đồng vi khuẩn trong rơm rạ. Nhằm định hƣớng sử dụng các công cụ sinh học phân tử hiện đại phân tích cộng đồng vi khuẩn, đánh giá sự hiện diện và biến động đa dạng vi khuẩn trong mẫu.

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Vi sinh Ứng dụng của Viện Sinh học Nhiệt Đới, số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, Khu phố 6, phƣờng Linh Trung, quận Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh và Phòng nghiên cứu GSALS, Đại Học Tokyo, Nhật Bản.

Vật liệu nghiên cứu: Mẫu rơm rạ dùng làm cơ chất trồng nấm Rơm thu nhận tại ấp Định Mỹ, xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp. Một số hình ảnh thu nhận mẫu rơm chƣa ủ ngay sau thu hoạch và gom lại trong ngày xem hình 2.1.A và thu nhận mẫu rơm sau khi ủ và trƣớc khi lên luống trồng nầm Rơm ở hình 2.1E ở độ sau trong ụ rơm ủ khoảng 50cm.

Các thông số diện tích của ụ rơm ủ có chiều dài khoảng 17-20m, chiều rộng 5-6m và chiều cao 1.2-1.5m xem hình 2.1C. Nhiệt độ đo ụ rơm ủ trong suốt giai đoạn ủ.

Hình 2.1. Một số hình ảnh thu nhận lấy mẫu Rơm.

A. Hình ảnh thu mẫu Rơm trƣớc khi ủ.

B. Hình ảnh ngƣời dân chuyển Rơm từ ghe lên nơi ủ.

C. Hình ảnh ụ rơm chuẩn bị ủ.

D. Hình ảnh đo nhiệt độ suốt trong giai đoạn ủ.

E. Hình ảnh thu mẫu Rơm sau hoàn tất giai đoạn ủ trƣớc khi trồng Nấm

Rơm.

F. Hình ảnh luống Rơm chuẩn bị cấy meo Nấm rơm.

Hóa chất

Agar CMC 1% (Carboxymethylcellelose Sodium Salt): CMC 10g,

Agar 20g, Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml. Thuốc nhuộm Congo red 0.1%: Congo red 0,5 g/500ml H2O.

Các hóa chất dùng trong ly trích DNA: Lysis buffer (100 mM Tris HCl, pH = 8; 100 mM sodium EDTA, pH = 8; 100 mM, sodium phosphate, pH = 8; 1,5 M NaCl và 1% CTAB), Proteinase K (10 mg/ml), SDS 20%, Chloroform/isoamyl alcohol (24:1), isopropanol, ethanol 70% lạnh, nƣớc cất 2 lần.

Các hóa chất dùng trong tinh sạch DNA: Bộ Kit QIAquick PCR Purification Kit (hãng QIAGEN) tinh sạch sản phẩm PCR vùng V3 của đoạn gen 16S-rDNA. Bộ Kit Gel Extraction of QIAEX II Kit (hãng QIAGEN) tinh sạch và thu nhận DNA từ gel polyacrylamide.

Các hóa chất dùng trong điện di: Agarose, TAE (Tris, Acid acetic,

EDTA), Ethidium bromide, loading dye 6X.

Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR: Nƣớc khử ion, dNTPs, Buffer

10X, MgCl2, Taq polymerase.

Các mồi đƣợc sử dụng trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các cặp mồi cho vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu.

Tác giả Gene Tên mồi Trình tự

27F 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3’

16S- rDNA Lane, 1991 1492R 5’- GGTTACCTTGTTACGACTT - 3’

357F- GC

V3 5’-CGCCCGCGCGCGGCGGGCGGG GCGGGGGCACGGGGGCCTACGGGA GGCAGCAG - 3’ Muyzer, 1993

5’ - ATTACCGCGGCTGCTGG - 3’ 517R

357F 5’ - CCTACGGGAGGCAGCAG - 3’ V3 Muyzer, 1993 517R 5’ - ATTACCGCGGCTGCTGG - 3’

Các hóa chất dùng trong kỹ thuật DGGE: Gel polyacrylamide, TAE, thuốc nhuộm SYBR Green, chất làm đông tụ gel TEMED, APS 10%, loading dye 6X.

Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị và dụng cụ đƣợc sử dụng trong thí nghiệm sau:

Máy khuấy từ, lò điện, máy vortex, máy đo pH, bể ổn nhiệt, tủ sấy Prolabo, máy ly tâm lạnh của hãng JiCa, bộ điện di, hộp đèn soi UV Uvitec, tủ lạnh, tủ đông -200C Alaska, lò viba, hệ thống chụp hình điện di BioRad, máy PCR Sprint Thermo Cycle, bộ điện di trong phân tích DGGE của hãng BioRad gồm các tấm kính dùng làm khuôn gel, lƣợc, buồng điện di và bộ nguồn.

Các dụng cụ đƣợc sử dụng: Các loại pipetteman có dung tích từ 0,5 - 1.000 µl và các đầu type tƣơng ứng, cân phân tích, ống ly tâm lớn, ống tube loại 1 ml và 1,5 ml, các loại dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt, buồng điện di, găng tay, khẩu trang, đồ bảo hộ.

2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Qui trình chung thực hiện các phƣơng pháp và kỹ thuật cho nghiên cứu

xem hình 2.2.

Hình 2.2. Qui trình thực hiện trong nghiên cứu.

2.2.1.Phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA

Quy trình ly trích và thu nhận DNA bộ gene vi sinh vật từ mẫu Rơm

nghiên cứu thực hiện theo hình 2.3.

Hình 2.3. Qui trình ly trích và thu nhận DNA từ mẫu Rơm.

2.2.2. Phƣơng pháp PCR nhân bản gene 16S rDNA và vùng gene V3

Phản ứng khuếch đại đoạn gen16S-rDNA đƣợc thực hiện với cặp mồi chuyên biệt cho nhóm vi khuẩn là 27F và 1492R. Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 25µl và chu trình nhiệt ở bảng 2.2và bảng 2.3.

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR.

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

Buffer 10X 2,5

2 MgCl2 (25 mM)

dNTPs (2,5 mM) 2

Primer 27F (100 µM) 0,1

Primer 1492R (100 µM) 0,1

DNA khuôn (200ng/µl) 1

Nƣớc khử ion 17,3

Tổng thể tích 25

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR.

Số chu kì lặp lại Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)

1 15 95

1 95

30 1 54

2 72

1 10 72

Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra qua bộ điện di trong gel agarose 1% và

dƣới ánh sáng UV.

Bƣớc 1. Chuẩn bị bộ điện di.

Bƣớc 2. Chuẩn bị gel agarose 1%; Cân 1g agarose cho vào chai thủy tinh có chứa 100ml TAE 1X. Đun cho đến khi agarose tan hoàn toàn, lắc đều, để nguội cho đến khoảng 50 - 600C thì đổ vào khuay gel.

Bƣớc 3. Cho gel vào bồn điện di và nạp mẫu vào giếng gel với thể tích

2µl Loading dye và 5µl mẫu, chạy điện di 45 phút với nguồn điện 110Volt.

Bƣớc 4. Sau điện di, thực hiện nhuộm gel với Ethidium Bromide trong

15 phút.

Bƣớc 5. Quan sát kết quả sản phẩm PCR dƣới hộp đèn UV.

Nhân bản vùng gene V3: Vùng V3 thuộc đoạn 16S-rDNA đƣợc khuếch đại với cặp mồi chuyên biệt cho nhóm vi khuẩn là 517R và 357F - GC. Thành phần phản ứng với tổng thể tích 25µl và chu trình nhiệt đƣợc trình bày ở bảng 2.4 và bảng 2.5.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR vùng gene V3.

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

Buffer 10X 2,5

2 MgCl2 (25 mM)

dNTPs (2,5 mM) 2

Primer 357F-GC (100 µM) 0,1

Primer 517R (100 µM) 0,1

DNA khuôn 0,5

Nƣớc khử ion 17,8

Tổng thể tích 25

Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR gene V3.

Số chu kì lặp lại Nhiệt độ (0C) Thời gian

1 3 phút 94

1 phút 94

30 1 phút 55

1 phút 30 giây 72

1 8 phút 72

Tƣơng tự nhƣ ở kiểm tra sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra qua bộ điện di

nhƣ trong gel agarose 2% và dƣới ánh sáng UV.

2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm gene V3

Trƣớc khi phân tích DGGE đoạn gen đã đƣợc khuếch đại, mẫu DNA đƣợc tinh sạch nhằm loại bỏ các tạp chất còn lại sau phản ứng PCR bằng bộ kit QIAGen PCR Purification Kit.

Quy trình tinh sạch nhƣ sau:

Bƣớc 1. Chuyển sản phẩm PCR vào ống tube 1.5ml, thêm buffer PB vào mẫu với tỉ lệ 5:1(v/v) rồi trộn đều (vortex). Nếu màu của hỗn hợp là màu cam hay tím thì thêm 10µl Sodium Acetate 3M, pH 5,0 và trộn đều cho hỗn hợp chuyển về màu vàng.

Bƣớc 2. Sau khi trộn đều chuyển toàn bộ dịch vào ống spin column

tube 2ml, ly tâm 13.000rpm/1phút ở 40C.

Bƣớc 3. Chuyển cột lọc sau ly tâm sang ống tube 2ml mới, thêm vào cột spin column thể tích 750µl buffer PE. Ly tâm 13.000rp/1phút ở 40C, sau đó tiếp tục chuyển cột spin column sang ống tube 2ml mới và ly tâm 13.000prm/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn PE.

Bƣớc 4. Cho thêm 500µl dung dịch đệm Capture vào cột spin column,

ly tâm 13.000rpm/phút trong 30 giây ở 40C.

Bƣớc 5. Loại bỏ phần dịch và thu cột spin column.

Bƣớc 6. Thêm 500µl dung dịch Wash buffer vào giữa cột spin column,

ly tâm 13.000rpm/phút trong 30 giây ở 40C.

Bƣớc 6. Tiếp tục loại bỏ phần dịch, thu cột spin column và đặt vào ống

tube mới.

Bƣớc 7. Thêm 50µl Tris - HCl 10mM hoặc nƣớc khử ion.

Bƣớc 8. Ủ trong khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng.

Bƣớc 9. Ly tâm 6.000rpm/phút trong 30 giây.

Bƣớc 10. Thu dịch chứa sản phẩm DNA.

2.2.4. Phƣơng pháp thực hiện kỹ thuật DGGE

2.2.4.1. Qui trình chuẩn bị gel polyacrylamine và thực hiện DGGE

Chuẩn bị bộ gel polyacrylamine dùng trong kỹ thuật DGGE với nồng

độ gel polyacrylamine đƣợc pha theo bảng 2.6.

Bảng 2.6. Chuẩn bị cách pha nồng độ bảng gel polyacrylamine.

0% UF 50% UF 0% UF 80% UF

Thành phần trong gel 6% BA 6% BA 12% BA 12% BA

1 1 2 50X TAE (ml) 2

3 6 12 Acrylamine (g) 6

Bis-Acrylamine (g) 0,162 0,081 0,162 0,324

10,5 0 33,6 Urea (g) 0

10 0 32 Formamide (ml) 0

50 50 100 Tổng thể tích (ml) 100

Sau khi pha gel polyacrylamide theo bảng 2.6, tiến hành phối trộn các

nồng độ trên vào hai xilanh:

- Xilanh 1: Tƣơng ứng với nồng độ polyacrylamide thấp.

- Xilanh 2: Tƣơng ứng với nồng độ polyacrylamide cao.

Tỷ lệ phối trộn vào 2 xilanh nhƣ bảng 2.7.

Bảng 2.7. Tỷ lệ phối trộn nồng độ gel polyacrylamide vào hai xilanh.

0% UF 50% UF 0% UF 80% UF Thể tích Thành phần 6% BA 6% BA 12% BA 12% BA

Xilanh 1 9,6 ml 6,4 ml 16 ml

Xilanh 2 4 ml 12 ml 16 ml

Các bƣớc thực hiện trong kỹ thuật DGGE.

Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và pha gel polyacrylamide.

Dung dịch đệm thƣờng sử dụng trong bản gel polyacrylamide là TAE 0,5X. Gel polyacrylamide đƣợc pha theo tỷ lệ phối trộn nhƣ bảng 3.7, sau đó lọc qua màng lọc có kích thƣớc khoảng 0.2µl và chất làm đông gel 10µl TEMED với 50µlAPS. Hút vào ống xilanh với hai nồng độ khác nhau, sau đó lắp vào hệ thống phân phối gel tiến hành đổ gel, sau hoàn tất nạp gel vào bảng gel chờ khoảng 3 giờ để gel đông tụ.

Bƣớc 2: Lắp gel vào bồn điện di, nhiệt độ ổn định trong bể là 600C.

Nạp mẫu vào mỗi giếng gel theo tỉ lệ 20µl mẫu: 6µl loading dye.

Bƣớc 3: Chạy điện di với điện áp 200volt trong 300phút và nhiệt độ

600C.

Bƣớc 4: Kết thúc quá trình điện di, tách các tấm gel, sau đó cho vào

khay để nhuộm gel bằng thuốc nhuộm SYBR Green.

Bƣớc 5: Quan sát kiểm tra kết quả sản phẩm DGGE trong bảng gel dƣới UV, sau đó tiến hành cắt band có sản phẩm cần nghiên cứu, ly trích và thu nhận sản phẩm.

Có thể thực hiện phƣơng pháp DGGE nhiều lần cho đến khi tách hoàn toàn từng gene riêng rẽ và các bƣớc thực hiện tƣơng tự nhƣ trên cho đến khi thu đƣợc các đoạn gene riêng biệt từ mẫu nghiên cứu ban đầu.

2.2.4.2. Quy trình thu nhận sản phẩm DGGE từ gel polyacrylamide

Sản phẩm gene V3 thu đƣợc trong gel polyacrylamide sẽ đƣợc thu hồi bằng cách sử dụng bộ Kit: Gel Extraction Kit of QIAEX II để tinh sạch và thu nhận DNA từ gel polyacrylamide, đƣợc thực hiện theo quy trình các bƣớc xem hình 2.4.

Hình 2.4. Qui trình thu nhận gene V3 từ gel polyacrylamdie.

2.2.4.3. PCR gene V3 sau khi thu nhận từ DGGE với cặp mồi 357F và

517R

Sau khi thu nhận đƣợc gene V3 từ DGGE sẽ tiếp tục tiến hành PCR lại

vùng V3 với cặp mồi 517R và 357F và thành phần phản ứng nhƣ bảng 3.5.

2.2.5. Phƣơng pháp tạo dòng

Vector và quy trình thực hiện đƣợc sử dụng trong kỹ thuật Tạo dòng là pGEM@-T Easy vector của hãng Promega có kích thƣớc là 3.015bp, bao gồm 3 vùng gene chính là: Ampicillin gene, Ori gene và Lac Z gene xem hình ảnh cấu trúc của vector hình 2.5.

Hình 2.5. Cấu trúc pGEM@-T Easy vector của hãng Promega.

Quá trình tách chiết và thu nhận plasmid thực hiện theo protocol của hãng Nippon Genetics. Chủng vi khuẩn dùng cho việc cloning là E.coli JM109. Qui trình thực hiện theo protocol của hãng Promega nhƣ sau;

Biến nạp pGEM@-T Easy vector tái tổ hợp mang sản phẩm gene V3 vào tế bào E.coli JM109: Hỗn hợp phản ứng gắn các gene V3 và pGEM@-T Easy vector (Promega) đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli JM109 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ở 420C trong 45-50 giây và làm lạnh nhanh trong đá 2 phút. Sau đó tế bào khả biến đƣợc nuôi trên đĩa petri chứa môi trƣờng LB agar (1,5%), bổ sung với 0,5mM IPTG và 80g/ml X-Gal ở 370C qua đêm. Chọn khuẩn lạc đơn màu xanh để nuôi cấy lắc trên môi trƣờng LB lỏng ở 370C lắc 150 rpm/phút trong khoảng 16-24 giờ, sau đó thu sinh khối tế bào để tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp. Thu sản phẩm vùng gene V3 trong vector bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi 357F và 517R các qui trình kỹ thuật tƣơng tự trên.

2.2.6. Giải trình tự gene V3 và xây dựng cây phát sinh loài

Sau khi tinh sạch và thu nhận đƣợc DNA từ gel polyacrylamide bằng Gel Extraction Kit of QIAEX II, tiến hành giải trình tự vùng gene V3 đƣợc giải mã trên máy ABI Genetic Analyzer tự động với bộ hóa chất chuẩn Big – Dye PCR với cặp mồi 357F/517R. Thành phần của Big – Dye PCR đƣợc thể hiện trong bảng 2.8. Sản phẩm gene V3 đƣợc giải trình tự tại Lab của trƣờng GSALS của Đại học và Cty Nam Khoa thành phố Hồ Chí Minh.

Bảng 2.8: Thành phần Big – dye PCR.

Thành phần Thể tích

DNA 13 µl

Primer 357F (3,2 pmol) hoặc 1 µl Primer 517R (3,2 pmol)

Taq buffer for sequencing 2 µl

Big – dye solution 4 µl

Tổng 20 µl

Sau khi có thành phần Big – Dye PCR là 20 µl, quy trình thực hiện với các bƣớc tiếp:

Bƣớc 1. Thêm 5µl EDTA 125 mM vào dung dịch Big – dye.

Bƣớc 2. Thêm 60 µl Ethanol 100%, tổng cộng thể tích dung dịch phản

ứng là 85µl.

Bƣớc 3. Giữ mẫu ở - 200 C trong 20 phút.

Bƣớc 4. Ly tâm 13000rpm/phút trong 30 phút ở 40 C.

Bƣớc 5. Loại Aluminm seal và bọc lại gel bằng giấy.

Bƣớc 6. Ly tâm 13000rpm/phút trong 10 giây, loại bỏ cồn.

Bƣớc 7. Thêm 85µl Ethanol 70% với tỷ lệ 1:1 (v/v).

Bƣớc 8. Ly tâm 13000 vòng trong 15 phút ở 40C.

Bƣớc 9. Loại aluminm seal và bọc lại gel bằng giấy.

Bƣớc 10. Ly tâm 13000rpm/phút trong 10 giây và loại cồn.

Bƣớc 11. Làm khô mẫu trong 15 phút bằng nhiệt.

Bƣớc 12.Thêm 18µl HiDi – formamide trên mỗi mẫu và vortex.

Bƣớc 13. Ly tâm 13000rpm/phút trong 10 giây.

Bƣớc 14. Thiết lập mẫu vào thiết bị và đọc kết quả sau khi máy

giải trình tự.

trong đồng hàng ngân liệu dữ

Hiệu chỉnh trình tự gene trong công cụ BLAST so sánh với các đoạn gen NCBI gen tƣơng (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Sử dụng các chƣơng trình và phần mềm BioEdit xây dựng cây phát sinh loài.

2.3. Khảo sát định tính enzyme cellulase trong mẫu Rn

Kiểm tra định tính enzyme cellulase trong mẫu rơm Rn nhằm xác định sự hiện diện của của enzyme cellulase phân giải cellulose rơm trong suốt quá trình ủ đƣợc sinh ra và tồn tại trong mẫu, nhằm đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase phân hủy rơm rạ của vi khuẩn trong mẫu. Thực hiện kiểm

tra sơ bộ mẫu sinh enzyme cellulase trong quá trình ủ bằng phƣơng pháp đĩa thạch CMC với thuốc thử Congo Red 0,1%. Chuẩn bị môi trƣờng CMC khử

trùng và đổ đĩa, tiến hành tạo các giếng trên mặt thạch, bơm 20 l dịch thu nhận trực tiếp từ mẫu vào giếng, đem ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.

Sau 30 phút, loại bỏ dung dich thuốc thử và thực hiện bƣớc giải nhuộm với 5ml NaCl 1M, sau 15 phút loại bỏ NaCl và đọc kết quả. Mẫu nào có sự phân giải CMC sẽ tạo vòng phân giải nhạt màu hơn so với màu của thuốc thử Congo red.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả kiểm tra nhiệt độ

Nhiệt độ đo đƣợc trong suốt quá trình ủ rơm trong nghiên cứu này là 18 ngày vì rơm ủ trồng nấm Rơm nên ngƣời dân chỉ thực hiện ủ trong giai đoạn ngắn, khi nhiệt độ trong ụ rơm ủ có hƣớng giảm, khác với rơm ủ làm phân bón. Nhiệt độ đo trong kết quả xem hình 3.1 và 2.1(D) cho thấy. Kết quả từ ngày thứ 5 đến 11 biên độ nhiệt độ tăng cao khoảng 60-800C, trong ngày 4, 8, 12 nhiệt độ thay đổi xuống thấp là do lúc này ngƣời dân phải đảo trộn lại ụ rơm nhằm tăng khả năng ủ đều cho rơm ở bên trong và cả bên ngoài đóng ủ. Tới ngày thứ 15 thì nhiệt bắt đầu giảm xuống, so sánh sự biến đổi nhiệt và thời gian tƣơng tự nhƣ công bố của tác giả Mohd L.C.J và Irnis A.Z [68, 69].

