Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ quả dứa

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI -- --

HOÀNG THỊ LỆ THƯƠNG

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN

ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT RƯỢU BRANDY

TỪ QUẢ DỨA

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 9 42 01 07

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quang Hào

TS. Trần Thị Thuý

Hà Nội - 2020

Luận án được hoàn thành tại

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quang Hào

TS. Trần Thị Thúy

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án tiến sĩ tại

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Vào hồi.... giờ.... ngày.... tháng.... năm 2020

Có thể tìm đọc luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Hà Nội

- Trung tâm thông tin thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Hoàng Thị Lệ Thương, Nguyễn Quang Hào (2014), Động thái lên men vang

dứa để sản xuất rượu Brandy của chủng Saccharomyces cerevisiae D8, Tạp

chí Khoa học, Đại học quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ,

30(6S), tr. 587-591.

2. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2016), Nghiên

cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và dinh dưỡng đến quá trình lên

men vang để sản xuất Brandy từ dứa Queen bằng chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae D8, Tạp chí Khoa học và công nghệ Nông nghiệp

Việt Nam, 12 (73), tr. 23-28.

3. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2017),

Taxonomic characterization and

identification of

Saccharomyces

cerevisiae D8 for brandy production from pineapple, Tạp chí sinh học, số

39 (4), tr. 474-482.

4. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2018), Cải biến

chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae D8 bằng kĩ thuật đột biến ngẫu

nhiên nhằm nâng cao hoạt lực lên men ethanol, Tạp chí công nghệ sinh học,

số 16 (2): tr. 337 – 344.

5. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2018), Vai trò

của gỗ sồi trong cất giữ brandy dứa ở Việt Nam, Tạp chí sinh học số 40 (2):

tr. 130 - 139.

MỞ ĐẦU

Brandy là loại rượu cao độ chưng cất từ vang chất lượng cao, rất được ưa chuộng.

Brandy có tác dụng kích thích thần kinh, tim mạch, tiêu hóa nên sử dụng một lượng nhỏ

mỗi ngày rất tốt cho sức khỏe. Rượu brandy phù hợp với nhu cầu của giới trẻ nói riêng

và người dân nói chung nên được sử dụng ngày càng nhiều. Tuy nhiên, rượu brandy mà

chúng ta sử dụng hiện nay chủ yếu vẫn là nhập ngoại, khối lượng nhập đứng thứ 3 trong

số các loại rượu mạnh nhập khẩu vào Việt Nam. Mức tăng trưởng của thị trường brandy

bình quân mỗi năm là 18,8% nên rượu có giá thành cao, chưa được sử dụng rộng rãi.

Chính vì vậy, việc tìm ra nguồn nguyên liệu trong nước và công nghệ phù hợp để chủ

động sản xuất brandy đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng có ý nghĩa quan trọng.

Dứa là cây ăn quả phổ biến ở nước ta, được phân bố từ Bắc đến Nam. Năm 2007

tổng sản lượng dứa trong cả nước đạt 529.100 tấn, năm 2011 đạt 532.700 tấn, năm 2016 đạt 579.982,3 tấn, năm 2018 đạt 674 nghìn tấn...luôn đứng đầu trong các loại cây ăn quả.

Quả dứa có thành phần dinh dưỡng phong phú. Hàm lượng nước, đường, protein, các

vitamin, khoáng chất và độ acid trong dịch quả cao, phù hợp cho sản xuất rượu vang chất

lượng để chưng cất thành brandy có hương vị đặc trưng. Cho đến nay, theo các tài liệu mà

chúng tôi tham khảo được, các nghiên cứu về quả dứa ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở quy

trình bảo quản quả tươi, sấy khô, làm siro, các đồ uống và lên men vang. Nhiều công ty,

doanh nghiệp và các cơ quan nghiên cứu về thực phẩm trong nước đã tiến hành quy trình sản

xuất rượu brandy từ vải thiều, táo, mận, điều…Riêng với rượu brandy từ dứa, hiện mới có

duy nhất dự án “Hoàn thiện công nghệ sản xuất brandy trái cây (vải, dứa) ở quy mô công

nghiệp” do Công ty TNHH MTV Bia rượu Eresson chủ trì. Theo hướng này, nấm men

được thu thập từ nhiều nguồn trong và ngoài nước, quy trình công nghệ chưng cất bằng tháp

cao. Sản phẩm brandy dứa đang dừng lại ở mức thăm dò thị trường, số lượng ít, giá thành

cao, chưa phổ biến. Do đó, việc nghiên cứu chế biến dứa thành rượu brandy theo hướng

truyền thống thành công sẽ là cơ sở khoa học để tổ chức sản xuất rượu brandy từ dứa ở Việt

Nam, tạo thêm hướng tiêu thụ cho quả dứa, giải quyết công ăn việc làm cho nông dân lao

động, góp phần phát triển kinh tế cho nhiều địa phương trồng dứa.

Xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất, nhằm giúp nông dân giải quyết khâu tiêu thụ

dứa bằng phương pháp chế biến, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn chủng

nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ quả dứa”.

Mục tiêu của đề tài

Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men etanol cao, tạo hương thơm đặc

trưng, phù hợp để sản xuất rượu brandy từ quả dứa đạt chất lượng tốt.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Các chủng nấm men lên men rượu etanol phân lập từ dịch ép dứa

Queen trồng tại Nông trường Đồng Giao - Tam Điệp - Ninh Bình.

Phạm vi nghiên cứu:

- Chủng vi sinh vật nghiên cứu: Các chủng nấm men lên men rượu được phân lập từ

dịch ép dứa Queen lên men tự nhiên.

- Nguyên vật liệu: Giống dứa Queen trồng tại Nông trường dứa Đồng Giao - Tam Điệp -

Ninh Bình.

Nội dung nghiên cứu

(1) Tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực lên men etanol cao và cho hương thơm

đặc trưng trong quá trình lên men dịch dứa Queen.

(2) Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chủng nấm men được tuyển chọn: Hình thái

khuẩn lạc, hình thái tế bào, khả năng lên men các loại đường, khả năng đồng hóa muối

nitrat, định tên khoa học, ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (hàm lượng đường, ảnh

hưởng của pH môi trường, ảnh hưởng của nguồn nitơ) đến sự sinh trưởng và phát triển của

chủng nấm men tuyển chọn

(3) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang dứa của chủng nấm

men được tuyển chọn: pH, nhiệt độ, acid hữu cơ, hàm lượng đường, hàm lượng oxy hòa tan, tỉ

lệ men giống; nghiên cứu quá trình lên men vang từ dịch dứa Queen.

(4) Cải biến chủng nấm men D8 bằng kĩ thuật đột biến ngẫu nhiên.

(5) Nghiên cứu quy trình chưng cất, làm sạch, tạo màu và hương vị cho brandy.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

- Ý nghĩa khoa học:

Luận án đã cung cấp những dẫn liệu khoa học về việc sử dụng quả dứa để lên men

vang sản xuất brandy chất lượng cao. Kết quả nghiên cứu đã phân tích được thành phần

cơ bản của dịch ép dứa Queen (nguyên liệu dùng để lên men vang sản xuất brandy);

tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men cao, hương thơm đặc trưng; cải

biến chủng nấm men này theo phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên tạo dòng nấm men

có khả năng chịu độ rượu, chịu đường và có hoạt lực lên men cao hơn 22% so với chủng

gốc. Luận án cũng đã đề xuất phương pháp loại bỏ các tạp chất không mong muốn trong

rượu brandy thô, chỉ ra tác dụng của gỗ sồi trong việc tàng trữ tạo màu sắc và hương vị

cho brandy dứa; xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất brandy từ dứa.

- Ý nghĩa thực tiễn

Các kết quả nghiên cứu của luận án có thể ứng dụng để sản xuất brandy dứa, làm đa dạng

hóa sản phẩm chất lượng cao từ quả dứa, mở thêm hướng giải quyết được đầu ra cho quả dứa.

Bên cạnh đó, luận án cũng có thể được dùng như một tài liệu tham khảo phục vụ học tập,

nghiên cứu, giảng dạy về lên men vang và ứng dụng trong sản xuất rượu brandy từ quả dứa.

Những điểm mới của luận án

- Luận án là công trình đầu tiên của Việt Nam nghiên cứu có hệ thống về sản xuất brandy

dứa từ phân lập, tuyển chọn, định tên khoa học của chủng nấm men được tuyển chọn, điều kiện

nhân giống, lên men, chưng cất, loại bỏ tạp chất, tàng trữ tạo hương vị và màu sắc đặc trưng

cho brandy.

- Tạo đươc biến chủng có hoạt lực lên men rượu cao đạt hàm lượng ethanol 15,1 % V/V

từ chủng S. cerevisiae bằng đột biến ngẫu nhiên.

- Đề xuất việc sử dụng nước chiết giá đỗ thay thế cho pepton trong nhân giống nấm

men để lên men vang, sản xuất brandy.

- Đề xuất được quy trình lên men vang để sản xuất brandy dứa sử dụng chủng nấm

men S. cerevisiae D8 và nguồn nguyên liệu dứa Queen

- Đề xuất phương pháp loại bỏ tạp chất trong rượu brandy trong môi trường acid bằng cách

kết hợp phương pháp hóa học và vật lý.

Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 136 trang, bao gồm các phần sau:

Mở đầu: 4 trang

Chương 1. Tổng quan vấn đề nghiên cứu: 44 trang

Chương 2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 23 trang

Chương 3. Kết quả và Thảo luận: 63 trang

Kết luận và Kiến nghị: 2 trang

Tài liệu tham khảo: Luận án tham khảo được 45 tài liệu tiếng Việt, 131 tài liệu tiếng

nước ngoài, 02 trang Web.

Phụ lục: Luận án có 9 phụ lục các kết quả phân tích

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Trong chương này, ba vấn đề liên quan đến các nghiên cứu trong luận án này đã được

tổng quan. Đó là: (1.1) NẤM MEN; (1.2) DỨA – NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT

BRANDY và (1.3) CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BRANDY.

Trong phần (1.1) NẤM MEN, Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm men trong sản

xuất rượu (mục 1.1.1.) trên thế giới và ở Việt Nam đã được trình bày cụ thể. Các tiêu chí

Phân loại, tuyển chọn các chủng nấm men (mục 1.1.3.) cũng được tổng quan. Các loài nấm

men được dùng trong sản xuất vang thuộc giống Saccharomyces (gồm 286 loài nằm

trong 17 chi. Đặc điểm sinh học của nấm men (Đặc điểm hình thái, cấu tạo tế bào và đặc

điểm sinh lý – mục 1.1.2) và Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và lên

men của nấm men (nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hóa tan, hàm lượng đường, hàm lượng rượu,

các chất khử trùng,…mục 1.1.4) được trình bày cụ thể từ trang 15 đến trang 20.

Trong phần (1.2) DỨA – NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT BRANDY, các tổng quan

về (1.2.1) Nguồn gốc của cây dứa; (1.2.2) Sơ lược tình hình trồng và chế biến dứa ở

Việt Nam; (1.2.3) Đặc điểm sinh học và thành phần dinh dưỡng của dứa được trình bày

từ trang 21 đến trang 26.

Phần (1.3) CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BRANDY mô tả (1.3.1) Lịch sử nghiên cứu

và sản xuất rượu brandy trên thế giới và ở Việt Nam, từ trang 27 đến trang 33; (1.3.2) Sản

xuất vang để chưng cất thu brandy từ trang 34 đến trang 38; (1.3.3) Chưng cất rượu

vang để thu brandy và (1.3.4.) Tàng trữ và tạo hương cho brandy trang 38 đến 44

(1.3.5) Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng brandy Việt Nam từ trang 45 đến 48.

Trong mục 1.3.1 (Tình hình nghiên cứu và sản xuất rượu brandy), một số sản phẩm

brandy của các nước (Pháp, Tây Ban Nha, Ý, Đức, Mỹ và châu Mỹ latin…) cùng một số quy

trình công nghệ sản xuất brandy trên thế giới (VD: Quy trình sản xuất rượu Cognac) đã được

tổng quan. Tình hình sản xuất vang và brandy của Việt Nam cũng được đề cập cụ thể.

Trong mục 1.3.2. (Sản xuất vang để chưng cất thu brandy) chúng tôi đã tổng quan

về: (1) Cơ chế lên men rượu; (2) Các giai đoạn lên men vang từ khâu chuẩn bị nguyên liệu,

dịch lên men đến nhân giống nấm men và các giai đoạn lên men được mô tả kỹ lưỡng.

Trong mục 1.3.3. (Chưng cất rượu vang để thu brandy) và mục 1.3.4. (Tàng trữ và tạo

hương cho brandy) chúng tôi đã mô tả các thiết bị chưng cất rượu (từ chưng cất gián đoạn, cải tiến

đến chưng cất liên tục) và các kỹ thuật làm sạch rượu, tạo màu và tạo hương cho brandy thành phẩm.

Trong mục 1.3.5. (Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng brandy Việt Nam) tiêu chuẩn về

nguyên liệu, cảm quan, thành phần hóa học, giới hạn về thành phần kim loại nặng, phụ gia

thực phẩm và quy cách đối với việc bao gói, ghi nhãn, bảo quản và vận chuyển brandy đều

được trình bày cụ thể.

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trong chương này, các Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị chính được trình bày trong

mục (2.1) bao gồm: (2.1.1) Nguyên liêu dứa; (2.1.2) Các hoá chất và môi trường; (2.2.3)

Chủng giống vi sinh vật và (2.1.4) Thiết bị nghiên cứu.

Các Phương pháp nghiên cứu (mục 2.2) được chia thành 04 nhóm chính như sau:

2.2.1. Phương pháp vi sinh gồm các phương pháp: Pha loãng mẫu để phân lập nấm

men, Phân lập nấm men trên môi trường Hansen đặc, Làm tiêu bản sống và tiêu bản cố định

nhuộm đơn, Bảo quản chủng giống nấm men, Hoạt hoá tế bào nấm men, Đếm số lượng tế bào

nấm men, Nghiên cứu hình thái, kích thước khuẩn lạc và tế bào nấm men, Xác định hoạt lực

lên men, Sàng lọc và tuyển chọn dòng đột biến có hoạt lực lên men cao, Định loại nấm men.

2.2.2. Phương pháp hóa lý-hoá sinh gồm các phương pháp: Xác định trị số pH, Xác

định hàm lượng oxy hòa tan, Xác định hàm lượng đường tổng, Xác định hàm lượng Vitamin

C, Xác định acid tổng số, Xác định hàm lượng rượu etanol, Thu hồi và làm sạch rượu, Xác

định hàm lượng furfurol và Xác định hiệu suất lên men.

2.2.3. Phương pháp phân tích cảm quan rượu

2.2.4. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men từ dịch ép dứa Queen

3.1.1. Phân lập nấm men trong môi trường dịch ép dứa Queen

Từ dịch ép dứa Queen lên men tự nhiên, chúng tôi đã phân lập được 8 chủng nấm

men, kí hiệu lần lượt là D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7 và D8 có khả năng sinh trưởng và lên

men etanol trong môi trường có hàm lượng đường và acid tổng số cao. Định hướng phân lập

như vậy tạo điều kiện thuận lợi cho việc tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng sinh

trưởng mạnh, lên men etanol tốt trong điều kiện lên men tự nhiên dịch ép dứa Queen, hạn

chế được sự tạp nhiễm từ các vi sinh vật khác trong tự nhiên.

3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men

a) Đánh giá sinh trưởng của 8 chủng nấm men phân lập được trong môi trường Hansen với lượng bổ sung giống ban đầu như nhau (13,4 × 106 tế bào/ml) cho thấy: Chủng nấm men

D1, D4 và D5 có khả năng sinh trưởng trong môi trường Hansen tốt hơn cả, mật độ tế bào trong bình nhân giống đạt trên 130 × 106 tế bào/ml. Các chủng D2, D3 và D8 sinh trưởng kém hơn,

6 đạt 121 – 128 × 106 tế bào/ml dịch môi trường nhân giống. Khả năng sinh trưởng của các chủng D6 và D7 trong môi trường nhân giống là kém nhất (đạt dưới 120 × 106 tế bào/ml).

b) Khảo sát hoạt lực lên men của 8 chủng nấm men phân lập được

Các tiêu chí chính được sử dụng để tuyển chọn chủng nấm men là: khả năng lên men

mạnh, chịu được độ đường cao, pH thấp và tạo hương thơm đặc trưng. Hoạt lực lên men của 8

chủng nấm men D1 - D8 được đánh giá thông qua lượng CO2 thoát ra sau 120 giờ lên men ở 28°C (Bảng 3.1). Ngoài ra, chúng tôi cũng so sánh khả năng tạo hương giữa các chủng để lựa

chọn được 04 chủng vừa có hoạt lực lên men etanol cao, vừa có hương thơm đặc trưng của dứa

trong dịch lên men; đó là các chủng: D3, D4, D5 và D8.

Hoạt lực lên men tính bằng lượng CO2 sinh ra (g/100ml)

Thời gian lên men (h)

4,44 ±

5,06 ±

4,88 ±

5,38 ±

5,79 ±

5,02 ±

4,63 ±

5,10 ±

0,02

0,03

0,02

5,08 ±

6,25 ±

6,02 ±

7,0 2 ±

8,70 ±

6,84 ±

5,55 ±

6,48 ±

0,02

0,03

0,01

0,02

0,03

0,02

0,01

7,32 ±

7,63 ±

7,96 ±

7,82 ±

Bảng 3.1. Hoạt lực lên men etanol và khả năng tạo hương của 8 chủng nấm men phân lập

8,13 ±

8,29 ±

9,67 ±

9,85 ±

0,02

0,03

0,02

0,01

0,02

0,03

0,01

7,35 ±

7,70 ±

8,24 ±

8,32 ±

9,73 ±

7,85 ±

7,98 ±

9,89 ±

120

0,02

0,01

0,03

0,02

0,03

0,02

0,03

Hương

+++

thơm

Chú thích: Khả năng tạo hương thơm: +++: Thơm nhiều; ++: Thơm trung bình ;+: Thơm ít

Đánh giá khả năng lên men của 4 chủng nấm men tuyển chọn trong môi trường có

pH thấp (Bảng 3.2) chúng tôi nhận thấy: chủng D8 có khả năng lên men mạnh nhất, tạo

Hoạt lực lên men tính bằng lượng CO2 thoát ra (g/100ml)

pH môi trường

2,5

2,79 ±0,03

3,32 ± 0,02

3,07 ± 0,01

2,49 ± 0,2

3,0

8,88 ± 0,02

8,79 ± 0,03

6,92 ± 0,02

ra từ 9,65 đến 9,88 g CO2/100 ml dịch lên men ở môi trường có pH từ 3,5 đến 4,5. Bảng 3.2. Khả năng lên men của 4 chủng nấm men D3, D4, D5, D8 ở các môi trường có pH thấp

9,10 ± 0,02

3,5

9,41 ± 0,01

9,44 ± 0,02

8,01 ± 0,02

9,65 ± 0,02

4,0

9,52 ± 0,01

9,62 ± 0,02

8,93 ± 0,02

9,88 ± 0,02

4,5

9,53 ±0,02

9,63 ±0,01

8,96 ±0,03

9,97 ±0,03

Ở môi trường có pH = 3, trong khi các chủng D3, D4 và D5 lên men yếu nhưng

chủng D8 vẫn lên men khá mạnh, tạo ra 9,10 g CO 2/100 ml. Sự khác biệt về khả năng

lên men etanol của các chủng nấm men tuyển chọn ở môi trường có pH 4,0 và 4,5

không nhiều, có ý nghĩa thống kê (p<0,5). Như vậy, chủng D8 không chỉ có hoạt lực

lên men cao trong môi trường pH thấp mà có hoạt lực lên men trong dải pH rộng có

khả năng tạo hương thơm nhiều, được chọn để tiếp tục nghiên cứu định loại và ứng

dụng sản xuất brandy.

3.2. Đặc điểm sinh học của chủng nấm men D8 đã được tuyển chọn

3.2.1. Hình thái của khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng nấm men D8 Chủng D8 được nuôi cấy trên môi trường Hansen đặc ở 28oC. Sau 96 h thu được các khuẩn

lạc có hình tròn, màu trắng, viền xung quanh nhẵn, đường kính từ 0,43 - 0,66 cm (Hình 3.1).

Hình 3.1. Khuẩn lạc của chủng D8 trên môi trường Hansen đặc ở 28oC sau 96 h nuôi cấy Tế bào của chủng D8 có hình oval hoặc hình trứng, kích thước khoảng (3,2 - 4,2) ×

(4,5 – 5,4) μm, đâm chồi, không đồng đều ở cả đỉnh cực và phía bên, chồi có kích thước

khoảng (2,5 – 3,0) × (4,3 – 5,3) μm. Bề mặt của nhiều tế bào có sẹo chồi hoặc vết lõm khá

lớn (kích thước lên tới khoảng 1000 nm).

Hình 3.2. Hình dạng tế bào của chủng D8 trên môi trường Hansen đặc sau 96h nuôi cấy ở 28 oC (chụp dưới kính hiển vi điện tử S4800-NHE)

A - Tế bào mẹ, B - Chồi , C - Lõm trên bề mặt tế bào, D - Sẹo (vị trí tách ra của chồi)

3.2.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng nấm men D8

Đặc điểm sinh lý - sinh hóa và khả năng chuyển hóa đường của chủng nấm men D8

được so sánh với chủng nấm men đối chứng S. cerevisiae TCCY bằng kit API C 20 AUX

được trình bày ở bảng 3.3 và bằng kit API ID32 C được trình bày ở bảng 3.4.

Chủng nấm men

Loại

Chủng D8

Chủng S. cerevisiae TCCY

Mẫu trắng

Bộ 3

đường

Phản

Mã định

Phản

Mã định

Phản

Mã định

Điểm Cộng

ứng

danh API

ứng

danh API

ứng

danh API

3041130

7040130

0000000

GLU

GLY

2KG

ARA

XYL

III

ADO

XLT

GAL

INO

SOR

MDG

NAG

CEL

LAC

MAC

SAC

TRE

VII MLZ

RAF

H/pH+

Ghi chú: +/-: Phản ứng/ không phản ứng; O: không đường; GLU: D-glucose; GLY: glycerol; 2KG: calcium-2;keto-

gluconate; ARA: L-arabinose; XYL: D-xylose; ADO: adonitol (ribitol); XLT: xylitol; GAL: D-galactose; INO:

inositol; SOR: D-sorbitol; MDG: Methyl-αD-glucopyranoside; NAG: N-acetyl-glucosamine; CEL: cellobiose; LAC:

D-lactose; MAL: D-maltose; SAC: D-saccharose; TRE: D-trehalose; MLZ: D-melezitose; RAF: D-raffinose.

Bảng 3.3. Khả năng lên men đường của chủng D8 và chủng TCCY bằng kit API C 20 AUX

Chủng D8

Chủng nấm men Chủng S. cerevisiae TCCY

Mẫu trắng

Bộ 3 Đường

Điểm Cộng

Mã định danh API 504001 0031

Mã định danh API 504000 0031

Mã định danh API 000000 0000

III

VII

VII I

0 0

1 0 4 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 0 1 0 0 0

Phản ứng + - + - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - + + - + - - -

Phản ứng - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Phản ứng + - + - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - + + - + - - -

GAL ACT SAC NAG LAT ARA CEL RAF MAL TRE 2 KG MDG SOR SYL RIB GLY RHA PLE ERY MEL GRT MLZ GNT LVT ĨX MAN LAC INO GLU SBE GLN ESC

1 0 4 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 0 1 0 0 0

Ghi chú: +/-: Phản ứng/ không phản ứng; O: không đường; GAL: D-galactose; ACT: cycloheximide (actidione);

SAC: D-saccharose; NAG: N-acetyl-glucosamine; LAT: lactic acid; ARA: L-arabinose; CEL: cellobiose; RAF: D-

raffinose; MAL: D-maltose; TRE: D-trehalose; 2KG: potassium-2;keto-gluconate; MDG: Methyl-αD-

glucopyranoside; SOR: D-sorbitol; XYL: D-xylose; RIB: D-ribose; GLY: glycerol; RHA: L-rhamnose; PLE:

palatinose; ERY: erythritol; MEL: D-melibiose; GRT: sodium glucuronate; MLZ: D-melezitose; GNT: potassium

gluconate; LVT: levulinic acid (levulinate); MAN: D-manitol; LAC: D-lactose; INO: inositol; GLU: D-glucose;

SBE: L-sorbose; GLN: glucosamine; ESC: esculin ferric citrate.

Bảng 3.4. Khả năng lên men đường của chủng D8 và chủng TCCY bằng kit API ID 32 C

Kết quả lên men các loại đường và một số đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng D8

bằng Kit API C20 AUX và API ID 32 đều cho phép khẳng định chủng D8 là Saccharomyces cerevisiae với xác suất >98%.

lớp Nấm túi

3.2.3. Xác định tên khoa học của chủng D8 Căn cứ vào các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào (3.2.1), đặc điểm sinh học của chủng nấm men D8 (3.2.2), chúng tôi xác định vị trí phân loại của chủng D8 thuộc chi Saccharomyces, lớp nấm túi (Ascomycota) (theo khóa phân loại Looder, 1971). trần Chủng D8 có khả năng đồng hóa (NH4)2SO4 thuộc phân (Hemiascomycetidae). Chủng D8 có khả năng sử dụng D-glucose, D-galactose, inositol, D- maltose, D-saccharose, D-manitol and D-lactose trong quá trình sinh trưởng và phát triển.

Chủng D8 không sử dụng nguồn các bon từ glycerol, L-arabinose, D-xytose, D-sorbitol, xilitol, D-cellobiose, D-trehalose, D/L-rafinose and L-sorbose. Do đó, theo khóa phân loại

truyền thống của Looder chủng D8 có nhiều đặc điểm của loài S. cerevisiae.

Nhằm khẳng định lại một lần nữa kết quả định danh bằng các đặc điểm hình thái

khuẩn lạc, hình thái tế bào và khả năng chuyển hóa đường đối với chủng nấm men D8,

chúng tôi đã định danh chủng D8 bằng phương pháp sinh học phân tử. Đoạn mã hóa trình tự

D1/D2 trong gen 28S r-RNA của chủng D8 được nhân lên bằng phản ứng PCR để so sánh

với trình tự đoạn gen tương tự của các chủng nấm men thuộc loài S. cerevisiae được lưu giữ

trong ngân hàng gen (NCBI).

> Trình tự D1/D2 của chủng nấm men D8

ACGTCGCAGTCCTCAGTCCCAGCTGGCAGTATTCCCACAGGCTATAATACTTACCGAGGCAAGCTACATTCCTATGGATT

TATCCTGCCACCAAAACTGATGCTGGCCCAGTGAAATGCGAGATTCCCCTACCCACAAGGAGCAGAGGGCACAAAACACC

ATGTCTGATCAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCA

TCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATTCC

CAAACAACTCGACTCTTCGAAGGCACTTTACAAAGAACCGCACTCCTCGCCACACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCC

TGTTCCAAGGAACATAGACAAGGAACGGCCCCAAAGTTGCCCTCTCCAAATTACAACTCGGGCACCGAAGGTACCAGATT

TCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAAGGCAATCCCGGT

Saccharomyces cerevisiae

Sequence ID: gb|KF646229.1|

Identities

531/531(100%)

Kết quả đọc trình tự đoạn D1/ D2 của chủng nấm men D8 và kết quả so sánh với

các trình tự tương tự trong ngân hàng gen NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) cho thấy

mức độ tương đồng của trình tự này là 99 đến 100% so với trình tự đoạn D1/D2 của các

chủng nấm men S. cerevisiae ATCC 18824 KC881066.1, S. cerevisiae SR127 CP011558.1,

S. cerevisiae NCIM3186 CP011821.1 và S. bayanus CHFY0321EU719073.

Kết quả định tên khoa học bằng hình thái tế bào và khuẩn lạc, bằng phương pháp hóa

sinh và bằng phương pháp sinh học phân tử đều khẳng định chủng D8 thuộc loài S.

cerevisiae họ Saccharomycetaceae, bộ Saccharomycetales. Chủng này được chúng tôi đặt

tên là S. cerevisiae D8 để tiếp tục tiến hành các nghiên cứu lên men rượu và sản xuất rượu

brandy từ dứa Queen. Các kết quả này được trình bày trong bài báo số 3.

3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men S. cerevisiae D8

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và

phát triển của nấm men S. cerevisiae D8 nhằm xác định môi trường nhân giống thích hợp.

Các yếu tố môi trường cơ bản ảnh hưởng đến quá trình nhân giống nấm men S. cerevisiae

D8 bao gồm: pH môi trường, nhiệt độ, hàm lượng đường, nguồn nitơ, được trình bày cụ thể

từ trang 79 đến 90 bản toàn văn của luận án tiến sỹ này. Đặc biệt, nước chiết giá đỗ không

những có thể thay thế pepton trong nhân giống S. cerevisiae D8 mà còn đem lại hiệu quả nhân

giống cao hơn so với khi dùng pepton. Nước chiết giá đỗ cung cấp nitơ và đặc biệt là

vitamin và khoáng (hai nhóm chất mà pepton bị thiếu hụt) cho sinh trưởng của nấm men.

Thêm vào đó, nước chiết giá đỗ lại rẻ tiền, dễ làm, dễ kiếm hơn so với pepton và ít ảnh

hưởng đến hương thơm và màu sắc tự nhiên của sản phẩm lên men cuối cùng.

Các nghiên cứu đó giúp chúng tôi xác định được môi trường nhân giống tốt nhất đối

với nấm men S. cerevisiae D8 là: Môi trường Hansen có hàm lượng đường 70g/l, pH 4,0 và nước chiết của 100 g giá đỗ /l, nhiệt độ nuôi là 28oC. Trong môi trường này, mật độ tế bào nấm men cực đại đạt 342,8 × 106 tế bào sống/ml, tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt 88%.

3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang dứa

3.3.1. Thành phần hóa học cơ bản của dịch dứa ép

Kết quả phân tích cho thấy dịch ép dứa Queen có hàm lượng đường tổng đạt trung

bình 126 g/l, hàm lượng vitamin C đạt 41 mg/l, acid tổng số 3,6 g/l, giá trị pH đạt 3,4. Kết

quả này cao hơn công bố trên cơ sở dữ liệu dinh dưỡng của USDA. Theo công bố của cơ sở

dữ liệu này, hàm lượng đường trong dịch dứa là 9,26 g/l, vitamin C 36,2 mg/l. Điều này

được giải thích bởi thành phần hóa học của dứa phụ thuộc vào giống dứa, đất trồng,

chế độ chăm sóc, mùa vụ và thời điểm thu hoạch… So sánh với tiêu chí nguyên liệu

sản xuất rượu brandy, thành phần hóa học của dịch ép dứa vừa phân tích hoàn toàn phù

hợp để lên men chưng cất rượu brandy.

3.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang dứa

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ đường, hàm

lượng oxy hòa tan, tỉ lệ men giống, đến khả năng lên men rượu của chủng S. cerevisiae D8

được dẫn ra từ bảng 3.7 đến 3.11 bản toàn văn của luận án này từ trang 92 - 98 và trong bài

báo số 2.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men dịch dứa

Chỉ tiêu

20

24 Nhiệt độ lên men (ᴼC) 28

32

36

10,82±0,4

10,91±0,2

11,04±0,1

11,02±0,2

10,82±0,3

Hàm lượng rượu (%V/V)

194,18±0,03 194,31±0,05 194,72±0,02 195,03±0,03 195,37±0,07

Đường tiêu hao (g/l)

5,71 ±0,02

5,93 ±0,05

6,09±0,02

6,14±0,02

6,22±0,03

Acid tổng số (g/l)

83,35±0,31

84,13±0,15

85,11±0,08

85,01±0,15

83,25±0,23

Hiệu suất lên men (%)

+++

Hương thơm của dịch lên men

Ghi chú: Khả năng tạo hương thơm: +++: thơm nhiều; ++: Thơm trung bình ; +: Ít thơm

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men vang dứa

Chỉ tiêu

pH ban đầu của môi trường lên men 3,5

4,5

11,03±0,01 11,08±0,03 11,16±0,06 11,01±0,02

10,84±0,2

Hàm lượng rượu (% V/V) Đường tiêu hao (g/l)

194,43±0,07 194,97±0,09 195,52±0,03 195,36±0,05 195,20±0,04

Acid (g/l)

5,44 ±0,03

5,62±0,03

5,68±0,01

5,89±0,04

6,04±0,05

Hiêu suất lên men (%)

85,1±0,08

85,84±0,23 86,28±0,46 85,01±0,15 83,64±0,15

Hương thơm của dịch

+++

lên men

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men

Hàm lượng đường trong môi trường lên men (g/l)

Chỉ tiêu

126

150

170

200

220

250

6,92±0,03 8,58±0,02 9,54±0,02

11,22±0,02

11,24±0,02 11,21±0,03

Hàm lượng rượu (% V/V)

194,46

211,22 ±0,02

Đường tiêu hao (g/l)

115,88 ±0,01

144,99 ±0,02

164,92 ±0,02

240,14 ±0,02

±0,03

Acid (g/l)

6,64±0,02 6,22±0,02 5,83±0,01

5,56±0,02

5,28±0,01

5,21±0,02

89,02±0,21 88,43±0,17 86,78±0,18 86,67±0,15

78,88±0,14 69,58±0,18

Hiêu suất lên men (%)

+++

Hương thơm của dịch lên men

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan ban đầu trong dịch lên men

đến quá trình lên men vang dứa

Hàm lượng oxy hòa tan trong dịch lên men (mg/l)

Chỉ tiêu

Hàm lượng rượu (%

11,29±0,02

11,88±0,02 11,36±0,02

11,81±0,02 12,37±0,02

V/V)

Đường tiêu hao (g/l)

197,5±0,02

197,6±0,02 198,8±0,02

197,4±0,02 197,3±0,02

Acid (g/l)

5,1±0,02

5,2±0,02

5,3±0,02

5,4±0,02

Hiệu suất lên men (%) 87,07±0,02

91,17±0,02 95,18±0,02

91,66±0,02 86,58±0,02

Hương thơm của

+++

dịch lên men

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của lượng men giống đến quá trình lên men vang dứa

Thể tích men giống (% V/V)

Chỉ tiêu

Hàm lượng rượu (% V/V)

12,35±0,01

12,37±0,02

12,37 ±0,02

12,34±0,01

Đường tiêu haog/l)

198,16±0,02 198,75±0,03 198,48±0,01 198,31 ±0,03

Acid (g/l)

4,52±0,02

4,67±0,01

4,81±0,01

4,83±0,02

Hiệu suất lên men (%)

95,09±0,08

95,28±0,15

94,99±0,08

Thời gian kết thúc lên men chính (ngày)

Hương thơm của dịch lên men

+++

Từ các kết quả nêu trên, chúng tôi lựa chọn môi trường thích hợp cho lên men vang

dứa Queen để sản xuất brandy là: Dịch ép dứa có pH=4, hàm lượng đường 220 g/l, lượng oxy hòa tan là 7 mg/l, hàm lượng men giống bổ sung là 17,1×106 tế bào/ml dịch lên men (5% thể tích V/V của bình lên men). Lên men ở 28o C trong 14 ngày đã thu được loại vang

dứa đạt tiêu chuẩn để chưng cất brandy dứa.

3.3.3. Quá trình lên men vang dứa (quy mô 20 và 100 lít/mẻ) bằng chủng S.

cerevisiae D8

Giống nấm men S. cerevisiae D8 được nhân giống cấp 1, 2 và 3 được mô tả cụ thể

trong phần phương pháp trang 53 của luận án.

Giống nấm men cần được kiểm tra nhanh từng giai đoạn bằng việc quan sát hình thái

và xác định mật độ tế bào nấm men sống, đảm bảo mật độ tế bào sống ở giai đoạn nhân

15 giống cấp 3 phải đạt tối thiểu 340 × 106 tế bào sống/ml, tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt xấp xỉ 88%.

Lên men vang dứa để sản xuất brandy từ dịch dứa Queen

Biến động về số lượng tế bào nấm men, đường tiêu hao, lượng rượu, hàm lượng acid

của dịch lên men được theo dõi trong 24 h đầu. Kết quả sau mỗi 4 h lấy mẫu được thể hiện

ở bảng 3.12.

Trong ngày đầu lên men lượng tế bào tăng nhanh, lượng đường tiêu hao chậm, chỉ tiêu

hao hết 38,5 g/l. Theo lý thyết sẽ tạo ra 5,9 g/100ml rượu tương đương 7,47% V/V nhưng

thực tế lượng rượu sinh ra chỉ đạt 2,24% V/V, thấp hơn nhiều so với lượng rượu tạo thành

theo lý thuyết. Điều này được lý giải là do lượng đường tiêu hao trong ngày đầu lên men

chủ yếu cho tế bào nấm men sinh trưởng và phát triển. Chỉ sau 24 h, khi số lượng tế bào trong dịch lên men đạt cực đại 342,8 ×106 tế bào/ ml, lượng đường tiêu hao mới chủ yếu

được dùng để tạo etanol.

Thời gian

Lượng rượu tạo thành

Đường tiêu hao

Số lượng tế bào nấm men (×106

Acid tổng số

(h)

(% V/V)

(g/l)

tế bào/ml)

(g/l)

3,6 ± 0,01

Bảng 3.12. Động thái của quá trình lên men dịch dứa trong 24 giờ đầu quy mô 20 lit/mẻ Chỉ tiêu

17,3 ± 0,2

2,8 ± 0,1

24,5 ± 0,3

0,16 ± 0,02

3,6 ± 0,01

5,9 ± 0,3

41,2 ± 0,5

0,34 ± 0,03

3,6 ± 0,01

12,6 ± 0,3

88,4 ± 0.6

0,72 ± 0,1

3,7 ± 0,02

18,7 ± 0,5

216,7 ± 0,8

1,09 ± 0,1

3,8 ± 0,02

26,1± 0.5

296,5 ± 3

1,63 ± 0,2

3,8 ± 0,02

38,5± 0,4

3,9 ± 0,02

342,8 ± 5

2,24 ± 0,3

Động thái lên men dịch dứa những ngày tiếp theo được đánh giá qua các chỉ tiêu như

trên theo từng ngày. Kết quả được biểu thị ở hình 3.9.

Hình 3.9. Động thái của quá trình lên men vang dứa quy mô 20 lit/mẻ

Thành phần dịch lên men thay đổi rõ ràng trong 10 ngày đầu lên men. Số lượng tế

bào, hàm lượng đường và hàm lượng rượu có liên quan chặt chẽ với nhau.

Sau ngày đầu số lượng tế bào sống đạt mức cực đại là 342,8 × 106 tế bào/ml, đường và

chất dinh dưỡng có trong môi trường tiêu hao chủ yếu cho nấm men sinh trưởng phát triển,

tạo sinh khối lớn vì thế lượng rượu tạo ra ít không tương ứng với lượng đường tiêu hao.

Ngày thứ hai, lượng tế bào sống không tăng, giữ ở pha cân bằng động, số tế bào

sinh ra tương đương với số tế bào chết đi. Lượng rượu tăng nhanh tương ứng với đường

tiêu hao cho quá trình lên men tạo rượu etanol.

Từ ngày thứ 3 trở đi, số lượng tế bào sống giảm nhanh dần, có thể giải thích tốc độ

giảm nhanh đó là do lượng oxy trong bình lên men giảm do nấm men đã dùng trong quá

trình sinh trưởng hiếu khí, đồng thời lượng rượu tạo thành tăng gây ức chế sinh trưởng

của nấm men, lượng CO2 thoát ra trong quá trình hô hấp và lên men của các tế bào nấm

men tạo môi trường kị khí trong bình lên men. Lúc này nấm men chuyển từ giai đoạn

sinh trưởng hiếu khí sang giai đoạn lên men, chuyển đường thành rượu là chủ yếu. Đặc

biệt hàm lượng rượu tăng nhanh nhất vào ngày thứ 3, thứ 4 và 5. Từ ngày thứ 6 trở đi,

quá trình lên men diễn ra chậm chạp, các thông số thay đổi không đáng kể, lượng đường,

cơ chất chính của quá trình lên men rượu, chỉ còn 50 g/l.

Đến ngày lên men thứ 10, lượng rượu tạo ra là 11,3 % V/V và hầu như không tăng

nữa. Ngày thứ 25, kết thúc quá trình lên men lượng rượu đạt 11,6 % V/V. Các kết quả này

được trình bày trong bài báo số 1.

3.3.4. Sản xuất brandy dứa ở quy mô thực nghiệm (100 lít/mẻ) bằng chủng S.

cerevisiae D8

Ở quy mô 100 lít, sau 10 ngày, quá trình lên men vang dứa cơ bản đã kết thúc, vang

non có độ rượu là 12,4 % V/V. Kết quả cao hơn một số công bố của Nadya Hajar, et al

(2012) đạt 8,6% V/V) tiệm cận kết quả lên men của Ibegbulem và cộng sự (2014) đạt

12,7% V/V). Hàm lượng đường sót 1,25 g/l, acid 5,67 g/l và hiệu suất lên men đạt 95,3%,

đạt tiêu chuẩn rượu vang để chưng cất brandy. Sau 25 ngày, quá trình lên men hoàn toàn

kết thúc, lượng rượu tạo ra đạt 12,4% V/V, hàm lượng đường sót còn 0,93 g/l, acid tổng

số là 5,78 g/l không khác biệt nhiều với thành phần dịch lên men sau 10 ngày. Hơn nữa,

kết quả cảm quan cho thấy: nếu chưng cất sau 10 ngày lên men, rượu brandy có hương vị

tốt còn nếu giai đoạn lên men phụ kéo dài đến 25 ngày, brandy kém thơm. Đây cũng chính

là sự khác biệt trong sản xuất Brandy từ dứa so với từ nho. Khi kéo dài lên men phụ dịch

nho lên men sau khi chưng cất sẽ cho brandy thơm hơn; tuy nhiên việc kéo dài thời gian

lên men phụ của vang dứa lại thu được brandy dứa mất hương nhiều. Vì vậy, chúng tôi

chọn ngày thứ 10 là thời điểm kết thúc lên men để chưng cất rượu brandy dứa.

Những kết quả trên cho phép khẳng định môi trường thích hợp cho lên men vang dứa

để sản xuất brandy là: Dịch ép dứa được điều chỉnh để có pH = 4, hàm lượng đường 220 g/l, lượng oxy hòa tan là 7mg/l, hàm lượng men giống bổ sung là 17,3 × 106 tế bào/ml dịch lên men, lên men ở 28o C, thời gian dừng lên men vang dứa để chưng cất là ngày thứ 10 sau lên

men.

3.4. Cải biến chủng nấm men S. cerevisiae D8 bằng kĩ thuật đột biến ngẫu nhiên

3.4.1. Tác dụng gây chết của hóa chất NTG, tia cực tím UV và kết hợp NTG với UV

đến tế bào nấm men S. cerevisiae D8

Chủng nấm men S. cerevisiae D8 được gây đột biến bằng 3 phương pháp: Sử dụng hóa chất

NTG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine), tia cực tím UV (50W, 260nm) và kết hợp NTG

với UV trong khoảng thời gian từ 20 – 140 phút. Tác dụng gây chết của từng tác nhân đột

biến đến tế bào nấm men S. cerevisiae D8 được trình bày trong hình 3.10.

Tỷ lê tế bào chết (%)

99,04 ± 3,57 99,24 ± 3,65 99,89 ± 3,98 99,99 ± 4,18

96,55 ±3,29

99,56 ±4,09 99,89 ± 4,13

100 97,65 ± 3,54

97,58 ± 3,93 98,72 ± 4,04

89,04 ± 2,52

93,35 ± 3,35

90 89,43 ± 3,28

85,76 ± 3,02

80 78,28 ± 2,13

67,53 ± 1,95

70,63 ±1,88

70

60 Tỷ lệ tế bào chết do xử lý NTG

57,13 ± 1,14

54,11 ± 1,09

50 Tỷ lệ tế bào chết do xử lí UV

40 Tỷ lệ tế bào chết do xử lí bằng NTG + UV

32,42 ± 0,25

30 28,24 ± 0,22

20

10 Thời gian (phút)

0 0 0

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Hình 3.10. Tác dụng gây chết của hóa chất NTG, tia cực tím UV và kết hợp NTG với UV đến tế

bào nấm men S. cerevisiae D8 Thời gian làm chết 99% tế bào nấm men S. cerevisiae D8 (có 3 × 106 tế bào sống/ml) khi xử lý với UV, NTG, UV kết hợp NTG lần lượt là ở 120 phút, 100 phút và

80 phút. Tỉ lệ tế bào chết cao đồng thời rút ngắn thời gian gây chết khi xử lý đột biến

kết hợp NTG và UV so với khi gây đột biến riêng lẻ bằng NTG hoặc UV đã đươc Liu

và các đồng tác giả (2011), Sridhar và các đồng tác giả (2002) công bố. Hiệu quả gây

chết khi kết hợp NTG với UV cao hơn khi kết hợp giữa sử dụng lực điện trường với

NTG cũng đã được công bố bởi Kim và Lee (1998).

3.7.2. Hoạt lực lên men etanol của các biến chủng

Việc gây đột biến ngẫu nhiên bằng phương pháp kết hợp giữa sử dụng NTG và

UV làm tăng tỉ lệ chết của nấm men so với xử lý riêng rẽ với NTG hoặc UV. Từ các

khuẩn lạc còn sống sót ở các thí nghiệm có tỷ lệ sống sót dưới 10,57%, các biến chủng

sinh etanol cao, chịu được hàm lượng đường và rượu cao đã được sàng lọc và tuyển

chọn.

Hoạt lực lên men của các biến chủng bới NTG và UV được thể hiện ở bảng 3.13 và

3.14 trang 105 đến 106 của luận án và bài báo số 4.

Bảng 3.14. Hoạt lực lên men ethanol của các biến chủng thu được từ xử lý đột biến tích lũy (kết hợp NTG và UV)

Khả năng sinh ethanol của các chủng/biến chủng so với

STT

Chủng nấm men/ biến chủng

biến chủng N140.6 (%)

chủng S. cerevisiae D8 (%)

100

S.c erevisiae D8 N140.6 NU120.4 NU140.12 NU80.17 NU100.8 NU60.11 NU120.9 NU140.4 NU100.16 NU80.24 NU60.18 NU120.6 NU60.5 NU80.8

Nồng độ rượu ethanol thu được (%V/V) 12,4 ± 0,2 14,0 ± 0,2 15,1 ± 0,2 14,8 ± 0,1 14,8 ± 0,1 14,6 ± 0,2 14,5 ± 0,1 14,4 ± 0,3 14,3 ± 0,2 14,3 ± 0,2 14,3 ± 0,1 13,8 ± 0,2 13,8 ± 0,1 13,6 ± 0,2 13,3± 0,1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

113 122 119 119 118 117 116 115 115 115 111 111 110 107

100 108 106 106 105 104 103 102 102 102 99 99 97 95

Các biến chủng S. cerevisiae D8 sống sót sau khi xử lý với NTG được sàng lọc

trong môi trường lên men có hàm lượng đường tổng là 220 g/l và thu được 5 biến

chủng có hoạt lực lên men rượu cao hơn chủng S. cerevisiae D8. Đăc biệt biến chủng

140.6 có hoat lực lên men đạt 14,02 % V/V, cao hơn 13% so với chủng gốc S.

cerevisiae D8. Biến chủng N140.6 được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu.

Hoạt lực lên men etanol của các biến chủng có thể phân thành 3 nhóm khác biệt có ý

nghĩa (các biến chủng trong một nhóm có hoạt lực lên men khác nhau không có ý nghĩa). Nhóm 1 gồm các biến chủng tích lũy NU140.12, NU80.17, NU100.8 có hoạt lực lên men etanol cao

hơn 20% so với chủng S. cerevisiae D8. Nhóm 2 gồm các biến chủng tích lũy NU60.11,

NU120.9, NU140.4, NU100.16, NU80.24 có hoạt lực lên men etanol cao hơn 16 - 20% so với chủng S. cerevisiae D8. Nhóm 3 gồm các biến chủng NU60.18, NU120.6, NU60.5, NU80.8 có hoạt lực lên men cao hơn 10% so với chủng S. cerevisiae D8. Đặc biệt biến chủng tích lũy NU120.4 có hoạt lực lên men etanol cao nhất (đạt hàm lượng rượu etanol 15,1% V/V sau 10

ngày lên men), tăng 22% so với chủng S. cerevisiae D8 và tăng 8% so với biến chủng gốc N140.6. Khả năng lên men sinh etanol của biến chủng tích lũy NU 120.4 cao hơn và khác biệt so với 12 biến chủng còn lại với mức ý nghĩa p = 0,05. Kết quả này là cao hơn so với các công

bố trước đây của Kim và Lee (1998) về gây đột biến trên S. cerevisiae bằng các phương pháp khác (đạt hàm lượng rượu etanol 13,3%).

Biến chủng NU 120.4 có hoạt lực lên men etanol cao và ổn định (đạt hàm lượng rượu

15,1% V/V tăng 22% so với chủng nấm men S. cerevisiae D8) trong môi trường lên men có 250 g/l đường và phát triển tốt ở môi trường có từ 6 đến 10% rượu etanol, có hoạt lực lên men etanol

cao ở. Do vậy, biến chủng tiềm năng này đã được chúng tôi lưu giữ để tiếp tục các nghiên cứu

sâu hơn trước khi ứng dụng trong sản xuất rượu cao độ từ dịch dứa Queen.

3.5. Chưng cất, làm sạch, tàng trữ và tạo hương cho brandy dứa từ chủng S.

cerevisiae D8

3.5.1. Chưng cất và làm sạch rượu Hoạt động của nấm men trong quá trình lên men rượu thường đi kèm nhiều sản phẩm phụ

không mong muốn như: acid, metanol, aldehit, furfurol (Mục Thành phần các tạp chất có trong

brandy dứa thô được trình bày ở trang 111 của luận án). Do vậy, việc nghiên cứu để tìm ra một phương pháp phù hợp để loại bỏ tạp chất trong rượu một cách hiệu quả là rất cần thiết. Nghiên

cứu sử dụng ba phương pháp làm sạch rượu khác nhau: chưng cất phân đoạn (từ trang 112 đến

114 của luận án), phương pháp hóa học (từ trang 114 đến 119 của luận án) và phương pháp kết

hợp hóa học và chưng cất phân đoạn (từ trang 119 đến 121 của luận án) là các nghiên cứu nhằm

tìm kiếm phương pháp phù hợp để loai bỏ tạp chất trong brandy dứa sản xuất từ chủng S.

cereveisiae D8.

Phương pháp làm sạch kết hợp cho rượu brandy có hàm lượng tạp chất giảm mạnh:

lượng aldehit giảm 94,5% còn 12 mg/l; rượu bậc cao giảm 45,9% còn 332,0 mg/l; ester

giảm 54,2% còn 125,0 mg/l; metanol giảm 44,6% còn 36 mg/l; acid giảm 62,7% còn 0,2 g/l; furfurol không phát hiện; điểm cảm quan đạt 16/20. Rượu Brandy dứa làm sạch bằng

phương pháp kết hợp đạt tiêu chuẩn rượu Việt Nam QCVN6-3: 2010/BYT.

Phương pháp làm sạch kết hợp là phương pháp tối ưu so với phương pháp chưng cất

phân đoạn và phương pháp hóa học khi thực hiện riêng rẽ. Brandy dứa thô được làm sạch

bằng phương pháp này đã loại bỏ được phần lớn các tạp chất, rượu sạch, không bị mất hương

thơm, chất lượng rượu đạt tiêu chuẩn rượu Việt Nam.

Đơn vi mg/l; g/l; điểm

700.0 614.0 ± 0.4

600.0

500.0 Brandy dứa thô

400.0 332.0 ± 3

273.0 ± 0.2

Brandy làm sạch bằng phương pháp tổng hợp

300.0 220.0 ± 0.3

200.0 125.0 ± 3

100.0 65.0 ± 0.2 36.0 ± 0.2

16 ± 0.04

0.6 ± 0.05

0.9 ± 0.05

12.0 ± 0.3

12 ± 0.04

0.2 ± 0.03

0.0 Hàm lượng andehit (mg/l)

Hàm lượng este (mg/l)

Cảm quan (điểm)

Chỉ tiêu

Hàm lượng rượu bậc cao (mg/l)

Hàm lượng methanol (mg/l)

Hàm lượng fucfurol ( mg/l)

Hàm lượng axit (theo axit axetic) (g/l))

Hình 3.15. Thành phần tạp chất có trong brandy dứa được làm sạch bằng phương pháp kết hợp

3.5.2. Tàng trữ và tạo hương đặc trưng cho brandy dứa từ chủng S. cerevisiae D8

Tàng trữ và tạo hương đặc trưng cho brandy dứa bằng gỗ sồi

Đánh giá cảm quan rượu brandy dứa sau khi đã ngâm với bột/thanh gỗ sồi được

xử lí ở các mức độ khác nhau

Thanh gỗ sồi và bột gỗ sồi thương mại nhập từ Pháp được sử dụng để nghiên cứu vai

trò của gỗ sồi trong sản xuất brandy dứa ở Việt Nam.

Sử dụng bột gỗ sồi thương mại trong quá trình tàng trữ brandy dứa cần khối lượng ít hơn

(4 g/l) so với khi dùng gỗ sồi dạng thanh (10 g/l) nhưng vẫn đạt màu sắc, hương vị và điểm cảm

quan cao hơn khi xử lí với thanh gỗ sồi (Kết quả được ghi lại trong Bảng 3.20 từ trang 123 đến

124 của luận án và bài báo số 5).

Bảng 3.21. Một số thành phần hương chính của brandy dứa trắng sau 24 tháng

tàng trữ không có gỗ sồi

Tên hợp chất

Đặc điểm chung về hương vị

Thứ tự

Hàm lượng (%)

Công thức phân tử

Thời gian lưu (phút) 23,63 Metyl caprate

4,22

C11H22O2 Mùi vị của trái cây lên men

24,76 Geranic acid

3,91

C10H16O2 Hương gỗ, vị béo ngậy ngọt ngào

25,78

Copaene

1,82

Hương gỗ, vị ngọt mật ong, cay nhẹ

C15H24

25,96

Ethyl decanoate

Sáp, trái cây, táo ngọt

1,53

C12H24O2

28,99 Muurolene

Hương thảo dược

0,94

C15H24

29,70 Muurolene

Hương thảo mộc

2,80

C15H24

Sáp, kem, béo với xà phòng, sắc

30,02 Methyl laurate

0,84

C13H26O2

thái dừa

30,38

Cadinene

Hương thảo dược

0,56

C15H24

30,45

Calamene

Hương hoa, vị cay yếu

2,10

C15H22

31,10

Calacorene

Thơm nhựa thông

0,34

C10H16

33,61

Cubenol <1-epi>

Hương thảo dược, vị trà xanh, cay

3,76

C15H26O

Muurolol (

34,01

4,12

Hương vị mật ong, cây thảo dược

C15H26O

=T- Muurolol)

Cadinol (

34,10

2,19

Hương hoa oải hương

C15H26O

=Tau -Muurolol)

34,38

Cadinol

0,98

34,97

Cadalene

1,02

C15H18

Hương trái cây, kem và lên men,

42,65

Ethyl Palmitate

3,71

C18 H36O2

vani, sắc thái balsamic )

Total

34,88

Bảng 3.22. Thành phần hương của brandy dứa được tàng trữ 24 tháng

với bột gỗ sồi thương mại (4g/l)

Tên hợp chất

Đặc điểm chung về hương vị

Thứ tự

Hàm lượng (%)

Thời gian lưu (phút) 5,54

Pinene

0,17

Công thức phân tử C10H16

Hương gỗ thông xanh Hương gỗ, thơm mát, bạc hà, giống như

5,91 Camphene

0,13

C10H16

trong lá lim xanh, vỏ chanh, cam quýt

6,22 Benzadehyde

0,42

C7H6O

Hương trái cây: Ngọt, dầu mỡ, hạnh nhân, anh đào, gỗ

8,52

Salicyaldehyde

0,12

C7H6O2

12.30 Benzenpropanal

0,70

C9H12O

Hương hạnh nhân đắng Hương gỗ ở cây bồ đề, nhựa dương sỉ, vỏ quả và lá của một số cây khác như ổi, dâu tây, có trong rượu rum, vang, có trong một số nấm và mạch nha

0,17

12,43 Borneol (=Endo- Borneol)

14,19 Cinnamaldehyde

0,97

Mùi quế

74,22

Hương quế

18,97

Mùi cay quế tươi

16,15 Cinnamaldehyde 20,12 Cinamaldehyde dimethyl acetal

21,25 Coumarin

1,54

Hương thơm ngọt ngào

21,33 Cinanamic acid

0,19

Mùi trái cây và thơm hương quế với chút hổ phách

21,47 Cinamyl acetate

1,23

0,12

0,36

C10H18O Mùi long não C9H8O C9H8O C11H14O2 C9H6O2 C11H12O2 C11H12O2 Hương hoa quế và mật ong C15H24 Mùi trái cây, hương thơm cam quýt nhựa thơm opoponax cay C10H10O2 Thơm ngọt của dâu tây, anh đào

23,38 Bisabolene(b-) 24,08 Methoxycinnamaldehy de <(E)-0-> Total

99,31

Gỗ sồi có vai trò quan trọng trong việc tàng trữ, tạo hương, vị và màu sắc đặc trưng

cho brandy dứa. Thành phần và hàm lượng chất thơm trong brandy được tàng trữ với gỗ sồi hoàn toàn khác biệt với brandy dứa trắng từ đó dẫn đến màu sắc, hương vị và cảm quan

cũng khác biệt. Ban đầu, brandy dứa không màu, trong suốt; brandy được tàng trữ với bột

gỗ sồi có màu hổ phách đặc trưng. Thành phần các hợp chất thơm, dễ bay hơi (16 chất phân

tích được) trong brandy dứa không tàng trữ với gỗ sồi chủ yếu thu được sau 20 phút sắc ký GC-MS, chiếm 34,88% thành phần chất thơm có trong rượu brandy trắng. Thành phần, các hợp chất thơm, dễ bay hơi trong brandy dứa tàng trữ với bột gỗ sồi chủ yếu thu được trong khoảng 15- 20 phút sắc ký GC-MS, gồm có 14 chất mới, trong đó có 3 loại terpene, 1 dẫn

xuất của terpene, 2 hợp chất thơm; 5 loại aldehyde, 1 acide, 1 ester.

Tóm lại, gỗ sồi có vai trò quan trọng trong việc tàng trữ, tạo hương, vị và màu sắc đặc trưng cho brandy dứa. Sử dụng gỗ sồi thương mại (4g/l trong thời gian 24 tháng, lâu hơn càng tốt), thể tích không khí bên trong bình tàng trữ là 6%, nhiệt độ trung bình 25 °C, độ ẩm tương đối của không khí 80%) để thu được brandy dứa có màu sắc, hương vi tốt nhất, điểm cảm quan cao nhất 18,5/20 điểm.

3.5.3. Quy trình công nghệ sản xuất brandy từ dứa bằng chủng S. cerevisiae D8

Từ các nghiên cứu thử nghiệm (20 - 100 lít), chúng tôi đề xuất quy trình công nghệ sản xuất

Quả dứa

Chủng S. cerevisiae D8

Nhân giống cấp 1

- Gọt vỏ,loại mắt, rửa sạch, để ráo nước - Xay, ép nước bằng máy

Nhân giống cấp 2

Sơ chế nguyên liệu chuẩn bị dịch ép dứa

- Điều chỉnh các chỉ tiêu hoá lý -Sunfit hoá 6 - 10 h

Nhân giống cấp 3

Chuẩn bị dịch lên men

5% thể tích dịch lên men

t = 28oC, 4 ngày

Lên men chính

6 ngày

Lên men phụ để thu vang non

Chưng cất thu rượu brandy thô

Oxy hóa tạp chất bằng KMnO4 và khử acid bằng NaOH Chưng cất phân đoạn

Làm sạch bandy dứa

rượu brandy từ dứa Queen dưới đây.

Tàng trữ và tạo hương cho brandy dứa Gạn cặn, pha loãng, điều chỉnh các chỉ tiêu

Đóng chai, dán nhãn, bao bì

Brandy thành phẩm

Hình 3.18. Sơ đồ quy trình sản xuất brandy dứa

Thuyết minh quy trình công nghệ sản xuất brandy từ dứa được trình bày ở trang 132

và 133 của luận án. Quy trình gồm 8 công đoạn chính: (1) Nhân giống nấm men, (2) Sơ chế

nguyên liệu chuẩn bị dịch ép dứa, (3) Chuẩn bị dịch lên men, (4) Lên men chính, (5) Lên

men phụ để thu vang non, (6) Chưng cất và làm sạch brandy dứa, (7) Tàng trữ và tạo hương

cho brandy dứa và (8) Đóng chai, dán nhãn, bao bì.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Từ dịch dứa lên men tự nhiên đã phân lập được 8 chủng nấm men, tuyển chọn được

01 chủng nấm men D8 có khả năng lên men ethanol cao, tạo ethanol đạt 12,4% v/v trong môi

trường lên men có hàm lượng đường 220 g/l, hiệu suất lên men đạt 95,3%, có khả năng sinh

trưởng tốt trong quá trình lên men.

2. Đã xác định được tên khoa học của chủng D8 là S. cerevisiae D8 dựa trên các đặc

điểm hình thái, hóa sinh và sinh học phân tử; xác định được môi trường nhân giống thích hợp

của S. cerevisiae D8 là: hàm lượng đường 70g/l, (NH4)2SO4 2 g/l và nước chiết của 100 g giá

3. Đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men vang dứa và xác

đỗ /l, pH 4,0, nhiệt độ 28ºC. Ở các điều kiện như vậy, số lượng tế bào nấm men sống cực đại đạt 342 × 106 tế bào/ml, tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt 88%.

định được môi trường thích hợp cho lên men vang dứa Queen để sản xuất brandy là: Dịch ép

dứa có pH= 4, hàm lượng đường 220 g/l, lượng oxy hòa tan là 7mg/l, hàm lượng men giống bổ sung là 17,1 × 106 tế bào/ml dịch lên men ở nhiệt độ 28oC.

4. Đã cải biến được chủng S. cerevisiae D8 bằng kỹ thuật đột biến ngẫu nhiên và thu

được dòng đột biến tích lũy NU 120.4 có khả năng lên men ethanol cao đạt hàm lượng

ethanol 15,1% V/V, tăng 22% so với chủng gốc S. cerevisiae D8

5. Đã làm sạch được brandy dứa thô bằng phương pháp kết hợp hóa học và vật lý thu

đươc brandy trắng có thành phần hương phong phú, đã xác định được 16 chất, chiếm 34,88%

tổng lượng các chất bay hơi có trong brandy dứa trắng, bao gồm có 4 loại rượu, 2 loại acid; 3

loại ester và 7 loại poly saccharides (terpene); đạt điểm cảm quan 16,0/20 điểm.

Đã xác định được hàm lượng bột gỗ sồi thích hợp để tàng trữ và tạo hương cho brandy dứa là

4 g/l. Rượu brandy dứa tàng trữ 24 tháng có điểm cảm quan tốt 18,5/20. Qua đó xây dựng quy

trình công nghệ sản xuất brandy dứa gồm 8 bước chính, (1) Nhân giống nấm men, (2) Sơ chế

nguyên liệu chuẩn bị dịch ép dứa, (3) Chuẩn bị dịch lên men, (4) Lên men chính, (5) Lên men

phụ để thu vang non, (6) Chưng cất và làm sạch brandy dứa, (7) Tàng trữ và tạo hương cho

brandy dứa, (8) Đóng chai, dán nhãn, bao bì.

KIẾN NGHỊ

1. Cần phối hợp với các đơn vị sản xuất, các cơ quan chức năng để sản xuất chính thức và đưa

sản phẩm brandy dứa ra thăm dò thị trường

2. Tiếp tục nghiên cứu xác định gen đột biến và vị trí đột biến của dòng đột biến tiềm năng

NU 120.4, nghiên cứu tính an toàn thực phẩm trước khi ứng dụng chủng cải biến vào sản xuất.

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ quả dứa

Mục đích nghiên cứu của Luận án này nhằm tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men etanol cao, tạo hương thơm đặc trưng, phù hợp để sản xuất rượu brandy từ quả dứa đạt chất lượng tốt. Mời các bạn cùng tham khảo!

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI -- --

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN

ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT RƯỢU BRANDY

TỪ QUẢ DỨA

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Luận án được hoàn thành tại

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quang Hào

TS. Trần Thị Thúy

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án tiến sĩ tại

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Vào hồi.... giờ.... ngày.... tháng.... năm 2020

Có thể tìm đọc luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Hà Nội

- Trung tâm thông tin thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

1. Hoàng Thị Lệ Thương, Nguyễn Quang Hào (2014), Động thái lên men vang

dứa để sản xuất rượu Brandy của chủng Saccharomyces cerevisiae D8, Tạp

chí Khoa học, Đại học quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ,

30(6S), tr. 587-591.

2. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2016), Nghiên

cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và dinh dưỡng đến quá trình lên

men vang để sản xuất Brandy từ dứa Queen bằng chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae D8, Tạp chí Khoa học và công nghệ Nông nghiệp

Việt Nam, 12 (73), tr. 23-28.

3. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2017),

Taxonomic characterization and

identification of

Saccharomyces

cerevisiae D8 for brandy production from pineapple, Tạp chí sinh học, số

39 (4), tr. 474-482.

4. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2018), Cải biến

chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae D8 bằng kĩ thuật đột biến ngẫu

nhiên nhằm nâng cao hoạt lực lên men ethanol, Tạp chí công nghệ sinh học,

số 16 (2): tr. 337 – 344.

5. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2018), Vai trò

của gỗ sồi trong cất giữ brandy dứa ở Việt Nam, Tạp chí sinh học số 40 (2):

tr. 130 - 139.

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

8,13 ±

8,29 ±

9,67 ±

9,85 ±

0,01

0,02

0,03

0,01

9,10 ± 0,02

9,65 ± 0,02

9,88 ± 0,02

9,97 ±0,03

> Trình tự D1/D2 của chủng nấm men D8

Chỉ tiêu

20

24

Nhiệt độ lên men (ᴼC) 28

32

36

Chỉ tiêu

pH ban đầu của môi trường lên men 3,5

Hàm lượng đường trong môi trường lên men (g/l)

Chỉ tiêu

Hàm lượng oxy hòa tan trong dịch lên men (mg/l)

Chỉ tiêu

Thể tích men giống (% V/V)

Chỉ tiêu

17,3 ± 0,2

342,8 ± 5

2,24 ± 0,3

Tỷ lê tế bào chết (%)

99,04 ± 3,57 99,24 ± 3,65 99,89 ± 3,98 99,99 ± 4,18

96,55 ±3,29

99,56 ±4,09 99,89 ± 4,13

100

97,65 ± 3,54