viÖn hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam
viÖn c«ng nghÖ sinh häc
VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH
CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ (Cinnamomum
cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA
HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG Streptomyces cavourensis YBQ59
Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số : 9 42 01 07
tãm t¾t luËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc
hµ néi - 2019
Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Phí Quyết Tiến
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS. TS. Chu Kỳ Sơn
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính
thức tại Viện Công nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội
Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019.
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Viện Công nghệ sinh học
- Trang web của Bộ GD&ĐT
1
MỞ ĐẦU
Một trong những thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh và
kháng vi sinh vật (VSV). Cho đến nay, sử dụng kháng sinh là phương thức quan
trọng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm do VSV gây ra. Tuy nhiên việc lạm dụng
thuốc kháng sinh đã trở thành yếu tố chính dẫn tới xuất hiện các chủng VSV gây
bệnh kháng đa thuốc (Singh, 2012). Theo Demain và Sanchez (2009), VSV đã và
đang thay đổi tính kháng với các thuốc kháng sinh hiện đang sử dụng trong điều trị
nhờ xuất hiện các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền. Vì vậy, hướng
nghiên cứu và phát triển các tác nhân kháng khuẩn mới là ưu tiên của nhiều nhà khoa
học và các công ty dược phẩm trên thế giới (Alekshun, 2007). Theo Bérdy (2012),
khoảng 70% chất kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong lâm sàng
được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn. Trong số 33.500 hợp chất hoạt tính sinh học có
nguồn gốc từ VSV, xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces đóng vai trò quan trọng và cho
thấy đã sinh tổng hợp 10.400 hợp chất. Vì vậy, sự đa dạng của xạ khuẩn trong tự
nhiên nói chung và XKNS nói riêng rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác và
ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn trong nhiều
lĩnh vực của đời sống. Ngoài ra, nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học từ
xạ khuẩn được sinh tổng hợp bởi các enzyme polyketide synthase (PKS) và
nonribosomal peptide synthetase (NRPS) nên việc nghiên cứu những gen pks, nrps
liên quan đến quá trình trao đổi chất thứ cấp rất hữu ích trong việc đánh giá tiềm năng
sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) từ xạ khuẩn (Ayuso và cs., 2005). Cho đến nay,
rất ít nghiên cứu về tài nguyên XKNS trên cây dược liệu Việt Nam được công bố và
cần được nghiên cứu nhằm bảo tồn, lưu giữ và khai thác nguồn gen VSV bản địa.
Trong y học cổ truyền Việt Nam tinh dầu của cây quế (Cinnamomum sp.) đã được
chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư
(Singh và cs., 1995; Tariq và cs., 2006) nhưng các nghiên cứu về XKNS trên cây quế
chưa được công bố nhiều. Trong nghiên cứu này, các XKNS được phân lập trên các
môi trường chọn lọc và đa dạng sinh học của XKNS được đánh giá qua đặc điểm sinh
học, phân bố, khả năng sinh kháng sinh và đặc điểm di truyền. Các chủng XKNS có
hoạt tính kháng VSV kiểm định, ức chế phát triển tế bào ung thư phổi, mang các gen
chức năng pks-I, pks-II, nrps được sàng lọc. Từ đó, nghiên cứu xác định điều kiện
nuôi cấy phù hợp và tách chiết, tinh sạch các hợp chất và giải trình tự, lắp ráp de
novo, dự đoán và chú giải hệ gen của XKNS được tuyển chọn để tìm kiếm thông tin
về những gen liên quan đến quá trình tổng hợp kháng sinh. Từ những lý do trên
nghiên cứu sinh thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng
sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam
và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59”
2
1. Mục tiêu
Đánh giá được sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên
cây quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập tại miền Bắc Việt Nam và tinh sạch
được một số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và các gen liên
quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59.
2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và nghiên cứu sự đa dạng sinh học của các chủng XKNS trên cây quế
(C. cassia Presl) thu thập tại các điểm thuộc tỉnh Hòa Bình, Yên Bái và Lai Châu.
- Tuyển chọn xạ khuẩn sinh chất kháng sinh hoạt tính cao và xác định một số gen
liên quan đến tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn.
- Nghiên cứu đặc điểm di truyền, lên men, tách chiết và xác định một số cấu trúc
kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59.
3. Những đóng góp mới của luận án
- Là nghiên cứu đầu tiên, có hệ thống về đa dạng, sinh tổng hợp chất kháng sinh
của XKNS trên cây quế (C. cassia Presl) tại miền Bắc Việt Nam.
- Sàng lọc được chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 sinh kháng sinh phổ
rộng và phân lập được 8 hợp chất kháng sinh: 1-monolinolein (1), bafilomycin (2),
nonactic acid (3), daidzein (4), 3′-hydroxydaidzein (5), 5,11-epoxy-10-cadinanol (6),
prelactone B (7), daucosterol (8), trong đó các hợp chất 1, 3-8 được phát hiện lần đầu
từ loài S. cavourensis và hợp chất 1, 2 có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng kháng sinh
cao (MIC50 8,5-30,3 µg/ml) và ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư A549, MCF,
Hep3B (IC50 3,6-24,7 µM).
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 150 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (32
trang, 3 bảng, 6 hình); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (11 trang);
Chương 3: Kết quả nghiên cứu (37 trang, 10 bảng, 20 hình); Chương 4: Bàn luận kết
quả (28 trang, 8 hình); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình công
bố (2 trang); Tóm tắt luận án bằng tiếng Anh (7 trang); Tài liệu tham khảo (28 trang
với 7 tài liệu tiếng Việt, 243 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục (63 trang).
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Thuật ngữ nội sinh “endophytic” được đưa ra bởi de Bary (1866), theo định nghĩa
của ông, “VSV nội sinh là những VSV sống bên trong các mô thực vật và có sự khác
biệt đáng kể so với những loại VSV được tìm thấy trên bề mặt thực vật”. Các hợp
chất có hoạt tính sinh học từ XKNS được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng
và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh,
kháng nấm, tiêu diệt tế bào ung thư, kháng viêm, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất
diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng... (Bacon và White, 2000; Qin và cs., 2011). Cho
3
đến nay rất nhiều kháng sinh mới được tìm ra như munumbicin A-D (Castillo và cs.,
2002), celastramycin A-B (Pullen và cs., 2002), kakadumycin (Castillo và cs., 2003)
và demethylnovobiocin (Igarashi, 2004) từ XKNS hiện đang có các ứng dụng trong
nông nghiệp, công nghiệp và y dược (Golinska và cs., 2015).
XKNS là một trong những nhóm VSV rất đa dạng và còn ít được nghiên cứu, có
khả năng sinh ra những chất có ích cho cây chủ (Golinska và cs., 2015; Nalini và
Prakash, 2017). Theo quan niệm đó, sự đa dạng sinh học của XKNS là sự đa dạng về
thành phần loài, chi về các taxon, nhưng đồng thời cũng là một sự đa dạng về các hợp
chất tự nhiên có hoạt tính do chúng sinh ra. XKNS rất đa dạng và mức độ đa dạng có
thể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu và các loài thực vật khác nhau. Sự đa dạng về chi
và số lượng xạ khuẩn nội sinh phần lớn phụ thuộc vào phương pháp và môi trường
phân lập (Qin và cs., 2011; Nalini và Prakash, 2017). Nghiên cứu này không những
mở ra hướng nghiên cứu mới về VSV học ứng dụng ở Việt Nam, mà còn góp phần
quan trọng trong việc xác định được mức độ đa dạng sinh học nguồn tài nguyên
XKNS trên một số cây dược liệu của Việt Nam. Việc phát hiện được các nguồn gen
xạ khuẩn mới, tiềm năng nhằm ứng dụng và phát triển các sản phẩm chuyển hóa thứ
cấp do chúng sản sinh trong lĩnh vực nông nghiệp, y dược và thực phẩm một cách
bền vững, không dẫn đến việc huỷ hoại cây chủ, bảo vệ sự đa dạng tài nguyên thực
vật cũng như VSV của Việt Nam là cấp thiết.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
- Mẫu nghiên cứu: 9 mẫu (rễ, thân, lá) cây quế thu thập từ xã Thung Nai, Cao
Phong, Hòa Bình (20°47’21”N;105°21’20”E) ở độ cao 399 m, tháng 12/2013; 9 mẫu
từ xã Tân Hợp, Văn Yên, Yên Bái (21°53’14”B;104°35’9”Đ) ở độ cao 700 m, tháng
02/2014 và 9 mẫu từ xã Phăng Sô Lin, Sìn Hồ, Lai Châu (22°21’41”B;103°16’4”Đ) ở
độ cao 800 m, tháng 02/2014. Mẫu thực vật Cinnamomum cassia Presl được lưu trữ
tiêu bản và phân loại vào tháng 01/2106 bởi TS. Nguyễn Thế Cường tại Viện sinh
thái và Tài nguyên sinh vật, Viện HL KH&CN VN.
- Các chủng VSV kiểm định: Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Typhimurium ATCC 14028 (viết rút gọn Salmonella Typhimurium ATCC 14028),
Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea ATCC 9341, Bacillus cereus ATCC
11778, Proteus vulgaris ATCC 49132, Pseudomonas auroginosa ATCC 9027,
Candida albicans ATCC 10231, Enterobacter aerogenes ATCC 13048,
Staphylococcus epidermidis kháng methicilin (MRSE) ATCC 35984 và
Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) ATCC 33591 nhận từ Bộ sưu tập