Thực tập tốt ngiệp "Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp" được nghiên cứu với mục đích: Thực tập quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật QF-PCR, hiểu và phân tích kết quả QF-PCR sau khi tiến hành điện di mao quản, đánh giá độ chính xác của kỹ thuật QF-PCR. Để hiểu rõ hơn về đề tài này mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.
Mở đầu
Thực tập Tốt nghiệp
Một đứa con sinh ra khỏe mạnh, thông minh, hoàn thiện về mặt tinh thần và thể
chất là điều ao ước của biết bao bà mẹ. Tuy nhiên, không phải tất cả những đứa trẻ
sinh ra đều được bình thường, có những đứa trẻ sinh ra đã bị dị tật, dị dạng khiến
chúng không thể sống sót khi được sinh ra hoặc có thể sống nhưng lại trở thành gánh
nặng cho gia đình và xã hội. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ dị
tật bẩm sinh trên thế giới chiếm 1,73%. Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy
tỷ lệ dị tật bẩm sinh là 1,5 – 3%, trong đó 20 – 40% nguyên nhân là do các rối loạn
nhiễm sắc thể. Các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp ở trẻ sinh ra sống phần lớn có
liên quan đến các nhiễm sắc thể 21, 18, 13 và nhiễm sắc thể giới tính. Đây cũng là
nguyên nhân của một số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể thường gặp như hội
chứng Down, hội chứng Edwards, hội chứng Patau và một số hội chứng bất thường
của nhiễm sắc thể giới tính như Klinefelter, Turner. Vì vậy, chẩn đoán trước sinh đóng
vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm các dị tật bẩm sinh để có thể can thiệp ở
giai đoạn bào thai nhằm giảm tỉ lệ trẻ sơ sinh mắc các rối loạn di truyền.
Với sự tiến bộ của y học, nhiều kỹ thuật chẩn đoán trước sinh đã ra đời. Từ
năm 1966, kỹ thuật nuôi cấy tế bào và phân tích nhiễm sắc thể đồ (karyotype), gọi tắt
là karyotyping, ra đời và được đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong lĩnh vực chẩn đoán
trước sinh. Tuy nhiên, kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số hạn chế như thời gian thực
hiện dài (14 – 21 ngày), thao tác phức tạp, tốn nhiều công lao động. Do đó, nhu cầu
xuất hiện các kỹ thuật khác nhanh hơn và giúp giảm đáng kể thời gian lo lắng cho các
bậc cha mẹ là cần thiết. Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (Fluorescence In Situ
Hybridization – FISH) đã được giới thiệu với độ nhạy cao và thời gian trả kết quả
ngắn hơn đáng kể. Ngay sau đó, một kỹ thuật mới khác đã ra đời, kết hợp các đặc tính
của PCR và đánh dấu huỳnh quang được gọi là kỹ thuật QF-PCR (Quantitative
Fluorescence Polymerase Chain Reaction). Kỹ thuật QF-PCR có nhiều ưu điểm vượt
trội hơn FISH là có thể tự động hóa cùng lúc nhiều mẫu, chi phí thấp hơn và tốn ít
1
nhân công lao động hơn. Từ năm 1993, kỹ thuật QF-PCR được chứng minh có thể áp
Mở đầu
Thực tập Tốt nghiệp
dụng vào chẩn đoán một số rối loạn số lượng nhiễm sắc thể thường gặp nên đã được
áp dụng tại nhiều nước trên thế giới.
Hiện nay ở Việt Nam, tại một số bệnh viện lớn như bệnh viện Từ Dũ, bệnh
viện Hùng Vương và bệnh viện Phụ sản Trung ương đã triển khai áp dụng kỹ thuật
QF-PCR vào chẩn đoán trước sinh. Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học của bệnh viện
Từ Dũ được đánh giá là đơn vị đi đầu cả nước về di truyền người và chẩn đoán trước
sinh, đã ứng dụng thành công các kỹ thuật di truyền phân tử để chẩn đoán các dị tật
bẩm sinh trong đó phải kể đến kỹ thuật QF-PCR. Do đó, trong hai tháng tại khoa Xét
nghiệm Di truyền Y học của bệnh viện Từ Dũ, chúng tôi đã thực hiện đề tài thực tập:
“Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh các rối loạn nhiễm sắc thể
thường gặp” với các mục tiêu như sau:
1. Thực tập quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật QF-PCR.
2. Hiểu và phân tích kết quả QF-PCR sau khi tiến hành điện di mao quản.
2
3. Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật QF-PCR.
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
1.1. GIỚI THIỆU SƠ NÉT VỀ CÁC RỐI LOẠN NHIỄM SẮC THỂ
THƢỜNG GẶP
Bộ nhiễm sắc thể (NST) của người bình thường bao gồm 22 cặp NST thường
và 1 cặp NST giới tính, XX ở người nữ và XY ở người nam. Công thức NST hay còn
gọi là NST đồ (karyotype) được viết dưới dạng: 46,XX hoặc 46,XY. Bất kỳ một thay
đổi nào có liên quan đến số lượng hoặc cấu trúc NST so với công thức NST chuẩn
được gọi là rối loạn NST. Rối loạn NST là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến thai dưới ba
tháng bị chết lưu. Rối loạn NST có thể là do di truyền từ bố mẹ, hoặc đột biến trong
quá trình tạo noãn, tạo tinh trùng, thụ tinh và phát triển của phôi. Nhiều nghiên cứu
cũng cho thấy tỷ lệ rối loạn NST tăng lên rõ rệt theo tuổi của người mẹ.
Lệch bội, sự mất đi hoặc tăng thêm một hoặc một vài NST là nguyên nhân phổ
biến của rối loạn NST ở người. Một NST thêm vào gọi là “tam nhiễm sắc thể”
(trisomy) là nhóm chiếm nhiều nhất trong các bất thường NST (chiếm khoảng 90%)
và là một trong những nguyên nhân quan trọng của dị dạng bẩm sinh cũng như chậm
phát triển tâm thần vận động. Trisomy của NST 13 (hội chứng Patau), 18 (hội chứng
Edwards), và 21 (hội chứng Down) là một mối quan tâm lớn trong chẩn đoán trước
sinh bởi vì chúng là ba NST thường được tìm thấy với tần số cao ở các bất thường của
các ca sinh sống [26], [27]. Ngoài ra, sự không phân tách của các nhiễm sắc thể giới
tính trong quá trình giảm phân ở người gây ra một số nhiễm sắc thể bất thường như:
XO (hội chứng Turner), XXY (hội chứng Klinefelter),…Sự không phân tách cũng có
thể xảy ra trong nguyên phân gây ra các thể khảm ở các tế bào bình thường và lệch
bội.
1.1.1. Hội chứng Down
Hội chứng (HC) Down lần đầu tiên được mô tả bởi bác sĩ Iohn Langdon Down
vào năm 1887. Đến năm 1959, nguyên nhân về mặt di truyền của HC Down đã được
phát hiện là do thừa một NST số 21 trong bộ NST nên còn được gọi là trisomy 21. HC
Down chiếm tỷ lệ 1/700 – 1/800 ở trẻ sơ sinh còn sống và tỷ lệ này tương tự giống
3
nhau ở các nước và các chủng tộc khác nhau trên thế giới [33].
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
Trẻ mắc HC Down thường có biểu hiện lâm sàng: cơ thể thấp bé, đầu bé, chẩm
dẹt, lỗ mũi rộng, lưỡi dày có xu thế thò ra ngoài, vành tai biến dạng, ngón tay ngắn
biến dạng, đường vân tay thay đổi rõ rệt, nhược cơ, tăng động khớp và chậm phát triển
trí tuệ [1]. Bên cạnh đó, trẻ mắc HC Down thường kèm theo dị tật ở tim, dị tật tiêu
hóa,…Khoảng 15 – 20% trẻ mắc HC Down chết sớm do bệnh tim bẩm sinh, một số ít
có thể sống đến 50 – 60 tuổi nếu không kèm theo các dị tật nguy hiểm.
Hình 1.1. Karyotype và hình ảnh của trẻ mắc HC Down.
(Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ, [9])
Nguyên nhân chính xác gây ra tình trạng rối loạn này vẫn chưa được xác định
cụ thể ở từng người. Tuy nhiên, thống kê thấy rằng phụ nữ từ 35 tuổi trở lên có nguy
cơ sinh con bị HC Down tăng lên rõ rệt thể hiện ở hình 1.2. Ở phụ nữ 30 tuổi nguy cơ
sinh con mắc HC Down là 0,2% nhưng tăng lên 0,8% ở tuổi 40 và 3,6% ở tuổi 45.
4
Hình 1.2. Đồ thị biểu diễn mối liên hệ giữa tuổi mẹ và HC Down [24].
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
1.1.2. Hội chứng Edwards
HC Edwards được bác sĩ John Hilton Edwards mô tả lần đầu vào tháng 4/1960
trên tạp chí y học Lancet. HC Edwards xảy ra khi bệnh nhân bị thừa một NST số 18
nên còn gọi là trisomy 18, đây là trisomy phổ biến đứng hàng thứ hai sau HC Down
với tỉ lệ khoảng 1/3.000 trẻ sơ sinh [11].
Trẻ mắc HC Edwards thường có các đặc điểm kiểu hình như: đầu nhỏ, cằm
nhọn, trán hẹp, tai thấp, tay bất thường, ngón tay co quắp, chân khoèo,…và 90% trẻ
có dị tật tim đi kèm [2]. HC Edwards thường gây chết thai hoặc tử vong sớm sau sinh.
Khoảng 80% trẻ bị HC Edwards chết trong tuần đầu tiên sau sinh. Một số ít có thể
sống hơn một tháng. Khoảng 5 - 10% có thể sống hơn một năm tuổi [3].
Hình 1.3. Karyotype và hình ảnh tay bất thường của trẻ mắc HC Edwards.
(Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ, [9])
Nguyên nhân chủ yếu của HC này là do trong quá trình phát sinh giao tử ở bố
hoặc mẹ cặp NST 18 không phân ly tạo ra các tinh trùng hoặc trứng thừa một NST 18.
Khi tế bào sinh dục bất thường thụ tinh với tế bào sinh dục bình thường sẽ tạo nên hợp
tử có bộ NST bất thường. Khoảng 95% các trường hợp dạng trisomy 18 thuần và
5
khoảng 5% là thể khảm hoặc các thể phối hợp khác như chuyển đoạn [4].
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
1.1.3. Hội chứng Patau
So với hai HC Down và Edwards, HC Patau được quan sát sớm hơn vào năm
1657 nhưng mãi đến năm 1960, cơ chế di truyền của HC này mới được bác sĩ Klaus
Patau mô tả đầy đủ. HC Patau là một dạng rối loạn NST nặng nên khả năng sống sót
của thai nhi mắc HC này là rất thấp, do đó tần số xuất hiện ở trẻ sơ sinh chỉ khoảng
1/10.000.
Đặc điểm kiểu hình của HC Patau bao gồm: tật dư ngón tay, ngón chân, chân bị
khuyết tật, đầu nhỏ, mắt nhỏ, mũi dị dạng, hở vòm miệng,…Đa số trẻ bị tổn thương hệ
thần kinh, bị các dị tật như: dị tật tim (chiếm 80%), dị tật hệ bài tiết (trên 60%) và dị
tật ở cơ quan sinh sản (75%). Do có quá nhiều dị tật nặng nề nên những trẻ mắc HC
Patau không sống được lâu khoảng 90% chết trong vòng 1 tuổi [4].
Hình 1.4. Karyotype và hình ảnh của trẻ mắc HC Patau.
(Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ, [9])
Giống với HC Down và Edwards, hơn 90% nguyên nhân của HC Patau là do
sự thừa một NST 13, nên được gọi là trisomy 13, phần còn lại ở dạng thể khảm hoặc
chuyển đoạn.
Hiện tượng rối loạn NST không chỉ xảy ra ở các cặp NST thường mà còn gặp ở
6
các NST giới tính.
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
1.1.4. Một số rối loạn nhiễm sắc thể giới tính
1.1.4.1. Hội chứng Klinefelter
Đây là HC rối loạn NST giới tính hay gặp nhất ở nam giới, chiếm tỉ lệ khoảng
1/500 – 1/1.000 ở các bé trai mới sinh ra [29]. HC này được bác sĩ Harry Klinefelter
mô tả lần đầu tiên vào năm 1942, nguyên nhân là do dư một nhiễm sắc thể giới tính X
nên có bộ nhiễm sắc thể là 47,XXY. Bên cạnh đó, HC Klinefelter còn có các dạng
khác như: thể khảm 47,XXY/46XY; 48XXXY; 48,XXYY và 49,XXXXY. Hầu hết
các bất thường NST này do hiện tượng không phân ly NST xảy ra ở bố hoặc mẹ.
Người mắc HC Klinefelter thường vô sinh, chỉ số IQ hơi thấp hơn bình thường,
phát triển các đặc điểm thiên về nữ giới như vú phát triển, lông mu mọc theo kiểu nữ,
ít râu, …
Hình 1.5. Karyotype và hình ảnh của người mắc HC Klinefelter [9].
1.1.4.2. Hội chứng Turner
Nếu HC Klinefelter là rối loạn NST giới tính thường gặp nhất ở nam thì HC
Turner thường gặp nhất ở nữ, chiếm tỉ lệ khoảng 1/2.000 bé gái sơ sinh [16]. Năm
7
1938, Henry Turner đã mô tả các triệu chứng chính của bệnh: lùn, thiểu năng sinh dục,
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
thừa da cổ, tóc mọc thấp, cẳng tay cong ra ngoài [31]. Các bất thường này là do mất
một phần hoặc toàn bộ một NST giới tính X trong bộ NST.
HC Turner do mất hoàn toàn một NST X và bộ NST chỉ còn duy nhất một NST
giới tính X là nguyên nhân thường gặp nhất chiếm khoảng 50%. Trường hợp này còn
gọi là monosomy X và kí hiệu là 45,X hoặc 45,XO. Khoảng 1/3 các trường hợp nữ bị
HC Turner do mất đoạn xảy ra trên một NST X. Ngoài ra, HC Turner còn xuất hiện ở
thể khảm và những trường hợp này thường gây rối loạn nhẹ hơn monosomy X [34].
Hình 1.6. Karyotype và hình ảnh của người mắc HC Turner [9].
Với mục tiêu nâng cao chất lượng dân số, hạn chế những hậu quả nặng nề do dị
tật bẩm sinh gây ra, giảm thiểu số người tàn tật, thiểu năng trí tuệ trong cộng đồng,
chương trình sàng lọc và chẩn đoán trước sinh ngày càng được quan tâm ở nước ta.
1.2. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP SÀNG LỌC TRƢỚC SINH
Sàng lọc trước sinh là chương trình thực hiện xét nghiệm thường quy cho phụ
nữ mang thai 3 tháng đầu (quý 1), 3 tháng giữa (quý 2) để phát hiện sớm các thai kỳ
8
có nguy cơ về bệnh lý di truyền như thiếu men G6PD, bệnh về NST như HC Down và
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
các dị tật bẩm sinh khác. Sàng lọc trước sinh là một bước quan trọng cần phải thực
hiện để có thể phát hiện sớm các hiện tượng bất thường của thai nhi nhằm đưa ra các
biện pháp chăm sóc hay điều trị phù hợp và kịp thời. Các bước sàng lọc trước sinh nên
thực hiện gồm siêu âm thai, xét nghiệm Double test và Triple test.
1.2.1. Siêu âm thai
Siêu âm là phương pháp sàng lọc không xâm lấn đến thai nhi nên có thể được
xem là công cụ an toàn để phát hiện các dị tật của thai nhi.
Khi thai nhi được 11 tuần – 13 tuần 6 ngày tuổi, siêu âm cho phép đánh giá tuổi
thai và đo độ mờ da gáy (nuchal translucency – NT). Độ mờ da gáy là chiều rộng lớn
nhất của khoang dịch nằm giữa da và đốt sống cổ của thai nhi. Chỉ số bình thường của
NT là < 3mm, nếu NT 3mm là có nguy cơ cao [7]. Ngoài ra, siêu âm còn giúp xác
định xương mũi của thai nhi, nếu xác định không thấy xương mũi của thai nhi thì
nguy cơ trẻ mắc HC Down càng cao.
Vào tuần thứ 21 – 25 của thai kỳ, kết quả siêu âm có thể cho biết hầu hết các
bất thường về hình thái thai nhi như: sứt môi, hở hàm ếch, dị tật của các cơ quan
khác,…Đây là siêu âm quan trọng vì nếu cần đình chỉ thai kỳ thì phải thực hiện trước
tuần thứ 28 [35].
1.2.2. Xét nghiệm máu
Việc xác định nồng độ một số chất trong máu có thể giúp phát hiện các thai nhi
có nguy cơ bị dị tật như thai vô sọ, nứt đốt sống, một số rối loạn NST,…Có 2 xét
nghiệm tầm soát phổ biến là Double test được thực hiện ở quý 1 và Triple test ở quý 2
của thai kỳ. Giống như siêu âm, cả hai xét nghiệm Double test và Triple test là các xét
nghiệm không xâm lấn và không có ảnh hưởng đến mẹ và thai nhi.
1.2.2.1. Xét nghiệm Double test
Xét nghiệm Double test là xét nghiệm sinh hóa lấy máu mẹ để thực hiện 2 xét
9
nghiệm: định lượng PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A) và -hCG
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
(beta-human chorionic gonadotropin). PAP-A là protein được sản xuất bởi nhau thai
ở giai đoạn sớm của thai kỳ. -hCG là hormone cũng được tạo ra bởi nhau thai ở giai
đoạn sớm của thai kỳ [7]. Cả hai chất trên đều do thai nhi sản xuất và xuất hiện ở
máu mẹ. Do đó, nếu thai nhi có hiện tượng lệch bội NST thì nồng độ của các chất này
sẽ thay đổi trong máu mẹ và việc định lượng chúng kết hợp với kết quả siêu âm có
thể giúp đánh giá nguy cơ dị tật bẩm sinh của thai nhi. Theo nghiên cứu của Wald và
cộng sự, tỷ lệ phát hiện dị tật bẩm sinh của xét nghiệm Double test là 75% [30]. Tuy
nhiên, xét nghiệm này không có khả năng phát hiện tất cả dị tật của thai nhi mà chỉ
cảnh báo thai có nguy cơ cao với một số dị tật như HC Down, HC Edwards và HC
Patau. Nếu kết quả chỉ ra nguy cơ dị tật bẩm sinh cao, cần phải tiến hành các xét
nghiệm chẩn đoán. Nếu thai có nguy cơ dị tật ở mức ranh giới, cần thử tiếp Triple
test ở quý 2 của thai kỳ để đánh giá mức độ nguy cơ rõ ràng hơn.
1.2.2.2. Xét nghiệm Triple test
Khi thai được 14 – 22 tuần tuổi, Triple test sử dụng máu mẹ để đo mức độ của
3 chất trong huyết thanh gồm AFP, -hCG và Estriol. Trong đó, AFP (alpha-
feroprotein) là protein từ thai nhi, -hCG là hormone do nhau thai sản xuất và Estriol
là hormone nhóm estrogen do cả nhau và thai tạo ra. Nồng độ AFP tăng gợi ý thai có
nguy cơ bị dị tật ống thần kinh như cột sống chẻ đôi và vô sọ. Nồng độ AFP giảm nếu
kết hợp với nồng độ -hCG và Estriol giảm thì thai có nguy cơ cao bị HC Down, HC
Edwards hoặc bất thường NST khác. Để ước tính chính xác mức độ nguy cơ bị dị tật
của thai nhi cần kết hợp kết quả của Triple test với nhiều yếu tố khác như tuổi mẹ,
chủng tộc, tiền sử người mẹ, số thai, tuổi thai và tiền sử sản khoa [3]. Xét nghiệm
Triple test giúp khẳng định lại kết quả của xét nghiệm Double test.
Nếu xét nghiệm Double test và Triple test có kết quả cho thấy thai có nguy cơ
cao bị một hoặc nhiều rối loạn NST thì cần tiến hành chẩn đoán trước sinh bằng các
10
thủ thuật xâm lấn như chọc ối hoặc sinh thiết gai nhau.
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
1.3. CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH RỐI LOẠN NHIỄM
SẮC THỂ
Một lĩnh vực đặc biệt quan trọng đối với y học cộng đồng là công tác chẩn
đoán trước sinh đối với các bất thường NST, nhất là khi việc kiểm soát dân số và phát
triển kinh tế cũng như dân trí khiến những người làm bố mẹ ngày càng quan tâm hơn
đến đứa con mà họ sẽ sinh ra. Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán trước sinh là những
thủ tục chẩn đoán chuyên sâu có nguy cơ gây sẩy thai và tốn kém về mặt kinh tế nên
chỉ được khuyến cáo áp dụng cho những thai phụ có nguy cơ cao mang thai bị rối loạn
NST. Do đó, các cặp vợ chồng nên được tư vấn và thảo luận kỹ trước khi quyết định
thực hiện các thủ thuật chẩn đoán.
1.3.1. Kỹ thuật thu mẫu tế bào thai nhi
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều phương pháp để thu nhận tế bào thai như
phương pháp chọc hút dịch ối (amniocentesis), sinh thiết gai nhau (chorionic villus
sampling – CVS), lấy máu thai nhi từ cuống rốn [28].
1.3.1.1. Chọc hút dịch ối
Chọc hút dịch ối hay còn gọi chọc ối là phương pháp được lựa chọn nhiều nhất
hiện nay. Chọc ối cho phép thu nhận tế bào thai nhi bằng cách đưa kim vào buồng ối
dưới sự chỉ dẫn của siêu âm để hút dịch ối. Thời điểm chọc ối lý tưởng là ở tuần thai
16 đến 18 vì khi đó tỷ lệ dịch ối/thai là lớn nhất [17].
Các tế bào trong dịch ối có nguồn gốc từ nhiều mô khác nhau của thai nhi như:
màng ối, da, đường tiết niệu, đường hô hấp, đường tiêu hóa và tế bào tạo máu thai.
Lượng tế bào trong dịch ối thay đổi tùy theo thai kỳ.
Chẩn đoán trước sinh dựa trên tế bào ối có độ chính xác cao vì nguy cơ ngoại
nhiễm tế bào mẹ thấp. Tuy nhiên, chọc ối là một trong những thủ thuật xâm lấn trước
sinh nên có thể dẫn đến một số tai biến không mong muốn như: sẩy thai (khoảng
11
1/200), khuyết tật thai, nhiễm trùng mẹ, rỉ ối [8].
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
1.3.1.2. Sinh thiết gai nhau
Sinh thiết gai nhau hiện là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất trong chẩn
đoán 3 tháng đầu của thai kỳ. Dưới sự chỉ dẫn của siêu âm, kỹ thuật này thu nhận
mẫu bánh nhau từ tử cung. Mẫu bánh nhau sẽ được lấy bằng catheter (một ống dài)
hoặc sử dụng kim chọc qua đường bụng hay đường âm đạo. Kỹ thuật này cho phép
chẩn đoán dị tật thai nhi sớm hơn chọc ối nhưng kèm theo rủi ro cao hơn (tỷ lệ sẩy
thai khoảng 1,9 – 2,1%) [8], [17].
1.3.1.3. Chọc hút máu cuống rốn
Đây là kỹ thuật lấy máu thai nhi qua đường dây rốn dưới sự chỉ dẫn của siêu
âm, được thực hiện vào tuần thai 18. Kỹ thuật này ít được áp dụng hơn so với hai kỹ
thuật chọc ối và sinh thiết gai nhau vì khả năng tai biến cao như: sẩy thai, chảy máu
kéo dài, chảy máu từ thai sang mẹ, bất thường cấu trúc thai, thai chậm phát triển, nang
nước [2].
Các tế bào của thai nhi sau khi thu nhận bằng những kỹ thuật trên sẽ được sử
dụng cho các kỹ thuật di truyền để phân tích các bất thường của NST.
1.3.2. Kỹ thuật lập nhiễm sắc thể đồ (karyotype)
Năm 1952, kỹ thuật karyotype đã được sử dụng trong nghiên cứu di truyền tế
bào và đến nay qua nhiều đợt cải tiến, kỹ thuật này trở thành một công cụ không thể
thiếu trong việc phân tích các rối loạn di truyền ở người. Karyotype được các nhà
nghiên cứu đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán trước sinh những bất thường
của NST.
Karyotype dựa trên nguyên tắc khảo sát bộ NST của tế bào ở kỳ giữa
(metaphase) hoặc kỳ giữa sớm (pro-metaphase). Karyotype được thực hiện bằng cách
nuôi cấy tế bào trong môi trường dinh dưỡng đặc biệt. Sau thời gian thích hợp, tế bào
được thu hoạch, trải lên lam sau đó tiến hành nhuộm GTG (Giemsa Trypsin G-
12
banding) để phân tích bộ NST.
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
Karyotype có thể xác định bất thường về số lượng lẫn cấu trúc các NST với độ
chính xác lên đến 99,4 – 99,8% và rất đáng tin cậy [4], [10]. Tuy nhiên, bên cạnh
những lợi ích đáng kể mà karyotype mang lại thì kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số
hạn chế như thời gian trả kết quả dài từ 14 – 21 ngày do thời gian nuôi cấy ít nhất phải
mất 10 ngày [19]. Điều này dẫn đến một tâm lý bất an kéo dài đối với thai phụ và
khiến cho việc chấm dứt thai kỳ nếu có trở nên phức tạp và nguy hiểm hơn. Ngoài ra,
karyotype đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ và chuyên môn trong việc nuôi cấy, nhuộm
và phân tích bộ NST. Một nhược điểm khác của karyotype là không thể phát hiện các
bất thường cấu trúc NST nhỏ hơn 5 Mb [4].
1.3.3. Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH)
Kỹ thuật FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) ra đời từ năm 1989, là kỹ
thuật trung gian giữa di truyền tế bào và sinh học phân tử. Nguyên tắc của kỹ thuật là
sử dụng các đầu dò đặc hiệu được đánh dấu chất phát huỳnh quang lai với NST ở kỳ
giữa (metaphase), và/hoặc nhân tế bào ở gian kỳ (interphase). Dưới kính hiển vi quang
học, các vị trí lai sẽ được phát hiện, số lượng tín hiệu huỳnh quang trong mỗi nhân tế
bào đại diện cho số lượng bản sao NST. Nếu có 2 tín hiệu là bình thường, 1 tín hiệu là
monosomy và 3 tín hiệu là trisomy [5], [21].
Kỹ thuật FISH là một kỹ thuật mới có giá trị sàng lọc cao, được sử dụng trong
chẩn đoán trước sinh nhằm phát hiện các lệch bội NST thường gặp. Kỹ thuật FISH
được thực hiện trên nhân tế bào ở gian kỳ không cần trải qua thời gian nuôi cấy tế bào
nên có ưu điểm hơn kỹ thuật karyotype là cho kết quả xét nghiệm nhanh chỉ trong
vòng 2 – 3 ngày. Đây là bước tiến lớn trong việc giảm thời gian chờ đợi cho thai phụ
cũng như giảm bớt khó khăn trong các trường hợp thai bất thường cần đình chỉ [5].
Mặc dù nhanh và đáng tin cậy nhưng chi phí cho hóa chất xét nghiệm còn khá cao và
13
tốn nhiều công lao động nên kỹ thuật này vẫn chưa được áp dụng rộng rãi ở nước ta.
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
Hình 1.7. Hình ảnh minh họa kết quả FISH của thai nhi mắc hội chứng Patau.
(Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ)
1.3.4. Kỹ thuật QF-PCR
Khắc phục nhược điểm thời gian thực hiện dài của karyotype, chí phí cao và
tốn nhiều công thao tác của FISH, kỹ thuật QF-PCR đã ra đời và lần đầu tiên được áp
dụng để phát hiện các rối loạn NST vào năm 1993 [18]. Đến nay, kỹ thuật này đã trở
thành phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu quả và được ứng dụng ở nhiều nơi
trên thế giới.
1.3.4.1. Khái niệm
Kỹ thuật QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction)
được gọi là phản ứng chuỗi polymer huỳnh quang định lượng, dùng để khuếch đại các
đoạn DNA ngắn đặc hiệu (STR), đánh dấu bằng tín hiệu huỳnh quang và định lượng
bằng điện di mao quản [23].
STR (short tandem repeat) hay microsatellite là các trình tự lặp lại song song
ngắn có tính đa hình rất cao do số lần lặp lại khác nhau giữa các cá thể. STR chứa
trình tự lặp lại gồm 2 – 6 nucleotide. STR cũng đặc trưng cho từng NST nên các NST
khác nhau chứa các trình tự STR khác nhau. Trong kỹ thuật QF-PCR, STR đóng vai
trò là các marker để khuếch đại một số locus nhất định trên các NST 13, 18, 21, X và
Y, qua đó xác định được số lượng các alen thông qua hình ảnh điện di. Ngoài ra, STR
14
được lựa chọn làm marker phải có mức độ dị hợp tử cao vì kết quả với nhiều alen
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
đồng hợp tử thì không có ý nghĩa chẩn đoán và kích thước trong khoảng 100 – 400 bp
nhằm đảm bảo phản ứng khuếch đại PCR sẽ thực hiện hiệu quả hơn [4], [25], [32].
1.3.4.2. Nguyên tắc của kỹ thuật QF-PCR
QF-PCR sử dụng các cặp mồi gắn chất phát huỳnh quang để khuyếch đại các
marker đa hình STR sau đó sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR sẽ được định
lượng trên hệ thống điện di mao quản để xác định số lượng NST [25]. Nguyên tắc của
QF-PCR dựa trên cơ sở, trong giai đoạn đầu của sự khuếch đại, lượng DNA tạo ra từ
các alen của 1 locus sẽ tỷ lệ thuận với DNA mục tiêu trong mẫu ban đầu. Do đó, ở các
trường hợp dị hợp tử bình thường, sản phẩm QF-PCR của một STR đặc trưng NST sẽ
hiển thị 2 đỉnh huỳnh quang với tỷ lệ 1:1. Ở trường hợp trisomy sẽ xuất hiện 3 đỉnh
huỳnh quang với tỷ lệ 1:1:1 (trisomy 3 alen) hoặc 2 đỉnh với tỷ lệ 2:1 (trisomy 2 alen).
Disomy
Trisomy
Trisomy
Không có ý nghĩa
Trường hợp đồng hợp tử sẽ hiển thị 1 đỉnh huỳnh quang duy nhất [12].
Hình 1.8. Hình ảnh mô tả nguyên tắc kỹ thuật QF-PCR [20].
1.3.4.3. Tình hình ứng dụng kỹ thuật QF-PCR ở một số nước trên thế giới
Việc có nên thay thế kỹ thuật karyotype truyền thống bằng kỹ thuật QF-PCR
vẩn còn tranh cãi ở nhiều nơi trên thế giới. Tại Anh, kỹ thuật QF-PCR được sử dụng
độc lập để chẩn đoán rối loạn số lượng NST trước sinh mà không cần karyotype.
15
Trong khi đó, ở Mỹ và Canada, các kết quả QF-PCR phải được kiểm tra lại bằng
Tổng quan tài liệu
Thực tập Tốt nghiệp
karyotype. Ở Hà Lan, Thụy Điển và Phần Lan, những thai có nguy cơ do tuổi mẹ, xét
nghiệm sàng lọc huyết thanh dương tính và kết quả siêu âm có dấu hiệu gợi ý thì được
đề nghị áp dụng kỹ thuật QF-PCR còn những thai có bất thường hình thái khi siêu âm
16
thì nên thực hiện karyotype [4].
Vật liệu – Phương pháp
Thực tập Tốt nghiệp
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Mẫu phân tích
Dịch ối của các thai phụ có nguy cơ cao về rối loạn số lượng NST dựa trên kết
quả sàng lọc trước sinh (siêu âm, xét nghiệm Double test, Triple test, kết hợp với tiền
sử bản thân thai phụ và gia đình bị rối loạn NST), được chỉ định chọc ối tại bệnh viện
Từ Dũ.
Địa điểm thu mẫu: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ, Tp Hồ
Chí Minh.
2.1.2. Hóa chất
2.1.2.1. Hóa chất ly trích DNA bằng kit InstaGene Matrix
Dung dịch PBS 10X
NaCl 40g
KCl 1g
4,6g Na2HPO4
1g KH2PO4
Bổ sung nước cất hai lần cho đủ 500ml.
Kit InstaGene Matrix (Bio Rad)
2.1.2.2. Hóa chất trong điện di mao quản
Kit Devyser Complete và Devyser Resolution (Devyser AB) Hi-DiTM Formamide (Applied Biosystems)
560 SIZER ORANGE (Applied Biosystems)
GeneScan 500 ROX (Applied Biosystems)
Pop 7, 3500 (Applied Biosystems)
17
Buffer Anode, Cathode (Applied Biosystems)
Vật liệu – Phương pháp
Thực tập Tốt nghiệp
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị và phần mềm cho kỹ thuật QF-PCR
Tube vô trùng 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml
Micropipette các loại với thể tích từ 0,2 – 1000 l (Eppendorf)
Đầu tip vô trùng các loại với thể tích từ 0,2 – 1000 l
Đĩa PCR 96 giếng (Axygen)
Máy ly tâm ống 15 ml
Máy ly tâm tube 1,5 ml (Eppendorf)
Máy vortex (Eppendorf)
Máy khuấy từ (Heidolph)
Máy ủ nhiệt khô có lắc (Eppendorf)
Máy luân nhiệt theo chu kỳ Mastercycler Pro S (Eppendorf)
Hệ thống giải trình tự ABI 3500 (Applied Biosystems)
Phần mềm phân tích đoạn DNA GeneMarker (SoftGenetics)
Tủ mát 4OC (Sanyo)
Tủ lạnh -20OC (Sanyo)
Ngoài ra còn có một số dụng cụ cơ bản khác: găng tay vô trùng, bình cồn, khay
18
để tube, dụng cụ mở nắp tube,...
Vật liệu – Phương pháp
Thực tập Tốt nghiệp
Tip Tube Micropipette
Máy ly tâm Máy vortex Máy khuấy từ
Máy PCR Máy ủ lắc Hệ thống điện di mao quản
Hi-DiTM Formamide InstaGene Matrix Kit Devyser
19
Vật liệu – Phương pháp
Thực tập Tốt nghiệp
2.2. PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN
Các bước chính trong quy trình thực hiện kỹ thuật QF-PCR có thể tóm tắt theo
sơ đồ 2.1.
Ly trích DNA tổng số
Điện di mao quản
Phân tích kết quả
Sơ đồ 2.1. Quy trình thực hiện kỹ thuật QF-PCR
2.2.1. Phƣơng pháp ly trích DNA từ dịch ối bằng kit Instagen Matrix
Các bước chính được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất [6].
- Sau khi nhận mẫu dịch ối, ly tâm 1.500 rpm trong 5 phút để kiểm tra chất
lượng mẫu. Nếu mẫu lẫn máu nhiều sẽ được chuyển sang bước cấy để nuôi
cấy tế bào ối.
- Chuẩn bị các tube 1,5 ml đánh số tương ứng với mã số bệnh nhân.
- Đổ bớt dịch ối đến thể tích 2 ml thì ngừng. Sử dụng micropipette hút
200 l cặn dịch ối sang tube đã chuẩn bị sẵn.
- Ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút loại bỏ dịch nổi.
- Bổ sung 200 l dung dịch PBS. Vortex. Ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút
thu cặn, loại bỏ dịch nổi.
- Tùy theo lượng cặn ối tiến hành bổ sung 100 – 200 l InstaGene Matrix.
- Vortex sau đó tiến hành spin.
20
- Ủ trong 8 phút ở 99 - 100OC.
Vật liệu – Phương pháp
Thực tập Tốt nghiệp
- Vortex ở tốc độ cao. Ly tâm 12.000 rpm trong 2 phút.
Những bước chính trong ly trích DNA bằng kit InstaGene Matrix được tóm tắt
theo sơ đồ 2.2.
- - - - -
Mẫu dịch ối
Ly tâm
Ly tâm
- - - -
Hút bỏ dịch nổi
Bổ sung dung dịch InstaGene Matrix
Hút cặn dịch ối và rửa với dung dịch PBS Vortex
Vortex
Ly tâm
- - - -
21
Sơ đồ 2.2. Quy trình ly trích DNA bằng kit InstaGene Matrix.
Vật liệu – Phương pháp
Thực tập Tốt nghiệp
2.2.2. Quy trình phản ứng luân nhiệt – PCR
Ứng với mỗi mẫu DNA sau khi được ly trích sẽ được chạy 2 phản ứng PCR đa
mồi riêng biệt trong bộ kit Devyser Complete.
Thành phần phản ứng PCR 1 gồm có:
DNA mẫu 5 l
PCR Activator 20 l Devyser Complete Mix 1
Thành phần phản ứng PCR 2 gồm có:
DNA mẫu 5 l
PCR Activator 20 l Devyser Complete Mix 2
Devyser Complete Mix 1 gồm các cặp mồi được đánh dấu huỳnh quang đặc
hiệu cho 14 marker đặc trưng trên các NST 13, 18, 21. Tương tự, Devyser Complete
Mix 2 gồm các cặp mồi được đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho 19 marker đặc
trưng trên các NST 13, 18, 21, X, Y và đặc biệt trong đó có 2 marker là T1, T3 được
sử dụng để đếm số lượng NST X. Các marker được trình bày trong bảng 2.1. và 2.2.
Bảng 2.1. Các marker được sử dụng trong phản ứng PCR 1 [13].
Kí hiệu Tên Marker Vị trí trên NST Độ dài (bp) Màu huỳnh quang
D13S742 13q12.12 222 – 334 Xanh lá 13A
D13S634 13q21.32-q21.33 365 – 435 Xanh dương 13B
D13S628 13q31.1 420 – 475 Vàng 13C
D13S305 13q13.3 435 – 505 Xanh lá 13D
D13S1492 13q21.1 100 – 175 Vàng 13K
D18S978 18q12.3 195 – 230 Vàng 18B
22
D18S535 18q12.3 300 – 350 Xanh dương 18C
Vật liệu – Phương pháp
Thực tập Tốt nghiệp
18-D1 D18q22.1 18q22.1 336 – 430 Xanh lá
18M GATA178F11 18p11.32 350 – 410 Vàng
D18S391 18p11.31 130 – 205 Xanh dương 18P
D21S1435 21q21.3 150 – 208 Xanh dương 21A
D21S11 21q21.1 215 – 290 Xanh dương 21B
D21S1411 21q22.3 245 – 345 Vàng 21C
D21S1444 21q22.13 440 – 495 Xanh dương 21D
Bảng 2.2. Các marker được sử dụng trong phản ứng PCR 2 [13].
Kí hiệu Tên Marker Vị trí trên NST Độ dài (bp) Màu huỳnh quang
D13S800 180 – 230 Vàng 13q22.1 13E
D13S252 255 – 320 Xanh dương 13q12.2 13F
18D-2 D18S386 336 – 430 Xanh lá 18q22.1
D18S1002 325 – 380 Xanh dương 18q11.2 18G
D18S976 18p11.31 Vàng 440 – 495 18J
D21S1446 Xanh lá 435 – 495 21q22.3 21G
D21S1442 Vàng 362 – 420 21q21.3 21H
385 – 485 Xanh dương D21S2055 21q22.2 21J
AMEL AMELX, X = 104 Xp22.2, Yp11.2 Xanh dương AMELY Y = 110 XY
Yp11.31 236 Xanh dương SRY SRY
7 = 181 7q34 7X Xanh lá T1 X = 201 Xq13
3 = 133 3p24.2 3X Xanh dương T3 X = 137 Xq21.1
DXS1187 120 – 170 Xanh lá Xq26.2 X1
DXS981 262 – 300 Xanh lá Xq13.1 X2
XHPRT Vàng Xq26.2-q26.3 265 – 308 X3
23
Vàng DXS2390 Xq27.1-q27.2 312 – 357 X9
Vật liệu – Phương pháp
Thực tập Tốt nghiệp
XY2 DXYS267 Xq21.31, Yp11.31 175 – 217 Xanh dương
XY3 DXYS218 Xp22.33, Yp11.32 215 – 260 Xanh lá
ZFYX ZFY, ZFX Yp11.31, Xp22.11 157 – 166 Vàng
Nếu kết quả của 2 phản ứng không cung cấp đủ thông tin để chẩn đoán về 1
NST thường 13, 18, 21 hoặc nhiễm sắc thể giới tính X, Y thì mẫu DNA sẽ được chạy
tiếp phản ứng PCR đa mồi khác trong bộ Devyser Resolution với các marker chỉ có
trên 1 loại NST cần khảo sát. Bộ kit bao gồm 4 thành phần riêng biệt cho các NST 13,
18, 21 và NST giới tính X,Y. Ở các phản ứng này, bên cạnh các marker được sử dụng
giống như hỗn hợp phản ứng PCR 1 và 2 còn có thêm một số marker khác được trình
bày như trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các marker bổ sung trong bộ kit Devyser Resolution [14].
Kí hiệu Tên Marker Vị trí trên NST Độ dài (bp) Màu huỳnh quang
D13S325 13q14.11 312 – 417 Vàng 13G
D18S391 18q11.31 190 – 230 Xanh dương 18A
D18S858 18q21.31 360 – 418 Vàng 18I
D21S1437 21q21.1 105 – 152 Vàng 21I
DXS8377 Xq21.33 292 – 342 Xanh dương X4
DXS6854 Xq26.1 392 – 430 Xanh lá X5
DXS8377 Xq28 430 – 500 Xanh dương X6
DXS6803 Xq21.31 100 – 140 Xanh dương X8
DYS448 Yq11.223 346 – 380 Xanh dương Y2
24
Xq23 Xq23 X = 117 Vàng T2 2P23.2 2p23.2 2 = 122
Vật liệu – Phương pháp
Thực tập Tốt nghiệp
Các phản ứng PCR đều được thực hiện trên máy luân nhiệt Master Cycler Pro
theo chu trình được cài đặt như sau:
Bảng 2.4. Chu trình PCR
95OC 15 phút 1 chu kỳ
94OC 30 giây
26 chu kỳ 58OC 90 giây
72OC 90 giây
72OC 30 phút 1 chu kỳ
4OC +
Quy trình chuẩn bị PCR được tóm tắt theo sơ đồ 2.3.
DNA ly trích Hút DNA vào tube M1, M2
Xếp các tube M1, M2 vào máy PCR
25
Sơ đồ 2.3. Quy trình chuẩn bị PCR.
Vật liệu – Phương pháp
Thực tập Tốt nghiệp
2.2.3. Phƣơng pháp điện di mao quản trên hệ thống ABI 3500
Sản phẩm PCR được phân tách và định lượng bằng hệ thống điện di mao quản
ABI 3500.
Quá trình điện di gồm các bước chính:
- Chuẩn bị tube 1,5 ml chứa hỗn hợp gồm 600 l Hi-DiTM Formamide và 12
l 560 SIZER ORANGE đối với kit Devyser Complete (GeneScan ROX
đối với kit Devyser Resolution) đã được vortex.
- Bổ sung 10 l hỗn hợp trên vào đĩa 96 giếng vô trùng.
- Hút 1 l của từng mẫu cho vào mỗi giếng có chứa sẵn hỗn hợp trên.
- Đậy đĩa PCR 96 giếng và đưa vào máy điện di mao quản với các thông số
được cài đặt như sau: mao quản 50 cm, POP7, điện thế bơm mẫu là 2,5 kV,
thời gian bơm mẫu là 20 giây, điện thế điện di là 19,5 kV và thời gian điện
di là 1.700 giây.
2.2.4. Phân tích kết quả bằng phần mềm Gene Marker
Sau khi điện di mao quản, kết quả sẽ được xuất ra dưới dạng tập tin .fsa và
chuyển sang máy tính để phân tích bằng phần mềm GeneMarker 1.85. Tất cả tiêu
chuẩn phân tích, đánh giá thực hiện theo “Hướng dẫn thực hành chẩn đoán lệch bội
bằng QF-PCR, phiên bản 3.01 năm 2012” của Hiệp hội Di truyền Lâm sàng Vương
quốc Anh [22]. Theo đó:
Chỉ phân tích các marker có tín hiệu từ 50 rfu (relative fluorescent unit) đến
6.000 rfu. Không phân tích các marker có tín hiệu < 50 rfu hoặc > 6.000 rfu.
Các marker dị hợp tử có 2 alen được phân tích bằng cách tính tỉ số giữa các tín
hiệu (tín hiệu của alen ngắn / tín hiệu của alen dài).
Kết luận về số lượng NST phụ thuộc vào tỷ số giữa các alen trong cùng một
marker được trình bày tóm tắt như bảng 2.5. Nếu khoảng cách giữa 2 alen < 24bp thì
26
áp dụng tiêu chuẩn 1, nếu khoảng cách giữa 2 alen 24bp thì áp dụng tiêu chuẩn 2.
Vật liệu – Phương pháp
Thực tập Tốt nghiệp
Bảng 2.5. Đánh giá tỷ lệ giữa các alen trong cùng một marker [15].
Marker Tỷ lệ giữa các alen
Marker 2 alen 1:2 Không xác định 1:1 Không xác định 2:1
Tiêu chuẩn 1 < 0,65 0,65 – 0,74 0,75 – 1,44 1,45 – 1,75 > 1,75
Tiêu chuẩn 2 < 0,65 0,65 – 0,74 0,75 – 1,54 1,55 – 1,75 > 1,75
Marker 3 alen Không xác định 1:1:1 Không xác định
< 0,74 0,75 – 1,44 > 1,45 Tiêu chuẩn 1
< 0,74 0,75 – 1,54 > 1,55 Tiêu chuẩn 2
Kết quả điện di được thể hiện dưới dạng các biểu đồ đỉnh. Vị trí của đỉnh tương
ứng với chiều dài và độ cao của đỉnh tương ứng với nồng độ DNA sản phẩm PCR.
Các marker đồng hợp tử (chỉ có 1 alen) không có ý nghĩa trong việc đánh giá
số lượng NST.
Trường hợp được xác định là disomy (bình thường) khi có ít nhất 2 marker của
NST đó ở dạng dị hợp tử với tỷ lệ giữa 2 alen là 1:1.
Trường hợp được xác định là trisomy khi có ít nhất 2 marker của NST đó ở
dạng dị hợp tử với tỷ lệ giữa 3 alen là 1:1:1 hoặc 2 alen với tỷ lệ 2:1/1:2 (do 2 trong 3
alen có cùng kích thước).
Trường hợp được xác định là monosomy khi tất cả các marker của NST chỉ có
1 alen.
Các trường hợp không rõ ràng sẽ được kiểm tra lại về quy trình thực hiện (ly
trích DNA, PCR, điện di) hoặc khả năng mẫu bất thường: khảm, ngoại nhiễm tế bào
27
mẹ,…
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Spin
3.1. KẾT QUẢ CỦA KỸ THUẬT QF-PCR
Trong khoảng thời gian từ ngày 7/4/2014 đến ngày 30/5/2014, khoa Xét
nghiệm Di truyền Y học đã thực hiện kỹ thuật QF-PCR cho 860 mẫu dịch ối trong đó
có 846 mẫu (98,4%) với hơn hai marker cho thông tin trên mỗi NST khảo sát, 1 mẫu
khảm và 13 mẫu không có kết quả do (mẫu nhiễm máu mẹ nhiều, mẫu cấy thất bại,
mẫu lưu,…)
Bảng 3.1. Kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật QF-PCR
Kết quả QF-PCR Số lƣợng Tỷ lệ (%)
Bình thƣờng 96,1 813
Bất thƣờng 3,9 33
2,0 17 Trisomy 21
1,4 12 Trisomy 18
0,2 2 Trisomy 13
0,1 1 Klinefelter XXY
0,1 1 Turner
Tổng 100 846
Bảng 3.1. cho thấy trong tổng số 846 mẫu, có 813 trường hợp bình thường
chiếm 96,1% và 33 trường hợp bất thường do rối loạn số lượng NST chiếm 3,9%.
Trong 33 trường hợp bất thường, trisomy 21 chiếm tỷ lệ cao nhất (2,0%) phù hợp với
tỷ lệ mắc HC Down thường gặp hơn các HC khác (HC Edwards, Patau, Klinefelter,
Turner). Trisomy 13 chiếm tỷ lệ thấp nhất trong 3 trường hợp rối loạn NST thường vì
thai mắc HC Patau có tỷ lệ tử vong cao ở 3 tháng đầu thai kỳ trước khi đến thời điểm
chọc ối vào 3 tháng giữa thai kỳ. Bên cạnh đó, kỹ thuật QF-PCR cũng phát hiện hai
trường hợp mắc HC Klinefelter và Turner cho thấy các rối loạn NST giới tính cũng
28
thường được bắt gặp.
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Về thời gian xét nghiệm bằng kỹ thuật QF-PCR, ngoại trừ các trường hợp
nhiễm máu mẹ nặng và khảm, kỹ thuật này cung cấp kết quả chỉ sau 36 – 48 giờ kể từ
lúc nhận mẫu. Điều này giúp giảm bớt tâm lý lo lắng cho thai phụ, gia đình và nâng
cao chất lượng quản lý thai kỳ.
3.1.1. Kết quả của mẫu bình thƣờng
3.1.1.1. Kết quả nữ giới bình thường (46,XX)
Hỗn hợp phản ứng PCR 1 Hỗn hợp phản ứng PCR 2
Hình 3.1. Hình ảnh minh họa cho kết quả QF-PCR của (46,XX).
Hình 3.1. cho biết:
Tất cả marker STR của NST 13, 18 và 21 đều hiển thị 2 đỉnh với tỷ lệ
1:1.
Tại marker AMELXY chỉ xuất hiện 1 đỉnh của AMELX. Tại marker
AMELY và SRY không có tín hiệu. Điều này là phù hợp vì hai marker
29
AMELY và SRY chỉ có trên NST Y của nam giới.
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Các marker đếm số lượng NST X (T1 và T3) hiển thị tỷ lệ marker là 1:1,
phù hợp với sự hiện diện của 2 NST X.
Các marker STR của NST X (X1, X2, X3 và X9) đều hiển thị 2 đỉnh với
tỷ lệ 1:1.
Tỷ lệ các marker STR của vùng giả NST thường (XY2 và XY3) là 1:1
chứng tỏ sự hiện diện của 2 NST giới tính.
3.1.1.2. Kết quả nam giới bình thường (46,XY)
Hỗn hợp phản ứng PCR 1 Hỗn hợp phản ứng PCR 2
Hình 3.2. Hình ảnh minh họa cho kết quả QF-PCR của (46,XY).
Hình 3.2. cho biết:
Tất cả marker STR của NST 13, 18 và 21 đều hiển thị 2 đỉnh với tỷ lệ
1:1.
Khác với nữ giới, tại marker AMELXY xuất hiện thêm 1 đỉnh tương
ứng với AMELY và 1 đỉnh tại marker SRY phù hợp với giới tính là
30
nam.
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Các marker đếm số lượng NST X (T1 và T3) hiển thị tỷ lệ marker là 2:1
và các marker STR của NST X chỉ xuất hiện 1 đỉnh (không có ý nghĩa)
cho biết số lượng NST X dự kiến là 1.
Tỷ lệ các marker không đa hình (AMELXY và ZFYX) là 1:1 chứng tỏ
sự hiện diện của 2 NST giới tính.
3.1.2. Kết quả của mẫu bất thƣờng số lƣợng nhiễm sắc thể
3.1.2.1. Kết quả của mẫu trisomy 21 (hội chứng Down)
Hỗn hợp phản ứng PCR 1 Hỗn hợp phản ứng PCR 2
Hình 3.3. Hình ảnh minh họa cho kết quả của mẫu (47, XY, +21).
Hình 3.3. cho biết:
Các marker STR trên NST 21 hiển thị tỷ lệ marker bất thường là 1:2
chứng tỏ có 3 NST 21 nên thai nhi có nguy cơ mắc hội chứng Down.
Bên cạnh đó, các marker trên các NST 13, 18 đều hiển thị tỷ lệ marker
31
bình thường là 1:1.
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Mẫu sẽ được kiểm tra lại với kit Devyser Resolution gồm các thành phần phản
ứng PCR riêng biệt cho NST 21.
Hình 3.4. Kết quả của mẫu (47, XY, +21) với các marker bổ sung cho NST 21.
Hình 3.4. cho thấy các marker đều có tỷ lệ bất thường là 1:2, 2:1, 1:1:1 chứng
minh mẫu có nguy cơ cao mắc hội chứng Down.
3.1.2.2. Kết quả của mẫu trisomy 18 (hội chứng Edwards)
Hỗn hợp phản ứng PCR 2 Hỗn hợp phản ứng PCR 1
32
Hình 3.5. Hình ảnh minh họa kết quả của mẫu (47, XY, +18).
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Hình 3.5. cho biết các marker STR trên NST 18 hiển thị tỷ lệ marker bất
thường là 1:2, 2:1 và 1:1:1 chứng tỏ có 3 NST 18 nên thai nhi có nguy cơ mắc hội
chứng Edwards. Các marker trên các NST 13, 21 đều hiển thị tỷ lệ marker bình
thường là 1:1. Mẫu sẽ được kiểm tra lại với kit Devyser Resolution gồm các thành
phần phản ứng PCR riêng biệt cho NST 18.
Hình 3.6. Kết quả của mẫu (47, XY, +18) với các marker bổ sung cho NST 18.
Hình 3.6. cho thấy các marker đều có tỷ lệ bất thường là 1:2, 2:1, 1:1:1 chứng minh mẫu có nguy cơ cao mắc hội chứng Edwards.
3.1.2.3. Kết quả của mẫu trisomy 13 (hội chứng Patau)
Hỗn hợp phản ứng PCR 1 Hỗn hợp phản ứng PCR 2
33
Hình 3.7. Hình ảnh minh họa kết quả QF-PCR của mẫu (47, XY, +13).
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Hình 3.7. cho biết các marker STR trên NST 13 hiển thị tỷ lệ marker bất
thường là 1:2, 2:1 và 1:1:1 chứng tỏ có 3 NST 13 nên thai nhi có nguy cơ cao mắc hội
chứng Patau. Trong khi đó, các marker trên các NST 18, 21 đều hiển thị tỷ lệ marker
bình thường là 1:1. Mẫu sẽ được kiểm tra lại với kit Devyser Resolution gồm các
thành phần phản ứng PCR riêng biệt cho NST 13.
Hình 3.8. Kết quả của mẫu (47, XY, +13) với các marker bổ sung cho NST 13.
Hình 3.8. cho thấy có 5 marker (>2) có tỷ lệ bất thường là 1:2, 2:1 chứng minh
mẫu có nguy cơ cao mắc hội chứng Patau.
3.1.2.4. Kết quả của mẫu Klinefelter (47,XXY)
34
Hình 3.9. Hình ảnh minh họa kết quả QF-PCR của mẫu (47, XXY).
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Hình 3.9. cho biết:
Đa số các marker STR của NST 13, 18 và 21 đều có tỷ lệ marker bình
thường là 1:1.
Tại marker AMELXY tỷ lệ marker bất thường của AMELX với
AMELY là 2:1 thể hiện khả năng có 3 NST giới tính.
Các marker đếm số lượng NST X (T1 và T3) hiển thị tỷ lệ marker bất
thường ở nam giới là 1:1 phù hợp với khả năng có 2 NST X.
Tại vị trí của 2 marker (X3 và X9) của NST X xuất hiện 2 đỉnh với tỷ lệ
1:1 chứng tỏ có 2 NST X.
Tín hiệu hiện diện tại marker AMELY và SRY chứng tỏ sự hiện diện
của một NST Y.
Tại marker ZFYX hiển thị tỷ lệ bất thường là 1:2 khẳng định có 3 NST
giới tính.
3.1.2.5. Kết quả của mẫu monosomy (hội chứng Turner)
35
Hình 3.10. Hình ảnh minh họa kết quả QF-PCR của mẫu (45, XO).
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Hình 3.10. cho biết:
Đa số các marker của NST 13, 18 và 21 đều hiển thị tỷ lệ marker bình
thường là 1:1.
Tín hiệu xuất hiện tại marker AMELX mà không có tại các marker
AMELY và SRY chứng tỏ giới tính nữ.
Các marker đếm số lượng NST X (T1 và T3) hiển thị tỷ lệ marker bất
thường là 2:1 phù hợp với sự hiện diện duy nhất 1 NST X.
Các marker X1, X2, X3, X9, XY2 và XY3 đều chỉ hiển thị 1 đỉnh duy
nhất (không có ý nghĩa), phù hợp với 1 NST X.
3.1.3. Kết quả của mẫu khảm
Hình 3.11. Hình ảnh minh họa kết quả QF-PCR của mẫu khảm (46, XY/45, XO)
Hình 3.11. cho biết:
Đa số các marker STR của các NST 13, 18 và 21 đều có tỷ lệ marker
36
bình thường là 1:1.
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Tín hiệu xuất hiện tại các marker AMELX, AMELY và SRY chứng tỏ
giới tính nam.
Tại các marker đếm số lượng NST X (T1, T3) , tỷ lệ marker là 2:1 cho
thấy có 1 NST X.
Các marker của NST X đều xuất hiện 1 đỉnh nên không có ý nghĩa chẩn
đoán, phù hợp với 1 NST X.
Tuy nhiên, tại marker ZFYX, XY3 có tỷ lệ marker bất thường là 1:2 cho
thấy khả năng có đến 3 NST giới tính.
Mẫu sẽ được kiểm tra lại với kit Devyser Resolution gồm các thành phần phản
ứng PCR riêng biệt cho NST giới tính X, Y.
Hình 3.12. Kết quả của mẫu (46, XY/45, XO) với các marker bổ sung cho NST XY.
Hình 3.12. cho thấy các tín hiệu đều phù hợp với mẫu nam giới bình thường
37
(46, XY). Để khẳng định kết quả chắc chắn, mẫu sẽ được kiểm tra với kỹ thuật FISH.
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Hình 3.13. Hình ảnh minh họa kết quả FISH của mẫu (46, XY/45, XO).
Kết quả FISH cho thấy có sự tồn tại của 2 dòng tế bào khác nhau là dòng tế bào
bình thường (46, XY) và dòng tế bào bất thường (45, XO) nhưng dòng tế bào bất
thường chiếm tỷ lệ thấp hơn.
3.2. MỐI TƢƠNG QUAN GIỮA TUỔI THAI PHỤ VÀ KẾT QUẢ CHẨN
ĐOÁN
Bảng 3.2. Mối tương quan giữa tuổi thai phụ và kết quả QF-PCR
Tuổi thai phụ
Kết quả QF-PCR < 35 tuổi 35 tuổi
Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%)
479 Bình thƣờng 96 334 96,3
20 Bất thƣờng 4 13 3,7
8 Trisomy 21 1,6 9 2,6
8 Trisomy 18 1,6 4 1,1
2 Trisomy 13 0,4 0 0
1 Klinefelter XXY 0,2 0 0
1 Turner XO 0,2 0 0
38
Tổng 499 100 347 100
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
Bảng 3.2. cho thấy nhóm thai phụ < 35 tuổi có tỷ lệ thai bất thường NST là 4%
cao hơn so với nhóm thai phụ 35 tuổi có tỷ lệ là 3,7%. Điều này là do số lượng thai
phụ < 35 tuổi thực hiện chọc ối nhiều hơn số lượng thai phụ 35 tuổi và độ tuổi < 35
tuổi là độ tuổi sinh đẻ. Tỷ lệ thai trisomy 21 ở nhóm thai phụ 35 tuổi cao hơn ở
nhóm thai phụ < 35 tuổi (2,6% so với 1,6%), phù hợp với nguy cơ cao mắc HC Down
ở phụ nữ 35 tuổi. Trong khi đó, tỷ lệ trisomy 18, trisomy 13, Klinefelter và Turner
ở nhóm < 35 tuổi cao hơn nhóm 35 tuổi (lần lượt 1,6%, 0,4%, 0,2% và 0,2% so với
1,1%, 0%, 0% và 0%). Điều này xảy ra có thể do số lượng mẫu bất thường không
nhiều và chưa mang tính đại diện.
3.3. ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA QF-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN LỆCH BỘI
NHIỄM SẮC THỂ
Độ chính xác của kỹ thuật QF-PCR được đánh giá dựa trên các nghiên cứu so
sánh giữa kết quả karyotype và QF-PCR vì karyotype được xem là tiêu chuẩn vàng
trong chẩn đoán trước sinh các rối loạn NST.
Trong báo cáo nghiệm thu “Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR vào chẩn đoán nhanh
trước sinh rối loạn số lượng nhiễm sắc thể ở người” của Nguyễn Khắc Hân Hoan và
Phùng Như Toàn, QF-PCR có độ nhạy là 100%, độ đặc hiệu là 100%, giá trị tiên đoán
dương là 100% và giá trị tiên đoán âm là 100%.
Theo nghiên cứu của Cirigliano, V. và cộng sự, kỹ thuật QF-PCR có giá trị tiên
đoán dương là 100% và giá trị tiên đoán âm là 99,7%.
Những số liệu trên cho thấy, kỹ thuật QF-PCR có độ tin cậy cao trong việc
chẩn đoán trước sinh các rối loạn NST thường gặp ở những thai phụ có nguy cơ cao
39
trong sàng lọc trước sinh.
Kết quả – Biện luận
Thực tập Tốt nghiệp
3.4. ƢU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA KỸ THUẬT QF-PCR
Bảng 3.3. Bảng tóm tắt ưu điểm và hạn chế của QF-PCR
Ưu điểm Hạn chế
Thời gian thực hiện ngắn (36–48 giờ) Không phát hiện bất thường
cấu trúc NST Chi phí thấp
Phụ thuộc hóa chất và thiết bị Độ chính xác cao
nước ngoài Lượng mẫu ít (khoảng 0,5–1ml dịch
ối)
Tự động hóa, có thể thực hiện cùng
lúc nhiều mẫu
Ít tốn công lao động
Có thể phát hiện trường hợp khảm và
ngoại nhiễm tế bào mẹ
Những lợi ích mà kỹ thuật QF-PCR mang lại rõ ràng lớn hơn những hạn chế
nên kỹ thuật QF-PCR được nhiều bệnh viện lớn đặc biệt là ở các nước đang phát triển
như nước ta lựa chọn trong chẩn đoán trước sinh để phát hiện các rối loạn NST
40
thường gặp.
Kết luận – Đề nghị
Thực tập Tốt nghiệp
4.1. KẾT LUẬN
Sau khi kết thúc đề tài thực tập: “Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán
trước sinh các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp”, chúng tôi rút ra một số kết luận:
1. Ly trích DNA bằng kit InstaGene Matrix với số lần thao tác chuyển tube ít
giúp rút ngắn thời gian thực hiện và giảm công lao động nhưng vẫn đảm bảo lượng
DNA cần thiết.
2. Phản ứng PCR khuếch đại 32 locus đặc hiệu trên các NST 13, 18, 21, X và Y
với các marker có độ dị hợp tử cao thích hợp với người dân Việt Nam.
3. Các thông số đã được thiết lập trên máy điện di mao quản ABI 3500 cho kết
quả điện di phù hợp với tiêu chuẩn phân tích: các đỉnh tín hiệu không bị chẻ đôi, độ
cao từ 100 – 6000 rfu.
4. Trong tổng số 846 mẫu dịch ối, có 813 trường hợp bình thường chiếm 96,1%
và 33 trường hợp bất thường do rối loạn số lượng NST chiếm 3,9%. Trong đó, trisomy
21, trisomy 18 và trisomy 13 chiếm đa số. Trisomy 21 có tỷ lệ là 2% cao hơn các bất
thường khác như trisomy 18 (1,4%), trisomy 13 (0,2%), Klinefelter và Turner là 0,1%.
5. Khi so sánh mối tương quan giữa độ tuổi thai phụ và kết quả QF-PCR, nhóm
thai phụ 35 tuổi có tỷ lệ trisomy 21 cao hơn nhóm thai phụ < 35 tuổi. Trong khi đó,
tỷ lệ của các bất thường còn lại như trisomy 18, trisomy 13, Klinefelter và Turner
không mang tính đại diện.
7. Kỹ thuật QF-PCR có thể phát hiện trường hợp khảm và ngoại nhiễm tế bào
mẹ.
8. Kỹ thuật QF-PCR có độ chính xác cao với giá trị tiên đoán dương 100% và
41
giá trị tiên đoán âm là 99,7% .
Kết luận – Đề nghị
Thực tập Tốt nghiệp
4.2. ĐỀ NGHỊ
1. Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh rối loạn số lượng
NST 13, 18, 21 và NST giới tính thay thế cho karyotype trong những trường hợp thai
có nguy cơ cao được phát hiện dựa trên tuổi mẹ, xét nghiệm sàng lọc trước sinh hoặc
có dấu hiệu siêu âm bất thường.
2. Thực hiện thêm kỹ thuật karyotype nếu kết quả sàng lọc là bất thường với
nguy cơ rối loạn NST nhưng kết quả QF-PCR là bình thường.
3. Thực hiện thêm kỹ thuật FISH cho các trường hợp lệch bội thể khảm.
4. Sử dụng QF-PCR phối hợp với karyotype với những trường hợp thai phụ
hoặc chồng có rối loạn cấu trúc NST và các bất thường không thuộc các lệch bội NST
13, 18, 21 và NST giới tính.
5. Tiếp tục ứng dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh trên nhiều
42
loại mẫu khác như gai nhau, máu cuống rốn, mô thai.
Tài liệu tham khảo
Thực tập Tốt nghiệp
Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Như Hiền (2005), Di truyền tế bào, Nhà xuất bản Đại học quốc gia
Hà nội.
2. Nguyễn Thị Như Hoàng (2013), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF-PCR
(quantitative fluorescent polymerase chain reaction) trong chẩn đoán
nhanh trisomy 13, 18, 21, Luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa học tự nhiên,
Thành phố Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Thành Khôi (2011), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật MLPA để phát
hiện lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, Luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa học
tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh.
4. Trần Nguyễn An Phú (2012), Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR vào phát hiện
lệch bội nhiễm sắc thể trong chẩn đoán trước sinh trên mẫu gai nhau, Luận
văn thạc sĩ, Đại học Khoa học tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Thị Tân Sinh, Ngô Diễm Ngọc, An Thùy Lan, Đinh Thị Hồng
Nhung, Lê Thị Liễu, Nguyễn Thanh Liêm (2011), “Ứng dụng kỹ thuật lai
huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể
thường gặp”, Tạp chí Y học lâm sàng, số đặc biệt, 253-258.
6. Nguyễn Quỳnh Thơ (2011), Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hội chứng
Turner, Luận án Tiến sĩ Khoa Y sinh học di truyền, Đại học Y Hà Nội.
7. Lê Trần Anh Thư, Võ Hồ Quỳnh Như và cộng sự (2013), “Tầm soát phát
hiện thai nhi bị hội chứng Down ở các bà mẹ mang thai ba tháng đầu tại
bệnh viện Hoàn Mỹ Đà Nẵng”, Tạp chí Phụ sản, 11(1).
8. Cung Bình Trung & Cung Hồng Sơn (2007), Khái niệm về bệnh lý di truyền
ở người, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
9. Phan Thị Xinh (2013), Giới thiệu rối loạn gen do bất thường nhiễm sắc thể,
43
Tài liệu bộ môn huyết học – Trường Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh.
Tài liệu tham khảo
Thực tập Tốt nghiệp
Tài liệu tiếng Anh
10. Bili C. Divane A. & Apessos A. (2002), “Prenatal diagnosis of common
aneuploidies using quantitative fluorescent PCR”, Prenatal Diagnosis, 11,
767-774.
11. Carey, J.C. (2010), “Trisomy 18 and Trisomy 13 syndromes”, Management
of Genetic Syndromes (third ed.), John Wiley & Sons, Inc., 807-824.
12. Cirigliano, V., Voglino, G., Marongiu, A., Canadas, P., Ordonez, E.,
Lloveras, E., Plaja, A., Fuster, C. & Adinolfi, M. (2006), “Rapid prenatal
Diagnosis by QF-PCR: Evaluation of 30,000 consecutive clinical samples
and future applications”, The Annals of the New York Academy of Sciences,
1075, 288-298.
13. Devyser (2013), Devyser Complete v2 QF-PCR, Instruction for use,
Devyser AB.
14. Devyser (2013), Devyser Resolution v2 QF-PCR, Instruction for use,
Devyser AB.
15. Devyser (2013), Handbook Devyser Extend v2 RUO. Art. No.:8-A015,
Instruction for use, Devyser AB.
16. Donaldson MD, Gault EJ, Tan KW, Dunger DB (2006), “Optimising
management in Turner syndrome: from infancy to adult transfer”, Arch.
Dis. Child, 91(6), 513-520.
17. Elian P. & Juliano S. (2010), Handbook of Prenatal Diagnosis: Methods,
Issues & Health Impacts, Nova Science Publishers.
18. Kader, A.M.H.D. (2007), QF-PCR as a rapid technique to be introduced
into routine prenatal cytogenetic diagnosis, Protocol of thesis, Ain Shams
University, Egypt.
19. KESKIN L.H., et al. (2009), “The efficacy of quantitative fluorescent (QF-
PCR) in the diagnosis of prenatal aneuploidy”, Turk J Med Sci, 39(5), 741-
44
746.
Tài liệu tham khảo
Thực tập Tốt nghiệp
20. Mann, K. (2013), An introduction to QF-PCR, Devyser.
21. Mann, K., Donaghue, C., Fox, P.S., Docherty Z. & Ogilvie, M.C. (2004),
“Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy”,
European Journal of Human Genetics, 12, 907-915.
22. Mann, K., Ogilvie, C., Mountford, R. & McAnulty, C. (2012), QF-PCR for
the diagnosis of aneuploidy best practice guidelines v3.01, Association for
Clinical Cytogenetics and Clinical Molecular Genetics Society.
23. Nicolini, U., Lalatta, F., Natacci, F., Curcio, C. & Bui, T. H. (2004), “The
introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for
reconsideration”, Human Reproduction Update, 10(6), 541-548.
24. OpenStax College (2013), Chromosomal basis of inherited disorders, Rice
University.
25. Putzova, M., Pecnova, L., Dvorakova, L., Soldatova, I., Goetz, P. &
Stejskal,D. (2008), “OmniPlex-a new QF-PCR assay for prenatal diagnosis
of common aneuploidies based on evaluation of the heterozygosity of short
tandem repeat loci in the Czech population”, Prenat Diagn, 28(13), 1214-
1220.
26. Saadi, V., A., Kushtagi, P., Gopinath & Satyamoorthy, K. (2010),
“Quantitative fluorescence polymerase chain reaction (QF-PCR) for
prenatal diagnosis of chromosomal aneuploidies”, Int J Hum Genet, 10(1-
..
3), 121-129.
27. Schmidt, W., Jenderny, J., Hecher, K., Hackeloer, B., Kerber, S., Kochhan,
L. & R.Held, K., “Detection of aneuploidy in chromosome X, Y, 13, 18 and
21 by QF-PCR in 662 selected pregnancies at risk”, Molecular Human
Reproduction, 5(9), 855-860.
28. Speevak, M. D., Dolling, J., Terespolsky, D., Blumenthal, A. & Farrell, S.
A. (2008), “An algorithm for the prenatal detection of chromosome
anomalies by QF-PCR and G-banded analysis”, Prenat Diagn, 28(13),
1221-1226.
29. U.S. National library of medicine (2013), Klinefelter syndrome, USA
45
Government.
Tài liệu tham khảo
Thực tập Tốt nghiệp
30. Zhao Y. & Zou L. (2004), “Application of fetal DNA in maternal plasma in
noninvasive prenatal diagnosis”, J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,
24(1), 59-61.
Tài liệu Internet
31. http://thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/nghien-cuu-dac-diem-lam-sang-va-
bat-thuong-nhiem-sac-the-cua-hoi-chung-turner/4059.yhoc
32. http://thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/nghien-cuu-ung-dung-ky-thuat-qf-
pcr-trong-chan-doan-truoc-sinh-mot-so-hoi-chung-lech-boi-nst/3473.yhoc
33.
34. http://thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/nghien-cuu-bat-thuong-nhiem-sac- the-cua-hoi-chung-down-khi-bo-me-mang-chuyen-doan-can-bang-cua- nhiem-sac-the-21/5477.yhoc http://tudu.com.vn/vn/y-hoc-thuong-thuc/suc-khoe-phu-nu/lam-me-an-
toan/cham-soc-tre-so-sinh/hoi-chung-turner/
35. http://www.webtretho.com/forum/f92/sang-loc-truoc-sinh-phat-hien-som-
46
di-tat-bam-sinh-cua-thai-nhi-1903540/
