Đồ án tốt nghiệp: Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN THANH LONG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÁC NHÂN GÂY BỆNH

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai

Sinh viên thực hiện

: Võ Thị Lan Thanh

MSSV: 1051110144

Lớp: 10DSH2

TP. Hồ Chí Minh, 2014

PHOØNG XEÙT NGHIEÄM NK-BIOTEK 793/58 TRAÀN XUAÂN SOÏAN, P. TAÂN HÖNG, Q.7, TP. HCM

ÑT: (08) 37715818, (08) 37752252

Fax: (08) 37750583, ( 08) 37752250

Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com, namkhoa.biotek@gmail.com

GP soá: 41G8005341

Theo ñònh höôùng ISO 15189

328/2014/DVVS

Số:

KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

THÔNG TIN VỀ MẪU THỬ

VÕ THỊ LAN THANH

Nơi gởi mẫu:

Mẫu thử:

Yêu cầu:

TL Định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 28 S

PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN  Giải trình tự gen 28 S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH

Kết quả

SAB

Kết quả giải trình tự gen 28 S CACACCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTG GTGTTGGGCGTTTTGTCTTTGCATCAAAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCGGCCTA CTGGTTTCGGAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAGAGGTCGGCAATCCATC AAGTCCATTTCTCACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGG CAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGGCG CTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCC CGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC

Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH

Cochliobolus lunatus internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|JF798505.1|Length: 929Number of Matches: 1 Related Information Range 1: 77 to 716GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match

Alignment statistics for match #1

Score

Expect

Identities

Gaps

Strand

1083 bits(586)

0.0

623/640(97%)

6/640(0%)

Plus/Plus

Query 1 CACACCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT 60

|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 77 CACATCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT 136

Query 61 TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 137 TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC 196

Query 121 GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 197 GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC 256

Query 181 CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTT 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 257 CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTT 316

Query 241 GGTGTTGGGCGTTTT--GTCTTTGCAT--CAAAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCG 296

||||||||||||||| ||||||| | |||||||||||||||||| ||||||||||||

Sbjct 317 GGTGTTGGGCGTTTTTTGTCTTTGGTTGCCAAAGACTCGCCTTAAAAGGATTGGCAGCCG 376

Query 297 GCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGC--AAGAGGTCGGCA 354

|||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| |||||

Sbjct 377 GCCTACTGGTTTCGCAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAAAGAGGACGGCA 436

Query 355 ATCCATCAAGTCCATTTCTCACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT 414

|||||||||| | ||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 437 ATCCATCAAGACTCCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT 496

Query 415 AAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTG 474

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 497 AAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTG 556

Query 475 AAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAG 534

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 557 AAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAG 616

Query 535 AGGGCGCTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGA 594

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 617 AGGGCGCTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGA 676

Query 595 GAATCCCGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC 634

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 677 GAATCCCGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC 716

Cochliobolus lunatus

KẾT LUẬN

TP. Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 06 năm 2014 TRƯỞNG PHÒNG

TS.BS.Phạm Hùng Vân

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin “CAM ĐOAN”, luận văn tốt nghiệp này đƣợc tôi thực hiện dƣới sự

hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm

– Môi trƣờng, trƣờng Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Tôi cam đoan

những nội dung, các số liệu và trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp là hoàn toàn trung thực.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 9 tháng 8 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Võ Thị Lan Thanh

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nổ lực hết sức của bản thân,

em còn nhận đƣợc sự hổ trợ, giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô, gia đình và bạn bè, em

xin chân thành gửi lời “CÁM ƠN” tới:

Em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể thầy cô trƣờng Đại học Công Nghệ Thành

Phố Hồ Chí Minh, quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng

đã truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền tảng để em thực hiện khóa luận tốt

nghiệp.

Em xin gửi lời cảm ơn, lời tri ân sâu sắc đến TS.Nguyễn Thị Hai, Cô đã tận tình

hƣớng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm để em hoàn thành khóa luận thật

tốt.

Con xin gửi lời cảm ơn, lòng biết ơn sâu sắc đến ba, mẹ, gia đình, ngƣời thân đã

luôn bên cạnh con, cổ vũ, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để con có thể hoàn thành

tốt khóa luận tốt nghiệp.

Em xin gửi lời cám ơn đến quý thầy, cô và các bạn trong phòng thí nghiệm đã

giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp một cách tốt

nhất.

Trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp, khó tránh khỏi sai sót; đồng thời, do trình

độ cũng nhƣ kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi

những thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của quý Thầy, Cô để em có

thêm nhiều kiến thức cũng nhƣ kinh nghiệm trong công việc sắp tới.

Em xin chân thành cảm ơn !

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 9 tháng 8 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Võ Thị Lan Thanh

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC ................................................................................................................... i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1

2. Mục đích nghiên cứu đề tài ...................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 3

1.1. Giới thiệu về cây thanh long ................................................................................. 3

1.1.1. Nguồn gốc ......................................................................................................... 3

1.1.2. Phân loại ........................................................................................................... 3

1.1.3. Đặc điểm phân bố .............................................................................................. 5

1.1.4. Đặc điểm chung của cây thanh long .................................................................. 5

1.2. Thành phần bệnh hại trong sản xuất thanh long .................................................... 6

1.2.1. Tình hình dịch hại trên thanh long ..................................................................... 6

1.2.2. Các bệnh thường gặp trên cây thanh long .........................................................10

1.2.2.1. Bệnh thối đầu cành ........................................................................................10

1.2.2.2. Bệnh đốm nâu trên cành ................................................................................10

1.2.2.3. Bệnh rám cành ...............................................................................................10

1.2.3. Côn trùng gây hại trên cây thanh long ..............................................................10

1.2.3.1. Kiến ...............................................................................................................10

1.2.3.2. Bọ xít .............................................................................................................11

1.2.3.3. Ruồi vàng hay ruồi trái cây ............................................................................11

1.2.4. Các hiện tượng sinh lý thường gặp trên cây thanh long ....................................11

1.2.4.1. Hiện tượng rụng nụ ........................................................................................11

Đồ án tốt nghiệp

1.2.4.2. Hiện tượng nứt vỏ trái....................................................................................11

1.3. Một số bệnh hại chính ..........................................................................................11

1.3.1. Bệnh thán thư ...................................................................................................12

1.3.1.1. Đặc điểm gây hại ...........................................................................................12

1.3.1.2. Phổ ký chủ .....................................................................................................13

1.3.1.3. Phương pháp phòng trừ .................................................................................14

1.3.2. Bệnh đốm trắng ................................................................................................16

1.3.2.1. Thời gian xuất hiện ........................................................................................17

1.3.2.2. Tác hại ...........................................................................................................17

1.3.2.3. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên thanh long .......................................18

1.3.2.4. Một số biện pháp phòng trừ bệnh đốm trắng ..................................................20

1.4. Giới thiệu về nấm Cochliobolus lunatus ..............................................................22

1.4.1. Phân loại ..........................................................................................................22

1.4.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa ............................................................................23

1.4.3. Phổ ký chủ ........................................................................................................23

1.4.4. Cơ chế xâm nhập và gây bệnh...........................................................................24

1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus

lunatus ........................................................................................................................24

1.4.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................................24

1.4.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ........................................................................25

1.4.5.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại .....................................................................25

1.4.5.4. Ảnh hưởng của pH .........................................................................................25

1.4.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................................26

1.5. Sử dụng nấm Trichoderma trong phòng trừ bệnh đốm trắng ................................26

1.5.1. Giới thiệu về nấm đối kháng Trichoderma. .......................................................26

1.5.1.1. Đặc điểm phân loại ........................................................................................26

1.5.1.2. Nguồn gốc......................................................................................................26

Đồ án tốt nghiệp

1.5.1.3. Đặc điểm hình thái nấm .................................................................................26

1.5.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .............................................................................27

1.5.2. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma ...........................................................28

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 34

2.1. Địa điểm và thời gian...........................................................................................34

2.1.1. Địa điểm ...........................................................................................................34

2.1.2. Thời gian ..........................................................................................................34

2.2. Vật liệu ................................................................................................................34

2.2.1. Nguyên liệu .......................................................................................................34

2.2.1.1. Trái và cành thanh long .................................................................................34

2.2.1.2. Chủng nấm mốc .............................................................................................35

2.2.2. Hóa chất ...........................................................................................................35

2.2.3. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................35

2.2.3.1. Dụng cụ .........................................................................................................35

2.2.3.2. Thiết bị ..........................................................................................................35

2.2.3.3. Môi trường nuôi cấy ......................................................................................36

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. ....................................................................................37

2.3.1. Phương pháp vi sinh .........................................................................................37

2.3.1.1. Phương pháp thu thập, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh ....................37

2.3.1.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến tốc độ phát triển kích

thước khuẩn lạc ..........................................................................................................42

2.3.1.3. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh với các chủng

Trichoderma . .............................................................................................................43

2.3.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu.................................................................................46

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 48

3.1. Kết quả nhận dạng, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cành

thanh long...................................................................................................................48

iii

Đồ án tốt nghiệp

3.1.1. Kết quả phân lập...............................................................................................48

3.1.1.1. Chủng nấm N1 ................................................................................................48

3.1.2.2. Chủng nấm N2 ................................................................................................51

3.1.1.3. Chủng nấm N3 ................................................................................................53

3.1.2. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch ...................................................55

3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến kích thƣớc tăng trƣởng của nấm

Cochliobolus lunatus ..................................................................................................60

3.2.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến kích thước tăng trưởng của nấm Cochliobolus

lunatus ........................................................................................................................60

3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus lunatus

...................................................................................................................................62

3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus

lunatus ........................................................................................................................64

3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm

Cochliobolus lunatus ..................................................................................................67

3.3.1. Khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma virens với nấm Cochliobolus

lunatus ........................................................................................................................67

3.3.2.Khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma harzianum với nấm

Cochliobolus lunatus ..................................................................................................69

3.3.3. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma virens, Trichoderma harzianum với

nấm Cochliobolus lunatus ..........................................................................................70

Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 73

4.1. Kết luận ...............................................................................................................73

4.2. Kiến nghị .............................................................................................................73

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................74

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BVTV: Bảo vệ thực vật

Ctv: Cộng tác viên

GĐ: Giám đốc

PDA: Potato D – Glucose Agar

TL: Thanh long

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại các loài xƣơng rồng (có trái ăn đƣợc) khác nhau dựa trên đặc điểm

sinh thái, màu vỏ và ruột thịt của trái ........................................................................... 4

Bảng 1.2. Điều kiện phát triển thích hợp của cây thanh long........................................ 6

Bảng 1.3. Thành phần dịch hại quan trọng trên thanh long .......................................... 8

Bảng 3.1. Thành phần nấm phân lập đƣợc trên cành thanh long bị bệnh đốm trắng ....48

Bảng 3.2. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N1 trƣớc Koch ...........................50

Bảng 3.3. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N2 .............................................53

Bảng 3.4. Đƣờng kính trung bình (mm) tản nấm N3....................................................55

Bảng 3.5. Tỷ lệ bệnh của 3 loại nấm trên cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo .....

...................................................................................................................................56

Bảng 3.6. Hình thái chủng nấm N1 trƣớc Koch và sau Koch .......................................58

Bảng 3.7. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên môi

trƣờng PDA với các điều kiện chiếu sáng khác nhau khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng ...61

Bảng 3.8. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên môi

trƣờng PDA ở các mức pH khác nhau.........................................................................63

Bảng 3.9. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu nấm Cochliobolus lunatus trên

môi trƣờng PDA có bổ sung nguồn nitơ khác nhau .....................................................64

Bảng 3.10. Đƣờng kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của Trichoderma

virens với nấm Cochliobolus lunatus ..........................................................................67

Bảng 3.11. Đƣờng kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của Trichoderma

harzianum với nấm Cochliobolus lunatus ...................................................................69

Bảng 3.12. Phần trăm ức chế trung bình 3 lần nhắc của nấm Trichoderma virens,

Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus ..............................................70

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình quả thanh long ..................................................................................... 4

Hình 1.2. Hình ký sinh của nấm Trichoderma ............................................................31

Hình 2.1. Cành thanh long bị bệnh đốm trắng .............................................................34

Hình 2.2. Dịch bào tử sau khi lắc ................................................................................41

Hình 2.3. Cành thanh long trƣớc khi lây bệnh nhân tạo ..............................................41

Hình 2.4. Phƣơng pháp cấy đối kháng ........................................................................46

Hình 3.1. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N1 ....................................................49

Hình 3.2. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N1 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b),

7NSC (c) ....................................................................................................................50

Hình 3.3. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N2 ....................................................52

Hình 3.4. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N2 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b),

7NSC (c) ....................................................................................................................53

Hình 3.5. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N3 ....................................................54

Hình 3.6. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N3 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b),

7NSC (c) ....................................................................................................................55

Hình 3.7. Cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch ....................56

Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA ............................................................59

Hình 3.9. Kết quả tra cứu BLAST SEARCH ..............................................................60

Hình 3.10. Đƣờng kính trung bình của nấm Cochliobolus lunatus ở các điều kiện chiếu

sáng khác nhau qua 4 ngày sau cấy .............................................................................62

Hình 3.11. Đƣờng kính trung bình tản nấm Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA

ở các mức pH khác nhau qua 4 ngày sau cấy ..............................................................64

Hình 3.12. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu nấm Cochliobolus lunatus trên

môi trƣờng PDA với các nguồn nitơ khác nhau ở 4 ngày sau cấy ...............................67

Hình 3.13. Mức độ đối kháng của nấm Trichoderma virens, Trichoderma harzianum

với nấm Cochliobolus lunatus ....................................................................................72

vii

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Cây thanh long (Hylocereus undatus) là cây trồng chủ lực mang lại hiệu quả

kinh tế cao cho ba tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang (Huyện Chợ Gạo) và Long An (Huyện

Châu Thành). Trong những năm gần đây do việc mở rộng diện tích đất canh tác để gia

tăng sản xuất, thâm canh đồng thời ứng dụng nhiều kỹ thuật mới vào sản xuất (chong

đèn xử lý nghịch vụ, trồng mới bằng trụ bê tông, tăng lƣợng phân bón, chăm sóc

vƣờn,…) nên năng suất đƣợc nâng cao, phục vụ cho nhu cầu của ngƣời tiêu dùng trong

nƣớc và quốc tế cũng nhƣ cải thiện đáng kể nguồn thu nhập của ngƣời sản xuất. Tuy

nhiên, ngoài những mặt tích cực trên vẫn còn tồn tại những mặt tiêu cực của vấn đề này

là tình hình sâu bệnh trên cây thanh long ngày càng trở nên phức tạp hơn. Trong những

năm qua nhiều đối tƣợng dịch hại đã có xu hƣớng phát triển và gây hại ngày càng nặng

hơn trên cây thanh long nhƣ bệnh thối trái do vi khuẩn, bệnh thán thƣ, đốm đồng tiền,

hiện tƣợng vàng bẹ rám cành… Đặc biệt, vài năm gần đây bệnh đốm trắng hay nhiều

nơi bà con còn gọi là bệnh lạ phát triển mạnh và gây thiệt hại nặng ở các vùng trồng

thanh long trong cả nƣớc. Bệnh gây hại trên cành và trái làm giảm khả năng quang

hợp, gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất cũng nhƣ chất lƣợng trái thanh long. Hiện

nay, ngƣời ta vẫn chƣa biết đối tƣợng gây bệnh lạ trên thanh long cũng nhƣ chƣa tìm ra

phƣơng thức lây lan và giải pháp quản lý hữu hiệu để ứng dụng vào trong sản xuất.

Bệnh này đang là bức xúc lớn cho nông dân mà còn cho các nhà chức năng ở các địa

phƣơng.

Việc tìm ra tác nhân gây bệnh và biện pháp quản lý để giúp làm giảm thiệt hại

cho sản xuất thanh long ở các vùng là nhu cầu rất cấp thiết hiện nay. Xuất phát từ lý do

trên, sinh viên thực hiện đề tài “Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long

và bƣớc đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến tác nhân gây bệnh”.

Đồ án tốt nghiệp

2. Mục đích nghiên cứu đề tài

Xác định đƣợc tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long, các yếu tố ảnh

hƣởng đến nấm gây bệnh làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng biện pháp phòng trừ

loại bệnh mới này.

3. Nội dung nghiên cứu

Xác định tác nhân gây bệnh lạ trên cây thanh long.

Ảnh hƣởng của các yếu tố đến sự phát triển của nấm gây bệnh đốm trắng.

Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với tác nhân gây bệnh

đốm trắng thanh long trong in vitro.

Đồ án tốt nghiệp

Chƣơng 1

TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về cây thanh long 1.1.1. Nguồn gốc (Nguyễn Văn Kế, 2000)

Cây thanh long có tên khoa học là Hylocereus undatus Haw thuộc họ xƣơng

rồng Cactaceae, tên tiếng Anh là Pitahaya hay còn gọi là dragon fruit. Thanh long có

xuất xứ từ những vùng rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Mehico, Trung và Nam Mỹ

(bao gồm miền Nam Mehico, bờ Thái Bình Dƣơng của các nƣớc: Guatemala, Costa

Rica, El Salvador, Venezuela, Colombia, Ecuador, Nicaragua, Panama, Brazil và

Uruguay).

Cây thanh long là cây có khả năng chịu nhiệt nên đƣợc trồng ở vùng nóng nhƣ

vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia.

Thanh long đƣợc ngƣời Pháp đem vào trồng ở Việt Nam từ thời Pháp thuộc

nhƣng mới đƣợc sản xuất ở quy mô lớn từ thập niên 1980. Hiện nay, Việt Nam là nƣớc

duy nhất ở Đông Nam Á trồng thanh long tƣơng đối tập trung trên quy mô thƣơng mại.

1.1.2. Phân loại (Bùi Vũ Thùy Dương, 2013)

Việc phân loại các loài cây xƣơng rồng (có trái ăn đƣợc) dựa trên đặc điểm sinh

thái, màu vỏ và màu ruột thịt của trái. Các loài cây xƣơng rồng có trái ăn đƣợc, đƣợc

chia làm 2 nhóm (dựa trên đặc điểm hình thái): vine cacti (có thân bò trên trụ đỡ) và

columnar cacti (có thân cột). Nhóm vine cacti thuộc về hai chi khác nhau là Hylocereus

và Selenicereus. Nhóm columnar cacti thuộc về ba chi Cereus, Pachycereus và

Stenocereus.

Ở Việt Nam, dựa theo đặc điểm của trái thanh long đƣợc chia thành ba loại phổ

biến:

- Thanh long ruột trắng với vỏ hồng (hoặc đỏ): có tên khoa học là Hylocereus

undatus thuộc chi Hylocereus.

Đồ án tốt nghiệp

- Thanh long ruột đỏ với vỏ hồng (hoặc đỏ): có tên khoa học là Hylocereus

polyrhizus thuộc chi Hylocereus.

- Thanh long ruột trắng với vỏ vàng: có tên khoa học là Hylocereus megalanthus

thuộc chi Hylocereus nhƣng trong một nghiên cứu gần đây loài này có nguồn gốc lai

giữa hai chi là Hylocereus Selenicereus.

Hình 1.1. Hình quả thanh long (a. Quả thanh long ruột trắng, vỏ đỏ Hylocereus

undatus, b. Qủa thanh long ruột đỏ, vỏ đỏ Hylocereus undatus, c. Qủa thanh long ruột

trắng, vỏ vàng Hylocereus megalanthus (Trần Thị Hoài Vi, 2011)

Bảng 1.1. Phân loại các loài xƣơng rồng (có trái ăn đƣợc) khác nhau dựa trên đặc điểm

sinh thái, màu vỏ và ruột thịt của trái

Màu sắc của Loài Vỏ quả Ruột thịt quả

Vine cacti

Hylocereus udatus Đỏ Trắng

Hylocereus udatus Đỏ Đỏ

Hylocereus triangularis Vàng Trắng

Hylocereus costaricensis Đỏ Đỏ

Hylocereus polyrhizus Đỏ Đỏ

(syn H. monacanthus)

Hylocereus ocamponic Vàng Đỏ

Selenicereus megalanthus Vàng Trắng

Đồ án tốt nghiệp

(syn H. megalanthus)

Columnar cacti

Cereus triangular Vàng Trắng

Acanthocereus pitajaya Vàng Trắng

Cereus ocamponic Đỏ Đỏ

(Nguồn: Crane và Balerdi, 2004; Mizrahi và Nerd, 1999)

1.1.3. Đặc điểm phân bố (Nguyễn Văn Kế, 2000)

Thanh long là loài thực vật bản địa tại Mehico và các nƣớc ở khu vực Trung và

Nam Mỹ, từ đây thanh long đƣợc du nhập sang các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới ở

châu Mỹ, châu Á, châu Đại Dƣơng và vùng Trung Đông. Thanh long cũng đƣợc trồng

ở các nƣớc trong khu vực Đông Nam Á nhƣ Việt Nam, Malaysia, Philippines, Thái

Lan, Indonesia; ngoài ra chúng cũng hiện diện ở khu vực miền Nam Trung Quốc, Đài

Loan và một số khu vực khác. Hiện nay, thanh long đang đƣợc trồng ở ít nhất 22 nƣớc

nhiệt đới nhƣ: Australia, Cambodia, China, Colombia, Ecuador, Guatemala, Indonesia,

Israel, Philippines, Tây Ban Nha, Sri Lanka, Đài Loan, Thái Lan, miền Nam nƣớc Mỹ

và Việt Nam.

Ở Việt Nam, thanh long đƣợc trồng đầu tiên ở Nha Trang và Phan Thiết từ thời

Pháp thuộc. Sau khi thanh long trở thành hàng hóa thƣơng mại và xuất khẩu ra nhiều

nƣớc trên thế giới, phong trào trồng thanh long phát triển mạnh ở Phan Rang, Phan

Thiết, Bình Thuận, Buôn Ma Thuộc và các tỉnh ở đồng bằng sông Cửu Long nhƣ: Tiền

Giang, Long An…. Trong những vùng trồng thanh long ở Việt Nam, Bình Thuận có

diện tích trồng thanh long thƣơng mại ƣớc tính khoảng 1000 ha trong khi cả nƣớc

chiếm khoảng 2000 ha.

1.1.4. Đặc điểm chung của cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000)

Thanh long là cây có nguồn gốc nhiệt đới có khả năng chịu hạn nên thƣờng

đƣợc trồng ở những vùng nóng, chúng thích nghi đƣợc với những nơi có cƣờng độ ánh

sáng mạnh. Thanh long mọc đƣợc trên nhiều loại đất khác nhau nhƣ đất xám bạc màu

Đồ án tốt nghiệp

(Bình Thuận), đất phèn (Thành phố Hồ Chí Minh), đất đỏ latosol (Long Khánh)…,

đồng thời cây thanh long có khả năng thích nghi với các độ chua (pH) khác nhau của

đất (thanh long thích nghi tốt với đất hơi acid). Không giống nhƣ các loài xƣơng rồng

khác, thanh long tuy có khả năng chịu hạn nhƣng cũng cần một lƣợng nƣớc nhất định

cho sự phát triển và tạo quả. Lƣợng mƣa hằng năm từ 500 – 1500 mm thích hợp nhất

cho sự phát triển của cây thanh long.

Bảng 1.2. Điều kiện phát triển thích hợp của cây thanh long

Yếu tố khí hậu Điều kiện tối ƣu

Lên tới 1700 m

Độ cao (m) Nhiệt độ (0C) 20 – 30

Lƣợng mƣa (mm) 500 – 2000 (với thời tiết nóng ẩm nhiệt

đới có hai mùa mƣa nắng luân phiên)

Đất Có khả năng thoát nƣớc tốt

pH 5,5 – 6,5

(Nguồn: H. P. M. Gunasena và ctv, 2004)

1.2. Thành phần bệnh hại trong sản xuất thanh long

1.2.1. Tình hình dịch hại trên thanh long (Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hòa,

2014)

Thanh long là một loại cây ở vùng nhiệt đới nên chúng dễ dàng bị nhiễm bệnh

hoặc dịch hại. Tuy nhiên, so với các loại cây ăn trái khác, cây thanh long có ít đối

tƣợng dịch hại nghiêm trọng hơn (Bảng 1.3), ngoại trừ gần đây đã xuất hiện bệnh đốm

trắng gây hại nặng nề và diễn tiến bệnh có xu hƣớng ngày càng phức tạp đối với tất cả

các vùng trồng thanh long trọng điểm ở phía Nam. Theo số liệu tổng hợp ghi nhận từ

Chi cục Bảo vệ thực vật các tỉnh Tiền Giang, Long An và Bình Thuận, trong năm 2013

có khoảng 6000 ha thanh long nhiễm bệnh (chiếm 20 – 25% tổng diện tích), bệnh tấn

công mạnh vào mùa mƣa và gây thiệt hại nặng nề 20 – 50% năng suất. Các giải pháp

kỹ thuật tạm thời đƣợc các địa phƣơng khuyến cáo áp dụng vẫn chƣa đạt đƣợc hiệu quả

Đồ án tốt nghiệp

nhƣ mong muốn và ngƣời trồng thanh long đã sử dụng nhiều biện pháp khác nhau mà

chủ yếu là thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) nhƣng tỷ lệ thành công còn thấp, ngƣợc lại

tiềm ẩn nguy cơ mất an toàn do ô nhiễm thuốc BVTV là rất cao.

Trong năm 2011, Bộ môn Bảo vệ thực vật - Viện Cây ăn quả miền Nam đã giám

định một số mẫu bệnh đốm trắng trên cành thanh long do Chi cục Bảo vệ thực vật Bình

Thuận gửi đến. Qua kết quả phân lập và giám định đã xác định tác nhân gây bệnh đốm

trắng trên thanh long là do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Kết quả cũng tƣơng

tự đối với những mẫu bệnh trên cành và trái thanh long ở Long An, Tiền Giang.

Trƣớc đây, nấm Neoscytalidium dimidiatum có nhiều tên gọi khác nhau nhƣ:

Fusicoccum dimidiatum, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula

toruloidea... Theo ghi nhận của Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hòa (2014) bệnh

đốm trắng chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh vào mùa mƣa, nhiệt độ thích hợp cho nấm bệnh phát triển từ 20 - 300C, ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho

bệnh tấn công và lây lan.

Bên cạnh đó, theo ghi nhận của Viện Cây ăn quả miền Nam cũng cho thấy một

số đối tƣợng dịch hại mới khác nhƣ: hiện tƣợng đỏ đầu trái (chín ngƣợc), sâu đục cành

hoặc thân, ốc sên trắng cũng bắt đầu gây hại rải rác ở các địa phƣơng trồng thanh long

trọng điểm nêu trên.

Cùng với sự hội nhập ngày càng sâu rộng, các yêu cầu về mặt chất lƣợng sản

phẩm của các quốc gia nhập khẩu càng trở nên khắc khe và cũng là rào cản kỹ thuật

đối với trái thanh long Việt Nam, đặc biệt là vấn đề tồn dƣ dƣ lƣợng thuốc BVTV trở

nên nóng bỏng hơn bao giờ hết.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.3. Thành phần dịch hại quan trọng trên thanh long

Mức

Tác nhân gây Bộ phận bị Thời điểm độ TT Dịch hại phổ bệnh hại gây hại

biến

I. Bệnh hại

1 Bệnh đốm trắng Neoscytalidium Cành, trái Quanh năm +++

(đốm nâu, tắc kè…) dimidiatum non và thu

hoạch

2 Bệnh thối trái (ruột Erwinia Bông, trái Quanh năm +++

đỏ), thối đầu trái chrysanthemi non

(ruột trắng)

3 Thán thƣ Colletotrichum Trái, hoa Mùa mƣa +++

gloeosporioides

Colletotrichum sp.

4 Rỉ sét (đốm đen) Bipolaris sp. Bông Mùa mƣa +++

5 Vàng bẹ rám cành Fusarium equiseti, Cành Mùa nắng +++

Bipolaris crutacea

6 Nấm bồ hóng Capnodium sp. Cành, hoa, Quanh năm +++

trái

7 Thối trái Fusarium sp. Trái sắp Mùa mƣa ++

chín

8 Thối bẹ Alternaria sp., Cành Cuối mùa ++

Fusarium sp., nắng, đầu

bacteria mùa mƣa

9 Đốm nâu Glocosporium Cành Quanh năm +

Đồ án tốt nghiệp

avages

II. Côn trùng

1 Bọ trĩ Thrip sp. Bông, trái Mùa nắng +

non

2 Ngâu Protaetia sp. và Cành, bông Quanh năm ++

Hypomeces

squamesus

3 Kiến Cành,

bông, trái

non

Solenopsis Kiến lửa Quanh năm +

geminate

Kiến riện Cardiocondyla Cành, Quanh năm +++

wroughtoni bông, trái

non

Kiến xám Paratrechina Quanh năm +++ Cành,

longicornis bông, trái

non

4 Ruồi đục quả Bactrocera Trái chín Mùa mƣa +

dorsalis

5 Rệp sáp Pseudococcus sp. Cành, trái Mùa nắng +

6 Ốc sên Achtina sp. Cành, trái Mùa mƣa +

thu hoạch

7 Rầy mềm Toxoptera sp. Cành, trái Quanh năm +

non

Ghi chú: + mức độ bệnh thấp, ++ mức độ bệnh trung bình, +++ mức độ bệnh khá phổ biến.

(Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hòa, 2014)

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2. Các bệnh thường gặp trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000)

1.2.2.1. Bệnh thối đầu cành

Triệu chứng bệnh: Ngọn cành thanh long chuyển màu vàng, rồi mềm, sau đó

thối. Cây tăng trƣởng chậm, số cành giảm hẳn. Bệnh hay xảy ra vào cuối mùa nắng.

Bệnh xảy ra không những trên đất phèn (đất thấp) mà còn cả trên đất cao nữa. Nguyên

nhân chính là do nấm Alternaria sp. gây ra. Biện pháp phòng trị bằng cách phun

Rovral 2 lần liên tiếp cách nhau 1 tuần.

1.2.2.2. Bệnh đốm nâu trên cành

Triệu chứng bệnh là trên thân cành thanh long có những đốm tròn nhƣ mắt cua

màu nâu. Vết bệnh nằm rải rác hoặc tập trung, thƣờng kéo dài thành từng vệt dọc theo

thân cành. Có nhiều vết acervulus tròn đen nằm rải rác. Tác nhân là nấm Gloeosporium

agavaes.

1.2.2.3. Bệnh rám cành

Triệu chứng: Bệnh rám cành làm cho thân, cành thanh long có một lớp màng

mỏng màu xám tro, nhám. Tác nhân gây bệnh rám cành là nấm Macssonina agaves

Syd và Sphaceloma sp. Họ Nectrioidaceae, Bộ Melanconiales, Lớp Deuteromycetes.

Biện pháp phòng trị chung cho các bệnh thanh long là vệ sinh đồng ruộng,

chống úng và chống hạn cho cây. Khi bệnh phát triển nhiều thì dùng thuốc Rovral,

hoặc Anvil 5sc (30 – 100 g/ha) phối hợp với Topas (10 – 50 g/ha). Ngoài sâu bệnh kể

trên thanh long còn bị dơi, chim, chuột phá hoại quả.

1.2.3. Côn trùng gây hại trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000)

1.2.3.1. Kiến

Cắn, đục khoét làm hƣ hỏng giống và các cành thanh long non, cắn mất tai lá

trên trái, gây tổn thƣơng vỏ trái, đây là loại côn trùng dễ phòng trừ. Để phòng trị dùng

Basudin (Diazinon) 10H, Padan 4G, 10G trộn đều với cát 2/1000 rải đều quanh gốc

hoặc những nơi chúng làm tổ. Khi phun vào các ổ kiến thì dùng Bi 58, Diazinon…

Đồ án tốt nghiệp

1.2.3.2. Bọ xít

Hại thanh long từ khi có nụ hoa đến khi trái hình thành, chúng chích hút nhựa,

để lại những vết chích rất nhỏ nhƣng đến khi quả chín nơi các vết chích sẽ xuất hiện

một chấm đen, mất giá trị xuất khẩu. Việc phòng trừ dùng Trebon, Applaud, Bassa…

nồng độ 0,2%. Phun lên khu vƣờn có bọ xít xuất hiện.

1.2.3.3. Ruồi vàng hay ruồi trái cây (Dacus dorsalis)

Đây là đối tƣợng nguy hiểm đang đƣợc báo động hiện nay. Chúng trƣởng thành

chích và đẻ trứng vào quả gây thoái hóa phần thịt quả và phần nhựa chảy ra ngoài vỏ

làm quả thanh long bị hƣ, không xuất vƣờn đƣợc. Tuy chúng là đối tƣợng mới xuất

hiện trên thanh long nhƣng ruồi trái cây đã gây hại rất nhiều loại quả ở nƣớc ta vì thế

cần chú ý phòng trừ. Cần vệ sinh đồng ruộng nhƣ thu dọn và tiêu hủy các quả rụng, rải

thuốc diệt nhộng dƣới đất, đặt bả có chứa chất dẫn dụ trích từ cây é tía trộn với thuốc

trừ sâu để diệt ruồi. Hiện nay, các thuốc nhƣ Ruvacon 90L và Vizubon D đã có chứa

sẵn chất dẫn dụ là Metyl eugenol 75% nên tiện cho nhà vƣờn hơn.

1.2.4. Các hiện tượng sinh lý thường gặp trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế,

2000)

1.2.4.1. Hiện tượng rụng nụ

Xuất hiện khi số nụ trên cành nhiều. Sau khi nụ xuất hiện 5 – 7 ngày thì nụ

không phát triển nữa, vàng rồi rụng. Tỷ lệ rụng từ 10% đến 20%. Cây thanh long tự

quân bình sinh lý để nuôi quả còn lại trên cây. Để hạn chế sự rụng quả sinh lý cần bón

phân tƣới nƣớc đầy đủ.

1.2.4.2. Hiện tượng nứt vỏ trái

Do thời tiết, trời hạn ở giai đoạn vỏ quả phát triển, sau đó mƣa nhiều hoặc tƣới

nhiều nƣớc vào lúc ruột đang phát triển nên quả nứt. Mặt khác, do nhà vƣờn treo quả

lâu đợi dịp có giá mới bán. Để hạn chế nên kiểm soát độ ẩm đất, không để vƣờn khô

hạn trong thời kỳ cây nuôi quả.

1.3. Một số bệnh hại chính

Đồ án tốt nghiệp

1.3.1. Bệnh thán thư

1.3.1.1. Đặc điểm gây hại

a. Sự nguy hại của bệnh thán thƣ (Nguyễn Văn Hòa, 2013; Vũ Triệu Mân, 2007)

Bệnh thán thƣ do nấm Collectotrichum gloeospoides gây ra trên thanh long là

bệnh gây hại quan trọng nhất làm tổn thất đến năng suất và phẩm chất của trái, đặc biệt

vào mùa mƣa bão, nấm tấn công lên thân, cành, nụ hoa và trên trái ở các giai đoạn khác

nhau, nhiễm nặng nhất là giai đoạn sau thu hoạch.

b. Triệu chứng bệnh (Nguyễn Văn Hòa, 2013; Vũ Triệu Mân, 2007)

Bệnh gây hại chủ yếu trên đọt, hoa và trái, đôi khi trên cành cũng bị tấn công.

Trên cành: Vết bệnh bắt đầu từ mép cành lan dần vào bên trong. Vết bệnh dạng

tròn hay bất định. Khi nấm tấn công vào cành làm cho cành thối mềm có màu vàng

sáng, sau một thời gian ngắn chuyển sang màu nâu, thối từ phần ngọn vào trong.

Trên hoa: Nấm tạo thành những đốm đen nhỏ làm hoa bị thâm đen và rụng.

Bệnh tấn công cả phần nụ hoa, làm cho nụ hoa biến thành màu nâu, sau đó rụng rất

nhanh.

Trên trái: Ở điều kiện ngoài đồng bệnh ít khi tấn công trên trái, tuy nhiên ở giai

đoạn trái lớn sắp thu hoạch hoặc đã thu hoạch và tồn trữ. Vết bệnh là những đốm tròn

hoặc gần tròn, có tâm màu nâu đỏ, lõm xuống, xung quanh có những vòng đồng tâm

nâu sậm, sau đó phát triển nhanh thành những mãng thối lõm vào vỏ, gây thất thoát lớn

trong quá trình vận chuyển, tồn trữ.

c. Đặc điểm phát sinh và phát triển của bệnh (Nguyễn Văn Hòa, 2013; Vũ Triệu Mân,

2007)

Bệnh thán thƣ phát triển mạnh ở điều kiện ẩm ƣớt và nhiệt độ không khí cao. Nấm có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 40C, nhƣng tối thích là 25 – 290C. Bề mặt mô bệnh

ẩm ƣớt kéo dài có ảnh hƣởng đến sự xâm nhiễm và sinh trƣởng của nấm

Collectotrichum gloeosporioides.

Đồ án tốt nghiệp

Trong điều kiện ngoài đồng: Bệnh bình thƣờng tồn tại trong xác bã thực vật có

trong vƣờn hoặc trên cành, trái bệnh.

Bệnh phát triển mạnh và bộc phát ở điều kiện ẩm độ cao nhất là vào mùa mƣa.

Bệnh phát triển và gây hại nặng ở giai đoạn ra hoa, trái sắp thu hoạch và sau thu

hoạch.

1.3.1.2. Phổ ký chủ (Stanley Freeman, 2008; Steven John Mackenzie, 2005)

Collectotrichum spp. là tác nhân gây bệnh trên phạm vi rộng, nhiều loài có thể

lây nhiễm một vật chủ duy nhất và loài duy nhất có thể lây nhiễm vật chủ khác nhau

(Freeman và ctv, 1998). Thí dụ một vật chủ có thể bị nhiễm bệnh bởi nhiều loài

Collectotrichum kể cả dâu tây bị nhiễm bệnh bởi 3 loài Collectotrichum, cụ thể là C.

acutatum, C. fragariae, và C. gloeosporioides ; quả bơ và xoài nhiễm bệnh do cả hai

loại nấm C. acutatum và C. gloeosporioides ; hạnh nhân và các loại trái cây chín vào

một thời kỳ nhất định bị nhiễm bệnh do nấm C. acutatum hoặc C. gloeosporioides gây

ra; cam quýt bị bệnh do ảnh hƣởng của các loài Colletotrichum khác nhau, đó là rụng

quả và bệnh loét do C. acutatum gây ra, cây chết mầm non do C. gloeosporioides

(Freeman và ctv, 1998). Hơn nữa nấm Colletotrichum còn là ký chủ trên cây cà phê,

cây bầu, cây hồ tiêu, cà chua và những cây khác (Bailey và Jeger, 1992).

Ở vùng nhiệt đới, nấm Collectotrichum gloeosporioides xuất hiện trên hầu hết

các loại cây trồng, giai đoạn tồn tại chủ yếu của nấm là sống hoại sinh trên mô chết

hoặc những tàn dƣ của cây trồng.

Theo Mills và ctv (1992), những mẫu nấm bệnh Collectotrichum gloeosprioides

thƣờng gây hại trên cây ký chủ nhƣ bơ, đu đủ, xoài, chuối, phong lan và cao su.

Ở Australia ngƣời ta phát hiện thấy trên cây cỏ Stylosanthes có hai chủng nấm

Collectotrichum gloeosprioides khác nhau. Qua quá trình phân lập mẫu bệnh và phân

tích sinh học phân tử đã phát hiện thấy có sự biến động xảy ra trong nhân mặc dù

không biết do yếu tố nào gây ra. Sự biến động này cũng tìm thấy ở trên cây dâu trồng ở

vùng ôn đới (Maner và ctv, 1992).

Đồ án tốt nghiệp

Nấm Colletotrichum gloeosporioides cũng đƣợc phân lập từ 23 loại cây ăn quả

ở Sri Lanka. Tác nhân gây bệnh này đã không đƣợc ghi nhận trƣớc đây trên sầu riêng,

măng cụt, chôm chôm và Jambu Pini và 11 cây ăn quả ít quan trọng về kinh tế khác ở

Sri Lanka. Các triệu chứng của nhiễm C. gloeosporioides trên các giống cây ăn quả,

đặc biệt là xoài và chôm chôm có thể gây ra lên đến 40%.

1.3.1.3. Phương pháp phòng trừ

Để phòng trừ bệnh thán thƣ, có một số biện pháp nhƣ sau:

a. Biện pháp canh tác (Nguyễn Văn Hòa, 2013)

Đào mƣơng lên lip (luống): Tùy theo độ cao của đất mà thiết kế líp đôi hay líp

đơn, sao cho đảm bảo mực nƣớc ở thời điểm cao nhất là 20 – 30 ci vì rễ rất dễ bị úng

và thối. Nên đắp mô cao để cây phát triển tốt, kích thƣớc mô 80 × 30 cm, khoảng cách trồng 3 × 3 m hoặc 3 × 3,5 m (mật độ khoảng 100 trụ/1000 m2).

Trồng cây chắn gió: Nên trồng cây chắn gió đối với những vùng chuyên canh để

hạn chế mầm bệnh lan vào.

Trụ để thanh long phát triển: Tốt nhất là sử dụng trụ xi măng vì trụ bằng cây

sống dễ mang mầm bệnh, sâu, không bền vững. Trụ xi măng cao 2 – 2,5 m, ngang 12 –

15 cm, phía trên trụ nên có que sắt dài 30 – 40 cm để làm giá đỡ cho thanh long.

Bón phân cân đối, hợp lý: Nên bón phân cân đối và hợp lý theo quy trình kỹ

thuật canh tác thanh long, liều lƣợng và phân tùy thuộc vào loại đất và điều kiện sinh

trƣởng của cây, khả năng cho trái của vụ trƣớc. Cần bón nhiều phân hữu cơ đã đƣợc ủ

hoai mục, nên cung cấp thêm vôi cho cây trƣớc và sau mùa mƣa.

Tƣới nƣớc: Nên thiết kế hệ thống tới để quản lý tốt nguồn nƣớc, tránh mầm

bệnh lây lan, tránh tƣới phun lên tán cây khi trong vƣờn có nhiều mầm bệnh thán thƣ.

Tủ gốc giữ ẩm: Tủ gốc giữ ẩm cho cây vào mùa nắng bằng rơm, rạ, cỏ khô, tủ

cách gốc 5 – 10 cm giúp giảm lƣợng cỏ dại, cung cấp dinh dƣỡng cho cây.

b. Biện pháp sử dụng giống chống chịu bệnh (Vũ Triệu Mân, 2007)

Đồ án tốt nghiệp

Tạo ra những giống kháng bệnh đã và đang đƣợc các cơ sở nghiên cứu nông

nghiệp trên thế giới quan tâm, tuy nhiên công việc này đòi hỏi phải mất nhiều thời

gian. Do vậy, hiện nay đối với cây trồng hằng năm mới chỉ tạo một số giống có khả

năng chống bệnh do nấm Collectotrichum gloeosporioides gây ra, đặc biệt trên cây

trồng lâu năm, số lƣợng những giống kháng với loại nấm này đem lại hiệu quả kinh tế

cao còn chƣa nhiều.

c. Biện pháp cơ học (Nguyễn Văn Hòa, 2013)

Khi cây còn nhỏ: Tỉa cành và tạo tán giúp cho cây có tán phân bố đều theo 4

hƣớng, giúp cây thông thoáng, quang hợp tốt, loại bỏ đƣợc cành sâu bệnh, cành giáp

mặt đất.

Sau thu hoạch: Nên cắt bỏ những cành sâu bệnh, cành tiếp đất. Thu gom tất cả

tàn dƣ sau khi cắt tỉa hoặc sau thu hoạch để giảm mầm bệnh trong vƣờn.

d. Biện pháp sinh học (Nguyễn Văn Hòa, 2013)

Đây là một trong những biện pháp phòng trừ tổng hợp dịch hại trên cây trồng.

Tùy theo từng loại bệnh trên những cây trồng khác nhau mà hiệu quả của biện pháp

này đem lại khác nhau. Còn rất ít những kết quả nghiên cứu khả năng phòng trừ nấm

Collectotrichum gloeosporioides trên đồng ruộng bằng biện pháp phòng trừ sinh học.

Để phòng trừ nấm Collectotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thƣ, trong

vƣờn nên bón nhiều phân hữu cơ và cung cấp nấm đối kháng Trichoderma vừa giúp

phân hủy chất hữu cơ nhanh, vừa diệt mầm bệnh hiện diện trên xác bã thực vật có trên

và trong đất.

Phun thuốc kháng sinh nhƣ Salicylic acid 15 ngày trƣớc khi thu hoạch.

Sử dụng biện pháp bao trái sau khi phun thuốc lần cuối (14 – 15 ngày trƣớc khi

thu hoạch).

e. Biện pháp hóa học (Nguyễn Văn Hòa, 2013)

Đồ án tốt nghiệp

Trên thực tế, đối với các bệnh do nấm gây ra nói chung và bệnh do nấm

Collectotrichum gây hại nói riêng thì biện pháp phòng trừ hóa học vẫn đóng vai trò cần

thiết.

Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1998), trong 6 nhóm thuốc trừ bệnh đƣợc

ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp, nhóm thuốc những hợp chất dị vòng có

tác dụng hữu hiệu trừ bệnh do nấm Collectotrichum gây ra.

Thuốc chứa hợp chất gốc đồng, Benzamidazole, Dithiocarbamates, Triazole và

các thuốc trừ nấm nhƣ: Chlorothalonil, Imazalil, Prochloraz có hiệu quả trừ nấm

Collectotrichum gloeosporioides do những nhóm thuốc này có khả năng xâm nhập vào

mô cây ngăn cản và phá hủy sự xâm nhiễm tiềm ẩn của nấm. Tuy nhiên việc dùng

Benzamidazole liên tục có thể làm tăng khả năng kháng thuốc của nấm.

Nên phun thuốc trừ nấm ngoài đồng sau khi thu hoạch, sau khi cắt tỉa để giảm

áp lực mầm bệnh, phun lần hai khi trái có nụ hoa.

Phun thuốc gốc Propineb khi vừa đậu trái và Difenoconazole 7 ngày tiếp theo.

f. Xử lý sau thu hoạch (Nguyễn Văn Hòa, 2013)

Sau khi thu hoạch tiến hành xử lý nƣớc nóng trái thanh long, ở nhiệt độ 530C

trong 10 phút không làm tổn thƣơng trái và giảm thiểu đáng kể mầm bệnh sau thu

hoạch.

Khi thu hoạch thấy có vết sâu bệnh xuất hiện trên trái phải loại ngay, không nên

để tồn trữ chung với những trái khác để tránh sự lây lan.

Đây là loại nấm đa ký chủ và gây hại quan trọng, khó quản lý, để phòng trị hiệu

quả nên thực hiện phòng trị đồng loạt trên diện rộng thì sẽ mang lại hiệu quả cao.

1.3.2. Bệnh đốm trắng

Bệnh đốm trắng trên thanh long hay còn gọi là bệnh lạ, đốm nâu, tắc kè, bệnh

ma là những tên gọi khác nhau mà bà con nông dân trồng thanh long ở tỉnh Bình

Thuận, Tiền Giang và Long An đặt tên cho một loại dịch hại mới phát sinh, gây thiệt

hại nghiêm trọng và có xu hƣớng ngày càng lan rộng.

Đồ án tốt nghiệp

1.3.2.1. Thời gian xuất hiện (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2013)

Theo ghi nhận của Viện Nghiên cứu Cây ăn quả miền Nam thì trên thực tế bệnh

này đã xuất hiện rải rác đầu tiên vào năm 2008 tại Bình Thuận và Tiền Giang và đến

năm 2011 trở lại đây thì bệnh tấn công mạnh và lây lan nhanh hơn tại những địa

phƣơng này.

Theo TS Nguyễn Nhƣ Cƣờng, GĐ Trung tâm Nghiên cứu BVTV Nam bộ, tác

nhân gây bệnh là một loài nấm. Năm 2009, bệnh lần đầu đƣợc ghi nhận ở Đài Loan và

Bình Thuận của Việt Nam, bệnh này đƣợc đặt với nhiều tên gọi khác nhau nhƣ “đốm

nâu”, “mắt cua”, “đốm trắng”, “tắc kè”.

Mức độ bệnh xuất ở các vƣờn dao động từ 20 – 50%, có những vƣờn mất trắng

năng suất do quả bị nhiễm bệnh nặng không thể thu hoạch đƣợc, thiệt hại rất lớn cho

nhà vƣờn trồng thanh long.

Bên cạnh đó, theo ông Trần Minh Tiến, Chi Cục trƣởng Chi cục BVTV tỉnh

Bình thuận cho biết, bệnh đốm trắng cành và quả thanh long đã xuất hiện từ năm 2009

– 2010 nhƣng chỉ xuất hiện rải rác, cục bộ tại một số vƣờn thanh long ở Hàm Thuận

Bắc.

Sau khi kiểm tra thực tế tại Cẩm Hang (xã Hàm Hiệp) và một số vƣờn ở Hàm

Thuận Nam, Chi cục BVTV Bình Thuận đƣa ra nhận định, hiện tƣợng bệnh đốm trắng

trên thanh long chỉ xảy ra vào đầu mùa mƣa. Đồng thời xuất hiện ở những vƣờn cỏ

nhiều, chăm sóc kém, độ pH trong gốc thấp, bộ rễ kém phát triển. Đầu tiên, những đốm

chấm trắng xuất hiện trên cành non, trái gần chín và trái chín. Trên cành non sau khi

xuất hiện vết chấm thì 7 – 10 ngày lớp biểu bì sẽ chết, nấm và vi khuẩn xâm nhập vào

gây thối, cháy cành. Nhƣng đến nay, chỉ sau một thời gian ngắn bệnh đã phát triển

mạnh ở hầu hết các vùng trồng thanh long trong tỉnh.

1.3.2.2. Tác hại (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2013)

Bệnh thƣờng gây hại trên bẹ non, nụ bông, trái non và giai đoạn chuẩn bị thu

hoạch. Lúc đầu triệu chứng trên bẹ hoặc trái là những đốm tròn nhỏ màu trắng, vết

Đồ án tốt nghiệp

bệnh trũng thấp so với bề mặt bẹ, về sau vết bệnh có màu vàng cam và phát triển nhô

lên những vết ghẻ có màu nâu và đôi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn công nặng.

Bệnh còn tấn công trên trái chín chuẩn bị thu hoạch. Những đốm này xuất hiện

rõ hơn và nhiều hơn, buộc lòng những trái này bị dạt ra hoặc bán với giá rẻ hơn, làm

giảm thu nhập của nhà vƣờn.

Theo thống kê đến cuối năm 2013, diện tích thanh long bị nhiễm bệnh đốm

trắng nhẹ ở tỉnh Bình Thuận là 800 ha, nặng 400 ha, trong tổng số 21 nghìn ha; Tiền

Giang với gần 3 nghìn ha thanh long thì có đến 2420 ha nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ,

diện tích nhiễm nặng 80 ha; Long An, nhiễm đốm trắng nhẹ 766 ha, nặng 41 ha, trong

tổng số gần 2700 ha… và đang có xu hƣớng lây lan nhanh.

Thanh long Việt Nam đã xuất khẩu tới 40 quốc gia và vùng lãnh thổ. Năm 2013,

kim ngạch xuất khẩu (chính ngạch) trái cây tƣơi đạt 307 triệu USD thì thanh long

chiếm tới 61,4%. Ngoài một số thị trƣờng truyền thống nhƣ Trung Quốc, Thái Lan,

Indonesia, Malaysia, Hà Lan… thanh long đang từng bƣớc xâm nhập vào một số thị

trƣờng mới nhƣ Ấn Độ, New Zealand, Úc, Chi Lê tạo đƣợc sự đa dạng hóa trong cơ

cấu thị trƣờng xuất khẩu thanh long của Việt Nam. Tuy nhiên, với tình hình bệnh đốm

trắng trên thanh long đang có xu hƣớng lây lan nhanh, làm giảm năng suất và chất

lƣợng quả thanh long, không đảm bảo kim ngạch xuất khẩu có nguy cơ mất một số thị

trƣờng tiêu thụ lớn.

1.3.2.3. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên thanh long

Trƣớc thực trạng bệnh gây hại nặng trên cây thanh long, Viện Cây ăn quả miền

Nam đã tiến hành nghiên cứu, khảo nghiệm bằng nhiều phƣơng pháp khoa học, chuyển

giao kỹ thuật và triển khai tập huấn “Quy trình quản lý tổng hợp sâu bệnh hại quan

trọng trên thanh long” cho gần 600 nông dân trồng thanh long tập trung ở Bình Thuận

và Tiền Giang.

Mặt khác, Viện còn cử 18 bác sĩ cây trồng từ Viện và sáu chuyên gia đến từ

Malaysia đi thăm khám định kỳ tại một số xã có trồng thanh long ở huyện Chợ Gạo,

Đồ án tốt nghiệp

tỉnh Tiền Giang. Ngoài ra, Viện cũng đã đƣa ra quy trình “Quản lý bệnh đốm trắng trên

thanh long tạm thời” trên thông tin đại chúng để giúp nhà vƣờn trồng thanh long ứng

dụng vào sản xuất, bƣớc đầu đã có hiệu quả.

Bên cạnh đó, một số đề tài nghiên cứu về bệnh trên cây thanh long đã cho một

số hiệu quả nhƣ: kết quả phân lập, kiểm chứng và giám định tác nhân gây hiện tƣợng

vàng bẹ thanh long đƣợc khẳng định là do 2 loại nấm Bipolaris crustacean và

Fusarium equiseti gây hại (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2012). Nấm Bipolaris

crustacean có khả năng mọc trên môi trƣờng PDA. Tản nấm ban dầu có màu trắng sau

chuyển sang màu xám đen hoặc nâu đen. Sợi nấm có màu nâu, mịn dày, sợi nấm có cấu

trúc giống len. Bào tử nấm có 2 đến 3 vách ngăn, cong hoặc uốn gấp, bào tử tách ra

hoặc nằm theo nhóm.

Tuy nhiên, gần đây tác giả này lại cho rằng tác nhân gây bệnh đốm trắng trên

thanh long là do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra trong nghiên cứu xác định tác

nhân, đặc điểm hình thái và sinh học của nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long

(Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014). Nấm Neoscytalidium dimidiatum phát triển khá

nhanh trên môi trƣờng PDA sau 3 ngày nuôi cấy, tản nấm có đƣờng kính 90 mm. Tản

nấm tròn, ban đầu có màu trắng sau chuyển sang màu xám đen rất nhanh. Sợi nấm có

màu nâu đến nâu sậm, mịn, dày. Sợi nấm phân nhánh, có màu nâu, có vách ngăn và tự

tách ra thành bào tử đốt. Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau: elip, trứng, que, tròn.

Bào tử đốt hình thành rất nhanh chỉ sau 2 ngày nuôi cấy, có màu nâu nhạt đến nâu sẫm,

có 1 vách ngăn.

Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Phan Thị Thu Hiền và ctv (2014) cũng đã

cho rằng nấm Neoscytalidium dimiditaum là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh

long. Đồng thời tác giả còn đã đƣa ra môi trƣờng PDA là môi trƣờng thích hợp cho sự

sinh trƣởng và phát triển của Neoscytalidium dimiditaum với khoảng nhiệt độ thích hợp là 30 – 350C. Điều kiện pH và ánh sáng không có ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh

trƣởng và phát triển của Neoscytalidium dimiditaum. Không dừng lại ở đó, một số đề

Đồ án tốt nghiệp

tài còn nghiên cứu biện pháp để trừ bệnh đốm trắng đã cho một số kết quả nhƣ trong

tổng số 22 loại thuốc khảo sát ở điều kiện in vitro chỉ có 8 loại thuốc có khả năng ức

chế hoàn toàn sự phát triển nấm Neoscytalidium dimiditaum là Cyat (Trifloxystrobin),

Tilt supper (Propiconazole + Difenoconazole), Map supper (Difenoconazole +

Propiconazole), Map Unique (Tebuconazole + Tricyclazole), Sagorain

(Difenoconazole + Propiconazole), Viroval (Iprodione), Ridomyl gold (Metalaxyl-M +

mancozeb) và Dithan (Mancozeb). Kết quả khảo sát hiệu quả của 20 loại thuốc đối với

bệnh đốm trắng trên cành cho thấy Dithan M45 có hiệu quả tốt nhất, kế đến là

Riddomyl gold, Saiporra, Vicarben, Map Hero và Viroval. Tƣơng tự, Saipora

(Carbendazim + Hexaconazole) cho hiệu quả tốt nhất, làm giảm chỉ số bệnh trên trái

dƣới 10%, kế đến là Ridomil gold (Metalaxyl-M + Mancozeb), Dithan (Mancozeb) và

Vicarben (Carbendazim) trong đề tài “Đánh giá hiệu quả của một số loại thuốc hóa học

đối với bệnh đốm trắng gây hại trên thanh long” (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014).

1.3.2.4. Một số biện pháp phòng trừ bệnh đốm trắng

Bệnh đốm trắng có thể xuất hiện ở nơi có độ ẩm cao, nhiệt độ thấp… tùy điều

kiện thích hợp mà bệnh phát triển nhanh hay chậm và cũng tùy vào giai đoạn bệnh mà

có cách trừ bệnh thích hợp. Tuy nhiên, khi cây đã bị nhiễm bệnh, thƣờng bệnh lây lan

rất nhanh.

Do đó, khi phát hiện vƣờn thanh long có dấu hiệu nhiễm nấm bệnh bà con nên

áp dụng các biện pháp sau đây để khắc phục và tránh lây lan bệnh:

Bƣớc 1:

- Vệ sinh vƣờn, tạo thông thoáng cho vƣờn: cắt tỉa cành bệnh, trái bệnh, thu gom

tập trung lại một chỗ, đào hố, dùng vôi để xử lý. (Không vứt xuống mƣơng, rạch hoặc

trong vƣờn vì sẽ tạo điều kiện cho bệnh lây lan nhanh khó trị).

- Quản lý chặt nguồn nƣớc: đánh rảnh thoát nƣớc, không cho ứ đọng trên liếp

vƣờn.

Bƣớc 2:

Đồ án tốt nghiệp

- Rãi vôi xung quanh gốc để khử mầm bệnh: 400 – 500 kg/ha (không rãi lên

cây)

- Sau đó, phun các loại thuốc trừ nấm phổ rộng trƣớc khi áp dụng biện pháp sinh

học bên dƣới 5 – 7 ngày.

Lƣu ý: Trong thời gian cây bị bệnh, hạn chế sử dụng phân hóa học có hàm

lƣợng đạm cao và phân gà tƣơi.

Bƣớc 3: Sau khi thực hiện bƣớc 2 đƣợc 7 ngày

- Bón phân hữu cơ vi sinh TRICHOMIX-DT hoặc phân hữu cơ sinh học

TRIMIX-N1 (50 kg/bao, liều bón: 1 – 2 kg/gốc), bón xung quanh gốc và nên ủ cỏ mục,

rơm hoặc lấp đất ở gốc để giữ ẩm, bón 2 – 3 lần liên tục cách nhau 15 – 20 ngày.

- Phun men vi sinh siêu đậm đặc TRICHOMIX-DT (liều phun 01 gói 500g/100

lít nƣớc/100 trụ) trên khắp tán cây, thân cây và gốc cây, phun liên tục 4 – 5 ngày/lần.

Lƣu ý: Nếu vƣờn không bị nhiễm bệnh bà con chỉ áp dụng bƣớc 3.

Ngoài ra còn những biện pháp khác nhƣ ông Trần Minh Tiến, Chi cục BVTV

Bình Thuận đã đƣa ra một số giải pháp để khắc phục đối với một số vƣờn đang bị bệnh

đốm trắng.

- Cần vệ sinh sạch cỏ dại, thu gom trái, cành bị hƣ hỏng ra khỏi vƣờn

- Phun vệ sinh vƣờn khoảng 2 lần, cách nhau 1 tuần/ lần bằng các loại thuốc

BVTV nhƣ Agri-life, Actinovate…

- Bón phân chăm sóc gốc thanh long bằng các loại phân Humix, lân

phosphoprite… để cây có bộ rễ mới, khỏe.

- Giai đoạn từ nụ nhỏ đến nở hoa, quả non, quả chín phải phòng trừ bằng các

biện pháp tổng hợp nhƣ quy trình thanh long VietGAP. Lƣu ý: giảm bớt thuốc kích

thích sinh trƣởng.

- Bên cạnh đó, phun bổ sung thêm các loại phân bón lá. Đồng thời tập trung

thâm canh, bón phân cân đối, khai thác vừa phải và không lạm dụng chất kích thích

Đồ án tốt nghiệp

sinh trƣởng. Đây là những điều kiện cần thiết nhằm giúp cây thanh long đủ sức vƣợt

qua các yếu tố biến đổi của thời tiết.

Theo Trần Thanh Phong (2013) một biện pháp phòng trừ khác là:

- Thoát nƣớc tốt cho vƣờn thanh long.

- Thƣờng xuyên thăm vƣờn, kịp thời phát hiện các cành trái bị bệnh để cắt bỏ.

Gom các cành trái bị bệnh để tiêu hủy.

- Tuyệt đối không đƣợc vứt bỏ cành, trái bị bệnh xuống nƣớc vì sẽ làm bệnh lây

lan nhanh.

- Hạn chế tƣới nƣớc mƣơng lên tán thanh long, nhất là sau khi trời mƣa.

- Không bón phân gà tƣơi hay bột xơ dừa cho vƣờn thanh long.

- Sử dụng phân chuồng hoai và nấm đối kháng Trichoderma hoặc phân hữu cơ

vi sinh.

- Bón phân cân đối giữa đạm, lân, kali. Không bón thừa phân đạm.

Tuy nhiên, các biện pháp trên không thể trừ một cách triệt để đƣợc bệnh đốm

trắng, nhƣng nếu chúng ta chủ động thực hiện theo những phƣơng pháp trên sẽ giúp

giảm thiểu tác hại và sự lây lan của bệnh đốm trắng.

1.4. Giới thiệu về nấm Cochliobolus lunatus

1.4.1. Phân loại (R. R. Nelson và Haasis, 1964)

Nấm Cochliobolus lunatus thuộc:

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Dothideomycetes

Phân lớp: Pleosporomycetidae

Bộ: Pleosporales

Họ: Pleosporaceae

Giống: Cochliobolus

Loài: C. lunatus

Đồ án tốt nghiệp

1.4.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa

Đặc điểm hình thái: Theo nghiên cứu của R. R. Nelson và Haasis (1964), tản

nấm C. lunatus phát triển nhanh chóng trên môi trƣờng thạch đƣờng khoai tây, ban đầu

có màu trắng sau đó chuyển sang màu nâu, nâu đen hoặc đen, tản nấm giống len hoặc

lông mƣợt nhƣ nhung và có cấu trúc sắp xếp lỏng lẻo. Sợi nấm chủ yếu mọc trong điều

kiện ẩm ƣớt. Bào tử nấm C. lunatus có dạng bào tử đính, có thể đơn nhân hoặc đa nhân

nằm riêng lẻ hoặc theo nhóm, thẳng hoặc cuộn xoắn đôi khi quặp. Bào tử có vách ngăn

màu nhạt đến màu nâu sẫm; bào tử có chiều dài lên đến 650 µm, rộng 5 – 9 µm. Nấm

C. lunatus đƣợc phân biệt với các loài khác ở chỗ bào tử có 3 vách ngăn và 4 tế bào,

các tế bào đầu và cuối thƣờng nhạt màu hơn tế bào ở giữa.

Đặc điểm sinh hóa: C. lunatus có phân bố rộng rãi nhƣng phần lớn chúng phổ

biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi có khí hậu ẩm ƣớt thuận lợi cho sự sinh

trƣởng và phát triển của nấm bệnh. Bào tử và túi bào tử có khả năng phát tán trong

không khí. Ngoài ra, chúng cũng có thể tồn tại trong đất. Nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm vào khoảng 24 – 300C, bào tử sẽ bị chết ở nhiệt độ 590C trong vòng 1 phút và 550C trong thời gian 5 phút. Nấm Cochliobolus lunatus có thể tồn

tại trong đất ở dạng hạch nấm trong khoảng 2 năm và trong thời gian 3 năm chúng sẽ

giải phóng bào tử lên những cây dễ bị tổn thƣơng (R. R. Nelson và Haasis, 1964).

1.4.3. Phổ ký chủ

Nấm Cochliobolus lunatus có phạm vi ký chủ rất rộng. Chúng là một tác nhân

gây bệnh trên hạt giống làm hạt giống không nảy mầm, làm tàn lụi cây con của những

cây khác nhƣ cây mía đƣờng, lúa nƣớc, lúa mì, cây kê. Nó cũng gây tổn thƣơng cho

thân, cành lá và hoa trên phạm vi ký chủ rộng lớn (R. R. Nelson và Haasis, 1964).

Theo Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), chi Cochliobolus cũng là tác nhân gây bệnh

đốm lá, bệnh rỉ sét (thối khô), biến dạng hạt, biến dạng màu (bạc màu) hạt và thậm chí

thối rễ.

Đồ án tốt nghiệp

Nấm C. lunatus còn đƣợc biết đến nhƣ tác nhân gây bệnh vàng lá cây và làm hạt

không nảy mầm đối với các cây trồng loại đơn tử diệp nhƣ mía, gạo, kê và ngô. Ngoài

ra, chúng còn gây bệnh đốm lá trên các thực vật hạt kín. Theo Bengyella Louis và ctv

(2014), nấm C. lunatus là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm, chúng phát triển mạnh

trên các cây trồng quan trọng nhƣ lúa nƣớc, lúa mì, sắn, dâu tây và khoai tây. Ngoài ra,

chúng còn là tác nhân gây bệnh trên các loài cỏ dại trên ruộng lúa.

1.4.4. Cơ chế xâm nhập và gây bệnh

Nấm Cochliobolus lunatus phần lớn sản sinh bào tử và phát tán chủ yếu qua

không khí, quá trình lây nhiễm vào lá cây khoai tây của nấm Cochliobolus lunatus khá

phức tạp (Bengyella Louis và ctv, 2014), cách thức xâm nhiễm nhƣ sau:

Cách thức xâm nhập của nấm C. lunatus chủ yếu bằng con đƣờng cơ học. Để

xâm nhập đƣợc vào tế bào chủ, bào tử nấm C. lunatus tiếp xúc, bám lên lá cây. Khi gặp

điều kiện thuận lợi, bào tử nấm nảy mầm thành ống mầm để xâm nhập vào trong lá.

Trong quá trình xâm nhập, nếu pH môi trƣờng không thuận lợi, nấm C. lunatus điều

hòa pH của môi trƣờng tạo điều kiện cho nấm xâm nhập vào tế bào chủ. Sau đó, nấm

bệnh tiết độc tố melanin (có màu đen) nhằm ức chế và tiêu diệt những tế bào tại vị trí

xâm nhập vào cây chủ làm cho vết bệnh sau đó có màu đen và lan rộng. Ngoài ra,

melanin còn có khả năng giúp nấm chống lại các tác nhân oxy hóa và quá trình ly giải

trong cơ chế bảo vệ của tế bào chủ (Miguel J. Benltrán-García và ctv, 2014).

Thời gian ủ bệnh 4 – 5 ngày sau khi nhiễm bệnh và triệu chứng bắt đầu biểu

hiện với sự hình thành bào tử của mầm bệnh trên các vết bệnh xảy ra vào ngày thứ 6.

Điều kiện ẩm ƣớt trên bề mặt cây chủ trong khoảng 13 giờ là cần thiết cho việc nhiễm

bệnh thành công (R. R. Nelson và Haasis, 1964).

1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus

lunatus

1.4.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Đồ án tốt nghiệp

Nhiệt độ có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển và hình thành bào tử của

nấm bệnh. Theo Jyothi G và ctv (2013), nấm Cochliobolus lunatus sản sinh bào tử nhiều nhất ở nhiệt độ 250C. Tuy nhiên, sự sinh trƣởng và phát triển kích thƣớc tản nấm nhanh nhất ở nhiệt độ 300C, nấm bệnh phát triển chậm lại ở nhiệt độ 150C và 400C.

Bên cạnh đó theo Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013), nấm C. lunatus có khả năng tăng trƣởng ở nhiệt độ 30 – 400C. Ở nhiệt độ 45 – 500C, quá trình sinh trƣởng và phát triển

của nấm bị ngừng lại. Một nghiên cứu khác của Gao Ying và ctv (2009) cũng cho rằng nhiệt độ tốt nhất cho các chủng Cochliobolus spp. sinh trƣởng là 25 – 300C.

1.4.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Đối với những nguồn cacbon khác nhau, sự sinh trƣởng và phát triển của nấm C.

lunatus cũng khác nhau. Theo Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013), nấm C. lunatus phát

triển tốt nhất trong môi trƣờng có bổ sung đƣờng glucose, sau đó là đƣờng maltose và

cuối cùng là đƣờng sucrose. Nhƣng đối với môi trƣờng có bổ sung đƣờng lactose và

cellulose, nấm không phát triển. Một nghiên cứu khác của Gao Ying và ctv (2009)

cũng cho rằng nguồn cacbon tốt nhất cho sự phát triển của các chủng nấm

Cochliobolus spp. là glucose và galactose.

1.4.5.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại

Các ion kim loại có ảnh hƣởng đến sự phát triển và các hoạt động phân giải

protein của nấm C. lunatus. Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013) cho rằng nấm này có thể

sinh trƣởng và phát triển trên môi trƣờng có bổ sung các muối nhƣ NH4Cl, KH2PO4,

K2HPO4, NaCl. Tuy nhiên, đối với muối chứa ion kim loại nhƣ là MgSO4 và CaCl2,

nấm không phát triển đƣợc.

1.4.5.4. Ảnh hưởng của pH

Yếu tố pH có ảnh hƣởng khá lớn đến sự phát triển của nấm Cochliobolus

lunatus. Theo Gao Ying và ctv (2009), pH tốt nhất cho sự sinh trƣởng của nấm

Cochliobolus spp. là khoảng pH 6 – 8, càng xa khoảng pH này sự sinh trƣởng và phát

triển của nấm bệnh càng giảm.

Đồ án tốt nghiệp

1.4.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ là một trong các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ tăng trƣởng của nấm

bệnh. Nguồn nitơ thích hợp cho sự phát triển của chủng nấm Cochliobolus spp. là kali

nitrate và glycin (Gao Ying và ctv, 2009).

1.5. Sử dụng nấm Trichoderma spp. trong phòng trừ bệnh đốm trắng

1.5.1. Giới thiệu về nấm đối kháng Trichoderma spp.

1.5.1.1. Đặc điểm phân loại (Lê Thị Huệ, 2010)

Trichoderma spp. thuộc:

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Sordariomycetes

Bộ: Hypocreales

Họ: Hypocreaceae

Giống: Trichoderma

1.5.1.2. Nguồn gốc

Trichoderma spp. đƣợc tìm thấy ở mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc.

Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng

nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ

cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác (Gary J. Samuels, 2004).

Trichoderma spp. rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội ký sinh

với thực vật. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác

nhau (Gary E. Harman, 2000). Nhìn chung các loài Trichoderma spp. xuất hiện ở các

vùng đất acid nhiều hơn ở vùng đất trung tính và kiềm (Papavizas, 1985).

1.5.1.3. Đặc điểm hình thái nấm (Gary J. Samuels, 2004)

Khuẩn ty (sợi nấm) của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển nhanh trên

môi trƣờng PDA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang màu xanh đậm,

Đồ án tốt nghiệp

xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch

của môi trƣờng PDA hóa vàng.

Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chƣa đƣợc xác định. Cuống bào tử của

một số nấm bệnh xen vào nhau. Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những

cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T.

koningii), có kích thƣớc từ 1 – 7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng nhƣ bông

không rắn chắc, những nốt sần dạng này đƣợc tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và

chúng hoạt động nhƣ chồi mầm.

Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống

sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn,

không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy.

Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trƣng, một số

ít có màu trắng (nhƣ T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc

hình ovan (với tỉ lệ dài: rộng từ 1 – 1,1 µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài: rộng là

hơn 1,4 µm), đa số các bào tử trơn láng, kích thƣớc không quá 5 µm.

Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà T.

harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng.

Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của

Trichoderma trong môi trƣờng không đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng nên

chlamydospores có thể đƣợc dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học.

1.5.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5

và phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ƣu thƣờng là 25 – 300C. Một vài dòng phát triển tốt ở 350C. Một số ít phát triển đƣợc ở 400C (Gary J.

Samuels, 2004). Theo Prausun K. M. và Kanthadai R. (1997), hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 350C chúng tạo

Đồ án tốt nghiệp

ra những khuẩn lạc rắn dị thƣờng với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thƣờng, ở 370C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy.

Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme nhƣ chitinolytic

(enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là hai enzyme

chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với

Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Tuy nhiên

cơ chế của tác động này chƣa đƣợc biết (Gary J. Samuels, 2004).

Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tƣợng đột

biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác

động của điều kiện môi trƣờng sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng

trong kiểu gen cũng nhƣ kiểu hình của cùng một loại Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra

những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là

những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng nhƣ trong việc tạo chế phẩm sinh học

kiểm soát mầm bệnh thực vật (Gary E. Harman, 2000).

1.5.2. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma (Huỳnh Văn Phục, 2006)

Theo Nguyễn Thị Hai (2013), rất nhiều nghiên cứu về vi sinh vật đã cho thấy

nấm Trichoderma là một trong những nhóm đứng đầu của vi sinh vật trong đất có tính

đối kháng và đƣợc nghiên cứu rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới. Việc nghiên cứu tính

đối kháng, đặc biệt là tính chọn lọc của những chất đặc trƣng do nấm Trichoderma tiết

ra đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm và tiến hành nghiên cứu nhằm giải thích cơ chế

tác động của nhóm nấm này đối với các vật gây bệnh cho cây trồng và sử dụng chúng

trong phòng chống bệnh hại cây trồng.

Đối với Okigbo và Ikediugw (2000), hai nhà khoa học này cho biết những loài

Trichoderma spp. có hệ sợi nấm nhỏ, mảnh là một nhân tố có triển vọng trong phòng

trừ sinh học chống bệnh thối hạt, thối rễ và quản lý bệnh hại sau thu hoạch.

Đồ án tốt nghiệp

Nấm Trichoderma spp. tấn công trực tiếp bằng cách cuộn quanh và tiết ra

enzyme phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng

thời giúp cây trồng kháng lại bệnh (Klein và Eveleigh, 1998).

Một số loại enzyme do Trichoderma tiết ra bao gồm glucan 1,3 – beta –

glucosidase, endochitinase, chitobiosidase, N – acetyl – beta – D – glucosaminidase

(NAGase), trypsin, chymotrypsin, cellulose, protease, lipase, khi kết hợp hai enzyme

glucan 1,3 – beta – glucosidase và endochitinase sẽ ngăn đƣợc quá trình tăng trƣởng

của nhiều loại Ascomycetes trong nuôi cấy, thêm vào đó sẽ có hiệu quả cao trong việc

ngăn cản sự nảy mầm của bào tử hơn là từng loại enzyme đơn lẻ (Margolles và Clark,

1995).

Hầu hết các tác nhân kiểm soát sinh học đƣợc biết là sản xuất enzyme chitinase

và β – 1,3 – glucanase có thể làm rã thành tế bào dẫn đến ly giải sợi nấm của mầm

bệnh (Esposito .E, Silva .D.M, 1998). Phát hiện thấy hoạt động của các enzym -

chitinase và β - 1,3 glucanase trong Trichoderma spp. mạnh hơn khi ủ với tế bào mầm

bệnh. Sản xuất β - 1,3 glucanase cũng đã đƣợc báo cáo là một enzyme quan trọng trong

kiểm soát sinh học của tác nhân gây bệnh vì β - 1,3 glucan là một thành phần cấu trúc

của màng tế bào nấm (Denis, C và Webster, 1971).

Đối với cơ chế đối kháng nấm bệnh của nấm Trichoderma, các nhà khoa học

đƣa ra những cơ chế khác nhau nhƣng nhìn chung thì nấm Trichoderma kiểm soát sinh

học thông qua 3 cơ chế chính:

a. Tiết kháng sinh

T. virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự phát triển của các

loài Rhizoctinia solani và Pythium spp. Isonitriles đƣợc sản xuất bởi T. hamatum,

harzianum, viride, koningii, polysporum giúp hạn chế sự phát triển của nấm bệnh. Ở

một vài loài T. atroviride và T. viride tiết 6 – pentyl alpha – pyrone (α – pyrone) có

hƣơng dừa, hoạt động của loại phytotoxin này có thể ngăn cản sự nảy mầm của những

noãn bào tử nấm bệnh Phytophthrora cinnamomea và bào tử của Botrytis cinnerea.

Đồ án tốt nghiệp

Peptaibols do T. polysporum, T. harzianum, T. koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng

hợp enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích

cây trồng kháng lại mầm bệnh. T. virens, T. koningii, T. viride sản xuất sesquiterpenes

và polyketides đƣợc T. harzianum sản xuất. Steroids (viridian) là một độc tố thực vật

có hiệu lực nhƣ một loại thuốc diệt cỏ giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử, đƣợc sản

xuất bởi T. virens.

b. Ký sinh

Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ có tính hƣớng hóa chất, nó ký

sinh phân nhánh hƣớng về những nấm đã đƣợc định trƣớc (do những nấm này tiết ra

các hóa chất). Ngoài ra, vật ký sinh và vật đối kháng đƣợc Trichoderma nhận dạng qua

trung gian là lectin trên bề mặt tế bào của mầm bệnh và vật đối kháng). Đồng thời,

Trichoderma ký sinh và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thông qua hình thành các dạng

móc hay dạng giác bám, tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease những enzyme

này có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi

nấm vật chủ, đây là khả năng tấn công trực tiếp của Trichoderma. Không những thế,

Trichoderma còn có khả năng tiết những enzyme phân giải nhƣ chitinase, glucanase,

protease giúp bào mòn thành tế bào sau khi ký sinh và cuộn quanh nấm gây bệnh đối

kháng với nó. Khi ký sinh vào cây T. asperellum tiết cellulose, cho phép nó tấn công

vào những nấm nhƣ Phytophthora spp. và Pythium spp. khi chúng bám vào cây trồng.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Hình ký sinh của nấm Trichoderma (a. Trichoderma ký sinh trên nấm

Pythium gây bệnh ở các cây họ đậu. (Trichoderma nhuộm màu; Pythium nhuộm màu

xanh), b. Nấm Trichoderma sp. quấn lấy sợi nấm gây bệnh (Tô Duy Khƣơng, 2007)).

c. Cạnh tranh (Nguyễn Ngọc Phúc, 2005)

Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đƣa ra khái niệm cạnh tranh khai

thác và cạnh tranh cản trở vào tƣơng tác giữa quần thể nấm. Sự cạnh tranh cản trở liên

quan đến cơ chế hóa học và tập tính bởi vi sinh vật này giới hạn vi sinh vật khác tiếp

xúc cơ chất và xảy ra do sự tƣơng tác giữa hệ sợi nấm trong cùng loài hoặc khác loài.

Sự cạnh tranh khai thác xảy ra giữa 2 loài cùng khai thác một nguồn lợi nhƣng

khác nhau về tốc độ và hiệu quả khai thác. Trong trƣờng hợp nguồn lợi là nguồn dinh

dƣỡng đƣợc xem nhƣ cạnh tranh dinh dƣỡng.

- Sự cạnh tranh cho mô hoại sinh

Botrytis và Sclerotinia spp. là mầm bệnh cơ hội tấn công vào mô thực vật lão

hóa hoặc chết coi đó nhƣ nguồn dinh dƣỡng, từ đây tiếp tục tấn công vào những mô

khỏe mạnh. Khi đã xử lý Trichoderma, chúng làm suy yếu, làm chậm sự hình thành

khuẩn lạc của Botrytis vào mô thực vật. Sau đó làm giảm mức độ bệnh trên cây.

Trichoderma đã đƣợc ứng dụng thành công trong kiểm soát Botrytis và Sclerotinia trên

những loại rau cải, trái cây khác nhau: dâu, dƣa chuột…

- Sự cạnh tranh cho chất dịch rỉ từ hạt

Bệnh chết nhát (Damping - off) gây bởi Pythium ultimum ở một số loại ngũ cốc

và rau quả đƣợc xuất phát bởi sự đáp ứng nhanh chóng của mầm bệnh đối với dịch rỉ từ

Đồ án tốt nghiệp

hạt. Túi bào tử của Pythium nảy mầm và xâm nhiễm vào hạt giống trong vòng vài giờ

khi Pythium đã tràn lan trong đất. Xử lý hạt giống với Trichoderma làm giảm sút sự

nảy mầm của túi bào tử Pythium, hiện tƣợng này đƣợc cho là sự cạnh tranh chất kích

thích nảy mầm.

Sự cạnh tranh dinh dƣỡng cũng đƣợc xem nhƣ cơ chế hữu hiệu nhất sử dụng bởi

T. harzianum T-35 trong sự kiểm soát Fusarium oxysporum trong vùng rễ cây bông vải

và dƣa hấu.

- Sự cạnh tranh trên vị trí vết thƣơng

Một trong những thí nghiệm thành công đầu tiên của sự kiểm soát sinh học trên

vết thƣơng gây do cắt xén là sử dụng T. viride, áp dụng trong phun xịt hoặc dùng kéo

lớn cắt, để kiểm soát mầm bệnh gây bạc lá (Chondrostoreum purpureum). Thể

Trichoderma đƣa vào đƣợc chứng minh có khả năng mọc sợi nấm trên cây vừa bị cắt

và ngăn ngừa sự xâm nhiễm của mầm bệnh ở rễ (Amillaria luteobubalina).

Sự thối thân thƣờng theo cùng sự xâm nhiễm Botrytis vào vết thƣơng bị cắt trên

cây cà chua trong nhà kính; căn bệnh này rất khó kiểm soát bởi những biện pháp canh

tác. Thể Trichoderma đƣợc chứng minh có khả năng kiểm soát sự thối thân khi tiêm

chủng trƣớc hay cùng lúc với Botrytis, nhƣng không có hiệu quả kiểm soát nếu đƣợc

tiêm sau, nhƣ vậy có thể cho rằng sự cạnh tranh mọc sợi nấm trên vết thƣơng là yếu tố

xác định sự giảm bệnh.

Trong một nghiên cứu sự xâm nhiễm của Pythium vào rễ dƣa chuột đã chỉ ra

rằng mặc dù không có sự hình thành sợi nấm của chủng T. harzianum T3 trên toàn bộ

rễ nhƣng vẫn có sự hình thành sợi nấm tại vết thƣơng. Sự cạnh tranh dinh dƣỡng từ

dịch rỉ vết thƣơng của thể cạnh tranh là nguyên nhân giảm sự xâm nhiễm của Pythium.

Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt

chúng bằng cách hút hết những dƣỡng chất một cách thụ động và dai dẳng bằng những

bào tử chống chịu (chlamydospores).

Đồ án tốt nghiệp

Trong hoạt động sống ký sinh của nấm Trichoderma spp. thì enzyme thủy phân

chitinase và β – glucanase đóng vai trò rất quan trọng (Crus và ctv, 1995). Nấm

Trichoderma harzianum có khả năng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào nhƣ

chitinase, β – 1,3 – glucanase đây là hai enzyme quan trọng trong quá trình ký sinh lên

nấm gây hại (Muhammad và Amusa, 2003).

Khả năng tiết enzyme của Trichoderma spp. chịu ảnh hƣởng của độ yếm khí,

lƣợng oxy hòa tan, tốc độ lắc (Marco và ctv, 2002).

Một vấn đề quan trọng trong sự hình thành cơ chế đối kháng đƣợc trình bày ở

nhiều báo cáo là tùy thuộc vào dòng vi sinh vật đối kháng, nguồn gốc của chúng và

điều kiện môi trƣờng, vì thế khi chọn một tác nhân sinh học nên quan tâm đến hƣớng

áp dụng, nguồn gốc của mầm bệnh (Kubicek và Harman, 1998).

Đồ án tốt nghiệp

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian 2.1.1. Địa điểm

Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh, Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi

trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.

2.1.2. Thời gian

Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 07/04/2014 đến ngày 31/07/2014.

2.2. Vật liệu

2.2.1. Nguyên liệu

2.2.1.1. Trái và cành thanh long

Trái và cành thanh long bị bệnh đƣợc thu từ huyện Châu Thành, tỉnh Long An.

Cành thanh long sạch bệnh đƣợc thu từ huyện Châu Thành, tỉnh Long An.

Hình 2.1. Cành thanh long bị bệnh đốm trắng (Nguyễn Thành Hiếu và ctv)

Đồ án tốt nghiệp

2.2.1.2. Chủng nấm mốc

Chủng nấm mốc Trichoderma đƣợc cung cấp, do bạn Nguyễn Thái Minh Hiếu

phân lập từ nấm linh chi, sinh viên Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi

Trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.

2.2.2. Hóa chất

- D – Glucose (Trung Quốc)

- Agar (Việt Nam)

- Tween 80 (Trung Quốc)

- Kháng khuẩn Chloramphenycol

- Urê (Trung Quốc)

- KNO3 (Trung Quốc)

- (NH4)2SO4 (Trung Quốc)

- NaCl (Trung Quốc)

2.2.3. Dụng cụ và thiết bị

2.2.3.1. Dụng cụ

- Erlen 250ml

- Bình môi trƣờng 250ml, 500ml

- Ống đong 100ml, 250ml

- Cốc 100ml, 250ml,1000ml, 2000ml

- Pipet 1ml, 10ml

- Ống nghiệm

- Que cấy

- Bình tia

- Đũa thủy tinh

2.2.3.2. Thiết bị

- Cân phân tích (Satorius, Đức)

- Cân kỹ thuật (Shimadzu, Nhật)

Đồ án tốt nghiệp

- Bếp từ

- Nồi hấp Autoclave

- Tủ hút

Các dụng cụ, thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm...

2.2.3.3. Môi trường nuôi cấy

a. Môi trƣờng WA (Water Agar)

Thành phần môi trƣờng:

- Nƣớc cất: 1000 ml

- Agar: 20 g/l

- Thuốc kháng khuẩn Chloramphenycol: 0,25 g/l

Cách nấu: Cho agar và thuốc kháng khuẩn vào nƣớc cất đun sôi, đem hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau khi hấp khử trùng xong, để môi trƣờng hạ xuống nhiệt độ 600C, đem đổ môi trƣờng. Môi trƣờng WA là môi trƣờng phổ biến để phân lập

nấm bệnh.

b. Môi trƣờng PDA (Potato D – Glucose Agar)

Thành phần môi trƣờng:

- Khoai tây: 200 g

- Đƣờng D – Glucose: 20 g

- Agar: 20 g

- Nƣớc cất: 1000 ml

Cách nấu: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt hạt lựu, cân đủ 200 g cho nƣớc cất vào

đun sôi khoảng 20 phút kể từ khi bắt đầu sôi. Lọc bỏ phần bã, đun sôi trở lại, tiếp theo

cho lần lƣợt đƣờng và agar vào (Lƣu ý vừa cho vừa khuấy đều để tránh bị vón cục). Cho vào bình môi trƣờng, đem hấp khử trùng ở nhiệt 1210C trong 20 phút.

Đồ án tốt nghiệp

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.

2.3.1. Phương pháp vi sinh

2.3.1.1. Phương pháp thu thập, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh

a. Phƣơng pháp nhận dạng và thu thập mẫu (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L.

và Phan H.T. 2009)

Bệnh đốm trắng trên thanh long xuất hiện trên bẹ hoặc trái ban đầu là những

chấm nhỏ li ti nhƣ kim, phát triển thành những đốm nhỏ màu trắng, vết bệnh trũn thấp

so với bẹ, về sau vết bệnh có màu vàng cam và phát triển nhô lên vết ghẻ màu nâu và

đôi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn công nặng.

Chọn mẫu ở giai đoạn khi là những chấm nhỏ li ti, đốm nhỏ màu trắng để phân

lập tác nhân gây bệnh.

b. Phƣơng pháp phân lập nấm bệnh (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan

H.T. 2009)

Mục đích: nhằm phân lập đƣợc nấm trên mô bệnh

Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị:

- Cành thanh long bị bệnh lạ cần phân lập.

- Đĩa petri vô trùng có chứa môi trƣờng nuôi cấy WA (2%).

Các bƣớc phân lập nấm bệnh từ mô cây bệnh nhƣ sau:

- Rửa mẫu bệnh dƣới nƣớc máy để loại bỏ đất và bụi bẩn.

- Dùng cồn ethanol 70% lau sạch bụi bẩn xung quanh vết bệnh.

- Cắt mẫu bệnh thành từng miếng cấy nhỏ khoảng 2 x 2 mm, cho vào cồn

ethanol 96% trong 5 giây, rửa lại bằng nƣớc cất, vớt ra để lên giấy thấm nƣớc sau đó

đặt lên môi trƣờng agar - nƣớc cất. Đặt đĩa petri ở nhiệt độ phòng thí nghiệm cho nấm

phát triển.

c. Phƣơng pháp cấy truyền (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T.

2009)

Đồ án tốt nghiệp

Mục đích của giai đoạn này là giúp xác định vi sinh vật nào đã đƣợc phân lập.

Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị:

- Đĩa nấm bệnh đã nuôi cấy trên môi trƣờng WA (2%).

- Đĩa petri vô trùng có chứa môi trƣờng PDA.

Quy trình cấy truyền

- Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày dƣới kính lúp soi nổi và đánh giá sự phát triển

của sợi nấm từ các miếng cấy.

- Xác định xem có nhiều hơn một loại nấm mọc lên hay không.

- Cấy truyền khi sợi nấm mọc đƣợc khoảng 5 mm từ miếng cấy.

- Cắt một miếng thạch nhỏ (2 × 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm và cấy sang môi

trƣờng PDA Sau khi cấy truyền các mẫu nấm có trong mẫu cấy ban đầu, ta tiến hành

làm thuần các mẫu nấm từ các mẫu nấm cấy truyền.

d. Phƣơng pháp làm thuần (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan

H.T. 2009)

Mục đích của phƣơng pháp này là đảm bảo nấm đƣợc cấy hoàn toàn thuần

Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị:

- Đĩa nấm bệnh đã đƣợc cấy truyền trên môi trƣờng PDA.

- Đĩa petri vô trùng có chứa sẵn môi trƣờng PDA.

Cách thực hiện

Dùng que cấy dẹp đã khử trùng, lấy một miếng thạch nhỏ chứa phần đỉnh của

một sợi nấm duy nhất trên đĩa nấm đã cấy truyền cấy sang đĩa môi trƣờng PDA. Kí

hiệu tên mẫu cấy, ngày cấy.

e. Phƣơng pháp làm phòng ẩm (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T.

2009; Phạm Minh Nhựt, 2010)

Đồ án tốt nghiệp

Mục đích của việc quan sát dƣới kính hiển vi là để nhận ra tác nhân gây bệnh và

chuẩn đoán bệnh.

Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị:

- Đĩa petri có chứa nấm bệnh đã đƣợc làm thuần.

- Đĩa petri vô trùng có chứa môi trƣờng PDA.

- Đĩa petri có chứa một lớp mỏng bông gòn thấm nƣớc phía dƣới, đặt giấy lọc

lên trên, đem hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút.

- Lame, lamelle vô trùng.

- Nƣớc cất vô trùng.

Cách thực hiện

- Dùng kẹp gắp miếng lame đặt vào giữa đĩa petri vô trùng có chứa bông gòn và

giấy lọc.

- Đĩa petri chứa môi trƣớng PDA, dùng dao mổ cắt thành những miếng hình

vuông với kích thƣớc 1 × 1 cm.

- Dùng kẹp gắp miếng môi trƣờng PDA (1 × 1 cm) đặt vào giữa miếng lame.

- Dùng que cấy thƣớc thợ, lấy một ít sinh khối bào tử nấm bệnh cấy vào bốn bên

của miếng thạch, đặt lamelle lên miếng thạch vừa cấy xong.

- Đổ nƣớc cất vô trùng vào miếng giấy lọc trong đĩa vừa cấy. Lƣu ý là không đổ

nƣớc lên lame sẽ ảnh hƣởng đến việc hình thành bào tử.

- Cuối cùng đậy nắp đĩa lại, ghi chú tên mẫu cấy, ngày, giờ cấy.

Tùy thuộc vào thời gian sinh bào tử của từng loài nấm mà sau 3 ngày, 5 ngày

hoặc 7 ngày, ta bắt đầu soi bào tử dƣới kính hiển vi.

Chuẩn bị:

- Đĩa phòng ẩm

- Kính hiển vi quang học

- Lame, bông gòn thấm nƣớc vô trùng

Đồ án tốt nghiệp

- Cồn 960, methylen blue, dầu soi kính

Cách thực hiện - Dùng bông gòn lau lame bằng cồn 960.

- Nhỏ 1 giọt methylen blue lên lame, sau đó dùng kẹp gắp lamelle trong đĩa

phòng ẩm đặt lên giọt methylen blue, soi ở vật kính 10X để xem hình thái sợi nấm.

- Sau đó, cho 1 giọt dầu soi kính lên miếng lamelle, soi ở vật kính 100X.

f. Phƣơng pháp lây bệnh nhân tạo (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014; Burgess L.W.,

Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009)

Mục đích: thông thƣờng mục đích của phƣơng pháp lây bệnh nhân tạo, nhằm

khẳng định một vi sinh vật đƣợc phân lập là tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch.

Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:

- Công thức 1: Phun nƣớc cất vô trùng (đối chứng)

- Công thức 2: Phun nấm Fusarium

- Công thức 3: Phun nấm Colletotrichum

- Công thức 4: Phun chủng nấm N1

Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên cành thanh long khỏe chƣa có dấu vết bị

thƣơng. Mỗi công thức nhiễm 4 cành, mỗi cành gây 10 vết thƣơng bằng cách dùng kim

châm nhẹ lên cành tạo vết thƣơng.

Các bƣớc thực hiện

- Dùng bông thấm nƣớc lau sạch vết bụi bẩn trên các cành cây thanh long. Phun

nƣớc cất vô trùng cho ƣớt các cành cây thanh long.

- Đối với mẫu thí nghiệm: Một mẫu dùng kim tiêm gây vết thƣơng trên các cành

thanh long. Sau đó, dùng bình xịt chứa bào tử nấm bệnh phun lên các cành đã gây vết

thƣơng.

- Đối với mẫu đối chứng: Dùng kim tiêm gây vết thƣơng nhƣng không phun

dịch bào tử mà phun nƣớc cất vô trùng.

Đồ án tốt nghiệp

- Đặt mẫu nơi thoáng mát có độ ẩm cao, tránh ánh nắng trực tiếp, ghi chú tên

mẫu nấm bệnh đƣợc lây bệnh và ngày lây bệnh. Mỗi ngày, tƣới nƣớc 2 lần vào sáng

sớm và lúc chiều tối trừ 2 ngày đầu khi mới lây bệnh.

- Kiểm tra và so sánh những cành đƣợc lây bệnh với mẫu đối chứng. Quan sát,

ghi nhận các triệu chứng và so sánh với các triệu chứng của mẫu thu đƣợc từ đồng

ruộng.

Lƣu ý: Để làm thí nghiệm này, ta nên chọn những cành thanh long khỏe, không

bị nhiễm bệnh.Trong dịch bào tử nấm nên cho vài giọt tween 80 giúp tăng khả năng

bám dính của bào tử nấm vào vết thƣơng.Thời gian phun tốt nhất là vào buổi chiều tối

khoảng 17g. Lúc này không còn ánh sáng mặt trời nên hiệu quả sẽ đạt cao nhất.

Chỉ tiêu theo dõi:

Thời gian xuất hiện bệnh, tỷ lệ bệnh và quan sát triệu chứng xuất hiện vết bệnh

của từng nghiệm thức ghi nhận bằng hình ảnh sau khi lây bệnh.

Hình 2.2. Dịch bào tử sau khi lắc (a. Colletotrichum, b. Chủng nấm N1, c. Fusarium)

Hình 2.3. Cành thanh long trƣớc khi lây bệnh nhân tạo

Đồ án tốt nghiệp

2.3.1.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng và

phát triển của nấm bệnh

a. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến khả năng sinh trƣởng

và phát triển của nấm bệnh (Phan Thị Thu Hiền và ctv, 2014)

Nguyên tắc: Ánh sáng mặt trời là nguồn năng lƣợng chủ yếu của quá trình

quang hợp vì vậy rất cần cho các vi sinh vật. Tuy nhiên, mỗi loài vi sinh vật khác nhau

có sự sinh trƣởng và phát triển khác nhau với các mức độ chiếu sáng khác nhau. Do đó,

việc khảo sát các điều kiện chiếu sáng khác nhau (24 giờ chiếu sáng, 12 giờ sáng: 12

giờ tối) là cần thiết để xác định điều kiện chiếu sáng phù hợp cho việc nuôi cấy vi sinh

vật và qua đó tìm điều kiện thích hợp phòng trừ một số vi sinh vật gây hại cho vật chủ.

Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:

- Công thức 1: 24 giờ chiếu sáng

- Công thức 2: 12 giờ sáng: 12 giờ tối

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố, 3 lần lặp lại,

mỗi lần lặp lại là một đĩa petri.

Tiến hành thí nghiệm

- Dùng cây đục lỗ đƣờng kính 5 mm, đục lỗ thạch trên đĩa petri có chứa sinh

khối nấm bệnh.

- Dùng dao cấy chuyển cục thạch vừa đục xong sang đĩa môi trƣờng PDA vô

trùng đã chuẩn bị sẵn.

- Ghi chú tên nấm, ngày, giờ cấy và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Trong đó, 1 mẫu

thí nghiệm để nơi có đèn chiếu sáng liên tục, 1 mẫu thí nghiệm để nơi có ánh sáng

chiếu 12 giờ và 12 giờ không chiếu sáng.

Chỉ tiêu theo dõi:

- Đo đƣờng kính tản nấm (mm) ở 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy (NSC).

d1+ d2 2

- Đƣờng kính trung bình tính theo công thức: 𝑑 =

(Trong đó, d1 và d2 là hai đƣờng chéo tản nấm phân bố).

Đồ án tốt nghiệp

b. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của

nấm bệnh (Phan Thị Thu Hiền và ctv, 2014; Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014)

Nguyên tắc: Độ pH có ảnh hƣởng rõ rệt đối với sự sinh trƣởng của vi sinh vật.

Mỗi loài vi sinh vật đều có một phạm vi pH sinh trƣởng nhất định và pH sinh trƣởng tốt nhất. pH của môi trƣờng đƣợc quyết định bởi nồng độ ion H+. Nồng độ ion H+ thay

đổi sẽ làm thay đổi trạng thái điện tích ở thành tế bào, điều này ảnh hƣởng đến khả

năng hấp thụ khoáng, các acid hữu cơ, làm giảm khả năng sử dụng dinh dƣỡng của vi

sinh vật. Bên cạnh đó, pH còn ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme, sự hình thành ATP

cũng nhƣ ảnh hƣởng đến sự hình thành bào tử đối với tế bào nấm. Do đó, việc khảo sát

ảnh hƣởng của pH là cần thiết để xác định khoảng pH phù hợp nhất cho sự phát triển

của vi sinh vật nhằm tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy.

Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:

- Công thức 1: pH 5

- Công thức 2: pH 6

- Công thức 3: pH 7

- Công thức 4: pH 8

Thí nghiệm đƣợc thực hiện theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố với 3 lần

lặp lại, mỗi lần lặp lại là một đĩa petri.

Tiến hành

- Dùng cây đục lỗ đƣờng kính 5 mm khoang lỗ thạch trên sinh khối nấm bệnh.

- Dùng dao mỗ cấy truyền lỗ thạch sang đĩa petri chứa môi trƣờng PDA. Ghi

chú tên nấm, ngày giờ cấy và đem ủ ở nhiệt độ phòng.

Chỉ tiêu theo dõi:

- Đo đƣờng kính tản nấm (mm) ở 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy (NSC).

d1+ d2 2

- Đƣờng kính trung bình tính theo công thức: 𝑑 =

(Trong đó, d1 và d2 là hai đƣờng chéo tản nấm phân bố).

Đồ án tốt nghiệp

c. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trƣởng và phát

triển của nấm bệnh (N. Khattabi và ctv, 2004; R. K. Jayaswal và ctv, 2003).

Nguyên tắc: Nguồn nitơ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trƣởng và

phát triển của vi sinh vật. Chúng là thành phần cấu tạo của các amino acid, ATP,… nên

có ảnh hƣởng lớn đến tốc độ tăng trƣởng của vi sinh vật cũng nhƣ khả năng hình thành

bào tử của nấm sợi. Do đó, việc khảo sát ảnh hƣởng của nguồn nitơ là cần thiết để xác

định các yếu tố thích hợp cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật.

Thí nghiệm đƣợc bố trí với các công thức nhƣ sau:

- Công thức 1: Urê ((NH2)2CO) – lƣợng nitơ 0,28 g/l

- Công thức 2: Kali nitrate (KNO3) – lƣợng nitơ 0,28 g/l

- Công thức 3: Ammonium sulphate ((NH4)2SO4) – lƣợng nitơ 0,28 g/l

- Công thức 4: Urê ((NH2)2CO) – lƣợng nitơ 0,14 g/l

- Công thức 5: Kali nitrate (KNO3) – lƣợng nitơ 0,14 g/l

- Công thức 6: Ammonium sulphate ((NH4)2SO4) – lƣợng nitơ 0,14 g/l

- Công thức 7: Không bổ sung nitơ

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại, mỗi lần

lặp lại là 1 đĩa. Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng WA

Cách thực hiện

- Dùng cây đục lỗ đƣờng kính 5 mm khoang lỗ thạch trên sinh khối nấm bệnh.

- Dùng dao mỗ cấy truyền lỗ thạch sang đĩa petri chứa môi trƣờng PDA. Ghi

chú tên nấm, ngày giờ cấy và đem ủ ở nhiệt độ phòng.

Chỉ tiêu theo dõi:

Đo đƣờng kính tản nấm sau 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy.

d1+ d2 2

Đƣờng kính đƣợc tính theo công thức: 𝑑 =

(Trong đó, d1 và d2 là hai đƣờng chéo tản nấm phân bố).

Đồ án tốt nghiệp

2.3.1.3. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma spp.

với nấm Cochliobolus lunatus (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2012; Tô Duy Khương,

2007)

a. Nguyên tắc

Trong quần thể vi sinh vật, các loài vi sinh vật tác động qua lại, loài này có khả

năng kiểm soát và điều hòa số lƣợng của loài khác qua cơ chế đối kháng hay cạnh

tranh.

b. Bố trí thí nghiệm gồm các nghiệm thức sau

- Nấm Trichoderma virens đối kháng với nấm Cochliobolus lunatus

- Nấm Trichoderma harzianum đối kháng với nấm Cochliobolus lunatus

- Mẫu đối chứng nấm Cochliobolus lunatus

Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức lăp lại 3 lần,

mỗi lần 3 đĩa.

c. Tiến hành thí nghiệm

- Đối với đĩa cấy đối kháng, dùng khoan thạch hình trụ, đƣờng kính 5 mm, vô

trùng, khoan lấy một phần thạch ở trên khuẩn lạc nấm bệnh, chọn vị trí có nhiều bào tử

nấm, đặt vào đĩa petri có đƣờng kính 90 mm trong môi trƣờng PDA dùng cho nuôi cấy

khảo sát tính đối kháng. Đặt khoan thạch cách mép đĩa petri 1,0 cm.

- Sau đó, hai ngày dùng khoan thạch có đƣờng kính 5 mm, khoan lấy khuẩn lạc

nấm Trichoderma đặt vào đĩa petri cũng cách mép đĩa petri 1,0 cm nhƣng ở phía đối

diện với nấm bệnh.

- Ở đĩa đối chứng, ta cũng khoan thạch nấm bệnh bằng khoan hình trụ với

đƣờng kính 5 mm, đặt khoan thạch vào đĩa petri cùng loại chứa môi trƣờng PDA vô

trùng, khoan thạch cách mép đĩa petri 1,0 cm.

d. Chỉ tiêu theo dõi

Đồ án tốt nghiệp

Chỉ tiêu theo dõi đƣợc thực hiện trong thử nghiệm này là phần trăm ức chế sự

phát triển hệ sợi nấm và số ngày đối kháng lại hoàn toàn nấm bệnh của Trichoderma:

sau 3, 5, 7, 10 ngày và sau khi quan sát thấy sự đối kháng xảy ra hoàn toàn.

e. Đánh giá hiệu quả đối kháng

Hiệu quả đối kháng đƣợc đánh giá bằng cách đo đƣờng kính khuẩn lạc nấm

bệnh (R2) và đƣờng kính của khuẩn lạc nấm bệnh trong đĩa đối chứng (R1). Các số liệu

R1− R2 R1

đƣợc tính toán theo công thức (Esposito và Silva, 1998) là: 𝑃𝐼𝑀𝐺 = × 100%

Sau khi đo và tính phần trăm ức chế sự phát triển hệ sợi nấm sau 3, 5, 7, 10

ngày, việc theo dõi vẫn tiếp tục để ghi nhận thời gian Trichoderma đối kháng lại hoàn

toàn nấm bệnh thực vật. Thời gian mọc che kín khuẩn lạc nấm bệnh đƣợc ghi nhận cho

từng chủng Trichoderma kể cả những chủng mọc che kín sớm nhất và muộn nhất. Tuy

nhiên, thời gian tối đa cho thí nghiệm là 10 ngày.

R1 R2

Hình 2.4. Phƣơng pháp cấy đối kháng

2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu

Tiến hành xử lý số liệu thống kê trong Statgraphics theo trình tự:

- Xử lý số liệu của kết quả nghiên cứu

- So sánh các tham số đặc trƣng của hai hay nhiều kết quả nghiên cứu

Phép phân tích phƣơng sai ANOVA và giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD

với độ tin cậy 95%.

Đồ án tốt nghiệp

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nhận dạng, phân lập và xác định nấm bệnh

3.1.1. Kết quả phân lập

Trên cơ sở các mẫu thanh long vừa mới bị bệnh thu thập tại các vƣờn thanh long

ở Châu Thành, Long An. Sinh viên đã phân lập đƣợc 3 loại nấm có những đặc điểm

hình thái tƣơng đối khác nhau và tần suất xuất hiện (bảng 3.1) cũng hoàn toàn khác

nhau. Cụ thể nhƣ sau:

Bảng 3.1. Thành phần nấm phân lập đƣợc trên cành thanh long bị bệnh đốm trắng

Tần suất xuất hiện (%) Trung bình Chủng nấm (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3

50 50 100 66,67 N1

20 50 0 23,33 N2

30 0 0 10 N3

3.1.1.1. Chủng nấm N1

Đặc điểm đại thể: Khi quan sát hình thái đại thể của chủng nấm N1, tản nấm

tròn, khi mới mọc mặt trên tản nấm có màu trắng, sau đó có màu nâu, từ nâu sang nâu

đen, giống lông, mịn nhƣ nhung, kết cấu giống len, sắp xếp lỏng lẻo, sợi nấm phát triển

nhanh trên môi trƣờng thạch khoai tây (PDA). Mặt dƣới tản nấm có màu đen.

Đặc điểm vi thể: Khi quan sát dƣới kính hiển vi quang học ở vật kính 100X, bào

tử của chúng có vách ngăn, bào tử tách ra hoặc nằm theo nhóm, thẳng hoặc uốn cong,

có màu nhạt đến màu nâu sẫm. Bào tử có khoảng 3 vách ngăn, 4 tế bào. Các tế bào đầu

tiên và cuối cùng thƣờng có màu nâu nhạt hơn ở giữa.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.1. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N1 (a. Mặt trƣớc tản nấm, b. Mặt sau

tản nấm, c. Hình thái sợi nấm vật kính 10X, d, e, f. Hình thái sợi nấm, bào tử vật kính

100X)

Sau khi phân lập vết bệnh từ cành thanh long ruột trắng bị bệnh đốm trắng, tần

suất xuất hiện trung bình của chủng nấm N1 ở cả 3 lần phân lập là 66,67% (bảng 3.1).

Chủng nấm này tăng trƣởng nhanh trên môi trƣờng PDA. Đƣờng kính trung bình tản

Đồ án tốt nghiệp

nấm ở 3, 5, 7 ngày sau cấy lần lƣợt là 50,67 ± 2,08 (mm), 81,67 ± 1,53 (mm), 89 ± 1

(mm) (bảng 3.2).

Bảng 3.2. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N1 trƣớc Koch

Mẫu nấm

3NSC 49 Ngày sau cấy 5NSC 83 7NSC 90

53 82 88 N1

50 80 89

Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy

50,67 ± 2,08 81,67 ± 1,53 89 ± 1 Đƣờng kính trung bình

Hình 3.2. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N1 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b),

7NSC (c)

Về đặc điểm đại thể nhƣ hình dạng, màu sắc tản nấm, sự phát triển của sợi nấm

trên môi trƣờng PDA, chủng nấm N1 rất giống với nghiên cứu của Nguyễn Thành Hiếu

và ctv (2014).Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2014), chủng

nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long thuộc loài Neoscytalidium dimidiatum. Hình

thái bào tử của nấm Neoscytalidium dimidiatum ban đầu có màu trắng sau đó chuyển

sang màu xám đen rất nhanh. Sợi nấm có màu nâu đến nâu sậm. Tản nấm tròn, phát

triển nhanh trên môi trƣờng PDA. Tuy nhiên, về đặc điểm vi thể lại có sự khác biệt.

Đặc điểm vi thể giống loài Bipolaris crustacean trong nghiên cứu của Nguyễn Thành

Hiếu và ctv (2012). Trong nghiên cứu của Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2012) cho rằng

Đồ án tốt nghiệp

loài này có đặc điểm vi thể, bào tử có màu nhạt đến nâu, có vách ngăn, hơi cong hoặc

uốn quặp.

Sau khi so sánh đặc điểm đại thể, vi thể của chủng nấm N1 với các nghiên cứu

trƣớc, chủng nấm N1 giống với loài Neoscytalidium dimidiatum về đặc điểm đại thể

(Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014) nhƣng lại giống với loài Bipolaris crustacean về

đặc điểm vi thể (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2012), chƣa thể khẳng định chủng nấm N1

thuộc loài nào trong 2 loài kể trên.

3.1.1.2. Chủng nấm N2

Đặc điểm đại thể: Khi quan sát hình thái tản nấm chủng nấm N2, mặt trên tản

nấm có màu trắng hơi ngả sang màu kem, hình thể tơi xốp, ở giữa phồng lên nhƣ bông

gòn. Sợi nấm đan xen vào nhau và phát triển rất nhanh trên môi trƣờng PDA. Mặt dƣới

tản nấm có vòng tròn đồng tâm, có màu vàng nhạt đến vàng cam hơi hồng.

Đặc điểm vi thể: Qua quá trình quan sát bằng kính hiển vi quang học ở vật kính

100X, bào tử nấm có kích thƣớc lớn, có hình dạng lƣỡi liềm, dạng cong quẹo hoặc thon

dài. Bào tử có 3 đến 5 vách ngăn đƣợc hình thành trên bọc giả gắn trên các tế bào sinh

bào tử rất dài hoặc trên các cành bào phân sinh nhánh.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.3. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N2 (a. Mặt trên tản nấm, b. Mặt

dƣới tản nấm)

Khi phân lập tác nhân gây bệnh trên cành thanh long ruột trắng bị bệnh đốm

trắng, phân lập đƣợc chủng nấm N2 với tần suất xuất hiện trung bình là 23,33% qua 3

lần phân lập. Chủng nấm N2 phát triển nhanh trên môi trƣờng PDA với đƣờng kính

trung bình tản nấm qua 3, 5, 7 ngày sau cấy lần lƣợt là: 42,67 ± 2,52 (mm), 74,5 ± 0,5

(mm), 89,67 ± 0,58 (mm) (bảng 3.3).

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.3. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N2

Mẫu nấm

3NSC 43 Ngày sau cấy 5NSC 75 7NSC 90

45 74 89 N2

40 74,5 90

Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy

42,67 ± 2,52 74,5 ± 0,5 89,67 ± 0,58 Đƣờng kính trung bình

Hình 3.4. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N2 (mm) trong 3NSC (a),

5NSC (b), 7NSC (c)

Đối chứng với tài liệu của Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), Vũ Triệu Mân (2012)

và Agrios (2005), đặc điểm hình thái và đặc điểm vi thể đặc trƣng nhƣ tản nấm phồng

lên ở giữa giống bông gòn, tản nấm có màu trắng tới màu kem. Bào tử có kích thƣớc

lớn có vách ngăn thuộc chi Fusarium. Chủng nấm N2 có đặc điểm đại thể và vi thể mô

tả hoàn toàn giống với chi Fusarium. Tuy nhiên, chủng nấm Fusarium có thể không

phải là tác nhân gây bệnh chính trên cành thanh long, bởi vì tần suất xuất hiện chỉ có

23,33% qua 3 lần phân lập.

3.1.1.3. Chủng nấm N3

Đặc điểm đại thể: Khi quan sát hình thái đại thể tản nấm N3, mặt trên tản nấm có

màu trắng đến trắng xám nhạt hoặc xám đậm, ở giữa hơi phồng lên và phát triển nhanh

Đồ án tốt nghiệp

trên môi trƣờng thạch khoai tây PDA. Mặt dƣới có màu vàng nhạt đến cam nhạt với

những đốm tròn nhỏ có màu đen nằm rãi rác.

Đặc điểm vi thể: Khi quan sát qua kính hiển vi quang học ở vật kính 100X, bào

tử chủng nấm 3 có hình que, khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn. Cuống bào tử không

có vách ngăn, bào tử có hình que, trong suốt.

Hình 3.5. Hình thái đại thể và vi thể của chủng nấm N3 (a. Mặt trƣớc tản nấm, b. Mặt

sau tản nấm, c, d. Bào tử nấm)

Qua quá trình phân lập tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long, tần

suất xuất hiện trung bình của chủng nấm N3 sau 3 lần phân lập là 10%. Tần suất xuất

hiện thấp nhất trong 3 chủng phân lập đƣợc. Chủng nấm N3 sinh trƣởng và phát triển

trên môi trƣờng PDA với đƣờng kính trung bình tản nấm ở 3, 5, 7 ngày sau cấy lần lƣợt

là: 43,67 ± 2,08 (mm), 73,67 ± 0,29 (mm), 89,33 ± 1,15 (mm) (bảng 3.4).

