PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC
lượt xem 30
download
Một trong những mục tiêu cơ bản của di truyền y học là hiểu biết cơ sở di truyền. Trên cơ sở những hiểu biết đó, tìm ra các phương pháp nghiên cứu, phương pháp thăm dò, chẩn đoán, điều trị bệnh một các có hiệu quả hơn. Trong tiểu luận, chúng tôi sẽ trình bày một số phương pháp chủ yếu trong nghiên cứu, chẩn đoán và trị liệu di truyền.
Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!
Nội dung Text: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC
- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC Một trong những mục tiêu cơ bản của di truyền y học là hiểu biết cơ sở di truyền. Trên cơ sở những hiểu biết đó, tìm ra các phương pháp nghiên cứu, phương pháp thăm dò, chẩn đoán, điều trị bệnh một các có hiệu qu ả h ơn. Trong tiểu luận, chúng tôi sẽ trình bày một số phương pháp ch ủ y ếu trong nghiên cứu, chẩn đoán và trị liệu di truyền. Một trong những thành tựu nổi bật của sự phát triển khoa học kỹ thuật ngày nay là kỹ thuật phân tử. Kỹ thuật phân tử phát tri ển và nó đ ược ứng d ụng mạnh mẽ trong rất nhiều lĩnh vực, đặc biệt nó giúp cho ngành Nông nghi ệp, Y học có những bước phát triển vượt bậc. Trong tiểu luận, chúng tôi cũng đi sâu trình bày những kỹ thuật phân tử cơ bản, mới, được ứng dụng nhiều trong y học giúp cho việc chẩn đoán, phòng, chữa bệnh di truy ền và trong s ản xu ất t ạo nhiều chế phẩm có chất lượng cao. 1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC 1.1. Những khó khăn Khi tiến hành nghiên cứu di truyền y học người ta gặp ph ải nh ững khó khăn chủ yếu như sau: Rụng trứng sinh dục muộn, sinh sản chậm Tổ chức cấu trúc di truyền của con người rất phức tạp Không thể áp dụng các thí nghiệm lai ở sinh vật đối với con người Số lượng con cháu trong các gia đình ngày càng ít Thời gian sống và thời gian sinh trưởng của con người đều rất dài so với các động vật thí nghiệm. 1.2. Những thuận lợi Các đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân nên dễ quản lý, theo dõi. Ngày nay con người đã hiểu biết rất rõ về các đặc tính, hình thái, giải
- phẫu, sinh lý, sinh hoá của mình. Ngày càng có nhiều phương tiện kỹ thuật hiện đại giúp cho vi ệc nghiên cứu các tính trạng ở người được thuận tiện nhanh chóng và chính xác. 2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC 2.1. Phương pháp nghiên cứu phả hệ 2.1.1.Khái niệm: Là phương pháp nghiên cứu sự di truy ền 1 tính trạng nào đó ở nhiều người trọng cùng 1 dòng họ qua nhiều thế hệ đề xem xét: - Tính trạng trội hay lăn - Tính trạng này do một gen hay nhiều gen quay định - Tính trạng này có di truyền liên kết với giới tính hay không - Khả năng mắc bệnh của các thế hệ tiếp theo Trong một số trường hợp còn xác định được người dị hợp tử mang gen bệnh. Phương pháp này kết hợp với các xét nghiệm khác cho phép có thể rút ra những lời khuyên về di truyền chính xác và hữu ích cho các gia đình về việc sinh con hoặc kết hôn. 2.1.2. Các bước tiến hành 2.1.2.1. Lập sơ đồ phả hệ Để lập sơ đồ phả hệ (phả hệ đồ) người ta sử dụng hệ thống ký hiệu quốc tế để biểu diễn với số lượng các thế hệ gia đình bệnh nhân ít nhất là từ 3 đến 4 thế hệ theo những nguyên tắc cơ bản sau: Các cá thể thuộc cùng một thế hệ được xếp cùng trên một hàng ngang theo thứ tự ngày sinh từ trái sang phải và được đánh dấu bằng chứ số Ả rập (1,2,3,4...). Các thế hệ được xếp theo chiều dọc theo thứ tự từ trên xuống dưới và được đánh dấu bằng chữ số La mã (I, II, III, IV...) ở ph ần đ ầu bên trái m ỗi hàng.
- Thế hệ này được nối với thế hệ kia bằng đoạn thẳng vuông góc t ừ gi ữa vạch kết hôn của thế hệ trước xuống thế hệ sau. Ngoài ra trong khi tiếp xúc với người bệnh phải tránh yếu tố tâm lý bất lợi của họ khiến cho thông tin cung cấp cho bác sỹ bị sai lệch. Một số ký hiệu thường dùng trong lập phả hệ. 1. Nam giới; 2. Nữ giới; 3. Không biết giới; 4. Có thai; 5. Ng ười lành; 6. Ng ười bệnh; 7. Người có hội chứng bệnh hoặc dấu hiệu bệnh lý không đầy đủ/ dị hợp tử mang gen lặn bệnh lý; 8. Người lành mang gen lặn b ệnh lý liên k ết-X; 9. Người chưa có thông tin hoặc thông tin không đầy đủ; 10. Người không được kiểm tra kỹ cũng bị bệnh như người bệnh; 11. Đương sự; 12. Chết; 13. Ch ết non ( ở tuổi thiếu nhi); 14. Chết thai và dưới 1 năm; 15. S ẩy thai; 16. V ợ ch ồng; 17. Hai vợ (hai chồng); 18. Vợ chồng ngoài giá thú; 19. Hôn nhân cùng huyết thống; 20. Hôn nhân không có con; 21. Anh chị em cùng bố mẹ; 22. Hai hôn nhân với các con của mỗi hôn nhân; 23. Số con không biết; 24. Không rõ là con đ ể hay không; 25. Con nuôi (không cùng huyết thống); 26. Con sinh đôi một h ợp t ử; 27. Con sinh đôi hai hợp tử; 28. Không rõ kiểu sinh đôi một h ợp tử hay hai h ợp tử; 29. Con ngoài hôn nhân; 30. các thế hệ; 31. Anh chị em trong cùng một th ế hệ. 2.1.2.2. Phân tích phả hệ
- Đây là bước quan trọng để xác định tính chất di truyền và cách thức di truyền của tính trạng bệnh lý. Để làm công việc này phải hiểu và biết vận dụng các qui luật di truyền cơ bản kết hợp với việc tính toán thống kê để sử lý các dữ liệu từ phả hệ. Hình 3.2: Một số sơ đồ phả hệ điển hình. (A) Trội autosome; (B) Lặn autosome; (C) Lặn liên kết-X; (D) Trội liên kết-X; (E) Liên kết-Y Ví dụ: Nếu như trong một phả hệ, ở các thế hệ đều th ấy có người b ị b ệnh, khả năng mắc bệnh ở cả giới nam và giới nữ đều như nhau, trong gia đình có cha hoặc mẹ bị bệnh mà tỷ lệ các con bị bệnh là 50%, thì có th ể nghĩ r ằng b ệnh là bệnh di truyền do gen trội nằm trên nhiễm sắc thể thường gây ra. Còn nếu như trong phả hệ thấy bệnh được di truyền có tính chất cách quãng, con trai bị bệnh nhiều hơn con gái, ông ngoại truyền bệnh cho cháu trai thì có
- thể cho rằng bệnh là bệnh di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắc th ể gi ới tính X gây ra. 2.1.3. Kết quả nghiên cứu: -Đã xác định được nhiều gen quy định tính trạng ở người là gen trội hay lặn. Ví dụ + Da đen, tóc quăn, môi dày, mũi cong, long mi cong là các tính trạng trội + Da trắng, tóc thẳng, môi mỏng, mũi cao, long mi ngắn là các tính trạng lăn. - Xác định được một số gen gây bệnh nằm trên NST giới tính. Ví dụ: + Bệnh mù màu, máu khó đông, tật dính ngón tay… là do gen lặn nằm trên X. + Tật dính ngón tay 2-3, túm lông ở tai do gen trên NST giới tính Y qui định. - Xác định được một số tính trạng do nhiều gen quy định. Ví dụ: + Năng khiếu toán, âm nhạc, hội họa,… là di truyền đa gen, song chịu ảnh hưởng của môi trường và xã hội. 2.2. Phương pháp trẻ sinh đôi (đồng sinh) 2.2.1. Những đặc điểm và giá trị của phương pháp Phương pháp trẻ sinh đôi là phương pháp dựa vào các trẻ sinh đôi. Đây là một trong những phương pháp có hiệu quả nhất để đánh giá vai trò của yếu tố di truyền và môi trừơng đối với sự phát triển một tính trạng nào đó ở người. Phương pháp trẻ sinh đôi cũng thường được sử dụng để đánh giá hiệu qu ả của các phương pháp nuôi dạy trẻ, đánh giá chất lượng các loại th ực ph ẩm, các loại thuốc... 2.2.2. Các bước tiến hành 2.2.2.1. Chọn các mẫu sinh đôi
- Các mẫu sinh đôi có thể được lựa chọn bằng 2 cách. Một là trong dân c ư lựa ra các trẻ sinh đôi rồi trong các trẻ sinh đôi ấy ch ọn l ấy các c ặp có tính trạng cần nghiên cứu. Hai là từ các nhóm dân cư lựa ra những trẻ có tính tr ạng cần nghiên cứu sau đó chọn ra các cặp sinh đôi. Cần chú ý thêm là chỉ tiến hành nghiên cứu khi có đủ cả 2 người trong mỗi cặp. Còn nếu chỉ có một người thì loại bỏ cả hai. 2.2.2.2. Chẩn đoán kiểu sinh đôi Đây là bước quan trọng đòi hỏi sự chính xác cao. Để chẩn đoán chính xác phải sử dụng rất nhiều các chỉ tiêu so sánh về hình thái, sinh lý, sinh hóa nh ư giới tính, màu tóc, màu mắt, màu da, dạng tóc và ki ểu ph ủ tóc, lông trên đ ầu và thân, hình dạng miệng, mũi, tai, vân da bàn tay, các h ệ th ống nhóm máu, các protein huyết thanh v.v.. Hình 3.3: Rau thai và các màng ở trẻ sinh đôi. A. Rau thai, màng nuôi và màng đệm đều riêng; B. Rau thai chung, màng đệm chung, màng ối riêng; C. Rau thai và màng đệm chung, màng ối dính Nếu như tất cả các chỉ tiêu so sánh ở 2 người trong cặp sinh đôi đ ều gi ống nhau thì chứng tỏ đó là các trẻ sinh đôi có nguồn gốc một hợp tử (cùng trứng). Còn nếu chúng không giống nhau hoặc có giống nhau nhưng mức độ giống cũng không khác biệt gì nhiều so với các anh ch ị em ruột khác trong gia đình thì đi ều đó chứng tỏ rằng đó là các trẻ sinh dôi có nguồn gốc 2 hợp tử (khác trứng). Mức độ giống, khác nhau giúp chẩn đoán kiểu sinh đôi có thể được thực hiện bằng
- các phiếu điều tra bằng câu hỏi đối với chính đối tượng, bố m ẹ, người thân trong gia đình như bố mẹ có hay nhầm lẫn không, thầy giáo, các bạn trong lớp có hay lẫn giữa hai người hay không v.v.. Đối với các trẻ sơ sinh, có thể chẩn đoán kiểu sinh đôi qua tính chất của các màng quanh thai: màng ối (trong), màng đệm (ngoài). Ở trẻ sinh đôi hai h ợp tử luôn có màng đệ riêng, màng ối và nhau thai riêng. Tuy nhiên có tr ường h ợp các thai khác hợp tử làm tổ ở tử cung thành hàng, cái này cạnh cái kia thì nhau thai có thể chung. Trường hợp có màng ối riêng nhưng có màng đệm chung ở sinh đôi hai hợp tử là rất hiếm. Nếu có màng đệm riêng, màng ối riêng, rau thai chung thì cũng có thể là sinh đôi một hợp tử nhưng rất hiếm gặp (chiếm 25% số sinh đôi một hợp tử và 50% sinh đôi hai hợp tử). 2.2.2.3. Đối chiếu so sánh các chỉ tiêu, rút ra kết luận đánh giá Đánh giá mức độ tương đồng: để đánh giá mức độ tương đồng của một tính trạng nào đấy ở các cặp sinh đôi người ta sử dụng một công thức tính gọi là công thức Alen- Smith: Kp = Ở đây C là số cặp tương đồng; D là số cặp không tương đồng theo tính trạng so sánh Thí dụ: Khi nghiên cứu tính trạng là bệnh tâm thần phân liệt ở 50 cặp sinh đôi một hợp tử (MZ) người ta thấy có 43 cặp, trong đó cả 2 trẻ đ ều b ị b ệnh (tương đồng) còn 7 cặp thì chỉ có một trẻ trong mỗi cặp bị bệnh (không tương đồng). Theo công thức Alen- Smith ta có thể tính đ ược mức đ ộ t ương đ ồng trong trường hợp này là: KpMZ = = = 86 (%)
- Còn khi nghiên cứu tính trạng này ở 50 cặp sinh đôi hai hợp tử ( DZ ), nếu người ta thấy số cặp tương đồng là 8, số cặp không tương đồng là 42 thì ta sẽ có mức độ tương đồng trong trường hợp này là: KpDZ = = 16 (%) Đánh giá vai trò của yếu tố di truyền và yếu tố môi tr ường: để xác định vai trò của yếu tố di truyền đối với sự phát triển của m ột tính tr ạng nào đó, người ta áp dụng một công thức tính khác gọi là công thức Holzinger: H= (%) Theo công thức này ta có thể tính được vai trò của yếu tố di truy ền đối với bệnh tâm thần phân liệt theo các số liệu ở trên: H = = = 83 (%) Vì mỗi tính trạng ở con người đều là kết quả của s ự tương tác gi ữa y ếu t ố di truyền (H) và yếu tố môi trường (C) ở những mức độ khác nhau. B ởi vậy đ ể xác định vai trò của yếu tố môi trường trong trường hợp này đối với bệnh tâm thần phân liệt, ta có: H + C = 100% ; C = 100% - H = 100% - 83% =17%. 2.3. Phương pháp vân da 2.3.1. Những đặc điểm và giá trị của phương pháp Phương pháp nghiên cứu vân da là phương pháp nghiên cứu di truyền y học dựa trên những đặc tính của các đường nét, hình thù của bề mặt da ở các đầu ngón tay và lòng bàn tay. Phương pháp này có giá trị trong việc góp phần chẩn đoán s ớm m ột s ố b ệnh lý ở người, trong lĩnh vực khoa học hình sự và trong việc xác định trẻ sinh đôi.
- Cơ sở khoa học của phương pháp vân da là ở ch ỗ hình thù và đường nét vân da mang tính cá thể nghiêm ngặt do chúng được kiểm soát bởi nhi ều gen. Trong quá trình phát triển cá thể, các hoa vân trên tay đ ược hình thành t ừ tháng th ứ sáu và hầu như không bị biến đổi trong suốt cuộc đời. Hình 3.4: Các delta đáy ngón a,b,c,d; Hình 3.5. Các đường vân chính các vùng trong lòng bàn tay (Th, Hy, A,B,C,D và kiểu vân trong lòng bàn tay. I1,I2,I3,I4) và gã ba trục t. 2.3.2. Các bước tiến hành 2.3.2.1. Lấy mẫu in vân da trên giấy trắng 2.3.2.2. Phân tích mẫu in theo các chỉ tiêu Tổng số các đường vân đầu ngón. Công thức vân đầu ngón. Cường độ vân đầu ngón. Tần số mỗi loại vân. Chỉ số Cummins. Các kiểu vân trên vùng mô cái và mô út. Góc ngã ba trục atd. Số lượng và hình dạng các rãnh lòng bàn Rút ra các kết luận nhận xét so sánh kết quả nghiên cứu ở các nhóm đối tượng khác nhau.