Hình 3.1. Biểu đồ thay đổi nhiệt độ trong qúa trình ủ rơm. Sự gia tăng nhiệt lên khoảng 700C sẽ làm thay đổi thành phần vi sinh vật về số lƣợng và số loài, trong đó đặc biệt là nhóm chịu nhiệt có thể tồn tại và phát triển. Còn đa phần các nhóm vi khuẩn còn lại thì giảm hẳn hoặc có

khả năng chết. Vì thế biến đổi nhóm vi khuẩn về số lƣợng, thành phần loài trong có sự thay đổi. Nhiệt độ ủ ở các độ sâu khác nhau (0, 30, 50 cm) cho thấy sự tăng nhẹ ở thời điểm ban đầu với các độ sâu khác nhau theo nghiên cứu Mohamed H.,[70]. Nhƣng sau 20 ngày ủ, nhiệt độ của đống ủ cho thấy sự gia tăng rõ rệt ở độ sâu 30 và 50 cm tƣơng ứng đạt xấp xỉ 570C và 690C, và thể hiện nhiệt độ tối đa đƣợc ghi lại trong quá trình ủ. Thời gian tại 40 và 60 ngày ủ, nhiệt độ cho thấy sự giảm rõ rệt cho biết nó đạt đến nhiệt độ ban đầu khi bắt đầu quá trình ủ.

3.2. Kết quả thu nhận DNA genome của vi sinh vật trong mẫu Rơm

Kết quả ly trích và thu nhận DNA bộ gene của cộng đồng vi sinh trực tiếp theo phƣơng pháp SDS có CTAB của mẫu Rơm chƣa ủ (R) trên gel agarose 0.8% xem hình 3.2. Cả 03 mẫu sau ly trích điều có DNA và cũng phù hợp với các công bố của tác giả Muyzer G [53], Wang J [54], Learn H.L.C [55], Tomoyukihori [57], Cheon J [59], Vila R.C [61], N.Đ.Duy [65]. Do số lƣợng và hàm lƣợng vi sinh vật trong mẫu tự nhiên ban đầu thƣờng ít.

Hình 3.2. Kết quả ly trích thu nhận DNA bộ gene vi sinh trong mẫu R.

Sản phẩm DNA bộ gene trên hình 3.2 chƣa cho biết thành phần DNA của thành phần vi sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm mốc, thực vật, hoặc động vật nhỏ. Cho nên tiếp tục tiến hành sử dụng cặp mồi chung của nhóm vi khuẩn là 27F và 1492R để mục đích nhân bản và thu nhận gene 16S rDNA thuộc nhóm vi khuẩn.

3.3. Kết quả thu nhận gene 16S rDNA và gene V3 của mẫu R

Chọn mẫu sản phẩm DNA bộ gene ở giếng đầu tiên ở hình 3.2, thu nhận gene 16S rDNA dựa trên cặp mồi 27F và 1492R xem hình 3.3(A). Sau đó tiếp tục lấy sản phẩm PCR trên để nhân bản gene V3 thuộc vùng gene 16S rDNA dựa trên cặp mồi 357F-GC và 517R với kết quả PCR thu đƣợc ở hình 3.3(B) với kích thƣớc gene V3 trong khoảng 200bp. Tuy nhiên, kết quả này chƣa cho biết đƣợc gì về các đoạn gene chuyên biệt của từng loài vi khuẩn trong cùng một mẫu. Chuyển sang kỹ thuật DGGE lần 1 xem hình 3.3(C) cho thấy trong cùng một sản phẩm PCR gene V3 thì cho ra 5 phân đoạn V3 đƣợc tách rời nhau trên gel polyacrylamide. Năm vùng gene V3 này đƣợc ly trích và thu nhận, sau đó tiếp tục DGGE lần 2 trong với mỗi giếng mỗi phân đoạn.

Kết quả DGGE lần 2 xem hình 3.3(D) 5 gene V3 của mẫu R nhằm tách riêng rẻ theo thời gian, chiều dài bảng gel chạy và vị trí tƣơng ứng với DGGE lần 1 trong cùng gradient biến tính có nồng độ từ 40% đến 60% của gel polyacrylamide. Từ kết quả trong bảng gel mẫu R có tồn tại 5 đoạn gene V3 đƣợc ký hiệu là R1, R2, R3, R4 và R5 có thể thuộc các chủng vi khuẩn khác nhau.

A.Sản phẩm nhân bản gene 16S rDNA của mẫu R trên gel agarose 1%.

Hình 3.3. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu R.

B. Sản phẩm nhân bản gene V3 thuộc vùng gene 16S rDNA trên gel agaorse

1% điện di trong 100volt/40phút.

C. DGGE lần 1 trên hệ thống BioRad với nguồn điện 200volt/300phút trên

gel polyarylamide 40-60%.

D. DGGE lần 2 tƣơng tự C.

Tiếp tục cắt và thu nhận bảng gel trực tiếp của đoạn gene R1, R2, R3, R4 và R5 trong gel polyarylamide bằng bộ kit QIAGen và PCR sản phẩm V3 với cặp mồi 517F và 357R và xem kết quả trình tự gene.

3.4. Kết quả phân tích dữ liệu cộng đồng vi khuẩn của mẫu R

Trình tự 5 đoạn gene trên và so sánh mức độ tƣơng đồng gene trong ngân hàng dữ liệu NCBI với công cụ BLAST và xây dựng cây phân loại loài xem hình 3.4. Cho thấy tính đa dạng nhóm vi khuẩn trong mẫu rơm chƣa ủ và có mức độ tƣơng đồng vùng gene V3 tƣơng ứng nhƣ sau; gene R1 tƣơng ứng với chi Agrobacterium, R2 thuộc chi Clostridium, R3 tƣơng ứng với chi Bacteroidetes, R4 tƣơng tự chi Thermopolysporasa và R5 thuộc chi Bacillus.

Hình 3.4. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu R. Dựa trên phân tích trình tự vùng gene V3 (R1, R2, R3, R4 và R5) và các chủng vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu NCBI.

Theo dữ liệu công bố nghiên cứu của Vila R.C [41] đã cho thấy cộng đồng vi khuẩn trong phân và rơm ủ có Alphaproteobacteria trong mẫu rơm rạ ban đầu chƣa ủ, Bacillus và Actinomycetes ở giai đoạn ƣa nhiệt, Cytophaga và Clostridial trong giai đoạn ủ nhiều tuần. Một nghiên cứu khác của Steger K [60] cũng thấy có thay đổi thành phần trong cộng đồng Actinobacteria trong quá trình ủ thải hữu cơ theo quy mô của hộ gia đình. So sánh với kết quả thu đƣợc cho thấy hệ vi khuẩn của mẫu rơm chƣa ủ có sự hiện diện của vài dòng vi khuẩn giống nhƣ đã công bố. Bên cạnh đó tính đa dạng nhóm vi khuẩn cũng tùy thuộc vào từng loại rơm rạ, quá trình canh tác và vận chuyển.