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.4. Đƣờng kính trung bình (mm) tản nấm N3

Mẫu nấm

3NSC 46 Ngày sau cấy 5NSC 73,5 7NSC 90

43 74 90 N3

42 73,5 88

Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa ± SD, NSC: Ngày sau cấy.

43,67 ± 2,08 73,67 ± 0,29 89,33 ± 1,15 Đƣờng kính trung bình

Hình 3.6. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N3 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b),

7NSC (c)

Đối chứng với tài liệu của Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), Vũ Triệu Mân (2012)

và Agrios (2005), tản nấm Colletotrichum có màu trắng đến xám nhạt, giống bông gòn,

sợi nấm mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn. Nấm này sinh sản bằng bào tử,

bào tử không có vách ngăn, bào tử thon nhọn không phân nhánh. Chủng nấm N3 có

những đặc điểm giống với mô tả của tác giả nên kết luận chủng nấm N3 là nấm

Colletotrichum. Tuy nhiên, chủng nấm Colletotrichum không phải là tác nhân gây bệnh

đốm trắng trên thanh long do qua 3 lần phân lập tần suất xuất hiện chỉ có 10%.

3.1.2. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch

Qua quá trình phân lập, kết quả phân lập đƣợc 3 loại nấm với tần suất xuất hiện

khác nhau. Vì vậy để xác định 3 loại nấm là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cành

Đồ án tốt nghiệp

thanh long. Sinh viên đã tiến hành nhiễm lại các nấm phân lập đƣợc từ cành thanh long

bị bệnh đốm trắng lên cành thanh long khỏe. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ sau:

Bảng 3.5. Tỷ lệ bệnh của 3 loại nấm trên cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo

Công thức

Số vết bệnh bị nhiễm Tỷ lệ vết bệnh xuất hiện

Số cành thanh long nhiễm bệnh 4 cành 4 cành 4 cành 4 cành 40 40 40 40 Tỷ lệ các cành nhiễm bệnh 0 0 0 100% 0 0 0 90% Đối chứng (nƣớc cất) Fusarium Colletotrichum Chủng nấm N1

Hình 3.7. Cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo (a. Đối chứng, b. Fusarium, c.

Colletotrichum, d và e. Chủng nấm N1)

Từ số liệu bảng 3.5 cho thấy, nấm Fusarium và Colletotrichum có tỷ lệ vết bệnh

xuất hiện giống công thức đối chứng là không có vết bệnh nào xuất hiện sau khi lây

bệnh nhân tạo. Chẳng những không xuất hiện vết bệnh mà ở cả 3 công thức: đối chứng,

nhiễm nấm Fusarium và nhiễm nấm Colletotrichum cành thanh long vẫn phát triển

bình thƣờng và lên chồi mới. Chứng tỏ nấm Fusarium và Colletotrichum hoàn toàn

không gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long ruột trắng. Đồng thời, ở kết quả phân

Đồ án tốt nghiệp

lập tác nhân gây bệnh đốm trắng, tần suất xuất hiện của hai chủng nấm Fusarium và

Colletotrichum lần lƣợt là 23,33% và 10% sau 3 lần phân lập. Nấm Fusarium có thể là

nấm hoại sinh do nấm Fusarium phân lập đƣợc khi vết bệnh đem cấy đã cũ hoặc lâu

ngày. Khi đó, vết bệnh có dấu hiệu bị hỏng nên nấm Fusarium dễ xuất hiện hơn. Sở dĩ,

chúng xuất hiện ở vết bệnh hỏng là do nấm Fusarium thuộc loại nấm ký sinh cơ hội,

khi đối tƣợng ký chủ có dấu hiệu hỏng thì nấm Fusarium sẽ tấn công và ký sinh lên

trên vất bệnh đó. Theo Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), nấm Fusarium thuộc lớp phụ

Hypomycetes. Lớp này phần lớn là nấm hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vật. Đối với

nấm Colletotrichum, nấm này có thể là nấm gây bệnh thán thƣ trên thanh long do nấm

này có phổ ký chủ rộng, chúng có thể tồn tại trong xác bã thực vật trong vƣờn. Sở dĩ

phân lập đƣợc nấm Colletotrichum có thể do trong quá trình phân lập lấy ở vị trí gần

vết đốm vàng gần mép cành. Đối với chủng nấm N1, đây là tác nhân gây bệnh đốm

trắng trên thanh long, sau khi lây bệnh nhân tạo theo phƣơng pháp Koch, tỷ lệ các cành

nhiễm bệnh là 100% và tỷ lệ vết bệnh xuất hiện là 90%. Ngoài ra, ở những vị trí vết

bệnh xuất hiện, qua thời gian dài, vết bệnh bắt đầu lan rộng về diện tích và chuyển sang

màu đen, có thể là do có những sợi nấm mọc trên vết bệnh. Với kết quả này, lại một lần

nữa khẳng định chủng nấm N1 là tác nhân chính gây bệnh đốm trắng trên cành thanh

long.

Tuy nhiên, để xác định chính xác tác nhân cũng nhƣ để chứng minh những nghi

ngờ trên đúng là tác nhân chính gây bệnh đốm trắng trên thanh long, một căn bệnh

đang là nổi lo, nổi bức xúc của các nhà vƣờn, sinh viên tiến hành phân lập lại tác nhân

gây từ vết bệnh ở những cành thanh long bị nhiễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo theo

phƣơng thức Koch. Kết quả phân lập lại đƣợc thể hiện trong bảng 3.6

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.6. Hình thái chủng nấm N1 trƣớc Koch và sau Koch

Chỉ tiêu quan sát Trƣớc Koch Sau Koch

Tản nấm khi mới mọc, Tản nấm tròn có hình thể

mặt trƣớc có màu trắng, giống nhƣ lông, mịn, dày,

sau đó có màu nâu, từ màu ban đầu có màu trắng sau

Hình thái tản nấm nâu sang nâu đen, giống đó chuyển qua màu nâu

lông, min nhƣ nhung hoặc đến nâu đen. Mặt sau tản

kết cấu lỏng lẻo. Mặt dƣới nấm có màu đen không có

tản nấm có màu đen vòng tròn đồng tâm.

Sợi nấm có vách ngăn,

Sợi nấm có màu xám đến không màu chuyển thành Hình thái sợi nấm nâu, có vách ngăn màu nâu hoặc nâu sậm khi

già

Bào tử của chúng có vách

ngăn, bào tử tách ra hoặc Bào tử có 3 vách ngăn, 4

nằm theo nhóm, thẳng tế bào, bào tử tách ra hoặc

Hình dạng bào tử hoặc uốn cong. Bào tử có nằm theo nhóm, thẳng

3 vách ngăn, 4 tế bào, hoặc cong, có màu từ nhạt

hiếm khi có 4 vách ngăn, đến sậm khi già.

có màu nhạt đến nâu sậm.

Đƣờng kính tản nấm (mm) 81,67 ± 1,53 82,33 ± 3,79 sau 5 ngày nuôi cấy

Nhƣ vậy, sau khi so sánh các đặc điểm đặc trƣng về hình thái tản nấm, sợi nấm,

bào tử và đƣờng kính tản nấm ở 5 ngày sau cấy của chủng nấm N1 trƣớc Koch và sau

Koch đều có những đặc điểm mô tả hoàn toàn giống nhau. Điều này có thể khẳng định

chắc chắn rằng tác nhân gây bệnh trên cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo chính

Đồ án tốt nghiệp

là nấm gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long thu thập đƣợc trong vƣờn của nông

dân.

Để xác định tên khoa học của chủng nấm N1 gây bệnh đốm trắng trên thanh

long, sinh viên đã gửi chủng nấm đi định danh tại phòng xét nghiệm của Công ty Nam

Khoa – Biotek. Kết quả định danh bằng sinh học phân tử sau khi giải trình tự gen 28S

rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH, cho kết quả hoàn toàn khác với kết quả nghi

ngờ của chúng tôi. Kết quả này cho thấy chủng nấm Cochliobolus lunatus mới chính là

tác nhân chính gây bệnh đốm trắng trên thanh long. Kết quả này có phần khác với kết

quả của Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2014). Trong nghiên cứu của Nguyễn Thành Hiếu

và ctv (2014), tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long là do nấm Neoscytalidium

dimidiatum.

Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.9. Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH

3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến sự sinh trƣởng và phát triển

của nấm Cochliobolus lunatus

3.2.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và phát triển của nấm

Cochliobolus lunatus

Ánh sáng là một trong những yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi sinh

vật. Đối với các điều kiện chiếu sáng khác nhau, sự sinh trƣởng và phát triển của vi

sinh vật cũng khác nhau. Do đó, việc khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện chiếu sáng

khác nhau là cần thiết nhằm tìm ra điều kiện, nguyên nhân phát triển của nấm bệnh và

phƣơng pháp phòng trừ bệnh thích hợp. Thế nên sinh viên đã khảo sát ảnh hƣởng của 2

điều kiện chiếu sáng (24 giờ chiếu sáng, 12 giờ sáng: 12 giờ tối). Kết quả đƣợc thể hiện

trong bảng 3.7.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.7. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên môi

trƣờng PDA với các điều kiện chiếu sáng khác nhau khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng

Ánh sáng Mẫu nấm 1NSC

Đƣờng kính tản nấm 3NSC 2NSC 28b ± 1 SLT

4NSC 30,75b ± 0,66 17,17 ± 0,72 23,33b ± 0,76 17,25 ± 0,43 27,33a ± 0,29 36,83a ± 0,76 45,33a ± 0,58 12S: 12T

TL trƣớc Koch 3,10 9,27 15,13 15,96 CV %

SLT

Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy, TL trước Koch:

Mẫu nấm Cochliobolus lunatus phân lập trên cành thanh long bị bệnh, TL sau Koch: Mẫu

nấm Cochliobolus lunatus phân lập từ cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo, CV: Hệ số

biến thiên, SLT: Sáng liên tục (hay 24 giờ chiếu sáng), 12S:12T: 12 giờ sáng: 12 giờ tối, các

chữ cái trên cùng 1 cột có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95%.

17,09b ± 0,87 31,25b ± 1,30 39,08b ± 2,79 45,33b ± 2,89 19,25a ± 0,43 40,17a ± 0,38 53,08a ± 0,88 68,67a ± 1,26 12S: 12T TL sau Koch 7,37 13,89 17,11 22,69 CV %

Kết quả nghiên cứu với điều kiện chiếu sáng (24 giờ chiếu sáng và 12 giờ sáng:

12 giờ tối) đƣợc trình bày ở bảng 3.7 cho thấy các mẫu nấm Cochliobolus lunatus đều

có khả năng sinh trƣởng và phát triển.

Mẫu nấm Cochliobolus lunatus trƣớc Koch đƣờng kính trung bình ở 2 điều kiện

chiếu sáng khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở 1NSC. Tuy nhiên ở 2NSC,

3NSC, 4NSC đƣờng kính trung bình lại có sự khác biệt về mặt thống kê, đƣờng kính

trung bình của mẫu nấm ở điều kiện chiếu sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối lớn hơn so với

điều kiện 24 giờ chiếu sáng. Mức ánh sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối nấm sinh trƣởng và

phát triển tốt hơn với đƣờng kính trung bình tản nấm sau 2NSC, 3NSC, 4NSC lần lƣợt

là 27,33 (mm), 36,83(mm), 45,33 (mm).

Đối với mẫu nấm Cochliobolus lunatus sau Koch, đƣờng kính trung bình ở 2

điều kiện chiếu sáng có sự khác biệt về mặt thống kê qua các ngày sau cấy. Điều kiện

chiếu sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối, nấm sinh trƣởng và phát triển tốt hơn điều kiện

Đồ án tốt nghiệp

chiếu sáng 24 giờ với đƣờng kính trung bình tản nấm qua 1NSC, 2NSC, 3NSC, 4NSC

lần lƣợt là 19,25 (mm), 40,17 (mm), 53,08 (mm), 68,67 (mm).

So sánh với kết quả nghiên cứu của Adeniyi, D.O. và ctv (2011), Y. K. Kim và

ctv (2005), kết quả của sinh viên phù hợp với kết quả của các tác giả.

Nhìn chung, ở điều kiện chiếu sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối thích hợp nhất cho sự

sinh trƣởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus. Điều này có thể giải thích vì

sao nấm gây bệnh đốm trắng trong vụ khô phát triển thấp hơn trong vụ mƣa. Giải thích

điều này là vì trong mùa khô ẩm độ thấp và lƣợng mƣa ít hơn nên ít thuận lợi cho sự

phát triển của nấm so với trong mùa mƣa. Mặt khác trong mùa khô ngƣời nông dân

thƣờng chong đèn nên điều này cũng làm hạn chế sự phát triển của nấm.

d Hình 3.10. Đƣờng kính trung bình của nấm Cochliobolus lunatus ở các điều kiện chiếu

sáng khác nhau qua 4 ngày sau cấy (a. SLT trƣớc Koch, b. 12S:12T trƣớc Koch, c. SLT

sau Koch, d. 12S:12T sau Koch)

3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus

lunatus

Các yếu tố môi trƣờng đặc biệt là pH ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm

bệnh. Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hƣởng của yếu tố pH môi trƣờng tới sự sinh trƣởng

của nấm Cochliobolus lunatus là điều rất cần thiết để từ đó biết đƣợc khả năng sinh

trƣởng thích hợp của loài nấm này ở khoảng pH nào, từ đó đƣa biện pháp phòng trừ

hiệu quả nhất.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.8. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên môi

trƣờng PDA ở các mức pH khác nhau

pH Mấu nấm 1NSC Đƣờng kính tản nấm 3NSC 2NSC 4NSC

TL 7

17,29a ± 0,29 38,33b ± 0,58 51,83ab ± 2,08 69,67b ± 0,14 70,08b ± 0,38 17,67a ± 0,52 38,25b ± 0,43 50,75b ± 3,13 72,58a ± 0,38 55,33a ± 0,76 40a 17,83a ± 0,52 51,08c ± 1,59 29,42c ± 0,38 40,33c ± 0,88 15b ± 0,5

Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy, TL: Mẫu nấm

Cochliobolus lunatus được phân lập từ cành thanh long bị bệnh, CV: Hệ số biến thiên, các

chữ cái trên cùng 1 cột có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95%.

8 CV (%) 7,8 11,91 12,26 13,68

Kết quả nghiên cứu về ảnh hƣởng của pH đƣợc trình bày ở bảng 3.8 cho thấy

nấm Cochliobolus lunatus đều có khả năng sinh trƣởng và phát triển đƣợc ở các mức

pH từ 5 – 8. Ở mỗi thời điểm khác nhau đƣờng kính tản nấm phát triển cũng khác nhau

nhƣng nhìn chung thì pH thích hợp cho sự phát triển của tản nấm qua 4 ngày sau cấy

vẫn là pH 7 với đƣờng kính trung bình tản nấm là 72,58 (mm) sau đó đến pH 5, pH 6

với đƣờng kính tản nấm lần lƣợt là (69,67) mm và 70,08 (mm), cuối cùng là pH 8 với

đƣờng kính là 51,08 (mm).

Đối chứng với kết quả nghiên cứu của Gao Ying và ctv (2009), Khailare, V.C và

Rafi Ahmed (2012), Kishore và ctv (2009) và Prasad và ctv (1992), kết quả nghiên cứu

của sinh viên khá phù hợp với kết quả của các tác giả trƣớc.

Tóm lại, pH thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng và phát triển đƣờng kính tản nấm

Cochliobolus lunatus là pH 7, kế đến là pH 5, pH 6 và sau cùng trong thí nghiệm này là

pH 8. Nhƣ vậy, nấm C. lunatus có khả năng sinh trƣởng ở môi trƣờng hơi acid đến

trung tính.

Đồ án tốt nghiệp

d Hình 3.11. Đƣờng kính trung bình tản nấm Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA

ở các mức pH khác nhau qua 4 ngày sau cấy (a. pH 5, b. pH 6, c. pH 7, d. pH 8)

3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tăng trưởng kích thước của nấm

Cochliobolus lunatus

Nguồn nitơ là một trong những yếu tố cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển

của vi sinh vật. Do đó, sinh viên thực hiện khảo sát ảnh hƣởng của nguồn nitơ bổ sung

ở 3 dạng urê ((NH2)2CO), kali nitrate (KNO3), ammonium sulphate ((NH4)2SO4) và kết

quả đạt đƣợc có sự khác biệt giữa 3 nguồn nitơ bổ sung vào môi trƣờng WA.

Bảng 3.9. Đƣờng kính trung bình tản nấm của mẫu nấm Cochliobolus lunatus trên môi

trƣờng WA có bổ sung nguồn nitơ khác nhau

Ngày sau cấy

Lƣợng nitơ 3NSC 1NSC 4NSC

Nguồn nitơ 2NSC (NH2)2CO 12,83c ± 0,14 26,92c ± 0,14 40,75b ± 0,25 50.67b ± 0,38 16,5a ± 0,25 33,83a ± 0,29 52,17a ± 0,52 67,17a ± 0,14 KNO3 0,28 g/ l 39c ± 0,52 48c ± 0,66

12,33c ± 0,58 25,17d ± 0,29 36,25d ± 0,66 45,17d ± 0,14 (NH4)2SO4 15,42b ± 0,14 27,58b ± 0,14 Không bổ sung

CV (%) 12,88% 15,09% 16,94%

KNO3 0,14 g/ l

12,07% (NH2)2CO 12,58b ± 0,14 25,42c ± 0,29 38,25b ± 0,43 48,83b ± 0,76 12,66b ± 0,29 28,92a ± 0,14 45,92a ± 0,52 59,5a ± 0,75 (NH4)2SO4 14,92a ± 0,14 26,75b ± 0,25 37,42b ± 0,29 45,75c ± 0,76 Không bổ 12,33b ± 0,58 25.17c ± 0,29 36,25c ± 0,66 45,17c ± 0,14 sung

Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy, CV: Hệ số biến

thiên, các chữ cái trên cùng 1 cột có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95%.

CV (%) 8,58% 5,90% 10,10% 12,12%

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả ảnh hƣởng của nguồn nitơ đƣợc trình bày ở bảng 3.9 cho thấy nấm

Cochliobolus lunatus đều có khả năng sinh trƣởng và phát triển trên môi trƣờng WA có

bổ sung nguồn nitơ và lƣợng nitơ khác nhau. Tuy nhiên, ở mỗi nguồn nitơ và lƣợng

nitơ khác nhau chủng nấm Cochliobolus lunatus lại có khả năng sinh trƣởng và phát

triển khác nhau.

Ở các nguồn nitơ khác nhau với lƣợng nitơ 0,28 g/l, đƣờng kính tản nấm C.

lunatus tăng dần qua 4 ngày sau cấy. Ở thời điểm 1 ngày sau cấy, nguồn nitơ bổ sung

dƣới dạng KNO3 cho tốc độ phát triển mạnh nhất với đƣờng kính trung bình tản nấm là

16,5 mm, kế đến là (NH4)2SO4 và sau cùng là (NH2)2CO và không bổ sung nitơ. Sau

thời điểm 2, 3, 4 ngày sau cấy, nguồn nitơ bổ sung dƣới dạng KNO3 vẫn cho tốc độ

phát triển mạnh nhất so với 3 nguồn nitơ còn lại, với đƣờng kính trung bình tản nấm ở

4 ngày sau cấy của nguồn KNO3 là 67,17 (mm). Đối với các nguồn nitơ còn lại có sự

khác biệt, ở thời điểm 3, 4 ngày sau cấy nguồn nitơ bổ sung dƣới dạng (NH2)2CO lại

cho đƣờng kính tản nấm phát triển mạnh hơn (NH4)2SO4 với đƣờng kính trung bình tản

nấm là 50,67 (mm) đối với (NH2)2CO và 48 (mm) đối với (NH4)2SO4. Còn đối với môi

trƣờng không bổ sung nguồn nitơ, nấm C. lunatus phát triển chậm nhất do thiếu nguồn

dinh dƣỡng cung cấp cho sự phát triển của nấm C. lunatus.

Đối với lƣợng nitơ là 0,14 g/ l, nhìn chung nguồn nitơ bổ sung dƣới dạng KNO3

vẫn cho tốc độ tăng trƣởng của nấm C. lunatus vẫn đạt cao nhất ở 2, 3, 4 ngày sau cấy.

Trong đó, ở thời điểm 4 ngày sau cấy, đƣờng kính trung bình tản nấm trên môi trƣờng

có chứa KNO3 là 59,5 (mm), kế đến là (NH2)2CO và cuối cùng vẫn là (NH4)2SO4 và

không bổ sung nguồn nitơ với đƣờng kính trung bình lần lƣợt là 48,83 (mm), 45,75

(mm) và 45,17 (mm).

Nguồn nitơ bổ sung ở dạng KNO3 là tốt nhất cho sự phát triển của nấm ở cả hai

liều lƣợng. So sánh giữa hai liều lƣợng nitơ (0,28 g/ l và 0,14 g/ l), nấm C. lunatus phát

triển đƣờng kính tản nấm ở liều lƣợng nitơ 0,28 g/ l cao hơn so với 0,14 g/ l trong cùng

nguồn nitơ. Điển hình, nguồn nitơ dạng KNO3 với liều lƣợng 0,28 g/ l có đƣờng kính

Đồ án tốt nghiệp

lớn hơn so với nguồn nitơ dạng KNO3 liều lƣợng 0,14 g/ l với mức ý nghĩa 95% (phụ

lục B.3). Điều này giải thích vì sao, bón phân càng nhiều nấm phát triển càng mạnh.

Đối chứng với nghiên cứu của Gao Ying và ctv (2009), Azhar Hussain và ctv

(2003), Khattabia và ctv (2004), Basamma (2008), Khilare, V.C. và Rafi Ahamed

(2011), kết quả nghiên cứu của sinh viên phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả

trƣớc.

Tóm tại trong thí nghiệm này, KNO3 là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sự phát

triển của nấm C. lunatus, kế đến là (NH2)2CO. Đối với nguồn nitơ có dạng (NH4)2SO4

không phù hợp với sự phát triển của nấm C. lunatus.

Do đó, trong quá trình trồng cây thanh long nên hạn chế bón phân đạm, chỉ bón

ở mức độ phù hợp không nên bón thừa phân đạm. Vì khi bón thừa đạm, cây trồng sẽ

lớn nhanh, dễ bị đỗ ngã. Mặt khác còn làm tăng khả năng nhiễm bệnh do thiếu sức đề

kháng dễ bị nấm bệnh hại tấn công.

Một trong những nguyên nhân làm cho bệnh đốm trắng phát triển mạnh trên

thanh long là do cây thanh long có hiệu quả kinh tế cao nên ngƣời nông dân đẩy mạnh

việc trồng loại cây này để nâng cao thu nhập, mà cây thanh long là loại cây thân leo

cành trƣờng, bò trên trụ đỡ nhƣng cành thanh long lại chứa lƣợng nƣớc khá cao; điều

này làm cho cành mềm hơn so với những loại cây khác nên dễ bị đỗ ngã, nhiễm bệnh.

Vì thế ngành Nông Nghiệp khuyến cáo ngƣời nông dân sử dụng kali nitrate để phun

cho cây trồng với mục đích giúp thân cây cứng hơn chống đỗ ngã nhƣng kali nitrate lại

là nguồn nitơ tốt nhất cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm bệnh. Đồng thời việc sử

dụng phân kali nitrate sẽ cho trái có độ ngọt cao hơn, màu vỏ đẹp hơn, vỏ trái cứng

chắc và lâu hƣ thối, dễ cất trữ vận chuyển. Ngoài ra, việc phun kali nitrate lên cây

thanh long sẽ cho trái có trọng lƣợng nặng hơn so với không phun (Nguyễn Minh

Châu, 2001). Vì vậy, để có hiệu quả kinh tế cao ngƣời nông dân vừa phun kali nitrate,

urê ở trên cây vừa bón lót ở dƣới đất để cây mau ra hoa kết quả. Chính những nguyên

nhân trên làm cho nấm này phát triển và lây lan nhanh trên thanh long.

Đồ án tốt nghiệp

Nguồn nitơ Lƣợng nitơ (NH2)2CO KNO3 (NH4)2SO4 Không bổ sung

0,28 g/ l

0,14 g/ l

Hình 3.12. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu nấm Cochliobolus lunatus trên

môi trƣờng PDA với các nguồn nitơ khác nhau ở 4 ngày sau cấy

3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm

Cochliobolus lunatus

3.3.1. Khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma virens với nấm

Cochliobolus lunatus

Bảng 3.10. Đƣờng kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của Trichoderma

virens với nấm Cochliobolus lunatus

Ngày sau cấy Lần nhắc CTTD 3NSC 7NSC 10NSC

45,75 ± 1,06 45,75 ± 1,06

Lần 1 ĐKTB CĐK 46,25 ± 1,06 ĐKTB CĐC 56,83 ± 0,76 5NSC 46 ± 1,41 74 ± 1,73 90 90

% Ức chế

Lần 2 90 90

49,5

Lần 3 57,5 ± 0,71 76,25 ± 0,35 90

Ghi chú: Các giá trị là trung bình 3 đĩa cấy ± SD và % ức chế ± SD, CTTD: Chỉ tiêu theo dõi,

NSC: Ngày sau cấy, ĐKTB CĐK: Đường kính trung bình của nấm Cochliobolus lunatus ở đĩa

18,62 ± 1,87 37,84 ± 1,91 49,17 ± 1,18 49,17 ± 1,18 ĐKTB CĐK 46,33 ± 0,58 46,33 ± 0,58 46,33 ± 0,58 46,17 ± 0,29 71,5 ± 1,80 ĐKTB CĐC % Ức chế ĐKTB CĐK ĐKTB CĐC % Ức chế 56,5 ± 0,87 17,99 ± 1,02 35,20 ± 0,81 48,52 ± 0,64 48,70 ± 0,32 49,25 ± 0,35 49,25 ± 0,35 49,25 ± 0,35 90 35,41 ± 0,46 45,28 ± 0,39 45,28 ± 0,39 13,91

cấy nấm đối kháng Trichoderma virens, ĐKTB CĐK: Đường kính trung bình của nấm

Cochliobolus lunatus ở đĩa đối chứng chỉ cấy nấm bệnh

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy nấm Trichoderma virens có khả năng đối kháng

với nấm Cochliobolus lunatus, hiệu quả đối kháng tăng dần từ 3 ngày sau cấy đến 10

ngày sau cấy.

Đối với lần 1, ở thời điểm 3 ngày sau khi cấy nấm đối kháng, tản nấm

Trichoderma virens và tản nấm Cochliobolus lunatus chạm nhau. Sợi nấm

Trichoderma virens phía ngoài có màu trắng, ở gần miếng thạch có màu xanh, tản nấm

hình thành vòng tròn đồng tâm. Phần trăm ức chế của Trichoderma virens là 18,62%, ở

thời điểm này chƣa có sự đối kháng xảy ra. Đến ngày thứ 5 sau cấy, sợi nấm

Trichoderma virens bắt đầu lan vào phần tiếp xúc với tản nấm Cochliobolus lunatus.

Phần trăm ức chế của Trichoderma virens là 37,84%, có xảy ra đối kháng nhƣng mức

độ đối kháng yếu. Sau đó, ở thời điểm 7 và 10 ngày sau cấy, sợi nấm lan phủ lên bề

mặt nấm Cochliobolus lunatus và hình thành bào tử màu xanh. Phần trăm ức chế là

49,17%, hiệu quả đối kháng cao hơn ở ngày 7 và ngày 10. Ở ngày thứ 10, phần trăm ức

chế của tản nấm hầu nhƣ không tăng thêm, chỉ có bào tử nấm đối kháng nhiều hơn

ngày 7, có màu xanh sậm hơn.

Kết quả từ 3 lần nhắc ở bảng 3.10, cho thấy phần trăm ức chế của nấm

Trichoderma virens với nấm Cochliobolus lunatus không có sự khác biệt giữa 3 lần

nhắc với mức ý nghĩa 95%.

Nhìn chung, chủng nấm T. virens có khả năng đối kháng với chủng nấm C.

lunatus, chủng nấm này bị ức chế không phát triển đƣờng kính tản nấm cũng nhƣ

không có khả năng hình thành bào tử trên đĩa đối kháng.

Đồ án tốt nghiệp

3.3.2. Khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma harzianum với nấm

Cochliobolus lunatus

Bảng 3.11. Đƣờng kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của Trichoderma

harzianum với nấm Cochliobolus lunatus

Ngày sau cấy CTTD Lần nhắc 7NSC 10NSC

3NSC 44 ± 1 43,67 ± 0,76 43,67 ± 0,76

Lần 1 ĐKTB CĐK ĐKTB CĐC 56,83 ± 0,76 5NSC 44 ± 1 74 ± 1,73 90 90

% Ức chế

Lần 2 22,58 ± 1,76 40,54 ± 1,35 51,48 ± 0,85 51,48 ± 0,85 42,5 ± 0,5 90 71,5 ± 1,80 90

56,5 ± 0,87 24,48 ± 1,02 40,33 ± 0,81 52,59 ± 0,64 52,78 ± 0,56 44,83 ± 0,58 44,83 ± 0,58 45 ± 0,87

Lần 3 90 90

Ghi chú: Các giá trị là trung bình 3 đĩa cấy ± SD và % ức chế ± SD, CTTD: Chỉ tiêu theo dõi,

NSC: Ngày sau cấy, ĐKTB CĐK: Đường kính trung bình của nấm Cochliobolus lunatus ở đĩa

cấy nấm đối kháng Trichoderma harzianum, ĐKTB CĐK: Đường kính trung bình của nấm

Cochliobolus lunatus ở đĩa đối chứng chỉ cấy nấm bệnh

ĐKTB CĐK 42,67 ± 0,58 42,67 ± 0,58 42,67 ± 0,58 ĐKTB CĐC % Ức chế ĐKTB CĐK ĐKTB CĐC % Ức chế 45 ± 0,87 57,5 ± 0,71 76,25 ± 0,35 21,74 ± 1,51 40,98 ± 1,14 50,19 ± 0,64 50,19 ± 0,64

Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy nấm Trichoderma harzianum có khả năng đối

kháng với nấm Cochliobolus lunatus, hiệu quả đối kháng tăng dần từ 3 ngày sau cấy

đến 10 ngày sau cấy.

Đối với lần 1, ở thời điểm 3 ngày sau cấy đối kháng, tản nấm của Trichoderma

harzianum và tản nấm Cochliobolus lunatus đã chạm nhau và nấm đối kháng lan sang

phần rìa của nấm bệnh, ở gần miếng thạch có xuất hiện bào tử nhƣng khá ít. Phần trăm

ức chế của Trichoderma harzianum là 22,58%, ở thời điểm này bắt đầu có sự đối

kháng xảy ra nhƣng với mức độ đối kháng yếu. Đến ngày thứ 5 sau cấy, sợi nấm

Trichoderma harzianum lan sang tản nấm Cochliobolus lunatus. Phần trăm ức chế của

Trichoderma harzianum là 40,54%, khả năng đối kháng đã mạnh hơn, tản nấm đối

kháng lan qua tản nấm bệnh nhiều hơn ở thời điểm 3 ngày sau cấy. Sau đó, ở thời điểm

7 và 10 ngày sau cấy, sợi nấm lan phủ lên trên tản nấm Cochliobolus lunatus có hình

Đồ án tốt nghiệp

thành lớp bào tử màu xanh của nấm Trichoderma harzianum. Phần trăm ức chế là

51,48%, hiệu quả đối kháng cao hơn ở ngày 7 và ngày 10. Ở ngày thứ 10 sau cấy, phần

trăm ức chế không tăng thêm, chỉ có bào tử của nấm đối kháng trên bề mặt nấm bệnh

nhiều hơn với màu sậm hơn, làm môi trƣờng chuyển sang màu vàng nhạt. Đồng thời, ở

vị trí tiếp xúc của nấm T. harzianum với nấm C. lunatus có xuất hiện đƣờng cong màu

đen sậm.

Kết quả 3 lần nhắc ở bảng 3.11, cho thấy phần trăm ức chế của nấm

Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus không có sự khác biệt giữa 3

lần nhắc với mức ý nghĩa 95%.

Nấm Tricoderma harzianum đối kháng khá mạnh với chủng nấm Cochliobolus

lunatus, chủng nấm này bị ức chế không thể hình thành bào tử hay phát triển đƣờng

kính tản nấm trên đĩa đối kháng. Sợi nấm tàn lụi dần với lớp bào tử nấm đối kháng trên

bề mặt nấm bệnh.

3.3.3. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum

với nấm Cochliobolus lunatus

Để đánh giá hiệu lực đối kháng của Trichoderma virens và Trichoderma

harzianum với nấm Cochliobolus lunatus, sinh viên đã tiến hành thí nghiệm trên môi

trƣờng PDA. Kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng 3.12.

Bảng 3.12. Phần trăm ức chế trung bình 3 lần nhắc của nấm Trichoderma virens,

Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus

Ngày sau cấy Chủng

T1: Mẫu nấm Trichoderma virens, T2: Mẫu nấm Trichoderma harzianum, CV: Hệ số biến

thiên, các chữ cái trên cùng 1 cột có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95%.

7NSC 47,66b ± 2,08 51,75a ± 0,74 5,32 3NSC 18,84b ± 0,98 22,93a ± 1,40 11,92 10NSC 47,72b ± 2,12 51,82a ± 0,85 5,37 T. virens T. harzianum CV (%) 5NSC 36,15b ± 1,47 40,62a ± 0,33 6,84 Ghi chú: Các giá trị là trung bình phần trăm ức chế ở 3 lần nhắc ± SD, NSC: Ngày sau cấy,

Đồ án tốt nghiệp

Qua kết quả ở bảng 3.12, ta thấy cả hai chủng nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum đều có khả năng đối kháng với nấm Cochliobolus lunatus.

Tuy nhiên, hiệu quả đối kháng của hai chủng lại có sự khác nhau ở những ngày khác

nhau.

Ở thời điểm 3 ngày sau cấy, chủng nấm Trichoderma harzianum có hiệu quả đối

kháng mạnh với nấm Cochliobolus lunatus và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so

với chủng nấm Trichoderma virens. Lúc này chủng nấm T. harzianum đã đối kháng

với nấm bệnh với mức độ đối kháng yếu; trong khi đó, nấm T. virens chƣa đối kháng

với nấm bệnh.

Đến ngày thứ 5, 7 và 10 ngày sau cấy, nấm Trichoderma harzianum lại có hiệu

quả đối kháng mạnh với nấm Cochliobolus lunatus và khác biệt có ý nghĩa về mặt

thống kê so với chủng nấm Trichoderma virens.

Chủng nấm Cochliobolus lunatus đều bị ức chế bởi nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum. Trong đó, nấm Trichoderma harzianum đối kháng mạnh hơn

nấm Trichoderma virens. Vì vậy có thể sử dụng nấm Trichoderma harzianum là nguồn

để tạo chế phẩm sử dụng trong phòng trừ nấm Cochliobolus lunatus gây bệnh đốm

trắng trên thanh long.

Đồ án tốt nghiệp

Ngày sau cấy Chủng

nấm 3NSC 5NSC 7NSC 10NSC

harzianum

T. virens

Đối chứng

Hình 3.13. Mức độ đối kháng của nấm Trichoderma virens (T1), Trichoderma

harzianum (T2) với nấm Cochliobolus lunatus (C)

Đồ án tốt nghiệp

Chƣơng 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Kết quả phân lập, lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch và định danh cho thấy

tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long là do nấm Cochliobolus lunatus gây ra.

- Nấm Cochliobolus lunatus có khả năng sinh trƣởng và phát triển trong điều

kiện pH khoảng 5 – 8. Điều kiện chiếu sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối là tốt nhất cho sự

phát triển của nấm Cochliobolus lunatus.

- Nguồn nitơ có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm

Cochliobolus lunatus. Trong đó, kali nitrate cho sự phát triển của nấm Cochliobolus

lunatus là tốt nhất so với urê và sulphate amon.

- Cả hai chủng nấm đối kháng Trichoderma harzianum và Trichoderma virens

đều có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Cochliobolus lunatus trong điều kiện in

vitro.

4.2. Kiến nghị

- Thực hiện nhiều nghiên cừu về con đƣờng xâm nhiễm bệnh cũng nhƣ các điều

kiện môi trƣờng tác động dẫn đến sự phát triển nhanh của bệnh đốm trắng. Từ đó đƣa

ra những biện pháp nhằm ngăn chặn sự lây lan của bệnh.

- Nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh đốm trắng để có quy trình phòng trừ

hiệu quả và thân thiện với môi trƣờng.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Nguyễn Văn bá, Cao ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành, 2005. Giáo trình môn Nấm học.

Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học. Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Minh Châu, 2001. Đánh giá tiềm năng cây ăn quả vùng Đồng bằng Sông Cửu

Long – triển vọng tiêu thị nội địa và xuất khẩu. Hội thảo thƣơng mại hoa trái

cây nhiệt đới miền Nam Việt Nam.

Bùi Vũ Thùy Dƣơng, 2013. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất nước thanh long

(Hylocereus undatus) lên men bằng chủng nấm Saccharomyces cerevisiae. Đồ

án tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học. Đại học Công Nghệ TP. Hồ

Chí Minh.

Trần Thị Thu Hà và Phạm Thanh Hòa, 2012. Khả năng đối kháng của nấm

Trichoderma với nấm bệnh hại cây trồng Sclerotium rolfsii Sacc trong điều kiện

In vitro. Tạp chí khoa học, Đại học Huế, Tập 75A, Số 6, 49 – 55.

Nguyễn Thị Hai, 2013. Bài giảng ứng dụng công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật.

Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí minh.

Phan Thị Thu Hiền và ctv, 2014. Nghiên cứu định danh và khảo sát đặc điểm sinh học

của tác nhân gây bệnh đốm trắng hại thanh long (Hylocereus undatus). Hội

thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam 6 – 7/5/2014.

Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2012. Nghiên cứu xác định tác nhân gây hiện tượng vàng

bẹ - rám cành thanh long (Hylocereus undatus) và khảo sát hiệu quả phòng trị

của một sốvi sinh vật đối kháng và thuốc sinh, hóa học trong điều kiện In vitro.

Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam 20 – 23/4/2012. Viện Cây ăn

quả miền Nam.

Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014. Nghiên cứu xác định tác nhân, đặc điểm hình thái và

sinh học của nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên thanh

Đồ án tốt nghiệp

long (Hylocereus undatus). Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam 6 –

7/5/2014. Viện Cây ăn quả miền Nam.

Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014. Biện pháp quản lý tạm thời bệnh đốm trắng trên cây

thanh long. Viện Cây ăn quả miền Nam.

Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014. Tình hình dịch hại trên thanh long và kết quả nghiên

cứu của Viện Cây ăn quả miền Nam trong thời gian qua. Viện Cây ăn quả miền

Nam.

Lê Thị Huệ, 2010. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số

chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng. Luận văn

thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học. Đại học Sƣ Phạm TP. Hồ Chí Minh.

Nguyễn Văn Kế, 2000. Cây thanh long. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh.

Võ Minh Kha, 1996. Hướng dẫn thực hành sử dụng phân bón. Nhà xuất bản Nông

Nghiệp, Hà Nội.

Tô Duy Khƣơng, 2007. Khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp và khả

năng đối kháng với một số nấm gây bệnh thực vật. Luận văn thạc sĩ sinh học

chuyên ngành vi sinh. Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh.

Vũ Triệu Mân, 2007. Giáo trình Bệnh cây chuyên khoa. Trƣờng Đại học Nông Nghiệp

I – Hà Nội.

Phạm Minh Nhựt, 2010. Bài giảng thực tập vi sinh đại cương. Trƣờng Đại học Công

Nghệ TP. Hồ Chí Minh.

Huỳnh Văn Phục, 2006. Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với

Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúa và bắp. Khóa

luận tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học. Trƣờng Đại học Nông Lâm

TP. Hồ Chí Minh.

Nguyễn Ngọc Phúc, 2005. Bước đầu khảo sát mối liên hệ giữa sự hiện diện

Trichoderma và các yếu tố của đất. Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Công

nghệ sinh học. Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

Đồ án tốt nghiệp

Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009. Cẩm nang chẩn đoán

bệnh cây ở Việt Nam. Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210 pp. ACIAR: Canberra.

Nguyễn Thị Khả Tú, 2007. Định danh và phân nhóm nấm Trichoderma spp. phân lập

tại Việt Nam. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học. Trƣờng Đại

học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

Trần Thị Hoài Vi, 2011. Nghiên cứu và đánh giá sự phát triển của tác nhân gây bệnh

sau thu hoạch trên quả thanh long trong điều kiện được xử lý nhiệt. Luận văn

tốt nghiệp chuyên ngành bảo quản sau thu hoạch. Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ

TP. Hồ Chí Minh.

TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI

Adeniyi, D. O., Oriajo, S. B., Fademi, O. A., Adenuga, O. O. and Dongo, L. N., 2011.

Physiological studies of fungi complexes associated with cashew disease. Arpn

Journal of Agricultural and Biological Science.

Anil Kumar R, and RajKumar H. Garampalli, 2013. Screening of indigenous potential

antagonistic Trichoderma species from tomato rhizospheric soil against

Fusarium oxysporum f. sp. lycoperscisi. IOSR Journal of Agriculture and

Veterinary Science.

Azhar Hussain SH, Muhammad IN, Abdul Majeed H, 2003. Physiological study of

Sclerotium rolfsii Sacc. M. Sc. Pakistan J. Plant Pathol.

Basamma, 2008. Integrated management of Sclerotium wilt of potato caused by

Sclerotium rolfsii Sacc. M. Sc. Thesis. University of Agricultural Sciences.

Dharwad.

Bengyella Louis, Sayanika Deli Waikhom, Pranab Roy, Pardeep Kumar Bhardwaj,

Chandradev K. Sharma, Mohendro Wakambam Singh and Narayan Chandra

Talukdar, 2014. Host – Range Dynamics of Cochliobolus lunatus: From a

Biocontrol Agent to a Severe Environmental Threat. BioMed Research

International.

Đồ án tốt nghiệp

Bengyella Louis, Sayanika Devi Waikhom, Pranab Roy, Pardeep Kumar Bhardwaj,

Mohendro Wakambam Singh, Sailendra Goyari, Chandradev K Sharma and

Narayan Chandra Talukdar, 2014. Secretome weaponries of Cochliobolus

lunatus interacting with potato leaf at different temperature regimes reveal a

CL[xxxx]LHM – motif. BMC Genomics.

Chet, L, G.E.Harman, and R.Baker, 1981. Trichoderma hamatum: Its hyphal

interactions with Rhizoctonia solani and Pythium spp., Microb. Ecol. 7, pp 28 –

29.

Denis, C; Webster, 1971. J. Antagonistic properties of species – groups of

Trichoderma production of volatile antibiotics. Trans. Br. Mycol. Soc (84), pp

25 – 39.

Elad and Y., I.Chet, P.Boyle and Y.Hennis, 1983. Parasitism of Trichoderma spp. on

Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii scaning electron microscopy and

fluorescence microscopy, Phytopathology 73: pp 85 – 88.

Elad Y, Chet I, Henuls Y, 1982. Degradation of plant pathogenic fungi by

Trichoderma harzianum, J. Can. J. Microbiol, 1982, 28: 719 – 725.

Esposito .E, Silva .D.M, 1998. Systematics and environmental application of the Genus

Trichodema. Crical reviews in Microbiology 24 (2), pp. 89 – 98.

Gao Ying, Xue ChunSheng, Jiang XiaoYing, 2009. Comparative study onbiological

characters of Cochliobolus lunatus. Journal of Maize Sciences 2009.

Khattabia N, Brahim E, Latifer L, Abdullah O, 2004. Effect of nitrogen fertilizers on

Trichoderma harzianum and Sclerotium rolfsii. Agronomia.

Khilare, V.C. and Rafi Ahamed, 2012. Effect of different Media, PH and Temperature

on the growth of Fusarium oxysporum f. sp. ciceri causing chickpea wilt.

International journal of advanced biological research.

Đồ án tốt nghiệp

Khilare, V. C. and Rafi Ahmed, 2011. Effect of nutritional sources on the Growth of

Fusarium oxysporum f. sp. ciceri. Causing chickpes wilt. International Journal

of Science and Nature.

Kishore, R., Pandey, M., Dubey, K. and Kumar, Y, 2009. Effect of Temperature and

PH on Growth and Sporulation of Fusarium oxysporum f. sp. lini (Bolley)

Snyder and Hensan Causing Linseed Wilting. Prog. Agric. 9(1): 147 – 149.

Jyothi G, Reddy KRN, Reddy KRK and podile AR, 2013. Exploration of suitable solid

media for mass multiplication of Cochliobolus lunatus and Alternaria alternate

used as mycoherbicide for weed management (barnyard grass) in rice. Journal

of Experimental Biology and Agricultural Sciences, September – 2013.

Mohammad Reza Safari Motlagh, 2011. Evaluation of Curvularia lunata as an

Biological Control Agent in Major Weeds of Rice Paddies. Life Science Journal.

Manjal, R. L. and Gautam, S. R., 1977. Effect of vitamins on growth and sporulation of

Septoria humuli. Indian Phytopath. 30: 566 – 567.

Mansoor Ahmad Lone, Mohd. Rafig Wani, Subzar A. Sheikh, Sanjay Sahay, M.

Suliman Dar, 2012. Antagonistic Potentiality of Trichoderma harzianum

Against Cladosporium spherospermum, Aspergillus niger and Fusarium

oxysporum. Journal of Biology, Agriculture and Heathcare.

Miguel J. Benltrán-García, Fernanda M. Prado, Marilene S. Oliveira, David Ortiz-

Mendoza, Alexsandra C. Scalfo, Adalberto Pessoa Jr, Marisa H. G. Medeiros,

James F. White, Paolo Di Mascio, 2014. Singlet Molecular Oxygen Generation

by Light – Activated DHN – Melanin of the Fungal Pathogen Mycosphaerella

fijiensis in Black Sigatoka Disease of Bananas.

Naima Khattabi, Brahim Ezzahiri, Latifa Louali, Abdallah Oihabi, 2004. Effect of

nitrogen fertilizers and Trichoderma harzianum on Sclerotium rolfsii.

Agronomie 24 (2004) 281 – 288.

Nelson and Haasis, 1964. Cochliobolus lunatus. Mycology 56:316.

Đồ án tốt nghiệp

Prasad, A., Chaulhary, R. S. and Chaudhary, S. K., 1992. Effect of Different pH levels

on Growth and Sporulation of Fusarium monoliforme V. subglutinans Wr. And

Rg., The Causal Organism of Wilt of Maize. Bio. J. 4 (1 and 2): 75 – 78.

R. K. Jayaswal, Raiesh Singh and Youn Su Lee, 2003. Influence of Physiological and

Environment Factors on Growth and Sporulation of an Antagonistic Strain of

Trichoderma viride RSR 7. Mycobiology 31(1): 36 – 41 (2003). The Korean

Society of Mycology.

Sajid Farooq, Sh, Muhammad Iqbal and Ch. Abdul Rauf, 2005. Physiological Studies

of Fusarium oxysporum f. sp. ciceri. International Journal of Agriculture and

Biology.

S. Sundaramoorthy and P. Balabaskar, 2013. Biocontrol efficacy of Trichoderma spp.

against wilt of tomato caused by Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Journal

of Applied Biology and Biotechnology.

Steven John Mackenzie, 2005. Population structure and pathogenicity of

Collectotrichum gloeosporioides from strawberry and noncultivated hosts in

Florida. A dissertation presented to The Graduate School of The University of

Florida in Partial fulfillment of The Requirements for the degree of doctor oh

Philosophy. University of Florida.

Stanley Freeman, 2008. Management, Survival Strategies, and Host Range of

Collectotrichum acutatum on Strawberry. HostScien February 2008 vol. 43 no.1

66 88

Vinit Kumar Mishra, 2010. In vitro Antagonism of Trichoderma Species against

Pythium aphanidermatum. Journal of Phytology 2010.

Yan HH, Chen J, Xia SC, Liu P, Gao ZG, 2002. Albinism isolates of Curvularia

lunata. Mycosystema 2002.

Yasmeen Faiz Kazi, Pardeep Kumar and Irshad Hussain Soomro, 2013. Keratinolytic

activity exhibited in an indigenous non – dermatophytic fungus strain

Đồ án tốt nghiệp

Cochliobolus lunatus isolated from Khairpur Sindh Pakistan. Full Length

Resesrch Paper.

Y. K. Kim and C. L. Xiao, 2005. Influence of culture media and environmental factors

on mycelia growth and pycvidial production of Sphaeropsis pyriputrescens.

Mycologia.

TÀI LIỆU INTERNET

Nguyễn Thành Hiếu, Nguyễn Văn Hòa và Nguyễn Minh Châu. Biện pháp quản lý tạm

thời bệnh đốm trắng trên thanh long, Viện Cây ăn quả miền Nam,

http://sofri.org.vn/NewsDetail.aspx?l=&id=545&cat=1&catdetail=5

Nguyễn Thành Hiếu, Nguyễn Văn Hòa, Nguyễn Minh Châu. Bệnh đốm trắng thanh

long và giải pháp quản lý tạm thời, 2013,

http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi-vn/25/113540/khuyen-nong/benh-dom-

trang-thanh-long-giai-phap-quan-ly-tam-thoi.html

Nguyễn Văn Hòa. Những yếu tố cần thiết trong bảo vệ thực vật trên cây thanh long

trong sản xuất theo hướng GAP, Viện Cây ăn quả miền Nam, 2013,

http://thanhlongchauthanhlongan.com/bao-ve-thuc-vat/bao-ve-thuc-vat-56.html

Trần Thanh Phong. Phòng trừ bệnh đốm trắng trên thanh long, 2013,

http://baoapbac.vn/khoa-hoc/201307/phong-tru-benh-dom-trang-tren-thanh-

long-318453/

Nông Nghiệp Việt Nam. Hướng mới điều trị bệnh đốm trắng (đốm nâu) thanh long,

2013, http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi-vn/25/118246/ky-thuat-nghe-

nong/huong-moi-dieu-tri-benh-dom-trang-dom-nau-cay-thanh-long.html

Nông Nghiệp Việt Nam. Sớm ban hành quy trình quản lý bệnh đốm trắng thanh long,

2014, http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi-vn/25/121413/ky-thuat-nghe-

nong/som-ban-hanh-quy-trinh-quan-ly-benh-dom-trang-thanh-long.html

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A. CÁC BẢNG SỐ LIỆU THÔ

A.1. Tỷ lệ vết bệnh xuất hiện sau khi lây bệnh nhân tạo

Ngày sau chủng Mẫu nấm 20NSC 30NSC

16/40 36/40 Chủng nấm N1

Fusarium 0 0

Collectotrichum 0 0

ĐC (không lây bệnh) 0 0

A.2. Đƣờng kính (mm) tản nấm C. lunatus ở các mức ánh sáng khác nhau

Ngày sau cấy Mức ánh Lần lặp Mẫu

sáng lại nấm 1NSC 2NSC 3NSC 4NSC

1 18 24 29 31,25

SLT 2 16,75 22,5 27 30,5 C.

3 16,75 23,5 28 31 lunatus

trƣớc 1 17,75 27,5 37 45

Koch 12S :12T 2 17 27 36 45

3 17 27,5 37,5 46

1 18 32,75 42,25 47

SLT 2 17 30,5 37 47 C.

3 16,25 30,5 38 42 lunatus

sau 1 19 40,5 53 67,5

Koch 12S :12T 2 19,75 40,25 52,25 68,5

3 19 39,75 54 70

Đồ án tốt nghiệp

A.3. Đƣờng kính (mm) tản nấm C. lunatus ở các pH khác nhau

Ngày sau cấy Ph Lần lặp lại 1NSC 2NSC 3NSC 4NSC

1 18,25 39 49,5 69,5

pH 5 2 17,75 38 52,5 69,75

3 17,75 38 53,5 69,75

1 17,5 38 47,5 70

pH 6 2 18,25 38,75 51 69,75

3 17,25 38 53,75 70,5

1 18,25 40 56 72,25

pH 7 2 18 40 54,5 72,5

3 17,25 40 55,5 73

1 15 29,5 41,25 52

pH 8 2 15,5 29,75 40,25 52

3 14,5 29 39,5 49,25

A.4. Đƣờng kính (mm) tản nấm C. lunatus ở các nguồn nitơ khác nhau

Ngày sau cấy Lƣợng Lần lặp Nguồn nitơ nitơ lại 1NSC 2NSC 3NSC 4NSC

1 40,75 27 13 50,25 Urê 2 40,5 27 12,75 50,75 ((NH2)2CO) 3 41 26,75 12,75 51

0,28 g/ l 1 52,75 34 16,75 67,25

2 52 34 16,25 67,25 KNO3

3 51,75 33,5 16,5 67

1 39,25 27,5 15,5 47,75 (NH4)2SO4

Đồ án tốt nghiệp

2 15,5 27,75 38,75 47,5

3 15,25 27,5 39 48,75

1 13 25,5 36,75 45,25 Không bổ 2 12 25 36,6 45,25 sung nitơ 3 12 25 35,5 45

1 12,75 25,75 38,75 49 Urê 2 12,5 25,25 38 49,5 ((NH2)2CO) 3 12,5 25,25 38 48

1 12,5 29 45,5 59,5

2 12,5 29 45,75 60,25 KNO3

3 13 28,75 46,5 58,75 0,14 g/ l 1 15 26,5 37,75 45,5

2 26,75 37,25 46 14,75 (NH4)2SO4

3 15 27 37,25 45,75

1 13 25,5 36,75 45,25 Không bổ 2 12 25 36,6 45,25 sung nitơ 3 12 25 35,5 45

A.5. Đƣờng kính (mm) tản nấm C. luantus ở đĩa đối kháng và đối chứng qua các ngày

cấy đối kháng

Lần nhắc Lần 1 Lần 2 Lần 3

Ngày sau cấy Ngày sau cấy Ngày sau cấy Mẫu Lần

nấm lặp 3 5 7 10 7 10 3 5 7 10 5 3

44 44 43,5 43,5 1 43 43 46 46 45,5 45,5 43 43

T2 43,5 43 43 43 2 42 42 44,5 44,5 44,5 44,5 42 42

3 45 45 44,5 44,5 42,5 42,5 44,5 44,5 44,5 44,5 43 43

Đồ án tốt nghiệp

45,5 45 45 1 46 46 46 46 49,5 49,5 49,5 49,5 49,5

T1 47 47 46,5 2 46 46 46 46 49,5 49 49 49 49

3 - - - 47 47 47 - - - - 46,5 -

1 57 75 90 90 57 72 90 58 76,5 90 90 90

2 ĐC 57,5 75 90 90 57 73 90 57 76 90 90 90

3 56 72 90 90 55,5 69,5 90 - - - - 90

Ghi chú: T2 là chủng nấm Trichoderma harzianum, T1 là chủng nấm Trichoderma

virens, (-) đĩa cấy bị rơi bào tử.

PHỤ LỤC B. KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU

B.1. Ảnh hƣởng của các mức ánh sáng đến tốc độ tăng trƣởng kích thƣớc nấm C.

luantus.

Ảnh hƣởng của các mức ánh sáng đến tốc độ tăng trƣởng kích thƣớc nấm C. luantus

trƣớc Koch thời điểm 1 ngày sau cấy.

ANOVA Table for duong kinh tan nam by muc anh sang Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 0.0104167 0.0104167 0.03 1 0.8722

Within groups 1.41667 0.354167 4

Total (Corr.) 1.42708 5

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by muc anh sang

Method: 95.0 percent LSD

Muc anh sang Count Mean Homogeneous Groups

X SLT 3 17.1667

X 12S:12T 3 17.25

Đồ án tốt nghiệp

Ảnh hƣởng của các mức ánh sáng đến tốc độ tăng trƣởng kích thƣớc nấm C. luantus

trƣớc Koch thời điểm 2 ngày sau cấy.

ANOVA Table for duong kinh tan nam by muc anh sang

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 24.0 24.0 72.00 0.0011 1

Within groups 1.33333 0.333333 4

Total (Corr.) 25.3333 5

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by muc anh sang

Method: 95.0 percent LSD

Muc anh sang Count Mean Homogeneous Groups

X slt 3 23.3333

X 12s12t 3 27.3333

Ảnh hƣởng của các mức ánh sáng đến tốc độ tăng trƣởng kích thƣớc nấm C. luantus

trƣớc Koch thời điểm 3 ngày sau cấy.

ANOVA Table for duong kinh tan nam by muc anh sang

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 117.042 117.042 147.84 0.0003 1

Within groups 3.16667 0.791667 4

Total (Corr.) 120.208 5

Đồ án tốt nghiệp

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by muc anh sang

Method: 95.0 percent LSD

Muc anh sang Count Homogeneous Groups Mean

X SLT 3 28.0

X 12S:12T 3 36.8333

Ảnh hƣởng của các mức ánh sáng đến tốc độ tăng trƣởng kích thƣớc nấm C. luantus

trƣớc Koch thời điểm 4 ngày sau cấy.

ANOVA Table for duong kinh tan nam by muc anh sang Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 311.76 311.76 1301.26 1 0.0000

Within groups 0.958333 0.239583 4

Total (Corr.) 312.719 5

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by muc anh sang

Method: 95.0 percent LSD

Muc anh sang Count Mean Homogeneous Groups

Slt 3 30.9167 X

12s12t 3 45.3333 X

Đồ án tốt nghiệp

Ảnh hƣởng của các mức ánh sáng đến tốc độ tăng trƣởng kích thƣớc nấm C. luantus

sau Koch thời điểm 1 ngày sau cấy.

ANOVA Table for duong kinh tan nam by muc anh sang

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 7.04167 7.04167 14.70 0.0186 1

Within groups 1.91667 0.479167 4

Total (Corr.) 8.95833 5

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by muc anh sang

Method: 95.0 percent LSD

Muc anh sang Count Mean Homogeneous Groups

X SLT 3 17.0833

X 12S:12T 3 19.25

Ảnh hƣởng của các mức ánh sáng đến tốc độ tăng trƣởng kích thƣớc nấm C. luantus

sau Koch thời điểm 2 ngày sau cấy.

ANOVA Table for duong kinh tan nam by muc anh sang

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 119.26 119.26 130.10 0.0003 1

Within groups 3.66667 0.916667 4

Total (Corr.) 122.927 5

Đồ án tốt nghiệp

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by muc anh sang

Method: 95.0 percent LSD

Muc anh sang Count Homogeneous Groups Mean

X SLT 3 31.25

X 12S:12T 3 40.1667

Ảnh hƣởng của các mức ánh sáng đến tốc độ tăng trƣởng kích thƣớc nấm C. luantus

sau Koch thời điểm 3 ngày sau cấy.

ANOVA Table for duongkinh tan nam by mucanh sang

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 294.0 294.0 68.84 0.0012 1

Within groups 17.0833 4.27083 4

Total (Corr.) 311.083 5

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by muc anh sang

Method: 95.0 percent LSD

Muc anh sang Count Mean Homogeneous Groups

X SLT 3 39.0833

X 12S:12T 3 53.0833

Ảnh hƣởng của các mức ánh sáng đến tốc độ tăng trƣởng kích thƣớc nấm C. luantus

sau Koch thời điểm 4 ngày sau cấy.

ANOVA Table for duong kinh tan nam by muc anh sang Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 816.667 816.667 164.71 1 0.0002

Within groups 19.8333 4.95833 4

Đồ án tốt nghiệp

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by muc anh sang

Method: 95.0 percent LSD

Muc anh sang Count Mean Homogeneous Groups

SLT 3 45.3333 X

12S:12T 3 68.6667 X

B.2. Ảnh hƣởng của pH đến tốc độ tăng trƣởng kích thƣớc nấm C. luantus

Thời điểm 1 ngày sau cấy

ANOVA Table for duong kinh tan nam by pH

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 17.8073 5.93576 27.13 0.0002 3

Within groups 1.75 0.21875 8

Total (Corr.) 19.5573 11

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by pH

Method: 95.0 percent LSD

Count Homogeneous Groups pH Mean

X pH8 3 15.0

X pH6 3 17.6667

X pH7 3 17.8333

X pH5 3 17.9167

Đồ án tốt nghiệp

Thời điểm 2 ngày sau cấy

ANOVA Table for duong kinh tan nam by pH

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 206.542 68.8472 413.08 0.0000 3

Within groups 1.33333 0.166667 8

Total (Corr.) 207.875 11

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by pH

Method: 95.0 percent LSD

Count Mean Homogeneous Groups pH

X pH8 3 29.4167

X pH6 3 38.25

X pH5 3 38.3333

X pH7 3 40.0

Thời điểm 3 ngày sau cấy

ANOVA Table for duong kinh tan nam by pH

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 375.141 125.047 32.27 0.0001 3

Within groups 31.0 3.875 8

Total (Corr.) 406.141 11

Đồ án tốt nghiệp

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by pH

Method: 95.0 percent LSD

Count Mean Homogeneous Groups Ph

X 40.3333 3 pH8

X 50.75 3 pH6

XX 51.8333 3 pH5

X 55.3333 3 pH7

Thời điểm 4 ngày sau cấy

ANOVA Table for duong kinh tan nam by pH Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 887.641 295.88 417.71 3 0.0000

8 Within groups 5.66667 0.708333

Total (Corr.) 893.307 11

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by pH

Method: 95.0 percent LSD

Count Mean Homogeneous Groups pH

51.0833 X 3 pH8

69.6667 X 3 pH5

70.0833 X 3 pH6

72.5833 X 3 pH7

B.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến tốc độ tăng trƣởng kích thƣớc nấm C. luantus

Lƣợng nitơ là 0,28 g/ l

Thời điểm 1 ngày sau cấy

ANOVA Table for duong kinh tan nam by nguon nito

Đồ án tốt nghiệp

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 36.3073 12.1024 110.65 0.0000 3

Within groups 0.875 0.109375 8

Total (Corr.) 37.1823 11

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by nguon nito

Method: 95.0 percent LSD

Nguon nito Count Mean Homogeneous Groups

khongbo sung 3 12.3333 X

Ure 3 12.8333 X

3 15.4167 X (NH4)2SO4

3 16.5 X KNO3

Thời điểm 2 ngày sau cấy

ANOVA Table for duong kinh tan nam by nguon nito

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 128.521 42.8403 822.53 0.0000 3

Within groups 0.416667 0.0520833 8

Total (Corr.) 128.938 11

Đồ án tốt nghiệp

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by nguon nito

Method: 95.0 percent LSD

Nguon nito Count Mean Homogeneous Groups

khongbo sung 25.1667 X 3

Ure 3 26.9167 X

3 27.5833 X (NH4)2SO4

3 33.8333 X KNO3

Thời điểm 3 ngày sau cấy

ANOVA Table for duong kinh tan nam by nguon nito

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 440.937 146.979 705.50 0.0000 3

Within groups 1.66667 0.208333 8

Total (Corr.) 442.604 11

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by nguon nito

Method: 95.0 percent LSD

Nguonnito Count Mean Homogeneous Groups

khongbo sung 3 36.25 X

3 39.0 X (NH4)2SO4

Ure 3 40.75 X

3 52.1667 X KNO3

Thời điểm 4 ngày sau cấy.

ANOVA Table for duong kinh tan nam by nguon nito

Đồ án tốt nghiệp

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 876.75 292.25 1870.40 0.0000 3

Within groups 1.25 0.15625 8

Total (Corr.) 878.0 11

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by nguon nito

Method: 95.0 percent LSD

Nguon nito Count Mean Homogeneous Groups

45.1667 X Khong bo sung 3

48.0 X 3 (NH4)2SO4

50.6667 X Ure 3

67.1667 X 3 KNO3

Lƣợng nitơ là 0,14 g/ l

Thời điểm 1 ngày sau cấy

ANOVA Table for duong kinh tan nam by nguon nito

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 13.0208 4.34028 37.88 0.0000 3

Within groups 0.916667 0.114583 8

Total (Corr.) 13.9375 11

Đồ án tốt nghiệp

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by nguon nito

Method: 95.0 percent LSD

Nguon nito Count Mean Homogeneous Groups

khongbo sung 3 12.3333 X

Ure 3 12.5833 X

3 12.6667 X KNO3

3 14.9167 X (NH4)2SO4

Thời điểm 2 ngày sau cấy

ANOVA Table for duong kinh tan nam by nguon nito

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 26.5156 8.83854 141.42 0.0000 3

Within groups 0.5 0.0625 8

Total (Corr.) 27.0156 11

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by nguon nito

Method: 95.0 percent LSD

Nguonnito Count Mean Homogeneous Groups

Khong bo sung 3 25.1667 X

Ure 3 25.4167 X

3 26.75 X (NH4)2SO4

3 28.9167 X KNO3

Thời điểm 3 ngày sau cấy

ANOVA Table for duong kinh tan nam by nguon nito

Đồ án tốt nghiệp

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 172.896 57.6319 235.43 0.0000 3

Within groups 1.95833 0.244792 8

Total (Corr.) 174.854 11

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by nguon nito

Method: 95.0 percent LSD

Nguon nito Count Homogeneous Groups Mean

Khong bo sung 3 36.25 X

3 37.4167 X (NH4)2SO4

Ure 3 38.25 X

3 45.9167 X KNO3

Thời điểm 4 ngày sau cấy

ANOVA Table for duong kinh tan nam by nguon nito

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 398.682 132.894 432.47 0.0000 3

Within groups 2.45833 0.307292 8

Total (Corr.) 401.141 11

Đồ án tốt nghiệp

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by nguon nito

Method: 95.0 percent LSD

Nguon nito Count Mean Homogeneous Groups

Khong bo sung 3 45.1667 X

3 45.75 X (NH4)2SO4

Ure 3 48.8333 X

3 59.5 X KNO3

So sánh lƣợng nitơ 0,28 g/l và 0,14 g/l

ANOVA Table for duong kinh tan nam by luong nito

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 88.1667 88.1667 302.29 1 0.0001

Within groups 1.16667 0.291667 4

Total (Corr.) 89.3333 5

Multiple Range Tests for duong kinh tan nam by luong nito

Method: 95.0 percent LSD

Luong nito Count Homogeneous Groups Mean

0.14 3 59.5 X

0.28 3 67.1667 X

B.4. Đánh giá khả năng đối kháng của chủng T. virens và T. harzianum với chủng nấm

C. lunatus

Thời điểm 3 ngày sau cấy

ANOVA Table for PIGM by CHUNG

Đồ án tốt nghiệp

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 25.1331 25.1331 17.16 0.0143 1

Within groups 5.85687 1.46422 4

Total (Corr.) 30.9899 5

Multiple Range Tests for PIGM by CHUNG

Method: 95.0 percent LSD

CHUNG Count Homogeneous Groups Mean

X T1 3 18.84

X T2 3 22.9333

Thời điểm 5 ngày sau cấy

ANOVA Table for PIGM by CHUNG

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 29.9267 29.9267 26.45 0.0068 1

Within groups 4.52627 1.13157 4

Total (Corr.) 34.4529 5

Multiple Range Tests for PIGM by CHUNG

Method: 95.0 percent LSD

CHUNG Count Homogeneous Groups Mean

X T1 3 36.15

X T2 3 40.6167

Thời điểm 7 ngày sau cấy

ANOVA Table for PIGM by CHUNG

Đồ án tốt nghiệp

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

1 Between groups 25.174 25.174 10.30 0.0326

4 Within groups 9.77613 2.44403

5 Total (Corr.) 34.9501

Multiple Range Tests for PIGM by CHUNG

Method: 95.0 percent LSD

CHUNG Count Mean Homogeneous Groups

X T1 3 47.6567

X T2 3 51.7533

Thời điểm 10 ngày sau cấy.

ANOVA Table for PIGM by CHUNG

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

1 Between groups 25.215 25.215 9.65 0.0360

4 Within groups 10.4505 2.61263

5 Total (Corr.) 35.6655

Multiple Range Tests for PIGM by CHUNG

Method: 95.0 percent LSD

CHUNG Count Mean Homogeneous Groups

T1 3 47.7167 X

T2 3 51.8167 X

Đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp: Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN THANH LONG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÁC NHÂN GÂY BỆNH

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHOØNG XEÙT NGHIEÄM NK-BIOTEK 793/58 TRAÀN XUAÂN SOÏAN, P. TAÂN HÖNG, Q.7, TP. HCM

Theo ñònh höôùng ISO 15189

KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

THÔNG TIN VỀ MẪU THỬ

VÕ THỊ LAN THANH

TL Định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 28 S

PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN  Giải trình tự gen 28 S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH

Kết quả

SAB

Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH

Score

Expect

Identities

Gaps

Strand

Cochliobolus lunatus

KẾT LUẬN

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CÁM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU

Chƣơng 1

TỔNG QUAN

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

d Hình 3.10. Đƣờng kính trung bình của nấm Cochliobolus lunatus ở các điều kiện chiếu

d Hình 3.11. Đƣờng kính trung bình tản nấm Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA

Chƣơng 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok