Đồ án tốt nghiệp: Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC TRICHODERMA KONINGII VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

Sinh viên thực hiện

: TRẦN THỊ YẾN NHI

MSSV: 1151110242 Lớp: 11DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của cá nhân em. Những kết quả và

số liệu trong báo cáo tốt nghiệp được thực hiện tại Viện sinh học nhiệt đới và phòng

thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, không sao chép bất kỳ

nguồn nào khác. Em hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan

này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 08 năm 2015

Sinh viên

Trần Thị Yến Nhi

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Kỹ

Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học

– Thực phẩm – Môi trường cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt

những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình học tập tại

trường. Đó là những hành trang quý giá giúp em hòa nhập tốt vào xã hội, góp một

phần sức lực nhỏ bé của mình vào công cuộc xây dựng đất nước.

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đỗ Thị Tuyến – người đã tạo

điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian

nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp.

Em xin cảm ơn Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. HCM và các anh chị phụ trách

phòng các hoạt chất có hoạt tính sinh học đã tạo điều kiện và hướng dẫn em hoàn

thành một số thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu tại đây.

Chân thành cảm ơn các thầy phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và tất cả

các bạn trong phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ trong lúc thực hiện đề

tài này.

Con xin gửi tình thương yêu và lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, mọi người

trong gia đình và những người luôn bên cạnh luôn sẵn sàng ủng hộ, chăm sóc, động

viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con trong mọi bước đường đi.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015

Sinh viên

Trần Thị Yến Nhi

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................... viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH...................................................................................... ix

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ .................................................................................... x

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1

1.1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................. 1

1.2. Tình hình nghiên cứu .................................................................................. 2

1.3. Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 3

1.4. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................... 3

1.5. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 3

1.6. Các kết quả đạt được của đề tài ................................................................. 3

1.7. Kết cấu của đồ án ......................................................................................... 4

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 5

2.1. Khái quát chung về enzyme ........................................................................... 5

2.1.1. Sơ lược về enzyme ..................................................................................... 5

2.1.2. Tính chất của enzyme ................................................................................ 6

2.1.2.1. Bản chất sinh học ................................................................................. 6

2.1.2.2. Bản chất hóa học .................................................................................. 7

2.2. Giới thiệu sơ lược về cellulose. ....................................................................... 7

2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase .......................................................... 9

2.3.1. Định nghĩa ................................................................................................. 9

2.3.2. Phân loại .................................................................................................. 10

2.3.3. Tính chất .................................................................................................. 10

Đồ án tốt nghiệp

2.3.3.1. Tính đặc hiệu ...................................................................................... 10

2.3.3.2. Đặc tính vật lý và hóa học .................................................................. 10

2.3.3.3. Các chất ức chế .................................................................................. 10

2.3.4. Cơ chế tác động của enzyme ................................................................... 11

2.3.4.1. Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) .................. 11

2.3.4.2. Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) .............................. 11

2.3.4.3. Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) ........................ 12

2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase . 12

2.3.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy ....................................................... 12

2.3.5.2. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 13

2.3.5.3. pH môi trường .................................................................................... 14

2.3.5.4. Độ ẩm ................................................................................................. 14

2.3.5.5. Môi trường không khí ........................................................................ 14

2.3.6. Ứng dụng của enzyme cellulase ............................................................. 14

2.3.6.1. Cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc ............................... 14

2.3.6.2. Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật ................... 15

2.3.6.3. Thủy phân gỗ và các phế liệu giàu cellulose ..................................... 15

2.4. Vi sinh vật tổng hợp cellulase ...................................................................... 15

2.4.1. Nấm sợi .................................................................................................... 15

2.4.2. Nấm mốc Trichoderma koningii ............................................................. 16

2.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase ..................... 17

2.5.1. Bã mía ...................................................................................................... 17

2.5.2. Cám gạo ................................................................................................... 17

2.6. Phương pháp lên men bề mặt ...................................................................... 19

Đồ án tốt nghiệp

2.7. Giới thiệu sơ lược về phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme ........ 20

2.8. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase .................................................. 22

2.8.1. Xác định hoạt tính exoglucanase ........................................................... 23

2.8.2. Xác định hoạt tính endoglucanase ......................................................... 23

2.9. Sơ lược về sắc ký lọc gel ............................................................................... 24

2.9.1. Bản chất của phương pháp ..................................................................... 24

2.9.2. Đặc tính của gel ....................................................................................... 25

2.10. Sơ lược về phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide ..... 26

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 28

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................... 28

3.2. Vật liệu ........................................................................................................... 28

3.2.1. Nguồn vi sinh vật ..................................................................................... 28

3.2.2. Cơ chất ..................................................................................................... 28

3.2.3. Hóa chất ................................................................................................... 28

3.3. Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 29

3.3.1. Thiết bị ..................................................................................................... 29

3.3.2. Dụng cụ .................................................................................................... 30

3.4. Môi trường ..................................................................................................... 31

3.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ........................................................ 31

3.5.1. Phương pháp phân tích độ ẩm cơ chất .................................................. 31

3.5.2. Phương pháp tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy ........................ 32

3.5.3. Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii.............................................. 32

3.5.3.1. Cấy giống trên môi trường thạch nghiêng PGA ................................ 32

3.5.3.2. Nhân giống trên môi trường lúa ......................................................... 33

iii

Đồ án tốt nghiệp

3.5.3.3. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase ......................... 34

3.5.4. Phương pháp mô tả hình thái T. koningii.............................................. 35

3.5.5. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu

............................................................................................................................ 36

3.5.6. Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô ................................................ 36

3.5.7. Khảo sát khả năng phân hủy cellulose ................................................... 36

3.5.8. Xác định hàm lượng proteintheo phương pháp Bradford .................... 37

3.5.9. Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) ........... 40

3.5.10. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp enzyme cellulase ........ 42

3.5.10.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất ............................................... 43

3.5.10.2. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ban đầu ....................... 43

3.5.10.3.Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu ................................................ 44

3.5.10.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng ................................. 45

3.5.10.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ..................................... 45

3.5.10.6. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống ................................................. 45

3.5.11. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm ................................................. 46

3.5.12. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch enzyme và dung môi tủa enzyme . 47

3.5.12.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa dịch enzyme và dung môi tủa .. 47

3.5.12.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi tủa enzyme ........................ 48

3.5.13. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase ......... 48

3.5.13.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme cellulase .... 48

3.5.13.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cellulase

......................................................................................................................... 48

3.5.13.3. Hoạt tính enzyme cellulase của dịch chiết thô ................................. 48

Đồ án tốt nghiệp

3.5.14. Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel ............ 49

3.5.14.1. Nguyên tắc ....................................................................................... 49

3.5.14.2. Hóa chất và dụng cụ ......................................................................... 49

3.5.14.3. Tiến hành thí nghiệm ....................................................................... 49

3.5.15. Phương pháp điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide ....... 51

3.5.16. Phương pháp bố trí và xử lý số liệu ...................................................... 55

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 56

4.1. Khảo sát hình thái đại thể và vi thể của chủng T.koningii ........................ 56

4.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy cellulose trên đĩa thạch ...... 57

4.3. Kết quả định lượng mốc giống bằng buồng đếm hồng cầu ...................... 57

4.4. Kết quả xác định độ ẩm cơ chất .................................................................. 58

4.5. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

cellulase trên môi trường lên men bán rắn ....................................................... 59

4.5.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ BM:CG đến khả năng sinh tổng hợp cellulase ... 59

4.5.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp cellulase

............................................................................................................................ 60

4.5.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu khả năng sinh tổng hợp cellulase ........... 61

4.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng đến khả năng sinh tổng hợp

cellulase .............................................................................................................. 62

4.5.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

cellulase .............................................................................................................. 64

4.5.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp cellulase ....... 65

4.6. Quy hoạch thực nghiệm ............................................................................... 66

4.7. Khảo sát tỷ lệ tủa và chọn ra loại dung môi tủa enzyme cellulase tốt nhất

............................................................................................................................... 71

Đồ án tốt nghiệp

4.7.1. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi ethanol ........... 71

4.7.2. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi acetone ........... 73

4.7.3. Khảo sát chọn ra dung môi tủa enzyme tối ưu ...................................... 74

4.8. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase .. 75

4.8.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase ............... 75

4.8.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase ....... 76

4.9. Tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc lọc gel ............................................... 77

4.10. Kết quả phân tách hệ cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS

– PAGE ................................................................................................................. 79

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 82

5.1. Kết luận .......................................................................................................... 82

5.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 83

PHỤ LỤC

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BM:CG : Bã mía và cám gạo

: Coomasie brilliant blue CBB

: Carboxymethyl cellulose CMC

CMCase : Carboxymethyl cellulase

: 3,5-dinitrosalicylic acid DNS

: Dithiothreitol DTT

EC : Enzyme commission number (tiểu ban về enzyme)

FPA : Filter paper activity (hoạt tính giấy lọc)

HEC : Hydroxyethyl cellulose

HL : Hàm lượng protein (mg)

HT : Hoạt tính enzyme (U)

HTR : Hoạt tính riêng (U/mg)

MT : Môi trường

MW : Molecular weight (trọng lượng phân tử)

NĐC : Nồng độ chuẩn

OD : Optical density (trị số mật độ quang)

PGA : Potato glucose agar

SDS – PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel

Electrophoresis

T. koningii : Trichoderma koningii

TEMED : N, N, N’, N’ – Tetramethyl – ethylenediamine

U : Đơn vị hoạt tính enzyme

VSV : Vi sinh vật

vii

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Hàm lượng các chất trong cám gạo .......................................................... 18

Bảng 2.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase ................................................ 22

Bảng 3.1. Thành phần các chất trong môi trường Czapek ....................................... 31

Bảng 3.2. Môi trường xác định khả năng sinh enzyme cellulase của vi sinh vật ..... 37

Bảng 3.3. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Albumine ............................................... 39

Bảng 3.4. Thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose ................................................... 41

Bảng 3.5. Bảng bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính CMCase ................................. 42

Bảng 3.6. Bảng bố trí thí nghiệm tỷ lệ cơ chất ......................................................... 43

Bảng 3.7. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ......... 44

Bảng 3.8. Khảo sát tỷ lệ giữa dung môi tủa và dịch enzyme ................................... 47

Bảng 3.9. Thành phần các chất trong gel phân tách ................................................. 53

Bảng 3.10. Thành phần các chất trong gel gom ....................................................... 54

Bảng 4.1. Kết quả đo độ ẩm cơ chất BM:CG ........................................................... 59

Bảng 4.2. Các giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

cellulase của T. koningii trước quy hoạch thực nghiệm ............................................ 66

Bảng 4.3. Mã hóa các biến số ................................................................................... 66

Bảng 4.4. Ma trận kế hoạch hóa ............................................................................... 67

............................................................................................................................................. 68

Bảng 4.5. Kết quả hoạt tính CMCase theo thực nghiệm và theo phương trình hồi quy

Bảng 4.6. Kết quả 𝑏𝑗 và 𝑏𝑖𝑗 ....................................................................................... 69

Bảng 4.7. Giá trị trung bình của 3 thí nghiệm trung tâm .......................................... 69

Bảng 4.8. Giá trị hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase

khi tủa bằng dung môi ethanol 960 và dung môi acetone ......................................... 74

Bảng 4.9. Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel ...................................................... 78

Bảng 4.10. Giá trị 𝑅𝑓 và log của các protein trong thang chuẩn .............................. 79

Bảng 4.11. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 2 .................. 81

Bảng 4.12. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 3 .................. 81

Bảng 4.13. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 4 .................. 81

viii

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose ................................................................ 7

Hình 2.2. Cấu trúc của enzyme cellulase ................................................................... 9

Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của exoglucanase ......................................................... 11

Hình 2.4. Cơ chế hoạt động của endoglucanase ....................................................... 11

Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của cellobiase .............................................................. 12

Hình 2.6. Hình thái nấm Trichoderma koningii ....................................................... 16

Hình 2.7. Bã mía ....................................................................................................... 17

Hình 2.8. Cám gạo .................................................................................................... 17

Hình 2.9. Quá trình tách các phân tử bằng sắc ký lọc gel ........................................ 24

Hình 4.1. Nấm mốc T. koningii sau khi nuôi cấy 2 ngày (hình a) và 4 ngày (hình

b) ................................................................................................................................ 56

Hình 4.2. Nấm mốc T. koningii chụp ở vật kính 40X bằng kính hiển vi (hình c) và

kính hiển vi điện tử (hình d) ...................................................................................... 56

Hình 4.3. Vòng phân giải CMC của nấm mốc T. koningii 18 mm sau 24 giờ (hình

e), 25 mm sau 32 giờ (hình f) và 35 mm sau 48 giờ (hình g) ................................... 57

Hình 4.4. Bào tử nấm T. koningii được quan sát dưới kính hiển vi ......................... 58

Hình 4.5. Sắc ký đồ tinh sạch enzyme cellulase ...................................................... 78

Hình 4.6. Kết quả điện di .......................................................................................... 79

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.

koningii có tỷ lệ cơ chất BM:CG khác nhau ............................................................. 59

Đồ thị 4.2. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.

koningii có độ ẩm ban đầu khác nhau ....................................................................... 61

Đồ thị 4.3. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.

koningii có pH ban đầu khác nhau ............................................................................ 62

Đồ thị 4.4. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.

koningii có nồng độ dinh dưỡng khác nhau .............................................................. 63

Đồ thị 4.5. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.

koningii có thời gian nuôi cấy khác nhau .................................................................. 64

Đồ thị 4.6. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.

koningii có tỷ lệ giống khác nhau ............................................................................. 65

Đồ thị 4.7. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa dịch

chiết enzyme cellulase với dung môi ethanol ........................................................... 72

Đồ thị 4.8. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa dịch

chiết enzyme cellulase với dung môi acetone ........................................................... 73

Đồ thị 4.9. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase

khi được tủa bằng dung môi ethanol 96° và dung môi acetone ................................ 74

Đồ thị 4.10. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những pH khác nhau ....... 75

Đồ thị 4.11. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những nhiệt độ khác nhau 76

Đồ thị 4.12. Sự tương quan giữa log (trọng lượng phân tử) của những protein trong

thang chuẩn với 𝑅𝑓 .................................................................................................... 80

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1. Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay, cuộc sống hiện đại với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật,

các ngành khoa học ứng dụng ngày càng được áp dụng nhiều hơn vào thực tế góp

phần giúp cho đời sống con người ngày càng được nâng cao và hoàn thiện. Trong đó,

ngành công nghệ sinh học là có nhiều ứng dụng và nghiên cứu triển vọng, đặc biệt là

trong lĩnh vực sản xuất và nghiên cứu về enzyme.

Nhân tố quan trọng để thúc đẩy ngành công nghiệp enzyme phát triển là khả

năng to lớn của vi sinh vật. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh chóng,

do đó có khả năng đáp ứng được mọi nhu cầu của con người, đồng thời enzyme do

vi sinh vật tạo ra có hoạt lực cao. Bên cạnh đó, môi trường nuôi cấy vi sinh vật cho

phép chúng ta có thể tận dụng được các phế thải của các ngành khác.

Nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn

như: rơm rạ, trấu, bã mía, agar,…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose.

Cellulose có thể bị phân hủy bằng phương pháp vật lý và hóa học nhưng việc này rất

phức tạp. Trong khi đó, nếu sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật

bằng công nghệ sinh học để xử lý các chất thải hữu cơ sẽ có nhiều điểm ưu việt hơn

kể cả về mặt kỹ thuật, môi trường cũng như về kinh tế.

Hằng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzyme

cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm môi trường. Mặt khác, số

lượng loài vi sinh vật tham gia tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên

rất phong phú như nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn,…Nấm Trichoderma spp hiện diện

gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác với mật độ

cao. Các nhà khoa học phân lập thành công chủng nấm mốc Trichoderma koningii để

tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả và giá thành lại rẻ. Bên cạnh đó,

celluase được ứng dụng rộng rãi trong các ngành và lĩnh vực khác nhau như công

nghiệp, nông nghiệp, y học,…Vì vậy, việc sản xuất được một lượng lớn enzyme

cellulase với chi phí thấp là một điều rất cần thiết. Và để thu nhận được enzyme

cellulase một cách hiệu quả nhất thì ta cần khảo sát các điều kiện, yếu tố ảnh hưởng

Đồ án tốt nghiệp

đến môi trường sinh tổng hợp tối ưu của enzyme này nhằm tạo ra sản phẩm sinh học

có giá trị cao trong ứng dụng.

1.2. Tình hình nghiên cứu

Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về khả năng sinh tổng hợp

enzyme cellulase từ Trichoderma koningii (T. koningii), nhưng trên thế giới đã có

nhiều đề tài nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme của T. koningii.

Theo Cui Fumian và cộng sự (1995), thí nghiệm khảo sát khả năng sinh tổng

hợp enzyme cenllulase đã được thực hiện bằng cách phát triển các giống đột biến trên

môi trường bán rắn bao gồm 3 g bột rơm, 2 g cám lúa mì và 10 ml ammonium sulfate

1% trong 250 ml bình ở 280C, 72 giờ tại pH ban đầu là 6,0. Với hiệu suất tổng hợp

enzyme cellulase là 4880 U/g carboxymethyl cellulose – Na và 480 U/g trên sợi bông.

Hoạt tính enzyme cellulase từ chủng đột biến là gấp 3 lần so với chủng mẹ. Các điều

kiện tối ưu cho hoạt động enzyme trên bông là pH 4,5 – 5,0 và 45 – 500C. Enzyme

ổn định ở mức pH 3,5 – 6,5 ở 450C trong 4 giờ. Sau khi ủ men ở 600C trong 1 giờ,

vẫn còn 20% hoạt tính của enzyme cellulase.

Theo Liu Xiao-jie và cộng sự (2003), khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

của T. koningii trên môi trường bột rơm đã có tác động tốt, trong khi môi trường

(NH4)2SO4 có tác động tiêu cực đến sinh tổng hợp enzyme cellulase. Hoạt tính mạnh

nhất của enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase), hoạt tính giấy lọc (FPA) và β –

glucosidase lần lượt là 765,8 U/ml, 155,3 U/ml và 39,54 U/ml, tương ứng với môi

trường nuôi cấy tối ưu hóa sau 6 ngày.

Theo Zou Shui – yang và cộng sự (2011), điều kiện nuôi cấy được tối ưu cho

nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase từ T. koningii đã được thiết lập như sau:

tỷ lệ rơm : cám là 3 : 2 (w/w), tỷ lệ dinh dưỡng môi trường là 1:1,5 (w/v), pH ban đầu

là 5,5 và nuôi cấy trong 120 giờ ở 28,50C. Với điều kiện tối ưu trên, hoạt tính giấy

lọc, β – glucosidase và xylanase lần lượt là 13,1 U/g chất khô, 12,2 U/g chất khô và

994,7 U/g chất khô.

Theo Wang S và cộng sự (2013), các gen sản sinh enzyme cellulase và

xylanase của nấm Trichoderma tồn tại dưới dạng sợi carbon catabolite áp trung gian

Đồ án tốt nghiệp

bởi các hoạt hóa dị hóa carbon (CRE1). Việc sản xuất enzyme có thể được cải thiện

hơn nữa bằng cách bất hoạt gen CRE1. Việc bất hoạt gene CRE1, dẫn đến thay đổi

biểu hiện gen sinh enzyme cellulase trong nuôi cấy cơ bản trên đường. Kết quả là

hoạt tính giấy lọc, hoạt tính β – 1,4 – exoglucanase, hoạt tính β – 1,4 – edoglucanase

và hoạt tính xylanase đã thay đổi trên lần lượt là 2,1, 1,4, 0,8 và 0,8 lần. Việc can

thiệp vào RNA là một phương pháp khả thi để phân tích các cơ chế quản lý biểu hiện

gen và cải thiện năng suất sinh enzyme xylanase và enzyme cellulase trong T.

koningii.

1.3. Mục đích nghiên cứu

Làm cơ sở nghiên cứu để sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trichoderma

koningii một cách tối ưu nhất.

1.4. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Quan sát đại thể và vi thể hình thái của nấm mốc Trichoderma koningii.

- Thu nhận enzyme cellulase từ việc nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii

trên môi trường bán rắn.

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase

của Trichoderma koningii.

- Khảo sát tỷ lệ tủa và chọn ra dung môi tủa enzyme cellulase tốt nhất.

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase.

- Tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel.

- Phân tách hệ enzyme cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE.

1.5. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm.

- Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2010 và

stagraphic plus.

1.6. Các kết quả đạt được của đề tài

- Thu được enzyme cellulase.

- Có được các thông số tối ưu quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase của

Trichoderma koningii.

Đồ án tốt nghiệp

- Bước đầu tạo chế phẩm enzyme cellulase bằng phương pháp kết tủa.

- Tinh sạch được enzyme cellulase.

1.7. Kết cấu của đồ án

Đồ án tốt nghiệp gồm 5 chương:

Chương 1: Mở đầu.

Chương 2: Tổng quan tài liệu.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.

Chương 4: Kết quả và thảo luận.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Khái quát chung về enzyme

2.1.1. Sơ lược về enzyme (Lê Minh Trí, 2011)

Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme

có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng

hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng

ngoài tế bào (invitro). Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi

là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học

khác.

Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra

trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay

kiềm mạnh,…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp

nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng

(370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh,…).

Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả

năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một

kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất.

Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận

enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể vi sinh vật. Tất cả các tế bào

động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa nhiều enzyme thì hoàn toàn khác nhau.

Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:

- Động vật (hạn chế)

- Thực vật (hạn chế)

- Vi sinh vật (phổ biến)

Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu

thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế.

Đồ án tốt nghiệp

Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau:

- Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn.

- Hệ enzyme có vi sinh vật vô cùng phong phú.

- Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng

tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng

trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là

rất cao.

- Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh.

- Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể

tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể

dễ dàng điều khiển các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu

được hiệu suất cao trong sản xuất.

- Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô công

nghiệp.

2.1.2. Tính chất của enzyme (Nguyễn Văn Mùi, 2011)

2.1.2.1. Bản chất sinh học

Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen.

Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng

cả trong và ngoài tế bào. Một gen  một enzyme  một phản ứng.

Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ sinh

vật, các enzyme thu nhận từ nguồn sinh vật như rau quả thông dụng không có tính

chất gây độc.

Đa số các enzyme hoạt động xúc tác trong các phản ứng sinh học ở điều kiện

nhiệt độ 20 – 450C, 1 atm, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính.

Mỗi enzyme tham gia xúc tác đặc hiệu với một cơ chất nhất định, vận tốc phản

ứng tăng gấp nhiều lần so với chất xúc tác sinh học, vì vậy enzyme cần dùng với

lượng rất nhỏ. Có thể điều chỉnh hay ngừng phản ứng bằng nhiệt độ, pH, …

Đồ án tốt nghiệp

2.1.2.2. Bản chất hóa học

Gồm hai nhóm:

- Nhóm enzyme đơn cấu tử: enzyme chỉ được cấu tạo bởi một thành phần duy

nhất là protein.

- Nhóm enzyme đa cấu tử: là những loại enzyme mà được cấu tạo bởi hai thành

gồm: một thành phần là protein và thành phần còn lại không phải protein.

Thành phần này là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình

xúc tác.

