i trình t tr c ti p s n ph m PCR đ c hi u gen ị ủ ể ằ ậ ỹ ả ự ự ế ả ệ ẩ ặ Xác đ nh ki u gen c a HPV b ng k thu t gi L1
Ph m Hùng Vân*
(2), Lê Thúy Quyên(1), Hòang Hi u Ng c
ạ
(11), Võ Đ c Xuyên An ứ
ọ (1)
ế
ị
ệ
ồ
ệ
ộ ố
i m t s phòng thí nghi m t ệ ạ c genotype HPV, đó là s d ng ph
ả
ượ
ử ụ
ẩ
ể ị ặ
ng pháp gi ự
i trình t
tr c ti p s n ph m PCR đ c hi u gene L1 nh đó xác đ nh
ủ c k t qu genotype HPV. ả ng pháp gi
ị
ờ
ặ
ẩ
ả
ệ
ể
ụ
ờ ậ ề
ự ự ế ả
ệ
ể ị
ế ậ
ứ Các tác gi
ử ả cung xác đ nh đ
ị
ậ
ệ
ượ
ẫ ớ
ệ ổ ử
ng pháp nghiên c u: ươ các b nh ph m qu t c t ẩ
đã th áp d ng các ti p c n này đ đ nh genotype 39 m u trích bi ờ ỹ ộ
ấ
ệ
ượ
ế
ẫ c genotype dù giai đ an PCR cho k t qu [+] r t rõ và 1 m u k t qu PCR-ELISA d
ươ
ế
ế
ấ
ẫ
ả
ử
ệ
ấ
ẫ
ị
tr c ti p vùng gen L1 cũng cho k t qu đ nh genotype hòan tòan t
ế i trình t ả
ự ự
ẫ
ả ị ự
ươ ớ
ồ ẫ
ị
ả ả i trình t
ế ả ả
ị ế
ượ
ế
ẫ
ả
ẫ
c cho th y các m u mà PCR-ELISA đã xác đ nh là genotype 6, 11, 16, 18, và 58 thì ng đ ng. 3 m u mà xác đ nh là genotype 33. V i 4 m u PCR-ELISA cho 1 m u là genotype 62, m t m u là genotype 83, ộ ng tính c hai genotype ả ươ
ế
ả
ộ
c k t qu genotype thì k t qu gi ẫ không đ ượ ả
ế ậ V i các k t qu này, các tác gi
ng tính r t rõ. ấ ng pháp gi ả ươ
ự ự
ả
ẩ
ị
i trình t ự ế ượ
ế ả
ệ
ả
ươ ứ
ượ
ấ
ặ
ế i trình t ự ẫ c dù k t qu PCR cho d ươ ả đã nh n đ nh ph ậ ệ ộ ử ng gi ng ng do s l ươ
ố ớ
ả
ộ ử
ủ
ệ
ệ
ờ
ệ ọ
ệ
ể
ế
ặ
ng pháp PCR-ELISA v
ả ẫ
ượ
ễ
ề
ẩ
ươ ợ
ế
ế
ị
tr c ti p s n ph m PCR. Trong các tr ự ự , nhà nghiên c u c n ph i s d ng ph ự
ẩ ứ ầ
ả ử ụ
ườ ươ
ậ
ạ
ấ
ố
tắ Tóm t ề Hi n nay, công ty Nam Khoa đã có kit PCR-ELISA đ phát hi n và đ nh genotype HPV và kit này đã Đ t v n đ : ể ệ ặ ấ i TP. H Chí Minh. Tuy nhiên hãy còn m t ti p tri n khai s d ng khá h u hi u t ộ ế ạ ử ụ ữ ể tr c ti p i trình t i trình t c n khác đ có th đ nh đ ế đ gi ự ự ự ể ả ươ ể ậ s n ph m PCR đ c hi u vùng gen L1 c a HPV và so sánh trình t ủ các genotype c a này trên th vi n trình t ệ ự ư ệ ả HPV, nh v y mà có th cho đ ượ ế ể M c tiêu đ tài: Phát tri n ph ươ genotype HPV. Ph t DNA ụ c genotype HPV nh k thu t PCR-ELISA v i 5 genotype 6, 8 t ừ genotype 16, 7 genotype 16, 8 genotype 58, 3 genotype 31/33/35 (vì trên b kit PCR-ELISA do công ty Nam Khoa c phát hi n trong cùng m t gi ng) , 3 genotype 11. Ngòai ra có 4 m u PCR-ELISA s n xu t, 3 genotype này đ ộ ả không cho đ ớ ng tính v i ọ ả ượ c hai genotype 16 và 11 cũng đ c đ a vào th nghi m. ượ ư ả ả K t qu thu nh n đ K t qu : ậ ượ ả ế k thu t gi ế ậ ỹ PCR-ELISA xác đ nh là genotype 31/33/35 thì k t qu gi không cho đ m t m u là genotype 54, và 1 m u là genotype 52. Riêng m u PCR-ELISA cho k t qu d ẫ 16 và 11 thì gi ả K t lu n: tr c ti p s n ph m PCR có i trình t ế ả ớ c các genotype HPV mà b th nghi m PCR-ELISA ch a phát hi n đ kh năng phát hi n đ ấ c vì nhà s n xu t ượ ệ ư c ph dò đ c hi u. Ngòai i h n c a các gi ng đ không cung c p các dò đ c hi u type t ủ ặ ớ ạ ủ ệ ố ượ ệ ế i trình t ra đ i v i nhà s n xu t b th nghi m PCR-ELISA thì ph ng pháp gi tr c ti p đ xác đ nh genotype ị ể ế ự ự ả ệ ấ ộ ử c a HPV cũng còn có th giúp hòan thi n b th nghi m này nh cho bi t thêm các genotype c a HPV hi n đang ế ủ ể l u hành mà nhà s n xu t c n ph i ch n thêm các dò đ c hi u đ ph trên các gi ng ELISA. Tuy nhiên trong ư ủ ả ấ ầ ộ ơ t tr i h n ng h p các m u b nh ph m có nhi m nhi u genotype HPV thì ph tr ợ ườ ệ ng h p này, n u mu n đ nh genotype HPV i trình t ph ng pháp gi ố ả ả ươ b ng k thu t gi ờ ng pháp t o dòng khá t n kém và m t th i i trình t ả ỹ ằ gian.
Abstract
Genotyping of HPV by direct sequencing the PCR product specific to L1 gene of the virus Background: The Nam Khoa Biotek co. has developed the PCR-ELISA kit to detect and genotype of HPV from different clinical samples and this kit has been used usefullty at some clinical laboratories in Ho Chi Minh City. However, there have another approach to genotype of HPV, that is the direct sequencing of the PCR product of the L1 gene and align the detected sequence to the library of HPV genotype sequences to get the result of HPV genotyping. Objectives: Develop the direct sequencing of the PCR product specific to the L1 gene for genotyping of the HPV Methods: The authors have tried this approach to detect and genotype of HPV from 39 DNA samples extracted from the cervical swabs that were already confirmed the HPV genotype by PCR-ELISA including 5 genotype 6, 8 genotype 16, 7 genotype 18, 8 genotype 58, 3 genotype 31/33/35 (because in the PCR-ELISA kit produced by Nam Khoa Biotek Co., these 3 genotypes are detected in one ELISA well), 3 genotype 11. In addition, 4 samples that could not be defined the genotype by PCR-ELISA even though the PCR of PCR-ELISA were strongly positive, and 1 positive with both genotype 16 and genotype 11 detected by PCR-ELISA. Results: The received results demonstrated there were no difference between PCR-ELISA and sequencing in the detection and genotyping of the samples infected with single HPV genotype like: 6, 11, 16, 18, and 58. All 3 samples that were defined as 31/33/35 by PCR-ELISA were determined as genotype 33 by sequencing. However with 4 samples that could not be defined the genotype of HPV by PCR-ELISA, the sequencing has determined 1 was belong to genotype 62, one to genotype 83, one to genotype 54 and 1 to geotype 52. The sample that PCR-ELISA has detected as the mixed infection of 2 genotype 16 and 11 was not get the sequencing result even though the PCR give the very clear and strong result. Conclusions: With these results, the authors could conclude that the direct sequencing of the PCR products that were amplified from the L1 gene of HPV could genotype of the HPV that the PCR-ELISA could not detect because of the
1*Tác gi
chính,
(2)Công Ty Nam Khoa
ả
()Đ i H c Y D c TP. HCM. ượ
ạ
ọ
1
limitation of the number of wells coated with genotype-specific probes. In addition, the sequencing can also help to improve the HPV genotype PCR-ELISA kit since it could recommend the manufacturer to add more genotype-specific probes in order to detect more currently existed genotype in the patients samples. However, the direct sequencing to genotype the HPC could not replace the PCR-ELISA in samples that contained the mix infection of HPV genotype that required the sequencing of the laboreous and expensive sequencing method: the sequencing of the cloned PCR product.
ụ i trình t ể ủ ả ắ ề ư ổ ử ư ế ớ ư c a đ tài này là th áp d ng và đánh giá các u ử ủ ề ự ự ng pháp gi c đi m c a ph nh tr c ươ ượ ti p s n ph m PCR đ đ nh genotype HPV so ả ể ị ẩ ế v i ph ng pháp PCR-ELISA mà công ty Nam ươ ớ Khoa đã phát tri n. ể ệ ớ ư ổ ử V t li u và ph ng pháp nghiên c u ậ ệ ươ ứ cung ủ ượ ẫ ử Là các m u trích bi ố
ả ộ ơ ộ ấ ộ ị ồ ọ ả ẫ ượ ự ị ẫ ế ị ẫ ể ị ẫ cung. Tuy nhiên nh ư ổ ử ng pháp t ươ ớ ộ ấ ả ị ượ ượ ệ ẫ ệ ượ ọ ế ỉ ệ ổ ử ẫ xét nghi m t ệ ổ ợ ệ c l u tr ử ở ọ cung trên ph ệ ư ổ ử ệ ả ẩ M u th : ủ t DNA c a ẫ ệ ệ cung đã làm xét nghi m b nh ph m qu t c t ệ ổ ử ẩ ệ và có k t qu phát hi n và xác đ nh genotype ị ệ ế HPV b ng b xét nghi m “HPV genotype PCR- ệ ằ ELISA kit” do công ty Nam Khoa s n xu t. Có 39 m u đ c l a ch n, g m 5 m u xác đ nh ẫ genotype 6, 8 xác đ nh genotype 16, 7 m u xác đ nh genotype 18, 8 m u xác đ nh genotype 58, 3 ị m u xác đ nh genotype 31/33/35 (vì trên b kit PCR-ELISA do công ty Nam Khoa s n xu t, 3 ộ genotype này đ c phát hi n trong cùng m t gi ng), 3 xác đ nh genotype 11, 4 m u không xác ị ế c genotype dù giai đ an PCR cho k t đ nh đ ế ị ươ qu [+] r t rõ, 1 m u cho k t qu v a d ng ả ừ ẫ ấ ả ng tính genotype 11. tính genotype 16 v a d ươ ừ -20oC T t c các m u DNA đ u đ ượ ư ấ ả ề ẫ ằ c đ a vào đ nh genotype b ng cho đ n ngày đ ư ị ế ượ tr c ti p s n ph m PCR i trình t k thu t gi ả ế ự ự ậ ỹ đ xác đ nh genotype. ể ị nh v y có th đánh giá đ ị ể ễ ẫ ậ ự ự Th c hi n k thu t PCR: Các m u trích bi ệ
ậ ổ ớ ể ị ầ ượ ả ượ ọ ấ ớ
[16,17], ph
ị ạ ỹ ươ ứ ạ ộ ồ ở ộ ậ ề ế ể ng pháp có th ươ ạ ủ ượ ủ ể ư t nh sau: Cho 10ul trích bi ắ ư ệ ươ ử ế ử ụ i th p ạ c phát tri n đ phát hi n đ ể ươ [14,15], ph ươ ỏ ạ ủ ế ạ ứ ẵ ẹ ể ắ ạ ươ ế ể ệ ậ ị ế ớ ứ ệ ộ ế ạ ướ ớ ụ c áp d ng trong ch n đóan t ượ ệ ạ ệ ộ ố ụ ư ừ ộ ế ẩ ươ ệ ự ự ế t ệ ệ ỹ ộ c th c hi n PCR trong m t DNA nói trên đ c g i là HPV-PCR mix do công ty PCR mix đ Nam Khoa s n xu t v i các thành ph n ch y u ủ ế là PCR buffer (Biorad), dNTP (Roche), Taq polymerase (Biorad), MgCl2 (Biorad), và m iồ MY09 và MY11 (Invitrogen) các n ng đ thích h p đ khu ch đ i m t đ an DNA dài 450bp ọ ộ ợ ể trên vùng gen L1 c a HPV. Ph t DNA vào tóm t tube PCR 0.2 ch a s n 40ul HPV PCR mix, sau t khi ly tâm nh đ l ng cho vào máy luân nhi ệ ệ iCycler (Biorad) ch y ch t ng trình luân nhi g m 1 chu kỳ 40oC/10 phút, ti p theo 1 chu kỳ ồ ướ 95oC/5 phút, ti p theo 20 chu kỳ v i 2 b c t đ 95oC/30 giây và 70oC/30 giây, ti p theo nhi là 35 chu kỳ v i 3 b t đ 95oC/1 phút – c nhi 55oC/1 phút – 72oC/1 phút, và cu i cùng là 1 chu ạ ượ kỳ 72oC/ 10 phút. S n ph m khu ch đ i đ c ả đi n di trên gel agarose (Biorad) 2% pha trong ớ TBE (công ty Nam Khoa s n xu t) 0.5X cùng v i ả ấ Đ t v n đ ặ ấ ứ cung là ung th đ ng hàng th 2 Ung th c t ư ứ c a ung th ph n v i s m i m c ph i hàng ả ụ ữ ớ ố ớ ủ vong m i năm năm trên th gi i là 470.000 và t ỗ ử là 250.000[1]. HPV là tác nhân đã đ c xem là có ượ [2-5]. Cho đ n hi n ệ liên h v i ung th c t ế nay có trên 100 genotype c a HPV đã đ c xác ượ c phân làm 3 đ nh trong đó có 29 genotype đ ị cung, nhóm theo m i liên h v i ung th c t ư ổ ử ệ ớ đó là: nhóm nguy c cao v i 15 genotype (16, 18, ớ ơ 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, và 82), 3 genotype là thu c nhóm nguy c cao ti m ề ơ ấ tàng (26, 53, 66), và 11 thu c nhóm nguy c th p (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, và 81) [3]. c xem bào h c (PAP smear) đ Ph ọ ượ ươ ng pháp khá h u d ng đ có th phát là ph ể ụ ữ ờ hi n s m ung th c t ệ c các ngày nay khoa h c đã xác đ nh đ ọ ư ổ ử genotype HPV có nguy c cao gây ung th c t ơ cung nên xét nghi m phát hi n và xác đ nh ị ệ cung genotype HPV trong các m u qu t c t bào không ch có vai trò h tr ế h c mà có nhi u khi còn là xét nghi m ch y u ủ ế ề ọ ụ đ sàng l c s m ung th c t ớ ể nữ[2,3,6-10]. Ngòai ra, xét nghi m phát hi n và xác đ nh genotype HPV còn có giá tr trong đánh giá ị ượ s phân b d ch t c ố ị ờ ậ ự c khi có s h u hi u c a vaccin ng a HPV. Tr ướ ừ ệ ủ ự ữ i ta dùng k thu t lai k thu t khu ch đ i ng ậ ỹ ườ ạ ế ỹ i ch v i probe đ c hi u đ phát hi n và đ nh t ệ ệ ặ ạ genotype HPV trong m u th , tuy nhiên các ẫ ng pháp này b h n ch s d ng vì k thu t ph ậ ấ [11-13]. Ngày hôm ph c t p mà đ nh y l ạ ạ ng nay, v i k thu t khu ch đ i, có nhi u ph ươ ế ớ ỹ ượ pháp đã đ c ệ ng pháp lai trong genotype c a HPV nh ph ng pháp lai pha l ng (hybrid capture 2) ng pháp lai trên trên v ch (InoLIPA) [18,19]. T i Vi t gi ng ELISA c a Roche Amplicor ệ Nam, công ty Nam Khoa cũng đã phát tri n kể ỹ thu t PCR-ELISA đ phát hi n và đ nh genotype ứ [20,21] và hi nệ HPV ng d ng trong nghiên c u ộ cũng đã đ i m t ẩ s b nh vi n nh T Dũ và B ch Mai. Tuy ố ệ ng pháp ti p c n khác nhiên hãy còn m t ph ậ ế ươ i đ đ nh genotype HPV, đó là ph ả ng pháp gi ể ị ạ ừ tyrình t tr c ti p s n ph m PCR khu ch đ i t ẩ [22,23]. Do v y m c tiêu vùng gene L1 c a HPV ậ ế ả ủ ụ
2
Đ nh genotype HPV c a trình t ộ ế ị ủ c cho là d 100-1000 ng tính khi ị gi ủ 450 bp. m t gi ng ch a thang DNA chu n t ứ ẩ ừ bp (Biorad). K t qu đ ế ươ cho v ch khu ch đ i rõ nét ế ả ượ ạ ạ ở c lên NCBI blast search đ ằ i đ ả i trình t ả ệ ự ớ Th c hi n gi ẩ ả ị ế ằ ạ ự ộ ế ộ c h ượ ướ ả ế ủ ề ượ ầ ẩ i đ ả ượ ổ ờ ệ ự ả ượ c: i đ ự Chúng tôi xác đ nh genotype HPV c a trình t c b ng hai cách, đó là: (1) Đăng nh p ậ gi i đ ả ượ ể gi trình t ượ ự ng trình so sánh trình t đăng nh p v i các ch ậ ự ươ trên genbank và hi n th k t qu so sánh. trình t ả ể ự (2) xây d ng m t th vi n các trình t c a các ự ủ ư ệ genotype tham chi u c a HPV, cho th vi n này ế ủ ư ệ vào các th vi n c a ch ng trình Bio-edit, sau ươ ủ ư ệ ự đó dùng phân m m này đ đăng nh p trinh t ậ ể ng trinh gi c vào local blast search đ ch ể ươ so sánh trình t đã đăng nh p v i trình t có ự ớ ậ trong th vi n r i hi n th k t qu so sánh. ể ự ư ệ ồ ị ế ả
ạ ả K t quế ả ệ ượ ả ứ ệ ự ồ ộ ả
6 7 8 9 10 11 12 13 14 MK 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 MK 31 32 33 34 35 36 37 1 2 3 4 5 38 39
i đây là ả ạ ọ ướ ả ứ ẫ ả ủ đ ự ượ ự ả ế t iCycler (Biorad). Sau ph n ng chu kỳ gi ạ , s n ph m đ ự ả ẩ ạ ạ ọ ế ậ ấ ệ ả ứ ủ ẫ ượ ư ướ ượ ủ ệ ấ ả ẫ ủ i trình t ượ ị ng t ượ ế ả ạ i trình t đ ự ượ K t qu phát hi n HPV d a trên PCR ế khu ch đ i đ an DNA 450bp trên gene L1: ế ả Hình 1 cho th y k t qu Trình bày d ấ ế ẫ t t các m u PCR c a 39 m u DNA trích bi ủ ệ ừ ẫ t c các cung. K t qu cho th y t qu t c t ệ ổ ử ấ ấ ả ứ m u đ u cho v ch khu ch đ i rõ và s c, ch ng ẫ ắ ế ề k thu t PCR khu ch đ i đ an DNA 450bp t ỏ ỹ ự trên gene đ c hi u HPV trên gene L1 đ c th c ặ t. T t c các m u trên sau khi tinh hi n r t t ẫ ấ ố ệ ề s ch v i b PCR clean-up kit c a Promega đ u ớ ộ ạ ng DNA trên náy cho s n ph m khi đ nh l ẩ ả 50 đ n GeneQuant cho k t qu đ nh l ế ừ ả ị ủ ấ t 65ng/ul v i đ tinh s ch (OD260/OD280) c a t ớ ộ c đ u trên 1.8. ả ề ả ề ớ ọ i trình t K t qu gi ế ả ả c ch n đ phân tích là: (1) trình t ng trình t ố ượ ẩ ấ ượ i đây k t qu ế x u ự ấ ở ả ắ ỏ ướ ẩ ự ủ ẩ tr c ti p s n ph m ự ự ế ả ng tính PCR: S n ph m PCR có k t qu d ả ươ c làm tinh s ch b ng b kit PCR clean-up đ ượ ở c a Promega theo qui trình đ ng d n b i ẫ ủ nhà s n xu t đ l ai b các dimer primer, và các ỏ ấ ể ọ thành ph n không s d ng h t c a PCR mix. ử ụ S n ph m PCR tinh s ch sau đó đ c đ nh ị ạ ả GenQuant ng DNA b ng quang ph l ằ ượ i trên gel (Amersham) và đ ng th i đi n di l ạ ồ agarose 2% pha trong TBE 0.5X đ ch c ch n đã ắ ể ắ ẩ l ai s ch dimer primer. Sau đó 1 – 2ul s n ph m ọ PCR tinh s ch đ c th c hi n ph n ng chu kỳ ự ạ gi v i m t m i MY09, dùng CEQ i trình t ự ớ DTCS Quick Start kit (Becman Coulter) theo đúng ng d n c a nhà s n xu t. Ph n ng chu kỳ h ướ c th c hi n trong máy luân i trình t gi ả ả i nhi ệ c làm t a b ng ethanol, trình t ằ ng d n c a Becman theo qui trình nh h ủ ệ Coulter. Sau khi đã làm khô, hòa t a trong đ m i m u là CEQ Sample Loading Solution t ả ự (Becman Coulter), và cu i cùng là gi ố ả CEQ8000 c a Becman v i máy gi i trình t ủ ự ả ớ ả Coulter. Sau khi hòan t i trình t t gi , k t qu ự ế ấ ầ c đ c và phân tích b ng ph n gi ằ ọ m m sequence analysis đi kèm theo máy v i các ự thông s đ ể ự c a s n ph m PCR, (2) ch t l ả ủ c hai trung bình, và (3) c t b các trình t đ u.ầ ề ấ ự ự PCR: Trình bày trong b ng 1 ả gi ẫ ả ả đ ế ượ ả gi ủ ả tr c ti p s n ph m ẩ ế ả ả d c a 39 m u s n ph m PCR sau khi i trình t c làm tinh s ch. K t qu cho th y chi u dài c c a các s n ph m PCR i trình t ả ạ đ ự ượ ẩ
Hình 1:
K t qu PCR phát hi n HPV c a 39 m u DNA trích bi
qu t c t
ẫ
t t ệ ừ
ệ ổ ử
ế
ệ
i ch mã s c a m u th nghi m. MK là thang DNA t
ướ
ử
ệ
ẫ
ả c đánh d u bên d ấ
ệ ỉ
ủ ố ủ
cung b nh nhân. Các s th ố ứ 100 đ n 1000bp v i các ớ
ừ
ế
đ t ự ượ v ch cách nhau 100bp. ạ
B ng 1:
i trình t
c c a
đ
B ng 2:
K t qu đ nh genotype HPV sau khi đăng
ả
ề
ả
ự ượ ủ
ả
ế
ả các s n ph m PCR
nh p lên trình t
i đ
c lên NCBI blast search
ả ị gi
K t qu chi u dài gi ế ẩ
ả
ậ
ự ả ượ
M u sẫ ố
M u sẫ ố
K t qu PCR-ELISA
K t qu đ nh genotype HPV sau khi dăng nh
p lên NCBI blast
ế
ả
ả ị
ế
ậ
searchScore và E valueT 1 đ n 5HPV genotype 6>408 (score), <4e
ừ
ế
i trình t
c c a s n ph m PCR
đ
đ nh genotype HPVChi u dài gi ị
ề
ả
ự ượ ủ ả
ẩ
T 1 đ n 5HPV genotype 6360bp – 420bp
T 6 đ n 13HPV genotype
ừ
ế
ừ
ế
(E)T 6 đ n 13HPV genotype 16>408 (score), <4e (E)
T 14 đ n
ừ
ế
ừ
ế
16361bp – 410bpT 14 đ n 20HPV genotype 18344bp – 410bp
T 21
ừ
ế
ừ
20HPV genotype 18>242 (score), <7e (E)T 21 đ n 28HPV genotype
ừ
ế
đ n 28HPV genotype 58269bp – 395bp
T 29 đ n 31HPV genotype
ế
ừ
ế
58>462 (score), <3e (E)T 29 đ n 31HPV genotype 33
>762 (score), 0.0
ừ
ế
31/33/35377bp – 419bpT 32 đ n 34HPV genotype 11354bp –
ừ
ế
(E) T 32 đ n 34HPV genotype 11>604 (score), 0.0 (E)
35Genotype
ừ
ế
406bp35Không đ nh đ
c genotype397bp
36Không đ nh đ
c
ị
ượ
ị
ượ
62117
(score), 3e-23
(E)36Genotype 54626
(score), 1e-176
genotype362bp 37Không đ nh đ
c genotype340bp
38Không đ nh đ
c
ị
ượ
ị
ượ
(E)37Genotype 83579 (score), 2e-162 (E)38Genotype 52347 (score), 2e-
genotype419bp 39HPV genotype 16 và genotype 11Không gi
i đ
c
ả ượ
92 (E)39Không đ nh đ
c genotypeKhông gi
i đ
c trình t
ị
ượ
ả ượ
ự
trình tự
3
ng t ế ừ ả ế là k t qu đ nh genotype c a các trình t ủ ả ị ị ượ ậ ứ gi ạ ả ị ợ ị ươ ặ i trình t ấ ớ ế tr c ti p s n ph m PCR. Trong các trình t ẩ ự ự ng h p này, n u mu n đ nh genotype HPV tr ố ợ ườ ế , nhà nghiên c u c n i trình t b ng k thu t gi ầ ằ ự ả ỹ ng pháp t o dòng khá t n ph i s d ng ph ố ả ử ụ ươ ả ử ụ d ng kém và m t th i gian, hay là ph i s ờ ấ dùng m i đ c hi u i trình t ph ệ ng pháp gi ồ ự ả genotype[24] hay các ph ng pháp gi ự ả ươ [25]. khác cũng khá ph c t p và t n kém ố ứ ạ
K t lu n ế ậ ượ c v i trình t này, NCBI blast ch tìm đ ớ ả ỉ ượ ự ể 360bp đ n 420bp. Trình bày trong th ườ ự b ng 2 ế ả c sau khi đang nh p lên NCBI blast gi i đ ậ ả c đ u cho k t ế i đ search. Đa s các trình t ự ả ượ ề ố ế 340 đ n qu đ nh genotype v i score khá cao t ớ ừ ng h p đ nh genotype 62 v i 650. Ch có m t tr ớ ộ ườ ỉ ự ả ượ gi score khá th p, ch 117 so v i trình t c i đ ỉ lên đ n 397bp (xem b ng 1), ch ng t trong trình ỏ ứ c không quá 130bp t ự là có th so sánh đ HPV trong gene bank. ả ế ị cung l y t ụ ữ
ọ K t qu local blast search v i ph n m m bio- ề ầ NCBI blast ả ươ ậ c thành l p c a các ự ủ ớ ng t edit cũng cho k t qu t ự ế search vì th vi n genotype HPV đ ượ ư ệ cũng do chúng tôi l y t các trình t ấ ừ genotype HPV tham chi u t gene bank. ế ừ ệ ể Bi n lu n ệ ậ ầ ấ ả ế ứ ể ễ ố ớ ộ ẫ ẫ ư ng pháp gi ươ ặ ễ ừ ươ ư ự ữ ệ ẫ ả ể ệ ế ị ệ i Vi ạ ộ ử ằ ậ ớ ả ủ ớ ứ ụ ng pháp gi ậ ằ ươ ộ ệ ứ ả ế ế ớ ấ ả ẫ ị ươ ự ộ ậ ủ ị i trình t ng pháp gi ả ầ ả ế ộ ố ấ ế ả ả ả ệ ả ộ ng pháp gi ả ươ ộ ị ượ c genotype HPV thì ph ẫ ẫ t là các m u d ẫ ẫ ế ớ i trình t ả ị ể ệ Phát hi n và xác đ nh genotype HPV trong các ệ ph n là m t xét m u qu t c t ộ ấ ừ ẫ ệ ổ ử ấ ầ c ch ng minh là r t c n nghi m hi n nay đã đ ượ ệ ứ ệ ư ổ t đ sàng l c và ch n đóan s m ung th c thi ớ ế ể ẩ h c thì xét cung, và xét v m t d ch t t ề ễ ọ ặ ị ử ự c th c t ph i đ nghi m này cũng r t c n thi ả ượ ế ấ ầ c các genotype đang hi n đ có th phát hi n đ ệ ượ ể ệ ễ l u hành trong m t vùng hay qu n th d ch t ể ị ộ ư ượ ự ữ c s h u h c đ có th tiên đóan và đánh giá đ ọ ể d ng c a các ph ng pháp phòng ch ng lây ố ủ ụ nhi m cũng nh s h u hi u c a vaccin phòng ủ t Nam, công ty ng a. M c dù hi n nay t ệ Nam Khoa đã phát tri n b th nghi m phát hi n ệ và đ nh genotype HPV b ng k thu t PCR- ỹ c trong nghiên c u và ch n ELISA ng d ng đ ẩ ượ ự đóan, tuy nhiên v i ph i trình t ớ ạ ừ tr c ti p s n ph m PCR 450bp khu ch đ i t ẩ ả m t vùng đ c hi u HPV trên L2, chúng tôi đã ệ ặ nh n đ nh là kit PCR-ELISA c a công ty Nam Khoa cũng còn c n ph i thêm vào kh năng phát ả t hi n m t s genotype khác, trong đó nh t thi ế ơ ph i có genotype 52 là m t genotype có nguy c ướ cao. Dĩ nhiên đây ch là m t nghiên c u b c ứ ỉ i trình đ u. Chúng tôi cho là nên nghiên c u gi ứ ầ ả ữ đ đ nh genotype thêm trên nhi u m u n a, t ự ể ị ẫ ề ng tính HPV mà không đ c bi ươ ệ ặ ể có k t qu đ nh genotype v i kit PCR-ELISA đ ế t ệ đó có th hòan thi n b kit PCR-ELISA hi n ộ ừ có. ươ ả ớ
ệ ng pháp gi ả ị ẩ ả ượ ệ ượ Tài li u tham kh o ả 1. Parkin, D. M., F. I. Bray, and S. S. Devesa. 2001. Cancer burden in the year 2000. The global picture. Eur. J. Cancer 37(Suppl. 8):S4–S66.
ệ ứ ạ ớ
ể ị
2. Bosch, F. X., A. Lorincz, N. Munoz, C. J. Meijer, and K. V. Shah. 2002. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J. Clin. Pathol. 55:244–265.
ệ ệ ậ ằ ỹ ị
i trình t ự ẽ ả ể ọ ệ ợ
3. Munoz, N., F. X. Bosch, S. de Sanjose, R. Herrero, X. Castellsague, K. V. Shah, P. J. Snijders, and C. J. Meijer. 2003. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N. Engl. J. Med. 348:518–527. 4. Walboomers, J. M., M. V. Jacobs, M. M. Manos, F. X. Bosch, J. A. Kummer, K. V. Shah, P. J. Snijders, J. Peto, C. J. Meijer, and N. Munoz. 1999. Human
ệ ươ t tr i h n ph ng pháp gi ẫ K t qu nghiên c u cho th y đ i v i các m u mà PCR-ELISA đã xác đ nh nhi m m t genotype ị HPV nh 6 (5 m u), 11 (3 m u), 16 (8 m u), 18 ẫ ả (7 m u), và 58 (8 m u), thì ph i ẫ tr c ti p s n ph m PCR dài 450bp trình t ế ẩ ự ự ả vùng L2 c a HPV cho k t qu khu ch đ i t ạ ừ ế hòan tòan trùng kh p v i k t qu xác đ nh ị ế ự genotype HPV b ng k thu t PCR-ELISA th c ỹ hi n trên b “HPV genotype PCR-ELISA kit” do công ty Nam Khoa s n xu t. V i 3 m u mà ng pháp PCR-ELISA đã xác đ nh là thu c ph ộ ự genotype 31/33/35 thì ph ươ đã cho k t qu c 3 m u là genotype 33. Có 4 ẫ m u mà k t qu PCR-ELISA không xác đ nh ị ẫ i trình đ ượ ộ đã xác đ nh đ t c 1 m u là genotype 62, m t ự m u là genotype 83, m t m u là genotype 54, và ộ ẫ 1 m u là genotype 52. Riêng 1 m u mà PCR- ẫ ng tính c hai genotype ELISA cho k t qu d ả ươ ả dù 16 và 11 thì không có k t qu v i gi ự ả ớ ế ả ng tính r t rõ. V i các k t k t qu PCR cho d ế ế ấ ả i qu này, chúng tôi nh n đ nh ph ươ ậ ả tr c ti p s n ph m PCR có kh năng trình t ế ự ự ộ ử phát hi n đ c các genotype HPV mà b th ệ c do trên nghi m PCR-ELISA ch a phát hi n đ ư ệ ệ b th nghi m không cung c p các dò đ c hi u ặ ộ ử ấ i h n c a các ng gi ng ng vì s l type t ủ ố ượ ươ ươ gi ng đ ng c ph dò đ c hi u. Ngòai ra, ph ủ ượ ệ ặ ế tr c ti p đ xác đ nh genotype pháp gi i trình t ế ự ự ả ộ ử c a HPV cũng còn có th giúp hòan thi n b th ể ủ nghi m đ nh genotype HPV b ng k thu t PCR- ELISA vì nh k t qu đ nh genotype HPV qua ờ ế ả ị s cho bi ủ t thêm các genotype c a gi ế HPV hi n đang l u hành đ có th ch n thêm ư ệ ể các dò đ c hi u đ ph trên các gi ng ELISA. ể ế ủ ặ ẩ ng h p các m u b nh ph m Tuy nhiên trong tr ẫ ườ ng pháp có nhi m nhi u genotype HPV thì ph ề ễ ả i PCR-ELISA v ượ ươ ộ ơ
