Luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THANH HẢI HÀ

PH¸T TRIÓN SINH KhèI Virus NH¢N §A DIÖN (NPV)

TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT

THUèC TRõ S¢U SINH HäC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THANH HẢI HÀ

PH¸T TRIÓN SINH KhèI VIrus NH¢N §A DIÖN (NPV)

TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT

THUèC TRõ S¢U SINH HäC

Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS.TS. Hoàng Đình Hoà

PGS.TS. Lê Văn Trịnh

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án này là

trung thực, không trùng lặp với các đề tài luận án nào khác và chưa được tác giả

khác công bố.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả

MỤC LỤC

Diễn giải Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu 1

2. Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài 3

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4

5. Những đóng góp mới của luận án 4

CHƯƠNG 1. CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu 5

1.2. Tổng quan tài liệu 6

1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 6

1.2.1.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng 6

1.2.1.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại 8

1.2.1.3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng 12

1.2.1.4. Nghiên cứu điều kiện phát triển sinh khối của tế bào côn trùng 18

1.2.1.5. Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi 28

1.2.1.6. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV 32

1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước 35

1.2.2.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng 35

1.2.2.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại 36

1.2.2.3. Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng 37

1.2.2.4. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV 38

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 43

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 43

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 43

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 44

2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 44

2.2.2. Thời gian nghiên cứu 44

2.3. Nội dung nghiên cứu 44

2.4. Phương pháp nghiên cứu 44

2.4.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang 44

2.4.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây 48 nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân

2.4.2. 1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang 50

2.4.2.2. Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân nuôi 54

2.4.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 60

2.4.3.1. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào 60

2.4.3.2. Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 61

2.4.3.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được

2.4.4. Phương pháp tính toán, xử lý số liệu 65

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn virus nhân đa diện (NPV) trên sâu khoang 66

3.1.1. Mức độ phổ biến và khả năng gây chết sâu khoang của virus nhân đa diện (NPV) ngoài đồng ruộng 66

3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao 70

3.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi 77

3.2.1. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 78

iii

3.2.1.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 78

3.2.1.2. Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mô phòng thí nghiệm 88

3.2.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang trên tế bào nuôi nhân 92

3.2.2.1. Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm virus nhân đa diện ( NPV) 93

3.2.2.2. Mức độ phát triển sinh khối tế bào và hình thành thể vùi trong quá trình lây 101 nhiễm virus nhân đa diện (NPV)

3.2.2.3. Mức độ gây chết sâu khoang và hình thành thể vùi của NPV nhân trên tế bào và trên sâu 105

3.2.2.4. Hiệu lực trừ sâu khoang của chủng virus TL.1a nhân trên tế bào 107

3.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang và tạo chế phẩm dạng bột thấm nước 109

3.3.1. Tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang 109

3.3.2. Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước 114

3.3.3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được 117

3.3.3.1. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm 117

3.3.3.2. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trên bắp cải ngoài nhà lưới 117

3.3.3.3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng 120

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

126 1. Kết luận

127 2. Đề nghị

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 128

129 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu, Diễn giải chữ viết tắt

ADN Axit Deroxyribo Nucleic

Công thức CT

Coefficient of Variation (Hệ số biến động) CV

Fetal Bovin Serum (Huyết thanh) FBS

Những người khác et al.

Multiplicity of Infection (Chỉ số lây nhiễm) MOI

Những người khác nnk.

NSNN Ngày sau nuôi nhân

NSLN Ngày sau lây nhiễm

Nuclear Polyhedrosis Virus (Virus nhân đa diện) NPV

Occlusion Bodies (Thể vùi) OB

Photphatse Buffer Saline PBS

Polyhedral shaped inclusion Bodies (Thể vùi nhân đa diện) PIB

QCVN Qui chuẩn Việt Nam

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

Sodium Dodecyl Sulfate SDS

Trung bình TB

DANH MỤC BẢNG

Diễn giải Trang

Bảng 3.1. Mật độ sâu khoang phát sinh và tỷ lệ sâu chết do NPV trên các cây trồng

ngoài đồng ruộng (2014- 2015) 68

Bảng 3.2. Mức độ phổ biến của NPV ký sinh sâu khoang trên các cây trồng ngoài

đồng ruộng (2014- 2105) 69

Bảng 3.3. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang ở các ngày sau lây

nhiễm của các chủng NPV sau phân lập lần 1 72

Bảng 3.4. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang sau lây nhiễm của

các chủng NPV sau phân lập lần 2 74

Bảng 3.5. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng

NPV điển hình sau phân lập lần thứ 4 75

Bảng 3.6. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng

NPV đã được lựa chọn 76

Bảng 3.7. Mật độ tế bào sâu khoang ở các ngày sau nuôi nhân trên các môi trường

79 khác nhau

Bảng 3.8. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau 81

Bảng 3.9. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức pH môi trường khác

83 nhau

Bảng 3.10. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân trên môi trường có bổ sung

huyết thanh FBS với tỷ lệ khác nhau 85

Bảng 3.11. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân in vitro ở điều kiện thích hợp 86

Bảng 3.12. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân theo phương pháp tĩnh và lắc

trên bình lọc khuẩn 250ml 89

Bảng 3.13. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân với lượng 750ml môi trường

trên bình lọc khuẩn 1000ml theo phương pháp tĩnh và lắc 91

Bảng 3.14. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào có mật độ khác

94 nhau

Bảng 3.15. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào theo chỉ số MOI

khác nhau 95

Bảng 3.16. Số lượng thể vùi hình thành sau thời gian ủ lây nhiễm NPV khác nhau

Bảng 3.17. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang

với các loại môi trường khác nhau 98

Bảng 3.18. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang

ở nhiệt độ khác nhau 99

Bảng 3.19. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang

ở các mức pH môi trường khác nhau 101

Bảng 3.20. Mật độ tế bào sâu khoang và số thể vùi hình thành sau các ngày lây

nhiễm NPV theo chỉ số MOI khác nhau 104

Bảng 3.21. Hiệu lực trừ sâu khoang của các nguồn NPV được tạo ra từ lây nhiễm

trên tế bào và trên sâu khoang 105

Bảng 3.22. Số lượng thể vùi hình thành từ các nguồn NPV tạo ra từ lây nhiễm trên

tế bào và trên sâu khoang 106

Bảng 3.23. Hiệu lực trừ sâu khoang của các chủng NPV được nhân sinh khối trên tế

bào và trên sâu khoang 108

Bảng 3.24. Số lượng thể vùi sâu khoang và tỷ lệ thu hồi sau tinh sạch theo các

phương pháp khác nhau 111

Bảng 3.25. Các chủng NPV sâu khoang sử dụng trong phân tích phả hệ 113

Bảng 3.26. Thành phần phụ gia, chất lượng và liều lượng sử dụng chế phẩm NPV

dạng bột thấm nước 116

Bảng 3.27. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV sau 6 ngày phun

trong điều kiện phòng thí nghiệm 117

Bảng 3.28. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải của chế phẩm NPV trong

điều kiện nhà lưới 118

Bảng 3.29. Số lượng thể vùi hình thành trên sâu khoang trên bắp cải sau khi sử

dụng chế phẩm NPV ngoài nhà lưới 119

vii

Bảng 3.30. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên bắp cải ngoài

đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội) 121

Bảng 3.31. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liều

lượng khác nhau trên bắp cải ngoài đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội) 122

Bảng 3.32. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liều

lượng khác nhau trên đậu tương ngoài đồng ruộng tại Mỹ Thành (Hà Nội) 124

Bảng 3.33. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên đậu tương tại

124 Mỹ Thành (Hà Nội)

viii

DANH MỤC HÌNH

Trang

Diễn giải

Hình 1.1. Các giai đoạn phát dục của sâu khoang 7

Hình 1.2. Các dạng Baculovirus (A), thể chồi (B) và thể vùi của NPV (C, D) 8

Hình 2.3. Buồng đếm hồng cầu Neubauer 54

Hình 3.1. Triệu chứng sâu non sâu khoang chết do NPV trên lạc và bắp cải 67

Hình 3.2. Thể vùi NPV màu trắng đục hình thành và lắng đọng 69

Hình 3.3. Lây nhiễm NPV trên sâu non sâu khoang trong phòng thí nghiệm 72

Hình 3.4. Thể thể vùi (OB) và thể hoạt động (virion) của chủng TL.1a 77

Hình 3.5. Thí nghiệm xác định môi trường nuôi nhân tế bào thích hợp A: Ban đầu;

B: Sau nuôi nhân 3 ngày 80

Hình 3.6. Tế bào sâu khoang sau 6 ngày nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau.

A: 240C; B: 260C, C: 280C và D: 290C 81

Hình 3.7. Tế bào sâu khoang sau 6 ngày đã nuôi nhân đợt tháng 11/2016 quan sát

dưới kính với độ phóng đại 100X 86

Hình 3.8. Tế bào sâu khoang sau nuôi nhân 6 ngày khi quan sát dưới kính hiển vi có

độ phóng đại 600X và 200X 87

Hình 3.9. Nhân tế bào theo phương pháp lắc (A) và theo phương pháp tĩnh (B) 90

Hình 3.10. Thể vùi NPV sâu khoang sau khi tinh sạch khi quan sát dưới kính hiển vi

với độ phóng đại 200X và 600X 111

Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR các mẫu NPV trên tế bào và trên sâu 112

Hình 3.12. Thể vùi sau tinh sạch (A), được đưa vào lọ bảo quản (B) 113

Hình 3.13. Cây phả hệ dựng theo phương pháp Neighbor-joining. 114

Hình 3.14. Đóng gói chế phẩm NPV sau khi tạo dạng sử dụng 116

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu

Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là loài sâu ăn tạp thường gây hại trên

các đối tượng cây trồng cạn, phân bố rộng ở nhiều nước thuộc khu vực nhiệt đới và

á nhiệt đới. Theo Kumari và Singh (2009); Hong (2002), sâu khoang có thể sống và

gây hại trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau [1, 2]. Ở Việt Nam, sâu

khoang thường phát sinh phá hại nặng trên nhiều loại cây trồng, điển hình như các

loại rau họ Thập tự, nho, đậu đỗ, cà chua, dưa chuột, rau muống, khoai sọ, thuốc lá,

đậu tương, lạc, bông, đay, v.v. (Viện Bảo vệ thực vật, 2003, 2006) [3, 98].

Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (2001), để bảo vệ cây trồng

khỏi tác hại do sâu khoang, nông dân thường phải sử dụng nhiều loại thuốc hóa học

bảo vệ thực vật với liều lượng cao [4]. Sự lệ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật hóa

học đã làm tăng mức độ kháng thuốc của sâu khoang, gây khó khăn cho công tác

phòng trừ và gây nhiễm bẩn thực phẩm, gây độc hại đáng kể đối với sức khỏe người

sản xuất và tiêu dùng sản phẩm, ô nhiễm môi trường và làm tổn hại đến quần thể

các loài sinh vật có ích trên đồng ruộng .

Trên đồng ruộng, cũng như các loài côn trùng thuộc bộ Cánh phấn khác, sâu

khoang thường bị chết do nhiễm NPV. Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực

vật (2001), khi sâu khoang phát sinh ở mật độ cao, tỷ lệ sâu chết do bị nhiễm NPV

(Nuclear Polyhedrosis Virus) từ 0,2- 1,5% trên rau bắp cải, từ 0,9- 1,6% trên đậu

tương và 0,3- 1,9% trên lạc [4].

Rohrmann và George (2011), Kitajima (1989); Kamakoff và Ward (2007) đã

xác định NPV lây nhiễm, gây chết trên sâu khoang là loài vi rút nhân đa diện

(Nuclear Polyhedrosis Virus- NPV) thuộc họ Baculoviridae và thuộc nhóm vi rút

sinh thể vùi (Oclusion Bodies - OB), mỗi thể vùi có thể chứa tới 200 thể vi rút hoạt

động (virion) hình que có vỏ ngoài protein bao bọc phân tử ADN (nhân) dạng vòng

xoắn kép. Thể vùi của NPV côn trùng có hình khối đa diện với kích thước từ 0,15-

15µm. NPV sâu khoang rất chuyên tính và có hiệu quả gây chết cao đối với sâu

khoang, không lây nhiễm trên các loài không phải là ký chủ của nó [5, 6, 7].

Vì vậy, việc khai thác sử dụng và nghiên cứu khả năng phát triển sinh khối

NPV phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học NPV là cần thiết, nhằm đáp ứng yêu cầu

phòng trừ sâu khoang hại trên các cây trồng nông nghiệp. Sử dụng chế phẩm sinh

học NPV còn góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản

xuất nông sản an toàn, chất lượng cao cho tiêu dùng và xuất khẩu, bảo tồn các loài

sinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng. Đồng thời, thông qua việc sử

dụng chế phẩm sinh học này trong việc phòng trừ sâu khoang, sẽ góp phần bổ sung

nguồn vi sinh vật có ích NPV vào đồng ruộng.

Lâu nay, việc phát triển sinh khối NPV vẫn tiến hành theo phương pháp thủ

công với qui mô nhỏ hẹp. Bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau đó nhiễm

NPV của loài sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử dụng (Nguyễn Văn Cảm

et al., 1996) [8]. Theo cách này, việc sản xuất chế phẩm NPV phòng trừ sâu hại khó

thực hiện với qui mô công nghiệp, vì để nuôi được số lượng lớn cá thể của một loài

sâu hại phục vụ sản xuất chế phẩm là một vấn đề hết sức khó khăn, phải có đủ nhà

xưởng, trang thiết bị và việc nuôi sâu phải tiến hành trong điều kiện vô trùng.

Để có thể tạo được khối lượng lớn sinh khối NPV của các sâu hại với qui mô

công nghiệp, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng thành công

kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất các loại chế phẩm NPV

phục vụ phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp (Granados et al., 2007;

Goodman, 2008; Elanchezyan, 2009) [9, 10, 11]. Đến nay, nhiều nước như: Mỹ, Hà

Lan, Canada, Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, v.v. đã và đang ứng dụng để sản xuất, cung

cấp cho thị trường nhiều loại chế phẩm NPV có hiệu lực cao trong phòng trừ sâu

hại cây trồng. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phát triển sinh khối NPV trên cơ sở ứng

dụng kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng là vấn đề còn rất mới, kết quả

thu được mới dừng lại ở bước khởi đầu và còn rất hạn chế.

Việc thực hiện đề tài: ”Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên tế

bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học”được tiến hành nhằm đóng

góp tư liệu khoa học về tiềm năng của NPV và khả năng lây nhiễm, phát triển sinh

khối virus trên tế bào sâu khoang nhân nuôi, làm cơ sở cho việc phát triển chế phẩm

sinh học phục vụ phòng trừ sâu hại ở nước ta, góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ

sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn cho tiêu dùng và xuất khẩu,

bảo tồn các loài sinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng.

2. Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài

2.1. Mục đích

- Trên cơ sở đánh giá tiềm năng ký sinh tự nhiên, tiến hành tuyển chọn chủng

vi rút nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao trong phòng chống sâu khoang.

- Xác định được kỹ thuật nuôi nhân tế bào sâu khoang và lây nhiễm phát

triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại.

2.2. Yêu cầu cần đạt

- Đánh giá được khả năng gây chết sâu khoang ngoài tự nhiên, thu thập và

tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang.

- Nghiên cứu xác định được điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào

sâu khoang và lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào nuôi nhân.

- Thử nghiệm phát triển chế phẩm virus nhân đa diện (NPV) sâu khoang

dạng bột thấm nước có hiệu quả cao phòng trừ sâu khoang hại cây trồng.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1. Ý nghĩa khoa học

- Các dẫn liệu đánh giá tiềm năng gây chết sâu khoang của NPV trên đồng

ruộng và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao có ý nghĩa to lớn trong định hướng

khai thác, sử dụng NPV để quản lý sâu hại cây trồng nông nghiệp.

- Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân

đa diện (NPV) trên tế bào sẽ góp phần làm sáng tỏ tiềm năng ứng dụng trong phát

triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học.

- Kết quả nghiên cứu tinh sạch thể vùi (OB) của NPV sâu khoang, thử

nghiệm tạo chế phẩm sinh học NPV dạng bột thấm nước có hiệu quả cao trong

phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng làm cơ sở định hướng tiêu chuẩn hoá chất

lượng chế phẩm sinh học dựa trên số lượng thể vùi sau khi sản xuất.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả điều tra, thu thập và tuyển chọn 3 chủng NPV có tiềm năng cao trong

phát sinh thể vùi và gây chết sâu khoang phục vụ phát triển chế phẩm sinh học.

Với kết quả phát triển được 2 chế phẩm NPV có hiệu lực trừ sâu cao sẽ góp

phần định hướng xây dựng qui trình sản xuất và sử dụng chế phẩm để phòng trừ sâu

khoang, nhằm hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất

nông sản an toàn và bảo vệ môi trường đồng ruộng.

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1. Đối tượng nghiên cứu

- Virus nhân đa diện (NPV) sâu khoang: Được thu thập ngoài đồng ruộng và

được phân lập tại phòng thí nghiệm Sinh học (Viện Bảo vệ thực vật).

- Tế bào sâu khoang: Nguồn thực liệu tế bào sâu khoang sử dụng trong

nghiên cứu do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp, là dòng tế bào phát triển từ tế bào

gốc của mô phôi sâu khoang và đã được phân lập nuôi nhân, chọn lọc qua 135 chu

kỳ, hiện đang được lưu giữ bảo quản tại Viện Bảo vệ thực vật.

- Sâu non sâu khoang: Được nhân nuôi trong các lồng nuôi sâu chuyên dụng

với thức ăn bằng lá bắp cải thu hái hàng ngày và xử lý vô trùng bằng cồn 700.

4.2. Phạm vi nghiên cứu

- Đánh giá tiềm năng gây chết sâu khoang của NPV trên bắp cải, lạc, đậu

tương và khoai sọ ngoài đồng ruộng. Thu thập, phân lập và tuyển chọn chủng NPV

có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang.

- Xác định điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang

- Điều kiện lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào sâu khoang.

- Kỹ thuật tinh sạch thể vùi, tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước.

5. Những đóng góp mới của luận án

- Lần đầu tiên cung cấp các dẫn liệu khoa học có hệ thống về khả năng phát

triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) trên tế

bào, phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học tại Việt Nam.

- Bổ sung các dẫn liệu khoa học mới về mức độ phổ biến của NPV trên sâu

khoang hại bắp cải, lạc, đậu tương và khoai sọ. Phân lập, tuyển chọn được 3 chủng

NPV có tiềm năng (TL.1a; TL.2a; TL.3a), trong số đó TL.1a có hoạt lực gây chết sâu khoang cao nhất (80%) và số thể vùi hình thành nhiều (2,6 x 108 OB/10 sâu).

- Bước đầu xác định được kỹ thuật tinh sạch thể vùi NPV phục vụ tạo dạng

sử dụng chế phẩm. Phát triển được 2 chế phẩm NPV dạng bột thấm nước (NPV-1

WP và NPV-2 WP) có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu khoang hại trên cây bắp cải

(80,51- 82,29%) và đậu tương (96,92%).

CHƯƠNG 1

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu

NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) thuộc giống Alphabaculovirus, họ

Baculoviridae là một trong số ít vi rút có thể tồn tại ở dạng thể vùi (Occlusion

Bodies- OB) nên dễ dàng phân lập, lưu giữ và tạo dạng thành chế phẩm sinh học.

Trên đồng ruộng, NPV thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao và luôn

tồn tại dưới dạng thể vùi, các thể vùi có thể tồn tại tới 30 năm ngoài tự nhiên và chỉ

bị tiêu diệt khi thể vùi gặp phải môi trường đất, nước có pH ≥ 9,0 hoặc dính bám

trên thân cây, lá cây, tàn dư cây trồng khi phơi nhiễm dưới ánh sáng trực xạ mạnh

hoặc tia cực tím (Kitajima, 1989; Grzywacz et al.,1996; Erayya, 2013) [6, 12, 13].

Sau khi các cá thể sâu non ăn phải thức ăn có mang thể vùi NPV, gặp pH cao

(> 9,0) của ruột giữa làm vỏ protein của thể vùi bị phá vỡ, giải phóng các thể hoạt

động (virion) và các thể vi rút hoạt động này sẽ xâm nhiễm vào nhu mô ruột giữa.

Sau đó xâm nhiễm sang các mô bào khác của cơ thể côn trùng. Sau 2-3 ngày, sâu

ngừng ăn và sau 5- 7 ngày thì sâu chết (Sajap et al., 2000) [14].

Khi sâu non chết, cơ thể căng mọng rất dễ bị vỡ khi có va chạm nhẹ và sau

khi vỡ, thân sâu dính bám vào lá hoặc thân cây và treo ngược cơ thể. Khi sâu chết,

các thể hoạt động của NPV tập hợp lại trong vỏ bọc protein thành thể vùi, thể vùi

được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và tồn tại trong đất, trên tàn dư cây

trồng. Một sâu non chết bệnh NPV có thể chứa tới 24.553 thể vùi được giải phóng

ra môi trường đồng ruộng và có thể tồn tại từ 20-30 năm. Trong quá trình canh tác

cây trồng, làm đất hoặc do mưa gió, các thể vùi này dính bám lên lá cây và tiếp tục

chờ cơ hội tiếp tục xâm nhiễm gây chết cho sâu hại (Pourmirza, 2000) [15].

Như vậy, việc phun chế phẩm NPV vừa có ý nghĩa như một loại thuốc sinh

học để phòng trừ sâu hại một cách trực tiếp, vừa có tác dụng bổ sung nguồn virus

hữu ích, góp phần bảo vệ cân bằng sinh thái trên đồng ruộng.

Tuy nhiên, NPV chỉ có thể lây nhiễm và phát triển sinh khối trong các tế bào

sống của cơ thể côn trùng ở điều kiện môi trường thích hợp, như vậy việc phát triển

sinh khối NPV phải được thực hiện trên cơ thể sâu còn sống như phương pháp nuôi

sâu truyền thống hoặc lây nhiễm trên các mô, tế bào được nuôi nhân (Kalmakoff và

Ward, 2007; Elanchezhyan, 2009; Granados et al., 2007; Agathos et al., 2007,

Rohrmann và George, 2011) [6, 11, 9, 16].

Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu để có sự hiểu biết đầy đủ về điều kiện phát

triển sinh khối tế bào côn trùng, lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân trên cơ sở sử

dụng các chủng NPV có hoạt lực cao đã được tuyển chọn để phát triển sinh khối

NPV phục vụ phát triển thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại.

1.2. Tổng quan tài liệu

1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

1.2.1.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng

Các nhà khoa học trên thế giới đều xác định sâu khoang (Spodoptera litura

Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) là loài sâu đa thực, phá hại trên trên 290 loài cây

thuộc 90 họ thực vật khác nhau và được coi là đối tượng sâu hại quan trọng trong

sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới (Kumari và Singh, 2009; Hong,

2002, Jadhav et al, 2015, Cherry et al.,2000) [1, 2, 20]. Theo tổng hợp của Kuldeep

et al. (2018) [17], sâu khoang phân bố rộng khắp ở khu vực Đông Nam châu Á, gây

hại trên 63 loại cây thuộc 22 họ, là sâu hại nguy hiểm gây thiệt hại nặng trên các

loại rau màu, đậu tương và bông, đay, v.v. Riêng tại Ấn độ, theo Alfred và

Samiayyan (2017) [18] đã thống kê và xác định sâu khoang phá hại trên 140 loài

cây thuộc 40 họ thực vật khác nhau, chủ yếu trên các cây trồng nông nghiệp.

Sâu khoang có thời gian qua các giai đoạn phát dục khá dài, nhất là giai đoạn

sâu non là thời gian sâu phá hại trên cây trồng, nên mức hại do sâu gây ra lớn.

Nghiên cứu sự phát triển của sâu khoang trên cà chua, Nagamandla và Shantanu

(2018) [19] xác định ở nhiệt độ 200C thời gian sâu non kéo dài tới 41,8 ± 3,56 ngày

và thời gian hoàn thành vòng đời là 60,4 ± 3,13 ngày; ở nhiệt độ 250C, thời gian

tương ứng là 25,8 ± 0,67 và 41,6 ± 1,08 ngày, nhưng ở nhiệt độ 300C thời gian phát

dục của sâu khoang rút ngắn, còn 16,3 ± 0,83 và 30,1 ± 1,29 ngày (tương ứng).

Kết quả nghiên cứu của Jadhav et al. (2015) chỉ rõ, khi sinh sống trên cây

nho ở điều kiện nhiệt đới, vòng đời của sâu từ 52- 56 ngày, trong đó thời gian phát

dục của trứng, sâu non, nhộng và trưởng thành sâu khoang là 5- 7 ngày; 20- 23

ngày; 4- 6 ngày và 9- 12 ngày (tương ứng), một trưởng thành cái đẻ trung bình

499,2 trứng/con cái. Tác giả cũng xác định tỷ lệ trứng nở của sâu khoang và khả

năng sống sót của sâu non tuổi lớn khá cao, vì vậy tác hại do sâu khoang gây ra trên

cây trồng thường rất lớn [20]. Theo nghiên cứu của Patil et al., (2014), sâu khoang

có tiềm năng sinh sản rất cao, một trưởng thành cái có thể đẻ từ 500- 1.263 trứng và

khi trứng nở với thời gian sống của sâu non tới 24,5- 28,2 ngày thì mức gây hại của

chúng là rất lớn [21].

Nghiên cứu của Alfred và Samiayyan (2017) chỉ rõ sức ăn của sâu khoang

trên cây đậu triều ở mức cao nhất với chỉ số tiêu thụ thức ăn tới 3,889 trên đậu đỗ,

trong khi với các cây trồng khác ở mức từ 2,825- 3,343 [22]. Theo Liu et al. (1995)

xác định điều kiện thích hợp cho sâu khoang phát triển số lượng là 28- 300C và độ

ẩm không khí từ 85- 95% [23]. Kết quả nghiên cứu của Muniappan và Marutani

(1992) xác định số lượng quần thể sâu khoang phát triển mạnh ở nhiệt độ không khí

29- 300C và độ ẩm trên 90%. Các tác giả chỉ rõ sâu khoang phát triển nhanh với mật

độ cao trên bắp cải (185,7 con/10 cây), cải dưa và cải cuốn (169,0 con/10 cây) [24].

Trứng Sâu non

Trưởng thành Nhộng

Hình 1.1. Các giai đoạn phát dục của sâu khoang

Kết quả nghiên cứu Jat et al. (2017) [25] và Srivastava et al. (2018) [26] xác

định NPV là tác nhân vi sinh vật gây chết sâu khoang rất phổ biến, được coi là nhân

tố quan trọng và có hiệu quả cao trong điều hoà số lượng quần thể sâu hại trên đồng

ruộng. Hiện nay, các nhà bảo vệ thực vật rất quan tâm đến việc phát triển, ứng dụng

các chế phẩm NPV trong hệ thống quản lý tổng hợp (IPM) sâu hại nói chung và sâu

khoang nói riêng.

Tại Quảng Đông (Trung Quốc), Liu et al., (1995) xác định yếu tố hạn chế

đáng kể sự phát triển số lượng quần thể sâu khoang ngoài đồng ruộng là các tác

nhân ký sinh trên sâu non, đặc biệt NPV có thể làm sâu chết từ 7,2- 30,5%. Mặt

khác, do sâu hoá nhộng trong đất nên khi mưa kéo dài làm đất ngập nước thì nhộng

có thể chết tới 100% [23].

1.2.1.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại

Theo Evans (1986), Summer và Smith (1987), Rohman và George (2011) chỉ

rõ vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus) thuộc họ Baculoviridae, lớp

Virus, bao gồm 2 giống: vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus- NPV) và

vi rút hạt (Granulosis Virus – GV) [27, 28]. NPV là tác nhân gây chết cao đối với

các loài côn trùng thuộc các Bộ Lepidoptera, Hymenoptera, Diptera, Neuroptera,

Coleoptera, Trichoptera và nhện. Theo Arayya et al. (2013) NPV phát sinh và tồn

tại phổ biến trong tự nhiên, rất chuyên tính với ký chủ, không lây nhiễm trên động

vật máu nóng, an toàn với thiên địch và môi trường [29].

Hình 1.2. Các dạng Baculovirus (A), thể chồi (B) và thể vùi của NPV (C, D) (Nguồn: Rohrmann và George, 2011)

Theo Arayya et al. (2013), NPV có dạng hình gậy, có kích thước 40- 70 x

250 - 400nm bao gồm lớp vỏ lipoprotein bao quanh nhân (capsid) chứa thể DNA-

protein (core) và được gọi là nucleo- capsid. NPV tồn tại dưới dạng các hạt tinh thể

sáng, góc cạnh gọi là thể vùi (OB) hay còn gọi là polyhedra hoặc thể nhân đa diện

(PIB). Khi quan sát dưới kính hiển vi phản pha, thể vùi có kích thước 1-7µm. Tinh

thể này có nhiều cạnh và tạo thành 1 protein có khối lượng phân tử khoảng 25- 30

kDa. Các hạt virus có một lớp bọc bên ngoài gọi là nhân capsit (virion) và NPV có

một đặc tính hình thành các protein tinh thể trong nhân của tế bào vật chủ với kích

thước 0,5 - 15 nm [13].

Theo Hong et al. (2002), Rohrmann và George (2011) [2, 5], cấu tạo của

NPV gồm 3 phần: vỏ ngoài, vỏ capsid và lõi axit nucleic.

- Vỏ ngoài: là một lớp màng lipoprotein ngoài cùng còn gọi là protein ngoài.

Protein ngoài mang tính kháng nguyên và có tác dụng kích thích vào hệ thống miễn

dịch của cơ thể vật chủ.

- Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được ngăn

cách với lớp vỏ ngoài bởi một lớp dịch. Protein tạo nên vỏ capsid được gọi là

protein trong. Protein trong mang tính kháng nguyên, có tác dụng làm tăng khả

năng gây bệnh của virus.

- Genom: Genom của NPV là một phân tử ADN gồm 2 mạch xoắn kép. Khi

nhiễm vào tế bào vật chủ virus đưa lõi ADN vào tế bào vật chủ, ADN của virus sử

dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào vật chủ để tổng hợp nên

protein và quá trình nhân lên của ADN. Mặt khác, khi tế bào bị nhiễm virus, ADN

của virus sinh ra men Azenaza ức chế ADN của tế bào vật chủ và phân giải tạo

thành các nucleotit tự do. Sau khi tổng hợp đủ các thành phần như vỏ, ADN thì

NPV tạo thành thể virus mới.

Theo Lynn (2002), vỏ của polyhedrin (thể vùi) được bao bọc là protein.

Polyhedrin dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm. Do đó trong dịch ruột giữa của

sâu khoang với pH là 9-10 các thể đa diện bị phá vỡ, giải phóng các hạt virus tự do

(virion). Các hạt virus xâm nhập vào tế bào máu đến tế bào da, tế bào biểu mô khí

quản và tế bào mỡ để gây bệnh [30].

Quá trình nhân lên của NPV và sự hình thành thể đa diện được tiến hành

trong nhân tế bào, vỏ của thể đa diện được tổng hợp ở ngoài nhân sau đó vận

chuyển vào trong nhân để hình thành các thể đa diện. Số lượng virus và thể đa diện

ngày một tăng, kết quả phá vỡ tế bào vật chủ, giải phóng virus tự do và thể đa diện.

Virus tự do lại tiếp tục xâm nhập vào tế bào lân cận, bắt đầu chu trình phá vỡ tế bào

tiếp theo. Khi các tế bào vật chủ bị phá vỡ, quá trình phát bệnh của sâu hại sẽ biểu

hiện ra bên ngoài.

Phân tích trên kính hiển vi điện tử thấy các thể vùi đa diện nhân là những

tinh thể lớn, nhiều cạnh, có dạng như hình thoi, hình vuông, kích thước từ 1- 7m.

Các thể vùi này có cấu tạo vỏ bọc bởi các thể protein. Các lát cắt cực mỏng phóng

đại trên 60.000 lần cho thấy các khối đa diện chứa nhiều virion hình que (Rohrmann

và George, 2011; Khosaka et al., 1971) [5].

Theo Harrap (1972), các virion của NPV có một nucleocapsid trong một lớp

vỏ bao và nucleopsid này cũng có dạng hình que, chiều dài trung bình của các

virion là 200µm và đường kính 30 µm [31]. Rohrmann và George (2011) [5] còn

chỉ rõ các virion có 2 loại, gồm thể vùi (OB) và thể chồi (BV).

Theo Rohrmann và George (2011), thể vùi (Occlusion Bodies – OB) hay còn

gọi là thể vùi đa diện (Polyhedrosis Inclusion Bodies – PIB) có tính bền vững cao

và chống chịu tốt với điều kiện môi trường bình thường, chúng chứa thể đa diện

trong lớp vỏ protein gọi là polyhedrin. Các khối đa diện có đặc điểm dễ bị kiềm

hoá, dùng NaOH 0,1N có thể phá vỡ các vỏ đa diện giải phóng các virion. Vì vậy

trong ruột côn trùng, dịch ruột mang tính kiềm nên các polyhedra dễ bị phân huỷ để

lây nhiễm tiếp vào các nhân của các tế bào khác. Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một sợi

đôi ADN dạng vòng. Khối lượng phân tử 75 - 10 x 106 Da.

Thể chồi (BV) được hình thành trong quá trình xâm nhiễm vào tế bào nhu

mô ruột giữa của vật chủ, sau đó các polyhedra của thể chồi xâm nhiễm vào các tế

bào của các cơ quan vật chủ. Đến cuối quá trình xâm nhiễm, các virion tập hợp lại

và hình thành lớp vỏ bọc protein trở thành thể vùi (OB) trong tế bào vật chủ và sau

đó giải phóng ra môi trường theo xác chết bị phân rã của cơ thể vật chủ [5].

Theo Farrar et al. (1999) thì NPV là nhóm virus lớn và có hiệu quả gây chết

cao đối với các loài côn trùng, mỗi loài virus thường rất chuyên tính. Đặc biệt, các

loài NPV hoàn toàn không lây nhiễm trên các loài động vật có xương sống. Vì thế,

chúng là những tác nhân sinh học rất hữu ích trong phòng trừ sâu hại cây trồng [32].

Kết quả thí nghiệm đồng ruộng trên cải bắp của Jat et al. (2017) xác định hiệu lực

trừ sâu khoang (Spodoptera litura) đạt từ 58,15- 72,13% khi phun với liều lượng

1,5 x1012 OB/ha [33]. Kết quả của Grzywacz et al. (2008) cho thấy hiệu quả trừ sâu

Spodoptera exempta trên đậu đỗ đạt tới 96% khi phun SpexNPV với liều lượng 5 x

1011 OB/ha [34]. Kết quả thí nghiệm của Bedjo (2017) trên đậu tương tại vùng

Đông Java (Indonesia) với các chủng khác nhau ở nồng độ từ 1 x 106 đến 1 x 1012

PIB/ml thì chủng có tỷ lệ sâu non sâu khoang tuổi 3 cao nhất đạt từ 51,11- 77,78%

sau 168 giờ xử lý [35]. Tại Malaysia, Sajap et al. (2000) đánh giá mức độ chuyên

tính của NPV sâu khoang (Spodoptera litura) đã xác định khi phun NPV sâu

khoang với liều lượng 6 x 107 PIB và 6 x 108 PIB/sâu non sâu khoang cho hiệu quả

gây chết tương ứng là 80,81 và 95,95%, nhưng hoàn toàn không gây chết sâu non

Spodoptera retorta Clerk (Noctuidae) và Preroma pendulla Joanis (Psychidae) [14].

Kết quả nghiên cứu của Jat et al.(2017) khi so sánh hiệu lực của các thuốc bảo vệ

thực vật dùng phòng trừ sâu khoang trên bắp cải, xác định hiệu lực của NPV đạt

76,11%, trong khi thuốc Spinosat đạt 85,99% và chế phẩm Bt đạt 52,93% sau 7

ngày phun [33].

Từ kết quả đánh giá hiệu quả của NPV trong phòng từ sâu khoang khi sử

dụng riêng rẽ hoặc phối hợp với thuốc hoá học trên bắp cải tại Pakistan, nhóm tác

giả Maqsood et al. (2017) và Sumaira et al. (2017), đã khẳng định NPV là tác nhân

vi sinh vật có hiệu quả cao trong quản lý sâu khoang, chúng không chỉ gây chết sâu

non mà cả nhộng và trưởng thành mới vũ hoá [36, 37]. Arayya et al. (2013) cho

rằng NPV với nhiều đặc tính quí được coi là thuốc trừ sâu sinh học có tiềm năng

cần được khai thác sử dụng để phòng trừ sâu hại [13]. Theo tổng hợp của Devi et al.

(2016), hiện nay đã có 15 loại chế phẩm NPV đã được thương mại hoá, các sản

phẩm đóng vai trò quan trọng trong công tác bảo vệ cây trồng và thân thiện môi

trường. Tuy nhiên, theo tác giả, do NPV thuộc tác nhân ký sinh bắt buộc, chỉ có thể

phát triển sinh khối trên sâu, mô hoặc tế bào sống, điều này được xác định là khó

khăn lớn nhất cho việc phát triển sinh khối NPV để phòng chống sâu hại [38]. Mặt

khác, NPV phát sinh rất phổ biến trên đồng ruộng nhưng hoạt lực diệt sâu hại của

chúng cũng rất khác nhau, nên khi phát triển thành chế phẩm có hiệu quả cần thiết

phải qua quá trình tuyển chọn (Escribano,1999) [39]. Kết quả nghiên cứu của Bedjo

(2017) xác định chỉ có 1 trong 6 chủng phân lập NPV sâu khoang hại đậu tương là

SlNPV-JTM 97c có hiệu lực gây chết sâu đạt 77,9% [35].

Hơn nữa, kết quả nghiên cứu của Salama et al. (2017) chỉ ra rằng virus còn

chịu tác động của tia UV (Ultra violet), nhất là khi sử dụng chế phẩm trong mùa hè,

do tia UV sẽ làm giảm số lượng thể vùi của chế phẩm từ 25,2- 34,5% khi phơi

nhiễm UV từ 2- 4 giờ, dẫn tới làm giảm hiệu quả trừ sâu của thuốc còn 67,3% và

kéo dài thời gian trước khi chết của sâu ngoài đồng ruộng từ 2- 3 ngày. Vì vậy, việc

chọn thời điểm sử dụng chế phẩm NPV cũng là vấn đề cần thiết [40].

1.2.1.3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng

Cũng như tế bào động vật nói chung, các dòng tế bào của các loài côn trùng

cũng thuộc nhóm Eukaryote, là tế bào của sinh vật có nhân chuẩn, có màng nhân

ngăn cách nhân với tế bào chất và trong nhân tế bào phân tử DNA kết hợp với các

protein tạo thành các sợi nhiễm sắc thể (Sills, 2005) [41].

Theo tổng kết của Granados et al. (2007), Elanchezyan (2009), Lynn (2002)

và Sudeep et al. (2005) thì trong những năm đầu của thế kỷ 20 khoa học nghiên cứu

về côn trùng trong một số lĩnh vực đã có những ý tưởng đầu tiên về việc sử dụng tế

bào côn trùng trong nuôi cấy in vitro như là một công cụ thí nghiệm cho các nghiên

cứu cơ bản về sinh học tế bào, bệnh lý côn trùng, v.v. [9, 11, 30, 42]

Dẫn theo tài liệu tổng hợp của Granados et al. (2007) [9], thí nghiệm nhân

nuôi tế bào côn trùng in vitro đầu tiên do Goldsmidt tiến hành vào năm 1915, ông

đã nuôi cấy các phần mô tách ra từ loài tằm Hyalophora cecropia. Sau đó, vào cuối

những năm 1930, Trager thực hiện một bước đột phá lớn bởi đã phát triển được một

môi trường nuôi cấy dựa trên những hiểu biết về tính chất vật lý và hóa học của tế

bào máu côn trùng. Đến năm 1956, Wyatt đã phát triển một môi trường dựa trên

phân tích sinh hóa chi tiết của tế bào máu tằm và chứng minh môi trường này gây ra

sự tăng trưởng của tế bào từ mô buồng trứng của loài tằm Bombyx mori, đóng góp

vào sự tăng trưởng và duy trì sự sống sót của tế bào trong phòng thí nghiệm trong

thời gian dài đến ba tuần.

Gần 50 năm sau kết quả nghiên cứu đầu tiên của Goldschmidt (1915), Grace

(1962) đã nghiên cứu ra môi trường nuôi cấy cùng với việc phân lập, nhân nuôi

thành công dòng tế bào đầu tiên từ bộ Lepidoptera, kể từ đó có tới hơn 500 dòng tế

bào khác nhau đã được phát triển, chủ yếu là ở các bộ Diptera, Lepidoptera,

Hemiptera và Orthoptera (Dẫn theo Granados et al. 2007 và Lynn, 1998) [9, 43].

Khi bắt đầu nuôi cấy tế bào côn trùng, một phương pháp chung giống như

phương pháp duy trì nuôi cấy tế bào động vật đã được áp dụng cho nuôi cấy tế bào

côn trùng. Tuy nhiên, điều kiện cụ thể cần phải được thay đổi và có tiêu chuẩn riêng

đối với từng loài tùy thuộc vào mô chọn để nuôi cấy ban đầu, môi trường nuôi cấy,

chất dinh dưỡng bổ sung, pH, nhiệt độ nuôi, v.v. (Freshney, 1987) [44].

Theo Grace (1982) và Granados et al. (2007), trong phát triển sinh khối tế

bào từ các tế bào gốc thì tế bào sẽ phân chia liên tục trong thời gian dài ở môi

trường thích hợp. Nếu mô tế bào phân lập không chứa tế bào gốc thì tế bào sẽ phát

triển chậm hoặc phát triển với tốc độ giảm dần và cuối cùng chúng không phân chia

tiếp mà sẽ tự chết dần [45, 9].

Theo Elanchezyan (2009), việc nhân nuôi phát triển sinh khối tế bào côn

trùng có ý nghĩa to lớn để phục vụ cho nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng

dụng và thương mại. Chúng được sử dụng để sản xuất chế phẩm vi rút cho từng loài

thuộc bộ Lepidoptera, tạo ra thuốc trừ sâu sinh học hoặc sử dụng cho protein tái tổ

hợp. Vì vậy, việc nghiên cứu và sử dụng tế bào côn trùng ngày càng được quan tâm

tại nhiều nước trên thế giới. Sản phẩm tế bào nhân nuôi còn phục vụ việc sản xuất

protein tái tổ hợp, nghiên cứu sinh học và hoá sinh học tế bào; hiển thị các gen lạ

trong công nghệ tái tổ hợp gen; phát hiện tác nhân gây bệnh và tương tác giữa tế

bào và vi rút; sản xuất qui mô thương mại các vacxin chữa bệnh [11].

Theo đánh giá của Guy and Goodman (2008), hiện nay các nghiên cứu tập

trung nhiều vào việc phát triển các chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật sử dụng vi rút

côn trùng, coi đó như một công cụ mới trong quản lý sâu hại cây trồng nông lâm

nghiệp [46]. Còn Granados et al. (2007) và Weiss et al. (1981) cho rằng định hướng

thời gian tới sẽ là thời kỳ nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng với qui

mô lớn và thúc đẩy sản xuất cũng như thương mại sản phẩm từ nhân nuôi tế bào

trên thị trường, nhất là các thuốc trừ sâu sinh học virus [9, 47]. Sudeep et al. (2005)

chỉ rõ có tới 15 dòng tế bào của bộ Lepidoptera đã được xác định tại Ấn Độ đang và

sẽ sử dụng để nhân sinh khối virus với qui mô lớn phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu

sinh học [42].

Qua 25 năm nghiên cứu, Lynn (2002) [30] đã tổng kết thành qui trình chung

cho việc nhân sinh khối tế bào côn trùng qua 11 công đoạn với các yêu cầu cụ thể

khác nhau cho từng công đoạn nhân nuôi. Đồng thời, chỉ rõ các loại vật liệu và thiết

bị cần có để nuôi nhân tế bào, đồng thời mô tả chi tiết các bước thực hiện của

phương pháp có hiệu quả để nhân nuôi đối với các dòng tế bào côn trùng khác nhau,

cụ thể như:

- Bốn bước thực hiện chung cho các dòng tế bào côn trùng;

- Bốn bước thực hiện đối với tế bào không bám dính hoặc bám dính lỏng lẻo,

như các dòng tế bào của loài Spodoptera litura và Mamestra brassica v.v...

- Sáu bước thực hiện với các dòng tế bào bám dính chặt, như các dòng tế bào

của loài Spodoptera frugipera, Anticarsa gemmatalis và Plutella xylostella, v.v.

- Đối với các dòng tế bào bám dính rất chặt như loài Heliothis armigera và

Diabrotica undecimpuncta phải thực hiện 7 bước bằng phương pháp Tripsin hoá.

Lynn (2002) cũng chỉ rõ vấn đề cần lưu ý trong nuôi cấy tế bào động vật nói

chung cũng như nuôi cấy tế bào côn trùng nói riêng đó là việc kiểm soát lây nhiễm

trong quá trình nhân nuôi in vitro tạo vật liệu tế bào [30].

Theo Hurton et al. (2005), có 5 yếu tố liên quan đến việc không nhận biết và

khắc phục được tế bào nuôi cấy bị lây nhiễm, bao gồm: Một là: do kỹ thuật thao tác

không đúng và nhiễm từ nguồn thực liệu ban đầu; Hai là: nhận biết nhiễm qua kiểm

tra cảm quan (độ đục, màu sắc của môi trường nuôi cấy chuyển sang màu vàng,

v.v.); Ba là: có khoảng 6% các mẻ nuôi cấy tế bào bị nhiễm mà không thể nhận biết

ngay nên không kịp khắc phục; Bốn là: không nhận biết được do có chất kháng sinh

trong môi trường nuôi cấy đã ức chế tạm thời vi khuẩn; Năm là: không có cách khắc

phục dẫn đến tế bào bị phá hủy. Theo đó nguồn nhiễm có thể là từ mô ban đầu chưa

sạch, nhiễm chéo trong quá trình nuôi cấy, do các dụng cụ phòng thí nghiệm, môi

trường, thuốc thử chưa vô trùng và do thao tác của các kỹ thuật viên [48].

Theo Lynn (1996) cách đơn giản để tránh nhiễm khuẩn là không sử dụng

kháng sinh trong nuôi cấy duy trì dòng tế bào. Trong khi điều này nghe có vẻ mâu

thuẫn thì lí do thật đơn giản. Nếu không có kháng sinh trong môi trường, nếu nuôi

cấy bị nhiễm khuẩn thì sự nhiễm vi khuẩn đó sẽ nhận biết ngay trong môi trường

nuôi cấy giàu dinh dưỡng chỉ trong ít ngày nuôi cấy. Điều này giúp kĩ thuật viên

phát hiện sớm nhất có thể và nuôi cấy trở lại để phục hồi tế bào bị nhiễm [49].

Ngược lại, nếu nuôi cấy duy trì tế bào có kháng sinh có thể cấy chuyền tế

bào trong nhiều tuần hoặc nhiều tháng với mật độ nhiễm thấp mà không phát hiện

được. Điều đó có thể giải thích là do chất kháng sinh được sử dụng liên tục sẽ làm

chậm sự phát triển của vi khuẩn trong tế bào bị nhiễm mà mắt thường không nhận

biết được nhưng thực tế nuôi cấy đó đã bị nhiễm khuẩn. Bằng cách đó, tất cả các tế

bào nuôi cấy sẽ bị nhiễm khuẩn lan rộng và khi đó cũng sẽ có ít hy vọng phục hồi.