2.2. Giới thiệu sơ lược về cellulose.

Hằng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp ra nhờ

quá trình quang hợp. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần

chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40 – 50% trong gỗ (Lê

Ngọc Tú và cộng sự, 1982).

Hình 2.1. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose (http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch05/cellulose.html)

Ligno – cellulose là thành phần cấu trúc chính của cây gỗ và cây thân mềm

(cỏ, rơm rạ) gồm cellulose, hemicellulose và lignin (Hamelinck và cộng sự, 2003).

Cellulose (40 – 60% trọng lượng khô) là polymer thẳng của các đơn vị β-D-1,4-

Đồ án tốt nghiệp

glucan. Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen cho thấy, cellulose có cấu tạo

dạng sợi. Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi là các microfibril có cấu

trúc không đồng nhất, có những phần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn

(phần vô định) (Lê Ngọc Tú và cộng sự, 1982), (Hamelinck và cộng sự, 2003).

Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững, không tan trong

nước mà chỉ có thể bị phồng lên do hấp thu nước, bị phân hủy khi đun nóng với acid

hoặc kiềm ở nồng độ khá cao. Cellulose bị thủy phân ở nhiệt độ bình thường hoặc ở

nhiệt độ 40 – 500C nhờ các ezyme thủy phân cellulose – được gọi chung là cellulase

(Lê Ngọc Tú và cộng sự, 1982).

Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20

– 40% trọng lượng khô), đây là loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide

như galactose mananose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl; do bản chất

không kết tinh nên hemicellullose tương đối dễ bị thủy phân. Cellulose còn liên kết

chặt chẽ với lignin (10 – 25% trọng lượng khô). Đây là thành phần ảnh hưởng rất

nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzyme. Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ

trong sợi bông) cellulose tồn tại trong trạng thái một polymer gần tinh khiết (Lê Ngọc

Tú và cộng sự, 1982), (Hamelinck và cộng sự, 2003).

Khoảng một nửa hợp chất carbon trong sinh khối trên mặt đất là cellulose. Tất

cả sản phẩm sinh khối sẽ được khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme của vi sinh vật

(VSV). Hệ thống enzyme phân giải cellulose thường chậm và không hoàn toàn –

cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Các chủng VSV như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn

có khả năng phân hủy mạnh cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ cellulase.

Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất

này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp hóa chất, nhiên liệu, thực

phẩm, rượu và bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy và bột giấy (Hamelinck và

cộng sự, 2003).

Đồ án tốt nghiệp

2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase

2.3.1. Định nghĩa (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013)

Hình 2.2. Cấu trúc của enzyme cellulase

(http://sci.waikato.ac.nz/farm/content/microbiology.html)

Cellulase là hệ enzyme xúc tác phản ứng cho quá trình chuyển hóa cellulose

thành sản phẩm hòa tan. Phức hệ enzyme cellulase là enzyme khá phức tạp. Một mặt,

cellulase tương tự enzyme cảm ứng (mà ở đây cellulose lại là chất cảm ứng chặt chẽ),

mặt khác chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu kiểm soát

bởi cơ chế dị hóa.

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các acid

amin này được nối với nhau bởi liên kết peptid -CO-NH-. Cấu trúc không gian

cellulose bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian.

Cấu trúc không gian khoảng 280 – 600 acid amin nhưng chiều dài cellulase

thường khoảng 300 – 450 acid amin và trung tâm xúc tác có khoảng 250 acid amin.

Cellulase là một loại homopolymer của β-D-glucose được nối với nhau qua

liên kết β-D-1,4-glucan. Hệ thống enzyme thủy phân cellulose bao gồm ít nhất 3

enzyme khác nhau: endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase,

Đồ án tốt nghiệp

EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-β-D glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91) và β-

glucosidase (β-D-glucosid glucohydrolase, EC.3.2.1.21). Các enzyme này có tính đặc

hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau. Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết 1,4-

β-D glucoside trong phân tử cellobiose và sau cùng β-glucosidase phân cắt cellobiose

thành glucose.

2.3.2. Phân loại

Theo phân loại của Hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế (IUBMB –

International Union pf Biochemistry and Molecular Biology) hệ thống các enzyme

thủy phân cellulose gồm có endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase có

ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucansidase có ký hiệu EC 3.2.1.21 (Huỳnh Thị Hồng

Sương, 2013).

2.3.3. Tính chất (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013)

2.3.3.1. Tính đặc hiệu

Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucoside trong cellulose và các β-

D-glucan của ngũ cốc. Người ta cho rằng đầu tiên exoglucanase tác động trên các đầu

chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là cellulobiose, β-glucosidase thủy phân các

gốc β-D-glucose cuối cùng từ các đầu phân tử cellulose.

2.3.3.2. Đặc tính vật lý và hóa học

Theo nghiên cứu, hầu hết các cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và thành

phần acid amin giống nhau. Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau.

Bên cạnh hoạt tính cellulase, các chế phẩm cellulase thường chứa các hoạt động khác

của enzyme và các hoạt động này có ảnh hưởng đến đặc tính của chế phẩm.

Cenllulase hoạt động ở pH từ 3 – 7, nhưng pH tối ưu trong khoảng 4 – 5. Nhiệt

độ tối ưu từ 40 – 500C. Hoạt tính cellulase bị phá huỷ hoàn toàn ở 800C trong 10 đến

15 phút.

2.3.3.3. Các chất ức chế

Cellulase bị ức chế bởi chính các sản phẩm phản ứng được tạo ra như glucose,

cellobiose. Thủy phân ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác nhau như

Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ.

Đồ án tốt nghiệp

2.3.4. Cơ chế tác động của enzyme

2.3.4.1. Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) (Nguyễn Hoàng

Phúc và những cộng sự, 2012)

Enzyme này còn có tên gọi khác như: exoglucanase, cellobiohydrolase, exo-

cellobiohydrolase, exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase, 1,4-β-D-glucan

cellobiohydrolase, cellobiosidase, CBH 1, C1 cellulase, avicelase.

Enzyme này thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ đầu không khử của chuỗi

cellulose để tạo thành cellobiose.

Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của exoglucanase (http://worthington-biochem.com/cel/images/reactionExo)

2.3.4.2. Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) (Nguyễn Hoàng Phúc và

những cộng sự, 2012)

Enzyme này còn có tên gọi khác như: Endoglucanase, Endo-1,4-β-D-

glucanase, Endo-1,4-β-D-glucanase, β-1,4-endoglucan hydrolase, Carboxymethyl

cellulase, Celludextrinase, Cellulase A, Cellulosin AP, Alkali Cellulase, Cellulase

A3, 9.5 Cellulase, Avicelase, Pancellase SS.

Hình 2.4. Cơ chế hoạt động của endoglucanase (http://worthington-biochem.com/cel/images/reactionEndo)

Đồ án tốt nghiệp

Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của

chuỗi cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc.

2.3.4.3. Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) (Nguyễn Hoàng Phúc

và những cộng sự, 2012)

Enzyme này có tên gọi khác như là: β-glucosidase, β-D-glucosidase, β-1,6-

glucosidase, β-glucoside glucohydrolase, p-nitrophenyl β-glucosidase, aryl-β-

glucosidase, gentiobiase, cellobiase, emulsin, elaterase, arbutinase, amygdalinase,

primeverosidase, amygdalase, limarase, salicilinase.

Enzyme này thủy phân gốc β-D-glucoside không khử ở đầu tận cùng để phóng

thích ra β-D-glucose.

Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của cellobiase (http://worthington-biochem.com/cel/images/reactionCello)

2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

2.3.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy

 Nguồn carbon (Lương Đức Phẩm, 1998)

Theo lý thuyết sinh tổng hợp cảm ứng, trong môi trường nuôi cấy các vi sinh

vật tổng hợp enzyme cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất cảm ứng và nguồn

carbon.

Những nguồn cellulose có thể là giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô, mạt

cưa, bã củ cải, rơm, than bùn. T. lignorum và T. koningii được nuôi trên môi trường

có nguồn carbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme cao nhất. Kết quả tương tự như vậy

khi nuôi Myrothecium verucaria trên môi trường có giấy lọc và lõi ngô, bã củ cải.

Chất cảm ứng enzyme cellulase còn là cellobiose octaacetate, cám mì, lactose, salixyl.

Đồ án tốt nghiệp

Đối với Stachy botrys atra nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợp cellulase là tinh

bột.

Các nguồn carbon khác (glucose, cellobiose, acetate, citrat, oxalate, succinat

và những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs) có tác dụng kìm hãm sinh tổng

hợp cellulase. Nhưng trong môi trường có nồng độ glucose thấp có tác dụng kích

thích vi sinh vật phát triển, không cảm ứng tổng hợp enzyme.

 Nguồn Nitơ (Lương Đức Phẩm, 1998)

Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh cellulase là

muối nitrate. Đối với các giống của bộ nấm bông (hyphomycetales) nguồn nitơ tốt

nhất lại là (NH4)2HPO4. Nó chung các muối amon ít có tác dụng nâng cao hoạt tính

enzyme này thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì trong môi trường nuôi cấy,

các muối này làm acid hóa môi trường. Do đó, ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme

và thậm chí có thể làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành.

Natri nitrate làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo

thành cellulase. Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp

cellulase. Điều này phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng giống. Cao ngô và

cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt tính cellulase của vi sinh vật; nhưng với cao

ngô, khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase cao hơn cao nấm men.

 Các nguyên tố khoáng (Lương Đức Phẩm, 1998)

Các nguyên tố khoáng như: Fe, Mn, Zn, Mo, Cu có ảnh hưởng rõ đến khả năng

tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Trong đó Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo

thành enzyme này ở nhiều chủng. Nồng độ tối thích của Zn là 1,11 – 2,2 mg/l, Fe 2 –

10 mg/l, Mn 3,4 – 27,2 mg/l.

2.3.5.2. Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự phát triển và sinh tổng hợp

enzyme của vi sinh vật. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp đối với việc sinh trưởng và tích

lũy cellulase của nhiều loại nấm khác nhau thường ở nhiệt độ 28 – 300C.

Đồ án tốt nghiệp

2.3.5.3. pH môi trường (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009)

pH của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng

sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật, đối với những loài vi sinh vật.

2.3.5.4. Độ ẩm (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009)

Độ ẩm không những ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh

vật mà còn ảnh hưởng đáng kể đến đặc tính lý hóa của cơ chất. Các cơ chất khác nhau

có khả năng giữ nước khác nhau. Do đó, quá trình lên men bán rắn được thực hiện

với hàm lượng nước trong cơ chất khác nhau từ 30 – 80%.

2.3.5.5. Môi trường không khí (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009)

Vi sinh vật hiếu khí thì môi trường nuôi cấy cần đảm bảo cung cấp đủ oxy để

vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng thường để

trên máy lắc, môi trường bán rắn thì cơ chất phải có độ xốp tạo sự thông thoáng giữa

các tiểu phần cơ chất. Ngược lại vi sinh vật kỵ khí chỉ phát triển trên môi trường

không có sự hiện diện của oxy. Ngoài ra cũng có vi khuẩn sống được cả hai điều kiện

trên.

2.3.6. Ứng dụng của enzyme cellulase

2.3.6.1. Cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc

Sử dụng phối hợp enzyme cellulase với các enzyme thủy phân khác như

pectinase, hemicellulase,…trong quá trình ủ cỏ xanh có tác dụng phân giải thành tế

bào thực vật, do đó tăng nguồn dinh dưỡng cho các nhóm vi khuẩn lactobacillus lên

men sinh acid lactic, ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh có hại khác.

Trong chăn nuôi (với động vật ăn cỏ) nấu thức ăn có trộn thêm cellulase sẽ

tăng sự tiêu hóa, hấp thụ thức ăn cho động vật, đặc biệt động vật ăn còn non có hệ

tiêu hóa chưa hoàn chỉnh, do đó sẽ làm giảm chi phí thức ăn cho động vật và chúng

sẽ tăng trọng nhanh hơn.

Đồ án tốt nghiệp

2.3.6.2. Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật

Cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật giúp cho việc trích ly các chất từ thực

vật, từ cây thuốc được dễ dàng. Sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào thực vật, tế

bào thực vật mất vách cellulose trở thành tế bào trần. Sử dụng tế bào trần để nghiên

cứu lai tế bào nhằm tạo ra các tế bào lai có những tính trạng mới theo hướng mong

muốn, tế bào trần còn được sử dụng để tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gene.

2.3.6.3. Thủy phân gỗ và các phế liệu giàu cellulose

Cellulase được ứng dụng trong sản xuất glucose, mật đường từ nguyên liệu

giàu cellulose như rơm rạ, mạt cưa, gỗ vụn (thay dần cho phương pháp thủy phân

bằng acid) dùng làm thức ăn cho người và động vật.

Dịch đường sau khi đã thủy phân làm nguồn nuôi cấy nấm men rất tốt. Sử

dụng cellulase của T. viride để chuyển hóa nguyên liệu có cellulose thành ethanol

đang được nghiên cứu và áp dụng. Theo biện pháp này, nếu tận dụng được ba triệu

tấn cellulose trong phế liệu hằng năm ở Mỹ thì có thể thỏa mãn tới 20% nhu cầu nhiên

liệu của nước này. Người ta thấy rằng nếu trộn xăng với ethanol sẽ làm giảm đáng kể

chi phí nhiên liệu cho các loại xe máy, ô tô và bớt khói bụi.

2.4. Vi sinh vật tổng hợp cellulase

2.4.1. Nấm sợi

Nấm sợi còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất ở

môi trường khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Trong tự nhiên nấm sợi phân bố rộng rãi và

tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải các chất

hữu cơ và hình thành chất mùn (Võ Thị Bích Viên, 2009).

Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống

Alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Pinicillium, Cladosporum.

Trong đó hai giống nấm sợi là Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa

học nghiên cứu để sản xuất cellulase.

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2. Nấm mốc Trichoderma koningii (Clipson, 2001)

Trichoderma koningii được phân loại như sau:

Lớp: Sordariomycetes

Bộ: Hypocreales

Họ: Hypocreacea

Giống: Trichoderma

Loài: T. koningii

 Đặc điểm: Hình 2.6. Hình thái nấm Trichoderma koningii

T. koningii hiện diện nhiều ở lớp đất mặt nhưng ở độ sâu 120 cm vẫn có sự

hiện diện của loài nấm này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ từ 260C trở lên tùy theo

nguồn gốc của loài. pH cho sự phát triển của nấm là 3,7 – 6,0 (Domsch và Gams,

1980).

Khuẩn lạc có đường kính 3 – 5 cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200C, bào

tử đính có dạng hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước (3,0 – 4,8 µm) x (1,3 – 2,8

µm).

 Khả năng phân hủy chất hữu cơ của nấm Trichoderma spp.

Nấm Trichoderma spp. đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy dư thừa

thực vật có trong đất (Kredics và cộng sự, 2003). Theo Klein và Eveleigh (1998),

nấm Trichoderma spp. hiện diện khắp nơi, sống hoại sinh và có khả năng phân hủy

nhanh các chất hữu cơ trong tự nhiên. Khả năng phân hủy cellulose của nấm

Trichoderma spp. bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như: ẩm độ, độ thoáng khí,

pH, hàm lượng nitrogen (Alexander, 1962).

Chế phẩm nấm Trichoderma spp. được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm

rạ, sau đó được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ. Phân

hữu cơ được bón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng. Kết

quả nghiên cứu hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân

hữu cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50%

Đồ án tốt nghiệp

phân hữu cơ với 50% phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46%.

Khi bón 100% phân hữu cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trễ hơn và ít gây

hại cho cây lúa và quần thể vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn

so với bón 100% phân vô cơ (Lưu Hồng Mẫn và cộng sự, 2001).

2.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase

2.5.1. Bã mía

Bã mía chiếm 25 – 30% trọng

lượng mía đem ép.Thành phần trung bình

của bã mía:

- Nước: khoảng 40 – 50%.

- Xơ: khoảng 45 – 48% (trong đó

45–55% là cellulose).

- Chất hoà tan (đường): 2,5%.

Tùy theo loại mía và đặc điểm nơi

Hình 2.7. Bã mía trồng mía mà thành phần hoá học các chất

có trong bã mía khô (xơ) có thể biến đổi. Thành phần của bã mía sau khi rửa sạch và

sấy khô gồm: cenlulose khoảng 45 – 55%, hemicellulose khoảng 20 – 25%, lignin

khoảng 18 – 24 %, tro 1 – 4%, sáp: <1%,…

2.5.2. Cám gạo (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009)

Cám gạo là sản phẩm phụ của

quá trình xay xát và chế biến gạo.

Cám gạo có giá trị khá cao. Cám được

thu hồi dưới 2 dạng là cám khô và

cám ướt. Cám gạo thường có dạng

bột, mềm và mịn. Cám gạo chiếm

khoảng 10 – 12% khối lượng lúa chưa

xay xát. Cám gạo thường được cho

các loại gia súc và thủy sản ăn chứ Hình 2.8. Cám gạo

không cho người. Nguyên nhân là do

Đồ án tốt nghiệp

cám gạo có một số enzyme (chất men) nội tại hoạt động rất mạnh mẽ sẽ oxy hóa các

nhóm béo chưa no của cám rất nhanh chỉ vài giờ sau khi chế biến tạo mùi hôi khó

chịu. Thêm vào đó công nghệ xay xát gạo chưa cao lại ít được đầu tư theo hướng thu

cám sạch nên cám thường lẫn rất nhiều loại tạp chất (vỏ trấu, sạn đá). Vì lý do này

mà hầu hết lượng cám thu được thường được bà con nông dân dùng làm thức ăn cho

các loại gia súc, gia cầm. Hằng năm trên thế giới có khoảng 40 – 45 triệu tấn cám

được sản xuất và 90% là nằm ở châu Á.

Bảng 2.1. Hàm lượng các chất trong cám gạo

Thành phần Khối lượng/100g

Calori 316 KJ

Tổng số lipid 21 g

Chất béo bão hòa 4 g

Chất xơ tiêu hóa được 21 g

Carbohydrat 28 g

Đường 0,9 g

Protein 13,3 g

Vitamin E 4,9 g

Vitamin B6 4,1 mg

Canxi 47 mg

(http://www.nutriondata.com)

Theo bảng 2.1, cám có lượng dinh dưỡng rất cao và lượng chất béo chưa bão

hòa cao, vitamin nhóm E, nhóm B, phylate, kẽm, canxi đều rất cao, ngoài ra trong

cám còn chứa chất béo omega 3 khá cao; 65% chất dinh dưỡng của gạo tập trung ở

cám, thành phần của cám có nhiều loại vitamin và chất béo tốt, lại cân đối với nhiều

chất xơ dễ tiêu có thể xem là rất tốt cho cả con người.

Đồ án tốt nghiệp

2.6. Phương pháp lên men bề mặt (Trần Anh Đào, 2012)

Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy vi sinh vật thường được thực hiện

theo phương pháp lên men bề mặt. Phương pháp này phát triển rất rộng rãi, không

chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng

sinh và một số quá trình lên men truyền thống.

 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt (Trần Anh Đào, 2012)

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật

phát triển trên bề mặt môi trường, những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy này là:

- Nuôi cấy dễ thực hiện, quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng

enzyme tạo ra từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy

chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng để giải thích tại sao nuôi cấy bề

mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại.

- Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật,

enzyme và nước). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.

- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận

hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa ít tốn kém.

- Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ vẫn rất dễ dàng xử lý. Môi

trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm

chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy, những khu vực khác

sẽ hoàn toàn được an toàn.

Phương pháp nuôi cấy bề mặt có những nhược điểm cần quan tâm để khắc

phục và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất là khá tốn nhiều diện

tích nuôi cấy, phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt của môi trường (môi

trường lỏng hoặc bán rắn) nên cần nhiều diện tích.

Đồ án tốt nghiệp

 Phương pháp lên men bề mặt và thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc

Trichoderma koningii

Đây là quá trình vi sinh vật sinh trưởng và trao đổi chất trên cơ chất rắn (bã

mía, cám gạo) được làm ẩm với nước nhưng không có dòng nước tự do (hàm lượng

nước từ 30 – 70% phụ thuộc vào khả năng hấp thụ nước của cơ chất và thế nước tối

thiểu cần cho sự phát triển của vi sinh vật) (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013).

T. koningii phát triển trên môi trường chất dinh dưỡng dạng rắn (môi trường

rắn trước khi nuôi cấy nấm mốc cần làm ẩm trước). Để môi trường không bị bết dính

trong khi hấp chín cần bổ sung một số chất dinh dưỡng khác. Sau khi hấp môi trường

được làm nguội 30 – 400C, sau đó cấy vi sinh vật vào, trộn đều và nuôi ở nhiệt độ 28

– 300C trong 35 – 48 giờ, trong phòng thí nghiệm vô trùng có độ ẩm không khí 80 –

90% (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013).

Nấm khi phát triển sẽ lấy những chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng

oxy của không khí để hô hấp. Để đảm bảo nấm mốc mọc đều trên bề mặt của môi

trường và sử dụng nhiều chất dinh dưỡng để sản sinh enzyme, lớp môi trường rắn cần

phải mỏng, chiều dày khoảng từ 2 – 5 cm (Lương Đức Phẩm, 1998).

Sau khi nuôi đủ thời gian để T. koningii tổng hợp enzyme, thu lấy môi trường

và sấy nhẹ ở nhiệt độ 400C để đạt độ ẩm 8 – 12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong chai,

lọ sứ, thủy tinh hay túi PE. Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzyme thô. Muốn có chế

phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tách và tinh chế (Đông Thị Thanh Thu, 1995).

2.7. Giới thiệu sơ lược về phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme (Huỳnh

Thị Hồng Sương, 2013)

Trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào. Các phân tử enzyme không có

khả năng đi qua màng của tế bào. Do đó để có thể chiết rút enzyme nội bào trước hết

cần phải phá vỡ cấu trúc của tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện

pháp cơ học (nghiền với bột thủy tinh hoặc đồng hóa bằng các thiết bị đồng hóa) bằng

tác dụng của các dung môi hữu cơ (rượu butanol, acetone, glycerin) của sóng siêu

âm.

Đồ án tốt nghiệp

Việc tách enzyme ra khỏi tế bào gặp rất nhiều khó khăn, do đó khi tách phải

hết sức lưu ý:

Enzyme có trong tế bào vi sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần

khác. Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là việc rất khó khăn. Enzyme

là chất hữu cơ không bền, rất dễ bị biến tính khi chịu các tác động bên ngoài.

Enzyme có trong tế bào vi sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần

khác. Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là việc rất khó khăn. Enzyme

là chất hữu cơ không bền, rất dễ bị biến tính khi chịu các tác động bên ngoài.

Enzyme là protein mà protein enzyme luôn luôn đi cùng với những loại protein

không phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hóa rất giống nhau. Do đó việc tách

protein enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt

và không phải không gặp những khó khăn nhất định.

Đa số ngành sản xuất thực phẩm cũng như công nghiệp nhẹ thì lại đòi hỏi phải

dùng enzyme sạch. Để tách chiết enzyme từ môi trường rắn, thường dùng nước, các

dung dịch muối trung tính và các dung dịch đệm thích hợp. Trong đó nước được sử

dụng rộng rãi và cho kết quả tốt nhất. Các enzyme được chuyển từ tế bào vào nước

do sự chênh lệch nồng độ. Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzyme được cô đặc dưới

áp suất thấp sao cho hàm lượng chất khô không nhỏ hơn 50 – 55%.

