M ĐUỞ Ầ
1. Tính c p thi t đ tàiấ ế ề
Bacillus anthracis và Yersinia pestis là hai loài vi khu n gâyẩ
b nh t i nguy hi m t ng ng là b nh than và d ch h ch, t ng gâyệ ố ể ươ ứ ệ ị ạ ừ
nên n i kinh hoàng trong l ch s loài ng i, có th b l i d ng làmỗ ị ử ườ ể ị ợ ụ
vũ khí sinh h c.ọ ỞVi t Nam, ệB. anthracis còn xu t hi n r i rác ấ ệ ả ở
các t nh mi n núi phía B c, trong khiỉ ề ắ Y. pestis v n t n t i trên m tẫ ồ ạ ộ
s loài g m nh m khu v c Tây Nguyên và có th bùng phátố ặ ấ ở ự ể
thành d ch b t k lúc nào. M t khác, chúng ta c n có ph ng ánị ấ ỳ ặ ầ ươ
ng phó nhanh, k p th i trong phòng ch ng kh ng b sinh h c. ứ ị ờ ố ủ ố ọ
Trong m t v t n công nghi ng có kh ng b sinh h c hay m uộ ụ ấ ờ ủ ố ọ ẫ
môi tr ng nghi nhi m các m m b nh này, vi c phát hi n nhanh,ườ ễ ầ ệ ệ ệ
chính xác tác nhân sinh h c là m t trong nh ng y u t quy t đnhọ ộ ữ ế ố ế ị
đn s c kh e c ng đng và an ninh qu c gia. Vi c sàng l c nhanhế ứ ỏ ộ ồ ố ệ ọ
nh ng m u nghi ng giúp ki m soát s lây lan và đm b o đi u trữ ẫ ờ ể ự ả ả ề ị
chính xác. Ph ng pháp nuôi c y truy n th ng đc xem là “tiêuươ ấ ề ố ượ
ch n vàng” trong xác đnh ẩ ị B. anthracis và Y. pestis. Tuy nhiên, m cặ
dù có đ nh y cao,ộ ạ ph ng pháp này đòi h i th i gian 2 - 3 ngày,ươ ỏ ờ
m t s tr ng h p đ đc hi u không cao, c n ti n hành các thộ ố ườ ợ ộ ặ ệ ầ ế ử
nghi m b sung. Ngoài ra, ph ng pháp này c n ti n hành đi uệ ổ ươ ầ ế ở ề
ki n phòng an toàn sinh h c c p 3 (BSL-3) v i nhân viên đc đàoệ ọ ấ ớ ượ
t o và có kinh nghi m. Các ph ng pháp mi n d ch đc nghiênạ ệ ươ ễ ị ượ
c u d i d ng các que th nhanh r t thu n ti n nh ng đ nh y,ứ ướ ạ ử ấ ậ ệ ư ộ ạ
đ đc hi u th p. ộ ặ ệ ấ Do đó, các ph ng pháp này khó ng d ng trongươ ứ ụ
ch n đoán trên th c đa và phòng ch ng kh ng b sinh h c. ẩ ự ị ố ủ ố ọ
Hi n nay, đã có m t s k thu t d a trên PCR dùng đ xác đnhệ ộ ố ỹ ậ ự ể ị
nhanh và chính xác B. anthracis cũng nh ưY. pestis đc phát tri nượ ể
v i nh ng u đi m n i b t nh đ nh y, đ đc hi u cao và cóớ ữ ư ể ổ ậ ư ộ ạ ộ ặ ệ
th th c hi n v i các m u đã b t ho t (nên ch c n th c hi n ể ự ệ ớ ẫ ấ ạ ỉ ầ ự ệ ở
đi u ki n phòng an toàn sinh h c c p 2). Tuy nhiên, h u h t các kề ệ ọ ấ ầ ế ỹ
thu t này ch phát hi n m t lo i plasmid đc l c v i t ng tác nhânậ ỉ ệ ộ ạ ộ ự ớ ừ
nên không phát hi n đc các tr ng h p ch ng thi u m t trongệ ượ ườ ợ ủ ế ộ
các plasmid trên. Đi v i ố ớ B. anthracis trong t nhiên, đ ch n đoánự ể ẩ
chính xác nh ng ch ng gây b nh, ngoài gen đc tr ng trên nhi mữ ủ ệ ặ ư ễ
s c th , c n ch ra đc s có m t đy đ c a hai plasmid đc l cắ ể ầ ỉ ượ ự ặ ầ ủ ủ ộ ự
là pXO1 và pXO2. Trong th c t có nh ng ch ng ự ế ữ ủ B. anthracis
thi u m t trong hai plasmid trên nên kh năng gây b nh thay đi.ế ộ ả ệ ổ
T ng t , ươ ự Y. pestis ch a hai plasmid liên quan đn tính đc làứ ế ộ
pPCP1 và pMT1 v i các gen đc tr ng t ng ng. Do đó, các kớ ặ ư ươ ứ ỹ
thu t này có th không đánh giá đc đy đ tình tr ng đc l cậ ể ượ ầ ủ ạ ộ ự
c a ủB. anthracis, Y. pestis và ph i ph thu c vào thi t b chuyênả ụ ộ ế ị
d ng đt ti n nh ng v n có th b sót ch n đoánụ ắ ề ư ẫ ể ỏ ẩ , ch a đ c pư ề ậ
đn là chúng có th không phù h p v i m t s ch ng trong n cế ể ợ ớ ộ ố ủ ướ .