Vì lý do nêu trên, Lynn (1996) cho rằng chỉ nên sử dụng kháng sinh trong

những thí nghiệm trong thời gian ngắn hoặc nuôi cấy sơ cấp. Trong trường hợp nuôi

cấy sơ cấp, sau mỗi lần nhân sinh khối tế bào môi trường nuôi cấy cũ được thay thế

bằng môi trường mới phải bổ sung chất kháng sinh (thường sau cấy chuyển lần thứ

5). Như thế tránh được hầu hết mọi sự nhiễm khuẩn [49].

Theo tác giả này, mối lo ngại chính khi nuôi cấy tế bào côn trùng lại là việc

tế bào bị nhiễm vi rút và mycoplasma. Để tránh nhiễm vi rút và mycoplasma thì giải

pháp tốt nhất đó là không bao giờ được sử dụng pipet hút bằng miệng và môi

trường, huyết thanh không chính hãng. Bên cạnh đó, tác giả cũng khẳng định một

lợi thế khi nuôi nhân tế bào côn trùng, trong khi rất nhiều các tác nhận và chất gây

nhiễm khi nuôi cấy tế bào động vật có xương sống phải đối mặt thì lại không phải là

một vấn đề với các tế bào côn trùng .

Để loại bỏ tất cả các nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy tế bào côn trùng cần

phải kiểm tra vô trùng ở tất cả các giai đoạn nuôi cấy, cần tiến hành định kỳ hàng

tháng cho nuôi cấy các dòng tế bào liên tục, định kỳ hàng tuần trong trường hợp

phòng thí nghiệm bị nhiễm, trước mỗi lần bảo quản và trong trường hợp gặp cùng

một vấn đề với những kết quả bị lặp đi lặp lại. Khi phát hiện nhiễm cần loại bỏ ngay

tế bào đang nuôi cấy và kiểm tra tế bào đang bảo quản. Đồng thời, cô lập tất cả các

mẫu bảo quản liên quan đến mẫu nhiễm, khử trùng phòng thí nghiệm theo qui trình

tiêu chuẩn và loại bỏ ngay lập tức những tế bào không thể phục hồi thay thế.

Các nhà khoa học của Invitrogen Life Technologies (2002a) đã nêu khá chi

tiết về qui trình nuôi nhân, môi trường nhân sinh khối cần phải sử dụng và các

phương pháp nhận biết, xử lý khi sinh khối tế bào nuôi nhân bị nhiễm tạp. Qui trình

cũng chỉ rõ từ khâu chuẩn bị các trang thiết bị cần thiết, chuẩn bị môi trường nhân

nuôi, hệ thống điều khiển điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, pH và không

khí, v.v.) và kỹ thuật bảo quản tế bào trong thời gian chờ sử dụng, v.v. Các tác giả

này cũng nêu rõ 2 chỉ tiêu đánh giá chất lượng nuôi nhân dựa trên kết quả tính tổng

số tế bào có trong dịch thể, hình thái của tế bào và mức độ biến động số lượng tế

bào dựa trên xác định tổng số tế bào sống có được [50].

Như vậy, khi phát triển sinh khối đối với mỗi dòng tế bào của 1 loài côn

trùng cần thiết phải có sự nghiên cứu chi tiết để xác định rõ các yếu tố thích hợp

cho sự phát triển của tế bào, gồm: chủng loại môi trường, huyết thanh bổ sung,

nhiệt độ và pH môi trường nhân nuôi, v.v.

Theo Murhammer (2007) [51], quá trình nuôi nhân tế bào của loài côn trùng

nào đó cũng đều phải trải qua 3 công đoạn khác nhau, gồm: nhân sơ cấp, nhân thứ

cấp và nhân sản xuất. Các bước thực hiện cũng tương tự như nuôi nhân một tác

nhân vi sinh vật hữu ích để phát triển chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật, bao gồm:

- Nhân giống thực liệu từ giống gốc hay còn gọi là nhân sơ cấp hoặc nhân sơ

khởi (Initiation culture): nguồn thực liệu tế bào hay còn gọi là giống gốc thường

được bảo quản trong điều kiện lạnh sâu, như tủ lạnh sâu (-1980C) hoặc trong bình ni

tơ lỏng. Khi đưa vào nhân nuôi phải thực hiện giai đoạn nhân phục hồi, loại bỏ hoạt

chất duy trì, thay bằng môi trường nuôi nhân nhằm giúp tế bào phục hồi trở lại các

hoạt động sống của mình.

- Nhân nguồn thực liệu hay còn gọi là nhân thứ cấp (Subculture): Đây là giai

đoạn cần thiết để tạo ra sinh khối tế bào với khối lượng đủ lớn làm cơ sở cho nhân

giống tế bào, phục vụ cho các nghiên cứu chuyên sâu và sản xuất chế phẩm.

- Nhân sản xuất sinh khối tế bào (Cell culture): Tuỳ theo mục đích sử dụng,

như: để nghiên cứu, để phát triển khối lượng nguồn tế bào phục vụ lây nhiễm vi rút

tạo chế phẩm . Để sản xuất chế phẩm sinh học, tuỳ theo điều kiện trang thiết bị, nhu

cầu về khối lượng chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật, cần sản xuất mà việc nhân

sinh khối có thể tiến hành với qui mô nhỏ hoặc lớn.

Trong quá trình nuôi nhân, thời gian đầu trong môi trường đầy đủ nên hàm

lượng tế bào tăng dần và đạt đỉnh cao sau 4- 8 ngày tuỳ theo dòng tế bào, sau đó

giảm nhanh do dinh dưỡng trong môi trường hết dần. Murhammer (2007) chia diễn

biến tăng trưởng mật độ tế bào trong quá trình phát triển số lượng tế bào thành 4

giai đoạn: 1) Pha chậm hay còn gọi là pha khởi động; 2) Pha tăng trưởng mật độ

theo hàm số số mũ; 3) Pha ổn định và 4) Pha suy giảm, tế bào chết dần do thiếu

dinh dưỡng và điều kiện môi trường (như: dinh dưỡng, pH, v.v.) không còn thích

hợp cho tế bào hấp thu để phân chia tăng trưởng mật độ, đòi hỏi phải loại bỏ dịch

môi trường cũ và thay bằng môi trường mới để tiếp tục phát triển. Trong pha chậm,

các tế bào đưa vào nuôi cấy dần thích ứng với môi trường nuôi cấy mới, còn ở pha

ổn định thì mật độ tế bào không tăng và cần thu hoạch tế bào vào thời điểm này. Vì

vậy, thời gian tính từ khi bắt đầu nhân nuôi đến khi kết thúc pha phát triển ổn định

được xác định là một chu kỳ nuôi cấy [51].

Theo Murhammer (2007) [51] đề xuất việc tính khả năng tăng trưởng mật độ

tế bào trong một chu kỳ nhân nuôi của một loài côn trùng nào đó có thể tính theo

công thức sau:

N = N0exp(µt).

Trong đó: N : là mật độ tế bào (tế bào/ml) ở thời điểm t;

N0 : là mật độ tế bào (tế bào/ml) ở thời điểm t =0; µ là tốc độ

tăng trưởng đặc trưng (h-1) và

t : là thời gian nhân nuôi (giờ).

Đồng thời, tác giả cũng đã tổng hợp và chỉ rõ các bước thưc hiện của kỹ

thuật nhân sinh khối tế bào côn trùng ở giai đoạn nhân sơ khởi, sản xuất ở qui mô

nhỏ dưới 10 lít và với qui mô lớn đến 100 hoặc tới 5.000 lít.

Theo Elanchezhyan (2009) hoàn toàn có thể nuôi nhân tế bào côn trùng với

môi trường nhân tạo có chứa đầy đủ các hợp chất hữu cơ, vitamin, axit hữu cơ,

muối vô cơ và huyết thanh động vật trên bình nuôi cấy kích thước nhỏ và bình có

dung tích lớn [11], song cần phải nghiên cứu nhu cầu của từng dòng tế bào cụ thể.

1.2.1.4. Nghiên cứu điều kiện phát triển sinh khối của tế bào côn trùng

• Môi trường nuôi nhân

Theo Elanchezhyan (2009), các loại tế bào côn trùng được nuôi nhân trong

môi trường nhân tạo có đầy đủ các thành phần, gồm: carbohydrate, các vitamin, axít

hữu cơ, muối vô cơ v.v. Ngoài ra, các môi trường phải được bổ sung với các hợp

chất hóa học xác định khác để góp phần thúc đẩy phát triển và phân chia của tế bào,

chẳng hạn như huyết thanh bào thai bê, thành phần hữu cơ chiết xuất từ vi khuẩn

hoặc protein thủy phân [11].

Đến nay, các nhà khoa học đã phát triển khá nhiều loại môi trường có tính

năng khác nhau phục vụ nuôi nhân tế bào côn trùng, đã được giới thiệu thương mại

hoá trên thị trường và nhà sản xuất sinh khối tế bào chỉ việc lựa chọn sao cho có

hiệu quả kinh tế. Thành phần môi trường nuôi nhân cơ bản gồm có muối vô cơ,

carbonhydrate, axit amin, vitamin, axít béo và các loại lipid, protein, peptide, huyết

thanh và các chất đệm điều chỉnh pH môi trường nuôi cấy (Lynn,1996) [49].

Granados et al. (2007) đã tổng hợp lại lịch sử việc nghiên cứu môi trường

nuôi nhân tế bào chỉ rõ, từ năm 1935 Trager đã thiết lập môi trường để nuôi nhân tế

bào tằm dâu với 6 thành phần và bổ sung 10% huyết tương của tằm nhưng nhận

thấy số lượng tế bào tăng không nhiều. Đến năm 1956, Wyatt đã thành công nuôi

cấy tế bào tằm dâu khi sử dụng môi trường với 34 thành phần, gồm 5 loại muối vô

cơ, 3 loại đường, 4 axít vô cơ, 22 loại axit amin và được bổ sung 10% huyết tương

của tằm dâu [9].

Tác giả này cũng chỉ rõ hiện nay có nhiều loại môi trường nhân nuôi tế bào

khác nhau được thương mại hoá trên thị trường và thường bao gồm 30 thành phần

khác nhau. Tuy nhiên, theo tác giả này thì không hẳn tất cả các thành phần đó đều

cần thiết cho sinh trưởng của tế bào. Vì tác giả này lý giải dựa trên kết quả nghiên

cứu của Gaw et al. (1958) thì chỉ cần môi trường có 6 thành phần được bổ sung

thêm huyết tương loại không có hoạt tính là đủ và cho rằng có thể trong huyết tương

có chứa yếu tố sinh trưởng đóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng và tạo tế bào,

vì vậy việc bổ sung huyết tương có tác dụng thúc đẩy phát triển của tế bào.

Theo Agathos (2007), sự sinh trưởng của tế bào côn trùng cũng như tế bào

của các động vật khác đều yêu cầu môi trường thích hợp để phân chia tế bào. Môi

trường nuôi cấy là một hỗn hợp của các vitamin, aminoaxit, carbonhydrate và một

lượng nhỏ huyết tương hoặc huyết thanh. Việc nuôi nhân tế bào truyền thống đều

dựa trên môi trường cơ bản, như môi trường Grace, TNM-FH hoặc TC-100 có bổ

sung 5 hoặc 10% huyết thanh (FBS). Đồng thời, một số công ty hoá sinh về nuôi

nhân tế bào côn trùng còn đưa ra các loại môi trường cho phép giúp việc nhân tế

bào với mật độ cao, như: SF 900 II, Express FiveTM của hãng Invitrogen; Ex- Cell

400, Ex- Cell 401, Ex- Cell 405, Ex- Cell 420 của hãng JRH Biociences, v.v. [16].

Từ các kết quả nghiên cứu của mình, Agathos (2010) khẳng định môi trường nuôi

nhân thích hợp là yếu tố quyết định sự thành công của việc nuôi nhân tế bào ở các

cấp độ từ qui mô nhỏ trên bình có dung tích 25cm2 đến qui mô lớn 2000 lít [52].

Lynn (1996) cũng khẳng định vấn đề quan trọng nhất cần xem xét để phát

triển sinh khối của một dòng tế bào mới là môi trường nhân nuôi. Tác giả cho rằng

nhiều môi trường được sản xuất đặc biệt dành cho nuôi cấy tế bào các loài thuộc bộ

Lepidoptera. Các môi trường này được cải tiến từ môi trường Grace như ExCell

401, SF-900 và Insect-Xpress hoặc môi trường cải biến từ môi trường BML/TC-10,

đó là môi trường TC-100 có bổ sung thêm các peptit (như 1,25% phytone peptone,

1,25% peptone #P0521, 0,075% peptone P7750 và 5- 10% Fetal Bovine Serum

(Sigma)). Ngoài ra, những điểm chính cần cân nhắc trong việc lựa chọn một môi

trường cho phát triển sinh khối một loài côn trùng là pH, độ thẩm thấu, số lượng và

tỷ lệ các chất muối vô cơ có trong môi trường nhân nuôi [49].

Theo Lynn (2002) [30], hiện nay các công ty hóa sinh đã giới thiệu ra thị

trường nhiều loại môi trường tiêu chuẩn và các thành phần bổ trợ khác nhau cho

việc nuôi nhân tế bào côn trùng. Các sản phẩm đó được tạo ra có đầy đủ các thành

phần dinh dưỡng nên vừa có hiệu quả cao trong việc nhân nuôi tế bào côn trùng,

vừa có tính ổn định và tiện sử dụng. Song vẫn phải đánh giá lựa chọn chủng loại

môi trường và xác định tỷ lệ chất bổ trợ phù hợp với từng loại tế bào và từng loài

côn trùng cụ thể [30].

Mishuhashi (1976) tiến hành nuôi nhân sơ cấp dòng tế bào sinh trưởng liên

tục được phân lập từ phôi của nhộng sâu khoang (S. litura) bằng môi trường MGM-

450 được bổ sung 10% FBS hoặc bằng môi trường MM có 3% FBS thì mật độ tế

bào tăng gấp 2 lần sau 48 giờ [53]. Bhutia et al. (2012) đã tiến hành thí nghiệm so

sánh mật độ tế bào tạo ra khi nuôi nhân với dòng tế bào SF9 trên 2 loại môi trường

là IPL-41và EMICG, kết quả mật độ tế bào khi nuôi trên IPL-41 tăng 14,81 lần và

trên EMICG tăng 13,76 lần so với mật độ ban đầu trước khi nuôi nhân [54].

Segura và Felio (2012) đã tiến hành nhân nuôi dòng tế bào mô phôi loài

muỗi vằn Culex quinquefasciatus (Diptera). Khi nuôi cấy trong các môi trường khác

nhau, như: L-15, Grace’s, Grace’s/L-15, MM/VP12, Schneider’s và DMEM để tìm

ra môi trường nhân nuôi thích hợp, với pH 6,7 - 6,9 và ủ ở 280C. Kết quả là môi

trường Grace’s/L-15 là thích hợp nhất cho việc nuôi nhân tế bào bám dính và tăng

sinh khối tế bào [55].

Như vậy, để nuôi nhân sinh khối tế bào côn trùng đạt hiệu quả cao thì việc

nghiên cứu xác định lựa chọn chủng loại môi trường nuôi nhân cho phù hợp với

từng cấp độ nhân và với dòng tế bào của từng loài côn trùng cụ thể là vấn đề cần

thiết, là yêu cầu đầu tiên của việc nhân sinh khối tế bào.

• Nhiệt độ khi nuôi nhân

Nhiệt độ cũng là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng thành công

của nhân nuôi in vitro tế bào côn trùng. Theo Lynn et al. (2005), hầu hết các dòng

tế bào côn trùng nhân nuôi ở nhiệt độ từ 250C – 290C, nhưng khi nuôi nhân sơ cấp

thì tiến hành ở nhiệt độ từ 260C – 280C. Tác giả cho rằng đây khoảng nhiệt độ phù

hợp nhất và tốt nhất cho hầu hết các tế bào côn trùng phân chia, có thể đó là khoảng

nhiệt độ thích hợp đối với hầu hết các loài côn trùng sinh sống trong tự nhiên [56].

Tuy nhiên, theo khuyến cáo của Invitrogen Life Technologies (2002) thì cần duy trì

ổn định ở nhiệt độ 270C là thích hợp nhất khi nuôi nhân các dòng tế bào SF9 và

SF21 [52]. Còn Murhammer (2007) lại nuôi nhân thành công các dòng tế bào này ở

nhiệt độ 27- 280C [51].

Theo Elanchezhyan (2009) thì nhiệt độ thích hợp nhất để nuôi nhân hầu hết

các dòng tế bào côn trùng là 27,0- 27,50C [11]. Toprak và Gurkan (2004) chỉ rõ

nhiệt độ không khí là 27 ± 0,50C và độ ẩm không khí trong buồng nuôi nhân là 75%

là thích hợp nhất khi nuôi nhân tế bào Spodoptera litoralis [57]. Knudson và Tisley

(1974) sử dụng mức nhiệt 270C khi nuôi nhân tế bào sâu hại này để đánh giá khả

năng lây nhiễm vi rút NPV [58], trong khi đó Lynn et al., (2005) lại tiến hành nuôi

nhân 12 dòng tế bào ở nhiệt độ 260C [56] và Petchprakob et al. (2007) nuôi nhân tế

bào sâu xanh Heliothis zea ở nhiệt độ 270C [59] cũng như McAteer và Davis (1994)

khi nuôi nhân dòng tế bào SF9 và SF21 của sâu khoang Spodoptera frugiperda, của

tằm dâu Bm5 và của sâu đo xanh BT1-Tn-5B-4 cũng đều ở nhiệt độ 270C [60]. Guy

và Goodman (2008) nuôi nhân 2 dòng tế bào tạo được từ sâu xanh Heliothis

virescens ở nhiệt độ 280C cho mật độ tế bào từ 0,5 x 107 tế bào/ml lên tới 1,35 x 107

tế bào/ml tăng 2,7 lần) trong bình nuôi T-75 cm2 [46]. Trong khi đó, Mishuhashi

(1995) nhận thấy nuôi nhân dòng tế bào sâu khoang Spodoptera litura ở nhiệt độ

250C cho mật độ tế bào tăng gấp 2 lần sau 43 giờ [61]. Agathos (2007) khuyến cáo

nên duy trì ở nhiệt độ 27 ± 0,50C khi nuôi nhân tế bào theo phương pháp lắc [16].

Còn Knudson và Tinsley (1974) khuyến cáo nên duy trì nhiệt độ 270C khi nhân sinh

khối tế bào với khối lượng lớn [58].

Khuyến cáo của Invitrogen Life Technologies (2002) đã chỉ ra rằng phạm vi

nhiệt độ từ 27 đến 30°C là thuận lợi cho sự tăng trưởng tế bào côn trùng và phạm vi

tối ưu cho phát triển sinh khối là 27- 28°C, ở nhiệt độ trên ≥30°C thì tế bào chết dần

và mật độ tế bào trong bình nuôi nhân bị giảm đi rõ rệt. Sau đó, khi trở lại nhiệt độ

27 hoặc 28°C thì sinh khối tế bào sẽ không thể phục hồi trở lại được nữa [50].

Hầu hết các nghiên cứu hiện tại của nuôi cấy tế bào côn trùng sử dụng một

mức nhiệt độ ổn định trong quá trình nuôi cấy. Lynn (1996) đã nghiên cứu ảnh

hưởng của nhiệt độ dao động đến sự phát triển tế bào côn trùng. Các tế bào được

nuôi cấy ở nhiệt độ 280C trong 2 ngày và sau đó chuyển sang điều kiện các mức

nhiệt độ khác nhau. Giới hạn nhiệt độ trên được giữ ở 280C và giới hạn dưới là 20,

22, 24, hoặc 260C. Kết quả cho thấy rằng nhiệt độ dao động có thể kéo dài giai đoạn

tăng trưởng tế bào của các dòng tế bào. Dao động tối ưu từ 24 đến 280C giúp cho

việc thúc đẩy một giai đoạn tăng trưởng tế bào dài mà không làm giảm mật độ tế

bào tối đa. Ở nhiệt độ dưới 220C, tế bào phát triển quá chậm và không đạt được một

mật độ tế bào cao như đã đạt được khi nuôi cấy ở 280C [49].

Theo Mitsuhashi và Goodwin (1976) việc nuôi cấy tế bào côn trùng in vitro

ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 25 đến 300C. Nhiệt độ tối ưu cho hầu hết các dòng

tế bào bộ Cánh phấn (Lepidoptera) là 280C. Tế bào nuôi trong môi trường không có

huyết thanh ít chịu ảnh hưởng do thay đổi của nhiệt độ hơn các tế bào phát triển

trong môi trường có bổ sung huyết thanh [62].

Agathos (1994) chỉ rõ nếu nhân nuôi tế bào côn trùng theo phương pháp lớp

mỏng tốt nhất phải tuân thủ qua 7 bước và trong quá trình nhân tế bào phải duy trì

điều kiện nhiệt độ 27 ± 0,50C trong thời gian 4 - 6 ngày. Còn nhân nuôi tế bào theo

phương pháp lắc thì cần nhiệt độ là 270C - 290C [63]. Kết quả nghiên cứu của

Demir et al. (2009) chỉ ra rằng nhiệt độ 280C là thích hợp để nhân thứ cấp 7 dòng tế

bào với khối lượng nhỏ [64].

Felio et al. (1995) đã phân lập và nuôi nhân, phát triển thành công dòng tế

bào từ trứng của phôi loài muỗi rừng Psorophora confinnis khi nuôi nhân ở 280C

[65]. Theo Yeh et al. (2007), nuôi nhân nuôi tế bào sâu đục quả đậu đỗ Maruca

vitrata ở nhiệt độ 280C sẽ có hiệu quả cao nhất [66].

Lynn (1998) đã sử dụng môi trường TC-100 ở nhiệt độ 260C để nhân nuôi

phát triển dòng tế bào sâu xanh Heliothis virescens để đảm bảo duy trì tế bào nhân

nuôi. Tác giả cũng cho biết để không bị nhiễm khuẩn thì trong các công đoạn nhân

nuôi đều cần bổ sung kháng sinh với lượng 100 đơn vị Penicilin và 0,1mg

Streptomycin cho 1 ml môi trường nhân nuôi tế bào [67].

Mitsuhashi (1976) nhân nuôi sơ cấp tế bào sâu xanh hại bắp cải Mamestra

brassicae L. (Lepidoptera: Noctuidae) phân lập từ phôi lại sử dụng môi trường

MGM-401 có chứa 1 số kháng sinh (gồm 10 mg Dihydro-streptomycin sulfate, 100

đơn vị Penicilin G potassium, 10 mg Karamycin Sulfate và 1 mg Novobiocin cho

100 ml môi trường), ở nhiệt độ nhân nuôi là 250C [53].

McAteer và Davis (1994) cũng đã nuôi cấy tế bào từ sợi râu của loài

Mamestra brassicae trong môi trường Grace có bổ sung Lactalbumine hydrolysate

và Yeastolate ở 260C. Trong nhân nuôi sơ cấp có bổ sung hỗn hợp kháng sinh

Penicilin theo tỷ lệ 100 IU/ml hoặc Streptomicin tỷ lệ 100 µg /ml [60].

Theo Trang et al. (2003), ngay việc nuôi nhân sâu non sâu khoang để phát

triển sinh khối vi rút cần duy trì ở mức nhiệt độ phù hợp. Theo tác giả, nhiệt độ

thích hợp nhất để nuôi sâu ở nhiệt độ 27 ± 20C và độ ẩm không khí là 60 ± 10%.

Điều này cho thấy có mối quan hệ chặt chẽ giữa nhiệt độ trong nuôi nhân tế bào côn

trùng và nhiệt độ thích hợp cho sâu non phát triển trong tự nhiên [68].

Qua các tài liệu khoa học đã công bố, có thể nhận thấy nhiệt độ duy trì trong

quá trình nuôi nhân tế bào côn trùng cũng là một trong những yếu tố quan trọng

quyết định sự thành công hay thất bại của nuôi nhân tế bào. Các tài liệu đều chỉ rõ

hầu hết các dòng tế bào từ các loài côn trùng đều phát triển sinh khối thích hợp với

nhiệt độ từ 26- 280C. Điều đó có thể xuất phát từ nhu cầu về nhiệt độ đã được hình

thành trong quá trình phát triển lịch sử của loài với điều kiện môi trường sống và đã

được mã hoá trong hệ thống di truyền của chúng [69].

• Điều kiện pH môi trường

Điều kiện nuôi nhân tế bào chịu ảnh hưởng lớn của các yếu tố, như: môi

trường, nhiệt độ, pH, huyết thanh, v.v. Tuy nhiên, không có nhiều nghiên cứu sâu

về ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả nuôi nhân tế bào côn trùng.

Theo Lynn và Shapiro (1998) thì hầu hết các loại tế bào yêu cầu điều kiện

pH tối ưu cho phân chia và phát triển sinh khối trong khoảng từ 7,0- 7,4, nhưng

hiện nay không phải quan tâm nhiều vì các loại môi trường cung ứng trên thị trường

có chứa sẵn thành phần chất đệm đảm bảo pH môi trường ở mức tối ưu cho việc

nuôi nhân các dòng tế bào và có thể đảm bảo ổn định cho cả chu kỳ nhân nuôi [67].

Kết quả nghiên cứu của Rey et al. (2000) cho thấy khi nhân nuôi tế

bào với dòng tế bào loài sâu Lutzomya longipalpis (Diptera: Psychodidae) trên môi

trường MM/VP12 có pha thêm 20% huyết thanh ở nhiệt độ 280C thì cần duy

trì pH từ 6,7- 6,9 là thích hợp nhất [70].

Theo Petcharawan et al. (2006) nhân nuôi dòng tế bào sâu tơ KMITL-PX-E1

ở giai đoạn nhân thứ cấp từ chu kỳ 17- 18 trở đi vẫn có thể dùng môi trường TNM-

FH và duy trì pH là 6,8 [71]. Theo tài liệu của Invitrogen Life Technologies (2002)

thì các dòng tế bào phát triển từ phôi sẽ phát triển tốt ở điều kiện pH = 7,4, còn các

dòng tế bào khác yêu cầu pH từ 7,0- 7,4. Riêng đối với dòng tế bào SF9 và SF21 lại

yêu cầu điều kiện pH tối ưu là 6,2 [50].

Jakubowska et al. (2009) cho rằng pH của hemolymph ở đa số các loài côn

trùng ngoài tự nhiên nằm trong khoảng 6,4- 7,5, nhưng một số môi trường trên thị

trường có pH= 6 nên có ảnh hưởng lớn đến khả năng phát triển sinh khối của tế bào

và sự lây nhiễm của NPV trên tế bào. Vì vậy, cần xác định pH phù hợp với dòng tế

bào sẽ nuôi nhân khối lượng lớn [69].

• Huyết thanh bổ sung

Huyết thanh là một hỗn hợp các albumin, các thành phần thúc đẩy tế bào

sinh trưởng và thường được bổ sung vào môi trường nuôi nhân tế bào. Hiện nay,

huyết thanh sử dụng phổ biến gồm huyết thanh bê và huyết thanh ngựa. Chất lượng,

chủng loại và nồng độ của huyết thanh rất quan trọng, ảnh hưởng đến quá trình sinh

trưởng của tế bào. Theo Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2010), huyết thanh là

nhân tố cung cấp các chất dinh dưỡng tăng trưởng cần thiết cho chức năng tế bào,

huyết thanh còn hoạt động như một chất đệm pH, làm bất hoạt các chất độc góp

phần làm tăng khả năng ổn định của sinh trưởng tế bào trong quá trình nhân sinh

khối tế bào. Huyết thanh còn cung cấp hormon và chứa các protein bám giúp vận

chuyển các hormone, chất dinh dưỡng và tế bào chống tác hại của các chất thải

trong quá trình nhân nuôi. Ngoài ra, huyết thanh còn chứa các nhân tố biệt hoá và

chất ức chế men Protease phân huỷ tế bào [72].

Sudeep et al. (2005) cho rằng FBS là chất bổ sung hiệu quả trong nuôi nhân

tế bào côn trùng nhưng thành phần lại khá khác so với huyết thanh nuôi nhân tế bào

ở động vật có xương sống. Tác giả cũng chỉ rõ có rất ít dòng tế bào duy trì tăng

trưởng tế bào trong điều kiện không bổ sung FBS [42].

Để nhân tế bào dòng HV-AM1 từ sâu xanh Heliothis virescens, Javier et al.

(2008) đã sử dụng MM có bổ sung 3% FBS, nhưng để nhân các dòng tế bào He-

AM1, Hz-AM1, Sf9, BMN4 và Ld652Y tác giả đã sử dụng môi trường TC-100 có

bổ sung 10% huyết thanh FBS [95]. Maeda et al. (1990) nuôi nhân dòng tế bào

CLS-79 trên môi trường IPL-41 và dòng tế bào BmN trên môi trường TC-100, dòng

tế bào Sf-21 và TN-368 trên môi trường TNM-FH nhưng tất cả các môi trường này

đều được bổ sung 10% huyết thanh FCS. Trong khi đó, khi nuôi nhân tế bào các

dòng TN-CL1 của sâu Trichoplusia, HZ-FB33 của sâu Helicoverpa zea, HV-OV

của sâu Heliothis virescens, dòng SF-TS của sâu Spodoptera frugiperda và dòng tế

bào SE-E4 của sâu Spodoptera exigua [73]. Mclntosh et al. (2003) đều sử dụng môi

trường ExcellTM401 có bổ sung 10% FBS đã được bất hoạt ở nhiệt độ 560C trong 30

phút [74]. Cũng như Popham et al. (2010) đã sử dụng môi trường Ex-Cell 420 có bổ

sung 10% FBS đã được bất hoạt bằng nhiệt khi nuôi nhân dòng tế bào Hz-AM1 từ

sâu Heliothis zea và BCIRL-Hv-AM1 từ sâu Heliothis virescens [75].

Petchprakob et al. (2007) nuôi nhân dòng tế bào của sâu xanh Heliothis zea

trên môi trường SF-900II có bổ sung 10% huyết thanh FBS không bất hoạt [59],

còn tác giả Woo et al. (2007) sử dụng môi trường TC-100 bổ sung thêm 10% FBS

cũng không xử lý bất hoạt để nuôi nhân tế bào các dòng Sf9, Sf21 từ sâu

Spodoptera frugiperda và dòng tế bào Bm5 từ tằm dâu (Bombyx mori) và dòng

BT1-Tn-5B-4 từ sâu đo xanh (Trichoplusia ni) [76].

Lery et al. (1995) sử dụng môi trường Grace cải tiến và có chứa 20% FBS

trong giai đoạn nhân nuôi sơ cấp để phát triển dòng tế bào thu nhận từ phôi của sâu

đục củ khoai tây Phthorimaea operculelia (Zeller), còn ở giai đoạn nhân thứ cấp

cũng tiến hành như ở giai đoạn sơ cấp nhưng chỉ bổ sung 10% FBS [77]. Felio et al.

(1995) cũng áp dụng kỹ thuật tương tự đã phát triển và nuôi nhân thành công sinh

khối dòng tế bào phát triển từ mô phôi của muỗi Aedes taeniorhynchus (Diptera:

Culicidae) [65].

Felio et al. (1995) đã phát triển dòng tế bào từ phôi loài muỗi rừng

Psorophora Confinnis với 62 lần cấy chuyền liên tục, trong nuôi nhân sơ cấp tế bào

được nhân trên môi trường MM/VP12 với 20% FBS và 1% kháng sinh (Penicillin

và Streptomycin) và kháng nấm (Anphoterycin B). Tuy nhiên, ở giai đoạn nhân

nuôi thứ cấp, tế bào lại thể hiện khả năng bám dính trong môi trường Grace có bổ

sung 10% FBS [65].

Petcharawan et al. (2006) đã sử dụng môi trường TNM-FH có chứa 20%

FBS trong giai đoạn nhân nuôi sơ cấp để phát triển dòng tế bào sâu tơ KMITL-PX-

E1 từ trứng 2 - 3 ngày tuổi. Trong giai đoạn nhân thứ cấp từ chu kỳ 17 - 18 trở đi

vẫn dùng môi trường TNM-FH nhưng chỉ bổ sung 10% FBS; Sudeep et al. (2009)

đã nuôi cấy ấu trùng muỗi hổ châu Á Aedes aegypti với 20% FBS, trong nhân nuôi

thứ cấp FBS giảm xuống 10% từ chu kỳ cấy chuyền thứ 19 [71].

Mitshuhashi (1995) đã nuôi cấy dòng tế bào phân lập từ buồng trứng nhộng

sâu khoang, nuôi cấy sơ cấp trong môi trường MGM-450 có bổ sung 5% FBS và

3% hemolymph Antheraea pernyi (APH). Tuy nhiên dòng tế bào này cũng sinh

trưởng được trong môi trường MGM-450 với 10% FBS hoặc môi trường MM được

bổ sung 3% FBS [61].

Bên cạnh việc sử dụng FBS (huyết thanh bò) là chất bổ trợ cho sinh trưởng

tế bào, một số nghiên cứu còn sử dụng huyết thanh của các loài động vật khác với

tỷ lệ khác nhau để nhân nuôi tế bào côn trùng. Theo nghiên cứu đã công bố, Vaughn

et al. (1977) đã nuôi nhân 2 dòng tế bào là IPLB-Sf 21 và IPL-SF 1254 từ loài sâu

xanh da láng Spodoptera frugiperda được nuôi cấy với môi trường IPL-40 và IPL-

45, có bổ sung 4,2% huyết thanh gà tây và 4,2% huyết thanh gà tây thường và hỗn

hợp kháng sinh (100IU Penicilin/ml và 100µg Streptomicin/ml) [78]. Theo khuyến

cáo của Invitrogen Life Technologies (2002a), khi nhân sinh khối tế bào với dòng tế

bào SF9, SF21 nếu dùng 60% môi trường Grace, 30% FBS và 10% DMSO đạt mật

độ tới 1x 107 tế bào/ml, với dòng tế bào High FiveTM sử dụng 85% môi trường

Express Five®SFM, 5% FBS và 10% DMSO thì chỉ đạt 3x106 tế bào/ml [50].

Như vậy, qua các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy việc bổ sung huyết

thanh vào môi trường nuôi cấy tế bào là rất cần thiết. Tuỳ theo từng cấp độ nhân

sinh khối của từng dòng tế bào các loài côn trùng mà tỷ lệ huyết thanh cần bổ sung

có khác nhau, có thể tới 20%, thậm chí tới 40%.

• Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng khối lượng lớn

Theo Elanchezhyan (2009), sự thành công của việc sản xuất thương mại các

chế phẩm dựa trên nhân sinh khối tế bào côn trùng phụ thuộc vào một số vấn đề,

như: đặc điểm và sự phát triển của tế bào thích ứng với sản xuất khối lượng lớn, giá

đầu tư và mức độ thuận tiện trong cung ứng của các chủng loại môi trường. Đặc

biệt là với môi trường hoá chất không huyết thanh và protein, phù hợp với bình

nhân sinh khối lớn và tối ưu với hệ thống nhân sinh khối có công suất lớn [11].

Freshney (1987) chỉ rõ kỹ thuật nuôi nhân tế bào phải được điều chỉnh cho

phù hợp tùy theo dòng tế bào của từng loài côn trùng, môi trường nuôi cấy, môi

trường bổ trợ, pH, nhiệt độ nuôi nhân và cơ chế phát triển của tế bào theo phương

thức bám dính bề mặt hay huyền phù [44].

Theo Agathos (1994), tùy theo nguồn thực liệu tế bào của các côn trùng mà thu

được hiệu quả nhân tế bào khác nhau. Tác giả này cũng như một số tài liệu khác đều

cho rằng hoàn toàn có thể nuôi nhân tế bào qui mô lớn bằng hệ thống nuôi cấy liên

hoàn theo 2 phương pháp: nhân lớp mỏng trên bình dung tích 250- 1.500 ml và

nhân lắc trên bình dung tích từ 2- 15 lít [63]. Còn Kanokwan et al. (2003) đã tiến

hành thành công việc nuôi nhân tế bào và lây nhiễm vi rút để sản xuất chế phẩm

NPV-Ha trên bình nuôi cấy tự động 50 lít [79].

Từ năm 1988, Maiorella et al. đã phát triển nhân sinh khối tế bào S.

frugiperda qui mô lớn bằng các bình nuôi cấy dung tích 21 lít, đạt mật độ 5 x 106 tế

bào/ml. Tuy nhiên, các thử nghiệm nhân sinh khối tế bào với dung tích cực lớn tại

Mỹ, từ 500 đến 2.000 lít thì đều không cho kết quả như mong muốn, hàm lượng tế

bào chỉ đạt 50% so với nuôi nhân bằng bình 100 lít. Các thử nghiệm với dung tích

5.000 lít thì hoàn toàn thất bại [80].

Còn Miranda et al. (1997) đã tiến hành nuôi nhân tế bào trên hàng loạt bình

có dung tích từ 1,0- 6,0 lít theo 3 bước: bước 1 nhân trên bình 0,5 lít trong 72 giờ;

bước 2 chuyển sang bình 3 lít trong 48 giờ và bước 3 nhân trong bình 6 lít trong 72

giờ. Cả 3 bước đều để ở chế độ lắc 1.000 vòng/phút. Kết quả vẫn có thể đạt mật độ

3,0 x 109 tế bào/ml [81].

Theo Elanchezhyan (2009) [11], có thể nhân tế bào qui mô nhỏ có thể dễ

dàng thực hiện dần dần qua các bước như Miranda et al. (1997) đã làm, từ mức

250ml lên 1000ml và sau đó tới khối lượng lớn hơn. Tiến hành như vậy thì việc

quản lý nhiễm tạp trong quá trình nuôi nhân sẽ dễ dàng và có hiệu quả hơn [81].

Cynthia et al. (2007) và Agathos (2010) đều cho rằng việc sử dụng huyết

thanh FBS chỉ nên áp dụng để nhân nguồn thực liệu tế bào, còn khi nhân tế bào

khối lượng lớn thì sử dụng môi trường không huyết thanh như: Ex-cell 405; Ex-Cell

420, SFM, v.v. hoặc các môi trường cơ bản như: IPL-41, Grace, TC - 100 BML-

TC/10, TNM-FH, v.v. Cách làm như vậy nhằm để hạ giá thành sản xuất sinh khối tế

bào vì giá mua huyết thanh trên thị trường thường rất đắt [82, 52].

1.2.1.5. Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi

Theo tổng kết của Elanchezhyan (2009), các dòng tế bào hiện nay được thiết

lập từ 8 bộ côn trùng, trong đó chủ yếu từ bộ Cánh phấn (Lepidoptera) vì bộ côn

trùng này là bộ lớn thứ 2 với hơn 200.000 loài của 130 họ. Các dòng tế bào chủ yếu

từ các loài côn trùng thuộc bộ Cánh phấn gây hại cây trồng nông nghiệp để nghiên

cứu phát triển chế phẩm vi rút [11].

Virus ký sinh côn trùng với tổng số 29 loài thuộc họ Baculoviridae, bao gồm

2 giống là Granulovirus (còn gọi là virus hạt) và Nucleo polyhedrosis virus (virus

nhân đa diện). Riêng nhóm Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV) có tới 19 loài đã

được xác định và có khả năng hình thành thể vùi (Rohrmann và George, 2011; Devi

et al., 2016) [5, 38]. Tuy nhiên, NPV có đặc điểm rất chuyên tính và chỉ lây nhiễm

trên ký chủ của nó nên độ an toàn sinh học rất cao, đồng thời có hoạt lực cao trong

gây chết sâu hại và có khả năng hình thành thể vùi có thể tồn tại bền vững trong môi

trường. Chính vì vậy, nhiều năm qua các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nhiều

đến việc nghiên cứu phát triển chế phẩm vi rút NPV trên cơ sở nhân sinh khối tế

bào côn trùng phục vụ phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp.

Trên đồng ruộng, NPV có thể tồn tại trong đất dưới dạng thể vùi (OB) trong

thời gian dài 20- 30 năm. Trong quá trình canh tác, làm đất trồng trọt cây trồng các

thể vùi dính bám trên cây, khi các cá thể sâu non ăn phải thức ăn có mang thể vùi

NPV, gặp pH cao (> 9,0) của ruột giữa thì màng protein của thể vùi bị phá vỡ, giải

phóng các thể hoạt động (virion), các thể vi rút hoạt động này sẽ xâm nhiễm vào

nhu mô ruột, sau đó xâm nhiễm sang các mô bào khác của cơ thể côn trùng. Sau 2-3

ngày, sâu ngừng ăn và sau 5- 7 ngày thì sâu chết (Sajap et al., 2000) [14].

Tuy nhiên, NPV chỉ có thể lây nhiễm và phát triển sinh khối trong các mô, tế

bào sống của cơ thể côn trùng ở điều kiện môi trường thích hợp, đòi hỏi việc phát

triển sinh khối NPV để phòng trừ sâu hại phải được thực hiện trên cơ thể sâu còn

sống như phương pháp truyền thống bằng cách nuôi sâu để nhiễm tạo sinh khối

(Grzywacz et al., 1996) [12], hoặc lây nhiễm trên tế bào của loài sâu hại đã được

nhân nuôi (Granados et al., 2007; Agathos et al., 2007; Elanchezhyan, 2009,

Sudeep et al. 2005) [9, 16, 11, 42].

Mặt khác, tế bào côn trùng chỉ tồn tại và phát triển sinh khối trong điều kiện

pH ≤ 7,0 (Lynn, 1998; Rey et al., 2000; Petcharawan et al., 2006) [43, 70, 71]. Vì

vậy, không thể thực hiện bằng cách sử dụng thể vùi của NPV một cách trực tiếp để

lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân, do pH của môi trường dịch tế bào khi lây

nhiễm không phù hợp để có thể phá vỡ màng bọc protein của thể vùi để giải phóng

các thể hoạt động như diễn ra trong ruột giữa của côn trùng.

Vì vậy, để lây nhiễm NPV thành công trên tế bào nuôi nhân, các nhà khoa

học phải tiến hành phá vỡ thể vùi trong điều kiện pH cao trước khi lây nhiễm vào

dịch tế bào. Tipvadee et al., (1988) sử dụng Na2CO3 0,1M có pH= 11,2 trong thời

gian 20 phút, những thể vùi chưa bị phá vỡ được tách khỏi dịch vi rút bằng cách ly

tâm ở tốc độ 2.500 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Nếu muốn phá vỡ triệt để các

thể vùi thì sử dụng Na2CO3 0,1M có pH= 11,2 để trong thời gian 15 phút, sau đó lắc

với tốc độ 50 vòng/phút trong 3 phút rồi để tiếp trong thời gian 12 phút [83].

Cách xử lý của Knudson và Tinsley (1974) có phần phức tạp hơn, bằng cách

sử dụng dung dịch nồng độ từ 0,005M đến 0,05M có chứa 0,05M NaCl trong 1- 3

giờ ở nhiệt độ 50C [58]. Còn Escribano et al. (1999) phá vỡ thể vùi giải phóng thể

hoạt động (virion) trước khi nhiễm bằng cách ủ trong dung dịch đệm DAS (Na2CO3

0,3M, NaCl 0,5M, EDTS 0,03M ở pH= 10,5) ở nhiệt độ bình thường trong 5 phút.

Các virion được bảo quản ở 40C trong khi chờ sử dụng. Thể vùi còn lại được ly tâm

thu hồi ở tốc độ 1480 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 40C [39].

Theo Sudeep et al. (2005), trong hơn 2 thập kỷ qua hầu hết các công trình

nghiên cứu tiến hành ở Ấn Độ tập trung vào các dòng tế bào bộ Cánh phấn

(Lepidoptera) do tiềm năng phát triển chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học. Các chế

phẩm vi rút tạo ra có độc tính cao và có hiệu quả cao trong phòng trừ các sâu hại, lại

rất an toàn đối với người và động vật máu nóng [42].

Kết quả nghiên cứu của Mclntosh et al. (2003) xác định khi nhiễm vi rút

NPV trên 5 dòng tế bào trên môi trường Ex-CellTM 401 có bổ sung thêm 10% FBS

bất hoạt, số lượng thể vùi hình thành ở dòng tế bào TN-CL1 đạt ít nhất (0,57 ± 3,83

x 106 OB/ml), dòng tế bào SF-TS đạt cao nhất tới 1,165 ± 12,06 x 106 OB/ml [74].

Các nhà khoa học cho rằng việc lây nhiễm vi rút trên tế bào cần dựa theo chỉ

số lây nhiễm (Multiplicity of Infection – MOI), là tỷ lệ giữa số lượng thể vùi và mật

độ tế bào trong 1 đơn vị thể tích khi lây nhiễm. Zitzmann et al. (2017) chỉ rõ quá

trình lây nhiễm virus phải kéo dài trong một thời gian nhất định, nếu sử dụng chỉ số

MOI thấp (<0,1) thì quá trình lây nhiễm diễn ra 2 giai đoạn, giai đoạn ban đầu tế

bào tiếp tục phân chia và bắt đầu quá trình lây nhiễm virus, nhưng với tỷ lệ tế bào bị

nhiễm không nhiều, giai đoạn 2 quá trình lây nhiễm tái tổ hợp virus chiếm ưu thế và

hầu hết tế bào bị nhiễm virus. Nếu sử dụng chỉ số MOI > 1 thì hầu hết (tới 95%) tế

bào bị nhiễm virus ngay sau khi nhiễm [84]

Theo Lynn (2003), mức độ tối ưu của việc lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào

tuỳ thuộc vào 2 yếu tố là chỉ số MOI và thời gian ủ lây nhiễm, theo tác giả, cần

kiểm tra mật độ tế bào và thể vùi của NPV trước khi lây nhiễm để tính chỉ số MOI,

hầu hết các nguồn tế bào nên lây nhiễm virus với chỉ số MOI từ 0,1- 0,5 và ủ lây

nhiễm thực hiện trong thời gian 3- 4 ngày [85].

Để đánh giá mức độ lây nhiễm vi rút của tế bào, Demir et al. (2009) đã tiến

hành lây nhiễm virus ManeNPV trên sinh khối của 6 loại tế bào trên môi trường

nuôi nhân theo trị số MOI là 10 ở nhiệt độ 280C và ủ lây nhiễm trong thời gian 3

ngày. Kết quả đã cho thấy có sự khác nhau rõ rệt khả năng lây nhiễm giữa các dòng

tế bào khác nhau [64].

Còn Knudson et al. (1974) đã tiến hành nhiễm vi rút trên tế bào nhân nuôi

của sâu xanh (Spodoptera frugiperda). Kết quả xác định thời gian tối ưu khi nhiễm

vi rút NPV ở mật độ tế bào là 2,5 x 104 tế bào/ml với chỉ số MOI là 0,1 trong 3 ngày

ở nhiệt độ 270C và đạt 100% số tế bào bị nhiễm vi rút, còn ở nhiệt độ 17 và 370C thì

số lượng tế bào giảm nhanh và tỷ lệ tế bào nhiễm vi rút rất thấp [58].

Nhằm cải tiến việc sản xuất NPV trên tế bào sâu xanh Th-HaNPV bằng thiết

bị bình lên men (Bioreactor) với môi trường SF 900II bổ sung 10% FBS ở nhiệt độ

270C, Petchprakob et al. (2007) đã tiến hành sử dụng Na2SO4 và Na2SO3 với nồng

độ 0,2 và 0,4 mg/l (tương ứng) để phá vỡ màng bọc của thể vùi và nhiễm vi rút với

chỉ số MOI là 0,5 trên sinh khối tế bào có mật độ 5x105 tế bào/ml cho thấy chúng đã

làm tăng số lượng thể vùi từ 500- 900 OB/ml [59].

Theo kết quả của Mclntosh et al. (2003) khi đánh giá khả năng tái tổ hợp

của NPV với 5 dòng tế bào nhân trên môi trường Ex-CellTM 401, kết quả khi nhiễm

NPV tương ứng của sâu hại với chỉ số MOI là 1 thì số lượng thể vùi đạt từ 0,57-

11,65 x 106 OB/ml tuỳ loại tế bào côn trùng [74].

Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của Jakubowska et al. (2009), khi nhiễm

NPV trên tế bào dòng SE301 và sử dụng môi trường Grace bổ sung 10% FBS ở các

mức pH khác nhau. Kết quả sau 8 ngày lây nhiễm, số lượng thể vùi thu hoạch lớn

nhất ở điều kiện pH là 6,5 đạt tới 3,5 x 106 OB/ml. Còn ở mức pH là 6 và 7, số

lượng thể vùi thu được thấp hơn so với số thể vùi ở mức pH= 6,5 là 51,0 và 51,5%

(tương ứng). Kết quả lây nhiễm trên tế bào của các dòng Sf21 và HzGUT cũng cho

kết quả tương tự như với dòng tế bào SE301 [69]. Kết quả nghiên cứu về pH có ý

nghĩa lớn đối với việc nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào côn trùng để đạt hiệu

quả cao trong việc nhân sinh khối NPV.

Barbara et al. (2007) Bryony và Nusawadany (2007) đã tổng hợp và phân

tích khá chi tiết về đặc điểm cấu trúc tế bào của Baculovirus nói chung và NPV nói

riêng, cũng như về sự phát triển và vòng đời của NPV tái tổ hợp và sử dụng NPV

trong phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp [86, 87].

King et al. (2007) cho rằng việc nhân sinh khối tế bào và lây nhiễm NPV

trên các bình 1 hoặc 2 lít sẽ cho hiệu quả nhất đối với qui mô nhỏ và phòng thí

nghiệm, như bình Erlenmeyer, Spinner hoặc Shake, v.v. Tác giả đã xây dựng và đề

xuất qui trình lây nhiễm và nhân sinh khối NPV, bao gồm: 8 bước chuẩn bị; 14

bước lây nhiễm nhân sinh khối và 6 bước tinh sạch thể vùi của NPV. Tác giả cũng

chỉ ra 16 khía cạnh cần lưu ý và chỉ rõ trước khi nhân sinh khối NPV cần phải xác

định cụ thể dòng tế bào tương ứng, lựa chọn môi trường phù hợp, mật độ tế bào côn

trùng không quá cao, tế bào phải khoẻ. Đồng thời, lây nhiễm vi rút theo chỉ số MOI

thấp (<1,0) khi phát triển sinh khối NPV, còn khi nhân nguồn thực liệu vi rút có thể

lây nhiễm với chỉ số MOI cao hơn [88].

Theo công bố của Kanokwan et al. (2004) về kết quả nhân thử nghiệm NPV

với qui mô 50 lít, tác giả đã chia thành 2 giai đoạn: Nhân nguồn thực liệu NPV và

nhân sinh khối NPV. Cả 2 giai đoạn đều sử dụng môi trường MM8 có bổ sung 5%

huyết thanh FBS và mật độ tế bào sâu xanh (Spodoptera exigua) là 3 x 105 tế

bào/ml ở nhiệt độ 270C trên bình nuôi cấy 50 lít với tốc độ khuấy 50 vòng/phút. Sau

2 ngày nhân khi sinh khối tế bào đạt 1 x 106 tế bào/ml thì tiến hành nhiễm vi rút

theo chỉ số MOI là 0,1 hoặc 0,3. Thu hoạch thể vùi vào thời điểm 7 ngày sau lây

nhiễm và kết quả đã thu được lượng thể vùi 4,3 x 106 OB/ml khi nhiễm với chỉ số

MOI là 0,1 và đạt 7,8 x 106 OB/ml khi nhiễm với chỉ số MOI là 0,3 [89].

1.2.1.6. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV

Kanokwan et al. (2004) đã thực hiện tinh sạch thể vùi tinh bằng cách ly tâm

với tốc độ 5.000 vòng/phút để loại bỏ môi trường nuôi nhân, sau đó ly tâm lại bằng

nước cất và tạo dạng để lưu giữ bằng cách cứ 10gam thể vùi đã tinh sạch được trộn

với 15ml Glycerin, 250ml Emulsogen Elan và 2 gam Triton X-100. Tipvadee et al.,

(1988) tinh sạch thể vùi NPV sâu xanh áp dụng phương pháp ly tâm 2.500

vòng/phút trong 10 phút, tiến hành ly tâm ở tốc độ 16.000 vòng/phút trong 90 phút

để tinh sạch thể hoạt động (virion) của NPV, phần lắng cặn (NPV) được hoà trong

chất đệm 0,005M có pH= 8 rồi bảo quản trong điều kiện lạnh đông [89].

Theo Shapiro et al. (2008), các thành phần như Bentonite, Kaolin, bột tan và

khoáng sét thường được sử dụng để tạo dạng bột thấm nước vì chúng có chứa các

thành phần khoáng chống tia tử ngoại, dễ hấp phụ vi rút và chúng hoạt động như

một hợp chất ngăn chặn tác động của tia cực tím. Nhìn chung, việc sử dụng các

dạng chế phẩm bột thấm nước bao gồm tác nhân hoạt động (virus), chất phụ gia

(với nguyên liệu có nguồn gốc Silicat, như Bentonite, Kaolin, bột tan hoặc khoáng

sét) và thành phần hoạt động bề mặt (chất bám dính). Cũng theo tác giả này thì hiện

nay có 2 loại sản phẩm có khả năng chống tia cực tím với hiệu quả cao đã được

nghiên cứu và đưa ra thương mại tại Mỹ là Tinopal LPW và Calcofluor M2R [90].

Kết quả nghiên cứu chất phụ gia tạo dạng NPV sâu xanh của Patricia et al.

(2001) với bột ngô, lignin và đường Sucrose, đã xác định các hỗn hợp Lignin/NPV;

lignin và đường/NPV theo tỷ lệ 2:1 cho hiệu quả diệt sâu tốt nhất đạt từ 80,0-

96,6% [91]. Mushobozi et al. (2004) cho rằng công nghệ đơn giản nhất trong việc tạo

sản phẩm NPV dạng bột thấm nước là sử dụng caolin hoặc khoáng sét được nghiền với

độ mịn đảm bảo phun rải dễ dàng khi pha loãng. Tuy khả năng chống tia cực tím

bảo vệ thể vùi NPV của Kao lanh hoặc khoáng sét không cao so với sử dụng

Tinopal LPW và Calcofluor M2R, nhưng vẫn có tác dụng ở mức khá tốt [92]. Còn

Goulson et al. (2000) khuyến cáo nên phối trộn 5% Tinopal CBS sẽ cho hiệu quả

cao trong việc chống tia cực tím [93].

Ngoài ra, theo Cisneros et al. (2002) thì việc bổ sung dưới 1% axit Boric sẽ

góp phần duy trì độ pH trong chế phẩm ở mức thấp giúp thể vùi không bị công phá

và bảo vệ thể vùi không bị diệt (bất hoạt) khi bị tác động của ánh sáng cực tím và

ánh nắng trực xạ khi sử dụng chế phẩm NPV trên đồng ruộng [94].

Về liều lượng thể vùi cần thiết để phòng trừ sâu hại, các công trình công bố

đều cho thấy không có liều lượng áp dụng chung cho tất cả các loài sâu hại, mà tuỳ

thuộc từng loài khác nhau. Kết quả nghiên cứu của các tác giả Lynn (2002) và

Cisneros et al. (2002), đã xác định cần phải sử dụng tới 1,5 x 1012 OB/ha khi phòng

trừ loài sâu xanh Spodoptera frugiperda ngoài đồng ruộng [30, 94]. Grzywacz et al.

(1996) đã chỉ rõ, việc tạo dạng sử dụng dù theo cách nào và định hướng liều lượng

sử dụng chế phẩm là bao nhiêu thì mục tiêu cuối cùng vẫn phải đảm bảo tổng lượng

thể vùi NPV phun rải cho 1 ha cây trồng đạt từ 9 x 1010 đến 1 x 1012 OB/ha tuỳ theo

loài sâu hại cần phòng trừ [12].

Maqsood et al. (2017) đã tiến hành một thí nghiệm trong phòng phối hợp

giữa NPV với liều lượng 1 x 108 OB/ml và thuốc hoá học Flubendiamide 0,01%.

Kết quả nếu sử dụng riêng NPV thì tỷ lệ chết của sâu non sâu khoang tuổi 2 chỉ đạt

39,81% và sâu tuổi 4 đạt 30,69%, nhưng nếu sử dụng phối hợp với thuốc hoá học

thì tỷ lệ sâu chết ở các tuổi tương ứng đạt 91,02 và 69,35% [36]. Điều đó cho thấy

có thể làm tăng hiệu quả phòng trừ sâu khoang trên cơ sở phối hợp giữa thuốc sinh

học virus nhân đa diện (NPV) và thuốc hoá học. Ngoài ra, có thể sử dụng NPV ra

môi trường thông qua việc nhiễm NPV trên ong ký sinh Cotesia (Apanteles)

angaleti Muesbeck (Hymenoptera: Braconidae) cũng cho hiệu quả cao trong gây

chết sâu non sâu khoang (Trang et al., 2003) [68].

Qua các tài liệu cho thấy việc tạo dạng chế phẩm theo 3 hướng khác nhau, tùy

theo mục đích sử dụng mà áp dụng phương pháp tạo dạng cho phù hợp, cụ thể là:

1/ Sản xuất chế phẩm dạng đông khô: Đây là phương pháp chủ yếu áp dụng

cho việc sản xuất tạo nguyên liệu gốc nhằm phục vụ cho việc lưu giữ lâu dài nguồn

thực liệu vi rút. Ngoài ra, phương pháp này được áp dụng để sản xuất nguyên liệu vi

rút để vận chuyển xa đến nơi tạo dạng sử dụng trước khi đưa ra thị trường tiêu thụ.

2/ Sản xuất chế phẩm dạng dịch lỏng: Là phương pháp sử dụng thể vùi tinh

được hòa trong dịch lỏng chuyên dụng nhưng không làm phá vỡ thể vùi và hòa tan

với nước khi sử dụng để trừ dịch hại. Tuy nhiên, dịch lỏng này được tạo ra như thế

nào là bí quyết công nghệ của mỗi công ty sản xuất chế phẩm NPV.

3/ Sản xuất chế phẩm dạng bột thấm nước: Đây là phương pháp sản xuất chế

phẩm NPV phổ biến nhất. Song đòi hỏi phụ gia bột thấm nước phải đảm bảo duy trì

pH ≤ 7,0 và có thể giúp thể vùi dễ dàng bám dính vào thành phần phụ gia.

Các kết quả nghiên cứu nêu trên đã cho thấy tiềm năng phát triển và sản xuất

các loại chế phẩm NPV theo hướng công nghiệp với qui mô lớn từ nguồn tế bào

nhân nuôi để sản xuất sinh khối NPV phục vụ phòng trừ sâu hại cây trồng.

Theo giới thiệu của Viện nghiên cứu Động vật, thuộc Viện hàn lâm Khoa

học Trung Quốc năm 2006 [96], nhiều sản phẩm NPV được sản xuất trên cơ sở nuôi

nhân tế bào côn trùng đã được thương mại hóa như: Keyun HaNPV dạng dịch lỏng

hàm lượng 5bPIB/gam để trừ sâu xanh (tức 5 x 109 OB/gam); Keyun PxGV dạng

dịch lỏng hàm lượng 30bOB/gam (tức 30 x 109 OB/gam) để trừ sâu tơ hại bắp cải;

Keyun SeNPV dạng bột thấm nước hàm lượng 30bPIB/gam (tức 30 x 109 OB/gam)

và Keyun SeNPV dạng dịch thể hàm lượng 30bPIB/gam (tức 30 x 109 OB/gam) để

trừ sâu keo da láng; Keyun HaNPV dạng bột thấm nước hàm lượng 60bPIB/gam

(tức 6 x 1010 OB/gam) để trừ sâu xanh; Keyun Spl-NPV dạng bột thấm nước hàm

lượng 20bPIB/gam (tức 2 x 1010 OB/gam) để trừ sâu khoang hại cây trồng.

Theo tổng hợp của Granados et al. (2007) [9], tại Ấn Độ và châu Âu, các sản

phẩm đã được thương mại khá phổ biến như: Spodopterin (SlNPV), Gemstar

(HzNPV), Gypcheck (LdNPV), Mamestrin (MbNPV), Spodex (SeNPV). Còn tại

Mỹ và Bắc Mỹ, có các sản phẩm: NPV-Plu, NPV- Spl, NPV- Ha, NPV- Se, NPV-

Mb và chế phẩm NPV-Ns, v.v.

1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước

1.2.2.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng

Sâu khoang (S. litura) được xác định là sâu hại quan trọng trên các cây trồng

cạn ở nước ta. Theo báo cáo kết quả chương trình cải tiến công tác bảo vệ thực vật ở

Việt Nam (Cục BVTV, Viện BVTV và ĐH Tổng hợp, 1995) [97] cũng như kết quả

điều tra của Viện BVTV, 2006), sâu khoang thường phát sinh gây hại nặng trên

nhiều loại cây trồng, có thể làm giảm năng suất thu hoạch từ 7,5- 11,5% trên bắp

cải, từ 5,6- 14,6% trên đậu tương cũng như nhiều loại cây trồng khác [98].

Theo nghiên cứu của Nguyễn Duy Nhất (1970), điều kiện thích hợp cho sâu

khoang phát triển ở nhiệt độ 28- 300C và độ ẩm không khí từ 85- 92%, độ ẩm đất

20% thích hợp cho sâu hoá nhộng. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ rõ sâu khoang có

tiềm năng sinh sản cao, một ngài cái có thể đẻ 2,3- 6,4 ổ trứng với tổng lượng trứng

đẻ từ 123,3- 1605,0 trứng. Trên đồng ruộng, quần thể sâu khoang phát triển với mật

độ cao trên bắp cải trong vụ Hè Thu và Xuân Hè từ tháng 9- 11 và từ tháng 2- 4.

Điều đáng chú ý là tỷ lệ sâu non thường bị ký sinh cao trong mùa mưa nóng từ

tháng 4 đến tháng 7, bệnh thối nhũn (do NPV) có thể gây chết sâu tới 33,84% vào

tháng 6 hàng năm [99].

Lê Văn Trịnh (1996) xác định thời gian vòng đời sâu khoang từ 20,1- 60,6

ngày và một ngài cái đẻ từ 491,9- 668 trứng với tỷ lệ trứng nở đạt 97,6- 98,9%.

Ngoài đồng ruộng, sâu phát sinh rộ từ tháng 9 đến tháng 11 hàng năm với 2 đỉnh

cao mật độ quần thể. Tác giả cũng chỉ rõ các đợt mưa lớn kết hợp với sự phát sinh

của NPV trong thời gian từ tháng 5 đến tháng 11 là nguyên nhân chủ yếu làm giảm

mật độ sâu khoang tới 30,92% trên đồng rau Thập tự ở đồng bằng sông Hồng [100].

Viện Bảo vệ thực vật (2001, 2006) xác định sâu khoang là đối tượng sâu hại

quan trọng trên hầu hết các cây trồng cạn trong phạm vi cả nước, thậm chí chúng có

thể phát sinh thành dịch trên diện tích hàng chục hecta đậu tương tại các tỉnh như

Hậu Giang, Cần Thơ, v.v., trên rau muống hoặc bắp cải trong vụ Xuân Hè tại Hà

Nội, Hải Dương và một số tỉnh đồng bằng sông Hồng [4, 98].

1.2.2.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại

• Kết quả điều tra NPV trên sâu hại

Nguyễn Văn Cảm et al. (1996a, 1996b) đã điều tra thu thập các mẫu sâu

nhiễm bệnh trên bông, đay, thuốc lá và rau màu ở nhiều tỉnh khác nhau thuộc khu

vực phía Bắc và Đông Nam Bộ, đã xác định có 5 loài Baculovirus. Các loài

Baculovirus bao gồm 4 loài NPV của sâu xanh (H. armigera), sâu khoang (S. litura)

hại rau màu, sâu đo xanh (A. flava) hại đay, sâu róm hại thông (D. punctatus) và 1

loài vi rút hạt (GV) trên sâu tơ (P. xylostella) hại rau họ Thập tự. Qua nghiên cứu

NPV trên sâu xanh cho thấy vi rút NPV không chỉ gây chết đối với sâu non, mà còn

gây chết hoặc ức chế khả năng hoàn thành phát dục của nhộng và trưởng thành [8,

101]. Theo nghiên cứu của Hoàng Thị Việt và Nguyễn Văn Cảm (2002), ở Việt

Nam đã xác định có 10 chủng NPV trên 10 loài sâu hại và 2 chủng GV trên 2 loài

sâu hại rau là sâu tơ (P. xylostella) và sâu xanh bướm trắng (P. rapae) [102].

Trịnh Thị Xuân et al. (2005), đã phân lập được bốn chủng NPV sâu keo da

láng (Spodoptera exigua) gồm SeNPV – VL5, SeNPV – CT3, SeNPV – ĐT2 và

SeNPV – AG1 thu tại Vĩnh Long, Cần Thơ, Đồng Tháp và An Giang. Bằng phương

pháp cho ăn nhỏ giọt trên sâu tuổi 2, hiệu quả gây chết 100% sau 5 ngày lây nhiễm.

Giá trị LC50 của các chủng SeNPV –VL5, SeNPV – CT3, SeNPV – ĐT2 và SeNPV –

AG1 đối với sâu keo da láng tuổi 3 lần lượt là 1,6 x 103 OBs/ml, 3,1 x 104 OBs/ml,

5,0 x 102 OBs/ml và 1,7 x 102 OBs/ml sau 5 ngày lây nhiễm [103].

• Nghiên cứu phân lập và chọn lọc chủng NPV có hoạt lực cao

Với các công trình nghiên cứu về NPV sâu hại đã công bố thì nguồn thực liệu

NPV đều được thu thập từ đồng ruộng rồi đem về phòng thí nghiệm nghiền lọc tạo

dịch thể. Sau đó lây nhiễm luôn trên sâu nuôi hoặc sâu được thu gom ngoài đồng

ruộng để sản xuất chế phẩm. Nói cách khác, việc phân lập, làm thuần và chọn lọc

chủng NPV có hoạt lực cao hầu như chưa được chú ý nghiên cứu trong suốt thời

gian trước năm 2002.

Theo công bố của Trần Văn Hai et al. (2010), đã phân lập và làm thuần được

5 chủng NPV sâu khoang từ 5 nguồn sâu nhiễm bệnh tại Cần Thơ, Sóc Trăng, Trà

Vinh, An Giang và Tiền Giang. Đã xác định 2 chủng NPV thu thập tại Trà Vinh và

An Giang có hiệu quả diệt sâu khoang tới 94,5% sau 9 ngày nhiễm. Những nguồn

thực liệu NPV đã được chọn lọc này đã được bảo quản lưu giữ tại đại học Cần Thơ

để phục vụ cho các mục đích nghiên cứu lâu dài [104].

Tác giả Trần Văn Hai et al. (2010) đã tiến hành thu thập sâu khoang bị lây

nhiễm NPV ngoài đồng ruộng tại 5 tỉnh thuộc khu vực đồng bằng sông Cửu Long.

Qua nghiên cứu, tác giả nhận thấy các nguồn NPV nhân từ các nguồn sâu nhiễm bệnh thu

thập ngoài tự nhiên trên sâu non sâu khoang tuổi 2 đều cho tỷ lệ sâu nhiễm bệnh

hình thành thể vùi đạt từ 5- 9,33 x 108 OB/ml trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thí

nghiệm so sánh các nguồn NPV thu thập được với hàm lượng 10,8 x 108 OB/ml thì

hiệu lực gây chết trên sâu non sâu khoang tuổi 2 từ 72,5- 94,5%, song với mức độ

rất khác nhau giữa các nguồn NPV thu thập được từ các vùng sản xuất nông nghiệp

khác nhau [104]. Kết quả công bố của Trịnh Thị Xuân et al. (2016), chủng NPV sâu

xanh thu từ Cần thơ có hiệu lực gây chết cao, đạt từ 67,7- 85,2% tuỳ theo từng các

giai đoạn phát dục của sâu [103].

1.2.2.3. Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào và áp dụng trong

thực tiễn chưa nhiều. Các lĩnh vực đã áp dụng thành công công nghệ nuôi nhân tế

bào động vật mới chỉ tập trung trong ngành y tế và thú y để sản xuất vắc xin phòng

chống dịch bệnh. Nuôi nhân tế bào phôi của một số giống gia súc và cá trong chăn

nuôi và thủy sản để duy trì nguồn gen bản địa và kiểm định dịch bệnh.

Trong trồng trọt cũng đã bước đầu nghiên cứu nuôi nhân bao phấn phục vụ

lai tạo giống. Riêng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật, việc nuôi nhân phát triển sinh

khối tế bào côn trùng phục vụ sản xuất chế phẩm vi rút phòng trừ sâu hại còn rất

mới mẻ, trong khi việc phát triển sinh khối NPV sâu hại theo phương thức truyền

thống đã kết thúc do gặp nhiều hạn chế khó khắc phục (như trình bày ở phần sau).

Để hướng tới việc phát triển sinh khối tế bào phục vụ lây nhiễm NPV tạo chế

phẩm sinh học, từ năm 2011, Lê Văn Trịnh và Lê Thanh Hải Hà đã bước đầu

nghiên cứu và đã tạo được dòng tế bào từ mô phôi và mô mỡ. Trong đó, dòng tế bào

mô phôi có nhiều tiềm năng, qua nhân nuôi sơ cấp, dòng tế bào từ mô phôi đã đạt

mật độ 2,9 x 108 tế bào/ml ở chu kỳ nuôi nhân lần đầu và đạt 2,57 x 1010 tế bào/ml ở

chu kỳ 3, còn với dòng tế bào từ mô mỡ đạt tương ứng là 1,62 x 108 và 1,71 x 1010

tế bào/ml. Trong nhân nuôi thứ cấp ở chu kỳ 9, dòng tế bào từ mô phôi đã đạt 3,03

x 1010 tế bào/ml và dòng tế bào từ mô mỡ đạt 2,17 x 1010 tế bào/ml. Các tác giả đã

xác định dòng tế bào này có tiềm năng phát triển cao và ổn định, có thể lây nhiễm

để phát triển sinh khối NPV. Hiện tại, 2 dòng tế bào từ mô phôi và mô mỡ đã được

duy trì bảo quản trong bộ sưu tập quĩ gen vi sinh vật tại Viện Bảo vệ thực vật và đã

đăng ký bản quyền sở hữu trí tuệ để phục vụ cho nghiên cứu phát triển sinh khối tế

bào côn trùng và phát triển chế phẩm sinh học sau này [105].

1.2.2.4. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV

Trong những năm 1990- 2002, việc lây nhiễm NPV được tiến hành trên sâu

non bằng cách nghiền sâu chết bệnh thu ngoài đồng rồi pha với nước cất, cứ 1 sâu

pha với 10- 60ml nước rồi lây nhiễm trên sâu khỏe qua con đường thức ăn nuôi sâu,

kết quả cho tỷ lệ chết từ 72- 100% (Nguyễn Văn Cảm et al.1996a) [8].

Việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV sâu hại ở nước ta tập trung nhiều từ

năm 1985 đến năm 2005 do 2 cơ quan là Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Bông

Nha Hố (nay là Viện Nghiên cứu cây Bông) tiến hành.

Tại Viện Bảo vệ thực vật, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV được

khởi xướng từ năm 1996 với sự giúp đỡ của các chuyên gia Liên Xô (cũ). Sau đó,

được tiến hành theo chương trình CNSH qua 2 đề tài cấp Nhà nước kế tiếp nhau từ

năm 1996 đến năm 2005 và 01 dự án giai đoạn 1990- 1995. Các đề tài, dự án đã thu

được nhiều thành tựu to lớn và có giá trị thực tiễn cao đối với công tác bảo vệ thực

vật ở Việt Nam. Tổng hợp đến năm 2005, đã đạt được kết quả cụ thể sau:

- Đã nghiên cứu, xây dựng được qui trình sản xuất thức ăn nhân tạo nuôi sâu.

Đã thiết lập được 01 pilot và tổ chức nhân nuôi được số lượng đáng kể sâu non của

loài sâu xanh và sâu đo xanh phục vụ lây nhiễm vi rút để sản xuất chế phẩm NPV.

- Xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm NPV từ nguồn sâu

non nhân nuôi. Đã nghiên cứu kỹ thuật tạo dạng sử dụng chế phẩm dưới dạng bột

thấm nước. Phối hợp với chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) tạo sản phẩm phổ

rộng (ký hiệu VBt) để phòng trừ sâu hại [97, 98].

Cũng trong các năm 2000-2005 tại Trung tâm bông Nha Hố, việc nghiên cứu

sản xuất chế phẩm NPV sâu xanh cũng được tiến hành khá mạnh mẽ theo phương

pháp nuôi sâu kết hợp với thu thập nguồn sâu trên đồng ruộng. Sau đó đem về

phòng thí nghiệm lây nhiễm vi rút và nghiền lọc lấy dịch thể chứa virus để sử dụng.

Trung tâm đã sản xuất được từ 50- 100 lít/năm chế phẩm NPV dạng thô để phòng

trừ loại sâu khoang và sâu xanh hại bông (Nguyễn Thị Hai, 2005) [106].

Tại Viện Bảo vệ thực vật, việc sản xuất chế phẩm NPV đề phòng trừ sâu đo

xanh hại đay cách và sâu róm hại thông bằng 2 cách: Cách 1 là nuôi sâu non đến tuổi

3- 4 thì nhiễm NPV, sau đó thu hồi sâu chết, nghiền lọc lấy dịch đem sử dụng hoặc

tạo dạng chế phẩm khô; Cách 2: thu sâu non ngoài đồng về nhiễm vi rút, rồi nghiền

lọc và đem sử dụng (Nguyễn Văn Cảm et al., 1996b; Trương Thanh Giản et al.,

1996, Hoàng Thị Việt et al. 2002) [101, 107, 102].

Tuy nhiên, vào các năm sau đó thì cả 2 đơn vị này không sản xuất chế phẩm

NPV tại chỗ, mà chuyển giao hướng dẫn kỹ thuật cho nông dân cách thu thập sâu

non sâu khoang, sâu xanh bị nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng. Đem về nhà nghiền lọc,

rồi đem sử dụng để phòng trừ các sâu này trên ruộng của chính mình. Hoạt động đó

đã góp phần nâng cao đáng kể nhận thức và kỹ thuật cho nông dân trong việc sử

dụng nguồn lợi vi rút tự nhiên để phòng chống sâu hại.

Từ kết quả nghiên cứu và sản xuất chế phẩm NPV sâu khoang và sâu xanh của

2 cơ quan nói trên. Nhận thấy để có thể sản xuất chế phẩm qui mô lớn theo phương

pháp nuôi sâu cần phải giải quyết một số vấn đề sau:

1/ Phải có hệ thống các phòng nuôi nhân tương ứng với các pha phát dục của

sâu và hệ thống xử lý vô trùng sâu non trước khi nhiễm vi rút với các trang thiết

bị đồng bộ.

2/ Phải thiết lập hệ thống dây chuyền chuyên sản xuất thức ăn nuôi sâu số lượng

lớn và đảm bảo không bị tạp nhiễm.

3/ Có hệ thống phòng, thiết bị biệt lập phục vụ việc lây nhiễm vi rút NPV.

4/ Phải có hệ thống phòng và hệ thống thiết bị tạo dạng chế phẩm và kiểm định

chất lượng chế phẩm.

Mặt khác, thực tế sản xuất chế phẩm đã gặp phải 2 cản trở lớn nhất về công

nghệ. Trước hết là khả năng nuôi sâu số lượng lớn không thể đạt tỷ suất nhân như

mong muốn và không thể chủ động, do tỷ lệ sâu chết bệnh cao và sức sống của sâu

qua các đợt nuôi ngày càng kém. Đồng thời, chất lượng thức ăn sản xuất ra không

đáp ứng ổn định cho việc nhân nuôi sâu non.

Những khó khăn phát triển sản xuất chế phẩm NPV với qui mô công nghiệp

như đã nói trên ở Việt Nam cũng hoàn toàn giống như các nước khác trên thế giới.

Theo tổng kết của Grzywacz et al. (1996), việc nhân sinh khối vi rút bằng con

đường nhiễm NPV trên sâu non ở Ấn Độ có 3 vấn đề cản trở là: 1/ Khả năng sinh

sản của sâu giảm nhanh qua thời gian nuôi; 2/ Các dụng cụ, thiết bị nhân nuôi sâu bị

nhiễm vi sinh vật hại và vi sinh vật cạnh tranh với NPV làm chất lượng chế phẩm

kém; 3/ Không thể cung cấp lượng lớn sâu non đồng đều, có chất lượng [12].

Các tác giả cũng cho rằng có nhiều nguyên nhân không thể sản xuất chế phẩm

NPV có chất lượng ổn định với qui mô công nghiệp, có 6 nguyên nhân quan trọng nhất

không thể phát triển, đó là: 1/ Chất lượng sâu nuôi kém; 2/ Thực liệu NPV để lây

nhiễm không đảm bảo; 3/ Liều lượng NPV lây nhiễm không thích hợp do kích thước

sâu không đều; 4/ Kỹ thuật nuôi sâu rất khó cải tiến; 5/ Thu hồi sản phẩm không

đúng lúc do sâu non phát triển không đồng đều; 6/ Vệ sinh vô trùng phòng nuôi

nhân sâu rất khó khăn [12, 97, 98].

Với kết quả nghiên cứu thu được, các nhà nghiên cứu về bảo vệ thực vật ở

Việt Nam cũng đều khẳng định vi rút nhân đa diện (NPV) là tác nhân gây bệnh khá

phổ biến và có hiệu quả phòng trừ các loài sâu hại ngoài đồng ruộng (Viện Bảo vệ

thực vật, 2006) [98]. Tuy nhiên, những nghiên cứu chuyên sâu về NPV cũng như

nghiên cứu phát triển sinh khối tạo sản phẩm để phòng chống sâu hại còn rất ít.

1.2.2.5. Nghiên cứu tạo dạng và sử dụng chế phẩm NPV phòng trừ sâu hại

Nguyễn Văn Cảm et al. (1996a) đã nghiên cứu tạo dạng chế phẩm theo công

nghệ nuôi sâu hàng loạt, rồi tiến hành nhiễm NPV trên sâu non. Sau đó, thu hồi các

cá thể sâu chết để tạo chế phẩm phòng trừ sâu hại. Việc tạo dạng sử dụng chế phẩm

bằng cách lây nhiễm trên sâu non được tiến hành bằng 2 cách:

+ Dạng dịch thể: Bằng cách nghiền nguồn vật liệu sâu chết bệnh rồi pha

nước thành dạng dịch thể, sau đó lọc bỏ xác sâu, bổ sung hóa chất chống thối. Sau

đó, đóng chai và chuyển đến nơi sử dụng. Sản phẩm được đem sử dụng trực tiếp

trên đồng ruộng với liều lượng 500 sâu chết bệnh để phun cho 1 ha.

+ Dạng bột khô: Các cá thể sâu chết bệnh sau khi thu gom được sấy khô ở

nhiệt độ 450C. Sau đó, nghiền nhỏ, đóng gói hoặc phối trộn với bột tan để bảo quản

hoặc đem sử dụng ngay, liều lượng tương ứng là 500 sâu chết bệnh cho 1 ha.

Các tác giả thử nghiệm bổ sung chất phụ gia vào dịch virus, như: sữa bột,

đường vàng 5%, nước gỉ đường 5% và Glycerine 50%. Sau phơi nắng 1 giờ, các sản

phẩm có chứa phụ gia đều không mất hoạt tính, còn hiệu lực của sản phẩm không

có phụ gia bị giảm 20- 25%. Sử dụng cho 1 ha với lượng dịch của 250- 500 sâu có

bổ sung 5% đường đỏ hoặc 5% Glycerine, hiệu lực trừ sâu đo xanh đạt 30- 68%.

Nếu phun 1 lần cho hiệu quả 31,1% và 2 lần hiệu quả 70,3% sau 20 ngày phun. Nếu

phun dập dịch, sau 32 ngày phun đạt hiệu quả 53,1% (1 lần) và 56,5% (2 lần) [8].

Trương Thanh Giản et al. (1996) đã tiến hành tạo dạng dịch thể sản phẩm NPV

sâu róm thông bằng cách sau khi nghiền, lọc lấy dịch thể có chứa NPV và bổ sung

thêm 20- 30% Glycerin hoặc 5% than hoạt tính hoặc 5% mực tàu. Rồi đem phun ngay

hoặc bảo quản trong chai màu ở nhiệt độ 0- 50C. Còn để tạo dạng bột chế phẩm thì

sử dụng bột tan, than hoạt tính và dịch thể chứa NPV sâu róm thông [107].

Thử nghiệm NPV-Ha trừ sâu xanh hại thuốc lá, sau 9 ngày phun dạng bột

sấy khô có hiệu quả đạt 33,78%, dạng dịch thể đạt 51,2%. Khi đó, thuốc Monitor

đạt tới 82,2% (Nguyễn Văn Cảm et al. 1996a) [8]. Ngoài ra, để tạo ra chế phẩm phổ

rộng diệt 2- 3 loại sâu, các tác giả cũng đã phối trộn 2- 3 loại chế phẩm NPV khác

nhau hoặc NPV với Bt (Baccilus thuringiensis) ở dạng dịch thể cho hiệu quả phòng

trừ sâu khá tốt (Hoàng Thị Việt et al., 2002) [102].

Nguyễn Thị Hai (2005) ứng dụng chế phẩm NPV sâu keo da láng

(Spodoptera exigua) dạng dịch thể được sản xuất bằng cách nhiễm NPV trên sâu

non và nghiền lọc. Kết quả sử dụng chế phẩm với lượng 500 sâu chết/ha trên bông,

nho, ngô, hành và đậu xanh đều có hiệu quả phòng trừ đạt từ 82- 91%. Thử nghiệm

trên hành lá tại 3 hộ nông dân, hiệu quả trừ sâu keo da láng đạt từ 26,67- 71,43%

sau 3 ngày phun và đạt từ 98,41- 99,49 sau 9 ngày phun, chi phí sử dụng chế phẩm

phòng trừ sâu keo da láng cho 1 ha vào khoảng 1,92 triệu đồng [106].

Theo Nguyễn Văn Cảm (1996a), dịch NPV chế biến từ sâu đo xanh chết

bệnh nếu để lâu dễ bị phân hủy do nhiệt độ, ánh sáng và pH. Xác định nếu để dịch

NPV trong chai màu ở nhiệt độ từ 20,4- 29,60C có thể duy trì hiệu lực trừ sâu từ

88,3- 100% trong 8 tháng đầu. Sau 14 tháng hiệu lực chỉ còn 16,6% [8].

Hoàng Thị Việt et al. (2002) xác định nếu bảo quản dịch NPV trong tủ lạnh

nhiệt độ 5- 100C, sau 36 tháng bảo quản vẫn có hiệu lực trừ sâu tới 81,27- 82,05%.

Nếu bảo quản ở nhiệt độ trong phòng, sau 36 tháng hiệu lực còn 58,73% khi chế

phẩm có bổ sung 50% Glycerin. Nếu không bổ sung chất bảo quản, chỉ bảo quản

dịch trong lọ màu thì hiệu lực chỉ còn 37,5% [102].

Nhận xét chung: Qua tổng hợp các tài liệu công bố đã cho thấy:

1. NPV là tác nhân sinh học hữu ích phổ biến trên đồng ruộng và có tiềm

năng cao trong phòng trừ sâu hại, được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

nhằm khai thác và phát triển thành thuốc sinh học bảo vệ thực vật.

2. Ở nước ngoài, việc nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng phục vụ phát

triển sinh khối virus, sản xuất thuốc sinh học phòng trừ sâu hại đã phát triển khá

mạnh với các cấp độ, qui mô khác nhau và đã thu được nhiều thành công.

3. Tại Việt Nam, chủ yếu tập trung vào nghiên cứu và phát triển sinh

khối NPV bằng cách lây nhiễm NPV trên sâu non hoặc thu sâu chết bệnh ngoài

đồng rồi đem nghiền, lọc để tạo chế phẩm trong những năm 1990- 2005.

Vì vậy, việc nghiên cứu nuôi nhân tế bào, tuyển chọn chủng virus nhân

đa diện (NPV) có hoạt lực cao và lây nhiễm trên tế bào nhân nuôi, sản xuất

thuốc trừ sâu sinh học phục vụ phòng trừ sâu hại là yêu cầu cấp thiết, có tính

thời sự phục vụ sản xuất nông sản an toàn, hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực

vật hoá học, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái ở nước ta.

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hoá chất và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

- Các loại môi trường nuôi nhân tế bào do công ty Invitrogen Life

Technologies cung cấp: Excell 420- 14419C serum free (Sigma), Schneider (Sigma),

TC - 100 BML-TC/10 (Sigma), TNM- FH (Sigma), IPL-41 (Sigma), Grace (Gibco),

v.v. Huyết thanh Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco), Photphatse Buffer Saline có

pH 7,2 (1X) (PBS) (Gibco), Dimethyl sulfoxide 10% (DMSO) (Gibco), Trypan blue

0.4%, Trypsin-EDTA 10X (Gibco). Kháng sinh Gentamicine (50mg/ml) (Gibco),

Streptomycin (1gram), Penicilin (106 IU), Fungizone (250µg/ml) (Gibco).

- Các loại hóa chất dùng trong nghiên cứu NPV như: SDS (Sodium Dodecyl

Sulfate), Tryphto broth, Na2CO3, NaOH, nước cất 1-2 lần, v.v. Các loại kháng sinh

đặc dụng như: Gentamicine (50mg/ml) (Gibco), Streptomycine (1gram/lọ),

Penicilin (1.000.000 IU), kháng nấm Fungizone (250µg/ml) (Gibco), dung dịch KCl

0,001%. Các hóa chất khác có liên quan như: cồn 70%, 90%.

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

- Các dụng cụ thí nghiệm: Bình nuôi nhân tế bào, gồm bình cổ vếch có nắp

lọc khuẩn loại 25cm2, 75 cm2, 250 cm2, bình 250ml và 1000ml (Corning SPL- Hàn

Quốc), ống nghiệm thủy tinh. Hộp nhân nuôi, đánh giá tế bào Multiple Well Plates

loại 12 giếng (Corning- Mỹ). Ống bảo quản mẫu tế bào 2ml đáy tròn, lọ bảo quản

thể vùi NPV (Corning SPL- Hàn Quốc) và dao nạo tế bào các loại.

Dụng cụ, vật liệu nuôi sâu và thí nghiệm trên sâu khoang gồm: lồng nuôi sâu

kích thước 40 x40x 60cm, chậu nhựa, khay nhựa, đĩa petri, bô can, ống tuýp, pank,

kéo, chổi lông, giấy thấm và bông thấm nước, v.v.

Các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu: Bao gồm buồng cấy vô trùng, máy lắc

để bàn N-Biotek (Hàn Quốc), máy ly tâm từ 3000- 9.000 vòng/phút, tủ nuôi tế bào

Binder (Mỹ), tủ lạnh sâu -960C, tủ lạnh thường, micropipette các loại, kính hiển vi

soi nổi Zeiss (Đức), kính hiển vi soi ngược Nikon Ti-U (Nhật Bản), kính hiển vi

quang học, buồng đếm hồng cầu, v.v.

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1. Địa điểm nghiên cứu

Việc điều tra mức độ phát sinh NPV trên sâu khoang được tiến hành trên bắp

cải và lạc tại Đông Anh (Hà Nội), lạc và khoai sọ tại Yên Phong (Bắc Ninh). Các

thí nghiệm trong phòng được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Sinh học, Viện Bảo vệ

thực vật- phường Đức Thắng, Bắc Từ Liêm, Hà Nội. Các thí nghiệm đồng ruộng

tiến hành tại Đông Anh và Mỹ Đức (Hà Nội).

2.2.2. Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 9/2014 đến tháng 12/ 2019

2.3. Nội dung nghiên cứu

1- Điều tra, đánh giá và phân lập, tuyển chọn NPV sâu khoang

- Điều tra đánh giá mức độ phổ biến và khả năng gây chết của NPV trên sâu

khoang ngoài đồng ruộng.

- Thu thập và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực trong gây chết sâu non sâu

khoang và có tiềm năng sinh thể vùi cao.

2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và

lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân

- Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang

- Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mô phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào nuôi nhân

3- Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước

- Nghiên cứu tinh sạch, thu hoạch thể vùi NPV

- Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước

- Đánh giá hiệu quả phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang

• Điều tra mức độ phổ biến của NPV trên sâu khoang ngoài đồng ruộng

Điều tra mức độ phổ biến của sâu khoang chết bệnh được tiến hành theo

phương pháp điều tra cơ bản sâu bệnh hại cây trồng của Viện Bảo vệ thực vật

(1997) [108] và theo QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT [110] về phương pháp điều tra

sinh vật hại cây trồng. Thực hiện điều tra 3 lần vào tháng 10/2014, tháng 3 và tháng

4 năm 2015 trên đồng ruộng trồng bắp cải tại Đông Anh và đậu tương tại Mê Linh

(Hà Nội), lạc và khoai sọ tại Yên Phong (Bắc Ninh).

Tại mỗi vùng sản xuất, chọn 3 khu đồng đại diện cho hiện trạng sản xuất (địa

hình, mức độ thâm canh). Tại mỗi khu đồng, tiến hành điều tra 3 ruộng, tại mỗi

ruộng điều tra 5 điểm theo đường chéo góc, mỗi điểm điều tra 1m2 cây trồng. Ghi

chép số sâu khoang sống và chết tại các điểm điều tra.

Đồng thời, thu thập tất cả các cá thể sâu khoang sống tại điểm điều tra để

trong hộp riêng có chứa thức ăn cho sâu là cây trồng của ruộng điều tra. Sau đó,

đem về phòng thí nghiệm tiếp tục nuôi theo dõi cho đến khi sâu hoá nhộng để xác

định cá thể sâu nhiễm NPV được tiến hành theo phương pháp của Viện Bảo vệ thực

vật (2000) có tham khảo phương pháp nghiên cứu của Hong (2002), Grzywacz et

al. (1996) và Evans (1986) [109, 2, 12, 27].

Những cá thể sâu chết được thu thập xử lý vô trùng bằng cồn 900 trong 30

giây, để khô và cho riêng rẽ từng cá thể sâu chết vào từng ống nghiệm loại 5ml. Sau

đó, cho 3ml nước cất vô trùng vào mỗi ống nghiệm đựng mẫu, nút kín và ngâm

trong 7 ngày để thể vùi NPV lắng đọng xuống đáy ống nghiệm. Những cá thể sâu

ngâm trong nước có thể vùi màu trắng đục hình thành và lắng đọng xuống đáy ống

nghiệm được xác định cá thể sâu đó đã nhiễm NPV ngoài đồng ruộng.

Đánh giá độ bắt gặp và tấn xuất xuất hiện của sâu chết do NPV được xác

định như sau:

Số điểm điều tra bắt gặp

Độ bắt gặp P(%) = -------------------------------- x 100 Tổng số điểm điều tra

Mức độ phổ biến của NPV trên sâu khoang ngoài đồng ruộng được đánh giá

theo thang bậc sau:

-: Rất ít phổ biến với độ bắt gặp/tần suất xuất hiện đạt <5%

+: Ít phổ biến với độ bắt gặp/tần suất xuất hiện đạt 5- <25%

++: Phổ biến mức trung bình với độ bắt gặp/tần suất xuất hiện 25- <50%

+++: Phổ biến với độ bắt gặp/tần suất xuất hiện đạt 50- <75%

++++: Rất phổ biến với độ bắt gặp/tần suất xuất hiện đạt >75%

• Phân lập, tuyển chọn chủng NPV sâu khoang có hoạt lực cao

Các mẫu sâu khoang bị bệnh thu được qua điều tra tại Đông Anh, Mê Linh

và Tiền Phong (Hà Nội). Phân lập thể vùi của sâu bị bệnh theo phương pháp của

Grzywacz et al. (1996) và Escribano et al. (1999) [12, 39], được tiến hành tại phòng

thí nghiệm của Viện Bảo vệ thực vật.

Phương pháp phân lập thể vùi NPV được tiến hành cụ thể như sau:

Quan sát và lựa chọn các cá thể sâu có triệu chứng nhiễm bệnh NPV tự nhiên

ngoài đồng ruộng sau khi ngâm nước trong 7 ngày để thể vùi màu trắng đục lắng

đọng ổn định dưới đáy ống nghiệm. Sau đó, tiến hành nghiền sâu trong dung dịch

SDS 0,1% và ly tâm với tốc độ 1.500 vòng/phút trong thời gian 10 phút, thu phần

cặn lắng màu trắng đục chính là thể vùi của NPV. Lọc loại bỏ bã xác sâu và phần

dịch nổi bên trên.

Thu phần thể vùi của NPV rồi tiếp tục bổ sung nước cất và lắc với tốc độ 50

vòng/phút trong 5 phút, sau đó ly tâm lần 2 ở tốc độ 1.500 vòng/phút trong 10 phút.

Sau đó, gạn bỏ phần dịch nổi, thu phần cặn trắng đục, rồi tiếp tục bổ sung

dung dịch SDS 0,1% mới, lắc với tốc độ 50 vòng/phút trong 5 phút, sau đó ly tâm

lần 3 với tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút. Tiếp tục bỏ phần dịch nổi, thu phần

cặn lắng, bổ sung nước cất và lắc với tốc độ 50 vòng/phút trong 5 phút, sau đó ly

tâm lần 4 ở tốc độ 1.500 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó loại bỏ phần dịch nổi và

thu hồi phần cặn màu trắng đục là thể vùi NPV sâu khoang đã được làm sạch.

Để các thể vùi NPV dễ dàng tách rời không bị vón cục khi lấy mẫu đếm số

lượng thể vùi, cần phải tiến hành thêm bước bổ sung dung dịch Tryphto broth 1%,

lắc trong 10 phút, rồi ly tâm ở 1000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó, bỏ phần dịch

nổi thu phần cặn lắng, bổ sung nước cất, lắc với tốc độ 50 vòng/phút trong 5 phút và

ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút. Sau ly tâm thu phần cặn lắng thể vùi màu

trắng đục cho vào ống bảo quản loại 2ml để riêng rẽ cho từng các thể sâu bị bệnh.

Quá trình phân lập và làm thuần nguồn NPV được tiến hành như sau:

Việc phân lập NPV được tiến hành theo phương pháp của Grzywacz et al.

(1996) [12]. Sau khi phân lập được nguồn NPV trên các mẫu sâu chết thu được

ngoài đồng ruộng, tiến hành lây nhiễm riêng rẽ trở lại trên sâu khỏe được nuôi nhân

ngay sau khi trứng nở bằng thức ăn sạch là lá bắp cải được trồng trong nhà lưới,

không phun bất kỳ loại thuốc bảo vệ thực vật nào. Hàng ngày kiểm tra số sâu chết

bệnh và thu các mẫu sâu chết NPV điển hình. Các mẫu sâu chết thu được hàng ngày

cũng được để riêng trong từng ống nghiệm theo ngày và tiến hành xử lý thu hoạch

thể vùi như đã nêu ở phần trên.

Các bước phân lập và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao được tiến hành

lặp lại theo các bước thực hiện như nêu trên trong 3- 4 lần. Tại mỗi bước, tiến hành

việc phân lập và làm thuần kết hợp đánh giá hiệu quả gây chết sâu khoang, tới khi

xác định được chủng NPV có hoạt lực gây chết sâu cao, sinh thể vùi nhiều và tương

đối ổn định qua các lần phân lập thì tiến hành lưu giữ làm thực liệu để thực hiện các

thí nghiệm tiếp theo và phát triển sinh khối NPV sau này.

Thí nghiệm ở các bước phân lập được tiến hành theo phương pháp nghiên

cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (2000) [109] với 5 công thức (CT).

Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại thực hiện với 50 sâu non sâu khoang

tuổi 2 đã được nuôi bằng lá bắp cải sạch. Cụ thể:

CT1: Nhiễm thể vùi tinh phân lập từ sâu chết bệnh trên bắp cải

CT2: Nhiễm thể vùi tinh phân lập từ sâu chết bệnh trên lạc

CT3: Nhiễm thể vùi tinh phân lập từ sâu chết bệnh trên khoai sọ

CT4: Nhiễm thể vùi tinh từ chủng NPV lưu giữ trong quĩ gen (QG.NPV)

CT5: Đối chứng sâu không nhiễm NPV

Theo dõi tỷ lệ sâu chết và số lượng thể vùi của 10 sâu chết sau 3, 7 và 10

ngày lây nhiễm vi rút thu từ một cá thể sâu chết bệnh NPV ban đầu.

Đánh giá hiệu lực gây chết sâu của các chủng NPV sau khi được tuyển chọn:

Đánh giá hiệu lực gây chết sâu để từ đó lựa chọn chủng NPV có hoạt lực cao

và khả năng sinh thể vùi lớn. Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp nghiên

cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (2000) [109] trên sâu non sâu khoang

sạch trong điều kiện phòng thí nghiệm, bằng cách phun dịch chứa thể vùi của các chủng NPV với số lượng thể vùi 1,5 x 108 OB/ml với liều lượng 5ml cho mỗi khay

đựng lá thầu dầu, là loại cây thức ăn sâu khoang ưa thích nhất để sâu non có thể ăn được tối đa thể vùi NPV, đã được xử lý vô trùng bằng cồn 900 trong 5 phút.

Thí nghiệm được tiến hành với 4 công thức, gồm 3 công thức là 3 chủng

NPV có nguồn gốc thu từ bắp cải, lạc và khoai sọ. Mỗi công thức (CT) thí nghiệm

được nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại tiến hành với 100 sâu khoang khoẻ tuổi 3.

CT1: Nhiễm thể vùi tinh của chủng NPV có nguồn gốc trên bắp cải

CT2: Nhiễm thể vùi tinh của chủng NPV có nguồn gốc trên lạc

CT3: Nhiễm thể vùi tinh của chủng NPV có nguồn gốc trên khoai sọ

CT4: Đối chứng phun nước lã (không nhiễm NPV)

Sau 3; 7 và 10 ngày xử lý đánh giá tỷ lệ sâu bị chết và đếm số lượng thể vùi

tạo ra sau nhiễm NPV ở các công thức. Từ đó tính hiệu lực gây chết sâu khoang của

các nguồn vi rút đã được lựa chọn và đánh giá hàm lượng thể vùi được hình thành.

Phương pháp xác định số lượng thể vùi:

Xác định số lượng thể vùi theo phương pháp của Grzywacz et al. (1996)

[12], bằng cách dùng micropipet lấy 1ml dịch thể vùi NPV sau phân lập, pha loãng

2- 3 lần bằng nước cất vô trùng.

Sau đó, nhuộm màu bằng Tryphan Blue và đếm số thể vùi hiện diện trên

buồng đếm hồng cầu Neubauer dưới kinh hiển vi. Đếm 3 lần rồi lấy số liệu trung

bình. Số lượng thể vùi được tính theo công thức:

a × 400 × 10n

A = ---------------------- × 10.000 b

Trong đó: A: Số lượng thể vùi có trong 1ml

a: Số lượng thể vùi đếm được trên 1 ô nhỏ

b: Số ô đếm (16 x 25 ô = 400 ô nhỏ)

n: Hệ số pha loãng

10.000: Hằng số

2.4.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và

lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân

+ Nuôi nhân nguồn thực liệu tế bào để tiến hành các thí nghiệm: Nguồn thực

liệu tế bào ban đầu chứa trong các lọ lưu trữ 2ml được bảo quản lưu giữ ở điều kiện

lạnh sâu ở nhiệt độ -1980C tại Viện Bảo vệ thực vật. Trước khi thực hiện nhân

nguồn thực liệu tế bào cho các thí nghiệm, lấy 3 lọ và tiến hành công đoạn phục hồi

nguồn thực liệu tế bào theo phương pháp của Lynn (2002) [30], bằng cách đặt lọ tế

bào bảo quản vào cốc nước ấm 370C trong thời gian 2 phút. Sau đó, lấy ra khỏi cốc

nước ấm và nhanh chóng lau khô bên ngoài lọ tế bào bằng cồn 70%, dùng

micropippete hút 1,0ml thực liệu tế bào cho vào bình cổ vếch có nắp lọc khuẩn

dung tích 25cm2 có chứa 4,0 ml môi trường Ex-cell 420- 14419C đã chuẩn bị sẵn và

bọc xung quanh miệng bình bằng giấy parafilm. Rồi chuyển vào tủ nuôi nhân ở

nhiệt độ 280C cho tế bào phát triển bám vào đáy bình trong 30 - 45 phút.

Sau khi hình thành lớp tế bào bám dính ở đáy bình, nhẹ nhàng hút bỏ hết môi

trường cũ, các mảng tế bào chết và những tế bào không khỏe mạnh không bám dính

được. Sau đó, bổ sung 4,0ml môi trường Ex-cell 420- 14419C mới và đưa vào tủ

nuôi nhân có nhiệt độ 280C. Cứ sau 24 giờ, tiếp tục loại bỏ môi trường cũ, thay môi

trường mới và lặp lại 3- 4 lần cho đến khi lớp tế bào bám dính đồng nhất hình thành

ở đáy bình nuôi nhân.

Do tế bào sâu khoang thuộc nhóm tế bào bám dính lỏng lẻo, không chặt nên

dễ dàng tạo dịch tế bào dạng huyền phù bằng phương pháp Trypsin hóa theo

phương pháp của Lynn (2002) [30]. Đến lần nuôi nhân cuối cùng sau 3- 4 lần nuôi

nhân trong bình cổ vếch 25cm2, tiến hành loại bỏ môi trường nuôi nhân cũ và bổ

sung 2ml chất đệm Trypsin-EDTA 0,25%. Đặt các bình tế bào vào buồng cấy vô

trùng ở nhiệt độ trong phòng, sau 5 phút tiến hành hút hết dung dịch Trypsin-EDTA

và để bình nuôi trong buồng cấy thêm 5 phút. Sau đó, cho 4ml môi trường mới và

lắc với tốc độ 50 vòng/phút trong 2 phút để tạo dịch tế bào dạng huyền phù, rồi

chuyển sang nuôi nhân khối lượng lớn trong bình cổ vếch có nắp lọc khuẩn loại

250cm2 chứa sẵn 150ml môi trường Ex-cell 420- 14419C ở nhiệt độ 28 ± 0,50C.

Tiếp tục nuôi nhân trong 6 ngày, sau đó thu dịch tế bào dạng huyền phù vào

các ống ly tâm 50ml và ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong thời gian 10 phút,

gạn bỏ dịch môi trường cũ, cho vào mỗi ống ly tâm 5ml môi trường Ex-cell 420-

14419C mới và dùng micropipet hút đẩy nhẹ nhàng để các tế bào phân bố đồng đều

trong môi trường rồi chuyển vào các bình nuôi cấy cổ vếch loại 250cm2 mới có

chứa sẵn 150ml môi trường và đặt trong tủ nuôi nhân tế bào ở nhiệt độ 28 ± 0,50C.

Sau 3 ngày tiến hành lắc nhẹ với tốc độ 50 vòng/phút và tiếp tục đặt vào tủ nuôi

nhân, đến ngày thứ 6 hàm lượng tế bào có thể đạt tới 0,5 x 1010 tế bào/ml và sẵn

sàng để sử dụng cho yêu cầu của các thí nghiệm tiếp theo.

2.4.2. 1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang

• Xác định môi trường thích hợp trong nuôi nhân tế bào sâu khoang

Được thực hiện theo phương pháp của Lynn và Shapiro (1998) [67], thí

nghiệm tiến hành trên khay 12 giếng với 5 công thức là môi trường nhân sinh khối

không bổ sung 15% FBS và điều chỉnh pH là 6,8. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần trong điều kiện nhiệt độ 28 ± 0,50C với hàm lượng tế bào ban đầu là 0,5 x 1010 tế

bào/ml. Trước và sau 2, 6 và 10 ngày nhân nuôi, lấy mẫu đếm trên buồng đếm hồng

cầu và tính số lượng tế bào có trong 1ml dịch nuôi.

Công thức 1: Môi trường Excell 420- 14419C

Công thức 2: Môi trường Schneider S9895

Công thức 3: Môi trường TNM-FH T3285

Công thức 4: Môi trường TC-100 T3160

• Điều kiện nhiệt độ thích hợp để nuôi nhân tế bào sâu khoang

Tiến hành thí nghiệm về ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình phát triển sinh

khối tế bào được tiến hành theo qui trình hướng dẫn của Invitrogen Life

Technologies (2002) [50]. Thí nghiệm được tiến hành trên bình cổ vếch nắp lọc

khuẩn 25cm2 với 4 công thức nhiệt độ khác nhau, mỗi công thức nhắc lại 3 lần trên

môi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 20% FBS và pH= 6,8 với mật độ tế bào

ban đầu là 0,5 x 1010 tế bào/ml.

Công thức 1: Nhiệt độ nuôi cấy 24 ± 0,50C

Công thức 2: Nhiệt độ nuôi cấy 26 ± 0,50C

Công thức 3: Nhiệt độ nuôi cấy 28 ± 0,50C

Công thức 4: Nhiệt độ nuôi cấy 29 ± 0,50C

Trước và sau 2, 4, 6 và 8 ngày nhân nuôi, lấy mẫu đếm số lượng tế bào hình

thành có trong 1ml dịch nuôi trên buồng đếm hồng cầu.

• Điều kiện pH môi trường thích hợp nuôi nhân tế bào sâu khoang

Theo qui trình hướng dẫn của Invitrogen Life Technologies (2002) [50]. Thí

nghiệm được tiến hành trên bình cổ vếch nắp lọc khuẩn 25 cm2 với môi trường

Excell 420- 14419C có bổ sung 20% FBS ở nhiệt độ 29 ± 0,50C với hàm lượng tế

bào 0,5 x 1010 tế bào/ml. Tiến hành với 6 công thức là các mức pH khác nhau, mỗi

công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại gồm 3 bình nuôi nhân. Cụ thể như sau:

Công thức 1: pH = 6.0

Công thức 2: pH = 6.2

Công thức 3: pH = 6.4

Công thức 4: pH = 6.6

Công thức 5: pH = 6.8

Công thức 6: pH = 7.0

Trước và sau 2, 4, 6 và 8 ngày nhân nuôi thì lấy mẫu đếm số lượng tế bào

hình thành có trong 1ml dịch nuôi trên buồng đếm hồng cầu.

• Xác định tỷ lệ FBS thích hợp nhân nuôi tế bào sâu khoang

Thí nghiệm cũng được tiến hành theo phương pháp của Lynn (2002) [30]

trên bình cổ vếch nắp lọc khuẩn 25cm2 với 6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3

lần và mỗi lần nhắc lại là 3 bình nuôi nhân trên môi trường Excell 420- 14419C ở

nhiệt độ 29 ± 0,50C và pH= 6,2 với hàm lượng tế bào 0,5 x 1010 tế bào/ml.

Thí nghiệm đánh giá hiệu quả bổ sung FBS theo 6 công thức như sau:

Công thức 1: Bổ sung vào môi trường nuôi nhân 5% FBS

Công thức 2: Bổ sung vào môi trường nuôi nhân 10% FBS

Công thức 3: Bổ sung vào môi trường nuôi nhân 15% FBS

Công thức 4: Bổ sung vào môi trường nuôi nhân 20% FBS

Công thức 5: Bổ sung vào môi trường nuôi nhân 25% FBS

Công thức 6: Không bổ sung FBS vào môi trường nuôi nhân (Đối chứng)

Trước và sau 2, 6 và 10 ngày nhân nuôi tiến hành lấy mẫu đếm số lượng tế

bào hình thành có trong 1ml dịch nuôi trên buồng đếm hồng cầu.

• Đánh giá tiềm năng phát triển sinh khối tế bào khi nuôi nhân in vitro ở

điều kiện thích hợp nhất

Tiến hành theo phương pháp của Lynn et al (2005) [56], thí nghiệm tiến

hành trong 3 đợt vào tháng 10; 11 và 12/ 2016 bằng việc áp dụng các điều kiện

thích hợp nhất trong phát triển sinh khối tế bào trên 5 bình nuôi nhân loại bình cổ

vếch nắp lọc khuẩn 25cm2, sử dụng môi trường Excell 420- 14419C có bổ sung

25% FBS ở nhiệt độ 28 ± 0,50C và pH= 6,8 với hàm lượng tế bào 0,5 x 1010 tế

bào/ml trước khi đưa vào nuôi nhân.

Trước và sau 1, 2, 4, 6 và 8 ngày nuôi nhân tiến hành lấy mẫu đếm số lượng

tế bào hình thành có trong 1ml dịch nuôi nhân trên buồng đếm hồng cầu.

• Nghiên cứu nhân sinh khối tế bào sâu khoang với lượng 150ml trên bình

lọc khuẩn 250ml theo phương pháp tĩnh và lắc

Từ các kết quả của các thí nghiệm riêng lẻ nêu trên, tiến hành nhân sinh khối

tế bào sâu khoang dựa theo phương pháp của Lynn et al. (2005) [56] theo các thông

số kỹ thuật tối ưu đã xác định với hàm lượng tế bào ban đầu 0,5 x 1010 tế bào/ml,

thực hiện trên bình lọc khuẩn 250ml theo 2 phương pháp tĩnh và lắc với lượng 150ml

môi trường Excell 420-14419C có bổ sung 25% FBS ở nhiệt độ 28 ± 0,50C và pH=

6,8. Công thức nuôi nhân theo phương pháp lắc được tiến hành với tốc độ lắc 50

vòng/phút liên tục 24 giờ. Thí nghiệm với 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần

với 1 bình cho mỗi lần nhắc lại.

Công thức 1: Nuôi nhân tế bào theo phương pháp tĩnh

Công thức 2: Nuôi nhân tế bào theo phương pháp lắc.

Sau 6 ngày nuôi nhân tiến hành lắc với tốc độ lắc 50 vòng/phút trong 5 phút,

sau đó lấy mẫu đếm số lượng tế bào hình thành có trong 1ml dịch tế bào trên buồng

đếm hồng cầu.

• Nghiên cứu nhân sinh khối tế bào sâu khoang theo phương pháp tĩnh và

lắc với lượng 750ml môi trường trên bình 1000ml

Nhằm hướng tới nuôi nhân tế bào với sinh khối lớn với chi phí thấp bằng các

loại môi trường rẻ tiền hơn. Thí nghiệm thực hiện dựa theo phương pháp của

Kanokwan et al. (2003), Maiorella et al. (1988) và Miranda et al. (1997) [79, 80,

81]. Ngoài môi trường thích hợp nuôi nhân tế bào là môi trường Excell 420-

14419C, đề tài còn tiến hành đánh giá thêm với 2 môi trường rẻ tiền hơn là

Schneider S9895 và Grace. Thí nghiệm với lượng 750ml môi trường có bổ sung

25% FBS trên bình lọc khuẩn Erlemeeyer Flask dung tích 1000ml ở nhiệt độ 28 ±

0,50C, pH= 6,8 với hàm lượng tế bào ban đầu 0,5 x 1010 tế bào/ml.

Tiến hành với 3 công thức thí nghiệm, mỗi công thức nhắc lại 3 lần là 3 bình

nhân sinh khối tế bào theo phương pháp lắc tốc độ 50 vòng/phút liên tục trong 24

giờ (công thức 1) và phương pháp tĩnh (công thức 2).

Công thức 1: + Trên môi trường Excell 420-14419C theo phương pháp tĩnh

+ Trên môi trường Excell 420-14419C theo phương pháp lắc

Công thức 2: + Trên môi trường Schneider S9895 theo phương pháp tĩnh

+ Trên môi trường Schneider S9895 theo phương pháp lắc

Công thức 3: + Trên môi trường Grace theo phương pháp tĩnh

+ Trên môi trường Grace theo phương pháp lắc

Sau 2, 6, 10 và 14 ngày nhân nuôi, tiến hành lắc với tốc độ 50 vòng/phút

trong 5 phút tạo dịch tế bào dạng huyền phù, sau đó lấy mẫu đếm số lượng tế bào

hình thành có trong 1ml dịch tế bào trên buồng đếm hồng cầu.

• Phương pháp đếm tế bào

Phương pháp đếm tế bào được tiến hành theo chỉ dẫn của Lynn (2002) [30].

Cụ thể, để xác định tổng số số lượng tế bào và số tế bào sống trong nuôi cấy được

tiến hành qua các bước như sau:

+ Sau khi dịch tế bào được lắc tạo huyền phù trong môi trường, lấy ra 0,2 ml.

+ Xác định mật độ tế bào sử dụng buồng đếm hồng cầu (buồng đếm

Neubauer, là một bản kính dày hình chữ nhật, mặt trên có 2 khu vực có kẻ ô đếm)

Dưới kính hiển vi sẽ thấy rõ cấu tạo của buồng đếm hồng cầu như sau:

Buồng đếm được chia thành 9 ô vuông lớn, mỗi ô có diện tích 1 mm2. Ô chính giữa

được sử dụng để đếm tế bào, các cạnh là những đường song song, được chia thành

25 ô trung bình, mỗi ô trung bình được thành 16 ô nhỏ. Tổng số ô đếm hồng cầu có

400 ô nhỏ (mỗi ô có diện tích 1/400 mm2).

+ Chuẩn bị sẵn dung dịch gồm 0,5 ml Trypan blue 0,4% trộn với 0,3 ml PBS

(pH 7,2 - 7,4) trong một ống nghiệm nhỏ.

+ Pha hỗn hợp này với 0,2 ml dịch tế bào.

+ Đưa vào buồng đếm hồng cầu Neubauer (Hình 1.3) và quan sát ngay dưới

kính hiển vi ở độ phóng đại 600X kết nối với máy vi tính. Sau khi nhuộm với

Trypan blue, tế bào nào bị nhuộm có màu xanh được xác định là những tế bào chết.

Đếm số lượng tế bào có màu xanh và tổng số tế bào. Đếm trong ô lớn trung

tâm, tiến hành đếm 5 ô trung bình (4 ô ở bốn góc và 1 ô ở giữa). Trong mỗi ô trung

bình đếm tất cả 16 ô nhỏ. Mỗi mẫu được đếm hai lần trên năm khu vực của buồng

đếm rồi lấy số liệu trung bình.

% số tế bào sống = [100 - (số tế bào màu xanh/tổng số tế bào)] x 100

Số tế bào trong 1ml mẫu ban đầu được tính:

C (tế bào/ml) = 5 x (N x H) x 104

Trong đó: C là số tế bào trong 1ml mẫu ban đầu

H là hệ số pha loãng;

N: là tổng số tế bào đếm được trên 5 ô lớn của mẫu đã pha loãng.

Hình 2.3: Buồng đếm hồng cầu Neubauer

2.4.2.2. Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân nuôi

• Phương pháp phá vỡ thể vùi trước khi nhiễm virus trên tế bào

Do việc lây nhiễm virus trên tế bào chỉ thực hiện được khi virus ở dạng hoạt

động (virion), tức phải tiến hành phá vỡ vỏ bọc protein các thể vùi (Occlusion

Bodies). Vì vậy, trước khi thực hiện các thí nghiệm để xác định điều kiện thích hợp

cho lây nhiễm virus trên tế bào sâu khoang để phát triển sinh khối NPV, cần tiến

hành qua 2 bước: Trước hết, định lượng số lượng thể vùi cần thiết theo yêu cầu của

từng thí nghiệm. Sau đó, phải tiến hành bước phá vỡ vỏ bọc protein của thể vùi

(Oclussion Bodies) theo phương pháp của Tipvadee et al. (1988) [83]. Bằng cách

hoà trộn số thể vùi NPV đã được xác định với dung dịch Na2CO3 0,1M có pH =

11,2 và để yên trong thời gian 15 phút ở nhiệt độ bình thường trong phòng, sau đó

lắc với tốc độ 50 vòng/phút trong 3 phút rồi tiếp tục để tiếp 12 phút để tất cả các thể

vùi được phá vỡ. Sau đó, tiến hành các thí nghiệm theo mục đích nghiên cứu.

• Xác định nồng độ tế bào thích hợp cho lây nhiễm

Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Lynn (2002) [30] với 4

công thức thí nghiệm tương ứng với 4 công thức nồng độ tế bào khác nhau trên môi

trường Excell 420- 14419C có bổ sung 15% FBS và pH= 7,0 ở nhiệt độ 28 ± 0,50C.

Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành nhắc lại 3 lần trên khay 12 giếng với số lượng

thể vùi để lây nhiễm ở các công thức là 0,1 x 108 OB/ml. Các công thức thí nghiệm

tiến hành gồm:

Công thức 1: Lây nhiễm ở nồng độ 1,0 x 108 tế bào/ml

Công thức 2: Lây nhiễm ở nồng độ 2,0 x 108 tế bào/ml

Công thức 3: Lây nhiễm ở nồng độ 3,0 x 108 tế bào/ml

Công thức 4: Công thức đối chứng là dịch tế bào không nhiễm NPV.

Sau 3 và 6 ngày thì tiến hành lấy mẫu xác định số lượng thể vùi hình thành

trong dịch nhiễm theo phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu

Neubauer ở mỗi lần nhắc lại của các công thức thí nghiệm trên kính hiển vi.

• Xác định hàm lượng thể vùi NPV thích hợp cho lây nhiễm

Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức thí nghiệm tương ứng với 3 chỉ số

MOI khi lây nhiễm. Chỉ số MOI là tỷ lệ giữa số thể vùi NPV và số tế bào sâu

khoang có trong môi trường nuôi nhân theo phương pháp của Lynn (2003) [85].

Mỗi công thức thí nghiệm được nhắc lại 3 lần trên khay 12 giếng trên môi trường

Excell 420- 14419C có bổ sung 15% FBS và pH= 7,0 ở nhiệt độ 28± 0,50C. Dịch tế

bào để nhiễm virus có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml.

Công thức 1: Lây nhiễm theo chỉ số MOI = 0,1

Công thức 2: Lây nhiễm theo chỉ số MOI = 0,3

Công thức 3: Lây nhiễm theo chỉ số MOI = 0,5

Công thức 4: Dịch tế bào không nhiễm vi rút (đối chứng).

Sau 3 và 6 ngày thì tiến hành lấy mẫu xác định số lượng thể vùi hình thành

theo phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu Neubauer ở mỗi

lần nhắc lại của các công thức thí nghiệm trên kính hiển vi.

• Xác định thời gian ủ lây nhiễm vi rút thích hợp

Nhằm tìm hiểu khả năng hình thành thể vùi của NPV ở các thời gian ủ lây

nhiễm khác nhau đối với nguồn NPV được nhân trên tế bào sâu khoang. Thí nghiệm

tiến hành theo phương pháp của Grzywacz et al. (1996) và Lynn (2003) [12, 85]

với 5 công thức tương ứng với 4 mức thời gian ủ lây nhiễm vi rút trên tế bào khác

nhau gồm 1, 3, 6 và 10 ngày. Mỗi công thức thí nghiệm được nhắc lại 3 lần trên

khay 12 giếng trên môi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 15% FBS và pH=

7,0 ở nhiệt độ 28 ± 0,50C. Số lượng thể vùi khi lây nhiễm là 0,1 x 108 OB/ml và

dịch tế bào mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml, cụ thể:

Công thức 1: Thời gian ủ lây nhiễm vi rút trong 1 ngày

Công thức 2: Thời gian ủ lây nhiễm vi rút trong 3 ngày

Công thức 3: Thời gian ủ lây nhiễm vi rút trong 6 ngày

Công thức 4: Thời gian ủ lây nhiễm vi rút trong 10 ngày

Công thức 5: Công thức đối chứng là dịch tế bào không nhiễm vi rút

Sau nuôi nhân 1, 3, 6 và 10 ngày, tiến hành lấy mẫu xác định số lượng thể

vùi hình thành theo phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu

Neubauer ở mỗi lần nhắc lại của các công thức trên kính hiển vi.

• Xác định môi trường lây nhiễm NPV thích hợp

Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức thí nghiệm theo phương pháp của

Lynn (2003) [85] tương ứng với 4 loại môi trường khác nhau có bổ sung 15% FBS

và pH= 7,0 ở nhiệt độ 28± 0,50C. Mỗi công thức thí nghiệm được nhắc lại 3 lần trên

khay 12 giếng. Số lượng thể vùi khi lây nhiễm là 0,1 x 108 OB/ml và dịch tế bào

mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml.

Công thức 1: Lây nhiễm vi rút trên môi trường Excell 420- 14419C

Công thức 2: Lây nhiễm vi rút trên môi trường Schneider S9895

Công thức 3: Lây nhiễm vi rút trên môi trường TC-100 T3160

Công thức 4: Lây nhiễm vi rút trên môi trường IPL- 41

Sau 1, 3 và 6 ngày lây nhiễm, lấy mẫu xác định số lượng thể vùì hình thành

theo phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu Neubauer ở mỗi

lần nhắc lại của các công thức thí nghiệm dưới kính hiển vi.

• Xác định nhiệt độ thích hợp cho lây nhiễm

Thí nghiệm tiến hành trong phòng thí nghiệm theo phương pháp của Lynn

(2003) [85] với 3 công thức thí nghiệm tương ứng với 3 mức nhiệt độ khác nhau

trong tủ định ôn trên môi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 15% FBS và pH=

7,0 với dịch tế bào có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml và số lượng thể vùi là 0,1 x 108

OB/ml. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần trên khay 12 giếng.

Công thức 1: Lây nhiễm vi rút ở nhiệt độ 26 ± 0,50C

Công thức 2: Lây nhiễm vi rút ở nhiệt độ 28 ± 0,50C

Công thức 3: Lây nhiễm vi rút ở nhiệt độ 30 ± 0,50C

Sau 1, 3 và 6 ngày sau lây nhiễm, tiến hành lấy mẫu xác định số lượng thể

vùi hình thành theo phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu

Neubauer ở mỗi lần nhắc lại của các công thức thí nghiệm dưới kính hiển vi.

• Xác định pH lây nhiễm NPV thích hợp

Tiến hành thí nghiệm với 3 công thức thí nghiệm theo phương pháp của

Lynn (2003) [85]. Mỗi công thức thí nghiệm được nhắc lại 3 lần trên khay 12 giếng

chứa môi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 15% FBS và pH= 7,0 ở nhiệt độ

28 ± 0,50C với số lượng thể vùi khi lây nhiễm là 0,1 x 108 OB/ml và dịch tế bào mật

độ 1,0 x 108 tế bào/ml. cụ thể:

Công thức 1: Lây nhiễm vi rút ở mức pH= 6,0

Công thức 2: Lây nhiễm vi rút ở mức pH= 6,5

Công thức 3: Lây nhiễm vi rút ở mức pH= 7,0

Công thức 4: Lây nhiễm vi rút ở mức pH= 7,5

Sau 1, 3 và 6 ngày, tiến hành lấy mẫu xác định số lượng thể vùi hình thành

theo phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu Neubauer ở mỗi

lần nhắc lại của các công thức thí nghiệm dưới kính hiển vi.

• Tìm hiểu mức độ hình thành thể vùi và khả năng phát triển sinh khối tế

bào sâu khoang trong quá trình lây nhiễm NPV

Do lây nhiễm virus trên tế bào được tiến hành trên môi trường nuôi nhân gần

tương tự như quá trình nhân sinh khối tế bào, vì vậy trong quá trình lây nhiễm NPV

thì tế bào vẫn tiếp tục phân chia, duy trì với mức độ nhất định.

Tìm hiểu vấn đề này qua một thí nghiệm đã được thực hiện theo phương

pháp của Lynn (2003) [85] với 3 công thức, nhắc lại 3 lần với 3 bình cho mỗi lần

nhắc lại. Lây nhiễm virus theo chỉ số MOI trên bình cố vếch nắp lọc khuẩn 25cm2

chứa môi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 15% FBS và pH= 7,0 ở nhiệt độ

28 ± 0,50C. Mật độ tế bào trong dịch để lây nhiễm là 1,0 x 108 tế bào/ml.

Công thức 1: Lây nhiễm theo chỉ số MOI = 0,1

Công thức 1: Lây nhiễm theo chỉ số MOI = 0,3

Công thức 1: Lây nhiễm theo chỉ số MOI = 0,5

Sau 1, 3 và 6 ngày, tiến hành lấy mẫu xác định số lượng thể vùi hình thành

theo phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu Neubauer ở mỗi

lần nhắc lại của các công thức thí nghiệm dưới kính hiển vi.

• Đánh giá khả năng lây nhiễm hình thành thể vùi của nguồn NPV tạo ra

từ tế bào và từ sâu khoang

Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Lynn (2003) [85] với 4

công thức, 3 lần nhắc lại trên khay 12 giếng chứa môi trường Excell 420- 14419C

có bổ sung 15% FBS và pH = 7,0 ở nhiệt độ 28 ± 0,50C với dịch tế bào có mật độ

1,0 x 108 tế bào/ml và dịch virus được tạo ra từ sâu và từ nuôi nhân trên tế bào với

số lượng thể vùi 0,1 x 108 OB/ml khi lây nhiễm. Cụ thể:

Công thức 1: Lây nhiễm bằng NPV tạo ra từ tế bào sâu khoang

Công thức 2: Lây nhiễm bằng NPV tạo ra từ sâu khoang

Công thức 3: Đối chứng 1 là dịch tế bào không nhiễm NPV

Công thức 4: Đối chứng 2 là dịch NPV không được lây nhiễm trên tế bào

Vào thời điểm 3, 6 và 10 ngày sau lây nhiễm (NSLN), tiến hành đánh giá tỷ lệ

sâu khoang chết theo công thức Abbott (1925) và lấy 30 mẫu sâu chết để xác định

số lượng thể vùi hình thành theo phương pháp ngâm nước và đếm số lượng thể vùi

theo phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu Neubauer ở mỗi

lần nhắc lại của các công thức thí nghiệm.

• Đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các chủng NPV được nhân sinh

khối theo phương pháp khác nhau

Nhằm đánh giá hiệu lực gây chết sâu khoang của NPV tạo ra từ lây nhiễm

trên sâu non sâu khoang với các chủng TL.1a, TL.2a và TL.3a và của NPV nhân

sinh khối từ tế bào đối với chủng TL.1a. Thí nghiệm được tiến hành theo phương

pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (2000) [109] với 4 công

thức, 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại lây nhiễm 5ml với số lượng thể vùi 1,0 x 108

OB/ml trên 30 sâu non sâu khoang tuổi 2 đã được nuôi bằng thức ăn sạch.

Công thức 1: Lây nhiễm TL.1a tạo ra từ tế bào

Công thức 2: Lây nhiễm TL.1a tạo ra từ sâu

Công thức 3: Lây nhiễm TL.2a tạo ra từ sâu

Công thức 4: Lây nhiễm TL.3a tạo ra từ sâu

Tiến hành theo dõi xác định tỷ lệ sâu chết vào các thời điểm 3, 6 và 10 ngày

sau lây nhiễm (NSLN). Tính toán hiệu lực gây chết sâu khoang của các chủng NPV

theo công thức Abbott (1925).

• Giải trình tự gen NPV nhân trên tế bào bằng phương pháp PCR

Kiểm định NPV sâu khoang thu được qua lây nhiễm trên tế bào bằng giải trình

tự gen theo phương pháp PCR và so sánh với ngân hàng Genbank theo phương

pháp của Maeda et al. (1990) [73]. Các gen để kiểm định gồm 2 gen có mức độ bảo

thủ cao trong các NPV là gen polhS và polhM được sử dụng để làm DNA khuôn

cho phản ứng PCR Polyhedrin (Polh). Tách chiết DNA theo phương pháp dung

dịch CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) của Doyle và Doyle 1990).

Trình tự các cặp mồi (primer) đặc hiệu để khuếch đại gen polhS và PolhM

F: CAAGAATTCCATAATGTATACTCG

Sản phẩm Vị trí Primer Trình tự primer nucleotide PCR

R: ACGATGTCAACTGAATCGCAAGT

F: AAATATAATGTATACTCGTTACAGCTA

-13 đến 11* 778 polhS 764 đến 742*

R: GTTTTAATTATTAATAGGCGG

759 -7 đến 17** polhM 752 đến 751**

Ghi chú: Vị trí nucleotide từ trình tự nucleotide hoàn chỉnh của *HearSNPV-

G4 và **HearMNPV bộ genome.

+ Thành phần phản ứng PCR (25µl): bao gồm 20 ng DNA virus; 0,2 mM

dNTPs mix; 0,5µM cho mỗi primer ngược và xuôi; 0,2 µM UTaq polymerase

(Fermentas Life Sciences); 1,5 mM MgCl2; Taq reaction buffer 1x và lượng nước

vừa đủ để đạt 50 µl.

+ Phản ứng PCR: Thực hiện ở nhiệt độ 95oC trong 3 phút. Sau đó, tiến hành từ

36- 40 chu kỳ ở nhiệt độ 95oC trong 30 giây, rồi ở nhiệt độ 50 - 53oC trong 1 phút

và 72oC trong 1 phút. Bước cuối cùng ở nhiệt độ 72oC trong 10 phút.

+ Hệ thống PCR dùng khuếch đại gen là Eppendorf Mastercycler Pro- S

+ Phương pháp xử lý sản phẩm PCR cho giải trình tự: Sản phẩm PCR được

phân ly bằng 1% Agarose gel và được tinh sạch từ Agarose gel sử dụng DNA

Purification Kit (Qiagen, Đức). Sau đó, sản phẩm PCR tinh sạch được gắn vào

pDrive cloning vector sử dụng pDrive Cloning kit (Qiagen) và giải trình tự trực tiếp

2 chiều bằng máy ABI3100 sử dụng BigDye Terminator 3.1 Kit (Applied Biotech)

theo phương pháp Sanger tại Hàn Quốc.

Các trình tự kết quả được BLAST so sánh bằng công cụ trực tuyến trên Ngân

hàng Gen (NCBI) so sánh mức độ tương đồng với nhau bằng phần mềm ClustalW2.

Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining trong phần mềm

MEGA 6.0.

2.4.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước

2.4.3.1. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào

Tiến hành lây nhiễm NPV vào dịch tế bào sâu khoang nuôi nhân trên môi

trường Excell 420- 14419C bổ sung 15% FBS theo chỉ số MOI là 0,1 ở nhiệt độ 28

± 0,50C và pH môi trường nuôi nhân là 7,0 trong thời gian 3 ngày trên các bình cổ

vếch nắp lọc khuẩn loại 250m2 theo phương pháp lắc 50 vòng/phút liên tục 24 giờ.

Sau đó, thu hoạch dịch thể virus để thực hiện thí nghiệm tinh sạch thể vùi NPV dựa

theo phương pháp của các tác giả Shapiro và Shepard (2007), Kanokwan et al. (2003)

và Sajap et al. (2000) [90, 79, 14].

Thể vùi NPV sâu khoang sau lây nhiễm được tinh sạch bằng cách ly tâm loại

bỏ dịch lây nhiễm được tiến hành qua thí nghiệm với 7 công thức, mỗi công thức

thực hiện với lượng 100ml dịch chứa thể vùi. Cụ thể các công thức như sau:

Công thức 1: Ly tâm 2 lần bằng nước cất

Công thức 2: Ly tâm 3 lần bằng nước cất

Công thức 3: Ly tâm 4 lần bằng nước cất

Công thức 4: Ly tâm 2 lần, gồm 1 lần nước cất và 1 lần bằng dung dịch SDS

Công thức 5: Ly tâm 3 lần theo thứ tự: nước cất- SDS- nước cất

Công thức 6: Ly tâm 4 lần theo thứ tự: SDS- nước cất- SDS- nước cất

Công thức 7: Ly tâm 5 lần, gồm 3 lần nước cất và 2 lần bằng dung dịch SDS

theo thứ tự các bước: nước cất- SDS- nước cất- SDS- nước cất

Trước và sau khi ly tâm, tiến hành lấy mẫu xác định hàm lượng thể vùi theo

phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu Neubauer ở mỗi lần

nhắc lại của các công thức thí nghiệm. Đồng thời, thể vùi được cho vào các lọ bảo

quản loại 10ml có chứa 1ml DMSO lắc đều và bảo quản lâu dài ở điều kiện nhiệt độ

5- 100C hoặc ở điều kiện phòng thí nghiệm không bị ánh nắng hoặc tia tử ngoại

chiếu vào trước khi sử dụng tạo dạng chế phẩm.

2.4.3.2. Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước

Việc phát triển chế phẩm dạng bột thấm nước được tiến hành dựa theo

phương pháp của Shapiro et al. (2008) và Cisneros et al. (2002) [90, 94]. Thành

phần phụ gia để tạo dạng bột thấm nước gồm 60% bột tan và 40% bột khoáng sét.

Các phụ gia được nghiền nhỏ mịn với kích thước 0,02- 0,05mm.

Trước hết, đếm số lượng thể vùi tinh và tính toán số lượng thể vùi cần thiết

trong chế phẩm dự kiến tạo dạng, để có thể sử dụng với liều lượng 500 gam/ha cần

có số lượng thể vùi trong chế phẩm là 2 x 109 OB/gam, để sau khi phối trộn đảm

bảo lượng thể vùi sẽ phun rải cho 1 ha cây trồng là 1 x 1012 OB/ha như chỉ dẫn của

Cisnaros et al. (2002) [4] và Lynn (2002) [30]. Việc phối trộn để tạo chế phẩm bột

thấm nước được thực hiện trên máy xay sinh tố trong thời gian 5 phút.

Sau 3 phút đầu của quá trình phối trộn, tiến hành kiểm tra và điều chỉnh đảm

bảo mức pH từ 6,5- 7,0 bằng KOH 0,1%. Sau đó, tiếp tục đảo trộn trong thời gian 2

phút rồi đưa vào sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 30- 350C trong thời gian 10- 12 giờ

để độ ẩm ở mức 10- 12%. Đóng gói trong bao giấy bạc và bảo quản chế phẩm ở

nhiệt độ thường hoặc nhiệt độ từ 5 đến 100C.

Chế phẩm sử dụng cho thí nghiệm trong phòng và ngoài nhà lưới đã qua bảo

quản 28 ngày và thí nghiệm ngoài đồng ruộng đã qua bảo quản 30 ngày ở điều kiện

bình thường.

2.4.3.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được

• Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang trong điều kiện

phòng thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí trong phòng thí nghiệm theo phương pháp Nghiên

cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (2000) [109] tại Trung tâm Đấu tranh

Sinh học. Tiến hành theo phương pháp nhúng lá vào dịch thuốc đã pha cho từng

loại thuốc, để ráo rồi thả sâu. Thực hiện với 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc

lại, mỗi lần nhắc lại với 50 sâu khoang tuổi 2, gồm các công thức (CT) sau:

CT 1: Chế phẩm NPV-1 2.109 OB/gam WP, nồng độ phun 0,1%

CT 2: Chế phẩm NPV-2 2.109 OB/gam WP (có 0,5% Boric), nồng độ 0,1%

CT 3: Sâu chết bệnh nghiền lọc, liều lượng 500 sâu/ha, nồng độ phun 5%

CT 4: Đối chứng nhúng nước lã

Theo dõi số sâu sống, sâu chết sau 7 ngày phun và tính hiệu lực gây chết sâu

khoang theo công thức Abbot (1925): C – T H(%) = ------------ x 100 C

Trong đó: H (%): Tỷ lệ sâu chết

C: Số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm

T là số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm

• Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang ngoài nhà lưới

Thí nghiệm tiến hành ngoài nhà lưới trong năm 2018 theo Tiêu chuẩn Việt

Nam TCVN 12561:2018 về Khảo nghiệm hiệu lực của thuốc bảo vệ thực vật của

Bộ Nông nghiệp và PTNT [110], với 4 công thức (CT), mỗi công thức nhắc lại 3

lần. Mỗi lần nhắc lại tiến hành trên 10 cây bắp cải 50 ngày tuổi được thả 5 sâu tuổi

2 cho mỗi cây. Sau 1 ngày để sâu phân bố ổn định trên cây thì tiến hành phun chế

phẩm 120ml/lần nhắc lại nước thuốc pha theo tỷ lệ cho mỗi công thức thí nghiệm.

CT1: Phun NPV-1 (không có Boric), liều lượng 500 gam/ha, nồng độ phun 0,1%

CT2: Phun NPV-2 (có 0,5% Boric), liều lượng 500 gam/ha, nồng độ phun 0,1%

CT3: Sâu chết bệnh nghiền, lọc với liều lượng 500 sâu/ha và nồng độ phun 5%

CT4: Đối chứng, phun nước lã

Theo dõi số sâu khoang sống trên 3 cây ngẫu nhiên của một lần nhắc lại vào

thời điểm trước phun và sau phun 7 ngày. Tính hiệu lực phòng trừ sâu khoang của

chế phẩm theo công thức Henderson – Tilton (1955):

Ta x Cb H (%) = (1 - ----------- ) x 100 Tb x Ca

Trong đó: H (%): Hiệu lực trừ sâu

Ta là số sâu sống ở công thức thí nghiệm sau xử lý

Tb là số sâu sống ở công thức thí nghiệm trước xử lý

Ca là số sâu sống ở công thức đối chứng sau xử lý

Cb là số sâu sống ở công thức đối chứng trước xử lý

• Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng

+ Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải

- Đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên bắp cải

Việc đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm trên bắp cải được

tiến hành theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 12561:2018 về Khảo nghiệm hiệu lực

của thuốc bảo vệ thực vật của Bộ Nông nghiệp và PTNT [110]. Thí nghiệm tiến

hành tại Vân Nội (Đông Anh- Hà Nội) và được bố trí theo khối ngẫu nhiên với 4

công thức, nhắc lại 3 lần, diện tích bắp cải sử dụng cho mỗi lần nhắc lại là 50m2 với

lượng 3 lít nước thuốc đã pha phun cho mỗi lần nhắc lại theo tỷ lệ cho từng công

thức thí nghiệm.

CT1: Sử dụng NPV1 (không bổ sung Boric) với liều lượng 500 gam/ha

CT2: Sử dụng NPV2 (có bổ sung 0,5% Boric) với liều lượng 500 gam/ha

CT3 (đối chứng 1): Sâu nghiền, lọc với lượng 500 sâu/ha, nồng độ phun 5%

CT4 (đối chứng 2): Phun nước lã

Theo dõi theo phương pháp 5 điểm chéo góc, tại mỗi ô nhắc lại theo dõi số

sâu khoang sống trên diện tích 1m2 bắp cải vào thời điểm trước phun, sau phun 5; 7

và 10 ngày. Tính hiệu lực phòng trừ sâu theo công thức Henderson- Tilton (1955).

- Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang với các liều lượng sử dụng chế

phẩm NPV-1 WP khác nhau trên bắp cải

Thí nghiệm tiến hành tại Vân Nội (Đông Anh- Hà Nội) trong vụ Đông Xuân

năm 2018 nhằm xác định liều lượng thích hợp khi sử dụng chế phẩm để phòng trừ

sâu khoang trên bắp cải theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 12561:2018 về Khảo

nghiệm hiệu lực của thuốc bảo vệ thực vật của Bộ Nông nghiệp và PTNT [110].

Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên với 5 công thức, mỗi công thức

nhắc lại 3 lần với diện tích mỗi ô thí nghiệm là 100 m2. Phun với lượng 6 lít nước

thuốc đã pha cho mỗi lần nhắc lại theo tỷ lệ thuốc pha cho từng công thức thí

nghiệm.

Công thức 1: Liều lượng 400g/ha

Công thức 2: Liều lượng 500g/ha

Công thức 3: Liều lượng 600g/ha

Công thức 4: Phun thuốc Aba Fax 3.6EC chứa hoạt chất Abamectin với liều

lượng 200 gam/ha theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

Công thức 5: Đối chứng không phun.

Theo dõi số sâu khoang sống trong mỗi ô nhắc lại theo phương pháp 5 điểm

chéo góc, mỗi điểm tiến hành điều tra 1m2 vào các thời điểm trước phun, sau phun

5; 7 và 10 ngày. Tính hiệu lực phòng trừ sâu của chế phẩm theo công thức

Henderson- Tilton (1955).

+ Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên đậu tương

- Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP với các

liều lượng sử dụng khác nhau trên đậu tương

Thí nghiệm trên đậu tương được tiến hành tại Mỹ Thành (Mỹ Đức- Hà Nội)

trong vụ Xuân Hè năm 2018 nhằm xác định liều lượng thích hợp khi sử dụng chế

phẩm để phòng trừ sâu khoang trên đậu tương. Thí nghiệm tiến hành theo Tiêu

chuẩn Việt Nam TCVN 12561:2018 về Khảo nghiệm hiệu lực của thuốc bảo vệ

thực vật của Bộ Nông nghiệp và PTNT [110]. Thí nghiệm được bố trí theo khối

ngẫu nhiên với 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, phun 6 lít nước thuốc đã

pha cho mỗi ô thí nghiệm với diện tích 100 m2.

Công thức 1: Liều lượng 400g/ha

Công thức 2: Liều lượng 500g/ha

Công thức 3: Liều lượng 600g/ha

Công thức 4: Phun thuốc Aba Fax 3.6EC chứa hoạt chất Abamectin với liều

lượng 200 gam/ha theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

Công thức 5: Đối chứng không phun.

Theo dõi số sâu sống trên đậu tương theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi

điểm điều tra 1m2 của mỗi ô nhắc lại vào thời điểm trước và sau phun 5; 7 và 10

ngày. Tính hiệu lực phòng trừ sâu của chế phẩm theo công thức Henderson – Tilton.

- Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên đậu

tương

Tiến hành theo phương pháp của Viện Bảo vệ thực vật (2000) [109] và Tiêu

chuẩn Việt Nam TCVN 12561:2018 về Khảo nghiệm hiệu lực của thuốc bảo vệ

thực vật của Bộ Nông nghiệp và PTNT [110]. Thí nghiệm diện rộng không nhắc lại,

trên đậu tương khi sâu non sâu khoang tuổi 2 phát sinh rộ vào giai đoạn cây chuẩn

bị ra hoa. tại Mỹ Thành (Mỹ Đức- Hà Nội) trong vụ Xuân Hè năm 2018 với 2 công

thức diện tích của mỗi công thức là 1ha. Cụ thể:

- Công thức 1: Phun NPV-1 với lượng 500 gam/ha và nồng độ phun 0,1%.

- Công thức 2: Đối chứng, phun thuốc hoá học Aba Fax 3.6EC với lượng

phun 200 gam/ha

Theo dõi số sâu khoang tương tự như với thí nghiệm trên bắp cải nêu trên,

bằng cách điều tra số sâu khoang sống theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi

điểm điều tra 1m2 vào các thời điểm: trước phun và sau phun 5, 7, 10 ngày. Tính

hiệu lực phòng trừ sâu khoang theo công thức Henderson – Tilton (1955).

2.4.4. Phương pháp tính toán, xử lý số liệu

- Xác định hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV trong phòng tính theo

công thức Abbott (1925), ở ngoài đồng theo công thức Henderson – Tilton (1955).

