BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC XỬ LÝ
HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG
Ngành:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GVHD:
TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
SVTH:
NGUYỄN THANH HIẾU
MSSV: 1411100748
Lớp: 14DSH04
TP. Hồ Chí Minh, 8/2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC XỬ LÝ
HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG
Ngành:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GVHD:
TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
SVTH:
NGUYỄN THANH HIẾU
MSSV: 1411100748
Lớp: 14DSH04
TP. Hồ Chí Minh, 8/2018
Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Sinh viên thực hiện luận văn
Nguyễn Thanh Hiếu
i
Đồ án tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghệ
TP. HCM đã tạo điều kiện cho chúng em được học tập tại Trường. Em cũng xin chân
thành biết ơn sự dạy dỗ tận tình của toàn thể quý thầy cô Viện Khoa học Ứng dụng
Hutech, Trường Đại học Công nghệ TP. HCM đã cho chúng em những kiến thức quan
trọng trong suốt thời gian qua, nhờ vậy chúng em mới có được những tri thức quý giá
để làm hành trang cho con đường sự nghiệp phía trước.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Hoài Hương đã trang bị cho
em những kiến thức bổ ích và luôn theo sát quá trình làm việc của em để kịp thời
hướng dẫn cũng như khắc phục những lỗi sai để công việc đạt kết quả tốt nhất. Cô
luôn chia sẽ cũng như động viên em khi công việc chưa ổn và giúp em tìm được niềm
vui khi thấy được thành quả mình sắp gặt hái được.
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã tiếp cho em nghị lực, sự
bình yên trong tâm hồn, luôn bên em những lúc khó khăn. Em cũng xin được cảm ơn
tới những người bạn đã gắn bó, động viên và giúp đỡ em suốt quãng thời gian thực
hiện đồ án tốt nghiệp.
Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy/Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời
gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này. Em xin gửi đến Thầy/Cô lời chúc sức khỏe
va. Trong quá trı̀nh làm đồ án, do kinh nghiệm còn thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên có nhiều thiếu sót, mong các Thầy Cô bỏ qua.
TP. HCM, ngày 3 tháng 08 năm 2018
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thanh Hiếu
ii
Đồ án tốt nghiệp
MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
2. Tình hình nghiên cứu .......................................................................................... 2
2.1. Ngoài nước: ..................................................................................................... 2
2.2.Trong nước: ...................................................................................................... 3
3.Mục đích nghiên cứu: .......................................................................................... 3
4.Mục tiêu nghiên cứu: ........................................................................................... 3
5. Nội dung nghiên cứu: ......................................................................................... 3
6. Phương pháp nghiên cứu: ................................................................................... 4
6.1.Phương pháp luận: ........................................................................................... 4
6.2.Phương pháp xử lý số liệu: ............................................................................... 4
7. Kết quả đạt được: ................................................................................................ 4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ....................................................................................... 5
1. Tổng quan về xử lý hạt giống: ............................................................................ 5
1.1. Giới thiệu chung: ............................................................................................. 5
1.2. Các phương pháp khử nhiễm độc tố: ............................................................... 6
1.2.1. Phương pháp vật lý: ...................................................................................... 6
1.2.2. Phương pháp hóa học: .................................................................................. 9
1.2.3. Phương pháp sinh học:.................................................................................. 9
2. Các vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng cây trồng: ..................................................... 12
iii
Đồ án tốt nghiệp
2.1. Khả năng phân giải lân: .................................................................................. 12
2.1.1. VSV phân giải lân hữu cơ ............................................................................. 13
2.1.2. VSV phân giải lân vô cơ ............................................................................... 14
2.2. Tạo màng sinh học biofilm .............................................................................. 15
2.3. Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA)....................................................... 17
3. Tổng quan về vi khuẩn lactic. ............................................................................. 19
3.1. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus sp. .................................................... 19
3.2. Đặc điểm sinh lý .............................................................................................. 20
3.3. Đặc điểm sinh hóa............................................................................................ 20
3.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ......................................................... 21
3.5. Quá trình trao đổi chất ..................................................................................... 23
3.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển
của vi khuẩn lactic ....................................................................................... 28
3.7. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic ........................................................ 29
3.7.1. Khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic .................................... 29
3.7.2. Các hợp chất kháng nấm ............................................................................... 30
3.7.3. Các hợp chất kháng khuẩn khác ................................................................... 37
3.8. Ứng dụng của vi khuẩn lactic .......................................................................... 40
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 42
2.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................ 42
2.2. Thời gian thực hiện .......................................................................................... 42
2.3. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 42
2.3.1. Vật liệu .......................................................................................................... 42
2.3.2. Hóa chất sử dụng .......................................................................................... 42
2.3.3. Thiết bị .......................................................................................................... 43
2.3.4. Dụng cụ ......................................................................................................... 43
2.4. Phương pháp luận ............................................................................................ 44
iv
Đồ án tốt nghiệp
2.4.1. Mục tiêu đồ án .............................................................................................. 44
2.4.2. Nội dung ....................................................................................................... 44
2.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 45
2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................... 45
2.5.2. Khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic ................................................. 46
2.5.2.1. Nhuộm gram .............................................................................................. 47
2.5.2.2. Nhuộm bào tử ............................................................................................ 48
2.5.2.3. Thử nghiệm Catalase ................................................................................. 49
2.5.2.4. Thử nghiệm khả năng lên men đường ....................................................... 49
2.5.2.5. Khả năng di động ....................................................................................... 50
2.5.3. Khả năng phân giải lân ................................................................................ 51
2.5.4. Khả năng sinh IAA ....................................................................................... 52
2.5.5. Khả năng tạo màng Biofilm .......................................................................... 53
2.5.6. Chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. ....................................................... 54
2.5.6.1. Khảo sát sự phát triển trên các loại môi trường ........................................ 55
2.5.6.2. Khảo sát hình thái ...................................................................................... 55
2.5.7. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc
Aspergillus sp. CĐP1. .................................................................................. 56
2.5.8. Phương pháp khảo sát môi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic .. 56
2.5.9. Xác định acid lactic....................................................................................... 57
2.5.10. Xác định mật độ vi khuẩn ........................................................................... 57
2.5.11. Phương pháp khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc
Aspergillus sp. CĐP1 ................................................................................... 60
2.5.12. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N
đối với sự phát triển của hạt giống. .............................................................. 68
2.5.12.1. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5, L3,
L2N đối với sự nảy mầm của hạt. ................................................................ 68
v
Đồ án tốt nghiệp
2.5.12.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillussp. L5, L3, L2N đến độ khỏe mầm ở
cây đạu phộng .............................................................................................. 69
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 70
3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hoá của chủng vi khuẩn lactic: .................................... 70
3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc: ....................................................................... 70
3.1.2 Nhuộm Gram: ................................................................................................ 71
3.1.3 Nhuộm bào tử: ............................................................................................... 71
3.1.4 Thử nghiệm Catalase: .................................................................................... 72
3.1.5 Thử nghiệm tính di động: .............................................................................. 73
3.1.6 Thử nghiệm lên men các loại đường ............................................................. 74
3.2 Khảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 .......................... 76
3.3. Khảo sát môi trường lên men thích hợp. ......................................................... 78
3.3.1. Khảo sát khả năng sinh acid lactic và mật độ tế bào của các chủng
Lactobacillus spp. L5, L2N, L3 ................................................................... 79
3.3.2. Khảo sát khả năng tạo màng sinh học biofilm của các chủng Lactobacillus
spp. L5, L2N, L3 .......................................................................................... 83
3.3.3. Đánh giá khả năng phân giải lân của các chủng Lactobacillus spp. L5, L2N,
L3 ................................................................................................................. 86
3.3.4. Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng Lactobacillus spp. L5, L2N, L3.
...................................................................................................................... 91
3.3.5. Đánh giá khả năng kháng nấm invitro của các chủng vi khuẩn lactic ......... 93
3.5.6. Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng ................................................. 96
3.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới sự
phát triển của hạt giống. ............................................................................... 100
3.3.7.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới khả năng
phát triển của cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm. .................................... 100
vi
Đồ án tốt nghiệp
3.3.7.2. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N,
L3 tới cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm ............................................... 104
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 110
4.1. Kết luận ........................................................................................................... 110
4.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 111
vii
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Lactic acid bacteria/ Lactobacillales LAB
Vi sinh vật VSV
Vi khuẩn VK
BVTV Bảo vệ thực vật
Indole-3-acetic acid IAA
Extracellular polymeric substance EPS
de Man, Rogosa and Sharpe MRS
Potato Detrose Agar PDA
Đối chứng ĐC
Thí nghiệm TN
Nghiệm thức NT
Không điều chỉnh KĐC
Môi trường MT
viii
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn.................... 10
Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động ........... 27
Bảng 1.3: Một số hợp chất tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men .......................... 30
Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất ..................................................... 34
Bảng 1.5: Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M. P. Zacharof, 2012) .......... 38
Bảng 1.6: Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB ........... 39
Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm bảo quản trong chai ........................................................ 67
Bảng 3.1 Khả năng lên men đường của các chủng L5, L3, L2N. ............................... 75
Bảng 3.3 Thống kê xếp hạng OD 550nm của các chủng vi khuẩn lactic. ................. 84
Bảng 3.3. Khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic ở ngày 3 ................. 90
Bảng 3.4: Hàm lượng IAA do 3 chủng vi khuẩn tổng hợp. ........................................ 92
Bảng 3.5: Tỷ lệ ức chế của 3 chủng vi khuẩn trên các loại môi trường với chủng nấm
mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. ........................................................... 94
Bảng 3.6: Ngày xuất hiện tơ nấm trong thí nghiệm bảo quản hạt đậu phộng............. 98
Bảng 3.7: Thành phần các nghiệm thức ngâm đậu phộng. ......................................... 100
Bảng 3.8: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ mầm trên các nghiệm thức của đậu phộng ..... 101
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7
ngày sau nảy mầm. ...................................................................................................... 103
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều dài của cây đậu phộng sau 14
ngày nảy mầm ............................................................................................................. 104
ix
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Một số loại auxin phổ biến .......................................................................... 18
Hình 1.2: Con đường lên men Glucose ....................................................................... 26
Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của các hợp chất kháng nấm ........................................... 33
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................ 45
Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic ...................................... 46
Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng phát triển của chủng nấm CĐP1 ......................... 53
Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc
Aspergillus sp. CĐP1. ................................................................................................. 55
Hình 2.5: Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn .................................................................. 58
Hình 2.6: Sơ đồ khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp.
CĐP1 ........................................................................................................................... 60
Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5, L3,
L2N đối với sự phát triển của hạt giống...................................................................... 68
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc các chủng Lactobacillus spp. trên môi trường MRS agar
..................................................................................................................................... 70
Hình 3.2: Kết quả nhuộm gram của các vi khuẩn ....................................................... 71
Hình 3.3: Kết quả nhuộm bào tử của các vi khuẩn ..................................................... 72
Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ........................ 73
Hình 3.5: Thử nghiệm tính di động của chủng Lactobacillus sp. L5 và chủng vi khuẩn
đối chứng Bacillus subtilis. ......................................................................................... 74
Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn ......................................... 75
Hình 3.7: Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 trên môi trường
MRS Agar cải tiến ....................................................................................................... 77
Hình 3.8: Hình thái nấm nấm Aspergillus sp. CĐP1 .................................................. 78
Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic sp. L5............... 79
Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic L2N ............... 80
x
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.11: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic L3 .................. 80
Hình 3.12: Hàm lượng acid tổng của chủng L5 trên các môi trường ......................... 81
Hình 3.13: Hàm lượng acid tổng của chủng L2N trên các môi trường ...................... 82
Hình 3.14: Hàm lượng acid tổng của chủng L3 trên các môi trường ......................... 82
Hình 3.15: Biểu đồ đánh giá khả năng tạo màng biofilm của ba chủng vi khuẩn lactic
trên các môi trường. .................................................................................................... 84
Hình 3.16: Vi khẩn tạo màng biofilm trên thành ống nghiệm .................................... 86
Hình 3.17: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L5 .............................. 87
Hình 3.18: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L2N ........................... 88
Hình 3.19: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L3 .............................. 89
Hình 3.20: Biều đồ so sánh khả năng phân giải lân tổng cộng của ba chủng vi khuẩn
lactic trên 3 môi trường theo ngày. ............................................................................. 89
Hình 3.21: Biểu đồ thể hiện khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic trên
ba môi trường ở ngày 3. .............................................................................................. 90
Hình 3.22. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh
IAA của 3 chủng vi khuẩn. ......................................................................................... 92
Hình 3.23: Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn trên môi trường khác nhau. .... 94
Hình 3.24: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kháng nấm của 3 chủng vi khuẩn trên 3 môi trường
khác nhau..................................................................................................................... 95
Hình 3.25: Hình ảnh bảo quản đậu phộng trong chai sau 25 ngày ............................. 97
Hình 3.26: Cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm ........................................................ 101
Hình 3.27: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ của mầm trên các nghiệm thức của hạt đậu
phộng ........................................................................................................................... 102
Hình 3.28: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn của 3 nghiệm thức
TN1-TN1, TN3-NT8 và TN1-NT12 đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7 ngày sau nảy
mầm ............................................................................................................................. 103
xi
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.29: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng dịch nuôi cấy của 3 nghiệm thức TN1-NT1, TN1-
NT12, TN3-NT8 cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm. ............................................ 105
Hình 3.30: Cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm. ..................................................... 106
xii
Đồ án tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề xã hội cần giải quyết kịp thời để bảo vệ
sức khoẻ con người. Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong
không khí thường cao, là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc
tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, gây độc cho người và gia súc, gây tổn thương
gan (ung thư gan…). Tình trạng phơi nhiễm của nấm mốc ảnh hưởng đến 25 % mùa
màng trên toàn thế giới, làm tổn thất trung bình 418 triệu đô và ảnh hưởng trên gia súc
472 triệu đô mỗi năm (theo Bô Nông Nghiệp Mỹ, 2009). Tại Việt Nam, mỗi năm bị
ảnh hưởng khoảng 13-16 % lượng nông sản tuỳ loại.
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên nông sản (được bảo quản trong kho
tàng , bao bì...), nấm mốc làm giảm nghiêm trọng chất lượng của các loại nông sản
được bảo quản. Nhiều loài nấm mốc phát triển trên nông sản (thóc, ngô, lạc, đậu
tương...) làm cho sản phẩm nông nghiệp biến đổi màu sắc, mùi vị, giảm chất lượng,
đặc biệt là các chất dinh dưỡng như tinh bột, đường, protein, acid amin, lipid, vitamin
và các khoáng chất. Nấm mốc làm thối rữa các sản phẩm nông nghiệp như hoa quả,
rau, hạt ngũ cốc và tạo điều kiện cho nhiều loại vi khuẩn khác phát triển và gây hại làm
ảnh hưởng đến chất lượng hạt, sản lượng thu hoạch và gây thiệt hại cho người sử dụng.
Bên cạnh sử dụng các biện pháp trong lúc trồng trọt như canh tác ruộng đất, bón
phân, phun thuốc,.. thì một trong những xu hướng hiện nay là xử lý hạt giống. Xử lý
nguồn bệnh tồn tại trên hạt giống trước khi gieo trồng là một trong những điều quan
trọng trong việc đảm bảo chất lượng hạt giống, vừa tăng khả năng chống chọi của hạt
khỏi những tác nhân gây bệnh, ngăn ngừa nguồn bệnh lan truyền từ hạt sang đồng
ruộng, vừa làm tăng sản lượng thu hoạch có lợi cho người nông dân, góp phần phát
triển nền nông nghiệp bền vững, không ảnh hưởng môi trường.
1
Đồ án tốt nghiệp
Xử lý hạt giống bằng hóa chất ngày nay được sử dụng rộng rãi để phòng trừ sâu
bệnh hại cây trong nông nghiệp với những ưu điểm tác dụng nhanh, tương đối đơn
giản, đem lại hiệu quả kinh tế cao,…nhưng các hợp chất hóa học dần có những yếu
điểm độc hại với môi trường gây ô nhiễm đất, nguồn nước và không khí, hình thành
các loài kháng thuốc, ảnh hưởng đến quần thể sinh vật và đăc biệt ảnh hưởng đến sức
khỏe con người. Do đó, các hợp chất sinh học được thay thế mang lại hiệu quả và thân
thiện, an toàn với môi trường đặc biệt các hợp chất sinh học từ các loài vi sinh vât. Một
trong những chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất chính là các chủng sinh
acid lactic. Vi khuẩn dạng này có hoạt tính sinh học khá cao, an toàn, có khả năng tiêu
diệt vi sinh vật có hại và là nguồn vi sinh vật hữu ích, duy trì hệ cân bằng vi khuẩn
đường ruột. Nhận thấy đây là những lý do cần thiết cho đời sống của con người và đó
là lý do chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic xử lý hạt giống
đậu phộng”
2. Tình hình nghiên cứu:
2.1. Ngoài nước:
Trên thế giới, có rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm do vi khuẩn sinh acid
lactic tạo thành, chẳng hạn như:
“Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium in
vitro và trong nấu mạch nha lúa mạch” của A. Laitila và công sự (2002).
Năm 2004, Cassandra De Muynck và công sự nghiên cứu “Khả năng kháng nấm
của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất kháng nấm trong thực phẩm”.
Kim Jeong Dong với “Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic phân
lập từ kimchi kháng Aspergillus fumigatus” năm 2005.
R Muñoz và cộng sự với nghiên cứu “Ngăn cản sự sản xuất độc tố của Aspergillus
nomius vsc 23 của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae” năm 2010.
“Độc tố aflatoxin bị ức chế bởi các vi khuẩn lactic như Lactobacillus casei có hoạt
động mạnh chống sự phát triển của nấm và sự nảy mầm của bào tử nấm” Kim, 2005.
2
Đồ án tốt nghiệp
2.2. Trong nước:
Hiện nay, nước ta cũng một số sản phẩm và công trình nghiên cứu vi khuẩn kháng
nấm bệnh trên các loại cây và hạt khác nhau như:
Công trình nghiên cứu như Chế phẩm EM bảo vệ cây trồng hay ứng dụng trong
thuỷ sản.
Chế phẩm Sadi Bio 1 (là tên gọi của chế phẩm vi sinh Biomix 2) của Viện công
nghệ Môi trường Việt Nam, được sản xuất từ các chủng vi sinh vật hữu ích thuộc nhóm
xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm sinh tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào, có khả năng
sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm.
“Khả năng giảm hàm lượng Aflatoxin từ nấm mốc của vi khuẩn lactic và nấm
Trichoderma” của Lương Thị Phương Thảo (2015).
Chế phẩm vi sinh SB2 của công ty Công nghệ Cát Tường có công dụng phòng
trừ tác nhân gây bệnh cho cây trồng như nấm, vi khuẩn, virus, xạ khuẩn,…
Vi khuẩn lactic chưa được ứng dụng rộng rãi trong xử lý hạt giống trong các nghiên
cứu trong nước ta hiện nay.
3. Mục đích nghiên cứu:
Nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn lên men lactic tạo chế phẩm sinh học bảo quản và
xử lý hạt giống.
4. Mục tiêu nghiên cứu:
Khảo sát khả năng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N trong
bảo quản và phát triển của hạt đậu phộng.
5. Nội dung nghiên cứu:
Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 và chủng nấm Aspergillus
sp. CĐP1
Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2N,
L3
3
Đồ án tốt nghiệp
Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 với
các chủng nấm Aspergillus sp.CĐP1
Khảo sát môi trường lên men thích hợp của chủng Lactobacillus sp. L5, L2N, L3.
Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 trong bảo quản
và xử lý hạt đậu phộng.
Xây dựng quy trình sản xuất hạt giống đã xử lý.
6. Phương pháp nghiên cứu:
6.1. Phương pháp luận:
Để ứng dụng vi khuẩn lactic xử lý hạt giống đậu phộng thay cho chất hóa học, vi
khuẩn lactic có nguồn phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống được khảo sát
tuyển chọn theo khả năng sinh acid, tạo sinh khối, tạo màng biofilm, đối kháng nấm,
phân giải lân và sinh hoocmon tăng trưởng thực vật IAA. Đồng thời ảnh hưởng của các
môi trường lên men lên các tính chất này cũng được khảo sát. Sau khi chọn được môi
trường lên men thích hợp, thí nghiệm xử lý hạt đậu phộng và nảy mầm được tiến hành
để so sánh độ khỏe mầm của hạt đậu phộng xử lý và không xử lý.
6.2. Phương pháp xử lý số liệu:
Phần mềm Excel để tính toán và vẽ đồ thị
Phần mềm thống kê SAS 9.1
7. Kết quả đạt được:
Xác định khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N
đối với chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 phân lập từ hạt đậu phộng.
Xác định được khả năng bảo quản hạt của chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N
khỏi nấm mốc.
Xác định được ảnh hưởng của dịch nuôi cấy lên sự phát triển của hạt đậu phộng (tỷ
lệ nảy mầm, độ khỏe mầm,..).
Xây dựng được quy trình xử lý hạt đậu phộng.
4
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1. Tổng quan về xử lý hạt giống: 1.1. Giới thiệu chung:
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại thuốc xử lý hạt giống với nhiều thương
hiệu khác nhau của các công ty thuốc BVTV. Nông dân bắt đầu làm quen với lợi ích
của việc xử lý hạt giống trong bảo vệ cây trước sự tấn công của sâu bệnh, côn trùng, vi
khuẩn, nấm gây hại.
Trước kia việc xử lý giống chỉ có mục đích duy nhất là giúp giữ giống không bị
nấm bệnh hại tấn công. Các hạt giống được áo các loại thuốc trừ nấm như captan,
thiram hay là carbendazim để trừ nấm bệnh trên bề mặt hạt giống. Sau đó hạt giống
này được nhuộm phẩm màu đỏ để cảnh báo người tiêu dùng không được sử dụng làm
thực phẩm. Nhưng carbendazim cùng một số hoạt chất khác bị cấm sử dụng hiện nay
vì là hoạt chất hóa học có độc tính cao, với nhiều tác động tới môi trường, hệ sinh thái
cũng như sức khỏe con người.
Thuốc trừ nấm bảo vệ hạt giống đang nảy mầm và tránh khỏi bị sâu bệnh trong đất
tấn công, giúp tăng tỷ lệ nảy mầm, mọc đều ngay cả trong điều kiện bất lợi như thiếu
hoặc thừa nước. Lợi ích của xử lý hạt giống:
- Giúp hạt giống nảy mầm nhanh, bắt rễ sớm.
- Giúp hình thành nốt sần ở cây họ đậu
- Tiệt kiệm lượng thuốc và công lao động trên cùng đơn vị diện tích so với
phân bón gốc và phân bón lá.
- Dễ áp dụng hơn phân bón gốc và phân bón lá, chỉ trộn thuốc xử lý hạt với
giống gieo sạ.
Việc xử lý hạt giống còn mở ra nhiều triển vọng mới như :
Tăng cường tính kháng bệnh: Kích thích tính kháng bệnh ở cây trồng (kích kháng)
là phương pháp giúp cho giống cây bị nhiễm bệnh trở nên có khả năng kháng bệnh ở
mức độ nào đó sau khi được xử lý chất kích kháng. Kích kháng không tác động trực
5
Đồ án tốt nghiệp
tiếp lên mầm bệnh mà nó kích thích quá trình tự vệ của cây trồng. Chất kích kháng có
thể có nguồn gốc hóa học hoặc vi sinh vật.
Tăng cường chịu điều kiện bất lợi: Các vi khuẩn sống vùng rễ lúa cố định đạm
như Azospirillum lipoferum, Azospirillum lipoferum; vi khuẩn Pseudomonas sp,
Baccilus sp đều kích thích khả năng tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
như Auxin và Gibberelin giúp bộ rễ cây trồng phát triển tốt hơn, gia tăng diện tích tiếp
xúc của rễ với đất. Các vi khuẩn này vừa tăng cường cung cấp dinh dưỡng cho cây
trồng, vừa tăng cường chống chịu điều kiện bất lợi.
Các chất ly trích thực vật như Lychnis viscaria, xoan Melia azedarach đều có tác
dụng kích hoạt tăng cường cây trồng chống chịu điều kiện bất lợi khi gieo sạ như ngập
úng, hạn hán…
Phòng trừ sâu bệnh: Đây là xu thế phổ biến hiện nay của phần lớn các sản phẩm xử
lý hạt giống trên thị trường. Điển hình là thuốc xử lý hạt giống Cruiser có chứa chất
Thiamethoxam là hoạt chất chuyên trên rầy nâu và bọ trỉ, chất Defenoconazole thuốc
trừ nấm phổ rộng ức chế tổng hợp màng tế bào nấm, chất Fludioxonil là hoạt chất trừ
nấm trên hạt không lưu dẫn, chủ yếu trên bệnh lúa von.
Ngoài ra còn có Gaucho chứa hoạt chất imidacloprid là thuốc trừ sâu ức chế thần
kinh trừ bọ trỉ, rầy nâu. Sunato chứa hoạt chất Fipronil là thuốc trừ sâu thuộc nhóm
phenylpyrazole bảo vệ lúa 7-14 ngày sau khi sạ, cùng với Isotianil là thuốc trừ sâu
thuộc nhóm Cloronicotinyl chuyên trừ rầy nâu, bọ trỉ.
1.2. Các phương pháp khử nhiễm độc tố: 1.2.1. Phương pháp vật lý:
Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: Dùng không khí nóng thổi qua nguyên
liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên
cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể. Nếu nhiệt độ không khí nóng
đưa vào là 100 °C – 145 °C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb
6
Đồ án tốt nghiệp
còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb. Nếu tăng nhiệt độ lên tới 165°C có thể làm cho
lượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao
dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy nhanh
chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Theo Rehana (1979) nhận thấy
nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120°C (thêm
nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng
có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120°C trong 4 giờ giảm
còn 370 ppb. Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng
một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụ
thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao.
Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vô
cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium
alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một
số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl
polypyrrolidone). Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra
ngoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối với
thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có
hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành
phần dinh dưỡng của thức ăn. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng
việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexan-
ethanol-nước và hexan-acetone-nước. Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và
2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng
thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần
bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg.
7
Đồ án tốt nghiệp
Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao
dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy nhanh
chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Theo Rehana (1979) nhận thấy
nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120 °C (thêm
nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng
có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120 °C trong 4 giờ giảm
còn 370 ppb. Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng
một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụ
thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao.
Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vô
cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium
alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một
số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl
polypyrrolidone). Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra
ngoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối với
thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có
hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành
phần dinh dưỡng của thức ăn. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng
việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexan-
ethanol-nước và hexan-acetone-nước. Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và
2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng
thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần
bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg.
Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím. Ở
bước sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại. Okonkwo (1978) nhận
8
Đồ án tốt nghiệp
thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10
giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
1.2.2. Phương pháp hóa học:
Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: Các chất oxy hóa-khử như Natri
Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính
của aflatoxin. Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất
màu sắc của hạt và biến chất các acid amin. Khí ozone (O3) cũng được thử nghiệm về
khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng
là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin.
Phương pháp sử dụng các chất kiềm: Ammonium Hydroxide (NH4OH) và Natri
Hydroxide (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hoạt aflatoxin. Các chất này
đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin.
Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc
dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin. Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm
ứng dụng hơn cả. Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ
bên ngoài là 25 °C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200 ppb có thể giảm
xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
1.2.3. Phương pháp sinh học:
Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp
dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn là không thể
tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng
con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa
chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào
thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất.
Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như
sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực tiếp
9
Đồ án tốt nghiệp
nhờ vi sinh vật. Một số vi khuẩn có khả năng khử nhiễm độc tố aflatoxin được trình
bày trong bảng 1.1.
Bảng 1.1: Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn
Tên vi khuẩn Đối tượng Cơ chế khử nhiễm Tác giả
Sử dụng các sản phẩm trao
đổi chất ngoại bào, sinh ra
trong quá trình nuôi cấy B. Aspergillus C. Munimbazi và Bacillus pumilus pumilus, ức chế sự phát triển parasiticus LB.Bullerman, 1997 và quá trình tổng hợp độc chất
aflatoxin của nấm Asp.
parasiticus
Streptomyces sp. tổng hợp
được aflastatin A, là hợp chất
có bản chất là protein, ức chế Aspergillus Ono. M và cộng sự, Streptomyces sp. 1 số enzyme esterase tham gia parasiticus 1997 quá trình tổng hợp độc chất
aflatoxin của nấm Asp.
parasiticus
A. xylosoxidan tổng hợp
Cyclo (L-leucyl-L-prolyl), là
Achromobacter Aspergillus 1 cyclodipeptide, ức chế sự PS. Yan và cộng sự,
xylosoxidans parasiticus phát triển và sự tổng hợp 2004
aflatoxin của nấm Asp.
parasiticus.
Lactobacillus Aspergillus Sử dụng các sản phẩm trao I. Chang và JD.
10
Đồ án tốt nghiệp
casei flavus đổi chất ngoại bào, sinh ra Kim, 2007.
trong quá trình nuôi cấy L.
casei, ức chế sự phát triển và
quá trình tổnghợp độc chất
aflatoxin của nấm Asp.
flavus.
Bacillus subtilis Aspergillus Ting Zang và cộng Hợp chất thứ cấp B-FS06 flavus sự, 2007.
B. subtilis tổng hợp các
enzyme ngoại bào như Aspergillus R. Thakaew và cộng Bacillus subtilis protease, chitinase, β-1,3- flavus sự, 2013 glucanase làm ức chế sự phát
triển của nấm Asp. flavus.
Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, cà
phê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa... xuất khẩu đậu phộng của Việt Nam, bao gồm
nguyên vỏ, bóc vỏ và hạt cao (số liệu này không bao gồm thương mại biên giới với
Trung Quốc). Các thị trường xuất khẩu chính của Việt Nam là Đài Loan, Hồng Kông,
Thái Lan, Nga, Malaysia và một số nước khác. Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) điều
chỉnh ước tính cho xuất khẩu đậu phộng của Việt Nam trong vụ 2016/17 lên 10 nghìn
tấn, bao gồm xuất khẩu đậu phộng thông qua thương mại biên giới và xuất khẩu đậu đã
qua chế biến. Để đạt được năng suất ấy, người nông dân sử dụng rất nhiều phân bón
hóa chất khác và không ít các loại thuốc bảo vệ thực vật. Hệ quả không chỉ nông dân
phải mất nhiều tiền vào hóa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá
nghiêm trọng. Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa
học khuyến khích sử dụng vì chúng có những ưu điểm sau:
11
Đồ án tốt nghiệp
- Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng
như thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất.
- Cân bằng hệ sinh thái trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói
chung.
- Không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất.
- Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất
lượng nông phẩm.
- Tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng
bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại
thuốc BVTV có nguồn gốc hóa chất. Tác dụng của CPSH đến từ từ chứ
không nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu.
- Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nông
nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường.
- Các chủng nấm sinh độc tố sẽ không thể hình thành cơ chế kháng.
2. Các vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng cây trồng: 2.1. Khả năng phân giải lân:
Vi khuẩn phân giải lân khó tan đã được sử dụng như phân bón sinh học thương mại
để cải thiện tình trạng nông nghiệp. Nhóm vi khuẩn phân giải lân được coi là phân bón
sinh học có triển vọng nhất vì rất nhiều loại đất giàu lân tổng số nhưng lại thiếu hụt
trầm trọng lân dễ tan cung cấp cho cây trồng. Các vi khuẩn phân giải lân lại rất có tiềm
năng để sản xuất phân vi sinh đa chức năng vì có thể tương tác kết hợp tốt với các vi
khuẩn có lợi khác như Azospirillum và Azotobacter. Ngoài vai trò cung cấp lân dễ tan
cho cây trồng, các vi khuẩn hòa tan lân còn có khả năng sinh các yếu tố có vai trò nâng
cao hiệu suất tăng trưởng như cố định đạm, sinh tổng hợp các phytohormone, kháng
sinh hay các enzyme chitinase, cellulase... giúp cây trồng phát triển tốt hơn, chống chịu
tốt hơn đối với điều kiện bất lợi từ bên ngoài.
12
Đồ án tốt nghiệp
VSV phân giải lân thúc đẩy sự tăng trưởng của thực vật, làm tăng lượng lân có giá
trị cho cây trồng. Hòa tan lân là một hiện tượng phức tạp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố
như dinh dưỡng, điều kiện sinh lý và phát triển của các VSV. Trong đất, các VSV là
trung tâm của chu trình chuyển hóa lân và đóng vai trò trung gian quan trọng trong
việc chuyển hóa lân vô cơ và hữu cơ, sau đó giải phóng lân có giá trị cung cấp cho cây
trồng.
Trong quần thể VSV đất, VSV phân giải lân có thành phần loài khác nhau và thay
đổi tùy từng loại đất. VSV phân giải lân được phân lập từ vùng rễ của các cây trồng
khác nhau. Số lượng VSV phân giải lân hiện diện ở vùng rễ nhiều hơn so với đất
ngoài vùng rễ. Các VSV phân giải lân chiếm 0,1-0,5 % của tổng số vi khuẩn và nấm.
VSV phân giải lân phát triển ở cả vùng đất màu mỡ giàu lân và đất thiếu lân.
Penicillium sp. và Aspergillus sp. là hai loại nấm chủ yếu chi phối khả năng phân giải
lân trong vùng rễ. Các vi khuẩn phân giải lân quan trọng nhất là Pseudomonas,
Bacilllus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium,Microccocus,
Flavobacterium và Erwinia.
Theo Babenko và cộng sự (1984), lượng lân hòa tan tăng tuyến tính cùng với sự
tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy, lượng lân hòa tan tăng tại các
điểm khác nhau trong những giai đoạn tăng trưởng (không phải trong suốt thời gian
nuôi cấy).
Rodríguez và Fraga (1999) cũng so sánh khả năng phân giải lân của 13 chủng vi
khuẩn khác nhau và nhận thấy rằng Rhizobium, Pseudomonas và các loài vi khuẩn
Bacillus là những chủng mạnh nhất trong việc phân giải lân.
2.1.1. VSV phân giải lân hữu cơ
Các chất hữu cơ chứa lân sẽ được vô cơ hóa do các enzyme tiết ra từ VSV trong
đất. Trong quá trình sống, VSV cần phân hủy các chất hữu cơ thành các đường đơn để
lấy carbon cho sự phát triển của chúng. Trong quá trình phân hủy này, nhờ các men
13
Đồ án tốt nghiệp
của VSV tiết ra, các hợp chất hữu cơ có chứa lân đã phóng thích lân dưới dạng
phosphate.
Chủng Bacillus: B. megaterium, B. subtilis, B. malaberensis... không những có khả
năng phân giải hợp chất lân vô cơ mà còn có khả năng phân giải hợp chất lân hữu cơ
(Bạch Phương Lan, 2004). Đồng thời B. megaterium còn có khả năng hình thành bào
tử nên sức sống rất mạnh (Nguyễn Hữu Hiệp, 2009). Ngoài ra còn có Serratia,
Proteus, Arthrobscter, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Cunnighamella,
Streptomyces... Cơ chế phân giải: sự chuyển hóa các hợp chất lân hữu cơ thành muối
của H3PO4 theo sơ đồ sau:
1. Nucleoprotein → Nuclein → Acid nucleic → Nucleotic → H3PO4 2. Leucine → Glixerphosphate → H3PO4
Trong sự phân hủy acid phytic, VSV tiết ra men phytase nhờ enzyme này acid
phytic được phân ra làm một phân tử inositol và 6 phân tử H3PO4.
Phytin cũng được phân hủy như trên vì phytin là một muối canxi và magiê của acid
phytic. Sự phân hủy của phytin hoặc acid phytic trong đất chậm hơn so với các acid
nucleic.
2.1.2. VSV phân giải lân vô cơ
Trong đất, lân vô cơ khó tan có thể được VSV chuyển hóa thành lân dễ tan. Phần
lớn VSV trong đất đều có khả năng này. Có đến 1/10 đến 1/2 chủng vi khuẩn phân lập
được từ đất có khả năng chuyển hóa lân khó tan thành lân dễ tan. Theo
Katznelson và cộng sự (1984), VSV phân giải những hợp chất lân khó tan thuộc
nhiều nhóm, nhiều loại khác nhau, có thể chiếm khoảng 10- 15% hệ VSV đất, vi
khuẩn phân giải những hợp chất lân vô cơ khó tan thường gặp gồm các giống:
Pseudomonas denitrificans, Alcaligenes faecalis, Achromobacter delicatulus,
Agrobacterium radiobacter, Aerobacter aerogenes, Escherichia freundi,
Brevibacterium, micrococus, Flavobacterium aurantiacus, Chlorobacterium
denitrificans, Mycobacterium cyaneum, Sarcina flava, Bacillus megaterium var.
14
Đồ án tốt nghiệp
phosphaticum. Người ta dùng chúng làm phân bón vi sinh phân giải lân. Bên cạnh
các vi khuẩn, xạ khuẩn, các chủng nấm như Penicillium, Aspergillus, Rhizopus,
Sclerotium cũng có tác dụng trong quá trình hòa tan hợp chất lân khó tan.
Đại đa số nghiên cứu đều cho rằng, sự phân giải Ca3(PO4)2 có liên quan mật thiết
với sự sản sinh acid trong quá trình sống của VSV. Trong đó, acid carbonic đã làm cho
Ca3(PO4)2 phân giải.
Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O → Ca(PO4)2.H2O + Ca(HCO3)2
Trong đất, vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tác
dụng quan trọng trong việc phân giải Ca3(PO4)2. Vì trong quá trình sống, các vi khuẩn
này tích lũy trong đất HNO3 và H2SO4. Quá trình hòa tan có thể biểu thị theo phương
trình sau:
Ca3(PO4)2 + 4HNO3 → Ca(H2PO4)2 + 2Ca(NO3)2
Ca3(PO4)2 + 2H2SO4 → Ca(H2PO4)2 + 2CaSO4
Các nghiên cứu cho thấy sự xuất hiện các acid này xảy ra cùng lúc với sự xuất
hiện lân hòa tan. Có nghĩa là ngay sau khi VSV tiết ra các acid thì chúng tác dụng lên
lân khó tan và cho ra ngay lân hòa tan. Mặt khác các dạng lân bị cố định trong đất
như phosphate sắt và phosphate nhôm cũng được chuyển hóa sang dạng dễ tan dưới
tác dụng của VSV trong đất. Một số vi khuẩn có khả năng sinh ra H2S tác dụng lên
phosphate sắt hoặc nhôm và phóng thích ra dạng phosphate dễ tan. Hiện tượng này
xảy ra trong điều kiện thiếu oxy. Cơ chế của hiện tượng này chưa được giải thích rõ.
Ở đất phèn trồng lúa, hầu hết lân đều ở dạng phosphate sắt hoặc nhôm, lúa
không hấp thu được. Trong điều kiện này việc bón phân chuồng hoặc chôn vùi rơm rạ
kết hợp với bón đạm và vôi để giúp VSV phát triển sẽ giúp chuyển lân cố định sang
dạng dễ tan và cung cấp cho lúa. Sự chuyển hóa này hơi chậm nên tự nó không cung
cấp lân đủ cho nhu cầu của lúa nên phải kết hợp thêm lân trong phân bón hóa học
nhưng với liều lượng ít hơn.
2.2. Tạo màng sinh học biofilm
15
Đồ án tốt nghiệp
Các tế bào vi khuẩn sinh sống trôi nổi trong môi trường lỏng (dạng phù du) vô tình
bám vào một bề mặt nào đó, và nếu sau một thời gian chúng không chịu tác động di
chuyển đi nơi khác, quá trình sinh trưởng vẫn cứ tiếp tục, dần sẽ hình thành một kiểu
khuẩn lạc trên bề mặt đó, đây là giai đoạn đầu của sự hình thành màng sinh học. Kế đến
vi khuẩn sẽ bắt đầu thay đổi thay đổi kiểu hình, khả năng sinh hóa mới để thuận lợi hơn
trong việc tổng hợp nên cơ chất ngoại bào - extracellular polymeric substance (EPS).
Phân tích về mặt hình thái học kết hợp với di truyền học, người ta xác định rằng các tế
bào xuất hiện cấu trúc tua, nhung mao hoặc tiêm mao sẽ tăng thêm độ vững chắc của
màng sinh học. Giai đoạn cuối của sự hình thành màng sinh học, các tế bào sẽ một lần
nữa biến đổi quay lại dạng phù du, tách ra khỏi màng sinh học để tìm địa điểm định cư
khác, giai đoạn này gọi là giai đoạn phát tán. Khả năng tạo màng sinh học như là một
cách thức tồn tại, phát triển của vi sinh vật trong những điều kiện dinh dưỡng thấp của
môi trường.
EPS là các polymer sinh học có trọng lượng phân tử cao được vi sinh vật tiết ra
ngoài môi trường sống xung quanh chúng. EPS là thành phần chính, đồng thời quyết
định tính hóa lý của màng sinh học. EPS chiếm từ 50 – 90% tổng lượng chất hữu cơ của
một màng sinh học. EPS là vật liệu giúp cho tế bào vi khuẩn bám dính lên một bề mặt
nào đó và đồng thời liên kết với các tế bào khác.
Trong màng sinh học, các tế bào liên kết với nhau bằng mạng lưới do chúng tự tổng
hợp nên EPS. EPS không chỉ bao gồm polysaccharides do tế bào tổng hợp ra, mà còn
các thành phần từ môi trường xung quanh như các ion khoáng, bụi bẩn, hồng cầu,
fibrin, protein và các acid nucleic. Xen kẽ với mạng lưới EPS còn có các kênh nước,
giúp vận chuyển chất dinh dưỡng và tín hiệu giữa các tế bào.
EPS sẽ bao phủ tế bào vi khuẩn, nhưng vẫn tạo điều kiện cho các tế bào trao đổi tín
hiệu sinh hóa cũng như trao đổi gen với nhau. EPS chính là chìa khóa quan trọng cho
việc sự hình thành, phát triển của màng sinh học. EPS còn có chức năng giữ cho các
16
Đồ án tốt nghiệp
enzyme ngoại bào gần với tế bào, giúp hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn ổn định
hơn.
Nghiên cứu về màng sinh vật (Biofilm) góp phần tạo ra những sản phẩm ứng dụng
cao trong cuộc sống như tạo các công nghệ sinh học xử lý ô nhiễm môi trường, ứng
dụng trong nghiên cứu phòng bệnh cho cây trồng cũng như các nghiên cứu trong công
nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm,…
2.3. Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA)
Indole-3-acetic acid (IAA) hay còn goi là Auxin, là chất điều hòa chủ yếu của sự
sinh trưởng thực vật. IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, sự phân sinh
mô, sự phát triền trái và hạt , chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng
(Theologis và Gay 1982).
Auxin là những hợp chất có nhân indol, được tổng hợp từ tryptophan trong mô
phân sinh (ngọn, lóng) và lá non. Sau đó, auxin sẽ di chuyễn đến rễ và tích tụ trong rễ.
Có nhiều loại auxin khác nhau với cấu trúc hoá học khác nhau. Loại auxin quan
trọng nhất là β-indol-acetic acid (IAA), ngoài ra một số auxin khác cũng khá phổ biến
là napthalen-acetic acid (NAA), phenyl-acetic acid (PAA)
17
Đồ án tốt nghiệp
Hình 1.1: Một số loại auxin phổ biến
Với nhiều thí nghiệm khác nhau của nhiều nhà khoa học đã chứng minh được vai
trò của IAA do vi sinh vật tạo ra đối với cây trồng như kích thích sự kéo dài rễ, tăng số
lượng rễ phụ, làm tăng khả năng nẩy mầm của hạt.
Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng VSV dựa trên nồng độ IAA có trong
dịch chiết nuôi cấy vi khuẩn. Nồng độ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khả
năng sinh IAA của VSV càng mạnh. Nồng độ IAA được xác định bằng phương pháp
so màu trên máy quang phổ với thuốc thử Salkowski ở bước sóng 530nm.
3. Tổng quan về vi khuẩn lactic.
18
Đồ án tốt nghiệp
3.1. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus sp.
Vi khuẩn lactic có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng 25 – 35 °C. Chúng chịu
được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống được trong
môi trường 10-15 % cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống
trong môi trường từ 7-10 % NaCl. Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy
protein thành peptide, acid amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau,
thường ở trực khuẩn là cao hơn.
Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình
cầu và hình que, đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5 μm. Các tế bào
hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực
khuẩn lactic từ 1 – 8 μm. Trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi. Kích thước
của chúng thay đổi tùy từng loài.
Phân loại khoa học giống Lactobacillus:
- Giới: - Ngành: - Lớp: - Bộ: - Họ: - Giống: Vi khuẩn Firmicutes Bacilli Lactobacillales Lactobacillacea Lactobacillus
Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L. acidophilus, L. brevis, L.
casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus,...
Các loài Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật,
đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh
dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có
chứa các vi khuẩn này.
Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian,
Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus
plantarum.
19
Đồ án tốt nghiệp
3.2. Đặc điểm sinh lý
Lactobacillus spp. thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. Các loài trong chi không
có khả năng di động, không sinh bào tử.
Phổ nhiệt tăng trưởng từ 2 – 53oC, nhưng tối ưu ở khoảng 30 – 40oC. Tăng trưởng
tốt trong điều kiện môi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2, nhưng vẫn có thể chịu
được mức pH 5.0 hoặc thấp hơn. Tốc độ tăng trưởng giảm trong điều kiện pH môi
trường trung tính hoặc kiềm. Vì Lactobacillus spp. có khả năng chịu được môi trường
có pH cao, nên việc tiết ra acid lactic chính là yếu tố cạnh tranh của chúng đối với những
vi khuẩn khác trong cùng một môi trường.
Thường được tìm thấy trong các sản phẩm có nguồn gốc từ sữa, ngũ cốc, thịt, cá,
bia, rượu, trái cây, nước trái cây, rau củ muối chua, bã thực phẩm, dưa cải bắp, cỏ ủ, bột
nhào chua, nước, đất, chất thải. Chúng cũng xuất hiện trong cơ quan sinh dục nữ,
khoang miệng, hệ tiêu hóa ở người và nhiều động vật khác. Đây là những môi trường
được cung cấp thường xuyên nguồn carbohydrate và một số chất dinh dưỡng khác.
Chính là nơi thích hợp để chúng thực hiện các phản ứng lên men và cho ra sản phẩm
chính là acid lactic
3.3. Đặc điểm sinh hóa
Lactobacillus spp. âm tính với thử nghiệm nitrate, một số trường hợp hiếm dương
tính chỉ xảy ra khi pH môi trường cân bằng ở 6.0 trở lên hoặc bổ sung sắc tố đỏ heme
bào môi trường nuôi cấy. Không có khả năng phân giải gelatin, casein. Thử nghiệm
Indole, Citrate và khả năng sinh H2S âm tính. Thử nghiệm catalase âm tính.
Lactobacillus spp. thường sinh ra mùi đặc trưng khi có mặt trong thực phẩm. Một
nửa sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là lactate. Ngoài ra quá trình lên men
còn sinh các sản phẩm khác như là: diacetyl, acetic acid, và acetaldehyde. Bên cạnh đó
quá trình dị hóa amino acid sẽ sinh ra H2S, amines, hợp chất carbonyl, cresol, skatol,
20
Đồ án tốt nghiệp
benzaldehyde, và methanethiol. Tất cả những sản phẩm của quá trình trao đổi chất này
đã tạo ra nhiều loại hương đặc trưng của sản phẩm lên men.
Lactobacillus spp. thường không có khả năng gây bệnh, ngoài trừ một số ít trường
hợp có bệnh tiềm ẩn bởi khả năng sinh ra acid khử khoáng men răng.
Đa số các loài trong chi Lactobacillus đều có khả năng tổng hợp EPS, nhưng chia
thành hai dạng. Homopolysaccharides là dạng EPS được tổng hợp từ carbohydrate chủ
yếu là dextran, glucan và levan. Trong khi dạng Heteropolysaccharides được tổng hợp
từ nucleotide. Homopolysaccharides chủ yếu được tổng hợp từ loài lên men dị hình như
L. pontis, L. frumenti, L. sanfranciscensis và L. reuteri. Heteropolysaccharides được
tổng hợp với số lượng ít, khoảng 0.1 – 1.5 g/l bởi những loài lên men đồng hình như L.
kefiranofaciens, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. paracasei, L. rhamnosus, L.
helveticus, và L. sakei
3.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi khuẩn
lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau.
Để sinh trưởng bình thường chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa
các nguyên tố cơ bản như carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và
lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ,
các chất sinh trưởng…
3.4.1. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate từ các monosaccharide
(glucose, fructose) và các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các
polysaccharide (tinh bột, dextrin).
Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế
bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric,
lactic, pyruvic, fumaric, acetic,..
3.4.2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
21
Đồ án tốt nghiệp
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi
khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ.
Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn
nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao
thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone… Hiện nay cao nấm
men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. tuy nhiên ở quy mô
công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
3.4.3. Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên
rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả
năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các
chất chứa vitamin thường được sử dụng như dịch chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay
dịch tự phân nấm men.
3.4.4. Nhu cầu các chất hữu cơ khác
Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác
cho sự phát triển như các base nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có ảnh
hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic.
Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần
môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic.
Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng
đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các
muối acetate để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.
3.4.5. Nhu cầu các muối vô cơ khác
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối
vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu
huỳnh, magie, mangan. Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức
22
Đồ án tốt nghiệp
năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế
bào.
3.4.6. Nhu cầu dinh dưỡng oxy
Vi khuẩn lactic có khả năng sống được trong môi trường có oxy hay không có oxy.
Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với
trong điều kiện kị khí.
Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều
kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành
CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP
Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ
chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn.
3.5. Quá trình trao đổi chất
Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc
lên men lactic. Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên men
carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác
và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường). LAB có khả
năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose…),
disaccharide (lactose, saccharose…); pentose (arabinose, xylose, ribose…) và các hợp
chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy
nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao
đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau.
Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai
nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 1.2).
- Lên men lactic đồng hình
23
Đồ án tốt nghiệp
Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra
chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di-
acetiyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:
→
C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J
Con đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas pathway)
được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli,
Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase
để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3-
phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo
thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được oxy
hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ
yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình.
-
Lên men lactic dị hình Một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đường
pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose monophosphate, con đường 6-
phosphogluconate. Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo
6-phosphogluconate. Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục
chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate. GAP được
tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic.
Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo
thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này ngoài sản phẩm acid
lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic,
acid succinic... thì nó được gọi là lên men lactic dị hình.
Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:
24
→
Đồ án tốt nghiệp
C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH +
C2H5OH +CO2
Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic
và acid acetic 10% các loại khí 20%.... đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự
tích luỹ một lượng ít acid foocmic. Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo
thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn
so với lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học
người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị
hình.
Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường
glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK. Tuy nhiên
nó không phải dúng cho tất cả các trường hợp (Owen R. Fennema et al. 2004).
25
Đồ án tốt nghiệp
Hình 1.2: Con đường lên men Glucose
26
Đồ án tốt nghiệp
Chú thích hình 1.7
(A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB)
(B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase)
Các enzyme tham gia vào quá trình : 1. Glucokinase; 2. Fructose-1,6-
diphosphate aldolase; 3. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4. Pyruvate
kinase; 5. Lactate dehydrogenase; 6. Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7. 6-
phosphogluconate dehydrogenase; 8. Phosphoketolase; 9. Acetaldehyde
dehydrogenase; 10. Alcohol dehydrogenase.
Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động.
Sản phẩm chuyển hoá Phương thức hoạt động
Ngăn cản sự khử nhóm carboxyl, Carbon dioxide giảm tính thấm của màng
Diacetyl Phản ứng với protein gắn arginine
Hydrogen peroxide/ Lactoperoxidase Oxy hoá các protein cơ bản
Acid lactic bị phân ly đi xuyên qua
màng, làm thấp pH nội bào. Nó gây Acid lactic trở ngại quá trình chuyển hoá như
oxi hoá khử phosphor.
Ảnh hưởng đến màng, tổng hợp Bacteriocin protein và DNA.
27
Đồ án tốt nghiệp
3.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn lactic
Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần
đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là
lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp
không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn
•
ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.
Thành phần môi trường nuôi cấy
Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho
hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi
trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa
nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi
khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế
bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn
carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối
khoáng và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với
liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên
• Yếu tố môi trường
men.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh enzyme của tế bào vi sinh vật.
Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme,
làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng
và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn
vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40 0C. Một số có thể sinh trưởng
28
Đồ án tốt nghiệp
dưới 15 0C và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5 0C (Wood B.J.B and
Holzapfel W.H, 1995).
- Ảnh hưởng của pH
Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm, và khi nó
giảm tới mức nào đó nó sẽ ức chế chính sự phát triển của vi khuẩn lactic. Do đó, cần
phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuôi. Để
lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ưu phải nầm giữa 5.5 và 6.0.
- Ảnh hưởng của nồng độ acid
Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn
lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong
môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình
thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người ta cho vào
môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra
thông thường chất đệm này là CaCO3.
- Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men
Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức
độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất
cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men.
3.7. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 3.7.1. Khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic
Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các vi sinh
vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất
kháng sinh (Holzapfel, 1995). Khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế đã được
tìm thấy và công nhận trong nhiều nghiên cứu.
Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như lactic acid và
reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxide hydro, bacteriocine kháng khuẩn và
các loại peptide kháng nấm. Các vi khuẩn lactic đã được biết đến trong nhiều năm và
29
Đồ án tốt nghiệp
đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men. Lợi
ích sức khỏe của vi khuẩn lactic được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường
tiêu hóa của con người (Cogan và cộng sự năm 1995, Hafidh và cộng sự năm 2010).
Giống Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng
khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại một loạt các nấm làm hỏng thực phẩm. Hoạt
động kháng nấm của L. coryniformis ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH
3 – 4.5 (Magnusson và Schnurer, 2001).
Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại
protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L. plantarum
và L. sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng nấm (Corsetti
và cộng sự năm 1998). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy
nhất - Nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic
(Gardiner và cộng sự, 2000; Corcoran và cộng sự, 2004.).
Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đã xác định được một số hợp chất có
tác dụng ức chế chống lại nấm mốc và các loài nấm men khác nhau (Corsetti và cộng
sự, 1998, (Bảng 1.6).; Lavermicocca và cộng sự, 2000;.NikuPaavola và cộng sự, 1999;
Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005).
3.7.2. Các hợp chất kháng nấm
Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998)
Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất
4-hydroxy-phenyllactic acid Lactobacillus plantarum 21B 3-phenyllactic acid
30
Đồ án tốt nghiệp
3-hydroxydecanoic acid
3-hydroxydodecanoic acid Lactobacillus plantarum
3-hydroxytetradecanoic acid MILAB14
3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid
Cyclo(Gly-Leu) Lactobacillus plantarum VTTE- Methylhydantoin 78076 Mevalonolactone
Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, formic- and Lactibacillus sanfranciscensis
n-valeric acid. CB1
Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính axit và
các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác
định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất
proteinaceous, acid béo hydroxyl,…
a b
31
Đồ án tốt nghiệp
c d
e f
g h
32
Đồ án tốt nghiệp
i j
k l
Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của các hợp chất kháng nấm
a) 4-hydroxy-phenyllactic acid, b) 3-phenyllactic acid,
c) 3-hydroxydecanoic acid, d) 3-hydroxydodecanoic acid,
e) 3-hydroxytetradecanoic acid, f) 3-hydroxy cis-dodecenoic acid,
g) Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin mevalonolactone,
h) Caproic acid, i) Propionic acid,
j) Butyric acid, k) Formic aicd,
l) n-valeric acid
33
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất
Tổng hợp của lactic acid và acid acetic là một trong những
nhân tố chủ yếu chịu trách nhiệm về việc bảo tồn sinh học (Trias,
Baneras, Badosa và Montesinos, 2008a). Sản xuất acid trong môi
trường gây ra sự suy giảm pH dẫn đến sự ức chế của nấm, các phân tử
acid gây ra sự phá vỡ màng tế bào. pH thấp sẽ chuyển đổi các phân tử
acid phân ly thành các phân tử acid không phân ly khi pH giảm xuống
dưới pKa của acid tương ứng (Piper, Calderon, Hatzixanthis và
Mollapour, 2001). Các phân tử acid hoạt động ở dạng không phân
tách, vì chúng là lipo-philic và do đó có thể đi qua màng tế bào chất.
Do pH nội bào cao, acid phân ly giải phóng proton và anion (cơ sở
tiếp hợp) làm gián đoạn lực chuyển động của proton màng (Adams và
Hall, 1988).
Acid hữu cơ Sự ức chế tác nhân gây bệnh nấm bằng acid hữu cơ có thể liên
quan đến sự ức chế hoạt động của enzyme, bên cạnh cơ chế phá vỡ
màng tế bào gây ra bởi các cấu tử hoạt động không liên kết của các
acid hữu cơ này (Gerez, Carbajo, Rollan, Torres, và Font de Valdez,
2010). Baek, Kim, Choi, Yoon, Kim (2012) và Lan et al. (2012) báo
cáo việc sản suất hỗn hợp các acid hữu cơ của Leuconostoc và
Weissella sp. việc sử dụng chúng trong việc bảo tồn sinh học để ngăn
chặn sự phát triển của nấm gây hư hỏng thực phẩm.
Acid 3-phenyllactic (PLA) cũng ức chế nấm và vi khuẩn.
PLA ức chế sự phát triển của nấm Candida pulcherrima, C.
parapsilosis và Rhodotorula mucilaginosa (Schwenninger và cộng sự,
2008). Trong số vi khuẩn lactic, hoạt động của PLA từ Lact.
plantarum 21B được chứng minh bởi Lavermicocca et al. (2000) và
34
Đồ án tốt nghiệp
Lavermicocca, Valerio và Visconti (2003) lần đầu tiên chỉ ra rằng
PLA được sinh ra từ Lactobacillus plantarum có khả năng ức chế sự
sinh trưởng và phát triển của 23 chủng nấm mốc thuộc 14 loài của chi
Aspergillus, Penicillium và Fusarium đặc biệt có những loài sinh độc
tố như Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus, Penicillium
roquefoti, Penicillium verrucosum và Penicillium citrium phân lập từ
các sản phẩm như bánh, bột, ngũ cốc. Một số vi khuẩn lactic đã được
chứng minh là có khả năng tổng hợp các axit PLA và 4-hydroxy-
phenyllactic acid (Valerio, Lavermicocca, Pascale và Visconti,
2004).
Acid béo được biết là chất gây ức chế nấm (Hou và Forman,
2000). Bốn loại HFA kháng nấm, cụ thể là 3-(R)-hydroxydecanoic
acid, 3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid,3-(R)-hydroxydodecanoic
acid và 3-(R)-hydroxytetradecanoic acid, đã được phân lập từ dịch
nuôi cấy nổi phía trên của Lact. plantarum MiLAB 14 (Sjogren,
Magnusson, Broberg và Schnurer, 2003). Tất cả các HFA được tổng
hợp trong giai đoạn tăng trưởng logarit. Điều này cho thấy HFA
không xuất hiện từ màng tế bào lysed của tế bào vi khuẩn. Cơ chế Acid béo hoạt động chính xác của hoạt động của HFA không được hiểu rõ. Cơ
chế chung có thể là, chúng thể hiện hoạt động giống như chất tẩy rửa
và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn. Do đó, tính thấm của màng tăng lên
và giải phóng các chất điện giải nội bào và protein từ tế bào nấm.
Lact. sanfrancisco CB1 từ bột chua sản xuất axit butyric,
caproic, propionic và valeric ức chế sự phát triển của Fusarium sp.,
Penicillium sp., Aspergillus sp. và Monilia sp. (Corsetti, Gobbetti,
Rossi và Damiani, 1998). Trong số này, axit caproic là hợp chất
35
Đồ án tốt nghiệp
kháng nấm chính hoạt động kết hợp với các axit khác.
Gần đây, Ryu, Yang, Woo và Chang (2014) đã tinh chế thuốc
kháng nấm 3-hydroxy-decanoic acid, 5-oxododecanoic acid và 3-
hydroxy-5-dodecenoic từ Lact. plantarum phân lập từ kim chi.
Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và
sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và
phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm
chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và
Fusarium sp.. Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này
(Roy và cộng sự, 1996)
Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Các chủng
kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti và
cộng sự, 1996), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phô mai và sữa (Roy
và cộng sự, 1996).
Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính axit và
các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác
định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất
proteinaceous, acid béo hydroxyl,…
3.7.3. Các hợp chất kháng khuẩn khác
Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học do vi khuẩn tiết ra, có thể tiêu diệt hoặc
ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác có quan hệ họ hàng với chúng.
Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhóm vi khuẩn đa
dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng, đặc điểm
sinh hóa và nguồn gốc gene (Klaenhamme, 1993).
Bacteriocin có bản chất là peptide kháng khuẩn sinh ra để chống lại vi khuẩn khác,
vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Các
36
Đồ án tốt nghiệp
tế bào sản xuất thì miễn dịch với hoạt tính bacteriocin (TS. Vũ Thị Lâm An, 2013).
Bacteriocin được sinh ra ở cả vi khuẩn Gram dương và âm, nhưng bacteriocin từ vi
khuẩn lactic được nghiên cứu nhiều nhất do tính hiệu quả, mức độ an toàn và khả năng
ứng dụng làm chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên trong công nghiệp thực phẩm.
Bacteriocin không phải thuốc kháng sinh; do chúng là các peptide được tổng hợp
bởi ribosome vi khuẩn, không phải chất chuyển hóa thứ cấp nên nhanh chóng bị phân
cắt bởi protease trong hệ thống tiêu hóa của người. Ưu điểm của bacteriocin là có hoạt
tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở nồng độ rất thấp. Tuy nhiên, bacteriocin thường có
phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh. Khác với chất kháng sinh, bacteriocin thường
được dùng trong thực phẩm và không có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn còn chất
kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn. Trên
thế giới bacteriocin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic.
Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi được trình bày trong bảng 1.5.
Đa số các bacteriocin của vi khuẩn LAB có trọng lượng nhỏ (<10 kDa), điện
dương, ổn định nhiệt và có màng thấm peptide và chia thành 3 lớp:
- Lớp I (Lantibiotics): Là những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chứa những amino
acid hiếm và một số amino acid khử nước. Lantibiotic được tạo thành ở trạng
thái bất hoạt với trình tự leader peptide ở đầu N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong
quá trình trưởng thành để phóng thích phân tử peptide hoạt hóa.
- Lớp II (Non-lantibiotics): Các bacteriocin nhỏ (< 10 kDa), không chứa
Lanthionine, tương đối ổn định nhiệt và có màng peptide.
- Lớp III: Đây là nhóm các bacteriocin lớn (> 30 kDa), có tính thấm nước, không
ổn định nhiệt và không được nghiên cứu rộng rãi.
- Lớp IV: Là các đại phân tử, kị nước, thường là những phức vì còn có thêm chất
khác.
• Ứng dụng bacteriocin
37
Đồ án tốt nghiệp
- Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thường là vi khuẩn lactic – LAB: Lactic acide
bacteria) để tạo bacteriocin. Trong trường hợp này, khả năng LAB sinh trưởng
và tạo bacteriocin trong sản phẩm là quyết định.
- Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực
phẩm.
- Sử dụng bán thành phẩm lên men trước đó với một chủng sinh bacteriocin như
là một thành phần trong quá trình chế biến thực phẩm.
- Một lựa chọn mới hiện nay trên cơ sở dạng thứ hai là dùng màng polyethylen
hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm.
Bảng 1.5: Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M. P. Zacharof, 2012)
Chủng Bacteriocins Tác động
Nisin Vi khuẩn gram dương
Clostridium spp.
Listeria monocytogenes
Staphylococcus aureus
Lactococcus lactis spp. Lacticin 3147 Staphylococcus dysgalace
Enterococcus feacalis
Propionibacterium acne
Streptococcus mutans
L. acidphilus spp. Acidophin CH5 Vi khuẩn gram dương
Pediococcus
Carnobacteria L. plantarum spp. Plantaricin EF, Plantaricin W, Plantaricin JK, Plantaricin S
Clostiridia
38
Đồ án tốt nghiệp
Listeria monocytogenes Leucocin A Leuconostoc gelidum Enterococcus feacalis
Lactocin 705 Listeria monocytogenes
L. casei spp.
Các vi khuẩn sinh acid lactic còn có khả năng ức chế sự phát triển gây bệnh thông
qua một số các sản phẩm biến dưỡng ngoài bacteriocins. Khả năng đối kháng của các
sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB được trỉnh bày trong bảng 1.6.
Bảng 1.6: Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB.
(Holzapfel và cộng sự, 1995)
Sản phẩm Các sinh vật ảnh hưởng
Acid lactic Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài nấm
Acid acetic Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối rửa
Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức H2O2 ăn giàu protein
Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản Hệ thống lactoperoxidase với H2O2 phẩm làm từ sữa)
Lysozyme Vi khuẩn gram dương
Reuterin (3-OH- propoonaldehyde) Nấm mốc, nấm men
Diacetyl Vi khuẩn gram âm
Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau
39
Đồ án tốt nghiệp
Chất ức chế tăng trưởng nấm có tầm quan trọng cả trong việc kiểm soát tác nhân
gây bệnh của con người và động vật, và trong công tác phòng chống nấm mọc trong
thực phẩm và các vật liệu khác. Các phương thức hoạt động của kháng sinh chống nấm
hiện nay là rất quan trọng cho sự ức chế nấm. Nhiều chất trong số các chất này được
dành riêng cho sử dụng lâm sàng nhưng một số đang được sử dụng trong sự kiểm soát
của nấm gây bệnh thực vật. Thuốc kháng sinh được xác định là chất được sản xuất bởi
các vi sinh vật có tác dụng diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác ở nồng độ
thấp.
3.8. Ứng dụng của vi khuẩn lactic
Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính
kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều
trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và
nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm.
3.8.1. Trong công nghiệp
Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu acid lactic. Có vi chua dễ chịu và có
đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch
quả, mứt. Chúng được dùng để axit hóa rượu vang và hoa quả nghèo axit. Ngoài ra còn
được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt , nhuộm, sơn và chất dẻo.
3.8.2. Trong nông nghiệp và môi trường
Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium loại nấm gây bệnh
quan trọng trong nông nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu đi và đây là
cơ hội gây bệnh cho cây trồng.
Các chế phẩm EM hay chế phẩm vi sinh hữu cơ bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó
có sự góp mặt của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng
suất cây trồng. Giải quyết vấn đề gây ô nhiễm môi trường.
40
Đồ án tốt nghiệp
Trong nông nghiệp vi khuẩn lactic được sử dụng để ủ chua thức ăn gia súc cho mục
đích sử dụng lâu dài và làm tăng giá trị dinh dưỡng.
Ở Việt Nam, gần đây người ta không chỉ thành công trong lên men lactic để bảo
quản thức ăn cỏ xanh cho trâu, bò mà còn thành công trong việc bảo quản cá, tôm và
sản phẩm phụ, phế phẩm gây ra khi thiếu hoặc không có phương tiện bảo quản chuyên
chở, chế biến kịp thời. Do đó đã hạn chế được các sản phẩm phụ, phế phẩm của các xí
nghiệp chế biến thuỷ hải sản, các lò mổ…
3.8.3. Trong y dược
Vi khuẩn lactic được trong y học để chữa bệnh đường ruột, dùng trong phẫu thuật
chỉnh hình, nha khoa, bệnh phụ khoa….
3.8.4. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm
Khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất
hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm,
làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất
cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn,
độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có
tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy,
2007). Vi khuẩn lactic còn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong
bảo quản sinh học. Ngoài ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt
tính kháng nấm như reuretin, acid lactic,...
Vi khuẩn lactic được sử dụng làm dưa muối, làm quả chua mà không mất màu tự
nhiên của quả. Dùng trong sản xuất đậu phụ hay lên men sữa.
41
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh Viện Khoa Học Ứng Dụng
Hutech Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.
2.2. Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ 1/2018 đến 7/2018.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu
Các giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacilus sp. (L5), Lactobacillus sp. (L3),
Lactobacillus sp. (L2N) và nấm Aspergillus sp. (CDP1) do phòng thí nghiệm vi sinh
Viện Khoa Học Ứng Dụng Hutech Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí
Minh cung cấp.
Hạt đậu phộng và bắp được mua tại chợ Thị Nghè, quận Bình Thạnh, Thành Phố
Hồ Chí Minh.
Hạt đậu nành mua tại siêu thị, Thành phố Hồ Chí Minh.
Bắp cải và giá đậu được mua ở chợ, Thành phố Hồ Chí Minh.
2.3.2. Hóa chất sử dụng
Các hoá chất dùng để pha môi trường MRS – broth, MRS cải tiến và môi trường
PDA.
Các hoá chất dùng để pha các loại thuốc thử: Lugol, Phenolphthalein, Crystal
violet
NaOH 0.1N
Cồn 96°, 70°
Nước cất
- Môi trường sử dụng:
Môi trường MRS broth, MRS agar cải tiến để nuôi cấy vi khuẩn lactic.
Môi trường PDB, PDA để nuôi cấy các chủng nấm mốc.
42
Đồ án tốt nghiệp
2.3.3. Thiết bị
Tủ cấy vi sinh (Brlad France)
Tủ ủ (Memmert Germany)
Tủ lạnh Toshiba
Tủ sấy (Memmert Germany)
Máy ly tâm (Tuttligen Germany)
Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)
Autoclave (Memmert - Đức)
Cân phân tích (Orbital Germany) Bếp từ (Billy – England)
Máy nước cất (Branstead USA)
Bể điều nhiệt
2.3.4. Dụng cụ
Ống nghiệm, đĩa petri thuỷ tinh, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong,
đũa thuỷ tinh, chai thủy tinh 100 ml.
Pipet thuỷ tinh 5 ml, 10 ml, 20 ml, pipetman 100 – 1000 µl.
Que cấy, que trang, kẹp gắp thạch, que đục lỗ thạch, đèn cồn, eppendorf 1 ml, ống
falcon 50 ml.
Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy lọc, giá đỡ ống.
2.4. Phương pháp luận
2.4.1. Mục tiêu đồ án
Khảo sát khả năng dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N trong bảo
quản và xử lý của hạt đậu phộng.
2.4.2. Nội dung
Hoạt hóa các chủng lactic Lactobacilus sp. (L5), Lactobacillus sp. (L3),
Lactobacillus sp. (L2N) và chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1.
Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L2N.
43
Đồ án tốt nghiệp
Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với Aspergillus sp.
CĐP1.
Khảo sát môi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic.
Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic đến khả năng nảy mầm của
các loại hạt giống.
Khảo sát khả năng bảo quản các loại hạt giống khỏi Aspergillus sp. CĐP1 của dịch
nuôi cấy vi khuẩn lactic.
Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên men lactic đến sự phát triển
của hạt giống.
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu
44
Đồ án tốt nghiệp
Chủng nấm Vi khuẩn lactic
mốc CĐP1 L5, L2N, L3
Khảo sát hình thái, sinh lý Khảo sát khả năng phát
hóa triển, hình thái
Khảo sát khả năng: Khảo sát môi trường lên sinh acid lactic, sinh men thích hợp (MRS borth, IAA, phân giải lân, Bắp cải, Giá đậu) tạo màng biofilm,
đối kháng nấm
Chọn môi trường
hợp ba chủng lactic bảo
Khảo sát khả năng phối
lên men quản hạt đậu phộng
Tỷ lệ phối trộn L5:L3:L2N lần lượt 1:1:1,
1:1:2, 1:2:1 x Không xử lý nhiệt, 85 0C -10
phút, 100 0C - 3 phút x Không trung hòa,
Tỷ lệ nảy pH5, pH6
mầm, chiều
Ứng dụng vi khuẩn lactic kích thích nảy dài, khối
mầm, tăng trưởng cây đậu phộng lượng thân lễ,
độ khỏe mầm Đề nghị quy trình sản xuất hạt giống đã
xử lý
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu
45
Đồ án tốt nghiệp
2.5.2. Khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic
Phương pháp khảo sát độ thuần khiết của các chủng vi khuẩn lactic Lactobacilus
sp. (L5), Lactobacillus sp. (L3), Lactobacillus sp. (L2N) và chủng nấm mốc
Aspergillus sp. CĐP1.
Chủng vi
khuẩn lactic
Tăng sinh trong môi trường
MRS Broth
37 0C,24 h
Quan sát hình Cấy truyền sang MRS agar thái khuẩn lạc
Sinh IAA,
Phân giải lân, Khảo sát đặc điểm nuôi cấy
Các thử Tạo Biofilm của chủng vi khuẩn lactic
nghiệm sinh
hóa, sinh lý
Thích hợp tạo
chế phẩm
Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic
46
Đồ án tốt nghiệp
Các chủng vi khuẩn sinh acid lactic và nấm mốc có khả năng bị suy yếu hoặc
nhiễm các loài vi khuẩn khác, chính vì thế cần phải được hoạt hoá, khảo sát để đánh
giá sự thuần khiết.
Ba chủng vi khuẩn sinh lactic L5, L2N, L3 có khả năng kháng nấm cao, sinh acid
lactic mạnh được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực
Phẩm – Môi Trường của Trường Đại Học Công Nghệ Hồ Chí Minh.
Chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong môi trường MRS Broth và ủ ở 37 °C
trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành cấy chuyển trên MRS Agar và ủ 1 ngày ở 37 °C, sau
khi quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuôi cấy ở hai điều kiện lắc và
không lắc, đem thử nghiệm thí nghiệm sinh lý, sinh hoá, khả năng sinh IAA, phân giải
P và khả năng tạo biofilm.
2.5.2.1. Nhuộm gram
Mục đích: Giúp ta phân loại được 2 nhóm lớn: Vi khuẩn Gram dương (Gram-
positive) bắt màu tím và Vi khuẩn Gram âm (Gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra
nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống.
Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến
- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi
cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. - Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Việc cố định
nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm
vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống. - Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 30 giây, rửa nước, để khô trong
không khí.
47
Đồ án tốt nghiệp
- Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.
Kết quả: Vi khuẩn gram dương bắt màu tím, gram âm bắt màu hồng.
2.5.2.2. Nhuộm bào tử
Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khó bắt màu,
chứa nhiều lipid). Đầu tiên xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và acid.
Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh.
Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó
tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ
có màu xanh và tế bào có màu hồng.
Các vi khuẩn Gram dương thu được từ bước trên được tiếp tục kiểm tra khả năng
sinh bào tử. Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già để nhuộm bào tử. Từ kết quả thu
được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương không sinh bào
tử.
Tiến hành: Phương pháp Schaeffer – Fulton và sử dụng dịch nuôi cấy sau 7 ngày. - Nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 – 7 ngày.
- Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram.
- Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, rửa nước.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
- Soi kính: dùng vật kính dầu 100x
Kết quả: Bào tử bắt màu lục, tế bào bắt màu hồng. Chú ý: Phân biệt bào tử với các
hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục
2.5.2.3. Thử nghiệm Catalase
Mục đích: Kiểm tra khả năng phân hủy H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản
sinh enzyme catalase.
48
Đồ án tốt nghiệp
Các chủng vi khuẩn thu được sau bước nhuộm acid được tiến hành thử nghiệm
Catalase. Trong thí nghiệm này, chỉ có những chủng vi khuẩn cho catalase âm tính là
có khả năng là vi khuẩn lactic.
Tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính.
- Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt
H2O2 trên phiến kính.
Kết quả: Vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase nếu xuất hiệt bọt khí sủi bọt
mạnh và nhanh, âm tính khi không có hiện tượng xảy ra.
2.5.2.4. Thử nghiệm khả năng lên men đường
Mục đích: Kiểm tra khả năng lên men các loại đường khác nhau của vi khuẩn.
Tiến hành: Môi trường MRS Broth lần lượt thay thế đường glucose thành các loại
đường (Sucrose, D-galactose, D-glucose, D-malnitol, Fructose, D(+)manose) cần kiểm
tra, bổ sung Bromocresol green và có ống durham, hấp khử trùng và cấy vi khuẩn vào,
ủ ở 37°C trong 24 giờ.
Kết quả: Nếu môi trường đổi màu, đục và có bọt khí bên trong ống Durham thì
chủng vi khuẩn đó lên men dị hình. Đối với những ống nghiệm không có bọt khí trong
ống Durham thì cần kiểm tra lại bằng cách đốt đỏ que cấy và đặt sát bề mặt môi
trường, nếu thấy có bọt khí nổi lên thì chủng vi khuẩn đó cũng lên men có sinh khí yếu.
Đánh giá khả năng lên men qua mức độ đổi màu môi trường.
Môi trường màu vàng: lên men mạnh (+++)
Môi trường màu xanh lá: lên men trung bình (++)
Môi trường màu xanh dương nhạt: lên men yếu (+)
Môi trường màu lam đậm (không đổi màu): không lên men (-)
49
Đồ án tốt nghiệp
2.5.2.5. Khả năng di động
Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm
0,5 – 0,7% agar.
Vì vi khuẩn lactic không có khả năng di động, chỉ mọc theo đường cấy thẳng đứng
trong ống chứa môi trường thạch mềm và không làm đục môi trường xung quanh nên
trong thử nghiệm này, ta loại bỏ được các vi khuẩn di động không phải là vi khuẩn
lactic, chúng sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh.
Tiến hành:
- Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường
thạch bán lỏng.
- Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-3 ngày, có
khi lâu hơn.
Kết quả: Vi khuẩn có khả năng di động khi đường cấy lan ra, vi khuẩn chỉ mọc
theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động, một vài trường hợp do vi khuẩn
sinh hơi nên thạch bị nứt.
2.5.3. Khả năng phân giải lân
Mục đích:
Các chủng khác nhau sẽ có khả năng phân giải phosphate khó tan khác nhau. Do
đó, để thu được chủng có đặc tính phân giải phosphate khó tan tốt ứng dụng được trong
thực tiễn nông nghiệp, cần thiết đánh giá hoạt tính phân giải phosphate khó tan của
từng chủng VSV.
Vi sinh vật phân giải hợp chất phosphor khó tan là vi sinh vật, thông qua hoạt động
của chúng tương tác với các hợp chất phosphor khó tan được chuyển hóa thành dễ tiêu
đối với cây trồng (cơ chế tiết acid hữu cơ hoặc enzyme phosphatase). Vi sinh vật phân
giải hợp chất khó tan tạo vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc (vòng phân giải)
trên môi trường chứa nguồn phosphor duy nhất là Ca3(PO4) hoặc lecithin (chủ yếu là
phosphatidylcholine).
50
Đồ án tốt nghiệp
3-) có trong dịch nuôi cấy. Nồng độ orthophosphate càng cao
Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate của các chủng VSV dựa trên nồng độ
orthophosphate (PO4
chứng tỏ lượng phosphate khó tan bị phân giải càng nhiều.
Nồng độ orthophosphate được xác định bằng phương pháp Stannous Chloride.
Trong môi trường acid, orthophosphate trong mẫu sẽ phản ứng với ammonium
molypdate (AM) tạo thành molypdophosphoric acid màu vàng, acid này sau đó bị khử
bởi SnCl2 và sản phẩm khử là phức chất màu xanh dương. Phức màu xanh có bước
sóng hấp thụ cực đại ở 690nm.
- Nuôi cấy vi khuẩn lactic trên môi trường MRS Broth, trong 24 giờ ở điều kiện lắc.
- Kiểm soát dịch tăng sinh OD 600nm = 0.8.
- Hút 1ml dịch nuôi cấy và chuyển vào 20ml môi trường P đã hấp khử trùng.
- Kiểm tra khả năng phân giải phosphate khó tan sau 3, 5, 7 ngày bằng phương
pháp Stannous Chloride: Lấy dịch nuôi cấy VSV, đem ly tâm 10000 vòng/phút
trong 10 phút, thu dịch trong, bổ sung thêm 4ml AM, 10 giọt dung dịch SnCl2.
Định mức tới vạch 50ml bằng nước cất, đảo đều bình, đợi 10-12 phút, đo
OD690nm.
2.5.4. Khả năng sinh IAA
Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng VSV dựa trên nồng độ IAA có trong
dịch chiết nuôi cấy vi khuẩn. Nồng độ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ
khả năng sinh IAA của VSV càng mạnh. Nồng độ IAA được xác định bằng phương
pháp so màu trên máy quang phổ với thuốc thử Salkowski ở bước sóng 530nm.
Thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000v/p trong 15 phút, lấy 1ml dịch trong cho vào
ống nghiệm dán băng keo đen, bổ sung 2ml thuốc thử Salkowski, lắc đều, để 15 phút
trong tối ở nhiệt độ phòng chờ phản ứng xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo OD ở bước
sóng 530nm.
Tạo đường chuẩn:
51
Đồ án tốt nghiệp
• Cân 0.01g IAA bổ sung vào 100ml môi trường MRS Broth ban đầu, thu được
dung dịch IAA có nồng độ 100mg/l. Pha loãng để thu được dung dịch IAA ở
các nồng độ 5, 10, 15, 20, 25 mg/l.
• Hút 1ml mỗi nồng độ IAA ở trên cho vào ống nghiệm được dán băng keo đen,
bổ sung vào mỗi ống 2ml thuốc thử Salkowski, lắc đều, để 15 phút trong tối ở
nhiệt độ phòng chờ phản ứng xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo OD ở bước sóng
530nm.
2.5.5. Khả năng tạo màng Biofilm
Mục đích: Xác định khả năng tạo màng biofilm của vi khuẩn.
Tiến hành:
- Pha loãng dịch nuôi cấy 1:100 trong môi trường MRS Broth mới.
- Phối 5ml vào 1 ống falcon (15ml), mỗi chủng 8-10 ống.
- Ủ ở 37°C, qua đêm.
- Đổ bỏ dịch trong, lắc nhẹ cho trôi hết môi trường.
- Rửa nhẹ bằng nước cất vô trùng (không được làm khuấy đảo lớp tế bào), đổ bỏ
nước. Lặp lại như vậy 3 lần.
- Cố định tế bào bằng cách đặt ống falcon trong tủ sấy 80°C, trong 30 phút.
- Thêm 6.5ml dung dịch Crystal Violet (CV) 0.1%, để ở nhiệt độ phòng 10 – 15
phút.
- Rửa bằng nước cất vô trùng, lắc và dậm lên 1 tờ khăn giấy để loại bỏ tế bào dư
và thuốc nhuộm.
- Lập úp ống để khô.
- Thêm 6.5ml acid acetic 30% (trong nước cất) vào ống falcon để hoà tan CV.
- Để ở nhiệt độ phòng từ 10 – 15 phút.
- Chuyển vào trong ống cuvette.
- Đo quang phổ ở bước sóng 550nm. Mẫu blank sử dụng là acid acetic 30%
2.5.6. Chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1.
52
Đồ án tốt nghiệp
Chủng nấm Aspergillus sp.
CĐP1
370C,24h
Tăng sinh trong môi trường PDB
Cấy điểm 370C,72h
Đĩa peptri MRS Quan sát hình Đĩa peptri PDA agar cải tiến thái, sợi nấm
của nấm
Đo đường kính tăng trưởng
Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát khả năng phát triển của chủng nấm CĐP1
Chủng nấm CĐP1 phân lập từ hạt đậu phộng (CĐP1) được lấy từ phòng thí
nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường trường đại học
Công Nghệ Hồ Chí Minh, người thực hiện tiến hành kiểm tra sự phát triển của các
chủng nấm, vì chủng nấm mốc cần khoẻ mạnh để làm đề tài.
Chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 được nuôi cấy trong cấy điểm trên đĩa môi
trường PDA và MRS Agar cải tiến đã được hấp khử trùng và ủ ở 37°C trong vòng 72
giờ. Tiến hành đo đường kính vòng phát triển của nấm, so sánh khả năng phát triển của
chủng nấm mốc trên 2 loại môi trường.
53
Đồ án tốt nghiệp
Quan sát hình thái chủng nấm dưới kính hiển vi điện tử và thực hiện phương pháp
phòng ẩm để quan sát vi thể. Xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin và xác định mật
độ.
2.5.6.1. Khảo sát sự phát triển trên các loại môi trường
Mục đích: Kiểm tra môi trường MRS Agar cải tiến không làm ảnh hưởng đến sự
phát triển của nấm mốc. Thích hợp sử dụng để thực hiện các thí nghiệm về sau.
Tiến hành:
- Chủng nấm mốc được cấy điểm sang đĩa môi trường PDA đã được hấp khử
trùng và ủ ở 37°C trong vòng 72 giờ.
- Sau đó dùng que đục, đục lỗ thạch nấm và chuyển từ môi trường PDA sang môi
trường MRS Agar cải tiến, ủ ở 37°C trong vòng 72 giờ.
- Tiến hành đo đường kính vòng phát triển của nấm.
2.5.6.2. Khảo sát hình thái
Quan sát dưới kính hiển vi và thực hiện phương pháp phòng ẩm.
Tiến hành
- Chuẩn bị môi trường: Đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) môi trường PDA
lên đĩa petri. Khi thạch đông cứng dùng dao mổ vô trùng cắt thành từng mẫu
hình vuông 1cm x 1cm.
- Chuẩn bị đĩa petri, lame, lamelle, giấy lọc, tất cả đều được vô trùng bằng cách
sấy 1600C trong vòng 1h hoặc hấp vô trùng.
- Đặt khối thạch (1cm2) lên lame.
- Dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, lấy một ít sinh khối nấm cấy lên
4 góc khối thạch. Sau đó đậy lamelle lên khối thạch rồi cho vào đĩa petri có lót
sẵn giấy thấm.
- Nhỏ giọt nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa.
- Đậy nắp đĩa petri và ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 – 3 ngày.
54
Đồ án tốt nghiệp
- Lấy khẽ lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch có sẵn một giọt
Methylene blue.
- Lấy nhẹ nhàng khối thạch ra khỏi lame, nhỏ một nhọt Methylene blue và đặt
một miếng lamelle sạch lên.
- Sử dụng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 10X và 40X để quan sát.
- Các thao tác thực hiện như trên được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn
2.5.7. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc
Aspergillus sp. CĐP1.
Thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định khả năng kháng nấm mốc Aspergillus
sp. CĐP1 của vi khuẩn lactic in vitro.
Chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37°C trong
24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%.
Dịch nuôi cấy
chủng LAB
Cấy 2 đường
Đục lỗ
Nấm mốc trên Đĩa petri MRS Agar cải tiến
72 giờ
PDA 370C,
Đo đường kính vòng phát Tỷ lệ ức chế nấm mốc triển của nấm
Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm
mốc Aspergillus sp. CĐP1.
55
Đồ án tốt nghiệp
Tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm.
- Môi trường sử dụng là MRS Agar cải tiến.
- Chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 được đục từ môi trường PDA đã cấy
trước đó 3 ngày và đặt vào tâm đĩa. Ủ ở 37 0C trong 24 giờ.
- Dùng que cấy ria 2 đường song song nhau, cách thành đĩa 1,5 cm.
- Ủ ở 37 0C trong 72 giờ. Sau đó đo đường kính vòng nấm và tính tỉ lệ kháng
nấm. Công thức tính tỉ lệ kháng nấm được tính theo W.S. Abbott.
Tỉ lệ kháng nấm (%) = × 100% Dđối chứng − Dthí nghiệm Dđối chứng
Trong đó: Dđối chứng – Đường kính vòng nấm đĩa đối chứng (mm).
Dthí nghiệm – Đường kính vòng nấm đĩa thí nghiệm (mm).
2.5.8. Phương pháp khảo sát môi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn
lactic
Nhằm tìm kiếm môi trường thích hợp cho sự phát triển và sản xuất chế phẩm sinh
học. Các loại môi trường khác nhau được sử dụng để khảo sát và so sánh với môi
trường MRS Broth gồm có:
- MRS Broth
- Nước giá: 500 g giá được nấu với 1 L nước trong 15-20 phút, bổ sung 15 g
đường và 12 g pepton. Đem hấp khử trùng.
- Nước bắp cải: 500 g bắp cải được nấu với 1 L nước trong 15-20 phút, bổ sung
15 g đường và 12 g peptone. Đem hấp khử trùng.
Chủng vi khuẩn lactic L5, L2N và L3 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth
trong 24 giờ, ở 37 0C. Sau đó chuyển qua các môi trường khảo sát, tỉ lệ cấy giống 5%.
Tiến hành so sánh mật độ tế bào, khả năng sinh acid lactic của các chủng LAB giữa
các loại môi trường. Đồng thời kiểm tra khả năng: Kháng nấm, sinh IAA, phân giải P
và tạo biofilm để khẳng định vi khuẩn vẫn còn duy trì các khả năng mong muốn.
2.5.9. Xác định acid lactic
56
Đồ án tốt nghiệp
Mục đích: Xác định hàm lượng acid tổng bằng phương pháp quy về acid lactic để
xác định hàm lượng acid lactic sinh ra từ chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm nhằm. Hàm
lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự
đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein.
Tiến hành: Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên nuôi cấy vi khuẩn, thêm 2 – 3 giọt
Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu
hồng nhạt. Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8,0 và ghi kết quả.
Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic như sau
% Acid lactic = × 100% V1 × K V2
Trong đó:
V1 – Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml).
K – Hệ số đổi ra acid tương ứng, với acid lactic là 0,009.
V2 – Thể tích dịch nuôi cấy đem đi chuẩn độ (ml).
Đường chuẩn vi khuẩn lacti
2.5.10. Xác định mật độ vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường lỏng trong 24 giờ. Ly tâm
4000 vòng/phút trong 15 phút. Thu sinh khối. Rửa lại bằng nước cất để sạch môi
trường, đem ly tâm 4000 vòng/phút. Lặp lại 3 lần. Đưa về thể tích ban đầu bằng nước
muối sinh lý 0.9%. Pha loãng theo hệ số 2n. Đo OD 600 nm, ống trắng là nước muối
sinh lý 0.9%. Dựng đường chuẩn
57
Đồ án tốt nghiệp
37 0C, 24 giờ
Chủng vi khuẩn lactic
Ly tâm 400 vòng/phút trong
Pha loãng ra các nồng độ bằng
Tăng sinh trong môi trường lỏng
15phút môi trường lên men
Thu sinh khối, hòa tan bằng Phương pháp bản
nước muối sinh lý giọt
Đo OD600nm Đếm khuẩn lạc
Đường chuẩn tế bào
Hình 2.5: Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn
Đĩa petri chứa môi trường MRS Agar được đặt trong tủ sấy qua đêm, nhiệt độ
37°C để khô mặt môi trường.
Chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong môi trường lên men.
Tiến hành pha loãng bằng eppendorf thành các nồng độ thích hợp.
Hút 10µl dịch pha loãng và nhỏ lên đĩa petri. Lặp lại 3 lần, 4 nồng độ trên 1 dĩa
petri.
Ủ đĩa ở 37°C, trong 24 tiếng. Đếm số khuẩn lạc. Công thức tính số tế bào vi khuẩn.
58
Đồ án tốt nghiệp
A (cfu/ml) = N n1 × V × f1 + ⋯ + ni × V × fi
Trong đó: A – Số tế bào vi khuẩn trong 1ml.
N – Tổng số khuẩn lạc.
n – Số lượng cấy tại độ pha loãng.
V – Thể tích (ml) cấy vào môi trường.
f – Độ pha loãng tương ứng.
Xác định mật độ tế bào (tb/ml): Sử dụng kết quả A và chia cho các hệ số pha loãng
2n, để ra được mật độ tế bào tại từng độ pha loãng đó. Lấy log.
Dựng đường tương quan của 5 giá trị OD600nm (có OD < 0.4) và log (tb/ml).
2.5.11. Phương pháp khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc
Aspergillus sp. CĐP1
Sơ đồ thí nghiệm được trình bày như trên hình 2.6
59
Đồ án tốt nghiệp
Các chủng VK lactic 108 cfu/ml
Hạt đậu Điều chỉnh pH, Phối theo tỷ lệ phộng xử lý nhiệt độ
Ngâm 15 phút
Ngâm
Khử trùng bề mặt
Làm khô
Vào chai thủy tinh
100 ml vô trùng
Bảo quản ở nhiệt độ phòng và
theo dõi tơ nấm mọc theo các
ngày
Hình 2.6: Sơ đồ khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp.
CĐP1
Chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong môi trường lên men chọn được ở nội
dung 2 ở 37 0C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5 %, mật độ tế bào được đưa về 108
cfu/ml, bổ sung thêm 0.1 % Tween 80 và đem xử lý ở các điều kiện khác nhau như trên
bảng 2.1
60
Đồ án tốt nghiệp
Hạt đậu phộng được chọn lựa kĩ càng, đồng đều nhau, không có hư hỏng, nứt hạt.
Hạt được rửa sạch bằng nước cất và để ráo. Sau đó cứ 50 g hạt mỗi loại được ngâm
trong 120 ml dung dịch. Có công thức phối trộn và xử lý như sau:
Thí nghiệm 1: Dịch nuôi cấy không trung hoà pH.