3.5. Kết quả thu nhận DNA, gene 16S rDNA và gene V3 của mẫu Rn

Qui trình và các bƣớc thực hiện kỹ thuật mẫu rơm sau ủ (Rn) cũng giống nhƣ ở các mục 3.1, 3.2, 3.3 và 3.4, kết quả thu nhận DNA của cộng đồng vi sinh vật trực tiếp từ mẫu Rn sử dụng làm nguyên liệu trồng nấm Rơm. Sản phẩm DNA bộ gene vi khuẩn xem hình 3.5(A), sản phẩm nhân bản gene V3 xem hình 3.5(B), tách gene V3 chạy DGGE lần 1 cho khoảng 4 đoạn gene V3 và DGGE lần 2 tách gene riêng biệt từng gene V3 trong hình 3.5(C,D).

Với kết quả của mẫu Rn thu đƣợc khoảng 4 band kí hiệu là Rn1, Rn2, Rn3 và Rn4 so với mẫu R có 5 band, kết quả này cũng hợp lý vì khoảng 18 ngày ủ và nhiệt độ cao cho nên số lƣợng và số loài có thể giảm so với mẫu ban đầu.

A.Sản phẩm nhân bản gene 16S rDNA của mẫu Rn trên gel agarose 1% điện

di trong 100volt/40phút.

B. Sản phẩm nhân bản gene V3 thuộc vùng gene 16S rDNA trên gel agaorse

1% điện di trong 100volt/40phút.

C. DGGE lần 1 trên hệ thống BioRad với nguồn điện 200volt/300phút trên

gel polyarylamide 40-60%.

D. DGGE lần 2 tƣơng tự C.

Hình 3.5. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu Rn.

3.6. Kết quả tạo dòng trên vector pGEM@-T Easy của hãng Promega

Chọn sản phẩm gene V3 của mẫu Rn ở mục 3.5 ở trên thực hiện chèn vào vector pGEM@-T Easy và biến nạp vào E.coli JM109 theo qui trình kỹ thuật của hãng sàn xuất Nippon Genetics.

Từ quá trình chuyển những đoạn gene V3 vào vector và biến nạp vào E.coli JM109 cho thấy sản phẩm thu nhận đƣợc ở hình 3.6 (A,B,C) trong đó có khuẩn lạc màu xanh và trắng. Điều này cho kết luận rằng khuẩn lạc có màu trắng đã đƣợc chuyển gene V3 thành công, vì đoạn gene V3 đã chèn vào giữa vùng gene Lac Z làm cho β-lactamase không tạo ra nên khuẩn lạc trong môi trƣờng LB để tạo khuẩn lạc có màu xanh mà là khuẩn lạc sẽ có biểu hiện màu trắng.

Hình 3.6. Kết quả thu nhận sản phẩm tạo dòng, khuẩn lạc có màu trắng thì đoạn gene đã chèn vào vector pGEM@-T Easy và vetor đã biến nạp vào E.coli (A, B) và chọn khuẩn lạc có màu trắng cấy chuyền thuần trên môi trƣờng LB (C) có chứa Ampicillin, PIG và X-Gal.

Kết quả này chứng minh rằng khuẩn lạc nào có màu trắng là khuẩn lạc đã chuyển thành công vector pGEM@-T Easy có chứa đoạn gene V3. Tiếp tục chọn khoảng 30 khuẩn lạc màu trắng thực hiện cấy chuyền lập lại nhằm mục đích kiểm tra tính ổn định vector đã chuyển vào vi khuẩn E.coli JM109 mà không bị đào thải qua các vòng đời sinh sản của chủng E.coli JM109.

3.7. Kết quả thu nhận vùng gene V3 sau khi đã tạo dòng

Chọn khoảng 30 khuẩn lạccó màu trắng đã cấy thuần qua nhiều lần và sử dụng qui trình của QIAGEN plasmid kít tách chiết và thu nhận lại vector rồi sau đó PCR cho kết quả sản phẩm gene V3 ở hình 3.7(A,B).

Hình 3.7. Kết quả 32 sản phẩm PCR đoạn gene V3 thể hiện trên gel agarose 1% đƣợc ly trích và thu nhận từ vi kuẩn E.coli JM109 đã đƣợc chèn vào vector pGEM@-T Easy (A và B).

3.8. Kết quả kiểm tra gene V3 sau khi tạo dòng bằng kỹ thuật DGGE

Lấy kết quả sản phẩm PCR ở hình 3.7(A, B) thực hiện phƣơng pháp DGGE từ kết quả vị trí các mẫu gene V3 cho thấy gene 5 tƣơng ứng với vị trí gene Rn1, đoạn gene 11, 26 tƣơng ứng gene Rn2, tƣơng tự đoạn gene 6, 8,10,12,14, 21, 23, 25, 27 và 29 tƣơng ứng vị trí gene Rn3, phần còn lại là 1, 2, 3, 4, 9, 13, 15, 16, 17,18, 19, 20, 24, 27 và 30 tƣơng ứng với gene Rn4. So sánh sản phẩm DGGE với hình 3.5D cho thấy vị trí các đoạn gene giữa phƣơng pháp DGGE và tạo dòng điều cho kết quả giống nhau.

Hình 3.8. Kết quả 30 sản phẩm DGGE chạy trên hệ thống BioRad với

nguồn điện 200volt/300phút trên gel polyarylamide 40-60% (A, B).

Chọn đại diện đoạn gene V3 của sản phẩm tạo dòng tƣơng ứng với vị trí đoạn gene Rn cho mẫu nhƣ sau; gene 5, 26, 8 và 3 xem hình 3.8 (A,B) của sản phẩm tạo dòng và Rn1, Rn2, Rn3, Rn4 của sản phẩm DGGE xem hình 3.5(D) giải trình tự gene và so sánh kết quả các dữ liệu gene đoạn V3 trong ngân hàng dữ liệu NCBI với công cụ BLAST.

Kết quả trình tự của đoạn gene 5 giống Rn1, gene 26 giống Rn2, gene 8 giống Rn3 và tƣơng tự gene 3 với Rn4. Dựa vào so sánh tính tƣơng đồng của mẫu các trình tự Rn với tham chiếu trong Genbank với từng mức cụ thể nhƣ sau; Kết quả cho thấy gene 5 (Rn1) tƣơng đồng với chi Agrobacterium là 96%, gene 26 (Rn2) và gene 8 (Rn3) thuộc chi Clostridium với mức độ tƣơng thermocellum, Clostridium đồng gần với các chủng Clostridium aurantibutyricum lần lƣợt tƣơng ứng là 99%, 98% và gene 3 (Rn4) có mức độ tƣơng đồng với loài Agrobacterium là 95% xem hình 1.9.

Thông qua kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng với kết quả thu đƣợc đều giống nhau ở mẫu Rn, còn lại hai chi Clostridium, Agrobacterium. Vì giai đoạn rơm ủ nhiệt độ tăng trong khoảng 70-800C và thời gian ủ kéo dài khoảng 18 ngày, làm cho sự hiện diện tính đa dạng dòng vi khuẩn không còn nhƣ mẫu rơm ban đầu ở nhƣ kết quả phân tích ở hình 1.1D và 1.2. [70].

Hình 3.9. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu Rn. Dựa trên phân tích trình tự vùng gen V3 (Rn1, Rn2, Rn3 và Rn4) với các chủng vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu NCBI.

Các vi khuẩn đƣợc xác định phổ biến nhất gặp phải các đống phân ủ ở giai đoạn đầu tiên và cuối cùng của chu kỳ ủ phân và đại diện cho các vi khuẩn ƣa ấm, nhiệt độ 10-400C (mesophilic bacteria) phát triển nhƣ Staphylococcus sp, Staphylococcus aureus, Bacillus sp. B. subtilis, B. brevis, B. polymyxa là loài chiếm ƣu thế khi bắt đầu quá trình ủ phân trong tất cả các loại phân ủ và dần biến mất hoàn toàn sau 20 ngày, chỉ còn lại nhóm vi khuẩn Bacillus sp có khả năng tạo bào tử. Ngoài ra có nhóm nấm Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Fusarium moniliforme, Rhizopus nigricans, Penicillium citrinum nhiều công bố trong các nghiên cứu. [69.70.71].

3.9. Kết quả sơ bộ định tính enzyme cellulase trong mẫu Rn

Xác định khả năng tồn tại enzyme cellulase trong mẫu Rn (Rn1, Rn2 và Rn3) thông qua phƣơng pháp đĩa CMC nhằm kiểm tra kết quả sơ bộ định tính có sự hiện diện của enzyme cellulase tạo vòng phân giải CMC trong môi trƣờng thạch đĩa xem hình 3.10.

Hình 3.10. Thử khả năng sinh cellulase trên đĩa CMC của mẫu Rn.

Kết quả trên cho thấy rằng trong mẫu rơm rạ sau có enzyme cellulase. Chứng tỏ rằng nhóm vi khuẩn tồn tại trong mẫu rơm rạ trong suốt quá trình ủ có khả năng sinh enzyme cellulase nhằm phân hủy cellulose rơm rạ cung cấp nguồn glucose cho sự tồn tại và phát triển.

Tóm lại: Mẫu Rơm (Rn) đƣợc thu nhận tại xã Tân Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp cho kết quả cùng sản phẩm PCR từ thu nhận DNA bộ gene và nhân bản đoạn gene V3 thuộc vùng gene 16S rDNA dựa trên cặp mồi chung là 357F-GC và 517R. Thông qua phân tích cộng đồng vi khuẩn bằng kỹ thuật DGGE cho 4 đoạn gene V3 là Rn1, Rn2, Rn3, Rn4. Kỹ thuật Tạo dòng cũng cho 4 phân đoạn gene 5 tƣơng ứng với vị trí gene Rn1, đoạn gene 11, 26 tƣơng ứng gene Rn2, tƣơng tự đoạn gene 6, 8,10,12,14, 21, 23, 25, 27 và 29 tƣơng ứng vị trí gene Rn3, phần còn lại là 1, 2, 3, 4, 9, 13, 15, 16, 17,18, 19, 20, 24, 27 và 30 tƣơng ứng với gene Rn4. Ngoài ra mẫu Rơm (R) cho thấy tính đa dạng vi khuẩn trong mẫu chƣa thông qua ủ khoảng 5 chi và còn lại khoảng 2 chi vi khuẩn sau giai đoạn ủ. Kỹ thuật phân tích PCR-DGGE và Tạo dòng có thể áp dụng cho việc phân tích cộng đồng vi khuẩn nói riêng

và các nhóm vi sinh nói chung trong các loại mẫu khác nhau, trong điều kiện hệ vi sinh luôn luôn thay đổi và bên cạnh đó giúp các định hƣớng phân lập giống vi khuẩn và hỗ trợ cho các nghiên cứu tiếp theo từ kết quả trong phân tích kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng.

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Kết quả phân tích mẫu rơm trƣớc ủ (R) với phƣơng pháp PCR-DGGE thu đƣợc gene R1 ứng với chi Agrobacterium, R2 thuộc chi Clostridium, R3 tƣơng ứng với chi Bacteroidetes, R4 tƣơng tự chi Thermopolysporasa và R5 thuộc chi Bacillus

Kết quả phân tích mẫu rơm sau ủ (Rn) với phƣơng pháp PCR-DGGE và tạo dòng cho thấy gene Rn1 (gene 5) và gene Rn4 (gene 3) tƣơng đồng với chi Agrobacterium, gene Rn2 (gene 26) và gene Rn3 (gene 8) thuộc chi Clostridium.

Kết quả dữ liệu gene trong mẫu R có đa dạng vi khuẩn khoảng 5 chi, còn trong mẫu Rn thì tính đa dạng vi khuẩn ít hơn khoảng 2 chi. Điều này cho thấy sự biến động đa dạng vi khuẩn trong giai đoạn rơm ủ.

Việc sử dụng và so sánh giữa kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng với mẫu Rn cho kết quả hoàn toàn giống nhau ở vị trí trên gel polyacrylamide và trình tự gene trong các đoạn gene V3 trên mẫu Rn. Điều này có thể sử dụng độc lập kỹ thuật PCR-DGGE hoặc tạo dòng trong phân tích cộng đồng vi sinh vật hoặc kết hợp cả hai phƣơng pháp với nhau.

4.2. Kiến nghị

Cần phân tích các thông số ngoại sinh ảnh hƣởng trực tiếp và gián tiếp ở ụ rơm ủ nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, pH và kết hợp kiểm tra sự thay đổi cộng đồng vi khuẩn liên tục theo từng ngày và chất lƣợng rơm trong suốt giai đoạn ủ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2017, Rice

1. Market Monitor. FAO.

2. Su HJ., Bo SK.,Joo SK., 2008, Production of bio-oil from rice straw and bamboo sawdust under various reaction conditions in a fast pyrolysis plant equipped with a fluidized bed and a char separation system, J. Anal. Appl. Pyrolysis, 82, pp. 240–247.

3. Kapoor M., Soam S., Agrawal R., Gupta RP., Tuli DK and Kumar R., 2017, Pilot scale dilute acid pretreatment of rice straw and fer-mentable sugar recovery at high solid loadings, Bioresour Technol, 224, pp.688-693.

4. Wi SG., Choi IS., Kim KH., Kim HM., Bae HJ., 2013, Bioethanol production from rice straw by popping pretreatment, Biotechnol Biofuel, 6(1). Pp. 1-7.

Belal EB., 2013, Bioethanol production from rice straw residues, Braz

5. Microbiol, 44(1), pp. 225-234.

Yang B., Dai Z., Ding SY., Wyman C E., 2011, Enzymatic hydrolysis

6. of cellulosic biomass, Biofuels, 2(4), pp.421-449.

7. Abe K., Yano H., 2009, Comparison of the characteristics of cel-lulose microÞ bril aggregates of wood, rice straw and potato tuber, Cellulose, vol 16(6), pp. 1017-1023.

8. Hallac BB., Ragauskas AJ., 2011, Analyzing cellulose degree of polymerization and its relevancy to cellulosic ethanol, Biofuels Bioprod Bioref, 5(2), pp.215-225.

Lê Đức Ngoan, 2005, Giáo trình thức ăn gia súc, Nhà xuất bản Nông

9. nghiệp.

10. Fan G., Wang M., Liao C., Fang T., Li J., Zhou R., 2013, Isolation of cellulose from rice straw and its conversion into cellulose acetate catalyzed by phosphotungstic acid, Carbohydr Polym, 94(1), pp.71-76.

11. Wang H., Ben H., Ruan H., Zhang L., Pu Y., Feng M., 2017, Effects of lignin structure on hydrodeoxygenation reactivity of pine wood lignin to valuable chemicals, ACS Sustain Chem Eng, 5(2), pp.1824-1830.

12. Oladosu Y., RaÞi MY., Abdullah N., Magaji U., Hussin G., Ramli A., 2016, Fermentation quality and additives: a case of rice straw silage, Biomed Res Int, p.1-14.

13. Nguyen HV., Nguyen CD., Tran TV., Hau HD., Nguyen NT., Gummert M., Energy effciency, greenhouse gas emissions, and cost of rice straw collection in the mekong river delta of vietnam. Field Crops Res, 198, pp.16-22.

14. Balagurumurthy B., Srivastava V., Vinit KJ., Biswas B., Singh R., 2015, Value addition to rice straw through pyrolysis in hydrogen and nitrogen environments, Bioresour Technol, 188, pp.273-279. (2015).

15. Jung SH., Kang BS., Kim JS., 2008, Production of bio-oil from rice straw and bamboo sawdust under various reaction conditions in a fast pyrolysis plant equipped with a ß uidized bed and a char separation system, J Anal Appl Pyrolysis, 82(2), pp.240-247. (2008).

16. Wu W., Yang M., Feng Q., McGrouther K., Wang H., Lu H., 2012, Chemical characterization of rice straw-derived biochar for soil amendment, Biomass Bioenerg, 47, pp.268-276. (2012).

17. Nguyễn Đức Lƣợng, 2010, Công nghệ sản xuất enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, Tp. Hồ Chí Minh.

18. Yang B., 2011, Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass. Biofuels 2, pp.421-449.

19. Shewale J., 1982, β-Glucosidase: its role in cellulase synthesis and hydrolysis of cellulose, International Journal of Biochemistry, 14, pp.435- 443.

20. Wiseman JWA., 1983, Fungal and other β-dglucosidases: their properties and applications, Enzyme and Microbial Technology, 4, pp. 73– 79.

21. Wilson DB., 2008, Three microbial strategies for plant cell wall degradation, Annals of the New York Academy of Sciences, 1125, pp.289- 297.

22. Oyeleke S., Okusanmi T., 2008. Isolation and characterization of cellulose hydrolysing microorganism from the rumen of ruminants, African Journal of Biotechnology.

23. Huang S., 2012, Isolation and identification of cellulolytic bacteria from the gut of Holotrichia parallela larvae (Coleoptera: Scarabaeidae), International journal of molecular sciences, 13, pp.2563-2577.

24. Hu X., 2014, Cellulolytic bacteria associated with the gut of Dendroctonus armandi Larvae (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae), Forests, 5, pp.455-465.

25. Schwarz W., 2001, The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria, Applied microbiology and biotechnology, 56, pp.634- 649.

26. Rastogi G., 2009, Isolation and characterization of cellulose- degrading bacteria from the deep subsurface of the Homestake gold mine, Lead, South Dakota, USA, Journal of industrial microbiology & biotechnology, 36, pp.585-598.

27. Kluepfel D.,1986, Characterization of cellulase and xylanase lividans, Applied microbiology and activities of Streptomyces biotechnology, 24, pp.230-234.

28. Semêdo L., 2004, Streptomyces drozdowiczii sp. nov., a novel cellulolytic streptomycete from soil in Brazil, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 54, pp. 1323-1328.

29. Schrempf H., Walter S., 1995, The cellulolytic system of Streptomyces reticuli, International journal of biological macromolecules, 17, pp.353-355.

30. Chang CC., 2009, Activity of cellulase from Thermoactinomycetes and Bacillus spp. isolated from Brassica waste compost, Scientia Agricola, 66, pp.304-308.

31. Mba CC., 1997, Rock phosphate solubilizing Streptosporangium isolates from casts of tropical earthworms, Soil Biology and Biochemistry, 29, pp.381-385

32. Shahriarinour M., 2011, Screening, isolation and selection of cellulolytic fungi from oil palm empty fruit bunch fibre, Biotechnology, 10, pp.108-113.

33. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2008, Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục.

34. Ausubel FM., Brent R., Kinhston RE.,, Moore DD., Seidman JG., Smith JA., Struhl K., 1992, Current protocols in molecular biology, New York: Greene Publishing Association; Wiley-Interscience, vol.1.

35. Zhu H., Qu F., Zhu LH., 1993, Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride, Nucleic Acids Res, 21, pp.5279- 5280.

Zhou J., Bruns MA., Tiedje JM., 1996, DNA recovery from soils of

36. diverse composition, Appl Environ Microbiol, 62, pp.316 - 322.

37. Jara C., Mateo E., Guillamón JM., Torija MJ., Mas A., 2008, Analysis of several methods for the extraction of high quality DNA from acetic acid bacteria in wine and vinegar for characterization by PCR based methods, International Journal of Food Microbiology, 128, pp.336-321.

38. Jia X., Han .J., Zhao YH., Zhou YM., 2006, Comparisons of extraction and purification methods of soil microorganism DNA from rhizosphere soil, Journal of Forestry Research, 17, pp. 31 - 34.

39. Sabine W., Stephan S., Ralf C., 2001, Bacterial Populations Colonizing and Degrading Rice Straw in Anoxic Paddy Soil, Appl Environ Microbiol, 67, pp.1318- 1327.

40. Sung HG., 2007, Low ruminal pH reduces dietary fiber digestion via reduced microbial attachment, Association Animal Production Societies, 20, pp. 200 - 207.

41. Vila RC., Kazuo M., Susumu A., Makoto K., 2003, Succession and phylogentic composition of bacterial communities responsible for the composting process of rice straw estimated by PCRDGGE analysis, Soil Sci Plant Nut, 49, pp. 619 - 630.

42. Haruta S., Cui Z., Huang Z., Li M., Ishii M., Igarashi Y., 2002, Construction of a stable microbial community with high cellulose degradation ability, Appl Microbiol Biotechnol, 59(4), pp. 529 - 534.

43. Saiki R., Scharf S., Faloona F., Mullis K., Horn G., Erlich H., 1985, Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science, 230, pp.1350-4.

44. Arvind Kumar Singh, 2012, Molecular taxonomy: use of modern methods in the identification of species, Indian J.L.Sci, 2(1), pp.143-147.

45. Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H., 1986, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction, Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 51, pp.63-73.

46. Mullis K., Faloona F., 1987, Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction, Methods Enzymol,155, pp.335-350.

47. Arvind Kumar Singh, 2012, Molecular taxonomy: use of modern methods in the identification of species, Indian J.L.Sci, 2(1), pp.143-147.

48. Adam K., Anna K., Hubert S., Michał N., Marta M., 2017, A Review of Conventional PCR Assays for the Detection of Selected Phytopathogens of Wheat, J Mol Microbiol Biotechnol, 27, pp.175–189.

49. Daniela B., Paola C., Lorenzo B., Fabio Q., Milena B., Daniele D., Piero A., 2009, Endophytic bacterial diversity in grapevine (Vitis vinifera L.) leaves described by 16S-rDNA gene sequence analysis and length heterogeneity-PCR, Journal of Microbiology, 47, pp. 393 - 401.

50. Lucia A., Ilaria M., Roberto P., Lucia C., Francesca C., 2004, Amplified ribosomal DNA restriction analysis for the characterization of Azotobacteraceae : a contribution to the study of these free-living nitrogen- fixing bacteria, Journal of Microbiological Methods, 57, pp.197 - 206.

51. Lu JJ., Perng CL., Lee SY., Wan CC., 2000, Use of PCR with universal primers and restriction endonuclease digestions for detection and indentification of common bacterial pathogens in cerebrospinal fluid, Journal of Clincical Microbiology, 38, pp.2076 – 2080.

52. Elmilson RG., Yoko BR., 2002, Phylogentic analysis of Xanthomonas species based upon 16S-23S rDNA intergenic spacer sequences, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52, pp.355- 361.

53. Fircher SG., Lerman LS., 1983, DNA fragments differing by single in denaturing gradient gels: base pair subtitutions are separated correspondence with melting theory, Proc Natl Acad Sci USA, 80, pp.1579 - 1583.

54. Muyzer G., Brinkhoff T., Nuben U., Santegoeds C., Schofer H., Wawer C., 1997, Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology, Molecular Microbial Ecology manual, pp.1-27.

55. Wang J., Ma T., Zhao L., Li J., Zhao L., Li G., 2008, PCR-DGGE method for analyzing the bacterial community in a high temperature petroleum reservoir, World of Journal Microbioal Biotechnol, 21, pp.1981- 1987.

56. Learn HLC., Shiran MS., Vui CMWL., Nurul SAM., Son R., Andrase HM., 2012, Andrade. Identification of actinomycete communities

in Antarctic soil from Barrientos Island using PCR-denaturing gradient gel electrophoresis, Genetics and Molecular Research, 11 , pp.277-291.

57. Okada H., 2010, Technical report on the PCR-DGGE analysis of soil Nematode community, Ver.2.3.

58. Tomoyukihori, Shin H., Yohiyuki U., Masaharu I., Yasuo I., 2006, Direct comparinson of singlestand conformation polymorphism (SSCP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to characterize a microbial community on the basis of 16S RNA gene fragments, Journal of Microbiological Methods, 6, pp. 6165–169.

59. Takeshi W., Susumu A., Asumi., Kazunari N., Makoto K., 2004, DGGE method for analyzing 16S rDNA of methanogenic archaeal community in paddy field soil. FEMS Microbiology letters, 232, pp.15-163.

60. Cheon J., Hidaka T., Mori S., Koshikawa H., Tsuno H., 2008, Applicability of random cloning method to analyze microbial community in full-scale anaerobic digesters, J Biosci Bioeng, 106(2), pp.134-40.

61. Steger K., Sjogren AM., Jarvis A., Jansson JK., Sundh I., 2007, Development of compost maturity and Actinobacteria populations during full-scale composting of organic household waste, Journal of Applied Microbiology, 103, pp. 487 – 498.

62. Vila RC., Kazuo M., Susumu A., Makoto K., 2003, Succession and phylogentic composition of bacterial communities responsible for the composting process of rice straw estimated by PCRDGGE analysis, Soil Sci Plant Nut 49, pp.619 – 630.

63. Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng và Đặng Thị Cẩm Hà, 2008, Xác định đa dạng vi khuẩn trong bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ thuật PCR-DGGE. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6, pp. 59 - 65.

64. Nghiêm Ngọc Minh, 2004, Sử dụng kỹ thuật điện di trên gel gradient biến tính để nghiên cứu đa dạng vi sinh vật, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2, pp.397 - 406.

65. Nguyễn Thanh Thủy, La Thị Phƣơng và Đặng Thị Cẩm Hà, 2004, Sử dụng phƣơng pháp điện di gel gradient biến tính để xác định mức độ đa dạng của vi sinh vật trong các công thức thử nghiệm xử lý đất ô nhiễm chất độc hóa học, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2, pp.381- 388

66. N.Đ.Duy, H.N.P.Thảo, H.Q.Khánh, N.T.Nguyên, P.Đ.Tuấn, Makoto Ato, Chihaya Yamada, Kouji Yoshida, Yasuo Igarashi, 2013, Sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE phân tích cộng đồng vi khuẩn trong Rơm rạ tại huyện Lai Vung, Đồng Tháp, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 51 (3A), pp.1-16.

67. Ngo.Đ.D, Nguyen T..T.V, Dao.T.T.H, Hoang Q. K, Mannix P., Yamada C., Yoshida K., Igarashi Y, 2012, Phân tích Cộng đồng vi khuẩn trong phân ủ bằng phƣơng pháp DGGE, Tạp chí Sinh học 34(SE), pp.118- 124.

68. Brown TA., 1998, Gene cloning in Research and Biotechnology. Gene cloning an introduction, Stanley Thornes (Publishers) Ltd.

69. Mohd LCJ., Latifah AM., Puziah AL., 2013, Composting of rice straw with effective microorganisms (EM) and its influence on compost quality, Iranian J Environ Health Sci Eng, 10(1), pp. 17. 56.

70. Irnis AZ., Siti NBK., Norhasykin MR., 2018, Effect of pH, temperature and moisture content during composting of rice straw burning at different temperature with food waste and effective microorganisms, International Conference on Civil & Environmental Engineering, vol 34.

71. Mohamed H., Mohamed G., Osama MN., 2013, Microbial diversity during composting cycles of rice straw, International journal of Advanced Biological and Biomedical Research, 1, pp.232-245.

72. Tang JC., Shibata A., Zhou Q., Katayama A., 2007, Effect of temperature on reaction rate and microbial community in composting of cattle manure with rice straw, J Biosci Bioeng, 104(4), pp.321-8.

73. Yu S., Bukin Y., Galachyants P., Morozov IV., Bukin1 SV., Zakharenko AS., Zemskaya TI., 2019, Data Descriptor: The effect of 16S

rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results, https://doi.org/10.1038/sdata.2019.7.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ bằng kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ bằng kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok