vietnam medical journal n01&2 - february- 2020
204
bởi tính hiệu quả của nó, dễ sử dụng và không
gây tác hại như hóa chất (42,9% hộ gia đình
trang bị) hay nhang muỗi (19,7% trang bị nhang
muỗi), 9,5% hộ gia đình có trang bị máy
đuổi/hút muỗi. Kết quả của nghiên cứu của
Nguyễn Thị Hải Hà là 33% đối tượng sử dụng
hóa chất [2]. Tình trạng vật chưa có lăng quăng:
27,9% hộ gia đình tại thời điểm điều tra có dụng
cụ chứa nước có lăng quăng. Có thể nói trong
thời điểm mùa mưa thì tỷ lệ này là con số cần
nghiêm túc chú ý và có biện pháp xử lý, tránh
bệnh SXH có điều kiện lây lan trong cộng đồng.
V. KT LUẬN
Vãng gia không đạt mục tiêu chiến dịch
(90%). Cần tập trung vào giải pháp để hoạt
động này hiệu quả hơn như: Nâng cao hiểu biết
của lực lượng vãng gia về bệnh sốt xuất huyết,
ban chỉ đạo chiến dịch các cấp tăng cường giám
sát để nắm rõ tình hình thực hiện nhiệm vụ của
lực lượng này, kiên quyết không thanh quyết
toán đối với địa phương không hoàn thành
nhiệm vụ. Xem xét công tác tuyên truyền trên
loa-đài phát thanh, tờ rơi và cán bộ y tế vì hiệu
quả không cao như mong đợi. Nhấn mạnh khẩu
hiệu “không có lăng quăng không có SXH” khi đi
vãng gia.
TÀI LIỆU THAM KHO
1. Lê Thị Tài, Nguyễn Văn Hiến, Lê Thị Lan Anh,
Hoàng Thị Hải Vân, Vũ Minh Tuấn (2013),
Kiến thức, thực hành về bệnh SXH Dengue của
người dân tại hai xã, huyện Chư Sê, tỉnh Gia Lai
năm 2013, Tạp chí Y học dự phòng, tập XXV, số 6
(166) 2015 Số đặc biệt.
2. Nguyễn Thị Hải Hà và cộng sự (2012), Kiến
thức, thái độ, thực hành về phòng chống SXH của
người dân tại xã Minh Đạo thuộc huyện Tiên Du,
tỉnh Bắc Ninh năm 2016.
3. Ủy ban nhân dân tỉnh Bình Dương (2018), kế
hoạch tổ chức chiến dịch tổng vệ sinh môi trường
phòng chống SXH, tay chân miệng và zika năm 2018.
SỰ THAY ĐỔI PHÂN BỐ LYSYL OXIDASE TẠI TẾ BÀO NỘI MÔ
MẠCH MÁU VÕNG MẠC TRONG MÔI TRƯỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO
Nguyễn Ngân Hà1,2,3, Nguyễn Minh Phú2,
Trần Huy Thịnh1, Sayon Roy3
TÓM TẮT52
Mục tiêu: Đánh giá sự thay đổi phân bố lysyl
oxidase (LOX) tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc
trong môi trường nồng độ glucose cao và ảnh hưởng
của nó tới độ thẩm thấu của tế bào. Phương pháp
nghiên cứu: Nghiên cứu thử nghiệm. Tế bào nội mô
mạch máu võng mạc chuột được chia thành 3 nhóm
nuôi cấy trong môi trường bình thường, môi trường
nồng độ glucose cao, và môi trường nồng độ glucose
cao ủ với LOXsiRNA. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh
quang giúp xác định mật độ LOX. Kỹ thuật phân tích
độ thẩm thấu sử dụng FITC-dextran được dùng để
đánh giá độ thẩm thấu của tế bào. Kết quả: Mật độ
LOX trong protein toàn phần và chất nền ngoại bào
tăng trong môi trường glucose nồng độ cao. Bên cạnh
đó, độ thẩm thấu của tế bào tăng khi nuôi cấy trong
điều kiện nồng độ glucose cao và được điều hoà bởi
LOXsiRNA. Kết luận: Môi trường glucose nồng độ
cao gây tăng mật độ LOX tại tế bào nội mô mạch máu
võng mạc và điều hoà LOX có thể giúp ngăn ngừa
hiện tượng tăng độ thẩm thấu tế bào.
1Trường Đại học Y Hà Nội
2Bệnh viện Mắt Trung ương
3Trường Đại học Boston, Hoa Kỳ
Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Ngân Hà
Email: dr.nganha@gmail.com.
Ngày nhận bài: 9.12.2019
Ngày phản biện khoa học: 13.01.2020
Ngày duyệt bài: 21.01.2020
Từ khoá:
Lysyl oxidase, tế bào nội mô mạch máu
võng mạc, độ thẩm thấu tế bào.
SUMMARY
CHANGES OF LYSYL OXIDASE
DISTRIBUTION IN RETINAL ENDOTHELIAL
CELLS UNDER HIGH GLUCOSE CONDITION
Purpose: Evaluate the changes of lysyl oxidase
(LOX) distribution and its effect on cell permeability in
retinal endothelial cells under high glucose conditon.
Methods: Experimental research. Rat retinal
endothelial cells were grown in normal, high glucose
medium, and high glucose medium with LOXsiRNA.
Immunostatining was performed to detemine LOX
density in 3 groups. The in vitro permeability assay
using FITC-dextran was performed to assess cell
permeability. Results: LOX density in total protein
and extracellular protein increased under high glucose
condition. Cell permeability increased significantly in
cells grown under high glucose condition and was
regulated by LOXsiRNA. Conclusion: High glucose
promotes LOX overexpression in total protein and
extracellular protein. Moreover, blockage of LOX
expression helps reduce cell permeability.
Keywords:
Lysyl oxidase, retinal endothelial cells,
cell permeability.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cơ chế sinh bệnh của bệnh lý vi mạch do đái
tháo đường nói chung và bệnh lý võng mạc đái
tháo đường nói riêng, bị ảnh hưởng bởi sự thay
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 487 - THÁNG 2 - SỐ 1&2 - 2020
205
đổi về chất lượng và số lượng các thành phần
màng đáy mạch máu [1]. Sự ổn định về hình
thái và chức năng của màng đáy phụ thuộc vào
các liên kết chéo giữa các bó sợi collagen mà
quá trình hình thành được xúc tác bởi LOX [2].
LOX là một enzym xúc tác quá trình oxy hoá
khử peptidyl và hydroxylysin dư thừa tạo nên các
sợi collagen và elastin không hoà tan hình thành
nên màng đáy hoàn chỉnh [2]. Nhiều nghiên cứu
đã chỉ ra vai trò quan trọng của liên kết chéo
qua trung gian LOX đối với tính toàn vẹn và chức
năng của mô, đặc biệt là mô mạch máu và mô
liên kết [2, 5]. Cùng nằm trong nhóm bệnh có
tổn thương màng đáy mạch máu nhưng hiểu biết
về vai trò của LOX trong bệnh võng mạc đái tháo
đường còn chưa rõ ràng. Do đó, trong nghiên
cứu này, chúng tôi đánh giá sự thay đổi phân bố
LOX tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong
môi trường nồng độ glucose cao và ảnh hưởng
của nó tới độ thẩm thấu của tế bào.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đi tưng nghiên cứu:
- Nhóm nghiên cứu: Nhóm các tế bào nội mô
mạch máu võng mạc chuột nuôi cấy trong môi
trường glucose nồng độ cao và nhóm các tế bào
nội mô mạch máu võng mạc chuột nuôi cấy
trong môi trường glucose nồng độ cao ủ với
LOXsiRNA.
- Nhóm đối chứng: Các tế bào nội mô mạch
máu võng mạc chuột nuôi cấy trong môi trường
nồng độ glucose bình thường.
2.3. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thử
nghiệm. Mỗi thử nghiệm được lặp lại 6 lần.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Nuôi cấy tế bào.
Các tế bào nội mô
mạch máu võng mạc chuột được nuôi cấy trên
các lam kính trong 1 đĩa tế bào ở môi trường
nồng độ glucose bình thường (N, 5mM glucose)
và 2 đĩa tế bào ở môi trường nồng độ glucose
cao (HG, 30mM glucose). Sau 7 ngày, 1 đĩa tế
bào có nồng độ glucose cao được ủ với 33nM
LOX siRNA trong 24 giờ (Santa Cruz
Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).
2.4.2. Phân lập chất nền ngoại bào bằng
Amonium Hydroxide (NH4OH).
Sau khi nuôi cấy
trong môi trường bình thường hoặc môi trường
glucose nồng độ cao trong 7 ngày, mỗi đĩa tế
bào được bơm 1ml NH4OH 20 mM và đặt ở nhiệt
độ phòng. Sau 5 phút, tế bào tách khỏi đĩa đươc
rửa sạch bằng dH2O. Đĩa tế bào chỉ còn chứa
chất nền ngoại bào được rửa lại bằng dH2O
trong 4 lần.
2.4.3. Nhuộm miễn dịch huỳnh quang.
Các
lam kính chứa tế bào hoặc chất nền ngoại bào
được nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng
thể nguyên phát là kháng thể kháng LOX dòng
chuột (1:50, Catalog No. 373995, Santa Cruz,
Dallas, Texas, Hoa Kỳ) và kháng thể thứ phát là
kháng thể kháng chuột. Sinh hiển vi điện tử
được dùng để chụp lại những hình ảnh nhuộm.
Sự khác biệt về mật độ phân bố LOX của 3 nhóm
được phân tích bằng phần mềm ImageJ (Wayne
Rasband, National Institutes of Health, Bethesda,
MD, Hoa Kỳ).
2.4.4. Xác định độ thẩm thấu tế bào
. Sau khi
7 ngày nuôi cấy và ủ với LOXsiRNA, dung dịch
nuôi cấy được thay thế bởi 600 μl FITC-dextran
0.5 mg/ml trong 1 giờ. Tiếp đó, 200 μl dung dịch
FITC-dextran từ 3 nhóm được bơm vào các khay
đưa vào máy phân tích độ thẩm thấu tế bào
(SpectraMax Gemini Vmax, Molecular Devices,
SunnySunnyvale, CA).
2.5. Xl sliu. Tất cả các số liệu được
tính theo giá trị trung bình. Các giá trị của nhóm
đối chứng được coi là 100% và giá trị của các
nhóm glucose nồng độ cao được tính theo phần
trăm của nhóm đối chứng. So sánh giữa các
nhóm sử dụng thuật toán 1-way ANOVA theo
kiểm định Bonferroni. Mức p < 0.05 được coi là
có ý nghĩa thống kê.
III. KT QU NGHIÊN CỨU
3.1. Sự phân b LOX trong protein ton
phần. Phân tích hình ảnh thu được qua kỹ thuật
nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy mật độ
LOX tại các tế bào được nuôi cấy trong môi
trường nồng độ glucose cao tăng đáng kể so với
nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình
thường (179 ± 7% nhóm đối chứng, p<0.05,
n=6). Thêm vào đó, khi các tế bào nuôi cấy
trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ
với LOXsiRNA, mật độ LOX trở về gần mức bình
thường (114 ± 6% nhóm đối chứng, p<0.05,
n=6) (Hình 1).
Hình 1. Sự thay đổi phân b LOX trong
protein ton phần.
N: môi trường bình thường.
HG: môi trường nồng độ glucose cao,
HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao
ủ với LOXsiRNA.
vietnam medical journal n01&2 - february- 2020
206
3.2. Sự phân b LOX trong chất nền
ngoại bo
Kết quả phân tích qua phần mềm ImageJ cho
thấy mật độ LOX tăng rõ rệt tại chất nền ngoại
bào của các tế bào nuôi cấy trong môi trường
nồng độ glucose cao (160 ± 7% nhóm đối
chứng, p<0.05, n=6). Bên cạnh đó, khi các tế
bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ
cao được ủ với LOXsiRNA, mật độ LOX tại chất
nền ngoại bào trở về gần mức bình thường (110
± 6% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Hình 2).
Hình 2. Sự thay đổi phân b LOX tại chất
nền ngoại bo.
N: môi trường bình thường. HG: môi trường
nồng độ glucose cao, HG+LOXsiRNA: môi trường
nồng độ glucose cao ủ với LOX siRNA.
3. Tác động của sự thay đổi phân b
lysyl oxidase tới độ thẩm thấu tế bo
Qua phân tích độ thẩm thấu tế bào cho thấy
độ thẩm thấu tế bào tăng mạnh khi tế bào được
nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao
(299±18% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) và
chỉ số này trở lại gần mức bình thường khi môi
trường glucose nồng độ cao được ủ với
LOXsiRNA, chất ức chế LOX (114± 8% nhóm đối
chứng, p<0.05, n=6) (Hình 3).
Hình 3. Tác động của sự thay đổi phân
b LOX tới độ thẩm thấu của tế bo nội mô
mạch máu võng mạc.
N: môi trường bình thường. HG: môi trường
nồng độ glucose cao, HG+LOXsiRNA: môi trường
nồng độ glucose cao ủ với LOX siRNA.
IV. BÀN LUẬN
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy
môi trường glucose cao gây tăng mật độ LOX
trong protein toàn phần và chất nền ngoại bào.
Thêm vào đó, khi tế bào nuôi cấy trong môi
trường glucose nồng độ cao được ủ LOXsiRNA,
mật độ LOX giảm về gần mức bình thường. Bên
cạnh đó, độ thẩm thấu của tế bào tăng rõ rệt khi
tế bào được nuôi cấy ở môi trường glucose nồng
độ cao và được điều chỉnh khi môi trường này
được ủ thêm LOXsiRNA. Điều này chỉ ra sự phân
bố LOX có tác động tới độ thẩm thấu của tế bào.
Các nghiên cứu cho thấy tăng mật độ LOX
dẫn đến dư thừa các liên kết chéo phụ thuộc
LOX gây tích lũy chất nền ngoại bào [2, 5]. Mặc
dù mâu thuẫn nhưng nghiên cứu của Pazek và
cộng sự đã chỉ ra rằng sự gia tăng độ cứng của
chất nền ngoại bào có thể gây tăng cường vận
chuyển qua chất nền ngoại bào bằng cách thay
đổi phức hợp tín hiệu thụ thể bề mặt tế bào [4].
Nghiên cứu của Lucero, Rodriguez và Nishioka
cũng cho thấy rằng tính toàn vẹn của màng đáy
và cấu trúc chất nền ngoại bào đòi hỏi lượng
thích hợp liên kết chéo phụ thuộc LOX [2, 3, 5].
Tuy nhiên cơ chế glucose nồng độ cao gây tăng
mật độ LOX còn chưa rõ ràng, do đó những
nghiên cứu tiếp theo nhằm làm rõ hơn vai trò
của LOX trong cơ chế sinh bệnh võng mạc đái
tháo đường.
V. KT LUẬN
Môi trường glucose nồng độ cao gây tăng mật
độ LOX tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc.
Bên cạnh đó, LOXsiRNA gây giảm mật độ LOX
qua đó ngăn ngừa hiện tượng tăng độ thẩm thấu
tế bào. Những phát hiện này giúp làm sáng tỏ
hơn cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường,
từ đó mở ra các hướng nghiên cứu mới giúp dự
phòng và điều trị bệnh lý này.
TÀI LIỆU THAM KHO
1. Effie Tsilibary, Microvascular basement
membranes in diabetes mellitus. The Journal of
Pathology: A Journal of the Pathological Society of
Great Britain and Ireland, 2003. 200(4): p. 537-546.
2. Lucero HA and Kagan HM, Lysyl oxidase: an
oxidative enzyme and effector of cell function.
Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 2006.
63(19-20): p. 2304-2316.
3. Nishioka Takeshi, Eustace Amanda, and
Westest Catharine, Lysyl oxidase: from basic
science to future cancer treatment. Cell structure
and function, 2012. 37(1): p. 75-80.
4. Paszek Matthew, Zahir Nastaran, Johnson
Kandice, et al., Tensional homeostasis and the
malignant phenotype. Cancer cell, 2005. 8(3): p.
241-254.
5. Rodríguez Cristina, Rodríguez-Sinovas
Antonio, and Martínez-González JoseJose, Lysyl
oxidase as a potential therapeutic target. Drug
news & perspectives, 2008. 21(4): p. 218-224.