Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HOÀNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HOÀNG THỊ GIANG

TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC

SƢƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA

KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng

Mã số: 62 62 01 11

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Nguyễn Quang Thạch

2. TS. Ramona Thieme

HÀ NỘI – 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên

cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn,

các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày… tháng… năm…

Tác giả luận án

Hoàng Thị Giang

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự

hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Quang Thạch – Viện Sinh học Nông nghiệp – Học Viện

Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian, tâm huyết và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Ramona Thieme, TS. Thilo

Hammann – Viện Nghiên cứu Chọn tạo Giống Cây trồng (Viện JKI)- CHLB Đức, là những ngƣời thầy đã tận tình luôn tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức

và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ

môn Di truyền và Chọn giống cây trồng, Khoa Nông học- Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Sinh học Nông

nghiệp, đặc biệt là các cán bộ Phòng Sinh học phân tử & Công nghệ vi sinh đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều

kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./.

Hà Nội, ngày... tháng... năm 20...

Nghiên cứu sinh

Hoàng Thị Giang

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình ix

Trích yếu luận án xi

Thesis abstract xiii

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

Tính cấp thiết của đề tài 1.1 1

Mục tiêu của đề tài 1.2 3

Phạm vi nghiên cứu 1.3 3

1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3

1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam 5

2.2 Nguồn gen khoai tây dại và tình hình khai khác nguồn gen khoai tây dại 7

2.2.1 Vai trò của nguồn gen kháng bệnh trên cây khoai tây 7

2.2.2 Tình hình khai thác nguồn gen kháng bệnh trong chọn tạo giống khoai tây 8

2.3 Cơ sở khoa học của phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 10

2.3.1 Tách tế bào trần 10

2.3.2 Nuôi cấy tế bào trần 11

2.3.3 Tái sinh tế bào trần 12

2.3.4 Dung hợp tế bào trần 13

2.3.5 Chọn lọc các con lai soma 14

2.4 Bệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây 15

2.4.1 Giới thiệu về bệnh mốc sƣơng 15

2.4.2 Đặc điểm xâm nhiễm của nấm P. infestans 17

2.4.3 Cơ sở phân tử của tính kháng bệnh mốc sƣơng do nấm P. infestans gây ra 18

iii

2.4.4 Các nghiên cứu về gen kháng bệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây 20

2.5 Các phƣơng pháp chọn tạo giống khoai tây 23

2.5.1 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp truyền thống 23

2.5.2 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp chuyển gen 23

2.5.3 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 24

PHẦN 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 30

3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 30

3.1.2 Thời gian nghiên cứu 30

3.2 Vật liệu nghiên cứu 30

3.2.1 Vật liệu thực vật 30

3.2.2 Hóa chất 31

3.2.3 Thiết bị 32

3.3 Nội dung nghiên cứu 32

3.3.1 Nội dung 1: Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại

với các giống khoai tây trồng 32

3.3.2 Nội dung 2: Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp xác định

độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 33

3.3.3 Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai

soma và các đặc tính nông sinh học 33

3.3.4 Nội dung 4: Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng

để tạo quần thể chọn lọc 34

3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 34

3.4.1 Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống

khoai tây trồng 34

3.4.2 Xác định con lai soma bằng đo độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị

phân tử SSR 38

3.4.3 Đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây

nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 39

3.4.4 Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần

thể chọn lọc 43

3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 44

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1 Kết quả 45

4.1.1 Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống

khoai tây trồng 45

4.1.2 Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây

trồng thu thập đƣợc 48

4.1.3 Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp 51

4.1.4 Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đo độ bội (Flow

cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 55

4.1.5 Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây

nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 58

4.1.6 Nghiên cứu tạo con lai trở lại giữa các con lai soma với các giống khoai

tây trồng 73

4.2 Thảo luận 84

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91

5.1 Kết luận 91

5.2 Kiến nghị 92

Danh mục các công trình công bố 93

Tài liệu tham khảo 94

Phụ lục 104

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

: 6-benzyl amino purine BA

: Backcross BC

CNSH : Công nghệ sinh học

: Công thức CT

: Coefficient of variation CV

DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich –

Enzyme linked imunosorbent assay

: Deoxyribonucleic acid DNA

: Enzyme – linked imunosorbent assay ELISA

: Food and Agriculture Organization FAO

: Gibberellic Acid GA3

: Indole-3-acetic acid IAA

: Julius Kuehn Institute JKI

KLCTB : Khối lƣợng củ trung bình

: Least significant difference LSD

: Murashige and Skoog MS

: Naphthaleneacetic acid NAA

: Năng suất lý thuyết NSLT

: Năng suất thực thu NSTT

: Optical density OD

: Polymerase chain reaction PCR

: Polyethylene glycol PEG

: Potato virus X PVX

: Potato virus Y PVY

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA

: Statistical Analysis Systems SAS

: Somatic hybrid SH

: Simple sequence repeat SSR

: Nhiệt độ gắn mồi Tm

: Ultra violet UV

DANH MỤC BẢNG

TT Tên bảng Trang

2.1 Năng suất và năng lƣợng của một số cây lƣơng thực ở các nƣớc đang

phát triển 5

2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới năm 2013 6

2.3 Tốp 10 quốc gia có sản lƣợng khoai tây lớn nhất thế giới 6

2.4 Diện tích, năng suất và sản lƣợng khoai tây của Việt Nam giai đoạn 2006

- 2013 7

2.5 Tổng kết về kết quả đánh giá tính kháng của các loài khoai tây dại chính

đối với một số loại sâu, bệnh hại trên cây khoai tây và chống chịu với các

điều kiện bất thuận của môi trƣờng 8

3.1 Các vật liệu đã thu thập, nguồn gốc, độ bội và các tính trạng mong muốn

phục vụ cho lai soma 31

3.2 Các mồi sử dụng để chọn lọc con lai 32

3.3 Các cặp mồi phát hiện gen kháng mốc sƣơng 32

4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ macerozym và cellulase trong dung dịch enzym

đến hiệu suất tách tế bào trần của các dòng/giống khoai tây thí nghiệm 45

4.2 Ảnh hƣởng của thời gian ủ của mô lá trong dung dịch enzym đến hiệu

suất tế bào trần thu đƣợc 47

4.3 Ảnh hƣởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lƣợng tế bào sau dung

hợp (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat) 48

4.4 Kết quả tái sinh và độ bội của các con lai tái sinh sau dung hợp ở các mật

độ tế bào dung hợp khác nhau (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum

bulbocastanum và Delikat) 50

4.5 Kết quả dung hợp giữa các dòng khoai tây dại nhị bội với các giống

khoai tây trồng tứ bội bằng phƣơng pháp xung điện 51

4.6 Sự phân chia của các tổ hợp lai sau khi dung hợp trên các điều kiện môi

trƣờng khác nhau 52

4.7 Sự phân chia của các tổ hợp lai trên các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau 53

vii

4.8 Ảnh hƣởng của môi trƣờng tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của

các tổ hợp lai 54

4.9 Kết quả nuôi cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai sau dung hợp 55

4.10 Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai sau dung hợp 56

4.11 Kết quả chọn lọc con lai soma bằng phân tích độ bội và chỉ thị phân tử SSR 58

4.12 Đặc điểm hình thái của nấm P. infestans trong quá trình nuôi cấy 59

4.13 Phản ứng của một số giống khoai tây với 2 mẫu mốc sƣơng thu thập từ

Hà Nội và Lạng Sơn 59

4.14 Kết quả đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma và

dòng bố mẹ bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời 61

4.15 Kết quả đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma và

dòng bố mẹ bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (tuber slice test) 63

4.16 Kết quả đánh giá các con lai soma và các dòng bố mẹ về khả năng kháng

bệnh mốc sƣơng trên đồng ruộng và đánh giá sự thành thục của cây 64

4.17 Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các dòng/giống khoai

tây bố mẹ và con lai soma 68

4.18 Đánh giá các tính trạng trên củ của các con lai soma và các dòng bố mẹ 70

4.19 Kết quả lai lai trở lại giữa các con lai soma với giống khoai tây trồng làm bố 74

4.20 Đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai BC1 ở giai

75 đoạn cây con

4.21-A Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các con lai BC. 78

4.21-B Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các con lai BC 79

4.22 Kết quả đánh giá năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của cá con

80 lai BC1

viii

DANH MỤC HÌNH

TT Tên hình Trang

3.1 Các loài khoai tây dại nhị bội đƣợc trồng trong nhà kính để phục vụ thí nghiệm 30

4.1 Hình ảnh tế bào trần của các dòng/giống khoai tây khác nhau với các

enzym phù hợp. 46

4.2 Chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở các tần số và số lần xung khác nhau. 48

4.3 Các macrocallus tái sinh sau khi dung hợp 51

4.4 Sự phân chia của tổ hợp lai trn3G + Delikat trên các điều kiện môi

trƣờng khác nhau sau 4 ngày nuôi cấy 52

4.5 Khả năng tái sinh chồi của tổ hợp lai trn + Rasant sau 12 tuần trên môi

trƣờng khác nhau 55

4.6 Hình ảnh độ bội của dòng khoai tây bố mẹ và con lai 56

4.7 Kết quả phân tích SSR với chỉ thị phân tử STIIKA của tổ hợp lai trn 3G

+ cv.Rasant. 57

4.8 Kết quả phân tích SSR với chỉ thị phân tử STM2022 của tổ hợp lai trn

3G + cv.Rasant 57

4.9 Bọc động bào tử và cành bọc động bào tử của nấm mốc sƣơng 59

4.10 So sánh tính độc của 2 nguồn nấm bệnh phân lập từ Hà Nội và Lạng Sơn 60

4.11 Sự biểu hiện vết bệnh trên lá sau 6 ngày lây nhiễm 62

4.12 Sự biểu hiện tính kháng trên đồng ruộng của con lai soma blb2G +

Delikat (SH2283/5) 65

4.13- A Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 1/1’ 66

4.13-B Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu blb1 66

4.13-C Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu blb3 67

4.14 Các đặc tính hình thái, sinh trƣởng và đặc điểm ra hoa của các con lai

soma (2283/5/1; 2281/10, 2292/4, 2295/1) của tổ hợp lai blb2G (+)

Delikat so với các dòng/giống bố mẹ (Delikat, S.bulbocastanum) 71

4.15-A Các biến dị về hình thái, kiểu sinh trƣởng của các con lai soma trong

cùng một tổ hợp lai 72

4.15- B Các biến dị về dạng lá của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai 72

4.15- C Các biến dị về dạng hoa của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai

Delikat (+) trn3G 73

4.15- D Các biến dị về dạng củ của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai

Rasant (+) trn3G 73

4.16 Một số tổ hợp lai backcross thành công 74

Cây con sau gieo hạt 10 ngày 4.17 75

Kết quả phân tích độ bội của các con lai BC1 4.18 76

4.19 Sự đa dạng kiểu hình của các con lai BC1 của tổ hợp lai Delikat + blb)

SH2283/5 x Delikat 83

4.20 Dạng củ của: A- Atlantic; B- pnt2G; C- con lai soma pnt2G (+) Atlantic;

D- BC1 của tổ hợp lai khoai tây của một số tổ hợp lai pnt2G (+) Atlantic

với giống khoai tây trồng Atlantic 83

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Hoàng Thị Giang

Tên Luận án: Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sƣơng bằng dung hợp tế bào trần

giữa khoai tây dại và khoai tây trồng

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 62 62 01 11

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Tạo đƣợc các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại

nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sƣơng từ

loài dại vào khoai tây trồng, sau đó lai trở lại (backcross) với khoai tây trồng nhằm tạo

đƣợc nguồn vật liệu di truyền khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng.

Phƣơng pháp nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Các dòng khoai tây dại kháng bệnh mốc sƣơng (Solanum

bulbocastanum, S. tarnii, S. pinnatisectum thu thập từ Ngân hàng Gen khoai tây quốc tế

tại Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK,

Genebank); các giống khoai tây trồng mang các tính trạng nông sinh học quý thích nghi

với điều kiện khí hậu ở Việt Nam

- Nội dung và phương pháp nghiên cứu: (1) Tách và dung hợp tế bào trần giữa

các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng theo Morller et al. (1992) và đƣợc

cải tiến bởi Thieme et al. (1997, 2008); (2) xác định các con lai soma bằng các phƣơng

pháp đo độ bội (Flow cytometry) theo (Thieme et al., 2008) và bằng chỉ thị phân tử SSR

(theo Dinu and Thieme, 2001; Song et al., 2005); (3) đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc

sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo (theo Darsow et al., 2004;

Hammann et al., 2009) và bằng chỉ thị phân tử (theo Wang et al., 2008 và Lokossou et

al., 2010); (4) lai trở lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần

thể chọn lọc

Kết quả chính

- Đã xác định đƣợc các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại

mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch

enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung

dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung hợp ở thông

số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml; môi trƣờng nuôi cấy các sản phẩm sau dung hợp là môi

trƣờng VKMII lỏng; môi trƣờng Cul-medium để tạo callus và môi trƣờng RJM để tái

sinh chồi.

- Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội (2x)

mang gen kháng bệnh mốc sƣơng (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii) với

giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.). Các con lai soma của tổ hợp lai giữa

dòng khoai tây dại S. bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4,

2181/10 và 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn

vật liệu kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây

kháng bệnh của Việt Nam.

- Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo đƣợc 11

tổ hợp lai và chọn đƣợc 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat

(13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng

đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật liệu có giá trị cho

chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nƣớc ta.

xii

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Hoang Thi Giang

Thesis title: Study of interspecific somatic hybrids between wild potato species and

potato cultivars via protoplast fusion for selection of late blight resistant potato

Major: Genetics and Plant Breeding Code: 62 62 01 11

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

The aims of this study was to produce interspecific somatic hybrids and then to

investigate the possibilities to incorporate late blight resistance from diploid wild potato

species into tetraploid potato cultivars. These hybrids and progenies could be promising

materials for breeding program of late blight resistant potato in Vietnam.

Materials and Methods

- Material: Late blight resistant wild-type potatoes (Solanum bulbocastanum, S.

tarnii, S. Pinnatisectum) that come from the Leibniz Institute of Plant Genetics and

Crop Plant Research, IPK, Genebank, Germany); cultivated potatoes with promising

agronomical traits in Vietnamese condition.

- Methods: Protoplast fusion was conducted between late blight resistant wild-

type potates (S. bulbocastanum, S. tarnii, S. pinnatisectum) and potato cultivars

(Solanum tuberosum L.). In the present study, protocols for protoplast isolation, fusion,

and culture according to Morller and Wenzel (1992) and modified by Thieme et al.

(1997, 2008) were used to obtain interspecific somatic hybrids. Flow cytometry (Dinu

and Thieme, 2001) and single sequence repeat methods (Song Ye-Su et al., 2005) were

ultilized to identify all the regenerated plants and selected interspecific somatic hybrids

which were hexaploid (2n=6x=72). These interspecific somatic hybrids were assessed

continuously resistance to late blight via detached leaflet assay, tuber slice test and field

test (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009) and molecular markers to find the

presence of resistant genes Rpi-blb (Wang et al., 2008, Lokossou et al., 2010). In

addition, backcrossing (backcross-BC) between the somatic hybrids and the cultivated

potato varieties as the pollen donor to generate the BC1 progeny were conducted in the

present study.

xiii

Main findings and conclusions

In the present study 1612 calluses from seven different fusion combinations

were generated, of which 188 progeny plants were regenerated. Flow cytometry (Dinu

and Thieme, 2001) and single sequence repeat methods (Song Ye-Su et al., 2005) were

ultilized to identify all the regenerated plants and selected 69 interspecific somatic

hybrids which were hexaploid (2n=6x=72). These interspecific somatic hybrids were

assessed continuously resistance to late blight via detached leaflet assay, tuber slice test

and molecular markers to find the presence of resistant genes Rpi-blb. Only somatic

hybrid plants between S. bulbocastanum with Delikat exhibited resistance against late

blight disease. Futhermore, Rpi-blb1 and Rpi-blb3 genes, which belong to resistant-

related genes, Rpi-blb, were found in somatic hybrids of these combination. Moreover,

these BC1 also exposed many precious agronomical characteristics of cultivated

potatoes. These hybrids and progenies could be promising materials for breeding

program of late blight resistant potato in Vietnam.

xiv

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Khoai tây là một trong bốn cây lƣơng thực quan trọng của loài ngƣời. Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, khoai tây bị nhiều tác nhân gây bệnh tấn công, ảnh hƣởng đáng kể tới năng suất. Trong các bệnh gây hại khoai tây, bệnh mốc sƣơng do Phytophthora infestans (Mont.) de Bary gây ra đƣợc coi là bệnh phổ biến và nguy hại nhất. Trong điều kiện thuận lợi bệnh có thể phát triển nhanh thành dịch, phá hủy toàn bộ mùa màng trong vòng một đến hai tuần lễ. Nhiều biện pháp đã đƣợc xây dựng và đề xuất để hạn chế tác hại của bệnh mốc sƣơng nhƣ sử dụng giống kháng bệnh và đặc biệt sử dụng các loại thuốc hoá học phòng chống bệnh mốc sƣơng. Trung tâm Khoai tây quốc tế (CIP) ƣớc lƣợng hàng năm Mỹ, châu Âu và các nƣớc đang pháp triển phải chi khoảng 1 tỉ đôla cho thuốc hóa học để kiểm soát bệnh mốc sƣơng (Anonymous, 1997). Việc sử dụng biện pháp phòng chống bệnh hại bằng thuốc hóa học vừa gây ô nhiễm môi trƣờng vừa tăng chi phí sản xuất (Darsow et al., 2008) nhƣng vẫn không giảm thiệt hại hoàn toàn. Hơn nữa, nấm mốc sƣơng có tính di truyền khá linh động và thích ứng cao nên dễ kháng các loại thuốc hóa học. Chọn giống kháng bệnh mốc sƣơng đƣợc coi là một biện pháp hiệu quả, đặc biệt sau dịch bệnh mốc sƣơng gây ra nạn đói ở Ái-nhĩ-lan giữa thế kỷ 19 (1845-1846) và các dịch bệnh xảy ra vào nửa đầu thế kỷ 20 ở châu Âu.

Chọn giống khoai tây kháng bệnh vào đầu thế kỷ 20 (những năm 1950 và 1960) tập trung vào việc sử dụng các gen trội (R còn gọi là gen Rpi) chính kháng mốc sƣơng từ loài hoang dại Solanum demissum và 11 gen R đƣợc chuyển vào khoai tây. Mặc dù gen kháng chính có hiệu quả cao, nhƣng tính kháng ở các giống mang gen kháng chính R nhanh chóng bị vƣợt qua vì nấm mốc sƣơng có khả năng thích nghi với cây kháng rất nhanh (Fry, 2008; McDonald and Linde, 2002). Tuy nhiên, nhiều chiến lƣợc khác nhau đƣợc xem xét để sử dụng các gen kháng nhằm tạo khả năng kháng đồng ruộng bền vững (Jones, 2001; Park et al., 2009) và sử dụng các gen kháng từ nhiều loài hoang dại khác nhau. Các gen kháng từ các nguồn khác nhau đƣợc tích tụ nhờ phƣơng pháp lai chuyển gen truyền thống và sử dụng chị thị phân tử (Tan et al., 2008, 2010).

Các nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài khoai tây dại nhƣ Solanum pinnatisectum (pnt2G), Solanum tarnii (trn3G), Solanum bulbocastanum (blb2G)

(Thieme et al., 2008; Szczerbakowa et al., 2005), Solanum cardiophyllum (Thieme et al., 2010) mang nguồn gen kháng bệnh mốc sƣơng cao. Tuy nhiên,

rất khó để chuyển đặc tính kháng này qua con đƣờng lai hữu tính giữa các loài

hoang dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do cơ chế cách ly về

sinh sản (Jackson and Hanneman, 1999), cụ thể là sự khác biệt về số lƣợng nhiễm sắc thể và số cân bằng nội nhũ (Borgato et al., 2007; Tiwari et al,, 2010).

Để khắc phục rào cản lai này nhà chọn giống có thể sử dụng kỹ thuật nhiễm sắc thể, lai bắc cầu, thụ phấn mento, xử lý auxin và cứu phôi. Dung hợp tế bào trần

để tạo con lai, gọi là con lai soma, là một giải pháp để khắc phục rào cản lai xa

(Oberwalder et al., 2000; Wielgat and Wasilewska, 2001) và chuyển nhiều gen

kháng vào khoai tây trồng. Dung hợp tế bào trần hay lai soma có thể chuyển các

tính trạng đơn gen và đa gen từ các loài hoang dại vào khoai tây nhƣng vẫn bảo toàn đƣợc hệ gen nhân và tế bào chất (Gavrilenko et al., 2003) và tạo ra nguồn

vật liệu đa dạng mang mức kháng bệnh cao (Mattheij et al., 1992; Thach et al.,

1993; Davey et al., 2005; Thieme et al., 2010).

Các nhà nghiên cứu đã thu nhận đƣợc nhiều con lai soma kháng mốc

sƣơng giữa khoai tây trồng với S. circaeifolium (Mattheij et al., 1992), S.

pinnatisectum (Thieme et al., 1997), S. bulbocastunum (Helgeson et al., 1998), S.

nigrum (Horsma et al., 2001), S. berthaultii (Bidani et al., 2007), S. tarnii

(Thieme et al., 2008) và S. cardiophyllum (Thieme et al., 2010). Một số con lai

soma giữa khoai tây với S. bulbocastunum (Helgeson et al., 1998), S. nigrum

(Horsman et al., 2001), S. tarnii (Thieme et al., 2004, 2008) đã đƣợc lai lại với

khoai tây trồng tạo vật liệu tiền chọn giống để khai thác trong các chƣơng trình

chọn giống.

Mặc dù quy trình lai soma ở thực vật, kể cả khoai tây đã đƣợc thiết lập,

phƣơng pháp phân lập tế bào trần và tái sinh cây đối với các loài hoang dại từ Mexico chƣa đạt hiệu quả cao (Chen et al., 2006). Chen et al. (2006) cho rằng để

ứng dụng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần hai tiêu chí phải thỏa mãn, đó là phải phân lập đƣợc số lƣợng tế bào trần đủ lớn và chúng có khả năng nhân và tái sinh thành cây mới. Nhìn chung, tế bào trần có thể phân lập dễ dàng từ mô lá thông qua xử lý emzym. Song các điều kiện phân lập phụ thuộc vào kiểu gen, thay đổi mạnh giữa các loài do sự khác nhau về thành phần của thành tế bào. Davis (1985) chỉ ra rằng các điều kiện khác nhau ảnh hƣởng tới năng suất và khả năng tái sinh của tế

bào trần, do đó cần phải xác định pháp và điều kiện cụ thể cho từng loài.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập tế bào trần từ ba loài khoai tây hoang dại S. pinnatisectum, S. tarnii và S. bulbocastanum (pnt2G, trn3G và blb2G) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và dung hợp với tế bào trần từ các giống khoai tây trồng tứ bội Delikat, Atlantic, Agave và Rasant, mẫn cảm với bệnh mốc sƣơng.

1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Xác định đƣợc các thông số để tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội kháng bệnh mốc sƣơng và các giống

khoai tây trồng mẫn cảm với bệnh mốc sƣơng.

Tạo đƣợc các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai

tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh

mốc sƣơng từ loài dại vào khoai tây trồng.

Tạo đƣợc các con lai lại (backcross) giữa các con lai soma với các giống

khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo đƣợc dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen

kháng và có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây

kháng bệnh mốc sƣơng ở Việt Nam.

1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Trên cơ sở thu thập đƣợc nguồn vật liệu quý là các dòng khoai tây dại

mang nguồn gen kháng bệnh mốc sƣơng, đề tài tập trung nghiên cứu quy trình

tách, dung hợp tạo các thể lai soma cải thiện đƣợc khả năng kháng bệnh mốc

sƣơng đồng thời tổ hợp đƣợc những tính trạng quý từ khoai tây trồng. Trên nền

đa dạng di truyền đã tạo ra, đánh giá, chọn lọc các thể lai soma có khả năng

kháng bệnh mốc sƣơng và mang các đặc tính nông sinh học phù hợp.

1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đã xác định đƣợc các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong

dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung hợp ở thông số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml; môi trƣờng nuôi cấy các sản phẩm sau dung hợp là môi trƣờng VKMII lỏng; môi trƣờng Cul-medium để tạo callus và môi trƣờng RJM để tái sinh chồi.

Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội

(2x) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii) với giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) tứ bội (4x) mẫn cảm

với bệnh mốc sƣơng (Agave, Atlantic, Delikat, Quarta và Rasant) nhƣng có năng

suất và chất lƣợng tốt. Các con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng khoai tây dại S.

bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4, 2181/10 và 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn vật liệu

kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây kháng

bệnh của Việt Nam.

Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo đƣợc 11 tổ hợp lai và chọn đƣợc 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5

x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật

liệu có giá trị cho chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nƣớc ta.

1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1. Ý nghĩa khoa học

Đây là một nghiên cứu có tính khoa học chuyên sâu về di truyền chọn

giống cây trồng. Đề tài cũng là một bƣớc phát triển kỹ thuật cao của công nghệ tế

bào thực vật (kỹ thuật dung hợp tế bào trần) trong tạo giống khoai tây. Các kết

quả của đề tài có giá trị khoa học cả trong nƣớc và quốc tế. Đề tài đã góp phần

chứng minh khả năng chuyển đƣợc tính kháng bệnh mốc sƣơng từ các loài khoai

tây dại sang các giống khoai tây trồng thông qua dung hợp tế bào trần và ứng

dụng thành công kết quả này trong chọn tạo các giống khoai tây trồng kháng các

loại bệnh quan trọng.

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu đã chọn tạo đƣợc thành công 4 dòng con lai soma và khoai tây

trồng giống Delikat (blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat là các dòng 13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11 có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng đồng thời có đặc điểm nông sinh học phù hợp. Đây là nguồn vật liệu có giá trị cho

chƣơng trình chọn giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng ở Việt Nam.

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT KHOAI TÂY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

Khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ sau đó mở rộng sang các nƣớc phát

triển. Theo các chuyên gia nhận định: Khoai tây chính là cây lƣơng thực của

tƣơng lai dành cho những nƣớc nghèo và nƣớc đang phát triển Khi giá lúa gạo

và lúa mỳ tăng lên, khoai tây trở thành lƣơng thực giàu dinh dƣỡng cho những

nƣớc đó với giá rất rẻ (FAO, 2006). Mặt khác Khoai tây là cây trồng tạo ra

khối lƣợng sinh học và năng lƣợng nhiều hơn bất kỳ một loại cây trồng lƣơng

thực nào (sau lúa gạo, ngô, lúa mỳ) trong thời gian ngắn trên cùng một đơn vị

diện tích (FAO, 2005). Theo Struik and Wiersema (1999), khoai tây là loại cây

lƣơng thực có hàm lƣợng chất khô, năng lƣợng cũng nhƣ hàm lƣợng dinh dƣỡng

cao gần gấp đôi so với lúa mỳ và gạo (bảng 2.1).

Bảng 2.1. Năng suất và năng lƣợng của một số cây lƣơng thực ở các nƣớc đang phát triển

Năng suất tấn ha Hàm lƣợng chất kh tấn ha Năng lƣợng (MJ/ha/ngày) Năng suất protein (kg/ha/ngày)

11,0 2,2 216 1,4 Khoai tây

Nguồn: FAO (2005) Do vậy, khoai tây chính là cây trồng giàu tiềm năng phát triển trong tƣơng

lai, với diện tích trồng ngày càng đƣợc mở rộng với năng suất, chất lƣợng ngày

càng tăng nhanh, nhất là ở các nƣớc đang phát triển và nƣớc chậm phát triển.

Theo số liệu tổng kết của FAOSTAT (2014), tổng diện tích trồng khoai

tây trên thế giới năm 2013 là 19.463.041 ha, trong đó khu vực Châu Á chiếm

51,68% tổng diện tích trồng khoai tây trên thế giới. Châu Âu là châu lục đứng

thứ 2 trên thế giới về diện tích trồng khoai tây (chiếm 29,42%). Châu Mỹ La tinh

có diện tích trồng khoai tây thấp nhất (chiếm 8,4%) (bảng 2.2).

Năng suất bình quân của thế giới là 18,9 tấn/ha trong đó châu Mỹ la Tinh

lại là châu lục có năng suất cao nhất (21,7 tấn/ha). Châu Âu cũng là châu lục có

năng suất bình quân cao hơn của thế giới (19,8 tấn/ha).

1,5 2,2 1,3 1,9 135 151 1,3 0,9 Lúa mỳ Gạo

Bảng 2.2. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới năm 2013

Diện tích thu Sản lƣợng Năng suất trung Vùng lãnh thổ hoạch ha tấn ình tấn ha

17,9 19,8 Châu Á Châu Âu 10.058.568 5.725.707 180.460.442 112.980.347

21,7 15,1 Mỹ Latinh Châu Phi 1.627.959 2.005.331 42.619.996 30.198.747

Nguồn: FAOSTAT (2014)

18,9 13,6 Thế Giới Việt Nam 19.463.041 23.007 368.096.362 313.383

Bảng 2.3. Tốp 10 quốc gia có sản lƣợng khoai tây lớn nhất thế giới 1000 tấn

STT Nƣớc Năm 2005 Năm 2009 Năm 2013

88.987,0 Trung Quốc 70.906,73 69.059,65 1

45.343,6 Ấn Độ 28.787,70 34.391,00 2

30.199,13 Liên bang Nga 37.279,82 31.133,96 3

- Mỹ 19.222,70 19.569,11 4

22.258,6 Ukraine 19.462,40 19.666,10 5

9.669,7 Đức 11.624,20 11.617,50 6

6.334,2 Ba Lan 10.369,25 9.702,80 7

5.913,7 Belarus 8.184,95 7.124,98 8

6.975,0 Pháp 6.604,60 7.164,20 9

6.334,2 6.777,00 7.181,00 10 Hà Lan

Thế giới 325.099,74 329.556,91 368.096,36

Chú thích: (-): Số liệu chƣa đƣợc cập nhật

Nguồn: FAOSTAT (2014) Khuynh hƣớng chung của sản xuất khoai tây trên thế giới là: giảm dần ở

các nƣớc phát triển; tăng dần ở các nƣớc đang phát triển; tăng cƣờng tỷ lệ khoai

tây chế biến; tăng cƣờng chất lƣợng giống và cơ giới hóa sản xuất khoai tây và

khoai tây là cây đƣợc quan tâm trong thời đại khí hậu thay đổi.

Ở Việt Nam cùng với việc mở rộng diện tích trồng, năng suất cây khoai tây

tăng chậm qua các năm, tuy nhiên tới năm 2013 tuy diện tích có giảm nhƣng năng

suất có chiều hƣớng tăng lên (theo FAOSTAT, 2014). Theo thời gian, cây khoai tây

đã và đang khẳng định vị trí của mình, dần trở thành cây trồng quan trọng trong cơ

Việt Nam 434,00 239,08 23,08

cấu nông nghiệp của nƣớc ta. Thực tế cho thấy là tiềm năng năng suất của khoai tây

ở đồng bằng sông Hồng có thể đạt 40 tấn/ha, trong đó năng suất đƣợc nông dân chấp

nhận và mong muốn phát triển 15 - 30 tấn/ha. Thế nhƣng năng suất bình quân thực

tế của chúng ta mới chỉ đạt 13,6 tấn/ha.

Bảng 2.4. Diện tích, năng suất và sản lƣợng khoai tây của Việt Nam giai đoạn 2006 - 2013

Chỉ tiêu Diện tích Sản lƣợng Năng suất

Năm (ha) tấn tấn ha

2006 35000 370000 10,57

2007 36000 372000 10,33

2008 36000 380000 10,56

2009 37000 388000 10,49

2010 37100 446200 12,03

Nguồn: FAOSTAT (2014) Vấn đề khó khăn nhất hiện nay đối với ngành sản xuất khoai tây đó là

giống, đặc biệt là các giống khoai tây sạch bệnh. Hiện giống khoai tây ở trong

nƣớc mới chỉ đáp ứng từ 20-25% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung

Quốc, Hà Lan…

2013 23077 313383 13,60

2.2. NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI VÀ TÌNH HÌNH KHAI KHÁC NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI

2.2.1. Vai trò của nguồn gen kháng ệnh trên cây khoai tây

Giống nhƣ tất cả các cây trồng, khoai tây rất nhạy cảm với các loài sâu

bệnh. Một thực tế là đối với nền nông nghiệp hiện đại thƣờng sử dụng một vài

giống tƣơng đối đồng nhất trên một diện tích rộng lớn. Do vậy, nếu nhƣ một loại

sâu bệnh tấn công trên một cây thì sẽ dễ dàng lây lan nhanh chóng sang những cây khác trên cả một cánh đồng, một vùng hay thậm chí bùng nổ thành dịch bệnh nguy hiểm cho cả một quốc gia. Trong khi đó, đối với việc canh tác truyền thống, nơi có rất nhiều các dòng/giống khác nhau đƣợc trồng chung trên một diện tích đất thì sâu bệnh khó mà tấn công và bùng nổ thành dịch do đặc tính đa dạng di truyền. Thậm chí một nhóm giống cây trồng trồng nào đó hay một nhóm chủng vi sinh vật trong đất lại mang các gen hữu ích có thể bảo vệ đƣợc cây trồng khỏi bị tấn công bởi các loài sâu bệnh hại. Nhiều cây trồng có thể bị biến mất do

không có hệ thống gen kháng lại sâu bệnh hại (Hawkes, 1990).

Trong suốt cả một thời gian dài, chúng ta đã phải dùng thuốc hóa học để kiểm soát đƣợc sâu bệnh hại. Tuy nhiên chi phí cho việc dùng thuốc hóa học thì rất

đắt đỏ và rất khó khăn đối với những ngƣời nông dân nghèo trong một thế giới phát

triển. Các nhà chọn tạo giống cây trồng đã hết sức cố gắng trong việc đƣa nguồn gen

kháng vào nhiều cây trồng. Điều này góp phần đáng kể vào việc giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng do sử dụng thuốc hóa học. Ngay từ những năm 30, 40 của thế

kỷ trƣớc, các nhà chọn tạo giống đã nhận ra rằng rất cần thiết phải đƣa các nguồn đa dạng di truyền từ các loài khoai tây dại vào khoai tây trồng để chuyển đƣợc

tính kháng với các loại sâu, bệnh hại cũng nhƣ chống chịu đƣợc với các điều kiện

bất thuận của môi trƣờng nhƣ chịu lạnh, chịu hạn, chịu nóng... (Hawkes, 1990).

2.2.2. Tình hình khai thác nguồn gen kháng ệnh trong chọn tạo giống khoai tây Có rất nhiều các loài dại đã đƣợc phát hiện mang các đặc tính kháng sâu

bệnh và chống chịu với các điều kiện bất thuận đã đƣợc phát hiện và khai thác

vào nguồn gen khoai tây trồng.

Bảng 2.5. Tổng kết về kết quả đánh giá tính kháng của các loài khoai tây dại chính đối với một số loại sâu, ệnh hại trên cây khoai tây và chống chịu với các điều kiện ất thuận của m i trƣờng

STT Đối tƣợng kháng Tên loài dại

I. KHÁNG NẤM

Solanum demisssum, S. bulbocastanum, S. polyadenim, 1 infestans

Phytophthora (Bệnh mốc sƣơng)

S. pinnatisecstum, S. stoloniferum, S. verrucosum, S. tuberosum subsp. andigena, S. phureja,

S. microdontum, S. berthaultii, S. tarrijense, S. circaeifolium, S. vernei.

S. sparsipilum, S. acaule, S. Spegazzinii 2

Synchytrium endobioticum (bệnh ung thƣ)

Stretomyces scabies (Bệnh S. chacoense, S. commersonii, 3

ghẻ) S. yungasense và một số loài khoai tây trồng khác

II. KHÁNG KHUẨN

Raltonia solanacearum Smith (Bệnh héo xanh vi khuẩn) S. chacoense, S. phureja, S. stenotonum, S. microdontum

Erwinia carotovara (Bệnh thối nhũn)

S. bulbocastanum, S. chacoense, S. demissum, S. hjertingii, S. leptophyes, S. microdotum, S. megistacrolobum, S. phureja, S. pinatisectum, S. tuberosum subsp. andigena,...

STT Đối tƣợng kháng Tên loài dại

III. KHÁNG VIRUS

Potato virus X (Bệnh virus PVX)

S. acaule, S. chacoense, S. curtilobum, S. phureja, S. sucrense, S. tarijense, S. sparsipilum, S. tuberosum subsp. andigena,...

Potato virus Y (Bệnh virus PVY) S. chacoense, S. stoloniferum, S. phureja, S. demissum, S. tuberosum subsp. Andigena

Potato leaf roll virus (Bệnh virus PLRV) S. brevidens, S. etuberosum, S. acaule, S. raphanifonium

S. acaule, S. berthaultii, S. guerreroense Spindle tuber viroid

IV. KHÁNG SÂU

Leptinotarsa decemlineata (Bọ cánh cứng) S. chacoense, S. demissum, S. commersonii, S. berthaultii, S. tarijense, S. Polyadenium

11 Myzus persicae,

Macrosiphum euphorbiae (rệp) S. berthaultii, S. stoloniferum, S. multidissectum, S. medians, S. marinasense, S. lignicaule, S. infunundibuliforme, S. chomatophilum,

V. KHÁNG TUYẾN TRÙNG

Globodera rostochiensis, G. Pallida (Bệnh tuyến trùng nốt sần) S. acaule, S. spegazzinii, S. vernei, S. gourlayi, S. capsicibaccatum, S. boliviense, S. bulbocastanum, S. cardiophylum, S. oplocense, S. sparsipilum, S. sucrense

S. chacoense, S. microdontum, S. phureja, S. 13 Meloidogyne incognita

(bệnh tuyến trùng trên rễ)

sparsipilum, S. tuberosum subsp. andigena, S. Curtilobum

VI. CÁC ĐẶC TÍNH SINH LÝ

14 S. cacaule, S. ajanhuiri, S. brachistotrichum, S.

Chịu sƣơng giá (Frost)

brevicaule, S. brevidens, S. canasense, S. chomatophilum, S. commersonii, S. curtilobum, S.

demissum, S. juzepczukii,

15 Chịu nhiệt và hạn (Heat, S. acaule, S. bulbocastanum, S. chacoense,

drought)

S. megistacrolobum, S. microdontum, S. papita, S. pinnatisectum, S. Tarijiense

16 S. hjertingii

Nguồn: Hawkes (1990) Ross (1986) đã chỉ ra rằng có 6 loài khoai tây dại đƣợc khai thác cho các giống khoai tây trồng của Châu Âu bao gồm: S. demissum (kháng mốc sƣơng,

Sự hóa đen ở củ (Lack of tuber blackening

PLRV), S. acaule (Kháng PVX, PLRV, PSTV, wart, Globoder và chịu sƣơng giá), S. stoloniferum (Kháng PVA, PVY), S. chacoense (Kháng PVA, PVY, mốc

sƣơng, Colorado beetle, bọ nhậy), S. spegazzinii (kháng Fusarium, wart,

Globodera), S. vernei (kháng GloboderaI, có hàm lƣợng tinh bột cao). Theo thời

gian, nguồn gen kháng từ các loài khoai tây dại đã đƣợc khai thác và chuyển vào nguồn gen khoai tây trồng. Bảng 2.5 cho biết một số tính kháng đã đƣợc phát

hiện ở các loài khoai tây dại.

2.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƢƠNG PHÁP DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

Một trong những lĩnh vực quan trọng nhất cho sự phát triển công nghệ

nuôi cấy mô tế bào thực vật đã đƣợc chứng minh là công nghệ tách, nuôi cấy và

dung hợp tế bào trần. Cocking et al. (1960) đã chứng minh đƣợc rằng có thể sử

dụng enzym để phân giải thành tế bào thực vật một cách dễ dàng, điều này có ý

nghĩa vô vùng to lớn đối với di truyền học tế bào thực vật bậc cao. Nuôi cấy tế

bào trần đƣợc áp dụng không chỉ cho dung hợp tế bào trần mà còn cho kỹ thuật

ADN ngoại lai, cơ quan tử, vi khuản và virus. Do đó, kỹ thuật tách, nuôi cấy tế

bào trần đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu rất quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Những khâu quan trọng của kỹ thuật này bao gồm: tách, nuôi

cấy và tái sinh tế bào trần; dung hợp tế bào trần; chọn lọc các thể lai soma.

2.3.1. Tách tế ào trần

Tế bào trần (protoplast) là phần của tế bào nằm trong thành tế bào, có khả

năng co nguyên sinh và có thể đƣợc tách rời khỏi thành tế bào bằng phƣơng pháp

cơ học hoặc emzym. Tế bào trần đƣợc bao bọc bởi màng nguyên sinh, nó có thể tái tạo lại thành tế bào mới và phân chia. Tế bào trần có thể tách từ mô hoặc từ

các cơ quan thực vật nhƣ lá, rế, hạt phấn hoặc mô sẹo (callus).

Vào những năm 60 của thế kỷ XX, Cooking đã sử dụng một enzyme để

phân giải thành tế bào và kết quả là tạo ra các tế bào trần chóp rễ của cây cà chua. Quy trình này cũng đƣợc áp dụng thành công trên nhiều đối tƣợng thực vật

khác, rất dễ sử dụng và đạt hiệu quả cao.

Để tách đƣợc tế bào trần ngƣời ta có thể sử dụng hai phƣơng pháp tách cơ học và tách bằng enzyme. Tách cơ học là làm cho tế bào trần ở trạng thái co nguyên sinh sau đó tác động cơ học để giải phóng tế bào trần. Tuy nhiên phƣơng pháp này có nhiều mặt hạn chế: chỉ áp dụng trên một vài đối tƣợng thực vật; mật độ tế bào trần thu đƣợc không cao; khả năng tái sinh yếu. Phƣơng pháp tách tế

bào trần bằng enzyme đã khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên. Hiện nay,

phƣơng pháp enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao.

2.3.2. Nu i cấy tế ào trần

Các phƣơng pháp nuôi cấy nói chung đã đƣợc nhiều tác giả công bố trong đó có phƣơng pháp nuôi cấy dịch huyền phù và giọt. Tế bào trần đƣợc hòa lơ lửng trong môi trƣờng lỏng ở mật độ khoảng 105 tế bào trần/ml trong hộp chứa một lớp mỏng môi trƣờng và nuôi cấy trong điều kiện tĩnh. Quá trình nuôi cấy giọt đã đƣợc

phát triển bởi Kao et al. (1974). Theo phƣơng pháp này các tác giả đã đặt một giọt (khoảng 50µl) dịch huyền phù tế bào trần (với mật độ 104- 105 tế bào trần /ml trong đĩa petri nhựa, quấn paraphin và nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu.

Một phƣơng pháp khác cũng đƣợc sử dụng là nuôi cấy trong thạch. Một

thể tích dịch huyền phù có tế bào trần đƣợc trộn với một thể tích tƣơng đƣơng của thạch (1-2%) và giữa ở trong 450C trong bể ấm trong một thời gian nhất định, sau đó lấy 5ml hỗn hợp này đổ vào hộp lồng, quấn paraphin xung quanh và

tiến hành nuôi cấy (Nagata et al., 1971)

Bên cạnh các phƣơng pháp đã nêu trên ngƣời ta còn sử dụng một số các

phƣơng pháp nuôi cấy tế bào trần khác nhƣ nuôi cấy trong buồng vi nuôi cấy hay

nuôi cấy hỗ trợ.

Kao et al. (1975) đã cải tiến môi trƣờng cơ bản để nuôi cấy tế bào trần

đơn dòng của loài Vicia hajastana cho nhiều loài khác để tái sinh tế bào trần.

Thông thƣờng môi trƣờng nuôi tế bào trần chứa 3-5% sucrose nhƣng với một vài

loài (nhu thuốc lá) trong môi trƣờng lƣợng đƣờng thấp hơn 1%. Vitamin cũng

đƣợc sử dụng cho môi trƣờng nuôi tế bào trần tƣơng tự nhƣ trong môi trƣờng cơ

bản. Cả hai chất điều tiết sinh trƣởng (auxin và cytokinin) cũng đƣợc sử dụng

trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào trần ở những tỷ lệ khác nhau, ảnh hƣởng đến sự

tái tạo thành tế bào và sự phân chia của tế bào trần. Nguồn auxin ảnh hƣởng đến khả năng hình thành callus từ tế bào trần (2,4D, α-NAA hay IAA). Cytokinin thƣờng đƣợc sử dụng là BA, Kinetin, 2-Pi hay zeatin. Tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trƣờng của mỗi loài khác nhau để kích thích sự phân chia hình thành callus

của các tế bào trần.

Duy trì áp suất thẩm thấu cho môi trƣờng nuôi cấy là yếu tố cần thiết cho

sự ổn định, khả năng sống và sự phát triển tiếp theo của tế bào trần. Trong quá

trình tách, nuôi cấy tế bào trần đều phụ thuộc vào sự ổn định của áp suất thẩm

thấu, nó sẽ hạn chế sự vỡ tế bào cho đến khi tái tạo thành tế bào. Áp suất thẩm thấu trong môi trƣờng nuôi cũng quan trọng nhƣ trong dung dịch enzym bao gồm

sorbitol, manitol, glucose hay sucrose. Với tế bào trần của các cây họ ngũ cốc,

đậu thì cả sorbitol và manitol đƣợc chứng minh là thích hợp tạo áp suất thẩm

thấu ổn định, còn với tế bào trần của các cây khoai tây, đậu hoa, dứa và sắn thì sucrose là tốt hơn glucose hay manitol, còn với tế bào trần của thuốc lá thì cả

galactose và fructose đều đƣợc sử dụng để tạo áp suất thẩm thấu. Áp suất thẩm thấu của môi trƣờng nuôi dần đƣợc giảm bởi việc thêm định kỳ vài giọt môi

trƣờng mới để các tế bào trần tái tạo thành và phân chia tạo callus.

2.3.3. Tái sinh tế ào trần

Các tế bào trần sau khi nuôi cấy thƣờng có biểu hiện tăng thể tích tế bào chất, tăng kích thƣớc và phát sinh hầu hết các cơ quan tử (chủ yếu là lục lạp) tụ thành đám quanh nhân (có thể quan sát rõ trên kính hiển vi). Tỷ lệ tái tạo và độ thành thục của thành tế bào trong quá trình nuôi cấy phụ thuộc vào các yếu tố: giai đoạn phân hóa của tế bào trần, điều kiện tách tế bào trần và tính đặc thù của loài thực vật. Quá trình tái tạo thành tế bào diễn ra ngay vài giờ sau khi tách và có thể hoàn thiện sau 2-7 ngày. Sau khi thành tế bào đƣợc tái tạo hoàn chỉnh, tế bào trần không còn giữ nguyên hình dạng nhƣ ban đầu.

Sự phân chia diễn ra liên tục và tạo thành các cụm đa bào gọi là microcallus (những cụm đa bào này là kết quả của sự tái tạo thành và sự phân chia tế bào). Sự phân chia tiếp tục xảy ra sau 1-3 tuần nuôi cấy và bắt đầu hình thành microcallus. Sau đó các microcallus đƣợc chuyển sang môi trƣờng không có áp suất thẩm thấu cao (môi trƣờng cứng) đê tạo thành macrocallus. Các macrocallus khi đƣợc chuyển sang môi trƣờng định hƣớng phân hóa có thể tiếp tục phát sinh thành cơ quan phân hóa nhƣ chồi, rễ, lá.. hay tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình phân chia của tế bào trần để hình thành callus phụ thuộc vào loại, nồng độ và tỷ lệ auxin/cytokinin bổ sung vào môit rƣờng nuôi cấy (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009).

Các tế bào trần đƣợc nuôi cấy trong đĩa petri nhỏ ( 3,5cm hoặc  5cm) với môi trƣờng lỏng phù hợp trong điều kiện tối 250C. Sau 3-4 tuần có thể thấy các microcallus xuất hiện. Các microcallus này sẽ đƣợc cấy chuyển sang đĩa petri

lớn ( 9cm) chứa môi trƣờng cứng Cul-medium (Haberlach et al., 1985). Các đĩa petri này đƣợc đặt trong phòng nuôi với quang chu kỳ là 16h chiếu sáng/ngày, nhiệt độ là 220C.

Sau 3-8 tuần có thể thu đƣợc các marcocallus với kích thƣớc 0,5-1,5mm nằm trên bề mặt thạch. Các marcocallus đƣợc cấy chuyển tiếp sang môi trƣờng tái sinh RJM (Möllers and Wenzel, 1992), đặt trong điều kiện nuôi cấy macrocallus. Khoảng 8-12 tuần sau khi cấy chuyển, marcocallus sẽ tái sinh thể chồi. Các thể chồi đƣợc chuyển sang môi trƣờng MS (Murashige and Skoog, 1962) để tạo cây hoàn chỉnh.

2.3.4. Dung hợp tế ào trần

Dung hợp tế bào trần hay tạo thể lai soma là một trong những ứng dụng

quan trọng nhất của nuôi cấy tế bào trần Quá trình dung hợp protoplast đƣợc kích

thích để hòa trộn 2 bộ genome của 2 loài vào mới nhau trong đó có thể là lai cùng loài, lai khác loài, khác genome hay thậm chí khác giới (điều mà không thể

thực hiện đƣợc bằng phƣơng pháp lai thông thƣờng). Thực tế là các tế bào trần

sau khi đƣợc tách ra, thành tế bào bị phân giải, chúng rất dễ dàng hòa trộn vào

với nhau trong điều kiện in vitro (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Quá trình

dung hợp tế bào trần có thể xảy ra một cách tự phát hay do kích thích bằng một

số nhân tố nhƣ cơ học, hóa học hay vật lý (gọi chung là dung hợp do kích thích).

2.3.4.1. Dung hợp tự phát

Sau khi các tế bào trần đƣợc tách ra (từ mô callus nuôi cấy hay các tế bào

sinh dƣỡng) dƣới dạng huyền phù nhờ các enzym phân giải thành tế bào, các sợi

liên bào (yếu tố kết nối giữa các tế bào tiếp giáp nhau) sẽ bị đứt gãy, từ đó kích

thích cá tế bào tiến sát lại gần nhau và xảy ra quá trình dung hợp tự phát hình

thành lên các tế bào đa nhân (2-40 nhân).

Kiểu dung hợp này thƣờng hay gặp ở các tế bào callus, với những tế bào có

kích thƣớc trung bình, hiếm gặp ở những tế bào sinh dƣỡng (mô lá). Chính vì vậy

quá trình dung hợp tự phát sẽ không thể tái sinh đƣợc cây hoàn chỉnh mà khả năng

phân chia rất ít. Hơn nữa trong quá trình tách tế bào trần hay cấy huyền phù tế bào

thƣờng làm cho các tế bào co nguyên sinh mạnh, hoặc làm đứt gãy cả nhóm sợi liên

bào nên sẽ làm giảm hiệu suất dung hợp. Do đó kiểu dung hợp này ít đƣợc sử dụng.

2.3.4.2. Dung hợp do kích thích

Sử dụng các nhân tố cơ học, hóa học hay điện năng để kích thích sự dung

hợp tế bào trần. Phƣơng pháp dung hợp bằng cơ học: Dùng micropipet trộn đều hỗn hợp hai loại tế bào trần của cùng một loài hay khác loài. Đầu tip của pipet đƣợc giới hạn một cách không hoàn toàn, các tế bào trần đƣợc hút lên hút xuống nhiều lần để tạo thành áp lực dòng chảy nén chúng lại để kích thích sự dung hợp.

Quá trình này dễ làm tổn thƣơng tế bào.

Hai đối tƣợng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới một

cách tự phát hoặc đƣợc cảm ứng bởi tác nhân nhƣ hóa chất (dung hợp hóa chất

polyethylen glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điện- electrofusion). Đối với cây khoai tây ngƣời ta đã sử dụng cả hai phƣơng pháp

trên. Tuy nhiên so với phƣơng pháp dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xung điện

đƣợc áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao hơn hơn do thao tác đơn giản, tốc độ

nhanh, hiệu suất dung hợp cao trong cùng một thời điểm và ít gây độc đối với tế

bào. Phƣơng pháp dung hợp bằng hóa chất PEG thƣờng gây độc cho tế bào trần do không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh sau này

(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009).

2.3.5. Chọn lọc các con lai soma

Nhìn chung khoảng 20%-25% tế bào trần có thể bị kích thích dung hợp

bởi các yếu tố kích thích mặc dù sự hình thành thể nhân có thể là 50-70%

(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Tuy nhiên, sự nhận biết các thể dị nhân là

không đơn giản, cần phải có các phƣơng pháp chọn lọc đặc trung. Việc tách đƣợc các cá thể lai heterocariot (dị nhân) ra khỏi các cá thể đồng dung hợp hay chƣa

dung hợp khi tái sinh là hết sức quan trọng. Trong mục tiêu nghiên cứu lý thuyết,

ngƣời ta có thể sử dụng các bố , mẹ có đặc trƣng rất khác nhau để dễ dàng

thanh lọc ra các thể lai trên môi trƣờng chọn lọc.

Bằng các phƣơng pháp chỉ thị phân tử (AFLP, RAPD, RELP, PCR) hoặc

Isozyme có thể xác định chính xác các con lai soma mang các gen của cả bố

và mẹ dung hợp.

Theo Thach et al. (1993) đã tạo thành công con lai soma giữa các nhóm

khoai tây thuộc Solanum tuberosum L., việc xác định con lai dựa trên phân tích

isozyme esterase, peroxidase và kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là EcoRI) đã xác định đƣợc các con lai đều có sự biểu hiện của 2 allele trội đơn gen Rx và Ry từ

bố mẹ dung hợp (partners).

Theo Thieme et al. (2008), con lai giữa Solanum tuberosum cv. Delikat và S. tarnii đƣợc xác nhận bằng chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeat) và AFLP (Amplified Fragment length polymorphism), đồng thời cũng dựa vào

đặc điểm hình thái và phân tích Flow cytometry. Kết quả cho thấy chỉ thị SSR

không cho kết quả với tổ hợp lai trên và các con lai BC1 còn AFLP cho kết quả

tốt để khẳng định đúng con lai soma.

Ngoài ra, để xác định con lai soma một số tác giả đã nghiên cứu thành

phần, hàm lƣợng alkaloid trong các cây lai. Theo Laurila et al. (1996) để xác

định con lai soma tiến hành phân tích thành phần SGAA (Steroidal Glycoalkaloid Aglycone) của cây lai. Kết quả cho thấy các thành phần alkaloid

của bố mẹ bao gồm solanidine và slanthrene của S. tuberosum, tomatidine của S.

brevidens đều có mặt trong cây lai. So sánh với bố mẹ, cho biết thành phần

SGAA trong cây lai cao hơn so với S. tuberosum nhƣng hàm lƣợng thấp vào

khoảng 20 mg/ 100g trọng lƣợng tƣơi.

Hơn nữa ngƣời ta có thể xác định con lai dựa vào đặc điểm hình thái khi

bố mẹ có đặc điểm khác nhau rõ rệt. Tuy nhiên phƣơng pháp này chỉ đƣợc áp

dụng đồng thời với phƣơng pháp xác định ở mức phân tử thì mới cho kết

quả chính xác nhất.

2.4. BỆNH MỐC SƢƠNG TRÊN CÂY KHOAI TÂY

2.4.1. Giới thiệu về ệnh mốc sƣơng

Bệnh mốc sƣơng do nấm Phytophthora infestans gây ra là bệnh gây hại

nghiêm trọng bậc nhất, đặc biệt bệnh nếu bùng phát thành dịch sẽ rất nguy hiểm

ở các vùng chuyên canh. Nguồn mốc sƣơng lan truyền chủ yếu là từ Mỹ vì tại

Mexico vào thế kỉ 19 khoai tây không phải loại lƣơng thực đƣợc trồng rộng rãi.

Cùng với sự phát tán của khoai tây tới các vùng trồng trọt ở châu Âu và châu Mỹ

một thời gian ngắn sau bệnh mốc sƣơng cũng nhanh chóng lan truyền và gây hại

nặng ở các vùng trồng trọt này. Bệnh mốc sƣơng đã gây ra mất mùa khoai tây ở

vụ đông năm 1845 và năm 1846 tại Ireland làm hơn 1.5 triệu ngƣời chết đói và

gần 1 triệu ngƣời chết trong khi di cƣ sang Mỹ để tránh nạn đói này. Bệnh mốc

sƣơng cũng gây nạn đói thứ 2 xảy ra ở nƣớc Đức năm 1919.

Triệu chứng bệnh trên lá bệnh lúc đầu chỉ là những điểm nhỏ màu xanh tái, hình dạng không đều, sau đó chuyển thành màu nâu và xanh nhạt, vết bệnh không có giới hạn rõ rệt. Lúc đầu bệnh thƣờng xuất hiện ở mép lá, cuống lá sau đó lan rộng vào phiến lá tạo thành những đám mô bị thối nâu, khi trời ẩm ƣớt

mặt dƣới lá chỗ có vết bệnh xuất hiện lớp nấm trắng xốp nhƣ sƣơng muối.

Về đặc điểm phát sinh và gây bệnh, nấm có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 4-260C nhƣng tối thích ở khoảng 16-200C, ẩm độ thích hợp là từ 91- 100%. Bào tử nấm có kích thƣớc trung bình khoảng 36 x 22 µm - 29 x 19 µm

(Erwin and Ribeiro, 1996), đƣờng kính sợi nấm từ 3,5 - 4,0 µm, khi nuôi cấy trên môi trƣờng nhân tạo có thể đạt kích thƣớc từ 7,0 - 16 µm. Trên mô bệnh nấm

hình thành các bào tử phân sinh hình ôvan, elíp hoặc hình quả chanh yên, bào tử

ngắn, đỉnh bào tử có núm nhỏ, kích thƣớc bào tử khoảng 29 - 36 µm x 19 - 22 µm.

Nấm mốc sƣơng có chu kì phát triển hoàn toàn với hai giai đoạn sinh sản

vô tính và sinh sản hữu tính. Sinh sản vô tính bằng bọc bào tử, dƣới hai hình thức

nảy mầm trực tiếp và nảy mầm gián tiếp thông qua bào tử động (hình thành trong

điều kiện lạnh, có giọt nƣớc). Nấm mốc sƣơng có 2 kiểu ghép cặp A1, A2 và một

dạng hữu tính. Sinh sản hữu tính phần lớn xảy ra ở các vùng lạnh ẩm và phải có đủ cả kiểu ghép cặp A1, A2. Bào tử trứng đƣợc hình thành khi có sự kết hợp giữa

A1 và A2 ở cạnh nhau, cơ quan sinh sản trên sợi nấm là bao trứng (Oogonium), và bao đực (Antheridium). Sau khi phối giao, nhân của bao đực dồn sang bao

trứng thụ tinh hình thành bào tử trứng lƣỡng bội (Oospore) với kích thƣớc

khoảng 31 x 50 m (Erwin and Ribeiro, 1996). Khi ở vùng khí hậu không thuận

lợi cho sự hình thành bào tử trứng hoặc chỉ có 1 trong 2 chủng nấm thì nấm mốc

sƣơng chỉ sinh sản theo kiểu vô tính.

Trong những nghiên cứu sau này chủng quần bao gồm cả A1 và A2 còn

đuợc phát hiện thêm ở Thái Lan, Nepal và Trung Quốc (Koh, 1999; Nishimura,

1999). Ở một số nƣớc tây Âu, Mỹ, Canada đã phát hiện giai đoạn sinh sản hữu

tính (Drenth, 1996).

Tại Việt Nam bệnh mốc sƣơng cà chua, khoai tây (còn đƣợc gọi là bệnh sƣơng mai, bệnh rám sƣơng, bệnh dịch muộn v.v… là một trong những bệnh nguy hiểm nhất trên cà chua, khoai tây, bệnh đặc biệt nghiêm trọng tại các vùng trồng có khí hậu mát và ẩm nhƣ Đà Lạt, Sơn La...

Các nghiên cứu trên đối tƣợng nấm mốc sƣơng P. infestans tại Việt Nam cho thấy bệnh phát triển mạnh trong điều kiện độ ẩm cao, nhiệt độ ban đêm tƣơng đối thấp, độ nhiệt ban ngày tƣơng đối cao. Nhiệt độ thích hợp cho bệnh phát sinh ban đầu vào khoảng 18 - 22°C, nếu trong điều kiện ẩm độ cao nhƣng nhiệt độ lại thấp hơn 10°C hoặc lớn hơn 28°C thì khó có khả năng xuất hiện bệnh trên đồng ruộng, ẩm độ thích hợp nhất cho bào tử P. infestans nảy mầm và xâm nhập vào cây phải đạt từ 90% cho đến độ ẩm bão hoà, ẩm độ thích hợp nhất cho sự phát triển bệnh là 76%, đặc biệt nếu thời tiết có thêm mƣa phùn và sƣơng mù thì bệnh sẽ phát triển rất nhanh, cây có thể bị tàn lụi trong vòng 7 - 10 ngày.

Nghiên cứu về đặc tính sinh học của quần thể nấm vào năm 2003 trong toàn bộ 130 isolate nấm thu thập đƣợc trên cà chua và khoai tây kết quả cho thấy tất cả các chủng đƣợc thu thập đều thuộc kiểu ghép cặp A1 (Ngô Thị Xuyên và Lê Hồng Vĩnh, 2003). 254 chủng thu thập đƣợc trong năm 2005 cũng thuộc kiểu A1 (Ngô Thị Xuyên và Lê Hồng Vĩnh, 2005). Nghiên cứu về cấu trúc gen của quần thể nấm P. infestans tại Việt Nam bằng mt-DNA haplotype và nhận dạng vùng GR57 cũng khẳng định rằng chủng quần nấm tại Việt Nam vẫn là chủng quần cũ (Le et al., 2008).

2.4.2. Đặc điểm xâm nhiễm của nấm P. infestans

Theo Andrivon et al. (2007), nấm mốc sƣơng P.infestans có thể xâm

nhiễm trực tiếp từ các bọc động bào tử hoặc xâm nhiễm gián tiếp nhờ động bào

tử. Các bọc động bào tử đƣợc phát tán nhờ gió, khi tiếp xúc với bề mặt lá khoai

tây mỗi bọc động bào tử có thể giải phóng 6 đến 12 động bào tử, điều này chỉ xảy

ra khi gặp điều kiện nhiệt độ thích hợp và bề mặt lá phải đủ ẩm. Sau khi tiếp xúc

các bọc động bào tử nhanh chóng nảy mầm để hình thành nên cấu trúc ống mầm là

bộ phận sẽ đâm xuyên vào mô lá trong quá trình xâm nhiễm. Dƣới điều kiện tối ƣu

quá trình xâm nhiễm thƣờng diễn ra trong vòng 2 giờ và sự xâm nhiễm có thể xảy

ra ở cả 2 mặt lá. Trong quá trình xâm nhiễm, sợi nấm mốc sƣơng tạo ra cấu trúc

vòi hút ăn lan giữa các khoảng gian bào và phát triển vào vùng tế bào chất. Từ vòi

hút của nấm P.infestans sẽ sản sinh ra các protein hiệu ứng (effector) mà cây trồng

có thể hoặc không thể nhận biết khi chúng đi qua màng tế bào.

Năm 2009 các nhà khoa học đã hoàn thành việc giải trình tự genome của nấm

P. infestans, genome của chúng có kích thƣớc khoảng 240 Mbp, lớn hơn nhiều so với

genome của các loài Phytopthora khác: genome của Phytophthora sojae có kích

thƣớc 95 Mbp và genome của Phytophthora ramorum có kích thƣớc khoảng 65 Mbp.

Genome của nấm P. infestans mang hàng loạt yếu tố di động và rất nhiều gen mang thông tin di truyền mã hóa cho các protein hiệu ứng có liên quan tới quá

trình gây bệnh. Những protein này đƣợc phân thành 2 nhóm dựa vào vị trí mà chúng đƣợc sản sinh. Nhóm thứ nhất là nhóm protein đƣợc sinh ra bên trong tế bào chất của tế bào ký chủ, gồm các protein RXLR có chứa trình tự Arginine-X- Leucine-Arginine (trong đó X là amino acid bất kỳ) ở đầu N của phân tử. RXLR, là những protein không độc nghĩa là chúng sẽ đƣợc cây nhận biết và khởi động phản ứng siêu nhạy (HR) để tiêu diệt nấm P. infestans. Khi nghiên cứu tổ hợp nấm P. infesstans trên cây khoai tây và sử dụng kính hiển vi video, ngƣời ta đã quan sát thấy

tế bào ký chủ sụp đổ và chết sau 26 giây và nấm chết sau đó khoảng 20 giây. Nấm P. infestans đƣợc cho là chứa một lƣợng lớn các protein hiệu ứng, nhiều hơn khoảng

60% so với các loài Phytopthora khác, điều này cho phép chúng có thể nhanh chóng

phá vỡ các chiến lƣợc tự vệ của cây ký chủ (Haverkort et al., 2009).

Theo nghiên cứu của Jiang et al. (2008) thì các protein hiệu ứng RXLR đƣợc

mã hóa bởi khoảng 700 gen thuộc họ gen Avh (avirulence homologs genes). Các nhà

khoa học thuộc trƣờng đại học Wageningen (Hà Lan) và Viện Nghiên cứu cây

lƣơng thực Xcốt-len đã tiến hành nghiên cứu trên 700 gen mã hóa protein hiệu ứng

và nhận thấy rằng có khoảng 400 gen không tạo ra RNA trong cây và vì vậy chúng không tạo ra chất hiệu ứng trong quá trình xâm nhiễm của nấm P. infestans. Nhóm

chất hiệu ứng thứ hai là các protein đƣợc sinh ra trong gian bào của tế bào ký chủ (apoplast), bao gồm các enzyme thủy phân nhƣ protease, lipase và glycosylase đóng

vai trò phá hủy mô thực vật; các enzyme ức chế đóng vai trò bảo vệ nấm khỏi các cơ

chế phòng thủ của cây ký chủ trong quá trình xâm nhiễm.

2.4.3. Cơ sở phân tử của tính kháng ệnh mốc sƣơng do nấm P.infestans gây ra Theo Adillah et al. (2008) trong quá trình phát triển cây khoai tây cũng nhƣ các cây trồng khác luôn là đối tƣợng gây hại của rất nhiều các tác nhân gây cả

trên và dƣới mặt đất, đặc biệt là các vi sinh vật gây hại nhƣ virus, vi khuẩn,

nấm... với từng đối tƣợng gây bệnh, cây trồng sẽ có các chiến lƣợc kháng để

chống lại sự xâm nhiễm và gây bệnh của chúng. Các chiến lƣợc này là một phần

của hệ thống miễn dịch thực vật, có thể đƣợc chia làm 2 nhóm lớn. Thứ nhất là

chiến lƣợc kháng dựa trên cơ sở các thụ thể trên màng tế bào (receptor) nhận biết

các mô hình liên quan đến tính gây bệnh (pathogen/microbe associated molecular

patterns – MAMP/PAMPs). Chiến lƣợc nhận biết MAMP/PAMPs đƣợc coi nhƣ

tín hiệu cảnh báo sớm cho tế bào khi xảy ra sự xâm nhiễm, một số mô hình

MAMP/PAMPs bao gồm các phân tử tín hiệu nhƣ flagellin, lipopolysaccharide và các nhân tố Tu kéo dài có nguồn gốc từ các vi khuẩn Gram âm; chitin, b- glucan và ergosterol có nguồn gốc từ nấm; họ protein CBEL có khả năng liên kết chặt với cellulose và PEP13 – một cấu trúc peptide nằm trong enzyme chuyển

hóa Glutamine có nguồn gốc từ nấm trứng.

Các phân tử tín hiệu (chất kích hoạt) đƣợc nhận biết trong mô hình tƣơng tác MAMP/PAMPs có đặc điểm là khá bảo thủ ở nhiều đối tƣợng sinh vật, sự nhận biết các chất kích hoạt đƣợc đảm nhiệm bởi các thụ thể nằm trên màng tế bào để tạo ra tính kháng cơ bản. Tuy nhiên, tác nhân gây bệnh có thể khắc phục

tính kháng cơ bản bằng cách tiết vào tế bào cây các chất hiệu ứng (effector) vƣợt qua rào cản kiểm soát của các thụ thể trên màng tế bào. Các loại nấm sinh dƣỡng/bán sinh dƣỡng tiết vào tế bào cây nhiều effector thông qua vòi hút (haustorium) hình thành bên trong tế bào ký chủ. Nhiều effector của tác nhân gây bệnh có hoạt tính enzym, có vai trò biến đổi các protein của ký chủ nhằm tạo điều kiện cho sự gây bệnh và vô hiệu hóa khả năng nhận biết của cây. Một trong các vai trò của các effector này là ức chế phản ứng phòng thủ của cây thông qua mô hình nhận biết MAMP/PAMPs. Nếu hoạt động của các effector này có hiệu quả, cây sẽ bị nhiễm bệnh (Adillah et al., 2008).

Nhƣng ngoài chiến lƣợc kháng bệnh dựa trên các mô hình MAMP/PAMPs, cây trồng còn có chiến lƣợc kháng thứ 2 cho hiệu quả kháng cao hơn và kháng trên phổ rộng đó là tính kháng dựa trên các protein kháng (resistance proteins) đƣợc mã hóa bởi các gen kháng R (resistance genes). Các protein kháng R có vai trò nhận biết, tƣơng tác với các chất hiệu ứng có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh và khởi động phản ứng siêu nhạy, tƣơng tác giữa protein kháng R - chất hiệu ứng đƣợc nghiên cứu đầu tiên bởi Flor (1971) và ông đƣa ra thuật ngữ “gen đối gen” để chỉ mối tƣơng tác này. Các chất hiệu ứng đƣợc nhận biết bởi các protein R đƣợc gọi là các protein không độc Avr (Avirulence protein) mã hóa bởi các gen Avr – gen quy định tính không độc.

Các nghiên cứu gần đây trên đối tƣợng nấm mốc sƣơng P. infestans chỉ mới phát hiện đƣợc một số gen Avr mã hóa các protein nội bào, các protein này đƣợc cho là sẽ hoạt động bên trong tế bào ký chủ. Tất cả các gen Avr của nấm P. infestans đã đƣợc phát hiện cho đến nay đều mã hóa cho các protein mang đoạn peptide tín hiệu có trình tự Arginine – X – Leucine – Arginine (trong đó X là axit amin bất kỳ) và chứa trình tự EER ở đầu axit của phân tử protein. Cấu trúc kép RXLR – EER này cần thiết cho quá trình xâm nhập và di chuyển của các protein hiệu ứng bên trong tế bào ký chủ. Nhờ có cấu trúc kép RXLR-EER, protein Avr3a đƣợc sinh ra tại vòi hút của nấm P. infestans đi vào tế bào chất của tế bào ký chủ. Sau khi vào tế bào chất, protein Avr3a có thể tƣơng tác với các protein kháng R của cây ký chủ và phản ứng kháng của cây đƣợc khởi động (Whisson et al., 2007).

Dựa trên cơ sở tƣơng tác phân tử giữa nấm bệnh P. infestans – cây trồng, các nhà khoa học hiện đang tập trung nghiên cứu theo hƣớng sử dụng các gen kháng R trong công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng và bƣớc

đầu đã đạt đƣợc kết quả khá khả quan.

2.4.4. Các nghiên cứu về gen kháng ệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây

Sau khi bệnh mốc sƣơng khoai tây trở thành một vấn nạn vào khoảng giữa

thế kỉ 20, đã có nhiều giải pháp khác nhau đƣợc đề xuất. Đầu tiên là biện pháp hóa

học: sử dụng hỗn hợp Boocđo, một hỗn hợp giữa vôi cùng với dung dịch đồng

sunphat…. Một giải pháp khác đƣợc đề xuất vào khoảng những năm 1900s, sau khi

Salaman thu đƣợc một ít củ của loài khoai tây dại từ vƣờn bách thảo Kew nƣớc

Anh, có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng. Loài dại này sau đó đƣợc chứng minh là

loài S. demissum, có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng nhƣng không hoàn toàn

(Salaman, 1910). Từ đây 11 gen kháng R (R1-R11) từ loài S. demissum đã đƣợc phát

hiện (Black et al., 1953; Eide et al., 1959; Malcolmson et al., 1969), sau đó đã đƣợc

đƣa vào khoai tây trồng cung cấp cho thị trƣờng trong những năm 1950s, 1960s.

Sau khi đƣợc phát hiện, đã có nhiều nghiên cứu thực hiện trên các đối

tƣợng gen kháng này, trong số 11 gen kháng có đƣợc từ loài khoai tây S.

demissum, gen R1 nằm trên nhiễm sắc thể số V (Leonards and Schippers, 1992),

gen R2 định vị trên nhiễm sắc thể số IV, các gen R3, R6, R7 đƣợc định vị trên

nhiễm sắc thể số XI, gen kháng R5, R8, R9, R10 và R11 đều nằm trên nhiễm sắc

thể XI và là các alen khác nhau của locus gen R3 (Li et al., 2011).

Bradshaw et al. (2005) chỉ ra rằng gen R10 và R11 nằm trên nhiễm sắc thể

số 11 và là các dạng alen khác nhau của các gen thuộc locus R3 trên nhiễm sắc

thể XI. Các nhà khoa học đã tiến hành định vị các gen kháng, theo đó gen R11

liên kết với marker PAG/MAAG-172.3 với khoảng cách 8,5cM và gen R10 liên

kết với chỉ thị phân tử PAC/MATC-264.1.

Nghiên cứu theo hƣớng tối ƣu hóa phƣơng pháp PCR nhằm phát hiện các

gen kháng bệnh bằng marker phân tử trên cây khoai tây của Mori et al. (2011) đã

kết luận rằng gen R1 có nguồn gốc từ loài S. demissum đƣợc định vị trên nhiễm

sắc thể số V (Leonards and Schippers, 1992) liên kết chặt với chỉ thị phân tử R1

và đƣợc phát hiện nhờ cặp mồi liên kết đặc hiệu 76-2sf2 – 76-2SR, khi tiến hành

phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu sẽ cho sản phẩm có kích thƣớc khoảng

1400bp. Gen kháng R2 định vị trên nhiễm sắc thể số IV liên kết chặt với chỉ thị

phân tử R2-800, đƣợc phát hiện nhờ cặp mồi đặc hiệu R2SP-S7 – R2SP-A9 và

cho kích thƣớc đoạn nhân khoảng 800bp.

Với 11 gen kháng (R1-R11) đã đƣợc phát hiện đều là các gen kháng đặc

hiệu chủng có tính kháng cao nhƣng chỉ kháng đƣợc một số kiểu gen (chủng,

nòi) của tác nhân gây bệnh, tính kháng dựa trên các gen kháng này đƣợc gọi là

tính kháng đặc hiệu chủng hay tính kháng dọc.

Tuy nhiên, tính kháng có đƣợc từ những gen này chƣa thực sự hiệu quả,

ngay sau khi các giống kháng bệnh đƣợc đƣa vào sản xuất thì tác nhân gây bệnh

đã cho thấy khả năng biến đổi mô hình gây bệnh của chúng, kết quả là tạo ra các

chủng mới có thể gây bệnh trên cây khoai tây mang các gen kháng R. Vì vậy

hƣớng đi này nhanh chóng cho thấy sự kém hiệu quả trong biểu hiện tính kháng

đối với tác nhân gây bệnh cũng nhƣ hạn chế về tính bền vững.

Yêu cầu đặt ra cho các nhà chọn tạo giống khoai tây là cần phải tìm đƣợc

những nguồn vật liệu mới cho tính kháng trên diện rộng, kháng đƣợc nhiều chủng

nấm P. infestans (tính kháng không đặc hiệu chủng) và cho hiệu quả kháng bền

vững. Cho đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện đƣợc nguồn vật liệu thay thế các

gen kháng đặc hiệu chủng có nguồn gốc từ S. demissum, đó là các locus gen và gen

kháng không đặc hiệu chủng hay các gen kháng ngang có nguồn gốc từ các loài

khoai tây dại nhƣ S. berthaultii, S. pinnatisectrum và S. microdontum….

Bằng các phƣơng pháp phân tích di truyền định tính và định lƣợng thực

hiện trên loài S. microdontum, Adillah et al. (2008, 2010) đã phát hiện đƣợc một

locus gen kháng bệnh mốc sƣơng trên loài dại này. Locus gen này nằm trên vai

ngắn của nhiễm sắc thể số IV, giữa chỉ thị phân tử AFLP pCTmAGG_310 và

CAPS (sự đa hình các đoạn cắt đƣợc khuếch đại - Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) chỉ thị TG339, T0703. Vị trí của gen Rpi-mcd1 đƣợc phát hiện là trùng khớp với một cụm gen kháng P. infestans khá bảo thủ, mang các gen kháng gồm R2, R2-like, Rpi-blb3 và Rpi-abpt trên nhiễm sắc thể sốIV4. Điều này cho thấy gen Rpi-mcd1 đƣợc phát hiện từ loài dại S. microdontum là gen kháng thứ 5 đƣợc tìm thấy trong cụm gen này.

Trên loài khoai tây dại S. berthaultii các nhà khoa học đã phát hiện gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-ber nằm trên nhiễm sắc thể số 10. Các chỉ thị đặc hiệu trên nhiễm sắc thể số 10 gồm Q133, CT214 và TG63 liên kết khá chặt với gen Rpi-ber với khoảng cách lần lƣợt là 6.4, 5.1 và 1.3cM.

Một số gen kháng có nguồn gốc từ các loài khoai tây dại khác đã đƣợc định vị, chẳng hạn nhƣ gen kháng trội Rpi1 từ loài dại S. pinnatisectum đƣợc định vị nằm trên nhiễm sắc thể số VII (Kuhl et al., 2001), các gen kháng từ những loài dại nhƣ S. Mochiquense: gen Rpi-moc1 (Smilde et al., 2005); loài dại

S. Phureja: gen Rpi-phu1 (Sliwka et al., 2011); loài dại S. venturiiI: gen Rpi-vnt1 (Foster et al., 2009); loài dại S. Dulcamara: gen Rpi-dlc1 (Golas et al., 2010) đều đƣợc định vị trên nhiễm sắc thể số X.

Một nguồn gen kháng mốc sƣơng mới đƣợc phát hiện gần đây và hiện

đang đƣợc tập trung nghiên cứu là các gen kháng có nguồn gốc từ loài khoai tây

dại Solanum bulbocastanum. Đây là loài dại nhị bội, có nguồn gốc từ vùng trung

Mỹ, phát triển tại vùng đồi núi có độ cao từ 1200 đến 2300 mét so với mực nƣớc

biển, thuộc đông bắc Mexico (Spooner et al., 2005). Cho đến nay các nhà khoa

học đã phát hiện và nhân dòng đƣợc 4 gen kháng bệnh mốc sƣơng có nguồn gốc

từ loài dại Solanum bulbocastanum thuộc vùng lặp giàu Leucine (NBS-LRR), bao gồm: Gen Rpi-blb1 (van der Vossen et al., 2003) hay còn đƣợc biết đến với tên RB (Song et al., 2003); gen Rpi-blb2 (van der Vossen et al., 2005); gen Rpi-blb3 (Lokosou et al., 2009); gen Rpi-bt1 (Oosumi et al., 2009) đƣợc phát hiện từ phép lai giữa S. bulbocastanum và S. tuberosum.

Trong đó, gen Rpi-blb1/RB, định vị trên nhiễm sắc thể số VIII, gần chỉ thị CT64 và thuộc một cụm gồm 4 gen kháng tƣơng đồng (resistance gene analogues – RGAs) (van der Vossen et al., 2003); gen Rpi-blb2 nằm trên nhiễm sắc thể số VI gần chỉ thị phân tử CT119; gen Rpi-blb3 định vị trên nhiễm sắc thể số IV gần chỉ thị phân tử TG339 và nằm trong cụm gen kháng mốc sƣơng đặc hiệu chủng (R2, Rpi-abpt, R2-like). Nhóm gen kháng này là các gen kháng không đặc hiệu chủng, cho hiệu quả kháng cao và khá bền vững.

Các nghiên cứu về sự đa dạng, phạm vi phân bố cũng nhƣ quá trình tiến

hóa của các gen kháng mốc sƣơng có ở loài dại S. bulbocastanum đã đƣa ra các cặp mồi liên kết đặc hiệu với những gen kháng này. Gen Rpi-blb1/RB đƣợc phát hiện bởi 2 cặp mồi là Blb1 (Wang et al., 2008) và 1/1’, các cặp mồi này liên kết đặc hiệu với gen Rpi-blb1/RB và sẽ khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc lần lƣợt là 820 và 213bp (Wang et al., 2008); gen Rpi-blb2 đƣợc phát hiện nhờ cặp mồi Blb2F/R, cặp mồi này liên kết đặc hiệu với gen Rpi-blb2 và cho đoạn DNA đƣợc khuếch đại có kích thƣớc khoảng 715bp (Lokossou et al., 2010), trong khi Wang

et al. (2008) cho rằng cặp mồi Blb2F/R sẽ khuếch đại đoạn DNA có kích thƣớc

khoảng 773bp.

Cặp mồi Blb3F/R đƣợc cho là liên kết đặc hiệu với gen kháng mốc sƣơng Rpi-blb3 và sẽ khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 618bp (Wang et al., 2008).

2.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY

2.5.1. Chọn tạo giống khoai tây ằng phƣơng pháp truyền thống

Các phƣơng pháp chọn tạo khoai tây truyền thống thƣờng đƣợc áp dụng

nhƣ kỹ thuật lai tạo, lai lại (backcross), đột biến và chọn lọc (Kuckuck et al., 1985). Nhƣợc điểm của phƣơng pháp truyền thống là vấp phải những khó khăn về

mặt đặc tính di truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum). Đó là bộ

genom của khoai tây trồng trọt ở thể tứ bội tetraploid (2n=4x = 48 nhiễm sắc thể),

gây ra sự phân ly sau lai tạo với một quần thể rất lớn, rất phức tạp, đòi hỏi quá

trình chọn lọc tốn rất nhiều công sức. Quá trình này đòi hỏi tối thiểu 10 năm để có đƣợc một giống lai ra đời (Fitsden, 1984). Ngoài ra, nhiều đặc tính chống chịu do

nhiều gen quy định sẽ có thể mất dần trong quá trình chọn lọc ở các thế hệ tiếp sau.

Các tính trạng không mong muốn ở các dòng khoai dại (hình thái củ xấu, mắt

sâu,…) lại xuất hiện ở con lai lại đòi hỏi quá trình lai lại tốn rất nhiều thời gian.

2.5.2. Chọn tạo giống khoai tây ằng phƣơng pháp chuyển gen

Ngay từ năm 1986, để giảm thiệt hại do bệnh hại và virus, con ngƣời đã chuyển nạp các gen mang trình tự mã hóa protein có tác dụng làm tăng tính kháng virus hoặc kháng bệnh vào thực vật. Trồng khoai tây kháng virus đã đem lại lợi nhuận tăng tới 22% ở Mexico (trong khi chỉ có 1/4 diện tích trồng khoai tây của nƣớc này sử dụng giống khoai tây xác nhận). Các phƣơng pháp tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng con đƣờng chuyển gen bao gồm: chuyển gen tổng hợp protein vỏ tạo cây khoai tây kháng virus; tạo cây khoai tây kháng virus nhờ chuyển gen tổng hợp protein vận chuyển của virus; tạo cây khoai tây kháng virus nhờ chuyển gen tổng hợp enzym sao chép và tạo cây khoai tây kháng virus nhờ làm câm các gen sau phiên mã của virus.

Ngoài chuyển gen kháng bệnh virus, cũng có các nghiên cứu về chuyển gen kháng bệnh mốc sƣơng đƣợc phát hiện từ loài khoai tây dại S. bulbocastanum có nguồn gốc từ Mê-xi-cô. Ngoài kháng bệnh mốc sƣơng, loài dại này cũng kháng bệnh tuyến trùng (root-knot), héo xanh (Verticillium wilt) và rệp.

Nhược điểm của phương pháp chuyển gen

+ Nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng không thể chuyển vào cây trồng bằng công nghệ gen do chúng đƣợc kiểm soát bởi đa gen; hoặc các gen kiểm soát các tính trạng mong muốn vẫn chƣa đƣợc biết đến.

+ Nhiều gen rất khó để tách ra đƣợc và nhân dòng thành công.

+ Do khoai tây là cây lƣơng thực, thực phẩm nên vẫn còn nhiều tranh cãi

về sử dụng sản phẩm chuyển gen (GMO).

2.5.3. Chọn tạo giống khoai tây ằng phƣơng pháp dung hợp tế ào trần 2.5.3.1. Các nghiên cứu về chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương bằng phương pháp dung hợp tế bào trần ở nước ngoài

Có rất nhiều biện pháp đã đƣợc đƣa ra để hạn chế tác hại của bệnh mốc sƣơng gây ra nhƣ sử dụng tập đoàn giống mới cho các vùng nhiễm bệnh, sử dụng

các thuốc hoá học nhƣng chƣa đem lại kết quả nhƣ mong đợi. Các nghiên cứu

gần đây cho thấy các loài khoai tây dại nhƣ S. pinatisectum, S. tarnii,

S. bulbocastanum mang nguồn gen kháng bệnh mốc sƣơng cao. Tuy nhiên rất

khó để chuyển đặc tính kháng này qua lai tạo hữu tính giữa các loài dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do sự không tƣơng hợp về genom, sự bất

thụ trong lai xa. Để khắc phục hiện tƣợng này, lai soma (dung hợp tế bào) đƣợc

áp dụng để chuyển tính kháng mốc sƣơng từ khoai tây dại vào khoai tây trồng.

Đây là hƣớng đi đúng đắn và đã đƣợc nhiều nghiên cứu chứng minh về khả năng

chuyển các đặc tính quý của các loài khoai tây khác nhau thông qua dung hợp tế

bào (Mattheij et al., 1992; Thach et al., 1993; Thieme et al., 2000, 2008, 2010).

Hƣớng nghiên cứu mới là sử dụng nguồn gen khoai tây dại có đặc tính

kháng bệnh mốc sƣơng rất điển hình làm nguyên liệu dung hợp trực tiếp với các

dòng khoai tây trồng để tạo các con lai soma mang đặc tính chống chịu virus mốc

sƣơng và rệp truyền bệnh Các dòng lai này sẽ đƣợc sử dụng làm vật liệu lai lại

với chính bố mẹ của chúng. Kết quả tạo ra các dòng khoai tây trồng trọt mang

đặc tính kháng bệnh virus rõ rệt cùng với các đặc tính nông sinh học tốt của bố

mẹ. Đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại để chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai hữu tính

(Thieme et al., 2010): S. Chacoense (Butenko et al., 1982); S.niggrum (Binding et

al., 1982, 1988); S.brevidens (Austin et al., 1985; Helgeson, 1993); S.circaeifolium (Mattheij et al., 1992); S.berthaultii (Serraf et al.,1991); S.commersonii (Cardi et al., 1993); S.khasianum, S.aculeatissimum (Stattmann et al., 1994); S.torvum (Jadari et al., 1992); S.phureja (Puite et al., 1986); S.pinnatisectum (Sidorov et al., 1987, 1994; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995); S.bulbocastanum (Austin et al., 1993; Brown et al., 1995; Schilde-Rentschler et

al., 1993; Thieme et al., 1995).

Mê-xi-cô là một trung tâm phát sinh của cả P. infestans và các loài khoai

tây dại. Nơi đây đã tồn tại các chủng P. infestans có hoạt tính mạnh nhất và độc hại nhất. Sở dĩ các loài khoai tây dại có thể sống đƣợc ở đây là do chúng có khả

năng kháng cao với hầu hết các chủng gây bệnh. Do đó, các loài khoai tây dại

này nhƣ một nguồn cung cấp gen giàu có cho quá trình cải tiến giống khoai tây

của các nhà chọn tạo giống và các nhà di truyền học. Chi Petota thuộc họ Solanum gồm khoai tây trồng và các loài dại thân thuộc của chúng, gồm khoảng

200 loài dại. Trong chúng có các loài có khả năng kháng với các loại bệnh và dịch hại cũng nhƣ các stress phi sinh học. Nhiều loài đã đƣợc bảo tồn trong ngân

hàng gen khoai tây quốc tế ở Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and

Crop Plant Research, IPK, Genebank) và các nƣớc khác, chúng đã đƣợc đánh giá

và khai thác cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây. Chúng đƣợc đánh giá

một cách có hệ thống về các tính kháng và sự hình thành năng suất, chúng đƣợc ghi vào danh sách và lƣu trữ nhằm để cung cấp các tính trạng vốn không có ở

nguồn gen cây trồng. Để khai thác các dòng khoai tây dại, có hàng loạt các công

bố theo hƣớng này.

Thieme et al. (1997) đã lai tạo thành công giữa khoai tây trồng S.

tuberosum (2n = 2x và 2n = 3x) với 2 loài khoai tây dại nhị bội Mê-xi-cô

(S.pinnasisexta và S.bulbocastana) qua dung hợp tế bào trần bằng xung điện. Sắc

xuất thành công của dung hợp đạt 63-89%. Tỷ lệ thành công cao này có thể đƣợc

giải thích là do các protoplast của bố mẹ đã bị chết hoặc các con lai có khả năng

tái sinh cao hơn so với các dạng bố mẹ. Qua phân tích isozym và chỉ thị phân tử

(RAPD) đã chọn lọc đƣợc các con lai soma tổ hợp đƣợc các đặc tính nông sinh

học quý của khoai tây trồng S. tuberosum và khả năng kháng bệnh mốc sƣơng

cao của các loài khoai tây dại.

Dinu and Thieme (2000) đã tạo thành công tổ hợp lai giữa các loài khoai

tây dại với các giống khoai tây trồng S. tuberosum L., các dòng khoai tây chọn tạo giống và các dòng nhị bội nhằm để chuyển các gen kháng bệnh mốc sƣơng và

các gen kháng bệnh virus vào khoai tây trồng. Sử dụng phân tích Flow cytometry, microsatellite và isozym để xác định các con lai khác loài. Các nguyên liệu này là nguồn tiềm năng cho việc cải biến tính di truyền và nông sinh học cho cây khoai tây. Ngoài tổ hợp các đặc tính kháng bệnh, phƣơng pháp dung hợp tế bào trần còn để tổ hợp các đặc tính kháng các stress sinh học và phi sinh

học vào cây trồng (Chen et al., 1999; Naess et al., 2000; McGrath et al., 2002).

Thieme et al. (2004) đã tạo đƣợc 500 con lai soma khác loài qua dung hợp

tế bào trần giữa các loài khoai tây dại thuộc chi Pinnatisecta và chi Etuberoa với các dòng/giống khoai tây trồng. Các loài dại S. cardiophyllum và S. tarnii có khả

năng kháng với P. infestans. Các con lai soma đƣợc chọn lọc và lai lại

(backcross) với khoai tây trồng. Sử dụng phƣơng pháp test trên lá, củ; phƣơng

pháp lây nhiễm nhân tạo, cho thấy các con lai soma và các dòng con lai BC đều có khả năng kháng với bệnh mốc sƣơng trên lá và củ.

Thieme et al. (2007) đã dung hợp thành công tổ hợp S. tarnii (2n=2x=24)

và S. Etuberosum với cv. Delikat. Con lai soma tạo thành đƣợc xác định độ bội

bằng máy Flowcytometry, xác nhận con lai soma heterozygote bằng kỹ thuật

SSR, chỉ thị AFLP và phân tích đa hình isozym. Những cây lai soma đều biểu

hiện tính kháng rất cao với dòng virus PVY và kháng nấm P. infestans rất tốt qua

phản ứng siêu nhạy (HR-hypersensitive reaction). Thế hệ BC1 và BC2 cũng biểu

hiện tính kháng virus và kháng nấm cao, không những vậy tính kháng này rất bền

vững ở cả con lai và thế hệ BC.

Các con lai soma khác loài giữa giống khoai tây trồng Delikat với loài

khoai tây dại S. tarnii lần đầu tiên đƣợc tạo ra bằng công nghệ dung hợp tế bào

trần bằng xung điện (Thieme et al., 2008). Các con lai ngẫu nhiên tái sinh đƣợc

chọn lọc bằng các chỉ thị phân tử (SSR, AFLP); phân tích hình thái và xác định

độ bội bằng Flow cytometry. Các con lai soma chọn lọc đƣợc đã đƣợc lai lại thành

công với cv.Delikat. Các dòng bố mẹ, các con lai soma, các con lai BC1 đều đƣợc

kiểm tra tính kháng virus PVY bằng lây nhiễm nhân tạo, ghép với cây chỉ thị và

tiếp xúc với môi giới truyền bệnh trên đồng ruộng; đồng thời chúng cũng đƣợc

kiểm tra tính kháng bệnh mốc sƣơng trên lá và trên củ. Kết quả cho thấy, các con

lai soma đều không có biểu hiện bị nhiễm virus PVY và hầu hết chúng đều có khả

năng kháng cao với bệnh mốc sƣơng trên lá. Các con lai BC1 có khả năng kháng

cao với virus PVY và một số ít kháng đƣợc mốc sƣơng trên lá. Các con lai soma

và con lai BC1 chọn lọc đƣợc cũng đƣợc đánh giá trên đồng ruộng về khả năng

hình thành năng suất và chất lƣợng củ. Một số dòng BC1 đã hình thành củ với

năng suất và chất lƣợng tốt. Các kết quả này đã khẳng định, ở con lai soma có biểu

hiện đồng thời cả tính kháng virus và mốc sƣơng; tính kháng virus đƣợc chuyển

vào thế hệ BC1, nhƣng tính kháng mốc sƣơng thì rất khó chuyển. Điều này chứng

tỏ rằng công nghệ lai tế bào là một công cụ đắc lực trong việc tạo các nguyên liệu

đầu vào cho chọn tạo giống với độ đa dạng di truyền cao.

Thieme et al. (2010) đã tạo đƣợc các con lai không chỉ đa dạng về hình

thái, các tính trạng nông sinh học mà chúng cũng đồng thời kháng đƣợc cả bệnh

và sâu hại. Trƣớc đây, các con lai soma chƣa đƣợc đánh giá một cách hoàn thiện

về tất cả các dữ liệu. Trong nghiên cứu này, các tác giả đã tạo đƣợc các con lai

soma với đầy đủ các dữ liệu về đặc điểm hình thái, đặc tính nông sinh học, độ

bội, tính kháng với virus, mốc sƣơng và côn trùng hại CPB (Colorado potato

beetles). Điểm khác biệt rõ nhất ở nghiên cứu này là các nhà nghiên cứu đã tạo ra

đƣợc các con lai soma và các con lai BC mang đồng thời tính kháng bệnh virus,

mốc sƣơng và côn trùng CPB.

Để chuyển tính kháng bệnh mốc sƣơng từ loài khoai tây dại Solanum

michoacanum (mch) (có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng cao) vào khoai tây

trồng Solanum tuberosum, các phép lai soma bằng dung hợp tế bào trần đã đƣợc

áp dụng giữa mch với 2 dòng khoai tây nhị bội DG 81-68 và DG 88-89 và

giống khoai tây trồng tứ bội Rynal nhạy cảm với bệnh mốc sƣơng (Smyda et

al., 2013). Tổng số có 18,775 callus đƣợc hình thành trong đó tái sinh đƣợc

1,482 chồi. Sử dụng các chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequences Repeat), CAPS

(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences), RAPD (Random Amplified

Polymorphic DNA, các tác giả đã xác định đƣợc 228 con lai khác loài và 116

con lai cùng loài (4x mch). Các con lai này đã đƣợc đánh giá về các đặc tính

hình thái, khả năng ra hoa, sức sống của hạt phấn, khả năng hình thành củ và

khả năng kháng bệnh mốc sƣơng bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời.

Sau 2 vụ đánh giá các tác giả đã chọn lọc đƣợc 3 con lai soma giữa khoai tây

dại mch với khoai tây trồng Solanum và 109 con lai cùng loài 4x mch có khả

năng kháng bệnh mốc sƣơng. Các dạng kháng bệnh này đồng thời có sức sống

hạt phấn tốt sẽ đƣợc dùng cho các chƣơng trình lai tạo để chuyển tính kháng

bệnh từ loài dại mch vào khoai tây trồng.

Tiếp nối các nghiên cứu này, Smyda et al. (2016) đã dung chỉ thị DArT

(Diversity array technology) để phân tích thành phần genom nhân của 97 con lai

soma của tổ hợp lai giữa S.michoacanum với S.tuberosum và 11 con lai cùng loài

4x mch (những con lai có tính kháng bệnh mốc sƣơng). Phân tích cấu trúc nhiễm

sắc thể của các con lai đã cho thấy sự có mặt hay không có mặt của các chỉ thị

phân tử từ genom của cả bố và mẹ dọc theo chiều dài của nhiễm sắc thể của các

con lai soma.

2.5.3.2. Các nghiên cứu về chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương bằng phương pháp dung hợp tế bào trần ở trong nước

Mặc dù thế giới đang tiến rất nhanh và đạt đƣợc khá nhiều thành tựu trong

chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh và sâu hại bằng công nghệ dung hợp tế bào

trần, song ở Việt Nam, cho đến nay công nghệ này vẫn còn hết sức mới mẻ.

Một số nghiên cứu trong nƣớc về chọn tạo giống khoai tây chống chịu

bệnh mốc sƣơng: Tại Sapa – Lào Cai (1988-1990) đã tiến hành đánh giá tính

kháng bệnh mốc sƣơng trên nguồn vật liệu do CIP cung cấp gồm 6 dòng giống BR: 2-71; 2-46; 2-88; 2-33; 2-100 vụ thu đông 1990 (Từ tháng 9 đến tháng 11),

kết quả cho thấy có 3 dòng kháng ở mức độ khá với bệnh mốc sƣơng (LBR: 2-

71; 2-46 và 2-100), thể hiện tính kháng cao hơn so với đối chứng (Đào Huy

Chiên và Trịnh Văn Mỵ, 1990). Theo tác giả Phạm Xuân Tùng (1988) tại Đà Lạt, điều kiện khí hậu và tính kháng của giống là rất quan trọng đối với sự phát triển

của bệnh mốc sƣơng, ví dụ trên cùng giống khoai tây Atzimba mức độ nhiễm

mốc sƣơng mùa mƣa là 5, năng suất là 6,3 tấn/ha và mùa khô là 3 và năng suất là

13,3 tấn/ha (chênh lệch 211%), giống LT-2: 238%, Giống P-006-16: 247%.

Nhƣng đối với giống kháng BR-112-113 mức độ nhiễm bệnh mùa mƣa là 4 và

mùa khô là 3 tƣơng ứng năng suất là: 14,3 và 13,1.

Bằng việc áp dụng công nghệ sinh học đánh dấu phân tử trong chọn tạo

giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng, tháng 5 năm 2005, CIP đã cung cấp cho

Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Cây có củ (RCRDC) 32 dòng giống kháng

bệnh mốc sƣơng, trung tâm đã nghiên cứu đánh giá các dòng giống trên ở các

vùng sinh thái đồng bằng (tại Thanh trì- Hà nội) và vùng cao phía bắc (tại Tân

lạc và Đà bắc thuộc tỉnh Hoà bình.

Nhƣ vậy hƣớng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây lâu nay ở Việt Nam

chủ yếu vẫn là công tác nhập nội và khảo nghiệm, trên cơ sở đó đề xuất các giống phù hợp cho sản xuất. Cùng với những tiến bộ và thành tựu đạt đƣợc của thế giới trong nghiên cứu cải tạo giống cây trồng bằng dung hợp tế bào trần, Việt Nam đang dần kế thừa và bắt đầu nghiên cứu kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo

giống khoai tây kháng virus và bệnh cũng nhƣ một số dịch hại nguy hiểm khác.

Ở Việt Nam hƣớng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây có sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần đã đƣợc bắt đầu tiến hành. Nguyễn Thị Phƣơng Thảo và cs. (2009) đã thu thập, đánh giá một số dòng khoai tây nhị bội về đặc tính nông sinh học và đặc tính kháng virus. Nhóm tác giả trên cũng đã dung hợp

thành công giữa các dòng khoai tây nhị bội tạo ra các con lai soma tứ bội. Trong số các con lai soma tứ bội tạo ra đã chọn lọc đƣợc 02 dòng con lai triển vọng

mang khả năng kháng bệnh virus PVY và mang các đặc tính nông sinh học quý

đang đƣợc phát triển thành giống sản xuất thử (Nguyễn Thị Phƣơng Thảo và cs.,

2011a, 2011b; 2012; Đỗ Thị Thu Hà và cs., 2012; Đinh Thị Thu Lê và cs., 2012; Vũ Thị thu hằng và cs., 2012). Tiếp tục hƣớng nghiên cứu này, chúng tôi tiến

hành nghiên cứu tạo các con lai soma tổ hợp đƣợc đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng từ loài dại và các đặc tính nông học quý từ khoai tây trồng. Đây là hƣớng

đi quan trọng để tạo vật liệu khởi đầu cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây

của Việt Nam.

PHẦN 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1.1. Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại Viện Sinh học nông nghiệp – Học Viện

Nông nghiệp Việt Nam và Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI-

CHLB Đức).

3.1.2. Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ năm 2011 đến năm 2015.

3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.2.1. Vật liệu thực vật

Các dòng khoai tây dại kháng bệnh mốc sƣơng: S. bulbocastanum,

S. tarnii, S. pinnatisectum thu thập từ Ngân hàng Gen khoai tây quốc tế tại Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK, Genebank) và hiện đang đƣợc lƣu trữ lại Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (bảng 3.1, hình 3.1).

A

B

C

Hình 3.1. Các loài khoai tây dại nhị bội đƣợc trồng trong nhà kính để phục vụ thí nghiệm

A- S.tarnii; B-S. pinnatisectum; C-S. bulbocastanum

Các giống khoai tây trồng mang các tính trạng nông sinh học quý thích

nghi với điều kiện khí hậu ở Việt Nam (bảng 3.1).

Bảng 3.1. Các vật liệu đã thu thập, nguồn gốc, độ ội và các tính trạng mong muốn phục vụ cho lai soma

Kiểu gen Dạng vật liệu Ký hiệu Độ bội Các tính trạng mục tiêu cho chọn tạo giống (kháng, chất lƣợng)

S. bulbocastanum blb2G 2x Kháng mốc sƣơng Khoai tây dại

S. pinnatisectum pnt2G 2x Kháng mốc sƣơng Khoai tây dại

S. tarnii trn3G 2x Kháng mốc sƣơng Khoai tây dại

4x Agave Nguồn gốc (Ngân hàng gen, công ty, Viện nghiên cứu) Ngân hàng gen Khoai tây quốc tế IPK, CHLB Đức Ngân hàng gen Khoai tây quốc tế IPK, CHLB Đức Ngân hàng gen Khoai tây quốc tế IPK, CHLB Đức Công Ty NORIKA, CHLB Đức

4x Mỹ Atlantic

4x Delikat

4x Quarta

4x Rasant Công Ty NORIKA, CHLB Đức EUROPLANT Lüneburg, CHLB Đức Công Ty NORIKA, CHLB Đức Năng suất, chất lƣợng Năng suất, chất lƣợng Năng suất, chất lƣợng Năng suất, chất lƣợng Năng suất, chất lƣợng Khoai tây trồng Khoai tây trồng Khoai tây trồng Khoai tây trồng Khoai tây trồng

3.2.2. Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô (phụ lục 1)

Hóa chất tách tế bào trần (phụ lục 2).

Hóa chất dung hợp tế bào trần (phụ lục 3).

Hóa chất nuôi cấy và tái sinh các tế bào trần sau dung hợp (phụ lục 4, 5, 6, 7, 8, 9)

Hóa chất tách chiết ADN (phụ lục 10).

Hóa chất PCR (phụ lục 11, 12, 13).

Các mồi SSR sử dụng để chọn lọc con lai đƣợc cung cấp bởi Công ty

Bio-Rad laboratories, Inc. (bảng 3.2).

Các cặp mồi phát hiện gen kháng mốc sƣơng đƣợc cung cấp bởi Công ty

Bio-Rad laboratories, Inc. (bảng 3.3).

Bảng 3.2. Các mồi sử dụng để chọn lọc con lai

STT Tên mồi (SSR) Trình tự mồi (FORWARD-REVERSE)

1 STM 2022

2 STM 1106

3 STM 3023

4 STM1104

Nguồn: Song Ye-Su et al. (2005)

5 STIIKA GCGTCAGCGATTTCAGTACTA TTCAGTCAACTCCTGTTGCG TCCAGCTGATTGGTTAGGTTG ATGCGAATCTACTCGTCATGG AAGCTGTTACTTGATTGCTGCA GTTCTGGCATTTCCATCTAGAGA TGATTCTCTTGCCTACTGTAATCG CAAAGTGGTGTGAAGCTGTGA TTCGTTGCTTACCTACTA CCCAAGATTACCACATTC

Bảng 3.3. Các cặp mồi phát hiện gen kháng mốc sƣơng

Marker Trình tự Tmo Gen mục tiêu Độ lớn đoạn đƣợc nhân

F: AACCTGTATGGCAGTGGCATG 66oC 820 bp Rpi-blb1 blb 1 R: GTCAGAAAAGGGCACTCGTG

1/1’ F: CACGAGTGCCCTTTTCTGAC 57oC 213 bp Rpi-blb1 R: ACAATTGAATTTTTAGACTT

Nguồn: Wang et al. (2008); Lokosou et al. (2009)

62oC 618 bp Rpi-blb3 blb3 F: TGTCGCTGAAAGAGTAGGCC R: TATGGAGTGGCTTCTTGAAC

3.2.3. Thiết ị

Tủ cấy vô trùng Lab Caire HFL; nồi hấp vô trùng; máy xung điện Electro

Cell Fusion CFA 500 (Krüss GmbH, Hamburg); Máy PCR Eppendorf; thiết bị

điện di Run-one Electrophoresis, máy khử trùng Satorious, máy xác định độ bội (Beckman Counter Cell Lab QuantaTM Flow cytometry.

3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.3.1. Nội dung 1: Tách và dung hợp tế ào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 3.3.1.1. Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic

- Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch enzym đến mật độ tế

bào trần thu đƣợc

- Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzym

đến mật độ tế bào trần thu đƣợc

3.3.1.2. Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây trồng thu thập được

- Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất

lƣợng tế bào sau dung hợp

- Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của mật độ tế bào trần đến hiệu suất dung hợp

- Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh

tế bào sau dung hợp

3.3.1.3. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp

- Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng nuôi cấy đến sự

phân chia của tế bào trần sau khi dung hợp

- Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của loại môi trƣờng nuôi cấy đến sự phân

chia của các tổ hợp lai sau dung hợp

- Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của môi trƣờng tái sinh khác nhau đến sự tái

sinh chồi của các tổ hợp lai

3.3.2. Nội dung 2: Xác định các con lai soma ằng các phƣơng pháp xác định độ ội Flow cytometry và ằng chỉ thị phân tử SSR

- Thí nghiệm 9: Xác định con lai soma bằng phƣơng pháp đo độ bội (Flow

cytometry)

- Thí nghiệm 10: Xác định on lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR

3.3.3. Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng ệnh mốc sƣơng của các con lai soma và các đặc tính n ng sinh học 3.3.3.1. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử

- Thí nghiệm 11: Phân lập nấm Phytophthora infestans và đánh giá độc

tính của nguồn nấm thu thập đƣợc

- Thí nghiệm 12: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai

soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời – Detached Leaflet Assay

- Thí nghiệm 13: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai

soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (Tuber slice test)

- Thí nghiệm 14: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai

soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng (Field test)

- Thí nghiệm 15: Đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sƣơng bằng

chỉ thị phân tử

3.3.3.2. Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học của các con lai soma

- Thí nghiệm 16: Đánh giá con lai soma về các tính trạng nông sinh học

3.3.4. Nội dung 4: Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc

- Thí nghiệm 17: Đánh giá và chọn lọc từ quần thể các con lai lại thu đƣợc

về khả năng kháng mốc sƣơng và các đặc tính nông sinh học

3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1. Tách và dung hợp tế ào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 3.4.1.1. Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic a. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch enzym đến mật độ tế bào trần

Các dòng/giống đƣợc nhân in vitro trên môi trƣờng MS (Murashige and Skoog, 1962) trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng và 22oC, sau 3-4 tuần tuổi (theo Thieme et al., 2008) lấy mẫu lá in vitro để tách tế bào trần (theo quy trình của

Cooking et al. (1960), có cải tiến theo Thach et al. (1993) và Thieme et al. (1997)).

Hóa chất tách tế bào trần đƣợc trình bày trong phụ lục 2 (đƣợc cung cấp

bởi Công ty Bio-Rad laboratories, Inc.

Do các dòng/giống khoai tây khác nhau có cấu tạo thành phần mô và vách

tế bào khác nhau (tỷ lệ cellulose, pectine,...). nên việc xác định loại dung dịch

enzym có tỷ lệ enzym phân giải cellulose và pectine có trong thành tế bào phù

hợp với từng dòng/giống để thu đƣợc mật độ tế bào trần cao là rất cần thiết.

Trong thí nghiệm này mỗi dòng/giống đƣợc tách tế bào trần ở 4 nồng độ enzym

khác nhau: E1 = Dung dịch enzym 1: có 0,2% Macerozym, 0,8% Cellulase; E2 =

Dung dịch enzym 2:có 0,1% Macerozym, 0,6% Cellulase, E3 = Dung dịch enzym

3:có 0,1% Macerozym, 0,8% Cellulase; E4 = Dung dịch enzym 4: có 0,1%

Macerozym, 1% Cellulase.

Chỉ tiêu theo dõi: mật độ tế bào trần = số tế bào trần thu đƣợc/ml dung dịch.

Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc thực hiện

năm 2011 tại Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI - CHLB Đức)

b. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzym đến

mật độ tế bào trần thu được

Thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzym không phù hợp có thể gây độc

cho tế bào, làm cho tế bào bị vỡ. Chính vì vậy mục tiêu của thí nghiệm này là xác

định đƣợc thời gian ủ trong dung dịch enzym phù hợp với từng dòng/giống.

Phƣơng pháp chuẩn bị vật liệu và tách tế bào trần tƣơng tự nhƣ trong thí

nghiệm 1. Dung dịch enzym phù hợp dùng để tách tế bào trần của từng

dòng/giống đã đƣợc xác định trong thí nghiệm 1 là: E1 (0,2% Macerozym và

0,8% Cellulase) cho các dòng/giống blb2G, trn3G, Rasant, Agave; E2 (0,1%

Macerozym và 0,6% Cellulase) cho các dòng/giống pnt2G và Delikat; E3 (0,1% Macerozym và 0,8% Cellulase) giống Quatar (đạt đƣợc mật độ tế bào là 2,9 x105 tế bào trần/ml); E4 (0,1% Macerozym và 1% Cellulase) cho giống Atlantic. Mẫu

lá của các dòng/giống khoai tây thí nghiệm đƣợc ủ trong dung dịch enzym ở các

thời gian ủ khác nhau: 13 giờ; 14 giờ; 15 giờ và 16 giờ.

Chỉ tiêu theo dõi: mật độ tế bào trần = số tế bào trần thu đƣợc/ml.

Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc thực hiện năm

2011 tại Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI - CHLB Đức).

3.4.1.2. Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây trồng a. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng

tế bào sau dung hợp

Có thể giả thuyết rằng tần số xung điện và số lần xung có ảnh hƣởng đến khả

năng dung hợp giữa 2 dòng/giống bố mẹ. Trong thí nghiệm này, để dung hợp tế bào trần giữa 2 dòng bố mẹ chúng tôi đã sử dụng mật độ tế bào trần 1 x 105 tế bào/ml với các thông số dung hợp khác nhau về số lần xung và tần số xung điện: tần số 700

kHz với 3 lần xung (Rokka et al., 1994), tần số 800 kHz với 2 lần xung (Thieme et

al., 2008), tần số 900 kHz với 2 lần xung, tần số 1000KHz với 1 lần xung.

Dựa theo phƣơng pháp của Thieme et al. (2008) có sự thay đổi về tần số xung điện và số lần xung, tế bào huyền phù của 2 dòng bố mẹ đƣợc trộn theo tỷ lệ 1:1, (bằng cách ly tâm trong 8 phút, 80g = 700 rpm). Sử dụng máy xung điện

Electro Cell Fusion CFA 500 (Krüss GmbH, Hamburg).

Hóa chất dung hợp tế bào trần đƣợc trình bày trong phụ lục 3.

Chỉ tiêu theo dõi: thời gian tế bào bắt đầu phân chia (ngày), thời gian xuất

hiện các microcallus (ngày), số lƣợng các macrocallus)/đĩa petri.

Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc thực hiện

năm 2011 tại Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI - CHLB Đức)

b. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật độ tế bào trần đến hiệu suất dung hợp

Mật độ ảnh hƣởng đến thời gian bắt đầu phân chia tế bào và tỷ lệ con lai lục bội tạo thành. Theo Thieme et al., (2008), mật độ tế bào trần sử dụng cho dung hợp bằng xung điện là 1 x 105 tế bào trần/ml. Tuy nhiên tỷ lệ các con lai soma tạo ra còn thấp (63/204). Chính vì thế mục tiêu của thí nghiệm này là xác định đƣợc

mật độ tế bào trần thích hợp cho dung hợp tế bào trần để tạo ra đƣợc tỷ lệ các con

lai soma lục bội cao nhất. Phƣơng pháp xung điện tƣơng tự nhƣ trong thí nghiệm

3 với các thông số đã tìm ra trong thí nghiệm 3 là xung điện ở tần số 800 kHz với 2 lần xung, tiến hành dung hợp với các mật độ tế bào trần khác nhau: 1x 105 tế bào trần/ml, 2 x 105 tế bào trần/ml, 3 x 105 tế bào trần/ml, 4 x 105 tế bào trần/ml và 5 x 105 tế bào trần/ml.

Chỉ tiêu theo dõi: thời gian tế bào bắt đầu phân chia (ngày), số lƣợng các

macrocallus (đại callus)/đĩa petri, tỷ lệ các con lai có độ bội 2x (%), 4x (%), 6x (%).

Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc thực hiện

năm 2011 tại Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI - CHLB Đức)

c. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến kết quả tái sinh sau

dung hợp

Mục tiêu của thí nghiệm là theo dõi ảnh hƣởng của các tổ hợp lai khác

nhau đến kết quả tái sinh sau dung hợp. Phƣơng pháp xung điện tƣơng tự nhƣ

trong thí nghiệm 3 với các thông số 800 kHz, 2 lần xung, mật độ tế bào trần dung hợp là 4 x 105 tế bào trần/m.

Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng các macrocallus tái sinh, số lƣợng chồi tái sinh,

tỷ lệ chồi tái sinh/số callus tạo thành.

Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc thực hiện năm

2011, 2012 tại Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI - CHLB Đức)

3.4.1.3. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp a. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phân chia

và tái sinh sau dung hợp

Sau khi dung hợp, tế bào trần đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp trong

điều kiện 25oC và tối. Sự kết tụ tế bào (sự tạo thành mô sẹo, trông giống nhƣ các hạt tấm màu trắng) đƣợc hình thành sau 3-4 tuần nuôi cấy; chuyển các hạt

microcalli sang môi trƣờng tạo callus trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng 4000 lux và nhiệt độ 22oC (Thieme et al., 2008).

Nuôi cấy các tổ hợp lai trên môi trƣờng VKM II (theo Thieme et al.,2008)

ở 3 điều kiện khác nhau: môi trƣờng lỏng (không chứa agar); môi trƣờng bán

lỏng (nhỏ giọt agar) và môi trƣờng rắn (bổ sung 5g agar/lít môi trƣờng). Do khối

lƣợng công việc thí nghiệm rất lớn nên các số liệu thí nghiệm đƣợc tổng hợp lại

từ các thí nghiệm riêng rẽ cho từng tổ hợp lai trên mỗi một loại môi trƣờng.

Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian xuất hiện phân chia (ngày), thời gian xuất

hiện macrocallus (ngày).

Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc thực hiện

năm 2011, 2012 tại Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI -

CHLB Đức).

b. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và

tái sinh của các tổ hợp lai sau dung hợp

Các sản phẩm sau dung hợp đƣợc nuôi cấy trên môi trƣởng lỏng (từ kết quả

của thí nghiệm 7 với thành phần môi trƣờng khác nhau: môi trƣờng VKM II

(Binding and Nehls, 1977), Medium A* (Ehsanpour et al., 2001), KM8P* (Davey

et al., 1994). Tƣơng tự nhƣ thí nghiệm 6, các số liệu thí nghiệm đƣợc tổng hợp lại

từ các thí nghiệm riêng rẽ cho từng tổ hợp lai trên mỗi một loại môi trƣờng.

Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian xuất hiện phân chia (ngày), thời gian xuất

hiện macrocallus (ngày).

Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc thực hiện

năm 2011, 2012 tại Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI -

CHLB Đức).

c. Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh

chồi của các tổ hợp lai

Cấy chuyển các callus trên các môi trƣờng tái sinh khác nhau: RIM (Masson et

al., 1988), MSO (Pan et al., 2004), K8P (Wei et al., 1994). Theo dõi 10 đĩa petri/tổ

hợp lai, mỗi đĩa petri cấy 10 macrocallus (đƣờng kính từ 2-4mm). Mỗi callus chỉ

lấy 1 chồi đầu tiên và lấy số lƣợng chồi trung bình/đĩa. Tƣơng tự nhƣ thí nghiệm

6 và 7, các số liệu thí nghiệm đƣợc tổng hợp lại từ các thí nghiệm riêng rẽ cho

từng tổ hợp lai trên mỗi một loại môi trƣờng.

Chỉ

tiêu

theo dõi: Số

lƣợng chồi

tái sinh, chất

lƣợng chồi

(khỏe/yếu/trung bình)

Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc thực hiện

năm 2012 tại Viện Sinh học nông nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

3.4.2. Xác định con lai soma ằng đo độ ội Flow cytometry và ằng chỉ thị phân tử SSR a. Thí nghiệm 9: Xác định con lai soma bằng đo độ bội thể

Lá đƣợc lấy từ cây tái sinh sau dung hợp, cắt nhỏ, bổ sung dung dịch

nhuộm màu (DAPI, 800 µl) và lọc huyền phù tế bào, sau đó đƣa vào máy để xác định độ bội. Sử dụng máy xác định độ bội thể Cell Lab QuantaTM Flow cytometry (Beckman Counter).

Chỉ tiêu theo dõi: Số lƣợng con lai có độ bội thể 6x (hexaploid), 8x

(octoploid), hỗn bội (mixoploid); Tỷ lệ % các con lai 6x/ tổng số con lai đem

phân tích độ bội thể.

Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc thực hiện

năm 2012 tại Viện Nghiên cứu Chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI - CHLB

Đức) và phòng thí nghiệm CNSH tế bào thực vật- Khoa Công nghệ Sinh học-

Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.

b. Thí nghiệm 10: Xác định con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR

Để xác định con lai soma bằng chỉ thị phân tử, các con lai đuwocj chọn

ngẫu nhiên đƣợc xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Theo Dinu and Thieme,

2001) sử dụng cặp mồi (theo Song et al., 2005) (Bảng 3.2).

ADN tổng số của các cây in vitro đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của

Doyle và Doyle (1987), đƣợc cải tiến bởi Veilleux (1995) và Eduard Chani et al.,

2000. Mỗi gam lá nguyên liệu in vitro đƣợc nghiền trong 3,3 ml dung dịch đệm chiết

(0,1M Tris HCl; 1,4 M NaCl; 0,02 M EDTA; 2% hexadecyltrimethylammonium C-

Tab và 1% fress β-mercaptoethanol) (cung cấp bởi công ty Bio-Rad laboratories, Inc). Ủ từ 1-2 giờ ở nhiệt độ 60 0C, ly tâm 15 phút, ADN sẽ đƣợc kết lắng trong isopropanol và tái lơ lửng trong TE bufer bổ sung thêm 1µl RNAse A. Bảo quản mẫu ADN trong tủ lạnh sâu -200C. .

Các con lai ngẫu nhiên sau dung hợp đƣợc xác định bằng chỉ thị phân tử

SSR (Dinu and Thieme, 2001) (đƣợc cung cấp bởi công ty Bio-Rad laboratories,

Inc). Phản ứng PCR (20µl) bao gồm: 1 x assay buffer (50 mM MgCl2, 160 µM dNTPs; 1,5U Taq polymerase (Pomega, Madison, WI); 0,1 µM mỗi loại mồi và

50 ng mẫu ADN, đƣợc bọc bởi 1 giọt dầu vô cơ nhẹ (light mineral oil). Phản ứng PCR lặp lại 40 chu kỳ với: 1 phút ở 95 0C, 2 phút ở 55 0C, 1,5 phút ở 72 0C và 1 chu kỳ với 5 phút ở 720C. Các sản phẩm nhân đƣợc phân tách trên gel điện di agarose Metaphor 3% (FMC Bioproducts pockland, Meck) với 1 x TBE buffer

tại 90 V trong 4 giờ; hoặc gel polyacrylamise 6% trên Sequin-Gen GT (Bio-Rad laboratories, Inc.). Nhuộm các bản gel điện di với ethidium bromide (10 mg ml-1) trong 20 phút và chụp ảnh dƣới tia UV và đọc kết quả.

Các chỉ tiêu cần đánh giá: tổng số con lai soma có kiểu gen dị hợp nhân;

tỷ lệ % các con lai soma thu đƣợc

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Viện

Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI - CHLB Đức).

3.4.3. Đánh giá tính kháng ệnh mốc sƣơng của các con lai soma ằng lây nhiễm nhân tạo và ằng chỉ thị phân tử

Sau khi nuôi cấy các cây lai soma khoảng 4 tuần trong điều kiện in vitro,

các dòng bố mẹ và các con lai soma đƣợc chuyển vào chậu vại trong điều kiện

nhà kính. Quan sát các đặc tính sinh trƣởng, hình thái, sinh sản và khả năng

kháng bệnh. So sánh giữa các dạng dại, khoai tây trồng và con lai soma.

3.4.3.1. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử a. Thí nghiệm 11: Phân lập nấm Phytophthora infestans và đánh giá độc tính của

nguồn nấm thu thập được

Nguồn nấm bệnh đƣợc thu từ các cây khoai tây bị bệnh mốc sƣơng tại 2 vùng trồng khoai tây thƣợc hà Nội và lạng Sơn. Các lá bệnh sau khi thu thập đƣợc nuôi trên lát cắt củ khoai tây trong điều kiện tối, nhiệt độ 18 – 20oC, độ ẩm cao ở mức 90 – 100%. Sau khi lây nhiễm từ 6-7 ngày, thu các sợi bào tử nấm trong dung dịch nƣớc cất. Đếm mật độ bọc động bào tử bằng phƣơng pháp đếm tế bào hồng cầu để có đƣợc dung dịch lây nhiễm nhân tạo (1,5x104 bọc động bào tử/ml). Nguồn nấm này đƣợc liên tục nuôi trên lát cắt củ để lƣu giữ (Darsow et al., 2004; Hammann et

al., 2009).

Thí nghiệm đƣợc lặp lại 5 lần, dùng hàm variance để xử lý số liệu thống

kê cho biết đƣợc mức độ sai khác có ý nghĩa hay không ý nghĩa đối với các

nguồn nấm bệnh thu thập đƣợc.

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013 tại

Viện Sinh học Nông nghiệp – Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học

viện Nông nghiệp Việt Nam)

b. Thí nghiệm 12: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma

bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời – Detached Leaflet Assay

Mẫu lá khoai tây đƣợc lấy từ các cây trồng trong chậu vại hoặc trên đồng

ruộng ở giai đoạn cây chuẩn bị ra hoa. Dùng kéo sắc để cắt các lá đơn, trong quá

trình cắt tránh làm tổn thƣơng bề mặt lá. Mỗi kiểu gen lặp lại 5 lần (lấy 5 lá).

Nhỏ dung dịch lây nhiễm với nồng độ 1,5x104 bọc động bào tử/ml (mỗi giọt khoảng 20 - 30µl) lên trên lá, đặt trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng, nhiệt độ 18 – 200C, độ ẩm trên 90%. Triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 5-6 ngày sau khi lây nhiễm.

Phƣơng pháp đo vết bệnh trên lá: đo kích thƣớc vết hoại tử bề mặt trƣớc

của lá và đo mật độ hình thành bào tử nấm ở bề mặt sau của lá. Sử dụng kính

hiển vi để quan sát (Theo Darsow et al., 2004, 2008; Hammann et al., 2009).

Cách đo kích thƣớc vết hoại tử bề mặt trƣớc của lá nhƣ sau: Điểm 1: không có

vết bệnh ở cả mặt trƣớc và mặt sau lá; điểm 2: có 1 điểm ở bề mặt sau lá; không

có vết bệnh ở bề mặt trƣớc lá; điểm 3: 1-4 % vùng lá bị nhiễm bệnh, khoảng 4 cm2; điểm 4: 5-12% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 5: 13-30% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 6: 31-55% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 7: 56-78% diện

tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 8: 79-96% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 9: 97-

100% diện tích lá bị nhiễm bệnh. Cách đo sự hình thành bào tử nấm ở bề mặt

sau của lá: điểm 1: từ không có triệu chúng vết bệnh hoặc vết hoại tử 2-4mm;

điểm 2: nhiễm trung bình 5-55% diện tích bề mặt lá; điểm 3: 56-100% diện tích

lá bị nhiễm bệnh.

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013 tại

Viện Sinh học Nông nghiệp – Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học

viện Nông nghiệp Việt Nam).

c. Thí nghiệm 13: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma

bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (Tuber slice test)

Củ mới đƣợc thu hoạch (trong vòng 24h) hoặc cho các củ đƣợc bảo quản trong kho lạnh từ 1 – 2 tháng ở nhiệt độ 8 – 90C. Mỗi kiểu gen đƣợc lặp lại 5 lần (5 lát củ). Nhỏ lên mỗi lát củ 1 giọt dung dịch dịnh lây nhiễm (20 - 30µl) với nồng độ 1,5x104 bọc động bào tử/ml, trong điều kiện tối, nhiệt độ 18 – 20oC, độ ẩm cần đảm bảo ở mức 90% đến bão hòa. Ngày hôm sau tiến hành lật đảo bề mặt lát củ.

Triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 7-10 ngày. Đánh giá và cho điểm dựa vào

kích thƣớc vết hoại tử (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009). Cách tính

điểm nhƣ sau: điểm 1: không có vết bệnh; điểm 2: 1% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (20mm2); điểm 3: 0,5-5% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (150mm2); điểm 4: 6-12% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (300mm2); điểm 5: 25% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 6: 43% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 7: 62% diện tích

lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 8: 85% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 9: 96-

100% diện tích củ bị nhiễm bệnh.

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013 tại

Viện Sinh học Nông nghiệp – Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học

viện Nông nghiệp Việt Nam).

d. Thí nghiệm 14: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma

bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng (Field test)

Thí nghiệm trên đồng ruộng đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi

lần lặp lại có 15 cây trên 3 luống (bao gồm cả các giống đối chứng và các dòng mang gen kháng R). Nồng độ dung dịch lâu nhiễm là 20 x 103 bọc động bào tử/ml. Tiến hành lây nhiễm tại thời điểm khi cây bắt đầu hoặc kết thúc có hoa

vào lúc tối muộn khi trời ẩm ƣớt (lây nhiễm theo kiểu dạng dạng phun mù). Triệu

chứng sẽ bắt đầu xuất hiện sau 1 tuần lây nhiễm.

Tiến hành đo vết bệnh ít nhất 5 lần khi sự nhiễm bệnh bắt đầu từ 0,1% - 100%. Đánh giá phản ứng của bệnh trong toàn bộ quá trình phát triển của bệnh theo chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (Area Under Disease Progress Curve - AUDPC) và chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian tƣơng đối (r) AUDPC; Phân tích

sự sai khác (variance) đƣợc sử dụng để đánh giá tất cả các giống. Kết quả có thể

đƣợc so sánh với giống đối chứng) (Truberg et al., 2008). Giá trị chỉ số tích lũy

bệnh theo thời gian đƣợc tính theo công thức dƣới đây:

n= số lần đo bệnh yi = cƣờng độ bệnh (chỉ số bệnh hoặc tỷ lệ bệnh) ti = thời gian tồn tại lần đo thứ i

n=1 AUDPC = ∑ (yi + yi+1) ( ti+1 –ti)/2 i=1 Trong đó: (∆)rAUDPC: Hệ số kháng bệnh điều chỉnh theo độ thành thục của cây (∆)rAUDPC = AUDPC/max AUDPC n-1 (∆)rAUDPC = AUDPC/max AUDPC = AUDPC/ ∑ 100 (ti+1 –ti) i=1 Trong đó: ti+1 - ti = tổng thời gian dịch bệnh

Sự thành thục của cây có tƣơng quan chặt chẽ với tính kháng bệnh. Đánh giá

sự thành thục của cây theo thang điểm từ 1-9 trong đó: 1=chín sớm ; 9=chín muộn.

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013 tại

Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI - CHLB Đức).

e. Thí nghiệm 15: Đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ

thị phân tử

Các con lai soma và các dòng đối chứng đƣợc trồng trong chậu trong điều

kiện nhà kính. Lấy lá để tách chiết ADN theo phụ lục 11.

Xác định các gen kháng Rpi-blb ở các con lai soma có sử dụng các mồi

đặc hiệu của các gen: Rpi-blb1 (Wang et al., 2008) và Rpi-blb3 (Lokossou et al.,

2010) (bảng 3.3).

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013 tại

Viện Sinh học Nông nghiệp – Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học

viện Nông nghiệp Việt Nam).

3.4.3.2. Đánh giá con lai soma về các tính trạng nông sinh học Thí nghiệm 16: Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học

Các dòng con lai soma và các dòng bố mẹ sau nuôi cấy in vitro 4 tuần đƣợc trồng vào vụ Đông – Xuân năm 2013-2014 tại cánh đồng thực nghiệm- Viện Sinh học Nông nghiệp để đánh giá các tính trạng về hình thái, sinh trƣởng, phát triển, các yếu tố cấu thành năng suất cũng nhƣ khả năng kháng bệnh. Thí

nghiệm đƣợc bố trí 3 lần lặp cho mỗi dòng, mỗi lần lặp lại 10 cây.

Phƣơng pháp đánh giá: Theo tiêu chuẩn ngành (số 32-1998/QĐ-BNN- KHCN ngày 24 tháng 2 năm 1998) và quy chuẩn của Bộ Nông nghiệp và Phát

triển Nông thôn (QCVN 01- 69:2011/BNNPTNT) (Phụ lục 14).

Thời gian và địa điểm thực hiện: Thí nghiệm đƣợc thực hiện năm 2013- 2014 tại Viện Sinh học Nông nghiệp – Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay

là Học viện Nông nghiệp Việt Nam).

3.4.4. Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc Thí nghiệm 17: Đánh giá và chọn lọc từ quần thể các con lai BC thu được về khả năng kháng mốc sương và các đặc tính nông sinh học

Các con lai soma đƣợc trồng trong chậu vại và chăm sóc trong nhà màn

để hạn chế các nguồn bệnh từ bên ngoài. Một trong những thao tác quan trọng

trên cây mẹ là kìm hãm sự sinh trƣởng tạo củ, kích thích sự sinh trƣởng thân lá.

Phấn đƣợc lấy từ cây bố (các giống khoai tây trồng tứ bội) đƣợc thụ cho cây mẹ

(con lai soma). Thu các quả lai sinh trƣởng sau 2-3 tháng, bảo quản quả trong điều kiện 4-80C.

Các hạt lai khoai tây đƣợc xử lý ngủ nghỉ bằng dung dịch Gibberelic Acid

Solution (GA3 nồng độ 1mg/l), ngâm qua đêm và gieo hạt trên các nền giá thể

mịn với mật độ khoảng 200 hạt/khay, phủ nilon để giữ ẩm. Khi hạt nảy mầm đến

giai đoạn 2 lá thật, phun dịch lây nhiễm bệnh mốc sƣơng (nồng độ dịch lây

nhiễm là 6000 túi bào tử/ml), phun ƣớt và đều trên bề mặt lá, phủ nilon hoặc đậy

tấm kính để giữ ẩm trong vòng 8h – 12h.

Triệu chứng sẽ xất hiện sau 3 ngày, giữ lại cây khỏe và loại bỏ những cây

bệnh. Dùng thuốc trừ nấm phun phòng cho những cây khỏe sau lây nhiễm. Tiếp

tục chăm sóc cho đến khi thu hoạch củ, mỗi cây giữ lại 1 củ cho vụ sau. Các củ

còn lại tiếp tục đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng trên củ.

Đánh giá theo Theo tiêu chuẩn ngành (số 32-1998/QĐ-BNN-KHCN ngày 24 tháng 2 năm 1998) và quy chuẩn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

(QCVN 01- 69:2011/BNNPTNT) (Phụ lục 14).

Thời gian và địa điểm tiến hành:

Các thí nghiệm lai tạo đƣợc tiến hành tại 3 vùng sinh thái của Việt Nam:

+ Vụ đông xuân năm 2013; 2014 tại Hà Nội (Viện Sinh học Nông nghiệp)

+ Vụ hè năm 2013; 2014 tại Sapa (Trang trại của hộ gia đình anh Lê Văn Vi)

+ Vụ hè năm 2015 tại Đà Lạt (Trung tâm Khoai tây-Viện KHKT Nông

nghiệp miền Nam).

Các thí nghiệm đánh giá các con lai đƣợc tiến hành năm 2014; 2015 tại

Viện Sinh học nông nghiệp- Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

3.5. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

+ Số liệu trong các thí nghiệm tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh tế bào

trần đƣợc xử lý theo chƣơng trình EXCEL (thí nghiệm 1; 2; 3; 4 và 5)

+ Số liệu trong các thí nghiệm đánh giá cho điểm bệnh mốc sƣơng đƣợc

xử lý theo chƣơng trình EXCEL, dùng hàm standard deviation (= stdev) để

xác định sai số giữa các lần lặp lại (thí nghiệm 11; 12 và 13).

+ Số liệu trong các thí nghiệm đánh giá các đặc tính nông sinh học của các

con lai (các chỉ tiêu: chiều cao cây, số củ trung bình/khóm, khối lƣợng củ trung

bình/khóm trong thí nghiệm 16) đƣợc xử lý thông kê đánh giá sự sai khác có ý

nghĩa ở mức α = 0,05 theo phần mềm SAS 9.1 (phụ lục 15).

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. KẾT QUẢ

4.1.1. Tách và dung hợp tế ào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 4.1.1.1. Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và các giống khoai tây trồng a. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch enzym đến mật

độ tế bào trần

Các dòng/giống khoai tây khác nhau có cấu tạo thành phần mô và vách tế

bào khác nhau (tỷ lệ cellulose, pectine,...). Chính vì thế việc xác định loại dung

dịch enzym có tỷ lệ enzym phân giải cellulose và pectine có trong thành tế bào

phù hợp với từng dòng/giống để cho hiệu suất tế bào trần thu đƣợc tối đa là rất

cần thiết. Các kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện trên bảng 4.1.

Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của nồng độ macerozym và cellulase trong dung dịch enzym đến hiệu suất tách tế ào trần của các dòng giống khoai tây thí nghiệm

Tên Loại dung dịch enzyme E số tế ào trần ml dòng giống

pnt2G blb2G

trn3G Delikat

Quatar Rasant E4 1,0 x 105 0,0 0,3 x 105 0,1 x 105 0,0 0,0

Ghi chú: E1 = Dung dịch enzym 1: có 0,2% Macerozym, 0,8% Cellulase

E2 = Dung dịch enzym 2:có 0,1% Macerozym, 0,6% Cellulase

E3 = Dung dịch enzym 3:có 0,1% Macerozym, 0,8% Cellulase

E4 = Dung dịch enzym 4: có 0,1% Macerozym, 1% Cellulase

Các loại dung dịch enzym khác nhau có ảnh hƣởng khác nhau đến hiệu

quả tách tế bào trần. Để tách tế bào trần có hiệu suất cao nhất, mỗi dòng/giống

khoai tây cần một loại dung dịch enzyme phù hợp (bảng 4.1).

Kết quả thí nghiệm cho thấy dung dịch E1 (0,2% Macerozym và 0,8%

Agave Atlantic E1 1,1 x 105 3,7 x 105 4,1 x 105 2,8 x 105 1,1 x 105 3,6 x 105 3,5 x 105 1,2 x 105 E2 4,1 x 105 2,5 x 105 1,1 x 105 3,0 x 105 1,6 x 105 2,3 x 105 1,1 x 105 1,2 x 105 E3 0,7 x 105 0,5 x 105 2,6 x 105 0,1 x 105 2,9 x 105 0,7 x 105 0,4 x 105 1,8 x 105 0,0 3,1 x 105

Cellulase) có thể đƣợc sử dụng để tách tế bào trần của các dòng/giống blb2G,

trn3G, Rasant, Agave. Khi ủ mẫu lá bằng dung dịch enzym này các dòng/giống

khoai tây trên cho hiệu quả tách tế bào trần cao nhất, dịch tế bào trần thu đƣợc với mật độ tế bào dày đặc (3,5x105 tế bào trần/ml). Đối với các dòng/giống pnt2G và Delikat, dung dịch enzyme thích hợp nhất cho tách tế bào trần của các

dòng/giống này là dung dịch E2 (0,1% Macerozym và 0,6% Cellulase). Tế bào trần thu đƣợc có mật độ tế bào trần cao (trên 3x105 tế bào trần/ml).

Dung dịch E3 (0,1% Macerozym và 0,8% Cellulase) cho hiệu quả tách cao nhất với giống Quatar (đạt đƣợc mật độ tế bào là 2,9 x105 tế bào trần/ml). Dung dịch E4 (0,1% Macerozym và 1% Cellulase) lại cho hiệu quả cao nhất với giống Atlantic (đạt đƣợc mật độ tế bào là 3,1 x105 tế bào trần/ml).

Một số hình ảnh tế bào trần của các dòng/giống khoai tây thu đƣợc sau

tách đƣợc thể hiện trong hình 4.1.

Quatar (E3)

Delikat (E1)

Agave (E1)

Atlantic (E4)

pnt2G (E2)

blb2G (E1)

Hình 4.1. Hình ảnh tế bào trần của các dòng/giống khoai tây khác nhau với các enzym phù hợp. b. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch

enzym đến hiệu suất tách tế bào trần

Thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzym có ảnh hƣởng rõ rệt đến kết quả tách tế bào trần. Thời gian ủ vừa đủ thu đƣợc mật độ tế bào trần cao, trong

khi thời gian ủ dài sẽ gây độc cho tế bào, làm cho tế bào bị vỡ nát (do enzym macerozym gây độc cho tế bào) (bảng 4.2). Thí nghiệm đã tiến hành ủ các mẫu lá

của các dòng/giống khoai tây (đã đƣợc cắt nhỏ và xử lý qua dung dịch gây co

nguyên sinh) ở các thời gian ủ trong dung dịch enzym khác nhau dao động trong

khoảng 13 giờ -16 giờ.

Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của thời gian ủ của m lá trong dung dịch enzym đến hiệu suất tế ào trần thu đƣợc

Tên Thời gian ủ giờ

dòng giống số tế ào trần ml)

pnt2G

blb2G

trn3G

Delikat

Quatar

Rasant

Agave

Thời gian ủ mô lá trong dung dịch enzym có ảnh hƣởng rõ rệt đến hiệu

quả tách tế bào trần. Thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch

enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ (bảng 4.2).

Thời gian ủ mẫu lá thích hợp cho các giống Rasant, Agave, Atlantic là 14 giờ. Ở thời gian ủ này cho số lƣợng tế bào trần thu đƣợc là cao nhất (từ 3,5 x 105 đến 4,6 x 105 tế bào trần/ml). Ngoài ra thời gian ủ trong dung dịch enzym cũng ảnh hƣởng rõ rệt đến chất lƣợng tế bào trần thu đƣợc. Khi thời gian ủ tăng lên 15-

16 giờ thì lƣợng tế bào trần thu đƣợc giảm dần, tế bào bị vỡ nhiều.

Với các dòng/giống blb2G, trn3G, Delikat, Quatar thời gian ủ thích hợp

nhất là 15 giờ, số lƣợng tế bào trần đƣợc giải phóng cao hơn cả (mật độ tế bào

trần thu đƣợc của các dòng/giống trên khi ủ mẫu lá trong 15 giờ lần lƣợt là 3,4 x 105; 4,0x105 ; 3,6 x 105 ; 3,4 x 105 tế bào trần/ml).

Riêng dòng pnt2G thời gian ủ thích hợp dài nhất là 16 giờ, cho số lƣợng tế

bào trần cao nhất (3,9 x105 tế bào trần/ml).

13 giờ 0,9 x 105 1,4 x 105 1,1 x 105 1,2 x 105 1,2 x 105 2,4 x 105 2,1 x 105 2,1 x 105 15 giờ 3,0 x 105 3, 4 x 105 4,0x 105 3,6 x 105 3,4 x 105 3,8 x 105 3,9 x 105 3, 1 x 105 16 giờ 3,9 x 105 2, 6 x 105 3,4 x 105 2,8 x 105 3,3 x 105 2,8 x 105 2,5 x 105 2,1 x 105 Atlantic 14 giờ 2,7 x 105 2,9 x 105 2,9 x 105 2,8 x 105 2,9 x 105 4,6 x 105 4,4 x 105 3,5 x 105

4.1.2. Dung hợp tế ào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây trồng thu thập đƣợc 4.1.2.1. Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế bào sau dung hợp Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế bào sau dung hợp

Tế bào trần của dòng dại Solanum bulbocastanum với giống Delikat ở mật độ 2 x 105 tế bào/ml đƣợc dung hợp với các thông số xung điện khác nhau. Chất lƣợng tế bào thu đƣợc sau xung điện đƣợc thể hiện qua bảng 4.3.

Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lƣợng tế ào sau dung hợp (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat)

STT CT Thời gian tế bào phân chia (ngày)

Thời gian xuất hiện microcallus* (ngày) 21 Số lƣợng macrocallus** đĩa 49,5 1 CT1 3

Chú thích: CT1- AC=700 kHz+ 3 lần xung (Rokka et al, 1994), CT2- 800 kHz+ 2 lần xung, CT3- 900 kHz+2 lần xung, CT4- 1000KHz+1 lần xung; (*) microcallus- tiểu callus; (**) macrocallus- đại callus

Chất lƣợng tế bào của tổ hợp Solanum bulbocastanum và Delikat sau dung

hợp đƣợc thể hiện qua hình 4.2.

2 3 4 CT2 CT3 CT4 2 4 4 18 28 24 65,4 27,6 38,2

C A

D B

Hình 4.2. Chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở các tần số và số lần xung khác nhau (nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat)

Chú thích: A-chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở tần số 700 kHz+ 3 lần xung, B- chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở tần số 800 kHz+ 2 lần xung, C- chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở tần số 900 kHz+ 2 lần xung, D- chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở tần số 1000 kHz+ 1 lần xung

Tần số và số lần xung hợp ảnh hƣởng rõ rệt đến chất lƣợng tế bào sau

dung hợp (bảng 4.3, hình 4.2).

Ở tần số 700 kHz và 3 lần xung, tế bào thu đƣợc sau dung hợp hầu nhƣ bị vỡ nát, những tế bào sống sót sau 5 ngày nuôi cấy mới có hiện tƣợng phân chia và sau 27 ngày microcallus mới hình thành, tỷ lệ hình thành macrocallus từ microcallus thấp trung bình chỉ có 9,5 macrocallus/đĩa.

Tế bào đƣợc dung hợp ở các thông số của CT2 (tần số 800kHz và 2 lần xung), tế bào có tỷ lệ nguyên vẹn cao, thời gian xuất hiện hiện phân chia sớm (sau 2 ngày nuôi cấy), các microcallus hình thành sau 18 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng, số macrocallus hình thành/đĩa nhiều nhất (trung bình 65,4 macrocallus/đĩa).

Khi tăng tần số xung lên 900 kHz và giữ nguyên số lần xung (CT3) thì tỷ lệ tế bào vỡ tăng, tế bào phân chia muộn hơn so với CT2 (4 ngày), số macrocallus hình thành chỉ đạt 27,6 macrocallus/đĩa. Tƣơng tự, khi dung hợp ở tần số 1000 kHz và 1 lần xung sau 3 ngày tế bào mới phân chia và số macrocallus/đĩa đạt 38,2 macrocallus.

Nhƣ vậy dung hợp ở thông số 800 kHz và 2 lần xung là thích hợp nhất cho dung hợp xung điện giữa các dòng khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội.

4.1.2.2. Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến sự hiệu suất dung hợp Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến sự hiệu suất dung hợp

Tiến hành thí nghiệm dung hợp xung điện tế bào giữa dòng khoai tây dại Solanum bulbocastanum và giống Delikat ở mật độ khác nhau để xác định mật

độ thích hợp nhất cho tỷ lệ con lai lục bội cao nhất (6x=72), kết quả đƣợc trình

bày ở bảng 4.4.

Mật độ ảnh hƣởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân chia tế bào và tỷ lệ con lai lục bội tạo thành. Mật độ tế bào tham gia dung hợp càng cao thì tế bào phân chia sớm và tỷ lệ con lai con lai lục bội (6x) càng tăng (bảng 4.4).

Ở mật độ dung hợp 1 x 105 tế bào/ml sau 3 ngày tế bào mới phân chia, tỷ lệ con lai tái sinh có độ bội 2x cao nhất (56,3%) trong khi đó con lai có độ bội 6x chỉ đạt 18,7%.

Khi tăng mật độ dung hợp từ 2 x 105 tế bào/ml đến 5 x 105 tế bào/ml, tế bào cảm ứng nhanh và phân chia chỉ sau 2 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ con lai 6x lại tăng ở hai mật độ dung hợp này (53,2% và 65,6% con lai là con lai 6x khi dung hợp ở mật độ 4 x 105 tế bào/ml và 5 x 105 tế bào/ml)

Bảng 4.4. Kết quả tái sinh và độ ội của các con lai tái sinh sau dung hợp ở các mật độ tế ào dung hợp khác nhau (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat)

Số macrocallus* đĩa Sau 4 tuần Tỷ lệ cây 2x (%) Tỷ lệ cây 4x (%) Tỷ lệ cây 6x (%)

Chú thích: dung hợp với các thông số AC= 800 kHz, DC=120V và 2 lần xung; (*) macrocallus- đại callus

Nhƣ vậy mật độ xung cho hiệu quả dung hợp tạo con lai 6x cao nhất là từ

4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml.

Thời gian xuất hiện phân chia (ngày) 3 2 2 2 2 28,5 75,7 85,6 68,3 62,6 Số cây tái sinh (cây) Sau 8 tuần 16 35 46 47 29 56,3 37,1 13,9 14,9 10,3 25,0 34,3 45,6 31,9 24,1 18,7 28,6 40,5 53,2 65,6 Mật độ xung hợp tế ào ml) 1x 105 2 x 105 3 x 105 4x 105 5 x 105

4.1.2.3. Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế bào sau dung hợp Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế bào

sau dung hợp

Tế bào trần của các dòng khoai tây dại và các giống khoai tây trồng đƣợc tách, pha loãng tạo mật độ 4 x 105 tế bào trần/ml trong dung dịch dung hợp và trộn theo tỷ lệ 1:1. Sử dụng máy xung điện máy xung điện CFA 500 (Krüss GmbH, Hamburg) với các thông số nhƣ kết luận ở thí nghiệm 3. Sau dung hợp tế bào đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng VKM II (Thieme et al., 1997). Các microcalli đƣợc hình thành sau 2-3 tuần nuôi cấy. Cấy chuyển các microcalli màu xanh, tƣơi với đƣờng kính khoảng 2-3 mm sang môi trƣờng tái sinh macrocallus (Cul- medium). Các macrocallus này sẽ hình thành các chồi đầu tiên sau 8-12 tuần nuôi cấy tùy thuộc vào tổ hợp dòng khoai tây nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 4.5.

Toàn bộ các tổ hợp dung hợp phân chia tế bào xảy ra sau 2-3 ngày nuôi cấy. Khả năng tạo macrocallus và tái sinh chồi phụ thuộc vào tổ hợp dung hợp hay phụ thuộc vào bản chất di truyền của dòng cây nghiên cứu. Tổng cộng đã tạo đƣợc 07 tổ hợp lai giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng (bảng 4.5, hình 4.3).

Hình 4.3 cho thấy sự phân chia hình thành callus của các tổ hợp lai khác nhau sau dung hợp phụ thuộc vào bản chất di truyền. Các tổ hợp lai giữa giống khoai

tây trồng Atlantic với các dòng khoai tây dại khác nhau cho kết quả khác nhau.

Bảng 4.5. Kết quả dung hợp giữa các dòng khoai tây dại nhị ội với các giống khoai tây trồng tứ ội ằng phƣơng pháp xung điện

Số lƣợng callus Số lƣợng chồi Tỷ lệ tái sinh STT Tên tổ hợp lai tái sinh tái sinh (%)

1 trn3G + Agave 39 32,5 120

2 3 trn3G + Rasant blb2G + Delikat 25 31 25,8 12,4 97 250

4 5 trn3G + Delikat Pnt2G + Atlantic 64 23 25,6 11,9 250 193

6 7 blb2G + Atlantic trn3G + Atlantic 4 2 1,3 0,5 307 395

3

1

2 Hình 4.3. Các macrocallus tái sinh sau khi dung hợp

nu i cấy trên m i Cul-medium sau 3 tuần nu i cấy

Chú thích: 1. Tổ hợp blb2G + Atlantic; 2- Tổ hợp pnt2G +Atlantic; 3- Tổ hợp trn3G+Atlantic

4.1.3. Nu i cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp 4.1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến kết quả tái sinh sau khi dung hợp Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến kết quả tái sinh

sau khi dung hợp

Tế bào trần của các dòng khoai tây dại nhị bội và các giống khoai tây trồng tứ bội đƣợc dung hợp bằng xung điện theo quy trình đã đƣợc tối ƣu hóa ở giai đoạn trƣớc. Tế bào trần sau khi dung hợp đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng VKM II (Thieme et al., 1997) ở các nền khác nhau (lỏng; bán lỏng và rắn). Kết

quả đƣợc thể hiện trên bảng 4.6 và hình 4.4.

Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng khác nhau đến sự phân chia của tế

bào trần là rất rõ rệt (bảng 4.6). Trên môi trƣờng lỏng, tế bào trần của các các tổ

hợp lai bắt đầu phân chia sau 2-3 ngày nuôi cấy và tạo microcallus sau khoảng 2

tuần nuôi cấy. Trong khi đó các tế bào trần trên môi trƣờng bán lỏng (nhỏ giọt agar) có thời gian xuất hiện phân chia lâu hơn (sau từ 4-7 ngày). Trên môi trƣờng

rắn, các tế bào hầu nhƣ không có khả năng phân chia hoặc chỉ có rất ít tổ hợp có

xuất hiện phân chia tế bào (blb + Delikat; trn + Delikat; blb + Atlantic) nhƣng sau

thời gian lâu hơn rất nhiều (trên 9 ngày). Điều này rất đúng với lý thuyết là môi trƣờng nuôi cấy tế bào trần phải đảm bảo đƣợc sự cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trƣờng và nội bào, nồng độ Ca2+ trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào trần thƣờng cao hơn 2-4 lần so với môi trƣờng bình thƣờng cho tới khi tái sinh đƣợc vách tế

bào đƣợc hình thành và hình thành microcallus. Nhƣ vậy chỉ có môi trƣờng lỏng

mới đảm bảo đƣợc các điều kiện trên.

Bảng 4.6. Sự phân chia của các tổ hợp lai sau khi dung hợp trên các điều kiện m i trƣờng khác nhau*

Thời gian xuất hiện tế ào phân chia (ngày) Thời gian xuất hiện microcallus (ngày) Tổ hợp lai

Lỏng Bán lỏng Rắn Lỏng Bán lỏng Rắn

trn3G + Agave 3 4 12 21 - -

trn3G + Rasant blb2G + Delikat 3 2 3 5 14 11 21 26 - - - 15

trn3G + Delikat pnt2G + Atlantic 3 2 6 6 12 10 25 22 - - 9 -

Chú thích: (*) 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp đƣợc theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên môi

trƣờng VKM II trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia.

blb2G + Atlantic trn3G + Atlantic 3 3 5 4 12 14 23 24 - - 11 -

1

2

3 Hình 4.4. Sự phân chia của tổ hợp lai trn3G + Delikat trên các điều kiện môi trƣờng khác nhau sau 4 ngày nuôi cấy

Chú thích: 1- VKM II lỏng; 2- VKM II bán lỏng; 3- VKM II rắn

Điều kiện môi trƣờng cũng có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng phân chia tạo microcallus của các tế bào trần sau dung hợp. Trên môi trƣờng lỏng, hầu

nhƣ các tế bào phân chia tạo hạt microcallus sau khoảng 10-14 ngày với chất lƣợng

microcallus trắng sáng, kích thƣớc hạt to nhƣ hạt tấm. Khả năng hình thành

microcallus trên môi trƣờng bán lỏng chậm hơn (sau khoảng 20 ngày) và chất lƣợng microcallus kém hơn (xuất hiện nhiều microcllus màu nâu sáng, hạt nhỏ). Trên

môi trƣờng rắn các tế bào không có khả năng phân chia hình thành microcallus.

4.1.3.2. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia của các tổ hợp lai sau dung hợp Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia của

các tổ hợp lai sau dung hợp

Tế bào trần của các tổ hợp lai sau khi dung hợp đƣợc nuôi cấy trên các

loại môi trƣờng lỏng khác nhau: môi trƣờng VKM II (Thieme et al., 1997),

Medium A* (Ehsanpour et al., 2001), KM8P* (Paula Conde et al., 2006) đƣợc

trình bày ở bảng 4.7.

Bảng 4.7. Sự phân chia của các tổ hợp lai trên các m i trƣờng nu i cấy khác nhau

Thời gian xuất hiện tế ào phân chia Thời gian xuất hiện microcallus Số lƣợng microcallus trung Tổ hợp lai (ngày) (ngày) ình đĩa petri

VKMII A* KM8P* VKMII A* KM8P* VKMII A* KM8P*

trn3G + Agave trn3G + Rasant 3 3 5 4 6 5 12 14 - 21 - - 22,7 13,3 - 4,4 - -

blb2G + Delikat trn3G + Delikat 2 3 7 9 5 4 11 12 - 21 - - 29,6 35,7 - - - 5,8

Pnt2G + Atlantic blb2G + Atlantic 2 3 6 9 6 4 10 12 - - 22 - 48,3 5,1 - - 1,3 -

Chú thích: 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp đƣợc theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên môi

trƣờng lỏng trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia.

Trên môi trƣờng A* và KM8P*, thời gian bắt đầu phân chia của tế bào trần của các dòng khoai tây nghiên cứu là 4-9 ngày. Tốc độ phân chia tế bào thấp và không đồng đều. Hầu nhƣ các tế bào trần không hình thành đƣợc microcallus và chết sau 2 tuần nuôi cấy. Chỉ có rất ít tổ hợp lai có hình thành microcallus trên

môi trƣờng A* và KM8P* nhƣng sau thời gian rất lâu (bảng 4.7).

trn3G + Atlantic 3 7 8 14 21 - 9,4 5,9 -

Các tế bào trần nuôi cấy trên môi trƣờng VKMII bắt đầu phân chia chỉ sau 2-3 ngày nuôi cấy tùy thuộc vào dòng khoai tây nuôi cấy. Sau 3 ngày nuôi cấy, toàn bộ các dòng đều phân chia và tạo microcallus sau 2 tuần nuôi cấy. Các tổ hợp lai khác nhau cũng có sự phân chia và sự hình thành microcallus khác nhau trên môi trƣờng VKMII. Nhƣ vậy: môi trƣờng VKMII là môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy tạo microcallus của tế bào trần sau khi dung hợp.

4.1.3.3. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi của các tổ hợp lai Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi

của các tổ hợp lai

Các tổ hợp lai sau khi dung hợp phân chia tạo microcallus trên môi trƣờng lỏng VKMII đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng Cul-medium (theo Thieme et al.,

2008) để tạo các macrocallus. Các macrocallus đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng

tái sinh tạo chồi. Thí nghiệm theo dõi 10 đĩa petri/tổ hợp lai, mỗi đĩa petri cấy 10

macrocallus (đƣờng kính từ 2-4mm). Mỗi callus chỉ lấy 1 chồi đầu tiên và lấy số

lƣợng chồi trung bình/đĩa. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.8, hình 4.5.

Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của m i trƣờng tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai

Số lƣợng chồi tái sinh chất lƣợng chồi Tổ hợp lai M i trƣờng RJM M i trƣờng MSO M i trƣờng K8P

trn3G + Agave 3,3/++ 0,8/+ 2,5/+

trn3G + Rasant blb2G + Delikat 5,5/++ 6,5/++ 1,6/+ 0/- 1,3/+ 2,4/+

trn3G + Delikat pnt2G + Atlantic 8,8/++ 6,4/++ 0/- 1,65/+ 0,8/- 0/-

(-): Chồi yếu, màu trắng; +: Chồi phát triển trung bình, màu vàng nhạt; ++: chồi tốt, mập, xanh

Môi trƣờng khác nhau có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng tái sinh tạo chồi của các tổ hợp lai. Nhìn chung, trên môi trƣờng MSO và K8P, các callus của các tổ hợp lai tái sinh kém, số chồi trung bình /đĩa chỉ đạt từ 0-2,5 chồi/đĩa. Nhiều đĩa không có khả năng tái sinh chồi. Trên môi trƣờng RJM, hầu nhƣ các tổ hợp lai đều có khả năng tái sinh tạo chồi với số chồi trung bình/đĩa dao động từ 1,3-9,1 chồi/đĩa. Khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai khác nhau cũng khác nhau rõ rệt. Các tổ hợp lai trn3G + Delikat, pnt3G +Atlantic có khả năng tái sinh cao với số

blb2G + Atlantic trn3G + Atlantic 1,7/+ 2,3/- 0/- 0/- 0/- 0/-

chồi trung bình/đĩa lần lƣợt là 8,8 và 6,4. Các chồi này phát triển tốt, màu xanh. Tổ hợp lai blb2G +Atlantic; trn3G +Atlantic có khả năng tái sinh kém, chất lƣợng chồi kém, màu trắng xốp (bảng 4.8).

1 2 3

Hình 4.5 Khả năng tái sinh chồi của tổ hợp lai trn + Rasant sau 12 tuần trên m i trƣờng khác nhau 1- Môi trƣờng RJM; 2- Môi trƣờng MSO; 3- Môi trƣờng K8P.

Tổng hợp các kết quả nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp thì

thấy đã tái sinh đƣợc tổng số 1612 callus và tạo đƣợc 188 chồi trong đó tỷ lệ tái

sinh chồi của các tổ hợp lai khác nhau rõ rệt (bảng 4.9).

Bảng 4.9. Kết quả nu i cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai sau dung hợp

Số lƣợng callus Số lƣợng chồi Tỷ lệ tái sinh Tên tổ hợp lai tái sinh tái sinh (%)

trn3G + Agave 120 39 32,5

trn3G + Rasant blb2G + Delikat 97 250 25 31 25,8 12,4

trn3G + Delikat pnt2G +Atlantic 250 193 64 23 25,6 11,9

blb2G + Atlantic trn3G + Atlantic 307 395 4 2 1,3 0,5

Tổng số 1612 188

4.1.4. Xác định các con lai soma ằng các phƣơng pháp đo độ ội Flow cytometry và ằng chỉ thị phân tử SSR 4.1.4.1. Xác định các con lai soma bằng phương pháp đếm độ bội thể (Flow cytometry) Thí nghiệm 9: Xác định các con lai soma bằng phương pháp đếm độ bội thể

(Flow cytometry)

Từ kết quả dung hợp tế bào trần đã tạo đƣợc 07 tổ hợp lai giữa các dòng khoai tây dại nhị bội và các giống khoai tây trồng tứ bội. Các tổ hợp lai đƣợc

nuôi cấy tái sinh để tạo microcallus, macrocallus và tái sinh chồi. Sử dụng phƣơng pháp phân tích độ bội thể Flow cyometry để đo độ bội của các con lai.

Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 4.10, hình 4 .6.

Bảng 4.10. Kết quả tái sinh và phân tích độ ội thể của các tổ hợp lai sau dung hợp

STT Tên tổ hợp lai Số lƣợng callus tái sinh Số lƣợng chồi tái sinh Số dòng lục ội 2n= 6x

1 trn3G + Agave 120 39 15

2 3 4 trn3G + Rasant blb2G +Delikat trn3G + Delikat 97 250 250 25 31 64 12 15 28

5 6 7 pnt2G +Atlantic blb2G + Atlantic trn3G + Atlantic 193 307 395 23 4 2 9 3 0

Tổng 1612 188 82

C B A

Hình 4.6. Hình ảnh độ ội thể của dòng khoai tây ố m và con lai

Chú thích: A- Giống khoai tây trồng (4x), B- Dòng khoai tây dại (2x), C- con lai soma lục bội (6x)

Từ 188 chồi tái sinh sau dung hợp chỉ có 82 cây có độ bội thể 2n=6x (chiếm tỷ lệ 43,6 %). Tỷ lệ cây lục bội (2n=6x) phụ thuộc vào các tổ hợp dung hợp khác nhau. Trong 7 tổ hợp dung hợp thì tổ hợp lai Delikat (+) trn3G cho tỷ lệ cây tái sinh có độ bội thể 6x là cao nhất trong khi đó tổ hợp lai giữa Atlantic

(+) trn 3G không cho kết quả tạo con lai lục bội (bảng 4.10).

Sử dụng máy flow cytometry đã xác định đƣợc 82/102 dòng là thể lục bội.

Mục tiêu của nghiên cứu cần tách đƣợc các thể lai dị nhân lục bội (con lai soma).

4.1.4.2. Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR Thí nghiệm 10: Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR

Mục tiêu của nghiên cứu cần chọn lọc đƣợc các thể lai có kiểu gen dị hợp

nhân (con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng). Các con lai ngẫu nhiên đƣợc xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Dinu and Thieme 2001), sử dụng cặp mồi

theo Song et al. (2005). Hình 4.7 và 4.8 minh họa cho kết quả điện di cho phân

tích 2 chỉ thị SSR là chỉ thị STIIKA và chỉ thị STM2022 nhằm xác định kiểu gen

dị hợp nhân của các dòng lục bội của tổ hợp lai giữa trn3G+ Rasant. Trong số 25

dòng con lai tái sinh ngẫu nhiên của tổ hợp lai dòng dại trn3G và giống Rasant

đƣợc phân tích có 6 con lai lục bội có kiểu gen dị hợp nhân.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Hình 4.7. Minh họa kết quả điện di cho phân tích chỉ thị phân tử STIIKA để xác định kiểu gen dị hợp nhân của tổ hợp lai trn 3G + cv.Rasant

Chú thích: giếng 1- trn3G; giếng 2- Rasant; giếng 3-27 là 25 dòng lai ngẫu nhiên tái sinh của tổ hợp lai

giữa trn3G + Rasant trong đó có 6 con lai lục bội dị hợp nhân gồm: giếng 6- con lai 1/6, giếng 12- con lai

3/4, giếng 20- con lai 3/5, giếng 21- con lai 3/ 7, giếng 22- 3/9, giếng 24- 3/12.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Hình 4.8 Minh họa kết quả điện di cho phân tích chỉ thị phân tử STM2022 để xác định kiểu gen dị hợp nhân của tổ hợp lai trn 3G + cv.Rasant

Chú thích: giếng 1- trn3G; giếng 2- Rasant; giếng 3-27 là 25 dòng lai ngẫu nhiên tái sinh của tổ hợp lai giữa trn3G + Rasant trong đó có 6 con lai lục bội dị hợp nhân gồm: giếng 6- con lai 1/6, giếng 12- con lai

3/4, giếng 20- con lai 3/5, giếng 21- con lai 3/ 7, giếng 22- 3/9, giếng 24- 3/12.

Kết quả bảng 4.11 cho thấy trong số 188 con lai tái sinh có 82 con có độ bội thể 6x nhƣng chỉ có 69 con có kiểu gen dị hợp nhân. Tùy thuộc vào các tổ hợp lai khác nhau, tỷ lệ con lai soma của các tổ hợp lai là rất khác nhau (2/11 tổ

hợp dung hợp không có con lai soma có kiểu gen dị hợp nhân. Tổ hợp lai trn3G + Delikat có số con lai soma cao nhất (28 dòng) chiếm tỷ lệ 43,8% trong số các con lai sinh sau dung hợp.

Bảng 4.11. Kết quả chọn lọc con lai soma ằng phân tích độ ội và chỉ thị phân tử SSR

Tổ hợp lai Tên mồi xác định con lai Số con lai soma (Hetezygous)

trn3G + Agave trn3G + Rasant blb2G + Delikat trn3G + Delikat pnt2G +Atlantic blb2G + Atlantic trn3G + Atlantic Tống Số cây xác định độ ội 39 25 31 64 23 4 2 1612 Số con lai lục ội (2n= 6x) 15 12 15 28 9 3 0 82 15 6 14 28 6 0 0 69 Tỷ lệ con lai soma/ con lai tái sinh (%) 38,5 24,0 45,2 43,7 26,1 0,0 0,0 STM2022 STM2022, STIIKA STM2022 STM2022 STM3023 STM1106 STM1104

4.1.5. Đánh giá đặc tính kháng ệnh mốc sƣơng của các con lai soma ằng lây nhiễm nhân tạo và ằng chỉ thị phân tử 4.1.5.1. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử a. Thí nghiệm 11: Phân lập nấm Phytophthora infestans và đánh giá độc tính của

nguồn nấm bệnh thu thập được

Mẫu nấm mốc sƣơng đƣợc phân lập từ mẫu lá bệnh thu thập ở các vùng

trồng khoai tây tại Hà Nội và Lạng Sơn. Nguồn nấm đƣợc nuôi trên các lát củ,

sau 6 – 7 ngày triệu chứng của nấm xuất hiện trên lát cắt củ.

Quan sát thấy trên bề mặt lát củ xuất hiện vết chết hoại, chuyển màu nâu xám, hình thành một lớp nấm trắng mịn ăn lan khắp lát củ. Đây là những triệu

chứng đặc trƣng của bệnh mốc sƣơng trên củ khoai tây do nấm Phytopthora

infestans gây ra.

Quan sát dƣới kính hiển vi cho thấy sợi nấm có cấu tạo đơn bào, không màu, cành bọc động bào tử không màu, phân nhiều nhánh cấp 1 so le với nhau. Bọc động bào tử quan sát đƣợc có dạng hình quả chanh yên hoặc hình trứng, có núm nhỏ ở đỉnh. Bọc bào tử động bài tử hình thành ở đỉnh nhánh theo kiểu vô hạn khiến cho nhánh có các chỗ phình ra, thót vào (hình 4.9). Đây là đặc điểm riêng

biệt của cành bọc động bào tử nấm P. infestans so với các loài Phytophthora khác.

Qua quan sát các triệu chứng bệnh và đặc điểm hình thái của hệ sợi nấm và bọc động bào tử của chủng nấm phân lập dƣới kính hiển vi (bảng 4.12), nghiên cứu đã khẳng định chủng nấm phân lập mang các đặc điểm đặc trƣng về hình thái của nấm mốc sƣơng Phytopthora infestans.

Hình 4.9. Bọc động bào tử và cành bọc động bào tử của nấm mốc sƣơng

(quan sát dƣới kính hiển vi)

Bảng 4.12. Đặc điểm hình thái của nấm P. infestans trong quá trình nu i cấy

Chỉ tiêu theo dõi Đặc điểm

Dạng tản nấm Màu sắc tản nấm Màu sắc bề mặt lát củ

Sợi nấm Bào tử nấm

Xốp, đâm tia nhanh, phát triển mạnh trên bề lát cắt củ Hình thành lớp nấm xốp, trắng mịn Trên bề mặt lát củ xuất hiện các vết chết hoại, chuyển màu nâu xám, bề mặt khô Sợi nấm đa bào, không màu, phân nhánh nhiều Bọc động bào tử có dạng quả chanh yên, bầu dục, có núm nhỏ ở đầu. Hình thành ở đỉnh cành bào tử

Bảng 4.13. Phản ứng của một số giống khoai tây với 2 mẫu mốc sƣơng thu thập từ Hà Nội và Lạng Sơn

Kích thƣớc vết hoại tử trên lá điểm

Tên giống Đánh giá sai khác về tính độc Chủng Hà Nội Chủng Lạng Sơn Đánh giá iểu hiện ệnh (Mean±SD)*

(Chú thích: * Mean= giá trị trung bình của kích thƣớc vết hoại tử trên lá với 5 lần lặp lại trong đó 1=

kháng; 9 = nhiễm; SD là sự sai khác giữa 5 lần lặp lại.)

PO7 Solara KT2 VC38-6 KT3 Atlantic Delikat 3,0 ± 0,5 5,2 ± 2,2 5,0 ± 0,5 5,0 ± 1,0 6,2 ± 1,2 5,2 ± 2,2 4,0 ± 0,25 3,8 ±.2 4,6 ± 0,3 5,6 ± 1,3 6,0 ± 0,5 5,8 ± 1,7 5,6 ± 2,8 4,8 ± 0,7 Không sai khác Không sai khác Không sai khác Không sai khác Không sai khác Không sai khác Không sai khác

Nguồn nấm bệnh phân lập đƣợc từ 2 vùng sinh thái khác nhau đều thể hiện tính độc trên các giống khoai tây trồng tại Việt Nam, thể hiện mức độ gây bệnh khá cao trên các đối tƣợng khảo sát. Qua bảng 4.13 cho thấy các chủng nấm phân lập đƣợc từ 2 địa phƣơng đều thể hiện tính độc trên các giống khoai tây trồng tại Việt Nam, thể hiện mức độ gây bệnh khá cao trên các đối tƣợng khảo sát. Sau khi xử lý số liệu thống kê chúng tôi nhận thấy không có sự sai khác về tính độc giữa 2 chủng nấm đƣợc phân lập. Nguồn nấm bệnh này hoàn toàn có thể sử dụng cho các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo.

Hình 4.10. So sánh tính độc của 2 nguồn nấm bệnh phân lập từ Hà Nội và Lạng Sơn

b. Thí nghiệm 12: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma

bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời

Các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo đƣợc thực hiện trên mẫu lá của các vật liệu nghiên cứu trồng trong chậu vại ở thời kỳ cây chuẩn bị ra hoa. Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 4.14.

Kết quả đánh giá bằng lây nhiễm nhân tạo cho thấy các dòng khoai tây dại sử dụng để dung hợp S.bulbocastanum, S. tarnii và S. pinnatisectum đều có đặc tính kháng cao với bệnh mốc sƣơng (điểm đánh giá kích thƣớc vết hoại tử nằm trong khoảng từ 1,0 – 1,8), trong khi các giống khoai tây trồng Delikat, Agave, Atlantic, Quarta, Rasant có tính kháng bệnh mốc sƣơng khá thấp (điểm đánh giá vết hoại tử nằm trong khoảng từ 3,6-4,6). Các con lai soma của tổ hợp lai giữa S. tarnii; S. pinnatisectum với các giống khoai tây trồng Delikat, Atlantic, Rasant và Agave hầu nhƣ không làm thay đổi khả năng kháng bệnh mốc sƣơng. Chỉ có các con lai soma của tổ hợp lai giữa loài dại S. bulbocastanum với giống khoai

tây trồng Delikat có tính kháng rất cao với bệnh mốc sƣơng. Điều này chứng tỏ dòng dại S.bulbocastanum có khả năng chuyển đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của nó cho các giống khoai tây trồng thông qua dung hợp.

Bảng 4.14. Kết quả đánh giá tính kháng ệnh mốc sƣơng của các con lai soma và dòng ố m ằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời

Tên dòng giống Kí hiệu

blb2G trn3G pnt2G

S.bulbocastanum S. tarnii S. pinnatisectum cv.Delikat cv.Atlantic cv.Rasant cv.Agave trn 3G+cv.Delikat SHtrn3G+Delikat SHtrn3G+Delikat SHtrn3G+Delikat SHtrn3G+Delikat SHtrn3G+Delikat trn 3G+cv.Rasant SHtrn3G+Rasant SHtrn3G+Rasant SHtrn3G+Rasant SHtrn3G+Rasant trn 3G+cv.Agave SHtrn3G+Agave SHtrn3G+Agave SHtrn3G+Agave SHtrn3G+Agave SHtrn3G+Agave SHtrn3G+Agave SHtrn3G+Agave blb 2G+cv.Delikat SHblb2G+Delikat SHblb2G+Delikat SHblb2G+Delikat SHblb2G+Delikat Kích thƣớc vết hoại tử Điểm Mean±SD 1 1,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 1,8±0,2 4,0±0,1 3,6±0,1 4,6±0,0 4,6±0,0 5,2±0,0 4,0±0,1 4,2±0,2 5,2±0,2 4,0±0,0 4,4±0,1 4,4±0,0 4,4±0,0 6,0±0,0 4.,6±0,1 3,4±0,0 5,0±0,1 3,8±0,0 - 4,2±0,3 4,2±0,3 1,8±0,2 2,4±0,0 1,6±0,0 1,4±0,1 Sự hình thành ào tử nấm Điểm Mean±SD 2 1,0±0,0 1,0±0,0 1,0±0,0 2,8±0,0 2,0±0,0 2,0±0,0 2,2±0,0 2,8±0,0 2,0±0,0 2,3±0,0 3,0±0,0 2,3±0,0 1,0±0,0 1,8±0,0 2,3±0,0 3,0±0,0 2,3±0,1 1,3±0,1 2,5±0,1 1,5±0,0 - 2,0±0,0 1,5±0,0 1,0±0,0 1,3±0,1 1,0±0,0 1,0±0,0 857/5 851/2 849/5 849/4 838/11 1/6 3/9 3/7 3/5 4/12 4/13 4/20 4/22 7/3 7/4 7/7 2281/10 2283/5 2292/4 2295/1

Kí hiệu Tên dòng giống

Sự hình thành ào tử nấm Điểm Mean±SD 2 3,0±0,0 2,5±0,1 - 2,3±0,0 2,7±0,0 - 2,5±0,1 2,3±0,1 - - pnt 2G+cv.Delikat SHpnt2G+Delikat SHpnt2G+Delikat SHpnt2G+Delikat SHpnt2G+Delikat SHpnt2G+Delikat pnt2G+cv.Atlantic SHpnt2G+Atlantic SHpnt2G+Atlantic SHpnt2G+Atlantic SHpnt2G+Atlantic SHpnt2G+Atlantic 2196/4 2199/6 2197/6 2204/3 2235/1 257/2 245/6 248/1 254/1 257/1

lần lặp lại; SD là sự sai khác giữa 5 lần lặp lại.

Điểm 1: không có vết bệnh ở cả mặt trƣớc và mặt sau lá; điểm 2: có 1 điểm ở bề mặt sau lá; không có vết bệnh ở bề mặt trƣớc lá; điểm 3: 1-4 % vùng lá bị nhiễm bệnh, khoảng 4 cm2; điểm 4: 5-12% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 5: 13-30% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 6: 31-55% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 7: 56-78% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 8: 79-96% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 9: 97-100% diện tích lá bị nhiễm bệnh.

2 Đo sự hình thành bào tử nấm ở bề mặt sau của lá: điểm 1: từ không có triệu chúng vết bệnh hoạc vết hoại tử 2-4mm; điểm 2: nhiễm trung bình 5-55% diện tích bề mặt lá; điểm 3: 56-100% diện tích lá bị nhiễm bệnh. (-) không đánh giá

Kích thƣớc vết hoại tử Điểm Mean±SD 1 4,0±0,1 4,6±0,1 - 4,0±0,1 5,4±0,0 - 4,8±0,0 4,0±0,1 - - Chú thích: SH: con lai soma; 1 Mean= giá trị trung bình của kích thƣớc vết hoại tử trên lá với 5

Hình 4.11. Sự biểu hiện vết bệnh trên lá sau 6 ngày lây nhiễm

Chú thích: 136= blb 2G, 144 = cv.Delikat, 50, 51, 52, 53 là con lai soma 2281/10; 2283/5; 2292/4; 2295/1)

c. Thí nghiệm 13: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma

bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ

Sau 7-9 ngày lây nhiễm trên các lát cắt củ bắt đầu xuất hiện các triệu chứng của bệnh mốc sƣơng. Đánh giá và cho điểm đặc tính kháng bệnh mốc

sƣơng của các đối tƣợng nghiên cứu dựa trên mức độ biểu hiện triệu chứng và sự hình thành bào tử trên quan sát đƣợc trên lát cắt củ. Kết quả đánh giá đƣợc biểu hiện tại bảng 4.15.

Bảng 4.15. Kết quả đánh giá tính kháng ệnh mốc sƣơng của các con lai soma và dòng ố m ằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ tu er slice test

Tên dòng giống Kí hiệu

Chú thích: Mean= giá trị trung bình của kích thƣớc vết hoại tử trên lát cắt củ với 5 lần lặp lại trong đó

1= kháng; 9= nhiễm; SD là sự sai khác giữa 5 lần lặp lại: điểm 1: không có vết bệnh; điểm 2: 1% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (20mm2); điểm 3: 0,5-5% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (150mm2); điểm 4: 6-12% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (300mm2); điểm 5: 25% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 6: 43% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 7: 62% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 8: 85% diện tích lát củ bị

nhiễm bệnh; điểm 9: 96-100% diện tích củ bị nhiễm bệnh. (-) không đánh giá.

Sự hình thành ào tử nấm trên lát củ điểm Mean±SD 4,2±0.0 3,5±0,2 4,6±0,0 2,7±0,1 1,0±0,0 1,0±0,0 1,00±0,0 - 1,0±0,0 1,0±0,0 1,0±0,0 1,0±0,0 1,0±0,0 1,0+-0,0 1,0±0,0 1,0±0,0 1,0±0,0 - - 1,0±0,0 1,0±0,0 - - 1,0±0,0 1,0±0,0 cv.Atlantic cv.Rasant cv.Delikat cv.Agave blb2G trn3G pnt2G 245/6 248/1 2044/1 2281/10 2283/5 2292/4 2295/1 838/11 851/2 2195/2 2196/4 1/6 3/9 3/7 4/22 4/12 7/7 7/4 Atlantic Rasant Delikat Agave S.bulbocastanum S.tarnii S. pinnatisectum pnt2G+Atlantic pnt2G+Atlantic pnt2G+ Rasant blb2G+Delikat blb2G+Delikat blb2G+Delikat blb2G+Delikat trn3G+Delikat trn3G+Delikat pnt2G+Delikat pnt2G+Delikat trn3G+Rasant trn3G+Rasant trn3G+Rasant trn3G+Agave trn3G+Agave trn3G+Agave trn3G+ Agave Kích thƣớc vết hoại tử trên lát củ điểm (Mean±SD) 4,0±0,0 4,5±0,2 5,5±0,3 4,7±0,1 1,0±0,0 1,0±0,0 1.8±1,7 - 2,2±1,7 2,8±0,7 1,0±0,0 0,0 1,0 1,0±0,0 1,0±0,0 1,4±0,3 2,6±0,3 1,2±0,2 - - 1,0±0,0 1,6±0,3 - - 1,4±0,8 0,0 1,0

Kết quả cho thấy rằng tất cả các dòng giống đều có biểu hiện kháng khác nhau với nguồn mốc sƣơng đã phân lập. 4 con lai soma của tổ hợp lai S.

bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat có biểu hiện kháng cao với

bệnh mốc sƣơng. Một số con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng dại S. tarnii với

khoai tây trồng cũng có biểu hiện kháng cao với bệnh mốc sƣơng trên củ.

Tổng hợp các kết quả lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời và trên lát

cắt củ cho thấy các con lai soma của tổ hợp lai giữa S.bulbocastanum và Delikat có tính kháng bệnh mốc sƣơng rất cao. Các con lai này tiếp tục đƣợc kiểm tra khả

năng có mặt của gen kháng bệnh mốc sƣơng.

d. Thí nghiệm 14: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma

bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng (Field test)

Các vật liệu sẽ tiếp tục đƣợc đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sƣơng

trên đồng ruộng, sử dụng dung dịch lây nhiễm với nồng độ 20.000 bọc động bào

tử/ml. Thí nghiệm lây nhiễm đƣợc tiến hành vào chiều tối mát, duy trì nhiệt độ khoảng 180C- 250C, ẩm độ khoảng 70-80%. Triệu chứng bệnh sẽ bắt đầu xuất hiện khoảng 1 tuần sau lây nhiễm. Tiến hành đo đếm mỗi tuần 1 lần trong suốt

quá trình diễn biến của bệnh (7 lần). Kết quả đƣợc tính theo chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (bảng 4.17). Hệ số kháng bệnh điều chỉnh theo độ thành thục

(∆)rAUDPC > 0 cho thấy giống rất mẫn cảm với bệnh, (∆)rAUDPC < 0 nghĩa là

giống có khả năng kháng cao với bệnh trong đó giá trị tuyệt đối của (∆)rAUDPC

càng nhỏ thì khả năng kháng bệnh càng cao.

Bảng 4.16. Kết quả đánh giá các con lai soma và các dòng ố m về khả năng kháng ệnh mốc sƣơng trên đồng ruộng và đánh giá sự thành thục của cây

Tình trạng cây ký hiệu Tình trạng cây/ tổ hợp lai Cấp ệnh trung bình (leaflet assay)

Sự thành thục của cây 1- Chín sớm; 9-Chín muộn Hệ số kháng ệnh điều chỉnh theo độ thành thục (ΔrAUDPC)

Delikat 5,0 (1) S 0,311 (2) 4,8

Giống thƣơng phẩm Loài dại Blb + Delikat S. bulbocastanum SH 2282/4 SH 2283/5 SH 2283/9 SH 2292/4 1,0 R 1,0 R 1,4 R 1,8 R 1,0 R - -0,352 -0,248 -0,324 -0,030 - 6,0 6,5 6,0 7,4

Giống khoai tây trồng Delikat rất mẫn cảm với bệnh trong khi các con lai soma của dòng giống này với dòng dại S. bulbocastanum có khả năng kháng bệnh cao (bảng 4.16). Thông qua đánh giá về sự thành thục trên đồng ruộng cũng cho thấy có sự tƣơng quan giữa tính kháng bệnh mốc sƣơng với sự thành thục của các kiểu gen khác nhau. Các kiểu gen có tính kháng bệnh cao thì thƣờng là chín muộn và ngƣợc lại. Có nhiều khả năng liên quan đến sự liên kết hay tƣơng tác giữa các gen dẫn đến kết quả trên. Con lai SH 2292/4 có độ chín muộn trong khi các con lai khác có độ chín trung bình (bảng 4.16). Nhƣ vậy có sự tƣơng quan chặt chẽ giữa tính kháng bệnh mốc sƣơng và độ chín của cây. Điều này nói nên rằng diễn biến của bệnh trên đồng ruộng khá phức tạp, chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố của tự nhiên, do nhiều gen kiểm soát và đƣợc cho là tính kháng có ý nghĩa quan trọng nhất (tính kháng về số lƣợng- Quantatitive resistance)

SH 2283/5

Hình 4.12. Sự biểu hiện tính kháng trên đồng ruộng của con lai soma blb2G + Delikat (SH2283/5)

e. Thí nghiệm 15: Đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử

Cho đến nay đã có 4 gen kháng có nguồn gốc từ loài dại Solanum bulbocastanum thuộc vùng lặp giàu leucine (NBS-LRR) đƣợc phát hiện và nhân dòng, bao gồm: Gen Rpi-blb1 (van der Vossen et al., 2003; Wang et al., 2008) hay còn đƣợc biết đến với tên RB (Song et al., 2003), định vị trên nhiễm sắc thể số VIII, gần chỉ thị CT64 và thuộc một cụm 4 gen kháng tƣơng đồng (resistance gene analogues – RGAs) (van der Vossen et al., 2003); gen Rpi-blb2 (van der Vossen et al., 2005) nằm trên nhiễm sắc thể số VI gần chỉ thị CT119; gen Rpi-blb3 (Lokosou et al., 2009) định vị trên nhiễm sắc thể số IV gần chỉ thị TG339 và nằm trong cụm gen kháng mốc sƣơng đặc hiệu chủng (R2, Rpi-abpt, R2-like); gen Rpi-bt1 (Oosumi et al., 2009) có đƣợc từ phép lai giữa S. bulbocastanum và S. tuberosum.

Trong thí nghiệm này, để phát hiện gen kháng Rpi-blb1 chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi 1/1’ và blb1 trong đó cặp mồi 1/1’ nhân đoạn DNA có kích thƣớc 213bp (Colton et al., 2006) và cặp mồi blb1 nhân đoạn DNA có kích

thƣớc 820bp liên kết chặt với gen Rpi-blb1 (Wang et al., 2008). Kết quả nhƣ hình 4.13-A, 4.13-B và 4.13-C.

Hình 4.13- A. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 1 1’

Chú thích: Ladder (giếng 1); blb (giếng 2); SHblb2G+Deli - 2281/10 (giếng 3); SHblb2G+Deli - 2283/5 (giếng 4); SHblb2G+Deli - 2292/4 (giếng 5); SHblb2G+Deli - 2295/1 (giếng 6); Delikat (giếng 7); pnt 2G (giếng 8); trn 3G (giếng 9); cph (giếng 10); 1031 (giếng 11); 1032 (giếng 12).

Hình 4.13-B. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu blb1

Sản phẩm phản ứng PCR khi chạy với cặp mồi 1/1’ chỉ xuất hiện ở các giếng 2, 3, 4, 5 và 6 tƣơng ứng với vị trí của dòng khoai tây dại S. bulbocastanum và các con lai soma giữa Delikat và S. bulbocastanum nhƣng không xuất hiện vạch băng ở vị trí của dòng Delikat. Tất cả các vạch băng của blb và con lai soma đều rõ ràng, có cùng kích thƣớc, đối chiếu với thang chuẩn kích thƣớc 100bp chúng tôi nhận thấy kích thƣớc của sản phẩm PCR xấp xỉ 213bp bằng với kích thƣớc của đoạn DNA liên kết chặt với gen Rpi-blb1 đƣợc nhân lên nhờ cặp mồi 1/1’.

Kết quả chạy PCR với cặp mồi Blb1 cũng cho thấy sản phẩm PCR chỉ xuất hiện tại vị trí của dòng khoai tây dại S. bulbocastanum và các con lai soma giữa Delikat và S. bulbocastanum. Đối chiếu kết quả PCR với thang chuẩn có kích thƣớc 1kb cho thấy các vạch băng đều có cùng kích thƣớc xấp xỉ 820bp, tƣơng đƣơng với kích thƣớc đoạn DNA liên kết với gen Rpi-blb1 đƣợc nhân lên nhờ cặp mồi Blb1.

Thí nghiệm đánh giá sự có mặt của gen kháng Rpi-blb2 có nguồn gốc thừ loài dại S. bulbocastanum cũng đƣợc chúng tôi thực hiện, trong đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu blb2 nhân đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 773bp (Wang et al., 2008) . Tuy nhiên việc kết quả không phát hiện đƣợc gen kháng Rpi-blb2 có mặt trong các con lai soma.

Để đánh giá sự có mặt của gen Rpi-blb3 chúng tôi sử dụng cặp mồi blb3

nhân đoạn DNA có kích thƣớc 618bp tiến (Wang et al., 2008).

Hình 4.13-C. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu blb3

(giếng 8); trn 3G (giếng 9); cph (giếng 10); 1031 (giếng 11); 1032 (giếng 12).

Kết quả của phản ứng PCR khi chạy với cặp mồi blb3 cho thấy sản phẩm

PCR chỉ có mặt tại các giếng số 2,3,4,5 và giếng số 6 tƣơng ứng với vị trí của dòng khoai tây dại S. Bulbocastanum và các con lai soma của tổ hợp lai giữa

Delikat và S. bulbocastanum, không có sản phẩm PCR ở các giếng còn lại. Các

vạch băng hiển thị khá rõ nét và có cùng kích thƣớc, khi đối chiếu với các vạch

băng của ladder 100bp tiêu chuẩn chúng tôi nhận thấy kích thƣớc của các vạch băng đều xấp xỉ 618bp, bằng với kích thƣớc đoạn DNA liên kết với gen Rpi-blb3.

Nhƣ vậy dòng dại S.bulbocastanum, các con lai soma của tổ hợp lai giữa S.bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2281/10, 2283/5, 2292/4 và

2295/1) đều có mang gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-blb1 và Rpi-blb3. Kết quả này

phù hợp với kết quả thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo. Điều này thêm một lần nữa

khẳng định đƣợc đã chuyển đƣợc đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng từ loài khoai tây

dại S.bulbocastanum vào các con lai soma thông qua dung hợp tế bào trần.

4.1.5.2. Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học Thí nghiệm 16: Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học

Cùng với khả năng kháng bệnh hại thì khả năng sinh trƣởng và phát triển của cây cũng là chỉ tiêu quan trọng ảnh hƣởng tới năng suất chất lƣợng khoai tây thu đƣợc khi trồng. Các con lai soma lục bội là kết quả của phép lai tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội sẽ mang các tính trạng của cả bố và mẹ. Chính vì thế, để chọn ra đƣợc những dòng lai soma khoai tây mang những tính trạng nông sinh học giống với khoai tây trồng là rất cần thiết. Kết quả đánh giá các đặc tính hình thái, sinh trƣởng, phát triển và

khả năng ra hoa của các con lai soma đƣợc thể hiện trên bảng 4.17; hình 4.14.

Bảng 4.17. Kết quả đánh giá các tính trạng n ng sinh học của các dòng giống khoai tây ố m và con lai soma

STT Tên dòng giống Hình thái cây sức sinh trƣởng của cây Kiểu sinh trƣởng 1=dạng thân, 2= Dạng trung gian, 3=dạng lá Chiều cao cây (cm)

Các dòng bố, mẹ

1 2 3 4 5 6 7 cv. Agave cv.Atlantic cv. Delikat cv. Rasant pnt2G blb2G trn3G 4,2 4,5 4,3 4,3 4,8 6,2 4,9 2 2 2 2 3 3 3

4/12 4/22 7/4 7/7 8 9 10 11 2,5 4,0 2,9 2,7 1 1 1 1

Dạng trồng, +++ Dạng trồng, +++ Dạng trồng,+++ Dạng trồng, +++ Dạng dại,++ Dạng dại, ++ Dạng dại, + Con lai của tổ hợp lai trn3G + Agave Dạng dại, + Dạng dại, + Dạng dại, + Dạng dại, + Con lai của tổ hợp lai pnt2G+Atlantic Dạng dại, + Dạng trồng, ++ 245/6 248/1 12 13 3,9 4,3 1 1

Con lai của tổ hợp lai trn3G + Delikat

14 15 838/11 851/2 Dạng trồng, ++ Dạng trồng, ++ 4,3 6,1 2 1

Con lai của tổ hợp lai blb2G+Delikat

16 17 18 19 2281/10 2283/5 2292/4 2295/1 Dạng trồng, +++ Dạng trồng, +++ Dạng trồng, +++ Dạng trồng, +++ 4,1 5,5 3,9 4,4 2 2 2 2

Con lai của tổ hợp lai pnt2G+Delikat

20 21 22 2195/2 2196/4 2235/1 Dạng trồng, +++ Dạng trồng, +++ Dạng trồng, +++ 5,6 2,7 4,0 2 1 2

Con lai của tổ hợp lai trn3G + Rasant

23 24 25 TR 1/6 TR 3/7 TR 3/9 Dạng trồng, ++ Dạng dại, + Dạng trồng, ++ 4,2 2,1 5,1 1 1 1

Con lai của tổ hợp lai pnt2G+ Rasant

Dạng trồng, +++ Khả năng ra hoa - 7 1 - 3 - - - - - - - 7 7 5 5 9 7 7 7 5 5 - - - - 2

Chú thích: (-): không đánh giá; (+): yếu, (++): trung bình, (+++): Khỏe;

2044/1 CV (%) LSD (%) 6,0 2,8 0,58

Đa số các con lai tạo ra đều có hình thái tƣơng tự với khoai tây trồng

(tuberosum) trừ các con lai 245/6 của tổ hợp lai cv. Atlantic + pnt2G; 3/7 của tổ

hợp lai cv (bảng 4.17). Rasant + trn 3G; 4/12; 7/7; 4/4 của tổ hợp lai cv. Agave +

trn 3G là có kiểu hình tƣơng đối giống dạng dại (Wild type).

Khả năng ra hoa của các con lai soma cũng rất khác nhau. Các con lai có

khả năng ra hoa cao nhƣ 2044/1; 2281/10; 2295/1 và 2195/2. Đây sẽ là những

con lai có triển vọng cho chọn tạo giống vì chỉ những con lai có khả năng ra

hoa mới có thể tiếp tục lai trở với khoai tây trồng để chọn tạo đƣợc những

giống khoai tây mang đặc tính mong muốn. Các con lai của tổ hợp lai trn 3G +

cv. Rasant và trn 3G + cv.Agave không có khả năng ra hoa.

Nhiều con lai soma có số lƣợng củ trung bình trên khóm đạt từ 4-5

củ/khóm nhƣ các con lai 248/1 của tổ hợp Delikat; 838/11 và 851/2 của tổ hợp

lai trn3G +cv.Delikat; 2044/1 của tổ hợp lai pnt2G + cv.Rasant; 2292/4 của tổ

hợp lai blb 2G + cv; 2196/4 của tổ hợp lai pnt2G + cv.Delikat. Đồng thời củ

của chúng có hình dạng củ đẹp, phù hợp với tiêu chuẩn ăn tƣơi hoặc chế biến

(bảng 4.18).

Qua quá trình đánh giá chúng chúng tôi nhận thấy có sự đa dạng về

kiểu hình trong quần thể các dòng con lai soma tạo ra. Những biến dị cũng thể

hiện ngay trên các dòng con lai soma của cùng một tổ hợp lai (hình 4.14-A).

Một số một số con lai soma có xuất hiện các biến dị ở thân, lá, hoa và củ và

khác nhau trong cùng một tổ hợp lai (hình 4.15-B, C và D). Các biến dị xuất

hiện rất đa dạng và khác nhau giữa các tổ hợp lai khác nhau và khác nhau

trong cùng một tổ hợp lai.

Do các con lai soma đƣợc tạo ra thông qua phép lai xa giữa các loài

khoai tây dại với khoai tây trồng (có bộ genome khác nhau) sẽ mang nhiều

tính trạng khác xa với khoai tây trồng. Các biến dị này xuất hiện cả trên kiểu

hình thân, lá, hoa và cấu tạo hoa, củ. Trong đó nhiều biến dị có lợi cho chọn

tạo giống. Ngoài ra cũng xuất hiện nhiều biến dị không mong muốn (nhƣ hình

thái và cấu tạo của hoa). Các biến dị này sẽ tiếp tục đƣợc chọn lọc thông qua

các thế hệ lai lại với khoai tây trồng nhằm chọn lọc đƣợc các dòng con vừa

mang đặc tính của khoai tây trồng lại vừa có khả năng kháng bệnh.

Bảng 4.18. Đánh giá các tính trạng trên củ của các con lai soma và các dòng ố m

Màu Màu Độ sâu Dạng

vỏ thịt Ký hiệu Slc TB Tên dòng/giống mắt ngủ củ 1-6. 1=tròn, dòng/giống /khóm củ 1- củ: 1- Klc TB/khóm (gam) 6=dài 1-9 10 8

Atlantic 2 3,9±1,1 128,3±19,1 3 2 2

Rasant - - - - - -

Delikat 3 8,0±2,3 169,6±18,2 3 2 3

Agave - - - - - -

S.bulbocastanum blb 2G - - - - - -

S. tarnii trn 3G - - - - - -

S.pinnatisectum pnt2G 3 88,4±8,8 3 8 1

pnt2G+Atlantic 245/6 2 19,6±0,6 3 8 1

pnt2G+Atlantic 248/1 2 48,8±1,4 3,0±0,0 5,2±1,2 108,9±15,4 5 4 1

pnt2G+Rasant 2044/1 5 4,7±2 151,1±19,4 1 2 4

blb2G+Delikat 2281/10 5 3,6±1,3 97,8±14,4 3 2 4

blb2G+Delikat 2283/5 3 4,4±1,8 142,2±2,94 3 2 3

blb2G+Delikat 2292/4 3 4,3±0,8 118,9±6,4 5 2 3

blb2G+Delikat 2295/1 5 2,6±0,3 106,1±17,9 3 2 3

trn3G+Delikat 838/11 4 4,6±1,5 102,2±11,4 5 2 3

trn3G+Delikat 851/2 5 4,9±3,6 185,0±8,3 5 4 3

pnt2G+Delikat 2195/2 2 2,2±0,4 105,6±14,0 3 2 3

pnt2G+Delikat 2196/4 5 4,8±2,5 141,1±17,9 1 2 3

trn3G+Rasant tr1/6 5 2,7±2,5 98,3±10,0 5 8 4

trn3G+Rasant tr3/9 5 2,6±2,6 125,6±4,1 3 8 4

trn3G+Rasant tr3/7 3 1,7±0,5 11,6±4,0 3 2 2

trn3G+Agave 4/22 3 2,1±0,1 45,6±4,4 3 8 3

trn3G+Agave 4/12 3 2,5±0,2 46,7±16,0 5 8 4

trn3G+Agave 7/7 3 1,4±0,4 36,1±7,9 3 4 3

trn3G+Agave 7/4 4 2,5±0,2 25,2±0,1 3 2 3

LSD0,05 0,43 7,39

Chú thích: (-) không đánh giá, phƣơng pháp đánh giá Dạng củ, màu vỏ củ, màu thịt củ và độ sâu mắt ngủ

theo phụ lục 14.

CV% 7,6 4,7

Wild species S. bulbocastunum

Hình 4.14. Các đặc tính hình thái, sinh trƣởng và đặc điểm ra hoa của các con lai soma (2283/5/1; 2281/10, 2292/4, 2295/1) của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat so với các dòng/giống bố m (Delikat, S.bulbocastanum)

1 2

Hình 4.15-A. Các biến dị về hình thái, kiểu sinh trƣởng của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai

1- Delikat, (Delikat + pnt2G) 2196/4, (Delikat + pnt2G)2235/1, pnt2G (theo thứ tứ tự từ trái sang phải); 2- Agave, (Agave + trn3G) 4/13, (Agave + trn3G) 4/22, (Agave + trn3G), trn3G (theo thứ tứ tự từ trái sang phải)

Hình 4.15- B. Các biến dị về dạng lá của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai

1- Delikat, (Delikat + pnt2G) 2196/4, (Delikat + pnt2G)2235/1, pnt2G (theo thứ tứ tự từ trái sang phải); 2- Agave, (Agave + trn3G) 4/13, (Agave + trn3G) 4/13, (Agave + trn3G), trn3G (theo thứ tứ tự từ trái sang phải)

Hình 4.15- C. Các biến dị về dạng hoa của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai Delikat (+) trn3G

Hình 4.15- D. Các biến dị về dạng củ của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai Rasant (+) trn3G

4.1.6. Nghiên cứu tạo con lai trở lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng Thí nghiệm 17: Đánh giá các con lai BC1 về độ bội, các đặc tính nông sinh học, khả năng kháng bệnh mốc sương

Lai soma là phƣơng pháp lai xa cho nên các con lai soma tạo thành có thể

mang nhiều biến dị khác xa so với khoai tây trồng. Để tổ hợp đƣợc các đặc tính của khoai tây trồng vào các con lai soma chúng tôi tiến hành lai hữu tính giữa các con lai trên với khoai tây trồng (sử dụng khoai tây trồng làm bố). Kết quả lai tạo

đƣợc thể hiện qua bảng 4.19 và hình 4.16.

Kết quả cho thấy đã tạo thành công 11 tổ hợp lai trở lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng tứ bội. Các hạt lai đƣợc thu hoạch sẽ tiếp tục

đƣợc đánh giá và sàng lọc tính kháng bệnh mốc sƣơng và các tính trạng nông

sinh học.

Bảng 4.19. Kết quả lai lai trở lại giữa các con lai soma với giống khoai tây trồng làm ố

Tổ hợp lai soma Ký hiệu Số STT Nguồn gốc Cây ố Ký hiệu dòng m dòng m hạt

1 2013-Hanoi trn3G (+) Delikat 2195/2 Delikat 70 13.1302

2 3 2013-Hanoi 2013-Hanoi blb2G (+) elikat pnt2G (+) Delikat 2283/5 2235/1 Delikat Delikat 17 32 13.1303 13.1304

4 5 2013-Sapa 2013-Sapa blb2G (+) Delikat pnt2G (+) Delikat 2281/5 2195/2 Delikat Delikat 17 320 13.1306 13.1310

6 7 2013-Sapa 2013-Sapa blb2G (+) Delikat trn3G (+) Delikat 2292/4 851/2 Delikat Delikat 110 220 13.1311 13.1314

8 9 2013-Sapa 2013-Sapa trn3G (+) Delikat pnt2G (+) Atlantic 838/11 248/1 Delikat Atlantic 500 158 13.1315 13.1317

Chú thích: Sapa-2013: con lai đƣợc tạo ra tại Sapa- Lào Cai năm 2013; Hà Nội- 2013: con lai đƣợc tạo ra tại hà Nội năm 2013

10 11 2013-Sapa 2013-Sapa blb2G (+) Delikat blb2G (+) Delikat 2295/1 2283/5 Delikat Delikat 6 34 13.1320 13.1322

Hình 4.16. Một số tổ hợp lai backcross thành công

a. Kết quả đánh giá tính kháng bệnh trên cây con trồng từ hạt lai BC1

Việc sàng lọc tính kháng ở giai đoạn cây con sẽ làm giảm đƣợc công lao động, tiết kiệm đƣợc thời gian và giúp cho việc theo dõi và đánh giá các thí nghiệm tiếp theo một cách thuận lợi hơn. Các hạt lai BC1 sau khi đƣợc xử lý ngủ nghỉ đã đƣợc gieo trên nền giá thể mùn tơi xốp. Khả năng này mầm của các tổ hợp lai khác nhau đã có sự khác biệt rõ rệt (hình 4.17).

1

2

3 Hình 4.17. Cây con sau gieo hạt 10 ngày

Chú thích: 1- 13.1310; 2- 13.1314; 3- 13.1320.

Sau nảy mầm khoảng 10 ngày sẽ lây nhiễm nhân tạo (dung dịch nấm 6.000 túi bào tử/ml). Kết quả sàng lọc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai BC1 đƣợc thể hiện trên bảng 4.20.

Bảng 4.20. Đánh giá khả năng kháng ệnh mốc sƣơng của các con lai BC1 ở giai đoạn cây con

Cây ố Tổ hợp lai soma dòng m Ký hiệu dòng m Số cây khỏe mạnh

Ký hiệu dòng lai năm 2013 13.1302 13.1303 13.1304 13.1306 13.1310 13.1311 13.1314 13.1315 13.1317 13.1320 13.1322 Số hạt nảy mầm 50 13 25 7 256 102 93 173 48 - 5 9 7 5 3 120 57 29 68 23 - 3 Tỷ lệ số cây khỏe mạnh (%) 18,0 53,8 20,0 42,9 46,9 55,8 31,2 39,3 47,9 - 60,0 trn3G + Delikat blb2G + Delikat pnt2G + Delikat blb2G + Delikat pnt2G + Delikat blb2G + Delikat trn3G + Delikat trn3G + Delikat pnt2G + Atlantic blb2G + Delikat blb2G + Delikat 2195/2 2283/5 2235/1 2281/5 2195/2 2292/4 851/2 838/11 248/1 2295/1 2283/5 Delikat Delikat Delikat Delikat Delikat Delikat Delikat Delikat Atlantic Delikat Delikat

Kết quả cho thấy các con lai của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat có khả năng kháng cao hơn những con lai của tổ hợp lai khác. Con lai 13.1322 đạt tỷ lệ 60%; Con

lai 13.1303 đạt 53,8%; Con lai 13.1311 đạt 55,8%. Các con lai BC1 sau khi đƣợc

thanh lọc tính kháng bệnh ở giai đoạn cây con đƣợc trồng trong điều kiện chậu vại.

b. Kết quả phân tích độ bội của các con lai BC1:

Sử dụng máy flow cytometry để kiểm tra độ bội của các con lai BC1 triển

vọng. So sánh kết quả với mẫu chuẩn nhị bội (2n = 2x=24) để kết luận về mức đa bội

của các mẫu cần đánh giá. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 4.18.

2n=2x=24 (tnr 3G)

2n=4x=48 (Atlantic)

2n=5x=60 (BC1 13.1303.1)

2n=5x=60 (BC1 13.1304.1)

2n=5x=60 BC1 13.1300.13)

2n=5x=60 (BC1 13.1301.5)

Hình 4.18. Kết quả phân tích độ bội của các con lai BC1

Dựa vào sự bắt màu của mẫu và các đỉnh đo OD chúng ta thấy các con lai BC1 đều có độ bội 2n=5x, đã giảm bội so với con lai soma 2n=6x. Vì vậy theo lý thuyết, chúng tôi tiếp tục tiến hành lai lại các con lai này với các giống khoai

tây trồng với mục đích giảm bội. Sao cho các dòng lai BC có độ bội giống với

khoai tây trồng 2n=4x.

c. Kết quả đánh giá các đặc tính trồng trọt của các con lai BC1

Kết quả đánh giá cho thấy hầu hết con lai BC1 đã bảo toàn đƣợc đặc tính

hình thái ở dạng khoai tây trồng và có sức sinh trƣởng tƣơng đối giống với

khoai tây trồng (Bảng 4.21-A và B). Ngoài ra khả năng ra hoa của các con lai

và bố mẹ của chúng cũng đƣợc đánh giá bởi khả năng ra hoa sẽ quyết định cho

việc có thể tiếp tục lai trở lại với khoai tây trồng để chọn tạo ra những giống

khoai tây mang đặc tính mong muốn đƣợc hay không. Các con lai có khả năng

ra hoa nhƣ 13.1302; 13.1303; 13.1304 trong đó dòng 13.1304 có khả năng ra

hoa cao hơn.

Các con lai trong cùng một tổ hợp lai có biểu hiện tính đa dạng về kiểu

hình một cách rõ rệt. Trong quần thể các con lai đƣợc đánh giá, đặc biệt lƣu ý

đến các con lai của tổ hợp lai Delikat + blb2G lai trở lại với giống khoai tây

trồng Delikat (hình 4.19). Các con lai BC1 1303.2; BC1 1303.11 và BC1

1303.3 có kiểu hình tƣơng đối giống với khoai tây trồng, khả năng sinh trƣởng

phát triển rất tốt và biểu hiện khả năng kháng bệnh mốc sƣơng rất cao dƣới áp

lực bệnh trong điều kiện tự nhiên. Đặc biệt là con lai BC1 1303.2 thể hiện tính

ƣu việt hơn cả về khả năng sinh trƣởng, sức sống, chiều cao, kích thƣớc lá.

Kết quả đánh giá các tính trạng về củ của các con lai BC1 cho thấy đa số

các con lai BC1 có hình thái củ giống với khoai tây trồng. Độ sâu mắt ngủ của

các con lai BC1 đều nông hoặc rất nông rất thích hợp cho chế biến công nghiệp.

Ngoài ra ở các con lai BC1 cũng xuất hiện một số dạng củ giống với dạng dại.

Nhƣ vậy rất cần thiết phải tiếp tục lai trở lại với khoai tây trồng qua nhiều thế hệ

để tổ hợp đƣợc các đặc tính trồng trọt của khoai tây trồng vào các con lai. Nhiều

con lai có tiềm năng năng suất cao (trên 30 tấn/ha) nhƣ các con lai 1303.2;

1303.4, 1303.6, 1303.11 và 1303.28 của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat x Delikat;

con lai 1305.5 của tổ hợp lai pnt2G (+) Delikat x Delikat (bảng 4.22).

Qua đánh giá các tính trạng phẩm chất củ cũng cho thấy các con lai

1304.2, 1303.4, 1303.6 và 1303.11 có hình thái củ đẹp, mắt ngủ nông, chất lƣợng

thử nếm rất ngon và hàm lƣợng chất khô cao, phù hợp với tiêu chuẩn ăn tƣơi và

chế biến (bảng 14.23-A và B). Đây sẽ là nguồn vật liệu quan trọng cho chƣơng

trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng của Việt Nam. Các con lai

này sẽ tiếp tục đƣợc chọn tạo làm ngyên liệu cho chọn giống.

Bảng 4.21-A. Kết quả đánh giá các tính trạng n ng sinh học của các con lai BC.

7 8

Số thân khóm Kí hiệu Kiểu sinh trƣởng ( đứng, nửa đứng, bò) Tỉ lệ mọc

BC1.1303.2 BC1.1305.6 BC1.1305.4 BC1.1301.4 BC1.1303.11 BC1.1301.11 BC1.1301.2 BC1.1301.8 BC1.1300.3 BC1.1305.2 BC1.1301.7 BC1.1303.3 BC1.13.1202.4 BC1.1303.6 BC1.1301.5 BC1.1300.17 BC1.1303.4 BC1.1301.1 ĐC.Solara 100% 70% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 80% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Cấu trúc tán (dạng thân, trung gian, dạng lá) Trung gian Dạng Thân Trung gian Trung gian Trung gian Dạng Thân Dạng Thân Trung gian Trung gian Dạng Lá Trung gian Trung gian Trung gian Trung gian Trung gian Dạng Lá Trung gian Dạng Thân Trung gian Nửa đứng Bò Đứng Đứng Đứng Bò Đứng Bò Nửa đứng Bò Nửa đứng Đứng Đứng Đứng Đứng Nửa đứng Đứng Đứng Đứng Hình thái sức sinh trƣởng dạng dại/ dạng trồng; +yếu;++trung bình;+++khỏe Tu, +++ Tu, + Tu, ++ Tu, +++ Tu, +++ Tu, ++ Tu, +++ Tu, +++ Tu, +++ Tu, +++ Tu, ++ Tu, ++ Tu, +++ Tu, +++ Tu, ++ Tu, ++ Tu, +++ Tu, ++ Tu, +++ 3 3 4 3 3 4 4 3 4 3 2 2 3 2 2 3 2 1 4

Bảng 4.21-B. Kết quả đánh giá các tính trạng n ng sinh học của các con lai BC

7 9

Kí hiệu Lá: Kích cỡ Nhỏ/TB/Rộng Sự mở của lá Đóng/TG/Rộng Thân (Sắc tố antoxian) Lá chét thứ cấp Ít/TB/Nh iều Màu sắc của lá Nhạt/TB/ Đậm Chiều cao cây Rất ngắn/Ngắn/TB/ Cao/Rất cao

BC1.1303.2 BC1.1305.6 BC1.1305.4 BC1.1301.4 BC1.1303.11 BC1.1301.11 BC1.1301.2 BC1.1301.8 BC1.1300.3 BC1.1305.2 BC1.1301.7 BC1.1303.3 BC1.13.1202.4 BC1.1303.6 BC1.1301.5 BC1.1300.17 BC1.1303.4 BC1.1301.1 ĐC.Solara Trung Bình Đậm Nhạt Đậm Trung Bình Đậm Trung Bình Nhạt Đậm Nhạt Trung Bình Đậm Trung Bình Trung Bình Đậm Trung Bình Trung Bình Trung Bình Trung Bình Rộng Nhỏ TB TB Rộng Nhỏ TB Rộng Nhỏ Rộng Nhỏ Rộng TB Rộng Nhỏ TB TB Nhỏ TB Trung Gian Rộng Trung Gian Rộng Đóng Trung Gian Rộng Trung Gian Rộng Đóng Rộng Đóng Trung Gian Trung Gian Rộng Đóng Rộng Rộng Rộng TB Ít Ít TB TB TB TB Nhiều Nhiều Nhiều TB Ít Nhiều Ít TB Nhiều Ít Nhiều TB Đậm Đậm TB TB Nhạt Đậm Đậm Đậm Đậm Nhạt Đậm TB Đậm TB Đậm TB Nhạt Đậm TB Lá Sắc tố antoxian trên gân chính của mặt bên Nhạt Nhạt Nhạt Trung Bình Nhạt Nhạt Nhạt Nhạt Nhạt Nhạt Trung Bình Nhạt Nhạt Nhạt Trung Bình Nhạt Nhạt Trung Bình Trung Bình Lá chét Lông phiến lá tại đỉnh hoa thị Có Có Có Có Không Có Có Có Có Có Có Có Có Có Không Có Có Có Có Cao Rất Ngắn TB Cao Ngắn Cao Cao Rất Cao Cao Cao Cao Ngắn TB TB TB TB Ngắn Rất Cao TB

Bảng 4.22. Kết quả đánh giá năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của cá con lai BC1

8 0

Tên giống

Chú thích: KLTLTB/khóm: Khối lƣợng thân lá trung bình/khóm; KLCTB/khóm: Khối lƣợng củ trung bình/khóm; NSSVH: năng suất sinh vật học; NSLT ;

Năng suất lý thuyết; NSTT: Năng suất thực thu

BC1.1302.2 BC1.1303.2 BC1.1305.4 BC1.1305.6 BC1.1303.11 BC1.1301.8 BC1.1305.2 BC1.13.1301.10 BC1.1301.4 BC1.1301.2 BC1.1303.6 BC1.1300.17 BC1.1303.4 BC1.1303.1 BC1.1312.06 BC1.1305.5 BC1.1303.28 BC1.1300.3 BC1.1300.17 CV% LSD0,05 KL TL TB/khóm(g) 133.33 183.33 23.33 58.33 116.67 216.67 183.33 200.00 150.00 133.33 100.00 283.33 100.00 160.00 96.67 150.00 166.67 46.67 90.00 2.02619 109.8 KLC TB/khóm(g) 150.00 550.00 83.33 100.00 550.00 316.67 366.67 333.33 216.67 350.00 400.00 350.00 450.00 303.33 233.33 400.00 400.00 250.00 340.00 2.026 180.91 SL củ TB/khóm 4.00 10.67 4.00 4.00 9.00 9.00 8.00 10.67 8.67 6.33 6.00 10.00 7.67 9.67 3.67 6.00 6.67 6.33 9.33 2.026 3.2667 NSSVH (g/cây) 283.33 566.67 106.67 158.33 250.00 533.33 550.00 533.33 366.67 483.33 233.33 633.33 266.67 463.33 330.00 550.00 566.67 296.67 430.00 2.026 247.72 NSLTSVH (g/m2) 2833.33 5666.67 1066.67 1583.33 2500.00 5333.33 5500.00 5333.33 3666.67 4833.33 2333.33 6333.33 2666.67 4633.33 3300.00 5500.00 5666.67 2966.67 4300.00 2.026 2477.2 NSLT (g/m2) 1500.00 5500.00 833.33 1000.00 5500.00 3166.67 3666.67 3333.33 2166.67 3500.00 4000.00 3500.00 4500.00 3033.33 2333.33 4000.00 4000.00 2500.00 3400.00 2.026 1809.1 NSTT (g/m2) 1300.00 4000.00 500.00 750.00 4700.00 1250.00 1750.00 1550.00 1200.00 1800.00 4100.00 2200.00 4000.00 2100.00 2400.00 4100.00 3150.00 2100.00 2200.00 2.026 1000

Bảng 4.23. A. Kết quả đánh giá phẩm chất củ của các con lai BC1

8 1

Tên Giống Dạng Củ Màu Vỏ Củ Màu Thịt Củ

BC1.1303.4 BC1.1305.2 13.1301.1 BC1.1301.4 BC1.1305.6 BC1.1301.2 BC1.1300.17 BC1.1302.2 BC1.1301.8 BC1.1303.3 BC1.1301.11 BC1.1303.2 BC1.1303.1 BC1.1303.28 BC1.1305.5 BC1.1300.3 BC1.1300.17 BC1.1301.11 BC1.1301.1 BC1.1301.5 BC1.1301.7 BC1.1304.1 BC1.1302.7 BC1.1303.22 TGST (ngày) 67 67 67 67 67 67 67 67 67 67 67 67 71 92 92 92 92 92 104 104 104 104 104 97 O van O Van Ngắn Tròn Ovan dài Ovan dài Ovan Ovan Ovan dài Ovan Ovan Tròn Tròn Ovan Ngắn Ovan dài Ovan dài Ovan Dài Ovan Dài Ovan Ovan Ngắn Ovan dài Dài Dài Ovan Dài Ovan Vàng Kem Nhạt Vàng Tím 1 phần Kem Nhạt Tím 1 phần Vàng Vàng Tím 1 phần Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Tím Vàng Vàng Vàng Tím Tím 1 phần Xanh 1 phần Vàng Vàng Vàng Trung Bình Vàng Nhạt Vàng Vàng Nhạt Vàng Nhạt Vàng Vàng Nhạt Vàng Vàng Nhạt Vàng Vàng Nhạt Vàng Vàng Vàng Nhạt Vàng Nhạt Vàng Nhạt Kem Vàng Nhạt Vàng Vàng Nhạt Vàng Vàng Đậm Vàng Vàng Độ Sâu Mắt Ngủ Nông Nông Nông Trung Bình Nông Nông Trung Bình Trung Bình Nông Nông Trung Bình Nông Nông Nông Nông Trung Bình Trung Bình Nông Trung Bình Trung Bình Nông Trung Bình Trung Bình Trung Bình Phân Loại Củ % >50mm 30mm-50mm <30mm 74.44 51.11 59.65 29.67 20.93 45.12 60.19 57.45 75.38 40.4 31.16 55.84 53.75 51.28 53.78 66.67 45.56 43.48 40.08 61.11 70.42 30.19 53.57 22.23 33.33 40.39 70.33 79.07 54.88 33.9 42.55 24.62 59.6 68.84 30.45 42.5 30.77 29.41 29.16 52.22 56.52 16.34 22.22 25.36 69.81 35.72 3.33 15.56 0 0 0 0 2.91 0 0 0 0 13.71 3.75 17.95 16.81 4.17 2.22 0 35.58 16.67 4.22 0 10.71

Chú thích: TGST: Thời gian sinh trƣởng

Bảng 4.23- B. Kết quả đánh giá phẩm chất củ của các con lai BC1

8 2

Tên Giống Độ Bở Nứt Sau Luộc Đánh Giá Nếm Tỉ trọng

BC1.1303.2 BC1.1303.4 BC1.1301.8 BC1.1303.6 BC1.1303.11 BC1.1300.17 BC1.1301.2 BC1.1305.6 13.1301.10 BC1.1301.4 BC1.1305.2 BC1.1303.28 BC1.1301.11 BC1.1300.3 BC1.1305.5 BC1.1301.1 BC1.1301.5 BC1.1301.7 BC1.1302.7 BC1.1303.22 BC1.1303.4 BC1.1303.2 Bở Ít Bở Trung Bình Ít Trung Bình Trung Bình Bở Bở Ít Trung Bình Ít Trung Bình Trung Bình Bở Trung Bình Bở Trung Bình Rất Bở Ít Bở Bở Rất Bở Bở Ít Ít Không Không Có Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Có Có Có Có Có Có Rất Ngon Trung Bình Trung Bình Ngon Ngon Dở Ngon Ngon Trung Bình Trung Bình Trung Bình Rất Ngon Trung Bình Ngon Ngon Ngon Rất Ngon Rất Ngon Ngon Ngon Ngon Rất Ngon 1.081 1.071 1.066 1.058 1.082 1.102 1.062 1.093 1.086 1.095 1.11 1.076 1.111 1.085 1.095 1.089 1.086 1.089 1.064 1.087 1.082 1.081 Hàm lƣợng chất khô(%) 19.1 16.8 15.7 19.8 19.4 24.3 14.7 22.1 20.5 22.5 26.2 18.1 26.1 20.2 22.6 20.6 20.5 20.8 15.6 20.6 19.4 19.1

BC1 1303.2

BC1 1303.11

Blb

Delikat

BC1 1303.3

Hình 4.19. Sự đa dạng kiểu hình của các con lai BC1 của tổ hợp lai Delikat + blb) SH2283/5 x Delikat

A D B

Hình 4.20. Dạng củ của: A- Atlantic; B- pnt2G; C- con lai soma pnt2G (+) Atlantic; D- BC1 của tổ hợp lai khoai tây của một số tổ hợp lai pnt2G (+) Atlantic với giống khoai tây trồng Atlantic

4.2. THẢO LUẬN

Mục tiêu của nghiên cứu là tạo các con lai soma khác loài giữa các loài

khoai tây dại nhị bội (S.pinnatisectum, S.bulbocastanum, S.tarnii) với các giống

khoai tây trồng tứ bội (cultivar) và khẳng định đƣợc có thể chuyển đƣợc tính kháng bệnh mốc sƣơng từ loài dại vào khoai tây trồng để tạo ra nguồn vật liệu mới cho

chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng của Việt Nam.

Các thí nghiệm đƣợc mô tả trong nghiên cứu này đã tối ƣu hóa đƣợc các thông số trong quy trình tách, dung hợp tế bào trần bằng xung điện, nuôi cấy và

tái sinh các tổ hợp lai giữa các dòng khoai tây dại và các giống khoai tây trồng.

Chen et al. (2007) cho rằng để ứng dụng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần hai tiêu

chí phải thỏa mãn, đó là phải phân lập đƣợc số lƣợng tế bào trần đủ lớn và chúng có

khả năng nhân và tái sinh thành cây mới. Nhìn chung, tế bào trần có thể phân lập dễ dàng từ mô lá thông qua xử lý emzym. Song các điều kiện phân lập phụ thuộc vào

kiểu gen, thay đổi mạnh giữa các loài do sự khác nhau về thành phần của thành tế

bào. Davis (1985) chỉ ra rằng các điều kiện khác nhau ảnh hƣởng tới năng suất và

khả năng tái sinh của tế bào trần, do đó cần phải xác định pháp và điều kiện cụ thể

cho từng loài. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định đƣợc các thông số để

xây dựng đƣợc quy trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần của các

dòng khoai tây dại nhị bội và các giống khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung

dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống, thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá

trong dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ,

dung hợp ở tần số 800 kHz với 2 lần xung và mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml, môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy tế bào trần sau dung hợp là môi trƣờng VKMII lỏng và môi trƣờng tái

sinh tạo chồi từ callus của các tổ hợp lai là môi trƣờng RJM. Chúng tôi tiến hành

phân lập tế bào trần từ ba loài khoai tây hoang dại S. pinnatisectum, S. tarnii và

S. bulbocastanum (pnt2G, trn3G và blb2G) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và dung hợp với tế bào trần từ các giống khoai tây trồng tứ bội Delikat, Atlantic, Agave và Rasant, mẫn cảm với bệnh mốc sƣơng. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã đạt đƣợc một tỷ lệ khá cao các con lai tái sinh từ các tổ hợp lai dung hợp. Từ 7 tổ

hợp dung hợp bằng xung điện, đã tái sinh đƣợc 188 chồi 1612 callus.

Phân tích độ bội Flow cytometry đã chọn đƣợc 82/188 (43%) các con lai có độ bội mong muốn (4x tbr + 2x pnt, blb, trn). Ngoài ra kết quả phân tích độ bội cũng cho thấy phép dung hợp tế bào trần cũng tạo ra một tổ hợp các con lai

có độ bội khá đa dạng. Các con lai có độ bội không mong muốn nhƣ con lai tứ bội (2x + 2x), con lai đa bội (polyploidy) hay con lai hỗn bội (multiploidy) là kết quả của nhiều lần dung hợp xung điện hoặc do đột biến dòng tế bào soma. Ramona Thiemei et al., (1997) đã tạo đƣợc 239 callus tái sinh từ các tổ hợp lai giữa dòng khoai tây nhị bội (T17) với dòng dại S. pinnatisectu (2n = 2x), trong số đó đã chọn lọc đƣợc 47-89% con lai có độ bội mong muốn, 7-16% con lai là hỗn bội.

Trong khi việc lai khác loài giữa khoai tây dại và khoai tây trồng rất khó

thành công thông qua phép lai hữu tính, lai khác loài thông qua dung hợp tế bào

trần đã trở thành công cụ hữu hiệu để chuyển các đặc tính mong muốn từ các loài

khoai tây dại vào các giống khoai tây trồng, chẳng hạn nhƣ trong nghiên cứu của các tác giả Thieme et al. (2008) đã tạo thành công các con lai soma giữa loài dại

S. tarnii với giống khoai tây trồng Delikat. Sau đó 1 năm, Jansky and Hamernik

(2009) đã dung hợp giữa loài khoai tây dại Solanum cardiophilum với giống

khoai tây trồng của Đức Agave và Delikat và tạo đƣợc một tỷ lệ rất thành công

các con lai soma khác loài.

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về dung hợp tế bào trần trên cây khoai tây

cũng mới chỉ thành công trong việc tạo các con lai soma giữa các dòng khoai tây

nhị bội kháng virus cùng loài (Nguyễn Thị Phƣơng Thảo và cs., 2009, 2011,

2012). Nghiên cứu của chúng tôi cũng đã tạo đƣợc 69 con lai khác loài giữa các

loài khoai tây dại blb2G, pnt2G và trn3G với giống khoai tây trồng Delikat,

Rasant, Agave và Atlantic. Đáng chú ý là lần đầu tiên chúng tôi tạo đƣợc con lai

soma giữa loài khoai tây dại S. pinnatisectum với giống khoai tây trồng tứ bội

Atlantic (một giống khoai tây chế biến nhất nhạy cảm với bệnh mốc sƣơng đang

đƣợc trồng phổ biến tại Việt Nam.). Trong số các tổ hợp lai tái sinh tạo callus, mặc

dù mỗi callus từ các tổ hợp lai chúng tôi chỉ lấy một chồi tái sinh (sau này sẽ đƣợc coi là một dòng con lai), chúng tôi cũng đã chọn lọc đƣợc 188 dòng lai ngẫu nhiên

tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chọn lọc đƣợc 69 con lai soma. Các con lai này rất đa dạng về hình thái, các đặc tính nông sinh học và khả năng kháng bệnh mốc sƣơng. Mục tiêu của nghiên cứu không chỉ tạo đƣợc các con lai soma mà phải chọn lọc đƣợc các con lai vừa mang khả năng kháng bệnh mốc sƣơng, vừa mang các đặc tính hình thái, nông sinh học quý. Thông qua kết quả đánh giá các đặc tính hình thái, chỉ những con lai có khả năng sinh trƣởng tốt và mang nhiều đặc tính

giống với khoai tây trồng, đồng thời có khả năng kháng bệnh thì mới đƣợc chọn lọc và tiếp tục lai lại với khoai tây trồng nhằm tổ hợp đƣợc các đặc tính quý từ

khoai tây trồng vào các con lai. Những biến dị hình thái ở các con lai soma sẽ tiếp tục đƣợc chọn lọc, giữ lại những biến dị có lợi, loại bỏ những biến dị bất lợi cho

chọn tạo giống. Nhƣ vậy con đƣờng chọn tạo giống phải mất ít nhất 4-5 năm mới

có thể chọn ra đƣợc các dòng vật liệu triển vọng giới thiệu cho sản xuất.

Việc đánh giá sự biểu hiện tính kháng bệnh ở các con lai soma là một trong

những nội dung quan trọng của đề tài. Trong nghiên cứu này, 69 con lai soma đã

đƣợc đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng một cách hệ thống bao gồm đánh giá lây

nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời, trên lát cắt củ và đánh giá sự có mặt của gen

kháng bằng chỉ thị phân tử. 4 con lai của tổ hợp lai giữa S. solanum bulbocastanum và Delikat có biểu hiện kháng cao với bệnh mốc sƣơng trên lá (2281/10; 2283/5;

2292/4; 2295/1). Kết quả này cũng hoàn toàn trùng hợp với kết quả đánh giá lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ. Điều này chứng tỏ dòng dại S.bulbocastanum có khả

năng chuyển đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của nó cho các giống khoai tây trồng

thông qua dung hợp.

Trong hầu hết các con lai soma có biểu hiện tính kháng ở mức vừa hoặc thấp

hơn một chút so với giống khoai tây trồng, hay nói cách khác là khả năng kháng

bệnh ở các con lai soma đã đƣợc cải thiện rõ rệt. Thieme et al. (2008) đã chỉ ra rằng trong số 31 con lai soma tạo ra giữa loài khoai tây dại Solanum tarnii và giống khoai

tây trồng Delikat có 24 con lai biểu hiện kháng bệnh mốc sƣơng trong đó có 4 con

lai có biểu hiện tính kháng cao với bệnh (điểm đánh giá khi lây nhiễm nhân tạo trên

lá là 9), so với loài dại Solanum tarnii (điểm đánh giá là 8,7). Kết quả lây nhiễm

nhân tạo trên củ cũng cho thấy các con lai soma điều biểu hiện ở mức 3,7-6,1 điểm

(kháng cao hơn so với giống Delikat có mức điểm là 3,2, trong khi loài dại Solanum

tarnii có mức điểm là 7,0). Nhóm tác giả trên đã sử dụng thang điểm 1-9 để đánh giá

trong đó 1 = Nhạy cảm; 9 = kháng bệnh. Trong nghiên cứu này, các con lai soma

của tổ hợp lai giữa loài dại Solanum tarnii với giống Delikat (857/5, 851/2, 849/5, 849/4 và 838/11) đều biểu hiện nhiễm bệnh với mức điểm đánh giá trên lá từ 4,0 -5.

Điều này cũng có thể lý giải là do chủng Phytophthora của Việt Nam tạo ra sự khác

biệt so với chủng Phytophthora của Châu Âu.

Gần đây vẫn chƣa có đƣợc giống khoai tây thƣơng mại có khả năng kháng

đƣợc bệnh mốc sƣơng do tính kháng với các chủng đặc hiệu đơn gen ngày càng nhanh chóng bị vƣợt qua bởi các chủng gây bệnh mốc sƣơng (McDonald and Linde, 2002). Việc kiểm soát bệnh này bằng thuốc hóa học sẽ rất tốn kém, lại gây ô nhiễm môi trƣờng. Do đó, các con lai soma giữa các loài khoai tây dại Mexico

mang khả năng kháng bệnh mốc sƣơng rất cao sẽ là nguồn vật liệu quan trọng cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây. Các công bố đi trƣớc đã thành công

trong việc tạo các con lai soma giữa khoai tây trồng với loài dại S.pinnatisectum

đã mang khả năng kháng cao với bệnh mốc sƣơng (Orczyk et al., 2003). Con lai

soma giữa loài dại S.bulbocastanum với S.tuberosum và các thể lai BC đã biểu hiện tính kháng cao khi lây nhiễm với các chủng mốc sƣơng ngoài đồng ruộng

(Helgeson et al., 1998). Các thể lai này tiếp tục đƣợc backross nhiều thế hệ với khoai tây trồng nhằm chuyển đƣợc tính kháng bệnh vào các dòng vật liệu chọn

tạo giống khoai tây.

Cho đến nay đã có 4 gen kháng có nguồn gốc từ loài dại Solanum

bulbocastanum thuộc vùng lặp giàu leucine (NBS-LRR) đƣợc phát hiện và nhân dòng, bao gồm: Gen Rpi-blb1 (van der Vossen et al., 2003; Wang et al., 2008) hay còn đƣợc biết đến với tên RB (Song et al., 2003), định vị trên nhiễm sắc thể số

VIII, gần chỉ thị CT64 và thuộc một cụm 4 gen kháng tƣơng đồng (resistance gene analogues – RGAs) (van der Vossen et al., 2003); gen Rpi-blb2 (van der Vossen et al., 2005) nằm trên nhiễm sắc thể số VI gần chỉ thị CT119; gen Rpi-blb3 (Lokosou et al., 2009) định vị trên nhiễm sắc thể số IV gần chỉ thị TG339 và nằm trong cụm gen kháng mốc sƣơng đặc hiệu chủng (R2, Rpi-abpt, R2-like); gen Rpi-bt1 (Oosumi et al., 2009) có đƣợc từ phép lai giữa S. bulbocastanum và S.

tuberosum. Dựa trên cơ sở đó, chúng tôi cũng đã sử dụng các cặp mồi đặc hiệu của gen kháng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 để kiểm tra sự có mặt của gen kháng ở các con lai soma. Kết quả đã phát hiện đƣợc 2 gen kháng kể trên ở các con lai soma giống

nhƣ ở loài dại S. bulbocastanum. Điều này thêm một lần nữa khẳng định đƣợc đã

chuyển đƣợc đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng từ loài khoai tây dại

S.bulbocastanum vào các con lai soma thông qua dung hợp tế bào trần.

Bên cạnh việc đánh giá tính kháng bệnh của các con lai soma thì việc đánh giá các đặc tính hình thái, sinh trƣởng, khả năng ra hoa, các tính trạng liên

quan đến củ, năng suất và phẩm chất củ của các con lai soma là rất quan trọng. Bởi vì con lai soma là kết quả dung hợp giữa loài khoai tây dại với giống khoai tây trồng khác xa về bộ genom. Chúng tôi cũng chứng minh đƣợc rằng các tính trạng biểu hiện ở các con lai soma khác loài đƣợc tổ hợp từ cả bố và mẹ. Kết quả này đã khẳng định bộ genom của cả bố và mẹ đã đƣợc biểu hiện ở các con lai soma. Nhiều tính trạng của loài dại vẫn biểu hiện rất rõ trong các con lai soma. Trong khi đó mục tiêu của nghiên cứu là chọn lọc đƣợc các vật liệu vừa mang

tính kháng bệnh mốc sƣơng, lại vừa mang các đặc điểm tƣơng đối giống với khoai tây trồng (hình thái củ, kích thƣớc củ, khả năng ra hoa...). Chính vì vậy

việc lai trở lại (backcross) với khoai tây trồng nhằm tổ hợp những tính trạng quý

từ khoai tây trồng là bƣớc tiếp theo của nghiên cứu này. Khi đánh giá các đặc

tính nông sinh học của các con lai soma, chúng tôi nhận thấy rằng đa số các con lai soma có hình thái cây, củ có xu hƣớng giống với hình thái của khoai tây trồng

(Tuberosum). Củ của một số con lai 245/6 (Atlantic + pnt2G); 3/7 (Rasant + trn 3G); 4/12, 7/7 (Agave + trn 3G) lại có kiểu hình tƣơng đối giống dạng dại (Wild

type). Một số con lai soma có xuất hiện các biến dị trên thân, lá, hoa và củ. Các

biến dị này tiếp tục đƣợc chọn lọc.

Khả năng ra hoa của các con lai soma cũng đƣợc đánh giá, điều này rất cần thiết bởi vì chỉ những con lai có khả năng ra hoa mới tiếp tục đƣợc lai tạo và

chọn lọc cho chƣơng trình chọn tạo giống. Thƣờng thì các con lai soma khác loài

giữa khoai tây dại và khoai tây trồng biểu hiện tính bất dục. Chẳng hạn các con

lai soma giữa S.tuberosum và S.bulbocastanum cho hạt phấn bất dục (Austin et

al., 1993; Brown et al., 1995). Hầu hết các con lai soma tạo ra giữa S.tuberosum

với loài dại S.comersonii đã cho hạt phấn bị biến dị (Cardi et al., 1993) và các

con lai soma bất dục (Binding et al., 1982, 1988). Trong nghiên cứu của chúng

tôi cũng tìm thấy các con lai của tổ hợp lai trn 3G + cv. Rasant và trn 3G +

cv.Agave không có khả năng ra hoa. Chúng tôi đã chọn đƣợc các con lai có khả

năng ra hoa cao nhƣ: 2281/10; 2283/5; 2295/1. Đây sẽ là những con lai có triển

vọng cho việc lai tạo trong chọn tạo giống. Còn lại hầu hết các con lai soma đều

có khả năng ra hoa, trừ các con lai soma của tổ hợp lai giữa trn3G + Delikat. Đây

sẽ là những con lai có triển vọng cho việc lai tạo trong chọn tạo giống.

Từ lâu đã có công bố thành công trong việc tạo các hạt lai khoai tây ở thế

hệ backcross đầu tiên (Ehlenfelt and Helgeson, 1987; Hermsen, 1994). Dung hợp giữa dòng khoai tây nhị bội thuộc S.tuberosum với dòng khoai tây dại nhị bội đã

tạo ra hầu hết các con lai soma có độ bội là tứ bội (tetraploidy) và lục bội (hexaploidy). Những con lai lục bội có tiềm năng hơn trong các phép lai trở lại so với các con lai tứ bội (Ehlenfeldt & helgeson, 1987). Ở thế hệ backross đầu tiên, các con lai 6x đã đƣợc lai trở lại với khoai tây trồng 4x tạo ra các thể lai pentaploidy (5x). Các thể lai này lại tiếp tục lai trở lại với khoai tây trồng tứ bội hoặc các dòng vật liệu chọn tạo giống qua nhiều thế hệ sẽ cho đƣợc giống khoai tây mang các đặc tính mong muốn. Thieme et al., (1997) đã tiến hành dung hợp

giữa loài khoai tây dại nhị bội (S.pinnatisectum, 2x, 1EBN, Endosperm Balance Number) với dòng khoai tây nhị bội S. tuberosum T17 (2x, 2EBN) và dòng khoai

tây T 15 (3x, 3 EBN). Các con lai soma tạo ra bao gồm con lai tứ bội (4x, 3

EBN) và con lai ngũ bội (5x, 4 EBN). Khi backcross giữa các con lai tứ bội (3

EBN) với giống khoai tây trồng tứ bội (4 EBN) thì không thành công (do sự mất cân bằng nội nhũ 3 EBN: 2 EBN). Trong khi đó phép lai backcorss giữa con lai

soma ngũ bội (4 EBN) với giống khoai tây trồng tứ bội (4 EBN) lại cho quả lai

và hạt lai thành công do sự cân bằng nội nhũ giữa thể bố và mẹ (2:1).

Trong thí nghiệm của chúng tôi, các dòng con lai soma 6x là kết quả của phép dung hợp tế bào trần giữa loài khoai tây dại (2x, 1 EBN) với khoai tây trồng

(4x, 4 EBN), do đó có giá trị nội nhũ là 5 EBN. Backcorss các con lai lục bội với khoai tây trồng tứ bội sẽ cho các con lai BC ở thế hệ đầu tiên có độ bội 5x. Tiếp

tục tiến hành lai trở lại các con lai này qua nhiều thế hệ sẽ cho giống khoai tây

trồng mang các đặc tính mong muốn.

Kết quả này có ý nghĩa lớn cho sản xuất khoai tây của Việt Nam vì thực tế là chúng ta chƣa tạo ra đƣợc giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng. Các giống hiện có chủ yếu là thông qua con đƣờng nhập nội. Các vật liệu kháng bệnh tạo ra bằng con đƣờng dung hợp tế bào trần, không phải là giống chuyển gen nên dễ dàng đƣợc sản xuất chấp nhận, đồng thời giảm thiểu việc dùng thuốc hóa học gây ô nhiễm môi trƣờng.

Lần đầu tiên ở Việt Nam, chúng tôi đã thành công trong việc tạo con lai khác loài giữa các loài khoai tây dại mang gen kháng bệnh mốc sƣơng với các giống khoai tây trồng mẫn cảm với bệnh, trong đó có giống Atlantic- một giống khoai tây đang đƣợc trồng rất phổ biến trong cả nƣớc. Đây sẽ là nguồn vật liệu rất quý cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng của Việt Nam.

Tuy nhiên do thời gian nghiên cứu có hạn, chúng tôi mới chỉ tạo đƣợc những con lai BC1 và đánh giá các con lai này trong điều kiện chậu vại. Việc tiếp tục lai trở lại các vật liệu này qua vài thế hệ để chọn lọc đƣợc các dòng vừa mang khả năng kháng bệnh của loài khoai tây dại, vừa mang các đặc tính nông sinh học quý của khoai tây trồng là hết sức cần thiết.

Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ sở lý thuyết của sự biểu hiện gen kháng bệnh ở các con lai cần phải đƣợc tiếp tục vì các con lai soma của các tổ hợp lai từ các loài khoai tây dại khác nhau có biểu hiện khả năng kháng bệnh rất khác nhau.

Trong khi cả 3 loài khoai tây dại đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này đều có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng rất cao, nhƣng chỉ những con lai soma của loài S.bulbocastanum là biểu hiện tính kháng bệnh rất cao, đa số những con lai soma còn lại chỉ biểu hiện tính kháng bệnh mốc sƣơng ở mức vừa hoặc có cải thiện đôi chút so với giống khoai tây trồng. Vấn đề này cần phải tiếp tục đƣợc nghiên cứu.

Ngoài ra việc nghiên cứu thêm về cơ chế thay đổi số lƣợng nhiễm sắc thể, EBN và độ bội ở các thế hệ lai BC cũng rất cần thiết cho giai đoạn tiếp theo của nghiên cứu này.

Thêm một lần nữa, nghiên cứu này đã khẳng định đƣợc có thể chuyển đƣợc tính kháng bệnh mốc sƣơng từ loài khoai tây dại vào khoai tây trồng thông qua dung hợp tế bào trần. Trong giai đoạn tới, chúng tôi sẽ tiếp tục lai tạo và chọn lọc các thể lai vừa mang đƣợc khả năng kháng bệnh, vừa mang các đặc tính quý của khoai tây trồng để có thể phát triển thành giống.

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

1) Đã xác định đƣợc các thông số để xây dựng đƣợc quy trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần của các dòng khoai tây dại nhị bội và các

giống khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho từng

dòng/giống, thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với

các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ, dung hợp ở tần số 800 kHz với 2 lần xung và mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml, môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy tế bào trần sau dung hợp là môi trƣờng VKMII lỏng và môi trƣờng tái sinh tạo chồi từ callus của các tổ

hợp lai là môi trƣờng RJM.

2) Đã dung hợp thành công 07 tổ hợp dung hợp giữa các dòng khoai tây

dại nhị bội (blb2G, pnt2G, trn3G) với các giống khoai tây trồng tứ bội (Atlantic,

Delikat, Rasant và Agave); trong đó đã tái sinh đƣợc 1612 callus và 188 chồi từ

các tổ hợp lai.

3) Đã xác định đƣợc 82/102 dòng là thể lục bội (6x) bằng phân tích độ bội

Flow cytometry trong đó có 69 dòng con lai soma có kiểu gen dị hợp nhân khi

phân tích bằng chỉ thị SSR bao gồm: 15 con lai soma của tổ hợp lai trn3G +

Delikat, 6 con lai soma của tổ hợp lai trn3G+ Rasant, 14 con lai soma của tổ hợp

lai blb2G+ Delikat, 28 con lai soma của tổ hợp lai trn3G+Delikat và 6 con lai

soma của tổ hợp lai pnt2G+ Atlantic.

4) Đã đánh giá đƣợc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma

bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá, trên củ và trên đồng ruộng. Kết quả đã chọn

lọc đƣợc các con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng dại S.bulbocastanum với

giống khoai tây trồng Delikat có biểu hiện kháng cao với bệnh mốc sƣơng (SH 2283/5; SH 2281/10, SH 2292/4 và SH 2295/1), đồng thời các con lai này có mang gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-blb1 và Rpi-blb3.

5) Đã đánh giá đƣợc các đặc tính về hình thái, sinh trƣởng, phát triển và các yếu tố cấu thành năng suất của các con lai soma. Các con lai thể hiện sự đa dạng về kiểu hình giữa các tổ hợp lai khác nhau và trong cùng một tổ hợp lai. Nhiều con lai của tổ hợp blb2G (+) Delikat có kiểu hình tƣơng đối giống với

khoai tây trồng (Tuberosum), sinh trƣởng tốt và có khả năng chống chịu mốc sƣơng cao.

6) Đã lai tạo thành công 11 tổ hợp lai backcross giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng. Kết quả đánh giá quần thể chọn lọc đã lựa chọn ra

đƣợc 4 dòng con lai của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat

(13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6, 13.1303.11) có khả năng kháng mốc sƣơng

cao, đồng thời mang nhiều tính trạng nông sinh học tốt. Đây sẽ là nguồn vật liệu có giá trị cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng.

5.2. KIẾN NGHỊ

Nguồn vật liệu là các dòng khoai tây lai kháng bệnh mốc sƣơng cần phải

đƣợc tiếp tục nghiên cứu cả về về mức độ kiểu gen và kiểu hình, đặc biệt là sự ổn

định của tính kháng theo thời gian để có thể sử dụng cho chƣơng trình chọn tạo

giống khoai tây kháng bệnh của nƣớc ta.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

Hoàng Thị Giang, Đỗ Thị Thu Hà, Vũ Thị Hằng, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Quang Thạch, Ramona Thieme và Thilo Hammann (2013). Nghiên cứu tạo,

đánh giá con lai soma khác loài giữa các giống khoai tây trồng Solanum tuberosum L. (2n=4x=48) và các dòng khoai tây dại Solanum bulbocastanum,

Solanum tarnli, Solanum pinatisectum (2n=2x=24) mang khả năng kháng bệnh mốc sƣơng bằng dung hợp tế bào trần. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông

thôn 22/2013, trang 3-10

2. Hoàng Thị Giang, Vũ Thị Hằng, Nguyễn Thị Thủy, Đỗ Thị Thu Hà, Ramona

Thieme, Thilo Hammann và Nguyễn Quang Thạch (2014). Đánh giá khả năng chuyển đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng từ khoai tây dại sang khoai tây trồng

thông qua dung hợp tế bào trần. Tạp chí Khoa học và Phát triển tập 12, số 7/2014, trang 1149-1156.

Hoàng Thị Giang, Nguyễn Thị Thủy, Vũ Thị Hằng, Đỗ Thị Thu Hà, Ramona Thieme, Thilo Hammann và Nguyễn Quang Thạch (2014). Khả năng kháng

bệnh mốc sƣơng và các đặc tính nông học của các dòng lai lại giữa con lai soma và khoai tây trồng. Tạp chí Khoa học và Phát triển tập 12, số 8-2014, trang

1302-1313.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Đinh Thị Thu Lê, Đỗ Thị Hà, Vũ Thị Hằng, Hoàng Thị Giang, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, Nguyễn Quang Thạch, R. Thieme và A. Schwarzfischer (2012). Đánh giá khả năng sinh trƣởng phát triển, năng suất, phẩm chất chế biến của con lai soma khoai tây trồng ở vụ Đông 2011 tại Quế Võ-Bắc Ninh. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 12: 11-16

2. Đỗ Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Thủy, Vũ Thị Hằng, Hoàng Thị Giang, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, Nguyễn Quang Thạch, R. Thieme và A. Schwarzfischer (2012). Nghiên cứu xác định con lai soma khoai tây từ thể tái sinh sau dung hợp. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 10: 16-25.

3. Ngô Thị Xuyên và Hoàng Văn Thọ (2003). Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy nấm và thuốc Metalaxyl đến sự sinh trƣởng, phát triển của nấm Phytophthora infestans (Mont.) de Bary trên một số giống cà chua, khoai tây. Tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp 3(1): 197-202.

4. Ngô Thị Xuyên, Lê Hồng Vĩnh, Burger và Hermansen (2005). Nghiên cứu đặc điểm của nấm Phytophthora infestans ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp: 97-102

5. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần Văn Minh và Nguyễn Thị Phƣơng Thảo (2009). Cơ sở công nghệ sinh học. Tập 3- Công nghệ sinh học tế bào. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. Tr. 152-182.

6. Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, Đỗ Thị Thu Hà, Vũ Thị Hằng, Hoàng Thị Giang và Nguyễn Quang Thạch (2011a). Nghiên cứu tách, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội phục vụ tạo giống bằng dung hợp tế bào trần. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 2: 11-16.

7. Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, Hoàng Thị Giang, Đỗ Thị Thu Hà, Vũ Thị Hằng, Đinh Thị Thu Lê và Nguyễn Quang Thạch (2011b). Đánh giá các đặc tính nông sinh học và khả năng kháng virus PVY của con lai soma khoai tây. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 22: 11-16.

8. Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, Nguyễn Quang Thạch, Ninh Thị Thảo, Hoàng Thị Giang, Lƣơng Văn Hƣng và Nguyễn Xuân Trƣờng (2009). Đánh giá một số đặc tính nông sinh học và khả năng kháng virus PVX, PVY của tám dòng khoai tây nhị bội. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 2: 8-13.

9. Vũ Thị Hằng, Hoàng Thị Giang, Đỗ Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo và Nguyễn Quang Thạch (2012). Nghiên cứu tạo cây nhị bội (2n=2x) từ cây khoai tây tứ bội Solanum tuberosum (2n=4x) theo hƣớng trinh sinh sử dụng khoai tây dại Solanum phureja (dòng cho phấn) là cây cảm ứng giảm bội. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 8: 18-23.

Tiếng Anh

10. Adillah T.M.Y., C. B. Ronald Hutten, Carolina Celis, Tae-Ho Park, E. Rients Niks, G. F. Richard Visser and J. Herman van Eck (2008). The Rpi-mcd1 Locus from Solanum microdontum Involved in Resistance to Phytophthora infestans, Causing a Delay in Infection, Maps on Potato Chromosome 4 in a Cluster of NBS-LRR Genes. The American Phytopathological Society, MPMI 21(7): 909–918

11.

Adillah Tan M.Y., C. B. Ronald Hutten, G. F. Richard Visser, J. Herman van Eck (2010). The effect of pyramiding Phytophthora infestans resistance genes RPi- mcd1 and RPi-ber in potato. Theor Appl Genet 121:117–125.

12. Andrivon D. (1995). Biology, Ecology and epidemilogy of the potato late blight pathogen Phytophthora infestans in soil. Phytopathology, Vol 85, P. 1053-1056.

13. Anonymous (1997). "CIP in 1996. The International Potato Center Annual Report." , International Potato Center, Lima, Peru. 59pp.

14. Black W., C. Mustenbroek, W.R. Mills and L.C. Peterson (1953). A proposal for an international nomenclature of races of Phytophthora infestans and of genes controlling immunity in Solanum demissum derivates. Euphytica 2: 173-179.

15. Bidani A., O. Wouri-Ellowz, L.Lackhoua, D.Sihachakr, C.chenilet, A.Mahjoub, N.Drira and B.Gargouri (2007). Interspecific potato somatic hybrids between Sonalum berthaultii and S.tuberosum L. showed recombinant plastome and improved tolerance to salinity. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture 91: 179-189.

16. Binding H. and R. Nehts (1977). Regeneration of isolated protoplasts to plants in Solanum dulcamone L. ZPllanzenphysiol 85: 279-280.

17. Borgato L., C. Cobicella, F. Pisani and A. Furini (2007). Production and fertile Solanum melongena + Solanum characterization of arboreous and marginatum somatic hybrids plants. Planta 226:961–969.

18. Bradshaw E.J., G.J. Bryan, A.K. Lees, K. Mclean and R.M. Solomon-Blackburn (2005). Mapping the R10 and R11 genes for resistance to late blight (Phytopthora infestans) present in the potato (Solanum tuberosum) R-gene differentials of Black. Theor Appl Genet 112: 744-751.

19. Chani E., E. Richard and T. Boluarte (2000). Improveed androgenesis of interspecific potato and efficiency of SSR markers to identify homozygous regenerants. Plan Cell, Tissue and Organ Culture 60: 101-112.

20. Chen S., L. Tao, L. Vega-Sanchez, K, Zeng, M.E. Umemura

and G.L. Wang (2006). A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Pathol 7: 417–427.

21. Cocking E.C. (1960). A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature: 187: 962-963.

22. Colon L., B. Nielsen and U.Darsow (2004). Eucablight protocol Detached leaflet assay for foliage blight resistance.

23. Darsow U. (2008). Pre-breeding for Quatitative resistance of potato to late blight. Institute of Agriculture Crops in Gross Luesewitz in the department research in

BMELV.

24. Davey M.R. and A. Kumar (1983). Higher plant protoplasts-retrospect and prospect. Int. Rev. Cytology Suppl. 16: 1219-299.

25. Davey M R., A. Kumar and N. Hammatt (1994). In vitro culture of legume. In: Plant Cell and Tissue Culture (Eds Vasil I K and Therpe). Kluwer Academic Publisher, Dor drencht, pp: 313-329.

26. Davis B. (1985). Factors influencing potato plant isolation. New York: macel Deckker Inc., 45-71.

27.

Dinu. I and T. Ramona (2001). Utilization of genentic resources in Solanum for potato breeding through biotechnological methods. Schriften zu Genetischen Ressourcen 16, 120-127.

28. Ehlenfeltdt M.K and J.P. Helgeson (1987). Fertility of somatic hybridsfrom protoplast fusions of Solanum brevidens and S. tuberosum. TAG 73: 395-402.

29. Ehsanpour A. and F. Amini (2003). Effect of salt and drought stress on acid (Medicago sativa L.) explants under in in alfalfa phosphatase activities vitro culture. Afr. J. Biotechnol., 2: 133-135

30. Ehsanpour A.A. and M.G.K. Jones (2001) Plant regeneration from mesophyll protoplasts of potato (Solanum Tuberosum L.) cultivar delaware using silver thiosulfate (STS). Journal of Sciences of the Islamic Republic of Iran, 12 (2). pp. 103-110.

31. Ehsanpour A.A. and Z. Nejati (2013). Effect of naosilver on potato plant growth and protoplast viability. Biological lett, 50(1): 35-43.

32.

Eid M. A., M. A. Sayed, M.E. Ebtsa, H.E. mahmound (2010). Genetic diversity among late blight ressitant and susceptible potato genotypes. Saui journal of Biological Sciences 17: 133-138.

33. Ekaterina A. Sokalova, Oksana A. Fadina, Emil E. Khavkin, Elena V. Rogozina, Mariya A. Kuznetsova, Richard W. Jone and Kenneth L (2014). Deahl. Structural homologues of CC-NBS-LRR genes for potato late blight resistance in wild Solanum species. Ppo-special Report No 16-2014, 247-254.

34. Erwin D. C. and O.K. Ribeiro (1960). Phytophthora Diseases Wordwide. The American Pathological Society. APS Press.st.nl. p. 346 -349.

35. Feingold S., J.Lloyd, N.Norero, M.Bonierbale and J.Lorenzen (2005). Mapping and characterization of new EST-derived microsatellites for potato (Solanum tuberosum L.). Theor Appl Genet 111: 456-466.

36. Firozeh Torabi, Ahmad Majad and Ali Akbar Ehsanpour (2008). Plant (Solanum Regeneration of Potato from Cell Suspension Culture tuberosum L.). Pakistan Journal of Biological Sciences, 11: 778-782.

37. Flor H.H. (1971). Current status of the gen- for-gen concept. Annual Review of Phytopathology 9: 275-296.

38.

Foster S.T., T.H. Park, M. Pel, G. Brigneti, J. Sliwka, L. Jagger, E. van der Vossen and J.D.G. Jones (2009). Rpi-vnt1.1, a Tm-22 homolog from Solanum venturii, confers resistance to potato late blight. Molecular Plant-Microbe Interaction 22 (5): 589-600.

39.

Fry W E., S. B. Goodwin, A. T. Dyer, J.M. Matuszak, A. Dreth, P.W. Tooley, L.S. Sujkowski, Y.J, Koh, B.A. Cohen, L.J. Spielman,K.L. Dheal, D.A. Inglis and K.P. Sandlan (1993). Historical and recent migrations of Phytophthora infestans, chronology, pathways, implications. Plant disease, vol 77, P. 653-661

40. Gavrilenko T., R. Thieme, U.Heimbach, and T. Thieme (2003). Fertile somatic hybrids of Solanum etuberosum (+) dihaploid Solanum tuberosum and backcrossing progenies: relationships of genome dosage with development and resistance to potato virus Y. Euphytica 131: 323-332.

41. Gillund F., Myhr, A. and Hilbeck, A. (2015). Stakeholder perception on sustainability of genetically modified potato. Wageningen Academic Publishers, pp. 55-61. http://dx.doi.org/10.3920/978-90-8686-813-1_7.

42. Golas T.M., A. Sikkema, J. Gros, R.M.C. Feron, R.G. van den Berg, G.M. van der Weerden, C. Mariani and J.J.H.M. Allefs (2010). Identification of a resistance gene Rpi-dlc1 to Phytophthora infestans in European accession of Solantum dulcamara. Theoretical and Applied Genetics 120 (4): 794-808.

43.

Haberlach G.T., B.A. Cohen, N.A. Reichert, A. Baer, L.E. Towill, J.P. Helgeson (1985). Isolation, culture, and regeneration of protoplasts from potato and several related Solanum species. Plant Sci: 39:67–74.

44.

Hammann T., B. Truberg, R. Thieme (2009). Improving resistance to late blight (Phytophthora infestans [Mont.] de Bary) by using interspecific crosses in potato (Solanum tuberosum ssp.). Proc 3rd Symp on Plant Protetion and Plant Health in Europe, Berlin, 428-436.

45. Haverkort A. J., P. C. Struik, R. G. F. Visser and E. Jacobsen (2009). Applied Biotechnology to Combat Late Blight in Potato Caused by Phytophthora Infestans. Potato Research, 52:249–264.

46. Hawkes J.G. (1990). The potato. Evolution, Biodiversity and Genetic Resources. Smithsonian Institution Press, United States, pp. 199-211.

47. Helgeson J.P, J.D. Pohlman, S. Austin, G.T. Haberlach, S.M. Wielgus, D. Roni, L.Zambolim, P.Tooley, J.M.McGranth, R.V. James and W.R.Stevenson (1998). Somatic hybrids between Solanum bulbocastanum and potato: a new source of resistance to late blight. Theor. Appl.Genet 96: 735-742.

48.

Hermsen, J.G. (1994). Introgression of genes from wild species including molecular and cellular approaches. In: Bradshaw, J.E. & G.R. mackay (Eds), Potato Genetics, pp. 515-538. CBA International Wallingford, UK.

49. Horsma K., T. Gavrivenko, J.Bergervoet, D.J.Huigen, A.J.W.Joe and E. Jacobsen (2001). Plant Breed 120, 201.

50.

Hu C.H., F.G. Perez, R. Donahoo, A. McLeod, K.Myers, K.Ivors, G.Secor, P.D. Robert, K.L. Deahl, WE.Fry and J.B. Ristaino (2012). Recent genotypes of Phytophthora infestans in eastem United States reveal clonal populations and reapprearance of mefenoxam sensitivity. Plant Disease 96: 1323-1330.

51. Hwang Y., C. Wijekoon, M. Kakischuk, D. Jonnson, R. Howard, D. Prufer and L. Kawchuk (2014). Evolution and Management of the Irish Potato Famine Pathogen Phytophthora infestans in Canada and the United States. Am.J.Potato Res 91: 579-593.

52. Jackson, S.A. and R.E. Hanneman (1999). Crossability between cultivated and wild tuber-and non-tuber-bearing Solanums. Euphytica (Netherlands) 109 (1):51-67.

53. Jacobs M.M., B. Vosman, V.G. Vleeshouwers, R.G. Visser, B. Henken, and R.G. can den Berg (2010). A novel approach to locate Phytophthora infestans resistance genes on the potato genetic map. Theoretical and Applied Genetic 120: 785-796.

54. Jansky S. and A. Hamernik (2009). The introgression of 2x 1EBN Solanum species into the cultivated potato using Solanum verrucosum as a bridge. Genet Resour Crop Evol 56: 1107-1115.

55. Jiang R.H.Y. and B.M, Tyler (2012). Mechanisms and evolution off virulence in oomycetes. Annual review of phytopphthora 50: 295-318.

56.

Jo K.R., M. Arens, T.Y.Kim, M.A. Jongsma, R.Ga. Visser, E. Jacobsen and J.H. Vossen (2011). Mapping of the S. demissum late blight ressistance gene R8 to a new locus on chromosome IX. Theoretical and Aplied Genetic 123: 1331-1340.

57. Jones J.D.G. (2001). Putting knowkedge of plant disease resistance genes to work. Gurr Opin Plant Biol 4: 281-287.

58. Kalischuk M.L., K.I. Al-Mughrabi, R.D. Peters, R.J. Howward, H.W. Platt and L.M.. Kawchuk (2012). Genetic composition of Phytophthora infestans in Canada reveals migration and increased diversity. Plant Disease 96: 1729-1735.

59. Kao K.N., F. Constabel, M.R. Michauluk and O.L. Gamborg (1974). Plants protoplast fusion and growth of intergeneric hybrid cells. Plata (Berl.) 120, 215-22

60.

Kawwchuk L.M., R.J. Howard, R.D. Peters and K.I. Al-Mughrabi (2011). First report of Phytophthora infestans genotype US-23 causing late blight in Canada. Plant Disease 85: 873.

61. Kuhl J.C., R.E. Hanneman and M.T. Havey (2001). Characterization and mapping of Rpi1, a late blight resistance locus from fiploid (1EBN) Mexican Solanum pinnatisectum. Mol Genet Genomics 265: 977-985.

62.

Laurila J., I.Laakso, J.P.T. Valkomen, R. Hihune and E. Pehu (1996). Formation of parental type and novel alkaloids in somatic hybrids between Solanum breviders and S. Tuberosum. Plant Sci 118: 145-155.

63. Le V.H., X.T. Ngo, M. B. Brurberg and A. Hermansen (2008). Characterisation infestans populations from Vietnam. Australasian Plant of Phytophthora Pathology 37: 592–599.

64.

Leonards – Schipers C., W. Grieffers, F. Salamuni and C. Gebhurdt (1992). The R1 gene conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans in potato located on potato chromosome V. Mol. Gen, Genet 233: 278-283.

65.

Li G., S. Huang, X. Guo, Y. Li., Y. Yang, Z. Guo, H. Kuang, H. Rietman, M. Bergervoet, V.G.A.A Vleeshouwers, E.A.G., van der Vossen, D. Qu, R.G.F. Visser, E. Jacobsen and J.H. Vossen (2011). Cloning and characterization of R3b: members of the R3 superfamily of late blight resistance genes show sequence and functional devergenece. Molecular Plant-Microbe Interactions 24 (10): 1132-1142.

66. Lokossou A.A., T.H. Park, G. van Arkel, G.M. Arens, C. Ruyter-Spire, J. Morales, S.G. Whisson, P.R.J. Birch, R.G.F. Visser, E. Jacobsen and E.A.G. van

der Vossen (2009). Exploiting knowledge of R/aAvr genes to rapidly clone a new LZ-NBS-LRR family of late blight resistance genes from potato linkage group IV. Mol Plant Microbe Interact 22: 630-641.

67.

Lokossow A.A., H. Rietman., M. Wang., D. Krenek, H. van der Schoot, B. Henken, R. Hoekstra, V.G.A.A Vleeshouwers, E.A.G. van der Vossen, R.G.F. Visser, E. Jacobsen and B. Vosman (2010). Diversity, distribution and evolution of Solanum bulbocastanum late blight resistnace genes. Molecular Plant Microbe interaction 23 (9): 1206-1216.

68. Masson JM, Lecerf M, Rouselle P, Prennee P and Rellettier G (1988). Plant regeneration from protoplasts of diploid potato derived from crosses of Solanum tuberosum with wild Solanum species. Plant Sci 53: 167-176.

69.

Mattheij W.M. and K.J. Puite (1992). Tetraploid potato hybrids through protoplast fusion and analysis of their performance in the field. Theor Appl. Genet. 83: 807-812.

70.

tuberosum L. and

Mattheij, W.M., R.Eijlander, J.R.A. de Koning and K.M. Louwes (1992). Interspecific hybridization between the cultivated potato Solanum tuberosum the wild species S. circaeofolium subsp. subspecies cirsaeifolium Bitter exhibiting resistance to Phytophthora infestans (Mont.) de Bary and Golbodera pallida (Stone). Behrens TAG 83: 459-466.

71. Matveeva N.A., A.M. Shakhovskii and N.V. Kuchuk (2008). Somatic hybrids between transgenic Solanum tuberosum potato plants and transplastome Solanum rickii plants. Cytology and Genetics, 42(4): 246-251.

72. McDonald B.A. and C. Linde (2002). The polulation genetics of plant pathogens and breeding stragies for durable resistance. Euphytica 124: 163-180.

73.

Milbourne, D., R.C. Meyer, A.J. Collins, C.D. Rasamy, C. Gebbardt and R. Waugh (1998). Isolation, characterization and mapping of sequence repeat loci in potato. Molecular and General Genetics, 259, 233-245.

74. Mori K., Y.Sakamoto, N.Mukojima, S.Tamiya, T.Nakao, T.Ishii and K. Hosaka (2011). Development of a multiplex PCR method for simultaneous detection of diagnostic DNA markers of five disease and pest resistance genes in potato. Euphytica 180: 347-355.

75. Möllers C. and G. Wenzel (1992). Somatic hybridization of diploid potato protoplasts as a tool for potato breeding. Bot Acta 105: 133-139.

76. Murashige T. and F. Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and bio- assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.

77. Nagata T. and I. Takebe (1971). Planting of Isolated Tobaco Mesophyll Protoplasts on Agar Medium. Planta (Berl.) 99, 12-20.

asymmetric symmetric obtained from and 78. Oberwalder B., L. Schilde-Rentschler, B. Löffelhardt-Ruoß and H. Ninnemann (2000). Differences between hybrids of Solanum tuberosum L.and Solanum circaeifoliumBitt. fusion experiments. Potato Res 43:71–82.

79. Oosumi T., D.R. Rockhold and M.M. Maccree (2009). Gene Rpi-bt1 from Solanum bulbocastanum confers resistance to late blight in transgenic potatoes. Am.J.Pot Res (2009) 86: 456-465.

80.

Orczyk W., J. Przetakiewicz and A. Nadolska-Orczyk (2003). Somatic hybrids of Solanum tuberosum-application to genetics and breeding. Plant Cell Tiss Organ Cult 74: 1-13.

81. Park T.H., S. Foster, G. Brigneri and T.D.G. Jones (2009). Two distinct potato late blight resistance genes from Solanum berthaultii are located on chromosome 10. Euphytica 165: 269-277.

82. Pan Z.G., C.Z. Lin, S.M.A. Zobayed and P.K. Saxena (2004). Plant regeneration from mesophyll protoplasts of Echinacea purpurea. Plant Cell Tissue Organ Cult.77, 251-255.

83. Peters R., K. Almughrabi, M. Kalischuk, K. Dobinson, K. Conn, H Alkher, M. Islam,, F. Daayf, J.Lynn, B. Bizimungngu, D. De Koeyer, A. Levesque and L. Kachuk (2014). Characterization of Phytophthora infestans population diversity in Canada reveals increased migration and genotype recombination. Canada Joulnal of plant Pathology 36: 73-82.

84. Pijnacker L.P. and K. Sree Ramulu (1990). Somaclonal variation in potato: a karyotypic evaluation. Acta bot, neere 39: 163-169.

85. Raffaele S. and S. Kamoun (2012). Genome evolution in filamentous plant pathogens: wwy bigger can be beter. Nature Reviews Microbiology 10: 417-430.

86.

Raffaele S., J. WWin, L.M. Cano and S. Kamoun (2010a). Analyses of genome architecture and gene expression reveal novel candidate virulence factors in the secretome of Phytophthora infestans. BMC Genomics 11: 637.

87.

Raffaele S., R.A. Farrer, L.M. Cano, D.J.. Studholme, D. MacLean, M. Thines, R.H.Y. Jiang, M.C. Zody, S.G.Kunjeti, N.M. Donofrio. B.C. Meyers, C. Nusbaum and S. Kamoun (2010b). Genome evolution following host jimps in the Irish potato famone pathogen genotype. Science 330: 1540-1543.

88. Razdan M.K. and A.K. Mattoo (2005). Genetic Improvement of Solanaceous Crops. Science Publishers, Inc. 293-331.

89. Rivas S. and S. Genin (2011). A plethora off virulence strategies hidden behind nuclear targeting off microbial effectors. Frontiers in Plant Science 2: 104.

90.

Rojas. J.A., W.W. Kirk, E. Gachango, D.S. Douches and L.E. Hanson (2014). Tuber Blight development in potato cultivars in respone to different genotypes of Phytophthora infestans. Journal of Phytopathology 162: 33-42.

91. Sharma S., D.Sarkar, S.K. Pandey, P. Chandel and J.K. Tiwari (2011). Stoloniferous shoot protoplast, an efficient cell system in potato for somatic cell gentic manipulations. Scientia Horticulturae 128: 84-91.

92. Schormack S., M. Van Damme, T.O. Bozkurt, L.M. Cano, M.Smoker, M.Thines, E. Gaulin, S. Kamoun and E. Huitmema (2010). Ancient class of translocated oomycete effectors targets the host nucleus. Proceedings of the national Academy of Science of the United States of America 107: 17421-17426.

93.

Schubert J., Thieme, T., Thieme, R., Cuong Ha Viet and Hoang Thi, G., (2014). Molecular and biological characterization of Potato virus Y isolates from Vietnam. J Phytopathol doi 10.1111/jph.12362: 1-14.

100

94.

Seidl A.C. and A.J. Gevens (2013). Characterization and distribution of three new clonal lineages of Phytophthora infestans causing late blight in Wwisconsin from 2009 to 2012. American Journal of Potato Research 90: 551-560.

95. Śliwka

J., H.Jakuczun, M.Chmielarz, A. HaraSkrzypiec, I.Tomczyńska, A. Kilian and E. Zimnoch-Guzowska (2011). A resistance gene against potato late blight originating from Solanum × michoacanum maps to potato chromosome VII. Theor Appl Genet.124(2): 397–406.

96. Smyda P., H. Jakuczun, K. Debski, J. Sliwka, R. Thieme, M. Nachtigall, I. Wasilewicz-Flis and E. Zimnoch-Guzowsk (2013). Development of somatic hybrids Solanum x michoacanum Bitter. (Rydb.) (+) S. tuberosum and autofused 4x S. x michoacanum plants as potential sources of late blight resistance for potato breeding. Plant Cell Rep 32: 1231-1241.

97. Smyda P., W. Jad, W. Iwona, J. Henryka and G. Ewazimmach (2016). Genetic composition of interspecific potato somatic hybrids and autofused 4x plants evaluated by DArT and cytoplasmic DNA markers. Plant Cell Rep DOI 10.1007/S00299-016-1966-2.

98. Solomon B., R.M. and H. Barket (2001a). A review of host major-gene resistance to potato viruses X,Y, A and V in potato: gene, genetics and mapped locations. Heredity 86: 8-16.

99.

Solomon B., R.M and H. Barket (2001b). Breeding virus resistant to potatoes (Solanum tuberosum): a review of traditional and molecular approaches. Heredity 86: 17-35.

100. Song J.Q., J.M. Brandeen, S.K. Naess, J.A. Raasch, S.M. Wielgus, G.T. Haberlach, J. Liu, H.H. Kuang, S. Austin-Phillips, C.R. Buell, J.P. Helgeson and J.M. Jiang (2003). Gene RB cloned from Solanum bulbocastanum confers broad spectrum resistance to potato late bight.Proc Natl AcadSci USA 100: 9128-9133

101. Song Y., L. Heptimg, G. Schweizer, L. Hartl, G. Wenzel and A. Schwarzfischer (2005). Mapping of extreme resistance to PVY (Rysto) on chromosome XII using anther-culture-derived primary dihaploid potato lines. Theor Appl Genet 111: 879-887.

102. Song Y. and A. Schwarzfischer (2008). Development of SSR markers for selection of extreme resistance (RYsto) to PVY and materal pedigree analysis of extremely resistant cultivars. Am J Potato Res 85: 159-170.

103. Spooner D.M. and R.J. Hijmans (2010). Potato systemmatics and germplasm collecting, 1989,-2000. Amer J Potato Res 78: 237-268.

104. Spooner D.M., K. Mclean, G. Rasamy, R. Wangh and G.J. Brayan (2005). A single domestication length polymorphism genotyping. Proceeding of the National Academy of Sciences 102: 14094-14699.

105. Stewart S., D.Wickramasinghe, A.E. Dorrance and A.E. Robertson. (2011). Comparion of three microsatellite analysis methods for detecting genetic diversity in Phytophthora sojae (Stramenopila: Oomycete).Biotechnol Lett, 33: 2217-2223.

106. Szczerbakowa A., D. Boltowicz, R. Lebecka, P. Radomski and B. Wielgat (2005). Characteristics of the interspecific somatic hybrids Solanum pinnatisectum (+) S. tuberosum H-8105. Acta Physiol Plant 3a(27), 265–273.

101

107. Thach N. Q., U. Frei and G. Wenzel (1993). Somatic fusion for combining virus resistance in Solanum tuberosum L. Theor Appl. Genet 85, 863-867.

108. Tan M.Y. A., R. C. Hutten, C. Celis, T. H. Park , R. E. Niks, R. G. Visse, H. J. van Eck (2008). The R(Pi-mcd1) locus from Solanum microdontum involved in resistance to Phytophthora infestans, causing a delay in infection, maps on potato chromosome 4 in a cluster of NBS-LRR genes. Mol. Plant Microbe Interact, 21(7): 909-918.

109. Thieme R., U. Darsow, L. Rakosy-Tican, Z. Kang, T. Gavrilenko, O.Antonova, U.Heimbach and T.Thieme (2004). Use of somatic hybridisation to transfer resistance to late blight and potato virus Y (PVY) into cultivated potato. Plant breeding and seed science 50: 1113-118.

110. Thieme R., U. Darsow, T. Gavrilenko, D. Dorokhov and H. Tiemann (1997). Production of somatic hybrids between S.tuberosum L. and late blight resistan Mexican wild potato species. Euphytica 97: 189-200.

111. Thieme R., I. Dinu, U. Darsow, L. Rakosy-Tica, Z. Kang, T. Gavrilanko, O. Antonova, U. Heimbach and T. Thieme (2003). Somatic hybrids between Solanum tarnii and potato: a new source of resistance to virus disease and late blight. (In:) Proc. EAPR- EUCARPIA conf. Breeding and adaptation of potatoes, 26.7- 30.7.2003, Oulu, Finland: 49.

112. Thieme R., Elena Rakosy, Tican, Marion Nachtigall, Jorg Schubert, Thilo Hammann, Olga Antonova, Tatjana Gavrilenko, Udo Heimbach and Thomas Thieme (2010). Characterization of the multiple resistance traits of somatic hybrids between Solanum cardiophyllum Lindl. and two commercial potato cultivars. Plant Cell Rep 29: 1187-1201.

113. Thieme R., L. Rakosy-Tican, Z. Kang, T. Gavrilenko, O.Antonova, U.Heimbach, J. Schubert, M. Nachtigall and T. Thieme (2005). Utilization of the resisitance to pathogenes and pests in wild species of Solanum for breeding potatos. European association for potato reseach 55: 246-250.

114. Thieme R., T. Thieme, U. Heimbach and T. Gavrilenko (2000). Incorporation and testing of new geneitc sources for virus resistance in potato, Global res Devel1: 271-278.

115. Thieme R., U. Heimbach and T. Thieme (2004). Breeding for aphid and virus resistance in potatoes. In: J,C.Salmon, C-A. Dedryver, C. Rispe, M.Hulle (eds), Aphids in new millenium. JNRA Editions, Paris, pp. p.28.

116. Thieme R., Rakosy-Tican E, Gavrilenko T, Antonova O, Schubert J, Nachtigall M, Heimbach U. and Thieme T. (2008). Novel somatic hybrids and their fertile BC1 progenies of potato (Solanum tuberosum L. + S. tarnii), extremely resistance to potato virus Y and late blight. Theor Appl Genet 116, 691–700.

117. Thieme T. and R. Thieme (1998). Evaluation of resistance to potato virus Y (PVY) in wild psecies and potato breeding clones of the genus Solanum. Aspects Appl Biol 52: 355-359.

118. Tiwari J.K., P.D.Sarkar, S.K. Pandey, J. Gopal and S.R. Kumar (2010). Molecular and morphological characterization of somatic hybrids between Solanum tuberosum L. and S. etuberosum Lindl. Plant Cell Tiss Org Cult 103:175–187.

102

119. Truberg B., T. Hammann, U. Darsow and H. Piepho (2008). Empirical comparision of different methods for correcting late blight (Phytophthora infestans [Mont.] de Bary) data for maturity in selection experiments of potato (Solanum tuberosum subsp. Tuberosum). Journal for Plant Culture 61 (3): 77-81.

120. van der Vossen E.A., J. Gros, A. Sikkema, M. Musken, D. Wouters, A. Pereira and S. Allefs (2005). The Rpi-blb2 gene from Solanum bulbocastanum is an Mi-1 gene Homolog confering broard-spectrum late blight resistance in potato.Plant Journal 44: 208-222.

121. van der Vossen E.A., A. Sikkema, B.L. Hekkert, J. Gros, P. Stevents, M. Musken, D. Wouters, A. Peteira, W. Stiekema and S. Alleft (2003). An ancient R genes from the wild potato species Solanum bulbocastanum confers broad-spectrum resistance to Phytophthora infestans in cultivated potato and tomato. Plant Journal 36: 867-882

122. Vleeshouwers V.G., S. Raffaele, J. Vossen, N. Champouret, R. Oliva, M.E. Segregtin, H.Rietman, L.M. Cano, A.Lokossou, G. Kessel, M.A. Pel and S.Kamoun (2011). Understanding and exploiting late blight ressistance in the age off effector. Annual Review of Phytopathology 49: 507-531.

123. Wang M., S. Allefs, R.G. van den Berg, V.G. Vleeshouwers, E.A. van der Vossen and B. Vosman (2008). Allele mining in Solanum: conserved homologues of Rpi- blb1 are identified in Solanum stoloniferum. Theor Appl Genet 116(7):933-943.

124. Wang X. A., T. Rinehart, A. Phillip Wadl, M. James Spiers, Denita Hadziabdic, Mark T. Windham and N. Robert Trigiano (2009). A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. African Journal of Biotechnology Vol. 8 (11): 2432-2436.

125. Wei Z., Xu, Z., Huang, X., Xu, N. and Huang, M.. Plants regenerated from mesophyll protoplasts of white mulberry. Cell Research (1994), 4, 183–189.

126. Wenzel G., O. Schieder, T. Przewozny, S.K. Sopory and G. Melchers (1979). Comparision of single cell culture derived Solanum tuberosum L. Plants and a model foe their application in breeding programs. Theor. Appl. Genet., 35, 49-55.

127. Wielgat B. and L.D. Wasilewska (2001). Somatic hybridization between wild and cultivated Solanum species. Biotechnology 2:9–15.

128. Wijekonn C.P., R.D. Peters, K.I. Al-Mughrabi and L.M.Kawchuk (2014). First report of late blight caused by Phytophthora infestans clonal lineage US-23 on tomato and potato in Atlantic Canada. Plant Disease 98:426.

129. Whisson S.C., P. Boevink, L. Moleleki, A.O. Avrova, J.G. Morales, A.M. Gilroy, M.R. Armstrong, S. Grouffaud, P. van West, S. Chapman, I. Hein, I.K. Joth, L. Pritchard and P.R.J. Birch (2007). A translocation signal for delivery of oomycete effector proteins into host plant cells. Nature 450: 115-119.

130. Wiszniewska A. and B. Piwowarczyk (2014). Studies on cell wall regeneration in protoplast culture of legumes- the effect of organic medium additives on cell wall component, Czech J. genet. Plant Breed, 50 (2): 84-91

103

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Hóa chất nu i cây m : Thành phần m i trƣờng MS

(Musashige and Skoog,1962):

Khối lƣợng (cho 1 lít dung Đơn vị Hóa chất Ghi chú (Lƣợng lấy cho 1 lít môi trƣờng dịch mẹ)

g 33.00 Đa lƣợng g 38.00

g 7.40 50ml/l g 3.40

g 50ml/l 8.80

mg 620.00

mg 2230.00

mg 860.00 Vi lƣợng

NH4NO3 KNO3 MGSO4.7H2O KH2PO4 CaCl2.2H2O H3BO4 MnSO4.4H2O ZnSO4.4H2O KI mg 83.00

10ml/l mg 25.00

mg 2.50

g 5.56 5ml/l g 7.76

MoO4Na2.2H2O CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O FeSO4.7H2O Na2EDTA Glycine mg 400.00

mg 100.00 5ml/l mg 100.00

mg 20.00

B5 B6 B1 Inositol mg 100.00

Agar g 6.00

Sacaroza g 25.00

PH 5.7 - 5.8

104

Phụ lục 2: Hóa chất tách tế ào trần

Tên dung dịch Thành phần

 Đa lƣợng, vi lƣợng và vitamin theo

Dung dịch enzyme (Mollers)

 Riêng nồng độ NH4NO3 là 150mg/l  11g/100ml Sucrose  1g/100ml

MS (Enzym Solution)

Polivynylpyrrolidon

 0.125g/100ml BSA

 0.2g/100ml Macerozym  0.8g/100ml Cellulose

 0.6g/100ml MES

(PVP)

 Muối khoáng và vitamin theo MS  Riêng nồng độ NH4NO3 là 150mg/l  110g/l sucrose

Dung dịch nổi (Rinsing Solution)

 Muối khoáng và vitamin theo MS  Riêng nồng độ NH4NO3 là 150mg/l  17g/l NaCl

Dung dịch rửa I (Washing Solution I)

 9.1g/100ml Mannitol  0.01g/l CaCl2

Dung dịch rửa II (Washing Solution II)

Phụ lục 3: Hóa chất dung hợp tế ào trần

Tên dung dịch Thành phần

Dung dịch dung hợp xung điện

o 0,4 M Manitol o 1,0 mM CaCl2 o pH = 5,6

(Fusion Solution)

(lọc vô trùng)

105

Phụ lục 4: Thành phần m i trƣờng nu i cấy tế ào trần VKMII lỏng) (Binding and Nehls, 1977)

Thành phần mg l M i trƣờng VKM II

1480 984 735 68 40 3 10 2 0.25 0.025 0.025 0.75 250 90000 250 each 250

KNO3 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O KH2PO4 NaFe-EDTA H3BO3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O KI Saccharose Glucose Mannitol Sorbitol, Ribose, Xylose, Mannose, Rhamnose, Fructose, Cellobiose Inositol Na-Pyruvat Fumaric acid Acetic acid Malic acid Ca-Pantothenate Choline choloride Ascorbic acid Nicotinamide Pyridoxine HCl Thiamine HCl Aminobenzoic acid Folic acid Biotin Vitamin A Vitamin D3 Vitamin B12 2.4D (Dichlorophenoxyacetic acid) NAA (Naphty lacetate) Zeatin Caseinhydrolysate BSA (Bovine Serum Albumin) Coconut milk (mL/L) 100 20 40 40 40 1 1 2 1 1 10 0.02 0.4 0.01 0.01 0.01 0.02 0.2 1 0.5 250 (1000) có hoặc không 20

Môi trƣờng VKM II bán lỏng (nhỏ giọt agar nồng độ 0,65%); Môi trƣờng VKM II rắn (Agar 0,65%)

106

Phụ lục 5. Thành phần m i trƣờng A* (Ehsanpour and Amini, 2003) Môi trƣờng MS (Musashige and Skoog, 1962) Bổ sung thêm 2 mg/l Kinetin, 2mg/l 2,4-D và 2mg/l α-NAA

Phụ lục 6. Thành phần m i trƣờng KM8P* (Davey et al., 1994)

Thành phần KM8P*

Đa lƣợng

KNO3 1900

600

NH4NO3 MgSO4.7H2O 300

CaCl2.2H2O 600

KH2PO4 170

Sequestrene 330 Fe 28

Vi lƣợng

H3BO3 3

MnSO4.H2O 10

ZnSO4.7H2O 2

Na2MoO4.H2O 0.25

CuSO4.5H2O 0.025

CoCl2.6H2O 0.025

KI 0.75

Đƣờng

Saccharose 250

Glucose 90000

Mannitol 250

each 250 Sorbitol, Ribose, Xylose, Mannose, Rhamnose, Fructose, Cellobiose Vitamin

Myo-inositol 100

Na-Pyruvat 20

Citric acid 40

Fumaric acid 40

Malic acid 40

Ca-Pantothenate 1

Choline choloride 1

Ascorbic acid 2

107

Thành phần KM8P*

Abssisic acid 0.02

Nicotinamide 1

Pyridoxine HCl 1

Thiamine HCl 1

Riboflavin 0.2

Biotin 0.01

Vitamin A 0.01

Vitamin D3 0.01

Vitamin B12 0.02

Các chất khác

each 250

Sorbitol, Ribose, Xylose, Mannose, Rhamnose, Fructose, Cellobiose 2.4D (Dichlorophenoxyacetic acid) 0.2

NAA (Naphty lacetate) 1

Phụ lục 7. Thành phần m i trƣờng nu i cấy và tái sinh protoplast

Thành phần M i trƣờng tái sinh callus M i trƣờng tái sinh chồi

Cul-medium (Haberlach et al., 1985) RJM- medium (Masson et al., 1988)

MS- Đa lƣợng, vi lƣợng + +

MS-Vitamins + +

Inositol (mg) 100 100

NaFe-EDTA (mg) 40 40

Glucose (g) 5 0

Saccharose (g) 15 10

Mannitol (g) 30 15

IAA (Indoleacetic acid, mg) 0 0.5

NAA (Naphtyacetate, mg) 0.2 0

Zeatin (mg) 0 1

BAP (Benzy laminopurin, mg) 1 0.5

GA3 (Gibberellic acid, mg) 0 0.2

Agar-Agar (g) 7.5 7.5

108

Phụ lục 8. Thành phần m i trƣờng K8P (Wei et al., 1994)

Khối lƣợng lấy Thể tích dung dịch m

Phần 1 (200ml) 120mg

180mg

Phần 2 (200ml) 60mg

Phần 3 (600ml) 80mg

175mg

Tên chất Ca(NO3)2.4.H2O KNO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 (NH4)2(SO4) NaFeEDTA 6mg

0.6mg

MnSO4.7H2O Glycine 1mg

Nicotinic acid 5mg

Thiamine 10mg

Pyridoxine 5mg

Peptone Soja 500mg

Sucrose 15g

Agar 5g

Geltrite 1g

Môi trƣờng MS (Musashige and Skoog, 1962)

Bổ sung thêm 5 mg/l BA, 2mg/l IBA

Phụ lục 9. Thành phần m i trƣờng MSO (Pan et al., 2004)

Phụ lục 10: Hóa chất chiết tách DNA

 Dung dịch I: NaCl 10,37g; CTAB (Cethrimethyl amonium bromind) 0,25g, tổng thể

tích 100ml.

 Dung dịch II (CI): Hỗn hợp Chloroform: Isoamylalcohol (24:1)

 Dung dịch TE: 1ml Tris-HCl 1M; 0,2ml EDTA 0,5M, tổng thể tích 100ml, PH=8.

 Ethanol 90% và 70%

Phụ lục 11. Các ƣớc chiết tách DNA:

 Bƣớc 1: Cân 0,13 – 0,15 gam lá tƣơi từ cây in vitro cho vào cối sứ sạch, bổ sung 500µl CTAB đã ủ trong waterbath ở 60OC trong 10 phút. Sau đó dùng chày sứ nghiền nhanh, đều đến khi nhuyễn, đồng nhất rồi bổ sung tiếp 500µl CTAB, cuối cùng chuyển toàn bộ mẫu sang tube 1,5ml. Tube mẫu đƣợc giữ trong waterbath 60OC trong 10 phút

109

 Bƣớc 2: Tiến hành ly tâm tube mẫu ở 12000 rpm trong 5 phút, máy ly tâm lạnh

khoảng 4OC

 Bƣớc 3: Sau đó hút 700 µl dịch trong phía trên chuyển sang tube mới và bổ sung

dung dịch CI theo tỷ lệ 1: 1, giữ 10 phút trên đá lạnh.

 Bƣớc 4 Tiếp tục đem ly tâm 12000 rpm trong 10 phút..

 Bƣớc 5: Sau ly tâm hút 500 µl dịch trong phía trên chuyển sang tube mới và bổ sung

dung dịch CI theo tỷ lệ 1: 1, giữ 10 phút trên đá lạnh.

 Bƣớc 6: Ly tâm mẫu 12000rpm trong 10 phút

 Bƣớc 7: Hút 300 µl dịch trong phía trên chuyển sang tube mới và bổ sung dung dịch

isopropanol theo tỷ lệ 1: 1 để tủa DNA, giữ 30 phút trong tủ lạnh sâu -20OC.

 Bƣớc 8: Ly tâm tube ở 12000rpm trong 15 phút

 Bƣớc 9: Hút bỏ nƣớc phía trên và rửa tủa DNA bằng ethanol 70% (3 lần), sau đó để

khô tự nhiên trong 30 phút.

 Bƣớc 10: Sau khi khô bổ sung 50 µl TE để hòa tan tủa DNA, giữ trong tủ lạnh -

20OC sử dụng lâu dài.

Phụ lục 12: Thành phần phản ứng PCR

STT Tên hóa chất Thể tích

1 PCR buffer 10x 1,5µl

2 dNTP 2,5mM 0,15µl

3 Forward primer 10ppmol/µl 0,5µl

4 Reverse primer 10ppmol/µl 0,5µl

5 Nƣớc cất 10,53µl

6 0,12µl MgCl2

7 Taq polymerase 5U/µl 0,2µl

8 DNA tổng số 0,5µl

Tổng 14µl

110

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

3 phút 1 chu kỳ

1 phút

30 chu kỳ 94o C 94o C Tm 72o C 2 phút 1,5 phút

72oC 5 phút 1 chu kỳ

4oC

Phụ lục 13: Hóa chất điện di sản phẩm PCR

 Agarose 1-1,5%

 Dung dịch TAE 1x

 Sản phẩm PCR

 Vật liệu và thiết bị máy móc cần thiết cho kỹ thuật điện di (buồng điện di, buồng tối

UV, máy ảnh…)

Phụ lục 14. Các chỉ tiêu đánh giá các đặc điểm n ng sinh học theo QCVN 01-69: 2011/BNNPTNT

Các tính trạng đặc trƣng của giống khoai tây

Tính trạng Giai đoạn Mã số

Mầm: Kích cỡ Lightsprout: Size Mầm: Hình dạng Lightsprout: Shape 1 1. (+) VG 2. (*) (+) VG

3. (*) VG 1 Mầm: Mức độ sắc tố antoxian trên gốc mầm Lightsprout: Intensity of anthocianin coloration of base

1 4. (*) VG Trạng thái biểu hiện Nhỏ Trung bình To Hình cầu Hình trứng Hình nón Hình trụ Hình trụ dài Không có hoặc rất nhạt Nhạt Trung bình Đậm Rất đậm Không có hoặc ít Trung bình Nhiều 3 5 7 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 Mầm: Tỷ lệ màu xanh của sắc tố antoxian trên gốc mầm Lightsprout: Proportion of blue in anthocyanin coloration of base

111

Tính trạng Giai đoạn Mã số

Mầm: Lông ở gốc mầm Lightsprout: Pubescence of base 1 5. (*) (+) VG

Mầm: Kích cỡ phần đỉnh so với gốc Lightsprout: Size of tip in relation to base Mầm: Dạng đỉnh Lightsprout: Habit of tip 1

Cây: Cấu trúc tán Plant: Foliage structure Trạng thái biểu hiện Rất ít Ít Trung bình Nhiều Rất nhiều Nhỏ Trung bình Lớn Đóng Trung bình Mở Dạng thân (tán lá mở, nhìn rõ thân cây) 6. (+) VG 7. (+) VG 12. (+) VG 2 1 3 5 7 9 3 5 7 1 3 5 1 2 3

Cây: Kiểu sinh trƣởng Plant: Growth habit 2 Trung gian Dạng lá (tán lá ken dầy, rất khó nhìn thấy thân Đứng Nửa đứng Bò 3 5 7

Thân: Sắc tố antoxian Stem: Anthocyanin coloration

13. (*) (+) VG 14. (*) (+) VG

Lá: Kích cỡ Leaf: Outline size 2

Lá: Sự mở Leaf: Openness 2

Lá: Lá chét thứ cấp Leaf: Presence of secondary leaflets Lá: Màu xanh Leaf: Green color 2

15. (+) VG 16. (+) VG 17. (+) VG 18. (+) VG 19. (+) VG 2

Lá: Sắc tố antoxian trên gân chính của mặt trên Leaf: Anthocyanin coloration on midrib of upper side Không có hoặc rất nhạt Nhạt Trung bình Đậm Rất đậm Nhỏ Trung bình Rộng Đóng Trung gian Mở Ít Trung bình Nhiều Nhạt Trung bình Đậm Không có hoặc rất nhạt Nhạt Trung bình Đậm Rất đậm 1 3 5 7 9 3 5 7 1 3 5 3 5 7 3 5 7 1 3 5 7 9

112

Tính trạng Giai đoạn Mã số

20. (+) VG Đôi lá chét bên thứ 2: Kích cỡ Second pair of lateral leaflets: Size 2

2 Trạng thái biểu hiện Rất nhỏ Nhỏ Trung bình Lớn Rất lớn Hẹp Trung bình Rộng 1 3 5 7 9 3 5 7 21. (+) VG

22. (*) VG 2 Đôi lá chét bên thứ 2: Chiều rộng so với chiều dài Second pair of lateral leaflets: Width in relation to length Lá chét đỉnh và bên: Mức độ lá hợp. Terminal and lateral leaflets: Frequency of coalescence

Lá chét: Sự lƣợn sóng của mép Leaflet: Waviness of margin 2 23. (+) VG

2 Lá chét: Độ sâu của gân Leaflet: Depth of veins

Không có hoặc rất thấp Thấp Trung bình Cao Rất cao Không hoặc rất ít Ít Trung bình Nhiều Rất nhiều Nông Trung bình Sâu Mờ Trung bình Bóng Không có Có 1 3 5 7 9 1 3 5 7 9 3 5 7 3 5 7 1 9 24. (+) VG 25. (+) VG 26. VG 1

27. (+) VG Lá chét: Độ bóng mặt trên lá Leaflet: Glossiness of the upperside Lá chét: Lông của phiến lá tại đỉnh hoa thị Leaflet: Pubescence of blade at apical rosette Nụ hoa: Sắc tố antoxian Flower bud: Anthocyanin coloration 1

28. VG Cây: Chiều cao Plant: Height 2

Cây: Mức độ ra hoa Plant: Frequency of flowers 2 29. (+) VG Không có hoặc rất nhạt Nhạt Trung bình Đậm Rất đậm Rất ngắn Ngắn Trung bình Cao Rất cao Không có hoặc rất ít Ít Trung bình Nhiều 1 3 5 7 9 1 3 5 7 9 1 3 5 7

113

Tính trạng Giai đoạn Mã số

Chùm hoa: Kích thƣớc Inflorescence: Size 2

2 30. (+) VG 31. (+) VG Chùm hoa: Sắc tố antoxian trên cuống hoa Inflorescence: Anthocyanin coloration on peduncle

Cánh hoa: Kích thƣớc Flower corolla: Size 2

2 32. (+) VG 33. (*) (+) VG Cánh hoa: Mức độ sắc tố anthocyan ở mặt trong Flower corolla: Intensity of anthocyanin coloration on inner side

Trạng thái biểu hiện Rất nhiều Nhỏ Trung bình Lớn Không có hoặc rất nhạt Nhạt Trung bình Đậm Rất đậm Nhỏ Trung bình Lớn Không có hoặc rất nhạt Nhạt Trung bình Đậm Rất đậm Không có hoặc rất ít Trung bình Nhiều 9 3 5 7 1 3 5 7 9 3 5 7 1 3 5 7 9 1 2 3 2 34. (*) (+) VG

2 35. (*) (+) VG Cánh hoa: Tỷ lệ màu xanh của sắc tố antoxian ở mặt trong Flower corolla: Proportion of blue in anthocyanin coloration on inner side Cánh hoa: Khoảng rộng sắc tố antoxian bên trong Flower corolla: Extent of anthocyanin coloration on inner side

Cây: Thời gian sinh trƣởng Plant: Time of maturity 3 36. (*) (+) MG

Củ: Hình dạng Tuber: Shape

37. (*) (+) VG

38. VG Củ: Độ sâu mắt củ Tuber: Depth of eyes 4

Không có hoặc rất nhỏ Nhỏ Trung bình Rộng Rất rộng Rất sớm Sớm Trung bình Muộn Rất muộn Tròn Ovan ngắn Ovan Ovan dài Dài Rất dài Rất nông Nông Trung bình Sâu 1 3 5 7 9 1 3 5 7 9 1 2 3 4 5 6 1 3 5 7

114

Tính trạng Giai đoạn Mã số

Củ: Màu của vỏ củ Tuber: Color of skin 39. (*) VG

Củ: Màu đáy mắt Tuber: Color of base of eye 40. (*) VG 4

Củ: Màu thịt củ Tuber: Color of flesh 41. (*) VG

42. (+) VG

Trạng thái biểu hiện Rất sâu Kem nhạt Vàng Đỏ Đỏ một phần Xanh Xanh một phần Nâu đỏ Màu khác Trắng Vàng Đỏ Xanh Màu khác Trắng Kem Vàng nhạt Vàng trung bình Vàng đậm Đỏ Đỏ một phần Xanh Xanh một phần Màu khác Không có hoặc rất yếu Yếu Trung bình Khoẻ Rất khoẻ 9 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 3 5 7 9

Chỉ ở giống vỏ màu kem nhạt và vàng: Củ: Sắc tố antoxian của vỏ phản ứng với ánh sáng Light beige and yellow skinned varieties only: Tuber: Anthocyanin coloration of skin in reaction to light

115

CH THÍCH:

(*) Tính trạng đƣợc sử dụng cho tất cả các giống trong mỗi vụ khảo nghiệm và luôn có trong bản mô tả giống, trừ khi trạng thái biểu hiện của tính trạng trƣớc đó hoặc điều kiện

môi trƣờng làm cho nó không biểu hiện đƣợc. (+) Đƣợc giải thích, minh họa và hƣớng dẫn theo dõi ở Phụ lục A.

mẫu đƣợc sử dụng và xử lý cho nhiều file và nhiều chỉ tiêu có thể một lần trong

SAS. Có thể sử dụng file excel để tạo file mẫu. File word mẫu gồm ba phần: (1)

nhập lệnh khai biến, (2) nhập số liệu từ excel (hoặc trực tiếp, từ các file khác) và

(3) nhập lệnh xử lý ANOVA và xếp nhóm.

Phụ lục 15: Phƣơng pháp xử lý số liệu theo chƣơng trình SAS 9.1 Bƣớc 1: Tạo file word mẫu sample : file mẫu là file thông dụng để xử lý bằng chƣơng trình SAS với các lệnh (command) ANOVA và xếp nhóm. File word

Bƣớc 2: Xử lý số liệu với SAS

- Mở chƣơng trình (ex: SAS v.8, v.9), giao diện có các phần cho xử lý thống kê nhƣ Program editor, Log, Ouput ở thanh bar phía dƣới cùng.

Chọn (click) phần Program editor.

- Copy file word mẫu và patse vào phần Program editor.

- Có thể mở trực tiếp dạng file lƣu từ .sas hoặc word .txt.

Bƣớc 3: Phân tích kết quả

- Nghiệm thức T có F Value 15,46 với Pr > F là <0,0001, các nghiệm thức khác biệt rất có nghĩa ở mức p < 0,01. - Xem xếp nhóm t grouping (t- test) ở mức p = 0,01 và các nghiệm thức đƣợc xếp bốn nhóm theo ký tự là A, B, C, D; các trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa (Means with the same letter are not significantly different). - Lƣu ý: xem Coeff Var = 15,16212 (hệ số biến thiên CV% trong bảng ANOVA) và Least Significant Difference = 3,5806 (t Tests (LSD) for NSUAT). Bƣớc 4: Ghi LSD khác iệt có nghĩa nhỏ nhất , xác suất p và CV%.

116

XỬ LÝ SỐ LIỆU theo chƣơng trình SAS 9.1 I- Xử lý số liệu phần đánh giá các dòng con lai kháng nh mốc sƣơng

CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 2

The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 19 4730.392750 248.968039 100.85 <.0001 Error 20 49.375000 2.468750 Corrected Total 39 4779.767750 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.989670 3.822236 1.571226 41.10750 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 19 4730.392750 248.968039 100.85 <.0001 CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 3 The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for N NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally has a higher Type II error rate than REGWQ. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 20 Error Mean Square 2.46875 Critical Value of Studentized Range 5.71363 Minimum Significant Difference 6.348

117

Means with the same letter are not significantly different. Tukey Grouping Mean N T A 61.250 2 V3 A B A 55.650 2 V10 B B C 53.850 2 V6 C D C 48.250 2 V5 D C D C 48.050 2 V19 D D E 47.000 2 V4 D E D E F 44.700 2 V1 D E F D E F 44.600 2 V7 D E F D G E F 42.650 2 V11 D G E F D G E F 42.500 2 V12 D G E F D G E F 42.000 2 V2 G E F G E F 41.250 2 V20 G F G H F 39.550 2 V14 G H F G H F 39.250 2 V9 G H F G H F 38.650 2 V8 G H G H 36.800 2 V15 H H 34.900 2 V13

118

CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 4 The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for N Means with the same letter are not significantly different. Tukey Grouping Mean N T I 24.600 2 V17 I I 22.900 2 V18 J 13.750 2 V16 CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 5 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 20 Error Mean Square 2.46875 Critical Value of t 2.08596 Least Significant Difference 3.2775 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 61.250 2 V3 B 55.650 2 V10 B B 53.850 2 V6 C 48.250 2 V5 C C 48.050 2 V19 C

119

D C 47.000 2 V4 D D E 44.700 2 V1 D E D E 44.600 2 V7 E F E 42.650 2 V11 F E F E G 42.500 2 V12 F E G F E G 42.000 2 V2 F G F H G 41.250 2 V20 F H G F I H G 39.550 2 V14 I H G I H G 39.250 2 V9 I H I H 38.650 2 V8 I I J 36.800 2 V15 J J 34.900 2 V13 K 24.600 2 V17 CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 6 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T K K 22.900 2 V18 L 13.750 2 V16

120

CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 7 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 20 Error Mean Square 2.46875 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Critical Range 3.278 3.440 3.544 3.616 3.669 3.710 3.742 3.767 3.787 3.803 Number of Means 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Critical Range 3.817 3.827 3.836 3.843 3.848 3.852 3.855 3.857 3.859 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N T A 61.250 2 V3 B 55.650 2 V10 B B 53.850 2 V6 C 48.250 2 V5 C D C 48.050 2 V19 D C D C 47.000 2 V4 D D E 44.700 2 V1 D E D E 44.600 2 V7 E F E 42.650 2 V11 F E F E 42.500 2 V12

121

F E F E G 42.000 2 V2 F E G F E G 41.250 2 V20 F G F H G 39.550 2 V14 F H G F H G 39.250 2 V9 H G H G 38.650 2 V8 H CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 8 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for N Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N T I H 36.800 2 V15 I I 34.900 2 V13 J 24.600 2 V17 J J 22.900 2 V18 K 13.750 2 V16 CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 9 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 20 Error Mean Square 2.46875 Critical Value of t 2.84534 Least Significant Difference 4.4707

122

Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 61.250 2 V3 B 55.650 2 V10 B B 53.850 2 V6 C 48.250 2 V5 C C 48.050 2 V19 C D C 47.000 2 V4 D C D C E 44.700 2 V1 D C E D C E 44.600 2 V7 D E D F E 42.650 2 V11 F E F E 42.500 2 V12 F E F E 42.000 2 V2 F E G F E 41.250 2 V20 G F G F 39.550 2 V14 G F G F H 39.250 2 V9 G F H G F H 38.650 2 V8 G H G H 36.800 2 V15 H H 34.900 2 V13 I 24.600 2 V17

123

CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 10 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T I I 22.900 2 V18 J 13.750 2 V16 CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 11 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 20 Error Mean Square 2.46875 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Critical Range 4.470 4.663 4.790 4.883 4.954 5.011 5.058 5.096 5.129 5.158 Number of Means 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Critical Range 5.182 5.204 5.222 5.239 5.254 5.267 5.279 5.289 5.299 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N T A 61.250 2 V3 B 55.650 2 V10 B

124

B 53.850 2 V6 C 48.250 2 V5 C C 48.050 2 V19 C D C 47.000 2 V4 D C D C E 44.700 2 V1 D C E D C E 44.600 2 V7 D E D F E 42.650 2 V11 D F E D F E 42.500 2 V12 F E F E 42.000 2 V2 F E G F E 41.250 2 V20 G F G F H 39.550 2 V14 G F H G F H 39.250 2 V9 G F H G F H 38.650 2 V8 G H CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 12 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for N Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N T G H 36.800 2 V15 H H 34.900 2 V13 I 24.600 2 V17 I I 22.900 2 V18 J 13.750 2 V16

125

KL THAN LA TB CON LAI BC 17:02 Thursday, June 2, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 37 Error Mean Square 4530.725 Critical Value of t 2.02619 Least Significant Difference 109.8 Harmonic Mean of Cell Sizes 3.085714 NOTE: Cell sizes are not equal. KL CU TB CON LAI BC (<3cm) 17:14 Thursday, June 2, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 37 Error Mean Square 12299.27 Critical Value of t 2.02619 Least Significant Difference 180.91 Harmonic Mean of Cell Sizes 3.085714 NOTE: Cell sizes are not equal. SO LUONG CU TB CON LAI BC (<3cm) 17:19 Thursday, June 2, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 37

126

Error Mean Square 4.010431 Critical Value of t 2.02619 Least Significant Difference 3.2667 Harmonic Mean of Cell Sizes 3.085714 NOTE: Cell sizes are not equal. NSSVH CON LAI BC (<3cm) 17:29 Thursday, June 2, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 37 Error Mean Square 23060.57 Critical Value of t 2.02619 Least Significant Difference 247.72 Harmonic Mean of Cell Sizes 3.085714 NOTE: Cell sizes are not equal. NSLTSVH CON LAI BC (<3cm) 17:29 Thursday, June 2, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 37 Error Mean Square 2306057 Critical Value of t 2.02619 Least Significant Difference 2477.2 Harmonic Mean of Cell Sizes 3.085714 NOTE: Cell sizes are not equal. NSLT CON LAI BC (<3cm) 17:22 Thursday, June 2, 2016 3

127

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 37 Error Mean Square 1229927 Critical Value of t 2.02619 Least Significant Difference 1809.1 Harmonic Mean of Cell Sizes 3.085714 NOTE: Cell sizes are not equal. NSTT CON LAI BC (<3cm) 17:26 Thursday, June 2, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 37 Error Mean Square 375817.9 Critical Value of t 2.02619 Least Significant Difference 1000 Harmonic Mean of Cell Sizes 3.085714 NOTE: Cell sizes are not equal.

128

Wild species S. pinnatisectum

Các đặc tính hình thái, sinh trƣởng và đặc điểm ra hoa của các con lai soma (2044/1; 2235/1, 2196/4, 2195/2) của tổ hợp lai pnt2G (+) Delikat so với các dòng/giống bố m (Delikat, S.pinnatisectum)

129

Wild species S.tarnii

Somatic hybrid 838/11

851/2

838/11

Các đặc tính hình thái, sinh trƣởng và đặc điểm ra hoa của các con lai soma (851/2; 838/11) của tổ hợp lai trn3G (+) Delikat so với các dòng/giống bố m (Delikat, S.tarnii)

130

A

B

C

F

E

D

Quy trình dung hợp và nuôi cấy các tổ hợp lai sau dung hợp

A- Dung hợp protoplast bằng xung điện; B- Các protoplast kết hợp với nhau nhờ luồng xung điện; C- Sự phân chia tạo microcallus của các tổ hợp lai trên môi trƣờng VKM II lỏng; D- Các macrocalli hình thành sau 4 tuần

nuôi cấy trên môi trƣờng Cul-medium tạo callus;E- Các callus hình thành trên môi trƣờng Cul-medium trƣớc khi chuyển sang môi trƣờng tái sinh chồi; F- Macrocallus tái sinh chồi

A

B

C

Hình 4.7. Nuôi cấy tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp

A- Các tế bào sau dung hợp bằng xung điện; B- Tế bào phân chia sau 4 tuần nuôi cấy; C- Các chồi tái

sinh từ callus của các tổ hợp lai sau dung hợp

131