Đối chứng 1 Nước cất
Đối chứng 2 Daconil 0.5g/l
1 Dịch nuôi cấy L5 không gia nhiệt
1 Dịch nuôi cấy L3 không gia nhiệt Nghiệm thức 1 1 Dịch nuôi cấy L2N không gia nhiệt
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 không gia nhiệt
2 Dịch nuôi cấy L3 không gia nhiệt Nghiệm thức 2 1 Dịch nuôi cấy L2N không gia nhiệt
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 không gia nhiệt
1 Dịch nuôi cấy L3 không gia nhiệt Nghiệm thức 3 2 Dịch nuôi cấy L2N không gia nhiệt
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 4 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút
2 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 5 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút
0.1% Tween 80
61
Đồ án tốt nghiệp
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 6 2 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 7 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút
2 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 8 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 9 2 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 10 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút
2 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 11 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 12 1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút
62
Đồ án tốt nghiệp
2 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút
0.1% Tween 80
Thí nghiệm 2: Dịch nuôi cấy trung hoà pH về 5.0
Đối chứng 1 Nước cất
Đối chứng 2 Daconil 0.5g/l
1 Dịch nuôi cấy L5 không gia nhiệt
1 Dịch nuôi cấy L3 không gia nhiệt Nghiệm thức 1 1 Dịch nuôi cấy L2N không gia nhiệt
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 không gia nhiệt
2 Dịch nuôi cấy L3 không gia nhiệt Nghiệm thức 2 1 Dịch nuôi cấy L2N không gia nhiệt
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 không gia nhiệt
1 Dịch nuôi cấy L3 không gia nhiệt Nghiệm thức 3 2 Dịch nuôi cấy L2N không gia nhiệt
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 4 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút
2 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 5 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút
0.1% Tween 80
63
Đồ án tốt nghiệp
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 6 2 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 7 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút
2 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 8 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 9 2 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 10 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút
2 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 11 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 12 1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút
64
Đồ án tốt nghiệp
2 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút
0.1% Tween 80
Thí nghiệm 3: Dịch nuôi cấy trung hoà pH về 6.0
Đối chứng 1 Nước cất
Đối chứng 2 Daconil 0.5g/l
1 Dịch nuôi cấy L5 không gia nhiệt
1 Dịch nuôi cấy L3 không gia nhiệt Nghiệm thức 1 1 Dịch nuôi cấy L2N không gia nhiệt
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 không gia nhiệt
2 Dịch nuôi cấy L3 không gia nhiệt Nghiệm thức 2 1 Dịch nuôi cấy L2N không gia nhiệt
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 không gia nhiệt
1 Dịch nuôi cấy L3 không gia nhiệt Nghiệm thức 3 2 Dịch nuôi cấy L2N không gia nhiệt
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 4 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút
2 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 5 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút
0.1% Tween 80
65
Đồ án tốt nghiệp
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 65°C trong 15 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 65°C trong 15 phút Nghiệm thức 6 2 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 65°C trong 15 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 7 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút
2 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 8 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 85°C trong 10 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 85°C trong 10 phút Nghiệm thức 9 2 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 85°C trong 10 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút
1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 10 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút
2 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 11 1 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút
0.1% Tween 80
1 Dịch nuôi cấy L5 gia nhiệt 100°C trong 3 phút Nghiệm thức 12 1 Dịch nuôi cấy L3 gia nhiệt 100°C trong 3 phút
66
Đồ án tốt nghiệp
2 Dịch nuôi cấy L2N gia nhiệt 100°C trong 3 phút
0.1% Tween 80
Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm bảo quản trong chai.
Đối chứng âm thay dịch vi khuẩn bằng nước cất, đối chứng dương thay dịch vi
khuẩn bằng dung dịch daconil 0,5g/l. Sau từng khoảng thời gian thích hợp với mỗi loại
hạt, hạt được để khô ở nhiệt độ phòng, phối vào các chai thuỷ tinh đã được hấp khử
trùng.
Các chai được đặt ở nơi khô thoáng và theo dõi kết quả từng ngày và ghi nhận kết
quả thời gian nấm mốc bắt đầu phát triển.
Các thí nghiệm lặp lại 3 lần.
2.5.12. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5,
L3, L2N đối với sự phát triển của hạt giống.
2.5.12.1. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5,
L3, L2N đối với sự nảy mầm của hạt.
67
Đồ án tốt nghiệp
Các chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N.
Tăng sinh trong môi trường thích hợp từ nội dung 2
Phối trộn các chủng và xử lý thích hợp (nội dung 3)
Hạt đậu đã Ngâm hạt 15 phút khử trùng
bề mặt
Đất được
Trồng cây hấp khử
trùng
Xác định tỷ lệ nảy mầm; chiều dài
thân, rễ; sinh khối thân rễ; độ khỏe
mầm
Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5, L3,
L2N đối với sự phát triển của hạt giống
Các chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L2N được tăng sinh trong môi trường chọn được
từ nội dung 2 ở 37 0C trong 24 giờ, tỷ lệ cấy giống 5 %, phối trộn theo tỉ lệ và xử lý
như kết quả nội dung 3. Đối chứng âm thay dịch vi khuẩn bằng nước cất, đối chứng
dương thay dịch vi khuẩn bằng dung dịch daconil 0,5 g/L.
68
Đồ án tốt nghiệp
Hạt đậu phộng đã được khử trùng bề mặt bằng cồn 700 được ngâm 15 phút trong
các dịch xử lý nêu trên.
Đất trồng được mua tại vườn cây cảnh sau đó được hấp khử trùng ở 121 0C trong
20 phút nhằm loại bỏ vi khuẩn, nấm lẫn trong đất. Sau đó đất được chia theo từng
nghiệm thức, tiến hành gieo hạt đã ngâm.
Quan sát thời gian nảy mầm của các loại hạt giống và tính tỉ lệ nảy mầm theo công
thức của Harish Manmathan (2013).
Tỉ lệ nảy mầm (%) = × 100% Số hạt nảy mầm Tổng số hạt
Mỗi nghiệm thức tiến hành gieo 20 hạt. Lặp lại 3 lần.
2.5.12.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillussp. L5, L3, L2N đến độ khỏe
mầm ở cây đạu phộng
Mục đích: Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây bắp trong điều kiện phòng
thí nghiệm.
Tiến hành: Kết quả khảo sát đến độ khoẻ của mầm theo (Abdul Baki and
Anderson, 1973) với công thức:
Độ khỏe mầm = (Trung bình chiều dài rễ + Trung bình chiều dài chồi) x Tỷ lệ hạt
nảy mầm (%).
69
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hoá của chủng vi khuẩn lactic:
Ba chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3, và Lactobacillus sp.
L2N được khảo sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm Gram, nhuộm bào tử,
thử nghiệm catalase, di động, để kiểm tra tính thuần khiết cũng như khả năng lên men
lactic của các chủng.
3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc:
Khuẩn lạc lactic trên môi trường MRS Agar thường có đường kính từ 2-5 mm, bờ
đều, láng và lồi, mờ đục.
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc các chủng Lactobacillus spp. trên môi trường
MRS Agar
Kết quả: Khuẩn lạc các chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N mờ đục, tròn đều và
lồi.
70
Đồ án tốt nghiệp
3.1.2 Nhuộm Gram:
Các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N là chủng vi khuẩn Gram dương,
hình que. Bước đầu tiên ta tiến hành nhuộm Gram đối với các tế bào còn non (trong
khoảng 24 giờ nuôi cấy) vì khi già vi khuẩn lactic đều trở thành Gram âm.
Khi tiến hành nhuộm Gram trước tiên tiến hành nhuộm hai chủng biết trước là vi
khuẩn Bacillus subtilis Gram dương và vi khuẩn E.coli Gram âm có ở phòng thí
nghiệm để làm đối chứng. Sau đó tiến hành nhuộm Gram 3 chủng Lactobacillus sp.
L5, L3, L2N và dựa vào mẫu đối chứng để kết luận.
Ở bước nhuộm Gram này ta đã tăng tính an toàn cho các chủng vi khuẩn được
chọn vì đã loại bỏ một số chủng vi khuẩn gây bệnh là Gram âm ví dụ như vi khuẩn E.
coli.
Hình 3.2: Kết quả nhuộm gram của các vi khuẩn: Từ trái qua phải, vi khuẩn
E.coli gram âm, vi khuẩn Bacillus subtilis gram dương, vi khuẩn Lactobacillus sp. L5
Kết quả: Ba chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3,
Lactobacillus sp. L2N bắt màu tím, gram dương, que ngắn.
3.1.3 Nhuộm bào tử:
Ngoài nấm mốc cũng có các vi khuẩn có khả năng sinh bào tử. Sự hình thành bào
tử là hình thức đổi mới tế bào khi vi khuẩn sống trong môi trường bất lợi như nhiệt độ,
áp suất, dinh dưỡng… không phù hợp cho việc sinh trưởng và phát triển bình thường
71
Đồ án tốt nghiệp
của chúng hoặc khi tế bào trở nên già. Ở vi khuẩn lactic, chúng không có khả năng này
nên đây cũng trở thành đặc điểm của chúng.
Sự hình thành bào tử là hình thức đổi mới tế bào khi vi khuẩn sống trong môi
trường bất lợi như nhiệt độ áp suất dinh dưỡng… không phù hợp cho việc sinh trưởng
và phát triển bình thường của chúng hoặc khi tế bào trở nên già. Ở vi khuẩn lactic
chúng không có khả năng này nên đây cũng trở thành đặc điểm của chúng.
Sau khi nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương phá Schaeffer-Fulton sử dụng vi
khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy hơn 1 tuần làm đối chứng dương quan sát dưới kính
hiển vi ở vật kính 100x sẽ thấy được các bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu
xanh của thuốc nhuộm Malachite green và vi khuẩn E.coli làm đối chứng âm.
Tiến hành nhuộm bào tử 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus spp.
Hình 3.3: Kết quả nhuộm bào tử của các vi khuẩn: Từ trái qua qua phải, vi khuẩn
Bacillus subtilis sinh bào tử, vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 không sinh bào tử
Kết quả: Các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3,
Lactobacillus sp. L2N không sinh bào tử và bắt màu hồng dưới thuốc nhuộm bổ sung.
3.1.4 Thử nghiệm Catalase:
Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa H2O2
thành H2O và O2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi bọt khí,
72
Đồ án tốt nghiệp
sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis và nước cất có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng
dương và âm hình 3.4.
Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm
tính.
Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 (Từ trên xuống:
Thử nghiệm âm tính vi khuẩn L5, thử nghiệm dương tính với vi khuẩn Bacillus
subtilis)
Kết quả: Thử nghiệm cho thấy 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5,
Lactobacillus sp. L3, Lactobacillus sp. L2N không có khả năng sinh catalase. Thử
nghiệm được so sánh với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.
3.1.5 Thử nghiệm tính di động:
Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường
thạch mềm, chúng sẽ phát triển lan sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không
mọc theo vết cấy, tạo thành những vệt mờ đục môi trường.
Vi khuẩn Lactobacillus spp. là vi khuẩn hiếu khí chịu oxy nên chúng vừa có thể
phát triển ở phía trên vừa có thể phát triển ở sâu trong môi trường ở những chủng
không có tiên mao, chúng sẽ tăng sinh khối theo vết cấy vì chúng không có khả năng di
chuyển, vì vậy ta thấy một vệt thẳng theo vết cấy.
Các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. chỉ mọc dọc theo đường cấy, môi trường
không đục.
73
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.5: Thử nghiệm tính di động của chủng Lactobacillus sp. L5 và chủng vi khuẩn
đối chứng Bacillus subtilis.
Kết quả: Các chủng Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3, Lactobacillus sp.
L2N không có khả năng di động.
3.1.6 Thử nghiệm lên men các loại đường:
Đối với lên men đồng hình, acid lactic là sản phẩm duy nhất theo con đường đường
phân, đối với lên men dị hình vì sử dụng con đường 6- phosphorgluconate
/phosphoketolase vì thế thì ngoài acid lactic còn có CO2. Như vậy, nếu chỉ sinh acid,
không sinh khí thì LAB thuộc nhóm lên men đồng hình. Ngược lại nếu cả acid và khí
tạo thành LAB thuộc nhóm lên men dị hình.
74
Đồ án tốt nghiệp
Các chủng LAB khác nhau có khả năng lên men các loại đường khác nhau.
Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn L5 (I), L2N (II), L3
(III) (A – Glucose; B – Fructose; C – Sucrose; D – Mannose; E – Mannitol; F –
Galactose)
Bảng 3.1 Khả năng lên men các loại đường của các chủng Lactobacillus sp. L5,
L3, L2N.
Chủng L5 L3 L2N Đường
Glucose +++ + +++
Fructose +++ + +++
75
Đồ án tốt nghiệp
Sucrose ++ - -
Mannose +++ +++ -
Mannitol ++ + +
Galactose +++ - +
3.2 Khảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1
Chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 được phân lập từ hạt đậu phộng lấy từ phòng thí
nghiệm vi sinh viện Khoa học Ứng dụng thuộc trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố
Hồ Chí Minh.
Chủng nấm mốc này cần phải được kiểm tra khả năng phát triển, để xác định xem
chúng có thích hợp làm nấm mốc chỉ thị tiến hành thí nghiệm.
Môi trường thử nghiệm là MRS agar cải tiến (không chứa Ammonium Citrate),
đây là môi trường do nhóm sử dụng vì đáp ứng yêu cầu cho thử nghiệm hoạt tính
kháng nấm vi khuẩn phát triển tốt và thành phần môi trường không làm ảnh hưởng đến
khả năng phát triển của nấm mốc, thích hợp để khảo sát hoạt tính kháng nấm của các
chủng vi khuẩn Lactobacillus spp.
76
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.7: Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 trên môi
trường MRS Agar cải tiến sau 5 ngày.
Kết quả trên hình 3.7 cho thấy, sau 5 ngày trên môi trường MRS Agar cải tiến
(không bỏ Ammonium citrate), chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 phát triển bình
thường với đường kính trung bình là (67.67 ± 3.51) mm.
Kết quả trên cho thấy, chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 hoàn toàn khỏe mạnh và
không bị nhiễm các chủng nấm khác, thích hợp để tiến hành các thí nghiệm khảo sát.
Thực hiện phương pháp phòng ẩm, quan sát dưới kính hiển vi để xác định hình thái
sợi nấm Aspergillus sp. CĐP1.
77
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.8: Hình thái nấm nấm Aspergillus sp. CĐP1
3.3. Khảo sát môi trường lên men thích hợp.
Sau khi kiểm tra tính thuần khiết, các tính chất sinh lý, sinh hoá, khả năng sinh
acid, kiểm tra mật độ tế bào, tính kháng nấm, cũng như hoạt tính sinh hormone tăng
trưởng thực vật IAA, phân giải lân, tạo màng sinh học biofilm. Nhóm đề tài kết luận 3
chủng Lactobacillus sp. L5, L2N, L3, có tiềm năng trong việc tạo chế phẩm sinh học
bảo vệ, kháng nấm cũng như kích thích tăng trưởng nảy nầm cho hạt giống.
Bên cạch đó việc tạo chế phẩm ngoài việc đạt các tính chất sinh học như mong
muốn, còn đáp ứng nhu cầu kinh tế. Nhóm đề tài đã tiến hành khảo sát thêm hai môi
trường lên men nữa đó là môi trường nước giá đậu và môi trường bắp cải song song
với môi trường lên men MRS Broth. Mục tiêu kiểm tra các hoạt tính sinh học trên hai
môi trường nước giá đậu và môi trường bắp cải so sánh với môi trường MRS Broth, từ
đó chọn ra một môi trường lên men thích hợp tạo chế phẩm.
Môi trường MRS là môi trường lý tưởng cho vi khuẩn lactic, chứa các nguồn
đường, cao thịt, pepton, cao nấm men và các khoáng đa vi lượng. Môi trường dịch
chiết giá đậu và bắp cải thay thế phần lớn các thành phần trong môi trường MRS, chỉ
cần bổ sung glucose 12 g/L và pepton 15 g/L để ngang bằng đường khử và protein với
môi trường MRS.
78
Đồ án tốt nghiệp
Việc chọn môi trường lên men thích hợp dựa trên các chỉ tiêu acid tổng, mật độ tế
bào, khả năng sinh IAA, phân giải lân, tạo màng biofilm và kháng nấm in vitro.
3.3.1. Khảo sát khả năng sinh acid lactic và mật độ tế bào của các chủng
Lactobacillus spp. L5, L2N, L3
Để thử nghiệm môi trường khảo sát kháng nấm tốt cũng như khảo sát khả năng
tăng trưởng cây trồng, nhóm đề tài tiến hành thử nghiệm xác định hàm lượng acid tổng
và mật độ tế bào để so sánh khả năng sinh acid của ba chủng vi khuẩn lactic trên ba
môi trường.
Ba chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2, L3 được nuôi cấy trên 3 môi trường
MRS Broth, nước giá và bắp cải, với tỷ lệ cấy giống 5 %, và được theo dõi chỉ số acid
3.50
3.00
2.50
và mật độ tế bào từ 0 giờ đến 72 giờ.
)
2.00
m n 0 0 6 (
1.50
D O
1.00
0.50
0.00
0
3
6
12
16
22
24
30
36
48
66
72
Thời gian (giờ)
Nước Giá
Nước Bắp Cải
MRS Broth
Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5
79
3.50
3.00
2.50
Đồ án tốt nghiệp
)
2.00
m n 0 0 6 (
1.50
D O
1.00
0.50
0.00
0
3
6
12
16
22
24
30
36
48
66
72
Thời gian (giờ)
Nước Giá
Nước Bắp Cải
MRS Broth
3.50
3.00
2.50
Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L2N
)
2.00
m n 0 0 6 (
1.50
D O
1.00
0.50
0.00
0
3
6
12
16
22
24
30
36
48
66
72
Thời gian (giờ)
Nước Giá
Nước Bắp Cải
MRS Broth
Hình 3.11: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L3
80
Đồ án tốt nghiệp
Kết quả từ hình 3.9, 3.10, 3.11 trên cho thấy sau khi nuôi cấy 3 chủng vi khuẩn
lactic 72 giờ, trên cả 3 môi trường mật độ đế bào tăng từ 0 giờ đến 72 giờ, mật độ tế
bào tăng mạnh từ 0 giờ đến 12 giờ và sau đó tăng nhẹ đến 72 giờ.
Mật độ tế bào 3 chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS Broth cao hơn môi
trường bắp cải và nước giá, nhưng không có sự chênh lệch lớn.
Cụ thể ở các chuẩn vi khuẩn lactic:
- Chủng L5: Chủng vi khuẩn lactic L5 phát triển mạnh nhất trên MRS Broth, đạt
cực đại ở 66 giờ, sau đó suy yếu. Môi trường nước giá đạt cực đại tại 48 giờ và
suy yếu sau đó. Trong khi môi trường nước bắp cải, mật độ vi khuẩn vẫn tăng
sau 72 giờ và có tốc độ phát triển gần như bằng với MRS Broth.
- Chủng L2N: Mật độ tế bào trên môi trường MRS Broth không ổn định, đạt cực
đại ở 66 giờ và giảm sau đó. Đối với môi trường nước giá, vi khuẩn phát triển
ổn định, nhanh và đạt cực đại ở 66 giờ sau đó suy giảm. Môi trường nước bắp
cải cho mật độ phát triển ổn định và tiếp tục tăng đến sau 72 giờ.
- Chủng L3: Vi khuẩn phát triển mạnh trên môi trường MRS Broth và mật độ tiếp
tục tăng đến sau 72 giờ. Đối với 2 môi trường nước giá và bắp cải, mật độ đạt
2.50
2.00
cực đại sau 66 giờ và giảm sau đó.
)
%
1.50
1.00
( d i c a g n ợ ư
l
0.50
m à H
0.00
0
3
6
12
30
36
48
66
72
16 22 24 Thời gian (giờ) Nước Giá
Nước Bắp cải
MRS Broth
81
Đồ án tốt nghiệp
2.50
2.00
Hình 3.12: Hàm lượng acid tổng của Lactobacillus sp. L5 trên các môi trường
)
%
( d
1.50
i c a
1.00
g n ợ ư
l
0.50
m à H
0.00
0
3
6
12
16
22
24
30
36
48
66
72
Thời gian (giờ)
Nước Giá
Nước Bắp cải
MRS Broth
2.50
2.00
Hình 3.13: Hàm lượng acid tổng của Lactobacillus sp. L2N trên các môi trường
)
%
1.50
1.00
( d i c a g n ợ ư
l
0.50
m à H
0.00
0
3
6
12
30
36
48
66
72
16
24 22 Thời gian (giờ) Nước Giá
Nước Bắp cải
MRS Broth
Hình 3.14: Hàm lượng acid tổng của Lactobacillus sp. L3 trên các môi trường.
82
Đồ án tốt nghiệp
Để theo dõi khả năng sinh acid của 3 chủng vi khuẩn lactic sau 24 giờ nhóm đề tài
tiếp tục khảo sát khả năng sinh acid và mật độ vi khuẩn tới 72 giờ, kết quả được thể
hiện trên (hình 3.9), (3.10) và (3.11) .
Hàm lượng acid của 3 chủng vi khuẩn lactic trên 3 môi trường vẫn tiếp tục tăng sau
từ 0 giờ đến 72 giờ. Trên môi trường MRS Broth hàm lượng acid cao hơn môi trường
nước giá và môi trường nước bắp cải.
Cụ thể ở các chủng vi khuẩn lactic:
- L5: Hàm lượng acid trên môi trường MRS Broth cao nhất, cực đại ở 66 giờ.
Môi trường nước giá và bắp cải hàm lượng tương đương nhau nhưng bắp cải đại
cực đại ở 66 giờ còn nước giá vẫn tăng
- L2N: Hàm lượng acid trên MRS Broth cao nhất và đạt cực đại ở 30 giờ. Với 2
môi trường nước giá và nước bắp cải, hàm lượng acid đạt cực đại ở 66 giờ và
bắt đầu giảm (nhưng vẫn thấp hơn MRS Broth), sau đó bắp đầu giảm.
- L3: Hàm lượng acid trên môi trường MRS Broth cao nhất ở các mốc thời gian,
đạt cực đại ở 30 giờ. Đối với môi trường nước giá, hàm lượng acid vẫn tiếp tục
tăng sau 72 giờ và ở môi trường bắp cải thì đạt cực đại ở 66 giờ
Mặc dù trên hai môi trường nước giá và nước bắp cải, acid lactic tổng hợp thấp hơn
hẳn môi trường MRS. Tuy nhiên, sinh khối ở hai môi trường giá đậu và bắp cải cho
thấy không có sự chênh lệch so với môi trường MRS nhưng các hoạt tính sinh học có ý
nghĩa quan trọng hơn cả. Độ chua cao có thể ảnh hưởng không thuận lợi cho sự phát
triển cây trồng, vì vậy tìm kiếm môi trường làm giảm acid lactic sinh ra mà vẫn giữ
được các hoạt tính sinh học khác là mục tiêu của đề tài.
3.3.2. Khảo sát khả năng tạo màng sinh học biofilm của các chủng Lactobacillus
sp. L5, L2N, L3
Nhiều nghiên cứu cho thấy thành phần môi trường nuôi cấy có thể tăng khả năng
sinh biofilm của vi sinh vật, do ảnh hưởng lên tổng hợp polysaccharide ngoại bào. Khả
năng tạo biofilm càng cao, khả năng bám của vi khuẩn trên bề mặt hạt càng tốt.
83
Đồ án tốt nghiệp
Để khảo sát khả năng tạo màng sinh học biofilm của 3 chủng vi khuẩn lactic, nhóm
đề tài đã sử dụng phương pháp nhuộm với tím kết tinh. Vi khuẩn được nuôi cấy trong
ống nghiệm với tỷ lệ cấy giống 5% ủ 37 0C, sau 24 giờ nhuộm thành ống nghiệm bằng
Crystal Violet, rửa bằng acid acetic 5 %, rồi đo quang phổ ở bước sóng 550 nm, phần
0.700
0.600
0.500
0.400
OD 550 nm
0.300
OD 600nm
0.200
0.100
0.000
L5 Mrs Broth
L2N Mrs Broth
L3 Mrs Broth
L5 Nước giá
L2N Nước giá
L3 Nước giá
L5 Nước bắp cải
L3 Nước bắp cải
L2N Nước bắp cải
dịch còn lại đo quang phổ ở bước sóng 600 nm để xác định vi khuẩn tự do.
Hình 3.15: Biểu đồ đánh giá khả năng tạo màng biofilm của 3 chủng vi khuẩn lactic
trên các môi trường.
Bảng 3.2: Thống kê xếp hạng OD 550nm của các chủng vi khuẩn lactic.