- Các kiểu vân đầu ngón: 1: vân cung Các miền quanh gan bàn tay (1-13) đơn giản; 2: vân cung lều; 3; vân và chỉ số Cummins. móc/búi/nút; 4,5,6: kiểu vân vòng đối xứng, vòng xoáy và vòng móc kép. Mức độ giống nhau về nếp vân da và quan hệ huyết thống. Quan hệ Mức độ giống nhau Thực tế Lý thuyết Sinh đôi một hợp tử 0,95 1,00 Sinh đôi hai hợp tử 0,49 0,50 Anh chị em ruột 0,5 0,50 Bố mẹ- con 0,48 0,50 Không quan hệ huyết 0,05 0,00 thống 2.4. Phương pháp nghiên cứu di truyền phân tử. Các thành tựu to lớn trong những năm gần đây về lĩnh vực Di truyền học người, đặc biệt là thành tựu giải mã bộ gene người đạt được là nh ờ sử d ụng các kỹ thuật sinh học phân tử như tách chiết, phân tích định tính và định lượng nucleic acid; các phương pháp lai phân tử: Southern blot, Northern blot,
- lai tại chỗ (in situ hybridization),... ; các phương pháp xác định trình tự nucleic acid; tạo dòng (cloning); xây dựng thư viện bộ gene, thư viện cDNA; phương pháp PCR (polymerase chain reaction); Sinh tin (Bioinfomatics),... 2.4.1.Các phương pháp tách chiết acid nucleic, các phương pháp định tính và định lượng cơ bản. 2.4.1.1.Các phương pháp tách chiết acid nucleic: 2.4.1.1.1.Phương pháp tách chiết DNA. + Bước 1: phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô trong h ỗn hợp, chất tẩy (SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Chất tẩy là các phân tử lưỡng cực, sẻ kết hợp với protein màng và các phân tử phospholipid làm phá vỡ cầu trúc màng. Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn. + Bước 2: loại protein: lắc mẫu trong dung dịch phenol: chloroform để biến tính protein đồng thời không hòa tan acid nucleic. Protein b ị bi ến tính s ẻ không hòa tan trong pha nước có chứa acid nucleic và sau khi li tâm s ẻ t ủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol : chloroform. Thu h ồi acid nucleic trong pha nước. + Bước 3: thu hồi acid nucleic : thu hồi dưới dạng tủa acid nucleic nhằm thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân li của các enzyme và khi cần có thể hòa tan lại trong nước theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa trong ethanol hoặc trong isopropan ol.
- 2.4.1.1.2.Tách chiết ARN. Phương pháp tách chiết ARN toàn phần cũng bao gồm các bước cơ bản như tách chiết ADN: - Giải phóng ADN và ARN ra khỏi màng tế bào. - Tách bỏ phần protein. - Tủa acid nucleic Bước tiếp theo: dịch chiết chứa acid nucleic được ủ với ADN polimerase để phân hủy ADN. Sau đó phân hủy dịch chiết chứa ARN trong n ước; t ủa bằng ethanol, để thu được ARN toàn phần. mARN có thể tách riêng. Dựa vào cấu trúc phân tử có đuôi mARN có đuôi poly A có thể tách mARN bằng sắc ký ái lực trên cột oligo T –cellulose. Hiện nay đã sử dụng bộ kit ( bộ mẫu thử chuyên dụng) sử dụng các viên bi từ có mang oligo T trên b ề m ặt. Thông qua liên kết bổ sung A=T các mARN bám lên bề mặt các viên bi t ừ. Sau đó b ằng kỹ thuật li tâm thu lại các viên bi và tách mARN. K ỹ thu ật này cho phép tách giữ lại mARN với khối lượng rất nhỏ.
- Chú ý trong quá trình thao tác, tránh lẫn ADN và ARN, ARN của đối tượng khác vào dụng cụ. Tránh các enzym phá hủy ADN hoặc ARN cần nghiên cứu. Đặc biệt ARN không bền dễ bị phân li bởi ARN polimerase. Sau khi tách chiết ADN kiểm tra độ tinh khiết của ADN bằng xác định tỉ lệ OD260/OD280 và OD260/OD 230 = 1,7 – 2 được coi là sạch hoặc bằng phương pháp điện di ADN. 2.4.1.1.3.Phương pháp sắc ký + Sắc ký ái lực: trên poly U-Sepharose hay oligodT-cellulose, dùng để tinh sạch mARN. + Sắc ký lọc gel dùng trong phân tách các acid nucleic và nucleotic tự do sau quá trình tạo mẫu dò (probe) đánh dấu. + Sắc ký trong hiệu suất cao: có độ phân giải rất cao dùng trong tinh sạch các oligonucleotide tổng h ợp, plasmid, phân tách các đoạn DNA. + Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi một lượng rất nhỏ DNA.
- 2.4.1.2.Các phương pháp định tính và định lượng thô acid nucleic. 2.4.1.2.1.Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế. Cho phép định lượng tương đối nồng độ acid nucleic có trong mẫu. Nguyên tắc là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa vào mối tương quan một đơn vi OD260nm tương ứng với nồng độ: + 50µg/ml cho một dung dịch DNA sợi dôi. + 40µg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn. Định tính: độ sạch dựa trên tỉ số OD 260/OD280, tính chất của các acid nucleic (mạch đôi/đơn) (280nm là bước sóng ở đó các protein có mức độ hấp thụ cao nhất. 2.4.1.2.2.Phương pháp điện di. Mục tiêu: + Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thước. + Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng. + chuẩn bị: thu hồi đoạn DNA (dùng trong tạo dòng) Nguyên tắc: dựa vào đặc tính, cấu trúc của acid nucleic: tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt của điện trường nên sẻ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử khi di chuyển trong đi ện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ các chất cấu thành gel.
- Kiểu điện di: Agarose, Polyacylamide, điện li trong trường xung (PDGE – Pulse Field Gel Electrophoresis). a.Điện di trên gel polyacrylamide. Được dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ, dưới 1000 cặp base. Điện di theo phương thẳng đứng. Độ phân giải cao, phân biệt được những trình tự chỉ cách nhau 1 nucleotide. Phương pháp phát hiện: DNA phóng xạ tự gỉ, xanh methylene, ethidium bromide, protein – xanh coomassie nhuộm nitracte bạc. ứng dụng: tinh sạch các oligonucleotic tổng hợp, xác định trình tự DNA, tách các trình tự DNA có khoảng cách gần bằng nhau, SDS – PAGE (phân tích protein). b. Điện di trên gel agarose. Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, th ường dùng đ ể phân tách nh ững đoạn có kích thước 0,5 – 20 kb. Điện di theo phương nằm ngang. Độ phân giải thay đổi khi nồng độ agarose hay loại agarose thay đổi. Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi, nhuộm ethidium bromicde. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của acid nucleic và sẻ phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại. Ứng dụng: phát hiện một trình tự DNA, phân tích trình tự các h ỗn h ợp DNA (Southern blot), chuẩn bị nguyên liệu. 2.4.2.Các phương pháp lai phân tử. 2.4.2.1.Cơ sở của lai phân tử. Khái niệm về lai phân tử:
- + Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy Tm thì hai mạch sẻ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết H ở hai mạch. + Sau khi hai mạch tách rời nếu nhiệt độ phản ứng được làm gi ảm t ừ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẻ bắt cặp trở l ại, hi ện tượng này gọi là sự lai phân tử. Đặc điểm của sự lai phân tử: + Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung với nhau. + Các trình tự bổ sung có thể là DNA, RNA dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA – RNA, RNA – RNA hay các phân tử lai DNA – DNA. 2.4.2.2.Các kiểu lai phân tử. 2.4.2.2.1.Lai trên pha lỏng. Các trình tự cần lai nằm trong pha lỏng, là một dung d ịch đ ệm. S ự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuy ển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm. Phương pháp này sử dụng để phát hiện các trình tự tương đồng giữa các loài hay một cá thể. 2.4.2.2.2.Lai tại chổ:
- trình tư acid nucleic cần tìm không được tách chiết ra khỏi mô hay tế bào. Quá trình lai với mẫu dò đã được đánh dấu và phát hi ện các phân t ử lai đ ược thực hiện ngay trên NST, tế bào hay lát cắt mô. 2.4.2.2.3.Lai trong pha rắn. Một tron hai trình tự cần lai là cố định trên giá th ể rắn ( màng lai). Phát hiện phân tử lai thông qua mẫu dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ. Ba kỹ thuật lai trên pha rắn thông dụng là Southern blot, Nothern blot và Dot blot. a.Southern blot. Nguyên tắt của Southern blot là màng lai nitrocellulose có kh ả năng ti ếp nhận DNA đã được biết từ lâu và được sử dụng trong nghiên cứu lai acid nucleic khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960. Đầu thập niên 1970, sự ra đời của phương pháp điện di trên gel đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. Từ đó nước phát triển tiếp theo của phương pháp chuyển các đoạn DNA phân tách từ gel lên lai màng lai nitrocellulose. Phương pháp này được Southern mô tả tại đại học Edingburgh vào năm 1975. Southern Blot bao gồm các bước cơ bản sau:
- - Cắt DNA bằng enzym hạn chế thích hợp. - Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose. - Làm biến tính DNA ngay trên gel, DNA sợ kép sẻ được tách thành DNA sợ đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai. - Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai ( màng nitrocellulose hay màng nylon). Việc chuyển DNA thường được tiến hành bằng hoạt tính mao dẫn trong khoảng vài tiếng hoặc có thể dùng một thiết bị thấm chân không. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được giữ nguyên không thay đổi. - Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu. - Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa DNA trên màng lai với mẫu dò. Để đánh giá người ta th ường s ử d ụng P32, biotin/streptavidin hoặc một vài mẫu dò phát quang sinh học. - Định vi các phân tử DNA – mẫu dò. Nếu sử dụng các mẫu dò đánh dấu phóng xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định. Nếu sử dụng biotin/ streptavidin thì dùng phương pháp so màu ho ặc nếu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì thì phát hiện bằng sự phát quang. b.Northern blot.
- Sau khi Southern mô tả phương pháp Southern blot năm 1975, người ta dung một phương pháp tương tự để xác định các đoạn RNA đặc biệt gọi là Northern blot. Northern blot bao gồm các bước sau: + RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) bằng phân tách bằng điện di trên gel agarose. + RNA sau khi đã được phân tách chuy ển lên màng lai (các phân t ử RNA giữ nguyên vị trí như ở trên gel) + RNA cố định trên màng lai với mẫu dò DNA sợi đơn ( hoặc RNA ) có đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một enzyme tạo thành phân tử lai RNA – DNA hoặc RNA - RNA sợi kép. + Vị trí của mẫu dò được xác định bằng phương pháp phóng xạ tự ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò được gắn với enzyme thì đem ủ với một cơ chất không màu. Enyme liên kết với nó sẻ biến đổi thành một sản ph ẩm màu có th ể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà có thể phát hi ện bằng phim X quang một cách trực tiếp. c.Phương pháp Dot blot – Slot blot Lai theo phương pháp Dot blo là phương pháp sàng lọc nhanh th ường thực hiện với những mẫu dò ASO để phân biệt sự khác nhau gi ữa các alen
- ở vị trí một nu. Phương pháp này không cần điện di trên th ạch mà b ằng thấm trực tiếp từ đó để xác định những đoạn nu khác nhau. Quy trình thực hiện của kỹ thuật qua các bước sau: + Bước 1: dung dịch ADN được biến tính bằng nhiệt độ hay bằng dung dịch Kali để tách ADN sợi kép thành ADN sợi đ. + Bước 2: Gắn ADN đích đã được biến tính lên màng lai. + Bước 3: đưa màng lai chứa ADN đích vào dung dịch chứa ADN dò. + Bước 4: sau khoảng 20 – 24h ADN dò sẻ g ắn vào ADN đích t ạo thành chuổi kép. + Bước 5: Rửa màng lai. Để khô tự nhiên sau đó phân tích bằng tự chụp phóng xạ. Ngoài ra còn có thể gắn ADN dò lên màng lai, ADN đích đ ược đ ể ở trong dung dịch và các bước tương tự như trên. Phương pháp lai tại chổ (In Situ Hybridization) Phương pháp lai tại chổ vừa là phương pháp di truyền tế bào vừa là phương pháp di truyền phân tử. Phương pháp thường được dùng là lai NST ở kì giữa hoặc NST trong nhân tế bào gian kỳ với ADN dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc bằng phóng xạ huỳnh quang. Quang sát sự có mặt của đoạn ADN đích trong đoạn ADN lai bằng tự ch ụp hình phóng x ạ hoặc bằng kính hiễn vi huỳnh quang. Bằng phương pháp này chuỗi nh ẹ kappa của globulin miễn dịch đã được xác định có locus trên nhánh ng ắn c ủa NST số 2. Phương pháp lập bản đồ mất đoạn. Phương pháp này dựa vào sự có mặt hay vắng mặt của một s ố vùng đ ặc biệt nào đó hoặc của một locus trong ADN lấy từ bệnh nhân có bất thường NST hay từ mẫu lai các tế bào sô ma của người và gậm nhấm, trong mẫu có chứa đoạn ADN đã biết trước của NST người. Lập bản đồ mất đoạn đặc bi ệt có ích cho
CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD
-
Bài tập môn: Phương pháp nghiên cứu khoa học
9 p | 7601 | 1509
-
Phương pháp nghiên cứu khoa học
7 p | 2022 | 637
-
Báo cáo môn Phương pháp nghiên cứu khoa học trong kinh doanh: Các yếu tố ảnh hưởng đến quyết định chọn mua điện thoại thông minh của nhân viên văn phòng tại TP. HCM
32 p | 2203 | 190
-
Đề tài Phương pháp nghiên cứu kinh tế: Ảnh hưởng của vốn đầu tư trực tiếp từ nước ngoài đến phát triển bền vững ở Việt Nam giai đoạn 2001-2014
18 p | 603 | 164
-
Tiểu luận: Phương pháp SCAMPER và một số ứng dụng của phương pháp này
12 p | 713 | 85
-
Bài giảng Phương pháp nghiên cứu khoa học: Chương 2
6 p | 583 | 40
-
Luận văn: Phương pháp nghiên cứu khoa học và phương pháp luận nghiên cứu khoa học
18 p | 181 | 39
-
Tiểu luận: Phương pháp sáng tạo khoa học ứng dụng trong phát triển điện thoại di động
26 p | 217 | 34
-
Tiểu luận Phương pháp nghiên cứu khoa học: Nghiên cứu gặp kẹt xe khi đi học của sinh viên trường đại học công nghiệp Hà Nội
33 p | 410 | 33
-
Tiểu luận: Nghiên cứu phương pháp sáng tạo trên điện thoại di động
64 p | 180 | 28
-
Bài giảng Phương pháp nghiên cứu khoa học: Chương 5
6 p | 169 | 23
-
Tiểu luận:VẬN DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỂ XÂY DỰNG DỊCH VỤ “SỔ LIÊN LẠC ĐIỆN TỬ”
24 p | 136 | 23
-
Tiểu luận: Tìm hiểu về hệ thống tư vấn thông tin di động
29 p | 125 | 20
-
Tiểu luận: Nghiên cứu ứng dụng thuật giải di truyền để tìm kiếm thông tin trên văn bản - ĐH QGTP HCM
22 p | 96 | 15
-
Tiểu luận:Dịch vụ di động Viettel và ứng dụng phương pháp khoa học trong quá trình phát triển
18 p | 186 | 15
-
Tiểu luận báo cáo đề tài : Phương pháp nghiên cứu trong môn tin học
14 p | 112 | 11
-
Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Văn học: Tư tưởng học thuật và phương pháp biên định di sản văn chương của Lê Quý Đôn, Bùi Huy Bích và Phan Huy Chú
27 p | 6 | 2
Chịu trách nhiệm nội dung:
Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA
LIÊN HỆ
Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM
Hotline: 093 303 0098
Email: support@tailieu.vn