Đồ án tốt nghiệp: Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS SPP.

PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN

TRUYỀN THỐNG ĐỂ KÉO DÀI

THỜI GIAN BẢO QUẢN BÁNH MÌ

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: ThS. Huỳnh Phương Quyên

TS. Nguyễn Hoài Hương

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thái Thiên Dung

MSSV: 1311100223

Lớp: 13DSH01

TP.Hồ Chí Minh, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu

trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

khác.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được

cám ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc.

TP.HCM, ngày 05 tháng 08 năm 2017

Học viên thực hiện luận văn

Nguyễn Thái Thiên Dung

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý Thầy, Cô trường

Đại học Công Nghệ TP. HCM đã nhiệt tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cũng như

niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho sinh viên trong suốt thời gian học tập.

Để hoàn thành được đồ án “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập

từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì”

trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp phải không ít

lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của ThS.

Huỳnh Phương Quyên và TS. Nguyễn Hoài Hương, Giảng viên Khoa Công nghệ

Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, cùng những

kiến thức và kỹ năng cần thiết Cô truyền dạy mà em có thể đạt được thành quả của

ngày hôm nay. Em xin chân thành cảm ơn các Cô.

Em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc

và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe.

Cám ơn các bạn đại học khóa 2013 – 2017 và các em khóa 2015 – 2019 trường

Đại học Công nghệ TP. HCM, luôn bên cạnh và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm

đồ án tại truờng. Cuối cùng, từ tận đáy lòng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia

đình đã luôn dành tình yêu thương vô vàn cho con, đã luôn ủng hộ, động viên và tạo

niềm tin để con luôn vững bước trên con đường mình đã chọn.

TP.HCM, ngày 05 tháng 08 năm 2017

Sinh viên thực hiện đồ án

Nguyễn Thái Thiên Dung

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT ....................................................................................... v

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. vi

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH ..........................vii

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1 1.

Tình hình nghiên cứu .............................................................................. 2 2.

3. Mục tiêu ................................................................................................... 2

Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................. 2 4.

Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 3 5.

Kết quả đạt được của đề tài .................................................................... 3 6.

Kết cấu đồ án ........................................................................................... 3 7.

Chương 1: TỔNG QUAN...................................................................................... 5

1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic .................................................................. 5

1.1.1 Giới thiệu chung ............................................................................... 5

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus ......................................... 7

1.1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ......................................... 9

1.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn lactic ................................................................. 10

1.1.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic ............... 12

1.1.2.1 Quá trình trao đổi chất ................................................................. 12

1.1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic ....................................................... 13

1.1.3. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic ...................................... 14

1.2 Tổng quan về nấm mốc ......................................................................... 15

1.2.1. Đặc điểm ......................................................................................... 16

1.2.2 Độc tố do nấm tiết ra ....................................................................... 16

1.2.3 Tác hại của nấm.............................................................................. 17

Đồ án tốt nghiệp

1.2.4 Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm .................................... 17

1.3 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì .......................................... 18

1.3.1 Giới thiệu chung ............................................................................. 18

1.3.2 Quy trình làm bánh mì .................................................................... 19

1.3.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì .................. 23

1.3.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì ................................. 24

1.4 Tổng quan về bột chua .......................................................................... 25

1.4.1. Đặc tính của bột chua ..................................................................... 25

1.4.2. Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua ................................. 26

1.4.3. Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với

hương vị của bánh mì ................................................................................... 27

1.4.4. Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua ........... 28

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 31

2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 31

2.2. Thời gian thực hiện ............................................................................... 31

2.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 31

2.3.1. Giống vi sinh vật ............................................................................. 31

2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng .................................................... 31

2.3.2.1. Hoá chất ....................................................................................... 31

2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy ..................................................................... 31

2.4. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................ 32

2.4.1. Thiết bị ............................................................................................ 32

2.4.2. Dụng cụ ........................................................................................... 32

2.5. Phương pháp luận ................................................................................. 32

2.6. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 33

2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................ 33

2.6.2. Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. ............................................. 34

2.6.2.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............... 34

2.6.2.2 Khả năng sinh acid .......................................................................... 37

Đồ án tốt nghiệp

2.6.2.4 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro

................................................................................................................... 38

2.6.3. Xây dựng đường chuẩn................................................................... 41

2.6.3.1. Lactobacillus spp. ......................................................................... 41

2.6.3.2. Nấm mốc Aspergillus niger........................................................... 44

2.6.4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh

mì của vi khuẩn LAB với nấm men ............................................................... 47

2.6.5 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì .................. 50

2.6.5.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn

Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau ........... 50

2.6.5.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có

bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản .. 52

2.6.5.3 Độ nở bánh mì .............................................................................. 54

2.6.5.4 Độ ẩm bánh mì ............................................................................. 54

3.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. ................................................... 55

3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát về sinh lý, sinh hóa ................ 55

3.1.2 Khả năng sinh acid ............................................................................. 56

3.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro

....................................................................................................................... 57

3.2 Xây dựng đường chuẩn ......................................................................... 59

3.2.1. Lactobacillus spp. ........................................................................... 59

3.2.2. Nấm mốc Aspergillus niger ............................................................ 59

3.3 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng

lên men bánh mì với nấm men ........................................................................ 60

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì ....................... 63

3.4.1. Đánh giá cảm quan ........................................................................... 63

3.4.1.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn

iii

Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau ........... 63

Đồ án tốt nghiệp

3.4.1.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có

bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản .. 66

3.4.2 Đánh giá độ nở ................................................................................... 68

3.4.3 Đánh giá độ ẩm .................................................................................. 71

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................... 74

1. Kết luận ................................................................................................. 74

2. Kiến nghị ............................................................................................... 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 76

Tài liệu tiếng Việt ............................................................................................ 76

Tài liệu tiếng Anh ............................................................................................ 77

PHỤ LỤC THÀNH PHẨN MÔI TRƯỜNG ........................................................ 1

PHỤ LỤC BẢNG MÃ HÓA MẪU THỬ CẢM QUAN ....................................... 3

PHỤ LỤC KẾT QUẢ ............................................................................................ 9

PHỤ LỤC HÌNH ................................................................................................. 11

PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU ............................................................................... 18

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC VIẾT TẮT

Vi sinh vật - VSV:

- LAB: Lactic acid bacteria/Lactobacillales

- MRS agar: de Man, Rogosa, Sharpe Agar

- MRS broth: de Man, Rogosa, Sharpe Broth

- PDA: Potato Dextrose Agar

- PDB: Potato Dextrose Broth

- SAS: Statistical Analysis Systems

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men

(Corsetti và cộng sự, 1998) .................................................................................... 15

Bảng 2.1: Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì. ... 48

Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn Lactobacillus spp. 55

Bảng 3.2: Độ acid (% TA) của chủng Lactobacillus spp. ...................................... 57

Bảng 3.3: Tỉ lệ ức chế của vi khuẩn Lactobacillus spp. với nấm mốc theo phương

pháp cấy 2 đường vi khuẩn .................................................................................... 57

Bảng 3.4: Kết quả mật độ Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 .................. 60

Bảng 3.5: Bảng tính mật độ nấm mốc để cảm nhiễm. ............................................ 61

Bảng 3.6: Bảng mật độ / khối lượng cần bổ sung .................................................. 61

Bảng 3.7: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu .................................................... 62

Bảng 3.8: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 ............ 64

Bảng 3.9: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.C1 ............ 64

Bảng 3.10: Kết quả đánh giá cảm quan mức độ ưa thích về các chỉ tiêu màu sắc, độ

xốp, mùi, vị của các mẫu bánh mì .......................................................................... 66

Bảng 3.11: Đánh giá chung về mức độ ưa thích của các mẫu bánh mì................... 67

Bảng 3.12: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BML5 ... 69

Bảng 3.13: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BMC1 ... 69

Bảng 3.14: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của các mẫu bánh mì ........ 70

Bảng 3.15: Đánh giá độ ẩm của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 và

Lactobacillus sp.C1 ............................................................................................... 72

Bảng 3.16: Đánh giá độ ẩm của các mẫu bánh mì khi vừa nướng xong và sau 7 ngày

bảo quản ................................................................................................................ 72

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus ................................................................. 7

Hình 1.2: Tế bào nấm Aspergillus niger ................................................................ 16

Hình 1.3: Bánh mì thành phẩm ............................................................................. 18

Hình 1.4: Quy trình làm bánh mì .......................................................................... 20

Hình 1.5: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid

lactic (được chuyển thể từ Liu và những người khác năm 2008) ............................ 30

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu đề tài.......................................................... 33

Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus spp........ 34

Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus spp. ............. 37

Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm

mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. ....................................................... 39

Hình 2.6: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường vi

khuẩn..................................................................................................................... 41

Hình 2.7: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn chủng Lactobacillus spp. ................ 42

Hình 2.8: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn nấm mốc A.niger ............................ 44

Hình 2.9: Vùng đếm hồng cầu .............................................................................. 45

Hình 2.10: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì.

.............................................................................................................................. 47

Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc trên MRS agar ....................................................... 56

Hình 3.2: Kết quả nhuộm Gram ............................................................................ 56

Hình 3.3: Đồ thị khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus sp.L5 và

Lactobacillus sp.C1 ............................................................................................... 58

Hình 3.4: Đối kháng nấm Aspergillus niger .......................................................... 58

Hình 3.5: Đường chuẩn củng vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1

.............................................................................................................................. 59

vii

Hình 3.6: Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus niger .............................................. 59

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.7: Khảo sát đối kháng in vivo .................................................................... 63

Hình 3.8: Mẫu bánh mì bổ sung 2 chủng lactic chuẩn bị đánh giá cảm quan ......... 65

Hình 3.9: Tiến hành thí nghiệm cảm quan mẫu bổ sung 2 chủng lactic. ................ 66

Hình 3.10: Mẫu bánh mì chuẩn bị đánh giá cảm quan ........................................... 68

Hình 3.11: Tiến hành thí nghiệm cảm quan ........................................................... 68

viii

Hình 3.12: Độ nở của bánh mì .............................................................................. 71

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, chất lượng cuộc sống và nhu cầu của

con người ngày càng cao, nhất là nhu cầu về lương thực thực phẩm. Con người đòi

hỏi thực phẩm đa dạng, tiện dụng, an toàn và hiệu quả.

Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối và nấm men, để

lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín. Khoảng một nửa số dân trên thế giới

dùng bánh mì làm món ăn vào buổi sáng bởi tính tiện dụng. Trên khắp thế giới, bánh

mì rất đa dạng về cả hình dạng và công thức chế biến cũng như cách bảo quản. Sự hư

hỏng của sản phẩm bánh mì chủ yếu là do sự tăng trưởng của nấm; các loài chủ yếu

liên quan đến là Aspergillus, Fusarium, và Penicillium. Ngoài những thiệt hại kinh tế

lớn bắt nguồn từ sự hiện diện của nấm mốc, mối quan tâm khác là việc nấm mốc sản

xuất độc tố tiềm năng có thể gây ra vấn đề sức khỏe cộng đồng (Legan, 1993). Trong

những năm gần đây, bảo quản sinh học (dùng vi khuẩn và / hoặc các chất chuyển hóa

của vi khuẩn để ngăn chặn sự hư hỏng và để kéo dài thời hạn sử dụng của thực phẩm)

(Stiles, 1996) đã đạt được sự quan tâm ngày càng tăng do nhu cầu của người tiêu

dùng. LAB có lịch sử lâu dài trong việc bảo quản thực phẩm khỏi các vi sinh vật gây

hư hỏng - chúng thường được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm, có thể sản

sinh ra một số chất chuyển hóa mang lại lợi ích cho sức khỏe và do đó thường được

coi là an toàn (GRAS) (Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid Saari, 2011),

chẳng hạn như axit hữu cơ, axit béo, hydrogen peroxide và bacteriocins. Hoạt tính

kháng nấm của LAB (Hassan & Bullerman, 2008; Magnusson, Strom, Roos, Sjogren,

& Schnürer, 2003; Sjogren, MAG nusson, Broberg, Schnürer, & Kenne, 2003) có thể

sử dụng để chống nấm mốc kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì.

Chính vì thế, tôi thực hiện đề tài về: “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp.

phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì”.

Đồ án tốt nghiệp

2. Tình hình nghiên cứu

Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để tạo chế phẩm trong

nông nghiệp cả trong nước và trên thế giới.

Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng lại

nấm bệnh theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi, 2004) như: “Nghiên cứu

sử dụng vi khuẩn probiotic Lactobacillus plantarum trong chế biến sữa chua” (Đoàn

Anh Dũng, Nguyễn Công Hà, Lý Nguyễn Bình và Lê Nguyễn Đoan Duy - Khoa

Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, 2015), đồ án tốt nghiệp

“Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus niger và Mucor sp. của

vi khuẩn Lactobacillus sp.L5” (Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015).

Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic

được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong- 75, Hàn Quốc

theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và Schnurer, 2001). Ngăn ngừa sự

hư hỏng nấm mốc bằng cách sử dụng vi khuẩn axit lactic có đặc tính chống nấm

(Carla Luciana Gerez, Maria Ines Torino, Graciela Rollán, Graciela Font de Valdez,

2009). Vi khuẩn acid lactic trong bảo quản nâng cao chất lượng bánh mì (Belal J.

Muhialdin, Zaiton Hassan và Nazamid Saari, 2015).

3. Mục tiêu

Sử dụng Lactobacillus spp. kết hợp nấm men trong lên men bánh mì nhằm kéo

dài thời gian bảo quản bánh mì và cải thiện cảm quan sản phẩm.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacullus sp.C1.

- Xây dựng đường chuẩn của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacullus

sp.C1, nấm Aspergillus niger để xác định mật độ tế bào, bào tử từng chủng.

- Khảo sát khả năng kháng nấm mốc của vi khuẩn LAB in vitro.

Đồ án tốt nghiệp

- Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men

bánh mì với nấm men.

- Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì.

5. Phương pháp nghiên cứu

a) Phương pháp luận

Chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ nem chua, cơm mẻ nên bản thân chủng

vi khuẩn đã có tính an toàn thực phẩm. Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của

vi khuẩn lactic đối với các nấm gây hư hỏng thực phẩm, người thực hiện đề tài tiếp

tục nghiên cứu và tìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm thực phẩm. Từ đó ứng

dụng chủng vi khuẩn lactic để ức chế nấm mốc trên thực phẩm và cụ thể là bánh mì.

b) Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị. -

Sử dụng phần mềm SAS9.4 để xử lí số liệu. -

6. Kết quả đạt được của đề tài

- Khẳng định được hoạt tính sinh học của chủng Lactobacillus spp..

- Xác định được mật độ tế bào của Lactobacillus spp., A.niger.

- Đánh giá tỉ lệ ức chế nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương pháp kháng

nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. (Dual Culture Two Line

Culture Method).

- Xác định và kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì.

7. Kết cấu đồ án

- Mở đầu

- Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên

quan đến tài liệu nghiên cứu.

Đồ án tốt nghiệp

- Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến

các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.

- Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà

đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biến chứng cho kết quả thu được.

- Kết luận và kiến nghị - nội dung chương tóm tắt lại những kết quả mà đề tài

đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.

Đồ án tốt nghiệp

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.1.1 Giới thiệu chung

Lịch sử phát hiện ra vi khuẩn lactic:

- Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hoá học người Thuỵ Điển Scheele đã tách được

acid lactic từ sữa bò lên men chua.

- Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả

hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic.

- Vào năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là

Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic).

- Đến năm 1881, ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình

thành.

Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không có khả năng

tạo bào tử. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tuỳ nghi, không chứa cytochrom

và enzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh. Chúng

phân giải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển. Chính do sự sinh acid lactic, một

acid yếu nên vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong các thực phẩm lên men, dùng

để ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây hư hỏng. LAB có thể lên men các loại

đường monosaccharide và disaccharide nhưng không phải bất cứ chủng vi khuẩn

lactic nào cũng có thể lên men đường disaccharide: một số chủng không thể lên men

saccharose, một số lại không thể sử dụng được lactose, các vi khuẩn latic không lên

men được tinh bột (ngoại trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các loại

polysaccharide khác.

Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình

thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác

nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu

được acid hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và

các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại

Đồ án tốt nghiệp

cũng được sử dụng trong phân loại. Theo khóa phân loại của Bergey, họ

Lactobacilliaceae chia làm 2 họ: Streptococeae và Lactobacieae.

- Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc.

- Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus.

Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên. Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là cỏ

khô, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột. Một số loài trong họ vi khuẩn

lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh. Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng

gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu, hình que...Phân

biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình. Khả năng tổng hợp nhiều hợp

chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu (Nguyễn Đức Lượng, 2002).

Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu xếp

thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic

từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi.

Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn

etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 – 15% cồn hoặc cao hơn,

một số trực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%). Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển

ở nhiệt độ tương đối thấp (5 oC hoặc thấp hơn), các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng

tối thích là 25 - 35 oC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 45 oC. Khi gia

nhiệt tới 60 – 80 oC hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Sự phát triển của nó cần

có sự có mặt của peptone, acid amin hay muối amin. Chúng có yêu cầu đặc biệt về

chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra

tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5.5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5.5 quá trình lên men

bị dừng lại. Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân huỷ protein của sữa thành các

peptid và acid amin. Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trực khuẩn cao

hơn. Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit. Một số loài có khả năng tạo thành

màng nhầy. Một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật

gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic,

các loài này còn có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (người ta

gọi các hợp chất này là bacteriocin). Những chất kháng sinh này không dùng trong y

Đồ án tốt nghiệp

học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan. Các vi khuẩn

lactic ngoài việc tạo thành acid còn có 1 số loài tạo được chất thơm ( diacetyl, acetoin,

acid bay hơi...) như Streptococcus diacetylactic.

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus

Tuỳ theo hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình

cầu và hình que. Kích thước của chúng cũng thay đổi tuỳ theo từng loài.

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus

Phân loại khoa học:

- Giới: Vi khuẩn

- Ngành: Firmicutes

- Lớp: Bacilli

- Bộ: Lactobacillales

- Họ: Lactobacillacea

- Giống:

Lactobacillus

Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L.acidophilus, L.brevis,

L.casei, L.fermentum, L.plantarum, L.bulgaricus,...

Đồ án tốt nghiệp

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase

âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu

bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes. Các loài

Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt

là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục

người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có

chứa các vi khuẩn này. Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như:

Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus,

Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, plantarum. Sự phân chia của vi khuẩn lactic

dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài

Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm.

- Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, chúng được gọi là Thermobacterium, có

fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase). Chúng lên men được hexose để

tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng phát triển ở 45℃.

- Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có

FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình

và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic.

- Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có

phosphoketolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacillus có vai trò hữu ích

trong điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột

kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy khi đi du lịch, tiêu chảy do

nhiễm khuẩn Clotridium difficile, tình trạng không dung nạp Lactose, bệnh về da như:

bang đỏ do sốt, chàm, mụn trứng cá, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường

hô hấp.

Đồ án tốt nghiệp

1.1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi

khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Để sinh trưởng bình

thường, ngoài nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như nguồn

carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà chúng còn

có nhu cầu về một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng.

 Nhu cầu dinh dưỡng carbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các

monosaccharide (glucose, fructose, manose) và các disaccaride (saccharose, lactose,

maltose) cho đến các polysaccaride (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon

này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình

lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,..

 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi

khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Vì

vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ

có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt,

cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,.. Hiện nay, cao nấm men

là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên ở quy mô công

nghiệp người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.

 Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào,

nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không

có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại

vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà

rốt hay dịch tự phân nấm men.

 Nhu cầu các chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ

khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có

Đồ án tốt nghiệp

ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid

oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm

thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic.

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng

đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng

các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.

 Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các

muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho,

lưu huỳnh, magie, mangan. Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo

chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu

trúc tế bào.

 Nhu cầu dinh dưỡng oxy

Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí (microaerophile), sinh trưởng trên

bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí (B.J.B

Wood and Holzapfel W.H, 1995). Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong

môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy. Tuy nhiên, trong

điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện

kị khí.

1.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn lactic

Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát

triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu

suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh

dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình

nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm

sinh khối sau này.

Đồ án tốt nghiệp

 Thành phần môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết

cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất

với môi trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic

có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình

nuôi cấy vi khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển

hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng

làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin),

vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh

dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng

cao hiệu suất lên men.

 Yếu tố môi trường

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ môi trường cũng ảnh hưởng rất

lớn đối với vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây

ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến

quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men

càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40℃. Một

số có thể sinh trưởng dưới 15℃ và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới

5℃ (B.J.B Wood and Holzapfel W.H, 1995).

- Ảnh hưởng của pH

Vi khuẩn lactic nói chung có thể phát triển được trong môi trường acid, khoảng

pH của chúng có thể từ 4.5 – 8.5. Trong quá trình lên men, vi khuẩn sẽ sinh ra acid

lactic, khi pH thấp hơn 4 một mặt nó sẽ ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên nó

cũng ức chế sự phát triển của chính nó, do đó cần phải theo dõi suốt quá trình lên

men, dùng bazơ để điều chỉnh pH về thích hợp.

Đồ án tốt nghiệp

- Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men

Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở

những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá

trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men.

1.1.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic

1.1.2.1 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc

lên men lactic. Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn

lactic làm hai nhóm:

 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình

Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic

tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol,

di-acetiyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:

𝐶6𝐻12𝑂6 → 2𝐶𝐻3CHOHCOOH + 21,8.104 J .

Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose được chuyển hóa theo chu

trình EMP (Embden-Mayerhoff), vi khuẩn sử dụng tất cả loại enzyme aldolase cho

quy trình này, còn hydro tách ra khi dehydro hóa triozophophat được chuyển đến

pyruvat. Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase

cho nên acid pyruvic không thủy phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic.

 Lên men lactic dị hình

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài các sản phẩm phụ

như acid acetic, ethanol, acid succinic, C𝑂2. Phương trình chung biễu diễn quá trình

lên men:

Đồ án tốt nghiệp

𝐶6𝐻12𝑂6 → 𝐶𝐻3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝐶2𝐻5𝑂𝐻 + 𝐶𝑂2

Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu

etylic và acid acetic 10% các loại khí 20%, đôi khi không có các khí mà thay vào đó

là sự tích lũy một lượng lớn acid formic. Như vậy, trong quá trình lên men lactic dị

hình có nhiều sản phẩm phụ khác nhau đáng kể được tạo thành, chứng tỏ quá trình

này phức tạp hơn nhiều so với quá trình lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm

tiến hóa sinh lý trong vi sinh vật học, người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là

hướng tiến hóa độc lập của lên men dị hình.

1.1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrat khác nhau, hoạt tính

kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều

trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong

nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược

và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. Khi ứng dụng trong bảo quản

thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý

nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản

vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp

ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn

liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như

giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic còn

sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học. Ngoài

ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng nấm như

reuretin, acid lactic,...

Đồ án tốt nghiệp

1.1.3. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic

LAB được biết đến bởi khả năng kháng nấm của chúng, điều đó liên quan đến

việc sản xuất 1 loạt các loại hợp chất bao đồm acid, alcohol, CO2, diacetyl, H2O2,

phenyllactic acid, bacteriocin và cycle peptide. Đặc tính nổi bật của hợp chất bề mặt

của LAB là tính ổn định nhiệt của các hợp chất kháng nấm có trong nó. Điều này thúc

đẩy việc sử dụng các hợp chất bề mặt của LAB hoặc các hợp chất chống nấm trong

các thực phẩm được xử lý nhiệt. Các hợp chất bề mặt của LAB hoạt động trong phổ

pH rộng, kéo dài từ 3 đến 9 tùy thuộc vào từng chủng khác nhau. Đây có thể coi là

một yếu tố chính khi LAB được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm khi so

sánh với chất bảo quản hóa học (Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid

Saari, 2011). Giống Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi

đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt động

kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt

độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và cộng sự, 2001). Nghiên cứu về tiềm năng

kháng nấm của LAB đã xác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế chống lại

nấm mốc và các loài nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.2).;

Lavermicocca và cộng sự, 2000; Niku- Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003;

Sjogren và cộng sự, 2003; Sjogren, 2005). Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được

2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng

nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus

subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus

NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp.. Nấm Aspergillus IARI được

xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996)

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998)

Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất

4-hydroxy-phenyllacticacid 3- Lactobacillusplantar 21B phenyllacticacid

3 -hydroxydecanoicacid 3 -

hydroxydodecanoicacid 3 - Lactobacillusplantarum MILAB14 hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5-cis

– dodecenoicacid

cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin Lactobacillusplantarum VTTE-

mevalonolactone 78076

Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, Lactibacillus sanfranciscensis CB1 formic- and n- valeric acid.

1.2 Tổng quan về nấm mốc

Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng

có thành tế bào bằng kitin (chitin). Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi

đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium). Nấm thường sinh

sản qua bào tử hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng. Quá trình sinh sản có thể là vô

tính hay hữu tính. Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm

lớn (nấm quả thể). Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường.

Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh

trên cơ thể động vật, thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ

sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình

chuyển hóa và trao đổi vật chất.

Đồ án tốt nghiệp

1.2.1. Đặc điểm

Phân loại khoa học

Ngành: Ascomycota

Lớp: Eurotiomycetes

Bộ: Eurotiales

Họ: Trichocomaceae

Chi: Aspergillus

Tên Khoa Học: Aspergillus niger

Nấm mốc Aspergillus có hình dạng sợi, phân nhánh có vách ngăn (cấu tạo đa

bào). Khi mới phát triển sợi nấm màu trắng, sau đó sẫm lại nhưng không hoàn toàn

đen. Bào tử của chúng là có màu đen tuyền. Từ một sợi đầu tiên chúng phân nhánh

tạo ra 2 - 4 nhánh sợi nhỏ. Nấm mốc Aspergillus có hai hình thức sinh sản: hữu tính

và vô tính.

Hình 1.2: Tế bào nấm Aspergillus niger

1.2.2 Độc tố do nấm tiết ra

Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối

lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc

Đồ án tốt nghiệp

đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người. Hiện nay có khoảng 300 loài độc

tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong

thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Các độc tố

của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), ochratoxin A, stermatocystin,

axit cyclopianxoic. Aspergillus niger chứa nhiều độc tố, một số vô hại. Các độc tố nó

chứa malformin C, và ochratoxin A. A. niger có thể là có lợi mặc dù nó là độc

hại. Thông qua quá trình lên men, nó có thể sản xuất các enzym hữu ích mà có thể

được sử dụng trong việc sản xuất xi-rô ngô, Beano, rượu vang và rượu táo (Rajkumar,

2010).

1.2.3 Tác hại của nấm

Aspergillus niger là một loại nấm và một trong những loài phổ biến nhất của

các chi Aspergillus. Nó gây ra một căn bệnh được gọi là nấm mốc đen trên một số

loại trái cây và rau quả như nho, hành tây, và đậu phộng, và là một chất gây ô nhiễm

phổ biến của thực phẩm. Aspergillus niger là một trong những nguyên nhân phổ biến

nhất của nhiễm trùng tai nấm, mà có thể gây đau, thính lực tạm thời mất mát, và trong

trường hợp nghiêm trọng, thiệt hại cho ống tai và màng tympanic.

1.2.4 Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm

Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) có 3 chủng giống nấm

mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và

Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào thời gian trước, trong và

sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu đỗ,... Có 4 tác động gây độc của độc tố vi

nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp

tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với

trường hợp nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê

liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Nhiều công trình

Đồ án tốt nghiệp

thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặc biệt là ở gan. Qua thử

nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn

tới sự sao chép ADN và gây hậu quả là đột biến hoặc quái thai.

1.3 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì

1.3.1 Giới thiệu chung

Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối và nấm men, để

lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín. Bột mì và nấm men là hai nguyên

liệu chính ảnh hưởng nhiều nhất đến quy trình sản xuất và chất lượng sản phẩm.

Hình 1.3: Bánh mì thành phẩm

 Hệ enzyme trong bột mì:

Enzyme trong bột có đầy đủ các hệ trong hạt mì, tuy nhiên trong sản xuất

cần đặc biệt lưu ý protease và amilase. Protease phân giải protein cấu trúc bậc ba,

do đó gluten bị vụn nát làm giảm chất lượng bột nhào. Protease bột mì có hoạt độ

mạnh ở 45 - 47°C và pH = 4,5 - 5,6. Khi bổ sung chất khử thì hoạt độ của protease

tăng nhưng với chất oxy hoá và muối ăn thi bị kìm hãm. Amylase thuỷ phân tinh

bột giúp cho bột nhào lên men nhanh và tăng chất lượng bánh vì lượng đường

Đồ án tốt nghiệp

trong bột không đủ cho quá trình lên men. Tác dụng tích cực này chỉ đối với

amylase vì nó thuỷ phân tinh bột thành maltose, còn α - amylase thuỷ phân tinh

bột thành dextrin mà dextrin thì liên kết với nước kém làm cho ruột bánh bị ướt,

do đó làm giảm chất lượng bánh.

1.3.2 Quy trình làm bánh mì

 Nguyên liệu:

Bột mì số 11 200 gram

Men 2.5 gram

Đường 30 gram

Sữa tươi không đường 135 ml

Bơ Zelachi 15 gram

Trứng gà 1 2⁄ trứng

Muối 2 gram

Vani 1 ống

Đồ án tốt nghiệp

 Quy trình làm bánh mì:

Nguyên liệu

Nhào bột

Lên men ổn định sơ bộ

Chia bột

Vê bột

Tạo hình

Lên men kết thúc

Nướng

Làm nguội

Sản phẩm

Hình 1.4: Quy trình làm bánh mì

Đồ án tốt nghiệp

 Thuyết minh quy trình:

1. Nguyên liệu:

Các thành phần khô gồm bột mì, men, đường, muối được trộn trước để đảm

bảo sự phân bố đều các hạt khô trong bột mì. Cho men khô vào bột trước khi cho sữa

vào sẽ giúp cho khả năng hoạt động của men tốt hơn.

Sau đó trộn bơ, sữa, trứng và vani. Lưu ý: Bơ lúc này đã được làm tan chảy và

sữa đã được gia nhiệt đến 80℃. Sau khi trộn, dùng dụng cụ đậy kín để bột nghỉ 10

phút tạo điều kiện cho độ ẩm có thể phân tán hết khối bột.

2. Nhào bột:

 Mục đích: Phân bố đều các nguyên liệu tạo thành khối bột nhào đồng nhất.

Tạo thành mạng gluten có tính đàn hồi và nhớt dẻo, cố khả năng giữ khí.

 Cách làm: Khoảng 30 – 45 phút, đến khi nào không còn ảm giác bột dính tay

và trở nên trơn mịn, dẻo dai có thể cảm nhận được. Đây là khâu quan trọng nhất

trong việc làm bánh nở bông và mềm. Bột nhào chưa đủ hoặc nhào quá kỹ đều làm

giảm khả năng nở của bột.

3. Lên men ổn định sơ bộ:

 Mục đích: tạo khí CO2 làm nở bột, tạo độ xốp cho bánh. Tạo mùi vị thơm ngon

cho bánh mì. Tăng độ tiêu hóa của bánh mì đối với cơ thể người.

 Cách làm: khối bột nhào sau khi đã đạt mức độ thích hợp được để yên trong

30 phút.

4. Chia bột:

 Mục đích: sau khi lên men, khí CO2 được sinh ra cần được ép hết đi, phân tán

men và nhiệt độ nhiều hơn trong toàn khối bột.

 Cách làm: Tuỳ theo độ lớn nhỏ của bánh mì mà chia khối bội thành từng khối

bột nhỏ hơn có khối lượng bằng nhau. Việc chia bánh nhỏ có khối lượng bằng nhau

sẽ kích thích việc nở tối đa và nở đồng đều cho từng khối bột.

Đồ án tốt nghiệp

5. Vê bột, tạo hình:

 Mục đích: sau khi chia cấu trúc của bột nhào bị phá vỡ, phải qua quá trình vê

để ổn định lại cấu trúc.

 Cách làm: Sau khi chia bột thành những khối đồng đều nhau, từng khối được

vê thành các khối cầu tròn có bề mặt nhẵn mịn để tránh tình trạng bánh bị nứt sau lên

men. Hình dáng cầu cũng là hình dáng giúp cho khối bột nở tốt nhất trong quá trình

lên men.

6. Lên men kết thúc:

 Mục đích: lên men ổn định là bước kỹ thuật quan trọng có ảnh hưởng quyết

định tới chất lượng bánh. Trong quá trình chia và tạo hình thì hầu hết lượng CO2

trong cục bột thoát ra ngoài. Muốn cho bánh nở và có thể tích, hình dáng cần thiết

thì phải để cục bột lên men kết thúc rồi mới đưa vào lò nướng.

 Cách làm: Vệ sinh, đặt vào lò 1 cốc chứa nước để cấp ẩm và bật lò nướng ở

nhiệt độ 150℃ trong vòng 10 phút để làm nóng môi trường ủ, mở cửa lò cho nhiệt

độ giữ ở mức vừa phải không quá nóng để bánh lên men tốt hơn. Cho bánh đã tạo

hình vào ủ trong 35-400C/40 – 45 phút.

7. Nướng:

 Mục đích: tiêu diệt hệ vi sinh vật và ức chế hệ enzyme trong khối bột nhào.

Làm chín bánh, tạo hương vị, màu sắc cho sản phẩm.

 Cách làm: Nhiệt độ sử dụng là 150 - 170℃ trong vòng 10 – 15 phút. Nhiệt độ

và thời gian nướng phụ thuộc và khối lượng mỗi bánh. Bánh nhỏ thì nhiệt độ buồng

nướng cao, thời gian nướng ngắn. Bánh to thì phải hạ nhiệt độ xuống đồng thời kéo

dài thời gian nướng vì nếu nhiệt độ cao, vỏ bánh sẽ cháy nhưng ruột bánh lại không

kịp chín.

8. Làm nguội:

 Mục đích: chuẩn bị cho quá trình bao gói bánh sau khi nướng.

Đồ án tốt nghiệp

1.3.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì

Trong điều kiện độ ẩm không khí dưới 79% và nhiệt độ dưới 20℃, ẩm độ của

hạt dưới 15% vi sinh vật trong bột sẽ không tăng lên mà dần dần chết đi khi bảo quản

bột trong thời gian dài. Nếu ẩm độ của bột chỉ cần tăng lên 1 – 2% thì vi khuẩn và

nấm mốc trong bột sẽ phát triển mạnh. Để bảo quản bột tốt cần bảo quản bột ở độ ẩm

không khí dưới 79%, ẩm độ của bột không quá 14 – 15% trong điều kiện nhiệt độ ổn

định. Ở điều kiện này, giữ bột được 3 – 5 tháng, ở điều kiện ẩm độ bột từ 12 – 13%

giữ được 1 năm.

1.3.3.1 Hệ vi sinh vật bánh mì

Hệ vi sinh vật bánh mì bắt nguồn từ bột mì, man bánh mì và tạp nhiễm. Khi

làm bột nhào men bánh mì hoạt động mạnh tạo ra rượu và khí carbonic làm nở bột

nhào. Khi nắn bánh và đem nướng hầu hết vi sinh vật đều bị tiêu diệt trừ một số bào

tử chịu nhiệt còn tồn tại. Khi nướng bánh nhiệt độ bên ngoài tới 180 – 200℃, các vi

sinh vật ngoài vỏ bánh chết hết và trong ruột bánh nóng dần lên nhưng bào tử của

chúng vẫn còn sống. Khi gặp điều kiện thuận lợi, các bào tử của trực khuẩn khoai tây

và trực khuẩn cỏ khô phát triển làm hỏng bánh mì. Trong quá trình vận chuyển và

bảo quản còn bị tạp nhiễm các vi sinh vật trong đó có cả trực khuẩn đường ruột rất

nguy hiểm. Vì vậy khi vận chuyển và bảo quản cần đảm bảo vệ sinh an toàn.

1.3.3.2 Hư hỏng bánh do vi sinh vật

Do bánh mì thành phẩm còn một số bào tử của các trực khuẩn không bị tiêu

diệt khi nướng bánh hay các tế bào sinh dưỡng của một số vi sinh vật tạp nhiễm trong

quá trình vận chuyển và bảo quản. Đó chính là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì.

- Bệnh nhớt ruột bánh mì do vi khuẩn Bacillus: bệnh này do trực khuẩn khoai

tây và trực khuẩn cỏ khô gây ra. Khi chúng phát triển sẽ tiết ra enzyme protease

thuỷ phân protein l àm ruột bánh mì bị dính nhớt, thẫm màu và có mùi khó chịu.

Để hạn chế bệnh này cần tăng độ axit của bột nhào, làm pH giảm xuống khoảng

4,5 - 5 sẽ kiềm hãm trực khuẩn Bacillus mesentericus và Bacillus subtilis phát

triển.

Đồ án tốt nghiệp

- Ruột bánh mì bị đỏ: có một số vi khuẩn và nấm sinh sắc tố phát triển trong

ruột bánh mì và làm ruột bánh mì có màu đỏ. Bệnh này không nguy hiểm đối với

người, thường gặp vi khuẩn Bacillus prodigiosum.

- Mốc bánh mì: bánh mì thường bị mốc bên ngoài do tạp nhiễm các bào tử nấm

mốc và bảo quản trong điều kiện nóng ẩm cũng như ẩm độ của bánh mì cao và

xếp quá chặt.

- Bệnh say bánh mì: bệnh này do nấm Fusarium sporotrichioides có lẫn trong

bột mì từ những hạt lúa mì ở những cây có nấm này ký sinh trên đồng ruộng. Nấm

này chiụ nhiệt cao và không bị chết khi nướng bánh. Khi chúng phát triển trên

bánh mì không thấy dấu hiệu hư rõ rệt nhưng chúng tiết ra độc tố khi ăn phải

người bị ngộ độc thấy ngây ngất như say rượu.

1.3.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì

Chức năng chính của nấm men là sinh khí CO2 làm tăng thể tích khối bột nhào.

Ngoài ra, các sản phẩm của quá trình lên men được tích lũy trong khối bột sẽ tạo nên

các hương vị đặc trưng cho bánh mì thành phẩm. Vì vậy, nấm men có vai trò rất quan

trọng trong lên men bánh mì. Nấm men sử dụng đường có trong bột mì làm cơ chất

chủ yếu để tạo ra sản phẩm là cồn và CO2 theo phương trình:

𝐶6𝐻12𝑂6 → 2𝐶2𝐻5 + 2𝐶𝑂2

Lượng CO2 tích tụ trong khối bột nhào tạo nên những túi khí, do đó khối

bột trở nên xốp và thể tích tăng lên rõ rệt. Khi nướng bánh ở nhiệt độ cao, CO2 có

trong mạng lưới gluten tăng thể tích làm cho mạng gluten cũng căng lên và trở thành

túi chứa CO2. Nhiệt độ càng tăng, CO2 bắt đầu thoát khỏi mạng gluten sẽ tạo nên

những lỗ xốp trong bột bánh làm cho bánh có độ xốp.

Trong suốt quá trình lên men bột nhào và lên men kết thúc, luôn xảy ra những

phản ứng sinh hóa sinh ra các sản phẩm như: rượu, acid, este, andehyde, ceton,

furfurol... nhằm tích tụ hương thơm và mùi vị đặc trưng cho bánh mì. Đặc biệt khi

nướng bánh, gần 70 chất gây hương vị được tạo thành và có xảy ra phản ứng Maillard

sinh ra melanoidin (là các polymer không no hòa tan được trong nước, sau đó là các

Đồ án tốt nghiệp

polymer không no và không hòa tan trong nước, nhưng đều có màu đậm và gọi chung

là melanoidin). Nấm men cũng giúp chuyển hóa những chất có cấu trúc phức tạp

trong bột mì thành những chất đơn giản giúp cho hệ tiêu hóa của người sử dụng.

1.4 Tổng quan về bột chua

Lên men bột và nước dựa trên một quá trình tức thời để tạo ra bột nhào chua

là một phương pháp quan trọng hiện nay (Vogel và cộng sự, 1999). Khối bột lỏng sẽ

được bổ sung chủng khởi động, sử dụng các công thức và điều kiện lưu giữ để làm

mới men cái theo chu kỳ (Hammes & Ganzle, 1995; Onno & Rouseel, 1994;

Ottogalli, Galli, & Foschino, 1996). Trong các vi khuẩn lên men chính, ngoại trừ nấm

men còn có vi khuẩn sinh acid lactic (LAB). Trong quá trình tạo bột chua truyền

thống, một phần bột được trộn lẫn với men và bổ sung đủ nước để tạo độ xốp, sau đó

để lên men trong vài giờ, thường là để qua đêm và cho tiếp xúc với không khí. Khối

bột xốp sau đó sẽ được trộn chung với phần bột còn lại, ngoài ra còn có nước, muối

và chất béo đến một độ dẻo nhất định và được cho lên men trong một thời gian ngắn

trước khi kiểm tra lại và đem đi nướng. Kết quả, bánh mì có hương vị tuyệt vời hơn

nhờ vi khuẩn lên men xâm nhập từ không khí hoặc do việc bổ sung vào 2-5% phần

sản phẩm lên men của mẻ trước (Bruemmer & Lorenz, 1991). Trong quá trình chuẩn

bị nướng bánh mì, một khối bột nhào xốp nên có mật độ vi khuẩn lactic vào khoảng

108 – 109 cfu/g còn nấm men thì 106 – 107 cfu/g, để có thể làm acid hóa giúp lên men

khối bột và làm nở bột. Tuy nhiên, LAB có thể nhiễm vào bột 1 cách tự nhiên, từ 1

sản phẩm sữa lên men hoặc từ các chủng khởi động thương mại có chứa các dòng

LAB đặc trưng được sản xuất trong quá trình lên men công nghiệp (Vuyst & Neysens,

2005).

1.4.1. Đặc tính của bột chua

Đặc trưng điển hình bột chua (bột bánh mì) chủ yếu là do VSV của nó, về cơ

bản đại diện bởi LAB và nấm men. Do sự có mặt của VSV, bột được chuyển hóa.

Những VSV này đảm bảo sản xuất acid khi đun sôi hỗn hợp bột và nước. Cơ chế

Đồ án tốt nghiệp

chua rất phức tạp (Hammes và Gänzle, 1998). Trong quá trình lên men, các thay đổi

sinh hóa xảy ra trong các thành phần carbohydrate và protein của bột nhờ hoạt động

của vi khuẩn và các enzyme (Spicher, 1983). Nhiều tính chất vốn có của bột chua dựa

vào các hoạt động trao đổi chất của LAB: lên men lactic, thủy phân protein, và tổng

hợp các hợp chất dễ bay hơi, chất chống mốc là một trong những hoạt động quan

trọng nhất trong quá trình lên men chua (Hammes và Gänzle, 1998; Gobbetti và cộng

sự, 1999). Sự lên men bột, cụ thể là bột chua, bị chi phối bởi LAB đặc biệt với nồng

độ thích hợp 108 cfu/g, có thể cùng tồn tại hoặc có thể cộng sinh với các loại nấm

men thông thường có nồng độ thấp hơn (Gobbetti và cộng sự, 1999; Vogel và cộng

sự, 2002). Nấm men thường kết hợp với LAB trong bột chua với tỷ lệ nấm men/LAB

thường là 1:100 (Gobbetti và cộng sự, 1994; Ottogalli và cộng sự, 1996).

1.4.2. Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua

Quá trình lên men bột chua là yếu tố quan trọng trong việc tạo ra mùi vị cho

bánh mì (Lund và cộng sự, 1989; Rothe & Ruttloff, 1983). Các hoạt động trao đổi

chất kết hợp của các vi sinh vật, tạo ra sự acid hóa hoặc tạo chua có ảnh hưởng đến

đặc tính của bánh mì, đặc biệt là kết cấu, tăng thời hạn sử dụng bằng cách giảm sự

tăng trưởng của mốc trong quá trình bảo quản (Corsetti và cộng sự, 2000; Oura,

Soumalainen & Wiskari, 1982; Rochenck và Voysey, 1995) và tạo ra các thành phần

hương vị điển hình mang lại đặc điểm cảm quan chua đặc trưng (Gobbetti, 1998;

Katina và cộng sự, 2005). Trong quá trình lên men có hai loại hợp chất hương vị được

sản xuất. Hợp chất không bay hơi bao gồm acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn

đồng hình (Gobbetti, Corsetti, & De Vincenzi, 1995a) và dị hình (Gobbetti, Corsetti,

& De Vincenzi, 1995b) làm acid hóa, giảm độ pH và đóng góp hương vị cho bột bánh

mì (Barber, Benedito de Barber, Martinez-Anaya, Martinez, và Alberola, 1985;

Galal, Johnson, và Varriano-Marston, 1978). Loại thứ hai các hợp chất dễ bay hơi

của bánh mì từ bột chua chứa rượu, aldehyde, ketones, este và lưu huỳnh. Tất cả các

Đồ án tốt nghiệp

hợp chất này được sản xuất bằng phương pháp sinh học và các hoạt động sinh hóa

trong quá trình lên men và đóng góp vào hương vị (Spicher, 1983).

 Hợp chất không bay hơi

Phản ứng giữa vi khuẩn lactic với các enzyme ngoại bào ảnh hưởng đến hoạt

tính của vi sinh vật trong quá trình acid hóa, sản sinh acid acetic và các đặc tính kết

cấu bánh mì. Nó thể hiện sự tăng cường các hoạt động enzyme nội sinh trong bột đã

thu được khi kết hợp LAB với glucose oxidase VSV, lipase, endo xylanase, amylase

và protease.

 Hợp chất bay hơi

Sự chuyển hóa ở vi khuẩn chứng minh việc sản xuất các hợp chất dễ bay hơi

khác nhau cho sự lên men của nhóm vi khuẩn lactic. Các sản phẩm được tạo ra của

quá trình lên men là 2-metyl-1-propanol; 2,3 methyl-1-butanol và các iso-alkoho

khác. Các dòng LAB có sự khác biệt trong sự trao đổi chất và các hợp chất thơm. Sản

xuất các hợp chất thơm dễ bay hơi trong quá trình lên men với sự kết hợp của các

chủng đơn lẻ S. cerevisiae và C. guilliermondii, Lb. Plantarum đã được thử nghiệm,

được sử dụng trong cả bột lúa mì và các chất nền đơn giản như maltose và glucose

(Stolz và cộng sự, 1993). Chỉ sử dụng men trong bánh mì, bảy chất dễ bay hơi đã

được tìm thấy nhiều: acetaldehyde, aceton, ethyl acetat, ethanol, hexanal, rượu

isobutyl, và propanol.

1.4.3. Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với

hương vị của bánh mì

Các phản ứng Maillard và Caramel hóa ảnh hưởng chính đối với sự hình thành

hương vị trong các sản phẩm từ hạt khi có sự đun nóng thì phản ứng liên quan đến

các tiền chất đơn giản như acid amin và aldose đơn giản hoặc ketose đường (Rothe

& Ruttloff, 1983). Số lượng acid amin tự do cao nhất đã được tạo ra trong quá trình

lên men bột chua với sự kết hợp giữa LAB và S. exigus M14 (Gobbetti, Corsetti và

Đồ án tốt nghiệp

cộng sự, 1994; Gobbetti, Simonetti và cộng sự, 1994; Kratochivil & Holas, 1983,

Rothe, 1974). Các acid amin này là đơn chất của iso-alcohols (Gobbetti, Corsetti, &

De Vincenzi, 1995b; Hansen & Schieberle, 2005) góp phần trực tiếp cho hương vị

bánh mì trong quá trình lên men và nướng bánh mì (Bredie, Mottram & Guy, 2002;

Damiani và cộng sự, 1996). Các sản phẩm phản ứng Maillard từ quá trình xử lý nhiệt

độ cao bao gồm pyrazines, pyrrole, furan và các hợp chất chứa sunfur và các sản

phẩm khác như alkanals, alkenals 2 và 2,4-alkadienal (Parker, Hassell, Mottram, &

Guy, 2000). Hơn nữa, ở nhiệt độ cao hơn thì pyrrole, thiophenes, thiophenones,

thiapyrans và thiazolines tăng lên và furan và aldehyde giảm (Bredie và cộng sự,

2002). Pyrazin là các hợp chất có chứa nitơ có đặc tính mùi và hương vị rất mạnh (Ji

và Berhard, 1992). Do đó, việc sản xuất các hợp chất này có ảnh hưởng đáng kể đến

hương vị của bánh mì.

1.4.4. Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua

Các carbohydrate có trong bột mì gồm maltose tiếp theo sucrose, glucose,

fructose và, cùng với một số trisaccharides như maltotriose và raffinose. Lượng

glucose tăng quá trình lên men, trong khi giảm sucrose trong sự hiện diện của nấm

men do tác động của VSV. Các nấm men có mặt trong bột chua không thể lên men

maltose, một loại đường phổ biến trong bột. Tuy nhiên, tế bào nấm men vẫn có thể

phát triển vì glucose cung cấp vào môi trường bởi một số loài LAB, đáng chú ý

L. sanfranciscensis. Bắt đầu từ glucose, LAB lên men đồng hình sản xuất acid lactic

qua đường phân (lên men đồng hình), trong khi LAB lên men dị hình cũng sản xuất,

ngoài acid lactic, CO2, acid aCetic, và/hoặc ethanol thông qua con đường 6-

phosphogluconate/phosphoketolase(6-PG/PK) (lên men dị hình). Hexoses khác với

glucose đi vào những con đường chính ở mức glucose-6-phosphate hoặc fructose-6-

phosphate sau khi đồng phân hóa và/hoặc phosphoryl (Axelsson,

1999). Disaccharides được chia bởi hydrolases và/hoặc phosphohydrolases cụ thể đối

với monosacarit rằng sau đó nhập vào con đường chính. Pentoses là phosphoryl hóa

và chuyển đổi sang ribulose-5-phosphate hoặc xylulose-5-phosphate bởi epimerases

Đồ án tốt nghiệp

hoặc isomerase và sau đó chuyển hóa phần sau của con đường 6-PG/PK (Axelsson,

1999). Sử dụng pentoses không chỉ giới hạn đối với các loài LAB có chứa

phosphoketolase cấu thành, các enzyme quan trọng của con đường 6-PG/PK (lên men

dị hình bắt buộc); LAB lên men dị hình tùy nghi, tạo ra hexose lên men thông qua

glycolysis vì chúng có chứa một aldolase fructose-1,6-diphosphate cấu thành

(enzyme chính của glycolysis), pentoses lên men giống như loài lên men dị hình bắt

buộc. Trong những trường hợp như vậy, phosphoketolase của LAB lên men dị hình

tùy nghi được gây ra bởi các đường pentose sẵn có (Hammes và Vogel, 1995). Quá

trình lên men của pentoses tạo ra một lượng cân bằng của acid lactic và acid

axetic; không có CO2 được hình thành, và vì không có bước khử là cần thiết để đạt

được các trung gian xylulose-5-phosphate, acetyl phosphate được sử dụng bởi kinase

acetate trong một bước phosphoryl mức bề mặt năng suất acetate và adenosine

triphosphate. Buộc LAB lên men đồng hình không lên men pentoses (Axelsson,

1999). Cho đến nay, một số nghiên cứu đã được nhắm vào các trình tự của bộ gen

hoàn chỉnh của lactobacilli, bao gồm L. brevis (Makarova và cộng sự, 2006), L.

plantarum (Kleerebezem và cộng sự, 2004), và Lb . reuteri cũng được tìm thấy trong

bột chua, hoàn chỉnh.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.5: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid

lactic (được chuyển thể từ Liu và cộng sự, 2008)

Các con đường trao đổi chất của LAB ảnh hưởng đến chất lượng bánh mì được

kết hợp với nguồn cacbon trung tâm sẵn có của các đồng yếu tố ảnh hưởng đến thế

oxi hóa khử tế bào và môi trường. Chuyển hóa đồng hình và dị hình khác nhau về

yêu cầu tái tạo đồng phân giảm, giảm nicotinamide adenine dinucleotide hoặc

nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. Việc sử dụng các chất đồng nhất, như

oxy hoặc fructose, như chất nhận electron bởi LAB lên men dị hình bắt buộc phải kết

hợp với việc gia tăng sản xuất acetat trong bột nhão. Dựa trên các yêu cầu trao đổi

chất khác nhau cho sự tái tạo cofactor, LAB lên men đồng hình và dị hình có ảnh

hưởng đến các phản ứng oxi hóa khử trong bột chua có ảnh hưởng đến chất lượng

bánh mì ngoài sự hình thành của acetate.

Đồ án tốt nghiệp

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh và phòng thí nghiệm

thực phẩm khoa Công Nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại Học

Công Nghệ TP.HCM.

2.2. Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ 24/04/2017 đến 16/07/2017.

2.3. Vật liệu nghiên cứu

2.3.1. Giống vi sinh vật

Giống vi khuẩn lên men Lactobacillus sp.L5, Lactobacillus sp.C1, nấm mốc

Aspergillus niger do phòng thí nghiệm vi sinh, nấm men Saccharomyces cerevisiae

của Saf-Instant.

2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng

2.3.2.1. Hoá chất

Các hoá chất dùng để pha môi trường MRS, môi trường PDA. -

Các hoá chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm: Tím kết tinh (Crystal violet), -

Fushin, Malachite green.

Chất bảo quản Natri benzoate và Canxi propionate. -

2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy

Môi trường MRS – broth, MRS cải tiến, MRS agar. -

Môi trường PDA, PDB. -

Đồ án tốt nghiệp

2.4. Thiết bị và dụng cụ

2.4.1. Thiết bị

- Tủ cấy vi sinh (Brlad France)

- Tủ ủ (Memmert Germany)

- Tủ lạnh Toshiba

- Tủ sấy (Memmert Germany)

- Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

- Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 henesis (USA)

- Autoclave (Memmert Germany)

- Bếp từ (Billy – England)

- Máy nước cất (Branstead USA)

- Bể điều nhiệt

2.4.2. Dụng cụ

- Ống nghiệm, đĩa petri, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong, đũa thuỷ

tinh.

- Pipet thuỷ tinh 5ml, 10ml, 20ml, pipetman 100 – 1000μl

- Que cấy, que trang, cây đục thạch, đèn cồn, eppendorf 1ml, ống ly tâm lớn.

- Bông thấm nước, bông không thấn nước, giấy lọc, lam, lamell, buồng đếm

hồng cầu, giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa.

2.5. Phương pháp luận

 Mục tiêu: Khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger khi đồng lên men

bánh mì của vi khuẩn Lactobacullus spp. với nấm men.

 Nội dung:

 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1.

 Xây dựng đường chuẩn của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và

Lactobacullus sp.C1, nấm Aspergillus niger để xác định mật độ tế bào, bào tử.

Đồ án tốt nghiệp

 Khảo sát khả năng đối kháng Aspergillus niger của vi khuẩn LAB.

 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng

lên men bánh mì với nấm men.

 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì.

2.6. Phương pháp nghiên cứu

Xây dựng đường chuẩn bào tử Aspergillus niger

Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 C1

2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu

Xây dựng đường chuẩn tế bào LAB

Mật độ nấm 105 (bt/ml)

Mật độ LAB - 1010 (cfu/ml) - 109 (cfu/ml) - 108 (cfu/ml)

Mật độ nấm 104 (bt/ml)

Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men bánh mì với nấm men

Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì

- Đánh giá cảm quan - Độ nở bánh mì. - Độ ẩm bánh mì.

- Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa. - Khả năng sinh acid. - Khả năng đối kháng Aspergillus niger in vitro.

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu đề tài

Đồ án tốt nghiệp

2.6.2. Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp.

2.6.2.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Chủng vi khuẩn LAB

Tăng sinh trong môi trường MRS-broth

Ủ 24-48h

Cấy truyền sang môi trường MRS agar

Quan sát hình thái khuẩn lạc

Cấy giữ giống

Khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa

- Nhuộm Gram - Nhuộm bào tử - Catalase

Khẳng định chủng LAB thuần khiết

 Quy trình thí nghiệm:

Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus spp.

 Thuyết minh quy trình:

Mục đích: Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi

sinh vật khác trong quá trình bảo quản. Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí

nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng.

Đồ án tốt nghiệp

Tiến hành:

 Khảo sát đặc điểm nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc:

Chủng vi khuẩn lactic L5 và C1 được hoạt hoá và tăng sinh trong môi trường

MRS broth đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 30 phút và ủ ờ 37℃ trong 24 giờ.

Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển sang môi trường MRS agar để ủ ở 37℃

trong 48 giờ, sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc lactic.

Tiếp theo, tiến hành khảo sát lại các đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn

lactic bao gồm các phương pháp: nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase.

 Môi trường giữ giống:

Sau khi đã khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng,

tiến hành cấy chuyển khuẩn lạc sang môi trường MRS agar trong ống thạch nghiêng,

ủ ở 37℃ trong 24 đến 48 giờ và bảo quản trong tủ lạnh phòng thí nghiệm.

 Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá

 Nhuộm Gram

- Tiến hành:

Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến

 Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau

khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không

khí.

 Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.

 Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

 Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

 Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước, thấm khô.

 Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 30 giây, rửa nước, để khô

trong không khí.

 Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.

- Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.

Đồ án tốt nghiệp

 Nhuộm bào tử

- Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton  Nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 – 7 ngày.

 Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram.

 Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, rửa nước.

 Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.

 Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.

- Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ.

Chú ý: phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục.

 Thử nghiệm catalase

- Tiến hành:

 Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính.

 Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào

giọt H2O2 trên phiến kính.

- Kết quả: Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính.

Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết

quả tương tự.

Đồ án tốt nghiệp

2.6.2.2 Khả năng sinh acid

Chủng vi khuẩn LAB

Tăng sinh trong môi trường MRS-broth

Ủ 370C 24h

Ly tâm

Sinh khối

Dịch sau ly tâm

Phenolphthalein

 Quy trình thí nghiệm:

Chuẩn độ

NaOH 0.1N

Khả năng sinh acid

Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus spp.

 Thuyết minh quy trình:

- Mục đích: Xác định khả năng sinh acid của chủng Lactobacillus spp..

- Tiến hành:

+ Chủng vi khuẩn lactic L5 và C1 được hoạt hoá và tăng sinh trong môi

trường MRS broth đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 30 phút và ủ ờ 37℃

trong 24 giờ.

+ Hút 10ml dịch tăng sinh vào ống Falcon (lặp lại 3 lần). Ly tâm 4000 vòng/15

phút, phần dịch sau ly tâm cho vào erlen.

Đồ án tốt nghiệp

+ Bổ sung 3 giọt phenolphthalein, chuẩn độ bằng NaOH 0.1N đến khi dung

dịch có màu hồng nhạt và pH = 8 – 8.3

%𝑇𝐴 =

𝑠ố 𝑚𝑙 𝑁𝑎𝑂𝐻 × 0.1𝑁 × 90 × 100 𝑡ℎể 𝑡í𝑐ℎ 𝑚ẫ𝑢 1000

- Kết quả:

Trong đó

%TA: độ acid

Số ml NaOH: thể tích NaOH 0.1N đã sử dụng đổ chuẩn độ.

Thể tích mẫu (ml): dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus spp..

Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4

2.6.2.4 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro

 Quy trình thực hiện:

Hoạt hóa A.Niger trên môi trường PDB

Đồ án tốt nghiệp

Hoạt hóa chủng vi khuẩn LAB trên môi trường MRS-broth

Tăng sinh A.Niger trên môi trường PDB

Đặt thạch nấm

Lặp lại 3 lần

Ria 2 đường LAB

ĐC âm (Không ria vi khuẩn)

Ủ 72h ở nhiệt độ phòng

Tăng sinh chủng vi khuẩn LAB trên môi trường MRS-broth Cấy vào đĩa petri chứa môi trường PDA

Tỷ lệ ức chế nấm bệnh

Đo đường kính ức chế nấm

Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với

nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn.

 Thuyết minh quy trình:

- Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của chủng vi khuẩn

theo phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn.

Đồ án tốt nghiệp

- Tiến hành:

 Chuẩn bị môi trường vi khuẩn:

Hoạt hóa 2 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong môi

trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi

trường MRS broth ở 370C trong 24h.

Chuẩn bị chủng nấm để đối kháng: 

Hoạt hóa chủng nấm mốc có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong 

môi trường PDB ở 370C trong. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi

trường PDB ở 370C trong 24h.

 Cấy điểm vào đĩa petri chứa môi trường PDA và ủ 72h ở nhiệt độ

phòng.

 Chuẩn bị môi trường khảo sát đối kháng:

Môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. 

Sau đó, phối vào đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa 15ml.

Khi thạch đã đông, ta tiến hành đục thạch ở đĩa nấm mốc đặt vào tâm 

các đĩa. Mỗi đĩa lặp lại 3 lần. Sau đó, ủ 24h ở nhiệt độ phòng.

Sau 24h, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn cách ngoài mép đĩa 1,5cm (2 

vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đường

kính) cần thử đối kháng vào. Mẫu đối chứng là chỉ cấy nấm vào tâm đĩa, không

cấy 2 vạch vi khuẩn lên. Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng.

 Quan sát, đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm sau 3

ngày.

Đồ án tốt nghiệp

Dtn

Dđc

1.5 cm

Đường cấy vi khuẩn

 Ta tiến hành đo tỉ lệ ức chế theo hình và công thức phần trăm:

Hình 2.6: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường

vi khuẩn

Trong đó:

Dđc: đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng

Dtn: đường kính (cm) đĩa thí nghiệm

Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4

2.6.3. Xây dựng đường chuẩn

2.6.3.1. Lactobacillus spp.

Đường chuẩn = vẽ đồ thị tương quan giữa OD600nm và log(tb/ml).

 Quy trình thí nghiệm:

LAB

Ủ 370C 24h

Tăng sinh trong môi trường MRS-broth

Cấy trang

Đo OD600nm

Đếm khuẩn lạc

Đồ án tốt nghiệp

Đường chuẩn

Hình 2.7: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn chủng Lactobacillus spp.

 Thuyết minh quy trình:

- Mục đích: Xác định mật độ vi khuẩn lactic bổ sung vào bánh mì.

- Tiến hành: Chủng Lactobacillus spp. được tăng sinh trong môi trường MRS-

broth ở 37℃ trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, ta tiến hành đo 𝑂𝐷600𝑛𝑚 và cấy trang ở

cùng thời điểm.

 Đo 𝑶𝑫𝟔𝟎𝟎𝒏𝒎: Ta thực hiện pha loãng theo hệ số 2𝑛 bằng cách:

+ Hút 5ml môi trường MRS broth đã được khử trùng ở 121℃ trong 30 phút vào

10 ống nghiệm, trong đó gồm 9 ống dùng để pha loãng và 1 ống làm mẫu trắng.

+ Đối với 9 ống nghiệm để pha loãng (tất cả đều được đánh số thứ tự rõ ràng):

Hút 5ml dịch tăng sinh cho vào ống thứ nhất, lắc đều ta được dung dịch pha loãng

2 lần. Sau đó từ ống thứ nhất hút 5ml sang ống thứ 2, lắc đều ta được dung dịch

pha loãng 4 lần.

Đồ án tốt nghiệp

+ Tiến hành tương tự ta được chuỗi ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng theo

hệ số 2𝑛: 2 lần, 4 lần, 8 lần, 16 lần, 32 lần, 64 lần, …

+ Đo 𝑂𝐷600𝑛𝑚 9 ống chứa dịch đã pha loãng.

 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:

- Pha loãng mẫu:

 Chuẩn bị 9 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý đã được

hấp khử trùng ở 121℃ trong 30 phút. Đánh số thứ tự từ 1 đến 9 tương ứng với

9 mật độ pha loãng từ 10−1đế𝑛 10−9.

 Hút 1ml dịch tăng sinh vào ống thứ nhất, lắc đều. Sau đó, hút 1ml từ

ống thứ nhất sang ống thứ 2, tương tự thao tác cho đến hết 9 ống.

- Cấy trang:

 Hút 0.1ml dịch pha loãng ở ống 10−5 vào đĩa petri chứa môi trường

MRS agar. Chọn nồng độ từ 10−5đế𝑛 10−9 để cấy trang, mỗi nồng độ lặp lại

trên 3 đĩa.

 Sau khi trang khô, ta ủ ở nhiệt độ 37℃ trong 24 – 48 giờ cho khuẩn lạc

có thể phát triển thuận lợi để đếm.

𝑁 =

ΣC (𝑛1 + 0.1𝑛2)𝑑

 Sau khi đếm khuẩn lạc, ta định lượng vi sinh vật bằng công thức

Trong đó:

N – số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu.

C – số khuẩn lạc đếm được trên các đãi petri đã chọn (chọn các đĩa có số khuẩn

lạc dao động từ 25 – 250 khuẩn lạc).

𝑛1, 𝑛2 – số đĩa petri ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp đã chọn.

d – hệ số pha loãng mẫu.

Đồ án tốt nghiệp

2.6.3.2. Nấm mốc Aspergillus niger

Đường chuẩn = vẽ đồ thị tương quan giữa OD620nm và log(tb/ml).

Aspergillus niger

Cấy truyền sang môi trường PDA

Ủ 370C 72h

Cạo bào tử trên đĩa petri

Định mức 100ml

Đo OD620nm

Buồng đếm hồng cầu

 Quy trình thực hiện:

Đường chuẩn

Hình 2.8: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn nấm mốc A.niger

 Thuyết minh quy trình:

- Mục đích: Xác định mật độ tế bào nấm mốc để cảm nhiễm bánh mì.

- Tiến hành:

 Chuẩn bị mẫu:

Giống được cấy truyền sang môi trường PDA agar và được ủ ở nhiệt độ phòng

trong vòng 3 đến 4 ngày để nấm có thể mọc kín đĩa môi trường. Sau khi ta thu được

đĩa nấm nuôi cấy, hút 5ml nước muối sinh lý 0.9% có bổ sung Tween 80 vô trùng

vào đĩa nấm, dùng muỗng inox đã được hấp khử trùng cạo bề mặt đĩa nấm sau đó đổ

Đồ án tốt nghiệp

vào bình định mức 100ml. Lặp lại thao tác cạo khoảng 5 lần đến khi bề mặt đĩa nấm

được cạo sạch. Cuối cùng định mức dịch nấm bằng nước muối sinh lý có Tween đến

100ml, ta được mẫu dung dịch nấm cần.

 Đo 𝑶𝑫𝟔𝟐𝟎𝒏𝒎: Ta thực hiện pha loãng theo hệ số 2𝑛 bằng cách:

+ Hút 5ml môi trường MRS broth đã được khử trùng ở 121℃ trong 30 phút vào

10 ống nghiệm, trong đó gồm 9 ống dùng để pha loãng và 1 ống làm mẫu trắng.

+ Đối với 9 ống nghiệm để pha loãng (tất cả đều được đánh số thứ tự rõ ràng):

Hút 5ml dịch tăng sinh cho vào ống thứ nhất, lắc đều ta được dung dịch pha loãng

2 lần. Sau đó từ ống thứ nhất hút 5ml sang ống thứ 2, lắc đều ta được dung dịch

pha loãng 4 lần.

+ Tiến hành tương tự ta được chuỗi ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng theo

hệ số 2𝑛: 2 lần, 4 lần, 8 lần, 16 lần, 32 lần, 64 lần, …

+ Đo 𝑂𝐷620𝑛𝑚 9 ống chứa dịch đã pha loãng.

 Định lượng:

 Hút 1ml mẫu + 4ml dung dịch nước muối sinh lý có pha Tween 80, ta thu được

dịch pha loãng 5 lần. Dùng ống nhỏ giọt hút 1 giọt dung dịch pha loãng lên buồng

đếm và đậy lamer, tiến hành soi và đếm ở vật kính x40. Đếm số tế bào ở những ô

màu trắng (Hình 2.9).

Hình 2.9: Vùng đếm hồng cầu

Đồ án tốt nghiệp

𝐵𝑇𝐵1 =

𝐵1 + 𝐵2 + 𝐵3 + 𝐵4 4

 Sau đó, số liệu sau khi đếm được tính toán theo công thức:

Với: 𝐵1, 𝐵2, 𝐵3, 𝐵4 lần lượt là số tế bào đếm được của 4 ô ở 4 góc buồng đếm

𝐵𝑇𝐵1 là số tế bào trung bình của buồng đếm ở lần 1.

𝐵𝑇𝐵 =

𝐵𝑇𝐵1 + 𝐵𝑇𝐵2 + 𝐵𝑇𝐵3 3

 Lặp lại thao tác đếm 3 lần, ta được:

𝑆ố 𝑇𝐵 (𝑇𝐵/𝑚𝑙) =

𝑥 𝐹

𝐵𝑇𝐵 𝑥 1000 1𝑚𝑚2 𝑥 0.1𝑚𝑚

 Khi đó:

Với: 𝐵𝑇𝐵 – số tế bào trung bình ở cả 3 lần đếm

1𝑚𝑚2 𝑥 0.1 𝑚 – thể tích 1 ô (trong 4 ô) của buồng đếm

F – hệ số pha loãng

Đồ án tốt nghiệp

2.6.4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh

mì của vi khuẩn LAB với nấm men

 Quy trình thí nghiệm

Lactobacillus spp.

Aspergillus niger

TS trong môi trường MRS – Broth

Ủ + lắc

Cấy truyền sang môi trường PDA

Đo OD600nm

Ủ 370C 72h

Cạo bào tử trên đĩa petri

Pha loãng đến các mật độ 1010, 109, 108 (cfu/ml) Sau 24 giờ

Định mức 100ml

Ly tâm

Bỏ dịch

Rửa nước cất

Đo OD620nm

x2

Ly tâm

Pha loãng đến các mật độ 105, 104 (tb/ml)

TH1: 104

TH3: không cảm nhiễm

TH2: 105

Sinh khối

Bánh mì

Theo dõi ngày đầu tiên xuất hiện tơ nấm sau nướng

Hình 2.10: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.1: Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì.

Mật độ nấm TH1: Cảm TH2: Cảm TH3:

nhiễm A.niger nhiễm A.niger (tb/ml) không cảm nhiễm

mật độ 104 mật độ 105

Chất bổ sung

L5 mật độ 1010(cfu/ml)

BML5-10/4 BML5-10/5 BML5-10

L5 mật độ 109(cfu/ml)

BML5-9/4 BML5-9/5 BML5-9

L5 mật độ 108(cfu/ml)

BML5-8/4 BML5-8/5 BML5-8

C1 mật độ 1010(cfu/ml)

BMC1-10/4 BMC1-10/5 BMC1-10

C1 mật độ 109(cfu/ml)

BMC1-9/4 BMC1-9/5 BMC1-9

C1 mật độ 108(cfu/ml)

BMC1-8/4 BMC1-8/5 BMC1-8

BMNa/4 BMNa/5 BMNa Natri benzoate

BMCa/4 BMCa/5 BMCa Canxi propionate

BMTL/4 BMTL/5 BMTL Không bổ sung

 Thuyết minh quy trình:

 Mục đích: Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. trên

bánh mì.

 Tiến hành:

 Chủng Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 cấy truyền 5% sang

môi trường MRS để tăng sinh với 200ml, sau đó được đem đi ủ và lắc đồng

thời ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 tiếng.

 Sau đó đo OD600nm, pha loãng huyền phù gốc bằng nước muối sinh lý

0.9% vô trùng để đạt được các mật độ 1010, 109, 108 (cfu/ml) với lượng dịch

là 67.5ml.

 Lấy 67.5ml dịch pha loãng, ly tâm 4000 vòng trong 15 phút trong ống

Falcon, sau đó bỏ dịch.

Đồ án tốt nghiệp

 Cho nước cất vô trùng vào ống, lắc nhẹ để rửa sạch sinh khối sau đó

đem ly tâm 4000 vòng trong 15 phút. Lặp lại thao tác rửa nước cất rồi ly tâm

thêm 1 lần nữa để loại bỏ tối ưu các tạp chất của môi trường nuôi cấy còn sót.

 Sinh khối thu được sẽ được hòa với 67.5ml sữa không đường, lắc nhẹ

cho hòa tan rồi bổ sung vào với các thành phần bánh mì. Mỗi mẫu bánh có

khối lượng tỉ lệ với 100gr bột mì.

Bột mì số 11 100 gram

Men 1.25 gram

Đường 15 gram

Sữa tươi không đường 67.5 ml

Bơ Zelachi 7.5 gram

Trứng gà 1 4⁄ trứng

Muối 1 gram

Vani 1 2⁄ ống

 Trường hợp 1: Có cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 104 (tb/ml)

 Giống được cấy truyền sang môi trường PDA agar và được ủ ở nhiệt

độ phòng trong vòng 3 đến 4 ngày để nấm có thể mọc kín đĩa môi trường.

 Sau khi ta thu được đĩa nấm nuôi cấy, hút 5ml nước muối sinh lý 0.9%

có bổ sung Tween 80 vô trùng vào đĩa nấm, dùng muỗng inox đã được hấp

khử trùng cạo bề mặt đĩa nấm sau đó đổ vào bình định mức 100ml. Lặp lại

thao tác cạo khoảng 5 lần đến khi bề mặt đĩa nấm được cạo sạch.

 Định mức dịch nấm bằng nước muối sinh lý có Tween 80 đến 100ml,

ta được mẫu dung dịch nấm cần.

 Sau đó đo OD620nm, pha loãng bằng nước muối sinh lý 0.9% có bổ sung

Tween 80 vô trùng đến mật độ 104 (tb/ml).

 Cho cả 9 mẫu bánh mì vào từng bao khác nhau và tiến hành xịt nấm lên

Đồ án tốt nghiệp

bề mặt cả 9 mẫu.

 Đóng kín miệng bao rồi theo dõi từng ngày đến khi bánh mì có dấu hiệu

nổi mốc và ghi nhận kết quả.

Trường hợp 2: Có cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 105 (tb/ml) (tương 

tự như trường hợp 1 với mức cảm nhiễm nấm mật độ 104 (tb/ml)).

Trường hợp 3: Không cảm nhiễm nấm, để ngoài tự nhiên 

- Cho cả 9 mẫu bánh mì vào từng bao khác nhau và đóng kín miệng bao.

- Theo dõi từng ngày đến khi bánh mì có dấu hiệu nổi mốc và ghi nhận kết quả.

Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4.

2.6.5 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì

2.6.5.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn

Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau

 Mục đích

- Sử dụng phép thử Cho điểm thị hiếu.

- Phép thử Cho điểm thị hiếu cho phép đánh giá mức độ ưa thích sản phẩm của

người thử đối với một dãy các mẫu khác nhau về các đặc tính cảm quan, bằng

cách cho điểm theo thang điểm đã được quy ước.

 Nguyên tắc

Người thử sẽ nhận được lần lượt 1 dãy mẫu đã được mã hóa, yêu cầu người

thử cho điểm lần lượt từng mẫu theo thang điểm đã được quy ước (thang điểm 9).

Khi giới thiệu mẫu, các trật tự mẫu phải được trình bày ngẫu nhiên đối với tất

cả người thử và xuất hiện cùng một số lần như nhau đảm bảo sự cân bằng đối với

nhóm người thử.

Đồ án tốt nghiệp

 Cách tiến hành:

- Dụng cụ: Các dụng cụ thông thường (đĩa, ly nhựa).

- Phòng đánh giá: Phòng A.04.29, Cơ sở Điện Biên Phủ.

- Điều kiện phòng cảm quan: sạch sẽ, thoáng mát, không có mùi lạ, yên tĩnh,

ánh sáng trắng.

- Số lượng người thử: 120 người.

- Trình độ người thử: sinh viên không qua huấn luyện.

- Trật tự trình bày mẫu: sử dụng hình vuông Latin Williams (n=3).

- Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4

Phiếu hướng dẫn

Vui lòng thanh vị bằng nước lọc trước khi bắt đầu thử mỗi mẫu.

Bạn sẽ nhận được lần lượt 3 mẫu bánh mì. Hãy nếm các mẫu bánh này và cho biết mức độ ưa thích của bạn đối với từng mẫu bánh mì đó trên thang điểm 9 trong phiếu trả lời bằng cách GHI MÃ SỐ MẪU và đánh dấu (x) vào ô điểm mà bạn cho là thích hợp nhất.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Trong đó:

6: hơi thích thích 7: thích 8: rất thích 9: cực kì thích

Điểm 1: cực kì không thích 2: rất không thích 3: không thích 4: hơi không thích 5: không thích cũng không ghét

Chân thành cảm ơn các bạn đã tham gia buổi cảm quan!

Đồ án tốt nghiệp

Phiếu trả lời

PHIẾU ĐÁNH GIÁ

Mã số mẫu:…… Mã số người thử: Ngày:

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Chân thành cảm ơn các bạn đã tham gia buổi cảm quan!

2.6.5.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có

bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản

 Mục đích

- Sử dụng phép thử Cho điểm thị hiếu

- Phép thử Cho điểm thị hiếu cho phép đánh giá mức độ ưa thích sản phẩm của

người thử đối với một dãy các mẫu khác nhau về các đặc tính cảm quan, bằng

cách cho điểm theo thang điểm đã được quy ước.

 Nguyên tắc

Người thử sẽ nhận được lần lượt 1 dãy mẫu đã được mã hóa, yêu cầu người

thử cho điểm lần lượt từng mẫu theo thang điểm đã được quy ước (thang điểm 9).

Khi giới thiệu mẫu, các trật tự mẫu phải được trình bày ngẫu nhiên đối với tất

cả người thử và xuất hiện cùng một số lần như nhau đảm bảo sự cân bằng đối với

nhóm người thử.

 Cách tiến hành:

- Dụng cụ: Các dụng cụ thông thường (đĩa, ly nhựa).

- Phòng đánh giá: Phòng A.04.29, Cơ sở Điện Biên Phủ.

- Điều kiện phòng cảm quan: sạch sẽ, thoáng mát, không có mùi lạ, yên tĩnh,

ánh sáng trắng.

- Số lượng người thử: 60 người.

- Trình độ người thử: sinh viên không qua huấn luyện.

- Trật tự trình bày mẫu: sử dụng hình vuông Latin Williams (n=5).

- Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4.

Đồ án tốt nghiệp

Phiếu hướng dẫn

Vui lòng thanh vị bằng nước lọc trước khi bắt đầu thử mỗi mẫu.

Bạn sẽ nhận được lần lượt 5 mẫu bánh mì. Hãy nếm các mẫu bánh này và

cho biết mức độ ưa thích của bạn đối với từng mẫu bánh mì đó. Người thử ghi mã số mẫu và đánh dấu (x) lên thang 9 điểm trong phiếu trả lời.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Trong đó:

6: hơi thích thích 7: thích 8: rất thích 9: cực kì thích Điểm 1: cực kì không thích 2: rất không thích 3: không thích 4: hơi không thích 5: không thích cũng không ghét

Chân thành cảm ơn các bạn đã tham gia buổi cảm quan!

Phiếu trả lời

PHIẾU ĐÁNH GIÁ

Mã số mẫu:…… Mã số người thử: Ngày:

Màu sắc:

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Độ xốp:

1 2 3 4 5 7 8 6 9

Mùi:

1 2 3 4 5 7 8 6 9

Vị:

1 2 3 4 5 7 8 6 9

Đánh giá chung:

1 2 3 4 5 7 8 6 9

Chân thành cảm ơn các bạn đã tham gia buổi cảm quan!

Đồ án tốt nghiệp

2.6.5.3 Độ nở bánh mì

- Nguyên tắc: Đánh giá so sánh độ nở thông qua sự thay đổi về chiều cao và bề ngang

của mỗi chiếc bánh.

- Tiến hành:

+ Dùng thước đo đường kính và chiều cao của khối bột sau khi nhào.

+ Bột sau khi lên men sử dụng thước đo lại đường kính và chiều cao để xác định

độ thay đổi của khối bột.

+ Bánh sau khi đã nướng, dùng thước đo đường kính và chiều cao để xem sự thay

đổi của bánh.

- Khả năng nở của bột được đánh giá qua hiệu số (D-d) và (H-h)cm. (D-d) và (H-h)

càng lớn thì khả năng nở của bột càng cao.

Trong đó : D : là đường kính khối bột sau khi ủ/sau khi nướng (cm).

d : là đường kính khối bột trước khi ủ/trước khi nướng (cm).

H : là chiều cao khối bột sau khi ủ/sau khi nướng (cm).

h : là chiều cao khối bột trước khi ủ/trước khi nướng (cm).

Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4

2.6.5.4 Độ ẩm bánh mì

- Nguyên tắc: Dùng nhiệt để làm bay hơi nước có trong mẫu. Từ chênh lệch khối

lượng mẫu trước và sau khi sấy, tính được độ ẩm của mẫu.

- Tiến hành: Sấy mẫu ở 100 – 1050C đến khối lượng không đổi, khi đó lượng nước

tự do có trong mẫu sẽ bốc hơi hết.

- Công thức tính độ ẩm (W): W% = ((M1 - M2)/M) x 100

Trong đó: W: độ ẩm (%)

M1 là khối lượng petri và mẫu trước khi sấy (g)

M2 là khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy (g)

M là khối lượng mẫu đem sấy (g)

Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4

Đồ án tốt nghiệp

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp.

3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát về sinh lý, sinh hóa

Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi sinh vật khác

trong quá trình bảo quản. Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này

nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng.

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử. Các thử nghiệm

catalase tạo điều kiện cho việc phát hiện các enzyme catalase trong vi khuẩn. Phản

ứng catalase là rất cần thiết để phân biệt từ catalase âm Streptococcaceae đến catalase

dương Micrococcaceae. Một số báo cáo ghi nhận giá trị của phản ứng catalase trên

các chủng Enterobacteriaceae. Các thử nghiệm catalase cũng rất có giá trị trong việc

phân biệt các vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí bắt buộc, ví dụ như các vi khuẩn kỵ khí

thường thiếu các enzyme này. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn catalase âm tính (theo khóa

phân loại Bergey).

Qua các khảo sát (Bảng 3.1), 2 chủng Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus

sp.C1 đã đảm bảo được chủng thuần khiết lactic, đảm bảo được sự chính xác của đề

tài.

Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn Lactobacillus spp.

Lactobacillus sp.L5

Lactobacillus sp.C1

Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn, lồi,

Khuẩn lạc to, tròn, nhẵn, lồi, mép

Khuẩn lạc trên

bóng, màu trắng đục, rìa tròn

gợn sóng, màu trắng đục

MRS agar

Vi khuẩn hình que hơi ngắn

Vi khuẩn hình que dài

Mô tả hình thái

vi khuẩn

(+)

Nhuộm gram

(-)

Nhuộm bào tử

(-)

Catalase

Chú thích: (+) dương tính – (-) âm tính

Đồ án tốt nghiệp

A B

Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc trên MRS agar

A: Lactobacillus sp.L5 – B: Lactobacillus sp.C1

A B

Hình 3.2: Kết quả nhuộm Gram

A: Lactobacillus sp.L5 – B: Lactobacillus sp.C1

3.1.2 Khả năng sinh acid

Vì đề tài khảo sát sự ảnh hưởng của vi khuẩn lactic khi đồng lên men với nấm

men mà acid lactic (0,1-0,3%) có tác dụng làm gluten trương nở và liên kết với tinh

bột tốt hơn, làm chậm quá trình thoái hoá tinh bột (Bùi Đức Hợi, 2009). Để khảo sát

chủng lactic sử dụng có khả năng bảo quản tốt bánh mì về mặt tính chất, người thực

hiện đề tài khảo sát khả năng sinh acid lactic của Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus

sp.C1. Chủng Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 thuộc nhóm vi khuẩn lên

men đồng hình (Lưu Đại Kim Phượng, 2016). Hàm lượng % acid lactic của 2 chủng

Đồ án tốt nghiệp

vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS broth ở 37oC trong 24 giờ (Bảng

3.2). Kết quả cho thấy được với chủng Lactobacillus sp.L5 (1.83%) sinh acid cao hơn

Lactobacillus sp.C1 (1.76%).

Bảng 3.2: Độ acid (% TA) của chủng Lactobacillus spp.

Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1

%TA 1.83𝑎 ± 0.02 1.76𝑏 ± 0.01

(Kết quả được so sánh theo dòng dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%)

3.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro

Aspergillus niger là một loại nấm nhiệt có khả năng sinh trưởng mạnh trong

điều kiện thời tiết nóng ẩm (Metzger, 2008). A.niger là một loại nấm phổ biến phát

triển rất nhanh của các chi Aspergillus. Nó gây ra một căn bệnh được gọi là nấm mốc

đen lên bánh mì. Phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture

Method) trên môi trường rắn theo mô tả của Brunner và cộng sự (2005) là phương

pháp dễ thực hiện và thể hiện rõ nét sự ức chế của vi khuẩn đối với nấm trong thời

gian ngắn. Nên người thực hiện đề tài chọn phương pháp ria 2 đường vi khuẩn cùng

với nấm A.niger làm VSV chỉ thị trong khảo sát in vitro. Kết quả được thể hiện qua

Bảng 3.2. Ta có tỷ lệ đối kháng Lactobacillus sp.L5 (65.15%) và Lactobacillus sp.C1

(59.87%) tương đương nhau.

Tỷ lệ đối kháng (%) Vi khuẩn

Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1 65.15𝑎 ± 12.00 59.87𝑎 ± 12.02

Bảng 3.3: Tỉ lệ ức chế của vi khuẩn Lactobacillus spp. với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%)

Đồ án tốt nghiệp

TỶ LỆ ĐỐI KHÁNG NẤM

60.00

80.00

40.00

20.00

0.00

L5 C1

Hình 3.3: Đồ thị khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus sp.L5 và

Lactobacillus sp.C1

Hình 3.4: Đối kháng nấm Aspergillus niger

A: Đĩa đối chứng – B: Đĩa kháng nấm chủng Lactobacillus sp.C1 – C: Đĩa kháng

nấm chủng Lactobacillus sp.L5

Đồ án tốt nghiệp

3.2 Xây dựng đường chuẩn

3.2.1. Lactobacillus spp.

Mục đích: Xác định mật độ tế bào vi khuẩn lactic để bổ sung vào bánh mì.

Đường chuẩn Lactobacillus sp.C1

Đường chuẩn Lactobacillus sp.L5

0.5

0.4

y = 0.3052x - 1.4226 R² = 0.9251

0.3

0.2

y = 0.2784x - 1.948 R² = 0.9133

m n 0 0 6 D O

0.1

7.3

7.8

8.3

6.8

4.5

5.5

log cfu/ml

Hình 3.5: Đường chuẩn chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1

3.2.2. Nấm mốc Aspergillus niger

Mục đích: Xác định mật độ bào tử nấm để cảm nhiễm bánh mì khảo sát sự

đối kháng.

Đường chuẩn Aspergillus niger ĐN3

0.4

0.3

0.2

y = 0.2856x - 1.5645 R² = 0.9134

m n 0 2 6 D O

0.1

5.2

5.7

6.2

6.7

log tb/ml

Hình 3.6: Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus niger

Đồ án tốt nghiệp

3.3 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng

lên men bánh mì với nấm men

 Lactobacillus spp.

Để xác định được mật độ của dịch tăng sinh, người thực hiện đề tài tiến hành

pha loãng đo OD600nm, kết quả được thể hiện qua Bảng 3.4.

Bảng 3.4: Kết quả mật độ Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1

Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1

y = 0.2784x - 1.948 y = 0.3052x - 1.4226

0.468

0.477

OD600nm

8.678

6.224

log (cfupha loãng/ml)

1675387.744

cfu pha loãng/ml

476607551.934

10𝑥

tb pha

loãng/ml x hệ

2.440 × 1011

5.489 × 1010

cfu/ml

số pha loãng

Vậy: ta xác định được mật độ vi khuẩn lactic trong bình tăng sinh

+ Lactobacillus sp.L5 là 1011(cfu/ml) => Để đạt được mật độ mong muốn là

1010(cfu/ml), 109(cfu/ml) và 108(cfu/ml), ta lần lượt pha loãng dịch gốc 10, 100

và 1000 lần.

+ Lactobacillus sp.C1 là 1010(cfu/ml) => Để đạt được mật độ mong muốn là

109(cfu/ml) và 108(cfu/ml), ta lần lượt pha loãng dịch gốc 10 và 100 lần.

 Aspergillus niger ĐN3

Để xác định được mật độ của nấm, người thực hiện đề tài tiến hành pha loãng

đo OD620nm, kết quả được thể hiện qua Bảng 3.5

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.5: Bảng tính mật độ nấm mốc để cảm nhiễm.

y = 0.2856x - 1.5645

y 0.428 OD620nm

x 6.98 log (tb pha loãng/ml)

9474157.849 tb pha loãng/ml 10𝑥

tb pha loãng/ml x hệ 9.474 × 106 tb/ml số pha loãng

Vậy mật độ nấm mốc là: 106 (bt/ml).

Để đạt được mật độ mong muốn là 105(bt/ml) và 104(bt/ml), ta lần lượt pha

loãng dịch gốc 10 và 100 lần.

Sử dụng bình xịt để cảm nhiễm, thể tích cảm nhiễm cho 1 mẫu bánh mì

tương ứng 100gr bột mì là 1ml dịch nấm.

Bảng 3.6: Bảng mật độ / khối lượng cần bổ sung

Mật độ dự tính Mật độ thực tế Chất bổ sung (cfu/ml)/(bt/ml)

1010 Lactobacillus sp.L5 1.65 × 1010 cfu/g Mẫu BML5-10

109 Lactobacillus sp.L5 1.65 × 109 cfu/g Mẫu BML5-9

108 Lactobacillus sp.L5 1.65 × 108 cfu/g Mẫu BML5-8

1010 Lactobacillus sp.C1 3.71 × 1010 cfu/g Mẫu BMC1-10

109 Lactobacillus sp.C1 3.71 × 109 cfu/g Mẫu BMC1-9

108 Lactobacillus sp.C1 3.71 × 108 cfu/g Mẫu BMC1-8

- - Mẫu BMTL

- 1gr Mẫu BMNa C6H5COONa

- C6H10CaO4 1gr Mẫu BMCa

105 Aspergillus niger 9.47 × 103 bt/g Mật độ nấm

104 Aspergillus niger 9.47 × 102 bt/g Mật độ nấm

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.7: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu

Mật độ nấm Cảm nhiễm Cảm nhiễm

nấm A.niger nấm A.niger (bt/ml) Không cảm nhiễm

mật độ 104 mật độ 105

Mẫu

Mật độ

(cfu/ml) Thời gian sau nướng bắt đầu xuất hiện tơ nấm (ngày)

1010 3.83de ± 0.29 3.67b ± 0.29 7.50ab ± 1.80 BML5-10

109 4.17cde ± 0.29 3.83b ± 0.58 7.50ab ± 0.87 BML5-9

108 4.83abc ± 0.29 4.50ab ± 0.50 7.50ab ± 0.50 BML5-8

1010 4.33bcde ± 0.29 3.83b ± 0.29 7.67ab ± 2.08 BMC1-10

109 5.33a ± 0.58 5.00a ± 0.87 8.00ab ± 1.32 BMC1-9

108 5.17ab ± 0.58 4.50ab ± 0.00 7.33ab ± 0.76 BMC1-8

3.67e ± 0.29 BMNa 3.50b ± 0.00 7.83ab ± 1.76

10.00a ± 1.80 BMCa 4.67abcd ± 0.29 4.17ab ± 0.29

3.67e ± 0.29 3.50b ± 0.00 5.50b ± 0.50 BMTL

(Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%)

Dựa vào kết quả Bảng 3.7, khi không cảm nhiễm nấm, mẫu BMCa có số ngày

bảo quản lâu nhất còn mẫu BMTL có số ngày bảo quản ít nhất. Các mẫu còn lại tương

đương nhau.

Khi cảm nhiễm nấm (105bt/ml) ở mật độ cao có thể dẫn đến sai lệch về kết

quả. Kết quả cho thấy mẫu BMC1-9 số ngày bảo quản lâu nhất và BMCa, BML5-8,

BMC1-8 có số ngày bảo quản tương đương nhau. Còn những mẫu BML5-10, BML5-

9, BMC1-10, BMNa và BMTL số ngày bảo quản ít nhất.

Đồ án tốt nghiệp

Khi cảm nhiễm nấm (104bt/ml) ở mật độ thấp hơn, mẫu BMC1-9 có số ngày

bảo quản lâu nhất và BMNa, BMTL số ngày bảo quản ít nhất. Còn những mẫu được

bổ sung vi khuẩn lactic BML5-10, BML5-9, BML5-8, BMC1-10, BMC1-8 và mẫu

bổ sung chất bảo quản BMCa số ngày bảo quản tương đương nhau.

Điều này cho thấy rằng, mẫu BML5 và BMC1 là 2 mẫu có bổ sung vi khuẩn

lactic có khả năng sinh hợp chất giúp kháng nấm bảo quản bánh mì trong thời gian

dài tương đương với mẫu BMCa là mẫu có bổ sung chất bảo quản sử dụng phổ biến

hiện nay. Và mẫu BMNa cũng là chất bảo quản nhưng do hoạt động tốt môi trường

acid nên khi sử dụng bảo quản bánh mì không đạt hiêu quả cao bằng mẫu BMCa là

chất hoạt động động tốt ở môi trường không cần acid. Đồng thời cũng cho thấy tính

khả thi của đề tài đưa ra là sử dụng vi khuẩn lactic kéo dài thời gian bảo quản thay

thế cho hợp chất bảo quản.

Hình 3.7: Khảo sát đối kháng in vivo

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì

3.4.1. Đánh giá cảm quan

3.4.1.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn

Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau

Đồ án tốt nghiệp

Qua kết quả dựa trên cơ sở lí hoá, nhận thấy được lợi ích của việc bổ sung vi

khuẩn lactic vào bánh mì sẽ giúp cải thiện được chất lượng của bánh. Thế nhưng, trên

thực tế người tiêu dùng ít dựa vào các chỉ tiêu lí hoá để đánh giá chất lượng bánh mì

mà chủ yếu quan tâm đến giá trị cảm quan sản phẩm. Điều quan ngại là mùi chua đặc

trưng của acid lactic được sản sinh bởi vi khuẩn lactic bổ sung vào bánh mì có thể

gây ảnh hưởng đến giá trị cảm quan. Chính vì vậy, người làm đề tài bố trí thí nghiệm

cảm quan với phép thử Cho điểm thị hiếu nhằm tìm hiểu mức độ ưa thích đối với các

mẫu sản phẩm được bổ sung chủng LAB với các mật độ LAB khác nhau và thu được

kết quả thể hiện qua Bảng 3.8 và Bảng 3.9.

Bảng 3.8: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5

Mẫu Mật độ Mức độ ưa thích (điểm)

(cfu/ml)

BML5-10 1010 4.97b

BML5-9 109 5.67a

BML5-8 108 5.22ab

(Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%) Bảng 3.9: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.C1

Mẫu Mật độ Mức độ ưa thích (điểm)

(cfu/ml)

BMC1-10 1010 4.73b

BMC1-9 109 6.37a

BMC1-8 108 6.87a

(Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 99%)

Biện luận:

Theo kết quả đánh giá cảm quan như trên, cho thấy:

Đối với mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5: mẫu BML5-8 và mẫu

BML5-10 có mức độ ưa thích không có sự khác biệt. Tuy nhiên, mức độ ưa thích của

2 mẫu này thấp hơn mẫu BML5-9.

Đồ án tốt nghiệp

Đối với mẫu bánh bổ sung Lactobacillus sp.C1: mẫu BMC1-9 và mẫu BMC1-

8 không có sự khác biệt về giá trị cảm quan. Riêng mẫu BMC1-10 ít được ưa thích

hơn.

Do ở cả 2 mẫu A của chủng L5 và C1 với mật độ tế bào LAB khá cao dẫn đến

sinh acid lactic và enzyme protease, enzyme amylase nhiều làm kiềm hãm những

biến đổi sinh lý, sinh hóa trong quá trình lên men của khối bột nhào: enzyme protease

phá hủy mạng gluten và enzyme amylase sinh dextrin làm giảm chất lượng bột nhào,

sinh acid lactic quá nhiều làm bánh có vị chua.

Dựa vào kết quả đánh giá cảm quan, cho thấy người thử ưa thích mẫu bánh mì

bổ sung vi khuẩn lactic ở 2 mật độ 108 (cfu/ml) và 109 (cfu/ml) và các thí nghiệm

sinh lý, sinh hóa về nấm men thường kết hợp với LAB trong bột chua với tỷ lệ nấm

men/LAB thường là 1:100 (Gobbetti và cộng sự, 1994; Ottogalli và cộng sự, 1996)

kết hợp thử nghiệm in vivo mẫu có mật độ 109 (cfu/ml) kéo dài số ngày bảo quản

được lâu hơn, người thực hiện đề tài chọn 2 mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5

ở mật độ 109 (cfu/ml) và Lactobacillus sp.C1 ở mật độ 109 (cfu/ml) để thực hiện thêm

khảo sát mức độ ưa thích với mẫu bổ sung chất bảo quản và mẫu bánh mì thường

cùng với khảo sát độ nở và độ ẩm.

B Hình 3.8: Mẫu bánh mì bổ sung 2 chủng lactic chuẩn bị đánh giá cảm quan

A: Mẫu bổ sung Lactobacillus sp.L5 – B: Mẫu bổ sung Lactobacillus sp.C1

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.9: Tiến hành thí nghiệm cảm quan mẫu bổ sung 2 chủng lactic.

3.4.1.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có

bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản

Để khảo sát và so sánh xem liệu những mẫu bánh mì có bổ sung LAB có được

người tiêu dùng ưa thích bằng những mẫu có bổ sung chất bảo quản không, người

thực hiện đề tài tiến hành buổi thí nghiệm cảm quan với phép thử Cho điểm thị hiếu

để đánh giá mức độ ưa thích về các chỉ tiêu màu sắc, độ xốp, mùi, vị của mẫu bánh

mì bổ sung LAB cùng với mẫu bánh mì bổ sung Canxi propionate, Natri benzoate và

mẫu bánh mì thường. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.10 và Bảng 3.11.

Bảng 3.10: Kết quả đánh giá cảm quan mức độ ưa thích về các chỉ tiêu màu sắc, độ xốp, mùi, vị của các mẫu bánh mì

Mẫu Mức độ yêu thích (điểm)

Mật độ Màu sắc Độ xốp Mùi Vị

(cfu/ml)

BML5 109 6. 68ab 6.72a

BMC1 109 6.63ab 6.27𝑏 6.33b 6.33b 6.58a

BMNa 6.07b 6.32𝑏

BMCa 6.30b 5.38c 6.92a 5.68b 6.68a 6.90a 7.00a

BMTL 6.55a 6.90ab 6.32ab 6.75ab

(Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 99%)

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.11: Đánh giá chung về mức độ ưa thích của các mẫu bánh mì

Mẫu Mức độ yêu thích (điểm)

Mật độ (cfu/ml) Đánh giá chung

BML5 109 6.85ab

BMC1 109 6.30bc

BMNa 5.52d

BMCa 6.88a

BMTL 6.10c

(Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 99%)

Biện luận:

Dựa vào điểm trung bình cảm quan về các chỉ tiêu màu sắc, độ xốp, mùi, vị

của 5 mẫu bánh mì khảo sát cho thấy: mẫu BMCa có điểm mức độ ưa thích cao nhất

trong khi mẫu BMNa có mức điểm thấp nhất. Qua thí nghiệm cảm quan cũng nhận

thấy rằng tất cả các mẫu bổ sung vi khuẩn LAB có những tính chất về độ xốp, mùi

và vị tương đương với mẫu bánh mì thường và mẫu bánh mì bổ sung Canxi

propionate là chất bảo quản được sử dụng phổ biến, trong khi mẫu bổ sung Natri

benzoat được đánh giá ở mức thấp nhất. Điều này cho thấy không có sự khác biệt về

giá trị cảm quan, khẳng định tính khả thi của đề tài được đề ra do đó có thể sử dụng

vi khuẩn LAB để thay thế cho chất bảo quản. Ngoài ra, ở thí nghiệm khảo sát khả

năng kháng nấm trên bánh mì của vi khuẩn lactic cũng góp phần chứng minh giả

thuyết kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì.

Đồ án tốt nghiệp

B D A E C

Hình 3.10: Mẫu bánh mì chuẩn bị đánh giá cảm quan

A: Mẫu bổ sung Lactobacillus sp.L5 – B: Mẫu bổ sung Lactobacillus sp.C1

C: Mẫu bổ sung Natri benzoate – D: Mẫu bổ sung Canxi propionate

E: Mẫu không bổ sung

Hình 3.11: Tiến hành thí nghiệm cảm quan

3.4.2 Đánh giá độ nở

Độ nở của bánh thể hiện khả năng lên men của nấm men và vi khuẩn lactic.

Tác nhân làm bánh mì nở là CO2 sinh ra trong quá trình lên men và được giữ lại trong

các mạng gluten. Khi nướng bánh ở nhiệt độ cao, CO2 sẽ tăng thể tích, mạng gluten

sẽ căng ra và tạo thành những túi chứa CO2. Khi nhiệt độ cao hơn, CO2 sẽ thoát ra

khỏi túi chứa nó và tạo ra những lỗ xốp trong bánh, kết quả là bánh có độ xốp. Khả

năng lên men càng mạnh, độ xốp của bánh càng lớn, bánh càng nở và thể tích bánh

càng tăng.

Đồ án tốt nghiệp

Để đánh giá khả năng lên men của các mẫu có bổ sung chủng vi khuẩn lactic

được phân lập từ nem chua vs cơm mẻ, thí nghiệm tiến hành so sánh độ nở của các

mẫu thông qua sự thay đổi về chiều cao và bề ngang của mỗi chiếc bánh sau quá trình

lên men và nướng, kết quả thể hiện ở các bảng sau:

Bảng 3.12: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BML5

Mẫu Độ nở sau khi Mẫu Độ nở sau khi

ủ (cm) nướng (cm)

Mật độ Ngang Cao Mật độ Ngang Cao

(cfu/ml) (cfu/ml)

1010 BML5-10 BML5-10 1010

1.20a BML5-9 BML5-9 109 109 1.07a

BML5-8 BML5-8 108 108 1.30a 1.00a 0.87a 1.00a 0.93a 0.80a

1.27a 1.27a 1.17a 0.97a (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%)

Mẫu được bổ sung vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 giữa các mật độ không có sự

khác biệt về độ nở sau khi ủ cũng như sau khi nướng (Bảng 3.12).

Bảng 3.13: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BMC1

Mẫu Độ nở sau khi Mẫu Độ nở sau khi

ủ (cm) nướng (cm)

Mật độ Ngang Cao Mật độ Ngang Cao

(cfu/ml) (cfu/ml)

BMC1-10 1010 BMC1-10 1010 1.00a

BMC1-9 109 BMC1-9 109

0.93a 0.97a 1.17a 1.20a 1.30a 1.23a 108 108 BMC1-8 BMC1-8 1.10a 1.07a 0.67b

1.20a 1.00a (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%)

Đồ án tốt nghiệp

Còn ở mẫu được bổ sung vi khuẩn Lactobacillus sp.C1, chiều cao mẫu BMC1-

8 có độ nở thấp hơn với 2 mẫu còn lại BMC1-10 và BMC1-9. Sau khi nướng, các

mẫu BMC1 không có sự khác biệt (Bảng 3.13).

Bảng 3.14: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của các mẫu bánh mì

Mẫu Độ nở sau khi ủ Mẫu Độ nở sau khi

(cm) nướng (cm)

Mật độ Ngang Cao Mật độ Ngang Cao

(cfu/ml) (cfu/ml)

BML5 109 BML5 109 0.98b 1.17b

BMC1 109 BMC1 109 1.05b 1.30b 1.27b 1.23b

BMNa BMNa 0.91b 0.86b 0.53c 0.37c 0.90c 0.80c

BMCa BMCa 1.60a 0.43c 2.00a 1.60a

BMTL BMTL 1.50a 1.40b 1.20b 1.37a

(Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 99%)

Sau khi ủ, mẫu BMTL có xu hướng nở tốt nhất, còn ở mẫu BMNa nở kém

nhất. Hai mẫu BML5, BMC1 nở tương đương nhau nhưng nở kém hơn BMCa và

BMTL.

Xét về các mẫu bánh mì sau khi hoàn thành, mẫu BMCa có độ nở tốt nhất và

mẫu BMNa nở kém nhất. Hai mẫu BML5, BMC1 nở tương đương nhau nhưng nở

kém hơn BMCa và BMTL. (Bảng 3.14)

Đối với mẫu BMTL là mẫu bánh mì thường không bị ức chế bởi một chất nào

nên nấm men hoạt động tốt giúp sinh CO2 làm tăng thể tích bánh. Ở 2 mẫu có bổ sung

vi khuẩn lactic BML5 và BMC1 vì do sinh acid lactic nên phần nào làm kiềm hãm

sự hoạt động của nấm men và như khảo sát khả năng sinh acid thì chủng Lactobacillus

sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 sinh lượng acid tương đương nhau nên ở thí nghiệm

khảo sát độ nở cũng có độ nở tương đương nhau. Do mẫu BMCa là mẫu được bổ

sung Canxi propionate bản chất không đòi hỏi môi trường acid như benzoate mà trong

Đồ án tốt nghiệp

quá trình lên men nấm men có thể không tạo ra được môi trường acid thích hợp cho

benzoate hoạt động nên so 2 mẫu bổ sung chất bảo quản hóa học thì BMCa nở tốt

hơn BMNa.

Và qua khảo sát, ta cũng thấy được, mẫu bổ sung vi khuẩn lactic có độ nở

tương đương với mẫu bổ sung Canxi propionate là chất bảo quản được sử dụng phổ

biến. Điều này cho thấy không có sự khác biệt về mặt tính chất khi sử dụng vi khuẩn

lactic làm chất bảo quản, khẳng định tính khả thi của đề tài được đề ra.

A

B

C

Hình 3.12: Độ nở của bánh mì

A: Mẫu sau khi nhào – B: Mẫu sau khi ủ – C: Mẫu sau khi nướng

3.4.3 Đánh giá độ ẩm

Sau khi nướng, làm nguội và trong quá trình bảo quản bánh mì đã xảy ra các

biến đổi phân bố ẩm giữa vỏ và ruột bánh làm giảm độ ẩm của bánh, thay đổi tính

chất cơ cấu ruột bánh, bánh trở nên dẻo và đàn hồi. Nhằm so sánh sự khác biệt lượng

nước sau khi nướng và sự thay đổi sau khi bảo quản 7 ngày trong các mẫu bánh mì,

người thực hiện đề tài thực hiện thí nghiệm đánh giá độ ẩm của bánh mì.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.15: Đánh giá độ ẩm của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 Mẫu

Mẫu

W%

∆W%

Mật độ

(cfu/ml)

1010

BML5-10

BMC1-10

1010

BML5-9

BMC1-9

109 BMC1-8

BML5-8

108

1.597𝑏 4.193𝑎 3.383𝑎𝑏

5.269𝑎 1.936𝑏 4.845𝑎 (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%)

24.457𝑎 24.213𝑎 25.313𝑎 25.827𝑎 25.000𝑎 28.210𝑎

Đối với mẫu bổ sung Lactobacillus sp.L5, độ ẩm sau khi nướng không có sự

khác biệt giữa các mật độ. Nhưng sau 7 ngày bảo quản, mẫu BML5-9 độ ẩm giảm

nhiều và bánh cứng hơn so với mẫu BML5-10.

Đối với mẫu bổ sung Lactobacillus sp.C1, độ ẩm sau khi nướng không có sự

khác biệt giữa các mật độ. Nhưng sau 7 ngày bảo quản, 2 mẫu BMC1-10 và BMC1-

8 độ ẩm giảm nhiều và bánh cứng hơn so với mẫu BMC1-9.

Bảng 3.16: Đánh giá độ ẩm của các mẫu bánh mì khi vừa nướng xong và sau 7 ngày bảo quản

Mẫu

W%

∆W%

Mật độ (cfu/ml)

BML5

109 BMC1

109

24.662𝑎𝑏 26.346𝑎𝑏

BMNa

BMCa

BMTL

3.058𝑑 4.017𝑐𝑑 5.814𝑎𝑏 5.186𝑏𝑐 6.458𝑎 26.974𝑎𝑏 28.737𝑎 21.795𝑏

(Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%)

Sau khi nướng, mẫu BMCa đạt độ ẩm cao nhất và mẫu BMTL có độ ẩm thấp

nhất. Các mẫu BML5, BMC1, BMNa có độ ẩm tương đương nhau. Sau 7 ngày bảo

quản, mẫu BMTL độ ẩm giảm nhiều và bánh cứng các mẫu còn lại. Ở 2 mẫu có bổ

Đồ án tốt nghiệp

sung vi khuẩn lactic BML5 và BMC1 độ ẩm giảm rất ít, bánh vẫn còn độ mềm xốp.

Đối với 2 mẫu bổ sung chất bảo quản, mẫu BMCa giữ được độ ẩm tốt hơn mẫu

BMNa.

Sau khi nướng khoảng 10-15 giờ, bánh bắt đầu ỉu. Mùi và vị bắt đầu giảm dần,

vỏ cứng trở nên mềm dẻo, tính chất ruột bánh thay đổi nhiều (kém đàn hồi và dễ vỡ).

Nguyên nhân của quá trình ỉu là do tinh bột bị thoái hoá. Các gel tinh bột tạo thành

trong quá trình nướng do hồ hoá không bền. Trong thời gian bảo quản, gel bị thoái

hoá, tinh bột nhả nước ra. Các phân tử tinh bột liên kết chặt lại và giảm thể tích: do

đó độ ẩm bánh giảm và bánh cứng. Ngoài thị trường, các công ty sản xuất bánh mì

sẽ sử dụng các phụ gia kìm hãm sự ỉu của bánh mì là tinh bột hồ hoá, maltose, glucose,

fructose, protein đậu nành và acid lactic. Đối với các mẫu BML5 và BMC1, vi khuẩn

lactic sinh acid lactic trong quá trình lên men giúp kiềm hãm sự ỉu. Acid lactic (0,1-

0,3%) có tác dụng làm gluten trương nở và liên kết với tinh bột tốt hơn, làm chậm

quá trình thoái hoá tinh bột (Bùi Đức Hợi, 2009). Chính vì thế, ở mẫu BML5 và

BMC1 sau 7 ngày bảo quản vẫn giữ được độ xốp mềm của sản phẩm. So với mẫu

BMCa là mẫu bổ sung chất bảo quản ngoài thị trường thì độ ẩm giữ lại tốt hơn hẳn,

khẳng định tính khả thi của đề tài.

Đồ án tốt nghiệp

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 được khẳng định là thuần khiết và

là vi khuẩn lactic qua khảo sát lại đặc điểm, hình thái sinh lý và sinh hoá.

Từ đường chuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 đã dựng giúp

kiểm soát được mật độ vi khuẩn lactic cho vào bánh mì thử nghiệm là 1010(cfu/ml),

109(cfu/ml), 108(cfu/ml).

Từ đường chuẩn nấm mốc Aspergillus niger đã dựng giúp kiểm soát được mật

độ nấm sử dụng để cảm nhiễm là 104(bt/ml), 105(bt/ml).

Ở đối kháng in vitro – đối kháng trực tiếp ria 2 đường vi khuẩn, 2 chủng

Lactobacillus sp.L5 (65.15%) và Lactobacillus sp.C1 (59.87%) có khả năng đối

kháng nấm A.niger tương đương nhau.

Khi cảm nhiễm bánh mì với 104 bt/ml nấm mốc, thời gian bảo quản của bánh

mì có bổ sung chủng Lactobacillus sp.C1 mật độ 109cfu/ml có số ngày bảo quản lâu

nhất. Những mẫu có bổ sung vi khuẩn lactic khi để ngoài môi trường tự nhiên kéo

dài được thời gian bảo quản tương đương với mẫu bổ sung Canxi propionate là chất

bảo quản được sử dụng phổ biến hiện nay.

Độ nở của mẫu có bổ sung 2 chủng vi khuẩn lactic tương đương nhau nhưng

kém hơn mẫu bổ sung Canxi propionate. Nhưng xét về độ ẩm còn giữ được sau 7

ngày bảo quản, mẫu có bổ sung vi khuẩn lactic giữ được độ ẩm tốt hơn.

Các khảo sát đều cho thấy, khi sử dụng vi khuẩn lactic đồng lên men bánh mì

với nấm men mật độ 107 tb/ml thì mật độ 109 cfu/ml cho kết quả tốt nhất về kháng

nấm và cả về chất lượng bánh mì.

Tuy về khảo sát in vivo, mẫu bổ sung Lactobacillus sp.C1 mật độ 109 cfu/ml

cho thấy khả năng kháng nấm tốt hơn và các khảo sát về độ nở, độ ẩm thì chủng

Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 tương đương nhau. Nhưng khi khảo sát

mức độ ưa thích, người tiêu dùng ưa thích mẫu có bổ sung Lactobacillus sp.L5 hơn

vì ở mẫu có bổ sung Lactobacillus sp.C1 có vị chua hơn.

Đồ án tốt nghiệp

Về mức độ ưa thích đối với các mẫu, mẫu có bổ sung vi khuẩn lactic có mức

ưa thích tương đương với mẫu bổ sung chất bảo quản Canxi propionate. Cho thấy

việc bổ sung vi khuẩn lactic vào bánh mì không ảnh hưởng đến chất lượng bánh mì

thành phẩm.

2. Kiến nghị

Khảo sát về khả năng sinh enzyme amylase và enzyme protease của 2 chủng

vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 để tìm hiểu về điểm ức chế khi

đồng lên men với nấm men.

Quy trình sản xuất chế phẩm sinh khối vi khuẩn lactic dạng khô, phương pháp

bảo quản chế phẩm sinh khối vi khuẩn lactic dạng khô.

Phương pháp sử dụng kết hợp vi khuẩn lactic và nấm men sao cho cả 2 phát

huy hiệu quả hoạt động tối ưu.

Khảo sát thêm nhiều chủng phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Dương Thị Quế Anh (2009). “Quy trình sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic và bảo quản bằng phương pháp lạnh đông”. Trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM.

Huỳnh Nguyễn Quế Anh (2009). “Nấm mốc và độc tố Aflatoxin”. Trường Đại học

Bách Khoa TP.HCM.

Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000). Vi nấm - dùng trong công nghệ sinh học.

NXB Khoa học và Kỹ Thuật Hà Nội, trang 184 - 188.

Bùi Đức Hợi (2009), Kỹ thuật chế biến Lương thực – Tập 2 – NXB KHKT Hà Nội.

Nguyễn Đức Lượng (2002). Công nghệ vi sinh vật tập 2 Vi sinh vật học công nghiệp.

NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM, trang 33 - 34.

Lê Văn Việt Mẫn (2011). Công nghệ chế biến thực phẩm. NXB đại học Quốc Gia

TP.HCM, trang 480 – 494.

Lưu Đại Kim Phượng (2016). Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.. Trường đại học Công Nghệ TP.HCM.

Tú, Hoa Thị Minh, Nguyễn Thị Đà, và Lê Thanh Bình (2001). Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp Bacteriocin. Tạp chí Khoa học và Công Nghệ 47.5 : 17-25.

Phan Nguyễn Hương Thảo (2015). Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus niger và Mucor sp. của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5. Trường đại học Công Nghệ TP.HCM.

Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức, Nguyễn Văn Dịp (2003). Vi sinh vật thực phẩm - Kỹ thuật kiểm tra và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Y Học Hà Nội, trang 26 - 35, 64 - 65, 72-85.

Đồ án tốt nghiệp

Tài liệu tiếng Anh

Axelsson L. (1999). Lactic acid bacteria: classification and physiology.

In: SalminenS, von WrightA, editors. Lactic acid bacteria microbiology and

functional aspects. New York : Marcel Dekker. p 1–72.

B. J. B. Wood and W. H. Holzapfel (1995), “The Genera of Lactic Acid Bacteria in

the Lactic acid Bacteria,” In: B. J. B. Wood and W. H. Holzapfel Eds., The

Genera of Lactic Acid Bacteria Blackie, Academic and Professional, London,

1995, p. 398. doi:10.1007/978-1-4615-5817-0

Barber, S., Benedito de Barber, C., Martinez-Anaya, M. A., Martinez, J., & Alberola,

J. (1985). Cambios en los acidos organicos volatiles C2-C5 durante la

fermentacation de mases panarias preparados con masas madres comerciales y

con cultivos puros de microorganismos. Revista de Agroquimica y Technologia

de Alimentos, 25, 223-232.

Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid Saari (2015). Lactic Acid Bacteria

in Biopreservation and the Enhancement of the Functional Quality of Bread.

http://dx.doi.org/10.5772/51026

Bredie, W. L. P., Mottram, D. S., & Guy, R. C. E. (2002). Effect of temperature and

pH on the generation of flavor volatiles in extrusion cooking of wheat flour.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 1118-1125.

Bruemmer, J. M., & Lorenz, K. (1991). Europeon development in wheat sourdoughs.

Cereal Food World, 36, 310-312.

Carla Luciana Gerez, Maria Ines Torino, Graciela Rollán, Graciela Font de Valdez.

(2009). Prevention of bread mould spoilage by using lactic acid bacteria with

antifungal properties. Food Control 20 (2009) 144–148.

Corsetti, A., M. Gobbetti, and E. Smacchi. (1996). Antibacterial activity of

sourdough lactic acid bacteria: isolation of a bacteriocin-like inhibitory

substance from Lactobacillus sanfrancisco C57. Food Microbiology 13(6):447-

456.

Đồ án tốt nghiệp

Corsetti, A., Gobbetti, M., De Marco, B., Balestrieri, F., Paletti, F., Russi, L., et al.

(2000). Combined effect of sourdough lactic acid bacteria and additives on bread

firmness and staling. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 3044-3051.

Damiani, P., Gobbetti, M., Cossignani, L., Corsetti, A., Simonetti, M. S., & Rossi, J.

(1996). The sourdough microflora. Characterization of hetero- and

homofermentative lactic acid bacteria, yeasts and their interactions on the basis

of the volatile compounds produced. LWT-Food Science and Technology, 29, 63-

70.

Dan Zhao (2011). “Isolation of Antifungal Lactic Acid bacteria from Food Sources

and Their Use to Inhibit Mold Growth in Cheese”. California Polytechnic State

University.

De Vuyst, L., R. Callewaert, and K. Crabbe. (1996). Primary metabolite kinetics of

bacteriocin biosynthesis by Lactobacillus amylovorus and evidence for

stimulation of bacteriocin production under unfavourable growth conditions.

Microbiology 142 (4):817‐827.

De Vuyst, L. and F. Leroy. (2007). Bacteriocins from lactic acid bacteria:

Production, purification and food applications. Journal of Molecular

Microbiology and Biotechnology 13:194-199.

Dieuleveux, V., Van der Pyl, D., Chataud, J., & Gueguen, M. (1998). Purification

and characterization of anti-Listeria compounds produced by Geotrichum

candidum. Applied and Environmental Microbiology, 64, 800–803.

Galal, A. M., Johnson, J. A., & Varriano-Marston, E. (1978). Lactic acid and volatile

(C2-C5) organic acids of San Francisco sourdough French bread. Cereal

Chemistry, 55, 461-468.

Gobbetti M, Corsetti A, Rossi J, La Rosa F, De Vincenzi S. (1994). Identification

and clustering of lactic acid bacteria and yeasts from wheat sourdoughs of central

Italy. Italian J Food Sci 1:85–94.

Đồ án tốt nghiệp

Gobbetti, M., Simonetti, M. S., Rossi, J., Cossignani, L., Corsetti, A., Damiani, P.

(1994). Free D- and L-amino acid evolution during sourdough fermentation and

baking. Journal of Food Science, 59, 881-884.

Gobbetti, M., Corsetti, A., & De Vincenzi, S. (1995a). The sourdough microflora.

Characterization of homofermentative lactic acid bacteria based on acidification

kinetics and impedance tests. Italian Journal of Food Science, 2, 91-102.

Gobbetti, M., Corsetti, A., & De Vincenzi, S. (1995b). The sourdough microflora.

Characterization of heterofermentative lactic acid bacteria based on acidification

kinetics and impedance tests. Italian Journal of Food Science, 2, 103-112.

Gobbetti, M. (1998). The sourdough microflora: interactions of lactic acid bacteria

and yeasts. Trends in Food Science & Technology, 9, 267-274.

Gobbetti M, De Angelis M, Arnault P, Tossut P, Corsetti A, Lavermicocca

P. (1999). Added pentosans in breadmaking: fermentations of derived pentoses

by sourdough lactic acid bacteria. Food Microbiol 16:409–18.

Gourama, H. and L. B. Bullerman. (1997). Anti-aflatoxigenic activity of

Lactobacillus casei pseudoplantarum. International Journal of Food

Microbiology 34(2):131-143.

Hammes WP, Vogel RF. (1995). The genus Lactobacillus.

In: WoodBJB, HolzapfelW, editors. The genera of lactic acid bacteria. London:

Blackie Academic and Professional. p 19–54.

Hammes WP, Gänzle MG. (1998). Sourdough breads and related products.

In: WoodBJB, editor. Microbiology of fermented foods, Vol. 1. London: Blackie

Academic and Professional. p 199–216.

Hansen, A., Lund, B., & Lewis, M. J. (1989a). Flavour of sourdough rye bread

crumb. LWT-Food Science and Technology, 22, 141-144.

Hansen, A., & Schieberle, P. (2005). Generation of aroma compounds during

sourdough fermentation: applied and fundamental aspects. Trends in Food

Science & Technology, 16, 85-94.

Đồ án tốt nghiệp

Hassan, Y. I. and Bullerman, L. B. (2008). Antifungal activity of Lactobacillus

paracasei ssp. tolerans isolated from a sourdough bread culture. International

Journal of Food Microbiology, 121: 112-115.

Holzapfel, W. H., R. Geisen, and U. Schillinger. (1995). Biological preservation of

foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade enzymes.

International Journal of Food Microbiology 24(3):343-362.

Ji, H., & Berhard, R. A. (1992). Effect of microwave heating on pyrazine formation

in a model system. Journal of the Science of Food and Agriculture, 59, 283-289

Kamin´ski, E., Przybylski, R., & Gruchala, L. (1981). Thermal degradation of

precursors and formation of flavour compounds during heating of cereal

products. Part I. Changes of amino acids and sugars. Die Nahrung, 25, 507-518.

Katina, K., Arendt, E., Liukkon, K.-H., Autio, K., Flander, L., & Poutanen, K. (2005).

Potential of sourdough for healthier cereal products. Trends in Food Science and

Technology, 16, 104-112.

Kleerebezem M, Boekhorst J, van Kranenburg R, Molenaar D, Kuipers OP, Leer

R, Tarchini R, Peters SA, Sandbrink HM, Fiers MWEJ, Stiekema W, Lankhorst

RMK, Bron PA, Hoffer SM, Groot MNN, Kerkhoven R, de Vries M, Ursing B, de

Vos WM, Siezen RJ. (2004). Complete genome sequence of Lactobacillus

plantarum WCFS1. Proceed Nat Acad Sci USA 100:1990–5.

Kratochivil, J., & Holas, J. (1983) Study of proteolytic processes Rye sour.

Developments in food science, Vol. 5B. Oxford: Elsevier (pp. 791-798).

Lavermicocca, P., Valerio, F., Evidente, A., Lazzaroni, S., Corsetti, A. and Gobbetti,

M. (2000). Purification and characterization of novel antifungal compounds by

sourdough Lactobacillus plantarum 21B. Applied and Environmental

Microbiology, 66: 4084-4090.

Legan GD. (1993). Mould spoilage of bread: the problems and some solutions. Intern

Biodeter Biodegradation 32:33–53.

Đồ án tốt nghiệp

Liu M, Nauta A, Francke C, Siezen RJ. (2008). Comparative genomics of enzymes in

flavor-forming pathways from amino acids in lactic acid bacteria. Appl Environ

Microbiol 74:4590–600.

Lund, B., Hansen, A˚., & Lewis, M. J. (1989). The influence of dough yield on

acidification and production of volatiles in sourdoughs. LWT-Food Science and

Technology, 22, 150-153.

Magnusson, J. and J. Schnurer. (2001). Lactobacillus coryniformis subsp.

coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal

compound. Appl Environ Microbiol 67(1):1-5.

Magnusson, J. (2003). Antifungal activity of lactic acid bacteria. Page 397 in Agraria

Vol. PhD thesis. Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Sweden.

Magnusson, J., K. Strom, S. Roos, J. Sjogren, and J. Schnurer. 2003. Broad and

complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria.

Fems Microbiology Letters 219(1):129-135.

Makarova K, Slesarev A, Wolf Y, Sorokin A, Mirkin B, Koonin

E. (2006). Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceed Nat Acad

Sci USA 103:15611–6.

Metzger, B. (2008). Aspergillus niger. In Mushroom Observer. Retrieved January 28,

2014, from

http://mushroomobserver.org/name/show_name/15030?_js=on&_new=true

Muhialdin, B. J., &Hassan, Z. (2011). Screening of Lactic Acid Bacteria for

Antifungal Activity against Aspergillus oryzae. American Journal of Applied

Sciences, 8(5), 447.

Niku-Paavola, M. L., A. Laitila, T. Mattila-Sandholm, and A. Haikara. (1999). New

types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum. Journal

of Applied Microbiology 86(1):29-35.

Onno, B., & Rouseel, P. (1994). Technologie et microbiologie de le panification au

levain. In H. De Roissart, & F. M. Luquet (Eds.), Bacteries lactiques, Vol. 2 (pp.

293-321). France: Lorica Uriage.

Đồ án tốt nghiệp

Ottogalli G, Galli A, Foschino R. (1996). Italian bakery products obtained with

sourdough: characterization of the typical microflora. Adv Food Sci 18:131–44.

Oura, E., Soumalainen, H., & Wiskari, R. (1982). Sourdough. In A. H. Rose (Ed.),

Fermented foods (pp. 123-146). London: Academic Press.

Parker, J. K., Hassell, G. M., Mottram, D. S., & Guy, R. C. (2000). Sensory and

instrumental analyses of volatile generated during the extrusion cooking of oat

flour. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 3497-3506.

Ryan LAM, Dal Bello F, Arendt EK. 2008. The use of sourdough fermented by

antifungal LAB to reduce the amount of calcium propionate in bread. Intl J Food

Microbiol 125:274–8.

Ro¨cken, W., & Voysey, P. A. (1995). Sourdough fermentation in breadmaking.

Journal of Applied Bacteriology (Symposium Supplement), 79, 38S-48S.

Rothe, M. (1974). Aroma in bread (in German). Berlin: Akademie.

Rothe, M., & Ruttloff, H. (1983). Aroma retention in modern bread production. Die

Nahrung, 27, 505-512.

Roy, U., V. K. Batish, S. Grover, and S. Neelakantan. (1996). Production of

antifungal substance by Lactococcus lactis subsp. lactis CHD-28.3. International

Journal of Food Microbiology 32(1-2):27-34.

Rupesh S. Chavan, Shraddha R. Chavan (2011). Sourdough Technology—A

Traditional Way for Wholesome Foods: A Review. First published: 6 April 2011.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2011.00148.x/full

Salim-ur-Rehman, Alistair Paterson and John R. Piggott (2006). Flavour in

sourdough breads: a review. Trends in Food Science & Technology 17 (2006)

557-566.

Sathe, S. J., Nawani, N. N., Dhakephalkar, P. K., & Kapadnis, B. P. (2007).

Antifungal lactic acid bacteria with potential to prolong shelf-life of fresh

vegetables. Journal of applied microbiology, 103(6), 2622-2628.

Spicher, G. (1983). Baked goods. In J. H. Rehm, & G. Reed (Eds.), Biotechnology

(pp. 1-80). Weinheim: Verlag Chemie.

Đồ án tốt nghiệp

Sjogren, J., J. Magnusson, A. Broberg, J. Schnurer, and L. Kenne. (2003). Antifungal

3-Hydroxy Fatty Acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14. Appl. Environ.

Microbiol. 69(12):7554-7557.

Stiles, M. E. (1996). Biopreservation by lactic acid bacteria. Antonie van

Leeuwenhoek, 70, 331–345.

Stolz, P., Bo¨cker, G., Vogel, R. F., & Hammes, W. P. (1993). Utilization of maltose

and glucose by lactobacilli isolated from sourdough. FEMS Microbiology

Letters, 109, 237-242.

Vogel, R. F., Knorr, R., Mu¨ller, M. R. A., Steudel, U., Ga¨nzle, M. G., & Ehrmann,

M. A. (1999). Non-dairy lactic acid fermentations: the cereal world. Antonie van

Leeuwenhoek, 76, 403-411.

Vogel RF, Ehrmann MA, Gänzle MG. (2002). Development and potential of starter

lactobacilli resulting from exploration of the sourdough ecosystem. Antonie van

Leeuwenhoek 81:631–38.

Vuyst, L. D., & Neysens, P. (2005). The sourdough microflora: biodiversity and

metabolic interactions. Trends in Food Science & Technology, 16, 43-56.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC THÀNH PHẨN MÔI TRƯỜNG

- Thành phần môi trường PDA: (Potato Dextrose Agar):

 Khoai tây 200g

 D-Glucose 20g

 Agar 1%

 Nước cất 1000ml

- Thành phần môi trường MRS agar:

 Tween 80 1ml

 Cao thịt 10g

 Pepton 5g

 Yest Extract 5g

 D-glucose 10g

 Diamonium Citrate 2g

 MgSO4.7H2O 0.2g

 MgSO4.4H2O 0.2g

 K2PO4 2g

 Nước cất 1000ml

2%  Agar

- Thành phần môi trường MRS Broth:

 Tween 80 1ml

 Cao thịt 10g

 Pepton 5g

 Yest Extract 5g

 D-glucose 10g

 Diamonium Citrate 2g

 MgSO4.7H2O 0.2g

 MgSO4.4H2O 0.2g

Đồ án tốt nghiệp

 K2PO4 2g

 Nước cất 1000ml

- Thành phần môi trường MRS Cải tiến:

 Tween 80 1ml

 Cao thịt 10g

 Pepton 5g

 Yest Extract 5g

 D-glucose 10g

 MgSO4.7H2O 0.2g

 MgSO4.4H2O 0.2g

 K2PO4 2g

 Nước cất 1000ml

 Agar 2%

- Thành phần nước muối sinh lí 85%:

 NaCl 9g

 Tween 80 1ml

 Nước cất 1000ml

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC BẢNG MÃ HÓA MẪU THỬ CẢM QUAN

Bảng 1: Bảng mã hoá trật tự và trình bày mẫu BML5

Người

Trật tự

Mã hóa

Người

Trật tự

Mã hóa

thử

mẫu

thử

mẫu

A - B - C

219 – 251 – 485

B - C - A

089 – 801 – 579

B - C - A

619 – 930 – 655

C - B - A

877 – 598 – 700

C - A - B

812 – 875 – 329

A - C - B

678 – 763 – 560

C - B - A

426 – 043 – 556

B - A - C

983 – 393 – 144

A - C - B

640 – 687 – 005

B - C - A

601 – 987 – 266

B - A - C

866 – 677 – 945

C - A - B

720 – 234 – 591

C - A - B

724 – 215 – 462

A - B - C

365 – 175 – 602

A - B - C

322 – 345 – 301

B - C - A

114 – 345 – 299

B - A - C

278 – 935 – 618

C - A - B

882 – 566 – 786

C - B - A

880 – 994 – 558

C - B – A

494 – 501 – 069

A - C - B

254 – 354 – 174

A - C - B

855 – 478 – 355

A - B - C

431 – 117 – 102

B - A - C

021 – 772 – 248

B - C - A

526 – 373 – 669

C - A - B

146 – 917 – 966

C - B - A

163 – 942 – 446

A - B - C

255 – 459 – 054

A - C - B

453 – 169 – 045

B - A - C

481 – 669 – 684

B - A - C

671 – 123 – 150

C - B - A

298 – 341 – 149

B - C - A

877 – 377 – 947

A - C - B

634 – 045 – 251

C - A - B

693 – 988 – 671

A - B - C

207 – 933 – 071

A - B - C

643 – 190 – 137

B - C - A

166 – 659 – 769

B - C - A

646 – 840 – 611

C - B - A

293 – 303 – 739

C - A - B

100 – 776 – 187

A - C - B

806 – 494 – 957

C - B - A

823 – 552 – 159

B - A - C

579 – 877 – 867

A - C - B

641 – 513 – 247

B - C - A

046 – 023 – 359

B - A - C

703 – 538 – 375

C - A - B

137 – 746 – 249

C - A - B

581 – 776 – 879

A - B - C

095 – 606 – 721

A - B - C

546 – 791 – 418

B - C - A

024 – 978 – 577

B - A - C

265 – 528 – 599

C - A - B

364 – 942 – 306

C - B - A

580 – 160 – 171

C - B - A

748 – 304 – 041

A - C - B

561 – 862 – 953

A - C – B

131 – 219 – 448

A - B - C

441 – 617 – 267

B - A - C

967 – 703 – 168

Đồ án tốt nghiệp

Với

 Mẫu A: Bánh mì bổ sung Lactobacillus sp. L5 mật độ 1010

 Mẫu B : Bánh mì bổ sung Lactobacillus sp. L5 mật độ 109

 Mẫu C: Bánh mì bổ sung Lactobacillus sp. L5 mật độ 108

Bảng 2: Bảng mã hoá trật tự và trình bày mẫu BMC1

Người

Trật tự

Mã hóa

Người

Trật tự

Mã hóa

thử

mẫu

thử

mẫu

A - B - C

434 – 919 – 987

B - C - A

444 – 671 – 401

B - C - A

846 – 543 – 033

C - B - A

218 – 022 – 448

C - A - B

669 – 003 – 300

A - C - B

965 – 809 – 507

C - B - A

679 – 964 – 202

B - A - C

499 – 399 – 686

A - C - B

201 – 136 – 575

B - C - A

954 – 261 – 217

B - A - C

770 – 916 – 196

C - A - B

666 – 957 – 849

C - A - B

162 – 116 – 864

A - B - C

418 – 639 – 994

A - B - C

035 – 070 – 327

B - C - A

012 – 453 – 696

B - A - C

005 – 863 – 877

C - A - B

712 – 981 – 492

C - B - A

400 – 200 – 794

C - B – A

925 – 990 – 365

A - C - B

287 – 366 – 052

A - C - B

257 – 520 – 512

A - B - C

614 – 920 – 410

B - A - C

866 – 227 – 844

B - C - A

461 – 331 – 443

C - A - B

895 – 851 – 922

C - B - A

019 – 542 – 111

A - B - C

867 – 662 – 019

A - C - B

292 – 424 – 591

B - A - C

639 – 874 – 660

B - A - C

140 – 567 – 357

C - B - A

441 – 536 – 917

B - C - A

537 – 911 – 426

A - C - B

853 – 808 – 652

C - A - B

412 – 439 – 555

A - B - C

489 – 557 – 464

A - B - C

284 – 491 – 722

B - C - A

689 – 796 – 589

B - C - A

664 – 358 – 615

C - B - A

900 – 703 – 789

C - A - B

013 – 289 – 371

A - C - B

497 – 734 – 358

C - B - A

204 – 347 – 347

B - A - C

563 – 076 – 616

A - C - B

484 – 272 – 553

B - C - A

210 – 106 – 672

B - A - C

512 – 766 – 114

C - A - B

314 – 512 – 363

C - A - B

827 – 718 – 723

A - B - C

335 – 588 – 905

A - B - C

825 – 684 – 772

B - C - A

027 – 973 – 989

B - A - C

961 – 341 – 015

C - A - B

086 – 346 – 315

C - B - A

053 – 016 – 203

C - B - A

583 – 905 – 030

A - C - B

249 – 350 – 242

A - C – B

973 – 987 – 050

A - B - C

103 – 883 – 606

B - A - C

344 – 208 – 838

Đồ án tốt nghiệp

Với

 Mẫu A : Bánh mì bổ sung Lactobacillus sp. C1 mật độ 1010

 Mẫu B : Bánh mì bổ sung Lactobacillus sp. C1 mật độ 109

 Mẫu C : Bánh mì bổ sung Lactobacillus sp. C1 mật độ 108

Bàng 3: Bảng mã hoá trật tự và trình bày mẫu

Người thử

Trật tự mẫu

Mã hóa

A - B – E – C – D

453 – 321 – 921 – 426 – 740

B - C – A – D – E

758 – 443 – 692 – 537 – 053

C - D – B – E – A

719 – 883 – 923 – 577 – 086

D - E – C – A – B

887 – 840 – 437 – 902 – 079

E – A – D – B – C

662 – 203 – 167 – 510 – 143

D – C – E – B – A

396 – 890 – 968 – 107 – 356

E – D – A – C – B

869 – 619 – 026 – 630 – 307

A – C – B – D – E

790 – 004 – 710 – 772 – 215

B – A – C – E – D

583 – 272 – 303 – 648 – 653

C – B – D – A – E

479 – 877 – 255 – 279 – 515

A - B – E – C – D

423 – 352 – 950 – 750 – 489

B - C – A – D – E

023 – 460 – 767 – 330 – 139

C - D – B – E – A

936 – 882 – 778 – 408 – 250

D - E – C – A – B

826 – 912 – 636 – 958 – 907

E – A – D – B – C

569 – 748 – 718 – 275 – 647

D – C – E – B – A

781 – 406 – 554 – 852 – 417

E – D – A – C – B

445 – 420 – 257 – 523 – 448

A – C – B – D – E

926 – 148 – 264 – 486 – 923

B – A – C – E – D

348 – 376 – 242 – 422 – 469

C – B – D – A – E

757 – 819 – 113 – 671 – 528

A - B – E – C – D

282 – 969 – 955 – 116 – 925

B - C – A – D – E

013 – 320 – 188 – 317 – 493

C - D – B – E – A

652 – 059 – 601 – 541 – 674

D - E – C – A – B

223 – 382 – 817 – 067 – 415

E – A – D – B – C

236 – 691 – 452 – 276 – 503

D – C – E – B – A

597 – 651 – 024 – 852 – 992

E – D – A – C – B

798 – 690 – 676 – 106 – 802

A – C – B – D – E

376 – 935 – 610 – 179 – 392

B – A – C – E – D

805 – 697 – 552 – 190 – 112

C – B – D – A – E

053 – 721 – 276 – 238 – 028

A - B – E – C – D

531 – 956 – 570 – 702 – 693

B - C – A – D – E

830 – 327 – 858 – 657 – 039

C - D – B – E – A

748 – 682 – 647 – 415 – 970

D - E – C – A – B

824 – 446 – 454 – 516 – 159

E – A – D – B – C

384 – 538 – 153 – 519 – 829

D – C – E – B – A

862 – 726 – 403 – 436 – 941

E – D – A – C – B

642 – 171 – 592 – 651 – 895

A – C – B – D – E

019 – 028 – 632 – 803 – 476

B – A – C – E – D

345 – 118 – 889 – 715 – 436

C – B – D – A – E

292 – 014 – 442 – 325 – 411

A - B – E – C – D

843 – 508 – 203 – 461 – 814

B - C – A – D – E

223 – 208 – 387 – 618 – 952

Đồ án tốt nghiệp

C - D – B – E – A

769 – 074 – 995 – 797 – 539

D - E – C – A – B

475 – 349 – 125 – 809 – 251

E – A – D – B – C

354 – 061 – 808 – 661 – 694

D – C – E – B – A

306 – 059 – 213 – 036 – 708

E – D – A – C – B

098 – 879 – 687 – 262 – 968

A – C – B – D – E

734 – 797 – 796 – 813 – 245

B – A – C – E – D

876 – 814 – 008 – 893 – 029

C – B – D – A – E

269 – 807 – 926 – 958 – 153

A - B – E – C – D

634 – 175 – 675 – 206 – 715

B - C – A – D – E

046 – 891 – 123 – 177 – 086

C - D – B – E – A

425 – 059 – 905 – 190 – 559

D - E – C – A – B

081 – 624 – 152 – 634 – 349

E – A – D – B – C

590 – 662 – 704 – 862 – 581

D – C – E – B – A

224 – 828 – 998 – 491 – 312

E – D – A – C – B

413 – 306 – 122 – 898 – 016

A – C – B – D – E

146 – 257 – 075 – 263 – 032

B – A – C – E – D

432 – 522 – 621 – 396 – 616

C – B – D – A – E

035 – 973 – 227 – 081 – 313

Đồ án tốt nghiệp

Với:

 Mẫu A: Bánh mì bổ sung Lactobacillus sp. L5.

 Mẫu B : Bánh mì bổ sung Lactobacillus sp. C1.

 Mẫu C: Bánh mì bổ sung Natri benzoat.

 Mẫu D: Bánh mì bổ sung Canxi propionate.

 Mẫu E: Bánh mì bình thường không bổ sung vi khuẩn lactic.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC KẾT QUẢ

XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN

 Lactobacillus spp.

Đo 𝑂𝐷600𝑛𝑚 9 ống nghiệm pha loãng theo hệ số 2𝑛, ta chọn các giá trị từ OD

≈ 0.4 và thu được dãy kết quả:

Định lượng VSV bằng phương pháp trang đĩa ở 3 nồng độ, mỗi mật độ tương

ứng với 3 đĩa, ta thu được kết quả đếm khuẩn lạc:

Bảng 1: Kết quả đếm khuẩn lạc Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1

Chủng Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1

𝟏𝟎−𝟖 𝟏𝟎−𝟗 𝟏𝟎−𝟔 𝟏𝟎−𝟕 𝟏𝟎−𝟒 𝟏𝟎−𝟓 Nồng độ

217 57 5 250 31 10 Đĩa 1

201 64 6 250 29 14 Đĩa 2

209 70 6 241 30 28 Đĩa 3

Từ kết quả, tính được số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu ban đầu:

+ Lactobacillus sp.L5

N = = 2,48 × 109(cfu/ml) = x 217+201+209+57+64+70 (3+0,1 𝑥 3) 𝑥 10−7

+ Lactobacillus sp.C1

N = = 2,52 × 106(cfu/ml) = x 250+250+241+31+29+30 (3+0,1 𝑥 3) 𝑥 10−4

Tổng hợp cả số liệu đo 𝑂𝐷600𝑛𝑚 và số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu ban đầu.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2: Số liệu dựng đường chuẩn Lactobacillus sp.L5

Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1

x logx OD600nm n x logx OD600nm n

154924242 8.190 0.382 629545.45 5.799 0.396 16 4

77462121 7.889 0.207 314772.73 5.498 0.222 32 8

38731061 7.588 0.130 0.121 64 16 157386.36 5.197

7.287 0.072 0.060 128 19365530 32 78693.182 4.896

0.031 0.017 256 9682765.2 6.986 64 39346.591 4.595

 Aspergillus niger

Dùng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu định lượng số

lượng tế bào nấm mốc ta thu được kết quả:

= 613.25 (𝑡𝑏) 𝐵𝑇𝐵1 = 624 + 663 + 672 + 539 4

= 500 (𝑡𝑏) 𝐵𝑇𝐵2 = 532 + 315 + 373 + 780 4

= 776.75 (𝑡𝑏) 𝐵𝑇𝐵3 = 652 + 839 + 800 + 816 4

𝑡𝑏

630 𝑥 1000

= 630 (𝑡𝑏) ⇒ 𝐵𝑇𝐵 = 613.25 + 500 + 776.75 3

𝑚𝑙

1 𝑥 0.1

Khi đó: 𝑆ố 𝑇𝐵 ( ) = 𝑥 5 = 3.15 × 107(𝑡𝑏/𝑚𝑙)

Tổng hợp cùng số liệu đo OD:

Bảng 3: Số liệu dựng đường chuẩn nấm mốc Aspergillus niger

2n x logx OD

8 3937500 6.595 0.371

16 1968750 6.294 0.191

32 984375 5.993 0.107

64 492187.5 5.692 0.062

128 246093.8 5.391 0.005

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC HÌNH

HÌNH THÁI KHUẨN LẠC, TẾ BÀO – ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA

B A

Hình 1: Hình thái khuẩn lạc trên MRS agar

A: Lactobacillus sp.L5 – B: Lactobacillus sp.C1

B A

Hình 2: Kết quả nhuộm Gram

A: Lactobacillus sp.L5 – B: Lactobacillus sp.C1

Đồ án tốt nghiệp

A

B

Hình 3: Kết quả nhuộm bào tử

A: Lactobacillus sp.L5 – B: Lactobacillus sp.C1

Hình 4: Kết quả thử Catalase

Đồ án tốt nghiệp

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM A.NIGER CỦA VI KHUẨN

LAB KHI ĐỒNG LÊN MEN BÁNH MÌ VỚI NẤM MEN

Hình 5: Mẫu BML5 không cảm nhiễm nấm

Hình 6: Mẫu BMC1 không cảm nhiễm nấm

Đồ án tốt nghiệp

Hình 7: Mẫu BMNa, BMCa, BMTL không cảm nhiễm nấm

Hình 8: Mẫu BML5 cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 104 (bt/ml)

Đồ án tốt nghiệp

Hình 9: Mẫu BMC1 cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 104 (bt/ml)

Hình 10: Mẫu BMNa, BMCa, BMTL cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 104 (bt/ml)

Đồ án tốt nghiệp

Hình 11: Mẫu BML5 cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 105 (bt/ml)

Hình 12: Mẫu BML5 cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 105 (bt/ml)

Đồ án tốt nghiệp

Hình 13: Mẫu BMNa, BMCa, BMTL cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 105 (bt/ml)

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU

KHẢ NĂNG SINH ACID DO ACID

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class

Levels Values

CHUNG

2 C1 L5

Number of Observations Read 6

Number of Observations Used 6

DO ACID

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DOACID

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

0.00714150 0.00714150

24.89 0.0075

Error

0.00114750 0.00028688

Corrected Total 5

0.00828900

R-Square Coeff Var

Root MSE DOACID Mean

0.861564 0.944903

0.016937

1.792500

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

CHUNG

1 0.00714150 0.00714150

24.89 0.0075

DO ACID

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DOACID

Note:

This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.000287

Critical Value of t

2.77645

Least Significant Difference 0.0384

with

same

the

letter

Means are not significantly different.

t Grouping

Mean

N CHUNG

1.82700

3 L5

1.75800

3 C1

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class

Levels Values

CHUNG

2 C1 L5

Number of Observations Read 18

Number of Observations Used 18

TY LE DOI KHANG

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: TYLEDK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

125.378270 125.378270

0.87 0.3650

Error

2307.417024 144.213564

Corrected Total 17

2432.795294

R-Square Coeff Var

Root MSE TYLEDK Mean

0.051537 19.21242

12.00890

62.50588

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

Source

1 125.3782699 125.3782699

0.87 0.3650

CHUNG

TY LE DOI KHANG

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TYLEDK

Note:

This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

144.2136

Critical Value of t

2.11991

Least Significant Difference 12.001

with

same

the

letter

Means are not significantly different.

t Grouping

Mean

N CHUNG

65.145

9 L5

59.867

9 C1

ĐỐI KHÁNG INVITRO (CẤY 2 ĐƯỜNG VI KHUẨN) TY LE DOI KHANG

Đồ án tốt nghiệp

SO NGAY NHIEM NAM MAT DO MUOI MU BON

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class

Levels Values

9 BMC1-10 BMC1-8 BMC1-9 BMCa BML5-10 BML5-8 BML5-9

MAU

BMNa BMTL

Number of Observations Read

Number of Observations Used 27

SO NGAY NHIEM NAM MAT DO MUOI MU BON

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: SONGAYNHIEM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

9.51851852 1.18981481

8.57 <.0001

Error

2.50000000 0.13888889

Corrected Total 26

12.01851852

R-Square

Coeff Var

Root MSE

SONGAYNHIEM Mean

0.791988

8.455719

0.372678

4.407407

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

8 9.51851852 1.18981481

8.57 <.0001

SO NGAY NHIEM NAM MAT DO MUOI MU BON

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for SONGAYNHIEM

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.138889

Number of Means

Critical Range .8759 .9136 .9384 .9564 .9701 .9810 .9899 .9973

ĐỐI KHÁNG INVIVO Mật độ nấm 104

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N MAU

5.3333 3 BMC1-9

5.1667 3 BMC1-8

4.8333 3 BML5-8

4.6667 3 BMCa

4.3333 3 BMC1-10

4.1667 3 BML5-9

3.8333 3 BML5-10

3.6667 3 BMNa

3.6667 3 BMTL

Đồ án tốt nghiệp

SO NGAY NHIEM NAM MUOI MU NAM

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class

Levels Values

MAU

9 BMC1-10 BMC1-8 BMC1-9 BMCa BML5-10 BML5-8 BML5-9

BMNa BMTL

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

SO NGAY NHIEM NAM MUOI MU NAM

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: SONGAYNHIEM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

6.50000000 0.81250000

4.62 0.0034

Error

3.16666667 0.17592593

Corrected Total 26

9.66666667

Mật độ nấm 105

R-Square

Coeff Var

Root MSE

SONGAYNHIEM Mean

0.672414

10.34224

0.419435

4.055556

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

8 6.50000000 0.81250000

4.62 0.0034

SO NGAY NHIEM NAM MUOI MU NAM

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for SONGAYNHIEM

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.175926

Number of Means

Critical Range 0.986 1.028 1.056 1.076 1.092 1.104 1.114 1.122

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N MAU

5.0000 3 BMC1-9

4.5000 3 BMC1-8

4.5000 3 BML5-8

4.1667 3 BMCa

3.8333 3 BMC1-10

3.8333 3 BML5-9

3.6667 3 BML5-10

3.5000 3 BMNa

3.5000 3 BMTL

Đồ án tốt nghiệp

SO NGAY NHIEM NAM KHONG CAM NHIEM

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

MAU

9 BMC1-10 BMC1-8 BMC1-9 BMCa BML5-10 BML5-8 BML5-9 BMNa BMTL

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

SO NGAY NHIEM NAM KHONG CAM NHIEM

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: SONGAYNHIEM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

31.40740741 3.92592593

2.02 0.1029

Error

35.00000000 1.94444444

Corrected Total 26

66.40740741

R-Square

Coeff Var

Root MSE

SONGAYNHIEM Mean

0.472950

18.23230

1.394433

7.648148

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

8 31.40740741 3.92592593

2.02 0.1029

SO NGAY NHIEM NAM KHONG CAM NHIEM

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for SONGAYNHIEM

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

1.944444

Number of Means

Critical Range 2.392 2.510 2.584 2.635 2.673 2.702 2.724 2.741

Không cảm nhiễm

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N MAU

10.000 3 BMCa

8.000 3 BMC1-9

7.833 3 BMNa

7.667 3 BMC1-10

7.500 3 BML5-10

7.500 3 BML5-8

7.500 3 BML5-9

7.333 3 BMC1-8

5.500 3 BMTL

Đồ án tốt nghiệp

ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN

DIEM SO CAM QUAN BML5

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class

Levels Values

MAU

3 A B C

Number of Observations Read 180

Number of Observations Used 180

Mức độ ưa thích giữa các mật độ của các chủng Lactobacillus sp.L5

DIEM SO CAM QUAN BML5

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DIEM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

15.1000000

7.5500000

2.97 0.0537

Error

177

449.4500000

2.5392655

Corrected Total 179

464.5500000

R-Square Coeff Var

Root MSE DIEM Mean

0.032505 30.16102

1.593507 5.283333

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 15.10000000 7.55000000

2.97 0.0537

DIEM SO CAM QUAN BML5

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DIEM Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

177

Error Mean Square

2.539266

Critical Value of Studentized Range

3.34263

Minimum Significant Difference

0.6876

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean

N MAU

5.6667

60 B

5.2167

60 C

4.9667

60 A

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class

Levels Values

MAU

3 A B C

Lactobacillus sp.C1 DIEM SO CAM QUAN BMC1

Number of Observations Read 180 Number of Observations Used 180

DIEM SO CAM QUAN BMC1

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DIEM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

149.3777778 74.6888889

43.69 <.0001

Error

177

302.6000000

1.7096045

Corrected Total 179

451.9777778

R-Square Coeff Var

Root MSE DIEM Mean

0.330498 21.83240

1.307518 5.988889

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 149.3777778 74.6888889

43.69 <.0001

DIEM SO CAM QUAN BMC1

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DIEM Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

177

Error Mean Square

1.709605

Critical Value of Studentized Range 4.17386

Minimum Significant Difference

0.7045

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean

N MAU

6.8667 60 C

6.3667 60 B

4.7333 60 A

Đồ án tốt nghiệp

MAU SAC

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class

Levels Values

MAU

5 A B C D E

Number of Observations Read

300

Number of Observations Used 300

MAU SAC

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DIEM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

23.4466667

5.8616667

3.04 0.0177

Error

295

568.9000000

1.9284746

Corrected Total 299

592.3466667

R-Square Coeff Var

Root MSE DIEM Mean

0.039583 21.21225

1.388695 6.546667

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

4 23.44666667 5.86166667

3.04 0.0177

MAU SAC

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DIEM

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

295

Error Mean Square

1.928475

Critical Value of t

2.59260

Least Significant Difference

0.6573

Mức độ ưa thích giữa các mẫu bánh mì Màu sắc

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean N MAU

7.0000 60 D

6.7500 60 E

6.3333 60 A

6.3333 60 B

6.3167 60 C

Đồ án tốt nghiệp

DO XOP

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class

Levels Values

MAU

5 A B C D E

Number of Observations Read

300

Number of Observations Used 300

DO XOP

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DIEM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

26.0133333

6.5033333

4.03 0.0034

Error

295

475.7833333

1.6128249

Corrected Total 299

501.7966667

R-Square Coeff Var

Root MSE DIEM Mean

0.051840 19.73025

1.269970 6.436667

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

4 26.01333333 6.50333333

4.03 0.0034

Độ xốp

DO XOP

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DIEM

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

295

Error Mean Square

1.612825

Critical Value of t

2.59260

Least Significant Difference

0.6011

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean N MAU

6.9000 60 D

6.6333 60 A

6.3167 60 E

6.2667 60 B

6.0667 60 C

Đồ án tốt nghiệp

MUI

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class

Levels Values

MAU

5 A B C D E

Number of Observations Read

300

Number of Observations Used 300

MUI

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DIEM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

44.4533333 11.1133333

6.21 <.0001

Error

295

527.5833333

1.7884181

Corrected Total 299

572.0366667

Mùi

R-Square Coeff Var

Root MSE DIEM Mean

0.077711 20.75506

1.337317 6.443333

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

4 44.45333333 11.11333333

6.21 <.0001

MUI

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DIEM

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

295

Error Mean Square

1.788418

Critical Value of t

2.59260

Least Significant Difference

0.633

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean

N MAU

6.7167 60 A

6.6833 60 D

6.5833 60 B

6.5500 60 E

5.6833 60 C

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class

Levels Values

MAU

5 A B C D E

Number of Observations Read

300

Number of Observations Used 300

Vị

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DIEM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

98.0466667 24.5116667

14.95 <.0001

Error

295

483.7500000

1.6398305

Corrected Total 299

581.7966667

R-Square Coeff Var

Root MSE DIEM Mean

0.168524 19.89475

1.280559 6.436667

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

4 98.04666667 24.51166667

14.95 <.0001

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DIEM

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

295

Error Mean Square

1.639831

Critical Value of t

2.59260

Least Significant Difference

0.6061

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean N MAU

6.9167 60 D

6.9000 60 E

6.6833 60 A

6.3000 60 B

5.3833 60 C

Đồ án tốt nghiệp

DANH GIA CHUNG

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

MAU

5 A B C D E

Number of Observations Read 300

Number of Observations Used 300

DANH GIA CHUNG

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DIEM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

77.5133333 19.3783333

13.15 <.0001

Error

295

434.8166667

1.4739548

Corrected Total 299

512.3300000

R-Square Coeff Var

Root MSE DIEM Mean

0.151296 19.17955

1.214065 6.330000

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

Source

4 77.51333333 19.37833333

13.15 <.0001

MAU

DANH GIA CHUNG

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DIEM

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

295

Error Mean Square

1.473955

Critical Value of t

2.59260

Least Significant Difference

0.5747

Đánh giá chung

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean N MAU

6.8833 60 D

6.8500 60 A

6.3000 60 B

6.1000 60 E

5.5167 60 C

Đồ án tốt nghiệp

KHẢO SÁT ĐỘ NỞ Sau khi ủ

Lactobacillus sp.L5

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Levels Values

Class

MAU

3 BML5-10 BML5-8 BML5-9

Number of Observations Read

Number of Observations Used

DO NO SAU U BML5 NGANG

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

0.06222222 0.03111111

1.22 0.3599

Error

0.15333333 0.02555556

Corrected Total 8

0.21555556

R-Square Coeff Var

Root MSE DONO Mean

0.288660 16.34943

0.159861 0.977778

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 0.06222222 0.03111111

1.22 0.3599

Bề ngang DO NO SAU U BML5 NGANG

DO NO SAU U BML5 NGANG

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DONO Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.025556

Critical Value of Studentized Range 4.33917

Minimum Significant Difference

0.4005

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N MAU

1.0667 3 BML5-9

1.0000 3 BML5-8

0.8667 3 BML5-10

Đồ án tốt nghiệp

DO NO SAU U BML5 CAO

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Levels Values

Class

MAU

3 BML5-10 BML5-8 BML5-9

Number of Observations Read

Number of Observations Used

DO NO SAU U BML5 CAO

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

0.06222222 0.03111111

1.47 0.3016

Error

0.12666667 0.02111111

Corrected Total 8

0.18888889

R-Square Coeff Var

Root MSE DONO Mean

0.329412 15.94719

0.145297 0.911111

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 0.06222222 0.03111111

1.47 0.3016

Chiều cao

DO NO SAU U BML5 CAO

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DONO Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.021111

Critical Value of Studentized Range 4.33917

Minimum Significant Difference

0.364

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N MAU

1.0000 3 BML5-10

0.9333 3 BML5-9

0.8000 3 BML5-8

Đồ án tốt nghiệp

Lactobacillus sp.C1

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

MAU

3 BMC1-10 BMC1-8 BMC1-9

Number of Observations Read Number of Observations Used

9 9

DO NO SAU U BMC1 NGANG

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

0.01555556 0.00777778

1.00 0.4219

Error

0.04666667 0.00777778

Corrected Total 8

0.06222222

R-Square Coeff Var Root MSE DONO Mean

0.250000 8.355004 0.088192 1.055556

Bề ngang DO NO SAU U BMC1 NGANG

Source DF MAU

Anova SS Mean Square F Value Pr > F 1.00 0.4219

0.00777778

2 0.01555556

DO NO SAU U BMC1 NGANG

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DONO Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.007778

Critical Value of Studentized Range 4.33917

Minimum Significant Difference

0.2209

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N MAU

1.10000 3 BMC1-9

1.06667 3 BMC1-8

1.00000 3 BMC1-10

Đồ án tốt nghiệp

DO NO SAU U BMC1 CAO

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Levels Values

Class

MAU

3 BMC1-10 BMC1-8 BMC1-9

Number of Observations Read

Number of Observations Used

DO NO SAU U BMC1 CAO

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

0.16222222 0.08111111

4.87 0.0555

Error

0.10000000 0.01666667

Corrected Total 8

0.26222222

Chiều cao

R-Square Coeff Var

Root MSE DONO Mean

0.618644 15.08955

0.129099 0.855556

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 0.16222222 0.08111111

4.87 0.0555

DO NO SAU U BMC1 CAO

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DONO Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.016667

Critical Value of Studentized Range 4.33917

Minimum Significant Difference

0.3234

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N MAU

0.9667 3 BMC1-9

0.9333 3 BMC1-10

0.6667 3 BMC1-8

Đồ án tốt nghiệp

DO NO SAU U NGANG

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Levels Values

Class

MAU

5 BMC1 BMCa BML5 BMNa BMTL

Number of Observations Read

Number of Observations Used

Các mẫu bánh mì Bề ngang

DO NO SAU U NGANG

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

2.38906667 0.59726667

36.75 <.0001

Error

0.16253333 0.01625333

Corrected Total 14

2.55160000

R-Square Coeff Var

Root MSE DONO Mean

0.936301 12.25852

0.127489 1.040000

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

4 2.38906667 0.59726667

36.75 <.0001

DO NO SAU U NGANG

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DONO

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.016253

Critical Value of t

3.16927

Least Significant Difference

0.3299

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean N MAU

1.6000 3 BMCa

1.2000 3 BMTL

1.0533 3 BMC1

0.9800 3 BML5

0.3667 3 BMNa

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Levels Values

Class

MAU

5 BMC1 BMCa BML5 BMNa BMTL

Number of Observations Read

Number of Observations Used

DO NO SAU U CAO

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

1.62176000 0.40544000

87.51 <.0001

Error

0.04633333 0.00463333

Corrected Total 14

1.66809333

R-Square Coeff Var

Root MSE DONO Mean

0.972224 8.294305

0.068069 0.820667

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

Source

4 1.62176000 0.40544000

87.51 <.0001

MAU

DO NO SAU U CAO

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DONO

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.004633

Critical Value of t

3.16927

Least Significant Difference

0.1761

Chiều cao DO NO SAU U CAO

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean N MAU

1.36667 3 BMTL

0.91333 3 BML5

0.85667 3 BMC1

0.53333 3 BMNa

0.43333 3 BMCa

Đồ án tốt nghiệp

Sau khi nướng Lactobacillus sp.L5

DO NO SAU NUONG BML5 NGANG

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

MAU

3 BML5-10 BML5-8 BML5-9

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

DO NO SAU NUONG BML5 NGANG

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

0.01555556 0.00777778

0.16 0.8534

Error

0.28666667 0.04777778

Corrected Total 8

0.30222222

R-Square Coeff Var Root MSE DONO Mean

0.051471 17.40913 0.218581 1.255556

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU

2 0.01555556 0.00777778

0.16 0.8534

Bề ngang

DO NO SAU NUONG BML5 NGANG

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DONO Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.047778

Critical Value of Studentized Range 4.33917

Minimum Significant Difference

0.5476

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N MAU

1.3000 3 BML5-8

1.2667 3 BML5-9

1.2000 3 BML5-10

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Levels Values

Class

MAU

3 BML5-10 BML5-8 BML5-9

Number of Observations Read

Number of Observations Used

DO NO SAU NUONG BML5 CAO

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

0.14000000 0.07000000

3.00 0.1250

Error

0.14000000 0.02333333

Corrected Total 8

0.28000000

R-Square Coeff Var

Root MSE DONO Mean

0.500000 13.47816

0.152753 1.133333

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 0.14000000 0.07000000

3.00 0.1250

Chiều cao DO NO SAU NUONG BML5 CAO

DO NO SAU NUONG BML5 CAO

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DONO Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.023333

Critical Value of Studentized Range 4.33917

Minimum Significant Difference

0.3827

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N MAU

1.2667 3 BML5-10

1.1667 3 BML5-9

0.9667 3 BML5-8

Đồ án tốt nghiệp

DO NO SAU NUONG BMC1 NGANG

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

MAU

3 BMC1-10 BMC1-8 BMC1-9

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

DO NO SAU NUONG BMC1 NGANG

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

0.02888889 0.01444444

1.86 0.2356

Error

0.04666667 0.00777778

Corrected Total 8

0.07555556

Lactobacillus sp.C1 Bề ngang

R-Square Coeff Var

Root MSE DONO Mean

0.382353 7.215685

0.088192 1.222222

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 0.02888889 0.01444444

1.86 0.2356

DO NO SAU NUONG BMC1 NGANG

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DONO Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.007778

Critical Value of Studentized Range 4.33917

Minimum Significant Difference

0.2209

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N MAU

1.30000 3 BMC1-9

1.20000 3 BMC1-8

1.16667 3 BMC1-10

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

MAU

3 BMC1-10 BMC1-8 BMC1-9

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

Chiều cao DO NO SAU NUONG BMC1 CAO

DO NO SAU NUONG BMC1 CAO

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

0.09555556 0.04777778

2.26 0.1852

Error

0.12666667 0.02111111

Corrected Total 8

0.22222222

R-Square Coeff Var

Root MSE DONO Mean

0.430000 12.69582

0.145297 1.144444

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 0.09555556 0.04777778

2.26 0.1852

DO NO SAU NUONG BMC1 CAO

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DONO Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.021111

Critical Value of Studentized Range 4.33917

Minimum Significant Difference

0.364

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N MAU

1.2333 3 BMC1-9

1.2000 3 BMC1-10

1.0000 3 BMC1-8

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

MAU

5 BMC1 BMCa BML5 BMNa BMTL

Các mẫu bánh mì Bề ngang DO NO SAU NUONG NGANG

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15

DO NO SAU NUONG NGANG

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

1.90266667 0.47566667

25.48 <.0001

Error

0.18666667 0.01866667

Corrected Total 14

2.08933333

R-Square Coeff Var

Root MSE DONO Mean

0.910657 9.948496

0.136626 1.373333

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

4 1.90266667 0.47566667

25.48 <.0001

DO NO SAU NUONG NGANG

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DONO

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.018667

Critical Value of t

3.16927

Least Significant Difference

0.3535

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean N MAU

2.0000 3 BMCa

1.4000 3 BMTL

1.3000 3 BMC1

1.2667 3 BML5

0.9000 3 BMNa

Đồ án tốt nghiệp

DO NO SAU NUONG CAO

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

MAU

5 BMC1 BMCa BML5 BMNa BMTL

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15

DO NO SAU NUONG CAO

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DONO

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

1.18266667 0.29566667

40.32 <.0001

Error

0.07333333 0.00733333

Corrected Total 14

1.25600000

R-Square Coeff Var Root MSE DONO Mean

0.941614 6.796419 0.085635 1.260000

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU

4 1.18266667 0.29566667

40.32 <.0001

DO NO SAU NUONG CAO

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DONO

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.007333

Critical Value of t

3.16927

Least Significant Difference

0.2216

Chiều cao

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean N MAU

1.60000 3 BMCa

1.50000 3 BMTL

1.23333 3 BMC1

1.16667 3 BML5

0.80000 3 BMNa

Đồ án tốt nghiệp

DO AM BML5 SAU NUONG

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Levels Values

Class

MAU

3 BML5-10 BML5-8 BML5-9

Number of Observations Read

Number of Observations Used

DO AM BML5 SAU NUONG

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DOAM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

2.00308889 1.00154444

0.39 0.6927

Error

15.38300000 2.56383333

Corrected Total 8

17.38608889

R-Square Coeff Var

Root MSE DOAM Mean

0.115212 6.492803

1.601197 24.66111

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 2.00308889 1.00154444

0.39 0.6927

KHẢO SÁT ĐỘ ẨM Độ ẩm sau khi nướng Lactobacillus sp.L5

DO AM BML5 SAU NUONG

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DOAM Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

2.563833

Critical Value of Studentized Range 4.33917

Minimum Significant Difference

4.0114

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N MAU

25.313 3 BML5-8

24.457 3 BML5-10

24.213 3 BML5-9

Đồ án tốt nghiệp

DO AM BMC1 SAU NUONG

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Levels Values

Class

MAU

3 BMC1-10 BMC1-8 BMC1-9

Number of Observations Read

Number of Observations Used

DO AM BMC1 SAU NUONG

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DOAM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

16.66775556 8.33387778

2.07 0.2073

Error

24.16726667 4.02787778

Corrected Total 8

40.83502222

R-Square Coeff Var

Root MSE DOAM Mean

0.408173 7.617821

2.006957 26.34556

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 16.66775556 8.33387778

2.07 0.2073

Lactobacillus sp.C1

DO AM BMC1 SAU NUONG

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DOAM Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

4.027878

Critical Value of Studentized Range 4.33917

Minimum Significant Difference

5.0279

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N MAU

28.210 3 BMC1-8

25.827 3 BMC1-10

25.000 3 BMC1-9

Đồ án tốt nghiệp

DO AM SAU KHI NUONG

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class

Levels Values

MAU

5 BMC1 BMCa BML5 BMNa BMTL

Number of Observations Read

Number of Observations Used

DO AM SAU KHI NUONG

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DOAM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

82.7792466 20.6948116

4.70 0.0215

Error

44.0282245

4.4028224

Corrected Total 14

126.8074711

R-Square Coeff Var

Root MSE DOAM Mean

0.652795 8.163672

2.098290 25.70278

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

4 82.77924657 20.69481164

4.70 0.0215

Các mẫu bánh mì

DO AM SAU KHI NUONG

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for DOAM

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

4.37277

Number of Means

Critical Range 3.587 3.764 3.875 3.952 4.009 4.051 4.084 4.110

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N MAU

28.737 3 BMCa

28.210 3 BMC1-8

26.973 3 BMNa

25.827 3 BMC1-10

25.313 3 BML5-8

25.000 3 BMC1-9

24.457 3 BML5-10

24.213 3 BML5-9

21.793 3 BMTL

Đồ án tốt nghiệp

LUONG DO AM BML5 GIAM SAU BAY NGAY

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Levels Values

Class

MAU

3 BML5-10 BML5-8 BML5-9

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

LUONG DO AM BML5 GIAM SAU BAY NGAY

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DOAM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

10.59095556 5.29547778

8.19 0.0193

Error

3.88140000 0.64690000

Corrected Total 8

14.47235556

R-Square Coeff Var

Root MSE DOAM Mean

0.731806 26.30345

0.804301 3.057778

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 10.59095556 5.29547778

8.19 0.0193

LUONG DO AM BML5 GIAM SAU BAY NGAY

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DOAM Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.6469

Critical Value of Studentized Range

4.33917

Minimum Significant Difference

2.015

Độ ẩm sau 7 ngày bảo quản Lactobacillus sp.L5

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean

N MAU

4.1933

3 BML5-9

3.3833

3 BML5-8

1.5967

3 BML5-10

Đồ án tốt nghiệp

LUONG DO AM BMC1 GIAM SAU BAY NGAY

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Levels Values

Class

MAU

3 BMC1-10 BMC1-8 BMC1-9

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

LUONG DO AM BMC1 GIAM SAU BAY NGAY

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DOAM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

19.76090979 9.88045489

24.79 0.0013

Error

2.39175287 0.39862548

Corrected Total 8

22.15266266

R-Square Coeff Var

Root MSE DOAM Mean

0.892033 15.71765

0.631368 4.016936

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

2 19.76090979 9.88045489

24.79 0.0013

LUONG DO AM BMC1 GIAM SAU BAY NGAY

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DOAM Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally

has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.398625

Critical Value of Studentized Range 6.33032

Minimum Significant Difference

2.3075

Lactobacillus sp.C1

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N MAU

5.2698 3 BMC1-10

4.8452 3 BMC1-8

1.9358 3 BMC1-9

Đồ án tốt nghiệp

LUONG DO AM GIAM SAU BAY NGAY

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Levels Values

Class

MAU

5 BMC1 BMCa BML5 BMNa BMTL

Number of Observations Read

Number of Observations Used

LUONG DO AM GIAM SAU BAY NGAY

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DOAM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

22.54079324 5.63519831

27.02 <.0001

Error

2.08560560 0.20856056

Corrected Total 14

24.62639885

R-Square Coeff Var

Root MSE DOAM Mean

0.915310 9.308147

0.456684 4.906286

Source

Anova SS Mean Square

F Value Pr > F

MAU

4 22.54079324 5.63519831

27.02 <.0001

LUONG DO AM GIAM SAU BAY NGAY

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for DOAM

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.453567

Các mẫu bánh mì

Number of Means

Critical Range 1.583 1.651 1.696 1.728 1.753 1.773 1.789 1.802

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N MAU

6.4578 3 BMTL

5.8137 3 BMNa

5.2698 3 BMC1-10

5.1845 3 BMCa

4.8452 3 BMC1-8

4.1954 3 BML5-9

3.3831 3 BML5-8

1.9358 3 BMC1-9

1.5967 3 BML5-10

Đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp: Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm sử dụng Lactobacillus spp. kết hợp nấm men trong lên men bánh mì nhằm kéo dài thời gian bảo quản bánh mì và cải thiện cảm quan sản phẩm. Mời các bạn cùng tham khảo.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS SPP.

PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN

TRUYỀN THỐNG ĐỂ KÉO DÀI

THỜI GIAN BẢO QUẢN BÁNH MÌ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TS. Nguyễn Hoài Hương

Nguyễn Thái Thiên Dung

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus ................................................................. 7

MỞ ĐẦU

Chương 1: TỔNG QUAN

- Giống:

Nguyên liệu

Nhào bột

Lên men ổn định sơ bộ

Chia bột

Vê bột

Tạo hình

Lên men kết thúc

Nướng

Làm nguội

Sản phẩm

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chuẩn độ

Pha loãng đến các mật độ 1010, 109, 108 (cfu/ml) Sau 24 giờ

x2

TH1: 104

TH3: không cảm nhiễm

TH2: 105

Chất bổ sung

L5 mật độ 1010(cfu/ml)

L5 mật độ 109(cfu/ml)

L5 mật độ 108(cfu/ml)

C1 mật độ 1010(cfu/ml)

C1 mật độ 109(cfu/ml)

C1 mật độ 108(cfu/ml)

Phiếu hướng dẫn

PHIẾU ĐÁNH GIÁ

Phiếu hướng dẫn

PHIẾU ĐÁNH GIÁ

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Lactobacillus sp.L5

Lactobacillus sp.C1

Khuẩn lạc trên

MRS agar

Mô tả hình thái

vi khuẩn

Nhuộm gram

Nhuộm bào tử

Catalase

TỶ LỆ ĐỐI KHÁNG NẤM

Đường chuẩn Lactobacillus sp.C1

Đường chuẩn Lactobacillus sp.L5

y = 0.3052x - 1.4226 R² = 0.9251

m n 0 0 6 D O

m n 0 0 6 D O

log cfu/ml

log cfu/ml

Đường chuẩn Aspergillus niger ĐN3

m n 0 2 6 D O

log tb/ml

Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1

OD600nm

log (cfupha loãng/ml)

cfu pha loãng/ml

cfu/ml

Mẫu

B Hình 3.8: Mẫu bánh mì bổ sung 2 chủng lactic chuẩn bị đánh giá cảm quan

A

B