Chủng vi khuẩn Môi trường nuôi cấy OD 550nm
MRS Broth 0.163b ± 0.016
L5 Nước giá 0.423a ± 0.028
Nước bắp cải 0.427a ± 0.012
84
Đồ án tốt nghiệp
MRS Broth 0.253b ± 0.039
L2N Nước giá 0.329a ± 0.017
Nước bắp cải 0.323a ± 0.014
MRS Broth 0.239a ± 0.022
L3 Nước giá 0.083b ± 0.014
Nước bắp cải 0.26a ± 0.023
( So sánh thống kê khả năng tạo màng biofilm của ba chủng vi khuẩn trên ba môi
trường )
So sánh kết quả OD 600 nm (đánh giá số lượng tế bào sống tự do) và OD 550 nm
sau khi nhuộm tím kết tinh (đánh giá số lượng tế bào liên kết) nhận thấy, số lượng tế
bào tự do trong môi trường của các chủng vi khuẩn lactic khi được nuôi cấy trên 2 môi
trường nước giá đậu và nước bắp cải thấp hơn nhiều so với số lượng tế bào liên kết tạo
biofilm. Điều này chứng tỏ phần lớn các tế bào của 3 chủng vi khuẩn trên đã chuyển
từ dạng sống tự do trôi nổi sang dạng liên kết tạo biofilm khi được nuôi cấy ở 2 môi
trường trên. Và cũng nhận thấy là chủng vi khuẩn có hoạt tính tổng hợp biofilm mạnh
thì số lượng tế bào tự do trong môi trường thấp và ngược lại.
Kết quả trên hình (3.12) và bảng (3.3) cho thấy, 3 chủng vi khuẩn lactic trên môi
trường nước bắp cải và môi trường nước giá tạo màng biofilm tốt hơn môi trường MRS
Broth.
Chủng vi khuẩn L5 được nuôi cấy trên môi trường nước bắp cải (0.323a ± 0.014)
và môi trường nước giá ( 0.329a ± 0.017) tạo màng biofilm tốt nhất.
85
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.16: Vi khẩn tạo màng biofilm đã nhuộm tím tinh thể trên thành ống nghiệm
3.3.3 Đánh giá khả năng phân giải lân của các chủng Lactobacillus sp. L5, L2N,
L3
Vi khuẩn lactic tổng hợp acid lactic có khả năng phân giải phosphate khó tan. Tuy
nhiên, tính chất này còn phụ thuộc nhiều vào môi trường nuôi cấy.
Trong thử nghiệm này nhóm đề tài đã sử dụng phương pháp Stannous Chloride để
đánh giá khả năng phân giải phosphate khó tan của 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.
L5, L3, L2N.
Các chủng vi khuẩn lactic trong các môi trường khác nhau nên khả năng phân giải
phosphate khó tan của chúng cũng sẽ khác nhau. Để thực hiện nhóm đề tài đã nuôi cấy
các chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS Broth, nước giá và nước bắp cải có
bổ sung Ca3(PO4)2 thay cho K2HPO4 với tỷ lệ cấy giống 5 %, sau đó xác định nồng độ
orthophosphate do VSV hòa tan vào dịch ở các mốc thời gian khác nhau 3 ngày, 5
ngày, 7 ngày bằng phương pháp Stannous Chloride.
86
6000
5000
4000
Đồ án tốt nghiệp
) l / g m
(
3000
2000
1000
- 3 4 O P ộ đ g n ồ N
0
Ngày 3
Ngày 7
Ngày 5 Thời gian
Nước giá
Nước bắp cải
Mrs Broth
Hình 3.17: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L5
Nhận thấy ở chủng vi khuẩn lactic L5, khả năng phân giải lân ở môi trường nước
giá là tốt nhất và thấp nhất là ở môi trường bắp cải, nhìn chung trên cả ba môi trường
nhận thấy sự tăng nhẹ nồng độ PO43- ở môi trường nước giá, và tăng mạnh ở hai môi
trường nước bắp cải và MRS Broth từ ngày 3 đến ngày 5, sau đó giảm nhanh vào ngày
7.
Nồng độ PO43- đạt cực đại của chủng lactic L5 tại ngày 3 ở môi trường nước giá là
(5010.8 mg/l).
87
5000
4500
4000
3500
Đồ án tốt nghiệp
) l / g m
3000
2500
2000
1500
( - 3 4 O P ộ đ g n ồ N
1000
500
0
Ngày 3
Ngày 7
-500
Ngày 5 Thời gian
Nước giá
Nước bắp cải
Mrs Broth
Hình 3.18: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L2N
Chủng vi khuẩn lactic L2N có khả năng phân giải lân tốt nhất ở môi trường nước
giá và thấp nhất là môi trường MRS Broth, nhận thấy nồng độ PO43- giảm dần từ ngày
3 đến ngày 7.
Nồng độ PO43- cao nhất ở môi trường nước giá tại ngày 3 với nồng độ PO43- là
(4027.4 mg/l).
88
5000
4500
4000
3500
Đồ án tốt nghiệp
) l / g m
3000
(
2500
2000
1500
- 3 4 O P ộ đ g n ồ N
1000
500
0
Ngày 3
Ngày 7
Ngày 5 Thời gian Nước giá
Mrs Broth
Bắp cải
Hình 3.19: Khả năng phân giải lân của vi khuẩn lactic L3
Ở chủng vi khuẩn lactic L3 nhận khả năng phân giải lân trên môi trường nước giá
không ổn định khi giảm mạnh xuống từ ngày 3 đến ngày 5, còn ở hai môi trường MRS
5000
4500
4000
3500
3000
Mrs Broth
2500
2000
Nước giá
Broth và bắp cải thì có sự tăng nhẹ, và đều giảm vào ngày 7.
- 3 4 O P ộ đ g n ồ N
1500
Bắp cải
1000
500
0
Ngày 3
Ngày 7
Ngày 5 Thời gian
Hình 3.20: Biều đồ so sánh khả năng phân giải lân tổng cộng của ba chủng vi khuẩn
lactic trên 3 môi trường theo ngày.
89
Đồ án tốt nghiệp
Nhận thấy cả 3 môi trường đều có nồng độ PO43- cao nhất vào ngày 3 và thấp nhất
6000
5000
4000
vào ngày 7.
) l / g m
(
Mrs Broth
3000
Nước giá
2000
Nước bắp cải
- 3 4 O P ộ đ g n ồ N
1000
0
L5
L2N
L3
Chủng vi khuẩn
Hình 3.21: Biểu đồ thể hiện khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic trên
ba môi trường ở ngày 3.
Bảng 3.3. Thể hiện khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic trên ba môi
trường ở ngày 3
Chủng vi khuẩn Môi trường khảo sát Nồng độ PO43- (mg/l)
865.3b ± 147.8 MRS Broth
L5 5010.8a ± 168.0 Nước giá
1015.8b ± 67.8 Nước bắp cải
2958.4b ± 125.5 MRS Broth L2N
4027.4a ± 262.1 Nước giá
90
Đồ án tốt nghiệp
Nước bắp cải 3303b ± 457.5
MRS Broth 3152.7b ± 245.7
L3 Nước giá 3834.7a ± 472.9
Nước bắp cải 2395.1c ± 46.5
( So sánh thống kê khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn trên ba môi
trường )
Dựa vào ANOVA củng như kết quả xử lý excel nhận thấy:
- Chủng vi khuẩn lactic L5 phân giải lân tốt nhất ở môi trường nước giá với nồng
độ PO43- là (5010.8a ± 168.0 mg/l), còn lại 2 môi trường nước bắp cải và MRS
Broth xếp sau và đồng hạng.
- Chủng vi khuẩn lactic L2N phân giải lân tốt nhất ở môi trường nước giá vời
nồng độ PO43- sinh ra là (4027.4a ± 262.1), xếp sau là môi trường bắp cải và
nước giá đồng hạng không có sai khác về mặt thống kê.
- Chủng vi khuẩn lactic L3 phân giải lân tốt nhất ở môi trường nước giá (3834.7a
± 472.9), thấp nhất là môi trường bắp cải.
- Như vậy khả năng phân giải lân tốt nhất trong môi trường nước giá.
3.3.4. Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng Lactobacillus sp. L5, L2N, L3.
Basavaraj M. Kuraber và cộng sự (2012) đã nghiên cứu về khả năng sinh IAA của
các chủng để kích thích khả năng sinh trưởng và phát triển của các loại hạt. Nhóm thực
hiện đề tài đã kiểm tra khả năng sinh IAA trong dịch nuôi cấy 3 chủng vi khuẩn
Lactobacillus sp. L5, L3, L2N trên 3 loại môi trường khác nhau.
91
12.000
10.000
8.000
Đồ án tốt nghiệp
) l
6.000
m / g µ (
L5
L2N
4.000
L3
A A I ộ đ g n ồ N
2.000
0.000
Nước giá
Mrs
Bắp cải
Môi trường
Hình 3.22. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh
IAA của 3 chủng vi khuẩn.
Bảng 3.4: Hàm lượng IAA do 3 chủng vi khuẩn tổng hợp.
Hàm lượng IAA (µg/ml) Vi khuẩn MRS Nước giá Bắp cải
L5 7.910a±0.808 3.756b±1.171 4.938b±0.621
L2N 5.833a±2.081 4.627a±1.362 3.905a±0.544
L3 8.744a±1.607 2.239c±0.691 4.863b±0.578
Kết quả thí nghiệm khảo sát cho thấy 3 chủng vi khuẩn lactic trên 3 môi trường
đều có khả năng sinh IAA.
Nồng độ IAA của 3 chủng vi khuẩn được tao ra trên môi trường MRS Broth cao
nhất với tổng nồng độ IAA sinh ra của 3 chủng là 22.487 (µg/ml) , thấp nhất là môi
trường nước giá với tổng nồng độ là 10.622 (µg/ml).
92
Đồ án tốt nghiệp
Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn lactic L5 cho thấy hàm lượng
IAA sinh ra trên môi trường MRS Broth cao nhất với (7.910a±0.808), cho thấy sự khác
biệt về mặt thống kê so với 2 môi trường còn lai.
Chủng L2N không có sự sai khác về mặt thống kê về khả năng sinh IAA trên 3 môi
trường khảo sát, hàm lượng IAA sinh ra gần tương đương nhau.
Chủng L3 trên môi trường MRS Broth cho hàm lượng IAA cao nhất
(8.744a±1.607), thấp hơn là môi trường bắp cải (4.863b±0.578), và cuối cùng là môi
trường nước giá (2.239c±0.691).
3.3.5. Đánh giá khả năng kháng nấm invitro của các chủng vi khuẩn lactic
Theo một số nghiên cứu gần đây cho biết vi khuẩn lactic có khả năng kháng nấm
nhờ sản xuất 1 số chất như acid hữu cơ và reuterin các peptide các enyzme để ức chế
sự tăng trưởng của nấm hư hỏng trên hạt giống. Nhằm mục đích tuyển chọn ra các
chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm thì nhóm thực hiện đề tài đã chọn ra phương
pháp cấy 2 đường vi khuẩn đây l phương pháp đơn giản dễ thực hiện và kết quả đạt
được cũng phần nào nói lên được khả năng ức chế nấm bệnh của vi khuẩn lactic trong
thí nghiệm. Khả năng đối kháng nấm của vi khuẩn lactic sau 3 ngày thể hiện khác
nhau và được trình bày đại diện qua chủng mạnh nhất qua các hình. Khả năng đối
kháng được xác định dựa trên đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm mốc
so với đối chứng và được trình bày trên hình và bảng dưới.
93
Đồ án tốt nghiệp
E
E
E
Hình 3.23: Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn L5 (I); L2N (II); L3 (III) (A –
Daconil 0.5g/L; B – MRS cải tiến; B – Nước giá; C – Nước bắp cải; E- ĐC (-))
Bảng 3.5: Thống kê số liệu phần trăm tỷ lệ ức chế của 3 chủng vi khuẩn trên 3
môi trường nuôi cấy MRS Broth, bắp cải, nước giá, với đối chứng (+) Daconil với
chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn.
Chủng VK L5 L2N L3
NT
Đối chứng (+) 26.85b±3.91 26.85b±3.91 26.85b±3.91 Daconil
94
Đồ án tốt nghiệp
MRS 42.610a ± 1.53 41.380a ± 2.99 45.813a ± 1.48
Bắp Cải 40.887a ± 1.95 44.333a ± 4.07 44.597a ± 3.39
Nước Gía 42.857a ± 4.45 45.070a ± 4.07 43.597a ± 3.79
60.00
50.00
)
%
(
40.00 ĐC (+)
MRS Broth 30.00
Nước giá 20.00
m ấ n g n á h k ệ l ỉ
Nước bắp cải
T
10.00
L5
L3
0.00
L2N Chủng vi khuẩn
Hình 3.24: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kháng nấm của 3 chủng vi khuẩn trên 3 môi
trường khác nhau.
Sau khi xử lý ANOVA với độ tin cậy là 99%, dựa trên các kết quả nhóm đề tài
nhận thấy:
Tỷ lệ kháng nấm khi thực hiện trên 3 môi trường khảo sát cao hơn đối chứng là
95
Đồ án tốt nghiệp
Daconil (0.5g/l). Theo kết quả xử lý thống kê thì kết quả kháng nấm trên 3 môi
trường Mrs Broth, nước giá và bắp cải xếp đồng hạng a và cao hơn so với đối chứng
(+) Daconil (0.5g/l) xếp hạng b.
Không có sự chênh lệch nhiều về tỷ lệ phần trăm kháng nấm của 3 chủng vi khuẩn
trên 3 môi trường khảo sát MRS, nước giá và bắp cải.
Như vậy trong các tính chất sinh học của các chủng LAB thí nghiệm trong 3 môi
trường có thề thấy:
Trong môi trường nước giá đậu và bắp cải sau thời gian nuôi cấy 24 giờ, sinh khối
3 chủng LAB ở môi trường bắp cải tương đương và bằng 90.9 % so với môi trường
MRS còn ở môi trường giá đâu là 90% so với môi trường MRS, acid lactic tổng hợp ở
môi trường bắp cải bằng 70 % so với môi trường MRS và trên môi trường giá đậu là
64.8 % so với môi trường MRS, khả năng sinh IAA vượt trội trong môi trường bắp cải,
khả năng phân giải lân cao nhất trong môi trường nước giá, khả năng tạo màng biofim
trên môi trưởng bắp cải tốt hơnvà khả năng kháng nấm tương đương giữa môi trường
nước giá, bắp cải và môi trường MRS.
Nhận thấy các hoạt tính sinh học khảo sát trên môi trường bắp cải tốt hơn so với
giá đậu nên nhóm đề tái quyết định chọn bắp cải là môi trường lên men cho các thử
nghiệm sau.
3.3.6. Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng
Vi khuẩn lactic có khả năng kháng nấm và chúng có khả năng tạo màng biofilm
khi nuôi cấy trong môi trường bắp cải. Thí nghiệm này được thực hiện nhằm thăm dò
khả năng phối hợp giữa 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 để tạo màng
bao kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1.
Thí nghiệm được thực hiện khi phối hợp ba chủng vi khuẩn lactic L5, L2N, L3 với
những tỷ lệ phối trộn khác nhau và những chế độ xử lý nhiệt khác nhau, sau đó điều
chỉnh pH về 5 hoặc 6.
Kết quả được trình bày trong bảng dưới đây
96
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.25: Hình ảnh bảo quản đậu phộng trong chai sau 25 ngày
97
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 3.6: Ngày xuất hiện tơ nấm trong thí nghiệm bảo quản hạt đậu phộng sau 25
ngày khảo sát
Ngày đầu tiên mọc nấm
TN1(Không Nghiệm thức TN2 TN3 điều chỉnh (pH5) (pH6) pH)
Đối chứng 1 – nước cất 14
Đối chứng 2 – Daconil (0.5g/l) 21
NT1 – 1 : 1 : 1 – t0 phòng 18 21
*
NT2 – 1 : 2 : 1 – t0 phòng 21 21 25
NT3 – 1 : 1 : 2 – t0 phòng 18 18 21
NT4 – 1 : 1 : 1 – 650C/15 phút 14 14 25
NT5 – 1 : 2 : 1 – 650C/15 phút 21 21 21
NT6 – 1 : 1 : 2 – 650C/15 phút 18 18 25
NT7 – 1 : 1 : 1 – 850C/10 phút 14 25 18
NT8 – 1 : 2 : 1 – 850C/10 phút 14 21
*
NT9 – 1 : 1 : 2 – 850C/10 phút 25 25 25
NT10 – 1 : 1 : 1 – 1000C/3 phút 21 21 21
NT11 – 1 : 2 : 1 – 1000C/3 phút 14 14 21
NT12 – 1 : 1 : 2 – 1000C/3 phút 18 25
*
(Chú thích: * không có sự nhiễm nấm sau 25 ngày khảo sát)
Nhận thấy: Nhìn chung các nghiệm thức cho khả năng kháng nấm tốt hơn nước
cất, đặc biệt ba nghiệm thức TN1-NT1, TN1-NT12, TN3-NT8 cho khả năng kháng
nấm tốt hơn đối chứng Daconil.
98
Đồ án tốt nghiệp
- TN1-NT1 (1:1:1) khi không gia nhiệt thì thí nghiệm bảo quản hạt kéo dài hơn
30 ngày không thấy sự mọc nấm. Rõ ràng là trong trường hợp này acid hữu cơ
là tác nhân kháng nấm do khả năng phân ly không hoàn toàn trong môi trường
pH thấp, khuếch tán qua màng sinh chất dẫn đến giảm pH trong tế bào (phân ly
thành ion trong môi trường trung tính nội bào).
- TN1-NT12 (1:1:2) khi gia nhiệt ở 1000C/3 phút không trung hòa thí nghiệm bảo
quản hạt cũng kéo dài hơn 30 ngày mà vẫn không thấy mọc nấm. Kết quả này
tương tự như trường hợp trên nhưng tỉ lệ vi khuẩn có điểm khác biệt là mật độ
L2N cao gấp đôi mật độ hai vi khuẩn còn lại cho thấy ngoài tác nhân kháng nấm
là acid hữu cơ, tác nhân kháng nấm ở L2N có thể còn do hợp chất không phải là
0C, 3 phút có thể gây biến đổi thuận lợi hơn cho sự kháng nấm.
protein nên không những không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, mà chế độ nhiệt 100
- TN3-NT8 (1:2:1) khi gia nhiệt ở 850C/10 phút, trung hòa đến pH = 6, thí
nghiệm bảo quản hạt kéo dài hơn 30 ngày vẫn không thấy sự mọc nấm Trường
hợp này chủng L3 có mật độ cao gấp đôi 2 chủng còn lại, chế độ xử lý nhiệt
tương tự trường hợp trên là điều kiện thanh trùng. Như vậy hoạt chất kháng nấm
nổi bật ở chủng L3 không phải là protein và không phải là acid hữu cơ, nhưng
chất này hoạt động trong điều kiện pH 6 tốt hơn cả, và tương tự xử lý nhiệt giúp
chất này hoạt động tốt hơn (biến tính các protein tương tác).
Đây chỉ là những kết quả ban đầu, các nghiên cứu sâu hơn về bản chất các hợp chất
kháng nấm cần được tiếp tục nghiên cứu.
99
Đồ án tốt nghiệp
3.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới
sự phát triển của hạt giống.
3.3.7.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới khả
năng phát triển của cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm.
Sau khi xác định được khả năng kháng nấm vượt trội của 3 nghiệm thức TN3-NT8,
TN1-NT1 và TN1-NT12 nhóm đề tài tiếp tục tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dịch
nuôi cấy 3 nghiệm thức trên trong khả năng kích thích phát triển hạt đậu phộng.
Bảng 3.7 Thành phần các nghiệm thức ngâm hạt đậu phộng.
Kí hiệu Thành phần
L5:L2N:L3 tỷ lệ 1:1:1, không gia nhiệt, không điều chỉnh pH, bổ TN1-NT1 sung Tween 80
L5:L2N:L3 tỷ lệ 1:1:2, gia nhiệt 100 °C trong 3 phút, không điều TN1-NT12 chỉnh pH, bổ sung Tween 80
L5:L2N:L3 tỷ lệ 1:2:1, gia nhiệt 85 °C, điều chỉnh về pH=6, bổ sung TN3-NT8 Tween 80
Hạt đậu phộng sau khi được ngâm trong dịch vi khuẩn của 3 nghiệm thức trên sẽ
được làm khô và khảo sát khả năng nảy mầm trên đất.
100
Đồ án tốt nghiệp
ĐC (-)
TN1-NT1
TN3-NT8
TN1-NT12
ĐC (+)
Hình 3.26: Cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm
Bảng 3.8: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ mầm trên các nghiệm thức của hạt đậu phộng.
Nghiệm thức Tỷ lệ nảy mầm (%) Độ khoẻ mầm
66.6b ± 2.88 61.5b ± 3.35 Nước cất
73.3b ± 7.63 76b ± 10.8 Daconil (0.5 g/l)
76.6ab ± 7.63 115.2b ± 10 TN1-NT1
88.3a ± 7.63 135.4a ± 12.3 TN3-NT8
76.6ab ± 10.4 115.8b ± 15.2 TN1-NT12
101
Đồ án tốt nghiệp
%
100
160
90
140
80
120
70
100
60
50
80
40
60
30
40
20
20
10
0
0
ĐC (-) Nước cất
ĐC (+) Daconil
TN1-NT1
TN3-NT8
TN1-NT12
Nghiệm thức
Độ khoẻ mầm
Tỷ lệ nảy mầm
Hình 3.27 Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ của mầm trên các nghiệm thức của hạt đậu
phộng
Kết quả xử lý thống kê ANOVA cho thấy tỷ lệ nảy mầm của ba nghiệm thức dịch
vi khuẩn cao hơn so với đối chứng nước cất và Daconil. Đặc biệt nghiệm thức TN3-
NT8 cho tỷ lệ nảy mầm cao hơn 21.7% so với nước cất và 15.4% so với đối chứng (+)
Daconil.
Về độ khoẻ của mầm nhận thấy cả ba nghiệm thức dich nuôi cấy vi khuẩn lactic
cho độ khoẻ của mầm vượt trội so với hai nghiệm thức đối chứng nước cất và daconil,
đặc biệt nghiệm thức TN3-NT8 (135.4a ± 12.3) cho độ khoẻ nảy mầm vượt trội so với
2 nghiệm thức dịch nuôi cấy vi khuẩn còn lại.
102
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7
ngày sau nảy mầm.
Chiều dài rễ Chiều dài Sinh khối rễ Sinh khối Nghiệm thức (mm) thân (mm) (g) thân (g)
ĐC (-) Nước 43.3b ± 2.88 49b ± 6.55 0.21b ± 0.02 0.89bc ± 0.02 cất
ĐC(+) Daconil 48b ± 7.21 55.6b ± 2.51 0.22b ± 0.03 0.86c ± 0.04
TN1-NT1 68.6a ± 2.3 81.6a ± 3.05 0.28ab ± 0.04 1.09ab ± 0.03
TN1-NT12 67.6a ±2.51 83.3a ± 5.68 0.59a ± 0.24 1.04a ± 0.08
1.2
100
90
1
80
TN3-NT8 68.3a ± 3.51 85a ± 2 0.58a ± 0.31 1.03ab ± 0.17
)
70
0.8
) g (
m m
60
g n ợ ư
0.6
50
l
( i à d u ề i
40
g n ọ r T
0.4
h C
30
20
0.2
10
0
0
ĐC (+) Daconil
TN1-NT1
TN3-NT8
TN1-NT12
ĐC (-) Nước cất
Nghiệm thức
Chiều dài rễ
Chiều dài thân
Sinh khối rễ
Sinh khối thân
Hình 3.28 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn của 3 nghiệm thức
TN1-TN1, TN3-NT8 và TN1-NT12 đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7 ngày sau nảy
mầm
103
Đồ án tốt nghiệp
Kết quả xử lý thống kê ANOVA cho thấy các chỉ tiêu về chiều dài cũng như
sinh khối đều vượt trôi so với đối nước nước cất và daconil.
Ở chỉ tiêu chiều dài rễ và chiều dài thân nghiệm thức TN3-NT8 cho ảnh hưởng
chiều dài rễ tốt nhất (68.3a ± 3.51) mm và chiều dài thân (85a ± 2), nhưng không có sai
khác về ý nghĩa thống kê với 2 nghiệm thức dịch nuôi cấy vi khuẩn còn lại.
Về chỉ tiêu sinh khối rễ nghiệm thức TN1-NT12 cho ảnh hưởng chiều dài tố
nhất (0.59a ± 0.24) và đồng hạng thống kê với TN3-NT8 và cao hơn nghiệm thức TN1-
NT1 (0.28ab ± 0.04).
Ở chỉ tiêu sinh khối thân nhận thấy 3 nghiệm thức dich nuôi cấy vi khuẩn cao hơn
so với đối chứng nước cất và daconil, nghiệm thức TN1-TN12 cho kết quả về sinh khối
thân tốt nhất với giá trị khối lượng (1.04a ± 0.08) g, và hai nghiệm thức dịch nuôi cấy
vi khuẩn còn lại đồng hạng với nhau.
3.3.7.2. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5,
L2N, L3 tới cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm.
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều dài của cây đậu phộng sau 14
ngày nảy mầm
Nghiệm Chiều dài rễ Chiều dài Sinh khối rễ Sinh khối
thức (mm) thân (mm) (g) thân (g)
Đối chứng (-) 72.6b ± 3.21 101.6b ± 2.88 0.54c ± 0.55 1.05b ± 0.06 Nước cất
Đối chứng (+) 70.6b ± 6.02 108.3b ±7.63 0.57bc ± 0.09 1.54b ± 0.04 Daconil 0,5g/l
TN1-NT1 89.3a ± 7.37 136.3a ± 6.02 0.69ab ± 0.02 1.91a ± 0.03
TN1-NT12 88a ± 1 136.6a ± 7.63 0.72a ± 0.08 1.93a ± 0.05
TN3-NT8 88.3a ± 7.09 140a ± 8.66 0.71ab ± 0.1 1.98a ± 0.07
104
2.5
160
140
2
120
Đồ án tốt nghiệp
)
) g (
100
1.5
m m
g n ợ ư
80
l
( i à d u ề i
1
60
g n ọ r T
h C
40
0.5
20
0
0
ĐC (+) Daconil
TN1-NT1
TN3-NT8
TN1-NT12
ĐC (-) Nước cất
Nghiệm thức
Chiều dài rễ
Chiều dài thân
Sinh khối rễ
Sinh khối thân
Hình 3.29: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng dịch nuôi cấy của 3 nghiệm thức TN1-NT1,
TN1-NT12, TN3-NT8 cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm.
Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng và hình
cho thấy, ở ngày 14 dịch nuôi cấy các nghiệm thức vi khuẩn vẫn ảnh hưởng tích cực
đến khả năng tăng chiều dài rễ , chiều dài thân và sinh khối rễ, sinh khối thân tốt hơn 2
đối chứng Daconil và nước cất.
Và không có sự sai khác về mặt thống kê giữa các nghiệm thức vi khuẩn ở các chỉ
tiêu chiều dài rễ, chiều dài thân, và sinh khối thân khả năng ảnh hưởng của các nghiệm
thức vi khuẩn tương đương nhau. Còn ở chỉ tiêu chiều sinh khối rễ TN1-NT12 cho kết
quả tốt nhất (0.72a ± 0.08) g.
105
Đồ án tốt nghiệp
ĐC (-)
ĐC (+)
TN1-
TN1-
TN3-
NT1
NT12
NT8
Hình 3.30: Cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm.
Cây đậu từ hạt giống xử lý với dịch vi khuẩn có khả năng nảy mầm, sinh trưởng và
phát triển tốt hơn so với hạt đậu phộng có hạt xử lý với nước cất. Những cây có hạt xử
lý với dịch vi khuẩn lactic ở các nghiệm thức TN1-NT1, TN1-NT12, TN3-NT8 cho
thấy sự sinh trưởng cao hơn so với đối chứng nước cất và daconil.
Ở nghiệm thức xử lý hạt với daconil, daconil là thuốc hóa học phòng trừ nấm, có
khả năng kiểm soát nấm và bệnh, trong khoảng thời gian từ lúc gieo đến khi thu kết
quả ít có sự xuất hiện của nấm mốc so với nước cất và hạt phát triển bình thường. Ở thí
nghiệm ngâm hạt với chế phẩm vi khuẩn, ban đầu xung quanh hạt có xuất hiện một ít
tơ nấm trắng nhưng biến mất sau một thời gian, lá mầm chỉ hư hại hại nhỏ nhưng kết
106
Đồ án tốt nghiệp
quả tốt hơn so với nước cất. Ở các nghiệm thức xử lý với chế phẩm vi khuẩn, ta nhận
thấy lá và rễ của các cây xử lý với chế phẩm tốt hơn và mạnh hơn so với xử lý bằng hai
đối chứng, nguyên nhân là do khả năng sinh tổng hợp hormone tăng trưởng thực vật
IAA của vi khuẩn cũng như các khả năng giúp cây trồng phát triển khác như khả năng
phân giải lân, tạo màng biofilm và khả năng đối kháng nấm.
107
Đồ án tốt nghiệp
ĐỀ NGHỊ QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM KÍCH THÍCH TĂNG
TRƯỞNG VÀ BẢO QUẢN HẠT CỦA CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS
SP. L5, L3, L2N
Bắp cải
Xử lý
Chuẩn bị môi trường
nuôi cấy
Các chủng
Tiệt trùng 121 0C/15phút L5, L3, L2N
Nuôi cấy ở 37 0C/24
giờ
Nhân giống trên môi trường MRS broth ở 37 0C/24 giờ
0C/10 phút, điều chỉnh pH6
Phối trộn L5:L3:L2N theo tỷ lệ 1:2:1, gia nhiệt 85
Ngâm hạt đậu phộng 15 phút
Sấy 850C đến độ ẩm <10%
Hạt đậu phộng đã xử lý
108
Đồ án tốt nghiệp
Thuyết minh quy trình:
- Hoạt hóa, tăng sinh các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N trong
môi trường tăng sinh MRS Agar ở 37 0C trong 24 giờ.
- Bắp cải xử lý thu dịch chiết chuẩn bị môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm
pepton và glucose. Tiệt trùng môi trường 121 0C/15 phút
- Cấy các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N vào môi trường bắp cải
nuôi cấy 37 0C trong 24 giờ.
- Sau 24 giờ, tạo chế phẩm bằng cách phối trộn các chủng vi khuẩn Lactobacillus
sp. L5, L3, L2N lần lượt theo tỷ lệ 1:2:1 điều chỉnh pH 6 đồng thời gia nhiệt lên
85 0C trong vòng 10 phút.
- Tiến hành ngâm hạt 15 phút.
- Sấy hạt 850C đến độ ẩm <10%.
- Bảo quản khô ráo.
109
Đồ án tốt nghiệp
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N ban đầu được khẳng định là chủng
vi khuẩn lactic bằng các biện pháp sinh hoá, sinh lý, hình thái.
Trên môi trường nước bắp cải có bổ sung peptone và cao nấm men, cả 3 chủng vi
khuẩn L5, L3, L2N đều có khả năng kháng nấm, tạo biofilm, sinh IAA và phân giải
lân.
Khả năng kháng nấm in vitro của 3 chủng vi khuẩn sinh acid lactic L5, L3, L2N
được xác định bằng phương pháp đối kháng trực tiếp bằng cách cấy ria 2 đường vi
khuẩn cho thấy chúng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc Aspergillus sp.
CĐP1 tốt tương đương với đối chứng hóa học Daconil 0,5g/l.
Dịch nuôi cấy các chủng vi khuẩn L5:L3: L2N theo tỷ lệ 1:2:1 gia nhiệt 850C trong
10 phút và tỷ lệ gia nhiệt 1000C trong 3 phút có khả năng bảo quản hạt đậu phộng tốt
nhất.
Ngâm hạt giống đậu phộng 15 phút trong hỗn hợp vi khuẩn tỉ lệ L5:L3: L2N 1:2:1
xử lý nhiệt 850C 10 phút sau đó đem gieo cho tỉ lệ nảy mầm cao nhất là 88.3 %, độ
khỏe mầm cao nhất là 135.4, sinh khối thân cao gấp 1.9 lần so với đối chứng nước cất
và 1.28 lần so với daconil, về sinh khối rễ cao gấp 1.31 lần so với nước cất và 1.24 lần
so với daconil. Từ đó đề nghị quy trình sản xuất dịch nuôi cấy.
Phối hợp Lactobacillus sp. L5, L3, L2N để ngâm hạt đậu phộng hỗ trợ tăng trưởng
cây trồng.
4.2. Kiến nghị
Ứng dụng kết quả từ thí nghiệm bảo quản để tạo chế phẩm hạt giống được xử lý
mang những tính năng vượt trội hơn hạt giống thông thường.
Khảo sát thêm thời gian bảo quản hạt giống đã được xử lý bởi dịch nuôi cấy vi
khuẩn.
Khảo sát dịch ngâm hạt giống để tạo chế phẩm sinh học dạng lỏng.
110
Đồ án tốt nghiệp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt:
1. Trần Lê Bích Trâm (2016) “Khảo sát khả năng kháng nấm của hợp chất thứ
cấp vi khuẩn lactic và ứng dụng trong bảo quản hạt giống”. Trường Đại học
Công Nghệ TP.HCM.
2. Lưu Đại Kim Phượng (2016) “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên
men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus
spp.”. Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM.
3. Nguyễn Lân Dũng, 2003, Vi sinh vật học, NXB Nông Nghiệp.
4. Nguyễn Đức Lượng (2002). Công nghệ vi sinh vật tập 2 Vi sinh vật học
công nghiệp. NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM.
5. Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003), Nấm mốc và độc tố Aflatoxin
trong thức ăn chăn nuôi. NXB Nông Nghiệp.
6. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Hồng, Lê Đình Lương (1982). Vi
nấm. NXB Khoa học và kỹ thuật, trang 108 - 110.
7. Nguyễn Xuân Việt (2017) “Khảo sát khả năng ứng dụng dịch nuôi cấy vi
khuẩn Lactobacillus sp. L5 vào bảo quản và xử lý hạt bắp.”. Trường Đại học
Công Nghệ TP.HCM.
Tài liệu Tiếng Anh:
8. A. Laitila, H-L. Alakomi, L. Raaska, T. Mattila-Sandholm and A. Haikara
(2002). Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against
Fusarium moulds in vitro and in malting of barley.
9. Klaenhammer R. 1993. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid
bacteria. FEMS Microbiology Reviews, vol.12. page 39-89 .
10. Roy, U., V. K. Batish, S. Grover, and S. Neelakantan. 1996. Production of
antifungal substance by Lactococcus lactis subsp. lactis CHD-28.3.
International Journal of Food Microbiology 32(1-2): 27-34.
111
Đồ án tốt nghiệp
11. José Luis Parada; Carolina Ricoy Caron; Adriane Bianchi P. Medeiros;
Carlos Ricardo Soccol. 2007. Bacteriocins from lactic acid bacteria:
purification, properties and use as biopreservatives 15.
12. M. P. Zacharof, R. W. Lovitt. 2012. Bacteriocins Produced by Lactic Acid
Bacteria A Review Article: 51-55.
Tài liệu Internet:
13. http://en.wikipedia.org/wiki/Lactic_acid_bacteria. 14. http://www.microbelibrary.org
112
Đồ án tốt nghiệp
PHỤ LỤC
A. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM
A.1 Môi trường MRS Broth
Đây là môi trường tổng hợp đặc hiệu cho việc nuôi cấy vi khuẩn lactic, tên đầy
đủ là: de Man, Rogosa and Sharpe (Robinson, 2007)
• Peptone 10g
• Meat extract 10g
• Yeast extract 5g
• D- Glucose 20g
• Diamoni citrate 2g
• Natri acetate 5g
• MgSO4 . 7H2O 0,1g
• MnSO4.4H2O 0,05g
• K2HPO4 2g
• Tween 80 1ml
• Nước cất 1000ml
Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25 0C. Khử trùng ở 121 0C trong 15 phút.
A.2 Môi trường MRS Agar (de Man, Rogosa and Sharpe (Robinson, 2007))
• Peptone 10g
1
Đồ án tốt nghiệp
• Meat extract 10g
• Yeast extract 5g
• D- Glucose 20g
• Natri acetate 5g
• Diamoni citrate 2g
• MgSO4.7H2O 0,1g
• MnSO4.4H2O 0,05g
• K2HPO4 2g
• Tween 80 1ml
• Nước cất 1000ml
• Agar 20g
Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25 0C. Khử trùng ở 121 0C trong 15 phút.
A.3 Môi trường MRS cải tiến
• Peptone 10g
• Meat extract 10g
• Yeast extract 5g
• D- Glucose 20g
• Natri acetate 5g
• MgSO4.7H2O 0,1g
• MnSO4. 4H2O 0,05g
2
Đồ án tốt nghiệp
• K2HPO4 2g
• Tween 80 1ml
• Nước cất 1000ml
• Agar 20g
Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25 0C. Khử trùng ở 121 0C trong 15 phút.
A.4 Môi trường Potato Dextrose Agar.
Gam/L Thành phần
20 D-glucose
1000ml Dịch chiết khoai tây 1000ml
20 Agar
5,6 ± 0,2 pH
Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, đun với 1000ml nước cất trong 30
phút. Thu dịch chiết và định mức lên 1000ml.
A5. Môi trường Potato Dextrose Broth.
Gam/L Thành phần
20 D-glucose
1000ml Dịch chiết khoai tây 1000ml
5,6 ± 0,2 pH
Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, đun với 1000ml nước cất trong 30
phút. Thu dịch chiết và định mức lên 1000ml
3
Đồ án tốt nghiệp
B. PHỤ LỤC HÌNH ẢNH
B1. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
Chủng Gram Bào tử Catalase Di động vi khuẩn
L2N
L3
C. PHỤ LỤC BIỂU ĐỒ
C.1 Đường chuẩn 3 vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2, L3
Đường chuẩn Lactobacillus sp. L5
4
7
6.5
) l
6
y = 4.7785x + 5.0579 R² = 0.9223
5.5
m / o à b ế t ( g o L
5
4.5
4
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
OD 600 nm
Đồ án tốt nghiệp
7
6.5
) l
6
5.5
y = 3.8194x + 4.8107 R² = 0.9606
5
m / o à b ế t ( g o L
4.5
4
0
0.1
0.2
0.4
0.5
0.6
0.3 OD 600 nm
Đường chuẩn Lactobacillus sp. L3
Đường chuẩn Lactobacillus sp. L2N
5
7
6.5
) l
6
y = 3.2524x + 4.6543 R² = 0.9431
5.5
m / o à b ế t ( g o L
5
4.5
4
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
OD 600 nm
Đồ án tốt nghiệp
C2. Đường chuẩn IAA
Bảng 3.3 Kết quả biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ IAA.
Thể tích IAA 100m/l 0 5 10 15 20 25
(ml)
Thể tích môi trường 100 95 90 85 80 75
MRS
Nồng độ IAA (µg/ml) 5 10 15 20 25 0
Số đo OD 530 0.167 0.298 0.445 0.555 0.675 0
6
0.8
0.7
Đồ án tốt nghiệp
)
0.6
0.5
m n 0 3 5 (
0.4
D O
0.3
y = 0.0268x + 0.022 R² = 0.9955
0.2
0.1
0
0
5
10
15
20
25
30
Nồng độ IAA (μg/ml)
Đường chuẩn IAA, tương quan giữa OD 530nm và nồng độ IAA tinh khiết (µg/ml) .
C3. Đường chuẩn phosphate
3- (mg/l)
Bảng 3.4 Chỉ số OD 690nm của các nồng độ KH2PO4 khác nhau.
Nồng độ PO4 Hoá
chất 0 0.8 1.6 2.4 3.2 4.00
Dung
dịch
0 4 8 12 16 20 KH2PO4
10 mg/l
(ml)
Dung
dịch 4 4 4 4 4 4 AM
(ml)
7
Đồ án tốt nghiệp
Dung
dịch 10 10 10 10 10 10 SnCl2
(giọt)
Định mức tới vạch 50ml bằng nước cất, đảo đều bình, đợi 10-12 phút, đo OD690nm
y = 0.2245x - 0.0043 R² = 0.9999
OD 0 0.168 0.357 0.533 0.716 0.893
m n 0 9 6 D O
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1
Nồng độ PO4
Đánh giá khả năng phân giải lân của 3 chủng vi khuẩn trên 3 môi trường nuôi cấy có
bổ sung Ca3(PO4)2.
D. PHU LỤC BẢNG LIỆU
D.1 So sánh khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn LAB trên các môi
trường
D1.1 Chủng L5
DATA; INPUT MOITRUONG $ TILEKHANGNAM; CARDS;
8
Đồ án tốt nghiệp
DC 23.89
DC 25.37
DC 31.28
L5_MRS 40.89
L5_MRS 43.84
L5_MRS 43.10
L5_NG 47.54
L5_NG 38.67
L5_NG 42.36
L5_BC 38.67
L5_BC 41.63
L5_BC 42.36
; PROC ANOVA; CLASS MOITRUONG; MODEL TILEKHANGNAM =
MOITRUONG; MEANS MOITRUONG / LSD; MEANS MOITRUONG/ LSD
ALPHA = 0.05; TITLE ‘KHA NANG KHANG NAM L5; RUN;
KHA NANG KHANG NAM L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ TILEKHANGNAM; CARDS;DC 23.89DC 25.37DC 3 88
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Class Level Information
9
Đồ án tốt nghiệp
Class Levels Values
MOITRUONG 4 DC L5_BC L5_MRS L5_NG
Number of Observations Read 12
Number of Observations Used 12
KHA NANG KHANG NAM L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ TILEKHANGNAM; CARDS;DC 23.89DC 25.37DC 3 89
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: TILEKHANGNAM
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3 531.6270000 177.2090000 17.16 0.0008
Error 8 82.6336000 10.3292000
Corrected Total 11 614.2606000
R-Square Coeff Var Root MSE TILEKHANGNAM Mean
0.865475 8.391403 3.213907 38.30000
10
Đồ án tốt nghiệp
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 3 531.6270000 177.2090000 17.16 0.0008
KHA NANG KHANG NAM L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ TILEKHANGNAM; CARDS;DC 23.89DC 25.37DC 3 90
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for TILEKHANGNAM
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 10.3292
Critical Value of t 2.30600
Least Significant Difference 6.0513
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N MOITRUONG
11
Đồ án tốt nghiệp
A 42.857 3 L5_NG
A
A 42.610 3 L5_MRS
A
A 40.887 3 L5_BC
B 26.847 3 DC
D1.2 Chủng L3
DATA; INPUT MOITRUONG $ TILEKHANGNAM; CARDS;
23.89 DC
25.37 DC
31.28 DC
43.84 L3_MRS
52.71 L3_MRS
40.89 L3_MRS
39.41 L3_NG
44.58 L3_NG
46.80 L3_NG
47.93 L3_BC
44.58 L3_BC
12
Đồ án tốt nghiệp
L3_BC 42.36
; PROC ANOVA; CLASS MOITRUONG; MODEL TILEKHANGNAM =
MOITRUONG; MEANS MOITRUONG / LSD; MEANS MOITRUONG / LSD
ALPHA = 0.05; TITLE ‘MOI TRUONG TOI UU L3; RUN;
MOI TRUONG TOI UU L3; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ TILEKHANGNAM; CARDS;DC 23.89DC 25.37DC 3 164
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 4 DC L3_BC L3_MRS L3_NG
Number of Observations Read 12
Number of Observations Used 12
MOI TRUONG TOI UU L3; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ TILEKHANGNAM; CARDS;DC 23.89DC 25.37DC 3 165
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: TILEKHANGNAM
13
Đồ án tốt nghiệp
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3 731.8246000 243.9415333 12.94 0.0019
Error 8 150.7558667 18.8444833
Corrected Total 11 882.5804667
R-Square Coeff Var Root MSE TILEKHANGNAM Mean
0.829187 10.77088 4.341023 40.30333
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 3 731.8246000 243.9415333 12.94 0.0019
MOI TRUONG TOI UU L3; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ TILEKHANGNAM; CARDS;DC 23.89DC 25.37DC 3 166
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for TILEKHANGNAM
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
14
Đồ án tốt nghiệp
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 18.84448
Critical Value of t 2.30600
Least Significant Difference 8.1735
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N MOITRUONG
A 45.813 3 L3_MRS
A
A 44.957 3 L3_BC
A
A 43.597 3 L3_NG
B 26.847 3 DC
D1.3 Chủng L2N
DATA; INPUT MOITRUONG $ TILEKHANGNAM; CARDS;
23.89 DC
25.37 DC
15
Đồ án tốt nghiệp
DC 31.28
L2N_MRS 38.67
L2N_MRS 44.58
L2N_MRS 40.89
L2N_NG 43.10
L2N_NG 49.75
L2N_NG 42.36
L2N_BC 42.36
L2N_BC 49.01
L2N_BC 41.63
; PROC ANOVA; CLASS MOITRUONG; MODEL TILEKHANGNAM =
MOITRUONG; MEANS MOITRUONG / LSD; MEANS MOITRUONG / LSD
ALPHA = 0.05; TITLE ‘MOI TRUONG TOI UU L2N; RUN;
I TRUONG TOI UU L2N; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ TILEKHANGNAM; CARDS;DC 23.89DC 25.37DC 140
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 4 DC L2N_BC L2N_MRS L2N_NG
16
Đồ án tốt nghiệp
Number of Observations Read 12
Number of Observations Used 12
MOI TRUONG TOI UU L2N; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ TILEKHANGNAM; CARDS;DC 23.89DC 25.37DC 141
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: TILEKHANGNAM
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3 653.9790917 217.9930306 15.22 0.0011
Error 8 114.6017333 14.3252167
Corrected Total 11 768.5808250
R-Square Coeff Var Root MSE TILEKHANGNAM Mean
0.850892 9.604433 3.784867 39.40750
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
17
Đồ án tốt nghiệp
MOITRUONG 3 653.9790917 217.9930306 15.22 0.0011
MOI TRUONG TOI UU L2N; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ TILEKHANGNAM; CARDS;DC 23.89DC 25.37DC 142
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for TILEKHANGNAM
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 14.32522
Critical Value of t 2.30600
Least Significant Difference 7.1263
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N MOITRUONG
A 45.070 3 L2N_NG
18
Đồ án tốt nghiệp
A
A 44.333 3 L2N_BC
A
A 41.380 3 L2N_MRS
B 26.847 3 DC
D1.4 Vòng kháng nấm
VONG UC CHE NAM’
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
CHUNG 3 l2 l3 l5
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: VONGUCCHE
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 9.84206956 4.92103478 2.38 0.1731 2
Error 12.39314267 2.06552378 6
Corrected Total 22.23521222 8
R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean
19
Đồ án tốt nghiệp
R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean
0.442634 3.306899 1.437193 43.46044
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
CHUNG 2 9.84206956 4.92103478 2.38 0.1731
‘VONG UC CHE NAM’
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for VONGUCCHE
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 6
Error Mean Square 2.065524
Critical Value of t 2.44691
Least Significant Difference 2.8714
Means with the same letter
are not significantly different.
t Grouping Mean N CHUNG
A 44.669 3 l3
A
20
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter
are not significantly different.
t Grouping Mean N CHUNG
A 43.594 3 l2
A
A 42.118 3 l5
D.2 So sánh khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn LAB trên các môi
trường ngày 3.
D2.1 Chủng L5
NONG DO PO4 SINH RA CUA CHUNG L5’
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 3 MRS NBAPCAI NGIA
Number of Observations Read 9
Number of Observations Used 9
NONG DO PO4 SINH RA CUA CHUNG L5’
21
Đồ án tốt nghiệp
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: NONGDO
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 33168534.90 16584267.45 909.86 <.0001 2
Error 109363.23 18227.20 6
Corrected Total 33277898.13 8
R-Square Coeff Var Root MSE NONGDO Mean
0.996714 5.876768 135.0082 2297.320
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 2 33168534.90 16584267.45 909.86 <.0001
‘NONG DO PO4 SINH RA CUA CHUNG L5’
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for NONGDO
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 6
22
Đồ án tốt nghiệp
Error Mean Square 18227.2
Critical Value of t 2.44691
Least Significant Difference 269.73
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MOITRUONG
A 5010.8 3 NGIA
B 1015.9 3 NBAPCAI
B
B 865.3 3 MRS
D2.2 Chủng L2N
NONG DO PO4 SINH RA CUA CHUNG L2N’
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 3 MRS NBAPCAI NGIA
Number of Observations Read 9
23
Đồ án tốt nghiệp
Number of Observations Used 9
NONG DO PO4 SINH RA CUA CHUNG L2N’
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: NONGDO
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 1786063.557 893031.778 9.12 0.0152 2
Error 587790.198 97965.033 6
Corrected Total 2373853.755 8
R-Square Coeff Var Root MSE NONGDO Mean
0.752390 9.126085 312.9937 3429.660
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 2 1786063.557 893031.778 9.12 0.0152
NONG DO PO4 SINH RA CUA CHUNG L2N’
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for NONGDO
24
Đồ án tốt nghiệp
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 6
Error Mean Square 97965.03
Critical Value of t 2.44691
Least Significant Difference 625.33
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MOITRUONG
A 4027.4 3 NGIA
B 3303.1 3 NBAPCAI
B
B 2958.5 3 MRS
D2.3 Chủng L3
NONG DO PO4 SINH RA CUA CHUNG L3’
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 3 MRS NBAPCAI NGIA
25
Đồ án tốt nghiệp
9 Number of Observations Read
9 Number of Observations Used
NONG DO PO4 SINH RA CUA CHUNG L3’
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: NONGDO
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3111522.696 1555761.348 16.30 0.0038 2
Error 572498.045 95416.341 6
Corrected Total 3684020.741 8
R-Square Coeff Var Root MSE NONGDO Mean
0.844600 9.876704 308.8954 3127.515
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 2 3111522.696 1555761.348 16.30 0.0038
‘NONG DO PO4 SINH RA CUA CHUNG L3’
The ANOVA Procedure
26
Đồ án tốt nghiệp
t Tests (LSD) for NONGDO
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 6
Error Mean Square 95416.34
Critical Value of t 2.44691
Least Significant Difference 617.14
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MOITRUONG
A 3834.7 3 NGIA
B 3152.7 3 MRS
C 2395.1 3 NBAPCAI
D3 So sánh khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn LAB trên các môi trường
D3.1 Chủng L5
DATA; INPUT MOITRUONG $ NONGDOIAA; CARDS;
27
Đồ án tốt nghiệp
DC 25.000
DC 25.000
DC 25.000
L5_MRS 7.164
L5_MRS 7.799
L5_MRS 8.769
L5_NG 3.358
L5_NG 2.836
L5_NG 5.075
L5_BC 5.634
L5_BC 4.440
L5_BC 4.739
; PROC ANOVA; CLASS MOITRUONG; MODEL NONGDOIAA = MOITRUONG;
MEANS MOITRUONG / LSD; MEANS MOITRUONG / LSD ALPHA = 0.05;
TITLE ‘KHA NANG SINH IAA L5; RUN;
KHA NANG SINH IAA L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ NONGDOIAA;
CARDS;DC 25.000DC 25.000DC 25 136
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Class Level Information
28
Đồ án tốt nghiệp
Class Levels Values
MOITRUONG 4 DC L5_BC L5_MRS L5_NG
Number of Observations Read 12
Number of Observations Used 12
KHA NANG SINH IAA L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ NONGDOIAA;
CARDS;DC 25.000DC 25.000DC 25 137
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: NONGDOIAA
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3 879.9965017 293.3321672 486.53 <.0001
Error 8 4.8233020 0.6029128
Corrected Total 11 884.8198037
R-Square Coeff Var Root MSE NONGDOIAA Mean
0.994549 7.465264 0.776475 10.40117
29
Đồ án tốt nghiệp
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 3 879.9965017 293.3321672 486.53 <.0001
KHA NANG SINH IAA L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ NONGDOIAA;
CARDS;DC 25.000DC 25.000DC 25 138
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for NONGDOIAA
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 0.602913
Critical Value of t 2.30600
Least Significant Difference 1.462
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N MOITRUONG
30
Đồ án tốt nghiệp
A 25.0000 3 DC
B 7.9107 3 L5_MRS
C 4.9377 3 L5_BC
C
C 3.7563 3 L5_NG
D3.2 Chủng L2N
2.2.3 Khả năng sinh IAA:
DATA; INPUT MOITRUONG $ NONGDOIAA; CARDS;
DC 25.000
DC 25.000
DC 25.000
L2N_MRS 3.881
L2N_MRS 5.597
L2N_MRS 8.022
L2N_NG 3.955
L2N_NG 3.731
L2N_NG 6.194
31
Đồ án tốt nghiệp
L2N_BC 4.179
L2N_BC 4.291
L2N_BC 3.246
; PROC ANOVA; CLASS MOITRUONG; MODEL NONGDOIAA = MOITRUONG;
MEANS MOITRUONG / LSD; MEANS MOITRUONG / LSD ALPHA = 0.05;
TITLE ‘KHA NANG SINH IAA L2N; RUN;
KHA NANG SINH IAA L2N; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ NONGDOIAA; CARDS;DC 25.000DC 25.000DC 2 160
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 4 DC L2N_BC L2N_MRS L2N_NG
Number of Observations Read 12
Number of Observations Used 12
KHA NANG SINH IAA L2N; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ NONGDOIAA; CARDS;DC 25.000DC 25.000DC 2 161
21:00 Thursday, April 30, 2018
32
Đồ án tốt nghiệp
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: NONGDOIAA
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3 924.8342507 308.2780836 189.33 <.0001
Error 8 13.0259620 1.6282452
Corrected Total 11 937.8602127
R-Square Coeff Var Root MSE NONGDOIAA Mean
0.986111 12.96600 1.276027 9.841333
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr >
MOITRUONG 3 924.8342507 308.2780836 189.33 <.0001
KHA NANG SINH IAA L2N; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG
$ NONGDOIAA; CARDS;DC 25.000DC 25.000DC 2 162
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for NONGDOIAA
33
Đồ án tốt nghiệp
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 1.628245
Critical Value of t 2.30600
Least Significant Difference 2.4026
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N MOITRUONG
A 25.000 3 DC
B 5.833 3 L2N_MRS
B
B 4.627 3 L2N_NG
B
B 3.905 3 L2N_BC
D3.3 Chủng L3
34
Đồ án tốt nghiệp
DATA; INPUT MOITRUONG $ NONGDOIAA; CARDS;
DC 25.000
DC 25.000
DC 25.000
L3_MRS 7.090
L3_MRS 8.843
L3_MRS 10.299
L3_NG 1.567
L3_NG 2.201
L3_NG 2.948
L3_BC 4.627
L3_BC 5.522
L3_BC 4.440
; PROC ANOVA; CLASS MOITRUONG; MODEL NONGDOIAA = MOITRUONG;
MEANS MOITRUONG / LSD; MEANS MOITRUONG / LSD ALPHA = 0.05;
TITLE ‘KHA NANG SINH IAA L5; RUN;
KHA NANG SINH IAA L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ NONGDOIAA;
CARDS;DC 25.000DC 25.000DC 25 188
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
35
Đồ án tốt nghiệp
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 4 DC L3_BC L3_MRS L3_NG
Number of Observations Read 12
Number of Observations Used 12
KHA NANG SINH IAA L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ NONGDOIAA;
CARDS;DC 25.000DC 25.000DC 25 189
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: NONGDOIAA
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3 939.0774362 313.0258121 368.91 <.0001
Error 8 6.7881567 0.8485196
Corrected Total 11 945.8655929
36
Đồ án tốt nghiệp
R-Square Coeff Var Root MSE NONGDOIAA Mean
0.992823 9.020798 0.921151 10.21142
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 3 939.0774362 313.0258121 368.91 <.0001
KHA NANG SINH IAA L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ NONGDOIAA;
CARDS;DC 25.000DC 25.000DC 25 190
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for NONGDOIAA
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 0.84852
Critical Value of t 2.30600
Least Significant Difference 1.7344
37
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N MOITRUONG
A 25.0000 3 DC
B 8.7440 3 L3_MRS
C 4.8630 3 L3_BC
D 2.2387 3 L3_NG
D4 So sánh khả năng tạo màng biofilm của các chủng vi khuẩn LAB trên các môi
trường
D4.1 Chủng L5
DATA; INPUT MOITRUONG $ OD; CARDS;
0.000 DC
0.000 DC
0.000 DC
L5_MRS 0.174
L5_MRS 0.169
L5_MRS 0.145
L5_NG 0.454
38
Đồ án tốt nghiệp
L5_NG 0.414
L5_NG 0.401
L5_BC 0.420
L5_BC 0.419
L5_BC 0.441
; PROC ANOVA; CLASS MOITRUONG; MODEL OD = MOITRUONG; MEANS
MOITRUONG / LSD; MEANS MOITRUONG/ LSD ALPHA = 0.05; TITLE ‘KHA
NANG TAO BIOFILM L5; RUN;
KHA NANG TAO BIOFILM L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ OD;
CARDS;DC 0.000DC 0.000DC 0.000L5_ 112
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 4 DC L5_BC L5_MRS L5_NG
Number of Observations Read 12
Number of Observations Used 12
39
Đồ án tốt nghiệp
KHA NANG TAO BIOFILM L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ OD;
CARDS;DC 0.000DC 0.000DC 0.000L5_ 113
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: OD
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3 0.39368758 0.13122919 453.43 <.0001
Error 8 0.00231533 0.00028942
Corrected Total 11 0.39600292
R-Square Coeff Var Root MSE OD Mean
0.994153 6.721996 0.017012 0.253083
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 3 0.39368758 0.13122919 453.43 <.0001
KHA NANG TAO BIOFILM L5; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ OD;
CARDS;DC 0.000DC 0.000DC 0.000L5_ 114
21:00 Thursday, April 30, 2018
40
Đồ án tốt nghiệp
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for OD
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 0.000289
Critical Value of t 2.30600
Least Significant Difference 0.032
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N MOITRUONG
A 0.42667 3 L5_BC
A
A 0.42300 3 L5_NG
B 0.16267 3 L5_MRS
C 0.00000 3 DC
41
Đồ án tốt nghiệp
D4.2 Chủng L2N
DATA; INPUT MOITRUONG $ OD; CARDS;
DC 0.000
DC 0.000
DC 0.000
L2N_MRS 0.292
L2N_MRS 0.215
L2N_MRS 0.252
L2N_NG 0.347
L2N_NG 0.327
L2N_NG 0.313
L2N_BC 0.322
L2N_BC 0.338
L2N_BC 0.310
; PROC ANOVA; CLASS MOITRUONG; MODEL OD = MOITRUONG; MEANS
MOITRUONG / LSD; MEANS MOITRUONG / LSD ALPHA = 0.05; TITLE ‘KHA
NANG TAO BIOFILM L2N; RUN;
KHA NANG TAO BIOFILM L2N; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ OD;
CARDS;DC 0.000DC 0.000DC 0.000L2 148
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
42
Đồ án tốt nghiệp
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 4 DC L2N_BC L2N_MRS L2N_NG
Number of Observations Read 12
Number of Observations Used 12
KHA NANG TAO BIOFILM L2N; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ OD;
CARDS;DC 0.000DC 0.000DC 0.000L2 149
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: OD
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3 0.21566200 0.07188733 145.79 <.0001
Error 8 0.00394467 0.00049308
Corrected Total 11 0.21960667
43
Đồ án tốt nghiệp
R-Square Coeff Var Root MSE OD Mean
0.982038 9.810963 0.022205 0.226333
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 3 0.21566200 0.07188733 145.79 <.0001
KHA NANG TAO BIOFILM L2N; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ OD;
CARDS;DC 0.000DC 0.000DC 0.000L2 150
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for OD
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 0.000493
Critical Value of t 2.30600
Least Significant Difference 0.0418
Means with the same letter are not significantly different.
44
Đồ án tốt nghiệp
t Grouping Mean N MOITRUONG
A 0.32900 3 L2N_NG
A
A 0.32333 3 L2N_BC
B 0.25300 3 L2N_MRS
C 0.00000 3 DC
D4.3 Chủng L3
DATA; INPUT MOITRUONG $ OD; CARDS;
DC 0.000
DC 0.000
DC 0.000
L3_MRS 0.238
L3_MRS 0.208
L3_MRS 0.242
L3_NG 0.099
L3_NG 0.080
45
Đồ án tốt nghiệp
L3_NG 0.071
L3_BC 0.281
L3_BC 0.235
L3_BC 0.264
; PROC ANOVA; CLASS MOITRUONG; MODEL OD = MOITRUONG; MEANS
MOITRUONG / LSD; MEANS MOITRUONG / LSD ALPHA = 0.05; TITLE ‘KHA
NANG TAO BIOFILM L3; RUN;
KHA NANG TAO BIOFILM L3; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ OD;
CARDS;DC 0.000DC 0.000DC 0.000L3_ 172
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 4 DC L3_BC L3_MRS L3_NG
Number of Observations Read 12
Number of Observations Used 12
KHA NANG TAO BIOFILM L3; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ OD;
CARDS;DC 0.000DC 0.000DC 0.000L3_ 173
46
Đồ án tốt nghiệp
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: OD
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3 0.13545433 0.04515144 165.59 <.0001
Error 8 0.00218133 0.00027267
Corrected Total 11 0.13763567
R-Square Coeff Var Root MSE OD Mean
0.984151 11.53385 0.016513 0.143167
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 3 0.13545433 0.04515144 165.59 <.0001
KHA NANG TAO BIOFILM L3; RUN;DATA; INPUT MOITRUONG $ OD;
CARDS;DC 0.000DC 0.000DC 0.000L3_ 174
21:00 Thursday, April 30, 2018
The ANOVA Procedure
47
Đồ án tốt nghiệp
t Tests (LSD) for OD
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 0.000273
Critical Value of t 2.30600
Least Significant Difference 0.0311
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N MOITRUONG
A 0.26000 3 L3_BC
A
A 0.22933 3 L3_MRS
B 0.08333 3 L3_NG
C 0.00000 3 DC
48
Đồ án tốt nghiệp
D5 Các chỉ tiêu cây đậu phộng
D5.1 Tỷ lệ nảy mầm
‘TY LE NAY MAM’
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MAU 5 DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8
Number of Observations Read 15
Number of Observations Used 15
‘TY LE NAY MAM’
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: TYLE
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 4 740.000000 185.000000 3.17 0.0632
Error 10 583.333333 58.333333
Corrected Total 14 1323.333333
49
Đồ án tốt nghiệp
R-Square Coeff Var Root MSE TYLE Mean
0.559194 10.00562 7.637626 76.33333
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MAU 4 740.0000000 185.0000000 3.17 0.0632
TY LE NAY MAM’
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for TYLE
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 58.33333
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 13.895
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
A 88.333 3 TN3-NT8
50
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
A
B A 76.667 3 TN1-NT12
B A
B A 76.667 3 TN1-NT1
B
B 73.333 3 DC+
B
B 66.667 3 DC-
D5.2 Độ khoẻ mầm
‘DO KHOE MAM NGAY 7
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MAU 5 DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8
51
Đồ án tốt nghiệp
Number of Observations Read 15
Number of Observations Used 15
DO KHOE MAM
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: DOKHOE
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
4 11329.68667 2832.42167 22.67 <.0001 Model
10 1249.33333 124.93333 Error
Corrected Total 14 12579.02000
R-Square Coeff Var Root MSE DOKHOE Mean
0.900681 11.08865 11.17736 100.8000
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MAU 4 11329.68667 2832.42167 22.67 <.0001
DO KHOE MAM
52
Đồ án tốt nghiệp
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for DOKHOE
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 124.9333
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 20.335
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
135.500 3 TN3-NT8 A
A
A 115.600 3 TN1-NT12
A
A 115.167 3 TN1-NT1
B 76.200 3 DC+
53
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
B
B 61.533 3 DC-
D5.3 Chiều dài rễ cây đậu phộng ngày 7
CHIEU DAI RE NGAY 7
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MAU 5 DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8
Number of Observations Read 15
Number of Observations Used 15
CHIEU DAI RE XU LY 7
NGAY’
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: CHIEUDAI
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 4 1865.733333 466.433333 27.65 <.0001
54
Đồ án tốt nghiệp
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Error 10 168.666667 16.866667
Corrected Total 14 2034.400000
R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUDAI Mean
0.917093 6.937339 4.106905 59.20000
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MAU 4 1865.733333 466.433333 27.65 <.0001
CHIEU DAI RE XU LY 7 NGAY’
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for CHIEUDAI
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 16.86667
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 7.4716
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
55
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
68.667 3 TN1-NT1 A
A
A 68.333 3 TN3-NT8
A
A 67.667 3 TN1-NT12
B 48.000 3 DC+
B
B 43.333 3 DC-
D5.4 Chiều dài thân cây đậu phộng ở ngày 7
CHIEU DAI THAN XU NGÀY 7
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MAU 5 DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8
Number of Observations Read 15
Number of Observations Used 15
56
Đồ án tốt nghiệp
CHIEU DAI THAN NGAY 7
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: CHIEUDAI
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 4 3542.933333 885.733333 46.62 <.0001
Error 10 190.000000 19.000000
Corrected Total 14 3732.933333
R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUDAI Mean
0.949102 6.145064 4.358899 70.93333
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MAU 4 3542.933333 885.733333 46.62 <.0001
CHIEU DAI THAN NGAY 7
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for CHIEUDAI
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 19
57
Đồ án tốt nghiệp
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 7.93
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
85.000 3 TN3-NT8 A
A
A 83.333 3 TN1-NT12
A
A 81.667 3 TN1-NT1
B 55.667 3 DC+
B
B 49.000 3 DC-
D5.5 Trọng lượng rễ cây đậu phộng ngày 7
SINH KHOI RE NGAY 7
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MAU 5 DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8
58
Đồ án tốt nghiệp
Number of Observations Read 15
Number of Observations Used 15
TRONG LUONG RE NGAY 7
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: SINH KHOI
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
4 0.43537333 0.10884333 3.32 0.0565 Model
10 0.32820000 0.03282000 Error
Corrected Total 14 0.76357333
R-Square Coeff Var Root MSE TRONGLUONG Mean
0.570179 47.84232 0.181163 0.378667
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MAU 4 0.43537333 0.10884333 3.32 0.0565
59
Đồ án tốt nghiệp
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
TRONG LUONG RE XU NGAY 7
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for TRONGLUONG
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 0.03282
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 0.3296
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
0.5900 3 TN1-NT12 A
A
A 0.5800 3 TN3-NT8
A
B A 0.2867 3 TN1-NT1
B
B 0.2233 3 DC+
60
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
B
B 0.2133 3 DC-
D5.6 Trọng lượng thân cây đậu phộng ngày 7
TRONG LUONG THAN NGAY 7’
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MAU 5 DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8
Number of Observations Read 15
Number of Observations Used 15
TRONG LUONG THAN NGAY 7’
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for TRONGLUONG
Alpha 0.05
61
Đồ án tốt nghiệp
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 0.00814
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 0.1641
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
1.09000 3 TN1-NT12 A
A
B A 1.04333 3 TN1-NT1
B A
B A 1.03667 3 TN3-NT8
B
B C 0.89667 3 DC-
C
C 0.86000 3 DC+
D5.7 Chiều dài rễ cây đậu phộng ngày 14
CHIEU DAI RE NGAY 14
The ANOVA Procedure
62
Đồ án tốt nghiệp
Class Level Information
Class Levels Values
MAU 5 DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8
Number of Observations Read 15
Number of Observations Used 15
CHIEU DAI RE NGAY 14
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: CHIEUDAI
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
4 1035.733333 258.933333 8.50 0.0030 Model
10 304.666667 30.466667 Error
Corrected Total 14 1340.400000
R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUDAI Mean
0.772705 6.747753 5.519662 81.80000
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MAU 4 1035.733333 258.933333 8.50 0.0030
63
Đồ án tốt nghiệp
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
CHIEU DAI RE NGAY 14
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for CHIEUDAI
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 30.46667
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 10.042
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
89.333 3 TN1-NT1 A
A
A 88.333 3 TN3-NT8
A
A 88.000 3 TN1-NT12
B 72.667 3 DC-
64
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
B
B 70.667 3 DC+
D5.8 Chiều dài thân cây đậu phộng ngày 14
CHIEU DAI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MAU 5 DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8
Number of Observations Read 15
Number of Observations Used 15
CHIEU DAI THAN CAY DAU PHONG NGAY
14
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: CHIEUDAI
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
65
Đồ án tốt nghiệp
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
4 3932.933333 983.233333 20.80 <.0001 Model
10 472.666667 47.266667 Error
Corrected Total 14 4405.600000
R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUDAI Mean
0.892712 5.517717 6.875076 124.6000
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MAU 4 3932.933333 983.233333 20.80 <.0001
‘CHIEU DAI THAN NGAY 14
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for CHIEUDAI
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 47.26667
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 12.508
Means with the same letter are
not significantly different.
66
Đồ án tốt nghiệp
t Grouping Mean N MAU
140.000 3 TN3-NT8 A
A
A 136.667 3 TN1-NT12
A
A 136.333 3 TN1-NT1
B 108.333 3 DC+
B
B 101.667 3 DC-
D5.9 Sinh khối rễ cây đậu phộng ngày 14
SINH KHOI RE CAY DAU PHONG NGAY 14
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
MAU 5 DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8
Number of Observations Read 15
Number of Observations Used 15
67
Đồ án tốt nghiệp
SINH KHOI RE CAY DAU PHONG NGAY 14
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: SINH KHOI
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 4 0.08602667 0.02150667 3.45 0.0509
Error 10 0.06226667 0.00622667
Corrected Total 14 0.14829333
R-Square Coeff Var Root MSE SINH KHOI Mean
0.580111 12.15235 0.078909 0.649333
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MAU 4 0.08602667 0.02150667 3.45 0.0509
SINH KHOI RE CAY DAU PHONG NGAY 14
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for SINH KHOI
Alpha 0.05
68
Đồ án tốt nghiệp
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 0.006227
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 0.1436
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
0.72333 3 TN1-NT12 A
A
B A 0.71667 3 TN3-NT8
B A
B A 0.69000 3 TN1-NT1
B
B C 0.57333 3 DC+
C
C 0.54333 3 DC-
D5.10 Sinh khối thân cây đậu phộng ngày 14
SINH KHOI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14
The ANOVA Procedure
Class Level Information
69
Đồ án tốt nghiệp
Class Levels Values
MAU 5 DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8
Number of Observations Read 15
Number of Observations Used 15
SINH KHOI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: SINH KHOI
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 4 0.63617333 0.15904333 45.70 <.0001
Error 10 0.03480000 0.00348000
Corrected Total 14 0.67097333
R-Square Coeff Var Root MSE SINH KHOI Mean
0.948135 3.322842 0.058992 1.775333
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
MAU 4 0.63617333 0.15904333 45.70 <.0001
SINH KHOI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14
70
Đồ án tốt nghiệp
The ANOVA Procedure
t Tests (LSD) for SINH KHOI
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 10
Error Mean Square 0.00348
Critical Value of t 2.22814
Least Significant Difference 0.1073
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
1.98000 3 TN3-NT8 A
A
A 1.93667 3 TN1-NT12
A
A 1.91000 3 TN1-NT1
B 1.54333 3 DC+
B
71
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are
not significantly different.
t Grouping Mean N MAU
B 1.50667 3 DC-
72