Theo phương pháp khuếch tán bằng nước, có thể chiết được lượng enzyme

trên 90 – 95% và trong dịch chiết không chứa các tạp chất không tan. Nước thường

dùng để chiết có nhiệt độ 25 – 280C. Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong,

chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống còn 10 – 120C.

Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, để loại

bỏ những thành phần tạp cần thực hiện nhiều biện pháp khác nhau. Để loại bỏ muối

và các tạp chất có phân tử lượng thấp, thường sử dụng biện pháp thẩm tích đối với

nước hay các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel. Để loại bỏ các protein

tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp nhiều biện pháp

khác nhau. Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của

môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi

Đồ án tốt nghiệp

hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương

pháp lọc gel.

2.8. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase (Uhlig Helmut, 1998)

Bảng 2.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase

Cơ chất Đo hoạt tính Phương pháp xác định

Giấy lọc

Avicel Glucose Tổng hoạt tính cellulase (C1)

Solkafloc

Giấy lọc Giảm trọng lượng

Avicel Hoạt tính hòa tan Đo mật độ quang

Cellulose azur Đo mật độ quang

CMC, HEC, Cellulase Đường khử Endoglucanase Giảm độ nhớt được tẩm H3PO4

Exoglucanase Avicel, giấy lọc Đường khử

Β-glucosidase Cellobiose Glucose

Wood và McCrae (1972) đã chứng minh rằng hoạt tính exoglucanase (được

tinh chế) có khả năng phân cắt mạnh cellulose (được xử lý với acid phosphoric) nhưng

hoạt động trên CMC rất chậm. Sản phẩm phần lớn là cellobiose (95%).

Endoglcanase (EC 3.2.1.4) phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucosid

ngay ở vùng trong của chuỗi cellulose được xử lý với acid phosphoric và cũng phân

cắt các dẫn xuất của cellulose như CMC và HEC (hydroxyethyl cellulose).

Vì bản chất của cơ chất lẫn enzyme đều phức tạp, nên việc phân tích hoạt tính

cellulase cũng không đơn giản. Cellulase thu nhận được từ các vi sinh vật khác nhau

cho thấy có rất nhiều dữ liệu khác nhau. Thành phần của enzyme từ cùng một chủng

vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào phương pháp lên men, thành phần môi trường và các

điều kiện lên men.

Đồ án tốt nghiệp

Cơ chất để phân tích hoạt động phối hợp của endoglucanase, exoglucanase và

β-glucosidase là cellulose tinh thể không tan như Avicel, Solkafloc và đặc biệt là giấy

lọc. Tuy nhiên, việc tiêu chuẩn hóa các cơ chất này rất khó, vì bản chất đại phân tử

như mức độ polymer hóa, mức độ tinh thể, mức độ tinh sạch và nguồn gốc của cơ

chất; tất cả đều ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

Các cơ chất phân tử nhỏ như p-nitrophenyl-β-glucoside, cellobiose hoặc

oligocellulodextrin là cơ chất lý tưởng để chuẩn hóa việc phân tích hoạt tính cellulose.

Tuy nhiên, các cơ chất này không thích hợp cho hoạt động phối hợp của cả hệ

cellulase mà chỉ thích hợp cho β-glucosidase.

2.8.1. Xác định hoạt tính exoglucanase (hoạt tính giấy lọc)

Hoạt tính giấy lọc được định nghĩa là lượng đường được tạo ra khi ủ giấy lọc

Whatman No. 1 (50 mg) với 0,5 ml dung dịch enzyme ở pH 4,8 (đệm Na-citrate)

trong một giờ với tổng thể tích 1,5 ml.

Vì phản ứng xác định hoạt tính FPU không tuyến tính, phản ứng tuyến tính là

phản ứng mà sản phẩm tạo ra tỷ lệ thuận với lượng enzyme trong mỗi phút của phản

ứng, nên enzyme phải được pha loãng đến nồng độ mà có thể thủy phân giấy lọc sinh

ra 2 mg đường khử/giờ.

2.8.2. Xác định hoạt tính endoglucanase

Cơ chất ở đây là dẫn xuất của cellulose hòa tan trong nước như CMC hoặc

HEC được sử dụng phổ biến. Tuy nhiên, phương pháp này không xác định hoạt tính

cellulase thực sự mong muốn mà chỉ xác định hoạt tính endoglucanase là chính.

Phân tích hoạt tính endoglucanase bằng cách đo lượng đường khử tạo ra sau

phản ứng thủy phân cơ chất CMC hay HEC bằng thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid

hoặc thuốc thử Nelson – Somogy hoặc sử dụng ferric cyanide theo phương pháp của

Wood và McCrae (1972).

Đồ án tốt nghiệp

2.9. Sơ lược về sắc ký lọc gel

2.9.1. Bản chất của phương pháp (Phan Thị Ánh Nhung, 2011)

Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân tử

và phân tích định lượng tương tác phân tử.

Hình 2.9. Quá trình tách các phân tử bằng sắc ký lọc gel (Http://voer.edu.vn/m/phuong-phap-nghien-cuu-enzyme/e887870c)

 Một số thông số vật lý của phương pháp

 Giới hạn tách (exclution limit): là trọng lượng phân tử (MW) của phân tử nhỏ

nhất không chui vào bên trong hạt gel. Thí dụ giới hạn tách của G-75 có FR

từ 30.000 – 80.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui

vào hạt gel.

 Phạm vi tách (fractionation range): Thí dụ, sephadex G-75 có FR từ 30.000

– 80.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ

được phân tách dễ dàng bởi G-75.

 Độ ngậm nước (water regain): là trọng lượng nước mà 1 gam bột gel khô

hấp thụ vào. Thí dụ G-50 có WR là 5,0 ± 0,3g. Giá trị này chưa tính đến

lượng nước bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng để tính thể tích của cột.

 Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu

khi trương nở trong nước. G-50 có thể tích nền 9 – 11 ml/g gel khô.

Đồ án tốt nghiệp

 Hạt gel (gel particle): Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định

bằng mesh hoặc đường kính hạt (bead diameter) tính theo µm. Hạt có kích

thước lớn (50 – 100 mesh, 100 – 300 µm) cho tốc độ dòng chảy qua cột cao,

nhưng kết quả tách thấp. Ngược lại những hạt mịn (400 mesh, 10 – 40 µm)

lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, hiệu quả tách cũng không tốt. Các hạt

gel có kích thước 100 – 200 mesh (50 - 150 µm) thường được chọn.

 Thể tích trống (void volume): là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel

trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Daltons.

 Thể tích thổi (elution volume): là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần tách

ra khỏi cột.

2.9.2. Đặc tính của gel (Trần Lương Hồng Yến, 2012)

Có 4 loại gel thường được sử dụng.

 Dextran: có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia – LKB

(Thụy Điển) cung cấp với tên thương mại là Saphadex. Giới hạn tách của gel

dextran – 600.000 Daltons, vì dextran tự nhiên chứa ít liên kết ngang nên khó

giữ nguyên vẹn hạt nếu kích thước lỗ to hơn. Tuy nhiên nếu dextran được bổ

sung thêm các liên kết ngang bởi N, N’ – methylenebisacrylamide thì dextran

có giới hạn tách gia tăng (xem sephacryl cũng do Pharmacia – LKB cung

cấp).

 Gel polyacrylamide: tạo bởi quá trình đồng hóa polymer của acrylamide và

N, N’ – methylenebisacrylamide (Bio-Rad cung cấp, Bio-gel – P là tên

thương hiệu).

 Gel agarose: là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ

galactose và anhydrogalactose. Mạng gel được ổn định nhờ liên kết hydro

nhiều hơn là do các liên kết ngang. Hãng Bio-Rad cung cấp agarose với tên

thương mại là Bio-gel A, còn Pharmacia cung cấp với tên thương mại là

sepharose và seperose.

Đồ án tốt nghiệp

Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultragel, nó cho

phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp suất

để tách.

2.10. Sơ lược về phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide (Trần

Linh Thước, 2003)

Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử

acrymide và N, N’ – methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác

bởi hệ thống ammonium persulfate (APS), N, N, N’, N’-Tetramethyl ethylenediamine

(TEMED). Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích

thước của lỗ gel. Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các

phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-

acrylamide. Nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép tách các phân tử sinh học

có kích thước lớn và ngược lại.

SDS – PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel

Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide có sự hiện diện của

SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ

thuật này, protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là

mercaptoethanol hoặc dithiothreitol (DTT). Với tác nhân này, protein có cấu trúc bậc

2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được

tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc

vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân

tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng

của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử

tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường.

Để xác định phân tử lượng của một protein, cần so sánh với một thang phân tử

chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết. Để đưa

các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt

hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục

(discontinuos gel). Trong phương pháp này gel gồm hai lớp:

Đồ án tốt nghiệp

- Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): các protein trong mẫu được dồn lại và

trong một lớp băng mỏng.

- Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): tạo ra các băng protein có

trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát

ban đầu. Hai lớp gel này được phân biệt nhau dung dịch đệm, nồng độ

acrylamide và vị trí.

Kỹ thuật SDS – PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng

lượng phân tử từ 10.000 – 20.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn

hơn 200.000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn

2,5%.

Ngoài kỹ thuật SDS – PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến

tính protein, (Denaturing condition), người ta dùng một số kỹ thuật điện di trên gel

polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính

(Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số

vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính protein như tạo liên kết giữa

các protein với nhau. Một số protein không có sự tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng

giữa những protein khác, người ta sử dụng kỹ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện

(Isoelctic focusing gel electrophoresis).

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện nghiên cứu từ 16/05/2015 đến 16/08/2015 ở phòng các

hoạt chất có hoạt tính sinh học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh và

phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí

Minh.

3.2. Vật liệu

3.2.1. Nguồn vi sinh vật

Giống nấm mốc Trichoderma koningii được cung cấp bởi phòng vi sinh ứng

dụng – Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh.

3.2.2. Cơ chất

Bã mía được phơi khô, cắt nhỏ và cám gạo do Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.

Hồ Chí Minh cung cấp.

3.2.3. Hóa chất

Các hóa chất dùng để chuẩn bị môi trường giữ giống và bổ sung vào môi

trường lên men bán rắn gồm: (NH4)2SO4, K2HPO4, urea, glucose, peptone, CaCl2,

MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, MnSO4, ZnSO4, CoCl2 của Trung Quốc sản xuất.

Các hóa chất dùng để pha dung dịch đệm: CH3COONa.3H2O, CH3COOH.

Các hóa chất dùng để xác định hoạt tính enzyme: glucose (Trung Quốc), CMC,

giấy lọc, thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid).

Các hóa chất dùng để xác định hàm lượng protein: albumine, thuốc thử

Bradford (Coomassie Brilliant Blue, Ethanol 960, Acid phosphoric 85%).

Các hóa chất dùng trong phương pháp điện di: Sodium dodecyl sulphate,

ammonium persulfate, bromophenol blue, N,N,N’,N’-Tetramethyl ethylenediamine

(C6H16N2-TEMED), acrylamide/bisacrylamide, β-mercaptoethanol, thang phân tử

lượng nhỏ (sigma) glycerol, glycine (C2H5O2N).

Đồ án tốt nghiệp

Cách pha một số thuốc thử:

- Dung dịch đệm acetate 0,05 M pH 5: dung dịch acid acetic 0,05 M hút 2,91

ml acid acetic định mức tới 1000 ml. Cân 4,1 g natri acetate định mức tới 1000 ml,

chỉnh pH bằng máy đo pH.

- Dung dịch thuốc thử lugol: cân đúng 2 g KI hòa tan trong khoảng 100 ml nước

cất. Nghiền 1 g tinh thể iode trong cối và thêm 50 – 100 ml nước cất. Cho dung dịch

iode vào dung dịch KI khuấy cho tan hoàn toàn rồi thêm nước cất đến 300 ml.

- Dung dịch thuốc thử DNS (2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic):

+ Cân 10 g DNS cho vào beaker 1000 ml, thêm khoảng 400 ml nước cất, đặt

cốc vào chậu nước 800C và khuấy đều.

+ Hòa tan 16 g NaOH trong 150 ml nước cất. Thêm dung dịch NaOH từ từ vào

dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800C.

+ Tiếp tục thêm 300 g potassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch

DNS và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 800C.

+ Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng sau đó chuyển dung dịch vào

bình định mức 1000 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung

dịch DNS trong chai màu nâu có nắp.

- Dung dịch CMC (1%): cân 10 g CMC hòa tan với 800 ml nước cất, tiếp tục

cho vào 100 ml acid acetic 1 M. Điều chỉnh pH 5 với NaOH 1N. Định mức

với nước cất 1000 ml.

3.3. Thiết bị và dụng cụ

3.3.1. Thiết bị

- Autoclave (Memmert – Đức).

- Máy đo quang phổ kế UV – Vis 2500.

- Kính hiển vi quang học Nikon.

- Cân phân tích, cân kỹ thuật.

- Tủ cấy vô trùng.

- Tủ mát Alaska.

- Bể ủ nhiệt Memmert.

Đồ án tốt nghiệp

- Tủ sấy (Memmert – Đức).

- Máy ly tâm.

- Máy đo pH.

- Bộ điện di đứng.

- Hệ thống máy sắc ký cột áp suất thấp BIO-RAD BioLogic.

- Bếp điện, bếp từ.

- Máy nước cất.

3.3.2. Dụng cụ

- Đĩa petri.

- Cốc thủy tinh 100 ml, 200 ml, 1000 ml.

- Erlen 100 ml, 250 ml, 500 ml.

- Ống đong 50 ml, 100 ml, 500 ml.

- Pipet thủy tinh 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml.

- Pipetman 100 – 1000 µl. Đầu típ.

- Ống ly tâm.

- Que cấy, que gắp.

- Đũa thủy tinh.

- Giá đỡ ống nghiệm.

- Đèn cồn.

- Bình định mức.

- Bóp cao su

- Bông thấm nước.

- Bông không thấm nước

- Lamlle, lamelle.

- Buồng đếm hồng cầu.

- Phễu, giấy lọc.

- Bao nilon hấp, dây thun.

- Giấy gói,…

Đồ án tốt nghiệp

3.4. Môi trường

 Môi trường Czapek (môi trường bổ sung khoáng cho môi trường lên men

bán rắn).

Bảng 3.1. Thành phần các chất trong môi trường Czapek

Thành phần Hàm lượng

3,5 g NaNO3

1,5 g K2HPO4

30 g (NH4)2SO4

0,5 g MgSO4.7H2O

KCl 0,5 g

0,01 g FeSO4

Saccaroza 30 g

Nước 1000 ml

3.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.5.1. Phương pháp phân tích độ ẩm cơ chất

Tiến hành theo nguyên tắc: áp dụng phương pháp sấy khô đến khối lượng sản phẩm

không đổi.

Sử dụng tủ sấy:

- Tiến hành: sấy 3 cốc sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C đến trọng lượng không

đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng cốc cân 𝑚0 (g). Cho vào mỗi cốc 2

g cơ chất, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng khối lượng cốc và

mẫu 𝑚1 (g).

- Đặt cốc vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 1050C, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra

để nguội 30 phút trong bình hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy. Cân xong để cốc vào sấy

tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu các lần sấy

không thay đổi. Ghi nhận khối lượng 𝑚2 (g). Kết quả tính độ ẩm:

(𝑚1− 𝑚2) × 100 𝑚1− 𝑚0

W =

Đồ án tốt nghiệp

Trong đó:

𝑚0: khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi.

𝑚1: khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy

𝑚2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi.

3.5.2. Phương pháp tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy (Karimi, 2009)

𝐴 × (𝐵 − 𝐶)

Công thức tính lượng khoáng cần bổ sung vào môi trường:

100 − 𝐵

F =

Trong đó:

A: khối lượng cơ chất nuôi cấy (g)

B: độ ẩm môi trường mình cần (%)

C: độ ẩm trong cơ chất A (%)

F: lượng nước cần bổ sung vào môi trường để đạt độ ẩm thích hợp (ml)

100: độ ẩm 100%.

20 × (50 − 10)

Ví dụ: 20 g cơ chất có độ ẩm khoảng 10% nhưng cần đạt độ ẩm 50%.

100 − 50

Từ công thức trên suy ra: F = = 16 ml

Như vậy cần bổ sung thêm 16 ml nước cất sẽ được độ ẩm là 50%.

3.5.3. Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii

Cấy chuyển giữ giống và nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii trên môi

trường bán rắn nhằm thu nhận enzyme cellulase phục vụ cho quá trình nghiên cứu.

3.5.3.1. Cấy giống trên môi trường thạch nghiêng PGA

 Mục đích: ổn định giống.

 Chuẩn bị:

Môi trường giữ giống PGA gồm có: khoai tây 200 g, glucose 20 g, agar 20 g,

nước cất 1000 ml, pH môi trường là 6,5.

Khoai tây sau khi gọt vỏ, rửa sạch, cắt miếng nhỏ cho vào cốc, cho nước cất

vào nấu đến khi khoai tây chín mềm trong khoảng 30 phút sau đó đem ra để nguội rồi

lọc chiết lấy nước. Cho agar vào và tiếp tục nấu, trong quá trình nấu phải khuấy đều,

cuối cùng cho glucose vào và khuấy cho tan hết.

Đồ án tốt nghiệp

Cho môi trường vào 1/4 các ống nghiệm, hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong

15 phút, sau đó xếp nghiêng các ống nghiệm, để nguội tạo môi trường thạch nghiêng.

Mặt thạch không vượt quá 2/3 chiều dài ống nghiệm.

 Thao tác thực hiện:

Dùng que cấy móc đã khử trùng, lấy một ít bào tử từ ống giống cấy nhẹ nhàng

lên bề mặt thạch nghiêng được chuẩn bị ở trên theo hình ziczăc. Sau 2 ngày ở nhiệt

độ phòng, bào tử nấm phát triển và mọc đều, các ống nghiệm giữ giống sẽ được cấy

sang môi trường giữ giống cấp 2 (môi trường lúa) hoặc được bảo quản trong tủ lạnh

ở nhiệt độ 5 – 90C để sử dụng cho các thí nghiệm về sau. Tất cả các thao tác trên đều

được thực hiện trong điều kiện vô trùng.

3.5.3.2. Nhân giống trên môi trường lúa

 Mục đích: nhằm tạo giống tốt hơn, bảo quản được lâu hơn và chuẩn bị giống,

đảm bảo lượng giống cho việc nuôi cấy trên môi trường bán rắn.

 Chuẩn bị:

Lấy 40 g lúa cho đều vào 2 bình tam giác 500 ml, bổ sung môi trường khoáng

tối ưu và nước sao cho độ ẩm môi trường đạt 50%, hấp thanh trùng môi trường ở

1210C trong 15 phút. Môi trường lúa sau khi nguội sẽ được cấy mốc giống từ môi

trường thạch nghiêng vào.

Lượng khoáng bổ sung vào môi trường được tính theo công thức đã được trình

bày ở phần 3.5.2.

 Thao tác thực hiện:

Dùng pipet hút 2 ml nước cất vô trùng cho vào ống thạch nghiêng chứa giống,

dùng que cấy cạo lớp sinh khối, sau đó chuyển dịch chứa sinh khối sang bình môi

trường lúa. Trộn đều, đậy nút bông lại, bao gói, ủ ở nhiệt độ 300C. Các thao tác cấy

phải tiến hành gần ngọn đèn cồn, dụng cụ phải vô trùng bằng cồn 700. Sau khi cấy 2

– 3 ngày, quan sát thấy nấm mốc mọc đều và bao phủ kín bề mặt các hạt lúa thì được

đem bảo quản ở 40C trong tủ lạnh.

Đồ án tốt nghiệp

3.5.3.3. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase (Raimbault, 1998),

(Tolan, 1999)

 Mục đích: tạo môi trường dinh dưỡng tối ưu nhất cho nấm mốc phát triển để

thu nhận enzyme hiệu quả nhất.

 Chuẩn bị:

Phối trộn bã mía với cám gạo (BM:CG) theo các tỷ lệ khối lượng cần khảo sát.

Cơ chất được chứa trong các erlen có dung tích 250 ml và được làm ẩm bằng nước

có bổ sung môi trường dinh dưỡng Czapek (lượng nước và khoáng bổ sung được tính

theo công thức đã trình bày ở phần 3.5.2). Điều chỉnh theo độ ẩm ban đầu, pH ban

đầu, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống. Hấp khử trùng môi trường ở 1210C, 1 atm trong

20 phút, làm nguội.

 Thao tác thực hiện:

Cho nước cất vô trùng từ bình erlen vào bình môi trường lúa sao cho vừa ngập

hết cơ chất, lắc đều, dùng đũa thủy tinh vô trùng khuấy đều (để bào tử nấm mốc tách

khỏi môi trường lúa) để có huyền phù.

Dùng pipet hút dung dịch chứa nấm mốc trong bình môi trường lúa vào bình

môi trường bán rắn, khuấy đều, đậy nút bông lại và đem ủ ở nhiệt độ phòng trong

thời gian thích hợp sẽ trích ly thu nhận enzyme.

Để xác định thành phần môi trường và các điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng

và sinh tổng hợp enzyme, nấm mốc được nuôi trên môi trường có tỷ lệ bã mía và cám

gạo khác nhau (2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3), độ ẩm môi trường ban đầu từ 45 – 65%,

pH ban đầu từ 4 – 8, nồng độ dung dịch dinh dưỡng từ không bổ sung đến nồng độ

gấp 0,5 – 3 lần nồng độ chuẩn (NĐC), thời gian nuôi cấy từ 8 – 112 giờ, tỷ lệ giống

từ 0,5x107 – 3x107 bào tử/môi trường.

Đồ án tốt nghiệp

3.5.4. Phương pháp mô tả hình thái T. koningii (Trần Linh Thước, 2003)

Thí nghiệm quan sát hình thái nhằm khẳng định lại các đặc điểm khuẩn lạc

của chúng trên môi trường PGA, hình thái vi thể và các đặc tính các chủng vi nấm.

 Quan sát đại thể

Dùng que cấy móc (vô trùng) gạt nhẹ trên bào tử đính của nấm mốc, chuyển

sang đĩa petri chứa môi trường PGA đã hấp vô trùng, cắm đầu móc xuống mặt thạch

thành 3 điểm. Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 – 7 ngày. Quan sát khuẩn lạc của

nấm mốc (hình dạng và màu sắc).

 Quan sát vi thể

Để quan sát thấy hình dạng của vi nấm trước tiên ta phải nuôi cấy buồng ẩm.

Chuẩn bị 5 đĩa petri có giấy thấm nước vừa đĩa petri đặt ở đáy đĩa, trên giấy

đặt một miếng lamlle và một miếng lamelle, ta đem hấp khử trùng cùng với nước cất,

môi trường 50 ml môi trường PGA, 1 đĩa petri sạch.

Sau khi hấp khử trùng xong, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn đổ môi

trường PGA vào đĩa petri, chờ cho môi trường PGA trong đĩa nguội và đặc lại. Sau

đó ta dùng dao có mũi nhọn được khử trùng dưới ngọn đèn cồn, ta cắt và chia đều

thạch PGA trong đĩa thành miếng vuông có kích thước 1,5 x 1,5 cm. Cho miếng thạch

vuông lên miếng lamlle trong đĩa petri đã chuẩn bị sẵn, sau đó dùng que cấy móc lần

lượt cấy giống trong thạch nghiêng môi trường PGA lên 4 góc của miếng thạch

vuông. Tiếp đó dùng lamelle đặt lên trên mặt thạch vừa cấy mẫu, rồi cho vài giọt

nước cất vô trùng lên miếng giấy thấm nước đặt ở đáy đĩa, đậy nắp đĩa petri lại để ở

nhiệt độ phòng.

Chờ sau 24 – 48 giờ lấy miếng lamelle ra khỏi đĩa petri. Nhỏ vài giọt cồn 960

lên lamelle, dùng giấy thấm lau khô sau đó cho vài giọt NaOH 10%, đậy lá kính lên

và quan sát dưới kính hiển vi (vật kính 40X) cuống sinh bào tử đính và ti thể. Mục

đích của việc trên là tăng khả năng thấm nước của sợi nấm, đuổi bọt khí trong sợi

nấm và làm sợi nấm nở to ra để dễ quan sát.

Đồ án tốt nghiệp

3.5.5. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu (Lê

Duy Linh và cộng sự, 1997)

Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men,

bào tử nấm mốc). Các loại buồng đếm hồng cầu thường được sử dụng: buồng đếm

Thomas và buồng đếm Goriep.

Nguyên tắc cấu tạo của hai loại buồng đếm này đều giống nhau. Đó là một

phiến kính hình chữ nhật, chia thành ba khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành hai

khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông.

Mỗi ô lớn có diện tích là 1/25 mm2 lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là

16 ô), mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2 và chiều cao là 0,1 mm. Như vậy thể tích

của một ô nhỏ là 1/400 mm2 x 0,1 mm = 1/4000 mm3 hay 1/4000000 ml.

3.5.6. Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô

 Mục đích: tách dịch enzyme thô từ môi trường bán rắn.

 Nguyên tắc: dùng nước cất để hòa tan enzyme trong sinh khối nuôi cấy để thu

được dung dịch có chứa enzyme ta gọi là enzyme thô.

 Thao tác thực hiện:

Sau thời gian nuôi cấy tốt nhất đã khảo sát, cân lấy 10 g canh trường. Thêm

nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy bằng máy khuấy với

tốc độ 600 vòng/phút trong vòng 30 – 45 phút, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút

trong vòng 10 phút để loại bỏ tạp chất và thu dịch. Dịch chiết enzyme thô để mát ở

nhiệt độ 40C.

3.5.7. Khảo sát khả năng phân hủy cellulose

CMC là cacbonxylmethylcellulose các đơn vị glucose liên tiếp với nhau bằng

liên kết 1-4-β glucose được sử dụng như một phần nguồn cacbon. Ta tiến hành pha

môi trường và chuẩn bị đĩa petri hấp khử trùng cùng với môi trường. Sau đó tiến hành

đổ đĩa trong tủ cấy vô trùng. Chờ môi trường nguội tiến hành cấy giống. Ủ ở nhiệt độ

phòng và sau 48 giờ tiến hành nhỏ lugol đo đường kính phân giải CMC.

Tiến hành pha môi trường CMC – agar trong nước cất. Cân 2 g CMC thêm

nước cất thành 200 ml môi trường, tiến hành đổ khoảng 18 đĩa môi trường. Sau khi

Đồ án tốt nghiệp

môi trường nguội ta tiến hành đục mỗi đĩa 3 lỗ. Sau thời gian trích ly, chuẩn bị đĩa

thạch và nhỏ dịch enzyme vào lỗ thạch. Sau 24 – 48 giờ, nhỏ vài giọt lugol vào đĩa

petri và quan sát vòng phân giải CMC.

Bảng 3.2. Môi trường xác định khả năng sinh enzyme cellulase của vi sinh vật

Hóa chất Hàm lượng

0,4 g NaNO3

0,2 g K2HPO4

MgSO4 0,1 g

KCl 0,1 g

CMC 1 g

Pepton 0,04 g

Agar 2,5 g

Nước cất 200 ml

Sau khi hấp đĩa và môi trường xong tiến hành đổ 5 đĩa. Đợi môi trường nguội

tiến hành cấy điểm. Sau 24 – 48 giờ, nhỏ thuốc thử lugol lên và đo đường kính vòng

phân giải.

3.5.8. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford (Đinh Hoàng Yến,

2012)

Nguyên lý của phương pháp Bradford là dựa vào sự thay đổi giữa 3 trạng thái

tồn tại của Coomassie Blue G: cation (màu đỏ), trung tính (màu xanh lá cây) và anion

(màu xanh da trời). Dưới điều kiện acid mạnh, Coomassie Blue G chủ yếu tồn tại ở

trạng thái bị proton hoá do bị gắn 2 H+ hoặc còn gọi là cation có màu đỏ. Ở trạng thái

này Coomassie Blue G có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 470 nm. Tuy nhiên, khi

gắn với protein, nó chuyển sang dạng ổn định ở trạng thái không bị proton hoá hay

còn gọi là anion và có màu xanh da trời. Trong quá trình phản ứng tạo phức với

protein có 2 dạng tương tác hoá học xảy ra. Dạng cation (màu đỏ) chuyển các điện tử

tự do của nó vào các nhóm có thể ion hoá có trong phân tử protein dẫn đến việc bộc

lộ một số vùng kị nước trong phân tử protein. Những vùng này sẽ phản ứng với vùng

Đồ án tốt nghiệp

không phân cực của Coomassie Blue G thông qua lực van der Waals (giữa các nhóm

amin mang điện tích dương và nhóm mang điện tích âm của chất màu ở khoảng cách

rất gần nhau). Liên kết này đồng thời cũng được giữ ổn định thêm bởi sự tương tác

ion giữa 2 nhóm này. Độ hấp thụ ánh sáng tỷ lệ thuận với hàm lượng protein có trong

mẫu. Hàm lượng protein có trong mẫu sẽ được xác định dựa vào đường chuẩn

albumin.

 Hóa chất

Dịch chiết enzyme cellulase đã thu cần xác định hàm lượng protein.

Dung dịch albumine 1 mg/ml: cân chính xác 10 g albumine pha trong 1 ml

nước cất, lắc đều cho tan. Giữ ở 200C, khi dùng thì pha loãng 100 lần để có được

dung dịch albumine có nồng độ 0,1 mg/ml.

Dung dịch thuốc thử Bradford gồm: Coomassie brilliant blue (CBB: 0,005 g),

Ethanol 960: 50 ml, Acid phosphoric (H3PO4) 85%: 42,5 g.

Phẩm màu coomassie brilliant blue được làm tan bằng ethanol trong chai màu

tối có nắp đậy kín có bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 500 ml bằng nước

cất.

 Thiết bị: Máy đo quang phổ UV – Vis.

 Dựng đường chuẩn Albumine

Để xác định hàm lượng protein trong mẫu, cần xây dựng một đường chuẩn với

dung dịch protein chuẩn đã biết nồng độ. Dung dịch protein chuẩn dùng trong phòng

thí nghiệm là bovine serum albumine.

Để dung dịch albumine chuẩn có các nồng độ từ 10 – 50 µg/ml, cần thực hiện

như bảng 3.3.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.3. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Albumine

Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5

50 Nồng độ (µg/ml) 10 20 30 40 0

1 0 1 1 1 1 Thể tích Albumine chuẩn (ml)

0 1 0 0 0 0 Nước (ml)

2 2 2 2 2 2 Thuốc thử Bradford (ml)

 Tính kết quả

Tiến hành đo trị số mật độ quang (OD) cho các dung dịch trong các ống

nghiệm ở bước sóng 595 nm. Trị số mật độ quang của các ống từ 1 – 5 sau khi trừ đi

trị số của ống đối chứng sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ

quang (OD) theo nồng độ protein.

 Xác định nồng độ protein của mẫu

Dịch chiết enzyme thô của chủng nấm mốc cũng được tiến hành tương tự như

trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng đường

chuẩn. Mật độ quang của mẫu cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, sau

đó dựa vào đường chuẩn để tính ra lượng protein trong mẫu thí nghiệm (g/ml).

 Công thức xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

Hàm lượng protein (mg/g) = (X × V × f × 10-3)/m.

Trong đó:

X: hàm lượng protein trong mẫu dựa vào phương trình đường chuẩn (µg/ml).

10-3: hệ số chuyển đổi từ g sang mg.

V: thể tích dịch chiết enzyme thu được (ml).

f: là hệ số pha loãng.

m: khối lượng cơ chất tiến hành tách chiết enzyme (g).

Đồ án tốt nghiệp

3.5.9. Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) (Pitt và

Hocking, 1997)

 Nguyên tắc

Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi enzyme

carboxymethyl cellulase ở pH 5 và 400C. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng

đường khử. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với 2-hydroxy-3,5-

dinitrosalicylic acid (DNS), màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương

pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 540 nm.

Định nghĩa đơn vị hoạt tính: Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzyme

sẽ giải phóng đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút

dưới các điều kiện phản ứng thực nghiệm.

 Hóa chất

Tiến hành pha dung dịch đệm: pha 1000 ml nước cất với 4,1 g acid acetic

(CH3COOH), chuẩn độ tới pH 5 (dùng NaOH 0,1N và HCl 0,1N) để có được dung

dịch đệm CH3COONa 50 mM, pH 5.

Tiến hành pha dung dịch cơ chất CMC 1% w/v: cân chính xác 1 g CMC, hòa

tan trong 100 ml dung dịch đệm Na – acetate (CH3COONa) 50 mM, pH 5, đun đến

khi CMC tan hết, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm cho đến

vạch 100 ml và lắc đều để được dung dịch đệm CMC 1%.

Tiến hành pha dung dịch 3,5 – dinitrosalicylic acid (DNS): cân 10 g DNS cho

vào becher 1000 ml, thêm khoảng 400 ml nước cất, đặt becher trong chậu nước 800C

và khuấy đều. Thêm dung dịch NaOH (16 g NaOH trong 150 ml nước cất), từ từ vào

dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800C. Tiếp tục thêm 300 g potassium sodium

tartrate tetrhydate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 800C. Làm lạnh

dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào bình định mức 1000ml,

thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có

nắp.

Hòa tan 100 mg glucose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào bình

định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch 100 ml và lắc đều.

Đồ án tốt nghiệp

 Xây dựng đường chuẩn glucose

Việc dựng đường chuẩn glucose được thực hiện như bảng 3.4.

Bảng 3.4. Thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose trên cơ chất CMC

Ống số 1 2 3 4 5 6 0

Nồng độ glucose 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 (mg/ml)

Thể tích dd glucose 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 (mg/ml)

Thể tích dd CMC 1 1 1 1 1 1 1 1% (ml)

Thể tích dd DNS- 2 2 2 2 2 2 2 lactose (ml)

Thể tích nước cất 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 1 (ml)

Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh

đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. So màu trên máy quang phổ ở bước

sóng 540 nm.

 Tiến hành phản ứng

Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm thử thật, 1ml dung dịch

enzyme đã đun sôi làm mất hoạt tính đối với ống đối chứng mẫu và 1 ml nước cất

làm ống đối chứng. Đặt 3 ống nghiệm vào bể ổn nhiệt ở 400C/5 phút. Thêm 1 ml dung

dịch CMC 1% vào 2 ống nghiệm (ống mẫu và đối chứng mẫu) sau đó lắc đều. Phản

ứng ở 400C trong thời gian chính xác 10 phút. Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose vào

3 ống nghiệm, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Thêm 1 ml dung dịch CMC 1%

vào ống đối chứng. Đun sôi cách thủy 3 ống nghiệm trong 15 phút. Làm lạnh đến

nhiệt độ phòng trong 1 chậu nước mát. So màu ở bước sóng 540 nm dựa theo đường

glucose chuẩn trên máy đo quang phổ UV – Vis.

Đồ án tốt nghiệp

+ 0,3 ⁄ 𝐴𝐺 0,3

(0,1 ⁄ 𝐴𝐺 0,1

+ …+ 0,6 ⁄ 𝐴𝐺 0,6

)

Công thức xác định hoạt tính enzyme CMCase: + 0,2 ⁄ 𝐴𝐺 0,2 Giá trị F =

(𝐴𝑇 − 𝐴𝐵 ) × 1000 × 𝐹 180 × 10 𝑝ℎú𝑡 × 1 𝑚𝑙 × 𝐶

CMCase (U/g) =

Trong đó:

𝐴𝑇 : độ hấp thu của dung dịch phản ứng enzyme.

𝐴𝐵: độ hấp thu của dung dịch không có phản ứng enzyme.

F: yếu tố glucose (mg/ml).

1000: chuyển mg thành µg.

180: phân tử lượng của glucose monohydrate, chuyển thành µmol.

10: thời gian phản ứng (phút).

1: thể tích dung dịch enzyme (ml).

C: nồng độ dung dịch mẫu (g/ml)

Bảng 3.5. Bảng bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính CMCase

Đối chứng Mẫu không phản ứng Mẫu thí nghiệm

1 ml enzyme 1 ml đệm 1 ml enzyme (đun sôi 5 phút)

2 ml thuốc thử 1 ml CMC 2 ml thuốc thử DNS-lactose DNS-lactose (ủ 400C trong 10 phút)

1 ml CMC 1 ml CMC 2 ml thuốc thử DNS-lactose

Đun sôi cách thủy 15 phút, làm nguội, đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm

3.5.10. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp enzyme cellulase

T. koningii sau khi được nhân giống trên môi trường lúa được đưa sang môi

trường bán rắn có cơ chất cảm ứng để tạo ra cellulase. Môi trường lên men bán rắn

được điều chỉnh sao cho việc thu nhận enzyme là tốt nhất. Để biết được điều kiện nào

tốt nhất phải tiến hành khảo sát các yếu tố sau.

Đồ án tốt nghiệp

3.5.10.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất

Độ ẩm môi trường ban đầu là 55%, pH ban đầu là 5, nhiệt độ nuôi cấy 300C,

trong 40 giờ nuôi cấy. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy có tỷ lệ cơ chất BM:CG như

bảng 3.6.

Bảng 3.6. Bảng bố trí thí nghiệm tỷ lệ cơ chất

Tỷ lệ cơ chất BM:CG (g:g) Bã mía (g) Cám gạo (g)

2 8 2:8

3 7 3:7

4 6 4;6

5 5 5:5

6 4 6:4

7 3 7:3

Tổng khối lượng cơ chất trong mỗi bình là 10 g. Mỗi nghiệm thức tỷ lệ cơ chất

lặp lại 3 lần nên có 15 nghiệm thức. Cấy với tỷ lệ giống là 107 bào tử/MT (bào tử/môi

trường). Sau thời gian 40 giờ, khi tơ trắng bao phủ toàn bộ trên bề mặt lớp cơ chất,

cân lấy 10 g canh trường ở mỗi bình. Thêm nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là

1:4. Tiến hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch

enzyme, xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme để chọn ra tỷ lệ cơ chất cho hàm

lượng và hoạt tính enzyme cellulase cao nhất.

3.5.10.2. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ban đầu

Sau khi chọn ra được tỷ lệ BM:CG tốt nhất, cố định yếu tố này để khảo sát ảnh

hưởng độ ẩm môi trường ban đầu. Khảo sát các độ ẩm như sau: 45%, 50%, 55%,

60%, 65% với pH ban đầu là 5, ở nhiệt độ 300C, trong 40 giờ nuôi cấy với tỷ lệ giống

là 107 bào tử/MT. Cách xác định độ ẩm được thực hiện theo bảng 3.7.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.7. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường

Dung dịch dinh dưỡng cần Nghiệm thức Độ ẩm (%) bổ sung (ml)

1 45 6,07

2 50 7,67

3 55 9,64

4 60 12,09

5 65 15,25

Tổng khối lượng cơ chất trong mỗi bình là 10 g. Mỗi nghiệm thức độ ẩm ban

đầu được lặp lại 3 lần nên có 15 nghiệm thức. Sau thời gian 40 giờ, khi tơ trắng bao

phủ toàn bộ trên bề mặt lớp cơ chất, cân lấy 10 g canh trường ở mỗi bình. Thêm nước

cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000

vòng/phút trong 15 phút và thu dịch enzyme, xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme

để chọn ra độ ẩm ban đầu cho hàm lượng và hoạt tính enzyme cellulase cao nhất.

3.5.10.3.Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu

Sau khi khảo sát và chọn ra được tỷ lệ BM:CG, độ ẩm ban đầu tốt nhất. Cố

định 2 yếu tố này để khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu. Khảo sát ở các pH ban đầu:

pH 4, 5, 6, 7 và 8 với tỷ lệ cơ chất, độ ẩm ban đầu tốt nhất đã được chọn, ở nhiệt độ

300C, trong 40 giờ nuôi cấy với tỷ lệ giống là 107 bào tử/MT.

Mỗi nghiệm thức pH ban đầu được lặp lại 3 lần nên có 15 nghiệm thức. Sau

thời gian 40 giờ, khi tơ trắng bao phủ toàn bộ trên bề mặt lớp cơ chất, cân lấy 10 g

canh trường ở mỗi bình. Thêm nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến

hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch enzyme,

xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme để chọn ra pH ban đầu cho hàm lượng và

hoạt tính enzyme cellulase cao nhất.

Đồ án tốt nghiệp

3.5.10.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng

Sau khi khảo sát và chọn ra được tỷ lệ BM:CG, độ ẩm ban đầu, pH ban đầu

tốt nhất. Cố định những yếu tố này để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng.

Gọi x là nồng độ dinh dưỡng môi trường Czapek 100%, khảo sát các nồng độ 0, 0,5x,

x, 1,5x, 2x, 2,5x, 3x. Bổ sung 7,67 ml dung dịch dinh dưỡng tương ứng với các nồng

độ trên vào các bình tam giác chứa môi trường tỷ lệ cơ chất BM:CG, độ ẩm ban đầu,

pH ban đầu tốt nhất đã được chọn, ở nhiệt độ 300C, trong 40 giờ nuôi cấy với tỷ lệ

giống là 107 bào tử/MT. Thể tích dung dịch dinh dưỡng bổ sung vào bình tam giác

được tính theo công thức tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy đã trình bày ở 3.5.2.

Mỗi nghiệm thức nồng độ dinh dưỡng lặp lại 3 lần nên có 18 nghiệm thức. Sau

thời gian 40 giờ, khi tơ trắng bao phủ toàn bộ trên bề mặt lớp cơ chất, cân lấy 10 g

canh trường ở mỗi bình. Thêm nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến

hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch enzyme,

xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme để chọn ra nồng độ dinh dưỡng cho hàm

lượng và hoạt tính enzyme cellulase cao nhất.

3.5.10.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Sau khi khảo sát và chọn ra được tỷ lệ BM:CG, độ ẩm ban đầu, pH ban đầu,

nồng độ dinh dưỡng tốt nhất. Cố định những yếu tố này để khảo sát thời gian nuôi

cấy. Thời gian khảo sát như sau: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, và

112 giờ với tỷ lệ giống là 107 bào tử/MT.

Mỗi nghiệm thức thời gian lặp lại 3 lần nên có 42 nghiệm thức. Sau những

khoảng thời gian nuôi cấy trên, cân lấy 10 g canh trường ở mỗi bình. Thêm nước cất

với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000

vòng/phút trong 15 phút và thu dịch enzyme, xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme

để chọn ra thời gian nuôi cấy cho hàm lượng và hoạt tính enzyme cellulase cao nhất.

3.5.10.6. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống

Sau khi khảo sát và chọn ra được tỷ lệ BM:CG, độ ẩm ban đầu, pH ban đầu,

nồng độ dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy tốt nhất. Cố định những yếu tố này để khảo

sát tỷ lệ giống. Hòa 30 – 40 ml dung dịch nước muối sinh lý có chứa tween 80 0,1%

Đồ án tốt nghiệp

vào bình giống cấp 2, khuấy trộn đều, đếm bào tử ở độ pha loãng 1000 lần. Sau khi

tính được số bào tử trong 1 ml, nếu có nhiều hơn 107 bào tử/ml phải pha loãng để đạt

được tỷ lệ 107 bào tử/ml dịch huyền phù bào tử. Sau đó cấy huyền phù bào tử giống

cấp 2 vào các môi trường đã chuẩn bị ở trên với thể tích huyền phù bào tử lần lượt

như sau: 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml, 2,5 ml và 3 ml tương ứng 0,5x107, 1x107, 1,5x107,

2x107, 2,5x107 và 3x107 bào tử.

Mỗi yếu tố tỷ lệ giống lặp lại 3 lần nên có 18 nghiệm thức. Sau thời gian nuôi

cấy tốt nhất đã khảo sát, cân lấy 10 g canh trường ở mỗi bình. Thêm nước cất với tỷ

lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút

trong 15 phút và thu dịch enzyme, xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme để chọn

ra tỷ lệ giống cho hàm lượng và hoạt tính enzyme cellulase cao nhất.

3.5.11. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm (Nguyễn Cảnh, 1993)

(N.X.ÊGÔROOV và Nguyễn Lân Dũng, 1976)

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm không chỉ cho phép nghiên cứu tác động

đồng thời của nhiều yếu tố lên quá trình mà còn cho phép đánh giá một cách định

lượng mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố đó.

Sau khi thực hiện các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như tỷ lệ

BM:CG, độ ẩm ban đầu, pH ban đầu, nồng độ dung dịch dinh dưỡng, thời gian nuôi

cấy và tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T. koningii, xác định được

thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy cơ sở được gọi là môi trường cơ sở

cho chủng nấm mốc sinh trưởng và tạo ra cellulase.

Từ môi trường cơ sở tiến hành tối ưu hóa các yếu tố trên. Quy hoạch thực

nghiệmtheo yếu tố 2n là việc thể hiện tất cả các tổ hợp có thể có giữa n các yếu tố

nghiên cứu. Mỗi yếu tố đều được kiểm tra đồng thời và không phụ thuộc lẫn nhau ở

hai mức độ là trên (+) và dưới (-). Trung tâm của thực nghiệm là môi trường cơ sở đã

xác định được.

Đồ án tốt nghiệp

3.5.12. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch enzyme và dung môi tủa enzyme

Loại dung môi tủa enzyme (tác nhân tủa) và tỷ lệ dung môi tủa enzyme là

những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme. Dịch enzyme sau khi tác chiết được sử

dụng để khảo sát ảnh hưởng của dung môi tủa và tỷ lệ tủa enzyme.

3.5.12.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa dịch enzyme và dung môi tủa

Tủa dịch enzyme bằng 2 loại dung môi là ethanol 960 lạnh và acetone lạnh

theo các tỷ lệ như bảng 3.8.

Bảng 3.8. Khảo sát tỷ lệ giữa dung môi tủa và dịch enzyme

Tỷ lệ dịch enzyme và dung môi Dịch enzyme Dung môi tủa

(ml) (ml) (ml)

1:1 10 10

1:2 10 20

1:3 10 30

1:4 10 40

1:5 10 50

1:6 10 60

1:7 10 70

Mỗi nghiệm thức tỷ lệ được lặp lại 3 lần nên có 21 nghiệm thức. Cho 10 ml

dịch chiết enzyme vào erlen có thể tích 100 ml. Đặt erlen vào bình bercher chứa nước

đá vụn. Khuấy nhẹ dung dịch enzyme trong erlen. Cho từ từ lượng dung môi tủa

(ethanol, acetol) vào erlen. Khuấy tiếp đến 10 phút và giữ yên trong 30 phút ở môi

trường lạnh. Sau đó ly tâm dịch ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút, thu tủa, hòa

tan trong 5 ml dung dịch đệm acetate 50 mM, pH 5. Enzyme được bảo quản trong lọ

ở nhiệt độ 40C. Tủa thu được với hai loại dung môi khác nhau được xác định hàm

lượng protein và xác định hoạt tính CMCase nhằm chọn ra dung môi tủa enzyme tốt

nhất cho quá trình tinh sạch sơ bộ enzyme cellulase.

Đồ án tốt nghiệp

3.5.12.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi tủa enzyme

Sau khi chọn ra được tỷ lệ tủa enzyme tốt nhất, so sánh 2 nghiệm thức có tỷ lệ

tủa cho hoạt tính CMCase và hàm lượng protein cao nhất của 2 loại dung môi với

nhau để chọn ra được loại dung môi nào tủa enzyme tốt nhất cho các thí nghiệm về

sau.

3.5.13. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase

pH và nhiệt độ là các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme. Mỗi enzyme

có pH và nhiệt độ hoạt động thích hợp nhất định. Việc nghiên cứu ảnh hưởng của pH

và nhiệt độ đến hoạt tính CMCase là rất cần thiết.

3.5.13.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme cellulase

Mẫu enzyme được tủa bằng dung môi tốt nhất với tỷ lệ cho hoạt tính cao nhất

được sử dụng cho thí nghiệm này. Tiến hành hút 5 ml dung dịch đệm acetate đã được

chuẩn độ ở các mức pH 4, 5, 6, 7 và 8 hòa tan vào mẫu enzyme và được giữ ở nhiệt

độ 400C. Mỗi yếu tố pH được lặp lại 3 lần nên có 15 nghiệm thức. Chuẩn bị dung

dịch CMC 1% được giữ ấm ở 400C trong bể ổn nhiệt. Tiến hành xác định hoạt tính

enzyme cellulase để xác định được độ pH tốt nhất mà enzyme có thể hoạt động.

3.5.13.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cellulase

Mẫu enzyme được tủa bằng dung môi tốt nhất với tỷ lệ cho hoạt tính cao nhất

được sử dụng cho thí nghiệm này. Tiến hành hút 5 ml dung dịch đệm acetate ở pH

tốt nhất cho hoạt động của enzyme, hòa tan vào mẫu enzyme và được giữ nhiệt ở

400C. Chuẩn bị dung dịch CMC 1% được giữ ấm ở 400C trong bể ổn nhiệt. Sau đó

cho enzyme phản ứng ở các nhiệt độ là 30, 40, 50, 60 và 700C. Mỗi yếu tố nhiệt độ

được lặp lại 3 lần nên có 15 nghiệm thức. Tiến hành xác định hoạt tính enzyme

cellulase để chọn ra nhiệt độ tốt nhất mà enzyme có thể hoạt động.

3.5.13.3. Hoạt tính enzyme cellulase của dịch chiết thô

Cân 50 g canh trường với 200 ml nước cất, khuấy trong vòng 30 phút, tiếp tục

lọc qua vải thô, thu dịch và ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch chiết, tiến

hành hút chân không, điều chỉnh dịch enzyme vào 200 ml. Thu dịch chiết enzyme,

xác đinh hoạt tính của dịch chiết enzyme nhằm phục vụ cho các thí nghiệm sau.

Đồ án tốt nghiệp

3.5.14. Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel

3.5.14.1. Nguyên tắc

Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng

phân tử khác nhau bằng cách cho các phân tử đi qua cột gel. Những phân tử có kích

thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột,

trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển

nhanh và được thoát ra khỏi cột sớm các phân tử nhỏ chạy trong lỗ gel.

3.5.14.2. Hóa chất và dụng cụ

 Hóa chất

Gel Sephadex G-75 có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45 – 90 µm;

khả năng ngậm nước là 12 ml/g gel khô; phạm vi phân tách là 30.000 – 80.000

Daltons. Đệm acetate có pH 5 phải khử bọt khí trước khi dùng.

 Dụng cụ

- Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-Rad BioLogic

- Phễu đổ gel

- Flow adaptor 1,5 cm

- Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 50 x 1,5 cm

- Thiết bị đuổi khí

3.5.14.3. Tiến hành thí nghiệm

 Chuẩn bị mẫu

Mẫu chạy sắc ký là enzyme được hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm

acetate có pH 5.

 Chuẩn bị gel và nhồi cột

Cân 10 g gel Sephadex G-75 khô, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm acetate

pH 5 chứa trong cốc. Dùng dung dịch đệm acetate pH 5 với thể tích nhiều gấp 2 lần

so với thể tích lớp nền gel cần cho vào cột sắc ký. Cụ thể ít nhất là 53 x 2 = 106 ml

dung dịch đệm. Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại

lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để

loại hơn 90% hạt mịn cản trở quá trình lọc gel.

Đồ án tốt nghiệp

Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm vào

làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển

nhẹ. Tránh làm bắn gel ra ngoài, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bọt khí. Khi lớp

nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được

nạp đầy gel. Khi cột đã được nạp đầy, khóa đầu ra lại và gắn adaptor vào.

Chạy máy sắc ký để ổn định cột bằng đệm acetate pH 5 với lượng đệm bằng 2

– 3 lần thể tích cột. Sau khi cột ổn định, khóa đầu ra của cột và điều chỉnh adaptor

xuống sát lớp nền gel.

 Quá trình nạp mẫu

Tủa 10 ml dung dịch enzyme thô ủ lạnh với acetone, ly tâm thu cặn, pha với

đệm cho đủ 2 ml, lấy 1 ml mẫu này để tinh sạch bằng sắc ký. Dùng xi lanh bơm mẫu

vào hệ thống sắc ký. Sau khi mẫu thấm hết vào cột, nối cột với bình chứa dịch thổi

cột.

Khởi động cho máy chạy mẫu, mẫu tinh sạch sẽ hòa tan vào trong đệm acetate

có pH 5 và đi ra các ống nghiệm hứng mẫu. Dựa vào sắc ký đồ hiển thị trên máy tính

để xác định những ống nghiệm chứa enzyme có cùng trọng lượng phân tử.

 Thu và xác định mẫu tách được

Dịch thổi cột được ổn định ở tốc độ thích hợp, liên tục. Tốc độ thổi cột cao

cho kết quả tách mẫu thấp và nếu tốc độ thổi cột quá thấp thì lại kéo dài thời gian

tách mẫu, các peak bị hoãn ra cũng cho kết quả tách thấp.

Dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng đầu dò

(detector). Độ hấp thụ được thể hiện trên máy tính dưới dạng sắc ký đồ bằng phần

mềm LP – Data View. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector). Dựa vào

sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các peak sẽ được xác

định hàm lượng protein và hoạt tính CMCase sau tinh sạch.

 Xác định lượng protein và hoạt tính enzyme cellulase sau tinh sạch

Thu dịch chứa enzyme cellulase đã tinh sạch qua sắc ký lọc gel, tiến hành xác

định hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp xác định hoạt tính carboxymethyl

cellulase (CMCase) và hàm lượng protein.

𝐻𝑇2

Đồ án tốt nghiệp

 Công thức tính hiệu suất tinh sạch: H % =

× 100

𝐻𝑇1

Trong đó:

H %: hiệu suất tinh sạch

HT1: hoạt tính mẫu cellulase trước sắc ký (U).

𝐻𝑇2

HT2: hoạt tính mẫu cellulase sau sắc ký (U).

𝐻𝐿1

 Công thức tính hoạt tính riêng: HTR = (U/mg)

Trong đó:

HTR: hoạt tính riêng của mẫu sau sắc ký (U/mg)

HT2: hoạt tính mẫu cellulase sau sắc ký (U).

HL2: Hàm lượng protein của mẫu sau sắc ký (mg).

𝐻𝑇𝑅2 𝐻𝑇𝑅1

 Công thức tính độ tinh sạch: ĐTS =

Trong đó:

ĐTS: Độ tinh sạch của mẫu sau sắc ký.

HTR2: Hoạt tính riêng của mẫu sau sắc ký (U/mg).

HTR1: Hoạt tính riêng của mẫu trước sắc ký (U/mg).

3.5.15. Phương pháp điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide (Trần Linh

Thước, 2003)

 Nguyên tắc

Điện di trên gel polyacrylamide làm tăng khả năng phân tách mẫu protein vì

sự di chuyển của mẫu trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước lỗ gel. Khả

năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà

gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide; nếu nồng

độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước

lớn; ngược lại nồng độ cao sẽ cho lỗ gel nhỏ, vì vậy chỉ có khả năng phân tách những

phân tử sinh học có kích thước nhỏ.

Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS – PAGE)

là kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS (sodium

Đồ án tốt nghiệp

dodecyl sulfate), một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phần tử. Phương pháp

này thường được sử dụng để xác định trọng lượng phân tử protein thành phần và độ

tinh sạch của chế phẩm protein trong quá trình tinh chế. Trong kỹ thuật này, protein

được xử lý bằng SDS và các tác nhân khử các cầu nối disulfate là mercatoethanol

hoặc dithiothreitol (DTT). Với tác nhân này, protein cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến

đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả protein chỉ phụ thuộc kích thước nhỏ

khi đi qua lỗ gel có kích thước nhất định. Trong thực tế, để xác định phân tử lượng

của một protein, cần phải so sánh với một phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các

protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết.

Với mục đích đưa các protein trong mẫu về cùng một mẫu xuất phát đồng thời

tạo ra sự phân tách tốt hơn, có thể sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên

tục gồm 2 lớp:

- Lớp gel gom (stacking gel): các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một

lớp băng mỏng.

- Lớp gel phân tách (separating gel): tạo ra các băng protein có trọng lượng

phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.

 Hóa chất

Thang phân tử lượng nhỏ (sigma), gồm các protein chuẩn có kích thước

(Daltons) xác định như sau: 209.000, 124.000, 80.000, 49.100, 34.800, 28.900,

20.600, 7.100.

SDS 10%: cân chính xác 10 g SDS cho vào becher 100 ml, thêm vào 80 ml

nước cất, khuấy đều, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch 100

ml và lắc đều.

Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8,

0,4% SDS; cân 36,3 g Tris pha trong 100 ml nước cất thêm dần HCl 6 N và khuấy

dung dịch lên cho tới khi pH đạt 8,8. Hút 8 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm

nước cất cho đủ 200 ml, lắc đều và giữ ở 40C.

Dung dịch đệm gel gom (stacking gel buffer) Tris-HCl 0,5M, pH 6,8, 0,4%

SDS; cân 6,8 g Tris pha trong 100 ml nước cất thêm dần HCl 6 N và khuấy dung dịch

Đồ án tốt nghiệp

trên cho đến khi pH đạt 6,8. Hút 4 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất

cho đủ 100 ml, lắc đều và giữ ở 40C.

Ammonium persulfate 10% (chỉ pha trước khi dùng): cân 0,1 g cho vào một

eppendorf 1000 µl thêm 1 ml nước cất, lắc đều và để ở nhiệt độ phòng.

Dung dịch điện di Tris-glycerine pH 8,3 (10X); 30 g Tris, 144 g glycine và 10

g SDS hòa trong 1000 ml nước cất.

Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer); 2,5 ml dung dịch đệm Tris-HCl

0,5 M, pH 6,8; 4 ml dung dịch SDS 10%; 2 ml glycerol; 2 mg bromophenol blue; 0,2

ml mercaptoethanol; thêm nước đủ 10 ml.

Dung dịch nhuộm gel: chuẩn bị 250 ml dung dịch nhuộm gel chứa 0,625 g

coomassie blue G 250, 112,5 ml ethanol tuyệt đối, 112,5 ml nước cất và 25 ml acid

acetic đậm đặc, lắc đều, giữ trong chai màu tối.

Dung dịch giải nhuộm, 30 ml methanol: 10 ml acid acetic; 60 ml nước cất.

 Gel phân tách

Chuẩn bị đổ gel có kích thước 100 x 100 x 0,75 mm có nồng độ acrylamide là

10%. Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml.

Bảng 3.9. Thành phần các chất trong gel phân tách

Thành phần Thể tích

40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) 2,5 ml

Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 – SDS 0,4% 2,5 ml

Nước cất 4,445 ml

TEMED 5 µl

Ammonium persulfate 10% 50 µl

Tổng thể tích 10 ml

Sau khi cho ammonium persulfate vào, dùng pipette Pasteur hoặc micropipette

bơm dung dịch vào khuôn đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao 7 cm. Sau đó, nhẹ

nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp gel vừa đổ để quá trình polymer hóa xảy ra,

chờ gel đông.

Đồ án tốt nghiệp

 Gel gom (stacking gel)

Cho các thành phần sau theo thứ tự vào một becher 50 ml khác theo bảng 3.10.

Bảng 3.10. Thành phần các chất trong gel gom

Thành phần Thể tích

40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) 0,5 ml

Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 – SDS 0,4% 1 ml

Nước cất 2,476 ml

TEMED 4 µl

Ammonium persulfate 10% 20 µl

Tổng thể tích 10 ml

Sau khi gel phân tách đã đông hoàn toàn (sau 25 – 30 phút), hút hết nước bên

trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng piptte Pasteur hoặc micropipette bơm

dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào gel để tạo các giếng mẫu. Sau

khi gel đông, lấy lược ra và lắp đĩa gel vào bộ điện di. Cho dung dịch điện di vào

buồng điện di.

 Xử lý mẫu

Hút 30 µl mẫu trộn với 30 µl dung dịch nạp mẫu trong một eppendorf sạch,

đậy nắp và lắc nhẹ, đều, đun sôi cách thủy 5 – 10 phút. Đối với thang phân tử lượng

nhỏ, hút 2 µl vào eppendorf 1 ml chứa 8 µl nước cất vào 10 µl dung dịch nạp mẫu.

Nồng độ protein trong mẫu vừa đủ sao cho hàm lượng protein trong một giếng không

vượt quá 20 – 40 µg.

 Tiến hành chạy điện di

Dùng micropipette hút 10 µl mẫu được xử lý nạp vào các giếng (20 µl/giếng).

Tiến hành chạy điện di với hiệu điện thế ổn định 100 V, cường độ dòng điện dao động

cho phép từ 25 – 50 mA. Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn

bị (45 – 60 phút). Tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải

nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Thay mới dung dịch giải

nhuộm khi dung dịch này có màu tương đương với màu trong nền gel.

Đồ án tốt nghiệp

Đo khoảng cách di chuyển của các protein trong thang chuẩn và trong các dịch

enzyme cellulase. Đo khoảng cách di chuyển của phẩm màu bromophenol blue. Tính

giá trị 𝑅𝑓 của từng protein trong thang chuẩn và các vạch protein trong các dung dịch

enzyme cellulase.

Khoảng cách di chuyển của protein

Công thức tính giá trị 𝑅𝑓

𝑅𝑓 = Khoảng cách di chuyển của phẩm mầu bromophenol blue

Vẽ đồ thị thể hiện sự tương quan giữa log (trọng lượng phân tử) của những

protein trong thang chuẩn với 𝑅𝑓. Từ giá trị 𝑅𝑓 xác định được, dựa vào đồ thị chuẩn

đã vẽ, xác định trọng lượng phân tử của các vạch protein.

3.5.16. Phương pháp bố trí và xử lý số liệu

Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp

lại. Số liệu được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel và phần mềm MSTATC, được

phân tích biến lượng đơn yếu tố (one-way ANOVA) để đánh giá sự khác biệt và phân

nhóm xếp hạng bằng trắc nghiệm Duncan’s test mức P ≤ 0,005.

Sau khi thu nhận kết quả của phương pháp quy hoạch thực nghiệm, tiến hành

nuôi cấy nấm mốc theo các yếu tố để hoạt tính cellulase tối ưu nhất để thu chế phẩm

enzyme nhằm phục vụ cho các thí nghiệm khảo sát enzyme về sau.

Mục đích của quá trình này nhằm khảo sát từng thông số kỹ thuật ảnh hưởng

đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase và quá trình tinh sạch sơ bộ enzyme.

Qua kết quả từ các thí nghiệm, lấy kết quả trung bình để chọn ra thông số tối ưu cho

các thí nghiệm tiếp theo và cũng chính là thông số tối ưu của quá trình nghiên cứu.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Khảo sát hình thái đại thể và vi thể của chủng T.koningii

Để khảo sát hình thái đại thể khuẩn lạc, nấm T. koningii được cấy trên PGA.

Để quan sát hình thái vi thể, nấm được nuôi cấy bằng phương pháp nuôi cấy phòng

ẩm và quan sát dưới kính hiển vi. Kết quả quan sát đại thể và vi thể ghi nhận được ở

hình 4.1 và 4.2.

a b

Hình 4.1. Nấm mốc T. koningii sau khi nuôi cấy 2 ngày (hình a) và 4 ngày (hình b)

c d

Hình 4.2. Nấm mốc T. koningii chụp ở vật kính 40X bằng kính hiển vi (hình c) và kính hiển vi điện tử (hình d)

Đồ án tốt nghiệp

Hình thái đại thể: tốc độ sinh trưởng của T. koningii tăng trưởng khá nhanh

trên môi trường PGA, tơ có dạng bông, khi còn non khuẩn lạc có màu trắng, khi già

khuẩn lạc có màu xanh lục, đây là màu của bào tử đính.

Hình thái vi thể: khuẩn ti có vách ngăn, cuống sinh bào tử có dạng phân nhánh

giống như cành cây, mỗi nhánh có nhiều tế bào sinh ra bào tử đính và mang bào tử

đính riêng lẻ.

4.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy cellulose trên đĩa thạch

Enzyme cellulase được xác định dựa vào phương pháp đục lỗ thạch và nhỏ

dịch enzyme vào lỗ thạch với môi trường thạch có bổ sung 1% CMC. Sau 24 – 48

giờ phát hiện vòng phân giải bằng thuốc thử lugol.

g f e

Hình 4.3. Vòng phân giải CMC của nấm mốc T. koningii 18 mm sau 24 giờ (hình e), 25 mm sau 32 giờ (hình f) và 35 mm sau 48 giờ (hình g)

4.3. Kết quả định lượng mốc giống bằng buồng đếm hồng cầu

Bình giống cấp 2 (môi trường lúa) sau khi nuôi cấy nấm T. koningii được

khoảng 6 – 7 ngày, lúc này nấm đã mọc khắp cơ chất, sinh bào tử nhiều. Cho 30 – 40

ml dung dịch nước muối sinh lý có chứa Tween 80 0,1% vào bình giống cấp 2, khuấy

trộn đều tạo dịch huyền phù bào tử. Ta pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,… lần rồi quan sát

qua kính hiển vi để đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu.

𝐴 × 4000 × 𝐴𝑃𝐿

Ở nồng độ pha loãng 10-6 lần, ta tính được:

5 × 16

12 × 4000 × 106 5 × 16

Số tế bào trong 1 mm3 = = = 60 x 107 tế bào

Đồ án tốt nghiệp

Trong đó:

A: số tế bào trong 80 ô nhỏ

4000 = 400 x 10 (1/400 mm2: diện tích một ô nhỏ; 1/10 mm: chiều cao từ mặt

buồng đếm đến tấm lamelle)

APL: độ pha loãng

h i

Hình 4.4. Bào tử nấm T. koningii được quan sát dưới kính hiển vi Hình h: độ pha loãng 10-5. Hình i: độ pha loãng 10-6

4.4. Kết quả xác định độ ẩm cơ chất

Tiến hành xác định độ ẩm qua 3 lần thí nghiệm lặp lại để có kết quả tốt nhất.

Độ ẩm được tính theo công thức:

(𝑚1− 𝑚2) × 100 𝑚1− 𝑚0

W =

𝑚0: khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi.

𝑚1: khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy

𝑚2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi.

Kết quả được thể hiện ở bảng 4.1, ta có độ ẩm của cơ chất là 11,64%.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 4.1. Kết quả đo độ ẩm cơ chất BM:CG

Khối lượng W (%) m0 (g) m1 (g) m2 (g) Wtb (%)

22,4980 24,5209 24,2852 11,65 Lần 1

21,3352 23,3953 23,1561 11,64 11,61 Lần 2

22,8768 24,9415 24,7009 11,65 Lần 3

4.5. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

cellulase trên môi trường lên men bán rắn

4.5.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ BM:CG đến khả năng sinh tổng hợp cellulase

Tỷ lệ cơ chất ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và trao đổi chất của VSV trên môi

trường lên men bán rắn. Việc tối ưu hóa các chất dinh dưỡng tương đối khó vì có sự

ảnh hưởng tương tác giữa các chất dinh dưỡng, pH môi trường và độ ẩm.

Kết quả thí nghiệm được ghi nhận ở đồ thị 4.1. Theo kết quả phân tích biến lượng và

xếp hạng bằng trắc nghiệm Duncan, sự khác biệt giữa các nghiệm thức tỷ lệ cơ chất

rất có ý nghĩa (P < 0,05). Trong đó, môi trường có tỷ lệ BM:CG (3:7) cho hoạt tính

CMCase cao nhất (phụ lục 2, 3, 4).

ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ CƠ CHẤT

6

5 ) g / U

) g / g m

( n

4

3

2 ( e s a C M C h n

i e t o r p g n ợ ư

l

1 í t t ạ o H

m à H

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

0 2:8

3:7

4:6

5:5

6:4

7:3

Tỷ lệ cơ chất BM:CG (g:g)

Hoạt tính CMCase (U/g)

Hàm lượng protein (mg/g)

Đồ thị 4.1. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T. koningii có tỷ lệ cơ chất BM:CG khác nhau

Đồ án tốt nghiệp

Theo kết quả từ đồ thị 4.1, hoạt tính CMCase và hàm lượng protein cao nhất

(81,24 U/g và 4,34 mg/g) ở môi trường có tỷ lệ BM:CG là 3:7. Ở môi trường có tỷ lệ

BM:CG là 4:6 cũng cho hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tương đối cao. Bốn

môi trường còn lại có tỷ lệ BM:CG lần lượt là 2:8, 5:5, 6:4 và 7:3 cho hoạt tính

CMCase và hàm lượng protein tương đối thấp.

Kết quả này có thể giải thích như sau: bã mía có khả năng giữ nước cao và có

cấu trúc phức tạp hơn cám gạo; khi pha chế các môi trường có tỷ lệ BM:CG khác

nhau với cùng một lượng nước, ở các môi trường có tỷ lệ BM:CG là 5:5, 6:4 và 7:3

có độ ẩm và lượng cám gạo thấp hơn ba môi trường còn lại. Ngược lại, ở môi trường

có tỷ lệ BM:CG là 2:8, độ ẩm và lượng cám gạo cao hơn nhưng do có độ xốp thấp

hơn nên độ thoáng khí cũng thấp hơn. Bốn môi trường này không thích hợp cho sự

sinh trưởng và sinh tổng hợp ra cellulase của T. koningii.

Tuy nhiên, ở môi trường có tỷ lệ BM:CG là 3:7 chưa phải là môi trường tối ưu

vì còn có nhiều yếu tố khác ảnh hưởng như độ ẩm ban đầu, nồng độ dinh dưỡng, pH

ban đầu, tỷ lệ giống và thời gian nuôi cấy cũng như sự tương tác giữa các yếu tố này

ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của T. koningii. Thêm vào

đó lượng cellulose trong cám gạo thấp hơn trong bã mía, nên việc tìm môi trường

thích hợp để T. koningii sử dụng một phần cellulose trong bã mía vừa có ý nghĩa kinh

tế vừa thu được lượng cellulase cao trong môi trường nuôi cấy.

4.5.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp cellulase

Độ ẩm vừa ảnh hưởng đến sự sinh trưởng vừa ảnh hưởng đến sự trao đổi chất

của VSV trong quá trình lên men bán rắn. Kết quả được ghi nhận ở đồ thị 4.2. Theo

kết quả phân tích biến lượng và xếp hạng bằng trắc nghiệm Duncan, sự khác biệt giữa

các nghiệm thức độ ẩm ban đầu là rất có ý nghĩa (P < 0,05). Trong đó, môi trường có

độ ẩm ban đầu là 50% cho hoạt tính CMCase cao nhất (phụ lục 5, 6, 7).

Đồ án tốt nghiệp

ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ ẨM BAN ĐẦU

140

6

120

5 ) g / U

) g / g m

100 ( n

4

80

3

60

2 ( e s a C M C h n

i e t o r p g n ợ ư

40 l

1

20 í t t ạ o H

m à H

0

45

50

60

65 55 Độ ẩm ban đầu (%)

Hoạt tính CMCase (U/g)

Hàm lượng protein (mg/g)

Đồ thị 4.2. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T. koningii có độ ẩm ban đầu khác nhau

Theo kết quả ở đồ thị 4.2, môi trường có độ ẩm ban đầu là 50%, hoạt tính

CMCase và hàm lượng protein thu được cao nhất (119,08 U/g và 5,14 mg/g) trong

khi ở môi trường có độ ẩm ban đầu 45% cho hoạt tính protein thấp hơn (101,04 U/g).

Điều này có thể là do khi tăng độ ẩm đến giá trị thích hợp, có tác dụng làm cơ chất

phồng lên, tăng độ xốp, tạo điều kiện cho T. koningii tiếp xúc cơ chất dễ hơn. Các

môi trường còn lại có độ ẩm ban đầu tăng dần thì hoạt tính CMCase và hàm lượng

protein thấp dần. Hiện tượng này có thể do cơ chất quá ẩm, có độ xốp giảm nên ngăn

cản sự khuếch tán O2 từ bên ngoài vào môi trường. Kết quả này gần phù hợp với báo

cáo của Jian Liu và Jichu Yang (2007).

4.5.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu khả năng sinh tổng hợp cellulase

pH có ảnh hưởng rõ rệt đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật

đều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất. Kết quả

được ghi nhận ở đồ thị 4.3. Theo kết quả phân tích biến lượng và xếp hạng bằng trắc

nghiệm Duncan, sự khác biệt giữa các nghiệm thức pH ban đầu là rất có ý nghĩa (P <

Đồ án tốt nghiệp

0,05). Trong đó, môi trường có pH ban đầu là 6 cho hoạt tính CMCase cao nhất (phụ

lục 8, 9, 10).

ẢNH HƯỞNG CỦA pH

180

14

160

12 ) g / U

) g / g m

140 ( n

10

120

8

100

80

6 ( e s a C M C h n

60 i e t o r p g n ợ ư

4 l

40

2

20 í t t ạ o H

m à H

0

4

5

7

8 6 pH ban đầu

Hoạt tính CMCase (U/g)

Hàm lượng protein (mg/g)

Đồ thị 4.3. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T. koningii có pH ban đầu khác nhau

Theo kết quả ở đồ thị 4.3, môi trường có pH ban đầu là 5 cho hoạt tính CMCase

và hàm lượng protein thu được cao nhất (162,55 U/g và 8,04 mg/g). Môi trường có

pH ban đầu là 4 không phù hợp để T. koningii sinh tổng hợp enzyme cellulase vì ở

pH thấp, T. koningii sinh trưởng yếu hơn, cho kết quả hoạt tính CMCase và hàm

lượng protein thấp. Môi trường có pH ban đầu cao hơn từ pH 6 – 8 hoạt tính CMCase

và hàm lượng protein giảm dần. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Jian

Liu và Jichu Yang (2007), pH ban đầu là 5 chính là pH tối ưu để T. koningii sinh tổng

hợp cellulase và kết quả có thể thay đổi nhẹ trong quá trình nuôi cấy.

4.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase

Nguồn cơ chất có cung cấp tất cả dinh dưỡng cho VSV sinh trưởng là cơ chất

lý tưởng. Tuy nhiên, nhiều chất dinh dưỡng ở dưới mức tối ưu hay thậm chí không

có trong cơ chất, vì vậy bổ sung thêm các chất dinh dưỡng từ bên ngoài khi pha chế

môi trường lên men. Kết quả được ghi nhận ở đồ thị 4.4. Theo kết quả phân tích biến

lượng và xếp hạng bằng trắc ngiệm Duncan, sự khác biệt rất giữa các nghiệm thức

Đồ án tốt nghiệp

nồng độ dinh dưỡng rất có ý nghĩa (P < 0,05). Trong đó, môi trường có nồng độ dinh

dưỡng 100% NĐC cho hoạt tính CMCase cao nhất (phụ lục 11, 12, 13).

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ DINH DƯỠNG

180

12

160

10 ) g / g m

) g / U

140 ( n

120

8

100

6

80 ( e s a C M C h n

60

4 i e t o r p g n ợ ư

l

40

2 í t t ạ o H

m à H

20

0

50

100

250

200

300 150 Nồng độ dinh dưỡng (% nồng độ dinh chuẩn)

Hoạt tính CMCase (U/g)

Hàm lượng protein (mg/g)

Đồ thị 4.4. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường

nuôi cấy T. koningii có nồng độ dinh dưỡng khác nhau

Theo kết quả từ đồ thị 4.4, hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ môi

trường có nồng độ dinh dưỡng 100% NĐC là cao nhất (161,62 U/g và 10,04 mg/g),

môi trường có nồng độ dinh dưỡng 50% NĐC cho hoạt tính CMCase và hàm lượng

protein thấp hơn, có lẽ do nồng độ các chất dinh dưỡng trong môi trường này ở dưới

mức tối ưu. Môi trường có nồng độ dinh dưỡng 0% NĐC (không bổ sung môi trường

dinh dưỡng) cho hoạt tính CMCase và hàm lượng protein thấp nhất, vì dinh dưỡng

có sẵn trong môi trường không đủ cung cấp cho T. koningii sinh tổng hợp enzyme.

Các môi trường còn ở môi trường có nồng độ dinh dưỡng 150, 200, 250 và 300%

NĐC cho hoạt tính CMCase và hàm lượng protein giảm dần, có lẽ T. koningii không

chịu được áp suất thẩm thấu cao từ môi trường nuôi cấy.

Đồ án tốt nghiệp

4.5.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase

Thời gian nuôi cấy là yếu tố có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình sinh tổng

hợp cellulase của VSV. Việc tìm ra thời gian nuôi cấy tối ưu là cần thiết để thu nhận

enzmye đúng lúc, đồng thời tránh việc kéo dài thời gian vừa không có hiệu quả kinh

tế vừa giảm hoạt tính của chế phẩm enzyme.

Kết quả được ghi nhận ở đồ thị 4.5. Theo kết quả phân tích biến lượng và xếp

hạng bằng trắc nghiệm Duncan, sự khác biệt giữa các nghiệm thức thời gian nuôi cấy

rất có ý nghĩa (P < 0,05). Trong đó, thời gian nuôi cấy sau 40 giờ cho hoạt tính

CMCase cao nhất (phụ lục 14, 15, 16).

ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN NUÔI CẤY

200

20

180

18 ) g / U

) g / g m

160

16 ( n

140

14

120

12

100

10 ( e s a C M C h n

i e t o r p g n ợ ư

80

8 l

60

6 í t t ạ o H

m à H

40

4

20

2

0

8

16

24

32

40

80

88

96

104

112

56

64 48 72 Thời gian (giờ)

Hoạt tính CMCase (U/g)

Hàm lượng protein (mg/g)

Đồ thị 4.5. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi

cấy T. koningii có thời gian nuôi cấy khác nhau

Theo kết quả từ đồ thị 4.5, hoạt tính CMCase và hàm lượng protein cao nhất

sau 40 giờ nuôi cấy (170,60 U/g và 13,57 mg/g). Sau thời gian này, hoạt tính CMCase

và hàm lượng protein giảm dần. T. koningii bắt đầu sinh trưởng và tạo ra cellulase

sau 8 giờ nuôi ủ, có nghĩa là thời gian pha lag khá ngắn. Từ 8 giờ - 40 giờ nuôi ủ,

hoạt tính và hàm lượng protein tăng lên rõ rệt, sau đó bắt đầu giảm.

Đồ án tốt nghiệp

4.5.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp cellulase

Tỷ lệ giống đôi khi vẫn có sự ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme của

VSV. Kết quả được ghi nhận ở đồ thị 4.6. Theo kết quả phân tích biến lượng và xếp

hạng bằng trắc nghiệm Duncan, sự khác biệt giữa các nghiệm thức tỷ lệ giống không

có ý nghĩa (P = 0,0502 > 0,05) (phụ lục 17, 18, 19).

ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ GIỐNG

160

18

17

155

16 ) g / U

) g / g m

15 ( n

150

14

145

13

12 ( e s a C M C h n

140 i e t o r p g n ợ ư

11 l

10

135 í t t ạ o H

m à H

9

130

8 0,5x10^7

1,0x10^7

1,5x10^7

2,0x10^7

2,5x10^7

3,0x10^7

Tỷ lệ giống (bào tử/môi trường)

Hoạt tính CMCase (U/g)

Hàm lượng protein (mg/g)

Đồ thị 4.6. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường

nuôi cấy T. koningii có tỉ lệ giống cấy khác nhau

Theo kết quả từ đồ thị 4.6, các nghiệm thức đều cho hoạt tính CMCase và hàm

lượng protein gần bằng nhau. Vậy tỷ lệ giống ảnh hưởng không đáng kể đến sinh tổng

hợp enzyme cellulase. Tỷ lệ giống thường có mật độ từ 104 đến 107 bào tử/g môi

trường, để đảm bảo tất cả tiểu phần cơ chất nhanh chóng được bao phủ bởi hệ sợi

nấm, nhằm hạn chế sự tạp nhiễm. Thí nghiệm trên có mật độ bào tử/g môi trường

khoảng từ 1,39x105 đến 8,33x105 bào tử/g, lấy tổng số bào tử trên môi trường chia

cho 18 g môi trường (10 g cơ chất + 8 ml gồm dịch dinh dưỡng và dịch huyền phù).

Các nghiệm thức tỷ lệ giống trên nằm trong khoảng mật độ cho phép là từ 104 đến

107 bào tử/g môi trường (King Monkut’s Institue of Technology Thonburi, 1996).

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 4.2. Các giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

cellulase của T. koningii trước quy hoạch thực nghiệm

Hàm lượng protein Hoạt tính CMCase Yếu tố (mg/g) (U/g)

4,34 81,24 Tỷ lệ BM:CG (3:7)

5,14 119,08 Độ ẩm ban đầu 50%

8,04 162,55 pH ban đầu là 6

Nồng độ dinh dưỡng 100% 10,04 161.62 NĐC

13,57 170.60 Thời gian nuôi cấy

14,46 151,97 Tỷ lệ giống 107 bào tử/MT

4.6. Quy hoạch thực nghiệm

Để quá trình thí nghiệm có ý nghĩa, chọn ra 4 yếu tố ảnh hưởng là tỷ lệ pH ban

đầu, tỷ lệ dinh dưỡng và thời gian nuôi cấy để khảo sát lại tác động của 4 yếu tố này

lên quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase như thế nào của loài T. koningii. Sau đó

cố định 2 yếu tố tỷ lệ BM:CG là 3:7, tỷ lệ giống là 107 bào tử/MT. Bảng 4.3 và 4.4

sau đây là bảng mã hóa và bảng ma trận bố trí thí nghiệm.

Bảng 4.3. Mã hóa các biến số

Mức dưới Mức cơ sở Mức trên Mức biến thiên Các biến số (-) (0) (+) (λ)

4 5 6 1 X1: pH ban đầu

X2: thời gian nuôi cấy 32 40 48 8 (giờ)

X3: độ ẩm ban đầu 45 50 55 5 (%)

X4: nồng độ dinh 50 100 150 50 dưỡng (% NĐC)

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 4.4. Ma trận kế hoạch hóa

Biến số mã hóa Số thí Kí hiệu

nghiệm hàng X1 X2 X3 X4 X0

- + “1” - - - 1

- + X1 + - - 2

- + X2 - + - 3

- + X1X2 + + - 4

- + X3 - - + 5

- + X1X3 + - + 6

- + X2X3 - + + 7

- + X1X2X3 + + + 8

+ + X4 - - - 9

+ + X1X4 + - - 10

+ + X2X4 - + - 11

+ + X1X2X4 + + - 12

+ + X3X4 - - + 13

+ + X1X3X4 + - + 14

+ + X2X3X4 - + + 15

+ + X1X2X3X4 + + + 16

0 0 - 0 0 0 17

0 0 - 0 0 0 18

0 0 - 0 0 0 19

Từ bảng 4.3 và 4.4 chuẩn bị 19 thí nghiệm trong đó có 3 thí nghiệm trung tâm,

16 thí nghiệm bố trí theo mức biến thiên của từng yếu tố. Lưu ý, phải đánh số thứ tự

cho 19 bình tam giác trước khi cho cơ chất, khoáng vào. Sau những 3 mức thời gian

nuôi cấy thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt tính CMCase.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 4.5. Kết quả hoạt tính CMCase theo thực nghiệm và theo phương trình hồi quy

Biến số mã hóa STT Y Ŷ (Y – Ŷ)2 X1 X2 X3 X4

32 45 4 104,33 84,24 403,61 1 0,5

32 45 6 143,80 122,30 462,25 2 0,5

48 45 4 163,54 180,82 298,60 3 0,5

48 45 6 191,74 201,96 104,45 4 0,5

32 55 4 53,57 69,42 251,22 5 0,5

32 55 6 146,62 162,48 251,54 6 0,5

48 55 4 152,26 132,16 404,01 7 0,5

48 55 6 157,90 137,82 403,21 8 0,5

32 45 4 101,51 84,24 298,25 9 1,5

32 45 6 138,16 122,30 251,54 10 1,5

48 45 4 160,72 180,82 404,01 11 1,5

48 45 6 174,82 201,96 736,58 12 1,5

32 55 4 47,93 69,42 461,82 13 1,5

32 55 6 140,98 162,48 462,25 14 1,5

48 55 4 149,44 132,16 298,60 15 1,5

48 55 6 155,08 137,82 297,91 16 1,5

40 50 5 183,28 - - 17 1

40 50 5 180,56 - - 18 1

40 50 5 188,92 - - 19 1

(Với Y là hoạt tính enzyme cellulase theo thực nghiệm, Ŷ là hoạt tính enzyme theo

phương trình hồi quy).

Phương trình hồi quy có dạng:

Ŷ = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b4x4 + b12x12 + b13x13 + b14x14 + b23x23 + b24x24 +

b34x34 + b123x123 + b124x124 + b134x134 + b234x234 + b1234x1234

Đồ án tốt nghiệp

∑

16 𝑖=1

Các hệ số trong phương trình hồi quy được xác định như sau:

𝑋𝑖𝑗𝑌𝑖 16

𝑏𝑗 =

16 𝑖=1

Các hiệu ứng tương tác được xác định tương tự như những hiệu ứng tuyến tính:

∑ (𝑋𝑗𝑋𝑖)𝑖𝑌𝑖 16

𝑏𝑖𝑗 =

Dựa vào công thức tính hệ số, kết quả Y ở bảng ma trận và phần mềm excel thu

được kết quả 𝑏𝑗 và 𝑏𝑖𝑗 như bảng 4.5 sau:

Bảng 4.6. Kết quả 𝑏𝑗 và 𝑏𝑖𝑗

𝒃𝟎 𝒃𝟏 𝒃𝟐 𝒃𝟑 𝒃𝟒 𝒃𝟏𝟐 𝒃𝟏𝟑 𝒃𝟏𝟒

136,40 19,74 26,79 -10,93 -2,82 -13,04 4,94 -1,06

𝒃𝟐𝟑 𝒃𝟐𝟒 𝒃𝟑𝟒 𝒃𝟏𝟐𝟑 𝒃𝟏𝟐𝟒 𝒃𝟏𝟑𝟒 𝒃𝟐𝟑𝟒 𝒃𝟏𝟐𝟑𝟒

-17,27 -0,35 0,71 -8,81 -0,70 1,06 1,06 0,71

Để kiểm định tính ý nghĩa của hệ các hệ số trong phương trình hồi quy và sự

tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm, cầm phải tìm phương sai tái

hiện ở 3 thí nghiệm tại tâm.

𝟎 ∑(𝒀𝒖

Bảng 4.7. Giá trị trung bình của 3 thí nghiệm trung tâm

𝟎 )𝟐

𝟎 𝒀𝑻𝑩

𝟎 𝟎- 𝒀𝑻𝑩 𝒀𝒖

𝟎 − 𝒀𝑻𝑩

𝟎 𝒀𝒖

𝟎 )𝟐

− 𝒀𝑻𝑩

STT (𝒀𝒖

0 𝑌𝑇𝐵

183,28 -0,97 0,94 1

3 ∑ 𝑢=1 3

180,56 -3,69 13,62 36,37 2 = 184,25

36,37

3 ∑ 𝑢 =1

0 0− 𝑌𝑇𝐵

188,92 4,67 21,81 3

=

= 18,19

2 = 𝑆𝑡ℎ

(𝑌𝑢 𝑛−1

(với n = 3 là số thí nghiệm tại tâm). Suy ra 𝑆𝑡ℎ = 4,26

Phương sai các hệ số:

Đồ án tốt nghiệp

(với N = 16 thí nghiệm)

=

= 1,07

𝑆𝑏𝑗 =

𝑆𝑡ℎ √𝑁

4,26 √16

Đánh giá mức ý nghĩa theo tiêu chuẩn Student

𝑡𝑗 =

|𝑏𝑗| 𝑆𝑏𝑗

> 𝑡𝑙𝑡 (với 𝑡𝑙𝑡: ở mức p = 0,05; bậc tự do f = n – 1 = 2)

Tra bảng tiêu chuẩn student với 𝑡(0,05; 2) = 4,3

= 127,48 > 4,3

𝑡0 =

|𝑏0| 𝑆𝑏𝑗

Tương tự tính được:

𝑡1 = 18,45 > 4,3 𝑡13 = 4,62 > 4,3 𝑡123 = 8,23 > 4,3

𝑡2 = 25,04 > 4,3 𝑡14 = 0,99 < 4,3 𝑡124 = 0,65 < 4,3

𝑡3 = 10,21 > 4,3 𝑡23 = 16,14 > 4,3 𝑡134 = 0,99 < 4,3

𝑡4 = 2,64 < 4,3 𝑡24 = 0,33 < 4,3 𝑡234 = 0,99 < 4,3

𝑡12 = 12,19 > 4,3 𝑡34 = 0,66 < 4,3 𝑡1234 = 0,66 < 4,3

Vì t0, t1, t2, t3, t12, t13, t23, t123 > 𝑡𝑙𝑡 còn t4, t14, t24, t34, t124, t134, t234, t1234 < tlt nên

chỉ có các hệ số b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23, b123 là có ý nghĩa, còn hệ số b4, b14, b24, b34,

b124, b134, b234, b1234 là không có ý nghĩa và cần loại ra khỏi chương trình.

Vậy phương trình hồi quy có dạng:

Ŷ = 136,40 + 19,74*X1 + 26,79*X2 – 10,93*X3 – 13,04*X12 + 4,94*X13 –

17,27*X23 – 8,81*X123.

Đánh giá mức độ tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher.

Tính các giá trị Ŷ: kết quả được trình bày trong bảng 4.4.

∑

0−

2182,40

Ŷ𝑖)2

16 𝑢 =1

Phương sai tương thích:

2 = 𝑆𝑡𝑡

(𝑌𝑢 𝑁−𝑙

16−8

= = 272,80

2 = 18,19.

Với N: số thí nghiệm = 16 và l: hệ số có ý nghĩa = 8.

272,80

Vì phương sai tái hiện: 𝑆𝑡ℎ

18,19

2 𝑆𝑡𝑡 2 = 𝑆𝑡ℎ

= 15,00 (1) F =

(với 𝑆𝑡𝑡: phương sai tương thích; 𝑆𝑡ℎ: phương sai tái hiện)

Đồ án tốt nghiệp

Giá trị chuẩn Fisher ở mức p = 0,05, f1 = N – l, f2 = n – 1 tra bảng Fisher:

𝐹(0,05;8;2) = 19,371 = Flt (2)

Ghi chú:

f1: N – l (N = 16 là số thí nghiệm, l = 8 là số nghiệm thực).

f2: là bậc tự do của thí nghiệm tại tâm.

Điều kiện để mô hình tương thích là: 𝐹𝑡𝑛< 𝐹𝑙𝑡

Từ (1) và (2) suy ra được: 15,00 < 19,371  𝐹𝑡𝑛< 𝐹𝑙𝑡

Vậy phương trình hồi quy Ŷ = 136,40 + 19,74*X1 + 26,79*X2 – 10,93*X3 –

13,04*X12 + 4,94*X13 – 17,27*X23 – 8,81*X123 tương thích với thực nghiệm.

Từ kết quả thực nghiệm, rút ra kết luận sau:

- Trong 4 yếu tố tác động đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T.

koningii, yếu tố thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng lớn nhất (b2 = 26,79), tiếp

theo đến pH ban đầu (b1 = 19,74) và độ ẩm ban đầu (b3 = -10,93), nồng độ

dinh dưỡng ảnh hưởng rất nhỏ.

- Xét về sự tương tác giữa các yếu tố, kết quả cho thấy trừ yếu tố dinh dưỡng ra

thì 3 yếu tố còn lại có sự tương tác. Trong đó tương tác giữa thời gian nuôi cấy

và độ ẩm ban đầu là mạnh nhất (b23 = -17.27).

- Qua kết quả phân tích biến lượng và xếp hạng bằng trắc nghiệm Duncan, sự

khác biệt giữa các nghiệm thức rất có ý nghĩa (P < 0,05). Trong đó, môi trường

thứ 4 (nghiệm thức thứ 4) cho giá trị hoạt tính CMCase cao nhất (191,74 U/g)

với 4 yếu tố: pH ban đầu là 6, độ ẩm ban đầu 45%, thời gian nuôi cấy 48 giờ,

nồng độ dinh dưỡng 50% NĐC (phụ lục 20, 21, 22).

4.7. Khảo sát tỷ lệ tủa và chọn ra loại dung môi tủa enzyme cellulase tốt nhất

4.7.1. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi ethanol

Dịch chiết enzyme thu được từ môi trường tối ưu, được tủa với dung môi

ethanol 960 ở các tỷ lệ cần khảo sát, sau đó xác định hoạt tính CMCase và hàm lượng

protein. Kết quả được ghi nhận ở đồ thị 4.7. Theo kết quả phân tích biến lượng và

xếp hạng bằng trắc nghiệm Duncan, sự khác biệt giữa các nghiệm thức tỷ lệ dịch chiết

enzyme và dung môi ethanol rất có ý nghĩa (P < 0,05). Trong đó, tỷ lệ 1:4 giữa dịch

Đồ án tốt nghiệp

chiết enzyme và dung môi ethanol cho hoạt tính CMCase cao nhất (phụ lục 23, 24,

25).

ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ ATHANOL

250

25

23

200

21 ) g / g m

) g / U

19 ( n

150

17

15

100

13 ( e s a C M C h n

i e t o r p g n ợ ư

11 l

50

9 m à H

7 í t t ạ o H

0

5 1:1

1:2

1:3

1:4

1:5

1:6

1:7

Tỷ lệ dịch chiết enzyme và dung môi athanol (ml:ml)

Hoạt tính CMCase (U/g)

Hàm lượng protein (mg/g)

Đồ thị 4.7. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa

dịch chiết enzyme cellulase với dung môi ethanol

Theo kết quả từ đồ thị 4.7, dịch enzyme được tủa với dung môi ethanol 960 ở

tỷ lệ 1:4 cho hoạt tính CMCase và hàm lượng protein cao nhất (225,28 U/g và 18,31

mg/g). Khi cho dung môi ethanol lạnh vào dung dịch enzyme, các phân tử protein bị

mất nước và kém bền trong dung dịch, vì ethanol là dung môi háo nước sẽ tách nước

của protein ra làm khả năng hòa tan của protein giảm, hằng số điện ly của dung môi

giảm dẫn đến sự tạo tủa của enzyme. Tuy nhiên, ethanol lại có ái lực với các bề mặt

kỵ nước của phân tử protein và có thể làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa.

Khi tăng lượng dung môi, càng nhiều enzyme cellulase được kết tủa do đó hoạt độ

tăng lên. Nhưng càng về sau, khi enzyme cellulase bị tủa hết, càng tăng lượng dung

môi tủa thì càng có nhiều tạp chất bị tủa làm cho hoạt tính thấp. Do đó, khi tủa ở tỷ

lệ có nồng độ ethanol cao (1:5, 1:6, 1:7) hay thấp (1:1, 1:2, 1:3) đều ảnh hưởng đến

hoạt tính của enzyme.

Đồ án tốt nghiệp

4.7.2. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi acetone

Dịch chiết enzyme thu được từ môi trường tối ưu, tiếp tục được sử dụng để tủa

với dung môi acetone ở các tỷ lệ cần khảo sát, sau đó xác định hoạt tính CMCase và

hàm lượng protein. Kết quả được ghi nhận ở đồ thị 4.8. Theo kết quả phân tích biến

lượng và xếp hạng bằng trắc nghiệm Duncan, sự khác biệt giữa các nghiệm thức tỷ

lệ dịch chiết enzyme và dung môi acetone rất có ý nghĩa (P < 0,05). Trong đó, tỷ lệ

1:4 giữa dịch chiết enzyme và dung môi acetone cho hoạt tính CMCase cao nhất (phụ

lục 26, 27, 28).

ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ ACETONE

250

25 ) g / U

) g / g m

200

20 ( n

150

15

100

10 ( e s a C M C h n

i e t o r p g n ợ ư

l

50

5 í t t ạ o H

m à H

0 1:1

1:2

1:3

1:4

1:5

1:6

1:7

Tỷ lệ dịch chiết enzyme và dung môi acetone (ml:ml)

Hoạt tính CMCase (U/g)

Hàm lượng protein (mg/g)

Đồ thị 4.8. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa

dịch chiết enzyme cellulase với dung môi acetone

Theo kết quả từ đồ thị 4.8, dịch enzyme được tủa với dung môi acetone ở tỷ lệ

1:4 cho hoạt tính CMCase và hàm lượng protein cao nhất (230,41 U/g và 20,21 mg/g).

Tương tự như dung môi ethanol, khi cho dung môi acetone lạnh vào dung dịch

enzyme, các phân tử protein bị mất nước và kém bền trong dung dịch, vì acetone là

dung môi háo nước, sẽ tách nước của protein ra làm khả năng hòa tan của protein

giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, acetone lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước

của phân tử protein có thể làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Nếu tỷ lệ

acetone quá cao có thể ảnh hưởng đến lực hút tĩnh điện làm giảm khả năng kết tủa,

Đồ án tốt nghiệp

còn nếu tỷ lệ quá thấp sẽ không đủ để kết tủa hết enzyme. Do đó, khi tủa ở tỷ lệ có

nồng độ acetone cao (1:5, 1:6, 1:7) hay thấp (1:1, 1:2, 1:3) đều ảnh hưởng đến hoạt

tính của enzyme.

4.7.3. Khảo sát chọn ra dung môi tủa enzyme tối ưu

So sánh 2 kết quả có hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của 2 loại

dung môi với nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 4.8 và đồ thị 4.9.

Bảng 4.8. Giá trị hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase

khi tủa bằng dung môi ethanol 960 và dung môi acetone

Dung môi tủa Hoạt tính (U) Tỷ lệ dịch enzyme: dung môi tủa Hàm lượng (mg/g)

Ethanol 960 1:4 225,28 18,31

Acetone 1:4 230,41 20,21

ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI DUNG MÔI TỦA

240

235 ) g / U

) g / g m

230 ( n

225

220

215 ( e s a C M C h n

210 i e t o r p g n ợ ư

l

205 í t t ạ o H

200 22 22 21 21 20 20 19 19 18 18 17

m à H

Ethanol 96°

Acetone

Dung môi tủa enzyme

Hoạt tính CMCase (U/g)

Hàm lượng protein (mg/g)

Đồ thị 4.9. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase khi được tủa bằng dung môi ethanol 96° và dung môi acetone

Theo kết quả từ bảng 4.8 và đồ thị 4.9, trong 2 loại dung môi, khi tủa dịch

enzyme bằng dung môi acetone ở tỷ lệ 1:4 sẽ cho hoạt tính CMCase và hàm lượng

protein cao nhất (230,41 U/g và 20,21 mg/g). Vậy phương pháp tủa enzyme cellulase

bằng dung môi acetone là tối ưu.

Đồ án tốt nghiệp

4.8. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase

pH, nhiệt độ là các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzyme cellulase,

để biết được mức độ hoạt động của enzyme cellulase ở các điều kiện khác nhau, tiến

hành các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố pH, nhiệt độ đến hoạt tính

enzyme cellulase.

4.8.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase

pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cellulase cho nên

việc khảo sát ảnh hưởng của pH là điều cần thiết. Kết quả được ghi nhận ở đồ thị

4.10. Theo kết quả phân tích biến lượng và xếp hạng bằng trắc nghiệm Duncan, sự

khác biệt giữa các nghiệm thức pH rất có ý nghĩa (P < 0,05). Trong đó, pH 5 cho hoạt

tính CMCase cao nhất (phụ lục 29, 30, 31).

ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE

) g / U

( e s a C M C h n

í t t ạ o H

245 240 235 230 225 220 215 210 205 200 195

4

5

7

8 6 pH

Hoạt tính CMCase (U/g)

Đồ thị 4.10. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những pH khác nhau

Theo kết quả của đồ thị 4.10, môi trường phản ứng ở pH 5 cho hoạt tính cao

nhất (236,23 U/g). Môi trường pH 6, hoạt tính CMCase giảm rõ rệt so với pH 5 và

giảm dần đến pH 8. Môi trường pH 4 không phù hợp và hoạt tính CMCase có sự khác

biệt lớn so với hoạt tính CMCase ở pH 5. Qua kết quả, thấy rõ được sự ảnh hưởng

mạnh của pH đến hoạt tính enzyme cellulase. Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi

Đồ án tốt nghiệp

trường, pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng

đến độ bền enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với một vùng pH nhất định, ở giá trị pH

quá cao hoặc quá thấp thì đều làm giảm hoạt tính của enzyme cellulase. Và ở môi

trường pH 5 là môi trường mang tính acid sẽ cho phép enzyme hoạt động tốt nhất.

Kết quả trên phù hợp với kết quả báo cáo của Iwasaki và cộng sự (1975) và Wood

(1968).

4.8.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme. Tốc độ phản ứng của

enzyme tăng khi nhiệt độ tăng nhưng không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt

độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt

quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme giảm và làm enzyme vô hoạt.

Kết quả được ghi nhận ở đồ thị 4.11. Theo kết quả phân tích biến lượng và xếp

hạng bằng trắc nghiệm Duncan, sự khác biệt giữa các nghiệm thức nhiệt độ rất có ý

nghĩa (P < 0,05). Trong đó, nhiệt độ 500C cho hoạt tính CMCase cao nhất (phụ lục

32, 33, 34).

ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE

300 ) g / U

250

200

150 ( e s a C M C h n

100

50 í t t ạ o H

0

30

40

60

70 50 Nhiệt độ (°C)

Hoạt tính CMCase (U/g)

Đồ thị 4.11. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những nhiệt độ khác nhau

Theo kết quả ở đồ thị 4.11, môi trường phản ứng ở nhiệt độ 500C cho hoạt tính

cao nhất (251,77 U/g). Khi tăng nhiệt độ thì hoạt tính cellulase tăng và cao nhất ở

Đồ án tốt nghiệp

500C. Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ, hoạt tính cellulase giảm nhanh. Điều này phù hợp

với lý thiết: enzyme càng tinh sạch, càng nhạy với nhiệt độ cao. Ở nhiệt độ thấp,

enzyme chưa thể hoạt động một cách tốt nhất bên cạnh đó nếu nhiệt độ quá cao sẽ

làm biến tính enzyme cellulase, hoạt tính xúc tác giảm nhanh nên vận tốc phản ứng

cũng giảm theo. Theo báo cáo của Khatijah và cộng sự (1983), nhiệt độ tối ưu cho

hoạt động của enzyme cellulase của T. koningii là 450C, vì tác giả khảo sát các nhiệt

độ 30, 37, 45, 55, 65, 70 và 800C nên nhiệt độ tối ưu khác nhau nhưng vẫn có sự

tương đồng với nhau, vì giữa 450C và 500C, khoảng cách nhiệt độ không quá lớn nên

có thể ước lượng được khoảng nhiệt độ tối ưu cho phản ứng của enzyme cellulase

của T. koningii là từ 45 – 500C.

4.9. Tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel

Sau khi tiến hành tủa 10 ml dung dịch enzyme thô ủ lạnh với dung môi acetone

ở tỷ lệ 1:4, ly tâm thu cặn, pha với đệm acetate natri pH 5 cho đủ 2 ml. Lấy 1 ml mẫu

này sẽ được tinh sạch qua hệ sắc ký cột với các thông số sau:

Gel: Sephadex G-75. Vmẫu: 1 ml.

Cột: 50 cm × 15 cm. Phân đoạn: 2 ml.

Flow adaptor: 1,5 cm A280: độ hấp thụ protein ở bước sóng 280 nm.

Tốc độ dòng chảy: 0,14 ml/phút.

Kết quả tinh sạch enzyme cellulase qua lọc gel thu được 3 peak với thứ tự sau:

Peak 1: từ ống 15 đến 24 thu được 18 ml.

Peak 2: từ ống 33 đến 43 thu được 20 ml.

Peak 3: từ ống 44 đến 63 thu được 38 ml.

Xác định hàm lượng protein và hoạt tính CMCase 3 peak. Từ kết quả hàm

lượng, hoạt tính, tính hoạt tính riêng trước, sau khi sắc ký và tính được hiệu suất, độ

tinh sạch.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 4.5. Sắc ký đồ tinh sạch enzyme cellulase

Bảng 4.9. Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

∑HT (U) 299,97 ∑HL (mg) 158,42 HTR (U/mg) 1,89 Độ tinh sạch (lần) 1 Hiệu suất (%) 100

202,719 27,17 7,46 3,95 67,58

Các bước TN Trước sắc ký Sau sắc ký

Sau khi chạy sắc ký, ta thấy rằng enzyme sau tinh sạch có hoạt tính và hàm

lượng protein thấp hơn so với enzyme trước tinh sạch. Điều này xảy ra do các thao

tác tủa, ly tâm, trong quá trình tinh sạch đã làm thất thoát enzyme. Tuy nhiên, hoạt

tính riêng tăng lên gần 3,95 lần, độ tinh sạch hơn 3,95 lần, hiệu suất tinh sạch đạt

67,58% điều này có được là do sau khi tinh sạch các protein tạp đã được loại một

phần.

Đồ án tốt nghiệp

4.10. Kết quả phân tách hệ cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS –

PAGE

1 2 3 4

Enzyme sau khi tinh sạch, đông khô thì được

hòa tan trong dung dịch đệm acetate 50mM pH 5 và

sau đó thực hiện chạy điện di SDS – PAGE. Tính

giá trị 𝑅𝑓 của từng protein trong thang chuẩn và các

vạch protein trong các giếng mẫu. Kết quả ghi nhận

được như hình 4.6.

Giếng 1: Thang chuẩn

Giếng 2: Enzyme thô

Giếng 3: Enzyme cellulose tinh sạch

Giếng 4: Enzyme cellulose chuẩn

Hình 4.6. Kết quả điện di

Bảng 4.10. Giá trị 𝑅𝑓 và log (trọng lượng phân tử) của các protein trong thang chuẩn.

Trọng lượng phân tử (Dal) Log MW 𝑹𝒇 (cm)

0,075 118,000 5,071

0,132 90,000 4,954

0,320 50,000 4,698

0,433 34,000 4,531

0,515 26,000 4,414

0,612 19,000 4,278

Đồ án tốt nghiệp

ĐƯỜNG CHUẨN

6

5

4

3 W M g o L

y = -1.4537x + 5.1633 R² = 0.9987

2

1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

𝑅𝑓

Log MW

Linear (Log MW)

Đồ thị 4.12. Sự tương quan giữa log (trọng lượng phân tử) của protein trong thang chuẩn với 𝑅𝑓

Tiến hành xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính tương quan giữa giá trị

𝑅𝑓 và Log của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel, ta được

phương trình: y = - 1,4537x + 5,1633

Trong đó: y = Log trọng lượng phân tử protein

x = 𝑅𝑓 tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di

chuyển của phẩm màu bromophenol blue

y = Log MW => MW = 10Y

Đồ án tốt nghiệp

Từ phương trình trên ta dùng phương pháp ngoại suy để tính trọng lượng phân

tử của các vạch protein trong các giếng ở hình 4.6.

Bảng 4.11. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 2

Giếng 2

Daltons Log MW 𝑹𝒇

0,241 65.006,726 4,813

0,354 44.533,845 4,649

0,403 37.797,136 4,577

0,430 34.530,987 4,538

0,483 28.917,643 4,461

0,516 25.304,094 4,413

Bảng 4.12. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 3

Giếng 3

Daltons Log MW 𝑹𝒇

0,430 34.530,987 4,538

Bảng 4.13. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 4

Giếng 4

Daltons Log MW 𝑹𝒇

0,430 34.530,987 4,538

Từ kết quả điện di, có thể dự đoán trọng lượng phân tử của enzyme cellulase

của nấm mốc T. koningii là 34.530,987 Daltons.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

Nghiệm thức tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme cellulase của T. koningii sau khi quy hoạch thực nghiệm gồm có: tỷ lệ cơ

chất bã mía và cám gạo là 3:7 (g:g), độ ẩm ban đầu là 45%, pH ban đầu là 6, nồng độ

dinh dưỡng là 50% nồng độ chuẩn, thời gian nuôi cấy là 48 giờ. Riêng tỷ lệ giống

ảnh hưởng không đáng kể nhưng chọn tỷ lệ giống là 107 bào tử/môi trường để thực

hiện thí nghiệm các thí nghiệm khảo sát các yếu tố trên.

Dung môi tủa enzyme tốt nhất là dung môi acetone ở tỷ lệ giữa dịch chiết và

dung môi acetone là 1:4 (ml:ml). pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme

cellulase của T. koningii là pH 5 và nhiệt độ 500C.

Sau sắc ký enzyme được tinh sạch với độ tinh sạch là 3,95 và hiệu suất tinh

sạch 67,58% với hoạt tính riêng 7,46 (U/mg). Trọng lượng phân tử của protein cần

tìm là 34.530,987 Daltons.

5.2. Kiến nghị

- Thực hiện kế hoạch leo dốc để tìm ra môi trường thích hợp nhất cho chủng

nấm mốc Trichoderma koningii nghiên cứu tạo enzyme cellulase mạnh nhất.

- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T. koningii trên môi

trường lên men bán rắn với các cơ chất khác như trấu, bột mì tinh, cám mì,

cám bắp, malt đại mạch,…

- Nghiên cứu khảo sát các điều kiện bảo quản enzyme tốt nhất.

- Khảo sát thêm các phương pháp tủa khác như lắng tủa đẳng điện, lắng tủa bằng

các chất đa điện phân,…

- Tiến hành cố định enzyme cellulase trên các chất mang (algrinate, chitosan…)

- Thử nghiệm làm chế phẩm enzyme dùng trong xử lý rác thải cellulose, xử lý

phân bón trong nông nghiệp.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Cảnh (1993). Quy hoạch thực nghiệm, NXB Đại học Bách Khoa

Thành phố Hồ Chí Minh.

2. Trần Anh Đào (2012). Phương pháp tách và tinh chế enzyme protease nhằm

thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao, Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Hóa thực

phẩm, Đại học Vinh.

3. N.X.ÊGÔRÔV hiệu đính, Nguyễn Lân Dũng dịch (1976). Thực tập vi sinh vật

học, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội.

4. Lê Duy Linh và cộng sự (1997). Thực tập nhỏ vi sinh, Tủ sách Đại học Khoa

học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh.

5. Nguyễn Văn Mùi (2001). Thực hành hóa sinh, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà

Nội, trang 42 – 43, 117 – 119.

6. Phan Thị Ánh Nhung (2011). Tối ưu hóa thực nghiệm và tinh sạch enzyme

protease từ nấm mốc Trichoderma Viride trên môi trường lên men cám gạo :

bã đậu nành, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí

Minh.

7. Lương Đức Phẩm (1998). Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp,

Hà Nội.

8. Nguyễn Hoàng Phúc và những cộng sự (2012). Tìm hiểu về ứng dụng của

nhóm enzyme cellulase, Tiểu luận tốt nghiệp, Đại học Công nghệ Thực phẩm

Tp. Hồ Chí Minh.

9. Nguyễn Như Quỳnh (2006). Tìm hiểu về một loại nấm Linh chi thu hái tại Thủ

Đức – Tp Hồ Chí Minh, Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại

học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

10. Huỳnh Thị Hồng Sương (2013). Nghiên cứu quá trình tách chiết và tinh sạch

sơ bộ enzyme cellulase từ Trichoderma viride, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học

Sài Gòn.

11. Nguyễn Bá Phương Thảo (2009). Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả

năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger và Mucor

Đồ án tốt nghiệp

trên môi trường lên men bán rắn, Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh

học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

12. Nguyễn Tiến Thắng. Thực tập sinh học phân tử, Viện sinh học nhiệt đới, Tp.

Hồ Chí Minh, trang 7.

13. Đông Thị Thanh Thu (1995). Hóa sinh ứng dụng, Tủ sách Đại học Tổng hợp

Tp. Hồ Chí Minh.

14. Trần Linh Thước (2003). Tài liệu thực tập chuyên đề cao học chuyên ngành

vi sinh khóa X, XI, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh.

15. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Chấu và Nguyễn Lân Dũng (1982).

Enzyme vi sinh vật, tập 2, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.

16. Võ Thị Bích Viên (2009). Khảo sát đặc điểm sinh học một số nhóm nấm sợi

từ rừng ngập mặn Cần Giờ Tp. Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Khoa học Sinh

học, Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh.

17. Trần Lương Hồng Yến (2012). Nghiên cứu quá trình tách chiết và tinh sạch

protein trong rong bún Enteromorpha spp, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Kỹ thuật

Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

18. Đinh Hoàng Yến (2012). Báo cáo thực hành môn công nghệ protein – enzyme,

(GVHD: TS. Nguyễn Thành Trung).

Tài liệu nước ngoài

19. Bio-Rad Laboratories (2004). Molecular weight determination by SDS-PAGE,

BioRadiations, A resource for life science research, 114: 25-27.

20. Hamelinck Carlo Noel, Hooijdonk Geertje van and Faaij Adrianus Petrus

Cornelis (2003). Prospects for ethanol from lignocellulosic biomass: Techno-

economic performance as development progresses, Utrecht University,

Copernicus Instinute, Science Technology Society.

21. Cui Fumian, Liu Han and Han Lui (1995). Studies on the conditions for

cellulase production from Trichoderma koningii CP88329, Wei Sheng wu xue

Tong bao: 72-76.

Đồ án tốt nghiệp

22. Uhlig Helmut (1998). Industrial Enzymes and Their Applications, Hoboken,

John Wiley and Sons, Inc, New Jersey.

23. King Monkut’s Institue of Technology Thonburi (1996). The workshop on

solid substrate fermentation in biotechnology.

24. Pitt J.I. and Hocking A.D (1997). Fungi and Food Spoilage, Blackie Academic

and Professional-An Imprint of Chapman and Hall.

25. Tolan J.S (1999). Alcohol production from cellulosic biomass: The logen

process, a model system in operation, In: Jacques, and L. T. Kelsall, The

alcohol textbook: 117-129. Nottingham University Press.

26. Jian Liu and Jichu Yang (2007). Cellulase production by Trichoderma

koningii AS3.4262 in solid-state fermentation using lignocellulosic waste, In:

Food Technology and Biotechnology, 45: 420-425. Zagreb Croatia.

27. Karimi M., Kheiralipour K., Tabatabaeefar A., Khoubakht. G.M., Naderi M.

and Heidarbeigi K (2009). The effect of moisture content on physical

properties of wheat, In: Pakistan Journal of Nutrition: 90-95.

28. Khatijah Masbah, Mohammad Ismail Yaziz and Chow Chin Tong (1983).

Degradation of cellulose by Aspergillus sp, Trichoderma koningii and

Myriococcum sp., 8-16.

29. Raimbault Maurice (1998). General and microbiological aspects of solid

substrate fermentation, In: EJM Electronic Journal of Biotechnology Vol.1,

No. 3: 174-188.

30. Clipson N., Landy E., Costello M.J. and Otte M (2011). A check-list of the

marine species in Europe and a bibliography of guides to their identification.

Collection Patrimoines Naturels, 50. In: European register of marine species:

15-19. Muséum national d’Histoire naturelle, Paris.

31. Wang S, Liu G, Yu J, Tian S, Huang B and Xing M. (2013). RNA interference

with carbon catabolite repression in Trichoderma koningii for enhancing

cellulase production, In: Enzyme Microb Technol, Vol 53, isue 2: 104-109.

Đồ án tốt nghiệp

32. Zou Shui-yang, Liu Chuan-sheng, Zhu Dan (2011). Solid state fermentation

for cellulase and xylanlase production by Trichoderma koningii, In: Journal

of Dongguan University of technology.

33. Iwasaki T., Ikeda R., Hayashi K. and Fatnatsu M (1975). Biochemical studies

on cellulase. II Properties of two types of cellulase from Trichoderma koningii,

In J. Biochem 57: 478-487.

34. Wood T. M (1986). Cellulolytic enzyme system of Trichoderma koningii.

Separation of components attacking native cotton, In: J. Biochem, 109: 217-

227.

35. Wood T. M. and McCrae S.I. (1972). The purification and properties of the

C1 component of Trichoderma koningii cellulase, In: J. Biochem, 128: 1183-

1192.

36. Liu Xiao-jie,He Guo-qing and Chen Qi-he (2003). Culture medium

optimization for producing cellulase by Trichoderma koningii ZJ5, In: Journal

of Zhejiang University (Engineering Science).

Tài liệu điện tử

37. Karen and Peter (2009). Plant gene mapping may lead to better biofuel

production. Http://www.bnl.gov/newsroom/news.php?a=1928

38. Krystal Worthington (1993). Cellulase, In: Worthington Enzyme Manual.

Worthington Biochemical Corp. Http://www.worthington-biochem.com/cel/.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Các đường chuẩn

Đường chuẩn Albumine

ĐƯỜNG CHUẨN ALBUMINE

0.14

0.12 y = 0.0024x + 0.0028 R² = 0.9974

0.1

0.08 OD

0.06 m n 5 9 5 D O

Tuyến tính

0.04

0.02

0

10

20

30

40

50

60 Nồng độ Albumine

Đồ thị P1. Đường chuẩn Albumine Đường chuẩn glucose

ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSE

0.9

0.8 y = 1.3571x - 0.0296 R² = 0.9956

0.7

0.6

0.5

0.4 OD

0.3 Tuyến tính

m n 0 4 5 D O

0.2

0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7 -0.1

Nồng độ glucose

Đồ thị P2. Đường chuẩn glucose

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 2 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo sát

ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất BM:CG đến khả năng tổng hợp enzyme cellulase

Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 1 2 3

1 (2:8) 43,52 43,39 40,95 42,62

2 (3:7) 81,27 81,01 81,44 81,24

3 (4:6) 72,01 72,41 73,32 72,58

4 (5:5) 49,46 50,19 52,18 50,61

5 (6:4) 44,28 44,53 41,03 43,28

6 (7:3) 40,85 38,57 36,44 38,62

Phụ lục 3 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất BM:CG

trên kết quả phụ lục 2

ANOVA Table

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 4712.58 942.517 426.22 0.0000 5

Within groups 26.536 2.21133 12

Total (Corr.) 4739.12 17

Summary Statistics

Count Average Standard deviation Standard error Sum

ty le 2:8 3 42.62 0.835843 127.86 1.44772

ty le 3:7 3 81.15 0.145029 243.45 0.251197

ty le 4:6 3 72.58 0.387599 217.74 0.671342

ty le 5:5 3 50.61 0.812794 151.83 1.4078

ty le 6:4 3 43.28 1.12731 129.84 1.95256

ty le 7:3 3 38.62 1.2733 115.86 2.20543

Total 18 54.81 3.93539 986.58 16.6965

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 4 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ

chất BM:CG trên kết quả phụ lục 2

Multiple Range Tests

Method: 95.0 percent Duncan

Count Mean Homogeneous Groups

ty le 7:3 3 38.62 X

ty le 2:8 3 42.62 X

ty le 6:4 3 43.28 X

ty le 5:5 3 50.61 X

ty le 4:6 3 72.58 X

ty le 3:7 3 81.15 X

Phụ lục 5 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo sát

ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 2 3 1

1 (45%) 101,53 101,47 100,12 101,04

2 (50%) 118,44 119,89 118,91 119,08

3 (55%) 81,73 80,99 82,65 81,79

4 (60%) 55,48 57,33 56,78 56,53

5 (65%) 43,17 40,90 42,23 42,10

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 6 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm trên kết quả

phụ lục 5

ANOVA Table

Sum of Source Df Mean Square F-Ratio P-Value Squares

Between groups 11881.0 2970.24 3641.79 0.0000 4

Within groups 8.156 0.8156 10

Total (Corr.) 11889.1 14

Summary Statistics

Count Average Standard deviation Standard error Sum

do am 45 % 3 101.04 0.797308 0.460326 303.12

do am 50 % 3 119.08 0.739797 0.427122 357.24

do am 55 % 3 81.79 0.831625 0.480139 245.37

do am 60 % 3 56.53 0.95 0.548483 169.59

do am 65 % 3 42.1 1.14057 0.658508 126.3

Total 15 80.108 29.1414 7.52429 1201.62

Phụ lục 7 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm

ban đầu trên kết quả phụ lục 5

Multiple Range Tests

Method: 95.0 percent Duncan

Count Mean Homogeneous Groups

do am 65 % 3 42.1 X

do am 60 % 3 56.53 X

do am 55 % 3 81.79 X

do am 45 % 3 101.04 X

do am 50 % 3 119.08 X

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 8 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo sát

ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 2 3 1

97,62 99,19 98,33 98,38 1 (pH 4)

164,05 163,44 160,16 162,55 2 (pH 5)

132,35 133,39 132,06 132,60 3 (pH 6)

116,49 123,64 119,18 119,77 4 (pH7)

110,34 111,65 111,67 111,22 5 (pH 8)

Phụ lục 9 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu trên kết quả

phụ lục 8

ANOVA Table

Sum of Source Df Mean Square F-Ratio P-Value Squares

Between groups 7180.75 4 1795.19 469.77 0.0000

Within groups 38.2138 10 3.82138

Total (Corr.) 7218.96 14

Summary Statistics

Count Average Standard deviation Standard error Sum

pH 4 3 98.38 0.786193 0.453909 295.14

pH 5 3 162.55 2.09215 1.2079 487.65

pH 6 3 132.6 0.699357 0.403774 397.8

pH 7 3 119.77 3.61133 2.085 359.31

pH 8 3 111.22 0.762168 0.440038 333.66

Total 15 124.904 22.7077 5.86311 1873.56

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 10 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH ban

đầu trên kết quả phụ lục 8

Multiple Range Tests

Method: 95.0 percent Duncan

Count Homogeneous Groups Mean

pH 4 3 98.38 X

pH 8 3 111.22 X

pH 7 3 119.77 X

pH 6 3 132.6 X

pH 5 3 162.55 X

Phụ lục 11 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo sát

ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

cellulase

Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 1 2 3

1 (0% NĐC) 81,54 83,29 84,65 83,16

2 (50% NĐC) 154,81 155,84 160,08 156,91

3 (100% NĐC) 161,46 160,75 162,65 161,62

4 (150% NĐC) 152,08 154,39 154,84 153,77

5 (200% NĐC) 123,51 123,73 124,64 123,96

6 (250% NĐC) 113,64 112,86 117,15 114,55

7 (300% NĐC) 105,67 108,33 106,10 106,70

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 12 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng

môi trường ban đầu trên kết quả phụ lục 11

ANOVA Table

Sum of Source Df Mean Square F-Ratio P-Value Squares

Between groups 15865.8 2644.3 882.83 0.0000 6

Within groups 41.9338 2.99527 14

Total (Corr.) 15907.8 20

Summary Statistics

Count Average Standard deviation Standard error Sum

0% NĐC 3 83.16 1.55907 0.90013 249.48

100% NĐC 3 161.62 0.960052 0.554286 484.86

150% NĐC 3 153.77 1.48078 0.854927 461.31

200% NĐC 3 123.96 0.599083 0.345881 371.88

250% NĐC 3 114.55 2.28519 1.31936 343.65

300% NĐC 3 106.7 1.4279 0.824399 320.1

50% NĐC 3 156.91 2.79319 1.61265 470.73

Total 21 128.667 28.2026 6.15432 2702.01

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 13 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ

dinh dưỡng môi trường trên kết quả phụ lục 11

Multiple Range Tests

Method: 95.0 percent Duncan

Count Mean Homogeneous Groups

0% NĐC 3 83.16 X

300% NĐC 3 106.7 X

250% NĐC 3 114.55 X

200% NĐC 3 123.96 X

150% NĐC 3 153.77 X

50% NĐC 3 156.91 X

100% NĐC 3 161.62 X

Phụ lục 14 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo sát

ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

Lần lặp lại Trung bình Nghiệm thức 1 3 2

9,21 42,54 101,71 140,82 169,72 8,94 42,56 102,45 139,13 172,35

1 (8 giờ) 2 (16 giờ) 3 (24 giờ) 4 (32 giờ) 5 (40 giờ) 6 (48 giờ) 7 (56 giờ) 8 (64 giờ) 9 (72 giờ) 10 (80 giờ) 11 (88 giờ) 12 (96 giờ) 13 (104 giờ) 14 (112 giờ) 7,86 45,01 99,44 136,42 169,73 160,28 131,36 112,77 104,33 70,94 67,41 60,12 48,53 33,58 157,95 130,67 107,25 103,96 72,21 64,87 55,52 44,31 35,92 158,86 128,33 109,62 103,98 73,72 67,22 57,85 45,94 34,6 8,67 43,37 101,20 138,79 170,60 159,03 130,12 109,88 104,09 72,29 66,50 57,83 46,26 34,70

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 15 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trên

kết quả phụ lục 14

ANOVA Table

Sum of Source Df Mean Square F-Ratio P-Value Squares

Between groups 94835.8 7295.06 2621.56 0.0000 13

Within groups 77.9162 2.78272 28

Total (Corr.) 94913.7 41

Summary Statistics

Count Average Standard deviation Standard error Sum

104 gio 3 1.22867 138.78 46.26 2.12812

112 gio 3 0.677348 104.1 34.7 1.1732

16 gio 3 0.82002 130.11 43.37 1.42032

24 gio 3 0.905557 303.6 101.2 1.56847

32 gio 3 1.2815 416.37 138.79 2.21962

40 gio 3 0.875005 511.8 170.6 1.51555

48 gio 3 0.677963 477.09 159.03 1.17427

56 gio 3 0.916897 390.36 130.12 1.58811

64 gio 3 1.59878 329.64 109.88 2.76917

72 gio 3 0.120139 312.27 104.09 0.208087

8 gio 3 0.412432 26.01 8.67 0.714353

80 gio 3 0.803513 216.87 72.29 1.39173

88 gio 3 0.816844 199.5 66.5 1.41481

96 gio 3 1.32794 173.49 57.83 2.30007

48.1141 Total 42 88.8093 7.42417 3729.99

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 16 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian

nuôi cấy trên kết quả phụ lục 14

Multiple Range Tests

Method: 95.0 percent Duncan

Count Mean Homogeneous Groups

8 gio 3 8.67 X

112 gio 3 34.7 X

16 gio 3 43.37 X

104 gio 3 46.26 X

96 gio 3 57.83 X

88 gio 3 66.5 X

80 gio 3 72.29 X

24 gio 3 101.2 X

72 gio 3 104.09 X

64 gio 3 109.88 X

56 gio 3 130.12 X

32 gio 3 138.79 X

48 gio 3 159.03 X

40 gio 3 170.6 X

Phụ lục 17 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo sát

ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

Nghiệm thức Trung bình

1 (0,5 x 107 bào tử/MT) 2 (1 x 107 bào tử/MT) 3 (1,5 x 107 bào tử/MT) 4 (2 x 107 bào tử/MT) 5 (2,5 x 107 bào tử/MT) 6 (3 x 107 bào tử/MT) Lần lặp lại 2 147,61 153.17 149,87 148,19 150,84 148,11 3 146,13 149,55 145,84 149,04 149,25 150,10 1 146,33 151,72 151,53 148,21 150,75 150,83 146,69 151,48 149,08 148,48 150,28 149,68

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 18 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống trên kết

quả phụ lục 17

ANOVA Table

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 40.1642 5 8.03285 3.10 0.0502

Within groups Total (Corr.) 31.0822 71.2464 12 17 2.59018

Summary Statistics

Count Average Standard deviation Standard error Sum

1 146.69 0.802994 0.463609 440.07 3

2 151.48 1.82189 1.05187 454.44 3

3 149.08 2.92611 1.68939 447.24 3

4 148.48 0.485077 0.28006 445.44 3

5 150.28 0.893141 0.515655 450.84 3

6 149.68 1.4078 0.812794 449.04 3

2.04719 Total 18 149.282 0.482526 2687.07

Phụ lục 19 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian

nuôi cấy trên kết quả phụ lục 17

Multiple Range Tests

Method: 95.0 percent Duncan

Count Mean Homogeneous Groups

X 1 3 146.69

XX 4 3 148.48

XXX 3 3 149.08

XX 6 3 149.68

XX 5 3 150.28

X 2 3 151.48

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 20 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo sát

tối ưu hóa thực nghiệm

Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 1 3 2

1 103,51 103,31 104,33 106,17

2 145,81 143,48 143,80 142,11

3 165,12 162,67 163,54 162,83

4 191,78 193,48 191,74 189,96

5 51,76 53,31 53,57 55,64

6 148,34 144,45 146,62 147,07

7 152,56 150,77 152,26 153,45

8 157,99 159,18 157,90 156,53

9 100,23 101,88 101,51 102,42

10 138,69 138,27 138,16 137,52

11 158,23 162,49 160,72 161,44

12 175,65 175,22 174,82 173,59

13 49,28 46,64 47,93 47,87

14 140,35 143,40 140,98 139,19

15 149,58 149,51 149,44 149,23

16 156,21 154,21 155,08 154,82

17 183,76 183,85 183,28 182,23

18 178,68 182,89 180,56 180,11

19 190,13 188,42 188,92 188,21

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 21 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa thực nghiệm trên kết quả

phụ lục 20

ANOVA Table

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 90113.2 5006.29 2150.11 0.0000 18

Within groups 88.4786 2.32838 38

Total (Corr.) 90201.7 56

Summary Statistics

Count Average Standard deviation Standard error Sum

1 3 104.33 1.59662 0.92181 312.99

10 3 138.16 0.592706 0.342199 414.48

11 3 160.72 2.21939 1.28137 482.16

12 3 174.82 1.08669 0.627402 524.46

13 3 47.93 1.32102 0.762693 143.79

14 3 140.98 2.17456 1.25548 422.94

15 3 149.44 0.185203 0.106927 448.32

16 3 155.08 1.02504 0.591805 465.24

17 3 183.28 0.910439 0.525642 549.84

18 3 180.56 2.14077 1.23597 541.68

19 3 188.92 1.05314 0.60803 566.76

2 3 143.8 1.87064 1.08002 431.4

3 3 163.54 1.37066 0.791349 490.62

4 3 191.74 1.76034 1.01633 575.22

5 3 53.57 1.95302 1.12758 160.71

6 3 146.62 1.98366 1.14527 439.86

7 3 152.26 1.36495 0.788057 456.78

8 3 157.9 1.32729 0.766312 473.7

9 3 101.51 1.14092 0.658711 304.53

40.1341 Total 57 143.956 5.31589 8205.48

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 22 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa thực

nghiệm trên kết quả phụ lục 20

Multiple Range Tests

Method: 95.0 percent Duncan

Count Mean Homogeneous Groups

13 3 47.93 X

5 3 53.57 X

9 3 101.51 X

1 3 104.33 X

10 3 138.16 X

14 3 140.98 X

2 3 143.8 X

6 3 146.62 X

15 3 149.44 X

7 3 152.26 X

16 3 155.08 X

8 3 157.9 X

11 3 160.72 X

3 3 163.54 X

12 3 174.82 X

18 3 180.56 X

17 3 183.28 X

19 3 188.92 X

4 3 191.74 X

100

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 23 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo

sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa với dung môi ethanol đến hoạt tính enzyme cellulase

Nghiệm thức Trung bình

1 (1:1) 2 (1:2) 3 (1:3) 4 (1:4) 5 (1:5) 6 (1:6) 7 (1:7) 1 27,55 105,11 167,14 225,11 205,55 189,27 162,42 Lần lặp lại 2 33,26 104,21 168,03 223,25 203,12 191,53 164,07 3 30,36 105,02 168,20 227,48 204,89 188,69 157,02 30,39 104,78 167,79 225,28 204,52 189,83 161,17

Phụ lục 24 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase

với dung môi ethanol trên kết quả phụ lục 23

ANOVA Table

Source Df Mean Square F-Ratio P-Value

6 13395.7 6323.86 0.0000 Sum of Squares 80374.1 Between groups

14 2.11828 29.6559 Within groups

20 80403.8 Total (Corr.)

Summary Statistics

Count Average Standard deviation Standard error Sum

30.39 2.85512 1.6484 91.17 ty le 1:1 3

104.7 0.455302 0.262869 314.1 ty le 1:2 3

167.653 0.460471 0.265853 502.96 ty le 1:3 3

ty le 1:4 3 224.547 0.650188 673.64 1.12616

ty le 1:5 3 204.397 0.704186 613.19 1.21969

ty le 1:6 3 190.21 0.67951 570.63 1.17695

ty le 1:7 3 162.553 0.839808 487.66 1.45459

Total 21 154.921 13.8361 3253.35 63.405

101

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 25 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa

enzyme cellulase với dung môi ethanol trên kết quả phụ lục 23

Multiple Range Tests

Method: 95.0 percent Duncan

Homogeneous Groups

ty le 1:1 ty le 1:2 Count 3 3 Mean 30.39 104.7

X X X ty le 1:7 3 162.553

X X X X ty le 1:3 ty le 1:6 ty le 1:5 ty le 1:4 3 3 3 3 167.653 190.21 204.397 224.547

Phụ lục 26 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo sát

ảnh hưởng tỷ lệ tủa với dung môi acetone đến hoạt tính enzyme cellulase

Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 1 2 3

1 (1:1) 52,11 49,69 52,73 51,51

2 (1:2) 103,20 105,77 102,25 103,74

3 (1:3) 176,03 176,54 178,04 176,87

4 (1:4) 229,59 230,36 231,28 230,41

5 (1:5) 166,34 163,78 165,24 165,12

6 (1:6) 162,30 159,31 161,99 161,20

7 (1:7) 124,33 124,47 125,12 124,64

Phụ lục 27 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase

với dung môi acetone trên kết quả phụ lục 26

ANOVA Table

Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 5674.36 9917.4 1.74776 59504.4 24.4686 59528.8 6 14 20 P-Value 0.0000

102

Đồ án tốt nghiệp

Summary Statistics

Count Average Standard deviation Standard error Sum

ty le 1:1 3 51.51 1.60636 0.927434 154.53

ty le 1:2 3 103.74 1.82107 1.0514 311.22

ty le 1:3 3 176.87 1.04484 0.603241 530.61

ty le 1:4 3 230.41 0.846109 0.488501 691.23

ty le 1:5 3 165.12 1.28421 0.74144 495.36

ty le 1:6 3 161.2 1.64411 0.949228 483.6

ty le 1:7 3 124.64 0.421545 0.243379 373.92

Total 21 144.784 54.5568 11.9053 3040.47

Phụ lục 28 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tủa

enzyme cellulase với dung môi acetone trên kết quả phụ lục 26

Multiple Range Tests

Method: 95.0 percent Duncan

Count Mean Homogeneous Groups

ty le 1:1 3 51.51 X

ty le 1:2 3 103.74 X

ty le 1:7 3 124.64 X

ty le 1:6 3 161.2 X

ty le 1:5 3 165.12 X

ty le 1:3 3 176.87 X

ty le 1:4 3 230.41 X

103

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 29 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo sát

ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase

Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 1 2 3

1 (pH 4) 206,28 206,33 204,46 205,69

2 (pH 5) 234,84 234,52 239,33 236,23

3 (pH 6) 232,50 229,71 230,31 230,84

4 (pH7) 219,15 219,01 216,65 218,27

5 (pH 8) 212,86 211,64 211,44 211,98

Phụ lục 30 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính

enzyme cellulase trên kết quả phụ lục 29

ANOVA Table

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 1953.59 488.397 186.57 0.0000 4

Within groups 26.1782 2.61782 10

Total (Corr.) 1979.77 14

Summary Statistics

Count Average Standard deviation Standard error Sum

1.0655 0.615169 617.07 pH 4 3 205.69

2.68944 1.55275 708.69 pH 5 3 236.23

1.46857 0.84788 692.52 pH 6 3 230.84

1.40471 0.811008 654.81 pH 7 3 218.27

0.768635 0.443772 635.94 pH 8 3 211.98

Total 15 220.602 11.8917 3.07042 3309.03

104

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 31 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến

hoạt tính enzyme cellulase trên kết quả phụ lục 29

Multiple Range Tests

Method: 95.0 percent Duncan

Count Mean Homogeneous Groups

pH 4 3 205.69 X

pH 8 3 211.98 X

pH 7 3 218.27 X

pH 6 3 230.84 X

pH 5 3 236.23 X

Phụ lục 32 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo

sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase

Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 2 3 1

155,74 154,23 154,34 154,77 30°C

224,08 226,38 223,13 224,53 40°C

249,61 253,65 252,05 251,77 50°C

160,17 161,92 161,84 161,31 60°C

126,52 131,25 124,79 127,52 70°C

Phụ lục 33 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt

tính enzyme cellulase trên kết quả phụ lục 32

ANOVA Table

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 32384.0 8096.0 2044.49 0.0000 4

Within groups 39.5992 3.95992 10

Total (Corr.) 32423.6 14

Summary Statistics

105

Đồ án tốt nghiệp

Count Average Standard deviation Standard error Sum

3 154.77 0.841843 0.486038 464.31 30°C

3 224.53 1.67108 0.964797 673.59 40°C

3 251.77 2.0345 1.17462 755.31 50°C

3 161.31 0.988079 0.570468 483.93 60°C

3 127.52 3.34408 1.93071 382.56 70°C

15 183.98 48.1246 12.4257 2759.7 Total

Phụ lục 34 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

đến hoạt tính enzyme cellulase trên kết quả phụ lục 32

Multiple Range Tests

Method: 95.0 percent Duncan

Count Mean Homogeneous Groups

70°C 3 127.52 X

30°C 3 154.77 X

60°C 3 161.31 X

40°C 3 224.53 X

50°C 3 251.77 X

106

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 35 Một số hình ảnh máy móc, thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

Hình P1. Máy ly tâm Hình P2. Kính hiển vi quang học

Hình P4 Buồng đếm hồng cầu

Hình P5. Cân phân tích Hình P3. Autoclave

107

Đồ án tốt nghiệp

Hình P7. Bể ủ nhiệt Hình P6. Kính hiển vi điện tử

Hình P8. Hệ thống máy sắc ký cột Hình P9. Thiết bị điện di đứng

Hình P10. Máy đo quang phổ kế UV – Vis Hình P11. Tủ sấy

108

Đồ án tốt nghiệp

Hình P12. Bếp điện Hình P13. Máy đo pH

Phụ lục 36 Hình ảnh thí nghiệm

a b

Hình P14. Môi trường lên men bán rắn trước khi cấy nấm T. koningii (hình a) và sau khi cấy nấm 48 giờ (hình b)

Hình P16. Mẫu đo hàm lượng protein của enzyme cellulase Hình P15. Mẫu đo hoạt tính enzyme cellulase

109