- Xử lý thống kê số liệu theo chương trình Irristat 4.0 và Statistix 8.2 trên

phần mềm Microsoft Excel.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn virus nhân đa diện (NPV) trên

sâu khoang

Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là đối tượng sâu hại phổ biến, phân bố

rộng ở nhiều nước thuộc khu vực nhiệt đới và á nhiệt đới. Đây là một loài sâu ăn

tạp, có thể sống và gây hại trên nhiều loại cây (Srivastava et al., 2018; Viện Bảo vệ

thực vật, 1976) [26, 110]. Trên đồng ruộng sâu khoang thường bị chết do xâm

nhiễm của nhiều tác nhân sinh học khác nhau, trong đó NPV (Nucleo Polyhedrosis

Virus) là tác nhân gây bệnh phát sinh khá phổ biến và có tiềm năng gây chết sâu

khoang từ 0,2- 1,9% (Viện Bảo vệ thực vật, 2006) [98]. Tuy nhiên, hoạt lực gây

chết sâu non sâu khoang của NPV khác nhau tùy theo điều kiện môi trường ở mỗi

vùng sinh thái, Như kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Hai et al., (2010), qua điều

tra thu thập NPV sâu khoang tại 5 tỉnh, xác định chỉ có 2 chủng phân lập từ nguồn

thu thập tại Trà Vinh và Sóc Trăng có hiệu lực trừ sâu khoang cao tới 94,5%.

Theo Farrar và Ridgway (1999) [32], Maeda et al. (1990) [73], Rohrmann và

George (2011) [5], NPV là nhóm virus lớn và được coi là những tác nhân sinh học

rất hữu ích trong phòng trừ sâu hại cây trồng vì có hiệu quả gây chết cao đối với các

loài côn trùng, chuyên tính theo ký chủ và hoàn toàn không lây nhiễm trên các loài

động vật có xương sống. Grzywacz et al. (1996) đã chỉ rõ nên khai thác sử dụng

chủng virus có nguồn gốc bản địa thường có hiệu lực phòng trừ sâu hại cao [12]. Vì

vậy, việc thu thập, phân lập và lựa chọn nguồn NPV có hoạt lực cao phục vụ phát

triển thuốc sinh học để phòng trừ sâu hại là vấn đề cần thiết.

3.1.1. Mức độ phổ biến và khả năng gây chết sâu khoang của virus nhân đa diện

(NPV) ngoài đồng ruộng

Ngoài đồng ruộng, sâu khoang thường bị chết do nhiều tác nhân gây bệnh và

những tác nhân này đóng vai trò quan trọng trong điều hoà số lượng của quần thể

sâu khoang. Theo Kitajima (1989) [6], các tác nhân ký sinh gây bệnh trên côn trùng

Cánh vảy (Lepidoptera) bao gồm các nhóm chính với các triệu chứng sau:

+ Nấm ký sinh: khi sâu chết nấm phát triển và lớp bào tử nấm màu trắng

vàng bao phủ trên bề mặt cơ thể sâu, như Beauveria, Metarhizium, v.v.

+ Vi khuẩn: gây chết sâu và làm cơ thể sâu khô tóp và có màu thâm đen.

+ Vi rút: biểu hiện đặc trưng nhận biết các cá thể sâu chết do NPV như cơ

thể sâu căng phồng, màu xám hoặc vàng nhạt và dễ vỡ khi bị va chạm. Đốt cuối

thân bám chặt vào lá, thân cây, đầu sâu chúc xuống nhả dịch virus màu vàng xuống

ruộng (Hình 3.1). Khi xử lý ngâm sâu chết bệnh do NPV trong nước, thể vùi màu

trắng đục sẽ hình thành và lắng đọng dưới đáy ống nghiệm.

Kết quả qua 2 đợt điều tra trên 4 loại cây trồng, gồm bắp cải, lạc, đậu tương

và khoai sọ vào tháng 10/2014 và 4/2015 tại Đông Anh, Mê Linh và Tiền Phong

(Hà Nội) cho thấy mật độ sâu khoang phát sinh cao nhất trên đậu tương, mật độ

trung bình tới 2,71 con/m2, trên lạc đạt 1,65, bắp cải: 1,52 con/m2 và thấp nhất trên

khoai sọ có mật độ 0,93 con/m2. Với mật độ sâu như vậy có thể gây thiệt hại đáng

kể đối với cây trồng và phát sinh với mật độ cao ở các lứa sâu tiếp theo.

Hình 3.1. Triệu chứng sâu non sâu khoang chết do NPV trên lạc và bắp cải Theo dõi trên các cá thể sâu khoang qua điều tra thu thập ngoài đồng ruộng

thì tỷ lệ sâu có thể vùi (sâu chết do NPV) cũng khác nhau, trong đó trên bắp cải có

tỷ lệ sâu chết do NPV cao nhất tới 21,67%, trên đậu tương đạt thấp nhất (14,22%),

trên lạc là 15,77% và trên khoai sọ đạt 16,82% (Bảng 3.1).

Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật trong những năm 1996-2000

thì mật độ sâu khoang đạt từ 3,6- 4,2 con/m2 tuỳ theo từng loại cây trồng, nhưng khi

sâu khoang phát sinh ở mật độ cao thì tỷ lệ sâu chết do NPV đạt từ 0,2- 1,5% trên

rau bắp cải, từ 0,9- 1,6% trên đậu tương và 0,3- 1,9% trên lạc. Tính chung tỷ lệ sâu

khoang chết do NPV chỉ đạt từ 10- 12,4% trong số các sâu chết do các bệnh khác

nhau, như: NPV, vi khuẩn, nấm có ích, v.v. (Viện Bảo vệ thực vật, 2001) [4].

Kết quả điều tra trong năm 2014- 2015 (Bảng 3.1) lại hoàn toàn ngược lại

với kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (2001) trong những năm 1996-2000,

mật độ sâu khoang phát sinh thấp hơn chỉ từ 0,93-2,71 con/m2 nhưng tỷ lệ sâu chết

do NPV trong số sâu chết bệnh lại cao hơn, đạt từ 14,22- 21,67% [4].

Có thể trong những năm gần đây, người dân sử dụng nhiều các loại thuốc

sinh học (như Bt, VBt, Bitadin, v.v.) hoặc thuốc hoá học có độ độc thấp theo qui

định chung (như các thuốc thuộc nhóm: Abamectin, Avermectin, v.v.), nên quần thể

các loài thiên địch phục hồi và phát triển giúp hạn chế mật độ sâu khoang phát sinh

và thúc đẩy các tác nhân sinh học có ích (như: NPV, nấm Beauveria, Metarhizium,

v.v.) phát triển đã gây chết sâu khoang và các sâu hại khác trên đồng ruộng.

Bảng 3.1. Mật độ sâu khoang phát sinh và tỷ lệ sâu chết do NPV

trên các cây trồng ngoài đồng ruộng (2014- 2015)

Cây trồng Mật độ sâu Số sâu theo Số sâu chết Tỷ lệ sâu chết TT điều tra (con/m2) dõi (con) do NPV (con) do NPV (%)

1 Bắp cải 1,52 300 65 21,67

2 Đậu tương 2,71 415 59 14,22

3 Lạc 1,65 260 41 15,77

4 Khoai sọ 0,93 220 37 16,82

Đánh giá về mức độ phổ biến của NPV trên đồng ruộng thông qua chỉ tiêu

độ bắt gặp, kết quả điều tra nêu trong bảng 3.2 cũng cho thấy, trên ruộng bắp cải độ

bắt gặp có sâu chết bệnh chiếm tới 46,67% số điểm điều tra, trong số đó có tới

31,11% số điểm sâu chết có thể vùi NPV hình thành với mức độ phổ biến là ++.

Với kết quả đánh giá trên đậu tương số liệu tương ứng là 53,33 và 37,78%, trên lạc

là 57,78 và 48,89% và trên khoai sọ có độ bắt gặp thấp nhất, chỉ có 36,67 và

26,67% số điểm điều tra, đồng thời cũng ở mức độ phổ biến là ++ (bảng 3.2).

Bảng 3.2. Mức độ phổ biến của NPV ký sinh sâu khoang

trên các cây trồng ngoài đồng ruộng (2014- 2105)

Số điểm Số điểm Độ bắt gặp Mức độ Cây trồng Sâu chết điều tra bắt gặp phổ biến (%)

Sâu chết bệnh 46,67 ++ 21 Bắp cải 45 Sâu chết có NPV 31,11 ++ 14

Sâu chết bệnh 53,33 +++ 24 Đậu tương 45 Sâu chết có NPV 37,78 ++ 17

Sâu chết bệnh 57,78 +++ 26 Lạc 45 Sâu chết có NPV 48,89 ++ 22

Thể vùi NPV

Sâu chết bệnh 36,67 ++ 11 30 Khoai sọ Sâu chết có NPV 26,67 ++ 8

Hình 3.2. Thể vùi NPV màu trắng đục hình thành và lắng đọng

dưới đáy ống nghiệm khi kiểm tra sâu khoang nhiễm NPV

Riêng số điểm bắt gặp sâu chết bệnh nói chung (gồm sâu chết do nấm, vi

khuẩn và NPV) ở mức độ phổ biến là +++ trên đậu tương và lạc. Chứng tỏ trên đậu

tương và lạc có độ bắt gặp sâu chết bệnh là khá cao, nhưng mức độ phổ biến sâu

chết do NPV cũng chỉ tương tự như trên các cây trồng khác ở mức ++ (Bảng 3.2).

Kết quả điều tra cho thấy sự hiện diện của NPV trên đồng ruộng khá phổ

biến và là tác nhân sinh học quan trọng góp phần hạn chế mật độ sâu khoang phát

sinh gây hại cây trồng ở nước ta. Trong những năm trước đây, Viện Bảo vệ thực vật

(2001, 2006) [4, 98], Hoàng Thị Việt et al. (2002) [102] và Nguyễn Văn Cảm et al.

(1996) [101] đã xác định có 10 loài NPV trên 10 loài sâu hại trên các cây trồng ở

khu vực phía Bắc và miền Đông Nam Bộ, trong đó có 4 loài NPV gây chết sâu

khoang (Spodoptera litura), sâu xanh (Heliothis armigera) hại rau màu, sâu đo xanh

hại đay (Anomis flava) và sâu róm hại thông (Dendrolimus punctatus). Điều đó đã

minh chứng sự tồn tại cũng như vai trò của NPV trong tự nhiên và tiềm năng có thể

khai thác, phát triển NPV thành chế phẩm sinh học phục vụ việc quản lý sâu hại

trên cây trồng như các nhà khoa học trong và ngoài nước đã khẳng định.

3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao

• Phân lập chủng NPV và đánh giá hoạt lực gây chết sâu khoang

Tác giả Grzywacz et al. (2008) chỉ rõ rằng khi phát triển sinh khối NPV để

phòng trừ sâu hại, khâu đầu tiên là phải phân lập, tuyển chọn được chủng có hoạt

tính cao, ổn định và tốt nhất nên phân lập từ sâu chết NPV ngoài tự nhiên của vùng

nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sau này [34]. Khattab (2013) đã thực hiện qui trình

phân lập tuyển chọn NPV của sâu xanh da láng Spodoptera exigua (Lepidoptera:

Noctuidae) trên cơ sở lây nhiễm NPV trên sâu non, khi sâu chết cho từng cá thể sâu

chết riêng rẽ vào ống nghiệm và ngâm trong nước. Khi thể vùi giải phóng hết thì

tiến hành lọc ly tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 20 phút để tinh sạch thể vùi.

Sau đó đếm số lượng thể vùi và xác định tỷ lệ sâu chết. Các bước phân lập tiếp theo

được lặp lại như bước đầu tiên [112].

Từ các mẫu thể vùi hình thành từ sâu bị bệnh thu được qua điều tra, thu thập

trong năm 2015 trên bắp cải và lạc tại Đông Anh, Mê Linh (Hà Nội), lạc và khoai

sọ tại Yên Phong (Bắc Ninh). Qua lây nhiễm lại trên sâu khoang khoẻ, sạch bệnh,

các cá thể sâu chết đều có triệu chứng sâu chết treo mình ở mặt dưới lá, toàn thân

mọng nước, xử lý trong phòng thí nghiệm và lựa chọn các cá thể sâu chết bệnh có

khối lượng thể vùi hình thành lớn. Kết quả đã xác định các mẫu thu trên ruộng bắp

cải, lạc và cây khoai sọ để phân lập tuyển chọn chủng có tiềm năng.

Sử dụng các nguồn thể vùi tinh phân lập được tiến hành lây nhiễm trên sâu

khoẻ để đánh giá hiệu quả diệt sâu và khả năng hình thành thể vùi. Kết quả (Bảng

3.3) cho thấy sau 3 ngày lây nhiễm, hiệu lực gây chết sâu khoang đạt thấp chỉ từ

14,29 đến 30,61%, đến thời điểm sau 7 ngày lây nhiễm vi rút thì hiệu lực gây chết

sâu khoang ở tất cả các nguồn NPV tăng lên rõ rệt đạt từ 22,45 đến 55,56%. Vào

thời điểm 10 ngày sau nhiễm hiệu lực gây chết sâu khoang của các nguồn đạt cao

nhất từ 55,0 – 80,0% (Bảng 3.3).

Trong số các nguồn vi rút từ sâu khoang chết trên 3 loại cây trồng, nhận thấy

nguồn NPV trên bắp cải có 3 mẫu NPV có hoạt lực gây chết sâu cao là NPV1.3,

NPV1.5 và NPV1.6 với tỷ lệ sâu chết tương ứng đạt 80,0; 77,5 và 75,0% và khả

năng hình thành thể vùi tương ứng đạt 2,64; 1,80 và 1,95 x 108 OB/10 sâu. Nguồn

NPV trên lạc có 2 mẫu NPV có tiềm năng là NPV2.1 và NPV2.2, hiệu lực tương

ứng đạt 77,50% và 77,50% và hàm lượng thể vùi đạt 1,87 và 1,80 x 108 OB/10 sâu.

Còn với nguồn NPV trên khoai sọ, chỉ xác định có 1 mẫu có tiềm năng là NPV3.2

với hiệu lực gây chết sâu đạt 77,50% và khả năng hình thành thể vùi đạt 1,75 x 108

OB/10 sâu sau phân lập lần 1. Trong khi đó, hiệu lực gây chết sâu khoang của

nguồn NPV từ quĩ gen chỉ đạt cao nhất 48,79% ở thời điểm 10 ngày sau xử lý và số

lượng thể vùi chỉ đạt 1,02 x 107 OB/10 sâu (Bảng 3.3). Tuy nhiên, với tỷ lệ sâu chết

do NPV và mức độ phổ biến của chúng trên lạc và đậu tương có xu hướng gần

tương tự nhau, vì vậy cần tiếp tục phân lập, đánh giá đối với nguồn NPV trên đậu

tương để có thể tuyển chọn được chủng NPV có tiềm năng cao.

Kết quả trên cho thấy giữa các nguồn NPV và giữa các cá thể sâu chết bệnh

sau khi phân lập lần 1 có hiệu quả gây chết sâu khoang và tiềm năng hình thành thể

vùi rất khác nhau. Kết quả thí nghiệm hoàn toàn phù hợp với kết quả công bố của

Trần Văn Hai et al. (2010) [104]; Farrar và Ridgway (1999) [32] và Grzywacz et

al. (1996) [12] đã chỉ rõ sự khác nhau về hiệu lực trừ sâu khoang của NPV có

nguồn gốc thu thập khác nhau.

Theo Grzywacz et al. (1996) [12]; Sajap et al., (2000) [14]; Senthil Kumar et

al., (2005) [113]; Sireesha et al., (2010) [114], chủng NPV được tuyển chọn phải

đảm bảo vừa có độc tính cao, vừa có khả năng sinh thể vùi lớn mới có ý nghĩa trong

phát triển chế phẩm sinh học vì hiệu quả diệt sâu và tiềm năng ứng dụng của chế

phẩm NPV tạo ra tuỳ thuộc rất nhiều vào 2 chỉ tiêu này.

Bảng 3.3. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang

ở các ngày sau lây nhiễm của các chủng NPV sau phân lập lần 1

Hiệu quả (%) trừ sâu Số thể vùi

ở các ngày sau lây nhiễm Chủng NPV

3 ngày 7 ngày 10 ngày

NPV1.1 14,29 37,78 62,50

NPV1.2 30,61 33,33 60,00

NPV1.3 18,37 30,61 80,00 Bắp cải NPV1.4 14,29 53,33 62,50

NPV1.5 20,41 55,56 77,50

NPV1.6 26,53 44,44 75,00

NPV2.1 18,37 51,11 77,50

NPV2.2 14,29 55,56 77,50 Lạc NPV2.3 20,41 33,33 55,00

NPV2.4 14,29 30,61 60,00

NPV3.1 30,61 40,00 62,50

Khoai sọ NPV3.2 14,29 22,45 77,50

NPV3.3 22,45 46,67 62,50

QG.NPV ĐC 1 20,12 34,26 48,79

Sâu khoẻ ĐC 2 hình thành (OB/10 sâu) 1,50 x 108 1,40 x 108 2,64 x 108 1,00 x 108 1,80 x 108 1,95 x 108 1,87 x 108 1,80 x 108 1,56 x 108 1,55 x 108 1,60 x 108 1,75 x 108 1,50 x 108 1,02 x 107 - - - -

Ghi chú:

NSN: Ngày sau nhiễm, QG.NPV: Nguồn NPV từ quĩ gen ĐC 2: Đối chứng sâu khoẻ được xử lý bằng nước cất

Hình 3.3: Lây nhiễm NPV trên sâu non sâu khoang trong phòng thí nghiệm

Tiếp tục tiến hành phân lập các chủng NPV điển hình, gồm 3 chủng từ NPV-

1 trên bắp cải, 2 chủng trên lạc và 1 chủng trên khoai sọ, qua đánh giá hiệu lực trừ

sâu trên sâu non sạch bệnh được nuôi trong phòng nhằm lựa chọn được chủng NPV

có hoạt lực trừ sâu cao và có khả năng sinh thể vùi lớn. Kết quả tuyển chọn sau

phân lập lần 2 xác định được 10 chủng có nguồn gốc từ NPV1 (bắp cải), 10 chủng

có nguồn gốc từ NPV2 (lạc) và 3 chủng có nguồn gốc từ NPV-3 (khoai sọ).

Đánh giá lại hiệu quả gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi đối với

các chủng đã lựa chọn đã xác định sau phân lập lần 2, kết quả (Bảng 3.4) cho thấy:

Có 5 chủng phân lập có nguồn gốc từ NPV1 là NPV1.3.1; NPV1.5.1;

NPV1.5.2; NPV1.6.1 và NPV1.6.2 với khả năng sinh thể vùi đạt từ 1,75- 2,59 x 108

OB/10sâu và tỷ lệ trừ sâu khoang từ 70,0- 77,5%. Nổi bật nhất là chủng NPV1.3.1

đạt hiệu quả trừ sâu 77,7% và thể vùi đạt 2,59 x 108 OB/10 sâu.

Với nguồn phân lập từ NPV2 đã xác định có 5 chủng có gồm: NPV2.1.1;

NPV2.1.2; NPV2.1.10; NPV2.2.1 và NPV2.2.2 với khả năng sinh thể vùi từ 1,8- 2,5

x 108 OB/10sâu và tỷ lệ trừ sâu khoang đạt từ 71,42- 77,14%. Trong số đó, nổi bật

nhất là chủng NPV2.1.1 có khả năng sinh thể vùi tới 2,5 x 108 OB/10sâu và hiệu

quả gây chết sâu tới 77,14%.

Trong khi đó, với các nguồn phân lập từ NPV3 trên khoai sọ, khi phân lập

lần 1 đã xác định được 1 chủng có hoạt lực cao là NPV3.2, nhưng sau khi phân lập

lần 2 chỉ xác định được 1 chủng điển hình có hoạt lực cao là NPV3.1.1 với khả

năng sinh thể vùi đạt 1,9 x 108 OB/10 sâu và tỷ lệ trừ sâu đạt tới 74,29%. Hai chủng

còn lại là NPV3.1.7 và NPV3.1.9 có khả năng sinh thể vùi đạt tương ứng là 1,54 và

1,65 x 108 OB/10sâu và hiệu quả trừ sâu chỉ đạt 51,43 và 42,86% (tương ứng).

Kết quả thí nghiệm (Bảng 3.4) đã cho thấy sự đa dạng các chủng NPV sâu

khoang thể hiện rõ qua mức độ rất khác nhau về hiệu lực trừ sâu và khả năng sinh

thể vùi của các chủng sau khi phân lập. Kết quả thu được cũng hoàn toàn phù hợp

với các nhận xét và kết quả công bố của Trần Văn Hai et al. (2010) [104] khi đánh

giá hiệu lực trừ sâu khoang và số thể vùi hình thành của các chủng NPV qua phân

lập từ các nguồn NPV thu từ 5 tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, cũng như kết quả

công bố của Farrar và Ridgway (1999) [32]; Grywacz et al. (1996) [12], Senthil

Kumar et al. (2005) [112] và Sireesha et al. (2010) [113].

Bảng 3.4. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang

sau lây nhiễm của các chủng NPV sau phân lập lần 2

Nguồn phân lập Nguồn phân lập Nguồn phân lập

Tỷ lệ sâu

Chủng

chết (%)

từ NPV1 (trên bắp cải) từ NPV2 (trên lạc) từ NPV3 (trên khoai sọ)

Số thể vùi hình thành (x108OB /10sâu) 2,59

Số thể vùi hình thành (x108OB /10sâu) 2,50

NPV1.3.1

75,00 NPV2.1.1

77,14 NPV3.1.1

Số thể vùi hình thành (x108OB /10sâu) 1,90

74,29

NPV1.5.1

1,90

70,00 NPV2.1.2

1,80

71,43 NPV3.1.7

1,54

51,43

NPV1.5.2

2,00

70,00 NPV2.1.5

1,75

57,14 NPV3.1.9

1,65

42,86

NPV1.5.3

1,60

55,00 NPV2.1.6

1,58

51,43

NPV1.5.5

1,60

52,50 NPV2.1.9

2,25

42,86

NPV1.5.6

1,50

50,00 NPV2.1.10 2,50

74,29

NPV1.5.7

1,50

42,50 NPV2.1.11 1,40

57,14

NPV1.6.1

1,90

77,50 NPV2.2.1

1,85

71,42

NPV1.6.2

1,75

70,00 NPV2.2.2

2,00

74,26

NPV1.6.3

1,60

57,50 NPV2.2.7

1,50

57,14

1,10

35,02

1,10

35,02

ĐC 1 QG.NPV ĐC 2 ĐC 1 QG.NPV ĐC 2 - -

ĐC 1 QG.NPV ĐC 2 Ghi chú: ĐC 1 - QG.NPV: Nguồn NPV từ quĩ gen.

ĐC 2: Đối chứng sâu khoẻ được xử lý bằng nước cất

Với phương pháp tiến hành thí nghiệm phân lập tương tự như đã nêu với lần

phân lập lần 1 và 2, sau chu kỳ phân lập lần 3 và tiếp tục phân lập lần 4 đã chọn lọc

được 3 chủng NPV có tiềm năng cao, gồm các chủng mang mã số: NPV1.3.1.1.2

(ký hiệu: TL.1a); NPV2.1.1.1.3 (ký hiệu: TL.2a) và NPV3.1.1.1.3 (ký hiệu: TL3a)

có khả năng sinh thể vùi tương ứng đạt 2,9; 1,8 và 2,8 x 108 OB/10sâu, hiệu lực trừ

sâu khoang của các chủng đạt tương ứng 80,09; 75,56 và 80,00% (Bảng 3.5).

Trong khi đó, hiệu lực trừ sâu khoang của chủng NPV lấy từ bộ sưu tập quĩ

gen (mã hiệu: QG.NPV) chỉ đạt 36,01% và khả năng hình thành thể vùi cũng chỉ đạt

1,1 x 107 OB/10 sâu. Chủng QG.NPV trong thí nghiệm có hoạt lực thấp, có thể

chủng virus này không được phục tráng định kỳ hàng năm trong 3 năm gần đây nên

hoạt lực của nó bị suy giảm, mặc dù khi được lựa chọn bảo quản thì hiệu quả trừ

sâu khoang cũng đạt tới 79,6% (Bảng 3.5).

Cả 3 chủng vi rút NPV sau khi đã được phân lập, đánh giá và nhân sinh khối

thể vùi đã được bổ sung lưu giữ trong bộ sưu tập quĩ gen vi sinh vật có ích của Viện

Bảo vệ thực vật phục vụ nghiên cứu và phát triển thuốc sinh học sau này.

Bảng 3.5. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang

của các chủng NPV điển hình sau phân lập lần thứ 4

TT Chủng lựa chọn Ký hiệu Số thể vùi hình thành Hiệu quả

sau phân lập (OB/10 sâu) trừ sâu (%) chủng

1 NPV1.3.1.1.2 TL.1a 2,9 x 108 80,09

2 NPV2.1.1.1.3 TL.2a 1,8 x 108 85,56

3 NPV3.1.1.1.3 TL.3a 2,8 x 108 80,00

4 Đối chứng QG.NPV 1,1 x 107 36,01

Ghi chú: OB: thể vùi; QG.NPV: Nguồn NPV từ quĩ gen.

• Hiệu lực gây chết sâu khoang của các chủng NPV sau tuyển chọn

Một thí nghiệm đánh giá lại nhằm khẳng định tính ổn định về khả năng gây

chết sâu khoang và hàm lượng thể vùi hình thành của các chủng NPV sau khi phân

lập đã được lựa chọn. Kết quả cho thấy chủng TL.1a vẫn thể hiện tính ổn định với

tỷ lệ gây chết sâu đạt tới 80,0% sau 10 ngày lây nhiễm và số lượng thể vùi hình

thành vẫn ổn định đạt mức cao nhất, tới 2,0 x 108 OB/10 sâu (Bảng 3.6).

Trong khi đó, số thể vùi hình thành của chủng TL.2a đạt thấp nhất chỉ đạt

1,60 x 108 OB/10 sâu và hiệu lực gây chết sâu khoang chỉ đạt 68,33%. So với kết

quả đánh giá sau phân lập lần 4 (1,8 x 108 OB/10 sâu và 85,56%), qua đánh giá lại

thì hoạt lực của chủng TL.2a có sự thay đổi đáng kể. Điều này cũng diễn ra tương

tự với chủng TL.3a, số thể vùi hình thành của chủng TL.3a đạt 2,8 x 108 OB/10 sâu

và hiệu lực trừ sâu chỉ đạt 73,33%, thấp hơn một cách đáng kể so với kết quả đánh

giá sau phân lập lần 4 (2,8 x 108 OB/10 sâu và 80,0%). Điều đó chứng tỏ 2 chủng

NPV này vẫn chưa thật sự ổn định về khả năng gây chết sâu khoang và hình thành

thể vùi qua các lần phân lập (Bảng 3.6).

Bảng 3.6. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang

của các chủng NPV đã được lựa chọn

Công Số thể vùi Số sâu Số thể vùi Hiệu quả thức lây nhiễm lây nhiễm hình thành trừ sâu (%) (x 108 OB/ml) (con) (x 108 OB/10 sâu)

TL.1a 1,50 300 2,60 80,00 a

TL.2a 1,50 300 1,60 68,33 c

TL.3a 1,50 300 1,85 73,33 b

Đ/C Nước cất 300 - -

CV% - - 0.71

LSD 0,05 - - 1,20

Ghi chú: Đ/C: Đối chứng xử lý bằng nước cất; OB: Thể vùi. Trong cùng cột,

các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05.

Kết quả thí nghiệm đã chứng tỏ chủng TL.1a có hoạt lực ổn định qua các lần

đánh giá phân lập và có khả năng sinh thể vùi cao nên được lựa chọn sử dụng trong

các thí nghiệm nghiên cứu lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào, cũng

như nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước. Hai chủng còn lại

TL.2a và TL.3a thể hiện hoạt lực không ổn định và cần tiếp tục phân lập, để có

được chủng có hoạt lực cao và ổn định hơn.

Kết quả ảnh chụp thể vùi (OB) dưới kính hiển vi với độ phóng đại 600X cho

thấy rõ (Hỉnh 3.4), thể vùi (OB) có hình dạng hình khối không đều và nổi rõ các thể

hoạt động ở bên trong, có kích thước 150 x 350nm. Thể hoạt động (virion) của NPV

dưới hiển vi điện tử (TEM) tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (Hà Nội), thể hoạt

động (virion) với độ phóng đại 25.000X của chủng TL.1a có dạng hình trụ với kích

thước 44,7 nm x 341nm. Kết quả quan sát được cũng tương tự như với kết quả đã

công bố của các tác giả Grzywacz et al., (1996) [12] và Rohrmann và George

(2011) [5] là kích thước thể vùi (OB) thường nằm trong khoảng 240- 400nm và của

Virion

thể hoạt động (virion) từ 40- 70 x 320- 450nm.

B

A

Hình 3.4. Thể thể vùi (OB) và thể hoạt động (virion) của chủng TL.1a

A: Thể vùi (OB) và thể hoạt động với độ phóng đại 600X

B: Thể virus hoạt động (virion) với độ phóng đại 25.000X

3.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên

tế bào nhân nuôi

Sâu khoang (Spodoptera litura Walk.- Noctuidae: Lepidoptera) là đối tượng

sâu hại quan trọng, gây hại trên nhiều loại cây trồng nông nghiệp, các chế phẩm

sinh học sử dụng tác nhân virus nhân đa diện- NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus)

thường có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu khoang (Hoàng Thị Việt, Nguyễn Văn

Cảm et al. 2002) [102]. Tuy nhiên, NPV chỉ có thể tồn tại, phát triển sinh khối vi rút

phải thực hiện trên cơ thể sâu sống hoặc trên các mô, tế bào sống của loài sâu hại là

ký chủ của chúng (Arayya et al., 2013) [13]. Lâu nay, việc sản xuất NPV vẫn tiến

hành bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau đó nhiễm vi rút NPV của loài sâu

tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử dụng. Theo cách này, để nuôi được số lượng

lớn một loài sâu hại rất khó thực hiện trên qui mô công nghiệp với chất lượng ổn

định. Còn việc phát triển sinh khối NPV trên tế bào côn trùng nuôi nhân ở nước ta

chưa được tiến hành. Điều đó cho thấy việc nghiên cứu nuôi nhân sinh khối tế bào

sâu khoang phục vụ sản xuất chế phẩm NPV là vấn đề cần thiết.

Như các tác giả Elanchezyan (2009) [11], Granados et al. (2007) [9], Lynn

(2002) [30], Sudeep et al. (2005) [42] đã chỉ rõ khi nhân nuôi tế bào của một loài

côn trùng cần thiết phải có sự nghiên cứu chi tiết để xác định rõ các yếu tố thích

hợp cho sự phát triển của tế bào, gồm: chủng loại môi trường, huyết thanh bổ sung,

nhiệt độ và pH của môi trường nhân nuôi, v.v.

3.2.1. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang

3.2.1.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang

• Xác định môi trường thích hợp nuôi nhân tế bào

Theo Freshney (1987), môi trường nuôi nhân là yếu tố quan trọng nhất trong

việc nuôi cấy nhân tế bào côn trùng, giúp cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết

cho sự phát triển của tế bào, yếu tố tăng trưởng và hoocmon kích thích tăng trưởng

tế bào, cũng như việc điều chỉnh độ pH và áp suất thẩm thấu của môi trường [44].

Từ nguồn tế bào đã được nuôi nhân từ thực liệu ban đầu đã được chuẩn bị

dưới dạng huyền phù phục vụ các thí nghiệm. Một thí nghiệm đánh giá khả năng

nhân sinh khối của tế bào sâu khoang trên các môi trường nuôi nhân khác nhau

được tiến hành trong phòng thí nghiệm vào tháng 4/2015.

Kết quả nêu trong bảng 3.7 cho thấy ở tất cả 4 loại môi trường nhân nuôi thì

mật độ tế bào đạt được ở môi trường Excell 420- 14419C vào thời điểm sau 2 ngày

nuôi nhân đạt cao nhất, tới 1,394 x 1010 tế bào/ml, còn trên các loại môi trường khác

cho mật độ tế bào đạt từ 1,083- 1,130 x 1010 tế bào/ml. Tuy nhiên, qua phân tích

thống kê thì mật độ tế bào thu được không có sự sai khác giữa 4 loại môi trường

nuôi nhân.

Đến thời điểm 6 ngày sau nuôi nhân, qua đánh giá có 2 môi trường cho sinh

khối có mật độ tế bào cao là Excell 420-14419C, Schneider S9895 và TNM-FH

T3285. Trong số đó, môi trường Excell 420-14419C có mật độ tế bào hình thành

cao nhất tới 1,884 x 1010 tế bào/ml. Tiếp đến là môi trường Schneider S9895 và

TNM-FH T3285 với mật độ tế bào đạt tương ứng 1,606 x 1010 và 1,414 x 1010 tế

bào/ml, còn môi trường TC-100 T3160 mật độ tế bào tăng rất ít so với thời điểm 2

ngày sau nuôi nhân (1,162 x 1010 tế bào/ml).

Kết quả thí nghiệm đã chứng tỏ môi trường Excell 420-14419C thích hợp

nhất đối với phát triển sinh khối tế bào sâu khoang. Mặc dù sau 10 ngày nhân nuôi

ở môi trường này, mật độ tế bào hình thành có giảm, nhưng vẫn đạt tới mật độ

1,630 x 1010 tế bào/ml.

Còn môi trường Schneider S9895 và TC-100 T3160 có xu hướng duy trì khả

năng phát triển sinh khối một cách khá ổn định. Sau 2 ngày nuôi nhân, mật độ tế

bào đạt tương ứng là 1,130 x 1010 và 1,127 x 1010 tế bào/ml. Sau 6 ngày nhân nuôi,

mật độ tế bào đạt tương ứng là 1,606 x 1010 và 1,414 x 1010 tế bào/ml

Bảng 3.7. Mật độ tế bào sâu khoang ở các ngày sau nuôi nhân

trên các môi trường khác nhau

Mật độ tế bào sâu khoang (x 1010 tế bào/ml) Môi trường ở các ngày sau nuôi nhân nuôi STT nhân nuôi 2 ngày 6 ngày 10 ngày

1 Excell 420- 14419C 1,394 a 1,884 a 1,630 a

2 Schneider S9895 1,130 a 1,606 b 1,171 a

3 TNM-FH T3285 1,083 a 1,414 ab 1,131 a

4 TC-100 T3160 1,127 a 1,162 b 1,152 a

CV (%) 3,690 4,922 2,570

0,251 0,546 0,287 LSD0,05

Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có

ý nghĩa ở độ tin cậy P < 0,05

Đến 10 ngày sau nuôi nhân, ở môi trường Excell 420-14419C mật độ tế bào

vẫn đạt tới 1,630 x 1010 tế bào/ml, còn Schneider S9895 vẫn duy trì 1,171 x 1010 tế

bào/ml, với môi trường TNM-FH T3285 đạt mật độ 1,131 x 1010 tế bào/ml và ở môi

trường TC-100 T3160 vẫn đạt tới 1,152 x 1010 tế bào/ml và (Bảng 3.7).

Từ kết quả thí nghiệm xác định môi trường Excell 420-14419C thích hợp

nhất để nuôi nhân tế bào sâu khoang và thu hoạch tế bào tốt nhất vào thời điểm sau

6 ngày nhân nuôi. Mặc dù tế bào sâu khoang vẫn phát triển sinh khối trong môi

trường Schneider S9895, TNM-FH T3285, TC-100 T3160 và đạt từ 1,162- 1,606 x

1010 tế bào/ml, nhưng giá mua các loại môi trường này cũng gần bằng giá mua

Excell 420-14419C. Do vậy, nên sử dụng môi trường Excell 420-14419C để nhân

sinh khối tế bào sẽ cho hiệu quả cao.

Hình 3.5: Thí nghiệm xác định môi trường nuôi nhân tế bào thích hợp

A: Ban đầu; B: Sau nuôi nhân 3 ngày

• Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi nhân tế bào

Theo Lynn et al. (2005) [56], nhiệt độ thích hợp để nuôi nhân tế bào của

nhiều loài côn trùng trong khoảng 26- 280C và đó cũng là khoảng nhiệt độ thích hợp

đối với nhiều loài côn trùng sinh sống trong tự nhiên. Kết quả các nghiên cứu đã

công bố thì việc nuôi nhân tế bào côn trùng thích hợp ở nhiệt độ 27- 280C giúp cho

sự tăng trưởng sinh khối đạt mức tối ưu, chúng phát triển chậm hơn ở nhiệt độ thấp

< 270C hoặc cao hơn 300C. Trên 300C, khả năng sống sót của tế bào côn trùng giảm

đáng kể và các tế bào không thể phục hồi việc phân chia ngay cả khi đưa nhiệt độ

về lại 280C [10, 44, 45, 46, 50, 53, ...]. Trên cơ sở đó, thí nghiệm tìm hiểu nhiệt độ

thích hợp nhân sinh khối sâu khoang được tiến hành với 4 mức nhiệt độ nuôi nhân

khác nhau trong khoảng từ 24- 290C.

Kết quả trình bày ở bảng 3.8 cho thấy với mật độ tế bào ban đầu đưa vào thí

nghiệm là 0,5 x 1010 tế bào/ml được nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau từ

240C đến 290C thì sau 2 ngày nhân nuôi mật độ tế bào đạt từ 0,628 – 1,496 x 1010 tế

bào/ml. Tại nhiệt độ 26 và 280C, mật độ tế bào đạt cao nhất tới 1,496 và 1,463 x

1010 tế bào/ml (tương ứng). Đến thời điểm sau 4 ngày nhân nuôi, mật độ tế bào lại

có biểu hiện giảm đi, tương ứng với mức nhiêt độ 24 và 260C là 0,576 và 0,944 x

1010 tế bào/ml và ở nhiệt độ 290C cũng chỉ đạt 0,78 x 1010 tế bào/ml, riêng ở nhiệt

độ 280C vẫn đạt mức cao 1,165 x 1010 tế bào/ml.

Sau 6 ngày nhân nuôi, hàm lượng tế bào tăng lên và đạt cao nhất trong số các

ngày theo dõi ở tất cả các công thức nhiệt độ, đạt tới 2,141 x 1010 tế bào/ml ở nhiệt

độ 240C và 2,341 x 1010 tế bào/ml ở nhiệt độ 290C. Trong số đó, ở nhiệt độ 260C đạt

2,954 x 1010 tế bào/ml. Riêng công thức nhiệt độ 280C, mật độ tế bào vẫn đạt mức

cao nhất, tới 3,708 x 1010 tế bào/ml.

Đến thời điểm sau 8 ngày nhân nuôi, mật độ tế bào trong sinh khối đều giảm,

ở nhiệt độ 240C mật độ tế bào còn 1,645 x 1010 tế bào/ml và ở nhiệt độ 290C mật độ

tế bào chỉ đạt 1,80 x 1010 tế bào/ml. Trong khi đó, ở mức nhiệt độ 260C đạt 2,258 x

1010 tế bào/ml, nhưng ở 280C mật độ tế bào vẫn duy trì ở mức cao tới 2,325 x 1010

tế bào/ml (tương ứng).

Bảng 3.8. Mật độ tế bào sâu khoang

khi nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau

Mật độ tế bào (x 1010 tế bào/ml) ở các ngày sau nuôi nhân nuôi

Nhiệt độ (0C) Ban đầu 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày

0,628 b 0,576 c 2,141 b 1,645 b 0,5 24

1,463 a 0,944 b 2,954 ab 2,258 a 0,5 26

1,496 a 1,165 a 3,708 a 2,325 a 0,5 28

1,039 ab 0,780 bc 2,341 b 1,800 b 0,5 29

6,510 4,728 2,593 2,767 CV (%)

0,895 0,938 1,430 0,829 LSD0,05

Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác

có ý nghĩa ở độ tin cậy P < 0,05

Hình 3.6. Tế bào sâu khoang sau 6 ngày nuôi nhân ở các mức

nhiệt độ khác nhau. A: 240C; B: 260C, C: 280C và D: 290C

Như vậy, khi nhân nuôi tế bào ở nhiệt độ 280C mật độ tế bào đạt cao nhất tới

3,708 x 1010 tế bào/ml sau 6 ngày. Đến 8 ngày sau nhân nuôi, hàm lượng tế bào tuy

có giảm đi song vẫn đạt tới 2,325 x 1010 tế bào/ml. Điều đó cho thấy nhiệt độ 280C

là nhiệt độ phù hợp cho việc nhân nuôi tế bào sâu khoang và sinh khối tế bào đạt

cao nhất sau 6 ngày nhân nuôi.

• Điều kiện pH môi trường thích hợp nhân nuôi tế bào

Theo Lynn (2002) [30] thì quá trình phát triển sinh khối của tế bào côn trùng

còn bị ảnh hưởng rõ rệt của pH môi trường nuôi nhân. Jakubowska et al. (2009)

khuyến cáo, pH của hemolymph côn trùng thường từ 6,4- 7,5, nên việc môi trường

nuôi nhân tế bào cần giữ pH trong khoảng giá trị này.

Tìm hiểu điều kiện pH thích hợp đối với việc nuôi nhân tế bào sâu khoang,

qua thí nghiệm được tiến hành với 6 mức pH của môi trường nuôi nhân khác nhau.

Kết quả theo dõi sau 2 ngày nuôi nhân ở các mức pH là 6,0, 6,2 và 6,4, mật độ tế

bào đạt được khá thấp, chỉ đạt tương ứng là 1,091, 1,329 và 1,12 x 1010 tế bào/ml và

ở pH 6,6 và 7,0 mật độ đạt tương ứng 1,404 và 1,237 x 1010 tế bào/ml. Riêng ở điều

kiện pH là 6,8 mật độ tế bào đạt cao nhất, tới 1,504 x 1010 tế bào/ml. (Bảng 3.9).

Đến 4 ngày sau nuôi nhân, mật độ tế bào thu được cũng không có sự thay đổi

nhiều và có phần giảm đi chút ít, mật độ tế bào tương ứng với các mức pH 6,0, 6,2

và 6,4 là 1,008, 1,133 và 1,021 x 1010 tế bào/ml. Ở các mức pH 6,6 và 7,0 mật độtế

bào trong sinh khối đạt 1,245 và 0,983 x 1010 tế bào/ml. Riêng ở pH môi trường là

6,8, mật độ tuy có giảm nhưng vẫn đạt mức cao nhất trong số các mức pH thí

nghiệm, tới 1,312 x 1010 tế bào/ml.

Sau 6 ngày nhân nuôi, mật độ tế bào đạt mức cao nhất ở tất cả các mức pH

trong các thời điểm sau nhân nuôi, nhưng có sự khác nhau rõ rệt giữa các công thức

thí nghiệm. Khi nhân nuôi ở điều kiện pH là 6,0, 6,2 và 6,4 mật độ tế bào chỉ đạt

1,55, 1,591 và 1,233 x 1010 tế bào/ml (tương ứng). Tương ứng với điều kiện pH là

6,6 và 7,0 mật độ tế bào đạt 1,954 và 1,766 x 1010 tế bào/ml. Riêng công thức pH

6,8 mât độ tế bào vẫn đạt mức cao nhất trong số các công thức thí nghiệm, tới 2,125

x 1010 tế bào/ml (Bảng 3.9).

Bảng 3.9. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân

ở các mức pH môi trường khác nhau

Mật độ tế bào (x 1010 tế bào/ml) ở các ngày sau nhân nuôi Mức pH

môi trường Ban đầu 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày

6,0 0,5 1,091 d 1,008 b 1,550 c 0,766 bc

6,2 0,5 1,120 d 1,012 b 1,233 d 0,633 c

6,4 0,5 1,329 bc 1,133 ab 1,591 c 0,883 b

6,6 0,5 1,404 ab 1,245 a 1,954 ab 1,125 a

6,8 0,5 1,504 a 1,312 a 2,125 a 1,241 a

7,0 0,5 1,237 bc 0,983 b 1,766 bc 0,867 b

CV (%) 3,892 2,977 4,021 4,395

0,324 0,386 0,318 0,297 LSD0,05

Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác

có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Vào thời điểm sau 8 ngày nuôi nhân, mật độ tế bào đều giảm rõ rệt so với mât

độ tế bào ở thời điểm 6 ngày. Tương ứng với các mức pH là 6,0, 6,2 và 6,4 thì mật

độ tế bào chỉ đạt 0,766, 0,633 và 0,883 x 1010 tế bào/ml, còn ở mức pH là 6,6 và 7,0

mật độ tế bào cũng chỉ đạt tương ứng là 1,125 và 0,867 x 1010 tế bào/ml. Riêng với

điều kiện pH là 6,8 mật độ tế bào tuy giảm nhưng vẫn đạt mức cao nhất so với các

mức pH còn lại, tới 1,241 x 1010 tế bào/ml (Bảng 3.9).

Kết quả thí nghiệm đã cho thấy điều kiện pH thích hợp cho tế bào sâu khoang

phát triển sinh khối là pH ở mức 6,8 và sinh khối tế bào đạt mật độ cao nhất cũng

vào thời điểm 6 ngày sau nuôi nhân.

Mặt khác, cũng như kết quả thí nghiệm về môi trường nuôi nhân nêu ở phần

trên, mật độ tế bào trong sinh khối có biểu hiện xu thế giảm sau 4 ngày nuôi nhân,

sau đó đạt đỉnh cao vào thời điểm sau 6 ngày rồi giảm mạnh sau 8 ngày nuôi nhân.

Theo kết quả công bố của Grace (1982) và phân tích của Freshney (1987), sự giảm

mật độ tế bào ở thời điểm sau 4 ngày là nhịp điệu phát triển bình thường của sinh

khối tế bào, còn biểu hiện giảm sau 8 ngày có liên quan đến sự thiếu hụt dinh dưỡng

đáp ứng nhu cầu của sinh khối tế bào trong môi trường nuôi nhân [45, 44].

• Xác định tỷ lệ huyết thanh FBS bổ sung vào môi trường nhân tế bào

Theo Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2010) [72], huyết thanh là nhân tố

cung cấp các chất dinh dưỡng tăng trưởng cần thiết cho chức năng tế bào, cung cấp

hormon và chứa các protein bám giúp vận chuyển các hormone, chất dinh dưỡng và

tế bào chống tác hại của các chất thải trong quá trình nhân nuôi. Ngoài ra, huyết

thanh còn chứa các nhân tố biệt hoá và chất ức chế men Protease phân huỷ tế bào.

Sudeep et al. (2005) [42] cho rằng FBS (Fetal Bovin Serum) là chất bổ sung hiệu

quả trong nuôi nhân tế bào côn trùng, giúp tế bào duy trì sự tăng trưởng trong quá

trình nhân nuôi.

Thí nghiệm với 5 mức tỷ lệ FBS bổ sung vào môi trường nuôi nhân tế bào sâu

khoang cho thấy nếu có bổ sung FBS vào môi trường nuôi nhân trong phạm vi từ 5-

25% thì sinh khối tế bào thu được đều có mật độ cao hơn so với đối chứng không

bổ sung huyết thanh FBS (Bảng 3.10).

Khi nhân nuôi tế bào với các mức bổ sung FBS khác nhau, ở thời điểm 2 ngày

sau nhân nuôi (NSNN), mật độ tế bào đều đạt từ 0,713- 0,937 x 1010 tế bào/ml.

Riêng ở công thức bổ sung 25% FBS mật độ tăng nhanh nhất đạt tới 0,937 x 1010 tế

bào/ml, trong khi đó, ở công thức đối chứng có mật độ tế bào thấp nhất, chỉ đạt

0,671 x 1010 tế bào/ml.

Đến 6 ngày sau nuôi nhân, tại tất cả các công thức bổ sung FBS đều đạt mật độ

tế bào cao hơn so với đối chứng một cách rõ rệt, đạt từ 1,079- 2,165 x 1010 tế

bào/ml, trong khi đối chứng chỉ đạt 0,655 x 1010 tế bào/ml.