Vi t Nam, vi c s d ng các k thu t d a trên PCR đ ch nỞ ệ ệ ử ụ ỹ ậ ự ể ẩ
đoán B. anthracis và Y. pestis đã đc m t s tác gi công b , tuyượ ộ ố ả ố
nhiên nh ng nghiên c u này ch m i d ng vi c thi t k k thu tữ ứ ỉ ớ ừ ở ệ ế ế ỹ ậ
PCR đ ch n đoán t ng lo i vi khu n trên. Đi u này có nghĩa làể ẩ ừ ạ ẩ ề
trong th c t khi b nh d ch x y ra mà ch a bi t tác nhân nào đcự ế ệ ị ả ư ế ượ
s d ng, n u dùng PCR v i tác nhân th nh t cho k t qu âm tínhử ụ ế ớ ứ ấ ế ả
thì ph i dùng PCR l n th hai v i tác nhân khác, nh v y đòi h iả ầ ứ ớ ư ậ ỏ
th i gian và kinh phí. Dờo đó, k thu t PCR đa m i (multiplex PCR -ỹ ậ ồ
mPCR) có th xác đnh chính xác đng th i hai lo i tác nhân ể ị ồ ờ ạ B.
anthracis và Y. pestis là m t l a ch n kh thi. ộ ự ọ ả Xu t phát t nh ngấ ừ ữ
v n đ trên, chúng tôi th c hi n đ tài: ấ ề ự ệ ề “Nghiên c u phát tri nứ ể
k thu t multiplex PCR xác đnh nhanh đng th i ỹ ậ ị ồ ờ Bacillus
anthracis và Yersinia pestis”.
2. M c tiêu nghiên c uụ ứ
- Phát tri n k thu t ể ỹ ậ multiplex PCR xác đnh nhanh đng th iị ồ ờ
Bacillus anthracis và Yersinia pestis.
-Đánh giá kh năng phát hi n c a k thu t ả ệ ủ ỹ ậ multiplex PCR trên
các b m u chu n và các ch ng phân l pộ ẫ ẩ ủ ậ .
3. N i dung nghiên c u c a đ tàiộ ứ ủ ề
- Thi t k các c p m i cho k thu t mPCR xác đnh nhanhế ế ặ ồ ỹ ậ ị
đng th i ồ ờ B. anthracis và Y. pestis.
- Thi t k , t i u k thu t mPCR xác đnh nhanh đng th i ế ế ố ư ỹ ậ ị ồ ờ B.
anthracis và Y. pestis.
- Đánh giá kh năng phát hi n c a k thu t mPCR ch n đoánả ệ ủ ỹ ậ ẩ
đng th i ồ ờ B. anthracis và Y. pestis trong phòng thí nghi m và ệcác
ch ng phân l pủ ậ .
- Phân tích trình t các gen đích đc tr ng và gen đc l c c aự ặ ư ộ ự ủ
các ch ng ủB. anthracis và Y. pestis.
4. Đóng góp m i c a lu n ánớ ủ ậ
Lu n án là công trình đu tiên Vi t Nam đã thành công trongậ ầ ở ệ
nghiên c u phát tri n k thu t multiplex PCR xác đnh nhanh đngứ ể ỹ ậ ị ồ
th i ờB. anthracis và Y. pestis. K thu t multiplex PCR v i 6 c pỹ ậ ớ ặ
m i đc thi t k , t i u cho phép khu ch đi đng th i 7 s nồ ượ ế ế ố ư ế ạ ồ ờ ả
ph m bao g m: 3 gen đích là ẩ ồ vrrA (thu c nhi m s c th ), ộ ễ ắ ể pagA
(thu c plasmid pXO1), ộcapA (thu c plasmid pXO2) c a ộ ủ B.
anthracis; và 3 gen đích là ypo2088 (thu c nhi m s c th ), ộ ễ ắ ể pla
(thu c plasmid pPCP1),ộ caf1 (thu c plasmid pMT1) c a ộ ủ Y. pestis,
cùng 1 gen ch ng n i t i là plasmid tái t h p đ xác minh k t quứ ộ ạ ổ ợ ể ế ả
ch n đoán. Do đó, kh c ph c đc hi n t ng d ng tính gi điẩ ắ ụ ượ ệ ượ ươ ả ố
v i tr ng h p các ch ng vi khu n ớ ườ ợ ủ ẩ B. anthracis và Y. pestis không
đy đ đc l c, phân bi t v i ch ng gây b nh, giúp gi m giáầ ủ ộ ự ệ ớ ủ ệ ả
thành ch n đoán so v i vi c ph i th c hi n các l n PCR riêng r ,ẩ ớ ệ ả ự ệ ầ ẽ
rút ng n th i gian ch n đoán.ắ ờ ẩ
5. C u trúc c a lu n ánấ ủ ậ
Lu n án g m 1ậ ồ 39 trang, đc chia thành các ph n: M đuượ ầ ở ầ
(3 trang); Ch ng 1: T ng quan tài li u (ươ ổ ệ 30 trang); Ch ng 2: V tươ ậ
li u và ph ng pháp nghiên c u (1ệ ươ ứ 4 trang); Ch ng 3: K t quươ ế ả
nghiên c u (ứ47 trang); Ch ng 4: Bàn lu n k t qu (ươ ậ ế ả 21 trang); K tế
lu n và ki n ngh (ậ ế ị 2 trang); Các công trình đã công b c a tác giố ủ ả
(1 trang). Tóm t t n i dung lu n án b ng ti ng Anh (ắ ộ ậ ằ ế 6 trang), Tài
li u tham kh o (ệ ả 15 trang). Lu n án có ậ16 b ng bi u, ả ể 44 hình và
151 tài li u tham kh o b ng ti ng Vi t và ti ng Anh.ệ ả ằ ế ệ ế
Ch ng 1. T NG QUAN TÀI LI Uươ Ổ Ệ
Lu n án đã tham kh o các tài li u trong và ngoài n c v 3ậ ả ệ ướ ề
v n đ chính: (1) ấ ề T ng quan v vi khu n ổ ề ẩ B. anthracis và Y. pestis:
đc đi m sinh h c, h gen cũng nh s liên quan gi a ặ ể ọ ệ ư ự ữ B. anthracis,
Y. pestis và vũ khí sinh h cọ; (2) Các ph ng pháp xác đnh ươ ị B.
anthracis và Y. pestis: các ph ng pháp vi sinh truy n th ng, xácươ ề ố
đnh sinh hóa, d a trên ái l c và các ph ng pháp d a trên axitị ự ự ươ ự
nucleic; (3) Ki m đnh kit mPCR ch n đoánể ị ẩ .
B. anthracis là tr c khu nự ẩ thu c chi ộBacillus, họ Bacillaceae.
Chi Bacillus g m ồcác vi khu n Gram d ngẩ ươ sinh bào tử, đa số
không gây b nh, m t s gây nhi m trùng nhi m đc th c ănệ ộ ố ễ ễ ộ ứ
(Bacillus cereus), m t s có l i cho con ng i (ộ ố ợ ườ Bacillus subtilis,
Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides). Đc đi m hình thái, tínhặ ể
ch t sinh lý, sinh hoá, tính ch t nuôi c y c a các loài thu c chiấ ấ ấ ủ ộ
Bacillus r t gi ng nhau.ấ ố Tuy nhiên, B. anthracis có đc đi m khácặ ể
bi t v i các loài tr c khu n hi u khí sinh bào t khác, đo la co ệ ớ ự ẩ ế ử
plasmid pXO1 ma hoa khang nguyên b o v va pXO2 mã hoá vo. ả ệ *
Y. pestis thu c chi ộYersinia, h Enterobacteriaceae. Chi ọYersinia có
11 loài, là các vi khu n Gram âm, không sinh bào t . Trong chiẩ ử
Yersinia, ch có ba loài gây b nh ng i là ỉ ệ ở ườ Y. pestis, Yersinia
pseudotuberculosis và Yersinia enterocolitica (Radnedge, 2001).
Loài nguy hi m nh t, ể ấ Y. pestis gây b nh d ch h ch và viêm ph iệ ị ạ ổ
c p tính. ấ
Vũ khí sinh h c hi n nay ọ ệ đã tr thành m i quan tâm ở ố hàng đuầ
c a an ninh qu c giaủ ố b i có th b các t ch c kh ng b l i d ngở ể ị ổ ứ ủ ố ợ ụ
trong chi n tranh sinh h c. ế ọ Trong các tác nhân đã đc WHO vàượ
CDC nêu ra, B. anthracis, Y. pestis đc đánh giá là tác nhân cóượ
nguy c cao nh t trong kh ng b vì gây b nh nguy hi m, d nuôiơ ấ ủ ố ệ ể ễ
c y, tăng sinh kh i v i s l ng l n, không c n trang b hi n điấ ố ớ ố ượ ớ ầ ị ệ ạ
l i d s d ng, v n chuy n và gây nhi m. ạ ễ ử ụ ậ ể ễ
Vi t Nam đã có m t s nghiên c u v phòng ch ng chi nỞ ệ ộ ố ứ ề ố ế
tranh sinh h c đ phòng các tình hu ng đch t n công b ng vũ khíọ ề ố ị ấ ằ
sinh h c. S quan tâm đc đt m c đc bi t v i hai lo i viọ ự ượ ặ ở ứ ặ ệ ớ ạ
khu n là ẩB. anthracis và Y. pestis. Xác đnh t m quan tr ng c aị ầ ọ ủ
vi c xác đnh nhanh và chính xác hai lo i vi khu n này, đ tài KCBệ ị ạ ẩ ề
01-09 và m t s đ tài đã thi t k các ph n ng PCR ch n đoánộ ố ề ế ế ả ứ ẩ
cho t ng lo i tác nhân. Năm 2005, Lê Thanh Hòa và cs. đã nghiênừ ạ
c u xây d ng ph ng pháp ch n đoán nhanh ứ ự ươ ẩ Y. pestis trên các lo iạ
môi tr ng gi đnh. Tuy nhiên, công trình ch d ng l i vi cườ ả ị ỉ ừ ạ ở ệ
kh ng đnh ẳ ị Y. pestis thông qua m t đo n gen duy nh t trên plasmidộ ạ ấ
gây đc là pPCP1 (Lê Thanh Hòa, 2005). Trên th c t , m t sộ ự ế ộ ố
ch ng ủY. pestis plasmid pPCP1 có th b m t đi thì s n ph m c aể ị ấ ả ẩ ủ
nghiên c u này s không áp d ng đc (Marston, 2005). Hayứ ẽ ụ ượ
nghiên c u tách dòng và đc trình t gen ứ ọ ự pagA mã hóa kháng
nguyên b o v t ch ng ả ệ ừ ủ B. anthracis VCM1167 (Ph m Thúyạ
Ki u, 2006)ề.
Nh v y, có th nói các đ tài v ư ậ ể ề ề B. anthracis và Y. pestis ở
Vi t Nam hi n nay còn ít và riêng l cho t ng lo i tác nhân. Do đó,ệ ệ ẻ ừ ạ
vi c nghiên c u phát tri n k thu t mPCR xác đnh nhanh và chínhệ ứ ể ỹ ậ ị
xác đng th i hai tác nhân nguy hi m này là c p thi t, đáp ng yêuồ ờ ể ấ ế ứ
c u an ninh qu c phòng và phòng ch ng d ch b nh. K thu tầ ố ố ị ệ ỹ ậ
mPCR đc phát tri n ượ ể nh m xác đnh đng th i ằ ị ồ ờ B. anthracis và Y.
pestis m t cách chính xác h n b ng vi c s d ng c p m i thi t kộ ơ ằ ệ ử ụ ặ ồ ế ế
trên nhi m s c th , đng th i cũng s d ng các c p m i đ phátễ ắ ể ồ ờ ử ụ ặ ồ ể
hi n các gen đc l c trên plasmid. ệ ộ ự
Ch ng 2.ươ V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊNẬ Ệ ƯƠ
C UỨ
2.1. V T LI U, HÓA CH T, THI T BẬ Ệ Ấ Ế Ị