HỘI NGHỊ QUỐC TẾ KIỂM SOÁT NHIỄM KHUẨN VÀ VI SINH LÂM SÀNG – BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y DƯỢC TPHCM
68
PHÁT HIỆN GEN KHÁNG CÁC KHÁNG SINH HIỆN DIỆN
TRONG CÁC TRỰC KHUẨN GRAM ÂM THƯỜNG GẶP
BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL-TIME PCR
Phạm Hùng Vân1,2, Lê Thị Kiều Thảo1,2,
Nguyễn Việt Quốc1,2, Phạm Thiên Hương1,2
TÓM TẮT9
Mục tiêu: Phát hiện tỷ lệ gen đề kháng các
kháng sinh trong 4 trực khuẩn Gram âm thường
gặp là K. pneumoniae (Klebsiella pneumoniae),
E. coli (Escherichia coli), P. aeruginosa
(Pseudomonas aeruginosa) và A. baumannii
(Acinetobacter baumannii) bằng phương pháp
MPL-rPCR (Multiplex real-time PCR) và so sánh
với phương pháp sử dụng NG-test.
Phương pháp: Từ mỗi chủng vi khuẩn được
phân lập, thực hiện tách chiết DNA
(Deoxyribonucleic acid) bằng phương pháp đun
sôi rồi lấy dịch nổi chạy MPL-rPCR với 10 hỗn
hợp gồm các đoạn mồi và đoạn dò đặc hiệu cho
các gen kháng thuốc AmpC, ESBL (Extended-
spectrum β-lactamase), carbapenemase và MCR
(mobile colistin resistant). Đồng thời thực hiện
NG-Test để so sánh các kết quả.
Kết quả: Nghiên cứu thu thập 316 chủng K.
pneumoniae, 311 chủng E. coli, 310 chủng P.
aeruginosa và 302 chủng A. baumannii. Các gen
CTX-M và ESBL được chủ yếu tìm thấy ở K.
pneumoniae và E. coli. Gen carbapenemase được
1Viện Nghiên cứu và Phát triển Vi sinh Lâm sàng
Việt Nam
2Phòng Xét nghiệm Công ty Nam Khoa
Chịu trách nhiệm liên hệ chính: Phạm Thiên
Hương
Email: phamthienhuong@gmail.com
Ngày nhận bài: 25/09/2024
Ngày phản biện khoa học: 03/10/2024
Ngày duyệt bài: 06/10/2024
tìm thấy ở cả 4 chủng với tỷ lệ 49,4% đối với K.
pneumoniae, 10,3% đối với E. coli, 38,1% đối
với P. aeruginosa và 75,2% đối với A.
baumannii. Các gen carbapenemase tiêu biểu
được phát hiện là KPC, NDM1, OXA-48 và
IMP. Trong đó: (i) KPC và OXA-48 được phát
hiện nhiều nhất ở K. pneumoniae (8,5% và
29,8%). (ii) NDM1 được phát hiện ở cả 4 chủng
với tỷ lệ thấp nhất ở E. coli (3,2%), cao nhất ở K.
pneumoniae (31,7%) và P. aeruginosa (31,3%),
(iii) Gen IMP được tìm thấy ở P. aeruginosa với
tỷ lệ 7,7%. (iv) A. baumannii chủ yếu mang gen
OXA-51 (85,8%) và OXA-23 (67,6%). Tỷ lệ
đồng thuận của MLP-rPCR và NG-Test là trên
90,0% với các gen CTX-M, carbapenemase, và
MCR1. Trong phát hiện gen IMP ở A. baumanii,
tỷ lệ này chỉ 56,0%.
Kết luận: Trực khuẩn Gram âm mang gen đề
kháng các kháng sinh, đặc biệt là gen sinh
carbapenemase đang tạo ra thách thức lớn cho
các nhà lâm sàng trong việc lựa chọn kháng sinh
điều trị. Với phổ phát hiện rộng, thời gian thực
hiện nhanh, giá thành hợp lý, kỹ thuật MLP-
rPCR là một giải pháp hữu hiệu trong việc tìm ra
nguồn gốc gen đề kháng kháng sinh.
