TNU Journal of Science and Technology
230(01): 217 - 224
http://jst.tnu.edu.vn 217 Email: jst@tnu.edu.vn
CONSTRUCTION OF A EXPRESSION VECTOR CONTAINING THE GmAP2
GENE FROM SOYBEAN [Glycine max (L.) Merr.]
Nguyen Thu Giang1, Vitchonneny Leuangvanh2, Nguyen Thi Hai Yen2, Nguyen Huu Quan3,
Nguyen Thi Ngoc Lan3, Vu Thi Thu Thuy3, Chu Hoang Mau3*
1TNU- University of Medicine and Pharmacy, 2TNU - University of Sciences
3TNU - University of Education
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received:
26/8/2024
Soybean is a drought and salinity-sensitive crop, so to increase soybean yield, it is
necessary to research and develop drought and salinity-tolerant cultivars. One
solution of interest is to overexpress key genes involved in synthesising drought/salt
tolerance proteins. AP2 is a large protein family of plant-specific transcription factors,
and some AP2 genes are inducible to abiotic stress and increase expression under
dehydration and high salinity conditions. Therefore, the gene encoding a protein
belonging to the AP2 transcription factor family was chosen as the target to determine
gene function and propose potential candidate genes in the strategy to improve
drought and salinity tolerance of soybeans. This paper reports the results of designing
an expression vector carrying the GmAP2 gene structure and expressing them in
tobacco plants. The result is an expression vector (pFGC_GmRAP2-4_syn) carrying
the soybean GmRAP2-4 gene that was successfully designed. The designed
GmRAP2-4_syn gene has a length of 1015 nucleotides encoding 311 amino acids,
including the amino acid coding region, the cmyc antigen coding sequence and
KDEL. In addition, at both ends of the gene, there is a segment containing the cutting
sites of the restriction enzymes AscI and BamHI. The pFGC_GmRAP2-4_syn
construct was successfully transformed into tobacco plants and 35 GmRAP2-4_syn
transgenic tobacco lines were obtained. Random testing of 3 transgenic tobacco lines
gave positive PCR results with specific primer pairs.
Revised:
17/10/2024
Published:
18/10/2024
KEYWORDS
AP2
Expression vector
Glycine max (L.) Merr
Gene Transfer
Vector construction
THIT K VECTOR BIU HIN MANG GENE GmAP2 T CÂY ĐẬU TƯƠNG
[Glycine max (L.) Merr.]
Nguyn Thu Giang1, Vitchonneny Leuangvanh2, Nguyn Th Hi Yến2, Nguyn Hu Quân3,
Nguyn Th Ngc Lan3, Vũ Thị Thu Thy3, Chu Hong Mu3*
1Trưng Đi hc Y c - ĐH Thái Nguyên, 2Trưng Đi hc Khoa hc - ĐH Thái Nguyên
3Trưng Đi hc Sư phm - ĐH Thi Nguyên
TÓM TT
Ngày nhn bài:
26/8/2024
Đậu tương là loi cây trng nhy cm vi hn mn, do vy đ tăng cưng năng
sut đậu tương cn nghiên cu pht trin cc ging c kh năng chu hn và mn.
Mt gii php đưc quan tâm là biu hin mnh cc gene cha kha liên quan đn
tng hp protein khng hn/mn. AP2 mt h protein ln gm các nhân t
phiên đặc trưng thc vt, mt s gene AP2 cm ng vi stress phi sinh hc
tăng cưng biu hin trong điều kin mt nước đ mn cao. Chnh v vy,
gene mã ha protein thuc h nhân t phiên mã AP2 đưc la chn làm gene mc
tiêu xc đnh chức năng đ xut gene ng c viên tiềm năng trong chin lưc
ci thin kh năng khng hạn mn của cây đậu tương. i bo này công b kt
qu thit k vector biu hin mang cu trc gen GmAP2 và biu hin chng trong
cây thuc l. Kt qu thu đưc vector biu hin (pFGC_GmRAP2-4_syn) mang
gene GmRAP2-4 của đậu ơng đã đưc thit k thành công. Gene GmRAP2-
4_syn thit k có kch thước 1015 nucleotide mã hoá 311 amino acid gm vùng mã
hoá amino acid, trình t mã hoá kháng nguyên cmyc và KDEL. Ngoài ra hai đu
của gene c đoạn cha v trí ct ca enzyme gii hn AscI BamHI. Cu trúc
pFGC_GmRAP2-4_syn đã đưc bin np thành công vào cây thuc l thu đưc
35 dòng cây thuc chuyn gene GmRAP2-4_syn. Kim tra ngu nhiên 3 dòng
cây thuc lá chuyn gene đều cho kt qu PCR dương tnh với cp mồi đặc hiu.
Ngày hoàn thin:
17/10/2024
Ngy đăng:
18/10/2024
DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.10997
* Corresponding author. Email: chuhoangmau@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 217 - 224
http://jst.tnu.edu.vn 218 Email: jst@tnu.edu.vn
1. Gii thiu
Hin nay, vi s bin đi khí hu toàn cu ngày mt gia tăng, cc vùng đt canhc tr nên khô
hn, mn và nghèo nàn dinh dưỡng. Đ đm bo an toàn bn vng cho cây trng vn đề không
d gii quyt, n đòi hỏi phi chin lưc đng đắn dài lâu trên toàn cu. Vic tìm kim các
ging cây trng có kh năng tồn tại dưới tc đng ca các yu t bt li khác nhau ph thuc phn
ln vào vic bo v và phát trin nhng ging hin có. Trong s ccy trng ch lc trên th gii,
đậu tương là cây trồng c gi tr kinh t và cây ci tạo đt, tuy nhiên li là cây trng đưc xp vào
nhm mn cm vi hn và mn [1], [2], do đ đ pht trin cc ging đậu tương năng sut cao cn
ch khc phục đặc đim này.
H gene hoá nhân t phiên mã AP2/ERF thuc nhm gene điều hòa, là mt nhóm ln các
nhân t phiên thc vật, như AP2 (APETALA 2), RAV (RelatedtoABI3/VP1), ERF
(Ethylene-responsive element binding factor) DREB (Dehydration responsive element
binding) [3]. Phân h AP2 bao gm các gene hóa các nhân t phiên miền AP2 đặc
trưng ln đu tiên đưc tìm thy Arabidopsis (APETALA 2) kh năng phản ứng đi vi
các tín hiu stress phi sinh hc t ngoi cnh. Mt s nghiên cứu đã xc đnh s ng gene thuc
phân h AP2 của đậu tương từ s d liu NCBI vi các dng ph bin ca min AP2 [4].
Nhân t phiên thuc h AP2 cha yu t c tc đng trans liên kt vi trình t cis ca
promoter đ kích hot s biu hin ca các gene mc tiêu phía h lưu (downstream) khi c tn
hiu stress thc vt [5]. Các gene thuc phân h AP2 cha min chức năng AP2 nhân t
phiên ha hn nhiu ng dng trong vic ci thin tính kháng hn mn ca thc vt bng
k thut chuyn gene.
Gene GmRAP2-4 trong h gene đậu tương nằm trên nhiễm sắc th s 13, hoá protein -
nhân t phn mã, c k hiu gene LOC100802961, đưc mô tả là gene mã ho ethylene-responsive
transcription factor RAP2-4 đưc vào locus GLYMA_13G088100v4 [6], [7]. Gene GmRAP2-4
thuc nhm genne chưa rõ chức năng, nhưng đưc dự đon là điều hoà cc gene mà sản phẩm liên
quan trực tip đn khả năng khng hạn, khng mặn của cây đậu tương [8]. Xut pht từ mục đch
nghn cứu chức ng gen thuc phân họ AP2 của cây đậu tương, chng tôi tin nh thit k
vector biu hin mang gene GmRAP2-4 từ cây đậu tương [Glycine max (L.) Merr.] và kim chứng
gene chuyn GmRAP2-4 hin din trên cây hnh thuc l K326. Kt quả nghiên cứu gp phn
làm tiền đề cho vic ứng dụng kỹ thuật chuyn gene trong cải thin khả năng chng chu cc yu t
bt li của ngoại cảnh trong thực tiễn chọn ging y trồng Vit Nam.
2. Vt liu v phương pháp nghiên cứu
2.1. Vt liu
Vt liu thc vt
Ht thuc lá K326 (Nicotinana tabacum K326) do Phòng Công ngh T bào Thc vt, Vin
Công ngh sinh hc cung cp. Ht thuc đưc kh trùng, ny mm, hình thành cây trong môi
trưng nuôi cy in vitro đưc lưu giữ trong phòng cây. thuc l đưc s dng làm
nguyên liu tip nhận gene trong kĩ thuật bin np di truyn.
Vector v chng vi khun
Vector tch dòng pTWIST, vector biu hin pFGC5941 cha promoter 35S, vi khun E.coli,
Agrobacterium tumefaciens AGL1 đưc s dng trong nghiên cu do Phòng Công ngh t bào
thc vt, Vin Công ngh Sinh hc, Vin Hàn lâm Khoa hc và Công ngh Vit Nam cung cp.
Cp mi PCR s dng trong nghiên cu
thuật PCR đưc s dụng đ phân tích s mt ca gene chuyn GmRAP2-4_syn trong
khun lc E. coli, A. tumefaciens và cây thuc lá chuyn gene, trnh t c th như sau:
GmRAP2-4_F 3’-TCAGAGGAGAACTCATGGAAG-5’
MYC-KDEL_R 3’-TCACAGCTCGTCCTTCAGATCC-5’
BAR3-F 3’-CAGCAGGTGGGTGTAGAGCG-5’
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 217 - 224
http://jst.tnu.edu.vn 219 Email: jst@tnu.edu.vn
BAR1-R 3’-TACCATGAGCCCAGAACGACGCCC-5’
2.2. Phương pháp
Các thí nghim trong nghiên cứu này đưc tin hành theo sơ đồ hình 1.
Hình 1. Sơ đồ tiến hành cc thí nghiệm thiết kế vector và biến np di truyền
2.2.1. Thiết kế vector biu hin gene to dòng A. tumefaciens mang vector biu hin cha
gene GmRAP2-4_syn
Tng hp gene GmRAP2-4: Phân tích thông tin ca gene RAP2-4 của đậu tương trên
GenBank, chn vùng mã hóa, thêm các trình t chứa đim ct ca enzyme gii hn và trình t mã
ha khng nguyên, sau đ đem tng hp ti công ty TWIST.
To vector biu hin gene GmRAP2-4_syn được tiến hành theo cc bưc: (1) Nhân dòng
vector ptwist_GmRAP2-4_syn trong E.coli; (2) M vòng vector pFGC5941 và ptwist_GmRAP2-
4_syn thu đoạn gene GmRAP2 bng AscI và BamHI (thành phn phn ng ct: Buffer 10x 3 µL;
AscI (10 u) 1 µL; BamHI (10 u) 1 µL; Plasmid 1 µg; H2O 30 µL); (3) Ni gene chuyn GmRAP2-
4_syn vào vector biu hin pFGC5941 bng T4 ligase to vector biu hin pFGC_ GmRAP2-
4_syn. Kim tra vector bng cp enzyme gii hn AscI/BamHI (Thành phn phn ng ni: T4
buffer 2 µL; T4 ligase 1 µL; pFGC5941 30 ng; GmRAP2-4_syn 10 ng; H2O 20 µL); (4) Nhân
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 217 - 224
http://jst.tnu.edu.vn 220 Email: jst@tnu.edu.vn
dòng vector pFGC_ GmRAP2-4_syn trong E.coli, tách plasmid tái t hp pFGC_GmRAP2-4.
Kim tra plasmid tái t hp pFGC_ GmRAP2-4 bng colony-PCR với căp mồi GmRAP2-
4_F/MYC-KDEL_R. (Thành phn phn ng: Master mix 2X 7,5 μL; Primer F (10 pM) 0,5 μL;
Primer R (10 pM) 0,5 μL; H2O 15 μL; Chu k nhit: 94°C trong 3 phút; lp li 27 chu k vi
94°C trong 30 giây, 55°C 30 giây 72°C 1 phút. Kt thúc 72°C 5 phút); (5) Kim tra
vector biu hin bng gii trình t đoạn gene GmRAP2-4_syn trong vector pFGC_ GmRAP2-
4_syn vi mi MYC-KDEL_R; (6) Bin np vector pFGC_ GmRAP2-4_syn vào A. tumefaciens
AGL1, to dòng A. tumefaciens mang vector biu hin cha gene GmRAP2-4_syn. Clony-PCR
kim tra khun lc A. tumefaciens AGL1 bng colony-PCR vi mi GmRAP2-4_F/MYC-
KDEL_R.
D liu gene GmRAP2-4_syn đưc phân tích bng phn mm tin sinh hc.
2.2.2. Phương php biến np gene GmRAP2-4_syn thuc to cây chuyn gene
thông qua A. tumefaciens
Kĩ thuật bin np vector cha cu trúc mang gene GmRAP2-4_syn vào thuc lá qua trung gian
A. tumefaciens đưc thc hin theo Topping (1998) [9] theo sơ đồ hình 2.
Hình 2. Sơ đồ thí nghiệm biến np gene chuyển GmRAP2-4_syn vào mô l thuốc l và to cây thuốc l
chuyển gene
Phân tích s có mt ca gene chuyn GmRAP2-4_syn bng k thut PCR.
3. Kết qu và tho lun
3.1. To vector biu hin pFCG_GmRAP2-4_syn v vi khun A. tumefaciens tái t hp
Gene GmRAP2-4_syn đưc thit k da trên thông tin gene RAP2-4 của đậu tương mang mã
s XM_003542406.5 trên GenBank. Gene RAP2-4 của đậu tương c 936 nucleotide ha 311
amino acid. Đ to gene chuyn GmRAP2-4_syn, đu 5’ của gene đã đưc b sung 19
nucleotide (ACCCCGGGTgggcgcgccc) cha v trí ct ca enzyme AscI đu 3’ thêm 18
nucleotide (ggatcctagggCGAGCTCGAA) cha v trí ct ca enzyme BamHI. Thêm mt đoạn
trình t khoảng 30 nucleotide ha đuôi cmyc
(GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG) 12 nucleotide hóa KDEL
(AAGGACGAGCTG). Như vy, gene chuyn GmRAP2-4_syn đưc thit k c kch thước 1015
nucleotide (Hnh 3). Gene GmRAP2-4_syn đưc tng hp gn trong vector tách dòng pTwist
(pTwist_GmRAP2-4_syn).
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 217 - 224
http://jst.tnu.edu.vn 221 Email: jst@tnu.edu.vn
To cu trúc vector mang cha gene GmRAP2-4_syn: Tin hành nhân dòng vector
pTwist_GmRAP2-4_syn trong E.coli chn dòng khun lc mang vector tái t hp bng
colony-PCR vi cp mi GmRAP2-4_F/MYC-KDEL_R. Kt qu phân tích colony-PCR hình
4A thu đưc đoạn DNA c kch thước khoảng 1 kb đng với kch thưc ca gene chuyn
GmRAP2-4_syn. Kt qu nh 4B thu đưc đoạn DNA khoảng 300 bp tương ng vi kích
thước ca trình t Bar trong vector. Như vậy, vector tách dòng pTwist_GmRAP2-4_syn đã đưc
xâm nhập và đưc khuch đại trong E.coli.
Hình 3. Trình tự nucleotide của gene chuyển GmRAP2-4_syn chứa điểm cắt của enzyme gii hn AscI và
BamHI; trình tự mã ho cmyc và KDEL
Plassmid pTwist_GmRAP2-4_syn đưc tách chit tinh sch. S dng cp enzyme
AscI/BamHI trong thí nghim m vòng vector pTwist_GmRAP2-4_syn v trí ct ca enzyme
như đã thit k kt qu thu đưc trình t gene GmRAP2-4_syn. Tip tc vi thí nghim ct
vector pFGC5941 bng hai enzyme AscI BamHI đ loi b đoạn “CHSA intron” ni trình
t gene GmRAP2-4_syn vào vector pFGC5941 vi s tham gia ca enzyme T4 ligase to thành
vector biu hin pFGC_GmRAP2-4_syn (Hình 5).
Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm colony_PCR khuếch đi trình tự gene GmRAP2-4_syn (A) và trình tự
đon Bar (B). M: thang DNA; 1, 2, 3: Cc dòng E.coli biến np; (-): Đối chứng âm: E.coli không biến np