Đến 10 ngày sau nuôi nhân, mật độ tế bào đạt mức cao nhất ở tất cả các công

thức có bổ sung FBS. Mức đạt cao nhất tại công thức bổ sung 25% FBS, đạt tới

3,271 x 1010 tế bào/ml. Trong khi đó, bổ sung 5% FBS chỉ đạt mật độ 1,978 x 1010

tế bào/ml, còn ở các công thức thí nghiệm với tỷ lệ FBS bổ sung từ 10, 15 và 20%

FBS vào môi trường nuôi nhân tế bào qua xử lý thống kê thì không có sai khác nhau

1 cách có ý nghĩa (P≤ 0,05%) giữa các công thức này.

Như vậy, sau 2, 6 và 10 ngày nuôi nhân cho thấy nếu bổ sung lượng FBS với

tỷ lệ càng lớn thì tế bào vẫn tiếp tục phân chia phát triển sinh khối trong thời gian

dài (tới 10 ngày sau nuôi nhân) và mật độ tế bào hình thành trong sinh khối càng

cao. Tỷ lệ FBS bổ sung tới 25% FBS hàm lượng tế bào vẫn đạt cao nhất, tới 3,271 x

1010 tế bào/ml đến thời điểm sau 10 ngày nhân nuôi.

Bảng 3.10. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân

trên môi trường có bổ sung huyết thanh FBS với tỷ lệ khác nhau

Mật độ tế bào (x 1010 tế bào/ml) ở các ngày sau nhân nuôi Tỷ lệ FBS

(%) Ban đầu 2 ngày 6 ngày 10 ngày

5 0,5 0,713 a 1,079 bc 1,978 b

10 0,5 0,736 a 1,365 b 2,473 bc

15 0,5 0,766 a 1,469 b 3,044 c

20 0,5 0,797 a 1,544 ab 3,183 c

25 0,5 0,937 b 2,165 a 3,271 d

Không có FBS 0,5 0,671 a 0,655 c 0,505 a

CV (%) 5,278 7,762 6,153

0,289 0,335 0,454 LSD0,05

Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác

có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Tuy nhiên, theo Weiss et al. (1981) [47], vẫn cần phải tiếp tục nghiên cứu cải

tiến thay thế FBS bằng việc bổ sung thành phần bổ trợ khác nhằm giảm tỷ lệ bổ

sung FBS. Vì không thể bổ sung FBS vào môi trường nuôi nhân với tỷ lệ cao tới

25% do giá mua FBS rất đắt, sẽ làm giá thành của sản xuất sinh khối tế bào tăng lên

cao và hiệu quả kinh tế của việc sản xuất sinh khối tế bào giảm đi. Tác giả này cũng

như Lynn (2002) [30] và một số tác giả khác [16, 42, 44, 45, ...] đều khuyến cáo khi

nuôi nhân tế bào với khối lượng lớn chỉ nên bổ sung 10- 15% FBS là hợp lý.

• Mật độ tế bào khi nuôi nhân ở điều kiện thích hợp nhất

Từ kết quả thu được từ các thí nghiệm riêng rẽ đánh giá ảnh hưởng của các

yếu tố đến khả năng phát triển sinh khối tế bào sâu khoang, đã xác định điều kiện

thích hợp nuôi nhân tế bào sâu khoang trên môi trường Excell 420-14419C có

pH=6,8 ở nhiệt độ 280C và tỷ lệ FBS bổ sung là 25%.

Đã tiến hành 3 đợt thử nghiệm nuôi nhân tế bào sâu khoang với theo tổ hợp

các điều kiện nuôi nhân tế bào sâu khoang in vitro thích hợp nhằm xác định khả

năng phát triển của sinh khối tế bào.

Bảng 3.11. Mật độ tế bào sâu khoang

khi nuôi nhân in vitro ở điều kiện thích hợp

Mật độ tế bào (x 1010 tế bào/ml) sau các ngày nhân nuôi Đợt

thí nghiệm 1 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày

1 (10/2016) 2,055 b 2,302 b 2,941 b 4,025 b 2,675 a

2 (11/2016) 2,791 a 2,809 a 3,150 a 5,750 a 2,475 a

3 (12/2016) 2,018 b 2,415 b 3,051 a 4,987 a 1,990 b

CV(%) 3,531 6,458 5,622 5,289 3,934

0,862 0,728 1,598 1,634 0,987 LSD0,05

Ghi chú: Trong cùng hàng, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác

có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Kết quả (Bảng 3.11) cho thấy sau 1 ngày nuôi nhân đạt mật độ tế bào từ

2,018- 2,791 x 1010 tế bào/ml. Sau 4 ngày đạt từ 2,941- 3,150 x 1010 tế bào/ml. Hàm

lượng tế bào đạt cao nhất sau 6 ngày nuôi nhân, từ 4,025- 5,750 x 1010 tế bào/ml và

cao nhất ở thử nghiệm lần 2 (tháng 11/2016) mật độ tế bào đạt tới 5,750 x 1010 tế

bào/ml, cao hơn hẳn hàm lượng tế bào đạt được khi nuôi nhân tế bào sâu khoang

trong từng điều kiện tối ưu riêng rẽ.

Hình 3.7: Tế bào sâu khoang sau 6 ngày đã nuôi nhân đợt tháng 11/2016

quan sát dưới kính với độ phóng đại 100X

Tuy nhiên, đến thời điểm 8 ngày sau nhân nuôi hàm lượng tế bào biểu hiện

giảm rõ rệt, chỉ còn từ 1,990- 2,675 x 1010 tế bào/ml. Có thể sau khi sinh khối tế bào

phát triển nhanh và đạt đỉnh cao mật độ vào thời điểm 6 ngày sau nuôi nhân đã làm

nguồn dinh dưỡng trong môi trường bị thiếu hụt đáng kể, không đáp ứng nhu cầu

phát triển sinh khối và làm nhiều tế bào bị chết dẫn tới mật độ tế bào giảm thấp

nhanh. Kết quả qua 3 đợt nuôi nhân in vitro tế bào sâu khoang ở điều kiện thích hợp

cũng cho thấy việc thu hoạch sinh khối tế bào sâu khoang nên tiến hành vào sau 6

ngày nuôi nhân.

Hình 3.8: Tế bào sâu khoang sau nuôi nhân 6 ngày

200X xxxxx xxXXX x

600X XXxx XXX XXXX XXXx X

khi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 600X và 200X

Kết quả của Mishuhashi (1976) khi nuôi nhân dòng tế bào sinh trưởng liên

tục được phân lập từ phôi của nhộng sâu khoang (S. litura) bằng môi trường MGM-

450 được bổ sung 10% FBS hoặc bằng môi trường MM có 3% FBS thì mật độ tế

bào chỉ tăng gấp 2 lần sau 48 giờ [53]. Còn Guy và Goodman (2008) nuôi nhân 2

dòng tế bào tạo được từ sâu xanh Heliothis virescens ở nhiệt độ 280C cho hàm

lượng tế bào từ 0,5 x 107 tế bào/ml lên tới 1,35 x 107 tế bào/ml (tăng 2,7 lần) trong

bình nuôi T-75 cm2 [46]. Trong khi đó, Mishuhashi (1995) nhận thấy nuôi nhân

dòng tế bào sâu khoang Spodoptera litura ở nhiệt độ 250C cho hàm lượng tế bào

tăng gấp 2 lần sau 43 giờ [61].

Với kết quả nghiên cứu của đề tài trình bày trong bảng 3.11, khi nhân tế bào

ban đầu là 0,5 x 1010 tế bào/ml thì sau 2 ngày hàm lượng tế bào tăng 4,6- 5,62 lần

và sau 6 ngày nuôi nhân tăng 8,05- 11,5 lần. Như vậy, khi nuôi nhân tế bào với hàm

lượng ban đầu là 0,5 x 1010 tế bào/ml thì tốc độ tăng sinh khối tế bào khi thu hoạch

đạt mức cao hơn so với sử dụng hàm lượng tế bào ban đầu thấp, góp phần tiết kiệm

đáng kể môi trường nuôi nhân.

Như vậy, với các kết quả nghiên cứu về điều kiện thích hợp để phát triển

sinh khối tế bào sâu khoang như đã trình bày ở trên, cho phép khẳng định:

1/ Hoàn toàn có thể nuôi nhân tế bào sâu khoang trong điều kiện phòng thí

nghiệm và điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang cho hiệu quả

cao khi sử dụng môi trường Excell 420-14419C ở nhiệt độ 280C, pH=6,8 và tỷ lệ

FBS bổ sung là 25%.

2/ Khi nuôi nhân tế bào sâu khoang ở điều kiện thích hợp, mật độ tế bào đạt

cao nhất, từ 4,025 đến 5,750 x 1010 tế bào/ml sau 6 ngày nhân nuôi.

3.2.1.2. Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mô phòng thí nghiệm

Tìm hiểu khả năng nuôi nhân tế bào sâu khoang khối lượng lớn làm cơ sở

hướng tới phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại cây trồng, đề tài đã tiến

hành nuôi nhân tế bào với lượng môi trường 150ml và 750ml, theo phương pháp

tĩnh và phương pháp lắc ở điều kiện thích hợp với hàm lượng tế bào ban đầu đưa

vào nuôi nhân là 0,5 x 1010 tế bào/ml.

• Nhân sinh khối tế bào theo phương pháp tĩnh và lắc trên bình 250ml

Tiến hành thử nghiệm nhân nuôi tế bào sâu khoang với lượng 150ml trên bình

lọc khuẩn 250ml theo 2 phương pháp: dạng tĩnh và dạng lắc với mật độ tế bào ban đầu

là 0,5 x 1010 tế bào/ml trên môi trường Excell 420-14419C có bổ sung 25% FBS, ở

nhiệt độ 280C và pH= 6,8, riêng với công thức lắc tiến hành trên máy lắc tốc độ 50

vòng/phút liên tục 24 giờ.

Kết quả đánh giá qua 6 lần thí nghiệm nhân sinh khối hàm lượng tế bào và hệ số

nhân mật độ tế bào trong sinh khối vào 6 ngày sau nuôi nhân (Bảng 3.12) cho thấy:

Khi nuôi nhân tế bào theo phương pháp tĩnh, mật độ tế bào trong sinh khối đạt

từ 3,17 – 3,445 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân số lượng tế bào trong sinh khối tăng từ

6,26- 6,89 lần so với mật độ tế bào ban đầu khi đưa vào nuôi nhân. Mật độ tế bào trung

bình đạt 3,247 x 1010 tế bào/ml, chỉ tăng được 6,49 lần so với mật độ tế bào trước khi

đưa vào nhân sinh khối. Trong 6 đợt thí nghiệm, lần 1 cho mật độ tế bào cao nhất tới

3,445 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân sinh khối tế bào đạt 6,89 lần và lần thí nghiệm 4

chỉ đạt mật độ 3,17 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân đạt 6,34 lần so với mật độ tế bào

ban đầu đưa vào nhân sinh khối (Bảng 3.12).

Bảng 3.12. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân

theo phương pháp tĩnh và lắc trên bình lọc khuẩn 250ml

Phương pháp tĩnh Phương pháp lắc Mật độ Lần thí ban đầu Mật độ tế bào HS nhân Mật độ tế bào HS nhân nghiệm (x 1010 tb/ml) (x 1010 tb/ml) (lần) (x 1010 tb/ml) (lần)

3,445 a 6,89 4,580 b 9,16 1 0,5

3,337 b 6,67 4,780 ab 9,56 2 0,5

3,129 c 6,26 4,590 a 9,18 3 0,5

3,170 c 6,34 4,595 b 9,19 4 0,5

3,270 cb 6,54 4,587 b 9,17 5 0,5

3,133 c 6,27 4,879 a 9,76 6 0,5

6,49 9,50 TB 3,247 4,752 0,5

3,192 - 6,219 - CV (%)

0,616 - 0,494 - LSD0,05

Ghi chú: tb: Tế bào; HS: Hệ số nhân; TB: Mật độ tế bào trung bình;

Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ

tin cậy P ≤ 0,05

Khi nuôi nhân phát triển sinh khối tế bào theo phương pháp lắc với tốc độ 50

vòng/phút liên tục 24 giờ, mật độ tế bào đạt từ 4,58- 4,879 x 1010 tế bào/ml và hệ số

nhân số lượng tế bào đạt từ 9,16- 9,76 lần so với mật độ tế bào ban đầu. Trung bình cả

6 lần thí nghiệm, mật độ tế bào đạt 4,752 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân sinh khối tế

bào đạt được là 9,50 lần (Bảng 3.12).

Như vậy, nuôi nhân tế bào theo phương pháp lắc cho hiệu quả tăng mật độ tế

bào cao hơn so với phương pháp tĩnh trung bình 3,01 lần so với mật độ ban đầu.

Kết quả xử lý thống kê so sánh mật độ tế bào hình thành trong cùng một

phương pháp nhân nuôi thì mật độ tế bào và hệ số nhân cũng có sự khác nhau một

cách có ý nghĩa với độ tin cậy P ≤ 0,05, mặc dù giá trị thực tế sai khác nhau không

lớn giữa các đợt thí nghiệm.

B

A

Hình 3.9: Nhân tế bào theo phương pháp lắc (A) và theo phương pháp tĩnh (B)

• Khả năng phát triển sinh khối của tế bào sâu khoang theo phương pháp

tĩnh và lắc trên bình 1 lít

Nhằm hướng tới nuôi nhân tế bào với sinh khối lớn, một thử nghiệm đã được

tiến hành với lượng 750ml môi trường trên bình lọc khuẩn Erlemeeyer Flask dung

tích 1,0 lít với môi trường Excell 420-14419C và 2 loại môi trường rẻ tiền hơn

(bằng 60- 70% giá mua Excell 420-14419C) là Schneider S9895 và Grace.

Kết quả (Bảng 3.13) thí nghiệm cho thấy khi nhân sinh khối tế bào trên môi

trường Excell 420-14419C theo phương pháp lắc 50 vòng/phút liên tục 24 giờ, sau 2

ngày nuôi nhân mật độ tế bào đạt 2,68 x 1010 tế bào/ml, còn theo phương pháp tĩnh

đạt 2,42 x 1010 tế bào/ml. Sau 6 ngày, tương ứng với 2 phương pháp (tĩnh và lắc) mật

độ tế bào đạt cao nhất tới 3,14 và 4,08 x 1010 tế bào/ml. Sau 10 ngày nuôi nhân, với

phương pháp tĩnh và lắc đạt mật độ 2,69 và 3,45 x 1010 tế bào/ml (tương ứng) và đến

14 ngày sau nuôi nhân đạt 1,93 và 2,61 x 1010 tế bào/ml (tương ứng).

Khi sử dụng môi trường Schneider S9895 và Grace theo phương pháp lắc, mật

độ tế bào cũng đều cao hơn hẳn so với phương pháp tĩnh. Trong 2 ngày đầu sau khi

nuôi nhân theo phương pháp lắc, mật độ tế bào đạt 1,89 x 1010 tế bào/ml với môi

trường Schneider S9895, đạt 1,82 x 1010 tế bào/ml với môi trường Grace. Nhưng thực

hiện theo phương pháp tĩnh, mật độ tế bào trên 2 môi trường này chỉ đạt tương ứng là

1,8 và 1,62 x 1010 tế bào/ml.

Tại thời điểm 6 ngày sau nuôi nhân, ở công thức nuôi nhân theo phương pháp

lắc với môi trường Excell 420-14419C đạt tới 4,08 x 1010 tế bào/ml, còn với môi

trường Schneider S9895 đạt 2,97 x 1010 tế bào/ml, và với môi trường Grace đạt 2,37

x 1010 tế bào/ml. Trong khi ở công thức nuôi nhân theo phương pháp tĩnh, tương ứng

với 3 loại môi trường Excell 420-14419C, Schneider S9895 và Grace chỉ đạt tương

ứng 3,14, 2,62 và 2,15 x 1010 tế bào/ml.

Đến thời điểm 10 ngày sau nuôi nhân thì sinh khối tế bào chỉ tăng ở công thức

nuôi nhân theo phương pháp lắc với môi trường Excell 420-14419C và đạt tới 3,45 x

1010 tế bào/ml, còn ở công thức nuôi nhân theo phương pháp tĩnh với cùng loại môi

trường mật độ tế bào hình thành chỉ đạt 2,69 x 1010 tế bào/ml. Trong khi đó, nuôi

nhân tế bào với môi trường Schneider S9895 và Grace theo phương pháp lắc đạt 2,04

và 1,75 x 1010 tế bào/ml (tương ứng), còn theo phương pháp tĩnh mật độ tế bào giảm

nhanh, chỉ còn 1,20 và 1,16 x 1010 tế bào/ml (tương ứng).

Bảng 3.13. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân

với lượng 750ml môi trường trên bình lọc khuẩn 1000ml

theo phương pháp tĩnh và lắc

Mật độ tế bào ở các ngày sau nuôi nhân Công thức (x1010 tế bào/ml) TT thí nghiệm 2 ngày 6 ngày 10 ngày 14 ngày

Tĩnh (Excell 420-14419C) 2,42 b 3,14 b 2,69 b 1,93 b 1 Lắc (Excell 420-14419C) 2,68 a 4,08 a 3,45 a 2,61 a

Tĩnh (Schneider S9895) 1,80 c 2,62 c 1,20 e 1,13 e 2 Lắc (Schneider S9895) 1,89 bc 2,97 b 2,04 c 1,23 d

1,62 a 2,15 d 1,16 e 1,09 e

3 Tĩnh (Grace) Lắc (Grace) 1,82 c 2,37 cd 1,75 d 1,41 c

CV (%) 1,092 1,497 1,645 0,192

0,519 0,646 0,758 0,616 LSD0,05

Ghi chú: NSNN; Ngày sau nuôi nhân; Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ

cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P < 0,05

Thăm dò để kéo dài thời gian nuôi nhân tế bào tới 14 ngày sau, mật độ tế bào ở

tất cả các công thức đều giảm đáng kể cả khi nuôi nhân theo phương pháp lắc, tương

ứng với với 3 môi trường mật độ tế bào chỉ đạt 2,61, 1,23 và 1,41 x 1010 tế bào/ml.

Trong số đó, sử dụng môi trường Excell 420-14419C mật độ tế bào có giảm nhưng

vẫn còn tới 2,61 x 1010 tế bào/ml. Còn áp dụng theo phương pháp tĩnh, mật độ tế bào

chỉ đạt 1,93, 1,13 và 1,09 x 1010 tế bào/ml tương ứng với các môi trường Excell 420-

14419C, Schneider S9895 và môi trường Grace.

Như vậy, để nhân sinh khối tế bào sâu khoang với lượng 150ml hoặc 750ml có

hiệu quả cao, việc nuôi nhân theo phương pháp lắc liên tục trong 24 giờ là rất cần thiết

và nên thu hoạch sinh khối sau 6 ngày nuôi nhân. Có thể do lắc liên tục đã tạo điều kiện

thuận lợi cho quá trình cung cấp oxy cho sinh khối tế bào phát triển.

Kết quả nghiên cứu từ các thí nghiệm nói trên cho phép xác định để phát

triển sinh khối tế bào sâu khoang có hiệu quả, các yếu tố cần thiết đã được xác định

cụ thể như sau:

- Điều kiện thích hợp để phát triển sinh khối tế bào sâu khoang trên môi

trường Ex-Cell 420-14491C có bổ sung 25% FBS ở pH = 6,8 và nhiệt độ 280C.

Khi nhân nuôi tế bào ở điều kiện thích hợp hàm lượng tế bào có thể đạt từ 4,025-

5,750 x 1010 tế bào/ml vào 6 ngày sau nuôi nhân.

- Nuôi nhân tế bào theo phương pháp lắc liên tục 24 giờ tốc độ 50

vòng/phút cho hiệu quả hơn hẳn so với nuôi nhân ở trạng thái tĩnh, mật độ tế

bào 1,33- 1,56 lần (trung bình cao hơn từ 3,01 lần) với lượng 150ml môi trường

trên bình 250ml và 1,1- 1,3 lần (trung bình 1,18 lần) với lượng 750ml trên bình

1 lít. Điều đó chứng tỏ hoàn toàn có khả năng nuôi nhân tế bào sâu khoang ở

qui mô phòng thí nghiệm trên bình cổ vếch lọc khuẩn 250ml hoặc bình

Erlemeeyer Flask dung tích 1000ml.

3.2.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang trên tế bào nuôi nhân

Việc sản xuất chế phẩm sinh học NPV để phòng trừ sâu hại trước những năm

1990 được tiến hành bằng cách nuôi sâu rồi nhiễm vi rút, sau đó thu hoạch sâu chết

đem nghiền, lọc để sử dụng (Viện Bảo vệ thực vật, 2006) [98]. Theo phương pháp

này đã bộc lộ nhiều bất cập, đặc biệt là không thể sản xuất với khối lượng lớn sinh

khối thể vùi có chất lượng ổn định như Grzywacz et al., (1996) đã chỉ rõ [12].

Để khắc phục hạn chế nói trên, các nhà khoa học đã đi sâu nghiên cứu phát

triển sinh khối NPV bằng cách lây nhiễm trên tế bào côn trùng nuôi nhân

(Elanchezyan, 2009, Petchprakob et al., 2007, Kanokwan et al. 2003,Goodman et

al. 2001, Hink et al., 1977) [11, 59, 79, 115, 116].

Tuy nhiên, Hink et al. (1977) và Phejun et al. (2003) cũng chỉ rõ việc sản

xuất sinh khối NPV tạo chế phẩm sinh học trên tế bào nuôi nhân trước hết phải

nghiên cứu xác định rõ điều kiện lây nhiễm NPV đối với tế bào của từng loài côn

trùng cụ thể vì mỗi dòng tế bào của loài côn trùng yêu cầu khác nhau khi lây nhiễm

tạo sinh khối virus phục vụ sản xuất thuốc sinh học [116].

3.2.2.1. Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm virus nhân đa diện( NPV)

• Xác định mật độ tế bào thích hợp

Nhằm tìm ra mật độ tế bào thích hợp cho lây nhiễm có hiệu quả để có thể thu

hoạch thể vùi với số lượng cao. Kết quả thí nghiệm (Bảng 3.14) cho thấy sử dụng

với cùng số lượng thể vùi 0,1 x 108 OB/ml để lây nhiễm, khi mật độ tế bào sâu

khoang trong dịch nhiễm càng cao thì số thể vùi NPV hình thành thu hoạch được

sau lây nhiễm càng nhiều.

Sau 1 ngày lây nhiễm, ở công thức lây nhiễm với mật độ tế bào là 1,0 và 2,0

x 108 tế bào/ml số lượng thể vùi đạt 1,08 và 1,21 x 108 OB/ml, còn tại công thức có

mật độ tế bào cao nhất 3,0 x 108 tế bào/ml thì số lượng thể vùi hình thành cũng đạt

mức cao nhất, tới 1,68 x 108 OB/ml.

Tại thời điểm 3 ngày sau lây nhiễm (NSLN), khi nhiễm trên dịch có mật độ

tế bào ở mức 1,0 và 2,0 x 108 tế bào/ml, số lượng thể vùi thu được tương ứng là

1,14 và 1,45 x 108 OB/ml. Trong khi đó, khi nhiễm trên dịch có mật độ tế bào 3,0 x

108 tế bào/ml thì số lượng thể vùi đạt tới 2,47 x 108 OB/ml.

Nhưng tới thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm thì số lượng thể vùi thu được

ở cả 3 công thức thí nghiệm đều thấp hơn so với kết quả quan sát được ở cả 3

công thức thí nghiệm sau 3 ngày lây nhiễm. Tại công thức nhiễm virus trong

dịch tế bào có mật độ 1,0 và 2,0 x 108 tế bào/ml số lượng thể vùi thu được sau

6 ngày lây nhiễm đạt 1,01 và 1,27 x 108 OB/ml (tương ứng). Còn với công thức

có mật độ tế bào 3,0 x 108 tế bào/ml, số thể vùi thu được vẫn cao nhất, đạt tới

2,43 x 108 OB/ml sau 6 ngày lây nhiễm (Bảng 3.14).

Bảng 3.14. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV

trên tế bào có mật độ khác nhau

Số thể vùi hình thành ở các ngày sau lây nhiễm Mật độ tế bào Công (x 108 OB/ml) khi nhiễm thức (x 108 tế bào/ml) 1 ngày 3 ngày 6 ngày

1 1,0 1,08 b 1,14 b 1,01 b

2 2,0 1,21 b 1,45 b 1,27 b

3 3,0 1,68 a 2,47 a 2,43 a

CV (%) 0,635 1,441 1,524

0,247 0,500 0,123 LSD0,05

Ghi chú: tế bào/ml: tế bào trong 1 mililit; Trong cùng hàng, các giá trị kèm

chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy trong cả 3 công thức thí nghiệm với 1,0; 2,0

và 3,0 x 108 tế bào/ml, số lượng thể vùi hình thành cao nhất vào ngày thứ 3 sau lây

nhiễm đạt1,14; 1,45 và 2,47 x 108 OB/ml (tương ứng).

Như vậy, khi nhiễm vi rút trên dịch có mật độ tế bào cao thì vi rút lây nhiễm sẽ

hiệu quả hơn, vì trong quá trình lây nhiễm các thể hoạt động (virion) của virus có nhiều

cơ hội tiếp cận với tế bào sâu khoang trong khi vẫn còn một phần đáng kể tế bào vẫn

tiếp tục phân chia phát triển số lượng trong sinh khối. Điều này cũng hoàn toàn phù

hợp với kết quả nghiên cứu và nhận xét của Petchprakob et al., (2007) và Phejun

(2003) đã công bố [59, 117].

• Xác định nồng độ virus thích hợp

Theo Lynn (2002), mức độ tối ưu của việc lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào

tuỳ thuộc vào 2 yếu tố là chỉ số MOI (là tỷ lệ giữa số lượng thể vùi NPV và số

lượng tế bào khi lây nhiễm) và thời gian ủ lây nhiễm, theo tác giả, hầu hết các

dòng tế bào côn trùng thích hợp lây nhiễm virus theo chỉ số MOI từ 0,1- 0,5 [30].

Tìm hiểu khả năng lây nhiễm, tạo thể vùi của NPV trên tế bào sâu

khoang dựa theo chỉ số MOI khác nhau, nhằm tìm ra số lượng thể vùi lây

nhiễm thích hợp nhất. Kết quả được trình bày ở bảng 3.15 cho thấy với cùng

mật độ tế bào sử dụng cho lây nhiễm là 1,0 x 108 tế bào/ml, khi nhiễm với chỉ

số MOI càng cao tức là số thể vùi đưa lây nhiễm càng lớn thì số thể vùi hình

thành càng nhiều. Tại thời điểm sau 1 ngày khi nhiễm theo chỉ số MOI= 0,5, số

thể vùi hình thành đạt tới 0,97 x 108 OB/ml. Trong khi đó, với chỉ số MOI là

0,1 và 0,3 chỉ đạt 0,62 và 0,78 x 108 OB/ml (tương ứng).

Tuy nhiên, đến thời điểm 3 ngày sau lây nhiễm tại công thức áp dụng chỉ

số MOI là 0,1 và 0,3 cho hàm lượng thể vùi hình thành đạt tương ứng là 1,47,

cao hơn hẳn so với chỉ số MOI khi lây nhiễm 0,5. Còn tại công thức lây nhiễm

với chỉ số MOI 0,3 số lượng thể vùi hình thành 1,29 x 108 OB/ml, tương tự như

áp dụng chỉ số MOI 0,5.

Trong khi đó, hàm lượng thể vùi thu được của công thức lây nhiễm theo

chỉ số MOI 0,5 chỉ đạt 1,21 x 108 OB/ml và không có sự sai khác với công thức

nhiễm theo chỉ số MOI 0,3 tại cùng thời điểm 3 ngày sau lây nhiễm.

Bảng 3.15. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV

trên tế bào theo chỉ số MOI khác nhau

Công Chỉ số MOI Số lượng thể vùi hình thành ở các ngày sau lây nhiễm (x 108 OB/ml) thức khi lây nhiễm 1 ngày 3 ngày 6 ngày

1 0,1 0,62 c 1,47 a 1,08 a

2 0,3 0,78 b 1,29 b 0,53 b

3 0,5 0,97 a 1,21 b 0,37 c

CV (%) 4,381 3,184 6,311

0,224 0,636 0,208 LSD0,05

Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác

có ý nghĩa với độ tin cậy P ≤ 0,05

Nhưng đến thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm, qua theo dõi nhận thấy hàm

lượng thể vùi hình thành bị giảm đi rõ rệt ở tất cả các công thức có chỉ số lây

nhiễm MOI khác nhau, tương ứng với 3 chỉ số MOI 0,1; 0,3 và 0,5 số lượng thể

vùi hình thành là 1,08, 0,53 và 0,37 x 108 OB/ml. Điều này cũng có thể do hệ

quả của quá trình làm tăng độ pH trong môi trường dịch nhiễm, qua theo dõi

pH đã lên tới 8,5 sau 6 ngày lây nhiễm. Có thể do pH tăng (tới 9,0) đã phá vỡ

một bộ phận thể vùi (Occlusion Bodies - OB) để giải phóng các thể vi rút hoạt

động (virions) hoặc các virion không kết tụ để hình thành thể vùi như đã chỉ rõ

qua nghiên cứu của Kanokwan et al. (2003) [79] và Lynn (2003) [85]. Vì vậy, số

lượng thể vùi quan sát bị giảm so với lần quan sát vào 3 ngày sau lây nhiễm.

So sánh giữa 3 công thức lây nhiễm với chỉ số MOI khác nhau, thì lây nhiễm

với chỉ số MOI là 0,1 được xác định là thích hợp nhất và cho số lượng thể vùi cao

nhất ở cả hai thời điểm 3 ngày hoặc 6 ngày sau lây nhiễm, đạt số lượng thể vùi

tương ứng đạt 1,47 và 1,08 x 108 OB/ml, mặc dù ở thời điểm 1 ngày sau lây nhiễm

số lượng thể vùi hình thành 0,62 x 108 OB/ml. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp

với kết quả thí nghiệm về số lượng tế bào lây nhiễm như đã nêu ở phần trên, là khi

lây nhiễm ở mật độ tế bào càng cao thì số lượng thể vùi hình thành càng nhiều.

• Xác định thời gian ủ lây nhiễm virus thích hợp

Các kết quả nêu trên cho thấy việc xác định thời gian ủ thích hợp là vấn đề

cần thiết nhằm thu được số lượng thể vùi cao nhất trong mỗi mẻ lây nhiễm sản xuất

sinh khối NPV. Theo Lynn (2002) [30], thời gian ủ lây nhiễm virus trên tế bào của

nhiều loài côn trùng trong thời gian 3- 4 ngày, còn Knudson và Tinsley (1974) xác

định thời gian tối ưu là 3 ngày khi lây nhiễm NPV đối với tế bào sâu Spodoptera

frugiperda [58]. Vì vậy, một thí nghiệm nhằm tìm hiểu thời gian ủ thích hợp để có

thể thu hoạch số lượng thể vùi cao sau khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang

(S. litura) nhân nuôi theo chỉ số MOI là 0,1 trên sinh khối tế bào có mật độ 1,0 x

108 tế bào/ml đã được tiến hành.

Kết quả thí nghiệm nêu trong bảng 3.16 cho thấy khi nhiễm virus thì số

lượng thể vùi hình thành sau 1 ngày lây nhiễm đạt 0,72 x 108 OB/ml, sau 3 ngày số

thể vùi đạt cao nhất, tới 1,53 x 108 OB/ml. Nhưng sau đó số lượng thể vùi hình

thành lại giảm dần, còn 1,13 x 108 OB/ml vào thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm và

chỉ còn 0,95 x 108 OB/ml sau 10 ngày lây nhiễm.

Bảng 3.16. Số lượng thể vùi hình thành sau thời gian ủ

lây nhiễm NPV khác nhau

Công thức Thời gian ủ Số thể vùi hình thành

thí nghiệm lây nhiễm (ngày) (x 108 OB/ml)

1 1 0,72 b

2 3 1,53 a

3 6 1,13 c

4 10 0,95 d

CV (%) 1,612

LSD 0,411

Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác

có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Từ kết quả thí nghiệm nhận thấy, đối với tế bào sâu khoang (S. litura), thời

gian ủ lây nhiễm NPV thích hợp để thu hoạch thể vùi vào thời điểm 3 ngày sau lây

nhiễm. Kết quả thí nghiệm này cũng tương tự như kết quả thí nghiệm đã công bố

của Knudson và Tinsley (1974) trên tế bào sâu Spodoptera frugiperda [58].

• Xác định môi trường thích hợp cho lây nhiễm

Mclntosh et al., (2003) chỉ rõ để quá trình lây nhiễm của NPV trên tế bào côn

trùng thành công thì môi trường nuôi nhân có ý nghĩa hết sức quan trọng, vừa phải đảm

bảo duy trì các hoạt động sống của tế bào, vừa tạo thuận lợi cho quá trình xâm nhập

của các thể hoạt động (virion) của virus vào tế bào côn trùng [74].

Tìm hiểu vấn đề này, tiến hành thí nghiệm trong năm 2017 với 4 loại môi

trường khác nhau với với dịch tế bào sâu khoang có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml và

lây nhiễm virus theo chỉ số MOI là 0,1 với môi trường pH 7,0 và nhiệt độ 280C.

Kết quả đánh giá được trình bày ở bảng 3.17 chỉ ra tại thời điểm 1 ngày

sau nhiễm virus, với môi trường Excell 420-14419C có số lượng thể vùi hình

thành cao nhất tới 1,316 x 108 OB/ml, với môi trường Schneider S9895 đạt 1,142 x

108 OB/ml. Còn khi nhiễm virus trên tế bào với 2 loại môi trường TC-100- T3160

và IPL-41, số thể vùi hình thành đều đạt ở mức thấp, chỉ đạt 0,980 và 0,925 x 108

OB/ml (tương ứng).

Bảng 3.17. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV

trên tế bào sâu khoang với các loại môi trường khác nhau

Số lượng thể vùi sau các ngày lây nhiễm Môi trường (x 108 OB/ml) STT lây nhiễm virus Sau 1 ngày Sau 3 ngày Sau 6 ngày

1 Excell 420-14419C 1,316 a 2,014 a 1,290 a

2 Schneider S9895 1,142 b 1,835 b 0,205 b

3 TC 100- T3160 0,980 c 1,422 c 0,192 b

4 IPL- 41 0,925 c 1,341 c 0,192 b

CV (%) 1,874 0,528 0,723

0,204 0,215 0,134 LSD0,05

Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác

có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Sau 3 ngày lây nhiễm, số lượng thể vùi hình thành đều cao hơn hẳn so với

thời điểm sau nhiễm 1 ngày. Tại công thức sử dụng môi trường Excell 420-

14419C cho số lượng thể vùi hình thành vẫn đạt cao nhất tới 2,014 x 108 OB/ml,

với môi trường Schneider S9895 đạt 1,835 x 108 OB/ml, trên môi trường TC-100-

T3160 đạt 1,422 x 108 OB/ml và đạt số thể vùi thấp nhất khi lây nhiễm trên môi

trường IPL-41 chỉ đạt 1,341 x 108 OB/ml.

Đến thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm, số thể vùi thu được ở tất cả các công

thức sử dụng môi trường khác nhau đều giảm thấp, số lượng thể vùi hình thành

cao nhất đạt được khi sử dụng môi trường Excell 420-14419C là 1,290 x 108

OB/ml, với môi trường Schneider S9895 đạt 0,205 x 108 OB/ml. Còn trong các

môi trường lây nhiễm khác gồm TC-100- T3160 và IPL-41 đều chỉ đạt 0,192 x

108 OB/ml, nhưng qua phân tích thống kê giữa chúng không có sự sai khác có ý

nghĩa ở độ tin cậy P < 0,05 (Bảng 3.17).

Kết quả thí nghiệm cho thấy cao điểm thể vùi hình thành vào 3 ngày sau

lây nhiễm ở tất cả các môi trường, điều này cũng phù hợp với kết quả thí nghiệm

về thời gian ủ lây nhiễm. Điều đó cũng chứng tỏ sử dụng môi trường Excell 420-

14419C thích hợp và sẽ cho hiệu quả nhân sinh khối NPV cao hơn so với việc sử

dụng các môi trường khác khi lây nhiễm virus trên tế bào sâu khoang.

• Xác định nhiệt độ thích hợp cho lây nhiễm

Thí nghiệm lây nhiễm trên môi trường Excell 420- 14419C có bổ sung 15%

FBS và pH= 7,0 với dịch tế bào mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml. Lây nhiễm virus theo

chỉ số MOI 0,1 với số lượng thể vùi NPV ban đầu là 0,1 x 108 OB/ml. Thí nghiệm lây

nhiễm NPV được thực hiện ở 3 mức nhiệt độ khác nhau trong các tủ định ôn.

Kết quả trình bày trong bảng 3.18 cho thấy sau 1 ngày lây nhiễm ở nhiệt độ 26

± 0,50C, số lượng thể vùi đạt 1,08 x 108 OB/ml, ở nhiệt độ 28 ± 0,50C đạt 1,15 x 108

OB/ml và số lượng thể vùi đạt tới 1,31 x 108 OB/ml ở 30 ± 0,50C.

Tuy nhiên, đến thời điểm 3 ngày sau lây nhiễm, số lượng thể vùi hình thành đều

tăng cao tại tất cả 3 công thức nhiệt độ, trong đó số thể vùi đạt cao nhất lại ở công thức

nhiệt độ 28 ± 0,50C tới 1,85 x 108 OB/ml, còn ở nhiệt độ 26 ± 0,50C và 30 ± 0,50C số

lượng thể vùi có tăng nhưng ở mức thấp hơn so với ở nhiệt độ 28 ± 0,50C và đạt số

thể vùi tương ứng là 1,37 x 108 và 1,58 x 108 OB/ml. Tuy nhiên, khi xử lý thống kê

thì số lượng thể vùi thu được ở điều kiện nhiệt độ ủ lây nhiễm 28 ± 0,50C và 30 ±

0,50C không có sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05 (Bảng 3.18).

Bảng 3.18. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV

trên tế bào sâu khoang ở nhiệt độ khác nhau

Công Nhiệt độ khi Số lượng thể vùi ở các ngày sau lây nhiễm

thức lây nhiễm (0C) (x 108 OB/ml)

Sau 1 ngày Sau 3 ngày Sau 6 ngày

1,37 a 0,692 a 1 26 ± 0,5 1,08 a

1,85 b 0,714 b 2 28 ± 0,5 1,15 b

1,58 b 0,687 a 3 30 ± 0,5 1,31 b

1,612 0,861 CV (%) 1,508

0,411 0,153 0,385 LSD0,05

Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác

có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Đến thời điểm 6 sau lây nhiễm, số lượng thể vùi hình thành đều giảm ở cả 3

mức nhiệt độ thí nghiệm, nhưng ở nhiệt độ 28 ± 0,50C vẫn đạt mức cao nhất tới 0,714

x 108 OB/ml, còn ở 2 công thức nhiệt độ 26 ± 0,5 và 30 ± 0,50C số lượng thể vùi

giảm tới 50% chỉ còn tương ứng là 0,692 và 0,687 x 108 OB/ml. Có thể ở 2 mức

nhiệt độ này đã ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm của NPV bị giảm (Bảng 3.18).

Kết quả thí nghiệm thu được cũng phù hợp với kết quả về thời gian đạt đỉnh

cao số lượng thể vùi hình thành là 3 ngày sau nhiễm, như công bố của Knudson et

al. (1974) [58] khi nhiễm NPV trên tế bào sâu xanh (Spodoptera frugiperda) với chỉ

số MOI là 0,1 ở nhiệt độ 270C, sau 3 ngày sẽ đạt 100% số tế bào bị nhiễm virus,

nhưng ở nhiệt độ 17 và 370C làm số lượng tế bào giảm nhanh và tỷ lệ tế bào nhiễm

virus rất thấp.

• Xác định pH môi trường thích hợp cho lây nhiễm

Theo kết quả nghiên cứu đã công bố của nhiều tác giả cho thấy pH môi

trường khi lây nhiễm hình thành thể vùi của NPV có vai trò hết sức quan trọng.

Theo Jakubowska et al., (2009) [69], pH môi trường có tác động rất lớn đến khả

năng lây nhiễm của virus NPV trên tế bào côn trùng và khả năng hình thành thể vùi

bị ảnh hưởng rõ rệt khi lây nhiễm virus trong môi trường có pH cao, thậm chí số

lượng thể vùi bị giảm đáng kể do vỏ protein của thể vùi hiện có bị phá huỷ giải

phóng ra các thể virus hoạt động (virion). Tác giả này cũng chỉ rõ yêu cầu về pH

thích hợp cho lây nhiễm rất khác nhau tùy theo dòng tế bào của từng loài côn trùng.

Đánh giá khả năng hình thành thể vùi của NPV sâu khoang khi lây nhiễm ở

các điều kiện pH môi trường khác nhau, qua tiến hành lây nhiễm NPV sâu khoang

với số lượng thể vùi là 0,1 x 108 OB/ml trên dịch tế bào sâu khoang có hàm lượng

1,0 x 108 tế bào/ml.

Kết quả (Bảng 3.19) cho thấy ở thời điểm 1 ngày sau lây nhiễm, số lượng thể

vùi hình thành thu được cao nhất, đạt tới 0,44 x 108 OB/ml ở điều kiện pH là 7,0.

Còn ở mức pH là 6,0 và 6,5 hàm lượng thể vùi chỉ đạt tương ứng 0,27 và 0,32 x 108

OB/ml (bảng 3.19). Đặc biệt, ở điều kiện pH môi trường lây nhiễm là 7,5 số lượng

thể vùi chỉ đạt 0,21 x 108 OB/ml.

100

Bảng 3.19. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV

trên tế bào sâu khoang ở các mức pH môi trường khác nhau

Công pH môi trường Số lượng thể vùi hình thành

thức lây nhiễm ở các ngày sau lây nhiễm (OB/ml)

Sau 1 ngày Sau 3 ngày Sau 6 ngày

1 6,0 0,27 x 108 c 1,78 x 108 b 0,62 x 108 d

2 6,5 0,32 x 108 b 1,94 x 108 b 0,83 x 108 c

3 7,0 0,44 x 108 a 2,17 x 108 a 1,83 x 108 a

4 7,5 0,21 x 108 c 1,85 x 108 a 0,71 x 108 b

CV (%) 1,119 1,184 0,946

0,466 0,721 0,136 LSD0,05

Ghi chú: OB: Thể vùi; Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ

sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Sau 3 ngày lây nhiễm, số lượng thể vùi hình thành đạt mức cao nhất ở cả 4

công thức thí nghiệm, lên tới 2,17 x 108 OB/ml khi môi trường lây nhiễm có pH =

7,0 và 1,94 x 108 OB/ml khi pH = 6,5. Trong khi đó, ở môi trường có độ pH là 6,0

và 7,5 số lượng thể vùi đạt tương ứng là 1,78 và 1,85 x 108 OB/ml. Kết quả thí

nghiệm cho thấy số thể vùi hình thành cao ở môi trường có giá trị pH = 7,0.

Đến thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm, số lượng thể vùi ở tất cả các công thức

pH đều có biểu hiện giảm xuống một cách rõ rệt, nhưng vẫn cao hơn so với thời

điểm 1 ngày sau lây nhiễm. Với mức pH là 7,0 số lượng thể vùi hình thành vẫn đạt

cao nhất 1,83 x 108 OB/ml, tiếp đến là pH = 6,5 với số lượng thể vùi đạt 0,83 x 108

OB/ml. Trong khi đó, ở điều kiện pH là 6,0 và 7,5 số thể vùi chỉ đạt 0,62 và 0,71 x

108 OB/ml (tương ứng) (Bảng 3.19).

Như vậy, có thể xác định điều kiện pH thích hợp cho lây nhiễm NPV để đạt

số lượng thể vùi cao khi pH môi trường ở mức trung tính (pH = 7,0) và thời điểm

thích hợp để thu hoạch thể vùi là 3 ngày sau lây nhiễm (bảng 3.19).

Tổng hợp từ các kết quả thí nghiệm nêu trên cho thấy điều kiện thích hợp để

phát triển sinh khối thể vùi NPV sâu khoang có hiệu quả cần đáp ứng theo các

101

thông số kỹ thuật chủ yếu sau đây:

- Nồng độ tế bào khi nhiễm 1,0 x 108 tế bào/ml

- Chỉ số MOI khi lây nhiễm là 0,1

- Thời gian ủ lây nhiễm thích hợp trong 3 ngày

- Môi trường thích hợp cho lây nhiễm là Excell 420-14419C

- Nhiệt độ lây nhiễm thích hợp ở 280C.

- pH môi trường thích hợp cho lây nhiễm là 7,0

3.2.2.2. Mức độ phát triển sinh khối tế bào và hình thành thể vùi trong quá trình lây

nhiễm virus nhân đa diện (NPV)

Zitzmann et al. (2017) chỉ rõ nếu sử dụng chỉ số MOI thấp (<0,1) thì quá

trình lây nhiễm virus ở giai đoạn ban đầu tế bào tiếp tục phân chia và tỷ lệ tế bào bị

nhiễm không nhiều, sau thời gian nhất định quá trình lây nhiễm của virus chiếm ưu

thế và hầu hết tế bào sẽ bị nhiễm virus. Nếu sử dụng chỉ số MOI ≥ 1 thì hầu hết (tới

95%) tế bào bị nhiễm virus ngay sau khi nhiễm [84]. Tìm hiểu mức độ phát triển

sinh khối của tế bào trong quá trình lây nhiễm NPV theo chỉ số MOI khác nhau.

Kểt quả (bảng 3.20) cho thấy trong môi trường lây nhiễm tế bào sâu khoang

vẫn phân chia và phát triển sinh khối nhưng với mức độ thấp. Với mật độ tế bào ban

đầu trước khi lây nhiễm NPV là 1,0 x 108 tế bào/ml, sau 1 ngày lây nhiễm mật độ tế

bào ở các công thức thí nghiệm đã giảm xuống một cách đáng kể. Tại công thức lây

nhiễm với chỉ số MOI = 0,1 mật độ tế bào từ 1,0 x 108 tế bào/ml trước khi nhiễm

virus giảm xuống còn 0,716 x 107 tế bào/ml, còn ở công thức chỉ số MOI = 0,3 và

0,5 mật độ tế bào giảm nhiều hơn, còn tương ứng là 0,551 và 0,508 x 107 tế bào/ml.

Rõ ràng các thể hoạt động (virion) của NPV đã sử dụng số lượng lớn tế bào để thực

hiện quá trình tái tổ hợp virus, từ đó hình thành các thể vùi mới. Trong khi đối

chứng không nhiễm NPV thì mật tế bào tăng lên tới 1,203 x 108 tế bào/ml với mức

tăng 1,203 lần so với ban đầu.

Trái lại, số lượng thể vùi NPV hình thành sau lây nhiễm 1 ngày đã ở mức

khá cao. Ở công thức chỉ số MOI = 0,1, số lượng thể vùi đạt 1,17 x 108 OB/ml tăng

gấp 11,7 lần với ban đầu; còn ở công thức lây nhiễm với chỉ số MOI là 0,3 và 0,5 số

102

lượng thể vùi đạt tương ứng là 1,25 và 1,41 x 108 OB/ml, với mức tăng tương ứng là

41,67 và 28,2 lần so với số lượng ban đầu đưa vào lây nhiễm (Bảng 3.20).

Như vậy, chỉ sau 1 ngày lây nhiễm số thể vùi NPV sâu khoang tăng với tốc

độ nhanh trong khi mật độ tế bào trong sinh khối giảm. Rõ ràng NPV đã sử dụng tỷ

lệ đáng kể số lượng tế bào trong dịch nhiễm để phát triển sinh khối virus, dẫn tới

mật độ tế bào trong dịch nhiễm giảm đi. Đồng thời, khi lây nhiễm, sự có mặt của

NPV đã làm thay đổi đáng kể điều kiện môi trường sống của tế bào, làm ảnh hưởng

đến quá trình tái tổ hợp của tế bào dẫn tới mật độ tế bào giảm đi. Kết quả theo dõi

của thí nghiệm cũng tương tự như nghiên cứu của Kanokwan et al. (2003) [79] và

Lynn (2003) [85] đã công bố.

Theo dõi tại thời điểm 3 ngày sau lây nhiễm, cho thấy mật độ tế bào giảm rõ

rệt so với ban đầu khi nhiễm. Trong đó, ở công thức có chỉ số lây nhiễm MOI là 0,1

mật độ tế bào giảm còn 1,084 x 106 tế bào/ml (giảm 108,4 lần) và số lượng thể vùi

đạt tới 1,58 x 108 OB/ml, tăng 158 lần so với số lượng ban đầu (Bảng 3.20).

Trong khi đó, ở công thức lây nhiễm với chỉ số MOI = 0,3 thì mật độ tế bào

còn 0,887 x 106 tế bào/ml, giảm 88,7 lần so với mật độ ban đầu. Còn số lượng thể

vùi hình thành đạt 1,23 x 108 OB/ml tăng 41,0 lần, mức độ tăng thấp hơn hẳn so với

công thức lây nhiễm với chỉ số MOI là 0,1 (158 lần).

Tại công thức MOI = 0,5, mật độ tế bào giảm còn 0,769 x 106 tế bào/ml

(giảm 76,9 lần so với ban đầu) và hàm lượng thể vùi đạt 1,27 x 108 OB/ml (tăng

25,4 lần). Như vậy, sau 3 ngày khi lây nhiễm với chỉ số MOI là 0,1; 0,3 và 0,5 thì

mật độ tế bào giảm lần lượt là 108,4; 88,7 và 76,9 lần, còn số lượng thể vùi hình

thành tăng tương ứng 158,0; 41,0 và 25,4 lần (Bảng 3.20).

Kết quả theo dõi vào thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm, nhận thấy mật độ tế

bào ở các công thức thí nghiệm giảm đi rõ rệt, tương ứng với 3 công thức chỉ số

MOI là 0,1; 0,3 và 0,5 mật độ tế bào chỉ còn 0,280, 0,256 và 0,264 x 106 tế bào/ml.

Đồng thời, số lượng thể vùi cũng biểu hiện giảm tuy không nhiều so với thời điểm 3

ngày sau lây nhiễm, tương ứng với 3 công thức lây nhiễm theo chỉ số MOI hàm

lượng thể vùi chỉ đạt 1,28; 1,10 và 1,13 x 108 OB/ml (Bảng 3.20).

103

Bảng 3.20. Mật độ tế bào sâu khoang và số thể vùi hình thành

sau các ngày lây nhiễm NPV theo chỉ số MOI khác nhau

Sau nhiễm 1 ngày Sau nhiễm 3 ngày Sau nhiễm 6 ngày Công

thức Tế bào Thể vùi Tế bào Thể vùi Tế bào Thể vùi

thí (x 107 tế (x 108 (x 106 tế (x 108 (x 106 tế (x 108

nghiệm bào/ml) OB/ml) bào/ml) OB/ml) bào/ml) OB/ml)

MOI 0,1 0,716 a 1,17 b 1,084 a 1,58 a 0,280 a 1,28 a

MOI 0,3 0,551 b 1,25 b 0,887 b 1,23 b 0,256 b 1,10 b

MOI 0,5 0,508 b 1,41 a 0,769 b 1,27 b 0,264 b 1,13 b

Đ/C 1,203 - 1,206 - 1,180 -

CV (%) 2,551 0,458 1,673 0,393 6,428 4,251

0,123 0,108 0,155 0,478 0,500 0,636 LSD0,05

Ghi chú: Đ/C: Đối chứng là dịch tế bào, không nhiễm NPV.

OB: Thể vùi; Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai

khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Như các tác giả Goodman et al. (2001) [115] và Petchprakob et al. (2007)

[59] đã chỉ rõ, số lượng thể vùi sau 6 ngày lây nhiễm giảm do liên quan đến sự tăng

lên nhanh chóng của pH trong dịch nhiễm đã làm cho một bộ phận thể vùi bị phá

vỡ. Đồng thời, cùng với sự xâm nhiễm của virus và môi trường dinh dưỡng đã giảm

mạnh, không còn đủ đáp ứng nhu cầu cho tế bào duy trì sự phát triển sinh khối đã

làm giảm trực tiếp ở mức đáng kể về mật độ tế bào trong quá trình lây nhiễm.

Như vậy, với kết quả thí nghiệm nêu trên cho thấy hoàn toàn có thể lây

nhiễm có hiệu quả NPV trên tế bào sâu khoang nhân nuôi và thời điểm thu hoạch

thể vùi NPV thích hợp vào 3 ngày sau lây nhiễm. Đồng thời, kết quả thí nghiệm

cũng cho thấy triển vọng cho phép sản xuất sinh khối thể vùi số lượng lớn với qui

mô công nghiệp như khẳng định của các tác giả Elanchezyan (2009) [11], Goodman

et al. (2001) [115] và Kanokwan et al. (2003) [79] khi đánh giá về tiềm năng của

công nghệ nuôi nhân tế bào để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học NPV để phòng trừ

sâu hại cây trồng.

104

3.2.2.3. Mức độ gây chết sâu khoang và hình thành thể vùi của NPV khi nhân trên

tế bào và trên sâu

• Hiệu quả gây chết sâu khoang của NPV nhân trên tế bào và trên sâu

Theo Rohrmann và George (2011) [5], khi virus xâm nhiễm đầu tiên vào nhu

mô tế bào ruột giữa thì cơ chế miễn dịch trong cơ thể sâu sẽ được kích hoạt, hình

thành prophenoloxidase ức chế hoạt lực của virus và giảm bùng phát số lượng virus.

Ngoài ra, với sự hiện diện RNAi của sâu giúp ngăn cản sự xâm nhiễm RNA của

virus trong cơ thể sâu. Tuy nhiên, khả năng miễn dịch của cơ thể sâu còn tuỳ thuộc

tuổi sâu và từng loài côn trùng, biểu hiện ở tính đa dạng chủng và hoạt lực của các

chủng trong tự nhiên, nhưng khi nhiễm virus trên tế bào nhân nuôi thì khả năng

miễn dịch của tế bào rất yếu nên hoạt lực của virus hầu như không bị thay đổi.

Trong những năm trước đây, tại Việt Nam cũng như Ấn Độ việc sản xuất chế

phẩm nhằm khai thác tiềm năng của NPV để phòng trừ sâu hại cây trồng theo

phương pháp thủ công, bằng cách nuôi sâu số lượng lớn rồi nhiễm virus sau đó

nghiền lọc tạo dung dịch đem phun trừ sâu hại ngoài đồng ruộng. Tuy nhiên, hiệu

lực trừ sâu thường không cao và không ổn định [101, 102, 106].

Bảng 3.21. Hiệu lực trừ sâu khoang của các nguồn NPV được tạo ra từ lây nhiễm trên tế bào và trên sâu khoang

Hiệu lực trừ sâu khoang ở các ngày sau phun (%) Công thức Số sâu nhiễm

thí nghiệm (con) 2 ngày 3 ngày 6 ngày 10 ngày

NPV từ tế bào 150 27,71 b 41,56 a 76,27 a 62,13 a

NPV từ sâu 150 19,28 a 36,36 b 64,41 b 54,27 b

Đối chứng 150 - - - -

CV (%) 6,367 2,931 4,033 4,228

0,742 0,986 1,598 1,648 LSD0,05

Ghi chú: Đối chứng phun nước cất vô trùng. Trong cùng cột, các giá trị kèm

chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Nhằm tìm hiểu và so sánh hoạt lực của NPV sâu khoang được tạo ra theo

phương pháp truyền thống và theo công nghệ nuôi nhân tế bào, thí nghiệm tiến

105

hành trong phòng tại Viện Bảo vệ thực vật trong năm 2017. Kết quả (Bảng 3.21)

cho thấy khi lây nhiễm NPV tạo ra từ tế bào, hiệu lực trừ sâu khoang đạt 27,71%

sau 2 ngày, 41,56% sau 3 ngày, đạt cao nhất tới 76,27% sau 6 ngày và vẫn đạt

62,13% sau 10 ngày lây nhiễm.

Đối với NPV tạo ra từ sâu theo phương pháp truyền thống, hiệu lực trừ sâu

khoang đạt thấp hơn hẳn so với NPV tạo ra từ tế bào, chỉ đạt 19,28% sau 2 ngày,

36,36% sau 3 ngày, 64,41% sau 6 ngày và đạt 54,27% sau 10 ngày. Hiệu lực trừ sâu

khoang của NPV tạo ra từ sâu thấp có thể liên quan đến hoạt lực của virus đã bị ức

chế trong quá trình tạo sinh khối trên sâu non như Rohrmann (2011) đã nêu.

• Số lượng thể vùi hình thành của NPV nhân trên tế bào và trên sâu khoang

Đánh giá khả năng hình thành thể vùi trung bình của 10 sâu chết sau khi sử

dụng 2 nguồn NPV nói trên. Kết quả (Bảng 3.22) cho thấy số lượng thể vùi hình

thành trên sâu chết do NPV được nhân sinh khối từ sâu non sâu khoang đạt trung

bình 200,3 thể vùi/sâu, với nguồn NPV được nhân sinh khối từ tế bào số lượng thể

vùi hình thành trung bình đạt 241,1 OB/sâu, gấp 1,2 lần so với lượng thể vùi hình

thành khi nhiễm nguồn NPV tạo ra từ sâu.

Có sự khác nhau như vậy có thể NPV qua phát triển sinh khối từ tế bào có

hoạt lực sinh học cao hơn so với nguồn NPV tạo ra từ sâu. Có thể liên quan đến khả

năng miễn dịch của cơ thể sâu như Rohrmann (2011) [5] đã xác định, tuy nhiên

cũng cần được tiếp tục nghiên cứu tìm hiểu sâu thêm.

Bảng 3.22. Số lượng thể vùi hình thành từ các nguồn NPV

tạo ra từ lây nhiễm trên tế bào và trên sâu khoang

Công thức Số thể vùi hình thành Số thể vùi trung Xuất xứ sau nhiễm 10 ngày bình (OB/sâu) thí nguồn NPV nghiệm (OB/10 sâu)

I NPV tạo ra từ tế bào 2.411 241,1

II NPV tạo ra từ sâu 2.003 200,3

III Đối chứng 0 0

Ghi chú: Đối chứng phun nước cất vô trùng

106

Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy sau khi sâu chết do NPV sẽ giải phóng

một lượng đáng kể thể vùi ra ngoài đồng ruộng, tạo tiềm năng to lớn trong việc tăng

cường số lượng tác nhân sinh học hữu ích trong sinh quần đồng ruộng.

Như vậy, nguồn NPV tạo ra qua nhân sinh khối trên tế bào sẽ cho hiệu quả

trừ sâu khoang đạt cao nhất 76,27% vào 6 ngày sau phun và cho hàm lượng thể vùi

hình thành trên sâu đạt trung bình 241,1 OB/sâu sau khi chết

3.2.2.4. Hiệu lực trừ sâu khoang của chủng virus TL.1a nhân trên tế bào

Nhằm hướng tới sản xuất thuốc sinh học virus nhân đa diện (NPV) trên cơ sở

lây nhiễm trên tế bào sâu khoang nuôi nhân, việc lựa chọn chủng NPV có hoạt lực

sinh học cao là vấn đề cần thiết như Grzywacz et al (1996) [12] đã chỉ rõ. Một thí

nghiệm nhằm đánh giá lại hiệu lực trừ sâu của các chủng NPV đã lựa chọn và lưu

giữ qua phân lập tuyển chọn được tiến hành trong năm 2017 trên cơ sở so sánh hiệu

lực gây chết sâu khoang của các chủng TL.1a khi nhân sinh khối từ tế bào và TL.1a,

TL.2a và TL.3a tạo ra sau khi lây nhiễm trên sâu non sâu khoang.

Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.23 chỉ rõ sau 3 ngày lây nhiễm,

hiệu lực gây chết sâu của các chủng NPV đạt từ 27,33 - 43,33%, trong đó chủng

TL.1a từ sâu có hiệu lực gây chết sâu khoang cao nhất đạt 43,33% nhưng chỉ đạt

38,63% khi nhân trên tế bào. Trong khi đó, hai chủng nhân từ sâu là TL.2a và TL.3a

có hiệu lực trừ sâu thấp, chỉ đạt 27,33% và 35,00% (tương ứng).

Tại thời điểm 7 ngày sau nhiễm, hiệu lực gây chết sâu khoang của TL.1a khi

nhân sinh khối trên tế bào tăng cao, đạt tới 52,89%, nhưng khi nhân sinh khối trên

sâu chỉ đạt 46,0%. Hiệu lực trừ sâu của các chủng TL.2a và TL.3a nhân từ sâu đạt

tỷ lệ sâu chết thấp hơn, tương ứng là 37,33 và 46,67%. (Bảng 3.23)

Đến thời điểm 10 ngày sau lây nhiễm, hiệu lực trừ sâu khoang ở các công

thức đạt từ 69,00 - 80,47%. Trong đó, hiệu lực cao nhất là TL.1a nhân sinh khối

trên tế bào đạt tới 80,47%, tiếp theo là TL.2a từ sâu đạt 69,0%. Còn TL.1a và TL.3a

từ sâu cùng đạt tỷ lệ trừ sâu khoang đạt tương ứng 78,67% và 76,67%.

Như vậy, trong số các nguồn virus nói trên, nguồn NPV tạo ra từ việc lây

nhiễm trên tế bào nuôi nhân có hiệu lực trừ sâu khoang cao hơn so với nguồn NPV

tạo ra từ việc lây nhiễm trên sâu. Kết quả thí nghiệm cũng chỉ rõ trong số 3 chủng

107

NPV được nhân sinh khối từ sâu non, chủng TL.1a vẫn cho hiệu quả gây chết sâu

cao và ổn định (Bảng 3.23).

Bảng 3.23. Hiệu lực trừ sâu khoang của các chủng NPV

được nhân sinh khối trên tế bào và trên sâu khoang

Hiệu lực gây chết sâu khoang Số thể vùi

ở các ngày sau nhiễm (%) Nguồn NPV trước nhiễm

(x 108 OB/ml) 3 ngày 7 ngày 10 ngày

TL.1a từ tế bào 1,50 38,63 b 52,89 a 80,47 a

TL.1a từ sâu 1,50 43,33 a 46,00 b 78,67 a

TL.2a từ sâu 1,50 27,33 d 37,33 c 69,00 b

TL.3a từ sâu 1,50 35,00 c 46,67 b 76,67 a

Đối chứng 1,50 - - -

CV (%) 4,43 2,99 2,99

7,1921 9,7271 8,5457 LSD0,05

Ghi chú: OB: Thể vùi; NSN: Ngày sau nhiễm; Trong cùng cột, các giá trị

kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Kết quả thí nghiệm một lần nữa cho phép khẳng định tính ổn định về hiệu

lực trừ sâu khoang của chủng TL.1a đã được tuyển chọn, đồng thời cũng cho thấy

tiềm năng của chủng TL.3a cần tiếp tục nghiên cứu khai thác.

Tuy nhiên, qua phân tích thống kê thì hiệu quả trừ sâu khoang của TL.1a từ

tế bào sai khác một cách có ý nghĩa ở mức LSD ≤ 0,05% tại thời điểm quan sát 3 và

7 ngày sau lây nhiễm, nhưng không có sự sai khác giữa các công thức ở thời điểm

10 ngày khi sau lây nhiễm trên sâu khoang của các chủng virus.

Nghiên cứu của Bedjo (2017) tại East Java (Indonesia) về các chủng NPV

phòng trừ sâu khoang trên đậu tương xác định chỉ có 2 trong số 8 chủng cho hiệu

quả trừ sâu cao (tương ứng 78,5 và 82,1%) [120]. Còn Trần Văn Hai et al. (2010)

xác địn chỉ có 2 trong số 5 chủng phân lập có hiệu quả cao (94,5%) [104]. Qua kết

quả đánh giá nêu trong bảng 3.23 có thể thấy rõ sự khác nhau và tính ổn định về

hiệu quả trừ sâu khoang của 3 chủng phân lập.

108

3.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang và tạo chế phẩm dạng bột

thấm nước

3.3.1. Tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang

Các kết quả nghiên cứu ở các nước đều khẳng định liều lượng sử dụng NPV

phải tính theo tổng lượng thể vùi cho 1 ha cây trồng, liều lượng thể vùi cần phun cho 1

ha cây trồng để trừ sâu hại tùy theo từng đối tượng sâu hại khác nhau, đối với sâu

khoang và sâu keo da láng, tới 9,0 x 1011 OB/ha, còn đối với sâu xanh phải từ 1,5- 3,0 x

1012 OB/ha tùy theo từng loại cây trồng [12, 32, 34, 89, 115, ....].

Như vậy, việc tạo dạng sản phẩm để sử dụng phòng trừ sâu hại chủ đích có thể

có những khác nhau, nhưng nhiều tác giả đều khẳng định liều lượng sản phẩm sử dụng

có thể nhiều hay ít tùy theo công nghệ tạo dạng, nhưng cần phải đảm bảo được số

lượng thể vùi phun rải cho 1 ha đối với từng loài sâu hại cụ thể. Điều đó đòi hỏi nguyên

liệu thể vùi NPV phải được định lượng một cách chủ động trước khi tạo dạng. Có như

vậy mới có thể đảm bảo chế phẩm có chất lượng ổn định và hiệu quả cao trong phòng

trừ sâu hại khi sử dụng trên đồng ruộng.

Theo Lynn (2002) [30], Huda et al. (2012) [118], Nazli et al. (2012) [119]

thì SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) là một tác nhân tạo sủi với pH =7,0 nên rất

hiệu quả trong việc phân lập thể vùi tinh từ dịch thể vùi sau khi nhiễm NPV vì SDS

có tác dụng giúp cân bằng sinh lý tế bào, không gây phá vỡ vỏ protein của thể vùi

và chống hiện tượng kết mảng thể vùi sau khi phân lập thể vùi tinh.

Sajap et al. (2000) [14] cho rằng sử dụng SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) để

thu hoạch thể vùi tinh từ dịch nhiễm vừa có hiệu quả cao do chúng làm cho thể vùi

tách rời nhau, vừa dễ phân bố đồng đều trong phụ gia khi tạo dạng sản phẩm. Đồng

thời, bằng kỹ thuật thu hoạch thể vùi tinh còn tạo điều kiện bảo quản hiệu quả lâu

dài và dễ dàng vận chuyển đi xa đến nơi tiêu thụ sản phẩm mới tạo dạng mà chưa

cần phải tạo dạng sử dụng sản phẩm ngay.

Nhận thức rõ việc xác định được kỹ thuật phân lập thể vùi tinh là khâu kỹ

thuật hết sức quan trọng và có tính thực tiễn cao trong chuỗi công đoạn của quá

trình phát triển chế phẩm NPV. Tuy nhiên, vấn đề này chưa có tài liệu nào công bố

một cách đầy đủ. Để đạt được điều này, đề tài đã cố gắng tìm giải pháp tinh sạch để

109

thu hoạch thể vùi từ dịch tế bào đã nhiễm vi rút bằng các phương thức ly tâm 1.500

vòng/phút bằng nước cất kết hợp sử dụng SDS 0,1%, mỗi lần ly tâm với nước cất

hoặc SDS trong thời gian 5 phút.

Kết quả thí nghiệm với 7 công thức tinh sạch thể vùi khác nhau đối với dịch

thể vùi NPV thu hoạch sau khi nhiễm trên tế bào nhân nuôi được qua xác định đạt

2,8 x 108 OB/ml ở thời điểm 6 ngày sau lây nhiễm. Kết quả bảng 3.24 cho thấy khi

tinh sạch thể vùi, nếu sử dụng từ 2 – 4 lần nước cất vô trùng thì số lượng thể vùi

tinh thu được từ 1,04 - 1,80 x 108 OB/ml. Điều đó có nghĩa lượng thể vùi bị loại bỏ

đi khá nhiều, tỷ lệ thu hồi chỉ đạt 37,14- 64,29% số thể vùi có được trước khi đưa

vào tinh sạch (Bảng 3.24).

Nếu áp dụng tinh sạch 2 lần, gồm 1 lần nước cất vô trùng và 1 lần SDS 0,1%

và ly tâm trong thời gian 5 phút sau mỗi lần pha loãng, hàm lượng thể vùi tinh thu

được đạt từ 2,33 x 108 OB/ml, tức thu hồi được 83,21% lượng thể vùi trước tinh

sạch. Nếu thực hiện 3 lần gồm: 2 lần nước cất xen kẽ với 1 lần SDS và ly tâm trong

thời gian 5 phút/lần thì lượng thể vùi thu hồi được là cao nhất, tới 2,71 x 108 OB/ml

với tỷ lệ thu hồi thể vùi đạt 96,79% lượng thể vùi ban đầu.

Khi sử dụng 4 lần, gồm: 2 lần SDS 0,1% xen kẽ với 2 lần nước cất và ly tâm

trong thời gian 5 phút/lần thì hàm lượng thể vùi có thể đạt 2,10 x 108 OB/ml, với tỷ

lệ thu hồi 75,0%. Thực hiện 5 lần, gồm: 2 lần SDS xen kẽ với 3 lần nước cất, số

lượng thể vùi thu hồi được là 2,35 x 108 OB/ml, tương đương tỷ lệ thể vùi thu hồi

đạt 83,93% (Bảng 3.26).

Như vậy, thực hiện tinh sạch 2 lần bằng nước cất xen kẽ với 1 lần SDS và ly

tâm trong thời gian 5 phút với tốc độ 1.500 vòng/phút sau mỗi lần pha loãng thì

lượng thể vùi thu hồi đạt cao nhất, tới 2,71 x 108 OB/ml tương ứng với tỷ lệ thu hồi

thể vùi đạt 96,79% so với số lượng thể vùi ban đầu có trong dịch nhiễm.

Cách làm này cho phép tỷ lệ thu hồi thể vùi cao hơn so với phương pháp của

Kanokwan et al. (2004) [89] khi tinh sạch thể vùi NPV bằng cách ly tâm với tốc độ

cao tới 5.000 vòng/phút để loại bỏ môi trường khi lây nhiễm, sau đó ly tâm lại bằng

nước cất, thì tỷ lệ thu hồi thể vùi chỉ đạt 90,5%. Tuy nhiên, qui trình thực hiện của

Kanokwan et al. (2004) đơn giản, ít phức tạp hơn vì chỉ cần thực hiện qua 2 bước là

110

hoàn thành việc tinh sạch [89].

Bảng 3.24. Số lượng thể vùi sâu khoang và tỷ lệ thu hồi

sau tinh sạch theo các phương pháp khác nhau

Công thức Phương pháp tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang Tỷ lệ thu hồi (%)

2 lần bằng nước cất Số lượng thể vùi (x 108 OB/ml) 1,04 37,14 1

3 lần bằng nước cất 1,50 53,57 2

4 lần bằng nước cất 1,80 64,29 3

2 lần: nước cất - SDS 2,33 83,21 4

3 lần: nước cất- SDS- nước cất 2,71 96,79 5

5 lần: nước cất- SDS- nước cất- SDS- nước cất

4 lần: SDS- nước cất- SDS- nước cất 2,40 85,71 6

2,35 83,93 7

Ghi chú: SDS: Sodium Dodecyl Sulfate; OB: Thể vùi.

Các thể vùi NPV sau khi tinh sạch có màu trắng đục dạng bột nhão, dễ dàng

600X

200X

quan sát dưới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 200X và 600X (Hình 3.8)

Hình 3.10: Thể vùi NPV sâu khoang sau khi tinh sạch

khi quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 200X và 600X

Với lượng thể vùi thu được qua tinh sạch sẽ rất dễ dàng cho việc tạo sản

phẩm dạng bột thấm nước, dịch lỏng hoặc để đông khô phục vụ bảo quản lâu dài vì

thể tích để bảo quản thể vùi tinh sẽ ít hơn (Hình 3.9). Vì từ dịch thể tế bào nuôi

nhân sau khi nhiễm vi rút NPV (sản xuất theo công nghệ tế bào) hoặc từ dịch

nghiền sâu non chết sau khi nhiễm NPV (sản xuất theo công nghệ truyền thống), sau khi tinh sạch thể vùi sẽ cho phép dễ dàng trong bảo quản và tạo dạng sử dụng

111

chế phẩm khác nhau với hàm lượng thể vùi như đã được dự kiến cho 1 ha cây trồng

cần phòng trừ sâu khoang. Đặc biệt, dễ dàng tạo dạng bột thấm nước với hàm lượng

thể vùi trong chế phẩm như mong muốn.

• Giải trình tự gen NPV sâu khoang bằng kỹ thuật PCR

Phân tích trình tự gen bằng kỹ thuật PCR đối với 4 mẫu NPV sâu khoang

nhân trên tế bào (ký hiệu SplNPV từ 2-5) và 1 mẫu NPV từ sâu non chết (SplNPV 6),

so sánh với 9 trình tự gen SplNPV đã công bố của các nước Ấn độ, Nhật Bản, Hàn

Quốc, Đức, Australia và Pháp cùng với trình tự gen của virus hạt PiraGV trên sâu

Pieris rapae làm đối chứng.

Khoảng cách di truyền giữa các trình tự được xác định dựa trên mô hình thay

thế Kimura, độ tin cậy của các nhành được xác định bằng giá trị bootstrap, biểu diễn

bằng giá trị % với 1000 lần lặp lại trong phần mềm MEGA 6.0.

1

2

4

3

5

6 M

510 bp

M: Marker, 100 bp, Fermentas; 1: H2O (negative control); Mẫu 2- 5: NVP tế bào; Mẫu 6: NPV của sâu non bị bệnh

Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR các mẫu NPV trên tế bào và sâu

Các trình tự kết quả được BLAST so sánh bằng công cụ trực tuyến trên Ngân

hàng gen (NCBI). Qua so sánh, cả 5 mẫu phân tích đều có trình tự gen hoàn toàn tương

tự nhau (hình 3.9) và đều thuộc loài Spodoptera litura Nucleo Polyhedrosis Virus

(NPV sâu khoang), giống Alphabaculovirus, họ Baculoviridae với độ tương đồng

100% khi so sánh trình tự gen NPV trên ngân hàng GenBank và cùng nhánh với trình

tự gen NPV trên sâu khoang Ấn Độ (Hình 3.10).

112

Bảng 3.25. Các chủng NPV sâu khoang sử dụng trong phân tích phả hệ

Tên mẫu Mã số Nguồn vi rút Nguồn gốc phân tích GenBank

- Việt Nam Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene Từ SplNPV-2 đến NPVSpl-5

Spodoptera litura NPVSpl-6 - Việt Nam nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene (sâu chết bệnh)

Spodotera litura nuclear polyhydrosis SpltNPV-In X94437 Ấn Độ virus polh gene for polyhedrin

Spodoptera litura NPV gene for SpltNPV-Jap AB326102 Nhật Bản polyhedron

Spodoptera litura SpltNPV-Kore DQ152923 Hàn Quốc nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene

Spodoptera litura SpltNPV-Kore DQ350142 Hàn Quốc nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene

Spodoptera litura SpltNPV-Ger AY706714 Đức nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene

Spodoptera litura SpltNPV- Ger AY706715 Đức nucleopolyhedrovirus polyhedrin gene

Spodoptera litura nuclear polyhedrosis SpltNPV-Aus AF068189 Australia virus polyhedrin (polh) gene

SpltNPV- Fra D01017 Pháp Spodoptera littoralis NPV gene for nuclear polyhedron

Pieris rapae granloviruses PiraGV AY706673 -

Hình 3.12: Thể vùi sau tinh sạch (A), được đưa vào lọ bảo quản (B)

113

SpltNPV - Jap ( AB326102) SpltNPV - Jap ( AB326102)

95 95

SpltNPV - Ger ( AY706715) SpltNPV - Ger ( AY706715)

100 100

SpltNPV - Ger ( AY706714) SpltNPV - Ger ( AY706714)

SpltNPV - Aus ( AF068189) SpltNPV - Aus ( AF068189)

100 100

SpltNPV - Kore ( DQ152923) SpltNPV - Kore ( DQ152923)

SpltNPV - Kore ( DQ350142) SpltNPV - Kore ( DQ350142)

99 99

SpltNPV - Fra (D01017) SpltNPV - Fra (D01017)

SpltNPV - In (X94437) SpltNPV - In (X94437)

SpltNPV - SpltNPV - 2- 5

100 100

SpltNPV - 6 SpltNPV - 5

100 100

PiraGV (AY706673) PiraGV (AY706673)

0.05 0.05

Hình 3.13. Cây phả hệ dựng theo phương pháp Neighbor-joining.

Ghi chú: So sánh trình tự gen polh với các đại diện từ Ngân hàng Gen. Mẫu vi rút

NPV sâu khoang của Việt Nam được in đậm (mũi tên). Tên mẫu phân tích được chỉ

rõ ở bảng 1, mã số Ngân hàng Gen đặt trong dấu ngoặc đơn. Virus Pieris rapae

granuloviruses của sâu xanh bướm trắng được đưa vào làm đối chứng. Gốc nhánh

là giá trị thống kê Bootstrap với 1000 lần lặp (chỉ ghi những giá trị lớn hơn 80%).

Thước đo khoảng cách di truyền 5%.

3.3.2. Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước

Theo Grzywacz, et al. (1996) [12], dù tạo dạng sử dụng theo cách nào và

định hướng liều lượng sử dụng chế phẩm là bao nhiêu thì mục tiêu cuối cùng vẫn

phải đảm bảo tổng lượng thể vùi phun rải cho 1 ha cây trồng đạt từ 9 x 1010 đến 1 x

1012 OB/ha. Hơn nữa, theo Cisneros et al. (2002) [94], việc bổ sung axit Boric sẽ

góp phần duy trì độ pH trong chế phẩm ở mức thấp ≤ 7,0 để thể vùi không bị công

phá và giúp bảo vệ thể vùi không bị diệt khi bị tác động của ánh sáng cực tím. Điều

này cũng thể hiện rõ trong kết quả công bố của Salama et al. (2017) [120]. Kết quả

nghiên cứu của Winardo và Soebandrijo (2006) [121] đã chỉ rõ thành phần phụ gia

tạo dạng chế phẩm có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả trừ sâu, những phụ gia như dầu

cọ, bột mì, bột thạch cao có thể làm giảm hiệu quả từ 15,3- 28,5%, phụ gia tốt nhất

114

có thể sử dụng phải đảm bảo chế phẩm có pH không vượt quá 7,0 như bột tan,

khoáng sét, kaolin và bentonite , v.v.

Với định hướng đó, đề tài đã thử nghiệm tạo dạng sản phẩm dạng bột thấm

nước với phụ gia 2 thành phần gồm 60% bột tan và 40% kaolin được nghiền nhỏ

mịn với kích thước 0,02- 0,05mm. Với hàm lượng thể vùi có trong chế phẩm là 2,0

x 109 OB/gam, tương đương 1 x 1012 OB/ha với liều lượng sử dụng 500 gam/ha

nhằm đáp ứng yêu cầu phòng trừ sâu khoang có hiệu quả như Grzywacz, et al.

(1996) [12] đã chỉ rõ và dễ dàng cho người nông dân khi sử dụng.

Quá trình tạo dạng bột thấm nước của chế phẩm được thực hiện qua các bước:

Bước 1: Xác định số lượng thể vùi cần sử dụng cho 1 ha bằng cách đếm số thể

vùi hiện có sau khi tinh sạch phương pháp pha loãng, nhuộm màu bằng Tryphan

Blue trên buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi. Từ đó tính ra khối lượng thể vùi

tương ứng dựa theo khối lượng cần tạo dạng.

Bước 2: Phối trộn phụ gia, tiến hành phối trộn 60% bột tan với 40% bột kaolin

trên máy trộn trong 3 phút. Nếu tạo chế phẩm (NPV2) bằng cách pha axit Boric

nồng độ 0,5% với nước cất rồi phun với định lượng 50ml cho 1kg bột phụ gia rồi

tiếp tục quay trên máy trộn trong 3 phút.

Bước 3: Trộn thể vùi với phụ gia; bằng cách pha loãng thể vùi tinh trong

50ml nước cất. Sau đó, vừa phun và trộn đều thể vùi vào phụ gia trong thời gian 3

phút tiếp theo. Tiến hành lấy mẫu kiểm tra số lượng thể vùi có trong 1gam chế

phẩm, đồng thời kiểm tra pH và điều chỉnh sao cho pH ≤ 7,0.

Bước 4: Sấy khô và đóng gói: Chế phẩm được sấy khô trong tủ sấy hút gió ở

nhiệt độ ở nhiệt độ 40- 450C trong thời gian 10- 12 giờ cho tới khi độ ẩm ở mức 10-

12%. Sau đó, đóng gói trong bao giấy bạc và bảo quản chế phẩm ở nhiệt độ thường

hoặc nhiệt độ từ 5 đến 100C trong khi chờ sử dụng.

Bước 5: Đặt tên cho chế phẩm: Với 2 loại chế phẩm dạng bột thấm nước đã

được tạo ra, đều chứa 2 x 109 OB/gam nhưng thành phần phụ gia có khác nhau. Vì

vậy, để giúp nông dân dễ dàng nhận biết khi sử dụng nên tạm thời đặt tên như sau:

- Chế phẩm không chứa Boric là NPV-1 WP

- Chế phẩm có chứa 0,5% Boric là NPV-2 WP

115

Hình 3.14. Đóng gói chế phẩm NPV-1 WP sau khi tạo dạng sử dụng

Việc sản xuất chế phẩm theo định hướng quản lý hàm lượng thể vùi 2,0 x

109 OB/gam và sử dụng với liều lượng 500 gam/ha để có 1,0 x 1012 OB phun rải

cho 1ha cây trồng sẽ ưu việt hơn vì nhu cầu lượng phụ gia để tạo dạng ít hơn,

thuận tiện cho việc bảo quản, vận chuyển tiêu thụ sản phẩm và tiện dùng cho

người nông dân khi sử dụng chế phẩm để phòng trừ sâu khoang.

Bảng 3.26. Thành phần phụ gia, chất lượng và liều lượng

sử dụng chế phẩm NPV dạng bột thấm nước

Số lượng Liều Nồng độ Thành phần Độ ẩm Chế phẩm thể vùi lượng phụ gia và pH phun (%) (OB/gam) (gam/ha)

60% bột tan, 40% 10-12% NPV-1 WP 2,0 x 109 500 0,1 kaoin 6,8- 7,0

60% bột tan, 40% 10- 12% NPV-2 WP 2,0 x 109 500 0,1 kaoin, 0,5% Boric 6,8- 7,0

Với ý tưởng đó, đề tài đã tạo được 2 loại sản phẩm dạng bột thấm nước có số

lượng thể vùi 2,0 x 109 OB/gam. Thành phần phụ gia tạo dạng của hai sản phẩm NPV

gồm 60% bột tan, 40% kaoin. Sản phẩm có độ ẩm từ 10-12%, pH từ 6,8- 7,0 với

nồng độ phun 0,1% được trình bày qua bảng 3.26, được sử dụng với liều lượng 500

gam/ha. Bao gồm: chế phẩm không có axit Boric (ký hiệu NPV-1 WP) và chế phẩm

có bổ sung thêm 0,5% axit Boric (ký hiệu NPV-2 WP).

3.3.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được

3.3.3.1. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm

116

Đánh giá hiệu lực gây chết sâu khoang của các loại chế phẩm trong điều kiện

phòng thí nghiệm với các liều lượng và nồng độ phun khác nhau được tính toán dựa

trên số lượng thể vùi của vi rút NPV có trong sản phẩm và số lượng cần thiết cho 1

ha như khi sử dụng ngoài đồng ruộng.

Bảng 3.27. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV

sau 6 ngày phun trong điều kiện phòng thí nghiệm

Số sâu Liều lượng Nồng độ Hiệu lực Công Loại đánh giá cho 1 ha phun trừ sâu thức sản phẩm (con/lần nhắc) (gam) (%) (%)

CT 1 NPV-1 WP 100 0,1 81,23 b 500

CT 2 NPV-2 WP 100 0,1 87,14 a 500

CT 3 Đ/c 1: Sâu chết 100 500 sâu 5,0 46,95 c bệnh nghiền lọc

CT 4 Đ/c 2: Nước lã 100 - - -

CV (%) - - 2,534 -

- - 0,692 - LSD0,05

Ghi chú: Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác

có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Qua đánh giá cho thấy (Bảng 3.27) chế phẩm NPV-1 WP đạt 81,23%. Chế

phẩm NPV-2 WP, hiệu lực trừ sâu đạt tới 87,14%, cao hơn hẳn so với NPV-1 WP.

Trong khi đó, đối chứng sử dụng sâu chết NPV nghiền lọc theo phương pháp truyền

thống, hiệu lực phòng trừ sâu khoang rất thấp, chỉ đạt 46,95%.

Kết quả thí nghiệm bước đầu thể hiện rõ hiệu quả của chế phẩm dạng bột

thấm nước đã tạo ra. Đồng thời, cũng chứng minh được hiệu lực trừ sâu của chế

phẩm tạo ra theo phương pháp truyền thống trước đây.

3.3.3.2. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải ngoài nhà lưới

Kết quả đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang trên rau bắp cải của chế phẩm

trong nhà lưới (bảng 3.28) cho thấy: Khi sử dụng chế phẩm dạng bột thấm nước

NPV-1 WP có hàm lượng 2,0 x 109 OB/gam với liều lượng 500 gam/ha (tương

đương với 1,0 x 1012 OB/ha) hiệu quả đạt 81,13% ở thời điểm 7 NSP chế phẩm.

117

Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-2 WP đạt 82,92%, cao hơn so

với hiệu lực trừ sâu của chế phẩm NPV-1 WP là 1,79%. Tuy nhiên, kết quả xử lý

thống kê cho thấy không có sự sai khác có ý nghĩa về hiệu quả phòng trừ sâu

khoang giữa công thức phun chế phẩm NPV-1 WP và NPV-2 WP.

Bảng 3.28. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải

của chế phẩm NPV trong điều kiện nhà lưới

Lượng sử Nồng độ Hiệu lực ở Công Loại chế phẩm dụng 1 ha phun (%) 7NSP (%) thức

CT 1 NPV-1 WP 500 gam 0,1 81,13 a

CT 2 NPV-2 WP 500 gam 0,1 82,92 a

CT 3 Đ/c 1: Sâu chết bệnh nghiền lọc 500 sâu 5,0 47,68 b

CT 4 Đ/c 2: Nước lã - - -

CV (%) - - 0,437

- - 5,180 LSD0,05

Ghi chú: Đ/c: Đối chứng; NSP: Ngày sau phun. Trong cùng cột, các giá trị

kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Trong khi đó, nếu sử dụng sâu chết bệnh do NPV theo phương pháp

truyền thống với liều lượng sử dụng là 500 sâu chết bệnh đem nghiền lọc rồi

phun cho 1ha với nồng độ 5%, hiệu lực trừ sâu chỉ đạt 47,68% (Bảng 3.28). Kết

quả này hoàn toàn tương tự như kết quả thí nghiệm trước đây của tác giả Nguyễn

Văn Cảm et al. (1996a) [8].

Đi sâu tìm hiểu lý do tại sao chế phẩm tạo ra theo phương thức truyền

thống (nghiền sâu chết bệnh rồi phun) có hiệu quả trừ sâu thấp. Qua một thí

nghiệm đã được tiến hành, kết quả (Bảng 3.29) xác định với chế phẩm NPV thu

được từ sâu chết nghiền lọc thì một cá thể sâu khoang sau khi chết hình thành

trung bình 1,01 x 108 OB/10sâu.

Đánh giá khả năng sinh thể vùi của các cá thể sâu chết sau khi phun chế phẩm

(Bảng 3.29), với chế phẩm NPV-1 WP thì số lượng thể vùi hình thành đạt tới 1,13 x

109 OB/10 sâu, chế phẩm NPV-2 WP có số thể vùi đạt 1,12 x 109 OB/10 sâu. Trong

khi đó, các cá thể sâu chết khi phun dịch sâu chết bệnh, số lượng thể vùi chỉ đạt 1,01 x

118

108 OB/10 sâu. Qua phân tích, số lượng thể vùi của sâu chết hình thành sau phun

NPV-1 WP cao gấp 11,19 lần và từ NPV-2 WP gấp 11,09 lần so với số thể vùi

NPV hình thành từ sâu chết bệnh.

Như vậy, nếu sử dụng với liều lượng 500 sâu chết để phun cho 1 ha thì

tổng lượng thể vùi chỉ đạt 5,05 x 1010 OB/ha, thấp hơn 17,82 lần so với lượng

thể vùi cần thiết là 1,2 x 1011 đến 1,0 x 102 OB/ha (Grzywacz et al, 1996) mới có

thể đảm bảo được hiệu quả phòng trừ đối với sâu khoang [12]. Nói cách khác, để

phòng trừ sâu khoang trên đồng ruộng có hiệu quả như mong muốn bằng chế

phẩm tạo ra từ nguồn sâu chết bệnh rồi nghiền lọc thì phải dùng tới 8.910 sâu

mới đạt số lượng thể vùi 1,0 x 1012 OB/ha.

Bảng 3.29. Số lượng thể vùi hình thành trên sâu khoang

trên bắp cải sau khi sử dụng chế phẩm NPV ngoài nhà lưới

Nồng độ thuốc Số lượng thể vùi STT Loại chế phẩm phun (%) (x 108 OB/10sâu)

NPV-1 WP 1 0,1 1,13 a

NPV-2 WP 2 0,1 1,12 a

3 NPV từ sâu chết bệnh nghiền lọc 5,0 1,01 b

4 Đối chứng (nước lã) - -

CV (%) - 1,213

LSD - 5,082

Ghi chú: OB: Thể vùi. Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ

sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Tuy nhiên, với việc sử dụng sâu chết bệnh đem nghiền lọc rồi phun dù sao

cũng có hiệu quả nhất định và có thể khuyến cáo nông dân tự chế biến chế phẩm

NPV bằng cách thu gom sâu chết ngoài đồng đem về nhà chế biến tạo sản phẩm

bằng biện pháp thủ công để phòng trừ sâu hại.

Phương pháp nhân sinh khối thể vùi như nêu trên rõ ràng sẽ gặp khó khăn

và không thể chủ động trong kiểm soát được số lượng thể vùi cần thiết, nên hiệu

quả trừ sâu của sản phẩm nghiền lọc không cao và khó có thể sản xuất chế phẩm

theo hướng công nghiệp.

119

Các kết quả thí nghiệm nêu trên cho thấy sự cần thiết của việc tinh sạch

thể vùi và định hướng tạo chế phẩm có số lượng thể vùi đạt 1,0 x 1012 OB/ha để

có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu khoang hại cây trồng.

3.3.3.3. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng

• Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải

Thí nghiệm diện hẹp đánh giá hiệu lực của chế phẩm trong phòng trừ sâu

khoang trên rau bắp cải ngoài đồng ruộng được tiến hành tại Vân Nội (Đông

Anh, Hà Nội) trong vụ Thu Đông 2017. Qua kết quả theo dõi (bảng 3.30) nhận

thấy sau 7 ngày phun, hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP

và NPV-2 WP đạt tương tự nhau, tương ứng đạt 73,42 và 73,45% khi phun với

liều lượng 500 gam/ha tương ứng với 1 x1012 OB/ha, khi sử dụng sâu chết rồi

nghiền, lọc chỉ đạt hiệu lực 24,94%.

Sau 10 ngày phun chế phẩm, NPV-1 WP cho hiệu lực trừ sâu đạt 80,51%

còn chế phẩm NPV-2 WP cho hiệu lực trừ sâu đạt tới 82,29%. Trong khi đó, ở

công thức sử dụng chế phẩm sâu bị bệnh nghiền lọc đem phun, hiệu quả chỉ đạt

45,20%, thấp hơn kết quả thí nghiệm trong nhà lưới là 2,48%. Kết quả thí nghiệm

trên bắp cải cho phép khẳng định hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV tạo ra.

Kết quả đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm ngoài đồng ruộng

cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả thí nghiệm trong nhà lưới. Tuy nhiên, qua phân

tích thống kê thì không có sự sai khác có ý nghĩa giữa 2 công thức sử dụng chế

phẩm NPV-1 WP và NPV-2 WP.

Như vậy, hoàn toàn có thể sử dụng chế phẩm NPV-1 WP để phòng trừ sâu

khoang trên bắp cải mà không cần pha chế thêm axít Boric. Điều này cũng phù

hợp vì sâu khoang thường phát sinh gây hại nặng trên bắp cải trong vụ Đông

Xuân từ tháng 11 năm trước đến tháng 3 năm sau, là thời gian không có ánh

nắng mạnh gây ảnh hưởng đến sự tồn tại của thể vùi NPV trên đồng ruộng. Nếu

phòng trừ sâu khoang trong vụ trồng bắp cải Hè Thu, việc sử dụng chế phẩm

NPV-2 WP là hoàn toàn cần thiết, vì trong thời gian từ tháng 4 đến tháng 10

thường có nắng cường độ mạnh cùng với tia cực tím sẽ góp phần bảo vệ thể vùi

NPV khỏi bị phá huỷ.

120

Bảng 3.30. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV

trên bắp cải ngoài đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội)

Công Thành phần Liều lượng Sâu trước Hiệu lực trừ sâu (%)

thức chế phẩm phun 1 ha phun (con/m2) 7NSP 10NSP

CT 1 NPV-1 WP 500 gam 2,6 73,42 80,51 a

CT 2 NPV-2 WP 500 gam 2,8 73,45 82,29 a

CT 3 Sâu nghiền (đ/c 1) 500 sâu 2,4 24,94 45,20 b

CT 4 Nước lã (đ/c 2) - 2,8 - -

CV (%) - - 26,863 16,482

- - 20,468 22,518 LSD0,05

Ghi chú: CT: Công thức; NSP: Ngày sau phun; đ/c: Đối chứng. Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa

ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Nhằm hướng tới xây dựng qui trình kỹ thuật sử dụng chế phẩm sinh học, thí

nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên bắp

cải ngoài đồng ruộng khi sử dụng với các liều lượng khác nhau đã được tiến hành

tại Vân Nội (Hà Nội) trong vụ Đông Xuân 2018- 2019. Kết quả thí nghiệm được

trình bày qua bảng 3.31 với 3 công thức liều lượng khác nhau nhận thấy khi sử

dụng liều lượng càng cao thì hiệu quả trừ sâu khoang càng cao.

Tại thời điểm 5 ngày sau phun (NSP), tương ứng lượng chế phẩm sử dụng

với các liều lượng 400, 500 và 600 gam/ha tương ứng với số lượng thể vùi 0,8; 1,0

và 1,2 x 1012 OB/ha cho hiệu lực trừ sâu tương ứng chỉ đạt 64,58, 71,67 và 77,78%,

còn hiệu lực của thuốc hoá học Aba Fax 3.6EC đã đạt tới 82,29%.

Đến 7 ngày sau phun, hiệu lực trừ sâu của chế phẩm tăng lên rõ rệt tương

ứng với liều lượng 400 và 500 gam/ha hiệu lực đạt 73,44; 75,63, đạt cao nhất tới

81,75% khi sử dụng với liều lượng 600 gam/ha, tương đương với sử dụng thuốc hoá

học với liều lượng 200 gam/ha (81,90%).

Tới thời điểm 10 ngày sau phun, chỉ có duy nhất công thức sử dụng với liều

lượng 400 gam/ha cho hiệu lực trừ sâu khoang thấp, chỉ đạt 76,47%, còn công thức

sử dụng chế phẩm với liều lượng 500 và 600 gam/ha đều đạt hiệu quả tương đương

121

nhau, tương ứng là 80,30 và 80,95%, Trong khi đó, với công thức sử dụng thuốc

hoá học hiệu lực phòng trừ sâu khoang chỉ còn 70,77% (Bảng 3.31).

Bảng 3.31. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP

khi phun với liều lượng khác nhau trên bắp cải

ngoài đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội)

Hiệu lực ở các ngày sau phun (%)

Công thức Loại thuốc 5 NSP 7NSP 10NSP

1 2 3 4 5 NPV-1 WP NPV-1 WP NPV-1 WP Aba Fax 3.6EC Đối chứng Liều lượng (gam/ha) 400 500 600 200 Nước lã

Sâu trước phun (con/m2) 3,2 3,0 3,4 3,2 3,4 - - 64,58 d 71,67 c 77,78 b 82,29 a - 18,05 10,72 73,44 b 75,63 b 81,75 a 81,90 a - 17,24 9,84 76,47 b 80,30 a 80,95 a 70,77c - 16,16 8,97 CV(%) LSD0,05

Ghi chú: NSP: Ngày sau phun. Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác

nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Kết quả thí nghiệm còn cho thấy hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm sinh

học NPV-1 WP tuy ban đầu (vào 5 NSP) có hiệu lực thấp hơn thuốc hoá học, nhưng

vào các thời điểm sau đó thì hiệu lực tăng dần đạt tới 81,75% sau 7 ngày và duy trì

hiệu lực tới 80,95% sau 10 ngày phun chế phẩm. Điều đó cũng phù hợp với xu thế

chung đối với việc sử dụng các chế phẩm sinh học, ngoài việc phòng trừ trực tiếp

sâu hại mục tiêu còn có tác dụng bổ sung nguồn vi sinh vật hữu ích vào sinh quần tự

nhiên. Việc sử dụng thuốc hoá học cho hiệu quả phòng trừ sâu hại nhanh nhưng sẽ

gây tổn hại đáng kể tới môi trường và các tác nhân sinh học có ích trên đồng ruộng.

Hiệu quả trừ sâu khoang của NPV-1 WP đạt 81,75- 81,90%, cao hơn hẳn so

với kết quả thí nghiệm trừ sâu khoang trên bắp cải của Jat et al. (2017) [121], khi

tác giả sử dụng chế phẩm NPV liều lượng 250ml/ha cho hiệu quả đạt 70,522%,

trong khi thuốc hoá học Spinosad liều lượng 200 gam/ha đạt 80,33%, còn với Bt

liều lượng 1 lít/ha chỉ đạt 61,14%. Có thể do hoạt lực của chủng NPV sử dụng hoặc

điêu kiện khí hậu thời tiết có sự khác nhau giữa các nước đã ảnh hưởng đến hiệu

quả phòng trừ sâu khoang.

122

• Hiệu lực trừ sâu khoang trên đậu tương

Đánh giá hiệu lực của chế phẩm NPV-1 WP với các liều lượng phun khác

nhau được tiến hành tại Mỹ Thành (Mỹ Đức- Hà Nội). Kết quả đánh giá được trình

bày trong bảng 3.32 cho thấy hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1

đạt khá cao. Với liều lượng 400 gam/ha (tương đương 0,8 x 1012 OB/ha), ở thời

điểm 5 ngày sau phun (NSP) hiệu quả trừ sâu đã đạt tới 77,18%. Đến 7 ngày sau

phun, hiệu quả đạt 81,63% và hiệu quả phòng trừ sâu khoang đạt tới 90,76% tại thời

điểm 10 ngày sau phun.

Khi phun với liều lượng 500 gam/ha (tương đương 1,0 x 1012 OB/ha), tại

thời điểm 5NSP hiệu quả đạt 84,81% và đến 7 và 10 ngày sau phun hiệu quả trừ sâu

đạt tới 96,92%. Nếu sử dụng với liều lượng 600 gam/ha (tương đương 1,2 x 1012

OB/ha) thì hiệu quả đạt tới 89,2% ngay ở thời điểm 5 ngày sau phun, đạt 97,56%

vào 7 ngày sau phun và đạt tới 98,04% vào 10 ngày sau phun (Bảng 3.32).

Trong khi đó, thuốc trừ sâu Aba- Fax sử dụng với liều lượng khuyến cáo 200

gam/ha thì hiệu quả diệt sâu đạt cao, tới 96,89% vào các thời điểm 7 và 10 ngày sau

phun, tương tự như chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liều lượng 500 gam/ha (1,0

x 1012 OB/ha) ở thời điểm 7 và 10 ngày sau khi phun chế phẩm.

Với các kết quả các thí nghiệm như đã nêu nhận thấy để phòng trừ sâu

khoang có hiệu quả trên đậu tương và trên bắp cải có thể sử dụng chế phẩm NPV-1

WP với liều lượng 500 gam sử dụng cho một hecta.

Kết quả thí nghiệm đồng ruộng trên bắp cải, hiệu lực trừ sâu khoang như đã

trình bày đạt 80,51- 82,29% khi phun với liều lượng 1,0 x 1012 OB/ha, cao hơn so

với kết quả của Jat et al. (2017) với hiệu lực trừ sâu khoang (Spodoptera litura) đạt

từ 58,15- 72,13% khi phun với liều lượng 1,5 x1012 OB/ha.

Trên đậu tương, kết quả nghiên cứu của Grzywacz et al. (2008) xác định

hiệu quả trừ sâu loài Spodoptera exempta đạt tới 96% khi phun SpexNPV với liều

lượng 5 x 1011 OB/ha [34]. Trong khi đó, kết quả công bố của Bedjo (2017) tại khu

vực miền Đông Java (Indonesia) với các chủng khác nhau ở nồng độ từ 1 x 106 đến

1 x 1012 PIB/ml thì chủng có tỷ lệ gây chết sâu non sâu khoang tuổi 3 cao nhất đạt

từ 51,11- 77,78% sau 168 giờ xử lý [35].

123

Thí nghiệm trong phòng tại Malaysia, Sajap et al. (2000) đánh giá hiệu quả

của NPV trừ sâu khoang đã xác định khi phun NPV với liều lượng 6 x 107 PIB và 6

x 108 PIB/sâu non sâu khoang cho hiệu quả gây chết tương ứng là 80,81 và 95,95%

[14]. Như vậy, có sự khác nhau về hiệu quả trừ sâu khoang của NPV giữa các nước,

có thể do sự khác nhau về hoạt lực của các chủng NPV khi sử dụng hoặc do điều

kiện khí hậu khác nhau đã ảnh hưởng đến hiệu lực trừ sâu của chế phẩm.

Bảng 3.32. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP

khi phun với liều lượng khác nhau trên đậu tương

ngoài đồng ruộng tại tại Mỹ Thành (Hà Nội)

Công Loại thuốc Hiệu lực ở các ngày sau phun (%)

thức 5 NSP 7NSP 10NSP

1 Liều lượng (gam/ha) 400 Sâu trước phun (con/m2) 2,63 NPV-1 WP 77,18c 81,63 c 90,76 c

2 NPV-1 WP 500 2,40 84,81 b 96,92 b 96,92 b

3 NPV-1 WP 600 2,39 89,20 a 97,56 a 98,04 a

4 Aba Fax 3.6EC 200 2,81 73,40 c 96,80 b 96,89 b

5 Đối chứng Nước lã 2,42 - - -

CV(%) - 25,948 18,924 10,016

- 12,822 9,554 5,578 LSD0,05

Ghi chú: NSP: Ngày sau phun. Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác

nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05

Thử nghiệm triển khai ứng dụng chế phẩm NPV-1 WP để phòng trừ sâu

khoang trên đậu tương trên diện rộng, không nhắc lại với qui mô diện tích 1,0 ha tại

Hợp tác xã Mỹ Thành (huyện Mỹ Đức, Hà Nội) trong vụ Xuân 2018. Qua theo dõi

xác định khi sử dụng với liều lượng 500 gam/ha (tương ứng 1,0 x 1012 OB/ha) chế

phẩm NPV1 cho hiệu lực phòng trừ sâu khoang đạt 73,44% vào thời điểm 5NSP và

đạt 91,15% vào thời điểm 10NSP. Trong khi sử dụng thuốc Aba Fax 3.6EC đạt

75,33% vào thời điểm 5NSP và sau 10 ngày phun thuốc hiệu lực của thuốc giảm chỉ

còn 75,6% (Bảng 3.33).

Vào thời điểm 5NSP thì hiệu lực của chế phẩm NPV-1 WP đạt thấp hơn so

với thuốc Aba Fax 3.6EC, nhưng qua xử lý thống kê thì không có sự sai khác có ý

nghĩa về hiệu lực trừ sâu giữa 2 công thức. Còn ở thời điểm 10NSP thì hiệu lực trừ

124

sâu của chế phẩm NPV-1 WP đạt tới 91,15%, cao hơn hẳn so với dùng thuốc Aba

Fax 3.6EC (75,60%) (Bảng 3.33).

Bảng 3.33. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP

trên đậu tương tại Mỹ Thành (Hà Nội)

Công Loại thuốc Liều lượng Hiệu lực ở các ngày sau phun (%)

thức 1 ha (gam) 5 ngày 10 ngày

1 NPV-1 WP 500 73,44 91,15 (ruộng mô hình)

2 Aba Fax 3.6EC 200 75,33 75,60 (ruộng nông dân)

Ghi chú: NSP: Ngày sau phun

Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm khi sử dụng trên đậu tương cao

hơn trên rau bắp cải, có thể do kết cấu thảm cây đậu tương với bộ lá không che

khuất lẫn nhau, đã giúp thuốc phân bố đều trên các bộ phận của cây khi việc phun

rải, tạo cơ hội sâu tiếp cận với thể vùi của NPV-1 2.109 OB/gam WP khi ăn dễ dàng

hơn. Vì vậy, sâu dễ nhiễm virus và cho hiệu quả trừ sâu của chế phẩm cao hơn.

Ngoài ra, qua theo dõi trên đồng ruộng, chế phẩm NPV-1 2.109 OB/gam WP

không gây chết các sâu hại khác (như sâu cuốn lá đậu, dòi đục lá, v.v.) phát sinh

trên ruộng. Đồng thời, cũng không gây chết đối với các loài bắt mồi ăn thịt trên

ruộng, như bọ rùa, ba khoang, nhện v.v.

Điều đó thể hiện sự chuyên tính cao của chế phẩm đối với sâu khoang và cho

thấy sự cần thiết phát triển các loại virus nhân đa diện (NPV) của các sâu hại khác

để phối trộn với NPV sâu khoang, nhằm tạo ra sản phẩm thuốc sinh học có phổ

phòng trừ sâu hại rộng hơn mới đáp ứng yêu cầu của thực tiễn sản xuất, vì trên mỗi

cây trồng ngoài đồng ruộng thường phát sinh đồng thời một số sâu hại khác nhau

trong cùng một thời điểm.

125

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1.1. Xác định NPV là tác nhân sinh học thường phát sinh trên đồng ruộng

với mức độ phổ biến từ 26,67- 48,89%, tỷ lệ sâu khoang chết do NPV từ 14,22-

21,67%. Đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng NPV (gồm TL.1a, TL.2a và

TL.3a), trong đó TL.1a có hoạt lực gây chết sâu khoang tới 80,09% và khả năng

hình thành thể vùi tới 2,9 x 108 OB/10 sâu.

1.2. Hoàn toàn có thể nhân sinh khối tế bào sâu khoang với điều kiện

thích hợp trên môi trường Ex-Cell 420-14491C có bổ sung 25% FBS ở pH 6,8 và

nhiệt độ 280C. Nhân nuôi tế bào ở điều kiện thích hợp, mật độ tế bào có thể đạt

từ 4,025- 5,750 x 1010 tế bào/ml ở thời điểm 6 ngày sau nhân.

Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang với lượng 150ml môi trường Excell

420-14419C trên bình 250ml theo phương pháp lắc đạt mật độ 4,580- 4,879 x

1010 tế bào/ml, với lượng 750ml môi trường Excell 420-14419C trên bình 1 lít

theo phương pháp lắc đạt 4,08 x 1010 tế bào/ml.

1.3. Xác định được điều kiện thích hợp lây nhiễm phát triển sinh khối

NPV trên tế bào nuôi nhân khi mật độ tế bào 1,0 x 108 tế bào/ml theo chỉ số MOI

là 0,1, thời gian ủ lây nhiễm trong 3 ngày trên môi trường Excell 14420-14491C ở

pH = 7,0 và nhiệt độ 280C.

Lây nhiễm NPV trên tế bào có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml theo chỉ số MOI

0,1 đạt 1,58 x 108 OB/ml hình thành sau 3 ngày (mức độ tăng 158 lần so với ban

đầu). Hiệu lực gây chết sâu khoang của NPV tạo ra trên tế bào đạt 76,27% và thể

vùi hình thành tới 241,1 OB/sâu.

1.4. Tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang bằng phương pháp ly tâm 3 lần (2 lần

nước cất xen kẽ 1 lần SDS) lắc với tốc độ 1500 vòng/phút trong thời gian 5

phút/lần, số lượng thể vùi thu được 2,71 x 108 OB/ml với tỷ lệ thu hồi đến 96,79%.

1.5. Bước đầu tạo được 2 chế phẩm dạng bột thấm nước NPV-1 và NPV-2

với phụ gia gồm 60% bột tan và 40% kaolin chứa 2x 109 OB/gam để phòng trừ sâu

khoang với liều lượng 500gam/ha. Ngoài đồng ruộng, khi sử dụng 500 gam/ha chế

126

phẩm NPV-1, hiệu quả trừ sâu khoang trên bắp cải đạt 80,51% và NPV-2 đạt

82,29% , trên đậu tương phun NPV-1 cho hiệu quả trừ sâu đạt 91,15%.

2. Đề nghị

- Tiếp tục nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV với qui mô lớn bằng công

nghệ nuôi nhân tế bào, để sản xuất thuốc sinh học phục vụ phòng trừ sâu khoang

hại cây trồng nông nghiệp.

- Sử dụng các kết quả thu được vào nghiên cứu, giảng dạy và chỉ đạo

phòng trừ sâu khoang trong sản xuất

127

DANH MỤC CÔNG TRÌNH

ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

1. Lê Thanh Hải Hà, Lê Văn Trịnh, Hà Thị Thu Thuỷ (2017). Nghiên cứu kỹ

thuật nuôi nhân Invitro tế bào sâu khoang (S. litura) phục vụ sản xuất chế

phẩm virus NPV. Tạp chí Khoa học Viện Đại học Mở Hà Nội. Số 33

(07/2017). 32- 38.

2. Lê Thanh Hải Hà, Lê Văn Trịnh, Nguyễn Thị Nga (2017). Phân lập và đánh

giá hiệu lực gây chết sâu khoang của vi rút NPV (Nucleo polyhedrosis virus).

Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Số 23/2017. 58- 63.

3. Lê Thanh Hải Hà, Lê Văn Trịnh (2019). Nghiên cứu tinh sạch thể vùi Nucleo

polyhedrosis virus (NPV) và tạo dạng chế phẩm. Tạp chí khoa học Đại học Mở

thành phố Hồ Chí Minh. Số 14 (2). 12- 20.

4. Lê Thanh Hải Hà, Hoàng Đình Hoà, Lê Văn Trịnh, Nguyễn Thị Như Quỳnh

(2020). Hiệu quả phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV phát triển từ tế

bào nhân nuôi. Tạp chí Bảo vệ thực vật. Số 1/2020. 5-11.

128

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Kumari V. and Singh N. P. (2009). Spodoptera litura nuclear polyhedrosis virus

(NPV-S) as a component in integrated pest management (IPM) of Spodoptera

litura (Fab.) on cabbage. Jounal of Biopesticides. Volume 2. No.1. 84- 86.

2. Hong L. W. (2002). Characterization of granulovirus and nucleopolyherovirus

isolated from Spodoptera litura. PhD. Thesis. Univ. Putra Malaysia. 168 pps.

3. Viện Bảo vệ thực vật (2003). Atlat côn trùng hại cây trồng nông nghiệp ở Việt

Nam. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Trang 41- 49.

4. Viện Bảo vệ thực vật (2001). Báo cáo tổng kết đề tài khoa học cấp nhà nước

KHCN.02.07B (1996-2000): Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh (vi khuẩn,

vi nấm, virut) để sản xuất chế phẩm sinh học BVTV trong phòng trừ sâu hại cây

trồng. 134 trang.

5. Rohrmann, George F. (2011). Baculovirus Molecular Biology (2nd ed.).

Bethesda: National Center for Biotechnology Information.154 pps.

6. Kitajima E. W. (1989). Classification, identification and characterization of

insect viruses. Institute of Oswaldo Cruz. Volume 84. Suplement III. 9- 15.

7. Kamakoff D.A and Ward K.I. (2007). Baculovirues. Techniques Practical

Manual. University of Otago. 9 pages.

8. Nguyễn Văn Cảm, Hoàng Thị Việt; Nguyễn Văn Hoa và Lương Thanh Cù

(1996a). Một số yếu tố ảnh hưởng trong quá trình pha chế chế phẩm NPV sâu

xanh và khả năng sử dụng chúng trong phòng trừ sâu xanh (Helicoverpa

armigera Hubner) hại thuốc lá. Tuyển tập công trình nghiên cứu biện pháp sinh

học phòng trừ dịch hại cây trồng (1990- 1995). NXB Nông nghiệp. Trang 24-33.

9. Granados R.R., Li G. and Blissard G.W. (2007). Insect cell culture and

biotechnology. Virologica Sinica. Vol. 22. No. 2. April (2007). 83- 93.

10. Goodman C.L., Mclntosh A.H., Sayed G.N.E., Grasel J.J. and Stiles B. (2001).

Production of selected Baculoviruses in newly established Lepidopteran cell

lines. J. In Vitro Cell Development and Biology. No. 37 (2001). 374- 379.

129

11. Elanchezyan K. (2009). Insect cell culture and biotechnology. Current Biotica.

Vol.3. No.3. 2009. Tamil Nadu Agricultural University Publising House. 458-

489.

12. Grzywacz D., Rabindra R.J., Brown M., Jones A.K. and Parnell M. (1996). The

Helicoverpa armigera NPV production manual. Book of Instruction manual.

Academic Press, New York. 66 pgs.

13. Arayya, Jaba J. Sajeesh P.K. and Vinod U. (2013). Nuclear polyhedrosis virus

(NPV), a potential biopesticide: A review. Research Jounal of Agriculture and

Forestry Sciences. Vol. 1(8). 30-33

14. Sajap A. S., Kotulap J. R., Bakir M. A., Hong L. W., Samad N.A. and Kadir H.

A. (2000). Pathogenicity and characteristis of Spodoptera litura Nucleo

polyhedrovirus from Peninsular Malaysia. Journal of Tropical Agricultural

Sciences. Volum 23. No. 1. 23- 28.

15. Pourmirza A.A. (2000). Relationship between nuclear polyhedrosis virus

susceptibility and larval weight in Heliothis armigera. Journal of Sciences and

Technologies. Vollum 2. 291- 298.

16. Agathos S.N. (2007). Development of serum- free media for Lepidoteran for

insect cell lines. In: Baculovirus and insect cell expression protocol. Second

edition, Edited by D.W. Murhammer. Humana Press. Totowa, New Jersey. 155-

185.

17. Kuldeep S., Devinder S., Anal A. K. D., Sonika S. (2018). Integrated

Management of Spodoptera litura: A Review. International Journal Life Sciences

and Scientific Resouces. Vol. 2/2018. 226- 235.

18. Alfred D.J. and Samiayyan K. (2017). Growth parameter indices of cutworm

larva on various host plants. International Journal of Agriculture Sciences. Vol.

9, Issue 29. 4372- 4376.

19. Nagamandla R. S. and Shantanu J. (2018). Biology and morphometry

Spodoptera litura Fabricius on tomato. Jounal of Entomologies and Zoology

Studies. Vol. 6(5). 80- 82.

130

20. Jadhav R. S.; Yaday D. S.; Amala U.; Ghule S. and Sawant I.. S. (2015).

Morphological, biological and molecular description of Spodoptera litura

infesting grapevines in tropical climate of Maharashtra, India. Current Biotica

9(3): 207- 220.

21. Patil R.A., Mehta D.M. and Jat B.L. (2014). Studies on life fecundity tables of

Spodoptera litura Fabricius on Tobacco nicotiana tabacum Linnaeus. Journal of

Entomology, Ornithology & Herpetology. Vol. 3(1). 1-5.

22. Alfred D. J. and Samiayyan (2017). Growth parameter indices of Cut Worm

lavar on various host plants. International Journal of Agriculture Sciences,

Volume 9, Issue 29, 2017, 4372- 4376.

23. Liu SS, Brough E.J. and Norton G.A. (1995). Integrated pest management in

brassica vegetable crops. ACIAR workshop report. Hangzhou, China. CRC-

TPM, 24/6/1995. 69- 194.

24. Muniappan R. and Marutani M. (1992). Pest management for head cabbage

production in Guam. Proc. 2nd International Worshop. Tainan, Taiwan. AVRDC.

1992. 541- 550.

25. Jat G.C., Swaminathan R., Yadav P.C., Swati, Deshwal H.L., Suman C. and

Yadav S. K. (2017). Relative efficacy and economics of bio-pesticides against

Spodoptera litura (Fab.) on cabbage. International Journal of Current

Microbiology and Applied Sciences Vol. 6 (6) 1853-1866.

26. Srivastava K., Sharma D., Anal A.K.D, Sharma S.. (2018). Integrated

Management of Spodoptera litura: A Review. International. Journal of Life

Sciences and Scientific Resources. Vol. 4(1):1536-1538.

27. Evans H. F. (1986). Ecology and Epizootiology of baculoviruses, The Biology

of Baculovirutes, 2nd Editor, 89-132.

28. Summer M.D., Smith G.E. (1987). A manual of methods for Baculovirus vectors

and insect cell culture procedures. The Texas Agricultural Experiment Station.

Texas A & M University. 56 pages.

131

29. Erayya, Jaba J., Sajeesh P.K. and Vinod U. (2013). Nuclear Polyhedrosis Virus

(NPV), a potential biopesticide: A Review. Research Journal of Agriculture and

Forestry Sciences. Vol. 1(8), 30- 33.

30. Lynn D.E. (2002). Routine maintenanced storage of Lepidopteran insect cell

lines and Baculoviruses. Methods in Molecular Biology: Baculovirus and insect

cell expression protocol. Ed. by D.W. Murhammer. Murhammer Press. Totowa.

New York. Vol. 338. 187- 208.

31. Harrap K. A. (1972). The structure of nuclear polyhedrosis viruses: Virut

assembly and Virology. International Journal of Virology. Vol. 50(3). 133-139.

32. Farrar R.R., Ridgway R.L. (1999). Relative potency of selected nuclear

polyhedrosis viruses against five species of Lepidoptera. Journal of Agriculture

and Entomology. Vol.16. No.3. 187-196.

33. Jat G.C., Swaminathan R., Yadav P.C., Swati, Deshwat H.L. Choudhary S. and Suresh K.Y. (2017). Relative Efficacy and Economics of Bio-pesticides against

Spodoptera litura (Fab.) on Cabbage. International Journal of Current

Microbiology and Applied Sciences. Vol. 6, No. 6 1853- 1866.

34. Grzywacz D., Mushobozi W. L., Parnell M., Jolliffe F., Wilson K. (2008).

Evaluation of Spodoptera exempta nucleopolyhedrosis (SpexNPV) for field

control of African armyworm (Spodoptera exempta) in Tanzania. Crop

Protection No. 27 (2008), 17- 24.

35. Bedjo (2017). The potential of various isolates of Spodoptera litura nuclear

polyhedrosis viruses from East Java (Indonesia) to control Spodoptera litura on

Soybean. Biodiversitas Vol. 18, No. 2, April 2017. 582- 588.

36. Maqsood S., Afzal M., Aqueet M.A., Raza A.B.M., Wakil W. and Babar M.H.

(2017). Effcacy of nuclear polyhedrosis virus and flubendiamide alone and in

combination against Spodoptera litura F. Pakistan Jounal of Zoology. Vol.

49(5). 1783- 1788.

37. Sumaira M., Muhammad A., Anjum M. A., Abu Bakar M. R., Waqas W. and

Babar M. H. (2017). Efficacy of Nuclear Polyhedrosis Virus and Flubendiamide

132

Alone and in Combination against Spodoptera litura F. Pakistan Journal.

Zoology. Vol. 49(5), pp 1783-1788.

38. Devi E. B., Elangbam P. D. and Deepshikha, (2016). An Overview on Nuclear

Polyhedrosis Virus (NPV) as a Valuable Biopesticide in Enhancing Ecofriendly

Management of Insect Pests. International Journal of Current Research in

Biosciences and Plant Biology. Vol. 3(8). 97- 106.

39. Escribano A., Williamst, Goulson, Ronald D.C. Chapman J.W. and Caballero

J.W., (1999). Selection of a Nucleopolyhedrovirus for Control of Spodoptera

frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae): Structural, Genetic, and Biological

Comparison of Four Isolates from the Americas. Journal of Economycal.

Entomology. 92(5): 1079-1085

40. Salama M.S., Abd El-Salam, A.M.E., Dalia M. Mahmoud and Samah M.M.A.

(2017). Effect of ultra violet radiations on insecticidal activity of Spodoptera

littoralis multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus against Spodoptera

littoralis Boisd (Lepidoptera: Noctuidae). Biocience Research. Vol. 14(3), 645-

652.

41. Sills E.S., Takeuchi T., Tanaka N., Neri Q.V. and Palermo G.D. (2005).

Indentification and isolation of embryonic stem cells in reproductive

endocrinology: Theoretical protocols for conservation of human embryos

derived from in vitro fertilization. Training manual of BioMed Centre Co. LTD.

10 pps.

42. Sudeep A.B., Mourya D.T and Mishra A.C. (2005). Insect cell culture in

research: Indian scenario. Indian Journal of Medicin Research, No. 121, 2005.

725- 738.

43. Lynn D.E. (1998). Lepidopteran insect cell line isolation from insect tissue.

Volume 338: Baculovirus and Insect Cell Expression Protocol. Section 7. 139-

154. Books: Methods in Molecular Biology. Edited by: Murhammer D.W.

Humana Press Inc. Totowa. New York.

44. Freshney R. (1987). Culture of animal cell. Manual of basic technique. Second

edited; Wiley- Liss, New York. 397 pps.

133

45. Grace T.D.C. (1982). Development of insect cell culture. Journal of Invertebrate

Cell Culture, Application by Editors: Maramorosch K. and Mitsuhashi J.

Academic Press, New York. 1-8.

46. Guy S. C. L., Goodman D.S. (2008). Insect cell culture and applications to

research and pest management. Journal of In Vitro Cell Development and

Biology Animal. No. 10. 84- 89.

47. Weiss S.A., Smith G.C., Kalter S.S. and Vaughn J.L. (1981). Improved method

for the production of insect cell cultures in large volume. In Vitro Jounal. No.

17. 495- 502.

48. Hurton L.V., Berkson J.M. and Amith S. A. (2005). Selection of a standard

culture medium for primary culture of Limulus polyphemus amebocytes. In Vitro

Cell Dev. and Biology of Animal. Society for In Vitro Biology. No. 41. 325-

329

49. Lynn D.E., (1996). Development and characterization of insect cell lines.

Kluwer Academic Publishers. Cytotechnology. No. 20. 3- 11.

50. Invitrogen Life Technologies. (2002). Guide to Baculovirus expression vector

systems (BEVS) and insect cell culture techniques. Instruction Manual. 34 pps.

51. Murhammer (2007). Baculovirus and insect cell expression protocol. In:

Methods in molecular biology. Second Edition. 470pps.

52. Agathos (2010). Insect cell culture. American Society for Microbiology. No.25.

212- 222

53. Mishuhashi J. (1976). Primary cultures of the cells from ovaries of the Cabbage

Armyworm, Mamestra brassicae L. (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of

Development, Growth and Differentiation. Volume 18. No. 2. 163- 166.

54. Bhutia K.C.; Chakravathy A. K.; Doddabasappa B.; Narabenchi B.; Lingaraj

V.K. (2012). Evaluation and production of improved formulation of

nucleopolyhedrosis virus of Spodoptera litura. Bulletin of Insectology Vol. 65.

No.2. 247- 256.

134

55. Segura Nidya A, Felio Bello J. (2012). Establishment and characterisation of a

new cell line derived from Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Mem

Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 107(1): 89-95.

56. Lynn D. E., C. Goodman, G. Caputo (2005). Technique for the development of

new insect cell lines. Report in In vitro biology annual meeting 2005. Society for

in Vitro Biology. Murhammer Press. Totowa. New York.

57. Toprak U. and Gurkan M. O. (2004). First record of a NPV isolation from

Spodoptera litoralis (Boisd) (Lepidoptera: Noctuidae) in Turkey and its

molecular identification according to the partial lef-8 gene. Turkis Journal of

Biology. No. 28. 71- 77.

58. Knudson D. L. and Tinsley T. W. (1974). Replication of a nuclear polyhedrosis

virus in a continous cell culture of Spodoptera frugiperda: Purification, assay of

infectivity and growth cheracterristics of the virus. Journal of virology. No. 4.

Volum 14. 934- 944.

59. Petchprakob P., Mekvichitsaeng P., Akeprathumchai S., Dechmahikl W. and

Poomputsa K. (2007). Improvement of Baculovirus NPV production from cell in

Bioreactor for use as insecticides. Agricultural Scientific Journal. No. 38(6). 79-

82.

60. McAteer J., Davis J. (1994). Basic cell culture technique and the maintenance of

cell lines. Basic Cell Culture - A Practical Approach. Editor: Davis. Oxford

University Press Inc., New York. Pg. 93- 148.

61. Mishuhashi J. (1995). A continuous cell line from pupal ovaries of theo common

cutworm Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Applied entomology and

zoology. 30(1). 75-82.

62. Mishuhashi J. and Goodwin A. (1976). Primary cultures of the cells from

ovaries of the Cabbage Armyworm, Mamestra brassicae L. (Lepidoptera:

Noctuidae). Journal of Development, Growth and Differentiation. Volume 18.

No. 2. Page 163- 166

135

63. Agathos S.N. (1994). Large scale insect cell production. Book: Inscet Cell

Biotechnology by Editors: Maramorosch K. and Mclntosh. CRC Press, Tokyo.

89- 103.

64. Demir I., Gorel N., Naloacioglu R., Demirbag Z. (2009). Comparative

susceptibilities of six insect cell lines to infection by Malacosoma neustria

nucleopolyhedrovirus (ManeNPV). Turkey Journal of Biology. No. 33 (2009),

Page 259-273

65. Felio J.B. G., Jorge B., Gloria R., Alberto M. and Olano V.A. (1995). Initiation

of primary cell culture from embryos of the mosquitoes Anopheles albimanus

and Aedestaeniorhynchus (Diptera: Culicidae). Journal ff Mem Institute of

Oswaldo Cruz.. Rio de Janeiro. Volume 90. No. 4. Page 547- 551.

66. Yeh S.C., Lee S. T., Wu C.Y, Wang C.H. (2007). A cell line (NTU- MV)

established from Maruca vitrata (Lepidoptera: Pyralidae): Characterrization,

viral susceptibility and polyhedra production. Journal of Invertebrate Pathology.

No. 96 (2007). 138- 146.

67. Lynn D.E. and Shapiro M. (1998). New cell lines from Heliothis virescens:

Characterization and susceptibility to baculoviruses. Journal of Invertebrate

Pathogology. No. 72. Page 276- 280.

68. Trang T.T.K, Chaudhari S. and Gautam R.D. (2003). A note on the spread of

nuclear polyhedrosis virus through Cotesia (Apanteles) angaleti Muesbeck

(Hymenoptera: Braconidae). Omonrice No.11. 151- 152 (2003).

69. Jakubowska A., Ferre J., Herrero S. (2009). Enhancing the multiplication of

nucleopolyhedrosis virus in vitro by manipulation of the pH. Journal of

Viological methods. No. 161(2009). 254- 258.

70. Rey G.J., Ferro C., Bello F.J. (2000). Establishment and characterization of new

continuous cell line from Lutzomya longipalpis (Diptera: Psychodidae) and its

susceptibility to infections with Arboviruses and Leishmania chagasi. Inst. of

Oswaldo, Colombia. Vol.95 (1). 103-110.

71. Petcharawan O.; Mongkopoch K. and Belloncik S. (2006). Establishment of cell

line devived from embryonic tissue of the Diamondback Moth, Plutella

136

xylostella (L.). KMITL Science Technological Journal. Vol.6. No. 2. Dec. 2006.

56- 66.

72. Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2010). Công nghệ sinh học trên người và

động vật. NXB Giáo dục Việt nam. 895 trang.

73. Maeda S., Mukohara Y. and Kondo A. (1990). Characteristically distinct

isolates of the nuclear polyhedrosis virus from Spodoptera litura. Journal of

General Virology (1990). No. 71. 2631- 2639.

74. Mclntosh A.h., Grasela J.J., Kariuki C.W., Goodman C.L., Brennan L.A. and

Dierks P.M. (2003). Evaluation of recombinant diamondback moth baculvirus in

selected Lepidopteran cell lines and larvae. Journal of Insect Biochemistry and

Molecular Biology. Vol. 33 (2003). 927- 931.

75. Popham H. J.R., Grasela J.J., Goodman C. L. and Mclntosh A.H. (2010).

Baculovirus infection influences host protein expression in two established

insect cell lines. Journal of Insect Physiology. No.56 (2010). 1237- 1245.

76. Woo S. D., Jong Y. R., Choi J. Y. and Jin B. R. (2007). Propagation of Bombyx

mori nucleopolyhedrovirus in nonpermissive insect cell lines. The journal of

microbiology. April 2007. Page 133- 138.

77. Lery X., Zeddam J. L., Giannotti J., Fedriere G. and Ela S.A. (1995).

Establishment of a cell line derived from embryos of the potato tuber moth

Phthorimaea opercurella (Zeller). Journal of In Vitro Cell Development and

Biology of Animal. No. 31. 836-839.

78. Vaughn J.L., Goodwin R.H. and others. (1977). The establishment of two cell

lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). Vitro

Journal. Vol. 13, No. 4. 213- 219.

79. Kanokwan P., Kathariya P., Phenjun M. and Uthai K. (2003). Pilot scale

production of baculovirus using insect cell culture for biopesticides. Proceeding

of The 13th annual meeting of the Thai society for biotechnology 2003. Page

148- 155.

137

80. Maiorella B., Inlow D., Shauger A. and Harano D. (1988). Large scale insect

cell culture for recombinant protein production. Biotechnology Journal. No. 6

(1988). 1406-1410

81. Miranda E.A., Murcia G.D and Murcia M.D. (1997). Large- scale production

and purification of recombinant protein from an insect cell/ baculovirus system

in Erlenmeyer flasks: application to the chiken poly (ADP- ribose) polymerase

catalytic domain. Barzillian Jounal of Medical and Biological Research. No.30

(1997). 923- 928.

82. Cynthia B.E., Barbara J. and Kamine K. (2007). Recombinant protein

production in large- scale agitated bioreactor using the Baculovirus expression

vector system. In: Baculovirus and insect cell expression protocol. Second

edition, Edited by D. W. Murhammer. Humana Press. Totowa, New Jersey. 224-

245

83. Tipvadee A., Sudawan C., Suvalux C., Supat A. and Pissawan C. (1988).

Characterization of the nuclear polyhedrosis virus of the Cotton Bollworm,

Heliothis armigera. Kaseart Jounal (Natural Science). Vol. 22. No. 5. 14- 23.

84. Zitzmann J., Sprick G., Weidner T., Schreiber C. and Peter C. (2017). Process

optimization for recombinant protein expression in insect cells. The Hessen

State Ministry of Higher Education. 110 pages.

85. Lynn D.E. (2003). Comparative susceptibilities of twenlve insect cell lines to

infection by three Baculovirus. Journal of Invertebrate Pathogology. No. 82.

129- 131.

86. Barbara J. K., Linda A.K. and Robert D.P. (2007). Introduction to baculovirus

molecular biology. In: Baculovirus and insect cell expression protocol. Second

Ed., Edited by D.W. Murhammer. Humana Press. Totowa, New Jersey. 25- 54.

87. Bryony C.B. and Nusawadany T. (2007). Introduction to the use of

Baculoviruses as biological insecticides. In: Baculovirus and insect cell

expression protocol. Second edition, Edited by D.W. Murhammer. Humana

Press. Totowa, New Jersey. Page 359- 366.

138

88. King L.A., Hitchman R., and Posee R.D. (2007). Recombinant baculovirus

isolation. In: Baculovirus and insect cell expression protocol. Second edition,

Edited by D.W. Murhammer. Humana Press. Totowa, New Jersey. 76- 93

89. Kanokwan P., Kathariya P., Phenjun M. and Uthai K. (2004). Pilot scale

production of baculovirus using insect cell culture for biopesticides. Proceeding

of The 13th annual meeting of the Thai society for biotechnology 2003. 148-

155.

90. Shapiro M. and Shepard B.M., (2008). Evaluation of clays and fluorescent

brightener upon the activities of the Gypsy Moth (Lepidoptera: Lymantriidae)

nuleopolyhedrovirus. Jounal of agricultural uban entomology. 24(4). 165- 175.

91. Patricia T. G., McGuire R., Behle R. W., Shasha B. S. and Pingel R. L. (2002).

Storage stability of Anagrapha falcifera nucleopolyhedrovirus in spray- dried

formulations. Journal of Invertebrate Pathology. Vol. 79. Page 7- 16.

92. Mushobozi W., Grzywacz D., Moscardi F. and Wilson K. (2004). The African

Armyworm Spodoptera exempta nucleopolyhedrovirus (NPV) production and

application manual. Project Report. Natural Resources Institute. United

Kingdom. 116 pps.

93. Goulson D.; Martinez A. M.; Hughes W. O. H. and Williams T. (2000). Effects

of optical brighteners used in biopesticide formulations on the behavior of

pollinators. Journal of Biological Control. No. 19. 232- 236.

94. Cisneros J., Perez J. A., Penagos D. I., Ruiz J. V. Cabellero P. Cave R. D. and

Williams T. (2002). Formulation of a nucleopolyhedrosis with Boric acid for

control of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in maize. J. of

Biological Control Vol. 23. 87- 95.

95. Javier G. O., Sudawan C. Barbara L.C., Motoko I. And Michihiro K. (2008).

Susceptibility of the cell line Hv-AM1 from Heliothis virescens to eight selected

Nucleopolyhedroviruses. Journal of insect biotechnology and Sericology. No.

77. Page 141- 150.

96. Inst. of Zoology, Chinese Academy of Sciences. 2006. Introduction of bio-

pesticides products based biotechnological application. 12 pgs.

139

97. Cục BVTV, Viện BVTV, Trường ĐH Tổng hợp Hà Nội (1995). Báo cáo khoa

học về cải tiến công tác BVTV ở Việt Nam (VNM-8910-030) giai đoạn 1990-

1995. NXB Nông nghiệp. 154 trang.

98. Viện Bảo vệ thực vật (2006). Nghiên cứu chế phẩm sinh học đa chức năng bằng

công nghệ sinh học. Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước

KC.04-12 (2001- 2005). 119 trang

99. Nguyễn Duy Nhất (1970). Đặc tính sinh vật học, qui luật phát sinh và những

yếu tố ảnh hưởng đến mật độ sâu khoang trên đồng ruộng vùng Hà Nội. Tạp chí

KHKT Nông nghiệp. Số 6, 1970. 674- 679.

100. Lê Văn Trịnh (1996). Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của một số

sâu hại rau họ Thập tự vùng đồng bằng sông Hồng và biện pháp phòng trừ.

Luận án Tiến sỹ. 181 trang.

101. Nguyễn Văn Cảm, Hoàng Thị Việt; Nguyễn Văn Hoa và Lương Thanh Cù;

Trần Quang Tấn; Nguyễn Đậu Toàn và Huỳnh Thị Huệ (1996b). Bệnh thối nhũn

sâu đo xanh (Anomis falava Fabr.) và khả năng sử dụng chúng trong việc phòng

trừ sâu đo xanh hại đay. Tuyển tập công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 1990-

1995. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Trang 173- 181.

102. Hoàng Thị Việt, Nguyễn Văn Cảm et al. (2002). Một số kết quả nghiên cứu

về NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) và khả năng sử dụng trong phòng trừ sâu

hại cây trồng. Tuyển tập công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 2000- 2002.

NXB Nông nghiệp, Hà Nội, Trang 113- 130.

103. Trịnh Thị Xuân, Trương Thanh Xuân Liên, Dương Thị Thu Nhi và Trần Văn

Hai. (2016). Tiềm năng của vi rút SeNPV (Spodoptera exigua

nucleopolyhedrovirus) đối với sâu keo da láng Spodoptera exigua Hübner

(Lepidoptera: Noctuidae) tại đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Bảo vệ thực

vật. Số 5/2016. 19- 26

104. Trần Văn Hai, Trần Thị Xuân, Nguyễn Thị Minh Hạnh, Trần Thị Ánh Tuyết

và CTV. (2010). So sánh các dòng Nucleopolyhedrosis Virus tại đồng bằng

sông Cửu Long bằng phương pháp PCR và tiềm năng trong phòng trừ sâu ăn

140

tạp (Spodoptera litura Fabr.). Báo cáo Hội nghị khoa học công nghệ toàn quốc

về BVTV lần thứ 3. Trang 481- 487.

105. Lê Văn Trịnh, Lê Thanh Hải Hà (2011). Tạo dòng tế bào sâu khoang

Spodoptera litura từ mô phôi và mô mỡ. Tạp chí Bảo vệ thực vật. Số 3. 17- 20.

106. Nguyễn Thị Hai (2005). Sử dụng virus Nucleopolyhedrosis trong phòng trừ

sâu keo da láng (Spodoptera exigua) hại cây trồng. Báo cáo Hội nghị: Các biện

pháp sinh học trong phòng chống sâu bệnh hại cây trồng nông nghiệp. NXB

Nông nghiệp. Trang 175- 181

107. Trương Thanh Giản; Lê Văn Thuyết; Trần Quang Tấn; Nguyễn Đậu Toàn và

CTV. (1996). Bước đầu nghiên cứu sử dụng NPV của sâu róm thông

(Dendrolimus punctatus Walker) trên rừng thông Thanh Hóa. Tuyển tập công

trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 90- 95. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Trang 173-

181.

108. Viện Bảo vệ thực vật (1997). Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật-

Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng. Tập

1. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 99 trang.

109. Viện Bảo vệ thực vật (2000). Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật-

Phương pháp điều tra, đánh giá sâu, bệnh, cỏ dại, chuột hại cây trồng cạn. Tập

III. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 80 trang.

110. Bộ Nông nghiệp và PTNT (2018). Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 12561:2018

về Khảo nghiệm hiệu lực của thuốc bảo vệ thực vật.

111. Viện Bảo vệ thực vật (1976). Kết quả điều tra cơ bản côn trùng 1967- 1968.

NXB Nông thôn, Hà Nội. 415 trang.

112. Khattab M. (2013). Isolation of Nucleopolyhedrovirus (NPV) from the Beet

armyworm Spodoptera exigua (Hübner) (SpexNPV). International Journal of

Environmental Science and Engineering. Vol. 4: 75-83 (2013)

113. Senthil Kumar C.M.; Sathiah N. and Rabindra R.J. (2005). Optimizing the

time of harvest of Nucleopolyhedrovirus infected Spodoptera litura (Farbricius)

larvae under in vivo production systems. Current Science, Vol. 88. No. 10.

1682- 1684.

141

114. Sireesha K., Kumar Ch. S., Rao G.V. R, Arjuna R. P. and Lava P.K. (2010).

Effect of different storage conditions on the virulence of Helicoverpa armigera

nuclea polyhedrosisvirus (HaNPV). Journal of Entomology and Resources. Vol.

34.No. 1. 65-69.

115. Goodman C.L., Mclntosh A.H., Sayed G.N.E., Grasel J.J. and Stiles B.

(2001). Production of selected Baculoviruses in newly established Lepidopteran

cell lines. Journal of In Vitro Cell Development and Biology. No. 37 (2001). Pg.

374- 379.

116. Hink W. F., Strauss E. M. and Ramoska W.A. (1977). Propagation of

Autographa californica nuclear polyhedrosis virus in cell culture: Method for

infection cells. Journal of Invertebrate Pathology. No. 30. 185- 191.

117. Phejun M. Kanokwan P., Lertwerawat Y., Ketunuti U. And Morakot T.

(2003). Production of baculovirus for biopesticide in insect cell culture.

Proceeding of The 13th annual meeting of the Thai society for biotechnology

2003. 252- 260.

118. Huda N.; Sajap A. S. and Lau W. H. (2012). Stability of Spodoptera litura

nucleopolyhedrosis virus in Sodium Dodecyl Sulphate. African Journal of

Biotechnology. Vollume 11. No. 16. 3877- 3881.

119. Nazli H., Sajap A.S. and Lau W.H. (2012). Stability of Spodoptera litura

nucleo polyhedrosis virus in sodium dodecyl sulphate. African Journal of

Biotechnology. Volume 11. No. 16. 3877- 3881.

120. Salama, M.S., A. El-Salam, A.M.E., D. M. Mahmoud and Samah M.M.A.

(2017). Effect of ultra violet radiations on insecticidal activity of Spodoptera

littoralis multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus against Spodoptera

littoralis Boisd (Lepidoptera: Noctuidae). Bioscience Research. Vol. 14(3): 645-

652.

121. Winardo D. and Soebandrijo. (2006). Effectiveness of NPV formulated with

different carriers to Spodoptera litura F. and Helicoverpa armigera Hubner on

coton. Annual Reports of Indonesian Tobacco and Fiber Crops Research

Institute. Page 214- 234.

142

Luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

Mục tiêu nghiên cứu của Luận án nhằm xác định được kỹ thuật nuôi nhân tế bào sâu khoang và lây nhiễm phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại. Mời các bạn cùng tham khảo!

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THANH HẢI HÀ

PH¸T TRIÓN SINH KhèI Virus NH¢N §A DIÖN (NPV)

TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT

THUèC TRõ S¢U SINH HäC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THANH HẢI HÀ

PH¸T TRIÓN SINH KhèI VIrus NH¢N §A DIÖN (NPV)

TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT

THUèC TRõ S¢U SINH HäC

Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS.TS. Hoàng Đình Hoà

PGS.TS. Lê Văn Trịnh

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Hình 1.1. Các giai đoạn phát dục của sâu khoang

Số thể vùi hình thành (x108OB /10sâu) 2,59

Số thể vùi hình thành (x108OB /10sâu) 2,50

NPV1.3.1

75,00 NPV2.1.1

77,14 NPV3.1.1

Số thể vùi hình thành (x108OB /10sâu) 1,90

74,29

NPV1.5.1

1,90

70,00 NPV2.1.2

1,80

71,43 NPV3.1.7

NPV1.5.2

2,00

70,00 NPV2.1.5

74,29

NPV1.6.1

1,90

77,50 NPV2.2.1

1,85

71,42

NPV1.6.2

1,75

70,00 NPV2.2.2

2,00

74,26

B

A

A

Hình 3.8: Tế bào sâu khoang sau nuôi nhân 6 ngày

B

A

1

2

4

3

5

6

M

510 bp

SpltNPV - SpltNPV - 2- 5

SpltNPV - 6 SpltNPV - 5

DANH MỤC CÔNG TRÌNH

ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu