Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurella multocida, streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh

H(cid:1232)C VI(cid:1226)N NỌNG NGHI(cid:1226)P VI(cid:1226)T NAM ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯

ĐỖ T(cid:1192)T Đ(cid:1188)T

NGHIÊN CỨU M(cid:1244)T SỐ ĐẶC ĐIỂM B(cid:1226)NH LÝ CỦA LỢN M(cid:1202)C VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ SỬ DỤNG VACXIN PHọNG B(cid:1226)NH

Chuyên ng̀nh: B(cid:1227)nh lý h(cid:1233)c v̀ chữa b(cid:1227)nh v(cid:1201)t nuôi

9 64 01 02

M̃ ś:

TÓM T(cid:1202)T LU(cid:1200)N ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN H(cid:1023)C VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021

Công trình hòn th̀nh t(cid:1189)i:

H(cid:1232)C VI(cid:1226)N NỌNG NGHI(cid:1226)P VI(cid:1226)T NAM

Người hướng d(cid:1199)n: 1. PGS.TS. Nguy(cid:1225)n Bá Hiên

2. PGS.TS. Cù Hữu Phú

Ph(cid:1191)n bi(cid:1227)n 1: GS.TS Nguy(cid:1225)n Quang Tuyên Trường Đ(cid:1189)i h(cid:1233)c Nông Lâm, Đ(cid:1189)i h(cid:1233)c Thái Nguyên

Ph(cid:1191)n bi(cid:1227)n 2: PGS.TS Ph(cid:1189)m Ng(cid:1233)c Th(cid:1189)ch H(cid:1233)c viên Nông nghi(cid:1227)p Vi(cid:1227)t Nam

Ph(cid:1191)n bi(cid:1227)n 3: PGS.TS Ph(cid:1189)m Công Ho(cid:1189)t B(cid:1245) Khoa h(cid:1233)c và Công ngh(cid:1227)

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2021

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin, Thư viện Lương Định Của,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam

PH(cid:1194)Nă1.ăM(cid:1250)ăĐ(cid:1194)U

1.1. TệNHăC(cid:1192)PăTHI(cid:1218)TăC(cid:1258)AăĐ(cid:1220)ăTẨI

Trong ngành công nghiệp chăn nuôi ở Việt Nam thì chăn nuôi lợn đóng vai trò quan trọng. Tính đến đầu năm 2020, mặc dù ngành chăn nuôi lợn nước ta đã phải trải qua đợt dịch tả lợn Châu Phi gây thiệt hại nặng nề, tổng số lợn trong cả nước vẫn còn khoảng 20 triệu lợn (Tổng cục Thống kê, 2020). Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn vẫn luôn phải gánh chịu nhiều thiệt hại do những bệnh truyền nhiễm khác gây ra, vì vậy việc phòng chống bệnh nhằm giảm thiệt hại, nâng cao năng suất chăn nuôi luôn cần được coi trọng, phòng bệnh bằng vacxin là một trong những giải pháp quan trọng.

Trong các bệnh thường gặp trên lợn, những bệnh về đường hô hấp được xếp vào nhóm bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế. Bệnh đường hô hấp ở lợn hiện nay nguyên nhân do nhiều mầm bệnh gây ra, trong đó có cả sự kết hợp của virus và vi khuẩn gây bệnh, khiến việc điều trị bệnh gặp không ít khó khăn. Trong số những vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp ở lợn, vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae), Pasteurella multocida (P. multocida) và Streptococcus suis (S. suis) thường gây viêm phổi kế phát, giết chết rất nhiều lợn ở các lứa tuổi, đặc biệt quan trọng là lợn sau cai sữa, gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn ở nước ta (Cù Hữu Phú & cs., 2005). Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công ty khác nhau nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn gây ra, như vacxin Porcilis phòng bệnh phổi cho lợn do vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae), P. multocida serotype A, D và Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) gây ra của Intervet sản xuất, vacxin M+ PAC và vacxin Myco Shield phòng bệnh do vi khuẩn M. hyopneumoniae gây ra của Intervet sản xuất, vacxin Bayovac SuiShot của hãng Bayer chế tạo là vacxin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi cho lợn trên 5 tuần tuổi đã sử dụng 2 chủng A.pleuropneumoniae serotype 2, 5 và 1 chủng P. multocida serotype D; ... vv. Như vậy, các vacxin nhập ngoại đã và đang được sử dụng tại các trang trại chăn nuôi lợn ở nước ta là vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn được chế tạo từ chủng vi khuẩn Actinobacillus hoặc M. hyopneumoniae, P. multocida nhưng các chủng vi khuẩn sử dụng chế vacxin chưa hoàn toàn phù hợp với những nguyên nhân gây bệnh viêm phổi ở lợn tại thực địa, đồng thời vacxin nhập ngoại lại có giá thành cao.

Tại Việt Nam vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, S. suis và P.multocida gây ra là kế thừa và phát triển từ đề tài cấp Nhà nước kết quả nghiên cứu của Dự án SXTN đã được nghiệm thu năm 2014 và đưa vào sản xuất của Viện Thú y. Hiện nay ở nước ta duy nhất có công ty Marphavet sản xuất và được phép lưu hành vacxin đa giá vô hoạt với bổ trợ keo phèn để phòng viêm phổi cho lợn từ 4 tuần tuổi. Vacxin được chế tạo là vacxin đa giá vô hoạt bao gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, S. suis và P. multocida là nguyên nhân chủ yếu chủ yếu gây bệnh viêm phổi ở lợn. Tuy nhiên việc sử dụng bổ trợ keo phèn trong chế tạo vacxin vẫn có những hạn chế nhất định về hiệu lực, khả năng gây đáp ứng và độ dài miễn dịch chưa cao.

Hiện nay tại Việt Nam chưa có vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh cho lợn được chế tạo gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.multocida và S. suis. Vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu sẽ làm tăng hiệu lực phòng

bệnh của vacxin, liều vacxin tiêm giảm, đặc biệt là thời gian miễn dịch của vacxin được kéo dài hơn nhiều nhờ phức hợp nhũ kháng nguyên.

Xuất phát từ tình hình thực tiễn của sản xuất, đáp ứng được cơ sở khoa học cho việc phòng chống bệnh viêm phổi ở lợn, việc nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis và sử dụng vacxin phòng chống bệnh là yêu cầu cần thiết, nhằm đưa ra các giải pháp phòng trị bệnh viêm phổi ở lợn hiệu quả cao, giảm thiệt hại cho nghành chăn nuôi lợn. 1.2. M(cid:1256)CăTIểUăC(cid:1258)AăĐ(cid:1220)ăTẨI 1.2.1. M(cid:1257)cătiêuăchung Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý và xây dựng giải pháp phòng chống bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis bằng vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu. 1.2.2. M(cid:1257)cătiêuăc(cid:1257)ăth(cid:1223)

- Xác định được đặc điểm biến đổi bệnh lý chủ yếu của lợn mắc bệnh viêm phổi do

vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.

- Xây dựng quy trình sản xuất và quy trình sử dụng, bảo quản vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi có hiệu quả cao trên đàn lợn cho người chăn nuôi. 1.3. PH(cid:1188)MăVIăNGHIểNăC(cid:1260)U 1.3.1. Đ(cid:1237)iăt(cid:1133)(cid:1255)ngănghiênăc(cid:1261)u

- Bộ giống vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b ; vi khuẩn P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2 được sử dụng làm giống gốc (Master seed) lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty Marphavet.

- Lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis

gây ra. 1.3.2. Ph(cid:1189)măviănghiênăc(cid:1261)u

Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu các đặc tính vi sinh vật hóa học, cấu trúc kháng nguyên, độc lực và khả năng sử dụng làm chủng giống sản xuất vacxin của các vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; vi khuẩn P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2 được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty Marphavet.

Địa điểm nghiên cứu gồm: Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y; Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam ; Phòng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin theo tiêu chuẩn GMP WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet và một số cơ sở chăn nuôi lợn.

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020

1.4. NH(cid:1266)NGăĐịNGăGịPăM(cid:1246)IăC(cid:1258)AăĐ(cid:1220)ăTẨI

- Chế tạo thành công vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a, 5b; P. multocida serotype A, D và S. suis serotype 2 gây ra tại Việt Nam ở quy mô phòng thí nghiệm.

- Xây dựng được quy trình sản xuất, sử dụng và bảo quản vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn lần đầu tiên tại Việt Nam ở quy mô phòng thí nghiệm. Vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra trên lợn, có chất bổ trợ nhũ dầu đầu tiên được sản xuất tại Việt Nam, giúp tăng hiệu quả phòng bệnh, kéo dài thời gian miễn dịch và khả năng bảo hộ so với vacxin cùng loại có bổ trợ keo phèn. 1.5. Ý NGHƾAăKHOAăH(cid:1232)CăVẨăTH(cid:1268)CăTI(cid:1224)NăC(cid:1258)AăĐ(cid:1220)ăTẨI 1.5.1. ụănghƿaăkhoaăh(cid:1233)c

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã góp phần bổ sung thêm các thông tin về quy trình sản xuất vacxin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra tại Việt Nam tại quy mô phòng thí nghiệm. Đồng thời là cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin đa giá có chất bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn trên dây chuyền sản xuất vacxin quy mô công nghiệp. 1.5.2. ụănghƿaăth(cid:1269)căti(cid:1225)n

- Kết quả gây bệnh thực nghiệm với các vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis cùng với các bệnh tích lâm sàng của lợn mắc bệnh được sử dụng là phương pháp chẩn đoán lâm sàng bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra cho lợn nhanh chóng, có hiệu quả kinh tế cao.

- Vacxin vô hoạt đa giá nhũ dầu sản xuất thành công sẽ được sử dụng rộng rãi trong thực tế sản xuất, góp phần khống chế hiệu quả bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra ở lợn nuôi tại Việt Nam.

PH(cid:1194)N 2.ăT(cid:1240)NGăQUANăTẨIăLI(cid:1226)U 2.1. TỊNHăHỊNHăNGHIểNăC(cid:1260)U TRểNăTH(cid:1218)ăGI(cid:1246)I V(cid:1220)ăB(cid:1226)NHăVIểMăPH(cid:1240)Iă(cid:1250)ăL(cid:1254)Nă VẨăVACXINăPHọNGăB(cid:1226)NHă

Bệnh viêm phổi - màng phổi được Pattison phát hiện lần đầu tiên vào năm 1957 (Pattison & cs., 1957) và đã được Shope (1964) mô tả ca bệnh cấp tính với các triệu chứng tương tự ở đàn lợn nuôi tại một trang trại thuộc Argentina và gọi tên mầm bệnh là Haemophilus pleuroneumonia. Với kết quả nghiên cứu ADN, Haemophilus pleuroneumonia được xếp vào giống Actinobacillus và được đặt tên là Acitinobacillus pleuropneumoniae. Đây là một cầu trực khuẩn gram âm, có giáp mô. Hiện có 15 serotype được phân bố theo từng vùng. Mỗi serotype có thể tạo ra ngoại độc tố Apx I, II hoặc III. Các ngoại độc tố này chính là tác nhân chính gây thương tổn trên phổi và làm giảm năng suất của lợn (Herczeg & cs., 2014). Vào những năm đầu của thế kỷ 21, một thế hệ vacxin mới, vacxin tiểu đơn vị bao gồm ba ngoại độc tố RTX chính (ApxI, ApxII, và ApxIII) và một protein 42 kDa bên ngoài màng của A. pleuropneumoniae đã được nghiên cứu cho thấy có khả năng bảo vệ cao chống lại tất cả 12 kiểu huyết thanh chính (kiểu huyết thanh 1-12) trong điều kiện thí nghiệm cũng như trong các thử nghiệm thực tế (Van Den Bosch & Frey, 2003).

Bệnh viêm phổi do Pasteurella gây ra là kết quả của sự lây nhiễm của vi khuẩn P. multocida cho phổi. Bệnh thường thấy ở giai đoạn cuối của bệnh viêm phổi cục bộ hay ở những bệnh ghép ở đường hô hấp ở lợn (PRDC). Hội chứng này là một trong những bệnh

gây thiệt hại cho lợn đặc biệt khi chúng sản sinh tăng lên. Những tài liệu đã công bố thừa nhận rằng những tổn thương ở bệnh viêm phổi khi giết mổ rất điển hình, thậm chí cả ở những đàn lợn được quản lý tốt. Những báo cáo qua nghiên cứu nhiều năm tập chung ở lợn với những bệnh tích viêm phổi tại lúc mổ khám dao động từ thấp là 30% đến cao nhất là 80%. Những số liệu gần đây tại Mỹ cho thấy trong 6634 mẫu lấy từ lợn để kiểm tra phổ biến là 74% lợn bị viêm phổi và 13 % với chứng viêm màng phổi.

Những ghi nhận đầu tiên về bệnh do S. suis gây ra ở lợn được Jansen và Van Dorssen mô tả ở Hà Lan vào năm 1951 và tại Anh vào năm 1954 (Field & cs., 1954). (De Moor, 1963) lần đầu tiên đã phân lập được vi khuẩn Streptococcus gây dung huyết dạng alpha, dựa vào kết quả giám định đặc tính sinh hóa và định serotype đã xếp vào nhóm Lancefield R, S, RS và T. (Elliott & cs., 1966) thấy rằng các vi khuẩn nhóm S do Moor phân lập giống với PM Streptococcus mà ông phân lập đều thuộc nhóm Lancefield D và đề nghị gọi là Streptococcus suis serotype 1. Windsor & Elliott (1975) đã phân lập chủng Streptococcus suis tương ứng với nhóm R do Moor phân lập và đề nghị gọi là Streptococcus suis serotype 2. Clifton-Hadley (1984) thông báo phân lập được vi khuẩn Streptococcus suis thuộc nhóm T từ hạch amidan, dịch âm đạo và bao quy đầu của lợn và được Gottschalk & cs. (1989) gọi là Streptococcus suis serotype 15. 2.2. TỊNHăHỊNHăNGHIểNăC(cid:1260)UăT(cid:1188)IăVI(cid:1226)TăNAMăV(cid:1220)ăB(cid:1226)NHăVIểMăPH(cid:1240)Iă(cid:1250)ăL(cid:1254)Nă VẨăVACXINăPHọNGăB(cid:1226)NHă

Các nghiên cứu ở trong nước cho thấy, khi lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản thường gặp các loại vi khuẩn gây bệnh kế phát trong đường hô hấp như Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis serotype 2, Bordetella bronchiseptica Nguyễn Hữu Nam & Nguyễn Thị Lan (2007), Bùi Quang Anh & cs. (2008), Nguyễn Thị Kim Lan & cs. (2017), Cù Hữu Phú (2005) đã làm cho dịch trầm trọng với bệnh lý nặng, kéo dài và tỷ lệ chết cao. Theo Lê Văn Dương (2013) tại các ổ dịch lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản tại tỉnh Bắc Giang đã phân lập được các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis, trong đó cao nhất là S. suis (55,10%), tiếp sau là A. pleuropneumoniae (19,59%) và thấp nhất là P. multocida (17,44%). Các tác giả đã nghiên cứu chế tạo Autovaccine từ các chủng vi khuẩn trên phân lập được dùng để phòng bệnh viêm phổi cho lợn, kết quả cho thấy Autovaccine thử nghiệm có khả năng phòng bệnh viêm phổi cho lợn, cho đáp ứng miễn dịch trên bốn tháng và hiệu lực bảo hộ là 93,33%.

PH(cid:1194)Nă3.ăV(cid:1200)T LI(cid:1226)U,ăN(cid:1244)IăDUNG VÀ PH(cid:1132)(cid:1130)NGăPHỄPăNGHIểNăC(cid:1260)U

3.1. Đ(cid:1230)AăĐI(cid:1222)MăNGHIểNăC(cid:1260)U

- Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y; Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam; Phòng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin theo tiêu chuẩn WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet và một số cơ sở chăn nuôi lợn. 3.2.ăTH(cid:1248)IăGIANăNGHIểNăC(cid:1260)U

Đề tài thực hiện từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020.

3.3.ăV(cid:1200)TăLI(cid:1226)UăNGHIểNăC(cid:1260)U

- Bộ vi khuẩn sử dụng làm giống gốc (Master seed) sản xuất vacxin viêm phổi lợn lưu

giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin gồm có:

+ Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b. + Vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A và D + Vi khuẩn Streptococcus suis serotype 2 - Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu, sản xuất vacxin đa giá phòng viêm phổi

ở lợn

+ Các loại môi trường dùng để nuôi cấy, lưu giữ vi khuẩn do hãng Oxoid (Anh) và Merck (Pháp) sản xuất: Môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate, BHI broth, BHI agar, TSB, PLLO agar …

+ Các loại môi trường, hóa chất dùng để giám định, xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: Môi trường đường các loại, dung dịch Kovac’s, dung dịch H2O2 3%, giấy thử Oxidase, nước muối 6,5%, ...

+ NAD do hãng Oxoid (Anh) sản xuất. + Chất bổ trợ nhũ dầu IMS 1313 do công ty Seppic- Pháp cung cấp. - Động vật thí nghiệm: + Lợn sau cai sữa khỏe mạnh không tiêm vacxin có kháng nguyên A.

pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis.

+ Chuột nhắt trắng: 18- 20 g khỏe mạnh. - Máy móc, dụng cụ thí nghiệm + Các máy móc, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm, các hoá chất sát trùng, tiêu

độc, rửa dụng cụ ... để thực hiện các kỹ thuật như PCR, RT-PCR; ELISA, ....

+ Dây chuyền công nghệ chế tạo vacxin quy mô công nghiệp như bộ máy lên men

sục khí 15 lít và 120 lít SATORIUS của Đức; hệ thống ra chai tự động của Ý. 3.4.ăN(cid:1244)IăDUNGăNGHIểNăC(cid:1260)U 3.4.1.ăNghiênăc(cid:1261)uătri(cid:1227)uăch(cid:1261)ngălơmăsƠng,ăb(cid:1227)nhătíchăđ(cid:1189)iăth(cid:1223)ăc(cid:1259)aăl(cid:1255)năm(cid:1203)căb(cid:1227)nhădoăviă khu(cid:1197)năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra

- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn

A. pleuropneumoniae gây ra.

- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn

P. multocida gây ra.

- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn

S. suis gây ra. 3.4.2. Nghiênăc(cid:1261)uăđánhăgiáăkh(cid:1191)ănĕngă(cid:1241)năđ(cid:1231)nhăđ(cid:1211)cătínhăsinhăh(cid:1233)căc(cid:1259)a b(cid:1245) gi(cid:1237)ngăs(cid:1191)năxu(cid:1193)tă vacxinăphòngăb(cid:1227)nhădoăviăkhu(cid:1197)năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra

- Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin

phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra.

- Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin

phòng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra.

- Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin

phòng bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra. 3.4.3. Nghiênăc(cid:1261)uăquyătrìnhăs(cid:1191)năxu(cid:1193)tăvacxinăđaăgiáăvôăho(cid:1189)tănhǜăd(cid:1195)uăphòngăb(cid:1227)nhăviêmă ph(cid:1241)i (cid:1251)ăl(cid:1255)nădoăviăkhu(cid:1197)năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra

- Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.

- Nghiên cứu đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm. - So sánh khả năng sinh miễn dịch của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis.

- Xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm

phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.

- Xây dựng quy trình bảo quản vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm

phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra. 3.5.ăPH(cid:1132)(cid:1130)NGăPHỄPăNGHIểNăC(cid:1260)U 3.5.1. Ph(cid:1133)(cid:1131)ngăphápăgơyăb(cid:1227)nhăth(cid:1269)cănghi(cid:1227)măbằngăcácăch(cid:1259)ngăviăkhu(cid:1197)năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis master seed

Chọn 24 con lợn sau cai sữa (4 tuần tuổi) khỏe mạnh không tiêm vacxin viêm phổi có kháng nguyên A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. Trước khi gây bệnh cho lợn, tiến hành lấy máu kiểm tra kháng thể (âm tính) có trong máu lợn với A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. Lợn được chia làm 8 lô, mỗi lô có 3 con. Liều gây bệnh bằng 100 liều LD50, với đường gây bệnh dưới da lợn. Lợn đối chứng được tiêm BHI broth vô trùng. Theo TCVN 8685. 3.5.2. Ph(cid:1133)(cid:1131)ngăphápănuôiăc(cid:1193)yăviăkhu(cid:1197)năvƠăgiámăđ(cid:1231)nhăđ(cid:1211)cătínhăsinh hóa

- Xác định A. pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR theo (Gram & cs., 1998) - Xác định các type giáp mô A, B, D của vi khuẩn P. multocida dựa trên phản ứng

- Bốn serotype S. suis gây bệnh thường gặp nhất ở lợn là serotype 1, 2, 7 và 9 được

Phương pháp giám định các đặc tính nuôi cấy trên các loại môi trường, đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu theo (Moller & cs., 1996; Quinn & cs., 2012) và theo TCVN- 8685. Bệnh phẩm là phổi, dịch ngoáy vùng hầu họng được cấy sơ cấp lên môi trường thạch máu hoặc môi trường thạch chọn lọc Colombia. Sau khi nuôi cấy trong tủ ấm có 5% CO2, có thể chọn 1-2 khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng để giám định vi khuẩn về mặt hình thái và đặc tính sinh hóa tùy theo loại vi khuẩn. Việc kiểm tra đặc tính sinh hóa theo TCVN 8685. 3.5.3. Ph(cid:1133)(cid:1131)ngăphápăPCR PCR được mô tả bởi (Đỗ Ngọc Thúy & cs., 2007). xác định bằng phản ứng PCR. 3.5.4. Ph(cid:1133)(cid:1131)ngăphápăđánhăgiáăđ(cid:1245)căl(cid:1269)căviăkhu(cid:1197)nătrênăchu(cid:1245)tăvƠăl(cid:1255)n

Độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trong nghiên cứu này, được xác định trên chuột nhắt trắng và trên lợn. Xác định độc lực của các chủng

A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu trên chuột nhắt trắng theo phương pháp của (Carter, 1995), tính liều LD50 theo (Reed & Muench, 1938).Với mỗi chủng vi khuẩn, sử dụng canh trùng được nuôi cấy ở 37◦C/24 giờ, riêng với A. pleuropneumoniae nuôi cấy trong điều kiện có 5% CO2 mỗi một chủng vi khuẩn được tiêm cho 2 chuột thí nghiệm vào dưới da với liều 0,2 ml/con. Với lợn, mỗi lợn được gây bệnh thực nghiệm ở liều 5 ml/con (Theo TCVN 8685). 3.5.5. Ph(cid:1133)(cid:1131)ngăphápăch(cid:1219)ăt(cid:1189)oăvacxinăđaăgiáăvôăho(cid:1189)tănhǜăd(cid:1195)u

Giống gốc master seed: được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin gồm: Vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; Vi khuẩn P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2. Bộ giống gốc này đang được sử dụng để sản xuất vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh viêm phổi cho lợn, đã được phép lưu hành trên toàn quốc. Các vi khuẩn của bộ giống gốc này có cấu trúc kháng nguyên ổn định, kháng nguyên tính cao, sản sinh các loại độc tố và độc lực cao (Hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc thú y: Sản phẩm: MAR-APPSVAC - vacxin viêm phổi lợn đa giá, 2015). 3.5.6.ăPh(cid:1133)(cid:1131)ngăphápăki(cid:1223)m nghi(cid:1227)m vacxin * Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng

Kiểm tra cảm quan, đậm độ và vô trùng: Vacxin được kiểm tra vô trùng (không tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc) theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8684:2011 và theo quy trình của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y quốc gia. * Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn

Kiểm tra an toàn: Vacxin được kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng bằng cách tiêm bắp đùi liều 0,5 ml/con. Bên cạnh đó vacxin cũng được kiểm tra an toàn trên lợn bằng cách tiêm vacxin liều gấp đôi (4 ml/con) cho lợn 4 tuần tuổi với đường tiêm bắp. Theo dõi các phản ứng của chuột nhắt và lợn để xem mức độ an toàn của vacxin thử nghiệm. * Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực

Kiểm tra hiệu lực: Vacxin được kiểm tra phải có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đạt

hiệu lực ≥ 70% khi công cường độc. Lợn thí nghiệm là lợn khỏe mạnh, trên 4 tuần tuổi. 3.5.7. Ph(cid:1133)(cid:1131)ngăphápăx(cid:1265)ălỦăs(cid:1237)ăli(cid:1227)u

Số liệu thu được trong nghiên cứu được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm

Microsoft Excel 2019 và phần mềm R phiên bản 4.0.2.

PH(cid:1194)Nă4.ăK(cid:1218)T QU(cid:1190) VÀ TH(cid:1190)O LU(cid:1200)N 4.1. K(cid:1218)TăQU(cid:1190)ăNGHIểNăC(cid:1260)UăTRI(cid:1226)UăCH(cid:1260)NGăLỂMăSẨNG,ăB(cid:1226)NHăTệCHăĐ(cid:1188)IăTH(cid:1222)ă C(cid:1258)AăL(cid:1254)NăM(cid:1202)CăB(cid:1226)NHăDOăVIăKHU(cid:1196)NăA. PLEUROPNEUMONIAE, P. MULTOCIDA VÀ S. SUIS GÂY RA 4.1.1. K(cid:1219)tăqu(cid:1191)ănghiênăc(cid:1261)uătri(cid:1227)uăch(cid:1261)ngălơmăsƠng,ăb(cid:1227)nhătíchăđ(cid:1189)iăth(cid:1223)ăc(cid:1259)aăl(cid:1255)năm(cid:1203)căb(cid:1227)nhă doăviăkhu(cid:1197)năA. pleuropneumoniae gây ra 4.1.1.1 Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn

Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae,

chúng tôi đã xác định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm như sau: serotype 2: 4,5 x 109 CFU/ml; Chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae A. pleuropneumoniae serotype 5a và 5b có cấu trúc kháng nguyên và độc lực tương đồng nhau, nên chúng tôi chọn chủng 5a đại diện cho 2 chủng 5a và 5b để gây bệnh thực nghiệm cho lợn với liều A. pleuropneumoniae serotype 5a: 5 x 109 CFU/ml. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của giống vi khuẩn A. pleuropneumoniae được thể hiện ở bảng 4.1.

B(cid:1191)ng 4.1. K(cid:1219)t qu(cid:1191) đánhăgiáăkh(cid:1191) nĕngăgơyăb(cid:1227)nh (cid:1251) l(cid:1255)n c(cid:1259)a vi khu(cid:1197)n

A. pleuropneumoniae

K(cid:1219)tăqu(cid:1191)ătheoădõi

Lô thí nghi(cid:1227)m Ch(cid:1259)ngăviăkhu(cid:1197)năăgơyă b(cid:1227)nh S(cid:1237)ăconă ch(cid:1219)t Th(cid:1249)iăgiană ch(cid:1219)t Li(cid:1221)uăgơyă b(cid:1227)nhă (ml/con) S(cid:1237)ăl(cid:1255)nă thí nghi(cid:1227)m (con) Tỷăl(cid:1227)ă ch(cid:1219)t (%) Phân l(cid:1201)păl(cid:1189)iă vi khu(cid:1197)n

5 3 3/3 100 3/3 6 – 12 h

Lô 1

5 3 2/3 66,7 3/3 6 – 20 h

0 3 0 0 A. pleuropneumoniae serotype 2 A. pleuropneumoniae serotype 5a Lô 2 Đối chứng

B(cid:1191)ng 4.2. Tri(cid:1227)u ch(cid:1261)ng lâm sàng và b(cid:1227)nhătíchăđ(cid:1189)i th(cid:1223) c(cid:1259)a l(cid:1255)năđ(cid:1133)(cid:1255)c gây nhi(cid:1225)m

A. pleuropneumoniae

Bi(cid:1223)u hi(cid:1227)n Tỷ l(cid:1227)

S(cid:1237) l(cid:1255)n gây b(cid:1227)nh (con) 6 6 6 6 6 S(cid:1237) l(cid:1255)n bi(cid:1223)u hi(cid:1227)n (con) 6 6 5 5 6 6/6 6/6 5/6 5/6 6/6 Sốt Ho, thở khó Chảy máu mũi Khí quản chứa dịch nhày lẫn máu Viêm dính phổi và thành ngực

Ghi chú: A: Lợn chảy máu mũi; B: Phổi viêm dính thành ngực Hình 4.1. M(cid:1245)t s(cid:1237) b(cid:1227)nhătíchăđ(cid:1189)i th(cid:1223) c(cid:1259)a l(cid:1255)năđ(cid:1133)(cid:1255)c gây nhi(cid:1225)m A. pleuropneumoniae

4.1.1.2 Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ thuật PCR

Sau khi gây bệnh thực nghiệm, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây bệnh để khẳng định các chủng vi khuẩn nghiên cứu chính xác là A.pleuropneumoniae. Hình ảnh 4.2 chụp kết quả điện di những sản phẩm PCR của 03 mẫu đã phân lập

đều cho sản phẩm với độ dài 950 bp, đặc hiệu với độ dài của gen omlA của vi khuẩn A. Pleuropneumoniae.

khuẩn A. Pleuropneumoniae.