Từ khoá: đề kháng kháng sinh, trực khuẩn
Gram âm, MLP-rPCR, NG-test
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 544 - THÁNG 11 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024
69
SUMMARY
DETECTION OF ANTIBIOTIC
RESISTANCE GENES PRESENT IN
COMMON GRAM-NEGATIVE RODS
USING MULTIPLEX REAL-TIME PCR
Objective: To detect the ratio of antibiotic
resistance genes in 4 common Gram-negative
rods including K. pneumoniae, E. coli, P.
aeruginosa and A. baumannii by using Multiplex
real-time PCR (MPL-rPCR) and compare the
results with the NG-test.
Methods: DNA was extracted from each
isolated strain, followed by MPL-rPCR using 10
mixes of primers and probes specific for AmpC,
ESBL, carbapenemase and MCR genes. NG-Test
was performed simultaneously for comparison.
Results: 316 K. pneumoniae, 311 E. coli,
310 P. aeruginosa and 302 A. baumannii strains
were collected. CTX-M and other ESBL genes
were mainly found in K. pneumoniae and E. coli.
Carbapenemase genes were found in all 4 strains
with rates of 49.4% for K. pneumoniae, 10.3%
for E. coli, 38.1% for P. aeruginosa and 75.2%
for A. baumannii. Key carbapenemase genes
detected included KPC, NDM1, OXA-48 and
IMP: (i) KPC and OXA-48 were the most
prevalent in K. pneumoniae at 8.5% and 29.8%,
respectively. (ii) NDM1 was found across all
strains, lowest in E. coli (3.2%), highest in K.
pneumoniae (31.7%) and P. aeruginosa (31.3%),
(iii) IMP gene was mainly found in P.
aeruginosa (7.7%). (iv) A. baumannii
predominantly carried OXA-51 (85.8%) and
OXA-23 (67.6%). The agreement between MLP-
rPCR and NG-Test exceeded 90.0% for detecting
CTX-M, carbapenemase, and MCR1 genes, but
was lower at 56,0% for detecting IMP in A.
baumannii.
Conclusion: Gram-negative bacilli carrying
antibiotic resistance genes, especially
carbapenemase genes, pose a challenge for
clinical treatment. MLP-rPCR is a wide-
spectrum, effective and economical solution in
finding the origin of antibiotic resistance genes.
Keywords: antibiotic resistant gene, Gram-
negative bacilli, MLP-rPCR, NG-test
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm khuẩn do các trực khuẩn Gram
âm là thách thức lớn trong y học, đặc biệt
trong điều trị kháng sinh. Một trong những
nguyên nhân chính là do sự tiến hóa của
enzyme β-lactamase: từ dạng cổ điển,
AmpC, β-lactamase phổ rộng (ESBL) đến
carbapenemase có khả năng phả huỷ các
kháng sinh mạnh nhất như carbapenem, vốn
được xem là “búa tạ” trong điều trị nhiễm
khuẩn Gram âm đa kháng1.
Phân loại Ambler cho thấy sự khác biệt
chuỗi amino-acid tại vị trí hoạt động của các
enzyme này, dẫn đến sự khác nhau trong
nhóm thuốc ức chế, đặc biệt là đối với
carbapenemase. Loại A gồm ESBL và
carbapenemase KPC. Loại C là AmpC. Loại
D gồm các β-lactamase tác dụng lên β-
lactam phổ hẹp như oxacillin với gen OXA.
Loại B là carbapenemase có ion kẽm tại vị trí
hoạt động thay vì serine như loại A, C và D,
như IMP, VIM và NDM11.
Sự lây lan của các vi khuẩn kháng
carbapenem không chỉ làm tăng tỷ lệ tử vong
mà còn gia tăng chi phí điều trị. Do đó, thông
tin về gen đề kháng kháng sinh trong các vi
khuẩn Gram âm rất quan trọng để lựa chọn
kháng sinh hợp lý. Hiện nay, nhiều bộ kit
thương mại có thể phát hiện một số gen
carbapenemase như KPC, NDM, IMP và
OXA-48-like chỉ trong 15 phút bằng phương
HỘI NGHỊ QUỐC TẾ KIỂM SOÁT NHIỄM KHUẨN VÀ VI SINH LÂM SÀNG – BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y DƯỢC TPHCM
70
pháp sắc ký miễn dịch2. Tuy nhiên, việc áp
dụng phương pháp này rộng rãi còn gặp
nhiều thách thức do giá thành khá cao. Vì
vậy, cần có một giải pháp thay thế với giá
thành hợp lý và dễ áp dụng hơn.
Nghiên cứu này tập trung vào việc áp
dụng kỹ thuật MLP-rPCR, nhằm xác định sự
phân bố của các gen kháng thuốc phổ biến,
trong 4 trực khuẩn Gram âm thường gặp K.
pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa và A.
baumannii, những “thủ phạm” chính gây
nhiễm khuẩn nặng, đặc biệt ở người bệnh nội
trú, nơi tình trạng kháng kháng sinh lan rộng.
Đồng thời, nghiên cứu so sánh khả năng phát
hiện của MLP-rPCR với bộ kit thương mại
NG-test, nhằm đưa ra bức tranh tổng quát về
tỷ lệ các gen kháng thuốc, và cơ sở khoa học
giúp phát triển các chiến lược điều trị và
phòng ngừa nhiễm khuẩn.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi
khuẩn là 4 loại trực khuẩn Gram âm K.
pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa và A.
baumannii phân lập từ bệnh phẩm đàm, máu,
mủ và nước tiểu của người bệnh nhiễm
khuẩn phải nhập viện để điều trị nội trú tại 8
bệnh viện lớn tại Thành phố Hồ Chí Minh
(Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Thống Nhất,
Bệnh viện Trưng Vương, Bệnh viện Nhân
dân Gia Định, Bệnh viện Nguyễn Tri
Phương, Bệnh viện Nhi Đồng 1, Bệnh viện
Đại học Y Dược, Bệnh viện Thành phố Thủ
Đức).
Tiêu chuẩn chọn mẫu: Tất cả các chủng
được phân lập lần đầu từ các bệnh phẩm
tương ứng để phát hiện tác nhân vi sinh gây
nhiễm khuẩn theo chỉ định của các bác sĩ
điều trị.
Tiêu chuẩn loại trừ: Chủng phân lập từ
người bệnh đã sử dụng kháng sinh, từ các
mẫu kiểm soát môi trường và các chủng có
kết quả định danh không rõ ràng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang
Cỡ mẫu: 300-320 chủng mỗi loài vi
khuẩn, trung bình 80 chủng cho mỗi loại
bệnh phẩm. Chọn mẫu theo phương pháp
thuận tiện cho đến khi đủ số lượng.
Vận chuyển và bảo quản mẫu: Các
chủng thu thập được lưu giữ trong điều kiện
thích hợp tại các phòng xét nghiệm bệnh
viện, sau đó được gửi đến Phòng Xét nghiệm
thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Vi sinh
Lâm sàng Việt Nam. Tại đây, các chủng vi
khuẩn được lưu trữ trong dung dịch BHI
glycerol 20% ở -800C cho đến khi thực hiện
thử nghiệm.
Phương pháp thực hiện: Rã đông các
chủng vi khuẩn được lưu trữ, nuôi cấy tái
phân lập trên thạch máu (BA), ủ 37oC qua
đêm và tái định danh bằng phương pháp sinh
hoá với bộ thuốc thử IDS 14 GNR (do công
ty Nam Khoa sản xuất).
- Thử nghiệm MLP-rPCR: Từ mỗi chủng
vi khuẩn được phân lập, lấy 3-5 khúm cho
vào TE1X thành huyền dịch 0,5-2 McF. Tách
chiết DNA bằng phương pháp đun sôi rồi lấy
dịch nổi chạy MPL-rPCR trên máy CFX-96
(Biorad, USA) với 10 MPL-rPCR mix gồm
các primer và probe đặc hiệu cho các các gen
AmpC, ESBL, MCR và carbapenemase.
Chương trình luân nhiệt gồm: 95oC trong 15
phút, 40 chu kỳ 94oC trong 15 giây và 60oC
trong 1 phút.
- Thực hiện NG-Test (NG Biotech,
Pháp): Từ mỗi chủng vi khuẩn được phân
lập, lấy khoảng 3 khúm cho vào 150 µL dung
dịch đệm (extraction buffer) thành huyền
dịch 0,5 McF. Cho 100 µL huyền dịch vừa
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 544 - THÁNG 11 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024
71
pha vào các giếng “S”. Đọc kết quả các gen
đề kháng kháng sinh trên cassette CARBA-5
(phát hiện các gen carbapenemase), CTX-M
(gen ESBL) trên cassette CTX-M và gen
MCR trên cassette MCR trong vòng 15 phút.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu thu thập được tổng cộng
1239 chủng vi khuẩn, bao gồm 316 chủng K.
pneumoniae, 311 chủng E. coli, 310 chủng P.
aeruginosa và 302 chủng A. baumannii. Các
kết quả nghiên cứu được ghi nhận như sau:
3.1. Tình hình phát hiện các gen đề kháng các kháng sinh ở K. pneumoniae và E. coli
bng MLP-rPCR
Bảng 1. Tỷ lệ các gen
-lactamase ghi nhận ở K. pneumoniae và E. coli bằng MLP-
rPCR
Vi khuẩn (số
chủng)
AmpC
đơn độc
(%)
ESBL
(%)
Carbapenemase
MCR
(%)
KPC
(%)
OXA-48-
like
(%)
NDM1
(%)
K. pneumoniae
(N=316)
13
(4,1)
192
(60,6)
27
(5,8)
94
(29,8)
100
(31,7)
3
(1,0)
E. coli (N=311)
31
(10,0)
212
(68,2)
1
(0,3)
22
(7,1)
10
(3,22)
7
(2,3)
Nhận xét: Ở K. pneumoniae và E. coli, tỷ
lệ mang gen AmpC đơn độc đều còn khá
thấp (4,1% và 10,0%). Trong khi đó, ESBL
được ghi nhận ở 2 chủng với tỷ lệ hơn
60,0%. Tỷ lệ mang gen carbapenemase ở K.
pneumoniae là 49,4%, cao hơn so với E. coli
là 10,3%. Gen carbapenemase phổ biến nhất
ở K. pneumoniae là NDM1 (31,7%). Gen
OXA-48-like cũng chiếm tỷ lệ khá cao
(29,8%) và KPC ít gặp hơn (8,5%). Tỷ lệ các
gen carbapenemase ở E. coli khá thấp, với
OXA-48-like phổ biến nhất (7,1%). Đặc biệt,
ghi nhận 3 chủng K. pneumoniae (1,0%) và 7
chủng E. coli (2,3%) mang gen MCR
(mobile colistin-resistant) kháng colistin.
3.2. Tình hình phát hiện các gen đề
kháng các kháng sinh ở P. aeruginosa và
A. baumannii bng MLP-rPCR
Bảng 2. Tỷ lệ các gen carbapenemase ghi nhận ở P. aeruginosa và A. baumannii bằng
MLP-rPCR
Vi khuẩn
(số chủng)
KPC
(%)
NDM1
(%)
IMP
(%)
OXA-
48-like
(%)
OXA-
51
(%)
OXA-
58
(%)
OXA-
23
(%)
OXA-
24
(%)
Mang gen
carbapenemase
(%)
P. aeruginosa
(N=310)
23
(7,4)
97
(31,3)
24
(7,7)
0
(0,0)
0
(0,0)
0
(0,0)
0
(0,0)
0
(0,0)
118
(38,1)
A. baumannii
(N=302)
0
(0,0)
32
(10,6)
0
(0,0)
0
(0,0)
259
(85,8)
22
(7,3)
204
(67,6)
1
(0,3)
227
(75,2)
Nhận xét: Có 38,1% chủng P.
aeruginosa mang gen carbapenemase. Tỷ lệ
này ở A. baumannii cao hơn gấp đôi với
75,2%. Gen NDM1 phổ biến nhất trong P.
aeruginosa với tỷ lệ 31,3%. Đặc biệt, gen
IMP được ghi nhận với tỷ lệ 7,7%. Đối với
HỘI NGHỊ QUỐC TẾ KIỂM SOÁT NHIỄM KHUẨN VÀ VI SINH LÂM SÀNG – BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y DƯỢC TPHCM
72
A. baumannii, vắng bóng các gen KPC,
OXA-48, IMP, thay vào đó là các gen: cao
nhất là OXA-51 (85,8%), tiếp đến là OXA-
23 (67,6%). OXA-28 và OXA-24 cũng được
ghi nhận với tỷ lệ thấp (7,3% và 0,3%).
NDM1 cũng được phát hiện ở 32 chủng
(10,6%).
3.3. So sánh tỷ lệ các gen CTX-M,
MCR và carbapenemase được phát hiện
bng MLP-rPCR và NG-Test trên E. coli,
K. pneumoniae, P. aeruginosa và A.
baumannii
Bảng 3. So sánh tỷ lệ các gen CTX-M, MCR và carbapenemase được phát hiện bằng
MLP-rPCR và NG-Test trên E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa và A. baumannii
CTX-M
ĐT
K-ĐT
NDM1
ĐT
K-ĐT
IMP
ĐT
K-ĐT
E. coli
Cùng [+]
176
90,7
9,3
5
97,7
2,3
Không tìm thấy
Cùng [-]
106
299
MPL-rPCR [+], NG-test [-]
15
5
MPL-rPCR [-], NG-test [+]
14
2
K.
pneumoniae
Cùng [+]
178
93,4
6,6
84
90,8
9,2
0
99,7
0,3
Cùng [-]
117
203
315
MPL-rPCR [+], NG-test [-]
13
16
0
MPL-rPCR [-], NG-test [+]
8
13
1
KPC
ĐT
K-ĐT
Oxa48*
ĐT
K-ĐT
MCR
ĐT
K-ĐT
E. coli
Cùng [+]
1
100,0
0,0
15
96,5
3,5
4
98,1
1,9
Cùng [-]
310
285
301
MPL-rPCR [+], NG-test [-]
0
7
3
MPL-rPCR [-], NG-test [+]
0
4
3
K.
pneumoniae
Cùng [+]
26
97,2
2,5
87
94,6
5,4
0
99,1
0,9
Cùng [-]
282
212
313
MPL-rPCR [+], NG-test [-]
1
7
3
MPL-rPCR [-], NG-test [+]
7
10
0
CTX-M
ĐT
K-ĐT
NDM1
ĐT
K-ĐT
IMP
ĐT
K-ĐT
P.
aeruginosa
Cùng [+]
Không tìm thấy
90
95,5
4,5
22
99,4
0,6
Cùng [-]
206
286
MPL-rPCR [+], NG-test [-]
7
2
MPL-rPCR [-], NG-test [+]
7
0
A.
baumannii
Cùng [+]
Không tìm thấy
25
96,0
4,0
0
56,0
44,0
Cùng [-]
265
169
MPL-rPCR [+], NG-test [-]
7
0
MPL-rPCR [-], NG-test [+]
5
133
KPC
ĐT
K-ĐT
Oxa48*
ĐT
K-ĐT
MCR
ĐT
K-ĐT
P.
aeruginosa
Cùng [+]
21
99,4
0,6
0
99,7
0,3
Khônng tìm thấy
Cùng [-]
287
309