KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU
390
XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN C-KIT D816V
BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR TRÊN BỆNH NHÂN
LƠ XÊ MI CẤP DÒNG TỦY TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI
Nguyễn Thị Cúc Nhung1, Vũ Hoàng2, Vũ Minh Phương1
TÓM TẮT45
Đột biến gen c-Kit D816V là đột biến trên
gen c-Kit tại vị trí codon 816, thay thế acid amin
aspatart thành valin, từ đó làm thay đổi sự dẫn
truyền tín hiệu. Đột biến này đưc nhiều nghiên
cứu cho thấy như loại đột biến thứ phát trên bệnh
lơ xê mi cấp dòng tủy và có ý nghĩa tiên lưng
xấu cho nhóm bệnh nhân này. Vì vậy chúng tôi
tiến hành nghiên cứu với mục tiêu là nhận xét
đặc điểm đột biến gen C-kit D816V bằng phương
pháp real-time PCR và mô tả một số ca bệnh có
đột biến gen C-kit D816V. Nghiên cứu đưc
thiết kế là nghiên cứu mô tả, theo dõi dọc trên 75
bệnh nhân đưc chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng tủy
đưc chẩn đoán lần đầu tại Bệnh viện Bạch Mai.
Từ những kết quả nghiên cứu chúng tôi nhận xét
một số đặc điểm của đột biến gen C-Kit D816V
đưc phát hiện bằng phương pháp Real-time
PCR, sử dụng bộ kit geneMAP c-Kit D816V
Mutation Detection Kit (Genmark, Thổ Nhĩ Kỳ)
trên thiết bị Biorad CFX96 (Biorad, Mỹ). Tỷ lệ
đột biến c-Kit D816V ở 75 bệnh nhân Lơ xê mi
cấp dòng tủy, tại Bệnh viện Bạch Mai là 2,7%.
Theo dõi dọc hai trưng hp có đột biến c-Kit
D816V đều có kết cục xấu. Trưng hp bệnh
1Trường Đại học Y Hà Nội
2Bệnh viện Bạch Mai
Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Cúc Nhung
SĐT: 0368192226
Email: dr.cucnhung@gmail.com
Ngày nhận bài: 08/8/2024
Ngày phản biện khoa học: 08/8/2024
Ngày duyệt bài: 30/9/2024
nhân trẻ tuổi, thể trạng tốt thì có thi gian tái
phát sớm. Bệnh nhân này có thi gian sống toàn
bộ là 09 tháng, thi gian sống không bệnh là 02
tháng. Trưng hp bệnh nhân lớn tuổi có thi
gian sống thêm rất ngắn. Kết quả này phù hp
với nhiều nghiên cứu về nhận xét tiên lưng của
đột biến c-Kit D816V trên bệnh nhân lơ xê mi
cấp dòng tủy. Những kết quả bước đầu này gi ý
cần thực hiện nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để
tìm hiểu về đột biến c-Kit D816V trên bệnh nhân
lơ xê mi cấp dòng tủy.
Từ khóa: Lơ xê mi cấp dòng tủy, c-Kit
D816V, real-time PCR
SUMMARY
DETERMINATION OF C-KIT D816V BY REAL-
TIME PCR IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA AT
BACH MAI HOSPITAL
C-Kit D816V is a mutation in the c-Kit gene
at codon 816, substituting aspartic acid with
valine (D816V) renders the receptor independent
of ligand for activation and signaling. C-Kit
D816V has been confirmed to be a secondary-
type mutation in acute myeloid leukemia. The
group of c-Kit D816V patients has a bad
prognosis. Therefore, we conducted research
with the goal of commenting on the
characteristics of the C-kit D816V gene mutation
using real-time PCR method and describing some
cases with C-kit D816V gene mutation. The
study was designed as a descriptive, longitudinal
study of 75 patients diagnosed with acute
myeloid leukemia for the first time at Bach Mai
Hospital. From the research results, we comment
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
391
on some characteristics of the C-Kit D816V gene
mutation detected by Real-time PCR method,
using the geneMAP c-Kit D816V Mutation
Detection Kit (Genmark, Turkey) on the Biorad
CFX96 instrument (Biorad, American). The rate
of c-Kit D816V mutation in 75 AML patients at
Bach Mai Hospital is 2.7%. Longitudinal follow-
up of two cases with c-Kit D816V mutation both
had poor outcomes. If the patient is young and in
good health, there is an early recurrence time,
overall survival time is 09 months, and disease-
free survival time is 02 months. In the case of
elderly patients, the survival time is very short.
This result is consistent with many studies on the
prognosis of c-Kit D816V mutation in AML
patients. These initial results suggest the need to
expand the research subjects to learn about the c-
Kit D816V mutation in acute myeloid leukemia
patients.
Keywords: Acute myeloid leukemia, c-Kit
D816V, real-time PCR
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lơ xê mi cấp dòng tủy là nhóm bệnh máu
ác tính có biểu hiện bệnh và tiên lưng đa
dạng. Các nhà thực hành lâm sàng luôn
muốn mở rộng các yếu tố tiên lưng để có
thể phân loại đưc chính xác nhóm bệnh
nhân, từ đó lựa chọn đưc hướng điều trị phù
hp nhất cho ngưi bệnh. Đột biến gen C-kit
D816V là một yếu tố đưc kỳ vọng là yếu tố
tiên lưng xấu và vẫn đang đưc quan tâm.
Thụ thể tyrosine kinase của gen C-Kit đưc
bắt đầu phát hiện và mô tả từ những năm
1987 bởi Yarden Y và các cộng sự [1]. Sau
đó có nhiều nghiên cứu về gen này, đặc biệt
trên tế bào gốc tạo máu [2]. Một số nghiên
cứu nhận thấy đột biến gen c-Kit thưng liên
quan đến khả năng tái phát sớm và đáp ứng
điều trị kém, đặc biệt trên những nhóm bệnh
nhân đưc cho là có tiên lưng tốt như có
gen kết hp RUNX1-RUNX1T1 và CBFB-
MYH11 [3]. Tuy nhiên vẫn có một số nghiên
cứu không tm đưc mối liên quan rõ ràng
của đột biến trên gen c-Kit với những biến cố
xấu này [4]. V vai trtiên lưng còn tranh
cãi, nên ELN năm 2022 vẫn chưa khuyến cáo
c-Kit như một yếu tố tiên lưng xấu. Và để
làm rđiều này, một số nghiên cứu đã phân
tch đột biến của gen c-Kit theo các vị tr đột
biến (exon 8, exon 10-11 và exon 17). Khi
phân tích và tìm hiểu mối liên quan của từng
vị tr đột biến gen c-Kit, một số tác giả đã
thấy mối liên quan rõ ràng của đột biến gen
c-kit D816V (đột biến tại exon 17) với mức
độ biểu hiện nặng của bệnh AML [5], [6],
[7].
Vì những lí do trên chúng tôi tiến hành
nghiên cứu: “Xác định đột biến gen C-kit
D816V bằng phương pháp Real-time PCR
trên bệnh nhân Lơ xê mi cấp dòng tủy tại
Bệnh viện Bạch Mai” với mục tiêu:
1. Nhận xét đặc điểm đột biến gen C-kit
D816V đưc phát hiện bằng phương pháp
Real-time PCR trên bệnh nhân lơ xê mi cấp
dòng tủy.
2. Mô tả một số ca bệnh lơ xê mi cấp
dòng tủy có đột biến gen C-kit D816V.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Thời gian và địa điểm nghiên cứu:
Tháng 10/2023 đến T7/2024. Trung tâm
Huyết học và Truyền máu, Bệnh viện Bạch
Mai
- Đối tượng nghiên cứu: 75 Bệnh nhân
Lơ xê mi cấp dòng tủy, chẩn đoán lần đầu và
đưc điều trị tại Trung tâm Huyết học và
truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai, từ tháng
10 năm 2023 đến tháng 7 năm 2024.
- Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô
tả, báo cáo ca bệnh.
- Chọn mẫu thuận tiện.
- Sơ đồ nghiên cứu:
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU
392
Hnh 1. Sơ đồ nghiên cứu
- Chỉ số và biến số nghiên cứu:
+ Đột biến c-Kit D816V
+ Đặc điểm lâm sàng bao gồm: Hội
chứng thiếu máu, hội chứng xuất huyết, hội
chứng nhiễm trùng, hội chứng thâm nhiễm.
+ Đặc điểm xét nghiệm: Hb, TC, BC,
điểm DIC, LDH, acid uric, canxi toàn phần,
phospho.
- Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:
Tách DNA:
Bệnh phẩm: Dịch tủy xương của các đối
tưng nghiên cứu
Làm giàu bạch cầu: Rửa lớp Buffy Coat
bằng dung dịch RBC (Red blood cells lysis)
Bộ kit: QIAamp DNA Blood Kits
(Qiagen, Đức).
DNA sau tách đưc đánh giá độ tinh sạch
và nồng độ theo yêu cầu sau: Nồng độ DNA
từ 20-100 ng/µl, OD 260 1,6-2,0, OD
260/280 1,6-2,0
Xác định đột biến c-Kit D816V bằng
phương pháp Real-time PCR
Thiết bị: Máy Real-time CFX96 (hãng
Bio-rad, Mỹ).
Bộ kit hóa chất: geneMAP c-Kit D816V
Mutation Detection Kit (hãng Genmark, Thổ
Nhĩ Kỳ).
Quy trình theo bộ kit:
Hóa chất sau khi đưc rã đông tại nhiệt
độ phng, đặt trên đá, trộn nhẹ và ly tâm
trước khi mở nắp. Sau đó chuẩn bị mẫu và
hóa chất theo phân bổ sau:
Bảng 1: Hướng dẫn chuẩn bị mẫu và hóa chất trước phản ứng PCR
2x Real-time Master Mix
10
µl
Mutation Primer Probe Mix
5
µl
Mẫu DNA/ NTC/ PC
5
µl
Các mẫu chuẩn bị xong đưc chạy theo chu trình nhiệt:
Bảng 2: Chu trình nhit của phản ứng PCR
Nhiệt độ
Thời gian
Vòng
95°C
15 phút
1
95°C
15 giây
40
Đọc tín hiệu (FAM và
VIC)
62°C
40 giây
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
393
Các giá trị đưc khuyến cáo:
Bảng 3: Các giá trị Ct theo khuyến cáo
Tiêu chuẩn
Giá trị được chấp nhận
Khoảng giá trị Ct của tín hiệu nội chứng
24 ≤ Ct ≤ 32
Giá trị Ct của mẫu dương tnh
≤ 38
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Mục tiêu 1:
Thực hiện xét nghiệm phát hiện đột biến
c-Kit D816V cho 75 mẫu bệnh nhân lơ xê mi
cấp dòng tủy, đưc chẩn đoán lần đầu tại
Bệnh viện Bạch Mai. 75 mẫu đưc chia
thành 3 lần thực hiện. Các mẫu DNA sau
tách chiết đưc đánh giá bằng máy đo quang
phổ Beckman Coulter DU730 (Beckman
Coulter, Mỹ).
Bảng 4. Chất lượng mẫu DNA
Nồng độ DNA trung bình (X±SD) ng/µl
OD 260
OD 260/280
30 ± 4,6
1,6-2,0
1,6-2,2
Nhận xét: Nồng độ DNA trung bình là 30 ± 4,6 ng/µl. Các mẫu DNA đều đạt nồng độ
theo khuyến cáo từ 20-100 ng/µl, độ tinh sạch OD 260 1,6-2,0, OD 260/280 1,6-2,0.
Sau đó các mẫu đưc thực hiện phản ứng PCR theo đúng quy trnh khuyến cáo của bộ kit
hóa chất. Phát hiện 2 mẫu dương tnh với đột biến c-Kit D816V.
Hình 2: Hình ảnh tính hiu nội chứng của các mẫu
Nhận xét: Ct nội chứng của các mẫu trong khoảng từ 18 đến 24, sớm hơn giá trị khuyến
cáo của hãng là 24 ≤ Ct ≤ 32.
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU
394
Hình 3: Hình ảnh tín hiu đột biến của các mẫu
Nhận xét: Ct đột biến của 2 mẫu dương tnh lần lưt là 34 và 36, đáp ứng tiêu chuẩn ≤38.
Ct đột biến của các mẫu âm tnh đều >40.
Mục tiêu 2:
Bảng 5: Tỷ l đột biến C-Kit D816V trên bnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy
C-Kit D816V
Tần số (n)
Tỷ lệ (%)
Dương tnh
2
2,7
Âm tính
73
97,3
Tổng
75
100
Nhận xét: Tỷ lệ đột biên c-Kit D816V ở
bệnh nhân Lơ xê mi cấp dòng tủy là 2,7%.
Một số đặc điểm về lâm sàng, xét nghiệm
của 02 bệnh nhân có đột biến c-Kit D816V.
Bệnh nhân 01: Bệnh nhân Trương Thị
Đại H., nữ, 48 tuổi, vào viện tháng 8 năm
2023 vì sốt, khám thấy có hội chứng nhiễm
trùng hội chứng thiếu máu, hội chứng thâm
nhiễm, không có xuất huyết. Xét nghiệm lúc
vào viện theo như bảng 6, xét nghiệm công
thức nhiễm sắc thể tủy xương là 46,XX.
Bệnh nhân đưc chẩn đoán Lơ xê mi cấp thể
M4 (theo phân loại FAB), đưc điều trị 04
đt hóa chất theo hướng dẫn chẩn đoán và
điều trị của Bộ y tế năm 2022, đạt lui bệnh
hoàn toàn vào tháng 01 năm 2024. Tuy nhiên
sau 02 tháng theo di sau điều trị, bệnh nhân
tái khám phát hiện bạch cầu tăng cao, đưc
chẩn đoán Lơ xê mi cấp thể M4 tái phát.
Bệnh nhân đưc cho nhập viện, đánh giá và
điều trị phác đồ FLAG 1 đt. Trong pha
giảm bạch cầu sau điều trị hóa chất, bệnh
nhân bị nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn
Pseudomona aeruginose, suy hô hấp, viêm
phổi và tử vong vào tháng 04 năm 2024.
Thi gian sống toàn bộ sau khi phát hiện
bệnh của bệnh nhân là 09 tháng.