M 1 2 3

Ghi chú: - Giếng 1, 2, 3: Sản phẩm PCR xác định gen

omlA (950 bp) của A. pleuropneumoniae;

1000 bp

950 bp

- Giếng M: 1000 bp marker

Hình 4.2. S(cid:1191)n ph(cid:1197)m c(cid:1259)a kỹ thu(cid:1201)tăPCRăxácăđ(cid:1231)nh vi khu(cid:1197)n A. pleuropneumoniae

4.1.2. K(cid:1219)tăqu(cid:1191)ănghiênă c(cid:1261)uătri(cid:1227)uă ch(cid:1261)ngă lơmă sƠng,ăb(cid:1227)nhătíchăđ(cid:1189)iăth(cid:1223)ăc(cid:1259)aă l(cid:1255)năm(cid:1203)că b(cid:1227)nhădoăviăkhu(cid:1197)năP. multocida gây ra 4.1.2.1. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn

Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD50 của vi khuẩn P. multocida, chúng tôi đã xác định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm như sau: P. multocida serotype A: 4,5 x 109 CFU/ml và P. multocia serotype D: 4,5 x 109 CFU/ml.

B(cid:1191)ng 4.3. K(cid:1219)t qu(cid:1191) đánhăgiáăkh(cid:1191) nĕngăgơyăb(cid:1227)nh (cid:1251) l(cid:1255)n c(cid:1259)a vi khu(cid:1197)n P. multocida

K(cid:1219)tăqu(cid:1191)ătheoădõi S(cid:1237)ăl(cid:1255)nă Phân Lô thí thí Li(cid:1221)uăgơyă Th(cid:1249)iă l(cid:1201)păl(cid:1189)iă gian nghi(cid:1227)m Ch(cid:1259)ngăviăkhu(cid:1197)năgơyă b(cid:1227)nh b(cid:1227)nhă vi S(cid:1237)ăconă ch(cid:1219)t (ml/con) nghi(cid:1227)m (con) Tỷăl(cid:1227)ă ch(cid:1219)t (%) ch(cid:1219)t khu(cid:1197)n

P. multocida serotype A 5 3 3/3 20- 28 h 100 3/3 Lô 1 P. multocida serotype D 5 3 3/3 20- 24 h 100 3/3

0 3 0 0 Lô 2 Đối chứng

B(cid:1191)ng 4.4. Tri(cid:1227)u ch(cid:1261)ng lâm sàng và b(cid:1227)nhătíchăđ(cid:1189)i th(cid:1223) c(cid:1259)a l(cid:1255)năđ(cid:1133)(cid:1255)c gây nhi(cid:1225)m P. multocida

Bi(cid:1223)u hi(cid:1227)n Tỷ l(cid:1227) S(cid:1237) l(cid:1255)n gây b(cid:1227)nh (con) S(cid:1237) l(cid:1255)n bi(cid:1223)u hi(cid:1227)n (con)

6 6 6/6

6 6 6 5 6/6 5/6

6 6 6/6 Sốt Ho, thở khó Da đỏ tím Viêm phổi thùy

Phổi lợn bị viêm Hình 4.3. M(cid:1245)t s(cid:1237) b(cid:1227)nhătíchăđ(cid:1189)i th(cid:1223) c(cid:1259)a l(cid:1255)năđ(cid:1133)(cid:1255)c gây nhi(cid:1225)m P. multocida

4.1.2.2 Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ thật PCR

Sau khi gây bệnh, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm và xác định các serotype giáp mô A, B, D của vi khuẩn P. multocida dựa trên phản ứng PCR.

Ghi chú -Giếng M: 1000 bp marker -Giếng 1, 2, 3, 4: chủng phân lập serotype A (1044 bp) -Giếng 5: đối chứng dương serotype A (1044 bp); -Giếng 6: đối chứng dương serotype B (760 bp); -Giếng 7: đối chứng dương serotype D (657 bp)

Hình 4.4. S(cid:1191)n ph(cid:1197)m c(cid:1259)a kỹ thu(cid:1201)tăPCRăxácăđ(cid:1231)nh vi khu(cid:1197)n P. multocida 4.1.3. K(cid:1219)tăqu(cid:1191)ănghiênăc(cid:1261)uătri(cid:1227)uăch(cid:1261)ngălơmăsƠng,ăb(cid:1227)nhătíchăđ(cid:1189)iăth(cid:1223)ăc(cid:1259)aăl(cid:1255)năm(cid:1203)căb(cid:1227)nhă doăviăkhu(cid:1197)năS. suis gây ra 4.1.3.1. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn

Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD50 của vi khuẩn S. suis, chúng tôi đã xác

định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm là : 4,5 x 109 CFU/ml.

B(cid:1191)ng 4.5. K(cid:1219)t qu(cid:1191) đánhăgiáăkh(cid:1191) nĕngăgơyăb(cid:1227)nh (cid:1251) l(cid:1255)n c(cid:1259)a vi khu(cid:1197)n S. suis

K(cid:1219)tăqu(cid:1191)ătheoădõi

Li(cid:1221)uăgơyă

S(cid:1237)ăl(cid:1255)năthí

Lô thí

Ch(cid:1259)ngăviăkhu(cid:1197)nă

Tỷăl(cid:1227)ă

Phơnăl(cid:1201)pă

b(cid:1227)nhă

nghi(cid:1227)m

S(cid:1237)ăconă

Th(cid:1249)iă

nghi(cid:1227)m

gơyăb(cid:1227)nh

ch(cid:1219)t

l(cid:1189)iăviă

(ml/con)

(con)

ch(cid:1219)t

gianăch(cid:1219)t

(%)

khu(cid:1197)n

Lô 1 S. suis serotype 2

5

3 3/3

36 h

100 3/3

0

3

0 Lô 2 Đối chứng

B(cid:1191)ng 4.6. Tri(cid:1227)u ch(cid:1261)ng lâm sàng và b(cid:1227)nhătíchăđ(cid:1189)i th(cid:1223) c(cid:1259)a l(cid:1255)năđ(cid:1133)(cid:1255)c gây nhi(cid:1225)m S. suis

Bi(cid:1223)u hi(cid:1227)n

Sốt Ho, thở khó Triệu chứng thần kinh Viêm phổi Viêm khớp Viêm màng não

S(cid:1237) l(cid:1255)n gây b(cid:1227)nh (con) 3 3 3 3 3 3

S(cid:1237) l(cid:1255)n bi(cid:1223)u hi(cid:1227)n (con) 3 3 3 3 1 3

Tỷ l(cid:1227) (%) 3/3 3/3 3/3 3/3 1/3 3/3

Viêm khớp ở lợn

Hình 4.5. M(cid:1245)t s(cid:1237) tri(cid:1227)u ch(cid:1261)ng lâm sàng, b(cid:1227)nhătíchăđ(cid:1189)i th(cid:1223) c(cid:1259)a l(cid:1255)n gây nhi(cid:1225)m S. suis

4.1.3.2. Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ thuật PCR

Sau khi gây bệnh, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm và xác định vi khuẩn với mồi của phản ứng PCR. Kết quả hình 4.6 cho thấy: chủng S. suis nghiên cứu, sau quá trình chạy PCR và điện di đều cho một sản phẩm đặc hiệu và giống nhau là 688 bp

M 1 2 3

1000 bp 688 bp

Ghi chú: Giếng M: 1000 bp marker Giếng 1, 2, 3: sản phẩm PCR xác định gen gdh (688 bp) của S. suis

Hình 4.6. S(cid:1191)n ph(cid:1197)m c(cid:1259)a kỹ thu(cid:1201)t PCRăxácăđ(cid:1231)nh S. suis

4.2. K(cid:1218)Tă QU(cid:1190)ă ĐỄNHă GIỄă KH(cid:1190)ă NĔNGă (cid:1240)Nă Đ(cid:1230)NHă Đ(cid:1210)Că TệNHă SINHă H(cid:1232)Că C(cid:1258)Aă GI(cid:1236)NGăS(cid:1190)NăXU(cid:1192)TăVACXINăPHọNGăB(cid:1226)NHăDOăVIăKHU(cid:1196)NăA. PLEUROPNEUMONIAE, P. MULTOCIDA VÀ S. SUIS GÂY RA

4.2.1. K(cid:1219)tăqu(cid:1191)ăđánhăgiáăkh(cid:1191)ănĕngă(cid:1241)năđ(cid:1231)nhăđ(cid:1211)cătínhăsinhăh(cid:1233)căc(cid:1259)aăgi(cid:1237)ngăs(cid:1191)năxu(cid:1193)tăvacxină phòngăb(cid:1227)nhădoăviăkhu(cid:1197)năA. pleuropneumoniae gây ra 4.2.1.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái

Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn

A. pleuropneumoniae thể hiện ở hình 4.7.

Hình A: Khuẩn lạc của APP trên thạch PPLO Hình B: Vi khuẩn APP trên kính hiển vi

Hình 4.7. Khu(cid:1197)n l(cid:1189)c A. pleuropneumoniae và hình thái vi khu(cid:1197)n khi soi trên kính hi(cid:1223)n vi

4.2.1.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa

Sau khi nuôi cấy trên môi trường, chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất. Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa cho thấy: 100% số chủng dương tính với các phản ứng Oxidase, Catalase, Urease, CAMP, O.N.P.G và cần yếu tố V cho quá trình phát triển, 100% số chủng đều âm tính với phản ứng Indol. Các chủng A. pleuropneumoniae được kiểm tra có khả năng lên men các loại đường Glucose, Maltose, Mannitol, Xylose và không có chủng nào lên men các loại đường:

Arabinose, Lactose, Raffinose, Sorbitol. Như vậy cả 3 chủng A. pleuropneumoniae được lựa chọn dùng cho nghiên cứu đều mang các đặc tính sinh vật hóa học điển hình của vi khuẩn A. pleuropneumoniae như mô tả của (Moller & cs., 1996), cũng phù hợp với các nghiên cứu của (Trịnh Quang Hiệp & cs., 2004; Cù Hữu Phú & cs., 2005; Nguyễn Thị Thu Hằng, 2010). 4.2.1.3. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR

Trong nghiên cứu này, chúng tôi ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR để xác định sự có mặt của các gen mã hóa độc tố Apx ở 3 chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu. Kết quả thể hiện ở bảng 4.7.

B(cid:1191)ng 4.7. K(cid:1219)t qu(cid:1191) xácăđ(cid:1231)nh gen s(cid:1191)năsinhăđ(cid:1245)c t(cid:1237) c(cid:1259)a gi(cid:1237)ng s(cid:1191)n xu(cid:1193)t

A. pleuropneumoniae

Serotype

Ch(cid:1259)ngămangăgenăđ(cid:1245)c t(cid:1237) Apx apxICA apxIICA apxIIICA apxIBD

apxIIIBD

Ký hi(cid:1227)u ch(cid:1259)ng A1 A2 A3

2 5a 5b

S(cid:1237) ch(cid:1259)ng 1 1 1

0 1 0

1 1 0

1 0 1

1 1 1

1 0 1

serotype 5b mang

Kết quả cho thấy, các chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu đều có mang từ 3 đến 4 gen quy định sản sinh độc tố Apx. Tất cả 2 chủng thuộc serotype 5 đều mang ba loại gen mã hóa độc tố, trong đó chủng có serotype 5a mang tổ hợp gen tổ hợp gen apxICA/apxIICA/apxIBD, còn chủng có apxIIICA/apxIBD/apxIIIBD.

4.2.2. K(cid:1219)tăqu(cid:1191)ăđánhăgiáăkh(cid:1191)ănĕngă(cid:1241)năđ(cid:1231)nhăđ(cid:1211)cătínhăsinhăh(cid:1233)căc(cid:1259)aăgi(cid:1237)ngăs(cid:1191)năxu(cid:1193)tăvacxină phòngăb(cid:1227)nhădoăviăkhu(cid:1197)năPasteurella multocida gây ra

4.2.2.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái

Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn P. multocida thể

hiện ở hình 4.8.

Hình A: Khuẩn lạc của P. multocida

Hình B: Vi khuẩn P. multocida trên KHV

Hình 4.8. Khu(cid:1197)n l(cid:1189)c P. multocida và hình thái vi khu(cid:1197)n khi soi trên kính hi(cid:1223)n vi

4.2.2.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa

Tất cả các chủng đều dương tính với phản ứng Indol, Oxidase, Catalase. 100% chủng có khả năng lên men các loại đường Glucose, Galactose, Mannitol, Saccharose, Fructose và không lên men các đường Lactose, Arabinose, Maltose.

4.2.2.3. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phản ứng Multiplex PCR để xác định các type giáp mô A, B, D của các chủng P. multocida được lựa chọn dùng cho nghiên cứu theo quy trình đã được chuẩn hóa của Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y (Đỗ Ngọc Thúy & cs., 2007). Các cặp mồi được sử dụng là CAPA-F và CAPA-R dùng để xác định type A, CAPB-F và CAPB-R để xác định type B, CAPD-F và CAPD-R để xác định type D.

B(cid:1191)ng 4.8. K(cid:1219)t qu(cid:1191) xácăđ(cid:1231)nh y(cid:1219)u t(cid:1237) đ(cid:1245)c l(cid:1269)c c(cid:1259)a gi(cid:1237)ng s(cid:1191)n xu(cid:1193)t P. multocida

Serotype A

Serotype B

Serotype D

KH ch(cid:1259)ng

A4

+

TT 1 2

A5

+

4.2.3. K(cid:1219)t qu(cid:1191) đánhăgiáăkh(cid:1191) nĕngă(cid:1241)năđ(cid:1231)nhăđ(cid:1211)c tính sinh h(cid:1233)c c(cid:1259)a gi(cid:1237)ng s(cid:1191)n xu(cid:1193)t vacxin phòng b(cid:1227)nh do vi khu(cid:1197)n S. suis gây ra

4.2.3.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái

Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn S. suis thể hiện ở

hình 4.9.

Hình A: Khuẩn lạc của S. suis

Hình B: Vi khuẩn S. suis trên kính hiển vi

Hình 4.9. Khu(cid:1197)n l(cid:1189)c S. suis và hình thái vi khu(cid:1197)n khi soi trên kính hi(cid:1223)n vi

4.2.3.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa

Chủng kiểm tra không phát triển trong môi trường NaCl 6,5% và âm tính với phản ứng KOH 3%. Chủng đều âm tính với phản ứng Oxydase, Catalase, Indol. Chủng kiểm tra lên men các loại đường: Glucose, Galactose, Maltose, Lactose và không có chủng nào lên men các đường Mannitol, Sorbitol.

4.3. NGHIểNă C(cid:1260)Uă QUYă TRỊNHă S(cid:1190)Nă XU(cid:1192)Tă VACXINă ĐAă GIỄă VỌă HO(cid:1188)Tă NHǛă D(cid:1194)Uă PHọNGă B(cid:1226)NHă VIểMă PH(cid:1240)I (cid:1250)ă L(cid:1254)Nă DOă VIă KHU(cid:1196)Nă A. PLEUROPNEUMONIAE, P. MULTOCIDA VÀ S. SUIS GÂY RA

4.3.1. Nghiênăc(cid:1261)uăxơyăd(cid:1269)ngăquyătrìnhăs(cid:1191)năxu(cid:1193)tăvacxinăđaăgiáăvôăho(cid:1189)tănhǜăd(cid:1195)uăphòngăb(cid:1227)nhă viêmăph(cid:1241)i (cid:1251)ăl(cid:1255)nădoăviăkhu(cid:1197)năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra 4.3.1.1. Kết quả theo dõi các lô lên men sục khí

Chúng tôi đã chế tạo vacxin dạng vô hoạt có bổ trợ keo phèn và nhũ dầu theo quy trình thường quy của Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y và quy trình sản xuất vacxin theo dây chuyền sản xuất công nghiệp của nhà máy vacxin GMP-WHO. Các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis được nuôi cấy riêng từng loại vi khuẩn, mỗi loại vi khuẩn được nuôi cấy 3 lô khác nhau bằng phương pháp lên men sục khí.

B(cid:1191)ng 4.10. K(cid:1219)t qu(cid:1191) nuôi c(cid:1193)y vi khu(cid:1197)n bằngăph(cid:1133)(cid:1131)ngăphápălênămenăs(cid:1257)c khí

Lo(cid:1189)i vi khu(cid:1197)n S(cid:1237) l(cid:1195)n nuôi c(cid:1193)y S(cid:1237) l(cid:1133)(cid:1255)ng vi khu(cid:1197)n trung bình (x 109 CFU/ml)

A. pleuropneumoniae 3 10,67 ± 0,52 CFU/ml

P. multocida 3 13,33 ± 1,37 CFU/ml

S. suis 3 11,00 ± 0,89 CFU/ml

4.3.1.2. Chuẩn bị các loại kháng nguyên và bán thành phẩm

Sau khi vô hoạt vi khuẩn trong canh trùng thu được bằng cách sử dụng formol với tỷ lệ 0,3%, tiến hành kiểm tra vô trùng trên các loại môi trường nước thịt, thạch máu và nước thịt yếm khí. Các loại kháng nguyên sau khi kiểm tra đảm bảo vô hoạt 100% sẽ được tiến hành pha trộn với bổ trợ nhũ dầu IMS-1313 theo hướng dẫn của Seppic với tỷ lệ 25% (3 phần canh trùng kháng nguyên + 1 phần nhũ dầu).

Dựa trên kết quả lên men sục khí mỗi loại kháng nguyên (A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; S. suis serotype 2 và P. multocida serotype A và D), cần tiến hành pha trộn các loại kháng nguyên với nhũ dầu (25%) để có trong mỗi một liều tiêm vacxin cho lợn (2ml vacxin/lợn) đảm bảo như sau:

+ Kháng nguyên A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b có 4 - 4,5x109 CFU/liều

tiêm.

+ Kháng nguyên S. suis serotype 2: 4- 4,5 x109 CFU/liều tiêm + Kháng nguyên P. multocida A và D: 4- 4,5 x109 CFU/liều tiêm. Sau khi vacxin bán thành phẩm được sản xuất, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độ thuần khiết của vi khuẩn bằng phương pháp làm tiêu bản quan sát vi sinh vật chết và kiểm tra dưới kính hiển vi.

4.3.2. K(cid:1219)t qu(cid:1191) đánhăgiáăch(cid:1193)tăl(cid:1133)(cid:1255)ng vacxin bán thành ph(cid:1197)m

Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy trên các loại

môi trường như sau:

B(cid:1191)ng 4.11. K(cid:1219)t qu(cid:1191) ki(cid:1223)mătraăđ(cid:1201)măđ(cid:1245), thu(cid:1195)n khi(cid:1219)t và vô trùng c(cid:1259)a lô gi(cid:1237)ngăđ(cid:1131)năgiá

Lo(cid:1189)iăviăkhu(cid:1197)n S(cid:1237)ălôăthíă nghi(cid:1227)m Đ(cid:1201)măđ(cid:1245)ă (x 109 CFU/ml) Ch(cid:1229)ătiêuăki(cid:1223)mătra Thu(cid:1195)năkhi(cid:1219)t n (%) Vô trùng n (%)

A. pleuropneumoniae 10,67 ± 0,52 3/3 (100) 3/3 (100) 3

P. multocida 13,33 ± 1,37 3/3 (100) 3/3 (100) 3

S. suis 11,00 ± 0,89 3/3 (100) 3/3 (100) 3

B(cid:1191)ng 4.12. K(cid:1219)t qu(cid:1191) ki(cid:1223)m tra thu(cid:1195)n khi(cid:1219)t và vô trùng c(cid:1259)aăvacxinăđaăgiáăbánă

thành ph(cid:1197)m

Ch(cid:1229)ătiêuăki(cid:1223)mătra Lôăthíănghi(cid:1227)m Vô trùng

1 2

Thu(cid:1195)năkhi(cid:1219)t Đạt Đạt Đạt 3/3 (100%) Đạt Đạt Đạt 3/3 (100%) 3 Tổng hợp

Sau khi đã kiểm tra 3 lô canh trùng chế tạo được đều đạt các tiêu chuẩn chế vacxin, tiến hành trộn lẫn các lô canh trùng với nhau theo tỷ lệ phù hợp để đạt được một hỗn hợp canh trùng đồng nhất, rồi bổ sung nhũ dầu với tỷ lệ 1/4 để đảm bảo trong 2 ml vacxin có chứa 4- 5 x 109 CFU.

Kiểm tra an toàn của vacxin chế tạo trên chuột nhắt trắng: chọn mỗi lô 10 chuột, mỗi con chuột tiêm vacxin với liều 0,5 ml/con vào bắp đùi. Theo dõi chuột trong vòng 10 ngày.

B(cid:1191)ng 4.13. K(cid:1219)t qu(cid:1191) ki(cid:1223)m tra an toàn c(cid:1259)a vacxin bán thành ph(cid:1197)m

trên chu(cid:1245)t nh(cid:1203)t tr(cid:1203)ng

Bi(cid:1223)u hi(cid:1227)n Đ(cid:1255)t thí nghi(cid:1227)m Li(cid:1221)u tiêm và đ(cid:1133)(cid:1249)ng tiêm Th(cid:1249)i gian theo dõi (ngày) S(cid:1237) chu(cid:1245)t thí nghi(cid:1227)m (con) S(cid:1237) chu(cid:1245)t s(cid:1237)ng (con) Tỷ l(cid:1227) s(cid:1237)ng (%)

1 10 10 10 100

2 10 10 10 100

3 10 10 10 100 0,5 ml/con; tiêm bắp đùi 0,5 ml/con; tiêm bắp đùi 0,5 ml/con; tiêm bắp đùi Chuột phát triển, ăn uống bình thường Chuột phát triển, ăn uống bình thường Chuột phát triển, ăn uống bình thường

Lợn được kiểm tra an toàn với liều tiêm gấp đôi liều sử dụng theo tiêu chẩn kiểm nghiệm vacxin vi khuẩn vô hoạt: tất cả 5 lợn trên 4 tuần tuổi được tiêm vacxin theo mỗi lô đều sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng sau khi tiêm qua 10 ngày theo dõi. Điều này khẳng định rằng vacxin chế tạo đã đạt yêu cầu về chỉ tiêu an toàn 100% trên lợn.

B(cid:1191)ng 4.14. K(cid:1219)t qu(cid:1191) ki(cid:1223)m tra an toàn c(cid:1259)a vacxin bán thành ph(cid:1197)m trên l(cid:1255)n

Th(cid:1249)i gian theo dõi

Bi(cid:1223)u hi(cid:1227)n

Đ(cid:1255)t thí nghi(cid:1227)m

Li(cid:1221)u tiêm và đ(cid:1133)(cid:1249)ng tiêm

S(cid:1237) l(cid:1255)n s(cid:1237)ng (con)

(ngày)

S(cid:1237) l(cid:1255)n thí nghi(cid:1227)m (con)

Tỷ l(cid:1227) s(cid:1237)ng (%)

100

4 ml/con; tiêm bắp

100

4 ml/con; tiêm bắp

100

4 ml/con; tiêm bắp

Lợn khỏe mạnh, không có phản ứng nơi tiêm và phản ứng toàn thân Lợn khỏe mạnh, không có phản ứng nơi tiêm và phản ứng toàn thân Lợn khỏe mạnh, không có phản ứng nơi tiêm và phản ứng toàn thân

B(cid:1191)ng 4.15. K(cid:1219)t qu(cid:1191) th(cid:1265) hi(cid:1227)u l(cid:1269)c c(cid:1259)a vacxin trên chu(cid:1245)t nh(cid:1203)t tr(cid:1203)ng

bằngăph(cid:1133)(cid:1131)ngăphápăthay th(cid:1219)

S(cid:1237) l(cid:1133)(cid:1255)ng chu(cid:1245)t

Lô chu(cid:1245)t

Lo(cid:1189)i canh trùng tiêm

S(cid:1237) l(cid:1133)(cid:1255)ng chu(cid:1245)t ch(cid:1219)t (con)

Th(cid:1249)i gian ch(cid:1219)t chu(cid:1245)t (gi(cid:1249))

côngăc(cid:1133)(cid:1249)ngăđ(cid:1245)c

APP serotype 2

0/5

APP serotype 5a

1/5

APP serotype 5b

0/5

P. multocida serotype A

0/5

Thí nghiệm

P. multocida serotype D

0/5

S. suis serotype 2

0/5

Không tiêm

0/5

APP serotype 2

5/5

APP serotype 5a

5/5

APP serotype 5b

5/5

48-72

Đối chứng

P. multocida serotype A

5/5

P. multocida serotype D

5/5

S. suis serotype 2

5/5

B(cid:1191)ng 4.16. K(cid:1219)t qu(cid:1191) ki(cid:1223)m tra hi(cid:1227)u l(cid:1269)c vacxin trên l(cid:1255)n bằng

ph(cid:1133)(cid:1131)ngăpháp tr(cid:1233)ng tài

S(cid:1237) l(cid:1255)n công c(cid:1133)(cid:1249)ngăđ(cid:1245)c (con)

Lô l(cid:1255)n

Lo(cid:1189)i canh trùng tiêm

Đ(cid:1133)(cid:1249)ng tiêm

S(cid:1237) l(cid:1255)n ch(cid:1219)t (con)

Th(cid:1249)i gian ch(cid:1219)t (gi(cid:1249))

Li(cid:1221)u tiêm (ml)

A. pleuropneumoniae serotype 2

0/3

A. pleuropneumoniae serotype 5a

0/3

A. pleuropneumoniae serotype 5b

0/3

P. multocida serotype A

1/3

5 ml

Dưới da

Thí nghi(cid:1227)m

P. multocida serotype D

0/3

S. suis serotype 2

0/3

A. pleuropneumoniae + S. suis + P. multocida

A. pleuropneumoniae serotype 2

2/2

A. pleuropneumoniae serotype 5a

2/2

A. pleuropneumoniae serotype 5b

2/2

P. multocida serotype A

2/2

5 ml

Dưới da

Đ(cid:1237)i ch(cid:1261)ng

P. multocida serotype D

2/2

S. suis serotype 2

2/2

A. pleuropneumoniae + S. suis + P. multocida

Ghi chú: LD50 của A. pleuropneumoniae serotype 2 là 4,3 x 107 CFU/0,2 ml và serotype 5 là 4,8 x 107 CFU/0,2 ml. LD50 của chủng P. multocida serotype A là 4 x 107 CFU/0,2 ml và serotype D là 4,2 x 107 CFU/0,2 ml. LD50 của S. suis serotype 2 là 4,4 x 107 CFU/0,2 ml 4.3.3. K(cid:1219)t qu(cid:1191) so sánh kh(cid:1191) nĕngăsinhămi(cid:1225)n d(cid:1231)ch c(cid:1259)aăvacxinăđaăgiáăb(cid:1241) tr(cid:1255) keo phèn và vacxinăđaăgiáăb(cid:1241) tr(cid:1255) nhǜăd(cid:1195)u ch(cid:1237)ng l(cid:1189)i vi khu(cid:1197)n A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis

4.3.3.1. Kết quả kiểm tra kháng thể của vacxin vô hoạt nhũ dầu

Vacxin bán thành phẩm đa giá đã đạt được chỉ tiêu về cảm quan, vô trùng, an toàn và hiệu lực. Tuy nhiên, để biết được khả năng bảo hộ và thời gian bảo hộ của vacxin với bản động vật, hiệu giá kháng thể theo thời gian cần được xác định.

Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của vacxin đa giá cho thấy: trước thời điểm tiêm vacxin, những lợn thí nghiệm được kiểm tra và thấy đều âm tính kháng thể trong máu. Tuy nhiên, vacxin đa giá đã giúp cho cơ thể lợn sản sinh kháng thể ở mức cao. Vào thời điểm 21 ngày sau tiêm vacxin, hàm lượng kháng thể chống A. pleuropneumoniae dao động từ 6,5 ± 0,71 log2 đến 7,4 ± 0,52 log2. Hàm lượng kháng thể chống P. multocida type A và D là 6,5 ± 0,53 và 6,4 ± 0,52 còn hàm lượng kháng thể chống S. suis type 2 là 6,0 ± 0,00 log2. Với hiệu giá kháng thể ở những thời điểm sau đó (2 tháng, 3 tháng, 4 tháng, 5 tháng) đã cho thấy, hàm lượng kháng thể chống lại những mầm bệnh xét nghiệm giảm dần.

B(cid:1191)ng 4.17. K(cid:1219)t qu(cid:1191) ki(cid:1223)m tra kháng th(cid:1223) trên l(cid:1255)n tiêm vacxin vô ho(cid:1189)tănhǜăd(cid:1195)u phòng viêm ph(cid:1241)i l(cid:1255)n kháng l(cid:1189)i vi khu(cid:1197)n A. Pleuropneumoniae (serotype 2, 5a, 5b), P. multocida (serotype A, D), và S. suis serotype 2

K(cid:1219)tăqu(cid:1191)ăxácăđ(cid:1231)nhăhi(cid:1227)uăgiáăkhángăth(cid:1223) (log2)

Sau tiêm vacxin

Ch(cid:1229)ătiêuătheoădõi

21 ngày

2 tháng

3 tháng

4 tháng

5 tháng

Tr(cid:1133)(cid:1247)că tiêm vacxin

6,7d ± 0,48 4,9c ± 0,57 4,6bc ± 0,52 4,0ab ± 0,00 3,4a ± 1,26

6,5c ± 0,71 5,0b ± 0,82 4,3ab ± 0,48 3,9a ± 0,32 3,6a ± 0,52

7,4d ± 0,52 5,8c ± 0,92

4,7b ± 0,67 4,1ab ± 0,32 3,8a ± 0,42

A. pleuropneumoniae serotype 2 A. pleuropneumoniae serotype 5a A. pleuropneumoniae serotype 5b P. multocida serotype A P. multocida serotype D S. suis serotype 2

6,5b ± 0,53 6,4b ± 0,52 6,2b ± 0,42 5,9b ± 0,32 5,2a ± 0,79 6,4c ± 0,52 5,9bc ± 0,32 5,8b ± 0,42 5,7b ± 0,48 4,9a ± 0,32 5,8c ± 0,42 4,9b ± 0,32 4,0a ± 0,00 6,0c ± 0,00 5,9c ± 0,32

- - -

Ghi chú: a, b, c: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 4.3.3.2. Kết quả so sánh hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu Lợn thí nghiệm được chia ra 3 lô: lô 1 có 5 lợn được tiêm vacxin có bổ trợ keo phèn; Lô 2 có 5 lợn, được tiêm vacxin có bổ trợ nhũ dầu; Lô 3 có 3 lợn đối chứng, được tiêm nước sinh lý. Huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin 21 ngày, sử dụng để xác định hàm lượng kháng thể hình thành trong máu sau khi tiêm vacxin 21 ngày

B(cid:1191)ng 4.18. K(cid:1219)t qu(cid:1191) so sánh hình thành kháng th(cid:1223) kháng vi khu(cid:1197)n

A. pleuropneumoniae c(cid:1259)aăvacxinăđaăgiáăb(cid:1241) tr(cid:1255) keoăphènăvƠăvacxinăđaăgiáăb(cid:1241) tr(cid:1255) nhǜă d(cid:1195)u bằngăph(cid:1133)(cid:1131)ng pháp ELISA

Serotype 2

Serotype 5

S(cid:1237) tai

S(cid:1237) TT

Lo(cid:1189)i vacxin

Đ(cid:1133)(cid:1249)ng tiêm

Li(cid:1221)u tiêm

Đánhă giá

OD450

S/P

OD450

S/P

Keo phèn Dưới da 2 ml

67,418 42,623 118,955 59,324 39,652

0,591 1,421 0,54 0,59 0,112

2 ml

Nhũ dầu

Bắp

+ 56,462 + 144,386 + 51,059 + 56,356 - 5,720 62,80a ± 55,33 + 244,385 + 155,932 + 127,860 + 138,029 + 184,004

0,712 0,47 1,215 0,633 0,441 Trung bình 1,795 1,361 1,53 1,265 2,365

2,365 1,53 1,265 1,361 1,795

Nước thịt Dưới da 2 ml

+ + + + + 65,59a ± 31,98 + 178,381 + 133,914 + 151,230 + 124,078 + 236,783 Trung bình 164,88b ± 45,17 - - -

-1,127 -0,717 -0,615

170,04b ± 46,70 -1,377 -0,953 -0,636

- - -

0,043 0,047 0,048 1,030 0,054

0,045 0,049 0,052 1,002 0,058

TN1 1 TN2 2 TN3 3 TN4 4 TN5 5 TN6 6 TN7 7 TN8 8 9 TN9 10 TN10 11 TN11 12 TN12 13 TN13 14 15

Đối chứng dương Đối chứng âm

Kết quả ở bảng 4.18 cho thấy: trong 10 lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có 9/10 lợn dương tính với kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2 và 5. Trong khi đó lợn đối chứng đều âm tính với kháng thể này. Kết quả cũng cho thấy: các chỉ số OD và S/P đánh giá vacxin nhũ dầu kích thích cơ thể lợn hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2 và 5 tốt hơn ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ keo phèn.

4.3.3.3. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu

Để so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida serotype A và D hình thành trong máu lợn sau khi tiêm hai loại vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu khác nhau ở lợn sau 21 ngày được tiêm vacxin, chúng tôi đã lấy máu lợn ở cả 3 lô khác nhau trước và sau khi tiêm 21 ngày, tiến hành làm phản ứng ngưng kết.

B(cid:1191)ng 4.19. K(cid:1219)t qu(cid:1191) so sánh hi(cid:1227)u giá kháng th(cid:1223) kháng vi khu(cid:1197)n P. multocida c(cid:1259)a vacxin đaăgiáăb(cid:1241) tr(cid:1255) keoăphènăvƠăvacxinăđaăgiáăb(cid:1241) tr(cid:1255) nhǜăd(cid:1195)u

S(cid:1237) tai Lo(cid:1189)i vacxin Đ(cid:1133)(cid:1249)ng tiêm Đánhăgiá Li(cid:1221)u tiêm Serotype A Đánhă giá Serotype D S(cid:1237) TT

2 ml 3Log2 + 3Log2 + 1 TN1

Keo phèn Dưới da

+ + + + + + + +

Trung bình

3Log2 4Log2 4Log2 4Log2 3,60 Log2 ± 0,55 4Log2 4Log2 5Log2 + + + 3Log2 4Log2 4Log2 4Log2 3,60 Log2 ± 0,55 4Log2 4Log2 5Log2 + + + 2 TN2 3 TN3 4 TN4 5 TN5 6 TN6 7 TN7 8 TN8 2 ml Nhũ dầu Bắp

4Log2 4Log2 + + 9 TN9

5Log2 5Log2 + + 10 TN10

Trung bình 4,40 Log2 ± 0,55 4,40 Log2 ± 0,55

- - - - 11 TN11 2 ml

- - - - 12 TN12 Nước thịt Dưới da

- - - - 13 TN13

Kết quả cho thấy: hàm lượng kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida serotype A và D ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ nhũ dầu có cao hơn so với 5 lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ keo phèn.

4.3.3.4. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn S. suis của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu

Kết quả này bước đầu cho thấy không có sự khác biệt khả năng hình thành kháng thể kháng vi khuẩn S. suis serotype 2 ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ nhũ dầu. Do đó cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều hơn và thời gian miễn dịch kéo dài hơn để đánh giá về khả năng bảo hộ của 2 loại vacxin bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu đối với lợn.

B(cid:1191)ng 4.20. K(cid:1219)t qu(cid:1191) so sánh hi(cid:1227)u giá kháng th(cid:1223) kháng vi khu(cid:1197)n S. suis c(cid:1259)aăvacxinăđaă giá b(cid:1241) tr(cid:1255) keoăphènăvƠăvacxinăđaăgiáăb(cid:1241) tr(cid:1255) nhǜăd(cid:1195)u

Số TT Số tai Loại vacxin Đường tiêm Liều tiêm Serotype 2 Đánh giá

Keo phèn TN1 1 2ml 3Log2 + Dưới da

Keo phèn TN2 2 2ml 3Log2 + Dưới da

Keo phèn TN3 3 2ml 4Log2 + Dưới da

Keo phèn TN4 4 2ml 4Log2 + Dưới da

Keo phèn TN5 5 2ml 4Log2 + Dưới da

Trung bình 3,60 Log2 ± 0,55

TN6 6 2ml 4Log2 + Nhũ dầu Bắp

TN7 7 2ml 4Log2 + Nhũ dầu Bắp

TN8 8 2ml 4Log2 + Nhũ dầu Bắp

TN9 9 2ml 4Log2 + Nhũ dầu Bắp

10 TN10 2ml 5Log2 + Nhũ dầu Bắp

Trung bình 4,20 Log2 ± 0,55

11 TN11 2ml - - Nước thịt Dưới da

12 TN12 2ml - - Nước thịt Dưới da

13 TN13 2ml - - Nước thịt Dưới da

4.3.4. K(cid:1219)tăqu(cid:1191)ăxácăđ(cid:1231)nhăli(cid:1221)uătiêmăvacxinăviêmăph(cid:1241)iăl(cid:1255)n

Nhằm xác định liều tiêm vacxin viêm phổi lợn phù hợp để có hiệu lực bảo hộ đàn lợn sau khi tiêm vacxin cao nhất và có độ dài miễn dịch dài nhất như sau: Lô lợn thí nghiệm gồm 15 con, chia làm 3 nhóm khác nhau, mỗi nhóm lợn thí nghiệm có 5 lợn.

B(cid:1191)ng 4.21. K(cid:1219)t qu(cid:1191) xácăđ(cid:1231)nh kháng th(cid:1223) (cid:1251) l(cid:1255)n tiêm vacxin v(cid:1247)i li(cid:1221)u tiêm khác nhau

K(cid:1219)t qu(cid:1191) xácăđ(cid:1231)nh hi(cid:1227)u giá kháng th(cid:1223)

Sau tiêm vacxin M(cid:1199)u HT

Tr(cid:1133)(cid:1247)c tiêm vacxin A. pleuropneumoniae P. multocida S. suis

1 KT1 - 5Log2 5Log2 5Log2

2 3 KT2 KT3 - - 5Log2 5Log2 5Log2 5Log2 5Log2 5Log2

4 5 KT4 KT5 - - 5Log2 5Log2 5Log2 5Log2 5Log2 5Log2

6 7 KT6 KT7 - - 5Log2 5Log2 5Log2 5Log2 6Log2 5Log2

8 9 KT8 KT9 - - 5Log2 6Log2 6Log2 6Log2 5Log2 5Log2

10 11 12 13 14 KT10 KT11 KT12 KT13 KT14 - - - - - 6Log2 6Log2 7Log2 6Log2 6Log2 6Log2 6Log2 6Log2 6Log2 7Log2 6Log2 6Log2 6Log2 7Log2 6Log2

15 KT15 - 6Log2 6Log2 6Log2

Kết quả cho thấy: ở nhóm 1 (KT1-KT5) tiêm 1 mũi duy nhất với liều tiêm 2ml/con,

Lợn ở nhóm 2 (KT6-KT10): tiêm 2 mũi với liều tiêm 1ml/con, cách nhau 7 ngày

Lợn ở nhóm 3 (KT11-KT15): tiêm 2 mũi với liều tiêm 2ml/con, cách nhau 7 ngày, sau khi tiêm vacxin 1 tháng, hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis cao nhất so với 2 nhóm trên và đạt hiệu giá từ 6Log2 đến 7Log2.

Như vậy có thể đánh giá liều tiêm vacxin cho lợn đạt hiệu lực bảo hộ cao nhất là tiêm vacxin viêm phổi lợn 2 mũi, với liều tiêm 2ml/con /mũi cách nhau 7 ngày, tiêm dưới da sau hốc tai.

4.3.4. K(cid:1219)tăqu(cid:1191)ăxơyăd(cid:1269)ngăquyătrìnhăs(cid:1191)năxu(cid:1193)tăvacxinăđaăgiáăvôăho(cid:1189)tăb(cid:1241)ătr(cid:1255)ănhǜăd(cid:1195)uă phòngăb(cid:1227)nhăviêmăph(cid:1241)iă(cid:1251)ăl(cid:1255)n

Trên kết nghiên cứu chế tạo và đánh giá chất lượng vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae; P. multocida và S. suis gây ra ở lợn tại các lứa tuổi khác nhau, chúng tôi đã xây dựng được quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu được tóm tắt ở trang sau.

Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ nhũ dầu

Ghi chú: - TW: Tryptone Water

- TYE: Tryptone Yeast Extract Broth

- TSB: Tryptic Soy Broth

- PLLO: Pleuropneumonia-like organism

- THB: Todd Hewitt Broth

- BHI: Brain Heart Infusion

4.3.5. K(cid:1219)tă qu(cid:1191)ă xơyă d(cid:1269)ngă quyă trìnhă s(cid:1265)ă d(cid:1257)ngăvacxină đaăgiáăvôă ho(cid:1189)tăb(cid:1241)ătr(cid:1255)ănhǜă d(cid:1195)uă phòngăb(cid:1227)nhăviêmăph(cid:1241)iăchoăl(cid:1255)n

Trên kết quả nghiên cứu sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn tại thực địa,

chúng tôi xây dựng quy trình sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae; P. multocida và Streptococcus suis gây ra. Vacxin viêm phổi được tiêm bắp thịt với liều lượng như sau:

+ Lợn từ 21 ngày tuổi, sau cai sữa: tiêm 1 lần với 1 mũi tiêm duy nhất: 2ml/con + Lợn nái chửa: 1 năm tiêm 2 lần, mỗi 1 lần tiêm cần tiêm 2 mũi khác nhau: Mũi 1: 2ml/con, tiêm cho lợn nái chửa trước khi đẻ 1 tháng; Mũi 2: 2ml/con, sau mũi 1: 7- 10 ngày.

+ Lợn đực giống: 1 năm tiêm 2 lần, mỗi mũi tiêm 2 ml/con.

PH(cid:1194)Nă5.ăK(cid:1218)TăLU(cid:1200)NăVẨăĐ(cid:1220)ăNGH(cid:1230)

5.1. K(cid:1218)TăLU(cid:1200)N

Dựa trên kết quả thu được của luận án, chúng tôi có 3 kết luận chính như sau:

1) Lợn thí nghiệm đã được gây bệnh bằng các chủng vi khuẩn có trong bộ giống sử

dụng sản xuất vacxin gồm: vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5; vi khuẩn P. multocida serotype A, D và S. suis serotype 2 đều xuất hiện các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể điển hình của lợn mắc bệnh viêm phổi do các vi khuẩn này gây ra cho lợn ở trong thực tiễn.

2) Bộ giống vi khuẩn sử dụng sản xuất vacxin (Master seed) bao gồm 3 chủng

A. pleuropneumoniae, 2 chủng P. multocida và 1 chủng S. suis được lưu giữu dưới dạng đông khô trong nhiều nam vẫn hoàn toàn ổn định về đặc tính sinh học, cấu trúc kháng nguyên, cấu trúc gen, kháng nguyên tính và các yếu tố độc lực của chúng. Các chủng vi khuẩn đã được lựa chọn làm master seed đảm bảo để sản xuất vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn.

3) Sử dụng bộ giống gốc vi khuẩn (Master seed) đã kiểm tra để sản xuất thành công

vacxin đa giá vô hoạt có bổ bổ trợ nhũ dầu (IMS 1313) phòng bệnh viêm phổi ở lợn.

- Vacxin được kiểm nghiệm đạt chất lượng tốt. Hiệu lực phòng bệnh của vacxin chế tạo được thử nghiệm trên lợn với phương pháp công cường độc đạt tỷ lệ bảo hộ trên 80,0% và đạt tỷ lệ an toàn 100,0% ở lợn trên 4 tuần tuổi khi thử nghiệm tại thực địa. Vacxin gây đáp ứng miễn dịch tốt. Lợn sau khi tiêm vacxin 5 tháng, hiệu giá kháng thể trong huyết thanh đạt ≥ 1/16 (4log2), đảm bảo kháng lại vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a, 5b; P. multocida serotype A, D và S. suis serotype 2 gây viêm phổi ở lợn. Vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu kích thích lợn sản sinh kháng thể kháng 3 loại vi khuẩn trên tốt hơn so với vacxin đa giá vô hoạt bổ keo phèn.

- Đã xây dựng và hoàn thiện được quy trình sản xuất, quy trình sử dụng và bảo quản

vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do 3 loại vi khuẩn gây ra.

5.2. Đ(cid:1220)ăNGH(cid:1230)

1) Tiếp tục thử nghiệm vacxin đa giá vô hoạt với bổ trợ nhũ dầu (IMS 1313) phòng viêm phổi ở lợn trên diện rộng nhằm đánh giá về hiệu lực và độ dài miễn dịch của vacxin vô hoạt nhũ dầu lần đầu tiên chế tạo tại Việt Nam.

2) Khi đạt kết quả tốt, đề nghị cho phép sử dụng vacxin vô hoạt nhũ dầu (IMS 1313) phòng bệnh viêm phổi ở lợn đực và lợn nái tại các cơ sở lợn giống trên phạm vi toàn quốc.

DANH MỤC CỌNG TRÌNH CỌNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LU(cid:1200)N ÁN

1. Cù Hữu Phú, Đỗ Tất Đạt & Lương Thị Hương Giang (2019). So sánh chất lượng vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu chế tạo phòng bệnh viêm phổi cho lợn. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y. Tập XXVI, số 2, 2019. tr. 40.

2. Đỗ Tất Đạt, Cù Hữu Phú & Nguyễn Bá Hiên (2019). Chế tạo vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. Tập 15, số 5, 2019. tr. 351.